JP2019516364A - Ｅｇｆｒ及びｈｅｒ２をターゲティングする二重特異性抗体 - Google Patents

Abstract

本開示は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２をターゲティングする二重特異性抗体、及びこれらの抗体の生産方法に関する。当該二重特異性抗体は、２つのＶＨ−ＶＬ鎖が、リンカーを介して抗体の両ＶＨ鎖のＮＨ末端領域に結合している１つの完全抗体からなる。構成された二重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２をターゲティングする２つのモノクローナル抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）可変領域のアミノ酸配列、すなわち、それぞれセツキシマブ及びトラスツズマブを使用する。

Description

本発明は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２をターゲティングする二重特異性抗体、この抗体の生産方法、組成物並びにその使用に関する。

発明の背景
４つのチロシンキナーゼレセプター（ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４）を含むＨＥＲファミリーは、細胞増殖に関与する複数の部分的に冗長な相互接続下流シグナリングカスケード（例えば、ＭＡＰＫ及びＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路）を活性化する。多数の固形腫瘍（肺、結腸直腸、膵臓など）では、ＨＥＲ異常シグナリングが観察されている。ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２は、ＨＥＲファミリーレセプターとのホモ二量体化及びヘテロ二量体化を介して成長シグナルを伝達する細胞表面レセプターチロシンキナーゼ（ＴＫ）である。ＥＧＦＲとＨＥＲ２とのヘテロダイマーは、ＥＧＦＲ又はＨＥＲ２ホモ二量体化よりもより強力なＴＫシグナリング活性化を誘導する。腫瘍細胞がＥＧＦＲ及びＨＥＲ２の両方を過剰発現する場合、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２ヘテロ二量体化及びシグナリングの可能性が増加するため、それらは積極的な腫瘍細胞成長を示す。

膵臓ガンは、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２レセプターを発現する固形腫瘍の例であり、非常に予後不良である。膵臓腫瘍では、ＥＧＦＲは、膵臓ガンの４５〜９５％において発現され、一般に、発現は、切除膵臓ガンの転帰悪化と相関する。ＨＥＲ２の過剰発現もまた、膵臓ガンの７〜５８％において記録されており、ＨＥＲ２増幅膵臓ガンは非定型転移パターンを示すが、これは、ＨＥＲ２もまた、膵臓ガンにおける腫瘍形成の重要な駆動因子である可能性が高いことを示唆している。また、ＥＧＦＲ＋である膵臓ガン腫の約４分の１は、さらにＨＥＲ２＋でもあることが報告されており(Dancer et al (2007) Oncology Reports 18, p.151)、それらは二重陽性ＥＧＦＲ＋／ＨＥＲ２表現型となる。

膵臓ガンは、欧州では４番目に多いガン死亡原因であり、症例数が毎年増加している（男性では＋２％、女性では＋１０％）。早期に診断された場合であっても、それは非常に予後不良である。それは、過去４０年間に生存率がほとんど改善されていない唯一のガンの１つである：生存は、それぞれ１年後及び５年後で２０％及び５％よりも悪い。膵臓ガンは、２０１２年に世界で２３０，０００件超の死亡の原因であったが、それは依然として希少疾患であり、有効な処置がないので、新たに診断された患者と死亡とが同数である。現在、膵臓腺ガン（膵臓ガンの９０％）は、手術、化学療法又は放射線と化学療法との組み合わせのいずれかで処置されるが、結果は限定的である。第１選択処置として１９９６年に発売されたゲムシタビンは、無再発生存を中央値で１．３カ月間改善し、全生存（ＯＳ）を１年で２％から１８％に改善した。２００５年以来、様々な臨床試験にもかかわらず、膵臓ガンについては、２つの薬物（Tarceva（登録商標）（エルロチニブ）及びAbraxane（登録商標）（ｎａｂ−パクリタキセル））しか承認されておらず、組み合わせが中心であり、イノベーションはほとんどない。最初のターゲット療法であったエルロチニブは、ゲムシタビンと共同して、無再発生存を中央値で１カ月間だけ改善した。

ＨＥＲレセプターを直接ターゲティングするか又は下流キナーゼをターゲティングする治療剤による処置は、多くの場合、獲得耐性に直面するか、又はシグナル伝達ネットワークの固有のロバスト性によって制限される。

このような場合、自然の対策として併用療法が登場したが、それらの最適な設計は容易ではなく、腫瘍又はそのサブタイプに依存し得るので、事前の患者分類を必要とする(Fitzgerald JB, Schoeberl B, Nielsen UB, Sorger PK. Systems biology and combination therapy in the quest for clinical efficacy. Nat Chem Biol. 2006; 2:458-66.)。ＨＥＲシグナリングを阻害するために利用可能な最新の武器は、小分子チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、例えばラパチニブ又はエルロチニブ及び治療用抗体、例えばセツキシマブ又はトラスツズマブから構成される。実際、抗体は、シグナリングモデュレーションに限定されたＴＫＩとは対照的に、シグナリング減少の上流に対する免疫学的効果を誘導して腫瘍の排除を支援する強力なアプローチである。

多くの著者によって、抗体ベースの併用療法が提案されている。ｍＡｂの組み合わせによるＨＥＲダイマー、特にＥＧＦＲ／ＨＥＲ２ヘテロダイマーのターゲティングは、膵臓腫瘍成長の阻害に有利であることが実証された。

２つのｍＡｂのターゲットを併せ持つ二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）がさらに設計されている。いくつかの二重特異性抗ＥＧＦＲ／抗ＨＥＲ２抗体がより具体的に記載されている。しかしながら、それらは複雑な設計に悩まされており、その結果、通常は製造性及び安定性が低くなり、in vivo膵臓ガンモデルでは、二重特異性抗体による処置中であっても腫瘍の成長が継続したので、これらの抗体の有効性はさらに改善可能である。

例えば、Liuら(Liu et al. A Novel Antibody Engineering Strategy for Making Monovalent Bispecific Heterodimeric IgG Antibodies by Electrostatic Steering Mechanism. J Biol. Chem. 2015; 290(12):7535-62)は、それぞれパニツムマブ及びトラスツズマブの配列を利用した二重特異性抗ＥＧＦＲ及び抗ＨＥＲ２抗体の構築及び特性評価を記載している。前記抗体は、in vitro及びin vivoでＥＧＦＲ＋／ＨＥＲ２＋細胞株に対する活性の改善を示したが、しかしながら、この抗体の活性は依然として改善が必要である。Lewisら(Lewis et al. Generation of bispecific IgG antibodies by structure-based design of an orthogonal Fab interface. Nature Biotechnology. 2014; 32; 191-198)もまた、二重特異性抗ＥＧＦＲ及び抗ＨＥＲ２抗体を記載しているが、しかしながらこの場合、異なる抗体配列（マツズマブ及びペルツズマブの配列）及び異なる工学的設計が使用された。

国際公開公報第２０１４／００１３２４号には、ソルターゼＡなどのトランスペプチダーゼを使用することによって多重特異性実体を選択及び生産するための方法、並びに新規の特注多重特異性抗体を作製するためのこの方法の使用が報告されている。ペルツズマブ及びトラスツズマブを含有する二重特異性抗体が例示されている。国際公開公報第２０１４／１２４３２６号には、例えばトラスツズマブ及びセツキシマブを含有する多重特異性抗体構築物、並びに多重特異性抗体薬物コンジュゲートが記載されている。

二重特異性ＨＥＲ２／ＥＧＦＲ抗体は、欧州特許出願公開第２７２７９４０号にも記載されており、この抗体は、欧州特許出願公開第２０３５４５６号と同様に、重鎖において６つの突然変異を有しており、ヘテロダイマー対合を達成する。しかしながら、これらの抗体の構造は、不安定化及び免疫原性をもたらし得る。

Wangら(Cancer Lett 2012 Dec 28; 325(2):214-9)は、トラスツズマブ及びセツキシマブを使用して、抗ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２二重特異性抗体を操作した。しかしながら、天然抗体と同様に、両抗原に対する結合は二価ではなく一価であったので、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２阻害の全潜在能力が引き出されていなかった可能性がある。

上記を考慮すると、腫瘍を処置するための改善された二重特異性抗体構築物の必要性が依然として存在する。

今回、本発明者らは、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２をターゲティングする新規二重特異性抗体であって、様々なガンの処置において有用な新規二重特異性抗体を設計した。

より具体的には、本発明は、２本の重鎖及び４本の軽鎖を含む二重特異性抗体であって、
各重鎖が、
ａ．ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリンのＦｃ領域
を含み、
ｂ．このＦｃ領域が、前記ヒンジドメインによって、抗体１（Ａｂ１）のＦａｂ重鎖ＣＨ１−ＶＨに連結されており、
ｃ．そしてこれが、ポリペプチドリンカー配列によって、抗体２（Ａｂ２）のＦａｂ重鎖ＣＨ１−ＶＨに連結されており、該ポリペプチドリンカー配列が、Ａｂ１の前記Ｆａｂ重鎖ＶＨドメインのＮ末端と、Ａｂ２の前記ＣＨ１ドメインのＣ末端とを連結し、
４本の軽鎖が、それらの同種重鎖ドメインと会合したＡｂ１のＦａｂ軽鎖及びＡｂ２のＦａｂ軽鎖を含み；
Ａｂ１及びＡｂ２が異なるものであり、一方ではセツキシマブ又はその突然変異誘導体及び他方ではトラスツズマブ又はその突然変異誘導体からなる群より独立して選択される二重特異性抗体を提供する。

第１の実施態様では、Ａｂ１は、セツキシマブ又はその突然変異誘導体であり、Ａｂ２は、トラスツズマブ又はその突然変異誘導体である。

別の実施態様では、Ａｂ１は、トラスツズマブ又はその突然変異誘導体であり、Ａｂ２は、セツキシマブ又はその突然変異誘導体である。

より具体的には、二重特異性抗体であって、Ａｂ１又はＡｂ２が、
ｏ配列番号：４からなるＶＨドメイン、
ｏ配列番号：２、配列番号：５、配列番号：２０、配列番号：２１及び配列番号：２２からなる群より選択されるＣＨ１ドメイン、
ｏ配列番号：１３からなるＶＬドメイン、
ｏ配列番号：１１、配列番号：１４、配列番号：２３、配列番号：２４及び配列番号：２５からなる群より選択されるＣＬドメイン
を含むセツキシマブ又はその突然変異誘導体であり、
該ＣＨ１及びＣＬドメインが、以下
−配列番号：２と配列番号：１１、
−配列番号：５と配列番号：１４又は配列番号：２３のいずれか、
−配列番号：２０と配列番号：１４又は配列番号：２３のいずれか、
−配列番号：２１と配列番号：２４又は配列番号：２５のいずれか、
−配列番号：２２と配列番号：２４又は配列番号：２５のいずれか
のように会合する二重特異性抗体が記載される。

別の実施態様では、二重特異性抗体であって、Ａｂ１又はＡｂ２が、
ｏ配列番号：１の配列からなるＶＨドメイン
ｏ配列番号：２、配列番号：５、配列番号：２０、配列番号：２１及び配列番号：２２からなる群より選択されるＣＨ１ドメイン
ｏ配列番号：１０の配列からなるＶＬドメイン、
ｏ配列番号：１１、配列番号：１４、配列番号：２３、配列番号：２４及び配列番号：２５からなる群より選択されるＣＬドメイン
を含むトラスツズマブ又はその突然変異誘導体であり、
該ＣＨ１及びＣＬドメインが、以下
−配列番号：２と配列番号：１１
−配列番号：５と配列番号：１４又は配列番号：２３のいずれか
−配列番号：２０と配列番号：１４又は配列番号：２３のいずれか
−配列番号：２１と配列番号：２４又は配列番号：２５のいずれか
−配列番号：２２と配列番号：２４又は配列番号：２５のいずれか
のように会合する二重特異性抗体が記載される。

好ましくは、Ａｂ１のＣＨ１及びＣＬドメインは、Ａｂ２のＣＨ１及びＣＬドメインと異なる配列の組み合わせを有する。

有利な実施態様では、ポリペプチドリンカー配列は、配列番号：３、配列番号：１６又は配列番号：３４からなる。

特定の抗体であって、
ａ）２本の重鎖であって、それぞれが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
・配列番号：１からなるトラスツズマブ重鎖ＶＨ、
・配列番号：２からなるＣＨ１ドメイン、
・配列番号：３、配列番号：１６又は配列番号：３４からなるポリペプチドリンカー、
・配列番号：４からなるセツキシマブ重鎖ＶＨ、
・配列番号：５からなるＣＨ１ドメイン、
・配列番号：６からなるヒンジドメイン、
・配列番号：７からなるＣＨ２ドメイン、
・配列番号：８からなるＣＨ３ドメイン
を含む連続配列からなる２本の重鎖、
ｂ）２本のトラスツズマブ軽鎖であって、それぞれが、
・配列番号：１０からなるＶＬドメイン、
・配列番号：１１からなるＣＬドメイン
を含む２本のトラスツズマブ軽鎖、
ｃ）２本のセツキシマブ軽鎖であって、それぞれが、
・配列番号：１３からなるＶＬドメイン、
・配列番号：１４からなるＣＬドメイン
を含む２本のセツキシマブ軽鎖
からなる特定の抗体が提供される。

別の特定の抗体であって、
ａ）２本の重鎖であって、それぞれが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
・配列番号：４からなるセツキシマブ重鎖ＶＨ、
・配列番号：５からなるＣＨ１ドメイン、
・配列番号：３、配列番号：１６又は配列番号：３４からなるポリペプチドリンカー、
・配列番号：１からなるトラスツズマブ重鎖ＶＨ、
・配列番号：２からなるＣＨ１ドメイン、
・配列番号：６からなるヒンジドメイン、
・配列番号：７からなるＣＨ２ドメイン、
・配列番号：８からなるＣＨ３ドメイン
を含む連続配列からなる２本の重鎖、
ｂ）２本のトラスツズマブ軽鎖であって、それぞれが配列番号：１２を含む２本のトラスツズマブ軽鎖
ｃ）２本のセツキシマブ軽鎖であって、それぞれが配列番号：１５を含む２本のセツキシマブ軽鎖
からなる別の特定の抗体が提供される。

好ましい本発明の二重特異性抗体は、配列番号：４、配列番号：２６及び配列番号：２７の配列からなるセツキシマブＶＨ配列を有する抗体である。

本発明は、セツキシマブのヒト化型の軽鎖及び／又は重鎖を含有する二重特異性抗体をさらに包含する。

特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗体は、トラスツズマブの突然変異ＶＨ及びＶＬ配列を含有する。

本発明のタンパク質鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドも本明細書に記載される。前記ポリヌクレオチドはまた、さらなる配列を含み得る：特に、それは、有利には、前記タンパク質鎖の分泌を可能にするリーダー配列又はシグナルペプチドをコードする配列を含み得る。

本発明はまた、前記ポリヌクレオチドでトランスフォーメーションされた宿主細胞を包含する。

上記で定義される二重特異性抗体の重鎖からなるポリペプチド、及び前記ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドがされに記載される。

前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターでトランスフェクションされた宿主細胞も記載される。

本発明のさらに別の目的は、本発明の二重特異性抗体を調製するための方法である。

したがって、本発明の二重特異性抗体を生産するための方法であって、以下の工程：ａ）適切な培地中及び培養条件で、上記で定義される抗体重鎖及び上記で定義される抗体軽鎖を発現する宿主細胞を培養すること；並びにｂ）培養培地から、又は前記培養細胞から前記産生抗体を回収することを含む方法が提供される。

図１は、本発明の二重特異性抗体の概略図である。 図２Ａは、還元条件及び非還元条件下における二重特異性抗体BiXAb-3732SS及びBiXAb-3489のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。 図２Ｂは、還元条件及び非還元条件下における二重特異性抗体BiXAb-3486のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。 図２Ｃは、還元条件及び非還元条件下における二重特異性抗体BiXAb-E06528のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。 図３Ａは、BiXAb-3489のサイズ排除クロマトグラフィー分析を示す。 図３Ｂは、BiXAb-3732SSのサイズ排除クロマトグラフィー分析を示す。 図３Ｃは、BiXAb-E06528のサイズ排除クロマトグラフィー分析を示す。 図４は、デジタル走査熱量測定によって測定した２つの親抗体（抗ＨＥＲ２及び抗ＥＧＦＲ）及びBiXAb-3489の融解プロファイルを示す。 図５は、二重抗原（ＨＥＲ２及びＥＧＦＲ）結合ＥＬＩＳＡにおけるBiXAb-3486及びBiXAb-3489の結合プロファイルを示す。 図６Ａは、ターゲット細胞としてヒト膵臓ガン細胞株ＢｘＰＣ−３を用い、エフェクター細胞として非分画非プレ活性化単核細胞を用いたＡＤＣＣアッセイにおける２つの親抗体（抗ＨＥＲ２及び抗ＥＧＦＲ）、それらの１：１混合物、BiXAb-3486、BiXAb-3489、BiXAb-3732SS、BiXAb-E06528及びネガティブコントロール抗体抗ＣＤ２０の細胞傷害活性プロファイルを示す。 図６Ｂは、ターゲット細胞としてヒト皮膚扁平上皮ガン細胞株Ａ４３１を用い、エフェクター細胞として非分画非プレ活性化単核細胞を用いたＡＤＣＣアッセイにおける２つの親抗体（抗ＨＥＲ２及び抗ＥＧＦＲ）、それらの１：１混合物、BiXAb-3486、BiXAb-3489、BiXAb-3732SS、BiXAb-E06528及びネガティブコントロール抗体抗ＣＤ２０の細胞傷害活性プロファイルを示す。 図６Ｃは、ターゲット細胞としてヒト卵巣ガン細胞株ＳＫＯＶ３を用い、エフェクター細胞として非分画非プレ活性化単核細胞を用いたＡＤＣＣアッセイにおける２つの親抗体（抗ＨＥＲ２及び抗ＥＧＦＲ）、それらの１：１混合物、BiXAb-3486、BiXAb-3489、BiXAb-3732SS、BiXAb-E06528及びネガティブコントロール抗体抗ＣＤ２０の細胞傷害活性プロファイルを示す。 図７Ａは、ＢｘＰＣ−３を有するヌードマウスにおける、異なる用量（２mg/kg及び１０mg/kg）のBiXab-3486、BiXab-3489、並びに総濃度 ４mg/kgの親抗ＥＧＦＲ及び抗ＨＥＲ２の組み合わせ、並びにコントロールの効果を示す（リニアスケール）。 図７Ｂは、異なる用量（２mg/kg及び１０mg/kg）のBiXAb-3486及びBiXAb-3489、総濃度 ４mg/kgの抗ＨＥＲ２及び抗ＥＧＦＲ抗体の組み合わせ、又はコントロールを投与したマウスの６つの異なるコホートの腫瘍成長阻害（Ｔ／Ｃ％）を示す。腫瘍成長阻害（Ｔ／Ｃ％）は、処置群対コントロール群の腫瘍体積の中央値の比として定義し、Ｔ／Ｃ％＝［（Ｘ日目における処置群の腫瘍体積の中央値）／（Ｘ日目におけるコントロール群の腫瘍体積の中央値）］×１００として計算した。 図７Ｃ、異なる用量（２mg/kg及び１０mg/kg）のBiXAb-3486及びBiXAb-3489、総濃度 ４mg/kgの抗ＨＥＲ２及び抗ＥＧＦＲ抗体の組み合わせ、並びにコントロールで処置したマウスを比較したカプラン・マイヤー生存曲線。 図７Ｄは、処置を受けなかったマウス（コントロール）と比べた、BiXAb又は親抗ＨＥＲ２及び抗ＥＧＦＲの組み合わせによる処置を受けたマウスにおいて観察された治療効果を示す。治療効果は、処置群の生存期間の中央値−コントロール群の生存期間の中央値として定義する。

発明の詳細な説明
定義
天然に存在する抗体分子の基本構造は、非共有結合的相互作用及び鎖間ジスルフィド結合によって互いに保持される２本の同一の重鎖及び２本の同一の軽鎖からなるＹ字型テトラマ−四次構造である。

哺乳動物種では、免疫グロブリンのクラス（アイソタイプ）：それぞれＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭを決定する５つのタイプの重鎖：α、δ、ε、γ及びμがある。重鎖Ｎ末端可変ドメイン（ＶＨ）と、それに続いて、重鎖γ、α及びδにおいて（Ｎ末端からＣ末端へＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３とナンバリングされる）３つのドメインを含有する定常領域とがあり、重鎖μ及びεの定常領域は、（Ｎ末端からＣ末端へＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４とナンバリングされる）４つのドメインから構成される。ＩｇＡ、ＩｇＧ及びＩｇＤのＣＨ１及びＣＨ２ドメインは、異なるクラス間で並びにＩｇＡ及びＩｇＧの場合には異なるサブタイプ間で長さが異なるフレキシブルヒンジによって分離されている：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４は、それぞれ１５、１２、６２（又は７７）及び１２アミノ酸のヒンジを有し、ＩｇＡｌ及びＩｇＡ２は、それぞれ２０及び７アミノ酸のヒンジを有する。

重鎖アイソタイプのいずれかと会合し得る２つのタイプの軽鎖：λ及びκがあるが、所定の抗体分子では両方とも同じタイプのものである。両軽鎖は、機能的に同一であると思われる。Ｎ末端可変ドメイン（ＶＬ）と、それに続いて、ＣＬと称される単一ドメインからなる定常領域とがある。

重鎖及び軽鎖は、ＣＨ１及びＣＬドメイン間のタンパク質／タンパク質相互作用によって、並びにＶＨ／ＶＬ相互作用を介して対合し、２本の重鎖は、それらのＣＨ３ドメイン間のタンパク質／タンパク質相互作用によって会合する。免疫グロブリン分子の構造は、一般に、ＣＨ１及びＣＬドメイン間並びにヒンジ間の鎖間ジスルフィド結合によって安定化される。

抗原結合領域は、重鎖のＶＨ及びＣＨ１ドメインと対合した完全軽鎖からなるＹ字型構造のアームに対応し、Ｆａｂフラグメント（Fragment antigen bindingの略）と称される。最初、Ｆａｂフラグメントは、ヒンジ領域において鎖間ジスルフィド結合のアミノ末端側で抗体分子を切断して２つの同一の抗原結合アームを放出させるパパイン消化によって、ネイティブな免疫グロブリン分子から生成された。ペプシンなどの他のプロテアーゼもまた、ヒンジ領域においてただし鎖間ジスルフィド結合のカルボキシ末端側で抗体分子を切断して、２つの同一のＦａｂフラグメントからなるフラグメントであって、ジスルフィド結合によって依然として連結されたフラグメントを放出させる；Ｆ（ａｂ’）２フラグメントにおけるジスルフィド結合の還元により、Ｆａｂ’フラグメントが生成される。

ＶＨ及びＶＬドメインに対応する抗原結合領域の部分は、Ｆｖフラグメント（Fragment variableの略）と称される；それは、抗原結合部位（パラトープとも称される）を形成するＣＤＲ（相補性決定領域）を含有する。

エフェクター分子又は細胞に対する結合に関与する抗体のエフェクター領域は、Ｙ字型構造のステムに対応し、重鎖の対合したＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（又は、抗体のクラスに応じて、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４ドメイン）を含有し、Ｆｃ（Fragment crystallisableの略）領域と称される。

２本の重鎖及び２本の軽鎖の同一性により、天然に存在する抗体分子は、２つの同一の抗原結合部位を有し、それにより、２つの同一のエピトープに同時結合する。

抗体は、それが他の物質に結合するよりも高い親和性、アビディティで、より容易に、及び／又は長い持続時間で結合する場合に、ターゲット抗原に「特異的に結合する」。「特異的結合」又は「優先的結合」は、排他的結合（を含み得るが）を必ずしも必要としない。一般に、必ずではないが、結合への言及は、優先的結合を意味する。

セツキシマブ(Erbitux（登録商標）; ImClone/Lilly, Merck-Serono)は、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）をターゲティングするキメラマウス−ヒトモノクローナル抗体（ＡＴＣＣ ＨＢ−９７６４及びＡＴＣＣ−９７−６３）である。欧州特許出願公開第０３５９２８２号、欧州特許出願公開第０６６７１６５号及び米国特許第６２１７８６６を号参照のこと。セツキシマブは、結腸直腸ガン及び頭頸部の扁平上皮ガンの処置としての使用について承認されている。

トラスツズマブ(Herceptin（登録商標）; Genentech/Roche)は、ＨＥＲ２／ｎｅｕレセプターに干渉するヒト化ＩｇＧ１である。欧州特許出願公開第０５９００５８号、米国特許第５８２１３３７号、米国特許第８０７５８９０号、米国特許第６４０７２１３号、米国特許第６０５４２９７号、米国特許第５７７２９９７号、米国特許第６１６５４６４号、米国特許第６３９９０６３号及び米国特許第６６３９０５５号も参照のこと。その適応は、アジュバントの処置並びに転移性乳ガン及び転移性胃ガンである。

本発明との関連では、「ポリペプチドリンカー配列」という用語は、約２０〜８０アミノ酸、好ましくは３０〜６０アミノ酸、さらに好ましくは３０〜４０アミノ酸のポリペプチドである。有利には、リンカー配列は、「ヒンジ由来」（これは、ポリペプチドリンカーが、好ましくはヒト起源のＩｇＡ、ＩｇＧ及びＩｇＤから選択される１つ以上の免疫グロブリンのヒンジ領域の配列の全部又は一部を含むことを意味する）である。前記ポリペプチドリンカーは、ただ１つの免疫グロブリンのヒンジ領域の配列の全部又は一部を含み得る。この場合、前記免疫グロブリンは、隣接ＣＨ１ドメインが由来する免疫グロブリンと同じアイソタイプ及びサブクラスに属し得るか、又は異なるアイソタイプ若しくはサブクラスに属し得る。あるいは、前記ポリペプチドリンカーは、異なるアイソタイプ又はサブクラスの少なくとも２つの免疫グロブリンのヒンジ領域の配列の全部又は一部を含み得る。この場合、ＣＨ１ドメインの直後にあるポリペプチドリンカーのＮ末端部分は、好ましくは、前記ＣＨ１ドメインが由来する免疫グロブリンと同じアイソタイプ及びサブクラスに属する免疫グロブリンのヒンジ領域の全部又は一部からなる。

場合により、前記ポリペプチドリンカーは、免疫グロブリンのＣＨ２ドメインの２〜１５個、好ましくは５〜１０個のＮ末端アミノ酸の配列をさらに含み得る。

いくつかの場合では、ネイティブなヒンジ領域由来の配列が使用され得る；他の場合では、望ましくない鎖内又は鎖間ジスルフィド結合を回避するために、点突然変異（特に、アラニン又はセリンによるネイティブなＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ３ヒンジ配列中の１つ以上のシステイン残基の置換）がこれらの配列にもたらされ得る。

本発明の二重特異性抗体において使用され得るポリペプチドリンカーの非限定的な例は、以下の配列：

を有するポリペプチドである。

前記ポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１ヒンジの全長配列と、それに続いてヒトＩｇＧ１ ＣＨ２の９個のＮ末端アミノ酸（ＡＰＥＬＬＧＧＰＳ（配列番号：２８））と、ヒトＩｇＡ１ヒンジの配列の一部（ＴＰＰＴＰＳＰＳ（配列番号：２９））と、補足的なフレキシビリティをリンカーに提供するために付加されたジペプチドＧＧとからなる。別の好ましい実施態様では、ヒンジ由来ポリペプチドリンカー配列は、配列番号：１６又は配列番号：３４である。

「被験体」、「個体」及び「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用され、処置について評価されている及び／又は処置されている哺乳動物を指す。被験体はヒトであり得るが、他の哺乳動物、特にヒト疾患のための研究室モデルとして有用な哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌなども挙げられ得る。

「処置」又は「処置する」という用語は、被験体の症状を直接的又は間接的に改善することを目的として、ヒトを含む被験体を医学的支援に供する行為、適用又は治療を指す。特に、この用語は、いくつかの実施態様では発生率の減少、症候の緩和、再発の排除、再発の予防、発生の予防、症候の改善、予後の改善又はそれらの組み合わせを指す。当業者であれば、処置が症候の完全な非存在又は除去を必ずしももたらさないことを理解するであろう。例えば、ガンに関して「処置」又は「処置する」は、新生物若しくは悪性細胞成長、増殖若しくは転移の減速、新生物若しくは悪性細胞成長、増殖若しくは転移の発症の予防若しくは遅延、又はそれらのいくつかの組み合わせを指し得る。

二重特異性抗体の設計：
今回、本発明者らは、それらの各ターゲットに対する２つの結合部位と、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などのエフェクター機能の活性化を可能にする機能的Ｆｃドメインとを含む二重特異性四価抗体を提供する。

具体的には、本発明は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２をターゲティングする２つのモノクローナル抗体（すなわち、それぞれセツキシマブ及びトラスツズマブ）の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）可変領域のアミノ酸配列を使用して構築された二重特異性抗体に関する。

本発明の抗体は、全長抗体である。それらは、好ましくは、ヒト免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧ、さらに好ましくはＩｇＧ１由来の重鎖及び軽鎖を含む。

軽鎖は、好ましくは、κ軽鎖である。

ＩｇＧ様構造を有する本発明の抗体の例は、図１に示されている。

本発明の二重特異性抗体は、典型的には、
−Ｆｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）から構築される連続重鎖
−それに続いて、抗体１のＦａｂ重鎖（ＣＨ１−ＶＨ）及び抗体２の連続Ｆａｂ重鎖（ＣＨ１−ＶＨ）（後者は、ヒンジ由来ポリペプチドリンカー配列によって接続されている）
を含み、
−タンパク質発現中に、得られた重鎖はダイマーにアセンブルし、同時発現された抗体１及び抗体２軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）は、最終的なタンデム型Ｆ（ａｂ）’２−Ｆｃ分子を形成するために、それらの同種重鎖と会合し、
抗体１（Ａｂ１）及び抗体２（Ａｂ２）は異なるものであり、セツキシマブ、トラスツズマブ及びそれらの突然変異又はヒト化誘導体からなる群より選択される。

本発明の一実施態様では、二重特異性抗体は、
−Ｆｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）から構築される連続重鎖
−それに続いて、トラスツズマブのＦａｂ重鎖（ＣＨ１−ＶＨ）及びセツキシマブの連続Ｆａｂ重鎖（ＣＨ１−ＶＨ）（後者は、ヒンジ由来ポリペプチドリンカー配列によって接続されている）
を含み、
−タンパク質発現中に、得られた重鎖はダイマーにアセンブルし、同時発現された野生型又は突然変異トラスツズマブ及び野生型又は突然変異又はヒト化セツキシマブの軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）は、最終的なタンデム型Ｆ（ａｂ）’２−Ｆｃ分子を形成するために、それらの同種重鎖と会合する。

本発明の別の実施態様では、二重特異性抗体は、
−Ｆｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）から構築される連続重鎖
−それに続いて、セツキシマブのＦａｂ重鎖（ＣＨ１−ＶＨ）及びトラスツズマブの連続Ｆａｂ重鎖（ＣＨ１−ＶＨ）（後者は、ヒンジ由来ポリペプチドリンカー配列によって接続されている）
を含み、
−タンパク質発現中に、得られた重鎖はダイマーにアセンブルし、同時発現された野生型又は突然変異セツキシマブ及び野生型又は突然変異トラスツズマブの軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）は、最終的なタンデム型Ｆ（ａｂ）’２−Ｆｃ分子を形成するために、それらの同種重鎖と会合する。

好ましい実施態様では、二重特異性抗体であって、
・異なるＣＨ１及びＣＬドメインを有する２つのＦａｂフラグメントであって、
ａ）ヒトＩｇＧ１／κ由来のＣＨ１及びＣ−κドメインと、Ａｂ１のＶＨ及びＶＬドメインとを有するＦａｂフラグメント、
ｂ）ヒトＩｇＧ１／κ由来のＣＨ１及びＣ−κドメインと、Ａｂ２のＶＨ及びＶＬドメインとを有するＦａｂフラグメント、
ｃ）ヒトκ定常ドメイン由来の突然変異軽鎖定常ドメイン
からなる２つのＦａｂフラグメントを含み、
前記Ｆａｂフラグメントが、以下の順序
−ポリペプチドリンカーを介してＡｂ２ ＦａｂフラグメントのＶＨドメインのＮ末端に連結されたＡｂ１ ＦａｂフラグメントのＣＨ１ドメインのＣ末端、
−Ａｂ２フラグメントのＣＨ１ドメインのＣ末端をＣＨ２ドメインのＮ末端に連結するヒトＩｇＧ１のヒンジ領域、
−ヒトＩｇＧ１の二量体化ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン
でタンデムに配置されている二重特異性抗体が記載される。

さらに好ましい実施態様では、
−Ａｂ１は、
ｏ配列番号：１の配列に対応するＶＨ領域
ｏ配列番号：２、配列番号：５、配列番号：２０、配列番号：２１及び配列番号：２２からなる群より選択される配列の１つに対応するＣＨ１領域
ｏ配列番号：１０の配列に対応するＶＬ領域、
ｏ配列番号：１１、配列番号：１４、配列番号：２３、配列番号：２４及び配列番号：２５からなる群より選択される配列の１つに対応するＣκ領域、
ｏ以下の組み合わせ：
−配列番号：２と配列番号：１１
−配列番号：５と配列番号：１４又は配列番号：２３のいずれか
−配列番号：２０と配列番号：１４又は配列番号：２３のいずれか
−配列番号：２１と配列番号：２４又は配列番号：２５のいずれか
−配列番号：２２と配列番号：２４又は配列番号：２５のいずれか
においてのみ会合し得るＣＨ１及びＣκ領域
を有するトラスツズマブであり、
−Ａｂ２は、
ｏ配列番号：４の配列に対応するＶＨ領域
ｏ配列番号：２、配列番号：５、配列番号：２０、配列番号：２１及び配列番号：２２からなる群より選択される配列の１つに対応するＣＨ１領域、
ｏ配列番号：１３の配列に対応するＶＬ領域、
ｏ配列番号：１１、配列番号：１４、配列番号：２３、配列番号：２４及び配列番号：２５からなる群より選択される配列の１つに対応するＣκ領域、
ｏ以下の組み合わせ：
−配列番号：２と配列番号：１１、
−配列番号：５と配列番号：１４又は配列番号：２３のいずれか、
−配列番号：２０と配列番号：１４又は配列番号：２３のいずれか、
−配列番号：２１と配列番号：２４又は配列番号：２５のいずれか、
−配列番号：２２と配列番号：２４又は配列番号：２５のいずれか
においてのみ会合し得るＣＨ１及びＣκ領域
を有するセツキシマブであり、
−Ａｂ１及びＡｂ２はそれぞれ、異なるＣＨ１及びＣκ配列の組み合わせを有する。

別の態様では、
Ａｂ１は、
ｏ配列番号：４の配列に対応するＶＨ領域、
ｏ配列番号：２、配列番号：５、配列番号：２０、配列番号：２１及び配列番号：２２からなる群より選択される配列の１つに対応するＣＨ１領域、
ｏ配列番号：１３の配列に対応するＶＬ領域、
ｏ配列番号：１１、配列番号：１４、配列番号：２３、配列番号：２４及び配列番号：２５からなる群より選択される配列の１つに対応するＣκ領域、
ｏ以下の組み合わせ：
−配列番号：２と配列番号：１１、
−配列番号：５と配列番号：１４又は配列番号：２３のいずれか、
−配列番号：２０と配列番号：１４又は配列番号：２３のいずれか、
−配列番号：２１と配列番号：２４又は配列番号：２５のいずれか、
−配列番号：２２と配列番号：２４又は配列番号：２５のいずれか
においてのみ会合し得るＣＨ１及びＣκ領域
を有するセツキシマブであり、
Ａｂ２は、
ｏ配列番号：１の配列に対応するＶＨ領域、
ｏ配列番号：２、配列番号：５、配列番号：２０、配列番号：２１及び配列番号：２２からなる群より選択される配列の１つに対応するＣＨ１領域、
ｏ配列番号：１０の配列に対応するＶＬ領域、
ｏ配列番号：１１、配列番号：１４、配列番号：２３、配列番号：２４及び配列番号：２５からなる群より選択される配列の１つに対応するＣκ領域、
ｏ以下の組み合わせ：
−配列番号：２と配列番号：１１、
−配列番号：５と配列番号：１４又は配列番号：２３のいずれか、
−配列番号：２０と配列番号：１４又は配列番号：２３のいずれか、
−配列番号：２１と配列番号：２４又は配列番号：２５のいずれか、
−配列番号：２２と配列番号：２４又は配列番号：２５のいずれか
においてのみ会合し得るＣＨ１及びＣκ領域
を有するトラスツズマブであり、
−Ａｂ１及びＡｂ２はそれぞれ、異なるＣＨ１及びＣκ配列の組み合わせを有する。

本明細書を通して、アミノ酸配列は、Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)にしたがって定義される。

特定の実施態様では、二重特異性抗体は、以下の構造：
ａ）連続重鎖であって、
・配列番号：１に対応するトラスツズマブ重鎖可変領域（ＶＨ）、
・配列番号：２に対応するヒトＩｇＧ１由来の野生型ＣＨ１定常ドメイン（Kabat位置１９２の残基は、トレオニン、Ｔである）、
・配列番号：３に対応する２本のＦａｂ重鎖を接続するポリペプチドリンカー、
・配列番号：４に対応するセツキシマブ重鎖可変領域（ＶＨ）、
・配列番号：５に対応するヒトＩｇＧ１由来の突然変異ＣＨ１定常ドメイン（Kabat位置１９２の残基は、トレオニンからグルタミン酸、Ｅに突然変異されている）、
・配列番号：６に対応するヒトＩｇＧ１由来の野生型ヒンジ領域、
・配列番号：７に対応するヒトＩｇＧ１の野生型ＣＨ２ドメイン、
・配列番号：８に対応するヒトＩｇＧ１アロタイプＧ１ｍ（３）の野生型ＣＨ３ドメイン
からなる連続重鎖、
ｂ）トラスツズマブ軽鎖であって、
・配列番号：１０に対応する野生型可変領域（ＶＬ）、
・配列番号：１１に対応する野生型ヒトκ定常ドメイン（Kabat位置１１４及び１３７の残基は、それぞれセリン（Ｓ）及びアスパラギン（Ｎ）である）
からなるトラスツズマブ軽鎖、
ｃ）セツキシマブ軽鎖であって、
・配列番号：１３に対応する野生型可変領域（ＶＬ）、
・配列番号：１４に対応する突然変異ヒトκ定常ドメイン（Kabat位置１１４及び１３７の残基は、それぞれアラニン（Ａ）及びリシン（Ｋ）である）
からなるセツキシマブ軽鎖
を有する。

別の実施態様では、二重特異性抗体は、以下の構造：
ａ）連続重鎖であって、
・配列番号：１に対応するトラスツズマブ重鎖可変領域（ＶＨ）、
・配列番号：２に対応するヒトＩｇＧ１由来の野生型ＣＨ１定常ドメイン（Kabat位置１９２の残基は、トレオニン、Ｔである）、
・配列番号：１６又は配列番号：３４に対応する２本のＦａｂ重鎖を接続するポリペプチドリンカー、
・配列番号：４に対応するセツキシマブ重鎖可変領域（ＶＨ）、
・配列番号：５に対応するヒトＩｇＧ１由来の突然変異ＣＨ１定常ドメイン（Kabat位置１９２の残基は、トレオニンからグルタミン酸、Ｅに突然変異されている）、
・配列番号：６に対応するヒトＩｇＧ１由来の野生型ヒンジ領域、
・配列番号：７に対応するヒトＩｇＧ１の野生型ＣＨ２ドメイン、
・配列番号：８に対応するヒトＩｇＧ１アロタイプＧ１ｍ（３）の野生型ＣＨ３ドメイン
からなる連続重鎖、
ｂ）配列番号：１２に対応する野生型トラスツズマブ軽鎖のアミノ酸配列
ｃ）配列番号：１５に対応する突然変異セツキシマブ軽鎖のアミノ酸配列
を有する。

さらなる態様では、二重特異性抗体は、以下の構造：
ａ）連続重鎖であって、
・配列番号：４に対応するセツキシマブ重鎖可変領域（ＶＨ）、
・配列番号：５に対応するヒトＩｇＧ１由来の突然変異ＣＨ１定常ドメイン（Kabat位置１９２の残基は、トレオニンからグルタミン酸、Ｅに突然変異されている）、
・配列番号：３に対応する２本のＦａｂ重鎖を接続するポリペプチドリンカー、
・配列番号：１に対応するトラスツズマブ重鎖可変領域（ＶＨ）、
・配列番号：２に対応するヒトＩｇＧ１由来の野生型ＣＨ１定常ドメイン（Kabat位置１９２の残基は、トレオニン、Ｔである）、
・配列番号：６に対応するヒトＩｇＧ１由来の野生型ヒンジ領域、
・配列番号：７に対応するヒトＩｇＧ１の野生型ＣＨ２ドメイン、
・配列番号：８に対応するヒトＩｇＧ１アロタイプＧ１ｍ（３）の野生型ＣＨ３ドメイン
からなる連続重鎖、
ｂ）配列番号：１２に対応する野生型トラスツズマブ軽鎖のアミノ酸配列
ｃ）配列番号：１５に対応する突然変異セツキシマブ軽鎖のアミノ酸配列
を有し得る。

またさらなる態様では、二重特異性抗体は、以下の構造：
ａ）連続重鎖であって、
・配列番号：４に対応するセツキシマブ重鎖可変領域（ＶＨ）、
・配列番号：５に対応するヒトＩｇＧ１由来の突然変異ＣＨ１定常ドメイン（Kabat位置１９２の残基は、トレオニンからグルタミン酸、Ｅに突然変異されている）、
・配列番号：１６に対応する２本のＦａｂ重鎖を接続するポリペプチドリンカー、
・配列番号：１に対応するトラスツズマブ重鎖可変領域（ＶＨ）、
・配列番号：２に対応するヒトＩｇＧ１由来の野生型ＣＨ１定常ドメイン（Kabat位置１９２の残基は、トレオニン、Ｔである）、
・配列番号：６に対応するヒトＩｇＧ１由来の野生型ヒンジ領域、
・配列番号：７に対応するヒトＩｇＧ１の野生型ＣＨ２ドメイン、
・配列番号：８に対応するヒトＩｇＧ１アロタイプＧ１ｍ（３）の野生型ＣＨ３ドメイン
からなる連続重鎖、
ｂ）配列番号：１２に対応する野生型トラスツズマブ軽鎖のアミノ酸配列、
ｃ）配列番号：１５に対応する突然変異セツキシマブ軽鎖のアミノ酸配列
を有し得る。

二重特異性抗体は、以下の突然変異：
−配列番号：２０に対応するヒトＩｇＧ１由来の突然変異ＣＨ１定常ドメイン、
−配列番号：２１に対応するヒトＩｇＧ１由来の突然変異ＣＨ１定常ドメイン、
−配列番号：２２に対応するヒトＩｇＧ１由来の突然変異ＣＨ１定常ドメイン、
−配列番号：２３に対応する突然変異ヒトκ定常、
−配列番号：２４に対応する突然変異ヒトκ定常、
−配列番号：２５に対応する突然変異ヒトκ定常ドメイン
の少なくとも１つを含有し得る。

さらなる態様では、二重特異性抗体は、表１及び表２に列挙されている組み合わせに対応するＶＨ領域、ＣＨ１ドメイン、ＶＬ領域及びＣκドメインを有し、これらは、本発明の抗体の様々なフォーマットの可能性を示す。

二重特異性抗体は、好ましくは、ＥＧＦＲ及び／又はＨＥＲ２に対するより高い結合親和性を示す。例えば、二重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及び／又はＨＥＲ２に対して、１×１０^−７Ｍ未満、１０^−８Ｍ、好ましくは１×１０^−９未満又は１×１０^−１０ＭのＫｄを示し得る。

リンカーの設計
「ヒンジ由来ポリペプチドリンカー配列」又は「シュードヒンジリンカー」とも称されるポリペプチドリンカーは、好ましくはヒト起源のＩｇＡ、ＩｇＧ及びＩｇＤから選択される１つ以上の免疫グロブリンのヒンジ領域の配列の全部又は一部を含む。前記ポリペプチドリンカーは、ただ１つの免疫グロブリンのヒンジ領域の配列の全部又は一部を含み得る。この場合、前記免疫グロブリンは、隣接ＣＨ１ドメインが由来する免疫グロブリンと同じアイソタイプ及びサブクラスに属し得るか、又は異なるアイソタイプ若しくはサブクラスに属し得る。あるいは、前記ポリペプチドリンカーは、異なるアイソタイプ又はサブクラスの少なくとも２つの免疫グロブリンのヒンジ領域の配列の全部又は一部を含み得る。この場合、ＣＨ１ドメインの直後にあるポリペプチドリンカーのＮ末端部分は、好ましくは、前記ＣＨ１ドメインが由来する免疫グロブリンと同じアイソタイプ及びサブクラスに属する免疫グロブリンのヒンジ領域の全部又は一部からなる。

場合により、前記ポリペプチドリンカーは、免疫グロブリンのＣＨ２ドメインの２〜１５個、好ましくは５〜１０個のＮ末端アミノ酸の配列をさらに含み得る。

ポリペプチドリンカー配列は、典型的には、８０個未満のアミノ酸、好ましくは６０個未満のアミノ酸、さらに好ましくは４０個未満のアミノ酸からなる。

いくつかの場合では、ネイティブなヒンジ領域由来の配列が使用され得る；他の場合では、望ましくない鎖内又は鎖間ジスルフィド結合を回避するために、点突然変異（特に、アラニン又はセリンによるネイティブなＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ３ヒンジ配列中の１つ以上のシステイン残基の置換）がこれらの配列にもたらされ得る。

特定の実施態様では、ポリペプチドリンカー配列は、アミノ酸配列ＥＰＫＸ_１ＣＤＫＸ_２ＨＸ_３Ｘ_４ＰＰＸ_５ＰＡＰＥＬＬＧＧＰＸ_６Ｘ７ＰＰＸ_８ＰＸ_９ＰＸ_１０ＧＧ（配列番号：３６）（同一の又は異なるＸ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０は、任意のアミノ酸である）を含むか、又はそれからなる。特に、ポリペプチドリンカー配列は、

からなる群より選択される配列を含み得るか、又はそれからなり得る。

本発明の多重特異性抗原結合フラグメントにおいて使用され得るヒンジ由来ポリペプチドリンカーの非限定的な例は、配列番号：３を有するポリペプチドである。前記ポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１ヒンジの全長配列と、それに続いてヒトＩｇＧ１ ＣＨ２の９個のＮ末端アミノ酸（ＡＰＥＬＬＧＧＰＳ、配列番号：２８）と、ヒトＩｇＡ１ヒンジの配列の一部（ＴＰＰＴＰＳＰＳ、配列番号：２９）と、補足的なフレキシビリティをリンカーに提供するために付加されたジペプチドＧＧとからなる。別の好ましい実施態様では、ヒンジ由来ポリペプチドリンカー配列は、配列番号：３４又は配列番号：１６である。

特定の実施態様では、同一の又は異なるＸ_１、Ｘ_２及びＸ_３は、トレオニン（Ｔ）又はセリン（Ｓ）である。

別の特定の実施態様では、同一の又は異なるＸ_１、Ｘ_２及びＸ_３は、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ａｓｐ（Ｄ）及びＩｌｅ（Ｉ）からなる群より選択され、さらに好ましくは、同一の又は異なるＸ_１、Ｘ_２及びＸ_３は、Ａｌａ（Ａ）又はＧｌｙ（Ｇ）であり得る。

あるいは、同一の又は異なるＸ_１、Ｘ_２及びＸ_３は、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｔ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、好ましくはＬｅｕ（Ｌ）、Ｇｌｕ（Ｅ）又はＧｌｎ（Ｑ）であり得る。

特定の実施態様では、同一の又は異なるＸ_４及びＸ_５は、セリン（Ｓ）、システイン（Ｃ）、アラニン（Ａ）及びグリシン（Ｇ）からなる群より選択される任意のアミノ酸である。

好ましい実施態様では、Ｘ_４は、セリン（Ｓ）又はシステイン（Ｃ）である。

好ましい態様では、Ｘ_５は、アラニン（Ａ）又はシステイン（Ｃ）である。

特定の実施態様では、同一の又は異なるＸ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０は、トレオニン（Ｔ）又はセリン（Ｓ）以外の任意のアミノ酸である。好ましくは、同一の又は異なるＸ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０は、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ａｓｐ（Ｄ）及びＩｌｅ（Ｉ）からなる群より選択される。

あるいは、同一の又は異なるＸ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０は、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｔ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、好ましくはＬｅｕ（Ｌ）、Ｇｌｕ（Ｅ）又はＧｌｎ（Ｑ）であり得る。

好ましい実施態様では、同一の又は異なるＸ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０は、Ａｌａ（Ａ）及びＧｌｙ（Ｇ）からなる群より選択される。

さらに好ましい実施態様では、Ｘ_６及びＸ_７は同一のものであり、好ましくは、Ａｌａ（Ａ）及びＧｌｙ（Ｇ）からなる群より選択される。

好ましい実施態様では、ポリペプチドリンカー配列は、配列番号：３６の配列（同一の又は異なるＸ_１、Ｘ_２及びＸ_３は、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）であり；
Ｘ_４は、セリン（Ｓ）又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ_５は、アラニン（Ａ）又はシステイン（Ｃ）であり；
同一の又は異なるＸ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０は、Ａｌａ（Ａ）及びＧｌｙ（Ｇ）からなる群より選択される）を含むか、又はそれからなる。

別の好ましい実施態様では、ポリペプチドリンカー配列は、配列番号：３６の配列（同一の又は異なるＸ_１、Ｘ_２及びＸ_３は、Ａｌａ（Ａ）又はＧｌｙ（Ｇ）であり；
Ｘ_４は、セリン（Ｓ）又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ_５は、アラニン（Ａ）又はシステイン（Ｃ）であり；
同一の又は異なるＸ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０は、Ａｌａ（Ａ）及びＧｌｙ（Ｇ）からなる群より選択される）を含むか、又はそれからなる。

好ましい二重特異性抗体
いくつかの二重特異性抗体（BiXAb-3486、BiXAb-3489、BiXAb-3732SS及びBiXAb-E06528と名称される）の調製は、実施例に記載されている。

１つの好ましい本発明の二重特異性抗体（BiXAb-3486）は、以下の構造：
ｉ）連続重鎖であって、
・配列番号：１に対応するトラスツズマブ重鎖可変領域（ＶＨ）
・配列番号：２に対応するヒトＩｇＧ１由来の野生型ＣＨ１定常ドメイン（Kabat位置１９２の残基は、トレオニン、Ｔである）
・配列番号：３に対応する２本のＦａｂ重鎖を接続するポリペプチドリンカー
・配列番号：４に対応するセツキシマブ重鎖可変領域（ＶＨ）
・配列番号：５に対応するヒトＩｇＧ１由来の突然変異ＣＨ１定常ドメイン（Kabat位置１９２の残基は、トレオニンからグルタミン酸、Ｅに突然変異されている）
・配列番号：６に対応するヒトＩｇＧ１由来の野生型ヒンジ領域
・配列番号：７に対応するヒトＩｇＧ１の野生型ＣＨ２ドメイン
・配列番号：８に対応するヒトＩｇＧ１アロタイプＧ１ｍ（３）の野生型ＣＨ３ドメイン
を含む連続重鎖
（したがって、本発明の二重特異性抗体は、配列番号：９の連続重鎖（７０１個の残基）を有する）
ｉｉ）野生型トラスツズマブ軽鎖であって、
・配列番号：１０に対応する野生型可変領域（ＶＬ）
・配列番号：１１に対応する野生型ヒトκ定常ドメイン（Kabat位置１１４及び１３７の残基は、それぞれセリン（Ｓ）及びアスパラギン（Ｎ）である）
を含む野生型トラスツズマブ軽鎖
（したがって、トラスツズマブ軽鎖は、配列番号：１２に対応する）
ｉｉｉ）セツキシマブ軽鎖であって、
・配列番号：１３に対応する野生型可変領域（ＶＬ）
・配列番号：１４に対応する突然変異ヒトκ定常ドメイン（Kabat位置１１４及び１３７の残基は、それぞれアラニン（Ａ）及びリシン（Ｋ）である）
を含むセツキシマブ軽鎖
（したがって、セツキシマブ軽鎖は、配列番号：１５に対応する）
を有する。

別の好ましい本発明の二重特異性抗体（BiXAb-3489）は、以下の構造：
ｉ）連続重鎖であって、
・配列番号：１に対応するトラスツズマブ重鎖可変領域（ＶＨ）
・配列番号：２に対応するヒトＩｇＧ１由来の野生型ＣＨ１定常ドメイン（Kabat位置１９２の残基は、トレオニン、Ｔである）
・配列番号：１６に対応する２本のＦａｂ重鎖を接続するポリペプチドリンカー
・配列番号：４に対応するセツキシマブ重鎖可変領域（ＶＨ）
・配列番号：５に対応するヒトＩｇＧ１由来の突然変異ＣＨ１定常ドメイン（Kabat位置１９２の残基は、トレオニンからグルタミン酸、Ｅに突然変異されている）
・配列番号：６に対応するヒトＩｇＧ１由来の野生型ヒンジ領域
・配列番号：７に対応するヒトＩｇＧ１の野生型ＣＨ２ドメイン
・配列番号：８に対応するヒトＩｇＧ１アロタイプＧ１ｍ（３）の野生型ＣＨ３ドメイン
を含む連続重鎖
（したがって、本発明の二重特異性抗体は、配列番号：１７の連続重鎖（７０１個の残基）を有する）
ｉｉ）配列番号：１２からなる野生型トラスツズマブ軽鎖
ｉｉｉ）配列番号：１５からなるセツキシマブ軽鎖
を有する抗体である。

別の好ましい本発明の二重特異性抗体（BiXAb-E06528）は、以下の構造：
ｉ）連続重鎖であって、
・配列番号：１に対応するトラスツズマブ重鎖可変領域（ＶＨ）
・配列番号：２に対応するヒトＩｇＧ１由来の野生型ＣＨ１定常ドメイン（Kabat位置１９２の残基は、トレオニン、Ｔである）
・配列番号：３４に対応する２本のＦａｂ重鎖を接続するポリペプチドリンカー
・配列番号：４に対応するセツキシマブ重鎖可変領域（ＶＨ）
・配列番号：５に対応するヒトＩｇＧ１由来の突然変異ＣＨ１定常ドメイン（Kabat位置１９２の残基は、トレオニンからグルタミン酸、Ｅに突然変異されている）
・配列番号：６に対応するヒトＩｇＧ１由来の野生型ヒンジ領域
・配列番号：７に対応するヒトＩｇＧ１の野生型ＣＨ２ドメイン
・配列番号：８に対応するヒトＩｇＧ１アロタイプＧ１ｍ（３）の野生型ＣＨ３ドメイン
を含む連続重鎖、
（したがって、本発明の二重特異性抗体は、配列番号：３５の連続重鎖（７０１個の残基）を有する）
ｉｉ）配列番号：１２からなる野生型トラスツズマブ軽鎖
ｉｉｉ）配列番号：１５からなるセツキシマブ軽鎖
を有する抗体である。

別の好ましい本発明の二重特異性抗体は、以下の構造：
ｉ）連続重鎖であって、
・配列番号：４に対応するセツキシマブ重鎖可変領域（ＶＨ）
・配列番号：５に対応するヒトＩｇＧ１由来の突然変異ＣＨ１定常ドメイン（Kabat位置１９２の残基は、トレオニンからグルタミン酸、Ｅに突然変異されている）
・配列番号：３に対応する２本のＦａｂ重鎖を接続するポリペプチドリンカー
・配列番号：１に対応するトラスツズマブ重鎖可変領域（ＶＨ）
・配列番号：２に対応するヒトＩｇＧ１由来の野生型ＣＨ１定常ドメイン（Kabat位置１９２の残基は、トレオニン、Ｔである）
・配列番号：６に対応するヒトＩｇＧ１由来の野生型ヒンジ領域
・配列番号：７に対応するヒトＩｇＧ１の野生型ＣＨ２ドメイン
・配列番号：８に対応するヒトＩｇＧ１アロタイプＧ１ｍ（３）の野生型ＣＨ３ドメイン
を含む連続重鎖、
（したがって、本発明の二重特異性抗体は、配列番号：１８の連続重鎖（７０１個の残基）を有する）
ｉｉ）配列番号：１２からなる野生型トラスツズマブ軽鎖
ｉｉｉ）配列番号：１５からなるセツキシマブ軽鎖
を有する。

本発明のさらに別の好ましい二重特異性抗体（BiXab 3732SS）は、以下の構造：
ｉ）連続重鎖であって、
・配列番号：４に対応するセツキシマブ重鎖可変領域（ＶＨ）
・配列番号：５に対応するヒトＩｇＧ１由来の突然変異ＣＨ１定常ドメイン（Kabat位置１９２の残基は、トレオニンからグルタミン酸、Ｅに突然変異されている）
・配列番号：１６に対応する２本のＦａｂ重鎖を接続するポリペプチドリンカー
・配列番号：１に対応するトラスツズマブ重鎖可変領域（ＶＨ）
・配列番号：２に対応するヒトＩｇＧ１由来の野生型ＣＨ１定常ドメイン（Kabat位置１９２の残基は、トレオニン、Ｔである）
・配列番号：６に対応するヒトＩｇＧ１由来の野生型ヒンジ領域
・配列番号：７に対応するヒトＩｇＧ１の野生型ＣＨ２ドメイン
・配列番号：８に対応するヒトＩｇＧ１アロタイプＧ１ｍ（３）の野生型ＣＨ３ドメイン
を含む連続重鎖、
（したがって、本発明の二重特異性抗体は、配列番号：１９の連続重鎖（７０１個の残基）を有する）
ｉｉ）配列番号：１２からなる野生型トラスツズマブ軽鎖
ｉｉｉ）配列番号：１５からなるセツキシマブ軽鎖
を有する。

突然変異誘導体
本発明は、（セツキシマブ又はトラスツズマブの）野生型配列又はその突然変異誘導体を使用する。

「突然変異誘導体」、「突然変異体」又は「機能的変異体」という用語は、１個又は複数のアミノ酸の欠失、置換又は挿入によって、それが指す親配列と異なる配列を表す。好ましくは、突然変異体は、好ましくは、ネイティブな配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％の配列相同性を示す。特定の実施態様では、突然変異は、抗体の機能に実質的な影響を与えない。

突然変異誘導体又は機能的変異体は、本明細書に記載される参照配列のいずれかと少なくとも８５％（例えば、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨ鎖、本明細書に記載される参照配列のいずれかと少なくとも８５％（例えば、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）同一のアミノ酸配列を有するＶＬ鎖、又はその両方を含み得る。これらの変異体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に結合することができる。いくつかの例では、変異体は、上記参照抗体と同様の抗原結合親和性を有する（例えば、１０^−８Ｍ未満、好ましくは１×１０^−９未満又は１×１０^−１０ＭのＫｄを有する）。

結合の親和性は、ｋａ（会合速度定数）、ｋｄ（解離速度定数）又はＫＤ（平衡解離）という用語によって定義される。典型的には、抗体に関して使用される場合、特異的な結合は、１０^−８Ｍ未満、例えば１０^−９Ｍ未満又は１０^−１０Ｍの親和性（ＫＤ）値で、そのターゲットに特異的に結合する（「認識する」）抗体を指す。１０^−９のＫＤ値は、１０^−８のＫＤ値よりも高い結合親和性を示すように、より低いＫＤ値は、より高い結合親和性（すなわち、より強力な結合）を表す。

２つのアミノ酸配列の「パーセント同一性」は、Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993のように改変されたKarlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990のアルゴリズムを使用して決定される。このようなアルゴリズムは、Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３でＸＢＬＡＳＴプログラムを用いてＢＬＡＳＴタンパク質検索を実施して、目的のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。２つの配列間にギャップが存在する場合、Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997に記載されているように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴが利用され得る。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータが使用され得る。

他の実施態様では、本明細書に記載される機能的変異体は、ＣＤＲの１つ以上と相互作用すると予測される残基において存在しないことが好ましい１つ以上の突然変異（例えば、保存的置換）を含有し得る。

参照抗体と実質的に同一の突然変異誘導体又は機能的変異体が本明細書に記載される。

「実質的に同一」又は「非実質的」という用語は、変異体が、参照抗体と比べて実質的に類似の結合活性（例えば、親和性、特異性又はその両方）及び生物活性を有するように、変異体の（例えば、フレームワーク領域（ＦＲ）、ＣＤＲ、ＶＨ又はＶＬドメインにおける）関連アミノ酸配列が、参照抗体と比較して非実質的に異なる（例えば、保存的アミノ酸置換を含む）ことを意味する。このような変異体は、指定領域の５アミノ酸の配列において軽微なアミノ酸の変化、例えば１つ又は２つの置換を含み得る。一般に、ＣＤＲ領域とは対照的に、ＦＲ領域では、抗体の結合機能に有害な影響（例えば、元の抗体と比較して結合親和性の５０％超の減少）を与えない限り、より多くの置換が行われ得る。いくつかの実施態様では、配列同一性は、元の抗体と改変抗体との間で、約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上であり得る。いくつかの実施態様では、改変抗体は、元の抗体と同じ結合特異性を有し、元の抗体の親和性の少なくとも５０％を有する。

保存的置換は、このような改変が行われる元の分子のものと類似の機能的及び化学的な特徴を有する分子を生じさせるであろう。例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置におけるアミノ酸残基の極性又は電荷に対してほとんど又は全く効果がないように、別の残基でネイティブなアミノ酸残基を置換することを伴い得る。（保存的又は非保存的にかかわらず）所望のアミノ酸置換は、当業者によって決定され得る。例えば、アミノ酸置換は、分子配列の重要な残基を同定するために、又は本明細書に記載される分子の親和性を増加若しくは減少させるために使用され得る。１つ以上の保存的アミノ酸置換を含む変異体は、ポリペプチド配列を変化させるための当業者に公知の方法、例えばこのような方法を集めた参考文献、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989又はCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New Yorkに見られるものにしたがって調製され得る。アミノ酸の保存的置換としては、以下のグループ内のアミノ酸間で行われる置換が挙げられる：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；及び（ｇ）Ｅ、Ｄ。

本開示はまた、抗体の改善された生物学的特性、例えばより高い若しくはより低い結合親和性を有する、又は変化したＡＤＣＣ特性を有する、又はＥＧＦＲ及び／若しくはＨＥＲ２発現細胞の生存阻害に関する変化した効果を有する抗体変異体を提供する。

抗体のアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチド変化を抗体核酸に導入することによって、又はペプチド合成を介して調製され得る。このような改変としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失及び／又は前記残基への挿入及び／又は前記残基の置換が挙げられる。最終構築物が所望の特徴を有する限り、最終構築物を達成するために、欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせが行われる。抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当技術分野で公知の様々な方法によって調製され得る。これらの方法としては、限定されないが、以前に調製された変異型又は非変異（天然）型の抗体のオリゴヌクレオチド媒介性（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発及びカセット突然変異誘発が挙げられる。一実施態様では、本発明の抗体の平衡解離定数（ＫＤ）値は、１０^−８Ｍ未満、特に１０^−９Ｍ未満又は１０^−１０Ｍである。結合親和性は、当技術分野で公知の技術、例えばＥＬＩＳＡ若しくは生体特異的相互作用分析、又は当技術分野で公知の他の技術を使用して決定され得る。

本明細書に記載される抗体はいずれも、ルーチンな方法にしたがって、それらの特性、例えば抗原結合活性、抗原結合特異性及び生物学的機能を決定するために検査され得る。

本明細書に記載される抗体はいずれも、例えば、ＰＥＧ化、高度グリコシル化、毒素のコンジュゲーション、放射性標識などによって、当技術分野で公知の容易に利用可能なさらなる非タンパク質性部分を含有するように改変され得る。血清半減期を増強し得る改変が興味深い。

突然変異誘導体の例は、以下に記載されている。

本発明によれば、二重特異性抗体であって、
−配列番号：２０に対応するヒトＩｇＧ１由来の突然変異ＣＨ１定常ドメイン（Kabat位置１９２の残基は、トレオニンからアスパラギン酸、Ｄに突然変異されている）
−配列番号：２１に対応するヒトＩｇＧ１由来の突然変異ＣＨ１定常ドメイン（Kabat位置１９２の残基は、トレオニンからリシン、Ｋに突然変異されている
−配列番号：２２に対応するヒトＩｇＧ１由来の突然変異ＣＨ１定常ドメイン（Kabat位置１９２の残基は、トレオニンからアルギニン、Ｒに突然変異されている）
−配列番号：２３に対応する突然変異ヒトκ定常ドメイン（Kabat位置１１４及び１３７の残基は、それぞれアラニン（Ａ）及びアルギニン（Ｒ）である）
−配列番号：２４に対応する突然変異ヒトκ定常ドメイン（Kabat位置１１４及び１３７の残基は、それぞれアラニン（Ａ）及びグルタミン酸（Ｅ）である）
−又は配列番号：２５に対応する突然変異ヒトκ定常ドメイン（Kabat位置１１４及び１３７の残基は、それぞれアラニン（Ａ）及びアスパラギン酸（Ｄ）である）
を含む二重特異性抗体が記載される。

別の実施態様では、トラスツズマブのＶＨ及びＶＬ配列において、以下のKabat位置の残基が突然変異され得る：
ＶＨのKabat位置３１において、ＡｓｐからＧｌｕ又はＳｅｒへ
ＶＨのKabat位置３２において、ＴｈｒからＳｅｒ、Ａｓｎ又はＴｙｒへ
ＶＨのKabat位置５４において、ＡｓｎからＧｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ又はＳｅｒへ
ＶＨのKabat位置５５において、ＧｌｙからＰｒｏ、Ａｌａ及びＳｅｒへ
ＶＨのKabat位置６１において、ＡｓｐからＧｌｕへ
ＶＨのKabat位置６２において、ＳｅｒからＴｈｒへ
ＶＨのKabat位置９５において、ＴｒｐからＴｙｒ又はＰｈｅへ
ＶＨのKabat位置９８において、ＡｓｐからＧｌｕへ
ＶＨのKabat位置９９において、ＧｌｙからＰｒｏ又はＡｌａへ
ＶＬのKabat位置２８において、ＡｓｐからＧｌｕ又はＧｌｙへ
ＶＬのKabat位置２９において、ＶａｌからＩｌｅ又はＬｅｕへ
ＶＬのKabat位置３０において、ＡｓｎからＧｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ又はＳｅｒへ
ＶＬのKabat位置３１において、ＴｈｒからＳｅｒへ。

本発明の抗体はグリコシル化されていてもよいし、若しくはグリコシル化されていなくてもよく、又は様々なグリコシル化プロファイルを示してもよい。好ましい実施態様では、抗体は、重鎖及び軽鎖の可変領域ではグリコシル化されていないが、Ｆｃ領域ではグリコシル化されている。

例えば、セツキシマブのＶＨドメインにおけるＮ−グリコシル化部位を除去するために、Kabat位置Ｈ８５のＡｓｎは、配列番号：２６の配列のようにアスパラギン酸（Ｄ）に突然変異されるか、又はKabat位置Ｈ８５のＡｓｎは、配列番号：２７の配列のようにグルタミン酸（Ｅ）に突然変異される。

特定の突然変異誘導体は、ヒト化形態の参照セツキシマブ抗体（これは、その元の形態では、マウス起源の重鎖及び軽鎖可変領域を有するキメラ抗体である）を使用し得る。ヒト化アプローチでは、ドナーマウス可変領域由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）及び特定の他のアミノ酸をヒト可変アクセプター領域に移植し、次いで、ヒト定常領域に結合する。例えば、Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988)；米国特許第５，２２５，５３９号を参照のこと。

いくつかの例では、二重特異性抗体であって、
−ＩＭＧＴ／Ｇｅｎｅデータベースで定義されているヒト免疫グロブリン遺伝子κ可変６−１１アレル０２（ＩＧＫＶ６−１１＊０２）をベースとするセツキシマブの軽鎖ヒト化型、

（以下のKabat位置において、アミノ酸残基は、
Kabat位置Ｌ３１、Ｔｈｒ又はＳｅｒ
Kabat位置Ｌ３２、Ａｓｎ又はＳｅｒ
Kabat位置Ｌ３３、Ｉｌｅ又はＬｅｕ
Kabat位置Ｌ５３、Ｇｌｕ又はＧｌｎ
Kabat位置Ｌ８９、Ｇｌｎ又はＨｉｓ
Kabat位置Ｌ９１、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｒｇ
Kabat位置Ｌ９２、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｒｇ
Kabat位置Ｌ９３、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｒｇ
Kabat位置Ｌ９４、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＰｈｅ
Kabat位置Ｌ９６、Ｔｈｒ又はＴｙｒ
である）
−ＩＭＧＴ／Ｇｅｎｅデータベースで定義されているヒト免疫グロブリン遺伝子κ可変３−１１アレル０１（ＩＧＫＶ３−１１＊０１）をベースとするセツキシマブの軽鎖ヒト化型、

（以下のKabat位置において、アミノ酸残基は、
Kabat位置Ｌ２９、Ｉｌｅ又はＶａｌ
Kabat位置Ｌ３０、Ｇｌｙ又はＳｅｒ
Kabat位置Ｌ３１、Ｔｈｒ又はＳｅｒ
Kabat位置Ｌ３２、Ａｓｎ又はＴｙｒ
Kabat位置Ｌ３３、Ｉｌｅ又はＬｅｕ
Kabat位置Ｌ３４、Ｈｉｓ又はＡｌａ
Kabat位置Ｌ４９、Ｌｙｓ又はＴｙｒ
Kabat位置Ｌ５０、Ｔｙｒ又はＡｓｐ
Kabat位置Ｌ５３、Ｇｌｕ又はＡｓｎ
Kabat位置Ｌ５４、Ｓｅｒ又はＡｒｇ
Kabat位置Ｌ５５、Ｉｌｅ又はＡｌａ
Kabat位置Ｌ５６、Ｓｅｒ又はＴｈｒ
Kabat位置Ｌ９１、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ又はＬｙｓ
Kabat位置Ｌ９２、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｒｇ
Kabat位置Ｌ９４、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＰｈｅ
Kabat位置Ｌ９６、Ｔｈｒ又はＴｙｒ
である）
−ＩＭＧＴ／Ｇｅｎｅデータベースで定義されているヒト免疫グロブリン遺伝子重可変４−５９アレル０１（ＩＧＨＶ４−５９＊０１）をベースとするセツキシマブｍＡｂの重鎖ヒト化型、

（以下のKabat位置において、アミノ酸残基は、
Kabat位置Ｈ２９、Ｌｅｕ又はＩｌｅ
Kabat位置Ｈ３０、Ｔｈｒ又はＳｅｒ
Kabat位置Ｈ３１、Ａｓｎ又はＳｅｒ
Kabat位置Ｈ３３、Ｇｌｙ又はＴｙｒ
Kabat位置Ｈ３５、Ｈｉｓ又はＳｅｒ
Kabat位置Ｈ３７、Ｖａｌ又はＩｌｅ
Kabat位置Ｈ４８、Ｌｅｕ又はＩｌｅ
Kabat位置Ｈ５０、Ｖａｌ又はＴｙｒ
Kabat位置Ｈ５２、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＰｈｅ
Kabat位置Ｈ５３、Ｓｅｒ又はＴｙｒ
Kabat位置Ｈ５４、Ｇｌｙ又はＳｅｒ
Kabat位置Ｈ５６、Ａｓｎ又はＳｅｒ
Kabat位置Ｈ５８、Ａｓｐ又はＡｓｎ
Kabat位置Ｈ６１、Ｔｈｒ又はＰｒｏ
Kabat位置Ｈ６２、Ｐｒｏ又はＳｅｒ
Kabat位置Ｈ６４、Ｔｈｒ又はＬｙｓ
Kabat位置Ｈ６７、Ｌｅｕ又はＶａｌ
Kabat位置Ｈ７３、Ａｓｎ又はＴｈｒ
Kabat位置Ｈ７８、Ｖａｌ又はＰｈｅ
である）
−ＩＭＧＴ／Ｇｅｎｅデータベースで定義されているヒト免疫グロブリン遺伝子重可変３−３３アレル０１（ＩＧＨＶ３−３３＊０１）をベースとするセツキシマブｍＡｂの重鎖ヒト化型、

（以下のKabat位置において、アミノ酸残基は、
Kabat位置Ｈ２８、Ｓｅｒ又はＴｈｒ
Kabat位置Ｈ３０、Ｔｈｒ又はＳｅｒ
Kabat位置Ｈ４８、Ｌｅｕ又はＶａｌ
Kabat位置Ｈ４９、Ｇｌｙ又はＡｌａ
Kabat位置Ｈ５３、Ｓｅｒ又はＡｓｐ
Kabat位置Ｈ５５、Ｇｌｙ又はＳｅｒ
Kabat位置Ｈ５７、Ｌｙｓ又はＴｈｒ
Kabat位置Ｈ５８、Ａｓｐ又はＴｙｒ
Kabat位置Ｈ６０、Ａｓｎ又はＡｌａ
Kabat位置Ｈ６１、Ｔｈｒ又はＡｓｐ
Kabat位置Ｈ６２、Ｐｒｏ又はＳｅｒ
Kabat位置Ｈ６４、Ｔｈｒ又はＬｙｓ
Kabat位置Ｈ６５、Ｓｅｒ又はＧｌｙ
Kabat位置Ｈ７８、Ｖａｌ又はＬｅｕ
である）
を含む二重特異性抗体が記載される。

抗体の生産
本発明の抗体の重鎖及び軽鎖をコードする核酸は、発現ベクターに挿入される。軽鎖及び重鎖は、同じ又は異なる発現ベクターにクローニングされ得る。免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡセグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を保証する発現ベクター中のコントロール配列に作動可能に連結される。このようなコントロール配列は、シグナル配列、プロモーター、エンハンサー及び転写終結配列を含む。発現ベクターは、典型的には、宿主生物において、エピソームとして、又は宿主染色体ＤＮＡの必須部分として複製可能である。一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列でトランスフォーメーションされた細胞の検出を可能にするための選択マーカー、例えばテトラサイクリン又はネオマイシンを含有するであろう。

一例では、重鎖コード配列及び軽鎖コード配列（例えば、ＶＨ及びＶＬ、ＶＨ−ＣＨ１及びＶＬ−ＣＬ、又は全長重鎖及び全長軽鎖をコードする配列）は両方とも、１つの発現ベクターに含まれる。別の例では、抗体の重鎖及び軽鎖をそれぞれ個々のベクターにクローニングする。後者の場合、両鎖の発現のために、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターを１つの宿主細胞にコトランスフェクションし得、これらをin vivo又はin vitroでアセンブルして、インタクトな抗体を形成し得る。あるいは、重鎖及び軽鎖それぞれの発現のために、重鎖をコードする発現ベクター及び軽鎖をコードするものを異なる宿主細胞に導入し得、次いで、これらを精製及びアセンブルして、in vitroでインタクトな抗体を形成し得る。

特定の実施態様では、宿主細胞は、プラスミドなどの３つの独立した発現ベクターでコトランスフェクションされ、３本の鎖の全て（すなわち、それぞれ重鎖ＨＣ並びに２本の軽鎖ＬＣ１及びＬＣ２）が同時産生され、二重特異性抗体が分泌される。

より具体的には、３つのベクターは、有利には、以下の分子比２：１：１（ＨＣ：ＬＣ１：ＬＣ２）で使用され得る。

本明細書に記載される抗体の発現のためのリコンビナントベクターは、典型的には、構成的又は誘導性のいずれかのプロモーターに作動可能に連結された抗体アミノ酸配列をコードする核酸を含有する。ベクターは、原核生物、真核生物又はその両方における複製及び統合に適切であり得る。典型的なベクターは、転写及び翻訳終結と、開始配列と、抗体をコードする核酸の発現のレギュレーションに有用なプロモーターとを含有する。ベクターは、少なくとも１つの独立した終結配列と、原核生物及び真核生物の両方においてカセットの複製を可能にする配列（すなわち、シャトルベクター）と、原核生物系及び真核生物系の両方のための選択マーカーとを含有する遺伝子発現カセットを場合により含有する。

本明細書に記載される二重特異性抗体は、原核生物及び真核生物発現系、例えば細菌、酵母、糸状菌、昆虫及び哺乳動物細胞において産生され得る。本発明のリコンビナント抗体は、真核細胞においてグリコシル化又は発現される必要はない；しかしながら、一般に、哺乳動物細胞における発現が好ましい。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ヒト胎性腎臓細胞株（２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ細胞）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／−又は＋ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−ＤＧ４４、Ｆｌｐ−ｉｎ ＣＨＯ細胞）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ細胞）及びヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２細胞）である。

インタクトな免疫グロブリンを分泌することができる多くの適切な宿主細胞株が当技術分野で開発されており、ＣＨＯ細胞株、様々なＣｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、好ましくは骨髄腫細胞株又はトランスフォーメーションＢ細胞若しくはハイブリドーマが挙げられるので、哺乳動物組織細胞培養は、ポリペプチドを発現及び生産するために好ましい。

最も好ましい実施態様では、本発明の二重特異性抗体は、ＣＨＯ細胞株、最も有利にはＣＨＯ−Ｓ又はＣＨＯ−ＤＧ−４４細胞株又はそれらの誘導体を使用することによって生産される。

これらの細胞の発現ベクターは、発現コントロール配列、例えば複製起点、プロモーター及びエンハンサー、並びに必要なプロセシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終結配列を含み得る。好ましい発現コントロール配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルスなどに由来するプロモーターである。

目的のポリヌクレオチド配列（例えば、重鎖コード配列及び軽鎖コード配列並びに発現コントロール配列）を含有するベクターは、細胞宿主のタイプに応じて異なる周知の方法によって、宿主細胞に移入され得る。例えば、リン酸カルシウム処理又はエレクトロポレーションは、他の細胞宿主に使用され得る。（一般に、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2nd ed., 1989を参照のこと）。重鎖及び軽鎖が別個の発現ベクターにクローニングされる場合、ベクターは、インタクトな免疫グロブリンの発現及びアセンブリを得るためにコトランスフェクションされる。

宿主細胞は、（例えば、化学的トランスフェクション法又はエレクトロポレーション法によって）ベクターでトランスフォーメーション又はトランスフェクションされ、プロモーターを誘導し、トンスフォーマントを選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために、従来の（又は、必要に応じて改変された）栄養培地中で培養される。

抗体の発現は、一過性又は安定であり得る。

好ましくは、二重特異性抗体は、安定発現方法によって生産され、BiXAb-3486、BiXAb-3489、BiXAb-3732SS及びBiXAb-E06528などの二重特異性抗体の全てのポリペプチド鎖をコードするＤＮＡで安定にトランスフェクションされた細胞株は、持続的な発現が可能であり、治療薬の製造を可能にする。例えば、ＣＨＯ細胞株における安定発現が特に有利である。

発現させたら、本発明の全抗体、それらのダイマー、個々の軽鎖及び重鎖又は他の免疫グロブリン形態をさらに単離又は精製して、さらなるアッセイ及び適用のために実質的に均一な調製物を得ることができる。当技術分野で公知の標準的なタンパク質精製方法が使用され得る。例えば、適切な精製手順としては、免疫親和性又はイオン交換カラムによる分画、エタノール沈殿、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、硫酸アンモニウム沈殿及びゲルろ過が挙げられ得る（一般に、Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., 1982を参照のこと）。医薬用途では、少なくとも約９０〜９５％の均一性の実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８〜９９％又はそれ以上の均一性が最も好ましい。

in vitro生産は、本発明の所望の二重特異性抗体を大量に得るスケールアップを可能にする。このような方法は、例えばエアリフト反応器若しくは連続撹拌反応器における均一懸濁培養、又は例えば中空繊維、マイクロカプセル、アガロースマイクロビーズ若しくはセラミックカートリッジにおける固定化若しくは封入細胞培養を用い得る。

治療用途
本発明の二重特異性抗体は、腫瘍成長阻害を誘導することが示された。

本発明の二重特異性抗体は、医薬として、特にガンの処置において有用である。

本明細書で使用される場合、「ガン」という用語は、任意のガン、特に膵臓ガン、及びＥＧＦＲ又はＨＥＲ２発現又は過剰発現を特徴とする任意の他のガン、特にＥＧＦＲ及びＨＥＲ２の両方の同時発現を特徴とするガンを含む。

いくつかの実施態様では、ガンは、野生型ＫＲＡＳ遺伝子を有する細胞を含む。

ガンの例は、固形腫瘍、例えば膵臓ガン、頭頸部ガン（扁平上皮ガンを含む）、結腸直腸ガン、乳ガン、肺ガン、胃ガン、卵巣ガンである。

したがって、本発明の抗体を、このような処置を必要とする患者に投与することによって、ガンを患っている患者を処置する方法が記載される。したがって、本発明の別の態様は、ガンの処置のための医薬を製造するための、本発明の二重特異性抗体の使用である。

本発明の一態様は、本発明の抗体を含む医薬組成物である。本発明の別の態様は、医薬組成物を製造するための、本発明の抗体の使用である。本発明のさらなる態様は、本発明の抗体を含む医薬組成物を製造するための方法である。

別の態様では、本発明は、医薬担体と一緒に製剤化された本明細書で定義される抗体を含有する組成物、例えば医薬組成物を提供する。

本明細書で使用される場合、「医薬担体」は、生理学的に適合性の任意の及び全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与又は表皮投与（例えば、注射又は注入による）に適切である。

本発明の組成物は、当技術分野で公知の様々な方法によって投与され得る。投与経路及び／又は投与様式は、所望の結果に応じて変動するであろう。

特定の投与経路によって本発明の二重特異性抗体を投与するために、その不活性化を防止するための材料で本発明の二重特異性抗体をコーティングするか、又はその不活性化を防止するための材料と共に本発明の二重特異性抗体を同時投与することが必要であり得る。例えば、本発明の二重特異性抗体は、適切な担体、例えばリポソーム又は希釈剤で被験体に投与され得る。薬学的に許容し得る希釈剤としては、生理食塩水及び水性緩衝溶液が挙げられる。医薬担体としては、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野で公知である。

これらの組成物はまた、アジュバント、例えば保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤を含有し得る。微生物の存在の防止は、滅菌手順によって、並びに様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含めることによって保証され得る。塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含めることも望ましい場合がある。加えて、注射可能な医薬形態の持続吸収は、吸収を遅延させる薬剤を含めることによってもたらされ得る。

本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者に対する毒性を伴わずに、特定の患者、組成物及び投与様式に関する所望の治療応答を達成するために有効な有効成分の量を得るように変更され得る。

選択される投与量レベルは、用いられる本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、処置継続期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物及び／又は材料、処置される患者の年齢、性別、体重、症状、全般的な健康及び過去の病歴、並びに医学分野で周知の同様の要因を含む様々な薬物動態要因に依存するであろう。例えば、本発明の二重特異性抗体は、投与量 ０．２〜２０mg/kgで３回／週〜１回／月投与され得る。

このように上記に一般的に記載されている本発明は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解されるが、以下の実施例は実例として提供されており、本発明を限定することを意図しない。実施例は、以下の実験が、実施された全ての又は唯一の実験であることを表すことを意図しない。

実施例１．本発明の二重特異性抗体BiXAb-3486、BiXAb-3489及びBiXAb-3732SSの調製
遺伝子合成
GeneScriptプログラムを使用して哺乳動物発現のためにコドン最適化した後、抗ＨＥＲ２（トラスツズマブ、クローンｈｕｍＡｂ４Ｄ５−８）(Carter P., Presta L., Gorman C.M., Ridgway J.B., Henner D., Wong W.L., Rowland A.M., Kotts C., Carver M.E., Shepard H.M. (1992) Humanization of an anti-p185HER2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 15, 4285-4289)及び抗ＥＧＦＲ（セツキシマブ）(Humblet Y. (2004). Cetuximab: an IgG1 monoclonal antibody for the treatment of epidermal growth factor receptor expressing tumors. Expert Opin Pharmacother 5: 1621-1633.)のアミノ酸配列を使用して、ＤＮＡ配列を設計した。重鎖については、制限酵素消化のための隣接配列と共に、シグナルペプチドと、Ｆａｂ１の可変領域及び定常ＣＨ１ドメインと、それに続いてシュードヒンジリンカーと、Ｆａｂ２の可変領域及び定常ＣＨ１ドメインとをコードするＤＮＡをGeneScriptによって合成した。軽鎖については、シグナルペプチドと、可変及び定常κ領域とをコードするＤＮＡをGeneScriptによって合成した。

PfuTurbo Hot Startを使用したＰＣＲ反応を行ってインサートを増幅し、次いで、それぞれ重鎖及び軽鎖についてＮｏｔＩ＋ＡｐａＩ及びＮｏｔＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩによってこれを消化した。ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ＣＨ３ドメインが既に挿入されたＮｏｔＩ＋ＡｐａＩ処理ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター(Invitrogen)と二重消化重鎖フラグメントをライゲーションした。ＮｏｔＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター(Invitrogen)と二重消化軽鎖フラグメントをライゲーションした。二本鎖ＤＮＡ配列決定によって、プラスミドＤＮＡを検証した。

変異体の発現及び精製
懸濁液の無血清培地（CHO SFM-II培地、Life Technologies（商標））に適合されたＣＨＯ−Ｓ細胞において、２：１：１＝ＨＣ：ＬＣ１：ＬＣ２の分子比で別個のベクター上でコードされる３つの遺伝子（１本の連続重鎖（ＨＣ）及び２本の軽鎖（ＬＣ））をコトランスフェクションすることによる一過性遺伝子発現を用いて、本発明の二重特異性抗体（「BiXAb」分子とも称される）を生産した。典型的には、５０mL培地スケールの発現試験のために、１．５mLエッペンドルフチューブ中で、プラスミドＤＮＡ 合計５０μg（重鎖１ ２５μg、トラスツズマブ（抗ＨＥＲ２）軽鎖 １２．５μg及びセツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）軽鎖 １２．５μg）を混合し、３mg/mL ＰＥＩトランスフェクション試薬ｐＨ７．０(Polyplus) ２５μLを含有するＣＨＯ ＳＦＭ培地 １mLを追加し、室温で２０分間インキュベーションした。１２５mL振盪フラスコ中で、ＤＮＡ−ＰＥＩの混合物をLife Technologies’ Invitrogen FreeStyle（商標）ＣＨＯ−Ｓ細胞 ４９mLに１〜２×１０^６／mLでロードした。細胞をさらに６日間振盪した。細胞を３，０００rpmで１５分間遠心分離することによって、上清を採取した。ForteBioのプロテインＡバイオセンサー(Octet（登録商標）Systems)を使用して、上清中のBiXAbの発現力価を決定した。次いで、MabSelect SuRe (GE Healthcare Life Sciences)を使用してプロテインＡアフィニティー媒体によって、二重特異性モノクローナル抗体（BiXAb）を精製した。０．１ＭグリシンｐＨ３．５を使用してプロテインＡから抗体を溶出させ、１Ｍトリスによって中和した。ダルベッコＰＢＳ(Lonza BE17-512Q)中の精製抗体を滅菌ろ過（０．２μM滅菌フィルタ、Techno Plastic Products AG製）し、Eppendorf BioSpectrometer（登録商標）を使用して２８０nmでＯＤを読み取ることによって、最終濃度を決定した。

ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析
BioRad製のExperion（商標）自動電気泳動システムを使用することによって、精製BiXAb-3486、BiXAb-3489及びBiXAb-3732SS抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を実施した。バッファー中のラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下では、抗体がゲル中で移動する速度はそのサイズに主に依存するので、分子量決定が可能になる。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥのプロファイルは、図２Ａ及び２Ｂに示されている。図２Ａのレーン１及び２は、それぞれBiXAb-3732SS及びBiXAb-3489について、非還元（左）及び還元（右）条件下で得られたプロファイルを示す。図２Ｂは、BiXAb-3486のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイル（還元及び非還元）を実証する。

非還元条件下では、抗体の四次構造が維持され、観察される分子量は、異なる重鎖及び軽鎖の分子量の合計を表すはずである。

本発明の二重特異性抗体フォーマットは、６本の鎖（２本の重鎖及び４本の軽鎖）からなる。翻訳後修飾（ＰＴＭ）、例えばＮ−グリコシル化を考慮しなければ、理論分子量は、それぞれBiXAb-3486、BiXAb-3489及びBiXAb-3732SSについて２４５．５０、２４５．４４及び２４５．４５１kDaである。既知分子量の標準の使用して、非還元ゲル（図２Ａ及び図２Ｂ）を較正した。レーン１及び２（図２Ａ）並びにレーン１（図２Ｂ）で得られたプロファイルは、標準分子量 ２６０kDa以上の主な広いバンド（これは、ＰＴＭなしの計算分子量 ２４５kDaと一致する）を示す。BiXAb-3489、BiXAb-3732SS及びBiXAb-3486は、それらの重鎖において４つのＮ−グリコシル化部位（全ての従来のモノクローナル抗体のＮ２９７に見られるようにＦｃ領域において２つ（各重鎖上に１つ）、及び各Ｆａｂにおいて２つ（セツキシマブの可変領域のＮ８８において各重鎖上に１つ））を有する。

還元条件下では、還元剤ジチオスレイトール（ＤＴＴ）は、ジスルフィド結合を還元することによってBiXAbタンパク質をさらに変性させ、BiXAb分子の四次構造を破壊する。

６本のポリペプチド鎖は、それらの相対分子量にしたがって、ゲル中で別個に移動する；全く同じ分子量を有する２本の重鎖、並びに抗ＥＧＦＲ及び抗ＨＥＲ２ Ｆａｂドメイン由来の２組の軽鎖。

還元ゲルで得られたプロファイルは、２つのグループの主なバンド（分子量標準の移動度に基づいて、第１のものは約７５kDaであり、第２のものは約２５kDaである）の存在を実証している。上記セクションで議論されているように、各重鎖は、２つのＮ−グリコシル化部位を有しているが、これは、グリコシル化タンパク質の典型的な特徴であるバンドの広がりと、その見掛けの分子量が計算質量よりも高いこととを説明している。

抗ＥＧＦＲ（２３．４２５kDa）及び抗ＨＥＲ２（２３．４４３kDa）の軽鎖の計算分子量は類似しているが、おそらくは各軽鎖の流体力学的特性の差異により、それらはゲル上で分離可能である。

全ての分子（BiXAb-3486、BiXAb-3489及びBiXAb-3732SS）は、ＣＨＯ細胞における一過性発現によって、良好な発現レベル（約２００mg/L）を有する。この発現レベルは、親抗体の１つである抗ＥＧＦＲのものと同様に、従来のモノクローナル抗体で見られる発現レベルと同程度である。

結論として、BiXAb-3486、BiXAb-3489及びBiXAb-3732SSのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって得られたプロファイルは非常に類似しており、理論上の計算分子量と一致する。分子量の差異は、ＰＴＭの存在、特に２本の重鎖における４つのＮ−グリコシル化部位の存在によるものである可能性がある。

サイズ排除クロマトグラフィー分析
操作されたタンパク質分子では、タンパク質凝集が頻繁に観察される。本発明者らは、分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を実施して、一段階アフィニティー精製BiXAb-3489及びBiXAb-3732SS調製物の高分子量種含有量をアッセイした。本発明者らは、SEC-s3000 (300× 7.8 mm)カラム(BioSep)及びAktapurifier 10システム(GE Healthcare)を用いた；ＰＢＳバッファーｐＨ７．４を使用して、流速 １mL／分でアッセイを行った。

図３Ａ及び３Ｂに示されているＳＥＣクロマトグラムにより、両クロマトグラムにおける主ピークは、全サンプルのそれぞれ９６．４％及び９７．４％を占めるモノマーBiXAb-3489及びBiXAb-3732SSの予想サイズに対応することが実証された。加えて、BiXAb-3489及びBiXAb-3732SSについて、より高分子量の種（おそらくは、ダイマー）に対応する小さなピークが観察された；このピークは、全サンプルのそれぞれ３．６％及び２．６％を占めていた。したがって、本発明者らは、より高分子量の種の含有率がわずかであり、ＣＨＯ発現系において産生される従来のモノクローナル抗体と同様であると結論付けた。モノマーピークの狭い対称形状により、BiXAb-3489及びBiXAb-3732SSは両方とも正しくアセンブルされ、単一の種によって占められていたことが示唆された。

実施例２．本発明の二重特異性抗体BiXAb-E06528の調製
遺伝子合成
GeneScriptプログラムを使用して哺乳動物発現のためにコドン最適化した後、抗ＥＧＦＲ（セツキシマブ）及び抗ＨＥＲ２（トラスツズマブ）のアミノ酸配列を使用して、ＤＮＡ配列を設計した。これらの抗体は、「親」抗ＥＧＦＲ及び「親」抗ＨＥＲ２ ｍＡｂと称される。

シグナルペプチド、それに続いて配列（これは、可変領域と、それに続いてＦａｂ１（抗ＨＥＲ２）の定常ＣＨ１ドメインと、それに続いてＡＰリンカーと、それに続いて可変領域と、それに続いてＦａｂ２（抗ＥＧＦＲ）の定常ＣＨ１ドメイン（これは、Kabat位置１９２において、ＴｈｒからＧｌｕへの突然変異を導入した）とからなる）のように、重鎖のＤＮＡ構築物を設計した；制限酵素消化のための隣接配列を重鎖ＤＮＡ構築物の両端に導入した。シグナルペプチド、それに続いて可変領域、それに続いて定常κ領域のように、軽鎖のＤＮＡ構築物を設計した；抗ＥＧＦＲ軽鎖については、Kabat位置１３７（ＡｓｎからＬｙｓへ）及び１１４（ＳｅｒからＡｌａへ）における突然変異を定常κドメインに導入した。ＤＮＡ構築物は全て、Gene Artによって合成された。

PfuTurbo Hot Startを使用したＰＣＲ反応を行ってインサートを増幅し、次いで、それぞれ重鎖及び軽鎖についてＮｏｔＩ及びＡｐａＩ並びにＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩでこれを消化した。ヒトＩｇＧ１ヒンジとそれに続いてＣＨ２＋ＣＨ３ドメインが既に挿入されたＮｏｔＩ及びＡｐａＩ処理ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター(Invitrogen)と二重消化重鎖フラグメントをライゲーションした。ＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター(Invitrogen)と二重消化軽鎖フラグメントをライゲーションした。二本鎖ＤＮＡ配列決定によって、プラスミドＤＮＡを検証した。

発現及び精製
懸濁液の無血清培地（CHO SFM-II培地、Life Technologies（商標））に適合されたＣＨＯ−Ｓ細胞において、２：１：１＝ＨＣ：ＬＣ１：ＬＣ２の分子比で別個のベクター上でコードされる３つの遺伝子（１本の連続重鎖（ＨＣ）及び２本の軽鎖（ＬＣ））をコトランスフェクションすることによる一過性遺伝子発現を用いて、二重特異性抗体BiXAb-E06528を生産した。典型的には、５０mLスケールの発現のために、１．５mLエッペンドルフチューブ中で、プラスミドＤＮＡ 合計５０μg（重鎖 ２５μg、抗ＨＥＲ２軽鎖 １２．５μg及び抗ＥＧＦＲ軽鎖 １２．５μg）を混合し、次いで、３mg/mL ＰＥＩトランスフェクション試薬ｐＨ７．０(Polyplus) ２５μLを含有するＣＨＯ ＳＦＭ培地 １mLを追加し、反応物を室温で２０分間インキュベーションした。続いて、１２５mL振盪フラスコ中で、ＤＮＡ−ＰＥＩの混合物をLife Technologies’ Invitrogen FreeStyle（商標）ＣＨＯ−Ｓ細胞 ４９mLに１〜２×１０^６／mLで追加した。細胞を６日間振盪した。３，０００rpmで１５分間遠心分離することによって、上清を採取した。ForteBioのプロテインＡバイオセンサー(Octet（登録商標）Systems)を使用して、上清中のBiXAb-E06528の発現力価を決定した。次いで、プロテインＡアフィニティー樹脂(MabSelect SuRe, GE Healthcare Life Sciences)によって、BiXAb-E06528を精製した。０．１ＭグリシンｐＨ３．５を使用してプロテインＡから抗体を溶出させ、１Ｍトリスによって溶出液を中和した。ダルベッコＰＢＳ(Lonza)中の精製抗体を滅菌ろ過（０．２μM滅菌フィルタ、Techno Plastic Products AG）し、２８０nmの光学密度（ＯＤ）を読み取ることによって(Eppendorf BioSpectrometer（登録商標）)、最終濃度を決定した。

BiXAab-E06528は、典型的には、一過性ＣＨＯ発現において良好な発現力価（＞１８０mg／リットル）を示した。この発現レベルは、従来のモノクローナル抗体で見られる発現レベルと同程度である。

ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
精製BiXAb-E06528の品質を評価するために、本発明者らは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。ランニングバッファー中のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下では、抗体がゲル中で移動する速度はそのサイズに主に依存するので、分子量決定が可能になる。非還元条件下及び還元条件下で、このアッセイを実施した；後者は、ジスルフィド結合の破壊を可能にするので、個々のポリペプチド鎖（軽鎖及び重鎖）の可視化を可能にする。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥのデータは、図２Ｃに示されている。非還元条件下では、抗体の四次構造が維持され、観察される分子量は、異なる重鎖及び軽鎖の分子量の合計を表すはずである。本発明の二重特異性抗体（BiXAb-E06528）は、６本の鎖（２本の重鎖及び４本の軽鎖）からなる。翻訳後修飾（ＰＴＭ）、例えばアスパラギン２９７におけるＦｃのＮ−グリコシル化を考慮しなければ、BiXAb-E06528の理論分子量は２４５．１３９kDaである。既知分子量の標準の混合物を使用して、ゲルを較正した。非還元データは、主なバンドが分子量標準 ２５０kDa（これは、Ｆｃドメインにおける２９７位の２つのアスパラギンの計算分子量及び予想グリコシル化と一致する）付近にあることを示している。還元条件下では、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）は、ジスルフィド結合を還元して四次構造を破壊することによって、BiXAb-E06528をさらに変性させるので、６本のポリペプチド鎖は、それらの分子量に応じてゲル中で別々に移動するはずである。BiXAb-E06528の２本の同一の重鎖は、単一のバンドとして共に移動し、２組の軽鎖は、それらの分子量がほぼ同一であるため、第２のバンドとして共に移動した。したがって、データは、分子量標準の移動度に基づいて、約７５kDa及び２５kDaの２つの主なグループのバンドを示している。各重鎖は、アスパラギン２９７において１つのＮ−グリコシル化部位を有していたが、これは、より高分子量のバンドの広がりと、観察された分子量が計算よりもわずかに高いこと（７５．７０１kDa）とを説明している；この幅広さは、グリコシル化タンパク質に典型的である。抗ＨＥＲ２（２３．４４３kDa）及び抗ＥＧＦＲ（２３．４２５kDa）の軽鎖の計算分子量は類似しているが、おそらくは各軽鎖の流体力学的特性の差異により、それらはゲル上で分離可能である。

結論として、BiXAb-E06528のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、非還元条件下及び還元条件下の両方における予想プロファイルを示しており、重鎖におけるＮ−グリコシル化部位の存在を考慮すると、理論上の計算分子量と一致していた。

サイズ排除クロマトグラフィー分析
操作されたタンパク質分子では、タンパク質凝集が頻繁に観察される。本発明者らは、分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を実施して、一段階アフィニティー精製BiXAb-E06567調製物の高分子量種含有量をアッセイした（変異体の発現及び精製を参照のこと）。本発明者らは、SEC-s3000 (300× 7.8 mm)カラム(BioSep)及びAktapurifier 10システム(GE Healthcare)を用いた；ＰＢＳバッファーｐＨ７．４を使用して、流速 １mL／分でアッセイを行った。

図３Ｃに示されているＳＥＣクロマトグラムにより、主ピークは、モノマーBiXAb-E06528の予想サイズに対応することが実証された；このピークは、全サンプルの９９．９％を占めていた。したがって、BiXAb-E06528は、凝集体もより高分子量の種も示さず、一段階アフィニティークロマトグラフィー後に均一な抗体として生産することができる。モノマーピークの狭い対称形状により、BiXAb-E06528は正しくアセンブルされ、単一の種によって占められていたことが示唆された。

実施例３．示差走査熱量測定による特性評価
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用して、BiXAb-3489、親抗ＨＥＲ２ ｍＡｂ及び親抗ＥＧＦＲ ｍＡｂの熱安定性を比較した。MicrocalTM VP-Capillary DSCシステム(Malvern Instruments)を使用して、示差走査熱量測定実験を実施した。

全てのサンプルを遠心分離（２０，０００×ｇ、５分間、４℃）し、ＩｇＧ分析プログラムを用いたNanodrop ND-1000分光光度計(Thermo Scientific)を使用したＤＳＣ分析の前に、それらのタンパク質含有量を定量した。アッセイのために、全てのサンプルをＰＢＳで最終濃度 １mg/mLに希釈した。

予備平衡時間は３分間であり、得られたサーモグラムは、走査速度 ６０℃／時、ろ過時間 ２５秒間及びメディウムフィードバックにおいて２０〜１１０℃で取得されたものであった。サンプル分析の前に、５回のバッファー／バッファースキャンを測定して機器を安定化し、各タンパク質／バッファースキャンの間にバッファー／バッファースキャンを実施した。データを非二状態アンフォールディングモデルにフィッティングし、ベースラインを差し引くことによって遷移前及び遷移後を調整した。

（５０〜１００℃の範囲をカバーする）図４に示されているＤＳＣ曲線により、個々のＦｖ領域が異なるＦａｂアンフォールディングプロファイルにつながり得る方法が実証された；また、この実験により、Ｆｖ領域がＦａｂの見掛けの安定性を決定することが実証された。抗ＨＥＲ２ ｍＡｂのＤＳＣプロファイルは、２つの遷移（２７Kcal/モル/℃のＣｐ ｍａｘ及び７０．４℃のＴｍ１を有する小さなピーク（これは、ＣＨ２ドメインのアンフォールディングに対応する）、並びに１５２Kcal/モル/℃のＣｐ ｍａｘ及び８０．４℃のＴｍ２を有する大きなピーク（これは、ＣＨ３及びＦａｂドメインの両方のアンフォールディングに対応する））を示した。抗ＥＧＦＲ ｍＡｂのＤＳＣプロファイルは、２つの遷移（９５Kcal/モル/℃のＣｐ ｍａｘ及び７１．９℃のＴｍ１を有する大きなピーク（これは、ＣＨ２及びＦａｂドメインの両方のアンフォールディングに対応する）、並びに２２Kcal/モル/℃のＣｐ ｍａｘ及び８２．４℃のＴｍ２を有する小さなピーク（これは、ＣＨ３ドメインのアンフォールディングに対応する））を示した。

BiXAb-3489のＤＳＣプロファイルもまた、２つの大きなピークを有する２つの遷移を示した。第１のピークは、７０Kcal/モル/℃のＣｐ ｍａｘ及び７１．７℃のＴｍ１を有しており、抗ＥＧＦＲ ｍＡｂのＣＨ２及びＦａｂドメインのアンフォールディングに対応していた；第２のピークは、１６１Kcal/モル/℃のＣｐ ｍａｘ及び８０．９℃のＴｍ２を有しており、抗ＨＥＲ２ ｍＡｂのＣＨ３及びＦａｂドメインのアンフォールディングに対応していた。したがって、BiXAb-3489のＤＳＣプロファイルは、２つの親ｍＡｂの２つのＤＳＣプロファイルを重ね合わせたものに似ており、BiXAb-3489の優れたアセンブリ及び安定性を示した。BiXAb-3489のＴｏｎｓｅｔ（６０．０℃）は、親ｍＡｂのもの（抗ＨＥＲ２のＴｏｎｓｅｔ＝６３．１℃及び抗ＥＧＦＲのＴｏｎｓｅｔ＝６１．５℃）と同様であったが、これは、BiXAb-3489が、親抗体のものと同様の安定特性を有していたことを示している。

定義：
Ｔｍ又は変性／融解温度は、アンフォールディング種及びフォールディング種の濃度が等しい点であり、アンフォールディング遷移の中間点である。パラメータとして、それは、熱変性に対するタンパク質の感受性を表すので、それは、タンパク質の安定性に関連する。Ｔｍが高いほど、タンパク質はより安定である。

Ｔｏｎｓｅｔは、アンフォールディング遷移が開始する温度である。このパラメータの値は、通常、Ｔｍよりも５〜１０℃低い。それはまた、タンパク質の安定性を表すパラメータであるが、熱変性に対する耐性に関連する。

実施例４．無細胞結合特性
二重抗原結合ＥＬＩＳＡアッセイ
１×ＰＢＳ ｐＨ７．４による希釈によって調製した２μg/mLのリコンビナントヒトＦｃタグ付ＨＥＲ２(Bio-techne)１００μLを使用して、Maxisorpプレートを４℃で一晩コーティングした。１×ＰＢＳＴでプレートを５回洗浄し、次いで、１ウェル当たり１×ＰＢＳ中１％ＢＳＡ ２００μLによって室温で２時間ブロッキングした。１×ＰＢＳＴでプレートを５回洗浄した。８点３倍希釈系列の１×ＰＢＳ中BiXAb-3486及びBiXAb-3489（２μg/mLから開始）を調製し、各希釈段階を１アッセイウェル当たり１００μL追加した。プレートを室温で１時間インキュベーションし、続いて、１×ＰＢＳＴで５回洗浄した。１×ＰＢＳ中１μg/mL ビオチン化ヒトＥＧＦＲ(AcroBiosystems)を１ウェル当たり１００μL追加し、プレートを室温で１時間インキュベーションした。１×ＰＢＳＴで５回洗浄した後、１×ＰＢＳによる希釈によって調製した０．１μg/mL ストレプトアビジンコンジュゲートＨＲＰ(Biotechne)を１ウェル当たり１００μL追加した。プレートを室温で１時間インキュベーションした。１×ＰＢＳＴで５回洗浄した後、比色読み取りのために１×ＰＢＳ中ＴＭＢ基質を１ウェル当たり１００μL追加し、発色のためにプレートを室温で１０分間インキュベーションした。Victor2マイクロプレートリーダー(Perkin Elmer)を用いて、アッセイデータを６５０nmで収集した。

BiXAb-3486及びBiXAb-3489は、二重ＥＬＩＳＡフォーマットにおいて、重複する用量依存的結合曲線を示したが、これは、それらが、正しくアセンブルされた抗ＨＥＲ２及び抗ＥＧＦＲ Ｆａｂドメインを有していたことを示唆している（図５）。これにより、BiXAb-3486及びBiXAb-3489は両方とも、それぞれ１００ng/mL及び１０６ng/mLのＥＣ５０でＨＥＲ２及びＥＧＦＲに同時結合することができる二重特異性抗体であることが実証された。親抗ＨＥＲ２は、予想どおり、この二重ＥＬＩＳＡフォーマットにおいて結合も示さなかった。

実施例５．ＳＰＲによる結合パラメータの決定．
T200GxP機器(Biacore, GE Healthcare)ＳＰＲ分光法を行った。ランニングバッファーとして、（GE Healthcareが供給する１０×ＨＢＳ−ＥＰ＋から希釈した）ＨＢＳ−ＥＰ＋ｐＨ７．４を使用した。製造業者によって推奨されるように、測定を２５℃で行った。流速 ３０μL／分で全ての実験を行った。トラスツズマブの場合、プロテインＡ捕捉はリガンド結合親和性を損ない得るので、ヒトＦａｂ特異的捕捉を選択した。したがって、Amine Coupling Kit (GE Healthcare)を使用してＥＤＣ−ＮＨＳ化学によって、製造業者の説明書（Rimmob 約１００００RU）にしたがってHuman Fab Capture Kit (GE Healthcare)を使用して、CM5-S-Seriesセンサーチップ(GE Healthcare)を抗体捕捉に用いた。フローセル１（Ｆｃ１）を活性化及び非活性化して、ブランク除去のための基準として使用した。測定サイクル間に、推奨再生バッファー（Human Fab Capture Kitにおいて供給される１０mM グリシン−ＨＣｌ ｐＨ２．１）で４５秒間パルスすることによって、表面を再生した。バッファー注入を二重参照に使用した。

ｈＥＧＦＲ(EGR-H5222, Acro Biosystems)及びｈＨＥＲ２(HE2-H5225, Acro Biosystems)に対するBiXAb-3489及びBiXAb-3732SS並びにそれらの親抗ＥＧＦＲ及び抗ＨＥＲ２ ｍＡｂの結合パラメータの決定では、ランニングバッファー中の各分子の適切な希釈物を１８０秒間注入し、続いて、ｈＥＧＦＲ（２０nM）又はｈＨＥＲ２（２０nM）のいずれかを１８０秒間注入し、続いて、３００秒間の解離段階によって、分析物（ｍＡｂ又はBiXAb）約１００RUを捕捉した。Biocore T200評価ソフトウェアを使用して二重参照を実施した後、得られたセンサーグラムをBiacoreEval 3.0ソフトウェアでフィッティングすることによって、親和定数を決定した。固定パラメータとして実験的に決定したＲＭａｘと一緒に１：１結合モデルを使用して、結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）及び平衡解離定数（ＫＤ）を決定した。

１：１相互作用モデルを使用して単一濃度曲線をフィッティングすることによって、抗ＥＧＦＲ及び抗ＨＥＲ２親ｍＡｂ並びにBiXAb-3489及びBiXAb-3732SSと同種リガンドＥＧＦＲ及びＨＥＲ２との相互作用の親和定数を決定した。一般に、低ナノモル範囲内の非常に類似したＫＤ値が観察された（表３）。高い親和性を測定する場合、２倍の偏差が予想されるので、５０％までの差異を関連とみなすべきではない。「逆」シリーズでは、BiXAb-3732SSにおける抗ＨＥＲ２ Ｆａｂは、わずかに速いｋｄを示すと考えられる；それにもかかわらず、その場合にはｋｏｎが減少するので、これは、内部Ｆａｂドメインの立体障害と矛盾する。

結論として、抗ＨＥＲ２及び抗ＥＧＦＲ Ｆａｂドメインの特性は、それらがＦｃドメインの近位又は遠位に位置するかにかかわらず、BiXAb-3489及びBiXAb-3732SSの両方において非常に類似しており、対応する親抗体（抗ＥＧＦＲ及び抗ＨＥＲ２）と非常に類似していた。したがって、BiXAb分子における同種抗原ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２のＦａｂ結合は、立体障害されない。

実施例６．非分画非プレ活性化単核細胞（ＭＮＣ）を用いた抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）
１００μg/ml ペニシリン、１００μg/ml ストレプトマイシン及び１０％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ １６４０−Ｇｌｕｔａｍａｘ−Ｉ培地中で、ＢｘＰＣ３膵臓ガン細胞、Ａ４３１皮膚扁平上皮ガン、ＳＫＯＶ−３卵巣ガン細胞を培養した。

ＭＮＣの調製では、以下の手順を用いた。新たに採血した末梢血をクエン酸塩で抗凝固処理した。続いて、抗凝固処理全血 ６mlでFicoll-Paque PLUS溶液 ５mlを層化した。その後に遠心分離破砕を伴わずに、サンプルを２，５００rpm、室温で２０分間遠心分離した。血漿／Ｆｉｃｏｌｌ界面からＭＮＣを収集した。ＰＢＳでＭＮＣ細胞懸濁液を１：１０希釈し、１，８００rpm、室温で５分間遠心分離した。上清を除去し、氷冷蒸留水 ４５mlを細胞懸濁液に３０秒間かけて追加することによって赤血球を溶解し、その後、１０×ＰＢＳ ５mlを追加した。細胞を１８００rpm、室温で５分間遠心分離し、１×ＰＢＳで３回洗浄して、血小板を除去した。最後に、細胞を細胞培養培地 ５mlに再懸濁した。細胞数を調整して、ＡＤＣＣアッセイにおいて４０：１＝エフェクター細胞：腫瘍細胞比（ＭＮＣにおけるＮＫ細胞の割合に基づいて計算したところ、これは８：１＝ＮＫ細胞：腫瘍細胞比に対応していた）を達成した。

ＡＤＣＣ^５１クロム放出アッセイでは、ターゲット細胞（ＢｘＰＣ−３、Ａ５４１、Ａ４３１）１×１０^６個をＰＢＳ ２００μl中の５１クロム １００μCiと共に３７℃及び５％ＣＯ２で２時間インキュベーションした。２時間のインキュベーション後、培地 ７mlで細胞を３回洗浄し、最後に、細胞 ０．１×１０^６個／mlの濃度で再懸濁した。９６ウェルマイクロタイタープレート（アッセイ容量 ２００μl）中で、抗体の存在下におけるターゲット細胞（細胞 ５，０００個／ウェル）及びＭＮＣを３７℃及び５％ＣＯ２で４時間インキュベーションした。最大ターゲット細胞溶解（＝最大ｃｐｍ）の決定のために、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を追加した。基本^５１クロム放出（＝基本ｃｐｍ）を決定するために、ターゲット細胞をさらに操作しなかった。４時間のインキュベーション後、マイクロタイタープレートを２０００rpmで５分間遠心分離し、上清 ２５μlをOptiphase Supermix (Perkin Elmer) １２５μlと混合し、振盪インキュベーター中で１分間インキュベーションした。MicroBeta TriLux (Perkin Elmer)ベータカウンター機器で、サンプルをアッセイした。以下の式：
％溶解＝（実験ｃｐｍ−基本ｃｐｍ）／（最大ｃｐｍ−基本ｃｐｍ）×１００
を使用して、ターゲット細胞溶解を計算した。

全ての測定を３回反復で実施した。エフェクター細胞として非プレ活性化ＭＮＣを用いて、ＡＤＣＣアッセイを実施した。

図６Ａでは、ＢｘＰＣ−３細胞においてBiXAb-3486、BiXAb-3489、BiXAb-3732SS及びBiXAb-E06528を用いたＡＤＣＣアッセイが示されている。BiXAb-E06528（ＥＣ５０＝１．８nM）及びBiXAb-3489（ＥＣ５０＝２．２nM）については、強力な細胞傷害が観察されたが、これは、両親抗体の組み合わせ抗ＥＧＦＲ＋抗ＨＥＲ２（ＥＣ５０＝１．５nM）のものと同様であった；３つの抗体群全てにおいて、最大溶解はほぼ同一であった（約２０％）。＜１０％のかなり低い全溶解ではあるが、BiXAb-3486は同様の殺傷効力（ＥＣ５０＝２．０nM）を示した。親抗ＥＧＦＲ抗体のものと同様に、BiXAb-3732SSはほとんど溶解を示さなかった。親抗ＥＧＦＲ抗体は高い効力（ＥＣ５０＝０．８nM）を示したが、しかしながら、全溶解は、BiXAb-E06528、BiXAb-3489及び両親抗体の組み合わせ抗ＥＧＦＲ＋抗ＨＥＲ２と比べて減少した（１５％）。同様に、BiXAb-E06528（ＥＣ５０＝０．１２nM）及びBiXAb-3489（ＥＣ５０＝０．１２nM）は、Ａ４３１細胞に対して、親抗ＥＧＦＲ＋抗ＨＥＲ２の組み合わせ（ＥＣ５０＝０．０９nM）及び抗ＥＧＦＲのみ（ＥＣ５０＝０．０５nM）と同様の最大溶解及び非常に高い効力を示した（図６Ｂ）。やはり、BiXAb-3486及びBiXAb-3732SSは、低い効力（それぞれＥＣ５０＝０．２６nM及びＥＣ５０＝０．２４nM）及び低い最大溶解を示した。ＳＫＯＶ−３細胞に対するＡＤＣＣにより、BiXAb-E06528（ＥＣ５０＝０．８７nM）及びBiXAb-3489（ＥＣ５０＝０．８７nM）並びに親抗ＥＧＦＲ＋抗ＨＥＲ２の組み合わせ（ＥＣ５０＝０．８３nM）及び抗ＨＥＲ２（ＥＣ５０＝１．２nM）は、ガン細胞を強力に殺傷したが（図６Ｃ）、しかしながら、両BiXAb分子の最大溶解は、組み合わせ又は抗ＨＥＲ２のみと比べてわずかに減少したことが実証された。BiXAb-3486及びBiXAb-3732SSは、わずかに低い細胞傷害効力（ＥＣ５０＝１．２nM及びＥＣ５０＝２．１nM）及び最大溶解を示した。結論として、BiXAbは全て、いくつかの異なるタイプのＥＧＦＲ^＋／ＨＥＲ２^＋ガン細胞に対して細胞傷害活性を示し、BiXAb-E06528及びBiXAb-3489は、これらのガン細胞株に対して最高細胞傷害効力及び最大溶解を示した。

実施例７．ガン細胞株の生存性に対する効果の評価．
加湿雰囲気（５％ＣＯ２、９５％空気）、培養培地（それぞれＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ及びＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）中で、ＮＣＩ−Ｎ８７ヒト胃ガン及びＣＡＬ２７ヒト舌扁平上皮ガン細胞株を単層として３７℃で成長させた。実験的使用のために、トリプシン−ヴェルセンで５分間処理することによって培養フラスコから腫瘍細胞を分離し、完全培地の追加によって中和した。供給業者の説明書にしたがって血球計(KOVA slide)によって細胞をカウントし、０．２５％トリパンブルー排除によってそれらの生存性を評価した。

ガン細胞株の生存性に対する抗体効果を評価するために、最適細胞株密度（９６ウェル平底マイクロタイタープレート中、細胞 １１１０００個／mL）を使用した。１０％ＦＢＳを補充した無薬物ＲＰＭＩ１６４０培地中で処置前に、それらを３７℃で２４時間インキュベーションした。播種容量は、９０μlであった。１回の独立した実験において、化合物を３回反復で試験した。

処置開始時に、試験物質及びコントロール物質の希釈物 容量１０μLをウェルに追加して、以下の最終濃度を達成した：
−試験物質及びコントロール物質については、濃度は、１９０；１００；５０；２５及び１０μg/mLに等しかった。
−抗ＨＥＲ２＋抗ＥＧＦＲ抗体の組み合わせについては、抗ＥＧＦＲ及び抗ＨＥＲ２の両方の濃度は、１４０；１００；５０；２５及び１０μg/mLに等しかった。

試験物質を含有する培養培地 最終容量１００μL中、５％ＣＯ２下で、細胞を３７℃において３回反復で９６時間インキュベーションした。

９６時間の化合物インキュベーション後、製造業者の説明書にしたがってCellTiter-Glo発光アッセイキット(Promega)によって、ガン細胞の生存性に対する化合物の効果を明らかにした。簡潔に言えば、CellTiter Glo試薬 １００μLを調製し、各ウェルに追加した。次いで、発光の記録前に、プレートを振盪して細胞溶解を誘導した。

以下のように、生存の用量反応阻害（ＩＣ）を表した：
ＩＣ＝１００×（ＯＤ_{薬物曝露ウェル}／ＯＤ_{ビヒクル曝露ウェル}）

ＯＤ値は、３回の実験測定の平均であった。

BiXAb-E06528及びBiXAb-3489は、それぞれ１０２．６μg/mL及び５０．２μg/mLのＩＣ５０で、ＮＣＩ−Ｎ８７の生存性を強力に阻害した。抗ＥＧＦＲ＋抗ＨＥＲ２抗体の組み合わせは５０％生存阻害レベルに達せず、ＩＣ５０は＞１４０μg/mLであると推定された。親抗ＥＧＦＲ又は抗ＨＥＲ２の個々の調製物は、試験した濃度範囲内で最小限活性であり、５０％生存阻害レベルにも達しなかった；したがって、両ＩＣ５０は、＞１９０μg/mLであると推定された。

BiXAb-E06528及びBiXAb-3489によってＣＡＬ２７も効率的に阻害され、その生存性は最低濃度で約６０％阻害されたので、両分子のＩＣ５０は、＜１０μg/mLであると推定された。２つの親抗体の組み合わせ抗ＥＧＦＲ＋抗ＨＥＲ２は、ＩＣ５０＝１０．５μg/mLで生存性を阻害した。親抗ＥＧＦＲ ｍＡｂの個々の調製物は、ＩＣ５０＝９３．１μg/mLで、かなり低い阻害度を示した；親抗ＨＥＲ２ ｍＡｂの個々の調製物は、試験した濃度範囲内で阻害を示さなかった。

結論として、BiXAb-E06528及びBiXAb-3489は両方とも、胃及び舌扁平上皮ガンの生存性の強力な阻害を示したが、これは、２つの親抗体のいずれか又はそれらの組み合わせよりも強力であった。

実施例８：本発明の抗体の生物学的特性の評価
膵臓腫瘍ＢｘＰＣ−３を有するマウスにおいて、本発明の元の二重特異性四価抗体（これは、独自の方法でＥＧＦＲ及びＨＥＲ２レセプターを同時にターゲティングする）を評価し、抗ＥＧＦＲ及び抗ＨＥＲ２親抗体の組み合わせと比較した。

本発明の二重特異性四価抗体BiXAb-3486及びBiXAb-3489をアッセイに使用した。

処置スケジュール
ATCC (Rockville, MD)からＢｘＰＣ−３細胞株を入手し、１０％ウシ胎児血清、５０U/mlペニシリン及び５０μg/mlストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０中で培養した。

認可施設において、フランス国の規制及び実験動物研究に関する倫理ガイドラインにしたがって、全てのin vivo実験を実施した。

Harlan (Le Malcourlet, France)から購入した６週齢のヌード雌性無胸腺マウスの右脇腹に、ＢｘＰＣ−３（３．５×１０^６）細胞を皮下注射した。

次いで、腫瘍を有する検出可能な成長腫瘍を様々な群に分けた。腫瘍が所定体積 １００mm³に達した後、以下のスケジュールにしたがって、動物に腹腔内（ｉｐ）注射した：
・コントロールマウスには、動物を無作為に分けて６つのコホートに入れた日（０日目）から２８日目まで、無関係な抗体を週２回投与した。
・Ｃ＋Ｔマウスには、０日目から２８日目まで、抗ＥＧＦＲ＋抗ＨＥＲ２抗体を各２mg/kgで週２回投与した。
・BiXAbマウスには、以下のプロトコールにしたがって、二重特異性抗体を投与した：
−BiXAb-3486、２mg/kg、０日目から２８日目まで、週２回
−BiXAb-3486、１０mg/kg、０日目から２８日目まで、週２回
−BiXAb-3489、２mg/kg、０日目から２８日目まで、週２回
−BiXAb-3489、１０mg/kg、０日目から２８日目まで、週２回

抗腫瘍活性を評価するための基準
有効性のバイオマーカーとして安全性（体重、生存、臨床兆候及び行動）及び腫瘍成長を経過観察の主要エンドポイントとして採用し、全てのマウスについて、実験過程を通して週２回記録した。Newlab Oncologyソフトウェアによって、グラフ及び分析を実施した。

腫瘍体積
キャリパーを用いて腫瘍寸法を測定し、式Ｄ１×Ｄ２×Ｄ３／２によって体積を計算し、様々なエンドポイントを評価して処置の有効性を評価した。

腫瘍成長阻害
処置群対コントロール群の腫瘍体積の中央値の比として定義した腫瘍成長阻害（Ｔ／Ｃ％）を、Ｔ／Ｃ％＝［（Ｘ日における処置群の腫瘍体積の中央値）／（Ｘ日におけるコントロール群の腫瘍体積の中央値）］×１００として計算した。最適値は、達成される最大腫瘍成長阻害を反映する最小Ｔ／Ｃ％比である。

National Cancer Institute standard (Bissery MC and Chabot GG History and new development of screening and evaluation methods of anticancer drugs used in vivo and in vitro. 1991. Bull Cancer 78:587-602)によるＴ／Ｃ％比の有効基準は、＜４２％である。Ｔ／Ｃ＜１０％は非常に高い活性と考えられ、臨床研究に値する(B. A. Teicher. Tumor models in cancer research. Science & Business media 2010)。

この実験では、実験の最初から、すなわち１日目から４９日目まで、Ｔ／Ｃを評価した。

ΔＴ／ΔＣ
処置群及びコントロール群におけるベースラインからの腫瘍体積の変化を使用して、処置群（ΔＴ）及びコントロール群（ΔＣ）における中央値を計算した。Ｔ／Ｃ（％）は、選択した任意の日における中央値である。

ΔＴ／ΔＣ値が負である場合、それは、腫瘍の退縮を示す。

部分退縮、完全退縮及び無腫瘍生存体
部分退縮（ＰＲ）は、評価日にかかわらず、腫瘍体積の≧５０％の減少として定義した。完全退縮（ＣＲ）は、評価日にかかわらず、触知限界（Ｔ＝３０mm³）未満への腫瘍体積の減少として定義する。研究終了時（１０５日目）に、無腫瘍生存体（ＴＦＳ）（これは、いかなる触知可能な腫瘍も有しないマウスに対応する）の数を決定した(Vrignaud P, Semiond D, Lejeune P, Bouchard H, Calvet L, Combeau C, Riou JF, Commercon A, Lavelle F, Bissery MC. Preclinical antitumor activity of cabazitaxel, a semisynthetic taxane active in taxane-resistant tumors. Clin Cancer Res. 2013; 19 (11):2973-83)。

殺細胞数の常用対数値（Log cell kill）（ＬＣＫ）
式（Ｔ−Ｃ）／（３．３２×Ｔｄ）を使用して、グロスの殺細胞数の常用対数値を計算した。この式では、腫瘍成長遅延（Ｔ−Ｃ）は、所定体積（７５０〜１，０００mm³）に達するまでの時間の中央値（日数）に関するＴ群及びＣ群の腫瘍間の差として定義した。

コントロール群では、腫瘍倍加時間（Ｔｄ）を推定し、日数の関数としての腫瘍体積の対数（指数増殖期、すなわち１００〜１０００mm³範囲）は、Ｔｄ＝ｌｏｇ２／ａとして傾き「ａ」の線形モデルに従う。

これらの基準を使用して、抗腫瘍活性は、殺細胞数の常用対数値＞０．７として定義する。

Southern Research Institute (Birmingham, AL, USA)スコアを使用して、殺細胞数の常用対数値に基づく抗腫瘍活性を以下のように分類した：＜０．７＝−（不活性）；０．７〜１．２＝＋；１．３〜１．９＝＋＋；２．０〜２．８＝＋＋＋；＞２．８＝＋＋＋＋（高い活性）(Schabel FM, Griswold DP, Laster WR, Corbett TH, Lloyd HH. Quantitative evaluation of anticancer agent activity in experimental animals. Pharmacol. Ther 1977; 1:411 - 35)。

以下の式：ｎ−ＬＣＫ＝［（Ｔ−Ｃ）−処置期間の継続時間］／（３．３２×Ｔｄ）にしたがって、ネットのＬＣＫも評価した。ｎ−ＬＣＫのネットの値が正である場合、治療終了時に存在する細胞は開始時よりも少ない。他方、値が負である場合、処置中に腫瘍は成長する。

生存期間の中央値及び治療効果
また、腫瘍が所定体積 ２０００mm³に達するのに要した時間を使用して、適合カプラン・マイヤー生存曲線によって、結果を表した。遅延の中央値は、マウスの５０％が、所定体積に達した腫瘍を有した時間として定義した。

マン・ホイットニー検定
マン・ホイットニー検定は、値が正規分布すると仮定せずに、２つの群又は条件又は処置の比較を可能にするノンパラメトリック検定である。医学では、それは、同じものであるか否かにかかわらず、２つの医薬の効果を決定するために使用される。Newlab Oncologyソフトウェア（登録商標）(NewLab, 11 rue d’Amsterdam 54500 Vandoeuvre-Les-Nancy FRANCE)を用いて、マン・ホイットニーＵ検定を評価した。

薬物毒性
また、薬物関連死及び相対平均純体重減少の最大パーセントの両方を決定した。＞２０％の体重減少率（群の平均）＞２０％又は１０％の薬物死は、過剰毒性投与を示すとみなした。

膵臓腫瘍ＢｘＰＣ−３は、高レベルのＥＧＦＲレセプターを発現することが既に観察されており、この腫瘍では、抗ＥＧＦＲモノクローナルＡｂセツキシマブが有意に活性であることが観察された。対照的に、この腫瘍は、非常に低レベルのＨｅｒ２を発現し(Larbouret C, et al. In pancreatic carcinoma, dual EGFR/HER2 targeting with cetuximab/trastuzumab is more effective than treatment with trastuzumab/erlotinib or lapatinib alone: implication of receptors’ down-regulation and dimers’ disruption. Neoplasia. 2012 Feb; 14(2): 121-130)、その結果として、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体トラスツズマブは有意に活性ではなかった。

興味深いことに、両Ａｂの組み合わせは、セツキシマブで検出されたものよりも有意に高い活性をもたらす。

この実験では、ＢｘＰＣ−３腫瘍を有するマウスにおいて、本発明の二重特異性四価抗体BiXAb-3486及びBiXAb-3489の活性を親抗ＥＧＦＲ及び抗ＨＥＲ２抗体の組み合わせと比較したところ、研究の最初から毒性効果は検出されなかった。

０日目（無作為化の日）から２８日目まで、各抗体について２mg/kg/注射で、ＢｘＰＣ−３細胞を有するマウスを抗ＥＧＦＲ及び抗ＨＥＲ２抗体で週２回腹腔内（ＩＰ）処置した。以前の実験に基づいて、用量 ２mg/kgを選択した。

また、２又は１０mg/kg/注射のいずれかによる同じ処置スケジュールの下で、前記２つの本発明の二重特異性抗体を投与した（図７ａ）。

ビヒクル処置マウスでは、腫瘍は、倍加時間 ９日間で成長し、２８日目（最後の処置日）に平均値 １８５９＋／−４５９mm³に達した。その日、用量 ２mg/kgの抗ＥＧＦＲ及び抗ＨＥＲ２抗体の組み合わせで処置したマウスの群では、腫瘍の平均体積は６３４mm³であった。２又は１０mg/kgのBiXAb-3486で処置した群では、腫瘍の平均体積はわずか２１４mm³及び１１１mm³であり、２又は１０mg/kgのBiXAb-3489で処置した群では、２２３mm³及び２００mm³であった。

Ｔ／Ｃ及びΔＴ／ΔＣ評価（図７ｂ）は、
−全ての処置が有効であり、ＮＣＩ基準でＴ／Ｃ＜４２％であった
−BiXAb-3486又はBiXAb-3489で処置したマウスの群のみが非常に高い活性（Ｔ／Ｃ＜１０％）を示したのに対して、抗ＥＧＦＲ及び抗ＨＥＲ２抗体で処置したマウスは中程度の活性を経験した
−処置終了後（２８日目後）、非常に高い活性が維持された
ことを示している。

実験の最初から、部分退縮又は完全退縮（腫瘍体積の≧５０％の減少、又は触知限界未満への腫瘍体積の減少として定義した）及び治癒をモニタリングした（表４）。１０mg/kgのBiXAb-3486で処置したマウスの群では、動物 合計６／１０匹及び３／１０匹がそれぞれ完全退縮及び治癒を経験したが、これは、強力な活性を示している。

指数増殖及びその関連する倍加時間概念は、臨床的に関連する(Frei E III. Models and the clinical dilemma. In: Fidler IJ, White RJ, editors. Design of models for testing therapeutic agents. New York: Van Nostrand Reinhold; 1982. p. 248-59)。異なる組織タイプのガンは、観察可能な範囲の腫瘍サイズ内で多種多様な倍加時間を示す(Shackney SE, McCormack GW, Guchural GJ Jr. Growth rate patterns of solid tumors and their relation to responsiveness to therapy. An analytical review. Ann Intern Med. 1978;89:107)。

最も治療応答性のヒトガン、例えば精巣ガン及び絨毛ガンは、＜１カ月間の長さの倍加時間を有する傾向がある。低応答性のガン、例えば頭頸部の扁平上皮ガンは、約２カ月間で倍加するようである。比較的非応答性のガン、例えば結腸腺ガンは、３カ月ごとに倍加する傾向がある。明らかに、この臨床観察は、増殖細胞のより高い化学的感受性に関連し得る（以下を参照のこと）（すなわち、腫瘍が高割合の分裂細胞を有する場合、それはより速く成長する傾向があり、分裂細胞を殺傷する薬物に対してより応答性でもある傾向があるであろう）。あるいは、より高い細胞喪失率を有する腫瘍は比較的遅い成長速度を有し、薬物耐性に対してより高い突然変異率も有する傾向がある。

殺細胞数の常用対数値のモデルは、抗ガン薬が一次速度で作用するので、薬物感受性が均一であると仮定すると、それらは、腫瘍の初期サイズにかかわらず、一定数ではなく一定割合の腫瘍細胞を排除すると提案している。換言すれば、薬物処置が細胞 １０^６個を１０^５個に減少させる場合、同じ治療は、細胞 １０^４個を１０^３個に減少させるであろう。

実験では、本発明者らは、コントロール群における腫瘍の倍加時間が７日間であることを観察した（図７ａ）。

グロスの殺細胞数の常用対数値の計算［（Ｔ−Ｃ）／（３．３２×Ｔｄ）］及びネットの殺細胞数の常用対数値の計算［（Ｔ−Ｃ）−処置期間の継続時間］／（３．３２×Ｔｄ）（表５）によれば、抗ＥＧＦＲ及び抗ＨＥＲ２抗体の組み合わせは全体的に活性ではなく、処置中に腫瘍は成長したと思われる。

対照的に、BiXAb-3486又はBiXAb-3489で処置したマウスは有意な活性（＋＋又は＋＋＋）を経験し、BiXAb化合物によって、初期腫瘍塊の最大２ ｌｏｇ（９９％）が排除された。正であるネットの殺細胞数の常用対数値の計算は、BiXAb化合物による処置が効率的であり、処置終了時（２８日目）の腫瘍細胞が処置前（０日目）と比較して少ないことを示している。

生存期間の中央値、移植（マウスの５０％が体積 ２０００mm³の腫瘍を有するとき）後の日数及び治療効果（処置群の中央値−コントロール群の中央値）（図７Ｃ及び７Ｄ）は、２つのモノクローナル抗体治療の組み合わせと比べたBiXAb治療の明らかな治療上の利点を示している。

最後に、BiXAb化合物で処置した４つの動物群と、抗ＥＧＦＲ及び抗ＨＥＲ２抗体の組み合わせで処置した群とを比較するために、マン・ホイットニーＵ検定試験を実施した（表６）。

やはり、BiXAb化合物で処置した群は、抗ＥＧＦＲ及び抗ＨＥＲ２抗体の組み合わせで処置した群よりも高い活性を経験したと明らかに思われる。処置終了の２１日後においても、この差は観察可能であった。

実際には、細胞傷害化合物の抗腫瘍評価に古くから使用されているいくつかのエンドポイントを使用した。２つの本発明の二重特異性抗体は、抗ＥＧＦＲ及び抗ＨＥＲ２抗体の組み合わせよりも強力であると思われる。
１）Ｔ／Ｃ＜１０％は、２つの本発明の二重特異性抗体によってのみ得られたが、これは、臨床研究に値する高活性化合物への分類のためにＮＣＩが要求するパラメータである；
２）殺細胞数の常用対数値パラメータ（グロス及びネット）及び活性レーティングへのそれらの変換により、２つの本発明の二重特異性抗体は、抗ＥＧＦＲ及び抗ＨＥＲ２抗体の組み合わせよりも活性であることも確認された；
３）退縮（これは、強力な活性の特徴である）は、２つの本発明の二重特異性抗体で処置した群においてのみ観察された。

結論：実施例６及び７では、本発明者らは、抗体の治療活性に頻繁に関連する個々の作用機構（ＭＯＡ）を評価した。実施例６では、本発明者らは、３つの異なる細胞株において抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を試験した。２つのBiXAb分子BiXAb-E06528及びBiXAb-3489は、２つの親抗体抗ＥＧＦＲ＋抗ＨＥＲ２の組み合わせのものと同様の細胞性細胞傷害を示した。アッセイにおいて観察されたいくらかのばらつきは、ターゲットガン細胞上のＥＧＦＲ／ＨＥＲ２の比が異なることに起因し得る。実施例７では、本発明者らは、抗体の「直接的な」効果、すなわち、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及びこれらのレセプターと会合したヘテロダイマーを介した増殖促進シグナリングを遮断するそれらの能力（これは、ガン細胞株の生存性の減少に対して効果を有する）を試験した。これらの実験により、BiXAb-E06528及びBiXAb-3489は、個々の各親抗体（抗ＥＧＦＲ、抗ＨＥＲ２）又はそれらの組み合わせ（抗ＥＧＦＲ＋抗ＨＥＲ２）に関連するものよりも実質的に高い抗増殖活性を示すことが実証された。これは、両BiXAbが、親抗体に関連するものよりもかなり強い増殖及び成長阻害能力を示すことを意味する。実施例８では、本発明者らは、膵臓ガンの異種移植モデルにおいて、BiXAb-3489及びBiXAb-3486をin vivoで試験した。このモデルにより、BiXAbに関連する腫瘍成長阻害は、２つの親抗体の組み合わせと比較して驚くほど増加していることが実証された。

in vivoモデルでは、本発明者らは、薬物の活性に関連する全てのＭＯＡの合計を評価することができる；この場合、これは、免疫細胞性細胞傷害及び直接的な増殖阻害効果の両方が、異種移植モデルの転帰に寄与することを意味する。本発明の二重特異性抗体は効力を示したが、これは、膵臓腫瘍ではほとんど観察されないものである。

in vivoモデルは、BiXAbの活性が両親抗体の組み合わせのものと比べて実質的に改善されたことを示したので、本発明者らは、腫瘍における増殖促進シグナリングの直接阻害が、腫瘍の成長の阻害及び動物の生存の延長におけるBiXAbの活性に大きく寄与すると結論する（実施例８）。

Claims (15)

1. ２本の重鎖及び４本の軽鎖を含む二重特異性抗体であって、
   各重鎖が、
   ａ．ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリンのＦｃ領域
   を含み、
   ｂ．このＦｃ領域が、前記ヒンジドメインによって、抗体１（Ａｂ１）のＦａｂ重鎖ＣＨ１−ＶＨに連結されており、
   ｃ．そしてこれが、ポリペプチドリンカー配列によって、抗体２（Ａｂ２）のＦａｂ重鎖ＣＨ１−ＶＨに連結されており、該ポリペプチドリンカー配列が、Ａｂ１の前記Ｆａｂ重鎖ＶＨドメインのＮ末端と、Ａｂ２の前記ＣＨ１ドメインのＣ末端とを連結し、
   ４本の軽鎖が、それらの同種重鎖ドメインと会合したＡｂ１のＦａｂ軽鎖及びＡｂ２のＦａｂ軽鎖を含み；
   Ａｂ１及びＡｂ２が異なるものであり、一方ではセツキシマブ又はその突然変異誘導体及び他方ではトラスツズマブ又はその突然変異誘導体からなる群より独立して選択される、二重特異性抗体。
2. Ａｂ１又はＡｂ２が、
   ｏ配列番号：４を含み、好ましくは配列番号：４からなるＶＨドメイン、
   ｏ配列番号：２、配列番号：５、配列番号：２０、配列番号：２１及び配列番号：２２からなる群より選択される配列を含むＣＨ１ドメイン、
   ｏ配列番号：１３を含み、好ましくは配列番号：１３からなるＶＬドメイン、
   ｏ配列番号：１１、配列番号：１４、配列番号：２３、配列番号：２４及び配列番号：２５からなる群より選択される配列を含むＣＬドメイン
   を含むセツキシマブ又はその突然変異誘導体であり、
   該ＣＨ１及びＣＬドメインが、以下
   −配列番号：２と配列番号：１１、
   −配列番号：５と配列番号：１４又は配列番号：２３のいずれか、
   −配列番号：２０と配列番号：１４又は配列番号：２３のいずれか、
   −配列番号：２１と配列番号：２４又は配列番号：２５のいずれか、
   −配列番号：２２と配列番号：２４又は配列番号：２５のいずれか
   のように会合する、請求項１に記載の二重特異性抗体。
3. Ａｂ１又はＡｂ２が、
   ｏ配列番号：１の配列を含み、好ましくは配列番号：１の配列からなるＶＨドメイン
   ｏ配列番号：２、配列番号：５、配列番号：２０、配列番号：２１及び配列番号：２２からなる群より選択される配列を含むＣＨ１ドメイン
   ｏ配列番号：１０の配列からなる配列を含むＶＬドメイン、
   ｏ配列番号：１１、配列番号：１４、配列番号：２３、配列番号：２４及び配列番号：２５からなる群より選択される配列を含むＣＬドメイン
   を含むトラスツズマブ又はその突然変異誘導体であり、
   該ＣＨ１及びＣＬドメインが、以下
   −配列番号：２と配列番号：１１、
   −配列番号：５と配列番号：１４又は配列番号：２３のいずれか
   −配列番号：２０と配列番号：１４又は配列番号：２３のいずれか
   −配列番号：２１と配列番号：２４又は配列番号：２５のいずれか
   −配列番号：２２と配列番号：２４又は配列番号：２５のいずれか
   のように会合する、請求項１に記載の二重特異性抗体。
4. Ａｂ１のＣＨ１及びＣＬドメインが、Ａｂ２のＣＨ１及びＣＬドメインと異なる配列の組み合わせを有する、請求項４又は５のいずれかに記載の二重特異性抗体。
5. ポリペプチドリンカー配列が、配列番号：３、配列番号：１６又は配列番号：３４を含み、好ましくは配列番号：３、配列番号：１６又は配列番号：３４からなる、請求項１〜４のいずれかに記載の二重特異性抗体。
6. ａ）２本の重鎖であって、それぞれが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
   ・配列番号：１を含み、好ましくは配列番号：１からなるトラスツズマブ重鎖ＶＨ、
   ・配列番号：２を含み、好ましくは配列番号：２からなるＣＨ１ドメイン、
   ・配列番号：３、配列番号：１６又は配列番号：３４を含み、好ましくは配列番号：３、配列番号：１６又は配列番号：３４からなるポリペプチドリンカー、
   ・配列番号：４を含み、好ましくは配列番号：４からなるセツキシマブ重鎖ＶＨ、
   ・配列番号：５を含み、好ましくは配列番号：５からなるＣＨ１ドメイン、
   ・配列番号：６を含み、好ましくは配列番号：６からなるヒンジドメイン、
   ・配列番号：７を含み、好ましくは配列番号：７からなるＣＨ２ドメイン、
   ・配列番号：８を含み、好ましくは配列番号：８からなるＣＨ３ドメイン
   を含む連続配列を含み、好ましくは該連続配列からなる２本の重鎖、
   ｂ）２本のトラスツズマブ軽鎖であって、それぞれが、
   ・配列番号：１０を含み、好ましくは配列番号：１０からなるＶＬドメイン、
   ・配列番号：１１を含み、好ましくは配列番号：１１からなるＣＬドメイン
   を含む２本のトラスツズマブ軽鎖、
   ｃ）２本のセツキシマブ軽鎖であって、それぞれが、
   ・配列番号：１３を含み、好ましくは配列番号：１３からなるＶＬドメイン、
   ・配列番号：１４を含み、好ましくは配列番号：１４からなるＣＬドメイン
   を含む２本のセツキシマブ軽鎖
   を含み、好ましくはそれらからなる、請求項１〜５のいずれかに記載の二重特異性抗体。
7. ａ）２本の重鎖であって、それぞれが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
   ・配列番号：４を含み、好ましくは配列番号：４からなるセツキシマブ重鎖ＶＨ、
   ・配列番号：５を含み、好ましくは配列番号：５からなるＣＨ１ドメイン、
   ・配列番号：３、配列番号：１６又は配列番号：３４を含み、好ましくは配列番号：３、配列番号：１６又は配列番号：３４からなるポリペプチドリンカー、
   ・配列番号：１を含み、好ましくは配列番号：１からなるトラスツズマブ重鎖ＶＨ、
   ・配列番号：２を含み、好ましくは配列番号：２からなるＣＨ１ドメイン、
   ・配列番号：６を含み、好ましくは配列番号：６からなるヒンジドメイン、
   ・配列番号：７を含み、好ましくは配列番号：７からなるＣＨ２ドメイン、
   ・配列番号：８を含み、好ましくは配列番号：８からなるＣＨ３ドメイン
   を含む連続配列を含み、好ましくは該連続配列からなる２本の重鎖、
   ｂ）２本のトラスツズマブ軽鎖であって、それぞれが配列番号：１２を含む２本のトラスツズマブ軽鎖
   ｃ）２本のセツキシマブ軽鎖であって、それぞれが配列番号：１５を含む２本のセツキシマブ軽鎖
   を含み、好ましくはそれらからなる、請求項１〜５のいずれかに記載の二重特異性抗体。
8. 以下の突然変異：
   −配列番号：２０を含み、好ましくは配列番号：２０からなるヒトＩｇＧ１由来の突然変異ＣＨ１定常ドメイン、
   −配列番号：２１を含み、好ましくは配列番号：２１からなるヒトＩｇＧ１由来の突然変異ＣＨ１定常ドメイン、
   −配列番号：２２を含み、好ましくは配列番号：２２からなるヒトＩｇＧ１由来の突然変異ＣＨ１定常ドメイン、
   −配列番号：２３を含み、好ましくは配列番号：２３からなる突然変異ヒトκ定常ドメイン、
   −配列番号：２４を含み、好ましくは配列番号：２４からなる突然変異ヒトκ定常ドメイン、
   −配列番号：２５を含み、好ましくは配列番号：２５からなる突然変異ヒトκ定常ドメイン
   の少なくとも１つを含有する、請求項１に記載の二重特異性抗体。
9. セツキシマブ重鎖ＶＨドメインが配列番号：４、配列番号：２６又は配列番号：２７からなる、請求項１に記載の二重特異性抗体。
10. 請求項１〜９のいずれかで定義される二重特異性抗体の重鎖を含み、好ましくはそれからなる、ポリペプチド。
11. 請求項１０に記載のポリペプチドをコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
12. 請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターでトランスフェクションされた、宿主細胞。
13. 請求項１〜９のいずれかに記載の二重特異性抗体を生産するための方法であって、以下の工程：ａ）適切な培地中及び培養条件で、請求項１〜９のいずれかで定義される抗体重鎖及び請求項１〜９のいずれかで定義される抗体軽鎖を発現する宿主細胞を培養すること、並びにｂ）培養培地から、又は前記培養細胞から前記産生抗体を回収することを含む、方法。
14. 医薬として使用するための、請求項１〜９のいずれかに記載の二重特異性抗体。
15. ガンの処置において使用するための、請求項１〜９のいずれかに記載の二重特異性抗体。