CN103030695A - 抗c-Met人源化抗体及含其的预防或治疗癌症用的药物组合物 - Google Patents

抗c-Met人源化抗体及含其的预防或治疗癌症用的药物组合物 Download PDF

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Abstract

抗c-Met人源化抗体及包括其的用于预防或治疗癌症的药物组合物。所述抗c-Met人源化抗体包括具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区，或者包括具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的轻链可变区。根据所述抗c-Met人源化抗体及包括其的用于预防或治疗癌症的药物组合物，可有效地预防或治疗癌症。

Description

抗c-Met人源化抗体及含其的预防或治疗癌症用的药物组合物
技术领域
本公开内容涉及抗c-Met人源化抗体及包括其的用于预防和治疗癌症的药物组合物。
背景技术
c-Met是肝细胞生长因子(HGF)的受体，且HGF是与c-Met受体酪氨酸激酶的胞外区结合以诱发在多种正常细胞和肿瘤细胞中的有丝分裂发生、运动(movement)、形态发生和血管发生的一类细胞因子。c-Met是存在于细胞表面上的代表性的受体酪氨酸激酶，本身是原癌基因，且有时涉及与癌症相关的多种机制如癌症发生(development)、转移、迁移、侵入和血管发生，与配体HGF无关。因此，c-Met近来形成为新的用于抗癌治疗的靶。
特别地，已知c-Met涉及诱发对常用抗癌药物的耐药性，且因此被认为对于个人化的治疗是重要的。靶向表皮生长因子受体(EGFR)(ERBB1)的代表性的抗癌治疗药物即Erbitux或Tarceva通过阻断涉及癌症发生机制的信号的转导而起作用。另外，公知作为乳腺癌治疗药物的Herceptin靶向ERBB2(HER2)并通过阻断细胞增殖所必需的信号的转导而起作用。但是，近来的报道是，在对上述药物有耐药性的患者中，抗癌药物由于c-Met蛋白质的过表达而不起作用和诱发细胞增殖的其它信号的转导机制被激活。因此，对于许多药物公司，c-Met已形成为抗癌药物的靶分子。
相关技术公开了抑制c-Met作用的抗体治疗药物。但是，在该相关技术中，具有原始结构的所述抗体诱发c-Met分子的二聚，由此导致癌症。
在公开了抑制c-Met作用的抗体治疗药物的另一相关技术中，所述抗体能够抑制c-Met与HGF(其为c-Met配体)的结合，但是所述抗体与c-Met的结合诱发c-Met的二聚，与所述配体无关。结果，所述抗体作为诱发致癌信号的转导的激动剂。
另一相关技术公开了，为了防止c-Met的二聚，c-Met的单臂(one-armed)拮抗抗体(其通过修饰激动剂而制备)、和使用遗传重组方法的双臂(two-armed)抗体、及在临床试验中的产品开发目前正在进行中。但是，即使在该相关技术中，所述抗体仅在与化学治疗一起进行治疗时起作用，且当所述抗体独立地治疗时，抗癌治疗效果被证明是低的。
因此，仍需要开发抑制c-Met作用的用于预防和治疗癌症的新的药物组合物。
发明内容
提供抗c-Met人源化抗体。
提供用于预防和治疗癌症的包括抗c-Met人源化抗体的药物组合物。
附图说明
由结合附图考虑的实施方式的以下描述，这些和/或其它方面将变得明晰和更容易理解，其中：
图1说明根据实施方式证实嵌合抗体chAbF46及3种类型人源化抗体huAbF46-H1、huAbF46-H2和huAbF46-H4是否识别抗原的结果；
图2说明根据实施方式证实人源化抗体的激动副作用程度的结果；
图3说明根据实施方式使用BrdU测定证实具有修饰的铰链区的chAbF46的激动副作用程度的结果；
图4说明根据实施方式通过测量Akt磷酸化程度证实具有修饰的铰链区的chAbF46的激动副作用程度的结果；
图5说明根据实施方式在体外进行的具有修饰的铰链区的chAbF46的细胞增殖分析的结果的图；
图6说明根据实施方式在体内进行的在胃癌小鼠异种移植物模型中具有修饰的铰链区的chAbF46的抗癌分析的结果的图；
图7说明根据实施方式使用BrdU测定证实具有修饰的铰链区的人源化抗体huAbF46的激动副作用程度的结果；
图8说明根据实施方式在体外进行的具有修饰的铰链区的人源化抗体huAbF46的细胞增殖分析的结果的图；和
图9说明根据实施方式在体内进行的在胃癌小鼠异种移植物模型中具有修饰的铰链区的人源化抗体huAbF46的抗癌分析的结果的图。
具体实施方式
现在将详细介绍实施方式，其实例说明在附图中，其中相同的附图标记始终是指相同的元件。在这点上，本实施方式可具有不同的形式，且不应解释为限于本文中阐述的描述。因此，以下仅通过参考附图描述实施方式以解释本描述的各方面。如本文中使用的术语“和/或”包括相关所列项目的一个或多个的任何和全部组合。
根据本发明的一方面，提供抗c-Met人源化抗体，其包括具有SEQ IDNO：1的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区。
根据本发明的另一方面，提供抗c-Met人源化抗体，其包括具有SEQ IDNO：3的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的轻链可变区。
术语“c-Met”或“c-Met蛋白质”是指与肝细胞生长因子(HGF)结合的受体酪氨酸激酶。c-Met蛋白质包括通过确定为GenBank登录号NM 000245的核苷酸序列编码的多肽，通过确定为GenBank登录号NM 000236的核苷酸序列编码的蛋白质，和/或其胞外区。受体酪氨酸激酶c-Met参与多种机制如癌症发生、转移、迁移、侵入和血管发生。
所述c-Met可衍生自选自人、猴子、小鼠和大鼠的c-Met。
通过用所需抗原使非免疫性动物免疫产生的动物衍生的抗体当为了医疗向人注射时通常引起免疫原性，因此已开发嵌合抗体以抑制这样的免疫原性。嵌合抗体通过如下制备：通过遗传工程用人抗体的恒定区置换导致抗-同种型反应的动物衍生的抗体的恒定区。与动物衍生的抗体相比，嵌合抗体在抗-同种型反应方面显著改善，但是动物衍生的氨基酸仍存在于可变区中，因此嵌合抗体具有关于潜在的抗独特型基因型(anti-idiotypic)反应的副作用。开发人源化抗体以减少这样的副作用。人源化抗体通过如下产生：将在嵌合抗体的可变区中抗原结合方面起重要作用的互补决定区(CDR)移植到人抗体框架。
在CDR移植以产生人源化抗体中最重要的事情是选择最优化的人抗体以接受动物衍生的抗体的CDR，且因此采用抗体数据库的使用、晶体结构的分析和分子模型化的技术。但是，即使当动物衍生的抗体的CDR移植到最优化的人抗体框架时，也存在影响抗原结合的位于动物衍生的抗体的框架中的氨基酸。因此，在许多情况下，抗原结合力未保持，且因此应用另外的抗体工程技术以恢复所述抗原结合力是必需的。
所述c-Met的人源化抗体是使c-Met小鼠抗体的免疫原性最小化的人源化抗体，其包括具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列的轻链可变区。
根据实施方式，所述抗体可为单克隆抗体。
完整抗体包括两个全长轻链和两个全长重链，其中各轻链通过二硫键与所述重链连接。所述抗体具有重链恒定区和轻链恒定区。所述重链恒定区为伽马(γ)、谬(μ)、阿尔法(α)、德尔塔(δ)或厄普西隆(ε)型，其可进一步分类为伽马1(γ1)、伽马2(γ2)、伽马3(γ3)、伽马4(γ4)、阿尔法1(α1)或阿尔法2(α2)。所述轻链恒定区为卡帕(κ)或拉姆达(λ)型。
术语“重链”是指全长重链、及其片段，包括可变区VH和三个恒定区的域CH1、CH2、CH3、以及铰链，所述可变区VH包括其存在是抗原结合所必需的CDR的氨基酸序列。术语“轻链”是指全长轻链、及其片段，包括可变区VL和恒定区CL，所述可变区VL包括其存在是抗原结合所必需的CDR的氨基酸序列。
在本文中使用的术语“互补决定区(CDR)”是指抗体可变域的氨基酸残基，其存在是抗原结合所必需的。特别地，它们存在于免疫球蛋白的重链和轻链的高变区。各可变域典型地具有三个CDR，确定为CDR1(CDRH1&CDRL1)、CDR2(CDRH2&CDRL2)和CDR3(CDRH3&CDRL3)。CDR可提供在抗体与抗原或表位的结合中起主要作用的接触残基。另外，术语“特异性结合”或“特异性识别”是本领域技术人员公知的，且表明抗体和抗原彼此特异性相互作用以产生免疫学活性。
根据本发明的实施方式，所述抗体可为选自scFv、(scFv)2、Fab、Fab’和F(ab’)2的抗原结合片段。
本文中使用的术语“抗原结合片段”是指包括完整抗体的具有抗原结合区的部分的片段。例如，所述抗原结合片段可为scFv、(scFv)2、Fab、Fab’或F(ab’)2，但不限于此。Fab片段包含所述轻链的可变和恒定域以及所述重链的可变域和第一恒定域(CH1)。Fab片段具有一个抗原结合位点。Fab’片段与Fab片段的不同在于：Fab’具有在CH1的C-末端的拥有至少一个半胱氨酸残基的铰链区。F(ab’)2片段包括一对Fab片段，所述一对Fab片段通常通过在它们之间的铰链半胱氨酸残基经由在它们的羧基末端附近的二硫键共价连接。Fv片段是包含完整抗原识别和结合位点的抗体片段。该区由紧密联合的一个重和一个轻链可变区的二聚体组成，且用于产生Fv片段的重组技术是本领域公知的。Fv片段可具有其中所述重链和轻链可变区通过非共价键连接的结构。单链Fv(scFv)片段通常可具有其中重链和轻链可变区经由肽接头共价结合的二聚体结构，而二硫连接的(scFv)2片段可具有其中两个scFv片段经由肽接头在C-末端彼此直接连接的结构。所述抗原结合片段可使用蛋白酶获得，如使用木瓜蛋白酶以获得Fab片段和使用胃蛋白酶以获得F(ab’)2片段，且可通过遗传重组技术制备。
根据本发明的实施方式，所述抗体可包括具有通过缺失、插入或取代一个或多个氨基酸的修饰的氨基酸序列的铰链区。例如，所述抗体可包括具有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的氨基酸序列的铰链区。
术语“铰链区”是指抗体的重链中包含的区，其存在于CH1和CH2区之间，并用于向所述抗体中的抗原结合位点提供柔性。
当动物衍生的抗体经历嵌合(chimerization)过程时，动物衍生的IgG1铰链用人IgG1铰链置换，但是动物衍生的IgG1铰链的长度比人IgG1铰链的长度短，且在两个重链之间的二硫键由3个减少至2个，且因此铰链的刚性可具有不同的效果。因此，铰链区的修饰可增加人源化抗体的抗原结合效率。用于修饰所述铰链区的氨基酸序列的缺失、插入或取代氨基酸的方法是本领域技术人员公知的。
根据本发明的另一实施方式，提供包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的抗c-Met人源化抗体的重链可变区和包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列的抗c-Met人源化抗体的轻链可变区。
根据本发明的另一实施方式，提供包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列的抗c-Met人源化抗体的重链可变区和包括SEQ ID NO：4的氨基酸序列的抗c-Met人源化抗体的轻链可变区。
根据本发明的另一实施方式，提供用于预防或治疗癌症的药物组合物。所述药物组合物包括药物有效量的抗c-Met人源化抗体和可药用载体、稀释剂或赋形剂，所述抗c-Met人源化抗体包括具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区，或所述抗c-Met人源化抗体包括具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的轻链可变区。
根据实施方式，所述癌症可为选自如下的一种：鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、皮肤癌、皮肤或眼球中的黑素瘤、直肠癌、肛门附近的癌、食道癌、小肠肿瘤、内分泌腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、肝瘤(hepatoma)、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞腺瘤、乳腺癌(breast cancer)、结肠癌、大肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、和头颈癌。
根据本发明的实施方式，所述抗体可包括具有通过缺失、插入或取代一个或多个氨基酸的修饰的氨基酸序列的铰链区。例如，所述抗体可包括具有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的氨基酸序列的铰链区。
当所述组合物制造为用于预防或治疗癌症的药物组合物时，所述组合物可包括可药用载体。所述组合物中包括的可药用载体可包括常用的乳糖、葡萄糖(右旋糖)、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油，但不限于此。所述药物组合物可进一步包括润滑剂、润湿剂、增甜剂、增香剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂。
所述用于预防或治疗癌症的药物组合物可口服或胃肠外施用(给药)。所述胃肠外施用可包括静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、腹膜内注射、内皮施用、局部施用、鼻内施用、肺内施用、和直肠施用。由于口服施用导致蛋白质或肽的消化，因此活性组分必须包覆或配制在所述药物组合物中以防止消化。另外，所述药物组合物可具有靶向能力以在施用时追踪特定细胞。
所述用于预防或治疗癌症的药物组合物的合适剂量可取决于许多因素，如配制方法、施用方法、患者的年龄、体重、性别、病理情况、饮食、施用时间、施用途径、排泄速度和反应敏感性。对于成年人，所述药物组合物的合乎需要的剂量可在约0.001-100mg/kg的范围内。本文中使用的术语“药物有效量”是指在预防或治疗癌症和/或血管发生相关的疾病中使用的足够量。
所述药物组合物与可药用载体和/或添加剂可通过本领域中公知的方法配制为单位或多剂量形式。在这点上，所述配制物可为在油或水性介质中的溶液、悬浮液、糖浆、乳化溶液、浸膏(extract)、粉末、颗粒、片剂、或胶囊，且可进一步包括分散或稳定剂。另外，所述药物组合物可作为单独的药物施用、或与其它药物一起施用，且可与先前存在的药物顺序或同时施用。所述药物组合物包括所述抗体或其抗原结合片段，且因此可配制为免疫脂质体。包含所述抗体的脂质体可使用本领域中公知的方法制备。所述免疫脂质体为包括磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇衍生的磷脂酰乙醇胺的脂质组合物，且可通过反相蒸发法制备。例如，Fab’片段可通过硫醇-二硫化物交换附着到所述脂质体。化学药物如多柔比星(doxorubicin)也可包括在所述脂质体中。
根据本发明的实施方式，所述抗体可用作针对c-Met蛋白质的拮抗剂。
术语“拮抗剂”理解为包括部分或完全地将它们的目标(即c-Met)的至少一种生物学活性阻断、抑制和/或中和(neutralize)的所有分子。例如，术语“拮抗性抗体”是指抑制或降低抗体结合的抗原(例如c-Met)的生物学活性的抗体。拮抗剂可由于结合受体至配体而减少受体磷酸化，或可使由配体活化的细胞无能力或破坏。而且，拮抗剂可完全阻断受体和配体之间的相互作用，或可由于所述受体的三级结构变化或减量调节而实际上减少所述相互作用。
根据本发明的另一实施方式，提供向受验者(subject)施用用于预防或治疗癌症的药物组合物的方法。所述药物组合物包括药物有效量的抗c-Met人源化抗体和可药用载体、稀释剂或赋形剂，所述抗c-Met人源化抗体包括具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区，或者所述抗c-Met人源化抗体包括具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的轻链可变区。
所述用于预防或治疗癌症的药物组合物的详细描述和其施用方法已在上面提供。
所述用于预防或治疗癌症的药物组合物向其施用的受验者包括动物。例如，所述动物可为人、犬、猫或小鼠。
现在将参考以下实施例进一步详细描述本发明的一个或多个实施方式。但是，这些实施例仅用于说明的目的，而不意图限制本发明的范围。
实施例1：针对c-Met的小鼠抗体AbF46的制备
(1)小鼠的免疫
为了得到对于建立杂交瘤细胞系所必需的经免疫的小鼠，将100μg人c-Met/Fc融合蛋白(R&D Systems)和相同量的完全弗氏佐剂混合，并将混合物经由腹膜内注射向五只4-6周大的BALB/c小鼠(Japan SLC，Inc.)的每一只施用。在两周后，使用与上述相同的方法将所述抗原(先前注射量的一半)与不完全弗氏佐剂混合，并将混合物经由腹膜内注射向每一只小鼠施用。在一周后，进行最终的加强(boosting)，并在三天后从每一只小鼠的尾巴收集血液以得到血清。然后，将血清用PBS以1/1000稀释，并进行酶联免疫吸附测定(ELISA)以分析识别c-Met的抗体的滴定度是否增加。之后，选择其中得到足够量抗体的小鼠，并对所选择的小鼠进行细胞融合过程。
(2)细胞融合和杂交瘤细胞的制备
在细胞融合实验前的三天，将50μg PBS和人c-Met/Fc融合蛋白的混合物经由腹膜内注射向每一只小鼠施用。使每一只经免疫的小鼠麻醉，且然后将其位于身体左侧的脾取出并用网(mesh)磨碎以分离细胞，所述细胞然后与培养基(DMEM)混合以制备脾细胞悬浮液。将所述悬浮液离心以收集细胞层。将得到的1x108个脾细胞与1x108个骨髓瘤细胞(Sp2/0)混合，并将混合物离心以使细胞沉淀。将所述沉淀缓慢分散，用1ml在DMEM中的45%聚乙二醇(PEG)处理，并在添加1ml DMEM前保持在37℃一分钟。在引入另外10ml DMEM 1分钟后，将所得物保持在37℃的水浴中5分钟。通过添加DMEM使其总量达到50ml，并将所得物离心。将所得细胞沉淀以1×105个细胞/ml-2×105个细胞/ml的浓度再悬浮在分离培养基(HAT培养基)中。然后，将所得物分布至96-孔板(0.1ml/孔)，所述96-孔板置于37℃的二氧化碳温育器中以制备杂交瘤细胞。
(3)产生针对c-Met蛋白质的单克隆抗体的杂交瘤细胞的选择
为了从(2)中制备的杂交瘤细胞中选择与c-Met特异性结合的杂交瘤细胞，进行ELISA以筛选产生针对人c-Met/Fc融合蛋白和人Fc蛋白有活性的抗体的细胞。
将50μl(2μg/ml)人c-Met/Fc融合蛋白包被(coat)在微量滴定板的各孔中，并通过洗涤除去未反应的抗原。为了排除与Fc结合但不与c-Met结合的抗体，使用如上相同的方法在不同的微量滴定板的各孔中包被人Fc蛋白质。接着，将50μl杂交瘤细胞悬浮液添加到所述微量滴定板的各孔中以反应1小时。然后，将微孔板用磷酸盐缓冲液-吐温20(TBST)溶液洗涤。向其添加山羊抗小鼠IgG-辣根过氧化物酶(IgG-HRP)，并容许反应在室温下发生1小时，且用所述TBST溶液进行洗涤以除去未反应的抗体。随后，向各孔添加过氧化物酶的底物溶液(OPD)，并通过使用ELISA读取器测量在450nm的吸收评价反应度。通过该方法，重复地选择产生对人c-Met蛋白质且不对人Fc蛋白质高度特异性的抗体的杂交瘤细胞系。对获得的杂交瘤细胞系进行有限稀释以获得产生单克隆抗体的杂交瘤细胞系的单克隆(single clone)。所选择的产生单克隆抗体的杂交瘤细胞系以登记号KCLRF-BP-00220登记在韩国细胞系库(Korean Cell Line Bank)中。
(4)单克隆抗体的产生和纯化
将以上(3)中获得的杂交瘤细胞在无血清培养基中培养以产生和纯化单克隆抗体。
首先，将在50ml具有10%FBS的培养基(DMEM)中培养的杂交瘤细胞离心以获得细胞沉淀，其用20ml PBS洗涤超过两次以除去FBS。然后，引入50ml DMEM以使所述细胞沉淀再悬浮，并将所得物在37℃的二氧化碳温育器中温育3天。在离心以除去产生抗体的细胞后，将包括所述抗体的细胞培养物分离并在4℃储存，或直接使用。使用配有亲和柱(蛋白质G琼脂糖柱；Pharmacia，USA)的AKTA纯化设备(GE Health)从50-300ml所述培养物纯化抗体，并通过使用用于蛋白质聚集的过滤器(Amicon)以PBS置换上清液而储存纯化的抗体。
实施例2：制备针对c-Met的嵌合抗体chAbF46
通常，当为了医疗的目的将小鼠抗体注射到人中时，可经常发生免疫原性。因此，为了减少这样的反应，由在实施例1中制备的小鼠抗体AbF46制备嵌合抗体chAbF46，其中除了抗原结合所涉及的可变区之外的恒定区被人IgG1抗体的序列代替。
合成多核苷酸以具有各自设计有如下的结构，即对应于重链的序列的EcoRI-信号序列-VH-Nhel-CH-TGA-Xhol(SEQ ID NO:7)和对应于轻链的序列的EcoRI-信号序列-VL-BsiWI-CL-TGA-XhoI (SEQ ID NO:8)。然后，通过如下构建用于嵌合抗体表达的载体：通过分别使用限制酶EcoRI(NEB，R0101S)和XhoI(NEB，R0146S)将具有所述对应于重链的序列的DNA片段(SEQ ID NO:7)克隆入pOptiVECTM-由Invitrogen制造的OptiCHOTM AntibodyExpress Kit(Cat no.12762-019)中包括的TOPO TA Cloning Kit和将具有所述对应于轻链的序列的DNA片段(SEQ ID NO:8)克隆入pcDNATM3.3-TOPO TACloning Kit(Cat no.8300-01)。
使用Qiagen Maxiprep kit(Cat no.12662)扩增所构建的载体，并将包括所述重链的载体和包括所述轻链的载体用360μl 2M CaCl2以约4:1(约80μg:20μg)的比添加到293T细胞(2.5x107)且转染。接着，将混合物在添加有10%FBS的DMEM培养基中在37℃在5%CO2条件下培养5小时，然后在没有FBS的DMEM培养基中在37℃在5%CO2条件下培养48小时。
通过将培养的细胞分离获得各100ml上清液，并使用AKTA Prime(GEHealthcare)纯化。蛋白质A柱(GE Healthcare，17-0405-03)置于AKTA Prime中，且使培养的溶液以5ml/分钟的流速流动并用IgG洗脱缓冲液(ThermoScientific，21004)洗脱。将所述缓冲液用PBS缓冲液置换，且因此纯化最终的嵌合抗体(下文中chAbF46)。
实施例3：由嵌合抗体制备人源化抗体huAbF46
(1)重链人源化
对于H1-重和H3-重的2种类型的设计，首先使用Ig Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)分析与小鼠抗体AbF46的VH基因最同源的人种系基因。结果，证实VH3-71在氨基酸水平具有83%同源性，且小鼠抗体AbF46的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3使用Kabat编号方式进行编号，并设计使得小鼠抗体AbF46的CDR部分引入VH3-71的框架中。No.30(S→T)、No.48(V→L)、No.73(D→N)和No.78(T→L)的氨基酸回复突变为原始小鼠AbF46抗体的氨基酸序列。然后，在H1-重中，No.83(R→K)和No.84(A→T)的氨基酸额外地突变，由此完成H1-重(SEQ ID NO:9)和H3-重(SEQ ID NO:10)的构建。
对于H4-重的设计，得到人抗体的框架序列，且使用已知为具有与小鼠AbF46抗体框架序列类似的序列且常规已知为最稳定的VH3亚型以引入如Kabat编号方式限定的小鼠抗体AbF46的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
(2)轻链人源化
对于H1-轻(SEQ ID NO:12)和H2-轻(SEQ ID NO:13)的2种类型的设计，使用Ig Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)分析与小鼠抗体AbF46的VL基因最同源的人种系基因。结果，证实VK4-1在氨基酸水平具有75%同源性，且小鼠抗体AbF46的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3使用Kabat编号方式进行编号，并设计使得小鼠抗体AbF46的CDR部分引入VK4-1的框架中。在H1-轻中，No.36(Y→H)、No.46(L→M)和No.49(Y→I)的3个氨基酸回复突变，且在H2-轻中，仅No.49(Y→I)的1个氨基酸回复突变。
对于H3-轻(SEQ ID NO:14)的设计，使用Ig Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)分析与小鼠抗体AbF46的VL基因最同源的人种系基因。结果，选择VK2-40和上述VK4-1。证实小鼠抗体AbF46VL和VK2-40在氨基酸水平具有61%同源性，且小鼠抗体AbF46的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3使用Kabat编号方式进行编号，并设计使得小鼠抗体AbF46的CDR部分可引入VK4-1的框架中。H3-轻回复突变No.36(Y→H)、No.46(L→M)和No.49(Y→I)的3个氨基酸。
对于H4-轻(SEQ ID NO:15)的设计，得到人抗体的框架序列，且使用常规已知为最稳定的Vk1亚型以引入使用Kabat编号方式进行编号的小鼠抗体AbF46的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在H4-轻中，No.36(Y→H)、No.46(L→M)和No.49(Y→I)的3个氨基酸额外地回复突变。
然后，用于人源化抗体表达的载体通过如下构建：通过分别使用限制性内切酶EcoRI(NEB，R0101S)和XhoI(NEB，R0146S)将具有所述对应于重链的序列的DNA片段(H1-重：SEQ ID NO:16，H3-重：SEQ ID NO:17，和H4-重：SEQ ID NO:18)克隆入pOptiVECTM-由Invitrogen制造的OptiCHOTMAntibody Express Kit(Cat no.12762-019)中包括的TOPO TA Cloning Kit和将具有所述对应于轻链的序列的DNA片段(H1-轻：SEQ ID NO:19，H2-轻：SEQ ID NO:20，H3-轻：SEQ ID NO:21，和H4-轻：SEQ ID NO:22)克隆入pcDNATM3.3-TOPO TA Cloning Kit(Cat no.8300-01)。
使用Qiagen Maxiprep kit(Cat no.12662)扩增所构建的载体，并将包括所述重链的载体和包括所述轻链的载体用360μl 2M CaCl2以约4:1(约80μg:20μg)的比添加到293T细胞(2.5x 107)且转染。接着，将混合物在添加有10%FBS的DMEM培养基中在37℃在5%CO2条件下培养5小时，然后在没有FBS的DMEM培养基中在37℃在5%CO2条件下培养48小时。
通过将培养的细胞离心获得各100ml上清液，并使用AKTA Prime(GEhealthcare)纯化。蛋白质A柱(GE healthcare，17-0405-03)置于AKTA Prime中，且使培养的溶液以5ml/分钟的流速流动并用IgG洗脱缓冲液(ThermoScientific，21004)洗脱。将所述缓冲液用PBS缓冲液置换，且因此纯化最终的人源化抗体(下文中huAbF46)。
实施例4：具有修饰的铰链区的嵌合抗体和人源化抗体的制备
人IgG1的铰链具有‘EPKSCDKTHTCPPCP’的氨基酸序列(SEQ ID NO:23)。所述铰链分别用具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的U7-HC6铰链、具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的U3-HC9铰链、具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的U6-HC8铰链、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的U6-HC7铰链和具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的U8-HC5铰链置换。对于所述置换，合成包括各铰链序列的多核苷酸(SEQ ID NO:27-SEQ ID NO:31)编码基因(Bioneer，Inc.)，并将所得物通过使用限制酶KasI(NEB，R0544S)和BsrGI(NEB，R0575S)在实施例2或3中制备的包括chAbF46抗体或huAbF46抗体的重链区的载体上克隆。
使用Qiagen Maxiprep kit(Cat no.12662)各自扩增所述包括具有修饰的铰链区的重链区的载体和包括chAbF46或huAbF46的轻链区的载体，并将包括所述重链的载体和包括所述轻链的载体用360μl 2M CaCl2以约4:1(约80μg:20μg)的比添加到293T细胞(2.5x 107)且转染。接着，将混合物在添加有10%FBS的DMEM培养基中在37℃在5%CO2条件下培养5小时，然后在没有FBS的DMEM培养基中在37℃在5%CO2条件下培养48小时。
通过将培养的细胞离心获得各100ml上清液，并使用AKTA Prime(GEhealthcare)纯化。蛋白质A柱(GE healthcare，17-0405-03)置于AKTA Prime中，且使培养的溶液以5ml/分钟的流速流动并用IgG洗脱缓冲液(ThermoScientific，21004)洗脱。将所述缓冲液用PBS缓冲液置换，且因此最终纯化具有修饰的铰链区的嵌合抗体和具有修饰的铰链区的人源化抗体(下文中以在chAbF46或huAbF46后的铰链名称表示)。
实施例5：对于c-Met的chAbF46抗体和huAbF46抗体反应性的证实
使用ELISA分析在实施例2和3中制备的chAbF46抗体和huAbF46抗体是否识别鼠c-Met抗原。在当前实施方式中使用的人源化抗体为4种类型，且所述重链和轻链组合的每一种如表1中所示。
<表1>
 H1-轻   H2-轻   H3-轻   H4-轻
  H1-重  huAbF46-H 1   huAbF46-H2   -   -
  H3-重  -  -   huAbF46-H3   -
  H4-重  -  -   -   huAbF46-H4
首先，将50μl的2μg/ml浓度的人c-Met蛋白质(R&D Systems)添加到微量滴定板的单独的孔中，并通过洗涤除去非包被的抗原。接着，将50ng纯化的抗体添加到各孔并容许反应1小时。然后，用磷酸盐缓冲液-吐温20(TBST)溶液进行洗涤。向其添加山羊抗小鼠IgG-HRP并容许在室温下反应1小时，且用所述TBST溶液洗涤所述孔。
之后，向各孔添加过氧化物酶的底物溶液(OPD)，并通过如下评价反应度：使用ELISA读取器测量在450nm的吸收，以确定huAbF46或chAbF46是否结合到所述人c-Met蛋白质。
结果示于图1中。如图1中所示，嵌合抗体chAbF46和三种类型的人源化抗体huAbF46-H 1、huAbF46-H2和huAbF46-H4保持抗原识别能力。
实施例6：huAbF46的激动副作用程度的比较
使用Caki-1细胞(Korean Cell Line Bank)进行BrdU测定以比较在实施例5中保持抗原识别能力的3种类型人源化抗体的激动程度。基于小鼠AbF46抗体的激动进行比较。使用小鼠IgG作为阴性对照组，和使用公知作为激动剂的5D5抗体(ATCC Cat.#HB11895，由杂交瘤细胞分离和纯化)作为阳性对照组。
如图2中所示，在huAbF46人源化抗体的情况下，在抗体以低浓度处理的实验中几乎未观察到激动，但是当所述抗体以高浓度处理时，其激动增加高于小鼠抗体AbF46。而且，在huAbF46-H4人源化抗体的情况下，激动通常低于小鼠抗体AbF46。同时，在huAbF46-H2人源化抗体的情况下，其激动甚至在低浓度下也是高的，且因此之后将其从实验中排除。
如在实施例5和6中所述的，使用Biocare(GE healthcare)测量huAbF46-H1人源化抗体和huAbF46-H4人源化抗体对c-Met蛋白质的结合亲和力，所述huAbF46-H1人源化抗体和huAbF46-H4人源化抗体在低浓度下在激动方面有小的增加，同时保持抗原识别能力。将抗体各自固定化在CM5片上至约80～110RU，并将作为抗原的c-Met蛋白质以在约100nM-约0.39nM范围内的九个不同的浓度以30μl/分钟的速率注射以获得kon和koff值，如表2中所示，并由kon和koff值计算KD。嵌合抗体chAbF46显示约1.01-约1.42nM的对c-Met蛋白质的结合亲和力，且2种类型的人源化抗体(huAbF46-H1和huAbF46-H4)显示约1.89nM-约1.97nM和约2.05-约2.39nM(表2)的结合亲和力。因此，证实2种类型的人源化抗体保持与嵌合抗体类似的对c-Met蛋白质的结合亲和力。
<表2>
  抗体   kon(1/Ms)   koff(1/s)   KD(nM)
  chAbF46   3.63x105   3.67x10-4   1.01～1.42
  huAbF46-H 1   3.46x105   6.55x10-4   1.89～1.97
  huAbF46-H4   3.39x105   6.96x10-4   2.05～2.39
实施例7：具有修饰的铰链区的chAbF46的亲和力的分析
使用Biocare(GE healthcare)测量在实施例2和4中制备的嵌合抗体chAbF46和具有修饰的铰链区的嵌合抗体chAbF46对c-Met蛋白质的结合亲和力。将抗体各自固定化在CM5片上至约80～110RU，并将作为抗原的c-Met蛋白质以在约100nM-约0.39nM范围内的九个不同的浓度以30μl/分钟的速率注射以获得kon和koff值，如表3中所示，并由kon和koff值计算KD。嵌合抗体chAbF46显示约1.01的对c-Met蛋白质的结合亲和力，且6种具有修饰的铰链区的嵌合抗体显示约1.32nM-约1.66nM(表3)的结合亲和力。因此，证实具有修饰的铰链区的嵌合抗体保持与嵌合抗体chAbF46类似的对c-Met蛋白质的结合亲和力，而没有结合亲和力的降低。
<表3>
  抗体   kon(1/Ms)   koff(1/s)   KD(nM)
  chAbF46   3.63x105   3.67x10-4   1.01～1.42
  chAbF46-U6-MC 7   4.03x105   6.06x10-4   1.51
  chAbF46-U3-HC9   4.00x105   5.54x10-4   1.38
  chAbF46-U6-HC8   4.69x105   6.26x10-4   1.34
  chAbF46-U6-HC7   3.76x105   6.14x10-4   1.63
  chAbF46-U8-HC5   5.15x105   6.78x10-4   1.32
  chAbF46-U7-HC6   5.18x105   8.62x10-4   1.66
实施例8：具有修饰的铰链区的chAbF46抗体的激动副作用程度的比较-BrdU测定
为了比较在实施例4中制备的具有修饰的铰链区的嵌合化抗体的激动程度，进行使用NCI-H441细胞的BrdU测定。将人肺癌细胞NCI-H441悬浮在RPMI 1640培养基(Gibco)中(2x105个细胞/ml)以制备悬浮液，并将约100μl所述悬浮液引入96-孔组织培养板(Corning，Lowell，MA)的各孔中。将所述悬浮液在37℃在5%CO2条件下温育24小时，然后将所述培养基完全取出并用以抗体稀释的RPMI 1640置换。在将所述悬浮液在37℃在5%CO2条件下温育21小时后，添加5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)，并在进一步3小时的温育后进行BrdU测定(Roche，Indianapolis，IN)。在将细胞在所述板上变性/固定后，添加抗-BrdU抗体，并在一小时后添加基质以使用ELISAspectraMax读取器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)在370nm测量颜色反应。基于小鼠AbF46抗体的激动进行比较。使用小鼠IgG作为阴性对照组，且使用公知作为激动剂的5D5抗体作为阳性对照组。
如图3中所示，具有修饰为U7-HC6或U6-HC7的铰链区的嵌合抗体chAbF46(chAbF46-U7-HC6或chAbF46-U6-HC7)减少激动副作用。
实施例9：具有修饰的铰链区的chAbF46抗体的激动副作用程度的比较-Akt磷酸化
为了比较在实施例4中制备的具有修饰的铰链区的嵌合抗体的激动，使用Caki-1细胞(Korean Cell Line Bank)以证实Akt蛋白质磷酸化程度，其为c-Met的低信号转导和细胞增殖中涉及的标准。使用小鼠IgG作为阴性对照组，且使用公知作为激动剂的5D5抗体作为阳性对照组。
将2x105个细胞/ml的Caki-1引入96-孔板中，且在24小时后，将各自5μg/ml的抗体在无血清的培养基中处理30分钟。进行经处理的抗体的细胞溶解，并使用PathScan phospho-AKT1(Ser473)chemiluminescent SandwichELISA kit(Cell Signaling,cat.no#7134S)测量Akt磷酸化程度。
如图4中所示，具有修饰的铰链区的嵌合抗体chAbF46-U7-HC6和chAbF46-U6-HC7都显示小于20%的Akt磷酸化程度，且因此具有修饰的铰链区的嵌合抗体使激动减少。
实施例10：具有修饰的铰链区的chAbF46抗体的体外抗癌效果的分析
为了证实具有修饰的铰链区的嵌合抗体的由于癌细胞增殖抑制的抗癌效果，使用在细胞的表面上表达c-Met的MKN45胃癌细胞(Japanese CancerResearch Bank，JCRB，Tokyo，Japan)以进行体外细胞增殖分析。
将悬浮在50μl 5%FBS/DMEM培养物中的1x104个细胞引入96-孔板的各孔中，和将50μl具有修饰的铰链区的嵌合抗体chAbF46-U7-HC6和chAbF46-U6-HC7不处理或以0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml或10μg/ml的浓度处理，且在温育72小时后，通过使用具有光度计(PerkinElmer，2104Multilabel reader)的CellTiter-Luminescent Cell Viability Assay Kit(Promega，G7570)定量细胞的数目。
如图5中所示，尽管用作阴性对照组的小鼠IgG可完全不抑制癌细胞增殖，但是证实具有修饰的铰链区的嵌合抗体chAbF46-U7-HC6和chAbF46-U6-HC7具有癌细胞增殖抑制。
实施例11：具有修饰的铰链区的chAbF46抗体的体内抗癌效果的分析
为了证实在实施例4中制备的具有修饰的铰链区的嵌合抗体的抗癌效果，当所述具有修饰的铰链区的嵌合抗体在体内施用时，观察在移植有MKN45细胞(Japanese Cancer Research Bank，JCRB，Tokyo，Japan)的胃癌小鼠异种移植物模型中肿瘤细胞的尺寸的减小。
将50μl胃癌系MKN 45细胞的悬浮液(5x106个细胞/50μl)经由皮下注射向6周大的雄性BALB/c裸小鼠(Orient Bio Corp.)施用。在1周后，随机选择感染有癌症的每组12只小鼠。在形成肿瘤细胞后一周一次地经由静脉内注射向这些小鼠施用10mg/kg浓度的具有修饰的铰链区的嵌合抗体chAbF46-U6-HC7。而且，作为对照组，一周两次地向其它小鼠施用10mg/kg和20mg/kg浓度的小鼠AbF46抗体。
如图6中所示，施用chAbF46-U6-HC7的结果与施用小鼠AbF46抗体那样多地显著减小肿瘤细胞的尺寸，且因此证实癌症的抑制效果。
实施例12：具有修饰的铰链区的huAbF46的亲和力的分析
使用Biocare(GE healthcare)测量在实施例3和4中制备的人源化抗体huAbF46和具有修饰的铰链区的人源化抗体huAbF46对c-Met蛋白质的结合亲和力。将抗体各自固定化在CM5片上至约80～110RU，并将作为抗原的c-Met蛋白质以在约100nM-约0.39nM范围内的九个不同的浓度以30μl/分钟的速率注射以获得kon和koff值，如表4中所示，并由kon和koff值计算KD。人源化抗体huAbF46-H1和huAbF46-H4显示约1.89nM和约2.39nM的对c-Met蛋白质的结合亲和力，且3种具有修饰的铰链区的人源化抗体显示约1.89nM-约3.74nM(表4)的结合亲和力。因此，证实具有修饰的铰链区的人源化抗体保持与人源化抗体huAbF46类似的对c-Met蛋白质的结合亲和力。
<表4>
  抗体   kon(1/Ms)   koff(1/s)   KD(nM)
  huAbF46-H1   3.46x105   6.55x10-4   1.89
  huAbF46-H1-U6-MC7   5.16x105   10.01x10-4   1.89
  huAbF46-H4   3.36x105   8.02x10-4   2.39
  huAbF46-H4-U6-MC7   3.51x105   8.01x10-4   2.28
  huAbF46-H4-U7-HC6   2.63x105   9.81x10-4   3.74
实施例13：具有修饰的铰链区的huAbF46的激动副作用程度的比较-BrdU测定
为了比较在实施例4中制备的具有修饰的铰链区的人源化抗体的激动程度，进行使用NCI-H441细胞的BrdU测定。将人肺癌细胞NCI-H441悬浮在RPMI 1640培养基(Gibco)中(2x105个细胞/ml)以制备悬浮液，并将约100μl所述悬浮液引入96-孔组织培养板(Corning，Lowell，MA)的各孔中。将所述悬浮液在37℃在5%CO2条件下温育24小时，然后将所述培养基完全取出并用以抗体稀释的RPMI 1640置换。在将所述悬浮液在37℃在5%CO2条件下温育21小时后，添加5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)，并在进一步3小时的温育后进行BrdU测定(Roche，Indianapolis，IN)。在将细胞在所述板上变性/固定后，添加抗-BrdU抗体，并在一小时后添加基质以使用ELISAspectraMax读取器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)在370nm测量颜色反应。基于小鼠AbF46抗体的激动进行比较。使用小鼠IgG作为阴性对照组，且使用公知作为激动剂的5D5抗体作为阳性对照组。
如图7中所示，2种类型的具有修饰为U6-HC7的铰链区的人源化抗体huAbF46(huAbF46-H1-U6-HC7和huAbF46-H4-U6-HC7)减少激动副作用。
实施例14：具有修饰的铰链区的huAbF46抗体的激动副作用程度的比较-Akt磷酸化
为了比较在实施例4中制备的具有修饰的铰链区的人源化抗体的激动，使用Caki-1细胞(Korean Cell Line Bank)以证实Akt蛋白质磷酸化程度，其为c-Met的低信号转导和细胞增殖中涉及的标准。使用小鼠IgG作为阴性对照组，且使用公知作为激动剂的5D5抗体作为阳性对照组。
将2x105个细胞/ml的Caki-1引入96-孔板中，且在24小时后，将各自5μg/ml的抗体在无血清的培养基中处理30分钟。进行经处理的抗体的细胞溶解，并使用PathScan phospho-AKT1(Ser473)chemiluminescent SandwichELISA kit(Cell Signaling,cat.no#7134S)测量Akt磷酸化程度。
如图8中所示，与2种类型的具有未修饰的铰链区的人源化抗体huAbF46-H1和huAbF46-H4相比，2种类型的具有修饰的铰链区的人源化抗体huAbF46-H1-U6-HC7和huAbF46-H4-U6-HC7都显示Akt磷酸化程度的约20%的减少，且因此所有具有修饰的铰链区的人源化抗体使激动减少。
实施例15：具有修饰的铰链区的huAbF46抗体的体外抗癌效果的分析
为了证实在实施例4中制备的具有修饰的铰链区的人源化抗体的由于癌细胞增殖抑制的抗癌效果，使用在细胞的表面上表达c-Met的MKN45胃癌细胞(Korean Cell Line Bank)以进行体外细胞增殖分析。
将悬浮在50μl 5%FBS/DMEM培养物中的1x104个细胞引入96-孔板的各孔中，和将50μl具有修饰的铰链区的人源化抗体huAbF46-H1-U6-HC7和huAbF46-H4-U6-HC7及具有未修饰的铰链区的人源化抗体huAbF46-H1和huAbF46-H4不处理或以0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml或10μg/ml的浓度处理，且在温育72小时后，通过使用具有光度计(PerkinElmer，2104Multilabelreader)的CellTiter-
Figure BDA00002200374800181
Luminescent Cell Viability Assay Kit(Promega，G7570)定量细胞的数目。
如图9中所示，尽管用作阴性对照组的小鼠IgG可完全不抑制癌细胞增殖，但是证实具有修饰的铰链区的人源化抗体huAbF46-H1-U6-HC7和huAbF46-H4-U6-HC7及具有未修饰的铰链区的人源化抗体huAbF46-H1和huAbF46-H4具有癌细胞增殖抑制。而且，与具有未修饰的铰链区的人源化抗体huAbF46-H1和huAbF46-H4相比，具有修饰的铰链区的人源化抗体huAbF46-H1-U6-HC7和huAbF46-H4-U6-HC7具有约25%的增加的癌细胞抑制。
实施例16：嵌合和人源化抗体chAbF46和huAbF46的CDR氨基酸序列
嵌合和人源化抗体chAbF46和huAbF46的重和轻链CDR氨基酸序列显示在表5中。
<表5>
Figure BDA00002200374800182
Figure BDA00002200374800191
如上所述，根据本发明的以上实施方式的一个或多个的抗c-Met人源化抗体和包括其的药物组合物，可有效地预防或治疗癌症。
应理解，在本文中描述的示例性实施方式应仅在描述的意义上考虑，而不是用于限制的目的。在各实施方式中的特征或方面的描述应典型地被认为可用于其它实施方式中其它类似的特征或方面。
Figure IDA00002200375600011
Figure IDA00002200375600021
Figure IDA00002200375600031
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Figure IDA00002200375600161

Claims (16)

1.抗c-Met人源化抗体，包括具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区。
2.抗c-Met人源化抗体，包括具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的轻链可变区。
3.权利要求1或2的抗c-Met人源化抗体，其中所述c-Met衍生自选自人、猴子、小鼠和大鼠的c-Met。
4.权利要求1或2的抗c-Met人源化抗体，其中所述抗体为单克隆抗体。
5.权利要求1或2的抗c-Met人源化抗体，其中所述抗体为选自scFv、(scFv)2、Fab、Fab’和F(ab’)2的抗原结合片段。
6.权利要求1或2的抗c-Met人源化抗体，其中所述抗体包括具有通过缺失、插入或取代一个或多个氨基酸而修饰的氨基酸序列的铰链区。
7.权利要求1或2的抗c-Met人源化抗体，其中所述抗体包括具有SEQID NO：5或SEQ ID NO：6的氨基酸序列的铰链区。
8.抗c-Met人源化抗体的重链可变区，具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
9.抗c-Met人源化抗体的轻链可变区，具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
10.抗c-Met人源化抗体的重链可变区，具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
11.抗c-Met人源化抗体的轻链可变区，具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
12.用于预防或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包括药物有效量的根据权利要求1-7中任一项的抗c-Met人源化抗体和可药用载体、稀释剂或赋形剂。
13.权利要求12的药物组合物，其中所述癌症为选自如下的一种：鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、皮肤癌、皮肤或眼球中的黑素瘤、直肠癌、肛门附近的癌、食道癌、小肠肿瘤、内分泌腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、肝瘤、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞腺瘤、乳腺癌、结肠癌、大肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、和头颈癌。
14.权利要求12的药物组合物，其中所述抗体用作针对c-Met的拮抗剂。
15.治疗癌症的方法，所述方法包括向受验者施用用于预防或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包括药物有效量的根据权利要求1-7中任一项的抗c-Met人源化抗体和可药用载体、稀释剂或赋形剂。
16.根据权利要求1-7中任一项的抗c-Met人源化抗体在制造用于预防或治疗癌症的药物组合物或药物中的用途，所述药物组合物或药物包括药物有效量的所述抗c-Met人源化抗体和可药用载体、稀释剂或赋形剂。
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