CN101918030A - 抗vegf抗体的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开的是特异抑制VEGF与两个主要的VEGF受体中的仅一个(VEGFR2)结合的人类抗体。所述抗体有效抑制血管新生，并诱导肿瘤退化，并由于它们的特异性而具有提高的安全性。本发明因此提供用于治疗癌症和其它血管新生疾病的基于新的人类抗体的组合物、方法和组合的方案。同样提供使用新的VEGF特异的人类抗体的有利的免疫偶联物组合物和方法。

Description

抗VEGF抗体的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求：第一、2007年11月9日提交的序列号为60/987,015的美国临时申请的优先权；第二、2008年10月16日提交的序列号为61/106,047的美国临时申请的优先权；第三、2008年10月24日提交的序列号为61/108,023的美国临时申请的优先权。以上申请文件的全部的说明书、权利要求书、序列和附图以无放弃的参考方式结合至本文。
技术领域
本发明主要涉及抗体、血管新生和肿瘤治疗领域。更具体地，它提供了特异地抑制VEGF与两个VEGF受体中的仅一个(VEGFR2)结合的人类抗VEGF抗体。设计这样的抗体以抑制血管新生及诱导肿瘤退化，并且由于它们特异的阻碍性质而具有提高的安全性。本发明的基于抗体的组合物和方法同样延伸至免疫偶联物和其它治疗组合物、试剂盒和方法的应用。
背景技术
肿瘤细胞对化学治疗制剂的抗性代表了在临床肿瘤学的一个重要难题。事实上，这是为什么许多最流行种类的人类肿瘤仍然抵抗有效的化学治疗干预的主要原因之一，尽管在这个领域有一定的进步。
另一个肿瘤治疗策略是使用“免疫毒素”，其中抗肿瘤细胞的抗体用于将毒素递送至肿瘤细胞中。但是，当用于实体瘤时，和化学治疗手段一样，免疫毒素治疗同样遭遇明显的缺点。例如，抗原阴性或抗原缺乏细胞可以存活并重新形成肿瘤或导致更多的转移。
实体瘤抵抗基于抗体的治疗的深层原因是通常肿瘤块不能渗透大分子试剂，如抗体和免疫毒素(Burrows等，1992；Dvorak等，1991a；Baxter和Jain，1991)。肿瘤内的物质扩散距离和孔隙压力是这种类型治疗的重要局限。因此，构成所有人类癌症90％以上的实体瘤，迄今已经被证明能够抵抗抗体和免疫毒素的治疗。
更新的策略已经是靶向实体瘤的脉管系统。靶向肿瘤的血管，而不是肿瘤细胞本身，具有确定的优势在于它不可能导致有抵抗力的肿瘤细胞的发展，并且容易进入靶向的细胞。此外，血管的破坏导致抗肿瘤效果的扩大，因为许多肿瘤细胞依赖于单一血管获得氧和营养物(Burrows和Thorpe，1993；1994)。典型的血管靶向策略在美国专利5,855,866和5,965,132中描述，其中具体描述了抗细胞试剂和毒素向肿瘤脉管系统标记物的靶向递送。
血管靶向方法的另一个有效方式是靶向凝血因子至在肿瘤脉管系统中表达或吸附的标记物(Huang等，1997；美国专利5,877,289、6,004,555和6,093,399)。凝血剂，而不是毒素，递送至肿瘤脉管系统具有降低的免疫原性和甚至较低的毒性副作用风险的更多优势。如在美国专利5,877,289中公开的，在这样的肿瘤特异性的“凝血配体”(coaguligand)中使用的优选的凝血因子是截短形式的人类的诱导凝血蛋白、组织因子(TF)、血液凝结的主要起始剂。
尽管毒素和凝血因子特异递送至肿瘤血管代表了肿瘤治疗的重大进步，但是一些外围肿瘤细胞能够幸免由这样的治疗引起的肿瘤内部破坏。抗血管新生策略可以因此与美国专利5,855,866和6,004,555的肿瘤破坏方法结合使用。
抗血管新生的肿瘤治疗策略是基于抑制血管芽的增殖，通常在实体瘤的外围。在更多常规干预(如外科或化学治疗)之后或者与更多常规干预(如外科或化学治疗)联合使用时，这些治疗在降低微转移的风险和抑制实体瘤的生长中显著有效。
血管新生是新的脉管系统由先前存在的血管和/或循环的内皮干细胞的发育(Asahara等，1997；Springer等，1998；Folkman和Shing，1992)。血管新生在许多生理过程中扮演重要角色，如胚胎发生、创伤复原和月经。血管新生在一些病理情况中同样重要。除了在实体瘤的生长和转移中的作用之外，其它具有血管新生成分的显著的情形是关节炎、牛皮癣和糖尿病视网膜病(Hanahan和Folkman，1996；Fidler和Ellis，1994)。
血管新生在正常和恶性组织中通过在靶组织中以及远距离位点产生的血管新生刺激物和血管新生抑制剂的平衡而调节(Fidler等，1998；McNamara等，1998)。血管内皮生长因子A(VEGF，也被认为是血管渗透因子，VPF)是血管新生的主要刺激物。VEGF是多功能的细胞因子，由缺氧和致瘤性突变而诱导，能够由多种组织产生(Kerbel等，1998；Mazure等，1996)。
认识到VEGF作为在病理情况下的血管新生的主要刺激物致使多种阻碍VEGF活性的尝试。抑制性抗VEGF受体抗体，可溶的受体构建体，反义策略，针对VEGF的RNA配适体和低分子量VEGF受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂已经全部被提议用于干扰VEGF信号(Siemeister等，1998)。随着使用鼠科抗体对小鼠中肿瘤生长的抑制(Kim等，1993；Asano等，1998；Mesiano等，1998；Luo等，1998a；1998b；Borgstrom等，1996；1998)，被称为阿瓦斯汀(贝伐单抗)(Presta等，1997)的人源化抗VEGF抗体已经被批准用于临床使用(Hurwitz等，2004)。
已经报导了其它的识别VEGF和抑制VEGF诱导功能的鼠科抗体。这些包括被称为2C3的鼠科抗体，其具有抑制VEGF与两个主要VEGF受体中的仅一个结合的优势(Brekken等，2000)。通过阻碍VEGF结合VFGFR2，而不是VEGFR1，鼠科2C3抗体具有提高的安全性，保持了通过VEGFR1介导的有益效果(Brekken等，2000；美国专利6,342,219、6,524,583、6,342,221)。
但是，发明人已经意识到，识别VEGF并抑制VEGF诱导的血管新生的另外试剂的鉴别可能有益于扩大治疗选项的数目。例如，尽管有希望，鼠科2C3抗体有一定的局限性。特别是，2C3抗体不结合鼠VEGF，意味着它不能用在使用鼠同源肿瘤的临床前研究中。从临床前研究到临床使用的最有效的转化可能因此从结合鼠和人类VEGF的新抗体的开发中得到益处。
另外，发明人已经意识到，用于从免疫学角度而言具有更好耐药性的人类治疗的治疗试剂的发展将是有利的。在这点上，人类抗体通常具有至少三个用于人类治疗的潜在的优势。第一，人类免疫系统不会识别抗体作为异物。第二，人类循环系统中的半衰期将与自然发生的人类抗体相似，允许给予较小的和较低频率的剂量。第三，由于效应器部分是人，它将与人类免疫系统的其它部分更好地相互作用，例如，通过补体依赖性细胞毒作用(CDC)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)更有效地破坏靶细胞。
但是，尽管人类抗体通常被认为是呈现这些优势，已经知道具有高度充足的亲合力和适当的功能性质以使得它们成为成功的人类治疗的候选的人类抗体的开发绝不是简单的。因此本领域仍然缺少用于人类安全并有效治疗的抑制VEGF诱导的血管新生的试剂，并引起这样试剂开发的挑战。
发明内容
本发明通过提供新的在抗血管新生和抗肿瘤治疗中使用的治疗组合物和方法克服了现有技术的一些限制。本发明是基于如下人类抗体：其具有特异性抑制VEGF与两个主要VEGF受体中的仅一个(VEGFR2)结合的功能特性，以及对VEGF具有用于有效治疗方案的足够高度的亲合力。这样的抗体如同其它抗VEGF抗体一样有效地抑制血管新生和治疗肿瘤，包括已经被认可用于临床使用的那些和由于它们特定的阻碍性质迄今已经被改善安全性的那些抗体。本发明的组合物和方法同样扩展至免疫偶联物和组合物的使用，包括前药，使用提供的特定种类的抗体。
本发明的具体有益之处是提供的人类抗体仅抑制VEGF结合VEGFR2，而不抑制结合VEGFR1。这和现有技术的主要抗体形成对照，包括A4.6.1和人源化形式，阿瓦斯汀，它们抑制VEGF与VEGFR1和VEGFR2两者结合。由于VEGFR1有重要的与血管新生不相关的生物学功能，如在破骨细胞和破软骨细胞功能，本发明的仅抑制VEGFR2介导的血管新生的能力是明显优势。这转化为在骨新陈代谢中的显著的临床效果，如在儿科癌症的治疗中，没有反面影响。同样抑制了在肿瘤的进程和转移中巨噬细胞的有害作用，因为巨噬细胞群表达VEGFR2，其被本发明的抗体抑制。
更进一步的优势是，由于在本发明抗体的存在下保留了VEGF和VEGFR1的结合，它们可以通过与结合VEGFR1的VEGF结合而被用于特定地递送附加的治疗试剂至肿瘤脉管系统，VEGFR1在肿瘤内皮上上调表达。因此，在免疫偶联物的情形下，本发明提供在同一个分子中既有抗血管新生性质又具有肿瘤破坏性质的试剂。
更进一步的优势存在于提供的组合物中和通过VEGFR2介导的VEGF的残存信号的能力。因此本发明的裸抗体和偶联的抗体与其它治疗和/或附加的试剂形成增效组合物，特别是那些由于VEGF抵消它们的破坏性质的能力而未能在体内达到最大效力的方法和试剂。
本发明的结合VEGF的抗体分子的氨基酸和/或DNA序列以在本文中列出的多种SEQ ID NO描述，抗体分子的VH和VL区包括互补决定区(CDRs)。
在一实施方式中，本发明提供结合VEGF的抗体，其包括重链CDR1区，重链CDR1区包括SEQ ID NO：5的氨基酸序列或与其基本上一致的序列。
可选择地或另外地，在本发明的一实施方式中，结合VEGF的抗体包括重链CDR2区，重链CDR2区包括SEQ ID NO：6的氨基酸序列或与其基本上一致的序列。
可选择地或另外地，在本发明的一实施方式中，结合VEGF的抗体包括重链CDR3区，重链CDR3区包括SEQ ID NO：7的氨基酸序列或与其基本上一致的序列。
可选择地或另外地，在本发明的一实施方式中，结合VEGF的抗体包括轻链CDR1区，轻链CDR1区包括SEQ ID NO：8的氨基酸序列或与其基本上一致的序列。
可选择地或另外地，在本发明的一实施方式中，结合VEGF的抗体包括轻链CDR2区，轻链CDR2区包括SEQ ID NO：9的氨基酸序列或与其基本上一致的序列。
可选择地或另外地，在本发明的一实施方式中，结合VEGF的抗体包括轻链CDR3区，轻链CDR3区包括SEQ ID NO：10的氨基酸序列或与其基本上一致的序列。
因此，在一些实施方式中，本发明提供了结合VEGF的抗体，该抗体包括一个或多个重链CDR区，其中重链CDR区选自由
(a)包括SEQ ID NO：5的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的重链CDR1区；
(b)包括SEQ ID NO：6的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的重链CDR2区；以及
(c)包括SEQ ID NO：7的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的重链CDR3区组成的组。
在一些实施方式中，本发明同样提供结合VEGF的抗体，该抗体包括一个或多个轻链CDR区，其中轻链CDR区选自由
(a)包括SEQ ID NO：8的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的轻链CDR1区；
(b)包括SEQ ID NO：9的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的轻链CDR2区；和
(c)包括SEQ ID NO：10的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的轻链CDR3区组成的组。
在一些优选实施方式中，结合VEGF的抗体包括：(a)包括SEQ ID
NO：7的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的重链CDR3区；和(b)包括SEQ ID NO：10的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的轻链CDR3区。
更优选地，同样存在，包括SEQ ID NO：5的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的重链CDR1区和/或包括SEQ ID NO：8的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的轻链CDR1区，和/或包括SEQ ID NO：6的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的重链CDR2区和/或包括SEQ ID NO：9的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的轻链CDR2区。
在一优选实施方式中，包括SEQ ID NO：5的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的重链CDR1区、包括SEQ ID NO：6的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的CDR2区、和包括SEQ ID NO：7的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的CDR3区单独或以组合方式存在。
在另一优选实施方式中，包括SEQ ID NO：8的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的轻链CDR1区、包括SEQ ID NO：9的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的CDR2区、和包括SEQ ID NO：10的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的CDR3区单独或以组合方式存在。
可选择地认为，在一些实施方式中，本发明提供结合VEGF的抗体，其包括：包括SEQ ID NO：7的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的重链CDR3区和/或包括SEQ ID NO：10的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的轻链CDR3区。所述的抗体可选地进一步包括：包括SEQ ID NO：6的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的重链CDR2区和/或包括SEQ
ID NO：9的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的轻链CDR2区；和/或进一步包括：包括SEQ ID NO：5的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的重链CDR1区和/或包括SEQ ID NO：8的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的轻链CDR1区。
可选择地认为，在一些实施方式中，本发明提供结合VEGF的抗体，其包括：包括SEQ ID NO：6的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的重链CDR2区和/或包括SEQ ID NO：9的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的轻链CDR2区。所述抗体可选择地进一步包括：包括SEQ ID NO：7的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的重链CDR3区和/或包括SEQID NO：10的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的轻链CDR3区；和/或进一步包括：包括SEQ ID NO：5的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的重链CDR1区和/或包括SEQ ID NO：8的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的轻链CDR1区。
可选择地认为，在一些实施方式中，本发明提供结合VEGF的抗体，其包括：包括SEQ ID NO：5的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的重链CDR1区和/或包括SEQ ID NO：8的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的轻链CDR1区。所述抗体可选择地进一步包括：包括SEQ ID NO：7的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的重链CDR3区和/或包括SEQID NO：10的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的轻链CDR3区；和/或进一步包括：包括SEQ ID NO：6的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的重链CDR2区和/或包括SEQ ID NO：9的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的轻链CDR2区。
本发明的一些优选的抗体包括一个或多个选自由SEQ ID NO：5、6、7、8、9和10的序列或与任何一前述序列基本上一致的序列组成的组的CDR。
一些优选的抗体包括两个或多个SEQ ID NO：8、9或10或与任何一前述序列基本上一致的序列的轻链CDR。特别优选的结合分子包括3个SEQ ID NO：8、9或10或与任何一前述序列基本上一致的序列的轻链CDR(即：前述轻链CDR1和CDR2和CDR3或与其基本上一致的序列中的一个)。
其它一些优选的抗体包括两个或多个SEQ ID NO：5、6或7或与任何一前述序列基本上一致的序列的重链CDR。特别优选的结合分子包括3个SEQ ID NO：5、6和7或与任何一前述序列基本上一致的序列的重链CDR(即：前述重链CDR1和CDR2和CDR3或与其基本上一致的序列中的一个)。
一些更加特别优选的抗体包括3个SEQ ID NO：8、9或10或与这些序列中任何一个基本上一致的序列的轻链CDR(即：前述轻链CDR1和CDR2和CDR3或与其基本上一致的序列中的一个)，和3个SEQ IDNO：5、6或7或与这些序列中任何一个基本上一致的序列的重链CDR(即：前述重链CDR1和CDR2和CDR3或与其基本上一致的序列中的一个)。
一些特别优选的抗体包括：SEQ ID NO：5的重链CDR1区，SEQ IDNO：6的重链CDR2区，和SEQ ID NO：7的重链CDR3区，或与任何一前述序列基本上一致的序列；和/或包括：SEQ ID NO：8的轻链CDR1区，SEQ ID NO：9的轻链CDR2区，和SEQ ID NO：10的轻链CDR3区，或与任何一前述序列基本上一致的序列。
在进一步实施方式中，本发明提供结合VEGF并且包括至少一个包括3个CDR的重链可变区和至少一个包括3个CDR的轻链可变区的抗体，其中所述的轻链可变区包括：
(i)具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的可变轻链(VL)CDR1，
(ii)具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的VL CDR2，和
(iii)具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的VL CDR3。
在这个实施方式的优选方面，一个或多个所述的重链可变区CDR选自由：
(i)具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的VH CDR1，
(ii)具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的VH CDR2，和
(iii)具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的VH CDR3组成的组。
在这个实施方式的进一步优选方面，两个所述的重链可变区CDR选自由：
(i)具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的VH CDR1，
(ii)具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的VH CDR2，和
(iii)具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的VH CDR3组成的组。
在这个实施方式的仍然进一步优选方面中，三个所述的重链可变区CDR选自由：
(i)具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的VH CDR1，
(ii)具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的VH CDR2，和
(iii)具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的VH CDR3组成的组。
本发明的一些进一步优选实施方式提供了结合VEGF的抗体，其包括：包括一个、两个或三个SEQ ID NO：5、6或7或与SEQ ID NO：5、6或7的一个或多个基本上一致的序列的重链CDR的VH区，和/或包括一个、两个或三个SEQ ID NO：8、9或10或与SEQ ID NO：8、9或10的一个或多个基本上一致的序列的轻链CDR的VL区。
特别优选的VL区包括3个SEQ ID NO：8、9和10或与SEQ ID NO：8、9或10的一个或多个基本上一致的序列的轻链CDR(即：CDR1、CDR2和CDR3或与其基本上一致的序列中的一个)。
特别优选的VH区包括3个SEQ ID NO：5、6和7或与SEQ ID NO：5、6或7的一个或多个基本上一致的序列的重链CDR(即：CDR1、CDR2和CDR3或与其基本上一致的序列中的一个)。
本发明的更加特别优选的实施方式提供了结合VEGF的抗体，其包括：包括3个SEQ ID NO：8、9和10的轻链CDR的VL区，和包括3个重链CDR的VH区。在优选实施方式中，一个、两个或三个重链CDR如SEQ ID NO：5、6和7所限定。
本发明的一些优选的实施方式提供了结合VEGF的抗体，其包括具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的VH区和/或具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的VL区。
更优选的实施方式提供了结合VEGF的抗体，其包括具有SEQ IDNO：4的氨基酸序列的VL区和包括3个重链CDR的VH区。优选地，所述VH区具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
在进一步的实施方式中，本发明提供结合VEGF的抗体，该抗体包括SEQ ID NO：21的氨基酸序列(所述抗体在本文中同样被称为r84或PGN311或EJ173/112-C11)，或包括它的结合VEGF的片段，或与其基本上一致的序列。
在进一步实施方式中，本发明提供结合VEGF的抗体，其包括SEQ IDNO：21的氨基酸序列(所述抗体在本文中同样被称为r84或PGN311或EJ173/112-C11)，或包括其结合VEGF的片段。
本发明通过单克隆抗体r84(在本文中同样被称为PGN311和EJ-173-112-Cl1)举例证明，其单链形式在图1中示出(SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：20)，其全长IgG形式在实施例6中示出。r84抗体的CDR区，VH和VL区在表1和图1中示出。包括这些CDR区或VH和VL区(或与其基本上一致的序列)的抗体是本发明的优选方面。
本发明的优选实施方式是SEQ ID NO：21(氨基酸)所示的r84抗体的scFV形式，其优选由SEQ ID NO：20(核酸)编码。
本发明的另一优选实施方式是r84抗体的全长IgG形式，它的重链在SEQ ID NO：24(氨基酸)中示出，其优选由SEQ ID NO：22(核酸)编码；它的轻链在SEQ ID NO：25(氨基酸)中示出，其优选由SEQ ID NO：23(核酸)编码。
一些基本上一致的序列的例子是与公开的氨基酸序列有至少70％同源性的序列。
在一些实施方式中，本发明的结合VEGF的抗体包括至少一个轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少大约75％，更优选地至少大约80％，更优选地至少大约85％，更优选地至少大约90％或95％，以及最优选地至少大约97％、98％或99％的氨基酸序列同源性的氨基酸序列区，和/或至少一个重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少大约75％，更优选地至少大约80％，更优选地至少大约85％，更优选地至少大约90％或95％和最优选地至少大约97％、98％或99％氨基酸序列同源性的氨基酸序列区。
基本上一致的序列的其它优选实例是包含公开的氨基酸序列的保守氨基酸取代的序列。
基本上一致的序列的其它优选实例是在公开的一个或多个CDR区中包含1、2或3个，优选地1或2个改变的氨基酸的序列。这样的改变可能是保守的或非保守的取代，或它们的组合。
在所有这样的实施方式中，优选的改变是保守氨基酸取代。
在所有实施方式中，包含基本上一致的序列的抗体保留了结合VEGF的能力。
本发明的实施方式中，考虑改变轻链CDR3区，优选地所述CDR的第8位的L残基没有改变地保留。
本发明的其它实施方式提供结合VEGF的结合蛋白，该蛋白包括本发明的抗体，本发明的VH或VL区，或本发明的一个或多个CDR。在优选实施方式中，这样的结合蛋白是抗体。
本发明的优选抗体包括至少一个包括3个CDR的重链可变区和至少一个包括3个CDR的轻链可变区。这些CDR的典型的和优选的序列在本文中描述。
在本文中使用的简洁术语“VEGF”，除非其它特别的叙述或从科学术语学中清楚确定，表示血管内皮生长因子A(VEGF-A)，同样也被认为是血管渗透因子，VPF。
“VEGF”还意味着任何形式的VEGF，特别是因为VEGF在哺乳动物物种中保守。本发明的抗体或抗体片段可能因此结合例如人类、猴子、母牛(牛)、小鼠、大鼠、仓鼠、白鼬、豚鼠和/或兔子VEGF。优选地，本发明的抗体或抗体片段将至少结合人类VEGF。在一些优选实施方式中，本发明的抗体或抗体片段将至少结合人类和小鼠的VEGF。
本文中使用的本发明的抗体或抗体片段的上下文中的术语“结合VEGF”，意思是人类抗体或抗体片段能够有以下一种或多种能力；优选地，有多于以下一种的能力；以及最优选地，有以下全部的能力：
(a)结合非构象依赖性VEGF抗原表位，如通过在Western印迹中结合至VEGF而评估；
(b)结合游离的VEGF或在固体支持物上的VEGF；
(c)至少结合人类VEGF或鼠VEGF；
(d)明显抑制或明显降低VEGF结合VEGF受体VEGFR2(KDR/Flk-1)；
(e)不明显抑制或降低结合VEGF受体VEGFR1(Flt-1)；
(f)抑制，并优选地明显抑制VEGF诱导的VEGFR2的磷酸化；
(g)抑制，并优选地明显抑制VEGF诱导的血管渗透性；
(h)抑制，并优选地明显抑制VEGF介导的内皮细胞的增殖；
(i)抑制，并优选地明显抑制血管新生；
(j)抑制，并优选地明显抑制淋巴管新生；
(k)不明显抑制VEGFR1介导的细胞刺激或活化，如表达VEGFR1破骨细胞或破软骨细胞；和/或
(l)对具有血管化肿瘤的动物给药后局限在肿瘤脉管系统和/或肿瘤基质。
最优选地，本发明的人类抗体或抗体片段明显抑制VEGF结合VEGF受体VEGFR2(KDR/Flk-1)而没有明显抑制VEGF结合VEGF受体VEGFR1(Flt-1)。
因此本发明提供特异阻碍VEGF结合VEGFR2受体或仅阻碍VEGF结合VEGFR2受体的人类抗体。这样的人类抗体明显抑制VEGF结合VEGFR2受体(KDR/Flk-1)而没有明显抑制VEGF结合VEGFR1受体(Flt-1)。这样的人类抗体因此抑制VEGF结合VEGFR2受体(KDR/Flk-1)，实质上不抑制VEGF结合VEGFR1受体(Flt-1)，表现出体内抗血管新生和抗肿瘤效果并且不明显抑制VEGFR-1介导的情形，如破骨细胞或破软骨细胞功能。
本发明的人类抗体因此简洁地定义为“阻碍VEGFR2而非阻碍VEGFR1的人类抗VEGF抗体”。甚至更简洁地，它们被定义为“阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体”，以在本发明的所有组合物、用途和方法中简洁地使用。“阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体”是阻碍VEGF结合VEGFR2受体的抗VEGF人类抗体。应当清楚这样的抗体不是抗VEGFR2受体本身的抗体。
因此，依照本发明，可以制造一系列的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体并用在多种实施方式中，包括血管新生的抑制和血管新生疾病和肿瘤的治疗，不需要抑制通过VEGFR1受体的VEGF信号传导并且没有明显的缺点和与其相关的副作用。
在一些实施方式中，本申请进一步描述用于产生候选阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体的方法学，以及从候选物池中鉴定真实的阻碍VEGFR2特定抗体的实验的程序技术方面。
如在整个申请中贯穿使用，使用的术语“一”(a)和“一”(an)在某种意义上意味着“至少一个(种)”、“至少第一个(种)”、“一个(种)或多个(种)”或“多数”的引用的成分或步骤，除非在例子中在其后有明确陈述的上限。因此，这里使用的“抗体”意味着“至少第一种抗体”。本领域技术人员根据本发明公开的内容可以知道可操作的限制和组合物的参数，以及任何单一试剂的量。
本发明的“特异地抑制VEGF结合至VEGF受体VEGFR2(KDR/Flk-1)”的人类抗体可以通过竞争和/或功能性实验鉴定。简单而优选的实验是基于ELISA的竞争实验。在竞争实验中，预混合或混合VEGF和不同量的测试抗体(如100倍至1000倍摩尔过量，如500倍或750倍摩尔过量)并测定测试抗体降低VEGF结合VEGFR2的能力。VEGF可以预标记并直接探测，或者可以使用(二级)抗VEGF抗体或二级和三级抗体探测系统检测。这样的竞争实验的ELISA形式是优选形式，但是可以操作任何类型的免疫竞争实验。
在这样的竞争实验中，在完全不相关的抗体(包括非封闭的抗VEGF单克隆抗体)存在下，VEGF结合VEGFR2是对照高值(100％)。在测试实验中，在测试抗体存在下，VEGF结合VEGFR2明显降低是测试抗体明显抑制VEGF结合VEGF受体VEGFR2(KDR/Flk-1)的预示。
明显降低是在结合中“可再现的”降低，也就是一贯观察到的。根据本发明“明显降低”被定义为在抗体比VEGF超过大约100倍至大约1000倍摩尔之间(如大约500倍或大约750倍)的任何量时至少大约50％、大约55％、大约60％或大约65％的可再现的降低(在VEGF结合至VEGFR2中)。换一种看法，少于50％的信号(当与对照值100％相比)被认为是明显的结合抑制。
本发明优选特征是提供的人类抗体没有实质地或明显地抑制、降低或阻碍VEGF结合VEGFR1。表现出VEGF结合VEGFR2的适度地明显降低的人类抗体同样是有用的，只要它们没有实质地抑制VEGF结合VEGFR1。但是，更优选的抗体将是那些具有抑制VEGF结合VEGFR2更明显的能力的抗体。这些抗体是那些在抗体比VEGF超过大约100倍至大约1000倍摩尔之间(如大约500倍或大约750倍)的任何量时表现出降低VEGF结合VEGFR2到至少大约70％、大约75％或大约80％的可再现能力的抗体。尽管不需要实践本发明，均不排除降低VEGF结合VEGFR2到至少大约85％、大约90％、大约95％或甚至更高的抗体。
抑制VEGF结合VEGF受体VEGFR2(KDR/Flk-1)而没有明显抑制VEGF结合VEGFR受体VEGFR1(Flt-1)的人类抗VEGF抗体或它们的抗原结合片段很容易通过如上面描述的那些简单的竞争实验证实，但是使用VEGFR1。
缺乏明显抑制或降低是“可再现的”，即一贯观察到的，“结合的实质保持”。依据本申请，“结合的实质保持”被定义为在抗体比VEGF超过大约100倍至大约1000倍摩尔之间的任何量时至少大约60％、大约75％、大约80％或大约85％的可再现的保持(在VEGF结合VEGFR1中)。
使用没有实质抑制VEGF结合VEGFR1的人类抗体的目的是保持由VEGFR1介导的生物学功能。因此，抗体仅需要保持足够的VEGF与VEGFR1的结合，从而通过VEGF诱导生物学反应。但是，更优选的抗体将是那些具有保持VEGF结合VEGFR1更明显的能力的抗体。这些抗体是那些在抗体比VEGF超过大约100倍至大约1000倍摩尔之间的任何量时表现出保持VEGF结合VEGFR1至少大约88％、大约90％、大约92％、大约95％或大约98-99％的可再现能力的抗体。
应当理解，实质上更加抑制VEGF结合VEGFR2的人类抗体可能在结合VEGFR1时忍受更多的降低。相等地，当抗体在VEGF结合VEGFR2中具有适度的降低，结合VEGFR1的保持应当是要求更加严格。
鉴定和/或证实抗体抑制VEGF结合VEGF受体VEGFR2(KDR/Flk-1)的另一个优选结合实验是共沉淀实验。共沉淀实验测试了抗体阻碍VEGF与溶液中一个或多个受体结合的能力。在这样的实验中，VEGF或可检测的标记的VEGF用合适形式的受体孵育。
有许多用于操作免疫沉淀或共沉淀实验的形式。在本案例中，“受体的合适形式”可以是讨论中的VEGFR2受体或者受体的胞外域。免疫沉淀反应然后也需要基准试剂、抗VEGFR2受体或不同于VEGF结合位点的受体胞外域上的抗原表位的抗体的存在。本发明提供其它“合适”形式的VEGF受体，也就是连接至Fc抗体部分的受体胞外域。这样的受体/Fc结构可以用有效的免疫沉淀反应组合物，如基于蛋白质A的组合物通过孵育而沉淀。
不考虑合适的受体，免疫沉淀或共沉淀实验更优选与对照一起操作。VEGF单独结合至选择的受体的能力应当在抗VEGF抗体缺失时通过沉淀证实。优选地，在存在或不存在用作对照的具有已知结合特性的抗体时进行平行孵育。最优选地，使用封闭对照和非封闭对照抗体的实验平行进行。
任何结合的免疫学种类然后被免疫沉淀，如通过使用有效的免疫沉淀组合物，如蛋白A组合物或蛋白A琼脂糖珠孵育。然后检测沉淀物中VEGF的存在。在最初的孵育中的VEGF是可检测的标记的VEGF时，如放射性标记的VEGF，在免疫沉淀中的任何VEGF可以直接检测出。免疫沉淀中的任何非标记的VEGF可以通过其它合适的方法检测出，如通过凝胶分离和用抗VEGF抗体免疫检测。
在这样的共沉淀实验中，人类抗体阻碍VEGF结合VEGF受体如VEGFR2的能力可以容易地定量，尽管定性的结果同样有价值。量化可以通过标记的VEGF直接测量而完成，或如通过免疫检测的VEGF的光密度分析。表现出抑制VEGF结合VEGFR2的可再现性、即一贯观察到的能力的抗体可以因此被监测到，并且根据上述概括的量化标准可以选择有用的抗体。
没有明显抑制VEGF结合VEGF受体VEGFR1(Flt-1)的人类抗VEGF抗体同样可以通过操作上述的共沉淀实验而容易地鉴定，但是使用VEGFR1而不是VEGFR2。因此，抑制VEGF结合VEGF受体VEGFR2(KDR/Flk-1)而没有明显抑制VEGF结合VEGF受体VEGFR1(Flt-1)的抗VEGF抗体同样可以使用这样的方法容易地鉴定。
本申请同样提供多种鉴定和/或证实人类抗体明显抑制VEGF结合VEGF受体VEGFR2(KDR/Flk-1)的功能性实验。这些通常涉及作为负责一些明确的生物反应的受体的VEGFR2的鉴定。尽管前述的在无细胞系统中进行的竞争类型实验是最可再现的、可靠的、省力的和节约成本的，本发明条件下的以下实验同样有用。
例如，阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体可以通过检测抑制VEGF介导的内皮细胞生长(抑制VEGF的有丝分裂活性)的能力而鉴定。可以利用在VEGF存在下(存在或者不存在测试抗体)使用多种内皮细胞的任何一种合适的实验。优选地，平行地进行两组实验，如那些没有VEGF和那些具有明确特性(封闭和非封闭)的对照抗体实验。内皮细胞生长可以测定并优选地通过任何可接受的方法测量细胞数来精确地量化，包括比色测定。
具有抑制VEGF介导的内皮细胞生长能力的人类抗体将通常表现出一贯观察到的大约25％、30％、35％、40％、45％或50％大约的VEGF介导的内皮细胞生长的抑制。在这样的范围内的抑制将预示具有在体内足够抑制血管新生性质的抗体。具有更明显抑制活性的抗体并不排除在本发明之外。
鉴定根据本发明的人类抗体的进一步功能性实验是测定阻碍VEGF诱导的磷酸化的实验。可以利用使用多种内皮细胞的任何合适的实验，该内皮细胞表达任何形式的天然或重组的可磷酸化的VEGFR2。在存在或不存在将被检测的抗体时细胞与VEGF孵育合适的时间。优选地，平行地进行两组实验，如那些没有VEGF和那些具有明确特性(封闭和非封闭)的对照抗体实验。
VEGF诱导的VEGFR2的磷酸化可以测定，并优选地通过任何可接受的方式精确量化。通常，VEGFR2被免疫沉淀以用于进一步分析。VEGFR2的磷酸化程度可以直接测量，例如，细胞可以已经与32P标记的ATP孵育，允许在免疫沉淀的VEGFR2中的32P直接量化。优选地，免疫沉淀的VEGFR2通过其它方式分析，如通过凝胶分离和用结合至磷酸酪氨酸残基的抗体免疫检测。具有抑制VEGF诱导的VEGFR2的磷酸化的能力的抗体将通常表现出在磷酸化的VEGFR2水平的一贯观察到的降低。
鉴定根据本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体的进一步功能性实验是测试VEGF诱导的血管渗透性抑制的实验。尽管可以使用任何这样的实验，特别合适的实验是迈尔斯渗透性实验(Miles permeabilityassay)，其中动物如豚鼠被注入染料，如埃文蓝染料，在提供了存在或不存在测试抗体的VEGF之后测定动物皮肤中染料的出现。优选地，平行地进行两组研究，如那些没有VEGF和那些具有明确特性(封闭和非封闭)的对照抗体的研究。染料在动物皮肤中的出现典型地以斑点，如蓝色斑点，在动物背部，可以拍照和测量。
阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体将在低浓度下以一贯观察到的抑制而抑制VEGF诱导的血管渗透性，如当提供100倍或1000倍摩尔过量于VEGF。不阻碍VEGF结合至VEGFR2的抗体将不显示任何明显的VEGF诱导的血管渗透性的抑制。通常，仅在高浓度、如10倍摩尔过量于VEGF时阻碍VEGF诱导的渗透性的抗体将不是具有根据本发明的性质的抗体。
血管新生以及，因此抗血管新生制剂的广泛接受的功能性实验是新血管化的角膜植入微粒体(micropocket)实验和鸡胚绒毛尿囊膜实验(CAM)。美国专利5,712,291通过引用明确地合并在本文中，以说明角膜植入微粒体和CAM实验足以预测性地鉴定用于非常广泛范围的血管新生疾病的治疗的试剂。
美国专利5,001,116同样通过引用的方式明确地合并在本文中，为了描述CAM实验。本质上，已受精的鸡胚在第3或4天从壳中分离，包含检测化合物的甲基纤维素盘被灌输在绒毛尿囊膜上。大约48个小时之后测量胚胎，如果在甲基纤维素盘周围出现清楚的无血管区，测量那个区的直径。如在美国专利5,712,291中公开的，出于这个目的，该专利通过引用的方式明确地合并在本文中，依据本发明，任何无血管区的出现足以证明抗血管新生的抗体。区越大，抗体越有效。
新血管化的角膜植入微粒体实验可以使用大鼠或兔子角膜操作。由于临床有效性的预测，这个体内模型广泛地被接受，如在美国专利5,712,291和5,871,723中所证明的，出于证据目的，每一个都通过引用的方式明确地结合在本文中。尽管并不被相信与本发明有明确关系，角膜实验优于CAM实验，因为它们将一般性地识别本身非活性但发生代谢变化后产生活性化合物的化合物。
在本发明中，角膜植入微粒体实验用于鉴定抗血管新生的试剂。这通过在血管新生中的明显降低而证实，如通过角膜内的血管数量的一贯观察到的和优选显著的降低所表现的。这样的反应优选地定义为那些在与检测物接触时没有持续生长的证据、仅显示临时的萌芽和/或发夹环的角膜。
主张的发明依据本发明说明书和容易利用的科技文献、技术秘密和起始原料使之能够授权。
因此本发明的一些优选实施方式是包括至少本发明的第一个人类抗VEGF抗体，或它的抗原结合片段的组合物。
特异地抑制VEGF结合VEGF受体VEGFR2(KDR/Flk-1)的人类抗VEGF抗体或它们的抗原结合片段，以及抑制VEGF结合VEGF受体VEGFR2(KDR/Flk-1)而没有明显抑制VEGF结合VEGF受体VEGFR1(Flt-1)的抗VEGF抗体或它们的抗原结合片段形成了本发明的其它方面。
具有期望的性质组合的人类抗体可以通过上述的受体竞争、ELISA、共沉淀和/或功能性实验中的一种或多种或联合方式而被容易地鉴别。涉及抗体的定量测定的指导如上面所述，其中该抗体一贯地显著降低VEGF结合VEGFR2并且一贯地不显著抑制VEGF结合VEGFR1。
本文中，在100倍和500倍摩尔超过VEGF时，r84显示出分别降低束缚在VEGFR2包被的ELISA孔的VEGF的量至大约11％和2％。这些数字分别与大约89％和大约98％的VEGF结合VEGFR2减少量相等。本文中，当100倍和500倍摩尔超过VEGF时，r84显示出分别保持束缚在VEGFR1包被的ELISA孔的VEGF的量在大约94％和84％。甚至在1000倍摩尔超过VEGF时，r84仍然保持VEGF结合至VEGFR1在大约65％。应当再一次理解，更充分抑制VEGF结合VEGFR2的抗体很可能容许在结合VEGFR1中更多的降低。相等地，当抗体在VEGF结合至VEGFR2中具有适当的降低，结合至VEGFR1的保持应当要求更严格。因此应当意识到在两个值之间的“相当的”区别是重要的。
包括编码如本文中定义的本发明的人类抗体或它们的部分或片段的核苷酸序列的核酸分子，或与它们基本上一致的核酸分子，形成了本发明的更多方面。优选的核酸分子包括编码SEQ ID NO：21描述的氨基酸序列的序列(优选地由SEQ ID NO：20编码)。其它优选的核酸分子包括编码具有SEQ ID NO：24的氨基酸序列的重链(优选地由SEQ ID NO：22编码)和编码具有SEQ ID NO：25的氨基酸序列的轻链(优选地由SEQ IDNO：23编码)的序列。
其它优选的核酸分子包括编码本发明的抗体的IgG形式或鼠类嵌合形式的序列，例如在实施例6中所描述的那些。
如上面显示的，本发明包括的其它核酸分子是编码本发明的人类抗体的部分或片段的那些，如编码抗体重链的那些(如，编码SEQ ID NO：24的那些，如SEQ ID NO：22)或者编码抗体轻链的那些(如，编码SEQ IDNO：25的那些，如SEQ ID NO：23)。其它优选的核酸分子是编码本发明的抗体的VH区的那些(如，编码SEQ ID NO：3的那些，如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：26)。其它优选的核酸分子是编码本发明的抗体的VL区的那些(如，编码SEQ ID NO：4的那些，如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：27)。
因此，如在本文中定义的本发明的抗体的片段，或与其基本上一致的序列，或包括编码这样的片段的序列的核酸分子形成了本发明的更多方面。
有利地，本发明的抗体，当以IgG形式时，具有高的对于VEGF的结合亲合力，即，具有范围在1x10-8M或更低的Kd。重要地，具有这样的亲合力的抗体是在已经显示在治疗中有用的确定的范围内。优选地，本发明的抗体，当以IgG形式时，具有对于VEGF(优选人类VEGF)的结合亲合力相应于Kd小于20nM、15nM或10nM，更优选地，小于10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5或1nM。例如，当以IgG形式时，本发明的抗体的结合亲合力可以是6.7x10-9M或更低，如是大约7x10-9M或大约6x10-9M或是6.7x10-9M。可以使用测量Kd的任何合适的方法。但是，优选地，Kd通过体外检测多个浓度的检测抗体对多个浓度的抗原(VEGF)来确定饱和曲线而测量，如采用米氏方程与双倒数作图法；或优选通过使用商业上可利用的结合模型软件，如在Biacore 3000评估软件中的1∶1结合模型。为说明性目的，在实施例5中描述了合适的实验。优选地，Kd通过将抗原(VEGF)固定在固体支持物如Biacore芯片上并评定抗体与抗原的结合而测量。优选地，结合亲合力在室温下评估，如25℃温度，尽管也可以在其它温度下评估，如37℃(例如，人体温度)。
如本文别处讨论的，本发明优选的抗体结合至人VEGF和鼠VEGF。这是允许从临床前研究到临床使用的最有效的转化的重要的优势。例如，本发明的抗体结合人类VEGF和鼠VEGF的能力意味着这样的抗体可以在临床前研究中使用同源的或异种移植肿瘤模型而检测。不结合鼠VEGF的抗体不能用在同源的鼠模型中。
另外，与鼠和人类VEGF均结合的能力意味着在异种移植的鼠模型中由本发明的这样的抗体显示的结果更可能代表在人体中的抗体的活性。对此，原因是能够结合至人类VEGF而不是鼠VEGF的抗体(如阿瓦斯汀和2C3)将结合至鼠模型中由人类肿瘤细胞产生的VEGF，而不能结合至内源的鼠VEGF。这当然不同于人类病患的情形，其中将存在由肿瘤产生的VEGF和内源的VEGF。
具有这样情形的潜在优势是结合至人类VEGF而不是鼠VEGF的抗体可能在鼠异种移植模型中表现很好，但是这不能由存在更多VEGF的人类系统的相似表现而反应出来。换言之，在具有结合至人类VEGF而不是鼠VEGF的抗体的鼠异种移植系统中看到的抗肿瘤效果可能比临床现实中看到的更好。相反地，如果你使用能结合人类和鼠VEGF的抗体，这将结合至鼠模型系统中存在的所有形式的VEGF，并且当抗体植入人类时，这可能更代表该情形。
在根据本发明的组合物、免疫偶联物、医药品、化合物、鸡尾酒、试剂盒、第一和第二医学用途和所有方法的以下描述中，术语“抗体”和“免疫偶联物”，或它们的抗原结合区或片段，除非其它特别说明或从科学术语学清楚确定，指的是一系列的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF的抗体以及确定的r84抗体。
如这里使用的术语“抗体”和“免疫球蛋白”广泛地指代任何包括人类抗原结合区的免疫学结合试剂或分子，包括多克隆和单克隆抗体。依据重链恒定区的类型，所有抗体被分为五个主要种类中的一种：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。这些中的几个进一步被分成亚类或同型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等等。与不同种类的免疫球蛋白相对应的重链恒定区被分别定义为α、δ、ε、γ和μ。已熟知不同类型的免疫球蛋白的亚单元结构和三维结构。
通常，当在发明中使用全抗体而不是抗原结合区时，优选是IgG和/或IgM，因为它们是生理环境下最常用的抗体以及因为它们在实验室环境中最容易制作。
根据抗体恒定域的氨基酸序列和可变区的骨架区的一些氨基酸，哺乳动物抗体的“轻链”被指定为两种明显不同类型中的一种：卡帕(κ)和拉姆达(λ)。在本发明中本质上没有优选地使用κ或λ轻链恒定区。
本领域技术人员将理解，由术语“抗体”构成的免疫学结合试剂延伸至所有的人类抗体和它们的抗原结合片段，包括全抗体，二聚、三聚和多聚抗体，双特异性抗体，嵌合抗体，重组和工程供体，以及它们的片段。
因此术语“抗体”用于指代任何具有抗原结合区的人类抗体样分子，并且该术语包括含有抗原结合区的抗体片段，如Fab′、Fab、F(ab′)2、单域抗体(DABs)、TandAbs二聚物、Fv、scFv(单链Fv)、dsFv、ds-scFv、Fd、线形抗体(linear antibody)、微抗体、双链抗体、双特异性抗体片段等等。
本领域熟知用于制备和使用多种基于抗体的结构和片段的技术(见Kabat等，1991，通过引用方式明确地结合在本文中)。特别地，双链抗体在EP404,097和WO93/11161中进一步描述，而线形抗体在Zapata等(1995)中进一步描述。
可以使用常规技术使抗体片段化。例如，F(ab′)2片段可以通过用胃蛋白酶处理抗体而得到。得到的F(ab′)2片段可以被处理以去除二硫键以产生Fab′片段。胃蛋白酶消化可以导致Fab片段的形成。Fab、Fab′和F(ab′)2、scFv、Fv、dsFv、Fd、dAbs、TandAbs、ds-scFv、二聚物、微抗体、双链抗体、双特异性抗体片段和其它片段同样可以通过重组技术合成或者化学合成。本领域已经知道并描述了用于产生抗体片段的技术。例如，Beckman等，2006；Holliger和Hudson，2005；Le Gall等，2004；Reff和Heard，2001；Reiter等，1996；和Young等，1995中的每一个都进一步描述并能够产生有效的抗体片段。
人类抗体或抗体片段可以天然产生或可以完全地或部分地合成制成。因此，抗体可以来自任何合适来源，例如重组来源和/或在转基因动物或转基因植物中或使用IgY技术在卵中制造。因此，抗体分子可以在体外或体内制造。
优选地，人类抗体或抗体片段包括含有三个CDR区的抗体轻链可变区(VL)和含有三个CDR区的抗体重链可变区(VH)。所述的VL和VH通常形成抗原结合位点。
“Fv”片段是包含完全抗原识别和结合位点的最小的抗体片段。这个区具有一个重链和一个轻链可变区的紧密二聚体，非共价连接。在这个结构中，每个可变域的三个高变区(CDR)互相作用以界定VH-VL二聚物表面上的抗原结合位点。共同地，六个高变区(CDR)赋予抗体抗原结合特异性。
但是，在本领域中已充分证明来自抗体轻链可变区的三个CDR和来自抗体重链可变区的三个CDR的存在对于抗原结合并不是必需的。因此，比上面经典的抗体片段小的结构已知是有效的。
例如，骆驼科哺乳动物(camelid)抗体(Hamers-Casterman等，1993；Arbabi Ghahroudi等，1997)具有广泛的抗原结合能力(antigen bindingrepertoire)，但是缺少轻链。同样，包括单独的VH区(Ward等，1989；Davies和Riechmann，1995)或单独的VL区(van den Beucken等，2001)的单域抗体的结果显示出这些区可以结合至具有可接受的高亲合力的抗原。因此，三个CDR能够有效地结合抗原。
同样已知单一CDR或两个CDR能够有效地结合抗原。作为第一个实例，单一CDR可以插入至异源蛋白并在异源蛋白上赋予抗原结合能力，如通过显示VH CDR3区被插入至异源蛋白，如GFP，在异源蛋白上赋予抗原结合能力(Kiss等，2006；Nicaise等，2004)而例证。
已经进一步知道两个CDR能够有效结合抗原，甚至赋予比亲本抗体所具有的更好的性质。例如，已经显示(Qiu等，2007)，来自亲本抗体的两个CDR(VH CDR1和VL CDR3区)保留了母体分子的抗原识别性质但是具有更好的渗透肿瘤能力。用合适的连接序列(如来自VH FR2)连接这些CDR区以类似于天然亲本抗体的方式定位CDR，产生了甚至更好的抗原识别。因此，本领域已知可以构建结合抗原的抗体模拟物，该抗体模拟物包括以合适的骨架区方式定位的两个CDR区(优选地一个来自VH区，一个来自VL区，更优选地，两个CDR区之一是CDR3区)以保持在亲本抗体中发现的结构。
因此，尽管本发明的优选抗体可能包括6个CDR区(3个来自轻链，3个来自重链)，具有少于6个CDR区以及少至1或2个CDR区的抗体包括在本发明内。另外，同样考虑具有仅来自重链或轻链的CDR的抗体。
优选的本发明的结合至VEGF的抗体包括至少一个含有3个CDR的重链可变区和至少一个含有3个CDR的轻链可变区，其中所述的轻链可变区包括：
(a)具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的可变轻链(VL)CDR1；
(b)具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的VLCDR2；
(c)具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的VL CDR3。
优选的用于与特异的轻链CDR区结合的重链CDR区在本文其它地方描述。但是，同样考虑包括3个CDR的用于与本发明的轻链可变区结合的其它重链可变区。可以用于与本发明的轻链可变区结合的并且产生结合VEGF的抗体的合适的重链可变区可以由本领域技术人员容易地鉴别出。
例如，本发明的轻链可变区可以与单一的重链可变区或全套重链可变区结合，检测得到的抗体对VEGF的结合。可以预期，合理数量的本发明的轻链可变区与不同的重链可变区的这样的结合可以保留结合VEGF的能力。事实上，已经用本发明的优选抗体(r84/PGN311)证明了，其显示了这个抗体的VL区能够与几个不同的VH区结合，并仍然保留结合VEGF的能力。在这些实验中，被检测与r84抗体的VL区结合的7个VH区中的3个显示了与VEGF明显的结合，这是合理的比例并且是本发明的抗体的轻链可变区在决定VEGF结合特异性中尤其重要的证据，以及可以结合本发明的轻链可变区并产生结合VEGF的抗体的其它重链可变区能够容易鉴别的证据。用于结合本发明的抗体的轻链可变区的优选重链可变区是从已知的结合VEGF的抗体或抗体片段获得的或来源的那些。
类似的方法可以用于鉴别用于与本发明优选的重链可变区结合的可选择的轻链可变区。
在一些实施方式中，抗体或抗体片段包括所有或部分的重链恒定区，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgE、IgM或IgD恒定区。优选地，重链恒定区是IgG1重链恒定区，或它的一部分。此外，抗体或抗体片段可以包括κ轻链恒定区或λ轻链恒定区的全部或一部分，或它们的一部分。全部或部分这样的恒定区可以天然产生或可以全部或部分地合成。这样的恒定区的合适的序列是本领域熟知的并在现有技术中有记载的。当来自重链和轻链的完全补足的恒定区包括在本发明的抗体中时，这样的抗体在本文中典型地指代“全长”抗体或“完全”抗体。
当Fc区介导如ADCC和CDC效应功能，包含Fc区的抗体优选地为确定的用途，特别是体内治疗用途。
本文中使用的与氨基酸或核酸序列相关的术语“基本上一致”包括与公开的氨基酸和核酸序列具有至少70％或75％、优选至少80％和甚至更优选至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性的序列。因此本发明的基本上一致的序列包括本发明的序列的单一或多碱基或氨基酸变化(添加、取代、插入或缺失)。在组成本发明的序列的一个或多个骨架区和/或一个或多个CDR中，在氨基酸水平，优选地基本上一致的序列包含仅1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1或2个改变的氨基酸。所述的变化可以是保守的或非保守的氨基酸。优选地所述的变化是保守氨基酸取代。
基本上一致的核酸序列同样包括与公开的核酸序列(或它们的互补序列)杂交的核苷酸序列，如在至少适度严格杂交条件下，与编码一个或多个本发明的轻链或重链CDR、本发明的轻链或重链可变区、或本发明的抗体的核苷酸序列杂交(或与它们的互补序列杂交)。
术语“基本上一致”同样包括本发明的氨基酸和核苷酸序列的修饰或化学等效物，其以实质相同的方式表现与本发明的蛋白或核酸分子实质相同的功能。例如，任何基本上一致的抗体(或编码它的基本上一致的核酸)应当保留如上所述的结合VEGF的能力。优选地，任何基本上一致的结合蛋白应当保留特异结合如被所讨论的结合蛋白识别的相同VEGF抗原表位的能力，例如，如本文中描述的由本发明的CDR区或本发明的VH和VL区识别的同样的抗原表位。结合至相同的抗原表位/抗原可以由已知的和本领域所描述的方法很容易地检测，如使用结合实验，如竞争实验。
因此，本领域技术人员将意识到结合实验可以用于检测“基本上一致”的抗体是否具有与本发明的抗体和抗体片段相同的结合特异性，例如，如ELISA实验或Biacore实验的结合实验可以容易地用于确定这样的“基本上一致”的抗体是否可以结合VEGF。如以下列出的，竞争结合实验可以用于检测“基本上一致”的抗体是否保留特异结合与本发明抗体识别的基本上一样的VEGF抗原表位的能力。以下描述的方法仅是合适的竞争实验的一个例子。本领域技术人员将知道其它合适的方法和变化。
典型的竞争实验涉及在不同浓度的测试抗体(如实质上同源的抗体)的存在下，估测多种有效浓度的本发明的抗体与VEGF的结合。然后估测由测试抗体诱导的结合的抑制量。随着浓度的增加，表现出与本发明的抗体提高的竞争的测试抗体(即：渐增浓度的测试抗体导致结合至VEGF的本发明的抗体量相应的减少)是结合至实质上相同的抗原表位的证据。优选地，测试抗体明显降低了结合VEGF的本发明的抗体的量。优选地，测试抗体降低了结合VEGF的本发明的抗体的量至少大约80％。ELISA实验适于在这样的竞争实验中估测结合的抑制，但是其它合适的技术将是本领域技术人员熟知的。
本发明的蛋白的基本上一致的序列包括，但不限于，保守氨基酸取代；或例如不影响抗体VH、VL或CDR区的变化，例如，包括使用不同连接序列的scFv抗体或添加不影响抗原结合的标签序列或其它成分的抗体；或者使一种类型或形式的抗体分子或片段转变成另一种类型或形式的抗体分子或片段的变化(如从Fab转换成scFv，反之亦然)，或者从一种抗体分子到特定种类或亚类的抗体分子的转化(如，从抗体分子到IgG或它的亚类如IgG1或IgG3的转化)。
本文所使用的“保守氨基酸取代”是氨基酸残基用另一个具有相似侧链的氨基酸残基的取代。具有相似侧链的氨基酸家族已经在本领域中定义，包括碱性侧链(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(如甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支侧链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
可以用任何方便的方法估测同源性。但是，为检测序列之间的同源性程度，使多重序列比对的计算机程序是有用的，例如ClustalW(Thompson等，1994)。如果需要，Clustal W计算法可以与BLOSUM 62得分矩阵(Henikoff和Henikoff，1992)一起使用，空位开放罚分10，空位延伸罚分0.1，因此在序列之一的总长度的至少50％包括在比对中的两条序列之间获得最高顺序匹配。可以用于比对序列的其它方法是Needleman和Wunsch(1970)的比对方法，由Smith和Waterman(1981)修改，因此在两条序列之间获得最高顺序匹配并且在两条序列之间测量同样氨基酸的数目。其它计算两条氨基酸序列之间百分比同源性的方法通常是本领域验证过的，包括，例如，由Carillo和Lipton(1998)所描述的那些和在计算分子生物学，Lesk编，牛津大学出版社，纽约，1988生物计算学：信息学和基因组工程中描述的那些。
通常，将对这样的计算使用计算机程序。比较和比对成对序列的程序，如ALIGN(Myers和Miller，1988)、FASTA(Pearson和Lipman，1988；Pearson，1990)和空位的BLAST(Altschul等，1997)、BLASTP、BLASTN或GCG(Devereux等，1984)对于这个目的同样有用。此外，欧洲生物信息学研究所的Dali服务器提供蛋白序列的基于结构的比对(Holm，1993；1995；1998)。
为了提供参考点，根据本发明的具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列，序列同源性等可以使用默认参数的ALIGN程序测量(如在互联网上可用：在GENESTREAM网络服务器、IGH、Montpellier，法国)。
“至少适度严格的杂交条件”意味着挑选的在溶液中促进两条互补核酸分子选择性杂交的条件。杂交可以发生在全部或部分的核酸序列分子。杂交部分典型地至少15(如20、25、30、40或50)个核苷酸长度。本领域技术人员将认识到核酸双链或杂交产物的稳定性由Tm决定，在含钠的缓冲液中Tm是钠离子浓度和温度的函数(Tm＝81.5℃-16.6(Log10[Na+])+0.41(％(G+C)-600/l)，或相似的等式)。因此，在冲洗条件中决定杂交稳定性的参数是钠离子浓度和温度。为鉴别相似而不相同的分子，对于已知的核酸分子，可以假定1％的错配导致Tm降低1℃。例如，如果核酸分子发现有＞95％的同源性，最终的冲洗温度将降低大约5℃。基于这些考虑，本领域技术人员将能够容易地选择合适的杂交条件。在优选的实施方式中，选择严格的杂交条件。作为例子，可以使用以下条件来完成严格杂交：基于上述的等式，在Tm-5℃时在5x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)/5x Denhardt’s溶液/1.0％ SDS中杂交，接着在60℃时用0.2xSSC/0.1％ SDS冲洗。适度严格杂交条件包括在42℃在3xSSC中的冲洗步骤。作为进一步的例子，“杂交”的序列是那些在非严格条件(如室温时6xSSC，50％甲酰胺)下结合(杂交)以及在低严格度条件下(如2xSSC，室温；更优选地2xSSC，42℃)或在更严格度条件下(如2xSSC，65℃)(其中SSC＝0.15M，0.015M柠檬酸钠，pH7.2)冲洗的序列。
但是，应当理解，可以使用选择的缓冲液、盐和温度获得相等的严格度。关于杂交条件的附加的指导可以在现代分子生物学实验技术，JohnWiley和Sons，N.Y.，1989，6.3.1-6.3.6中以及在Sambrook等，分子克隆，实验手册，冷泉港出版社，1989，第3卷中发现。
一般而言，优选在高严格条件下杂交的序列，以及若不是因为密码的简并性将能够在高严格条件下杂交的序列。
在其它优选实施方式中，提供与最初的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体如r84相比，具有提高的或较好性能的第二代抗体。例如，第二代抗体可以具有更强的结合亲合力，更有效阻止VEGF与VEGFR2结合，更特异地阻止VEGF与VEGFR2结合，甚至更少地阻止VEGF与VEGFR1结合，提高的抑制VEGF诱导的内皮细胞的增殖和/或转移的能力，优异的抑制VEGF诱导的血管渗透性的能力，以及优选地，提高的抑制VEGF诱导的体内血管新生的能力，以及治疗包括血管瘤的血管新生疾病的能力。
鉴别有效的第二代抗体的比较是容易操作和量化的，例如，使用本文详细描述的多种试验中的一种或几种。与本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体、如由r84抗体所例证的比较，具有至少大约2倍、5倍、10倍、20倍以及优选地，至少大约50倍的提高的生物学性能或活性的第二代抗体包括在本发明中。
本发明的抗体、结合蛋白和核酸分子通常是“分离的”或“纯化的”分子，因此它们不同于人类或动物体内或源自人或动物体的组织样品内原位存在的任何这样的成分。但是，序列可以与在人或动物体内发现的序列相应或基本上一致。因此，本文使用的关于核酸分子或序列和蛋白质或多肽如抗体的术语“分离的”或“纯化的”指的是，从它们天然的环境中分离、纯化或实质上游离的这样的分子，如从人或动物体分离或纯化(如果事实上它们是天然存在的)，或指的是通过技术方法产生的这样的分子，即，包括重组体和合成产生的分子。
因此，当用于与核酸分子相关时，这样的术语可以指与和其天然相关的材料如其它核酸/基因或多肽实质上分离的核酸。这些术语同样可以指当通过重组DNA技术制备时实质上无细胞材料或培养基的核酸，或者当化学合成时实质上无化学前体或其它化学物的核酸。分离的或纯化的核酸同样可以是实质上无天然位于该核酸来源的核酸的侧翼的序列(即位于核酸5’和3’末端的序列)或者无通过例如基因工程使其连接在核酸侧翼的序列(如，标签序列或其它没有治疗价值的序列)。
因此，当用于与本发明的蛋白或多肽分子如轻链CDR1、2和3、重链CDR1、2和3、轻链可变区、重链可变区和结合蛋白或抗体(包括全长抗体)，术语“分离的”或“纯化的”典型地指实质上无来自其源自的原始材料的细胞材料或其它蛋白的蛋白。在一些实施方式中，特别是当蛋白用于对人或动物给药时，这样分离的或纯化的蛋白是当通过重组技术制备时无培养基的，或当化学合成时无化学前体或其它化学材料的。这样分离的或纯化的蛋白还可以是无侧翼序列，如在上面对分离的核酸分子所描述的。
本文使用的术语“核酸序列”或“核酸分子”指的是由天然存在的碱基、糖和糖之间的连接(骨架)组成的核苷或核苷酸单体的序列。该术语同样包括含有非天然存在的单体或它们的一部分的修饰的或取代的序列。本发明的核酸序列可以是脱氧核糖核酸序列(DNA)或核糖核酸序列(RNA)，并且可以包括天然存在的碱基，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。序列还可以包括修饰的碱基。这样修饰的碱基的例子包括氮杂(aza)和脱氮(deaza)腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶；以及黄嘌呤和次黄嘌呤。核酸分子可以是双链或单链。核酸分子可以是全部或部分地合成或重组。
本文使用的术语“人类”连同抗体分子和结合蛋白首先指分离自或源自人源库的或源自人类中(如在人类生殖或体细胞中)发现的序列或与人类中发现的序列对应的，具有可变区(如VH、VL、CDR或FR区)以及非必需的抗体恒定区的抗体和结合蛋白。r84抗体是这样的人类抗体分子的例子，其可变区从人源库中分离出。
本发明的“人类”抗体和结合蛋白进一步包括不是由人类序列编码的氨基酸残基，如通过体外随意或定点突变介导的突变，例如通过体外克隆或PCR介导的突变。这样的突变的详细的例子是包括抗体或结合蛋白在少量残基的保守取代或其它突变的突变，如在抗体或结合蛋白5、4、3、2或1个残基，优选地，例如在组成抗体或结合蛋白的一个或多个CDR的5、4、3、2或1个残基。这样“人类”抗体的确定的例子包括已经由标准的修饰技术改造以减少潜在的免疫位点的抗体和可变区。
因此，本发明的“人类”抗体包括源自人类中发现的序列的序列和与人类中发现的序列相关的序列，但是可能没有天然存在于体内人类抗体种系库中。此外，本发明的人类抗体和结合蛋白包括含有从人类序列中鉴定的人类共有序列、或与人类序列基本上一致的序列的蛋白。
此外，本发明的人类抗体和结合蛋白并不限于VH、VL、CDR或FR区的组合，VH、VL、CDR或FR区它们本身被发现组合在人类抗体分子中。因此，本发明的人类抗体和结合蛋白可以包括或相应于在人类中并不是必要天然存在的这样区的组合。
在优选实施方式中，人类抗体将是完全人类抗体。本文使用的“完全人类”抗体是包括如上面定义的“人类”可变区和/或CDR的抗体，没有实质上的非人类抗体序列或没有任何非人类抗体序列。例如，包括“没有实质上的非人类抗体序列”的人类可变区和/或CDR的抗体是其中仅大约5、4、3、2或1个氨基酸不是由人类抗体序列编码的抗体、区和/或CDR。因此，“完全人类”抗体不同于“人源化”抗体，“人源化”抗体是基于实质上非人类可变区，如鼠可变区，其中一些氨基酸已经被改变以更好地与典型地存在于人类抗体中的氨基酸相一致。
本发明的“完全人类”抗体可以是没有任何其它实质的抗体序列的人类可变区和/或CDR，如是单链抗体。可选地，本发明的“完全人类”抗体可以是结合在或可操作性地连接在一个或多个人类抗体的恒定区的人类可变区和/或CDR。确定的优选的完全人类抗体是具有IgG恒定区的全长互补序列的IgG抗体。
在其它实施方式中，本发明的“人类”抗体将是部分人类嵌合抗体。本文中使用的“部分人类嵌合”抗体是包括可操作性地连接至或嫁接至非人种类、如小鼠或者大鼠的恒定区的“人类”可变区和/或CDR的抗体。例如，可以将这样的部分人类嵌合抗体使用在临床前研究中，其中恒定区将优选是在临床前测试中使用的相同种类的动物的恒定区。这些部分人类嵌合抗体同样可以用在例如体外诊断中，其中非人类的恒定区可以提供抗体探测的另外选择。
本文使用的术语“片段”指的是生物学相关的片段，如对抗原结合有贡献的片段，如形成部分的抗原结合位点，和/或对VEGF抗原功能有抑制或降低的贡献，和/或对预防VEGF抗原与天然配体VEGFR2相结合有贡献。一些优选的片段包括本发明的抗体的重链可变区(VH区)和/或轻链可变区(VL区)。其它优选的片段包括一个或多个本发明的抗体的(或本发明的VH区的)重链CDR，或一个或多个本发明的抗体的(或本发明的VL区的)轻链CDR。确定的优选的片段是至少5个氨基酸长度，并且包括至少一个CDR区，优选地是CDR3区，更优选地是重链CDR3区。
在本发明的抗体包括任何定义的序列的片段(例如包括SEQ IDNO：21的片段)的实施方式中，如，是包括本发明的VH和/或VL区的抗体，或是包括本发明的一个或多个CDR的抗体或结合蛋白，然后这些区/域通常在抗体或结合蛋白之内被分开，因此每一个区/域可以表现出它的生物学功能，并且因此保留抗原结合的贡献。因此，VH和VL区优选地被合适的骨架序列/连接序列分开，CDR优选地通过合适的骨架区分开，合适的骨架区如在天然存在的抗体中和/或有效工程抗体中发现的那些。因此，本发明的VH、VL和个别的CDR序列优选地在合适的骨架之内提供或插入合适的骨架中以使得抗原结合。这样的骨架序列或区可以相应于天然存在的骨架区，FR1、FR2、FR3和/或FR4，因为适于形成合适的骨架，或者可以相应于共同骨架区，例如通过比较多个不同的天然存在的骨架区而鉴别的。可选地，可以使用非抗体骨架，如T细胞受体骨架。
可以用于骨架区的合适的序列是本领域熟知并有记载的，并且可以使用这些中的任何一个。优选的用于骨架区的序列是一个或多个组成本发明的VH和/或VL区的骨架区，即，一个或多个在SEQ ID NO：21或在表1中公开的骨架区，或者与其基本上一致的骨架区，以及特别地，允许抗原特异性保留的骨架区，例如导致实质上相同抗体或相同的抗体3D结构的骨架区。在一些优选实施方式中，在本发明的抗体中发现所有的四个可变轻链(SEQ ID NO：15、16、17和18)和/或可变的重链(SEQ IDNO：11、12、13和14)，视情况而定，SEQ ID NO：21的FR区(同样在表1中表示)，或与其基本上一致的FR区。
另外，尽管本发明的优选抗体是由本发明的VH、VL或CDR组成，应当注意，本发明的抗体同样包括一个或多个与不是本发明的其它VH、VL或CDR相结合的本发明的VH、VL或CDR，假设如上面概括的本发明的抗体或结合蛋白的VEGF结合特性仍然存在。
本文使用的术语“重链互补决定区”(“重链CDR”)指的是抗体分子的重链可变区(VH区)内的高变区。重链可变区具有三个CDR，从氨基端到羧基端依次命名为重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3。重链可变区同样有4个骨架区(从氨基端到羧基端FR1、FR2、FR3和FR4)。这些骨架区分开了CDR。
本文使用的术语“重链可变区”(VH区)指的是抗体分子的重链可变区。
本文使用的术语“轻链互补决定区”(“轻链CDR”)指的是抗体分子的轻链可变区(VL区)内的高变区。轻链可变区具有3个CDR，从氨基端到羧基端依次命名为轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3。轻链可变区同样具有4个骨架区(从氨基端到羧基端为FR1、FR2、FR3和FR4)。这些骨架区分开了CDR。
本文使用的术语“轻链可变区”(VL区)指的是抗体分子轻链可变区。
应当注意，当需要时，为了说明CDR的布置，本文遵循Kabat数据库(Kabat等，1991，通过引用明确地结合至本文)。
本领域技术人员将意识到，本发明的蛋白和多肽，如轻链和重链CDR、轻链和重链可变区、抗体、抗体片段和免疫偶联物可以以本领域已知的和描述的几种方法的任一制备，但是最优选地使用重组方法制备。
编码本发明的抗体的轻链和重链可变区的核酸片段可以以任何合适的方法得到或制备，如通过克隆或合成。这样的序列应当，例如，使用本领域已知的和描述的方法，通过克隆来自如人生殖系基因的合适序列，然后对生殖系序列做出任何必要的修饰以获得本发明的序列。可选择的和更有效的方法将是合成合适的轻链或重链可变区序列作为重叠引物，并使用引物延伸以获得全长序列。这个全长序列然后可以使用引物通过PCR进行扩增，该引物包含合适的酶切位点以用于进一步克隆和处理，如用于克隆至合适的表达载体。每个可变区5-7个重叠引物通常是充分的，因此使得这一技术非常有效和准确。
一旦已经获得编码本发明的抗体的轻链和重链可变区的核酸片段，这些片段可以进一步通过标准重组DNA技术制备，例如，将可变区片段转化成具有合适恒定区的全长抗体分子，或转化成本文别处讨论的抗体片段的特定形式，如Fab片段，scFv片段等。典型地，或作为这个进一步操作过程的一部分，编码本发明抗体分子的核酸片段通常是融合在合适的表达载体中以促进本发明的抗体的生产。
可能的表达载体包括但不限于粘粒、质粒或改良的病毒(如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，只要该载体与使用的宿主细胞相容。表达载体是“适于宿主细胞的转化”，这意味着表达载体包含本发明的核酸分子和基于用于表达的宿主细胞所选择的调控序列，这些序列有效地连接至核酸分子。有效地连接意思是核酸以能够使核酸表达的方式连接至调控序列。
因此本发明预期重组表达载体，其包含本发明的核酸分子或它的片段，以及用于由本发明的核酸分子编码的蛋白序列转录和翻译的必要的调控序列。
合适的调控序列可以源自多种来源，包括细菌的、真菌的、病毒的、哺乳动物的或昆虫的基因(例如，见在Goeddel，1990中描述的调控序列)。合适的调控序列的选取依赖于以下讨论的所选择的宿主细胞，并且可以容易地由本领域普通技术人员完成。这样的调控序列的例子包括：转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列，核糖体结合序列，包括翻译起始信号。另外，依赖于选择的宿主细胞和使用的载体，其它序列，如复制起点、额外的DNA限制性位点、增强子、和赋予转录可诱导性的序列可能融合至表达载体。
本发明的重组表达载体同样可以包含便于宿主细胞选择的选择性标记基因，其中宿主细胞转化或转染有本发明的重组分子。选择性标记基因的例子是编码蛋白的基因，如赋予对特定药物抵抗力的新霉素和潮霉素、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、萤火虫荧光素酶、或者免疫球蛋白或其部分如免疫球蛋白的Fc部分，优选IgG。选择性标记基因的转录通过选择性标记蛋白的浓度的变化监测，选择性标记蛋白如β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶或萤火虫荧光素酶。如果选择性标记基因编码的蛋白赋予抗生素抗性如新霉素抗性，转化细胞可以用G418筛选。已经融合选择性标记基因的细胞将存活，而其它细胞死掉。这使得显现和化验本发明的重组表达载体以及特别地测量突变对表达和表型的影响成为可能。选择性标记可以从感兴趣的核酸引进至分离的载体。
重组表达载体可以同样包含编码融合部分的基因，融合部分提供重组蛋白的增加的表达，重组蛋白增加的溶解性，和通过在亲和纯化中作为配体而有助于目标重组蛋白的纯化(例如可以存在能够纯化和/或鉴别的合适的“标签”，如组氨酸标签或myc标签)。例如，蛋白裂解位点可以添加至目标重组蛋白以使得重组蛋白从融合部分分离而随后纯化融合蛋白。典型的融合表达载体包括分别融合谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、或蛋白A至重组蛋白的pGEX(Amrad公司，墨尔本，澳大利亚)、pMal(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，皮斯卡塔韦，新泽西)。
重组表达载体可以引进至宿主细胞以产生转化的宿主细胞。术语“转化有”、“转染有”、“转化”和“转染”意味着包括通过本领域已知的许多可能的技术之一将核酸(例如载体)引进细胞中。本文使用的术语“转化的宿主细胞”意味着同样包括已经转化有本发明的重组表达载体的可以糖基化的细胞。原核细胞可以转化有核酸，通过，例如电穿孔或氯化钙介导的转化。例如，核酸可以通过常规技术引进哺乳动物细胞，例如磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-右旋糖苷介导的转染、脂质体、电穿孔或显微注射。用于转化和转染宿主细胞的合适的方法可以在Sambrook等1989和其它实验室教科书中找到。
合适的宿主细胞包括广泛多种的真核宿主细胞和原核宿主细胞。例如，本发明的蛋白可以在酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。其它合适的宿主细胞可以在Goeddel，1990中找到。另外，本发明的蛋白可以在原核细胞中表达，如大肠杆菌(Zhang等，2004)。
适于实现本发明的酵母和真菌宿主细胞包括，但不限于酿酒酵母、毕赤酵母属或克鲁维酵母酵母菌属和曲霉菌属的多个种。用于在酿酒酵母中表达的载体的例子包括pYepSec1(Baldari等，1987)，pMFa(Kurjan和Herskowitz，1982)，pJRY88(Schultz等，1987)，和pYES2(Invitrogen有限公司，圣地亚哥，加利福尼亚)。本领域技术人员熟知用于酵母和真菌转化的方案(见Hinnen等，1978，Ito等，1983，和Cullen等1987)。
适于实现本发明的哺乳动物细胞包括，其中：COS(如ATCC号CRL1650或1651)，BHK(如ATCC号CRL 6281)，CHO(ATCC号CCL 61)，HeLa(如ATCC号CCL 2)，293(ATCC号1573)和NS-1细胞。用于在哺乳动物细胞中指导表达的合适的表达载体通常包括启动子(如，源自病毒材料如多瘤病毒、腺病毒2、细胞巨化病毒或猿病毒40)，以及其它转录和翻译控制序列。哺乳动物表达载体的例子包括pCDM8(Seed，B.，1987)和pMT2PC(Kaufman等，1987)。
根据本文所提供的教导，可以同样很容易地实现用于将合适类型的表达载体引进植物、鸟类和昆虫细胞的启动子、终止子和方法。例如，在一个实施方式中，本发明的蛋白可以从植物细胞中表达(见Sinkar等，1987，评论了发根农杆菌载体的应用；同样见Zambryski等，1984，描述了用于植物细胞的表达载体的应用，其中，PAPS2022、PAPS2023和PAPS2034)。
适于实现本发明的昆虫细胞包括来自家蚕属、粉纹夜蛾或夜蛾种的细胞和细胞系。可用于在培养的昆虫细胞(SF9细胞)中蛋白表达的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等，1983)和pVL系列(Luckow和Summers1989)。一些适于本发明的重组蛋白的表达的杆状病毒-昆虫细胞表达系统在PCT/US/02442中描述。
可选地，本发明的蛋白同样可以在非人类转基因动物中表达，如大鼠、兔子、绵羊和猪(Hammer等，1985；Palmiter等，1983；Brinster等，1985；Palmiter和Brinster 1985和美国专利4,736,866)。
本发明的蛋白同样可以通过使用蛋白质化学中已知的技术通过化学合成制备，如固相合成(Merrifield(1964)；Frische等，1996)或者在均相溶液中合成(Houbenweyl，1987)。
包括偶联至其它分子如蛋白的本发明的抗体和蛋白的N-末端或C-末端融合蛋白可以通过重组技术通过融合而制备。得到的融合蛋白包括融合至本文所述的挑选的蛋白或标记蛋白或标签蛋白的本发明的抗体或蛋白。本发明的抗体或蛋白同样可以通过已知技术偶联至其它蛋白。例如，蛋白可以使用如在WO 90/10457中描述的异(基)双功能的含有硫醇的连接物连接，N-琥珀酰亚胺基-3-(2-硫代吡啶-丙酸酯)或者N-琥珀酰亚胺基-5-硫代乙酸酯。可以用于制备融合蛋白或偶联物的蛋白的例子包括细胞结合蛋白，如免疫球蛋白、荷尔蒙、生长因子、凝集素、胰岛素、低密度脂蛋白、胰高血糖素、内啡肽、铁转运蛋白、铃蟾肽、去唾液酸糖蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、红血球凝聚素和截短的myc。
不考虑制备第一种阻碍VEGFR2的抗VEGF抗体核酸片段的方式，更多合适的抗体核酸片段可以通过标准的分子生物学技术容易地制备。为了确认任何变异体、突变体或第二代阻碍VEGFR2的抗VEGF抗体的核酸片段适于在本发明中应用，核酸片段将被检测以确认依照本发明的阻碍VEGFR2的抗VEGF抗体的表达。优选地，变异体、突变体或第二代核酸片段将同样被监测以确认在标准的、更优选在标准严格杂交条件下的杂交。示范性的合适的杂交条件包括在大约50℃时在大约7％十二烷基硫酸钠(SDS)、大约0.5M NaPO4、大约1mM EDTA中杂交，并在大约42℃时用大约1％SDS清洗。
由于多种人类抗体可以容易地制备，本发明的治疗方法可以通过向动物或病患提供至少第一种核酸片段或分子而实行，其中第一种核酸片段或分子在病患中表达生物学有效量的至少第一种本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体。该“表达阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体的核酸片段或分子”将通常以至少表达构建体或载体的形式，以及可以以包括在病毒或重组宿主细胞中的表达构建体或载体的形式。优选的本发明的基因治疗载体将通常是病毒载体，如包括在重组逆转录病毒、单一疱疹病毒(HSV)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、细胞巨化病毒(CMV)等等。
因此，本发明进一步提供包括编码本发明的抗体的核苷酸序列的核酸片段或分子。同样包括与这样的序列基本上一致的核酸分子。优选的核酸分子编码SEQ ID NO：21描述的氨基酸。更优选的核酸分子包括SEQID NO：20所定义的核酸序列或与其基本上一致的序列。
进一方面提供了包括一个或多个本发明的核酸片段或分子的表达构建体或表达载体。优选地，表达构建体或载体是重组体。优选地，所述的构建体或载体进一步包括用于本发明的核酸分子编码的蛋白序列的转录和翻译的必要的调控序列。
进一方面提供了包括一个或多个本发明的表达构建体或表达载体的宿主细胞或病毒。同样提供的是包括一个或多个本发明的核酸分子的宿主细胞或病毒。表达本发明的抗体的宿主细胞或病毒形成了进一方面。
本发明的进一方面提供了制备本发明的抗体的方法，包括培养本发明的宿主细胞的步骤。优选的方法包括步骤：(i)在适于编码的抗体或蛋白表达的条件下，培养包括一种或多种本发明的重组表达载体或一种或多种本发明的核酸序列的宿主细胞；以及任选地(ii)从宿主细胞中或从生长培养基/上清液中分离抗体或蛋白。这样的制备方法同样可以包括抗体或蛋白产物纯化的步骤和/或将抗体或产物配制进包括至少一种添加成分，如药物学可接受的载体或赋形剂的组合物中。
在实施方式中，当本发明的抗体或蛋白由多于一种多肽链(如某些片段如Fab片段)组成时，然后所有的多肽优选地在宿主细胞中表达，来自相同或不同的表达载体，因此完全蛋白，如本发明的结合蛋白，可以在宿主细胞中组装并从其中分离或纯化。
本发明的抗体同样可以用于制备更多结合VEGF的抗体。这样的使用包括例如在亲本抗体的氨基酸序列中添加、缺失、取代或插入一个或多个氨基酸以形成新的抗体，其中所述的亲本抗体是如本文其它地方定义的本发明的抗体之一，并且检测得到的新抗体以鉴定对VEGF特异的抗体。这样的方法可以用于形成多种新抗体，这些新抗体全部可以被监测它们结合VEGF的能力。优选的所述的添加、缺失、取代或插入一个或多个氨基酸发生在一个或多个CDR区。
对亲本抗体的这样的修饰或突变可以使用本领域已知和记载的技术以任何适合的方式实现，例如通过实施随机或定点突变的方法。如果使用定点突变，然后一种为确定用于突变的合适的残基的策略利用结合蛋白-抗原复合物，如Ab-Ag复合物的晶体结构的解析，以确定结合抗原涉及的关键残基(Davies和Cohen，1996)。随后，这些残基可以被突变以增加相互作用。可选地，可简单地靶向用于定点突变的一个或多个氨基酸残基，并评估结合肿瘤细胞的效果。
随机突变可以以任何合适的方法实现，如，通过易错PCR，链改组或突变的大肠杆菌株。
因此，一个或多个本发明的VH区可以与来自任何合适来源的单一VL区或一组VL区结合，检测得到的新的抗体以鉴定对VEGF特异的抗体。相反地，一个或多个本发明的VL区可以与来自任何来源的单一VH区或一组VH区结合，检测得到的新抗体以鉴定对VEGF特异的抗体。例如，如上所述，已经显示本发明的优选的抗体(r84/PGN311)的VL区可以与几个不同的VH区结合，并仍然保留结合VEGF的能力。
相似地，本发明的VH和/或VL区的一个或多个，或优选所有的三个CDR可以适当地嫁接至单一VH和/或VL区或一组VH和/或VL区中，并检测得到的新抗体以鉴定对VEGF特异的抗体。
CDR的靶向突变，特别是轻链和/或重链的CDR3，已经显示出是用于增加抗体亲合力的有效和优选的技术。优选地，CDR3的3-4个氨基酸的区块或称为“热点”的特别区靶向用于突变。
“热点”是体内体细胞高突变发生的序列(Neuberger和Milstein，1995)。在一些密码子中，热点序列可以被定义为共有核苷酸序列。共有序列是四核苷酸，RGYW，其中R可以是A或G，Y可以是C或T，W可以是A或T(Neuberger和Milstein，1995)。此外，由核苷酸AGY编码的丝氨酸残基比那些由与潜在热点序列相关的TCN编码的丝氨酸残基突出地存在于可变区的CDR区(Wagner等，1995)。
因此，可以检查本发明的每一个抗体的重链和轻链CDR的核苷酸序列中热点序列和AGY密码子的存在。轻链和重链的CDR区的确定的热点然后可以使用国际免疫遗传学数据库(IMGT，http://imgt.cines.fr/textes/vquest/)(Davies等，1990)可选地比作重链和轻链的初始序列。与种系相同的序列暗示没有发生体细胞突变，因此，可以引进随机突变模仿体内发生的体细胞情况，或可选地，可以实现定点突变，如在热点和/或AGY密码子。相反地，不同的序列说明已经发生一些体细胞突变。仍将保留测定是否体内的体细胞突变是最佳的。
用于突变的优选的热点是编码暴露氨基酸(exposed amino acid)的那些，并且优选地是编码形成部分抗原结合位点的氨基酸的那些。用于突变的其它优选的热点是编码非保守氨基酸的那些。编码CDR内包埋氨基酸(buried amino acid)或保守氨基酸的热点优选不进行突变。这些残基通常在整个结构中是关键的，并且因为它们是被包埋的，不可能与抗原相互作用。
本领域技术人员熟知实现氨基酸和蛋白质结构域的上述处理的方法。例如，所述的处理可以便利地通过核酸水平的基因工程而实现，其中编码合适的结合蛋白及其结构域的核酸分子被修饰，以使得到的表达蛋白的氨基酸序列以合适的方式顺次被修饰。
检测一个或多个新抗体特异结合VEGF的能力可以通过任何合适的方法实现，这是本领域已知并记载的。VEGF样品是广泛可用的(见实施例)，并且这些可以容易地用于检测结合性，例如通过常规的方法，如ELISA，亲和层析法等。
通过这些方法制备的新抗体将优选地比其亲本抗体对VEGF具有更高的或提高的亲合力(或者至少相等的亲合力)，并且可以用如本文其它地方描述的本发明抗体的相同方法处理和使用(如治疗、诊断或在组合物中等)。
通过这些方法制备、获得或可获得的新抗体形成本发明的进一方面。
本发明进一步提供了包括至少一种本发明的人类抗体或抗体片段的组合物，可选地包括稀释剂。这样的组合物可以是制药学上可接受的组合物或在实验室研究中使用的组合物。就该药物组合物而言，它们可以优选地被配制成用于肠胃外给药，如用于静脉内给药，或用于眼睛给药。
本发明提供了许多方法和本发明的人类抗体和抗体片段的用途。涉及所有的方法，术语“一”(a)和“一”(an)用于表示在陈述的方法中“至少一个(种)”、“至少第一个(种)”、“一个(种)或多个(种)”或“多数”的步骤，除非有特别的说明。这与在治疗方法中的给药步骤特别相关。因此，不仅仅可以在本发明中使用不同的剂量，而且可以使用不同数目的剂量，如注射剂，等于并且包括多种注射剂。可以使用组合治疗，在施用抗VEGF治疗抗体之前、之后或之中给药。
提供具有重要生物学含义的本发明抗体的体外各种有用的方法和应用。首先提供的是结合VEGF的方法和在结合VEGF中的应用，通常包括用至少第一种本发明的阻碍VEGFR2的抗VEGF抗体或其结合抗原片段有效地接触包括VEGF，优选游离的(非受体结合)的VEGF的组合物。
提供探测VEGF的方法和在探测VEGF中的应用，通常包括，在使得VEGF/抗体复合物有效形成并探测如此形成的复合物的条件下，用至少第一种本发明的人类抗体或其结合抗原片段与怀疑含有VEGF的组合物接触。探测方法和应用可以与生物学样品一起使用，如用于血管新生和肿瘤的诊断学中的生物学样品，并同样提供基于此的诊断试剂盒。
本发明提供优先地或特异地抑制VEGF结合至VEGF受体VEGFR2的方法或在抑制VEGF结合至VEGF受体VEGFR2中的应用，通常包括在VEGF的存在下，在有效抑制VEGF结合至VEGF受体VEGFR2的条件下，用包括生物学有效量的至少第一种本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或其抗原结合片段的组合物接触一定数量的包括表达VEGFR2(KDR/Flk-1)的内皮细胞的细胞或组织。
提供明显抑制VEGF结合至VEGF受体VEGFR2，而不明显抑制VEGF结合至VEGF受体VEGFR1的方法和其中的应用。这些方法包括，在VEGF的存在下，在有效抑制VEGF结合至VEGF受体VEGFR2、而不明显抑制VEGF结合至VEGF受体VEGFR1的条件下，用包括生物学有效量的至少第一种本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或其抗原结合片段的组合物接触一定数量的包括表达VEGFR2(KDR/Flk-1)和VEGFR1(Flt-1)的内皮细胞群的细胞或组织。
本发明的进一步的方法和应用是分析命名为VEGFR2和VEGFR1的VEGF受体的生物学作用，包括步骤：
(a)用包括生物学有效量的至少第一种本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或其抗原结合片段的组合物，接触包括VEGF和表达VEGFR2(KDR/Flk-1)和VEGFR1(Flt-1)受体的细胞群的生物学组合物或组织；以及
(b)测量本发明的阻碍VEGFR2的抗VEGF抗体对VEGF的至少第一生物学反应的作用；其中
(i)在本发明的阻碍VEGFR2的抗VEGF抗体的存在下，生物学反应的改变是由VEGFR2受体介导的反应的指示；以及
(ii)在本发明的阻碍VEGFR2的抗VEGF抗体的存在下，生物学反应的保持是由VEGFR1受体介导的反应的指示。
提供包括特异抑制VEGF诱导的内皮细胞的增殖和/或转移的增殖抑制方法和应用，通常包括，在有效抑制VEGF诱导的内皮细胞增殖和/或转移的条件下，用含有生物学有效量的至少第一种本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或本发明的阻碍VEGFR2的抗VEGF抗体的抗原结合片段的组合物，接触一定数量的含有内皮细胞群和VEGF的细胞或组织。
同样提供抑制VEGFR2诱导的巨噬细胞功能的方法和其中的应用，通常包括，在有效抑制VEGFR2诱导的巨噬细胞功能的条件下，用含有生物学有效量的至少第一种本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或者抗VEGF抗体的抗原结合片段的组合物，接触一定数量的含有巨噬细胞和VEGF的细胞或组织。
前述的方法优选地应用在肿瘤的治疗中，其中所述方法抑制VEGFR2诱导的巨噬细胞功能，从而降低肿瘤浸润性巨噬细胞(tumorinfiltrating macrophage)的能力，其表达VEGFR2以促进肿瘤的进程和/或转移。
进一步提供抑制VEGF诱导的内皮细胞的增殖和/或转移，并且可选地抑制血管新生，而不明显抑制VEGFR1介导的破骨细胞或破软骨细胞的刺激的方法和其中的应用。所述方法通常包括，在有效抑制VEGF诱导的的内皮细胞增殖和/或转移或血管新生、而不明显抑制VEGFR1介导的破骨细胞或破软骨细胞的刺激的条件下，用含有生物学有效量的至少第一种本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或该抗体的抗原结合片段的组合物接触一定数量的含有内皮细胞和破骨细胞或破软骨细胞至少之一的细胞或组织。
在后面的情形中，前述的方法和应用可以在体外或体内实行，其中组织或细胞定位在动物体内并且将人类抗VEGF抗体给药于动物。在两个情形中，所述方法和应用成为用于抑制血管新生的方法和应用，包括在有效抑制血管新生的条件下，用含有生物学有效量的至少第一种本发明的阻碍VEGFR2的抗VEGF抗体或其抗原结合片段的抗血管新生组合物接触含有或一定数量的血管新生或潜在的血管新生血管的组织，即处于VEGF或潜在处于VEGF作用下的那些。
当许多潜在的血管新生的血管保持在体外时，本发明在药物发现程序中有作用。在抑制或促进血管新生的药物的开发中，以及在血管新生过程的进一步信息的描述中，作为第一步，具有可靠的阳性和阴性对照的体外筛选实验是有用的。当潜在的血管新生的血管定位在动物或病患体内，抗血管新生的组合物作为一种治疗形式对动物给药。
因此，就每一前述抑制方法而言，“生物学有效量”是本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体的量，其有效抑制VEGF诱导的内皮细胞的增殖和/或转移；抑制VEGF诱导的内皮细胞的增殖和/或转移，不明显抑制VEGFR1诱导的细胞学事件；抑制VEGF诱导的内皮细胞的增殖和/或转移或血管新生，不明显抑制破骨细胞或破软骨细胞的VEGFR1刺激；以及，全部地，以有效抑制血管生长或新生血管的方式减少血管内皮细胞的增殖和/或转移。
因此本发明提供抑制VEGF诱导的血管新生，以及优选地，治疗血管新生疾病而不明显抑制破骨细胞或破软骨细胞的VEGF刺激的方法和其中的应用。所述方法通常包括，在有效抑制VEGF诱导的血管新生和治疗血管新生疾病而不明显抑制破骨细胞或破软骨细胞的VEGF刺激的条件下，用含有生物学有效量的至少第一种本发明阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或该抗体的抗原结合片段的组合物接触一定数量的含有内皮细胞和破骨细胞或破软骨细胞至少之一的细胞或组织。
进一步提供抑制VEGF诱导的血管新生和优选地，治疗血管新生疾病、不对骨代谢引起明显副作用的方法及其应用。所述方法通常包括，在有效抑制VEGF诱导的血管新生和治疗血管新生疾病而通过不明显削弱破骨细胞或破软骨细胞的活性而对骨代谢不引起明显副作用的条件下，用含有生物学有效量的至少第一种本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或该抗体的抗原结合片段的组合物接触含有血管内皮细胞和破骨细胞或破软骨细胞至少之一的组织或一定数量的血管新生血管。
就具有任何疾病或失调、或处于任何疾病或失调的发展风险中的动物和病患而言，提供抗血管新生药物的筛选(体外)和治疗(体内)，其中所述任何疾病或失调通过不期望的、不适当的、异常的、额外的和/或病理的血管化而表征。本领域技术人员熟知，由于异常的血管新生发生在广泛范围的疾病和失调中，一旦在任何可接受的模型系统中显示出有效，给出的抗血管新生的治疗可以用于治疗整个范围的与血管新生相关的疾病和失调。
本发明的方法和应用特别地计划在动物和病患中使用，该动物或病患具有或处于以下疾病的发展风险中：任何形式的血管化肿瘤；黄斑变性，包括年龄相关性黄斑变性；关节炎，包括风湿性关节炎；动脉硬化症和动脉粥样硬化斑；糖尿病视网膜病和其它视网膜病；甲状腺增生，包括甲亢；血管瘤；新生血管性青光眼和牛皮癣。
本发明的方法和应用进一步计划用于动物和病患的治疗，该动物或病患具有或处于以下疾病的发展风险中：动静脉畸形(AVM)，脑膜瘤和血管再狭窄，包括血管成形术之后的再狭窄。其它治疗方法和应用的计划的目标是具有或处于以下疾病的发展风险中的动物或病患：血管纤维瘤、皮炎、子宫内膜异位、血友病性关节、增生瘢痕、炎性疾病和失调、化脓性肉芽肿、硬皮病、滑膜炎、沙眼和血管粘连。
如在美国专利5,712,291和6,524,583中所公开的，每一个都通过引用特别结合至本文，每一个前述的稍微优选的处理组决不是详尽类型的将要通过本发明处理的条件。美国专利5,712,291和6,524,583为一些特定目的通过引用结合至本文，包括鉴别许多通过抗血管新生的治疗可以有效处理的其它条件的目的；一旦已阐释的种类的抑制血管新生的化合物已经被公开并被要求保护(在本案中，本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体)，显示所有血管新生疾病的治疗代表统一的概念的目的；以及显示所有新生血管疾病的治疗可以通过仅来自单一模型系统的数据而实现的目的。
在另一方面，并且如同在美国专利5,712,291和6,524,583中所公开的，每一个通过引用的方式结合至本文，本发明的方法和应用计划用于动物和病患的治疗，该动物和病患具有或处于以下疾病的发展风险之中：维管组织的异常增殖、酒糟鼻、获得性免疫缺陷综合症、动脉闭塞、过敏性角膜炎、细菌性溃疡、白塞式病、血源性肿瘤、颈动脉阻塞性疾病、化学烧伤、脉络膜新生血管、慢性炎症、慢性视网膜脱离、慢性葡萄膜炎、慢性玻璃体炎、隐形眼镜过度磨损、角膜移植排斥、角膜新生血管、角膜移植新生血管、克罗恩氏病、伊尔斯病、流行性角膜结膜炎、真菌性溃疡、单纯疱疹病毒感染、带状疱疹感染、高粘稠度综合症、卡波济肉瘤、白血病、脂肪变性、莱姆病、边缘角蛋白溶解(marginal keratolysis)、蚕食性角膜溃疡、分支杆菌感染除了麻风病、近视、眼部新生血管疾病、视凹、奥斯勒-韦伯综合病症(奥斯勒-韦伯-朗迪、骨关节炎、佩吉特病、睫状体扁平部炎、类天疱疹、泡性角结膜炎(phylectenulosis)、多动脉炎、激光后并发症、原生动物感染、弹性纤维假黄瘤、翼状胬肉干燥性角膜结膜炎、放射状角膜切开术、视网膜血管新生、早产儿视网膜病变、晶体后纤维增生症、结节病、巩膜炎、镰状细胞血症、Sogrens综合症、实体瘤、斯特格病、斯-琼氏综合症、上缘角膜结膜炎、梅毒、系统性狼疮、Terrien角膜边缘性变性、弓形体病、外伤、尤文氏瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、眼癌、横纹肌肉瘤、溃疡性结肠炎、血管阻塞、维生素A缺乏和韦格纳肉状瘤。
本发明进一步提供治疗患有关节炎或处于关节炎的发展风险中的动物和病患的方法和应用，与美国专利5,753,230中描述的使用免疫制剂的关节炎的治疗一样，其通过引用的方式特定地结合至本文。美国专利5,972,922同样通过引用的方式特定地结合至本文，以甚至进一步例证抗血管新生策略在如下疾病相关的不期望的血管新生治疗中的应用：糖尿病、寄生虫病、异常创伤康复、手术后肥大、烧伤、受伤或外伤、毛发生长抑制、排卵和黄体形成的抑制、移植抑制和子宫中胚胎发育的抑制。因此，所有前述情况考虑用于通过本发明的方法和应用的治疗。
美国专利5,639,757进一步通过引用方式特定结合至本文以例证抗血管新生策略在移植排斥的一般治疗中的应用。使用基于VEGF抑制的抗血管新生策略的肺炎、肾病综合症、子痫前期、如与心包炎相关的心包积液和胸腔积液的治疗在WO98/45331中有描述，通过引用的方式特定地结合至本文。患有或处于上述情形的发病风险的动物和病患因此预期用于通过本发明的方法和应用的治疗。
如在WO98/16551(通过引用的方式特定地结合至本文)中描述的，拮抗VEGF功能的生物学分子同样适于用在治疗通过不期望的血管渗透而表征的疾病和失调中。因此，本发明的拮抗VEGF的抗体、方法和应用适用于治疗患有通过不期望的血管渗透表征的疾病和失调或处于通过不期望的血管渗透表征的疾病和失调的发展风险中的动物和病患，其中所述疾病和失调如与脑瘤相关的水肿、与恶性肿瘤相关的腹水、梅格综合症、肺炎、肾病综合症、心包积液和胸腔积液等等。
尽管所有上述疾病的治疗在统一的本发明中可以实现，本发明的方法和应用的特别优选的方面是对患有以下疾病或处于以下疾病的发展风险中的动物和病患使用抗血管新生的治疗：血管实体瘤、转移性肿瘤或来自原发性肿瘤的转移。
进一步提供抑制VEGF诱导的血管新生，和优选地发挥抗肿瘤或改进的抗肿瘤效果而不明显抑制破骨细胞或破软骨细胞的VEGF刺激的方法和其中的应用。方法通常包括，在有效抑制VEGF诱导的血管新生及发挥抗肿瘤或改进的抗肿瘤效果而不明显抑制破骨细胞或破软骨细胞的VEGF刺激的条件下，用含有生物学有效量的至少第一种本发明阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或该抗体的抗原结合片段的组合物接触含有血管内皮细胞和巨噬细胞、破骨细胞或破软骨细胞至少之一的组织、肿瘤环境或一定数量的血管新生血管。因此本发明进一步提供治疗与血管新生相关的疾病的方法和其中的应用，该疾病包括与血管新生相关的所有形式的癌症，包括对患有这样的疾病或癌症的动物或病患施用治疗上有效量的至少第一种药物组合物，该药物组合物包括本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或这样的抗VEGF抗体的抗原结合片段或免疫偶联物。
此外，本发明的方法和应用包括用于抑制淋巴管新生的方法和应用，其包括在有效抑制淋巴管新生的条件下，用抗血管新生的组合物接触含有淋巴管的组织或一定数量的淋巴管(淋巴管)，特别是处于VEGF或者潜在处于VEGF作用下的淋巴管，其中所述抗血管新生的组合物包括生物学有效量的至少第一种本发明的阻碍VEGFR2的抗VEGF抗体，或其抗原结合片段。
当很多淋巴管保留在体外时，本发明在药物发现过程中有作用。当淋巴管定位在动物或病患中时，本发明的组合物以治疗的形式对动物施用。
就抑制淋巴管新生而言，“生物学有效量”是有效抑制VEGF诱导的淋巴管新生的本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体的量，即VEGF-A刺激由VEGFR2诱导的淋巴管新生。优选地，VEGF诱导的淋巴管新生将被诱导没有明显抑制VEGFR1刺激的情形，如破骨细胞或破软骨细胞刺激。
因此办发明包括治疗与淋巴管新生相关的疾病的方法和其中的应用，该疾病包括与淋巴管相关的所有形式的癌症，包括对患有这样疾病或癌症的动物或病患施用治疗上有效量的至少第一种药物组合物，该药物组合物包括本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体，或这样的抗VEGF抗体的抗原结合片段或免疫偶联物。
本发明的进一方面提供了本发明的人类抗体或这样的抗体的抗原结合片段或免疫偶联物在制备用于治疗、成像或诊断的组合物或药物中的应用。
进一方面提供了用于治疗、诊断或成像的本发明的人类抗体或这样的抗体的抗原结合片段或免疫偶联物。
此外，本发明提供了含有本发明的人类抗体或这样的抗体的抗原结合片段或免疫偶联物和一种或多种制药学上可接受的赋形剂、载体、稀释剂、缓冲液或稳定剂的组合物。
如本文所描述的体内方法通常在哺乳动物中实现。可以治疗任何哺乳动物，如人和任何家畜、家养的或实验室动物。详细的例子包括小鼠、大鼠、猪、猫、狗、绵羊、兔子、母牛和猴子。但是优选地，哺乳动物是人。
因此，本文使用的术语“动物”或“病患”包括任何哺乳动物，例如人和任何家畜、家养的或实验室动物。详细的例子包括小鼠、大鼠、猪、猫、狗、绵羊、兔子、母牛和猴子。但是优选地，动物或病患是人体。
本发明连接使用无偶联的或裸抗体和其片段的抗血管新生的方法和使用免疫偶联物的靶向血管的方法，在免疫偶联物中本发明的人类抗体或其抗原结合片段有效地连接至治疗试剂上。除非有其它明确的陈述或在科学术语学中清楚定义，本文使用的术语“抗体和其片段”因此意思是“无偶联或裸”人类抗体或片段，没有连接至另一试剂，特别是治疗试剂或诊断试剂。这些定义没有排除抗体的修饰，如，仅作为例子，为提高抗体的生物半衰期、亲合力、强度或其它性质的修饰或抗体与其它效应物的结合。
本发明的抗血管新生的治疗的方法和应用同样包括无偶联和裸抗体和免疫偶联物的应用。在基于免疫偶联物的抗体血管新生的治疗方法中，本发明的人类抗体，或其抗原结合片段，优选地有效地连接至第二个抗血管新生试剂(抗VEGF抗体本身是第一个抗血管新生试剂)。所连接的抗血管新生试剂可以是具有直接或非直接抗血管新生效果的那些。
抗血管新生的治疗方法和应用包括对患有与血管新生相关的疾病的动物或病患施用治疗学有效量的第一种药物组合物，其中所述疾病包括与血管新生相关的所有形式的癌症，药物组合物包括至少第一种本发明的无偶联或裸的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或其抗原结合片段。同样地，所施用的抗体可以有效地与第二个抗血管新生试剂结合。
治疗转移癌的方法和其中的应用包括对患有转移癌的动物或病患施用治疗上有效量的至少第一种药物组合物，该药物组合物包括至少第一种本发明的无偶联或裸的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或其抗原结合片段。更多的方法是其中所施用的抗体可以有效地与第二个抗血管新生试剂结合的那些。
减少从原发性癌症转移的方法和其中的应用包括对患有原发性癌症或因原发性癌症而进行治疗的动物或病患施用治疗上有效量的至少第一种本发明的无偶联或裸的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或其抗原结合片段。相似地，所施用的抗体可以有效地与第二个抗血管新生试剂结合。
治疗血管新生相关的疾病，包括与血管新生相关的所有形式的癌症的方法和应用进一步包括以在疾病位点或血管肿瘤内抑制血管新生的有效量，对患有这样疾病如血管瘤的动物或病患施用至少第一种本发明的无偶联或裸的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或其抗原结合片段。相等地，所施用的抗体可以有效地与第二个抗血管新生试剂结合。
治疗与血管新生疾病相关的疾病，包括与血管新生相关的所有形式的癌症的方法和其中的应用进一步包括以抑制VEGF结合至VEGF受体VEGFR2(KDR/Flk-1)的有效量，对患有这样疾病或癌症的动物或病患施用至少第一种本发明的无偶联或裸的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或其抗原结合片段，从而在疾病或癌位点内抑制血管新生。所施用的抗体可以可选地有效地与第二个抗血管新生的试剂结合。
治疗与血管新生相关的疾病，包括与血管新生相关的所有形式的癌症的方法和其中的应用同样包括对患有血管肿瘤的动物或病患施用治疗上有效量的至少第一种本发明的无偶联或裸的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或其抗原结合片段，其中抗VEGF抗体实质上抑制VEGF结合至VEGF受体VEGFR2(KDR/Flk-1)而不明显抑制VEGF结合至VEGF受体VEGFR1(Flt-1)。相等地，所施用的抗体可以有效地与第二个抗血管新生试剂结合。
进一步治疗与血管新生相关的疾病，包括与血管新生相关的所有形式的癌症的方法和其中的应用包括对患有这样的疾病、癌症或血管瘤的动物或病患施用治疗上有效量的至少第一种本发明的无偶联或裸的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或其抗原结合片段；其中抗VEGF抗体实质上抑制VEGF结合至VEGF受体VEGFR2(KDR/Flk-1)而不明显抑制VEGF结合至VEGF受体VEGFR1(Flt-1)，因此在动物中在疾病位点、癌症或血管瘤之内抑制血管新生而不明显削弱VEGFR1介导的情形。所施用的抗体同样可以有效地与第二个抗血管新生试剂结合。
治疗与血管新生相关的疾病，包括与血管新生相关的所有形式的癌症的其它方法和其中的应用包括对患有这样的疾病、癌症或血管瘤的动物或病患施用治疗上有效量的至少第一种本发明的无偶联或裸的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或其抗原结合片段。其中抗VEGF抗体实质上抑制VEGF结合至VEGF受体VEGFR2(KDR/Flk-1)而不明显抑制VEGF结合至VEGF受体VEGFR1(Flt-1)，因此在疾病位点、癌症或血管瘤内抑制血管新生，包括在疾病位点中抑制表达VEGFR2的巨噬细胞，特别是表达VEGFR2的肿瘤浸润性巨噬细胞。所施用的抗体同样可以有效地与第二个抗血管新生试剂结合。
仍然进一步的治疗与血管新生相关的疾病，包括与血管新生相关的所有形式的癌症的方法和其中的应用包括对患有这样的疾病、癌症或血管瘤的动物或病患施用治疗上有效量的至少第一种本发明的无偶联或裸的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或其抗原结合片段。其中抗VEGF抗体实质上抑制VEGF结合至VEGF受体VEGFR2(KDR/Flk-1)而不明显抑制VEGF结合至VEGF受体VEGFR1(Flt-1)，因此在疾病位点、癌症或血管瘤内抑制血管新生而不明显削弱动物中的破骨细胞和/或破软骨细胞的活性。平等地，所施用的抗体可以有效地与第二个抗血管新生试剂结合。
治疗与血管新生相关的疾病，包括与血管新生相关的所有形式的癌症的方法和其中的应用进一步包括以在疾病位点或血管瘤内抑制血管新生而没有产生对骨代谢明显的副作用的有效量，对患有这样的疾病如血管瘤的动物或病患施用至少第一种本发明的无偶联或裸的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或其抗原结合片段。
前述的抗血管新生的治疗方法和应用将通常包括对动物或病患全身性地施用制药学有效的组合物，如通过透皮的、肌肉的、静脉注射等等。但是，可以接受能够使治疗试剂停留在包括肿瘤或瘤内血管内皮细胞的血管新生的位点或位置的任何治疗途径。因此，其它合适的递送途径包括口服的、直肠的、鼻的、表皮的和阴道的。出于包括进一步描述所包括的与治疗血管新生的疾病或失调相关的多种治疗途径的目的，通过引用的方式将美国专利5,712,291明确地结合至本文。
对于关节炎的治疗的应用和方法，如可以使用滑膜内给药，如在美国专利5,753,230中对其它免疫学试剂的描述，该专利通过引用的方式结合至本文。对于与眼睛相关的情况，眼部制剂和给药是预期的。
本文使用的“给药”意思是以有效发挥抗血管新生和/或抗肿瘤的效果的量和时间供应或递送阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体治疗。通常优选的是蛋白质的治疗的被动给药，部分地，出于它的简单和再现性。
但是，术语“给药”在这里用于指任何和所有的方法，通过其本发明的阻碍VEGFR2的抗VEGF抗体被递送或别的方式提供至肿瘤脉管系统。因此“给药”包括以有效导致递送至肿瘤的方式提供产生本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体的细胞。这样的实施方式中，期望在选择性的渗透膜、结构或可植入的装置中制备或包裹细胞，通常是可以移走以结束治疗的一种。外源的本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体将仍然通常是优选的，因为这代表了能够严密监控和控制剂量的非入侵的方法。
本发明的治疗方法和应用同样扩展至以有效导致它们在肿瘤附近表达或它们定位至肿瘤的方式提供核酸，其中该核酸编码本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体。可以使用任何基因治疗技术，如裸DNA递送，重组基因和载体，基于细胞的递送，包括病患细胞的体外处理，等等。
在进一步实施方式中，本发明提供用于递送选择的治疗或诊断试剂至疾病相关的新生血管的方法和其中的应用。这样的实施方式优选用于递送选择的治疗或诊断试剂至肿瘤或肿瘤内脉管系统或基质，并且包括对患有血管肿瘤的动物或患者施用生物学有效量的含有至少第一种免疫偶联物的组合物，在该免疫偶联物中，诊断或治疗试剂有效地连接至本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或其抗原结合片段。
尽管为了实施这样的实施方式并不需要理解本发明的目标方面之下的作用机理，应当认为本发明的抗体通过结合与在血管新生和肿瘤脉管系统上表达的VEGFR1结合的VEGF的优势，将递送所附的试剂至血管新生和肿瘤脉管系统。本发明的这些方法和应用因此涉及递送选择的治疗或诊断试剂至血管新生血管、肿瘤或肿瘤内脉管系统，并且包括对需要治疗的动物或病患施用生物学有效量的含有免疫偶联物的组合物，其中在该免疫偶联物中，诊断或治疗试剂有效地连接至至少第一种本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或其抗原结合片段，以有效使得抗体结合至与在血管新生血管、肿瘤或肿瘤内脉管系统表达、过量表达或上调的VEGFR1结合的VEGF上的方式，因此递送诊断或治疗试剂至血管新生血管、肿瘤或肿瘤内脉管系统上的VEGF-VEGFR1。
将选择的治疗试剂递送至肿瘤或肿瘤内脉管系统或基质表现出阻止血液流动，或特别地，阻止血液在肿瘤脉管系统中流动；破坏，或特别地破坏肿瘤脉管系统；以及诱导坏死，或特别地在肿瘤中的坏死。这些方法和应用因此可以总结为治疗患有血管肿瘤的动物或病患的方法，包括对动物或病患施用治疗上有效量的至少第一种含有至少第一种免疫偶联物的药物学组合物，其中免疫偶联物包括有效连接至治疗试剂的本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或其抗原结合片段。
在本发明中使用的“治疗上有效量”是本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或其免疫偶联物的有效量，这个有效量特别地杀死至少一部分肿瘤或肿瘤内血管内皮细胞；特别地在至少一部分肿瘤或肿瘤内血管内皮细胞中诱导细胞凋亡；特别地在至少一部分肿瘤或肿瘤内血管内血管中促进凝血；特别地阻塞或破坏至少一部分肿瘤的血液传输管；特别地在至少一部分肿瘤中诱导坏死；和/或在对选择的动物或病患给药的基础上诱导肿瘤退化或好转。这样的效果在以下情形中实现：表现出很少或没有结合至、或很少或没有致死正常的健康组织中的血管内皮细胞；在健康的正常组织中的血管很少或没有凝血、阻塞或破坏；以及动物或病患的正常的健康组织上产生可以忽略或可以处理的副作用。
因此，在本文中在肿瘤脉管系统中促进凝血或破坏肿瘤脉管系统的情况下，和/或在结合肿瘤基质和/或引起肿瘤坏死的情况下使用的术语“优选的”和“特定的”意思是本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或其免疫偶联物起完成充分地限制在肿瘤基质、脉管系统和肿瘤位置的基质结合、凝血、破坏和/或肿瘤坏死的作用，并且实质上不扩延以引起动物或病患的正常的健康组织的凝血、破坏和/或组织坏死。因此健康的细胞和组织的结合和功能通过本发明的处理实质上保持未被破坏。
尽管本发明的抗体通过结合至VEGFR1相关的VEGF而有效地递送试剂至血管新生和肿瘤脉管系统，其它的方法和应用以递送治疗试剂至肿瘤基质为基础进行操作，其中它发挥对邻近的血管的治疗效果。这些方法和应用包括，以在肿瘤基质之内有效结合免疫偶联物至非受体结合的VEGF的量，对患有血管肿瘤的动物或病患施用免疫偶联物，该免疫偶联物包括有效连接至至少第一种本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或其抗原结合片段的治疗试剂。
这些方法和应用包括，以有效局限免疫偶联物在肿瘤基质内的量，对患有血管肿瘤的动物或病患施用免疫偶联物，该免疫偶联物包括有效连接至至少第一种本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或其抗原结合片段的治疗试剂，使得所连接的治疗试剂表现出对周围肿瘤脉管系统和/或肿瘤细胞的抗肿瘤效果。
因此本发明的抗体和组合物，以及方法和应用延伸至含有阻碍VEGFR2的抗VEGF抗体的组合物，该阻碍VEGFR2的抗VEGF抗体包括有效连接至至少第一种治疗或诊断试剂的、至少第一种本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或其抗原结合片段，更具体地，第一种“不同的或外源的”治疗试剂。在这点上，“阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体”可以本身被定义为“第一种治疗试剂”。因此，任何所连接的治疗试剂可以被定义为第一种“不同的或外源的治疗试剂”，意思是它同样是治疗试剂，但是不同于并连接至阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体。对于这样的偶联物的相等的术语学是描述至少第一种本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或其抗原结合片段，有效地连接至至少“第二种、不同的”治疗或诊断试剂。
本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或治疗偶联物有效地连接至一种或多种放射治疗试剂、抗血管新生试剂、诱导细胞凋亡试剂、抗微管蛋白药物、抗细胞或细胞毒素试剂或凝血剂(凝血因子)。
本发明因此提供一系列的偶联的抗体和其片段，其中人类抗体有效地连接至至少第一种治疗或诊断试剂。术语“免疫偶联物”广泛用于定义抗体与另一种有效试剂的有效结合，并且并不意味着单独指代任何类型的结合，并且特别地并不限于化学“偶联”。特别预期重组的融合蛋白。只要递送或靶向试剂可以结合至目标和治疗或诊断试剂在递送时充分起作用，连接的方式将是合适的。
同样预期通过抗体上的碳水化合物部分的试剂的连接。糖基化，O-连接和N-连接，天然地发生在抗体中。如果需要，重组抗体可以被修饰以再产生或产生额外的糖基化位点，这可以简单地通过将合适的氨基酸序列(如天冬酰胺-X-丝氨酸、天冬酰胺-X-苏氨酸、丝氨酸或苏氨酸)设计成抗体的初级序列而完成。
目前优选的用在本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或治疗偶联物的试剂和相关的方法和应用是补充或提高抗体的效果的那些和/或选出用于特定肿瘤类型或病患的那些。“补充或提供抗体效果的治疗试剂”包括放射治疗试剂、抗血管新生试剂、诱导细胞凋亡试剂和抗微管蛋白药物，其中的任何一种或多种优选在这里使用。
优选的试剂与本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体的连接或结合提供了“免疫偶联物”，其中这样的偶联物通常具有提高的甚至增效的抗肿瘤的性质。以此方式应用的目前优选的抗血管新生的试剂是血管生成抑制素、内皮抑素、任何一种的促血管生成素、血管抑制素、血管能抑制素和乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂。目前优选的抗微管蛋白的药物包括秋水仙碱、紫杉醇、长春碱、长春新碱、长春地辛和一种或多种考布他汀。
抗细胞和细胞毒素试剂的应用导致本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体“免疫毒素”，但是凝血因子的应用导致了本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或“凝血配体”。同样预期至少两种治疗试剂的应用，如一种或多种放射治疗试剂、抗血管新生试剂、诱导细胞凋亡试剂、抗微管蛋白药物、抗细胞和细胞毒素试剂和凝血因子的联合。
在一些应用中，本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体治疗将有效地连接至具有杀死或抑制内皮细胞生长或细胞分裂能力的细胞毒素试剂、抑制细胞试剂或其它抗细胞试剂。合适的抗细胞试剂包括化学治疗试剂，如细胞毒素和细胞抑制剂。细胞抑制剂通常是那些扰乱靶细胞的正常细胞循环，优选地细胞从细胞循环中去除。
可举例的化学治疗试剂包括：类固醇；细胞因子；抗代谢物，如阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氨甲喋呤或氨喋呤；蒽环类；丝裂霉素C；长春花生物碱；抗生素；秋水仙胺；依托泊苷；光神霉素；和抗肿瘤烷化剂，如苯丁酸氮芥或美法仑。真正地，可以使用本文表C中公开的任何试剂。一些优选的抗细胞试剂是DNA合成抑制剂，如道诺霉素、阿霉素/阿霉素等等。全部的，紫杉醇/紫杉醇、多烯紫杉醇、顺铂、吉西他滨、考布他汀和阿霉素/阿霉素是目前优选的抗癌症试剂。
细胞因子和趋化因子中，目前优选试剂是IL-2、IL-12、TNF-α、α干扰素(IFN-α)、IFN-β、IFN-γ和LEC(肝脏表达的趋化因子)。V型ATP酶抑制剂同样是目前优选的，如salicylihalamide、刀豆素(concanamycin)或巴佛洛霉素(bafilomycin)，和蛋白合成抑制剂，如psymberin、岬毒素、irciniastatinA。
在一些治疗应用中，将优选毒素部分，由于与其它潜在的试剂相比，多数毒素的递送细胞杀死效果的能力更高。因此，一些本发明的用于阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体构建体优选的抗细胞试剂是植物源、真菌源或细菌源毒素。例证的毒素包括鬼臼素；细菌内毒素或细菌内毒素的脂质A部分；核糖体活性抑制蛋白，如皂素或白树毒素(gelonin)；a-八叠球菌；曲霉素；局限曲霉素；核糖核酸酶，如胎盘核糖核酸酶；白喉毒素和假单胞菌外毒素。目前优选的例子是蓖麻毒素、白树毒素、相思豆毒素、白喉、假单胞菌和百日咳毒素。
一些优选的毒素是A链毒素，如蓖麻毒素A链。最优选的毒素部分经常是已经经过修饰或除去碳水化合物残基处理的蓖麻毒素A链，因此称为“去糖基化A链”(dgA)。去糖基化的蓖麻毒素A链是优选的，因为它的强的效力、较长的半衰期，并且因为以临床分级和标准制造它在经济上是可行的。同样可以使用重组的和/或截短的蓖麻毒素A链。
对于肿瘤靶向和用免疫毒素治疗，出于甚至更进一步补充关于抗细胞和细胞毒素试剂的现有教导的目的，以下专利通过引用的方式特别地结合至本文：美国专利6,004,554、5,855,866、5,965,132、5,776,427、5,863,538、5,660,827和6,051,230。
本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体可以连接至抗微管蛋白药物。本文所使用的“抗微管蛋白药物”的意思是抑制细胞有丝分裂的任何试剂、药物、前药或它们的组合，优选地通过直接或间接抑制对于细胞有丝分裂必须的微管蛋白活性，优选地微管蛋白聚合或解聚作用。
目前优选的用于本文的抗微管蛋白药物是秋水仙碱；紫杉烷，如紫杉醇、多烯紫杉醇和紫杉醇(paclitaxel)；长春花生物碱，如长春碱、长春新碱和长春地辛；和考布他汀。典型的考布他汀是考布他汀A、B和/或D，包括A-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A-6、B-1、B-2、B-3、B-4、D-1和D-2和它们的前药形式。
本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体治疗可以包括能够促进凝血的成分，即凝血剂。这里，靶向抗体可以直接或间接地，如通过另一个抗体，连接至直接或间接刺激凝血的因子。
用于这样应用的优选的凝血因子是组织因子(TF)和TF衍生物，如截短的TF(tTF)，二聚的、三聚的、聚合的/多聚的TF，和突变的缺乏刺激因子VII的能力的TF。其它合适的凝血因子包括依赖维他命K的凝血剂，如因子II/IIa、因子VII/VIIa、因子IX/IXa和因子X/Xa；缺乏Gla修饰的依赖维他命K的凝血因子；鲁塞尔蝰蛇毒因子X催化剂；活化血小板化合物，如凝血氧烷A2和凝血氧烷A2合酶；和纤维蛋白溶解抑制剂，如α2-抗纤维蛋白溶酶。总体上，目前优选是截短的组织因子(tTF)。
用凝血配体(coaguligand)的肿瘤靶向和治疗在以下专利中描述，每一篇都出于进一步补充本发明的关于凝血配体和凝血因子的教导的目的，通过引用的方式特定地引用至本文：美国专利5,855,866、5,965,132、6,093，399、6,004,555、5,877,289和6,036,955。
免疫偶联物和免疫毒素的制备通常是本领域所熟知的(见，如美国专利4,340,535)。以下专利的每一篇都出于进一步补充本发明的关于免疫毒素的产生、纯化和使用的教导的目的，通过引用的方式结合至本文：美国专利6,004,554、5,855,866、5,965,132、5,776,427、5,863,538、5,660,827和6,051,230。
在免疫偶联物和免疫毒素的制备中，可以通过使用特定连接物获得优势。例如，含有空间“位阻的”二硫键的连接物通常是优选的，因为它们在体内具有更强的稳定性，因此在作用位点结合之前防止毒素部分的释放。通常期望在除了作用的预期位点之外在身体各处都可以发现的情况下，具有仍然保持完好的偶联物，在作用的预期位点期望偶联物具有好的“释放”特性。
依赖于所使用的特定的毒素化合物，可能有必要提供有效连接本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体和毒素化合物的间隔肽，其中间隔肽能够折叠成二硫键环结构。环内的蛋白裂解然后可以产生异二聚体多肽，其中抗体和毒素化合物仅通过单一的二硫键连接。
当利用一些其它的毒素化合物，可以提供非可裂解的间隔肽以有效连接本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体和毒素化合物。可以用于与非可裂解的间隔肽偶联的毒素是那些它们自己通过蛋白裂解转变成细胞毒素二硫键形式。这样的毒素化合物的例子是假单胞菌外毒素化合物。
多种化学治疗和其它药物学试剂同样可以成功地偶联至本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体治疗。已经偶联至抗体的典型的抗肿瘤试剂包括阿霉素、道诺霉素、氨甲喋呤和长春碱。此外，其它试剂如新制癌菌素、大分子霉素、三亚胺醌和α-蝇蕈素的连接已经被描述(见美国专利5,660,827、5,855,866和5,965,132，每一个都结合至本文)。
凝血配体的制备同样容易地实践。一个或多个凝血因子与本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体的有效的结合可以是直接连接，如上面对于免疫毒素描述的那些。可选地，有效结合可以是间接连接，如抗体有效地连接至结合凝血因子的第二结合区，优选地是抗体或抗体的抗原结合片段。凝血因子应当连接至本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体，在不同于它的功能性凝血位点的位置，特别是使用共价键连接分子的地方。
间接连接的凝血配体经常是基于双特异性抗体。双特异性抗体的制备同样是本领域熟知的。一种制备方法一方面包括对靶向的肿瘤成分具有特异性的抗体单独的制备，另一方面包括凝血剂的制备。然后产生来自两个挑选的抗体的消化性的F(ab′γ)2片段，接着通过每一个的还原产生分离的Fab′γSH片段。被连接的两个部分之一上面的SH基团然后用交联试剂烷基化，如次苯基二马来酰亚胺，以在一个部分上提供游离的马来酰亚胺基团。这个部分然后可以通过硫醚连接的方式连接至另一个，以形成期望的F(ab′γ)2异源偶联物(Glennie等，1987)。同样可以实行其它的方法，如与SPDP或蛋白A交联。
在免疫偶联物、免疫毒素和凝血配体的制备中，可以使用重组表达。编码选择的本发明阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体和治疗试剂、毒素或凝血剂的核酸序列连接在表达载体的框内。因此重组表达导致核酸翻译以产生期望的免疫偶联物。化学交联物和抗生物素蛋白：生物素桥同样可以结合治疗试剂至本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体。
以下专利每一个都通过引用的方式结合至本文，出于进一步补充本发明的关于凝血配体的制备、纯化和应用的教导的目的，包括双特异性抗体凝血配体：美国专利5,855,866、5,965,132、6,093,399、6,004,555、5,877,289和6,036,955。
具有放射性治疗试剂、抗血管新生试剂、诱导细胞凋亡试剂、抗微管蛋白药物、毒素和凝血剂的免疫偶联物，不管其通过化学偶联或重组表达而形成，可以使用生物学上可释放的键和/或选择性可裂解的间隔序列或连接物。这样的化合物在循环中优选地相当稳定并且优选地或特定地在递送到疾病或肿瘤位点上时释放。
一些优选的例子是酸敏感的间隔序列，其中特别预期本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体连接至秋水仙碱或阿霉素。其它优选的例子是含有肽酶和/或蛋白酶的裂解位点的肽连接物，该肽酶和/或蛋白酶特定地或优先地在疾病位点存在或有活性，如肿瘤环境。将免疫偶联物递送至疾病或肿瘤位点导致裂解和凝血因子相关地特定释放。
特定优选含有尿激酶、尿激酶原、血纤维蛋白溶酶、血纤维蛋白溶酶原、TGFβ、葡激酶、凝血酶、因子IXa、因子Xa或金属蛋白酶(MMP)，如间质胶原酶、白明胶酶或基质分解素的裂解位点的肽连接物，如在美国专利5,877,289和6,342,221描述和实现的，每一篇专利都出于这样的目的通过引用的方式结合至本文。
本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体同样可以被衍生化以引进使得治疗试剂通过生物学上可释放的键连接的官能团。因此靶向抗体可以被衍生化以引进以酰肼、肼、初级胺或次级胺基团作为末端的侧链。治疗试剂可以通过Schiff碱连接、腙或酰腙键或酰肼连接物连接(美国专利5,474,765和5,762,918)。
不管是初级的抗血管新生还是基于靶向血管，本发明的组合物和方法可以与其它的治疗法和诊断法一起使用。就生物学试剂而言，优选地是诊断或治疗试剂，用于与根据本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体“联合”使用，术语“联合”简明地用于包括一系列的实施方式。除非有其它特别陈述或从科学术语学中清楚表明，“联合”术语应用于多种形式的联合的组合物、医药品、鸡尾酒、试剂盒、方法和第一或第二医药用途。
因此本发明的“联合的”实施方式包括，例如，本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF是裸抗体，并且与没有有效与其连接的试剂或治疗试剂联合使用。在这样的例子中，试剂或治疗试剂可以以非靶向或靶向的形式使用。在“非靶向形式”中，试剂，特别是治疗试剂，将通常根据它们在本领域中的常规用法使用。在“靶向形式”中，试剂将通常有效地连接至不同的抗体或靶向区，递送试剂或治疗试剂至血管新生疾病位点或肿瘤。这样的靶向形式的生物学试剂，治疗试剂和诊断试剂的应用，在本领域中同样十分常规。
在本发明的其它“联合的”实施方式中，本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体是免疫偶联物，其中抗体是它本身与试剂或治疗试剂有效地连接或结合。有效地连接包括如在本文中所描述的或本领域已知的所有形式的直接或间接的连接。
“联合的”应用，特别是本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体与治疗试剂的联合，同样包括联合的组合物、医药品、鸡尾酒、试剂盒、方法和第一或第二医药用途，其中治疗试剂是以前药的形式。在这样的实施方式中，能够将前药转变成药物功能形式的激活的成分可以再一次与本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体有效连接。
在一些优选实施方式中，治疗组合物、化合物、医药品、鸡尾酒、试剂盒、方法和第一和第二医药用途将是“前药联合物”。如本领域技术人员所理解的，除非有其它陈述，术语“前药联合物”意思是本发明的抗体有效地连接至能够将前药转变成活性药物的成分，不是抗体连接至前药本身。但是，没有本发明的前药实施方式需要作为前药联合物使用的要求。因此，前药可以以在本领域中使用的任何方式使用，包括ADEPT和其它形式。
因此，当描述联合的组合物、医药品、鸡尾酒、试剂盒、方法和第一和第二医药用途，优选地在诊断试剂方面，更优选地治疗试剂，联合物包括是裸抗体的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体和免疫偶联物，并且其中本发明的体内实施方式的实践包括裸抗体或免疫偶联物和生物学、诊断或治疗试剂的在先、同时或在后的给药；只要，在一些偶联或非偶联的形式中，获得一些形式的抗体和一些形式的生物学、诊断或治疗试剂的全部供应。
特别优选的本发明的联合的组合物、方法和应用是包括本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体和内皮抑素(美国专利5,854,205)的那些。这些包括本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体是裸抗体或免疫偶联物，以及当是免疫偶联物时，其中本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体连接至内皮抑素，可选地，血管生成抑制素；其中联合的治疗方法和应用包括之前、同时或之后施用内皮抑素，可选地血管生成抑制素；只要，在一些偶联或未偶联的形式中，获得抗体、内皮抑素和可选地血管生成抑制素的全部提供。同样提供与胶原酶有效结合的本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体，作为胶原酶，当特定地递送至肿瘤时，将原位产生内皮抑素，得到相似的益处。
简单地作出本发明对肿瘤的效果的前述的和其它的解释以解释操作的联合模式、所连接的试剂的类型等等。这个描述性的方法不能被解释成本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体的有益特征的保守的陈述或过度简化。因此应当理解，这样的抗体本身具有抗血管新生性质和VEGF中和的性质(如中和VEGF的残余功能)，这样的抗体的免疫偶联物将保留这些性质并与所连接的试剂的性质结合；以及进一步地，该抗体和任何所连接的试剂的联合的效果将典型地被提高和/或放大。
因此本发明提供组合物、药物学组合物、治疗试剂盒和药用鸡尾酒，含有可选地，在至少第一种组合物或容器中，生物有效量的至少第一种本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体，或这样的抗VEGF抗体的抗原结合片段或免疫偶联物；以及生物学有效量的至少第二种生物学试剂、成分或系统。
“至少第二种生物学试剂、成分或系统”将经常是治疗或诊断试剂、成分或系统，但它不一定是。例如，至少第二种生物学试剂、成分或系统可以包含用于该抗体修饰和/或用于连接其它试剂至抗体的成分。一些优选的第二种生物试剂、成分或系统是前药或用于制备和使用前药的成分，包括用于制备前药本身的成分和用于使得本发明的抗体在这样的前药和ADEPT实施方式中起作用的成分。
当包括治疗或诊断试剂作为至少第二种生物学试剂、成分或系统，这样的治疗和/或诊断将典型地是针对血管新生疾病的那些。这样的试剂适于在治疗或诊断疾病或失调中使用，如在美国专利5,712,291、5,753,230、5,972,922、5,639,757，WO 98/45331和WO 98/16551任何一项中公开的，每一篇通过引用的方式结合至本文。
当需要治疗的疾病是癌症时，“至少第二种抗肿瘤试剂”将包括在治疗试剂盒或鸡尾酒中。关于本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体是第一种抗肿瘤试剂时，选定术语“至少第二种抗肿瘤试剂”。本发明的抗体可以因此与化学治疗试剂、放射治疗试剂、细胞因子、抗血管新生试剂、诱导细胞凋亡试剂或抗肿瘤免疫毒素或凝血配体结合。
本文使用的“化学治疗试剂”指的是在恶性肿瘤的治疗中使用的典型的化学治疗试剂或药物。出于简明目的使用本术语，尽管事实上其它化合物可能在技术上被描述为化学治疗试剂，因为它们发挥抗癌症效果。但是，“化学治疗的”已经达到在本领域中具有不同的意思并且根据这个标准的意思被使用。本文中描述了许多典型的化学治疗试剂。本领域技术人员将容易地理解化学治疗试剂的应用和合适的剂量，尽管在与本发明联合使用时，剂量可能适当地减少。
可以同样定义为“化学治疗试剂”的一类新的药物是诱导细胞凋亡的试剂。任何一种或多种这样的药物，适当地包括基因、载体、反义构建体和核酶，同样可以用于与本发明结合。目前优选的第二试剂是抗血管新生试剂，如血管生成抑制素、内皮抑素、血管抑制素、血管能抑制素(canstatin)和乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂。
其它典型的抗癌试剂包括，例如，新霉素、足叶草毒素、TNF-α、αvβ3拮抗剂、钙离子载体、钙通量诱导剂和它们任何的衍生物或前药。目前优选的抗微管蛋白药物包括秋水仙碱、紫杉醇、长春碱、长春新碱、长春地辛或它们的衍生物或前药。
抗癌症免疫毒素或凝血配体进一步是合适的抗癌症试剂。“抗癌症免疫毒素或凝血配体”或靶向的试剂/治疗试剂构建体，是基于靶向试剂，包括抗体和它们的抗原结合片段，该试剂结合至肿瘤细胞、肿瘤脉管系统或肿瘤基质的可靶向或可接近的成分，并且该试剂有效连接至治疗试剂，包括细胞毒素试剂(免疫毒素)和凝血因子(凝血配体)。肿瘤细胞、肿瘤脉管系统或肿瘤基质的“可靶向或可接近的成分”优选地是表面表达的、表面可接近的或表面定位的成分，尽管从坏死的或其它损坏的肿瘤细胞或血管内皮细胞释放的成分同样可以被靶向，包括细胞因子和/或核肿瘤细胞抗原。
可以使用抗体和非抗体靶向试剂，包括生长因子，如VEGF和FGF；含有三肽R-G-D的多肽，特异地结合至肿瘤脉管系统；以及其它靶向成分如膜联蛋白和相关的配体。
抗肿瘤细胞免疫毒素或凝血配体可以包括通过由定义为B3(ATCCHB 10573)、260F9(ATCC HB 8488)、D612(ATCC HB 9796)和KS1/4的抗体组成的组而例证的抗体，所述的KS1/4抗体从含有载体pGKC2310(NRRL B-18356)或载体pG2A52(NRRL B-18357)的细胞中获得。
同样预期抗肿瘤细胞靶向试剂，试剂含有抗体或它的抗原结合区，并结合从坏死的肿瘤细胞中释放的细胞内成分。优选地这样的抗体是单克隆抗体，或它们的抗原结合片段，其结合细胞内不溶性抗原，该细胞内不溶性抗原存在于可能被诱导具有浸润性的细胞中，或实际上所有的肿瘤和正常细胞的血影细胞中，但在哺乳动物正常活细胞的表面上不存在或不可接触。
美国专利5,019,368、4,861,581和5,882,626，每一篇都向Alan Epstein和其同事公布，每一篇都通过引用的方式特异地结合至本文，出于进一步描述和教导如何制备和使用对易从体内恶性细胞得到的细胞内抗原特异的抗体，。描述的抗体对哺乳动物恶性细胞的内在细胞成分十分特异，但是对外部细胞成分不特异。典型的例子包括组蛋白，但是包括所有的从坏死的肿瘤细胞中明确释放的细胞内成分。
在对患有血管肿瘤的动物或病患给药时，这样的抗体由于血管肿瘤天然包含坏死肿瘤细胞的事实(由于发生在体内并且引起至少一部分恶性肿瘤细胞坏死的肿瘤重构的过程)而局限在恶性细胞。另外，这样的抗体与其它提高肿瘤坏死治疗的应用适于提高靶向和后续治疗的效力。
这些类型的抗体因此可以用于直接或间接地与促血管生成素联合并用于将促血管生成素施用至血管肿瘤之内的坏死的恶性细胞，如本文一般性地公开的。
如同样在美国专利5,019,368、4,861,581和5,882,626中公开的，每一篇通过引用的方式结合至本文，这些抗体可以用在联合的诊断方法中(见下文)和用于测量抗肿瘤治疗的效力的方法中。这样的方法通常包括标记形式的抗体的制备和施用，和测量标记的抗体和内在细胞成分目标的结合，优选地该内在细胞成分结合在坏死组织之内。所述方法因此反映了坏死的组织，其中抗体的局部的浓度表示肿瘤的存在和显示已经被抗肿瘤治疗杀死的血影细胞。
抗肿瘤基质免疫毒素或凝血配体将通常包括结合至结缔组织成分、基底膜成分或有活性的血小板成分的抗体，如通过结合至纤维蛋白、RIBS或LIBS例证的。
抗肿瘤脉管系统免疫毒素或凝血配体可以包括配体、抗体或它们的片段，它们结合血管瘤的血液运输管(优选是瘤内血管)的表面表达的、表面接触的或表面定位的成分。这样的抗体包括结合至血管瘤的瘤内血管的表面表达成分的那些抗体，包括瘤内血管细胞表面受体，如endoglin(TEC-4和TEC-11抗体)、TGFβ受体、E-选择蛋白、P-选择蛋白、VCAM-1、ICAM-1、PSMA、VEGF/VPF受体、FGF受体、TIE、αvβ3整合素、多效生长因子、内皮唾液酸蛋白和MHC II类蛋白。抗体同样可以结合至瘤内血管的细胞因子可诱导的或凝血剂可诱导的成分。一些优选的试剂将结合至氨基磷脂，如磷脂酰丝氨酸或磷脂酰乙醇胺。
其它的抗肿瘤脉管系统免疫毒素或凝血配体可以包括结合至与瘤内血管细胞表面受体结合的配体或生长因子的抗体或其片段。这样的抗体包括结合至VEGF/VPF(GV39和GV97抗体)、FGF、TGFβ、结合至TIE的配体、肿瘤相关的纤连蛋白亚型、分散因子/肝细胞生长因子(HGF)、血小板因子4(PF4)、PDGF和TIMP的那些。当配体或生长因子或受体不在配体：受体或生长因子：受体复合物中时，抗体或其片段同样可以结合配体：受体复合物或生长因子：受体复合物，但是不结合至配体或生长因子，或受体。
抗肿瘤细胞、抗肿瘤基质或抗肿瘤脉管系统抗体-治疗试剂构建体可以包括抗血管新生试剂、诱导细胞凋亡试剂、抗微观蛋白药物、细胞毒素试剂如植物来源、真菌来源或细胞来源的毒素。蓖麻蛋白A链和去糖基化蓖麻蛋白A链通常是优选的。抗肿瘤细胞、抗肿瘤基质或抗肿瘤脉管系统抗体-治疗试剂构建体可以包括凝血剂(直接或间接起作用的凝血因子)或结合至凝血因子的第二抗体结合区。通常优选与组织因子或组织因子衍生物如截短的组织因子有效的联合。
在本发明的组合物、试剂盒和/或药剂方面，组合的有效量的治疗试剂可以包括在单一容器或容器装置之中，或包括在不同的容器或容器装置之中。鸡尾酒将通常被混合在一起用于组合的应用。将通常优选用于静脉内给药而配制的试剂。同样可以包括成像成分。试剂盒将同样包括使用所包括的至少第一种抗体和一种或多种其它生物学试剂的说明书。
一般地说，至少第二种抗癌症试剂可以与本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体实质上同时对动物或病患施用，如形成单一的药物组合物或形成几乎一起施用的两种药物学组合物。
可选地，可以在施用本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体一定时间之后，对动物或病患施用至少第二种抗癌症试剂。本文使用的“一定时间之后”，意味着“交错的”，使得对动物或病患在不同于施用本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体的时间，施用至少第二种抗癌症试剂。通常，两种试剂在有效间隔开的时间内施用，使得两种试剂发挥它们各自的治疗效果，即它们在“生物学有效的时间间隔”中施用。可以在本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体的生物学有效时间之前，或在那样的治疗的生物学有效时间之后对动物或病患施用至少第二种抗癌症试剂。
因此，本发明提供用于治疗患有血管肿瘤的动物或病患的方法，包括：
(a)对动物或病患进行充分降低肿瘤负荷的第一种处理；以及
(b)随后以有效抑制任何存活的肿瘤细胞转移的量，对动物或病患施用至少第一种抗血管新生试剂；其中第一种抗血管新生试剂是至少第一种本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体，或其抗原结合片段；可选地，其中抗体或片段与第二种抗血管新生试剂有效结合。
优选的第一种处理包括外科切除术和化学治疗干涉。同样可以使用联合的抗血管新生剂。
用于患有血管肿瘤的动物或病患的其它方法包括：
(a)以有效诱导充分的肿瘤坏死的量对动物或病患施用第一种抗体-治疗试剂构建体；其中第一种抗体-治疗试剂构建体包括有效连接至第一种抗体或其抗原结合片段的治疗试剂，所述第一种抗体或其抗原结合片段结合至肿瘤细胞、肿瘤脉管系统或肿瘤基质的表面表达的、表面可接触的或表面定位的成分；和
(b)然后以有效抑制任何存活的肿瘤细胞转移的量，对动物或病患施用第二种抗体；其中第二种抗体是至少第一种本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或其抗原结合片段；并且进一步可选地，其中抗体或片段与第二种抗血管新生试剂有效结合。
在特别优选的实施方式中，本发明的人类阻碍VEGFR2的抗VEGF抗体被提供与前药和ADEPT联合使用。在这样的组合物、联合物、医药品、试剂盒、方法和应用中，本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或其片段将被修饰以提供转变或酶的性能，或有效地结合至少第一种能够将至少一种前药转变成药物的活性形式的转变试剂或酶，优选地以共价连接或偶联。
酶的或酶偶联的抗体或片段将与“前药”的初始分离制剂结合。前药将是无活性的或微弱活性形式的药物，在与酶性能接触时转变成药物的活性形式，转变与本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF相关的功能或酶。
因此，提供的试剂盒包括，优选地在分开的组合物和/或容器中：
(a)生物学有效量的至少第一种本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或其片段，其具有酶的功能，优选地其中抗体或片段与至少第一种酶有效结合，共价连接或偶联；和
(b)生物学有效量的至少第一种实质上非活性的前药，该实质上非活性的前药通过阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或片段的酶功能、或与阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或片段结合、连接或偶联的酶转变成实质上活性药物。
本发明进一步提供有利的方法和应用，包括：
(a)对患有血管肿瘤的动物或病患施用生物学有效量的至少第一种药物组合物，该第一种药物组合物包括至少第一种本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或其抗原结合片段，其中抗体或片段具有酶的功能，优选地其中抗体或片段是有效结合、共价连接至、或偶联至少第一种酶；其中所述抗体或片段在施用后定位在血管肿瘤的脉管系统、瘤内脉管系统或基质；和
(b)随后，在有效时间期间后，对动物或病患施用生物学有效量的至少第二种药物组合物，第二种药物组合物包括生物学有效量的至少一种实质上非活性的前药；其中前药通过定位在所述的血管肿瘤的脉管系统、瘤内脉管系统或基质之中的本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或其片段的酶功能或与阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或片段结合、连接或偶联的酶转变成实质上活性的药物。
在一些其它的实施方式中，本发明的抗体和免疫偶联物可以与一种或多种诊断试剂结合，典型地在与血管新生疾病相关的应用中的诊断试剂。一系列的诊断组合物、试剂盒和方法因此包括在本发明中。
进一方面是实验体诊断或成像的方法，包括对实验体施用适量的本文定义的本发明的人类抗体或其它蛋白，和探测本发明的抗体或其它蛋白在实验体的存在和/或量和/或定位。
根据上面描述的应用和方法成像或诊断的合适的疾病包括如在本文其它地方描述的与血管新生相关的任何疾病。
在一个实施方式中，本发明提供诊断哺乳动物中与血管新生相关的疾病的方法，包括步骤：
(a)用任何一种或多种本发明的抗体接触从所述哺乳动物中取出的检测样品。
在进一步实施方式中，本发明提供诊断哺乳动物中与血管新生相关的疾病的方法，包括步骤：
(a)用一种或多种本发明的抗体接触从所述哺乳动物中取出的检测样品；
(b)测量在检测的样品中抗体-抗原复合物的存在和/或量和/或定位；以及，可选地
(c)与对照比较检测样品中的抗体-抗原复合物的存在和/或量。
在上面的方法中，所述的接触步骤在允许抗体-抗原复合物形成的条件下完成。本领域技术人员可以容易地决定合适的条件。
在上面的方法中，可以使用任何合适的检测样品，例如被怀疑感染疾病的活组织检查细胞、组织或器官或者组织切片。
在一些上面的方法中，在检测样品中的抗体-抗原复合物的任何量的存在将预示疾病的存在。优选地，对于进行的阳性诊断，在检测样品中的抗体-抗原复合物的量大于，优选地明显大于在合适的对照样品中发现的量。更优选地，明显更大的水平式统计学上有意义的，优选地具有概率值＜0.05。检测统计显著性的合适的方法是本领域熟知的并记载的，并且可以使用这些中的任何一个。
本领域技术人员可以容易地选择合适的对照样品，例如，在特定疾病的诊断的例子中，合适的对照可以是没有患有疾病的实验体的样品。合适的对照“值”同样可以容易地测量，而不需要在每一次检测中检测对照“样品”，如，参考本领域已知的正常实验体的范围。
对于在诊断或成像应用中的使用，本发明的抗体可以用可探测的标签标记，如不透射线或放射性同位素，如3H、14C、32P、35S、123I、125I、131I；放射性发射器(如α、β或γ发射器)；荧光的(荧光团)或化学发光的(发色团)化合物，如异硫氰酸荧光素酯、若丹明或虫荧光素；酶，如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶；成像试剂；或金属离子；或化学组成部分，如生物素，其可以通过结合至特定的同源的可检测的部分被检测，如标记的抗生素蛋白/链霉亲和素。对结合蛋白如抗体或抗体片段附上标记的方法是本领域已知的。这样的可探测的标记允许在被检测的检测样品中结合蛋白-抗原复合物的存在、量或定位。
优选的在体内使用的可探测的标记包括X-射线可探测的化合物，如铋(III)、金(III)、镧(III)或铅(II)；放射性离子，如铜67、镓67、镓68、铟111、铟113、碘123、碘125、碘131、汞197、汞203、铼186、铼188、铷97、铷103、锝99m或钇90；核磁自旋共振同位素，如钴(II)、铜(II)、铬(III)、镝(III)、铒(III)、钆(III)、钬(III)、铁(II)、铁(III)、锰(II)、钕(III)、镍(II)、钐(III)、铽(III)、钒(II)或镱(III)；或若丹明或荧光素。
本发明同样包括含有连接至直接或间接产生可探测信号的标签的本发明的抗体的诊断或成像试剂。合适的标签在本文的其它地方描述。
本发明进一步包括含有一种或多种本发明的人类抗体或组合物或一种或多种编码本发明的抗体的核酸分子，或一种或多种含有本发明的核酸序列的重组表达载体，一种或多种含有本发明的重组表达载体或核酸序列的宿主细胞或病毒的试剂盒。优选地，所述试剂盒用在本文所描述的方法和应用中，例如如本文所描述的治疗、诊断或成像方法，或者用在如本文所描述的体外实验或方法中。在这样的试剂盒中的抗体优选地可以是如本文其它地方描述的抗体偶联物，如可以偶联至可探测的部分或可以是免疫偶联物。优选地所述试剂盒包括使用试剂盒成分的说明书，例如在诊断中。优选地所述试剂盒用于诊断与血管新生相关的疾病并可选地包括使用诊断这样的疾病的试剂盒成分的说明书。
本文所定义的本发明的抗体同样可以用作体外或体内应用或实验的分子工具。由于抗体具有抗原结合位点，这些可以作为特定结合对的成员起作用，并且这些分子可以用在需要特定结合对成员的任何实验中。
因此，本发明的进一方面提供含有本文所定义的本发明的抗体的试剂和这样的抗体作为分子工具的应用，例如在体外或体内实验中。
在癌症的诊断和治疗方面，本发明的诊断和成像组合物、试剂盒和方法包括体内和体外诊断。例如，血管肿瘤可以使用诊断有效量的肿瘤诊断成分成像，其中肿瘤诊断成分包括至少第一种结合至肿瘤细胞、肿瘤脉管系统或肿瘤基质的可接触成分的结合区，其有效地连接至体内诊断成像试剂。
优选地使用诊断成分进行肿瘤成像以提供血管肿瘤的基质和/或脉管系统的成像，该诊断成分包括至少第一种结合至肿瘤脉管系统或肿瘤基质的可接触成分的结合区。可以使用任何合适的结合区或抗体，例如上面关于治疗构建体所描述的那些。一些优势将通过使用本发明构建体的可探测的-带标签的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体而提供，其中形成的图像将预示所使用的治疗剂的结合位点。
可探测的-带标签的体内肿瘤诊断剂，优选地本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体可以包括X-射线可探测化合物，例如铋(III)、金(III)、镧(III)或铅(II)；放射性离子，如铜67、镓67、镓68、铟111、铟113、碘123、碘125、碘131、汞197、汞203、铼186、铼188、铷97、铷103、锝99m或钇90；核磁自旋共振同位素，如钴(II)、铜(II)、铬(III)、镝(III)、铒(III)、钆(III)、钬(III)、铁(II)、铁(III)、锰(II)、钕(III)、镍(II)、钐(III)、铽(III)、钒(II)或镱(III)；或若丹明或荧光素。
肿瘤治疗前的预成像可以通过以下实现：
(a)对动物或病患施用诊断学有效量的药物组合物，该药物组合物包括有效连接至至少第一种结合区的诊断试剂，第一个结合区结合至肿瘤细胞、肿瘤脉管系统(优选地)或肿瘤基质(优选地)的可接触成分，包括有效连接至本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体构建体的诊断试剂；和
(b)随后探测结合至肿瘤细胞、肿瘤血管(优选地)或肿瘤基质(优选地)的可探测的-带标签的第一结合区(或本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体)；因此获得肿瘤、肿瘤脉管系统和/或肿瘤基质的图像。
肿瘤治疗同样可以通过以下实现：
(a)通过对患有血管肿瘤的动物或病患施用诊断学最小量的至少第一种可探测的-带标签的肿瘤结合剂形成血管肿瘤的图像，优选地是本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体构建体，含有有效连接至肿瘤结合试剂或本发明的阻碍VEGFR2的抗VEGF抗体的诊断试剂，从而形成肿瘤、肿瘤脉管系统(优选地)或肿瘤基质(优选地)的可探测的图像；和
(b)随后对同样的动物或病患施用治疗上最优化量的至少第一种本发明的裸的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或使用这样的抗体的治疗试剂-抗体构建体，因此引起抗肿瘤效果。
因此提供成像和治疗药剂或药物，通常包括：
(a)含有诊断有效量的可探测的-带标记的肿瘤结合试剂的第一中药物组合物，优选地是本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体构建体，其包括有效连接至肿瘤结合试剂或本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体的可探测试剂；和
(b)含有治疗有效量的至少一种本发明的裸的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或使用这样的抗体的治疗试剂-抗体构建体的第二种药物组合物。
本发明同样提供包括至少第一种组合物或药物组合物的体外诊断试剂盒，该第一种组合物或药物组合物含有生物学有效量的至少一种与至少第一种本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或它们的抗原结合片段有效结合的诊断试剂。
本发明进一步提供组合的试剂盒，其中诊断试剂计划被用在体外，优选地与在从动物或病患中获得的生物学样品上进行的操作的检测联合。同样地，本发明提供试剂盒，该试剂盒通常在至少两种不同的容器中包括至少第一种含有生物学有效量的至少第一种本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或这样的抗VEGF抗体的抗原-结合片段或免疫偶联物的组合物、药物组合物或药用鸡尾酒；和生物学有效量的用于体外使用的至少一种诊断试剂、成分或系统。
“用于体外使用的诊断试剂、成分或系统”将是能够诊断一种或多种含有新生血管成分的疾病的任何诊断试剂或试剂的组合。体外诊断因此包括了适于在产生与疾病或失调相关的诊断或预兆信息中使用的那些，如同在美国专利5,712,291、5,753,230、5,972,922、5,639,757，WO 98/45331和WO 98/16551任何一项中所公开的，每一篇都通过引用的方式结合至本文。
在癌症的诊断和治疗方面，体外诊断将优选地包括含有至少第一种结合区的诊断成分，该第一种结合区结合至肿瘤细胞、肿瘤脉管系统(优选地)或肿瘤基质(优选地)的可接触的成分，第一结合区有效连接在通过体外检测可直接或间接探测到的“可探测或报告试剂”。体外直接可探测的“可探测或报告试剂”包括那些如通过免疫荧光检测法可探测的放射性标记物和报告试剂。
体外间接可探测的“可探测的或报告试剂”包括在与其它外源试剂的联合中起作用的那些，如在与发色基质接触时产生有色产物的可探测的酶。体外间接探测同样延伸至含有与至少一种对第一结合区具有免疫特异性的探测抗体联合的第一个结合区的可探测或报告成分或系统，所述第一个结合区结合至肿瘤细胞、肿瘤脉管系统(优选地)或肿瘤基质(优选地)的可接触的成分。“探测抗体”优选地是连接至直接或间接可探测的试剂的“第二抗体”，如放射性标记物或酶。可选地，可以使用“第二或第三抗体探测系统”，包括对第一个结合区具有免疫特异性的第一个探测抗体和对第一探测抗体具有免疫特异性的第二个探测抗体，第二个探测抗体连接至直接或间接可探测的试剂。
附图说明
以下附图形成本说明书的一部分并包括在其中以进一步证明本发明的一些方面。通过引用一张或多张这些附图结合本文提出的具体实施方式的详细描述，可以更好地理解本发明。
图1显示scFv形式的克隆EJ173/112-Cl1(r84/PGN311)的重链(VH)和轻链(VL)可变区的核苷酸和氨基酸序列。ScFv通过Nco/NotI位点克隆至pHOG21(3.7Kb)。用于最初克隆的限制性位点(NcoI、HindIII、MluI和NotI)是斜体并加下划线的。VH和VL之间的连接序列是斜体的。
图2显示克隆EJ173/112-Cl1(r84/PGN311)scFv结合VEGF。图2显示评估EJ173/112-Cl1(r84)、它的亲本克隆(mother clone)和阳性对照抗体(鼠B9)与平板上的VEGF-A结合的ELISA实验的结果。克隆EJ173/112-Cl1(r84)显示最高的结合信号和因此最好的亲合力。
图3显示了克隆EJ173/112-Cl1(r84/PGN311)scFv与2C3抗体有效竞争结合VEGF，这通过竞争ELISA实验的结果显示。由于克隆EJ173/112-Cl1(r84)与2C3抗体有效竞争结合VEGF，这表示克隆EJ173/112-Cl1(r84)结合实质上与鼠2C3抗VEGF抗体一样的抗原表位。
图4显示克隆EJ173/112-Cl1(r84/PGN311)scFv结合鼠VEGF和人VEGF。
图5显示用于评估多种scFv抗体与固定的VEGF-A的结合亲合力的Biacore实验的结果。结合曲线在图5中显示，其中能够看出scFv形式的EJ173/112-Cl1(r84/PGN311)具有比单链形式的亲本克隆(m)显著更高的结合亲合力。所示的其它曲线是标记为v41、r68、r3和r26。
图6显示EJ173/112-Cl1(r84/PGN311)IgG抑制通过VEGFR2的VEGF介导的细胞内信号传导，由体内的细胞实验的结果显示，其中它显示了EJ173/112-Cl1(r84)IgG抑制Erk1/2的磷酸化。
图7显示克隆EJ173/112-Cl1(r84/PGN311)识别VEGF的截短的121亚型(VEGF121)，通过ELISA实验的结果显示。
图8A和图8B一起显示了r84/PGN311充分地阻止VEGF与VEGFR2的相互作用，而不充分阻止VEGF与VEGFR1的相互作用。含有或不含有指示的抗体的VEGF-生物素在用可溶的VEGFR1(图8A)或VEGFR2(图8B)包被的ELISA板的孔中孵育。单独的VEGF(VEGF)或含有指示的抗体的VEGF的信号被规格化为单独的VEGF(100％)。显示了平均值+/-SEM。N＝12(每一个处理4个同样的平板，一式三份)。少于50％的信号为认为是明显可观的结合抑制。Synagis是被用作阴性对照的人类抗RSV抗体。为了比较，同样示出了用阿瓦斯汀(贝伐单抗)(Presta等，1997)抗体的结果，其显示了阿瓦斯汀充分地抑制了VEGF与VEGFR2和VEGFR1的相互作用。
图9A和图9B显示了scFv表达载体。图9A显示了scFv表达载体pHOG21。ApR，氨苄青霉素抗性基因；ColE1，DNA复制起点；fIIG，噬菌体f1的基因间区；c-myc，单克隆抗体9E10识别的抗原表位；His6，6个组氨酸残基；pelB，细菌果胶裂解酶的信号肽；P/O，野生型lac启动子操作子。图9B显示C末端编码区的核苷酸序列(SEQ ID NO：28)和氨基酸序列(SEQ ID NO：29)。
图10A、图10B和图10C显示肿瘤相关的巨噬细胞表达VEGFR2。图10A显示在对照处理或2C3处理的动物肿瘤切片上染色的T014(VEGFR2抗体)和F4/80(巨噬细胞标记物)的共定位。图10A显示2C3减少巨噬细胞的浸润。但是，对照和2C3组都证明了VEGFR2和巨噬细胞标记物的共定位。图10B显示了对于三个不同的巨噬细胞标记物之一和VEGFR2双阳性的细胞数量。图10C使用两种不同的抗VEGFR2抗体以显示荷瘤动物的腹膜巨噬细胞表达VEGFR2。
图11显示r84/PGN311抑制MDA-MB-231肿瘤的生长。图11显示使用体内(鼠)MDA-MB-231乳腺癌肿瘤模型的研究的结果和r84、阿瓦斯汀或盐(对照)对肿瘤体积的影响。显示了平均肿瘤体积+/-SEM。阿瓦斯汀和r84处理的小鼠的肿瘤体积明显小于对照处理的动物。
图12显示了如图11所示的相同的研究的结果，除了图12显示了每一组中对于个体动物的肿瘤重量/体重比。阿瓦斯汀和r84/PGN311处理的小鼠的肿瘤重量/体重比明显小于对照处理的动物。
图13显示r84/PGN311抑制A673肿瘤的生长。图13显示使用体内(鼠)A673肿瘤模型的研究的结果和r84、2C3或对照抗体(Synagis-人类抗RSV)对肿瘤体积的影响。示出了平均肿瘤体积+/-SEM。2C3和r84处理的小鼠的肿瘤体积明显小于对照处理的动物。因此2C3和r84有效控制A673肿瘤的生长。
图14显示r84/PGN311明显降低肿瘤相关的巨噬细胞的浸润。从含有MDA-MB-231肿瘤细胞的小鼠中取得肿瘤，切片，并用抗巨噬细胞标记物(Mac-3)的抗体染色。分析来自对照动物的3个肿瘤和来自r84和2C3处理的动物的每一种中的3个肿瘤并研究每一个肿瘤的5张图像。图14显示r84和2C3处理的动物的肿瘤显示了明显地降低巨噬细胞标记物Mac-3的表达，以及r84具有比2C3更显著的效果(对于r84，p＜0.01)。
图15显示r84/PGN311明显降低MDA-MB-231动物模型肿瘤中的微血管密度。从含有MDA-MB-231肿瘤细胞的小鼠中取出肿瘤，切片并用抗鼠内皮细胞抗体染色(MECA-32)。分析来自对照动物的3个肿瘤和来自r84和2C3处理的动物的每一种中的3个肿瘤，研究每一个肿瘤的5张图像。图15显示r84和2C3处理的动物的肿瘤显示了明显降低的血管数/高倍视野(MECA-32，p＜0.0001)。
图16A和图16B显示了r84/PGN311选择性地阻止VEGFR2途径。图16A显示r84/PGN311抑制表达VEGFR2细胞(HDMEC)上的VEGF刺激(+VEGF)的Erk1/2(pERK1/2)和PLC-γ(pPLC-γ)的磷酸化。阳性对照阿瓦斯汀同样抑制VEGF刺激的Erk1/2和PLC-γ的磷酸化。图16B显示r84/PGN311不抑制表达VEGFR1细胞(PAE Flt)上的VEGF刺激的VEGFR1磷酸化，但是阳性对照，阿瓦斯汀，抑制VEGFR1的磷酸化。
图17A、图17B、图17C和图17D显示了r84/PGN311导致非小细胞肺癌细胞系产生的肿瘤的生长的明显减少。图17A、图17B、图17C和图17D显示了来自使用体内鼠模型和4种不同的非小细胞肺癌细胞系H460(图17A)、H1299(图17B)、H358(图17C)和A549(图17D)的研究的结果。示出了r84/PGN311、阿瓦斯汀或对照抗体(Synagis或XTL)对肿瘤重量的影响(示出了肿瘤平均重量+/-SEM)。r84/PGN311和阿瓦斯汀处理的小鼠的平均肿瘤重量明显低于对照处理的动物。r84/PGN311和阿瓦斯汀因此有效控制非小细胞肺癌细胞系的生长。至少在H460(图17A)、H1299(图17B)和A549(图17D)模型中r84/PGN311比阿瓦斯汀表现更好。在A549模型中r84明显好于阿瓦斯汀(图17D)。
图18A、图18B和图18C显示了在r84处理的肿瘤中的淋巴管密度明显低于对照肿瘤中。图18A(6板块)是免疫荧光染色的冷冻的MDA-MB-231肿瘤切片，显示了对照肿瘤(上面板块)和r84处理的肿瘤(下面板块)中的淋巴管标记物，podoplanin(绿色)、Prox1(红色)和混合的图像。图18B(2板块)显示了在对照肿瘤(上面板块)和r84处理的肿瘤(下面板块)中LYVE-1染色的MDA-MB-231肿瘤切片。LYVE-1染色的图案(图18B)与对于podoplanin和Prox1的相似(图18A)。在低倍率下检查每一个LYVE-1染色的肿瘤切片的整个区域，并使用NIS-基础成像软件测试每一视野的LYVE-1阳性区域的百分比(图18C)。具有最高的LYVE-1阳性百分比区域的10个视野一起平均以产生对于每一个肿瘤的最终数值，并通过未配对的student′s t-检验检测组平均值的显著性。对照肿瘤的LYVE-1阳性区域的百分比(7.03±1.013；n＝6)明显高于r84处理的肿瘤(2.23±0.986；n＝5)，P＝0.0042。
图19显示在完全地人和鼠嵌合的IgG形式的r84结合鼠VEGF和人类VEGF。人类VEGF(0.5μg/mL，R&D)或鼠VEGF(0.5μg/mL，Sigma)包被在96孔板的底部。孔被封闭然后用指定浓度的人r84(蓝线)或鼠嵌合的r84(绿线)孵育。通过用抗人Fc或抗鼠HRP结合的抗体探测结合至孔的抗体。显示出平均吸光值。
图20A和图20B显示了r84/PGN311有效抑制表达VEGFR2内皮细胞的VEGF诱导的转移。HDMEC(图20A)和PAE KDR表达细胞(图20B)使用在transwell实验中。所述细胞不被刺激(NS)，或暴露于100ng/mlVEGF以刺激转移(VEGF)，并检测500倍摩尔过量的r84、阿瓦斯汀(Avas)或对照(cntl)抗体(IgG形式)抑制VEGF诱导的转移的能力。与非刺激细胞相比，VEGF诱导转移(p＜0.01)。r84和阿瓦斯汀抑制VEGF诱导的转移(***，p＜0.0001vs单独VEGF)。
图21显示r84/PGN311不抑制表达VEGFR1内皮细胞的VEGF诱导的转移。表达PAE Flt-1的细胞不被刺激(NS)，或暴露于VEGF(VEGF)以刺激转移(VEGF)，并检测r84、阿瓦斯汀(Avas)或对照(Cntl)抗体抑制VEGF诱导的转移的能力。相比于未刺激的细胞，VEGF诱导转移。阿瓦斯汀明显抑制VEGF诱导的转移，而r84不抑制。因此，图21显示r84/PGN311不抑制表达VEGFR1的内皮细胞的VEGF诱导的转移。PAE Flt1，专门地表达VEGFR1的内皮细胞缺乏血清24小时，然后铺在transwell小室(insert)中的无血清培养基中(8μM孔，5,000细胞/小室)。至膜底部的转移通过向小室下面的孔中添加以下物质刺激：无血清培养基(NS)；VEGF(100ng/ml)；VEGF+对照IgG(Cntl)；VEGF+阿瓦斯汀(阿瓦斯汀)；VEGF+r84(r84)。细胞被允许移动24小时，这个时候膜被移走，细胞从膜的上表面移除，固定，用DAPI染色。在膜的下面的DAPI染色的核然后通过荧光显微镜计算并使用软件定量((Elements，Nikon)。*，p＜0.05r84vs阿瓦斯汀；**，p＜0.01阿瓦斯汀vs对照。
图22显示了r84/PGN311显著地降低了小鼠中Panc1胰腺肿瘤细胞的生长。对荷Panc1胰腺癌细胞的小鼠提供r84/PGN311IgG或Synagis(阴性对照)。在处理的时间过程中描述肿瘤体积。因此，图22显示了r84/PGN311减低了皮下的人类胰腺肿瘤异种移植物的生长。在第0天，将Panc1肿瘤细胞皮下注射至SCID小鼠(2x106细胞/动物)。在第1天，开始用500μg对照IgG(Synagis)或r84处理小鼠，每周2次。使用测径器检测随时间的肿瘤的体积。显示了平均(SEM)肿瘤体积(n＝5/组)相对注射肿瘤细胞(TCI)后的日期。
图23显示鼠嵌合形式的r84/PGN311延长了荷同源4T1乳腺癌小鼠的存活时间。将鼠4T1肿瘤原位移植地注入至Balb/C鼠中(每组鼠n＝8)。在第12天开始将鼠嵌合形式的r84/PGN311(mcr84，红线)或对照(对照，黑线)抗体通过腹腔注射给药，每周两次，并延续3周。对于对照相比，r84/PGN311延长了存活时间。
图24显示了血清中鼠VEGF的水平，其中血清来自用对照IgG、阿瓦斯汀、2C3或r84(如所指示的)处理的荷瘤鼠。收集血清，并使用来自R&D系统的试剂盒通过ELISA化验鼠VEGF的水平。此外，来自r84处理的小鼠的等分血清用蛋白G珠子预先清理。同样检测蛋白G清理的血清(r84supe)的上清液。
图25显示了r84，以及较小范围的阿瓦斯汀(bev)，减少体内CD11b+/Gr1+细胞浸润至MDA-MB-231肿瘤中，而2C3不。R84的减少是39％。单因素ANOVA显示用r84处理的动物的减少的浸润，而不是2C3或阿瓦斯汀(bev)处理的动物，与对照处理的动物在统计学上不同(指定的**，p＜0.01)。
具体实施方式
在人类中，实体瘤和癌占据了所有癌症的90％以上。尽管已经在淋巴瘤和白血病的治疗中研究单克隆抗体和免疫毒素的作用，这些试剂已经令人失望地在癌症和其它实体瘤的临床治疗中没有作用(Abrams和Oldham，1985)。基于抗体治疗无效的首要原因是巨大分子不容易被传送至实体瘤中。甚至在肿瘤块中，由于肿瘤细胞间的紧密结合、纤维性基质、空隙压力梯度和结合位点障碍的存在，这些分子不能均匀分布(Dvorak等，1991a)。
在研发治疗实体瘤的新策略中，包括靶向肿瘤的脉管系统而不是肿瘤细胞的方法提供不同的优势。肿瘤血管的有效的破坏或阻塞阻止了血液在肿瘤中的流动并导致了大量肿瘤细胞死亡。抗体-毒素和抗体-凝血剂构建体已经有效地用在肿瘤血管的特定靶向和破坏中，导致肿瘤坏死(Burrows等，1992；Burrows和Thorpe，1993；WO 93/17715；WO 96/01653；美国专利5,855,866；5,877,289；5,965,132；6,051,230；6,004,555；6,093,399。
当抗体、生长因子或其它结合配体被用于特异地递送凝血剂至肿瘤脉管系统时，这样的试剂被定义为“凝血配体”。目前优选的用在凝血配体中的凝血剂是截短的组织因子(tTF)(Huang等，1997；WO 96/01653；美国专利5,877,289)。TF是血液凝血的主要引发剂。在创伤处，血液中的因子VII/VIIa接触到并结合至血管周围组织中的细胞上的TF。在磷脂表面存在的TF：VIIa复合物激活因子IX和X，相应地，导致凝血酶和血纤维蛋白的形成，最终，导致血液凝块。
已经描述在肿瘤内皮上可利用的、但是很大程度地从正常内皮缺失的一系列合适的靶分子。例如，可以使用表达的目标，如endoglin、E-选择蛋白、P-选择蛋白、VCAM-1、ICAM-1、PSMA、TIE、与LAM-1反应的配体、VEGF/VPF受体、FGF受体、αvβ3整合素、多效生长因子或内皮唾液酸蛋白(美国专利5,855,866、5,877,289和6,004,555；Burrows等，1992；Burrows和Thorpe，1993；Huang等，1997；每一篇通过引用的方式结合至本文)。
其它通过天然肿瘤环境可诱导的目标或下面的人的干涉同样是可靶向的实体，如在美国专利5,776,427和6,036,955中描述的，每一篇都通过引用的方式结合至本文)。当与在正常组织中的在先的抑制和肿瘤血管诱导联合时，MHC II类抗原同样可以被用作目标(美国专利5,776,427、6,004,554和6,036,955；每一篇都通过引用的方式结合至本文)。
被吸附的目标是另一个适当的组，如VEGF、FGF、TGFβ、HGF、PF4、PDGF、TIMP、结合TIE的配体或与肿瘤相关的纤维连接蛋白亚型(美国专利5,877,289和5,965,132；每一篇都通过引用的方式结合至本文)。纤维连接蛋白亚型是结合至受体的整合素家族的配体。与肿瘤相关的纤维连接蛋白亚型是肿瘤脉管系统和肿瘤基质中均可靶向的成分。
一种目前优选的用于这样的临床靶向应用的标记物是与受体相关的VEGF。事实上，VEGF：受体复合物的组装是迄今为止观察到的肿瘤脉管系统的最特定的标记物之一(美国专利5,877,289、5,965,132和6,051,230；Lin-Ke等，1996；Dvorak等，1991b)。
VEGF：受体复合物代表了对于将药物或其它效应物特定递送至肿瘤内皮的有吸引力的目标——由于在大多数的实体瘤中发现，肿瘤含有丰富的细胞因子和生长因子及VEGF受体在缺氧的条件下上调(Mazure等，1996；Forsythe等，1996；Waltenberger等，1996；Gerber等，1997；Kremer等，1997)。与正常组织中的内皮比较，配体和它的受体均在肿瘤微环境中特异上调导致高浓度的肿瘤血管内皮上占据的受体(美国专利5,877,289和5,965,132)。Dvorak和同事同样展示了在注射进荷有同源肿瘤的鼠中后，抗VEGF的N-末端的兔多克隆抗体选择性地染色肿瘤血管(Lin-Ke等，1996)。
VEGF作为用于临床干涉的目标的功能不限于免疫毒素或凝血配体治疗。真正地，VEGF是实体瘤的血管新生所涉及的关键因子之一(Ferrara，1995；Potgens等，1995)，是有效的渗透剂(Senger等，1983；Senger等，1990；Senger等，1986)和内皮细胞有丝分裂原(Keck等，1989；Connolly等，1989；Thomas，1996)。VEGF和血管新生之间的联系已经导致针对VEGF干涉的多种治疗策略的提议((Siemeister等，1998)。
A.VEGF和VEGF受体
血管内皮生长因子亚型A(VEGF-A，在本申请中简洁地定义为“VEGF”)是通过缺氧和致瘤突变诱导的多功能的细胞因子。在胚胎形成中，VEGF是血管网络发育和维护的原发性刺激物。它作为有效的诱导渗透性试剂、内皮细胞趋药性试剂、内皮生存因子(endothelial survival factor)和内皮细胞增殖因子起作用(Thomas，1996；Neufeld等，1999)。它的功能对于正常胚胎发育是必需的(Fong等，1995；Shalaby等，1995)，由于VEGF的一个或两个等位基因的靶向破坏导致胚胎致死(Carmeliet等，1996；Ferrara等，1996)。
在血多生理学和病理学过程中，VEGF是驱动血管新生或血小管形成的重要因子，包括伤口康复(Frank等，1995；Burke等，1995)、糖尿病视网膜病(Alon等，1995；Malecaze等，1994)、牛皮癣(Detmar等，1994)、动脉硬化症(Inoue等，1998)、风湿性关节炎(Harada等，1998；Nagashima等，1999)、实体瘤生长(Plate等，1994；Claffey等，1996)。
广泛多种的细胞和组织产生VEGF，其存在至少5种亚型中(121、145、165、189、和206个氨基酸)，5种亚型是由同一基因编码的剪接变异体(Houck等，1991；Ferrara等，1991；Tischer等，1991)。两个较小的亚型，121和165是从细胞中分泌的(Houck等，1991；Anthony等，1994)。分泌的VEGF是在38-46kDa之间的专性二聚物(obligate dimer)，其中单体有两条二硫键连接。
VEGF二聚物以高亲合力结合至两种良好表征的受体，VEGFR1(FLT-1)和VEGFR2(KDR/Flk-1)，它们在内皮细胞上选择性地表达(Flt-1和Flk-1是鼠同源物)。结合至VEGFR1和VEGFR2的VEGF的Kd分别是15-100pM和400-800pM(Terman等，1994)。最近鉴定的第三种细胞表面蛋白神经毡蛋白-1(neuropilin-1)同样以高亲合力结合VEGF(Olander等，1991；De Vries等，1992；Terman等，1992；Soker等，1998)。
VEGFR1和VEGFR2是III型受体酪氨酸激酶(RTK III)家族的成员，该家族的特征是七个细胞外的IgG样重复、单跨膜域和细胞内的分裂的酪氨酸激酶域(Mustonen和Alitalo，1995)。直到最近，VEGFR1和VEGFR2被认为是几乎全部地在内皮细胞上表达(Mustonen和Alitalo，1995)。经过已经报道VEGFR1和VEGFR2对刺激内皮细胞增殖、转移和分化具有不同的功能(Waltenberger等，1994；Guo等，1995)，每一个受体在VEGF生物学和内皮细胞动态平衡中表现的精确的功能在本发明之前没有详细说明。
最近使用基因敲除小鼠的研究表明，VEGF、VEGFR1和VEGFR2中每一个对血小管新生、血管新生和胚胎发育都是必要的(Fong等，1995；Shalaby等，1995；Hiratsuka等，1998)。在致死性敲除的研究中，与每一个受体缺失相关的表型是不同的。VEGFR2的靶向的破坏导致缺少内皮细胞分化和没有形成卵黄囊血岛或没有经历血小管新生的胚胎(Shalaby等，1995)。VEGFR1无效突变体显示减弱的血小管新生、内皮细胞的紊乱聚集和扩大的血管(Fong等，1995；Hiratsuka等，1998)。VEGFR1明显地具有重要的生物学功能。
VEGFR1比VEGFR2对VEGF具有更高的亲合力，尽管它具有较低的酪氨酸激酶活性。这暗示VEGFR1的胞外域特别重要。这一假设由在基因敲除的小鼠中的研究中得到的结果强烈支持，其中VEGFR1的酪氨酸激酶域被去掉同时保留VEGF结合域完整(Hiratsuka等，1998)。VEGFR1-酪氨酸激酶缺陷型的胚胎发育出正常的血管并存活一定期限(Hiratsuka等，1998)。
除了较早的基因敲除外(Fong等，1995；Shalaby等，1995)，Hiratsuka等(1998)的研究显示VEGFR1具有重要的生物学功能。但是，酪氨酸激酶信号并未意味着临界因子。很有意思地注意到来自VEGFR1基因敲除的小鼠的巨噬细胞没有表现出VEGF诱导的趋药性(Hiratsuka等，1998；通过应用的方式结合至本文)，因此暗示VEGFR1作为受体负责介导对VEGF的重要的生物学反应。
一些团体已经报道在VEGF诱导的有丝分裂和渗透性中，VEGFR2是重要的信号受体(Waltenberger等，1994；Zachary，1998；Korpelainen和Alitalo，1998)。VEGFR1在内皮细胞功能中的作用更加不清楚，尽管在巨噬细胞转移和趋药性中的功能在上面讨论的Hiratsuka等(1998)的研究中证明。
Clauss等(1996，通过引用的方式结合至本文)同样报道了VEGFR1在单核细胞活化和趋药性中具有重要作用。事实上，巨噬细胞/单核细胞系的细胞仅表达VEGFR1，其是负责介导单核细胞补充和促凝血活性的受体(Clauss等，1996)。结合单核细胞和巨噬细胞上的VEGFR1的VEGF同样通过提高细胞内的钙和诱导酪氨酸磷酸化而起作用(Clauss等，1996)。
VEGF二聚体与VEGF受体的结合被认为是诱导受体二聚化。受体的二聚化然后引起特定酪氨酸残基的自动转磷酸作用，特定酪氨酸残基分别是VEGFR2和VEGFR1的细胞内侧的Y801和Y1175，和Y1213和Y1333。这导致信号转导级联，包括磷脂酶Cγ(PLCγ)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的活化和细胞内钙离子的增加(Hood和Meininger，1998；Hood等，1998；Kroll和Waltenberger，1998)。
在VEGF诱导的信号更下游的细胞内事件更不清楚，尽管许多团体已经显示在VEGF活化VEGFR2之后产生一氧化氮(NO)(Hood和Meininger，1998；Hood等，1998；Kroll和Waltenberger，1998)。通过VEGF的VEGFR2的活化，而不是VEGFR1同样已经显示激活Src和Ras-MAP激酶级联反应，包括MAP激酶、ERK1和ERK2(Waltenberger等，1994，1996；Kroll和Waltenberger，1997)。
VEGFR1在内皮细胞功能中的作用更少地知道，特别是由于Flt-1酪氨酸激酶缺陷型的小鼠能存活并发育出正常的血管(Hiratsuka等，1998)。已经暗示内皮上的VEGFR1的主要生物学功能是作为非信号配体结合分子，或将VEGF引至VEGFR2所必需的“诱饵”受体。
VEGF和病理性血管新生情形的联系已经提示了多种阻滞VEGF活性的尝试。这些包括某些抗VEGF的中和抗体的开发(Kim等，1992；Presta等，1997；Sioussat等，1993；Kondo等，1993；Asano等，1995)。已经描述了抗VEGF受体的抗体，如在美国专利5,840,301和5,874,542和后来的本发明、在WO 99/40118中所描述的。美国专利5,840,301和5,874,542甚至暗示了阻碍VEGF受体而不是VEGF本身是有利的多种原因。
可溶解的受体构建体(Kendall和Thomas，1993；Aiello等，1995；Lin等，1998；Millauer等，1996)、酪氨酸激酶抑制剂(Siemeister等，1998)、反义方法、RNA适配体和抗VEGF或VEGF受体的核酶已经被报道(Saleh等，1996；Cheng等，1996；每一篇通过引用的方式结合至本文)。
B.抗VEGF抗体
B1.抗体性质
多种抑制方法的应用已经显示通过VEGF信号传导干扰在阻碍血管新生和/或抑制肿瘤生长中至少稍微地有效。事实上，抗VEGF的单克隆抗体已经显示出在小鼠中抑制人类肿瘤异种移植物的生长和腹水的形成(Kim等，1993；Asano等，1995；1998；Mesiano等，1998；Luo等，1998a；1998b；Borgstrom等，1996；1998)。
抗体A4.6.1是高亲合力抗VEGF抗体，能够阻止VEGF结合至VEGFR1和VEGFR2(Kim等，1992；Wiesmann等，1997；Muller等，1998)。结合有A4.6.1的Fab片段的VEGF的丙氨酸扫描突变和X射线结晶显示A4.6.1结合的VEGF上的抗原表位是围绕氨基酸89-94。这个结构数据证明A4.6.1竞争性地抑制VEGF结合VEGFR2，但是抑制VEGF结合VEGFR1最可能是通过位阻(Muller等，1998；Keyt等，1996；每一篇都通过引用的方式结合至本文)。
到此为止，A4.6.1是文献中最广泛利用的中和抗VEGF抗体。它已经显示出在小鼠中抑制多种人类肿瘤的生长和VEGF诱导的血管的渗透性(Brem，1998；Baca等，1997；Presta等，1997；Mordenti等，1999；Borgstrom等，1999；Ryan等，1999；Lin等，1999；每一篇都通过引用的方式特异地结合至本文)。A4.6.1同样抑制良好表征的人类卵巢癌鼠模型中腹水的形成和转移鼠模型中的肿瘤扩散。A4.6.1已经通过单价噬菌体展示技术而人源化(Brem，1998；Baca等，1997；Presta等，1997；每一篇都通过引用的方式结合至本文)。得到的人源化的抗体，命名为阿瓦斯汀(贝伐单抗)，已经被批准用于临床使用(Hurwitz等，2004)。
尽管本领域中用抗VEGF的中和抗体获得成功，本发明人意识到，新抗体，特别是具有更加精确说明的与VEGFR1(Flt-1)和/或VEGFR2(KDR/Flk-1)相互作用的模式的人类抗体，出于种种原因，将是有好处的。例如，选择性地阻碍VEGF仅与两种VEGF受体之一相互作用的抗VEGF抗体的开发将允许对通过表达VEGFR1和VEGFR2的细胞中的VEGF激活的通路的更加精确的剖析。
本发明人认为，限定抗原表位特异性的阻碍VEGF与仅一种受体(VEGFR2)结合的人类抗体将具有临床优势。Hiratsuka等(1998)的基因敲除小鼠研究说明VEGFR1和VEGFR2均具有重要的生物学功能。在本发明之前，针对仅通过两种受体之一抑制VEGF介导的效果的治疗干预的现实机会受到缺失对人类给药最优化的有效的、合适的抑制试剂的妨碍。
满足阻碍血管新生的治疗上特异的人类抗体的需要，与VEGF上的抗原表位起反应的人类抗体已经被鉴别，且该人类抗体特意地和充分地阻碍它与VEGF受体2(VEGFR2，KDR/Flk-1)的相互作用，而不充分阻碍它与VEGF受体1(VEGFR1，Flt-1)的相互作用。
本发明人首先开发了一系列的与鼠抗体2C3竞争结合VEGF的完全人类抗VEGF抗体。许多展示出对VEGF高亲合力和显示选择性破坏VEGF和VEGFR2之间的相互作用而不破坏VEGF和VEGR1之间的相互作用的抗体克隆被选出用于进一步分析。最后这些克隆之一，被定义为“亲本克隆”，进行分化，之后选出新的克隆，新的克隆展示出更重要和明显的改进，如，对鼠VEGF和人VEGF的更好的结合亲合力，在血清中更高的稳定性和形成scFV形式聚集体的降低的趋势。该抗体被称为r84(和PGN311)，展示出对VEGF卓越的结合亲合力，具有以IgG形式的Kd值在7nM或更少，该值完全在显示的人类治疗的有效范围之内。
此外，r84抗体在本文中显示出在几个本领域可接受的体内肿瘤模型中明显降低肿瘤体积/肿瘤生长(具体地，A673横纹肌肉瘤肿瘤模型，MDA-MB231乳腺癌细胞肿瘤模型，多种人类非小细胞肺癌模型，Panc1胰腺癌细胞肿瘤模型和4T1乳腺癌模型)。特别地，r84的结果至少与定义为阿瓦斯汀的人源化抗VEGF抗体一样好，阿瓦斯汀已经被批准用于临床使用。完全人类抗体如r84将提供超过可利用的人源化抗体的优势。此外，r84具有结合鼠VEGF和人VEGF的有利性质。结合鼠VEGF的能力是r84抗体展示出的超过2C3和阿瓦斯汀的重要优势。此外，来自MDA-MB231肿瘤模型的结果同样显示了r84明显降低肿瘤相关的巨噬细胞的浸润，现在已知肿瘤相关巨噬细胞的浸润在癌症发展和转移中起积极作用因此对病患有害。在这点上，已经显示r84有效降低巨噬细胞标记物Mac-3的表达(p＜0.01)。此外，来自MDA-MB231肿瘤模型的结果显示r84有效抑制降低肿瘤中血管数量并因此有效降低肿瘤中的微血管密度(MVD)。
r84同样已经显示出有效抑制VEGF诱导的表达VEGFR2细胞的转移以及有效降低MDAMB231肿瘤中的淋巴管密度。在淋巴管密度上的效果支持本发明的人类抗体抑制淋巴管新生的作用。
由r84显示的进一步有利的性质是有效降低骨髓源抑制细胞，特别是CD11b+/Gr1+细胞浸润至肿瘤的能力。此外，这个性质没有被2C3抗体显示并且通过阿瓦斯汀仅处于更加降低的水平。因此，在荷有MDA-MB-231肿瘤的小鼠中的更多研究已经显示，相对于对照，明显较少的CD11b/Gr1双阳性细胞浸润r84治疗的动物的肿瘤。在比较研究中，2C3抗体或阿瓦斯汀都没有显示CD11b+/Gr1+浸润中统计学上明显的降低，尽管在阿瓦斯汀处理的动物中一些降低可以测量。在r84/PGN311处理的动物中观察的双阳性细胞数目的减少是39％(图25)。
骨髓源抑制细胞CD11b+/Gr1+的减少的浸润是特别的有用，因为表达两种标记物的细胞最近已经与抗VEGF治疗的肿瘤难治性的介导联系在一起(Shojaei等，2007)。骨髓源抑制细胞(CD11b+Gr1+)同样是肿瘤发展的重要贡献者。在肿瘤微环境中，这些细胞分泌免疫抑制介体并诱导T-淋巴细胞功能紊乱(Gabrilovich等，2001；Serafini等，2004)。
由于CD11b+/Gr1+细胞与抗VEGF治疗的肿瘤难治性相关并且对肿瘤发展有作用，r84/PGN311减少这些细胞浸润或补充进肿瘤的作用明显地对r84的治疗应用的具有潜在价值，特别是与血管新生疾病、包括癌症的治疗相关的治疗应用。
真正地，由于本文的结果显示CD11b+/Gr1+细胞的肿瘤浸润在用r84/PGN311治疗的动物中最少显现出来/明显更低，它暗示了与用靶向VEGF的其它药物、如其它抗VEGF抗体相比，用r84治疗很可能较少地倾向于药物抗性的发展或抗VEGF治疗的难治性。另外，给出的在肿瘤发展中CD11b+/Gr1+细胞的被提议的作用，r84/PGN311减少这样的细胞浸润或补充进肿瘤的能力可能充分地形成抗肿瘤活性所涉及的机制的一部分，如由r84/PGN311显示的肿瘤生长的抑制。
同样已经显示出在小鼠中r84/PGN311慢性给药并不诱导毒性。
这些是r84抗体的治疗潜力的进一步正面暗示。
B2.阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体
使用ELISA、受体结合实验和受体激活实验证实的本发明的一个重要部分是本发明的抗体选择性的阻碍VEGF与VEGFR2(KDR/Flk-1)的相互作用，而不是与VEGFR1(FLT-1)的相互作用。所述抗体抑制VEGF诱导的VEGFR2的磷酸化，并抑制通过VEGFR2的信号传导。所述抗体同样具有有效的抗肿瘤活性，在人类癌症的本领域可接受的动物模型中阻止建立的人类实体瘤的生长。另外，本发明的人类抗体具有抗血管新生性质并降低肿瘤中的微血管密度。
这些性质证明了所述抗体在分析表达VEGFR1和VEGFR2的细胞中由VEGF活化的通路以及在肿瘤生长和存活过程中加强VEGFR2活性的重要性的有效性。更重要地，它们提供了对于人类抗体的治疗干预的独特模式，允许特异地抑制VEGFR2诱导的血管新生，而不伴随抑制VEGFR1介导的事件，如破骨细胞和破软骨细胞功能。
本发明的抗体，简洁地定义为“阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体”，以及在非偶联或“裸的”形式和当偶联至其它治疗试剂或与其它治疗试剂结合时，均表现了在本领域的进步，并提供了许多优势。
本发明的体外结合研究证明所述人类抗体阻碍VEGF结合VEGFR2，但不抑制VEGF与VEGFR1结合。
本发明的人类抗体因此比其它阻碍VEGF的抗体明显改进，其它阻碍VEGF的抗体包括鼠A4.6.1抗体和它的人源化相似物，阿瓦斯汀(贝伐单抗)。A4.6.1和阿瓦斯汀抗VEGF抗体阻碍VEGF结合两种VEGF受体。晶体和突变研究已经显示对于VEGFR2和VEGFR1的结合抗原表位朝向VEGF二聚物的两个对称的两极集中(Wiesmann等，1997；Muller等，1997)。与两个受体相互作用的VEGF上的结合决定簇部分重叠，并且分布在跨越二聚物表面的四个不同的区(Muller等，1998)。抗体4.6.1结合两个受体的受体结合区内的VEGF区。
关于本发明的人类抗体对VEGF诱导的受体磷酸化的效果的研究显示所述抗体确实阻止了VEGF诱导的VEGFR2磷酸化。研究同样显示本发明的人类抗体抑制经由VEGFR2的细胞信号传导，例如，所述抗体在体外实验中已经显示出抑制Erk 1/2和PLC-γ的磷酸化。
本发明的人类抗体抑制体内的人类肿瘤的生长。通过本发明的人类抗体的肿瘤生长抑制的数量与使用不同的中和抗VEGF抗体、包括阿瓦斯汀相似。这些人类抗体的效力进一步证明VEGF在肿瘤血管新生和肿瘤生长中的作用，其中这些人类抗体的效力与其它研究者使用不同的抗VEGF抗体已经发现的效力相似。但是，本发明的人类抗体应当提供更安全的治疗，基于本文所讨论的特异抑制性质和根据完全人类抗体。
可以实现退化而不是肿瘤停滞的事实暗示VEGF提供了比仅仅用于肿瘤内皮的血管新生信号更多的东西。Benjamin等(1999)最近报道了肿瘤包含很大部分的不得与与内皮周围细胞建立联系的未成熟血管以及这些血管依赖VEGF而存活。VEGF的中和很可能引起这些未成熟血管经历细胞凋亡，因此减少肿瘤中存在的血管网络。同样可能在肿瘤中发生血管重建的动力学过程，包括血管形成和血管退化，以及VEGF的中和阻止血管形成从而导致纯粹向血管退化方向发展。
本发明的人类抗体完全同阿瓦斯汀一样(如果不是更多)抑制肿瘤生长的发现表明在肿瘤血管新生中VEGFR2的优势作用。血管新生的多步过程需要内皮细胞趋药性、金属蛋白酶产品、入侵、增殖和分化。VEGFR1在这些过程中可能没有作用，或者在这些过程中可能通过结合VEGF并将其递送至信号传导受体VEGFR2而起辅助作用。
本发明的人类抗体和阿瓦斯汀在肿瘤治疗中可比较的数字有高度的相关性：本发明的人类抗体至少与阿瓦斯汀一样有效，尽管它们仅抑制VEGF结合VEGFR2而不是VEGFR1。因此本研究显示VEGFR1在VEGF介导的肿瘤血管新生中并不起显著作用，并且进一步说明VEGFR1特异性抑制剂可能不影响肿瘤血管新生。这些结果同样意味着本发明的人类抗体可以与阿瓦斯汀等效或更有效，而同时引起较少的副作用。
特异性地抑制VEGF结合至VEGFR2和VEGFR2的活化、而不是VEGFR1(Flt-1)的能力具有临床重要性。本发明的人类抗体因此阻止VEGF血管新生活性，但是不抑制由VEGFR1介导的VEGF的其它有利的作用，如在一些免疫和骨细胞上的那些。因此临床重要性的一个范围涉及本发明的人类抗体在体内起作用的能力，而不抑制破骨细胞和破软骨细胞的有益效果。这意味着本发明阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体治疗的应用将没有对骨和/或软骨的副作用。
体内研究已经显示在软骨内骨化时VEGF结合肥大软骨重塑、骨化和血管新生，以及VEGF对于软骨重塑是必要的(Gerber等，1999；通过引用的方式特异地结合至本文)。通过施用可溶性的VEGFR1受体嵌合蛋白(Flt-(1-3)-IgG)，经由VEGFR1的VEGF信号传导的失活已经显示出通过减少破软骨细胞的补充和/或分化而削弱小梁骨的形成和肥大软骨区的扩张(Gerber等，1999)。
已经进一步显示在体内破骨细胞功能的支持下VEGF可以取代巨噬细胞克隆刺激因子(M-CSF)(Niida，1999；通过引用的方式特异地结合至本文)。在使用由M-CSF基因突变产生的破骨细胞缺陷型的骨质石化(op/op)小鼠(osteopetrotic(op/op)mice)的研究中，注射重组的人类M-CSF(rhM-CSF)使得破骨细胞补充和存活。在最近的研究中，已经显示单一注射重组人类VEGF可以同样地引起在op/op小鼠中破骨细胞的补充(Niida等，1999)。
Nidda等(1999)报道由于破骨细胞主要表达VEGFR1并且重组人类胎盘生长因子1对破骨细胞补充的活性比得上rhVEGF的活性，在骨质石化(op/op)小鼠中的VEGF信号传导的有益效果通过VEGF受体1(VEGFR-1)介导。这些作者进一步表明在VEGF之后的rhM-CSF诱导的破骨细胞的死亡被抑制(使用VEGFR1受体嵌合蛋白，VEGFR1/Fc)，但是这样的效果通过伴随的rhM-CSF的注射而消除。由rhM-CSF或内源的VEGF支持的破骨细胞在体内活性上没有显示出明显的区别(Niida等，1999)。
突变的op/op小鼠经受年龄相关的骨硬化病的消退，骨硬化病伴随着破骨细胞数量的增长。在Niida等(1999)的研究中，大多数的破骨细胞在注射抗VEGF抗体之后消失，证明内在产生的VEGF是造成突变小鼠中破骨细胞出现的原因。另外，得到体外破骨细胞分化的支持，rhVEGF代替rhM-CSF。这些结果证明在支持破骨细胞功能中，M-CSF和VEGF具有重叠的功能，并且VEGF以VEGFR-1受体起作用(Niida等，1999)。
因此可以总结，本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体不阻碍VEGF结合VEGFR1并激活VEGFR1，但是阻止VEGF结合VEGFR2及激活VEGFR2。这样的抑制VEGFR2的抗肿瘤效果已经被清楚地证明。这些结果显示VEGFR2是介导渗透性并突出它在肿瘤血管新生中的作用的VEGF受体。
因此本发明进一步证实了作为实体瘤治疗的疗法的VEGF的抑制。更重要地，本发明提供了一系列用于治疗干预的新的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体，以及具体地，用于作为在肿瘤和其它疾病中抑制血管新生的安全和有效的药物。
本发明的有益之处并不限于缺少副作用。尽管这些是具有显著优势的重要的特征，特别是在对患有骨失调的孩子和病患的治疗中，本发明的抗体具有很多其它优势。
例如，本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体在抑制肿瘤相关的巨噬细胞的有害作用中具有重要优势。现在已经知道肿瘤相关的巨噬细胞在癌症中起重要作用，既在初始的发展阶段，又在肿瘤的进展和转移中。如下面详细描述的，本发明的人类抗体理想地适于阻止这些巨噬细胞的不利效果。
肿瘤脉管系统的形成和/或进入宿主脉管系统在恶性肿瘤的发展中是至关紧要的步骤。当然，高密度血管网络的形成，定义为“血管新生开关”，与转变成恶性密切相关(Hanahan和Folkman，1996)。现在已经知道与原发性肿瘤相关的巨噬细胞在血管新生开关和恶性转变中均起关键作用(Lin等，2006)。此外，已经显示，抑制巨噬细胞浸润进肿瘤拖延了血管新生开关和恶性转变(Lin等，2006)。
在许多患有癌症的患者中，转移是死亡的最终原因。肿瘤细胞从原发性肿瘤入侵至周围连接的组织和血管是转移过程的关键步骤。较早地报道巨噬细胞与肿瘤进程和转移相关(Lin等，2001)。随后的研究已经显示肿瘤细胞和巨噬细胞间的相互作用促进了原发性肿瘤中癌细胞的转移，并且这个过程包括了旁分泌环路(paracrine loop)(Wyckoff等，2004；Goswami等，2005)。
此外，浸润肿瘤的和肿瘤相关的巨噬细胞现已知在多种肿瘤微环境中是重要的，肿瘤微环境包括入侵的区域、基质和血管周围的区域和无血管的和坏死周围的区域。巨噬细胞在这些肿瘤微环境的每一种中的作用通过分别促进癌症细胞活动力、转移和血管新生刺激了肿瘤进程和转移(Lewis和Pollard，2006)。因此，在与癌症的抗争中，巨噬细胞最近已经变成重要的目标(Condeelis和Pollard，2006)。
在这点上，本发明的人类抗体具有重要优势，因为它们阻止VEGFR2的活化并因此降低巨噬细胞浸润至肿瘤，并因此可以降低转变成恶性、肿瘤进程和/或转移。这通过来自本文介绍的动物研究的结果证实，显示肿瘤相关的巨噬细胞表达VEGFR2，并且VEGFR2介导了这些细胞的VEGF诱导的趋药性。本文同样显示由本发明的人类抗体引起的VEGFR2的选择性阻断发挥了有力的抗癌症效果。这个抗癌症效果伴随着巨噬细胞浸润至肿瘤的减少，预示了在宿主巨噬细胞中选择性阻断VEGF-VEGFR2相互作用对观察到的治疗效果有贡献。
本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体同样具有与减少肿瘤中淋巴管密度有关的优势。除进入肿瘤血管的肿瘤细胞出口之外，转移通过淋巴管新生促进，即，从在先存在的血管中的新的肿瘤内或肿瘤周围淋巴管的生长。在几种类型的癌症中，包括乳腺癌，通过淋巴系统的肿瘤细胞的溢出被认为是恶性细胞从原发性肿瘤通过此在远位点传播的主要方式。
在几年中，淋巴管新生被认为是主要由VEGF-C和/或VEGF-D诱导。但是，一批证据现在已经积聚暗示VEGF-A在淋巴管新生中。此外，最近的研究已经显示抗VEGF-A的鼠抗体在抑制体内肿瘤淋巴管新生和转移中有作用(Whitehurst等，2007)。
本文所提出的这些结果显示本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体确实减少了肿瘤淋巴管密度(图18A、图18B和图18C)。本发明的人类抗体将因此抑制肿瘤淋巴管新生并提供减少的通过淋巴路线的转移以及抑制血管新生和通过肿瘤血管的转移的额外益处。因此，可以看出本发明的人类抗体具有通过几个干涉点减低转移或转移情形的能力。
此外，图18A中的数据显示出本发明的抗体降低肿瘤淋巴管密度，如同在podoplanin和在PROX1中测量的降低。由于podoplanin是软组织癌如软骨肉瘤和淋巴癌如滤泡树突状细胞肉瘤的标记物(Xie等，2008)，以及由于PROX1已经在预示结肠癌的入侵中被暗示(Petrova等，2008)，这强调了本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体治疗这些特定疾病指征的应用。
本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体显示的进一步有利性质是显著降低骨髓源抑制细胞、特别是CD11b+/Gr1+细胞浸润或补充至肿瘤的能力。此外，这个性质没有由2C3抗体显示并且通过阿瓦斯汀仅表现出更加降低的水平。与对照水平相比(如，未处理的肿瘤或用对照抗体处理的肿瘤)，本发明优选的抗体能够减少30％或更多，优选地32％、34％、36％、38％或更多的CD11b+/Gr1+细胞浸润或补充至肿瘤(例如，减少肿瘤中存在的双阳性细胞的数量)。
因此，在荷有MDA-MB-231肿瘤小鼠的进一步研究已经显示，与对照相反，在r84处理的动物中，明显较少的CD11b/Gr1双阳性细胞浸润肿瘤。在比较研究中，2C3抗体或阿瓦斯汀都没有显出在CD11b+/Gr1+浸润中统计上明显的减少，尽管在阿瓦斯汀处理的动物中可测量一些减少。双阳性细胞数目中观察到的减少量是39％(图25)。
骨髓源抑制细胞CD11b+/Gr1+的减少的浸润是特别的有用，因为表达两种标记物的细胞最近已经与抗VEGF治疗的肿瘤难治性的介导联系在一起(Shojaei等，2007)。骨髓源抑制细胞(CD11b+Gr1+)同样是肿瘤进程的重要贡献者。在肿瘤微环境中，这些细胞分泌免疫抑制介体并诱导T-淋巴细胞功能紊乱(Gabrilovich等，2001；Serafini等，2004)。
由于CD11b+/Gr1+细胞与抗VEGF治疗的肿瘤难治性相关并且对肿瘤进程有作用，本发明的抗体减少这些细胞浸润进肿瘤的作用明显地对本发明的抗体的治疗应用的具有潜在价值，特别是与血管新生疾病、包括癌症的治疗相关的治疗应用。
真正地，由于本文的结果显示CD11b+/Gr1+细胞的肿瘤浸润在用本发明的抗体治疗的动物中最少显现出来/明显更低，它暗示了与用靶向VEGF的其它药物、如其它抗VEGF抗体相比，用本发明的抗体的治疗很可能较少地倾向于药物抗性的发展或抗VEGF治疗的难治性。另外，给出的在肿瘤发展中CD11b+/Gr1+细胞的被提议的作用，本发明的抗体减少这样的细胞浸润或补充进肿瘤的能力可能充分地形成抗肿瘤活性所涉及的机制的一部分，如由本发明的抗体显示的肿瘤生长的抑制。
本发明的阻碍VEGFR2、人类VEGF抗体同样显示出在体内慢性给药的小鼠模型中没有诱导毒性。
本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体优选地具有结合鼠VEGF和人VEGF的有利性质。结合鼠VEGF的能力是超过抗体2C3和阿瓦斯汀的重要优势。
此外，基于本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体的抗体偶联物可以用于递送治疗试剂至肿瘤环境，但是许多其它抗VEGF抗体不能。本发明的人类抗体在体内施用时结合肿瘤脉管系统和肿瘤基质，但是不结合正常器官或组织中的脉管系统或结缔组织。基于本发明的人类抗体的治疗构建体因此具有在一个分子内结合两种功能的性质：抗体或其片段的抗血管新生的性质和选择出用于连接的治疗试剂的性质。总之，本发明的人类抗体可以用作抗血管新生试剂和靶向血管试剂，然而在先技术的许多抗VEGF抗体不能用在靶向血管能力中。
由于VEGFR2是内皮上的关键受体，阻止VEGF结合VEGFR2对于抗血管新生效果是重要的。尽管VEGFR1在内皮上表达，在本文中，它是非信号传导的或被动的。因此，本发明的人类抗体不能阻止VEGF结合VEGFR1对它们作为抗血管新生和抗肿瘤试剂的效力无关紧要。事实上，而非抑制VGF结合VEGFR1(在先技术的封闭抗体而发生)，本发明的人类抗体结合VEGF以及实质上不打乱VEGF-VEGFR1相互作用的能力提高了这些新抗体的药物递送性质。
本发明人认识到封闭抗体将仍然被期望在递送治疗试剂至肿瘤环境中起作用，其通过结合未结合受体的肿瘤定位的VEGF。具体地，他们明白这样的人类抗体将结合肿瘤基质中的VEGF并递送治疗试剂至此。这在内皮周围提供了药物的储备，引起对血管内皮细胞的细胞毒性或其它破坏性的效果并发挥抗肿瘤效果。
与基质或结缔组织相关的VEGF没有结合在某种典型意义上的VEGF受体，即细胞表面受体。更确切地，VEGF结合至一种或多种结缔组织成分，包括蛋白多糖、如硫酸乙酰肝素蛋白，通过VEGF的基本区域。这些序列(和编码它们的外显子)在VEGF121蛋白(和根本的DNA)中缺失，因此这一亚型在基质中不应该大量存在。在肿瘤基质中的VEGF经常被定义为“游离”，尽管它仍然局限在肿瘤中，所以“游离”实质上意味着非受体结合。
本发明人进一步推论人类抗体阻止VEGF结合一个而不是两个受体，将仍然能够通过结合与脉管系统上的VEGF结合的受体而递送治疗试剂至肿瘤环境。这是本发明的有利特征之一。也就是，人类抗体的提供阻止VEGF结合VEGFR2并因此抑制来自VEGF的血管新生信号，但是不阻止VEGF结合VEGFR1。除通过其它细胞类型和组织中的VEGFR1维持VEGF信号传导而减少系统副作用之外，这些人类抗体能够将VEGF-VEGFR1复合物定位在肿瘤脉管系统上并直接递送治疗试剂至此。
VEGFR1和VEGFR2均在肿瘤内皮细胞上上调，这与正常组织中的内皮细胞相反。VEGFR1在肿瘤血管内皮上高度表达，这使得本发明的靶向方面显著有效。事实上，尽管在内皮中“非信号传导”，如果不能在更高水平，VEGFR1至少与VEGFR2在同一水平表达。这个现象潜在的因素是VEGFR1为应答缺氧和VEGF而上调，然而VEGFR2仅因应答VEGF而上调并且不能由缺氧而影响。
尽管VEGFR1在内皮上的作用仍然不确定，VEGFR1可以作为引诱受体以“捕获”VEGF并传送配体至信号传导受体VEGFR2上。因为这是正确的，人们可以预期引诱受体具有比信号传导受体对VEGF更高的结合力，这也确实是事实。根据这个，并且可能同样由于提高的表达水平，本发明的阻碍VEGFR2而不阻碍VEGFR1的人类抗体是对于肿瘤治疗的理想的递送试剂。这些抗体的治疗偶联物能够同时通过VEGFR2抑制血管新生和通过递送治疗试剂至VEGF-VEGFR1受体复合物而破坏现有的脉管系统。
本发明人决不限制于将在前的科学推论作为本发明人类抗体的有益的抗血管新生和肿瘤定位的性质的解释。尽管本发明的效用是不言而喻的并且不需要基本理论以实现，发明人已经考虑了选择性的机理，通过此阻碍VEGFR2而不阻碍VEGFR1的人类抗体可以有效地并特异地定位至肿瘤脉管系统。
这样的人类抗体可以结合与细胞表面上的另一个已知的或至今未表征的VEGF结合蛋白相关的VEGF或可以结合与内皮细胞表面的硫酸乙酰肝素糖蛋白结合的VEGF。抗体定位同样可以通过结合VEGF家族蛋白的另一个成员，即VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D(它们与血管相关)而提高，尽管这较少可能。
本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体的另一个有利性质是这些抗体中和通过VEGFR2介导的VEGF的残存信号或“保护作用”。除了使得人类抗体本身更有效之外，该性质使得它们在与其它试剂结合时特别有用，其它试剂受VEGF的残存的功能限制。
例如，VEGF保护内皮不受放射治疗损伤。因此，本发明的裸抗体和免疫偶联物对于结合放射治疗使用是理想的。通过使用这种连接到放射治疗试剂上的人类抗体提供更多的益处。该类型的构建体可能具有三个优势：(1)通过抗体部分发挥抗血管新生效果；(2)通过放射治疗试剂的递送发挥肿瘤脉管系统的破坏效果；和(3)防止VEGF的典型的残存信号抵消放射治疗试剂的效果。
具有同样的协同作用的其它构建体是与抗微管蛋白药物或前药、抗细胞凋亡试剂和其它抗血管新生试剂结合的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体。这些试剂或药物引起细胞凋亡的作用被VEGF拮抗。本发明因此通过中和VEGF改进了这些试剂的效力。VEGF残存信号同样拮抗内皮抑素，限制了这种治疗。因此，与内皮抑素联合使用，本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体将中和VEGF并增强内皮抑素的抗肿瘤效果。阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体同样可以用于特异地递送胶原酶至肿瘤，胶原酶将在原位产生内皮抑素，达到相似的益处。
在所有这样的增强的或增效的组合中，人类抗体和其它试剂可以分开施用，或第二种试剂可以连接至人类抗体以特异递送(即靶向递送至VEGFR1)。在与内皮抑素的结合中，化学偶联物或重组融合将是优选的，因为这些将抵消内皮抑素的短的半衰期，这是目前潜在的内皮抑素治疗的限制。同样可以结合使用组织型纤溶酶原激活剂(tPA)或组织型纤溶酶原激活剂的靶向形式。
本发明的人类治疗法的更多优势包括降低间隙压力的能力。由于VEGF介导的增加的渗透性对间隙压力有贡献，降低的通过VEGFR2的信号传导将降低渗透性和间隙压力。依次地，这将减少药物穿过整个肿瘤组织的障碍，因此远离脉管系统的肿瘤细胞将被杀死。同样可以达到延长的治疗，由于本发明的组合物具有无、可以忽略的或低的免疫原性。
B3.抗体CDR序列
本文中关于抗体所用的术语“可变的”意思是可变区的某些部分在抗体中的序列广泛不同，并且被用于对于其特定抗原的每一特定抗体的结合和特异性。但是，可变性并不是在抗体的可变区中平均分布。它集中在轻链和重链可变区中的被定义为“高变区”的三个片段中。
可变区的更高度保守的部分被称为骨架区(FR)。每一天然的重链和轻链的可变区都包括4个FR(分别是FR1、FR2、FR3和FR4)，主要采用β-折叠结构，由3个高变区连接，高变区形成连接β-折叠结构的环，并且在一些例子中，形成β-折叠结构的一部分。
每条链中的高变区保持在一起接近FR，并且同来自其它链的高变区一起有助于抗体的抗原结合位点的形成(Kabat，1991，通过应用的方式特异地结合至本文)。恒定区并不直接涉及在抗体与抗原的结合中，但是发挥多种效应物功能，如在抗体依赖性细胞毒作用中抗体的参与。
本文所使用的术语“高变区”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即，轻链可变区中的24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)残基和重链可变区中的31-35(H1)、50-56(H2)和95-102(H3)残基；Kabat等，1991，通过引用的方式特异地结合至本文)和/或来自“高变环”的那些残基(即，轻链可变区中的26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)残基和重链可变区中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)残基)。“骨架”和“FR”残基是如本文所定义的高变区残基之外的那些可变区残基。
r84 ScFv片段的VH和VL链的DNA和推导的氨基酸序列在本文中提供为SEQ ID NO：1(VH，核酸)、SEQ ID NO：2(VL，核酸)、SEQ IDNO：3(VH，氨基酸)和SEQ ID NO：4(VL，氨基酸)。r84全长IgG的VH和VL链的DNA序列在本文中提供为SEQ ID NO：26(VH，核酸)和SEQ ID NO：27(VL，核酸)。这些序列包括抗体的重链和轻链的可变区的CDR1-3。
如本文所叙述的(章节C7)，通过生物学分子的结构和功能信息的提供，可以产生一系列相当的或者甚至改进的分子。这适用本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体，如通过r84抗体例证的。尽管抗体的结合抗原和其它功能性质必需被保留，一旦参考的抗体已经被提供，在制备相当的和甚至改进的抗体中有绝对高水平的本领域的技术。根据本文提供的序列和信息，这样的技术技能可以被用在进一步抗体的制备中，进一步抗体具有相似的、改进的或其它想要的特性。
对于相当的抗体，一些氨基酸可以取代抗体恒定或可变区骨架区的其它氨基酸而没有相互结合能力的可见的损失。优选地这样的变化产生在编码抗体部分的DNA序列并且所述变化在自然中是保守的(见章节C7，表A中的密码子信息以及支持位点特异性突变的技术细节)。自然地，对应当产生的变化的数量有限制，但是这将是本领域普通技术人员知道的。
其它类型的变异体是与产生它们的亲本抗体相比具有改进的生物学性质的抗体。这样的变异体或第二代化合物，是典型的取代变异体包括亲本抗体的一个或多个取代的高变区残基。一种产生这样的取代变异体的便利的方法是使用噬菌体展示的亲合力成熟。
在使用噬菌体展示的亲合力成熟中，几个高变区位点(如6-7位点)被突变以产生在每一个位点的所有可能的氨基酸取代。因此产生的所述抗体变异体通过丝状噬菌体粒子以单价形式作为与包装在各粒子中的M13的基因III产物的融合而展示。然后筛选噬菌体展示变异体的如本文所公开的生物学活性(如结合亲合力)。为了鉴别用于修饰的候选的高变区位点，可以进行丙氨酸筛选突变以鉴别对结合抗原有显著贡献的高变区残基。
可选地或另外，预期对抗原-抗体复合物的晶体结构进行描述和分析以鉴别抗体和VEGF之间的接触点。这样的接触残基和邻近残基是用于取代的候选。一旦产生这样的变异体，变异体的平板将用于筛选，如本文所描述的，并且在一个或多个相关实验中具有相似但不同的甚至更好的性质的抗体被选出用于进一步发展。
因此本发明的进一方面涉及分离的或纯化的DNA片段和编码本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体重链和轻链(如r84的重链和轻链)的CDR区的重组载体，以及通过DNA技术的应用的重组宿主细胞的制备和应用，该重组宿主细胞表达这样的CDR区。
本发明因此涉及人类或合成的DNA片段，它们从总基因组DNA中分离出并能够表达本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体重链和/或轻链(如r84的重链和轻链)的CDR区。本文中所使用的术语“DNA片段”指的是从特定物种的总基因组DNA中分离或纯化的DNA分子。包括在术语“DNA片段”中的是DNA片段和这样的片段的小一些的片段，以及重组载体，包括例如，质粒、粘粒、噬菌体、病毒等等。
相似地，包括编码片段或编码纯化的本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体重链和/或轻链，如r84的重链和/或轻链的CDR区的分离或纯化的基因部分的DNA片段，指的是包括这样的编码序列和在一些方面调控序列的DNA片段，其中调控序列从其它天然存在的基因或蛋白编码序列中充分分离或纯化。在这方面，术语“基因”用于简称功能性蛋白、多肽或肽的编码单位。本领域技术人员将理解，这个功能性术语包括天然的抗体编码序列和表达或可以适于表达合适的抗原结合蛋白、多肽或肽的小一些的工程片段。
“从其它编码序列中充分分离或纯化的”意思是目标编码片段或分离的基因部分形成DNA片段编码区的重要部分，以及DNA片段不包含大的部分的天然存在的编码DNA，如大的染色体片段或其它功能性基因或cDNA编码区。当然，这指的是最初分离的DNA片段，不排斥后来通过人工加至所述片段的基因或编码区。
在具体实施方式中，本发明涉及插入DNA序列的分离的或纯化的编码片段、或分离的或纯化的基因部分和重组载体，所述DNA序列编码本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体重链和/或轻链，如r84的重链和/或轻链的CDR区，包括至少第一序列区，该第一序列区包括与SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少大约75％、更优选地至少大约80％、更优选地至少大约85％、更优选地至少大约90％和最优选地至少大约95％的同源性或这样的氨基酸序列的氨基酸序列区；其中所述的CDR区至少充分地保持了SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR区的生物学性质。
如本文所公开的，所述序列可以包括一些生物学功能上相当的氨基酸或“保守取代”。其它序列可以包括功能上非相当的氨基酸或故意设计以提高CDR或含有CDR的抗体的性质的“非保守取代”，如本领域普通技术人员已知的和本文中进一步描述的。
同样应当理解，氨基酸和核酸序列可以包括额外的残基，如额外的N-或C-末端氨基酸或5’或3’序列并仍然与本发明的序列相符，只要所述序列满足上面阐述的标准，优选地包括涉及蛋白表达的生物学蛋白活性的保持或提高。加入的末端序列包括多种在编码区，以及控制区的5’或3’部分侧翼的非编码序列。
本发明的核酸片段可以因此与其它DNA序列结合，如启动子、多腺苷化信号、额外的限制酶切位点、多克隆位点、其它的编码片段等等，因此它们的全长可以相当大地变化。因此预期可以使用几乎任何长度的核酸片段，由于总长度优选因制备的方便和在有意的重组DNA方案中的应用而限制。
因此重组载体形成本发明的进一方面。特别有用的载体预期是在载体中DNA片段的编码部分位于启动子的控制之下的那些载体。通常，尽管并不排斥，将使用重组或异源启动子，即在它们自然的环境中并不与编码序列正常联合的启动子。这样的启动子可以包括细菌的、病毒的、真核的和哺乳动物的启动子，只要该启动子有效地引导DNA片段在选出用于表达的细胞型、生物体或甚至动物中表达。
用于蛋白表达的启动子和细胞类型的组合的应用是分子生物学领域的技术人员所知道的。使用的启动子可以是组成型或诱导型的，并且可以在引导引进的DNA片段高水平表达的合适条件下使用，如在重组蛋白或多肽的大规模生产中有益的。
本发明的核酸序列的表达可以通过本领域普通技术人员已知的和本文进一步描述的一种或多种标准技术便利地实现。例如，融合蛋白的重组表达的随后的描述同样充分地应用于抗体和在核酸水平没有与另一个编码序列有效连接的抗体片段。
B4.来自噬菌粒文库的抗体
重组技术现在为由编码一系列抗体的重组基因制备具有期望的特异性的抗体提供可能(Van Dijk等，1989；通过引用的方式结合至本文)。确定的重组技术包括通过组合的免疫球蛋白噬菌体表达文库的免疫筛选分离抗体基因，该组合的免疫球蛋白噬菌体表达文库通过从免疫动物的脾中分离的RNA制备(Morrison等，1986；Winter和Milstein，1991；每一篇都通过引用的方式结合至本文)。
对于这样的方法，组合的免疫球蛋白噬菌粒文库通过从免疫动物的脾中分离的RNA制备，并且表达合适抗体的噬菌粒通过使用表达抗原的细胞和对照细胞的淘筛(panning)而选择。这一手段比通常的杂交瘤技术的优势是大约104倍的抗体可以在一轮中制备和筛选，并且通过H和L链结合可以产生新的特异性，进一步增加了产生的合适抗体的百分比。
在细菌中制备大量不同抗体分子的方法使用λ噬菌体作为载体(Huse等，1989；通过引用的方式结合至本文)。使用λ载体的抗体的制备包括将重链和轻链群的DNA序列克隆至单独的起始载体中。所述载体随后随机地联合以形成单一载体，该单一载体引导重链和轻链的共表达以形成抗体片段。重链和轻链DNA序列通过扩增脾细胞(或它的杂交瘤)中分离的mRNA而获得，优选地通过PCRTM或相关的扩增技术，其中脾细胞来自已经用选择的抗原免疫的动物。重链和轻链序列典型地使用引物扩增，引物将限制酶切位点引入扩增的DNA片段的末端以方便将重链和轻链片段克隆至起始载体。
用于产生和筛选大文库的全部地或部分地合成抗体结合位点或抗体结合部位的另一个方法利用源自丝状噬菌体如M13、f1或fd的展示载体。这些被指定为“噬菌粒”的丝状噬菌体展示载体产生大的具有不同和新的免疫特异性的单克隆抗体的文库。该技术使用丝状噬菌体外壳蛋白膜锚定区作为在丝状噬菌体复制的组装期中连接基因-产物和基因的方式，并且已经被用于来自组合的文库的抗体的克隆和表达(Kang等，1991；Barbas等，1991；每一篇都通过引用的方式结合至本文)。
用于丝状噬菌体展示的常规技术在美国专利5,658,727中描述，通过引用的方式结合至本文。在最常规的意义上，所述方法提供了用于使用单一载体系统从抗体基因库中同时克隆和筛选预选择的配体结合特异性的系统。用于预选择的配体结合能力的文库的分离的成员的筛选为表达的抗体分子的结合能力与方便的方法结合提供可能，以分离编码文库成员的基因。
表达和筛选的结合通过将融合多肽靶向在细菌细胞外周胞质中以使得功能性抗体装配和在噬菌体装配中将融合多肽靶向在丝状噬菌体颗粒的外壳上以使得方便筛选目标文库成员的联合而完成。靶向外周胞质通过功能多肽中的分泌信号域的存在而得到。靶向至噬菌体颗粒通过融合
Figure BPA00001181831101011
中丝状噬菌体外壳蛋白膜锚定域(即，cpIII-或cpVIII-源的膜锚定域)的存在而得到。
基于丝状噬菌体的组合抗体文库的多样性可以通过以下方式增加：通过将重链和轻链基因混在一起，通过改变克隆的文库中的重链基因的一个或多个互补决定区，或通过易错聚合酶链式反应将随机突变引进文库。用于筛选噬菌粒文库的其它方法在美国专利5,580,717、5,427,908、5,403,484和5,223,409中描述，每一篇都通过引用的方式结合至本文。
筛选大的组合抗体文库的另一个方法已经被开发，其利用在丝状噬菌体、如M13、f1或fd表面上的不同的重链和轻链序列群的表达(美国专利5,698,426，通过引用的方式结合至本文)。两个类群的不同的重链(Hc)和轻链(Lc)序列通过聚合酶链式反应(PCRTM)合成。这些类群被克隆至含有表达必需元件的单独的基于M13的载体。重链载体包含基因VIII(gVIII)外壳蛋白序列，因此重链序列的翻译产生gVIII-Hc融合蛋白。两个载体的类群被随机组合，因此仅含有Hc和Lc序列的载体部分被连接成单一环状载体。
组合的载体引导用于两条多肽装配的Hc和Lc序列的共表达和M13上的表面表达(美国专利5,698,426；通过引用的方式结合至本文)。组合步骤随机地将两个不同类群中的不同的Hc和Lc编码序列带进单一载体。来自每一个独立载体的载体序列对于可存活的噬菌体的制备是必需的。此外，因为假gVIII序列仅包含在两个起始载体之一中，功能性抗体片段如Lc联合的gVIII-Hc融合蛋白的共表达不能在噬菌体表面完成，除非载体序列在单一载体中连接。
抗体文库的表面表达在琥珀抑制株系中实现。在非抑制株系中，Hc序列和gVIII序列之间的琥珀终止密码子拆开了两个成分。分离从非抑制株系中产生的噬菌体和感染抑制株系将在表达时连接Hc序列至gVIII序列。感染后培养抑制株系使得文库中的所有抗体种类在M13的表面的共表达作为gVIII融合蛋白(gVIII-Fab融合蛋白)。可选地，DNA可以从非抑制株系中分离，然后引进抑制株系以达到相同的效果。
通过标准的亲和离析程序筛选表面表达文库以筛选结合预选择的分子的特异性Fab片段。这样的方法包括，例如淘筛(Parmley和Smith；1988；通过引用的方式结合至本文)，亲和层析和固相印迹实验。优选是淘筛，因为高滴定度的噬菌体可以简单地、快速地并且在小体积中筛选。此外，这个程序可以选择类群中较小的Fab片段种类，否则它们将可能不被探测到并扩增至实质上同源的类群。选择的Fab片段可以在噬菌体类群扩增后，通过对编码多肽的核酸测序而表征。
用于制备不同的抗体文库和筛选期望的结合特异性的另一个方法在美国专利5,667,988和5,759,817中描述，每一篇都通过引用的方式结合至本文。所述方法包括使用简并寡核苷酸和引物延伸反应以将简并性融合至免疫球蛋白可变重链和轻链可变区的CDR区，以噬菌粒文库的形式制备异源二聚体免疫球蛋白分子文库，和在噬菌粒表面展示诱变的多肽。其后，筛选展示的蛋白的结合预选择的抗原的能力。
用于制备异源二聚体免疫球蛋白分子的方法通常包括(1)将目标重链或轻链的V区编码基因引进至噬菌粒展示载体；(2)使用寡核苷酸通过引物延伸将随机结合位点引进至噬菌粒展示蛋白载体，该寡核苷酸含有与抗体V区基因的CDR同源的区并且含有简并区用于产生随机编码序列以形成大类群的展示载体，每一个能够表达在噬菌粒表面展示蛋白上展示的不同的假定结合位点；(3)在丝状噬菌体颗粒的表面上表达展示蛋白和结合位点；以及(4)使用亲和技术，如淘筛抗预选择的抗原的噬菌体颗粒，分离(筛选)表面表达的噬菌体颗粒，从而分离一种或多种含有展示蛋白的噬菌粒，该展示蛋白含有结合预选择的抗原的结合位点。
用于制备不同的抗体文库和筛选想要的结合特异性的方法的进一步变化在美国专利5,702,892中描述，通过引用的方式结合至本文。在该方法中，仅使用重链序列，重链序列在编码CDRI高变区或CDRIII高变区的所有核酸位置被随机化，并且CDR中的遗传变异性不需要任何生物学过程而得到。
在该方法中，制备两个文库以遗传性地打乱重链基因结构骨架中的寡核苷酸基序。通过CDRI或CDRIII的随机突变，重链基因的高变区被重新构建从而导致高度多变序列的集合。由突变的基因序列的集合编码的重链蛋白具有仅需要两条免疫球蛋白链之一而具有免疫球蛋白所有的结合特性的潜能。
具体地，在缺少免疫球蛋白轻链蛋白时实践本方法。展示修饰的重链蛋白的噬菌体文库同固定的配体孵育以选择编码特异地结合固定的配体的重组蛋白。然后将结合的噬菌体从固定的配体上分离，并在细菌宿主细胞中通过生长扩增。扩增每一个表达不同的重组蛋白的单个病毒噬菌体，然后可以分析单个克隆的结合活性。
B5.含有人类抗体文库的转基因小鼠
重组技术现在可用在抗体的制备中。除了上面公开的组合的免疫球蛋白噬菌体表达文库，另一个分子克隆方法是通过含有人类抗体文库的转基因小鼠中制备抗体。这样的技术在美国专利5,545,807中描述，通过引用的方式结合至本文。
在最通常的意义上，这些方法包括转基因动物的产生，编码至少部分的人类起源的免疫球蛋白或能够重排以编码一系列的免疫球蛋白的遗传材料已经插入至它的生殖细胞中。插入的遗传材料可以从人类来源中产生，或可以合成产生。所述材料可以编码至少部分的已知的免疫球蛋白或可以被修饰以编码至少部分的改变的免疫球蛋白。
插入的遗传材料在转基因动物中表达，导致至少部分源自插入的人类免疫球蛋白遗传材料的免疫球蛋白的产生。已经发现遗传材料在转基因动物中重排，因此可以产生一系列的一部分或部分源自插入的遗传材料的免疫球蛋白，即使插入的遗传材料融合在生殖细胞的错误位置或具有错误的布局。
插入的遗传材料可以以DNA形式克隆至原核载体，如质粒和/或粘粒。大的DNA片段使用酵母人工染色体载体插入(Burke等，1987，通过引用的方式结合至本文)，或通过染色体片段引入(Richer和Lo，1989，通过引用的方式结合至本文)。插入的遗传物质可以以惯常的方式引入至宿主，例如通过注射或其它程序至受精卵和胚胎干细胞。
在优选的方面，使用最初并不携带编码免疫球蛋白恒定区的遗传材料的宿主动物，所以得到的转基因动物在产生免疫球蛋白时将仅使用插入的人类遗传材料。这可以通过使用缺少相关遗传材料的天然发生的突变体宿主或通过人工制备的突变体而完成，人工制备的突变体如在最终产生宿主的细胞系中，其中相关的遗传材料已经从宿主中移除。
当宿主动物携带编码免疫球蛋白恒定区的遗传材料，转基因动物将携带天然存在的遗传材料和插入的遗传材料，并且将制备源自天然存在的遗传材料、插入的遗传材料和两种类型的遗传材料的混合物的免疫球蛋白。既然这样，期望的免疫球蛋白可以通过筛选源自转基因动物的杂交瘤而获得，例如通过利用抗体基因表达的等位排斥或特异染色体丢失的现象。
一旦已经制备了合适的转基因动物，所述动物用期望的免疫抗原简单地免疫。依赖于插入的材料的性质，当外源的遗传材料仅编码部分免疫球蛋白时，所述动物可以制备嵌合的免疫球蛋白，如混合的鼠/人起源的嵌合的免疫球蛋白；或者当外源的遗传材料编码全部的免疫球蛋白时，所述动物可以制备全部的外源免疫球蛋白，如全部的人类起源的外源免疫球蛋白。
多克隆抗血清可以从免疫之后的转基因动物中制备。制备免疫球蛋白的细胞可以从动物中移除以制备目标免疫球蛋白。优选地，单克隆抗体从转基因动物中制备，如，通过融合来自动物的脾细胞和骨髓瘤细胞以及筛选得到的杂交瘤以选择生产期望抗体的那些。用于这样的过程的合适的技术在文本中描述。
在可选择的方法中，遗传材料可以以这样的方式引入动物中：期望的抗体在体液如血清或动物的外分泌液如乳、初乳或唾液中产生。例如，通过将编码至少部分人类免疫球蛋白的体外遗传材料插入至动物的编码乳蛋白的基因中，然后将基因引入哺乳动物的受精卵，如通过注射，所述卵可以发育成产生乳的成年雌性哺乳动物，所述乳含有至少部分地源自插入的人类免疫球蛋白遗传材料的免疫球蛋白。期望的抗体然后可以从乳中收获。用于实现这样的过程的合适的技术是本领域技术人员已知的。
前述的转基因动物通常用于产生单一同型的人类抗体，更具体地，对B细胞成熟至关重要的同型，如IgM和可能地IgD。用于制备人类抗VEGF抗体的另一个优选方法是使用在美国专利5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016和5,770,429中描述的技术；每一篇都通过引用的方式结合至本文，其中转基因动物被描述成能够从B细胞发育所需要的一种同型转变成另一种同型。
在B淋巴细胞的发育中，所述细胞最初产生IgM，其具有通过有结果地重排的VH和VL区决定的结合特异性。随后，各B细胞和它的后代细胞合成具有同样的L和H链V区的抗体，但是它们可能转换H链的同型。mu或δ恒定区的应用很大程度由可变剪接决定，使得IgM和IgD在单一细胞中共表达。其它的重链同型(γ、α和ε)仅在基因重排情形删除C mu和Cδ外显子之后天然地表达。这个基因重排过程，定义为同型转换，典型地通过直接地定位在各重链基因(除δ)上游的所谓转换片段之间的重组而发生。单独的转换片段是在2和10kb之间的长度，并且主要地由短重复序列组成。
因为这些理由，转基因在各用于同型转换的转换区上游大约1-2kb内引入转录调控序列是优选的。这些转录调节序列优选地包括启动子和增强子元件，更优选地包括与转换区天然连接(即，发生在生殖细胞结构中)的5’侧翼(即上游)区。尽管来自一个转换区的5’侧翼序列能够有效地连接至不同的转换区用于转基因构建，在一些实施方式中，优选的是，引入转基因构建体中的各转换区具有5’侧翼区，5’侧翼区直接地存在于天然存在的生殖细胞结构中的上游。涉及免疫球蛋白转换区序列的序列信息是已知的(Mills等，1990；Sideras等，1989；每一篇都通过引用的方式结合至本文)。在美国专利5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016和5,770,429所描述的方法中，包含在转基因动物功能中的人类免疫球蛋白转基因恰当地在遍及了B细胞发育的途径中发挥作用，导致同型转换。因此，在这个方法中，这些转基因被构建以产生同型转换和以下的一个或多个：(1)高水平和细胞类型特异表达，(2)功能基因的重排，(3)等位排斥的激活和对其的应答，(4)充分的原发系列的表达，(5)信号转导，(6)体细胞超突变，和(7)在免疫反应中转基因抗体基因座的控制。
转基因功能的重要要求是第一抗体系统的产生是足够多样的，以引发对于宽范围抗原的二次免疫应答。重排的重链基因由信号肽外显子、可变区外显子和前后排列的多域恒定区(multi-domain constant region)组成，其中的每一个由几个外显子编码。各恒定区基因编码不同种类的免疫球蛋白的恒定部分。在B细胞的发育中，V区最接近的恒定区被删除，导致新的重链种类的表达。对于各重链种类，可选形式的RNA剪接产生跨膜的和分泌的免疫球蛋白。
人类重链基因座由范围是2Mb的大约200个V基因片段、范围是大约40kb的大约30个D基因片段、集中在3kb范围内的6个J片段和展开超过大约300kb的9个恒定区基因片段组成。整个基因座跨越了14号染色体的长臂的末端部位大约2.5Mb。含有所有6个已知的VH家族的成员，D和J基因片段，以及mu、δ、γ3、γ1和α1恒定区的重链转基因片段是已知的(Berman等，1988；通过引用的方式结合至本文)。同样地构建含有所有必需的基因片段和来自人类轻链基因座的调控序列的基因组片段。
成功重排的免疫球蛋白重链和轻链转基因的表达通常通过抑制在转基因的非人类动物中的内源免疫球蛋白基因的重排而具有优势的效果。但是，在一些实施方式中，希望达到内源Ig基因座的完全失活，因此不能形成含有人类可变区和非人类(如鼠)恒定区的杂交的免疫球蛋白链，例如通过转基因和内源Ig序列之间的反式转换(trans-switching)。使用胚胎干细胞和同源重组，可以容易地排除内源免疫球蛋白系统。此外，可以通过使用多种技术，如反义技术完成内源Ig基因的抑制。
在本发明的其它方面，可能理想的是产生反义转换的免疫球蛋白。含有这样的嵌合的反义转换的免疫球蛋白的抗体可以用于多种应用，其中期望具有非人类(如鼠)恒定区，如在宿主中保持效应物功能。鼠科恒定区的存在能够提供优于人类恒定区的优势，例如，提供鼠科的效应物功能(如ADCC，鼠科补体结合)，因此这样的嵌合抗体可以在鼠疾病模型中被检测出。动物检测之后，可以分离编码人类可变区的序列，如通过PCRTM扩增或从来源(杂交瘤克隆)的cDNA克隆，并被剪接成编码期望的人类恒定区的序列以编码更适于人类治疗使用的人类序列抗体。
B6.通过PCRTM的突变
特异位点诱变是在通过对在先DNA的特异诱变制备个别抗体中有用的技术。该技术进一步提供了制备和检测序列突变体的现成的能力，序列突变体引入一种和多种前述情形，不管是否人源化，通过将一个或多个核苷酸序列引入DNA中。
尽管许多方法适于在诱变中使用，聚合酶链式反应的应用现在通常是优选的。该技术提供了一个快速并有效的将期望的突变引入至给出的DNA序列中的方法。下面的文本具体地描述了PCRTM将点突变引入序列的应用，如同可以被用于改变由给出的序列编码的氨基酸。本方法的改变同样适于将限制性酶切位点引入至DNA分子中。
在这个方法中，设计合成的寡聚核苷酸以在扩增的片段的一个末端引入点突变。在PCRTM之后，扩增的片段通过用Klenow片段处理产生平末端，然后连接平末端的片段并亚克隆至载体以用于序列分析。
为准备实施者期望突变的模板DNA，DNA被亚克隆至高拷贝数载体，例如pUC19，使用位于突变的区域侧翼的限制性位点。然后使用质量小量制备制备模板DNA。基于亲本序列但是包含期望的点突变并位于限制性酶切位点5’端的合适的寡核苷酸引物使用自动合成仪合成。通常要求引物与模板DNA大约15个碱基的同源性。引物可以通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，尽管这对于在PCRTM中使用并不是绝对必需的。然后寡核苷酸的5’端应当被磷酸化。
模板DNA应当通过PCRTM扩增，使用含有期望的点突变的寡核苷酸引物。在扩增缓冲液中MgCl2浓度通常大约是15mM。通常应当根据下述条件完成大约20-25个循环的PCRTM：变性，95℃30秒；杂交50℃2分钟；和延伸，72℃2分钟。PCRTM将通常包括最后一个循环延伸，大约72℃10分钟。在最后一个延伸步骤之后，大约5个单位的Klenow片段应当加至反应混合物中，并在大约30℃下孵育15分钟。需要Klenow片段的外切酶活性使得末端削平并适于平末端克隆。
所得到的反应混合物通常应当通过非变性琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳分析以验证扩增产生了预期的产物。实施者然后可以通过移除大部分的矿物油、用氯仿萃取以移除剩余的油、用缓冲的酚提取然后通过用100％乙醇沉淀浓缩而处理反应混合物。接下来，实施者应当用限制性酶消化大约一半的扩增片段，限制性酶在使用在寡核苷酸的侧翼序列切割。消化的片段在低凝胶化/熔化的琼脂糖凝胶上纯化。
为亚克隆片段和检查点突变，实施者可以通过平末端连接亚克隆两个扩增片段至适当消化的载体。这可以用于转化大肠杆菌，随后其中可以使用小量制备来自大肠杆菌中的质粒DNA。质粒DNA的扩增部分然后可以通过DNA测序进行分析，以确定得到正确的点突变。这是重要的，因为Taq DNA聚合酶可能将额外突变引入至DNA片段中。
点突变的引入同样可以使用连续的PCRTM步骤而达到。在这个程序中，两个含有突变的片段互相退火并通过互相引物合成而延伸。然后这个片段通过第二个PCRTM步骤扩增，从而避免了在上面的方案中的要求的平末端连接。这个方法中，模板DNA的制备、寡核苷酸引物的产生和第一个PCRTM扩增如上面描述的完成。但是，在这个过程中，选择的寡核苷酸应当与模板DNA在大约15至大约20个碱基之间的长度上同源，并且同样必须互相重叠大约10个碱基或更多。
在第二个PCRTM扩增中，实施者可以使用各扩增的片段和各侧翼序列引物，并运行PCRTM大约20至大约25个循环之间，使用上面描述的条件。实施者可以再一次通过上面描述的步骤亚克隆片段并检查点突变是正确的。
在任一个前述方法的使用中，通常优选通过扩增尽可能小的片段引入突变。当然，如寡核苷酸的退火温度的参数，由于通常由GC含量和寡聚物的长度而影响，应当仔细地考虑。这些方法的执行，以及如果必要的话最优化它们的条件，将是本领域技术人员已知的，并且在多个出版物中进一步描述，如现代分子生物学实验技术，1995，通过引用的方式结合至本文。
当实行位点特异的诱变时，表A可用作参考。
表A
Figure BPA00001181831101101
B7.抗体片段和衍生物
不管最初的本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体的来源，完整的抗体、抗体多聚体，或多种抗体的功能性的抗原结合区的任何一种可以用在本发明中。可以例证的功能区包括含有抗原结合域的抗体片段，如Fab′、Fab、F(ab′)2、单域抗体(DABs)、TandAbs二聚物、Fv、scFv(单链Fv)、dsFv、ds-scFv、Fd、线形抗体、微抗体、双价抗体、双特异性抗体片段等等。用于制备这样的构建体的技术是本领域已知的并在本文中进一步描述。
抗体构建体的选择可以被多种因素影响。例如，延长的半衰期可以源于肾内的完整抗体的主动再吸收，免疫球蛋白的Fc片段的性质。因此，基于IgG的抗体被期望展示比它们的Fab′对应物减慢的血液清除。但是，基于Fab′片段的组合物将通常展示更好的组织穿透能力。
如果期望，可以选择具体的Fc区以提供长的寿命。例如，见WO99/43713，其涉及具有提高的循环半衰期的恒定区，提高的循环半衰期通过充分地减少结合至Fcγ受体，FcγRI、FcγRII和FcγRIII实现(Friman，1991)。此外，美国专利7,083,784涉及源于提高它们对FcRn的亲合力(新生的Fc受体)的修饰而具有增加的体内半衰期的改进的恒定区。美国专利7,083,784的技术可以用于创造具有更好寿命的抗体，具有或不具有充分的效应物功能。
抗体片段可以通过全人类免疫球蛋白的蛋白质水解获得，蛋白至水解通过非特异的硫醇蛋白酶，木瓜蛋白酶。木瓜蛋白酶消化产生两个同样的抗原结合片段，定义为“Fab片段”，各具有单一的抗原结合位点，和残留的“Fc片段”。
木瓜蛋白酶必须首先通过还原具有半胱氨酸、2-巯基乙醇或二硫苏糖醇的活性位点中的巯基基团激活。在备存的酶中的重金属应当通过用EDTA(2mM)螯合而除去以保证最大程度的酶活性。酶和底物通常以重量比1∶100混合在一起。孵育后，反应可以使用碘乙酰胺通过硫醇基团的不可逆转的烷基化停止，或简单地通过透析而停止。消化的完全性应当通过SDS-PAGE和通过蛋白A-琼脂糖或离子交换层析分离的多种片段监控。
从人类起源的IgG中制备F(ab′)2片段的通常的方法是通过酶胃蛋白酶的限制性水解。在37℃、pH4.5的醋酸缓冲液中100x抗体过量w/w的条件暗示抗体在重链间二硫键的C末端侧被切开。鼠IgG消化的速率可以随亚类和条件而变化，亚类和条件应当被选择以避免完全降解的IgG的大的量。具体地，IgG2b易于完全降解。其它亚类要求不同的孵育条件以产生最佳的结果，所有的这些都是本领域已知的。
完整抗体的胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并仍然能够交叉连接抗原的F(ab′)2片段。对于通过胃蛋白酶消化IgG的典型的条件需要的条件包括：在pH4.5、0.1M醋酸缓冲液中透析，然后用0.1％w/w胃蛋白酶孵育4个小时；如果第一次在4℃下，pH2.8的0.1M的甲酸盐缓冲液透析16个小时，然后在醋酸缓冲液中，将提高IgG1和IgG2a的消化。在37℃下，在pH7.8的含有葡萄球菌V8蛋白酶(3％w/w)的0.1M磷酸钠缓冲液中孵育4小时，IgG2b给出更多的一致的结果。
Fab片段同样包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab′片段与Fab片段不同，通过在重链CH1区的羧基末端添加几个残基，包括一个或几个来自抗体铰链区的半胱氨酸。F(ab′)2抗体片段最初作为Fab′片段对制备，Fab′片段对之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它的化学偶联同样是已知的。
“Fv”片段是最小的抗体片段，包含完全的抗原识别和结合位点。这一区由紧密地、非共价连接的重链和轻链可变区二聚物组成。在这个结构中，各可变区的3个高变区(CDR)相互作用，在VH-VL二聚物的表面界定了抗原结合位点。共同地，6个高变区赋予了抗体抗原结合特异性。但是，甚至于单一可变区(或仅包括3个高变区(CDR)的一半的Fv对于抗原特异)具有识别和结合抗原的能力。
“单链Fv”或“sFv”或“scFv”抗体片段包括抗体的VH和VL区，其中这些区在单一多肽链中存在。通常，Fv多肽进一步在VH和VL区之间包括多肽连接物，使得sFv形成期望的用于抗原结合的结构。
出于更进一步补充本发明的涉及抗体的功能性抗原结合区，包括抗VEGF抗体的scFv、Fv、Fab′、Fab和F(ab′)2片段的制备和使用的教导的目的，以下专利通过引用的方式特异地结合至本文：美国专利5,855,866、5,965,132、6,051,230、6,004,555、5,877,289和6,093,399。WO98/45331同样通过引用的方式结合至本文，出于包括更进一步描述和教导抗体的可变区、超变区、互补决定区(CDR)的制备的目的。
“双价抗体”是具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其片段包括在同一个多肽链中重链可变域(VH)连接至轻链可变域(VL)(VH-VL)。通过使用太短而不能使得在同一条链上的两个区之间配对的连接物，所述区被迫与另一条链的互补区配对，形成两个抗原结合位点。双价抗体在EP404,097和WO93/11161中描述。可以是双特异的或单特异的“线性抗体”包括一对串联的Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)，其形成一对抗原结合区，如在Zapata等(1995)中所描述的。
在使用抗体的Fab′或抗原结合片段中，带有对组织渗透的伴随的好处，实施者可以通过修饰片段以增加它的半衰期而得到额外的优势。可以使用多种技术，如对抗体分子本身的处理或修饰，以及与惰性载体的偶联。出于增加半衰期的单一目的，而不是递送试剂至目标的任何偶联应当在Fab′和其它片段被选择渗透组织中仔细处理。但是，预期偶联至非蛋白多聚体，如PEG等等。
除了偶联，修饰因此基于修饰抗体片段的结构以赋予它更稳定，和/或减少体中代谢的速率。对于这样的修饰的一个机理是使用D-氨基酸代替L-氨基酸。那些本领域的普通技术人员将明白这样的修饰的引入需要跟随着对结果分子的严格检测以确定它仍然保留期望的生物学性质。进一步稳定修饰包括增加稳定部分至N-末端或C-末端，或两个末端的应用，其通常被用于延长生物分子的半衰期。仅作为例子，实施者可以希望通过酰化或胺化改变末端。
与本发明一起使用的中度偶联类型的修饰包括将结合回收受体(salvage receptor)的抗原表位引入抗体片段。用于完成这个的技术包括抗体片段的适当区的突变或引入抗原表位作为连接至抗体片段的肽标签。WO96/32478通过引用的方式结合至本文，出于进一步例证这样的技术的目的。结合回收受体的抗原表位是典型的来自Fc区的1个或2个环的3个或多个氨基酸区，其中所述1个或2个环转移至抗体片段上的类似的位置。WO98/45331的结合回收受体的抗原表位通过引用的方式结合至本文，用于与本发明一起使用。
B8.结合和功能试验
尽管本发明在动物和人类治疗方案中具有明显的效用，它同样具有许多其它的实际应用，包括许多体外应用。一些这样的应用涉及人类抗体或免疫偶联物的特异结合性质。在本发明的所有化合物包括至少一种VEGF结合成分中，它们可以用在事实上所有的结合实施方式中，其中可以使用任何的抗VEGF抗体。
相关的附加试剂的存在，尽管提供了有利的性质，并没有否定人类抗体区在任何结合实验中的效用。因此合适的有用的结合实验包括本领域中一般使用的那些，如免疫印迹、Western印迹、点杂交、RIA、ELISA、免疫组织化学、荧光激活细胞分选(FACS)、免疫沉淀反应、亲和层析等等，在本文中进一步描述。
一些标准的结合实验是在实验中抗原固定在固体支持基质，如硝化纤维、尼龙或它们的组合物上的那些，如免疫印迹、Western印迹和相关实验。其它重要的实验是ELISA。所有的这些实验可以容易地改变以用在VEGF的探测中，以及可以使用在血管新生疾病的诊断中。本发明的试剂同样可以与既新鲜冷冻又用福尔马林固定的石蜡包埋的组织块联合使用，在免疫化学组织中；在荧光激活细胞分选、流式细胞术或流式显微荧光测定法中；在免疫沉淀反应中；在抗原纯化实施方式中，如亲和层析，甚至包括如果是双特异性抗体，一种或多种抗原同时一步快速纯化；以及在本领域技术人员已知的在本文中给出信息的许多其它的结合实验中。
本发明的人类抗体的进一步实际应用是在功能性实验中作为对照。这些包括许多体外和离体实验和系统，以及动物模型研究。由于本发明的人类抗体的结合和功能性性质是显著有效的，即，它们抑制VEGF结合至VEGFR2和通过VEGFR2的信号传导，而不抑制VEGFR1，这样的“对照”应用事实上非常地有价值。这些从本发明的这样的实际应用中受益的实验包括，例如，关于VEGF介导的内皮细胞生长的实验、VEGF诱导的磷酸化和VEGF诱导的血管渗透性，以及新血管化的角膜植入微粒体实验和鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验。这些实验体系能够发展成体外或离体药物筛选实验，其中具有良好限定的性质的生物学材料的提供特别重要。
C.免疫偶联物
尽管本发明提供了用于抗血管新生方法的令人惊讶地有效的裸的或非偶联的人类抗体，本文同样提供了阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体免疫偶联物、免疫毒素和凝血配体。目前用在阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体治疗偶联物的优选试剂是放射治疗试剂(如通过本文所公开的放射性诊断而例证的)、化学治疗试剂、抗血管新生试剂、诱导细胞凋亡试剂、抗微管蛋白药物、抗细胞或细胞毒素试剂、细胞因子、趋化因子、V型ATP酶抑制剂和凝血剂(凝血因子)。
为获得免疫偶联物、免疫毒素和凝血配体，可以使用重组表达以产生融合蛋白，如本领域技术人员已知的和在本文中进一步公开的。相同地，免疫偶联物、免疫毒素和凝血配体可以使用抗生物素蛋白：生物素桥或任何相关于抗体偶联物而发展的化学偶联和交联技术而产生。
C1.毒性和抗细胞试剂
对于一些应用，治疗试剂可以是细胞毒素试剂或药理学试剂，特别是具有杀死或抑制内皮细胞的生长或细胞分化能力的细胞毒素的、抑制细胞生长的或其它抗细胞试剂。通常，本发明的这些方面预期任何药理学试剂的应用，该任何药理学试剂可以与本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体偶联并以活性形式递送至靶向的内皮。
典型的抗细胞试剂包括化学治疗试剂，以及细胞毒素。可以使用的化学治疗试剂包括：激素，如类固醇；抗代谢物，如阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氨甲喋呤或氨喋呤；蒽环类；丝裂霉素C；长春花生物碱；秋水仙胺；依托泊苷；光神霉素；抗肿瘤烷化剂，如泵丁酸氮芥或美法仑。其它实施方式可以包括试剂如细胞因子。基本上，可以使用任何抗细胞试剂，只要它能够以一种形式成功地偶联或结合抗体，该形式将允许它在靶向的内皮细胞的位点上靶向、内在化、释放和/或呈现至血管成分。
可能有这些情况，如当通过与由毒性化合物引起的有效刺激一致的路线，目标抗原没有内在化时，其中实施者将期望靶向化学治疗试剂，如抗肿瘤药物、细胞因子、抗代谢物、烷化剂、激素等等。多种化学治疗和其它药理学试剂现在已经成功地与抗体偶联并显示药理学功能，包括阿霉素、道诺霉素、氨甲喋呤、长春碱、新制癌菌素、巨毛霉素、三亚胺醌和α-蝇蕈素。
在其它的情况中，来自基于细胞毒素治疗的潜在的副作用可以通过DNA合成抑制剂的使用而消除，如道诺霉素、阿霉素、阿霉素等等。因此这些试剂是用在本发明的抗细胞试剂的优选例子。在细胞抑制剂方面，这样的化合物通常打乱目标细胞的正常细胞周期，因此优选地细胞从细胞周期中被去除。
广泛多样的细胞毒素试剂已知可以与阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体偶联。例子包括多种有用的植物源、真菌源或细菌源毒素，作为例子，其包括多种A链毒素，特别是蓖麻毒素A链；核糖体失活蛋白，如皂草毒素蛋白或白树毒素；α-八叠球菌；曲霉素；局限曲霉素；核糖核酸酶，如胎盘核糖核酸酶；白喉毒素；和假单胞菌外毒素，仅列举几例。
已知的1992毒素书，“遗传工程毒素(Genetically EngineeredToxins)”，由Arthur E.Frankel编辑，包括附录，其包括大量毒素的初级氨基酸序列，通过引用的方式特异地结合至本文，出于进一步描述和使用在靶向构建体中毒素的应用的目的。
在毒素中，白树毒素和蓖麻蛋白A链是优选的。用于在这里使用的最优选的毒素部分是已经被处理以修饰或去除碳水化合物残基的毒素A链，称为去糖基化A链(dgA)。去糖基化蓖麻蛋白A链是优选的，因为它的极高的效力，更长的半衰期，和因为在临床分级和标准内制备它是经济上可行的。
从药理学观点可能期望使用最小的分子但可能提供适当的生物学反应。实施者因此期望使用提供适当的抗细胞反应的小一些的A链多肽。最终，已经发现蓖麻蛋白A链可以通过使用枯草菌蛋白酶(Sigma)去除30个N末端氨基酸而被“截短”，并仍然保持适当的毒素活性。当需要时，提议这个截短的A链可以被用在根据本发明的偶联物中。
可选地，实施者可以发现对毒素A链部分的重组DNA技术的应用将提供与发明一致的额外的好处。因为已经完成生物学活性的蓖麻蛋白A链的克隆和表达，现在可能鉴别和制备较小的或者另外的变异体多肽，但其表现出适当的毒素活性。此外，蓖麻蛋白A链现在已经被克隆的事实允许定点诱变的应用，通过此实施者可以容易地制备和筛选A链来源的多肽并获得与本发明连同使用的额外的有用的部分。
C2.凝血因子
本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体可以连接至能够直接或间接刺激凝血的成分，以形成凝血配体。这里，抗体可以直接地连接至凝血剂或凝血因子，或可以连接至第二结合区，第二结合区结合凝血剂或凝血因子，并然后释放凝血剂或凝血因子。本文所用的术语“凝血剂”和“凝血因子”每一个都用于指代在适当的条件下能够直接或间接刺激凝血的成分，优选地当被提供至特异的体内环境，如肿瘤脉管系统。
优选的凝血因子是组织因子组合物，如截短的TF(tTF)、二聚物、多聚物和突变的TF分子。“截短的TF”(tTF)指的是被赋予膜结合缺陷的TF构建体，膜结合缺陷通过去除足够的氨基酸序列以达到在性质上的该变化。本文中的“充分量”是最初充分进入膜上的TF分子或另外介导功能性膜结合TF蛋白的跨膜氨基酸序列的量。去除这样的“足够量的跨膜序列”因此造成了缺乏磷脂膜结合能力的截短的组织因子蛋白或多肽，因此所述蛋白是充分的可溶蛋白，并不明显结合磷脂膜。截短的TF因此在标准的TF实验中，实质上未能转变因子VII为因子VIIa，并且仍然保持所谓的催化活性，包括在因子VIIa的存在下激活因子X。
美国专利5,504,067通过引用的方式特异地结合至本文，出于进一步描述这样的截短的组织因子蛋白的目的。优选地，用在本发明这些方面的组织因子将通常缺少蛋白的跨膜和细胞溶质区(氨基酸220-263)。但是，没有必需将截短的TF分子限制在219个氨基酸的确切长度的分子。
组织因子组合物作为二聚物同样有用。任何截短的、突变的或其它组织因子构建体可以被制成二聚物的形式，用于在本发明中使用。本领域普通技术人员将知道，这样的TF二聚物可以通过使用分子生物学和重组表达的标准技术而制备，其中两个编码区框内制备并由表达载体表达。相等地，多种化学偶联技术可以用在TF二聚物的制备中。个别的TF单体可以在偶联之前衍生。所有这样的技术将是本领域技术人员容易知道的。
如果期望，组织因子二聚物或多聚物可以通过生物学上可释放的键而连接，如选择的-可裂解的连接物或氨基酸序列。例如，预期包括在肿瘤环境中对于酶优先定位或活跃的裂解位点的肽连接物。这样的肽连接物的典型形式是由尿激酶、纤维蛋白溶酶、凝血酶、因子IXa、因子Xa或金属蛋白酶，如胶原酶、白明胶酶或基质溶解酶裂解的那些。
在一些实施方式中，组织因子二聚物可以进一步包括阻止疏水膜插入部分，以随后促进组织因子和磷脂膜的功能结合，但是仅在一些详细定义的条件下。如在本文所描述的截短的组织因子，疏水膜结合序列通常是由于它们的疏水性质促进与磷脂环境的结合的氨基酸链。相等地，脂肪酸可以用于提供潜在的膜插入部分。
这样的膜插入序列可以定位在TF分子的N-末端或C-末端，或通常地附加在分子的任何其它点，只要它们的连接没有阻碍TF构建体的功能性质。阻止插入部分的目的是它保持了非功能性直到TF构建体定位在肿瘤环境内，和允许疏水性附加物以成为可接近的和甚至进一步促进与膜的物理结合。再一次，预期生物学可释放的键和选择性裂解序列将在这点上特别有用，键或序列仅在定位在肿瘤环境内和暴露于特定酶或其它生物学活性分子时被裂解或别的方式的修饰。
在其它实施方式中，tTF构建体可以是多聚的或二聚的。在本文中，“聚合构建体”包含3个或多个阻止因子构建体。“多聚的或聚合的TF构建体”是包括有效地连接至至少第二种和第三种TF分子或衍生物的第一种TF分子或衍生物的构建体。多聚物可以包括大约3至大约20个这样的TF分子。在多聚物或聚合物内的个别的TF单元同样可以通过所期望的选择性可裂解的肽连接物或其它生物学可释放的键连接。再一次，由于具有上面讨论的TF二聚物，构建体可以使用重组操作和表达或使用标准的合成化学而容易地制备。
甚至在本发明文中有用的进一步TF构建体是缺乏刺激因子VII能力的那些突变体。这样的“因子VII激活突变体”在本文中通常被定义为结合功能性因子VII/VIIa，蛋白水解性地激活因子X，但是实质上没有能力蛋白水解性地激活因子VII的TF突变体。因此，这样的构建体是缺失因子VII激活活性的TF突变体。
这样的因子VII激活突变体在促进肿瘤特异性凝血中起作用的能力是基于它们的特异递送至肿瘤脉管系统，和在血浆中低水平的因子VIIa的存在。当施用这样的因子VII激活突变体偶联物时，突变体将定位在血管肿瘤的脉管系统中。在定位之前，TF突变体可能通常不能在任何其它身体位置促进凝血，由于它不能将因子VII转换成因子VIIa。但是，当在肿瘤区定位和聚集时，所述突变体然后将遇到来自血浆的因子VIIa以发动外在的凝血途径，导致肿瘤特异的血栓症。外源因子VIIa同样可以对病患施用。
可以制备任何一个或多个多种因子VII激活突变体并且与本发明联合使用。大量存在关于TF分子上的对于因子VII/VIIa的识别位点的科学知识。因此应当理解，因子VII激活区通常位于TF分子的大约157位氨基酸和大约167位氨基酸之间。但是，预期在这个区之外的残基同样可能证明与因子VII激活活性相关，并且实施者可以因此考虑将突变引进至通常定位在TF序列的大约106位氨基酸和大约209位氨基酸之间的任何一个或多个残基(WO 94/07515；WO 94/28017；通过引用的方式结合至本文)。
多种其它凝血因子可以与本发明一起使用，如通过下面描述的试剂所例证的。凝血酶、因子V/Va和衍生物、因子VIII/VIIIa和衍生物、因子IX/IXa和衍生物、因子X/Xa和衍生物、因子XI/XIa和衍生物、因子XII/XIIa和衍生物、因子XIII/XIIIa和衍生物，因子X激活剂和因子V激活剂可以用在本发明中。
拉塞尔毒蛇毒液因子X激活剂预期用于本发明中。特异于拉塞尔毒蛇毒液中存在的因子X激活剂的单克隆抗体同样已经被制备，并且可以用于特异递送作为双特异性结合配体一部分的试剂。
通过血小板微粒体中的环氧化酶和凝血噁烷合成酶的连续作用，凝血噁烷A2由内过氧化物形成。凝血噁烷A2由血小板容易地产生，并且是有潜力的血管收缩药，由于它的引起血小板聚合的能力。凝血噁烷A2和它的活性相似物被预期用在本发明中。
凝血噁烷合酶和合成血小板激活的前列腺素的其它酶同样可以在本文中被用作“凝血剂”。抗凝血噁烷合成酶的单克隆抗体和凝血噁烷合酶的免疫亲和纯化是已知的，以及人类凝血噁烷合酶的cDNA。
α2-抗血纤维蛋白溶酶，或α2-血纤维蛋白溶酶抑制剂是在人类血浆中自然存在的蛋白酶抑制剂，有效地抑制由血纤维蛋白溶酶原激活剂诱导的纤维蛋白凝块的溶解。α2-抗血纤维蛋白溶酶是显著有效的抑制剂，并预期在本发明中使用。
由于α2-抗血纤维蛋白溶酶的cDNA序列是可利用的，优选的是重组表达和/或融合蛋白。抗α2-抗血纤维蛋白溶酶的单克隆抗体同样是可利用的，可以用在本发明的双特异性结合配体的实施方式中。这些抗体既可以用于递送外源的α2-抗血纤维蛋白溶酶至靶向位置或存储外源的α2-抗血纤维蛋白溶酶，又可以将其在靶向区内浓缩。
C3.抗微观蛋白药物
一系列药物通过干扰微管蛋白活性发挥它们的作用。由于微管蛋白的功能对于有丝分裂和细胞存活是必需的，一些“抗微观蛋白药物”是有利的化学治疗试剂。本文中使用的“抗微观蛋白药物”意思是抑制细胞有丝分裂的任何试剂、药物、前药或它们的结合，优选地通过直接或间接抑制对于细胞有丝分裂必需的微管蛋白活性，优选地微观蛋白聚合作用或解聚作用。
一些与本发明一起使用的更加已知的和目前优选的抗微观蛋白药物是秋水仙碱；紫杉烷，如紫杉醇(紫杉醇)和多烯紫杉醇；长春花生物碱，如长春碱、长春新碱和长春地辛；和考布他汀。其它合适的抗微观蛋白药物是细胞松弛素(包括B、J、E)、多拉斯他汀、auristatin PE、紫杉醇、稻曲病菌毒素D、利索新、1069C85、秋水仙酰胺、阿苯达唑、阿扎毒素和噻氨酯哒唑(nocodazole)。
如在美国专利5,892,069、5,504,074和5,661,143中所描述的，考布他汀是通常抑制细胞有丝分裂的雌二醇衍生物。可以与本发明联合使用的典型的考布他汀包括基于考布他汀A、B和/或D的那些和在美国专利5,892,069、5,504,074和5,661,143中所描述的那些。考布他汀A-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A-6、B-1、B-2、B-3和B-4是典型的前述类型。
美国专利5,569,786和5,409,953描述了考布他汀A-1、A2、A-3、B-1、B-2、B-3和B-4的每一种的分离、结构特征和合成，以及使用这样的考布他汀的制剂和治疗肿瘤生长的方法。任何一个或多个这样的考布他汀可以与本发明联合使用。
如在美国专利5,892,069、5,504,074、5,661,143和4,996,237中所描述的考布他汀A-4同样可以在这里使用。美国专利5,561,122进一步描述了合适的考布他汀A-4前药，其被预期与本发明联合使用。
美国专利4,940,726具体地描述了命名为考布他汀D-1和考布他汀D-2的大环内酯，其中每一个可以与本发明的组合物和方法联合使用。美国专利5,430,062涉及二苯乙烯衍生物和具有抗癌症活性的考布他汀类似物，可以与本发明联合使用。
C4.抗血管新生试剂
本发明详细地提供了组合的抗血管新生物。本发明的人类抗体可以连接至促血管生成素(Davis和Yancopoulos，1999；Holash等，1999；通过引用的方式结合至本文)，如促血管生成素-1(Ang-1)、促血管生成素-2(Ang-2)、促血管生成素-3(鼠)或促血管生成素-4(人)(Valenzuela等，1999；Kim等，1999)。
在这里使用的典型的抗血管新生物包括血管生成抑制素和内皮抑素。血管生成抑制素在美国专利5,776,704、5,639,725和5,733,876中公开，每一篇通过引用的方式结合至本文。血管生成抑制素是分子量在大约38KD和大约45KD之间的蛋白，通过还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳测定，其大约包括血纤维蛋白溶酶原分子的Kringle区1至4。血管生成抑制素通常具有氨基酸序列实质上相似于鼠血纤维蛋白溶酶原的片段的氨基酸序列，该片段起始于完整的鼠血纤维蛋白溶酶原分子的98位氨基酸。
血管生成抑制素的氨基酸序列在物种之间变化很少。例如，在人类血管生成抑制素中，氨基酸序列实质上相似于上面描述的鼠血纤维蛋白溶酶原片段的序列，尽管活性的人类血管生成抑制素序列可能起始于完整的人类血纤维蛋白溶酶原氨基酸序列的第97位或99位氨基酸。进一步，可以使用人类血纤维蛋白溶酶原，由于它具有相似的抗血管新生活性，如在鼠肿瘤模型中所显示的。
血管生成抑制素和内皮抑素已经成为深入研究的焦点，因为它们是第一个在小鼠中被证明不仅有抑制肿瘤生长并且可以引起肿瘤退化的血管新生抑制剂。已经有多种蛋白酶显示由血纤维蛋白溶酶原制备血管生成抑制素，包括弹性蛋白酶、巨噬细胞金属弹性蛋白酶(MME)、基质溶解因子(MMP-7)和92kDa白明胶酶B/类型IV胶原酶(MMP-9)。
MME可以在肿瘤中由血纤维蛋白溶酶原制备血管生成抑制素并且粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)通过巨噬细胞诱导血管生成抑制素的产生而上调MME的表达。在血管生成抑制素产生中MME的作用通过MME实际上在病患的肝细胞癌的临床样品中表达的发现支持。被认为能够产生血管生成抑制素的另一个蛋白酶是基质分解素-1(MMP-3)。MMP-3已经显示在体外由维蛋白溶酶原产生血管生成抑制素样片段。血管生成抑制素作用的机制目前是不清楚的，假设它结合内皮细胞上的未鉴定的细胞表面受体而引发内皮细胞进行程序性细胞死亡或有丝分裂阻止。
内皮抑素似乎是更加有力的抗血管新生和抗肿瘤试剂，在与阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体连接时特别优选。内皮抑素在小鼠中有效引起许多肿瘤模型退化。肿瘤不对内皮抑素产生抗性，并且在多循环治疗后，肿瘤进入休眠状态，在这个时候它们不增加体积。这个休眠状态中，经历细胞凋亡的细胞百分数增加，产生实质上保持同样大小的群体。
美国专利5,854,205，Folkman和O′Reilly，通过引用的方式特异地结合至本文，涉及内皮抑素和它作为内皮细胞增殖和血管新生的抑制剂的用途。内皮抑素蛋白相当于胶原类型XVIII的C末端片段，并且该蛋白可以从多种来源中分离。美国专利5,854,205同样教导了内皮抑素可以具有胶原类型XVIII、胶原类型XV或BOVMPE1前胃酯酶(pregastric esterase)片段的氨基酸序列。内皮抑素与其它抗血管新生蛋白，特别是血管生成抑制素的结合同样在美国专利5,854,205中描述，因此组合的组合物能够有效退化依赖血管新生的肿瘤的量。
根据本发明，内皮抑素和血管生成抑制素，特别是内皮抑素是优选的用于肿瘤递送的试剂。血管抑制素、血管能抑制素和乳腺丝氨酸蛋白酶抑制同样是优选试剂。同样可以制备内皮抑素融合蛋白，如美国专利6,342,221中所描述的，通过引用的方式结合至本文。同样可以制备多种形式的化学连接的内皮抑素，再一次如美国专利6,342,221中所例证的。
C5.诱导细胞凋亡试剂
本发明同样可以用于递送在肿瘤中任何细胞中诱导细胞凋亡的试剂，包括肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞。尽管许多抗癌症试剂可能具有诱导细胞凋亡的效果，作为它们作用机制一部分，一些试剂已经被发现、设计或选择具有这个作为主要机制，如下面所描述的。
许多形式的癌症已经报道在肿瘤抑制基因中的突变，如p53。p53的失活导致未能促进细胞凋亡。由于这个失败，癌细胞进展成肿瘤发生，而不是注定的细胞死亡。因此，同样考虑在本发明中使用肿瘤抑制物的递送以刺激细胞死亡。典型的肿瘤抑制物包括但不限于p53、眼癌基因(Rb)、威尔姆氏肿瘤(WT1)、bax alpha、白细胞介素-1b-转换酶和家族、MEN-1基因、神经纤维瘤病、类型1(NF1)、cdk抑制物p16、结肠癌基因(DCC)、家族性腺瘤性息肉病基因(FAP)、多肿瘤抑制基因(MTS-1)、BRCA1和BRCA2。
优选使用的是p53(美国专利5,747,469、5,677,178和5,756,455；每一篇都通过引用的方式结合至本文)、眼癌、BRCA1(美国专利5,750,400、5,654,155、5,710,001、5,756,294、5,709,999、5,693,473、5,753,441、5,622,829和5,747,282；每一篇都通过引用的方式结合至本文)、MEN-1(Genbank登录号U93236)和腺病毒E1A(美国专利5,776,743；通过引用的方式结合至本文)基因。
可以通过阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体递送的的其它组合物包括编码称为TRAIL的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体和TRAIL多肽的基因(美国专利5,763,223；通过引用的方式结合至本文)；美国专利5,605,826(通过引用的方式结合至本文)的24kD细胞凋亡相关蛋白酶；Fas相关因子，FAF1(美国专利5,750,653通过引用的方式结合至本文)。同样可以考虑用于本发明的这些方面的是提供白细胞介素-1β-转换酶和家族成员，它们同样被报道刺激细胞凋亡。
同样可以使用化合物，如喹诺酮衍生物(美国专利5,672,603和5,464,833；每一篇都通过引用的方式结合至本文)，分枝的成脂肽(branched apogenic peptide)(美国专利5,591,717；通过引用的方式结合至本为)，磷酸酪氨酸抑制剂和非水解的磷酸酪氨酸类似物(美国专利5,565,491和5,693,627；每一篇都通过引用的方式结合至本文)，RXR类维生素A受体激动剂(美国专利5,399,586；通过引用的方式结合至本文)，和甚至抗氧化剂(美国专利5,571,523；通过引用的方式结合至本文)。酪氨酸激酶抑制剂，如染料木黄酮，同样可以连接至本发明的试剂，本发明试剂靶向细胞表面受体VEGFR1(如由美国专利5,587,459支持的，通过引用的方式结合至本文)。
“第二线粒体来源的半胱氨酸蛋白酶激活剂”(SMAC)，同样被认为是DIABLO，是在细胞凋亡过程中从线粒体中释放出来的蛋白，并结合被称为“细胞凋亡蛋白抑制剂”(IAPs)的蛋白家族。IAP表达水平在许多人来肿瘤中增加。因此，IAP拮抗物或SMAC类似物已经被开发做为抗癌症试剂。这些可以与本发明联合使用，既可以作为偶联物，也可以联合治疗。
典型的IAP抑制剂包括基于SMAC和X连接的IAP(XIAP，也被认为是BIRC4)的BIR3域相互作用的晶体结构开发的那些和使用基于结构方法设计的单价和双价的IAP拮抗物(Vince等，2007；Varfolomeev等，2007)。同样可以使用被设计与SMAC的N-末端氨基酸相似的SMAC类似物，其与XIAP的BIR3域相互作用(Petersen等，2007)。已经显示SMAC类似物，甚至作为单一试剂，能够诱导敏感的人类肺癌异种移植物的退化，40％的治疗的动物保持了无肿瘤(Petersen等，2007)。
C6.细胞因子
细胞因子和趋化因子是连接至本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体的试剂的特别例子。可以使用一系列的细胞因子，包括IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-13、TGF-β、M-CSF、G-CSF、TNFβ、LAF、TCGF、BCGF、TRF、BAF、BDG、MP、LIF、OSM、TMF、IFN-α、IFN-β。更优选的细胞因子包括IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、GM-CSF、IFN-γ、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、血小板来源的生长因子-BB(PDGF-BB)和C-反应蛋白(CRP)等等。特别优选的例子是TNFα、TNFα诱导物、IL-2、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ和LEC。
例如，IL-12可以连接至阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体并用于将宿主抵御改变为攻击肿瘤血管。趋化因子LEC(肝表达的趋化因子，也被认为是NCC-4、HCC-4或LMC)是另一个优选的成分(Giovarelli等，2000)。LEC对于树突状细胞、单核细胞、T细胞、NK细胞和嗜中性粒细胞具有趋药性，因此能够提高宿主介导的抗肿瘤反应。
C7.生物学功能等效物
现在可以制备本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体的等效物，或甚至改进。可以在这样的抗体结构中做出修饰或变化并仍然获得具有相似或其它期望的特征的分子。例如，一些氨基酸可以取代蛋白结构中的其它氨基酸而没有可测量的相互结合能力的损失。这些考虑同样应用于毒素、抗血管新生试剂、诱导细胞凋亡试剂、凝血剂等等。
由于是蛋白的相互能力和自然性质限定了蛋白的生物学功能活性，一些氨基酸序列取代可以在蛋白序列中做出(或者当然地，其根本的DNA序列)并获得具有相似(拮抗)性质的蛋白。因此考虑可以在抗体和治疗试剂的序列中做出多种变化(或根本的DNA序列)而没有可测量的它们的生物学效用或活性的损失。可以使用本文表A中提供的密码子信息和关于位点特异突变的支持技术的详细资料制备由突变根本的DNA序列制备的生物学功能等效物。
本领域技术人员同样可以充分理解，“生物学功能等效”蛋白或肽的内在定义是对变化的数量有限定的概念，该变化可以在分子的限定部分之内产生，并仍然导致具有可接受的相当的生物学活性水平的分子。生物学功能等效蛋白和肽因此在本文中定义为其中一些，不是大多数或全部的氨基酸可以被取代的那些蛋白或肽。当然，具有不同取代的大多数不同的蛋白/肽可以容易地制成并根据本发明使用。这样的“生物学功能等效”肽可以被认为本文描述的“基本上一致的”序列的进一步的例子。
氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等等。对氨基酸侧链取代基的大小、形状和类型的分析显示精氨酸、赖氨酸和组氨酸都是正电荷残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸都是相似的大小；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸都具有通常相似的形状。因此，基于这些考虑，精氨酸、赖氨酸和组氨酸，丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸，和苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸在本文中被定义为生物学功能等效物。
在制备更多数量的变化中，可以考虑氨基酸的疏水系数(hydropathicindex)。每一个氨基酸已经被指定了疏水系数，基于它们的疏水性和电荷特性，这些是：异亮氨酸(+4.5)、缬氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)、甲硫氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、苏氨酸(-0.7)、丝氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、组氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天冬氨酸(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。
本领域通常理解氨基酸疏水系数对于赋予蛋白相互的生物学功能的重要性(Kyte和Doolittle，1982，通过引用的方式结合至本文)。已知一些氨基酸可以被取代为具有相似的疏水系数或分数的其它氨基酸并仍然保留相似的生物学活性。在基于疏水系数进行变化时，优先的是疏水系数在±2之内的氨基酸的取代，更优选的是在±1之内的那些，甚至更优选的是在±0.5之内的那些。
因此应当理解氨基酸可以被取代为另一个具有相似的亲水性数值的氨基酸并仍然获得生物学等效蛋白。如在美国专利4,554,101中详细说明的(通过引用的方式结合至本文)，以下的亲水性数值已经被指定给氨基酸残基：精氨酸(+3.0)、赖氨酸(+3.0)、天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、苏氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)、组氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、甲硫氨酸(-1.3)、缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)、色氨酸(-3.4)。
基于亲水性数值进行变化中，优先的是亲水性数值在±2之内的氨基酸的取代，更优选的是在±1之内的那些，甚至更优选的是在±0.5之内的那些。
C8.融合蛋白和重组表达
本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或免疫偶联物可以使用分子生物学技术作为融合蛋白而容易地制备。任何融合蛋白可以使用任何本文公开的和本领域已知的那些治疗试剂而设计和制备。融合蛋白技术容易适合于制备融合蛋白，其中两个部分通过选择性可裂解的肽序列连接。任何治疗试剂可以连接至抗体的末端或连接至不同于CDR的任何点。治疗试剂同样可以“完整地”制备，其中它们优选地与选择性可裂解的肽结合以允许靶向后试剂的释放。
使用重组DNA技术以实现这样的末端现在对于本领域技术人员是标准实践。这些方法包括例如，体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。另外地，DNA和RNA合成可以使用自动合成仪完成(见，例如，在Sambrook等，1989中描述的技术，通过引用的方式结合至本文)。
这样的融合蛋白的制备通常需要在框内制备第一个和第二个DNA编码区和功能性连接或这样的区的连接，以制备编码期望的融合蛋白的单一编码区。在本文中，阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体DNA序列将被连入具有编码治疗试剂的DNA序列的框内。通常并不相信构建体的哪一部分作为N-末端区或C-末端区被制备是特别相关的。
一旦期望的编码区已经制备，构建表达载体。表达载体包含一个或多个位于插入的DNA区的上游的启动子，启动子用于促进DNA的转录和因此促进编码的重组体蛋白的表达。这是“重组表达”的意思。
为得到被称为“重组体”形式的本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或它的免疫偶联物，它在重组细胞中表达。用于在原核或真核系统中表达的DNA片段的设计可以通过重组表达领域中的技术人员通常已知的技术实现。相信事实上任何表达系统可以被用在阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或免疫偶联物构建体的表达中。
这样的蛋白可以成功地在真核表达系统中表达，如CHO细胞，但是，预想细菌表达系统，例如大肠杆菌pQE-60将对于阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或免疫偶联物的大量制备和随后的纯化特别有用。cDNA同样可以在细菌系统中表达，编码的蛋白被作为与α-半乳糖苷酶、泛素、日本血吸虫谷胱甘肽S转移酶等等的融合物表达。相信在使用的方便性和由此获得的材料的质量方面，细菌表达将比真核表达具有优势。
在微生物表达方面，出于更进一步补充在重组宿主细胞中与基因表达相关的本发明的公开内容的目的，美国专利5,583,013、5,221,619、4,785,420、4,704,362和4,366,246通过引用的方式结合至本文。
重组制备的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体免疫偶联物可以被纯化或配制用于人类给药。可选地，编码免疫偶联物的核酸可以通过基因治疗递送。尽管可以使用裸的重组DNA或质粒，脂质体或载体的使用是优选的。一些病毒通过受体介导的细胞内吞作用进入细胞和整合至宿主细胞基因组并稳定和有效表达病毒基因的能力已经使得它们成为转移外源基因至哺乳动物的有吸引力的候选者。优选的用在本发明的基因治疗载体将通常是病毒载体。
逆转录病毒具有作为基因递送载体的希望，由于它们将它们的基因整合至宿主基因组的能力，转移大量的外源遗传物质，感染宽范围的物种和细胞类型并被包装在特定细胞系中。其它病毒，如腺病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、细胞巨化病毒(CMV)和腺相关病毒，如美国专利5,139,914所描述的那些(通过引用的方式结合至本文)同样可以被设计成用于基因转移的载体。
尽管一些可以接受外源遗传物质的病毒限制在它们能够容纳的核苷酸数量和它们感染的细胞范围中，这些病毒已经被证明能够成功影响基因表达。但是，腺病毒没有将它们的遗传物质整合至宿主基因组中，并且因此不需要宿主复制以用于基因表达，使得它们理想地适于快速、有效、异源基因表达。用于制备复制缺陷型感染性病毒的技术是本领域已知的。
在一些进一步的实施方式中，基因治疗载体将是HSV。使得HSV成为引人注意的载体的因素是基因组的大小和结构。因为HSV很大，多基因或表达盒的引入比在其它较小的病毒系统中少一些问题。另外，具有不同性能(如时间、强度)的不同病毒控制序列的可用性使控制比在其它系统中更广范围的表达成为可能。病毒具有相对少的剪接信息同样是个优势，进一步方便了遗传操作。HSV同样相对容易操作并可以生长至高滴定度。
当然，在使用病毒递送系统中，实施者将期望充分纯化病毒粒子以使得它基本上无不期望的污染物，如缺陷型干扰病毒粒子或内毒素和其它热原，因此它将不会在接受载体构建体的细胞、动物和个体中引起不适当的反应。纯化载体的优选方法包括浮力密度梯度的应用，如氯化铯梯度离心。
C9.抗体偶联物
阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体可以偶联至抗细胞或细胞毒素试剂，以制备“免疫毒素”；或者有效地与能够直接或间接刺激凝血的成分结合，因此形成“凝血配体”。在凝血配体中，所述抗体可以直接连接至直接或间接的凝血因子，或者可以连接至第二结合区，该第二结合区结合并然后释放直接或间接的凝血因子。“第二结合区”方法通常使用结合凝血剂的抗体作为第二结合区，因此导致双特异性抗体构建体。双特异性抗体的制备和应用通常是本领域熟知的，并在本文中进一步公开。
在制备免疫毒素、凝血配体和双特异性抗体中，可以使用重组表达。编码选择的抗体的核酸序列在框内被连接至编码选择的毒素、凝血剂或第二结合区核酸序列以产生表达单元或载体。重组表达导致新核酸的翻译，产生期望的蛋白产物。尽管使用编码抗体的核酸，而不是蛋白结合配体，重组方法本质上与本文上面描述的那些一样。
回到偶联技术，免疫毒素的制备通常是本领域熟知的。但是，在一些优选技术的应用中可以实现一些优势，在免疫毒素的制备中和用于随后的临床给药的它们的纯化中。例如，当基于IgG的免疫毒素将代表性地展示比它们的Fab′对应物更好的结合能力和减慢的血液清除时，基于Fab′片段的免疫毒素与基于IgG的免疫毒素相比将通常展示更好的组织渗透能力。
另外，虽然众多类型的含有二硫键的连接物已知能够成功地用于将毒素部分连接至阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体，但是基于不同的药理学特征和能力，一些连接物将通常比其它连接物优选。例如，优选含有空间上“位阻”的二硫键的连接物，由于它们在体内更加稳定，因此阻止毒素部分在结合作用位点之前释放。
广泛多种的细胞毒素试剂已知可以偶联至阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体，包括植物来源、真菌来源和细菌来源的毒素，例如蓖麻蛋白A链或去糖基化的A链。毒素A链与抗体的交联，在一些情形中，需要表现二硫化物功能的交联剂。这个原因并不清楚，但是很可能由于一旦试剂已经“递送”毒素至靶向细胞，这些毒素部分需要从抗体中容易地释放。
每一种类型的交联剂，以及交联如何实现，将倾向于改变得到的偶联物的药效。最后，在考虑可释放的毒素的例子中，实施者期望具有偶联物，该偶联物在身体中除了将要作用的位点之外的每一处所发现的条件下将保持完整，而在该将要作用的位点上期望该偶联物具有好的“释放”特性。因此，详细的交联方案，特别包括使用的具体的交联剂，并且交联的结构将是重要的。
取决于用于融合蛋白部分的明确的毒素化合物，可能需要提供有效连接抗体和毒素化合物的间隔肽，该间隔肽能够折叠进二硫键环结构。环内的蛋白裂解然后将产生异源二聚体多肽，其中抗体和毒素化合物仅由单一的二硫键连接。这样的毒素的例子是蓖麻蛋白A链毒素。
当使用一些其它的毒素化合物是，可以提供不可裂解的间隔肽以有效连接融合蛋白的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体和毒素化合物。可以用于与不可裂解的间隔肽连接的毒素是那些它们本身可以通过蛋白裂解而转换成细胞毒性的二硫键形式。这样的毒素化合物的例子是假单胞菌外毒素化合物。
可能有这样的情况，如当靶抗原通过与由免疫毒素引起的有效兴奋一致的途径没有内在化，实施者将期望靶向化学治疗试剂如抗肿瘤药物、其它的细胞因子、抗代谢物、烷化剂、激素等等时。多种化学治疗试剂和其它药物试剂现在已经成功地偶联至抗体并表现出起药理学功能。已经研究的典型的抗肿瘤试剂包括阿霉素、道诺霉素、氨甲喋呤、长春碱和多种其它的。此外，已经描述其它试剂的连接，如新制癌菌素、大分子霉素、三亚胺醌和α-蝇蕈素。
当凝血因子用于与本发明联用时，任何与抗体的共价连接应当在不同于它的功能性凝血位点的位点形成。组合物因此以任何有效的方式“连接”，有效方式允许每一个区表现它的预期的功能，没有明显的损伤。因此，抗体结合至VEGF，并且凝血因子促进血液凝结。
C10.生物化学交联剂
除上面提供的总说明之外，阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体可以使用一些优选的生物化学交联剂偶联至一种或多种治疗试剂。使用交联剂以形成将两个不同分子的官能团连接在一起的分子桥。为了以逐步方式连接两个不同蛋白，可以使用异源双功能交联剂以避免不期望的同聚物的形式。典型的异源双功能交联剂在表B中涉及。
表B
异源双功能交联剂
  交联剂 对......反应   优势和应用   交联后间隔臂长度
  SMPT   伯胺巯基   更加稳定   11.2A
  SPDP   伯胺巯基   硫醇化可裂解的交联   6.8A
  LC-SPDP   伯胺巯基   延长的间隔臂   15.6A
  Sulfo-LC-SPDP   伯胺巯基   延长的间隔臂可溶于水   15.6A
  SMCC   伯胺巯基   稳定的马来酰亚胺反应基酶-抗体偶联半抗原-载体蛋白偶联   11.6A
  Sulfo-SMCC   伯胺巯基   稳定的马来酰亚胺反应基可溶于水酶-抗体偶联   11.6A
  MBS   伯胺巯基   酶-抗体偶联半抗原-载体蛋白偶联   9.9A
  Sulfo-MBS   伯胺巯基   可溶于水   9.9A
  SIAB   伯胺巯基   酶-抗体偶联   10.6A
  Sulfo-SIAB   伯胺巯基   可溶于水   10.6A
  SMPB   伯胺巯基   延长的间隔臂酶-抗体偶联   14.5A
  Sulfo-SMPB   伯胺巯基   延长的间隔臂可溶于水   14.5A
  EDC/Sulfo-NHS   伯胺羧基   半抗原-载体偶联   0
  ABH   糖非选择性   与糖基团反应   11.9A
异源双功能交联剂包含两个反应基：一个通常与伯胺基团(如，N-羟基琥珀酰亚胺)反应，另一个通常与硫醇(如二硫吡啶、马来酰亚胺、卤素等等)反应。通过伯胺反应基，交联剂可以与一种蛋白(如，选择的抗体或片段)的赖氨酸残基反应，通过硫醇反应基，已经连接至第一种蛋白的交联剂与另一种蛋白(如凝血剂)的半胱氨酸残基(无巯基)反应。
因此组合物通常具有或衍生具有可用于交联目的的官能团。这种需要并没有考虑限制在可以以这种方式使用的广泛多种的基团。例如，伯胺或仲胺基团、酰肼或肼基团、羧基醇、磷酸或烷化基团可以用于结合或交联。
交联剂的两个反应基之间的间隔臂可以具有多种长度和化学成分。当桥中的一些特别的成分(如苯基)可能给予反应基额外的稳定性或对多方面作用的化学连接的增加的抵抗性(如，二硫键抵抗还原剂)时，较长的间隔臂允许偶联成分更好的弹性。同样可以考虑间隔肽的应用，如L-Leu-L-Ala-L-Leu-L-Ala。
优选的是使用在血液中具有合理稳定性的交联剂。含有二硫键的多种类型的连接物已知可以成功地使用于连接抗体和毒素或凝血剂。含有空间位阻的二硫键的连接物可以证实在体内给予更好的稳定性，预防在作用位点结合之前释放试剂。这些连接物因此是一个优选组的连接试剂。
用在免疫毒素中的一种最优选的交联试剂是SMPT，是双功能性交联剂，含有被邻近的苯环和甲基“空间位阻”的二硫键。认为二硫键的空间位阻提供了保护键免遭硫醇盐阴离子攻击的功能，硫醇阴离子如能够存在于组织和血液中的谷胱甘肽，并因此帮助预防连接物在递送连接的试剂至肿瘤位点之前被分开。考虑SMPT试剂同样可以与本发明的双特异性配体联合使用。
SMPT交联试剂，如与许多其它已知的交联试剂，给予交联官能团的能力，交联官能团如半胱氨酸的SH或伯胺(如赖氨酸的ε氨基基团)。另一个可能类型的交联剂包括含有可裂解的二硫键的异源双功能的光反应性叠氮苯，如磺基琥珀酰亚胺-2-(p-叠氮基水杨酰胺基)乙基-1，3′-二硫代丙酸酯。N-羟基-琥珀酰亚胺基基团与伯胺基团反应，叠氮苯(当光分解时)非选择性地与任何氨基酸残基反应。
除了位阻的交联剂，同样可以根据本文使用非位阻的交联剂。其它有用的交联剂，不考虑包含或产生保护的二硫化物，包括SATA、SPDP和2-亚氨基硫烷。这样的交联剂的应用是本领域熟知的。
一旦偶联，偶联物从未偶联的靶向和治疗试剂中分离以及从其它污染物中分离。很多纯化技术可以利用以用于提供充分程度纯度的偶联物以使得它们临床上有用。基于大小分离的纯化方法，如凝胶过滤、凝胶渗透或高效液相色谱法将通常是最多使用的。其它的色谱技术，如蓝色琼脂糖分离同样可以使用。
C11.生物学可释放的连接物
尽管优选的是任何连接部分将具有在血液中的合理的稳定性，以防止连接的试剂在靶向疾病或肿瘤位点之前实际的释放，在一些方面，可以考虑使用生物学可释放的键和/或选择性可裂解的间隔物或连接物。“生物学可释放的键”和“选择性可裂解的间隔物或连接物”在循环中仍然具有合理的稳定性。
因此本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体可以通过生物学可释放的键连接至一种或多种治疗试剂。可以使用任何形式的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体，包括完整的抗体，尽管在一些实施方式中ScFv片段将是优选的。
“生物学可释放的键”或“选择性可水解的键”包括仅在或优选在一些条件下可释放、可裂解或可水解的所有连接。这包括二硫化物和三硫化物键和酸不稳定性键，如在美国专利5,474,765和5,762,918中所描述的，每一篇通过引用的方式结合至本文。
特别考虑用于将治疗试剂或药物连接至本发明的抗体的酸敏感性间隔物的应用。在这样的实施方式中，治疗试剂或药物被释放在细胞内部的酸性间隔中。考虑酸敏感性释放可以发生在细胞外，但是仍然在特异靶向之后，优选地至肿瘤位点。一些目前优选的例子包括通过酸敏感间隔物连接至秋水仙碱或阿霉素的人类抗体。同样考虑通过抗体的碳水化合物部分的连接。在这样的实施方式中，治疗试剂或药物被释放在细胞内部的酸性间隔中。
同样可以衍生人类抗VEGF抗体以引进允许通过生物学可释放的键连接治疗试剂的官能团。所述人类抗体可以因此被衍生以引进以酰肼、肼、伯胺或仲胺基团终止的侧链。治疗试剂可以通过Schiff碱连接、腙或酰腙键或酰肼连接物偶联(美国专利5,474,765和5,762,918，每一篇都通过引用的方式结合至本文)。
如在美国专利5,474,765和5,762,918中所描述的，每一篇都通过引用的方式结合至本文，人类抗VEGF抗体可以通过一个或多个生物学可释放的键有效地连接至治疗试剂，生物学可释放的键是酶敏感性键，包括肽键、酯、酰胺、磷酸二酯和糖苷。
本发明优选的方式涉及肽连接物的应用，该肽连接物包括至少第一个对于优选定位在疾病位点内，具体地位于肿瘤环境内的肽酶和/或蛋白酶的裂解位点。因此抗体介导的连接的治疗试剂的递送导致在疾病位点或肿瘤环境内的特异的裂解，导致活性试剂的特异释放。一些肽连接物将包括裂解位点，该裂解位点重构中涉及的一种或多种酶识别。
包括用于尿激酶、尿激酶原、血纤维蛋白溶酶、血纤维蛋白溶酶原、TGFβ、葡激酶、凝血酶、因子IXa、因子Xa或金属蛋白酶，如间质胶原酶、白明胶酶或基质分解素的裂解位点的肽连接物是特别优选的。美国专利6,004,555、5,877,289和6,093,399通过引用的方式结合至本文，出于进一步描述和实施如何制备和使用含有生物学可释放的键和选择性可裂解的连接物和肽的靶向试剂-治疗试剂构建体的目的。具体地，美国专利5,877,289和6,342,221通过引用的方式特异地结合至本文，出于进一步描述和实施如何制备和使用含有选择性可裂解的肽连接物的抗体构建体的目的，该选择性可裂解的肽连接物在肿瘤环境中被尿激酶、血纤维蛋白溶酶、凝血酶、因子IXa、因子Xa或金属蛋白酶，如间质胶原酶、白明胶酶或基质分解素裂解。
目前优选的选择性可裂解的肽连接物是包括对于血纤维蛋白溶酶或金属蛋白酶(同样被认为是“基质金属蛋白酶”或“MMP”)如间质胶原酶、白明胶酶或基质分解素的可裂解位点的那些。可以有利地与本发明联合使用的额外的肽连接物包括，例如，来自尿激酶原、TGFβ、血纤维蛋白溶酶原、葡激酶、白明胶酶A、多种胶原、α2M、PZP、α1M、α1I3(2J)和α1I3(27J)的可裂解序列，包括在美国专利6,342,221中公开和要求保护的那些具体序列，通过引用的方式结合至本文。
C12.双特异性抗体
双特异性抗体在本发明的凝血配体和组合的抗血管新生方面特别地有用。但是，通常可以使用双特异性抗体，只要一个臂结合VEGF，并且双特异性抗体连接至治疗试剂，通常连接至不同于抗原结合位点的位点。
通常，本领域同样熟知双特异性抗体的制备。一种方法包括抗体的分离制备，抗体一方面具有对靶向的抗原的特异性，另一方面(如本文中)具有对凝血剂的特异性。消化的F(ab′γ)2片段由两个选择的抗体制备，跟着各自还原，以提供分离的Fab′γSH片段。两个连接的部分其中之一的SH基团然后用交联试剂如o-亚苯基二马来酰亚胺烷基化以在一个部分上提供游离的马来酰亚胺基团。这个部分然后可以通过硫醚连接连接至另一个，以提供期望的F(ab′γ)2异源偶联物。其它的技术是已知的，其中实现与SPDP或蛋白A的交联，或制备三特异性构建体。
D.药物组合物
本发明的药物组合物通常将包括有效量的至少第一种阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或免疫偶联物，其溶解或分散在药物学可接受的载体中或水介质中。同样考虑组合的治疗法，并且同样类型的根本的药物组合物可以用于单一或组合的药剂。
短语“药物学或药理学可接受的”指的是当适时施用于动物、或人类时，不产生相反的、过敏的或其它不适当的反应的分子实体和组合物。兽医应用相等地包括在本发明之内，并且“药物学可接受的”制剂包括用于临床和/或兽医使用的制剂。
如本文中所使用的，“药物学可接受的载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、包被物、抗细菌和抗真菌试剂、等压和吸收延迟试剂等等。这样的介质和试剂用于药物学活性物质的使用是本领域熟知的。除了任何惯例的介质或试剂与活性组成不相容的范围，考虑它在治疗组合物中的应用。对于人类给药，制备应当如FDA部门的生物制剂标准要求的满足无菌、致热原性、一般安全性和纯度标准。补充的活性成分同样可以引入至所述组合物中。
“单位剂量”制剂是那些含有适于特定时间递送的单次或分次施用的成分。例如，典型的“单位计量”制剂是含有日剂量或单位或日分剂量或周剂量或单位或周分剂量等等的那些。
D1.可注射的制剂
本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或免疫偶联物将最经常被制成用于肠胃外给药，如被制成用于通过静脉内、肌肉内、皮下、透皮或其它这样的途径注射，包括蠕动给药和直接的灌输至肿瘤或疾病位点(内腔给药)。本领域技术人员根据本发明的公开内容将知道含有这样的抗体或免疫偶联物作为活性成分的水组合物的制备。典型地，这样的组合物可以被制成注射剂，作为液体溶液或悬浮液；同样可以制备在注射之前添加液体时用于制备溶液或悬浮液的固体形式；所述的制剂同样可以被乳化。
适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液；包括芝麻油、花生油或水性丙二醇的制剂；和用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有的例子中，制剂应当是无菌的并流动至存在注射针通过性(syringability)的程度。它应当在制备和储存的条件下稳定并应当在抗微生物污染作用中保存，微生物如细菌和真菌。
阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或免疫偶联物组合物可以配制在无菌水组合物中，以中性或盐形式。作为游离碱或药物学可接受的盐的溶液可以在适宜地混合有表面活性剂的水中制备，如羟丙基纤维素。药物学可接受的盐，包括酸加成盐(与蛋白的游离氨基基团形成)，是与无机酸一起形成的那些，如盐酸或磷酸，或这样的有机盐如乙酸、三氟乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等等。由游离羧基形成的盐同样可以源自无机碱，如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物，和这样的有机碱如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等等。
合适的载体包括含有例如水、乙醇、多羟基化合物(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等等)、它们合适的混合物和植物油的溶剂和分散介质。在许多例子中，将优选地包括等压试剂，例如糖或氯化钠。可以保持适当的流动性，例如，通过使用包被物，如卵磷脂，通过在分散的情况下需要的微粒大小的保持和/或通过表面活性剂的使用。
在存储和使用的普通条件之下，所有的这样的制剂应当包含防腐剂以阻止微生物的生长。微生物作用的阻止可以通过多种抗细菌和抗真菌试剂实现，例如，对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等等。可注射组合物的延长的吸收可以通过在组合物中使用试剂延迟吸收而实现，例如，单硬脂酸铝和白明胶。
在制剂之前或制剂时，阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或免疫偶联物应当大量地透析以去除不期望的小分子量分子，和/或冻干至期望的载体中用于更迅速的制剂。无菌的注射溶液通过在适当的溶剂中引入需要量的活性试剂而制备，适当的溶剂具有多种以上列举的其它成分，如所需要的，跟着过滤灭菌。通常，分散通过引入多种灭菌的活性成分至无菌载体中制备，无菌载体含有基本的分散介质和需要的来自以上列举的那些的其它成分。
在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末情况下，制备的优选方法是产生活性成分，加上任何额外的来自它们之前过滤灭菌溶液的期望成分的粉末的真空干燥和冷冻干燥技术。
根据本发明的合适的药物组合物将通常包括一定量的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或免疫偶联物，其与可接受的药物稀释剂或赋形剂混合，如无菌水溶液，依赖于意图的使用而提供一系列的最终浓度。制备的技术通常是本领域熟知的，如雷明顿的药物学科学，第16版，Mack出版公司，1980，所例证的，通过引用的方式结合至本文。应当意识到内毒素污染物应当最低限度地保持在安全水平，例如，少于0.5ng/mg蛋白。此外，对于人类给药，制剂应当满足如FDA部门的生物学标准要求的无菌、致热原性、常规安全性和纯度标准。当为制剂时，抗体或免疫偶联物溶液将以与剂量制剂协调的形式给药并且以如治疗有效的量。
D2.缓释制剂
阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或免疫偶联物溶液的制剂可以容易地以多种剂量形式给药，如上面描述的注射溶液类型；但是同样可以考虑其它的药物学可接受的形式，如药片、药丸、胶囊或其它用于口服的固体物质，栓剂，阴道栓剂，鼻用溶液或喷雾，气雾剂，吸入剂，局部制剂，脂质体形式等等。给药的形式类型将与需要治疗的疾病或失调相匹配。
药物学“缓释”胶囊或“缓释”组合物或制品可以使用并通常可适用。缓释制剂通常被设计成超过延长的期限提供恒定药物水平并且可以用于递送根据本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或免疫偶联物。缓释制剂代表性地被输入至疾病位点的附近，例如，在肿瘤位点上。
合适的缓释制品的例子包括含有抗体或免疫偶联物的固体疏水性聚合物的半透性基质，其中基质是以成形的物品的形式，例如，膜或微囊体。缓释基质的例子包括聚酯；水凝胶，例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)；聚交酯，如美国专利3,773,919；L-谷氨酸和L-谷氨酸-γ-乙基酯的共聚物；不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯；可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如Lupron DepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射的微球体)；和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
当聚合体如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能够释放分子超过100天，一些水凝胶释放蛋白较短的时间期限。当装入胶囊的抗体在身体中保留长的时间，由于在37℃下暴露于湿气中，它们可能变性或聚合，因此导致降低生物学活性和/或变化的免疫原性。依赖所涉及的机制，合理的策略对于稳定性是可用的。例如，如果聚合机制包括通过硫-二硫化物交换的分子间的S-S键形成，稳定性通过修饰巯基残基、从酸溶液中冻干、控制水分含量、使用合适的添加剂、开发特异的聚合物基质组合物等等而实现。
D3.脂质体和纳米粒子
在一些实施方式中，脂质体和/或纳米粒子同样可以与阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或免疫偶联物一起使用。脂质体的形成和使用通常是本领域技术人员已知的，概括如下。
脂质体由分散在水介质中并同时形成多室同中心的双层脂质体(也被定义为多层脂质体(MLV)的磷脂形成。MLV的直径通常是25nm至4μm。MLV的超声降解导致小的单层囊泡的形成，其直径范围在200至500
Figure BPA00001181831101391
中心含有水溶液。
当在水中分散时，依赖于脂质对水的摩尔比例，磷脂可以形成多种不同于脂质体的结构。在低比例时，脂质体是优选的结构。脂质体的自然特性依赖于pH、离子强度和二价阳离子的存在。脂质体能够显示对离子和极性物质的低的渗透性，但是提高的温度遭受明显改变它们渗透性的相变。相变包括从密集有序的结构，已知如凝胶状态，至松散无序的结构的变化，已知如液体状态。这发生在典型的相变温度时并导致对离子、糖和药物的渗透性的增加。
脂质体与细胞相互作用通过4种不同机制：网状内皮组织系统的吞噬细胞的内吞作用，如巨噬细胞和嗜中性粒细胞；对细胞表面的吸附，通过非指定的弱疏水力或静电力，或通过与细胞表面成分的特定的相互作用；通过将脂质体的脂双层插入至质膜与浆细胞膜的融合，同时将脂质体内含物释放至细胞质；和通过将脂质体脂质转移至细胞或亚细胞膜，或反之亦然，没有脂质体内含物的任何联系。变化脂质体制剂可以改变机制有效，尽管同时可以操作多于一个。
纳米胶囊通常可以以稳定的和可再生的方式包陷化合物。为避免由于细胞内聚合物的超载引起的副作用，这样的极细小的粒子(大小大约0.1μm)应当被设计使用在体内可降解的聚合物。满足这些要求的生物可降解的聚氰基丙烯酸烷基酯纳米粒子可被考虑用在本发明中，并且这样的粒子可以容易地制备。
D4.眼药制剂
具有血管新生成分的许多疾病与眼睛相关。例如，与角膜新血管形成相关的可以根据本发明治疗的疾病包括，但不限于糖尿病视网膜病、早产儿视网膜病、角膜移植排斥、新生血管性青光眼和晶体后纤维素增生、流行性角膜结膜炎、维生素A缺乏、隐形眼镜过度磨损、过敏性角膜炎、上部角膜缘角结膜炎、翼状胬肉角结膜干燥、干燥、酒糟鼻、泡性角结膜炎、梅毒、分支杆菌感染、脂质恶化、化学性烧伤、细菌性溃疡、真菌性溃疡、单纯疱疹感染、带状疱疹感染、原生动物感染、卡波西肉瘤、蚕食性角结膜炎、Terrien角膜边缘性变性、边缘角蛋白溶解、外伤、风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多动脉炎、瓦格纳式肉瘤、巩膜炎、斯-琼氏综合征、放射状角膜切开术和角膜移植排斥。
与视网膜/脉络膜新血管形成相关的可以根据本发明治疗的疾病包括，但不限于，糖尿病视网膜病、黄斑变性、镰状细胞性贫血、结节病、梅毒、弹性假黄瘤、佩吉特病、静脉阻塞、动脉阻塞、颈动脉阻塞性疾病、慢性葡萄膜炎/玻璃体炎、分支杆菌感染、莱姆病、系统性红斑狼疮、早产儿视网膜病、Eales病、白塞氏病、感染引起的视网膜炎或脉络膜炎、眼假组织胞浆菌病、Bests病、近视、视凹、Stargart病、睫状体平坦部炎、慢性视网膜脱落、超高粘度综合症、弓形体病、外伤和激光后并发症。
可以根据本发明治疗的其它疾病包括，但不限于，与巩膜发红相关的疾病(视角的新血管形成)和由维管或纤维组织不正常的增殖引起的疾病，包括所有形式的增生性玻璃体视网膜病变，如论是否与糖尿病相关。
因此本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体和免疫偶联物可以有利地使用在药物组合物的制备中，所述药物组合物适于作为眼药溶液使用，包括玻璃体内和/或前房给药的那些，作为单一试剂或与其它的眼睛药物或试剂结合。对于治疗任何前述或其它失调，可以对需要治疗病患的眼睛施用本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体组合物，以根据常规的药物学实践制备的眼药制品的形式，见例如“雷明顿的药物学科学”第15版，1488页至1501页(Mack出版公司，伊斯顿，宾夕法尼亚州)。
眼药制品将含有在药物学可接受的溶液、悬浮液或药膏中，至少浓度在按重量计从大约0.01％至大约1％，优选地从大约0.05％至大约0.5％的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体。一些浓度变化将必要地发生，取决于使用的特别的化合物，需要治疗的病患的情况等等，并且对治疗负责的人将决定对个体病患最合适的浓度。眼药制品将优选地以灭菌水溶液形式，如果期望，灭菌水溶液含有额外的成分，例如防腐剂、缓冲液、张度剂、抗氧化剂和稳定剂、非离子加湿或澄清剂、粘性增加剂等等。
在这样的溶液中使用的合适的防腐剂包括杀藻胺、苄索氯铵、氯丁醇、硫柳汞等等。合适的缓冲液包括硼酸、碳酸氢钠和碳酸氢钾、硼酸钠和硼酸钾、碳酸钠和碳酸钾、乙酸钠、碳酸氢钠等等，以充分保持pH值在大约pH6和pH8之间的量，优选地，在大约pH7和pH7.5之间。合适的张度剂是右旋糖酐40、右旋糖酐70、葡萄糖、甘油、氯化钾、丙二醇、氯化钠等等，使眼药溶液中氯化钠当量范围在0.9±0.2％。
合适的抗氧化剂和稳定剂包括亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、硫脲等等。合适的加湿和澄清剂包括聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20泊洛沙姆282和四丁酚醛。合适的粘性增加剂包括右旋糖酐40、右旋糖酐70、白明胶、甘油、羟乙基纤维素、羟甲基丙基纤维素、羊毛脂、甲基纤维素、矿脂、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素等等。眼药制品将对需要治疗的病患的眼睛局部给药，通过常规的方法，例如以滴剂的形式或通过眼药溶液清洗眼睛。
D5.局部制剂
在最广泛的意义，用于局部给药的制剂包括通过口(口腔)和穿过皮肤递送的那些。“局部递送系统”同样包括含有被给药的成分的透皮贴剂。如果期望，穿过皮肤的递送可以更进一步地通过电离子透入疗法或电迁移而实现。
适于在口中局部给药的制剂包括含有加味基础的成分的止咳糖，通常是蔗糖和阿拉伯树胶或黄芪胶；含有惰性基础中的活性成分的锭剂，惰性基础例如白明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯树胶；和含有以合适的液体载体施用的成分的漱口水。
适于对皮肤局部给药的制剂包括含有在药物学可接受的载体中施用的成分的药膏、乳脂、凝胶和软膏。用于局部使用的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体制剂，如乳脂、药膏和凝胶，包括油质的或水溶性药膏基础的制品，如本领域所知的。例如，这些组合物可以包括植物油、动物脂肪、和更优选的，从石油中获得的半固体碳氢化合物。使用的特别的成分包括白色药膏、黄色药膏、十六醇酯蜡、油酸、橄榄油、石蜡、矿脂、白色矿脂、鲸油、淀粉甘油剂、白蜡、黄蜡、羊毛脂、无水羊毛脂和单硬脂酸甘油脂。也可以使用多种水溶性药膏基质，包括乙二醇醚和衍生物、聚乙二醇、硬脂酸聚烃氧(40)酯和聚山梨醇酯。
用于直肠给药的制剂可以表现为具有合适基质的栓剂，合适基质包括，例如可可油或水杨酸盐。适于阴道给药的制剂可以表现为阴道栓剂、棉球、乳脂、凝胶、软膏、泡沫或喷雾制剂，含有除活性成分之外的这样的本领域已知的合适的载体。
D6.鼻用制剂
可以考虑用于治疗多种情形的通过鼻和呼吸途径的局部递送。这些递送途径同样适合于将试剂递送至系统循环。鼻给药合适的载体中的活性成分制剂因此包括在本发明中，例如，鼻用溶液、喷雾、气雾剂和吸入剂。当载体是固体时，制剂包括粗粉，粗粉的微粒大小是例如范围在20至500微米，它通过例如靠近鼻子的粉末容器经过鼻子通道的快速吸入给药。
其中载体是液体的合适制剂在鼻子给药中是有用的。鼻用溶液通常是被设计成水溶液，以滴剂或喷雾对鼻道给药，因此它们在许多方面与鼻分泌物相似，因此保持正常纤毛作用。因此，水性鼻用溶液通常是等压的和轻度缓冲以保持pH5.5-6.5。此外，抗菌防腐剂，类似于在眼药制品中使用的那些，和合适的药物稳定剂，如果需要，可以包括在制剂中。多种商业鼻用制剂是已知的并包括，例如抗生素和抗组胺剂并用于哮喘预防。
吸入剂(inhalation)和吸入剂(inhalant)是为递送药物或化合物至病患的呼吸树而设计的药物学制剂。施用蒸汽或薄雾并达到影响区域。这个路线同样可以用于递送试剂至系统循环。吸入剂(inhalation)可以通过鼻或口呼吸路线给药。吸入剂(inhalant)溶液的给药仅在滴剂在大小上充分合适和统一，以使薄雾到达细支气管时有效。
另一组产品，也被认为是吸入剂(inhalation)，有时被称为吹入剂，包括通过使用特定的递送系统如药物气溶胶被携带至呼吸道的充分成粉的或液体药物，其在液化气体推进剂中含有药物的溶液或悬浮液。当通过合适的真空管和口头适配器释放时，定量吸入剂(inhalation)被推进病患的呼吸系统。微粒大小在这类型制品的给药中非常重要。已经报道用于穿入肺空洞的微粒最佳大小是达到0.5至7μm的程度。合适的喷雾通过加压气溶胶制备并因此它们的应用认为是有利的。
E.治疗试剂盒
本发明同样提供治疗试剂盒，包括用在本治疗方法中的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或免疫偶联物。这样的试剂盒通常包含，以合适的容器工具，至少一种阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或免疫偶联物的药物学可接受的制剂。所述试剂盒同样可以包含其它药物学可接受的制剂，用于诊断/成像或组合的治疗。例如，这样的试剂盒可以包含任意一个或多个系列的化学治疗或放射治疗药物；抗血管新生药物；抗肿瘤细胞抗体；和/或抗肿瘤脉管系统或抗肿瘤基质免疫毒素或凝血配体。
所述试剂盒可以具有单一容器(容器工具)含有阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或免疫偶联物，具有或不具有任何添加的成分，或它们可以具有对于每一种期望的试剂不同的容器。当提供组合的治疗时，单一溶液可以预混合，以摩尔相当的组合，或一种成分超过另一种。可选地，试剂盒的各阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或免疫偶联物和其它抗癌试剂成分在给病患施用之前可以保持在分开的不同的容器内。
当试剂盒的成分以一种或多种液体溶液提供时，液体溶液优选是水溶液，特别优选是灭菌水溶液。但是，试剂盒的成分可以作为干燥的粉末提供。当反应物或成分作为干燥粉末提供时，粉末可以通过添加合适的溶剂再造。预想同样可以在另一个容器中提供溶剂。
试剂盒的容器将通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其它的容器工具，阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或免疫偶联物和其它期望的试剂可以置于其中，并且优选地，合适地等分。当包括分开的成分时，试剂盒将同样通常含有将这些置于其中的第二个小瓶或其它容器，使得施用分开的期望的剂量。所述试剂盒同样可以包括第二个/第三个容器工具用于包含灭菌的药物学可接受的缓冲液或其它稀释剂。
所述试剂盒同样可以包含一种工具，通过其对动物或病患施用阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或免疫偶联物，例如，一个或多个针或注射器，或甚至一个滴眼药器、吸液管或其它这样相似的设备，制剂可以通过它们被注射至动物或应用在身体的患病区域。本发明的试剂盒将同样典型地包括用于包含小瓶或类似这样的，或其它成分的工具，以严格限制用于商业出售，例如，注射或吹膜塑料容器，期望的小瓶和其它设备将置于并保存在其中。
F.抗血管新生治疗
本发明可以用于治疗患有不正常血管新生的动物或病患，如对多种疾病或失调起作用，单独或以组合治疗。在癌症治疗领域外，最流行和/或临床上重要的包括关节炎、风湿性关节炎、牛皮癣、动脉硬化症、糖尿病视网膜病、年龄相关性黄斑变性、突眼性甲状腺肿、血管再狭窄、包括血管成形术后的再狭窄、动静脉畸形(AVM)、脑膜瘤、血管瘤和新生血管性青光眼。干涉的其它潜在的目标包括血管纤维瘤、动脉粥样硬化斑、角膜移植新血管形成、血友病性关节、增生性瘢痕、奥斯勒韦伯综合征、晶体后纤维增生症、硬皮病、沙眼、血管粘附、滑膜炎、皮炎、多种其它的炎性疾病或失调，甚至子宫内膜异位。由本发明可治疗的更多的疾病和失调和这样的血管新生失调的统一基础，在下面阐明。
血管新生涉及的一种疾病是风湿性关节炎，其中关节的滑膜衬垫里的血管遭受血管新生。除形成新血管网络外，内皮细胞释放因子和活性氧组分导致关节节翳的生长和软骨破坏。血管新生涉及的因子可能活跃地促进和帮助保持风湿性关节炎的慢性发炎状态。与血管新生相关的因子同样在骨关节炎中起作用，促进关节的破坏。
Harada等(1998，通过引用的方式特异地结合至本文)显示VEGF涉及在风湿性关节炎的发病机理中，并且此外，VEGF的血清浓度的测量是无创的、有用的监测风湿性关节炎的疾病活跃性的方法。这支持了本发明与风湿性关节炎相关的治疗和诊断用途。
Nagashima等(1999，通过引用的方式结合至本文)描述了在培养的风湿症滑膜细胞中抗治疗风湿药剂对VEGF的抑制效果。VEGF在风湿性关节炎的滑膜中组成型表达。已知的抗风湿药物，布西拉明(BUC)显示出在它的作用机理中包括抑制通过滑膜细胞的VEGF生产。因此，BUC的抗风湿药剂的效果通过如下方式调节：通过抑制滑膜细胞的VEGF的产生而抑制血管新生和关节炎滑膜中的滑液增殖。本发明作为抗风湿药治疗的应用由现有疗法的VEGF的抑制作用而支持。
另一个由血管新生调节的疾病例子是眼部新生血管疾病。这个疾病的特点是新血管入侵至眼部结构，如视网膜或角膜。这是失明最普通的起因，并涉及于大约二十种眼睛疾病中。在年龄相关性黄斑变性中，关联的视觉问题由脉络膜毛细管的内生长引起，通过玻璃膜中的缺陷和视网膜色素上皮之下的维管组织的增殖。血管新生的损害同样与糖尿病视网膜病、早产儿视网膜病、角膜移植排斥、新生血管性青光眼和晶体后纤维增生症相关。
其它与角膜新血管形成相关的疾病包括，但不限于，流行性角膜结膜炎、维生素A缺乏、隐形眼镜过度磨损、过敏性角膜炎、上部角膜缘角结膜炎、翼状胬肉角结膜干燥、干燥、酒糟鼻、泡性角结膜炎、梅毒、分支杆菌感染、脂质恶化、化学性烧伤、细菌性溃疡、真菌性溃疡、单纯疱疹感染、带状疱疹感染、原生动物感染、卡波西肉瘤、蚕食性角结膜炎、Terrien角膜边缘性变性、边缘角蛋白溶解、风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多动脉炎、外伤、瓦格纳式肉瘤、巩膜炎、斯-琼氏综合征、放射状角膜切开术和角膜移植排斥。
与视网膜/脉络膜新血管形成相关的疾病包括，但不限于，糖尿病视网膜病、黄斑变性、包括年龄相关性黄斑变性(AMD)、镰状细胞性贫血、结节病、梅毒、弹性假黄瘤、佩吉特病、静脉阻塞、动脉阻塞、颈动脉阻塞性疾病、慢性葡萄膜炎/玻璃体炎、分支杆菌感染、莱姆病、系统性红斑狼疮、早产儿视网膜病、Eales病、白塞氏病、感染引起的视网膜炎或脉络膜炎、眼假组织胞浆菌病、Bests病、近视、视凹、Stargart病、睫状体平坦部炎、慢性视网膜脱落、超高粘度综合症、弓形体病、外伤和激光后并发症。
至于脉络膜新血管形成，例如与黄斑变性、AMD和其它眼睛疾病相关的，本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体特别适于治疗应用。这部分地因为它们充分地阻碍了VEGF结合VEGFR2而没有充分地阻碍VEGF结合VEGFR1，结果对眼睛有益(Nozaki等，2006)，其突出了本发明优于现有的抗VEGF治疗如阿瓦斯汀和相关的产品Lucentis
Figure BPA00001181831101461
的另一个优势。
其它疾病包括，但不限于，与虹膜发红(视角的新血管形成)相关的疾病和由维管组织或纤维组织的不正常增殖，包括所有形式的增生性玻璃体视网膜病变引起的疾病。
慢性炎症同样涉及病态的血管新生。这样的疾病表示为溃疡性结肠炎和节段性回肠炎，表现出新血管向发炎组织的内生长的组织学变化。巴尔通体病，在南美发现的细菌性感染，可以导致特点是血管内皮细胞的增殖的慢性期。
另一个与血管新生相关的病理作用在动脉硬化症中发现。在血管内腔中形成的斑点已经显示出具有血管新生刺激物活性。人类冠状动脉硬化病变中的VEGF表达由Inoue等证明(1998，通过引用的方式结合至本文)。这显示了VEGF在人类冠状动脉硬化症的进程中，以及在阻碍性冠状疾病的重通过程中的病理生理重要性。本发明提供了对于这样的情况的有效的治疗。
一种孩童时期最经常发生的血管新生疾病是血管瘤。在大多数情况下，肿瘤是良性的并且不需要干涉而退化。在更严重的情况下，肿瘤发展至大的多洞穴的和渗透性形式并产生临床并发症。血管瘤的系统形式，多发血管瘤，具有高的死亡率。治疗抗性的血管瘤存在，不能用目前使用的治疗法治疗。
血管新生同样造成在遗传性疾病中发现的伤害，如奥斯勒-韦伯-朗迪病、或遗传性出血性毛细管扩张。这是遗传疾病，特点是多样的小血管瘤、血管或淋巴管肿瘤。血管瘤发现在皮肤和黏膜中，经常伴随着鼻出血(鼻血)或肠胃出血，并且有时具有肺部或肝的动静脉瘘。
血管新生同样涉及于正常的生理过程中，如繁殖和伤口康复。血管新生是排卵中和受精后囊胚培植的重要步骤。血管新生的预防可以用于诱导无月经，阻止排卵或防止通过囊胚的培植。
在伤口康复中，过多的修复或纤维素增生可以是外科过程中有害的副作用并且可能由血管新生引起或加剧。粘连是外科经常发生的并发症，并且导致例如小肠梗阻问题。
特点是不期望的血管渗透性的疾病或失调同样可以由本发明治疗。这些包括与脑肿瘤相关的浮肿，与恶性肿瘤、梅格斯氏综合征、肺炎、肾病综合症、心包积液和胸腔积液相关的腹水，如在WO98/16551中公开的，通过引用的方式结合至本文。
上述每一种疾病或失调，连通所用类型的肿瘤，如在下面部分中描述的，根据本领域的知识可以有效地由本发明治疗，如在美国专利5,712,291(通过引用的方式特异地结合至本文)中公开的，对血管新生疾病的治疗的抗血管新生策略的应用产生一致的效果。此外，美国专利6,524,583通过引用的方式特异地结合至本文，出于包括进一步描述和运行使用抗VEGF抗体的治疗广泛系列的疾病和失调的目的。
本发明的人类抗体和/或免疫偶联物最优选地使用在肿瘤治疗中。血管新生是重要的肿瘤包括恶性肿瘤和良性肿瘤，如听神经瘤、纤维神经瘤、沙眼和化脓性肉芽肿。在实体瘤形成和转移中，血管新生特别突出。但是，血管新生同样与血液产生的肿瘤相关，例如白血病，和多种骨髓急性或慢性肿瘤疾病，其中发生白细胞的无限制增殖，通常伴随贫血、减弱的血液凝血和淋巴结、肝和脾的肿大。血管新生同样在骨髓的异常性中起作用，引起白血病样肿瘤。
血管新生在肿瘤转移的两个阶段中重要。在原发肿瘤的血管形成中，血管新生允许细胞进入血流和贯穿身体循环。在肿瘤细胞离开原发位点之后，并已经停留至第二个、转移位点，血管新生必须在新肿瘤能够生长和扩大之前发生。因此，血管新生的预防能够预防肿瘤的转移和限制肿瘤在原发位点生长，允许通过其它治疗法治疗，具体地，靶向治疗试剂的试剂构建体(见下面)。
由本发明提供的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或免疫偶联物方法因此广泛地应用在任何具有血管成分的恶性肿瘤的治疗中。在使用本发明的抗体和/或免疫偶联物治疗肿瘤中，特别是血管的、恶性肿瘤，所述试剂可以单独使用或与例如化学治疗试剂、放射治疗试剂、细胞凋亡试剂、抗血管新生试剂和/或免疫毒素或凝血配体结合。
用于治疗的典型的血管瘤是实体瘤，特别是癌，其需要用于提供氧和养分的血管成分。可以用本发明治疗的典型的实体瘤包括，但不限于，肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、喉癌、食道癌、睾丸癌、肝癌、腮腺癌、胆管癌、结肠癌、直肠癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、甲状腺癌、鳞状上皮细胞癌、腺癌、小细胞癌、恶性黑素瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、成神经细胞瘤等等。WO98/45331同样通过引用的方式结合至本文以进一步例证可以使用抗VEGF抗体有效治疗的多种肿瘤类型。
血管新生在肿瘤的保持和转移中的作用的知识已经导致用于癌症如乳腺癌的预兆指示。在原发肿瘤中发现的新血管形成的量通过在入侵的乳腺癌中最集中的新血管形成区域中计算微血管密度而测量。高水平的微血管密度被发现与肿瘤复发相关。通过本发明治疗的血管新生的控制将减少或排除这样的肿瘤的复发。
本发明被预期用在治疗具有固体瘤的任何病患。根据阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体组合物的特定性质，本发明的疗法将具有减少的副作用。特别的优势将导致抗肿瘤的宿主免疫反应的保持或增加，并缺少对骨组织的副作用。因此本发明将是抗血管新生治疗的选择，用于治疗儿科癌症和患有骨质疏松和其它骨缺陷或处于骨质疏松和其它骨缺陷风险之中的病患。
尽管所有的恶性肿瘤和实体瘤可以由本发明治疗，本发明的未偶联的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体特别预期用在治疗患有更多血管新生肿瘤的病患中，或处于转移风险的病患中。
本发明同样被设计为预防性或保护性治疗。本发明的这些方面包括本发明治疗病患的能力，其中病患表现出患有原发肿瘤，其可能具有转移性肿瘤，或在转移性肿瘤播种的早期的肿瘤细胞。作为抗血管新生策略，本发明同样可以用于预防处于肿瘤发展的中度或高度风险中的病患中的肿瘤发展，根据预实验和/或遭受遗传癌症的近亲属。
特别预期偶联的或免疫毒素形式的本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体用于破坏或压实实体瘤。本发明的这些方面可以用在与本发明的未偶联的抗血管新生抗体结合，或与其它的抗血管新生方法结合。
本领域技术人员将很容易地意识到本治疗方法的免疫偶联物和前药形式具有比提供的单一治疗试剂的不同的优势，具有两个性质：抗体内在的抗血管新生性质和所连接试剂(如细胞毒素试剂、凝血剂、细胞凋亡试剂等等)的治疗性质。本发明抗体的偶联的和前药治疗形式因此在癌症治疗领域具有难以置信的广泛的效用。
本文提供的关于用在与本发明不同方面相关的更合适的病患的指导被设计为教义，一些病患的概况可能协助选择通过本发明治疗的病患。这些病患，或病患的种类的预选，不能以任何方式否定本发明的有用性，其中本发明与所有含有血管肿瘤或其它如上所述的血管新生疾病的病患的治疗相关。进一步的考虑是由本发明提供的对肿瘤攻击可能预先处理肿瘤以进行进一步治疗，因此随后的治疗导致全部的协同效应或甚至导致整个的好转或治愈。
并不认为任何特别类型的肿瘤应当从使用本发明的治疗中排除。但是，肿瘤细胞的类型可能与本发明和其它治疗试剂的结合的应用相关，特别是化学治疗和抗肿瘤细胞免疫毒素。本发明疗法的未偶联和偶联方面都将包括抗血管新生效果，那将抑制肿瘤血管增殖。偶联的和前药治疗方面将进一步破坏或阻塞肿瘤血管。由于血管在所有的实体瘤中基本上或完全地一样，本方法学将被理解是广泛地或完全地应用在所有实体瘤的治疗，不考虑肿瘤细胞本身具体的表现型或基因型。
使用来自动物模型的数据，如本文的研究中所详细展示的，可以容易地确定阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或免疫偶联物构建体的治疗上有效剂量。荷实体瘤的实验动物在转化为临床环境前经常被用于优化合适的治疗剂量。已知这样的模型在预测有效的抗癌症策略中是非常有效的。例如，荷实体瘤的小鼠，如在实施例中所使用的，广泛地用在前期临床检测中。发明人已经使用这样的本领域公认的鼠模型来确定提供有益的抗肿瘤效果并具有最小毒性的治疗试剂的工作范围。
在抗血管新生治疗中使用未偶联的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体时，实施者同样可以利用其它的发表的数据以辅助用于临床治疗的制剂剂量。例如，尽管本发明的抗体具有比本领域其它的那些不同的优势，文献中关于用其它抗VEGF抗体治疗的信息仍然可以与本申请的数据和教导联合使用以设计和/或优化治疗方案和剂量。
例如，Borgstom等(1999)，通过引用的方式特异地结合至本文，描述了在使用MAb A4.6.1的体内乳腺癌血管新生中VEGF的重要性。人源化形式的A4.6.1抗体(阿瓦斯汀，贝伐单抗)已经被批准用于临床使用(Hurwita等，2004)。由于与A4.6.1/阿瓦斯汀的研究比较，这个发明的人类抗体展示出相当的或甚至提高的抗肿瘤反应，这些抗体将同样在人类癌症，包括乳腺癌的治疗中具有重要的效用。发明人进一步了解，本领域普通技术人员同样将意识到，患有乳腺癌的病患典型地是中年或更高年龄的女士，其中关于骨质疏松症的关注同样明显。本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体将因此具有不引起骨代谢副作用的更多的优势，并因此将优选用于具有骨质疏松症或处于发展的骨质疏松症的风险中的乳腺癌病患。
同样类型的好处使得阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体治疗成为用于治疗小儿科癌症的优选药物。在患有癌症的儿童中，延续健康和充分的骨生长的需要是明显的。由于阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体将不能充分地削弱在骨发育中重要的破骨细胞和破软骨细胞的活性，这些抗体将具有比其它抗体如阿瓦斯汀重要的优势。
Borgstrom等(1999)，通过引用的方式特异地结合至本文，同样报导了当与阿霉素结合使用时，MAb A4.6.1导致了重要的肿瘤退化。这进一步支持了阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体和常规细胞毒素试剂或化学治疗试剂的组合应用已到实现治疗多种癌症中的重要的临床结果。可以考虑非偶联的阿霉素或阿霉素前药组合物。
Ferrara和同伴们同样报道了在荷肿瘤的小鼠中鼠抗VEGF单克隆抗体的功效和浓度效应以及对人类治疗的推断(Mordenti，1999，通过引用的方式特异地结合至本文)。研究被设计为评估鼠抗VEGF单克隆抗体的浓度效应关系，因此可以在癌症病患中估计重组的人源化形式的抗体的有效的血浆浓度。Mordenti等(1999)推断使用可以容易地对人类系统应用的鼠抗体的剂量实现在裸鼠中满意的肿瘤抑制，以定义有效保持对于人类使用所需要的有效范围内的治疗抗体的临床给药方案。因此，使用Mordenti等(1999)报道的分析类型，来自本领域公认的鼠模型的数据同样可以转化为合适的人类剂量，除本文所描述的本领域技术人员已知的技术之外。
重组的人源化形式的Genentech的抗VEGF抗体在猴子中的临床前安全性评估结果(Ryan等，1999，通过引用的方式特异地结合至本文)提供了例证特定候选者治疗的缺点。尽管抗体在这种动物中具有药理学活性，在这些研究中的猴子表现出骨骺发育不良，其表现为在肥大软骨细胞中的剂量相关的增长，软骨下骨板形成和生长板的血管侵入的抑制。在使用阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体中这样的缺点是不明显的，阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体不抑制破软骨细胞和软骨细胞中的VEGF结合和信号传导，其是由VEGFR1介导。
关于Genentech的人源化单克隆抗VEGF抗体的临床前药代动力学、种间类推和组织分布的进一步研究的数据由Lin等报导(1999，通过引用的方式结合至本文)。这些研究在小鼠、大鼠、猴子和兔子中执行，后者使用125I标记的抗体。来自小鼠、大鼠和猴子的药代动力学数据用于使用类比法预测人源化的对应抗体在人类中的药代动力学。因此，合适剂量信息可以开发用于人类病理条件的治疗，如风湿性关节炎、眼新生血管性疾病和癌症。
人源化形式的抗VEGF抗体A4.6.1(阿瓦斯汀，贝伐单抗)现在被批准用于临床使用(Hurwitz等，2004，通过引用的方式结合至本文)。因此，当设计用于本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体治疗的治疗剂量时，这样的临床数据同样可以被认为参考源。本发明显示了在荷肿瘤的小鼠的研究中，新的人类抗体与A4.6.1/阿瓦斯汀一样有效，尽管仅抑制VEGFR2介导的VEGF的作用的特异性是一个优势。WO98/45331同样通过引用的方式结合至本文以进一步例证可以用在治疗中的人源化抗VEGF抗体的剂量。
在肿瘤治疗中使用偶联的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体方面，实施者可以参考科技文献和专利文献，所述文献涉及成功递送广泛系列的治疗剂至肿瘤血管，以实现有益效果。作为例子，美国专利5,855,866、5,877,289、5,965,132、6,051,230、6,004,555、5,776,427、6,004,554、6,036,955和6,093,399的每一份都通过引用的方式结合至本文，出于进一步描述这样的治疗试剂-靶向试剂的构建体的应用的目的。在本案例中，治疗试剂-靶向试剂构建体包括发挥抗血管新生效果的靶向试剂部分，其将放大或另外地提高所连接的治疗试剂的抗肿瘤活性。
如本领域已知的，存在可以用作临床治疗进行前的临床前检测相关的指导的现实目的。但是考虑到在临床中其它抗VEGF抗体的发展、在本文所显示的公认模型中的示范的抗肿瘤效果和本策略的提高的安全性，目前的发明提供了一种具有快速达到临床治疗的治疗剂。因此，临床前测试可以用于选择最有优势的抗体、剂量或组合物。
导致任何一贯地可检测的抗血管新生效果、转移的抑制、肿瘤脉管系统的破坏、肿瘤血栓、坏死和/或一般的抗肿瘤效果的任何阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或免疫偶联物剂量、或组合的药物将详细说明一个有用的发明。本发明同样可以对肿瘤下游的血管有效，即，靶向至少部分排泄管(draining vessel)，特别是当肿瘤中释放的细胞因子将对这些血管起作用，改变它们的抗原性质。
同样将理解甚至在这样的情况下，其中阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或免疫偶联物剂量的抗血管新生和/或肿瘤效果或组合的治疗接近于计划的治疗范围的低端，可能是这种治疗仍然相当于或甚至更有效于具体的肿瘤目标或病患的上下文中的其它已知的治疗。对于临床医生而言，一些肿瘤和情形不能被有效地中期或长期治疗显然是不幸的，但是并不能否定本治疗的有效性，特别是它至少与其它通常提议的策略一样的有效。
在设计用于治疗血管肿瘤的合适剂量的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或免疫偶联物构建体，或组合的治疗中，实施者可以从本文描述的动物研究中和文献中的知识容易地推断以达到用于临床给药的合适剂量。为完成从动物到人类剂量的转化，实施者可以说明每一单位质量的实验动物的给药试剂的质量，并且优选地说明实验动物和人类病患之间的身体表面积(m2)的区别。所有这样的计算对于本领域普通技术人员是已知的和常规的。
例如，采用鼠研究中的成功的剂量和通过使用基于质量和表面积的标准计算，用在人类病患中的有效剂量将在大约1mg/m2和大约1000mg/m2之间，优选地，在大约50mg/m2和500mg/m2之间，以及最优选地，在大约10mg/m2和大约100mg/m2之间。这些剂量适于阻碍VEGFR2的人类抗VEGF的裸抗体和阻碍VEGFR2的人类抗VEGF免疫偶联物，尽管这些剂量优选与用作抗血管新生物的裸的或未偶联的抗体联合使用。
因此，利用这一信息，发明者预期用于人类给药的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或免疫偶联物的有效的低剂量将是大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45或大约50mg/m2；用于人类给药的这样的抗体或免疫偶联物的有效的高剂量将是大约600、650、700、750、800、850、900、925、950、975或大约1000mg/m2。用于人类给药的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或免疫偶联物的有效的中间计量预期是低范围和高范围之间的任何计量，如大约55、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、525、550或大约575mg/m2等等。
使用任何前述的典型剂量的任何具体范围或在具体所述范围之间的任何值是可以考虑的。当使用阻碍VEGFR2的人类抗VEGF免疫偶联物时，应当理解凝血剂免疫偶联物通常能够比毒素免疫偶联物用的剂量高。
通常，剂量范围在大约10-100mg/m2、大约10-90mg/m2、大约10-80mg/m2、大约20-100mg/m2、大约20-90mg/m2、大约20-80mg/m2、大约30-100mg/m2、大约30-90mg/m2、大约30-80mg/m2、大约15-100mg/m2、大约25-100mg/m2、大约35-100mg/m2、大约15-90mg/m2、大约25-90mg/m2、大约35-90mg/m2等等之间的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或免疫偶联物将是优选的。尽管有这些规定的范围，应当理解，本文给出的参数和详细的指导，在现行或优选范围内的更多的变化将包含在本发明中。
因此，应当理解，较低剂量可能更适于与其它试剂联合，高剂量仍然可以容忍，特别是给出阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体和免疫偶联体的提高的安全性。人类抗体的使用(和可选地，人类凝血剂或抗血管新生蛋白)使得本发明更安全用于临床使用，进一步减少健康组织中明显的毒性或副作用的可能性。
本发明的治疗规则的目的一般是产生有意义的抗肿瘤效果同时仍然保持低于与不可接受的毒性相关的水平的剂量。除改变剂量本身之外，给药规则同样适合优化治疗策略。一种治疗方案是给药大约1mg/m2和大约1000mg/m2之间，优选地，大约50mg/m2和500mg/m2之间，以及最优选地，大约10mg/m2和大约100mg/m2之间的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或免疫偶联物，或包含这些的治疗鸡尾酒，大约一周1至3次，优选地，通过静脉或肌肉注射，以及最优选地，静脉注射。
在给药具体剂量时，实施者可以优选地对病患系统地提供制药学上可接受的组合物(根据无菌、致热原性、纯度和常规安全性的FDA标准)。静脉注射通常是优选的。同样可以考虑大约1或2个小时或等等的期间的连续注射。
自然地，在广泛使用之前，将执行临床试验。根据本发明的公开，本领域技术人员将知道执行临床试验的多种要素，包括病患条件和监控。以下信息将呈现为用于建立这样的试验的常规指导。
选出用于第一种阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体治疗研究的病患将已经对至少一种常规治疗过程未能有反应，并且具有如通过身体检查、实验室技术和/或X光照相过程测定的客观地可测量的疾病。任何化学治疗应当在进入该研究至少两星期之前停住。当使用鼠单克隆抗体或抗体部分时，病患应当没有鼠免疫球蛋白的过敏史。
在具有三腔端口的中心静脉留置导管的使用中将发现一些优势。阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体应当被过滤，例如，使用0.22μ过滤器，并且适当地稀释，例如用盐，至终体积100ml。使用之前，检测样品同样应当以相似的方式过滤，并且它的浓度应当在过滤之前或之后通过测量A280来评定。期待的回收应当在87％至99％的范围之内，然后可以解决蛋白损失的调节。
阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或偶联物可以在大约4至24小时的期间内给药，每个病患在2-7天间隔中接受2-4次输注。同样可以在7天期间内以稳定的输注率实施给药。在任何计量水平给出的输注应当由任何观察到的毒性决定。因此，如果在任何单一输注后或在稳定速率输注的具体时段时到达II级毒性，应当停止更多的剂量或停止稳定速率输注，除非毒性被改进。阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体的增加的剂量应当对几组病患给药，直到在任何种类中大约60％的病患显示出不可接受的III级或IV级毒性。这个值的2/3的剂量被定义为安全剂量。
当然，身体检查、肿瘤测量和实验室测试应当在治疗之前实施，并且不时地实施，直到一个月后。实验室测试应当包括全部的血球计数、血清肌酐、肌酸激酶、电解液、尿素、氮、SGOT、胆红素、白蛋白和全部的血清蛋白。治疗后达到60天的血清样品应当通过放射性免疫测定评价施用的治疗剂的存在，和抗它们任何部分的抗体。使用任何标准实验如ELISA或RIA的血清免疫学分析将使得可以评估阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体的药代动力学和清除。
为评价抗肿瘤反应，病患应当在最后一次输注的48小时至1星期时检查，并在30天后复查。当存在明显的疾病时，应当在治疗期间和完成治疗的1周内每天，以及完成治疗的30天时测量所有块的两个垂直直径。为测量明显的疾病，连续CT扫描应当在贯穿胸部、腹部和盆骨以1cm间隔实施，在48小时至1周，并且在30天时再一次。同样应当通过组织细胞学和/或通过流式细胞仪评价组织样品，使用来自疾病位点或如果合适的血或液体样品的活组织检查。
可以通过可接受的测量详细说明临床反应。例如，可以通过在治疗一个月后所有可测量肿瘤的消失说明完全反应。然而可以通过在治疗一个月后所有可测量的肿瘤节结的垂直直径的乘积和减少50％或更多来说明部分反应，并且没有肿瘤位点显现出扩大。相似地，混合的反应可以通过治疗一个月后所有可测量的损害的垂直直径的乘积减少50％或更多来说明，在一个或多个位点上具有进展。根据临床试验结果，如上面所描述的那些，应当阐明一个更加精确的治疗法则。虽然如此，根据所要治疗的患者的情况，在剂量上的一些变化以后可能是必须的。根据本发明的公开，对给药负责的内科医生将能够决定用于个体患者的合适剂量。这样的最优化和调整在本领域可以常规实现，并且决不反映试验的不适当的量。
G.组合治疗
无论用于治疗抗血管新生疾病，如关节炎、牛皮癣、动脉硬化症、糖尿病视网膜病、年龄相关性黄斑变性、甲亢、血管再狭窄、血管瘤和新生血管性青光眼(或其它上述疾病)、或实体瘤，本发明能够与其它治疗结合。
本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体治疗方法可以与通常用于病患表现出具体的肿瘤、疾病或失调的治疗的任何其它方法结合。只要具体治疗方法已知对病患本身的情况没有害处，并且没有明显地抵消阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体治疗，可以考虑它与本发明的结合。
在关系实体瘤治疗中，本发明可以与经典方法联合使用，如外科手术、放射治疗、化学治疗等等。本发明因此提供组合的治疗，其中在外科手术或放射治疗的同时、之前或之后使用阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体构建体；或与常规的化学治疗试剂、放射治疗试剂或抗血管新生试剂、或靶向的免疫毒素或凝血配体同时、之前或之后给药于病患。
特别优选本发明与放射治疗、放射治疗试剂、抗血管新生试剂、诱导细胞凋亡试剂和抗微管蛋白药物的联合使用。这样试剂的许多例子已经在上面的与本发明相关的免疫偶联物中描述。起初描述的用作治疗偶联物一部分的任何试剂同样可以分开使用，但仍然与本发明有效联合。
当一种或多种试剂与阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体治疗结合时，对于组合的效果没有必要累积当单独操作每一种治疗时观察到的效果。尽管至少累积效果通常是期望的，以上一种单一治疗的任何增加的抗肿瘤效果将是有益的。同样，对于组合的治疗展示协同效应没有特别的要求，尽管这是当然可能和有利的。
为实现组合的抗血管新生治疗，如，治疗眼睛的或其它的血管新生疾病或失调，实施者应当简单地对动物给予与另一种治疗试剂组合的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体，另一种治疗试剂包括另一种(第二种)抗血管新生试剂，以有效导致在动物中它们组合的治疗或抗血管新生作用的方式。因此应当在有效导致它们在疾病位点之内组合的存在和它们在疾病环境中(如眼睛)具有组合的作用的有效量和期限提供所述试剂。
为达到这一目的，阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体和其它治疗试剂或抗血管新生试剂可以同时对动物给药，以单一组合物或作为使用不同给药途径的两种不同的组合物。可选地，阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体可以在其它治疗剂或抗血管新生治疗之前或随后，通过例如范围在分钟到周和月的间隔。实施者可以实行这样的治疗，因此阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体和其它治疗剂或抗血管新生试剂发挥有利地组合试剂效果。
至于肿瘤治疗，为实行组合的抗肿瘤治疗，实施者可以同样地对动物施用与另一种抗癌症试剂联合的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体，以有效导致在动物内它们组合的抗肿瘤作用的方式。将再一次有效导致它们在肿瘤脉管系统中组合的存在和在肿瘤环境中它们组合的作用的有效量和期限提供所述试剂。
阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体和抗癌症试剂将同时对动物施用，以单一组合物，或作为施用不同给药路径的两种不同的组合物。可选地，阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体可以在抗癌症试剂之前或之后给出，例如，从分开的分钟到周和月。抗癌症试剂和阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体将发挥对肿瘤的有利地组合的效果。许多抗癌症试剂将在阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体抗血管新生治疗之前给出。但是，许多其它的抗癌症试剂将与阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体同时或随后给出，特别是在阻碍VEGFR2的人类抗VEGF免疫偶联物之后使用。
在癌症治疗中通常使用的物质的组合是已知的。例如，美国专利5,710,134(通过引用的方式结合至本文)公开了与无毒物质或“前药”联合的在肿瘤中诱导坏死的成分。由坏死过程释放的酶将无毒“前药”分裂成毒性“药物”，导致肿瘤细胞死亡。同样，美国专利5,747,469(通过引用的方式结合至本文)公开了编码p53的病毒载体和DNA损伤试剂的组合的应用。任何这样的相似的方法可以与本发明一起使用。
在一些情形中，可能甚至期望明显延长治疗期限，其中在分别给药之间几天(2、3、4、5、6或7)，几周(1、2、3、4、5、6、7或8)或甚至几个月(1、2、3、4、5、6、7或8)间隔。这可能在以下情况中是有利的：其中一种治疗意图充分破坏肿瘤，如外科手术或化学治疗，另一种治疗意图阻止微转移或肿瘤再生长，如基于抗血管新生的治疗。抗血管新生剂将在外科手术后谨慎的时间施用使得有效的创伤康复。
同样预想将使用多于一种阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体或抗癌症试剂的给药。所述试剂可以交替地给药，在交替的日期或周；或可以给出阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体序列的治疗，跟着抗癌症试剂序列的治疗。无论如何，为达到使用组合治疗的肿瘤退化，所有必需的是以有效发挥抗肿瘤效果的组合的量递送两种试剂，不管给药的时间。
根据外科手术，任何外科干涉将与本发明联合实施。关于放射治疗，可以考虑在肿瘤细胞内局部地诱导DNA损伤的任何机制，如γ-放射、X-光、UV-放射、微波和甚至电子发射等等。同样考虑放射性同位素直接递送至肿瘤细胞，并且这可以和靶向抗体或其它靶向方式一起使用，优选地，阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体。
细胞因子治疗同样被证明对于组合的治疗方案是有效的部分。多种细胞因子可以用在这样的组合的方法中。细胞因子的例子包括IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、TGF-β、GM-CSF、M-CSF、G-CSF、TNFα、TNFβ、LAF、TCGF、BCGF、TRF、BAF、BDG、MP、LIF、OSM、TMF、PDGF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ。将根据标准规则施用细胞因子，与临床指示一致，如病患的情形和细胞因子的相关的毒性。子宫球蛋白同样可以用于预防和抑制转移(美国专利5,696,092；通过引用的方式结合至本文)。
G1.化学治疗
在一些实施方式中，本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体可以与化学治疗试剂一起使用。多种化学治疗试剂可以用在本文公开的组合治疗方法中。预期作为例子的化学治疗试剂包括，例如阿霉素、放线菌素、丝裂霉素、洋红霉素、道诺霉素、阿霉素、三苯氧胺、紫杉醇、泰索帝、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、依托泊苷(VP-16)、5-氟尿嘧啶(5FU)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、环磷酰胺、三胺硫磷、氨甲喋呤、喜树碱、放线菌素D、丝裂霉素C、顺铂(CDDP)、氨喋呤、考布他汀和它们的衍生物和前药。
如本领域普通技术人员所理解的，化学治疗试剂的合适的剂量将通常在已经在临床治疗中使用的那些的周围，其中化学治疗单独或与其它化学治疗一起施用。仅作为例子，可以使用试剂如顺铂，和其它DNA烷基化的试剂。顺铂已经广泛用在治疗肿瘤中，临床应用的有效剂量是每三周5天20mg/m2，一共三个疗程。顺铂不能通过口服吸收，因此必须通过静脉内、皮下、肿瘤内或腹膜内注射而递送。
更加有用的试剂包括干涉DNA复制、有丝分裂和染色体分离的化合物。这样的化学治疗化合物包括阿霉素，也被认为是阿霉素，依托泊苷，戊脉安，鬼臼毒素等等。广泛用在用于治疗肿瘤的临床环境中，这些化合物通过静脉弹丸注射给药，对于阿霉素剂量范围在25-75mg/m2，21天间隔，对于静脉内依托泊苷35-50mg/m2或者口头服用双倍的静脉内剂量。
同样可以使用破坏多核苷酸前体的合成和保真的试剂。特别有用的是已经经历广泛实验并且容易使用的试剂。同样地，试剂如5-氟尿嘧啶优选地被肿瘤组织使用，使得该试剂对靶向肿瘤细胞特别有用。尽管十分有毒，5-FU可用于宽范围的载体中，包括局部的，但是剂量范围在3-15mg/kg/天的静脉内给药是通常使用的。
用于组合治疗的典型的化学治疗试剂在表C中列出。每一种列出的试剂都是典型的并且不受限制。本领域技术人员被引导至“雷明顿的药物科学”第15版、33章、具体624-652页。根据所要治疗的情形，将很可能发生剂量上的变化。内科医生给药治疗将能够决定用于个别患者的合适的剂量。
表C 在肿瘤疾病中有用的化学治疗试剂
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G2.抗血管新生
在正常的生理学环境下，人类或动物仅在非常特异有限的情形中进行血管新生。例如，正常地，在创伤康复、胎儿和胚胎发育和黄体、子宫内膜和胎盘的形成中观察到血管新生。不受控制的(持久稳固的和/或未受调节的)血管新生与多种疾病情形相关，并且发生在肿瘤转移期间。
受控制的和不受控制的血管新生被认为是以相似的方式发展。由基膜围绕的内皮细胞和周细胞形成毛细血管。血管新生从基膜的侵蚀开始，通过由内皮细胞和白细胞释放的酶。排列成血管内腔的内皮细胞然后从基膜中突出。血管新生刺激物诱导内皮细胞经过侵蚀的基膜的移动。移动的细胞形成离开亲本血管的“萌芽”，其中内皮细胞进行有丝分裂和增生扩散。内皮萌芽彼此融合形成毛细管环，产生新的血管。
本阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体可以与任何一种或多种其它的抗血管新生治疗联合使用。包括与抑制VEGF的其它试剂的联合，如其它的中性抗体(Kim等，1992；Presta等，1997；Sioussat等，1993；Kondo等，1993；Asano等，1995；Hurwitz等，2004)、可溶的受体构建体(Kendall和Thomas，1993；Aiello等，1995；Lin等，1998；Millauer等，1996)、酪氨酸激酶抑制剂(Siemeister等，1998)、反义策略、RNA适配体和抗VEGF或VEGF受体的核酶(Saleh等，1996；Cheng等，1996；每一篇都通过引用的方式结合至本文)。同样可以使用具有拮抗性质的VEGF变异体，如在WO 98/16551中所描述的，通过引用的方式特异地结合至本文。
抗血管新生治疗可以基于抗血管新生试剂的提供或血管新生试剂的抑制。血管新生试剂的抑制可以通过一种或多种描述抑制VEGF的方法而达到，包括中和抗体、可溶性受体构建体、小分子抑制剂、反义、RNA适配体和核酶都可以使用。例如，可以使用抗血管生成素的抗体，如美国专利5,520,914所描述的，通过引用的方式特异地结合至本文。在FGF与血管新生联系时，同样可以使用FGF抑制剂。一些例子是在以2-O-硫酸化糖醛酸(2-O-sulfated uronic acid)作为它们主要的重复单元并具有交替的N-乙酰葡糖胺化合物，包括粘多糖，如archaran sulfate。这样的化合物如在美国专利6,028,061中所描述，通过引用的方式特异地结合至本文，并且可以与这里组合使用。
许多对于血管新生的治疗有用的酪氨酸激酶抑制剂，如在多种疾病情形中表现的，现在是已知的。这些包括，例如，美国专利5,639,757的4-氨基吡咯[2，3-d]嘧啶，通过引用的方式特异地结合至本文，同样可以与本发明联合使用。能够通过VEGFR2受体调节酪氨酸激酶信号转换的有机分子的更多的例子是喹唑啉化合物和美国专利5,792,771的组合物，通过引用的方式结合至本文，出于描述在血管新生疾病的治疗中与本发明联合使用的更多组合物的目的。
其它化学种类的化合物同样已经显示抑制血管新生，并且可以与本发明联合使用。例如，类固醇，例如血管生成抑制的4，9(11)-类固醇和C21-氧化类固醇，如在美国专利5,972,922中所描述的，通过引用的方式特异地结合至本文，可以用在联合治疗中。美国专利5,712,291和5,593,990，每一篇都通过引用的方式结合至本文，描述了沙利度胺和相关的化合物、前体、类似物、代谢物和水解产物，其同样可以与本发明联合使用以抑制血管新生。美国专利5,712,291和5,593,990中的化合物可以口头给药。与联合治疗相关有用的更多的典型的抗血管新生试剂在表D中列出。每一种本文列出的试剂都是典型的并且决不限制。
表D
血管新生抑制剂和负调节物
  物质   参考文件
  可溶的VEGFR1   Shibuya，2006
  可溶的神经纤毛蛋白-1(NRP-1)   Gagnon等，2000
  血管抑制素   O′Reilly等，1994
  内皮抑素   O′Reilly等，1997
  促血管生成素2   Maisonpierre等，1997
  钙网蛋白   Pike等，1999
  血管抑制因子   Pike等，1998
  血管抑制素   Kaur等，2005
  血管能抑制素   Kamphaus等，2000
  乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂   Zou等，1994
  物质   参考文件
  16kDa泌乳雌激素片段   Ferrara等，1991；Clapp等，1993；D′Angelo等，1995；Lee等，1998
  层粘连蛋白肽   Kleinman等，1993；Yamamura等，1993；Iwamoto等，1996；Tryggvason，1993
  纤维连接蛋白肽   Grant等，1998；Sheu等，1997
  组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP 1、2、3、4)   Sang，1998
  纤溶酶原激活物抑制物(PAI-1、-2)   Soff等，1995
  肿瘤坏死因子α(高剂量，体外)   Frater-Schroder等，1987
  TGF-β1   RayChadhury和D′Amore，1991；Tada等，1994
  干扰素(IFN-α、-β、γ)   Moore等，1998；Lingen等，1998
  ELR-CXC趋化因子：IL-12、IL-4、IL-18、SDF-1、MIG、血小板因子4(PF4)、IP-10、CXCL10   Moore等，1998；Hiscox和Jiang，1997；Coughlin等，1998；Tanaka等，1997
  血小板反应蛋白(TSP)、TSP-1和TSP-2   Good等，1990；Frazier，1991；Bornstein，1992；Tolsma等，1993；Sheibani和Frazier，1995；Volpert等，1998
  SPARC   Hasselaar和Sage，1992；Lane等，1992；Jendraschak和Sage，1996
  2-甲氧雌二醇   Fotsis等，1994
  物质   参考文件
  多育曲霉素相关蛋白   Jackson等，1994
  苏拉明   Gagliardi等，1992；Takano等，1994；Waltenberger等，1996；Gagliardi等，1998；Manetti等，1998
  沙利度胺   D′Amato等，1994；Kenyon等，1997；Wells，1998
  羧胺三唑(CAI)   Hussain等，2003
  可的松   Thorpe等，1993 Folkman等，1983 Sakamoto等，1986
  三羧氨基喹啉   Vukanovic等，1993；Ziche等，1998；Nagler等，1998
  烟曲霉素(AGM-1470；TNP-470)   Sipos等，1994；Yoshida等，1998
  三苯氧胺   Gagliardi和Collins，1993；Lindner和Borden，1997；Haran等，1994
  韩国榭寄生提取物(榭寄生(Viscum albumcoloratum))   Yoon等，1995
  类微生素A   Oikawa等，1989；Lingen等，1996；Majewski等，1996
  CM101   Hellerqvist等，1993；Quinn等，1995；Wamil等，1997；DeVore等，1997
  地塞米松   Hori等，1996；Wolff等，1997
  白血病抑制因子(LIF)   Pepper等，1995
用于抑制血管新生的一些优选的成分是血管抑制素、内皮抑素、血管抑制素、血管能抑制素和乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂。这样的试剂在上面的本发明的免疫偶联物的联合中描述，但是可以用于组合的但非偶联的形式。
一些抗血管新生治疗已经显示出引起肿瘤退化，包括细菌多糖CM101和抗体LM609。CM101是细菌多糖，已经充分表现出它在诱导肿瘤中新生血管炎症的能力。CM101结合并交联在去分化的内皮上的受体，去分化的内皮刺激了补体系统的活化。它同样启动细胞因子驱动的选择性靶向肿瘤的炎症反应。它是唯一的抗病理性血管新生试剂，下调了VEGF和它的受体的表达。CM101普遍地在临床试验中作为抗癌症药物，可以用在与本文的联合中。
血小板反应蛋白(TSP-1)和血小板因子4(PF4)同样可以与本发明联合使用。它们都是与肝素相关的血管新生抑制剂并且可以在血小板α-颗粒中找到。TSP-1是大的450kDa的多域糖蛋白，是细胞外基质成分。TSP-1结合至许多在细胞外基质中发现的蛋白聚糖分子，包括HSPGs、纤连蛋白、层粘连蛋白和不同类型的胶原。TSP-1抑制内皮细胞体外的转移和增殖以及体内的血管新生。TSP-1同样可以抑制转化的内皮细胞的恶性显型和肿瘤发生。肿瘤抑制基因p53已经显示出直接调节TSP-1的表达，p53活性的损失引起TSP-1的产生显著减少和并伴随着肿瘤引起的血管新生的增加。
PF4是70aa蛋白，是趋化因子CXC ELR家族的成员，能够有效的抑制内皮细胞体外的增殖以及体内的血管新生。肿瘤内使用FP4或通过腺病毒载体递送FP4能够引起肿瘤生长的抑制。
干扰素和金属蛋白酶抑制剂是两个其它种类的自然存在的血管新生抑制剂，可以与本发明联合。从1980年代早期已经知道干扰素的抗内皮活性，但是，抑制的机制仍然不清楚。已知它们能够抑制内皮细胞转移并且它们确实具有一些体内抗血管新生活性，这可能由抑制肿瘤细胞的血管新生促进剂的产生的能力而介导。血管肿瘤对干扰素特别敏感，例如，增生血管瘤可以由IFNα成功治疗。
金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP)是天然存在的基质金属蛋白酶(MMP)的抑制剂家族，其能够抑制血管新生以及可以用在组合的治疗方案中。MMP在血管新生过程中起关键作用，因为它们降解了当延伸或重造血管网络时内皮细胞和成纤维细胞移动穿过的基质。事实上，MMP的一个成员，MMP-2已经显示出与经过整合素αvβ3活化的内皮相关，推测出于这个目的。如果该相互作用由MMP-2的片段打断，然后血管新生被下调，并且肿瘤生长被抑制。
有许多药理学试剂抑制血管新生，其中的任何一种或多种可以与本发明联合使用。这些包括AGM-1470/TNP-470、沙利度胺和羧胺三唑(CAI)。在1990年发现烟曲霉素是血管新生的有效抑制剂，其后已经开发了烟曲霉素的合成类似物，AGM-1470和TNP-470。这两个药物都抑制内皮细胞体外增殖和体内血管新生。TNP-470已经在人类临床试验中被广泛研究，数据表明长期施用是最佳的。
沙利度胺最初用作镇静剂，但是发现是有效的致畸剂并停止使用。在1994年，沙利度胺被发现是血管新生抑制剂。沙利度胺目前在临床试验中作为抗癌症试剂以及血管性眼病的治疗而使用。
CAI是小分子量的合成的血管新生抑制剂，担当钙通道阻断物，防止肌动蛋白再组织、内皮细胞转移和在胶原IV上的分散。CAI在生理学可达到的浓度上抑制新血管形成并且癌症患者口服后耐受较好。用CAI的临床治疗已经在49％的治疗前患有进行性疾病的癌症病患中产生疾病稳定性。
含有肝素或肝素片段的可的松在小鼠中显示出通过阻碍内皮细胞增殖而抑制肿瘤生长。类固醇和肝素的累加抑制效应所涉及的机制是不清楚的，尽管认为肝素可以通过内皮细胞增加类固醇的吸收。混合物已经显示出增加新形成的毛细血管下的基膜的分散，这也是用于累加血管生成抑制效应可能的解释。肝素-氢化可的松偶联物在体内同样具有有效的血管生成抑制和抗肿瘤效果。
更多的特异的血管新生抑制剂，包括，但不限于，抗入侵因子、视黄酸和紫杉醇(美国专利5,716,981；通过引用的方式结合至本文)；AGM-1470(Ingber等，1990；通过引用的方式结合至本文)；鲨鱼软骨提取物(美国专利5,618,925；通过引用的方式结合至本文)；阴离子聚酰胺或聚脲低聚物(美国专利5,593,664；通过引用的方式结合至本文)；羟吲哚衍生物(美国专利5,576,330；通过引用的方式结合至本文)；雌二醇衍生物(美国专利5,504,074；通过引用的方式结合至本文)；以及噻唑并嘧啶衍生物(美国专利5,599,813；通过引用的方式结合至本文)同样预期用作本发明的组合的应用的抗血管新生组合物。
含有αvβ3整合素的拮抗剂的组合物同样可以与本发明联合用于抑制血管新生。如在美国专利5,766,591中公开的(通过引用的方式结合至本文)，含有RGD的多肽和盐，包括环多肽，是αvβ3整合素拮抗剂的合适的例子。
抗αvβ3整合素的抗体LM609同样诱导肿瘤退化。αvβ3整合素的拮抗剂，如LM609，诱导血管新生内皮细胞的细胞凋亡，留下未受影响的静止的血管。LM609或其它的αvβ3拮抗剂可能同样通过抑制αvβ3和MMP-2的相互作用起作用，蛋白水解酶被认为在内皮细胞和成纤维细胞的移动中起重要作用。美国专利5,753,230通过引用的方式特异地结合至本文以描述用于与本发明联合抑制血管新生的抗αvβ3的抗体(玻连蛋白αvβ3)。
在该情形中血管新生内皮的细胞凋亡可能对剩余的血管网络具有级联效应。从完全地响应肿瘤扩张信号而抑制肿瘤血管网络事实上可能启动网络的部分或完全萎陷，导致肿瘤细胞死亡和肿瘤体积的损失。很可能内皮抑素和血管抑制素以相似的方式起作用。LM609没有影响静止的血管但是可能引起肿瘤退化的事实强烈暗示为获得抗肿瘤效果，不是肿瘤中的所有的血管都需要靶向治疗。
基于改变通过Tie2受体的信号传导的治疗干预的其它方法同样可以与本发明联合使用，如使用能够阻止Tie2活化的可溶性的Tie2受体(Lin等，1998)。使用重组的腺病毒基因治疗的这样的构建体的递送已经显示出在治疗癌症和降低转移中有效(Lin等，1998)。
G3.诱导细胞凋亡试剂
阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体治疗试剂同样可以有利地与诱导细胞凋亡的方法结合。多种诱导细胞凋亡试剂已经在上面与本发明的免疫偶联物相关中描述了。任何这样的诱导细胞凋亡的试剂可以与本发明联合使用，不需要被连接至本发明的抗体。
除了上面作为免疫偶联物描述的诱导细胞凋亡试剂之外，许多致癌基因已经被确定抑制细胞凋亡，或程序性的细胞死亡。
在这个范围内的典型的致癌基因包括，但不限于，bcr-abl、bcl-2(不同于bcl-1、细胞周期蛋白D1；Genbank登录号M14745、X06487；美国专利5,650,491和5,539,094；每一篇都通过引用的方式结合至本文)和家族成员包括Bcl-xl、Mcl-1、Bak、A1、A20。bcl-2的过表达在T细胞淋巴瘤中第一次发现。bcl-2通过结合和失活Bax(细胞凋亡途径中的蛋白)作为致癌基因起作用。bcl-2功能的抑制阻止了Bax的失活，并使得细胞凋亡途径继续下去。
这类致癌基因的抑制，如，使用反义核苷酸序列，被考虑用在本发明中以增加细胞凋亡(美国专利5,650,491、5,539,094和5,583,034，每一篇都通过引用的方式结合至本文)。
G4.免疫毒素和凝血配体
本发明的治疗方法可以与免疫毒素和/或凝血配体联合使用，在免疫毒素和/或凝血配体中，它们的靶向部分，如抗体或配体，靶向肿瘤细胞、肿瘤脉管系统或肿瘤基质的相关的特异的标记物。与上面讨论的化学治疗试剂和抗血管新生试剂一样，靶向的毒素或凝血剂的组合应用将通常导致累加抗肿瘤效果，比累加抗肿瘤效果或甚至协同的抗肿瘤结果显著大的效果。
一般而言，用在本发明的这些补充部分的抗体或配体将优选地识别可接触的肿瘤抗原，所述肿瘤抗原优选地或特异地在肿瘤位点表达。所述抗体或配体将同样优选地表现出高亲合力的性质，并且它们的抗体、配体或偶联物将不出现抵抗维持生命正常组织的明显的体内副作用，如选自心脏、肾、大脑、肝脏、骨髓、结肠、乳腺、前列腺、甲状腺、胆囊、肺、肾上腺、肌肉、神经元、胰腺、皮肤中的一种或多种组织，或人体中其它维持生命的器官或组织。本文使用的术语“明显的副作用”指的是当在体内给药时，抗体、配体或抗体偶联物将仅产生可以忽略的或临床上可处理的副作用，如在化学治疗中通常遇到的那些。
与本发明联合使用的这些第二种抗癌症试剂的至少一个结合区将是能够递送毒素或凝血因子至肿瘤区的成分，即能够停留在肿瘤位点内。这样的靶向试剂可以直接针对肿瘤细胞、肿瘤脉管系统或肿瘤基质的成分。靶向试剂将通常结合至肿瘤细胞、肿瘤脉管系统或肿瘤基质的表面表达、表面可接触的或表面定位的成分。但是，一旦肿瘤脉管系统和肿瘤细胞的破坏开始，内在成分将被释放，使得事实上额外靶向任何肿瘤成分。
许多肿瘤细胞抗原已经被描述了，任何一种可以用作与本发明组合的方面相关的目标。用于靶向额外的免疫毒素和凝血配体的适当的肿瘤细胞抗原包括由抗体B3识别的那些(美国专利5,242,813)，通过引用的方式结合至本文，ATCC HB 10573；KSI/4(美国专利4,975,369)，通过引用的方式结合至本文，从含有载体NRRL B-18356和/或NRRL B-18357的细胞中获得的；260F9(ATCC HB 8488)；和D612(美国专利5,183,756)；通过引用的方式结合至本文；ATCC HB 9796。实施者可以同样查阅任何随后年份的ATCC目录，以确定产生抗肿瘤细胞抗体的其它适当的细胞系。
为靶向肿瘤脉管系统，靶向抗体或配体将通常结合至标记物，所述标记物由血管肿瘤的瘤内血管表达、吸收、诱导或另外地定位在血管肿瘤的瘤内血管。适当表达的目标分子包括，例如endoglin，E-选择素，P-选择素，VCAM-1，ICAM-1，PSMA(Liu等，1997)，TIE，与LAM-1反应的配体，VEGF/VPF受体，FGF受体，αvβ3整合素，多效生长因子(pleiotropin)和内皮唾液酸蛋白。合适的被吸收的目标是例如VEGF，FGF，TGFβ，HGF，PF4，PDGF，TIMP，结合至TIE和肿瘤相关的纤连蛋白亚型的配体。同样可以靶向天然地或人工地由细胞因子和凝血剂可诱导的抗原，如ELAM-1，VCAM-1，ICAM-1，与LAM-1反应的配体，endoglin，以及甚至II类MHC(细胞因子可诱导的，如通过IL-1、TNF-α、IFN-γ、IL-4和/或TNF-β)；和E-选择素、P-选择素、PDGF和ICAM-1(凝血剂可诱导的，例如，通过凝血酶、因子IX/IXa、因子X/Xa和/或血纤维蛋白溶酶)。
以下专利通过引用的方式特异地结合至本文，出于更进一步补充关于针对表达的、吸收的、诱导的或定位的肿瘤脉管系统标记物的免疫毒素的制备和使用的教导的目的：美国专利6,093,399、5,855,866、5,965,132、6,051,230、6,004,555、5,877,289、6,004,554、5,776,427、5,863,538、5,660,827和6,036,955。
更多的靶向肿瘤脉管系统的组合物和方法包括那些靶向氨磷脂的，如磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺，目前被发现是肿瘤血管的可接触的、特异标记物。单独施用抗氨磷脂抗体足以诱导血栓症和肿瘤退化。本发明因此可以有效地与未偶联的抗磷脂酰丝氨酸和/或磷脂酰乙醇胺抗体组合，或可以使用这样的抗体的免疫偶联物。
以下专利通过引用的方式特异地结合至本文，出于更进一步补充关于抗氨磷脂抗体和免疫毒素的制备和使用的教导的目的：美国专利6,406,693、6,312,694、6,783,760、6,818,213和7,067,109。美国专利6,312,694、6,783,760、6,818,213和7,067,109更进一步通过引用的方式结合至本文，出于进一步补充关于氨磷脂结合蛋白偶联物的使用的教导的目的，如膜连蛋白偶联物，用于递送毒素和凝血剂至肿瘤血管和用于诱导血栓症和肿瘤退化。
合适的肿瘤基质目标包括肿瘤细胞外间质或基质的成分，或限制在其中的成分；包括基膜标记物，类型IV胶原、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素、蛋白多糖、纤连蛋白、活化血小板、LIBS和腱生蛋白(tenascin)。用于这样使用的优选的目标是RIBS。
以下专利通过引用的方式特异地结合至本文，出于更进一步补充关于靶向肿瘤基质试剂的制备和使用的教导的目的：美国专利6,093,399、6,004,555、5,877,289和6,036,955。
第二种抗癌肿治疗剂可以有效地连接至本文所描述的任一细胞毒素试剂或抗细胞试剂以用在阻碍VEGFR2的抗VEGF抗体或基于阻碍VEGFR2的抗VEGF抗体的免疫毒素中。但是，合适的抗细胞试剂同样包括放射性同位素。优选是毒素一部分，例如蓖麻蛋白A链和去糖基化A链(dgA)。
可选的与本发明使用的第二种靶向的试剂可以包括能够促进凝血的靶向的成分，即，凝血配体。这里，靶向抗体或配体可以直接或间接地，例如通过另一个抗体，连接至直接或间接刺激凝血的任何因子，包括本文描述的任何用于阻碍VEGFR2的抗VEGF抗体或基于阻碍VEGFR2的抗VEGF抗体的凝血配体的那些。优选的出于这样使用的凝血因子是组织因子(TF)和TF衍生物，如截短的TF(tTF)、二聚和多聚TF，和缺乏激活因子VII能力的突变的TF。
在癌症治疗中组合使用的免疫毒素和凝血配体的有效剂量将在大约0.1mg/kg和大约2mg/kg之间，优选地，在大约0.8mg/kg和大约1.2mg/kg之间，通过IV路线以大约每周一次的频率给药。根据被治疗的病患的情形将必要地对剂量进行变化。负责给药的医生将决定个体患者的合适的剂量。
G5.TLR激动剂
现在已经确定通过Toll样受体(TLR)的信号传导有助于已知的抗癌症试剂的效果，包括减毒的猪霍乱沙门氏菌、BCG和紫杉醇，每一种都激活TLR4。真正地，ILR4信号传导有助于化学治疗和放射治疗的抗癌症效果(Apetoh等，2007)。既更好地理解一些已知的抗癌症试剂的作用机制，又认识到TLR信号传导的重要性已经同样促使了通过激活TLR起作用的新治疗的开发。
因此，本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体可以用在癌症治疗中，与一种或多种刺激通过TLR的信号传导的试剂结合，即与一种或多种TLR激动剂结合。至少第一种TLR激动剂可以同样有效地连接至本发明的人类抗体以产生治疗偶联物，如本文在免疫偶联物部分所描述的。以下的任何一种或多种或其它的TLR激动剂可以用在本发明的组合的癌症治疗中。
合适的TLR激动剂包括TLR1至TLR11中的一个或多个，优选地是TLR1、TLR2、TLR4、TLR7、TLR8或TLR9，并且最优选地是TLR4、TLR7、TLR8或TLR9的激动剂。TLR1/TLR2激动剂包括脂蛋白，如OspA和三酰基脂肽，TLR2激动剂包括细菌脂蛋白，LAM、MALP-2、GPI、糖脂和孔蛋白。
TLR4激动剂的具体的例子包括称为5D24.D4的竞争性抗TLR4抗体(Cohen等，2003)，LPS，脂质A和它们的衍生物，其中目前优选的是单磷酰脂质A(MPL)和MPL的类似物。MPL类似物已知如AGP可以用作与本发明联合的合成的TLR4激动剂(Alderson等，2006)。通过TLR4和CD14刺激信号传导的激动剂同样包括LPS、脂质A、MPL和MPL类似物，以及紫杉醇、紫杉醇、黄脂素(flavolipin)和GIPL。TLR4激动剂OK-432和OK-PSA已经用于治疗宫颈癌和非小细胞肺癌。
TLR7激动剂包括咪唑莫特、雷西莫特和艾沙托立宾(Finberg等，2005；Horsmans等，2005)，并且咪唑莫特被批准用于治疗基底细胞癌。其它的TLR7激动剂包括gardiquimod、洛索立宾、溴匹立明。雷西莫特同样是TLR8激动剂。TLR9激动剂，如CpG，已经被用于治疗非小细胞肺癌、非何杰金淋巴瘤、肾细胞癌和结直肠癌。
G6.ADEPT和前药治疗
本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体可以与前药联合使用，其中阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体有效地与激活前药的成分联合，如激活前药的酶，将前药仅在与抗体接触时转化成更有效的形式。这一技术通常定义为“ADEPT”，并在如WO 95/13095、WO 97/26918、WO97/24143和美国专利4,975,278和5,658,568，中描述，每一篇都通过引用的方式结合至本文。
本文使用的术语“前药”指的是，生物学上或制药学上的有效成分的前体或衍生物形式，与其基于的母体药物相比，其发挥出对靶向细胞减少的细胞毒素效果或抗细胞效果，所述靶向细胞包括肿瘤血管内皮细胞。优选地，与“天然的”或母体形式相比，前药或前体形式发挥明显减少的，或更优选的，可以忽略的细胞毒素或抗细胞效果。“前药”能够被激活或转换以产生更有活性的母体形式的药物。
本领域普通技术人员具备制备和使用前药的技术能力。Willman等(1998)和Stella和Himmelstein(1985)都通过引用的方式特异地结合至本文，出于进一步补充关于如何制备和使用多种前药的描述和教导的目的。可以用在本发明上下文中的典型的前药构建体包括，但不限于，含有磷酸盐的前药(美国专利4,975,278)，含有硫代磷酸盐的前药，含有硫酸盐的前药，基于肽的前药(美国专利5,660,829、5,587,161、5,405,990、WO 97/07118)，D氨基酸修饰的前药，糖基化的前药(美国专利5,561,119、5,646,298、4,904,768、5,041,424)，含有β-内酰胺的前药，含有可选地取代苯氧基乙酰胺的前药(美国专利4,975,278)，含有可选地取代苯基乙酰胺的前药，以及甚至5-氟胞嘧啶(美国专利4,975,278)和5-氟尿嘧啶核苷等等，其中每一篇专利都通过引用的方式结合至本文。
可以以前药形式使用的治疗试剂或细胞毒素药物的类型事实上是无限的。更多的细胞毒素试剂将被优选用于这样的递送形式，如较少地选用作为前药的凝血剂的递送。在形成前药中所需要的全部是设计构建体，从而前药是充分地无活性的，并且“被释放的”或激活的药物具有充分的或至少充足的用于计划的目的的活性。
同样已知并预期在这里使用的对初始前药的多种改进，如在WO95/03830、EP 751,144(蒽环类)、WO 97/07097(环丙基吲哚)、和WO96/20169中所公开的。例如，具有减少的Km的前药在美国专利5,621,002中描述，通过引用的方式特异地结合至本文，其可以用在本发明的内容中。在细胞内操作的前药治疗是已知的，如由WO 96/03151例证的，通过引用的方式特异地结合至本文，并可以在这里实施。
为了在ADEPT中使用，激活或将前药转换成更有活性药物的试剂有效地连接至阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体。阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体因此将转换前药的能力局限在血管新生位点内，优选地，在肿瘤脉管系统和基质之内，因此活性药物仅在这样的区域产生，而不在循环或在健康的组织中。
可以连接至阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体以产生前药激活功能的酶包括，但不限于，与含有磷酸盐的前药联合使用的碱性磷酸酶(美国专利4,975,278)；与含有硫酸盐的前药联合使用的芳基硫酸脂酶(美国专利5,270,196)；肽酶和蛋白酶，如沙雷氏菌肽酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶(美国专利5,660,829、5,587,161、5,405,990)和组织蛋白酶(包括组织蛋白酶B和L)，以与基于肽的前药联合使用；与D-氨基酸修饰的前药联合使用的D-丙氨酰羧肽酶；与糖基化前药联合使用的碳水化合物裂解酶如β-半乳糖苷酶和神经氨酸苷酶(美国专利5,561,119、5,646,298)；与含有β-内酰胺前药联合使用的β-内酰胺酶；与在氨基氮衍生的具有苯氧基乙酰胺或苯基乙酰胺基团的药物联合使用的青霉素酰胺酶，如青霉素V酰胺酶(美国专利4,975,278)或青霉素G酰胺酶；和与基于5-氟胞嘧啶的前药(美国专利4,975,278)联合使用的胞嘧啶脱氨酶(美国专利5,338,678、5,545,548)，其中每一篇专利都通过引用的方式结合至本文。
具有酶活性的抗体，已知如催化性抗体或“抗体酶”，同样可以用于将前药转换成活性药物。基于阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体的抗体酶因此形成本发明的另一方面。本领域普通技术人员同样具备制备抗体酶的技术能力，如由Massey(1987)所例证的，通过引用的方式结合至本文，出于补充抗体酶教导的目的。进一步考虑能够在氨基甲酸酯(如氮芥芳基氨基甲酸酯)位置催化前药分解的催化性抗体，如在EP745,673中描述的，通过引用的方式结合至本文。
G7.眼用组合物
本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体可以与其它治疗联合使用以治疗眼睛疾病和血管新生的眼睛疾病，包括糖尿病视网膜病、黄斑变性、年龄相关性黄斑变性、新生血管性青光眼和上面描述的其它眼睛疾病。所述抗体可以与任何通常用在眼睛疾病治疗中的其它方法联合，包括外科手术。
至于与其它治疗试剂的联合，阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体可以在其它治疗试剂之前、之后或实际上同时给药。实际上同时给药可以由单一组合物或从两个不同的组合物完成。
至于脉络膜新血管生成，如与黄斑变性、年龄相关性黄斑变性(AMD)和其它眼睛适应症相关的那些，一些本发明的优选的组合物是使用第二种试剂的那些，其中第二种试剂阻止、抑制、减低、下调或拮抗SPARC(分泌蛋白，酸性的，富含半胱氨酸)(Nozaki等，2006；美国2006/0135423)。由于本发明的抗体已经阻止VEGFR2活化，而不是VEGFR1活化，它们与一种或多种阻止SPARC的试剂的组合可能产生特别有效的方法以进一步减少眼睛中VEGF诱导的血管新生。
SPARC抑制剂或拮抗剂包括，例如，如已经成功开发抗VEGF本身的相同分子类型的那些。典型的SPARC抑制剂因此包括抑制性抗SPARC抗体和其抗原结合片段(如Sweetwyne等，2004)；反义策略，如RNA适配体和RNA/DNA适配体，沉默或干扰SPARC表达的沉默RNA(siRNA或RNAi)；核酶；以及其它蛋白、肽和小分子抑制剂。许多这样的SPARC抑制剂，包括多克隆和单克隆抗体和siRNA，是商业上可用的，如来自Sigma/Aldrich，Santa Cruz生物技术公司，R&D Systems。因此一种或多种SPARC抑制剂可以与本发明联合使用以额外地阻止、抑制、减少、下调或拮抗SPARC水平或活性，在DNA、RNA和/或蛋白水平。
H.诊断和成像
本发明进一步提供体内和体外的诊断和成像方法。这样的方法适于用在产生任何血管新生疾病的诊断的、预测的或成像信息，如通过关节炎、牛皮癣和实体瘤所例证的，但是包括所有的本文公开的血管新生疾病。在肿瘤诊断和成像领域之外，本发明的这些方面最优选的用在体外诊断试验中，优选地样品可以非入侵地获得并通过高通量试验测试和/或临床诊断是不确定的、而期望确定。
H1.免疫检测方法和试剂盒
在更多的实施方式中，本发明涉及用于结合、纯化、转移、定量和其它通常地检测VEGF和用于诊断血管新生疾病的免疫检测方法。本发明的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体可以用于体内(见下)，在分离的组织样品、活组织检查或药签中和/或在组织匀浆样品中检测VEGF。这样的免疫检测方法具有明显的诊断效用，但是对非临床样品同样可以应用，如在抗原样品的滴定中等等。
多种有用的免疫检测方法的步骤已经在科学文献中描述，如Nakamura等(1986，通过引用的方式结合至本文)。通常，免疫结合方法包括获得怀疑含有VEGF的样品，并在允许免疫复合物形成的有效条件下用阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体接触样品。在这样的方法中，抗体可以连接至固体载体，如列矩阵(column matrix)的形式，怀疑含有VEGF的样品将应用于固定抗体。
更优选地，免疫结合的方法包括用于在样品中检测或定量VEGF的量的方法，这些方法需要在结合过程中形成的任何免疫复合物的检测或定量。因此，实施者将获得怀疑含有VEGF的样品并用根据本文的抗体接触样品，然后检测或定量在特定条件下形成的免疫复合物的量。
被分析的生物学样品可以是怀疑含有VEGF的任何样品，通常来自怀疑患有血管新生疾病的动物或病患。样品可以是组织切片或标本、活组织切片、药签或涂片检查样品，它们的组织匀浆提取物或分离的或纯化的形式。
在使得免疫复合物(初级免疫复合物)形成的有效条件和充分期间下用抗体接触选择的生物学样品一般是简单地向样品中添加抗体组合物并孵育混合物足够长的期限使得抗体形成免疫复合物，即结合至任何存在的VEGF。这个时候之后，样品-抗体组合物，如组织切片、ELISA板、点杂交或蛋白印迹将通常被冲洗以移除任何非特异结合的抗体种类，仅使得在初级免疫复合物中特异结合的那些抗体可以被检测。
免疫复合物形成的检测是本领域已知的并且可以通过应用众多方法以实现。这些方法通常基于标记或标记物的检测，如本领域已知的任何放射性、荧光的、生物学的或酶的标签或标记。涉及这样的标记的使用的美国专利包括3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241，每一篇都通过引用的方式结合至本文。通常优选的是与发色底物接触时产生有色产物的酶的应用。如本领域已知的，同样可以使用第二结合配体，如第二抗体或生物素/抗生物素蛋白配体结合排列。
在检测中使用的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体本身可以连接至可检测的标记，其中实施者然后可以简单地检测这个标记，从而使得测定组合物中初级免疫复合物的量。
优选地，初级免疫复合物通过第二结合配体检测，该第二结合配体对本发明的抗体具有结合亲合力。在这样的案例中，第二结合配体可以连接至可探测的标记。第二结合配体本身经常是抗体，并因此被定义为“二”抗。在有效条件下，初级免疫复合物与标记的、第二结合配体或抗体接触充分期间以使得第二免疫复合物的形成。然后通常清洗第二免疫复合物以移除任何非特异结合标记的第二抗体或配体，然后检测在第二免疫复合物中的剩余的标记。
更多的方法包括通过两步方法的初级免疫复合物的检测。对一抗具有结合亲合力的第二结合配体，如抗体，被用于形成第二免疫复合物，如上所述。清洗之后，第二免疫复合物与对第二抗体具有结合亲合力的第三结合配体或抗体接触，，再一次在有效条件下和充分的期间以使得免疫复合物形成(第三免疫复合物)。第三配体或抗体连接至可检测的标记，使得检测因此形成的第三免疫复合物。如果需要，这个系统可以用作信号放大。
在患有血管新生疾病的病患的临床诊断或监测中，VEGF被检测到，或与来自正常实验体的相应生物学样品的水平比较，VEGF水平的增加，是患者患有血管新生疾病的指示。
但是，如本领域技术人员已知的，这样的临床诊断将不可能孤立地基于这样的方法完成。本领域技术人员非常熟悉区分代表阳性鉴定的生物标记的明显表达和生物标记的低水平或背景表达。事实上，背景表达水平通常用于形成“分界”，在其以上增加的染色将被记为明显或阳性。
H2.成像
本发明的这些方面优选用于肿瘤成像方法和组合的肿瘤治疗和成像方法。连接至一种或多种可检测的试剂的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体预想用于本身成像，或肿瘤预成像，以在治疗之前形成可靠图像。这样的组合物和方法同样可以用于成像和诊断任何其它血管新生疾病或情形，特别是非恶性肿瘤、动脉硬化症和出于诊断和预测目的或设计治疗而需要内成像的情形。
阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体成像抗体将通常包括有效连接至或偶联于可检测标记的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体。“可检测标记”是由于它们特异的功能性质或化学特性而能够被检测的化合物或元素，它们的使用可以使得它们连接的成分被检测，并且如果需要，进一步定量。用于体内诊断方案或“成像方法”的抗体偶联物中，需要使用非入侵方法而检测的标记。
本领域已知许多适当的成像试剂，以及它们与抗体和结合配体的连接的方法(见，如美国专利5,021,236和4,472,509，二者都通过引用的方式结合至本文)。一些连接方法涉及金属螯合物的应用，金属螯合物使用，例如有机螯合剂，如连接至抗体的DTPA(美国专利4,472,509)。单克隆抗体同样可以与酶在偶联剂的存在下反应，偶联剂如戊二醛或高碘酸盐。与荧光素标记物的偶联物在这些偶联剂的存在下或通过与异硫氰酸酯反应制备。
可检测的标记的例子是顺磁离子。在这样的案例中，合适的例子包括铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和铒(III)，其中钆是特别优选的。
在其它上下文中有用的离子，如X光成像，包括但不限于镧(III)、金(III)、铅(II)和尤其是铋(III)。荧光标记包括若丹明、荧光素和肾造影剂。若丹明和荧光素通常通过异硫氰酸酯中间体连接。
在用于诊断使用的放射性同位素的情况中，合适的例子包括14碳、51铬、36氯、57钴、58钴、铜67、152铕、镓67、3氢、碘123、碘125、碘131、铟111、59铁、32磷、铼186、铼188、75硒、35硫、锝99m和钇90。125I经常被优选用于一些实施方式中，锝99m和铟111同样是优选的，由于它们低的能量和适于长期检测。
在本发明中使用的放射性标记的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体的抗体可以根据本领域已知的方法制备。例如，经常被用于结合放射性同位素金属离子至抗体的中间官能团是二乙烯三胺五乙酸(DTPA)和乙二胺四乙酸(EDTA)。
单克隆抗体同样可以通过与碘化钠或碘化钾和化学氧化剂如次氯酸钠，或酶氧化剂如乳过氧化物酶接触而被碘化。根据本发明的抗体可以通过配体交换过程而用锝99m标记，例如，通过用锡溶液还原高锝酸盐、将还原的锝螯合至交联葡聚糖柱上并对该柱使用抗体；或通过直接的标记技术，如通过孵育高锝酸盐，还原剂如SNCl2，缓冲溶液如邻苯二甲酸钠-钾溶液和所述抗体。
任何前述类型的可检测的标记的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体可以用在本发明的成像或组合的成像和治疗方面。它们平等地适于用在体外诊断。用于体内成像实施方式的剂量通常少于用于治疗的，但是同样依赖于病患的年龄和体重。一次的剂量应当充分。
体内诊断或成像方法通常包括对病患施用诊断有效量的偶联至标记物的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体，该标记物可以通过非入侵方法检测。允许抗体-标记物偶联物以充分的时间在肿瘤中定位和结合至VEGF。然后病患经受检测仪器以识别可检测的标记物，因此形成肿瘤的图像。
H3.诊断试剂盒
在更进一步实施方式中，本发明提供诊断试剂盒，包括免疫检测和成像试剂盒，以与上面所述的免疫检测和成像方法一起使用。因此，试剂盒中提供阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体，通常包含在合适的容器中。
对于免疫检测，所述抗体可以结合至固体载体，如微量滴定板的孔，尽管优选用于重构的抗体溶液或粉末。免疫检测试剂盒优选地包括至少第一种免疫检测试剂。试剂盒的免疫检测试剂可以采取多种形式中的一种，包括那些与给出的抗体联合或连接至给出的抗体的可检测的标记。同样考虑与第二结合配体联合或连接至第二结合配体的可检测的标记。典型的第二配体是对一抗具有结合亲合力的那些二抗。
用在本试剂盒的更多的合适免疫检测试剂包括两种成分的试剂，包括对一抗具有结合亲合力的二抗，连同对二抗具有结合亲合力的三抗，三抗连接至可检测的标记。如上面所记录的，许多典型的标记是本领域已知的，并且所有这样的标记可以与本发明联合使用。这些试剂盒可以包含抗体-标记的偶联物，以完全偶联的形式，以中间体的形式，或作为由试剂盒的使用者偶联的分开的部分。
成像试剂盒将优选地包括已经连接至体内可检测的标记的阻碍VEGFR2的人类抗VEGF抗体。但是，所述标记和连接方式可以分开使用。
每一试剂盒可以进一步包括对照试剂，如VEGF的适当平分的组合物，标记或未标记的，如可以用于制作用于检测实验的标准曲线。试剂盒的成分可以包装在水介质中或以冻干形式。
试剂盒的容器工具将通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其它容器工具，抗体或抗原可以置于其中，并且优选地，适当地平分。当提供第二或第三结合配体或额外的成分，试剂盒将通常同样包括第二个、第三个或额外的容器，所述配体或成分将被置放在其中。试剂盒同样可以包括用于任何一种或多种血管新生疾病的诊断的其它诊断试剂。优选地，将使用不基于VEGF结合的第二种诊断。
本发明的试剂盒将同样典型地包括包含抗体的工具和用于商业出售的紧密密封的任何其它试剂的容器。这样的容器可以包括注射或吹塑成形塑料容器，期望的小瓶保持在其中。
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以下的实施例被包括以证明本发明的优选的实施方式。本领域技术人员应当意识到在随后的实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明实践中充分起作用的技术，并因此被考虑构成用于其实践的优选的方式。但是，根据本发明公开内容，本领域技术人员应当意识到可以在公开的特异的实施方式中做出许多变化并仍然保留相似或类型的结果，而不背离本发明的实质和范围。
实施例
实施例1：抗体选择
在胚胎发生、骨骼生长和生殖功能中，VEGF是生理学血管新生的关键调节物。通过与酪氨酸激酶受体VEGFR2相互作用的VEGF信号传导在病态的血管新生中同样重要，包括与血管生长相关的。给出阻止血管新生的治疗特异的人类抗体的需要，与VEGF上的抗原表位反应的人类抗体已经被鉴定，其特异地并充分地阻止它与VEGFR2(KDR/Flk-1)的相互作用，但不充分阻止它与VEGFR1(Flt-1)的相互作用。
单链形式的抗体在pHOG21质粒中克隆(Kipriyanov等，1996；1997)(图9A和图9B)(在NcoI和NotI限制性位点)，其包含c-myc和6x组氨酸标签抗原表位。大肠杆菌细胞，XL-1blue，在氨苄青霉素平板上转化和筛选，在IPTG诱导下scFv被表达。纯化的scFv通过ELISA检测抗VEGF的选择性生物学活性。选择性生物学活性进一步通过使用鼠抗体2C3的竞争性ELISA实验证实，鼠抗体2C3特异地阻止VEGF和VEGFR2的相互作用而不阻止VEGF和VEGFR1的相互作用(Brekken等，1998；2000)。同样Biacore显示了scFv抗体结合至固定的VEGF-A。同样评估了结合至鼠VEGF以及人类VEGF。
A.测序
示出了一种优选的产生抗体的克隆的重链和轻链核苷酸序列。抗体被指定为EJ173/112-Cl1(r84/PGN311)，并且已经以scFv形式(实施例1和图1)和全长IgG形式(实施例6)被制备。单链形式的EJ173/112-Cl1(r84/PGN311)的轻链和重链的核苷酸序列和氨基酸序列在图1和表1中示出。全长IgG形式的r84/PGN311的轻链和重链的核苷酸序列和氨基酸序列在实施例6中示出。EJ173/112-Cl1(r84/PGN311)的轻链和重链的CDR和骨架区在表1中示出。
实施例2：EJ173/112-Cl1(r84/PGN311)高亲合力地结合VEGF
为确认抗体的特异性，通过抗覆盖的人类VEGF-A(从Rolf A.Brekken教授处获得，UT西南医学中心，达拉斯，德克萨斯)的ELISA检测scFc形式的EJ173/112-Cl1(r84/PGN311)的结合。简要地，2μg/mlVEGF-A被覆盖在聚苯乙烯平板上。然后，20μg/ml纯化的EJ173/112-Cl1(r84/PGN311)scFv被添加至第一个孔中，并用3倍稀释液滴定。结合的scFv用抗c-myc标签鼠单克隆抗体(Invitrogen)和HRP偶联的二级兔抗鼠抗体检测。
ELISA结果显示EJ173/112-Cl1(r84/PGN311)scFv(图2)结合至VEGF并且重要地，与它的亲本克隆相比，具有增加的结合信号，和因此增加的亲合力。鼠B9抗体用作阳性对照，并且是抗人类VEGF-A的鼠scFv抗体(从Philip E.Thorpe教授处获得，UT西南医学中心，达拉斯，德克萨斯)。
EJ173/112-Cl1(r84/PGN311)显示出比其亲本克隆更多的有益的性质。已经显示EJ173/112-Cl1(r84/PGN311)与其亲本克隆相比，具有在血清中更高的稳定性以及以scFv形式形成聚集体的减少的趋势(数据没有显示)。
混合EJ173/112-Cl1(r84/PGN311)重链可变区和来自其它抗VEGF抗 体的7个不同的重链
EJ173/112-Cl1(r84/PGN311)的轻链可变区与源自不同于r84/PGN311的其它抗VEGF抗体克隆的7个不同的重链可变区结合以证实r84/PGN311的轻链可变区在保持VEGF结合性质中的重要性。得到的克隆被表达并在NiNTA柱上通过它们的组氨酸标签纯化。纯化后，测定浓度，并运行抗覆盖的人类VEGF-A的ELISA。添加20μg/ml纯化的scFv，结合的scFv用抗c-myc标签鼠单克隆抗体(Invittogen)和HRP偶联的二级兔抗鼠抗体检测。
已经显示出，在这个ELISA中，EJ173/112-Cl1(r84/PGN311)的轻链可变区和源自其它抗VEGF抗体克隆的重链可变区的7个组合中的3个显示出明显的与VEGF结合。这是合理的比例，证明r84/PGN311的轻链可变区对于保持与VEGF的结合是重要，以及能够与这个轻链可变区结合以产生结合VEGF的抗体的其它重链可变区同样可以容易地被鉴定。
实施例3：EJ173/112-Cl1(r84/PGN311)与鼠2C3竞争
为进一步证明抗体的特异性，使用抗覆盖的VEGF-A的ELISA测试在两个浓度的2C3存在时EJ173/112-Cl1(r84/PGN311)scFv的结合。简要地，2μg/ml VEGF-A覆盖在聚苯乙烯平板上，然后将1μg/ml纯化的EJ173/112-Cl1(r84/PGN311)scFv、亲本克隆或鼠B9scFv(图3)添加至6个平行的孔中，其中两个含有0.1μg、两个含有1μg鼠2C3IgG，分别导致终浓度为1和10μg/ml的2C3IgG。剩余的结合的scFv用HRP偶联的抗c-myc标签鼠单克隆抗体(Invitrogen)检测。
EJ173/112-CI1(r84/PGN311)scFv和VEGF的结合由于增加浓度的2C3IgG的竞争而减少。因此这些结果显示对于结合VEGF，EJ173/112-Cl1(r84/PGN311)与2C3抗体有效竞争，说明EJ173/112-Cl1(r84/PGN311)与2C3结合实质上一样的抗原表位。
实施例4：EJ173/112-Cl1(r84/PGN311)与人类和鼠VEGF的结合
测定了EJ173/112-Cl1(r84/PGN311)scFv与人类和鼠VEGF的结合。1μg/ml的鼠VEGF(R&D系统493-MV-005/CF，无载体鼠VEGF164)和人类VEGF覆盖在聚苯乙烯酶标板上。添加10μg/ml纯化的scFv并用抗c-myc标签鼠单克隆抗体(Invitrogen)和HRP偶联的二级兔抗鼠抗体检测。
结果显示EJ173/112-Cl1(r84/PGN311)scFv(图4)结合至鼠VEGF和人类VEGF。
此外，Biacore T100被用于估定scFv形式的r84和它的亲本克隆与鼠VEGF的结合亲合力。为此，1000RU的重组鼠VEGF164(493-MV/CF，R&D系统)被固定在CM5芯片上(Biacore)，单体scFv的稀释系列(100nM和2倍稀释)以50μl/min的流速流过。表示成KD的结合亲合力通过1∶1的拟合模型使用属于Biacore T100仪器的软件计算。计算出的KD值，对于EJ173/112-Cl1(r84/PGN311)是1.0x10-8M，对于亲本克隆是4.0x10-8M。因此r84/PGN311比其亲本克隆表现出对于鼠VEGF更高的结合亲合力。
这些结果显示该选择的抗体(r84/PGN311)适于在鼠的临床前研究使用和在人类中使用。
如下面实施例6详细描述的，完全地人类和鼠嵌合的IgG形式的r84抗体已经产生。ELISA结合研究证实了这些IgG形式的r84抗体的每一个同样结合鼠VEGF和人类VEGF(图19)。这些结果显示了充分选择的人类r84抗体超过2C3抗体的另一个优势，2C3抗体没有展示出有意义的结合鼠VEGF。
2C3与鼠VEGF有意义的结合的缺乏已经在间接的ELISA实验中证明。在这个试验中，2C3与人类和鼠VEGF以及其它VEGF家族成员的相互作用被估定。
间接ELISA实验本质上如在Brekken等，癌症研究1998和2000中所描述的实施。简要地，多种生长因子，即人类VEGF-A(VEGF)、鼠VEGF、PIGF、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D购自R&D系统，并包覆在ELISA板的孔上(50μl/孔，光敏处理缓冲液中0.5g/ml，4℃过夜)。37℃时，孔用5％CAH(酸水解酪蛋白，Sigma，以PBS补足)封闭1小时，并在室温下用三倍的1.0μg/ml的2C3抗VEGF抗体孵育2小时。用过氧化物酶偶联的二级抗体(抗人或抗鼠IgG，1∶5000稀释)检测结合。孔用TMB(用于HRP的比色底物)显色并读出在450nm处的吸光值。平均吸光值如下：人VEGF-A(3.07)，鼠VEGF(0.09)其与背景信号一样，PIGF(0.1)，VEGF-B(0.09)，VEGF-C(0.09)和VEGF-D(0.12)。
结果证明2C3结合人类VEGF-A但是不与鼠VEGF-A、PlGF、VEGF-B、VEGF-C或VEGF-D反应。这个实验已经重复了几次，具有相似的结果。
IgG形式的r84/PGN311抗体结合鼠VEGF，而2C3和阿瓦斯汀不结合鼠VEGF的更多的证据已经从实验中获得，实验中，血清中鼠VEGF水平已经在用r84、2C3和阿瓦斯汀治疗的动物中评价。
收集来自用对照IgG(Synagis)、阿瓦斯汀、2C3或r84治疗的荷肿瘤的动物的血清并使用来自R&D系统的试剂盒通过ELISA化验鼠VEGF的水平。此外，一些来自r84治疗的鼠的血清样品通过与G蛋白珠孵育将所有抗体免疫耗尽。
结果显示在图24中。鼠VEGF的血清水平在对照、阿瓦斯汀和2C3治疗的动物中非常相似。但是，鼠VEGF的血清水平比用r84治疗的动物中的显著更高。在对照、阿瓦斯汀和2C3治疗的动物中观察到的和在r84治疗的动物中观察到的鼠VEGF水平的不同是对照、阿瓦斯汀、2C3抗体不结合鼠VEGF而r84IgG抗体结合鼠VEGF的证据。
图24中的“r84”柱显示血清中VEGF的总量(即，游离的(生物学活性的)VEGF和与r84复合的VEGF)。认为游离的(生物学活性的)VEGF的量是当在治疗上使用抗VEGF抗体时被测量的重要参数，特别是评估抗体结合VEGF的有效性时(Loupakis等，2007)。“r84supe”柱显示了结合鼠VEGF的r84免疫球蛋白和r84通过蛋白G的孵育而移除之后血清中的游离VEGF的量。图24因此显示r84治疗的动物的血清中游离的鼠VEGF水平是在基线水平。因此，在图24中的结果不仅仅是证明了r84充分结合鼠VEGF，并且证明r84非常有效地清除血清中游离(生物学活性的)VEGF的水平，这是在治疗应用中的重要性质。
在下面实施例11E中所讨论的使用同源鼠乳腺癌模型并显示出鼠嵌合r84明显地提高了荷肿瘤的鼠的存活的结果进一步证实了在体内r84结合并阻止鼠VEGF活性。
上面描述的结合显示了完全人类r84/PGN311抗体结合鼠和人类VEGF，但是2C3和阿瓦斯汀抗体不结合鼠VEGF。在能够使用r84估定例如抗肿瘤活性方面，这是重要的优势，既在鼠同源模型中，即将鼠肿瘤细胞对鼠施用，又在异种移植物模型中，即将人类肿瘤细胞对鼠施用。
此外，由r84/PGN311显示的而不是由抗体如2C3和阿瓦斯汀显示的能结合鼠和人类VEGF的能力意味着在异种移植物鼠模型中由r84显示的结果更可能代表r84在人类个体中的活性，即，在临床前鼠模型中使用r84的结果对于当将抗体施用给病患时可能将要看到的很可能是好的模型。这个理由是，仅结合人VEGF的抗体(如阿瓦斯汀和2C3)将结合由人类肿瘤细胞产生的VEGF而不能结合内源的鼠VEGF。这当然不同于在人类病患中的情形，其中将存在肿瘤产生的VEGF和内源VEGF。
具有这样的情形的潜在劣势是结合人VEGF但不结合鼠VEGF的抗体可能在鼠异种移植物模型中充分表现，但是这不能由人类系统中的相似的表现而反映，而人类系统中存在更多的VEGF。换言之，在具有仅能结合人类VEGF的抗体的鼠异种移植物系统中看到的抗肿瘤效果可能比临床事实看上去更好。相反地，如果你使用能够结合人和鼠VEGF的抗体，然后它将结合在鼠模型系统中存在的所有形式的VEGF并可能更能代表当抗体放进人体中的情形。这是重要的优势并由本发明的抗体表现出来的。
实施例5：EJ173/112-Cl1(r84/PGN311)的结合亲合力
Biacore被用于评估多种抗体的结合亲合力。1μM(微摩尔)浓度的不同scFv抗体流过具有固定的VEGF(胺偶联)的CM5芯片。结合曲线在图5中显示，其中可以看出scFv形式的r84/PGN311比单链形式的亲本克隆(m)具有显著更高的结合亲合力。
此外，进行初始的研究以计算r84IgG对于VEGF的结合亲合力，其中多种浓度的r84 IgG流过固定的VEGF-A。在这点，用Kd表示的结合亲合力用Biacore3000评估软件中的1∶1结合模型计算。从初始研究中的r84 IgG获得的Kd值被计算为6.7x10-9M。
随后的使用BiaCore的亲合力研究产生表2中所示的亲合力数据。对于这些实验，IgG形式的EJ173/112-Cl1(r84/PGN311)和2C3的亲合力通过CM5芯片(Biacore)上固定的100RU人类VEGF-A来测定。每一个IgG的稀释系列(100nM和2倍稀释)以50μl/min的流速流过包被VEGF的流动池。来自用BSA包被的流动池的背景信号从结合曲线中减去。表示成KD的结合亲合力使用属于Biacore T100仪器的软件通过1∶1的拟合模型计算。
表2
  KD(M)   包被的VEGF(100RU)，25℃   包被的VEGF(100RU)，37℃
  2C3   1.24x10-8   3.13x10-7
  r84   3.21x10-9   5.22x10-9
上面数据显示在25℃和37℃，r84均以比2C3更好的亲合力结合VEGF。有理由期望在许多与血管新生疾病、包括癌症的治疗相关的临床环境中，与2C3比较，这个区别将导致更好的r84特性。在37℃时的结果特别的令人感兴趣，因为这是在体内使用时抗体将要遭遇的温度。同样应当注意，在这个实验中，当比较在25℃和37℃的结合时，阿瓦斯汀显示亲合力大约减少了10倍，而r84对温度敏感性较低(KD的减少甚至不到2倍)。
实施例6：scFv形式的r84/PGN311转化成IgG形式
首先构建完全的人类IgG形式的r84，如下。获得如图1所示的scFv形式的r84/PGN311抗体的VH和VL链的序列并插入至Lonza pConIgG1a和kappa表达载体中，然后组合以形成一个含有整个r84抗体基因的载体。为制备全长IgG抗体，载体然后转染至CHO K1SV细胞。
一旦生长条件是最优化的，细胞系的产率大约是每升细胞培养物5毫克抗体。尽管这个表达方法是有效的，不是所有的纯化抗体都是稳定的。在缓冲液最优化后，抗体的凝聚减少，达到89.5％单体和10.5％聚集物。
使用的最优化的生长条件是具有40μM MSX的Invitrogen CD-CHO，pH6.8-7.0，5％ CO2，37℃。使用的最优化的缓冲液是10mM的磷酸钠，25mM乙酸钠，50mM甘氨酸，ph5.5。
为进一步增加r84/PGN311的稳定性，分析氨基酸序列。对r84序列和典型的人类抗体序列的比较显示，r84的VL链的最后一个氨基酸从使用的构建体中消失(即最后一个赖氨酸残基，K，消失)。这个残基被再引入。DNA序列同样被改变(而没有改变翻译的氨基酸序列)以与CHO细胞更加“相容”。这个结果是新的DNA序列，和氨基酸序列，其中VL链以赖氨酸结尾。新的IgG抗体的完全的重链和轻链的核苷酸和氨基酸序列显示如下：
r84/PGN311IgG重链(核酸序列)CAGGTACAGCTTGTGCAGTCCGGAGCCGAGGTGAAGAAACCCGGAGCATCAGTGAAGGTTAGCTGCAAGGCATCTGGTGGGACATTTTCCTCCTATGCCATCTCCTGGGTTCGGCAGGCTCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGGGGGTTCGATCCCGAAGACGGAGAGACCATTTACGCACAGAAGTTTCAGGGTCGCGTGACCATGACCGAGGATACTTCTACCGACACAGCATATATGGAGCTCAGTAGCTTGCGCTCCGAGGACACGGCTGTATATTACTGTGCCACTGGACGGAGCATGGTGCGCGGGGTAATCATCCCTTTCAACGGGATGGATGTATGGGGCCAAGGGACCACCGTGACAGTCAGCTCTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGGTGAGAGGCCAGCACAGGGAGGGAGGGTGTCTGCTGGAAGCCAGGCTCAGCGCTCCTGCCTGGACGCATCCCGGCTATGCAGCCCCAGTCCAGGGCAGCAAGGCAGGCCCCGTCTGCCTCTTCACCCGGAGGCCTCTGCCCGCCCCACTCATGCTCAGGGAGAGGGTCTTCTGGCTTTTTCCCCAGGCTCTGGGCAGGCACAGGCTAGGTGCCCCTAACCCAGGCCCTGCACACAAAGGGGCAGGTGCTGGGCTCAGACCTGCCAAGAGCCATATCCGGGAGGACCCTGCCCCTGACCTAAGCCCACCCCAAAGGCCAAACTCTCCACTCCCTCAGCTCGGACACCTTCTCTCCTCCCAGATTCCAGTAACTCCCAATCTTCTCTCTGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGGTAAGCCAGCCCAGGCCTCGCCCTCCAGCTCAAGGCGGGACAGGTGCCCTAGAGTAGCCTGCATCCAGGGACAGGCCCCAGCCGGGTGCTGACACGTCCACCTCCATCTCTTCCTCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGTGGGACCCGTGGGGTGCGAGGGCCACATGGACAGAGGCCGGCTCGGCCCACCCTCTGCCCTGAGAGTGACCGCTGTACCAACCTCTGTCCCTACAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAG
(SEQ ID NO：22)
r84/PGN311IgG重链(氨基酸序列)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGFDPEDGETIYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATGRSMVRGVIIPFNGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO：24)
r84/PGN311 IgG轻链(核酸序列)GACATTCGGATGACTCAGTCTCCCTCCTCTTTGAGCGCTTCTGTGGGCGATAGGGTTACTATCACTTGTCGAGCCTCTCAATCCATCAGCTCCTACTTGAACTGGTACCAGCAGAAACCCGGGAAAGCACCCAAGCTGCTTATTTACGCCGCCTCCTCCCTGCAATCCGGAGTGCCCTCCCGGTTCAGCGGCTCCGGCTCTGGAACAGACTTTACCCTGACCATTTCTTCTTTGCAGCCTGAGGATTTTGCTACTTACTACTGTCAGCAGAGTTACTCCACCCCTTTGACATTCGGTGGTGGAACGAAAGTAGAAATTAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
(SEQ ID NO：23)
r84/PGN311IgG轻链(氨基酸序列)DIRMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO：25)
上面所示的新的r84/PGN311DNA序列被插入至Lonza pCon IgG1a和kappa表达载体中，然后组合以形成一个含有整个r84/PGN311抗体序列的载体。所述载体然后转染至CHO K1SV细胞中。抗体产量增加至超过每升350毫克，具有很少的细胞培养物的优化。更重要地，抗体更加稳定，单体超过99％。
IgG形式的r84/PGN311的可变重链和可变轻链的核酸序列同样在下面示出。
r84/PGN311 IgG VH链(核酸序列)CAGGTACAGCTTGTGCAGTCCGGAGCCGAGGTGAAGAAACCCGGAGCATCAGTGAAGGTTAGCTGCAAGGCATCTGGTGGGACATTTTCCTCCTATGCCATCTCCTGGGTTCGGCAGGCTCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGGGGGTTCGATCCCGAAGACGGAGAGACCATTTACGCACAGAAGTTTCAGGGTCGCGTGACCATGACCGAGGATACTTCTACCGACACAGCATATATGGAGCTCAGTAGCTTGCGCTCCGAGGACACGGCTGTATATTACTGTGCCACTGGACGGAGCATGGTGCGCGGGGTAATCATCCCTTTCAACGGGATGGATGTATGGGGCCAAGGGACCACCGTGACAGTCAGCTCT
(SEQ ID NO：26)
r84/PGN311 IgG VL链(核酸序列)GACATTCGGATGACTCAGTCTCCCTCCTCTTTGAGCGCTTCTGTGGGCGATAGGGTTACTATCACTTGTCGAGCCTCTCAATCCATCAGCTCCTACTTGAACTGGTACCAGCAGAAACCCGGGAAAGCACCCAAGCTGCTTATTTACGCCGCCTCCTCCCTGCAATCCGGAGTGCCCTCCCGGTTCAGCGGCTCCGGCTCTGGAACAGACTTTACCCTGACCATTTCTTCTTTGCAGCCTGAGGATTTTGCTACTTACTACTGTCAGCAGAGTTACTCCACCCCTTTGACATTCGGTGGTGGAACGAAAGTAGAAATTAAG
(SEQ ID NO：27)
同样构建鼠嵌合形式的r84抗体。这通过将完全的人类可变区连接至鼠恒定区而实现，提供了在一些在鼠中的临床前研究中使用的鼠抗体。鼠嵌合抗体的产生如上面对完全人类IgG所描述的而实现，但是将编码完全的人类可变区的核酸序列连接至编码鼠恒定区的核酸序列。
鼠嵌合IgG抗体的新的完全的重链和轻链的核苷酸和氨基酸序列显示如下：
R84/PGN 311嵌合重链(核酸序列)caggtgcagctggtgcaatctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggaggcaccttcagcagctatgctatcagctgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaggttttgatcctgaagatggtgaaacaatctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgaccgaggacacatctacagacacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcaacaggacgttctatggttcggggagtcattataccttttaacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcacgcgccgatgctgcaccgactgtctatccactggcccctgtgtgtggagatacaactggctcctcggtgactctaggatgcctggtcaagggttatttccctgagccagtgaccttgacctggaactctggatccctgtccagtggtgtgcacaccttcccagctgtcctgcagtctgacctctacaccctcagcagctcagtgactgtaacctcgagcacctggcccagccagtccatcacctgcaatgtggcccacccggcaagcagcaccaaggtggacaagaaagagcccagagggcccacaatcaagccctgtcctccatgcaaatgcccagcacctaacctcttgggtggaccatccgtcttcatcttccctccaaagatcaaggatgtactcatgatctccctgagccccatagtcacatgtgtggtggtggatgtgagcgaggatgacccagatgtccagatcagctggtttgtgaacaacgtggaagtacacacagctcagacacaaacccatagagaggattacaacagtactctccgggtggtcagtgccctccccatccagcaccaggactggatgagtggcaaggagttcaaatgcaaggtcaacaacaaagacctcccagcgcccatcgagagaaccatctcaaaacccaaagggtcagtaagagctccacaggtatatgtcttgcctccaccagaagaagagatgactaagaaacaggtcactctgacctgcatggtcacagacttcatgcctgaagacatttacgtggagtggaccaacaacgggaaaacagagctaaactacaagaacactgaaccagtcctggactctgatggttcttacttcatgtacagcaagctgagagtggaaaagaagaactgggtggaaagaaatagctactcctgttcagtggtccacgagggtctgcacaatcaccacacgactaagagcttctcccggactccgggtaaatga
(SEQIDNO：31)
R84/PGN 311嵌合重链(氨基酸序列)QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGFDPEDGETIYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATGRSMVRGVIIPFNGMDVWGQGTTVTVSSRADAAPTVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
(SEQ ID NO：32)
R84/PGN 311嵌合轻链(核酸序列)
GATATCAGGATGACGCAGAGTCCAAGCTCTCTGTCTGCCTCTGTGGGGGACAGGGTGACTATTACTTGTCGGGCATCACAGAGTATCTCCAGCTACCTTAATTGGTACCAGCAAAAGCCCGGCAAAGCCCCCAAATTGCTGATTTACGCAGCCAGCTCCCTTCAGTCTGGCGTCCCTAGCCGCTTCTCCGGGAGCGGATCAGGCACAGACTTTACGTTGACAATCAGTTCTCTGCAGCCGGAGGATTTTGCCACTTACTACTGTCAACAGAGCTACAGTACGCCTCTCACGTTTGGCGGTGGGACAAAGGTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCGACTGTGTCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGT
(SEQ ID NO：33)
R84/PGN 311嵌合轻链(氨基酸序列)DIRMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
(SEQ ID NO：34)
实施例7：EJ173/112-Cl1(r84/PGN311)抑制VEGFR2介导的情形
A.r84/PGN311抑制通过VEGFR2的细胞信号传导细胞试验被用于确定所选择的抗体的细胞行为。VEGF刺激通过MAPK激酶途径的细胞内信号传导，其同样涉及两个被称为MAPK1和MAPK2蛋白的活化(通过磷酸化作用)，蛋白分别为44和42千道尔顿。这些蛋白的另外名字是Erk1和Erk2。抑制VEGF和VEGFR2的相互作用的抗体也能够抑制Erk1/2活化。
bEnd.3或PAE/KDR细胞系(分别从Philip Thorpe博士，UT-西南医学中心，达拉斯，德克萨斯和Johannes Waltenberger博士，乌尔姆大学医学中心，乌尔姆，德国处获得)在它们表面表达VEGFR2，使得它们被VEGF刺激。使细胞系缺少血清和生长因子培养48小时，然后通过添加含有或不含有4μg/ml IgG形式的候选物的10(V10)和50ng/mlVEGF165(V50)刺激。非刺激的细胞是阴性对照(NS)。在这次刺激后，在它们被溶解之前，用含有不同的磷酸酶抑制剂的冰冷的PBS清洗细胞。离心的细胞提取物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离的蛋白然后被印迹在硝酸纤维素膜上。印迹用抗磷酸化的Erk1/2抗体检测以监控Erk1/2磷酸化的抑制(图6)。同样检测总的Erk1/2作为细胞水平的内在对照。r84/PGN311 IgG克隆抑制了Erk1/2的磷酸化。
VEGF同样刺激了通过磷脂酶Cγ(PLC-γ)通道的细胞内的信号传导，其涉及155千道尔顿的蛋白的活化(通过磷酸化)。抑制VEGF和VEGFR2相互作用的抗体也能够抑制PLC-γ活化。
人类皮肤微血管内皮细胞系(HDMEC、Lonza、编号CC2810)在它们表面表达VEGFR2，使得它们被VEGF刺激。HDMEC使用6孔平板以每孔250,000个细胞覆盖。细胞被允许在5％FBS ECM(内皮细胞培养基)中被吸附过夜。然后使所述的细胞缺乏血清培养24小时，并通过添加含有抗体、阿瓦斯汀(贝伐单抗，Presta等，1997)、r84/PGN311、2C3(全部以IgG形式)或对照的IgG抗体(Synagis(帕利珠单抗)、人类抗RSV(MedImmune)的50ng/ml VEGF 165(+VEGF)被刺激。以90μg/ml使用IgG。非刺激细胞是阴性对照(NT)。阿瓦斯汀和r84/PGN311同样被添加至不含VEGF的细胞中。
在这次刺激后，在它们溶解前，用含有不同的磷酸酶抑制剂的冰冷的PBS清洗细胞。离心的细胞提取物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离的蛋白然后被转移至硝酸纤维素膜。印迹用抗磷酸化的Erk1/2抗体(图16A，pERK1/2)和抗磷酸化的PLC-γ抗体(图16A，pPLC-γ)检测以监控磷酸化的抑制。同样检测总的Erk1/2(图16A，ERK1/2)和PLC-γ(图16A，PLC-γ)作为细胞水平的内在对照。在HDMEC上的VEGFR2的表达用抗VEGFR2的抗体检测(图16A)。图16A显示了r84/PGN311 IgG抗体抑制Erk1/2和PLC-γ的磷酸化。
使用上面所述的相同的方法学，在未被处理或通过添加含有或不含有抗体、阿瓦斯汀或r84/PGN311(以IgG形式)的50ng/ml VEGF165被刺激之前，表达VEGFR1的PAE Flt1细胞以相同的方法处理和饥饿。制备印迹，然后用抗磷酸化的VEGFR1抗体检测(图16B，磷酸化VEGFR1)。同样检测总VEGFR1(图16B，总VEGFR1)作为细胞水平的内对照。图16B中的数据显示r84/PGN311并不抑制VEGFR1的磷酸化，但是阳性对照、阿瓦斯汀抑制VEGFR1的磷酸化。共同地，图16A和图16B确实了r84/PGN311选择性地抑制VEGFR2途径。
B.r84/PGN311阻止表达VEGFR2细胞的VEGF诱导的转移
如所期待的，同样确认r84/PGN311能够有效地抑制表达VEGFR2的内皮细胞的VEGF诱导的转移。这一活性的例子在图20A中显示对于表达HDMEC的细胞，和在图20B中显示对于表达PAE KDR的细胞。在每一个这些实验中，应当注意到r84明显抑制表达VEGFR2的细胞的VEGF诱导的转移并至少阿瓦斯汀也表现出。
使用表达VEGFR1的PAE Flt1细胞的比较研究显示r84不抑制表达VEGFR1的细胞的VEGF诱导的转移(图21)。相反地，阿瓦斯汀明显抑制表达VEGFR1的细胞的VEGF诱导的转移(图21)。
实施例8：EJ173/112-Cl1(r84/PGN311)结合VEGF121
测定EJ173/112-Cl1(r84/PGN311)scFv与生物学活性亚型的VEGF-A、VEGF121的结合(R&D系统HuVEGF121298-VS-005/CF)。2μg/ml无载体的VEGF121被覆盖在聚苯乙烯酶标板上。添加10μg/ml的纯化的scFv并用抗c-myc标签鼠单克隆抗体(Invitrogen)和HRP偶联的二级兔抗鼠抗体检测。
结果显示EJ173/112-Cl1(r84/PGN311)(图7)对于VEGF121是阳性的。B9鼠scFv对照识别VEGF121，但是比人类变异体处于一个较低的水平。
实施例9：EJ173/112-CI1(r84/PGN311)阻止VEGF结合VEGFR2而不是 VEGFR1
96孔ELISA板(BD Falcon，编号353279)用可溶的HuVEGFR1/Fc(R&D系统，编号321-FL-050，CF)或HuVEGFR2(R&D系统357-KD-050/CF)4℃下包被过夜，以每孔50μl的光敏处理缓冲液中1.0μg/ml的浓度。用清洗缓冲液(WB)(TBSt(Tris缓冲盐，0.1％吐温20))清洗孔，并在WB中20％Aquablock(East Coast Biologics，Inc.)在37℃下封闭1小时。50μl合适浓度的IgG或WB被添加至孔中，立即跟着终浓度100ng/ml的VEGF-生物素。平板在室温下孵育2个小时，清洗3次，并在室温下用每孔100μl的在WB中以1∶7500稀释的过氧化物酶偶联的抗生物素蛋白(JacksonImmuno Research)孵育1小时。在清洗平板4次后，用TMB显示信号，用酸停止并在450nM处读数。
这些实验的结果显示在图8A和图8B中。单独的VEGF(VEGF)或含有指示抗体的VEGF的信号被规格化为单独的VEGF(100％)。显示了平均值+/-SEM。N＝12(每一个处理4个同样的平板，一式三份)。少于50％的信号为认为是明显的结合抑制。
如图8A和图8B所示，这些对照研究的结果显示r84/PGN311充分地阻止VEGF与VEGFR2的相互作用，但是不充分阻止VEGF与VEGFR1的相互作用。使用r84/PGN311和阿瓦斯汀(贝伐单抗)(Presta等，1997)的平行研究证实了阿瓦斯汀的已知的性质，即充分地阻止VEGF与VEGFR2和VEGFR1的相互作用。此外，使用r84/PGN311和初始的鼠2C3抗体的平行研究显示充分阻止VEGF结合VEGFR2而不充分阻止VEGF结合VEGFR1的区别，r84甚至更强于2C3。这显示了r84比2C抗体另一个令人惊奇的优势。
实施例10：肿瘤相关的巨噬细胞表达VEGFR2
A.模型
通过注射1x106 MiaPaCa-2细胞至胰腺的尾部在无胸腺的裸鼠(7-9周)中建立原位肿瘤。在开始治疗之前，使肿瘤发展一周。
B.治疗
用对照抗体(C44)，或鼠2C3抗体通过腹腔注射三周，每周两次处理动物。死后，肿瘤被切除，剩余的胰腺被称重、快速冷冻或固定在甲基卡诺(methyl carnoys)中用于组织化学和免疫组织化学分析。
C.IHC
用于巨噬细胞标记物的抗体包括CD86、CD14和F4/80。使用VEGFR2抗体T014和RAFL-2。
D.腹膜的巨噬细胞分离
通过灭菌的腹腔灌洗分离荷瘤(TB)或非荷瘤(NTB)动物的巨噬细胞。
E.结果
令人惊讶地，发现肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)表达VEGFR2。这解释了2C3减少体内VEGFR2阳性的TAM浸润的观察现象。结果显示在图10A、B和C中。
在这点上，图10A描述了T014(VEGFR2抗体)和F4/80(巨噬细胞标记物)的共定位，F4/80在对照处理或2C3处理的动物的肿瘤切片上着色。2C3减少了巨噬细胞的浸润。但是，两个组都证明了VEGFR2和巨噬细胞标记物的共定位。对于三个不同的巨噬细胞标记物之一和VEGF2双阳性的细胞的数量在图10B中描述。在图10C中，来自荷瘤动物的腹膜巨噬细胞证明VEGF R2使用两个不同的抗体。
实施例11：在动物中r84/PGN311减小肿瘤体积
动物模型被用于显示r84/PGN311抗体的施用导致肿瘤体积的明显减小。
A.MDA-MB-231乳腺癌细胞肿瘤模型
将5百万个MDA-MB-231细胞注射至SCID鼠的乳腺脂肪垫中。在开始治疗前将肿瘤发展26天。在这个时候，动物被随机地指定为治疗组。100μl的盐(对照，n＝5)或在100μl的缓冲液中的250μg阿瓦斯汀IgG(n＝8)或r84/PGN311 IgG(n＝9)通过皮下注射给药，每周2次。结果显示在图11中，表现了平均肿瘤体积+/-SEM。阿瓦斯汀和r84处理的小鼠的肿瘤体积明显小于对照处理的动物。图12展示了每一个组中个体动物的肿瘤重量/体重。阿瓦斯汀和r84处理的小鼠具有的肿瘤/身体比例明显地小于对照处理的动物。图11和图12中的结果显示r84表现出实质上同阿瓦斯汀一样的有效。
B.A673横纹肌肉瘤肿瘤模型
将1.0x106 A-673细胞(人类横纹肌肉瘤细胞系-ATCC CRL-1598)皮下注射至22个nu/nu(NCI)小鼠中。小鼠被分成3组(对于2C3和r84/PGN311，n＝8/组，以及n＝6/对照组)，并且在肿瘤细胞注射(TCI)后5天开始治疗。治疗由每周2次腹腔注射50μg的指示的IgG组成。检测动物重量和肿瘤体积。对照抗体是Synagis(人类抗-RSV)。
小鼠在TCI后的第5至第29天之间接受8次注射治疗。图13显示TCI后第30天每组的肿瘤体积。单因素ANOVA显示这些组在统计学上的不同；此外，2C3和r84/PGN311与对照通过“Dunnett的多重比较实验”(p＜0.05)不同。从这些结果中很清楚地得出在每周2次注射50μg适度剂量时2C3和r84减少肿瘤生长。r84显示实质上与2C3一样的活性。这个动物研究的全部结论是2C3和r84有效控制A673肿瘤的生长。
C.人类非小细胞肺癌(NSCLC)模型
使用更多的体内动物模型以显示施用r84/PGN311抗体导致肿瘤生长的明显的减少。
在四个不同的人类非小细胞肺癌(NSCLC)，H1299(ATCCCRL-5803)、H460(ATCC HTB-177)、H358(ATCC CRL-5807)和A549(ATCC CCL-185)中检测r84/PGN311抑制体内肿瘤生长的能力。用2.5x106个细胞皮下注射SCID小鼠(每细胞系n＝25)，并且在TCI后1天开始治疗。治疗由每周两次腹膜内递送250μg的Synagis或XTL(阴性对照)、Avastin IgG(阳性对照)或500μg的r84/PGN311 IgG组成。治疗一直进行到杀死小鼠。40天后杀死H460小鼠，48天后杀死H1299小鼠，55天后杀死A549小鼠，83天后杀死H358小鼠。测量肿瘤重量，结果显示在图17A(H460)、图17B(H1299)、图17C(H358)和图17D(A549)，以平均肿瘤重量+/-SEM。治疗的肿瘤重量与对照的肿瘤重量的比例同样在图17A、图17B、图17C和图17D中显示(“T/C”)。
图17A、图17B、图17C和图17D显示了阿瓦斯汀和r84/PGN311处理的动物的肿瘤重量明显小于对照处理的动物。在H460(图17A)、H1299(图17B)和A549(图17D)模型中r84/PGN311比阿瓦斯汀表现得更好。在H358实验中(图17C)，r84/PGN311表现出至少与阿瓦斯汀一样有效。
D.Panc1胰腺癌细胞肿瘤模型
对荷胰腺癌细胞的小鼠，Panc1，提供r84/PGN311 IgG或者Synagis作为阴性对照。治疗一直持续到小鼠被杀死。测量肿瘤体积，结果显示在图22中。可以看出与对照相比r84/PGN311显著地减少Panc1肿瘤生长(图22)。
E.4T1乳腺癌模型
使用鼠嵌合形式的r84/PGN311的对照研究显示r84抗体能够延长荷同源4T1乳腺癌的小鼠的存活时间。如在图23中所示的，用鼠嵌合r84/PGN311的治疗导致鼠比对照处理的组中的动物存活更久。
实施例12：r84/PGN311减少微血管密度和肿瘤相关的巨噬细胞的浸润
从实施例11描述的在MDA-MB-231动物模型研究中使用的小鼠，以及用100μl缓冲液中的250μg 2C3 IgG根据相同的方法平行处理的小鼠中取出肿瘤。这些肿瘤被切片并用抗鼠内皮细胞(MECA-32)和巨噬细胞标记物(Mac-3)的抗体染色。分析来自对照动物的三个肿瘤和来自r84/PGN311和2C3处理的动物的每一个的三个肿瘤并研究每一个肿瘤的5张图像。这些结果显示在图14和图15中，显示了来自r84和2C3处理的动物的肿瘤显示了明显地降低的血管数量/高倍视野(MECA-32，p＜0.0001，图15)和明显降低的巨噬细胞标记物(Mac-3，对于r84p＜0.01，图14)的表达。这是r84明显降低微血管密度和肿瘤相关的巨噬细胞浸润性的证据，以及在降低肿瘤相关的巨噬细胞的浸润性方面r84比2C3具有更明显的效果的证据。
实施例13：r84/PGN311对肿瘤浸润性细胞(细胞浸润肿瘤)的影响
A.多形核白细胞
从实施例11描述的在MDA-MB-231动物模型研究中使用的小鼠，以及用100μl缓冲液中的250μg 2C3 IgG根据相同的方法平行处理的小鼠中取出肿瘤。
研究已经显示，与对照相比，来自r84和2C3处理的动物的肿瘤具有明显增加的多形核白细胞(PMN)浸润性。这一影响对于r84和2C3抗体是统计学上显著的。尽管与对照相比阿瓦斯汀(贝伐单抗)同样增加了PMN至MDA-MB-231肿瘤的浸润性，与r84和2C3形成对比，阿瓦斯汀的增加不是统计学上显著的。
B.CD11b+/Gr1+细胞
在荷MDA-MB-231肿瘤的小鼠中的进一步研究已经显示，与对照相反，在r84处理的动物中明显少的CD11b/Gr1双阳性细胞浸润肿瘤。在比较研究中，2C3抗体或阿瓦斯汀都没有显示CD11b+/Gr1+浸润的统计学显著的减少，尽管一些减少在阿瓦斯汀处理的动物中是可测量的。
从实施例11描述的在MDA-MB-231动物模型研究中使用的小鼠，以及用100μl缓冲液中的250μg 2C3 IgG根据相同的方法平行处理的小鼠中取出肿瘤。
研究已经显示，与对照相反，在r84处理的动物中，明显少的CD11b+/Gr1+双阳性细胞浸润肿瘤(如通过ANOVA评定的，p＜0.01在图25中以**显示)。双阳性细胞数量的减少量是39％。在比较研究中，2C3没有显示在CD11b+/Gr1+浸润中的统计学显著的降低(图25)。
髓源性抑制细胞CD11b+/Gr1+降低的浸润性是特别有意义，由于所述的表达两个标记物的细胞目前已经与抗VEGF治疗的肿瘤复发的调节联系在一起(Shojaei等，2007)。髓源性抑制细胞(CD11b+/Gr1+)同样是肿瘤进程的重要贡献者。在肿瘤微环境中，这些细胞分泌免疫抑制调节物并诱导T淋巴细胞紊乱(Gabrilovich等，2001；Serafini等，2004)。
由于在r84处理的动物中，CD11b+/Gr1+细胞的肿瘤浸润是最不显著/明显较低的，它说明了用r84的治疗比用其它靶向VEGF的药物的治疗相比，较少地倾向于耐药性的发展或抗VEGF治疗的复发。
减少CD11b+/Gr1+细胞浸润至肿瘤的能力因此是由r84/PGN311抗体显示的进一步有利的性质和具有r84/PGN311的治疗应用的潜在重要性的性质。此外，这个性质没有由2C3抗体显示，并由阿瓦斯汀显示仅在一个更加降低的水平。
实施例14：r84/PGN311降低肿瘤中的淋巴管密度
患有MDA-MB-231肿瘤的小鼠用r84/PGN311或对照抗体处理，分析肿瘤切片以显示肿瘤中的淋巴管。所述结果在图18A、图18B和图18C中提出，显示了在r84处理的肿瘤中淋巴管密度明显低于对照肿瘤中。
特别地，首先完成冷冻的MDA-MB-231肿瘤切片的免疫荧光染色以通过淋巴管标记物，podoplanin和Prox1鉴别淋巴管。这些结果在图18A中列出，显示了podoplanin(绿色)、Prox1(红色)和融合的图像，因此鉴别对照中(上面板块)和r84处理的肿瘤(下面板块)中的淋巴管。LYVE-1染色同样在连续的MDA-MB-231肿瘤切片中进行。如在图18B中所显示的，这些结果显示LYVE-1染色的MDA-MB-231肿瘤切片中的淋巴管的图案与对于podoplanin和Prox1观察到的相似(图18A)。
为测定在对照和r84处理的肿瘤中的淋巴管密度是否不同，每一个LYVE-1染色的肿瘤切片的整个区域以低倍率检查并使用NIS-Elements成像软件测定每一视野的LYVE-1阳性区域的百分比。具有最高的LYVE-1阳性百分比区域的10个视野一起平均以产生对于每一个肿瘤的最终分值，并通过未配对的student′s t-检验检测组平均值的显著性。如在图18C中所描述的，对照肿瘤的LYVE-1阳性区域的百分比(7.03±1.013；n＝6)明显高于r84处理的肿瘤(2.23±0.986；n＝5)，P＝0.0042。这些结果显示用r84/PGN311的治疗明显降低淋巴管密度，因此支持本发明的人类抗体抑制淋巴管新生的作用。
实施例15：在小鼠中r84/PGN311的慢性施用不诱导毒性
非荷瘤和荷瘤小鼠使用在这些研究中。
将5x106个Panc-1细胞(人类胰腺癌细胞系，ATCC CRL-1469)注射至10只SCID小鼠中。在TCI后第一天，5只荷瘤小鼠和5只非荷瘤小鼠被腹腔注射500μg的Synagis或r84/PGN311 IgG。每周注射2次，持续12周，然后小鼠被杀死。杀死的时候，取血并分析标准的血液化学。同样获取肝、肾和甲状腺用于组织学评估。
这些分析显示在通过H&E染色检测的任何组织的组织学中没有明显的变化(这一检查通过病理学者以盲方式实现，所述病理学者擅长鼠组织学)。此外，对22种不同的分析物分析血液化学，在对照、未用药鼠或r84处理的动物之间没有发现明显的变化。
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虽然本发明的组合物和方法已经根据优选的实施方式描述，但是本领域技术人员将很清楚可以对本文描述的组合物、方法和方法中的步骤或方法中的步骤顺序上进行变化而不背离本发明的概念、实质和范围。更明确地，显然一些化学和生理学有关的试剂将取代本文描述的试剂，而可能取得相同或相似的结果。对本领技术人员很明显的所有这样相似的取代和修改被认为是在如所附的权利要求中描述的本发明的实质、范围和概念之内。
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Ziche，Donnini，Morbidelli，Parenti，Gasparini，Ledda，″Linomide blocksangiogenesis by breast carcinoma vascular endothelial growth factortransfectants，″Br.J.Cancer，77(7)：1123-1129，1998.
Zou，Anisowicz，Hendrix，Thor，Neveu，Sheng，Rafidi，Seftor，Sager，″Maspin，aserpin with tumor-suppressing activity in human mammary epithelial cells″，Science，28：263(5146)：526-9，1994.
序列表
<110>奥菲技术科学院
派瑞格恩医药公司
<120>抗VEGF抗体的组合物和方法
<130>FP1V100312ZX/UKDE/MY
<140>PCT/GB2008/003745
<141>2008-11-07
<150>US 60/987,015，
<151>2007-11-09
<150>US 61/108,023，
<151>2008-10-24
<150>US 61/106,047，
<151>2008-10-16
<160>34
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>378
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>抗体VH区
<400>1
caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc     60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc    120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggt tttgatcctg aagatggtga aacaatctac    180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctacaga cacagcctac    240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aacaggacgt    300
tctatggttc ggggagtcat tatacctttt aacggtatgg acgtctgggg ccaagggacc    360
acggtcaccg tctcctca                                                  378
<210>2
<211>321
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>抗体VL区
<400>2
gacatccgga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc     60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca    120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca    180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct    240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta ccccgctcac tttcggcgga    300
gggaccaagg tggagatcaa a                                            321
<210>3
<211>126
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体VH区
<400>3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Thr Gly Arg Ser Met Val Arg Gly Val Ile Ile Pro Phe Asn Gly
            100                 105                 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>4
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体VL区
<400>4
Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>5
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体VH CDR1
<400>5
Ser Tyr Ala Ile Ser
1               5
<210>6
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体VH CDR2
<400>6
Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>7
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体VH CDR3
<400>7
Gly Arg Ser Met Val Arg Gly Val Ile Ile Pro Phe Asn Gly Met Asp
1               5                   10                  15
Val
<210>8
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体VL CDR1
<400>8
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210>9
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体VL CDR2
<400>9
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1               5
<210>10
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体VL CDR3
<400>10
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
1               5
<210>11
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体VH FR1
<400>11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser
            20                  25                  30
<210>12
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体VH FR2
<400>12
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1               5                   10
<210>13
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体VH FR3
<400>13
Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr Met Glu
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr
            20                  25                  30
<210>14
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体VH FR4
<400>14
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>15
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体VL FR1
<400>15
Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
            20
<210>16
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体VL FR2
<400>16
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>17
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体VL FR3
<400>17
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
            20                  25                  30
<210>18
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体VL FR4
<400>18
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1               5                   10
<210>19
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>连接物
<400>19
Lys Leu Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe
1               5                   10                  15
Ser Glu Ala Arg Val
            20
<210>20
<211>762
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>完整的scFv克隆
<400>20
caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc     60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc    120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggt tttgatcctg aagatggtga aacaatctac    180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctacaga cacagcctac    240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aacaggacgt    300
tctatggttc ggggagtcat tatacctttt aacggtatgg acgtctgggg ccaagggacc    360
acggtcaccg tctcctcaaa gctttcaggg agtgcatccg ccccaaaact tgaagaaggt    420
gaattttcag aagcacgcgt agacatccgg atgacccagt ctccatcctc cctgtctgca    480
tctgtaggag acagagtcac catcacttgc cgggcaagtc agagcattag cagctattta    540
aattggtatc agcagaaacc agggaaagcc cctaagctcc tgatctatgc tgcatccagt    600
ttgcaaagtg gggtcccatc aaggttcagt ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc    660
accatcagca gtctgcaacc tgaagatttt gcaacttact actgtcaaca gagttacagt    720
accccgctca ctttcggcgg agggaccaag gtggagatca aa                       762
<210>21
<211>254
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>完整的scFv克隆
<400>21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Thr Gly Arg Ser Met Val Arg Gly Val Ile Ile Pro Phe Asn Gly
            100                 105                 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Lys Leu
        115                 120                 125
Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu
    130                 135                 140
Ala Arg Val Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
145                 150                 155                 160
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile
                165                 170                 175
Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
            180                 185                 190
Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg
        195                 200                 205
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
    210                 215                 220
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser
225                 230                 235                 240
Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
                245                 250
<210>22
<211>1977
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IgG重链
<400>22
caggtacagc ttgtgcagtc cggagccgag gtgaagaaac ccggagcatc agtgaaggtt     60
agctgcaagg catctggtgg gacattttcc tcctatgcca tctcctgggt tcggcaggct    120
cccggacagg gcctggagtg gatggggggg ttcgatcccg aagacggaga gaccatttac    180
gcacagaagt ttcagggtcg cgtgaccatg accgaggata cttctaccga cacagcatat    240
atggagctca gtagcttgcg ctccgaggac acggctgtat attactgtgc cactggacgg    300
agcatggtgc gcggggtaat catccctttc aacgggatgg atgtatgggg ccaagggacc    360
accgtgacag tcagctctgc ctccaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc    420
tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc    480
gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg    540
gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc    600
agcttgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg    660
gacaagaaag ttggtgagag gccagcacag ggagggaggg tgtctgctgg aagccaggct    720
cagcgctcct gcctggacgc atcccggcta tgcagcccca gtccagggca gcaaggcagg    780
ccccgtctgc ctcttcaccc ggaggcctct gcccgcccca ctcatgctca gggagagggt    840
cttctggctt tttccccagg ctctgggcag gcacaggcta ggtgccccta acccaggccc    900
tgcacacaaa ggggcaggtg ctgggctcag acctgccaag agccatatcc gggaggaccc    960
tgcccctgac ctaagcccac cccaaaggcc aaactctcca ctccctcagc tcggacacct   1020
tctctcctcc cagattccag taactcccaa tcttctctct gcagagccca aatcttgtga   1080
caaaactcac acatgcccac cgtgcccagg taagccagcc caggcctcgc cctccagctc   1140
aaggcgggac aggtgcccta gagtagcctg catccaggga caggccccag ccgggtgctg   1200
acacgtccac ctccatctct tcctcagcac ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc   1260
tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg   1320
tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg   1380
tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg   1440
tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca   1500
aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaaggtg   1560
ggacccgtgg ggtgcgaggg ccacatggac agaggccggc tcggcccacc ctctgccctg   1620
agagtgaccg ctgtaccaac ctctgtccct acagggcagc cccgagaacc acaggtgtac   1680
accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc   1740
aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac   1800
aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag   1860
ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat   1920
gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatag      1977
<210>23
<211>645
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IgG轻链
<400>23
gacattcgga tgactcagtc tccctcctct ttgagcgctt ctgtgggcga tagggttact     60
atcacttgtc gagcctctca atccatcagc tcctacttga actggtacca gcagaaaccc    120
gggaaagcac ccaagctgct tatttacgcc gcctcctccc tgcaatccgg agtgccctcc    180
cggttcagcg gctccggctc tggaacagac tttaccctga ccatttcttc tttgcagcct    240
gaggattttg ctacttacta ctgtcagcag agttactcca cccctttgac attcggtggt    300
ggaacgaaag tagaaattaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca    360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat    420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag    480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg    540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc    600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag                     645
<210>24
<211>456
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IgG重链
<400>24
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Thr Gly Arg Ser Met Val Arg Gly Val Ile Ile Pro Phe Asn Gly
            100                 105                 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
        115                 120                 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
    130                 135                 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145                 150                 155                 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
                165                 170                 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
            180                 185                 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
        195                 200                 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
    210                 215                 220
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225                 230                 235                 240
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
                245                 250                 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
            260                 265                 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
        275                 280                 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
    290                 295                 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305                 310                 315                 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
                325                 330                 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
            340                 345                 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
        355                 360                 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
    370                 375                 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385                 390                 395                 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
                405                 410                 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
            420                 425                 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
        435                 440                 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    450                 455
<210>25
<211>214
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IgG轻链
<400>25
Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
            20                 25                 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210>26
<211>378
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IgG VH区
<400>26
caggtacagc ttgtgcagtc cggagccgag gtgaagaaac ccggagcatc agtgaaggtt     60
agctgcaagg catctggtgg gacattttcc tcctatgcca tctcctgggt tcggcaggct    120
cccggacagg gcctggagtg gatggggggg ttcgatcccg aagacggaga gaccatttac    180
gcacagaagt ttcagggtcg cgtgaccatg accgaggata cttctaccga cacagcatat    240
atggagctca gtagcttgcg ctccgaggac acggctgtat attactgtgc cactggacgg    300
agcatggtgc gcggggtaat catccctttc aacgggatgg atgtatgggg ccaagggacc    360
accgtgacag tcagctct                                                  378
<210>27
<211>321
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IgG VL区
<400>27
gacattcgga tgactcagtc tccctcctct ttgagcgctt ctgtgggcga tagggttact     60
atcacttgtc gagcctctca atccatcagc tcctacttga actggtacca gcagaaaccc    120
gggaaagcac ccaagctgct tatttacgcc gcctcctccc tgcaatccgg agtgccctcc    180
cggttcagcg gctccggctc tggaacagac tttaccctga ccatttcttc tttgcagcct    240
gaggattttg ctacttacta ctgtcagcag agttactcca cccctttgac attcggtggt    300
ggaacgaaag tagaaattaa g                                              321
<210>28
<211>78
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>c-myc和组氨酸标签
<400>28
gcggccgctg gatccgaaca aaagctgatc tcagaagaag acctaaactc acatcaccat     60
caccatcact aatctaga                                                   78
<210>29
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>c-myc和组氨酸标签
<220>
<221>c-myc抗原表位标签
<222>(6)..(15)
<220>
<221>组氨酸抗原表位标签
<222>(18)..(23)
<400>29
Ala Ala Ala Gly Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn
1               5                   10                  15
Ser His His His His His His
            20
<210>30
<211>778
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>完整的scFv克隆包含NcoI和NotI限制性位点
<400>30
ccatggccca ggtgcagctg gtgcaatctg gggctgaggt gaagaagcct ggggcctcag     60
tgaaggtctc ctgcaaggct tctggaggca ccttcagcag ctatgctatc agctgggtgc    120
gacaggcccc tggacaaggg cttgagtgga tgggaggttt tgatcctgaa gatggtgaaa    180
caatctacgc acagaagttc cagggcagag tcaccatgac cgaggacaca tctacagaca    240
cagcctacat ggagctgagc agcctgagat ctgaggacac ggccgtgtat tactgtgcaa    300
caggacgttc tatggttcgg ggagtcatta taccttttaa cggtatggac gtctggggcc    360
aagggaccac ggtcaccgtc tcctcaaagc tttcagggag tgcatccgcc ccaaaacttg    420
aagaaggtga attttcagaa gcacgcgtag acatccggat gacccagtct ccatcctccc    480
tgtctgcatc tgtaggagac agagtcacca tcacttgccg ggcaagtcag agcattagca    540
gctatttaaa ttggtatcag cagaaaccag ggaaagcccc taagctcctg atctatgctg    600
catccagttt gcaaagtggg gtcccatcaa ggttcagtgg cagtggatct gggacagatt    660
tcactctcac catcagcagt ctgcaacctg aagattttgc aacttactac tgtcaacaga    720
gttacagtac cccgctcact ttcggcggag ggaccaaggt ggagatcaaa gcggccgc      778
<210>31
<211>1368
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合的重链
<400>31
caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc     60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc    120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggt tttgatcctg aagatggtga aacaatctac    180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctacaga cacagcctac    240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aacaggacgt    300
tctatggttc ggggagtcat tatacctttt aacggtatgg acgtctgggg ccaagggacc    360
acggtcaccg tctcctcacg cgccgatgct gcaccgactg tctatccact ggcccctgtg    420
tgtggagata caactggctc ctcggtgact ctaggatgcc tggtcaaggg ttatttccct    480
gagccagtga ccttgacctg gaactctgga tccctgtcca gtggtgtgca caccttccca    540
gctgtcctgc agtctgacct ctacaccctc agcagctcag tgactgtaac ctcgagcacc    600
tggcccagcc agtccatcac ctgcaatgtg gcccacccgg caagcagcac caaggtggac    660
aagaaagagc ccagagggcc cacaatcaag ccctgtcctc catgcaaatg cccagcacct    720
aacctcttgg gtggaccatc cgtcttcatc ttccctccaa agatcaagga tgtactcatg    780
atctccctga gccccatagt cacatgtgtg gtggtggatg tgagcgagga tgacccagat    840
gtccagatca gctggtttgt gaacaacgtg gaagtacaca cagctcagac acaaacccat    900
agagaggatt acaacagtac tctccgggtg gtcagtgccc tccccatcca gcaccaggac    960
tggatgagtg gcaaggagtt caaatgcaag gtcaacaaca aagacctccc agcgcccatc   1020
gagagaacca tctcaaaacc caaagggtca gtaagagctc cacaggtata tgtcttgcct   1080
ccaccagaag aagagatgac taagaaacag gtcactctga cctgcatggt cacagacttc   1140
atgcctgaag acatttacgt ggagtggacc aacaacggga aaacagagct aaactacaag   1200
aacactgaac cagtcctgga ctctgatggt tcttacttca tgtacagcaa gctgagagtg   1260
gaaaagaaga actgggtgga aagaaatagc tactcctgtt cagtggtcca cgagggtctg   1320
cacaatcacc acacgactaa gagcttctcc cggactccgg gtaaatga                1368
<210>32
<211>455
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合的重链
<400>32
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Thr Gly Arg Ser Met Val Arg Gly Val Ile Ile Pro Phe Asn Gly
            100                 105                 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Arg Ala
        115                 120                 125
Asp Ala Ala Pro Thr Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr
    130                 135                 140
Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro
145                 150                 155                 160
Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val
                165                 170                 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser
            180                 185                 190
Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys
        195                 200                 205
Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Glu Pro
    210                 215                 220
Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro
225                 230                 235                 240
Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys
                245                 250                 255
Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val
            260                 265                 270
Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn
        275                 280                 285
Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr
    290                 295                 300
Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp
305                 310                 315                 320
Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu
                325                 330                 335
Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg
            340                 345                 350
Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys
        355                 360                 365
Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp
    370                 375                 380
Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys
385                 390                 395                 400
Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser
                405                 410                 415
Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser
            420                 425                 430
Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser
        435                 440                 445
Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
    450                 455
<210>33
<211>642
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合的轻链
<400>33
gatatcagga tgacgcagag tccaagctct ctgtctgcct ctgtggggga cagggtgact     60
attacttgtc gggcatcaca gagtatctcc agctacctta attggtacca gcaaaagccc    120
ggcaaagccc ccaaattgct gatttacgca gccagctccc ttcagtctgg cgtccctagc    180
cgcttctccg ggagcggatc aggcacagac tttacgttga caatcagttc tctgcagccg    240
gaggattttg ccacttacta ctgtcaacag agctacagta cgcctctcac gtttggcggt    300
gggacaaagg tggaaatcaa acgggctgat gctgcaccga ctgtgtccat cttcccacca    360
tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac    420
cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg    480
aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg    540
ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca    600
tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gt                       642
<210>34
<211>214
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合的轻链
<400>34
Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
        115                 120                 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
    130                 135                 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145                 150                 155                 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
            180                 185                 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
    210

Claims (60)

1.一种分离的抗体，结合VEGF并包括至少1个包括3个CDR的重链可变区和至少1个包括3个CDR的轻链可变区，其特征在于，所述轻链可变区包括：
(a)具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的可变轻链(VL)CDR1，
(b)具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的VLCDR2，和
(c)具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的VL CDR3，
其中所述基本上一致的序列是与给出的CDR序列相比含有1、2或3个氨基酸取代的序列，或其中所述基本上一致的序列是含有给出的CDR序列的保守氨基酸取代的序列。
2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，1个或多个所述重链可变区CDR选自由
(a)具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的可变重链(VH)CDR1，
(b)具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的VHCDR2，和
(c)具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的VHCDR3组成的组，
其中所述基本上一致的序列是与给出的CDR序列相比含有1、2或3个氨基酸取代的序列，或其中所述基本上一致的序列是含有给出的CDR序列的保守氨基酸取代的序列。
3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，2个或多个所述重链可变区CDR选自由
(a)具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的可变重链(VH)CDR1，
(b)具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的VHCDR2，和
(c)具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的VHCDR3组成的组，
其中所述基本上一致的序列是与给出的CDR序列相比含有1、2或3个氨基酸取代的序列，或其中所述基本上一致的序列是含有给出的CDR序列的保守氨基酸取代的序列。
4.根据权利要求3所述的抗体，其特征在于，3个所述重链可变区CDR选自由
(a)具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的可变重链(VH)CDR1，
(b)具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的VHCDR2，和
(c)具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的VHCDR3组成的组，
其中所述基本上一致的序列是与给出的CDR序列相比含有1、2或3个氨基酸取代的序列，或其中所述基本上一致的序列是含有给出的CDR序列的保守氨基酸取代的序列。
5.根据权利要求1-4任何一项所述的抗体，其特征在于，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或与其具有至少80％序列同源性的序列。
6.根据权利要求1-5任何一项所述的抗体，其特征在于，所述重链可变区具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列，或与其具有至少80％序列同源性的序列。
7.根据权利要求1-6任何一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体包括SEQ ID NO：21的氨基酸序列，或与其具有至少80％序列同源性的序列。
8.根据权利要求1-7任何一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体是完全人类抗体。
9.根据权利要求1-8任何一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体是含有抗体恒定区的完整的抗体。
10.根据权利要求9所述的抗体，其特征在于，所述抗体是IgG抗体。
11.根据权利要求9或权利要求10所述的抗体，其特征在于，所述抗体包括具有SEQ ID NO：24的氨基酸序列或与其具有至少80％序列同源性的序列的重链和具有SEQ ID NO：25的氨基酸序列或与其具有至少80％序列同源性的序列的轻链。
12.根据权利要求1-8任何一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体是抗体的抗原结合片段。
13.根据权利要求12所述的抗体，其特征在于，所述抗体的所述抗原结合片段是Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv、Fv、dsFv、ds-scFv、Fd、DAB、TandAb二聚物、线形抗体、微抗体、双链抗体或双特异性抗体片段。
14.根据权利要求1-8任何一项所述的抗体，其特征在于，当所述抗体是以IgG形式时，所述抗体对VEGF具有的结合亲合力相应于Kd小于10nM。
15.根据权利要求1-14任何一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体被连接至至少第一种诊断或治疗试剂。
16.根据权利要求15所述的抗体，其特征在于，所述抗体被连接至至少第一种放射治疗试剂、化学治疗试剂、抗血管新生试剂、诱导细胞凋亡试剂、抗微管蛋白药物、抗细胞或细胞毒素试剂、类固醇、细胞因子、趋化因子或凝血剂。
17.根据权利要求15所述的抗体，其特征在于，所述抗体被连接至：
(a)放射性同位素砷；
(b)紫杉醇、多烯紫杉醇、紫杉醇、顺铂、吉西他滨、考布他汀、阿霉素或阿霉素；
(c)蓖麻蛋白、白树毒素、相思豆毒素、白喉、假单胞菌或百日咳毒素；
(d)V-型ATP酶抑制剂；
(e)IL-2、IL-12、TNF-α、干扰素或LEC；或
(f)截短的组织因子。
18.一种分离的抗体，结合VEGF并明显地抑制VEGF结合VEGF受体VEGFR2(KDR/Flk-1)而不明显抑制VEGF结合VEGF受体VEGFR1(Flt-1)；其特征在于，所述抗体包括至少1个包括3个CDR的重链可变区和至少1个包括3个CDR的轻链可变区，其中所述轻链可变区包括：
(a)具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的VLCDR1，
(b)具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的VLCDR2，和
(c)具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的VL CDR3，
其中所述基本上一致的序列是与给出的CDR序列相比含有1、2或3个氨基酸取代的序列，或其中所述基本上一致的序列是含有给出的CDR序列的保守氨基酸取代的序列。
19.一种分离的抗体，结合VEGF，并且当所述抗体是以IgG形式时，该抗体对VEGF具有的结合亲合力相应于Kd小于10nM；其特征在于，所述抗体包括至少1个包括3个CDR的重链可变区和至少1个包括3个CDR的轻链可变区，其中所述轻链可变区包括：
(a)具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的VLCDR1，
(b)具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的VLCDR2，和
(c)具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的VL CDR3，
其中所述基本上一致的序列是与给出的CDR序列相比含有1、2或3个氨基酸取代的序列，或其中所述基本上一致的序列是含有给出的CDR序列的保守氨基酸取代的序列。
20.一种分离的抗体，结合至少人类VEGF和鼠VEGF，其特征在于，所述抗体包括至少1个包括3个CDR的重链可变区和至少1个包括3个CDR的轻链可变区，其中所述轻链可变区包括：
(a)具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的VLCDR1，
(b)具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的VLCDR2，和
(c)具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列或与其基本上一致的序列的VL CDR3，
其中所述基本上一致的序列是与给出的CDR序列相比含有1、2或3个氨基酸取代的序列，或其中所述基本上一致的序列是含有给出的CDR序列的保守氨基酸取代的序列。
21.一种免疫偶联物，包括连接至至少第一种治疗或诊断试剂的权利要求1-20任何一项所述的抗体。
22.一种组合物，包括根据权利要求1-20任何一项所述的至少第一种抗体或它们的免疫偶联物。
23.根据权利要求22所述的组合物，其特征在于，所述组合物是制药学上可接受的组合物。
24.根据权利要求22或权利要求23所述的组合物，其特征在于，所述组合物进一步包括至少第二种治疗试剂。
25.一种核酸分子，包括编码权利要求1-20任何一项所述的抗体的核苷酸序列区。
26.根据权利要求25所述的核酸分子，其特征在于，所述核苷酸序列区编码具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列或与其具有至少80％序列同源性的序列的抗体。
27.根据权利要求26所述的的核酸分子，其特征在于，所述核苷酸序列区具有SEQ ID NO：20的核苷酸序列。
28.根据权利要求25所述的核酸分子，其特征在于，所述核苷酸序列区编码抗体，所述抗体包括具有SEQ ID NO：24的氨基酸序列或与其具有至少80％序列同源性的序列的重链和具有SEQ ID NO：25的氨基酸序列或与其具有至少80％序列同源性的序列的轻链。
29.根据权利要求28所述的核酸分子，其特征在于，所述编码SEQID NO：24的核苷酸序列区具有SEQ ID NO：22的核苷酸序列以及所述编码SEQ ID NO：25的核苷酸序列区具有SEQ ID NO：23的核苷酸序列。
30.一种表达载体，包括权利要求25-29任何一项所述的核酸分子。
31.一种宿主细胞，包括权利要求25-29任何一项所述的核酸分子或权利要求30所述的表达载体。
32.一种病毒，包括权利要求25-29任何一项所述的核酸分子或权利要求30所述的表达载体。
33.一种试剂盒，在至少第一个容器中包括：
(a)权利要求1-20任何一项所述的抗体；
(b)权利要求21所述的免疫偶联物；
(c)权利要求22-24任何一项所述的组合物；
(d)权利要求25-29任何一项所述的核酸分子；
(e)权利要求30所述的表达载体；
(f)权利要求31所述的宿主细胞；或
(g)权利要求32所述的病毒。
34.一种制备抗体的方法，包括：
(a)在有效表达编码的抗体的条件下培养包括权利要求30所述的表达载体的宿主细胞；和
(b)从所述宿主细胞中获得表达的载体。
35.一种结合VEGF的方法，包括用权利要求1-20任何一项所述的抗体或它们的免疫偶联物接触包括VEGF的组合物。
36.一种检测VEGF的方法，包括在有效允许VEGF/抗体复合物形成的条件下，用权利要求1-20任何一项所述的抗体或它们的免疫偶联物接触怀疑含有VEGF的组合物，并检测所形成的复合物。
37.一种诊断动物中与血管新生相关的疾病的方法，包括：
(a)在有效允许VEGF/抗体复合物形成的条件下，用权利要求1-20任何一项所述的抗体或它们的免疫偶联物接触所述动物的检测样品；
(b)检测所形成的VEGF/抗体复合物，从而测定所述检测样品中的VEGF的量；以及
(c)比较所述检测样品中的VEGF的量和相应对照样品中的VEGF的量，其中相比于所述对照样品中的VEGF的量，所述检测样品中VEGF的增加的量预示与血管新生相关的疾病。
38.根据权利要求37所述的方法，其特征在于，所述检测样品从所述动物中分离并与所述抗体或免疫偶联物在体外接触。
39.根据权利要求37所述的方法，其特征在于，对所述动物施用所述抗体或免疫偶联物，从而在体内接触所述检测样品。
40.根据权利要求37-39任何一项所述的方法，其特征在于，所述与血管新生相关的疾病是癌症。
41.一种抑制血管新生或淋巴管新生的方法，包括对动物施用有效量的权利要求1-20任何一项所述的抗体或它们的免疫偶联物以抑制在所述动物中的血管新生或淋巴管新生。
42.根据权利要求41所述的方法，其特征在于，所述动物患有癌症或眼新生血管性疾病。
43.根据权利要求41或权利要求42所述的方法，其特征在于，所述动物是人类个体。
44.一种用于治疗与血管新生相关的疾病的方法，包括对患有所述疾病的动物施用治疗上有效量的权利要求1-20任何一项所述的抗体或它们的免疫偶联物。
45.根据权利要求44所述的方法，其特征在于，所述动物患有眼新生血管性疾病、黄斑变性、年龄相关性黄斑变性、关节炎、风湿性关节炎、动脉硬化症、糖尿病视网膜病、甲状腺增生、甲亢、血管瘤、新生血管性青光眼或牛皮癣。
46.根据权利要求44所述的方法，其特征在于，所述动物患有癌症。
47.根据权利要求44-46任何一项所述的方法，进一步包括对所述动物施用第二种治疗试剂。
48.根据权利要求44-47任何一项所述的方法，其特征在于，所述动物是人类个体。
49.一种用于治疗与淋巴管新生相关的疾病的方法，包括对患有所述疾病的动物施用治疗上有效量的权利要求1-20任何一项所述的抗体或它们的免疫偶联物。
50.根据权利要求49所述的方法，其特征在于，所述动物患有癌症。
51.根据权利要求49或权利要求50所述的方法，其特征在于，所述动物是人类个体。
52.权利要求1-20任何一项所述的抗体或它们的免疫偶联物用于治疗或诊断。
53.权利要求52所述的抗体或免疫偶联物用于治疗或诊断与血管新生或淋巴管新生相关的疾病。
54.权利要求52或权利要求53所述的抗体或免疫偶联物用于治疗或诊断选自由癌症、眼新生血管性疾病、黄斑变性、年龄相关性黄斑变性、关节炎、风湿性关节炎、动脉硬化症、糖尿病视网膜病、甲状腺增生、甲亢、血管瘤、新生血管性青光眼和牛皮癣组成的组的疾病。
55.权利要求52-54任何一项所述的免疫偶联物的抗体用于治疗和诊断，进一步包括第二种治疗试剂的应用。
56.权利要求52-55任何一项所述的免疫偶联物的抗体，其特征在于，所述治疗或诊断在人类个体中实行。
57.权利要求1-20任何一项所述的抗体或它们的免疫偶联物在制备通过抑制血管新生或淋巴管新生治疗疾病的药物中的应用。
58.根据权利要求57所述的应用，其特征在于，所述疾病选择由癌症、眼新生血管性疾病、黄斑变性、年龄相关性黄斑变性、关节炎、风湿性关节炎、动脉硬化症、糖尿病视网膜病、甲状腺增生、甲亢、血管瘤、新生血管性青光眼和牛皮癣组成的组。
59.根据权利要求57或权利要求58所述的应用，进一步包括第二种治疗试剂的应用。
60.根据权利要求57-59任何一项所述的应用，其特征在于，所述治疗在人类个体上实现。
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