CN107537036A - 一种抗人血管内皮生长因子单克隆抗体的药物制剂及其应用 - Google Patents
一种抗人血管内皮生长因子单克隆抗体的药物制剂及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种含有抗人血管内皮生长因子单克隆抗体的药物制剂及其应用。所述制剂包括：2‑200mg/ml抗人血管内皮生长因子单克隆抗体；5‑80μmol/ml pH缓冲液；2.5‑120mg/ml保护剂；0.03‑1.2mg/ml表面活性剂。本发明公开的药物制剂可用于治疗多种疾病，尤其是眼底新生血管病变，如年龄相关性黄斑变性（AMD）、糖尿病黄斑水肿（DME）、病理性近视（PM）、视网膜静脉阻塞（RVO）、近视性脉络膜新生血管（mCNV）等。
Description
技术领域
本发明属于生物药物领域，涉及一种含有抗人血管内皮生长因子单克隆抗体的药物制剂及其应用。
背景技术
血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是一种高度特异的生长因子，具有促进内皮细胞有丝分裂、促进血管生成、增加血管内皮通透性，保护神经等功能。VEGF广泛分布于人体的脑、肾、肝、眼等组织器官，其中眼部的视网膜周细胞、色素上皮细胞、内皮细胞、神经节细胞等均可表达VEGF。
VEGF过量表达可引起新生血管的异常增生，从而导致多种疾病，如肿瘤、眼部新生血管增生性疾病，其中眼部新生血管增生性疾病包括年龄相关性黄斑变性（age-relatedmacular degeneration, AMD）、糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy, DR）、新生血管性青光眼（neovascular glaucoma, NVG）等。目前已有多种针对VEGF的药物研发和应用，其中开发较为成功的是VEGF单克隆抗体，如首个抗血管生成剂贝伐珠单抗。
CN 101935349 B公布了新型抗人血管内皮生长因子（VEGF）单克隆抗体原液的制备方式，但是其未公布药物制剂组分。另外抗体药物与常规化学药物相比，其质量在长期储存时更易受到多种因素的影响，抗体药物可能发生多种物理或化学变化，例如变性，降解，聚合或氧化等从而影响药物活性，最终影响药物疗效，并带来毒副作用。本发明针对此问题，制备获得一种稳定的药物制剂。
发明内容
本发明涉及一种含有抗人血管内皮生长因子单克隆抗体的药物制剂及其应用。
本发明所述抗体含有序列SEQ ID No :1和SEQ ID No :2，SEQ ID No :3和SEQ IDNo :4，SEQ ID No :1和SEQ ID No :4，或SEQ ID No :2和SEQ ID No :3。
本发明所述抗体生产方法参考专利CN 101935349 B。
为了维持抗人血管内皮生长因子单克隆抗体的稳定性和活性，本发明药物制剂包含药用缓冲液，所述缓冲液包含但不仅限于柠檬酸钠/柠檬酸、醋酸盐、磷酸氢二钠/磷酸二氢钠、Tris盐酸、组氨酸/组氨酸盐酸中的一种或多种。
为了保护抗人血管内皮生长因子单克隆抗体药物的结构，本发明药物制剂中包含保护剂，所述保护剂包含但不仅限于蛋氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、蔗糖、山梨醇、甘露醇、蔗糖、海藻糖、木糖醇中的一种或多种。
为了增加药物制剂的稳定性，抑制聚体生成，本药物制剂包含聚山梨酯20、聚山梨酯80、丙二醇、二甲基亚砜或其它药学上可以接受的表面活性剂中的一种或多种。
本发明提供的抗人血管内皮生长因子单克隆抗体药物制剂，主要组分包括：
a）2-200mg/ml抗人血管内皮生长因子单克隆抗体；
b）5-80μmol/ml pH缓冲液；
c）2.5-120mg/ml保护剂；
d）0.03-1.2mg/ml表面活性剂；
调节pH至5.0-7.0。
药物制剂有效成分优化组合：
a）3-160mg/ml抗人血管内皮生长因子单克隆抗体，其结构包含SEQ ID No :1和SEQ IDNo :2，或SEQ ID No :3和SEQ ID No :4序列；
b）10-70μmol/ml pH缓冲液，选自柠檬酸钠/柠檬酸、磷酸氢二钠/磷酸二氢钠、Tris盐酸、组氨酸/组氨酸盐酸中的一种或多种；
c）5-70mg/ml保护剂，选自蛋氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、蔗糖、山梨醇、甘露醇、麦芽糖、海藻糖的一种或者多种；
d）0.05-1.0mg/ml表面活性剂，选自聚山梨酯20、聚山梨酯80、丙二醇、二甲基亚砜或其它药学上可以接受的表面活性剂中的一种或多种；
调节pH至5.0-7.0。
药物制剂有效成分优化包括：
a）4-120mg/ml 含SEQ ID No :1和SEQ ID No :2序列的抗人血管内皮生长因子单克隆抗体；
b）15-60μmol/ml pH缓冲液，选自磷酸氢二钠/磷酸二氢钠、组氨酸/组氨酸盐酸中的一种或两种；
c）8-60mg/ml保护剂，选自甘露醇、蔗糖、海藻糖、精氨酸中的一种或多种；
d）0.08-0.8mg/ml表面活性剂，选自聚山梨酯20、聚山梨酯80、丙二醇中的一种或多种；
调节pH至5.5-6.5。
药物制剂更优化组合为：
a）5-100mg/ml含SEQ ID No :1和SEQ ID No :2序列的抗人血管内皮生长因子单克隆抗体；
b）20-50μmol/ml磷酸氢二钠/磷酸二氢钠；
c）10-50mg/ml甘露醇；
d）0.1-0.5 mg/ml聚山梨酯80；
调节pH至6.0-6.3。
在一些实施方式中，抗人血管内皮生长因子单克隆抗体为8-25mg/ml。
在其他一些实施方式中，抗人血管内皮生长因子单克隆抗体为25-60mg/ml。
在另一实施方式中，抗人血管内皮生长因子单克隆抗体为60-100mg/ml.
本发明所述药物制剂可以通过以下制备方法获得：
1）按配比将抗人血管内皮生长因子单克隆抗体、pH缓冲液、保护剂与表面活性剂混匀；
2）调节pH至5.0-7.0；
3）过滤除菌，分装。
药物制剂制备方法，还可以包括下列冻干步骤，具体为：冻干机板层温度预先冷冻到-10℃以下，将配制好的药液除菌过滤分装于适宜大小的西林瓶中。半压塞后置于预冷的板层上，在-30℃以下预冻4小时，开始抽真空，真空度低于80Pa后，板层以0.1～0.5℃/min的速率升温，温度到-25～-20℃后维持24～48小时，当可见水印消失后再逐渐升温，最终板层温度15～30℃保持3～5小时，压塞后出箱并轧盖。
本发明所述药物制剂可以以多种方式贮存，在一些实施方式中，所述药物制剂物储存在西林瓶中，在另外一些实施方式中，所述药物制剂物储存在预充注射器中。本发明药物制剂还可存储于安瓿中。上述储存方式装量在0.05-5ml。
本发明所述药物制剂可用于治疗多种疾病。例如可用于肿瘤的治疗，可抑制肿瘤部位的血管生长，由于肿瘤的生长与血管生成有密切的关系，因此本发明的药物制剂可用于治疗胃癌、肝癌、白血病、肺癌、小肠癌、骨癌、直肠癌、前列腺癌、大肠癌、宫颈癌等多种癌症。本发明的药物制剂还可用于治疗许多非肿瘤疾病，其包括：类风湿性关节炎、牛皮癣、动脉粥样硬化、糖尿病和其他增生性视网膜疾病等，尤其是眼底新生血管病变，如年龄相关性黄斑变性（AMD）、糖尿病黄斑水肿（DME）、病理性近视（PM）、视网膜静脉阻塞（RVO）、近视性脉络膜新生血管（mCNV）等的治疗。
本发明的药物制剂可以单独给药，或以各种组合给药，以及与其它治疗药剂一起联合给药。
本发明中的抗人血管内皮生长因子单克隆抗体制剂可以通过多种途径给予病人，包括但不局限于静脉给药，眼部注射，皮下给药，眼部玻璃体注射或眼药水滴眼等方式给药。
附图说明
图1 不同保护剂条件下药物制剂差式荧光扫描（DSF）结果图。
图2 37℃不同聚山梨酯体系条件下药物制剂考察90天的SEC-HPLC检测结果图。
具体实施例
实施例1 不同pH及缓冲体系对5 mg/ml（低浓度）抗血管内皮生长因子单抗药物制剂稳定性的影响
抗血管内皮生长因子单抗原液脱盐至纯化水中。按终浓度50 mmol/L加入配制好的缓冲液母液（其中pH 3.6、4.0、5.0及5.6选用柠檬酸钠/柠檬酸缓冲液，pH 6.0和7.0选用磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液，pH8.0选用Tris盐酸缓冲液），并调节抗血管内皮生长因子单抗终浓度至5 mg/ml，无菌过滤。各组样品分装至2 ml西林瓶，密封后置于37 ℃恒温培养箱中，第30天取样，采用还原SDS-PAGE和SEC-HPLC检测纯度。
表1 37℃不同pH及缓冲体系下药物制剂考察30天的SEC-HPLC纯度
试验表明，37 ℃放置30天，SEC-HPLC显示pH 8.0出现明显降解。而还原SDS-PAGE结果表明，pH 3.6，4.0及8.0均出现了明显的非特异性条带。
实施例2 不同pH及缓冲体系筛选对200 mg/ml（高浓度）抗血管内皮生长因子单抗药物制剂稳定性的影响。
为了考察pH及缓冲体系对制剂稳定性的影响，分别配制不同pH缓冲液母液（其中pH 5.0、5.5及6.0选用组氨酸/组氨酸盐酸盐缓冲液，pH 6.0、6.5及7.0选用磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液）。将抗血管内皮生长因子单抗原液超滤浓缩后置换至纯水中，分别加入各缓冲液母液至终浓度30 mmol/L。同时调节抗血管内皮生长因子单抗至终浓度200 mg/ml，无菌过滤。各组药物制剂分装至2 ml西林瓶，密封后置于37 ℃恒温培养箱中，第30、90天取样，采用SEC-HPLC检测样品纯度。
表2 37℃不同pH及缓冲体系下药物制剂考察不同时间的SEC-HPLC纯度
试验表明，在高浓度时，抗血管内皮生长因子药物制剂在pH 5.0及pH 7.0的条件下聚体及降解都显著升高。在pH 5.5至6.5之间聚体及降解均无明显差异。并且在pH 6.0时，组氨酸/组氨酸盐酸盐缓冲体系与磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲体系对蛋白稳定性的影响无明显差异。
实施例3 保护剂的选择
长时间存放会导致抗血管内皮生长因子药物制剂的聚体增加，这主要是因为蛋白质构象缓慢的变化导致某些疏水区域的暴露，从而使蛋白分子之间相互聚集形成聚体。海藻糖、甘露醇、蔗糖、精氨酸等保护剂可与蛋白分子相互作用，提高蛋白稳定性，抑制聚体生成。
3.1 保护剂对蛋白热稳定性的影响
在本实施例中考察了蛋氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、蔗糖、山梨醇、甘露醇、麦芽糖、海藻糖、蔗糖、精氨酸等单组分对蛋白热稳定性的影响；空白对照组为磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液组，无保护剂添加。抗血管内皮生长因子单抗原液置换至30mmol/L磷酸盐缓冲液（pH6.1）中，至终浓度2 mg/ml。加入蛋氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸等各单组分，浓度如表3所示。按差式荧光扫描（DSF）试剂盒（Life Technology公司，货号4461146）要求，在荧光定量仪（型号ABI7500）上检测单个保护剂对蛋白熔解温度（Tm）的影响，结果见表3及图1。
表3 不同保护剂条件下药物制剂的熔解温度（Tm）
从Tm值上可以看出，单独添加不同浓度的海藻糖，甘露醇，蔗糖及精氨酸的药物制剂与空白对照组相比，其蛋白的Tm值有明显增加，表明蛋白的热稳定性得到提高，而其余保护剂添加组作用不明显。
3.2 药物制剂加速稳定性试验
根据实施例3.1的结果，进行加速稳定性试验。抗血管内皮生长因子单抗原液置换至30mmol/L磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液（pH6.1）中，至终浓度25mg/ml。加入海藻糖、甘露醇、蔗糖和精氨酸单组分，浓度如表4所示。无菌过滤后分装所得药物制剂37℃存放，第30天、60天及90天分别取样，采用SEC-HPLC进行纯度分析。
表4 37℃不同保护剂条件下药物制剂考察不同时间的SEC-HPLC纯度
试验结果表明：各浓度甘露醇均可有效抑制聚体生成，增加制剂的稳定性。而其余保护剂海藻糖、蔗糖和精氨酸组的单体纯度在放置90天后都有明显的下降，并且聚体的增加没有得到明显抑制。
实施例4 表面活性剂的选择
表面活性剂可抑制蛋白分子间相互作用，增加蛋白质溶解性和稳定性。本实施例实验考察了聚山梨酯80和聚山梨酯20对抑制抗血管内皮生长因子单抗聚体的影响。
抗血管内皮生长因子单抗原液超滤置换至30mmol/L磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液（pH 6.1）中，至终浓度25mg/ml，加入甘露醇至浓度40mg/ml。同时加入5%的聚山梨酯80及5%的聚山梨酯20母液分别使其终浓度为0.03mg/ml，0.25mg/ml及1.2mg/ml。药物制剂37℃存放，第30天、60天及90天分别取样进行SEC-HPLC分析，部分结果见表5和图2。
表5 37℃不同聚山梨酯体系条件下药物制剂考察不同时间的SEC-HPLC纯度
试验表明，三种不同浓度的聚山梨酯80可以较好的抑制药物制剂在90天内聚体的生成，而聚山梨酯20的抑制聚体生成效果较聚山梨酯80弱。
实施例5 制剂处方稳定性考察
称取适量的甘露醇、聚山梨酯80、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠加注射用水搅拌溶解，再加入适量高浓度抗血管内皮生长因子单抗原液，各处方组分如表6所示。
表6 不同制剂处方组分
药物制剂在2-8℃下进行长期稳定性考察。采用还原SDS-PAGE电泳，SEC-HPLC，IEC-HPLC检测蛋白纯度，采用人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增值抑制法研究生物学活性，部分结果如表7。
表7 不同的药物制剂处方长期稳定性考察
试验表明，处方3中各纯度指标均有一定的下降，生物学活性也有明显下降。而处方1和处方2在放置3个月和6个月后各纯度指标和生物学活性无明显下降。
实施例6药物制剂抑制小鼠高氧致视网膜血管新生的药效学研究
新生KM小鼠45只，随机分为3组，其中药物组：小鼠与母鼠一起放于密闭高氧箱内饲养，从出生开始隔日腹腔注射一次处实施例5中处方1的药物制剂25mg/kg；模型组：小鼠与母鼠一起放于密闭高氧箱内饲养正常氧气的箱内饲养，从出生开始隔日腹腔注射一次生理盐水；正常组：小鼠与母鼠一起放于正常氧环境的箱内饲养。出生后第21天每组取6只小鼠麻醉后FITC-dextran心室灌注，视网膜铺片，荧光显微镜观察新生血管及荧光渗漏情况；每组取6只小鼠的12只眼睛甲醛固定、石蜡包埋、切片后HE染色，观察视网膜内界膜细胞数量。结果表明，正常组小鼠视网膜结构正常，几乎没有荧光渗漏；模型组小鼠血管迂曲、扩张，并由新生血管及荧光渗漏；抗血管内皮生长因子药物制剂药物组小鼠血管较模型组规则，荧光渗漏较少。视网膜内界膜血管内皮细胞数量统计汇总详见表8。结果表明，抗血管内皮生长因子药物制剂对氧致小鼠视网膜血管新生有较强的抑制作用。
表8小鼠视网膜内界膜血管内皮细胞数量
| 正常组 | 模型组 | 药物组 | |
| 细胞数量（个） | 4.3 | 142.9 | 35.1 |
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏泰康生物医药有限公司
<120> 一种抗人血管内皮生长因子单克隆抗体的药物制剂及其应用
<130> 2016
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385 390 395 400
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405 410 415
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
420 425 430
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
435 440 445
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
450 455 460
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
Claims (10)
1.一种含有抗人血管内皮生长因子单克隆抗体的药物制剂，其特征在于包含以下组分：
a）2-200mg/ml抗人血管内皮生长因子单克隆抗体；
b）5-80μmol/ml pH缓冲液；
c）2.5-120mg/ml保护剂；
d）0.03-1.2mg/ml表面活性剂；
调节pH至5.0-7.0。
2.权利要求1所述的药物制剂，其特征在于包含：
a）3-160mg/ml抗人血管内皮生长因子单克隆抗体，其结构包含SEQ ID No :1和SEQ IDNo :2或SEQ ID No :3和SEQ ID No :4序列；
b）10-70μmol/ml pH缓冲液，选自柠檬酸钠/柠檬酸、磷酸氢二钠/磷酸二氢钠、Tris盐酸、组氨酸/组氨酸盐酸中的一种或多种；
c）5-70mg/ml保护剂，选自蛋氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、蔗糖、山梨醇、甘露醇、麦芽糖、海藻糖的一种或者多种；
d）0.05-1.0mg/ml表面活性剂，选自聚山梨酯20、聚山梨酯80、丙二醇、二甲基亚砜或其它药学上可以接受的表面活性剂中的一种或多种；
调节pH至5.0-7.0。
3.权利要求2所述的药物制剂，其特征在于包含：
a）4-120mg/ml含SEQ ID No :1和SEQ ID No :2序列的抗人血管内皮生长因子单克隆抗体；
b）15-60μmol/ml pH缓冲液，选自磷酸氢二钠/磷酸二氢钠、组氨酸/组氨酸盐酸中的一种或两种；
c）8-60mg/ml保护剂，选自甘露醇、蔗糖、海藻糖、精氨酸中的一种或多种；
d）0.08-0.8mg/ml表面活性剂，选自聚山梨酯20、聚山梨酯80、丙二醇中的一种或多种；
调节pH至5.5-6.5。
4.权利要求3所述制剂的药物制剂，其特征在于包含：
a）5-100mg/ml含SEQ ID No :1和SEQ ID No :2序列的抗人血管内皮生长因子单克隆抗体；
b）20-50μmol/ml磷酸氢二钠/磷酸二氢钠；
c）10-50mg/ml甘露醇；
d）0.1-0.5 mg/ml聚山梨酯80；
调节pH至6.0-6.3。
5.权利要求4所述的药物制剂，其特征在于含SEQ ID No :1和SEQ ID No :2序列的抗人血管内皮生长因子单克隆抗体为10-60mg/ml。
6.权利要求1-5任一项所述药物制剂的制备方法，包含下列步骤：
1）按配比将抗人血管内皮生长因子单克隆抗体、pH缓冲液、保护剂与表面活性剂混匀；
2）调节pH至5.0-7.0；
3）过滤除菌，分装。
7.权利要求6所述的药物制剂制备方法，还可以包括下列冻干步骤，具体为：冻干机板层温度预先冷冻到-10℃以下，将配制好的药液除菌过滤分装于适宜大小的西林瓶中，半压塞后置于预冷的板层上，在-30℃以下预冻4小时，开始抽真空，真空度低于80Pa后，板层以0.1～0.5℃/min的速率升温，温度到-25～-20℃后维持24～48小时，当可见水印消失后再逐渐升温，最终板层温度15～30℃保持3～5小时，压塞后出箱并轧盖。
8.一种储存权利要求1-7任一项所述的药物制剂的容器，其特征为西林瓶或预充注射器或安瓿瓶，装量为0.05-3ml。
9.权利要求1-8任一项所述的药物制剂，适合静脉给药，皮下给药，眼部玻璃体注射给药或眼药水滴眼给药。
10.权利要求1-9任一项所述的药物制剂可用于制备治疗眼底新生血管病变药物的用途，所述病变如年龄相关性黄斑变性、糖尿病黄斑水肿、病理性近视、视网膜静脉阻塞、近视性脉络膜新生血管等。
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