CN105079804A - 一种高稳定的治疗vegf相关疾病的人源化抗体制剂 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种高稳定的治疗VEGF相关疾病的人源化抗体制剂，含有VEGF抗体、缓冲溶液和稳定剂，所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，所述的稳定剂为海藻糖，且海藻糖在制剂中的含量为15mg/ml以上。本发明在获得良好的温度耐受性的同时，在正常的保存温度可稳定保存至少42个月。

Description

一种高稳定的治疗VEGF相关疾病的人源化抗体制剂

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种治疗VEGF相关疾病的人源化抗体的制剂。具体地说，涉及一种具有较强高温耐受性的抗VEGF抗体液体制剂。

技术背景

癌症是世界严重的公共卫生问题，我国癌症的发病率也在逐年上升，平均每天每分钟有6人被诊断为恶性肿瘤。据统计，居全国恶性肿瘤发病第一位的是肺癌，其次为胃癌、结直肠癌、肝癌和食管癌。肿瘤是一种血管生成依赖性疾病,肿瘤的生长离不开血管及血液的供应。肿瘤血管靶向治疗(tumorvasculartargetingtherapy)逐步发展成为当今肿瘤领域研究的主攻方向之一。随着对恶性肿瘤研究的逐步深入，癌症的治疗方案也由最初的抗增殖治疗(单药化疗、联合化疗等)最终发展为化疗联合肿瘤血管靶向治疗(tumorvasculartargetingtherapy)。肿瘤组织产生血管内皮生长因子(VEGF)，与血管内皮细胞上的受体(VEGFR)结合后，能够通过胞内信号转导系统促进血管内皮细胞增殖、迁移、管腔形成，微血管通透性，并诱导血管生成，因此，VEGF成为抗肿瘤血管新生的重要靶标之一(Presta,L.G.,H.Chen,S.J.O'Connor,V.Chisholm,Y.G.Meng,L.Krummen,M.Winkler,andN.Ferrara.1997.CancerRes.57:4593-4599)。除了肿瘤以外，多种疾病的发病机制都与血管生成有关，包括眼内新生血管综合征，如增殖性视网膜病或年龄相关性黄斑变性(AMD)，类风湿关节炎和牛皮癣等(Folkman,J.等,J.Biol.Chem.267(1992)10931-10934；Klagsbrun,M.等,AnnuRev.Physiol.53(1991)217-239)。

目前，国内外上市靶向VEGF的生物药物按照适应症来分，可以分为两类：一类是治疗实体瘤的靶向药物，这类药物多用于静脉注射，如贝伐珠单抗；另一类则是治疗眼内新生血管综合征，这类药物多用于玻璃体注射，如雷珠单抗(CHMeyerandFGHolz，Eye(2011)25,661–672)。贝伐珠单抗和雷珠单抗来源于同一原始抗体，具有抗原决定簇相同，但是因为是针对不同的适应症，所以存在给药部位以及给药剂量等区别，这些区别导致了这两个药物的分子结构，生产工艺，制剂配方等方面均有很大的不同。贝伐珠单抗为完整的IgG1抗体，由哺乳动物细胞株CHO表达；雷珠单抗为Fab形式抗体，由大肠杆菌表达。贝伐珠单抗治疗实体瘤时，给药剂量大，相应的制剂浓度高；雷珠单抗给药体积小，但是对制剂的不溶颗粒，黏度等指标要求高，所以制剂浓度低，配方也有所不同。

一般来说，眼内注射液的制剂的要求比静脉注射液要求高。眼内注射溶液系指由药物与适宜辅料制成的无菌澄明溶液，供眼周围组织(包括球结膜下、筋膜下及球后)或眼内注射(包括前房注射、前房冲洗、玻璃体内注射、玻璃体内灌注等)的无菌眼用液体制剂。眼用液体制剂的质量要求有如下几点：无菌、澄明度、pH值、渗透压以及黏度等要求。对于抗体类药物来说，由于生物大分子在高浓度下不稳定，时间久了，容易出现变性、聚集，所以在配置眼用液体制剂时最需要的是要考察抗体的稳定性，特别是聚集体含量的多少。

因为VEGF信号通路与多种疾病的发生有着密切的关系，所以其生物靶向药物的应用范围也特别广泛。这种广泛性也决定着药物的制剂，配方不仅要具备广谱性，既可以静脉注射，又可以玻璃体注射；同时要适应抗体不同的浓度要求，如肿瘤部位的给药剂量、眼内给药剂量。

稳定的抗体液体制剂可用于静脉或者玻璃体注射。

这样的制剂必须满足两个关键的要求：1)必须达到所需的药物浓度，2)药物应为理化性质稳定的，以便具有足够的保存期限。为了使蛋白质保持生物活性，制剂必须保持蛋白质构象的完整性并且同时防止蛋白质的多个功能基团发生降解。蛋白质的降解途径会牵涉到化学不稳定性和物理不稳定性。例如，化学不稳定性可由如脱酰胺、水解、氧化、β-消除或二硫键交换引起，而物理不稳定性可由如变性、聚集、沉淀或吸附引起。聚集是蛋白质最常见降解途径之一。

蛋白质在水性制剂中的稳定性对于制药工业具有普遍重要意义。这一问题通过使蛋白质干燥(如通过冻干的方法)来解决。对需要每日注射抗体的患者来讲，产品易于操作、定量和注射是重要的。由于干燥的抗体制剂是以干粉形式分装和储存的，患者或医务人员在使用前必须将干粉在溶剂中重构(reconstitution)，这对于患者而言是不便的。因此，提供在使用前无需重构的抗体液体制剂是有利的。此外，冻干法是一种耗费资源和时间的方法，如果制备市售的抗体制剂时能够省略该步骤将是有益的。而且，如果最终的药用溶液仅含少量或不合添加剂，对治疗性产品的生产和配制也是有益的。

然而，目前这样的液体制剂具有一个较为突出的缺陷，即温度耐受性较低，在短暂的高温环境下(例如，35℃或更高的温度下)，制剂容易变性。即使在短暂的高温环境过后再重新贮存至合适的温度环境(例如，4℃)，变性的VEGF抗体也无法重新复性。事实上，目前很多注射用制剂的安全性事件是由保藏不当引起的。例如，由于在运输、搬运或储藏过程中供电的临时中断、或基层人员操作的欠妥，引起制剂在一段时间内暴露于较高的温度环境下。尤其是在运输过程中，这种情况更容易发生，此时制剂有可能会被暴露于高达例如40℃、45℃、50℃甚至更高的温度环境下。尤其是在不发达国家，由于运输条件的相对落后，由这种短期储藏温度短时间过高而造成的制剂安全性事件时有发生。

尽管如此，目前的VEGF抗体液体制剂，在温度耐受性上仍缺乏较好的研究成果。中国专利申请201010581534.X公开了一种VEGF受体融合蛋白制剂，其采用的配方为双功能VEGF受体融合蛋白5～50mg/ml，增溶剂0.1～2mg/ml，溶液稳定剂0～10mg/ml，等渗调节剂0～10mg/ml，缓冲液5～25mmol/l，该液体制剂可以明显的减少药品长期放置后产生的颗粒。然而，该制剂并无法耐受较高的温度环境，其最高耐受温度为30℃。

对于其他类型的水性抗体制剂，其温度耐受性其实早已有一些研究。美国专利号6,171,586(Lam等人)公开了稳定的水性抗体制剂，其利用醋酸钠和组氨酸-HCl缓冲液作为缓冲体系，使CD18抗体制剂可以耐受40℃的温度环境。rhuMAbCD18的优选制剂为10mM醋酸钠，8％海藻糖，0.01％TWEEN20TM，pH5.0。于40℃保存一个月的rhuMAbCD20的醋酸盐(pH5.0)制剂比在组氨酸中配制的那些样品(pH5.0或6.0)显示更大的稳定性。

在美国专利6,171,586的基础上，詹姆斯·D·安迪亚等人(PCT/US2005/037471)进一步研制出了组氨酸－醋酸盐缓冲液中的单克隆抗体制剂，组氨酸-醋酸盐缓冲液pH5.5-6.5，优选PH5.8-6.2。虽然其研究对象主要并非VEGF，但其公开了所述的单克隆抗体结合选自HER2，CD20，DR5，BR3，IgE和VEGF的抗原。制剂优选进一步包含糖，最优选二糖，如海藻糖或蔗糖。对于HER2抗体制剂来说，例示性的糖浓度为从大约10mM到大约1M，例如从大约60mM到大约250mM，最优选大约120mM，对于DR5抗体制剂来说为大约240mM。制剂优选进一步包括增溶剂，如聚山梨醇酯。一般包含减少可溶性聚集物形成(如在摇晃或运输后发生的)的量的增溶剂。并且，该制剂的优点之一在于并不包含大量的盐如氯化钠。该PCT申请所公开的制剂在大约40℃稳定至少大约2-4周，和/或在大约5℃和/或15℃稳定至少3个月，和/或在大约-20℃稳定至少3个月或至少1年。尽管可以在一定时间内耐受高达40℃的温度，但是该基于组氨酸－醋酸盐缓冲液的单克隆抗体的缺陷在于绝对有效期较短，其在5℃下仅能稳定3个月。

因此，市场上需要稳定的、液体的、可注射的VEGF抗体制剂；特别是，需要在短时间内能耐高温的、能在正常温度下长时间稳定而保持活性的VEGF抗体制剂。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种具有较高温度耐受能力的VEGF抗体液体制剂。

本发明的进一步目的在于提供一种具有较高温度耐受能力，且在低温环境下能长期稳定的VEGF抗体液体制剂。

本发明的进一步目的在于提供一种具有较高温度耐受能力，且在低温环境下能长期稳定的，能满足眼内玻璃体和静脉注射两种要求的VEGF抗体液体制剂。

本发明通过如下技术方案实现上述目的：

发明提供一种VEGF抗体制剂，其以磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液作为缓冲体系，并含有15mg/ml以上的海藻糖作为稳定剂。海藻糖与VEGF抗体的质量比为1:1～1:4，优选1:1～3:2。

优选地，所含海藻糖的浓度为15～60mg/ml；进一步优选30～60mg/ml，更优选30～45mg/ml。

制剂的pH值控制在5.7-6.7，优选5.9～6.3，更优选6.1-6.2。

优选地，该制剂含有增溶剂。在本发明的一种实施方式中，所述增溶剂为吐温-20或吐温-80。优选地，增溶剂选用吐温-80。优选地，增溶剂在上述制剂中的浓度为0.2～0.8mg/ml

上述VEGF抗体是指结合VEGF抗原的单克隆抗体，可选自目前已知的VEGF抗体，例如选自Avastin，也可以选自其他抗VEGF单克隆抗体。在本发明的一个实施方案中，选用的重组人源化抗VEGF单克隆抗体重链氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，轻链氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。

优选地，本发明的制剂含有15-40mg/ml的抗体浓度。

本发明VEGF单克隆抗体制剂选用特定pH值的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液作为缓冲体系，并含有15～60mg/ml的海藻糖作为稳定剂，是尤为重要的一种搭配。尽管上述物质均是常用的缓冲液及稳定剂，但是，研究者在此前的研究中，针对VEGF抗体制剂并无法从多种多样的缓冲液和稳定剂中找到结果理想的搭配，从而获得能耐受高温影响且保存期较长的VEGF抗体制剂。例如，PCT/US2005/037471以pH5.5-6.5组氨酸－醋酸盐缓冲液作为缓冲体系，尽管可以耐受40℃的高温，但其在正常的保存温度5℃下仅能稳定3个月左右。中国专利申请201010581534.X以磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液作为缓冲体系，0～10mg/ml的蔗糖作为稳定剂(其同时公开了可以使用其他常规的稳定剂，如海藻糖、麦芽糖之一或海藻糖、麦芽糖、蔗糖的任意组合)，然而事实上，对稳定剂的在0～10mg/ml任意的选取并不能获得具有良好温度耐受性的制剂。本发明经过大量的探索性试验发现，不同的糖的选取对制剂温度耐受性的影响是至关重要的。例如，选取蔗糖、山梨醇、或甘露醇作为稳定剂时，即使是在较高糖浓度下也不能获得良好的温度耐受性；而只有选取高于一定浓度的海藻糖作为稳定剂时，该制剂才显示出远高于其他糖类、或者低浓度海藻糖时的温度耐受性。值得肯定的是，与201010581534.X和PCT/US2005/037471不同，本发明在获得良好的温度耐受性(可耐受高达67℃的高温，耐受时间可长达12小时而保持性质稳定)的同时，在正常的保存温度(2～8℃)可稳定保存至少42个月。

本发明的稳定剂一方面起到稳定抗VEGF抗体的作用(稳定其理化性质及生物学活性结构域，使其不易水解、氧化、聚集、沉淀，蛋白质空间结构保持不变)，同时起到稳定渗透压的作用。

本发明的另一个优势在于在大于15mg/ml的海藻糖存在下，本发明可以省去其他渗透压调节剂的使用，例如省去盐(如NaCl)的使用。

本发明所开发的制剂，其中所含的高浓度抗体蛋白更加稳定，更加耐受高温变化引起的聚集反应，因此本发明的抗体制剂可用于保存治疗VEGF相关的人抗体，增强含重组人源化抗VEGF单克隆抗体等VEGF拮抗剂抗体药物的稳定性，延长其在含水制剂中的保存周期，对于治疗VEGF相关疾病有重要意义。

本发明结合临床用药安全的需要、参考化学药物制剂研究基本技术指导原则和化学药品注射剂基本技术要求(试行)设计出不同的药物制剂处方，并对药物制剂处方的pH值、其他辅料成分等进行了一系列研究，最终依据对目标成分SEC-HPLC蛋白质纯度分析、结构鉴定以及生物活性分析，选择了重组人源化抗VEGF单克隆抗体注射液的最佳制剂处方。

本发明所提供的最佳制剂处方能够明显降低制剂中的二聚体含量，增加抗体的稳定性，满足眼内玻璃体和静脉注射两种要求。

附图说明

图1为重组人源化抗VEGF单克隆抗体的圆二色谱图；

图2为Avastin的圆二色谱图；

图3为差式热量扫描仪检测重组人源化抗VEGF单克隆抗体结果；

图4A673人横纹肌瘤细胞模型中各治疗组和对照组小鼠肿瘤体积的生长变化情

具体实施方式

以下通过具体的实施例作为对本发明内容的进一步阐释。这些实施方式并非本发明保护范围的限制。

本发明所述的VEGF抗体可选用已知种类的抗VEGF抗体。在本发明的一种实施方式中，抗VEGF单克隆抗体是通过基因工程手段，在CHO细胞中表达，并且通过一系列标准的层析步骤纯化获得。在制备抗体原液后，制备药物制剂。

在本发明的所有实施方式中，采用的稳定剂只能唯一地选择海藻糖。尽管有研究显示，如麦芽糖、蔗糖、海藻糖、乳糖等的二糖对液体制剂的稳定性是有利的，但是，发明人确信的是，海藻糖在本发明中所起的作用并非主要来自二糖的性质，因为，在对另一种二糖-蔗糖的研究过程中，结果显示出其并不具备如海藻糖能显著提高VEGF抗体液体制剂高温耐受性的性质。发明人认为，海藻糖在VEGF抗体液体制剂中这种性质，可能跟其本身的结构及VEGF抗体特定活性结构域有关，从而形成相辅相成的稳定环境。

尽管海藻糖的浓度在达到一定水平后能够很好地提高制剂的热稳定性，然而对VEGF抗体的浓度也是有一定要求的，这可能是因为当海藻糖与VEGF抗体的浓度比严重失衡时，这种相辅相成的稳定环境将被打破，从而影响了制剂的整体稳定性。例如，当海藻糖与VEGF抗体的质量比为1:5～2:5时，制剂并无法在45～50℃下获得较好的热稳定性。在本发明的优选实施方案中，海藻糖与VEGF抗体的质量比为1:1～3:2。

在本发明的实施方案中，海藻糖的浓度至少为15mg/ml。高于该浓度的海藻糖能较好地提高制剂的高温耐受性。然而过高的海藻糖浓度将导致制剂溶液黏度偏高。作为一种优选的方案，海藻糖的最高浓度以60mg/ml为宜。

本发明所采用的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲体系，可采用合适的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠分别配置成合适的浓度，并进一步配置为pH5.7～6.7的缓冲溶液体系。在本发明的一种实施方式中，采用磷酸氢二钠(无水)，磷酸二氢钠(一水)配置缓冲溶液。注射用水可进一步用以调节终体积，从而决定体系中抗体浓度、海藻糖浓度及pH值等。

在本发明的一种优选的实施方案中，制剂的pH值稳定在5.9～6.3。

在本发明的一种实施方案中，制剂含有增溶剂。尤其是在抗体以较高浓度存在时，增溶剂的添加较为有利。增溶剂能减少所述制备的抗体的聚集和/或减少颗粒在所述制剂中的形成和/或减少吸附。在一种实施方式中，增溶剂采用吐温-20。在一种优选的实施方式中，增溶剂采用吐温-80。在一种优选方案中，所述制剂包括大约0.4mg/ml的吐温-80。

在本发明的一种实施方案中，所述抗体在所述液体含水药物制剂中的浓度为大约25mg/ml。在本发明的另一种实施方案中，所述抗体在所述液体含水药物制剂中的浓度为大约15mg/ml。在本发明的另一种实施方案中，所述抗体在所述液体含水药物制剂中的浓度为大约40mg/ml。

所述制剂在45℃下可保存至少2个月，在2～8℃下保质期为42个月。

本发明提供液体含水药物制剂，包括适合治疗用途的抗体，这种药物制剂便于施用，并且含有高蛋白浓度，主要用于治疗由VEGF引起的病症。在一种实施方案中，所述药物制剂具有增强了的稳定性。在另一种实施方案中，所述抗体针对人VEGF。在另一种实施方案中，所述抗体是重组人源化抗VEGF单克隆抗体。

在本发明的另一种实施方案中，所述液体含水药物制剂包括抗体或其抗原结合部分，它是重组抗体或其抗原结合部分，它能抑制人VEGF诱导的新生血管形成。在另一种实施方案中，所述要求保护的制剂包括重组人源化抗VEGF单克隆抗体。

所述液体含水药物制剂主要用于治疗由VEGF引起的病症。所述制剂既适合进行静脉注射，还适合进行玻璃体注射。所述液体含水药物制剂可增强含重组人源化抗VEGF单克隆抗体等VEGF拮抗剂抗体药物的稳定性，延长其在含水制剂中的保存周期。

实施例

以下实施例是对本发明的进一步阐明，应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明的范围。本发明引用的所有文献及专利收做本文参考。

实施例1：不同稳定剂的影响

发明人选择了4种不同配方的制剂作为比较，研究制备的4种制剂缓冲液的配方如下表1。所有处方的缓冲体系均为磷酸盐缓冲液；增溶剂均为吐温-80；稳定剂分别选择了海藻糖，甘露醇，山梨醇，蔗糖；各处方最终pH为6.2±0.1。

表1.制剂处方配方

VEGF抗体在上述各制剂配方中的终浓度为15mg/mL。

加入100μL到PCR小管中，PCR仪加热90min，温度区间为40-70℃，然后冷却到室温。将加热后的样品4℃离心2000rpm，20min。离心后的上清取出，4℃保存，用于下一步ELISA检测。配置VEGF包被液(1μg/mL)，向每个反应孔中加入100μLVEGF包被液，4℃包被过夜，BSA封闭。将待检测的上清样品1：16000稀释后加入包被好的ELISA板中孵育过夜，加入二抗，洗板8次后显色。将检测到的样品浓度与4℃保存的样品进行对比，计算出相对VEGF亲和力。

结果显示，处方1(海藻糖)具有最佳的温度耐受性。在高达67℃的温度下，处方1中的抗体仍具有接近98％的相对活性，并且可持续12小时。

其次是处方4(蔗糖)，其在50℃下持续12小时候，抗体相对活性下降至60％左右。

更次之的是处方2(甘露醇)和处方3(山梨醇)，在45℃下持续12小时，抗体相对活性下降至40％左右。

实施例2：增溶剂的影响

在优选处方1的基础上，将处方1中的增溶剂吐温-80更换成吐温-20配制成处方5，处方1与处方5中的其它各组成含量均一致，比较吐温-80与吐温-20这两种增溶剂对产品在配伍实验中的影响，重点考察配伍实验中出现不溶性微粒的数量情况。

结合临床给药量按5mg/kg(主药/体重)计，人均体重为60kg，即一次性给药量为300mg。具体实施方法如下：分别按处方1与处方5制备规格为100mg/4mL的制剂溶液，各取上述产品3支，加入到氯化钠注射液中，混匀后，将配伍溶液分别置于25℃和4℃条件下进行试验。在25℃条件下，分别于第2h，4h，8h，24h取样检测；在4℃条件下分别于第4h，8h，24h，48h取样检测。检测项目为不溶性微粒，检测结果与第0h进行比较。结果见表2。

表2.配伍实验检测数据

结果显示，配伍后的溶液在25℃下放置24h和在4℃下放置48h，与第0h比较，溶液的不溶性微粒出现逐渐增多的趋势,但并未超过标准。同时，处方1制剂配伍溶液与处方5制剂配伍溶液比较，处方1制剂配伍溶液中出现的不溶性微粒略少于处方5制剂配伍溶液。因此优选吐温-80作为制剂中的增溶剂。

实施例3：pH值的选择

根据实施例1和实施例2确定处方1为优选处方，按照处方1，制备3个不同的pH值(pH5.5±0.2、pH6.1±0.2、pH6.7±0.2)样品，分别置于高温光照环境条件下观察10天，于第0天、第5天、第10天取样进行纯度SEC-HPLC检测，结果如下表3。

表3.不同pH样品的SEC单体纯度变化

从结果来看，高温光照对样品纯度具有一定影响，且各pH值的样品SEC变化趋势接近，综合来看，PH6.1略优于PH6.7，本制剂PH值优选PH6.1±0.2。

处方1为最佳制剂即缓冲剂为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，稳定剂为海藻糖，增溶剂为吐温-80，pH为6.1±0.2。

实施例4：制剂的制备

在本发明中，制剂的制备是结合原液浓缩制备工艺完成的。

在本品制剂中，辅料为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、吐温80(聚山梨酯80)以及海藻糖。其中，在超滤缓冲液配制时已投加了磷酸二氢钠和磷酸氢二钠；另外为了防止目标蛋白在换液过程中出现聚合从而浑浊，在超滤缓冲液中投加了吐温80作为增溶剂。对于另一个添加物海藻糖，本研究中为了工序连续性以及原液稳定性的角度考虑，设计在超滤换液浓缩完成后立即投加海藻糖。

具体实施步骤如下：

称量出以下成分：48g磷酸二氢钠、232g磷酸氢二钠、16ml吐温80。

配置磷酸二氢钠溶液和磷酸氢二钠溶液，并进一步制备成所需pH值的40L缓冲液。

将预先称好的缓冲液成分添加到90％的注射用水中制备缓冲液。

最后添加最终体积的水，然后通过0.22um孔径，亲水性聚偏二氟乙烯的过滤膜，过滤膜可将缓冲液过滤到无菌容器中。所使用的过滤介质是过滤消毒的氨气。

将上述缓冲液对蛋白原液进行超滤换液。

制备40L制剂

对上述超滤液进行定量，取含1kg蛋白的上述浓缩液，称取2400g海藻糖，将上述海藻糖加入到超滤后的原液中，并用缓冲液将上述原液稀释到25mg/ml。

然后按照上述方法，通过过滤对包含它的所有成分的制剂进行过滤，所不同的是所述制剂是通过两层无菌0.22μm的膜过滤器过滤的。在消毒之后，对所述试剂进行包装，以便在西林瓶中使用。

技术人员还可以理解的是，本文所提到的重量和/或重量与体积比可以利用所述成分的公知的分子量换算成摩尔和/或摩尔浓度。本文所列举的重量是用于所述体积的。技术人员可以理解的是，在需要不同的制剂体积时，可以成比例地调整所述重量。例如30L、20L、10L制剂分别包括75％、50％、25％的所列举的重量。

实施例5：稳定性考察

配置如下配方的制剂：

上述配方的制剂均可在高达67℃的温度下持续12小时保持稳定，45℃下可保存二个月以上，在2～8℃下保质期42个月以上。综合高温耐受性、常温有效期、理化性状等方面来看，其中配方B、C最为适宜，为最优选配方。

实施例6：圆二色谱分析

本研究对本制剂所含抗体重组人源化抗VEGF单克隆抗体与Avastin的圆二色谱图形比较，进而验证他们的二级结构是否一致。分别独立处理重组人源化抗VEGF单克隆抗体和原研药Avastin，在190～250nm波段(远紫外区)用圆二色谱扫描仪测量，结果如图3，图2。

由上图可知，本制剂所含抗体重组人源化抗VEGF单克隆抗体和原研药Avastin在远紫外区图形没有差别，都在217nm有较强的负吸收，而且相同浓度的样品吸收值非常接近。根据文献报道，单克隆抗体三维结构中存在大量的β折叠，圆二色谱中在217nm附近的负吸收和单克隆抗体的β折叠的含量有相关关系，本研究结果显示本制剂所含抗体重组人源化抗VEGF单克隆抗体和原研药的二级结构中β折叠比例相同。

实施例7：差式热量扫描仪(Differentialscanningcalorimetry,DSC)检测

为了研究重组人源化抗VEGF单克隆抗体BAT-1706和重组人源化双特异性抗体BAT-906的热转化温度，我们运用毛细管差式热量扫描仪来检测BAT-1706抗体和BAT-906抗体分子各个结构域的热解折叠温度。仪器型号NanoDSC，毛细管样品池和参比池的体积均为0.300mL，加热速率为1℃/min，10min预平衡时间，过滤周期：10秒。从图3的实验结果中可以看出BAT-1706分子有二个熔解峰，第一个峰为Fab/CH2的熔解峰，Tm值为72.48℃；第二个峰为CH3熔解峰，Tm值为84.60℃。

实施例8：A673人横纹肌瘤细胞异种移植瘤的药效学研究

人横纹肌瘤细胞A673是EGFR阴性细胞株，为了观察重组人源化抗VEGF单克隆抗体BAT-1706对该细胞株体外移植瘤的杀伤作用，我们进行了A673体外移植瘤实验。首先培养A673细胞至对数生长期，制备细胞悬液。然后取4-8周龄的雌性裸鼠，于其右腋注射100μL含有2×10⁶细胞悬液，接种后24小时将动物随机分为3组，每组13-15只动物。分组后马上开始给药，各种抗体均按每公斤体重0.5mg抗体量的剂量每周三次总共给药9次，每次给药前称量动物体重以调整给药量。给药方式是腹腔注射，注射体积为每次100μL。肿瘤体积每三天用游标卡尺测量一次，计算肿瘤体积(V＝π/6×a×b²，a为小鼠皮下肿瘤最长径，b为最短径)，计算各组平均值，绘制肿瘤生长曲线。最后一次给药并测定肿瘤体积大小后(第一次给药24天后)，动物被立即以无痛至死，肿瘤被剥离并称重。因为A673是EGFR阴性细胞株，所以我们比较了BAT-1706，和贝伐珠单抗抑制肿瘤的效果，实验结果显示(图4)重组人源化抗VEGF单克隆抗体BAT-1706及贝伐珠单抗均能明显的抑制EGFR阴性肿瘤的生长，并且治疗效果相当。

实施例9：重组人源化抗VEGF单克隆抗体BAT-1706的氨基酸序列

一种治疗VEGF相关疾病的人源化抗体为重组人源化抗VEGF单克隆抗体BAT-1706，是通过基因工程手段，在CHO细胞中表达的，并且通过一系列标准的层析步骤纯化获得的。BAT-1706属于IgG1抗体，分子量为149kDa，由2条重链和2条轻链组成。每条重链含有453个氨基酸(C₂₂₃₅H₃₄₁₃N₅₈₅O₆₇₈S₁₆；分子量：49.8kDa；包括C末端赖氨酸脱落的分子)；每条轻链含有214个氨基酸(C₁₀₃₄H₁₅₉₁N₂₇₃O₃₃₈S₆；分子量：23.4kDa)。

重组人源化抗VEGF单克隆抗体重链氨基酸序列(453AA)(其中1～123AA为可变区，124～453AA为恒定区)：

SEQIDNO:1

5`> ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK<3`

重组人源化抗VEGF单克隆抗体轻链氨基酸序列(214AA)(其中1～108AA为可变区，109～214AA为恒定区)：

SEQIDNO:2

5`> TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC<3`

上述实施例呈现了实现发明的一些方式，但本领域技术人员基于本专利申请公开的内容，可基于本发明的精神和理念作进一步的修改、替换、扩展等，这些均不脱离本发明的实质，落入本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种高稳定的治疗VEGF相关疾病的人源化抗体制剂，含有VEGF抗体、缓冲溶液和稳定剂，其特征在于，所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，所述的稳定剂为海藻糖，且海藻糖在制剂中的含量为15mg/ml以上。

2.如权利要求1所述的治疗VEGF相关疾病的人源化抗体制剂，其特征在于，所述VEGF抗体和海藻糖的质量比为1:1～1:4，优选1:1～3:2。

3.如权利要求1所述的治疗VEGF相关疾病的人源化抗体制剂，其特征在于，所述海藻糖在制剂中的含量为15～60mg/ml，优选30～60mg/ml，更优选30～45mg/ml。

4.如权利要求1所述的治疗VEGF相关疾病的人源化抗体制剂，其特征在于，所述制剂的pH值为5.7-6.7，优选5.9～6.3，更优选6.1-6.2。

5.如权利要求1所述的治疗VEGF相关疾病的人源化抗体制剂，其特征在于，所述的VEGF抗体在制剂中的浓度为15-40mg/ml。

6.如权利要求1所述的治疗VEGF相关疾病的人源化抗体制剂，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲溶液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。

7.如权利要求1所述的治疗VEGF相关疾病的人源化抗体制剂，其特征在于，所述制剂还含有增溶剂；优选地，所述的增溶剂选自吐温-80或吐温-20，更优选选自吐温-80。

8.如权利要求7所述的治疗VEGF相关疾病的人源化抗体制剂，其特征在于，所述的增溶剂在制剂中的浓度为0.2～0.8mg/ml。

9.如权利要求1所述的治疗VEGF相关疾病的人源化抗体制剂，其特征在于，所述制剂在不高于67℃的环境下稳定保存至少12小时；或在不高于45℃的环境下稳定保存至少2个月；或在2～8℃的环境下稳定保存至少42个月。

10.如权利要求1所述的治疗VEGF相关疾病的人源化抗体制剂，其特征在于，所述制剂用于制备静脉注射药物，或用于制备玻璃体注射药物。