CN112717129A

CN112717129A - 抗vegf抗体制剂

Info

Publication number: CN112717129A
Application number: CN201910971802.XA
Authority: CN
Inventors: 罗晓萍; 吴用; 吴晓云; 李志强; 刘育杰; 王盛武; 刘翠华; 李胜峰
Original assignee: Bio Thera Solutions Ltd
Current assignee: Bio Thera Solutions Ltd
Priority date: 2019-10-14
Filing date: 2019-10-14
Publication date: 2021-04-30

Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种抗VEGF抗体制剂。所述抗体制剂靶向作用于人VEGF，能以高亲和力与人VEGF特异性结合，进而抑制新生血管生成，其主要为液体制剂。所述液体制剂可增强含重组抗VEGF人源化单克隆抗体药物的稳定性，延长其在制剂中的保存周期。本发明的制剂具有高稳定性，比如在经过高温40℃放置20天，至少5次循环冻融，25℃放置6个月后，或2～8℃保存至少12个月，仍然保持稳定。本发明的制剂可用于静脉、皮下、眼内、肌肉内或玻璃体注射使用。

Description

抗VEGF抗体制剂

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及抗VEGF抗体制剂及其制备方法以及应用。

背景技术

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)被认为是在生理和病理血管生成中最为关键的因子。VEGF除了是血管生成和脉管生成中的血管生成因子， VEGF还是多向性的生长因子，在内皮细胞存活、血管渗透性和血管舒张、单核细胞趋化性和钙流入中表现出多种生物效应，例如有报道称VEGF对视网膜色素内皮细胞和神经膜细胞有促进细胞分裂效应。大量数据显示VEGF在涉及病理性血管生成的疾病发展中起到关键作用，VEGF mRNA在大部分人类肿瘤中过表达，VEGF在房水中的浓度与在患有糖尿病或其它缺血性视网膜疾病的患者中发现的血管活性增生高度相关，尤其是在年龄相关黄斑病变(AMD)患者中脉络丛新血管形成膜中更甚。VEGF的过表达不一定是湿性 AMD的关键因子，但是无论是在实验模型还是在湿性AMD的病理性血管生成中，都发现存在高水平的VEGF表达。

有相当数量的文献报道，通过中和VEGF，血管新生和血管渗漏可以得到抑制。也有很多文献报道，抑制VEGF可以治疗多种肿瘤。所以抗VEGF抗体或VEGF抑制物是治疗实体瘤和多种眼内新生血管病症和其他与VEGF过表达相关疾病的有效候选物。现有技术中，已商业化的抗VEGF抗体如贝伐珠单抗(Bevacizumab，商品名：

)、雷珠单抗(Ranibizumab，商品名：

)、阿柏西普

康柏西普

然而，抗体作为蛋白质，比传统的无机和有机药物更加复杂。蛋白质药物制剂在保藏过程中容易存在化学不稳定性(如脱酰胺化、外消旋化、水解、氧化、β消除或二硫键交换等等)或者物理不稳定性(如变性、聚集、沉淀或吸附)所导致的降解。抗体制剂的不稳定性，不仅会带来药效的降低或消失，更会对患者的健康产生不利的影响。因此，抗体制剂需要是长期稳定的、含有安全且有效量的药物化合物。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种适用于特定抗体的制剂。

本发明的另一个目的是提供一种储藏和递送中保持稳定的抗体制剂。

本发明的另一个目的是提供可以包含高浓度抗体的稳定的抗体制剂。

本发明的另一个目的是提供适用于眼内施用的抗体制剂。

本发明的另一个目的是提供适用于玻璃体施用的抗体制剂。

本发明的上述目的通过以下技术手段实现：

一方面，本发明提供了抗体制剂，所述制剂含有抗VEGF抗体或其片段，以及缓冲剂。所述抗VEGF抗体或其片段的重链可变区含有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述抗VEGF抗体或其片段的轻链可变区含有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述抗VEGF抗体的重链含有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述抗VEGF抗体的轻链含有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述抗体是人源化全长抗VEGF的IgG1抗体。在一些实施方式中，所述抗体是BAT5906，其具体的情况参见专利201810011151.1。

在一些实施方式中，所述抗体是糖基化的和/或非糖基化的。

在一些实施方式中，所述抗体的量为5～100mg/ml；或为6～90mg/ml；或为6～80mg/ml；或为25～80mg/ml；或为25～50mg/ml。在一些实施方式中，抗体的量如上列举的那些范围内的任一值，例如6mg/ml、12mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、80mg/ml、90 mg/ml或100mg/ml等等。

在一些实施方式中，所述制剂pH为4.0～7.0，抗体在该pH范围内保持稳定。在一些实施方式中，所述制剂的pH为5.0～6.5。在一些实施方式中，所述制剂的pH为5.5～6.5；在一些实施方式中，所述制剂的pH为5.4～6.4。在一些实施方式中，所述制剂的pH为 5.8～6.2。在一些实施方式中，pH是如上列举的那些pH范围内的任一pH值，例如5.5、 5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5等等。

在一些实施方式中，所述缓冲剂选自组氨酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、醋酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂或其组合。在一些实施方式中，所述缓冲剂选自组氨酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、醋酸盐缓冲剂或其组合。在一些实施方式中，所述缓冲剂选自组氨酸盐缓冲剂。在一些实施方式中，组氨酸盐缓冲剂为L-组氨酸和L-组氨酸盐酸盐组成缓冲体系的缓冲剂。

在一些实施方式中，所述缓冲剂的量为约5～50mM；在一些实施方式中，所述缓冲剂的量为约5～30mM；在一些实施方式中，所述缓冲剂的量为约5～20mM；在一些实施方式中，所述缓冲剂的量为约5～15mM；在一些实施方式中，所述缓冲剂的量为约5～10mM。在一些实施方式中，所述缓冲剂的量如上列举的那些范围内的任一值，例如5mM、6mM、 7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17 mM、18mM、19mM、20mM、22mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27 mM、28mM、29mM、30mM等等。在一些实施方式中，所述缓冲剂的量为约10mM。在一些实施方式中，缓冲剂为约10mM的组氨酸盐缓冲剂。

在一些实施方式中，当所述缓冲体系选自两种的组合时，前者与后者在体系中的摩尔比为1:2～2:1；或为1:1。

本发明所述的抗体制剂还进一步含有稳定剂。

在一些实施方式中，所述稳定剂选自海藻糖、蔗糖、甘露醇、氯化钠、山梨醇、脯氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸，或其盐或水合物，或其组合。

在一些实施方式中，所述稳定剂选自蔗糖和/或海藻糖。

在一些实施方式中，所述稳定剂为海藻糖。

在一些实施方式中，所述稳定剂的量为0.5％～20％。在一些实施方式中，所述稳定剂的量约为0.5-15％。在一些实施方式中，所述稳定剂的量约为1％～15％。在一些实施方式中，所述稳定剂的量约为2％～10％；在一些实施方式中，所述稳定剂的量如上列举的那些范围内的任一值，例如10％、9％、8.9％、8.8％、8.7％、8.6％、8.5％、8.4％、8.3％、8.2％、 8.1％、8％、7.9％或7.8％。在一些实施方式中，稳定剂为海藻糖，用量相当于约8.8％的海藻糖二水合物。

本发明的抗体制剂可进一步含有表面活性剂。

在一些实施方式中，所述抗体制剂所选的表面活性剂属于非离子型表面活性剂。

在一些实施方式中，所述的表面活性剂选自吐温和/或泊洛沙姆。

在一些实施方式中，所述的表面活性剂选自吐温20，吐温80和/或泊洛沙姆188。

在一些实施方式中，所述吐温选自吐温20和/或吐温80。

在一些实施方式中，所述表面活性剂选自吐温20。

在一些实施方式中，所述表面活性剂的量为0.001％～0.2％；或为0.01％～0.2％。在一些实施方式中，所述表面活性剂的量为0.01％～0.1％。在一些实施方式中，所述表面活性剂的量如上列举的那些范围内的任一值。在一些实施方式中，所述表面活性剂的量为0.04％。在一些实施方式中，表面活性剂为约0.04％的吐温20。

在一些实施方式中，所述制剂含有以下组分：

(1)5～100mg/ml的抗VEGF抗体

(2)5～50mM缓冲剂

(3)0.5-20％稳定剂

(4)0.001％～0.2％表面活性剂

(5)注射用水；

所述制剂的pH为4.0～7.0。

在另一些实施方式中，所述制剂含有以下组分：

(1)6～90mg/ml的抗VEGF抗体

(2)5～30mM缓冲剂

(3)0.5％～10％稳定剂

(4)0.01％～0.2％表面活性剂

(5)注射用水；

所述制剂的pH为5.0～6.5。

其中，所述缓冲剂、稳定剂、表面活性剂如上所述。

在一些实施方式中，所述制剂含有以下组分：

(1)6～80mg/ml的抗VEGF抗体

(2)10～20mM组氨酸盐缓冲剂

(3)2％～10％海藻糖

(4)0.01％～0.1％吐温20

(5)注射用水

所述制剂的pH为5.5～6.5。

在一些实施方式中，所述制剂含有以下组分：

(1)6～80mg/ml的抗VEGF抗体

(2)10mM组氨酸盐缓冲剂

(3)2％～10％海藻糖

(4)0.01％～0.1％吐温20

(5)注射用水

所述制剂的pH为5.5～6.5；

在另一些实施方式中，所述制剂含有以下组分：

(1)约6、12、25、50或80mg/ml的抗VEGF抗体

(2)约10mM组氨酸盐缓冲剂

(3)约9％海藻糖

(4)约0.04％吐温20

(5)注射用水

所述制剂的pH为6.0±0.4；

在另一些实施方式中，所述制剂含有以下组分：

(1)约6或12或25或50或80mg/ml的抗VEGF抗体

(2)约10mM组氨酸盐缓冲剂

(3)约8％海藻糖

(4)约0.04％吐温20

(5)注射用水

其中，所述制剂的pH为6.0±0.4。

在一些实施方式中，所述抗体制剂的渗透压为150～400mOsm/Kg。在一些实施例中，所述抗体制剂的渗透压为200～350mOsm/Kg。在另一些实施方式中，所述抗体制剂的渗透压为260～340mOsm/Kg。

本发明所述抗体制剂的施用方式为静脉、皮下、眼内或肌肉内等等施用。在一些实施方式中，所述的眼内施用为通过注射施用，或者通过直接滴入的方式施用。在一些实施方式中，本发明的含水液体抗体制剂施用方式为眼内注射如玻璃体注射。

本发明提供的抗体制剂为液体制剂。在一些实施方式中，抗体制剂的溶剂为水。在一些实施方式中，抗体制剂的溶剂为无菌注射用水。

本发明另一方面提供了含有上述抗体制剂的递送装置。在一些实施方式中，所述递送装置是预填充注射器，预填充注射器具有方便性、准确性、无菌性和安全性，可用于诸如经玻璃体内等部位递送来施用所述抗体制剂。在一实施方式中，所述递送装置为具有随附或一体式针头的预填充注射器。在另一些实施方式中，所述递送装置为不具有随附针头的预填充注射器。在一实施方式中，所述递送装置为自动注射装置。其它可选的递送装置包括支架、导管、微针头及可植入控释装置等等。

本发明另一方面提供了所述抗体制剂，或所述递送装置在制备治疗、预防或缓解VEGF相关的疾病的药物用途。

本发明另一方面提供一种治疗VEGF相关疾病的方法，所述方法包括对患者施用所述抗体制剂。

在一些实施方式中，所述VEGF相关的疾病为VEGF过表达相关的疾病。

在一些实施方式中，所述抗体制剂可以治疗的疾病选自：视网膜分支静脉阻塞、视网膜中央静脉阻塞、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜病变、病理性近视性继发脉络膜新生血管、年龄相关性黄斑变性、新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、晶体后纤维增生症、乳腺癌、肺癌、胃癌、食管癌、结肠直肠癌、肝癌、卵巢癌、昏迷、男性细胞瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫内膜增生、子宫内膜异位、纤维肉瘤、绒毛膜癌、头颈癌、鼻咽癌、喉癌、肝母细胞瘤、卡波西肉瘤、黑素瘤、皮肤癌、血管瘤、海绵状血管瘤、血管母细胞瘤、胰腺癌、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、神经鞘瘤、少突胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、成骨肉瘤、平滑肌肉瘤、泌尿道癌、甲状腺癌、肾母细胞瘤、肾细胞癌、前列腺癌、与斑痣性错构瘤病相关的异常血管增生、水肿、麦格综合征、类风湿性关节炎、银屑病或动脉粥样硬化。

在一些实施方式中，所述抗体制剂可以治疗的疾病选自：年龄相关性黄斑变性、病理性近视继发脉络膜新生血管、糖尿病性视网膜病变、视网膜分枝静脉阻塞、视网膜中央静脉阻塞或糖尿病性黄斑水肿。

在一些实施方式中，所述患者是哺乳动物。

在一些实施方式中，所述哺乳动物是人。

本发明另一方面提供了所述抗体制剂的制备方法，其包含以下步骤：

(1)配制缓冲剂溶液；

(2)通过UF/DF超滤，采用步骤(1)制备的缓冲剂溶液对抗体进行超滤换液，然后进行浓缩，得到抗体溶液；

(3)配制含有稳定剂和/或表面活性剂的辅料母液，将所述辅料母液添加到步骤(2) 制备的抗体溶液中，得到抗体制剂。

在一些实施方式中，所述抗体制剂的制备方法，步骤还包括：

对步骤(3)中制备得到的抗体制剂进行除菌过滤。

向步骤(2)中制备得到的抗体溶液添加特定量的表面活性剂以达到所要求表面活性剂的浓度。

在一些实施方式中，所述抗体制剂的制备方法，其包含以下步骤：

(1)配制缓冲剂溶液；

(3)配制含有4倍目标浓度的稳定剂和/或4倍目标浓度的表面活性剂的辅料母液，将辅料母液添加到步骤(2)制备的抗体溶液中，使其辅料浓度最终达到目标浓度，并使其抗体浓度达到最终目标浓度。若辅料母液添加完毕后抗体浓度还需稀释，则使用含有稳定剂、表面活性剂和缓冲剂的溶液进行稀配处理，使辅料的浓度保持不变。

(4)对(3)中制备完成的抗体溶液进行除菌过滤。

(1)配制组氨酸盐缓冲剂；

(2)通过UF/DF超滤，采用步骤(1)制备的缓冲剂对抗体进行超滤换液，然后进行浓缩，得到抗体溶液；

(3)配制含有4倍目标浓度的海藻糖和4倍目标浓度的吐温20的辅料母液，将辅料母液添加到步骤(2)制备的抗体溶液中，使其辅料浓度最终达到目标浓度，使其抗体浓度达到最终目标浓度。若辅料母液添加完毕后抗体浓度还需改变，则使用含有海藻糖和吐温20的缓冲剂进行稀配处理，使辅料的浓度保持不变。

(4)对(3)中制备完成的抗体溶液进行除菌过滤。

在一些实施方式中，所述方法还包括除菌过滤后填充到容器。

辅料以液体的形式添加抗体溶液中，效果优于以固体的形式添加至抗体溶液中。

本发明的制剂可适用于玻璃体注射使用。

本发明的抗体制剂可增强含大浓度范围(低浓度到高浓度)的重组抗VEGF人源化单克隆抗体药物的稳定性，延长其在液体制剂中的保存周期，以满足对玻璃体注射不同剂量抗体的需要。

本发明的抗体制剂在经过高温40℃放置20天，至少5次循环冻融，25℃放置6个月后，2～8℃保存至少12个月，或24个月，仍然保持稳定。

附图说明

图1为实施例1中不同pH和缓冲剂在50℃条件下SEC单体纯度、IEC主峰变化趋势图。

图2为实施例2中不同pH和缓冲剂在50℃条件下SEC单体纯度、IEC主峰变化趋势图。

图3为实施例4中不同稳定剂在40℃条件下SEC单体纯度、IEC主峰变化趋势图。

图4为实施例4中不同稳定剂在光照条件下SEC单体纯度、IEC主峰变化趋势图。

图5为实施例4中不同氨基酸稳定剂在40℃条件下SEC单体纯度、IEC主峰变化趋势图。

图6为实施例4中不同氨基酸稳定剂在光照条件下SEC单体纯度、IEC主峰变化趋势图。

图7为实施例4中两种稳定剂在50℃条件下SEC单体纯度、40℃条件下IEC主峰变化趋势图。

图8为实施例4中两种稳定剂混合蛋白溶液在光照条件下的SEC单体纯度、IEC主峰变化趋势图。

图9为实施例5中含不同含量吐温样品振荡后浊度随时间的变化趋势图。

图10为实施例5中含不同含量吐温样品稀释后微粒数量。

图11为实施例6中含不同量的海藻糖蛋白溶液在40℃条件下的SEC单体纯度、IEC主峰变化趋势图。

图12为实施例7中不同pH在40℃条件下蛋白质量随着时间的变化趋势图。

图13为实施例7中不同pH在25℃条件下蛋白质量随着时间的变化趋势图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

需要说明的是，本发明中，涉及到组分的“％”。具体指重量体积(w/v)百分比，其中重量单位可以为g，体积单位可以为ml。比如溶液中含1％稳定剂表示100ml溶液中含有 1g稳定剂，或稳定剂含量为0.01g/ml。

“约”或“大约”指相关技术领域技术人员容易知道的相应数值的常规误差范围。在一些实施方式中，本文中提到“约”或“大约”指所描述的数值以及其±10％、±5％、± 1％或±0.1％的范围。

术语“缓冲剂”，在一些文献中，也被称为缓冲系统或缓冲体系，其包括但不限于有机酸盐，如琥珀酸、醋酸、柠檬酸，抗坏血酸，葡糖酸，碳酸，酒石酸或苯二甲酸及其盐；Tris，thomethamine盐酸盐，或磷酸盐缓冲剂。此外，氨基酸及其盐也可以用作缓冲剂。这样的氨基酸组分包括但不限于甘氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、谷氨酸或天冬氨酸。在一些实施方式中，缓冲剂为组氨酸盐缓冲剂。

本发明中缓冲剂的量，是指组成缓冲剂的缓冲体系中缓冲对的总量。在一些实施方式中，采用摩尔浓度作为缓冲剂的量的单位，其数值指缓冲剂的缓冲体系中缓冲对的摩尔浓度。如，由L-组氨酸和L-组氨酸盐酸盐组成的组氨酸盐缓冲剂作为缓冲剂时，给定浓度的组氨酸盐缓冲剂(如10mM)是L-组氨酸和L-组氨酸盐酸盐的组合浓度(如L-组氨酸为5mM，L-组氨酸盐酸盐为5mM；或者L-组氨酸为6mM，L-组氨酸盐酸盐为4mM。)

术语“稳定剂”包括但不限于单糖，例如果糖，麦芽糖，半乳糖，葡萄糖，山梨糖等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；和糖醇，如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨糖醇(葡萄糖醇)等；离子稳定剂，它们包括盐，如NaCl或氨基酸组分如精氨酸-HCl、脯氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸。

本发明制剂中稳定剂有调节渗透压的作用，故该稳定剂也可称作渗透压调节剂。

术语“表面活性剂”包括但不限于吐温(Tween，如吐温20和吐温80)；泊洛沙姆 (例如泊洛沙姆188)；Triton；十二烷硫酸钠(SDS)；月桂硫酸钠；辛基配糖物钠盐；月桂基磺基甜菜碱、肉豆蔻基磺基甜菜碱、亚油烯基磺基甜菜碱或硬脂基磺基甜菜碱；月桂基肌氨酸、肉豆蔻基肌氨酸、亚油烯基肌氨酸或硬脂基肌氨酸；亚油烯基甜菜碱、肉豆蔻基甜菜碱或鲸蜡基甜菜碱；月桂酰胺基丙基甜菜碱、椰油酰胺基丙基甜菜碱、亚油酰胺基丙基甜菜碱、肉豆蔻酰胺基丙基甜菜碱、棕榈酰胺基丙基甜菜碱或异硬脂酰胺基丙基甜菜碱 (例如月桂酰胺基丙基)；肉豆蔻酰胺基丙基二甲胺、棕榈酰胺基丙基二甲胺或者异硬脂酰胺基丙基二甲胺；甲基椰油酰基牛磺酸钠或甲基油基牛磺酸二钠；聚乙二醇，聚丙二醇，和乙烯与丙烯二醇的共聚物(例如Pluronics，PF68等)；等等。在一些实施方式中，表面活性剂为吐温20(Tween 20)。

吐温也称作聚山梨酯(例如，吐温20称作聚山梨酯20，吐温80称作聚山梨酯80)。

本发明所述的制剂可以用所述辅料或其水合物配制。比如组氨酸盐酸盐，又称盐酸组氨酸，可以是无水组氨酸盐酸盐，也可以是组氨酸盐酸盐水合物，如组氨酸盐酸盐一水合物。如所述的“5mM组氨酸盐酸盐”，为5mmol组氨酸盐酸盐或组氨酸盐酸盐一水合物溶解在溶剂里形成1L溶液；1.06mg组氨酸盐酸盐一水合物，包括1.06mg组氨酸盐酸盐一水合物或相应量的组氨酸盐酸盐。另如海藻糖，可以是无水海藻糖，也可以是海藻糖水合物，如海藻糖二水合物。如所述的“8％海藻糖”，为8g海藻糖(或相应量的海藻糖水合物 (如8.8g海藻糖二水合物))溶解在溶剂里形成100ml溶液，有特别说明除外。

术语“治疗有效量”是可以治疗疾病或病症的量。

本发明的抗体制剂对人体的施用量会随着患者的年龄、体重、性别、用药形态、健康状况及疾病危重程度而不同。

在一些实施方式中，本发明的抗体制剂可施用在患有VEGF过表达相关的疾病的患者上。在一些实施方式中，本发明的抗体制剂可施用在确诊为湿性年龄相关性黄斑变性、目前仍有活动性病变的患者上。其中，活动性病变为患者黄斑区存在以下任意病变：①视网膜内液体；②视网膜内脂质渗出；③视网膜下液体；④视网膜下出血；⑤视网膜色素上皮脱落；⑥脉络膜新生血管。在一些实施方式中，本发明的抗体制剂可施用在所有类型病灶总面积≤30mm²(12个视盘面积)的患者上。在一些实施方式中，本发明的抗体制剂可施用在最佳矫正视力≤70个字母(ETDRS视力表)(相当于snellen视力≤20/40)的患者上。

在一些实施方式中，针对VEGF过表达的相关疾病，抗体的用量为约0.3mg/眼～约4.0mg/眼。在一些实施方式中，针对VEGF过表达的相关疾病，抗体的用量为约0.6mg/眼～约2.5mg/眼。在一些实施方式中，针对VEGF过表达的相关疾病，抗体的用量为约 1.25mg/眼。在一些实施方式中，抗体的单位剂量约为0.3mg/眼，或0.6mg/眼，或1.25mg/ 眼，或2.5mg/眼，或4.0mg/眼。在一些实施方式中，抗体的单位剂量约为1.25mg/眼。

在一些实施方式中，针对VEGF过表达的相关疾病，对于施加于眼部的抗体制剂，给药体积约为0.01ml/眼～0.5ml/眼；在一些实施方式中，针对VEGF过表达的相关疾病，对于施加于眼部的抗体制剂，给药体积约为0.1ml/眼～0.3ml/眼；在一些实施方式中，针对VEGF过表达的相关疾病，对于施加于眼部的抗体制剂，给药体积约为0.2ml/眼。施加于眼部包括眼内注射、玻璃体内注射。

术语“哺乳动物”指分类为哺乳动物的任意一种动物，包括但不限于人、狗、马、猫、兔、猪、牛、鼠等。在一些实施方式中，哺乳动物是人。

患者疾病“治疗”指的是(1)阻止疾病在有倾向性或还没表现疾病症状的患者中出现；(2)抑制疾病或症状或阻止其发展；或(3)减轻疾病或症状或致其退化。

本文的“稳定性”、“稳定”，是指包含抗体的液体制剂中，抗体(包括其抗体片段)在给定的生产、制备、运输和/或贮存条件下不发生、或仅极少地发生聚集、降解或片段化。“稳定”制剂在给定的生产、制备、运输和/或贮存条件下保持生物学活性。可通过例如 SEC-HPLC、IEC-HPLC、CE-SDS(NR)、灯检及浑浊度、不溶性颗粒、DLS检测粒子粒径等技术测量的所述制剂的聚集、降解或片段化程度等，从而评估所述抗体)的稳定性。在一些实施方式中，“稳定”是指在一定贮存条件下经过一定时间单体纯度的下降不高于 10％，5％或2％。

本发明下面的实施例中的检测方法如下：

SEC-HPLC的分析方法(简称SEC)：

1，准备液相色谱系统和TOSOH生物科技TSK-GEL G3000SWXL色谱柱(柱规格为 7.8×300mm，5μm)。设置紫外检测器的波长为280nm，柱温设定为30℃或者室温，调流动相流速0.5ml/min，平衡约30～60min至基线平稳。

2，进样，记录色谱图，积分后按照峰面积归一法计算供试液的单体或多聚体百分含量。

IEC-HPLC的分析方法(简称IEC)：

1，准备液相色谱系统和ProPacTMWCX弱阳离子交换分离柱。以流动相A和流动相 B各50％，0.3ml/min初始条件平衡色谱柱，紫外检测器波长设定为280nm，柱温为30℃，待压力稳定后缓慢调流速至0.8ml/min至压力平稳，后用84％流动相A，平衡约30～60 min至基线平稳。

2，进样，对检测的色谱图进行手动积分，按峰面积归一化法分别计算酸性峰、主峰、碱性峰的百分含量。

CE-SDS(NR)(CE-SDS非还原)的分析方法：

毛细管电泳仪采用Agilent的CE 7100，样品进样后，记录色谱图，积分处理数据，采用面积归一化方法计算单体峰的百分含量。

灯检：使用澄明度检测仪，在光源1000～1500Lx处上下翻转，肉眼观察所检查的样品是否有乳光或可见异物。

浑浊度(OD340值)：使用紫外分光光度计，在UV340nm处进行样品检测，检测结果记录为样品浊度OD340。

不溶性颗粒：使用HIAC不溶性微粒检测仪或Flowcam不溶性微粒检测仪，对不同颗粒大小肉眼不可见的微粒进行检测。

DLS检测粒子粒径：使用DLS(动态光散射检测器)对样品进行颗粒大小检测。

本发明提供了一种含VEGF抗体的液体制剂。具体而言，本发明所提供的制剂为pH4.0～7.0的液体含水制剂，在一些实施方式中，该制剂含有5～90mg/ml浓度的抗体，并且具有增强含重组抗VEGF人源化单克隆抗体等VEGF拮抗剂抗体药物的稳定性作用。在一些实施方式中，本发明的制剂包括以下成分：能以高亲和力、低解离速度、高中和能力结合人VEGF的抗体，缓冲剂，包括L-组氨酸和组氨酸盐缓冲剂；渗透压调节剂，海藻糖、蔗糖；表面活性剂，包括吐温20。

在一些实施方式中，抗体制剂中的抗体为抗VEGF抗体或其片段。在一些实施方式中，所述抗VEGF抗体或其片段的重链可变区含有如SEQ ID NO:1所示的的氨基酸序列，所述抗VEGF抗体或其片段的轻链可变区含有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗VEGF抗体的重链含有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述抗VEGF 抗体的轻链含有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述抗体在所述液体含水药物制剂中的浓度为大约6～90mg/ml；在一些实施方式中，抗体在液体含水药物制剂中的浓度约为25～80mg/ml；在一些实施方式中，抗体在液体含水药物制剂中的浓度约为6mg/ml，或12mg/ml，或25mg/ml，或 50mg/ml，或80mg/ml，或任何两个浓度之间的范围，包括端点值。

在一些实施方式中，本发明提供了不同缓冲剂的含水抗体制剂，包括琥珀酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、组氨酸盐缓冲剂、醋酸盐缓冲剂等和注射用水，pH为大约5.0～7.0。

本发明提供液体含水抗体制剂，所述制剂包括缓冲剂。所述缓冲剂包括组氨酸盐缓冲剂、醋酸盐缓冲剂或磷酸盐缓冲剂。在本发明的制剂的一些方案中，作为缓冲剂的是组氨酸盐缓冲剂，组氨酸盐缓冲剂的浓度范围均为5～15mM，在一些方案中，组氨酸盐缓冲剂的浓度约为10mM。

本发明提供液体含水抗体制剂，所述制剂包括稳定剂，以便调节液体体系的渗透压，稳定所述抗体。将所述稳定剂添加到所述抗体中，其用量可以根据需要的所述制剂的等渗而改变。在一些实施方式中，被作为渗透压调节剂用在所述制剂中的是海藻糖，在本发明的一些方案中，所述稳定剂包括3.0％～10％蔗糖，和/或3％～10％海藻糖，或5％～10％海藻糖，比如约5％，6％，7％，8％，9％，10％或任何两个浓度之间的范围，包括端点值。

固体状态下，海藻糖通常以海藻糖二水合物存在的，所以在一些实施方式中，配制制剂时采用海藻糖二水合物，也可以采用其他形式的海藻糖配制。

本发明提供液体含水抗体制剂，所述制剂包括表面活性剂。典型的表面活性剂包括非离子表面活性剂，如吐温20。表面活性剂能减少所述制备的抗体的聚集和/或减少颗粒在所述制剂中的形成和/或减少吸附。在一些实施方式中，所述制剂以吐温20为表面活性剂。在一些实施方式中，所述制剂包括大约含0.01％～0.2％的吐温20，或约0.01％～0.1％。在一些实施方式中，在本发明的制剂中存在大约0.04％的吐温20。

在一些实施方式中，本发明提供的液体制剂的施用方式为静脉、皮下、眼内或肌肉内施用；在一些实施方式中，液体制剂的施用方式为眼内施用；在一些实施方式中，液体制剂的施用方式为玻璃体内注射施用。若该制剂用于静脉注射、眼内注射或者玻璃体内注射，液体制剂的渗透压是一个关键参数。在一些实施方式中，抗体制剂的渗透压约为150～400mOsm/Kg；在一些实施方式中，抗体制剂的渗透压约为200～350mOsm/Kg；在一些实施方式中，抗体制剂的渗透压约为260～340mOsm/Kg。

在一些实施方式中，本发明的液体制剂能够在抗体浓度约为6mg/ml～80mg/ml的范围内的任意浓度，渗透压维持在约为260～340mOsm/Kg。

在一些实施方式中，所述抗体制剂含有以下组分：5～100mg/ml的抗VEGF抗体、 5～50mM缓冲剂、0.5～20％稳定剂、0.001％～0.2％表面活性剂、注射用水，所述制剂的 pH为4.0～7.0。在一些实施方式中，所述抗体制剂含有以下组分：6～90mg/ml的抗VEGF 抗体、5～30mM缓冲剂、0.5％～10％稳定剂、0.01％～0.2％表面活性剂、注射用水，所述制剂的pH为5.0～6.5。在一些实施方式中，所述抗体制剂含有以下组分：6～80mg/ml的抗 VEGF抗体、10～20mM组氨酸盐缓冲剂、2％～10％海藻糖、注射用水，所述制剂的pH为 5.5～6.5。在一些实施方式中，所述抗体制剂含有以下组分：6～80mg/ml的抗VEGF抗体、 10mM组氨酸盐缓冲剂、2％～10％海藻糖、0.01％～0.1％吐温20、注射用水，所述制剂的 pH为5.5～6.5。在一些实施方式中，所述制剂含有以下组分：约6、12、25、50或 80mg/ml的抗VEGF抗体、约10mM组氨酸盐缓冲剂、约9％海藻糖(可用约10％海藻糖二水合物配制)、约0.04％吐温20、注射用水，所述制剂的pH为5.6～6.4。在一些实施方式中，所述制剂含有以下组分：约6、12、25、50或80mg/ml的抗VEGF抗体、约10mM 组氨酸盐缓冲剂、约8％海藻糖(可用约8.8％海藻糖二水合物配制)、约0.04％吐温20、注射用水，其中，所述制剂的pH为5.6～6.4。

综上所述，本发明提供的液体含水抗体制剂组合方案中，所述制剂缓冲剂包括组氨酸盐缓冲剂，比如L-组氨酸盐缓冲剂。所述制剂的稳定剂包括海藻糖和/或蔗糖。所述制剂的表面活性剂包括吐温20。所述制剂的pH值范围在4.0～7.0之间。所述制剂的渗透压范围在150～400mOsm/Kg之间。在本发明的一种方案中，被作为缓冲体系的是组氨酸盐缓冲剂，浓度范围为5～15mM，或约为10mM，pH值范围在4.0～7.0，或者pH值为5.6～6.4。

本发明提供液体含水药物制剂，包括适合治疗用途的抗体，这种药物制剂便于施用，并且含有高蛋白浓度，主要用于治疗由VEGF引起的病症。在一种实施方案中，所述药物制剂具有增强稳定性的作用。在另一种实施方案中，本发明的制剂在经过至少5次冻融循环后是稳定的。在另一种实施方案中，本发明的制剂，经过室温中放置1个月后保持稳定。在另一种实施方案中，本发明的制剂，在2～8℃中至少能保持24个月的稳定。在另一种实施方案中，所述抗体针对人VEGF。在另一种实施方案中，所述抗体是重组抗VEGF人源化单克隆抗体BAT5906。

本发明提供含水的药用制剂，包括有效量的抗体成分，缓冲剂是组氨酸盐缓冲剂，渗透压稳定剂为蔗糖或海藻糖，表面活性剂吐温20，pH为大约4.0～7.0。在本发明的一种实施方案中，所述制剂是适合于进行玻璃体注射。在本发明的一种实施方案中，所述抗体在所述液体含水药物制剂中的浓度约为80mg/ml。

本发明还提供一种治疗VEGF阳性相关疾病的方法，所述方法包括对患者施用所述抗体制剂。

在本发明的一些实施方案中，所制试剂是装在西林瓶的含有表1所示成分的0.2ml的溶液。在一些实施方式中，其中制剂包含的成份可以为25mg/ml有效量的抗VEGF抗体；

9％海藻糖，0.04％吐温20，10mM组氨酸盐缓冲剂(按表1制剂A处方配制)。在另一些实施方式中，其中制剂包含的成份可以为6，12，25，50，80mg/ml有效量的抗VEGF抗体；8％海藻糖，0.04％吐温20，10mM组氨酸盐缓冲剂(按表1制剂B处方配制)。在另一些实施方式中，其中制剂包含的成份可以为50mg/ml，80mg/ml有效量的抗VEGF抗体；8.5％海藻糖，0.04％吐温20，10mM组氨酸盐缓冲剂。

表1重组抗VEGF人源化单克隆抗体BAT5906制剂列表

实施例

实施例1：缓冲剂及pH筛选研究

制备3个不同的pH值(pH 5.5、pH 6.0、pH 6.5)样品，用三种缓冲剂：10mM磷酸盐缓冲剂，10mM柠檬酸盐缓冲剂，10mM组氨酸盐缓冲剂，蛋白(实施例中蛋白指 BAT5906)浓度为8mg/ml，具体组成成分见表2。在高温50℃的条件下观察20天，于第 0天(0D)、第10天(10D)、第20天(20D)取样进行SEC-HPLC、IEC-HPLC的检测，结果见表3，图1。

表2缓冲剂组成信息

表3 50℃条件下不同pH样品SEC、IEC随着时间的变化情况

从表3的SEC-HPLC数据可知，不同pH下的样品SEC单体纯度均随着时间的延长而下降，多聚体和片段则出现增多的趋势。从图1的SEC单体纯度变化趋势图可知，样品在 PB缓冲剂中SEC值不如样品在柠檬酸盐缓冲剂和组氨酸盐缓冲剂中稳定。

从图1的IEC主峰变化趋势图可以看出，在不同pH和缓冲剂下，样品的主峰下降趋势各不同，按样品主峰下降快慢顺序排列，有以下规律：pH6.0的样品主峰下降速度略慢于pH5.5和pH6.5的样品；缓冲剂IEC主峰下降速度有以下规律：组氨酸盐缓冲剂＜柠檬酸盐缓冲剂＜磷酸盐缓冲剂。从表2的IEC酸区变化数据可以看出，酸区变化快慢有以下顺序：His6.0＜His5.5＜NMS6.0＜His6.5＜PB6.0。同时还可以看出，不同pH下的蛋白溶液的IEC主峰含量随着时间的延长而下降，酸峰含量随着时间的延长而增多，碱峰含量变化不大。从图1可以看出，pH 6.5，pH 5.5样品的IEC主峰含量的下降速度快于pH6.0样品；样品在组氨酸盐缓冲剂比柠檬酸盐缓冲剂和PB缓冲剂中IEC主峰含量下降速度要慢。抗体在pH为5.5～6.5的柠檬酸盐缓冲剂跟组氨酸盐缓冲剂中，均能保持比较好的稳定性；pH 6.0时表现最佳。组氨酸盐缓冲剂稍好于柠檬酸盐缓冲剂。根据上述结果可以看出，pH6.0 的组氨酸盐缓冲剂可以作为该样品的较为稳定缓冲剂。

从实验结果可知，目的蛋白在不同pH值的缓冲剂中表现出不同的稳定性，但当pH值在某一个范围内波动时，并不会对目的蛋白的质量产生显著性的作用。且考虑到长期稳定性考察要求以及产业化要求，制剂pH值必须提供一个有效的范围，而非一个固定值。

根据两个关键质量属性的变化情况考察分析结果可知，当pH高于6.5和低于5.5时， BAT5906抗体的质量下降较快，表现不稳定。综上研究初步判定，在组氨酸盐缓冲剂中pH6.0相对稳定。

实施例2.缓冲剂筛选试验

不同缓冲剂对蛋白质量产生不一样的稳定作用。本研究选择单抗制剂中常用的醋酸盐缓冲剂(10mM)，其pH范围为5.0～6.0之间，与pH6.0的琥珀酸盐缓冲剂(10mM)及 pH筛选实验中结果较好的pH6.0的组氨酸盐缓冲剂(10mM)做对比试验，考察目的蛋白 (以蛋白浓度10mg/ml为例)在不同缓冲剂中质量的变化情况。具体配方见表4，在50℃的条件下进行试验，于第0天(0D)、第5天(5D)、第10天(10D)、第20天 (20D)、第30天(30D)对试验后的样品进行SEC-HPLC、IEC-HPLC的检测。结果见表5和图2。

表4缓冲剂组成信息

表5 50℃条件下不同缓冲剂中蛋白SEC、IEC随时间的变化情况

从表5数据和图2可以看出，在所选取的三种不同缓冲剂中，目的蛋白变化速率略有不同，在SEC-HPLC方面，组氨酸盐缓冲剂和琥珀酸盐缓冲剂的多聚体增加略慢于醋酸盐缓冲剂。蛋白在醋酸盐缓冲剂pH5.0，5.5，6.0这三个不同pH下，SEC单体纯度下降均快于组氨酸与琥珀酸盐缓冲剂，主要表现为聚体增多较快。

在IEC-HPLC方面，蛋白在组氨酸和琥珀酸盐缓冲剂中比在醋酸盐缓冲剂中主峰下降速率要慢。蛋白在醋酸盐缓冲剂pH5.0，5.5，6.0这三个不同pH下，在醋酸pH5.5缓冲剂中较好，但IEC主峰下降速率还是快于组氨酸与琥珀酸盐缓冲剂，表现为酸区与碱区的增加较快。由此，选择组氨酸和琥珀酸盐缓冲剂作为该制剂的一种相对较好的缓冲剂。

综合pH及缓冲剂筛选实验的实验结果也可以确定，组氨酸盐缓冲剂是可以作为目的蛋白的稳定缓冲剂的。

实施例3缓冲剂浓度筛选

分别制备10mM、20mM、30mM组氨酸盐缓冲剂，pH为6.0。将BAT5906超滤换液至该3组缓冲剂中，蛋白浓度为10mg/ml。样品除菌过滤后，分别在40℃放置5，10，20， 30天后进行检测和25℃放置1，2，3个月进行后进行检测。实验结果如下：

表6 40℃-SEC结果

表7 40℃-IEC结果

表8 25℃-SEC试验结果

表9 25℃-IEC实验结果

从上表结果可以看出，缓冲剂浓度在10～30mM之间，蛋白均有较好的稳定性。对比之下，10mM组氨酸盐缓冲剂的效果较好，因此可考虑采用10mM的组氨酸盐缓冲剂。

实施例4：稳定剂筛选研究

辅料是制剂处方中除了活性成分之外的其他所有组分。本节所述的辅料主要是指，提供专属性作用的稳定剂、增溶剂、渗透压调节剂等成分。

稳定剂的筛选

选用稳定剂海藻糖、蔗糖、甘露醇、氯化钠、山梨醇及麦芽糖，制备含这几种稳定剂的在10mM组氨酸盐缓冲剂(以下简称His)中的蛋白溶液(以蛋白浓度55mg/ml为例)，具体配方见表10，实验结果见表11和图3、4。将样品进行高温实验，于第0天(0D)、第5天(5D)、第10天(10D)、第20天(20D)取样检测，及光照实验，于第0天 (0D)、第5天(5D)、第10天(10D)、第14天(14D)取样检测，比较出对样品稳定性较好的样品。本实施例中海藻糖重量百分比是以海藻糖二水合物的重量计算的百分比。

表10不同稳定剂溶液配方

表11 40℃条件下含有不同稳定剂的样品随着时间的变化情况

从40℃SEC实验结果看，样品6(含麦芽糖)SEC变化最快，说明样品中加入还原糖麦芽糖，对蛋白稳定性较差。其余样品的SEC变化相当。

从40℃IEC实验结果看，同样是样品6(麦芽糖)主峰下降最快，其余稳定剂变化速度相当。其中样品4(氯化钠)相对较好。

表12光照条件下含有不同稳定剂的样品随着时间的变化情况

从光照实验结果来看，SEC方面样品6(麦芽糖)主峰下降最快，其次为样品4(氯化钠)，其余样品变化趋势接近。

IEC方面样品6(麦芽糖)主峰下降最快，其余样品主峰下降接近。

从高温及光照实验结果来看，海藻糖对样品的稳定性并不会带来像麦芽糖一样的加快样品降解的影响，是可以保持样品稳定存放的。因此，在上述几种稳定剂中选择海藻糖作为合适的稳定剂。

氨基酸稳定剂筛选实验

选用氨基酸作为稳定剂，制备含这几种稳定剂的在10mM组氨酸盐缓冲剂(以下简称 His)中的蛋白溶液(以蛋白浓度77mg/ml为例)，具体配方见表13。将样品进行高温实验，于第0天(0D)、第5天(5D)、第10天(10D)、第20天(20D)取样检测，及光照实验，于第0天(0D)、第5天(5D)、第10天(10D)取样检测，比较出对样品稳定性较好的样品。具体实验结果见表13，14及图5～6。

表13不同稳定剂溶液配方

表14 40℃条件下含有不同稳定剂的样品随着时间的变化情况

从40℃SEC，IEC结果可知，处方3(甘氨酸)较差，其余差别并不是特别大，处方 5(海藻糖)与处方6(蔗糖)稍占优势。说明在高温条件下，使用海藻糖是不会影响样品稳定性的。

表15光照条件下含有不同稳定剂的样品随着时间的变化情况

从光照SEC结果可知，样品4号(甲硫氨酸)，7号(海藻糖+甲硫氨酸)，8号(蔗糖+甲硫氨酸)，3号(甘氨酸)在光照条件下，SEC单体纯度下降最慢，聚体增加最慢，而5号(海藻糖)，6号(蔗糖)SEC主峰下降速度并没有占优势，说明甲硫氨酸及甘氨酸对于样品在光照条件下，有一定的保护作用。

从光照IEC结果可知，样品4号(甲硫氨酸)，7号(海藻糖+甲硫氨酸)，8号(蔗糖+甲硫氨酸)，3号(甘氨酸)在光照条件下，IEC主峰下降最慢，而5号(海藻糖)， 6号(蔗糖)SEC主峰下降速度并没有占优势，说明甲硫氨酸及甘氨酸对于样品在光照条件下，有一定的保护作用。从光照方面考虑，是可以选择这些作为辅料的。

综合光照及高温实验结果，3号(甘氨酸)在光照条件下能保护样品，降低样品SEC，IEC主峰下降速率，但高温条件下表现较差，样品主峰下降速度较快。而甲硫氨酸则在光照时，保护蛋白优势较明显，在高温时与海藻糖相近。考虑到成品会避光保存，可以不选择甲硫氨酸作为稳定剂。综合上述稳定剂筛选实验及加速长期稳定性的数据显示，选择海藻糖作为稳定剂，是能使成品在2～8℃条件下稳定存放2年及以上的。

两种稳定剂混合筛选试验

为考察不同稳定剂浓度对蛋白的影响进行实验，以确定合适的稳定剂浓度。设定不同含量的海藻糖(本文表格中海藻糖重量百分比均为以海藻糖二水合物重量计算的百分比) 与氯化钠混合，在高温50℃、40℃下考察。由于考虑到该注射液为玻璃体注射，需要注意样品的渗透压，经计算和测定，在10mM组氨酸盐缓冲剂中的该蛋白需要加入10％海藻糖渗透压能使蛋白浓度小于或等于25mg/ml的蛋白溶液达到渗透压240～360mmol/L范围，本实验以5mg/ml的蛋白浓度为例。由于稳定剂筛选试验中氯化钠能降低高温条件下IEC酸区的增加，且0.9％氯化钠渗透压也能达到血浆渗透压，于是选择海藻糖和氯化钠以不同比例且达到渗透压混合的方式进行试验，高温条件下放置第0天(0D)、第10天(10D)、第20天(20D)，以及光照条件下放置第0天(0D)、第1周(1W)、第2周(2W)、第3周(3W)，取样进行SEC-HPLC蛋白质纯度、IEC-HPLC电荷异构体分析，稳定剂具体配方见表16。实验结果见表17，表18和图7，图8。

表16两种稳定剂混合溶液配方表

表17高温(50℃与40℃)条件下，样品随着时间的变化情况

从SEC-HPLC数据可知，高温50℃条件下，处方1(不加稳定剂)主峰下降最快，处方2(10％海藻糖)主峰下降最慢，形成多聚体最少。处方3，处方4，处方5的海藻糖与氯化钠混合后，能降低主峰下降速度，但不如处方2(10％海藻糖)主峰下降速度慢。

从IEC-HPLC数据可知，高温40℃条件下，处方1(不加稳定剂)IEC主峰下降速度相对较快。说明稳定剂有降低主峰下降速度的作用。其中处方4(5％海藻糖+0.45％氯化钠)，处方5(3％海藻糖+0.6％氯化钠)降低主峰下降速度，减慢样品向酸区转变相对较好。

表18光照(25℃,4000lx)条件下，样品随着时间的变化情况

从SEC-HPLC数据可知，在光照条件下，SEC主峰变化明显。处方6(0.9％氯化钠) 与处方1(不加稳定剂)主峰下降速度最快。降低样品主峰下降速度最佳的为处方2(10％海藻糖)和处方3(7％海藻糖+0.3％氯化钠)。

从IEC-HPLC数据可知，在光照条件下，处方4(5％海藻糖+0.45％氯化钠)与处方1(不加稳定剂)主峰下降速度最快，说明处方4(5％海藻糖+0.45％氯化钠)在光照时不能有效减慢IEC主峰下降速度。而处方2(10％海藻糖)与处方3(7％海藻糖+0.3％氯化钠) 在光照条件下，能有效减慢IEC主峰转变为酸区和碱区的速度，其主峰下降速度是最慢的。

综合上述光照与高温实验结果，稳定剂的存在能够抑制酸性异构体产生和增加的速率，提高主峰含量。处方2(10％海藻糖)在高温与光照条件下减慢蛋白SEC-HPLC主峰下降速度，减慢蛋白IEC-HPLC主峰向酸区与碱区转变方面均有一定的作用，并且相比其他处方有一定的优势，因此该处方下的稳定剂及其含量可以作为该蛋白合适的稳定剂及其含量选择与使用。

实施例5：吐温含量筛选试验

选择吐温20作为表面活性剂，以10mM组氨酸盐缓冲剂(以下简称His)为缓冲剂，制备含有不同量吐温20的蛋白溶液(蛋白浓度：1.8mg/ml)，具体配方见表19。在室温环境，以200rpm的转速将样品平躺放置在摇床上，对蛋白溶液进行振荡试验。于第0h、第2h、第7h、第24h、第48h、第144h对溶液进行灯检及浑浊度(OD₃₄₀值)的检测，考察蛋白溶液质量的变化情况。结果见图9。(备注：OD值是在UV_340nm对蛋白溶液进行检测所得到的数值。)

表19不同含量吐温溶液配方表

从溶液的浑浊度可以看出，在振荡条件下放置2h，样品1开始出现浑浊，样品2，样品3，样品4放置至144h仍然保持澄明，说明吐温对样品在振荡条件下有一定的保护作用，可以防止蛋白抱团出现浑浊，起到增溶的作用。

吐温量太少可能会影响蛋白稳定性，吐温含量过多可能会带来安全性问题，而约0.04％吐温20能使蛋白保持稳定，起到防止蛋白在振荡条件下出现浑浊的现象，可选择0.04％吐温20作为合适的吐温浓度。

在增溶剂筛选实验中最终选择了0.04％吐温20作为该蛋白的增溶剂。为了证明该含量是对蛋白的稳定性良好，以10mM组氨酸盐缓冲剂(以下简称His)为缓冲剂，制备含有不同增溶剂的蛋白溶液(以蛋白浓度77mg/ml为例)，具体配方见表20。在室温环境，使用纯化水将样品进行50倍稀释，使最终样品浓度为0.5mg/ml，通过检测稀释后样品中含有的微粒数量多少来考察蛋白溶液质量的变化情况，证明0.04％吐温20可以作为合适的增溶剂。数据为同一样品重复检测的结果。详细结果见图10。

表20不同含量吐温溶液配方表

从含有不同含量吐温20的蛋白溶液稀释后检测的微粒结果来看，不加入吐温的蛋白溶液微粒明显最高，也说明了吐温的确有效防止蛋白聚集形成微粒，起到抗絮集作用。在加入不同含量的吐温的蛋白溶液中，其中加入0.04％吐温20的蛋白溶液，2μm，5μm， 10μm和25μm的微粒数量都是最少的，说明加入0.04％吐温20的确是能使蛋白溶液保持稳定。

实施例6海藻糖含量筛选试验

在含有0.04％吐温20的样品中，加入不同量的海藻糖，蛋白浓度为10mg/ml，进行高温实验，于第0天(0D)、第5天(5D)、第10天(10D)取样检测，观察不同含量的海藻糖是否对蛋白稳定性有影响。具体成分处方表21，实验结果见表22，图11。本实施例中海藻糖重量百分比是以海藻糖二水合物的重量计算的百分比。

表21海藻糖含量筛选溶液配方表

表22高温(40℃)条件下，样品随着时间的变化情况

从处方1～5可以看出，在高温40℃条件下放置一定的时间，含有不同量的海藻糖的处方中SEC，IEC基本上是没有区别。因此可以看出，海藻糖含量对SEC，IEC影响不大，在后面的实验中，海藻糖的用量仅用于调节渗透压。

实施例7pH范围的进一步筛选

制备最终选择的pH6.0附近的不同pH的样品，即pH5.6，pH5.8，pH 6.0，pH 6.2， pH6.4的样品。样品浓度为25mg/ml，样品中均含有最终选择的制剂处方成分，即组氨酸盐缓冲剂中含海藻糖(重量百分比以海藻糖二水合物计算为10％)和0.04％吐温20，由上述实验可知，海藻糖含量对样品SEC，IEC的变化影响不大，因此以下实验结果同样适用于海藻糖(重量百分比以海藻糖二水合物计算为8.8％)的处方中。将样品在高温条件下进行加速实验，40℃放置于第0天(0D)、第5天(5D)、第10天(10D)、第20天 (20D)、第30天(30D)，以及25℃放置于第0天(0D)、第1月(1M)、第2月 (2M)后取出样品进行SEC-HPLC，IEC-HPLC检测。40℃实验结果见表23和图12，25℃实验结果见表24和图13。

表23 40℃条件下不同pH蛋白质量随着时间变化情况表

从SEC-HPLC数据可知，40℃条件下，不同pH下的样品SEC变化规律基本一致，单体纯度下降速度接近，片段与聚体生成速度也接近。说明该蛋白在pH5.6～6.4范围内SEC 无明显区别，基本是能保持在稳定的水平。

从IEC-HPLC数据可知，40℃条件下，样品在pH5.6～6.4之间主峰下降速度一致。

pH6.4的样品在40℃条件下放置至第10d，IEC主峰开始下降较其他pH快，但与其他pH 下的样品主峰差别不大。可以认为抗体蛋白在pH5.6～6.4之间基本稳定。

表24 25℃条件下不同pH蛋白质量随着时间变化情况表

从SEC-HPLC数据可知，25℃条件下放置2个月，不同pH的样品SEC变化规律基本上一致，单体纯度下降速度接近，片段与聚体生成速度也接近，且放置至2个月SEC单体纯度仍然较高，说明该蛋白在pH5.6～6.4之间能保持稳定。

从IEC-HPLC数据可知，25℃条件下放置2个月，样品在pH5.6～6.4之间，IEC主峰下降速度基本上一致。pH6.4的样品在25℃条件下放置，IEC主峰下降较其他pH下的样品要快，主要是酸区增加较其他pH下的样品快。但样品pH6.4的主峰下降与其他pH下的样品主峰下降的差值在测量误差范围内，因此可以认为pH6.4与其他的pH下的样品下降速度是一致的。因此可以看出样品在pH5.6～6.4之间能保持稳定。

实施例8不同浓度样品稳定性数据

比较不同浓度下样品在高温50℃，40℃和光照条件下的稳定性情况。所设置的浓度有6mg/ml，12mg/ml，25mg/ml，50mg/ml及80mg/ml。除蛋白浓度不同外，其它组成相同，即还包括海藻糖(重量百分比以海藻糖二水合物计算为8.8％)、0.77mg/ml L-组氨酸、 L-组氨酸盐酸盐(含量以L-组氨酸盐酸盐一水合物计算为1.06mg/ml)、0.04％吐温20。

表25 50℃条件下不同浓度蛋白SEC、IEC随时间的变化情况

从50℃SEC单体纯度变化可以看出，随着放置时间的延长，不同浓度的样品，SEC单体纯度出现不同的下降趋势，其中样品浓度越高，SEC单体纯度下降越快，SEC多聚体形成的越快。在6，12，25，50，80mg/ml这几个浓度的样品中，6mg/ml的样品SEC单体纯度下降最慢，SEC多聚体形成速度最慢。

从50℃IEC变化来看，随着放置时间的延长，不同浓度的样品均出现相似的下降趋势，IEC主峰下降和IEC酸峰生成的速度，不同浓度的样品之间区别不大。

表26 40℃条件下不同浓度蛋白SEC、IEC随时间的变化情况

从40℃放置至28d的SEC单体纯度变化趋势来看，随着放置时间的延长，浓度高的样品SEC单体纯度下降快，下降趋势相似，但不同浓度的样品之间差别不大。SEC多聚体中，浓度高的样品形成多聚体速度比浓度低的样品快。

从40℃IEC变化来看，随着放置时间的延长，IEC主峰下降，不同浓度之间下降趋势接近，IEC酸区增加趋势接近。

表27光照条件下不同浓度蛋白SEC、IEC随时间的变化情况

从光照SEC变化来看，随着放置时间的延长，SEC单体纯度出现不同程度的下降，其中SEC单体纯度下降程度与样品浓度有相关性，结果可以看出80mg/ml的样品SEC单体纯度下降最快，即浓度越高的样品SEC单体纯度下降就越快，SEC多聚体形成越快。

从光照条件下IEC变化来看，IEC主峰下降程度与浓度有相关性。浓度越高的样品，IEC主峰下降就越快，IEC酸峰增加也越快。

对5种不同浓度样品的不溶性微粒进行检测，不溶性微粒检测结果如下表28(单位为“个/ml”)。

表28不同浓度蛋白不溶性微粒检测情况

从不溶性微粒检测结果可以看出，不溶性微粒≥10um的个数均较少，都符合标准。

对样品进行DLS检测粒子粒径，25℃条件下检测结果如下表29所示：

表29不同浓度蛋白粒径检测情况

蛋白浓度(mg/ml)	radius(nm)
		6	6.1
12	6.1
		25	5.2
50	4.5
		80	4.4

从样品半径来看，样品浓度在50，80mg/ml时样品半径比6，12，25mg/ml的样品半径小。

蛋白的浓度上升时，溶液渗透压会上升，本发明将海藻糖含量降下来，以使溶液渗透压在渗透压范围内。不同浓度的蛋白，加入同样含量的海藻糖，测渗透压，使所有样品的渗透压均在渗透压范围内，然后选取最合适的海藻糖浓度，作为该处方的合适蛋白浓度。由于上述有实验(海藻糖含量筛选实验)证明，海藻糖含量对蛋白稳定性影响不大，但是对渗透压影响较大。所以海藻糖含量的选择以达到渗透压为选择标准。

表30不同浓度蛋白不同海藻糖含量(重量百分比以海藻糖二水合物计算)样品渗透压

根据上述所测渗透压的结果，上述含量中的海藻糖含量基本上都能维持这5个抗体浓度的制剂在理想的渗透压300±40mOsmol/Kg，其中，较优的是以海藻糖二水合物计算在 8.8％左右(8.7％-8.9％)。

实施例9样品稳定性数据

按处方：10mM组氨酸盐缓冲剂+0.04％吐温20+海藻糖(用量为8.8％海藻糖二水合物)，蛋白浓度有6，12，25，50，80mg/ml，进行超滤换液最终灌装成含有上述处方的样品。进行灌装的25mg/ml稳定性数据如下表31：

表31样品稳定性

根据上述样品的稳定性数据，可以知道样品在25℃放置6个月仍然符合标准，在4℃放置9个月也在标准之内。

实施例10：样品影响因素研究

研究光照和25℃条件下，实施例9中的样品稳定性情况。

表32光照和高温试验结果

从表32的数据可知，样品在25℃条件下放置1个月或者光照下放置14天后，同第0天比较，样品仍为澄清透明液体，无可见异物出现，蛋白浓度也无明显变化。在25℃条件下放置1个月后，蛋白的CE-SDS，SEC-HPLC纯度和IEC-HPLC主峰含量均无明显变化，说明样品可以在25℃条件下短时间内保存，不会影响蛋白的质量。在光照条件下，CE- SDS主峰含量随着时间的延长而出现下降的趋势，SEC-HPLC单体纯度随着时间的延长而略有下降，多聚体则缓慢增多，说明蛋白在光照条件下会有聚合的趋势；IEC-HPLC主峰含量随着时间的延长而快速下降，说明目的蛋白的质量容易受到光照的影响，要避光保存。此外，经过14天的试验，蛋白的活性检测数据均在合格标准之内。

从25℃不溶性微粒数据可以看出，不同天的检测结果出现了一定的波动，但数据并没有出现逐渐增多的趋势，也未出现微粒突增的现象，而且溶液的微粒数均保持在很低的水平。样品的pH变化也在误差范围内变化。在光照条件下，从样品pH的变化来看，样品pH基本上变化不大，微粒也变化不大，在误差范围内，可以认为pH和微粒是不变的。

实施例11：样品进行反复冻融研究

对处方:25mg/ml重组抗VEGF人源化单克隆抗体(BAT5906)，10mM组氨酸盐缓冲剂，0.04％吐温20，10％海藻糖二水合物，配制的制剂的样品进行反复冻融实验，实验结果如表33所示：

表33反复冻融试验结果

从表33的数据可知，样品经过反复冻融5次后，同第0次比较，样品仍为澄清透明液体，无可见异物出现，样品的pH值、蛋白浓度也无明显变化，说明在反复冻融试验中，样品稳定，无析出物。此外，样品的SEC-HPLC纯度，IEC-HPLC主峰含量，CE-SDS纯度及活性等检测项也无明显变化。

从不溶性微粒的数据来看，反复冻融试验并不会使得样品的微粒出现增多的趋势。样品进行5次反复冻融后，样品微粒仍在合格范围内，说明样品能稳定存放。从反复冻融5 次pH的变化来看，pH并没有太大变化，都在误差范围内波动。

从影响因素与反复冻融实验结果来看，选择组氨酸盐缓冲剂作为该蛋白的缓冲体系，海藻糖作为稳定剂或渗透压调节剂，0.04％吐温20作为表面活性剂，是能使蛋白保持稳定的。

对处方：50mg/ml重组抗VEGF人源化单克隆抗体(BAT5906)，10mM组氨酸盐缓冲剂，0.04％吐温20，8.8％海藻糖二水合物，制备的制剂，进行反复冻融实验。实验结果如表34所示：

表34反复冻融试验结果

从表34可以看出，制剂经过反复冻融5次后，同第0次比较，制剂仍为澄清透明液体，无可见异物出现，制剂的pH值无明显变化，样品浓度在正常误差范围内波动，说明在反复冻融试验中，样品稳定。

从不溶性微粒的数据来看，反复冻融试验5次不溶性微粒数目高于反复冻融4次，但样品进行5次反复冻融后，样品微粒仍在合格范围内。从反复冻融5次pH的变化来看， pH并没有太大变化，都保持稳定。

实施例12：体内药效学研究

使用实施例9的配制的BAT5906制剂：25mg/ml抗体，10mM组氨酸盐缓冲剂， 0.04％吐温20，海藻糖(用量为8.8％海藻糖二水合物)。

本试验采用激光围绕恒河猴眼底黄斑中心凹光凝，诱导眼底脉络膜血管新生，建立与人类脉络膜新生血管类似的动物模型。光凝后20天进行荧光素眼底血管造影判定造模情况，选择造模成功的20只恒河猴(9雌11雄)分5组，分别为模型对照组(生理盐水)、阳性对照组(Lucentis(雷珠单抗)0.5mg/眼组)及重组抗VEGF人源化单克隆抗体BAT5906注射液0.25、0.5、1.25mg/眼组，每组4只猴，雌雄兼有。

光凝后21天，模型对照组、Lucentis组及BAT5906注射液0.25、0.5、1.25mg/眼组猴按50μl/眼经双眼玻璃体单次注射给予0.9％氯化钠注射液、10mg/ml的Lucentis、按10μl/眼、20μl/眼、50μl/眼经双眼玻璃体单次注射给予25mg/ml的BAT5906注射液，并分别于给药后14、28天进行眼底彩色照相、荧光素眼底血管造影、光学相干断层扫描(OCT)检查，观察供试品对脉络膜新生血管的抑制情况；于给药后29天，对所有猴双眼抽取房水进行VEGF检测，并实施安乐死后取双眼进行HE染色，左眼进行Masson三色染色，右眼进行CD31免疫组织化学染色检查组织病理学检查。主要结果如下(数据见表35-36,n＝8)：

本试验条件下，激光诱导脉络膜新生血管(CNV)模型的恒河猴经双眼玻璃体单次注射给予0.25、0.5、1.25mg/眼剂量的重组抗VEGF人源化单克隆抗体BAT5906注射液及0.5mg/眼的Lucentis，经视网膜血管荧光造影、OCT检查及眼组织病理学检查可见，0.25、0.5、1.25mg/眼剂量的重组抗VEGF人源化单克隆抗体注射液对猴CNV均具有明显的抑制作用。0.5、1.25mg/眼剂量的重组抗VEGF人源化单克隆抗体注射液药效略优于Lucentis。

恒河猴经双眼玻璃体单次注射给予0.25、0.5、1.25mg/眼剂量的重组抗VEGF人源化单克隆抗体注射液，呈线性动力学特征。

表35眼玻璃体注射BAT5906对恒河猴荧光素渗透面积减少量及改善率的影响

*与模型对照组相比，均数的差异有统计学意义(P≤0.05)

表36眼玻璃体注射BAT5906对恒河猴眼底视网膜厚度减少量及改善率的影响

*与模型对照组相比，均数的差异有统计学意义(P≤0.05) 。

序列表

<110> 百奥泰生物制药股份有限公司

<120> 抗VEGF抗体制剂

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 重链可变区氨基酸序列

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

50 55 60

Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 轻链可变区氨基酸序列

<400> 2

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile

35 40 45

Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105

<210> 3

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 重链氨基酸序列

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

50 55 60

Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 4

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 轻链氨基酸序列

<400> 4

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile

35 40 45

Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

Claims

1.一种抗体制剂，其特征在于，所述抗体制剂含有抗VEGF抗体或其片段；所述抗VEGF抗体或其片段的重链可变区含有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述抗VEGF抗体或其片段的轻链可变区含有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；以及，所述抗体制剂还包含缓冲剂、稳定剂和表面活性剂中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述抗体制剂，其特征在于，所述抗体的量为5～100mg/ml。

3.根据权利要求1所述抗体制剂，其特征在于，所述抗体制剂的pH为4.0～7.0。

4.根据权利要求1所述抗体制剂，其特征在于，所述缓冲剂选自组氨酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、醋酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂和磷酸盐缓冲剂中的一种或多种；优选地，所述缓冲剂的量是5～50mM。

5.根据权利要求1所述抗体制剂，其特征在于，所述稳定剂选自海藻糖、蔗糖、甘露醇、氯化钠、山梨醇、脯氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸中的一种或多种；优选地，所述稳定剂的量为0.5％～20％。

6.根据权利要求1所述抗体制剂，其特征在于，所述的表面活性剂选自吐温和/或泊洛沙姆；优选地，所述表面活性剂的量为0.001％～0.2％。

7.根据权利要求1所述抗体制剂，其特征在于，所述抗体制剂含有以下组分：

(1)5～100mg/ml的抗VEGF抗体

(2)5～50mM缓冲剂

(3)0.5％～20％稳定剂

(4)0.001％～0.2％表面活性剂

(5)注射用水；

所述制剂的pH为4.0～7.0。

8.根据权利要求7所述抗体制剂，其特征在于，所述制剂含有以下组分：

(1)6～90mg/ml的抗VEGF抗体

(2)10mM组氨酸盐缓冲剂

(3)2％～10％海藻糖

(4)0.01％～0.1％吐温20

(5)注射用水；

所述制剂的pH为5.5～6.5。

9.根据权利要求1～8中任一项所述抗体制剂，其特征在于，所述抗体制剂的渗透压为150～400mOsm/Kg。

10.根据权利要求1所述抗体制剂，其特征在于，所述抗体制剂的施用方式为静脉、皮下、眼内或肌肉内施用。

11.含有权利要求1～10任一所述抗体制剂的递送装置。

12.权利要求1～10任一所述抗体制剂，或权利要求11所述递送装置，在制备治疗VEGF相关的疾病的药物的用途。

13.权利要求1～10任一所述抗体制剂的制备方法，其特征在于包含以下步骤：

(1)配制缓冲剂溶液；

(3)配制含有稳定剂和/或表面活性剂的辅料母液，将所述辅料母液添加到步骤(2)制备的抗体溶液中，得到抗体制剂。