ES2574826T3

ES2574826T3 - Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional

Info

Publication number: ES2574826T3
Application number: ES10180043.1T
Authority: ES
Inventors: Nobuo Hanai; Kazuyasu Nakamura; Emi Shoji; Motoo Yamasaki; Kazuhisa Uchida; Toyohide Shinkawa; Susumu Imabeppu; Yutaka Kanda; Naoko Yamane; Hideharu Anazawa
Original assignee: Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Current assignee: Kyowa Kirin Co Ltd
Priority date: 1999-04-09
Filing date: 2000-04-07
Publication date: 2016-06-22
Anticipated expiration: 2020-04-07
Also published as: PT1176195E; DK2278003T3; ES2420835T3; EP1176195A1; EP2278003B1; NL300939I2; US7214775B2; EP2275540A3; ES2569919T3; US20070166300A1; ES2568899T3; CA2369292C; EP1914244A2; EP2275541A2; US7655228B2; EP2270147A3; CA2704600C; JP2009171976A; US7687061B2; ES2418360T3

Abstract

Procedimiento para controlar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) de una molécula de anticuerpo IgG, comprendiendo dicho procedimiento la regulación de la presencia o ausencia de unión de la fucosa a la N-acetilglucosamina del extremo reductor (1) de una cadena de azúcar unida al N-glucósido de tipo complejo biantenaria eliminando un gen que codifica una -1,6-fucosiltransferasa en una célula anfitriona, animal no humano o planta, o añadiendo una mutación al gen para reducir o eliminar la actividad enzimática en una célula anfitriona, animal no humano o planta en el que dicha cadena de azúcar se une a dicho anticuerpo y presenta principalmente la estructura siguiente:**Fórmula** en el que dicha regulación comprende unir una cadena de azúcar, en el que la fucosa no está unida a la N- acetilglucosamina del extremo reductor de una cadena de azúcar unida al N-glucósido de tipo complejo, a la molécula de anticuerpo, para así promover la ADCC de la molécula de anticuerpo.

Description

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[2].: Procedimiento según [1], en el que la molécula de anticuerpo es un anticuerpo humano, un anticuerpo

humanizado, un anticuerpo híbrido humano o un anticuerpo con RDC injertada humano.

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[3].: Procedimiento de producción de una molécula de anticuerpo IgG, comprendiendo dicho procedimiento

regular la presencia o ausencia de unión de la fucosa a la N-acetilglucosamina del extremo reductor (1) de

una cadena de azúcar unida al N-glucósido de tipo complejo biantenaria eliminando un gen que codifica

una α1,6-fucosiltransferasa en una célula anfitriona, animal no humano o planta, o añadiendo una mutación

10: al gen para reducir o eliminar la actividad enzimática en una célula anfitriona, animal no humano o planta

en: el que dicha cadena de azúcar se une a dicho anticuerpo y presenta principalmente la estructura

siguiente:

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[4].: Procedimiento según cualquiera de [1] a [3], que comprende además obtener la molécula de anticuerpo.

[5].: Molécula de anticuerpo IgG humanizado que puede obtenerse mediante el procedimiento según cualquiera

20: de [1]-[4], comprendiendo dicho procedimiento regular la presencia o ausencia de unión de la fucosa a la N

acetilglucosamina del extremo reductor (1) de una cadena de azúcar unida al N-glucósido de tipo complejo

biantenaria eliminando un gen que codifica la α1,6-fucosiltransferasa en la célula anfitriona, animal no

humano o planta, o añadiendo una mutación al gen para eliminar la actividad enzimática en la célula

anfitriona, animal no humano o planta

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en la que dicha cadena de azúcar se une a dicho anticuerpo y presenta principalmente la estructura

siguiente:

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30 [6]. Medicamento que comprende la molécula de anticuerpo IgG según [5].

[7]. Molécula de anticuerpo IgG según [5] para su utilización en el diagnóstico, la prevención o el tratamiento de un cáncer, una alergia, una enfermedad cardiovascular, una infección vírica o una infección bacteriana. 35 Además en la presente exposición se dan a conocer los puntos (1) a (62) siguientes:

(1) Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional, que comprende la regulación

de la presencia o ausencia de unión de fucosa a N-acetilglucosamina del terminal reductor de una cadena 40 de azúcar unida al N-glucósido que se une a la molécula inmunofuncional.

(2) Procedimiento según el punto (1), en el que la cadena de azúcar unida al N-glucósido que se une a la molécula inmunofuncional comprende:

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5: (3) Procedimiento para mejorar la actividad de una molécula inmunofuncional, que comprende unir una cadena de azúcar en la que la fucosa no está presente en N-acetilglucosamina del terminal reductor de una cadena de azúcar unida al N-glucósido a la molécula inmunofuncional.

(4): Procedimiento según el punto (3), en el que la cadena de azúcar comprende:

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(5) Procedimiento según el punto (3), en el que la cadena de azúcar se sintetiza en una célula que tiene una baja actividad enzimática de la adición de fucosa a N-acetilglucosamina del terminal reductor o no tiene dicha actividad enzimática.

15 (6) Procedimiento según el punto (5), en el que la enzima que añade fucosa a N-acetilglucosamina de la terminal reductor es una fucosiltransferasa.

(7) Procedimiento según el punto (6), en el que la fucosiltransferasa es α-1,6-fucosiltransferasa.

20 (8) Procedimiento según el punto (3), en el que la cadena de azúcar se sintetiza en una célula de mieloma de rata.

(9) Procedimiento según el punto (8), en el que la célula de mieloma de rata es YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20

(ATCC CRL 1662). 25

(10) Procedimiento para inhibir la actividad de una molécula inmunofuncional, que comprende unir una cadena de azúcar en la que la fucosa está presente en N-acetilglucosamina del terminal reductor de una cadena de azúcar unida al N-glucósido a una molécula inmunofuncional.

30 (11) Procedimiento según el punto (10), en el que la cadena de azúcar comprende:

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(12) Procedimiento según el punto (10), en el que la cadena de azúcar se sintetiza en una célula que tiene una 35 gran actividad enzimática de adición de fucosa a N-acetilglucosamina del terminal reductor.

(13) Procedimiento según el punto (12), en el que la enzima que añade fucosa a N-acetilglucosamina del terminal reductor es una fucosiltransferasa.

40 (14) Procedimiento según el punto (13), en el que la fucosiltransferasa es α-1,6-fucosiltransferasa.

(15) Procedimiento según el punto (1) a (14), en el que la molécula inmunofuncional es un anticuerpo, una proteína o un péptido.

45 (16) Agente estimulante de la actividad de una molécula inmunofuncional, que comprende una cadena de azúcar en la que la fucosa no está presente en N-acetilglucosamina del terminal reductor de una cadena de azúcar unida al N-glucósido.

(17) Agente estimulante de la actividad de una molécula inmunofuncional según el punto (16), en el que la 50 cadena de azúcar comprende:

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(18) Agente estimulante de la actividad de una molécula inmunofuncional según el punto (16), en el que la

cadena de azúcar se sintetiza en una célula que tiene una baja actividad enzimática de adición de fucosa a 5 N-acetil-glucosamina del terminal reductor o no tiene dicha actividad enzimática.

(19) Agente estimulante de la actividad de una molécula inmunofuncional según el punto (18), en el que la enzima que añade fucosa a N-acetilglucosamina del terminal reductor es una fucosiltransferasa.

10 (20) Agente estimulante de la actividad de una molécula inmunofuncional según el punto (19), en el que la fucosiltransferasa es α-1,6-fucosiltransferasa.

(21) Agente estimulante de la actividad de una molécula inmunofuncional según el punto (16), en el que la

cadena de azúcar se sintetiza en una célula de mieloma de rata. 15

(22) Agente estimulante de la actividad de una molécula inmunofuncional según el punto (21), en el que la célula de mieloma de rata es YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 (ATCC CRL 1662).

(23) Agente estimulante de la actividad de una molécula inmunofuncional según el punto uno cualquiera de (16) 20 a (22), en el que la molécula inmunofuncional es un anticuerpo, una proteína o un péptido.

(24) Molécula inmunofuncional que tiene una actividad estimulada inmunofuncional, a la que está unida la molécula de una cadena de azúcar en la que la fucosa no está presente en N-acetilglucosamina del terminal reductor de una cadena de azúcar unida al N-glucósido.

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(25) Molécula inmunofuncional que tiene una actividad inhibida inmunofuncional a la que está unida la molécula de una cadena de azúcar en la que la fucosa está presente en N-acetilglucosamina del terminal reductor de una cadena de azúcar unida al N-glucósido.

30 (26) Molécula inmunofuncional según el punto (24), en la que la molécula inmunofuncional es un anticuerpo, una proteína o un péptido.

(27) Molécula inmunofuncional según el punto (25), en la que la molécula inmunofuncional es un anticuerpo, una

proteína o un péptido. 35

(28) Procedimiento para producir la molécula inmunofuncional según el punto (24), que comprende la utilización de una célula que tiene una baja actividad enzimática de la adición de fucosa a N-acetilglucosamina del terminal reductor o no tiene dicha actividad enzimática.

40 (29) Procedimiento según el punto (28), en el que la enzima que añade fucosa a N-acetilglucosamina del terminal reductor es una fucosiltransferasa.

(30) Procedimiento según el punto (29), en el que la fucosiltransferasa es α-1,6-fucosiltransferasa.

45 (31) Procedimiento para producir la molécula inmunofuncional según el punto (24), en el que se utiliza una célula de mieloma de rata en el método para la producción de una molécula inmunofuncional que tiene una actividad inhibida inmunofuncional.

(32) Procedimiento según el punto (31), en el que la célula de mieloma de rata es YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20. 50

(33): Procedimiento para producir la molécula inmunofuncional según el punto (25), en el que se utiliza una célula que tiene una alta actividad enzimática de adición de fucosa a N-acetilglucosamina del terminal reductor.

(35): Procedimiento según el punto (34), en el que la fucosiltransferasa es α-1,6-fucosiltransferasa.

55 (34) Procedimiento según el punto (33), en el que la enzima que añade fucosa a N-acetilglucosamina del terminal reductor es una fucosiltransferasa.

60 (36) Molécula inmunofuncional según el punto (26), en la que el anticuerpo reconoce un antígeno tumoral.

Un antígeno tumoral utilizado según la presente invención es un antígeno que se expresa en una célula tumoral en

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(51): Agente para el diagnóstico de una cardiovasculopatía, que comprende el anticuerpo según el punto (42) como principio activo.

(52): Agente para el tratamiento de una cardiovasculopatía, que comprende el anticuerpo según el punto (42) como principio activo.

(53): Agente para la prevención de una cardiovasculopatía, que comprende el anticuerpo según el punto (42) como principio activo.

(54): Agente para el diagnóstico de una enfermedad autoinmunitaria, que comprende el anticuerpo según el punto (43) como principio activo.

(55): Agente para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria, que comprende el anticuerpo según el punto (43) como principio activo.

(56): Agente para la prevención de una enfermedad autoinmunitaria, que comprende el anticuerpo según el punto (43) como principio activo.

(57): Agente para el diagnóstico de una infección vírica o bacteriana, que comprende el anticuerpo según el punto (44) como principio activo.

(58): Agente para el tratamiento de una infección vírica o bacteriana, que comprende el anticuerpo según el punto (44) como principio activo.

(59): Agente para la prevención de una infección vírica o bacteriana, que comprende el anticuerpo según el punto (44) como principio activo.

(60): Agente para el diagnóstico de varias enfermedades, que comprende el péptido o proteína según el punto

(26) o (27) como principio activo.

Ejemplos de las diversas enfermedades según la presente invención incluyen un cáncer, una enfermedad alérgica, una enfermedad inflamatoria, una cardiovasculopatía, una enfermedad autoinmunitaria, una infección vírica o bacteriana y similares.

(61): Agente para el tratamiento de varias enfermedades, que comprende el péptido o proteína según el punto

(60) como principio activo.

(62): Agente para la prevención de varias enfermedades, que comprende el péptido o proteína según el punto

(60) como principio activo.

Basándose en la forma de unión de moléculas inmunofuncionales, la cadena de azúcar se clasifica a grandes rasgos en dos tipos, a saber, una cadena de azúcar que se une a la asparagina (denominada cadena de azúcar unida a Nglucósido) y una cadena de azúcar que se une a la serina, treonina y similares (denominada cadena de azúcar unida a O -glucósido).

La cadena de azúcar unida a N-glucósido según la presente invención presenta varias estructuras (Biochemical Experimentation Method 23 -Method for Studying Glycoprotein Sugar Chains (Gakkai Shuppan Center), editado por Reiko Takahashi (1989)), pero cada caso tiene la siguiente estructura de núcleo básico común.

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En la estructura anterior, el terminal de la cadena de azúcar que se une a la asparagina se denomina terminal reductor, y el lado opuesto se denomina terminal no reductor. La fucosa puede unirse a N-acetilglucosamina del terminal reductor, por ejemplo, por un enlace α-1,3 o un enlace α1,6.

Los ejemplos de cadenas de azúcar unidas a N-glucósido incluyen un tipo rico en manosa, en el que sólo manosa se une al terminal no reductor de la estructura del núcleo; un tipo complejo, en el que el lado del terminal no reductor de la estructura del núcleo tiene una o más ramificaciones de galactosa-N-acetilglucosamina (denominado en adelante "Gal-GlcNAc") y el lado del terminal no reductor de Gal-GlcNAc tiene además una estructura tal como por ejemplo un

o ácido siálico o bisecando N-acetilglucosamina; un tipo híbrido, en el que el lado del terminal no reductor de la estructura del núcleo tiene ambas ramas de la cadena de azúcar unida al N-glucósido rico en manosa y cadena de

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humanos, que se preparan basándose en avances recientes en ingeniería genética, ingeniería celular y técnicas de ingeniería de desarrollo.

El anticuerpo existente en el cuerpo humano puede obtenerse, por ejemplo, aislando un linfocito de la sangre periférica humana, inmortalizando mediante su infección con el virus EB, seguido de clonación, cultivando un linfocito capaz de producir el anticuerpo, y purificando el anticuerpo de la mezcla de cultivo.

La biblioteca de fagos de anticuerpo humano es una biblioteca en la que un fragmento de anticuerpo, tales como por ejemplo Fab o un anticuerpo monocatenario, se expresa en la superficie del fago insertando un gen de anticuerpo preparado a partir de linfocitos B humanos en un gen del fago. Un fago que expresa un fragmento de anticuerpo con la actividad de unión al antígeno deseado puede recuperarse de esta biblioteca, utilizando su actividad para unirse a un sustrato de antígeno inmovilizado como marcador. El fragmento de anticuerpo puede convertirse además en una molécula de anticuerpo humano que comprende dos cadenas H completas y dos cadenas L completas mediante técnicas de ingeniería genética.

Un animal transgénico no humano que produce anticuerpos humanos es un animal en el que un gen que codifica anticuerpos humanos está integrado en las células. Concretamente, un animal transgénico que produce anticuerpos humanos se puede preparar introduciendo un gen que codifica anticuerpos humanos en una célula ES de ratón, trasplantando la célula ES dentro de un embrión en la fase temprana de otro ratón y desarrollando un animal. El anticuerpo humano puede prepararse y acumularse en una mezcla de cultivo del animal transgénico que produce anticuerpos humanos obteniendo un hibridoma que produce anticuerpos humanos según un procedimiento de preparación de hibridomas llevado a cabo generalmente en mamíferos no humanos y a continuación cultivando el hibridoma.

Una actividad de los anticuerpos de la presente exposición incluye la actividad de ADCC.

La actividad de ADCC, como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una actividad para dañar, por ejemplo, una célula tumoral mediante la activación de una célula efectora por la unión de la región Fc de un anticuerpo a un receptor de Fc existente en la superficie de una célula efectora tal como un linfocito citolítico, un linfocito citolítico natural o un macrófago activado (Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc., capítulo 2.1 (1995)).

Se puede utilizar cualquier proteína y péptido, siempre y cuando se puedan activar varias respuestas inmunitarias. Los ejemplos incluyen moléculas de interferón, tales como la interleuquina-2 (IL-2) (Science, 193, 1007 (1976)) y la interleucina-12 (IL-12) (J. Leuc. Biol., 55, 280 (1994)), factores estimulantes de colonias, como el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) (J. Biol.. Chem., 258, 9017 (1983)), el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) (J. Exp. Med., 173, 269 (1992)) y el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) (J. Biol.. Chem., 252, 1998 (1977)); factores de crecimiento, tales como eritropoyetina (EPO)

(J. Biol..Chem., 252, 5558 (1977)) y trombopoyetina (TPO) (Nature, 369, 533 (1994)).

Las actividades de los anticuerpos de la presente invención son las actividades de diversas células inmunocompetentes, incluyendo los linfocitos (por ejemplo, linfocitos T y linfocitos B) y los macrófagos, o diversas reacciones de respuesta inmunitaria, cuando la proteína y el péptido que contienen la cadena de azúcar se administran en la cuerpo vivo.

La estimulación de las actividades de los anticuerpos de la presente invención incluye la activación de linfocitos citolíticos naturales y linfocitos T por IL-2 e IL-12, las actividades estimulantes de la producción de eritrocitos por EPO, que aumentan aún más.

1. Procedimiento para el análisis de la cadena de azúcar de una molécula inmunofuncional

(1) Análisis de la composición de azúcar neutro y aminoazúcar

Como se describió anteriormente, la cadena de azúcar de la IgG comprende un azúcar neutro, tal como por ejemplo, galactosa, manosa o fucosa, un aminoazúcar, tal como N-acetilglucosamina, y un azúcar ácido, tal como por ejemplo, ácido siálico.

En cuanto a análisis de la composición de la cadena de azúcar de un anticuerpo, la proporción en la composición puede analizarse mediante la liberación de azúcares neutros o aminoazúcares por hidrólisis ácida de la cadena de azúcar.

Métodos específicos incluyen un método que utiliza un analizador de la composición de azúcar (BioLC) producido por Dionex. El BioLC es un aparato para el análisis de la composición de azúcar por el método HPAEC-PAD (cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución con detección amperométrica pulsada) (J. Liq. Chromatogr., 6, 1577 (1983)).

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La proporción en la composición puede analizarse también por un método de marcaje de fluorescencia utilizando 2aminopiridina. Concretamente, la proporción en la composición se puede calcular por marcaje de fluorescencia de una muestra hidrolizada con ácido con 2-aminopiridina según un método conocido (Agric. Biol.. Chem., 55 (1), 283284 (1991)) y llevando a cabo el análisis por HPLC.

(2) Análisis de la estructura de la cadena de azúcar

La estructura de la cadena de azúcar de un anticuerpo puede analizarse por un método de cartografía de la cadena de azúcar en dos dimensiones (Anal. Biochem., 171, 73 (1988), Biochemical Experimentation Method 23 -Method for Studying Glycoprotein Sugar Chains (Gakkai Shuppan Center (Gakkai Shuppan Center), editado por Reiko Takahashi (1989)). El método de cartografía de la cadena de azúcar en dos dimensiones es un método en el que se estima la estructura de la cadena de azúcar, por ejemplo, representando el tiempo de retención o la posición de elución de la cadena de azúcar por cromatografía en fase inversa en el eje X y el tiempo de retención o la posición de elución de la cadena de azúcar por una cromatografía en fase normal en el eje Y, y comparando los resultados con los de las cadenas de azúcar conocidas.

Concretamente, la cadena de azúcar se libera del anticuerpo por hidrazinolisis del anticuerpo, se lleva a cabo marcaje de fluorescencia de la cadena de azúcar con 2-aminopiridina (denominada en adelante "PA") (J. Biochem., 95, 197 (1984)), y a continuación, la cadena de azúcar se separa de un exceso de reactivo de PA por filtración en gel y se sometió a cromatografía en fase inversa. Posteriormente, cada pico de la cadena de azúcar fraccionada se analiza por cromatografía en fase normal. Basándose en estos resultados, puede estimarse la estructura de la cadena de azúcar mediante el trazado de los puntos en una cartografía en dos dimensiones de la cadena de azúcar y comparándolos con los de los patrones de la cadena de azúcar (preparado por Takara Shuzo) o una referencia (Anal. Biochem., 171, 73 (1988)).

Además, la estructura estimada por el método de cartografía de cadena de azúcar en dos dimensiones se puede confirmar por espectrometría de masas, tal como por ejemplo MALDI-TOF-MS, de cada cadena de azúcar.

2. Método para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional

El método de la presente invención para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional se describe a continuación utilizando inmunoglobulina G (denominada en adelante, "IgG") como ejemplo.

La cadena de azúcar unida al N-glucósido que se une a la IgG es una cadena de azúcar compleja biantenaria compuesto principalmente la siguiente estructura (denominado en adelante "biantenario").

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La presente invención también incluye las cadenas de azúcar similares en las que un azúcar ácido, ácido siálico, se añade además a Gal del terminal no reductor de la cadena de azúcar unida al N-glucósido o a una Nacetilglucosamina bisectriz se añade a la cadena de azúcar unida al N-glucósido.

En un tipo IgG, una cadena de azúcar unida al N-glucósido se une a una posición en la región Fc. Dado que un tipo IgG comprende dos cadenas H, el resto Fc está presente en dos posiciones en una molécula de anticuerpo. Por consiguiente, la región de unión de la cadena de azúcar también está presente en dos posiciones.

La actividad de IgG cambia en función del número de cadenas de azúcar unidas al N-glucósido en las que la fucosa no está unida a N-acetilglucosamina, para añadirse a las dos regiones de unión de la cadena de azúcar anterior. Es decir, cuando la cadena de azúcar unida al N-glucósido en la que la fucosa no está unida a N-acetil-glucosamina se añade a por lo menos una de las regiones de unión de la cadena de azúcar, aumenta la actividad de la molécula inmunofuncional. Como ejemplo, el grado de actividad de IgG será la siguiente: anticuerpo F0 > anticuerpo F1 > anticuerpo F2, en el que el anticuerpo F0 designa un anticuerpo en el que la cadena de azúcar unida a N-glucósido en el que la fucosa no está unida a N-acetilglucosamina se añade a ambas dos regiones de unión a las cadenas de azúcar; el anticuerpo F1 designa un anticuerpo en el que la cadena de azúcar unida a N-glucósido en la que la fucosa no está unida a N-acetilglucosamina se añade a una de las regiones de unión de la cadena de azúcar, y el anticuerpo F2 designa un anticuerpo en el que la cadena de azúcar unida al N-glucósido en la que la fucosa está unida a N-acetilglucosamina se añade a ambas regiones de unión de la cadena de azúcar.

El anticuerpo producido no siempre puede tener una sola estructura de cadena de azúcar, y el anticuerpo F0, el anticuerpo F1 y el anticuerpo F2 puede estar presente como una mezcla cuando se tiene en cuenta la presencia o ausencia de fucosa. Para controlar la actividad de ADCC del anticuerpo producido, la cadena de azúcar unida al

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El vector para la expresión del anticuerpo humanizado puede ser cualquier vector en el que la cadena H y la cadena L del anticuerpo están presentes en vectores separados o un vector en el que están presentes en el mismo vector (denominado en adelante "vector en tándem"); sin embargo, es preferible un vector en tándem para la expresión del anticuerpo humanizado porque dichos vectores de expresión de anticuerpos humanizados en tándem se construyen fácilmente y se introducen en una célula animal y las cantidades de expresión de la cadena H y la cadena L del anticuerpo en la célula animal puede equilibrarse (J. Immunol. Methods, 167, 271 (1994)).

El vector construido para la expresión del anticuerpo humanizado puede utilizarse para la expresión de un anticuerpo híbrido humano y de un anticuerpo con RDC injertada humano en células animales.

(2) Preparación del ADNc que codifica la región V del anticuerpo proveniente de animales no humanos

El ADNc que codifica las regiones V de la cadena H y de la cadena L de un anticuerpo proveniente de un animal no humano, tal como un anticuerpo de ratón, se puede obtener como se describe a continuación.

El ADNc se sintetiza extrayendo ARNm de una célula de hibridoma capaz de producir el anticuerpo de ratón de interés. El ADNc sintetizado se clona en un vector, tal como un fago o un plásmido, para preparar una biblioteca de ADNc. Un fago recombinante o un plásmido recombinante que contiene un ADNc que codifica la región V de la cadena H y un fago recombinante o un plásmido recombinante que contiene un ADNc que codifica la región V de la cadena L se aíslan respectivamente de la biblioteca utilizando un resto de la región C o un resto de la región V de un anticuerpo conocido de ratón como sonda. Se determinan las secuencias completas de nucleótidos de las regiones V de la cadena H y de la cadena L del anticuerpo de ratón de interés en el fago recombinante o en el plásmido recombinante, y las secuencias de aminoácidos completas de las regiones V de la cadena H y de la cadena L se deducen a partir de las secuencias de nucleótidos.

El animal no humano puede ser cualquier animal, tal como, por ejemplo, ratón, rata, hámster o conejo, siempre que una célula de hibridoma pueda producirse a partir de los mismos.

El procedimiento para la preparación de ARN completo a partir de una célula de hibridoma incluye un método de tiocianato de guanidina-trifluoroacetato de cesio (Methods in Enzymol., 154, 3 (1987)). El procedimiento para la preparación de ARNm a partir de ARN completo incluye, por ejemplo, un método de columna oligo (dT) inmovilizada en celulosa (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab.. Press, Nueva York, 1989).También, el kit de aislamiento de ARNm Fast Track (producido por Invitrogen), el kit de purificación de ARNm Quick Prep (producido por Pharmacia) pueden ponerse como ejemplos de un kit para la preparación de ARNm a partir de una célula de hibridoma.

Ejemplos del procedimiento para la síntesis de ADNc y la preparación de una biblioteca de ADNc incluyen procedimientos convencionales (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab.. Press, Nueva York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, suplemento 1-34), un procedimiento que utiliza un kit disponible en el mercado, tal como Super Script™ Plasmid System para la síntesis de ADNc y la clonación de plásmidos (preparado por GIBCO BRL) o el kit ZAP-ADNc (producido por Stratagene).

El vector en el que el ADNc sintetizado utilizando ARNm extraído de una célula de hibridoma se inserta en la preparación de una biblioteca de ADNc puede ser cualquier vector, siempre que el ADNc se puede insertar. Los ejemplos incluyen ZAP Express (Strategies, 5, 58 (1992)), PBluescript II SK (+) (Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)), λzapII (producido por Stratagene), λgt10 y λgt11 (DNA Cloning: A Practical Approach, I, 49 (1985)), Lambda BlueMid (producido por Clontech), λExCell y pT7T3 18U (producido por Pharmacia), pcD2 (Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)) y PUC18 (Gene, 33, 103 (1985)).

Las E. coli que van a utilizarse para la introducción de la biblioteca de ADNc construida por un vector fago o plásmido pueden ser cualquier cepa, siempre y cuando la biblioteca de ADNc pueda introducirse, expresarse y mantenerse. Los ejemplos incluyen XL1-Blue MRF ' (Strategies, 5, 81 (1992)), C600 (Genetics, 39, 440 (1954)), Y1088 e Y1090 (Science, 222, 778 (1983)), NM522 (J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)), K802 (J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)) y JM105 (Gene, 38, 275 (1985)).

Un método de hibridación de colonias o hibridación en placa que utiliza un isótopo o sonda marcada con fluorescencia puede utilizarse para seleccionar un clon de ADNc que codifica las regiones V de cadena H y de cadena L de un anticuerpo proveniente de un animal no humano de la biblioteca de ADNc (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab.. Press, Nueva York, 1989). Además, el ADNc que codifica las regiones V de la cadena H y de la cadena L se pueden preparar por reacción en cadena de la polimerasa (denominada en adelante "RCP"; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab.. Press, Nueva York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, suplemento 1-34) preparando cebadores y utilizando ADNc preparado a partir de ARNm o una biblioteca de ADNc como plantilla.

La secuencia de nucleótidos del ADNc seleccionada por el procedimiento anterior se puede determinar, por ejemplo, digeriendo del ADNc con enzimas de restricción apropiados, clonando los fragmentos en un plásmido, tal como

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electroporación (solicitud de patente japonesa nº 257891/90 publicada no examinada, Cytotechnology, 3, 133 (1990)).

La célula animal en el que se introduce un vector de expresión del anticuerpo humanizado puede ser cualquier célula, con tal que sea una célula animal que puede producir el anticuerpo humanizado. Los ejemplos preferidos incluyen una célula que tiene una baja actividad enzimática de adición de fucosa a N-acetilglucosamina para unirse a la región Fc del anticuerpo producido y una célula que no tiene dicha actividad enzimática.

La célula que tiene una baja actividad enzimática de adición de fucosa a N-acetilglucosamina para unirse a la región Fc del anticuerpo o no tiene dicha actividad enzimática es una célula que tiene menos enzimas o ninguna relacionadas con el enlace α1,6-. Los ejemplos incluyen una célula que tiene una baja actividad de fucosiltransferasa, preferentemente actividad de FUT8, y una célula que no tiene dicha actividad.

Ejemplos de células que tienen una baja actividad enzimática de adición de fucosa a N-acetilglucosamina para unirse a la región Fc del anticuerpo o no tiene ninguna actividad enzimática incluyen, por ejemplo, una célula de mieloma de rata y células YB2/0. Una célula en la que un gen implicado en la enzima que lleva el enlace α1,6 se elimina o la actividad enzimática se reduce o elimina añadiendo una mutación al gen se puede utilizar también como una célula productora de anticuerpos.

Los ejemplos específicos incluyen las células de mieloma de ratón, tales como la célula NS0 y la célula SP2/0, las células de ovario de hámster chino, tales como la célula CHO/dhfr y la célula CHO/DG44; células de mieloma de rata, tales como la célula YB2/0 y la célula IR983F; células de mieloma humano, tal como las células Namalwa. Preferentemente, pueden utilizarse las células de ovario de hámster chino, tales como las células CHO/DG44.

Después de la introducción del vector de expresión, se puede seleccionar el transformante capaz de producir de manera estable el anticuerpo humanizado utilizando un medio para el cultivo de células animales que contiene un fármaco, tal como sulfato de G418 (denominado en adelante "G418"; producido por SIGMA) por el método descrito en la solicitud de patente japonesa nº 257891/90 publicada no examinada. El medio de cultivo de células animales incluye, por ejemplo, medio RPMI 1640 (producido por Nissui Pharmaceutical), medio GIT (producido por Nippon Pharmaceutical), medio EX-CELL 302 (producido por JRH), medio IMDM (producido por GIBCO BRL), medio de Hibridoma-SFM (producido por GIBCO BRL), o un medio preparado añadiendo diversos aditivos, tales como suero bovino fetal (denominado en adelante "SBF"), a cada uno de estos medios. El anticuerpo humanizado puede producirse cultivando del transformante obtenido en un medio, y acumularse en un sobrenadante de cultivo. La cantidad producida y la actividad de unión al antígeno del anticuerpo humanizado en el sobrenadante de cultivo se pueden medir por el ensayo inmunoabsorbente con enzima ligada (en adelante denominado "ELISA"; Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, capítulo 14, 1998; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996). Además, la producción del anticuerpo humanizado por el transformante puede aumentarse utilizando un sistema de ampliación del gen DHFR por el procedimiento descrito en la solicitud de patente japonesa nº 257891/90 publicada no examinada.

El anticuerpo humanizado se puede purificar a partir de un sobrenadante de cultivo que contiene transformante utilizando una columna de proteína A (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, capítulo 8, 1988; Anticuerpos monoclonales: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996). También, se pueden utilizar otros procedimientos de purificación utilizados generalmente para la purificación de la proteína. Por ejemplo, se puede purificar por una combinación de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico y ultrafiltración. El peso molecular de la cadena H, de la cadena L o de la molécula completa de anticuerpo del anticuerpo humanizado purificado se puede medir mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (denominado en adelante "SDS-PAGE"; Nature, 227, 680 (1970)), Método de inmunotransferencia Western (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, capítulo 12, 1988; Anticuerpos monoclonales: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996).

Un procedimiento de producción de anticuerpos se ha demostrado anteriormente utilizando una célula animal como anfitriona, y tal como se describe en el anterior punto 3, puede producirse también por una bacteria, una levadura, una célula de insecto, una célula vegetal, un animal o un vegetal.

(9) Evaluación de actividad de anticuerpo humanizado

La actividad del anticuerpo humanizado purificado para unirse a un antígeno o a una estirpe celular cultivada al antígeno se puede medir por el método ELISA y anticuerpos de fluorescencia (Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)). La actividad citotóxica para estirpes celulares cultivadas positivas a antígenos se puede evaluar determinando su actividad de CDC, actividad de ADCC (Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)). Además, los efectos de seguridad y terapéuticos del anticuerpo humanizado en seres humanos pueden evaluarse utilizando un modelo apropiado de una especie animal relativamente próxima a los humanos, tales como Macaca faseicularis.

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Ejemplos del vehículo incluyen lactosa y glicerol. Dependiendo de las propiedades del compuesto y el vehículo que va a utilizarse, es posible producir preparados farmacéuticos tales como atomizadores y polvos secos. Además, los componentes ejemplificados como agentes aditivos para preparados orales también se pueden añadir a estos preparados parenterales.

Aunque la dosis clínica o la frecuencia de administración varía dependiendo, por ejemplo, del efecto terapéutico objetivo, el método de administración, el período de tratamiento, la edad y el peso corporal, es por lo general de 10 µg/kg a 20 mg/kg por día y por adulto.

También, en relación con el método para examinar el efecto antitumoral de los anticuerpos en diversas células tumorales, los ensayos in vitro incluyen, por ejemplo, el método de medición de la actividad de CDC, el método de medición de la actividad de ADCC, y los ensayos in vivo incluyen, por ejemplo, un experimento antitumoral utilizando un sistema de tumor en un animal de experimentación tal como un ratón.

Se pueden llevar a cabo mediciones de actividad de CDC y de actividad de ADCC y experimentos antitumorales según los métodos descritos en las referencias (Cancer Immunology Immunotherapy, 36, 373 (1993); Cancer Research, 54, 1511 (1994)).

6. Procedimiento para estimular o inhibir la actividad de moléculas inmunofuncionales

La actividad de una molécula inmunofuncional puede estimularse mediante la producción de un anticuerpo, péptido

o proteína al que se une una cadena de azúcar exenta de fucosa por el procedimiento anterior.

Cuando la molécula inmunofuncional con actividad estimulada se administra al cuerpo vivo, diversas inmunocitos, incluyendo células tales como los linfocitos citolíticos, los linfocitos citolíticos naturales y los macrófagos activados como células efectoras en relación con la actividad de ADCC se activan en el cuerpo vivo, de manera que se hace posible controlar diversas respuestas inmunitarias.

Además, la actividad de una molécula inmunofuncional puede inhibirse produciendo un anticuerpo, un péptido o una proteína a la que una cadena de azúcar fucosa existente está unida por el procedimiento anterior.

Cuando la molécula inmunofuncional con actividad inhibida se administra al cuerpo vivo, las actividades de diversos inmunocitos que intervienen en la actividad de ADCC se debilitan en el cuerpo vivo, de modo que se hace posible el control de diversas respuestas inmunitarias.

Los ejemplos de la presente exposición se muestran a continuación, pero el alcance de la presente exposición no se limita a los mismos.

Breve explicación de los dibujos

La Fig. 1 es un gráfico que muestra los patrones de electroforesis de SDS-PAGE de cinco anticuerpos híbridos purificados anti-GD3 (utilizando gel de gradiente del 4 al 15%). El dibujo superior y el dibujo inferior muestran un resultado de la electroforesis en condiciones no reductoras y en condiciones reductoras, respectivamente. Las bandas 1 a 7 muestran un patrón de electroforesis de marcadores de alto peso molecular, un patrón de electroforesis de anticuerpos híbridos YB2/0-GD3, un patrón de electroforesis de anticuerpos híbridos CHO/DG44-GD3, un patrón de electroforesis de anticuerpos híbridos SP2/0-GD3, un patrón de electroforesis de anticuerpos híbridos NSO-GD3 (302), un patrón de electroforesis de anticuerpos híbridos NSO-GD3 (GIT) y un patrón de electroforesis de marcadores de bajo peso molecular, respectivamente.

La Fig. 2 es un gráfico que muestra la actividad de cinco anticuerpos híbridos anti-GD3 purificados para unirse a GD3, medida por el cambio de la concentración de anticuerpos. El eje de ordenadas y el eje de abscisas muestran la actividad de unión con GD3 y la concentración de anticuerpo, respectivamente. Los círculos blancos, los círculos negros, los cuadrados blancos, los cuadrados negros y los triángulos blancos muestran la actividad de anticuerpos híbridos YB2/0-GD3, la actividad de anticuerpos híbridos CHO/DG44-GD3, la actividad de anticuerpos híbridos SP2/0-GD3, la actividad de anticuerpos híbridos NS0-GD3 (302) y la actividad de anticuerpos híbridos NS0-GD3 (GIT), respectivamente.

La Fig. 3 es un gráfico que muestra la actividad de ADCC de cinco anticuerpos híbridos anti-GD3 purificados para una estirpe celular G-361 de melanoma humano. El eje de ordenadas y el eje de abscisas muestran la actividad citotóxica y la concentración de anticuerpo, respectivamente. Los círculos blancos, los círculos negros, los cuadrados blancos, los cuadrados negros y los triángulos blancos muestran la actividad de anticuerpo híbridos YB2/0-GD3, la actividad de anticuerpos híbridos CHO/DG44-GD3, la actividad de anticuerpos híbridos SP2/0-GD3, la actividad de anticuerpos híbridos NS0-GD3 (302) y la actividad de anticuerpos híbridos NS0-GD3 (GIT), respectivamente.

La Fig. 4 es un gráfico que muestra los patrones de electroforesis de SDS-PAGE de tres anticuerpos anti-hIL

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plásmido patrón.

Utilizando esta curva de calibración, se calculó la cantidad de ADNc del gen de interés en cada célula a partir de la cantidad del producto ampliado cuando el ADNc completo proveniente de cada célula se utilizaba como plantilla, y la 5 cantidad se definió como la cantidad de transcripción del ARNm en cada célula.

Las cantidades del producto FUT8 de transcripción en cada estirpe de células anfitrionas en la utilización de secuencias de FUT8 de rata como patrón y patrón interno se muestran en la Fig. 12. La estirpe de células CHO mostró una cantidad de transcripción 10 veces o más superior a la de la estirpe de células YB2/0 durante todo el

10 periodo de cultivo. Esta tendencia se encontró también cuando se utilizaron secuencias de FUT8 de hámster chino como patrón y patrón interno.

Además, la cantidad de transcripción de FUT8 se muestra en la Tabla 4 como un valor con relación a la cantidad de producto de transcripción de β-actina. 15 Tabla 4

Estirpe celular: Días de cultivo

Día 1: Día 2 Día 3 Día 4 Día 5

CHO: 2,0 0,90 0,57 0,52 0,54

YB2/0: 0,07 0,13 0,13 0,05 0,02

Mientras que la cantidad de transcripción de FUT8 de la estirpe de células YB2/0 fue de aproximadamente 0,1% de 20 β-actina, la de la estirpe celular CHO fue de 0,5 a 2%.

Basándose en los resultados anteriores, se demostró que la cantidad de producto de transcripción FUT8 en la estirpe celular YB2/0 fue significativamente más pequeña que la de la estirpe celular CHO.

25 Aplicabilidad industrial

La presente exposición se refiere a una cadena de azúcar que controla la actividad de una molécula inmunofuncional, tal como un anticuerpo, una proteína o un péptido, así como un anticuerpo, una proteína o un péptido que tiene la cadena de azúcar. La presente exposición se refiere además a procedimientos para la

30 producción de la cadena de azúcar y un anticuerpo, una proteína o un péptido que tiene la cadena de azúcar, así como a un agente de diagnóstico, un agente preventivo y un agente terapéutico que contiene estos productos como principio activo.

Las cláusulas numeradas siguientes son asimismo divulgadas explícitamente en la presente memoria: 35

1. Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional, que comprende regular la presencia o ausencia de unión de la fucosa a la N-acetilglucosamina del extremo reductor de una cadena de azúcar unida a N-glucósido que se une a la molécula inmunofuncional.

: 40 2. Procedimiento según la cláusula 1, en el que la cadena de azúcar unida a N-glucósido que se une a la molécula inmunofuncional comprende:

: 45 3. Procedimiento para aumentar la actividad de una molécula inmunofuncional, que comprende la unión de una cadena de azúcar en la que la fucosa no se encuentra presente en la N-acetilglucosamina del extremo reductor de una cadena de azúcar unida a N-glucósido a una molécula inmunofuncional.

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4. Procedimiento según la cláusula 3, en el que la cadena de azúcar comprende: 50

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5. Procedimiento según la cláusula 3, en el que la cadena de azúcar es sintetizada en una célula que presenta

una actividad enzimática baja de adición de la fucosa a la N-acetilglucosamina del extremo reductor o no 5 presenta dicha actividad enzimática.

6. Procedimiento según la cláusula 5, en el que la enzima que añade la fucosa a la N-acetilglucosamina del extremo reductor es una fucosiltransferasa.

: 10 7. Procedimiento según la cláusula 6, en el que la fucosiltransferasa es la α1,6-fucosiltransferasa.

8. Procedimiento según la cláusula 3, en el que la cadena de azúcar es sintetizada en una célula de mieloma de rata.

: 15 9. Procedimiento según la cláusula 8, en el que la célula de mieloma de rata es la célula YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 (ATCC CRL 1662).

10. Procedimiento para inhibir la actividad de una molécula inmunofuncional, que comprende unir una cadena

de azúcar en la que la fucosa se encuentra presente en la N-acetilglucosamina del extremo reductor de una 20 cadena de azúcar unida a N-glucósido a una molécula inmunofuncional.

11.: Procedimiento según la cláusula 10, en el que la cadena de azúcar comprende:

12.: Procedimiento según la cláusula 10, en el que la cadena de azúcar es sintetizada en una célula que presenta una actividad enzimática elevada de adición de la fucosa a la N-acetilglucosamina del extremo reductor.

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30 13. Procedimiento según la cláusula 12, en el que la enzima que añade la fucosa a la N-acetilglucosamina del extremo reductor es una fucosiltransferasa.

14. Procedimiento según la cláusula 13, en el que la fucosiltransferasa es la α1,6-fucosiltransferasa.

35 15. Procedimiento según cualquiera de las cláusulas 1 a 14, en el que la molécula inmunofuncional es un anticuerpo, una proteína o un péptido.

16. Agente de estimulación de la actividad de una molécula inmunofuncional, que comprende una cadena de

azúcar en la que la fucosa no se encuentra presente en la N-acetilglucosamina del extremo reductor de una 40 cadena de azúcar unida a N-glucósido.

17.: Agente de estimulación de la actividad de una molécula inmunofuncional según la cláusula 16, en el que la cadena de azúcar comprende:

18.: Agente de estimulación de la actividad de una molécula inmunofuncional según la cláusula 16, en el que la cadena de azúcar es sintetizada en una célula que presenta una actividad enzimática baja de adición de la fucosa a la N-acetilglucosamina del extremo reductor o no presenta dicha actividad enzimática.

19.: Agente de estimulación de la actividad de una molécula inmunofuncional según la cláusula 18, en el que la enzima que añade la fucosa a la N-acetilglucosamina del extremo reductor es una fucosiltransferasa.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para controlar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) de una molécula de anticuerpo IgG, comprendiendo dicho procedimiento la regulación de la presencia o ausencia de unión de la fucosa

5 ala N-acetilglucosamina del extremo reductor (1) de una cadena de azúcar unida al N-glucósido de tipo complejo biantenaria eliminando un gen que codifica una α1,6-fucosiltransferasa en una célula anfitriona, animal no humano o planta, o añadiendo una mutación al gen para reducir o eliminar la actividad enzimática en una célula anfitriona, animal no humano o planta

10 en el que dicha cadena de azúcar se une a dicho anticuerpo y presenta principalmente la estructura siguiente:

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en el que dicha regulación comprende unir una cadena de azúcar, en el que la fucosa no está unida a la N15 acetilglucosamina del extremo reductor de una cadena de azúcar unida al N-glucósido de tipo complejo, a la molécula de anticuerpo, para así promover la ADCC de la molécula de anticuerpo.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la molécula de anticuerpo es un anticuerpo humano, un

anticuerpo humanizado, un anticuerpo híbrido humano o un anticuerpo con RDC injertada humano. 20
3. Procedimiento de producción de una molécula de anticuerpo IgG, comprendiendo dicho procedimiento regular la presencia o ausencia de unión de la fucosa a la N-acetilglucosamina del extremo reductor (1) de una cadena de azúcar unida al N-glucósido de tipo complejo biantenaria eliminando un gen que codifica una α1,6-fucosiltransferasa en una célula anfitriona, animal no humano o planta, o añadiendo una mutación al gen para reducir o eliminar la

25 actividad enzimática en una célula anfitriona, animal no humano o planta

en el que dicha cadena de azúcar se une a dicho anticuerpo y presenta principalmente la estructura siguiente:

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4.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además obtener la molécula de anticuerpo.
5.

Molécula de anticuerpo IgG humanizado que puede obtenerse mediante el procedimiento según cualquiera de

35 las reivindicaciones 1 a 4, comprendiendo dicho procedimiento regular la presencia o ausencia de unión de la fucosa a la N-acetilglucosamina del extremo reductor (1) de una cadena de azúcar unida al N-glucósido de tipo complejo biantenaria eliminando un gen que codifica la α1,6-fucosiltransferasa en la célula anfitriona, animal no humano o planta, o añadiendo una mutación al gen para eliminar la actividad enzimática en la célula anfitriona, animal no humano o planta

40 en la que dicha cadena de azúcar se une a dicho anticuerpo y presenta principalmente la estructura siguiente:

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45 6. Medicamento que comprende la molécula de anticuerpo IgG según la reivindicación 5.
7. Molécula de anticuerpo IgG según la reivindicación 5 para su utilización en el diagnóstico, la prevención o el tratamiento de un cáncer, una alergia, una enfermedad cardiovascular, una infección vírica o una infección bacteriana.

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