JP4850922B2 - 免疫機能分子の活性を調節する方法 - Google Patents

Description

本発明は、抗体、蛋白質またはペプチドなどの免疫機能分子の活性を調節する方法、免疫機能分子活性促進剤、および免疫機能活性が促進された免疫機能分子に関する。

抗体は、高い結合活性、結合特異性及び血中での高い安定性を有することから、ヒトの各種疾患の診断、予防及び治療への応用が試みられてきた［モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｐｔｅｒ ２．１（１９９５）］。しかし、マウス抗体のようなヒト以外の動物の抗体はヒトに投与すると、異物として認識されることにより、ヒト体内にマウス抗体に対するヒト抗体（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ：以下、ＨＡＭＡと表記する）が誘導され、ＨＡＭＡは投与したマウス抗体と反応して副作用を引き起こしたり［ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．），２，８８１（１９８４）；ブラッド（Ｂｌｏｏｄ），６５，１３４９（１９８５）；ジャーナル・オブ・ザ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．），８０，９３２（１９８８）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），８２，１２４２（１９８５）］、投与したマウス抗体の血中からの消失を速め［ジャーナル・オブ・ニュークレアー・メディシン（Ｊ．Ｎｕｃｌ，Ｍｅｄ．），２６，１０１１（１９８５）；ブラッド（Ｂｌｏｏｄ），６５，１３４９（１９８５）；ジャーナル・オブ・ザ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．），８０，９３７（１９８８）］、マウス抗体の診断、予防及び治療の効果を減じてしまうことが知られている［ザ・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１３５，１５３０（１９８５）；キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．），４６，６４８９（１９８６）］。

これらの問題点を解決するため、遺伝子組換え技術を利用してヒト以外の動物の抗体をヒト型キメラ抗体或いはヒト型相補性決定領域（以下、ＣＤＲと表記する）移植抗体の様なヒト化抗体を作製することが試みられている。ヒト型キメラ抗体とは、抗体可変領域（以下、Ｖ領域と表記する）がヒト以外の動物の抗体で、定常領域（以下、Ｃ領域と表記する）がヒト抗体である抗体であり［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），８１，６８５１（１９８４）］、ヒトに投与した場合、重篤な副作用は認められず、かつマウス抗体に比べ血中半減期が約６倍伸びたことが報告されている［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），８６，４２２０（１９８９）］。ヒト型ＣＤＲ移植抗体とは、ヒト抗体のＣＤＲをヒト以外の動物の抗体のＣＤＲと置換した抗体であり［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３２１，５２２（１９８６）］、サルを用いた実験でマウス抗体に比べ免疫原性が低下し、血中半減期が４〜５倍伸びたことが報告されている［ザ・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１４７，１３５２（１９９１）］。これらの報告は、ヒトの各種疾患の診断、予防及び治療に応用する抗体としては完全なヒト抗体でなくてもヒト化抗体で十分な効果が期待できることを示しているが、実際に、抗腫瘍抗体に関しては、例えば抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体であるリツキサン［Ｒｉｔｕｘａｎ；アイデック（ＩＤＥＣ）社］や抗ＨＥＲ２／ｎｅｕヒト型ＣＤＲ移植抗体であるハーセプチン［Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ；ジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）社］の臨床試験が行われ、それぞれＢリンパ腫、乳癌において安全性及びある程度の治療効果が認められている［ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．），１６，２８２５（１９９８）、ジャーナル・オブ・ザ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート（Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ），９０，８８２（１９９８）］。また、既に抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａヒト型キメラ抗体の断片（Ｆａｂ’）であるレオプロ［ＲｅｏＰｒｏ；セントコア（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）社］は経皮経管冠動脈血管形成術後の合併症予防薬として欧米で販売されている。現在、これら以外にも多数のヒト化抗体の臨床試験が行われているが、ヒト化抗体の多くは遺伝子組換え技術を用いて作製され、適当な動物細胞を用いて製造されている。

哺乳類の抗体には、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥの５種類のクラスが存在することが明らかとなっているが、ヒトの各種疾患の診断、予防及び治療には血中半減期が長く、各種エフェクター機能を有する等の機能特性からヒトＩｇＧクラスの抗体が主として利用されている［モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｐｔｅｒ １（１９９５）］。ヒトＩｇＧクラスの抗体は、更にＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の４種類のサブクラスに分類されている。ＩｇＧクラスの抗体のエフェクター機能である抗体依存性細胞障害活性（以下、ＡＤＣＣ活性と表記する）や補体依存性細胞障害活性（以下、ＣＤＣ活性と表記する）については、これまでに多数の研究が行われ、ヒトＩｇＧクラスでは、ＩｇＧ１サブクラスの抗体が最も高いＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性を有していることが報告されている［ケミカル・イムノロジー（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），６５，８８（１９９７）］。以上の観点から、上記のリツキサン、ハーセプチンを始めとして、その効果発現に高いエフェクター機能を必要とする抗腫瘍ヒト化抗体の殆どはヒトＩｇＧ１サブクラスの抗体である。

ヒトＩｇＧ１サブクラスの抗体のＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性の発現には、抗体Ｆｃ領域と、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、活性化されたマクロファージ等のエフェクター細胞表面上に存在する抗体レセプター（以下、ＦｃγＲと表記する）及び各種補体成分との結合が必要であり、その結合については、抗体のヒンジ領域及びＣ領域の第２番目のドメイン（以下、Ｃγ２ドメインと表記する）内のいくつかのアミノ酸残基の重要性［ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），２３，１０９８（１９９３）、イムノロジー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），８６，３１９（１９９５）、ケミカル・イムノロジー（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），６５，８８（１９９７）］の他、Ｃγ２ドメインに結合している糖鎖の重要性［ケミカル・イムノロジー（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），６５，８８（１９９７）］が示唆されている。糖鎖に関しては、ボイド（Ｂｏｙｄ）らは、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）或いはマウスミエローマＮＳ０細胞で生産したヒト型ＣＤＲ移植抗体ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ（ヒトＩｇＧ１サブクラス）を各種糖分解酵素で処理し、糖鎖のＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性に対する影響を検討した結果、非還元末端のシアル酸の除去は、両活性に影響を与えないが、更にガラクトース残基を除去することでＣＤＣ活性のみが影響を受け、約５０％程度活性が低下すること、糖鎖の完全な除去は、両活性を消失させることを報告した［モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．），３２，１３１１（１９９５）］。また、ライフリー（Ｌｉｆｅｌｙ）らは、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞或いはラットミエローマＹ０細胞で生産したヒト型ＣＤＲ移植抗体ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ（ヒトＩｇＧ１サブクラス）の糖鎖の分析及びＡＤＣＣ活性を測定した結果、Ｙ０細胞由来のＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈが最も高いＡＤＣＣ活性を示し、その活性にはバイセクティングに位置するＮ−アセチル−グルコサミンが重要であることを示唆した［グリコバイオロジー（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ），５，８１３（１９９５）：ＷＯ９９／５４３４２］。これらの報告は、ヒトＩｇＧ１サブクラスの抗体のエフェクター機能に糖鎖の構造が極めて重要な役割を果たしており、糖鎖の構造を変えることでより高いエフェクター機能を有する抗体を作製することが可能であることを示している。しかし、実際には糖鎖の構造は多様かつ複雑であり、エフェクター機能に真に重要な構造は未だ特定できていない。

本発明の目的は、各種動物細胞で生産したヒトＩｇＧ１サブクラスの抗体の糖鎖を分析してＡＤＣＣ活性を高める糖鎖を特定し、免疫機能分子の活性を調節する方法を提供することにある。そのような抗体は、ＡＤＣＣ活性が増強し、抗腫瘍抗体のみならずその他の抗体、さらには蛋白質またはペプチドの場合でも、ヒトの各種疾患に対する治療効果の増大が期待される。特に抗腫瘍抗体の臨床応用では、現状では抗体単独の抗腫瘍効果は不充分な場合が多く、化学療法との併用療法が行われているが［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２８０，１１９７，１９９８］、ＡＤＣＣ活性の増強による抗体単独のより強い抗腫瘍効果が認められれば、化学療法に対する依存度が低くなり、副作用の低減も期待できる。

本発明者らは、２種類のチャイニーズハムスター卵巣細胞であるＣＨＯ／ｄｈＦｒ−細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ９０９６）及びＣＨＯ／ＤＧ４４細胞［ソマティック・セル・アンド・モレキュラー・ジェネティクス（Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），１２，５５５（１９８６）］、マウスミエローマＮＳ０細胞［ＲＣＢ０２１３、バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），１０，１６９（１９９２）］、マウスミエローマＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（以下、ＳＰ２／０細胞と表記する；ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、ラットミエローマＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（以下、ＹＢ２／０細胞と表記する；ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２）で生産したヒトＩｇＧ１サブクラスの各種ヒト化抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏの活性評価を行った結果、ラットミエローマＹＢ２／０細胞で生産したヒト化抗体のＡＤＣＣ活性が他の細胞で生産したヒト化抗体に比べ著しく高いことを見出した。更にカニクイザルを用いたｉｎ ｖｉｖｏの活性評価を行った結果、ＹＢ２／０細胞で生産したヒト化抗体が最も高い効果を示すことを見出し、ＡＤＣＣ活性の高い抗体のヒトの臨床応用での有用性を示した。更に各種動物細胞で生産したヒト化抗体の糖鎖の構造を詳細に分析、比較し、ＡＤＣＣ活性を高める機能を有する糖鎖を特定し、本発明を完成させるに至った。

本発明は、以下の（１）〜（１５）に関する。
（１）宿主細胞のα１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子に変異を加えるか、あるいは該遺伝子を欠損させることにより得られた、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を低下させた、または欠失させた宿主細胞。
（２）α１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を低下させることを特徴とする、上記（１）記載の宿主細胞。
（３）α１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を欠失させることを特徴とする、上記（１）記載の宿主細胞。
（４）Ｎ−グリコシド結合コンプレックス型糖鎖が結合した抗体分子を含有する抗体組成物であって、Ｎ−グリコシド結合コンプレックス型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースを有する糖鎖が結合した抗体に対して、Ｎ−グリコシド結合コンプレックス型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが存在しない糖鎖が結合した抗体を高い割合で含有することを特徴とする免疫機能分子組成物を生産することを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の宿主細胞。
（５）糖鎖が、
を含む糖鎖を含有する上記（４）記載の宿主細胞。
（６）糖鎖が、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を低下させるか、または当該α１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を欠失させた細胞が合成する糖鎖を含有する上記（５）記載の宿主細胞。
（７）抗体が、腫瘍関連抗原を認識する抗体である上記（４）〜（６）のいずれか１項に記載の宿主細胞。
（８）腫瘍関連抗原がガングリオシドＧＤ３である、上記（７）記載の宿主細胞。
（９）抗体が、７−９−５１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６９１）より生産される抗体である上記（７）または（８）記載の宿主細胞。
（１０）抗体が、アレルギーまたは炎症に関連する抗原を認識する抗体である上記（４）〜（６）のいずれか１項に記載の宿主細胞。
（１１）アレルギーまたは炎症に関連する抗原が、ヒトインターロイキン５レセプターα鎖である上記（１０）記載の宿主細胞。
（１２）抗体が、Ｎｏ．３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６９０）より生産される抗体である上記（１０）または（１１）記載の宿主細胞。
（１３）抗体が、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体である上記（４）〜（６）のいずれか１項に記載の宿主細胞。
（１４）抗体が、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体である上記（４）〜（６）のいずれか１項に記載の宿主細胞。
（１５）抗体が、ウィルスまたは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体である上記（４）〜（６）のいずれか１項に記載の宿主細胞。

第１図 精製した５種類の抗ＧＤ３キメラ抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１５％グラジエントゲルを使用）の電気泳動パターンを示した図である。上図が非還元条件、下図が還元条件でそれぞれ電気泳動を行った図である。レーン１が高分子量マーカー、２がＹＢ２／０−ＧＤ３キメラ抗体、３がＣＨＯ／ＤＧ４４−ＧＤ３キメラ抗体、４がＳＰ２／０−ＧＤ３キメラ抗体、５がＮＳ０−ＧＤ３キメラ抗体（３０２）、６がＮＳ０−ＧＤ３キメラ抗体（ＧＩＴ）、７が低分子量マーカーの泳動パターンをそれぞれ示す。 第２図 精製した５種類の抗ＧＤ３キメラ抗体のＧＤ３との結合活性を抗体濃度を変化させて測定した図である。縦軸はＧＤ３との結合活性、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。○がＹＢ２／０−ＧＤ３キメラ抗体、●がＣＨＯ／ＤＧ４４−ＧＤ３キメラ抗体、□がＳＰ２／０−ＧＤ３キメラ抗体、■がＮＳ０−ＧＤ３キメラ抗体（３０２）、△がＮＳ０−ＧＤ３キメラ抗体（ＧＩＴ）の活性をそれぞれ示す。 第３図 精製した５種類の抗ＧＤ３キメラ抗体のヒトメラノーマ細胞株Ｇ−３６１に対するＡＤＣＣ活性を示した図である。縦軸に細胞障害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。○がＹＢ２／０−ＧＤ３キメラ抗体、●がＣＨＯ／ＤＧ４４−ＧＤ３キメラ抗体、□がＳＰ２／０−ＧＤ３キメラ抗体、■がＮＳ０−ＧＤ３キメラ抗体（３０２）、△がＮＳ０−ＧＤ３キメラ抗体（ＧＩＴ）の活性をそれぞれ示す。 第４図 精製した３種類の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１５％グラジエントゲルを使用）の電気泳動パターンを示した図である。上図が非還元条件、下図が還元条件でそれぞれ電気泳動を行った図である。レーン１が高分子量マーカー、２がＹＢ２／０−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体、３がＣＨＯ／ｄ−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体、４がＮＳ０−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体、５が低分子量マーカーの泳動パターンをそれぞれ示す。 第５図 精製した３種類の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体のｈＩＬ−５Ｒαとの結合活性を抗体濃度を変化させて測定した図である。縦軸はｈＩＬ−５Ｒαとの結合活性、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。○がＹＢ２／０−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体、●がＣＨＯ／ｄ−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体、□がＮＳ０−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体の活性をそれぞれ示す。 第６図 精製した３種類の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体のｈＩＬ−５Ｒ発現マウスＴ細胞株ＣＴＬＬ−２（ｈ５Ｒ）に対するＡＤＣＣ活性を示した図である。縦軸に細胞障害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。○がＹＢ２／０−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体、●がＣＨＯ／ｄ−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体、□がＮＳ０−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体の活性をそれぞれ示す。 第７図 精製した３種類の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体のカニクイザルのｈＩＬ−５誘発好酸球増加モデルに対する抑制作用を示した図である。縦軸に末梢血中好酸球数、横軸に日数（抗体及びｈＩＬ−５の投与開始日を０日とした）をそれぞれ示す。１０１、１０２が抗体非投与群、３０１、３０２、３０３がＹＢ２／０−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体投与群、４０１、４０２、４０３がＣＨＯ／ｄ−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体投与群、５０１、５０２、５０３がＮＳ０−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体投与群の結果をそれぞれ示す。 第８図 ＹＢ２／０が生産した精製抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体（上側）およびＮＳ０が生産した精製抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体（下側）のＰＡ化糖鎖の逆相ＨＰＬＣ溶離の溶離図（左図）とそのＰＡ化糖鎖をα−Ｌ−フコシダーゼ処理した後に逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図（右図）を示したものである。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。 第９図 ＣＨＯ／ｄ細胞が生産した精製抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体からＰＡ化糖鎖を調製し、逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図を示したものである。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。 第１０図 非吸着画分、吸着画分の一部のＧＤ３との結合活性を、抗体濃度を変化させて測定した図である。縦軸はＧＤ３との結合活性、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。●が非吸着画分、○が吸着画分の一部をそれぞれ示す。下図は非吸着画分、吸着画分の一部のヒトメラノーマ細胞株Ｇ−３６１に対するＡＤＣＣ活性を示した図である。縦軸に細胞障害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。●が非吸着画分、○が吸着画分の一部をそれぞれ示す。 第１１図 非吸着画分、吸着画分の一部から調製したＰＡ化糖鎖を逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図を示したものである。左図に非吸着画分の溶離図、右図に吸着画分の一部の溶離図をそれぞれ示す。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。 第１２図 ラットＦＵＴ８配列をスタンダード、内部コントロールに用いた場合の各宿主細胞株におけるＦＵＴ８転写産物の量を示す。■がＣＨＯ細胞株、□がＹＢ２／０細胞株を宿主細胞として用いた場合をそれぞれ示す。

糖鎖は、免疫機能分子の結合様式により、アスパラギンと結合する糖鎖（Ｎ−グリコシド結合糖鎖という）ならびに、セリン、スレオニンなどと結合する糖鎖（０−グリコシド結合糖鎖という）の２種類に大別される。

本発明にかかるＮ−グリコシド結合糖鎖は、様々な構造を有しているが［生物化学実験法２３−糖蛋白質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９年）］、いずれの場合も下記に示す基本となる共通のコア構造を有する。

上記の構造において、アスパラギンと結合するの糖鎖の末端を還元末端、反対側の非還元末端という。還元末端のＮ−アセチルグルコサミンへのフコースの結合としては、α１，３結合、α１，６結合などがあげられる。

Ｎ−グリコシド結合糖鎖には、コア構造の非還元末端にマンノースのみが結合するハイマンノース型、コア構造の非還元末端側にガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃと称す。）の枝を並行して１ないしは複数本有し、更にＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃの非還元末端側にシアル酸、バイセクティングのＮ−アセチルグルコサミンなどの構造を有するコンプレックス型、コア構造の非還元末端側にハイマンノース型とコンプレックス型の両方の枝を持つハイブリッド型などがあげられる。

上記のいずれの型において、還元末端側のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合する糖鎖もあるが、本発明の糖鎖は、上述の糖鎖のみならず、Ｎ−アセチルグルコサミンにフコースが結合しない糖鎖であればいかなるものも包含する。

免疫機能分子とは、元来生体内に存在し、種々の免疫反応に関与する分子であり、具体的には、抗体、タンパク質、ペプチドなどを包含する。

抗体とは、外来抗原刺激の結果、免疫反応によって生体内に産生される蛋白質で、抗原と特異的に結合する活性を有するものをいう。抗体としては動物に抗原を免疫し、免疫動物の脾臓細胞より作製したハイブリドーマ細胞が分泌する抗体のほか、遺伝子組換え技術により作製された抗体、すなわち、抗体遺伝子を挿入した抗体発現ベクターを、宿主細胞へ導入することにより取得された抗体などがあげられる。具体的には、ハイブリドーマが生産する抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体などをあげることができる。

ハイブリドーマとは、ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞と、マウス等に由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、所望の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を産生する細胞を意味する。

ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型相同性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ：以下、ＣＤＲと略記する）移植抗体などがあげられる。

ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体重鎖可変領域（以下、重鎖はＨ鎖として、可変領域はＶ領域としてＨＶまたはＶＨとも称す）および抗体軽鎖可変領域（以下、軽鎖はＬ鎖としてＬＶまたはＶＬとも称す）とヒト抗体の重鎖定常領域（以下、定常領域はＣ領域としてＣＨとも称す）およびヒト抗体の軽鎖定常領域（以下、ＣＬとも称す）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。

ヒト型キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、宿主細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。

ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。

ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体を意味する。

ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列を任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することによりヒト型ＣＤＲ移植抗体を発現させ、製造することができる。

ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。

ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体を意味するが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーならびにヒト抗体産生トランスジェニック動物あるいはヒト抗体産生トランスジェニック植物から得られる抗体等も含まれる。

ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルス等を感染させ不死化、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養物中より該抗体を精製することができる。

ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、一本鎖抗体等の抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手法により、２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。

ヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物を意味する。具体的には、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニック動物を作製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体産生ハイブリドーマを得、培養することで培養物中にヒト抗体を産生蓄積させることができる。

本発明の抗体の活性とは、ＡＤＣＣ活性を意味する。
ＡＤＣＣ活性とは、腫瘍細胞等に結合した抗体が、抗体Ｆｃ領域とキラー細胞、ナチュラルキラー細胞、活性化されたマクロファージ等のエフェクター細胞表面上に存在するＦｃレセプターの結合を介してエフェクター細胞を活性化し、腫瘍細胞等を障害する活性を意味する［モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｐｔｅｒ ２．１（１９９５）］。

蛋白質およびペプチドとしては、種々の免疫反応を活性化できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、インターフェロン分子であるインターロイキン−２（ＩＬ−２）［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１９３，１００７（１９７６）］、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）［ジャーナル・オブ・ロイコサイト・バイオロジー（Ｊ．Ｌｅｕｃ．Ｂｉｏｌ．），５５，２８０（１９９４）］、コロニー刺激因子である顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２５８，９０１７（１９８３）］、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）［ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．），１７３，２６９（１９９２）］、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２５２，１９９８（１９７７）］、増殖因子であるエリスロポイエチン（ＥＰＯ）［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２５２，５５５８（１９７７）］、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３６９，５３３（１９９４）］などがあげられる。

本発明の蛋白質およびペプチドの活性とは、該糖鎖を有する蛋白質およびペプチドを生体内に投与した際の、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞等）、マクロファージ等をはじめとする各種免疫担当細胞の活性、または種々の免疫応答反応を意味する。

本発明の蛋白質およびペプチドの活性の促進とは、ＩＬ−２やＩＬ−１２によるＮＫ細胞、Ｔ細胞の活性化、ＥＰＯによる赤血球産生の促進作用等がさらに増強されることを意味する。

１．免疫機能分子の糖鎖の分析方法
（１）中性糖・アミノ糖組成分析
ＩｇＧ糖鎖は、上記で示したように、ガラクトース、マンノース、フコースなどの中性糖、Ｎ−アセチルグルコサミンなどのアミノ糖、シアル酸などの酸性糖から構成されている。

抗体の糖鎖の組成分析は、トリフルオロ酢酸等で、糖鎖の酸加水分解を行うことにより、中性糖またはアミノ糖を遊離し、その組成比を分析することができる。
具体的な方法として、Ｄｉｏｎｅｘ社製糖組成分析装置（ＢｉｏＬＣ）を用いる方法が挙げられる。ＢｉｏＬＣはＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｐｕｌｓｅｄ ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．），６，１５７７（１９８３）］によって糖組成を分析する装置である。

また、２−アミノピリジンによる蛍光標識化法でも組成比を分析することができる。具体的には、公知の方法［アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），５５（１），２８３−２８４（１９９１）］に従って酸加水分解した試料を２−アミノピリジル化で蛍光ラベル化し、ＨＰＬＣ分析して組成比を算出することができる。

（２）糖鎖構造解析
抗体の糖鎖の構造解析は、２次元糖鎖マップ法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１７１，７３（１９８８）、生物化学実験法２３−糖蛋白質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９年）］により行うことができる。２次元糖鎖マップ法は、例えば、Ｘ軸には逆相クロマトグラフィー糖鎖の保持時間または溶出位置を、Ｙ軸には順相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、それぞれプロットし、既知糖鎖のそれらの結果と比較することにより、糖鎖構造を推定する方法である。

具体的には、抗体をヒドラジン分解して、抗体から糖鎖を遊離し、２−アミノピリジン（以下、ＰＡと略記する）による糖鎖の蛍光標識［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），９５，１９７（１９８４）］を行った後、ゲルろ過により糖鎖を過剰のＰＡ化試薬などと分離し、逆相クロマトグラフィーを行う。次いで、分取した糖鎖の各ピークについて順相クロマトグラフィーを行う。これらの結果をもとに、２次元糖鎖マップ上にプロットし、糖鎖スタンダード（ＴａＫａＲａ社製）、文献［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１７１，７３（１９８８）］とのスポットの比較より糖鎖構造を推定することができる。

さらに各糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳなどの質量分析を行い、２次元糖鎖マップ法により推定される構造を確認することができる。

２．免疫機能分子の活性を調節する方法
本発明の免疫機能分子の活性を調節する方法について、イムノグロブリンＧ（以下、ＩｇＧと略記する）を例として以下に述べる。

ＩｇＧに結合するＮ−グルコシド結合糖鎖は、主として次式で示す構造（バイアンテナリーと記す）のバイアンテナリー複合型糖鎖である。

また、Ｎ−グルコシド結合糖鎖の非還元末端のＧａｌに、更に酸性糖であるシアル酸が付加する場合もあり、Ｎ−グルコシド結合糖鎖に、バイセクティングのＮ−アセチルグルコサミンが付加する場合もある。

ＩｇＧは、Ｆｃ領域内の１カ所に、Ｎ−グルコシド結合糖鎖が結合している。ＩｇＧは２本のＨ鎖から構成されているので、抗体１分子にはＦｃ部分が２カ所存在する。したがって、糖鎖結合部位も２カ所存在する。

ＩｇＧの活性は、上記２カ所の糖鎖結合部位への、Ｎ−アセチルグルコサミンにフコースが結合しないＮ−グルコシド結合糖鎖の付加する個数により活性が変化する。すなわち、糖鎖結合部位の少なくとも１カ所に、Ｎ−アセチルグルコサミンにフコースが結合しないＮ−グルコシド結合糖鎖が付加されるときには、免疫機能分子の活性が高まる。２カ所の糖鎖結合部位ともＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合しないＮ−グルコシド結合糖鎖が付加される抗体をＦ０構造を有する抗体（Ｆ０抗体）、１カ所の糖鎖結合部位にＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合しないＮ−グルコシド結合糖鎖が付加される抗体をＦ１構造を有する抗体（Ｆ１抗体）、糖鎖結合部位のどちらにもＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合したＮ−グルコシド結合糖鎖が付加する場合をＦ２構造を有する抗体（Ｆ２抗体）とすると、ＩｇＧの活性の高さは、Ｆ０抗体＞Ｆ１抗体＞Ｆ２抗体となる。

製造された抗体は、必ずしも単一の糖鎖構造を有しておらず、かつフコースの有無に着目した場合でもＦ０抗体、Ｆ１抗体およびＦ２抗体が混在して存在している。製造された抗体のＡＤＣＣ活性を調節するためには、上述した免疫機能分子の糖鎖の解析方法により抗体に結合している糖鎖を解析し、解析結果を指標としてＡＤＣＣ活性を調節することができる。

製造された抗体のＡＤＣＣ活性を促進するためには、Ｆ１抗体およびＦ０抗体の存在比率を高くすればよい。具体的には、Ｆ１抗体およびＦ０抗体を精製してもよいし、またＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合しないＮ−グルコシド結合糖鎖が免疫機能分子に付加するように、宿主細胞での発現を調節してもよい。

製造された抗体のＡＤＣＣ活性を抑制するためには、Ｆ２抗体の存在比率を高くすればよい。具体的には、Ｆ２抗体を精製してもよいし、またＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合したＮ−グルコシド結合糖鎖が免疫機能分子に付加するように、宿主細胞での発現を調節してもよい。

上述のように、Ｆ０抗体、Ｆ１抗体およびＦ２抗体を任意に存在比率を調節することにより、所望の活性の強弱を調節することができる。

３．免疫機能分子の製造方法
Ｎ−アセチルグルコサミンにフコースが結合しないＮ−グルコシド結合糖鎖を有する免疫機能分子、またはＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合するＮ−グルコシド結合糖鎖を有する免疫機能分子の製造方法について、以下に述べる。

抗体、ペプチドまたは蛋白質に所望の糖鎖を結合させる為には、目的とする抗体、ペプチドまたは蛋白質をコードする遺伝子を宿主細胞に導入し、該細胞を用いて生産させることができる。また、動物個体または植物個体に目的とする抗体、ペプチドまたは蛋白質をコードする遺伝子を導入し、該個体を用いて生産させることもできる。

Ｎ−アセチルグルコサミンにフコースが結合しないＮ−グルコシド結合糖鎖を有する免疫機能分子を製造するための宿主細胞または動物個体あるいは植物個体としては、例えば抗体で、抗体のＦｃ領域に結合するＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加させる酵素活性の低いまたは酵素活性を有しない細胞または個体であればいかなるものでもよい。抗体のＦｃ領域に結合するＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加させる酵素活性の低いまたは酵素活性を有しない細胞としては、ラットミエローマ細胞であるＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２；以下、ＹＢ２／０細胞と略記する）などがあげられる。

また、宿主細胞または動物個体あるいは植物個体のα１，６結合に関与する酵素の遺伝子を欠損させたり、該遺伝子への変異を与えて酵素活性を下げるか欠失させたりすることにより、α１，６結合に関与する酵素活性の少ない、または有しない細胞または個体を作製して宿主細胞または動物個体あるいは植物個体として用いることもできる。α１，６結合に関与する酵素としては、フコシルトランスフェラーゼ、好ましくはα１，６−フコシルトランスフェラーゼ（以下、ＦＵＴ８と称す）があげられる。

Ｎ−アセチルグルコサミンにフコースが結合するＮ−グルコシド結合糖鎖を有する免疫機能分子を製造するための宿主細胞または動物個体あるいは植物個体としては、例えば抗体で、抗体のＦｃ領域に結合するＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加させる酵素活性の高い細胞または個体であればいかなるものでもよい。

また、宿主細胞または動物個体あるいは植物個体のα１，６結合に関与する酵素の遺伝子を導入したり、該遺伝子への変異を与えて酵素活性をあげることにより、α１，６結合に関与する酵素活性の高い細胞または個体を作製して宿主細胞または動物個体あるいは植物個体として用いることもできる。α１，６結合に関与する酵素としては、フコシルトランスフェラーゼ、好ましくはＦＵＴ８があげられる。

宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。

細菌の宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＷ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＧＩ６９８、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＴＢ１、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ Ｓｅｒｒａｔｉａｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６６、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｄ−０１１０等をあげることができる。

酵母の宿主細胞としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属等に属する微生物、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ等をあげることができる。

動物細胞の宿主細胞としては、マウスミエローマ細胞であるＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞などがあげられる。好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣細胞であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞等があげられる。

昆虫細胞の宿主細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）〕、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を用いることができる。

植物細胞の宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
以上のようにして得られる本発明の形質転換体を培地に培養し、培養物中に免疫機能分子を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、免疫機能分子を製造することができる。
さらに、遺伝子が導入された動物個体または植物個体を造成し、これらの個体を用いて免疫機能分子を製造することもできる。

Ｎ−アセチルグルコサミンにフコースが結合しないＮ−グルコシド結合糖鎖を有する免疫機能分子を製造するための動物個体または植物個体としては、例えば抗体で、抗体のＦｃ領域に結合するＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加させる酵素活性の低いまたは酵素活性を有しない動物個体または植物個体であればいかなるものでもよい。

また、動物個体または植物個体のα１，６結合に関与する酵素の遺伝子を欠損させたり、該遺伝子への変異を与えて酵素活性を下げるか欠失させたりすることにより、α１，６結合に関与する酵素活性の少ない、または有しないノックアウト非ヒト動物またはノックアウト植物を作製して用いてもよい。α１，６結合に関与する酵素としては、フコシルトランスフェラーゼ、好ましくはＦＵＴ８があげられる。

Ｎ−アセチルグルコサミンにフコースが結合するＮ−グルコシド結合糖鎖を有する免疫機能分子を製造するための動物個体または植物個体としては、例えば抗体で、抗体のＦｃ領域に結合するＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加させる酵素活性の高い動物個体または植物個体であればいかなるものでもよい。

また、動物個体または植物個体のα１，６結合に関与する酵素の遺伝子を導入したり、該遺伝子への変異を与えて酵素活性を上げることにより、α１，６結合に関与する酵素活性の高いトランスジェニック非ヒト動物またはトランスジェニック植物を作製して用いてもよい。α１，６結合に関与する酵素としては、フコシルトランスフェラーゼ、好ましくはＦＵＴ８があげられる。
トランスジェニック非ヒト動物は、受精卵へ所望の遺伝子を直接インジェクションすることより取得することができる［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，７３８０（１９８０）］。

トランスジェニック非ヒト動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ヤギ、ウシなどがあげられる。

また、胚性幹細胞へ所望の遺伝子を導入し、集合キメラ法や注入キメラ法の手法で動物を作製することにより、所望の遺伝子のトランスジェニック非ヒト動物またはノックアウト非ヒト動物を作製することができる［Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）；Ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；バイオマテリアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）］。

胚性幹細胞としては、マウス［Ｎａｔｕｒｅ，２９２，１５４（１９８１）］、ラット、ニワトリ、ブタ、サル、ヤギ、ウシなどがあげられる。

さらに、所望の遺伝子を導入した核を、脱核した卵へ移植するというクローン技術を用いても、トランスジェニック非ヒト動物またはノックアウト非ヒト動物を作製することができる［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０，１２５６，１９９８；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８，８２４（１９９７）］。
上述の方法により作製された動物個体に、免疫機能分子をコードするＤＮＡを導入し、該免疫機能分子を動物個体中に生成・蓄積させ、該動物個体中より該免疫機能分子を採取することにより、該免疫機能分子を製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵等をあげることができる。

トランスジェニック植物の作製方法としては、文献［Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３８０，８２５（１９９９）］などがあげられ、ノックアウト植物の作製方法としては、文献［Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，１１，１１９５（１９９７）］があげられる。

植物個体を用いて免疫機能分子を製造する方法としては、例えば免疫機能分子をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法［組織培養，２０（１９９４）、組織培養，２１（１９９５）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５，４５（１９９７）］に準じて栽培し、該免疫機能分子を該植物中に生成・蓄積させ、該植物中より該免疫機能分子を採取することにより、該免疫機能分子を製造することができる。

また、フコシルトランスフェラーゼ、好ましくはＦＵＴ８のトランスジェニック非ヒト動物またはノックアウト非ヒト動物と同系他系統である所望の免疫機能分子のトランスジェニック動物とを交配させることにより、Ｎ−アセチルグルコサミンにフコースが結合しないＮ−グルコシド結合糖鎖を有する免疫機能分子またはＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合するＮ−グルコシド結合糖鎖を有する免疫機能分子を製造することができる、遺伝子改変動物を取得することができる。交配の方法としては、自然交配、体外受精などの方法があげられる。

また、単離した該酵素等の遺伝子群を酵母、大腸菌等へ導入し、該糖鎖の大量生産［ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１６，８４７（１９９８）］をすることもできる。また、生産された該酵素を、抗体、ペプチドまたは蛋白質への該糖鎖による修飾または生産に利用することもできる。

さらに、本発明の免疫機能分子の活性を促進する糖鎖をペプチドで代替することもできる［ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１６０，２９３（１９９８）］。該ペプチドは、上述の糖鎖の使用方法において有用性があり、また免疫機能分子との融合も容易であるので簡便性の点においても優れている。

以下に、免疫機能活性の促進された免疫機能分子の製造方法について述べる。ここでは一例として、ヒト化抗体の製造方法について記すが、他の免疫機能分子も上述の方法および当該方法に準じて作製することができる。

４．ヒト化抗体の製造方法
（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体の重鎖（以下、Ｈ鎖と表記する）及び軽鎖（以下、Ｌ鎖と表記する）Ｃ領域をコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることにより構築することができる。

ヒト抗体のＣ領域としては、任意のヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域であることができ、例えば、ヒト抗体のＨ鎖のＩｇＧ１サブクラスのＣ領域（以下、ｈＣγ１と表記する）及びヒト抗体のＬ鎖のκクラスのＣ領域（以下、ｈＣκと表記する）等があげられる。

ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンから成る染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。

動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［ジーン（Ｇｅｎｅ），２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１ β ｄ２−４［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），４，１７３（１９９０）］等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．），１４９，９６０（１９８７）］、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［セル（Ｃｅｌｌ），４１，４７９（１９８５）］とエンハンサー［セル（Ｃｅｌｌ），３３，７１７（１９８３）］等があげられる。

ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（以下、タンデム型と表記する）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖及びＬ鎖の発現量のバランスが均衡する等の点からタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ），１６７，２７１（１９９４）］。

構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体及びヒト型ＣＤＲ移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。

（２）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡは以下のようにして取得することができる。

目的のマウス抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージ或いはプラスミド等のベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、既存のマウス抗体のＣ領域部分或いはＶ領域部分をプローブとして用い、Ｈ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミド及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的のマウス抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の全塩基配列を決定し、塩基配列よりＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列を推定する。

ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。

ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１５４，３（１９８７）］、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９］等があげられる。また、ハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製するキットとしては、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製））、Ｑｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等があげられる。

ｃＤＮＡの合成及びｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １−３４］、或いは市販のキット、例えば、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ^ＴＭＰｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる方法などがあげられる。

ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、λｚａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ＤＮＡクローニング：ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ），Ｉ，４９（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３ １８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２［モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）］及びｐＵＣ１８［シーン（Ｇｅｎｅ）３３，１０３（１９８５）］等が用いられる。

ファージ或いはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現及び維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、Ｃ６００［ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６６，１（１９８３）］、Ｋ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］及びＪＭ１０５［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。

ｃＤＮＡライブラリーからのヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法或いはプラーク・ハイブリダイゼーション法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９］により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ或いはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ［以下、ＰＣＲ法と表記する；モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １−３４］によりＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを調製することもできる。

上記方法により選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等を用いて解析することで該ｃＤＮＡの塩基配列を決定することができる。

決定した塩基配列からＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。

（３）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域のアミノ酸配列の解析
分泌シグナル配列を含む抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さ及びＮ末端アミノ酸配列を推定でき、更にはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、Ｈ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］と比較することによって見出すことができる。

（４）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
本項４の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを、ヒト以外の動物の抗体Ｈ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の３’末端側の塩基配列とヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域の５’末端側の塩基配列とから成り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡとそれぞれ連結し、それぞれを本項４の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。

（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。まず、目的のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲを移植するヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のフレームワーク（以下、ＦＲと表記する）のアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ等のデータベースに登録されているヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖のＶ領域のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］等があげられるが、その中でも、十分な活性を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体を作製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。

次に、選択したヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を設計する。設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さから成る数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行う。この場合、ＰＣＲでの反応効率及び合成可能なＤＮＡの長さから、Ｈ鎖、Ｌ鎖とも６本の合成ＤＮＡを設計することが好ましい。

また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項４の（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローニングすることができる。ＰＣＲ後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、本項４の（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。

（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、目的のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲのみをヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元のヒト以外の動物の抗体に比べて低下してしまうことが知られている［バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），９，２６６（１９９１）］。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域では、ＣＤＲのみならず、ＦＲのいくつかのアミノ酸残基が直接的或いは間接的に抗原結合活性に関与しており、それらアミノ酸残基がＣＤＲの移植に伴い、ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲの異なるアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられている。この問題を解決するため、ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基やＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用したり、抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらを元のヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている［バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），９，２６６（１９９１）］。

ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を如何に効率よく同定するかが、最も重要な点であり、そのためにＸ線結晶解析［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１１２，５３５（１９７７）］或いはコンピューターモデリング［プロテイン・エンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ），７，１５０１（１９９４）］等による抗体の立体構造の構築及び解析が行われている。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来たが、その一方、あらゆる抗体に適応可能なヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製法は未だ確立されておらず、現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討する等の種々の試行錯誤が必要である。

ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸残基の改変は、改変用合成ＤＮＡを用いて本項４の（５）に記載のＰＣＲ法を行うことにより、達成できる。ＰＣＲ後の増幅産物について本項４の（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。

（７）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
本項４の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の上流に、本項４の（５）及び（６）で構築したヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、本項４の（５）及び（６）でヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域を構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項４の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。

（８）ヒト化抗体の安定的生産
本項４の（４）及び（７）に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な動物細胞に導入することによりヒト化抗体を安定に生産する形質転換株を得ることができる。

動物細胞への発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法［特開平２−２５７８９１、サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）３，１３３（１９９０）］等があげられる。

ヒト化抗体発現ベクターを導入する動物細胞としては、ヒト化抗体を生産させることができる動物細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、好ましくは生産される抗体のＦｃ領域に付加するＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加させる酵素活性の低いまたは酵素活性を有しない細胞があげられる。

抗体のＦｃ領域に付加するＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加させる酵素活性の低いまたは酵素活性を有しない細胞とは、α１，６結合に関与する酵素が少ない、またはない細胞であり、具体的にはフコシルトランスフェラーゼ、好ましくはＦＵＴ８活性が少ない、またはない細胞があげられる。

抗体のＦｃ領域に付加するＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加させる酵素活性の低い、または酵素活性を有しない細胞としては、ラットミエローマ細胞であるＹＢ２／０細胞などがあげられるが、α１，６結合に関与する酵素の遺伝子を欠損させたり、該遺伝子への変異を与えて酵素活性を下げるか欠失させた細胞を抗体生産細胞として用いることもできる。

具体的には、マウスミエローマ細胞であるＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞などがあげられる。好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣細胞であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞等があげられる。

発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に生産する形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８ ｓｕｌｆａｔｅ（以下、Ｇ４１８と表記する；ＳＩＧＭＡ社製）等の薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、またはこれら培地に牛胎児血清（以下、ＦＢＳと表記する）等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を生産蓄積させることができる。培養上清中のヒト化抗体の生産量及び抗原結合活性は酵素免疫抗体法［以下、ＥＬＩＳＡ法と表記する；アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，１９９８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６］等により測定できる。また、形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系等を利用してヒト化抗体の生産量を上昇させることができる。

ヒト化抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ８，１９８８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６］。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動［以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと表記する；ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７０）］やウエスタンブロッティング法［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １２，１９８８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６］等で測定することができる。

以上、動物細胞を宿主とした抗体の製造方法を示したが、上記３にあるように、細菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞または動物個体あるいは植物個体においても製造することができる。

（９）ヒト化抗体の活性評価
精製したヒト化抗体の抗原との結合活性、抗原陽性培養細胞株に対する結合活性はＥＬＩＳＡ法及び蛍光抗体法［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，３７３（１９９３）］等により測定できる。抗原陽性培養細胞株に対する細胞障害活性は、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性等を測定することにより、評価することができる［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，３７３（１９９３）］。更にヒト化抗体のヒトでの安全性、治療効果は、カニクイザル等のヒトに比較的近い動物種の適当なモデルを用いて評価することができる。

５．免疫機能分子の使用方法
上記４記載のヒト化抗体の例にあるように、高いＡＤＣＣ活性を有する抗体は、癌、アレルギー、循環器疾患、またはウィルスあるいは細菌感染をはじめとする各種疾患の予防および治療において有用である。
癌、すなわち悪性腫瘍は癌細胞が増殖する。通常の抗癌剤は癌細胞の増殖を抑制することを特徴とする。しかし、高いＡＤＣＣ活性を有する抗体は、殺細胞効果により癌細胞を障害することにより癌を治療することができるので、通常の抗癌剤よりも治療薬として有効である。

アレルギー反応は、免疫細胞によるメディエータ分子の放出により惹起されるため、高いＡＤＣＣ活性を有する抗体を用いて免疫細胞を除去することにより、アレルギー反応を抑えることができる。

循環器疾患としては、動脈硬化などがあげられる。動脈硬化は、現在バルーンカテーテルによる治療を行うが、治療後の再狭窄での動脈細胞の増殖を高いＡＤＣＣ活性を有する抗体を用いて抑えることより、循環器疾患を予防および治療することができる。

ウィルスまたは細菌に感染細胞を、高いＡＤＣＣ活性を有する抗体を用いてウィルスまたは細菌に感染細胞の増殖を抑えることにより、ウィルスまたは細菌感染をはじめとする各種疾患の予防および治療することができる。

また、ＡＤＣＣ活性が抑制された抗体は、自己免疫疾患の予防および治療において有用である。また、ＡＤＣＣ活性が抑制された抗体は、自己免疫疾患において亢進された免疫反応を押さえるという観点から、自己免疫疾患の予防および治療において有用である。

本発明の抗体を含有する医薬は、治療薬として単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。

投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができ、抗体製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。

投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。

経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。

乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。

カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。

非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。または、ヒト化抗体を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を調製することもできる。

座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。
また、噴霧剤は該化合物そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該化合物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。

担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該化合物および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。

投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。

また、抗体の各種腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を検討する方法は、インビトロ実験としては、ＣＤＣ活性測定法、ＡＤＣＣ活性測定法等があげられ、インビボ実験としては、マウス等の実験動物での腫瘍系を用いた抗腫瘍実験等があげられる。

ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性、抗腫瘍実験は、文献［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ），３６，３７３（１９９３）；キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），５４，１５１１（１９９４）］等記載の方法に従って行うことができる。

６．免疫機能分子の活性を促進または抑制させる方法
上述の方法によりフコースが存在しない糖鎖が結合された抗体、ペプチドまたは蛋白質を製造することにより免疫機能分子の活性を促進させることができる。

活性が促進された免疫機能分子を生体内に投与することにより、生体内では、ＡＤＣＣ活性を担うエフェクター細胞であるキラー細胞、ナチュラルキラー細胞、活性化マクロファージ等の細胞をはじめとする各種免疫細胞が活性化され、種々の免疫反応を調節することが可能となる。
また、上述の方法によりフコースが存在する糖鎖を結合された抗体、ペプチドまたは蛋白質を製造することにより免疫機能分子の活性を抑制させることができる。

活性が抑制された免疫機能分子を生体内に投与することにより、生体内では、ＡＤＣＣ活性を担う各種免疫細胞の活性が弱まり、種々の免疫反応を調節することが可能となる。

以下に、本発明の実施例を示すが、これにより本発明の範囲が限定されるものではない。

実施例１．抗ガングリオシドＧＤ３ヒト型キメラ抗体の作製
１．抗ガングリオシドＧＤ３ヒト型キメラ抗体のタンデム型発現ベクターｐＣｈｉＬＨＧＭ４の構築
抗ガングリオシドＧＤ３ヒト型キメラ抗体（以下、抗ＧＤ３キメラ抗体と表記する）のＬ鎖の発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＬＧＭ４［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ），１６７，２７１（１９９４）］を制限酵素ＭｌｕＩ（宝酒造社製）とＳａｌＩ（宝酒造社製）で切断して得られるＬ鎖ｃＤＮＡを含む約４．０３ｋｂの断片と動物細胞用発現ベクターｐＡＧＥ１０７［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］を制限酵素ＭｌｕＩ（宝酒造社製）とＳａｌＩ（宝酒造社製）で切断して得られるＧ４１８耐性遺伝子及びスプライシングシグナルを含む約３．４０ｋｂの断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結、大腸菌ＨＢ１０１株［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９］を形質転換してプラスミドｐＣｈｉ６４１ＬＧＭ４０を構築した。
次に、上記で構築したプラスミドｐＣｈｉ６４１ＬＧＭ４０を制限酵素ＣｌａＩ（宝酒造社製）で切断後、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑末端化し、更にＭｌｕＩ（宝酒造社製）で切断して得られるＬ鎖ｃＤＮＡを含む約５．６８ｋｂの断片と抗ＧＤ３キメラ抗体のＨ鎖の発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＨＧＭ４［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ），１６７，２７１（１９９４）］を制限酵素ＸｈｏＩ（宝酒造社製）で切断後、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑末端化し、更にＭｌｕＩ（宝酒造社製）で切断して得られるＨ鎖ｃＤＮＡを含む約８．４０ｋｂの断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結、大腸菌ＨＢ１０１株［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９］を形質転換して抗ＧＤ３キメラ抗体のタンデム型発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＬＨＧＭ４を構築した。

２．抗ＧＤ３キメラ抗体の安定生産細胞の作製
上記実施例１の１項で構築した抗ＧＤ３キメラ抗体のタンデム型発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＬＨＧＭ４を用いて抗ＧＤ３キメラ抗体の安定生産細胞を以下のようにして作製した。
（１）ラットミエローマＹＢ２／０細胞を用いた生産細胞の作製
抗ＧＤ３キメラ抗体発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＬＨＧＭ４の５μｇを４×１０^６細胞のラットミエローマＹＢ２／０細胞へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、４０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）［ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地］に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（住友ベークライト社製）に２００μｌ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＧＤ３キメラ抗体の抗原結合活性を実施例１の３項に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中に抗ＧＤ３キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＤＨＦＲの阻害剤であるメソトレキセート（以下、ＭＴＸと表記する；ＳＩＧＭＡ社製）を５０ｎＭ含むＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地に１〜２×１０^５細胞／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に２ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎＭ ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株の増殖が認められたウェルの培養上清中の抗ＧＤ３キメラ抗体の抗原結合活性を実施例１の３項に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。培養上清中に抗ＧＤ３キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を１００ｎＭ、２００ｎＭと順次上昇させ、最終的にＧ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、抗ＧＤ３キメラ抗体を高生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株については、２回の限界希釈法による単一細胞化（クローン化）を行った。
このようにして得られた抗ＧＤ３キメラ抗体を生産する形質転換細胞クローン７−９−５１は平成１１年４月５日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）にＦＥＲＭ ＢＰ−６６９１として寄託されている。
（２）ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を用いた生産細胞の作製
抗ＧＤ３キメラ抗体発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＬＨＧＭ４の４μｇを１．６×１０^６細胞のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、１０ｍｌのＩＭＤＭ−ＦＢＳ（１０）［ＦＢＳを１０％、ＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を１倍濃度で含むＩＭＤＭ培地］に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（岩城硝子社製）に２００μｌ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＧＤ３キメラ抗体の抗原結合活性を実施例１の３項に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中に抗ＧＤ３キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを１０ｎＭ含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地［透析牛胎児血清（以下、ｄＦＢＳと表記する；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を１０％含むＩＭＤＭ培地］に１〜２×１０^５細胞／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルプレート（岩城硝子社製）に０．５ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、１０ｎＭ ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。増殖が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を１００ｎＭに上昇させ、最終的にＧ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを１００ｎＭの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、抗ＧＤ３キメラ抗体を高生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株については、２回の限界希釈法による単一細胞化（クローン化）を行った。
（３）マウスミエローマＮＳ０細胞を用いた生産細胞の作製
抗ＧＤ３キメラ抗体発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＬＨＧＭ４の５μｇを４×１０^６細胞のマウスミエローマＮＳ０細胞へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３，１９９０］により導入後、４０ｍｌのＥＸ−ＣＥＬＬ３０２−ＦＢＳ（１０）［ＦＢＳを１０％、Ｌ−グルタミン（以下、Ｌ−Ｇｌｎと表記する；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を２ｍＭ含むＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地］に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（住友ベークライト社製）に２００μｌ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＧＤ３キメラ抗体の抗原結合活性を実施例１の３項に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中に抗ＧＤ３キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを５０ｎＭ含むＥＸ−ＣＥＬＬ３０２−ｄＦＢＳ（１０）培地（ｄＦＢＳを１０％、Ｌ−Ｇｌｎを２ｍＭ含むＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地）に１〜２×１０^５細胞／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に２ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎＭ ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株の増殖が認められたウェルの培養上清中の抗ＧＤ３キメラ抗体の抗原結合活性を実施例１の３項に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。培養上清中に抗ＧＤ３キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を１００ｎＭ、２００ｎＭと順次上昇させ、最終的にＧ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＥＸ−ＣＥＬＬ３０２−ｄＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、抗ＧＤ３キメラ抗体を高生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株については、２回の限界希釈法による単一細胞化（クローン化）を行った。

３．抗体のＧＤ３に対する結合活性の測定（ＥＬＩＳＡ法）
抗体のＧＤ３に対する結合活性は以下のようにして測定した。
４ｎｍｏｌのＧＤ３を１０μｇのジパルミトイルフォスファチジルコリン（ＳＩＧＭＡ社製）と５μｇのコレステロール（ＳＩＧＭＡ社製）とを含む２ｍｌのエタノール溶液に溶解した。該溶液の２０μｌ（４０ｐｍｏｌ／ウェルとなる）を９６ウェルのＥＬＩＳＡ用のプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）の各ウェルにそれぞれ分注し、風乾後、１％牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡと表記する；ＳＩＧＭＡ社製）を含むＰＢＳ（以下、１％ＢＳＡ−ＰＢＳと表記する）を１００μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、形質転換株の培養上清或いは精製したヒト型キメラ抗体の各種希釈溶液を５０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬社製）を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと表記する）で洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで３０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、５０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素を１μｌ／ｍｌで添加した溶液）を５０μｌ／ウェルで加えて発色させ、４１５ｎｍの吸光度（以下、ＯＤ４１５と表記する）を測定した。

４．抗ＧＤ３キメラ抗体の精製
（１）ＹＢ２／０細胞由来の生産細胞の培養及び抗体の精製
上記実施例１の２項（１）で得られた抗ＧＤ３キメラ抗体を生産する形質転換細胞クローン をＢＳＡを０．２％、ＭＴＸを２００ｎＭ、トリヨードチロニン（以下、Ｔ３と表記する；ＳＩＧＭＡ社製）を１００ｎＭの濃度で含むＨｙｂｒｉｄｄｏｍａ−ＳＦＭ培地に３×１０^５細胞／ｍｌとなるように懸濁し、２．０Ｌスピナーボトル（岩城硝子社製）を用いて５０ｒｐｍの速度で攪拌培養した。３７℃の恒温室内で１０日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＧＤ３キメラ抗体を精製した。精製した抗ＧＤ３キメラ抗体は、ＹＢ２／０−ＧＤ３キメラ抗体と名付けた。
（２）ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来の生産細胞の培養及び抗体の精製
上記実施例１の２項（２）で得られた抗ＧＤ３キメラ抗体を生産する形質転換細胞クローンをＬ−Ｇｌｎを３ｍＭ、脂肪酸濃縮液（以下、ＣＤＬＣと表記する；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を０．５％、プルロニックＦ６８（以下、ＰＦ６８と表記する；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を０．３％の濃度で含むＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地に１×１０^６細胞／ｍｌとなるように懸濁し、１７５ｍｍ^２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に５０ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で４日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＧＤ３キメラ抗体を精製した。精製した抗ＧＤ３キメラ抗体は、ＣＨＯ／ＤＧ４４−ＧＤ３キメラ抗体と名付けた。
（３）ＮＳ０細胞由来の生産細胞の培養及び抗体の精製
上記実施例１の２項（３）で得られた抗ＧＤ３キメラ抗体を生産する形質転換細胞クローンをＬ−Ｇｌｎを２ｍＭ、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを２００ｎＭ、ＦＢＳを１％の濃度で含むＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地に１×１０^６細胞／ｍｌとなるように懸濁し、１７５ｍｍ^２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に２００ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃で４日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＧＤ３キメラ抗体を精製した。精製した抗ＧＤ３キメラ抗体は、ＮＳ０−ＧＤ３キメラ抗体（３０２）と名付けた。また、該形質転換細胞クローンをＧ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＧＩＴ培地に３×１０^５細胞／ｍｌとなるように懸濁し、１７５ｍｍ^２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に２００ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃で１０日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＧＤ３キメラ抗体を精製した。精製した抗ＧＤ３キメラ抗体は、ＮＳ０−ＧＤ３キメラ抗体（ＧＩＴ）と名付けた。
（４）ＳＰ２／０細胞由来の生産細胞の培養及び抗体の精製
特開平５−３０４９８９に記載の抗ＧＤ３キメラ抗体を生産する形質転換細胞クローンをＧ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＧＩＴ培地に３×１０^５細胞／ｍｌとなるように懸濁し、１７５ｍｍ^２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に２００ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃で８日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＧＤ３キメラ抗体を精製した。精製した抗ＧＤ３キメラ抗体は、ＳＰ２／０−ＧＤ３キメラ抗体と名付けた。

５．精製した抗ＧＤ３キメラ抗体の解析
上記実施例１の４項で得られた各種動物細胞で生産、精製した５種類の抗ＧＤ３キメラ抗体の各４μｇを公知の方法［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０，１９７０］に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥし、分子量及び製精度を解析した。その結果を第１図に示した。第１図に示したように、精製した各抗ＧＤ３キメラ抗体は、いずれも非還元条件下では分子量が約１５０キロダルトン（以下、Ｋｄと表記する）の単一のバンドが、還元条件下では約５０Ｋｄと約２５Ｋｄの２本のバンドが認められた。これらの分子量は、抗体のＨ鎖及びＬ鎖のｃＤＮＡの塩基配列から推定される分子量（Ｈ鎖：約４９Ｋｄ、Ｌ鎖：約２３Ｋｄ、分子全体：約１４４Ｋｄ）とほぼ一致し、更に、ＩｇＧ型の抗体は、非還元条件下では分子量は約１５０Ｋｄであり、還元条件下では分子内のジスルフィド結合（以下、Ｓ−Ｓ結合と表記する）が切断され、約５０Ｋｄの分子量を持つＨ鎖と約２５Ｋｄの分子量を持つＬ鎖に分解されるという報告［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ１４，１９８８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６］と一致し、各抗ＧＤ３キメラ抗体が正しい構造の抗体分子として発現され、かつ精製されたことが確認された。

実施例２．抗ＧＤ３キメラ抗体の活性評価
１．抗ＧＤ３キメラ抗体のＧＤ３に対する結合活性（ＥＬＩＳＡ法）
上記実施例１の４項で得られた５種類の精製抗ＧＤ３キメラ抗体のＧＤ３（雪印乳業社製）に対する結合活性を実施例１の３項に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。第２図は、添加する抗ＧＤ３キメラ抗体の濃度を変化させて結合活性を検討した結果である。第２図に示したように、５種類の抗ＧＤ３キメラ抗体は、ほぼ同等のＧＤ３に対する結合活性を示した。この結果は抗体の抗原結合活性は、抗体を生産する動物細胞やその培養方法に関わらず、一定であることを示している。また、ＮＳ０−ＧＤ３キメラ抗体（３０２）とＮＳ０−ＧＤ３キメラ抗体（ＧＩＴ）の比較から抗原結合活性は、培養に用いる培地にも依らず、一定であることが示唆された。

２．抗ＧＤ３キメラ抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）
上記実施例１の４項で得られた５種類の精製抗ＧＤ３キメラ抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害活性を評価するため、以下に示す方法に従い、ＡＤＣＣ活性を測定した。
（１）標的細胞溶液の調製 ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で培養したヒトメラノーマ培養細胞株Ｇ−３６１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４２４）の１×１０^６細胞を調製し、放射性物質であるＮａ_２ ^５１ＣｒＯ_４を３．７ＭＢｑ当量加えて３７℃で１時間反応させ、細胞を放射標識した。反応後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で懸濁及び遠心分離操作により３回洗浄し、培地に再懸濁し、４℃で３０分間氷中に放置して放射性物質を自然解離させた。遠心分離後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地を５ｍｌ加え、２×１０^５細胞／ｍｌに調製し、標的細胞溶液とした。
（２）エフェクター細胞溶液の調製 健常人静脈血５０ｍｌを採取し、ヘパリンナトリウム（武田薬品社製）０．５ｍｌを加え穏やかに混ぜた。これをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｎｙｃｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａ ＡＳ社製）を用いて使用説明書に従い、遠心分離して単核球層を分離した。ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で３回遠心分離して洗浄後、培地を用いて２×１０^６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、エフェクター細胞溶液とした。
（３）ＡＤＣＣ活性の測定 ９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに上記（１）で調製した標的細胞溶液の５０μｌ（１×１０^４細胞／ウェル）を分注した。次いで（２）で調製したエフェクター細胞溶液を１００μｌ（２×１０^５細胞／ウェル、エフェクター細胞と標的細胞の比は２０：１となる）添加した。更に、各種抗ＧＤ３キメラ抗体を各最終濃度０．００２５〜２．５μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清の^５１Ｃｒ量をγ−カウンターにて測定した。自然解離^５１Ｃｒ量は、エフェクター細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて上記と同様の操作を行い、上清の^５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。全解離^５１Ｃｒ量は、抗体溶液の代わりに培地のみを、エフェクター細胞溶液の代わりに１規定塩酸を添加し、上記と同様の操作を行い、上清の^５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。ＡＤＣＣ活性は下式により求めた。

その結果を第３図に示した。第３図に示したように、５種類の抗ＧＤ３キメラ抗体のうち、ＹＢ２／０−ＧＤ３キメラ抗体が最も高いＡＤＣＣ活性を示し、次いでＳＰ２／０−ＧＤ３キメラ抗体、ＮＳ０−ＧＤ３キメラ抗体、ＣＨＯ−ＧＤ３キメラ抗体の順に高いＡＤＣＣ活性を示した。培養に用いた培地の異なるＮＳ０−ＧＤ３キメラ抗体（３０２）とＮＳ０−ＧＤ３キメラ抗体（ＧＩＴ）では、それらのＡＤＣＣ活性に差は認められなかった。以上の結果は、抗体のＡＤＣＣ活性は、生産に用いる動物細胞によって大きく異なることを示している。その機構としては、抗原結合活性が同等であったことから、抗体のＦｃ領域の構造の差に起因していることが推定された。

実施例３．抗ヒトインターロイキン５レセプターα鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製
１．抗ヒトインターロイキン５レセプターα鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体の安定生産細胞の作製
（１）ラットミエローマＹＢ２／０細胞を用いた生産細胞の作製
ＷＯ９７／１０３５４に記載の抗ヒトインターロイキン５レセプターα鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体（以下、抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体と表記する）の発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１２５９ＨＶ３ＬＶ０を用いて抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体の安定生産細胞を以下のようにして作製した。
抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１２５９ＨＶ３ＬＶ０の５μｇを４×１０^６細胞のラットミエローマＹＢ２／０細胞へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３，１９９０］により導入後、４０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（住友ベークライト社製）に２００μｌ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体の抗原結合活性を実施例３の２項に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中に抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを５０ｎＭ含むＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地に１〜２×１０^５細胞／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に２ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎＭ ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株の増殖が認められたウェルの培養上清中の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体の抗原結合活性を実施例３の２項に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。培養上清中に抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を１００ｎＭ、２００ｎＭと順次上昇させ、最終的にＧ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を高生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株については、２回の限界希釈法による単一細胞化（クローン化）を行った。このようにして得られた抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を生産する形質転換細胞クローンＮｏ．３は平成１１年４月５日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）にＦＥＲＭ ＢＰ−６６９０として寄託されている。
（２）ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞を用いた生産細胞の作製
ＷＯ９７／１０３５４に記載の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１２５９ＨＶ３ＬＶ０の４μｇを１．６×１０^６細胞のＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、１０ｍｌのＩＭＤＭ−ＦＢＳ（１０）に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（岩城硝子社製）に２００μｌ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体の抗原結合活性を実施例３の２項に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中に抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを１０ｎＭ含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地に１〜２×１０^５細胞／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルプレート（岩城硝子社製）に０．５ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、１０ｎＭ ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。増殖が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を１００ｎＭ、５００ｎＭに上昇させ、最終的にＧ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを５００ｎＭの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を高生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株については、２回の限界希釈法による単一細胞化（クローン化）を行った。
（３）マウスミエローマＮＳ０細胞を用いた生産細胞の作製
ヤラントン（Ｙａｒｒａｎｔｏｎ）らの方法［バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），１０，１６９（１９９２）］に従い、ＷＯ９７／１０３５４に記載の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１２５９ＨＶ３ＬＶ０上の抗体Ｈ鎖及びＬ鎖ｃＤＮＡを用いて抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体発現ベクターを作製し、ＮＳ０細胞を形質転換し、抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を高生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株については、２回の限界希釈法による単一細胞化（クローン化）を行った。

２．抗体のｈＩＬ−５Ｒαに対する結合活性の測定（ＥＬＩＳＡ法）
抗体のｈＩＬ−５Ｒαに対する結合活性は以下のようにして測定した。
ＷＯ９７／１０３５４に記載の抗ｈＩＬ−５Ｒαマウス抗体ＫＭ１２５７をＰＢＳで１０μｇ／ｍｌの濃度に希釈した溶液の５０μｌを９６ウェルのＥＬＩＳＡ用のプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）の各ウェルにそれぞれ分注し、４℃で２０時間反応させた。反応後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、ＷＯ９７／１０３５４に記載の可溶性ｈＩＬ−５Ｒαを１％ＢＳＡ−ＰＢＳで０．５μｇ／ｍｌの濃度に希釈した溶液を５０μｌ／ウェルで加え、４℃で２０時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、形質転換株の培養上清或いは精製したヒト型ＣＤＲ移植抗体の各種希釈溶液を５０μｌ／ウェルで加え、室温で２時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで３０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、５０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素を１μｌ／ｍｌで添加した溶液］を５０μｌ／ウェルで加えて発色させ、ＯＤ４１５を測定した。

３．抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体の精製
（１）ＹＢ２／０細胞由来の生産細胞の培養及び抗体の精製
上記実施例３の１項（１）で得られた抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を生産する形質転換細胞クローンをＧ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＧＩＴ培地に３×１０^５細胞／ｍｌとなるように懸濁し、１７５ｍｍ_２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に２００ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃で８日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりイオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過法を用いて抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を精製した。精製した抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体は、ＹＢ２／０−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体と名付けた。
（２）ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞由来の生産細胞の培養及び抗体の精製
上記実施例３の１項（２）で得られた抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を生産する形質転換細胞クローンをＬ−Ｇｌｎを３ｍＭ、ＣＤＬＣを０．５％、ＰＦ６８を０．３％の濃度で含むＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地に３×１０^５細胞／ｍｌとなるように懸濁し、４．０Ｌスピナーボトル（岩城硝子社製）を用いて１００ｒｐｍの速度で攪拌培養した。３７℃の恒温室内で１０日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりイオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過法を用いて抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を精製した。精製した抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体は、ＣＨＯ／ｄ−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体と名付けた。
（３）ＮＳ０細胞由来の生産細胞の培養及び抗体の精製
上記実施例３の１項（３）で得られた抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を生産する形質転換細胞クローンをヤラントン（Ｙａｒｒａｎｔｏｎ）らの方法［バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），１０，１６９（１９９２）］に従い、培養後、培養上清を回収した。培養上清よりイオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過法を用いて抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を精製した。精製した抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体は、ＮＳ０−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体と名付けた。

４．精製した抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体の解析
上記実施例３の３項で得られた各種動物細胞で生産、精製した３種類の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体の各４μｇを公知の方法［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７０）］に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥし、分子量及び製精度を解析した。その結果を第４図に示した。第４図に示したように、精製した各抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体は、いずれも非還元条件下では分子量が約１５０Ｋｄの単一のバンドが、還元条件下では約５０Ｋｄと約２５Ｋｄの２本のバンドが認められた。これらの分子量は、抗体のＨ鎖及びＬ鎖のｃＤＮＡの塩基配列から推定される分子量（Ｈ鎖：約４９Ｋｄ、Ｌ鎖：約２３Ｋｄ、分子全体：約１４４Ｋｄ）とほぼ一致し、更に、ＩｇＧ型の抗体は、非還元条件下では分子量は約１５０Ｋｄであり、還元条件下では分子内のジスルフィド結合（以下、Ｓ−Ｓ結合と表記する）が切断され、約５０Ｋｄの分子量を持つＨ鎖と約２５Ｋｄの分子量を持つＬ鎖に分解されるという報告［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，１９８８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６］と一致し、各抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体が正しい構造の抗体分子として発現され、かつ、精製されたことが確認された。

実施例４．抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体の活性評価
１．抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体のｈＩＬ−５Ｒαに対する結合活性（ＥＬＩＳＡ法）
上記実施例３の３項で得られた３種類の精製抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体のｈＩＬ−５Ｒαに対する結合活性を実施例３の２項に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。第５図は、添加する抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体の濃度を変化させて結合活性を検討した結果である。第５図に示したように、３種類の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体は、ほぼ同等のｈＩＬ−５Ｒαに対する結合活性を示した。この結果は実施例２の１項の結果と同様に、抗体の抗原結合活性は、抗体を生産する動物細胞やその培養方法に関わらず、一定であることを示している。

２．抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）
上記実施例３の３項で得られた３種類の精製抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害活性を評価するため、以下に示す方法に従い、ＡＤＣＣ活性を測定した。
（１）標的細胞溶液の調製
ＷＯ９７／１０３５４に記載のｈＩＬ−５Ｒα鎖及びβ鎖を発現しているマウスＴ細胞株ＣＴＬＬ−２（ｈ５Ｒ）をＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で培養し、１×１０^６細胞／０．５ｍｌとなるように調製し、放射性物質であるＮａ_２ ^５１ＣｒＯ_４を３．７ＭＢｑ当量加えて３７℃で１．５時間反応させ、細胞を放射標識した。反応後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で懸濁及び遠心分離操作により３回洗浄し、培地に再懸濁し、４℃で３０分間氷中に放置して放射性物質を自然解離させた。遠心分離後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地を５ｍｌ加え、２×１０^５細胞／ｍｌに調製し、標的細胞溶液とした。
（２）エフェクター細胞溶液の調製
健常人静脈血５０ｍｌを採取し、ヘパリンナトリウム（武田薬品社製）０．５ｍｌを加え穏やかに混ぜた。これをＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ（Ｎｙｃｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａ ＡＳ社製）を用いて使用説明書に従い、遠心分離して単核球層を分離した。ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で３回遠心分離して洗浄後、培地を用いて９×１０^６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、エフェクター細胞溶液とした。
（３）ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに上記（１）で調製した標的細胞溶液の５０μｌ（１×１０^４細胞／ウェル）を分注した。次いで（２）で調製したエフェクター細胞溶液を１００μｌ（９×１０^５細胞／ウェル、エフェクター細胞と標的細胞の比は９０：１となる）添加した。更に、各種抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を各最終濃度０．００１〜０．１μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清の^５１Ｃｒ量をγ−カウンターにて測定した。自然解離^５１Ｃｒ量は、エフェクター細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて上記と同様の操作を行い、上清の^５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。全解離^５１Ｃｒ量は、抗体溶液の代わりに培地のみを、エフェクター細胞溶液の代わりに１規定塩酸を添加し、上記と同様の操作を行い、上清の^５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。
ＡＤＣＣ活性は下式により求めた。

その結果を第６図に示した。第６図に示したように、３種類の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体のうち、ＹＢ２／０−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体が最も高いＡＤＣＣ活性を示し、次いでＣＨＯ／ｄ−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体、ＮＳ０−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体の順に高いＡＤＣＣ活性を示した。以上の結果は実施例２の２項の結果と同ように、抗体のＡＤＣＣ活性は、生産に用いる動物細胞によって大きく異なることを示している。更に、２種類のヒト化抗体のいずれの場合もＹＢ２／０細胞で生産した抗体が最も高いＡＤＣＣ活性を示したことから、ＹＢ２／０細胞を用いることにより、ＡＤＣＣ活性の高い抗体を製造できることが明らかとなった。

３．抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体のｉｎ ｖｉｖｏにおける活性評価
上記実施例３の３項で得られた３種類の精製抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体のｉｎ ｖｉｖｏにおける活性を評価するため、以下に示す方法に従い、カニクイザルのｈＩＬ−５誘発好酸球増加モデルに対する抑制作用を検討した。
カニクイザルに初日よりｈＩＬ−５（調製方法はＷＯ９７／１０３５４に記載）を１μｇ／ｋｇで１日１回、計１４回背部皮下より投与した。各種抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を０日のｈＩＬ−５の投与１時間前に０．３ｍｇ／ｋｇで静脈内に単回投与した。抗体非投与群をコントロールとして用いた。抗体投与群は各群３頭（Ｎｏ．３０１、Ｎｏ．３０２、Ｎｏ．３０３、Ｎｏ．４０１、Ｎｏ．４０２、Ｎｏ．４０３、Ｎｏ．５０１、Ｎｏ．５０２、Ｎｏ．５０３）、抗体非投与群は２頭（Ｎｏ．１０１、Ｎｏ．１０２）のカニクイザルを用いた。投与開始の７日前より投与後４２日目まで経時的に約１ｍｌの血液を伏在静脈または大腿静脈より採取し、１μｌの末梢血中の好酸球数を測定した。その結果を第７図に示した。第７図に示したように、ＹＢ２／０−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体を投与した群では、血中好酸球の増加が完全に抑制された。一方、ＣＨＯ／ｄ−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体の投与群では、１頭で完全な抑制作用が認められたものの、２頭ではその抑制作用は不充分であった。ＮＳ０−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体の投与群では、完全な抑制作用は認められず、その効果は不充分であった。以上の結果は、抗体のｉｎ ｖｉｖｏ活性は、生産に用いる動物細胞によって大きく異なることを示している。更に、抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体ではそのｉｎ ｖｉｖｏ活性の高さは、実施例４の２項で述べたＡＤＣＣ活性の高さと正の相関が認められたことから、その活性発現には、ＡＤＣＣ活性の高さが極めて重要であることが示唆された。
以上の結果から、ＡＤＣＣ活性の高い抗体は、ヒトの各種疾患の臨床においても有用であることが期待される。

実施例５．ＡＤＣＣ活性を高める糖鎖の解析
１．２−アミノピリジン標識糖鎖（ＰＡ化糖鎖）の調製
本発明のヒト化抗体を塩酸による酸加水分解にてシアル酸を除去した。塩酸を完全に除去した後、ヒドラジン分解により糖鎖を蛋白質から切断した［メソッド・オブ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），８３，２６３，１９８２］。ヒドラジンを除去した後、酢酸アンモニウム水溶液と無水酢酸加えてＮ−アセチル化を行った。凍結乾燥後、２−アミノピリジンによる蛍光標識を行った［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），９５，１９７（１９８４）］。蛍光標識した糖鎖（ＰＡ化糖鎖）を、Ｓｕｒｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＨＲ １０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて不純物と分離した。糖鎖画分を遠心濃縮機にて乾固させ、精製ＰＡ化糖鎖とした。

２．精製抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体のＰＡ化糖鎖の逆相ＨＰＬＣ分析
上記実施例５の１項で調製した各種抗ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体のＰＡ化糖鎖を用いて、ＣＬＣ−ＯＤＳカラム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製）による逆相ＨＰＬＣ分析を行った。過剰量のα−Ｌ−フコシダーゼ（ウシ腎由来、ＳＩＧＭＡ社製）をＰＡ化糖鎖に添加して消化を行い（３７℃、１５時間）、逆相ＨＰＬＣで分析した（第８図）。アスパラギン結合糖鎖は３０分間から８０分間の範囲に溶出することをＴａＫａＲａ社製ＰＡ化糖鎖スタンダードを用いて確認した。α−Ｌ−フコシダーゼ消化によって、逆相ＨＰＬＣの溶出位置が移動する糖鎖（４８分間から７８分間に溶出される糖鎖）の全体に占める割合を計算した。結果を第１表に示す。

ＹＢ２／０細胞で生産させた抗ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ移植抗体は約４７％、ＮＳ０細胞で生産させた抗ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ移植抗体は約７３％がα１−６フコースをもつ糖鎖であった。よって、ＹＢ２／０細胞で生産した抗体は、ＮＳ０細胞で生産した抗体と比較してα１−６フコースを持たない糖鎖が多かった。

３．精製抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体の単糖組成分析
トリフルオロ酢酸による酸加水分解により、ＹＢ２／０細胞、ＮＳ０細胞およびＣＨＯ／ｄ細胞で生産した抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体の糖鎖を単糖に分解し、ＢｉｏＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ社製）を用いて単糖組成分析を行った。
Ｎ−グリコシド結合糖鎖のうち、コンプレックス型では、１本の糖鎖におけるマンノース数は３であるため、マンノースを３として計算した場合の各単糖の相対比を第２表に示す。

フコースの相対比は、ＹＢ２／０＜ＣＨＯ／ｄ＜ＮＳ０であり、本結果でもＹＢ２／０細胞で生産した抗体の糖鎖はフコース含量が最も低かった。

実施例６．ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞生産抗体の糖鎖解析
ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞で生産した精製抗ｈＩｌ−５ＲαＣＤＲ移植抗体からＰＡ化糖鎖を調製し、ＣＬＣ−ＯＤＳカラム（島津社製）を用いて逆相ＨＰＬＣ分析を行った（第９図）。第９図において、溶出時間３５〜４５分間がフコースを持たない糖鎖、４５〜６０分間がフコースを持つ糖鎖であった。ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞で生産した抗ｈＩｌ−５ＲαＣＤＲ移植抗体は、マウスミエローマＮＳ０細胞で生産させた抗体と同様に、ラットミエローマＹＢ２／０細胞で生産させた抗体よりもフコースを持たない糖鎖の含量が少なかった。

実施例７．高ＡＤＣＣ活性抗体の分離
フコースを持つ糖鎖に結合するレクチンカラムを用いて、ラットミエローマＹＢ２／０細胞で生産させた抗ｈＩｌ−５ＲαＣＤＲ移植抗体の分離を行った。ＨＰＬＣは島津社製ＬＣ−６Ａを用い、流速は１ｍｌ／分、カラム温度は室温で行った。５０ｍＭトリス−硫酸緩衝液（ｐＨ７．３）で平衡化し、精製された抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を注入後、０．２Ｍα−メチルマンノシド（ナカライテスク社製）の直線濃度勾配（６０分間）にて溶出した。抗ｈＩｌ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を非吸着画分と吸着画分とに分離した。非吸着画分、吸着画分の一部をとり、ｈＩＬ−５Ｒαに対する結合活性を測定すると、同様の結合活性を示した（第１０図 上図）。ＡＤＣＣ活性を測定すると、非吸着画分の方が吸着画分の一部よりも高いＡＤＣＣ活性を示した（第１０図 下図）。さらに、非吸着画分、吸着画分の一部からＰＡ化糖鎖を調製し、ＣＬＣ−ＯＤＳカラム（島津社製）を用いて逆相ＨＰＬＣ分析を行った（第１１図）。非吸着画分は主としてフコースのない糖鎖をもつ抗体であり、吸着画分の一部は主としてフコースがある糖鎖もつ抗体であった。

実施例８．宿主細胞株におけるα１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子の転写物の定量
（１）各種細胞株由来一本鎖ｃＤＮＡの調製
チャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）および１倍濃度のＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に懸濁し、２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度で接着細胞培養用Ｔ７５フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社）に播種した。またラットミエローマ由来ＹＢ２／０細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｌｏｇｉｅｓ社）、４ｍＭグルタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に懸濁し、２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度で浮遊細胞培養用Ｔ７５フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社）に播種した。これらを３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーター内で培養し、培養１日目、２日目、３日目、４日目および５日目に各宿主細胞１×１０^７ｃｅｌｌｓを回収し、ＲＮＡｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により全ＲＮＡを抽出した。
全ＲＮＡを４５μｌの滅菌水に溶解し、ＲＱ１ Ｒｎａｓｅ−Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）０．５Ｕ／μｌ、付属の１０×ＤＮａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ、ＲＮａｓｉｎ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）０．５μｌをそれぞれに添加して、３７℃で３０分間反応させた。反応後、ＲＮＡｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社）により全ＲＮＡを再精製し、５０μｌの滅菌水に溶解した。
得られた各々の全ＲＮＡ３μｇについて、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとしてＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ^ＴＭ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）により、２０μｌの系で逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。各宿主細胞由来ＦＵＴ８およびβ−アクチンのクローニングには逆転写反応後の溶液の１倍濃度液を、競合的ＰＣＲによる各遺伝子転写量の定量には逆転写反応後の溶液を水で５０倍希釈したものを用い、各々使用するまで−８０℃で保管した。

（２）チャイニーズハムスターＦＵＴ８およびラットＦＵＴ８の各ｃＤＮＡ部分断片の取得
チャイニーズハムスターＦＵＴ８およびラットＦＵＴ８の各ｃＤＮＡ部分断片の取得は、以下のように行った。まず、ヒトＦＵＴ８のｃＤＮＡ［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１２１，６２６（１９９７）］およびブタＦＵＴ８のｃＤＮＡ［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７１，２７８１０（１９９６）］に共通の塩基配列に対して特異的なプライマー（配列番号１および配列番号２に示す）を設計した。
次にＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社）を用いて、（１）で調製した培養２日目のＣＨＯ細胞由来ｃＤＮＡおよびＹＢ２／０細胞由来ｃＤＮＡを各々１μｌを含む２５μｌの反応液［ＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、０．５μＭ上記特異的プライマー（配列番号１および配列番号２）］を調製し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲは、９４℃で１分間の加熱の後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとして３０サイクルの後、さらに７２℃で１０分間加熱する条件で行った。ＰＣＲにより得た各特異的増幅断片９７９ｂｐをＴＯＰＯ ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてプラスミドｐＣＲ２．１へ連結し、チャイニーズハムスターＦＵＴ８およびラットＦＵＴ８の各ｃＤＮＡ部分断片を含むプラスミド（ＣＨＦＴ８−ｐＣＲ２．１およびＹＢＦＴ８−ｐＣＲ２．１）を取得した。
取得した各ｃＤＮＡの塩基配列について、ＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）およびＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用いて決定し、取得したｃＤＮＡがチャイニーズハムスターＦＵＴ８およびラットＦＵＴ８（配列番号３および４に示す）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）部分配列をコードすることを確認した。

（３）チャイニーズハムスターβ−アクチンおよびラットβ−アクチンｃＤＮＡの取得 β−アクチン遺伝子は各細胞において恒常的に転写されており、その転写量は細胞間で同程度と考えられているため、各細胞由来ｃＤＮＡ合成反応の効率の目安としては、β−アクチン遺伝子の転写量を定量する。
チャイニーズハムスターβ−アクチンおよびラットβ−アクチンの取得は、以下の方法で行った。まず、チャイニーズハムスターβ−アクチンゲノム配列［ＧｅｎＢａｎｋ，Ｕ２０１１４］およびラットβ−アクチンゲノム配列［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１，１７５９（１９８３）］より、翻訳開始コドンを含む共通配列に特異的なフォワードプライマー（配列番号５に示す）および翻訳終止コドンを含む各配列特異的なリバースプライマー（配列番号６および配列番号７に示す）を設計した。
次にＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ（東洋紡社）を用いて、（１）で調製した培養２日目のＣＨＯ細胞由来ｃＤＮＡおよびＹＢ２／０細胞由来ｃＤＮＡ １μｌを含む２５μｌの反応液［ＫＯＤ ｂｕｆｆｅｒ ＃１（東洋紡社）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．４μＭ 上記遺伝子特異的プライマ−（配列番号５および配列番号６、または配列番号５および配列番号７）、５％ ＤＭＳＯ］を調製し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲは、９４℃で４分間の加熱の後、９８℃で１５秒間、６５℃で２秒間、７４℃で３０秒間からなる反応を１サイクルとして、２５サイクル行った。ＰＣＲにより得た各特異的増幅断片１１２８ｂｐの５’末端をＭＥＧＡＬＡＢＥＬ（宝酒造社）によりリン酸化した後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社）に、制限酵素ＥｃｏＲＶにより切断して得られる断片（２．９Ｋｂ）をＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社）で連結し、チャイニーズハムスターβ−アクチンおよびラットβ−アクチンの各ｃＤＮＡのＯＲＦ全長を含むプラスミド（ＣＨＡｃ−ｐＢＳ、ＹＢＡｃ−ｐＢＳ）を得た。
取得した各ｃＤＮＡの塩基配列を、ＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）およびＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて決定し、各々チャイニーズハムスターβ−アクチンおよびラットβ−アクチンの各ｃＤＮＡのＯＲＦ全長配列をコードすることを確認した。

（４）スタンダードおよび内部配列のコントロールの調製
生産細胞内のＦＵＴ８遺伝子からのｍＲＮＡ転写量を測定するために、まず検量線を作成した。
検量線に用いるＦＵＴ８のスタンダードとしては、（２）で得たチャイニーズハムスターＦＵＴ８およびラットＦＵＴ８の各ｃＤＮＡ部分断片をｐＣＲ２．１に組み込んだプラスミドであるＣＨＦＴ８−ｐＣＲ２．１およびＹＢＦＴ８−ｐＣＲ２．１を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断して得られたＤＮＡを直鎖化して用いた。
ＦＵＴ８定量の内部コントロールとしては、ＣＨＦＴ８−ｐＣＲ２．１およびＹＢＦＴ８−ｐＣＲ２．１のうち、チャイニーズハムスターＦＵＴ８およびラットＦＵＴ８の内部塩基配列のＳｃａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ間２０３ｂｐを欠失させることにより得られたＣＨＦＴ８ｄ−ｐＣＲ２．１およびＹＢＦＴ８ｄ−ｐＣＲ２．１を、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断して得られたＤＮＡを直鎖化して用いた。
生産細胞内のβ−アクチン遺伝子からのｍＲＮＡ転写量のスタンダードとしては、（３）で得たチャイニーズハムスターβ−アクチンおよびラットβ−アクチンのそれぞれのｃＤＮＡのＯＲＦ全長をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋）に組み込んだプラスミドであるＣＨＡｃ−ｐＢＳおよびＹＢＡｃ−ｐＢＳを、前者はＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩで、後者はＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで、各々切断して得られたＤＮＡを直鎖化して用いた。
β−アクチン定量の内部コントロールとしては、ＣＨＡｃ−ｐＢＳおよびＹＢＡｃ−ｐＢＳのうち、チャイニーズハムスターβ−アクチンおよびラットβ−アクチンの内部塩基配列のＤｒａＩＩＩ−ＤｒａＩＩＩ間１８０ｂｐを欠失させることにより得られたＣＨＡｃｄ−ｐＢＳおよびＹＢＡｃｄ−ｐＢＳを、前者はＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩで、後者はＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで、各々切断して得られたＤＮＡを直鎖化して用いた。

（５）競合的ＲＴ−ＰＣＲによる転写量の定量
ＦＵＴ８の転写産物の定量は以下のように行った。まず（２）で得たチャイニーズハムスターＦＵＴ８およびラットＦＵＴ８のＯＲＦ部分配列の内部配列に対し、共通配列特異的なプライマーセット（配列番号８および９に示す）を設計した。
次に、（１）で得られた各宿主細胞株由来のｃＤＮＡ溶液の５０倍希釈液 ５μｌおよび内部コントロール用プラスミド５μｌ（１０ｆｇ）を含む総体積２０μｌの反応液［ＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、０．５μＭ 上記遺伝子特異的プライマー（配列番号８および配列番号９）、５％ＤＭＳＯ］で、ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で３分間の加熱の後、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間からなる反応を１サイクルとして３２サイクル行った。
β−アクチンの転写産物の定量は、以下のように行った。（３）で得たチャイニーズハムスターβ−アクチンおよびラットβ−アクチンＯＲＦ全長の内部配列に対し、各遺伝子特異的なプライマーセット（前者を配列番号１０および配列番号１１に、後者を配列番号１２および配列番号１３に示す）をそれぞれ設計した。
次に、（１）で得られた各宿主細胞株由来のｃＤＮＡ溶液の５０倍希釈液 ５μｌおよび内部コントロール用プラスミド５μｌ（１ｐｇ）を含む総体積２０μｌの反応液［ＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、０．５μＭ 上記遺伝子特異的プライマー（配列番号１０および配列番号１１、または配列番号１２および配列番号１３）、５％ ＤＭＳＯ］で、ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で３分間の加熱の後、９４℃で３０秒間、６５℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとして１７サイクル行った。

第３表に記載のプライマーセットを用いて定量的ＰＣＲを行った。その結果、各遺伝子転写産物および各スタンダードからは、第３表のターゲット欄に示したサイズのＤＮＡ断片を、各内部コントロールからは、第３表のコンペティター欄に示したサイズのＤＮＡ断片を増幅させることができた。
ＰＣＲ後の溶液のうち、７μｌを１．７５％アガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）で染色した。増幅された各ＤＮＡ断片の発光強度をフルオロイメージャー（ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ ＳＩ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ社）で算出することにより、増幅されたＤＮＡ断片の量を測定した。
一方、細胞由来ｃＤＮＡに代えて（４）で調製したスタンダードプラスミド量を０．１ｆｇ、１ｆｇ、５ｆｇ、１０ｆｇ、５０ｆｇ、１００ｆｇおよび５００ｆｇとしてＰＣＲをそれぞれ行い、増幅産物量を測定した。そして、その測定値とスタンダードプラスミド量をプロットして検量線を作成した。
上述の検量線を用いて、各細胞由来全ｃＤＮＡを鋳型とした場合の増幅産物の量より各細胞中の目的遺伝子ｃＤＮＡ量を算出し、これを各細胞におけるｍＲＮＡ転写量とした。
ラットＦＵＴ８配列をスタンダード、内部コントロールに用いた場合の各宿主細胞株におけるＦＵＴ８転写産物の量を第１２図に示した。培養期間を通じてＣＨＯ細胞株はＹＢ２／０細胞株の１０倍以上の転写量を示した。この傾向は、チャイニーズハムスターＦＵＴ８配列をスタンダード、内部コントロールに用いた場合にも認められた。
また、第４表にβ−ａｃｔｉｎ転写産物の量との相対値としてＦＵＴ８転写量を示した。

ＹＢ２／０細胞株のＦＵＴ８転写量がβ−ａｃｔｉｎの０．１％前後であるのに対し、ＣＨＯ細胞株は０．５〜２％であった。
以上の結果より、ＹＢ２／０細胞株のＰＵＴ８転写産物量はＣＨＯ細胞株のそれよりも有意に少ないことが示された。

本発明は、抗体、蛋白質またはペプチドなどの免疫機能分子の有する活性を調節する糖鎖、および糖鎖を有する抗体、蛋白質またはペプチドに関する。本発明は更に、該糖鎖および糖鎖を有する抗体、蛋白質またはペプチドの製造法、ならびにそれらを有効成分として含有する診断薬、予防薬および治療薬に関する。

Claims (11)

1. 宿主細胞のα１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子に変異を加える工程、または該遺伝子を欠損させる工程により得られた、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を欠失させた宿主細胞を用いるタンパク質の製造方法。
2. タンパク質が、Ｎ−グリコシド結合糖鎖が結合したタンパク質である、請求項１記載の製造方法。
3. Ｎ−グリコシド結合糖鎖が、Ｎ−グリコシド結合コンプレックス型糖鎖である、請求項１または２記載の製造方法。
4. Ｎ−グリコシド結合コンプレックス型糖鎖が結合したタンパク質を含有するタンパク質組成物であって、Ｎ−グリコシド結合コンプレックス型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースを有する糖鎖が結合したタンパク質に対して、Ｎ−グリコシド結合コンプレックス型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが存在しない糖鎖が結合したタンパク質を高い割合で含有するタンパク質組成物を生産することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
5. 糖鎖が、
   
   を含む糖鎖を含有する請求項４記載の製造方法。
6. 糖鎖が、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を欠失させた細胞が合成する糖鎖を含有する請求項５記載の製造方法。
7. タンパク質が、腫瘍関連抗原を認識する抗体、アレルギーまたは炎症に関連する抗原を認識する抗体、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体およびウィルスまたは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体から選ばれる抗体である請求項４〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
8. 腫瘍関連抗原がガングリオシドＧＤ３である、請求項７記載の製造方法。
9. 抗体が、７−９−５１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６９１）より生産される抗体である請求項８に記載の製造方法。
10. アレルギーまたは炎症に関連する抗原が、ヒトインターロイキン５レセプターα鎖である請求項７に記載の製造方法。
11. 抗体が、Ｎｏ．３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６９０）より生産される抗体である請求項１０に記載の製造方法。