CN109562282A - 用于治疗癌症的使用merestinib和抗-pd-l1或抗-pd-1抑制剂的组合疗法 - Google Patents

用于治疗癌症的使用merestinib和抗-pd-l1或抗-pd-1抑制剂的组合疗法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于治疗多种癌症的组合疗法，所述组合疗法使用N‑(3‑氟‑4‑(1‑甲基‑6‑(1H‑吡唑‑4‑基)‑1H‑吲唑‑5‑基氧基)苯基)‑1‑(4‑氟苯基)‑6‑甲基‑2‑氧代‑1,2‑二氢吡啶‑3‑甲酰胺(merestinib,LY2801653)或其药学上可接受的盐以及结合人共抑制性免疫检验点诸如程序性死亡1配体1(PD‑L1)或程序性死亡1(PD‑1)的抗体。

Description

用于治疗癌症的使用MERESTINIB和抗-PD-L1或抗-PD-1抑制 剂的组合疗法
本发明涉及用于治疗多种癌症的组合疗法，所述组合疗法使用N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(merestinib, LY2801653)或其药学上可接受的盐以及结合人共抑制性免疫检验点诸如程序性死亡1配体1 (PD-L1)或程序性死亡1 (PD-1)的抗体。
肿瘤细胞通过多种机制逃避免疫系统的检测和消除。内源性免疫检验点途径被用于维持自身耐受性和控制T细胞活化。PD-1配体（PD-L1和PD-L2）与存在于T细胞上的PD-1受体的结合会抑制T细胞增殖和细胞因子产生。PD-1配体的上调发生在某些肿瘤中，且通过该途径的信号传递促进肿瘤的活性T-细胞免疫监视的抑制。已经证实，PD-1或PD-L1的抑制会恢复免疫介导的肿瘤破坏。临床研究已经发现，用针对这些蛋白中的至少一种的拮抗剂抗体靶向PD-1或PD-L1会释放PD-1途径介导的免疫应答（包括抗肿瘤应答）的抑制。
几种用于治疗癌症的免疫检验点疗法最近已经被FDA批准，包括抗-PD-1抗体(派姆单抗（pembrolizumab）/KEYTRUDA™；纳武单抗（nivolumab）/OPDIVO™)和抗-PD-L1抗体(阿特朱单抗（atezolizumab）/TECENTRIQ™)。这些免疫-肿瘤学化合物在多个肿瘤类型中表现出治疗应答。但是，仅在经批准的肿瘤适应症的患者亚群中表现出治疗应答。
N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(CAS # 1206799-15-6)，
在此被称作merestinib，是一种靶向MET和MST1R的ATP竞争性II型激酶抑制剂(又名RON)。除了MET和MST1R以外，merestinib也靶向几种其它肿瘤激酶，包括AXL、MERTK、TEK(又名Tie2)、NTRK1/2/3、ROS1和MKNK1/2(Yan, S.B., 等人,Invest New Drugs. Vol 31:833-844, 2013)。这些merestinib靶标当失调(诸如具有活化突变、扩增或具有染色体易位)时被牵涉成为肿瘤致癌驱动器。此外，这些靶标中的一些（诸如MST1R、AXL和MERTK）也可以在免疫细胞功能中起作用(Eyob, H. 等人,Cancer Dis. Vol 3:751-760, 2013;Lemke, G., Cold Spring Harbor Perspectives Biol. Vol 5:a009076, 2013; Lemke,G. 等人, Nat Rev Immunol. Vol 8:327-336, 2008; Rothlin, C.V., Lemke, G., CurrOpin Immunol. Vol 22:740-746, 2010; Paolino, M., 等人, Nature, Vol 507:508-512, 2014)。来自文献的新近数据也将AXL鉴别为11种不同类型肿瘤中的EMT (上皮间质转变)的主要标志物之一(Mak, M. P., 等人, Clin Cancer Res.Vol 22:609-620, 2016)。发现这些肿瘤类型中的EMT标志物的升高与肿瘤中的免疫检验点标志物（诸如CTLA-4、PD-1和PD-L1）的增加表达正相关。在肿瘤上的这些免疫检验点标志物的上调是肿瘤逃避免疫监视的潜在机制，从而导致肿瘤转移和生长。
广泛适用的癌症疗法仍然是难以找到的，且因而需要更多的和不同的可能被证实有效地治疗癌症的疗法。当与免疫检验点试剂（诸如抗-PD-L1或抗-PD-1抗体）组合时，Merestinib可能能够协作以增强和扩宽具有不同肿瘤类型的患者中的肿瘤消退的治疗应答。
已经公开了含有抗-PD-L1抗体和MET抑制剂（包括merestinib）的组合疗法(参见WO 2016/061142)。但是，本发明在本文中公开了用于治疗患者中的癌症的方法，所述癌症是例如肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、黑素瘤、结直肠癌、胰腺癌、胆道癌、黑素瘤(包括眼色素层黑素瘤)、肉瘤、膀胱癌、肾癌、尿道癌、头癌、颈癌、甲状腺癌、卵巢癌、遗传性乳头状肾细胞癌、肝细胞癌、胃癌和/或表现出在MET、MSTR1 (又名RON)、AXL、KRAS、FLT3、DDR1/2、ROS1、NTRK1/2/3、MKNK1/2和它的底物EIF4E中的改变的肿瘤，与由单独任一种试剂提供的治疗效果相比，所述方法会提供来自merestinib或其药学上可接受的盐和抗-人PD-L1抗体或抗-人PD-1抗体的组合活性的增强的和/或意外的有益治疗效果。此外，本发明公开了用于治疗患者中的癌症的方法，所述癌症是例如肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、黑素瘤、结直肠癌、胰腺癌、胆道癌、肉瘤、膀胱癌、肾癌、甲状腺癌、卵巢癌、尿道癌、黑素瘤(包括眼色素层黑素瘤)、头癌、颈癌、遗传性乳头状肾细胞癌、肝细胞癌、胃癌和/或表现出在MET、MSTR1 (又名RON)、AXL、KRAS、FLT3、DDR1/2、ROS1、NTRK1/2/3、MKNK1/2和它的底物EIF4E中的改变的肿瘤，所述方法作为特定治疗方案的部分，与由单独任一种试剂提供的治疗效果相比，所述特定治疗方案会提供来自merestinib或其药学上可接受的盐和抗-人PD-L1抗体或抗-人PD-1抗体的组合活性的增强的和/或意外的有益治疗效果。
因此，本发明提供了一种治疗患者中的癌症的方法，所述方法包括：与有效量的抗-人PD-L1抗体或抗-人PD-1抗体组合地给所述患者施用有效量的merestinib或其药学上可接受的盐。
本发明也提供了一种组合产品，其包含merestinib或其药学上可接受的盐和抗-人PD-L1抗体或抗-人PD-1抗体，它们同时、分别或依次用在癌症的治疗中。
另外，本发明进一步提供了所述抗-人PD-L1抗体是阿特朱单抗、YW243.55.S70、MEDI-4736、MSB-0010718C、、durvalumab、avelumab或MDX-1105。
并且，本发明提供了所述抗-人PD-L1抗体是LY3300054。
本发明也提供了所述抗-人PD-1抗体是纳武单抗、派姆单抗、pidilizumab或AMP-224。
本发明进一步提供了所述癌症是肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、黑素瘤、结直肠癌、胰腺癌、胆道癌、黑素瘤(包括眼色素层黑素瘤)、肉瘤、膀胱癌、肾癌、尿道癌、头癌、颈癌、甲状腺癌、卵巢癌、遗传性乳头状肾细胞癌、肝细胞癌、胃癌和/或表现出在MET、MSTR1(又名RON)、AXL、KRAS、FLT3、DDR1/2、ROS1、NTRK1/2/3、MKNK1/2和它的底物EIF4E中的改变的肿瘤。优选地，所述癌症是乳腺癌、黑素瘤和/或结直肠癌。也优选地，所述癌症是乳腺癌和/或结直肠癌。
本发明也提供了一种治疗患者中的癌症的方法，所述方法包括：与有效量的抗-人PD-L1抗体或抗-人PD-1抗体组合地给所述患者施用有效量的merestinib或其药学上可接受的盐，其中在21-天周期或28-天周期中以每天1次40 mg至120 mg的剂量施用merestinib或其药学上可接受的盐，且在14-天周期的第1天、在21-天周期的第1天、在21-天周期的第1天和第8天、在21-天周期的第1天和第15天、在21-天周期的第1天、第8天和第15天、在28-天周期的第1天或在28-天周期的第1天和第15天以1 mg/kg至10 mg/kg的剂量施用抗-人PD-L1抗体或抗-人PD-1抗体。优选地，所述施用是同时的。
本发明也提供了一种组合产品，其包含merestinib或其药学上可接受的盐和抗-人PD-L1抗体或抗-人PD-1抗体，它们同时、分别或依次用在癌症的治疗中，其中在21-天周期或28-天周期中以每天1次40 mg至120 mg的剂量施用merestinib或其药学上可接受的盐，且在14-天周期的第1天、在21-天周期的第1天、在21-天周期的第1天和第8天、在21-天周期的第1天和第15天、在21-天周期的第1天、第8天和第15天、在28-天周期的第1天或在28-天周期的第1天和第15天以1 mg/kg至10 mg/kg的剂量施用抗-人PD-L1抗体或抗-人PD-1抗体。优选地，所述使用是同时的。
本发明也提供了merestinib或其药学上可接受的盐向患者的治疗方案的添加，所述患者已经在用抗-人PD-L1抗体或抗-人PD-1抗体治疗。
本发明也提供了抗-人PD-L1抗体或抗-人PD-1抗体向患者的治疗方案的添加，所述患者已经在用merestinib或其药学上可接受的盐治疗。
术语“PD-l抑制剂”是指抗-PD-l抗体，其为全人的或人源化的IgG，任选地优化的单克隆抗体或小分子抑制剂。抗-PD-1抗体是优选的PD-1抑制剂。PD-1抑制剂包括纳武单抗和派姆单抗。纳武单抗 (OPDIVOTM)也被称作iMDX- 1106、MDX-1106-04、ONO-4538或BMS-936558且具有CAS登记号: 946414-94-4。纳武单抗是特异性地阻断PD-1的全人IgG4单克隆抗体。纳武单抗 (克隆5C4)和特异性地结合PD-1的其它人单克隆抗体公开在US 8,008,449和WO2006/121168中。派姆单抗 (KEYTRUDATM) (以前的lambrolizumab)，也被称作Merck3745、MK-3475或SCH-900475是结合PD-1的人源化的IgG4单克隆抗体。派姆单抗公开在Hamid, O. 等人, New England Journal of Medicine, 2013,369(2): 134-44、WO2009/114335和US 8,354,509中。另外的抗-PD-1抗体也包括pidilizumab (CT-011)和AMP-224。其它抗-PD-1抗体公开在US 8,609,089、US 2010028330和/或US 20120114649中。
术语“PD-L1抑制剂”是指抗-PD-L1抗体，其为全人的或人源化的IgG，任选地优化的单克隆抗体或小分子抑制剂。抗-PD-L1抗体是优选的PD-L1抑制剂。PD-L1抑制剂包括YW243.55.S70、MPDL3280A、MEDI-4736、MSB-0010718C和MDX-1105。YW243.55.S70是在WO2010/077634和US20100203056中描述的抗-PD-L1抗体。MDPL3280A (也被称作RG7446、RO5541267和阿特朱单抗)是一种全人源化的Fc优化的IgG1单克隆抗体，其缺乏结合PD-L1的Fc效应子功能。MDPL3280A和针对PD-L1的其它人单克隆抗体公开在US 7,943,743和US20120039906中。MEDI-4736 (也被称作durvalumab)是Fc优化的针对PD-L1的抗体。MSB-0010718C (也被称作avelumab)是针对PD-L1的全人IgG1单克隆抗体。MDX-1105（也被称作BMS-936559）是在WO2007/005874中描述的抗-PD-L1抗体。
LY3300054是缺乏Fc效应子功能的IgG1变体抗体，其结合人PD-L1 (SEQ ID NO:1)，其包含轻链(LC)和重链(HC)，其中所述轻链包含轻链可变区(LCVR)且所述重链包含重链可变区(HCVR)，且其中所述LCVR包含分别由氨基酸序列SGSSSNIGSNTVN (SEQ ID NO:5)、YGNSNRPS (SEQ ID NO: 6)和QSYDSSLSGSV (SEQ ID NO: 7)组成的轻链互补性决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，且其中所述HCVR包含分别由氨基酸序列KASGGTFSSYAIS (SEQ IDNO: 2)、GIIPIFGTANYAQKFQG (SEQ ID NO: 3)和ARSPDYSPYYYYGMDV (SEQ ID NO: 4)组成的重链互补性决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在LY3300054的某些实施方案中，所述抗体结合人PD-L1，且包含轻链(LC)和重链(HC)，其中所述轻链包含轻链可变区(LCVR)且所述重链包含重链可变区(HCVR)，其中所述LCVR具有在SEQ ID NO: 9中给出的氨基酸序列，且所述HCVR具有在SEQ ID NO: 8中给出的氨基酸序列。在LY3300054的某些实施方案中，所述抗体结合人PD-L1，其包含轻链(LC)和重链(HC)，其中所述LC具有在SEQ ID NO: 10中给出的氨基酸序列，且所述HC具有在SEQ IDNO: 11中给出的氨基酸序列。在一个实施方案中，LY3300054（抗体）包含两个轻链和两个重链，其中每个轻链具有在SEQ ID NO: 11中给出的氨基酸序列，且每个重链具有在SEQ IDNO: 10中给出的氨基酸序列。
本文中使用的术语“患者”表示哺乳动物，优选人。
术语“治疗”意图包括对患者所遭受的癌症的干预的全部范围，诸如施用Merestinib和PD-1或PD-L1抑制剂以减轻、减慢、停止或逆转一种或多种征状和延迟、停止或逆转癌症的进展（即使所述癌症没有被实际消除）。
术语“组合”、“治疗组合”和“药物组合”表示非固定的剂量组合，任选地与关于组合施用的说明书包装在一起，其中各种治疗剂merestinib或其药学上可接受的盐或水合物和PD-1或PD-L1抑制剂可以同时独立地施用或在允许所述治疗剂发挥协作效应的时间间隔内单独地施用。
术语“同时”施用是指merestinib和PD-1或PD-L1抑制剂中的每一种向患者的施用，其可以是在单个动作中或在并行的或基本上并行的动作中，诸如其中将merestinib和PD-1或PD-L1抑制剂中的每一种基本上同时独立地施用或在允许merestinib和PD-1或PD-L1抑制剂表现出协作治疗效果的时间间隔内单独地施用。
术语“单独”施用是指同时、基本上并行地或以任意次序依次地从非固定的剂量剂型向患者施用merestinib和PD-1或PD-L1抑制剂中的每一种。对于每种merestinib和PD-1或PD-L1抑制剂的施用，可以存在或不存在指定的时间间隔。
术语“依次”施用是指在单独的动作中从非固定的(单独的)剂型向患者施用merestinib和PD-1或PD-L1抑制剂中的每一种。两个施用动作可以由或不由指定的时间间隔连接。例如，施用merestinib后停药2天(每周3次)和每14-21天1次地在指定的时间施用PD-1或PD-L1抑制剂。
短语“与……组合”包括将Merestinib和PD-1或PD-L1抑制剂中的每一种同时、分别和依次施用给需要治疗的癌症患者。
对于PD-L1，将抗-鼠PD-L1克隆178G7用作LY3300054的替代抗体。178G7和LY3300054阻断PD-1与PD-L1的结合。178G7和LY3300054阻断PD-L1与CD80 (又名B7-1)的结合。178G7与以前鉴别的已知会阻断PD-L1/PD-1相互作用的替代抗体10F.9G2竞争且在临床中是抗-人抗体的已知替代物(Eppihimer等人 Microcirculation2002:9(2):133)。
178G7的HC是SEQ ID NO: 14，且178G7的LC是SEQ ID NO: 15。
在某些实施方案中，改变在本文中为本发明的方法提供的抗体以增加或降低所述抗体的糖基化程度。通过改变氨基酸序列从而建立或移除一个或多个糖基化位点，可以方便地实现对抗体添加或删除糖基化位点。
在抗体包含Fc区的情况下，可以改变与之连接的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分枝的双天线寡糖，所述寡糖通常借助N-键连接至Fc区的CH2结构域的Asn297。参见，例如，Wright等人 TIBTECH 15:26-32 (1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及与双天线寡糖结构的“茎”中的GlcNAc连接的岩藻糖。在某些实施方案中，可以修饰有关抗体中的寡糖以便建立具有某些改善的特性的抗体变体。另外，在某些实施方案中，可以修饰有关抗体中的寡糖以便促进包含这样的抗体的适当药物组合物。此外，在某些实施方案中，有关抗体中的寡糖的修饰可能需要对本文中指出的抗体剂量的适当调节以便在它的施用中补偿这样的修饰，尽管优选地在本文中提供的剂量是参考活性物质。
抗体变体可以具有碳水化合物结构，所述碳水化合物结构缺少与Fc区(直接地或间接地)连接的岩藻糖。例如，这类抗体中岩藻糖的量可以是1%-80%、1%-65%、5%-65%或20%-40%。通过以下方式确定岩藻糖的量：相对于如通过MALDI-TOF质谱法（例如，如WO 2008/077546中所述）所测量的与Asn297连接的全部糖结构(例如复杂结构、杂合结构和高甘露糖结构)的总和，计算糖链内在Asn297处的岩藻糖的平均量。Asn297表示位于Fc区中约位置297处的天冬酰胺残基(Fc区残基的Eu编号)；但是，由于抗体中的微小序列变异，Asn297也可以位于位置297的上游或下游约±3个氨基酸附近，即，在位置294和300之间。这样的岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。参见，例如，美国专利公开号US 2003/0157108(Presta, L.)；US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)。与“去岩藻糖基化的”或“岩藻糖-缺陷型”抗体变体相关的出版物的例子包括：US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328；和Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng. 87: 614 (2004)。能够生产去岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括蛋白岩藻糖基化缺陷型的Lec13 CHO细胞(Ripka等人 Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108 A1, Presta, L；和WO 2004/056312 A1, Adams等人)，和敲除的细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki等人Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. 等人, Biotechnol.Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；和WO2003/085107)。
本文中使用的术语“试剂盒”表示包含至少两个单独容器的包，其中第一容器含有merestinib或其药学上可接受的盐，且第二容器含有一种或多种共抑制性免疫检验点抑制剂，优选PD-1抗体或PD-L1抗体。“试剂盒”还可以包括说明书以将这些第一和第二容器的全部或部分内容物施用给癌症患者。
本文中使用的术语“癌症”和“癌性的”表示或描述患者中的生理情况，其通常特征在于失调的细胞增殖。
本文中使用的术语“原发肿瘤”或“原发癌”是指原始的癌症，且不指位于受试者的身体中的另一个组织、器官或位置的转移病灶。
本文中使用的术语“有效量”表示merestinib或其药学上可接受的盐的量或剂量，和共抑制性免疫检验点抑制剂（优选抗-抗体PD-1或抗-抗体PD-L1）的量或剂量，其在所诊断或治疗的患者中提供有效应答。
应当理解，通过以任意方式与化合物一起施用共抑制性免疫检验点抑制剂（优选抗体PD-1或抗体PD-L1）进行本发明的组合疗法，所述化合物是MET、AXL、MERTK、MKNK1/2、PDGFRA、TEK或MST1R抑制剂或其药学上可接受的盐，优选merestinib或其药学上可接受的盐，所述任意方式在体内提供有效水平的共抑制性免疫检验点抑制剂（优选抗体PD-1或抗体PD-L1）和化合物，所述化合物是MET或MST1R抑制剂或其药学上可接受的盐，优选merestinib或其药学上可接受的盐。
本文中使用的术语患者的“有效应答”或患者对药剂组合治疗的“应答性”表示在施用化合物（其为MET或MST1R抑制剂或其药学上可接受的盐，优选merestinib或其药学上可接受的盐）和共抑制性免疫检验点抑制剂（优选抗体PD-1或抗体PD-L1）后给患者提供的临床或治疗益处。
本文中使用的术语“与……组合”表示化合物（其为MET或MST1R抑制剂或其药学上可接受的盐，优选merestinib或其药学上可接受的盐）和共抑制性免疫检验点抑制剂（优选抗-PD-1抗体或抗-PD-L1抗体）的施用，其中在共抑制性免疫检验点抑制剂之前施用MET或MST1R抑制剂或其药学上可接受的盐。
优选地将Merestinib或其药学上可接受的盐使用药学上可接受的载体配制为药物组合物并通过多种途径施用。优选地，这样的组合物用于口服施用。优选地将PD-1或PD-L1抑制剂使用药学上可接受的载体配制为药物组合物并通过胃肠外途径（优选地静脉内输注）施用。优选地，这样的组合物可以是冻干的粉末或液体组合物。重构或稀释为易于施用剂量是根据标记或通过本领域中的常规技术。这样的药物组合物和制备它们的方法是本领域众所周知的。参见，例如，HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS, 第5版, Rowe等人, 编, Pharmaceutical Press (2006)；和REMINGTON:THE SCIENCE AND PRACTICE OFPHARMACY (Troy, 等人, 编, 第21版, Lippincott Williams & Wilkins (2006)。
Merestinib能够与许多无机和有机抗衡离子反应以形成药学上可接受的盐。这样的药学上可接受的盐和制备它们的普通方法是本领域众所周知的。参见，例如，P. Stahl,等人, HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS:PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002); S.M. Berge, 等人, “Pharmaceutical Salts, “Journal of Pharmaceutical Sciences, 第66卷, 第1期, 1977年1月。merestinib的药学上可接受的盐可能需要对本文中指出的merestinib剂量的适当调节以便在它的施用中补偿所述盐，尽管优选地在本文中提供的剂量是参考活性物质。
主治诊断医生（如本领域技术人员）通过使用已知技术和通过观察在类似情况下得到的结果可以容易地确定有效量。在确定患者的有效量时，主治诊断医生会考虑许多因素，包括、但不限于：患者的物种；它的大小、年龄和一般健康；涉及的具体疾病或障碍；疾病或障碍的程度或牵连或严重程度；个别患者的应答；施用的特定化合物；施用模式；施用的制品的生物利用度特征；选择的给药方案；伴随药物的使用；和其它有关的情况。
与抗-PD-1抗体或抗-PD-L1抗体组合地在21-天周期或28-天周期中以每天1次40mg至120 mg的剂量施用merestinib或其药学上可接受的盐。更优选地，与抗-PD-1抗体或抗-PD-L1抗体组合地在21-天周期或28-天周期中以每天1次80 mg的剂量施用merestinib或其药学上可接受的盐。甚至更优选地，与抗-PD-1抗体或抗-PD-L1抗体组合地在21-天周期或28-天周期中以每天1次120 mg的剂量施用merestinib或其药学上可接受的盐。
在14-天周期的第1天、在21-天周期的第1天、在21-天周期的第1天和第8天、在21-天周期的第1天和第15天、在21-天周期的第1天、第8天和第15天、在28-天周期的第1天或在28-天周期的第1天和第15天以1 mg/kg至10 mg/kg的剂量施用抗-PD-1抗体或抗-PD-L1抗体，与此相组合，在21-天周期或28-天周期中以每天1次40 mg至120 mg的剂量，更优选地在80 mg或在120 mg，施用merestinib或其药学上可接受的盐。更优选地，在14-天周期的第1天、在21-天周期的第1天、在21-天周期的第1天和第8天、在21-天周期的第1天和第15天、在21-天周期的第1天、第8天和第15天、在28-天周期的第1天或在28-天周期的第1天和第15天以2 mg/kg至8 mg/kg的剂量施用抗-PD-1抗体或抗-PD-L1抗体，与此相组合，在21-天周期或28-天周期中以每天1次40 mg至120 mg的剂量，更优选地在80 mg或在120 mg，施用merestinib或其药学上可接受的盐。甚至更优选地，在14-天周期的第1天、在21-天周期的第1天、在21-天周期的第1天和第8天、在21-天周期的第1天和第15天、在21-天周期的第1天、第8天和第15天、在28-天周期的第1天或在28-天周期的第1天和第15天以5 mg/kg的剂量施用抗-PD-1抗体或抗-PD-L1抗体，与此相组合，在21-天周期或28-天周期中以每天1次40 mg至120 mg的剂量，更优选地在80 mg或在120 mg，施用merestinib或其药学上可接受的盐。
在14-天周期的第1天、在21-天周期的第1天、在21-天周期的第1天和第8天、在21-天周期的第1天和第15天、在21-天周期的第1天、第8天和第15天、在28-天周期的第1天或在28-天周期的第1天和第15天以1 mg/kg至10 mg/kg的剂量施用LY3300054，与此相组合，在21-天周期或28-天周期中以每天1次40 mg至120 mg的剂量，更优选地在80 mg或在120 mg，施用merestinib或其药学上可接受的盐。更优选地，在14-天周期的第1天、在21-天周期的第1天、在21-天周期的第1天和第8天、在21-天周期的第1天和第15天、在21-天周期的第1天、第8天和第15天、在28-天周期的第1天或在28-天周期的第1天和第15天以2 mg/kg至8mg/kg的剂量施用LY3300054，与此相组合，在21-天周期或28-天周期中以每天1次40 mg至120 mg的剂量，更优选地在80 mg或在120 mg，施用merestinib或其药学上可接受的盐。甚至更优选地，在14-天周期的第1天、在21-天周期的第1天、在21-天周期的第1天和第8天、在21-天周期的第1天和第15天、在21-天周期的第1天、第8天和第15天、在28-天周期的第1天或在28-天周期的第1天和第15天以5 mg/kg的剂量施用LY3300054，与此相组合，在21-天周期或28-天周期中以每天1次40 mg至120 mg的剂量，更优选地在80 mg或在120 mg，施用merestinib或其药学上可接受的盐。
在14-天周期的第1天、在21-天周期的第1天、在21-天周期的第1天和第8天、在21-天周期的第1天和第15天、在21-天周期的第1天、第8天和第15天、在28-天周期的第1天或在28-天周期的第1天和第15天以50 mg至1500 mg的剂量施用抗-PD-1抗体或抗-PD-L1抗体，与此相组合，在21-天周期或28-天周期中以每天1次40 mg至120 mg的剂量，更优选地在80mg或在120 mg，施用merestinib或其药学上可接受的盐。更优选地，在14-天周期的第1天、在21-天周期的第1天、在21-天周期的第1天和第8天、在21-天周期的第1天和第15天、在21-天周期的第1天、第8天和第15天、在28-天周期的第1天或在28-天周期的第1天和第15天以200 mg至1200 mg的剂量施用抗-PD-1抗体或抗-PD-L1抗体，与此相组合，在21-天周期或28-天周期中以每天1次40 mg至120 mg的剂量，更优选地在80 mg或在120 mg，施用merestinib或其药学上可接受的盐。甚至更优选地，在14-天周期的第1天、在21-天周期的第1天、在21-天周期的第1天和第8天、在21-天周期的第1天和第15天、在21-天周期的第1天、第8天和第15天、在28-天周期的第1天或在28-天周期的第1天和第15天以700 mg的剂量施用抗-PD-1抗体或抗-PD-L1抗体，与此相组合，在21-天周期或28-天周期中以每天1次40mg至120 mg的剂量，更优选地在80 mg或在120 mg，施用merestinib或其药学上可接受的盐。
在14-天周期的第1天、在21-天周期的第1天、在21-天周期的第1天和第8天、在21-天周期的第1天和第15天、在21-天周期的第1天、第8天和第15天、在28-天周期的第1天或在28-天周期的第1天和第15天以50 mg至1500 mg的剂量施用LY3300054，与此相组合，在21-天周期或28-天周期中以每天1次40 mg至120 mg的剂量，更优选地在80 mg或在120 mg，施用merestinib或其药学上可接受的盐。更优选地，在14-天周期的第1天、在21-天周期的第1天、在21-天周期的第1天和第8天、在21-天周期的第1天和第15天、在21-天周期的第1天、第8天和第15天、在28-天周期的第1天或在28-天周期的第1天和第15天以200 mg至1200 mg的剂量施用LY3300054，与此相组合，在21-天周期或28-天周期中以每天1次40 mg至120 mg的剂量，更优选地在80 mg或在120 mg，施用merestinib或其药学上可接受的盐。甚至更优选地，在14-天周期的第1天、在21-天周期的第1天、在21-天周期的第1天和第8天、在21-天周期的第1天和第15天、在21-天周期的第1天、第8天和第15天、在28-天周期的第1天或在28-天周期的第1天和第15天以700 mg的剂量施用LY3300054，与此相组合，在21-天周期或28-天周期中以每天1次40 mg至120 mg的剂量，更优选地在80 mg或在120 mg，施用merestinib或其药学上可接受的盐。
短或长持续时间的治疗中断或施用中断可能发生在不同的时间，例如，由于临床计划安排延迟、用于缓解治疗突发不利事件的时机允许、有关癌症类型的减轻等。进一步治疗或施用应当是期望的或需要的，本发明包括定量给药方案，其中可以重新开始或恢复与抗-PD-1抗体或抗-PD-L1抗体一起的merestinib的治疗或施用。
通过在US 8,008,449和WO2006/121168; Hamid, O. 等人, New England Journal of Medicine, 2013, 369 (2): 134-44; WO2009/114335, 和US 8,354,509; US8,609,089, US 2010028330和/或US 20120114649; WO2007/005874; WO2010/077634; US7,943,743和US 20120039906中描述的程序，或通过本领域技术人员众所周知的且常规地使用的程序，可以制备PD-1或PD-L1抑制剂。
可以以任何方式改变施用途径，受限于药物的物理性质以及患者和护理人员的方便。优选地，将抗体PD-1或抗体PD-L1（优选地LY3300054）配制成用于胃肠外施用，诸如静脉内或皮下施用。优选地，将merestinib或其药学上可接受的盐配制成用于口服或胃肠外施用，包括静脉内或皮下施用。
可以将Merestinib配制成片剂或胶囊剂。这样的药物组合物及其制备方法是本领域众所周知的(参见，例如，Remington: The Science and Practice of Pharmacy, L.V.Allen, 编, 第22版, Pharmaceutical Press, 2012)。例如，可以将merestinib配制成片剂。这样的片剂可以由20%merestinib:醋酸羟丙甲基纤维素琥珀酸酯(HPMCAS)中级(M)(HPMCAS-M)喷雾干燥的分散体(SDD)的组合物制成。20%merestinib:HPMCAS-M SDD由含有merestinib (1%)、HPMCAS-M (4%)和丙酮(85.5%)和净化水(9.5%)的喷雾溶液组合物(重量%)制成。确保merestinib完全溶解在丙酮/水溶液中，然后加入聚合物。在开始喷雾干燥以制备SDD组合物之前，凭肉眼证实所述聚合物溶解。得到的SDD组合物是含有merestinib(200 mg/g)和HPMCAS-M (800 mg/g)的20%merestinib:HPMCAS-M SDD (mg/g)。如果必要的话，可以调节药用物质的量以考虑药用物质的测定。如果需要维持质量平衡，根据药用物质测定中的轻微变化可以调节HPMCAS-M的重量。在处理过程中将丙酮和净化水除去至残余水平。制剂组合物可以含有，例如，SDD merestinib和其它赋形剂诸如稀释剂(例如，微晶纤维素和甘露醇)、崩解剂(例如，交联羧甲纤维素钠)、表面活性剂(例如，月桂基硫酸钠)、助流剂(例如，syloid二氧化硅)和/或润滑剂(例如，硬脂酰富马酸钠)。片剂的制备包括喷雾干燥以产生merestinib的SDD，随后碾压和压制成片剂。然后给片剂涂布基于HPMC的彩色混合物的薄膜。
例如，可以将merestinib配制成片剂。这样的片剂可以由20%merestinib:醋酸羟丙甲基纤维素琥珀酸酯(HPMCAS)中级(M) (HPMCAS-M)喷雾干燥的分散体(SDD)的组合物制成。20%merestinib:HPMCAS-M SDD由含有merestinib (1%)、HPMCAS-M (4%)和丙酮(85.5%)和净化水(9.5%)的喷雾溶液组合物(重量%)制成。确保merestinib完全溶解在丙酮/水溶液中，然后加入聚合物。在开始喷雾干燥以制备SDD组合物之前，凭肉眼证实所述聚合物溶解。得到的SDD组合物是含有merestinib (200 mg/g)和HPMCAS-M (800 mg/g)的20%merestinib:HPMCAS-M SDD (mg/g)。如果必要的话，可以调节药用物质的量以考虑药用物质的测定。如果需要维持质量平衡，根据药用物质测定中的轻微变化可以调节HPMCAS-M的重量。在处理过程中将丙酮和净化水除去至残余水平。制剂组合物可以含有，例如，SDDmerestinib和其它赋形剂诸如稀释剂(例如，微晶纤维素和甘露醇)、崩解剂(例如，交联羧甲纤维素钠)、表面活性剂(例如，月桂基硫酸钠)、助流剂(例如，syloid二氧化硅)和/或润滑剂(例如，硬脂酰富马酸钠)。片剂的制备包括喷雾干燥以产生merestinib的SDD，随后碾压和压制成片剂。然后给片剂涂布基于HPMC的彩色混合物的薄膜。
在图表1中描述了40 mg剂量强度的merestinib SDD薄膜包衣片剂的单位配方的一种实施例片剂。
图表1
N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6- 甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(merestinib)片剂（40mg）的实施例单位配方
1. 如果必要的话，将调节SDD的量以考虑分散体的测定。
2. 除非另有说明，否则对于每种赋形剂允许±10%的合理变动。
3. 为了适应SDD效能的变化和维持总片剂重量，如果必要的话可以调节微晶纤维素的重量。
4. 在处理过程中将净化水除去至残余水平。
通过胃肠外途径（例如，皮下和静脉内）可以施用本发明的抗体或包含它们的药物组合物。可以将本发明的抗体与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂一起在单个或多个剂量中施用给患者。本发明的药物组合物可以通过本领域众所周知的方法(例如，Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第22版(2012), A. Loyd等人,Pharmaceutical Press)来制备，且包含如在本文中公开的抗体和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
通过通常用于评价癌症治疗的不同端点，包括、但不限于，肿瘤消退、肿瘤重量或大小收缩、至进展的时间、总存活、无进展存活、总应答率、应答的持续时间和生活质量，可以测量本发明的组合治疗的效力。在本发明中使用的治疗剂可以在没有原发肿瘤收缩的情况下造成转移扩散的抑制，可以诱导原发肿瘤的收缩，或可以简单地发挥肿瘤抑制效应。因为本发明涉及独特的抗肿瘤剂的组合的应用，可以任选地采用确定本发明的任何特定组合疗法的效力的新方案，包括、例如，测量关于血管生成和/或细胞周期活性的血浆或尿标志物，关于血管生成和/或细胞周期活性的基于组织的生物标志物，基于组织的免疫细胞评估，和通过放射学成像测量应答。以下实施例例证了单独的merestinib、单独的PD-1抑制剂或单独的PD-L1抑制剂以及merestinib和PD-1或PD-L1抑制剂的组合各自的活性。
LY3300054的纯化和表征
抗体表达和纯化
在下面在标题为“氨基酸和核苷酸序列”的部分中列出了LY3300054的重链和轻链的可变区的多肽、完整重链和轻链氨基酸序列以及编码它们的核苷酸序列。另外，在图表2中显示了LY3300054的轻链、重链、轻链可变区和重链可变区的SEQ ID NO。
可以基本上如下制备和纯化本发明的抗体，包括、但不限于，LY3300054。可以用用于分泌抗体的表达系统（使用最佳的预定HC:LC载体比率）或编码HC和LC的单一载体系统短暂地或稳定地转染一种适当的宿主细胞（诸如HEK 293或CHO）。使用许多通常使用的技术中的任一种，可以纯化在其中已经分泌了抗体的澄清培养基。例如，可以将所述培养基方便地应用于MabSelect柱(GE Healthcare)或针对Fab片段的KappaSelect柱(GE Healthcare)，所述柱已经用适合的缓冲液诸如磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)平衡过。可以将所述柱洗涤以除去非特异性的结合组分。可以将结合的抗体洗脱，例如，通过pH梯度(诸如20 mM Tris缓冲液pH 7至10 mM柠檬酸钠缓冲液pH 3.0，或磷酸盐缓冲盐水pH 7.4至100 mM甘氨酸缓冲液pH 3.0)。可以检测抗体级分，诸如通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)，然后可以合并。进一步纯化是任选的，取决于预期的用途。使用普通技术可以将抗体浓缩和/或无菌过滤。通过普通技术可以有效地除去可溶性聚集体和多聚体，包括尺寸排阻、疏水相互作用、离子交换、多模态或羟磷灰石色谱法。在这些色谱法步骤以后LY3300054的纯度大于95%。可以将产物立即在-70℃冷冻或可以冻干。
图表2: SEQ ID NO
结合动力学和亲和力
使用表面等离子体共振(Biacore)针对本发明的抗体确定对人PD-L1的动力学和平衡解离常数(KD)。
在25℃执行本发明的抗体作为配体在传感器芯片表面上的固定化。在0.0123 nM- 9 nM范围内的浓度注射作为分析物的可溶性人PD-L1-Fc融合蛋白(和在某些情况下，食蟹猴PD-L1-Fc融合蛋白)。在37℃执行分析。在30µL/分钟的每个样品的接触时间是180秒。解离时间是240-1500秒。将固定化的表面用0.95 M NaCl/25 mM NaOH在30µL/分钟再生18秒，然后稳定30秒。使用Biacore T200 Evaluation软件(3.0版)分析结合动力学。数据参比空白流动池，并将数据拟合至1:1结合模型。
在基本上如该测定所述执行的实验中，LY3300054以82 pM的KD结合人PD-L1。
图表3：通过SPR测量的LY3300054的结合
ELISA分析：LY3300054结合重组PD-L1
用ELISA测定可以测量本发明的抗体的结合人PD-L1的能力。对于PD-L1结合测定，在4℃用人PD-L1-Fc (R&D Systems)包被96-孔板(NUNC®)过夜。将孔用封闭缓冲液(含有5%脱脂奶粉的PBS)封闭2小时。将孔用含有0.1%TWEEN®-20的PBS洗涤3次。然后加入抗-PD-L1抗体或对照IgG(100 μL)并在室温温育1小时。洗涤以后，将平板与100 μL山羊抗-人IgG F(ab’)2-HRP缀合物(Jackson Immuno Research)一起在室温温育1小时。将平板洗涤并然后与100 μL 3,3’, 5,5’-四-甲基联苯胺一起温育。在酶标仪上读出在450 nm的吸光度。使用GraphPad Prism 6软件计算半数最大有效浓度(EC50)。
在基本上如该测定所述执行的实验中，LY3300054以0.11 nM的EC50结合人PD-L1。LY3300054在所有三种温度条件4℃、25℃和40℃下在4周以后仍保留它的结合活性。LY3300054表现出与S70和2.14H9OPT类似的对PD-L1的结合活性。
流式细胞计数分析：LY3300054结合细胞表面PD-L1
用流式细胞计数测定可以测量本发明的抗体结合细胞表面表达的人PD-L1的能力。将MDA-MB 231细胞(PD-L1-阳性的人乳腺癌细胞系)以1.5x105个细胞/孔加入96孔U-底平板中的200 μL染色缓冲液中并在4℃温育30分钟。将平板在1200 rpm离心5分钟并除去上清液。加入100 μL抗体-生物素(从10 μg/ml开始1:4系列稀释)。评价了共6个系列稀释物。在4℃温育30分钟以后，将细胞用DPBS洗涤2次。加入100 μL含有5 μL抗生蛋白链菌素-PE的检测缓冲液。在4℃再温育30分钟以后，将平板离心并用DPBS洗涤2次。将细胞重新悬浮在200μL DPBS中用于FACS分析。
在基本上如该测定所述执行的实验中，LY3300054以剂量依赖性的方式结合MDA-MB231细胞上的细胞表面PD-L1，具有0.14 nM的EC50。
ELISA分析：LY3300054阻断PD-L1与PD-1的相互作用
在ELISA测定中可以测量本发明的抗体阻断PD-L1与PD-1的结合的能力。对于受体-配体阻断测定，将不同量的抗-PD-L1抗体或对照IgG与固定量的生物素化的PD-L1-Fc融合蛋白(100ng/孔)混合并在室温温育1小时。将所述混合物转移至用PD-1-Fc (1 μg/ml)预包被的96-孔平板并然后在室温温育另外1小时。洗涤以后，加入抗生蛋白链菌素HRP缀合物，并读出在450 nm的吸光度。IC50代表50%抑制PD-L1与PD-1的结合所需的抗体浓度。
在基本上如该测定所述执行的实验中，LY3300054阻断PD-L1与PD-1的相互作用，具有0.95 nM的IC50。LY3300054在所有三种温度条件4℃、25℃和40℃下在4周以后仍保留它的阻断活性。LY3300054表现出与S70和2.14H9OPT类似的阻断PD-L1与PD-1相互作用的能力。
ELISA分析：LY3300054阻断PD-L1与B7-1(又名CD80)的相互作用
人PD-L1也结合B7-1。在ELISA测定中可以测量本发明的抗体的阻断PD-L1与B7-1的结合的能力。除了用1 μg/ml B7-1-Fc (R&D Systems)包被平板以外，PD-L1/B7-1阻断测定的程序类似于PD-L1/PD-1阻断测定。使用GraphPad prism 6软件计算50%抑制PD-L1与PD-1的结合所需的抗体浓度(IC50)。
在基本上如该测定所述执行的实验中，LY3300054阻断PD-L1与B7-1的相互作用，具有2.4 nM的IC50。LY3300054显示出与S70和2.14H9OPT类似的阻断PD-L1与B7-1受体的相互作用的能力。
在临床前同基因小鼠肿瘤模型中评价Merestinib和抗-PD-L1抗体的组合
实验推理
用于评价merestinib和抗-PD-L1抗体的潜在组合效应的同基因小鼠肿瘤模型是使用小鼠结直肠癌系CT26的CT26结直肠癌模型。在免疫感受态小鼠中进行该实验(Grosso和Jure-Kunkel, Cancer Immunity第13卷, 第5页，2013年1月; Duraiswamy等人, CancerResearch, 2013年6月15日73; 3591)。在小鼠研究中使用抗-PD-L1抗体替代物(178G7,LSN3370181) (Eppihimer等人 Microcirculation 2002:9(2):133)。
动物
将来自Envigo (Harlan Laboratories)的雌性BALB/c小鼠(18-20克)用于该研究。食物和水可随意得到。在任何实验操作之前使动物适应1周。根据AALAC公认的惯例指南执行研究。
化合物准备
每周1次将Merestinib配制为在10%PEG 400于90%[20%Captisol在水中]中的溶液。在PBS (磷酸盐缓冲盐水)中配制抗-PD-L1抗体(178G7, LSN3370181)。
研究设计
将CT26细胞(来自内部体内药理学细胞培养组批号CT26.WT.3184878)用于植入。在麻醉下将在HBSS中的大约1 x106个细胞皮下地植入动物的右后胁腹中。
研究S082015具有四个组：1)媒介物对照(10%PEG 400于90%[20%Captisol在水中]中)，每天1次口服施用21天；2)单一试剂merestinib，以6 mg/kg每天1次口服21天；3)单一试剂merestinib，以12 mg/kg每天1次口服21天；4)单一试剂merestinib，以24 mg/kg每天1次口服21天。在CT26细胞植入后第6天开始merestinib的给药。每组有15只动物。在CT26细胞植入后第13天和第20天取出每组5只动物用于收获脾和肿瘤，以检查merestinib对免疫功能的影响。每组5只动物保留至研究结束(第26天)。每2周测量肿瘤体积和体重。使用下式估计肿瘤体积: v = l x w2 x 0.536，其中l = 测量的直径中的较大者，且w = 垂直直径中的较小者。在研究结束时，使用CO2和颈椎脱位处死动物。
研究S010516具有六组：1)媒介物对照(10%PEG 400于90%[20%Captisol在水中]中)，每天1次口服施用21天，并在CT26细胞植入后第6天开始给药；2)单一试剂抗-PD-L1抗体(178G7, LSN3370181)，每周1次以500µg/动物腹膜内给药3周，在CT26细胞植入后第6天开始；3)单一试剂merestinib，以12 mg/kg每天1次口服21天并在CT26细胞植入后第6天开始；4) merestinib (12 mg/kg每天1次口服21天)和抗-PD-L1抗体(500µg/动物，每周1次腹膜内3周)的并行组合，并在CT26细胞植入后第6天开始；5) merestinib (12 mg/kg每天1次口服21天并在CT26细胞植入后第6天开始)和抗-PD-L1抗体(500µg/动物每周1次腹膜内施用3周并在CT26细胞植入后第13天开始)的依次组合；6) merestinib (12 mg/kg每天1次口服21天)和抗-PD-L1抗体(500µg/动物每周1次腹膜内施用3周)的延迟并行组合，并在CT26细胞植入后第10天开始。
每组有15只动物。在CT26细胞植入后第20天取出每组5只动物用于收获脾和肿瘤，以检查merestinib和抗-PD-L1抗体的组合对免疫功能的影响。在研究期间每组保留10只动物，除非如在研究方案中预定义的，如果肿瘤体积超过2500mm3或形成溃疡，则将动物处死。每2周测量肿瘤体积和体重。使用下式估计肿瘤体积: v = l x w2 x 0.536，其中l = 测量的直径中的较大者，且w = 垂直直径中的较小者。
对于第2组、第3组、第4组、第5组和第6组，分别在第20天、第27天、第27天、第27天和第31天接受最后一剂药物。在第64天，在结束药物给药后约1个月至1.5个月，将仍然存活且具有被归类为PR (部分应答者)或CR (完全应答者)的肿瘤应答的动物如下重新攻击：将CT26肿瘤细胞(1 x106个细胞在HBSS中)在麻醉下皮下地新植入动物的后胁腹的对侧(左侧)。PR和CR的定义是在下面的统计方法部分中。使用三只原初动物(研究方案S035116)作为对照，并在麻醉下向动物的左后胁腹中皮下地植入相同批次的CT26肿瘤细胞(1 x106个细胞在HBSS中)。在动物中监测和测量肿瘤生长。使用下式估计肿瘤体积：v = l x w2 x0.536，其中l = 测量的直径中的较大者，且w = 垂直直径中的较小者。第82天是研究S010516的最后一天。
在研究结束时，使用CO2和颈椎脱位处死动物。
统计方法
将肿瘤体积转化成对数标度以均衡时间和治疗组之间的变动。使用SAS软件(9.3版)中的MIXED程序，用时间和治疗的两因素重复测量方差分析来分析log体积数据。重复测量的关系模型是空间能力。在每个时间点将治疗组与对照组进行对比。还将MIXED程序分别用于每个治疗组以计算在每个时间点处的最小二乘法均值和标准误差。两种分析解释了每只动物内的自相关和当在第33天之前取出或丢失动物时发生的数据损失。
还关于两种治疗的组合的加和性针对效应的增加的统计证据在第33天分析这些数据。将对比声明用于检验使用组合的两种具体治疗在每个时间点的相互作用效应。这等同于Bliss Independence方法并假定肿瘤体积可以在理论上达到0，即，完全消退。在肿瘤体积量表上将所述组合的预期累加应答(EAR)计算为：应答(EAR) EAR体积= V1 * V2/V0，其中V0、V1和V2分别是媒介物对照、单独治疗1和单独治疗2的估计平均肿瘤体积。如果相互作用检验是显著的，在统计上宣布比累加更多或更少的组合效应，取决于观察到的组合平均体积分别小于或超过EAR体积。如果组合组在统计上小于媒介物和每种单一试剂，那么统计结论是累加的。否则，不存在组合效应。
在第64天使用顺序逻辑回归分析得到组合治疗效应关于协同作用、加和作用和拮抗作用的后验概率。基于它的第64天肿瘤体积，将每只动物分类为4个应答类型之一：I)进行性疾病(PD)、II)生长延迟(GD)、III)部分应答(PR)或IV)完全的且持久的消退(CR)。CR由在指定的时间点≤25 mm3的肿瘤体积定义。将PR定义为在治疗结束之后或在指定的更晚时间点发生的且持久的某种消退测量，包括持久的稳定疾病。将GD定义为明显可观察的延迟或生长的减慢，其不同于媒介物，但是没有达到停滞或消退的水平。将PD定义为与媒介物动物类似的未扰乱的指数生长。对于这些类型，使用具有相互作用治疗结构的2-因素方差分析定义成比例机率（proportional odds）顺序逻辑回归模型，使得相互作用效应参数的0值对应于精确加和。基于相互作用参数的log机率量表将累加活性的范围定义为-1.1至+1.1，其对应于机率的3倍减少或增加是在PD类型中，或一般而言，是在与精确加和相比更低的类型集合中。小于-1.1的相互作用参数的值指示协同作用(定义为相对于精确加和而言更小的PD机率)，且大于+1.1的值指示拮抗作用。使用Bayesian分析方法来拟合所述模型并得到组合疗法是在协同、累加或拮抗范围内的后验概率，给出数据。宣布具有最高后验概率的范围是最可能的组合效应。
流式细胞计量术分析
在指定的研究天从动物子集收集脾和肿瘤，并如下处理用于FACS分析：将组织穿过组织滤器均质化以制备在培养基中的单细胞混悬液。然后将单细胞混悬液用荧光标记的抗体染色以鉴别免疫标志物，包括: CD3、CD4、CD8、CD11b、CD19、CD45、FoxP3、PD-L1、F4/80和可固定的生存力染料。使用BD LSR II流式细胞计分析细胞。收集数据并使用Flowjo (TreeStar, Inc.)分析以测量在每个组织中的总活淋巴细胞(Live, CD45+)的百分比。然后将免疫细胞子集测量为CD45+ 细胞的百分比，或测量为直接亲本群体的百分比。
免疫-景观分析
使用Quantigene鼠-80集合(mu-80免疫集合#21681)针对80种标志物的基因表达来分析在研究第20天从来自每个治疗分支(研究S010516)的5只动物收集的样品的冷冻肿瘤片段。使用MAGMAX™96 Total RNA分离试剂盒(Life Technologies)从裂解的样品分离总RNA。如下裂解快速冷冻的肿瘤片段：给500µL制备的裂解/结合缓冲液(MAGMAX™96 TotalRNA分离试剂盒)加入单个不锈钢珠子(5 mm)，并然后在TissueLyser (Qiagen)上在25Hz均质化2分钟。然后将200µL裂解物与120µL 100%异丙醇和40µL制备的磁珠混合物一起转移至96深孔处理板。在MAGMAX™Express-96 Deep Well Magnetic Particle Processor (LifeTechnologies)上进行一系列洗涤和DNA酶温育步骤。在最终的洗涤步骤以后，用100µL洗脱缓冲液从磁珠洗脱RNA。通过分光光度计法确定RNA浓度以确定在260和280 nm的光密度，并然后稀释至25 ng/µl的终浓度。然后使用具有定制探针集合(mu-80免疫集合#21681,表6)的QuantiGene®2.0 Plex测定(Affymetrix)测量免疫相关基因的组织表达。使用4个持家基因(HKG: Gusb、Hprt1、Ppib、Rps18)来归一化基因表达数据。使用Genepattern脚本v28.8归一化和编制（curated）数据。使用统计学和生物信息学来分析数据。
将500 ng来自正在分析的样品的总RNA一式两份地加入96-孔杂交平板的各个孔中达到100µL的终体积，所述96-孔杂交平板含有Quantigene®磁性捕获珠子、Quantigene®探针集合#21681和Quantigene®封闭试剂。然后将杂交平板密封并在54℃温育，同时在600rpm搅拌16小时。然后将样品转移至96-孔测定板，并然后依次使珠子首先与100 μlQuantiGene®Pre-Amplifier Probe杂交，然后与QuantiGene®Amplifier Probe杂交，最后与QuantiGene®Label Probe杂交(每个步骤在50℃1小时，使用磁性捕获平板的每个步骤之间2-3次洗涤)。在最后的杂交步骤以后加入抗生蛋白链菌素-缀合的R-藻红蛋白(SAPE,Affymetrix)，并在600 rpm搅拌下在室温温育30分钟。然后在FLEXMAP 3D®Luminex仪器(Luminex Corp)上分析样品。用红激光鉴别珠子(mRNA靶标)，而通过用绿激光测量藻红蛋白的平均荧光强度(MFI)来确定RNA水平。然后使用具有GenePattern (Broad Institute)的质量控制分析脚本将粗MFI数据转化成每个基因的相对基因表达(归一化的、经调节的净MFI，减去背景并归一化至4个持家基因)。该脚本通过计算每个样品的每个基因的“净MFI”而执行每个样品的每个基因测量的下述计算：(样品MFI -空白孔的背景MFI)。接着，确定检测下限(LLOD) (平均背景MFI + 3标准差(SD))。然后使用LLOD计算“经调节的净MFI”(如果MFI > LLOD，那么“经调节的净MFI”= “净MFI”，如果MFI < LLOD，那么“经调节的净MFI”=LLOD - 背景)。然后通过将每个基因的经调节的净MFI归一化至选择的持家基因(HKG)的MFI的几何平均值来计算相对基因表达，所述选择的持家基因包括Hprt1、Gusb、Rps18和Ppib，如在表6中所示：(样品经调节的净MFI/几何平均经调节的净HKG MFI) *100的换算系数。然后使用下式相对于对照组来确定每个治疗组中的每个样品的每个基因的基因表达的倍数变化：(归一化的、经调节的净MFI治疗样品/平均归一化的、经调节的净MFI对照样品)；倍数变化值<1 = 阴性倍数变化，倍数变化值≥1 = 阳性倍数变化。对于统计分析，将归一化的、经调节的净MFI转化成Log2量表。然后为每个基因、治疗、动物和/或时间计算技术副本的平均值。对于每个基因，然后用单因素方差分析来分析治疗组以确定统计显著性。使用FDR (假发现率)程序来控制假阳性率。在所有基因之间为来自ANOVA模型的每个具体对比计算FDR程序。
结果
CT26 CRC肿瘤细胞携带KRAS活化突变G12D。蛋白质印迹分析指示，CT26细胞表达低水平的MET，但是不表达可检测水平的磷酸-MET (p-MET)。CT26细胞也表达高水平的磷酸-AXL(p-AXL)（通过蛋白质印迹分析），且证实merestinib在小鼠磷酸-RTK阵列中在500 nM的浓度使体外p-AXL下降超过60%，但是表现出非常小的对CT26细胞增殖的影响(IC50>20µM)。
研究S082015
与媒介物对照相比，所有三个评价的剂量(表1)证实单一试剂merestinib对CT26同基因小鼠肿瘤模型具有显著的抗肿瘤作用，24 mg/kg剂量实现肿瘤停滞。所有三个剂量的merestinib被良好耐受，因为没有显著的体重减轻。选择每日1次12 mg/kg剂量的merestinib用于在CT26同基因小鼠模型中的与抗-PD-L1抗体的组合评价。
研究S010516
在组合研究S010516中，CT26肿瘤细胞植入是在第0天，且药物给药的最后一天是在第26天和第30天之间，取决于治疗分支。媒介物对照组中的动物的最后一次肿瘤测量是在第33天（因为所有肿瘤体积超过2500 mm3），且由于肿瘤负载将媒介物组中的动物处死。在第33天来自merestinib和抗-PD-L1抗体组合在CT26同基因小鼠肿瘤模型中的抗肿瘤作用的数据显示在表2中。所有治疗组看起来被良好耐受，因为没有由大肿瘤负载引起的死亡。在第33天，所有5个接受治疗的组表现出与媒介物对照组相比显著的抗肿瘤作用。在第6天开始的merestinib和抗-PD-L1抗体的并行组合治疗(第4组)表现出在第33天显示肿瘤消退的最大抗肿瘤作用，43.5%肿瘤从基线收缩。在研究第33天，并行组合(第4组)的抗肿瘤作用显著优于单独的任一种单一试剂(表3.3)。还证实了并行组合(第4组)的抗肿瘤作用在第33天之前是累加的(表3.1和表3.2)。
在药物治疗停止以后继续监测肿瘤体积。对于merestinib作为单一试剂组，在结束21天给药期后(最后一个给药天是在第26天)，所有动物中的肿瘤在以后的研究天33-40中指数地生长。在抗-PD-L1抗体治疗组中的半数动物的肿瘤在第33天之前表现出应答和消退(表4)且在接下来的30天中继续消退。在组合治疗组的某些动物中的肿瘤表现出在第33天和第64天之间的继续消退。这表现在如表4所示的应答类型的变化中。在第6天开始给药的并行组合组中，完全的且持久的消退应答者(CR)从第33天的3增加至第64天之前的9。在依次组合组中，完全的且持久的消退应答者从第33天的0增加至第64天之前的2。
由于对于在第6天开始给药的merestinib和抗-PD-L1抗体而言在研究S010516中仅存在比较物单一试剂治疗分支，仅对在第6天开始给药的merestinib和抗-PD-L1抗体的并行组合进行了顺序回归分析。所述组合的后验概率是65%（对于协同作用）、31%（对于累加作用）和4%（对于拮抗作用）。merestinib和抗-PD-L1抗体的组合的相互作用效应大小(协同作用相对于加和作用)具有与所述组合仅实现加和作用相比低5.8倍的进行性疾病中值机率(在低144倍和高2.5倍之间的范围的90%概率)。Bayesian顺序回归分析数据指示当将merestinib与抗-PD-L1抗体治疗组合时的协同抗肿瘤作用。
基于历史数据，merestinib (在第6天开始)和抗-PD-L1抗体(在第13天开始)的依次组合提示比单独的任一种单一试剂更多的抗肿瘤作用。历史数据指示，在CT26模型中在第13天开始给药抗-PD-L1抗体后，不会产生任何治疗益处。merestinib在所述依次组合中的添加在第64天之前在两只部分应答者和一只完全的且持久的消退应答者中产生结果(表4)。
在第64天，将在抗-PD-L1组中的5只动物(2只部分应答者和3只完全的且持久的消退应答者)(表4)和在并行组合组中的9只动物(9只完全的且持久的消退应答者) (表4)在对侧(左)后胁腹区域皮下地用CT26肿瘤细胞(1 x 106细胞)重新攻击。监测并测量肿瘤生长直到第82天，即研究的最后一天。如在表5中所示，没有先前治疗或CT26细胞植入的先前暴露的原初动物表现出从CT26细胞的快速肿瘤生长，导致在483 - 906 mm3范围内的肿瘤体积。在抗-PD-L1抗体组的所有5只动物中和在并行组合组的9只动物中，没有观察到肿瘤生长(表5)，指示并行治疗产生免疫记忆和在用CT26肿瘤细胞重新攻击后的肿瘤生长抑制。如果转移到临床上，该免疫记忆可能是重要的，从而提示，所述组合治疗产生长期的持久的应答，其可能在比单独抗-PD-L1抗体治疗更大比例的治疗患者中转换成长期存活益处。
merestinib、抗-PD-L1和并行组合对肿瘤上的80-鼠免疫基因集合的治疗作用显示在表7中。尽管基于选择的80-鼠免疫基因集合单独的merestinib没有诱导免疫景观的任何显著变化(仅扰乱测量的80个免疫基因之一，与此相比，媒介物对照组表现出超过2倍数变化和<0.05的p-值)，但是抗-PD-L1抗体治疗诱导炎症性环境。在抗-PD-L1抗体组相对于媒介物对照组显著不同的46个免疫基因中，存在炎症性标志物诸如Cd4、Ifnγ、Ccl3和Ccl4的上调(表7)。与媒介物对照组相比，并行组合治疗组显著地扰乱测量的80个免疫基因中的56个。在merestinib治疗组和抗-PD-L1抗体组之间共有的仅一个基因(CDH1)显著不同于媒介物对照(表8a)。与单独merestinib组和单独抗-PD-L1抗体组相比，在并行组合组中存在显著不同的基因表达谱(表9)。
感兴趣的是被并行治疗组独特地表达且显著不同于媒介物对照的27个基因(表8b)。并行组合治疗中的基因表达谱显示炎性肿瘤环境。存在肿瘤浸润淋巴细胞的标志物诸如CD45 (Ptprc)、Cd3、Cd4和Cd8的上调。也存在免疫细胞活化标志物诸如Ifnγ、Tnfrsf18和它的配体Tnfsf18、Tnfrsf4和它的配体Tnfsf4以及Cd40 (在抗原呈递细胞上的共刺激性受体)的配体(Cd40Ig)的上调。也存在Itgam/Cd11b和Itgax/Cd11c标志物的上调，从而分别指示巨噬细胞和树突细胞的存在。也存在免疫抑制酶诸如Arg1、Nos2、Mpo和Tdo2的上调，其可能响应于最初的炎症信号。Sele (E-选择素)的减量调节提示白细胞滚动的阻止，而ICAM1的上调可能指示抗原呈递细胞的活化、迁移和外渗以及炎症应答。
并行组合组的基因表达谱进一步支持这两种化合物的组合的协同作用，导致扩大比例的治疗动物具有持久的完全肿瘤消退且具有免疫记忆，所述免疫记忆阻止在用肿瘤细胞重新攻击后的肿瘤生长。
结论
1) CT26 CRC肿瘤细胞携带KRAS活化突变G12D，表达低水平的Met，没有可检测水平的p-Met和高水平的p-Axl。在体外，500nM的merestinib使p-Axl减少超过60%，但是显示出对CT26细胞增殖的非常小的作用(IC50>20µM)。
2) 单一试剂merestinib在体内CT26同基因小鼠肿瘤模型中显示出与媒介物对照相比显著的抗肿瘤作用。当在CT26细胞植入后6天开始给药时，每天1次口服施用的它显示出肿瘤生长的剂量依赖性减小(6 mg/kg、12 mg/kg、24 mg/kg)。所有三种剂量被良好耐受。
3) 选择每日1次12 mg/kg剂量的merestinib用于与抗-PD-L1抗体一起的组合研究。Merestinib单一试剂在21天给药结束时显示出显著的抗肿瘤作用；但是，肿瘤在给药停止后1周内指数地生长。当肿瘤细胞植入后6天开始时，通过以每周1次500µg/动物(~24 mg/kg)的剂量腹膜内注射(3剂)，单独的抗-PD-L1抗体在体内CT26同基因小鼠肿瘤模型中也显示出显著的抗肿瘤作用。在最后一次治疗以后，在接下来的30天观察中所述动物子集中的肿瘤继续消退。
4) 发现在肿瘤细胞植入后6天开始的每天1次口服12 mg/kg的merestinib (共21天)和每周1次500µg (~24 mg/kg)的抗-PD-L1抗体(共3剂)的并行组合具有与单独的每种单一试剂相比显著改善的抗肿瘤活性。所述组合被良好地耐受。使用Bayesian顺序回归分析发现所述组合在第64天之前是协同的(超过两种单一试剂的预期加和作用)，对于协同作用而言具有65%的后验概率。
5) 在研究第64天之前，与单独抗-PD-1抗体组中的30%(3/10)相比，并行组合也会使完全的且持久的肿瘤消退的应答率增加至90%(9/10)。当用CT26肿瘤细胞的新植入重新攻击时，该并行组合也在9只完全应答者小鼠中导致“免疫记忆”并阻止肿瘤生长。
6) 如通过流式细胞计量术评价的，与并行组合或媒介物对照相比，用单独merestinib或单独抗-PD-L1抗体治疗的动物没有免疫细胞的显著变化。
7) 单独的Merestinib治疗没有显示与媒介物对照相比在肿瘤中的80-免疫基因集合(mRNA表达)中的79个的显著变化。并行组合组的80-免疫基因表达谱显著不同于单独的每种单一试剂。
8) 来自该临床前研究的数据强烈地支持merestinib和免疫检验点靶向PD-L1(抗-PD-L1抗体)的临床组合用于增加治疗应答者的比例和延长癌症患者的存活。
表1: 研究S 082015 -与媒介物对照组相比在第26天报告的肿瘤体积和体重分析
^ T/C是治疗组的肿瘤体积/媒介物对照组的肿瘤体积
* 统计上显著的(p<0.05)
NA - 不适用。
^ 媒介物组中多得多的体重增加是由于肿瘤负荷
* 统计上显著的(p<0.05)
NA - 不适用。
表2: 研究S 010516 -与媒介物对照组相比治疗组在第33天报告的肿瘤体积分析
^ T/C是治疗组的肿瘤体积/媒介物对照组的肿瘤体积；使用在第15天所有组从基线的总平均值来计算和改变T/C或消退
* 统计上显著的(p<0.05)
NA - 不适用。
表3.1: 在研究第33天，相互作用检验- merestinib和抗-PD-L1抗体的肿瘤体积指示所述并行组合(在第6天开始)是累加的
表3.2: 在研究第33天，相互作用检验- merestinib和抗-PD-L1抗体的肿瘤体积指示所述并行组合(在第6天开始)是累加的
a%应答是在基线以上的肿瘤体积的%∆T/C和在基线以下的肿瘤体积的%消退。
表3.3: 治疗对比(媒介物, 单独的抗-PD-L1抗体, 单独的merestinib和并行组合)–在第33天的对数标度
* 统计上显著的(p<0.05)
b差= 治疗1 - 治疗2。
表4: 治疗组(10只动物/组)在第33天之前和在第64天之前的治疗应答者
c进行性疾病(PD)、生长延迟(GD)、部分应答(PR)、完全的且持久的消退(CR)。CR由在指定的时间点≤25 mm3的肿瘤体积定义。将PR定义为在治疗结束之后或在指定的更晚时间点发生的且持久的某种消退。这也包括持久的稳定疾病。将GD定义为明显可观察的延迟或生长的减慢，其不同于媒介物，但是没有达到停滞或消退的水平。将PD定义为与媒介物动物类似的未扰乱的指数生长。
表5: 在第64天用CT26肿瘤细胞重新攻击以后，在第82天动物中的肿瘤体积
* - 没有先前植入CT26细胞的原初动物(研究S035116)和植入与在研究S010516中用于重新攻击相同批次的CT26细胞的原初动物。肿瘤细胞在与第64天同一天植入并在与第82天同一天测量。
表6: 在mu-80免疫基因集合中的基因的列表
表7: 将merestinib、抗-PD-L1抗体或并行组合与媒介物对照进行对比的免疫基因的倍数变化的差别分析
从单因素方差分析，下面显示的所有基因显著不同于媒介物对照(p≤0.05).
表8a: 显著不同于媒介物对照的在单独merestinib治疗和单独抗-PD-L1抗体之间共有的免疫基因表达
从单因素方差分析，下面显示的所有基因显著不同于单独的每种单一试剂(p≤0.05).
基因 注解 Log<sub>2</sub> (抗-PD-L1抗体与媒介物对照的差别) Log<sub>2</sub> (merestinib与媒介物对照的差别)
CDH1 EMT 1 1.01
表8b: 显著不同于媒介物对照的、并行组合组独有的免疫基因表达
从单因素方差分析，下面显示的所有基因显著不同于单独的每种单一试剂(p≤0.05).
基因 注解 Log<sub>2</sub> (并行组合与媒介物对照的差别)
<i>Cd3e</i> 细胞类型特异性的标志物 1.9
<i>Cd40lg</i> 共抑制性的/共刺激性的 1.2
<i>Cd68</i> 细胞类型特异性的标志物 1.0
<i>Cd86</i> 共抑制性的/共刺激性的 1.4
<i>Cd8b1</i> 细胞类型特异性的标志物 1.7
<i>Cspg4</i> EMT 1.0
<i>Epcam</i> EMT 1.1
<i>Foxp3</i> 细胞类型特异性的标志物 1.7
<i>Il13</i> 细胞因子/趋化因子 1.1
<i>Il17a</i> 细胞因子/趋化因子 1.1
<i>Il4</i> 细胞因子/趋化因子 1.1
<i>Itgam</i> 细胞类型特异性的标志物 1.3
<i>Itgax</i> 细胞类型特异性的标志物 1.4
<i>Lag3</i> 共抑制性的/共刺激性的 1.4
<i>Mpo</i> 免疫抑制酶 1.1
<i>Ms4a1</i> 细胞类型特异性的标志物 1.0
<i>Pdcd1</i> 共抑制性的/共刺激性的 1.5
<i>Sele</i> T细胞活化标志物 -1.9
<i>Tdo2</i> 免疫抑制酶 1.1
<i>Tgfb2</i> TGFb途径 1.1
<i>Tgfbr2</i> TGFb途径 1.1
<i>Timd4</i> 共抑制性的/共刺激性的 2.0
<i>Tnf</i> 细胞因子/趋化因子 1.6
<i>Tnfrsf18</i> 共抑制性的/共刺激性的 1.7
<i>Tnfrsf4</i> 共抑制性的/共刺激性的 1.3
<i>Tnfsf18</i> 共抑制性的/共刺激性的 1.0
<i>Twist1</i> EMT -1.4
表9: 与每种单一试剂相比并行组合治疗(merestinib+抗-PD-L1)的倍数变化的差别分析
从单因素方差分析，下面显示的所有基因显著不同于单独的每种单一试剂(p≤0.05).
在EMT6同基因小鼠乳腺癌肿瘤模型中对merestinib (LY2801653)与抗-PD-L1抗体的组合的体内评价
实验原理
使用同基因小鼠肿瘤模型评价merestinib和抗-PD-L1抗体在EMT6模型中的潜在组合效应(Rockwell, SC, Kallman, RF, Fajardo, LF. Characteristics of a seriallytransplanted mouse mammary tumor and its tissue-culture-adpated derivative. JNat Cancer Institute. 1972;49:735-749)。在小鼠研究中使用抗-PD-L1抗体替代物(178G7, LSN3370181) (Eppihimer等人 Microcirculation 2002:9(2):133)。
动物
将来自Envigo (Harlan Laboratories)的雌性BALB/c小鼠(18-20克)用于该研究。食物和水可随意得到。在任何实验操作之前，使动物适应至少1周。根据AALAC公认的惯例指南执行研究。
化合物准备
每周1次将Merestinib配制为在10%PEG 400于90%[20%Captisol在H2O中]中的溶液。在PBS (磷酸盐缓冲盐水)中配制抗-PD-L1抗体(LSN3370181)。
研究设计
将EMT6细胞(来自内部体内药理学细胞培养组批号EMT6-3184882)用于植入。在麻醉下将在HBSS中的大约5 x105个细胞皮下地植入动物的右后胁腹中。在开始药物施用之前，基于体重将动物随机化至治疗组。
在该研究中存在4个分支，每组15只动物：1)媒介物对照; 2) merestinib 12 mg/kg每天1次x 21次，口服; 3) LSN3370181 (抗-PD-L1) 0.5 mg/小鼠每周1次共3周，腹膜内；4)组合merestinib + 抗-PD-L1抗体；组合疗法遵循与单一疗法相同的给药计划。在肿瘤细胞植入后第6天开始治疗并持续21天(在第26天施用最终剂量)。每2周测量肿瘤体积和体重。使用下式估计肿瘤体积：v = l x w 2 x 0.536，其中l = 测量的直径中的较大者，且w= 垂直直径中的较小者。使用CO2和颈椎脱位处死动物。
在肿瘤细胞植入后第20天，将来自每组的5只动物取出用于收获脾和肿瘤进行作用机理(MOA)研究(FAC分析、基因表达)。剩余的动物继续如上所述的治疗。在给药期结束时(肿瘤细胞植入后第27天)，观察动物的肿瘤生长43天。当肿瘤负荷达到或超过2500 mm3时，从研究移除动物。为了评估免疫记忆，在肿瘤细胞植入后第70天，将在研究中保留的动物(完全应答者和部分应答者)用EMT6细胞在对侧的新植入重新攻击，并观察肿瘤生长15天。
统计方法
将肿瘤体积转化成对数标度以均衡时间和治疗组之间的变动。使用SAS软件(9.3版)中的MIXED程序，用时间和治疗的两因素重复测量方差分析来分析log体积数据。重复测量的关系模型是空间能力。在每个时间点将治疗组与对照组进行对比。还将MIXED程序分别用于每个治疗组以计算在每个时间点处的最小二乘法均值和标准误差。两种分析解释了每只动物内的自相关和当在研究结束之前取出或丢失动物时发生的数据损失。
在该研究的第69天使用Bayesian顺序逻辑回归分析得到组合治疗效应关于协同作用、加和作用或拮抗作用的后验概率。基于它的第69天肿瘤体积和通过与媒介物数据对比，将每只动物分类为3个应答类型之一：I)无应答者(NR)，II)部分应答者(PR)，III)完全应答者(CR)。CR由在第69天≤25 mm3的肿瘤体积定义。将NR定义为与媒介物动物类似的未扰乱的指数生长。需要至少2个时间点（具有低于媒介物平均值-3个SD的肿瘤体积）来将动物归类为PR。对于这些类型，使用具有相互作用治疗结构的2-因素方差分析配合成比例机率顺序逻辑回归模型，使得相互作用效应参数的0值对应于精确加和。基于相互作用参数的log机率量表将累加活性的范围定义为-1.1至+1.1，其对应于机率的3倍减少或增加是在NR类型中，或一般而言，是在与精确加和相比更低的类型集合中。小于-1.1的相互作用参数的值指示协同作用(相对于精确加和更小的NR机率)，且大于+1.1的值指示拮抗作用。使用Bayesian分析方法来拟合所述模型并得到组合疗法是在协同、累加或拮抗范围内的后验概率，给出数据。宣布具有最高后验概率的范围是最可能的组合效应。
结果
Merestinib (LY2801653) (12 mg/kg)在EMT6同基因小鼠乳腺癌肿瘤模型中表现出弱的单一试剂抗肿瘤活性。尽管在治疗期间观察到肿瘤生长延迟(表1)，一旦merestinib施用停止，肿瘤就快速地生长(表1)。治疗的最后一天是第26天。在表1中所示的数据是在研究第31天。在媒介物组中的四只动物由于肿瘤负荷(肿瘤体积≥2500 mm3)而在第31天之前被移除。与对照组相比，在第31天merestinib治疗组的肿瘤体积是T/C=35.2%(表1)。在研究第49天之前，在merestinib治疗组中的所有动物由于肿瘤负荷(肿瘤体积≥2500 mm3)而除去。抗-PD-L1治疗组和抗-PD-L1与merestinib组合治疗组在第31天之前表现出肿瘤消退(表1)，在组合治疗组中更多。两个治疗组中的某些动物的肿瘤在接下来的38天直到第69天中继续消退。
证实了抗-PD-L1抗体(LSN3370181)作为单一试剂在该模型中具有潜在的和持久的抗肿瘤活性，在研究结束时(第69天)具有6/10完全应答者(表2)。将merestinib与抗-PD-L1组合会产生与任一种单一试剂相比更大的效力，在研究结束时(第69天) 9/10的动物是完全应答者(表2)。针对merestinib和抗-PD-L1抗体的组合进行的Bayesian顺序逻辑回归分析确定了所示组合的后验概率是78%（对于协同作用）、19%（对于累加作用）和3%（对于拮抗作用）。因此，merestinib与抗-PD-L1抗体的组合产生协同的抗肿瘤作用。
在植入后第70天，将归类为完全应答者的所有动物和几个部分应答者在对侧用EMT6细胞重新攻击以评估免疫记忆。表3提供了在重新攻击时和在重新攻击后2个另外的时间点的原发肿瘤测量结果。继发肿瘤的测量结果也提供在表中。被归类为完全应答者的动物耐受重新攻击，从而指示免疫记忆的诱导，而3只被归类为部分应答者的动物在原发部位和继发部位都具有观察到的肿瘤生长。
治疗被良好地耐受，与对照组相比没有显著的临床上有意义的重量减轻(数据未显示)。
表10: 在第31天报告的肿瘤体积分析，将治疗组与媒介物对照组进行对比
在表10中的数据表明，在组合治疗组中观察到比抗-PD-L1治疗组更多的肿瘤消退。在merestinib治疗组中没有观察到肿瘤消退。
表11: 对于Bayesian顺序逻辑回归分析，治疗组(10只动物/组)在第69天的治疗应答者
c无应答者(NR)、部分应答者(PR)、完全应答者(CR)。CR由在第69天≤25 mm3的肿瘤体积定义。将NR定义为与媒介物动物类似的未扰乱的指数生长。需要至少2个时间点（具有低于媒介物平均值减去3个SD的肿瘤体积）来将动物归类为PR。
表11的数据表明，merestinib与抗-PD-L1的组合产生与任一种单一试剂相比更大的效力。将每只动物对治疗的应答归类为三种类型之一。将应答数据用于Bayesian顺序逻辑回归分析，其表明，所述组合治疗是协同的。
表12: 在EMT6模型中的重新攻击的肿瘤体积
原始肿瘤植入在右侧。重新攻击的EMT6在研究第70天植入在左侧。将从测量结果组合的数据捕获在WebDirector (S003617)中。
表12的数据表明，所述组合治疗不仅导致肿瘤的完全消退(CR)，而且诱导免疫记忆。向临床结果的转换是，所述组合治疗可以在患者中产生持久的减轻。
单独的和组合的抗-PD-L1检验点抗体(LY3300054)在具有晚期难治实体瘤(PACT)的参与者中的研究；研究治疗分支D：LY3300054 + Merestinib。
临床研究设计
临床试验研究NCT02791334是一个多中心的1期研究(在下文中称作“研究”)，且将分支D用于评估PD-L1抑制剂LY3300054作为单一疗法和与merestinib组合的安全性和耐受性，其可以安全地施用给具有晚期难治实体瘤的患者。
研究目的和量度
在阶段1中的研究的首要目的是评估PD-L1抑制剂LY3300054的安全性和耐受性，由此鉴别LY3300054的推荐的2期剂量，其作为单一疗法和与merestinib组合地施用给具有晚期实体瘤的参与者。主要结果量度是鉴别在所述研究中表现出剂量限制毒性(DLT)的参与者的数目。
在阶段1中的研究的次要目的是在具有实体瘤的患者中评估以下药剂的药代动力学：(i)作为单一疗法施用的PD-L1抑制剂LY3300054；(ii)与merestinib组合施用的PD-L1抑制剂LY3300054；和(iii)与LY3300054组合施用的merestinib。次要结果量度包括、但不限于：(i)作为单一疗法和与merestinib组合施用的LY3300054的最小浓度(Cmin)和近似最大浓度(Cmax)；(ii)与LY3300054组合施用的merestinib的Cmin和近似Cmax；(iii)目标响应率(ORR)，如通过RECIST标准v. 1.1所确定的，以鉴别具有完全应答(CR)或部分应答(PR)的参与者的比例；(iv)无进展存活(PFS)；(v)应答的持续时间(DOR)；(vi)至应答的时间(TTR)；和(vii)疾病控制率(DCR)。

Claims (14)

1.一种治疗患者中的癌症的方法，其中所述癌症是肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、黑素瘤、结直肠癌、胰腺癌、胆道癌、黑素瘤(包括眼色素层黑素瘤)、肉瘤、膀胱癌、肾癌、尿道癌、头癌、颈癌、甲状腺癌、卵巢癌、遗传性乳头状肾细胞癌、肝细胞癌、胃癌和/或表现出在MET、MSTR1 (又名RON)、AXL、KRAS、FLT3、DDR1/2、ROS1、NTRK1/2/3、MKNK1/2和它的底物EIF4E中的改变的肿瘤，所述方法包括：与有效量的抗-人PD-L1抗体或抗-人PD-1抗体组合地给所述患者施用有效量的merestinib或其药学上可接受的盐。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗-人PD-L1抗体是阿特朱单抗、YW243.55.S70、MEDI-4736、MSB-0010718C、MDPL3280A、durvalumab、avelumab或MDX-1105。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗-人PD-L1抗体是LY3300054。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗-人PD-1抗体是纳武单抗、派姆单抗、pidilizumab或AMP-224。
5.根据权利要求1-4中的任一项所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌、黑素瘤和/或结直肠癌。
6.根据权利要求1-5中的任一项所述的方法，其中在21-天周期或28-天周期中以每天1次40 mg至120 mg的剂量施用merestinib或其药学上可接受的盐，且在14-天周期的第1天、在21-天周期的第1天、在21-天周期的第1天和第8天、在21-天周期的第1天和第15天、在21-天周期的第1天、第8天和第15天、在28-天周期的第1天或在28-天周期的第1天和第15天以1mg/kg至10 mg/kg的剂量施用抗-人PD-L1抗体或抗-人PD-1抗体。
7.根据权利要求6所述的方法，其中与抗-人PD-L1抗体或抗-人PD-1抗体同时施用merestinib或其药学上可接受的盐。
8.一种组合产品，其包含merestinib或其药学上可接受的盐和抗-人PD-L1抗体或抗-人PD-1抗体，它们同时、分别或依次用在癌症的治疗中，其中所述癌症是肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、黑素瘤、结直肠癌、胰腺癌、胆道癌、黑素瘤(包括眼色素层黑素瘤)、肉瘤、膀胱癌、肾癌、尿道癌、头癌、颈癌、甲状腺癌、卵巢癌、遗传性乳头状肾细胞癌、肝细胞癌、胃癌和/或表现出在MET、MSTR1 (又名RON)、AXL、KRAS、FLT3、DDR1/2、ROS1、NTRK1/2/3、MKNK1/2和它的底物EIF4E中的改变的肿瘤。
9.权利要求8所述的组合产品，其中所述抗-人PD-L1抗体是阿特朱单抗、YW243.55.S70、MEDI-4736、MSB-0010718C、MDPL3280A、durvalumab、avelumab或MDX-1105。
10.权利要求8所述的组合产品，其中所述抗-人PD-L1抗体是LY3300054。
11.权利要求8所述的组合产品，其中所述抗-人PD-1抗体是纳武单抗、派姆单抗、pidilizumab或AMP-224。
12.权利要求8-11中的任一项所述的组合产品，其中所述癌症是乳腺癌、黑素瘤和/或结直肠癌。
13.权利要求8-12中的任一项所述的组合产品，其中在21-天周期或28-天周期中以每天1次40 mg至120 mg的剂量施用merestinib或其药学上可接受的盐，且在14-天周期的第1天、在21-天周期的第1天、在21-天周期的第1天和第8天、在21-天周期的第1天和第15天、在21-天周期的第1天、第8天和第15天、在28-天周期的第1天或在28-天周期的第1天和第15天以1 mg/kg至10 mg/kg的剂量施用抗-人PD-L1抗体或抗-人PD-1抗体。
14.权利要求13所述的组合产品，其中merestinib或其药学上可接受的盐用于与抗-人PD-L1抗体或抗-人PD-1抗体同时使用。
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