CN110291105A - 导蛋白-1干扰药物和免疫检查点抑制剂药物的组合治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明是在癌症治疗中的(i)能够破坏或阻碍导蛋白‑1/导蛋白‑1受体相互作用或导蛋白‑1介导的受体二聚化的化合物，在本文中也称为NTN1中和剂，该化合物可以是与导蛋白‑1或抗导蛋白‑1抗体结合的抗体，和(ii)免疫检查点抑制剂的组合或组合使用。该组合物可包含抗导蛋白‑1抗体和免疫检查点抑制剂，用作与抗导蛋白‑1抗体和免疫检查点抑制剂同时、分别或依次施用于患者的抗癌药物。

Description

导蛋白-1干扰药物和免疫检查点抑制剂药物的组合治疗
技术领域
本发明涉及治疗癌症的新型组合组合物和方法。
背景技术
轴突导向蛋白质导蛋白-1(Netrin-1)是一种可溶性蛋白质，被认为通过调节程序性细胞死亡在癌症进展中发挥关键作用。
实际上，导蛋白-1受体如DCC和UNC5H(即UNC5H1、UNC5H2、UNC5H3和UNC5H4也称为UNC5A、UNC5B、UNC5C或UNC5D)-属于所谓的依赖性受体家族。这些跨膜受体以两种相反的方式起作用：它们在其配体导蛋白-1存在下诱导导致细胞增殖、存活和分化的阳性信号传导。在没有导蛋白-1的情况下，这些受体在未结合时转导引发细胞凋亡的阴性信号传导。配体取出后，细胞死亡诱导的信号传导途径需要特异性顶端半胱天冬酶的相互作用和裂解。结果，在没有导蛋白-1的情况下观察到受体细胞内部分中半胱天冬酶位点的突变阻碍了细胞死亡诱导。因此，天冬氨酸-1290(D1290)残基上的单点突变足以抑制DCC诱导细胞死亡，而不干扰DCC阳性信号传导。携带该突变的小鼠自发地以相对低的水平发展肠肿瘤。当在APC1638N背景中交叉时，它们显示出肿瘤发生率的增加。
诱导细胞凋亡的依赖性受体的性质赋予它们肿瘤抑制活性。它们能够消除在提供有限量导蛋白-1的区域异常生长的细胞。在依赖性受体模型中，呈递到配体浓度有限的环境中的转化细胞或迁移到其中不存在配体的远端位点的转移细胞将显示未结合的依赖性受体并因此经历细胞凋亡。该机制将呈现出肿瘤发生的替代限制。在侵袭性肿瘤中，肿瘤细胞已经关闭了依赖性受体诱导的细胞死亡。与该假设一致，受体表达的丧失代表了肿瘤细胞的选择性优势，并且似乎是克服这种保护机制的主要方法。导致依赖性受体在癌症中表达丧失的许多分子机制已关联。依赖受体表达通过缺失杂合性(LOH)、通过超甲基化或表观遗传机制、翻译后修饰(例如微小RNA和错义突变)已与沉默相关。因此，DCC基因在70％的人结肠直肠癌中被LOH功能性沉默。由于启动子甲基化或突变，在许多情况下，UNCH5家族受体的表达在各种癌症中表现出下调。
由于依赖性受体在缺乏配体的区域诱导细胞死亡，肿瘤逃逸的另一种机制是肿瘤细胞对导蛋白-1的自分泌合成。因此，导蛋白-1的表达已与大部分肿瘤类型如卵巢、神经母细胞瘤、B细胞淋巴瘤、非小细胞肺癌、成神经管细胞瘤、炎症相关结肠直肠癌中的增加有关。另外，导蛋白-1过表达与乳腺癌的转移性和侵袭性形式相关。
已经在体内进行了表征为治疗靶标的概念证明研究。因此，通过siRNA沉默导蛋白-1或干扰导蛋白-1/依赖性受体相互作用伴随肿瘤细胞凋亡。已经表征了抗导蛋白-1单克隆抗体(HUM03)并且显示其在免疫受损小鼠的经典增殖性肿瘤生长模型中是有效的(Grandin等，癌细胞(Cancer Cell)，2016和WO2015/104360)。该抗体能够破坏导蛋白-1/依赖性受体相互作用或导蛋白-1介导的导蛋白-1受体二聚化。
此外，导蛋白-1最近被确定为免疫细胞迁移的调节因子，并导致大量研究探讨导蛋白-1如何在一些病症中控制炎症和炎性细胞迁移，该病症如：急性和慢性肾病、炎性关节炎、动脉粥样硬化或糖尿病/肥胖症。导蛋白-1通过阻碍发炎部位的巨噬细胞流出、动脉壁斑块或通过在脂肪组织中积累这些细胞来促进炎症性关节炎、动脉粥样硬化或肥胖，从而促进慢性炎症和胰岛素抵抗。因此，似乎导蛋白-1调节炎症，但这种发生的机制尚不清楚。
免疫疗法是癌症治疗领域的当前革命，在用免疫检查点抑制剂治疗的患者中观察到明确的持久反应，特别是针对PD1/PDL1或CTLA4的单克隆抗体。
CTLA4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4，也称为CD152(分化簇152))是一种蛋白质受体，其作为免疫检查点下调免疫应答。CTLA4在T淋巴细胞调节因子(Tregs)中组成性表达，但在活化后仅在常规T淋巴细胞中上调。当与抗原呈递细胞(APC)的细胞表面上的CD80或CD86结合时，它充当“关闭”开关。PD-1(程序性细胞死亡-1)受体(也称为CD279)在活化的T细胞表面上表达。PD-1的配体PD-L1(B7-H1；CD274)和PD-L2(B7-DC；CD273)通常在巨噬细胞或树突细胞的表面表达。PD1和PD-L1/PD-L2属于充当共抑制因子的免疫检查点蛋白家族，其可以停止或限制T细胞应答的发展。PD1/PD-L1相互作用确保免疫系统仅在适当的时间被激活，以减少长期自身免疫炎症的可能性。
当PD-1与PD-L1结合时，在T细胞中传递阴性信号传导，这减少了细胞因子的产生并抑制了T细胞的增殖。肿瘤细胞避免这种途径作为逃避检测和预防免疫应答的机制。PD-L1被描述为肿瘤细胞或微环境的过表达。在肿瘤细胞上表达的PD-L1与活化的T细胞上的PD-1受体结合，这导致细胞毒性T细胞的抑制。这些失活的T细胞在肿瘤微环境中保持受到抑制。PD1/PD-L1途径代表由肿瘤细胞响应内源性抗肿瘤活性而发挥的适应性免疫抗性机制。癌症免疫治疗研究正试图克服癌症阻断免疫应答的能力，并刺激机体自身的机制，以保持有效对抗癌症。
但是，已经报道了两个主要限制：
-主要限制是化合物的功效，因为只有一小部分患者对这些免疫检查点抑制剂有反应(可能对免疫检查点抑制剂没有反应)。因此，只有50％的黑色素瘤患者对CTLA4和PD1的组合阻断表现出客观反应，并且这一百分比在非小细胞肺癌中下降至约20％，在乳腺癌或结肠癌中下降至＜5％。
-第二个限制是到目前为止无法预测患者是否会做出积极的反应。免疫效应物(特别是CD8+细胞毒性T淋巴细胞，CTL)的丰度与肿瘤床中免疫抑制细胞(特别是FOXP3+调节性T细胞，Tregs)的稀缺性相结合是重要但不完美的预后因素。不同的报道表明化学疗法可能会增强免疫肿瘤药物的作用，特别是因为一些细胞毒性剂可以刺激恶性细胞的免疫原性细胞死亡(ICD)，因此有利于它们的免疫识别。目前尚不清楚导蛋白-1干扰诱导的细胞死亡是否具有免疫原性。此外，尽管导蛋白-1已被显示可作为癌症进展中的生存因子，但在非癌症环境中，最近已显示导蛋白-1可作为T细胞或巨噬细胞的免疫指导提示，即使已经描述了数据存在冲突(Ramkhelawon等，自然医学(Nature Med)，2013：Boneschansker等，免疫学(J.Immunology)，2016)。已知由肿瘤组织如CXCL12产生的不同趋化因子募集免疫抑制细胞，例如Treg和髓源衍生的免疫抑制细胞。这些细胞释放不同的损害细胞毒性T细胞和树突状细胞功能的介质，如TGF-β(转化生长因子-β)、IL10(白细胞介素-10)和VEGF(血管内皮生长因子)，产生免疫-耐受的微环境。已经描述了所有这些分泌的蛋白质与导蛋白-1相关。实际上，已经表明(i)导蛋白-1特异性地促进CXCL12的趋化性，(ii)IL-10通过增加导蛋白-1的表达促进神经突向外生长，(iii)TGF-β与导蛋白-1之间存在联系和(iv)VEGF和导蛋白-1之间存在联系，因为导蛋白-1刺激体内血管生成并增强对血管内皮生长因子的反应。
发明内容
药物组合的效果本质上是不可预测的。通常存在一种药物部分或完全抑制另一种药物的作用的倾向。本发明基于通过使用抗导蛋白-1抗体HUM03和针对CTLA4或PD-1的单克隆抗体的组合疗法显著增加异种移植小鼠存活率和延长疾病控制的惊人观察。获得的数据支持这样的观点，即将针对导蛋白-1的单克隆抗体与目前的免疫治疗相结合可提高其功效。在寻找可以解释免疫检查点抑制剂在导蛋白-1干扰存在下的这种增强作用的机制时，我们分析了响应单一疗法或组合治疗的肿瘤免疫浸润。如图5所示，虽然单一疗法(HUM03或CTLA4)不显著影响T细胞效应子/T细胞调节因子的比例，但该组合正在将该比例转向T细胞效应子。这通过暗示该组合增强杀伤性淋巴细胞(T细胞效应子)的存在来支持增加的功效。
本发明的一个目的是癌症治疗中的(i)能够破坏或阻碍导蛋白-1/导蛋白-1受体相互作用或导蛋白-1介导的受体二聚化的化合物，在本文中也称为NTN1中和剂，该化合物可以是与导蛋白-1或抗导蛋白-1抗体结合的抗体，和(ii)免疫检查点抑制剂的组合或组合使用。
本发明的另一个目的是癌症治疗中的与导蛋白-1或抗导蛋白-1抗体结合的抗体和免疫检查点抑制剂的组合或组合使用。
本发明的另一个目的是一种组合物，该组合物包含(i)能够破坏或阻碍导蛋白-1/导蛋白-1受体相互作用或导蛋白-1介导的受体二聚化的化合物，该化合物可以是与导蛋白-1或抗导蛋白-1抗体结合的抗体，和(ii)免疫检查点抑制剂，并用作将化合物(i)和免疫检查点抑制剂(ii)同时、分别或依次给药于患者的抗癌药物。
本发明的另一个目的是一种组合物，该组合物包含(i)与导蛋白-1或抗导蛋白-1抗体结合的抗体和(ii)免疫检查点抑制剂，用作将抗导蛋白-1抗体和免疫检查点抑制剂同时、分别或依次给药于患者的抗癌药物。
本发明的另一个目的还是一种联合抗癌治疗的方法，包括给患者施用(i)能够破坏或阻碍导蛋白-1/导蛋白-1受体相互作用或导蛋白-1介导的受体二聚化的化合物，该化合物可以是与导蛋白-1或抗导蛋白-1抗体结合的抗体，和(ii)免疫检查点抑制剂。
本发明的另一个目的还是一种联合抗癌治疗的方法，包括给患者施用(i)与导蛋白-1或抗导蛋白-1抗体结合的抗体和(ii)免疫检查点抑制剂。
本发明的另一个目的是体内调节肿瘤浸润(即淋巴细胞T或B、巨噬细胞、天然杀伤细胞)的方法，包括给患者施用(i)能够破坏或阻碍导蛋白-1/导蛋白-1受体相互作用或导蛋白-1介导的受体二聚化的化合物，该化合物可以是与导蛋白-1或抗导蛋白-1抗体结合的抗体，和(ii)免疫检查点抑制剂。
本发明的另一个目的是体内调节肿瘤浸润(即淋巴细胞T或B、巨噬细胞、天然杀伤细胞)的方法，包括给患者施用(i)与导蛋白-1或抗导蛋白-1抗体结合的抗体，和(ii)免疫检查点抑制剂。
另一个目的是通过激活癌细胞死亡或免疫原性细胞死亡来激活免疫应答，包括给患者施用(i)能够破坏或阻碍导蛋白-1/导蛋白-1受体相互作用或导蛋白-1介导的受体二聚化的化合物，该化合物可以是与导蛋白-1或抗导蛋白-1抗体结合的抗体，和(ii)免疫检查点抑制剂。
另一个目的是通过激活癌细胞死亡或免疫原性细胞死亡来激活免疫应答，包括给患者施用(i)与导蛋白-1或抗导蛋白-1抗体结合的抗体，和(ii)免疫检查点抑制剂。
本发明的其他具体目的是：
-用于癌症治疗方法中的药物组合物，该药物组合物包含抗导蛋白-1抗体和免疫检查点抑制剂，其中抗导蛋白-1抗体能够破坏或阻碍导蛋白-1/导蛋白-1受体相互作用或导蛋白-1介导的受体二聚化；
-药物组合物，该药物组合物包含抗导蛋白-1抗体和免疫检查点抑制剂，其中抗导蛋白-1抗体特异性结合氨基酸序列SEQ ID NO：35的多肽，并且能够破坏或阻碍导蛋白-1/导蛋白-1受体相互作用或导蛋白-1介导的受体二聚化；
-药物组合物，该药物组合物包含抗导蛋白-1抗体和免疫检查点抑制剂，其中抗导蛋白-1抗体包含(i)序列SEQ ID NO：5的CDR1-H、序列SEQ ID NO：6的CDR2-H、序列SEQ IDNO：7的CDR3-H，和序列SEQ ID NO：8的CDR1-L、序列YAS的CDR2-L和序列SEQ ID NO：9的CDR3-L，或(ii)序列SEQ ID NO：28的CDR1-H、序列SEQ ID NO：29的CDR2-H、序列SEQ ID NO：30的CDR3-H，和序列SEQ ID NO：31的CDR1-L、序列SEQ ID NO：32的CDR2-L和序列SEQ IDNO：9的CDR3-L；
-药物组合物，该药物组合物包含抗导蛋白-1抗体和免疫检查点抑制剂，其中抗导蛋白-1抗体能够破坏或阻碍导蛋白-1/导蛋白-1受体相互作用或导蛋白-1介导的受体二聚化，并且免疫检查点抑制剂选自由抗PD1、抗PD-L1、抗PD-L2和抗CTLA-4抗体组成的组；
-一种抗癌治疗方法，包括向有需要的患者施用有效量的抗导蛋白-1抗体和免疫检查点抑制剂，其中抗导蛋白-1抗体能够破坏或阻碍导蛋白-1/导蛋白-1受体相互作用或导蛋白-1介导的受体二聚化。
在一种实施方式中，待治疗的癌症是具有导蛋白-1表达的癌症，并且可能对免疫检查点抑制剂(单独，即如果不与抗导蛋白-1抗体等组合)没有反应。
这些不同的目的尤其可以使用HUM03抗体或其亲本抗体之一进行，如此后将呈现的。
在本发明的这些不同目的中，免疫检查点抑制剂可以是或特别包含抗体，优选单克隆抗体。
具体实施方式
NTN1(导蛋白-1)中和剂
NTN1中和剂是干扰导蛋白-1与导蛋白-1受体相互作用的能力的药物，或干扰导蛋白-1诱导导蛋白-1受体二聚化或多聚化的能力的药物。它在本文中称为能够破坏或阻碍导蛋白-1和依赖性受体相互作用或依赖性受体二聚化的化合物。本领域技术人员可以参考WO2007/099133，其通过引用并入本文，其公开了导蛋白-1与其受体之间的干扰，或者是导蛋白-1与受体之间的相互作用或结合的减少或抑制，或者是减少或抑制导蛋白-1诱导导蛋白-1受体的二聚化或多聚化(我们在此简称为二聚化，其可能包括多聚化)的能力，从而促进导蛋白-1受体诱导的细胞凋亡。
在一种实施方式中，NTN1中和剂是小干扰RNA或siRNA，其是双链RNA(dsRNA)(其长度可以为10至50个核苷酸)并且其降低编码导蛋白-1的基因的表达。第一链的部分与靶基因互补，即它具有足够的互补性以与靶基因杂交。例如，与靶基因或其部分具有至少80％的同一性。AP：人导蛋白-1mRNA序列登录号：NM_004822。可以使用的siRNA序列：序列NM_004822的氨基酸94-114。
在第二种实施方式中，NTN1中和剂是与导蛋白-1结合的分子(例如抗体、多肽、小分子等)，并且使导蛋白-1不能与其受体结合或诱导导蛋白-1受体的二聚化/多聚化，尤其是DCC和/或UNC5。
在第三种实施方式中，NTN1中和剂是与导蛋白-1受体结合的分子(例如抗体、多肽、小分子等)，这种结合抑制NTN1与受体的结合或受体的二聚化/多聚化。
NTN1中和剂可以诱导NTN1受体介导的细胞凋亡。
导蛋白-1受体尤其可以是DCC、UNC5A、UNC5B、UNC5C或UNC5D，再生蛋白和A2b。
在优选的实施方式中，NTN1中和剂是与导蛋白-1结合的抗体。
抗NTN1抗体(抗导蛋白-1抗体或与导蛋白-1结合的抗体)
它优选是特异性结合导蛋白-1的多克隆或单克隆抗体。抗体优选能够破坏或阻碍导蛋白-1/导蛋白-1受体相互作用或导蛋白-1介导的受体二聚化(即导蛋白-1受体包括UNC5B、A、C、D、DCC、再生蛋白和A2b)。
根据本领域技术人员已知的方法，NTN1多克隆抗体尤其可以通过在所选氨基酸序列的帮助下免疫动物如兔、小鼠等，收集并随后去除在例如含有免疫吸附剂的受体上获得的抗血清而获得。
导蛋白-1氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，导蛋白-1可全部或部分用于设计抗体。
通常，单克隆抗体可以根据和Milstein描述的常规淋巴细胞融合和杂交瘤培养方法获得(自然，1975，256(5517)：495-7)。制备单克隆抗体的其他方法也是已知的(Harlow等，ed.，1988“抗体：实验室手册”)。单克隆抗体可以通过免疫哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔或甚至人等)并使用导致杂交瘤的淋巴细胞融合技术来制备(和Milstein，1975)。存在这种常规技术的替代技术。例如，可以通过表达从杂交瘤克隆的核酸来产生单克隆抗体。也可以通过噬菌体展示技术通过将抗体的cDNA引入载体中来产生抗体，该载体通常是在噬菌体表面展示基因文库V的丝状噬菌体(例如用于大肠杆菌的fUSE5，ScottJ.K.，Smith G.P.，科学1990；249：386-390)。构建这些抗体文库的方案描述于J.D.Marks等，分子生物学刊物222(1991)，p.58)中。根据这些方法，对应于具有信号序列(SEQ ID NO：2)的全长导蛋白-1或其合适片段的cDNA可用于产生单克隆抗体。
在优选的实施方式中，NTN1中和抗体是WO2015/104360中公开的抗体，该参考文献通过引用并入本文。它是特异性结合具有氨基酸序列SEQ ID NO：3或35的NTN1表位或多肽的抗体或其变体。这些抗体具有与NTN1结合的特性，并通过导蛋白-1受体(例如UNC5或DCC受体)诱导肿瘤细胞的细胞死亡或凋亡。这些抗体优选是单克隆抗体。这些抗体能够破坏或阻碍导蛋白-1/导蛋白-1受体相互作用或导蛋白-1介导的二聚化。各种可衍生形式的抗体(包括其片段及其组合)将在后面描述。
在一种实施方式中，基于IMGT CDR的定义，抗体包含序列SEQ ID NO：5的CDR1-H、序列SEQ ID NO：6的CDR2-H、序列SEQ ID NO：7的CDR3-H，和序列SEQ ID NO：8的CDR1-L、序列YAS的CDR2-L和序列SEQ ID NO：9的CDR3-L。基于Kabat CDR的定义，该抗体包含序列SEQID NO：28的CDR1-H、序列SEQ ID NO：29的CDR2-H、序列SEQ ID NO：30的CDR3-H、序列SEQ IDNO：31的CDR1-L、序列SEQ ID NO：32的CDR2-L和序列SEQ ID NO：9的CDR3-L。
在第一系列实施方式中，本发明的抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO：10，11、12或13。通常，其包含序列SEQ ID NO：10和11两者、或SEQ ID NO：12和13两者。
在第二系列实施方式中，抗体是人源化的。优选地，它包含选自SEQ ID NO：14至19(VL)和/或SEQ ID NO：20至27(VH)的组的氨基酸序列。通常，抗体是人源化的并且包含选自SEQ ID NO：14至19的组的氨基酸序列和选自SEQ ID NO：20至27的组中的氨基酸序列。
具体实施方式是以下人源化抗体。该表中列出的第一列对应于将鼠CDR移植到人IgG1中。称为HUM的其他人源化抗体是具有可变人构架区的单克隆抗体。在一种实施方式中，本发明利用的本发明的组合物或本发明的组合物包含HUM01、HUM02、HUM03、HUM04、HUM05、HUM06、HUM07、HUM08、HUM09和/或HUM10。在典型的实施方式中，使用HUM03。表1还给出了人IgG1的CH和CL的参考：
NTN1受体多肽
在另一种实施方式中，NTN1(导蛋白-1)中和剂药物是包含导蛋白-1受体的胞外域或所述胞外域的片段的化合物。例如，导蛋白-1受体的胞外域的氨基酸序列或所述胞外域的片段的氨基酸序列在UniProt序列ID[胞外域位置范围]中给出：UNC5A：Q6ZN44[aas26-306，或片段34-240]；UNC5B：Q8IZJ1[aas27-377或片段29-244]；UNC5C：O95185[aas41-380或片段61-258]；UNC5D：Q6UXZ4[aas33-379]；DCC：P43146[aas26-1097]。这种药物能够与导蛋白-1结合。导蛋白-1受体可以是DCC、UNC5A、UNC5B、UNC5C或UNC5D。
在一种实施方式中，胞外域或其部分与抗体Fc部分结合。在优选的实施方式中，Fc部分是人IgG的Fc或其部分。人IgG可以是IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3。在优选的实施方式中，IgG是IgG1。
在一种实施方式中，融合蛋白是单链，这意味着蛋白质由DCC或UNC5片段构成，该DCC或UNC5片段分别包含或由DCC的第四或第五纤连蛋白样域或UNC5的两个Ig样域和改善化合物的药物参数的肽或蛋白质序列组成。
在另一个优选的实施方式中，融合蛋白是双链的，这意味着融合蛋白由两条链组成，每条链分别包含或由DCC的第四或第五纤连蛋白样域或UNC5的两个Ig样域和抗体Fc部分组成，其中两条链连接在一起，优选通过一个或多个，例如两个二硫键连接在一起。
在一种实施方式中，药物包含DCC的第五纤连蛋白域(Fn5或5Fbn)。优选地，药物包含DCC-融合蛋白，其包含与抗体Fc部分融合的该Fn5。在优选的实施方式中，Fc部分是人IgG的Fc或其部分。人IgG可以是IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3。在优选的实施方式中，IgG是IgG1。DCC基因可以例如得自NCBI，ID1630(2012年7月14日更新)，它将DCC受体蛋白编码为Uniprot P43146，更新于2012年7月11目。用于本发明并包含Fn5的DCC融合蛋白描述于WO2012025618中，其通过引用并入本文。在一种实施方式中，融合蛋白具有WO2012025618中的氨基酸序列SEQ ID NO：2、3或4。在一种实施方式中，融合蛋白由WO2012025618中的DNA序列SEQ ID NO：1编码。包含Fn5的融合蛋白的其他例子是在WO2007099133中描述的具有谷胱甘肽-S-转移酶(DCC-5Fbn-GST)的DCC-5-纤连蛋白融合蛋白。
在一种实施方式中，药物包含UNC5的两个Ig样域。优选地，药物包含UNC5-融合蛋白，其包含与抗体Fc部分融合的UNC5的两个Ig样域。人IgG可以是IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3。在优选的实施例中，IgG是IgG1。在一种实施方式中，UNC5是UNC5A。在另一种实施方式中，UNC5是UNC5B。在另一种实施方式中，UNC5是UNC5C。在另一种实施方式中，UNC5是UNC5D。
在一种实施方式中，UNC5A融合体中的UNC5A蛋白包含或由WO2014/041088中SEQID NO：1的氨基酸20至217组成，该文献通过引用并入本文。该融合蛋白可以进一步包含IgG1Fc，其包含或由该SEQ ID NO：1的氨基酸220至446组成。该Fc与UNC5A蛋白融合，例如通过接头，例如GT。在一种实施方式中，本发明涉及UNC5A蛋白的UNC5A融合体，其包含或由该SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成：Kappa2信号肽序列：氨基酸1-19；UNC5A的Ig样域：氨基酸20至217；接头：氨基酸218-219；人IgG1Fc：氨基酸220至446。在一种实施方式中，成熟融合蛋白不包含Kappa2信号肽序列。在优选的实施方式中，融合蛋白是双链的。本发明还包括在20-217个氨基酸序列或该SEQ ID NO：1的氨基酸20-446的全长上具有等于或大于90％，优选大于96、95、94、93、92或91％的同一性百分比的变体序列。氨基酸取代可以例如在20-217个氨基酸序列，或该SEQ ID NO：1氨基酸序列的全长上的9、72、74、87、144、164、170、193和/或210位中的一个或几个位置处发生。
在另一种实施方式中，UNC5B融合体中的UNC5B蛋白包含或由WO2014/041088中SEQID NO：2的氨基酸20至215组成。该融合蛋白可以进一步包含IgG1Fc，其包含或由该SEQ IDNO：2的氨基酸218至444组成。该Fc与UNC5B蛋白融合，例如通过接头，例如GT。在一种实施方式中，本发明涉及UNC5B蛋白的UNC5B融合体，其包含或由该SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成：Kappa2信号肽序列：氨基酸1-19；UNC5B的Ig样域：氨基酸20至215；接头：氨基酸216-217；人IgG1 Fc：氨基酸218至444。在一种实施方式中，成熟融合蛋白不包含Kappa2信号肽序列。在优选的实施方式中，融合蛋白是双链的。本发明包括在20-215氨基酸序列或该SEQID NO：2的氨基酸20-444的全长上具有等于或大于90％，优选大于96、95、94、93、92或91％的同一性百分比的变体序列。氨基酸取代可以例如在20-215个氨基酸序列，或该SEQ IDNO：2氨基酸序列的全长上的29、74、100、109、113、146、149、155、172、184、189、201、213和/或214中的一个或几个位置处发生。
在又一种实施方式中，UNC5C融合体中的UNC5C蛋白包含或由WO2014/041088中SEQID NO：3的氨基酸20至217组成。该融合蛋白可以进一步包含IgG1Fc，其包含或由该SEQ IDNO：3的氨基酸220至446组成。该Fc与UNC5C蛋白融合，例如通过接头，例如GT。在一种实施方式中，本发明涉及UNC5C蛋白的UNC5C融合体，其包含或由该SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成：Kappa2信号肽序列：氨基酸1-19；UNC5C的Ig样域：氨基酸20至217；接头：氨基酸218-219；人IgG1Fc：氨基酸220至446。在一种实施方式中，成熟融合蛋白不包含Kappa2信号肽序列。在优选的实施方式中，融合蛋白是双链的。本发明包括在20-217个氨基酸序列或该SEQID NO：3的氨基酸20-446的全长上具有等于或大于90％，优选大于96、95、94、93、92或91％的同一性百分比的变体序列。氨基酸取代可以例如在20-217个氨基酸序列，或该SEQ IDNO：3的氨基酸序列的全长上的33、66、109、129、136、178、189和/或211中的一个或几个位置处发生。
在另一种实施方式中，UNC5D融合体中的UNC5D蛋白包含或由WO2014/041088中SEQID NO：4的氨基酸20至217组成。该融合蛋白可以进一步包含IgG1Fc，其包含或由该SEQ IDNO：4的氨基酸220至446组成。该Fc与UNC5D蛋白融合，例如通过接头，例如GT。在一种实施方式中，本发明涉及UNC5D蛋白的UNC5D融合体，其包含或由该SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成：Kappa2信号肽序列：氨基酸1-19；UNC5D的Ig样域：氨基酸20至217；接头：氨基酸218-219；人IgG1 Fc：氨基酸220至446。在一种实施方式中，成熟融合蛋白不包含Kappa2信号肽序列。在优选的实施方式中，融合蛋白是双链的。本发明包括在20-217个氨基酸序列，或该SEQ ID NO：4的氨基酸20-446的全长上具有等于或大于90％，优选大于96、95、94、93、92或91％的同一性百分比的变体序列。氨基酸取代可以例如在20-217个氨基酸序列，或该SEQID NO：4氨基酸序列的全长上的38、79、80、115、131、178、186、201和/或212中的一个或几个位置处发生。
本发明可以提供编码那些多肽的核酸的给药，而不是多肽本身。可以使用能够在患者中表达多肽的载体，如通常那样。本领域技术人员可参考WO2007/099133和WO2014/041088，其描述了载体、制备载体的方法及其用途，其可用于实施本发明。
检查点抑制剂
在一个方面，免疫检查点抑制剂是生物治疗剂或小分子。另一方面，检查点抑制剂是单克隆抗体、人源化抗体、完全人抗体、融合蛋白或其组合。抗体可以针对任何参与该途径的蛋白质，更具体地针对受体或配体。众所周知，免疫检查点抑制剂能够恢复对癌细胞的免疫应答。特别地，抑制剂破坏或阻碍或抑制相互作用蛋白质之间的相互作用，并允许免疫应答，特别是T细胞杀死肿瘤细胞。在另一方面，检查点抑制剂抑制检查点蛋白，该检查点蛋白可以是CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2、A2aR、B-7或其组合。在另一方面，检查点抑制剂与检查点蛋白的配体相互作用，该检查点蛋白可以是CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2、A2aR、B-7或其组合。
抗PD-1、抗PD-L1和抗PD-L2抗体
本发明利用阻断、抑制或降低PD1/PD-L1和/或PD1/PD-L2途径的抗体。
目前在市场上或在临床评价中至少有五种阻断该途径的试剂，这些试剂中的任何一种都可以与本发明组合使用。这些试剂是BMS-936558(抗PD-L1mAb，纳武单抗/ONO-4538，百时美施贵宝(Bristol-Myers Squibb)、先前的MDX-1106(WO2006/121168中的抗体5C4)、MK-3475(抗PD1 mAb、派母单抗(lambrolizumab或pembrolizumab)，默克公司)、MPDL3280A/RG7446(抗PD-L1 mAb，罗氏/基因泰克)、AMP-224(包含抗PD-L2、Amplimmune和GSK的免疫粘附素)、Pidlizumab(抗PD1 mAb，CT-011，CureTech/TEVA-WO2009/101611)。
对于编码人源化抗体的重链和轻链可变区的MK-3475 DNA构建体，h409A11已经保藏在美国典型培养物保藏中心专利保藏中心(弗吉尼亚州马纳萨斯大学大道10801)。含有编码h409A-I 1重链的DNA的质粒于2008年6月9日保藏，并鉴定为081469_SPD-H，含有编码h409AI 1轻链的DNA的质粒于2008年6月9日保藏，并鉴定为0801470_SPD-L-I 1。
其他已知的PD-1抗体和其他PD-1抑制剂包括AMP-224(GSK许可的B7-DC/IgG1融合蛋白)，WO2012/145493中描述的AMP-514，WO2011/066389和US2013/034559中描述的抗体MEDI-4736(由阿斯利康/医学免疫公司开发的抗PD-L-1)，WO2010/077634中描述的抗体YW243.55.S70(抗PD-L1)，MDX-1105，也称为BMS-936559，是WO2007/005874中描述的由百时美施贵宝开发的抗PD-L1抗体，以及WO2006/121168、WO2009/014708、WO2009/114335和WO2013/019906中描述的抗体和抑制剂。本文提及的任何文件的公开内容均通过引用合并到本文中。WO2015/085847中公开了抗PD1抗体的其他例子，例如分别具有SEQ ID NO：6、SEQID NO：7和SEQ ID NO：8的轻链可变域CDR1、2和3，以及分别具有SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的重链可变域CDR1、2和3的抗体，其中SEQ ID NO引用是根据WO2015/085847的编号。
抗CTLA-4抗体
CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)，也称为CD152，是CD28受体家族的另一抑制剂成员，并在T细胞上表达。结合并抑制CTLA-4的抗体是本领域已知的。
在一个例子中，抗体是易普利姆玛(商品名伊匹单抗百时美施贵宝)，人IgG抗体。
这些免疫检查点抑制剂中的每一种，尤其是针对PD1、PD-L1或2或针对CTLA-4或天然结合配偶体或配体的这些抗体中的每一种，可以与表1中公开的单克隆抗体之一组合或一起使用，特别是与HUM01、HUM02、HUM03、HUM04、HUM05、HUM06、HUM07、HUM08、HUM09和/或HUM10之一组合或一起使用。在一种实施方式中，与HUM03组合或与HUM03一起使用。
本发明的定义和进一步的实施方式、变体和替代物：
如本文所用，“与参考序列至少85％相同”的序列是在其整个长度上与参考序列的整个长度具有85％或更多，特别是90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％的序列同一性的序列。
可以通过比较在比较窗口上最佳比对的两个序列来确定“序列同一性”的百分比，其中为了两个序列的最佳比对，比较窗口中的多肽序列的部分可以包含与参考序列(其不包括添加或缺失)相比的添加或缺失(即缺口)。通过确定两个序列中相同氨基酸残基出现的位置数来计算百分比，以产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数并将结果乘以100，得到序列同一性的百分比。用于比较的序列的最佳比对通过全局成对比对进行，例如，使用Needleman和Wunsch的算法(1970)分子生物学48：443。使用BLOSUM62矩阵的程序Needle，以及以下参数空位-开放(gap-open)＝10，空位-延长(gap-extend)＝0.5，可以容易地确定序列同一性的百分比。
在本发明的上下文中，“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链基团的另一氨基酸残基取代的氨基酸残基。通常，保守氨基酸取代不会显著改变蛋白质的功能特性。具有相似化学性质的侧链的氨基酸组的例子包括1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；7)含硫侧链：半胱氨酸和蛋氨酸。保守氨基酸取代基是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸-色氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
在整个本申请中，术语“包括”应被解释为包含所有具体提到的特征以及可选的、附加的、未指定的特征。如本文所用，术语“包含”的使用还公开了其中不存在除特别提及的特征之外的特征(即“由......组成”)的实施方式。
“抗体”可以是天然或常规抗体，其中两条重链通过二硫键彼此连接，并且每条重链通过二硫键与轻链连接。有两种类型的轻链，λ(λ)和κ(κ)。有五种主要的重链类别(或同种型)决定了抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每条链含有不同的序列域。轻链包括两个域或区，可变域(VL)和恒定域(CL)。重链包括四个域，可变域(VH)和三个恒定域(CH1，CH2和CH3，统称为CH)。轻链(VL)和重链(VH)的可变区决定了对抗原的结合识别和特异性。轻链(CL)和重链(CH)的恒定区域赋予重要的生物学特性，例如抗体链结合、分泌、转位移动、补体结合和与Fc受体(FcR)的结合。Fv片段是免疫球蛋白的Fab片段的N-末端部分，其由一条轻链和一条重链的可变部分组成。抗体的特异性在于抗体结合位点和抗原决定簇之间的结构互补性。抗体结合位点由主要来自高变或互补决定区(CDR)的残基组成。偶尔的，来自非高变区或构架区(FR)的残基影响整个域结构，并因此影响结合位点。
“互补决定区”或“CDR”是指一起定义天然免疫球蛋白结合位点的天然FV区的结合亲和力和特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各自具有三个CDR，分别命名为CDR1-L、CDR2-L、CDR3-L，和CDR1-H、CDR2-H、CDR3-H。因此，常规抗体抗原结合位点包括六个CDR，其包含来自重链和轻链V区中的每一个的CDR组。
“构架区”(FR)是指插入在CDR之间的氨基酸序列，即指在单一物种中不同免疫球蛋白中相对保守的免疫球蛋白轻链和重链可变区的那些部分。免疫球蛋白的轻链和重链各自具有四个FR，分别命名为FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。
如本文所用，“人构架区”是与天然存在的人抗体的构架区基本相同(约85％，或更多，特别是90％，95％，97％，99％或100％)的构架区。
在本发明的上下文中，免疫球蛋白轻链或重链中的CDR/FR定义基于IMGT定义来确定(Lefranc等(2003)发展与比较免疫学27(1)：55-77；www.imgt.org)。
如本文所用，术语“抗体”表示常规抗体及其片段，以及单域抗体及其片段，特别是单域抗体的可变重链，以及嵌合、人源化、双特异性或多特异性抗体。
如本文所用，抗体或免疫球蛋白还包括最近描述的“单域抗体”，其是其互补决定区是单域多肽的一部分的抗体。单域抗体的例子包括重链抗体、天然缺乏轻链的抗体、衍生自常规四链抗体的单域抗体、工程化单域抗体。单域抗体可以衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、山羊、兔和牛。单域抗体可以是天然存在的单域抗体，称为缺乏轻链的重链抗体。特别地，骆驼科物种，例如骆驼、单峰骆驼、美洲驼、羊驼和驼马，产生天然缺乏轻链的重链抗体。骆驼科动物重链抗体也缺乏CH1域。
这些缺乏轻链的单域抗体的可变重链在本领域中称为“VHH”或“纳米抗体 (nanobody)”。与常规VH域类似，VHH含有四个FR和三个CDR。纳米抗体优于常规抗体：它们比IgG分子小约10倍，因此可以通过体外表达产生适当折叠的功能性纳米抗体，同时实现高产率。此外，纳米抗体非常稳定，并且对蛋白酶的作用具有抗性。纳米抗体的性质和产生已在Harmsen和De Haard(2007)微生物生物技术的应用，77：13-22中所报道。
如本文所用的术语“单克隆抗体”或“mAb”是指针对特定抗原的单个氨基酸组成的抗体分子，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。单克隆抗体可以由B细胞或杂交瘤的单个克隆产生，但也可以是重组的，即通过蛋白质工程产生。
(常规)抗体的“片段”包含完整抗体的一部分，特别是完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fv、Fab、F(ab′)2、Fab′、dsFv、(dsFv)2、scFv、sc(Fv)2、双抗体、由抗体片段形成的双特异性和多特异性抗体。常规抗体的片段也可以是单域抗体，例如重链抗体或VHH。
术语“Fab”表示具有约50,000Da的分子量和抗原结合活性的抗体片段，其中通过用蛋白酶，木瓜蛋白酶处理IgG获得的片段中H链的N末端侧的约一半和整个L链通过二硫键结合在一起。
术语“F(ab′)2”是指具有约100,000Da的分子量和抗原结合活性的抗体片段，其略大于通过用蛋白酶，胃蛋白酶处理IgG获得的片段中通过铰链区的二硫键结合的Fab。
单链Fv(“scFv”)多肽是共价连接的VH：：VL异二聚体，其通常由包括通过肽编码接头连接的VH和VL编码基因的基因融合体表达。本发明的人scFv片段包括以适当构象保持的CDR，特别是通过使用基因重组技术。二价和多价抗体片段可以通过单价scFv的结合自发形成，或者可以通过肽接头偶联单价scFv产生，例如二价sc(Fv)2。
“dsFv”是通过二硫键稳定的VH：：VL异二聚体。
“(dsFv)2 ”表示通过肽接头偶联的两个dsFv。
术语“双特异性抗体”或“BsAb”表示在单个分子内组合两种抗体的抗原结合位点的抗体。因此，BsAb能够同时结合两种不同的抗原。已经越来越多地使用基因工程来设计、修饰和产生具有所需的一组结合特性和效应子功能的抗体或抗体衍生物，例如EP2050764A1中所述。
术语“多特异性抗体”表示在单个分子内组合两种或更多种抗体的抗原结合位点的抗体。
术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含与同一多肽链(VH-VL)中的轻链可变域(VL)连接的重链可变域(VH)。通过使用太短而不允许同一链上的两个域之间配对的接头，该域被迫与另一条链的互补域配对并产生两个抗原结合位点。
在一个具体实施例中，表位结合片段选自由Fv、Fab、F(ab′)2、Fab′、dsFv、(dsFv)2、scFv、sc(Fv)2、双抗体和VHH组成的组。
如本文所用，“嵌合抗体”是其中恒定区或其部分被改变、置换或交换的抗体，使得可变区与不同物种的恒定区连接，或属于另一抗体类或亚类。“嵌合抗体”还指其中可变区或其部分被改变、置换或交换的抗体，使得恒定区与不同物种的可变区连接，或属于另一抗体类或亚类。
术语“人源化抗体”是指最初完全或部分源自非人源并且已被修饰以替换某些氨基酸的抗体，特别是在重链和轻链的构架区中，以避免或最小化人体的免疫应答。人源化抗体的恒定域大多数时间是人CH和CL域。在一种实施方式中，人源化抗体具有人源的恒定域。如本文所用，术语“人源化抗体”是指嵌合抗体，其含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列，例如CDR。
术语“抗体”用于包括所有这些种类的抗体、片段或其组合。
人源化的目标是降低异种抗体(例如鼠抗体)的免疫原性以引入人体，同时保持抗体的完整抗原结合亲和力和特异性。人源化抗体或适于其他哺乳动物不排斥的抗体可以使用几种技术产生，例如表面重修和CDR移植。如本文所用，表面重修技术使用分子建模、统计分析和诱变的组合来改变抗体可变区的非CDR表面以类似于靶宿主的已知抗体的表面。
可以使用多种其他技术将抗体人源化，包括CDR-移植(EP0239400；WO91/09967；美国专利第5，530，101和5，585，089号)，饰面或表面重修(EP0592106；EP0519596；Padlan(1991)分子免疫学28(4/5)：489-498；Studnicka等(1994)蛋白质工程7(6)：805-814；Roguska等(1994)美利坚合众国国家科学院院刊91：969-973)和链改组(美国专利第5,565,332号)。人抗体可通过本领域已知的多种方法制备，包括噬菌体展示方法。可参见美国专利第4,444,887、4,716,111、5,545,806和5,814,318号；和国际专利申请WO98/46645、WO98/50433、WO98/24893、WO98/16654、WO96/34096、WO96/33735和WO91/10741。
在本发明的上下文中，如本文所用，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”意指逆转、减轻、抑制该术语所适用的疾病或病症的一个或多个症状的进展，或预防该术语所适用的疾病或病症。
本文所用的术语“治疗癌症”特别是指抑制肿瘤恶性细胞的生长和/或来自所述肿瘤的转移的进展。这种治疗还可以导致肿瘤生长的消退，即可测量肿瘤的尺寸减小。在一个具体实施方式中，这种治疗导致肿瘤或转移的部分消退。在另一个具体实施方式中，这种治疗导致肿瘤或转移的完全消退。在一些方面，治疗预防转移。
根据本发明，术语“患者”或“有此需要的患者”是指遭受或可能遭受恶性肿瘤影响的人或非人哺乳动物。
“治疗有效量”是指以适用于任何医学治疗的合理的受益/风险比足以治疗所述癌症疾病的活性剂的量。然而，应该理解的是，活性剂的总日常使用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。任何特定患者的特定治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的疾病和病症的严重程度；所用特定多肽或抗体的活性；所用的具体成分、患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；给药时间、给药途径和所用特定活性剂的排泄率；治疗的持续时间；与所用特定活性剂组合或巧合使用的药物；以及医学领域众所周知的因素。
“药学上”或“药学上可接受的”是指当适当地施用于哺乳动物，尤其是人时，不产生不利、过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。药学上可接受的载体或赋形剂是指无毒的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或任何类型的制剂助剂。
药物组合物：
包含本发明的多肽或抗体的药物组合物的形式和给药途径自然取决于待治疗的病症、疾病的严重程度、患者的年龄、体重和性别等。
本发明的活性剂可以配制用于局部、口服、肠胃外、鼻内、静脉内、肌肉内、皮下或眼内给药等。在一个具体实施方式中，静脉内给药本发明的活性剂。
特别地，包含本发明的活性剂的药物组合物可以含有对于能够注射的制剂是药学上可接受的载体。这些可以特别是等渗的、无菌的、盐水溶液(磷酸二氢钠或磷酸二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或这些盐的混合物)，或干燥的、特别是冷冻干燥的组合物，其在添加时取决于在无菌水或生理盐水的情况下，允许构成可注射溶液。
为了制备药物组合物，可以将有效量的本发明的活性剂溶解或分散在药学上可接受的载体或水性介质中。
适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，该形式必须是无菌的并且必须是在一定程度上流动的，以便存在易于注射的能力。它必须在制造和储存条件下稳定，并且必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。
载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，通过使用涂层如卵磷脂，通过在分散的情况下保持所需的粒度并通过使用表面活性剂、稳定剂、冷冻保护剂或抗氧化剂，可以保持适当的流动性。可以通过抗细菌和抗真菌剂来防止微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。
通过将所需量的活性剂掺入适当的溶剂中，根据需要加入上面列举的几种其它成分，然后过滤灭菌，制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌载体中来制备分散体，该无菌载体含有基础分散介质和所需的来自上面列举的那些其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从先前无菌过滤的溶液中得到活性成分和任何其他所需成分的粉末。
在配制时，溶液将以与剂量配方相容的方式并以治疗有效量给药。制剂易于以多种剂型给药，例如上述可注射溶液的类型，但也可使用药物释放胶囊等。
例如，对于在水溶液中的肠胃外给药，如果需要，溶液应适当缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适用于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内给药。就此而言，根据本发明内容，可以使用的无菌含水介质对于本领域技术人员而言是已知的。例如，可以将一个剂量溶解在1mL等渗NaCl溶液中，并且将其添加到1000mL的皮下注射液中或者在建议的输注部位注射(参见例如，“雷明顿药学科学(Remington′sPharmaceutical Sciences)”第15版，1035-1038页和1570至1580页)。取决于所治疗的受试者的状况，剂量的一些变化必然发生。在任何情况下，负责给药的人员将确定个体受试者的适当剂量。
药物管理和使用方法：
如本文所用，“同时”用于表示两种药剂同时给药，而术语“组合”用于表示如果不同时给药，则在它们都可用的时间范围内“依次”给药，以在同一时间范围内发挥治疗作用。因此，“依次”给药可以允许一种药剂在另一种药剂后5分钟、10分钟或数小时内给药，条件是第一种给药药剂的循环半衰期使得它们同时以治疗有效量存在。组分给药之间的时间延迟将根据组分的确切性质、它们之间的相互作用以及它们各自的半衰期而变化。
与“组合”或“依次”相反，“单独”在本文中用于表示在给药一种药剂与另一种药剂之间的间隔是显著的，即几小时，并且这可能包括当第二种药剂给药时，第一种给药的药剂不再以治疗有效量存在于血流中的情况。
在本发明的一种实施方式中，NTN1中和剂或抗导蛋白-1抗体在免疫检查点抑制剂之前依次或单独给药。
在特别优选的实施例中，免疫检查点抑制剂在NTN1中和剂或抗导蛋白-1抗体之前依次或单独给药。
在一种实施方式中，本文提供的NTN1中和剂或抗导蛋白-1抗体和免疫检查点抑制剂两者均与药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂在相同的组合物中。
在另一种实施方式中，它们以单独的药物形式或试剂盒呈现。这形成包含NTN1中和剂或抗导蛋白-1抗体和免疫检查点抑制剂的组合物或组或试剂盒，用于同时、分别或依次给药于患者。因此，本发明可以包括(i)包含两种活性成分作为混合物的组合物，或(ii)包含在相同条件下或在单独条件下保持分开的那些活性成分的组合物，并且通常参考(ii)情况下的试剂盒概念。
在一个治疗方法的实施方式中，使用的组合物是依次或单独给药的。两次给药之间的间隔可以是至少5、10、15、20或24小时，优选24至96小时，更优选24至72小时，或更长，特别是24至48小时，例如24小时。在一种实施方式中，在给药其他药剂或药物的第二天简单地给药一种药剂或药物。
不同的药物形式可以以足够的量用于本发明的治疗方法中。
本发明没有或可能不意味着改变免疫检查点抑制剂的剂量方案。然而，与NTN1中和剂或抗导蛋白-1抗体发生的协同作用可允许在患者中使用较低剂量的免疫检查点抑制剂方案。技术人员能够在本发明提供的组合治疗的背景下确定最佳剂量方案。
药物组合物可以以合适的剂量施用于受试者，即对于NTN1中和剂或抗导蛋白-1抗体，至少1mg/kg体重，例如约1mg/kg体重至约100mg/kg体重，特别是约10mg/kg体重至约60mg/kg体重的待治疗癌症的受试者。免疫检查点抑制剂可以按通常剂量给药，或者相对于通常剂量以减少的剂量给药，只要该组合具有协同功效。例如，免疫检查点抑制剂的剂量减少10％、20％、30％、40％、50％或更多。
如本文所用，术语“协同”是指活性组分(例如抗体)，当组合使用时产生比加入两种组分的单独效果所预期的更大的效果。有利地，协同相互作用可以允许向患者给药较低剂量的每种组分，从而降低化学疗法的毒性，同时产生和/或维持相同的治疗效果。因此，在特别优选的实施例中，每种组分可以以亚治疗量给药。
表2：序列描述：
在适当的情况下，IMGT下的CDR在表1中以粗体突出显示。
现在将参考附图使用非限制性实施例来描述本发明。
图1：用EMT-6乳腺细胞系移植小鼠并用抗导蛋白-1干扰药物(HUM03)；用对照抗体(NP006)；用HUM03+抗CTLA4或NP006+抗CTLA4(n＝12只动物/组)处理。在植入28天后，从外部测量肿瘤体积并定量肿瘤体积的总回归。该表显示28天后无肿瘤的小鼠数。
图2：与图1相同，但该图显示了在植入EMT-6乳腺肿瘤后长达80天的Kaplan-Mayer分析后定量的小鼠存活率百分比(P＝0.046)。
图3：与图1和2中相同的实验，但显示了每只动物的肿瘤生长。处理动物用表示。
图4：与图1-2-3相同类型的实验，但小鼠用4T1乳腺癌细胞系移植并用HUM03+抗PD-1或NP001+抗PD-1(n＝7只动物/组)处理。在第25天通过Kaplan-Mayer分析定量小鼠存活率(P＝0.0411)。
图5：HUM03与抗CTLA4的组合调节同源EMT6异种移植小鼠模型中的肿瘤T细胞效应子/Treg平衡。将106个EMT6细胞皮下移植到BalbCJ 8周龄雌性小鼠的侧腹中。通过HUM03(10mg/Kg I.P.)或NP001 IgG1对照同种型、单独或与抗CTLA4(BioX细胞克隆9H10-20mg/KgI.P.)组合，将动物随机分成4组处理3次(例如在第10，14，18天)。将EMT6肿瘤单独解离并通过流式细胞术用彻底的淋巴和骨髓染色板分析。在这里，我们专注于CD8 T细胞效应子(左)、CD4；FoxP3 TReg(中)和它们(右)之间的平衡。如右图所示，在HUM03/CTLA4 mAb组合中，平衡T细胞效应子/T调节剂向T细胞效应子移动。
实施例1：
材料和方法
细胞系：
小鼠乳腺癌EMT6(CRL2755TM-LGC标准-法国)细胞在补充有10％胎牛血清和抗生素(链霉素和青霉素)的伊格尔氏(Eagle)最低必需培养液中培养。
将小家鼠(Mus Musculus)乳腺4T1(CRL2539TM-LGC标准-法国)细胞在杜尔贝科(Dulbecco)改良伊格尔氏培养基(DMEM)、10％FBS中培养。
小鼠实验：
将小鼠维持在无特定病原体的动物设施中，并按照动物护理和使用委员会批准的机构指南和方案进行处理(莱昂贝拉德中心联合评估委员会、ENS过境动物、PBES和P4实验室；CECCAP)。
将5.105或10.105EMT6细胞皮下移植到BalbC/J 8周雌性小鼠的侧腹中。在第7、11和14天，通过400μg/注射抗CTLA4(BioX细胞USA-克隆9H10-)处理所有动物3次。将动物随机分成4组，分别用HUM03、NP006 IgG1对照同种型(Netris Pharma，法国)、HUM03+抗CTLA4和NP001+抗CTLA-4处理。NP006和HUM03抗体以10mg/Kg每周腹膜内给药两次。通过外部卡尺每周测量肿瘤两次。移植后29天测定肿瘤进展。当肿瘤达到2000mm3的体积时，处死小鼠并确定存活率。
将5.1054T1细胞皮下移植到BalbC/J 7周龄雌性小鼠的侧腹。在相应组(BioX细胞USA-克隆RMP1-14)中通过100μg/注射抗PD1抗体处理动物两周。将动物随机分成3组，分别用PBS、HUM03+抗PD1和NP001(Netris Pharma，法国)+抗PD1处理。通过外部卡尺每周测量肿瘤三次。当肿瘤达到1500mm3的体积时，处死小鼠并确定存活率。
统计：
使用GraphPad软件进行统计学，学生T检验是双侧的，并且P值小于0.05被认为是统计学显著的。
通过GraphPad软件上的Kaplan-Meier方法得到存活曲线。用Mantel-Cox检验分析数据。n表示重复次数。所有统计学检验均为双侧，P值小于0.05被认为统计学显著的。
结果/讨论
1)将HUM03和CTLA4 mAb组合延迟肿瘤复发并增加小鼠EMT6乳腺癌模型的存活率。
为了测试抗导蛋白-1mAb和抗CTLA4的组合，将乳腺EMT-6癌细胞移植到BalbC/J小鼠中。
如图1-3所示，将HUM03与免疫检查点抑制剂CTLA4组合可大大增强单独用CTLA4观察到的抗肿瘤响应。在处理的第28天，没有肿瘤的小鼠的数量分别从单独的HUM03组中的0/12和单独的CTLA4组中的2/12移动到组合处理中的8/12(图1)。
在80天Kaplan Mayer分析后，小鼠的存活率也进行了定量(p＝0.046)，结果显示该组合显著提高了小鼠的存活率(图2)，这似乎与组合治疗对疾病控制时间的延长有关(图3)。为了分析组合的这种增加的活性是否限于CTLA4或可以扩展到其他免疫检查点抑制剂，我们接下来分析了组合HUM03与PD-1的作用。
2)将HUM03和PD-1mAb组合增加小鼠4T1乳腺癌模型的存活率。
为了测试抗导蛋白-1mAb和抗PD1的组合，将乳腺4T1癌细胞移植到BalbC/J小鼠中。如图4所示，在移植后20天Kaplan Mayer分析后定量小鼠存活率(p＝0.0411)(图4)。与用CTLA4观察到的相似，PD-1/HUM03的组合比单独的PD-1更有效。实际上，虽然单独使用单一疗法PD1 mAb与不增加存活率相关(在第20天7只小鼠中有4只存活，与对照处理组中观察到的相似)，但将HUM03与PD1结合使小鼠存活率增加至100％(在第20天7只小鼠中有7只存活)。
这些数据共同支持将HUM03与目前的免疫治疗性治疗相结合提高了它们的疗效的观点。在寻找可以解释免疫检查点抑制剂在导蛋白-1干扰存在下的这种增强作用的机制时，我们分析了响应单一疗法或组合治疗的肿瘤免疫浸润。
3)将HUM03和CTLA4 mAb组合有利于EMT6乳腺癌模型中的肿瘤T细胞效应子/T调节因子比率。
为了分析抗导蛋白-1mAb和抗CTLA4的组合在肿瘤免疫浸润中的作用，如上所述，将乳腺EMT-6癌细胞移植到BalbC/J小鼠中并且分别用单独的HUM03、单独的CTLA4或HUM03+CTLA4 mAb的组合处理(与对照同种型NP001相比)。解离肿瘤并通过流式细胞术分析淋巴细胞含量。如图5所示，虽然单一疗法(HUM03或CTLA4)不显著影响T细胞效应子/T细胞调节因子的比例，但该组合正在将该比率转向T细胞效应子。这通过暗示该组合增强杀伤性淋巴细胞(T细胞效应子)的存在来支持增加的功效。
实施例2：
将5.105E0771细胞皮下移植到C57b6J 8周龄雌性小鼠的侧腹中。移植后6天，将动物随机分成4组，单独用NP137或NP001 IgG1对照同种型或与抗PD-1抗体组合处理。所有动物每周两次通过IP途径用20mg/Kg的抗CTLA4(BioX细胞-克隆9H10)和/或10mg/Kg的NP抗体处理。通过外部卡尺每周测量肿瘤体积两次。当肿瘤达到2000mm3的体积时，处死小鼠。
将5.105MC38细胞皮下移植到C57b6J 8周龄雌性小鼠的侧腹中。移植后6天，将动物随机分成4组，单独用NP137或NP001 IgG1对照同种型或与抗PD-1抗体组合处理。所有动物每周两次通过IP途径用5mg/Kg的抗PD1(BioX细胞-克隆RMP1-14)和/或10mg/Kg的NP抗体处理。通过外部卡尺每周测量肿瘤体积两次。当肿瘤达到2000mm3的体积时，处死小鼠。
将5.1060016eM3细胞皮下移植到C57b6J 8周龄雌性小鼠的侧腹中。移植后6天，将动物随机分成4组，单独用NP137或NP001IgG1对照同种型或与抗PD-1抗体组合处理。所有动物每周两次通过IP途径用5mg/Kg的抗PD1(BioX细胞-克隆RMP1-14)和/或10mg/Kg的NP抗体处理。通过外部卡尺每周测量肿瘤体积两次。当肿瘤达到2000mm3的体积时，处死小鼠。
EMT-6和4T1细胞(参见实施例1)也用于类似条件。
下表显示了NP137和抗PD1抗体组合产生的增强作用或协同作用。

Claims (29)

1.一种用于癌症治疗方法中的药物组合物，所述药物组合物包含抗导蛋白-1抗体和免疫检查点抑制剂，其中，所述抗导蛋白-1抗体能够破坏或阻碍导蛋白-1/导蛋白-1受体相互作用或导蛋白-1介导的受体二聚化。
2.根据权利要求1所述的用途的组合物，其中，待治疗的所述癌症是具有导蛋白-1表达且可能对单独的免疫检查点抑制剂没有响应的癌症。
3.根据权利要求1或2所述的用途的组合物，其中，所述免疫检查点抑制剂选自由抗PD1、抗PD-L1、抗PD-L2和抗CTLA-4抗体。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途的组合物，用于同时、分别或依次将抗导蛋白-1抗体和免疫检查点抑制剂施用于患者。
5.一种药物组合物，所述药物组合物包含抗导蛋白-1抗体和免疫检查点抑制剂，其中，所述抗导蛋白-1抗体特异性结合氨基酸序列SEQ ID NO：35的多肽，并且能够破坏或阻碍导蛋白-1/导蛋白-1受体相互作用或导蛋白-1介导的受体二聚化。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述抗导蛋白-1抗体包含(i)序列SEQ ID NO：5的CDR1-H、序列SEQ ID NO：6的CDR2-H、序列SEQ ID NO：7的CDR3-H，和序列SEQ ID NO：8的CDR1-L、序列YAS的CDR2-L和序列SEQ ID NO：9的CDR3-L，或(ii)序列SEQ ID NO：28的CDR1-H、序列SEQ ID NO：29的CDR2-H、序列SEQ ID NO：30的CDR3-H，和序列SEQ ID NO：31的CDR1-L、序列SEQ ID NO：32的CDR2-L和序列SEQ ID NO：9的CDR3-L。
7.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述抗导蛋白-1抗体包含氨基酸序列SEQ IDNO：10、11、12或13。
8.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述抗导蛋白-1抗体包含序列SEQ ID NO：10和11两者，或序列SEQ ID NO：12和13两者。
9.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述抗导蛋白-1抗体包含选自SEQ ID NO：14至19的组中的氨基酸序列。
10.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述抗导蛋白-1抗体包含选自SEQ ID NO：20至27的组中的氨基酸序列。
11.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述抗导蛋白-1抗体包含选自SEQ ID NO：14至19的组中的氨基酸序列和选自SEQ ID NO：20至27的组中的氨基酸序列。
12.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述抗导蛋白-1抗体选自由包含VH和VL氨基酸序列对SEQ ID NO：20和14、SEQ ID NO：21和15、SEQ ID NO：22和16、SEQ ID NO：23和17、SEQ ID NO：24和17、SEQ ID NO：25和16、SEQ ID NO：26和17、SEQ ID NO：22和17、SEQ IDNO：25和18、SEQ ID NO：21和16，或SEQ ID NO：27和19的抗导蛋白-1抗体组成的组。
13.根据权利要求5至12中任一项所述的组合物，其中，所述免疫检查点抑制剂选自由抗PD1、抗PD-L1、抗PD-L2和抗CTLA-4抗体组成的组。
14.根据权利要求5至13中任一项所述的组合物，其中，所述抗导蛋白-1抗体和所述免疫检查点抑制剂是分开的，用于同时、分别或依次将抗导蛋白-1抗体和免疫检查点抑制剂施用于患者。
15.根据权利要求5至13中任一项所述的组合物，用作为药物。
16.根据权利要求5至13中任一项所述的组合物，用于治疗癌症的方法中。
17.根据权利要求16所述的用途的组合物，用于同时、分别或依次将抗导蛋白-1抗体和免疫检查点抑制剂施用于患者。
18.一种药物组合物，所述药物组合物包含抗导蛋白-1抗体和免疫检查点抑制剂，其中，所述抗导蛋白-1抗体包含(i)序列SEQ ID NO：5的CDR1-H、序列SEQ ID NO：6的CDR2-H、序列SEQ ID NO：7的CDR3-H，和序列SEQ ID NO：8的CDR1-L、序列YAS的CDR2-L和序列SEQ IDNO：9的CDR3-L，或(ii)序列SEQ ID NO：28的CDR1-H、序列SEQ ID NO：29的CDR2-H、序列SEQID NO：30的CDR3-H，和序列SEQ ID NO：31的CDR1-L、序列SEQ ID NO：32的CDR2-L和序列SEQID NO：9的CDR3-L。
19.一种药物组合物，所述药物组合物包含抗导蛋白-1抗体和免疫检查点抑制剂，其中，所述抗导蛋白-1抗体能够破坏或阻碍导蛋白-1/导蛋白-1受体相互作用或导蛋白-1介导的受体二聚化，所述免疫检查点抑制剂选自由抗PD1、抗PD-L1、抗PD-L2和抗CTLA-4抗体组成的组。
20.抗癌治疗方法，包括向有需要的患者施用有效量的抗导蛋白-1抗体和免疫检查点抑制剂，其中所述抗导蛋白-1抗体能够破坏或阻碍导蛋白-1/导蛋白-1受体相互作用或导蛋白-1介导的受体二聚化。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述抗导蛋白-1抗体特异性结合氨基酸序列SEQ ID NO：35的多肽。
22.根据权利要求20所述的方法，其中，所述抗导蛋白-1抗体包含(i)序列SEQ ID NO：5的CDR1-H、序列SEQ ID NO：6的CDR2-H、序列SEQ ID NO：7的CDR3-H，和序列SEQ ID NO：8的CDR1-L、序列YAS的CDR2-L和序列SEQ ID NO：9的CDR3-L，或(ii)序列SEQ ID NO：28的CDR1-H、序列SEQ ID NO：29的CDR2-H、序列SEQ ID NO：30的CDR3-H，和序列SEQ ID NO：31的CDR1-L、序列SEQ ID NO：32的CDR2-L和序列SEQ ID NO：9的CDR3-L。
23.根据权利要求20所述的方法，其中，所述抗导蛋白-1抗体包含氨基酸序列SEQ IDNO：10、11、12或13。
24.根据权利要求20所述的方法，其中，所述抗导蛋白-1抗体包含序列SEQ ID NO：10和11两者，或序列SEQ ID NO：12和13两者。
25.根据权利要求20所述的方法，其中，所述抗导蛋白-1抗体包含选自SEQ ID NO：14至19的组中的氨基酸序列。
26.根据权利要求20所述的方法，其中，所述抗导蛋白-1抗体包含选自SEQ ID NO：20至27的组中的氨基酸序列。
27.根据权利要求20所述的方法，其中，所述抗导蛋白-1抗体包含选自SEQ ID NO：14至19的组中的氨基酸序列和选自SEQ ID NO：20至27的组中的氨基酸序列。
28.根据权利要求20所述的方法，其中，所述抗导蛋白-1抗体选自由包含VH和VL氨基酸序列对SEQ ID NO：20和14、SEQ ID NO：21和15、SEQ ID NO：22和16、SEQ ID NO：23和17、SEQID NO：24和17、SEQ ID NO：25和16、SEQ ID NO：26和17、SEQ ID NO：22和17、SEQ ID NO：25和18、SEQ ID NO：21和16，或SEQ ID NO：27和19的抗导蛋白-1抗体组成的组。
29.根据权利要求20所述的方法，其中，所述免疫检查点抑制剂选自由抗PD1、抗PD-L1、抗PD-L2和抗CTLA-4抗体组成的组。
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