KR20240041326A - 네트린-1 검출, 동반 테스트 및 방사선 기반 요법 - Google Patents
네트린-1 검출, 동반 테스트 및 방사선 기반 요법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 네트린-1이 암 세포의 세포 주변부에 있는 세포 기질에서 더 끈적한 방식으로 유지되는 반면, 네트린-1은 일부 종양에서 특이적으로 성인에서 발현된다는 발견에 기초한다. 또한 본원에서 네트린-1은 종양 형성 동안 매우 초기에 발현되는 것을 나타낸다. 이로 인해 네트린-1은 영상화 및/또는 표적 치료를 위한 예상치 못한 매우 특이적인 표적이 된다. 따라서, 본 발명은 항-네트린-1 항체, 특히 NP137, 선택적으로 방사성 동위원소와 회합된 킬레이트 모이어티를 포함하는 화합물 및 이들의 영상화, 진단, 특히 동반 진단, 또는 표적 치료에서의 이들의 용도에 관한 것이다. 동반 테스트일 수 있는 새로운 진단 테스트와 동반 테스트에 결합될 수 있는 새로운 암 요법도 제안된다.
Description
본 발명은 종양에서 네트린-1(Netrin-1)을 검출하고 위치를 찾거나 시각화하는 방법 및 시약뿐만 아니라 네트린-1의 존재에 기초하여 암을 치료하는 방법 및 제제에 관한 것이다. 본 발명은 특히 동반 테스트(companion test)일 수 있는 새로운 진단 테스트, 및 동반 테스트와 조합될 수 있는 새로운 암 요법에 관한 것이다.
현재 각 유형의 암을 치료하는 데 사용되는 방법은 수술, 방사선요법, 화학요법, 표적 요법 및 면역요법을 포함하여 여러 가지가 있다. 성공적인 암 요법은 원발성 종양과 임상적으로 명백하거나 미세한 모든 전이를 대상으로 한다.
환자는 가능한 한 초기에 암의 존재를 확인하고 가능하게는 암을 국소화하여 치료할 암의 유형을 결정하는 것이 중요하다. 초기 단계에 진단된 암은 성공적으로 치료될 가능성이 더 높다. 암이 퍼지면 효과적인 치료가 더 어려워지고 일반적으로 생존 가능성은 훨씬 낮아진다. 따라서, 공격적인 암의 확산을 예방하기 위해 강력하고 공격적인 치료 프로토콜을 즉시 사용해야 할 때를 아는 것이 중요한다.
또한, 치료 프로토콜이 매우 성공적이더라도 일부 부위에 종양 세포 또는 줄기 종양 세포가 남을 수 있다. 이러한 세포를 확인하고 국소화하는 것도 중요하다
환자가 항암 표적 요법을 제안할 수 있는 것도 관심사일 수 있다. 그러나, 표적 요법의 경우, 암의 생체내 검출 및 국소화, 및 암의 일부 분자적 시그니처 결정을 가능하게 하는 시약이 실제로 필요하므로, 적절한 표적 요법이 가능한 한 가장 초기 단계에서 제공되거나 상기 치료를 받을 자격이 있는 암을 가진 환자에게만 보완적 프로토콜로 제공될 수 있다.
네트린-1은 유기체의 발달, 특히 중추 신경계의 확립에 중요한 역할을 한다. 따라서, 이는 연합 뉴런에 대한 매력적인 역할을 가지고 있다. 네트린-1은 신경 발달에서 수년 동안 확산 가능한 등급의 분비 분자로 설명되어 왔다. 신호전달 경로는 DCC(Deleted in Colorectal Carcinoma), UNC-5(Uncoordinated-5) 계열 및 네오제닌(Neogenin)으로 불리는 수용체에 의해 변환된다. 모든 분자 경로는 네트린-1이 다면 발현 수의 질환 또는 신호전달 메커니즘에 작용하는 것으로 설명된다는 것을 의미한다.
네트린-1은 또한 유방암, NSCLC, 수모세포종과 같은 많은 유형의 암에서 상향 조절되는 것으로 나타났다. 종양 세포에 의한 이러한 과발현은 DCC 및 Unc-5 계열의 의존성 수용체 활성에 의해 유도된 세포 사멸을 차단하는 분자 메커니즘으로 작용하는 것으로 제안되었다. 이들 수용체는 종양 억제 유전자로 작용하며 리간드가 없을 때 세포 사멸을 유발한다. 이러한 보호 메커니즘에 대응하기 위해, 종양 세포는 네트린-1 발현을 활성화하여 이 단백질의 과발현을 유도하여, 예를 들어, 화학요법 후 세포 사멸을 억제한다. 따라서, 이러한 분자 메커니즘을 재활성화하는 것은 종양학에서 치료 표적으로 나타난다. 그 결과, 네트린-1을 차단하고 네트린-1과 암세포 표면 상의 수용체 사이의 상호작용을 보다 정확하게 억제하기 위한 치료 전략이 개발되었다. NP137(인간화 단일클론 항체)이라고 불리고 Unc5-B/네트린-1 상호작용을 차단할 수 있는 인간 IgG1을 평가하기 위한 I-II상 임상 시험이 시작되었다. 중간 결과는 단일 제제로서 임상 활동에 대한 고무적인 징후를 보여준다. 따라서, 네트린-1 차단은 일부 환자에서 효과적인 것으로 보이지만 승인된 단순 동반 테스트를 사용하여 환자의 이점을 예측하는 것은 부족하며 모든 생검 기반 테스트에는 침습적 조직 수집의 오류 및 한계가 있다.
J. Wischhusen 등(Theranostics 2018; 8(18) : 5126-5142)는 네트린-1이 네트린-1 양성 유방 종양에서 내피 CD31과 동시 국소화함을 개시한다. 네트린-1은 이들 종양의 혈관 내피에 국소화된다. 초음파 분자 영상(USMI)은 유방암에서 네트린-1 간섭 요법을 위한 비침습적 동반 진단법으로 제안되었다. 내피 세포 표면에서 검출된 네트린-1은 매우 짧은 시간(약 10분)으로 영상화되어 혈관을 구성하는 내피 세포에 격리된 네트린-1을 시각화할 수 있다. 종양 혼입의 측면에서 결과는 매우 낮으며, 배경 대 혼입 비율은 도 5a에서 매우 낮다: 32%에서 45%로, 즉 실질적으로 1.4배 증가.
방사능 영상 및 내부 방사능 요법은 막성 수용체 또는 표면 분자를 표적으로 하기 위해 수행된다. 일반적으로 어느 정도 확산 가능한 것으로 간주되는 분비 인자 또는 리간드는 일반적으로 이러한 기술에 대해 선택되지 않는다.
J. Wischhusen 등(아래)은 암 세포의 세포 주변부에 있는 세포 기질에 격리된 네트린-1을 개시하지 않으며, 네트린-1이 혈관을 구성하는 내피 세포에 격리되어 있다는 것이 개시되어 있는 것만으로는 네트린-1 발현 종양을 검출하고 국소화하기 위한 강력한 도구로서 네트린-1 검출의 자격이 없다.
주로 분비 단백질 또는 혈관 내피 세포 표면에 격리된 단백질로 분류되는 네트린-1은 주로 영상 및/또는 표적 요법의 후보로 보이지 않는다.
발명의 요지
본원에는 네트린-1의 종양 축적에 의해 밝혀진 바와 같이 네트린-1이 암세포의 세포 주변부에 있는 세포 기질에서 더 끈적한 방식(stickier manner)으로 유지된다는 예상치 못한 광범위한 입증이 제시되어 있다. 흥미롭게도, 배아 단계에서 발현되는 단백질인 네트린-1은 성인에서 일부 종양에서 특이적으로 발현된다. 네트린-1이 세포외 세포 기질(ECM)의 종양 위치에 유지된다는 사실과 결합하여, 네트린-1은 영상 및/또는 표적 요법을 위한 예상치 못한 매우 특이적인 표적이 된다. 종양 세포의 세포 기질에서 네트린-1의 격리는 약 24 내지 약 96시간과 같이 긴 획득 시간을 갖는 영상화 방법의 길을 열어주며 이는 문헌(J. Wischhusen et al)에 설명된 USMI와는 반대로 종양 자체의 세포외 기질에 격리된 네트린-1의 시각화를 가능하게 하며, 따라서 전체 종양에 대한 진실하고 강력한 영상화를 가능하게 한다.
예를 들어, SPECT와 같은 방법을 사용한 배경 대 혼입 비율은 4T1 세포에서 얻은 바와 같이, 예를 들어, 5.8배 정도로 높을 수 있다. 예기치 않게 또한, 네트린-1은 종양 형성 동안 매우 초기에 발현되고, 따라서 작은 병변이 나타나기 전이나 유방 촉진과 같은 촉진 전에 네트린-1을 발현하는 종양 세포를 매우 초기에 검출하고, 국소화하고/하거나 치료적으로 표적화할 수 있다는 것이 본원에 나와 있다.
따라서, 본 발명의 양태는 영상, 진단, 특히 동반 진단, 또는 표적 요법에 사용 가능한 화합물 그 자체에 관한 것이다. 기본은 항-네트린-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 상기 항체 또는 단편에 결합된 킬레이트 모이어티를 포함하는 화합물이 있으며, 여기서 상기 킬레이트 모이어티는 선택적으로 방사성 동위원소와 회합(associated with)된다. 이에 회합된 바로 그 동위원소가 영상과 표적 치료 사이에 화합물의 사용을 지시할 수 있다.
상세한 설명:
제1 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 화합물에 관한 것으로,
o 항-네트린-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및
o 상기 항체 또는 단편에 결합된 킬레이트 모이어티,
여기서 상기 킬레이트 모이어티는 선택적으로 방사성 동위원소와 회합되어 있다.
전형적으로, 항체 또는 이의 단편과 킬레이트 모이어티는 공유적으로 연결된다. 본 실시양태에 따르면, 본 화합물은 접합체이다. 일 실시양태에서, 킬레이트 모이어티는 항체 또는 이의 단편의 아미노산의 측쇄, 특히 라이신의 측쇄 잔기에 결합한다.
전형적으로, 방사성 동위원소는 공유 결합에 의해 킬레이트 모이어티에 결합되어 있다.
본 발명의 화합물은 생체내에서 네트린-1에 특이적으로 결합할 수 있으므로, 암 세포의 세포 주변부에서 세포 기질에서 항체가 네트린-1에 결합함으로써 상기 암의 영상화 또는 이의 표적화를 가능하게 하기 때문에 특히 유용하다. 이는 암의 국소화를 식별하고/하거나 암의 성장 또는 퇴행을 추적하는 데 특히 유리하다. 특히, 방사성 표지된 화합물은 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영(SPECT: Single Photon Emission Computed Tomography) 및 양전자 방출 단층 촬영(PET: Positron Emission Tomography)와 같은 다양한 기술을 통해 흐름 시각화에 사용된다. 방사성 표지된 화합물은 방사선 요법 또는 시각화 및 요법 둘 모두에 사용될 수도 있다.
항체
화합물은 바람직하게는 단일클론 항체(mAb) 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하고, 여기서 mAb 또는 이의 단편은 네트린-1에 특이적으로 결합한다. mAb는 뮤린, 키메라, 인간화 또는 완전-인간 단일클론 항체일 수 있다. 단편은 네트린-1에 결합하는 전체 항체의 능력을 실질적으로 유지하는 모든 유형의 mAb 단편일 수 있으며, 예를 들어, Fab 또는 F(ab')2일 수 있다.
유용한 뮤린, 키메라 및 인간화 단일클론 항체의 예는 US 10,494,427에 개시되어 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다. 상기 선행 문헌에 개시되어 있고 본원에 사용될 수 있는 특정 실시양태는 표 1에 나열된 하기 항체이다. 표 1에 나열된 첫 번째 것은 뮤린 4C11 mAb에 해당하고, 두 번째로 나열된 HUM00은 뮤린 4C11 CDR을 인간 IgG1에 이식하는 것에 해당한다. 10개의 mAb HUM01 내지 HUM10은 인간 IgG의 FR 영역에서 특이적인 변형이 있는 HUM00에서 유래한 인간화 mAb에 해당한다. HUM03은 NP137로도 불린다. 인간 IgG1 CH의 서열은 Genbank AEL33691.1 변형 R97K로부터 유래한다. 인간 IgG1 CL(카파)의 서열은 Genbank CAC20459.1로부터 유래한다. 다른 동종이형도 사용될 수 있다. 이러한 모든 mAb, Fab 단편 및 F(ab')2 단편의 네트린-1에 대한 특이적 결합은 US2018/0072800에 입증되어 있다.
[표 1]
일 실시양태에서, 항체는 하기를 포함하는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다:
하기를 포함하는 가변 도메인 VH:
- 서열 번호 1로 기재된 서열을 갖는 H-CDR1;
- 서열 번호 2로 기재된 서열을 갖는 H-CDR2;
- 서열 번호 3으로 기재된 서열을 갖는 H-CDR3;
하기를 포함하는 가변 도메인 VL:
- 서열 번호 4로 기재된 서열을 갖는 L-CDR1;
- 서열 YAS를 갖는 L-CDR2;
- 서열 번호 5로 기재된 서열을 갖는 L-CDR3;
또는
하기를 포함하는 가변 도메인 VH:
- 서열 번호 22로 기재된 서열을 갖는 H-CDR1;
- 서열 번호 23으로 기재된 서열을 갖는 H-CDR2;
- 서열 번호 24로 기재된 서열을 갖는 H-CDR3;
하기를 포함하는 가변 도메인 VL:
- 서열 번호 25로 기재된 서열을 갖는 L-CDR1;
- 서열 번호 26으로 기재된 서열을 갖는 L-CDR2;
- 서열 번호 5로 기재된 서열을 갖는 L-CDR3.
바람직하게는, 항체는 하기 쌍으로부터 선택되는 한 쌍의 VH 및 VL 서열을 포함하는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다: 서열 번호 21 및 13, 서열 번호 14 및 8, 서열 번호 15 및 9, 서열 번호 16 및 10, 서열 번호 17 및 11, 서열 번호 18 및 11, 서열 번호 19 및 10, 서열 번호 20 및 11, 서열 번호 16 및 11, 서열 번호 19 및 12, 서열 번호 15 및 10. 보다 바람직하게는, 항체는 서열 번호 16 및 10의 한 쌍의 VH 및 VL 서열을 포함하는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
항-네트린-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 IgG1 불변의 중쇄(CH) 및/또는 인간 IgG1 불변의 경쇄(CL)를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 인간 IgG1 CH의 서열은 Genbank AEL33691.1 변형된 R97K로부터 유래한다. 인간 IgG1 CL(카파)의 서열은 Genbank CAC20459.1로부터 유래한다. 일 실시양태서, mAb는 NP137이고, VH로서 서열 번호 16 및 10, 각각 VL 서열, 및 이들 특이적 IgG1 CH 및 CL을 포함한다.
[표 2] 서열 설명:
IMGT 아래의 CDR은 적절한 경우 표 1에서 굵게 강조 표시되어 있다.
사용될 수 있는 항-네트린-1 항체로서, 인간 네트린-1 또는 동물 네트린-1에 대해 개발된 다른 항체, 특히 단일클론 항체 또는 이들의 항원-결합 단편을 인용할 수 있으며, 네트린-1은 종들 사이에서 매우 상동성이다. 다음이 인용될 수 있다: Abcam 항체 ab126729, ab122903, ab201324, ab39370; AF1109, AF6419, AF128이다.
킬레이트 모이어티:
본원에 사용된 "킬레이트 모이어티" 또는 "킬레이트제(chelating agent)" 또는 "킬레이터(chelator)"는 임의의 방사성 동위원소를 킬레이트화할 수 있는 화합물을 지칭한다. 킬레이트 모이어티는 상응하는 유리 방사성 동위원소를 일반적으로 수용액으로부터 격리하여, 상기 동위원소를 특정 생물학적 응용에 적용할 수 있게 한다. 상기 킬레이트 모이어티는 이중기능 킬레이트제이다. 본원에 사용된 "이작용성 킬레이터" 또는 "이작용성 킬레이트제"는 금속 결합 모이어티 기능 및 항체에 대한 결합을 가능하게 하는 화학적 반응성 작용기를 갖는 화합물을 지칭한다.
수많은 이작용성 킬레이터가 당업계에 알려져 있다. 이들 중 상당수는 실제로 상업적으로 이용 가능하며 PET 영상화제로서 일상적으로 사용되어 왔다. 이작용성 킬레이트제의 예는 다음과 같다: NODAGA(1,4,7-트리아자사이클로노난-1-글루타르산-4,7-디아세트산), DOTA(1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산), p-SCN-Bn-NOTA, p-SCN-Bn-PCTA, p-SCN-Bn-옥소-DO3A, 데스페리옥사민-p-SCN, 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(DTPA), 1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산(TETA), NOTA(4,7-트리아자사이클로노난-1,4,7-트리아세트산.
이작용성 킬레이터는 바람직하게는 이들 킬레이트제의 에스테르이다. 바람직하게는, 킬레이터는 NODAGA-NHS(NODAGA N-하이드록시석신이미드 에스테르) 또는 DOTA-NHS(DOTA N-하이드록시석신이미드 에스테르)이다.
방사성 동위원소:
본원에 사용된 "방사성 동위원소"는 불안정한 핵을 가지며 붕괴 동안 보다 안정하거나 안정한 형태로 방사선을 방출하는 화학 원소의 한 버전이다. 본 화합물의 방사성 동위원소는 영상 또는 방사성핵종 요법에 사용되는 것들일 수 있다.
본 발명에 유용한 방사성 동위원소는 특히 68Ga, 64Cu, 89Zr, 186Re, 188Re, 153Sm, 111In, 99mTc, 123I, 177Lu, 90Y, 131I, 213Bi, 212Bi, 211At, 225Ac를 포함한다.
영상의 경우, 보다 특히 68Ga, 64Cu, 89Zr, 186Re, 188Re, 153Sm, 111In, 99mTc, 123I를 언급할 할 수 있다.
요법을 위해, 방사성핵종은 세포독성의 금속 유도인자인 내부 방사능 요법에 사용되는 것들 중에서 보다 구체적으로 선택될 수 있다. 루테튬-177(177Lu), 이트륨-90(90Y), 및 요오드-131(131I)과 같은 베타-방출 방사성핵종을 사용할 수 있다. 비스무트-213(213Bi), 비스무트-212(212Bi), 아스타틴-211(211At) 및 악티늄-225(225Ac)과 같은 알파-방출 방사성핵종도 사용할 수 있다.
이들 방사성 동위원소는 바람직하게는 반감기를 고려하여 선택되며, 이는 바람직하게는 길기 때문에 생체 내 사용, 예를 들어, PET/SPECT 영상화 또는 표적 방사선요법에 특히 적합하게 만든다
화합물 및 조성물
하나 또는 여러 개, 예를 들어, 2 내지 10개의 킬레이터 또는 킬레이트 모이어티가 하나의 항체에 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물은 하기를 포함할 수 있다:
o 항-네트린-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및
o 상기 항체 또는 단편에 결합된 하나 또는 여러 개, 특히 2 내지 10개의 킬레이트 모이어티,
여기서, 상기 킬레이트 모이어티는 방사성 동위원소와 선택적으로 회합되어 있다. 일 실시양태에서, 킬레이트 모이어티 중 하나 이상은 방사성 동위원소와 회합되어 있다. 항-네트린-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 기재된 단일클론 항체 또는 이들의 항원-결합 단편 중 임의의 것일 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 NP137이다.
본 발명의 또 다른 양태는 하기를 포함하는 이러한 화합물 및 약제학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 조성물이다:
o 항-네트린-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및
o 상기 항체 또는 단편에 결합된 하나 또는 여러 개, 특히 2 내지 10개의 킬레이트 모이어티,
여기서 상기 킬레이트 모이어티는 방사성 동위원소와 회합되어 있다. 일 실시양태에서, 항체에 결합된 하나 이상의 킬레이트 모이어티가 방사성 동위원소와 회합되어 있다.
일 실시양태에서, 조성물은 킬레이트 모이어티가 결합되지 않은 항-네트린-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다.
이들 화합물 및 조성물은 본원에 개시된 것과 같은 잘 알려진 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
이들 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 비히클을 추가로 포함할 수 있다.
화합물의 제조:
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 하기 단계를 포함한다.
o a) 킬레이트 모이어티를 항체 또는 이의 단편에 접합시키는 단계; 및
o b) 항체 또는 이의 단편과 킬레이터의 접합체를 회수하는 단계.
접합은 아민-반응성 킬레이트 모이어티를 항체 또는 이의 단편과 함께 인큐베이션하여 얻어진다. 인큐베이션은 킬레이트화를 얻기에 충분한 기간 동안 이루어진다. 전형적으로 지속 시간은 약 5분 내지 약 2시간이다. 인큐베이션은 항체 또는 이의 단편이 변성되지 않는 온도에서 이루어진다. 온도는 전형적으로 약 35℃ 내지 약 42℃, 바람직하게는 약 37℃ 내지 약 40℃로 구성될 수 있다.
본원에 기재된 방사성 동위원소에 대한 아민-반응성 킬레이트 구조는, 예를 들어, DOTA-NHS 및 NODAGA-NHS 에스테르와 같이 상업적으로 입수 가능하다. NHS 에스테르(N-하이드록시석신이미드 에스테르)는 펩타이드에서 발생하기 때문에 N-말단과 항체의 라이신(Lys, K) 아미노산 잔기의 측쇄에서 1차 아민과 반응할 것으로 간주된다. 따라서 결합은 본원에 자세히 설명할 필요가 없다.
하나 또는 여러 개, 예를 들어 2 내지 10개의 킬레이터 모이어티는 다수의 라이신 아미노산을 포함하는 하나의 항체에 결합할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 화합물을 제조하는 방법은 하기 단계를 추가로 포함하며:
o c) 항체 또는 이의 단편과 킬레이터의 접합체를 보완적 방사성 동위원소와 함께 인큐베이션하는 단계;
이에 따라, 본 발명의 화합물을 생성한다. 이어서, 화합물은 회수되어 약제학적 담체 또는 비히클에서 제형화될 수 있다.
인큐베이션 c)는 방사성 동위원소 결합을 보장하기에 충분한 기간 동안 이루어진다. 전형적으로, 지속 시간은 약 5분 내지 약 2시간이다. 인큐베이션은 항체 또는 이의 단편이 변성되지 않는 온도에서 이루어진다. 온도는 전형적으로 약 35℃ 내지 약 42℃, 바람직하게는 약 37℃ 내지 약 40℃로 구성될 수 있다.
영상화
또 다른 양태에서, 본 발명은 유기체(동물, 특히 포유류, 특히 인간)에게 화합물의 유효량을 투여함으로써, 대상체에서 네트린-1 존재 또는 국소화를 영상화하거나, 기관 또는 조직에서의 네트린-1 존재 또는 축적을 영상화하거나, 네트린-1 발현 암을 영상화하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 화합물은 영상화에 적합한 금속 동위원소를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 암의 생체내 영상화에 사용하기 위해, 항-네트린-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 상기 항체 또는 단편에 결합된 킬레이트 모이어티, 및 킬레이트 모이어티와 회합된 방사성 동위원소를 포함하는 화합물에 관한 것이다. 유리하게는, 네트린-1은 암 세포의 주변부에 있는 세포 기질에서 검출되며, 여기서 네트린-1이 축적된다.
일 실시양태에서, 영상화는 본 발명의 화합물로 인한 검출된 영역(예를 들어, 기관 또는 조직)에서의 네트린-1 존재 또는 발현의 상대적 수준에 대한 정보를 제공한다.
"네트린-1의 축적"은 특히 암성 세포 주변부에 있는 세포 기질에 네트린-1이 축적되는 것을 의미한다. 따라서, 네트린-1은 조직 또는 기관, 암 세포 또는 종양 부근 또는 주변 환경에 존재하고 축적될 수 있다.
영상화는 당업자에게 알려진 임의의 적절한 기술에 의해 수행될 수 있으며, 특히 CT 스캐너(컴퓨터 단층 촬영)에 결합된, 특히 PET 또는 SPECT를 검출 및/또는 시각화를 가능하게 한다. 사이클로트론 또는 발생기에서 생성된 것과 같은 방사성핵종은 방사성 추적자, 예를 들어, SPECT 또는 PET를 형성하는 생물학적 활성 분자에 부착된다. 이 경우, 분자는 항체 또는 이의 단편과 킬레이터로 이루어진 화합물이며, 이에 방사성핵종의 결합하여 방사성 추적자를 구성한다. 이어서, 방사성 추적자를 환자에게 도입하며, 바람직하게는 정맥내 주사(IV)와 같은 주사에 의해 도입된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 하기를 포함하는, 대상체에서 네트린-1 존재 또는 국소화(예를 들어, 시각화)를 영상화하는 방법이 제공된다:
o a) 본원에 기재된 화합물을 상기 대상체에게 투여, 바람직하게는 주사하는 단계;
o b) 생체내 영상화, 바람직하게는 PET 또는 SPECT 영상화에 의해 상기 화합물을 검출하거나 국소화하는 단계.
본 발명의 일 양태에 따르면, 하기를 포함하는, 대상체에서 암을 검출하고 국소화하는 방법이 제공된다:
a) 상기 대상체에게 하기를 포함하는 화합물을 투여하는 단계:
o 항-네트린-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
o 상기 항체 또는 단편에 결합된 킬레이트 모이어티, 및
o 킬레이트 모이어티에 회합된 방사성 동위원소,
b) 암 세포 주변에 있는 세포 기질에서 생체내 영상화에 의해 상기 암을 검출하고 국소화하는 단계.
일 양태에서, 검출 또는 국소화 전에, 단계 a) 및 b) 사이에 시간 경과가 고려되며, 이는 약 4 내지 약 172시간, 특히 약 12 내지 약 172시간, 바람직하게는 약 24 내지 약 96시간, 또는 약 24 내지 약 48시간과 같은 시간 또는 획득 시간이며, 이는 세포외 기질에 격리된 네트린-1에 의해 상기 화합물의 결합을 허용한다. 보다 정확하게는, 이는 투여된 화합물이 혈액 순환을 벗어나 종양 또는 종양들을 관통하여 종양 세포 기질에 격리된 네트린-1에 도달할 수 있도록 충분한 시간이다. 이는 생체내 영상화에 의해 상기 결합된 화합물을 검출하거나 국소화하는 다음 단계를 가능하게 한다.
단계 b) 또는 "용도"에서, 생체내 영상화는 적어도 하나의 신체 부위, 예를 들어, 기관 또는 조직에서의 화합물의 존재 또는 축적을 검출하거나 강조한다. 이러한 존재 또는 축적은 화합물이 상기 신체 부위에 축적된 네트린-1에 결합한다는 의미에서 특이적이다. 이는 화합물 투여와 영상화 사이에 시간 경과가 있기 때문에 구체적이다.
항체 또는 이의 단편이 네트린-1에 특이적으로 결합되는 시점에 검출 또는 영상화가 수행되도록 투여와 검출 사이의 지연 시간 또는 시간 간격을 선택한다. 실제로, 투여 후, 체내 및 그 기관에 화합물이 확산되는 단계가 있으며, 일정 시간이 지난 후에야 신체 기관 또는 일부에서의 화합물의 존재가 네트린-1의 존재 및 이에 대한 화합물의 결합에 대해 특이적이다. 시간 경과는 약 4시간 내지 약 168시간 정도일 수 있으며; 통상적으로, 약 4시간 내지 약 96시간이다. 실제로, 유지되는 시간 경과는 방사성 동위원소의 반감기와 양립할 수 있어야 하며, 그 반대의 경우도 마찬가지이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 영상화 방사성 동위원소 화합물로서 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 화합물이 제공된다. 이 용도는 특히 상기 설명한 바와 같이 대상체에서 네트린-1의 존재 또는 국소화를 영상화하기 위한 것이다. 화합물은 특히 생체내 영상화, 바람직하게는 PET 또는 SPECT 영상화에 사용하기 위한 것이다.
일 실시양태에서, 방법 또는 용도는 신체 일부의 이미지, 특히 기관 또는 조직 또는 이의 하위부분(예를 들어, 폐, 췌장, 방광, 비장, 콩팥, 위, 결장, 소장, 장, 식도, 근육, 피부, 뇌) 및 선택적으로 주변 조직 또는 기관의 이미지를 제공한다.
일 실시양태에서, 방법 또는 용도는 신체의 해부학적 부분의 이미지, 특히 다리, 팔, 가슴, 복부, 머리 및 그 하위부분의 이미지를 제공한다.
일 실시양태에서, 방법 또는 용도는 전신의 이미지를 제공한다.
PET에서 시스템은 방사성 추적자를 통해 신체 내로 유입되는 방사성핵종(추적자)에 의해 간접적으로 방출되는 감마선 쌍을 검출한다. 이어서, 신체 내 추적자 농도의 3차원 이미지가 컴퓨터 분석에 의해 구성된다. 최신 PET-CT 스캐너에서 3차원 영상화는 종종 동일한 세션 동안 동일한 기계에서 환자에게 수행되는 CT X선 스캔을 통해 수행된다.
PET에서, 표준 흡수 값은 관찰된 영역(예를 들어, 조직 또는 기관)에서 추적자의 정량화를 얻을 수 있도록 계산될 수 있다. 이를 통해 관찰된 영역에서 네트린-1 존재 또는 발현에 대한 특정 정량화를 생성할 수 있다. 대안으로, 방사선 전문의는 간단한 관찰에 의해 해당 영역에 추적자가 축적되는 것을 알아차릴 수 있는 기술을 가지고 있으며, 이러한 축적은 배경 노이즈와 구별 가능하다. 이를 본원에서 "양성 축적 검출"이라 불린다.
단일-광자 방출 컴퓨터 단층 촬영(SPECT)은 PET와 유사한 핵의학 영상 기술이다. 또한 방사성 표지된 추적자를 사용하며 감마선 검출을 기반으로 한다. PET와 달리, SPECT에 사용되는 방사성 표지는 직접 측정되는 감마선을 방출한다. CT 스캐너와 결합된 SPECT-CT는 3차원 영상화도 제공한다.
관찰 부위(예를 들어, 조직 또는 기관)와 간을 비교하여 SPECT 영상화를 활용할 수 있다. 이를 통해 간 수준보다 높거나 같거나 낮은 것으로 정의된 결과를 생성할 수 있다. 방사선 전문의는 간단한 관찰에 의해 해당 영역에 추적자가 축적되는 것을 알아차릴 수 있는 기술을 가지고 있으며, 이러한 축적은 배경 노이즈와 구별 가능하다. 이는 본원에서 "양성 축적 검출"이라 불린다.
대부분의 양전자 방출 방사성 동위원소는 반감기가 짧기 때문에 방사성 추적자는 전통적으로 PET 또는 SPECT 영상화 시설에 근접한 사이클로트론을 사용하여 생산되었다. 불소-18의 반감기는 충분히 길기 때문에 불소-18로 표지된 방사성 추적자를 외부 위치에서 상업적으로 제조되어 영상화 센터로 배송될 수 있다. 반면에 68Ga는 발전기에서 생산할 수 있으므로 사이클로트론이 필요 없다. 또한, 갈륨-68의 반감기는 18F의 반감기와 가깝기 때문에 이 방사성핵종은 PET 영상화에 특히 유용하다.
일 실시양태에서, 111In은 방사성핵종으로서 사용된다. 방사성 붕괴 동안 낮은 에너지 감마(γ) 광자를 방출하며 반감기는 2.8일이다. 일반적으로 사이클로트론에서 생산된다. 반감기는 충분히 길기 때문에 이로 표지된 방사성 추적자는 외부 위치에서 상업적으로 제조되어 영상화 센터로 배송될 수 있다.
상기 영상화 방법은 암성 조직, 암성 기관 또는 암성 대상체의 신체에서 네트린-1을 검출하고 국소화하는 데 적합하다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "암"은 전형적으로 조절되지 않은 세포 증식을 특징으로 하는 포유류에서의 생리학적 상태를 지칭하거나 설명한다. 본원에 사용된 용어 "암" 및 "암성"은 질환의 모든 단계를 포괄하는 의미이다. 본원에 사용된 "암"은 유기체에서 원치 않는 성장, 침입 및 특정 조건 하에 손상된 세포의 전이로부터 초래되는 임의의 악성 신생물이다. 암을 일으키는 세포는 유전적으로 손상되어 일반적으로 세포 분열, 세포 이동 행동, 분화 상태 및/또는 세포 사멸 메커니즘을 제어하는 능력을 상실한다. 암은 일반적으로 원발 부위에 형성되어 원발성 암을 유발한다. 국소적으로 또는 신체의 먼 부위로 퍼지는 암을 전이라고 한다. 본원의 영상화 방법은 네트린-1을 발현하는 모든 단계에서 고형암을 검출하고 국소화할 수 있다.
본 발명의 화합물은 또한 환자의 암을 진단하는 데 유용하다. 이러한 양태에 따르면, 본 발명은 환자의 암을 진단하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
o a) 본원에 기재된 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 상기 대상체에게 투여하는 단계;
o b) 생체내 영상화, 바람직하게는 PET 또는 SPECT 영상화에 의해 상기 화합물을 검출하거나 국소화하는 단계; 및
o c) 단계 b)에 기초하여 암을 진단하는 단계.
단계 b)에서, 생체내 영상화는 적어도 하나의 신체 부위, 예를 들어, 기관 또는 조직에서의 화합물의 존재 또는 축적을 검출하거나 강조한다. 이러한 존재 또는 축적은 화합물이 상기 신체 부위에 축적된 네트린-1에 결합한다는 의미에서 특이적이다. 이는 상기 개시된 바와 같이 화합물 투여와 영상화 사이에 시간 경과가 있기 때문에 특이적하다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 따라서 영상 진단 방사성 동위원소 화합물로서 사용하기 위해, 본원에 기재된 바와 같은 화합물이 제공된다. 이러한 사용은 상기 설명된 바와 같이, 대상체에서 네트린-1 존재 또는 국소화를 생체내에서 영상화하기 위한 것일 수 있다. 암 진단에 도움이 될 수 있다. 상기 화합물은 특히 생체내 영상화, 바람직하게는 PET 또는 SPECT 영상화에 사용하기 위한 것이다.
본 항체 또는 이의 단편은 네트린-1에만 결합한다. 따라서, PET 또는 SPECT 영상화에서 검출된 모든 신호는 네트린-1이 존재한다는 표시이다. 암성 세포 주변부에 있는 세포 기질에 네트린-1이 축적되고 본 방사성 표지된 화합물의 민감도로 인해 환자의 체내에서 암 세포를 확인할 수 있으며, 따라서 암을 진단하고, 암을 확인하고, 암을 국소화하고/하거나 암의 유형을 확인할 수 있다. 암의 유형에는 암인 기관 또는 조직의 이름이 포함된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 환자에서 암의 예후 예측 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
o a) 본원에 기재된 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 상기 대상체에게 투여하는 단계;
o b) 생체내 영상화, 바람직하게는 PET 또는 SPECT 영상화에 의해 상기 화합물을 검출하는 단계; 및
o c) 단계 c)의 검출에 기초하여 암을 예후 예측하는 단계.
단계 b)에서, 생체내 영상화는 적어도 하나의 신체 부위, 예를 들어, 기관 또는 조직에서의 화합물의 존재 또는 축적을 검출하거나 강조한다. 이러한 존재 또는 축적은 화합물이 상기 신체 부위에 축적된 네트린-1에 결합한다는 의미에서 특이적이다. 이는 상기 개시된 바와 같이 화합물 투여와 영상화 사이에 시간 경과가 있기 때문에 특이적하다.
이러한 방법은, 예를 들어, 항암 요법에 따라 치료 중이거나 치료를 받은 환자에서 의학적 예후 예측을 만드는 추가 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 따라서 영상화 예후 예측 방사성 동위원소 화합물로서 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 화합물이 제공된다. 이러한 용도는 특히 상기 설명된 바와 같이 대상체에서 네트린-1의 존재 또는 국소화를 생체 내에서 영상화하고 암을 예후 예측하기 위한 것이다. 상기 화합물은 특히 생체내 영상화, 바람직하게는 PET 또는 SPECT 영상화에 사용하기 위한 것이다.
본원에 사용된 "예후 예측"은 질환으로부터의 회복 가능성 또는 질환의 가능한 발달 또는 결과의 예측을 의미한다. 예를 들어, 단계 b)에서 검출된 단일체가 클수록 환자의 체내에서 암 덩어리가 클수록 예후 예측이 나빠진다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 암의 국소화를 결정하는 방법을 제공한다:
o a) 본원에 기재된 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 상기 대상체에게 투여하는 단계;
o b) 생체내 영상화, 바람직하게는 PET 또는 SPECT 영상화에 의해 상기 화합물을 검출하는 단계;
o c) 네트린-1 존재 또는 축적의 국소화를 시각화하는 단계.
단계 b)에서, 생체내 영상화는 단계 c)에서 시각화되는 적어도 하나의 신체 부위, 예를 들어, 기관 또는 조직에서의 화합물의 존재 또는 축적을 강조한다. 단계 c)에서, 신체 부위, 예를 들어, 기관 또는 조직은 네트린-1 존재 또는 축적을 포함하는 것으로 시각화되고 결정된다. 이 신체 부위에 네트린-1의 존재 또는 축적이 시각화되어 있다면 그 안에 암이 있을 것이라는 강력한 추정이 있다. 이것은 상기 환자에서 암을 발견하거나, 신체의 암 부위를 확인하거나, 동시에 둘 모두일 수 있다. 이러한 존재 또는 축적은 화합물이 상기 신체 부위에 축적된 네트린-1에 결합한다는 의미에서 특이적이다. 이는 상기 개시된 바와 같이 화합물 투여와 영상화 사이에 시간 경과가 있기 때문에 특이적하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 영상화 방사성 동위원소 화합물로서 사용하기 위해, 본원에 기재된 바와 같은 화합물이 제공된다. 이러한 사용은 특히 상기 설명된 바와 같이 대상체에서 네트린-1 존재 또는 국소화를 생체내에서 영상화하기 위한 것이다. 상기 화합물은 특히 생체내 영상화, 바람직하게는 PET 또는 SPECT 영상화에 사용하기 위한 것이다. 암 세포의 세포 주변부에 있는 세포 기질에서 네트린-1을 검출하기 위한 것이다.
이러한 방법 또는 용도는 주어진 조직 또는 기관, 또는 여러 조직 및/또는 기관에서의 암의 존재를 평가하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 그 존재는 네트린-1 존재 또는 축적에 의해 입증된다.
본 발명이 또한 초기 단계에서 암의 국소화를 확인할 수 있다는 것이 당업자에게 즉시 명백해질 것이다. 특히, 본 발명은 너무 작아서 달리 검출할 수 없는 암의 부위를 확인하는 데 특히 유용하다.
영상화를 위한 약제학적 조성물 또는 이의 단위 투여 형태는 상기 기재된 화합물의 유효량을 포함한다. 본 조성물 또는 단위 투여 형태는 약제학적으로 허용되는 담체와 조합하여 약 5 내지 약 3 GBq, 특히 10 내지 500 MBq의 상기 기재된 방사성핵종-표지된 영상화 화합물을 함유할 수 있다. 상기 언급된 사용 방법은 약 0.1 mCi 내지 약 100 mCi의 상기 기재된 방사성핵종-표지된 영상 화합물을 포함하는 조성물 또는 단위 투여 형태를 환자, 특히 인간에게 투여하는 것을 포함할 수 있다.
치료
또 다른 양태에 따르면, 치료학적 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 화합물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 네트린-1 발현 암을 치료하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 내부 방사능 요법을 받을 수 있다.
또 다른 양태에 따르면, 대상체에서 네트린-1 발현 암의 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 상기 화합물이 제공된다.
화합물은 항체 또는 이의 단편을 포함하며, 상기 항체 또는 단편은 방사성핵종과 회합된 킬레이터 모이어티에 접합된 네트린-1에 특이적으로 결합한다. 방사성핵종은 세포 독성의 금속 유도인자인 내부 방사능 요법에서 일반적인 것 중에서 선택할 수 있다. 루테튬-177(177Lu), 이트륨-90(90Y), 및 요오드-131(131I)과 같은 일반적인 베타 방출 방사성핵종을 사용할 수 있다. 비스무트-213(213Bi), 비스무트-212(212Bi), 아스타틴-211(211At) 및 악티늄-225(225Ac)와 같은 알파-방출 방사성핵종도 사용할 수 있다.
또 다른 양태에 따르면, 대상체에서 네트린-1 발현 암을 치료하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 화합물이 제공된다
일 실시양태에서, 177Lu는 방사성핵종으로서 사용된다. 이는 감마 및 베타 방출체이며 반감기는 6.7일이다. 일반적으로 사이클로트론에서 생산된다. 반감기는 충분히 길기 때문에 표지된 방사선 치료제가 외부 위치에서 상업적으로 제조되어 치료 센터로 배송될 수 있다.
일 실시양태에서, 225Ac는 방사성핵종으로서 사용된다. 이는 알파 입자-방출 방사성핵종으로 짧은 붕괴 사슬에서 4개의 순 알파 입자 동위원소를 안정적으로 209Bi로 생성하므로 알파 입자 나노발생기라고 할 수 있다. 반감기는 10일이다. 더 많은 정보에 대해 당업자는 문헌(M. Miederer et al. in Adv Drug Deliv Rev. 2008; 60(12): 1371-1382)을 참조한다.
화합물은 통상적인 경로, 바람직하게는 비경구 경로, 예를 들어, 주사에 의해 환자에게 전달된다.
일 실시양태에서, 방법 또는 용도는 네트린-1을 발현하는 암에 대해 양성으로 확인된 환자를 치료하기 위해 사용된다. 특히, 본원에 개시된 영상화 방법을 사용하여 환자를 확인하였다.
치료용 약제학적 조성물 또는 이의 단위 투여 형태는 유효량의 상기 기재된 화합물을 포함한다. 본 조성물 또는 단위 투여 형태는 약제학적으로 허용되는 담체와 조합하여 약 5 내지 약 1000 MBq, 특히 10 내지 500 MBq의 상기 기재된 방사성핵종-표지된 영상화 화합물을 함유할 수 있다
영상화(진단) 및 치료:
적절한 경우, "영상화" 및 "치료"에 대해 이전에 제시된 특성이 "영상화 및 치료"에 적용된다.
또 다른 양태에 따르면, 하기를 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 단편으로 치료할 수 있는 암을 가진 환자를 확인하는 방법이 제공되며, 상기 항체 또는 이의 단편은 암 세포 표면에서 네트린-1 및 그 수용체의 상호작용을 억제할 수 있다.
o a) 본원에 기재된 화합물을 상기 대상체에게 투여하는 단계;
o b) 생체내 영상화, 바람직하게는 PET 또는 SPECT 영상화에 의해 상기 화합물을 검출하는 단계;
o c) 네트린-1 존재 또는 축적의 국소화를 시각화하는 단계;
o d) 시각화된 암에 대해 상기 환자를 치료하는 단계.
또 다른 양태에 따르면, 바람직하게는 하기를 포함하는, 표적 방사선요법으로 치료할 수 있는 암을 가진 환자를 확인하는 방법이 제공된다:
o a) 본원에 기재된 화합물을 상기 대상체에게 투여하는 단계;
o b) 생체내 영상화 바람직하게는 PET 또는 SPECT 영상화에 의해 상기 화합물을 검출하는 단계;
o c) 네트린-1 존재 또는 축적의 국소화를 시각화하는 단계;
o d) 시각화된 암에 대해 상기 환자를 치료하는 단계.
또 다른 양태에 따르면, 하기를 포함하는, 네트린-1을 발현하는 암을 치료하는 방법이 제공된다:
o a) 본원에 기재된 바와 같은 영상화용 화합물을 상기 대상체에게 투여하는 단계;
o b) 생체내 영상화, 바람직하게는 PET 또는 SPECT 영상화에 의해 상기 화합물을 검출하는 단계;
o c) 네트린-1 존재 또는 축적의 국소화를 시각화하는 단계;
o d) 시각화된 암에 대해 상기 환자를 치료하는 단계.
이러한 방법에서, 단계 a) 및 b) 사이에 추가 단계가 존재하는데, 이는 상기 언급된 획득 시간, 특히 4 내지 172시간, 바람직하게는 24 내지 96시간을 대기하여 종양의 세포외 기질에 격리된 네트린-1에 의해 상기 화합물의 결합을 수득하는 단계를 포함한다.
이러한 상이한 양태에서, 단계 a)에서 투여된 화합물은 생체내 영상화를 위해 본원에 기재된 바와 같은 화합물 중 하나이다.
이러한 상이한 양태에서, 단계 d)에서의 치료는 기존의 항암 치료로 이루어질 수 있다. 그러나, 바람직한 실시양태에서, 치료는 네트린-1 발현 암을 특이적으로 표적으로 하는 치료로 이루어진다. 따라서, 이러한 치료는 US10,494,427에 개시된 바와 같은 유효량의 항-네트린-1 항체를 투여함으로써 이루어질 수 있다. 항체는 본원의 표 1에 개시된 단일클론 항체 중 하나, 특히 소위 NP137일 수 있다. 상기 방법은 치료학적 유효량의 상기 mAb 또는 이의 단편을 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 항체의 투여에 대해, 당업자는 언급된 미국 특허를 참조할 수 있다.
일 실시양태에서, 치료는 상기 개시된 바와 같은 내부 방사능 요법이다. 따라서, 요법은 치료학적 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 화합물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 화합물은 항체 또는 이의 단편을 포함하며, 상기 항체 또는 단편은 방사성 핵종과 회합된 킬레이터 모이어티에 접합된 네트린-1에 특이적으로 결합한다. 상기 항체는 본원의 표 1에 개시된 단일클론 항체 중 하나, 특히 소위 NP137일 수 있다. 항체 또는 단편은 본원에 설명되고 상세히 설명된 바와 같이, 그 자체가 방사성핵종에 결합된 킬레이트 모이어티에 접합된다. 상기 화합물은 세포 기질에 격리된 네트린-1을 포함하여 종양 내의 네트린-1에 결합하도록 의도되어 있으며, 방사선요법은 주변 종양 세포 또는 전체 종양에 그 효과를 발휘할 수 있다.
일 실시양태에서, 111In은 영상화를 위한 화합물과 회합된 방사성핵종으로서 사용된다.
일 실시양태에서, 177Lu 또는 225Ac는 내부 방사능 요법을 위한 화합물과 회합된 방사성핵종으로서 사용된다.
영상화 화합물 및 요법 화합물의 용량은 상기 개시된 바와 같다.
제형
본 발명의 조성물은 본 발명의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서 제형화될 수 있다. "약제학적으로 허용되는 담체"는 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 물질을 의미하는 것으로, 즉 상기 물질은 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하거나 물질 함유된 약제학적 조성물의 임의의 다른 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않고 대상체에게 투여될 수 있다. 당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 담체는 활성 성분의 임의의 분해를 최소화하고 대상체에서의 임의의 부작용을 최소화하도록 자연적으로 선택될 것이다. 약제학적으로 허용되는 담체 및 약제학적 조성물의 다른 성분에 대한 논의는, 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Company, 1990]을 참조한다. 일부 적합한 약제학적 담체는 숙련된 작업자에게 명백할 것이며, 예를 들어, 물(멸균수 및/또는 탈이온수 포함), 적합한 완충액(예컨대 PBS), 생리식염수, 세포 배양 배지(예컨대, DMEM), 인공 뇌척수액 등을 포함한다.
본 개시내용의 조성물에 대한 투여량은 단위 투여 형태일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "단위 투여 형태"는 동물(예를 들어, 인간) 대상체를 위한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 의미하며, 각 단위는 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 비히클과 관련하여 원하는 효과를 생성하기에 충분한 양으로 계산된, 미리 결정된 양의 본 발명의 화합물을 함유한다. 당업자는 개별 환자에서 원하는 유효량 또는 유효 농도의 제제를 달성하기 위해, 사용되는 조성물의 정확한 제형을 위한 적절한 용량, 스케줄 및 투여 방법을 용이하게 결정할 수 있다.
영상의 경우, 동물, 특히 인간에게 투여되는, 본원에 기재된 조성물의 용량은 합리적인 시간 프레임에 걸쳐 개체에서 적어도 검출 가능한 양의 진단 반응을 생성하기에 충분해야 한다. 용량의 크기는 사용되는 특정 제제 또는 이의 조성물에 수반될 수 있는 모든 부작용의 존재에 의해 결정될 것이다. 가능하면 부작용을 최소화하는 것이 일반적으로 바람직하다.
요법의 경우, 동물, 특히 인간에게 투여되는, 본원에 기재된 조성물의 투여량은 합리적인 시간 프레임에 걸쳐 개체에서 적어도 검출 가능한 양의 암세포 세포독성, 암세포 사멸, 암 성장 감소 또는 퇴행을 생성하기에 충분해야 한다. 용량의 크기는 사용되는 특정 제제 또는 이의 조성물에 수반될 수 있는 모든 부작용의 존재에 의해 결정될 것이다. 가능하면 부작용을 최소화하는 것이 일반적으로 바람직하다.
약제학적 또는 방사성약제학적 조성물은 비경구적으로, 즉 주사에 의해 투여될 수 있으며, 가장 바람직하게는 수용액이다. "약제학적으로 허용되는 담체"는 무균성, pH, 등장성, 안정성 등을 적절히 고려한 생체적합성 용액을 지칭하며, 임의의 모든 용매, 희석제(멸균 식염수, 염화나트륨 주사제, 링거 주사제, 덱스트로오스 주사제, 덱스트로오스 및 염화나트륨 주사제, 락트산 링거 주사제 및 기타 수성 완충액 포함), 분산 매질, 코팅, 항박테리아 및 항진균제, 등장성 제제 등을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 또한 당업자에게 잘 알려진 안정제, 보존제, 산화방지제, 또는 당업자에게 잘 알려진 기타 첨가제, 또는 당업계에 알려진 기타 비히클을 함유할 수 있다.
본 발명은 이제 다음을 포함하는 도면을 참조하는 비제한적인 예를 사용하여 보다 상세히 설명될 것이다:
도 1: 네트린-1은 세포외 기질 내에 결합하여 유지된다. 세포외 기질 성분에 대한 h-네트린-1(인간 재조합 네트린-1) 결합 분석: 생체층 간섭계 검정에 의한 재조합 마우스 라미닌(m-라미닌), 재조합 인간 피브로넥틴(h-피브로넥틴) 및 재조합 인간 비트로넥틴(h-비트로넥틴).
도 2: 단편 접합체의 특성분석. 도 2a. 금속 킬레이트에 사용되는 DOTA (1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산)-HS 에스테르 및 NODAGA(1,4,7-트리아자사이클로노난, 1-글루타르산-5,7 아세트산)-HS 에스테르 분자의 화학적 표현. 도 2b. NODAGA 또는 DOTA 킬레이트에 접합된 전체 항-네트린-1(NP137), F(ab)'2 및 Fab의 표현. 도 2c. NP137), F(ab)'2 및 Fab 접합체는 합성 및 효소 절단에 의해 생산되었으며 변성 또는 비변성 조건에서 전기영동을 거쳤다. 도 2d. NODAGA로 킬레이트화한 후 NP137), F(ab)'2 및 Fab의 생체층 간섭계 분석. 숫자는 NP137-NODAGA, F(ab)'2-NODAGA 및 Fab-NODAGA의 농도를 나타낸다.
도 3: 종양에서 SPECT/Ct 분석 및 네트린-1 검출.
a. NP137-NODAGA-111In의 IV 주사 후 4시간, 24시간; 48시간 및 72시간에 왼쪽에서 오른쪽으로 획득된, 4T1 및 67NR 세포주에서 Q-RT-PCR에 의한 네트린-1 발현의 정량화. b. NP137-NODAGA-111In의 IV 주사 후 4시간, 24시간; 48시간 및 72시간에 왼쪽에서 오른쪽으로 획득된, 4T1 종양(네트린-1에 대해 양성)이 있는 Balb/c 마우스의 전신에 대한 단층 촬영 신티그래피 및 X선 CT의 최대 강도 투영, c. NP137-NODAGA-111In의 IV 주사 후 24시간; 48시간 및 72시간에 왼쪽에서 오른쪽으로 획득된, 67NR(네트린-1에 대해 음성) 종양이 있는 Balb/c 마우스의 전신에 대한 단층 촬영 신티그래피 및 X선 CT의 최대 강도 투영;
도 4: 방사능 축적 측정. 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간에 4T1 이종이식편(네트린-1에 대해 양성) 대 67NR 이종이식편(네트린-1에 대해 음성)을 보유하는 Balb/cJ 마우스에서 도 4a. 111In-NODAGA-NP137-Fab, 도 4b. 111In-NODAGANP137-F(ab)'2 및 도 4c. -111In-NODAGA-NP137의 종양 생체분포 비율. 방사능 혼입은 종양의 그램당 주입된 용량의 백분율로 정량화된다. 도 4d. 48시간, 72시간 및 96시간에 4T1 이종이식편을 보유한 Balb/cJ 마우스에서 111In-NODAGA-NP137의 생체분포 특성을 모든 기관에 대해 측정하였다. 방사능 혼입은 기관의 그램당 주입된 용량의 백분율로 정량화된다.
도 5: 방사능 축적 측정
도 5a. NP137-NODAGA-111In의 주사 후 24시간; 48시간 및 72시간에 왼쪽에서 오른쪽으로 획득된, 유방 종양이 발생하도록 유전적으로 변형된 MMTV/neuT 마우스 종양의 전신에 대한 단층 촬영 신티그래피 및 X선 CT의 최대 강도 투영. 도 5b. 마우스의 10개 유선의 개략적 표현 및 위치. 도 5c. 72시간에 MMTV/NeuT 마우스에서 111In-NODAGA-NP137의 생체분포 특성을 종양 및 모든 마우스 기관에 대해 측정하였다. 방사능 혼입은 기관 그램당 주입된 용량의 백분율로 정량화된다.
도 6: 새로운 항암 요법
도 6a. Balb/cJ 마우스에 100만 개의 세포를 피하 주사하여 EMT6 세포를 이식하였다. 5일 후, 동물을 PBS; DOTA-NP137(항-네트린1); DOTA-NP137-177Lu의 IV 주사로 처리하였다. PBS 및 DOTA-NP137의 경우 n=9마리/그룹; DOTA-NP137-177Lu의 경우 n=12마리 동물/그룹; PBS와 DOTA-NP137-177Lu 사이에서 그리고 DOTA-NP137과 DOTA-NP137-177Lu 사이에서 p<0.0001. 도 6b. DOTA-NP137-177Lu는 EMT6 세포주가 이식된 마우스의 생존을 향상시킨다(A 참조). NP137로 처리되거나 처리되지 않은 마우스 생존에 대한 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선 분석. 맨텔 콕스 테스트(Mantel Cox test); PBS 및 DOTA-NP137의 경우 n=9마리/그룹; DOTA-NP137-177Lu의 경우 n=12마리 동물/그룹; PBS와 DOTA-NP137-177Lu 사이에서 그리고 DOTA-NP137과 DOTA-NP137-177Lu 사이에서 p<0.0001. 도 6c. Balb/c 마우스에 100만 개의 세포를 피하 주사하여 4T1 세포를 이식하였다. 8일 후, 동물을 PBS; DOTA-NP137(항-네트린-1); DOTA-NP137-177Lu의 IV 주사로 처리하였다. PBS 및 DOTA-NP137의 경우 n=5마리/그룹; DOTA-NP137-177Lu의 경우 n=6마리 동물/그룹. 도 6d. DOTA-NP137-177Lu는 4T1 세포주가 이식된 마우스의 생존을 향상시킨다(c 참조). NP137로 처리되거나 처리되지 않은 마우스 생존에 대한 카플란-마이어 생존 곡선 분석. 맨텔 콕스 테스트; PBS 및 DOTA-NP137의 경우 n= 5마리/그룹; DOTA-NP137-177Lu의 경우 n=6마리의 동물/그룹; PBS와 DOTA-NP137-177Lu 사이에서 그리고 DOTA-NP137과 DOTA-NP137-177Lu 사이에서 p<0.0001. 도 6e. NMRI 누드 마우스에 500만 개의 세포를 피하 주사하여 SYO1 세포를 이식하였다. 8일 후, 동물을 PBS; DOTA-NP137(항-네트린-1); DOTA-NP137-177Lu의 IV 주사로 처리하였다. PBS 및 DOTA-NP137의 경우 n=9마리/그룹; DOTA-NP137-177Lu의 경우 n=12마리 동물/그룹; PBS와 DOTA-NP137-177Lu 사이에서 그리고 DOTA-NP137과 DOTA-NP137-177Lu 사이에서 p<0.0001. 도 6f. H358 세포가 이식된 마우스의 NP137-177Lu 생존. DOTA-NP137로 처리되거나 처리되지 않은 마우스의 카플란-마이어 생존 곡선. 맨텔 콕스 테스트; PBS 및 DOTA-NP137의 경우 n = 8마리/그룹; NP137-177Lu의 경우 n=9마리 동물/그룹; PBS와 NP137-177Lu 사이에서 그리고 DOTA-NP137과 NP137-177Lu 사이에서 p = 0.025.
도 7: 헤파린으로 처리되거나 처리되지 않은 세포로부터 농축된 상청액에서 네트린-1 정량화.
도 8: NP137-NODAGA-111In의 IV 주사 후 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간에 획득된, H358(네트린-1 양성) 종양을 보유한 NMRI 누드 마우스의 전신에 대한 단층 촬영 신티그래피 및 X선 CT의 최대 강도 투영,
도 1: 네트린-1은 세포외 기질 내에 결합하여 유지된다. 세포외 기질 성분에 대한 h-네트린-1(인간 재조합 네트린-1) 결합 분석: 생체층 간섭계 검정에 의한 재조합 마우스 라미닌(m-라미닌), 재조합 인간 피브로넥틴(h-피브로넥틴) 및 재조합 인간 비트로넥틴(h-비트로넥틴).
도 2: 단편 접합체의 특성분석. 도 2a. 금속 킬레이트에 사용되는 DOTA (1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산)-HS 에스테르 및 NODAGA(1,4,7-트리아자사이클로노난, 1-글루타르산-5,7 아세트산)-HS 에스테르 분자의 화학적 표현. 도 2b. NODAGA 또는 DOTA 킬레이트에 접합된 전체 항-네트린-1(NP137), F(ab)'2 및 Fab의 표현. 도 2c. NP137), F(ab)'2 및 Fab 접합체는 합성 및 효소 절단에 의해 생산되었으며 변성 또는 비변성 조건에서 전기영동을 거쳤다. 도 2d. NODAGA로 킬레이트화한 후 NP137), F(ab)'2 및 Fab의 생체층 간섭계 분석. 숫자는 NP137-NODAGA, F(ab)'2-NODAGA 및 Fab-NODAGA의 농도를 나타낸다.
도 3: 종양에서 SPECT/Ct 분석 및 네트린-1 검출.
a. NP137-NODAGA-111In의 IV 주사 후 4시간, 24시간; 48시간 및 72시간에 왼쪽에서 오른쪽으로 획득된, 4T1 및 67NR 세포주에서 Q-RT-PCR에 의한 네트린-1 발현의 정량화. b. NP137-NODAGA-111In의 IV 주사 후 4시간, 24시간; 48시간 및 72시간에 왼쪽에서 오른쪽으로 획득된, 4T1 종양(네트린-1에 대해 양성)이 있는 Balb/c 마우스의 전신에 대한 단층 촬영 신티그래피 및 X선 CT의 최대 강도 투영, c. NP137-NODAGA-111In의 IV 주사 후 24시간; 48시간 및 72시간에 왼쪽에서 오른쪽으로 획득된, 67NR(네트린-1에 대해 음성) 종양이 있는 Balb/c 마우스의 전신에 대한 단층 촬영 신티그래피 및 X선 CT의 최대 강도 투영;
도 4: 방사능 축적 측정. 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간에 4T1 이종이식편(네트린-1에 대해 양성) 대 67NR 이종이식편(네트린-1에 대해 음성)을 보유하는 Balb/cJ 마우스에서 도 4a. 111In-NODAGA-NP137-Fab, 도 4b. 111In-NODAGANP137-F(ab)'2 및 도 4c. -111In-NODAGA-NP137의 종양 생체분포 비율. 방사능 혼입은 종양의 그램당 주입된 용량의 백분율로 정량화된다. 도 4d. 48시간, 72시간 및 96시간에 4T1 이종이식편을 보유한 Balb/cJ 마우스에서 111In-NODAGA-NP137의 생체분포 특성을 모든 기관에 대해 측정하였다. 방사능 혼입은 기관의 그램당 주입된 용량의 백분율로 정량화된다.
도 5: 방사능 축적 측정
도 5a. NP137-NODAGA-111In의 주사 후 24시간; 48시간 및 72시간에 왼쪽에서 오른쪽으로 획득된, 유방 종양이 발생하도록 유전적으로 변형된 MMTV/neuT 마우스 종양의 전신에 대한 단층 촬영 신티그래피 및 X선 CT의 최대 강도 투영. 도 5b. 마우스의 10개 유선의 개략적 표현 및 위치. 도 5c. 72시간에 MMTV/NeuT 마우스에서 111In-NODAGA-NP137의 생체분포 특성을 종양 및 모든 마우스 기관에 대해 측정하였다. 방사능 혼입은 기관 그램당 주입된 용량의 백분율로 정량화된다.
도 6: 새로운 항암 요법
도 6a. Balb/cJ 마우스에 100만 개의 세포를 피하 주사하여 EMT6 세포를 이식하였다. 5일 후, 동물을 PBS; DOTA-NP137(항-네트린1); DOTA-NP137-177Lu의 IV 주사로 처리하였다. PBS 및 DOTA-NP137의 경우 n=9마리/그룹; DOTA-NP137-177Lu의 경우 n=12마리 동물/그룹; PBS와 DOTA-NP137-177Lu 사이에서 그리고 DOTA-NP137과 DOTA-NP137-177Lu 사이에서 p<0.0001. 도 6b. DOTA-NP137-177Lu는 EMT6 세포주가 이식된 마우스의 생존을 향상시킨다(A 참조). NP137로 처리되거나 처리되지 않은 마우스 생존에 대한 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선 분석. 맨텔 콕스 테스트(Mantel Cox test); PBS 및 DOTA-NP137의 경우 n=9마리/그룹; DOTA-NP137-177Lu의 경우 n=12마리 동물/그룹; PBS와 DOTA-NP137-177Lu 사이에서 그리고 DOTA-NP137과 DOTA-NP137-177Lu 사이에서 p<0.0001. 도 6c. Balb/c 마우스에 100만 개의 세포를 피하 주사하여 4T1 세포를 이식하였다. 8일 후, 동물을 PBS; DOTA-NP137(항-네트린-1); DOTA-NP137-177Lu의 IV 주사로 처리하였다. PBS 및 DOTA-NP137의 경우 n=5마리/그룹; DOTA-NP137-177Lu의 경우 n=6마리 동물/그룹. 도 6d. DOTA-NP137-177Lu는 4T1 세포주가 이식된 마우스의 생존을 향상시킨다(c 참조). NP137로 처리되거나 처리되지 않은 마우스 생존에 대한 카플란-마이어 생존 곡선 분석. 맨텔 콕스 테스트; PBS 및 DOTA-NP137의 경우 n= 5마리/그룹; DOTA-NP137-177Lu의 경우 n=6마리의 동물/그룹; PBS와 DOTA-NP137-177Lu 사이에서 그리고 DOTA-NP137과 DOTA-NP137-177Lu 사이에서 p<0.0001. 도 6e. NMRI 누드 마우스에 500만 개의 세포를 피하 주사하여 SYO1 세포를 이식하였다. 8일 후, 동물을 PBS; DOTA-NP137(항-네트린-1); DOTA-NP137-177Lu의 IV 주사로 처리하였다. PBS 및 DOTA-NP137의 경우 n=9마리/그룹; DOTA-NP137-177Lu의 경우 n=12마리 동물/그룹; PBS와 DOTA-NP137-177Lu 사이에서 그리고 DOTA-NP137과 DOTA-NP137-177Lu 사이에서 p<0.0001. 도 6f. H358 세포가 이식된 마우스의 NP137-177Lu 생존. DOTA-NP137로 처리되거나 처리되지 않은 마우스의 카플란-마이어 생존 곡선. 맨텔 콕스 테스트; PBS 및 DOTA-NP137의 경우 n = 8마리/그룹; NP137-177Lu의 경우 n=9마리 동물/그룹; PBS와 NP137-177Lu 사이에서 그리고 DOTA-NP137과 NP137-177Lu 사이에서 p = 0.025.
도 7: 헤파린으로 처리되거나 처리되지 않은 세포로부터 농축된 상청액에서 네트린-1 정량화.
도 8: NP137-NODAGA-111In의 IV 주사 후 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간에 획득된, H358(네트린-1 양성) 종양을 보유한 NMRI 누드 마우스의 전신에 대한 단층 촬영 신티그래피 및 X선 CT의 최대 강도 투영,
재료 및 방법:
종양 세포주
4T1 및 67NR 뮤린 유방 암종 세포를 ATCC로부터 입수하여 10% 소 태아 혈청(FBS, Gibco) 및 항생제(스트렙토마이신 및 페니실린)가 보충된 RPMI-1640(ATCC) 배지에서 배양하였다. EMT-6 뮤린 유방 암종 세포를 ATCC로부터 입수하여 10% 소 태아 혈청(FBS, Gibco) 및 항생제(스트렙토마이신 및 페니실린)가 보충된 이글 최소 필수 배지(EMEM: Eagle Minimum Essential Medium, ATCC)에서 배양하였다. H358 인간 폐 선암종 H358 세포는 ATCC로부터 입수하여 10% BBS(Gibco) 및 항생제가 보충된 RPMI-1640 배지(ATCC)에서 배양하였다. 세포를 20% O2 및 5% CO2로 구성된 가습된 분위기 하에 37℃에서 배양하였다.
웨스턴 블롯:
컨플루언트 세포를 차가운 PBS로 세척하고 용해 완충액(Tris 10 mM pH 7.6; SDS 5; 글리세롤 10%; Triton X-100 1%, DTT 100 mM)에 버렸다. 초음파 처리 후, Pierce 660 nm 단백질 검정 시약(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 단백질을 검정하고 SDS 4-15% 폴리아크릴아미드 겔(Bio-Rad)에 로딩한 후, 트랜스-블롯 터보 트랜스퍼(Trans-Blot Turbo Transfer)(Bio-Rad)를 사용하여 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮겼다. 멤브레인을 네트린-1의 경우 5% 무지방 분유 및 5% BSA로 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 염색은 1차 항체인 네트린-1 항체(Ab126729, Abcam)로 밤새 수행하였다. 세척 후, 멤브레인을 2차 항체인 HRP와 결합된 항-염소 토끼 항체로 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. West Dura(Pierce) 화학발광 시스템을 사용하여 신호를 강화하였다. 영상화는 Chemidoch Touch(Bio-Rad)를 사용하여 수행하였다.
세포 기질에서 네트린-1의 결합을 위해, 1 x 106개의 세포를 100 mm3 배양 접시에 도말하였다. 24시간 후, 세포를 FBS가 없는 4 mL의 배지에 희석된 돼지 장 점막(H3147-100KU, Sigma)으로부터 200 μg/mL의 헤파린 나트륨 염으로 처리하였다. 하룻밤 인큐베이션한 후, 상청액을 수집하였다. 센트리콘즈(Centricons) 원심분리 필터를 사용하여 수집된 상청액에 단백질을 농축하였다. 이어서, Pierce 660 nm 단백질 검정 시약(22660, Thermofisher scientific)을 사용하여 단백질의 농도를 측정하였으며, 30 μg의 단백질을 면역블록에 로딩하였다.
생체내 전임상 모델:
NP137에 대한 인간 단일클론 항체(항-네트린-1, HUM03)는 Netris Pharma(Lyon, France)에 의해 친절하게 제공받았다. 8주령 암컷 Balbc/J 마우스를 Janvier Laboratories(Le Genest-Saint-Isle, France)로부터 입수하였다. 모든 동계 유방암 세포 1 x 106개의 EMT-6; 5 x 105개의 4T1 및 1 x 106개의 67-NR을 8주령 암컷 Balbc/J 마우스의 등 옆구리에 피하 이식하였다. 마우스는 특정 병원체가 없는 조건(Anican, Lyon - France and Imthernat facility, HCL Lyon, France)에서 유지되었으며 필터 뚜껑이 있는 멸균된 케이지에 보관하였다. 그들의 보살핌과 수용은 지역 CECCAP 윤리위원회에서 정의한 유럽 및 프랑스 기관 지침에 따랐다. 인간 세포주 H358(1 x 106개의 세포) 또는 SKBR7(2 x 106개의 세포)을 8주령 암컷 NMRI 면역 저하 마우스에 이식하고 동일한 조건 하에 유지하였다.
종양 부피는 일주일에 3회 캘리퍼스로 2개의 수직 종양 직경을 측정하여 평가하였다. 개별 종양 부피는 다음과 같이 계산하였다: V = (a*b2)/2. a는 가장 큰 직경이고 b는 가장 작은 직경이다. 종양이 200 내지 400 mm3의 부피에 도달했을 때, 마우스를 무작위로 동물 그룹으로 분리하고 111In-NODAGA-NP137, 111In-NODAGA-NP137-Fab,111In-NODAGA-NP137-F(ab')2 또는 177Lu-DOTA-NP137로 처리하고 영상/요법을 받았다. 모든 실험에 대해, 마우스는 가스 프로토콜(이소플루란/산소(2.5%/2.5%))을 사용하여 마취시켰다.
접합:
1 mL의 항-네트린1 단일클론 항체-NP137(또는 적절한 경우 그 단편, 모든 단편에 대해 동일한 조건)을 Amicon Ultra-15 50k(UFC905096)에 첨가한다. 1.2 g/L의 Chelex 100을 함유하는 0.1M 인산염 완충액(pH 8)에 대한 정용여과를 수행한다. 이 단계는 10 mL의 0.1 M 인산염 완충액(pH 8) 용액을 사용하여 각 세척 사이에 4900 rpm에서 25분 동안 원심분리하여 7회 반복한다. 이어서, 항-네트린 1 항체 농도를 나노드롭으로 계산한다. 이어서, 항체의 농도를 50 μM이 되도록 조정한다. DOTA-NHS 에스테르/NODAGA(1,4,7-트리아자사이클로노난, 1-글루타르산-5,7 아세트산)-HS 에스테르(CheMatech(C084))의 원액을 10 mg/mL(=13.13 mM)의 농도로 초순수에 용해시킨다. 50 μM의 항-네트린1 항체가 NODAGA-NHS 용액의 필수 DOTA-NHS와 1:25의 비율로 결합된다. 반응물을 실온에서 4시간 동안 수행되고 밤새 연속적인 엔드-오버-엔드(end-over-end) 혼합을 위해 4℃로 옮긴다. PBS(Chelex)에 대한 정용여과를 수행한다. 이 단계는 각 세척 사이에 4900 rpm에서 25분 동안 원심분리하면서 10 mL의 PBS(Chelex)를 사용하여 7회 반복한다. 이어서, DOTA/NODAGA-항-네트린 1 항체 농도를 나노드롭으로 계산한다.
방사성 표지:
NODAGA-NP137, NODAGA-NP137-Fab 또는 NODAGA-NP137-F(ab')2(40 내지 70 μL, 5 mg/mL)는 400 μL의 100 mM 아세테이트 완충액 pH 5 및 40 내지 400 MBq의 고순도 111In-염화물(Covidien, Petten, The Netherlands)을 첨가하여 방사성 표지되었다. 혼합물을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 100 μl의 1 mM DTPA 용액으로 반응을 중단시켰다. 유리 111In을 PD-10 컬럼을 사용하여 제거하였다. 컬럼을 먼저 15 ml의 0.1 M 아세테이트 완충액으로 세척한 다음, 표지된 혼합물을 컬럼에 로딩하고, 아세테이트 완충액으로 용출시켰다. 111In-NODAGA-NP137, 111In-NODAGA-NP137-Fab 또는 111In-NODAGA-NP137-F(ab')2가 먼저 용출되었다. 이동상으로 ITLC-SG(Biodex, Tec-control black)와 50 mM 구연산염 완충액(pH 5)을 사용하여 각 0.5 ml 분획의 방사화학적 순도(RCP)를 평가하였다. 방사성 표지된 NP-137은 원점에 남아 있는 반면 결합되지 않은 111In은 0.9 내지 1의 Rf로 이동하였다. 가장 높은 방사화학적 순도 분획을 풀링하였다.
안정성 테스트를 위해, 방사성 표지된 111In-NODAGA-NP137, 111In-NODAGA-NP137-Fab 또는 111In-NODAGA-NP137-F(ab')2의 분취량을 37℃에서 2 mL 인산염 완충 식염수(pH 7.4)에서 인큐베이션하고, 방사성 표지된 화합물의 방사화학적 순도(RCP)를 이동상으로 ITLC-SG 및 0.1 M 구연산염 완충액 pH 5를 사용하여 평가하였다.
111In-DOTA-NP137, 111In-DOTA-NP137-Fab 또는 111In-DOTA-NP137-F(ab')2에도 동일한 프로토콜이 적용될 수 있다.
동일한 프로토콜을 사용하여 DOTA-NHS와 함께 177Lu-DOTA-NP137을 생산하였다.
생체분포 연구
1 내지 10 MBq의 방사성 표지된 111In-NODAGA-NP137, 111In-NODAGA-NP137-Fab 또는 111In-NODAGA-NP137-F(ab')2 또는 111In DOTA-NP137을 최대 100 μL의 부피로 종양을 보유한 마우스에 정맥 주사하였다(각 그룹에 대해 n=3 또는 4). 마우스를 자궁경부 탈구에 의한 주사 후 4시간, 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간과 같은 정의된 시간에 희생시켰다. 관심 조직(혈액, 심장, 폐, 비장, 신장, 근육, 뇌 및 피부)을 제거하고 칭량하고, 감마 섬광 계수기(Wizard® 감마 계수기, Perkin Elmer, USA)에서 5분 동안 방사능을 계산하였다. 소변과 대변은 수용 및 계수를 위해 개별 대사 케이지에 수집되었다. 조직 분포는 그램당 주입된 용량의 백분율(%ID/g)로 표현되었다. 신장 및 간담도 제거는 주입된 총 활성도 하에 누적 방사능으로 표현되었다.
영상화:
획득은 작은 동물을 위한 Nano-SPECT/CT 시스템(Bioscan, Washington, DC, USA)을 사용하여 이루어졌다. 이 시스템은 상호 교환 가능한 다중 핀홀 개구부가 장착된 4개의 검출기(215 x 230 mm2 NaI, 33 PMT)로 구성된다. SPECT/CT 획득은 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간의 서로 다른 시간에 방사성 표지된 분자의 5 내지 15 MBq(메가 베크렐)을 IV 주사한 후 수행하였다. CT(55 kVp 튜브 전압, 500 ms 노출 시간 및 180회 투영) 및 SPECT/CT 획득은 체온(37℃로 설정)을 유지하기 위해 온도-조절 베드(Minerve, Esternay, France)에 놓인 안와자세의 종양 보유 마우스에서 수행하였다. 획득은 111In의 두 피크 171 keV 및 245 keV를 중심으로 2개의 15% 윈도우를 사용하여 40분 동안 수행하였다. 모든 이미지 데이터는 InVivo-Scope(Bioscan, Washington, DC, USA)를 사용하여 재구성 및 분석하였다.
Fab 및 F(ab')2 단편 생성 및 DOTA 및 NODAGA-면역접합체 합성
NP137의 단백질 분해 단편은 제조업체의 지침에 따라 Pierce™ Fab 및 F(ab')2 제조 키트를 사용하여 생성되었다. 표면 라이신 잔기에 대한 DOTA 또는 NODAGA의 접합을 위해, NP137 및 그 단편을 Chelex 100 수지를 사용하여 제조된 금속 비함유 완충액에서 DOTA-NHS-에스테르 또는 NODAGA-NHS 에스테르(Chematech, Dijon, France)와 함께 25:1 킬레이트:항체의 몰비로 접합하였다. 간략하게, 50 μM 항체를 0.1 M 인산염 완충액(pH8)에 대한 정용여과로 교환한 다음, 회전기에서 25℃에서 4시간 동안 1.25 mM DOTA-NHS-에스테르 또는 NODAGA-NHS 에스테르와 반응시켰다. 반응물을 밤새 연속적인 엔드-오버-엔드 혼합을 위해 4℃로 옮겼다. 과량의 킬레이터는 PBS에 대한 정용여과에 의해 제거하였다. 면역접합체를 4℃에서 보관하였다.
항체 친화도 측정
네트린-1에 대한 항체 단편의 친화도는 PBS, 0.02% Tween-20, 0.1% BSA(BB)에서 1000 rpm에서 일정하게 진탕시키면서 30℃에서 OctetRed96 시스템(ForteBio)을 사용하여 생물층 간섭계로 측정하였다. 간략하게, 재조합 인간 네트린-1(R&D)-코팅된 HIS1K 바이오센서를 일련의 농도의 항체 또는 단편과 함께 인큐베이션하고, 5분 동안 회합을 관찰하였다. 이어서, 바이오센서를 BB에서 추가로 5분 동안 배양하여 복합체의 해리를 관찰하였다. 결합 동역학은 1:1 결합 모델을 사용하여 ForteBio Octet RED 평가 소프트웨어 6.1로 평가하여 kon, koff 및 KD 값을 도출하였다.
결과
네트린-1은 확산성이 불량한 기질 결합 단백질이다:
면역조직화학(IHC)은 수년 동안 암의 표적 발현 특성분석을 위한 참고 자료가 되어 왔다. 그러나, 이러한 전략은 최근 면역관문 억제제로 얻은 최근 데이터에 의해 의문이 제기되었는데, 이는 환자 내에서 표적 발현과 반응 사이에 강한 불일치가 있기 때문이다. 따라서, PDL-1 항체에 반응하는 환자는 IHC에서 PDL-1의 발현에 대해 음성일 수 있고, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 표적 발현은 시간이 경과함에 따라 안정적이지 않고, IHC는 원발성 종양 진단 시 채취한 파라핀 블록으로 만들어지며, 전이에서 표적 발현이 상이하다는 가설을 세울 수 있다. 따라서. 종양 및 전이 내에서 단백질 발현의 모든 변화를 강조하기 위해 전신 규모에서 실시간으로 표적 발현을 분석하기 위한 새로운 진단 전략이 개발되어야 한다.
본 발명자들은 축색돌기 유도 성장 모델을 설명할 때 생각했던 바와 같이 네트린-1이 종양 세포에서 확산되지 않는다는 것을 발견하였다. 그들은 자궁내막 및 난소 인간 종양 파라핀 포매 종양 절편에서 네트린-1 면역조직화학 사진을 얻었다(나타내지 않음). 인간 종양의 네트린-1은 IHC 염색 후 세포의 기저막에 존재하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 세포 세포외 기질 내에 축적됨을 시사한다. 이러한 새로운 발견을 완성하고 확인하기 위해, 본 발명자들은 매트릭스 구성요소 내에서 네트린-1의 분자 파트너를 특성화하였다. 생물층 간섭계(BLI) 검정을 사용하여 네트린-1과 매트릭스 단백질의 상호작용 화면이 구현되었다. 그 결과, 네트린-1은 피브로넥틴, 라미닌 및 비트로넥틴에 강하게 결합할 수 있다(도 1).
헤파린은 플라스틱 재료에 대한 네트린-1의 상호작용을 차단한다. 헤파린을 처리하지 않은 조건에서 네트린-1 발현 4T1/EMT6 세포로부터 조건화된 배지에서는 네트린-1이 검출되지 않았지만, 헤파린을 첨가했을 때 네트린-1이 검출되었다(도 7).
이러한 모든 요소는 네트린-1이 확산되기보다는 암 세포의 세포외 기질에 격리되어 있음을 암시한다.
네트린-1 실시간 검출을 위한 새로운 동반 테스트의 특성분석:
단편(Fab 또는 F(ab')2)의 NP137이 인듐 111(111In)에 융합된 화합물을 생성하여 SPECT/Ct 분자 영상화로 검출하였다(도 2a). 형성된 3개의 분자는 생체내에서 상이한 분자 활성을 갖는 것으로 여겨지며, 완전한 항체는 혈류에서 더 긴 반감기를 가지며 Fab는 종양 내로 더 빠르게 침투할 수 있으며, F(ab')2는 중간 형태이다(도 2b). 보다 정확하게는, 항체 또는 이의 단편은 항체 또는 이의 단편의 라이신 잔기에 결합하는 금속 킬레이트제(DOTA 또는 NODAGA)에 접합되었고; 킬레이터는 인듐 동위원소와 회합되거나 결합하여 방사성 추적자를 완성한다. 입체 배제 크로마토그래피 정제 후, 방사성 표지된 NP-137, Fab 및 F(ab')2는 98%를 초과하는 방사화학적 순도(RCP)로 얻어졌다. 방사화학적 수율은 111In-NODAGA-NP137의 경우 70%, 111In-NODAGA-NP137-Fab의 경우 60%, 111In-NODAGA-NP137-F(ab')2의 경우 65%였다. 인큐베이션 후 5일에도, RCP는 인산염 완충 식염수(pH 7.4)에서 여전히 95%보다 높았으며, 이는 시험관 내 및 생체내 실험을 수행하기에 적합한 역학적 안정성을 나타낸다. 본 발명자들은 동위원소를 결합하는 데 필요한 이러한 화학적 변형이 생체층 간섭계에 의해 네트린-1을 결합하는 세 가지 형태의 능력을 방해하지 않았음을 보여준다(도 2d).
도 2d에 제시된 실험의 생체층 간섭계 분석 후 KD 계산은 다음과 같이 높은 친화성 KD를 나타낸다.
NP137-NODAGA: 1.72 E-10
F(ab)'2-NODAGA: 1.51 E-10
Fab-NODAGA: 1,52 E-10.
생체내에서 네트린-1을 검출하는 이러한 분자의 능력을 분석하기 위해, 본 발명자들은 종양의 두 가지 동계 모델을 사용하였다: 네트린-1 발현에 대해 양성인 4T1 세포 및 네트린-1에 대해 음성인 67NR을 음성 대조군.
먼저, 4T1 및 67NR 세포주에서 Q-RT-PCR에 의한 네트린-1 발현의 정량화를 수행하였다. 도 3a의 결과는 4T1 세포에서만 네트린-1 발현이 있음을 확인한다.
둘째, 111In-NODAGA-NP137-F(ab)'2, 111In-NODAGA-NP137-Fab, 또는 111In-NODAGA-NP137의 IV 주사 후 24시간; 48시간; 72시간 및 96시간에 획득된, 4T1(네트린-1에 대해 양성) 종양을 보유한 Balb/cJ 마우스의 전신에 대한 단층 촬영 신티그래피 및 X선 CT의 최대 강도 투영이 얻어졌다. 유사하게, 111In-NODAGA-NP137-F(ab)'2, 111In-NODAGA-NP137-Fab, 또는 111In-NODAGA-NP137의 IV 주사 후 24시간; 48시간 및 72시간에 획득된, 67NR(네트린-1에 대해 음성) 종양을 보유한 Balb/c 마우스의 전신에 대한 단층 촬영 신티그래피 및 X선 CT의 최대 강도 투영이 얻어졌다.
강한 종양 흡입은 111In-NODAGA-NP137 그룹의 4T1 종양에서 검출 가능한 반면(도 3b), 111In-NODAGA-NP137-F(ab)'2 그룹 및 111In-NODAGA-NP137-Fab 그룹에서는 느린 흡입이 검출 가능했다(데이터는 표시하지 않음). 흥미롭게도 67NR 보유 마우스의 모든 분자에 대해 흡입이 검출되지 않았으며, 이는 종양 흡입이 종양 네트린-1에 특이적임을 암시한다(도 3b 및 3c 비교). 국소화된 종양 흡입은 도 8의 H358 종양에서도 볼 수 있다.
본 발명자들은 67NR과 4T1 세포 사이의 흡입 비율에 대한 생체외 정량화를 수행했는데, 이는 처리 후 48시간 후에 최상의 특이적 결합이 검출된다는 것을 암시한다(도 4a-c). 이들 데이터는 종양 통합이 다른 형태보다 완전 항체에서 더 우수하다는 것을 확인하였다.
4T1 이종이식편을 보유하는 Balb/cJ 마우스에서 111In-NODAGA-NP137의 생체분포 특성을 48시간, 72시간 및 96시간에 모든 기관에 대해 측정하였다. 방사능 혼입은 장기 그램으로 주입된 용량의 백분율로 정량화된다. 주사된 용량(ID)의 25%에 가까운 강력한 종양 흡입이 표시된 시간 경과 후 종양에서 검출되었다. 다른 기관내의 혼입은 특이적 결합을 나타내지 않았다(도 4d).
새로운 진단 도구
추가 테스트는 내인성 수준의 네트린-1을 발현하는 유방 관내강 유방암 MMTV-NeuT(20)의 형질전환 모델에서 수행되었다. 도 5a는 111In-NODAGA-NP137 주사 후 24시간, 48시간 및 72시간에 왼쪽에서 오른쪽으로 시간에 따른 변화를 나타낸다.
지방 패드 조직에서 강한 염색이 검출되었으며, 이는 동물의 10개 유선에서 검출되었다(도 5b 참조).
일부 종양은 유방 촉진으로 검출되기 전에도 시각화되었다는 점은 매우 흥미로우며, 이는 네트린-1 발현 종양에 대한 조기 검출 도구로서 이 추적자의 관련성을 강화한다.
이러한 결과는 예상치 못한 것이었다. 모든 종양에서 주입된 용량(ID)의 8%에 가까운 강력한 종양 흡입은 종양 혼입 측정 후 검출할 수 있었으며, 이는 111In-NODAGA-NP137이 종양 질량 측면에서 작은 병변이 나타났을 때 네트린-1의 발현을 설명하는 좋은 진단 도구가 될 수 있음을 주장한다(도 5c).
도 8은 네트린-1 양성 인간 이종이식 뮤린 모델 H358(인간 비소세포 폐암 모델)에서 NP137-NODAGA-111In의 강력한 축적을 나타낸다. EMT6(뮤린 유방 암종 세포주)에서도 유사한 결과(나타내지 않음)를 얻었다. 두 모델 모두에서 종양 흡수량은 ID/g(주입된 용량/기관 무게, 그램 단위)의 10%를 초과했다.
저항성 종양을 표적으로 하는 새로운 테라노스틱스 화합물인 NP137-DOTA-
177
Lu.
본 발명자들은 암세포를 효과적으로 손상시키는 베타 방사선을 방출할 루테슘 177(도 6에서 DOTA-NP137-177Lu라고 불림)에 융합된 항체를 개발하였다. 루테슘은 1.8 mm 범위에서 강력한 방사선량을 방출하며, 표적 요법과 결합할 때 특이도가 높다.
본 발명자들은 먼저 이 분자를 사용하여 4T1 및 EMT6 세포주를 처리한다. 이들 세포주는 단일 제제로서 NP137에 내성이 있으며 가장 공격적인 전임상 모델에 속하는 것으로 알려져 있다. 그럼에도 불구하고, PBS 또는 DOTA-NP137을 사용한 대조군과 비교하여 단일 10 MBq 용량의 NP137-DOTA-177Lu로 처리한 경우 종양 성장이 감소하였다(도 6a, c 및 e). 그 결과, NP137-DOTA-177Lu 처리군에서 마우스의 생존율이 증가하였다(도 6b 및 d). 이러한 결과는 이러한 새로운 분자가 네트린-1을 발현하는 종양에서 생체내에서 항종양 활성으로 유발할 수 있음을 나타낸다. NP137-177Lu의 치료 효능은 인간 폐암 이종이식 모델 H358에서 추가로 평가되었으며, 여기서 치료는 종양 성장 속도를 다시 유의하게 감소시켜 확실한 항종양 효과를 확증하였다(p<0.001)(도 6f).
논의
이 연구에서 본 발명자들은 핵의학 SPECT/CT에 의한 네트린-1의 생체내 검출을 위한 새로운 동반 테스트를 설명하였다. 네트린-1은 현재 임상 분석에서 평가된 여러 유형의 암에서 치료 표적으로 특성화되었지만, 기존 테스트(즉, Elisa 검정을 사용한 혈청 검출, 질량 분석법, FFPE 샘플에서 네트린-1을 나타내는 병리학의 견고성)에서는 검정이 부족하기 때문에, 본 발명자들은 암 세포에서 생체내 네트린-1의 높은 발현을 검출하기 위한 혁신적이고 간단하며 강력한 동반 테스트를 개발하였다. 본 발명자들의 결과에 기초하여, 본 발명자들은 네트린-1 음성 종양 모델 67NR에서 RCP에 의해 밝혀진 바와 같이 우리의 전임상 모델에서 111In-NODAGA-NP137 또는 111In-DOTA-NP137의 비특이적 결합이 검출되지 않거나 매우 낮다고 말할 수 있다. 이러한 결과는 네트린-1이 성인 수준에서 널리 발현되지 않으며 종양 조직에 대한 높은 특이성을 보여줌을 나타낸다. 따라서, 종양 형성 동안 재발현되는 발생 네트린-1 유전자를 표적으로 하는 것은 종양 영상화의 특이성을 개선하기 위한 핵심 솔루션인 것으로 보인다.
SPECT 또는 PET 영상화에 가장 적합한 분자를 확인하기 위해, 본 발명자들은 임상적으로 사용되는 인간 항-네트린-1 NP137 단일클론 항체인 완전한 NP137-IgG1, NP137-F(ab')2 및 NP137-Fab를 기반으로 세 가지 상이한 제제를 설계하였다. 이들 모든 분자는 네트린-1에 강력하게 결합할 수 있다. 종양 특이성을 가진 생체내 최상의 축적은 완전한 NP137-IgG1 및 NP137-Fab를 함유하는 방사성 추적자에서 관찰되었고; 최상의 것은 완전한 항체를 포함하는 방사성 추적자였다. 완전한 NP137-IgG1은 종양 내 최상의 축적을 나타냈으며 임상 내 이식에 대한 가장 유망한 결과를 보였다. 이러한 전달은 분자 영상화에 사용되는 모든 금속 및 화합물을 사용하여 가정할 수 있다.
보다 기초적인 연구의 관점에서, 네트린-1은 수년 동안 신경 발달에서 확산 가능한 구배를 가진 분비 분자로 설명되었다. 네트린-1은 리간드이므로 영상 또는 내부 방사선요법의 표적으로서 일차적인 선택이 아니다.
또한, 이러한 입증된 종양 혼입을 기반으로 본 발명자들은 NP137-DOTA를 루테슘 177과 융합하여 NP137-DOTA-177Lu를 형성하는 새로운 분자를 설계한다. 그 결과, 이러한 분자는 네트린-1을 발현하는 종양 내에도 특이적으로 축적되었다. 루테슘 177은 종양 조직 내에서 1.8 mm 범위에서 강력한 방사선량을 전달할 수 있는 ß-방출체이다. 그 결과, 본 발명자들은 종양 성장의 현저한 감소가 종양을 보유한 마우스의 생존율 향상과 상관관계가 있음을 주목한다. 주목할 만한 점은 이러한 유형의 종양이 단일 제제로서 NP137에 완전히 내성이 있다는 것이다. 생존 연구는 이 화합물을 사용한 치료가 마우스 종양 모델 및 인간 종양 모델에서 대조군과 관련하여 마우스 수명을 2배 증가시켰다는 것을 보여준다. NP137은 단일 제제로서 안전성이 입증되었으며 177Lu 용량이 잘 특성화되어 있어 이 분자가 간단한 방법으로 종양을 치료하기 위해 전달될 수 있다.
Claims (17)
- 화합물로서,
o 항-네트린-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및
o 상기 항체 또는 단편에 결합된 킬레이트 모이어티를 포함하고,
여기서 상기 킬레이트 모이어티는 선택적으로 방사성 동위원소와 회합되어 있는 것인, 화합물. - 제1항에 있어서, 상기 항체가 하기를 포함하는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 화합물:
하기를 포함하는 가변 도메인 VH:
- 서열 번호 1로 기재된 서열을 갖는 H-CDR1;
- 서열 번호 2로 기재된 서열을 갖는 H-CDR2;
- 서열 번호 3으로 기재된 서열을 갖는 H-CDR3;
하기를 포함하는 가변 도메인 VL:
- 서열 번호 4로 기재된 서열을 갖는 L-CDR1;
- 서열 YAS를 갖는 L-CDR2;
- 서열 번호 5로 기재된 서열을 갖는 L-CDR3;
또는
하기를 포함하는 가변 도메인 VH:
- 서열 번호 22로 기재된 서열을 갖는 H-CDR1;
- 서열 번호 23으로 기재된 서열을 갖는 H-CDR2;
- 서열 번호 24로 기재된 서열을 갖는 H-CDR3;
하기를 포함하는 가변 도메인 VL:
- 서열 번호 25로 기재된 서열을 갖는 L-CDR1;
- 서열 번호 26으로 기재된 서열을 갖는 L-CDR2;
- 서열 번호 5로 기재된 서열을 갖는 L-CDR3. - 제2항에 있어서, 항체가 하기 쌍으로부터 선택된 한 쌍의 VH 및 VL 서열을 포함하는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 화합물:
서열 번호 21 및 13, 서열 번호 14 및 8, 서열 번호 15 및 9, 서열 번호 16 및 10, 서열 번호 17 및 11, 서열 번호 18 및 11, 서열 번호 19 및 10, 서열 번호 20 및 11, 서열 번호 16 및 11, 서열 번호 19 및 12, 서열 번호 15 및 10. - 제2항 또는 제3항에 있어서, 항체가 인간 IgG1 불변 중쇄(CH) 및/또는 인간 IgG1 불변 경쇄(CL)를 추가로 포함하는, 화합물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 킬레이트 모이어티가 NODAGA, NODAGA-NHS, DOTA, DOTA-NHS, p-SCN-Bn-NOTA, p-SCN-Bn-PCTA, p-SCN-Bn-옥소-DO3A, 데스페리옥사민-p-SCN, 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(DTPA), 또는 1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산(TETA)을 포함하는, 화합물.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 방사성 동위원소가 68Ga, 64Cu, 89Zr, 186Re, 188Re, 153Sm, 111In, 99mTc, 123I, 177Lu, 90Y, 131I, 213Bi, 212Bi, 211At 또는 225Ac인, 화합물.
- 대상체에서 네트린(Netrin)-1의 존재 또는 국소화를 영상화하는 방법으로서,
a) 상기 대상체에게 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 하기를 포함하는 화합물을 투여하는 단계:
o 항-네트린-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
o 상기 항체 또는 단편에 결합된 킬레이트 모이어티, 및
o 킬레이트 모이어티와 회합된 방사성 동위원소;
b) 4 내지 172시간, 바람직하게는 24 내지 96시간을 기다려 종양의 세포외 기질에 격리된 네트린-1에 의한 상기 화합물의 결합을 얻는 단계;
c) 생체내 영상화에 의해 상기 결합된 화합물을 검출하거나 국소화하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제7항에 있어서, 단계 b)에서 국소화가 적어도 하나의 신체 부위, 예를 들어, 기관 또는 조직에서의 화합물의 존재 또는 축적을 강조하는 것을 포함하는, 방법.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 방사성 동위원소가 68Ga, 64Cu, 89Zr, 186Re, 188Re, 153Sm, 111In, 99mTc, 및 123I로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 화합물로서,
o 항-네트린-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
o 상기 항체 또는 단편에 결합된 킬레이트 모이어티, 및
o 킬레이트 모이어티와 회합된 방사성 동위원소를 포함하고
여기서 상기 화합물은 내부 방사선요법에 의해 네트린-1 발현 암을 치료하는데 사용하기 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 것인, 화합물. - 제10항에 있어서, 방사성 동위원소가 177Lu, 90Y, 131I, 213Bi, 212Bi, 211At 또는 225Ac인, 화합물.
- 충분한 양의 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 네트린-1 발현 암을 앓고 있는 환자에서 네트린-1 발현 암의 내부 방사선요법 치료 방법.
- 제12항에 있어서, 화합물이 177Lu, 90Y, 131I, 213Bi, 212Bi, 211At and 225Ac로 이루어진 군으로부터 선택되는 방사성 동위원소를 포함하는, 방법.
- 네트린-1 발현 암을 가진 환자를 확인하고 치료하는 방법으로서,
a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 상기 대상체에게 투여하는 단계;
b) 4 내지 172시간, 바람직하게는 24 내지 96시간을 기다려 종양의 세포외 기질에 격리된 네트린-1에 의한 상기 화합물의 결합을 얻는 단계;
c) 생체내 영상화, 바람직하게는 PET 또는 SPECT 영상화에 의해 상기 화합물을 검출하는 단계;
d) 네트린-1 존재 또는 축적의 국소화를 시각화하는 단계;
e) 시각화된 암에 대해 상기 환자를 치료하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제14항에 있어서, 단계 a)에서 투여되는 화합물이 68Ga, 64Cu, 89Zr, 186Re, 188Re, 153Sm, 111In, 99mTc, 및 123I로 이루어진 군으로부터 선택되는, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물인, 방법.
- 제14항에 있어서, 단계 e)에서 환자를 치료하는 단계가 유효량의 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 방사성 동위원소는 177Lu, 90Y, 131I, 213Bi, 212Bi, 211At and 225Ac로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 재14항에 있어서, 단계 e)에서 환자를 치료하는 단계가 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같은 유효량의 항-네트린-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
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