ES2568898T3

ES2568898T3 - Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional

Info

Publication number: ES2568898T3
Application number: ES10180045.6T
Authority: ES
Inventors: Nobuo Hanai; Kazuyasu Nakamura; Emi Shoji; Motoo Yamasaki; Kazuhisa Uchida; Toyohide Shinkawa; Susumu Imabeppu; Yutaka Kanda; Naoko Yamane; Hideharu Anazawa
Original assignee: Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Current assignee: Kyowa Kirin Co Ltd
Priority date: 1999-04-09
Filing date: 2000-04-07
Publication date: 2016-05-05
Anticipated expiration: 2020-04-07
Also published as: US7763246B2; ES2572623T5; EP3031917A1; DK1176195T3; EP2270147A3; CY1117551T1; EP2275540B1; DK2275540T3; EP2278003B2; EP1176195A1; FR18C1021I2; EP1176195A4; CY2018015I2; NL300939I2; CY2018015I1; DK2270147T4; EP2270147A2; US7651688B2; EP2275540A2; ES2572623T3

Abstract

Anticuerpo IgG que presenta una actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo promovida, pudiendo obtenerse el anticuerpo introduciendo un gen que codifica dicho anticuerpo en una célula anfitriona, animal no humano o planta, en el que dicha célula anfitriona, animal no humano o planta, no presenta actividad de α1,6-fucosiltransferasa debido a la eliminación del gen que codifica dicha enzima o la adición de una mutación a dicho gen para eliminar dicha actividad de enzimática, y estando unida a dicho anticuerpo una cadena de azúcar unida a N-glucósido de tipo complejo bicatenaria, y en el que no está unida fucosa a la N-acetilglucosamina del extremo reductor de dicha cadena de azúcar, en el que dicha cadena de azúcar unida a N-glucósido de tipo complejo bicatenaria presenta principalmente la estructura siguiente**Fórmula** en el que el anticuerpo presenta una región constante de cadena pesada y una región constante de cadena ligera de un anticuerpo IgG humano.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

en el que el anticuerpo presenta una región constante de cadena pesada y una región constante de cadena ligera de un anticuerpo IgG humano. 5 [2]. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo reconoce un antígeno relacionado con tumores, siendo opcionalmente el antígeno relacionado con tumores el gangliósido GD3.

[3]. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo reconoce un antígeno relacionado a una 10 alergia o inflamación, siendo opcionalmente el antígeno relacionado a una alergia o inflamación la cadena α de receptor de interleucina 5 humana.

[4]. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo reconoce

15 (i) un antígeno relacionado a una enfermedad cardiovascular, o

(ii) un antígeno relacionado a una infección vírica o bacteriana.

[5]. Medicamento que comprende el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4. 20 [6]. Medicamento según la reivindicación 5, en el que dicho medicamento

(a) contiene dicho anticuerpo y está destinado a ser administrado como un fármaco terapéutico solo; o

25 (b) comprende además uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables.

[7]. Agente para la utilización en el diagnóstico, el tratamiento o la prevención de un cáncer, que comprende el anticuerpo según la reivindicación 2 como un principio activo.

30 [8]. Agente para la utilización en el diagnóstico, el tratamiento o la prevención de una alergia o inflamación, que comprende el anticuerpo según la reivindicación 3 como un principio activo.

[9]. Agente para la utilización en el diagnóstico, el tratamiento o la prevención de una enfermedad cardiovascular, que comprende el anticuerpo según la reivindicación 4 (i) como un principio activo. 35 [10]. Agente para la utilización en el diagnóstico, el tratamiento o la prevención de una infección vírica o bacteriana, que comprende el anticuerpo según la reivindicación 4 (ii) como un principio activo.

La presente divulgación proporciona asimismo los puntos (1) a (62) siguientes: 40

(1) Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional, que comprende la regulación de la presencia o ausencia de unión de fucosa a N-acetilglucosamina del terminal reductor de una cadena de azúcar unida al N-glucósido que se une a la molécula inmunofuncional.

45 (2) Procedimiento según el punto (1), en el que la cadena de azúcar unida al N-glucósido que se une a la molécula inmunofuncional comprende:

imagen4

50: (3) Procedimiento para mejorar la actividad de una molécula inmunofuncional, que comprende unir una cadena

de azúcar en la que la fucosa no está presente en N-acetilglucosamina del terminal reductor de una cadena

de azúcar unida al N-glucósido a la molécula inmunofuncional.

(4): Procedimiento según el punto (3), en el que la cadena de azúcar comprende:

55

imagen5

(5) Procedimiento según el punto (3), en el que la cadena de azúcar se sintetiza en una célula que tiene una

baja actividad enzimática de la adición de fucosa a N-acetilglucosamina del terminal reductor o no tiene 5 dicha actividad enzimática.

(6) Procedimiento según el punto (5), en el que la enzima que añade fucosa a N-acetilglucosamina de la terminal reductor es una fucosiltransferasa.

10 (7) Procedimiento según el punto (6), en el que la fucosiltransferasa es α-1,6-fucosiltransferasa.

(8) Procedimiento según el punto (3), en el que la cadena de azúcar se sintetiza en una célula de mieloma de rata.

15 (9) Procedimiento según el punto (8), en el que la célula de mieloma de rata es YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 (ATCC CRL 1662).

(10) Procedimiento para inhibir la actividad de una molécula inmunofuncional, que comprende unir una cadena

de azúcar en la que la fucosa está presente en N-acetilglucosamina del terminal reductor de una cadena de 20 azúcar unida al N-glucósido a una molécula inmunofuncional.

(11): Procedimiento según el punto (10), en el que la cadena de azúcar comprende:

(12): Procedimiento según el punto (10), en el que la cadena de azúcar se sintetiza en una célula que tiene una gran actividad enzimática de adición de fucosa a N-acetilglucosamina del terminal reductor.

imagen6

25

(13): Procedimiento según el punto (12), en el que la enzima que añade fucosa a N-acetilglucosamina del 30 terminal reductor es una fucosiltransferasa.

(14) Procedimiento según el punto (13), en el que la fucosiltransferasa es α-1,6-fucosiltransferasa.

(15): Procedimiento según el punto (1) a (14), en el que la molécula inmunofuncional es un anticuerpo, una 35 proteína o un péptido.

(16) Agente estimulante de la actividad de una molécula inmunofuncional, que comprende una cadena de azúcar en la que la fucosa no está presente en N-acetilglucosamina del terminal reductor de una cadena de azúcar unida al N-glucósido.

40

(17): Agente estimulante de la actividad de una molécula inmunofuncional según el punto (16), en el que la cadena de azúcar comprende:

(18): Agente estimulante de la actividad de una molécula inmunofuncional según el punto (16), en el que la cadena de azúcar se sintetiza en una célula que tiene una baja actividad enzimática de adición de fucosa a N-acetil-glucosamina del terminal reductor o no tiene dicha actividad enzimática.

imagen7

45

50 (19) Agente estimulante de la actividad de una molécula inmunofuncional según el punto (18), en el que la enzima que añade fucosa a N-acetilglucosamina del terminal reductor es una fucosiltransferasa.

(20) Agente estimulante de la actividad de una molécula inmunofuncional según el punto (19), en el que la

fucosiltransferasa es α-1,6-fucosiltransferasa. 55

imagen8

imagen9

5

15

25

35

45

55

(56): Agente para la prevención de una enfermedad autoinmunitaria, que comprende el anticuerpo según el punto (43) como principio activo.

(57): Agente para el diagnóstico de una infección vírica o bacteriana, que comprende el anticuerpo según el punto (44) como principio activo.

(58): Agente para el tratamiento de una infección vírica o bacteriana, que comprende el anticuerpo según el punto (44) como principio activo.

(59): Agente para la prevención de una infección vírica o bacteriana, que comprende el anticuerpo según el punto (44) como principio activo.

(60): Agente para el diagnóstico de varias enfermedades, que comprende el péptido o proteína según el punto

(26) o (27) como principio activo.

Ejemplos de las diversas enfermedades según la presente invención incluyen un cáncer, una enfermedad alérgica, una enfermedad inflamatoria, una cardiovasculopatía, una enfermedad autoinmunitaria, una infección vírica o bacteriana y similares.

(61): Agente para el tratamiento de varias enfermedades, que comprende el péptido o proteína según el punto

(60) como principio activo.

(62): Agente para la prevención de varias enfermedades, que comprende el péptido o proteína según el punto

(60) como principio activo.

Basándose en la forma de unión de moléculas inmunofuncionales, la cadena de azúcar se clasifica a grandes rasgos en dos tipos, a saber, una cadena de azúcar que se une a la asparagina (denominada cadena de azúcar unida a Nglucósido) y una cadena de azúcar que se une a la serina, treonina y similares (denominada cadena de azúcar unida a O -glucósido).

La cadena de azúcar unida a N-glucósido según la presente invención presenta varias estructuras (Biochemical Experimentation Method 23 -Method for Studying Glycoprotein Sugar Chains (Gakkai Shuppan Center), editado por Reiko Takahashi (1989)), pero cada caso tiene la siguiente estructura de núcleo básico común.

imagen10

En la estructura anterior, el terminal de la cadena de azúcar que se une a la asparagina se denomina terminal reductor, y el lado opuesto se denomina terminal no reductor. La fucosa puede unirse a N-acetilglucosamina del terminal reductor, por ejemplo, por un enlace α-1,3 o un enlace α1,6.

Los ejemplos de cadenas de azúcar unidas a N-glucósido incluyen un tipo rico en manosa, en el que sólo manosa se une al terminal no reductor de la estructura del núcleo; un tipo complejo, en el que el lado del terminal no reductor de la estructura del núcleo tiene una o más ramificaciones de galactosa-N-acetilglucosamina (denominado en adelante "Gal-GlcNAc") y el lado del terminal no reductor de Gal-GlcNAc tiene además una estructura tal como por ejemplo un ácido siálico o bisecando N-acetilglucosamina; un tipo híbrido, en el que el lado del terminal no reductor de la estructura del núcleo tiene ambas ramas de la cadena de azúcar unida al N-glucósido rico en manosa y cadena de azúcar compleja unida al N-glucósido.

Se incluye en la totalidad de estos tipos una cadena de azúcar en la que la fucosa se une a la N-acetilglucosamina del lado de terminal reductor, y la cadena de azúcar de la presente invención incluye no únicamente las cadenas de azúcar anteriormente sino asimismo cualquier otra cadena de azúcar, siempre que la fucosa no esté unida a la Nacetilglucosamina.

Una molécula inmunofuncional es una molécula que procede originalmente del cuerpo vivo y está implicada en varias respuestas inmunitarias. En concreto, incluye por ejemplo anticuerpos, proteínas y péptidos.

Un anticuerpo es una proteína que es producida in vivo por una respuesta inmunitaria como resultado de la estimulación por un antígeno extraño y tiene una actividad para unirse específicamente al antígeno. Los ejemplos del anticuerpo incluyen un anticuerpo segregado por una célula de hibridoma preparada a partir de células de bazo de un animal inmunizado después de la inmunización del animal con un antígeno, así como un anticuerpo preparado por técnicas de recombinación génica, a saber un anticuerpo obtenido introduciendo un anticuerpo que codifica el vector de expresión del anticuerpo insertado en el gen en una célula anfitriona. Los ejemplos incluyen un anticuerpo

5

15

25

35

45

55

65

producido por un hibridoma, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano.

Un hibridoma es una célula que produce un anticuerpo monoclonal que tiene una especificidad de antígeno deseada y se obtiene por fusión celular de un linfocito B preparado inmunizando un mamífero distinto del ser humano con un antígeno, con una célula de mieloma proveniente, por ejemplo de un ratón.

Los anticuerpos humanizados incluyen, por ejemplo, un anticuerpo híbrido humano, un anticuerpo injertado en una región determinante de complementariedad humana (denominada en adelante "RDC").

Un anticuerpo híbrido humano es un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada del anticuerpo (en adelante, denominada también "HV" o "VH", en el que la cadena pesada es una cadena H y la región variable es una región V) y una región variable de la cadena ligera de anticuerpo (en adelante denominada también "LV" o "VL", en el que la cadena ligera es una cadena L) proveniente de un animal no humano, una región constante de cadena pesada (en adelante denominado también "CH", en el que la región constante es una región C) de un anticuerpo humano y una región constante de cadena ligera (en adelante denominado también "CL") de un anticuerpo humano. Los animales no humanos pueden ser, por ejemplo, cualquiera de entre ratón, rata, hámster y conejo, siempre y cuando pueda prepararse un hibridoma a partir de los mismos.

El anticuerpo híbrido humano puede producirse obteniendo los ADNc que codifican VH y VL de un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal, insertando cada uno de los ADNc en un vector de expresión para una célula anfitriona que tiene un gen que codifica la CH del anticuerpo humano y la CL de anticuerpo humano para construir un vector de expresión de anticuerpo híbrido humano, y a continuación, introduciendo el vector en una célula anfitriona para expresar el anticuerpo.

Puede utilizarse cualquier CH del anticuerpo híbrido humano, siempre que pertenezca a una inmunoglobulina humana (denominado en adelante, "hIg"), pero se prefieren los de la clase hIgG y se puede utilizar cualquiera de las subclases pertenecientes a la clase hIgG, tales como hIgG1, hIgG2, hIgG3 y hIgG4. Por otra parte, puede utilizarse cualquier CL del anticuerpo híbrido humano, siempre que pertenezca a hIg, y se pueden utilizar los de la clase κ o la clase λ.

Un anticuerpo con RDC injertada humano es un anticuerpo en el que las secuencias de aminoácidos de las RDC de la VH y VL de un anticuerpo proveniente de un animal no humano se injertan a las posiciones apropiadas de la VH y VL de un anticuerpo humano.

El anticuerpo con RDC injertada humano puede producirse construyendo los ADNc que codifican las regiones V en la que las secuencias de RDC de la VH y VL de un anticuerpo provenientes de un animal no humano se injertan a las secuencias de RDC de la VH y VL de un anticuerpo proveniente de un animal no humano se injertan cada una de las ADNc en un vector de expresión para una célula anfitriona que tiene un gen que codifica la CH de un anticuerpo humano y la CL de un anticuerpo humano para construir un vector de expresión del anticuerpo con RDC injertada humano, e introduciendo el vector de expresión en una célula anfitriona para expresar el anticuerpo con RDC injertada humano.

La CH del anticuerpo con RDC injertada humano puede ser cualquier región que pertenezca a la hIg, pero se prefieren las de la clase hIgG. Cualquiera de las subclases pertenecientes a la clase hIgG, tales como hIgG1, hIgG2, hIgG3, y hIgG4 se pueden utilizar. Además, la CL del anticuerpo con RDC injertada humano puede ser cualquier región que pertenezca a hIg, y pueden utilizarse los de clase κ o la clase λ.

Un anticuerpo humano tiene que ser originalmente un anticuerpo existente de forma natural en el cuerpo humano, sino que también incluye anticuerpos obtenidos a partir de una biblioteca de fagos de anticuerpo humano y de un animal transgénico que produce anticuerpos humanos o de una planta transgénica que produce anticuerpos humanos, que se preparan basándose en avances recientes en ingeniería genética, ingeniería celular y técnicas de ingeniería de desarrollo.

El anticuerpo existente en el cuerpo humano puede obtenerse, por ejemplo, aislando un linfocito de la sangre periférica humana, inmortalizando mediante su infección con el virus EB, seguido de clonación, cultivando un linfocito capaz de producir el anticuerpo, y purificando el anticuerpo de la mezcla de cultivo.

La biblioteca de fagos de anticuerpo humano es una biblioteca en la que un fragmento de anticuerpo, tales como por ejemplo Fab o un anticuerpo monocatenario, se expresa en la superficie del fago insertando un gen de anticuerpo preparado a partir de linfocitos B humanos en un gen del fago. Un fago que expresa un fragmento de anticuerpo con la actividad de unión al antígeno deseado puede recuperarse de esta biblioteca, utilizando su actividad para unirse a un sustrato de antígeno inmovilizado como marcador. El fragmento de anticuerpo puede convertirse además en una molécula de anticuerpo humano que comprende dos cadenas H completas y dos cadenas L completas mediante técnicas de ingeniería genética.

Un animal transgénico no humano que produce anticuerpos humanos es un animal en el que un gen que codifica

imagen11

5

15

25

35

45

55

Concretamente, la cadena de azúcar se libera del anticuerpo por hidrazinolisis del anticuerpo, se lleva a cabo marcaje de fluorescencia de la cadena de azúcar con 2-aminopiridina (denominada en adelante "PA") (J. Biochem., 95, 197 (1984)), y a continuación, la cadena de azúcar se separa de un exceso de reactivo de PA por filtración en gel y se sometió a cromatografía en fase inversa. Posteriormente, cada pico de la cadena de azúcar fraccionada se analiza por cromatografía en fase normal. Basándose en estos resultados, puede estimarse la estructura de la cadena de azúcar mediante el trazado de los puntos en una cartografía en dos dimensiones de la cadena de azúcar y comparándolos con los de los patrones de la cadena de azúcar (preparado por Takara Shuzo) o una referencia (Anal. Biochem., 171, 73 (1988)).

Además, la estructura estimada por el método de cartografía de cadena de azúcar en dos dimensiones se puede confirmar por espectrometría de masas, tal como por ejemplo MALDI-TOF-MS, de cada cadena de azúcar.

2. Método para controlar la actividad de la molécula inmunofuncional

El método de la presente exposición para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional se describe a continuación utilizando inmunoglobulina G (denominada en adelante, "IgG") como ejemplo.

La cadena de azúcar unida al N-glucósido que se une a la IgG es una cadena de azúcar compleja biantenaria compuesto principalmente la siguiente estructura (denominado en adelante "biantenario").

imagen12

La presente invención también incluye las cadenas de azúcar similares en las que un azúcar ácido, ácido siálico, se añade además a Gal del terminal no reductor de la cadena de azúcar unida al N-glucósido o a una Nacetilglucosamina bisectriz se añade a la cadena de azúcar unida al N-glucósido.

En un tipo IgG, una cadena de azúcar unida al N-glucósido se une a una posición en la región Fc. Dado que un tipo IgG comprende dos cadenas H, el resto Fc está presente en dos posiciones en una molécula de anticuerpo. Por consiguiente, la región de unión de la cadena de azúcar también está presente en dos posiciones.

La actividad de IgG cambia en función del número de cadenas de azúcar unidas al N-glucósido en las que la fucosa no está unida a N-acetilglucosamina, para añadirse a las dos regiones de unión de la cadena de azúcar anterior. Es decir, cuando la cadena de azúcar unida al N-glucósido en la que la fucosa no está unida a N-acetil-glucosamina se añade a por lo menos una de las regiones de unión de la cadena de azúcar, aumenta la actividad de la molécula inmunofuncional. Como ejemplo, el grado de actividad de IgG será la siguiente: anticuerpo F0 > anticuerpo F1 > anticuerpo F2, en el que el anticuerpo F0 designa un anticuerpo en el que la cadena de azúcar unida a N-glucósido en el que la fucosa no está unida a N-acetilglucosamina se añade a ambas dos regiones de unión a las cadenas de azúcar; el anticuerpo F1 designa un anticuerpo en el que la cadena de azúcar unida a N-glucósido en la que la fucosa no está unida a N-acetilglucosamina se añade a una de las regiones de unión de la cadena de azúcar, y el anticuerpo F2 designa un anticuerpo en el que la cadena de azúcar unida al N-glucósido en la que la fucosa está unida a N-acetilglucosamina se añade a ambas regiones de unión de la cadena de azúcar.

El anticuerpo producido no siempre puede tener una sola estructura de cadena de azúcar, y el anticuerpo F0, el anticuerpo F1 y el anticuerpo F2 puede estar presente como una mezcla cuando se tiene en cuenta la presencia o ausencia de fucosa. Para controlar la actividad de ADCC del anticuerpo producido, la cadena de azúcar unida al anticuerpo se analiza utilizando el método anterior para analizar la cadena de azúcar de una molécula inmunofuncional, y utilizando el resultado analizado como índice.

La actividad de ADCC del anticuerpo producido puede estimularse aumentando de la relación existente entre el anticuerpo F1 y el anticuerpo F0. Concretamente, el anticuerpo F1 y el anticuerpo F0 pueden purificarse, o la expresión en una célula anfitriona pueden regularse de tal manera que la cadena de azúcar unida al N-glucósido en la que la fucosa no está unida a N-acetilglucosamina se añade a la molécula inmunofuncional.

La actividad de ADCC del anticuerpo producido puede inhibirse aumentando la proporción existente del anticuerpo F2. Concretamente, el anticuerpo F2 puede purificarse, o la expresión en una célula anfitriona puede regularse de tal manera que la cadena de azúcar unida al N-glucósido en la que la fucosa está unida a N-acetilglucosamina se añade a la molécula inmunofuncional.

Como se describió anteriormente, la fuerza de la actividad deseada puede controlarse regulando la proporción existente de anticuerpo F0, anticuerpo F1 y anticuerpo F2.

imagen13

imagen14

imagen15

5

15

25

35

45

55

65

interés. El ADNc sintetizado se clona en un vector, tal como un fago o un plásmido, para preparar una biblioteca de ADNc. Un fago recombinante o un plásmido recombinante que contiene un ADNc que codifica la región V de la cadena H y un fago recombinante o un plásmido recombinante que contiene un ADNc que codifica la región V de la cadena L se aíslan respectivamente de la biblioteca utilizando un resto de la región C o un resto de la región V de un anticuerpo conocido de ratón como sonda. Se determinan las secuencias completas de nucleótidos de las regiones V de la cadena H y de la cadena L del anticuerpo de ratón de interés en el fago recombinante o en el plásmido recombinante, y las secuencias de aminoácidos completas de las regiones V de la cadena H y de la cadena L se deducen a partir de las secuencias de nucleótidos.

El animal no humano puede ser cualquier animal, tal como, por ejemplo, ratón, rata, hámster o conejo, siempre que una célula de hibridoma pueda producirse a partir de los mismos.

El procedimiento para la preparación de ARN completo a partir de una célula de hibridoma incluye un método de tiocianato de guanidina-trifluoroacetato de cesio (Methods in Enzymol., 154, 3 (1987)). El procedimiento para la preparación de ARNm a partir de ARN completo incluye, por ejemplo, un método de columna oligo (dT) inmovilizada en celulosa (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab.. Press, Nueva York, 1989).También, el kit de aislamiento de ARNm Fast Track (producido por Invitrogen), el kit de purificación de ARNm Quick Prep (producido por Pharmacia) pueden ponerse como ejemplos de un kit para la preparación de ARNm a partir de una célula de hibridoma.

Ejemplos del procedimiento para la síntesis de ADNc y la preparación de una biblioteca de ADNc incluyen procedimientos convencionales (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab.. Press, Nueva York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, suplemento 1-34), un procedimiento que utiliza un kit disponible en el mercado, tal como Super Script™ Plasmid System para la síntesis de ADNc y la clonación de plásmidos (preparado por GIBCO BRL) o el kit ZAP-ADNc (producido por Stratagene).

El vector en el que el ADNc sintetizado utilizando ARNm extraído de una célula de hibridoma se inserta en la preparación de una biblioteca de ADNc puede ser cualquier vector, siempre que el ADNc se puede insertar. Los ejemplos incluyen ZAP Express (Strategies, 5, 58 (1992)), PBluescript II SK (+) (Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)), λzapII (producido por Stratagene), λgt10 y λgt11 (DNA Cloning: A Practical Approach, I, 49 (1985)), Lambda BlueMid (producido por Clontech), λExCell y pT7T3 18U (producido por Pharmacia), pcD2 (Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)) y PUC18 (Gene, 33, 103 (1985)).

Las E. coli que van a utilizarse para la introducción de la biblioteca de ADNc construida por un vector fago o plásmido pueden ser cualquier cepa, siempre y cuando la biblioteca de ADNc pueda introducirse, expresarse y mantenerse. Los ejemplos incluyen XL1-Blue MRF ' (Strategies, 5, 81 (1992)), C600 (Genetics, 39, 440 (1954)), Y1088 e Y1090 (Science, 222, 778 (1983)), NM522 (J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)), K802 (J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)) y JM105 (Gene, 38, 275 (1985)).

Un método de hibridación de colonias o hibridación en placa que utiliza un isótopo o sonda marcada con fluorescencia puede utilizarse para seleccionar un clon de ADNc que codifica las regiones V de cadena H y de cadena L de un anticuerpo proveniente de un animal no humano de la biblioteca de ADNc (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab.. Press, Nueva York, 1989). Además, el ADNc que codifica las regiones V de la cadena H y de la cadena L se pueden preparar por reacción en cadena de la polimerasa (denominada en adelante "RCP"; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab.. Press, Nueva York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, suplemento 1-34) preparando cebadores y utilizando ADNc preparado a partir de ARNm o una biblioteca de ADNc como plantilla.

La secuencia de nucleótidos del ADN seleccionada por el procedimiento anterior se puede determinar, por ejemplo, digeriendo del ADNc con enzimas de restricción apropiados, clonando los fragmentos en un plásmido, tal como pBluescript SK (-) (producido por Stratagene), llevando a cabo la reacción por un método de análisis de nucleótidos utilizado habitualmente, tal como el método didesoxi de Sanger et al.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)), y a continuación, analizando la secuencia utilizando un analizador automático de secuencia de nucleótidos tal como el secuenciador de ADN A.L.F. (producido por Pharmacia).

Si el ADNc obtenido codifica toda la secuencia de aminoácidos de las regiones V de la cadena H y de la cadena L del anticuerpo que contiene una secuencia señal de secreción puede confirmarse estimando la secuencia de aminoácidos completa de las regiones V de la cadena H y de la cadena L de la secuencia de nucleótidos determinada y comparándola con las secuencias de aminoácidos completas de las regiones V de la cadena H y de la cadena L de los anticuerpos conocidos (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991).

(3) Análisis de la región V de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo proveniente de animales no humanos

En cuanto a la secuencia de aminoácidos completa de las regiones V de la cadena H y de la cadena L del anticuerpo que comprende una secuencia señal de secreción, la longitud y la secuencia de aminoácidos del terminal

5

15

25

35

45

55

65

N de la secuencia señal de secreción puede estimarse y los subgrupos a los que pertenecen puede conocerse comparándola con secuencias de aminoácidos completas de las regiones V de la cadena H y de la cadena L de anticuerpos conocidos (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991). Cada secuencia de aminoácidos de RDC de las regiones V de la cadena H y de la cadena L puede identificarse también comparándola con secuencias de aminoácidos de las regiones V de la cadena H y de la cadena L de anticuerpos conocidos (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991).

(4): Construcción del vector de expresión de anticuerpo híbrido humano

Un vector de expresión de anticuerpo híbrido humano puede construirse clonando ADNc que codifica las regiones V de la cadena H y de la cadena L de un anticuerpo proveniente de un animal no humano corriente arriba de un gen que codifica las regiones C de la cadena H y de la cadena L de un anticuerpo humano en el vector de expresión de anticuerpo humanizado descrito en el punto 4 (1). Por ejemplo, un vector de expresión del anticuerpo híbrido humano puede producirse conectando los ADNc que codifican las regiones V de la cadena H y de la cadena L provenientes de un anticuerpo de un animal no humano, respectivamente, con un ADNc sintético que comprende unas secuencias de nucleótidos del lado del terminal 3' de las regiones V de la cadena H y de la cadena L de un anticuerpo proveniente de un animal no humano, una secuencia de nucleótidos del lado del terminal 5' de las regiones C de la cadena H y de la cadena L provenientes de un anticuerpo humano y secuencias que reconocen a la enzima de restricción apropiada en ambos extremos terminales, y la clonación de ellos corriente arriba de un gen que codifica las regiones C de la cadena H y L de de la cadena de un anticuerpo humano en el vector de expresión de anticuerpo humanizado descrito en el punto 4 (1) de tal manera que se expresan en una forma adecuada.

(5): Construcción de ADNc que codifica la región V del anticuerpo con RDC injertada humano

El ADNc que codifica las regiones V de la cadena H y de la cadena L provenientes de un anticuerpo con RDC injertada humano se pueden obtener como se describe a continuación. En primer lugar, se selecciona la secuencia de aminoácidos del marco (denominado en adelante, "FR") de las regiones V de la cadena H y de cadena L de un anticuerpo humano para injertar RDC de las regiones V de la cadena H y de cadena L de un anticuerpo proveniente de un animal no humano. Se puede utilizar cualquier secuencia como la secuencia de aminoácidos de FR de las regiones V de la cadena H y de cadena L de un anticuerpo humano, con tal de provenga de un anticuerpo humano. Por ejemplo, pueden utilizarse las secuencias de aminoácidos de FR de las regiones V de la cadena H y de la cadena L de anticuerpos humanos registrados en una base de datos, tal como el Protein Data Bank, una secuencia de aminoácidos común en cada subgrupo de FR de regiones V de la cadena H y de la cadena L de anticuerpos humanos (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991) y similares, pero para preparar un anticuerpo con RDC injertada humano que tiene suficiente actividad, es deseable seleccionar una secuencia de aminoácidos que tenga una gran homología (por lo menos del 60% o más) con la secuencia de aminoácidos objetivo de las regiones V de la cadena H y de la cadena L de un anticuerpo proveniente de un animal no humano.

A continuación, la secuencia de aminoácidos objetivo de RDC de las regiones V de la cadena H y de cadena L de un anticuerpo proveniente de un animal no humano se injerta a la secuencia de aminoácidos seleccionada de FR de las regiones V de la cadena H y de la cadena L de un anticuerpo humano, y se diseñan las secuencias de aminoácidos de las regiones V de la cadena H y de la cadena L del anticuerpo con RDC injertada humano. Teniendo en cuenta la utilización de codones hallada en la secuencia de nucleótidos del gen del anticuerpo (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991), las secuencias de aminoácidos diseñadas se convierten en secuencias de ADN y se diseñan las secuencias de ADN que codifican las secuencias de aminoácidos de las regiones V de la cadena H y de la cadena L del anticuerpo con RDC injertada humano. Basándose en las secuencias de ADN diseñadas, se sintetizan varios fragmentos de ADN sintéticos que tienen una longitud de aproximadamente 100 bases, y la RCP se lleva a cabo utilizando estos fragmentos. En este caso, basándose en la eficacia de la reacción en la RCP y la longitud del ADN que se puede sintetizar, es deseable diseñar 6 fragmentos de ADN sintético para cada cadena H y cadena L.

Además, la clonación en el vector para la expresión del anticuerpo humanizado construido en el punto 4 (1) puede llevarse a cabo fácilmente introduciendo la enzima de restricción apropiada que reconoce secuencias en los terminales 5' del ADN sintético situado en ambos extremos. Después de la RCP, un plásmido con una secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de las regiones V de la cadena H y de la cadena L del anticuerpo con RDC injertada humano deseado se obtiene por clonación del producto ampliado en el plásmido, tal como pBluescript SK (-) (producido por Stratagene), y determinación de la secuencia de nucleótidos mediante el método descrito en el punto 4 (2).

(6) Modificación de la secuencia de aminoácidos de la región V del anticuerpo con RDC injertada humano

Se sabe que cuando sólo la RDC de las regiones V de la cadena H y de la cadena L de un anticuerpo proveniente de un animal no humano de interés se injerta simplemente a la la FR de las regiones V de la cadena H y de cadena L de un anticuerpo humano, la actividad de unión al antígeno del anticuerpo con RDC injertada humano se reduce

imagen16

5

15

25

35

45

55

65

elimina o la actividad enzimática se reduce o elimina añadiendo una mutación al gen se puede utilizar también como una célula productora de anticuerpos.

Los ejemplos específicos incluyen las células de mieloma de ratón, tales como la célula NS0 y la célula SP2/0, las células de ovario de hámster chino, tales como la célula CHO/dhfr y la célula CHO/DG44; células de mieloma de rata, tales como la célula YB2/0 y la célula IR983F; células de mieloma humano, tal como las células Namalwa. Preferentemente, pueden utilizarse las células de ovario de hámster chino, tales como las células CHO/DG44.

Después de la introducción del vector de expresión, se puede seleccionar el transformante capaz de producir de manera estable el anticuerpo humanizado utilizando un medio para el cultivo de células animales que contiene un fármaco, tal como sulfato de G418 (denominado en adelante "G418"; producido por SIGMA) por el método descrito en la solicitud de patente japonesa nº 257891/90 publicada no examinada. El medio de cultivo de células animales incluye, por ejemplo, medio RPMI 1640 (producido por Nissui Pharmaceutical), medio GIT (producido por Nippon Pharmaceutical), medio EX-CELL 302 (producido por JRH), medio IMDM (producido por GIBCO BRL), medio de Hibridoma-SFM (producido por GIBCO BRL), o un medio preparado añadiendo diversos aditivos, tales como suero bovino fetal (denominado en adelante "SBF"), a cada uno de estos medios. El anticuerpo humanizado puede producirse cultivando del transformante obtenido en un medio, y acumularse en un sobrenadante de cultivo. La cantidad producida y la actividad de unión al antígeno del anticuerpo humanizado en el sobrenadante de cultivo se pueden medir por el ensayo inmunoabsorbente con enzima ligada (en adelante denominado "ELISA"; Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, capítulo 14, 1998; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996). Además, la producción del anticuerpo humanizado por el transformante puede aumentarse utilizando un sistema de ampliación del gen DHFR por el procedimiento descrito en la solicitud de patente japonesa nº 257891/90 publicada no examinada.

El anticuerpo humanizado se puede purificar a partir de un sobrenadante de cultivo que contiene transformante utilizando una columna de proteína A (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, capítulo 8, 1988; Anticuerpos monoclonales: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996). También, se pueden utilizar otros procedimientos de purificación utilizados generalmente para la purificación de la proteína. Por ejemplo, se puede purificar por una combinación de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico y ultrafiltración. El peso molecular de la cadena H, de la cadena L o de la molécula completa de anticuerpo del anticuerpo humanizado purificado se puede medir mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (denominado en adelante "SDS-PAGE"; Nature, 227, 680 (1970)), Método de inmunotransferencia Western (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, capítulo 12, 1988; Anticuerpos monoclonales: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996).

Un procedimiento de producción de anticuerpos se ha demostrado anteriormente utilizando una célula animal como anfitriona, y tal como se describe en el anterior punto 3, puede producirse también por una bacteria, una levadura, una célula de insecto, una célula vegetal, un animal o un vegetal.

(9) Evaluación de actividad de anticuerpo humanizado

La actividad del anticuerpo humanizado purificado para unirse a un antígeno o a una estirpe celular cultivada al antígeno se puede medir por el método ELISA y anticuerpos de fluorescencia (Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)). La actividad citotóxica para estirpes celulares cultivadas positivas a antígenos se puede evaluar determinando su actividad de CDC, actividad de ADCC (Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)). Además, los efectos de seguridad y terapéuticos del anticuerpo humanizado en seres humanos pueden evaluarse utilizando un modelo apropiado de una especie animal relativamente próxima a los humanos, tales como Macaca faseicularis.

5. Procedimiento de aplicación de la molécula inmunofuncional

Como se muestra en el anticuerpo humanizado descrito en el punto 4 anterior, un anticuerpo que tiene una alta actividad de ADCC es útil en la prevención y el tratamiento de varias enfermedades, incluyendo un cáncer, una alergia, una cardiovasculopatía y una infección vírica o bacteriana.

En el cáncer, es decir, un tumor maligno, las células cancerosas proliferan. Los agentes contra el cáncer convencionales tienen una característica de inhibición la proliferación de las células cancerosas. Por otro lado, ya que un anticuerpo que tiene una alta actividad de ADCC puede tratar cánceres al afectar la proliferación de las células cancerosas por su efecto citotóxico, que es más eficaz como fármaco terapéutico que los agentes anticancerosos convencionales.

Puesto que la liberación de una molécula mediadora de las células inmunitarias provoca la reacción alérgica, ésta puede ser inhibida por la eliminación de las células inmunitarias utilizando un anticuerpo que tiene una alta actividad de ADCC.

La cardiovasculopatía incluye, por ejemplo, la arteriosclerosis. La arteriosclerosis se trata actualmente mediante catéter con globo, pero las cardiovasculopatías puede prevenirse y tratarse inhibiendo la proliferación de las células

imagen17

imagen18

imagen19

imagen20

imagen21

imagen22

5

15

25

35

45

55

1.: Actividad de unión de los anticuerpos anti-GD3 híbridos a GD3 (ELISA)

La actividad de los cinco anticuerpos anti-GD3 híbridos purificados obtenidos en el punto 4 anterior del ejemplo 1 para unirse a GD3 (producido por Snow Brand Milk Products) se determinó por el ensayo ELISA mostrado en el punto 3 del ejemplo 1. La Fig. 2 muestra un resultado del examen de la actividad de unión medida cambiando la concentración del anticuerpo híbrido anti-GD3 que debe añadirse. Como se muestra en la Fig. 2, los cinco anticuerpos anti-GD3 híbridos mostraron casi la misma actividad de unión a GD3. Este resultado demuestra que las actividades de unión al antígeno de estos anticuerpos son constantes independientemente de las células de origen animal productoras de anticuerpos y sus métodos de cultivo. Además, se sugirió a partir de la comparación del anticuerpo NS0-GD3 híbrido (302) con el anticuerpo NS0-GD3 híbrido (GIT) que las actividades de unión al antígeno son constantes independientemente de los medios utilizados en el cultivo.

2.: Actividad citotóxica in vitro (actividad de ADCC) del anticuerpo anti-GD3 híbrido

Con objeto de evaluar la actividad citotóxica in vitro de los cinco anticuerpos anti-GD3 híbridos purificados obtenidos en el punto 4 anterior del ejemplo 1, se determinó la actividad de ADCC según el siguiente procedimiento.

(1): Preparación de la solución de células diana

Se cultivó una estirpe celular G-361 cultivada de melanoma humano (ATCC CRL 1424) utilizando el medio RPMI1640-SBF (10) para preparar 1×106 células, y las células se marcaron con radioisótopos haciéndolas reaccionar con 3,7 MBq equivalentes de una sustancia radiactiva Na251CrO4 a 37°C durante 1 hora. Después de la reacción, las células se lavaron tres veces con su suspensión en el medio RPMI1640-SBF (10) y centrifugación, se volvieron a poner en suspensión en el medio y a continuación se dejó reposar a 4°C durante 30 minutos en hielo para la disolución espontánea de la sustancia radiactiva. Después de la centrifugación, el precipitado se ajustó a 2×105 células/ml mediante la adición de 5 ml de la RPMI1640-SBF (10) y se utilizó como solución de células diana.

(2): Preparación de la solución de células efectoras

Se recogieron 50 ml de sangre venosa de una persona sana, y se mezclaron suavemente con 0,5 ml de heparina sódica (producida por Takeda Pharmaceutical). La mezcla se centrifugó para aislar una capa de células mononucleares utilizando Lymphoprep (producido por Nycomed Pharma AS) según las instrucciones del fabricante. Después de lavar con el medio RPMI1640-SBF (10) de centrifugación tres veces, el precipitado resultante se volvió a poner en suspensión para proporcionar una densidad de 2 × 106 células/ml utilizando el medio y se utilizó como solución de células efectoras.

(2): Medición de la actividad de ADCC

En cada pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo en forma de U (fabricada por Falcon), se repartieron 50 µl de la solución de células diana preparada en el punto (1) anterior (1 × 104 células/pocillo). A continuación se añadieron a la misma 100 µl de la solución de células efectoras preparada en el punto (2) anterior (2 × 105 células/pocillo, la proporción de células efectoras a células diana llega a ser 20:01). Posteriormente, se añadió cada uno de los anticuerpos anti-GD3 híbridos para proporcionar una concentración final de 0,0025 a 2,5 µg/ml, seguido de reacción a 37°C durante 4 horas. Después de la reacción, la placa se centrifugó, y se midió la cantidad de 51Cr en el sobrenadante utilizando un contador γ. La cantidad de 51Cr liberado espontáneamente se calculó mediante la misma operación utilizando sólo el medio en lugar de la solución de células efectoras y la solución de anticuerpo y midiendo la cantidad de 51Cr en el sobrenadante. La cantidad de 51Cr liberado total se calculó mediante la misma operación utilizando sólo el medio en lugar de la solución de anticuerpos y añadiendo ácido clorhídrico 1 N en lugar de la solución de células efectoras, y midiendo la cantidad de 51Cr en el sobrenadante. La actividad de ADCC se calculó a partir de la siguiente ecuación.

imagen23

Los resultados se muestran en la Fig. 3. Como se muestra en la Fig. 3, entre los cinco anticuerpos anti-GD3 híbridos, el anticuerpo YB2/0-GD3 híbrido mostró la mayor actividad de ADCC, seguido por el anticuerpo SP2/0-GD3 híbrido, el anticuerpo NSO-GD3 híbrido y el anticuerpo híbrido CHO-GD3 en ese orden. No se encontró diferencia en la actividad de ADCC entre el anticuerpo NS0-GD3 híbrido (302) y el anticuerpo NS0-GD3 híbrido (GIT) preparado utilizando diferentes medios en el cultivo. Los resultados anteriores demuestran que la actividad de ADCC de anticuerpos varía en gran medida dependiendo de las células animales que van a utilizarse en su producción. Como su mecanismo, ya que sus actividades de unión al antígeno eran idénticas, se considera que estaba producida por una diferencia en la estructura de la región Fc de anticuerpo.

imagen24

imagen25

imagen26

imagen27

imagen28

imagen29

imagen30

imagen31

5

15

25

45

55

Mientras que la cantidad de transcripción de FUT8 de la estirpe de células YB2/0 fue de aproximadamente 0,1% de β-actina, la de la estirpe celular CHO fue de 0,5 a 2%.

Basándose en los resultados anteriores, se demostró que la cantidad de producto de transcripción FUT8 en la estirpe celular YB2/0 fue significativamente más pequeña que la de la estirpe celular CHO.

Aplicabilidad industrial

La presente exposición se refiere a una cadena de azúcar que controla la actividad de una molécula inmunofuncional, tal como un anticuerpo, una proteína o un péptido, así como un anticuerpo, una proteína o un péptido que tiene la cadena de azúcar. La presente exposición se refiere además a procedimientos para la producción de la cadena de azúcar y un anticuerpo, una proteína o un péptido que tiene la cadena de azúcar, así como a un agente de diagnóstico, un agente preventivo y un agente terapéutico que contiene estos productos como principio activo.

Las cláusulas numeradas siguientes son asimismo divulgadas explícitamente en la presente memoria:

1. Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional, que comprende regular la presencia

o ausencia de unión de la fucosa a la N-acetilglucosamina del terminal reductor de una cadena de azúcar unida a Nglucósido que se une a la molécula inmunofuncional.

2.: Procedimiento según la cláusula 1, en el que la cadena de azúcar unida a N-glucósido que se une a la molécula inmunofuncional comprende:

3.: Procedimiento para aumentar la actividad de una molécula inmunofuncional, que comprende la unión de una cadena de azúcar en la que la fucosa no se encuentra presente en la N-acetilglucosamina del terminal reductor de una cadena de azúcar unida a N-glucósido a una molécula inmunofuncional.

4.: Procedimiento según la cláusula 3, en el que la cadena de azúcar comprende:

5.: Procedimiento según la cláusula 3, en el que la cadena de azúcar es sintetizada en una célula que presenta una actividad enzimática baja de adición de la fucosa a la N-acetilglucosamina del terminal reductor o no presenta dicha actividad enzimática.

6.: Procedimiento según la cláusula 5, en el que la enzima que añade la fucosa a la N-acetilglucosamina del terminal reductor es una fucosiltransferasa.

7.: Procedimiento según la cláusula 6, en el que la fucosiltransferasa es la α1,6-fucosiltransferasa.

8.: Procedimiento según la cláusula 3, en el que la cadena de azúcar es sintetizada en una célula de mieloma de rata.

9.: Procedimiento según la cláusula 8, en el que la célula de mieloma de rata es la célula YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 (ATCC CRL 1662).

10.: Procedimiento para inhibir la actividad de una molécula inmunofuncional, que comprende unir una cadena de azúcar en la que la fucosa se encuentra presente en la N-acetilglucosamina del terminal reductor de una cadena de azúcar unida a N-glucósido a una molécula inmunofuncional.

11.: Procedimiento según la cláusula 10, en el que cadena de azúcar comprende:

imagen32

imagen33

imagen34

12. Procedimiento según la cláusula 10, en el que la cadena de azúcar es sintetizada en una célula que presenta 5 una actividad enzimática elevada de adición de la fucosa a la N-acetilglucosamina del terminal reductor.

13. Procedimiento según la cláusula 12, en el que la enzima que añade la fucosa a la N-acetilglucosamina del terminal reductor es una fucosiltransferasa.

10 14. Procedimiento según la cláusula 13, en el que la fucosiltransferasa es la α1,6-fucosiltransferasa.

15. Procedimiento según cualquiera de las cláusulas 1 a 14, en el que la molécula inmunofuncional es un anticuerpo, una proteína o un péptido.

15 16. Agente de estimulación de la actividad de una molécula inmunofuncional, que comprende una cadena de azúcar en la que la fucosa no se encuentra presente en la N-acetilglucosamina del terminal reductor de una cadena de azúcar unida a N-glucósido.

17. Agente de estimulación de la actividad de una molécula inmunofuncional según la cláusula 16, en el que la 20 cadena de azúcar comprende:

imagen35

18. Agente de estimulación de la actividad de una molécula inmunofuncional según la cláusula 16, en el que la

25 cadena de azúcar es sintetizada en una célula que presenta una actividad enzimática baja de adición de la fucosa a la N-acetilglucosamina del terminal reductor o no presenta dicha actividad enzimática.

19. Agente de estimulación de la actividad de una molécula inmunofuncional según la cláusula 18, en el que la

enzima que añade la fucosa a la N-acetilglucosamina del terminal reductor es una fucosiltransferasa. 30

20. Agente de estimulación de la actividad de una molécula inmunofuncional según la cláusula 19, en el que la fucosiltransferasa es la α1,6-fucosiltransferasa.

21. Agente de estimulación de la actividad de una molécula inmunofuncional según la cláusula 16, en el que la 35 cadena de azúcar es sintetizada en una célula de mieloma de rata.

22. Agente de estimulación de la actividad de una molécula inmunofuncional según la cláusula 21, en el que la célula de mieloma de rata es la célula YB2/3HL.P2.G11:16Ag.20 (ATCC CRL 1662).

40 23. Agente de estimulación de la actividad de una molécula inmunofuncional según cualquiera de las cláusulas 16 a 22, en el que la molécula inmunofuncional es un anticuerpo, una proteína o un péptido.

24. Molécula inmunofuncional que presenta una actividad inmunofuncional estimulada, estando unida a dicha

molécula una cadena de azúcar en la que la fucosa no se encuentra presente en la N-acetilglucosamina del terminal 45 reductor de una cadena de azúcar unida a N-glucósido.

25. Molécula inmunofuncional que presenta una actividad inmunofuncional inhibida, estando unida a dicha molécula una cadena de azúcar en la que la fucosa se encuentra presente en la N-acetilglucosamina del terminal reductor de una cadena de azúcar unida a N-glucósido.

50

26. Molécula inmunofuncional según la cláusula 24, en la que la molécula inmunofuncional es un anticuerpo, una proteína o un péptido.

27. Molécula inmunofuncional según la cláusula 25, en la que la molécula inmunofuncional es un anticuerpo, una 55 proteína o un péptido.

28. Procedimiento para producir la molécula inmunofuncional según la cláusula 24, que comprende utilizar una célula que presenta una actividad enzimática baja de adición de la fucosa a la N-acetilglucosamina del terminal reductor o no presenta dicha actividad enzimática.

imagen36

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Anticuerpo IgG que presenta una actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo promovida,

5

pudiendo obtenerse el anticuerpo introduciendo un gen que codifica dicho anticuerpo en una célula anfitriona,

animal no humano o planta, en el que dicha célula anfitriona, animal no humano o planta, no presenta actividad

de α1,6-fucosiltransferasa debido a la eliminación del gen que codifica dicha enzima o la adición de una mutación

a dicho gen para eliminar dicha actividad de enzimática,

10

y estando unida a dicho anticuerpo una cadena de azúcar unida a N-glucósido de tipo complejo bicatenaria, y en

el que no está unida fucosa a la N-acetilglucosamina del extremo reductor de dicha cadena de azúcar, en el que

dicha cadena de azúcar unida a N-glucósido de tipo complejo bicatenaria presenta principalmente la estructura

siguiente

imagen1

en el que el anticuerpo presenta una región constante de cadena pesada y una región constante de cadena ligera de un anticuerpo IgG humano.

20 2. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo reconoce un antígeno relacionado con tumores, siendo opcionalmente el antígeno relacionado con tumores el gangliósido GD3.
3. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo reconoce un antígeno relacionado a una alergia o

inflamación, siendo opcionalmente el antígeno relacionado a una alergia o inflamación la cadena α de receptor de 25 interleucina 5 humana.
4. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo reconoce

(i) un antígeno relacionado a una enfermedad cardiovascular, o 30 (ii) un antígeno relacionado a una infección vírica o bacteriana.
5. Medicamento que comprende el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Medicamento según la reivindicación 5, en el que dicho medicamento 35

(a)

contiene dicho anticuerpo y está destinado a ser administrado como un fármaco terapéutico solo; o

(b)

comprende además uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables.
7. Agente para la utilización en el diagnóstico, el tratamiento o la prevención de un cáncer, que comprende el 40 anticuerpo según la reivindicación 2 como un principio activo.
8. Agente para la utilización en el diagnóstico, el tratamiento o la prevención de una alergia o inflamación, que comprende el anticuerpo según la reivindicación 3 como un principio activo.

45 9. Agente para la utilización en el diagnóstico, el tratamiento o la prevención de una enfermedad cardiovascular, que comprende el anticuerpo según la reivindicación 4 (i) como un principio activo.
10. Agente para la utilización en el diagnóstico, el tratamiento o la prevención de una infección vírica o bacteriana,

que comprende el anticuerpo según la reivindicación 4 (ii) como un principio activo. 50

42