JP2024504493A - B細胞媒介性免疫応答を調節するための方法及び手段 - Google Patents
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Abstract
本発明は、特定の比率の可溶性単一一価抗原及び複合多価抗原とB細胞を接触させることによる、B細胞媒介性免疫応答の標的調節のための方法及び手段に関する。B細胞免疫の標的調節は、抗体媒介性免疫に関連する様々な状態の診断及び療法のために哺乳動物で使用することができる。そのような状態としては、がん、自己免疫疾患、病原性感染症、炎症性疾患、アレルギー、及び食物不耐症などの増殖性疾患が挙げられる。本発明は、複合多価抗原構造が強いIgG型抗体B細胞応答を誘導する一方で、驚くべきことに一価抗原構造がそのようなIgG応答を抑制する能力を有する、又は自己抗原保護IgM応答の場合には特に保護オリゴマー抗インスリン抗体を誘導するという観察に基づいている。この点に関する本発明は、方法、組成物、治療薬、診断薬、及び食品添加物を提供する。【選択図】なし
Description
本発明は、特定の比率の可溶性単一一価抗原及び複合多価抗原とB細胞を接触させることによる、B細胞媒介性免疫応答の標的調節のための方法及び手段に関する。B細胞免疫の標的調節は、抗体媒介性免疫に関連する様々な状態の診断及び療法のために哺乳動物で使用することができる。そのような状態としては、がん、自己免疫疾患、病原性感染症、炎症性疾患、アレルギー、及び食物不耐症などの増殖性疾患が挙げられる。本発明は、複合多価抗原構造が強いIgG型抗体B細胞応答を誘導する一方で、驚くべきことに一価抗原構造がそのようなIgG応答を抑制する能力を有する、又は自己抗原保護IgM応答の場合には特に保護オリゴマー抗インスリン抗体を誘導するという観察に基づいている。この点に関する本発明は、方法、組成物、治療薬、診断薬、及び食品添加物を提供する。
自己寛容性は、自己免疫反応を回避することによって生理学的完全性を維持するために重要である。現在、絶対的な中枢及び末梢耐性は、B細胞発達中のB細胞受容体(BCR)レパートリーを制御し、それによって自己反応性B細胞の陽性選択を防止すると考えられている[1,2,4]。中枢耐性は、骨髄における早期B細胞発達中の自己反応性B細胞の欠失を強制すると仮定される[2、5~7]。更に、クローン欠失を逃れる自己反応性B細胞が受容体編集に供され、非自己反応性BCR特異性をもたらしている[8~10]。中枢耐性を回避し末梢に移動する自己反応性B細胞は、主にIgM BCR発現の抑制的調節によって無応答性をもたらすクローン性アネルギー(末梢耐性)によって相殺される[1,11~13]。しかしながら、血清IgMの大部分が自己反応性であるという所見は、自己反応性の一般的な排除の概念とは対照的であると思われる[14]。実際、いわゆる天然多反応性IgMは、恒常性において重要な役割を果たしており[15]、自己反応性抗体の絶対的排除に相反している。
興味深いことに、疾患特異的自己反応性B細胞が免疫前レパートリー内に存在し、共通の自己抗原であるインスリンに特異的な胚中心(GC)が、中枢B細胞耐性の概念と矛盾する野生型マウスで形成され得ることが示されている[16,17]。
過去数十年間、B細胞自己免疫研究は、トランスジェニックマウスモデルに主に焦点を当てていた[1、2、5、18、19]。自己免疫を研究するためのこれらのモデルの有用性は、いくつかの理由で激しく議論されている[20]。高親和性変異自己反応性BCRによる生殖細胞系構成の置き換えは、B細胞発達中の非定型的状況をもたらすだけでなく、単一特異性レパートリーも生成する[1、5、19]。更に、それらの利用可能性、価及び形態(可溶性対膜結合)に関するこれらの抗原の特徴については、適切に対処されていない[5、18]。更に、抗原自体は、既知の自己免疫疾患とは何の関連もない[21、22]。
疫学研究によると、先進国の人口の最大5%が、関節リウマチ(RA)、全身性エリテマトーデス(SLE)、又は1型糖尿病(T1D)などの自己免疫疾患に罹患していることが示されている[21]。特に、自己抗体は、自己免疫疾患の大部分に存在し、しばしば病因の原動力である[22]。更に、抗インスリン抗体は、インスリン活性、糖尿病の発症、及びインスリン治療に重要な役割を果たす[57~59]。
したがって、対象における免疫応答、特にインスリンに対する免疫応答の存在又は活性によって誘導又は特徴付けられる状態を検出又は治療又は回避するために、免疫応答の制御可能な調節のためのアプローチを開発することが依然として必要とされている。
(発明の簡単な説明)
一般的に、簡潔な説明として、本発明の主な実施形態は、以下のように説明することができる。
一般的に、簡潔な説明として、本発明の主な実施形態は、以下のように説明することができる。
1.オリゴマー抗インスリン抗体であって、
(i)好ましくは表面プラズモン共鳴によって測定される、Kd<5×10-7のインスリン及び/若しくはプロインスリンに対する親和性を有する;かつ/又は
(ii)インスリン及び/若しくはプロインスリンに対して単一特異性である、オリゴマー抗インスリン抗体。
(i)好ましくは表面プラズモン共鳴によって測定される、Kd<5×10-7のインスリン及び/若しくはプロインスリンに対する親和性を有する;かつ/又は
(ii)インスリン及び/若しくはプロインスリンに対して単一特異性である、オリゴマー抗インスリン抗体。
2.オリゴマー抗インスリン抗体が、IgMアイソタイプの抗インスリン抗体である、実施形態1のオリゴマー抗インスリン抗体。
3.オリゴマー抗インスリン抗体が、キメラ、ヒト化、又はヒトである、実施形態1又は2のオリゴマー抗インスリン抗体。
4.免疫グロブリンが、
a)配列番号2に定義されるCDR1、配列番号3に定義されるCDR2、及び配列番号4に定義されるCDR3を含む可変重鎖(VH)、並びに配列番号6に定義されるCDR1、配列DASで定義されるCDR2、及び配列番号7に定義されるCDR3を含む可変軽鎖(VL)、
b)配列番号9に定義されるCDR1、配列番号10に定義されるCDR2、及び配列番号11に定義されるCDR3を含む可変重鎖(VH)、並びに配列番号13に定義されるCDR1、配列GASで定義されるCDR2、及び配列番号14に定義されるCDR3を含む可変軽鎖(VL)、又は
c)配列番号16に定義されるCDR1、配列番号17に定義されるCDR2、及び配列番号18に定義されるCDR3を含む可変重鎖(VH)、並びに配列番号20に定義されるCDR1、配列DASで定義されるCDR2、及び配列番号21に定義されるCDR3を含む可変軽鎖(VL)を含む、実施形態1~3のオリゴマー抗インスリン抗体。
a)配列番号2に定義されるCDR1、配列番号3に定義されるCDR2、及び配列番号4に定義されるCDR3を含む可変重鎖(VH)、並びに配列番号6に定義されるCDR1、配列DASで定義されるCDR2、及び配列番号7に定義されるCDR3を含む可変軽鎖(VL)、
b)配列番号9に定義されるCDR1、配列番号10に定義されるCDR2、及び配列番号11に定義されるCDR3を含む可変重鎖(VH)、並びに配列番号13に定義されるCDR1、配列GASで定義されるCDR2、及び配列番号14に定義されるCDR3を含む可変軽鎖(VL)、又は
c)配列番号16に定義されるCDR1、配列番号17に定義されるCDR2、及び配列番号18に定義されるCDR3を含む可変重鎖(VH)、並びに配列番号20に定義されるCDR1、配列DASで定義されるCDR2、及び配列番号21に定義されるCDR3を含む可変軽鎖(VL)を含む、実施形態1~3のオリゴマー抗インスリン抗体。
5.オリゴマー抗インスリン抗体が、
a)配列番号1のアミノ酸配列、若しくは配列番号1と少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む可変重鎖(VH)配列、及び配列番号4のアミノ酸配列、若しくは配列番号4と少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む可変軽鎖(VL)配列を含むか、
b)配列番号8のアミノ酸配列、若しくは配列番号8と少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む可変重鎖(VH)配列、及び配列番号12のアミノ酸配列、若しくは配列番号12と少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む可変軽鎖(VL)配列を含むか、又は
c)配列番号15のアミノ酸配列、若しくは配列番号15と少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む可変重鎖(VH)配列、及び配列番号19のアミノ酸配列、若しくは配列番号19と少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む可変軽鎖(VL)配列を含む、実施形態4のオリゴマー抗インスリン抗体。
a)配列番号1のアミノ酸配列、若しくは配列番号1と少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む可変重鎖(VH)配列、及び配列番号4のアミノ酸配列、若しくは配列番号4と少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む可変軽鎖(VL)配列を含むか、
b)配列番号8のアミノ酸配列、若しくは配列番号8と少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む可変重鎖(VH)配列、及び配列番号12のアミノ酸配列、若しくは配列番号12と少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む可変軽鎖(VL)配列を含むか、又は
c)配列番号15のアミノ酸配列、若しくは配列番号15と少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む可変重鎖(VH)配列、及び配列番号19のアミノ酸配列、若しくは配列番号19と少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む可変軽鎖(VL)配列を含む、実施形態4のオリゴマー抗インスリン抗体。
6.実施例1~5のいずれか1つのオリゴマー抗インスリン抗体をコードするポリヌクレオチド。
7.実施形態6のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
8.実施形態7の宿主細胞を培養することを含む、オリゴマー抗インスリン抗体を産生するための方法。
9.実施形態1~5のいずれか1つのオリゴマー抗インスリン抗体、実施形態6のポリヌクレオチド、実施形態7の宿主細胞、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
10.更なる治療剤を含む、実施形態9の医薬組成物。
11.治療に使用するための、実施形態1~5のいずれか1つのオリゴマー抗インスリン抗体、実施形態6のポリヌクレオチド、実施形態7の宿主細胞、又は実施形態9~10の医薬組成物。
12.インスリン関連疾患又は障害の治療に使用するための、実施形態1~5のいずれか1つのオリゴマー抗インスリン抗体、実施形態6のポリヌクレオチド、実施形態7の宿主細胞、又は実施形態9~10の医薬組成物。
13.インスリン関連疾患又は障害を診断及び/又は予測する方法であって、
(i)試料からのプロインスリン及び/又はインスリンに対する抗インスリンIgM抗体の結合の親和性を決定するステップであって、
試料が、対象から得られたものであり、対象が、インスリン関連疾患若しくは障害を有すると診断されるか、又はそのリスクがある、ステップと、
(ii)ステップ(i)で決定されたレベルを基準値と比較するステップと、
(iii)ステップ(ii)で行われた比較に基づいて、前記対象におけるインスリン関連疾患又は障害を診断及び/又は予測するステップであって、好ましくは、プロインスリン及び/又はインスリンに対する抗インスリンIgM抗体の結合のより低い親和性が、インスリン関連疾患又は障害のより高いリスクを示す、ステップと、を含む方法。
(i)試料からのプロインスリン及び/又はインスリンに対する抗インスリンIgM抗体の結合の親和性を決定するステップであって、
試料が、対象から得られたものであり、対象が、インスリン関連疾患若しくは障害を有すると診断されるか、又はそのリスクがある、ステップと、
(ii)ステップ(i)で決定されたレベルを基準値と比較するステップと、
(iii)ステップ(ii)で行われた比較に基づいて、前記対象におけるインスリン関連疾患又は障害を診断及び/又は予測するステップであって、好ましくは、プロインスリン及び/又はインスリンに対する抗インスリンIgM抗体の結合のより低い親和性が、インスリン関連疾患又は障害のより高いリスクを示す、ステップと、を含む方法。
14.対象がインスリン関連疾患又は障害の治療に感受性であるかどうかを決定するための方法であって、
(i)試料からのプロインスリン及び/又はインスリンに対する抗インスリンIgM抗体の結合の親和性を決定するステップであって、
試料が、対象から得られたものであり、対象が、インスリン関連疾患若しくは障害を有すると診断されるか、又はそのリスクがある、ステップと、
(ii)ステップ(i)で決定されたレベルを基準値と比較するステップと、
(iii)対象がインスリン関連疾患又は障害の前記治療に感受性であるかどうかを決定するステップであって、好ましくは、プロインスリン及び/又はインスリンに対する抗インスリンIgM抗体の結合のより低い親和性が、インスリン関連疾患又は障害の治療に対するより高い感受性を示す、ステップと、を含む方法。
(i)試料からのプロインスリン及び/又はインスリンに対する抗インスリンIgM抗体の結合の親和性を決定するステップであって、
試料が、対象から得られたものであり、対象が、インスリン関連疾患若しくは障害を有すると診断されるか、又はそのリスクがある、ステップと、
(ii)ステップ(i)で決定されたレベルを基準値と比較するステップと、
(iii)対象がインスリン関連疾患又は障害の前記治療に感受性であるかどうかを決定するステップであって、好ましくは、プロインスリン及び/又はインスリンに対する抗インスリンIgM抗体の結合のより低い親和性が、インスリン関連疾患又は障害の治療に対するより高い感受性を示す、ステップと、を含む方法。
15.インスリン関連疾患又は障害が、膵臓損傷、1型糖尿病、2型糖尿病、外因性インスリン抗体症候群、妊娠性糖尿病、及び血糖異常の群から選択される、実施形態12の使用のためのオリゴマー抗インスリン抗体、実施形態12の使用のためのポリヌクレオチド、又は実施形態12の使用のための宿主細胞、又は実施形態12の使用のための医薬組成物、実施形態13若しくは14の方法。
16.血糖異常が、膵臓損傷、1型糖尿病、2型糖尿病、外因性インスリン抗体症候群、及び妊娠糖尿病の群から選択されるインスリン関連疾患又は障害を有する患者における血糖異常である、実施形態15の使用のためのオリゴマー抗インスリン抗体、実施形態15の使用のためのポリヌクレオチド、又は実施形態15の使用のための宿主細胞、実施形態15の使用のための医薬組成物、又は実施形態15の方法。
17.少なくとも1つの一価インスリン粒子及び少なくとも1つの多価インスリン粒子の混合物で哺乳動物を免疫化することを含む、好ましくはIgMアイソタイプのオリゴマー抗インスリン及び/又は抗プロインスリン抗体を産生するための方法。
18.インスリン関連疾患又は障害の治療及び/又は予防のための方法であって、治療有効量の、実施形態1~5のいずれか1つのオリゴマー抗インスリン抗体、実施形態6のポリヌクレオチド、実施形態7の宿主細胞、又は実施形態9~10の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
図は以下を示す。
以下では、本発明の様々な実施形態について説明する。これらの要素は、特定の実施形態で列挙されているが、それらは、追加の実施形態を形成するために、任意の方法及び任意の数で組み合わされ得ることを理解されたい。様々に説明された例及び好ましい実施形態は、本発明を明示的に説明された実施形態のみに限定するものと解釈されるべきではない。この説明は、明示的に説明される実施形態のうちの2つ以上を組み合わせるか、又は明示的に説明される実施形態のうちの1つ以上を任意の数の開示される要素及び/若しくは好ましい要素と組み合わせる実施形態を支持し、包含すると理解されるべきである。更に、本出願において記載される全ての要素の任意の順列及び組み合わせは、文脈により別段に指定されない限り、本出願の説明によって開示されるとみなされるべきである。
したがって、本発明は、オリゴマー抗インスリン抗体に関し、抗体は、(i)Kd<5×10-7のインスリン及び/又はプロインスリンに対する親和性を有する。
いくつかの実施形態では、本発明は、オリゴマー抗インスリン抗体に関し、抗体は、(i)好ましくは表面プラズモン共鳴によって測定される、Kd<5×10-7のインスリン及び/若しくはプロインスリンに対する親和性を有し、かつ/又は(ii)インスリン及び/若しくはプロインスリンに対して単一特異性である。
いくつかの実施形態では、本発明は、オリゴマー抗インスリン抗体に関し、抗体は、(i)Kd<5×10-7のインスリン及び/若しくはプロインスリンに対する親和性を有し、かつ/又は(ii)インスリン及び/若しくはプロインスリンに対して単一特異性である。
抗体の文脈における「単一特異性」という用語は、本明細書で使用される場合、それぞれが同じ抗原の同じエピトープに結合する1つ以上の結合部位を有する抗体を示す。より重要なことに、本発明の文脈における「単一特異性」という用語は、インスリンなどの1つの抗原に対して高い親和性を有し、任意の他の抗原に特異的に結合しないそのような抗体に関する。この実施形態では、単一特異性抗体は、10-7nM未満、好ましくは10-8nM未満、より好ましくは10-9nM未満、最も好ましくは約10-10nMのKDでインスリンなどの自己免疫障害と関連する抗原に結合する。したがって、そのようなモノクローナルIgMは、自己免疫疾患と関連する抗原以外の抗原である無関係の抗原と結合せず、したがって、好ましくは、本発明の治療は、自己免疫疾患と関連する抗原以外の抗原である無関係の抗原に特異的な多特異性抗体の使用を含まない。いくつかの実施形態では、抗体の単一特異性は、ELISAにおいてdsDNAを認識せず、Hep-2スライドにおいて結合を示さないことで定義される(例えば、実施例4、図16C、図16D、並びに材料及び方法を参照されたい)。
「KD」という用語は、本明細書で使用される場合、Kaに対するKdの比率(すなわちKd/Ka)であり、モル濃度(M)として表される。抗体のKD値は、プラズモン共鳴(BIAcore(登録商標))、バイオ層干渉法(BLI)、ELISA、及びKINEXAなどの当該技術分野で十分に確立された方法を使用して決定することができる。抗体のKDを決定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を用いることによるもの、好ましくはBIAcore(登録商標)システムなどのバイオセンサシステムを用いることによるもの、又はELISAによるものである。「Ka」(又は「K-assoc」)は、本明細書で使用される場合、特定の抗体-抗原相互作用の会合速度を広く指し、「Kd」(又は「K-diss」)という用語は、本明細書で使用される場合、特定の抗体-抗原相互作用の解離速度を指す。別の好ましい方法は、BLIの使用である。用語「バイオ層干渉法」又は「BLI」は、2つの表面から反射される白色光の干渉パターン、すなわちバイオセンサ先端上の固定化タンパク質の層、及び内部参照層を分析する光学分析技術を指す。バイオセンサ先端に結合した分子の数の任意の変化は、リアルタイムで測定され得る干渉パターンのシフトを引き起こす。いくつかの実施形態では、Kdは、表面プラズモン共鳴によって測定される。
本明細書に記載のインスリンは、任意の供給源を有することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のインスリンは、哺乳動物インスリン、部分又は完全合成インスリン、好ましくはヒトインスリンである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のインスリンは、アスパルト、リスプロ、グルリシン、グラルギン、デテミル、デグルテクの群から選択されるインスリン類似体などのインスリン変異体又はインスリン類似体である。
本明細書に記載の抗インスリン抗体は、抗プロインスリン抗体又は抗プロインスリン及び抗インスリン抗体であってもよい。
「プロインスリン」という用語は、本明細書で使用される場合、B及びAインスリンポリペプチド鎖を連結する連結ペプチド又は「C-ペプチド」を含むインスリンポリペプチドを指す。
本発明者らは、インスリン活性が、健康な対象及び糖尿病の対象において異なる抗インスリン抗体によって調節されることを実証する(例えば実施例6、7を参照されたい)。本明細書では、この調節システムを使用する、及び/又はそれに影響を与える手段及び方法を提供する。特に、本発明者らは、インスリンへの単一特異性及び/又は高親和性結合を有するオリゴマー抗インスリン抗体結合が、インスリン機能に対する保護効果を有することを実証する。理論に拘束されないが、本明細書に記載のオリゴマー抗インスリン抗体は、選択性及び/又は特異性がより低い抗体の結合時の分解からインスリンを保護する(実施例7)。
したがって、本発明は、インスリン活性に対するオリゴマー抗インスリン抗体の保護/調節効果に少なくとも部分的に基づいている。
いくつかの実施形態では、本発明は、対象における細胞媒介性標的抗原特異的免疫応答を誘発及び/又は調節する方法に関し、方法は、対象の1つ以上の免疫細胞(B細胞など)を、
(i)疾患関連抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの1つ以下を含む抗原性部分で構成される一価抗原粒子と、
(ii)疾患関連抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの2つ以上を含む抗原性部分で構成され、抗原構造のうちの2つ以上が共有結合的又は非共有結合的に架橋されている多価抗原粒子と
を含む組み合わせと接触させることを含む。
(i)疾患関連抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの1つ以下を含む抗原性部分で構成される一価抗原粒子と、
(ii)疾患関連抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの2つ以上を含む抗原性部分で構成され、抗原構造のうちの2つ以上が共有結合的又は非共有結合的に架橋されている多価抗原粒子と
を含む組み合わせと接触させることを含む。
第1の態様の代替であるいくつかの実施形態では、本発明は、対象における細胞媒介性標的抗原特異的免疫応答を誘発及び/又は調節するのに使用するための組み合わせに関し、組み合わせは、
(i)疾患関連抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの1つ以下を含む抗原性部分で構成される一価抗原粒子と、
(ii)疾患関連抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの2つ以上を含む抗原性部分で構成され、抗原構造のうちの2つ以上が共有結合的又は非共有結合的に架橋されている多価抗原粒子と
を含む組み合わせと接触させることを含み、
組み合わせは、対象の1つ以上の免疫細胞を組み合わせと接触させることによって使用される。
(i)疾患関連抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの1つ以下を含む抗原性部分で構成される一価抗原粒子と、
(ii)疾患関連抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの2つ以上を含む抗原性部分で構成され、抗原構造のうちの2つ以上が共有結合的又は非共有結合的に架橋されている多価抗原粒子と
を含む組み合わせと接触させることを含み、
組み合わせは、対象の1つ以上の免疫細胞を組み合わせと接触させることによって使用される。
第1及び第2の態様の更なる代替例では、組み合わせは、対象又は患者の疾患の治療又は予防(ワクチン接種)に使用するためのものであり、治療的又は予防的に有効な量で、組み合わせ又は組み合わせの少なくとも(i)若しくは(ii)を対象又は患者に投与することを含む。本発明の文脈における治療有効量は、IgG型又はIgM型(又はIgA)免疫応答などの特定のB細胞媒介性免疫応答を誘導又は抑制する量である。
本発明は、抗原が、それらが可溶性抗原として免疫細胞に提示されるか、又は複合多価抗原として提示されるかに応じて、異なる免疫応答を誘導し得るという驚くべき発見に基づいている。後者は特に強力で記憶的なIgG抗体応答をもたらすが、前者はそのようなIgG応答を抑制し、保護的なIgM(又はIgA)抗体応答を誘導し得る。したがって、本発明は、B細胞免疫の焦点を制御するために、可溶性と複合免疫応答との比を調節することを提案する。このアプローチは、新規の制御されたワクチン接種処置、又は糖尿病などの自己免疫疾患に取り組むために使用することができる。
本明細書に記載の方法は、いくつかの実施形態では、非治療的及び非外科的方法である。この実施形態では、本発明の方法は、対象を治療するためのものではなく、例えば、次のステップで単離される新規抗体の産生及び単離のための免疫応答を誘導するためのものである。この実施形態では、対象は、方法を実施することによって治療される任意の疾患に罹患していない概して健康な対象である。この実施形態では、対象は、好ましくは、非ヒト脊椎動物である。
本発明の文脈における「細胞媒介性抗原特異的免疫応答」とは、1つ以上のBリンパ球(B細胞)、好ましくはB細胞媒介性免疫応答を含む免疫応答を指す。「Bリンパ球」又は「B細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、適応免疫系の体液免疫において役割を果たすリンパ球を指し、細胞表面上にB細胞受容体(BCR)が存在することを特徴とする。B細胞型には、形質細胞、記憶B細胞、B-1細胞、B-2細胞、辺縁帯B細胞、濾胞B細胞、及び調節B細胞(Breg)が含まれる。
「価」という用語は、本出願内で使用される場合、それぞれ、抗体又は抗原分子内に特定の数の結合部位が存在することを示す。したがって、抗体の結合部位はパラトープであるが、抗原内の結合部位は一般にエピトープと称される。例えば、天然抗体又は本発明に従う完全長抗体は、2つの結合部位を有し、二価である。抗原タンパク質は、一価(単量体として存在する場合)であるが、そのような抗原タンパク質が多量体として提供される場合、それらは、2つ以上の同一のエピトープを含み得、したがって、二価、三価、四価等であり得る多価であり得る。したがって、「三価」という用語は、抗体分子内の3つの結合部位の存在を示す。したがって、「四価」という用語は、抗体分子内の4つの結合部位の存在を示す。
「一価抗原粒子」という用語は、本明細書に開示される本発明の文脈において、抗原性であり、したがって脊椎動物における免疫応答を刺激することができる、タンパク質又はタンパク質複合体等の分子又は分子複合体を指すものである。典型的には、一価抗原粒子は、そのような抗原構造に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの1つ以下を含む抗原性部分で構成される。本明細書で使用される場合、「抗原構造」という用語は、抗体媒介性免疫応答を刺激する能力を保持する抗原タンパク質の断片を指す。そのような抗原構造は、抗体と特異的に反応する分子の領域、より具体的には、抗体のパラトープと反応する分子の領域を指す抗原決定基又は「エピトープ」を提供すると理解される。本発明の好ましい実施形態では、本発明の一価抗原粒子は、抗原構造の1つの特異的エピトープの1つ以下のコピーを含む。したがって、好ましくは、特定のパラトープを有するある特定の抗体種の1つの抗体分子のみが、本発明による一価抗原粒子に結合し得る。
「多価抗原粒子」という用語は、本明細書に開示される本発明の文脈において、抗原性であり、したがって脊椎動物における免疫応答を刺激することができる、タンパク質又はタンパク質複合体等の分子又は分子複合体を指すものである。本発明において、一価抗原性粒子とは異なり、多価抗原性粒子は、抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原性構造のうちの2つ以上を含む抗原性部分で構成される。本発明の好ましい実施形態では、本発明の多価抗原粒子は、抗原構造の1つの特異的エピトープの2つ以上のコピーを含む。したがって、好ましくは、特定のパラトープを有するある特定の抗体種の2つ以上の抗体分子が、本発明による一価抗原粒子に結合し得る。そのような多価抗原粒子は、抗原構造のうちの2つ以上が互いに共有結合的又は非共有結合的に架橋された構造を有し得る。したがって、好ましい実施形態では、多価抗原粒子は、同時に2つの抗体の多価抗原粒子への結合を可能にする、少なくとも2つ、少なくとも3つ又は少なくとも4つの同一のエピトープを含む複合体を含む。好ましくは、多価抗原粒子の抗原性部分に含まれる抗原構造のうちの2つ以上は、複数の同一の抗原構造を含む。
本発明の多価抗原粒子は、好ましくは、互いに空間的に近接した、好ましくは1nm~10μm、より好ましくは1nm~5μm、1nm~1000nm、1nm~500nm、1nm~100nm、1nm~50nm及び1nm~10nmの範囲から選択されるナノメートル範囲内の抗原構造の少なくとも2つのコピーを含む。
本発明の文脈において、本発明の一価抗原粒子は、しばしば「可溶性」粒子又は抗原と称されるが、多価抗原粒子は、「複合」粒子又は抗原と称される。
本発明の別の実施形態では、一価抗原粒子は、任意選択的にリンカーを介して抗原性部分に結合される担体部分を更に含み、担体、及び任意選択的にリンカーは、抗原構造の別のコピーを含まず、担体部分、及び任意選択的にリンカーは、標的抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘発することができない。本発明の別の代替又は追加の実施形態では、多価抗原粒子は、任意選択でリンカーを介して抗原性部分に結合される担体部分を更に含む。本発明の文脈における「リンカー」は、本発明の化合物の2つの部分を互いに共有結合的又は非共有結合的に接続するために使用され得る任意の分子(複数可)、タンパク質、又はペプチドを含んでもよい。
本明細書に開示される本発明の文脈における「担体部分」という用語は、好ましくは、本発明の粒子の抗原構造を提示するか、又はそれを含む物質又は構造に関する。担体部分は、好ましくは、免疫原性又は非免疫原性ポリペプチド、免疫CpG島、リンペットヘモシアニン(KLH)、破傷風トキソイド(TT)、コレラトキシンサブユニットB(CTB)、細菌又は細菌ゴースト、リポソーム、キトソーム、ビロソーム、マイクロスフェア、樹状細胞、粒子、マイクロ粒子、ナノ粒子、又はビーズから選択される物質又は構造である。
好ましくは、担体部分、及び所望によりリンカーのいずれも、自己免疫疾患に関連する抗原等の標的抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘発することができない。
本発明の文脈における「リンカー」は、好ましくは、本発明の文脈における所与の用途に適切な任意のサイズ及び長さを有し得るペプチドリンカーである。リンカーは、長さ又は1~100アミノ酸、好ましくは2~50アミノ酸を有し得る。リンカーは、2、3、4、5、6、又はそれよりも多くの反復における典型的な4GSリンカーであり得る。
本発明の好ましい実施形態では、対象又は患者の1つ以上の免疫細胞を一価抗原粒子及び多価抗原粒子を含む組み合わせと接触させることは、(i)対象への一価抗原粒子の投与、(ii)対象への多価抗原粒子の投与、又は(iii)対象への一価抗原粒子及び多価抗原粒子の投与を伴い、(i)、(ii)及び(iii)において、対象の免疫細胞は、組み合わせと接触した投与の結果として、一価抗原粒子及び多価抗原粒子である。一般に、「接触させる」という用語は、好ましくはB細胞媒介性免疫応答を誘導するために、そのような抗原粒子を対象の免疫系に提示することと理解されるべきである。好ましくは、(i)において、対象は、一価抗原粒子の投与前の多価抗原粒子の存在を特徴とし、(ii)において、対象は、多価抗原粒子の投与前の一価抗原粒子の存在を特徴とする。
本発明の文脈において、一価及び多価抗原の特定の比率が、B細胞によって媒介される抗体免疫応答を調節することができることが見出された。したがって、一価抗原粒子及び多価抗原粒子を含む組み合わせが、好ましくは多価抗原粒子に対する一価抗原粒子の比率である特定の抗原比率を含むことが、本発明の好ましい実施形態である。特に、そのような好ましい実施形態のうち、対象における細胞媒介性標的抗原特異的免疫応答の調節は、対象のB細胞のうちの1つ以上を、1超、好ましくは101超、102超、103超、104超又はそれを超える特定の抗原比率を含む組み合わせと接触させることによる、対象におけるIgG型(又はIgM)標的抗原特異的B細胞応答の制御を構成する。本発明の他の実施形態では、対象のB細胞のうちの1つ以上を組み合わせと接触させることは、対象において1超、好ましくは101超、102超、103超、104超又はそれを超える特定の抗原比率を生成するのに有効な量の一価抗原粒子を対象に投与することを伴う。
本発明の更なる特定の実施形態では、方法は、対象のB細胞のうちの1つ以上を一価抗原粒子の量と接触させることが、対象に多価抗原粒子を投与することの直接的な組み合わせの有無にかかわらず投与される場合に好ましい。
本発明の文脈において、対象における細胞媒介性標的抗原特異的免疫応答の調節は、好ましくは、対象のB細胞のうちの1つ以上を、1未満、好ましくは10-1、10-2、10-3、10-4以下を下回る特定の抗原比率を含む組み合わせと接触させることによる、対象におけるIgG型標的抗原特異的B細胞応答の増加を構成する。好ましくは、対象のB細胞のうちの1つ以上を組み合わせと接触させることは、対象において1未満、好ましくは10-1、10-2、10-3、10-4以下を下回る特定の抗原比率を生成するのに有効な量の多価抗原粒子を対象に投与することを伴う。
対象のB細胞のうちの1つ以上を多価抗原粒子の量と接触させることは、対象に一価抗原粒子を投与する直接的組み合わせの有無にかかわらず投与されることが好ましい。
「抗原」という用語は、抗原構造を含む任意の、好ましくは疾患関連の分子又は構造を指し得る。好ましくは、本発明の抗原は、自己抗原、がん関連抗原、又は病原体関連抗原である。本発明の1つの非常に具体的な例示的実施形態では、抗原はインスリンであり、関連する疾患は糖尿病である。ヒトインスリンタンパク質は、c-ペプチド、インスリンB鎖、及び活性インスリンペプチドを含むプロインスリンとして産生される。アミノ酸配列及び更なる特性は、当業者に周知であり、2020年1月27日のバージョンのUniProtデータベース内の受託番号P01308(https://www.uniprot.org/uniprot/P01308)として得ることができる。
本発明の病原体関連抗原は、病原体、例えば、病原性ウイルス又は微生物において、その上に、又はそれによって発現される任意の抗原であり得、好ましくは、病原体は、寄生虫、単細胞真核生物、細菌、ウイルス又はビリオンから選択される。
本発明の抗原は、好ましくは、疾患又は状態、好ましくは、対象が罹患している、又は罹患していると疑われる疾患又は状態と関連する抗原である。そのような疾患は、言及されるように、病原体関連、自己免疫関連であり得、例えば治療用抗体などの治療薬として抗原性タンパク質を使用する場合は治療関連、又はがん関連などであり得る。本発明の抗原は、完全、断片的又は部分的免疫原性物質などの天然又は合成の免疫原性物質であり得、免疫原性物質は、核酸、炭水化物、ペプチド、ハプテン、又はそれらの任意の組み合わせから選択され得る。
本発明の文脈では、疾患又は状態は、細胞媒介性免疫応答の増加又は減少が治療に有益であることを特徴とする疾患又は状態から選択される。したがって、本発明は、炎症性障害、自己免疫疾患、増殖性障害、又は感染性疾患から選択される疾患又は状態などの疾患の治療として、本明細書に記載の方法による免疫系の本明細書に記載の調節を提供する。
「B細胞」(「Bリンパ球」としても知られる)という用語は、細胞表面免疫グロブリン分子を発現し、活性化されると最終的に抗体を分泌する細胞に分化する免疫細胞を指す。したがって、これには、例えば、従来型B細胞、CD5B細胞(B-1細胞及び移行型CD5B細胞としても知られる)が含まれる。「B細胞」はまた、B細胞突然変異体への言及を包含すると理解されるべきである。「突然変異体」には、限定されないが、遺伝子改変された細胞など、天然又は非天然で改変されたB細胞が含まれる。「B細胞」への言及はまた、B細胞画像へのコミットメントを示すB細胞にも拡張されると理解されるべきである。これらの細胞は、発達の任意の分化段階にあってもよく、したがって、必ずしも表面免疫グロブリン分子を発現しなくてもよい。B細胞のコミットメントは、免疫グロブリン遺伝子再配列の開始によって特徴付けられてもよく、又はそれは、CD45R、MHCII、CD10、CD19及びCD38の細胞表面発現などのいくつかの他の表現型又は機能的特徴によって特徴付けられるコミットメントの初期段階に対応してもよい。様々な分化段階にあるB細胞の例としては、早期B細胞前駆細胞、早期pro-B細胞、後期pro-B細胞、pre-B細胞、未成熟B細胞、成熟B細胞、形質細胞、及び記憶(B)細胞が挙げられる。本発明の文脈において、B細胞は、主にIgM型B細胞受容体を発現する非成熟B細胞、主にIgD型B細胞受容体を発現する成熟B細胞、又はIgG型B細胞受容体を発現する記憶B細胞として見ることができる。IgM型B細胞受容体とIgD型B細胞受容体との違いは、μ型又はδ型のいずれかである重鎖配列の型である。
本発明の文脈において、「細胞媒介性標的抗原特異的免疫応答」という用語は、好ましくは、免疫細胞、例えばリンパ球、好ましくはBリンパ球(B細胞媒介性免疫応答)、好ましくは、1つ以上の抗体、又はそのバリアント、及び/又は標的抗原に特異的なB細胞受容体、及び/又はそのバリアントを含む、及び/又は発現するものが関与する細胞免疫型応答に関する。好ましくは、免疫グロブリン(Ig)M、IgD、IgA若しくはIgG型抗体及び/又はB細胞受容体を発現するB細胞が、細胞媒介性標的抗原特異的免疫応答に関与する。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、そのエピトープへの結合を可能にする任意の免疫グロブリン(Ig)として最も広い意味で理解され得る。抗体そのものは、ABPの種である。全長「抗体」又は「免疫グロブリン」は、一般に、約150kDaのヘテロ四量体糖タンパク質であり、2つの同一の軽鎖及び2つの同一の重鎖で構成される。各軽鎖は、1つのジスルフィド共有結合によって重鎖に連結されるが、ジスルフィド連結の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変化する。各重鎖及び軽鎖はまた、規則的に離間した鎖内ジスルフィドブリッジを有する。各重鎖は、アミノ末端可変ドメイン(VH)、続いて3つのカルボキシ末端定常ドメイン(CH)を有する。各軽鎖は、可変N末端ドメイン(VL)及び単一のC末端定常ドメイン(CL)を有する。VH及びVL領域は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる、より保存された領域が点在する、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる、超可変性の領域へと更に細分することができる。各VH及びVLは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順序で配置された3つのCDR及び4つのFRで構成される:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞(例えば、エフェクター細胞)及び古典的な補体系の第1の構成要素(C1q)を含む、細胞又は因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介し得る。他の形態の抗体としては、2本の重鎖のみからなり、通常抗体に見られる2本の軽鎖を欠く重鎖抗体が挙げられる。重鎖抗体としては、ヒトコブラクダ、ラクダ、ラマ及びアルパカなどのラクダ科のhcIgG(IgG様)抗体、並びに軟骨性魚類(例えばサメ)のIgNAR抗体が挙げられる。更に、抗体の他の形態は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である単一ドメイン抗体(sdAb、開発者であるAblynxによりナノボディと呼ばれる)を含む。単一ドメイン抗体は、典型的には重鎖抗体から産生されるが、従来の抗体に由来してもよい。
本発明の文脈で議論される典型的な抗体Igバリアントは、IgG、IgM、IgE、IgA、又はIgD抗体を含む。
本明細書で使用される場合、「IgG」という用語は、当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、重g鎖を有する免疫グロブリンを指す。抗原に対する二次免疫応答の一部として産生されるこのクラスの免疫グロブリンは、総血清Igの約75%を構成する。IgGは、ヒトの胎盤を通過することができるIgの唯一のクラスであり、生後最初の数ヶ月間の新生児の保護に大きく関与している。IgGは、血液、リンパ液、脳脊髄液及び腹膜液中の主要な免疫グロブリンであり、体液性免疫応答の要である。健康なヒトの血清IgGは、アルブミン、酵素、他のグロブリン及び更に多くのもの以外に、総タンパク質の約15%を示す。ヒト、マウス、及びラットにおいては、4つのIgGサブクラス(例えば、ヒトにおけるIgGl、IgG2、IgG3、及びIgG4)が説明されている。サブクラスは、ジスルフィド結合の数及びヒンジ領域の長さ及び可撓性が異なる。可変領域を除いて、1つのクラス内の全ての免疫グロブリンは、約90%の相同性を共有するが、クラス間では60%のみである。IgG1は、全主要サブクラスIgGの60~65%を占め、タンパク質及びポリペプチド抗原に対する胸腺媒介性免疫応答に主に関与する。IgG1は、食細胞のFc受容体に結合し、C1複合体への結合を介して補体カスケードを活性化することができる。IgG1免疫応答は、既に新生児で測定され得、乳児期にその典型的な濃度に達する。IgGアイソタイプの2番目に大きいIgG2は、主要なサブクラスの20~25%を構成し、炭水化物/多糖抗原に対する一般的な免疫応答である。「成人」濃度は通常、6歳又は7歳までに到達する。IgG3は、総IgGの約5~10%を構成し、タンパク質又はポリペプチド抗原に対する免疫応答において主要な役割を果たす。IgG3の親和性は、IgG1の親和性よりも高くなり得る。通常、総IgGの4%未満を構成するIgG4は、多糖類と結合しない。過去には、IgG4の検査は食物アレルギーと関連していたが、最近の研究により、IgG4陽性形質細胞の浸潤によって引き起こされる硬化性膵炎、胆管炎、及び間質性肺炎に罹患した患者において、IgG4の血清レベルの上昇が見られることが示された。
ある特定の実施形態では、本発明は、本発明のオリゴマー抗インスリン抗体に関し、オリゴマー抗インスリン抗体は、IgMアイソタイプの抗インスリン抗体である。
本明細書で使用される場合、「IgM」という用語は、当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、重m鎖を有する免疫グロブリンを指す。血清IgMは、哺乳動物において五量体(又は六量体)として存在し、正常なヒト血清Ig含有量の約10%を構成する。それは、ほとんどの抗原に対する一次免疫応答において優勢であり、最も効率的な補体固定免疫グロブリンである。IgMはまた、Bリンパ球の形質膜上で膜関連免疫グロブリンとして発現される(これは、膜内で多タンパク質クラスターとして組織化され得る)。この形態では、それはB細胞抗原受容体であり、H鎖はそれぞれ、膜内に係止するための追加の疎水性ドメインを含有する。血清IgMの単量体は、ジスルフィド結合及び接合(J)鎖によって一緒に結合される。五量体構造内の5つの単量体のそれぞれは、2本の軽鎖(カッパ又はラムダのいずれか)及び2本の重鎖で構成される。IgG(及び上記に示される一般化された構造)とは異なり、IgM単量体における重鎖は、1つの可変領域及び4つの定常領域で構成され、追加の定常ドメインがヒンジ領域を置き換えている。IgMは、侵入する微生物上のエピトープを認識し、細胞凝集をもたらすことができる。次いで、この抗体-抗原免疫複合体は、マクロファージによる補体固定又は受容体媒介性エンドサイトーシスによって破壊される。IgMは、新生児によって合成される最初の免疫グロブリンクラスであり、いくつかの自己免疫疾患の病因において役割を果たす。免疫グロブリンMは、3番目に一般的な血清Igであり、全ての重鎖が同一であり、全ての軽鎖が同一である五量体(又はいくつかの状況下では六量体)の2つの形態のうちの1つをとる。膜関連形態は、膜上に多量体クラスターを形成することができる単量体(例えば、B細胞受容体としてBリンパ球上に見出される)である。
IgMは、免疫応答中に構築される最初の抗体である。理論的には、その五量体構造は、高い親和性を有するだけでなく、10個の遊離抗原結合部位を与えるため、凝集及び細胞溶解反応に関与する。10個のFab部分間の立体構造制約のために、IgMは5の価数のみを有する。更に、IgMはIgGほど多用途ではない。しかしながら、補体活性化及び凝集において極めて重要である。IgMは、主にリンパ液及び血液中に見られ、疾患の早期段階において非常に効果的な中和剤である。レベルの上昇は、最近の感染又は抗原への曝露の徴候であり得る。
本明細書で使用される場合、「IgA」という用語は、当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、重a鎖を有する免疫グロブリンを指す。IgAは、健康な血清における全ての免疫グロブリンの約15%を構成する。血清中のIgAは主に単量体であるが、唾液、涙、初乳、粘液、汗、及び胃液等の分泌物においては、IgAは、結合ペプチドによって接続される二量体として見出される。ほとんどのIgAは、分泌形態で存在する。これは、上皮表面に付着して貫通することによって病原体が侵入するのを防ぐ特性によるものと考えられている。IgAは、非常に弱い補体活性化抗体であるため、補体系を介して細菌細胞溶解を誘導しない。しかしながら、分泌型IgAは、細菌細胞壁内の炭水化物を加水分解することができ、それによって免疫系が感染をクリアすることを可能にするリゾチーム(多くの分泌流体にも存在する)と一緒に作用する。IgAは、それが主に中和抗体として作用する上皮細胞表面に見出される。ヒトには2つのIgAサブタイプ、IgA1及びIgA2が存在するが、マウスは1つのサブクラスのみを有する。それらは、重鎖の分子量及び血清中のそれらの濃度において異なる。IgA1は、血清中の全IgA濃度の約85%を構成する。IgA1は、いくつかのプロテアーゼに対して広範な耐性を示すが、ヒンジ領域に影響を与える/スプライスすることができるものがいくつかある。IgA1は、タンパク質抗原、及びより少ない程度では多糖及びリポ多糖に対する良好な免疫応答を示す。血清中の総IgAのわずか15%までを占めるIgA2は、多糖及びリポ多糖抗原と闘うために、気道、眼、及び胃腸管の粘膜において重要な役割を果たす。また、タンパク質分解及び多くの細菌プロテアーゼに対する良好な耐性を示し、細菌感染との闘いにおけるIgA2の重要性を裏付けている。
本明細書で使用される場合、「IgD」という用語は、当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、重d鎖を有する免疫グロブリンを指す。IgDは、未成熟Bリンパ球の形質膜内のタンパク質の約1%を構成する免疫グロブリンであり、通常、別の細胞表面抗体IgMと共発現される。IgDはまた、血清中の免疫グロブリンの0.25%を占める、血清中に非常に少量で見出される分泌型で産生される。分泌型IgDは、デルタ(δ)クラスの2つの重鎖、及び2つのIg軽鎖を有する単量体抗体として産生される。
「患者」(又は「対象」)という用語は、本明細書で使用される場合、障害又は疾患に罹患している、哺乳動物として分類される全ての動物を指し、限定されないが、家畜及び農業用動物、霊長類及びヒト、例えば人間、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、又はげっ歯類を含む。好ましくは、患者は、任意の年齢又は人種の男性又は女性のヒトである。
「免疫媒介性炎症性疾患」又は「IMID」という用語は、本明細書で使用される場合、決定的な病因を欠くが、炎症を引き起こす共通の炎症経路を特徴とし、正常な免疫応答の調節不全に起因し得るか、又はそれによって誘引され得る状態又は疾患の群のいずれかを指す。炎症が媒介し、多くの医学的及び自己免疫障害の主要な原因であるため、本発明の文脈では、免疫媒介性炎症性疾患という用語は、自己免疫障害及び炎症性疾患を包含することも意図する。
「自己免疫障害」又は「自己免疫疾患」という用語は、対象がそれ自身の細胞、組織、及び/又は器官に免疫学的反応によって引き起こされる、細胞、組織、及び/又は器官の損傷を特徴とする対象の状態を指す。本発明の方法又は医薬組成物で治療することができる自己免疫疾患の例示的で非限定的な例としては、斑状脱毛症、リウマチ性関節炎(RA)、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎及び精巣炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労免疫機能不全症候群(CFIDS)、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、チャーグ-ストラウス症候群、斑状性天疱症候群、クレスト症候群、冷グルチニン病、円盤状エリテマトーデス、必須混合クリオグロブリン血症、線維筋痛-線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン-バレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、IgA神経障害、若年性関節炎、扁平苔癬、メニエール病、混合性結合組織疾患、多発性硬化症、1型又は免疫媒介性糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多軟骨炎、多発性腺症候群、多発性筋肉痛リウマチ、多発性筋炎及び皮膚筋炎、原発性無γグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、サルコイドーシス、硬化症、進行性全身性硬化症、シェーグレン症候群、グッドパスチャー症候群、全身強直症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、高安動脈炎、一時性動脈瘤/巨大細胞動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、疱疹状皮膚炎脈管炎などの血管炎、白斑、ウェゲナー肉芽腫症、抗糸球体気管支膜疾患、抗リン脂質症候群、神経系の自己免疫疾患、家族性地中海熱、ランバート・イートン筋無力症候群、交感神経性眼炎、多発性内分泌障害、乾癬などが挙げられる。
「炎症性疾患」という用語は、炎症、例えば、慢性炎症を特徴とする対象における状態を指す。炎症性障害の例示的で非限定的な例としては、セリアック病、リウマチ性関節炎(RA)、炎症性腸疾患(IBD)、喘息、脳炎、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、炎症性骨溶解症、クローン病、潰瘍性大腸炎、アレルギー性障害、敗血症性ショック、肺線維症(例えば、特発性肺線維症)、炎症性血管炎(例えば、多動脈炎、ウェグナー肉芽腫症、高安動脈炎、側頭動脈炎、及びリンパ腫性肉芽腫症)、外傷後血管形成症(例えば、血管形成後の再形成症)、未分化性脊椎関節症、未分化性関節症、関節炎、炎症性骨溶解症、慢性肝炎、慢性ウイルス性又は細菌感染症から生じる慢性炎症、並びに敗血症などの急性炎症が挙げられるが、これらに限定されない。
「治療する」又は「治療」又は「治療すること」という用語は、本明細書で使用される場合、患者又は対象に直接関連して使用される場合、疾患又は障害に関連する1つ以上の症状の改善のために前記治療を必要とする患者対象に療法を施すことを意味すると解釈されるべきである。治療を必要としている者には、既に状態若しくは障害を患っている者、及び状態若しくは障害を有しやすい者、又は状態若しくは障害が予防されるべき者が含まれる。「治療する」又は「治療」又は「治療すること」という用語は、損傷した組織に関して直接使用される場合、損傷した組織の再生、損傷した組織(例えば瘢痕組織による)の修復又は置換などの直接的なメカニズム、並びに間接的なメカニズム、例えば炎症を低減し、それによって組織形成を可能にすることによる、そのような損傷の改善の両方を意味すると解釈されるべきである。
本発明の文脈において、多価抗原粒子とは対照的に一価抗原粒子が区別される。各粒子は、単一の分子実体とみなされ、これは、共有結合的又は非共有結合的に接続された部分を含み得る。しかしながら、本発明によれば、各粒子は、特定の抗原に対して免疫原性活性を有する。したがって、一価抗原粒子は、抗原に対する免疫応答を誘発することができる単一の抗原構造のみを含むと理解され、一方、多価抗原粒子は、そのような抗原構造の複数のコピーを含む。本発明の文脈において、時には「可溶性」抗原という用語は、多価抗原粒子の「複合体」抗原とは対照的な一価抗原粒子についても使用される。ほとんどの場合、抗原構造は、抗体免疫応答を誘発するエピトープを含むか又はそれからなり、一方で、本明細書の他の場所で定義されるように、細胞媒介性免疫応答に基づいて産生される抗体の結合部位であることを理解されたい。換言すれば、本発明は、可溶性単一エピトープとしての免疫誘発エピトープの提示又は複合アレイにおける同一のエピトープの提示を区別する。
いくつかの実施形態では、本発明は、対象において疾患関連抗原に特異的な免疫グロブリンG(IgG)型抗体の存在を特徴とする疾患を治療又は予防するための方法に関連し、方法は、治療有効量の一価抗原粒子を対象に投与することを含み、一価抗原粒子は、疾患関連抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの1つ以下を含む抗原性部分で構成される。
本発明の代替の態様では、対象において疾患関連抗原に特異的なIgG以外の抗体の存在を特徴とする疾患を治療又は予防するための方法が提供され、方法は、治療有効量の一価抗原粒子を対象に投与することを含み、一価抗原粒子は、疾患関連抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの1つ以下を含む抗原性部分で構成される。代替の第3の態様のそのような障害は、例えば、IgE媒介性アレルギーであり得る。
疾患関連抗原に特異的な免疫グロブリンG(IgG)型抗体の存在を特徴とする疾患は、好ましくは、対象の血清中の自己免疫及び同種免疫IgG抗体等の病理学的IgG分子の存在を特徴とする疾患である。したがって、「IgG媒介性疾患」という用語は、自己免疫疾患及び同種免疫疾患を含む。本明細書で使用される場合、「同種免疫疾患」という用語は、別の個体の外来抗原(例えば、大組織適合性同種抗原又は小組織適合性同種抗原)に対する宿主免疫応答がある場合、例えば宿主対移植片拒絶反応がある場合、又は代替的に移植片対宿主疾患がある場合を指し、移植免疫細胞は、移植片を受けている宿主に対する有害な効果を媒介する。
いくつかの実施形態では、本発明は、対象における疾患関連抗原に特異的な免疫グロブリンG(IgG)型抗体の存在を特徴とする疾患の治療又は予防に使用するための一価抗原粒子に関し、一価抗原粒子は、疾患関連抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの1つ以下を含む抗原性部分で構成される。
この実施形態では、上記に開示された特定の実施形態が、ここに等しく適用される。
いくつかの実施形態では、本発明は、対象においてワクチン接種によって疾患を治療又は予防するための方法に関し、この方法は、
(i)疾患関連抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの1つ以下を含む抗原性部分で構成される一価抗原粒子と、
(ii)疾患関連抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの2つ以上を含む抗原性部分で構成され、抗原構造のうちの2つ以上が共有結合的又は非共有結合的に架橋されている多価抗原粒子と
を含む有効量のワクチン接種組成物を投与することを含む。
(i)疾患関連抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの1つ以下を含む抗原性部分で構成される一価抗原粒子と、
(ii)疾患関連抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの2つ以上を含む抗原性部分で構成され、抗原構造のうちの2つ以上が共有結合的又は非共有結合的に架橋されている多価抗原粒子と
を含む有効量のワクチン接種組成物を投与することを含む。
この実施形態では、本明細書の他の場所に開示されるプライミング/ブーストスキームを含むワクチン接種スキームにおいて治療を対象に施すことが好ましくなり得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、対象の疾患の治療又は予防に使用するためのワクチン接種組成物に関し、ワクチン接種組成物は、
(i)疾患関連抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの1つ以下を含む抗原性部分で構成される一価抗原粒子と、
(ii)疾患関連抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの2つ以上を含む抗原性部分で構成され、抗原構造のうちの2つ以上が共有結合的又は非共有結合的に架橋されている多価抗原粒子と
を含む。
(i)疾患関連抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの1つ以下を含む抗原性部分で構成される一価抗原粒子と、
(ii)疾患関連抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの2つ以上を含む抗原性部分で構成され、抗原構造のうちの2つ以上が共有結合的又は非共有結合的に架橋されている多価抗原粒子と
を含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、
(i)抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの1つ以下を含む抗原性部分で構成される一価抗原粒子と、
(ii)抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの2つ以上を含む抗原性部分で構成され、抗原構造のうちの2つ以上が共有結合的又は非共有結合的に架橋されている多価抗原粒子と
を含む免疫原性組成物に関する。
(i)抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの1つ以下を含む抗原性部分で構成される一価抗原粒子と、
(ii)抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの2つ以上を含む抗原性部分で構成され、抗原構造のうちの2つ以上が共有結合的又は非共有結合的に架橋されている多価抗原粒子と
を含む免疫原性組成物に関する。
「(本)発明の」、「本発明に従う」、「本発明による」などの用語は、本明細書に記載及び/又は請求される本発明の全ての態様及び実施形態を指すことを意図している。
ある特定の実施形態における本発明の様々な態様の方法は、脊椎動物におけるある特定の所望の抗体応答の生成のための免疫化方法として見ることができる。この文脈において、本発明の方法の好ましい実施形態は、対象のプライミング/ブースト免疫スキームを含む。
抗原への免疫応答を「プライミングする」という用語は、単一の免疫原性組成物の投与によって得られる免疫応答よりも、同じ又は第2の組成物での後続の投与時に抗原へのより高いレベルの免疫応答を誘導する免疫原性組成物の対象への投与を指す。
抗原に対する免疫応答を「ブーストする」という用語は、プライミング免疫原性組成物の投与後に、第2のブースト免疫原性組成物を対象に投与することを指す。一実施形態では、免疫原性組成物のブースト投与は、プライミング用量の投与の約2~27週間後、好ましくは1~10週間後、より好ましくは1~5週間後、最も好ましくは約3週間後に行われる。
本発明の好ましい実施形態では、プライミングのステップは、疾患関連抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの1つ以下を含む抗原性部分で構成される一価抗原粒子で実行されるが、ブーストのステップは、疾患関連抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの2つ以上を含む抗原性部分で構成される多価抗原粒子の投与を含み、抗原構造のうちの2つ以上は、共有結合的又は非共有結合的に架橋している。本発明のそのようなプライミング/ブーストの実施形態では、プライミング及びブーストステップにおいて免疫応答を誘導するために使用される抗原構造は、同じ抗原構造である。
本発明のいくつかの実施形態では、ブーストのステップは、本明細書に記載されるように、一価及び多価抗原粒子の組み合わせを用いて行われてもよい。
いくつかの実施形態では、本発明は、自己免疫疾患の治療に使用するための単一特異性IgM型抗体又はそのバリアントに関し、モノクローナルIgM型抗体は特異的であり、自己免疫疾患に関連する抗原に対して高い親和性を有する。
別の実施形態では、本発明の単一特異性IgM型抗体若しくはそのバリアントはポリクローナル抗体ではない、又は抗原結合断片はポリクローナル抗体の断片ではない。より具体的な実施形態では、本発明の単一特異性IgM型抗体又はそのバリアントは、一次(多特異性)IgM型抗体ではない。
本発明の全ての単一特異性IgM型抗体又はそのバリアントの代替的かつ好ましい実施形態では、単一特異性IgM型抗体又はそのバリアントは、抗体又はその抗原結合断片であり、その抗体はモノクローナル抗体である、又はその抗原結合断片はモノクローナル抗体の断片である。
「モノクローナル抗体」又は「mAb」という用語は、本明細書で使用される場合、それらのアミノ酸配列に基づいて実質的に同一の抗体の集団から得られた抗体を指す。モノクローナル抗体は、典型的には極めて特異的である。更に、典型的には抗原の異なる決定基(例えばエピトープ)に対して指向性を有する異なる抗体を含む従来の(ポリクローナル)抗体調製物とは対照的に、各mAbは、典型的に、抗原上の単一の決定基に対して指向性である。それらの特異性に加えて、mAbは、他の免疫グロブリンによって汚染されていない細胞培養物(ハイブリドーマ、組換え細胞など)によって合成され得る点で有利である。本明細書におけるmAbとしては、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体若しくはヒト抗体、又は抗体断片が挙げられる。ある特定の実施形態では、本発明は、本発明のオリゴマー抗インスリン抗体に関し、オリゴマー抗インスリン抗体は、キメラ、ヒト化、又はヒトである。
本発明によるモノクローナルIgM抗体は、当業者に周知の方法によって調製され得る。例えば、マウス、ラット、ヤギ、ラクダ、アルパカ、ラマ又はウサギは、アジュバントとともに目的の抗原(又は目的の抗原をコードする核酸)で免疫化され得る。脾細胞は、血清抗体価を評価するために実施した試験的出血を伴って、ある特定の間隔でいくつかの免疫化を施される動物からプールとして採取される。脾細胞は、融合実験で直ちに使用されるか、又は将来の融合で使用されるために液体窒素中に貯蔵されるかのいずれかで調製される。次いで、融合実験が、Stewart&Fuller,J.Immunol.Methods 1989,123:45-53の手順に従って行われる。成長しているハイブリッドを有するウェルからの上清が、例えば、mAb分泌体についての酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によってスクリーニングされる。ELISA陽性培養物は、限界希釈又は蛍光活性化細胞選別のいずれかによってクローニングされ、典型的には、単一コロニーから確立されたハイブリドーマをもたらす。抗体断片又はサブ断片を含む抗体が特定の抗原に結合する能力は、当該技術分野で既知の結合アッセイによって、例えば、目的の抗原を結合パートナーとして使用することによって決定することができる。あるいは、免疫化抗原に結合する脾臓B細胞が単一細胞として選別され、続いて、重鎖及び軽鎖をコードするcDNAが単一細胞からクローニングされる。次いで、クローニングされたcDNAは、モノクローナル組換え抗体のインビトロ産生に使用され、これらの抗体は、免疫化抗原に対するそれらの特異性及び親和性に基づいて更に特徴付けられる。
本発明による単一特異性IgM型抗体又はそのバリアントは、抗原の単離又は合成を避けて、天然タンパク質が正常な転写後修飾でインビボで発現する遺伝子免疫化方法によって調製され得る。例えば、裸のプラスミドDNA発現ベクターの流体力学的尾部又は肢静脈送達を使用して、マウス、ラット、及びウサギにおいてインビボで目的の抗原を産生し、それによって抗原特異的抗体を誘導することができる(Tang et al,Nature 356:152(1992);Tighe et al,Immunol.Today 19:89(1998);Bates et al,Biotechniques,40:199(2006);Aldevron-Genovac,Freiburg DE)。これにより、診断及び/又は研究目的に特に有用であり得る高力価の抗原特異的抗体の効率的な生成が可能になる。そのような遺伝子免疫化のために、骨格筋、リンパ節、又は真皮への裸のプラスミドDNAの直接注入、エレクトロポレーション、弾道(遺伝子銃)送達、及びウイルスベクター送達を含む様々な遺伝子送達方法を使用することができる。
更なる好ましい実施形態では、本発明の単一特異性IgM型抗体又はそのバリアントは、抗体又はその抗原結合断片であり、その抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体若しくはキメラヒト抗体である、又はその抗原結合断片は、ヒト抗体、ヒト化抗体若しくはキメラヒト抗体の断片である。
ヒト抗体はまた、インビトロ方法によって誘導され得る。好適な例としては、ファージディスプレイ(CAT、Morphosys、Dyax、Biosite/Medarex、Xoma、Yumab、Symphogen、Alexion、Affimed)等が挙げられるが、これに限定されない。ファージディスプレイでは、単一のFab又はFv抗体断片をコードするポリヌクレオチドが、ファージ粒子の表面上に発現される(例えば、Hoogenboom et al.,J.Mol.Biol.,227:381(1991)、Marks et al.,J Mol Biol 222:581(1991)、米国特許第5,885,793号を参照されたい)。ファージは、標的に対する親和性を有するそれらの抗体断片を特定するために「スクリーニング」される。したがって、ある特定のそのようなプロセスは、糸状バクテリオファージの表面上での抗体断片レパートリーのディスプレイ、及びその後のそれらの標的への結合によるファージの選択を通じて免疫選択を模倣する。ある特定のそのような手順において、高親和性機能中和抗体断片が単離される。したがって、ヒト抗体遺伝子の完全なレパートリーは、末梢血リンパ球から天然に再配列されたヒトV遺伝子をクローニングすることによって(例えば、Mullinax et al.,Proc Natl Acad Sci(USA),87:8095-8099(1990)を参照されたい)、又はヒト抗体配列を有する完全合成若しくは半合成ファージディスプレイライブラリを生成することによって(Knappik et al 2000;J Mol Biol 296:57;de Kruif et al,1995;J Mol Biol 248):97を参照されたい)作成され得る。
あるいは、本明細書に記載の抗体は、XenoMouse(登録商標)技術の利用によって調製されてもよい。そのようなマウスは、ヒト免疫グロブリン分子及び抗体を産生することが可能であり、マウス免疫グロブリン分子及び抗体の産生が不十分である。特に、マウス及び抗体のトランスジェニック産生の好ましい実施形態は、1996年12月3日に出願された米国特許出願第08/759,620号、及び1998年6月11日に公開された国際特許出願第98/24893号、並びに2000年12月21日に公開されたWO00/76310に開示されている。また、Mendez et al.,Nature Genetics,15:146-156(1997)も参照されたい。そのような技術の使用を通じて、種々の抗原に対する完全なヒトモノクローナル抗体が産生されてきた。本質的に、マウスのXenoMouse(登録商標)株が目的の抗原、例えばIGSF11(VSIG3)で免疫化され、リンパ細胞(B細胞など)が超免疫化マウスから回収され、回収されたリンパ球が骨髄型細胞株と融合されて、不死ハイブリドーマ細胞株が調製される。これらのハイブリドーマ細胞株が、目的の抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定するためにスクリーニング及び選択される。他の「ヒト化」マウス、例えば、Medarex-HuMabマウス、Kymab-Kymouse、Regeneron-Velocimmuneマウス、Kirin-TCマウス、Trianni-Trianniマウス、OmniAb-OmniMouse、Harbour Antibodies-H2L2マウス、Merus-MeMoマウスもまた市販されている。また、以下の「ヒト化」された他の種も入手可能である。ラット:OmniAb-OmniRat、OMT-UniRat。ニワトリ:OmniAb-OmniChicken。
本発明による「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列(ただし典型的には依然として少なくとも一部)を含有する、免疫グロブリン鎖又はその断片(例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、又は抗体の他の抗原結合サブ配列)を指す。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエント抗体のCDR残基が所望の特異性を、親和性及び能力を有するマウス、ラット又はウサギ等の非ヒト種免疫グロブリン(ドナー抗体)からのCDR残基で置き換えられているヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。したがって、前記抗体又はその断片のフレームワーク配列の少なくとも一部分は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列であり得る。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基は、特異性又は親和性を増加させるために、対応する非ヒト残基で置き換えられる必要がある。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも導入されたCDR又はフレームワーク配列にも存在しない残基も含んでもよい。これらの修飾は、抗体性能を更に精密化し、最大化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、及び典型的には少なくとも2つの可変ドメインの実質的な全てを含み、CDRの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、フレームワーク領域の全て、又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分を含み、(例えばヒト)免疫グロブリン定常領域は、そのような領域の1つ以上の特性を最適化するために、及び/又は(例えば治療用)抗体の機能を改善するために、例えばFcエフェクター機能を増加又は減少させるために、又は血清半減期を増加させるために、(例えば突然変異又は糖鎖工学によって)修飾され得る。例示的なそのようなFc修飾(例えばFcエンジニアリング又はFc強化)は、本明細書の他の場所で説明される。
ヒト定常領域は、mu鎖配列に由来する可能性が最も高いが、例えば減衰したFc領域結合等のその任意のバリアント、例えばガンマ鎖定常配列は、本発明によるIgMバリアントとして使用され得る。
本発明による「キメラ抗体」という用語は、その軽鎖及び/又は重鎖遺伝子が、典型的には、遺伝子操作によって、マウス及びヒト等の異なる種の対応する配列と同一であるか、又は相同である免疫グロブリン可変及び定常領域から構築された抗体を指す。あるいは、可変領域遺伝子は特定の抗体クラス又はサブクラスに由来し、一方、鎖の残りは同じ又は異なる種の別の抗体クラス又はサブクラスに由来する。また、そのような抗体の断片も包含される。例えば、典型的な治療用キメラ抗体は、マウス抗体由来の可変又は抗原結合ドメイン、及びヒト抗体由来の定常又はエフェクタードメインで構成されるハイブリッドタンパク質であるが、他の哺乳動物種が使用されてもよい。
そのような実施形態の中で特に、本発明の単一特異性IgM型抗体又はそのバリアントは、抗体の抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインはヒト抗体のものである。好ましくは、単一特異性IgM型抗体又はそのバリアントは、ヒト抗原結合ドメインである抗体又はその抗原結合断片の抗原結合ドメインを含み、(ii)その抗体がモノクローナル抗体であるか、又はその抗原結合断片がモノクローナル抗体の断片であり、(iii)その抗体がヒト抗体若しくはヒト化抗体であるか、又はその抗原結合断片がヒト抗体、ヒト化抗体若しくはキメラヒト抗体の断片である。
ヒト抗体の軽鎖は、概して、カッパ軽鎖及びラムダ軽鎖として分類され、これらのそれぞれは、1つの可変領域及び1つの定常ドメインを含む。重鎖は、典型的には、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、又はイプシロン鎖として分類され、これらは、上記のように、抗体のアイソタイプをそれぞれ、IgM、IgD、IgG、IgA、及びIgEとして定義する。ヒトIgGは、lgG1、lgG2、lgG3、及びlgG4を含むがこれらに限定されない、いくつかのサブタイプを有する。ヒトIgMサブタイプには、IgMが含まれる。ヒトIgAサブタイプとしては、lgA1及びlgA2が挙げられる。ヒトでは、IgAアイソタイプは4つの重鎖及び4つの軽鎖を含み、IgG及びIgEアイソタイプは2つの重鎖及び2つの軽鎖を含み、IgMアイソタイプは10個又は12個の重鎖及び10個又は12個の軽鎖を含む。本発明による抗体は、IgG、IgE、IgD、IgA、又はIgM免疫グロブリンであってもよい。
いくつかの実施形態では、本発明の単一特異性IgM型抗体又はそのバリアントは、IgM抗体又はその断片である。好ましくは、本発明の抗体は、ヒト、ヒト由来のIgM免疫グロブリン、又はウサギ由来若しくはラット由来のIgMなどのIgG免疫グロブリン又はその断片であるか、それを含むか、又はそれに由来する。
免疫グロブリン定常領域(典型的にはヒト免疫グロブリンのもの)の少なくとも一部分を含む、本発明の単一特異性IgM型抗体又はそのバリアントは、Fcエフェクター機能を増加若しくは減少させる、又は血清半減期を増加させるなど、そのような領域の1つ以上の特性を最適化する、及び/又は(例えば治療)抗体の機能を改善するために、例えば、グリコエンジニアリング又は突然変異によって修飾されたそのような(例えばヒト)免疫グロブリン定常領域を有し得る。
したがって、異なる抗体アイソタイプ又は突然変異型アイソタイプを用いて、異なるFc-ガンマ受容体への結合の程度を制御するために、上記の本発明のABPのいずれかを生成することができる。Fc領域(例えばFab断片)を欠く抗体は、異なるFc-ガンマ受容体への結合を欠く。アイソタイプの選択は、異なるFc-ガンマ受容体への結合にも影響を及ぼす。3つの異なるFc-ガンマ受容体、Fc-ガンマ-RI、Fc-ガンマ-RII、及びFc-ガンマ-RIIIに対する様々なヒトIgGアイソタイプのそれぞれの親和性が決定されている(Ravetch&Kinet,Annu.Rev.Immunol.9,457(1991)を参照されたい)。Fc-ガンマ-RIは、単量体形態でIgGに結合する高親和性受容体であり、後者の2つは、多量体形態でのみIgGに結合する低親和性受容体である。一般に、IgG1及びIgG3は両方とも3つの受容体全てに対し、IgG4はFc-ガンマ-RIに対し、及びIgG2はIIaLRと呼ばれるただ1つの型のFc-ガンマ-RIIに対し有意な結合活性を有する(Parren et al.,J.Immunol.148,695(1992)を参照されたい)。したがって、ヒトアイソタイプIgG1は、通常、Fc-ガンマ受容体へのより強い結合のために選択され、IgG2又はIgG4は、通常、より弱い結合のために選択される。本発明の好ましい実施形態は、Fc受容体結合が減少又は排除されるそのような抗体を提供する。
Fc-ガンマ-R結合の増加と突然変異したFcとの間の相関は、標的化細胞毒性細胞ベースアッセイを使用して示されている(Shields et ah,2001,J.Biol.Chem.276:6591-6604;Presta et ah,2002,Biochem Soc.Trans.30:487-490)。特異的Fc領域変異を介してADCC活性を増加させるための方法は、234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、267、269、296、297、298、299、313、325、327、328、329、330及び332からなる群から選択される位置に少なくとも1つのアミノ酸置換を含むFcバリアントを含み、Fc領域内の残基の付番は、KabatにおけるEUインデックスの付番である(Kabat et ah,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health,Bethesda,Md.1987)。
ある特定の実施形態では、前記Fcバリアントは、L234D、L234E、L234N、L234Q、L234T、L234H、L234Y、L234I、L234V、L234F、L235D、L235S、L235N、L235Q、L235T、L235H、L235Y、L235I、L235V、L235F、S239D、S239E、S239N、S239Q、S239F、S239T、S239H、S239Y、V240I、V240A、V240T、V240M、F241W、F241L、F241Y、F241E、F241R、F243W、F243L、F243Y、F243R、F243Q、P244H、P245A、P247V、P247G、V262I、V262A、V262T、V262E、V263I、V263A、V263T、V263M、V264L、V264I、V264W、V264T、V264R、V264F、V264M、V264Y、V264E、D265G、D265N、D265Q、D265Y、D265F、D265V、D265I、D265L、D265H、D265T、V266I、V266A、V266T、V266M、S267Q、S267L、E269H、E269Y、E269F、E269R、Y296E、Y296Q、Y296D、Y296N、Y296S、Y296T、Y296L、Y296I、Y296H、N297S、N297D、N297E、A298H、T299I、T299L、T299A、T299S、T299V、T299H、T299F、T299E、W313F、N325Q、N325L、N325I、N325D、N325E、N325A、N325T、N325V、N325H、A327N、A327L、L328M、L328D、L328E、L328N、L328Q、L328F、L328I、L328V、L328T、L328H、L328A、P329F、A330L、A330Y、A330V、A330I、A330F、A330R、A330H、I332D、I332E、I332N、I332Q、I332T、I332H、I332Y及びI332Aからなる群から選択される少なくとも1つの置換を含み、Fc領域内の残基の付番は、KabatにおけるEUインデックスの付番である。
Fcバリアントはまた、V264L、V264I、F241W、F241L、F243W、F243L、F241L/F243L/V262I/V264I、F241W/F243W、F241W/F243W/V262A/V264A、F241L/V262I、F243L/V264I、F243L/V262I/V264W、F241Y/F243Y/V262T/V264T、F241E/F243R/V262E/V264R、F241E/F243Q/V262T/V264E、F241R/F243Q/V262T/V264R、F241E/F243Y/V262T/V264R、L328M、L328E、L328F、I332E、L3238M/I332E、P244H、P245A、P247V、W313F、P244H/P245A/P247V、P247G、V264I/I332E、F241E/F243R/V262E/V264R/I332E、F241E/F243Q/V262T/264E/I332E、F241R/F243Q/V262T/V264R/I332E、F241E/F243Y/V262T/V264R/I332E、S298A/I332E、S239E/I332E、S239Q/I332E、S239E、D265G、D265N、S239E/D265G、S239E/D265N、S239E/D265Q、Y296E、Y296Q、T299I、A327N、S267Q/A327S、S267L/A327S、A327L、P329F、A330L、A330Y、I332D、N297S、N297D、N297S/I332E、N297D/I332E、N297E/I332E、D265Y/N297D/I332E、D265Y/N297D/T299L/I332E、D265F/N297E/I332E、L328I/I332E、L328Q/I332E、I332N、I332Q、V264T、V264F、V240I、V263I、V266I、T299A、T299S、T299V、N325Q、N325L、N325I、S239D、S239N、S239F、S239D/I332D、S239D/I332E、S239D/I332N、S239D/I332Q、S239E/I332D、S239E/I332N、S239E/I332Q、S239N/I332D、S239N/I332E、S239N/I332N、S239N/I332Q、S239Q/I332D、S239Q/I332N、S239Q/I332Q、Y296D、Y296N、F241Y/F243Y/V262T/V264T/N297D/I332E、A330Y/I332E、V264I/A330Y/I332E、A330L/I332E、V264I/A330L/I332E、L234D、L234E、L234N、L234Q、L234T、L234H、L234Y、L234I、L234V、L234F、L235D、L235S、L235N、L235Q、L235T、L235H、L235Y、L235I、L235V、L235F、S239T、S239H、S239Y、V240A、V240T、V240M、V263A、V263T、V263M、V264M、V264Y、V266A、V266T、V266M、E269H、E269Y、E269F、E269R、Y296S、Y296T、Y296L、Y296I、A298H、T299H、A330V、A330I、A330F、A330R、A330H、N325D、N325E、N325A、N325T、N325V、N325H、L328D/I332E、L328E/I332E、L328N/I332E、L328Q/I332E、L328V/I332E、L328T/I332E、L328H/I332E、L328I/I332E、L328A、I332T、I332H、I332Y、I332A、S239E/V264I/I332E、S239Q/V264I/I332E、S239E/V264I/A330Y/I332E、S239E/V264I/S298A/A330Y/I332E、S239D/N297D/I332E、S239E/N297D/I332E、S239D/D265V/N297D/I332E、S239D/D265I/N297D/I332E、S239D/D265L/N297D/I332E、S239D/D265F/N297D/I332E、S239D/D265Y/N297D/I332E、S239D/D265H/N297D/I332E、S239D/D265T/N297D/I332E、V264E/N297D/I332E、Y296D/N297D/I332E、Y296E/N297D/I332E、Y296N/N297D/I332E、Y296Q/N297D/I332E、Y296H/N297D/I332E、Y296T/N297D/I332E、N297D/T299V/I332E、N297D/T299I/I332E、N297D/T299L/I332E、N297D/T299F/I332E、N297D/T299H/I332E、N297D/T299E/I332E、N297D/A330Y/I332E、N297D/S298A/A330Y/I332E、S239D/A330Y/I332E、S239N/A330Y/I332E、S239D/A330L/I332E、S239N/A330L/I332E、V264I/S298A/I332E、S239D/S298A/I332E、S239N/S298A/I332E、S239D/V264I/I332E、S239D/V264I/S298A/I332E、及びS239D/264I/A330L/I332Eからなる群から選択され得、Fc領域内の残基の付番は、KabatにおけるEUインデックスの付番である。参照により本明細書に組み込まれるWO2004/029207もまた参照されたい。
特定の実施形態では、ヒンジ連結領域内の部位上の、それに隣接する、又はそれに近い突然変異(例えば、残基234、235、236、及び/又は237を別の残基で置き換えること)は、全てのアイソタイプにおいて、Fc-ガンマ受容体、特にFc-ガンマ-RI受容体に対する親和性を低下させるために形成することができる(例えばUS6624821を参照されたい)。任意選択的に、234、236、及び/又は237位は、アラニンで置換され、235位は、グルタメートで置換されている(例えばUS5624821を参照されたい)。236位は、ヒトIgG2アイソタイプでは欠如している。ヒトIgG2の234、235、及び237位のアミノ酸の例示的なセグメントは、Ala Ala Gly、Val Ala Ala、Ala Ala Ala、Val Glu Ala、及びAla Glu Alaである。突然変異体の好ましい組み合わせは、L234A、L235E及びG237Aであるか、又はヒトアイソタイプIgG1についてはL234A、L235A、及びG237Aである。本発明の単一特異性IgM型抗体の特定の好ましいバリアントは、ヒトアイソタイプIgG1及びFc領域のこれらの3つの変異のうちの1つを有する抗体である。Fc-ガンマ受容体への結合を低減する他の置換は、E233P突然変異(特にマウスIgG1において)及びD265A(特にマウスIgG2aにおいて)である。Fc及び/又はC1q結合を低減する突然変異及び突然変異の組み合わせの他の例は、E318A/K320A/R322A(特にマウスIgG1において)、L235A/E318A/K320A/K322A(特にマウスIgG2aにおいて)である。同様に、ヒトIgG4中の残基241(Ser)は、例えば、Fc結合を破壊するためにプロリンと置き換えることができる。
エフェクター活性を調節するために、定常領域に対して追加の突然変異を形成することができる。例えば、A330S、P331S、又はその両方でIgG1又はIgG2定常領域に突然変異が形成され得る。IgG4については、E233P、F234V及びL235Aで、G236が欠失した状態で、又はそれらの任意の組み合わせで、突然変異が形成され得る。IgG4はまた、以下の突然変異S228P及びL235Eの一方又は両方を有することができる。エフェクター機能を調節するための破壊された定常領域配列の使用は、例えば、WO2006/118,959及びWO2006/036291に更に記載されている。
エフェクター活性を調節するために、追加の突然変異がヒトIgGの定常領域に形成され得る(例えばWO2006/03291を参照されたい)。これらには、ヒトIgG1に対する(i)A327G、A330S、P331S;(ii)E233P、L234V、L235A、G236欠失;(iii)E233P、L234V、L235A;(iv)E233P、L234V、L235A、G236欠失、A327G、A330S、P331S;及び(v)E233P、L234V、L235A、A327G、A330S、P331S;又は特に(vi)L234A、L235E、G237A、A330S及びP331S(例えばヒトIgG1に対する)の置換が含まれ、Fc領域内の残基の付番は、KabatにおけるEUのインデックスの付番である。参照により本明細書に組み込まれるWO2004/029207もまた参照されたい。
Fc-ガンマ-Rに対する抗体の親和性は、重鎖定常領域のある特定の残基を突然変異させることによって変化させることができる。例えば、ヒトIgG1のグリコシル化部位の破壊は、抗体のFc-ガンマ-R結合、したがってエフェクター機能を低減することができる(例えば、WO2006/036291を参照されたい)。トリペプチド配列NXS及びNXT(Xはプロリン以外の任意のアミノ酸である)は、N残基のグリコシル化のための酵素認識部位である。特にIgGのCH2領域におけるトリペプチドアミノ酸のいずれかの破壊は、その部位でのグリコシル化を防止する。例えば、ヒトIgG1のN297の突然変異は、グリコシル化を防止し、抗体へのFc-ガンマ-R結合を低減する。
ADCC及びCDCの活性化は、治療用抗体にとってしばしば望ましいが、本発明の単一特異性IgM型抗体又はそのバリアントがエフェクター機能を活性化することができないことが優先的な状況がある(例えば、不可知的調節物質である本発明の抗体)。これらの目的のために、IgG4は一般的に使用されてきたが、このサブクラスがFabアーム交換を受ける独自の能力のために、これは近年好まれなくなっており、重鎖はインビボでIgG4と残留ADCC活性との間で交換することができる。したがって、Fcエンジニアリングアプローチを使用して、Fc-ガンマ受容体及びC1qを有するFcドメインの主要相互作用部位を決定し、次いで、本発明の単一特異性IgM型抗体又はそのバリアントのFcなどのこれらの位置を変異させて、結合を低減又は無効化することもできる。アラニンスキャニングを通して、Duncan and Winter(1998;Nature 332:738)は、まずC1qの結合部位を、Fcドメインのヒンジ及び上部CH2をカバーする領域に単離した。Genmabの研究者らは、組み合わせてFc-ガンマ-R及びC1q結合をほぼ完全に無効化するのに十分である突然変異K322A、L234A及びL235Aを特定した(Hezareh et al,2001;J Virol 75:12161)。同様に、MedImmuneは、後に、非常に類似した効果を有する3つの突然変異、L234F/L235E/P331S(TMと呼ばれる)のセットを特定した(Oganesyan et al,2008;Acta Crystallographica 64:700)。代替的アプローチは、最適なFcR相互作用に必要であることが知られている、Fcドメインのアスパラギン297上のグリコシル化の修飾である。Fc-ガンマ-Rへの結合の喪失は、N297点突然変異(Tao et al,1989;J Immunol 143:2595)、酵素的に脱グリコシル化されたFcドメイン(Mimura et al,2001;J Biol Chem 276:45539)、グリコシル化阻害剤の存在下で組換え的に発現された抗体(Walker et al,1989;Biochem J 259:347)、及び細菌におけるFcドメインの発現(Mazor et al 2007;Nat Biotechnol 25:563)において観察されている。したがって、本発明はまた、そのような技術又は突然変異がエフェクター機能を低減するために使用されている単一特異性IgM型抗体又はそのバリアントの実施形態を含む。
IgGは、FcRn媒介性リサイクルにより、(例えばヒト)血清中で長期間自然に持続し、約21日間の典型的な半減期をもたらす。これにもかかわらず、FcドメインとFcRnとのpH依存性相互作用を操作して、pH7.4で最小限の結合を維持しながら、pH6.0で親和性を増加させるためのいくつかの努力がなされてきた。PDL BioPharmaの研究者らは、アカゲザルにおけるIgG半減期の約2倍の増加をもたらしたT250Q/M428Lの突然変異を特定し(Hinto et al,2004;J Biol Chem 279:6213)、MedImmuneの研究者らは、カニクイザルにおけるIgG半減期の約4倍の増加をもたらしたM252Y/S254T/T256E(YTEと称される)の突然変異を特定した(Dall’Acqua,et al 2006;J Biol Chem 281:23514)。M252Y/S254T/T256E突然変異と点突然変異H433K/N434Fの組み合わせは、同様の効果をもたらす(Vaccaro et al.,2005,Nat Biotechnol.Oct;23(10):1283-8)。また、本発明のABPは、PEG化されてもよい。PEG化、すなわち合成ポリマーポリエチレングリコール(PEG)との化学結合は、現在までに約10種類の臨床的に承認されたタンパク質及びペプチド薬物を用いて、長期作用を発揮する生物製剤の開発のための認められた技術として出現した(Jevsevar et al.,2010;Biotechnol J 5:113)。本発明の単一特異性IgM型抗体又はそのバリアントもまた、薬学的に活性なタンパク質の血漿半減期を延長するためのPEG化に対する生物学的代替物であるPAS化に供され得る(Schlapschy et al,2013;Protein Eng Des Sel 26:489;XL-protein GmbH,Germany)。同様に、AmunixのXTEN半減期延長技術は、PEG化の別の生物学的代替法を提供する(Schellenberger,2009,Nat Biotechnol.;27(12):1186-90.doi:10.1038/nbt.1588)。したがって、本発明はまた、そのような技術又は突然変異が、特にヒト血清中の血清半減期を延長するために使用されている抗体の実施形態を含む。
抗体断片には、「Fab断片」が含まれ、これは、重鎖及び軽鎖のそれぞれの1つの定常ドメイン及び1つの可変ドメインで構成され、軽鎖の隣接する定常領域及び重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)によって一緒に保持される。これらは、従来の抗体から、例えばパパインを用いたプロテアーゼ消化によって形成されてもよいが、同様のFab断片はまた、遺伝子操作によって生成されてもよい。Fab断片には、Fab’、Fab、及び「Fab-SH」(これらは、少なくとも1つの遊離スルフヒドリル基を含有するFab断片である)が含まれる。
Fab’断片は、抗体ヒンジ領域からの1つ以上のシステインを含む重鎖の第1の定常ドメインのカルボキシ末端に追加の残基を含む点でFab断片とは異なる。Fab’断片には、「Fab’-SH」(少なくとも1つの遊離スルフヒドリル基を含有するFab’断片である)が含まれる。
更に、抗体断片には、2つの軽鎖と、CH1ドメインとCH2ドメインとの間の定常領域の一部(「ヒンジ領域」)を含む2つの重鎖とを含むF(ab’)2断片が含まれ、その結果、2つの重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合が形成される。したがって、F(ab’)2断片は、2つの重鎖間のジスルフィド結合によって一緒に保持される2つのFab’断片で構成される。F(ab’)2断片は、ヒンジ領域の下で切断する酵素によるタンパク質分解切断によって、例えば、ペプシンによって、又は遺伝子操作によって、従来の抗体から調製され得る。
「Fv領域」は、重鎖及び軽鎖の両方の可変領域を含むが、定常領域を欠いている。「一本鎖抗体」又は「scFv」は、重鎖及び軽鎖可変領域が柔軟なリンカーによって接続されて単一のポリペプチド鎖を形成し、それが抗原結合領域を形成するFv分子である。
「Fc領域」は、抗体のCH2及びCH3ドメインを含む2つの重鎖断片を含む。2つの重鎖断片は、2つ以上のジスルフィド結合及びCH3ドメインの疎水性相互作用によって一緒に保持される。
したがって、いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、Fab’、Fab、Fab’-SH、Fab-SH、Fv、scFv及びF(ab’)2からなるリストから選択される抗体断片である。
好ましい実施形態では、本発明の抗体は、前記抗体又はその断片のフレームワーク配列の少なくとも一部分が、ヒトコンセンサスフレームワーク配列である抗体、例えばヒト生殖細胞系コードフレームワーク配列を含む抗体である。
他のある特定の実施形態では、本発明の単一特異性IgM型抗体又はそのバリアントは、特にヒト血清中の血清半減期を延長するように修飾される。例えば、本発明の抗体は、PEG化及び/若しくはPAS化されてもよく、又はT250Q/M428L、H433K/N434F/Y436、又はM252Y/S254T/T256E/H433K/N434F修飾を有するFc領域を有してもよい。
好ましい実施形態では、本発明の抗体は、少なくとも1つの抗体定常ドメインを含むことができ、特に、少なくとも1つの抗体定常ドメインは、CH1、CH2、若しくはCH3ドメイン、又はそれらの組み合わせである。
そのような実施形態の更なるものでは、抗体定常ドメインを有する本発明の抗体は、例えば、Fc領域とFc受容体(免疫エフェクター細胞上のFc受容体)との相互作用を減少させるための、突然変異Fc領域を含む(例えば、Saxena&Wu,2016;Front Immunol 7:580)。実施例及びその実施形態は、本明細書の別の箇所に記載されている。
他の実施形態では、本発明の単一特異性IgM型抗体又はそのバリアントは、エフェクター基及び/又は標識基を含み得る。「エフェクター基」という用語は、細胞傷害性剤として作用する任意の基、特に、抗原結合タンパク質などの別の分子に結合した基を意味する。好適なエフェクター基の例は、放射性同位体又は放射性核種である。他の好適なエフェクター基としては、毒素、治療基、又は化学療法基が挙げられる。好適なエフェクター基の例としては、カリケアマイシン、オーリスタチン、ゲルダナマイシン、アルファ-アマニチン、ピロロベンゾジアゼピン及びメイタンシンが挙げられる。
「標識」又は「標識基」という用語は、任意の検出可能な標識を指す。一般に、標識は、それらが検出されるアッセイに応じて、以下の様々なクラスに分けられる:a)放射性又は重同位体であり得る同位体標識、b)磁性標識(例えば磁性粒子)、c)酸化還元活性部分、d)光学色素、酵素基(例えば、ホースラジッシュペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ)、e)ビオチン化基、及びf)二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ(例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ等)。
ある特定の実施形態では、本発明は、本発明のオリゴマー抗インスリン抗体に関し、免疫グロブリンは、a)配列番号2に定義されるCDR1、配列番号3に定義されるCDR2、及び配列番号4に定義されるCDR3を含む可変重鎖(VH)、並びに配列番号6に定義されるCDR1、配列DASで定義されるCDR2、及び配列番号7に定義されるCDR3を含む可変軽鎖(VL)を含む;b)配列番号9に定義されるCDR1、配列番号10に定義されるCDR2、及び配列番号11に定義されるCDR3を含む可変重鎖(VH)、並びに配列番号13に定義されるCDR1、配列GASで定義されるCDR2、及び配列番号14に定義されるCDR3を含む可変軽鎖(VL)、又はc)配列番号16に定義されるCDR1、配列番号17に定義されるCDR2、及び配列番号18に定義されるCDR3を含む可変重鎖(VH)、並びに配列番号20に定義されるCDR1、配列DASで定義されるCDR2、及び配列番号21に定義されるCDR3によって定義される可変軽鎖(VL)を含む。
ある特定の実施形態では、本発明は、本発明のオリゴマー抗インスリン抗体に関し、オリゴマー抗インスリン抗体は、a)配列番号1のアミノ酸配列、又は配列番号1に対して少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%若しくは99%、好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む可変重鎖(VH)配列、及び配列番号4のアミノ酸配列、又は配列番号4に対して少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%若しくは99%、好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む可変軽鎖(VL)配列を含むか、あるいはb)配列番号8のアミノ酸配列、又は配列番号8に対して少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%若しくは99%、好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む可変重鎖(VH)配列、及び配列番号12のアミノ酸配列、又は配列番号12のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%若しくは99%、好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む可変軽鎖(VL)配列を含むか、あるいはc)配列番号15のアミノ酸配列、又は配列番号15に対して少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%若しくは99%、好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む可変重鎖(VH)配列、及び配列番号19のアミノ酸配列、又は配列番号19に対して少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%若しくは99%、好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む可変軽鎖(VL)配列を含む。
参照ポリペプチド配列に関して、「パーセント(%)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して、配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮せずに最大のパーセント配列同一性を達成した後、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のための整列は、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウェアを使用して、当該技術分野内にある様々な方式で達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大の整列を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマー抗インスリン抗体は、配列番号4、配列番号12又は配列番号21のアミノ酸配列に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有する可変軽鎖(VL)配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマー抗インスリン抗体は、配列番号4、配列番号12又は配列番号21のアミノ酸配列に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有する可変軽鎖(VL)配列を含み、参照配列と比較して置換、挿入、又は欠失を含有するが、高親和性及び/又は単一特異性を伴ってインスリン及び/又はプロインスリンに結合する能力を保持する。任意選択で、本発明のオリゴマー抗インスリン抗体は、配列番号4、配列番号12又は配列番号21のVL配列(その配列の翻訳後修飾を含む)を含む。
ある特定の実施形態では、本発明のオリゴマー抗インスリン抗体は、配列番号1、配列番号8又は配列番号15のアミノ酸配列に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の同一性を有する可変重鎖(VH)配列を含む。ある特定の実施形態では、本発明のオリゴマー抗インスリン抗体は、配列番号1、配列番号8又は配列番号15のアミノ酸配列に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有する可変重鎖(VH)配列を含み、参照配列と比較して置換、挿入、又は欠失を含有するが、高親和性及び/又は単一特異性を伴ってインスリン及び/又はプロインスリンに結合する能力を保持する。任意選択で、本発明のオリゴマー抗インスリン抗体は、配列番号1、配列番号8又は配列番号15のVH配列(その配列の翻訳後修飾を含む)を含む。
ある特定の実施形態では、合計1~10個のアミノ酸が、配列番号1、配列番号4、配列番号8、配列番号12、配列番号15、及び/又は配列番号21において置換、挿入、及び/又は欠失されている。ある特定の実施形態では、合計1~5個のアミノ酸が、配列番号1、配列番号4、配列番号8、配列番号12、配列番号15、及び/又は配列番号21において置換、挿入、及び/又は欠失されている。
ある特定の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、CDRの外側の領域(すなわちFR内)において生じる。好ましい実施形態では、哺乳動物細胞における発現を最適化するために、配列番号1、配列番号4、配列番号8、配列番号12、配列番号15、及び/又は配列番号21の合計6個のアミノ酸が置換されている。
抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、又はペプチド合成によって調製され得る。そのような修飾としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び/又は残基への挿入、及び/又は残基の置換が挙げられる。最終構築物が所望の特性、例えば抗原結合を有する限り、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが最終構築物を達成するために行われ得る。
ある特定の実施形態では、1つ以上のアミノ酸置換を有する抗体バリアントが提供される。アミノ酸置換は、対象となる抗体に導入されてもよく、生成物は、所望の活性、例えば、保持/改善された抗原結合、減少した免疫原性、又は変化したADCC又はCDCについてスクリーニングされてもよい。
置換バリアントの1つの型は、親抗体(例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体)の1つ以上の超可変領域残基を置換することを伴う。一般に、更なる研究のために選択される結果として生じるバリアントは、親抗体と比較して、ある特定の生物学的特性における修飾(例えば改善)(例えば、親和性の増加、免疫原性の減少)を有するであろう、及び/又は親抗体のある特定の生物学的特性を実質的に保持するであろう。例示的な置換バリアントは、例えば、本明細書に記載されるもの等のファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を使用して、好都合に生成され得る親和性成熟抗体である。簡潔に説明すると、1つ以上のCDR残基が突然変異し、バリアント抗体がファージ上にディスプレイされ、特定の生物学的活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。
例えば、抗体親和性を改善するために、CDRにおいて改変(例えば置換)が行われてもよい。そのような改変は、CDR「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で突然変異を受けるコドンによってコードされる残基(例えば、Chowdhury,2008,Methods Mol.Biol.207:179-196を参照されたい)、及び/又はSDR(a-CDR)において行われてもよく、得られたバリアントVH又はVLは、結合親和性について試験される。二次ライブラリを構築し、そこから再選択することによる親和性成熟は、例えば、Hoogenboom et al.,2002 in Methods in Molecular Biology 178:1-37に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施形態では、多様性は、様々な方法(例えば、エラープローンPCR、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド指向突然変異誘発)のいずれかによって成熟のために選択される可変遺伝子に導入される。次いで、二次ライブラリを作成する。次いで、ライブラリをスクリーニングして、所望の親和性を有する任意の抗体バリアントを特定する。多様性を導入する別の方法は、いくつかのCDR残基(例えば、一度に4~6個の残基)がランダム化されるCDR指向性アプローチを伴う。抗原結合に関与するCDR残基は、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発又はモデリングを使用して、特異的に特定することができる。特に、CDR-H3及びCDR-L3が標的化されることが多い。別の実施形態では、選択されたアミノ酸の組み合わせ突然変異を同時に評価及び最適化する多次元変異誘発方法により、ルックスルー突然変異誘発を用いて抗体親和性が最適化される(Rajpal,Arvind et al.,2005,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America vol.102,24:8466-71)
ある特定の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、1つ以上のCDR内で生じてもよい。例えば、結合親和性及び/又は単一特異性を実質的に低下させない保存的改変(例えば、本明細書において提供されるような保存的置換)が、CDRにおいて行われ得る。そのような改変は、CDR「ホットスポット」又はSDRの外側であってもよい。上記で提供されるバリアントVH及びVL配列の特定のある実施形態では、各CDRは、改変されていないか、又は1つ、2つ、若しくは3つ以下のアミノ酸置換を含有するかのいずれかである。
突然変異誘発のために標的とされ得る抗体の残基又は領域を特定するための有用な方法は、Cunningham and Wells,1989,Science,244:1081-1085により説明されるように「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、残基又は標的残基の群(例えば、arg、asp、his、lys、及びgluなどの荷電残基)が特定され、中性又は負に荷電したアミノ酸(例えば、アラニン又はポリアラニン)で置き換えられ、抗体と抗原との相互作用が影響されるかどうかが決定される。更なる置換は、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入され得る。あるいは、又は追加的に、抗原-抗体複合体の結晶構造を使用して、抗体と抗原との間の接触点が特定される。そのような接触残基及び隣接する残基は、置換の候補として標的化されるか、又は排除され得る。バリアントをスクリーニングして、それらが所望の特性を含むかどうかを決定することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、1つ以上のグリコシル化部位が形成又は除去されるようにアミノ酸配列を改変することによって好都合に達成され得る。
抗体がFc領域を含む場合、それに結合した炭水化物は改変され得る。哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は、典型的には、Fc領域のCH2ドメインのAsn297へのN結合によって一般的に結合される分岐した二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Wright et al.,1997,TIBTECH 15:26-32を参照されたい。オリゴ糖は、種々の炭水化物、例えば、マンノース、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐オリゴ糖構造の「茎」中のGlcNAcに付着したフコースを含み得る。いくつかの実施形態では、本発明の抗体中のオリゴ糖の修飾は、特定の改善された特性を有する抗体バリアントを形成するために行われ得る。
一実施形態では、Fc領域に(直接的又は間接的に)結合されたフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体バリアントが提供される。例えば、そのような抗体におけるフコースの量は、1%~80%、1%~65%、5%~65%又は20%~40%であってもよい。フコースの量は、例えば、WO2008/077546に記載のように、MALDI-TOF質量分析によって測定される、Asn297に結合した全ての糖構造(例えば、複合体、ハイブリッド及び高マンノース構造)の合計に対する、Asn297における糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Asn297は、Fc領域内の約297位に位置するアスパラギン残基(Fe領域残基のEu付番)を指すが、Asn297はまた、抗体中の少数の配列変異に起因して、297位の約±3アミノ酸上流又は下流、すなわち、294位と300位との間に位置し得る。そのようなフコシル化バリアントは、炎症に対する変化した影響を有し得る(Irvine,Edward B,and Galit Alter.,2020,Glycobiology vol.30,4:241-253)。例えば、US2003/0157108、US2004/0093621を参照されたい。「脱フコシル化」又は「フコース欠損」抗体バリアントに関連する刊行物の例としては、US2003/0157108、WO2000/61739、WO2001/29246、US2003/0115614、US2002/0164328、US2004/0093621、US2004/0132140、US2004/0110704、US2004/0110282、US2004/0109865、WO2003/085119、WO2003/084570、WO2005/035586、WO2005/035778、WO2005/053742、WO2002/031140、Okazaki et al.2004 J.Mol.Biol.336:1239-1249、Yamane-Ohnuki et al.,2004,Biotech.Bioeng.87:614が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例としては、タンパク質フコシル化が欠損したLec13 CHO細胞(Ripka et al.,1986,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545、US2003/0157108、及びWO2004/056312、特に実施例11)、並びにアルファ-1,6-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、FUT8、ノックアウトCHO細胞(Yamane-Ohnuki et al.,2004,Biotech.Bioeng.87:614、Kanda,Y.et al.,2006,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688、及びWO2003/085l07)が挙げられる。
抗体バリアントは、例えば、抗体のFc領域に結合した二分岐オリゴ糖がGlcNAcによって二分される、二分されたオリゴ糖を更に有する。そのような抗体バリアントは、変化したフコシル化及び/又は炎症に対する変化した影響を有し得る(Irvine,Edward B,and Galit Alter.,2020,Glycobiology vol.30,4:241-253)。そのような抗体バリアントの例は、例えば、WO2003/011878、米国特許第6,602,684号、及びUS2005/0123546に記載されている。Fc領域に結合したオリゴ糖内の少なくとも1つのガラクトース残基を有する抗体バリアントも提供される。かかる抗体バリアントは、改善されたCDC機能を有し得る。そのような抗体バリアントは、例えば、WO1997/30087、WO1998/58964、及びWO1999/22764に記載されている。
ある特定の実施形態では、1つ以上のアミノ酸修飾が、本明細書で提供される抗体のFc領域に導入されてもよく、それにより、Fc領域バリアントが生成される。Fc領域バリアントは、1つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾(例えば置換)を含むヒトFc領域配列(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4 Fc領域)を含み得る。
半減期が増加し、胎児への母体IgGの移行に関与する新生児Fc受容体(FcRn)への結合が改善された抗体(Guyer et al.,1976,J.Immunol.117:587及びKirn et al.,1994 J.Immunol.24:249)が、US2005/0014934に記載されている。これらの抗体は、その中にFc領域のFcRnへの結合を改善する1つ以上の置換を有するFc領域を含む。そのようなFcバリアントとしては、Fc領域残基:238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424又は434のうちの1つ以上での置換、例えばFc領域残基434の置換(US2006/0194291)を有するものが挙げられる。
ある特定の実施形態では、抗体の1つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作抗体、例えば、「thioMAb」を形成することが望ましい場合がある。特定の実施形態では、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位に生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基が抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書に更に記載されるように、抗体を他の部分、例えば薬物部分又はリンカー-薬物部分にコンジュゲートするために使用され得る。ある特定の実施形態では、以下の残基のうちの任意の1つ以上が、システインで置換されてもよい:軽鎖のV205(Kabat付番)、重鎖のA118(EU付番)、及び重鎖Fc領域のS400(EU付番)。システイン操作された抗体は、例えば、US7521541に記載されるように生成されてもよい。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、当該技術分野で既知であり、容易に利用可能な追加の非タンパク質性部分を含有するように更に修飾され得る。抗体の誘導体化に好適な部分としては、水溶性ポリマーが挙げられるが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレインコポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか)、及びデキストラン又はポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール、並びにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中での安定性のために、製造において利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量であり得、分枝状又は非分枝状であり得る。抗体に結合したポリマーの数は様々であり得、2つ以上のポリマーが結合している場合、それらは同じ又は異なる分子であり得る。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び/又は種類は、改善される抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が定義された条件下で治療に使用されるかどうか等を含むがこれらに限定されない考慮点に基づいて決定され得る。
ある特定の実施形態では、本発明は、本発明のオリゴマー抗インスリン抗体をコードするポリヌクレオチドに関する。
「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合、核酸配列を指す。核酸配列は、DNA又はRNA配列であってもよく、好ましくは、核酸配列はDNA配列である。本発明のポリヌクレオチドは、本質的に前述の核酸配列からなるか、又は前述の核酸配列を含むかのいずれかである。したがって、それらは、更なる核酸配列も含み得る。本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、単離されたポリヌクレオチド(すなわち、その天然のコンテキストから単離された)又は遺伝子改変形態のいずれかとして提供されるものである。本明細書で言及される単離されたポリヌクレオチドはまた、それらの天然細胞コンテキスト、すなわち異種ポリヌクレオチド以外の細胞コンテキストに存在するポリヌクレオチドを包含する。ポリヌクレオチドという用語は、一本鎖ポリヌクレオチド及び二本鎖ポリヌクレオチドを包含する。更に、グリコシル化若しくはメチル化ポリヌクレオチドなどの天然に存在する修飾ポリヌクレオチド、又はビオチン化ポリヌクレオチドなどの人工修飾ポリヌクレオチドを含む化学修飾ポリヌクレオチドも含まれる。
ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号22のヌクレオチド配列、又は配列番号22と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の配列同一性を有する配列を含む、好ましくは配列番号23、配列番号24及び配列番号25の配列を含む可変重鎖(VH)配列をコードするポリヌクレオチド配列に関する。
ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号26のヌクレオチド配列、又は配列番号26と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の配列同一性を有する配列を含む、好ましくは配列番号27、GATGCATCC及び配列番号28の配列を含む可変軽鎖(VL)配列をコードするポリヌクレオチド配列に関する。
ある特定の実施形態では、本発明は、a)配列番号22のヌクレオチド配列、又は配列番号22と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の配列同一性を有する配列を含む、好ましくは配列番号23、配列番号24及び配列番号25の配列を含む可変重鎖(VH)配列、並びにb)配列番号配列番号26のヌクレオチド配列、又は配列番号26と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の配列同一性を有する配列を含む、好ましくは配列番号27、GATGCATCC及び配列番号28の配列を含む可変軽鎖(VL)配列をコードするポリヌクレオチド配列に関する。
ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号29のヌクレオチド配列、又は配列番号29と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の配列同一性を有する配列を含む、好ましくは配列番号30、配列番号31及び配列番号32の配列を含む可変重鎖(VH)配列をコードするポリヌクレオチド配列に関する。
ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号33のヌクレオチド配列、又は配列番号33と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の配列同一性を有する配列を含む、好ましくは配列番号34、GGTGCATCC及び配列番号35の配列を含む可変軽鎖(VL)配列をコードするポリヌクレオチド配列に関する。
ある特定の実施形態では、本発明は、a)配列番号29のヌクレオチド配列、又は配列番号29と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の配列同一性を有する配列を含む、好ましくは配列番号30、配列番号31及び配列番号32の配列を含む可変重鎖(VH)配列、並びにb)配列番号33のヌクレオチド配列、又は配列番号33と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の配列同一性を有する配列を含む、好ましくは配列番号34、GGTGCATCC及び配列番号35の配列を含む可変軽鎖(VL)配列をコードするポリヌクレオチド配列に関する。
ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号36のヌクレオチド配列、又は配列番号36と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の配列同一性を有する配列を含む、好ましくは配列番号37、配列番号38及び配列番号39の配列を含む可変重鎖(VH)配列をコードするポリヌクレオチド配列に関する。
ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号40のヌクレオチド配列、又は配列番号40と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の配列同一性を有する配列を含む、好ましくは配列番号41、GATGCATCC及び配列番号42の配列を含む可変軽鎖(VL)配列をコードするポリヌクレオチド配列に関する。
ある特定の実施形態では、本発明は、a)配列番号36のヌクレオチド配列、又は配列番号36と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の配列同一性を有する配列を含む、好ましくは配列番号37、配列番号38及び配列番号39の配列を含む可変重鎖(VH)配列、並びにb)配列番号40のヌクレオチド配列、又は配列番号40と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の配列同一性を有する配列を含む、好ましくは配列番号41、GATGCATCC及び配列番号42の配列を含む可変軽鎖(VL)配列をコードするポリヌクレオチド配列に関する。
ある特定の実施形態では、本発明に記載の抗体をコードするポリヌクレオチドは、ベクターとしての使用に好適である。
ある特定の実施形態では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は、互換的に使用され、そのような細胞の子孫を含む、外因性核酸が導入された細胞を指す。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらには、一次形質転換細胞、及び継代の数に関係なくそれに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸含有量が親細胞と完全に同一ではなくてもよいが、突然変異を含んでいてもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生物学的活性を有する変異子孫が本明細書に含まれる。
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、療法(例えば、細胞療法)において直接的又は間接的に使用される。ある特定の実施形態では、細胞療法のための方法は、(i)対象から細胞を得るステップと、(ii)本発明のポリヌクレオチドを含むツール(例えばベクター)を使用して細胞を形質転換する、及び/又は細胞を形質転換して本発明の抗体を産生するステップと、(iii)形質転換された細胞を対象に投与するステップとを含む。ある特定の実施形態では、細胞療法の方法のステップ(i)及びステップ(iii)の対象は、同一の対象である。ある特定の実施形態では、細胞療法の方法のステップ(i)及びステップ(iii)における対象は、異なる対象である。ある特定の実施形態では、細胞療法の方法のステップ(i)及びステップ(iii)における対象は、異なる種に属する異なる対象である。ある特定の実施形態では、細胞療法の方法のステップ(i)における対象は、Sus属の対象であり、細胞療法の方法のステップ(iii)における対象は、ホモサピエンス種の対象である。
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、幹細胞である。他の実施形態では、宿主細胞は、分化細胞である。
したがって、本発明は、本発明の宿主細胞が、抗原機能制限抗原結合剤の結合と競合することによって、標的抗原、特にインスリンの機能を保護及び/又は調節する抗体、バリアント又は断片の産生を可能にするという驚くべき発見に少なくとも部分的に基づいている。
ある特定の実施形態では、本発明は、本発明の宿主細胞を培養することを含む、オリゴマー抗インスリン抗体を産生するための方法に関する。
特定の実施形態では、抗体の産生方法は、本発明の抗体の効率的な産生を可能にするのに好適な条件下で、本発明の宿主細胞を培養することを含む。
そのような一実施形態では、宿主細胞は、以下を含む(例えば、以下で形質転換されている):(1)本発明の抗体のVLを含むアミノ酸配列及び抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は(2)本発明の抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクター及び本発明の抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクター。一実施形態では、宿主細胞は、真核生物、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又はリンパ系細胞(例えば、YO、NSO、Sp20)である。一実施形態では、抗体を作製する方法であり、この方法は、上記で提供されるように、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に好適な条件下で培養することと、任意選択で、抗体を宿主細胞(又は宿主細胞培養培地)から回収することとを含む。
本発明による抗体(例えば保護調節抗体)の組換え産生のために、例えば上述のような抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞における更なるクローニング及び/又は発現のために1つ以上のベクターに挿入される。そのような核酸は、従来の手順を使用して(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって)容易に単離され、配列決定され得る。
抗体コードベクターのクローニング又は発現に好適な宿主細胞としては、本明細書に記載される原核細胞又は真核細胞が挙げられる。例えば、抗体は、特にグリコシル化及びFcエフェクター機能が必要とされない場合、細菌において産生され得る。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、US5648237、US5789199、及びUS5840523;Charlton,2003,Methods in Molecular Biology,Vol.248;BKC Lo,2003,Humana Press,pp.245-254を参照されたい。発現後、抗体は、可溶性画分で細菌細胞ペーストから単離され得、更に精製され得る。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物が、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的又は完全にヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす真菌及び酵母株を含む、抗体コードベクターに好適なクローニング又は発現宿主である。Gerngross,2004,Nat.Biotech.22:1409-1414、及びLi et al.,2006,Nat.Biotech.24:210-215を参照されたい。
グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞はまた、多細胞生物(無脊椎動物及び脊椎動物)に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と併せて使用され得る多数のバキュロウイルス株が特定されている。
植物細胞培養物もまた宿主として利用することができる。例えば、US5959177、US6040498、US6420548、US7125978、及びUS6417429(トランスジェニック植物において抗体を産生するためのPLANTIBODIES(商標)技術について記載)を参照されたい。
また、脊椎動物細胞が宿主として使用されてもよい。例えば、懸濁液中で増殖するように適合された哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40(COS-7)によって形質転換されたマカク腎臓CVl株;ヒト胚性腎臓株(例えば、Graham et al.,1997,J.Gen Viral.36:59に記載されている293又は293細胞);ベビーハムスター腎臓細胞(BHK);マウスセルトリ細胞(例えば、Mather,1980,Biol.Reprod.23:243-251に記載されているTM4細胞);マカク腎臓細胞(CV l) ;アフリカグリーンマカク腎臓細胞(VER0-76);ヒト子宮頸がん細胞(HELA);イヌ腎臓細胞(MDCK;バッファローラット肝細胞(BRL 3A);ヒト肺細胞(Wl38);ヒト肝臓細胞(Hep G2);マウス哺乳動物腫瘍(MMT 060562);TRI細胞(例えば、Mather et al.,1982,Annals N.Y Aead.Sei.383:44-68に記載されている);MRC 5細胞;及びFS4細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、DHFR CHO細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(Urlaub et al.,1980,Proc.Natl.Acad.Sc.USA 77:4216);並びにYO、NSO及びSp2/0などの骨髄腫細胞株が挙げられる。抗体産生に適したある特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Yazaki and Wu,Methods in Molecular Biology,Vol.248 BKC Lo,2003.,Humana Press,pp.255-268を参照されたい。
得られた特異的抗体の量は、ELISAを使用して定量することができ、ELISAはまた以下で説明される。抗体の産生のための更なる方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Harlow and Lane,1988,CSH Press,Cold Spring Harborを参照されたい。
ある特定の実施形態では、本発明は、本発明のオリゴマー抗インスリン抗体及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。ある特定の実施形態では、本発明は、本発明のポリヌクレオチド及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。ある特定の実施形態では、本発明は、本発明の宿主細胞及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。
「薬学的に許容される担体」という用語は、本明細書で使用される場合、使用される用量及び濃度においてレシピエントに非毒性である、有効成分以外の組成物中の成分を指す。
薬学的に許容される担体には、これらに限定されないが、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸等の緩衝液;アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤;保存料(塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチル、又はベンジルアルコール;メチルパラベン又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;及びm-クレゾール等);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸;グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖、二糖、及び他の炭水化物;EDTA等のキレート剤;スクロース、マンニトール、トレハロース、又はソルビトール等の糖;ナトリウム等の塩形成対イオン;金属錯体(例えば、亜鉛-タンパク質錯体)、及び/又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤が含まれる。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体としては、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)等の間質性薬物分散剤、例えば、rHuPH20(HYLENEX(登録商標)、Baxter International,Inc.)等のヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質が更に挙げられる。rHuPH20を含むある特定の例示的なsHASEGP及び使用方法は、US2005/0260186及びUS2006/0104968に記載されている。
薬学的に許容される担体及び/又は賦形剤は、本発明の手段の安定性、送達及び/又は薬物動態/薬力学的特性を促進し得る。
ある特定の実施形態では、本発明は、更なる治療剤を含む本発明の医薬組成物に関する。
「治療剤」という用語は、本明細書で使用される場合、治療有効量で対象に投与すると対象に治療上の利益を提供する化合物を指す。治療剤は、疾患又は医学的状態を治療、制御、又は予防するために使用される、任意の種類の薬物、医薬品、調剤、ホルモン、抗生物質、タンパク質、遺伝子、成長因子、生体活性物質であり得る。当業者は、「治療剤」という用語が、規制当局の承認を受けた薬物に限定されないことを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、治療剤は、小分子薬物、タンパク質/ポリペプチド、抗体、抗生物質活性を有する分子薬物、ファージベースの療法、核酸分子、及びsiRNAの群から選択され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療剤はペプチドである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療剤はホルモンである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療剤はインスリンである。
本発明者らは、本明細書に記載の手段及び方法が、内因性インスリンを調節するのに有用であることを実証する(例えば、実施例6及び7を参照されたい)。同じ機構を使用して、グルコースホメオスタシスに影響を与える治療剤(例えばインスリン)などの治療剤の効果を強化又は保護することができる。
したがって、本発明は、本明細書に記載の手段及び方法が他の治療剤の効果を改善することができるという発見に少なくとも部分的に基づいている。
ある特定の実施形態では、本発明は、治療における使用のための本発明のオリゴマー抗インスリン抗体に関する。
ある特定の実施形態では、本発明は、治療における使用のための本発明のポリヌクレオチドに関する。
ある特定の実施形態では、本発明は、治療における使用のための本発明の宿主細胞に関する。
ある特定の実施形態では、本発明は、治療における使用のための本発明の医薬組成物に関する。
ある特定の実施形態では、本発明は、インスリン関連疾患又は障害の治療に使用するための本発明のオリゴマー抗インスリン抗体、本発明のポリヌクレオチド、本発明の宿主細胞、又は本発明の医薬組成物に関する。
「インスリン関連疾患又は障害」という用語は、本明細書で使用される場合、インスリン産生、インスリン効果、インスリンシグナル伝達、インスリン分布、インスリン代謝及び/又はインスリン除去が調節不全である任意の疾患又は障害を指す。
いくつかの実施形態では、インスリン関連疾患又は障害は、多嚢胞性卵巣症候群、代謝症候群及び糖尿病の群から選択される少なくとも1つの疾患又は障害である。
いくつかの実施形態では、インスリン関連疾患又は障害は、アドレナリン、グルカゴン、コルチゾール、ソマトスタチンの群から選択される少なくとも1つの薬剤のレベルの増加に関連する少なくとも1つの疾患又は障害である。
いくつかの実施形態では、インスリン関連疾患又は障害は、インスリン調節剤の治療の少なくとも1つの副作用である。いくつかの実施形態では、インスリン調節剤は、アドレナリン、グルカゴン、ステロイド及びソマトスタチンの群から選択される。
本発明によって提供される手段及び方法は、インスリンに対する免疫応答の調節を可能にする。インスリンに対する免疫応答は、健康な対象及び/若しくは患者において、並びに/又はインスリン治療中に生じ得る(例えば、実施例6及び7を参照されたい)。発明者らは、広範囲のインスリン関連症状が、本発明の手段及び方法によって影響を受け得ることを示す(例えば、図11、図12、図16、実施例6及び7を参照されたい)。したがって、手段及び方法は、投与される及び/又は内因性インスリンの効果を改善し、任意のインスリン関連疾患又は障害を減少させることができる。
したがって、本発明は、本発明の手段及び方法を使用してインスリン機能を保護及び/又は調節することができるという驚くべき発見に少なくとも部分的に基づいている。
ある特定の実施形態では、本発明は、インスリン関連疾患又は障害を診断及び/又は予測する方法に関し、方法は、
(i)試料からのプロインスリン及び/又はインスリンに対する抗インスリンIgM抗体の結合の親和性を決定するステップであって、試料が対象から得られたものであり、対象が、インスリン関連疾患又は障害を有すると診断されるか、又はそのリスクがある、ステップと、(ii)ステップ(i)で決定されたレベルを基準値と比較するステップと、(iii)ステップ(ii)で行われた比較に基づいて、前記対象におけるインスリン関連疾患又は障害を診断及び/又は予測するステップであって、好ましくは、プロインスリン及び/又はインスリンに対する抗インスリンIgM抗体の結合のより低い親和性が、インスリン関連疾患又は障害のより高いリスクを示す、ステップと、を含む。
試料からのプロインスリン及び/又はインスリンに対する抗インスリンIgM抗体の結合の親和性を決定するステップは、測定器具又はデータベースから対応する情報を取得することによっても達成され得る。
ある特定の実施形態では、本発明は、対象がインスリン関連疾患又は障害の治療に感受性であるかどうかを決定するための方法に関し、方法は、(i)試料からのプロインスリン及び/又はインスリンに対する抗インスリンIgM抗体の結合の親和性を決定するステップであって、試料が対象から得られたものであり、対象が、インスリン関連疾患又は障害を有すると診断されるか、又はそのリスクがある、ステップと、(ii)ステップ(i)で決定されたレベルを基準値と比較するステップと、(iii)前記対象がインスリン関連疾患又は障害の治療に感受性であるかどうかを決定するステップであって、好ましくは、プロインスリン及び/又はインスリンに対する抗インスリンIgM抗体の結合のより低い親和性が、インスリン関連疾患又は障害の治療に対するより高い感受性を示す、ステップと、を含む。
本発明者らは、IgM抗体の親和性が、インスリン関連疾患又は障害における疾患の発症、進行及び転帰を予測することを見出した(実施例10)。
したがって、本発明は、対象のIgM抗体親和性の状態に含まれる予測情報に少なくとも部分的に基づいている。
ある特定の実施形態では、本発明は、本発明の使用のためのオリゴマー抗インスリン抗体、本発明の使用のためのポリヌクレオチド又は本発明の使用のための宿主細胞、又は本発明の使用のための医薬組成物、本発明の方法に関し、インスリン関連疾患又は障害は、膵臓損傷、1型糖尿病、2型糖尿病、外因性インスリン抗体症候群、妊娠性糖尿病、及び血糖異常の群から選択される。
本明細書に記載の「膵臓損傷」という用語は、アドレナリン、グルカゴン、ステロイド、及びソマトスタチンなどのインスリン産生、インスリン活性、及び/又はインスリン効果を調節するホルモンを脱調節する任意の形態の膵臓異常を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の膵臓損傷は、薬物誘導性膵臓損傷、肥満誘導性膵臓損傷、及びがん誘導性膵臓損傷の群から選択される。
「1型糖尿病」という用語は、本明細書で使用される場合、主にインスリン産生の減少を特徴とする糖尿病を指す。典型的には、1型糖尿病は、膵臓のインスリン産生ベータ細胞の損傷をもたらす自己免疫反応を特徴とする。
「2型糖尿病」という用語は、本明細書で使用される場合、主にインスリン抵抗性の増加を特徴とする糖尿病を指す。2型糖尿病は、インスリンレベルが正常又は上昇している場合に発生することが多く、組織がインスリンに適切に反応できないことが原因のようである。2型糖尿病患者のほとんどは肥満である。
「妊娠糖尿病」という用語は、本明細書で使用される場合、妊娠中の糖尿病を指す。妊娠糖尿病。妊娠糖尿病の症状は更に、子癇前症及び妊娠糖尿病の母親からの子供の症状などの妊娠関連症状を含み、これらに限定されないが、成長異常(例えば巨大症)、グルコースホメオスタシスの障害、黄疸、赤血球増加症、低カルシウム血症、及び低マグネシウム血症を含む。いくつかの実施形態では、妊娠糖尿病は、妊娠中に診断される。いくつかの実施形態では、妊娠糖尿病は、妊娠前に診断される。
「外因性インスリン抗体症候群」という用語は、本明細書で使用される場合、インスリン治療患者における循環インスリン抗体に関連する外因性インスリン及び/又はインスリン抵抗性に対する過敏症を指す。
「血糖異常」という用語は、本明細書で使用される場合、血糖安定性の異常を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の血糖異常症は低血糖である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の血糖異常症は高血糖である。いくつかの実施形態では、糖尿病は、経口グルコース耐性試験中のグルコース摂取(典型的には75gグルコース)の2時間後に140mg/dl、150mg/dl、160mg/dl、170mg/dl、180mg/dl、190mg/dl、200mg/dl、210mg/dl、又は220mg/dlを超える血中グルコースレベルによって診断される。いくつかの実施形態では、血糖異常は、100mg/dl又は110mg/dlを超える空腹時血糖レベルである。
本明細書に記載の手段及び方法を使用して、インスリン作用及び/又はインスリンに対する免疫応答によって影響を受ける、脱調節された恒常性インスリン及びホルモンを回復させることができる。
したがって、本発明は、本明細書に提供される手段及び方法が、様々なインスリン関連疾患又は障害における脱調節された恒常性を回復することができるという発見に少なくとも部分的に基づいている。
ある特定の実施形態では、本発明は、本発明の使用のためのオリゴマー抗インスリン抗体、本発明の使用のためのポリヌクレオチド、又は本発明の使用のための宿主細胞、本発明の使用のための医薬組成物、又は本発明の方法に関し、血糖異常は、膵臓損傷、1型糖尿病、2型糖尿病、外因性インスリン抗体症候群、及び妊娠糖尿病の群から選択されるインスリン関連疾患又は障害を有する患者における血糖異常である。
ある特定の実施形態では、本発明は、インスリン効果を増強するために使用するための本発明のオリゴマー抗インスリン抗体に関する。インスリン効果はまた、患者又は健康な対象において増強され得、インスリン効果は、必ずしも疾患又は障害を誘導することなく抗体によって調節される。例えば、標的抗原がインスリンである本発明の組成物、本発明の医薬製品、本発明のベクター、又は本発明の保護調節抗体、バリアント若しくは断片を使用して、筋肉の増加などの体重増加を上昇させることができる。いくつかの実施形態では、インスリン効果の増強には、グルコース取り込みの増加、DNA複製の増加、タンパク質合成の増加、脂肪合成の増加、脂肪酸のエステル化の増加、脂肪分解の減少、グリコーゲン合成の誘導、糖新生及びグリコーゲン分解の減少、タンパク質分解の減少、自己貪食の減少、アミノ酸取り込みの増加、血流の増加、胃内の塩酸分泌の増加、カリウム取り込みの増加、腎ナトリウム排出の減少が含まれるが、これらに限定されない。
本発明によって提供される手段及び方法は、インスリンに対する免疫応答の調節を可能にする。インスリンに対する免疫応答は、あらゆる形態の糖尿病及びあらゆる形態のインスリン治療において生じ得る。したがって、手段及び方法は、投与された及び/又は内因性インスリンの効果を改善することができ、例えば、糖尿病における任意のインスリン欠乏関連症状を軽減することができる。
したがって、本発明は、本発明の手段及び方法が、糖尿病における調節不全のインスリン機能を保護及び/又は調節するという驚くべき発見に少なくとも部分的に基づいている。
ある特定の実施形態では、本発明は、本発明の使用のためのオリゴマー抗インスリン抗体、本発明の使用のためのポリヌクレオチド又は本発明の使用のための宿主細胞、又は本発明の使用のための医薬組成物、本発明の方法に関し、インスリン関連疾患又は障害は、糖尿病又はその症状である。
「糖尿病」という用語は、本明細書で使用される場合、高血糖を特徴とする疾患又は障害を指す。いくつかの実施形態では、糖尿病は、経口グルコース耐性試験中のグルコース摂取(典型的には75gグルコース)の2時間後に140mg/dl、150mg/dl、160mg/dl、170mg/dl、180mg/dl、190mg/dl、200mg/dl、210mg/dl、又は220mg/dlを超えるグルコースレベルによって診断される。いくつかの実施形態では、糖尿病は、100mg/dl又は110mg/dlを超える空腹時グルコースレベルによって診断される。
糖尿病の症状としては、高血糖症、低インスリン血症、インスリン抵抗性、多尿症、多飲症、体重減少、ケトアシドーシス、糖尿症、疲労感、過敏性、ぼやけた視力、治癒の遅い痛み、頻繁な感染症(例えば、歯茎又は皮膚感染症及び膣感染症)、並びに炎症の増加(例えば、慢性低悪性度炎症)が挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、本発明は、少なくとも1つの一価インスリン粒子及び少なくとも1つの多価インスリン粒子の混合物で哺乳動物を免疫化することを含む、好ましくはIgMアイソタイプのオリゴマー抗インスリン抗体を産生するための方法に関する。
「インスリン粒子」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原粒子(例えば、多価又は一価の抗原粒子)を指し、抗原は、インスリン及び/又はプロインスリンに少なくとも部分的に含まれる。いくつかの実施形態では、インスリン粒子は、インスリン及び/又はプロインスリンの少なくとも5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、又は全てのアミノ酸を含む抗原を含む。
ある特定の実施形態では、本発明は、インスリン関連疾患又は障害の治療及び/又は予防方法に関し、方法は、治療有効量の、本発明のいずれか1つのオリゴマー抗インスリン抗体、本発明のポリヌクレオチド、本発明の宿主細胞、又は本発明の医薬組成物を投与するステップを含む。
上記に加えて、本発明は更に、以下の特定の項目別実施形態に関する。
項目1.対象における体液性及び/又は細胞媒介性標的抗原特異的免疫応答を誘発及び/又は調節する方法であって、対象の1つ以上の免疫細胞を、
(i)疾患関連抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの1つ以下を含む抗原性部分で構成される一価抗原粒子と、
(ii)疾患関連抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの2つ以上を含む抗原性部分で構成され、抗原構造のうちの2つ以上が共有結合的又は非共有結合的に架橋されている多価抗原粒子と
を含む組み合わせと接触させることを含む、方法。
項目2.リンパ球、好ましくはBリンパ球(B細胞媒介性免疫応答)、好ましくは、1つ以上の抗体、又はそのバリアント、及び/又は標的抗原に特異的なB細胞受容体、及び/又はそのバリアントを含む、及び/又は発現するものが、細胞媒介性標的抗原特異的免疫応答に関与する、項目1による方法。
項目3.免疫グロブリン(Ig)M、IgD、IgA若しくはIgG型抗体及び/又はB細胞受容体を発現するB細胞が、細胞媒介性標的抗原特異的免疫応答に関与する、項目1又は2の方法。
項目4.多価抗原粒子の抗原性部分に含まれる抗原構造のうちの2つ以上が、複数の同一の抗原構造を含む、項目1~3のいずれか1つの方法。
項目5.一価抗原粒子が、任意選択的にリンカーを介して抗原性部分に結合される担体部分を更に含み、担体、及び任意選択的にリンカーは、抗原構造の別のコピーを含まず、担体部分、及び任意選択的にリンカーは、標的抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘発することができない、項目1~4のいずれか1つの方法。
項目6.多価抗原粒子が、任意選択でリンカーを介して抗原部分に結合された担体部分を更に含む、項目1~5のいずれか1つの方法。
項目7.担体部分、及び任意選択でリンカーが、標的抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘発することができない、項目6の方法。
項目8.担体部分が、免疫原性又は非免疫原性ポリペプチド、免疫CpG島、リンペットヘモシアニン(KLH)、破傷風トキソイド(TT)、コレラトキシンサブユニットB(CTB)、細菌又は細菌ゴースト、リポソーム、キトソーム、ビロソーム、マイクロスフェア、樹状細胞、粒子、マイクロ粒子、ナノ粒子、又はビーズから選択される物質又は構造である、項目5~7のいずれか1つの方法。
項目9.対象の1つ以上の免疫細胞を一価抗原粒子及び多価抗原粒子を含む組み合わせと接触させることが、(i)対象への一価抗原粒子の投与、(ii)対象への多価抗原粒子の投与、又は(iii)対象への一価抗原粒子及び多価抗原粒子の投与を伴い、(i)、(ii)及び(iii)において、対象の免疫細胞は、組み合わせと接触した投与の結果として、一価抗原粒子及び多価抗原粒子である、項目1~8のいずれか1つの方法。
項目10.(i)において、対象が、一価抗原粒子の投与前の多価抗原粒子の存在を特徴とし、(ii)において、対象が、多価抗原粒子の投与前の一価抗原粒子の存在を特徴とする、項目9の方法。
項目11.一価抗原粒子及び多価抗原粒子を含む組み合わせが、特定の抗原比の一価抗原粒子:多価抗原粒子を含む、項目1~10のいずれか1つの方法。
項目12.対象における細胞媒介性標的抗原特異的免疫応答の調節が、対象のB細胞のうちの1つ以上を、1超、好ましくは101超、102超、103超、104超又はそれを超える特定の抗原比率を含む組み合わせと接触させることによる、対象におけるIgG型標的抗原特異的B細胞応答の低減を構成する、項目11の方法。
項目13.対象のB細胞のうちの1つ以上を組み合わせと接触させることが、対象において1超、好ましくは101超、102超、103超、104超又はそれを超える特定の抗原比率を生成するのに有効な量の一価抗原粒子を対象に投与することを伴う、項目12の方法。
項目14.対象のB細胞のうちの1つ以上を一価抗原粒子の量と接触させることは、対象に多価抗原粒子を投与する直接的組み合わせの有無にかかわらず投与される、項目12又は13の方法。
項目15.対象における細胞媒介性標的抗原特異的免疫応答の調節が、対象のB細胞のうちの1つ以上を、1未満、好ましくは10-1、10-2、10-3、10-4以下を下回る特定の抗原比率を含む組み合わせと接触させることによる、対象におけるIgG型標的抗原特異的B細胞応答の増加を構成する、項目11の方法。
項目16.対象のB細胞のうちの1つ以上を組み合わせと接触させることが、対象において1未満、好ましくは10-1、10-2、10-3、10-4以下を下回る特定の抗原比率を生成するのに有効な量の多価抗原粒子を対象に投与することを伴う、項目15の方法。
項目17.対象のB細胞のうちの1つ以上を多価抗原粒子の量と接触させることが、対象に一価抗原粒子を投与する直接的組み合わせの有無にかかわらず投与される、項目15又は16の方法。
項目18.多価抗原粒子が、互いに空間的に、好ましくはナノメートルの範囲内で近接した抗原構造の少なくとも2つのコピーを含む、項目1~17のいずれか1つの方法。
項目19.抗原が、自己抗原、がん関連抗原、又は病原体関連抗原である、項目1~18のいずれか1つの方法。
項目20.病原体が、寄生虫、単細胞真核生物、細菌、ウイルス又はビリオンから選択される、項目19の方法。
項目21.抗原が、疾患又は状態、好ましくは、対象が罹患している、又は罹患していると疑われる疾患又は状態に関連する抗原である、項目1~20のいずれか1つの方法。
項目22.抗原が、完全、断片的又は部分的免疫原性物質などの天然又は合成の免疫原性物質であり、免疫原性物質が、核酸、炭水化物、ペプチド、ハプテン、又はそれらの任意の組み合わせから選択され得る、項目1~21のいずれか1つの方法。
項目23.対象における疾患又は状態を治療するための方法である、上記項目のいずれか1つの方法。
項目24.疾患又は状態が、細胞媒介性免疫応答の増加又は減少が治療に有益であることを特徴とする疾患又は状態から選択される、項目23の方法。
項目25.疾患又は状態が、炎症性障害、自己免疫疾患、増殖性障害、又は感染性疾患から選択される、項目23又は24の方法。
項目26.対象において疾患関連抗原に特異的な免疫グロブリンG(IgG)型抗体の存在を特徴とする疾患を治療又は予防するための方法であって、治療有効量の一価抗原粒子を対象に投与することを含み、一価抗原粒子は、疾患関連抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの1つ以下を含む抗原性部分で構成される、方法。
項目27.疾患が、自己免疫疾患である、項目26の方法。
項目28.疾患関連抗原が、自己抗原である、項目26又は27の方法。
項目29.疾患が、疾患関連抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの2つ以上を含む抗原性部分で構成され、抗原構造のうちの2つ以上が共有結合的又は非共有結合的に架橋されて複合化された疾患関連抗原構造を形成する、内因性多価抗原粒子の存在によって特徴付けられる、項目26~28のいずれか1つの方法。
項目30.一価抗原粒子の治療有効量が、対象に投与されたときに、投与された一価抗原粒子と内因性多価抗原粒子との(血清/組織)比が1を超える量である、項目29の方法。
項目31.対象においてワクチン接種によって疾患を治療又は予防するための方法であって、
(i)疾患関連抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの1つ以下を含む抗原性部分で構成される一価抗原粒子と、
(ii)疾患関連抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの2つ以上を含む抗原性部分で構成され、抗原構造のうちの2つ以上が共有結合的又は非共有結合的に架橋されている多価抗原粒子と
を含む有効量のワクチン接種組成物を投与することを含む、方法。
項目32.疾患関連抗原が、外来抗原である、項目31の方法。
項目33.ワクチン接種組成物が、1未満の(i)と(ii)との比率を有する、項目31又は32の方法。
項目34.免疫原性組成物であって、
(i)抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの1つ以下を含む抗原性部分で構成される一価抗原粒子と、
(ii)抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの2つ以上を含む抗原性部分で構成され、抗原構造のうちの2つ以上が共有結合的又は非共有結合的に架橋されている多価抗原粒子
とを含む、免疫原性組成物。
項目35.(i)及び(ii)の抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造が同一である、項目30の免疫原性組成物。
項目36.薬学的に許容される担体及び/又は賦形剤を更に含む、項目34又は35の免疫原性組成物。
項目37.自己免疫疾患の治療に使用するための単一特異性IgM型抗体又はそのバリアントであって、モノクローナルIgM型抗体が特異的であり、自己免疫疾患に関連する抗原に対して高い親和性を有する、単一特異性IgM型抗体又はそのバリアント。
項目38.抗体が、10-7未満、好ましくは10-8未満、より好ましくは10-9未満、最も好ましくは約10-10のKDで、自己免疫疾患と関連する抗原に結合する、項目37の使用のための単一特異性IgM型抗体、又はそのバリアント。
項目39.モノクローナルIgMが、自己免疫疾患と関連する抗原以外の抗原である無関係の抗原に結合しない、項目37又は38の使用のための単一特異性IgM型抗体又はそのバリアント。
項目40.治療が、自己免疫疾患に関連する抗原以外の抗原である無関係の抗原に特異的な多特異性抗体の使用を含まない、項目37~39のいずれか1つの使用のための単一特異性IgM型抗体又はそのバリアント。
項目41.変異体が、単一特異性IgG型抗体又はそのバリアントであり、Fcが減衰しており、好ましくは自己免疫障害又は同種免疫障害の治療に使用するためのFcγ受容体又はC1qとの相互作用に欠陥がある、項目37~40のいずれか1つの使用のための単一特異性IgM型抗体又はそのバリアント。
項目1.対象における体液性及び/又は細胞媒介性標的抗原特異的免疫応答を誘発及び/又は調節する方法であって、対象の1つ以上の免疫細胞を、
(i)疾患関連抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの1つ以下を含む抗原性部分で構成される一価抗原粒子と、
(ii)疾患関連抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの2つ以上を含む抗原性部分で構成され、抗原構造のうちの2つ以上が共有結合的又は非共有結合的に架橋されている多価抗原粒子と
を含む組み合わせと接触させることを含む、方法。
項目2.リンパ球、好ましくはBリンパ球(B細胞媒介性免疫応答)、好ましくは、1つ以上の抗体、又はそのバリアント、及び/又は標的抗原に特異的なB細胞受容体、及び/又はそのバリアントを含む、及び/又は発現するものが、細胞媒介性標的抗原特異的免疫応答に関与する、項目1による方法。
項目3.免疫グロブリン(Ig)M、IgD、IgA若しくはIgG型抗体及び/又はB細胞受容体を発現するB細胞が、細胞媒介性標的抗原特異的免疫応答に関与する、項目1又は2の方法。
項目4.多価抗原粒子の抗原性部分に含まれる抗原構造のうちの2つ以上が、複数の同一の抗原構造を含む、項目1~3のいずれか1つの方法。
項目5.一価抗原粒子が、任意選択的にリンカーを介して抗原性部分に結合される担体部分を更に含み、担体、及び任意選択的にリンカーは、抗原構造の別のコピーを含まず、担体部分、及び任意選択的にリンカーは、標的抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘発することができない、項目1~4のいずれか1つの方法。
項目6.多価抗原粒子が、任意選択でリンカーを介して抗原部分に結合された担体部分を更に含む、項目1~5のいずれか1つの方法。
項目7.担体部分、及び任意選択でリンカーが、標的抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘発することができない、項目6の方法。
項目8.担体部分が、免疫原性又は非免疫原性ポリペプチド、免疫CpG島、リンペットヘモシアニン(KLH)、破傷風トキソイド(TT)、コレラトキシンサブユニットB(CTB)、細菌又は細菌ゴースト、リポソーム、キトソーム、ビロソーム、マイクロスフェア、樹状細胞、粒子、マイクロ粒子、ナノ粒子、又はビーズから選択される物質又は構造である、項目5~7のいずれか1つの方法。
項目9.対象の1つ以上の免疫細胞を一価抗原粒子及び多価抗原粒子を含む組み合わせと接触させることが、(i)対象への一価抗原粒子の投与、(ii)対象への多価抗原粒子の投与、又は(iii)対象への一価抗原粒子及び多価抗原粒子の投与を伴い、(i)、(ii)及び(iii)において、対象の免疫細胞は、組み合わせと接触した投与の結果として、一価抗原粒子及び多価抗原粒子である、項目1~8のいずれか1つの方法。
項目10.(i)において、対象が、一価抗原粒子の投与前の多価抗原粒子の存在を特徴とし、(ii)において、対象が、多価抗原粒子の投与前の一価抗原粒子の存在を特徴とする、項目9の方法。
項目11.一価抗原粒子及び多価抗原粒子を含む組み合わせが、特定の抗原比の一価抗原粒子:多価抗原粒子を含む、項目1~10のいずれか1つの方法。
項目12.対象における細胞媒介性標的抗原特異的免疫応答の調節が、対象のB細胞のうちの1つ以上を、1超、好ましくは101超、102超、103超、104超又はそれを超える特定の抗原比率を含む組み合わせと接触させることによる、対象におけるIgG型標的抗原特異的B細胞応答の低減を構成する、項目11の方法。
項目13.対象のB細胞のうちの1つ以上を組み合わせと接触させることが、対象において1超、好ましくは101超、102超、103超、104超又はそれを超える特定の抗原比率を生成するのに有効な量の一価抗原粒子を対象に投与することを伴う、項目12の方法。
項目14.対象のB細胞のうちの1つ以上を一価抗原粒子の量と接触させることは、対象に多価抗原粒子を投与する直接的組み合わせの有無にかかわらず投与される、項目12又は13の方法。
項目15.対象における細胞媒介性標的抗原特異的免疫応答の調節が、対象のB細胞のうちの1つ以上を、1未満、好ましくは10-1、10-2、10-3、10-4以下を下回る特定の抗原比率を含む組み合わせと接触させることによる、対象におけるIgG型標的抗原特異的B細胞応答の増加を構成する、項目11の方法。
項目16.対象のB細胞のうちの1つ以上を組み合わせと接触させることが、対象において1未満、好ましくは10-1、10-2、10-3、10-4以下を下回る特定の抗原比率を生成するのに有効な量の多価抗原粒子を対象に投与することを伴う、項目15の方法。
項目17.対象のB細胞のうちの1つ以上を多価抗原粒子の量と接触させることが、対象に一価抗原粒子を投与する直接的組み合わせの有無にかかわらず投与される、項目15又は16の方法。
項目18.多価抗原粒子が、互いに空間的に、好ましくはナノメートルの範囲内で近接した抗原構造の少なくとも2つのコピーを含む、項目1~17のいずれか1つの方法。
項目19.抗原が、自己抗原、がん関連抗原、又は病原体関連抗原である、項目1~18のいずれか1つの方法。
項目20.病原体が、寄生虫、単細胞真核生物、細菌、ウイルス又はビリオンから選択される、項目19の方法。
項目21.抗原が、疾患又は状態、好ましくは、対象が罹患している、又は罹患していると疑われる疾患又は状態に関連する抗原である、項目1~20のいずれか1つの方法。
項目22.抗原が、完全、断片的又は部分的免疫原性物質などの天然又は合成の免疫原性物質であり、免疫原性物質が、核酸、炭水化物、ペプチド、ハプテン、又はそれらの任意の組み合わせから選択され得る、項目1~21のいずれか1つの方法。
項目23.対象における疾患又は状態を治療するための方法である、上記項目のいずれか1つの方法。
項目24.疾患又は状態が、細胞媒介性免疫応答の増加又は減少が治療に有益であることを特徴とする疾患又は状態から選択される、項目23の方法。
項目25.疾患又は状態が、炎症性障害、自己免疫疾患、増殖性障害、又は感染性疾患から選択される、項目23又は24の方法。
項目26.対象において疾患関連抗原に特異的な免疫グロブリンG(IgG)型抗体の存在を特徴とする疾患を治療又は予防するための方法であって、治療有効量の一価抗原粒子を対象に投与することを含み、一価抗原粒子は、疾患関連抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの1つ以下を含む抗原性部分で構成される、方法。
項目27.疾患が、自己免疫疾患である、項目26の方法。
項目28.疾患関連抗原が、自己抗原である、項目26又は27の方法。
項目29.疾患が、疾患関連抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの2つ以上を含む抗原性部分で構成され、抗原構造のうちの2つ以上が共有結合的又は非共有結合的に架橋されて複合化された疾患関連抗原構造を形成する、内因性多価抗原粒子の存在によって特徴付けられる、項目26~28のいずれか1つの方法。
項目30.一価抗原粒子の治療有効量が、対象に投与されたときに、投与された一価抗原粒子と内因性多価抗原粒子との(血清/組織)比が1を超える量である、項目29の方法。
項目31.対象においてワクチン接種によって疾患を治療又は予防するための方法であって、
(i)疾患関連抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの1つ以下を含む抗原性部分で構成される一価抗原粒子と、
(ii)疾患関連抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの2つ以上を含む抗原性部分で構成され、抗原構造のうちの2つ以上が共有結合的又は非共有結合的に架橋されている多価抗原粒子と
を含む有効量のワクチン接種組成物を投与することを含む、方法。
項目32.疾患関連抗原が、外来抗原である、項目31の方法。
項目33.ワクチン接種組成物が、1未満の(i)と(ii)との比率を有する、項目31又は32の方法。
項目34.免疫原性組成物であって、
(i)抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの1つ以下を含む抗原性部分で構成される一価抗原粒子と、
(ii)抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造のうちの2つ以上を含む抗原性部分で構成され、抗原構造のうちの2つ以上が共有結合的又は非共有結合的に架橋されている多価抗原粒子
とを含む、免疫原性組成物。
項目35.(i)及び(ii)の抗原に対する抗体媒介性免疫応答を誘導することができる抗原構造が同一である、項目30の免疫原性組成物。
項目36.薬学的に許容される担体及び/又は賦形剤を更に含む、項目34又は35の免疫原性組成物。
項目37.自己免疫疾患の治療に使用するための単一特異性IgM型抗体又はそのバリアントであって、モノクローナルIgM型抗体が特異的であり、自己免疫疾患に関連する抗原に対して高い親和性を有する、単一特異性IgM型抗体又はそのバリアント。
項目38.抗体が、10-7未満、好ましくは10-8未満、より好ましくは10-9未満、最も好ましくは約10-10のKDで、自己免疫疾患と関連する抗原に結合する、項目37の使用のための単一特異性IgM型抗体、又はそのバリアント。
項目39.モノクローナルIgMが、自己免疫疾患と関連する抗原以外の抗原である無関係の抗原に結合しない、項目37又は38の使用のための単一特異性IgM型抗体又はそのバリアント。
項目40.治療が、自己免疫疾患に関連する抗原以外の抗原である無関係の抗原に特異的な多特異性抗体の使用を含まない、項目37~39のいずれか1つの使用のための単一特異性IgM型抗体又はそのバリアント。
項目41.変異体が、単一特異性IgG型抗体又はそのバリアントであり、Fcが減衰しており、好ましくは自己免疫障害又は同種免疫障害の治療に使用するためのFcγ受容体又はC1qとの相互作用に欠陥がある、項目37~40のいずれか1つの使用のための単一特異性IgM型抗体又はそのバリアント。
本明細書で使用される場合、「含む(comprising)」という用語は、「含む(including)」及び「からなる(consisting of)」の両方を包含し、両方の意味が具体的に意図され、したがって、本発明による個々に開示された実施形態を包含するものとして解釈されるべきである。本明細書で使用される場合、「及び/又は」という用語は、他方を伴うか若しくは伴わない2つの特定の特徴又は構成要素の各々の具体的な開示として理解されるべきである。例えば、「A及び/又はB」は、それぞれが本明細書に個別に記載されているかのように、(i)A、(ii)B、並びに(iii)A及びBのそれぞれの具体的な開示として解釈されるべきである。本発明の文脈において、「約」及び「およそ」という用語は、問題の特徴の技術的効果をそれでも確実にするために、当業者が理解するであろう正確性の間隔を示す。この用語は、典型的には、示された数値からの±20%、±15%、±10%、及び例えば±5%の偏差を示す。当業者に理解されるように、所与の技術的効果の数値に対する特定のそのような偏差は、技術的効果の性質に依存する。例えば、自然の又は生物学的な技術的効果は、一般に、人工又は工学的な技術的効果のものよりも大きなそのような偏差を有し得る。当業者に理解されるように、所与の技術的効果の数値に対する特定のそのような偏差は、技術的効果の性質に依存する。例えば、自然の又は生物学的な技術的効果は、一般に、人工又は工学的な技術的効果のものよりも大きなそのような偏差を有し得る。単数名詞を参照するときに不定又は定冠詞、例えば「a」、「an」、又は「the」が使用される場合、これは、他に特に明記されていない限り、その名詞の複数形を含む。
特定の問題又は環境への本発明の教示の適用、並びに本発明の変形又はそれに対する追加の特徴(更なる態様及び実施形態など)の包含は、本明細書に含まれる教示に照らして、当業者の能力の範囲内であることが理解されるべきである。
特に、提供される個々の定義、並びに本発明の一態様の文脈における記載された特定の実施形態は、本発明の他の態様に等しく適用されるものである。
文脈により別段に示されない限り、上述の特徴の説明及び定義は、本発明の任意の特定の態様又は実施形態に限定されず、説明される全ての態様及び実施形態に等しく適用される。
別段に指定されない限り、本明細書に記載の一般的方法及び技術は、当該技術分野で周知の従来の方法に従って行われ、また本明細書全体を通して引用及び議論される様々な一般的及びより具体的な参考文献に記載されるように行われる。例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)及びAusubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)、及びHarlow and Lane Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)を参照されたい。
本明細書で引用される全ての参考文献、特許、及び出版物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
ここで、本発明のある特定の態様及び実施形態を、例示として、ならび本明細書に記載の説明、図及び表を参照しながら解説する。本発明の方法、使用及び他の態様のそのような例は、単に代表的なものであり、本発明の範囲をそのような代表的な例のみに限定するものと解釈されるべきではない。
実施例は以下のとおりである。
実施例1:免疫化実験及び抗体応答
可溶性ハプテンの存在は、IgG産生を抑制する:インビボでのB細胞の相対応答性の概念を試験するために、担体としてKLH(キーホールリンペットヘモシアニン)に結合したハプテンとしてのNP(4-ヒドロキシ-3-ニトロフェニルアセチル)を使用して免疫化実験を行った(図2a及び図2b)。この目的のために、野生型マウスの群に、可溶性化合物としてのNP(sNP)又は多価複合体抗原(cNP)と称されるNP-KLHのいずれかを、NPに対して等しいモル比で注射した(図1a)。免疫後7日目(IgM)及び14日目(IgG)に抗体応答を決定した(図1b)。試験した抗原(CI)を欠く対照免疫(CI)と同様に、可溶性ハプテンのみ(sNP:cNP、1:0)の注射は、明確なIgM又はIgG抗体応答を誘導することができなかったが、多価抗原(sNP:cNP、0:1)としてのcNPの注射は、両方を誘導することができた。異なるモル比でのsNPのcNPへの添加は、抗体応答に干渉した。興味深いことに、IgG応答は、既に100:1のsNP対cNPの比率で有意に阻害された。より高い比率のsNP対cNP(>10.000:1)を使用することもまた、NPハプテンに対するIgM抗体応答を有意に抑制することができた(図2c)。重要なことに、担体(KLH)に対するIgG応答は、可溶性ハプテンの量にかかわらず類似していた(図1c)。
可溶性ハプテンの存在は、IgG産生を抑制する:インビボでのB細胞の相対応答性の概念を試験するために、担体としてKLH(キーホールリンペットヘモシアニン)に結合したハプテンとしてのNP(4-ヒドロキシ-3-ニトロフェニルアセチル)を使用して免疫化実験を行った(図2a及び図2b)。この目的のために、野生型マウスの群に、可溶性化合物としてのNP(sNP)又は多価複合体抗原(cNP)と称されるNP-KLHのいずれかを、NPに対して等しいモル比で注射した(図1a)。免疫後7日目(IgM)及び14日目(IgG)に抗体応答を決定した(図1b)。試験した抗原(CI)を欠く対照免疫(CI)と同様に、可溶性ハプテンのみ(sNP:cNP、1:0)の注射は、明確なIgM又はIgG抗体応答を誘導することができなかったが、多価抗原(sNP:cNP、0:1)としてのcNPの注射は、両方を誘導することができた。異なるモル比でのsNPのcNPへの添加は、抗体応答に干渉した。興味深いことに、IgG応答は、既に100:1のsNP対cNPの比率で有意に阻害された。より高い比率のsNP対cNP(>10.000:1)を使用することもまた、NPハプテンに対するIgM抗体応答を有意に抑制することができた(図2c)。重要なことに、担体(KLH)に対するIgG応答は、可溶性ハプテンの量にかかわらず類似していた(図1c)。
これらの所見を更に確認するために、ELISpotアッセイを行って、抗体分泌細胞の比率を直接評価した。血清免疫グロブリンデータと一致して、ELISpotの結果は、可溶性ハプテンとハプテン結合担体とを100:1の比で組み合わせることによりIgG分泌細胞の数が低減されるが、IgM分泌細胞は影響を受けないことを示した(図1d)。これらのデータは、可溶性一価抗原が同じ抗原の複合体形態に対する免疫応答を阻害するという本発明者の概念と一致する。IgMとは対照的に、IgG免疫応答に対する抑制効果は、低濃度の可溶性一価抗原で観察される。
重要な部分として、IgD型BCRの存在がこの調節にとって重要であることが示唆された。したがって、IgD型BCRを欠くIgDノックアウトマウスにおいてNP免疫化実験を行うことによって、IgDの役割を試験した。IgDノックアウトマウスは、可溶性NPをcNP免疫に添加した場合、阻害効果を示さなかった(図1e、図1f;図2c)。
まとめると、これらのデータは、成熟B細胞が、抗原決定基の密度に従って免疫応答を微調整することができ、それによって、同じ抗原の異なるエピトープに対する異なるIgM及びIgG応答をもたらすことを示唆している。
可溶性ペプチドの存在は、IgM抗体応答を増強する:ハプテン特異的抗体応答を試験した後、概念が自己抗原に対して有効であり、したがって、B細胞の選択及び自己破壊的免疫応答の制御のための異なるシナリオを提供し得るかどうかを試験した。導入遺伝子産物又は内因性構造のいずれかを認識する定義されたBCRを発現する単一特異的B細胞を人工的に保有するトランスジェニックマウスの使用を回避するために、インスリン関連自己抗原を自己免疫疾患の生理学的に関連する系として選択した。膵臓における生合成中、プロインスリンは、周知のホルモンインスリン及びいわゆるCペプチド(CP)に切断され、両方とも血流に分泌される。インスリンは血液中にナノモル量で見られ、血中グルコースレベル及び糖尿病の調節において重要な役割を果たすが、C-ペプチドはほとんど検出されず、血液中に低ピコモル量で存在し、恒常性機能を有しないようである[30]。完全長のCペプチド又はインスリン由来ペプチドを使用して、豊富で機能的に重要な(インスリン)に対する自己反応性抗体応答は、生理学的機能のないほとんど検出されない自己抗原(Cペプチド)と比較して調査されるべきである(図3a)。更に、インスリンとは対照的に、Cペプチドは保存されていない(図3b)。
インキュベーションによって複合化されたビオチン化C-ペプチドのいずれかを、ストレプトアビジン(SAV)とともに使用した。あるいは、KLHを、Cペプチドに結合した担体として使用して、多価複合体抗原(cCP)を生成した。C-ペプチドの非複合形態(sCP)を、可溶性抗原として使用した。NPハプテンと同様に、野生型マウスにsCP、cCP、又はこれらの組み合わせを注射して、自己反応性抗体応答を誘導するそれらの可能性を試験した(図3c)。予想どおり、sCPは検出可能なIgM又はIgG免疫応答を誘導しなかったが、多価形態のcCPは、それぞれd7及び14で測定した場合、IgM及びIgGの両方を誘導した(図3d)。ELISA実験に加えて、免疫化されたマウス由来の血清を使用して、生成された抗体応答の特異性を決定した。マウス血清を使用したウェスタンブロット分析は、cCPで免疫化されたマウスが、膵臓C-ペプチドを認識するIgG抗体に対して陽性であることを明らかにした(図4a)。これは、ハプテン免疫化と完全に一致し、単独では検出可能な免疫応答を誘導することができない可溶性ペプチドが、IgG記憶B細胞の産生を防止することを示す。実際に、d21で同じ抗原を用いた後の負荷は、cCPのみ、sCP:cCP比0:1で免疫化したマウスと比較して、sCP:cCP比20:1で免疫化したマウスにおいて弱いIgG応答をもたらした(図3d、d14及びd28IgG)。自己抗原としてのCペプチドに対する記憶応答を確認するために、アジュバントCpGを含まないcCPを使用してd42でリコール免疫化を行い、0:1のsCP:cCP比のみで免疫化したマウスにおいて、Cペプチドに対する堅牢なIgG応答を検出した(図3e)。
IgGとは対照的に、Cペプチド特異的IgM抗体応答は、20:1比のsCP:cCPのリコール免疫化時に誘導された(図3d、d28 IgM)。脾臓B細胞のFACS分析は、マウスの異なる群における有意差を明らかにしなかった(Suppl.図3b、図3c)。更に、Cペプチドの担体に対するIgG応答において差は検出されなかった(図4d)。
これらのデータは、可溶性一価抗原が免疫応答を調節し、免疫応答中の抗体分泌細胞のIgG:IgM比を決定することを示唆している。この結論は、ELISpot分析を行って、異なるマウス群におけるIgG又はIgM分泌細胞の数を決定することによって確認された。血清Igの結果と完全に一致して、ELISpot実験は、sCP:cCPの比20:1で免疫化されたマウスにおいてIgM分泌細胞の数が増加しており、一方IgG分泌細胞の数はcCP、sCP:cCP比0:1で免疫化されたマウスと比較して減少していることを示した(図3f)。
NP免疫化実験と同様に、sCP:cCP比によるB細胞応答性の調節にIgDが必要であるかどうかを試験するために、Cペプチド免疫化をIgDノックアウトマウスにおいて行った。IgDノックアウトマウスは、概して減少したIgG応答を示し、0:1比のsCP:cCPで免疫化されたマウスにおいて観察されたIgG抗体応答に対する可溶性ペプチドの調節効果はなかった(図3g)。
まとめると、これらのデータは、抗体応答が自己抗原に対して向けられることができることを示し、それぞれの自己反応性B細胞が中枢性トレランスによってクローン的に欠失されないことも、アネルギーによって機能的にサイレンシングされないことも示唆している。最も重要なのは、自己又は非自己抗原にかかわらず、結果は、B細胞応答が多価抗原によって誘導され、可溶性の対応物によって調節され、それによりB細胞応答性及び生成された抗体のアイソタイプが調節されることを示している。これにより、現在の考えとはまったく異なる動的かつ重要なB細胞機能が得られる。
実施例2:インスリンに対する自己抗体応答
多価天然インスリンは、有害な抗インスリンIgG応答を誘導する:C-ペプチドは、血液中でほとんど検出され得ず、既知の生理学的関連性を有さないため、自己抗体応答が、そのような非常に低い濃度で存在する自己抗原に対して実行可能であり得ることは除外されない。したがって、インスリンに対する自己抗体応答を試験した。まず、自己反応性B細胞が末梢に自然に存在し、中枢性トレランスによって欠失したり、現在の考えで提案されているようにアネルギーによって応答しなくなったりしないという基本的な仮定を試験した。この概念によれば、自己抗原複合体の形成は、天然に存在する自己反応性末梢B細胞からの自己反応性抗体の分泌を誘引する。これを試験するために、自己抗原は、ビオチン化天然マウスインスリンをストレプトアビジンでインキュベートすることによって生成された複合体であった(InsNat)。重要なことに、ビオチン化マウスインスリンは、可溶性形態で注射された場合、非ビオチン化内因性対応物と同様にグルコース代謝を調節するため、生物学的に活性である(データは示さず)。野生型マウスに10μgのInsNat複合体を注射し、血清中の抗インスリン抗体の存在について経時的に監視した。並行して、血中及び尿中のグルコースレベルを監視することによって、免疫化されたマウスが糖尿病様のグルコース代謝の調節不全を発症したかどうかを試験した。7日目にかなりの量の抗インスリンIgMが検出され、一方、抗インスリンIgGは、複合体化インスリンの注射後d14で検出された(図5a)。両方のアイソタイプは、d28でのブースト免疫化(d21)後に検出された。重要なことに、マウスは、d7で開始し(データは示さず)、d14まで継続し、d26でブースト(d21)後に更に増加する血中グルコース濃度の増加によって測定されるように、糖尿病の明確な徴候を示した(図5c)。血中グルコースレベルの上昇が自己抗体産生に依存することを示すために、B細胞欠損マウス(CD79Aとしても知られるBCR成分Igαを欠くmb-1ノックアウトマウス)に10μgのInsNat複合体を注射し、血中グルコースを監視した(図5b、図5c)。興味深いことに、B細胞欠損マウスにおいて血中グルコースの増加は観察されず、B細胞の存在及び自己抗体分泌が、野生型マウスにおいて観察される糖尿病症状の発症に重要であることを示唆している(図5c)。更に、血中グルコースの上昇は、複合体InsNatを注射された野生型マウスの尿中に検出可能なグルコースを伴った(図5d)。糖尿病の発症と一致して、複合体InsNatを注射された野生型マウスの水消費量は劇的に増加した(図5e)。糖尿病症状の予期せぬ重症度のために、マウスを27日目に屠殺し、膵臓及び脾臓を分析した。
多価天然インスリンは、有害な抗インスリンIgG応答を誘導する:C-ペプチドは、血液中でほとんど検出され得ず、既知の生理学的関連性を有さないため、自己抗体応答が、そのような非常に低い濃度で存在する自己抗原に対して実行可能であり得ることは除外されない。したがって、インスリンに対する自己抗体応答を試験した。まず、自己反応性B細胞が末梢に自然に存在し、中枢性トレランスによって欠失したり、現在の考えで提案されているようにアネルギーによって応答しなくなったりしないという基本的な仮定を試験した。この概念によれば、自己抗原複合体の形成は、天然に存在する自己反応性末梢B細胞からの自己反応性抗体の分泌を誘引する。これを試験するために、自己抗原は、ビオチン化天然マウスインスリンをストレプトアビジンでインキュベートすることによって生成された複合体であった(InsNat)。重要なことに、ビオチン化マウスインスリンは、可溶性形態で注射された場合、非ビオチン化内因性対応物と同様にグルコース代謝を調節するため、生物学的に活性である(データは示さず)。野生型マウスに10μgのInsNat複合体を注射し、血清中の抗インスリン抗体の存在について経時的に監視した。並行して、血中及び尿中のグルコースレベルを監視することによって、免疫化されたマウスが糖尿病様のグルコース代謝の調節不全を発症したかどうかを試験した。7日目にかなりの量の抗インスリンIgMが検出され、一方、抗インスリンIgGは、複合体化インスリンの注射後d14で検出された(図5a)。両方のアイソタイプは、d28でのブースト免疫化(d21)後に検出された。重要なことに、マウスは、d7で開始し(データは示さず)、d14まで継続し、d26でブースト(d21)後に更に増加する血中グルコース濃度の増加によって測定されるように、糖尿病の明確な徴候を示した(図5c)。血中グルコースレベルの上昇が自己抗体産生に依存することを示すために、B細胞欠損マウス(CD79Aとしても知られるBCR成分Igαを欠くmb-1ノックアウトマウス)に10μgのInsNat複合体を注射し、血中グルコースを監視した(図5b、図5c)。興味深いことに、B細胞欠損マウスにおいて血中グルコースの増加は観察されず、B細胞の存在及び自己抗体分泌が、野生型マウスにおいて観察される糖尿病症状の発症に重要であることを示唆している(図5c)。更に、血中グルコースの上昇は、複合体InsNatを注射された野生型マウスの尿中に検出可能なグルコースを伴った(図5d)。糖尿病の発症と一致して、複合体InsNatを注射された野生型マウスの水消費量は劇的に増加した(図5e)。糖尿病症状の予期せぬ重症度のために、マウスを27日目に屠殺し、膵臓及び脾臓を分析した。
対照マウスとは対照的に、複合体InsNat免疫化マウスは、膵臓へのマクロファージ、好中球及びB細胞の非常に増加した動員を示した(図5f)。更に、InsNat複合体免疫化マウスのIgG+マクロファージは、天然インスリンの結合を示した(図5f)。したがって、膵臓における自己抗体媒介性急性炎症プロセスを示唆している。FACS分析は、対照マウスと複合体InsNatで免疫したマウスとの間に脾B細胞の差を示さなかったが(図6)、ELISpot分析は、複合体InsNatを注射したマウスにおいて、抗インスリンIgGを分泌する脾B細胞の有意に増加した数を明らかにした(図5g)。
分泌されたIgGが糖尿病症状の原因であるかどうかを試験するために、複合体InsNat及び対照免疫化(図5h、図5i)を注射したマウス由来の血清を用いたIgGプルダウン実験を行った。IgG精製は、血清インスリン特異的IgGからの内因性インスリンの解離をもたらすと予想されるため(方法の項を参照)、我々は、精製後の総IgG中の抗インスリンIgGを決定した。InsNatマウスから単離されたIgGの最大40%(0.4mg/mg)がインスリンに反応性であることが判明し、直接血清IgG測定が内因性インスリンへの結合のためにインスリン特異的IgG全体を検出できないことが示唆された(図5a及び図5hを比較)。単離された抗インスリンIgGの病原性を試験するために、対照免疫化からの等量のIgGを、野生型動物に静脈内注射するか、又は複合インスリンをマウスに注射し、血中グルコースを監視した。2μgの抗インスリンIgGを含有する総IgGを注射することは、レシピエントマウスにおいて血中グルコースの増加を誘導するのに十分であることが判明し、複合インスリンを注射されたマウスからのIgGが糖尿病症状を引き起こすことが示唆された(図5j)。
これらのデータは、重要な代謝ホルモンを認識する自己反応性B細胞が欠失しておらず、機能的にサイレンシングされていないが、周辺に存在し、自己抗原のバランスが多価形態にシフトするときに重度の自己免疫を誘導し得ることを示している。
インスリン由来エピトープは、有害な抗インスリンIgG応答を誘導する:上記の所見を更に確認するために、インスリンA鎖由来ペプチド配列を使用して、インスリンに対する自己抗体応答における頻繁に報告されるエピトープであるInsA(図3b)と称される免疫化実験を行った[32]。HIV gp12033からのウイルス由来ペプチドを非関連外来ペプチド(ウイルス-ペプチド)として含めた。Cペプチドに関しては、選択されたペプチドを担体KLHに結合して複合多価抗原(cInsA)を生成し、次いで単独又は可溶性ペプチド(sInsA)と組み合わせて免疫化実験に使用した。続いて、免疫原に対する抗体応答、InsAペプチド、又は天然インスリンを測定して、有害な自己抗体応答の誘導を確認した。InsAが、天然インスリンを認識するIgM及びIgG自己抗体応答を誘導することが判明した(図7a)。28日目のブースト(d21)の1週間後、多価インスリン由来ペプチド単独(sInsA:cInsA比0:1)は、抗インスリンIgGの産生を容易に誘導したが、可溶性ペプチド(sInsA:cInsA比100:1)の添加は、28日目のこの自己反応性IgGの大幅な低減をもたらした(図7a)。重要なことに、内因性インスリンに結合した抗インスリンIgGが上述のように検出を逃れるため、自己反応性抗インスリンIgGの量は、直接血清ELISAで検出された量よりも高い可能性が最も高い(図5a、図5i)。
特に、可溶性InsAの存在は、d28で堅牢なインスリン特異的IgM産生をもたらし、これは、多価ペプチド単独で免疫化されたマウス(sInsA:cInsA比0:1)においてわずかに低減され、d28で検出可能な抗インスリンIgMを示した(図7a)。これは、ウイルスペプチドで免疫化されたマウスでは観察されなかった(図8a、図8b)。対照ペプチドとは対照的に、インスリンは生物体内に比較的高い量で存在し、内因性可溶性インスリンの存在が多価InsAのその免疫応答を調節し、それによって自己反応性ブースターIgM応答の増加をもたらす可能性があることを示唆している。総合すると、データは、多価対一価抗原の比率が、ブースター免疫後28日目の抗原特異的IgG対IgM(γ/μ比)抗体応答の比率によって反映されることを示す(図7b)。
可溶性ペプチドの存在下で免疫化されたマウスの血清IgG(sInsA:cInsA比100:1)とは対照的に、多価ペプチドのみで免疫化されたマウスの血清IgG(sInsA:cInsA比0:1)は、ウェスタンブロット分析で天然インスリンを容易に検出した(図7c)。更に、cInsAで免疫化されたマウスからの脾臓B細胞を用いたELISpot分析は、それぞれのマウスにおける自己反応性IgG分泌細胞の存在の増加を確認した(図7d)。
抗インスリンIgGの増加が有害な自己免疫応答に関連することを確認するために、cInsA(sInsA:cInsA比0:1)で免疫化されたマウスが糖尿病の徴候を示すかどうかを試験した。28日目のブースター免疫化(d21)の約1週間後に、このマウス群は、d27からd33までの血中グルコース及び水摂取量の増加を示すことが判明した(図7e及び図10)。加えて、多価インスリンペプチド(sInsA:cInsA、0:1)で免疫化されたマウスの尿中のグルコース濃度もまた上昇するかどうかを試験した。完全に一致して、増加した自己反応性抗インスリンIgGは、増加した尿グルコース濃度をもたらした(図7f)。自己反応性IgGとは対照的に、ブースター免疫化において増加した量の自己反応性抗インスリンIgMを有するマウスにおいて、自己免疫性糖尿病の検出可能な徴候は観察されなかった(図7e及び図7f)。
免疫化後のd28における抗原特異的B細胞の存在をFACS分析により確認した(図9a及び図9b)。対照と比較して、複合ペプチドのみ(sInsA:cInsA比0:1)で免疫化されたマウスは、増加したInsAペプチド結合によって決定されるように、自己反応性IgGに結合した膵臓におけるマクロファージの割合の増加を示す(図9c)。脾臓においても、同様の結果が観察された(図10)。
総合すると、データは、複合体多価自己抗原の比率の増加が、野生型動物における自己反応性IgG及びその後の自己破壊的自己免疫応答の量の増加をもたらすことを示唆している。
実施例3:InsA-ペプチド免疫化後の保護的抗インスリン-IgM発現
一価の自己抗原は、保護性IgMによって免疫寛容を誘導する:自己反応性IgGの自己破壊的役割とは別に、前述のデータは、糖尿病における自己反応性IgMの保護的役割を指摘している。実際に、結果は、対応する抗インスリンIgGと比較して高い抗インスリンIgMが、InsAで免疫化されたマウスにおけるグルコース代謝及び糖尿病の脱調節から保護することを示唆している(図7a~図7f)。完全に一致して、IgMに対するインスリン反応性IgGの低い比率(γ/μ<0.1)を示すマウスは、d28で糖尿病から保護された(図7g)。d42での第2のInsAブースター免疫化は、一価ペプチドを含めた場合抗インスリンIgMをもたらしたが、IgGはもたらさず(sInsA:cInsA比100:1)、対応するマウスはd42とd49との間に糖尿病の徴候を示さなかった(図11a及び図11b)。
一価の自己抗原は、保護性IgMによって免疫寛容を誘導する:自己反応性IgGの自己破壊的役割とは別に、前述のデータは、糖尿病における自己反応性IgMの保護的役割を指摘している。実際に、結果は、対応する抗インスリンIgGと比較して高い抗インスリンIgMが、InsAで免疫化されたマウスにおけるグルコース代謝及び糖尿病の脱調節から保護することを示唆している(図7a~図7f)。完全に一致して、IgMに対するインスリン反応性IgGの低い比率(γ/μ<0.1)を示すマウスは、d28で糖尿病から保護された(図7g)。d42での第2のInsAブースター免疫化は、一価ペプチドを含めた場合抗インスリンIgMをもたらしたが、IgGはもたらさず(sInsA:cInsA比100:1)、対応するマウスはd42とd49との間に糖尿病の徴候を示さなかった(図11a及び図11b)。
自己反応性抗インスリンIgMの増加した比率が、自己反応性抗インスリンIgGによって誘導されるグルコース代謝に対する負の効果に対抗するかどうかを直接試験するために、最初に一価のInsAペプチド(sInsA:cInsA比100:1)の存在下で免疫化されたマウスを、d51で多価抗原(sInsA:cInsA、0:1)のみで負荷した。興味深いことに、自己免疫糖尿病をd14から28まで誘導した治療(図12、d7対d14)は、自己反応性抗インスリンIgM応答のみを生成したが、d51から59までにおいて抗インスリンIgGもグルコース代謝の脱調節も生成しなかった(図13a~図13c)。
これらのデータは、一価InsAペプチド(sInsA:cInsA比100:1)の存在による一次免疫化が、多価InsA(sInsA:cInsA比0:1)による病原性免疫化に対する耐性を誘導したことが示唆している。更に、所見は、この独自の耐性メカニズムが、保護自己反応性IgM(pIgM)の生成を誘発し維持することによって、新たなクラスの記憶応答を生み出すことを示している。これを更に試験するために、抗インスリンIgM濃度の経時的な低下を監視し、続いて抗インスリンリコール応答を監視した(図7h)。本発明者らは、抗インスリンIgMが数週間持続し、71日目のブースターcInsA免疫化はIgMのみを誘導するが、グルコース代謝の脱調節の徴候なしにIgGを誘導しないことを示す(図7h、図7i及び図14)。抗原に対する抗体親和性の増加は通常、記憶応答と関連付けられるため、ELISA実験を行って、異なる時点でのインスリン特異的抗体の親和性を比較した。ブースターInsA免疫後に生成されたIgMは、7日目に収集された一次IgMと比較して高い抗インスリン親和性を示すことが判明した(図7j)。更に、pIgMの保護的役割を調べるために、マウスを、d0から開始して48時間毎に、5μgのpIgM(図15a、図15b)を含有する50μgの精製IgMの静脈内注射とともに、cInsA又はcInsAで免疫化した。興味深いことに、インスリン特異的pIgMの存在は、cInsAのみで免疫化されたマウスにおいて観察されるように、自己免疫性血糖異常を緩和し、糖尿を完全に防止した(図7k)。pIgM i.v.注射が免疫原(cInsA、i.p.)を中和したことを除外するために、抗担体ELISAを行った。予想どおり、7日目に抗KLH-IgMレベルの差は観察されなかった(図15c)。
特にインスリン及びInsAペプチドは、マウスとヒトとの間で高度に保存されているため(図3b)、データは、B細胞耐性の新規かつ動的な概念を提示するだけでなく、ヒトにおける抗インスリン抗体によって誘引される自己免疫糖尿病を理解するための基本的な動物モデルも導入する。
実施例4:保護記憶抗インスリン-IgMは単一特異性である。
上記の結果は、自己反応性一次IgMとPR-IgMとの間の予想外の根本的な違いを指摘している。実際に、一次抗インスリン-IgMは糖尿病症状を誘導したが、より高いインスリン親和性を有するが病理を誘導しなかった記憶PR-IgMと比較して、はるかに少ない量で産生された。自己反応性記憶PR-IgMの破壊的自己免疫に対する保護機能を直接試験するために、マウスを、d0から開始して48時間毎に、5μgの抗インスリン記憶PR-IgMを含有する50μgの総IgMの静脈内注射とともに、cInsA単独又はcInsAで免疫化した(図16a及び図16b)。興味深いことに、インスリン特異的PR-IgMの存在は、cInsA単独で免疫化されたマウスと比較して、7日目に自己免疫性血糖異常を緩和し、糖尿を完全に防止した(図16b)。PR-IgM注射が注射されたcInsAを中和したことを除外するために、抗担体(KLH)ELISAを行い、7日目に2つの群間で抗KLH-IgMレベルの差は見られなかった(図15C)。これらのデータは、記憶抗インスリンPR-IgMが、一次抗インスリンIgMによるインスリンの枯渇を防止し、それによって糖尿病の開始を防止することを示唆している。自己反応性一次及び記憶PR-IgMの間の違いの1つの説明は、一次IgMが多反応性であり、免疫保護の第1の選択としてB1 B細胞によって産生され得ることであり得る。おそらく、この多反応性は、複数の自己抗原を含有する高分子量の関節免疫複合体をもたらし、食細胞による除去を可能にし、それによって結合したインスリンを枯渇させる。対照的に、自己反応性記憶PR-IgMは、自己抗原に対して単一特異的であってもよく、したがって、免疫複合体を形成することなく結合した後に自己抗原を放出してもよい。これを試験するために、記憶PR-IgMと比較した一次IgMの多反応性を分析した。HEp-2スライドを用いた抗DNA ELISA(図16c)及び間接免疫蛍光(図16d)は、一次IgMとは対照的に、記憶PR-IgMが多反応性ではないがインスリンに特異的に結合することを示した(図16c及び図16d)。
上記の結果は、自己反応性一次IgMとPR-IgMとの間の予想外の根本的な違いを指摘している。実際に、一次抗インスリン-IgMは糖尿病症状を誘導したが、より高いインスリン親和性を有するが病理を誘導しなかった記憶PR-IgMと比較して、はるかに少ない量で産生された。自己反応性記憶PR-IgMの破壊的自己免疫に対する保護機能を直接試験するために、マウスを、d0から開始して48時間毎に、5μgの抗インスリン記憶PR-IgMを含有する50μgの総IgMの静脈内注射とともに、cInsA単独又はcInsAで免疫化した(図16a及び図16b)。興味深いことに、インスリン特異的PR-IgMの存在は、cInsA単独で免疫化されたマウスと比較して、7日目に自己免疫性血糖異常を緩和し、糖尿を完全に防止した(図16b)。PR-IgM注射が注射されたcInsAを中和したことを除外するために、抗担体(KLH)ELISAを行い、7日目に2つの群間で抗KLH-IgMレベルの差は見られなかった(図15C)。これらのデータは、記憶抗インスリンPR-IgMが、一次抗インスリンIgMによるインスリンの枯渇を防止し、それによって糖尿病の開始を防止することを示唆している。自己反応性一次及び記憶PR-IgMの間の違いの1つの説明は、一次IgMが多反応性であり、免疫保護の第1の選択としてB1 B細胞によって産生され得ることであり得る。おそらく、この多反応性は、複数の自己抗原を含有する高分子量の関節免疫複合体をもたらし、食細胞による除去を可能にし、それによって結合したインスリンを枯渇させる。対照的に、自己反応性記憶PR-IgMは、自己抗原に対して単一特異的であってもよく、したがって、免疫複合体を形成することなく結合した後に自己抗原を放出してもよい。これを試験するために、記憶PR-IgMと比較した一次IgMの多反応性を分析した。HEp-2スライドを用いた抗DNA ELISA(図16c)及び間接免疫蛍光(図16d)は、一次IgMとは対照的に、記憶PR-IgMが多反応性ではないがインスリンに特異的に結合することを示した(図16c及び図16d)。
抗インスリンIgMが観察された効果に特異的に関与することを示すために、本発明者らは、InsA免疫化マウス由来の血清を使用してインスリン特異的プルダウンアッセイを行った。プルダウンは、インスリンに対するウェスタンブロット分析によって明らかになったように、純粋なインスリン特異的IgMをもたらした(図17)。我々は、精製された一次抗インスリンIgM又は記憶抗インスリンPR-IgMを使用して、抗DNA ELISA(図16e)及びHEp-2スライド上で間接免疫蛍光(図16f)を行った。結果は、一次IgMとは対照的に、精製された抗インスリンPR-IgMは多反応性ではなく、インスリンに特異的に結合するという所見を裏付けている(図16e及び図16f)。一次抗インスリンIgMは大きな免疫複合体を形成し、PR-IgMは形成しないという仮説を直接検証するために、我々は、抗インスリン一次IgM又はPR-IgMをインスリン及びDNAとインキュベートし、サイズ排除スピンカラムを使用して免疫複合体の形成を決定した。PR-IgMとは対照的に、我々は、一次抗インスリンIgMが主に>104kDの大きな複合体を形成することを見出した(図16g)。精製された一次抗インスリンIgMがグルコース代謝の調節不全の原因であることを示すために、我々は、5μgの精製された抗インスリン一次IgM又はPR-IgMを静脈内注射し、血糖を監視した。PR-IgMとは対照的に、精製された一次抗インスリンIgMの注射後に血糖の激しい増加が観察された(図16h)。興味深いことに、血糖の増加は、総一次IgMと比較して、精製された抗インスリン一次IgMの注射後により早く現れた(図16h)。
要約すると、これらのデータは、自己抗原に対する特異性の増加が、自己反応性記憶PR-IgMが免疫応答中に保護的であるために重要であることを示唆している(図18)。更に、自己反応性PR-IgMの誘導生成は、B細胞耐性における重要なステップである可能性が最も高い。
実施例5:免疫化スキーム
ワクチン設計に関する本発明の免疫概念の影響を、Covid-19を引き起こすSARS-CoV-2コロナウイルスに由来する病原体特異的抗原を使用して試験した。感染中、SARS-CoV-2コロナウイルスは、受容体結合ドメイン(RBD)を介して、宿主細胞表面上のアンジオテンシン変換酵素2(ACE2)に結合する。したがって、RBD/ACE2相互作用を遮断する抗体応答を誘引することが、コロナウイルス感染を予防するための鍵であると考えられる。したがって、本発明者らは、免疫化中の免疫応答における抗原形態の役割にSARS-CoV-2由来のRBDを使用した。
ワクチン設計に関する本発明の免疫概念の影響を、Covid-19を引き起こすSARS-CoV-2コロナウイルスに由来する病原体特異的抗原を使用して試験した。感染中、SARS-CoV-2コロナウイルスは、受容体結合ドメイン(RBD)を介して、宿主細胞表面上のアンジオテンシン変換酵素2(ACE2)に結合する。したがって、RBD/ACE2相互作用を遮断する抗体応答を誘引することが、コロナウイルス感染を予防するための鍵であると考えられる。したがって、本発明者らは、免疫化中の免疫応答における抗原形態の役割にSARS-CoV-2由来のRBDを使用した。
複合体RBD(cRBD)による免疫化(複合体化にはストレプトアビジン及びビオチン化RBDが4:1の比率で使用された)は、可溶性RBD(sRBD)と比較してより強いIgG免疫応答を誘導することが判明した。RBDの産生のために、RBDのヘキサヒスチジンタグバージョンをコードする発現ベクターをHEK293-6E細胞に一過性にトランスフェクトした(Amanat,F.,et al.,2020,Nature medicine,26(7),1033-1036)。可溶性RBDを、ニッケル系固定化金属親和性クロマトグラフィー(TaKaRa)によってトランスフェクションの5日後に上清から精製した。しかしながら、抗体濃度は、インビトロ感染実験を使用したウイルス中和を可能にするのに十分ではなかった。したがって、免疫化前にsRBDでマウスを前処理することが免疫応答をブーストするかどうかを試験した。実際に、免疫化の2週間前に可溶性RBDでマウスを前処理すると、免疫応答が大幅に増強した(図19)。重要なことに、前処理されたマウスの血清は、インビトロでSARS-CoV-2感染を予防するための非常に高い能力を示した。
更に、免疫化カクテルの組成物中のsRBD対cRBDの異なる比率は、免疫化後の免疫応答の精密な制御を可能にする免疫グロブリンアイソタイプの異なる比率(すなわちIgG対IgM)をもたらすことが見出された。
実施例6:抗インスリンIgGは血中グルコース濃度を調節する。
我々は、野生型(WT)マウスから単離されたかなりの量の総IgGがインスリンに反応性であることに気づいた(図21A及び図21B)。これらのデータを確認するために、ELISpotアッセイを行い、抗インスリンIgG分泌B細胞がWTマウスの脾臓に存在することを見出した(図21C)。抗体を産生することができないWT及びB細胞欠損マウスの血中グルコース濃度を測定したところ、驚くべき差を検出した。予想外にも、B細胞欠損マウスは、WT対照と比較して異常に低下した血中グルコースレベルを示した(図21D)。
我々は、野生型(WT)マウスから単離されたかなりの量の総IgGがインスリンに反応性であることに気づいた(図21A及び図21B)。これらのデータを確認するために、ELISpotアッセイを行い、抗インスリンIgG分泌B細胞がWTマウスの脾臓に存在することを見出した(図21C)。抗体を産生することができないWT及びB細胞欠損マウスの血中グルコース濃度を測定したところ、驚くべき差を検出した。予想外にも、B細胞欠損マウスは、WT対照と比較して異常に低下した血中グルコースレベルを示した(図21D)。
この異常な減少が抗体欠乏によって引き起こされるかどうかを試験するために、我々はWTマウスからの総IgG、又は同じ総IgGの抗インスリンIgG枯渇対照をB細胞欠乏マウスに静脈内注射した。我々は、血中グルコース濃度が総マウスIgGでは増加するが、抗インスリンIgG枯渇対照では増加しないことを見出した(図21E)。適合性に対する定常状態血中グルコース低下の結果を試験するために、我々は、運動機能を評価するためにワイヤ吊り下げ試験を行い、B細胞欠損マウスが、WT対照と比較してワイヤ吊り下げ時間を有意に低減することを見出した。重要なことに、ワイヤ吊り下げ時間のこの損失は、全マウスIgGの静脈内注射後に回復した(図21F)。加えて、B細胞欠損マウスはまた、ロータロッド運動後に血中グルコースレベルの調節不全を示した。
健康なドナーからの総IgG製剤は、免疫不全の治療において静脈内免疫グロブリン(IVIg)注射としてしばしば使用されるため、これらの製剤における抗インスリンIgGの存在を試験した。全ての調製物は、相当量の抗インスリンIgGを含有した。しかしながら、米国が原産国である場合、抗インスリンIgG濃度は増加しているようであった。インスリンはヒトとマウスとの間で高度に保存されているため、ヒトIVIgをB細胞欠損マウスに注射し、インスリン濃度の低下を検出した(図21G)。更に、WTマウスに50μgのヒトIVIgを注射すると、血中グルコースが上昇し、この効果は、ヒトIVIgからの抗インスリンIgGの枯渇がIVIg誘導血中グルコース上昇を防止するため、抗インスリンIgGを必要とした(図21H)。
IVIg注射が、抗体欠乏に罹患しているヒト患者において同様の結果を示すかどうかを試験するために、我々は、IVIg注射の前後の血中グルコースを監視した。B細胞欠損マウスと同様に、抗体欠損患者は、健康なドナーと比較して、血中グルコース濃度の低下を示した。重要なことに、IVIg注射後、血中グルコース濃度は上昇し、正常レベルに達した(図21I)。更に、IVIgを受けた免疫不全患者は、血清インスリンレベルの低下を示した。
IVIgに存在する抗インスリンIgGがインスリンに特異的であることを示すために、我々は、バイオ層干渉法(BLI)を介して親和性を決定した。10~11の解離定数は、抗IgGがインスリンに対して極めて特異的であることを示唆している(図21J)。
これらのデータは、抗インスリンIgGが健康な個人に存在し、血中グルコース度の調節に必要であり得ることを示唆している。
実施例7:抗インスリンIgMによる血中グルコースの調節
健康な個体における抗インスリン抗体の存在に関する我々の所見を更に確認するために、異なる年齢層の血液中の抗インスリンIgG及びIgMを評価した。我々は、抗インスリンIgGが若年及び高齢のヒトにおいて類似していたが、抗インスリンIgMは、男性及び女性において年齢とともに減少するようであることを見出した(図22A)。興味深いことに、ヒト抗インスリンIgMは、インスリン上の複数のエピトープを認識する。
健康な個体における抗インスリン抗体の存在に関する我々の所見を更に確認するために、異なる年齢層の血液中の抗インスリンIgG及びIgMを評価した。我々は、抗インスリンIgGが若年及び高齢のヒトにおいて類似していたが、抗インスリンIgMは、男性及び女性において年齢とともに減少するようであることを見出した(図22A)。興味深いことに、ヒト抗インスリンIgMは、インスリン上の複数のエピトープを認識する。
高い特異性と一致して、抗インスリンIgGは、抗核抗体の検出のために一般的に使用される方法であるHEp-2細胞に対する間接免疫蛍光アッセイ(IIFA)において、任意の細胞構造への結合を示さなかった。しかしながら、抗インスリンIgMは、インスリンに対するそれらの親和性に従って生化学的に分離することができる2つの画分からなる。低親和性抗インスリンIgMは、溶出のために酸性条件(pH=2.8)を必要とする高親和性抗インスリンIgMと比較して、より高いpH(5)でインスリンカラムから溶出する(図22B、図22C)。低親和性IgMは、IIFA中の核構造への結合及びELISA中のdsDNA結合によって検出される多反応性を示すが、高親和性IgMは、これらのアッセイにおいて実質的に陰性である(図22D、図22E)。更に、我々は、BLIアッセイを行うことによって親和性の違いを確認し、それぞれ10-10及び10-7の解離定数を有する高親和性IgM及び低親和性IgMを見出した(図22F)。グルコース代謝に対する異なるIgM画分の効果を試験するために、我々は、等量のインスリン反応性IgMhigh及びIgMlowをWTマウスに注射した。IgMlowを受けたマウスでは、注射後2時間以内に血中グルコースの上昇が観察されたが、IgMhighは血中グルコースレベルを有意に変化させなかった(図22G)。更に、低血糖を引き起こす可能性のあるインスリン濃度の異常な増加の条件下で、IgMhighが調節的な役割を果たすかどうかを試験した。この目的のために、我々は、0.1μgのインスリンを、IgMhigh又は非特異的IgMアイソタイプ対照と組み合わせて注射した。驚くべきことに、IgMアイソタイプ対照ではなく抗インスリンIgMhighの存在が、インスリン注射直後に生じる血中グルコースの劇的な低下を防止した(図22H)。IgG媒介分解からインスリンを保護することにおけるIgMhighの調節的役割を更に試験するために、我々は、抗インスリンIgMhighと、IVIg調製物から精製された抗インスリンIgGとを組み合わせた。データは、抗インスリンIgMhighが、血中グルコースレベルの上昇をもたらすインスリンのIgG媒介性中和を防止するようにPR-IgMとして機能することを示している(図22I)。これらのデータは、抗インスリンIgMhighが、IgG媒介中和からインスリンを保護し、過剰なインスリンを結合し、それによってインスリン濃度の劇的な低下を防止することによって、グルコース代謝を調節するために重要であることを示唆している。加齢に伴うインスリン反応性IgMの減少(図21A)により、我々は、抗インスリンIgMhigh又はIgMlowがこの減少の影響を受けるかどうかを試験することにした。我々は、若年及び高齢の健康なドナーにおける抗インスリンIgMhigh又はIgMlowの量を決定し、抗インスリンIgMhighの比率が年齢とともに増加することを見出した(図22J)。
まとめると、これらのデータは、グルコース代謝が異なるクラスの抗体によって調節され、抗インスリンIgMhighが、年齢とともに特に重要であると思われるインスリン恒常性を調節することによってグルコース代謝を調節するPR-IgMとして機能することを示唆している。
実施例8:インスリン複合体による抗インスリン抗体の誘導。
複合体化自己抗原が任意のアジュバントとは無関係に自己反応性抗体応答を誘導することができるかどうかを調べるために、我々は、インスリンを、典型的なホモ二官能性架橋剤である1,2-フェニレン-ビス-マレイミドとインキュベートしたが、この架橋剤は、タンパク質中の遊離スルフヒドリル基に共有結合し、それによって目的のタンパク質を架橋する(図23A)。重要なことに、スルフヒドリル基含有薬物は、抗インスリン自己抗体を誘導することが報告されている。更に、膵臓活性の増加及びインスリン産生の上昇は、インスリンペプチド間のジスルフィド結合の異常な形成をもたらし、これは、酸化ストレスの条件下で、スルフヒドリル基媒介性架橋により影響を受けやすく、したがって複合体形成により影響を受けやすい異常なインスリン形態を生成し得る。1,2-フェニレン-ビス-マレイミドによるインスリンのホモ二官能性架橋をSDS pageで試験し、架橋されたインスリンを、単量体インスリン及び二量体インスリンを排除するサイズ排除スピンカラムを使用して精製した(図23B)。インスリン複合体を透析し、追加のアジュバントなしで、マウス当たり5μgでWTマウスに注入した。対照として、CpGをアジュバントとして、ストレプトアビジンを外来担体として用いて典型的な免疫化を行った。我々は、インスリン複合体が、免疫化と同様の処置のd7において、血中グルコース及び抗インスリンIgMの増加をもたらすことを見出した(図23C、図23D)。加えて、インスリン反応性IgGは、d14及びd26にELISAによって検出可能であった。d21でインスリン複合体を繰り返し注射すると、グルコース代謝の更なる脱調節がもたらされた(図23E)。このため、インスリン複合体の注射の1日後のd22に抗インスリンIgMhighを注射した。我々は、抗インスリンIgMhighが、インスリン複合体の注射によって誘導される血中グルコース脱調節を防止することができることを見出した(図23E)。
複合体化自己抗原が任意のアジュバントとは無関係に自己反応性抗体応答を誘導することができるかどうかを調べるために、我々は、インスリンを、典型的なホモ二官能性架橋剤である1,2-フェニレン-ビス-マレイミドとインキュベートしたが、この架橋剤は、タンパク質中の遊離スルフヒドリル基に共有結合し、それによって目的のタンパク質を架橋する(図23A)。重要なことに、スルフヒドリル基含有薬物は、抗インスリン自己抗体を誘導することが報告されている。更に、膵臓活性の増加及びインスリン産生の上昇は、インスリンペプチド間のジスルフィド結合の異常な形成をもたらし、これは、酸化ストレスの条件下で、スルフヒドリル基媒介性架橋により影響を受けやすく、したがって複合体形成により影響を受けやすい異常なインスリン形態を生成し得る。1,2-フェニレン-ビス-マレイミドによるインスリンのホモ二官能性架橋をSDS pageで試験し、架橋されたインスリンを、単量体インスリン及び二量体インスリンを排除するサイズ排除スピンカラムを使用して精製した(図23B)。インスリン複合体を透析し、追加のアジュバントなしで、マウス当たり5μgでWTマウスに注入した。対照として、CpGをアジュバントとして、ストレプトアビジンを外来担体として用いて典型的な免疫化を行った。我々は、インスリン複合体が、免疫化と同様の処置のd7において、血中グルコース及び抗インスリンIgMの増加をもたらすことを見出した(図23C、図23D)。加えて、インスリン反応性IgGは、d14及びd26にELISAによって検出可能であった。d21でインスリン複合体を繰り返し注射すると、グルコース代謝の更なる脱調節がもたらされた(図23E)。このため、インスリン複合体の注射の1日後のd22に抗インスリンIgMhighを注射した。我々は、抗インスリンIgMhighが、インスリン複合体の注射によって誘導される血中グルコース脱調節を防止することができることを見出した(図23E)。
更に、抗インスリンIgMhighは、膵臓におけるマクロファージ(CD11b+/LY6G+)及び好中球(LY6G+)浸潤の減少、並びに血液中の血清膵臓リパーゼの減少によって示されるように、膵臓の炎症及び損傷を防止することを見出した(図23F、図23G)。
抗インスリンIgMlowと比較して、抗インスリンIgMhighの保護的役割のためのメカニズムとして、我々は、dsDNAにも結合する後者の多反応性が、マクロファージによって貪食され得る免疫複合体の形成を誘導するが、抗インスリンIgMhighはインスリンに対して非常に特異的であり、したがってマクロファージによって容易に貪食される大きな免疫複合体を形成しないことを提案した。これを試験するために、ゲノムdsDNAの存在下で、抗インスリンIgMhigh又は抗インスリンIgMlowをインスリンとともにインキュベートした(図23H)。我々は、抗インスリンIgMhighと比較して、抗インスリンIgMlowの結合/食作用の増加を見出した(図23)。更に、IgMhighは、抗インスリンIgMhigh抗体と比較して、抗インスリンIgMlowを含有する上清においてインスリンの低下がより大きかったため、インスリンを分解から保護することができた。
これらのデータは、インスリン複合体の形成を活性化する条件下で抗インスリン抗体を生成することができ、これが、PR-IgMとして作用する抗インスリンIgMhighによって相殺され得るグルコース代謝の脱調節をもたらすことを示している。
実施例9 組換え抗インスリンIgMは、血中グルコースを調節することができる。
上記の結果は、インスリン特異的PR-IgMが、インスリンの恒常性を調節し、膵臓の機能不全を予防し得る(これらはともに正常な生理学及び糖尿病の予防に不可欠である)ため、大きな治療上の関心の対象となり得ることを示唆している。我々のデータによれば、抗インスリンIgMは、インスリンに対する高い親和性を有し、IIFAにおけるdsDNA又は核構造などの自己抗原に反応しない場合、PR-IgMとして機能することができる。我々は、ヒトインスリン特異的IgG抗体が、定常領域を交換することによってインスリン特異的PR-IgMに変換され得ると仮定した。
上記の結果は、インスリン特異的PR-IgMが、インスリンの恒常性を調節し、膵臓の機能不全を予防し得る(これらはともに正常な生理学及び糖尿病の予防に不可欠である)ため、大きな治療上の関心の対象となり得ることを示唆している。我々のデータによれば、抗インスリンIgMは、インスリンに対する高い親和性を有し、IIFAにおけるdsDNA又は核構造などの自己抗原に反応しない場合、PR-IgMとして機能することができる。我々は、ヒトインスリン特異的IgG抗体が、定常領域を交換することによってインスリン特異的PR-IgMに変換され得ると仮定した。
したがって、我々は、公開されているヒトインスリン特異的抗体[60]を、IgG1(抗インスリンIgGrec)及びIgM(抗インスリンIgMrec)としてクローニングし、発現した(図24A)。インビトロで産生された抗体の品質をテストするために、我々は、PNGaseF処理によるそれらのグリコシル化を評価し、その結果未処理の対照と比較して分子量が減少し、機能的グリコシル化を示唆した。我々は、IgG及びIgMの両方の親和性を10-9であると決定した(図24B)。総ヒト血清IgMと比較して、ELISAではほとんどdsDNA結合は観察されず、IIFAでは核染色は観察されなかった(図24C、図24D)。更に、我々は、単量体の抗インスリン-IgMがインスリンを分解から保護することができるかどうかを試験した。抗インスリンIgGは血中グルコースの上昇をもたらしたが、これは単量体の抗インスリンIgMが存在した場合無効化された(図24E)。
得られた組換えヒト抗インスリンIgMrecが保護調節機能を有するかどうかを試験するために、我々は、それをインスリンとともに注射し、抗インスリンIgMrecが、過剰なインスリンによって誘導されるグルコース濃度の劇的な低下を防止することを見出した(図24F)。更に、抗インスリンIgMrecは、抗インスリンIgGrecによって誘導される血中グルコースの増加を防止するため、抗インスリンIgGrec媒介性中和からインスリンを保護する(図24G)。加えて、抗インスリンIgMrecは、グルコースの尿中への漏出を相殺する(図24H)。
これらのデータは、IgMとして高親和性インスリン特異的抗体を発現させることが、インスリン恒常性を調節し、血中グルコース濃度の脱調節を防止し、インスリン関連疾患及び障害の治療のための新規な戦略を付与することを示唆している。
実施例10:疾患パラメータの予測
高自己反応性一次IgMレパートリーは、高親和性PR-IgMが二次免疫応答及び体細胞超突然変異によって生成され得ない場合、自己反応性損傷の高いリスクを表す。したがって、メモリIgMレパートリーは、適応性耐性の過程で生成されたPR-IgMの大部分からなる。体細胞超突然変異は、PR-IgM生成の失敗及び原発性IgMによって誘導される自己免疫損傷をもたらす。更に、高IgM症候群(HIGM)の全ての形態は、重度の自己免疫と関連している。HIGM患者は、特に、免疫血小板減少症、溶血性貧血及び腎炎等のIgM媒介性自己免疫疾患を発症する傾向がある。我々は、自己免疫及び/又はインスリン関連疾患を引き起こす自己反応性IgM抗体の親和性を測定し、(i)自己抗原に対する低親和性を疾患発症、疾患進行及び/又は死亡のリスク因子として、並びに(ii)高親和性自己反応性IgMを保護として考える。
高自己反応性一次IgMレパートリーは、高親和性PR-IgMが二次免疫応答及び体細胞超突然変異によって生成され得ない場合、自己反応性損傷の高いリスクを表す。したがって、メモリIgMレパートリーは、適応性耐性の過程で生成されたPR-IgMの大部分からなる。体細胞超突然変異は、PR-IgM生成の失敗及び原発性IgMによって誘導される自己免疫損傷をもたらす。更に、高IgM症候群(HIGM)の全ての形態は、重度の自己免疫と関連している。HIGM患者は、特に、免疫血小板減少症、溶血性貧血及び腎炎等のIgM媒介性自己免疫疾患を発症する傾向がある。我々は、自己免疫及び/又はインスリン関連疾患を引き起こす自己反応性IgM抗体の親和性を測定し、(i)自己抗原に対する低親和性を疾患発症、疾患進行及び/又は死亡のリスク因子として、並びに(ii)高親和性自己反応性IgMを保護として考える。
材料及び方法
実施例1~5に使用されたマウス
8~30週齢のC57BL/6マウス及びB細胞欠損マウスを、1×PBS中50μgのCpG-ODN1826(Biomers)を含む13~50μgの抗原の混合物で腹腔内(i.p.)で免疫化した。対照免疫(CI)マウスには、PBS及びCpG-ODN1826(50μg/マウス)を与えた。天然ビオチン化マウスインスリンは、BioEagleから購入した。
実施例1~5に使用されたマウス
8~30週齢のC57BL/6マウス及びB細胞欠損マウスを、1×PBS中50μgのCpG-ODN1826(Biomers)を含む13~50μgの抗原の混合物で腹腔内(i.p.)で免疫化した。対照免疫(CI)マウスには、PBS及びCpG-ODN1826(50μg/マウス)を与えた。天然ビオチン化マウスインスリンは、BioEagleから購入した。
実施例6~9に使用されたマウス
8~15週齢のメスのC57BL/6マウス及びmb1マウス45に、1×PBS中10μgの抗原(cInsulin又はInsulin-bio:SAV)の混合物を腹腔内(i.p.)注射した。対照注射(CI)マウスには、100μL/マウスの総体積でPBSを与えた。動物実験は、ドイツのチュービンゲンの責任のある地域委員会での動物実験用ライセンス1484に準拠して行った。この研究で使用した全てのマウスは、特定の病原体のない条件下でウルム大学の動物施設内で飼育及び収容したか、又は6週齢でJackson社から入手した。全ての動物実験は、ドイツの法律のガイドラインに従って行われ、ウルム大学の動物ケア及び委員会、並びに地方自治体によって承認された。
8~15週齢のメスのC57BL/6マウス及びmb1マウス45に、1×PBS中10μgの抗原(cInsulin又はInsulin-bio:SAV)の混合物を腹腔内(i.p.)注射した。対照注射(CI)マウスには、100μL/マウスの総体積でPBSを与えた。動物実験は、ドイツのチュービンゲンの責任のある地域委員会での動物実験用ライセンス1484に準拠して行った。この研究で使用した全てのマウスは、特定の病原体のない条件下でウルム大学の動物施設内で飼育及び収容したか、又は6週齢でJackson社から入手した。全ての動物実験は、ドイツの法律のガイドラインに従って行われ、ウルム大学の動物ケア及び委員会、並びに地方自治体によって承認された。
ペプチド
C-Peptideペプチド(RoyoBiotech、上海)、インスリン及びウイルス由来ペプチド(配列番号43;配列番号44)(Peptides&Elephants、ベルリン)を、純水、1%のDMSO又は1%のジメチルホルムアミド(DMF)中のそれらの水溶性に従って溶解した。ウイルス由来ペプチド(配列番号43;配列番号44)を、それぞれビオチン又はKLHに結合させた。1mgの量を購入し、1mlの体積に溶解した。10~50μgのKLH結合ペプチドを、腹腔内注射を介したマウスの免疫化に使用した。キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)へのペプチドの共有結合のために、N末端システインを添加した。ペプチドのストレプトアビジン(SAV、ThermoScientific)への結合は、N末端へのビオチンの添加によって行われた。C末端は、より良い取り扱いのためにOH基を残した。
C-Peptideペプチド(RoyoBiotech、上海)、インスリン及びウイルス由来ペプチド(配列番号43;配列番号44)(Peptides&Elephants、ベルリン)を、純水、1%のDMSO又は1%のジメチルホルムアミド(DMF)中のそれらの水溶性に従って溶解した。ウイルス由来ペプチド(配列番号43;配列番号44)を、それぞれビオチン又はKLHに結合させた。1mgの量を購入し、1mlの体積に溶解した。10~50μgのKLH結合ペプチドを、腹腔内注射を介したマウスの免疫化に使用した。キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)へのペプチドの共有結合のために、N末端システインを添加した。ペプチドのストレプトアビジン(SAV、ThermoScientific)への結合は、N末端へのビオチンの添加によって行われた。C末端は、より良い取り扱いのためにOH基を残した。
天然インスリン及びInsAペプチドの架橋。
天然ヒトインスリン(Merck)を、PBS中で1mg/mLに予め希釈した。化学チオール架橋を、10μg/mLの1,2-フェニレン-ビス-マレイミド(Santa Cruz、13118-04-2)を用いて行い、その後、10kDのカットオフスピンカラム(Abcam、ab93349)を用いて除去した。精製されたインスリン複合体(cInsulin)を、100μLの総体積で10μgのマウス当たりの腹腔内注射に使用した。
天然ヒトインスリン(Merck)を、PBS中で1mg/mLに予め希釈した。化学チオール架橋を、10μg/mLの1,2-フェニレン-ビス-マレイミド(Santa Cruz、13118-04-2)を用いて行い、その後、10kDのカットオフスピンカラム(Abcam、ab93349)を用いて除去した。精製されたインスリン複合体(cInsulin)を、100μLの総体積で10μgのマウス当たりの腹腔内注射に使用した。
フローサイトメトリー
細胞懸濁液を、ポリクローナルラットIgG-UNLB(2,4G2;BD)でブロックし、標準的なプロトコルに従って染色した。ビオチンコンジュゲートペプチド/抗体を、ストレプトアビジンQdot605(Molecular Probes;Invitrogen)を使用して検出した。生存細胞を、固定可能生存染料eFluor780(eBioscienc)の使用によって死細胞から区別した。細胞をCato II Flow Cytometer(BD)で取得した。特に明記しない場合、プロット内の数字は、それぞれのゲート内のパーセンテージを示し、ヒストグラムプロット内の数字は、平均蛍光強度(MFI)を示す。
細胞懸濁液を、ポリクローナルラットIgG-UNLB(2,4G2;BD)でブロックし、標準的なプロトコルに従って染色した。ビオチンコンジュゲートペプチド/抗体を、ストレプトアビジンQdot605(Molecular Probes;Invitrogen)を使用して検出した。生存細胞を、固定可能生存染料eFluor780(eBioscienc)の使用によって死細胞から区別した。細胞をCato II Flow Cytometer(BD)で取得した。特に明記しない場合、プロット内の数字は、それぞれのゲート内のパーセンテージを示し、ヒストグラムプロット内の数字は、平均蛍光強度(MFI)を示す。
酵素連結免疫吸着アッセイ(ELISA)
96ウェルプレート(Nunc、Maxisorp)を、10μg/mLの天然インスリン(Sigma-Aldrich、Cat.91077C)、ストレプトアビジン(ThermoScientific、Cat.21125)、又は仔牛胸腺DNA(ThermoScientific、Cat.15633019)、又は抗IgM、抗IgG抗体(SouthernBiotech)でコーティングした。SAVプレートのビオチン化ペプチド(2.5μg/mL)をロードし、遮断を1%BSA遮断緩衝液(Thermo Fisher)中で行った。1:3 IgM又はIgG抗体(SouthernBiotech)の連続希釈を標準として使用した。任意の単位(AU)として示される相対濃度を、それぞれ、アルカリホスファターゼ(AP)標識抗IgM/抗IgG(SouthernBiotech)による検出によって決定した。ジエタノールアミン緩衝液中のp-ニトロフェニルリン酸(pNPP;Genaxxon)を添加し、Multiskan FC ELISAプレートリーダー(Thermo Scientific)を使用して405nmでデータを取得した。全ての試料を2回測定した。
96ウェルプレート(Nunc、Maxisorp)を、10μg/mLの天然インスリン(Sigma-Aldrich、Cat.91077C)、ストレプトアビジン(ThermoScientific、Cat.21125)、又は仔牛胸腺DNA(ThermoScientific、Cat.15633019)、又は抗IgM、抗IgG抗体(SouthernBiotech)でコーティングした。SAVプレートのビオチン化ペプチド(2.5μg/mL)をロードし、遮断を1%BSA遮断緩衝液(Thermo Fisher)中で行った。1:3 IgM又はIgG抗体(SouthernBiotech)の連続希釈を標準として使用した。任意の単位(AU)として示される相対濃度を、それぞれ、アルカリホスファターゼ(AP)標識抗IgM/抗IgG(SouthernBiotech)による検出によって決定した。ジエタノールアミン緩衝液中のp-ニトロフェニルリン酸(pNPP;Genaxxon)を添加し、Multiskan FC ELISAプレートリーダー(Thermo Scientific)を使用して405nmでデータを取得した。全ての試料を2回測定した。
親和性成熟の分析のために、ペプチド(1)又はペプチド(4)のいずれかでコーティングされたプレートからの結果を、ペプチド(1)をペプチド(4)で除すことによって計算した。したがって、結果は、図中の相対単位[RU]として記載された。
酵素連結免疫スポットアッセイ(ELISpot)
総脾細胞を、300.000細胞/ウェルで3回測定した。ELISpotプレートを、天然インスリン(Sigma-Aldrich、Cat.91077C)、C-ペプチド(RoyoBiotech)のいずれかでプレコーティングした。細胞を37℃で12~24時間インキュベートした後、抗IgM-bio:SAV-AP又は抗IgG-bio:SAV-AP(Mabtech)により抗原特異的IgM又はIgGを検出した。プレート及び抗体濃度の取り扱いは、製造業者の推奨に従って行った。
総脾細胞を、300.000細胞/ウェルで3回測定した。ELISpotプレートを、天然インスリン(Sigma-Aldrich、Cat.91077C)、C-ペプチド(RoyoBiotech)のいずれかでプレコーティングした。細胞を37℃で12~24時間インキュベートした後、抗IgM-bio:SAV-AP又は抗IgG-bio:SAV-AP(Mabtech)により抗原特異的IgM又はIgGを検出した。プレート及び抗体濃度の取り扱いは、製造業者の推奨に従って行った。
HEp-2スライド及び蛍光顕微鏡法
HEp-2スライド(EUROIMMUN、F191108VA)を使用して、核抗原(ANA)に対する血清IgMの反応性を評価した。免疫化後7日目及び85日目のインスリン-A-ペプチド免疫化マウスの血清を、等濃度のIgM(両方の免疫化試料中約300ng/mLの抗インスリン-IgM)に希釈し、HEp-2スライド上に適用した。抗IgM-FITC(eBioscience、Cat.11-5790-81)をANA-IgMの検出に使用した。染色したHEp-2スライドを、蛍光顕微鏡Axioskop2(Zeiss)及びDMi8ソフトウェア(Leica)を使用して分析した。
HEp-2スライド(EUROIMMUN、F191108VA)を使用して、核抗原(ANA)に対する血清IgMの反応性を評価した。免疫化後7日目及び85日目のインスリン-A-ペプチド免疫化マウスの血清を、等濃度のIgM(両方の免疫化試料中約300ng/mLの抗インスリン-IgM)に希釈し、HEp-2スライド上に適用した。抗IgM-FITC(eBioscience、Cat.11-5790-81)をANA-IgMの検出に使用した。染色したHEp-2スライドを、蛍光顕微鏡Axioskop2(Zeiss)及びDMi8ソフトウェア(Leica)を使用して分析した。
グルコースレベルの監視
尿グルコースレベルの評価は、Combur 10 M試験ストライプ(Roche Diagnostics、Mannheim)を使用して行った。毎日のマウス処理中に無菌ストライプを使用し、テスト後に表示された色をmmol/Lのグルコースレベルの製造業者の標準と比較した。AccuCheck(Roche Diagnostics、Mannheim)血中グルコースモニタを使用して、マウスの血中グルコースレベルを測定した。血液を、任意給餌されたマウスの尾静脈から採取し、無菌試験ストライプに移した。グルコースレベルを、群当たりの各マウスについて、図に示される日にmmol/Lで測定した。対照免疫化は、同腹仔を用いて行い、1日の同様の時間に測定した。
尿グルコースレベルの評価は、Combur 10 M試験ストライプ(Roche Diagnostics、Mannheim)を使用して行った。毎日のマウス処理中に無菌ストライプを使用し、テスト後に表示された色をmmol/Lのグルコースレベルの製造業者の標準と比較した。AccuCheck(Roche Diagnostics、Mannheim)血中グルコースモニタを使用して、マウスの血中グルコースレベルを測定した。血液を、任意給餌されたマウスの尾静脈から採取し、無菌試験ストライプに移した。グルコースレベルを、群当たりの各マウスについて、図に示される日にmmol/Lで測定した。対照免疫化は、同腹仔を用いて行い、1日の同様の時間に測定した。
SDS page、クーマシー及びウェスタンブロット。
屠殺直後に臓器を採取し、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤(50mM TrisHCl、pH7.4、1% NP-40、0.25%デオキシコール酸ナトリウム、150mM NaCl、1mM EDTA(pH8)、1mMオルトバナジン酸ナトリウム、1mM NaF、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma-Aldrich)を含有するRIPA緩衝液中で溶解させた。試料を10~20%SDS-ポリアクリルアミドゲルで分離し、PVDF膜(Millipore)上でブロットするか、又はクーマシー(クーマシーブリリアントブルーR-250、ThermoFisher)で45分間インキュベートし、続いて脱染色した。続いて、膜を5%BSA PBS中で室温で1時間、一定の攪拌でブロックした。一次抗体を5% BSA PBS(BIOMOL Research Laboratories)中で希釈した。二次抗体を5%BSA PBS中で希釈した。膜の開発及びデータの記録は、光学系Fusion SL(Vilber)を用いて行った。
屠殺直後に臓器を採取し、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤(50mM TrisHCl、pH7.4、1% NP-40、0.25%デオキシコール酸ナトリウム、150mM NaCl、1mM EDTA(pH8)、1mMオルトバナジン酸ナトリウム、1mM NaF、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma-Aldrich)を含有するRIPA緩衝液中で溶解させた。試料を10~20%SDS-ポリアクリルアミドゲルで分離し、PVDF膜(Millipore)上でブロットするか、又はクーマシー(クーマシーブリリアントブルーR-250、ThermoFisher)で45分間インキュベートし、続いて脱染色した。続いて、膜を5%BSA PBS中で室温で1時間、一定の攪拌でブロックした。一次抗体を5% BSA PBS(BIOMOL Research Laboratories)中で希釈した。二次抗体を5%BSA PBS中で希釈した。膜の開発及びデータの記録は、光学系Fusion SL(Vilber)を用いて行った。
総血清免疫グロブリンのプルダウン
安楽死の直後に、免疫化されたマウスからの血清を採取し、IgM又はIgGのいずれかを精製した。抗体に結合した抗原の除去は、血清の繰り返しの凍結融解サイクル及び溶出中のpHシフトによって達成した52。IgGタンパク質Gについては、セファロースビーズ(Thermo Fisher)を製造業者のプロトコルに従って使用し、1×PBS中の10倍の試料体積中で一晩透析した。IgMについては、HiTrap IgMカラム(GE Healthcare、Sigma-Aldrich)を製造業者のプロトコルに従って使用し、10倍の試料体積1×PBS中で一晩透析した。単離した免疫グロブリンの品質チェックは、SDS page及びクーマシーにより対処し、インスリン特異的免疫グロブリンの量をELISAにより決定した。最後に、20~50μg(1~10μgのインスリン特異的Ig)を静脈内に注射した。
安楽死の直後に、免疫化されたマウスからの血清を採取し、IgM又はIgGのいずれかを精製した。抗体に結合した抗原の除去は、血清の繰り返しの凍結融解サイクル及び溶出中のpHシフトによって達成した52。IgGタンパク質Gについては、セファロースビーズ(Thermo Fisher)を製造業者のプロトコルに従って使用し、1×PBS中の10倍の試料体積中で一晩透析した。IgMについては、HiTrap IgMカラム(GE Healthcare、Sigma-Aldrich)を製造業者のプロトコルに従って使用し、10倍の試料体積1×PBS中で一晩透析した。単離した免疫グロブリンの品質チェックは、SDS page及びクーマシーにより対処し、インスリン特異的免疫グロブリンの量をELISAにより決定した。最後に、20~50μg(1~10μgのインスリン特異的Ig)を静脈内に注射した。
インスリン特異的血清免疫グロブリンの単離
安楽死の直後に、InsA及び対照免疫化マウス由来の血清を採取し、インスリン特異的免疫グロブリン単離のために調製した。ストレプトアビジンビーズカラム(Thermo-Scientific、Cat.21115)に、10μgのバイオ-インスリン(BioEagle)をロードした。血清を室温で90分間インキュベートして、インスリン特異的抗体のビーズへの結合を確実にした。インスリン抗体の単離は、製造業者の溶出及び中和溶液を使用してpHシフトによって行われた。単離した免疫グロブリンの品質を、抗IgM重鎖(Thermo-Scientific、Cat.62-6820)及び抗IgG重鎖(Cell Signaling Technologies、Cat.7076)抗体を使用したクーマシー及びウェスタンブロット分析によって調べた。更なるインビボ実験のために、単離された抗体を透析した。
安楽死の直後に、InsA及び対照免疫化マウス由来の血清を採取し、インスリン特異的免疫グロブリン単離のために調製した。ストレプトアビジンビーズカラム(Thermo-Scientific、Cat.21115)に、10μgのバイオ-インスリン(BioEagle)をロードした。血清を室温で90分間インキュベートして、インスリン特異的抗体のビーズへの結合を確実にした。インスリン抗体の単離は、製造業者の溶出及び中和溶液を使用してpHシフトによって行われた。単離した免疫グロブリンの品質を、抗IgM重鎖(Thermo-Scientific、Cat.62-6820)及び抗IgG重鎖(Cell Signaling Technologies、Cat.7076)抗体を使用したクーマシー及びウェスタンブロット分析によって調べた。更なるインビボ実験のために、単離された抗体を透析した。
バイオ層干渉法(BLI)
干渉性アッセイ(BLItzデバイス、ForteBio)を使用して、タンパク質-タンパク質相互作用の親和性を決定した[61]。ここでは、インスリン特異的IgM(インスリン特異的免疫グロブリンの単離を参照)及びインスリン-バイオ(ThermoFisher)を標的として使用した。標的をストレプトアビジンバイオセンサ(ForteBio)にロードした。IgMのインスリンへの結合親和性をnmで取得した。続いて、計算された親和性値(Ka)を使用して解離定数(Kd)を決定した。Kd=1/Ka。以下のプロトコルを使用した:30秒のベースライン、30秒のローディング、30秒のベースライン、240秒の会合、120秒の解離。試料、標的、及びプローブの緩衝には、製造者の試料緩衝液(ForteBio)を使用した。
干渉性アッセイ(BLItzデバイス、ForteBio)を使用して、タンパク質-タンパク質相互作用の親和性を決定した[61]。ここでは、インスリン特異的IgM(インスリン特異的免疫グロブリンの単離を参照)及びインスリン-バイオ(ThermoFisher)を標的として使用した。標的をストレプトアビジンバイオセンサ(ForteBio)にロードした。IgMのインスリンへの結合親和性をnmで取得した。続いて、計算された親和性値(Ka)を使用して解離定数(Kd)を決定した。Kd=1/Ka。以下のプロトコルを使用した:30秒のベースライン、30秒のローディング、30秒のベースライン、240秒の会合、120秒の解離。試料、標的、及びプローブの緩衝には、製造者の試料緩衝液(ForteBio)を使用した。
ワイヤ吊り下げ試験
直線ワイヤ吊り下げ試験は、マウスの運動強度及び機能を評価するために使用される。個々のマウスをケージの上の36cmの高さの水平ワイヤ上に置き、続いてマウスは、その足と筋力を使用してワイヤ上に留まろうとした。各マウスがワイヤ上に留まる時間(秒)での能力を記録した。最大持続時間を240秒に設定した。各マウスは、試験を3回連続して受けた。測定データから平均値を算出した。血中グルコース値を試験前後に測定した。
直線ワイヤ吊り下げ試験は、マウスの運動強度及び機能を評価するために使用される。個々のマウスをケージの上の36cmの高さの水平ワイヤ上に置き、続いてマウスは、その足と筋力を使用してワイヤ上に留まろうとした。各マウスがワイヤ上に留まる時間(秒)での能力を記録した。最大持続時間を240秒に設定した。各マウスは、試験を3回連続して受けた。測定データから平均値を算出した。血中グルコース値を試験前後に測定した。
統計分析
グラフを作成し、GraphPad Prism(バージョン6.0h)ソフトウェアを使用して統計分析を行った。個々の反復又はマウスの数(n)は、図又は図の凡例内に記載されている。P値は、それぞれの図の凡例に記載されている試験によって計算された。ウェルチ補正を用いたスチューデントt検定を使用して、1つの実験内の2つの群を比較した。P値>0.05は統計的に有意とみなされた(n.s.=有意でない;*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001、****p<0.0001)。
グラフを作成し、GraphPad Prism(バージョン6.0h)ソフトウェアを使用して統計分析を行った。個々の反復又はマウスの数(n)は、図又は図の凡例内に記載されている。P値は、それぞれの図の凡例に記載されている試験によって計算された。ウェルチ補正を用いたスチューデントt検定を使用して、1つの実験内の2つの群を比較した。P値>0.05は統計的に有意とみなされた(n.s.=有意でない;*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001、****p<0.0001)。
参考文献
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Claims (18)
- オリゴマー抗インスリン抗体であって、
(i)好ましくは表面プラズモン共鳴によって測定される、Kd<5×10-7のインスリン及び/若しくはプロインスリンに対する親和性を有する;かつ/又は
(ii)インスリン及び/若しくはプロインスリンに対して単一特異性である、オリゴマー抗インスリン抗体。 - 前記オリゴマー抗インスリン抗体が、IgMアイソタイプの抗インスリン抗体である、請求項1に記載のオリゴマー抗インスリン抗体。
- 前記オリゴマー抗インスリン抗体が、キメラ、ヒト化、又はヒトである、請求項1又は2に記載のオリゴマー抗インスリン抗体。
- 免疫グロブリンが、
a)配列番号2に定義されるCDR1、配列番号3に定義されるCDR2、及び配列番号4に定義されるCDR3を含む可変重鎖(VH)、並びに配列番号6に定義されるCDR1、配列DASで定義されるCDR2、及び配列番号7に定義されるCDR3を含む可変軽鎖(VL)、
b)配列番号9に定義されるCDR1、配列番号10に定義されるCDR2、及び配列番号11に定義されるCDR3を含む可変重鎖(VH)、並びに配列番号13に定義されるCDR1、配列GASで定義されるCDR2、及び配列番号14に定義されるCDR3を含む可変軽鎖(VL)、又は
c)配列番号16に定義されるCDR1、配列番号17に定義されるCDR2、及び配列番号18に定義されるCDR3を含む可変重鎖(VH)、並びに配列番号20に定義されるCDR1、配列DASで定義されるCDR2、及び配列番号21に定義されるCDR3を含む可変軽鎖(VL)
を含む、請求項1~3に記載のオリゴマー抗インスリン抗体。 - 前記オリゴマー抗インスリン抗体が、
a)配列番号1のアミノ酸配列、若しくは配列番号1と少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む可変重鎖(VH)配列、及び配列番号4のアミノ酸配列、若しくは配列番号4と少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む可変軽鎖(VL)配列を含むか、
b)配列番号8のアミノ酸配列、若しくは配列番号8と少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む可変重鎖(VH)配列、及び配列番号12のアミノ酸配列、若しくは配列番号12と少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む可変軽鎖(VL)配列を含むか、又は
c)配列番号15のアミノ酸配列、若しくは配列番号15と少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む可変重鎖(VH)配列、及び配列番号19のアミノ酸配列、若しくは配列番号19と少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む可変軽鎖(VL)配列を含む、
請求項4に記載のオリゴマー抗インスリン抗体。 - 請求項1~5のいずれか一項に記載のオリゴマー抗インスリン抗体をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項6に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
- 請求項7に記載の宿主細胞を培養することを含む、オリゴマー抗インスリン抗体を産生するための方法。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載のオリゴマー抗インスリン抗体、請求項6に記載のポリヌクレオチド、請求項7に記載の宿主細胞、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
- 更なる治療剤を含む、請求項9に記載の医薬組成物。
- 治療に使用するための、請求項1~5のいずれか一項に記載のオリゴマー抗インスリン抗体、請求項6に記載のポリヌクレオチド、請求項7に記載の宿主細胞、又は請求項9~10に記載の医薬組成物。
- インスリン関連疾患又は障害の治療に使用するための、請求項1~5のいずれか一項に記載のオリゴマー抗インスリン抗体、請求項6に記載のポリヌクレオチド、請求項7に記載の宿主細胞、又は請求項9~10に記載の医薬組成物。
- インスリン関連疾患又は障害を診断及び/又は予測する方法であって、
(i)試料からのプロインスリン及び/又はインスリンに対する抗インスリンIgM抗体の結合の親和性を決定するステップであって、
前記試料が、対象から得られたものであり、前記対象が、インスリン関連疾患若しくは障害を有すると診断されるか、又はそのリスクがある、ステップと、
(ii)ステップ(i)で決定されたレベルを基準値と比較するステップと、
(iii)ステップ(ii)で行われた比較に基づいて、前記対象におけるインスリン関連疾患又は障害を診断及び/又は予測するステップであって、好ましくは、プロインスリン及び/又はインスリンに対する抗インスリンIgM抗体の結合のより低い親和性が、インスリン関連疾患又は障害のより高いリスクを示す、ステップと、を含む方法。 - 対象がインスリン関連疾患又は障害の治療に感受性であるかどうかを決定するための方法であって、
(i)試料からのプロインスリン及び/又はインスリンに対する抗インスリンIgM抗体の結合の親和性を決定するステップであって、前記試料が対象から得られたものであり、前記対象が、インスリン関連疾患又は障害を有すると診断されるか、又はそのリスクがある、ステップと、
(ii)ステップ(i)で決定されたレベルを基準値と比較するステップと、
(iii)前記対象がインスリン関連疾患又は障害の前記治療に感受性であるかどうかを決定するステップであって、好ましくは、プロインスリン及び/又はインスリンに対する抗インスリンIgM抗体の結合のより低い親和性が、インスリン関連疾患又は障害の治療に対するより高い感受性を示す、ステップと、を含む方法。 - 前記インスリン関連疾患又は障害が、膵臓損傷、1型糖尿病、2型糖尿病、外因性インスリン抗体症候群、妊娠性糖尿病、及び血糖異常の群から選択される、請求項12に記載の使用のためのオリゴマー抗インスリン抗体、請求項12に記載の使用のためのポリヌクレオチド、又は請求項12に記載の使用のための宿主細胞、又は請求項12に記載の使用のための医薬組成物、請求項13若しくは14に記載の方法。
- 前記血糖異常が、膵臓損傷、1型糖尿病、2型糖尿病、外因性インスリン抗体症候群、及び妊娠糖尿病の群から選択されるインスリン関連疾患又は障害を有する患者における血糖異常である、請求項15に記載の使用のためのオリゴマー抗インスリン抗体、請求項12に記載の使用のためのポリヌクレオチド、又は請求項15に記載の使用のための宿主細胞、又は請求項15に記載の使用のための医薬組成物、請求項15に記載の方法。
- 少なくとも1つの一価インスリン粒子及び少なくとも1つの多価インスリン粒子の混合物で哺乳動物を免疫化することを含む、好ましくはIgMアイソタイプのオリゴマー抗インスリン及び/又は抗プロインスリン抗体を産生するための方法。
- インスリン関連疾患又は障害の治療及び/又は予防のための方法であって、治療有効量の、請求項1~5のいずれか一項に記載のオリゴマー抗インスリン抗体、請求項6に記載のポリヌクレオチド、請求項7に記載の宿主細胞、又は請求項9~10に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
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