BRPI0706840A2 - anticorpos anti- ephb4 isolado polinucleotìdeo, vetor, célula hospedeira, método para produção de um anticorpo anti ephb4, método para produção de um imunoconjugado anti ephb4, método para a detecção de ephb4, método para diagnosticar um distúrbio composição, método para inibir a angiogênese, método para tratar um cáncer, tumor e/ou distúrbio da proliferação celular e uso de um anticorpo - Google Patents

anticorpos anti- ephb4 isolado polinucleotìdeo, vetor, célula hospedeira, método para produção de um anticorpo anti ephb4, método para produção de um imunoconjugado anti ephb4, método para a detecção de ephb4, método para diagnosticar um distúrbio composição, método para inibir a angiogênese, método para tratar um cáncer, tumor e/ou distúrbio da proliferação celular e uso de um anticorpo Download PDF

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Abstract

ANTICORPOS ANTI-EphB4 ISOLADO, POLINUCLEOTìDEO, VETOR, CéLULA HOSPEDEIRA, MéTODO PARA PRODUçãO DE UM ANTICORPO ANTI-EphB4, MéTODO PARA PRODUçãO DE UM IMUNOCONJUGADO ANTI-EphB4, MéTODO PARA A DETECçãO DE EphB4, MéTODO PARA DIAGNOSTICAR UM DISTúRBIO, COMPOSIçãO, MéTODO PARA INIBIR A ANGIOGêNESE, MéTODO PARA TRATAR UM CáNCER, TUMOR E/OU DISTúRBIO DA PROLIFERAçãO CELULAR E USO DE UM ANTICORPO. A invenção fornece anticorpos anti-EphB4, e composições compreendendo métodos de uso desses anticorpos.

Description

"ANTICORPOS ANTI-EphB4 ISOLADO, POLINUCLEOTÍDEO, VETOR,CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE UM ANTICORPOANTI-EphB4, MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE UM IMUNOCONJUGADOANTI-EphB4, MÉTODO PARA A DETECÇÃO DE EphB4, MÉTODO PARADIAGNOSTICAR UM DISTÚRBIO, COMPOSIÇÃO, MÉTODO PARA INIBIR AANGIOGÊNESE, MÉTODO PARA TRATAR UM CÂNCER, TUMOR E/OUDISTÚRBIO DA PROLIFERAÇÃO CELULAR E USO DE UM ANTICORPO"
Referências Cruzadas Para Os Pedidos Relacionados
O presente pedido reivindica a prioridade sob 35 U.S.C. § 119(e)ao pedido provisório US n° 60/756.889, depositado em 5 de Janeiro de 2006 eo pedido provisório US n° 60/760.892 depositado em 20 de Janeiro de 2006,sendo que todo o conteúdo dos mesmos é incorporado ao presente pelareferência.
Campo Da Invenção
A presente invenção refere-se de modo geral ao campo dabiologia molecular. Mais especificamente, a invenção está relacionada aanticorpos anti-EphB4, e o uso do mesmo.
Antecedentes Da Invenção
Desenvolvimento de um suprimento vascular é um requisitofundamental para muitos processos fisiológicos e patológicos. O crescimentoativo de tecidos como em embriões e tumores exigem um suprimentoadequado do sangue. Eles satisfazem esta necessidade pela produção de pró-fatores angiogênicos, que promovem a formação de novos vasos sangüíneospor um processo denominado angiogênese. A formação do tubo vascular é umevento biológico complexo, mas ordenado envolvendo todos ou muitos dosseguintes passos: a) as células endoteliais (ECS) proliferam-se de ECSexistentes ou se diferenciam a partir de células progenitoras; b) as ECS migrame se unem para formar estruturas parecidas com um cordão; c) Os cordõesvasculares, em seguida, são submetidos a tubulogênese para formar vasoscom um lúmen central; d) cordões ou vasos existentes enviam germinaçõespara fora para formar vasos secundários; e) o plexo vascular primitivo sofreainda um remodelamento e transformação; e f) células peri-endoteliais sãorecrutadas para envolver os tubos endoteliais, fornecendo alimentos emodulando funções para os vasos, tais células incluem pericitos para ospequenos capilares, células musculares lisas para vasos maiores, e células domiocárdio no coração. Hanahan, Science 277:48-50 (1997); Hogan & Kolodziej,Nat. Rev. Genet. 3:513-23 (2002); Lubarsky & Krasnow, Cell 112:19-28 (2003).
Está atualmente bem estabelecido que angiogênese esteja envolvida napatogênese de uma variedade de doenças. Estas incluem tumores sólidos emetástase, aterosclerose, fibroplasia retrolental, hemangiomas, inflamaçãocrônica, doenças neovasculares intra-oculares tal como retinopatia proliferativa,por exemplo, retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade(AMD), glaucoma neovascular, imuno rejeição do transplante de córnea e deoutros tecidos, artrite reumatóide e psoríase. Folkman et ai, J. Bioi Chem.267:10931-34 (1992); Klagsbrun et ai, Annu. Rev. Physioi 53:217-39 (1991); eGarnerA., "Vascular diseases", In: Pathobiology of Ocular Disease. A DynamicApproach, A. Garner, Klintworth GK1 2 a Edição (Mareei Dekker, NY, 1994),págs 1625-1710.
No caso de crescimento tumoral, a angiogênese parece sercrucial para a transição de hiperplasia para neoplasia, e por forneceralimentação para o crescimento e metástase do tumor. Folkman et ai, Nature339:58 (1989). A neovascularização permite com que as células tumorais paraadquiram um crescimento um crescimento vantajoso e autonomia proliferativaem comparação com células normais. Um tumor normalmente começa comouma única célula aberrante que pode proliferar para o tamanho de apenaspoucos milímetros cúbicos, devido à distância dos leitos capilares disponíveis,e ele pode permanecer "adormecido", sem haver crescimento e disseminaçãopor um longo período de tempo. Algumas células tumorais mudam então para ofenótipo angiogênico para ativar células endoteliais, que se proliferam emadurecem novos vasos capilares. Estes vasos sangüíneos recém-formadosnão só permitem o crescimento contínuo do tumor primário, mas tambémpermitem a disseminação e recolonização de células tumorais metastáticas.Assim, foi observada uma correlação entre a densidade de microvasos emcortes de tumor e a sobrevivência em pacientes com câncer de mama, bemcomo em vários outros tumores. Weidner et ai, N. Engi J. Med. 324:1-6(1991); Horak et a/., Lancet 340:1120-24 (1992); Macchiarini et ai, Lancet340:145-46 (1992). Os mecanismos precisos que controlam o interruptorangiogênico não é bem compreendido, mas acredita-se que aneovascularização da massa tumoral resultada a partir do balanço de umamultidão de estimuladores e inibidores da angiogênese (Folkman, Λ/aí. Med.1(1):27-31 (1995)).
O processo de desenvolvimento vascular é estreitamenteregulado. Até a data, um número significativo de moléculas, principalmentefatores secretados produzidos por células circulantes, foram demonstrados porregular a diferenciação, proliferação, migração e junção das ECs em estruturassimilares a cordão. Por exemplo, fator de crescimento endotelial vascular(VEGF), foi identificado como o fator chave envolvido na estimulação daangiogênese e na indução da permeabilidade vascular. Ferrara et ai, Endocr.Rev. 18:4-25 (1997). A conclusão de que a perda de até mesmo um único alelodo VEGF resulta na Ietalidade embrionária e aponta para um papelinsubstituível desempenhado por este fator no desenvolvimento e nadiferenciação do sistema vascular. Além disso, o VEGF tem mostrado ser ummediador chave da neovascularização associada a tumores e distúrbios intra-oculares. Ferrara et ai, Endocr. Rev. Supra. O mRNA do VEGF está sobre-expresso na maioria dos tumores humanos examinados. Berkman et ai, J.Clin. Invest 91:153-59 (1993); Brown et al., Human Pathol. 26:86-91 (1995);Brown et al., Câncer Res. 53:4727-35 (1993); Mattern et al., Brit J Câncer .73:931-34 (1996); Dvorak et ai, Am. J. Pathol. 146:1029-39 (1995).
Além disso, os níveis de concentração de VEGF no fluido do olhoé altamente correlacionado com a presença ativa da proliferação de vasossangüíneos em pacientes com diabetes e outras retinopatias relacionadas coma isquemia. Aiello et al., N. Engi J. Med. 331:1480-87 (1994). Além disso,estudos têm demonstrado a localização de VEGF na membrana coróideneovascular em pacientes afetados pela AMD. Lopez et ai, Invest. Ophthalmol.Vis. Sei. 37:855-68 (1996).
Anticorpos anti-VEGF neutralizantes suprimem o crescimento deuma variedade de linhagens celular de tumores humanos em camundongosnude (Kim et al., Nature 362:841-44 (1993); Warren et ai, J. Clin. Invest.95:1789 - 97 (1995); Borgstrõm et al., CancerRes. 56:4032-39 (1996); Melnyket ai, Câncer Res. 56:921-24 (1996)) e também inibe angiogênese intra-ocularem modelos de distúrbios isquêmicos da retina (Adamis et ai, Arch.Ophthalmol. 114:66-71 (1996)). Por isso, os anticorpos monoclonais anti-VEGFou outros inibidores da ação do VEGF são candidatos promissores para otratamento de tumores e de vários distúrbios neovasculares intra-oculares.Esses anticorpos são descritos, por exemplo, no documento EP 817648,publicado 14 de janeiro de 1998, e nos documentos WO 98/45331 e WO98/45332, ambos publicados em 15 de outubro de 1998. Um anticorpo anti-VEGF, bevacizumab, foi aprovado pelo FDA para utilização em combinaçãocom a quimioterapia um esquema para tratar o câncer colorretal metastático(CRC). O bevacizumab está sendo investigado em muitos ensaios clínicos ecurso para o tratamento de várias indicações de câncer.
O receptor EphB4 ( "EphB4" ou "EphB4R") é um membro dafamília de receptores Eph1 que constitui a maior família de receptores detirosina quinase do genoma humano (revisado em Dodelet1 oncogene, 19:5614-5619, 2000). O receptor humano Eph tirosino quinase são categorizadospela identidade da seqüência em uma classe A e classe B com um Iigantecorrespondente tipo A e tipo B denominadas Efrinas. A sinalização podeocorrer de maneira a diante, no qual o receptor tirosina quinase é ativado peloligante, e de forma inversa, na qual os Iigantes transmembrana efrinaB sãoativados pela interação com os receptores. As interações do receptor Eph aoligante tem implicado em uma ampla gama de funções biológicas, incluindo aorientação do axônio, formação da borda do tecido, vasculogênese emotilidade celular (Kullander et al. Nat. Rev. Moi Cell. Biol., 3: 475-486, 2002 ;Cheng et al. Cytokine Growth FactorRev., 13: 75-85, 2002; Coulthard et ai Int.J. Dev. Bioi1 46: 375-384, 2002). O EphB4 se liga a Iigantes como efrina-B1,efrina-B2 e efrina-B3. O receptor EphB4 possuí uma região extracelular rica emmotivo cisteína estendendo sobre sua extremidade amino-terminal seguido pordois motivos fibronectina tipo II. Há um domínio intracelular que caracterizauma região quinase conservada e um domínio transmembrana.
Está claro que este âmbito continua a ser uma necessidade paraos agentes que possuem atributos clínicos que são ótimos para odesenvolvimento como agentes terapêuticos. A invenção descrita no presentesatisfaz essa necessidade e proporciona outros benefícios.
Todas as referências citadas no presente, incluindo pedidos depatente e publicações, são incorporadas pela referência em sua totalidade.
Descrição Resumida Da Invenção
A invenção é, em parte, baseada na identificação de umavariedade de agentes que se ligam a EphB4 (tal como imunoconjugados,anticorpos e fragmentos deste). O EphB4 se apresenta como um importante evantajoso alvo terapêutico e a invenção fornece composições e métodosbaseados na ligação ao EphB4. Os agentes que se ligam ao EphB4 dainvenção, como descrito no presente, fornecem importantes agentesterapêuticos e de diagnóstico para uso nas condições patológicas alvoassociadas a expressão e/ou atividade do EphB4 e via de sinalização doligante de EphB4. Assim, a invenção fornece métodos, composições, kits eartigos manufaturados relacionados a ligação de EphB4.
A presente invenção fornece um anticorpo que se liga (tal como,uma ligação específica) ao PphE4.
Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo isolado anti-EphB4, no qual o comprimento total do anticorpo na forma IgG se ligaespecificamente ao EphB4 humano a uma afinidade de ligação de cerca de 50pM ou melhor. Como está bem estabelecida no estado da arte, a afinidade deligação de um Iigante ao seu receptor pode ser determinado por qualquer umade uma variedade de experimentos, e expressa em termos de uma variedadede valores quantitativos. Assim sendo, em um exemplo de realização, a ligaçãoé expressa como valores Kd e reflete intrinsecamente a afinidade de ligação(por exemplo, com efeito de avidez minimizada). De modo geral, epreferencialmente, a afinidade de ligação é mesurada in vitro, seja em umacélula-livre ou em uma configuração associada. Qualquer um de uma série deensaios conhecida no estado da técnica, incluindo os aqui descritos, podem serutilizados para se obter medições da afinidade de ligação, incluindo, porexemplo, Biacore, radioimunoensaio (RIA) e ELISA.
Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que se liga aregião de ligação de um Iigante de EphB4. Em alguns exemplos de realização,o anticorpo isolado se liga um polipeptídeo composto, constituído por ouconstituídos essencialmente do domínio extracelular de EphB4.
Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-EphB4isolado que compete com o Iigante de EphB4 para a ligação ao EphB4.Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-EphB4isolado que inibe, reduz e/ou bloqueia a atividade do EphB4. Em algunsexemplos de realização, a autofosforilação do EphB4 é inibida, reduzida e/oubloqueada.
Em um aspecto, um anticorpo anti-EphB4 da invençãocompreende:
(a) pelo menos um, dois, três, quatro ou cinco seqüências deregiões hipervariáveis (HVR) selecionadas a partir do grupo constituído pelosseguintes elementos:
(i) HVR-L1 compreendendo a seqüência A1-A11, no qual, A1-A11é RASQDVSTAVA (SEQ ID No: 9).
(ii) HVR-L2 compreendendo a seqüência B1-B7, no qual, B1-B7 éSASFLYS (SEQ ID No: 11)
(iii) HVR-L3 compreendendo a seqüência C1-C9, no qual, C1-C9é QESTTTPPT (SEQ ID No: 15)
(iv) HVR-H1 compreendendo a seqüência D1-D10, no qual, D1-D10 é GFSISNYYLH (SEQ ID No: 2)
(v) HVR-H2 compreendendo a seqüência E1-E18, no qual, E1-E18 é GGIYLYGSSSEYADSVKG (SEQ ID No: 4) e;
(vi) HVR-H3 compreendendo a seqüência F1-F17, no qual, F1-F17 é ARGSGLRLGGLDYAMDY (SEQ ID No: 7); e
(b) pelo menos uma HVR variante, no qual a seqüência variantede HVR compreende a modificação de pelo menos um resíduo da seqüênciailustrado nas SEQ ID Nos :1-17.
Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que inclui um,dois, três, quatro, cinco ou seis HVRs, onde cada HVR compreende, ou éconstituído essencialmente por uma seqüência selecionada a partir do grupo,constituído pelas SEQ ID Nos: 1-17, e no qual a SEQ ID No: 9 ou 10correspondem a uma HVR-L1, SEQ ID No: 11 ou 12 correspondem a umaHVR-L2, SEQ ID No: 13, 14, 15, 16, ou 17 correspondem a uma HVR-L3, SEQID No: 1 ou 2 correspondem a uma HVR-H1, SEQ ID No: 3, 4, 5 ou 6correspondem a uma HVR-H2, e SEQ ID No: 7 ou 8 correspondem a umaHVR-H3.
Em um exemplo de realização, um anticorpo da invençãocompreende das HVR-L1, HVR-L2, L3-HVR, HVR-H1, HVR-H2, e HVR-H3, noqual cada, em ordem, compreende das SEQ ID NO: 9, 11, 13, 1, 3, 7.
Em um exemplo de realização, um anticorpo da invençãocompreende HVR-L1, HVR-L2, L3-HVR, HVR-H1, HVR-H2, e HVR-H3, no qualcada um, em ordem, compreende das SEQ ID NO: 10, 12, 14, 1, 3, 8.
Em um exemplo de realização, um anticorpo da invençãocompreende HVR-L1, HVR-L2, L3-HVR, HVR-H1, HVR-H2, e HVR-H3, no qualcada um, em ordem, compreende das SEQ ID NO: 9, 11, 15, 2, 4, 7.
Em um exemplo de realização, um anticorpo da invençãocompreende HVR-L1, HVR-L2, L3-HVR, HVR-H1, HVR-H2, e HVR-H3, no qualcada um, em ordem, compreende das SEQ ID NO: 9, 11, 16, 1, 5, 7.
Em um exemplo de realização, um anticorpo da invençãocompreende HVR-L1, HVR-L2, L3-HVR, HVR-H1, HVR-H2, e HVR-H3, no qualcada um, em ordem, compreende das SEQ ID NO: 9, 11, 17, 1, 6, 7.
O variante de HVRs em um anticorpo da invenção pode ter amodificação de um ou mais (tal como duas, três, quatro, cinco, ou mais)resíduos no interior da HVR.
Em um exemplo de realização, um variante de HVR-L1 compreende1-5 (1, 2, 3, 4 ou 5) substituições em qualquer combinação das seguintes posições:A6 (V ou S), A7 (S ou Ε), A8 (T ou I), A9 (A ou F) e A10 (V ou L).
Em um exemplo de realização, um variante de HVR-L2compreende 1-2 (1 ou 2) substituições em qualquer combinação das seguintesposições: B4 (F ou N) e B6 (Y ou E).
Em um exemplo de realização, um variante de HVR-L3compreende 1-7 (1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7) substituições em qualquer combinaçãodas seguintes posições: C2 (Q, E ou K), C3 (S ou T), C4 (Υ, Ν, Τ, E ou A), C5(T, A, ou Q), C6 (Τ, V, ou I), C8 (P, L, ou E), e C9 (T ou S).
Em um exemplo de realização, um variante de HVR-H1compreende 1-3 (1, 2 ou 3) substituições em qualquer combinação dasseguintes posições: D3 (T ou S), D6 (G ou N), e D9 (I ou L ).
Em um exemplo de realização, um variante de HVR-H2compreende 1-5 (1, 2, 3, 4 ou 5) substituições em qualquer combinação dasseguintes posições: E5 (P, ou L), E7 (S ou G), E8 ( G ou S), E10 (T, S, ou R) eE11 (D, Eou G).
Em um exemplo de realização, um variante de HVR-H3compreende 1 substituição nas seguintes posições: F3 (G ou S).
Letra(s) em parênteses seguinte a cada posição indica umasubstituição ilustrativa (isto é, troca) de aminoácido, como seria evidente para umespecialista no assunto, a adequação de outros aminoácidos como substituiçãoaminoácidos, no contexto aqui descrito pode ser avaliada utilizando técnicas derotina conhecidas no estado da técnica e/ou descrita no presente.
Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo quecompreende uma região HVR-H1, com a seqüência SEQ ID NO: 1 ou 2. Emum aspecto, a invenção fornece um anticorpo que compreende uma regiãoHVR-H2, com a seqüência SEQ ID NO: 3, 4, 5 ou 6. Em um aspecto, a invençãofornece um anticorpo que compreende uma região HVR-H3, com a seqüência SEQID NO: 7 ou 8. Em um exemplo de realização, a invenção fornece um anticorpo quecompreende uma região HVR-L1, com a seqüência SEQ ID NO: 9 ou 10. Em umexemplo de realização, a invenção fornece um anticorpo que compreende umaregião HVR-L2, com a seqüência SEQ ID No: 11 ou 12. Em um exemplo derealização, a invenção fornece um anticorpo que compreende uma região HVR-L3,com a seqüência SEQ ID No: 13, 14,15,16, ou 17.
Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo incluindo pelopelo menos dois, três ou todas dos seguintes:
(i) uma seqüência HVR-H1 compreendendo a seqüência SEQ
(ii) uma seqüência HVR-H2 compreendendo a seqüência SEQ
(iii) uma seqüência HVR-H3 compreendendo a seqüência SEQ
Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo incluindo pelopelo menos dois, três ou todas das seguintes:
(i) uma seqüência HVR-L1 compreendendo a seqüência SEQ
(ii) uma seqüência HVR-L2 compreendendo a seqüência SEQ
(iii) uma seqüência HVR-L3 compreendendo a seqüência SEQ
As seqüências de aminoácidos SEQ ID Nos :1-17 são numeradoscom relação a HVR individual (ou seja, H1, H2 e H3), como indicado na Figura1, a numeração a ser coerente com o sistema de numeração de Kabat comodescrito abaixo.
Em um aspecto, a invenção fornece anticorpos compreendendoas seqüências HVR de cadeias pesadas, conforme ilustrado na Figura 1.
Em um aspecto, a invenção fornece anticorpos compreendendoas seqüências HVR de cadeias leves, conforme ilustrado na Figura 1.
Alguns exemplos de realizações dos anticorpos da invençãocompreendem um domínio variável de cadeia leve do anticorpo 4D5
menos um,ID No: 2;ID No: 4ID No: 7.menos um,ID No: 9;ID No: 11;ID No: 15.humanizado (huMAb4D5-8) (HERCEPTIN Genentech, Inc., São Francisco,CA1 EUA) (também referido na Patente US 6.407.213 e Lee etal., J. Mol. Bioi(2004), 340 (5): 1073-93), conforme ilustrado na SEQ ID No: 18 abaixo.1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg ValThr Ile Thr Cys Arq Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln GlnLys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tvr Ser GlyVal Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile SerSer Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tvr Thr Thr ProPro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107 (SEQ ID NO: 18)(resíduos do HVR estão sublinhados)
Em uma realização, a seqüência da cadeia leve do domíniovariável huMAb4D5-8 é modificada em uma ou mais das posições 30, 66 e 91(Asn, Arg e His como indicado em negrito/itálico acima, respectivamente). Emuma realização, a seuqência huMAb4D5-8 modificada compreende Ser naposição 30, Gly na posição 66 e/ou Ser na posição 91. Desse modo, em umarealização, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável decadeia leve que compreende a seqüência descrita na SEQ ID NO:52 abaixo:1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg ValThr Ile Thr Cys Arq Ala Ser Gln Asp Val SerThr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln LysPro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tvr Ser Gly ValPro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser SerLeu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tvr Thr Thr Pro ProThr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107 (SEQ ID NO: 52) (resíduos doHVR estão sublinhados)
Resíduos substituídos com respeito ao huMAb4D5-8 sãoindicados acima em negrito/itálico.
Os anticorpos da invenção pode compreender qualquer seqüênciade domínio variável da região de estrutura adequada, desde que a atividade deligação ao EphB4 seja substancialmente mantida. Por exemplo, em algunsexemplos de realização, o anticorpo compreende uma seqüência de consensohumano da região de estrutura da cadeia pesada subgrupo III. Em um exemplode realização destes anticorpos, a seqüência da região de consensocompreende a substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Em alguns exemplos derealizações destes anticorpos, a posição 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A. Em umexemplo de realização, esses anticorpos incluem a seqüência da região deestrutura do domínio variável da cadeia pesada do huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®, Genentech1 Inc., São Francisco, CA, EUA) (também referido na Patente US6.407.213 e US 5.821.337, e Lee et ai., J. Moi Biol. (2004), 340 (5) :1073-93).Em um exemplo de realização, esses anticorpos humanos incluemadicionalmente uma seqüência consenso da região de estrutura da cadeia leveIk humana. Em um exemplo de realização, esses anticorpos incluem asseqüências de cadeia leve HVR do huMAb4D5-8, tal como descrito na PatenteUS 6.407.213 e US 5.821.337) Em um exemplo de realização, essesanticorpos incluem seqüências do domínio variável da cadeia leve dehuMAb4D5-8 (HERCEPTIN ®, Genentech, Inc., São Francisco, CA, EUA.)(também referido na Patente US 6.407.213 e US 5.821.337, e Lee et ai, J. Mol.Bioi (2004), 340 (5): 1073-93).
Em um exemplo de realização, um anticorpo da invençãocompreende um domínio variável de cadeia pesada, no qual a seqüência daregião de estrutura compreende a seqüência SEQ ID Nos: 19, 20, 21, 22, 23,24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 e/ou 37, e as seqüências HVRH1, H2, H3 são SEQ ID Nos: 9, 11 e 15, respectivamente. Em um exemplo derealização, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável dacadeia leve, no qual a seqüência da região de estrutura compreende aseqüência SEQ ID Nos: 38, 39, 40 e/ou 41, e as seqüências HVR L1, L2 e L3são SEQ ID Nos: 2, 4, e/ou 7, respectivamente.Em um exemplo de realização, um anticorpo da invençãocompreende um domínio variável de cadeia pesada, no qual a seqüência daregião de estrutura compreende a seqüência SEQ ID Nos: 46, 47, 48, e/ou 49,e as seqüências HVR H1, H2, H3 são SEQ ID Nos: 2, 4 e/ou 7,respectivamente. Em um exemplo de realização, um anticorpo da invençãocompreende um domínio variável da cadeia leve, no qual a seqüência daregião de estrutura compreende a seqüência SEQ ID Nos: 42, 43, 44 e/ou 45, eas seqüências HVR L1, L2 e L3 são SEQ ID Nos: 9, 11, e/ou 15,respectivamente.
Em um exemplo de realização, um anticorpo da invençãocompreende um domínio variável de cadeia pesada, no qual a seqüência daregião de estrutura compreende a seqüência SEQ ID Nos: 46, 47, 51 e 49, e asseqüências HVR H1, H2, H3 são SEQ ID Nos: 2, 4 e/ou 7, respectivamente.Em um exemplo de realização, um anticorpo da invenção compreende umdomínio variável da cadeia leve, no qual a seqüência da região de estruturacompreende a seqüência SEQ ID Nos: 42, 43, 50 e/ou 45, e as seqüênciasHVR L1, L2 e L3 são SEQ ID Nos: 9, 11, e/ou 15, respectivamente.
Em um exemplo de realização, um anticorpo da invenção ématurado por afinidade para se obter a meta da afinidade de ligação desejada.Em um exemplo, o anticorpo maturado por afinidade da invenção possuísubstituições de uma ou mais posição dos aminoácidos H28, H31, H34, H52a,H54, H55, H57, H58, H95, L29, L30, L31, L32, L33, L53, L55, L90, L91, L92,L93, L94, L96 ou L97. Em um exemplo, o anticorpo maturado por afinidade dainvenção possuí uma ou mais das seguintes substituições: (a) na cadeiapesada, T28S, G31N, I34L, P52aL, S54G, G55S, T57S ou R, D58, E ou G,G95S; ou (b), na cadeia leve, V29S, S30E, T31I, A32F, V33L, F53N, Y55E,Q90 E ou K, S91T, Y92 N T E ou A, T93V ou I, T94 V ou I, P96 L ou E, ouT97S.Em um exemplo de realização, um anticorpo da invenção consta deum domínio variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência SEQ ID No:53. Em um exemplo de realização, um anticorpo da invenção consta de um domíniovariável de cadeia leve compreendendo a seqüência SEQ ID No: 54. Em umexemplo de realização, um anticorpo da invenção consta de um domínio variável decadeia pesada compreendendo a seqüência SEQ ID No: 53 e um domínio variávelde cadeia leve compreendendo a seqüência da SEQ ID No: 54.
Em um exemplo de realização, um anticorpo da invenção consta deum domínio variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência SEQ ID No:55. Em um exemplo de realização, um anticorpo da invenção consta de um domíniovariável de cadeia leve compreendendo a seqüência SEQ ID No: 56. Em umexemplo de realização, um anticorpo da invenção consta de um domínio variável decadeia pesada compreendendo a seqüência SEQ ID No: 55 e um domínio variávelde cadeia leve compreendendo a seqüência da SEQ ID No: 56.
Em um exemplo de realização, um anticorpo da invenção consta deum domínio variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência SEQ ID No:57. Em um exemplo de realização, um anticorpo da invenção consta de um domíniovariável de cadeia leve compreendendo a seqüência SEQ ID No: 58. Em umexemplo de realização, um anticorpo da invenção consta de um domínio variável decadeia pesada compreendendo a seqüência SEQ ID No: 57 e um domínio variávelde cadeia leve compreendendo a seqüência da SEQ (D No: 58.
Em um exemplo de realização, um anticorpo da invençãoconsta de um domínio variável de cadeia pesada compreendendo aseqüência SEQ ID No: 59. Em um exemplo de realização, um anticorpo dainvenção consta de um domínio variável de cadeia leve compreendendo aseqüência SEQ ID No: 60. Em um exemplo de realização, um anticorpo dainvenção consta de um domínio variável de cadeia pesada compreendendoa seqüência SEQ ID No: 59 e um domínio variável de cadeia levecompreendendo a seqüência da SEQ ID No: 60.
Em um exemplo de realização, um anticorpo da invenção consta deum domínio variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência SEQ ID No:61. Em um exemplo de realização, um anticorpo da invenção consta de um domíniovariável de cadeia leve compreendendo a seqüência SEQ ID No: 62. Em umexemplo de realização, um anticorpo da invenção consta de um domínio variável decadeia pesada compreendendo a seqüência SEQ ID No: 61 e um domínio variávelde cadeia leve compreendendo a seqüência da SEQ ID No: 62.
Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que competecom nenhum dos anticorpos acima mencionados para se ligar ao EphB4. Emum aspecto, a invenção fornece um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo doEphB4 como um dos anticorpos acima mencionados.
Tal como é conhecido no estado da técnica, e como descrito emmaior detalhe abaixo do presente, a posição/limite do aminoácido que delineiauma região hipervariável de um anticorpo pode variar, dependendo do contextoe das várias definições conhecidas no estado da arte (como descrito abaixo).Algumas posições dentro de um domínio variável pode ser considerado comoposições hipervariáveis híbrida em que estas posições podem serconsideradas dentro de uma região hipervariável sob um conjunto de critériossendo ao mesmo tempo em que se considera fora de uma região hipervariávelsob um conjunto de critérios diferentes. Uma ou mais dessas posições tambémpodem ser encontradas em regiões hipervariáveis estendidas (conformedefinido mais adiante).
Em alguns exemplos de realização, o anticorpo é um anticorpomonoclonal. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo é um anticorpopoliclonal. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo é selecionado apartir do grupo, constituído por um anticorpo quimérico, anticorpo maturado porafinidade, anticorpo humanizado e anticorpo humano. Em alguns exemplos derealização, o anticorpo é um fragmento de anticorpo. Em alguns exemplos derealização, o anticorpo é uma Fab1 Fab', Fab1-SH1 F(ab')2 ou scFv.
Em um exemplo de realização, o anticorpo é um anticorpoquimérico, por exemplo, um anticorpo que possuí seqüências de ligação aoantígeno de um doador não-humana enxertado em uma seqüência heterólogahumana ou humanizada (por exemplo, região de estrutura e/ou seqüências dedomínio constante). Em um exemplo de realização, o doador não-humano é umcamundongo. Em um exemplo de realização, uma seqüência de ligação aoantígeno é sintética, por exemplo, obtidos por mutagênese (por exemplo,seleção por exibição de fago, etc.) Em um exemplo de realização, um anticorpoquimérico da invenção tem regiões V murino e região C humano. Em umexemplo de realização, a região V da cadeia leve luz murina é fundida a umacadeia leve kappa humana. Em um exemplo de realização, a região V dacadeia pesada murina é fundida a região C da IgGI humana.
Anticorpos Humanizados da invenção incluem aqueles quepossuem substituições de aminoácido na FR e variantes de maturação porafinidade com mudanças nos CDRs enxertados. Os aminoácidos substituídosno CDR ou FR não são limitados aos presentes no anticorpo doador oureceptor. Em outros exemplos de realização, os anticorpos da invençãoconstam de mudanças adicionais nos resíduos de aminoácido na região Fc queconduzirá à melhoria na função efetora incluindo uma melhor função da CDCe/ou ADCC e da função matadora das células B. Outros anticorpos da invençãoincluem os que apresentam alterações específicas que melhoram aestabilidade. Em outros exemplos de realização, os anticorpos da invençãoincluem mudanças nos resíduos de aminoácidos na região Fc que levam àdiminuição da função efetora, por exemplo, diminuiu a função da CDC e/ouADCC e/ou diminuem a função matadora das células B. Em alguns exemplosde realização, os anticorpos da invenção são caracterizados pela diminuição daligação (tal como ausência de ligação) ao fator do complemento C1q e/oureceptor Fc humano sobre as células natural killer (células NK). Em algunsexemplos de realização, os anticorpos da invenção são caracterizados peladiminuição de ligação (tal como ausência de ligação) ao FcyRI1 FcyRIIA1 e/ouFcyRIIIA humano. Em alguns exemplos de realização, os anticorpos dainvenção é da classe IgG (por exemplo, IgGI e lgG4) e constam de pelo menosuma mutação no E233, L234, G236, D265, D270, N297, E318, K320, K322,A327, A330, P331 e/ou P329 (numeração de acordo com o índice UE). Emalguns exemplos de realização, os anticorpos incluem constam de umamutação no L234A/L235A ou D265A/N297A.
Em um aspecto, a invenção fornece um polipeptídeo anti-EphB4contendo uma das seqüências de ligação ao antígeno fornecida pelo presente,onde o polipeptídeo anti-EphB4 se liga especificamente ao EphB4.
Os anticorpos da invenção se ligam (tal como, ligamespecificamente) ao EphB4 e, em alguns exemplos de realização, podemodular um ou vários aspectos dos efeitos associados ao EphB4, incluindomas não se limitando a ativação do EphB4, sinalização molecular à jusante deEphB4, ativação do Iigante de EphB4, sinalização molecular à jusante doligante de EphB4, ruptura do Iigante (por exemplo, efrina-B1, efrina-B2, e/ouefrina-B3) ligada ao EphB4, fosforilação do EphB4 e/ou multimerização doEphB4, e/ou fosforilação do Iigante de EphB4, e/ou de qualquer desordem doEphB4 biologicamente relevante e/ou via de sinalização biológica do Iigante deEphB4, inibição da angiogênese, e/ou tratamento e/ou prevenção de um tumor,distúrbio de células proliferativas ou câncer, e/ou no tratamento ou prevençãode uma patologia associada com a expressão e/ou atividade de EphB4 (comoum aumento na expressão e/ou atividade do EphB4). Em alguns exemplos derealização, os anticorpos da invenção se ligam especificamente ao EphB4. Emalguns exemplos de realização, o anticorpo se liga especificamente ao domínioextracelular (ECD) do EphB4. Em alguns exemplos de realização, o anticorpose liga especificamente a um polipeptídeo consistindo de ou consistindoessencialmente do domínio extracelular de EphB4. Em alguns exemplos derealização, o anticorpo se liga especificamente a um EphB4 com um Kd pM decerca de 50 pM ou mais. Em alguns exemplos de realização, os anticorpos dainvenção reduzem, inibem, e/ou bloqueiam a atividade do EphB4 in vivo e/ou invitro. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo reduz, inibe e/ou bloqueiaa autofosforilação do EphB4. Em alguns exemplos de realização, o anticorpocompete pela ligação com o Iigante de EphB4 (reduzindo e/ou bloqueando aligação do Iigante de EphB4 ao EphB4).
Em um aspecto, a invenção fornece o uso de um anticorpo dainvenção na preparação de um medicamento para a terapêutica e/outratamento profilático de um distúrbio, tal como um câncer, tumor, e/ou distúrbioda proliferação celular. Em alguns exemplos de realização, a desordem é umaneuropatia ou doença neurodegenerativa.
Em um aspecto, a invenção fornece o uso de um anticorpo dainvenção na preparação de um medicamento para a inibição da angiogênese.
Em um aspecto, a invenção fornece composições que incluem umou mais anticorpos da invenção e um veículo. Em um exemplo de realização, oveículo é farmaceuticamente aceitável.
Em um aspecto, a invenção fornece ácidos nucléicos quecodificam um anticorpo anti-EphB4 da invenção.
Em um aspecto, a invenção fornece vetores contendo o ácidonucléico da invenção.
Em um aspecto, a invenção fornece composições quecompreendem um ou mais ácidos nucléicos da invenção e um veículo. Em umexemplo de realização, o veículo é farmaceuticamente aceitável.
Em um aspecto, a invenção fornece células hospedeiras queconstam dos ácidos nucléicos ou de um vetor da invenção. Um vetor pode serde qualquer tipo, por exemplo, um vetor recombinante, tal como um vetor deexpressão. Uma variedade de células hospedeiras pode ser utilizada. Em umexemplo de realização, uma célula hospedeira procariótica é uma célula, porexemplo, de E. coli. Em um exemplo de realização, uma célula hospedeira éuma célula eucariota, por exemplo, uma célula de mamíferos como, porexemplo, células de ovário de hamster chinês (CHO).
Em um aspecto, a invenção fornece métodos para produzir umanticorpo da invenção. Por exemplo, a invenção fornece métodos para produzirum anticorpo anti-EphB4 (que, tal como definido no presente inclui ocomprimento total e fragmentos deste) ou imunoconjugados, o dito métodocompreende na expressão de um vetor recombinante da invenção que codificao dito anticorpo (ou fragmento deste), e a recuperação deste anticorpo.
Em um aspecto, a invenção fornece um artigo de manufaturacomposto por um recipiente e uma composição contida dentro do recipiente, noqual a composição compreende um ou mais anticorpos anti-EphB4 dainvenção. Em um exemplo de realização, a composição compreende de ácidosnucléicos da invenção. Em um exemplo de realização, uma composiçãocompreendendo um anticorpo inclui ainda um veículo, que em alguns exemplosde realização é farmaceuticamente aceitável. Em um exemplo de realização,um artigo manufaturado da invenção consta de instruções para a administraçãoda composição (para, por exemplo, anticorpos) à um paciente (tal como,instruções de um dos métodos descritos no presente).
Em um aspecto, a invenção fornece um kit compreendendo umprimeiro recipiente que contém uma composição que inclua uma ou maisanticorpos anti-EphB4 da invenção, e um segundo recipiente contendo umtampão. Em um exemplo de realização, o tampão é farmaceuticamenteaceitável. Em um exemplo de realização, uma composição que inclua umanticorpo consta adicionalmente de um veículo, que em alguns exemplo derealização é farmaceuticamente aceitável. Em um exemplo de realização, umkit inclui adicionalmente instruções para a administração da composição (porexemplo, o anticorpo) a um paciente.
Em um aspecto, a invenção fornece o uso de um anticorpo anti-EphB4 da invenção na preparação de um medicamento para a terapia e/outratamento profilático de um distúrbio, como o câncer, tumor, e/ou distúrbio daproliferação celular. Em alguns exemplos de realização, a desordem é umaneuropatia ou doença neurodegenerativa. Em alguns exemplos de realização,a desordem é uma condição patológica associada a angiogênese.
Em um aspecto, a invenção fornece o uso de um ácido nucléicoda invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêuticoe/ou profilático de uma desordem, tal como um câncer, um tumor, e/ou umadesordem proliferativa celular. Em algumas realizações, a desordem é umaneuropatia ou doença degenerativa. Em algumas realizações, a desordem éuma condição patológica associada à angiogênese.
Em um aspecto, a invenção fornece o uso de um vetor deexpressão da invenção na preparação de um medicamento para a terapia e/outratamento profilático de um distúrbio, como o câncer, tumor, e/ou distúrbio daproliferação celular. Em alguns exemplos de realização, a desordem é umaneuropatia ou doença neurodegenerativa. Em alguns exemplos de realização,a desordem é uma condição patológica associada a angiogênese.
Em um aspecto, a invenção fornece o uso de células hospedeirasda invenção na preparação de um medicamento para a terapia e/ou tratamentoprofilático de um distúrbio, como o câncer, tumor, e/ou distúrbio da proliferaçãocelular. Em alguns exemplos de realização, a desordem é uma neuropatia oudoença neurodegenerativa. Em alguns exemplos de realização, a desordem éuma condição patológica associada a angiogênese.Em um aspecto, a invenção fornece o uso de um artigo demanufatura da invenção na preparação de um medicamento para a terapiae/ou tratamento profilático de um distúrbio, como o câncer, tumor, e/oudistúrbio da proliferação celular. Em alguns exemplos de realização, adesordem é uma neuropatia ou doença neurodegenerativa. Em algunsexemplos de realização, a desordem é uma condição patológica associada aangiogênese.
Em um aspecto, a invenção fornece o uso de kit da invenção napreparação de um medicamento para a terapia e/ou tratamento profilático deum distúrbio, como o câncer, tumor, e/ou distúrbio da proliferação celular. Emalguns exemplos de realização, a desordem é uma neuropatia ou doençaneurodegenerativa. Em alguns exemplos de realização, a desordem é umacondição patológica associada a angiogênese.
A invenção fornece métodos e composições úteis para modular oestado de uma doença associada a expressão e/ou atividade do EphB4, talcomo a expressão e/ou atividade aumentada ou diminuída, ou expressão e/ouatividade indesejada.
Em um aspecto, a invenção fornece métodos para tratar ouprevenir um tumor, um câncer, e/ou distúrbio da proliferação celular associadaao aumento da expressão e/ou atividade da EphB4, no qual o métodocompreende em administrar uma quantidade de anticorpo anti-EphB4 a umpaciente que necessita de tal tratamento.
Em um aspecto, a invenção fornece métodos para matar umacélula (tal como células de câncer ou tumor), os métodos compreendem aadministração de uma quantidade efetiva de um anticorpo anti-EphB4 a umsujeito com necessidade de tal tratamento.
Em um aspecto, a invenção fornece métodos de redução,inibição, bloqueio, ou impede o crescimento de um tumor ou câncer, no qual ométodo compreende em administrar uma quantidade terapeuticamente eficazde um anticorpo anti-EphB4 a um paciente que necessita de tal tratamento.
Em um aspecto, a invenção fornece métodos para tratar ouprevenir uma neuropatia ou doença neurodegenerativa, ou reparar um célulasnervosas danificadas, no qual o método compreende em administrar umaquantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-EphB4 a um pacienteque necessita de tal tratamento.
Em um aspecto, a invenção fornece métodos para promover odesenvolvimento, proliferação, manutenção ou regeneração de neurônios, noqual o método compreende em administrar uma quantidade terapeuticamenteeficaz de um anticorpo anti-EphB4 a um paciente que necessita de taltratamento.
Em um aspecto, a invenção fornece métodos para inibirangiogênese compreendendo em administrar uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-EphB4 a um paciente quenecessita de tal tratamento.
Em um aspecto, a invenção fornece métodos para tratar umacondição patológica associada com a angiogênese compreendendo em administraruma quantidade terapeuticamente eficaz de anticorpo anti-EphB4 para um pacienteque necessita de tal tratamento. Em alguns exemplos de realização, o estadopatológico associado com a angiogênese é um tumor, câncer, e/ou doençaproliferativa. Em alguns exemplos de realização, o estado patológico associado coma angiogênese é uma doença neovascular intra-ocular.
Métodos da invenção podem ser usados para afetar qualquerestado patológico adequado. Exemplos de distúrbios são aqui descritos eincluem cânceres selecionados a partir do grupo constituído por câncer depulmão de pequenas células, neuroblastomas, melanoma maligno, carcinomade mama, câncer gástrico, câncer colorretal (CRC) e carcinoma hepatocelular.Em um exemplo de realização, uma célula que é visada em ummétodo da invenção é uma célula de câncer. Por exemplo, uma célula pode seruma selecionada a partir de um constituído por uma célula de câncer de mama,uma célula de câncer colorretal, uma célula de câncer de pulmão, uma célulade carcinoma papilar, uma célula de câncer de cólon, uma célula de câncer depâncreas, uma célula de câncer de ovário, uma célula de câncer de colo doútero, uma célula de câncer do sistema nervoso central, uma célula desarcoma osteogênico, uma célula de carcinoma de células renais, uma célulade carcinoma hepatocelular, uma célula de câncer de bexiga, uma célula decarcinoma gástrico, uma célula de carcinoma escamoso de cabeça e pescoço,uma célula de melanoma, uma célula de leucemia e uma célula de adenomade cólon. Em um exemplo de realização, uma célula que é alvo do método dainvenção é uma célula que apresenta hiperproliferação e/ou está hiperplásica.Em um exemplo de realização, uma célula que é alvo do método da invenção éuma célula que apresenta displasia. Em um exemplo de realização adicional,uma célula que é alvo do método da invenção é uma célula metastática.
Métodos da invenção podem ainda constar de uma etapa detratamento adicional. Por exemplo, em um exemplo de realização, um métodoconsta adicionalmente de uma nova etapa no qual uma célula e/ou tecido alvo(por exemplo, células de um câncer) é exposta a um tratamento de radiação ouagente quimioterápico.
Em um aspecto, a invenção fornece métodos compreendendo aadministração de quam quantidade eficaz de um anticorpos anti-EphB4combinada a uma quantidade eficaz de outro agente terapêutico (tal como umagente anti-angiogênico). Por exemplo, um(ns) anticorpo(s) anti-EphB4 é(são)usado(s) em combinação com um agente anti-câncer ou de um agente anti-angiogênico para tratar diversos condições neoplásicas ou não-neoplásicas.
Em um exemplo de realização, a condição neoplásica ou não-neoplásica é umacondição patológica associada com a angiogênese. Em alguns exemplos derealização, o outro agente terapêutico é um agente anti-angiogênico, umagente anti-neoplásico, e/ou um agente quimioterápico.
O anticorpo anti-EphB4 pode ser administrado subseqüentementeou em combinação com o outro agente terapêutico que é eficaz para estes fins,quer seja na mesma composição ou em composições distintas. Aadministração do anticorpo anti-EphB4 e o outro agente terapêutico (porexemplo, agente anti-câncer, agente anti-angiogênico) pode ser feito emsimultâneo, por exemplo, como uma única composição ou em duas ou maiscomposições distintas, utilizando a mesma ou vias de administração diferentes.Alternativamente ou adicionalmente, a administração pode ser feitaseqüencialmente, em qualquer ordem. Alternativamente ou adicionalmente, asetapas podem ser realizadas como uma combinação de ambosseqüencialmente e, simultaneamente, em qualquer ordem. Em certos exemplosde realização, intervalos variando de minutos a dias, de semanas a meses,podem estar presentes entre as administrações das duas ou mais composições.Por exemplo, o agente anti-câncer pode ser administrado em primeiro lugar,seguido do anticorpo anti-EphB4. No entanto, administração simultânea ouadministração do anticorpo anti-EphB4 em primeiro lugar é também contemplada.Deste modo, em um aspecto, a invenção fornece métodos de administração dacomposição de um anticorpo anti-EphB4, seguida pela administração de um agenteanti-angiogênico (tal como um anticorpo anti-VEGF, tais como bevacizumab). Emcertos exemplos de realização, os intervalos que variam de minutos a dias, desemanas a meses, podem estar presentes entre as administrações das duas oumais composições.
Em certos aspectos, a invenção fornece um método de tratamentode uma patologia (como um tumor, um câncer, e/ou uma desordemproliferativa) pela administração de quantidades eficazes de um anticorpo anti-EphB4 e/ou de um (uns) inibidor(res) da angiogênese e um ou mais agentesquimioterápicos. Uma variedade de agentes quimioterápicos podem serutilizados no método de tratamento combinado da invenção. Uma lista deexemplos não-limitantes de agentes quimioterápicos contemplados nestedocumento é fornecido em "Definições". A administração do anticorpo anti-EphB4 e os agentes quimioterápicos pode ser feita em simultâneo, porexemplo, como uma única composição ou as duas ou mais composiçõesdistintas, utilizando a mesma ou diferentes vias de administração.Alternativamente ou adicionalmente, as etapas podem ser realizadas comouma combinação de ambos seqüencialmente e, simultaneamente, em qualquerordem. Em certos exemplos de realização, intervalos variando de minutos adias, de semanas a meses, podem estar presentes entre as administraçõesdas duas ou mais composições. Por exemplo, o agente quimioterápico podeser administrado em primeiro lugar, seguido do anticorpo anti-EphB4. Noentanto, administração simultânea ou administração do anticorpo anti-EphB4em primeiro lugar é também contemplada. Deste modo, em um aspecto, ainvenção fornece métodos de administração da composição de um anticorpoanti-EphB4, seguida pela administração de um agente quimioterápico. Emcertos exemplos de realização, os intervalos que variam de minutos a dias, desemanas a meses, podem estar presentes entre as administrações das duasou mais composições.
Em um aspecto, a invenção fornece métodos para melhorar aeficácia de um agente anti-angiogênicos em um paciente com um estadopatológico associado a angiogênese, compreendendo em administrar aopaciente uma quantidade eficaz de anticorpo anti-EphB4 em combinação como agente anti-angiogênico, Aumentando, assim, a atividade inibitória do ditoagente anti-angiogênico.
Em outro aspecto, a invenção fornece métodos para a detecçãode EphB4, compreendendo o método na detecção de anticorpos do complexoEphB4 - anti-EphB4 na amostra. O termo "detecção", conforme utilizado nopresente inclui a detecção qualitativa e/ou quantitativa (mensurando níveis),com ou sem referência a um controle.
Em outro aspecto, a invenção fornece métodos para diagnosticar umapatologia associada com a expressão e/ou atividade de EphB4, compreendendo osmétodos na detecção do complexo anticorpo anti-EphB4 - EphB4 em uma amostrabiológica a de um paciente com ou com suspeita de ter o distúrbio. Em algunsexemplos de realização, a expressão de EphB4 é uma expressão aumentada ouexpressão anormal. Em alguns exemplos de realização, o distúrbio é um tumor,câncer, e/ou distúrbio da proliferação celular.
Em outro aspecto, a invenção fornece um dos anticorpos anti-EphB4 descrito no presente, onde o anticorpo anti-EphB4 inclui uma marcaçãodetectável.
Em outro aspecto, a invenção fornece um complexo de qualquerum dos anticorpos anti-EphB4 descrito no presente e EphB4. Em algunsexemplos, o complexo é in vivo ou in vitro. Em alguns exemplos de realização,o complexo compreende uma célula de câncer. Em alguns exemplos derealização, o anticorpo anti-EphB4 é marcado para a detecção.
Breve Descrição Das Figuras
FIGURA 1: a seqüência de alça HVR da cadeia pesada doanticorpo anti-EphB4. A figura exibe as seqüências HVR de cadeia pesada, H1,H2 e H3, e as seqüências HVR de cadeia leve, L1, L2 e L3. A numeração daseqüência é a seguinte: clone 30.35 (HVR-H1 é SEQ ID No: 1; HVR-H2 é SEQID No: 3; HVR-H3 é SEQ ID No: 7; HVR-L1 é SEQ ID No: 9; HVR - L2 é SEQID No: 11; HVR-L3 é SEQ ID No: 13); clone 30.35.1D2 (HVR-H1 é SEQ ID No:1; HVR-H2 é SEQ ID No: 3; HVR-H3 é SEQ ID No: 8; HVR-L1 é SEQ ID No:10; HVR-L2 é SEQ ID No: 12; HVR-L3 é SEQ ID No: 14); clone 30.35.2D8(HVR-H1 é SEQ ID No: 2; HVR-H2 é SEQ ID No: 4; HVR-H3 é SEQ ID No: 7;HVR-L1 é SEQ ID No: 9; HVR-L2 é SEQ ID No: 11; HVR-L3 é SEQ ID No: 15 );Clone 30.35.2D12 (HVR-H1 é SEQ ID No: 1; HVR-H2 é SEQ ID No: 5; HVR-H3é SEQ ID No: 7; HVR-L1 é SEQ ID No: 9; HVR-L2 é SEQ ID No: 11; HVR-L3 éSEQ ID No: 16); e clone 30.35.2D13 (HVR-H1 é SEQ ID No: 1; HVR-H2 é SEQID No: 6; HVR-H3 é SEQ ID No: 7; HVR-L1 é SEQ ID No: 9; HVR-L2 é SEQ IDNo: 11; HVR-L3 é SEQ ID No: 17).
As posições dos aminoácidos são numeradas de acordo com osistema de numeração de Kabat como descrito abaixo.
Figuras 2A e 2B & 3 representam de maneira exemplar asseqüência da estrutura de consenso humano aceptora para uso na prática dapresente invenção com as seqüências identificas do seguinte modo:
Estrutura De Consenso Variável Pesada (Vh) (Figuras 2a ε 2b)
Estrutura de consenso VH Humano subgrupo I menos CDRsKabat (SEQ ID No: 9).
Estrutura de consenso VH Humano subgrupo I menos regiõeshipervariáveis prolongadas (SEQ ID No: 20-22).
Estrutura de consenso VH Humano subgrupo Il menos CDRsKabat (SEQ ID No:23).
Estrutura de consenso VH Humano subgrupo Il menos regiõeshipervariáveis prolongadas (SEQ ID No: 24-26).
Estrutura de consenso VH Humano subgrupo Ill menos CDRs deKabat (SEQ ID No: 27).
Estrutura de consenso VH Humano subgrupo Ill menos regiõeshipervariáveis prolongadas (SEQ ID No: 28-30).
Estrutura aceptora VH Humano menos CDRs de Kabat (SEQ IDNo: 31).
Estrutura aceptora VH Humano menos regiões hipervariáveisprolongadas (SEQ ID No: 32-33).
Estrutura aceptora 2 VH Humano menos CDRs de Kabat (SEQID No: 34).
Estrutura aceptora 2 VH Humano menos regiões hipervariáveisprolongadas (SEQ ID No: 35-37).
Estrutura De Consenso Variável Leve (Vl) (Figura 3)
Estrutura de consenso VL Humano kappa subgrupo I (SEQ ID No:38).
Estrutura de consenso VL Humano kappa subgrupo Il (SEQ IDNo:39).
Estrutura de consenso VL Humano kappa subgrupo Ill (SEQ IDNo: 40)
Estrutura de consenso VL Humano kappa subgrupo IV (SEQ IDNo: 41)
A Figura 4 exibe as seqüências da região de estrutura dascadeias leve e pesadas da huMAb4D5-8. Os números em sobrescrito / negritoindicam as posições de aminoácido de acordo com Kabat.
A Figura 5 exibe as seqüências modificadas/variantes da regiãode estrutura das cadeias leve e pesadas da huMAb4D5-8. Os números emsobrescrito / negrito indicam as posições de aminoácido de acordo com Kabat.
A Figura 6 mostra as regiões variáveis da cadeia pesada e levedos anticorpos clones 30.35, 30.35.1D2, 30.35.2D8, 30.35.2D12 e 20.25.2D13.
A Figura 7: Um anticorpo monoclonal anti-EphB4 bloqueando asinalização de um receptor EphB4 em uma ensaio baseado em célula.
Descrição Detalhada Da Invenção
A presente invenção fornece anticorpos anti-EphB4, que são úteispara, por exemplo, o tratamento ou prevenção de doenças associadas comexpressão e/ou atividade de EphB4, tal como maior expressão e/ou atividadeou expressão e/ou atividade indesejada. Em alguns exemplos de realização, osanticorpos da invenção são usados para tratar um tumor, um câncer, e/oudistúrbio da proliferação celular.
Em outro aspecto, os anticorpos anti-EphB4 da invençãoencontram utilidade como reagentes para detecção e/ou isolamento de EphB4,tais como a detecção de EphB4 em vários tipos de tecidos e células.
A invenção fornece ainda métodos para produção de anticorposanti-EphB4, e polinucleotídeos que codificam os anticorpos anti-EphB4.
Técnicas Usuais
As técnicas e os procedimentos descritos ou referenciados nopresente são geralmente bem compreendidas e comumente empregadasusando a metodologia convencional por aqueles especialistas no assunto,como, por exemplo, as metodologias utilizadas amplamente descritas emSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3a. Edição (2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (FM Ausubel1 et al. eds., (2003)); asérie: METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: APRACTICAL APPROACH (MJ MacPherson, BD Hames e GR Taylor eds.(1995)), Harlow e Lane1 eds. (1988), ANTIBODIES, A LABORATORYMANUAL, e ANIMAL CELL CULTURE (RI Freshney, ed. (1987)).
Definições
Um anticorpo "isolado" é aquele que tenha sido identificado,separado e/ou recuperado a partir de um componente do seu ambiente natural.Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais quepoderiam interferir no uso diagnóstico ou terapêutico para o anticorpo e podemincluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não-proteináceos.Em exemplos de realizações preferidas, o anticorpo será purificado (1) até maisde 95% em peso de anticorpo, conforme determinado através do método Lowrye, de maior preferência, mais de 99% em peso; (2) até grau suficiente para aobtenção de pelo menos 15 resíduos de seqüência de aminoácidos interna ouN-terminal, através do uso de um seqüenciador de copo de fiação (spinningcup); ou (3) até a homogeneidade através de SDS-PAGE sob condiçõesredutoras ou não-redutoras utilizando azul de Coomassie ou,preferencialmente, coloração de prata. Anticorpo isolado inclui o anticorpo insitu em células recombinantes, desde que pelo menos um componente doambiente natural do anticorpo não esteja presente. Normalmente, entretanto, oanticorpo isolado é preparado através de pelo menos uma etapa de purificação.
Uma molécula de ácido nucléico "isolada" é uma molécula deácidos nucléico que seja identificada e separada de pelo menos uma moléculade ácido nucléico contaminante com a qual está comumente associada à fontenatural do ácido nucléico do anticorpo. Uma molécula de ácido nucléico isoladaé diferente, sob a forma ou a configuração em que é encontrado na natureza.Moléculas de ácido nucléico isoladas são moléculas, por conseguinte, distintasdas moléculas de ácidos nucléicos naturais, uma vez que existe em células. Noentanto, uma molécula de ácido nucléico isolada inclui uma molécula de ácidonucléico contidos nas células que normalmente expressam o anticorpo, noqual, por exemplo, a molécula de ácido nucléico está em localizada em umcromossomo diferente da encontrada na célula natural.
A expressão "numeração dos resíduos do domínio variável comoem Kabat" ou "numeração da posição dos aminoácidos como em Kabat", evariantes dos mesmos, referem-se ao sistema de numeração utilizado para odomínio variável da cadeia pesada ou cadeia leve da compilação dosanticorpos em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5aEd. National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), Usando este sistema denumeração, a seqüência de aminoácido linear real pode conter menos ou maisaminoácidos, o que corresponde a uma redução ou inserção em um domíniovariável FR ou CDR. Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada podeincluir um único aminoácido inserido (resíduo 52A, de acordo com Kabat) apóso resíduo 52 da H2 e inserido resíduos (por exemplo, resíduos 82a, 82b, 82c,etc., de acordo com Kabat), após o resíduo 82 da FR da cadeia pesada. Anumeração de Kabat dos resíduos pode ser determinada para um dadoanticorpo pelo alinhamento nas regiões de homologia da seqüência doanticorpo com uma seqüência numerada de Kabat "padrão".
As frases "substancialmente semelhante", "substancialmente omesmo", como utilizadas no presente, denota um grau de semelhançasuficientemente elevado entre dois valores numéricos (por exemplo, associadaa uma molécula e o outro associada a uma referência/ anticorpo decomparação) de tal forma que um técnico hábil no assunto iria considerar adiferença entre os dois valores como de pouca ou nenhuma significânciabiológica e/ou estatística no contexto da característica biológica mensuradapelos ditos valores (por exemplo, valores Kd,) A diferença entre os dois valoresé, por exemplo, inferiores a 50%, preferencialmente menor que 40%,preferencialmente inferiores a 30%, preferencialmente menores que 20% e/oupreferencialmente inferiores a 10% em função do valor de referência/ doanticorpo de comparação.
"Afinidade de ligação" refere-se, no geral, à força da soma total deinterações não-covalentes entre um sítio de ligação isolado de uma molécula(tal como anticorpo) e seu parceiro de ligação (tal como, um antígeno). A"afinidade de ligação" a menos que indicado de outro modo, refere-se aafinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação de 1:1 entre osmembros do par Iigante (por exemplo, anticorpo e antígeno) A afinidade damolécula X para seu parceiro Y pode geralmente ser representada pelaconstante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser medida através demétodos conhecidos no estado da técnica, incluindo os métodos descritos napresente invenção. Anticorpos de baixa afinidade ligam de forma fraca aoantígeno e tendem a se dissociar rapidamente, enquanto os anticorpos de altaafinidade ligam o antígeno de forma mais forte e permanecem ligados por maistempo. Uma variedade de métodos para mensurar a afinidade de ligação sãoconhecidos no estado da técnica, no qual qualquer um deles podem serutilizados para as propostas da presente invenção. Exemplos de realizaçãoespecificamente ilustrativos são descritos a seguir.
Em um exemplo de realização, o "Kd" ou " valor de Kd " de acordocom a presente invenção é medida por um teste de ligação com antígeno radio-marcado (RIA) realizado com a versão Fab de um anticorpo de interesse e osseus antígenos como descrito pelo seguinte ensaio. A solução da afinidade deligação dos Fabs pelos antígenos é mensurada pelo equilíbrio do Fab com umamínima concentração de antígeno marcado com I1251 na presença de umatitulação seriada de antígeno não marcado e, em seguida, capturando osantígenos ligados com uma placa com anticorpos anti-Fab (Chen, et ai, (1999)J. Mol Biol 293:865-881). Para estabelecer as condições para o ensaio, placasde microtitulação (Dynex) são revestidas durante a noite com 5 pg/ml deanticorpo anti-Fab (Cappel Labs), em 50 mM de carbonato de sódio (pH 9.6) e,subseqüente, bloqueio com albumina bovina 2% (p/v) em PBS por duas a cincohoras à temperatura ambiente (cerca de 23 °C). Em uma placa não-adsorvente(Nunc # 269620), antígenos 100 pM ou 26 pM [I125] são misturadas em umasérie de diluições Fab de interesse (por exemplo, consistente com a avaliaçãode anticorpos anti-VEGF, Fab-12, em Presta et ai, (1997) Câncer Res.57:4593-4599). A Fab de interesse é, em seguida, incubada overnight, noentanto, a incubação pode continuar por um período mais longo (por exemplo,65 horas) para se assegurar de que o equilíbrio é atingido. Posteriormente, asmisturas são transferidas para a incubação na placa de captura à temperaturaambiente (por exemplo, por uma hora). A solução é então retirada e a placa élavada oito vezes com 0,1% de Tween-20, em PBS. Quando as placas estãosecas, 150 μ l/poço de cintilante (MicroScint-20; Packard) é adicionado, e asplacas são contados em um contador Topcount gamma (Packard) durante dezminutos. As concentrações de cada Fab que tiverem resultados igual ou inferiora 20% de ligação máxima são escolhidos para serem utilizados em ensaios deligação competitiva. De acordo com outro exemplo de realização ou Kd ou valorde Kd é mensurado pelo ensaio de ressonância plasmônica de superfícieutilizando o BIAcore™-2000 ou um BIAcore™-3000 (BlAcore, Inc., Piscataway,NJ) a 25 0C com antígeno CM5 em chips a ~ 10 Unidades de Resposta (RU).
Resumidamente, chips de biosensores de dextrano carboximetilados (CM5,BIAcore Inc.) são ativados com cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e N-hidroxisucinimida (NHS) de acordo com as instruçõesdo fornecedor. O antígeno é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8,para 5 pg/ml (~ 0,2 μΜ) antes de injetar a uma velocidade de fluxo de 5μΙ/minuto para atingir aproximadamente 10 unidades de resposta (RU) deproteína acoplada. Após a injeção do antígeno, etanolamina 1M é adicionadapara bloquear grupos que não reagiram. Para a mediação cinética, diluiçõesseriadas em duplicatas de Fab (0,78 nM e 500 nM) são injetados em PBS com0,05% de Tween-20 (PBST) a 25 0C em uma taxa de fluxo de cerca de 25μΙ/min. A velocidade de associação (kon) e a velocidade de dissociação (k0ff)são calculadas utilizando um modelo de ligação simples um-para-um deLangmuir (BIAcore Evaluation Software version 3.2) pela montagem simultâneade sensogramas de associação e dissociação. A constante de dissociação emequilíbrio (Kd) é calculado como a relação k0ff/k0n· Vide, por exemplo, Chen, Y.,et ai, (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Se a medida for superior a 106 M"1 S1pelo ensaio de ressonância plasmônica acima, e depois, a medida pode serdeterminada por uma técnica de inibição (quenching) de fluorescência quemede o aumento ou a diminuição das emissões de intensidade defluorescência (excitação= 295 nm; Emissão = 340 nm, banda de passagem=16nm) a 25 0C de 20 nM de um anticorpo anti-antígeno (Na Forma Fab) em PBS1pH 7,2, na presença de concentrações crescentes do antígeno mensurado emespectrômetro, tal como um espectrofotômetro equipado com válvula stop-flow(Aviv Instruments) ou um espectrofotômetro SLM-Aminco série 8000(ThermoSpectronic), com agitador de cuveta.
Um "velocidade de entrada" ou "velocidade de associação" ou"kon", de acordo a presente invenção também pode ser determinada utilizandoo mesmo ensaio de ressonância plasmônica descrito acima usando umBIAcore™-2000 ou BIAcore™-3000 (BIAcore Inc., Piscataway1 NJ) a 25 0C comum chip de antígeno CM5 a ~ 10 unidades de resposta (RU). Resumidamente,chips de biosensores de destrano carboximetilados (CM5, BIAcore Inc.) sãoativados com cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) eN-hidroxisucinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. Oantígeno é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, para 5 pg/ml (~ 0,2μΜ) antes de injetar a uma velocidade de fluxo de 5 μΙ/minuto para atingiraproximadamente 10 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Para amediação cinética, diluições seriadas em duplicatas de Fab (0,78 nM e 500 nM)são injetados em PBS com 0,05% de Tween-20 (PBST) a 25 0C em umavelocidade de fluxo de cerca de 25 μΙ/min. A velocidade de associação (kon) e avelocidade de dissociação (k0ff) são calculadas utilizando um modelo de ligaçãosimples um-para-um de Langmuir (BIAcore Evaluation Software version 3.2)pela montagem simultânea de sensogramas de associação e dissociação. Aconstante de dissociação em equilíbrio (Kd) é calculado como a relação koff/kon.Vide, por exemplo, Chen, Y., et ai, (1999) J. Mol Biol 293:865-881. De qualquerforma, se a medida for superior a 106 M"1 S1 pelo ensaio de ressonânciaplasmônica acima, a medida pode ser determinada por uma técnica de inibição(quenching) de fluorescência que mede o aumento ou a diminuição das emissõesde intensidade de fluorescência (excitação= 295 nm; Emissão = 340 nm, banda depassagem=16 nm) a 25 0C de 20 nM de um anticorpo anti-antígeno (Na Forma Fab)em PBS1 pH 7,2, na presença de concentrações crescentes do antígeno mensuradoem espectrômetro, tal como um espectrofotômetro equipado com válvula stop-flow(Aviv Instruments) ou um espectrofotômetro SLM-Aminco série 8000(ThermoSpectronic), com agitador de cuveta.
O termo "vetor", da forma utilizada na presente invenção, refere-se a uma molécula de ácido nucléico capaz de transportar outro ácido nucléicoao qual ele está ligado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere auma alça de DNA de fita dupla circular no qual segmentos de DNA adicionaispodem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor fago. Outro tipo de vetor éum vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados nogenoma viral. Determinados vetores são capazes de replicação autônoma nacélula hospedeira na qual eles estão introduzidos (por exemplo, vetoresbacterianos que possuem uma origem de replicação bacteriana e vetores demamífero epissomais). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamíferosnão-epissomais) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeiramediante a introdução na célula hospedeira, e são replicados desta forma aolongo do genoma hospedeiro. Adicionalmente, determinados vetores sãocapazes de expressão direta dos genes aos quais eles são operacionalmenteligados. Ditos vetores são denominados no presente como "vetores deexpressão recombinantes" (ou simplesmente, "vetores recombinantes"). Nogeral, vetores de expressão úteis nas técnicas de DNA recombinante estãofreqüentemente na forma de plasmídeos. Na presente invenção, "plasmídeo" e"vetor" podem ser utilizados de forma intercambiável, uma vez que o plasmídeoé a forma de vetor mais utilizada.
"Polinucleotídeo," ou "ácido nucléico," utilizados de formaintercambiável no presente, refere-se a polímeros de nucleotídeos de qualquercomprimento, e incluem DNA e RNA. Os nucleotídeos podem serdeoxiribonucleoíídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos ou bases modificadas,e/ou seus análogos, ou qualquer substrato que pode ser incorporado em umpolímero pela DNA ou RNA polimerase ou por uma reação sintética. Umpolinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais comonucleotídeos metilados e seus análogos. Se presente, uma modificação naestrutura do nucleotídeo pode ser transmitida antes ou após o conjunto dopolímero. A seqüência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentesnão-nucleotídeos. Um polinucleotídeo pode ser adicionalmente modificadoapós a síntese, tal como por conjugação com um marcador. Outros tipos demodificações incluem, por exemplo, "caps", substituição de um ou maisnucleotídeos de ocorrência natural com um análogo, modificaçõesinternucleotídeo tais como, por exemplo, as com ligações não-carregadas (porexemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) eligações carregadas (tal como fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquelasque contém unidades pendentes, tais como, por exemplo, proteínas (porexemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeos de sinal, ply-L-lisina, etc.),as com intercalantes (tal como acridina, psoraleno, etc.), as que contémquelantes (tais como, metais, metais radioativos, bóro, metais oxidativos, etc.),as que contém alquilantes, as com ligações modificadas (tal como ácidosnucléicos alfa anoméricos, etc.), bem como formas não modificadas depolinucleotídeos. Adicionalmente, qualquer dos grupos hidroxilas geralmentepresentes nos açúcares pode ser substituído, por exemplo, por gruposfosfonatos, grupos fosfatos, protegidos por grupos protetores padrão, ouativados para preparar ligações adicionais a nucleotídeos adicionais, ou podemser conjugados para suportes sólidos ou semi-sólidos. O terminal OH 5' e 3'pode ser fosforilado ou substituído com unidades de grupos de proteçãoorgânicos ou aminas de 1 a 20 átomos de carbono. Outras hidroxilas podemainda ser derivadas para grupos protetores. Os polinucleotídeos podem aindaconter formas análogas de açúcares ribose ou deoxiribose são geralmenteconhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, 2'-0-metil-, 2-O-alil, 2'-fluoro-ou 2-azido-ribose, análogos de açúcar carboxílico, açúcares a-anoméricos,açúcares epiméricos tais como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcarespiranose, açúcares furanose, sedoheptuloses, análogos acíclicos, e análogosde nucleosídeos abásicos tais como metil-ribosídeo. Uma ou mais das ligaçõesfosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligação alternativos. Ditosgrupos de ligação alternativos incluem, mas sem limitar-se a, realizações emque fosfato é substituído por P(0)S("tioatoM), P(S)S ("ditioato"), "(O)NR2("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO ou CH2 ("formacetal"), em que cada R ou R1 éindependentemente H ou alquil substituído ou não-substituído (1-20 C.)contendo opcionalmente uma ligação éter (-0-), arila, alquenila, cicloalquila,cicloalquenila, ou araldila. Nem todas as ligações no polinucleotídeo precisamser idênticas. A descrição anterior aplica-se a todos os polinucleotídeosdescritos no presente, incluindo RNA e DNA.
"Oligonucleotídeo," da forma utilizada no presente, refere-segeralmente a polinucleotídeos geralmente sintéticos, curtos e de fita simplesque apresentam, no geral mas não necessariamente, menos de cerca de 200nucleotídeos de comprimento. Os termos "oligonucleotídeo" e "polinucleotídeo"não são mutuamente exclusivos. A descrição acima para polinucleotídeos éigualmente e completamente aplicável a oligonucleotídeos.
"Percentual (%) de identidade de seqüência de aminoácidos" nopresente é definido como o percentual de resíduos de aminoácidos na possívelseqüência que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na seqüência dopolipeptídeos ou peptídeo específico, após o alinhamento das seqüências eintrodução de intervalos, se necessário, para atingir o percentual máximo deidentidade de seqüências, sem considerar nenhuma substituição conservadoracomo parte da identidade de seqüências. O alinhamento para propósitos dadeterminação do percentual de identidade de seqüências de aminoácidos podeser atingido de várias formas que se encontram dentro do conhecimento datécnica, tais como o uso de softwares de computador disponíveis ao público, talcomo software BLAST1 BLAST-2, ALIGN1 ALIGN-2 ou Megalign (DNASTAR).
Os técnicos no assunto podem determinar parâmetros apropriados para mediro alinhamento, incluindo qualquer algoritmo necessário para atingir oalinhamento máximo ao longo do comprimento total das seqüências sendocomparadas. Para os propósitos do presente, entretanto, os valorespercentuais de identidade de seqüências de aminoácidos são obtidos conformedescrito abaixo, utilizando o programa de computador de comparação deseqüências ALIGN-2 no qual o código fonte completo é fornecido na Tabela Aabaixo. O programa de computador de comparação de seqüências ALIGN-2,de autoria da Genentech, Inc., foi depositado com a documentação do usuáriono Escritório Norte-Americano de Direitos Autorais, Washington DC 20559,Estados Unidos, onde foi registrado com o n° de Registro de Direitos AutoraisNorte-Americano TXU510087. O programa ALIGN-2é disponível ao público pormeio da Genentech, Inc., Califórnia, Estados Unidos. O programa ALIGN-2deverá ser compilado para uso em sistema operativo UNIX, preferencialmenteUNIX digital V4.0D. Todos os parâmetros de comparação de seqüências sãoestabelecidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.
Em situações no qual o ALIGN-2 foi empregado para acomparação das seqüências de aminoácidos, o percentual de identidade deseqüências de aminoácidos de uma dada seqüência de aminoácidos A para,com ou contra seqüência de aminoácidos B (que pode ser alternativamenteexpressa como uma dada seqüência de aminoácidos A que possui oucompreende certo percentual de identidade de seqüências de aminoácidospara, com ou contra uma dada seqüência de aminoácidos B) é calculado daseguinte forma:
100 vezes a fração X/Y
No qual, X é a quantidade de resíduos de aminoácidos avaliadoscomo coincidências idênticas pelo programa de alinhamento de seqüênciasALIGN-2 no alinhamento de A e B naquele programa e em que Y é aquantidade total de resíduos de aminoácidos em B. Apreciar-se-á que, quandoo comprimento da seqüência de aminoácidos A não for igual ao comprimentoda seqüência de aminoácidos Β, o percentual de identidade de seqüências deaminoácidos de A para B não seja igual ao percentual de identidade deseqüências de aminoácidos de B para A.
A menos que especificamente indicado em contrário, todos os valorespercentuais de identidade de seqüências de aminoácidos obtidos são utilizadosaqui, tal como descrito no parágrafo anterior utilizando o programa ALIGN-2.
O termo "EphB4" (indiferentemente denominado "EphB4R"), daforma como utilizado no presente, refere-se, a menos que especificado ouindicado pelo contexto de outra forma, a qualquer polipeptídeos EphB4 nativoou variante (se nativo ou sintético). O termo "seqüência nativa" abrangeespecificamente aqueles que ocorrem naturalmente sob forma truncada ousecretada (por exemplo, uma seqüência do domínio extracelular), formasvariantes que ocorrem naturalmente (por exemplo, formas com splicingalternativo) e variantes alélicos que ocorrem naturalmente. A expressão"EphB4 do tipo selvagem" refere-se geralmente a um polipeptídeo contendo aseqüência de aminoácidos que ocorrem naturalmente na proteína EphB4. Aexpressão "seqüência de EphB4 do tipo selvagem" refere-se geralmente a umaseqüência de aminoácido que ocorrem naturalmente no EphB4.
O termo "anticorpo" e "imunoglobulina" são utilizados de formaintercambiável no sentido mais amplo e incluem anticorpos monoclonais (taiscomo anticorpos monoclonais intactos ou de comprimento total), anticorpospoliclonais, anticorpos multiespecíficos (tais como anticorpos multiespecíficos aponto de exibir a atividade biológica desejada), e pode ainda incluirdeterminados fragmentos de anticorpos (conforme descrito em maior detalheabaixo). Um anticorpo pode ser quimérico, humano, humanizado e/oumaturado por afinidade.
O termo "variável" é utilizado no presente para descrever certasporções dos domínios variáveis que diferem de seqüência entre os anticorpos esão utilizadas na ligação e especificidade de cada anticorpo específico para oseu antígeno específico. Entretanto, a variabilidade normalmente não édistribuída regularmente ao longo dos domínios variáveis de anticorpos. Ela étipicamente concentrada em três segmentos denominados regiõesdeterminantes de complementaridade (CDRs) ou regiões hipervariáveis, tantonos domínios variáveis de cadeia leve como de cadeia pesada. As porçõesmais altamente conservadas dos domínios variáveis são denominadasestruturas (FR). Cada um dos domínios variáveis de cadeia leve e pesada nativoscompreende 4 regiões FR, que adotam em grande parte configuração de folha-β,conectadas por 3 CDRs, que formam alças (Ioops) que conectam e, em algunscasos, fazem parte da estrutura de folha-β. As CDRs em cada cadeia são mantidasjuntas em boa proximidade pelas regiões FR e, com as CDRs da outra cadeia,contribuem para a formação do sítio de ligação de antígenos de anticorpos (videKabat, E. A. et ai, Sequences of Proteins of Immunological Interest, NationalInstitutes of Health, Bethesda MD, Estados Unidos (1987)). Os domínios constantesnão estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, masexibem várias funções efetoras, tais como a participação do anticorpo em toxicidadecelular dependente de anticorpos.
A digestão de anticorpos por papaína produz dois fragmentos deligação de antígenos idênticos, denominados fragmentos "Fab", cada qual comum único sítio de ligação de antígenos, e um fragmento "Fc" residual, cujonome reflete a sua capacidade de rápida cristalização. O tratamento compepsina gera um fragmento F(ab')2 que contém dois sítios de ligação deantígenos e ainda é capaz de reticular antígeno.
"Fv" é o menor fragmento de anticorpo, que contém um sítiocompleto de reconhecimento e de ligação de antígenos. Esta região consisteem um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e em um de cadeialeve em forte associação não-covalente. Em uma única cadeia de Fv1 umdomínio variável da cadeia pesada e da cadeia leve pode ser covalentementeligado por um peptídeo Iigante flexível de tal forma que a cadeias leves epesadas podem se associar em uma estrutura "dimérica" análoga à de umacadeia de dois Fv. É nesta configuração que as três regiões hipervariáveis decada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação de antígenossobre a superfície do dímero Vr-Vl. Coletivamente, as seis regiõeshipervariáveis (CDRs) conferem especificidade de ligação de antígenos aoanticorpo. Entretanto, mesmo um domínio variável isolado (ou a metade de umFv que compreende apenas três regiões hipervariáveis específicas para umantígeno) possui a capacidade de reconhecer e se ligar ao antígeno, emboraem afinidade mais baixa que o sítio de ligação completo.
O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeialeve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Os fragmentosFab' diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no carbóxi-terminal do domínio CH1 de cadeia pesada, que inclui uma ou mais cisteínasda região de articulação do anticorpo. Fab-SH é a denominação do presentepara Fab', em que o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes contémpelo menos um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpos F(ab')2 foramoriginalmente produzidos na forma de pares de fragmentos de Fab' que contêmcisteínas de articulação entre tais fragmentos. Outros acoplamentos químicosde fragmentos de anticorpos também são conhecidos.As "cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) de qualquerespécie de vertebrado podem ser atribuídas a um dentre dois tipos claramentedistintos, denominados kappa (κ) e Iambda (A)1 com base nas seqüências deaminoácidos dos seus domínios constantes.
Dependendo da seqüência de aminoácidos do domínio constantedas suas cadeias pesadas, anticorpos podem ser atribuídos a classesdiferentes. Existem cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA, IgD1IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ser adicionalmente divididas emsubclasses (isoformas), por exemplo, IgGi, lgG2, lgG3, IgG4, IgAi, e IgA2. Osdomínios constantes de cadeia pesada que correspondem às classesdiferentes de anticorpos são denominados α, δ, ε, γ, e μ, respectivamente. Asestruturas de subunidades e configurações tridimensionais de diferentesclasses de imunoglobulinas são bem conhecidas.
"Fragmentos de anticorpos" compreendem uma porção deanticorpo intacto, onde a porção mantém pelo menos um, e como a maior parteou a totalidade, das funções normalmente associadas a porção que quandopresentes em um anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorposincluem Fab, Fab', F(ab')2 e fragmentos Fv, diacorpos, moléculas de anticorposlineares de cadeia única e anticorpos multiespecíficos formados por fragmentosde anticorpos. Em um exemplo de realização, um fragmento de anticorpopossuí o sítio de ligação ao antígeno do anticorpo e, assim, mantém intacta acapacidade de se ligar ao antígeno. Em outro exemplo de realização, umfragmento de anticorpo, por exemplo, um que compreende a região Fc1 retémpelo menos uma das funções biológicas normalmente associadas com a regiãoFc quando presente em um anticorpo intacto, tal como ligação de FcRn,modulação da meia vida do anticorpo, função ADCC e/ou ligação decomplemento. Em um exemplo de realização, um fragmento de anticorpo é umanticorpo monovalente que tem uma meia vida in vivo substancialmentesemelhante a um anticorpo intacto. Por exemplo, esse anticorpo podecompreender o braço de ligação ao antígeno ligado a uma seqüência Fc capazde conferir estabilidade in vivo ao fragmento.
A expressão "região hipervariável" ΉRV" ou "HV", quandoutilizada no presente, refere-se a regiões do domínio variável do anticorpo quesão hipervariáveis na seqüência e/ou forma de alças estruturalmente definidas.Geralmente, anticorpos contêm seis regiões hipervariáveis; três na VH (VH1,VH2, VH3) E três na VL (L1, L2, L3). Um número dé delineamento da regiãohipervariável é utilizada uso e englobadas neste documento. A regiãodeterminante de complementaridade de Kabat (CDR) é baseada na viabilidadeda seqüência e a mais comumente utilizada (Kabat et ai, Sequences ofProteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, NationalInstitutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia refere-se a localizaçãodas alças estruturais (Chothia e Lesk J. Moi Bioi 196:901-917 (1987)). Aregiões hipervariáveis AbM representam um acordo entre os CDRs de Kabat ealças estruturais de Chothia, e são utilizados pelo programa Oxford Molecular'sAbM antibody modeling. O "contacto" de regiões hipervariáveis são baseadasem uma análise das estruturas cristais complexas disponíveis. Os resíduos decada uma destas regiões hipervariáveis são descritas a seguir.
Alça Kabat AbM Chothia ContatoL1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (Numeração de Kabat) H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Numeração de Chothia) H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58Η3 Η95-Η102 Η95-Η102 Η96-Η101 Η93-Η101
Regiões hipervariáveis podem compreender "regiõeshipervariáveis alongadas" do seguinte modo: 24-36 e 24-34 (L1), 46-56 e 50-56(L2) ou 89-97 (L3), na VL e 26-35 (H1), 50-65 e 49-65 (H2) e 93-102, 94-102,ou 95-102 (H3) na VH. O resíduos do domínio variável são numeradas deacordo com a Kabat et al., Supra, para cada uma dessas definições.
Resíduos da "região estrutural" ou "FR" são os resíduos do domíniovariável diferentes dos resíduos da região hipervariável definidos no presente.
As formas "humanizadas" de anticorpos não-humanos (porexemplo, murinos) são anticorpos quiméricos que contêm uma seqüênciamínima derivada de imunoglobulina não-humana. Na maior parte, os anticorposhumanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor), nas quais osresíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduosde uma região hipervariável de uma espécie não-humana (anticorpo doador),tal como camundongo, rato, coelho ou primata não-humano que possui aespecificidade, afinidade e/ou capacidade desejadas. Em alguns casos, osresíduos da região estrutural (FR) da imunoglobulina humana são substituídospor resíduos não-humanos correspondentes. Além disso, os anticorposhumanizados podem compreender resíduos que não são encontrados noanticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas pararefinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Geralmente, o anticorpohumanizado compreenderá substancialmente todos dentre pelo menos um e,tipicamente, dois domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todasas alças hipervariáveis correspondem aos de uma imunoglobulina não-humanae todas ou substancialmente todas as FRs são as de uma seqüência deimunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também compreenderá,opcionalmente, pelo menos uma porção da região constante (Fc) daimunoglobulina, tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para detalhesadicionais, vide Jones et ai, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et ai,Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).Vide também os seguintes artigos de revisão e referências aqui citadas:Vaswani e Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998);Harris, Biochem. Soe. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle e Gross, Curr.Op. Biotech. 5:428-433 (1994).
Os anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas) possuem umaporção da cadeia leve e/ou pesada é idêntica a ou homologa às seqüênciascorrespondentes nos anticorpos derivados de uma espécie especifica, oupertencendo a uma classe ou subclasse de anticorpo específica, enquanto orestante da cadeia é idêntica a, ou homóloga as, seqüências correspondentesnos anticorpos derivados de outras espécies ou pertencentes a outra classe ousubclasse de anticorpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, de forma queeles exibem a atividade biológica desejada (Patente US 4.816.567; e Morrisonet ai, 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:6851-6855). Anticorpo humanizado,tal como é utilizado no presente é um subconjunto de anticorpos quiméricos.
Fragmentos de anticorpos "Fv de cadeia única" ou "scFv"compreendem os domínios VH e VL de anticorpo, em que esses domíniosestão presentes em uma única cadeia de polipeptídeos. Preferencialmente, opolipeptídeo Fv compreende adicionalmente um Iigante de polipeptídeo entreos domínios VH e VL que permite que o scFv forme a estrutura desejada paraligação de antígenos. Para uma análise de scFv, vide Pluckthun em ThePharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds.,Springer-Verlag, Nova Iorque, Estados Unidos, págs. 269-315 (1994).
Um "antígeno" é um antígeno predeterminado ao qual um anticorpopode se ligar seletivamente. O antígeno alvo pode ser um polipeptídeo, carboidrato,ácidos nucléico, lipídios, hapteno ou outro composto de origem natural ou sintética.Preferencialmente, o antígeno alvo é um polipeptídeo.O termo "diacorpos" designa pequenos fragmentos de anticorposcom dois sítios de ligação de antígenos, que compreendem um domíniovariável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeialeve (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH-VL). Utilizando um Iigante queé curto demais para permitir o pareamento entre os dois domínios sobre amesma cadeia, os domínios são obrigados a parear-se com os domínioscomplementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação de antígenos. Osdiacorpos são descritos de maneira mais completa, por exemplo, na patenteEP 404.097 e no documento WO 93/11161 e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad.Sei. USA, 90:6444-6448 (1993).
Um "anticorpo humano" é um anticorpo que possui umaseqüência de aminoácido correspondente a de um anticorpo produzido por umhumano e/ou foi produzido através do uso de qualquer das técnicas para aprodução de anticorpos descritas no presente. A presente definição exclui,especificamente, um anticorpo humanizado que compreende resíduos deligação de antígeno não-humanos.
Um anticorpo "maturado por afinidade" é um anticorpo que possuiuma ou mais alterações em um ou mais CDRs do mesmo que resulta emmelhora na afinidade de ligação do anticorpo ao antígeno, comparado aoanticorpo parental que não possui dita alteração(s). Em um exemplo derealização os anticorpos maturados por afinidades preferidos irão possuirafinidades nanomolares ou ainda picomolares ao antígeno alvo. Anticorposmaturados por afinidade são produzidos por procedimentos conhecidos. Vide,por exemplo, Marks, et al., 1992, Biotechnology 10:779-783 que descrevematuração por afinidade através da mistura (shuffling) do domínio VL e VH.Mutagênese aleatória de CDR e/ou resíduos de estrutura é descrita, porexemplo, em: Barbas, et al., Proc. Nat. Acad. Sei, USA 91:3809-3813(1994);Shierefa/., Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol. 155:1994-2004(1995); Jackson et al„ J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); e Hawkins et ai, J.Moi Biol. 226:889-896 (1992).
Um anticorpo com "funções efetoras" refere-se as atividadesbiológicas atribuídas a região Fc (uma seqüência nativa da região Fc ou umaseqüência de aminoácido variante da região Fe) de um anticorpo, e variam como isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras incluem ligação de C1q;citotoxicidade dependente de complemento; ligação de receptor Fc;citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose;diminuição dos receptores de superfície celular (por exemplo receptor decélulas B), e ativação da células B.
"Citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo" e"ADCC" referem-se a uma reação mediada por célula em que célulascitotóxicas não-específicas que expressam receptores para Fc (FcRs) (tal comocélulas natural killer (NK)1 neutrófilos e macrófagos) permitem que estas célulasefetoras citotóxica se liguem especificamente a um antígeno sobre a célula-alvo e, posteriormente, lisa a célula-alvo com citotoxinas. Os anticorpos "armam" as células citotóxicas e são absolutamente necessários para tal lise.Ascélulas NK1 as principais células mediadoras da ADCC, expressam apenasFcyRIII, enquanto monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressãoFcR em células hematopoiéticas é resumida na tabela 3, página 464 deRavetch et ai, 1991, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92. Para acessar a atividadeADCC de uma molécula de interesse, um teste ADCC in vitro tal como odescrito nas Patentes US 5.500.362 ou US 5.821.337 podem ser realizadas. Ascélulas efetoras úteis para tais testes incluem células mononucleares desangue periférico (PBMC) e células natural killer (NK). De forma alternativa ouadicional, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser acessada invivo, por exemplo, em um modelo animal tal como descrito em Clynes et ai,PNAS (USA) 95:652-656 (1998)."Células efetoras humanas" são leucócitos que expressam um oumais FcRs e realizam funções efetoras. De preferência, as células expressam pelomenos FcyRIII e realizam função efetora de ADCC. Exemplos de leucócitoshumanos que mediam ADCC incluem células mononucleares do sangue periférico(PBMC), células natural killer (NK)1 monócitos, células T citotóxicas, e neutrófilos;com PBMCs e células NK sendo preferidas. As células efetoras podem ser isoladasde uma fonte nativa, por exemplo, a partir do sangue.
Os termos "receptor Fc" ou "FcR" são utilizados para descreverum receptor que se liga a uma região Fc de um anticorpo. O FcR preferido éuma seqüência nativa de FcR humano. Adicionalmente, um FcR preferido éaquele que se liga a um anticorpo IgG (receptor gama) e inclui receptores dassubclasses FcyRI, FcyRII, e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e formassubmetidas a splicing alternativo destes receptores. Receptores FcyRII incluemFcyRIIA (uma "receptor de ativação") e FcyRIIB (um "receptor inibidor"), quetêm seqüências de aminoácidos similares que diferem principalmente nosdomínios citoplasmáticos. O receptor de ativação FcyRIIA possuí um motivo deativação com base em imunoreceptor tirosina (ITAM), no seu domíniocitoplasmático. O receptor de inibição FcyRIIB possuí um motivo de inibiçãocom base em imunoreceptor tirosina (ITIM) no seu domínio citoplasmático.(vide revisão em M. Daéron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). OutrasFcRs1 incluindo aquelas a serem identificadas no futuro, são englobadas pelotermo "FcR" na presente invenção. O termo também inclui o receptor neonatal,FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternos ao feto (VideGuyeref a/., 1976, J. Immunol. 117:587 e Kim et ai, 1994, J. Immunol. 24:249) eregula homeostase de imunoglobulinas. O documento WO 00/42072 (Presta)descreve variantes de anticorpo com ligação ao FcRs melhoradas oudiminuídas. O conteúdo desta publicação de Patente é especialmenteincorporada ao presente pela referência. Vide, também, Shields et al. J. BioiChem. 9 (2): 6591-6604 (2001).
Métodos para mensurar a ligação ao FcRn são conhecidos (vide,por exemplo, Ghetie 1997, Hinton 2004). A ligação ao FcRn humano in vivo e ameia vida da afinidade de ligação ao FcRn humano no soro podem seranalisadas, por exemplo, em camiindongos transgênicos ou transfectadas emlinhagens de células humanas expressando o FcRn humano, ou administradoem primatas com polipeptídeos variantes de Fc.
"Citotoxicidade dependente de complemento" ou "CDC" designa acapacidade de uma molécula de Iisar um alvo na presença de complemento. Avia de ativação de complementos é iniciada pela ligação do primeirocomponente do sistema de complemento (C1q) a um anticorpo (da subclasseapropriada) que se liga com um antígeno cognato. Para determinar a ativaçãodo complemento, pode ser realizado um teste de CDC1 conforme descrito, porexemplo, em Gazzano-Santoro et ai, J. Immunol. Methods 202:163 (1996).
Variantes de polipeptídeos com seqüências de aminoácidos da regiãoFc alteradas e capacidade de ligação de C1q aumentada ou reduzida são descritasna patente US 6.194.551 B1 e no documento WO 99/51642. O conteúdo de ditaspublicações é incorporado especificamente ao presente como referência. Videtambém Idusogie et ai, J. Immunol. 164:4178-4184 (2000).
O termo "polipeptídeo compreendendo a região Fc" refere-se aum polipeptídeo, tal como um anticorpo ou imunoadesina (vide definiçõesabaixo), que inclui uma região Fe. A Iisina C-terminal Iisina (resíduo 447 de acordocom o sistema de numeração EU) da região Fc pode ser removida, por exemplo,durante a depuração do polipeptídeo ou por engenharia recombinantes de ácidosnucléicos na codificação do polipeptídeo. Assim, uma composição que inclua umpolipeptídeo com uma região Fc de acordo com a presente invenção podecompreender polipeptídeos com K447, com todos os K447 removidos, ou umamistura de polipeptídeos com e sem os resíduos K447.Um anticorpo "antagonista" ou um anticorpo de "bloqueio" éaquele que inibe ou reduz a atividade biológica do antígeno ao qual se liga.Anticorpos de bloqueio preferidos ou anticorpos antagonistas inibem de formasubstancial ou completa a atividade biológica do antígeno.
Um "anticorpo agonista", do modo utilizado no presente, é umanticorpo que imita pelo menos uma das atividades funcionais de umpolipeptídeo de interesse.
Uma "região estrutural receptora" para os fins do presente é umaregião estrutural composta por uma seqüência de aminoácidos de uma regiãoestrutural VL ou VH derivadas de uma região estrutural de imunoglobulinahumana, ou a partir de uma região estrutural de consenso humano. Uma regiãoestrutural receptora humana "derivada de" uma região estrutural deimunoglobulina humana ou região estrutural de consenso humano pode incluira mesma seqüência de aminoácidos, ou podem conter uma modificação naseqüência de aminoácido pré-existente. Quando modificações de aminoácidospré-existentes estão presentes, de preferência não superior a 5 e, depreferência, 4 ou menos, ou 3 ou menos, modificações de aminoácidos pré-existentes estão presentes. Quando modificações de aminoácidos pré-existentes estão presentes em um VH1 de preferencialmente essas mudançassão apenas três, duas ou uma das posições 71 Η, 73H e 78H; por exemplo, osresíduos de aminoácido dessas posições podem ser 71 A, 73T e/ou 78A. Emum exemplo de realização, o a região estrutural aceptora humana VL é idênticaa seqüência da região estrutural VL da imunoglobulina humana ou regiãoestrutural de consenso humano.
Uma "região estrutural de consenso humano" é uma regiãoestrutural que representa os resíduos de aminoácidos mais comumenteencontrados em uma seleção das seqüências de região estrutural daimunoglobulina humana VL ou VH. Geralmente, a seleção de seqüências deimunoglobulina humana VL ou VH é de um subgrupo de seqüências dedomínio variável. Geralmente, o subgrupo de seqüências é um subgrupo como
0 de Kabat et al. Em um exemplo de realização, para o VL1 ou subgrupo Ikappa é similar ao de Kabat et al. Em um exemplo de realização, para o VL1subgrupo Ill kappa é similar ao de Kabat et al.
Uma "região estrutural de consenso VH subgrupo III" compreendea seqüência consenso obtida a partir de seqüências de aminoácidos nosubgrupo Ill variável pesado de Kabat et al. Em um exemplo de realização, aseqüência de aminoácido da região estrutural de consenso VH subgrupo Illinclui pelo menos uma parte ou a totalidade de cada uma das seguintesseqüências: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO:42)-H1-WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID No:43)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO:44)-H3-WGQGTLVTVSS (SEQ ID No:45).
Uma "região estrutural de consenso VL subgrupo I" compreende aseqüência consenso obtida a partir de seqüências de aminoácidos no subgrupo1 variável leve de Kabat et al. Em um exemplo de realização, a seqüência deaminoácido da região estrutural de consenso VL subgrupo I inclui pelo menosuma parte ou a totalidade de cada uma das seguintes seqüências:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID No: 46)-L1 -WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID No:47)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ IDNo: 48)-L3-FGQGTKVEIK (SEQ ID No: 49).
Um "distúrbio" ou "doença" é qualquer condição que poderá sebeneficiar com o tratamento com uma substância/molécula ou método dapresente invenção. Isto inclui doenças agudas e crônicas ou doenças incluindoas patologias que predispõem o mamífero para a desordem em questão.Exemplos não Iimitantes de doenças que podem ser tratadas no presenteincluem tumores malignos e benignos, carcinoma, blastoma e sarcoma.A expressão "distúrbio da proliferação celular" e "desordemproliferativa" referem-se a distúrbios que estão associados com algum grau deproliferação de células anormais. Em um exemplo de realização, a distúrbio daproliferação celular é câncer.
"Tumor", como é utilizado no presente, refere-se ao crescimento eproliferação de todas as células neoplásicas, quer sejam malignas ou benignas,e todas as células e tecidos pré-cancerosos e cancerosos. Os termos "câncer","cancerosos", "distúrbio da proliferação celular", "desordem proliferativa" e"tumor" não são mutuamente exclusivos como referido no presente.
O termo "câncer" e "canceroso" refere-se a ou descreve acondição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada pelocrescimento celular desregulado. Exemplos de câncer incluem, mas semlimitar-se a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, e leucemia. Exemplosmais particulares de ditos cânceres incluem câncer de células escamosas,câncer do pulmão de células pequenas, câncer do pulmão de células não-pequenas, adenocarcinoma do pulmão, carcinoma escamoso do pulmão,câncer de peritônio, câncer hepatocelular, câncer gastrointestinal, câncerpancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer do ovário, câncer do fígado,câncer da bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer do cólon, câncercolorretal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma de glândulas salivares,câncer dos rins, câncer do fígado, câncer de próstata, câncer vulval, câncer datireóide, carcinoma hepático, e vários tipos câncer de câncer da cabeça epescoço. A não regulação da angiogênese pode levar a muitos distúrbios quepodem ser tratados pelas composições e métodos da presente invenção. Estesdistúrbios incluir tanto condições neoplásicas quanto não neoplásicas.
Condições neoplásicas incluem, mas não se limitando aos acima descritos.Distúrbios não-neoplásicos incluem, mas sem se limitar a: hipertrofiaindesejada ou aberrante, artrite, artrite reumatóide (AR), psoríase, placaspsoriática, sarcoidose, aterosclerose, placas ateroscleróticas, diabetes e outrasretinopatias proliferativa incluindo retinopatia da prematuridade, retrolentalfibroplasia, glaucoma neovascular, Degeneração macular relacionada à idade,edema macular diabética, neovascularização da córnea, neovascularização doenxerto de córnea, rejeição ao enxerto da córnea, neovascularização daretina/coróide, neovascularização do ângulo (rubeosis), doença ocularneovascular, reestenose vascular, malformações arteriovenosas (AVM)1meningioma, hemangioma, angiofibroma, hiperplasias da tiróide (incluindo adoença de Graves), transplante de córnea e de outros tecidos, inflamaçãocrônica, inflamação pulmonar, lesão pulmonar aguda/ ARDS1 septicemia,hipertensão pulmonar primária, derrames pulmonares malignos, edemacerebral (por exemplo, associada com acidente vascular cerebral agudo/traumatismo craniano fechada / trauma), inflamação sinovial, formação depannus na AR, miosite ossificante, formação óssea hipertrófica, osteoartrose(OA)1 ascite refratária, doença do ovário policístico, endometriose, doenças defluido do "3o espaço" (pancreatite, síndrome de compartimento, queimaduras,doenças intestinais), fibróides uterinas, trabalhos prematura, tais como ainflamação crônica IBD (doença de Crohn e a colite ulcerativa), rejeição dealoenxertos renal, doença inflamatória intestinal, síndrome nefrótica,crescimento de tecido indesejável ou aberrante (não-cânceroso), articulaçõeshemofílicas, cicatrizes hipertróficas, inibição do crescimento do cabelo,síndrome de Osler-Weber, granuloma piogênico fibroplasias retrolental,esclerodermia, tracoma, aderências vasculares, sinovites, dermatite, pré-eclampsia, ascite, derrame pericárdico (como a que está associada apericardite), e derrame pleural.
Como usado no presente, "tratamento" refere-se à intervençãoclínica em uma tentativa de alterar o curso natural do indivíduo ou da célulaque estão sendo tratados, e pode ser executado para a profilaxia ou durante apatologia clínica. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem impedir aocorrência ou o retorno da doença, alívio dos sintomas, diminuição de qualquerconseqüência patológica direta ou indireta da doença, prevenindo oudiminuindo a metástase, diminuindo a velocidade de progressão da doença,melhorando o estado da doença ou melhorando o prognóstico. Em algumasincorporações, os anticorpos da invenção são usados para retardar odesenvolvimento de uma doença ou desordem.
As expressões "doença neurodegenerativa" e "distúrbioneurodegenerativo" são usadas no sentido mais amplo para incluir todas asdesordens que envolvem a patologia da degeneração e/ou disfunção neuronal,incluindo, sem se limitar a, neuropatias periféricas; transtornos motoneuranais,como a esclerose lateral amilotrópica (ALS, doença de Lou Gehrig), paralisiade Bell, e de várias condições que envolvem atrofia muscular espinhal ouparalisia; e outras doenças humanas neurodegenerativas, como a doença deAlzheimer, doença de Parkinson, epilepsia, esclerose múltipla, coréa deHuntington, síndrome de Down, surdez nervosa e doença de Meniere.
A "neuropatia periférica" é uma enfermidade neurodegenerativaque afeta os nervos periféricos, na maioria das vezes se manifesta como umaou uma combinação de disfunções motoras, sensoriais, sensorimotoras ouautônoma. As neuropatias periféricas, por exemplo, podem ser adquiridasgeneticamente, podem resultar de uma doença sistêmica ou pode ser induzidapor um agente tóxico, tais como uma droga neurotóxica, e agenteantineoplásico, ou industrial ou ambiental. A "neuropatia sensorial periférica" écaracterizada pela degeneração dos neurônios sensorial periféricos, que podeser idiopática, podendo ocorrer, por exemplo, como conseqüência da diabetes(neuropatia diabética), quimioterapia citostática em câncer (por exemplo, otratamento com agentes quimioterápicos, como a vincristina , Cisplatina,metotrexato, 3'-azido-3'-desoxitimidina, ou taxanos, por exemplo, paclitaxel[Taxol®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ] e doxetaxel[TAXOTERE®, Rhône-Poulenc Rorer, Antony, França]), alcoolismo, Síndromeda imunodeficiência adquirida (AIDS), ou predisposição genética. Neuropatiasperiféricas geneticamente adquiridas incluem, por exemplo, da doença deRefsum, doença de Krabbe, Ieucodistrfia metacromática, doença de Fabry,síndrome de Dejerine-Sottas, beta-lipoproteinemia, doença de Charcot-Marie-Dente (CMT) (também conhecida como atrofia muscular Proneal ouneuropatias sensitivo-motoras hereditárias (HMSN)). A maior parte dos tipos deneuropatia periférica se desenvolve lentamente, ao longo de vários meses ouanos. Na prática clínica, tais neuropatias são denominadas de crônicas. Àsvezes uma neuropatia periférica se desenvolve rapidamente, ao longo dealguns dias, e é referido como aguda. A neuropatia periférica sensitiva emotora geralmente afeta nervos em conjunto de forma a provocar umaneuropatia sensorial e motora mista, mas a neuropatia sensorial pura e aneuropatia motora pura também são conhecidas.
Um "indivíduo" é um vertebrado. Em certos exemplos derealização, vertebrado é um mamífero. Mamíferos incluem, mas sem limitar-sea, animais (tais como vacas), animais esportivos, animais de estimação (taiscomo gatos, cães e cavalos), primatas, camundongos e ratos. Em certosexemplos de realização, os vertebrados são seres humanos.
"Mamífero", para os propósitos de tratamento, refere-se a qualqueranimal classificado como mamífero, incluindo seres humanos, animais domésticos ede criação e animais de zoológico, esportivos ou de estimação, tais como cães,cavalos, gatos, vacas etc. Preferencialmente, o mamífero é humano.
Uma "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, emdosagens e por os períodos de tempo necessários para conseguir o resultadoterapêutico ou profilático desejado.
Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de uma substânciae/ou molécula da invenção, que pode variar de acordo com fatores tais como, oestado, idade, sexo e o peso do individual, e habilidade da substância e/oumolécula, agonista ou antagonista de eliciar uma resposta desejada noindivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também uma em quetodos os efeitos tóxicos ou prejudiciais da substância e/ou molécula, agonistaou antagonista são compensados pelos efeitos terapeuticamente benéficos.
Uma "quantidade profilaticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz,em dosagens e por os períodos de tempo necessários, para se conseguir oresultado profilático desejado. Tipicamente, mas não necessariamente, desdeque a dose profilática é usada nos pacientes antes da doença ou em umestágio mais precoce da doença, a quantidade profilaticamente eficaz serámenor do que a quantidade terapeuticamente eficaz.
A expressão "agente citotóxico", da forma utilizada no presente,indica uma substância que inibe ou evita o funcionamento das células e/oucausa destruição das células. A expressão destina-se a incluir isótopos4,211 1131 1125 x/90 D«186 d~188 çm153 q;212 p32radioativos (tais como At , I , I , Y , Re ,Re , bm , bi , r eisótopos radioativos de Lu), agentes quimioterápicos, por exemplo,metotrexato, adriamicina, alcalóides vinca (vincristina, vinblastina, etoposida),doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucil, daunorubicina ou outros agentesintercalantes, enzimas e fragmentos destes como, por exemplo, ezimasnucleotídeas, antibióticos e toxinas como, por exemplo, pequenas moléculas detoxina ou toxinas ezimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ouanimal, incluindo fragmentos ou variantes destes, e vários agentes anti-câncer ouanti-tumor descritos abaixo. Outros agentes citotóxicos estão descritos abaixo. Umagente tumoricida causa destruição das células tumorais.
Um "agente quimioterápico" é um composto químico útil notratamento de condições como o câncer. Exemplos de agentes quimioterápicosincluem agentes alquilantes, tais como tiotepa e ciclofosfamida CYTOXAN®;sulfonatos de alquila, tais como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas,tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etilenoiminas emetilamelaminas, incluindo altretamina, trietilenomelamina,trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina;
acetogeninas (especialmente bulatacin e bulatacinona); delta-9-tetrahidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapacone; lapacol;colcicines; ácido betulinico; camptotecina (incluindo o análogo sintéticotopotecan (HYCAMTIN®)), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®),acetlcamptotecina, scopolectina e 9-(aminocamptotecina); briostatina;calistatina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelesina,carzelesina e bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilinico; teniposida;(criptoficinas particularmente a criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina;duocarmicina (incluindo o análogo sintético, KW-2189 e CB1-TM1);eleuterobina; pancratistatina; sarcodictiina; espongistatina; mostardas denitrogênio, tais como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina,ifosfamida, mecloretamina, cloridrato oxido de mecloretamina, melfalan,novembiquin, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila;nitrossuréias, tais como carmustina, clorozotocin, fotemustina, lomustina,nimustina, ranimustina; antibióticos, tais como os antibióticos de enedina (porexemplo, caliqueamicin, especialmente caliqueamicin gamai I e caliquemicinomegaM; vide, por exemplo, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994);dinemicina, incluindo dinemicina A; esperamicina; bem como neocarzinostatinacromóforo e cromóforos antibióticos de enedina cromoproteína relacionadas),aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas,cactinomicin, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas,dactinomicina, daunorrubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina,doxorrubicina doxorubicina (incluindo ADRIAMYCIN®, morfolino-doxorubicina,cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina e desoxidoxorubicina),epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas como, porexemplo mitomicina C1 ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas,peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina,estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina;
antimetabólitos, tais como metotrexato e 5-fluorouracil (5-FU); análogos deácido fólico, tais como denopterin, metotrexato, pteropterin, trimetrexato;análogos de purina, tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina,tioguanina; análogos de pirimidina, tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina,floxuridina; andrógenos, tais como calusterona, propionato de dromostanolona,epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenais, tais comoaminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico, tal comoácido frolínico; aceglatona; aldofosfamido glicosídeo; ácido aminolevulínico;amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina;diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; epotilona; etoglucídeo; nitrato degálio; hidroxiuréia; lentinan; lonidamina; maitansinóides, tais como maitansina eansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitacrina; pentostatina;fenamet; pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etilidrazida; procarbazina; PSK®complexo polissacarídico (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano;rizoxin; sizofiran; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurin A, roridinA e anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina;manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosida("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxóides, tais como, paclitaxel TAXOL®(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), formulação de nanopartículasde paclitaxel construídas em albumina ABRAXANETM (AmericanPharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), e doxetaxel TAXOTERE®(Rhône-Poulenc Rorer, Antony1 França); clorambucil (GEMZAR®); gencitabina;6-tioguanina (VELBAN®); mercaptopurina; metotrexato; análogos de platinatais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposida (VP-16);ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®); oxaliplatin; leucovovin;vinorelbine (NAVELBINE®); novantrona; edatrexato; daunomicina;aminopterina; ibandronato; inibidor de topoisomerase RFS 2000;difluorometilornitina (DMFO); ácido retinóico; capecitabina (XELODA®); e ossais, ácidos ou derivados farmacêuticamente aceitáveis de quaisquer dosacima; bem como combinações de dois ou mais dos agentes descritos acimacomo, por exemplo CHOP, uma abreviação para a terapia combinada deciclofosfamidas, doxorubicina, vincristina, e prednisolona, e FOLFOX, umaabreviação para o regime de tratamento com oxaliplatina (ELOXATINTM)combinada com 5-FU e leucovovina.
São incluídos também nesta definição os agentes anti-hormonaisque agem para regular, reduzir, obstruir, ou inibir os efeitos dos hormônios quepodem promover o crescimento do câncer, e são freqüentemente forma detratamento sistêmica, ou de todo o corpo. Podem ser os próprios hormônios.
Os exemplos incluem antiestrógenos e os moduladores seletivos do receptordo estrógeno (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo otamoxifeno NOLVADEX®), raloxifeno (EVISTA®), droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, e toremifeno(FARESTON®); anti-progesteronas; reguladores supressores de receptor deestrógeno (ERDs); agentes que funcionam para suprimir o s ovários, porexemplo, hormônio agonista Iiberador de hormônio Iuteinizante (LHRH) taiscomo o acetato de Ieuprolida (LUPRON® e ELIGARD®), acetato de goserelina,acetato de buserelina e tripterelina; outros anti-andrógenos tais como aflutamida, nilutamida e a bicalutamida; e inibidores da aromatase que inibemenzima aromatase, que regula a produção do estrógeno nas glândulasadrenais como, por exemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acetato demegestrol (MEGASE®), exemestane (AROMASIΝ®), formestanie, fadrozole,vorozole (RIVISOR®), Ietrozole (FEMARA®), e anastrozole (ARIMIDEX®).Além disso, tal definição de agentes quimioterápicos inclui bisfosfonatos taiscomo o clodronato (por exemplo, o BONEFOS® ou o OSTAC®), etidronato(DIDROCAL®), NE-58095, ácido zoledrônico / zoledronate (ZOMETA®),alendronato (FOSAMAX®), pamidronato (AREDIA®), tiludronato (SKELID®) ourisedronato (ACTONEL®); bem como a troxacitabina (um 1,3-dioxolaneanálogo nucleosídeo da citosina); os oligonucleotídeos antisense,particularmente aqueles que inibem a expressão dos genes da via desinalização, implicando na proliferação aberrante da célula como, por exemplo,PKC-alfa, Raf, H-Ras e o receptor do fator de crescimento epidermal (EGF-R);vacinas tais como vacina THERATOPE® e vacinas de terapia gênica, porexemplo, vacina ALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN® e vacina VAXID®;inibidor da topoisomerase 1 (por exemplo, LURTOTECAN®); , ABARELIX®rmRH; ditosilato do Iapatinib (uma molécula pequena inibidora de tirosinaquinase ErbB-2 e um EGFR também conhecida como GW572016); e sais,ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos acima.
Um "agente inibidor de crescimento" quando usado η presenterefere_Se a um composto ou a uma composição que iniba o crescimento deuma célula (tal como uma célula que expressa EphB4)a in vitro e/ou in vivo.
Assim, o agente inibidor de crescimento pode ser aquele que reduzsignificativamente a porcentagem de células (tal como uma célula queexpressa EphB4) na fase S. Os exemplos de agentes inibidores do crescimentoincluem os agentes que bloqueiam a progressão do ciclo celular (em uma outrafase com exceção da fase S), como os agentes que induzem à parada do ciclocelular em G1 parada da fase M. Os bloqueadores clássicos da fase M incluemos vincas (vincristina e vimblastina), taxanos e inibidores da topoisomerase II,tais como, a doxorubicina, a epirubicina, a daunorubicina, a etoposida e ableomicina. Estes agentes que param o ciclo celular em G1 também sedifundem para a suspensão da fase S1 por exemplo, agentes alquilantes doDNA como o tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina,metotrexato, 5-fluorouracil, e ara-C. Informações adicionais podem serencontradas em The Molecular Basis of Câncer, Mendelsohn e Israel, eds.,Capítulo 1, intitulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplasticdrugs" por Murakami et al. (WB Saunders: Filadélfia, 1995), especialmente napg. 13. Os taxanos (paclitaxel e docetaxel) são os dois fármacos anti-neoplásicos derivados da árvore teixo. Docetaxel (TAXOTERE Rhone-Poulenc Rorer), obtidas a partir de teixos europeus, é um análogo semi-sintético do paclitaxel (Taxol ®, Bristol-Myers Squibb). Docetaxel e paclitaxelpromover a montagem dos microtúbulos dos dímeros de tubulina e estabilizaos microtúbulos, impedindo despolimerização, o que resulta na inibição damitose nas células.
"Doxorrubicina" é um antibiótico antraciclina. O nome completo doproduto químico é doxorrubicina (8S-cis)-10-[(3-amino-2, 3, 6-trideoxi-a-L-lixo-hexapiranosil)oxi]-7, 8, 9, 10-tetrahidro-6, 8, 11-trihidroxi-8-(hidroxiacetíl)-1-metoxi-5, 12-naftacenediona.
O termo "composição anti-neoplásica" refere-se a umacomposição útil no tratamento do câncer incluindo pelo menos um agenteterapêutico ativo, por exemplo, "agente anti-câncer". Exemplos de agentesterapêuticos (agentes anti-câncer, também denominado "agente anti-neoplásico" no presente) incluem, mas estão limitados a, por exemplo, agentesquimioterápicos, agentes inibidores de crescimento, agentes citotóxicos,agentes utilizados na radioterapia, agentes anti-angiogênicos, agentesapoptóticos, agentes anti-tubulina, toxinas, agentes e outros para o tratamentodo câncer, por exemplo, anticorpos neutralizantes anti-VEGF, antagonista deVEGF, anti-HER-2, anti-CD20, antagonista de receptor do fator de crescimentoepidérmico (EGFR) (por exemplo: Um inibidor da tirosina quinase), inibidor deHER1/EGFR, erlotinib, um inibidor da COX-2 (por exemplo, o celecoxib),interferons, citocinas, antagonistas (por exemplo, anticorpos neutralizantes)que se ligam a uma ou mais das ErbB2, ErbB3, ErbB4, ou receptor(es) deVEGF(s), inibidores para receptores de tirosina quinase para o fator decresciemtno crescimento derivado de plaqueta (PDGF) e/ou fator de célulastronco (SCF) (por exemplo, imatinib mesilato (Gleevec ® Novartis)),TRAIL/Apo2, e outros bioativos e agentes químicos orgânicos, etc.
O termo "pró-droga", da forma utilizada no presente pedido,designa uma forma precursora ou derivada de substância farmacêuticamenteativa que é menos citotóxica para células tumorais em comparação com adroga parental e é capaz de ser enzimaticamente ativada ou convertida naforma parental mais ativa. Vide, por exemplo, Wilman, Prodrugs em CâncerChemotherapy, Biochemical Society Transactions, 14, págs. 375-382, 615aReunião de Belfast (1986) e Stella et ai, Prodrugs: A Chemical Approach toTargeted Drug Delivery, Directed Drug Delivery, Borchardt et a/., (ed.), págs.247-267, Humana Press (1985). As pró-drogas de acordo com a presenteinvenção incluem, mas não se limitam a, pró-drogas que contêm fosfato, pró-drogas que contêm tiofosfato, pró-drogas que contêm sulfato, pró-drogas quecontêm peptídeos, pró-drogas modificadas com D-aminoácidos, pró-drogasglicosiladas, pró-drogas que contêm beta-lactama, pró-drogas que contêmfenoxiacetamida opcionalmente substituída ou pró-drogas que contêmfenilacetamida opcionalmente substituída, 5-fluorocitosina e outras pró-drogasde 5-fluorouridina que podem ser convertidas na droga livre citotóxica maisativa. Exemplos de drogas citotóxicas que podem ser derivadas em forma depró-droga para uso na presente invenção incluem, mas sem limitar-se a, osagentes quimioterápicos descritos acima.
Um "agente anti-angiogênese" ou "inibidor da angiogênese"refere-se a uma substância de pequeno peso molecular, um polinucleotídeo,um polipeptídeo, uma proteína isolada, uma proteína recombinante, umanticorpo, ou conjugados ou fusão de proteínas, que inibe a angiogênese, avasculogênese ou a permeabilidade vascular indesejável, quer direta ouindiretamente. Por exemplo, um agente anti-angiogênese é um anticorpo ououtro antagonista angiogênico a um agente, tal como definido anteriormente,por exemplo, anticorpos para VEGF, anticorpos para receptores de VEGF,pequenas moléculas que bloqueiam a sinalização do receptor de VEGF (porexemplo, PTK787/ZK2284, SU6668, SUTENT/SU11248 (malato sunitinib),AMG706). Agentes anti- angiogênese também incluem inibidores daangiogênese nativa, por exemplo, angiostatina, endostatina e etc. Vide, porexemplo, Klagsbrun D1Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991); Streit eDetmar, oncogene, 22:3172-3179 (2003) (por exemplo, a Tabela 3 lista aterapia com anti-angiogênicos em melanoma maligno); Ferrara & Alitalo, NatureMedicine 5(12): 1359-1364 (1999); Tonini et ai., Oncogene, 22:6549-6556(2003) (por exemplo, a Tabela 2 lista os fatores anti- angiogênicos), e, Sato Int.J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003) (por exemplo, a Tabela 1 lista os agentes anti-angiogênicos utilizados em ensaios clínicos).
Composições da Invenção ε Métodos De Produção Desta
Esta invenção abrange composições, incluindo composiçõesfarmacêuticas, contendo um anticorpo anti-EphB4; e polinucleotídeoscompreendendo as seqüências que codificam um anticorpo anti-EphB4. Talcomo utilizado no presente, as composições compreendem um ou maisanticorpos que se ligam ao EphB4, e/ou uma ou mais seqüências quecodificam polinucleotídeos compreendendo um ou mais anticorpos que seligam ao EphB4. Estas composições podem adicionalmente conter um veículoadequado, bem como excipientes farmaceuticamente aceitáveis, incluindotampões, que são bem conhecidos no estado da técnica.A invenção também engloba realizações com anticorpos isoladose polinucleotídeos. A invenção abrange também realizações com anticorpo oupolinucleotídeos substancialmente puros.
Os anticorpos anti-EphB4 da invenção são preferencialmentemonoclonais. Também estão enquadrados no escopo da invenção fragmentosde anticorpos Fab, Fab', Fab1-SH e F(ab')2 anti-EphB4 nele previsto. Estesfragmentos de anticorpos podem ser criados por meios tradicionais, tais comoa digestão enzimática, ou podem ser gerados por técnicas de recombinação.Esses anticorpos quiméricos ou fragmentos podem ser humanizados. Essesfragmentos são úteis no diagnóstico e objetivo terapêuticos aqui definidos.
Os anticorpos monoclonais podem ser obtidos a partir de umapopulação de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorposindividuais que compreendem a população são idênticos, exceto por possíveismutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidadesmenores. O adjetivo "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como nãosendo uma mistura de anticorpos parecidos.
Os anticorpos monoclonais anti-EphB4 da invenção podem serproduzidos por uma variedade de métodos conhecidos no estado da técnica,incluindo o primeiro método de hibridoma descrito por Kohler et ai, Naturel256:495 (1975), ou, alternativamente, podem ser produzidos por métodos deDNA recombinante (por exemplo,Patente US 4.816.567).
No método de hibridoma, um camundongo ou outro animalhospedeiro adequado, tal como um hamster, é imunizado para suscitarlinfócitos que produzem ou que são capazes de produzir anticorpos que seligam especificamente à proteína utilizada na imunização. Os anticorpos anti-EphB4 são preferencialmente elevados em animais por meio de múltiplasinjeções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) de EphB4 e um adjuvante. OEphB4 pode ser preparado usando métodos bem conhecidos na arte, algunsdos quais ainda estão descritas no presente. Por exemplo, a produção deEphB4 recombinante é descrito abaixo. Em um exemplo de realização, osanimais são imunizados com um derivado do EphB4 que contém o domínioextracelular (DCE) de EphB4 fundidos na porção Fc de uma cadeia pesada deimunoglobulina. Em um exemplo de realização preferida, os animais sãoimunizados com uma proteína de fusão EphB4-lgG1. Os animais normalmentesão imunizados contra um conjugados imunogênico ou derivados de EphB4com monofosforil lipídico A (MPL)/trealose dicrinomicolato (TDM) .(RibiImmunochem. Research, Inc., Hamilton, MT) e a solução é injetadaintradermicamente em vários locais. Duas semanas depois, os animais sãoestimulados. 7 a 14 dias mais tarde os animais são sangrados e é analisado otítulo de anti-EphB4 no soro. Os animais são estimulados até título platô.
Alternativamente, linfócitos podem ser imunizados in vitro.Linfócitos são então fundidos com células de mieloma usando um agente defusão adequado, tal como o polietileno-glicol, de modo a formar uma célula dehibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, págs.59-103 (Academic Press, 1986)).
As células de hibridoma assim preparadas podem ser semeadas ecultivadas em um meio de cultura apropriado que contém, preferencialmente, umaou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células demieloma parentais não-fundidas. Por exemplo, se as células de mieloma parentaisnão contenham a enzima hipoxantina-guanina-fosforribosiltransferase (HGPRT ouHPRT), o meio de cultura para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina,aminopterina e timidina (meio HAT), substâncias que evitam o crescimento decélulas com deficiência em HGPRT.
Células de mieloma preferidas são aquelas que se fundemeficientemente, suportam a produção estável em alto nível de anticorpos pelascélulas produtoras de anticorpos selecionadas e são sensíveis a um meio talcomo meio HAT. Entre estas, as linhagens de células de mieloma maispreferidas são linhagens de mieloma murino, tais como as derivadas detumores de camundongos MOPC-21 e MPC-11 que podem ser obtidas no SalkInstitute Cell Distribution Center, San Diego1 Califórnia, Estados Unidos, célulasSP-2 ou X63-Ag8-653 disponíveis a pelo American Type Culture Collection,Rockville, Maryland USA. Linhagens celulares de mieloma humano eheteromieloma humano/camundongo também foram descritas para a produçãode anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); eBrodeur et ai, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,págs. 51-63 (Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque)).
O meio de cultura em que são cultivadas células de hibridoma étestado para determinar a produção de anticorpos monoclonais dirigidos contrao antígeno. Preferencialmente, a especificidade de ligação de anticorposmonoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada através deimunoprecipitação ou de um ensaio de ligação in vitro, tais comoradioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoenzimático (ELISA).
A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, porexemplo, ser determinada pela análise de Scatchard de Munson et ai, Anal.Bioehem., 107:220 (1980).
Após a identificação de células de hibridoma que produzemanticorpos da especificidade, afinidade e/ou atividade desejadas, os clonespodem ser subclonados através da limitação de procedimentos de diluição ecultivados através de métodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies:Principies and Practice, págs.59-103 (Academic Press, 1986)). Meios decultura apropriados para este propósito incluem, por exemplo, meio D-MEM ouRPM 1-1640. Alternativamente, as células de hibridoma podem ser cultivadas invivo na forma de tumores ascíticos em mamíferos.
Os anticorpos monoclonais secretados pelos sub-clones sãoapropriadamente separados do meio de cultura, liquido ascítico ou soro pormeio de procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulina, taiscomo, por exemplo, proteína A-Sefarose, cromatografia de hidroxilapatita,eletroforese em gel, diálise ou cromatografia por afinidade.
Os anticorpos anti-EphB4 da invenção pode ser produzidosutilizando bibliotecas combinatórias para selecionar clones sintéticos com adesejada atividade ou atividades. Em princípio, os clones sintéticos deanticorpos são selecionados pela triagem de bibliotecas de fago contendofagos que exibem vários fragmentos da região variável de anticorpos (Fv)fundidos na proteína da cápside do fago. Essas bibliotecas de fago sãotestadas por cromatografia de afinidade contra o antígeno desejado. Clonesexpressando fragmentos Fv capazes de se ligar ao antígeno desejado sãoabsorvidos pelo antígeno e, assim, separados dos clones que não se ligam nabiblioteca. Os clones que se ligam são então eluídos do antígeno e podemainda ser enriquecidos por ciclos adicionais de adsorção/eluição de antígenos.
Qualquer um dos anticorpos anti-EphB4 da invenção pode ser obtido pelaconcepção de um procedimento de seleção adequado para selecionar o clonedo fago de interesse seguido pela construção de um anticorpo anti-EphB4 decomprimento total usando as seqüências Fv a partir do clone de fago deinteresse e a seqüência adequada da região constante (FC) descrita em Kabatet ai, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição,Publicação NIH 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3.
O domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo é formado apartir de duas regiões variáveis (V) de cerca de 110 aminoácidos, de cadacadeia leve (VL) e cadeia pesado (VH), ambos apresentam três alçashipervariáveis ou Regiões de Determinação de Complementaridade (CDRs).
Os domínios variáveis podem ser exibidos funcionalmente em fago, quer comofragmentos Fv de cadeia única (scFv), na qual VH e VL são covalentementeligados através de um peptídeos curto e flexível, ou como fragmentos Fab1 quesão fundidos para cada domínio constante e interagem não - covalentemente,tal como descrito em Winter et ai, Ann. Rev. Immunol., 12:433-455 (1994).Como utilizado no presente, clones de fago que codificam scFv e clones defago que codificam Fab são coletivamente referidas como "clones de fagos Fv"ou "clones Fv".
Repertórios de genes VH e VL podem ser clonadosseparadamente por reação em cadeia da polimerase (PCR) e recombinadosaleatoriamente em bibliotecas de fago, que podem ser pesquisada por ligação aoantígeno dos clones, tal como descrito em Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12:433-455 (1994). Bibliotecas de fontes imunizadas fornecem anticorpos de altaafinidade para o imunogeno sem a necessidade de construir hibridomas.
Alternativamente, os repertórios naive podem ser clonados para proporcionar umaúnica fonte de anticorpos humanos a uma vasta gama de antígenos não próprios etambém sem qualquer imunização, como descrito por Griffiths et al., EMBO J, 12:725-734 (1993). Por último, bibliotecas naive também podem ser feitassinteticamente clonando segmentos desarranjados do gene-V de células troncoutilizando primers de PCR contendo uma seqüência aleatória para codificar asregiões CDR3 altamente variáveis e para realizar um rearranjo in vitro, comodescrito por Hoogenboom e Winter, J. Moi Biol., 227: 381-388 (1992).
Fagos filamentosos são utilizados para exibir fragmentos deanticorpo pela fusão com a proteína menor da cápside plll. Os fragmentos deanticorpos podem ser visualizados como fragmentos Fv de cadeia única, naqual os domínios VH e VL estão ligados na mesma cadeia polipeptídicas porum polipeptídeo espaçador flexível, por exemplo, como descrito por Marks etal., J. Moi Biol., 222: 581-597 (1991), ou como fragmentos Fab, na qual, umacadeia está fundida na plll e a outra é secretada no periplasma da célulabacteriana hospedeira onde montagem de uma estrutura protéica cápside-Fab,é exibida na superfície do fago pela deslocação de algumas das proteínas dacápside do tipo selvagem, por exemplo, como descrito em Hoogenboom et ai,Nuci Acids Res., 19: 4133-4137 (1991).
Em geral, os ácidos nucléicos que codificam genes de fragmentosde anticorpo são obtidos a partir de células imunitárias colhidas de sereshumanos ou animais. Se uma biblioteca induzida a favor de clones de anti-EphB4 é desejada, o indivíduo é imunizado com EphB4 para gerar umaresposta imunitária, e as células esplênicas e/ou células B circulantes ou outroslinfócitos do sangue periférico (PBLs) são recuperadas para a construção dabiblioteca. Em um exemplo de realização, uma biblioteca de gene de anticorpohumano é induzida a favor de clones anti-EphB4 é obtida gerando umaresposta ao anticorpo anti-EphB4 em camundongos transgênicos portador deum arranjo do gene funcional de imunoglobulina humana (e com ausência deum sistema de produção de anticorpo endógena) assim, a imunização comEphB4 dá origem a células B que produzem anticorpos humanos contraEphB4. A geração de camundongos transgênicos que produzem anticorposhumanos é descrita a seguir.
Enriquecimento suplementar para a população de células reativasanti-EphB4 pode ser obtido utilizando um processo de seleção para se isolarcélulas B que expressam anticorpos na membrana que se ligamespecificamente à EphB4, por exemplo, a separação de células utilizando acromatografia por afinidade ou adsorção de células com EphB4 marcada comfluorocromo seguido pelo uso de um classificador de células fluorescentesativadas (FACS).
Alternativamente, a utilização de células esplênicas e/ou células Bou outras PBLs de um doador não imunizado proporciona uma melhorrepresentação das possíveis repertórios de anticorpos, e também permite aconstrução de uma biblioteca de anticorpo utilizando qualquer animal (humanoou não-humanos) na qual a EphB4 não é antigênica. Para bibliotecasincorporando a construção de genes de anticorpos in vitro, células tronco sãocolhidas a partir do indivíduo para fornecer ácidos nucléicos que codificamfrações de gene de anticorpos desarranjados. As células imunes de interessepodem ser obtidas a partir de uma variedade de espécies animais, tais comohumanos, camundongos, ratos, lagomorfos, luprinos, caninos, felinos, suínos,bovinos, eqüinos e espécies aviárias, etc.
Ácidos nucléicos que codificam segmentos de gene do anticorpovariável (incluindo os segmentos VH e VL) são recuperados das células deinteresse e amplificados. No caso de bibliotecas de genes de VH e VLrearranjados, o DNA desejado pode ser obtido isolando o DNA genômico ouRNAm de linfócitos seguido pela reação em cadeia da polimerase (PCR) comprímers correspondentes a 5 'e 3' dos genes VH e VL rearranjados comodescrito em Orlandi et ai, Proc. Nati Acad. Sci (USA), 86:3833-3837 (1989),tornando assim diverso o repertório de genes V para a expressão. Os genes Vpodem ser amplificados a partir do cDNA e DNA genômico, com os prímersreversos ao final 5' do exon que codifica o domínio V maduro e os prímersdiretos baseados no segmento-J, tal como descrito em Orlandi et ai (1989) eem Ward et ai, Nature, 341: 544-546 (1989). No entanto, para a amplificaçãode cDNA, os prímers anti-sense também podem ser baseados no exon lídercomo descrito em Jones et ai, Biotechnol., 9:88-89 (1991), e com o primersense dentro da região constante, tal como descrito em Sastry et ai., Proc.Nati Acad. Sei. (USA), 86:5728-5732 (1989).Para maximizar acomplementaridade, um enfraquecimento pode ser incorporado aos prímers, talcomo descrito em Orlandi et ai. (1989) ou Sastry et ai. (1989). Em certosexemplos de realização, a diversidade da biblioteca é maximizada por PCRusando prímers voltados para cada gene da família V, a fim de completar todosos arranjos VH e VL disponíveis presentes na amostra de ácido nucléico dascélulas imunitárias, por exemplo, como descrito no método de Marks et al., J.Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) ou conforme descrito no método de Orum et ai.,Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993). Para a clonagem do DNAamplificado em vetores de expressão, raros sítios restrição pode serintroduzidos dentro de um primer de PCR como um marcador em umaextremidade, tal como descrito em Orlandi et al. (1989), ou por umaamplificação por PCR adicional com um primer marcado como descrito emClackson et ai., Nature, 352: 624-628 (1991).
Repertórios de genes V sintéticos rearranjados podem ser obtidosin vitro a partir de segmentos de genes V. A maior parte dos segmentos degenes humanos VH foram clonados e seqüenciados (descrito em Tomlinson etal., J. Mol. Biol., 227: 776-798 (1992)), e mapeados (descrito em Matsuda etal.,Nature Genet., 3: 88-94 (1993); estes segmentos clonados (incluindo todas asprincipais conformações da alça H1 e H2) podem ser usados para gerardiversos repertórios de gene VH com primers de PCR codificando alças H3 dediversas ordem e comprimento, tal como descrito em Hoogenboom e Winter, J.Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Repertórios de VH também podem ser feitoscom toda a diversidade da seqüência centrada em uma alça longa H3 de umúnico comprimento, tal como descrito em Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sei.USA, 89:4457-4461 (1992). Segmentos Vk e VA humanos foram clonados eseqüenciados (descrito em Williams e Winters, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461(1993)) e podem ser usados para fazer repertórios sintéticos de cadeia leves.Repertórios sintéticos de gene V, com base em VH e VL, e comprimento H3 eL3, irá codificar anticorpos de considerável diversidade estrutural. Após aamplificação do DNA do gene codificador de V, segmentos germinal do gene Vpodem ser reorganizados, in vitro, de acordo com os métodos de Hoogenboome Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992).
Repertórios de fragmentos de anticorpos podem ser construídospela combinação de repertórios de genes VH e VL em conjunto de váriasmaneiras. Cada repertório pode ser criado em diferentes vetores, e os vetorespodem ser recombinados in vitro, por exemplo, como descrito em Hogrefe etai, Gene, 128:119-126 (1993), ou in vivo por infecção combinatória, porexemplo, o sistema IoxP descrito em Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21:2265-2266 (1993). A abordagem da recombinação in vivo explora a naturezadas duas cadeias do fragmento Fab de ultrapassar o limite no tamanho dabiblioteca impostas pela eficiência de transformação da E. coli. Repertórios VLe VH naives são clonados separadamente, um em um fagomídeo e o outro emum vetor fago. As duas bibliotecas são então combinadas pela infecção do fagona bactéria contendo o fagomídeo de modo que cada célula contenha umacombinação diferente e o tamanho da biblioteca é limitada apenas pelo númerode células presentes (cerca de 1012 clones). Ambos os vetores contêm sinaisde recombinação in vivo de modo que os genes VH e VL são recombinados emuma única replicação e são co-encapsuladas nos viriões de fagos. Estasbibliotecas enormes oferecem grandes números de diversos anticorpos de boaafinidade (Kd"1 de cerca de 10"8 M).
Alternativamente, os repertórios podem ser clonadosseqüencialmente no mesmo vetor, por exemplo, tal como descrito em Barbas etal., Proc. Nati Acad. Sei. USA, 88:7978-7982 (1991), montadas em conjuntopor PCR e, em seguida, clonadas, por exemplo, como descrito por Clackson etai, Nature, 352: 624-628 (1991). A montagem do PCR também pode ser usadapara unir os DNAs de VH e VL com o DNA que codifica um peptídeo espaçadorflexível para formar um Fv de cadeia única (scFv). Ainda em outra técnica,"montagem de PCR na célula" é usada para combinar os genes VH e VLdentro de linfócitos por PCR e, em seguida, clonar os repertórios de genesligados, tal como descrito por Embleton et al., Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837(1992).Os anticorpos produzidos por bibliotecas naives (tanto naturaisquanto sintéticas) podem ser de afinidade moderada (Kd" de cerca de 10 a107 M"1), mas a afinidade por maturação também pode ser mimetizada in vitro ere-selecionada pela construção de bibliotecas secundárias, tal como descritoem Winter et al. (1994), supra. Por exemplo, a mutação pode ser introduzida deforma aleatória, in vitro, utilizando uma polimerase propensa ao erro (descritoem Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989)) no método de Hawkins et ai., J.Moi. Bioi., 226: 889-896 (1992) ou no método de Gram et al., Proc. Nati Acad.Sei. USA, 89: 3576-3580 (1992). Adicionalmente, a afinidade maturação podeser realizada por uma mutação aleatória em um ou mais CDRs, por exemplo,utilizando primers de PCR que levam a seqüência aleatória abrangendo todo oCDR de interesse, selecionados em cada clone Fv e selecionando clones demaior afinidade. O documento WO 9607754 (publicado em 14 de Março de1996) descreve um método para induzir a mutagênese em uma regiãodeterminante de complementaridade de uma cadeia leve de imunoglobulinapara criara uma biblioteca de genes de cadeia leve. Outro método eficaz érecombinar os domínios VH ou VL selecionados por exibição de fagos comrepertórios de ocorrência natural de variantes do domínio V não imunizadosobtidos a partir de doadores e selecionados para maior afinidade em váriosciclos de reorganização da cadeia, tal como descrito em Marks et al.,Biotechnol., 10 : 779-783 (1992). Esta técnica permite a produção deanticorpos e fragmentos de anticorpos com afinidades na faixa de 10"9 M.
Seqüências de aminoácidos e ácidos nucléicos de EphB4 sãoconhecidos no estado da técnica. Seqüências de ácidos nucléicos que codificao EphB4 pode ser concebida utilizando a seqüência de aminoácidos da regiãodesejada de EphB4. Alternativamente, a seqüência de cDNA (ou fragmentosdeste) do n° de acesso GeneBank NM_004444, ou descrito na Patente US5.635.177, pode ser utilizado. O DNA que codifica a EphB4 pode ser preparadopor uma variedade de métodos conhecidos no estado da arte. Estes métodosincluem, mas não se limitam a, síntese química por qualquer dos métodosdescritos em Engels et al., Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 28:716-734 (1989),bem como os métodos de triéster, fosfito, fosforamidita e H-fosfonato. Em umexemplo de realização, códons preferidos para a expressão na célulahospedeira são utilizados na concepção do DNA que codifica a EphB4.
Alternativamente, o DNA que codifica a EphB4 pode ser isolado a partir de umabiblioteca genômica ou de um cDNA.
Após a construção da molécula de DNA que codifica a EphB4, amolécula de DNA está operativamente ligada a uma seqüência controle deexpressão em um vetor de expressão, como um plasmídeo, onde o aseqüência controle é reconhecida por uma célula hospedeira transformada como vetor. Em geral, plasmídeo vetores contêm seqüências de replicação e decontrole que são derivadas de espécies compatíveis com a célula hospedeira.
O vetor normalmente carrega um sítio replicação, bem como as seqüênciasque codificam proteínas que são capazes de fornecer a seleção fenotípica nascélulas transformadas. Vetores adequados para a expressão em célulashospedeiras eucarióticas e procarióticas são conhecidos no estado da técnica ealgumas ainda estão descritas no presente. Organismos eucarióticos como asleveduras ou células provenientes de organismos multicelulares, tais comomamíferos, podem ser utilizados.
Opcionalmente, o DNA que codifica a EphB4 estáoperacionalmente ligado a uma seqüência líder secretora, resultando nasecreção do produto de expressão da célula hospedeira no meio de cultura.
Exemplos de seqüência líder secretora incluem stll, ecotin, borrego, herpesGD1 Ipp, fosfatase alcalina, invertase, e o fator alfa. Também é adequado parao uso no presente a utilização da seqüência líder de 36 aminoácidos daproteína A (Abrahmsen et al., EMBO J., 4: 3901 (1985)).Células hospedeiras são transfectadas e preferencialmentetransformadas com os vetores de expressão ou de clonagem descritos acimadesta invenção e cultivadas em meio nutritivo convencional modificado, quandonecessário, para induzir os promotores, selecionar transformantes ou amplificaros genes codificadores das seqüências desejadas.
A transfecção se refere a ocupar um vetor de expressão em umacélula hospedeira independente se a seqüência de codificação é ou não de fatoexpressa. Numerosos métodos de transfecção são normalmente conhecidospelos hábeis no assunto, por exemplo, a precipitação em CaP04 eeletroporação. A transfecção bem sucedida é geralmente reconhecida quandoqualquer indicação a operação do presente vetor ocorre dentro da célulahospedeira. Métodos para a transfecção são bem conhecidas no estado datécnica, e alguns estão adicionalmente descritos no presente.
A transformação significa introdução do DNA em um organismode modo a que o DNA esteja replicável, quer como um elemento extra-cromossômico ou sendo integrante do cromossomo. Dependendo da célulahospedeira utilizada, a transformação é feita utilizando técnicas padrõesadequadas para tais células. Métodos de transformação são bem conhecidasno estado da técnica, e alguns estão adicionalmente descritos no presente.
Células hospedeiras procarióticas utilizadas para produzir oEphB4 podem ser cultivadas como descrito em Sambrook et al., Supra.
As células hospedeiras de mamíferos utilizadas para produzir oEphB4 podem ser cultivadas em uma variedade de meios de cultura, que sãobem conhecidas no estado da técnica e alguns dos quais são descritos nopresente.
As células hospedeiras referidas na presente divulgaçãoenglobam células em cultura in vitro, bem como células que estão dentro de umanimal hospedeiro.A purificação de EphB4 pode ser obtida usando métodosreconhecidos na arte, alguns dos quais são descritos no presente.
O EphB4 purificado pode ser associado a uma matriz adequadacomo, por exemplo, esferas de agarose, esferas de acrilamida, esferas devidro, celulose, vários copolímeros acrílicos, géis de metacrilato hidroxila,copolímeros poliacrílico e polimetacrílico, nylon, transportadores neutros eiônicos, e semelhantes, para uso na cromatografia por afinidade para aseparação dos clones de exibição por fago. A fixação do EphB4 à proteína damatriz pode ser realizada através dos métodos descritos em Methods inEnzymology, vol. 44 (1976). Uma técnica comumente empregada para fixar asproteínas Iigantes a matrizes de polissacarídeos, por exemplo, agarose,dextrano ou celulose, envolve a ativação de um veículo com um halogenatocianogênio e o subseqüente acoplamento do peptídeo Iigante do alifáticoprimários ou amino aromático para a matriz ativada.
Alternativamente, o EphB4 pode ser utilizado para revestir poços deplacas de adsorção, expressado em células hospedeiras fixados em placas deadsorção ou utilizado na classificação de células, ou conjugado com biotina paracapturar esferas revestidas com estreptoavidina, ou utilizado em qualquer outrométodo conhecido para expor as bibliotecas de exibição por fago panning.
As amostras da biblioteca de fagos são expostas à EphB4imobilizada em condições adequadas para a ligação de pelo menos umaporção das partículas do fago com o adsorvente. Normalmente, as condições,incluindo pH, força iônica, temperatura e similares são selecionados parasimular condições fisiológicas. Os fagos ligados à fase sólida são lavados e,em seguida, eluídos em ácido, por exemplo, como descrito em Barbas et ai,Proc. Nati Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991), ou por alcalino, por exemplo,como descrito em Marks et a!., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), ou porcompetição com o antígeno EphB4, por exemplo, em um processo semelhanteao método de competição por antígeno de Clackson et ai, Nature, 352: 624-628 (1991). Os fagos podem ser enriquecido de 20-1000 vezes em um únicociclo de seleção. Além disso, os fagos enriquecidos podem ser cultivados emculturas bacterianas sujeitas a novos ciclos de seleção.
A eficiência da seleção depende de vários fatores, incluindo acinética de dissociação durante a lavagem, e se múltiplos fragmentos deanticorpo em um único fago pode se acoplar simultaneamente com o antígeno.Anticorpos com rápida dissociação cinética (e fraca afinidade de ligação)podem ser retidos pelo uso de lavagens curtas, exibindo fagos multivalentes euma baixa densidade de revestimento de antígenos em fase sólida. A elevadadensidade não apenas estabiliza o fago através de interações polivalentes,mas favorece a re-ligação do fago dissociado. A seleção de anticorpos comdissociação cinética lenta (e boa afinidade de ligação) pode ser promovidaatravés da utilização de lavagens longas e exibição de fagos monovalentes, talcomo descrito em Bass et ai, Proteins, 8: 309-314 (1990) e no documento WO92/09690, e uma baixa densidade de revestimento de antígenos, tal comodescrito em Marks et a/., Biotechnol., 10:779-783 (1992).
É possível selecionar entre anticorpos de fagos de diferentesafinidades, mesmo com afinidades que diferem ligeiramente, para EphB4. Noentanto, mutações aleatórias de um anticorpo selecionado (por exemplo, asrealizadas em algumas das técnicas de maturação por afinidade) é susceptívela originar muitos mutantes, mais Iigantes ao antígeno, e alguns com maiorafinidade. Com a limitação da EphB4, raros fagos de alta afinidade fagopoderiam competir. Para manter a maior afinidade de todos os mutantes, osfagos podem ser incubados com excesso de EphB4 biotinilada, mas com umaconcentração de EphB4 biotinilada de molaridade menor do que a constantemolar de afinidade ao alvo para a EphB4. Fagos de alta afinidade de ligaçãopodem então ser capturados por esferas paramagnéticas revestidas deestreptoavidina. Tal "equilíbrio de captura" permite que os anticorpos sejamselecionados de acordo com as suas afinidades de ligação, com sensibilidadeque permita o isolamento de clones mutantes com uma afinidade de algo emtorno de duas vezes maior que a afinidade de um grande excesso de fagoscom menor afinidade. As condições utilizadas para a lavagem dos ligados afase sólida também podem ser manipulados para distinguir com base dadissociação cinética.
Os clones de anti-EphB4 podem ser selecionados ativamente. Emum exemplo de realização, a invenção fornece anticorpos anti-EphB4 quebloqueiam a ligação entre um Iigante de EphB4 (tal como efrina-B1. efrina-B2e/ou efrina-B3) e um EphB4, mas não bloqueia a ligação entre um Iigante deEphB4 e uma segunda proteína. Clones Fv correspondentes a essesanticorpos anti-EphB4 podem ser selecionados: (1) isolando clones anti EphB4a partir da biblioteca de fagos com descrito acima e, opcionalmente,amplificando as populações de clones de fagos isolados pelo crescimento emuma bactéria hospedeira adequada; (2) selecionando a EphB4 e uma segundaproteína contra a proteína que bloqueia e a proteína que não bloqueia aatividade que respectivamente, é desejada; (3) adsorvendo o clone de fagoanti-EphB4 para a EphB4 imobilizada; (4) utilizando um excesso da segundaproteína para eluir qualquer clone indesejável que reconheça a ligação deEphB4 determinante que se sobrepõem ou é partilhada com o determinante deligação da segunda proteína, e (5) eluindo os clones que continuam a serabsorvidos no passo seguinte (4). Opcionalmente, os clones com aspropriedades de bloquear ou não bloquear desejada ainda podem serenriquecidos repetindo os procedimentos de seleção descritos no presente poruma ou mais vezes.
O DNA codificador dos clones Fv é facilmente isolado eseqüenciado utilizando procedimentos convencionais (utilizando, por exemplo,sondas de oligonucleotídeos que sejam capazes de ligar-se especificamente agenes codificadores das cadeias pesada e leve de interesse a aprtir dohibridoma ou modelo de DNA do fago). Uma vez isolado, o DNA pode sercolocado em vetores de expressão, que são transfectados em seguida paracélulas hospedeiras, tais como células de E. coli, células COS de símios,células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou células de mieloma que, deoutra forma, não produzem proteína imunoglobulina, para obter a síntese deanticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Os artigos derevisão sobre a expressão recombinante em bactérias de DNA que codificaanticorpo incluem Skerra et ai., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) ePlückthun, Immunol. Revs., 130: 151-188 (1992).
O DNA codificador dos clones Fv da invenção pode sercombinado com seqüências de DNA conhecidas codificadoras das regiõesconstantes de cadeia pesada e/ou leve (por exemplo, as seqüênciasadequadas de DNA podem ser obtidas a partir de Kabat et ai., Supra) paraformar clones que codificam as cadeias pesadas/leves de comprimento total ouparcial. Será apreciado se as regiões constante de qualquer isotipo possa serutilizada para este fim, incluindo as regiões constantes de IgG, IgM, IgA, IgD,IgE, e que tais regiões constantes possam ser obtidas a partir de qualquerespécie animal ou humana. Um clone Fv derivado do DNA de um domíniovariável de um animal (como o humano) e, em seguida, fundido em um DNA deuma região constante de outra espécie animal para formar seqüência(s)"hibrida(s)", o comprimento completo da cadeia pesada e/ou leve está incluídona definição de anticorpo "quimérico" e "híbrido" como utilizado no presente.
Em um exemplo de realização, um clone Fv derivado do DNA humano variávelé fundido à seqüência de DNA da região constante humana para formar uma(s)seqüência(s) de codificação(ões) totalmente humana, de comprimento dacadeia pesada e/ou leve completa ou parcial.O DNA que codifica o anticorpo anti-EphB4 derivado de umhibridoma da invenção também pode ser modificado, por exemplo, substituindoa seqüência de codificação para o domínio constante de cadeia leve e pesada,por seqüências homólogas derivadas de clones hibridomas murinos (porexemplo, como no método de Morrison et ai, Proc. Nati Acad. Sei. USA., 81:6851-6855 (1984)). O DNA que codifica o hibridoma ou o anticorpo derivado doclone Fv ou fragmentos podem ainda ser modificados por junção covalente àseqüência codificadora de imunoglobulina na totalidade ou em parte daseqüência de codificação para um polipeptídeo não-imunoglobulina. Destaforma, anticorpo "quimérico" ou "híbrido" são preparados tendo aespecificidade de ligação do clone Fv ou anticorpo derivado do clone dohibridoma da invenção.
Fragmentos De Anticorpos
A presente invenção abrange fragmentos anticorpos. Emdeterminadas circunstâncias há uma vantagem maior de se usar fragmentos deanticorpos ao invés de anticorpos. O menor tamanho dos fragmentos permiterápida difusão, e pode conduzir melhor acesso aos tumores sólidos.
Foram desenvolvidas diversas técnicas para a produção defragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivadospor meio de digestão proteolítica de anticorpos intactos (vide por exemplo,Morimoto et ai, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117(1992); e Brennan et ai, Science 229: 81 (1985)). Entretanto, esses fragmentospodem ser agora produzidos diretamente por células hospedeirasrecombinantes. Os fragmentos Fab, Fv e ScFv podem ser expressosdiretamente de E. coli e assim permitindo a produção de grandes quantidadesdestes fragmentos. Os fragmentos de anticorpos podem ser isolados, porexemplo, a partir das bibliotecas de fagos de anticorpos discutidas acima.
Alternativamente, fragmentos Fab1-SH podem ser recuperados diretamente deΕ. coli e acoplados quimicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al.,Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem,fragmentos F(ab')2 podem ser isolados diretamente a partir da cultura decélulas hospedeiras recombinantes. Fragmentos Fab e F(ab')2 com maiormeia-vida in vivo que compreendem resíduos de epítopos de ligação dereceptores recuperados são descritos na patente US 5.869.046. Outrastécnicas para a produção de fragmentos de anticorpos serão evidentes para ostécnicos no assunto. Em outras realizações, o anticorpo selecionado é umfragmento Fv de cadeia única (scFv). Vide documento WO 93/16185; aspatentes US 5.571.894; e US 5.587.458. Fv e sFv são as únicas espécies comsítios de combinação intactos que são desprovidas de regiões constantes; porisso, elas são apropriadas para ligação não-especifica reduzida durante autilização in vivo. Proteínas de fusão sFv podem ser construídas para gerar afusão de uma proteína efetora no amino ou carbóxi terminal de um sFv. VideAntibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. O fragmento de anticorpo podetambém ser um "anticorpo linear", conforme descrito, por exemplo, na patenteUS 5.641.870. Ditos fragmentos de anticorpos lineares podem sermonoespecíficos ou biespecíficos.
Anticorpos Humanizados
A invenção abrange anticorpos humanizados. Vários métodos dehumanização de anticorpos não-humanos são conhecidos no estado datécnica. Preferencialmente, um anticorpo humanizado contém um ou maisresíduos de aminoácidos nele introduzidos a partir de uma fonte que não éhumana. Esses resíduos de aminoácidos não-humanos são muitas vezesdenominados resíduos "importados", que são tipicamente retirados de umdomínio variável "importado". A humanização pode ser essencialmenterealizada seguindo-se o método de Winter et al. (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et ai.,Science, 239:1534-1536 (1988)), por meio de substituição de seqüências deregiões hipervariáveis pelas seqüências correspondentes de anticorpo humano.Conseqüentemente, esses anticorpos "humanizados" são anticorposquiméricos (Patente US 4.816.567), em que substancialmente menos de umdomínio variável humano intacto tenha sido substituído pela seqüênciacorrespondente de uma espécie não-humana. Na prática, os anticorposhumanizados são tipicamente anticorpos humanos, em que alguns resíduos deregiões hipervariáveis e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídospor resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores.
A seleção de domínios variáveis humanos, tanto leves quantopesados, a serem utilizados na fabricação dos anticorpos humanizados é muitoimportante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o chamado métodode "melhor adequação" (best-fit), a seqüência do domínio variável de umanticorpo de roedor é selecionada em comparação com toda a biblioteca deseqüências de domínio variável humanas conhecida. A seqüência humana queé mais próxima da seqüência do roedor é então aceita como a região deestrutura humana (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et ai, J. Immunol.,151: 2296 (1993); Chothia et ai, J. Moi Biol., 196: 901 (1987)). Outro métodoutiliza uma região estrutural específica derivada da seqüência de consenso detodos os anticorpos humanos de um subgrupo específico de cadeias leves oupesadas. A mesma estrutura pode ser utilizada para vários anticorposhumanizados diferentes (Carter et al., Proc. Nati Acad. Sei. USA, 89: 4285(1992); Presta et ai, J. Immunoi, 151: 2623 (1993)).
É adicionalmente importante que os anticorpos sejamhumanizados com retenção de alta afinidade para o antígeno e outraspropriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objetivo, de acordo comum método preferido, os anticorpos humanizados são preparados por meio deum processo de análise das seqüências parentais e diversos produtoshumanizados conceituais, utilizando modelos tridimensionais das seqüênciasparental e humanizada. Modelos de imunoglobulina tridimensionais sãocomumente disponíveis e familiares para os técnicos no assunto. Sãodisponíveis programas de computador que ilustram e exibem prováveisestruturas de conformação tridimensional de seqüências de imunoglobulinacandidata selecionadas. A inspeção dessas exibições permite a análise dopapel provável dos resíduos no funcionamento da seqüência de imunoglobulinacandidata, ou seja, a análise dos resíduos que influenciam a capacidade daimunoglobulina candidata de ligar o seu antígeno. Desta forma, os resíduos deFR podem ser selecionados e combinados a partir das seqüências receptora eimportada, de forma que seja atingida a característica desejada do anticorpo,tal como maior afinidade para o(s) antígeno(s) desejado(s). Geralmente, osresíduos da região hipervariável são diretamente e mais substancialmenteenvolvidos na influência da ligação de antígenos.
Anticorpos Humanos
Anticorpos humanos anti-EphB4 da invenção pode serconstruídos através de uma combinação clone Fv da seqüência do domíniovariável selecionado a partir de uma biblioteca de exposição de fagos deorigem humana com as seqüências do domínio constante conhecidas, comodescrito acima. Alternativamente, os anticorpos monoclonais humanos anti-EphB4 da invenção podem ser preparados através do método de hibridoma.Linhagens celulares de mieloma humano e heteromielomahumano/camundongo para a produção de anticorpos monoclonais humanosforam descritos, por exemplo, por Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984), eBrodeur et ai, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,págs. 51-63 (Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, Estados Unidos, 1987) eBoerner et ai, J. Immunol., 147: 86 (1991).
É agora possível produzir animais transgênicos (por exemplo,camundongos) que são capazes, mediante imunização, de produzir umrepertório de anticorpos humanos na ausência de produção deimunoglobulina endógena. Descreveu-se, por exemplo, que a deleçãohomozigótica do gene da região de ligação de cadeia pesada de anticorpos(Jh) em camundongos quiméricos e mutantes de linhagem germinativa,resulta na inibição completa da produção de anticorpos endógenos. Atransferência do conjunto de genes de imunoglobulina da linhagemgerminativa humana nesses camundongos com mutação da linhagemgerminativa resultará na produção de anticorpos humanos mediante odesafio de antígenos. Vide, por exemplo, Jakobovits et ai, Proc. Natl.Acad. Sei. USA. 90, 2551-255 (1993); Jakobovits et ai, Nature, 362: 255-258 (1993), Bruggermann et ai, Yearin Immunol., 7: 33 (1993).
A alteração de genes pode também ser utilizada para derivaranticorpos humanos de anticorpos de roedores, em que o anticorpo humanopossui afinidades e especificidades similares ao anticorpo de roedor inicial. Deacordo com este método, que também é denominado "impressão de epítopos",o gene de domínio V de cadeia leve ou pesada de anticorpos de roedoresobtido através da técnica de exibição de fagos é substituído com um repertóriode genes de domínio V humanos, criando um população de scFv ou Fabquiméricos com cadeia não humana/cadeia humana. A seleção sobre antígenoresulta no isolamento de variável humana capaz de restaurar um sítio deligação de antígenos funcional, ou seja, o epítopo governa (imprime) a escolhado parceiro. Quando o processo for repetido, a fim de substituir o domínio V deroedor remanescente, é obtido um anticorpo humano (vide documento WO93/06213, publicado em 1 de abril de 1993). Ao contrário da humanizaçãotradicional de anticorpos de roedores através de enxerto de CDR, esta técnicafornece anticorpos completamente humanos, que não possuem resíduos deCDR ou FR de origem não humana.Anticorpos Biespecíficos
Os anticorpos biespecíficos são anticorpos monoclonais, quepossuem especificidades de ligação para pelo menos dois antígenosdiferentes. No presente caso, uma das especificidades de ligação é para aEphB4 e a outra é para qualquer outro antígeno. Anticorpos biespecíficosexemplares podem se ligar a dois diferentes epitopos da proteína EphB4.
Anticorpos biespecíficos também pode ser usados para localizar agentescitotóxicos para células que expressam EphB4. Estes anticorpos possuem umbraço de ligação ao EphB4- e um braço que se liga ao agente citotóxico (porexemplo, saporina, anti-interferon-α, alcalóides da vinca, cadeia da rícina A,metotrexato ou isótopo radioativo hapteno).Anticorpos biespecíficos podem serpreparados como anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpo(por exemplo, anticorpo F(ab')2 biespecífico).
Os métodos de fabricação de anticorpos biespecíficos sãoconhecidos na técnica. Tradicionalmente, a produção recombinante deanticorpos biespecíficos é baseada na co-expressão de dois pares de cadeialeve e cadeia pesada de imunoglobulina, em que as duas cadeias pesadaspossuem especificidades diferentes (Milstein e Cuello, Nature, 305: 537-539(1983)). Devido à seleção aleatória de cadeias leve e pesada deimunoglobulina, esses hibridomas (quadromas) produzem uma misturapotencial de 10 moléculas de anticorpos diferentes, das quais apenas umapossui a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, quenormalmente é realizada através de etapas de cromatografia de afinidade, éum tanto problemática e os rendimentos de produto são baixos. Procedimentossimilares são descritos no documento WO 93/08829 publicado em 13 de maiode 1993 e em Traunecker et ai, EMBO J. 10, 3655-2659 (1991).
De acordo com uma abordagem diferente, domínios variáveis deanticorpos com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinaçãode antígeno e anticorpo) são fundidos à seqüências de domínios constantes deimunoglobulina. A fusão ocorre preferencialmente com um domínio constantede cadeia pesada de imunoglobulina, que compreende pelo menos parte dasregiões de articulação, CH2 e CH3. Prefere-se ter a primeira região constante decadeia pesada (CH1) contendo o sítio necessário para ligação de cadeia levepresente em pelo menos uma das fusões. Os DNAs que codificam as fusõesde cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve deimunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados e são co-transfectados em um organismo hospedeiro apropriado. Isso proporcionagrande flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos 3 fragmentos depolipeptídeos em realizações quando razões desiguais das três cadeias depolipeptídeos utilizadas na construção fornecem os rendimentos ideais. Épossível, entretanto, inserir as seqüências de codificação para 2 ou todas as 3cadeias de polipeptídeos em um vetor de expressão quando a expressão depelo menos duas cadeias de polipeptídeos em razões iguais resultar em altosrendimentos ou quando as razões não foram de significância específica.
Em uma realização preferida da presente abordagem, osanticorpos biespecíficos são compostos de uma cadeia pesada deimunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação em umbraço, e um par de cadeias leve e pesada de imunoglobulina híbrida (quefornece uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Descobriu-seque essa estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecíficodesejado de combinações de cadeia de imunoglobulina indesejadas, pois apresença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas metade damolécula biespecífica fornece forma fácil de separação. Esta abordagem édescrita no documento WO 94/04690. Para mais detalhes de produção deanticorpos biespecíficos vide, por exemplo, Suresh et al., Methods inEnzymology, 121:210 (1986).De acordo com outra abordagem, a interface entre um par demoléculas de anticorpos pode ser construída de forma a maximizar opercentual de heterodímeros que é recuperado da cultura celular recombinante.A interface preferida compreende pelo menos uma parte do domínio CH3 de umdomínio constante de anticorpo. Neste método, uma ou mais cadeias lateraisde aminoácidos pequenos da superfície intermediária da primeira molécula deanticorpo são substituídas com cadeias laterais maiores (tais como tirosina outriptofano). "Cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou similar à(s)cadeia(s) lateral(is) grande(s) são criadas sobre a interface da segundamolécula de anticorpo, por meio da substituição de grandes cadeias laterais deaminoácidos com cadeias menores (tais como alanina ou treonina). Issoproporciona um mecanismo de aumento do rendimento do heterodímero sobreoutros produtos finais indesejados, tais como homodímeros.
Os anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou"heteroconjugados". Um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado,por exemplo, a avidina e o outro a biotina. Esses anticorpos foram propostos,por exemplo, para dirigir células do sistema imune a células indesejadas(Patente US 4.676.980) e para o tratamento de infecções por HIV (documentosWO 91/00360, WO 92/200373 e Patente EP 03.089). Anticorposheteroconjugados podem ser fabricados utilizando qualquer método reticulanteconveniente. Agentes reticulantes apropriados são bem conhecidos na técnicae são descritos na Patente US 4.676.980 juntamente com uma série detécnicas reticulantes.
As técnicas de geração de anticorpos biespecíficos a partir defragmentos de anticorpos também foram descritas na literatura. Anticorposbiespecíficos podem ser preparados, por exemplo, utilizando ligaçõesquímicas. Brennan et ai, Science, 229: 81 (1985) descrevem um procedimentoem que anticorpos intactos são proteoliticamente clivados para gerarfragmentos F(ab')2. Estes fragmentos são reduzidos na presença do agentearsenito de sódio formador de complexo de ditiol para estabilizar ditióis vizinhose evitar a formação de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos Fab' geradossão então convertidos em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dosderivados de Fab-TNB é então novamente convertido em Fab'-tiol por meio deredução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade eqüimolardo outro derivado de Fab1-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Osanticorpos biespecíficos produzidos podem ser utilizados como agentes para aimobilização seletiva de enzimas.
Progressos recentes possibilitaram a recuperação direta dosfragmentos Fab'-SH de E. coli, que podem ser acoplados quimicamente paraformar anticorpos biespecíficos. Shalaby et ai, J. Exp. Med., 175: 217-225(1992) descrevem a produção de uma molécula F(ab')2 de anticorpobiespecífico totalmente humanizado. Cada fragmento Fab' foi segregadoseparadamente de E. coli e submetido a acoplamento químico dirigido in vitropara formar o anticorpo biespecífico. O anticorpo biespecífico assim formado foicapaz de ligar-se a células que super-expressam o receptor de ErbB2 e célulasT humanas normais, bem como iniciar a atividade lítica de linfócitos citotóxicoshumanos contra alvos de tumor de mama humano.
Diversas técnicas de fabricação e isolamento de fragmentos deanticorpos biespecíficos diretamente a partir de cultura celular recombinantetambém foram descritas. Anticorpos biespecíficos foram produzidos, porexemplo, utilizando zíppers de leucina. Kostelny et ai, J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Os peptídeos de zípper de leucina das proteínas Fos e Junforam ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes por meio de fusãogênica. Os homodímeros de anticorpos foram reduzidos na região dearticulação para formar monômeros e, em seguida, novamente oxidados paraformar os heterodímeros de anticorpos. Este método pode também ser utilizadopara a produção de homodímeros de anticorpos. A tecnologia de "diacorpo"descrita por Hollinger et aí., Proc. Nati Acad. Sei. USA, 90: 6444-6448 (1993)forneceu um mecanismo alternativo para a fabricação de fragmentos deanticorpos biespecíficos. Os fragmentos compreendem um domínio variável decadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) porum Iigante que é curto demais para permitir o emparelhamento entre os doisdomínios sobre a mesma cadeia. Conseqüentemente, os domínios VH e VL deum fragmento são forçados a emparelhar-se com os domínios VL e VHcomplementares de outro fragmento, de maneira a formar dois sítios de ligaçãode antígenos. Outra estratégia de fabricação de fragmentos de anticorposbiespecíficos utilizando dímeros Fv de cadeia simples (sFv) também foirelatada. Vide Gruber et ai, J. Immunol., 152: 5368 (1994).
São contemplados anticorpos com mais de duas valências.Podem ser preparados, por exemplo, anticorpos triespecíficos. Tutt et ai, J.Immunol. 147: 60 (1991).
Anticorpos Multivalentes
Um anticorpo multivalente pode ser internalizado (e/oucatabolizado) mais rapidamente que um anticorpo bivalente por uma célula queexpresse um antígeno ao qual os anticorpos se ligam. Os anticorpos de acordocom a presente invenção podem ser anticorpos multivalentes (que sãodiferentes dos da classe IgM) com três ou mais sítios de ligação de antígenos(por exemplo, anticorpos tetravalentes), que podem ser facilmente produzidosatravés da expressão recombinante de ácido nucléico que codifica cadeias depolipeptídeo do anticorpo. O anticorpo multivalente pode compreender umdomínio de dimerização e três ou mais sítios de ligação de antígeno. O domíniode dimerização preferido compreende (ou consiste de) uma região Fc ou umaregião de articulação. Nessas condições, o anticorpo compreenderá umaregião Fc e três ou mais sítios de ligação de antígenos amino-terminais para aregião Fe (deve ser Fe). O anticorpo multivalente preferido do presentecompreende (ou consiste de) três a cerca de oito, mas preferencialmente,quatro sítios de ligação de antígenos. O anticorpo multivalente compreendepelo menos uma cadeia polipeptídica (e, preferencialmente, duas cadeiaspolipeptídicas), em que a(s) cadeia(s) polipeptídica(s) compreende(m) 2 oumais domínios variáveis. A(s) cadeia(s) polipeptídica(s) pode(m) compreender,por exemplo, VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, no qual VD1 é um primeiro domíniovariável, VD2 é um segundo domínio variável, Fc é uma cadeia polipeptídica deuma região Fe, X1 e X2 representam um aminoácido ou polipeptídeo e η é 0 ou1. A(s) cadeia(s) polipeptídica(s) pode(m) compreender, por exemplo: cadeiaVH-CH1-ligação flexível-VH-CH1-região Fc; ou cadeia VH-CH1-VH-CH1-regiãoFe. O anticorpo multivalente da presente invenção compreende adicionalmentede pelo menos dois (preferencialmente quatro) polipeptídeos de domíniovariável de cadeia leve. O anticorpo multivalente da presente invenção podecompreender, por exemplo, cerca de dois a cerca de oito polipeptídeos dedomínio variável de cadeia leve. Os polipeptídeos de domínio variável decadeia leve, contemplados na presente invenção, compreendem um domíniovariável de cadeia leve e, opcionalmente, um domínio CL.
Anticorpos Variantes
Em alguns exemplos, é(são) contemplada(s) modificação(ões)na(s) seqüência(s) de aminoácido(s) dos anticorpos descritos no presente. Porexemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outraspropriedades biológicas do anticorpo. Variantes da seqüência de aminoácidodo anticorpo são preparados pela introdução de nucleotídeos adequadosmodificando o ácido nucléico do anticorpo, ou pela síntese de peptídeo. Taisalterações incluem, por exemplo, supressão, e/ou inserção e/ou substituição,de resíduos dentro das seqüências de aminoácido do anticorpo. Qualquercombinação de deleção, inserção ou substituição podem ser feitas para sechegar a construção final, desde que o produto final tenha as característicasdesejadas. As alterações nos aminoácidos podem ser introduzidas no anticorpono momento em que seqüência é feita.
Um método útil de identificação de certos resíduos ou regiões doantagonista que são locais preferidos para mutagênese é denominado"mutagênese de varredura de alanina", conforme descrito por Cunningham eWells, Science, 244: 1081-1085 (1989). Aqui, um resíduo ou grupo de resíduosalvo é identificado (por exemplo, resíduos carregados, tais como arg, asp, his,lys e glu) e substituído por um aminoácido neutro ou negativamente carregado(de maior preferência alanina ou polialanina) para afetar a interação dosaminoácidos com antígeno. Esses locais de aminoácidos que demonstramsensibilidade funcional às substituições são refinados em seguida pela introduçãode outras variantes ou variantes adicionais nos sítios de substituição ou para estes.Desta forma, embora o sítio para introdução de uma variação de seqüência deaminoácidos seja previamente determinado, a natureza intrínseca da mutação nãonecessita ser previamente determinada. Para analisar o desempenho de umamutação em um dado sítio, por exemplo, varredura de ala ou mutagênese aleatóriaé conduzida no códon ou região alvo e as variantes de antagonistas expressas sãoselecionadas para a atividade desejada.
As inserções de seqüências de aminoácidos incluem fusões decarbóxi e/ou amino-terminal que variam de comprimento de um resíduo atépolipeptídeos que contenham cem ou mais resíduos, bem como inserçõesintra-seqüenciais de resíduos de aminoácidos isolados ou múltiplos. Exemplosde inserções terminais incluem um antagonista com um resíduo de metionila N-terminal ou o anticorpo fundido a um polipeptídeo citotóxico. Outras variantesde inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão ao N- ou C-terminal doanticorpo para uma enzima (por exemplo, para ADEPT) ou um polipeptídeoque aumente a meia vida do anticorpo no soro.Glicosilação de polipeptídeos é tipicamente tanto N-Iigada quantoO-ligada. N-Iigada refere-se à ligação da unidade de carboidrato à cadeialateral de um resíduo de asparagina. As seqüências de tripeptídeosasparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, em que X é qualquer aminoácidoexceto prolina, são as seqüências de reconhecimento para a ligaçãoenzimática da unidade de carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Destaforma, a presença de qualquer destas seqüências de tripeptídeos nopolipeptídeo cria um sítio de glicosilação potencial. Glicosilação O-Iigadarefere-se à ligação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose, ouxilose a um hidroxiaminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser utilizados.
A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é acompanhada,de forma conveniente, pela alteração da seqüência de aminoácido de forma aseqüência conter uma ou mais das seqüências de tripeptídeos descritas acima(para sítios de glicosilação N-ligados). A alteração pode também ser feitaatravés da adição de, ou substituição por, um ou mais resíduos de serina outreonina à seqüência do anticorpo ou polipeptídeo original (para sítios deglicosilação O-ligados).
Quando o anticorpo compreende uma região Fc, os carboidratosligados a estes podem ser alterados. Por exemplo, anticorpos com umaestrutura de carboidratos maduros que carecem de fucose anexada a umaregião Fc do anticorpo são descritos no pedido de Patente US 2003/0157108(Presta, L.). Vide também US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd).Anticorpos com uma N-acetilglucosamina cortada (GIcNAc) nos carboidratosassociados a uma região Fc do anticorpo são referenciados no documento WO2003/011878, Jean-Mairet et ai e Patente US 6.602.684, Umana et al.Anticorpos com pelo menos um resíduo galactose no oligossacarídeo anexadoa uma região Fc do anticorpos está descrito no documento WO 1997/30087,Patel et al. Vide também, o documento WO 1998/58964 (Raju, S.) e WO1999/22764 (Raju, S.), relativo a anticorpos com alterações nos carboidratosassociadas à região Fc. Vide também US 2005/0123546 (Umana et al.) emmoléculas ligadas a antígenos com glicosilação modificada.
A glicosilação variante preferida no presente compreende em umaregião Fc1 onde uma estrutura de carboidrato associada à região Fc carece defucose. Tais variantes resultam em uma melhor função ADCC. Opcionalmente,a região Fc inclui ainda um ou mais substituições aminoácidos que melhoramainda mais a função ADCC, por exemplo, substituições nas posições 298, 333,e/ou 334 da região Fc (numeração de resíduos UE). Exemplos de publicaçõesrelacionadas com anticorpos "defucosilados" ou "com deficiência de fucose"incluem: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; W02005/053742; Okazakiet ai J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et ai Biotech.Bioeng. 87: 614 (2004). Exemplos de linhagens celulares que produzemanticorpos defucosilados incluem células Lecl 3 CHO deficiente na fucosilaçãode proteína (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); Pedidode Patente US 2003/0157108 A1, Presta, L; e documento WO 2004/056312A1, Adams et ai, Especialmente no Exemplo 11), e linhagens celularesknockout, tais como gene alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8, células CHOknockout (Yamane-Ohnuki et ai Biotech. Bioeng. 87 : 614 (2004)).
Outro tipo de variante é uma variante de substituição deaminoácidos. Estas variantes contêm pelo menos um resíduo de aminoácidona molécula de anticorpo substituída por um resíduo diferente. Os sítios demaior interesse para mutagênese de substituição incluem as regiõeshipervariáveis, mas também são contempladas alterações de FR. Substituiçõesconservadoras são exibidas na Tabela 1 sob o título de "substituiçõespreferidas". Caso essas substituições resultem em mudança da atividadebiológica, então mudanças mais substanciais, denominadas "exemplos desubstituições" na Tabela 1, ou conforme descrito adicionalmente abaixo comreferência a classes de aminoácidos podem ser introduzidas e os produtos sãoselecionados.
Tabela 1
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Modificações substanciais das propriedades biológicas doanticorpo são atingidas por meio da seleção de substituições que diferemsignificativamente no seu efeito sobre a manutenção (a) da estrutura da cadeiaprincipal de polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, na forma defolha ou em conformação helicoidal; (b) da carga ou hidrofobicidade damolécula no sítio desejado; ou (c) do volume da cadeia lateral. Os resíduos deocorrência natural podem ser divididos em grupos com base nas propriedadescomuns da cadeia lateral.
(1) Hidrofílicos: Norleucina, Met1 Ala, Vai, Leu, lie;
(2) Hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr1 Asn, Gln;
(3) Ácido: Asp, Glu;
(4) Básico: His, Lys, Arg;
(5) Resíduos que influenciam na orientação das cadeias: Gly, Pro;
(6) Aromático: Trp1 Tyr, Phe.
Substituições não-conservadoras causarão a substituição de ummembro de uma dessas classes por outra classe.
Um tipo particularmente preferido de variante de substituiçãoenvolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de umanticorpo parental (por exemplo, anticorpo humano e humanizado).Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para desenvolvimentoadicional terá(ão) propriedades biológicas modificadas (por exemplo,aprimoradas) com relação ao anticorpo parental do qual é(são) gerado(s).Resumidamente, diversos sítios de regiões hipervariáveis (por exemplo, 6 a 7sítios) sofrem mutações para gerar todas as substituições amino possíveis emcada sítio. Os anticorpos assim gerados são exibidos a partir de partículas defagos fiiamentosos fundidos ao produto do gene Ill de M13 em cada partícula.As variantes exibidas por fago são, então, selecionadas de acordo com a suaatividade biológica (por exemplo, afinidade de ligação) conforme descrita napresente invenção. A fim de identificar possíveis sítios de regiões hipervariáveispara modificação, mutagênese por varredura de alanina pode ser realizadapara identificar resíduos de regiões hipervariáveis que contribuemsignificativamente para a ligação de antígenos. Alternativamente ouadicionalmente, pode ser benéfico analisar a estrutura cristalina do complexoantígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e oantígeno. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos são candidatos àsubstituição de acordo com as técnicas elaboradas no presente. Após ageração de tais variantes, o quadro de variantes é submetido à seleçãoconforme descrito na presente invenção e os anticorpos com propriedadessuperiores em um ou mais testes relevantes podem ser selecionados paradesenvolvimento adicional.
Moléculas de ácidos nucléicos que codificam variantes daseqüência de aminoácidos do anticorpo são preparadas por meio de uma sériede métodos conhecidos no estado da técnica. Estes métodos incluem, mas nãose limitam a, o isolamento a partir de uma fonte natural (no caso de variantesde seqüências de aminoácidos de ocorrência natural) ou preparação por meiode mutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou sítio-dirigida), mutagênesepor PCR e cassete de mutagênese de uma variante preparada anteriormenteou uma versão não-variante do anticorpo.Pode ser desejável introduzir uma ou mais modificações deaminoácidos em uma região Fc do peptídeo de imunoglobulina da invenção,gerando assim uma região Fc variante. A região Fc variante humana podecompreender uma seqüência região Fe (por exemplo, região Fc da IgGI, IgG2,IgG3 ou IgG4) que inclui uma modificação de aminoácido (por exemplo, umasubstituição) em um ou mais posições de aminoácidos incluindo o de umacisteína da dobradiça.
De acordo com esta descrição e os ensinamentos no estado datécnica, é contemplado que, em alguns exemplos, um anticorpo da invençãopode constar de uma ou mais alterações em comparação com o anticorpohomólogo do tipo selvagem, por exemplo, na região Fc. Estes anticorpos,porém, mantém sensivelmente as mesmas características exigidas para autilidade terapêutica, comparativamente ao seu homólogo do tipo selvagem.Por exemplo, podem ser feitas algumas alterações na região Fc, que alteraram(isto é, ou melhoram ou diminuem) a ligação ao C1q e/ou a citotoxicidadedependente do complemento (CDC), por exemplo, como descrito nodocumento WO99/51642. Vide também Duncan e Winter, Nature 322:738-40(1988); Patente US 5648260; Patente US. 5624821, e documento W094/29351relativas a outros exemplos de região Fc variantes. WO00/42072 (Presta) eWO 2004/056312 (Lowman) descrevem variantes de anticorpos com ligação aoFcRs melhorada ou diminuída. O conteúdo dessas publicações de patentessão especificamente incorporadas ao presente pela referência. Vide, também,Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001). Anticorpos com a meiavida aumentada e ligação ao receptor Fc neonatal (FcRn) melhorada, que éresponsável pela transferência de IgGs matenos para o feto (Guyer et al., J.Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al. , J. Immunol. 24:249 (1994)), sãodescritos na Patente US 2005/0014934A1 (Hinton et al.). Estes anticorpos Fcconstam de uma região com uma ou mais substituições que melhoram aligação da região Fc ao FcRn. Variantes de polipeptídeos com a sequencias deaminoácidos da região Fc alteradas e capacidade de ligação ao C1qaumentada ou diminuída são descritos na Patente US 6194551B1, documentoW099/51642. O conteúdo dessas publicações de patentes sãoespecificamente incorporadas ao presente pela referência. Vide, também,Idusogie et ai. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
Anticorpos Derivativos
Os anticorpos da invenção podem ainda ser modificados paraconter moléculas adicionais não-proteinácias que são conhecidos na técnica eprontamente disponíveis. Moléculas preferenciais adequadas paraderivatização do anticorpo são polímeros hidrossolúveis. Exemplos nãoIimitantes de polímeros hidrossolúveis incluem, mas não se limitando a,polietilenoglicol (PEG)1 copolímeros de etileno-glicol/propilenoglicol,carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, policloreto pirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero etileno/maleica anidrido,poliaminoácidos (homopolímeros ou copolímeros aleatórios), e dextrano ou poli(n-vinil pirrolidona) polietileno-glicol, homopolímeros de propropileno glicol, co-polímeros de oxido de prolipropileno óxido de etileno, poliálcool polióis (porexemplo, glicerol), álcool polivinílico, e suas misturas. O polietilenoglicolpropionaldeído pode ter vantagens no processo de fabricação devido à suaestabilidade na água. O polímero pode ser de qualquer peso molecular, e podeser ramificada ou sem ramificação. O número de polímeros acoplados poranticorpo pode variar, e se mais de um polímero encontra-se anexo, ospolímeros podem ser a mesma molécula ou moléculas diferentes. Em geral, onúmero e/ou tipo de polímeros utilizado para derivatização pode serdeterminado com base em considerações, incluindo mas não limitado-se a,propriedades específicas ou funções do anticorpo de ser melhorado, se osanticorpos derivados serão utilizados no âmbito de uma terapia, etc.Seleção De Anticorpos Com Propriedades Desejadas
Os anticorpos da presente invenção podem ser caracterizados porsuas propriedades física/ químicas e funções biológicas em diversos ensaiosconhecido no estado da técnica. Em alguns exemplos de realização, osanticorpos são caracterizados por qualquer um ou mais de redução ou bloqueioda ativação do EphB4, redução ou bloqueio da via de sinalização molecular àjusante de EphB4, redução ou bloqueio de ativação do Iigante de EphB4,redução ou bloqueio da via de sinalização molecular à jusante do Iigante deEphB4, distúrbio ou bloqueio do Iigante (por exemplo, efrina-B1, efrina-B2, e/ouefrina-B3) ligado a EphB4, fosforilação de EphB4 e/ou multimerização deEphB4, e/ou fosforilação do Iigante de EphB4, e/ou tratamento e/ou prevençãode um tumor, distúrbio da proliferação celular ou câncer, e/ou tratamento ouprevenção de uma patologia associada com a expressão e/ou atividade deEphB4 (como o aumento da expressão e/ou atividade de EphB4).
Os anticorpos purificado podem ser ainda caracterizados por umasérie de ensaios, incluindo, mas não se limitado a, seqüenciamento do N-terminal, análise de aminoácidos, exclusão por tamanho sem desnaturalizaçãopor cromatografia líquida de alta pressão (HPLC), espectrometria de massa,cromatografia de troca iônica e digestão por papaína.
Em certos exemplos de realização da invenção, os anticorposproduzidos no presente são analisados pela sua atividade biológica. Em algunsexemplos de realização, os anticorpos da presente invenção são testados pelasua atividade de ligação ao antígeno. Os ensaios de ligação ao antigeno quesão conhecidos no estadop da técnica podem ser usados no presente eincluem, sem se limitar, a qualquer ensaio de ligação competitiva direta ouatravés de técnicas como western blot, radioimunoensaios, ELISA (ensaio deimunoabsorção enzimática), imunoensaios "sanduíche", ensaios deimunoprecipitação, imunoensaios fluorescentes e imunoensaios de proteínas A.Um ensaio de ligação ao antígeno é ilustrado abaixo na seção dos exemplos.
Em outra exemplo de realização, a invenção fornece anticorposmonoclonais anti-EphB4 que competem com anticorpos 30.35, 30.35.1 D2 e/ouanticorpo 30.35.2D8 pela ligação ao EphB4. Tais anticorpos competidoresincluem anticorpos que reconhecem um epítopo EphB4 que é o mesmo ousobrepõem com o epítopo de EphB4 reconhecido pelo anticorpo 30,35,30.35.1 D2 e/ou 30.35.2D8. Esses anticorpos concorrentes podem ser obtidospelo rastreio de anti- anti-EphB4 no sobrenadante de hibridomas que se ligamao EphB4 imobilizado, concorrendo com os anticorpos 30.35, 30.35.1D2 e/ou30.35.2D8 marcados. Um sobrenadante de hibridoma contendo anticorposconcorrentes reduzirá a quantidade de ligação dos anticorpos marcadosdetectados na mistura de competição de ligação do ensaio em comparaçãocom a quantidade de ligação de anticorpos marcados detectados em umamistura de ligação controle contendo anticorpos irrelevantes (ou não). Qualquerum dos ensaios de competição de ligação descritos no presente sãoadequados na utilização dos processos precedentes.
Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo monoclonalanti-EphB4 que compreende um ou mais (tal como 2, 3, 4, 5, e/ou 6) HVRs dosanticorpos 30.35, 30.35.1D2 ou 30.35.2D8. Um anticorpo monoclonal anti-EphB4 que compreende um ou mais HVR (s) de 30.35, 30.35.1D2 e/ou30.35.2D8 pode ser construída por um ou mais enxertos de HVR(s) do 30.35,30.35.1D2 e/ou 30.35.2D8 em uma seqüência modelo de anticorpo, porexemplo, uma seqüência de anticorpo humano que é o mais próximo daseqüência correspondente murina do anticorpo parental, ou uma seqüênciaconsenso de todos os anticorpos humanos, em particular o subgrupo doanticorpo parental de cadeia leve ou pesada, e a(s) seqüência(s) resultante(s)quimérica(s) da região variável da cadeia leve e pesada expressa, com ou semacompanhamento da(s) seqüência(s) da região constante, em célulashospedeiras recombinantes como descrito no presente.
Anticorpos anti-EphB4 da invenção que possuem propriedadesúnicas descritas no presente podem ser obtidas pelo rastreio de anti-EphB4 emclones de hibridomas para as propriedades desejadas por qualquer métodoconveniente. Por exemplo, se um anticorpo monoclonal anti-EphB4 quebloqueia ou não a ligação dos Iigantes de EphB4 ao EphB4 é desejado, oanticorpo candidato pode ser testado em um teste de ligação por concorrência,como uma competição de ligação por ELISA, onde poços são revestidos comEphB4, e uma solução de anticorpo em um excesso do Iigante de Eph deinteresse é colocado nas placas revestidas, e o anticorpo ligado éenzimaticamente detectado, por exemplo, expondo o anticorpo ligado com umanticorpo anti-lgG conjugado com HRP ou anticorpo anti-lg biotinilado edesenvolvimento da reação de cor com HRP., por exemplo, através dodesenvolvimento de placas com estreptoavidina-HRP e/ou peróxido dehidrogênio e detectando a reação de cor do HRP por espectrofotometria a 490nm com um leitor de placa de ELISA.
Se um anticorpo anti-EphB4 que inibe ou ativa a ativação deEphB4 é desejado, o anticorpo candidato pode ser um testado em um ensaiode fosforilação de EphB4. Esses ensaios são conhecidos no estado da técnicae tal ensaio é descrito na seção de Exemplos.
Se um anticorpo anti-EphB4 que inibe o crescimento de células édesejado, o anticorpo candidato pode ser testado em ensaios in vitro e/ou invivo que mensurem a inibição do crescimento celular. Esses ensaios sãoconhecidos no estado da técnica e são discutidos em maior profundidade eexemplificados no presente.
Em um exemplo de realização, a invenção contempla umanticorpo modificado que possuí alguma, mas não todas as funções efetoras,que torna este anticorpo um candidato desejável para muitas aplicações noqual a meia vida do anticorpo in vivo é importante ainda que certas funçõesefetoras (como complemento e ADCC) são desnecessárias ou prejudiciais. Emcertos exemplos de realização, as atividades Fc do anticorpo são medidas paraassegurar que só as propriedades desejadas sejam mantidas. Um ensaio decitotoxicidade in vitro ou in vivo pode ser conduzido para confirmar a redução /depleção dos CDC e/ou atividades ADCC. Por exemplo, ensaios de ligaçãocom o receptor Fc (FcR) podem ser realizados a fim de garantir que o anticorponão tenha ligação ao FcyR (e portanto carece da atividade ADCC), masmantém a capacidade de ligação ao FcRn. As células primárias para amediação de ADCC, células NK, expressam unicamente FcyRIII, enquantomonócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR sobrecélulas hematopoiéticas é resumida na Tabela 3, pág. 464, de Ravetch e Kinet,Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Um exemplo de ensaio para sedeterminar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, está descritona Patente US 5.500.362 ou US 5.821.337. Células efetoras úteis para essestestes incluem células mononucleares sangüíneas periféricas (PBMC) e célulasNatural Killers (NK). Alternativa ou adicionalmente, a atividade de ADCC damolécula de interesse pode ser determinada in vivo, tal como em um modeloanimal como o descrito em Clynes et ai, PNAS (USA) 95: 652-656 (1998).
Ensaios de ligação de C1q também podem ser realizados para confirmar que oanticorpo é incapaz de se ligar a C1q e, portanto, carece de atividade CDC.Para determinar a ativação do complemento, pode ser realizado um ensaioCDC, conforme descrito, por exemplo, em Gazzano-Santoro et ai, J. immunol.Methods, 202: 163 (1996). A determinação da ligação de FcRn e a depuração/meia vida in vivo também pode ser realizada utilizando métodos conhecidos noestado da técnica, por exemplo, com descrito na seção de exemplos.
Vetores. Células Hospedeiras E Métodos Recombinantes
Para a produção recombinante de um anticorpo da invenção, osácidos nucléicos que codificadores são isolados e inseridos em um vetorreplicável para a clonagem (amplificação do DNA) ou para a expressão.Codificando o DNA o anticorpo é facilmente isolado e seqüenciado utilizandoprocedimentos convencionais (por exemplo, pela utilização de sondas deoligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente aos genescodificadores das cadeias leves e pesadas do anticorpo). Muitos vetores estãodisponíveis. A escolha do vetor depende em parte da célula hospedeira queserá utilizada. Células hospedeiras geralmente preferidas incluem, mas semlimitar-se a, células de origem procariótica ou eucariótica (geralmente demamíferos). Será apreciado que regiões constante de qualquer isotipo possamser utilizados para este fim, incluindo as regiões constantes de IgG1 IgM1 IgA1IgD e IgE1 e que tais regiões constantes possam ser obtidas a partir de humanoou qualquer espécie animal.
A. Produção De Anticorpos Utilizando Células HospedeirasProcarióticas
I Construção De Vetores
Seqüências polinucleotídicas codificadoras de polipeptídeoscomponentes do anticorpo da invenção podem ser obtidas utilizando técnicaspadrões de recombinação. As seqüências polinucleotídicas desejadas podemser isoladas e seqüenciadas de células produtoras de anticorpos, como célulasde hibridomas. Alternativamente, polinucleotídeos podem ser sintetizadosutilizando sintetizadores de polinucleotídeos ou técnicas de PCR. Uma vezobtido, as seqüências codificadoras de polipeptídeos são inseridas em umvetor recombinante capaz de replicar e expressar os polinucleotídeosheterólogos em hospedeiros procarióticos. Muitos vetores que estãodisponíveis e são conhecidos no estado da técnica podem ser utilizados paraos fins da presente invenção. A seleção de um vetor apropriado vai dependerprincipalmente do tamanho dos ácidos nucléicos a serem inseridos no vetor e acélula hospedeira específica a ser transformada com o vetor. Cada vetorcontém diversos componentes, dependendo de sua função (amplificação ouexpressão de polinucleotídeos heterólogos, ou ambos), e de suacompatibilidade coma a célula hospedeira particular na qual reside. Oscomponentes dos vetores geralmente incluem, mas não estão limitados a: umaorigem de replicação, um gene marcador de seleção, um promotor, um local deligação do ribossomo (RBS), um seqüência sinalizadora, a inserção do ácidonucléico heterólogo e uma seqüência de terminação de transcrição.
Geralmente, vetores plasmidiais recombinantes que contêmseqüências de controle e replicon que são derivadas de espécies compatíveiscom a célula hospedeira são utilizados na conexão com estas hospedeiras. Ovetor normalmente conduz como componentes da cadeia principal uma origemde local de reprodução, bem como seqüências de marcação que são capazesde fornecer seleção fenotípica em células transformadas. Por exemplo, a E.co//',é tipicamente, transformada utilizando um pBR322, um plasmídeo obtido apartir de uma espécie E. coli. pBR322 que possui os genes que conferem aresistência a ampicilina (Amp) e a tetraciclina (Tet) e, portanto, fornece meiospara a identificação de células transformadas. As pBR322, seus derivados, ououtros plasmídeos microbianos ou bacteriófagos também podem conter, ouserem modificados por, promotores, que podem ser utilizados pelo organismomicrobiano para a expressão de proteínas endógenas. Exemplos de derivadosde pBR322 utilizados para a expressão de anticorpos específicos são descritosem detalhes em Carter et al, Patente US 5.648.237.
Além disso, vetores de fagos que contêm seqüências de controlee de réplica que são compatíveis com o microorganismo hospedeiro podem serutilizados como vetores de transformação em conexão com esses hospedeiros.Bacteriófago tal como ÀGEM.TM.-11, por exemplo, pode ser utilizado nafabricação de vetor recombinante que pode ser utilizado para transformarcélulas hospedeiras suscetíveis tais como a E. coli LE392.
O vetor de expressão da invenção pode incluir dois ou mais parespromotores de cístrons, codificando cada componente do polipeptídeo. Opromotor é uma seqüência de regulação não traduzida localizada à montante(5') de um cístron que modula a sua expressão. Promotores de procariotosgeralmente se enquadram em duas classes, os induzíveis e os constitutivos.
Os promotores induzíveis são promotores que iniciam níveis aumentados detranscrição do cístron sob seu controle em resposta a mudanças na condiçãode cultura, por exemplo, a presença ou ausência de um nutriente ou de umamudança na temperatura.
Uma grande quantidade de promotores é reconhecida por umasérie de células hospedeiras potenciais. O promotor selecionado pode estaroperavelmente ligado a um DNA cístron que codifica a cadeia leve ou pesada,ao remover o promotor do DNA fonte por meio de enzimas de restrição einserindo a seqüência do promotor isolado no vetor da invenção. Tanto aseqüência promotora nativa e muitos promotores heterólogos podem serutilizados para direcionar a amplificação, pois eles geralmente permitem maiortranscrição e rendimentos mais altos do gene alvo expresso, quandocomparado com o promotor nativo.
Os promotores apropriados para uso com hospedeirosprocarióticos incluem o promotor phoA, sistemas promotores de Iactose e β-lactamase, sistema promotor de triptofano (trp) e promotores híbridos, taiscomo o promotor tac ou trc. Entretanto, outros promotores que são funcionaisem bactérias (tais como outros promotores de fagos ou bacterianosconhecidos) também são apropriados. Suas seqüências de nucleotídeos forampublicadas, de forma a permitir que os técnicos no assunto as liguemoperativamente a unidades de transcrição que codificam cadeias leves epesada alvo (Siebenlist et al, Cell, 20: 269 (1980)) utilizando Iigantes ouadaptadores para fornecer quaisquer locais de restrição necessários.
Em um aspecto da invenção, cada cístron no vetor recombinantecompreende um componente da seqüência sinalizadora de secreção que levaa translocação dos polipeptídeos expressos através de uma membrana. Deforma geral, a seqüência sinalizadora pode ser um componente do vetor oupode ser uma parte do DNA do polipeptídeo alvo que é inserido no vetor. Aseqüência sinalizadora de secreção selecionada para os propósitos de acordocom a presente invenção deverá ser uma que seja reconhecida e processada(ou seja, clivada por uma peptidase sinalizadora I) pela célula hospedeira. Paracélulas hospedeiras procarióticas que não reconhecem e processam asseqüências sinalizadora nativas para os polipeptídeos heterólogos, a seqüênciasinalizadora é substituída por uma seqüência sinalizadora procarióticaselecionada, por exemplo, a partir do grupo que consiste de fosfatase alcalina,penicilinase, Ipp ou líderes de enterotoxina Il estáveis ao calor (STII)1 LamB,PhoE, PeIB, OmpA e MBP. Em um exemplo de realização, a seqüênciasinalizadora utilizada em ambos os cístrons do sistema de expressão é umaseqüência sinalizadora STII ou variante desta.
Em outro aspecto, a produção de imunoglobulinas pode ocorrerno citoplasma das células hospedeiras, e assim não necessitando da presençadas seqüências sinais de secreção dentro de cada cístron. A este respeito, acadeia leve e pesada da imunoglobulina são expressas, em dobro e reunidaspara formar imunoglobulinas funcionais no citoplasma. Determinadas linhagensde células hospedeiras (por exemplo, cepas de E.Coli trxB) fornecemcondições citoplásmicas que favorecem a formação de pontes de dissulfeto,permitindo desta forma a dobradiça e reunião apropriada das subunidades dasproteínas expressas. (Proba e Plukthun1 Gene, 159:203(1995)).
As células hospedeiras procariontes apropriados para estepropósito incluem arquebactéria e eubactérias, tais como organismos gram-negativos ou gram-positivos. Exemplos de bactérias úteis incluem Escherichia(por exemplo, E. coli), bacilos (por exemplo, B. subtilis), Enterobactérias,espécies de Pseudomonas (por exemplo, Pseudomonas aeruginosa),Salmonella Typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella,Rhizóbia, Vitreoscilla ou Paracoccus. Em um exemplo de realização, célulasgram-negativas são usadas. Em um exemplo de realização, células E. coli sãousadas como hospedeiras para a invenção. Exemplos incluem cepas de E. colicepa W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biolopy. vol. 2 (Washington,D.C.: American Society for Microbiology, 1987), págs. 1190-1219; DepósitoATCC No. 27325) e seus derivados, incluindo as cepas 33D3 possuindo osgenótipos W3110 Δ fhuA (Δ tonA) ptr3 Iac Iq lacL8 Δ ompT Δ (nmpc-fepE)degP41 kanR (Patente US 5.639.635). Outras cepas e seus derivados, taiscomo E. coli 294 (ATCC 31446), E. coli Β, E. coli 1776 (ATCC 31537) e E. coliRV308 (ATCC 31608) também são adequadas. Estes são exemplospreferencialmente ilustrativos do que limitadores. Métodos para a construçãode derivados de qualquer uma das bactérias acima mencionadas que possuemo genótipo definido são conhecidas no estado da técnica, por exemplo, emBass et ai, Proteins, 8:309-314 (1990). Geralmente é necessário selecionar asbactérias adequadas levando em consideração a replicabilidade do repliconnas células bacterianas. Por exemplo, as espécies E. coli, Serratia ouSalmonella podem ser devidamente utilizadas como hospedeiras, quandoplasmídeos bem conhecidos, tais como os plasmídeos pBR322, pBR325,pACYC177 ou pKN410 são utilizados para a construção do replicon.Normalmente a célula hospedeira deve secretar quantidades mínimas deenzimas proteolíticas, e adicionalmente inibidores da protease podem serincorporadas na cultura celular.
Il Produção de Anticorpos
As células hospedeiras são transformadas com os vetores deexpressão descritos acima e cultivadas em meios nutrientes convencionaismodificados conforme apropriado para a indução de promotores, seleção detransformadores ou amplificação dos genes que codificam as seqüênciasdesejadas.
Transformação significa a introdução de DNA em hospedeiroseucarióticos a fim de que o DNA seja replicável, quer como um elemento extra-cromossômico ou integrado ao cromossomo. Dependendo da célulahospedeira utilizada, a transformação é feita utilizando técnicas padrãoadequada para tais células. O tratamento com cálcio empregando cloreto decálcio é geralmente utilizado para células bacterianas que contêm paredecelular. Outro método de transformação emprega polietileno-glicol / DMSO.Outra técnica ainda utilizada é eletroporação.
As células procarióticas utilizadas para produzir os polipeptídeos deacordo com a presente invenção são cultivadas em meios conhecidos na técnica esão apropriadas para cultivo das células hospedeiras selecionadas. Exemplos demeios apropriados incluem caldo Iuria (LB) mais os suplementos nutrientesnecessários. Em realizações preferidas, os meios também contêm um agente deseleção, selecionado com base na construção do vetor de expressão, para permitirseletivamente o crescimento de células procarióticas que contenham o vetor deexpressão.A ampicilina é adicionada aos meios, por exemplo, para crescimento decélulas que expressam o gene resistente à ampicilina.
Quaisquer suplementos necessários além de fontes de carbono,nitrogênio e fosfato inorgânico podem também ser incluídos em concentraçõesapropriadas introduzidas isoladamente ou na forma de mistura com outrosuplemento ou meio, tal como fonte de nitrogênio complexa. Opcionalmente, omeio de cultivo pode conter um ou mais agentes redutores selecionados apartir do grupo que consiste de glutationa, cisteína, cistamina, tioglicolato,ditioeritritol e ditiotreitol.As células hospedeiras procarióticas são cultivadas sobtemperaturas apropriadas. Para crescimento da E. coli, por exemplo, atemperatura preferida varia em cerca de 20 0C a 39 0C1 de maior preferênciaentre 25 0C a 37 °C, e cerca de 30 °C. O pH do meio pode ser qualquer pH queentre 5 a 9, dependendo principalmente do organismo hospedeiro. Para a E.coli, o pH é preferencialmente cerca de 6,8 a 7,4, de preferencialmente é 7,0.
Se um promotor induzível é utilizado no vetor de expressão dainvenção, a expressão da proteína é induzida em condições adequadas para aativação do promotor. Em um aspecto da invenção, promotores PhoA sãousados para controlar a transcrição de polipeptídeos. Assim, as células sãocultivadas em um meio Iimitante de fosfato para a indução. Em exemplo derealização, o meio Iimitante de fosfato é o meio C.R.A.P. (vide, por exemplo,Simmons et al., J. Immunol. Methods. (2002), 263:133-147). Uma variedade deoutros indutores pode ser utilizada, de acordo com a construção do vetorutilizado, como é conhecido no estado da técnica.
Em um exemplo de realização, os polipeptídeos da presenteinvenção expressos são segregados e recuperados do periplasma das célulashospedeiras. A recuperação de proteína envolve tipicamente o rompimento domicroorganismo, geralmente por meios tais como choque osmótico, sonicaçãoou lise. Após o rompimento das células, fragmentos celulares ou célulasinteiras podem ser removidas por meio de centrifugação ou filtragem. Asproteínas podem ser adicionalmente purificadas, por exemplo, porcromatografia de resina de afinidade. Alternativamente, as proteínas podem sertransportadas para o meio de cultivo e nele isoladas. As células podem serremovidas do cultivo e o sobrenadante de cultivo filtrado e concentrado parapurificação adicional do polipeptídeo produzido. Os polipeptídeos expressospodem ser adicionalmente isolados e identificados utilizando métodoscomumente conhecidos, tais como eletroforese de gel de poliacrilamida(PAGE) e teste Western Blot.
Em um aspecto da invenção, o anticorpo pode ser produzido emgrande quantidade por meio de processos de fermentação. Váriosprocedimentos de fermentação de alimentação de lotes em larga escala sãodisponíveis para a produção de proteínas recombinantes. As fermentações emlarga escala possuem capacidade de pelo menos 1000 litros, preferencialmentede 1000 a 100.000 litros de capacidade. Estes fermentadores utilizamimpulsionadores agitadores ou outros meios apropriados para distribuiroxigênio e nutrientes, especialmente glicose (uma fonte de carbono e energiacomum). A fermentação em pequena escala refere-se geralmente afermentação em fermentador que possui capacidade volumétrica de não maiorque cerca de 100 litros e pode variar de cerca de um 1 litro a 100 litros.
No processo de fermentação, a indução da expressão de proteínaé tipicamente iniciada após o crescimento das células sob condiçõesapropriadas até densidade desejada, tal como OD550 de cerca de 180 a 220 noqual as células estão no início da fase estacionária. Uma série de indutorespode ser utilizada, de acordo com a construção de vetor empregado, como éconhecido no estado da arte e descrito acima. As células podem ser cultivadaspor períodos mais curtos antes da indução. As células são normalmenteinduzidas por cerca de 12 a 50 horas, embora um tempo maior ou menor deindução possa ser utilizado.
Para aumentar adicionalmente o rendimento de produção e aqualidade do polipeptídeo da presente invenção, várias condições defermentação podem ser modificadas. Para melhorar a montagem e doanticorpo secretado, por exemplo, vetores adicionais que superexpressamproteínas chaperonas, tais como proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD e/ouDsbG) ou FkpA (peptidilprolil eis, trans-isomerase com atividade dechaperona), podem ser utilizados para co-transformar as células procarióticashospedeiras. Demonstrou-se que as proteínas de chaperona facilitam a formaçãode dobradiça e solubilidade adequadas de proteínas heterólogas produzidas emcélulas hospedeiras bacterianas. Chen et al, J. Bio. Chem., 274: 19601-19605(1999); Patentes US 6.083.715 e 6.027.888; Bothmann e Pluckthun1 J. Biol. Chem.,275: 17100-17105 (2000); Ramm e Pluckthun1 J. Biol. Chem., 275: 17106-17113(2000); Arie etal, Moi Microbiol., 39:199-210 (2001).
Para minimizar a proteólise de proteínas heterólogas expressas(especialmente as que são proteoliticamente sensíveis) tal como em célulashospedeiras procarióticas, certas linhagens hospedeiras com deficiência paraenzimas proteolíticas podem ser utilizadas para a presente invenção. Porexemplo, linhagens de células hospedeiras procarióticas podem sermodificadas para efetuar mutação(ões) genética(s) nos genes que codificamproteases bacterianas conhecidas, tais como Protease III, OmpT1 DegP, Tsp,TonA, PhoA, Protease I, Protease Mi1 Protease V, Protease Vl e suascombinações. Algumas linhagens de E. Coli com deficiência de protease sãodisponíveis e descritas, por exemplo, em Joly et al, (1998) supra; Georgiou etal. Patente US 5.264.365, Georgiou et al. Patente US 5.508.192; Hara et al,Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996).
Em um exemplo de realização, as cepas de E. coli deficientes deenzimas proteolíticas e transformadas com um ou mais plasmídeos quesuperexpressam proteínas chaperonas são utilizadas como célulashospedeiras no sistema de expressão da invenção.
III Purificação de Anticorpo
Podem ser empregados métodos padrões de purificação deproteínas conhecidos no estado de técnica. Os procedimentos a seguir sãoexemplos de procedimentos de purificação apropriados: através defracionamento em uma coluna de troca iônica; precipitação em etanol, HPLCde fase reversa; cromatografia em sílica ou em uma resina de troca catiônicatal como DEAE; cromatofocusação; SDS-PAGE; precipitação em sulfato deamônio; gel filtração utilizando, por exemplo, Sephadex G-75.
Em um aspecto, a proteína A imobilizada por uma fase sólida éutilizada para a purificação por imunoafinidade do anticorpo da invenção. Aproteína A é um proteína da parede celular de 41 kD do Staphylococcus áureosque se liga com alta afinidade a região Fc dos anticorpos. Lindmark1 et al.(1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13. A fase sólida para o qual a proteína A éimobilizada pode ser uma coluna que compreende uma superfície de vidro oude sílica, ou uma coluna de vidro porosa controlada ou coluna de ácido silícico.Em algumas aplicações, a coluna é revestida com um reagente, tal como oglicerol, possivelmente para evitar a aderência inespecífica de contaminantes.
Tal como a primeira etapa de purificação, a preparação derivadada cultura celular, como descrito acima pode ser aplicado a uma fase sólida deproteína A imobilizada para permitir a ligação do anticorpo específico deinteresse à proteína A. A fase sólida passaria então a ser lavada para removeros contaminantes não ligados especificamente à fase sólida. Por último, oanticorpo de interesse é recuperado da fase sólida por eluição.B - Produção de Anticorpo Utilizando Células Hospedeiras EucarióticasOs componentes do vetor geralmente incluem, mas sem se limitara, um ou mais dos seguintes: uma seqüência sinalizadora, uma origem dereplicação, um ou mais genes marcadores, um componente amplificador, umpromotor, e uma seqüência de terminação da transcrição.
(I) Componente De Seqüência SinalizadoraUm vetor para uso em uma célula hospedeira eucarióticastambém pode conter uma seqüência sinalizadora ou outro polipeptídeo quepossuí um sítio de clivagem específica no N-terminal da proteína oupolipeptídeo maduro de interesse. A seqüência sinalizadora heterólogaselecionada geralmente é aquela que é reconhecida e processada (ou seja,clivada por uma peptidase sinalizadora) pela célula hospedeira. Em células deexpressão de mamíferos, estão disponíveis as seqüências sinalizadora demamíferos, bem como líderes de secreção viral, tais como o sinal gD da herpessimplex.
O DNA para essa região precursora é ligado em estrutura deleitura a DNA codificador do anticorpo.
(II) Componente De Origem De ReplicacãoGeralmente, a origem do componente de replicação não énecessária para vetores de expressão em mamíferos. Por exemplo, a origemSV40 pode ser tipicamente utilizada somente porque contém o promotor inicial.
(HI) Componente Genético De SeleçãoOs vetores de clonagem e de expressão podem conter um genede seleção, também denominado marcador de seleção. Os genes de seleçãotípicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outrastoxinas, tais como ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina; (b)complementam deficiências autotróficas; ou (c) fornecem nutrientesfundamentais não-disponíveis no meio.
Um exemplo de esquema de seleção utiliza uma droga parainterromper o crescimento de uma célula hospedeira. As células que sãotransformadas com sucesso com um gene heterólogo que produz umaproteína que confere resistência a drogas e, desta forma, sobrevivem aoregime de seleção. Exemplos de tal seleção dominante utilizam as drogasneomicina, ácido micofenólico e higromicina.
Outro exemplo de marcadores de seleção apropriados paracélulas de mamíferos são os que permitem a identificação de célulascompetentes para a absorção do ácido nucléico de anticorpo, tal como DHFR,timidina quinase, metalotioneína-l e II, preferencialmente genes metalotioneínade primatas, adenosina deaminase, ornitina decarboxilase, e etc.Células transformadas com o gene de seleção DHFR1 porexemplo, são identificadas, em primeiro lugar, através do cultivo de todos ostransformantes em um meio de cultura que contenha metotrexato (Mtx),concorrente antagonista de DHFR. É utilizada uma célula hospedeiraapropriada que possuí DHFR do tipo selvagem, que é a linhagem celular deovário de hamster chinês (CHO) com deficiência na atividade de DHFR (porexemplo, ATCC CRL-9096).
Alternativamente, as células hospedeiras (particularmente, célulashospedeiras do tipo selvagem que contêm DHFR endógeno) transformadas ouco-transformadas com seqüências de DNA que codificam o anticorpo, aproteína DHFR do tipo selvagem e outro marcador selecionável tal comoaminoglicosídeo 3'-fosfotransferase (APH) podem ser selecionadas através decrescimento celular em um meio que contém um agente de seleção para omarcador selecionável tal como antibiótico aminoglicosídico, por exemplocanamicina, neomicina ou G418. Vide a Patente US 4.965.199.
(IV) Componente Promotor
Os vetores de clonagem e de expressão normalmente contêm umpromotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e é operacionalmenteligado ao ácido nucléico do polipeptídeo (por exemplo, um anticorpo). Asseqüências promotoras de eucariotos são conhecidas. São conhecidasseqüências promotoras para eucariontes. Virtualmente todos os geneseucariontes possuem uma região rica em AT localizada a cerca de 25 a 30bases a montante do sítio em que se inicia a transcrição. Outra seqüênciaencontrada a 70 até 80 bases a montante do início da transcrição de muitosgenes é uma região CNCAAT, em que N pode ser qualquer nucleotídeo. Naextremidade 3' da maioria dos genes eucariontes, encontra-se uma seqüênciaAATAAA que pode ser o sinal para adição da cauda poli A na extremidade 3'da seqüência codificadora. Todas essas seqüências são inseridas de formaapropriada em vetores de expressão eucarióticos.
A transcrição de polipeptídeos do anticorpo a partir de vetores emcélulas hospedeiras de mamíferos é controlada, por exemplo, por promotoresobtidos a partir dos genoma viral tais como vírus de polioma, vírus da catapora,adenovírus (tal como Adenovírus 2), vírus de papiloma bovino, vírus desarcoma aviário, citomegalovírus, retrovírus, vírus da hepatite B e, de maiorpreferência, Vírus Símio 40 (SV40), a partir de promotores de mamíferosheterólogos, tais como o promotor de actina ou um promotor deimunoglobulina, de promotores de choque térmico, desde que essespromotores sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras.
O promotor inicial e final do vírus SV40 são obtidosconvenientemente na forma de fragmento de restrição SV40 que tambémcontém a origem viral SV40 de replicação. O promotor inicial imediato docitomegalovírus humano é obtido convenientemente na forma de fragmento derestrição Hindlll E. Um sistema de expressão de DNA em hospedeirosmamíferos utilizando o vírus de papiloma bovino como vetor é descrito naPatente US 4.119.446. Uma modificação deste sistema é descrita na PatenteUS 4.601.978. Alternativamente, a repetição terminal longa de vírus dosarcoma de Rous pode ser utilizada como promotor.
(V) Componente Elemento Amplificador
A transcrição de um DNA codificador do polipeptídeo do anticorpode acordo com a presente invenção por eucariontes superiores éfreqüentemente aumentada através da inserção de uma seqüênciaamplificadora no vetor. Muitas seqüências amplificadoras são agoraconhecidas de genes de mamíferos (globina, elastase, albumina, a-fetoproteínae insulina). Tipicamente, entretanto, será utilizado um amplificador de um vírusde célula eucariótica. Exemplos incluem o amplificador SV40 sobre o ladoposterior da origem de replicação (bp 100-270), o amplificador promotor inicialde citomegalovírus, o amplificador de polioma sobre o lado terminal da origemde replicação e amplificadores de adenovírus. Vide também Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) sobre elementos de promoção para a ativação de promotoreseucarióticos. O amplificador pode também sofrer splicing no vetor na posição 5'ou 3' para a seqüência codificadora de anticorpo, mas encontra-se localizado,preferencialmente, em um sítio 5' do promotor.
(VI) Componente De Término De Transcrição
Os vetores de expressão utilizados em células hospedeiraseucariontes também irão conter seqüências necessárias para a terminação datranscrição e estabilização do mRNA. Ditas seqüências são normalmentedisponíveis a partir das regiões 5' não-traduzidas, ocasionalmente 3', dosDNAs ou cDNAs virais ou eucariontes. Estas regiões contêm segmentos denucleotídeos transcritos na forma de fragmentos poliadenilados na porção não-traduzida do mRNA codificador do anticorpo. Um componente de terminaçãode transcrição útil é a região de poliadenilação do hormônio de crescimentobovino. Vide o documento WO 94/11026 e o vetor de expressão nele descrito.
(VII) Seleção E Transformação De Células Hospedeiras
As células hospedeiras apropriadas para clonagem ou expressãodo DNA nos vetores do presente incluem as células eucarióticas superioresdescritas neste documento, incluindo células hospedeiras de vertebrados.Propagação de células hospedeiras de vertebrados em cultura (cultura detecido) tornou-se um procedimento rotineiro. Exemplos de linhagens de célulashospedeiras de mamíferos úteis são a linhagem CV1 de rim de macacotransformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embriônicahumano (293 ou células 293 sub-clonadas para crescimento em cultura desuspensão, Graham etal., J. Geri. Virol. 36: 59 (1977)); células de rim de filhotede hamster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/-DHFR(CHO, Urlaub et ai, Proc. NatL Acad. Sei. USA. 77: 4216 (1980)); células desertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980));células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macacoverde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervicalhumano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34);células de fígado de rato buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmãohumano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065);tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI(Mather et ai, Annals Ν. Y. Acad. Sei. 383:44-68 (1982)); células MRC 5;células FS4; linhagem de hepatoma humano (Hep G2).
As células hospedeiras são transformadas com os vetores declonagem ou expressão descritos acima para a produção de anticorpos ecultivadas em meios nutrientes convencionais modificados conformeapropriado para a indução de promotores, seleção de transformantes ouamplificando os genes codificadores das seqüências desejadas.
(VlII) Cultivo Das Células Hospedeiras
As células hospedeiras utilizadas para a produção do anticorpo deacordo com a presente invenção podem ser cultivadas em uma série de meiosdisponíveis comercialmente, tais como Ham's F10 (Sigma), Meio EssencialMínimo ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) e Meio Eagle Modificado daDulbecco ((DMEM), Sigma) que são apropriados para o cultivo das célulashospedeiras. Além disso, qualquer meio descrito em Ham et ai, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et ai, Anal. Biochem. 102: 255 (1980), Patentes US4.767.704; US 4.657.866; US 4.927.762; US 4.560.655; ou US 5.122.469;documentos WO 90/03430 e WO 87/00195 ou o pedido de Patente US US30.985 podem ser utilizados como meios de cultura para as célulashospedeiras. Qualquer um destes meios pode ser suplementado conformenecessário com hormônios e/ou outros fatores do crescimento (tais comoinsulina, transferrina ou fator de crescimento epidérmico), sais (como, cloretode sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tais como HEPES),nucleotídeos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tais como drogaGentamycin®), traços de elementos (definidos como compostos inorgânicosnormalmente presentes em concentrações finais na faixa micromolares) e glicoseou uma fonte de energia equivalente. Qualquer outro suplemento necessário podetambém ser incluído em concentrações apropriadas conhecidas dos técnicos noassunto. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e similares, são asutilizadas anteriormente com a célula hospedeira selecionada para expressão eserão evidentes para os técnicos no assunto.
(IX) Purificação Do Anticorpo
A partir do uso de técnicas recombinantes, o anticorpo pode serproduzido de forma intracelular ou secretado diretamente no meio. Caso oanticorpo seja produzido de forma intracelular, como uma primeira etapa, osfragmentos particulados, sejam eles células hospedeiras ou fragmentoslisados, são removidos, por exemplo, através de centrifugação ouultrafiltragem. Quando o anticorpo for secretado para o meio, sobrenadantesdesses sistemas de expressão são geralmente concentrados em primeiro lugarutilizando um filtro de concentração de proteínas disponível comercialmente,por exemplo, uma unidade de ultrafiltragem Amicon ou Millipore Pellicon. Uminibidor de protease, tal como PMSF, pode ser incluído em qualquer das etapasacima para inibir a proteólise e antibióticos podem ser incluídos para evitar ocrescimento de contaminantes imprevistos.
A composição de anticorpo preparada a partir das células podeser purificada através do uso, por exemplo, de cromatografia de hidroxilapatita,eletroforese em gel, diálise e cromatografia de afinidade, sendo a cromatografiapor afinidade a técnica de purificação preferida. A adequação da proteína Acomo Iigante de afinidade depende da espécie e do isotipo de qualquerdomínio Fc de imunoglobulina que esteja presente no anticorpo. A Proteína Apode ser utilizada para purificar anticorpos que se baseiem em cadeiaspesadas γ1, γ2 ou γ4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13(1983)). Recomenda-se Proteína G para todos os isotipos de camundongos epara γ3 humano (Guss et al., EMBO J. 5: 1567-1575 (1986)). A matriz ao qual oIigante de afinidade é anexado é freqüentemente a agarose, mas outrasmatrizes são disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis, tais como vidro deporos controlados ou poli-(estirenodivinil)-benzeno, permitem velocidades defluxo maiores e tempos de processamento mais curtos do que os que podemser atingidos com agarose. Quando o anticorpo constar de um domínio Ch3, aresina Bakerbond ABX® (J. T. Baker, Phillipsburg NJ, Estados Unidos) é útilpara a purificação. Outras técnicas de purificação de proteínas, tais comofracionamento sobre uma coluna de troca iônica, precipitação em etanol, HPLCde Fase Reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparinaSEPHAROSE™, cromatografia em uma resina de troca aniônica ou catiônica(tal como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofocagem, SDS-PAGE eprecipitação de sulfato de amônio também são disponíveis, dependendo doanticorpo a ser recuperado.
Após qualquer etapa(s) de purificação preliminar, a mistura quecompreende o anticorpo de interesse e contaminantes pode ser submetida acromatografia de interação hidrofóbica de baixo pH utilizando uma eluiçãotamponada em um pH de cerca de 2,5 a 4,5, preferencialmente realizada sobbaixas concentrações de sal (tal como, de cerca de O a 0,25 M de sal).
Imunoconjugados
A invenção fornece também imunoconjugados (denominado deforma intercambiável como "conjugados anticorpo-droga" ou "ADC"),compreendendo um dos anticorpos anti-OX40L (nt.: esta frase deve ter sidocopiada de outra patente, aqui deveria ser "anti-EphB4") descrito no presente,conjugado a um agente citotóxico como um agente quimioterápicos, umadroga, um agente inibidor do crescimento, uma toxina (por exemplo, toxinabacteriana enzimaticamente ativa de origem fúngica, vegetal, animais oufragmentos destas), ou um isótopo radioativo (ou seja, um radioconjugado).
O uso anticorpos conjugados com drogas para a entrega local deagentes citotóxicos ou citostático, isto é, drogas para matar ou inibir célulastumorais no tratamento do câncer (Syrigos and Epenetos (1999) AnticancerResearch 19:605-614; Niculescu-Duvaz e Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev.26:151-172; Patente US 4.975.278) teoricamente permitem a entrega da drogaa célula alvo de parte do tumor, e o acúmulo intracelular deste, onde aadministração sistêmica destes agentes não conjugados com drogas poderesultar em níveis inaceitáveis de toxicidade em células normais bem como emcélulas do tumor que precisam ser eliminadas (Baldwin et ai, (1986) Lancetpp. (15 de Março de 1986):603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers OfCytotoxic Agents In Câncer Therapy: Uma revisão em ,"Monoclonal Antibodies'84: Biological And Clinicai Applications, A. Pinchera et a\. (ed.s), pp. 475-506).É procurado desse modo a eficácia máxima com toxicidade mínima. Tanto osanticorpos policlonais quanto os anticorpos monoclonais foram relatados comoúteis nestas estratégias (Rowland et ai, (1986) Câncer Immunol. Immunother.,21:183-87). As drogas usadas nestes métodos incluem a daunomicina,doxorubicina, metotrexate, e a vindesina (Rowland et ai, (1986) Supra). Astoxinas usados em conjugados anticorpo-toxina incluem as toxinas bacterianastais como a toxina da difteria, toxina de plantas tais como a ricina, pequenasmoléculas de toxinas tais como a geldanamicina Mandler et ai (2000) Jour. ofthe Nat. Câncer Inst. 92(19): 1573-1581; Mandler et a/(2000) Bioorganic & Med.Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maitansinóides (Patente EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Nati Acad.Sei. USA 93:8618-8623), e caliceamicina (Lode et al (1998) Câncer Res.58:2928; Hinman et al (1993) Câncer Res. 53:3336-3342). As toxinas podemrealizar seus efeitos citotóxicos e citostáticos por mecanismos incluindo aligação da tubulina, a ligação do DNA ou a inibição da topoisomerase. Algumasdrogas citotóxicas tendem a ser inativas ou mais menos ativas quandoconjugadas com anticorpos ou Iigantes de proteínas receptoras.
ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetan, Biogen/ldec) é um conjugadoanticorpo-radioisótopo composto de um anticorpo monoclonal IgGI kappamurino dirigido contra ao antígeno CD20 encontrado na superfície de linfócitosnormais e malignos e ligado ao radioisótopo In111 ou Y90 ligado por um quelanteIigante a uma tiourea (Wiseman et a/(2000) Eur. Jour. NueL Med. 27(7):766-77;Wiseman et al (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig et aí (2002) J. Clin. OncoL20(10):2453-63; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69). EmboraZEVALIN tenha a atividade contra o Iinfoma de célula B não Hodgkin (NHL), aadministração resulta em citopenias graves e prolongadas na a maioria dospacientes. MYLOTARG™ (gemtuzumab ozogamicina, Wyeth Pharmaceuticals),um anticorpo conjugado a droga composto de um anticorpo hu CD33 ligado acaliceamicina, foi aprovado em 2000 para o tratamento da leucemia mielóideaguda por injeção (Drugs ofthe Future (2000) 25(7):686; Patente US 4970198;US 5079233; US 5585089; US 5606040; US 5693762; US 5739116; US5767285; US 5773001. ZEVALIND (ibritumomab tiuxetan, Biogen/ldec) é umconjugado anticorpo-radioisótopo composto de um anticorpo monoclonal IgGIkappa murino dirigido contra ao antígeno CD20 encontrado na superfície delinfócitos normais e malignizados e ligado ao radioisótopo In111 ou Y90 ligadopor um tiourea ligada a um quelante (Wiseman et al (2000) Eur. Jour. NucLMed. 27(7):766-77; Wiseman et al (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig et al(2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol.20(15):3262-69). Embora ZEVALIN tenha a atividade contra o Iinfoma de célulaB não Hodgkin (NHL), a administração resulta em citopenias graves eprolongadas na a maioria dos pacientes. MYLOTARG™ (gemtuzumabozogamicina, Wyeth Pharmaceuticals), um anticorpo conjugado a drogacomposto de um anticorpo hu CD33 ligado a caliceamicina, foi aprovado em2000 para o tratamento da leucemia mielóide aguda por injeção (Drugs of theFuture (2000) 25(7):686; Patente US 4970198; US 5079233; US 5585089; US5606040; US 5693762; US 5739116; US 5767285; US 5773001. Cantuzumabmertansina (Immunogen, Inc.), um conjugado anticorpo-droga composto peloanticorpo huC242 ligado através do Iigante SPP a fração maitansinóide dadroga, DM1 do bissulfeto, está avançando em experimentações de fase Il para otratamento dos cânceres que expressam CanAg como, por exemplo, pancreático,gástrico entre outros. MLN-2704 (Millennium Phanri., BZL Biologics, ImmunogenInc.), um conjugado anticorpo-droga composto pelo anticorpo monoclonal específicopara antígeno de membrana anti-prostático (PSMA) ligado a fração maitansinóideda droga, DM1, está sob o desenvolvimento para o tratamento potencial de tumoresde próstata. Os peptídeos da auristatina, auristatina E (AE) e a monometilauristatina(MMAE), análogos sintéticos da dolastatina, conjugado aos anticorpos monoclonaisquimérico cBR96 (específico para o carcinoma de Lewis Y) e cAC10 (específicopara o CD30 em malignidades hematológicas) (Doronina et al (2003) NatureBiotechnology 21(7):778-784) e estão sob desenvolvimento terapêutico.
Os agentes quimioterápicos úteis na geração de taisimunoconjugados são descritos no presente (acima). Toxinas enzimaticamenteativas e seus fragmentos que podem ser utilizados incluem cadeia A de difteria,fragmentos ativos não-ligantes da toxina de difteria, cadeia A de exotoxina (dePseudomonas aeruginosa), cadeia A rícina, cadeia A de abrina, cadeia A demodecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina,proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor Momordicacharantia, curcina, crotina, inibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina,mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Vide, porexemplo, o documento WO 93/21232 publicado em 28 de outubro de 1993.Uma variedade de radionucleotídeos está disponível para a produção deanticorpos radioconjugados. Exemplos incluem Bi212, I1311 In131, Y90 e Re186. Osconjugados do antagonista e agente citotóxico podem ser fabricados utilizandouma série de agentes acopladores de proteínas bifuncionais, tais comopropionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT)1derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetila HCI),ésteres ativos (tais como suberato de dissuccinimidila), aldeídos (tais comoglutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis-(para-azidobenzoil)-hexanodiamina), derivados bis-diazônio (tais como bis-(para-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolueno) ecompostos de flúor bis-ativo (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Pode-se preparar, por exemplo, uma imunotoxina rícina, conforme descrito em Vitettaet ai, Science 238: 1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietilenotriaminopentaacético marcado por carbono 14 (MX-DTPA) é um exemplo deagente quelante para conjugação de radionucleotídeo ao antagonista. Vide odocumento WO 94/11026.
Conjugados de um antagonista e uma ou mais toxinas demoléculas pequenas, tais como caliqueamicina, maitansinóides, tricoteno eCC1065 e seus derivados que também apresentam atividades de toxinas, sãocontemplados no presente.
Maitansina ε Maitansinóides
Em alguns exemplos de realizações, o imunoconjugadocompreende o anticorpo da invenção conjugado a uma ou mais moléculasmaitansinóides.
Maitansinóides são inibidores mitóticos que agem através dainibição da polimerização de tubulina. Maitansina foi isolada pela primeira vez apartir de Maytenus serrata (patente US 3.896.111). Descobriu-se em seguidaque determinados micróbios também produzem maitansinóides, tais comomaitansinol e ésteres C-3 de maitansinol (patente US 4.151.042). Maitansinolsintético, seus derivados e análogos são descritos, por exemplo, nas patentesUS 4.137.230, US 4.248.870, US 4.256.746, US 4.260.608, US 4.265.814, US4.294.757, US 4.307.016, US 4.308.268, US 4.308.269, US 4.309.428, US4.313.946, US 4.315.929, US 4.317.821, US 4.322.348, US 4.331.598, US4.361.650, US 4.364.866, US 4.424.219, US 4.450.254, US 4.362.663 e US4.371.533.
Frações da droga dos maitansinóides são frações atrativas dadroga em conjugados droga-anticorpo porque são: (i) relativamente acessíveispara serem preparadas pela modificação por fermentação ou modificaçãoquímica, derivada de produtos da fermentação, (ii) por serem receptivos àderivatização com os grupos funcionais apropriados para a conjugação atravésde ligações não dissulfeto aos anticorpos, (iii) o estáveis no plasma, e (iv)eficazes contra uma variedade de linhagens de células tumorais.
Imunoconjugados contendo maitansinóides e métodos deprodução dos mesmos são descritos, por exemplo, nas patentes US 5.208.020,US 5.416.064 e patente EP 0 425 235 B1, cujos conteúdos sãoexpressamente incorporados ao presente como referência. Liu et ai, Proc.Natl. Acad. Sei. USA 93: 8618-8623 (1996), descreveram imunoconjugadosque compreendem um maitansinóide denominado DM1 ligado ao anticorpomonoclonal C242 dirigido a câncer colo-retal humano. Concluiu-se que oconjugado é altamente citotóxico com relação a células cancerígenas do cóloncultivadas e exibiu atividade antitumoral em teste de crescimento tumoral invivo. Chari et ai, Câncer Research 52: 127-131 (1992) descrevemimunoconjugados em que um maitansinóide foi conjugado por meio de umaligação dissulfeto ao anticorpo A7 murino que se liga a um antígeno sobrelinhagens de células cancerígenas de cólon humano ou a outro anticorpo TA-1monoclonal murino que liga o oncogene HER-2/neu. A citotoxicidade doconjugado TA.1- maitansinóide foi testado in vitro em células da linhagemhumana SK-BR-3 de câncer de mama, que expressa 3 x 105 antígenos desuperfície HER-2 por célula. O conjugado da droga conseguiu um grau decitotoxicidade similar a droga maitansinóide livre, que poderia ser aumentadapelo aumento no número de moléculas maitansinóide por a molécula deanticorpo. Os conjugados A7- maitansinóide demonstrou baixa citotoxicidadesistêmica nos camundongos.
Os conjugados anticorpo-maitansinóide são preparadosquimicamente ligando um anticorpo a uma molécula de maitansinóide semdiminuir significativamente a atividade biológica do anticorpo ou da moléculamaitansinóide. Vide, por exemplo, a Patente US 5.208.020 (a divulgação doqual é expressamente incorporada a este pela referência). Uma média de 3-4moléculas maitansinóide conjugada por a molécula de anticorpo mostroueficácia em amplificar a citotoxicidade em células alvo sem afetarnegativamente a função ou a solubilidade do anticorpo, embora mesmo umamolécula de anticorpo/toxina se esperasse amplificar a citotoxicidade sobre ouso de um anticorpo nú. Maitansinóide são bem conhecidos no estado datécnica e podem ser sintetizados por técnicas conhecidas ou isolados de fontesnaturais. Maitansinóide apropriados são descritos, por exemplo, na patente US5.208.020 e outras atentes e publicações não patentes referidas abaixo nopresente. Os maitansinóides preferidos são maitansinol e análogos domaitansinol modificados no anel aromático ou em outras posições da moléculado maitansinol, tais como vários ésteres do maitansinol.
Existem diversos grupos de ligação conhecidos no estado datécnica para a fabricação de conjugados de anticorpo e maitansinóide, queincluem, por exemplo, os descritos na patente US 5.208.020 ou EP 0.425.235B1 e Chari et ai, Câncer Research 52: 127-131 (1992) e pedido de Patente US10/960.602, arquivado em 8 de outubro de 2004, a divulgação do qual éexpressamente incorporada a este pela referência. Conjugados anticorpo-maitansinóide contendo o componente Iigante SMCC pode ser preparadoconforme divulgado no pedido de Patente US 10/960602, arquivados em 8 deoutubro de 2004. Os grupos de ligação incluem grupos dissulfeto, grupostioéter, grupos de ácidos lábeis, grupos fotolábeis, grupos lábeis de peptidaseou grupos lábeis de esterase, conforme descrito nas patentes identificadasacima. Grupos de dissulfeto e tioéter são preferidos. Grupos de ligaçãoadicionais estão descritos e exemplificados no presente.
Os conjugados do anticorpo e maitansinóide podem serfabricados através da utilização de uma série de agentes acopladores protéicosbifuncionais, tais com propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio) (SPDP),cicloexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometila) (SMCC)1iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidatode dimetila HCI), ésteres ativos (tais como suberato de disuccinimidila),aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis-(para-azidobenzoil)-hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tais como bis-(para-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato detolueno) e compostos de flúor bis-ativo (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Os agentes acopladores particularmente preferidos incluempropionato de N-succinimidil-3-(2-piridiltio) (SPDP) (Carlsson et ai, Biochem. J.173: 723-737 (1978)) e pentanoato de N-succinimidil-4-(2-piridiltio) (SPP) paraproporcionar ligação dissulfeto.
O Iigante pode estar unido à molécula de maitansinóide emdiversas posições, dependendo do tipo da ligação. Uma ligação éster pode serformada, por exemplo, através da reação com um grupo hidroxila, utilizando-setécnicas convencionais de acoplamento. A reação pode ocorrer na posição C-3que possui um grupo hidroxila, na posição C-14 modificada com hidroximetila,na posição C-15 modificada com um grupo hidroxila e na posição C-20 quepossui um grupo hidroxila. Em uma realização preferida, a ligação é formadana posição C-3 de maitansinol ou um análogo do mesmo.
Auristatina ε Dolostahna
Em alguns exemplos de realização, o imunoconjugadocompreende um anticorpo da invenção conjugado com dolastatinas oupeptídicos análogos da dolastatinas e derivados destes, e auristatinas(Patentes US 5.635.483; 5.780.588). Dolastatinas e auristatinas mostraraminterferir com a dinâmica do microtúbulo, hidrólise da GTP e divisão nuclear ecelular (Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584) e possuem atividade anti-câncer (Patente US 5663149) e antifúngica(Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). A fração dasdrogas dolastatina ou auristatina podem ser unidas covalentemente a umanticorpo através do N-terminal (amino) ou do C-terminal (carboxila) da fraçãopeptídica da droga (WO 02/088172).
Realizações exemplares da auristatina incluem a ligação do N-terminal da fração DE e DF da droga monometilauristatina, divulgados em"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands". US10/983,340, arquivado em 5 de novembro de 2004, a divulgação do qual éexpressamente incorporada ao presente pela referência em sua totalidade.
Tipicamente, frações da droga baseadas em peptídeo podem serpreparadas formando uma ligação de peptídeos entre dois ou maisaminoácidos e/ou fragmentos de peptídeos. Tais ligações de peptídeos podemser preparadas, por exemplo, de acordo com o método de síntese de faselíquida (vide, E. Schrõder e K. Lübke, "The Peptides", volume 1, págs 76-136,1965, Academic Press) que é bem conhecido no campo da química depeptídeos. As moléculas das drogas auristatina/dolastatina podem serpreparadas de acordo com os métodos da Patente US 5.635.483; Patente US5.780.588; Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soe. 111:5463-5465; Pettit et al(1998) Anti-CancerDrug Design 13:243-277; Pettit1 GR, et al. Syntesis, 1996,719-725; e Pettit et al (1996) J. Chem. Soe. Perkin Trans. 1 5:859-863. Videtambém Doronina (2003) Nat Biotechnol 21 (7):778-784; "MonomethylvalineCompounds Capable of Conjugation to Ligands", Patente US N0 10/983340,arquivado em 5 de Novembro de 2004, incorporado ao presente pela referênciana sua totalidade (divulgando, por exemplo, Iigantes e métodos de preparaçãode compostos monometilvalina como MMAE e MMAF conjugado aos ligantes).
III Caliqueamicina
Em outro exemplo de realização, o imunoconjugado compreendeum anticorpo da invenção conjugado a uma ou mais moléculas decaliqueamicina. A família caliqueamicina de antibióticos é capaz de produzirquebras de DNA de fita dupla em concentrações sub-picomolares. Para apreparação de conjugados da família de caliqueamicina, vide as patentes US5.712.374, US 5.714.586, US 5.739.116, US 5.767.285, US 5.770.701, US5.770.710, US 5.773.001 e US 5.877.296 (todas da American CyanamidCompany). Análogos estruturais de caliqueamicina que podem ser utilizadosincluem, mas sem limitar-se a, γι1, α2', α3', N-acetil-γι1, PSAG e θ'ι (Hinman etal., CancerResearch 53: 3336-3342 (1993), Lode et al., Câncer Research 58:2925-2928 (1998) e as patentes US da American Cyanamid citadas acima).Outra droga antitumoral à qual o anticorpo pode ser conjugado é QFA, que éum antifolato. Tanto caliqueamicina quanto QFA contêm sítios intracelulares deação e não atravessam facilmente a membrana plasmática. Portanto, aabsorção celular desses agentes através de internalização mediada poranticorpos aumenta grandemente seus efeitos citotóxicos.
IV Outros Agentes Citotóxicos
Outros agentes antitumorais que podem ser conjugados aosanticorpos da invenção incluem BCNU, estreptozotocina, vincristina e 5-fluorouracil, a família do complexo LL-E33288 de agentes conhecidoscoletivamente descrito nas patentes US 5.053.394 e US 5.770.710, bem comoas esperamicinas (Patente US 5.877.296).
Toxinas enzimaticamente ativas e seus fragmentos que podemser utilizados incluem cadeia A de difteria, fragmentos ativos não-ligantes datoxina de difteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeiaA rícina, cadeia A de abrina, cadeia A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas deAleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI,PAPII e PAP-S), inibidor Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor deSapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicinae os tricotecenos. Vide, por exemplo, o documento WO 93/21232, publicadoem 28 de outubro de 1993.
A presente invenção contempla adicionalmente um antagonistaconjugado a um composto com atividade nucleolítica (por exemplo, ribonuclease ouuma endonuclease de DNA1 tal como deoxirribonuclease; DNase).
Para a destruição seletiva do tumor, o anticorpo pode conter umátomo altamente radioativo. Uma série de isótopos radioativos é disponível para aprodução de antagonistas radioconjugados. Exemplos incluem At211, I131, I125, Y90,Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu. Quando oconjugado for utilizado para diagnóstico, ele pode compreender um átomoradioativo para estudos cintigráficos, por exemplo, tc99m ou I123, ou uma marca decentrifugação para formação de imagem através de ressonância magnética nuclear(NMR) (também conhecida como formação de imagem por ressonância magnética,MRI), tal como novamente iodo-123, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13,nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro.
A radiomarcação ou outras marcações podem ser incorporadasao conjugado de formas conhecidas. O peptídeo pode ser, por exemplo,biosintetizado ou pode ser sintetizado por síntese química de aminoácidos,utilizando precursores de aminoácidos apropriados, envolvendo, por exemplo,flúor-19 no Iugarde hidrogênio. Marcares como tc99m, I123, Re186, Re188 e In111podem ser ligados no peptídeo por um resíduo de cisteína. O ítrio-90 pode serligado a um resíduo de lisina. O método IODOGEN (Fraker et al. (19 78),Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57) pode ser utilizado para aincorporação de iodo-123. Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy(Chatal, CRC Press1 1989) descreve outros métodos em detalhes.
Os conjugados do anticorpo e agente citotóxico podem serfabricados por meio de uma série de agentes acopladores protéicosbifuncionais, tais como propionato de N-succinimidila-3-(2-piridilditio) (SPDP)1cicloexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometila) (SMCC)1iminotiolano (IT)1 derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidatode dimetila HCI), ésteres ativos (tais como suberato de di-succinimidila),aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis-(para-azidobenzoil)-hexanodiamina), derivados bis-diazônio (tais como bis-(para-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato detolueno) e compostos de flúor bis-ativo (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Pode-se preparar, por exemplo, uma imunotoxina rícina,conforme descrito em Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminopentaacético marcado por carbono14 (MX-DTPA) é um exemplo de agente quelante para conjugação deradionucletídeo ao anticorpo. Vide o documento WO 94/11026. O Iigante podeser um "ligante capaz de ser clivado" que facilita a liberação da droga citotóxicana célula. Pode-se utilizar, por exemplo, um ligante de ácido lábil, ligantesensível à peptidase, ligante fotolábel, ligante de dimetila ou ligante contendodissulfeto (Chari et al., Câncer Research 52: 127-131 (1992); patente US5.208.020).
Os compostos da invenção contemplam expressamente, mas nãosão limitados a, ADC preparado com reagentes reticulantes: BMPS1 EMCS1GMBS, HBVS1 LC-SMCC, MBS1 MPBH1 SBAP1 SIA1 SIAB1 SMCC1 SMPB1SMPH1 sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC1 sulfo-SMPB, e SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato) que estãocomercialmente disponíveis (por exemplo, pela Pierce Biotechnology, Inc.,Rockford1 IL., EUA). Veja páginas 467-498 do Applications Handbook andCatalog 2003-2004.
V Preparação De Anticorpos Conjugados Com Drogas
Nos conjugados de anticorpos com drogas (ADC) da invenção,um anticorpo conjugado (Ab) a um ou mais frações da droga (D), por exemplo,cerca de 1 a 20 frações da droga por anticorpo, através de um Iigante (L). OADC da Fórmula I pode ser preparado por diversos protocolos, empregandoreações de química orgânica, circunstancias e reagentes conhecidos porhábeis na técnica, incluindo: (1) reação de um grupo nucleofílico de umanticorpo com um reagente Iigante bivalente a forma Ab-L, através de umaligação covalente, seguida pela reação com a fração de droga D; e (2) reaçãode um grupo nucleofílico de uma fração da droga com um reagente Iigantebivalente, a forma D-L, através de uma ligação covalente, seguida pela reaçãocom o grupo nucleofílico de um anticorpo. Métodos adicionais para preparaçãode ADC estão descritos no presente.
Ab-(L-D)p I
O Iigante pode ser composto por um ou mais componentesligante. Exemplos componentes de Iigantes incluem 6-maleimidocaproil ("CM"),maleimidopropanoil ("MP"), valina-citrulina ("val-cit"), alanina-fenilalanina ("Ala-phe"), p-aminobenziloxicarbonil ("PAB"), N-Succinimidil 4-(2-piridiltio)pentanoato ("SPP"), N-Succinimidol 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1carboxilato ("SMCC"), e Suceinimidil N-(4-iodo-acetil) aminobenzoato ("SIAB").Componentes de Iigantes adicionais são conhecidos na arte e alguns estãodescritos neste documento. Vide também "Monomethylvaline CompoundsCapable of Conjugation to Ligands", US N0 10/983340, arquivado em 5 deNovembro de 2004, o conteúdo do qual é aqui incorporado pela referência nasua totalidade.
Em alguns exemplos de realização, o Iigante pode compreenderde resíduos de aminoácidos. Exemplos de componentes aminoácidos Iigantesincluem dipeptídeos, tripeptídeos, tetrapeptídeos ou pentapeptídeos. Exemplosde dipeptídeos incluem: valine-citrulina (vc ou val-cit), alanina-fenilalanina (afou ala-phe). Exemplos de tripeptídeos incluem: glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) e glicina-glicina- glicina (gly-gly-gly). Resíduos de aminoácidos que incluamum componente Iigante de aminoácido incluem aqueles que ocorremnaturalmente, assim como aminoácidos pequenos e aminoácidos análogos quenão ocorrem naturalmente, tais como citrulina. Componentes Iigantes deaminoácidos podem ser concebidos e otimizados em sua seletividade para aclivagem enzimática por uma enzima específica, por exemplo, uma proteaseassociada a tumor, catepsina B, C, D, ou plasmina.
Os grupos nucleofílico nos anticorpos incluem, mas não sãolimitados: (i) grupos amino N-terminal, (ii) grupos amino da cadeia lateral, porexemplo lisina, (iii) grupos tiol da cadeia lateral, por exemplo cisteína, e (iv)hidroxila do açúcar ou grupos amino onde o anticorpo é glicosilado. Os gruposamino, tiol e hidroxila são nucleofílicos e capazes de reagir às ligações deforma covalente com os grupos eletrofílicos em frações dos Iigantes ereagentes Iigantes incluindo: (i) ésteres ativos tais como ésteres de NHS,ésteres de HOBt, haloformatos, e halides ácidos; (ii) Alquilas e halides benziltais como haloacetamidas; (iii) grupos dos aldeídos, das cetonas, carboxilas emaleimida. Determinados anticorpos têm ligações intercadeias reduzidas, istoé, pontes do cisteina. Os anticorpos podem ser feitos reativos pela conjugaçãocom os reagentes Iigantes pelo tratamento com um agente redutor, tal comoDTT (ditiotreitol). Cada ponte do cisteína dará forma assim, teoricamente, adois tióis nucleofílicos reativos. Os grupos nucleofílicos adicionais podem serintroduzidos em anticorpos pela reação das Iisinas com 2-iminotiolano(reagente de Traut) tendo por resultado a conversão de uma amina em um tiol.Grupos reativos de tiol podem ser introduzidos no anticorpo (ou fragmentodeste) pela introdução de um, dois, três, quatro, ou mais resíduos de cisteína(por exemplo, preparando anticorpos mutantes compreendendo um ou maisresíduos de aminoácidos não-nativos).
Os conjugados de anticorpos com drogas da invenção podemtambém ser produzidos pela modificação do anticorpo para introduzir a regiãoeletrofílicas, que podem reagir com os substituintes nucleofílicos no reagenteIigante ou na droga. Os açúcares de anticorpos glicosilados podem seroxidados, por exemplo, com os reagentes de oxidação periodato, para darforma ao aldeído ou aos grupos cetona que podem reagir com o grupo aminodos Iigantes reagentes ou frações das drogas. Os grupos iminas resultantes deSchiff do podem dar forma a uma ligação estável, ou podem ser reduzidos, porexemplo, pelo reagente borohidrido para formar ligações amino estáveis. Emum exemplo de realização, a reação da porção do hidrato de carbono de umanticorpo glicosilado com a galactose oxidase ou o metaperiodato de sódiopode formar grupos carbonil (aldeído e cetona) na proteína que desta formapode reagir com os grupos apropriados na droga (Hermanson, BioconjugateTechniques). Em outro exemplo de realização, as proteínas que contêm aserina N-terminal ou os resíduos do treonina podem reagir com o meta-periodato de sódio, tendo por resultado a produção de um aldeído no lugar doprimeiro aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; Patente US 5362852). Tal aldeído pode reagir com um Iigante reagente ouuma fração da droga nucleofílica.
Do mesmo modo, os grupos nucleofílicos em uma fração da drogaincluem, mas não são limitados a: grupos amino, tiol, hidroxila, hidrazida,oxime, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina e gruposarilhidrazida capazes de reagir na forma de ligações covalente com os gruposelectrofílicos em frações do Iigante e reagente do Iigante incluindo: (i) ésteresativos, tais como, ésteres de NHS1 ésteres de HOBt, haloformates e halidesácidos; (ii) Alquilas e halides benzil tais como haloacetamidas;; (iii) grupos dosaldeídos, das cetonas, carboxil e maleimida.
Alternativamente, uma fusão protéica compreendendo doanticorpo e do agente citotóxico pode ser feita, por exemplo, por técnicas oupela síntese de peptídeo recombinante. O comprimento do DNA podecompreender as regiões respectivas que codificam as duas parcelas doconjugado adjacente ou separadas por uma região que codifica um peptídeoligante que não destrua as propriedades desejadas do conjugado.
Ainda em outro exemplo de realização, o anticorpo pode estarconjugado a um "receptor" (como por exemplo, a estreptoavidina) para autilização no tumor pré-marcando onde o conjugado anticorpo-receptor éadministrado ao paciente, seguido pela remoção do conjugado não ligado dacirculação usando um agente de limpeza e então administrando um "ligante"(por exemplo, avidina) que é conjugado a um agente citotóxico (por exemplo,um radionucleotídeo).
Formulações Farmacêuticas
Formulações terapêuticas compreendendo o anticorpo dainvenção são preparadas são preparadas para o armazenamento através damistura de um anticorpo que tenha o grau desejado de pureza com veículos,excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais(Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edição, Osol, A. Ed.(2000)), na forma de formulações liofilizadas, soluções aquosas ou outrasformulações secas. Veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis sãoatóxicos para pacientes nas dosagens e concentrações empregadas e incluemtampões tais como fosfato, citrato, histidina e outros ácidos orgânicos,antioxidantes que incluem ácido ascórbico e metionina; conservantes (taiscomo cloreto de octadecildimetilbenzilamônio, cloreto de hexametônio, cloretode benzalcônio, cloreto de benzetônio; álcool fenólico, butílico ou benzílico;alquilparabenos tais como metil ou propilparabeno; catecol; resorcinol;cicloexanol; 3-pentanol e meta-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular(menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina do soro,gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais comopolivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina,histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outroscarboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes taiscomo EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol;contra-íons formadores de sais tais como sódio; complexos metálicos (porexemplo, complexos protéicos de Zn); e/ou tensoativos não-iônicos, tais comoTWEEN®, PLURONICS® ou polietilenoglicol (PEG).
A formulação da presente invenção pode também conter mais deum composto ativo, conforme necessário para a indicação específica sendotratada, preferencialmente, ditos compostos apresentam atividadescomplementares que não prejudica um ao outro. Tais moléculas sãoapresentadas de forma apropriada em combinação em quantidade que sãoeficazes para o propósito pretendido.
Os ingredientes ativos podem também ser armazenados emmicrocápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas conservação oupolimerização interfacial, tais como microcápsulas de hidroximetilcelulose oumicrocápsulas de gelatina e de poli-(metacrilato de metila), respectivamente,em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (por exemplo, lipossomos,microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas), ouem macroemulsões. Ditas técnicas são descritas em Remington: The Scienceand Practice ofPharmacy, 20a edição, Ed.: Osol1 A. (2000).
As formulações a serem utilizadas para administração in vivodeve ser estéril. O que é seguido por filtração através das membranas defiltração.
Podem ser fabricadas preparações de liberação prolongada.Exemplos apropriados de preparações de liberação prolongada incluemmatrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contenham oanticorpo, que se encontram na forma de artigos moldados, tais como filmes oumicrocápsulas. Exemplos de matrizes de liberação prolongada incluempoliésteres, hidrogéis (tais como poli-(metacrilato de 2-hidroxietila) ou álcoolpoli-(vinílico)), poli-lactídeos (patente US 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e L-glutamato de g etila, acetato de etilenovinila não-degradável,copolímeros degradáveis de ácido láctico e ácido glicólico, tal como LUPRONDEPOT® (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico eácido glicólico e acetato de leuprolide) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.Embora polímeros tais como etilenovinilacetato e ácido láctico-ácido glicólicopermitam a liberação de moléculas por mais de 100 dias, certos hidrogéisliberam proteínas por períodos de tempo mais curtos. Quando anticorposencapsulados permanecem no organismo por um longo período de tempo, elespodem desnaturas ou agregar como resultado da exposição à umidade a 37°C,resultando em uma perda da atividade biológica e possíveis mudanças naimunogenicidade. Estratégias racionais podem ser planejadas paraestabilização, dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se omecanismo de agregação for descoberto para ser a formação de ligação S-Sintermolécula através intercadeia tio-sulfeto, a estabilização pode seralcançada por resíduos sulfidrila, liofilização de soluções ácidas, controle doteor da umidade, utilizando aditivos apropriados, e desenvolvimento decomposições matrizes de polímero específicas.Uso
Um anticorpo da presente invenção pode ser utilizado, porexemplo, em métodos terapêuticos in vitro, in vivo em e ex vivo.
Em um aspecto, a invenção fornece métodos para tratar ouprevenir um tumor, câncer, e/ou um distúrbio da proliferação celular associadaao aumento da expressão e/ou atividade da EphB4, constando de métodoseficazes para administrar um quantidade de anticorpo anti-EphB4 a umpaciente que necessite de tal tratamento.
Em um aspecto, a invenção fornece métodos para reduzir, inibirou impedir o crescimento de um tumor ou câncer, constando de métodoseficazes para administrar uma quantidade de anticorpo anti-EphB4 a umpaciente que necessita de tal tratamento.
A EphB4 esta implicada na orientação do axônio motor emigração celular da crista neural nas vias de desenvolvimento embrionário.Assim, os anticorpos da invenção também são úteis no tratamento (incluindo aprevenção) dos distúrbios que estão envolvidas na patologia ou disfunções dadegeneração celular, como o no tratamento de diversas doenças (crônicas)neurodegenerativas e lesões agudas de células nervosas. Estas doençasneurodegenerativas incluem, sem se limitar a, neuropatias periféricas;perturbações neuro-motoras, tais como esclerose amilotrófica lateral (ALS,doença de Lou Gehrig), paralisia de Bell, e várias condições que envolvem aatrofia muscular espinhal ou paralisia; e outras doenças neurodegenerativashumanas, como a doença de Alzheimer , Doença de Parkinson, epilepsia,esclerose múltiplas, coréia de Huntington, síndrome de Down, surdez nervosa,e doença de Meniere, células nervosas e lesões agudas, por exemplo, devido atraumatismo ou lesão da medula espinhal.
Os anticorpos da invenção também são úteis para inibir aangiogênese. Em alguns exemplos de realização, o local de angiogênese é umtumor ou câncer.
Em um aspecto, a invenção fornece métodos para inibirangiogênese compreendendo em administrar uma quantidade eficaz deanticorpo anti-EphB4 em um paciente que necessita de tal tratamento.
Em um aspecto, a invenção fornece os métodos de tratamentoassociado a um estado de angiogênese patológica compreendendo naadministração de uma quantidade eficaz de anticorpo anti-EphB4 para umpaciente que necessita de tal tratamento. Em alguns exemplos de realização, oestado patológico associado à angiogênese é um tumor, câncer e/ou distúrbioda proliferação celular. Em alguns exemplos de realização, o estado patológicoassociado à angiogênese é uma doença neovascular intraocular.
Além disso, pelo menos alguns dos anticorpos da invençãopodem neutralizar a atividade do antígeno de outras espécies. Assim, osanticorpos da invenção podem ser usados para inibir a atividade de umantígeno específico, por exemplo, em uma cultura celular contendo osantígenos, em seres humanos ou em outros mamíferos, em indivíduos quetenham o antígeno com o qual um anticorpo da invenção reage cruzadamente(por exemplo, chimpanzé, babuíno, mico, cinomolgo e Rhesus, porco oucamundongo). Em um exemplo de realização, o anticorpo da invenção podeser usado para inibir a atividade do antígeno expondo o anticorpo com oantígeno de tal maneira que a atividade do antígeno é inibida.Preferencialmente, o antígeno é uma molécula de proteína humana.
Em um exemplo de realização, um anticorpo da invenção podeser usado em um método para se ligar a um antígeno em um paciente quesofre de uma doença associada com o aumento da expressão e/ou atividadedo antígeno, compreendendo em administrar ao paciente um anticorpo dainvenção na qual o antígeno do paciente está ligado. Preferencialmente, oantígeno é uma molécula de proteína humana e o paciente é um pacientehumano. Alternativamente, o paciente pode ser um mamífero que expressa oantígeno com o qual o anticorpo da invenção se liga. Adicionalmente, opaciente pode ser um mamífero no qual foi introduzido o antígeno (porexemplo, a administração do antígeno ou a expressão de um antígenotransgênico). O anticorpo da invenção pode ser administrado a um pacientehumano para fins terapêuticos. Além disso, o anticorpo da invenção pode seradministrado a um mamífero não-humano que expressa o antígeno com o qualo anticorpo se liga por reação cruzada (por exemplo, um primata, porco oucamundongo) para fins veterinários ou como um modelo animal de doençashumanas. Com relação a este último citado, esses modelos animais podem serúteis para avaliar a eficácia terapêutica dos anticorpos da invenção (porexemplo, testes de dosagens e curso de tempo da administração).
Os anticorpos da invenção podem ser usados para tratar, inibir,atrasar a progressão, prevenir/atrasar a reincidência, atenuar ou prevenirdoenças, distúrbios ou condições associadas à expressão anormal e/ouatividade de uma ou mais moléculas de antígenos.
Exemplos de distúrbios incluem carcinoma, linfoma, blastoma,sarcoma e leucemia linfóide ou neoplasias malignas. Exemplos maisespecíficos de tais células escamosas incluem células cancerosas (porexemplo, câncer de células epitelial escamosas), incluindo o câncer de pulmãode pequenas células, a câncer de pulmão de não-pequenas células,adenocarcinoma de pulmão e carcinoma escamoso de pulmão, câncer deperitônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou de estomago incluindocâncer gastrointestinal, câncer de pâncreas, glioblastoma, câncer de colo doútero, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer do tratourinário, hepatoma, câncer de mama, cancro de cólon, câncer retal, câncercolorretal, câncer de endométrio ou carcinoma uterino, carcinoma dasglândulas salivares, câncer de rim ou câncer renal, câncer de próstata, câncerde vulva, câncer de tiróide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma depênis, melanoma, mieloma múltiplo e Iinfoma de célula B1 câncer cérebro, bemcomo câncer de cabeça e pescoço, e associados e metástases. Em algunsexemplos de realização, o câncer é selecionado a partir do grupo, constituídopor câncer de pulmão de pequenas células, neuroblastomas, melanomamaligno, carcinoma mama, câncer gástrico, câncer colorretal (CRC) ecarcinoma hepatocelular.
Em um exemplo de realização especifico um imunoconjugado quecompreende um anticorpo com um ou mais agente citotóxico é administrado aopaciente. Em alguns exemplos de realização, o imunoconjugado e/ou oantígeno ao qual este está ligado é internalizado pela célula, resultando emaumento da eficácia terapêutica do imunoconjugado na morte de células a qualse liga. Em uma realização preferida, o agente citotóxico se combina ouinterfere com o ácido nucléico em células cancerosas. Exemplos de ditosagentes citotóxicos incluindo agentes quimioterápicos citados no presente (porexemplo, matasinóides, auristatinas, dolastatinas ou caliquiamicinas), isótposradioativos ou ribonucleases e endonucleases de DNA.
Os anticorpos da invenção podem ser utilizados isoladamente ouem combinação com outras composições em uma terapia. Por exemplo, umanticorpo da invenção pode ser co-administrado com outro anticorpo, agente(s)quimioterápico(s) (incluindo coquetéis de agentes quimioterápicos), outroagente(s) citotóxico(s)m, agente(s) anti-angiogênico(s), citocinas ou agente(s)inibidor(es) do crescimento. No qual o anticorpo da invenção inibe ocrescimento de um tumor, e este pode ser, se desejado, combinado com outroagente terapêutico adicional. Alternativamente ou adicionalmente, o pacientepode receber radioterapia combinada (por exemplo, feixe irradiação externa oua terapia com um agente radioativo marcado, como um anticorpo). Esta terapiacombinada referida acima inclui a administração combinada (onde dois ou maisagentes estão incluídos na mesmo ou em formulações distintas) e administraçãoseparada, e nesse caso, a administração do anticorpo da invenção pode ocorrerantes, e/ou após a administração da terapia ou terapias adjuntas.
Combinação de TerapiasTal como indicado anteriormente, a invenção fornece terapiascombinadas, no qual um anticorpo anti-EphB4 é administrado com outrotratamento. Por exemplo, anticorpos anti-EphB4 são usados em combinaçãocom um terapêutico anti-câncer ou um terapêutico anti-neovascularização ouum terapêutico anti-neoplásico para tratar várias condições neoplásicas ounão-neoplásicas. Em um exemplo de realização, a condição neoplásica ou nãoneoplásica patológica é caracterizada por distúrbios associados com aangiogênese aberrante ou indesejada. O anticorpo anti-EphB4 pode seradministrado seqüencialmente em combinação com outro agente que sejaeficaz para estes fins, quer na mesma composição ou em composiçõesdistintas. Alternativamente ou adicionalmente, vários inibidores de EphB4podem ser administrados.
A administração do anticorpo anti-EphB4 pode ser feito emsimultâneo, por exemplo, como uma única composição ou em duas ou maiscomposições distintas usando a mesma via de administração ou diferentesvias. Alternativamente ou adicionalmente, a administração pode ser feita demaneira seqüencial, em qualquer ordem. Em certos exemplos de realização,intervalos variando de minutos a dias, de semanas a meses, podem estarpresentes entre as administrações das duas ou mais composições. Porexemplo, o agente anti-câncer pode ser administrado em primeiro lugar,seguido pelo inibidor de EphB4. No entanto, administração simultânea ouadministração do anticorpo anti-EphB4 primeira também é contemplada.
As quantidades eficazes de agentes terapêuticos administrado emcombinação com um anticorpo anti-EphB4 será a de escolha do médico oumédico veterinário. A dosagem administrada e o ajuste são feitos para atingirmáxima gestão das condições a serem tratadas. A dose vai dependeradicionalmente de fatores como o tipo de agente terapêutico a ser utilizado e odoente específico a ser tratado. Dosagens apropriadas para quaisquer agentesanti-câncer são aquelas atualmente utilizadas e podem ser reduzidas devido àação combinada (sinergia) do agente anti-câncer e o anticorpo anti EphB4. Aexpressão "potencializar" refere-se a uma melhoria da eficácia de um agenteterapêutico e sua dose comum ou aprovada.
Normalmente, os anticorpos anti-EphB4 e agentes anti-câncer sãoadequados para as doenças idênticas ou semelhantes para bloquear ou reduziruma desordem patológica como, por exemplo, o crescimento tumoral oucrescimento de células cancerosas. Em um exemplo de realização, o agenteanti-câncer é um agente anti-angiogênese.
A terapia anti-angiogênica em relação ao tratamento do câncer éuma estratégia de tratamento do câncer destinada a inibir o desenvolvimentodos vasos sangüíneos do tumor que fornecem nutrientes necessários parasuportar o crescimento tumoral. Pelo fato da angiogênese estar envolvida tantono crescimento de tumores primário e metástases, o tratamento anti-angiogênico fornecidos pela invenção é capaz de inibir o crescimento do tumorneoplásico no sítio primário, bem como prevenir a metástase de tumores emsítios secundários, permitindo, assim, o ataque de tumores por outros métodosterapêuticos.
Muitos agentes anti- angiogênicos foram identificados e sãoconhecidos no estado da técnica, inclusive aqueles relacionados no presente,por exemplo, listadas em seção "Definições" e, em, por exemplo, Carmeliet eJain, Nature 407:249-257 (2000); Ferrara et ai, Nature ReviewsiDrugDiscovery1 3:391-400 (2004); e Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003). Videtambém, Pedido de Patente US 2003/0055006. Em um exemplo de realização,um anticorpo anti-EphB4 é usado em combinação com um anticorpos anti-VEGF neutralizantes (ou fragmentos deste) e/ou um ou outro antagonista deVEGF ou antagonista de receptor de VEGF1 incluindo, mas não se limitado a,por exemplo, receptor de VEGF solúvel (por exemplo: , VEGFR-1, VEGFR-2,VEGFR-3, neuropilinas (por exemplo, NRP1, NRP2)) fragmentos, aptameroscapazes de bloquear o VEGFR ou VEGF, anticorpos neutralizantes anti-VEGFR, inibidores de VEGFR tirosina quinases de baixo peso molécula (RTK)1estratégias antisense de VEGF1 ribozimas contra VEGF ou receptores deVEGF, antagonista variantes de VEGF, bem como quaisquer combinaçõesdestes. Alternativa ou adicionalmente, dois ou mais inibidores da angiogênesepode opcionalmente ser co-administrados ao paciente, além do antagonista deVEGF e outros agentes. Em certos exemplos de realização, um ou maisagentes terapêuticos adicionais, por exemplo, agentes anti-cânceres, podemser administrados em combinação com o anticorpo anti-EphB4, antagonista deVEGF e um agente anti-angiogênese.
Em certos aspectos da invenção, de outros agentes terapêuticosúteis para a terapia de combinação do tumor com um anticorpo anti-EphB4incluí outras terapias, (por exemplo, cirurgias, tratamentos radiológicos (porexemplo, envolvendo radiação ionizante ou administração de substânciasradioativas), quimioterapia, tratamento com agentes anti-câncer listados aqui econhecidas no estado da arte, ou combinações dos mesmos). Alternativamenteou adicionalmente, dois ou mais anticorpos se ligam ao mesmo ou em dois oumais antígenos diferentes divulgados no presente podem ser co-administradoao paciente. Algumas vezes, pode ser benéfico administrar também uma oumais citocinas ao paciente.
Agentes QuimioterápicosEm certos aspectos, a invenção fornece um método de bloquearou reduzir o crescimento tumoral ou crescimento de células cancerosas, pelaadministração de uma quantidade eficaz de antagonista de EphB4 e/ouinibidor(es) da angiogênese e um ou mais agente(s) quimioterápico(s) a umpaciente suscetível a, ou com diagnóstico de câncer. Diversos agentesquimioterápicos podem ser utilizados nos métodos de tratamento combinadoda invenção. Uma lista exemplar e não-limitante de agentes quimioterápicoscontempladas no presente é fornecido na seção "Definições".
Será compreendido por aqueles hábeis nas técnicas, que asdoses adequadas de agentes quimioterápicos são geralmente próximas a dasterapias já empregadas na clínica, no qual os quimioterápicos sãoadministrados isoladamente ou em combinação com outros quimioterápicos.Variações nas dosagens provavelmente irão ocorrer em função da condição aser tratada. O médico que irá administrar o tratamento será capaz dedeterminar a dose apropriada para o paciente individual.
Recaída do crescimento tu moral
A invenção fornece também métodos e composições para inibirou impedir a recaída do crescimento tumoral ou recidiva do crescimento celulardo câncer. Recaída do crescimento tumoral ou recidiva do crescimento celulardo câncer é usado para descrever uma condição na qual os pacientessubmetidos ao tratamento com uma ou mais terapêuticas disponíveisatualmente (por exemplo, terapias, como a quimioterapia, radioterapia, cirurgia,terapia hormonal e/ou terapia biológica/imunoterapia, terapêutica comanticorpos anti-VEGF, especialmente em um regime terapêutico normalespecial para o câncer) não é clinicamente adequado para tratar os doentes ouos pacientes já não estão recebendo qualquer efeito benéfico com aterapêutica de tal forma que estes pacientes precisam de mais eficáciaterapêutica. Assim como utilizado no presente, a frase pode também referir-sea uma condição "não responsiva / recidiva" do paciente, por exemplo, quedescreve os pacientes que respondem à terapêutica ainda sofrem com osefeitos secundários, desenvolvem resistência, não respondem à terapêutica,não respondem satisfatoriamente à terapia e etc. Em vários exemplos derealização, o câncer é uma recaída do crescimento tumoral ou recidiva docrescimento celular do câncer, no qual o número de células cancerosas nãotenha sido significativamente reduzido, ou tenha aumentado e o tamanho ou otumor não tenha sido significativamente reduzido, ou tenha aumentado, ou nãohouve qualquer nova redução no tamanho ou no número de célulascancerosas. A determinação de quando as células cancerígenas sofreramrecaída do crescimento tumoral ou recidiva do crescimento celular do câncerpode ser feita tanto in vivo ou in vitro por qualquer método conhecido no estadoda técnica para mensurar a eficácia do tratamento nas células cancerosas,utilizando significados aceitos no estado da arte de "recaída "ou "recidiva"ou"não responsivo" no presente contexto. Um tumor resistente ao tratamentoanti-VEGF é um exemplo de recaída do crescimento tumoral.
A invenção fornece métodos para bloquear ou reduzir a recaídado crescimento tumoral ou recidiva do crescimento celular no câncer em umpaciente administrando um ou mais anticorpos anti-EphB4 para bloquear oureduzir a recaída do crescimento tumoral ou recidiva do crescimento celular nocâncer em um paciente. Em certos exemplos de realização, o antagonista podeser administrado subseqüentemente à terapêutica para tratar o câncer. Emcertos exemplos de realização, o anticorpo anti-EphB4 é administradosimultaneamente com a terapêutica para tratar o câncer. Alternativamente ouadicionalmente, a terapia com os anticorpos anti-EphB4 e alternada com outraterapia, que pode ser realizada em qualquer ordem. A invenção tambémabrange métodos de administração a uma ou mais anticorpos inibidores paraprevenir o aparecimento ou a reincidência do câncer em pacientes compredisposição a ter câncer. Geralmente, o paciente foi ou está passando poruma terapia concomitante. Em um exemplo de realização, a terapia é otratamento com um agente anti-angiogênese, por exemplo, um antagonista deVEGF. O agente anti-angiogênese inclui aqueles conhecidos na arte e asencontradas na seção "Definições" no presente. Em um exemplo de realização,o agente anti-angiogênese é um anticorpo anti-VEGF neutralizante oufragmento (por exemplo, o anticorpo humanizado A4.6.1, AVASTIN®(Genentech, São Francisco, CA), Y0317, M4, G6, B20, 2C3, etc ). Vide, porexemplo, as Patentes US 6582959, US 6884879, US 6703020; documentosW098/45332; WO 96/30046; W094/10202; Patente EP 0666868B1; patentesUS 20030206899, US 20030190317, US 20030203409 e US 20050112126;Popkov et ai, Joumal of Immunological Methods 288 :149-164 (2004), edocumento W02005012359. Agentes adicionais podem ser administrados emcombinação com um antagonista de VEGF e um anticorpo anti-EphB4 parabloquear ou reduzir uma recaída do crescimento tumoral ou recidiva docrescimento celular no câncer, por exemplo, vide a seção intitulada "TerapiasCombinadas" no presente.
O anticorpo da invenção (e agente terapêutico adjunto) é/sãoadministrado(s) por qualquer meio apropriado, que inclui parenteral,subcutâneo, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal e, se desejado paratratamento local, administração intralesional. As infusões parenterais incluemadministração intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal ousubcutânea. Além disso, o antagonista é administrado adequadamente pormeio de infusão no pulso, particularmente com doses decrescentes doantagonista. Preferencialmente, a dosagem é fornecida por meio de injeções,de maior preferência injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo, emparte de se a administração é rápida ou crônica.
A composição de anticorpo deve ser formulada, dosada eadministrada de uma forma consistente com as boas práticas médicas. Fatorespara consideração neste contexto incluem a disfunção particular a ser tratada,o mamífero particular a ser tratado, a condição clínica do paciente, a causa dadisfunção, o local de fornecimento do agente, o método de administração, asincronização da administração e outros fatores conhecidos pelos médicos. Oanticorpo não precisa ser, mas é opcionalmente formulado com um ou maisagente normalmente utilizados para prevenir ou tratar a disfunção em questão.A quantidade eficaz destes outros agentes depende da quantidade doanticorpo presente na formulação, do tipo de disfunção ou tratamento, e outrosfatores discutidos acima. Estes são geralmente utilizados nas mesmasdosagens e com vias de administração conforme descritas acima ou cerca de 1a 99% das dosagens descritas no presente.
Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagemapropriada de anticorpo da invenção (quando utilizado isoladamente ou emcombinação com outros agentes tais como agentes quimioterapêuticos,conforme indicado acima) dependerá do tipo de doença a ser tratado, do tipode antagonista, da severidade e do curso da doença, se o antagonista éadministrado para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapia anterior,histórico clínico do paciente e reação ao antagonista e do critério do médicoatendente. O anticorpo é adequadamente administrado ao paciente em umavez ou ao longo de uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e daseveridade da doença, cerca de 1 µg/kg a 15 mg/kg (tal como 0,1 mg/kg a 10mg/kg) de anticorpo é uma possível dose inicial para administração aopaciente, seja, por exemplo, por meio de uma ou mais administraçõesseparadas ou por meio de infusão contínua. Uma dosagem diária típica poderávariar de cerca de 1 µg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatoresmencionados acima. Para administrações repetidas ao longo de vários dias oumais, dependendo da condição, o tratamento é mantido até que ocorrasupressão desejada de sintomas da doença. Uma dosagem exemplar doanticorpo estará na faixa de cerca de 0,05 mg/kg a 10 mg/kg. Desta forma, umaou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ouqualquer de suas combinações) podem ser administradas ao paciente. Essasdoses podem ser administradas intermitentemente, tal como semanalmente oua cada três semanas (por exemplo, de tal forma que o paciente receba cercade duas a vinte, tal como cerca de seis doses do anticorpo). Dose de ataqueinicial mais alta, seguida por uma ou mais doses mais baixas, pode seradministrada. Exemplo de regime de dosagem compreende a administração deuma dose de ataque inicial de cerca de 4 mg/kg, seguida por doses demanutenção semanais de cerca de 2 mg/kg do anticorpo. Entretanto, outrosregimes de dosagens podem ser úteis. O andamento desta terapia é facilmentemonitorado por meio de técnicas e ensaios convencionais.
Os anticorpos anti-EphB4 da invenção são úteis em ensaios para sedetectar a expressão de EphB4 (tais como testes diagnósticos ou prognósticos) emcélulas ou tecidos específicos no qual os anticorpos são marcados como descrito aseguir e/ou são imobilizados em uma matriz insolúvel.
Em outro aspecto, a invenção fornece métodos para a detecçãode EphB4, compreendendo os métodos de detecção de anticorpos anti-complexo EphB4-anti-EphB4 na amostra. O termo "detecção", da forma com éutilizado no presente inclui a detecção qualitativa e/ou quantitativa (mediçãodos níveis), com ou sem referência a um controle.
Em outro aspecto, a invenção fornece métodos para diagnosticar umapatologia associada com a expressão e/ou atividade de EphB4, compreendendotais métodos da detecção do complexo anticorpo anti-EphB4-EphB4 em umaamostra biológica de um paciente com ou com suspeita de ter a doença. Em algunsexemplos de realização, a expressão de EphB4 é uma expressão aumentada ouanormal (indesejável). Em alguns exemplos de realização, a desordem é um tumor,câncer e/ou distúrbio da proliferação celular.
Em outro aspecto, a invenção fornece qualquer um dos anticorposanti-EphB4 descrito no presente, no qual o anticorpo anti-EphB4 consta de ummarcador detectável.
Em outro aspecto, a invenção fornece um complexo de qualquerum dos anticorpos anti-EphB4 descrito no presente e EphB4. Em algunsexemplos de realização, o complexo está in vivo ou in vitro. Em algunsexemplos de realização, o complexo é formado em células de câncer. Emalguns exemplos de realização, o anticorpo anti-EphB4 é marcado de forma aser detectado.
Anticorpos anti-EphB4 podem ser utilizados para a detecção doEphB4 por qualquer um de uma variedade de métodos de detecção bemconhecidos. Por exemplo, uma amostra biológica podem ser submetida aoensaio do EphB4 para se obter a amostra a partir de uma fonte desejada,misturando a amostra com os anticorpos anti-EphB4 para permitir que osanticorpos formem o complexo anticorpos / EphB4 com um EphB4 presente naamostra, e detectando um complexo anticorpo / EphB4 presentes na amostra.A amostra biológica pode ser preparada para análise por métodos conhecidosna arte que são particularmente adequados para aquela amostra. Os métodospara misturar a amostra com os anticorpos e os métodos para a detecção docomplexo anticorpo/EphB4 são escolhidos em função do tipo de ensaioutilizado. Esses ensaios incluem imuno-histoquímica, ensaios imuno-competitivos e do tipo "sanduíche", e ensaios de inibição.
Métodos analíticos para todos EphB4 utilizam um ou mais dosseguintes reagentes: análogo do EphB4 marcado, análogo do EphB4imobilizado, anticorpo anti-EphB4 marcado, anticorpo anti-EphB4imobilizado econjugados estéricos. Os reagentes marcados também são conhecidos como"marcadores".
O marcador utilizado é uma funcionalidade detectável que nãointerfere na ligação do anticorpo anti-EphB4 ao EphB4. Diversos marcadoressão conhecidos para o uso em imunoensaio, incluindo, por exemplo, moléculasque podem ser detectadas diretamente, tais como fluorocromos,quimioluminescentes, marcadores radioativos, bem como moléculas, comoenzimas, que podem ser reagidas ou derivatizadas para serem detectadas.
Exemplos desses marcadores incluem: os radioisótopos P32, C14, I125, H3 e I131,fluorofóros tal como quelatos raros ou fluoresceínas e seus derivados,rodamina e seus derivados, dansil, umbeliferona, luceriferase, por exemplo,Luciferase firefly e Luciferases bacterianas (Patente US 4.737.456), Luciferina,2,3-dihidroftalazinadionas, peroxidase de rábano (HRP), fosfatase alcalina, p-galactosidase, glicoamilase, lisozima, sacarina oxidases, por exemplo, glicoseoxidase, galactose oxidase, e glicose-6-fosfato-desidrogenase, oxidasesheterocíclicas tais como uricase e xantina oxidase, conjugada com uma enzimaque emprega peróxido de hidrogênio para oxidar um corante precursor comoHRP, Iactoperoxidase ou microperoxidase, biotina/avidin, rótulos spin,bacteriófagos marcadores, radicais livres estáveis, e similares.
Os métodos convencionais estão disponíveis para ligar estesmarcadores covalentemente à proteínas ou polipeptídeos. Por exemplo,agentes acopladores tais como dialdeídos, carbodiimidas, dimaleimidas,imidatos-bis, benzidina bis- diazotizada e similares podem ser utilizados paramarcar os anticorpos com os marcadores fluorescentes, quimioluminescente eenzimáticos descritos acima. Vide, por exemplo, Patente US 3.940.475(fluorimetria) e US 3.645.090 (enzimático); Hunter et ai, Nature, 144: 945(1962); David et ai, Biochemistry, 13: 1014-1021 (1974); Pain et ai, J.Immunol. Methods, 40: 219-230 (1981); e Nygren, J. Histochem and Cytochem,30: 407-412 (1982). Marcadores preferidos no presente são enzimáticos comoa peroxidase de rábano e fosfatase alcalina. A conjugação de tal marcador,incluindo as enzimas, no anticorpo é um procedimento de manipulação padrãopara aqueles hábeis nas técnicas de imunoensaio. Vide, por exemplo,0'Sullivan et ai., "Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugatesfor Use in Enzyme Immunoassay" em: Methods in Enzymology, Ed. J.J.Langone e H. Van Vunakis, vol. 73 (Academic Press, Nova Iorque, NY1 1981),págs. 147-166.
A imobilização de reagentes é exigida para determinados ensaios
de medição. A imobilização implica na separação dos anticorpos anti-EphB4 apartir de qualquer EphB4 que permanece livre na solução. Isto é realizadoconvencionalmente, por qualquer insolubilização do anticorpo anti-EphB4 ouanálogo de EphB4 antes do procedimento de ensaio como pela adsorção emuma matriz ou superfície insolúvel em água (Bennich et al, Patente US3720760), por acoplamento covalente (por exemplo, utilizando reticulação emglutaraldeído) ou por insolubilização do anticorpo anti-EphB4 ou análogo deEphB4 após, por exemplo, a imunoprecipitação.
A expressão de proteínas em uma amostra pode ser analisadautilizando a imuno-histoquímica e protocolos de coloração. A coloração porimuno-histoquímica em cortes de tecidos tem se mostrado um método confiávelde avaliar ou detectar a presença de proteínas em uma amostra. Técnicas deimuno-histoquímica ("IHC") utiliza um anticorpo para sondar e visualizar osantígenos celulares de maneira in situ, geralmente por utilizando umcromógeno ou métodos fluorescentes. Para a preparação da amostra, umaamostra de tecido ou célula de um mamífero (geralmente um paciente homem)pode ser utilizado. Exemplos de amostras incluem, mas não se limitam a,células cancerígenas do cólon, mama, próstata, ovário, pulmão, estômago,pâncreas, linfoma, leucemia e células cancerosas. A amostra pode ser obtidoatravés de uma variedade de procedimentos conhecidos na arte, incluindo masnão se limitado a, excisão cirúrgica, aspiração ou biópsia. Os tecidos podemser frescos ou congelados. Em um exemplo de realização, a amostra é fixada eemblocada em parafina ou de maneira similar. A amostra de tecido pode serfixada (isto é, preservada) pelo método convencional. Os técnicos hábeis naarte apreciarão que a escolha do fixador é determinado pela finalidade a qual aamostra será histologicamente corada ou de outra forma analisada. Ostécnicos hábeis na arte também apreciarão que o tempo de fixação depende dotamanho da amostra, do tecido e do fixador utilizado.
A IHC pode ser realizada em combinação com outras técnicasadicionais, tais como coloração morfológica e/ou hibridização in situ porfluorescência. Dois métodos gerais de IHC são disponíveis; ensaios diretos eindiretos. De acordo com o primeiro ensaio, da ligação do anticorpo aoantígeno-alvo (por exemplo, EphB4) é determinado diretamente. Este ensaioutiliza um reagente marcado direto, tal como um marcador fluorescente ou umanticorpo primário marcado com enzima, que pode ser visualizado, sem ainteração de um anticorpo adicional. Em um ensaio indireto típico, o anticorpoprimário não conjugado liga-se ao antígeno e, em seguida, um anticorposecundário marcado se liga ao anticorpo primário. O anticorpo secundário éconjugado com um marcador enzimático, um substrato cromogênico oufluorogênico é adicionado para fornecer visualização do antígeno. Aamplificação do sinal ocorre porque vários anticorpos secundários podemreagir com diferentes epítopos do anticorpo primário.
O anticorpo primário e/ou secundário utilizado na imuno-histoquímica é tipicamente marcado com uma molécula detectável. Numerososmarcadores estão disponíveis e podem ser agrupados nas seguintescategorias:
Além dos procedimentos da preparação da amostra discutidosacima, a continuação do tratamento do corte de tecido antes, durante ou apósa IHC pode ser desejada, por exemplo, métodos de recuperação do epítopo(recuperação antigênica) como, por exemplo, pode ser realizado oaquecimento da amostra de tecido em tampão citrato (Vide, por exemplo,Leong et al. Appl. Immunohistochem. 4(3):201 (1996)).
Após uma etapa opcional de bloqueio, o corte de tecido é expostoao anticorpo primário por um período de tempo suficiente e em condiçõesadequadas, de modo que o anticorpo primário se liga ao antígeno da proteínaalvo na amostra de tecido. Condições adequadas para atingir isto pode serdeterminado pela experimentação de rotina. A extensão da ligação do anticorpo naamostra é determinada usando qualquer um dos marcadores detectáveis discutidosacima. De preferência, o marcador é um marcador enzimático (por exemplo,HRPO), que catalisa uma reação química do substrato cromógeno como ocromógeno 3,3-diaminobenzidina. De preferência o marcador enzimático éconjugado ao anticorpo que se liga especificamente ao anticorpo primário (porexemplo, o anticorpo primário é anticorpo policlonal de coelho e o anticorposecundário é anticorpo de cabra anti-anticorpo de coelho).
Espécimes assim preparados podem ser montados e colocadouma lamínula. A lâmina é então avaliada, por exemplo, utilizando ummicroscópio, empregando critérios de coloração e intensidade, rotineiramenteutilizados no estado da arte. Os critérios de intensidade de coloração podemser avaliados da seguinte maneira:
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Tipicamente, um padrão de coloração de pontuação de cerca de2+ ou mais em um ensaio de IHC é um diagnóstico e/ou prognóstico. Emalguns exemplos de realização, um padrão de coloração a pontuação de cercade 1+ ou mais é um diagnóstico e/ou prognóstico. Em outros exemplosrealização, um padrão de coloração de pontuação 3+ ou maior é diagnósticoe/ou prognóstico. Entende-se que, quando células e/ou tecido de um tumor decólon ou adenoma são analisados utilizando a coloração de IHC1 geralmente édeterminado ou avaliado nas células e/ou tecidos tumorais (em contraposiçãoao estroma ou tecido circundante que possa estar presente na amostra).
Outros métodos de medição, conhecido como ensaio competitivoou "sanduíche", são bem estabelecidos e amplamente utilizados na indústriadiagnostica comercial.
Ensaios competitivos vale se da habilidade de um marcadoranálogo EphB4 competir com o EphB4 da amostra do ensaio para um númerolimitado de locais de antígenos ligados a anticorpos anti-EphB4. O anticorpoanti-EphB4 geralmente é insolubilizado antes ou depois da competição e, emseguida, o marcador e EphB4 ligado ao anticorpo anti-EphB4 são separados domaterial não ligado ao marcador e EphB4. Esta separação é realizada pordecantação (onde o parceiro de ligação é pré-insolubilizado) ou porcentrifugação (onde o parceiro de ligação foi precipitado após a reação decompetição). A quantidade de amostra EphB4 é inversamente proporcional àquantidade de Iigante marcado medido pela quantidade de substânciamarcadora. Curvas dose-resposta com quantidades conhecidas de EphB4 sãopreparados e comparados com os resultados do teste para determinarquantitativamente a quantidade de EphB4 presentes na amostra teste. Estesensaios são chamados sistemas ELISA quando enzimas são utilizadas comomarcadores detectáveis.
Outra espécie de ensaio competitivo, chamado de ensaio"homogêneo", não exige uma fase de separação. Aqui, um conjugado de umaenzima com o EphB4 é preparada e utilizada de tal maneira que quandoanticorpo anti-EphB4 se liga ao EphB4 a presença do anticorpo anti-EphB4modifica a atividade enzimática. Neste caso, o EphB4 imunologicamente ativoou seus fragmentos são conjugados com uma ponte orgânica bifuncional talcomo uma enzima peroxidase. Conjugados são selecionados para uso com oanticorpo anti-EphB4 de modo que a ligação do anticorpo anti-EphB4potencializa ou inibe a atividade das enzimas marcadoras. Este método per seé amplamente praticado sob o nome de EMIT.
Conjugados estéricos são utilizados nos métodos de bloqueioestérico para ensaios de homogeneidade. Estes conjugados são sintetizadospor uma ligação covalente de um pequeno fragmento de hapteno de baixopeso molecular à EphB4 de modo que o anticorpo-hapteno é substancialmenteincapaz de ligar ao conjugado, ao mesmo tempo que anticorpos anti-EphB4.Sob este procedimento, a dosagem de EphB4 presente na amostra teste iráligar ao anticorpo anti-EphB4, permitindo assim o anti-hapteno se ligar aoconjugado, resultando em uma mudança nas características do haptenoconjugado, por exemplo, uma mudança na fluorescência quando o hapteno éum fluoróforo.
Ensaios do tipo "sanduíche" são particularmente úteis para adeterminação do EphB4 ou anticorpos anti-EphB4. Nos ensaios sanduíchesseqüenciais um anticorpo anti-EphB4 imobilizado é utilizado para adsorveramostra EphB4, a amostra é removida por lavagem, os EphB4 ligados sãoutilizados para adsorver um segundo anticorpo anti-EphB4 marcado e omaterial ligado é separadas do marcador residual. A quantidade de marcadorligado presente é diretamente proporcional à quantidade de EphB4 na amostra.Em ensaios do tipo "sanduíche" do "simultâneo" a amostra não é separadaantes da adição do anti-EphB4 marcado. Um ensaio sanduíche seqüencialusando um anticorpo monoclonal anti-EphB4 como anticorpo e uma anticorpoanti-EphB4 policlonal como outro anticorpo é útil para testar amostras para apresença de EphB4.
Os precedentes são meramente ensaios exemplificativos para adetecção EphB4. Outros métodos atuais ou que serão desenvolvidos no futuroque utilizam anticorpos anti-EphB4 para a determinação de EphB4 estãoincluídos dentro do escopo do presente, incluindo os bioensaios aqui descritos.
Artigos Manufaturados
Em outro aspecto da invenção, um artigo manufaturado, contendoos materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico dasdesordens acima descritas são fornecidos. O artigo manufaturado consta deum recipiente e rótulo ou uma bula sobre ou associado ao recipiente. Osrecipientes apropriados incluem, por exemplo, frascos, seringas, blisters, etc.Os recipientes podem ser feitos de uma variedade de materiais tais como ovidro ou o plástico. O recipiente guarda uma composição a qual está sozinhaou está combinada com outra composição eficaz para tratar prevenir e/oudiagnosticar a condição e que possa ter uma porta de acesso estéril (porexemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frascoque possui um controlador (stopper pierceable) colocado através de umaagulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição éum anticorpo da invenção como, por exemplo, o câncer. O rótulo ou a bulaindicam que a composição é útil para o tratamento de escolha. Adicionalmente,o artigo manufaturado pode compreender (a) um primeiro recipiente com umacomposição nele contida, onde a composição compreende um anticorpo dainvenção, e (b) um segundo recipiente com uma composição nele contida quecompreende um agente citotóxico. O artigo manufaturado nesta realização dainvenção pode ainda compreender um folheto informativo que indique que oprimeiro ou segundo anticorpo da composição pode ser usado para tratar umacondição específica. Alternativamente, ou adicionalmente, o artigomanufaturado pode ainda compreende de um segundo (ou terceiro) recipientecontendo um tampão farmaceuticamente aceitável, como água bacteriostáticapara injeção (BWFI)1 solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringere solução de dextrose. Pode-se incluir ainda outros materiais desejáveis apartir de uma perspectiva comercial e de uso, que inclui outros tampões,diluentes, filtros, agulhas e seringas.
O que se segue são exemplos de métodos e composições dainvenção. Entende-se que vários outros exemplos de realização podem serpraticados, dada a descrição geral fornecido acima.
Exemplos
Exemplo 1
Produção de Anticorpos Anti-EphB4
Anticorpos anti-EphB4 foram gerados usando exibição por fago,utilizando a proteína His-EphB4 para selecionar o fago. Uma variedade de métodossão conhecidos na arte para a produção de bibliotecas de exibição por fagos a partirdo qual um anticorpo de interesse pode ser obtido. Um método de produção deanticorpos de interesse é através do uso de uma biblioteca de anticorpo por fago, talcomo descrito em Lee et ai, J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93. Clonesselecionados através da exibição por fago foram rastreados contra a proteína His-EphB4 utilizando fagos ELISA. Clones únicos foram selecionados por adicionalcaracterização pela compentição de fagos em ELISA e um ensaio de bloqueio paradeterminar se o clone de anticorpo do fago poderia bloquear a interção EphB4-efrinaB2. Clone 30.35 realizado favoravelmente e foi selecionado para uma análisemais aprofundada. Para melhorar a afinidade do clone 30.35, bibliotecas deexibição por fago foram geradas em um fundo de YW30.35, cada alvo selecionadopara HVRs para aleatorização leve e pesada. Os clones foram selecionados porfagos em ELISA e, em seguida, expressos com proteínas Fab e sua afinidade foideterminada utilizando Biacore. Os clones foram reformatados como IgGs decomprimento total, e sua afinidade foi determinado utilizando Biacore. Asseqüências parenterais do clone 30.35 e os clones de afinidade maturada sãoexibidos na Figura 1.
Exemplo 2
Caracterização dos Anticorpos Anti-Eph B4
Para determinar a afinidade de ligação dos Mabs anti-EphB4, foiutilizado um ensaio de ressonância plasmônica de superfície (SRP) com umBlAcore™ 3000 (BlAcore, Inc., Piscataway1 NJ). Resumidamente, chipsbiosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BlAcore Inc.) foram ativados comcloridrato de n-etil-n'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e N-hidroxisuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. O anticorpoanti-EphB4 foi diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, em 5pg/ml antes dainjeção a uma velocidade de fluxo de cerca de 5pl/minuto para atingir cerca de 500unidades resposta (RU) de anticorpos acoplados. Em seguida, foi injetado 1Metanolamina para bloquear grupos não reativos. Para a medição da cinética,diluições seriadas em duas vezes de cada molécula EphB4-His humana ou murina(0.7nM a 500nM) foram injetadas em PBS com 0,05% Tween a 20 - 25 0C em umavelocidade de fluxo de 25pl/min. A velocidade de associação (kon) e a velocidade dedissociação (M são calculadas utilizando um modelo de ligação simples um-para-um de Langmuir (BlAcore Evaluation Software version 3.2). O equilíbrio daconstante de dissociação (Kd) é calculado como a relação Mw Os resultadosdeste experimento são exibidos na Tabela 3. "NA" significa que a medição não foirealizada.
Tabela 3
Afinidade De Ligação E Cinética Dos Anticorpos Anti-Ephb4 Ao Ephb4Humano E De Camundongo.
<table>table see original document page 159</column></row><table><table>table see original document page 160</column></row><table>
Em diversos experimentos, a reatividade cruzada dos
anticorpos anti-EphB4 clone 30.35 foi testada contra outros receptoresEphB. Resumidamente, células COS7 foram transitoriamente transfectadascom plasmídeos expressando EphBIhumano de comprimento total, EphB2humano, EphB4 humano ou EphB6 humano. 24 horas após a transfecção,as células foram submetidas a análise por FACS para detectar a ligaçãodos anticorpos anti-EphB4, se for o caso. O clone 30.35 Anti-EphB4 nãoreage cruzadamente com EphBI humano, EphB2 humano, EphB3 humanoou EphB6 humano.Exemplo 3
Anticorpos Anti-EphB4 Bloqueia a Sinalização do Receptor EphB4 em um
Ensaio Baseado em Célula
A fim de demonstrar a capacidade dos anticorpos anti-EphB4 debloquear a interação da ligação da EfrinaB2 e EphB4 na membrana, nósrealizamos uma análise baseada em célula na qual EphB4 e EfrinaB2 foramapresentadas por diferentes tipos de células. Células 3T3 que super-expressam EfrinaB2 humana foram utilizadas para estimular células HUVECque expressam um nível elevado de EphB4 mas um nível baixo de EfrinaB2, ea capacidade dos anticorpos anti-EphB4 de inibir a ativação de EphB4 foitestada.
Células 3T3 que super-expressam EfrinaB2 humana forampreparadas da seguinte forma: A EfrinaB2 humana de comprimento total foiclonada em um vetor pcDNA5/FRT (Invitrogen) e, posteriormente, utilizadaspara gerar uma linhagem celular estável com células 3T3.Flp (Invitrogen) deacordo com o manual do fabricante.
Células 3T3 que super-expressam EfrinaB2 humana foramsobrepostas em células HUVEC por 15 ou 30 minutos, na presença ouausência de anticorpos anti-EphB4. A ativação dos receptores EphB4 foiavaliada por imunoprecipitação das proteínas EphB4 e, em seguida, adetecção da presença ou ausência da fosforilação de receptores tirosinausando anticorpos anti-fosfotirosina (anticorpo 4G10; Upstate) utilizandoWestern Blotting. Resumidamente, as células foram Iisadas com tampão RIPA.Lisados celulares foram clarificadas por centrifugação e o anticorpo anti-EphB435.2D8 foi adicionado em 5 pg/amostra. Após incubação a 4 0C por duas horas,os imunocomplexos foram retirados usando agarose Proteína A. A fosforilaçãodo EphB4 foi analisada por Western Blot utilizando um anticorpo anti-fosfotirosina 4G10 (Upstate) a uma concentração de 1 pg/ml.
Os resultados desta experiência são exibidos na figura 7. Asuperposição de células 3T3 em células HUVEC causa uma dramáticafosforilação de tirosina da EphB4 (faixa 4 e 5). Uma pré-incubação de 30minutos de HUVECs com anticorpos anti-EphB4 (clone 35.2D8 em 5 pg/ml)aboli efetivamente a fosforilação de tirosina da EphB4 induzida pelasobreposição das células 3T3-EfrinaB2 (faixa 6). Em contrapartida, otratamento das células HUVEC com anti-EphB4 per se só não causou aativação de EphB4 em HUVECs (faixa 2 e 3), e células HUVEC não tratadasnão demonstraram ativação de EphB4. Estes resultados estabelecem queanticorpos anti-EphB4 bloqueia a interação ligante-receptor no contexto docontato direto célula-célula.
Apesar de a invenção precedente ter sido descrita em algumdetalhe pelas ilustrações e exemplos para fins de clareza do entendimento, asdescrições e exemplos não devem ser entendidas como uma limitação doescopo da invenção.Listagem de Seqüencia
<110> Yan Wu e Minhong Yan
<120> ANTICORPOS ANTI-EPHB4 E MÉTODOS USANDO O MESMO
<130> P2300R1
<150> US 60/756,889<151> 05-01-2006
<150> US 60/760,892<151> 20-01-2006
<160> 62
<210> 1<211> 10<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> HVR-Hl<400> 1
Gly Phe Thr Ile Ser Gly Tyr Tyr Ile His
5 10
<210> 2<211> 10<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> HVR-Hl<400> 2
Gly Phe Ser Ile Ser Asn Tyr Tyr Leu His
5 10
<210> 3<211> 18<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> HVR-H2<400> 3
Gly Gly Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser15 10 15
Val Lys Gly
<210> 4<211> 18<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> HVR-H2<400> 4
Gly Gly Ile Tyr Leu Tyr Gly Ser Ser Ser Glu Tyr Ala Asp Ser1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 5<211> 18<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> HVR-H2<400> 5
Gly Gly Ile Tyr Leu Tyr Ser Gly Ser Arg Gly Tyr Ala Asp Ser1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 6<211> 18<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> HVR-H2<400> 6
Gly Gly Ile Tyr Leu Tyr Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser15 10 15
Val Lys Gly
<210> 7<211> 17<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> HVR-H3
<400> 7
Ala Arg Gly Ser Gly Leu Arg Leu Gly Gly Leu Asp Tyr Ala Met
15 10 15Asp Tyr
<210> 8<211> 17<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> HVR-H3<400> 8
Ala Arg Ser Ser Gly Leu Arg Leu Gly Gly Leu Asp Tyr Ala Met1 5 10 15
Asp Tyr
<210> 9<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> HVR-Ll<400> 9
Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
5 10
<210> 10<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> HVR-Ll<400> 10
Arg Ala Ser Gln Asp Ser Glu Ile Phe Leu Ala
5 10
<210> 11<211> 7<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> HVR-L2
<400> 11Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
5
<210> 12<211> 7<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> HVR-L2
<400> 12Ser Ala Ser Asn Leu Glu Ser
<210> 13<211> 9<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> HVR-L3<400> 13
Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
5
<210> 14<211> 9<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> HVR-L3<400> 14
Gln Gln Ser Asn Ala Val Pro Leu Thr
5
<210> 15<211> 9<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> HVR-L3<400> 15
Gln Glu Ser Thr Thr Thr Pro Pro Thr
5
<210> 16<211> 9<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> HVR-L3<400> 16
Gln Lys Ser Glu Thr Ile Pro Pro Ser
5<210> 17<211> 9<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> HVR-L3<400> 17
Gln Gln Thr Ala Gln Thr Pro Glu Thr
5
<210> 18<211> 107<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Dominio variável da cadeia leve de huMab4D5-8<400> 18
Asd Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn
20 25 30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
80 85 90
His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
95 100 105
Ile Lys
<210> 19<211> 87<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly
i5 10 15Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg
35 40 45
Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
50 55 60
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
65 70 75
Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
80 85
<210> 20<211> 81<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada<400> 20
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly15 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala
20 25 30
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp
35 40 45
Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser
50 55 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr
65 70 75
Leu Val Thr Val Ser Ser
80
<210> 21<211> 80<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly15 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala
20 25 30Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp
35 40 45
Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser
50 55 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu
65 70 75
Val Thr Val Ser Ser
80
<210> 22<211> 79<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly15 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala
20 25 30
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp
35 40 45
Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser
50 55 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
65 70 75
Thr Val Ser Ser
<210> 23<211> 87<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada<400> 23
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser15 10 15
Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser
20 25 30
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg
35 40 45Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys 50 55 60
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 65 70 75
Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 80 85
<210> 24<211> 81<212> PRT<213> Seqüência Artificial
<220><223> Seqüência é Sintetizada
<400> 24Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 10 15
Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro 20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Arg Val Thr Ile Ser Val Asp 35 40 45
Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala 50 55 60
Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr 65 70 75
Leu Val Thr Val Ser Ser 80
<210> 25<211> 80<212> PRT<213> Seqüência Artificial
<220><223> Seqüência é Sintetizada
<400> 25
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 10 15
Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro 20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Arg Val Thr Ile Ser Val Asp 35 40 45
Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala 50 55 60Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu
65 70 75
Val Thr Val Ser Ser
80
<210> 26<211> 79<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada<400> 26
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser15 10 15
Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro
20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Arg Val Thr Ile Ser Val Asp
35 40 45
Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala
50 55 60
Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
65 70 75
Thr Val Ser Ser
<210> 27<211> 87<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg
35 40 45
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
50 55 60
Met Asn
Ser Leu Arg65
Ala
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala70 75Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 80 85
<210> 28<211> 81<212> PRT<213> Seqüência Artificial
<220><223> Seqüência é Sintetizada
<400> 28Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala 20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 35 40 45
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala 50 55 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr 65 70 75
Leu Val Thr Val Ser Ser 80
<210> 29<211> 80<212> PRT<213> Seqüência Artificial
<220><223> Seqüência é Sintetizada
<400> 29Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala 20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 35 40 45
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala 50 55 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu 65 70 75
Val Thr Val Ser Ser 80<210> 30<211> 79<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220><223> Seqüência é Sintetizada
<400> 30Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala 20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 35 40 45
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala 50 55 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 65 70 75
Thr Val Ser Ser
<210> 31<211> 87<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220><223> Seqüência é Sintetizada
<400> 31Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys 20 25 30
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg 35 40 45
Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 50 55 60
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser 65 70 75
Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 80 85
<210> 32<211> 81<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Seqüência é Sintetizada
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala
20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp
35 40 45
Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
50 55 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gln Gly Thr
65 70 75
Leu Val Thr Val Ser Ser
80
<210> 33
<211> 80
<212> PRT
<220>
<213> Seqüência Artificial
<223> Seqüência é Sintetizada
<400> 33
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
1 5
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
20
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
10 15
Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala
25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp
35 40 45
Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
50 55 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu
65 70 75
Val Thr Val Ser Ser
80
<210> 34
<211> 87
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys
20 25 30
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg
35 40 45
Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln
50 55 60
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
65 70 75
Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
80 85
<210> 35<211> 81<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada<400> 35
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15
Glv Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala
20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp
35 40 45
Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
50 55 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr
65 70 75
Leu Val Thr Val Ser Ser
80
<210> 36<211> 80<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Seqüência é Sintetizada<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala
20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp
35 40 45
Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
50 55 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu
65 70 75
Val Thr Val Ser Ser
80
<210> 37<211> 79<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada<400> 37
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala
20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp
35 40 45
Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
50 55 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
65 70 75
Thr Val Ser Ser
<210> 38<211> 80<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada<400> 38
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val15 10 15Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
20 25 30
Lvs Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
35 40 45
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
50 55 60
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr
65 70 75
Lys Val Glu Ile Lys
80
<210> 39<211> 80<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada<400> 39
Asd Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro
I 5 10 15
Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly
20 25 30
Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
35 40 45
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val
50 55 60
Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr
65 70 75
Lys Val Glu Ile Lys
80
<210> 40<211> 80<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada<400> 40
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro15 10 15
Glv Glu Arq Ala Thr Leu Ser Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
20 25 30Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
35 40 45
Glv Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu
50 55 60
Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr
65 70 75
Lys Val Glu Ile Lys
80
<210> 41<211> 80<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada<400> 41
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu15 10 15
Glv Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
20 25 30
Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
35 40 45
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
50 55 60
Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr
65 70 75
Lys Val Glu Ile Lys
80
<210> 42<211> 23<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val15 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 43<211> 15<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada<400> 43
Trp Tvr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr1 5 10 15
<210> 44<211> 32<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada
<400> 44
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe
15 10 15
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
20 25 30
Tyr Cys
<210> 45<211> 10<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada<400> 45
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
5 10
<210> 46<211> 25<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada<400> 46
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 47<211> 13<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada<400> 47
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
5 10
<210> 48<211> 30<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada<400> 48
Arq Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu15 10 I5
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 49<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada<400> 49
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
<210> 50<211> 32<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada<400> 50
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe15 10 15
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
20 25 30
Tyr Cys<210> 51 <211> 30 <212> PRT <213> Seqüência Artificial<220> <223> Seqüência é Sintetizada<400> 51
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu1 5 10 15
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 52<211> 107<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada
<400> 52Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
20 25 30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
80 85 90
Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
95 100 105
Ile Lys
<210> 53
<211> 128<212> PRT<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Região variável da cadeia pesada de Mab30.35<400> 53
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser
20 25 30
Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Gly Gly Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Ser Thr Asp Tyr
50 55 60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
65 70 75
Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met
80 85 90
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
95 100 105
Gly Ser Gly Leu Arg Leu Gly Gly Leu Asp Tyr Ala Met Asp Tyr110 115 120
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr125
<210> 54<211> 108<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Região variável da cadeia pesada de Mab30.35<400> 54
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val15 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
20 25 30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
80 85 90
Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
95 100 105Ile Lys Arg
<210> 55<211> 128<212> PRT<213> Seqüência Artificial
<220><223> Região variável da cadeia pesada de Mab30.35.1D2
<400> 55
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser20 25 30
Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu35 40 45
Glu Trp Val Gly Gly Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Ser Thr Asp Tyr50 55 60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe65 70 75
Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met80 85 90
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg95 100 105
Ser Ser Gly Leu Arg Leu Gly Gly Leu Asp Tyr Ala Met Asp Tyr110 115 120
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr125
<210> 56<211> 108<212> PRT<213> Seqüência Artificial
<220><223> Região variável da cadeia leve de Mab30.35.1D2
<400> 56
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ser Glu20 25 30
Ile Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys35 40 4522
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
80 85 90
Ser Asn Ala Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
95 100 105
Ile Lys Arg
<210> 57
<211> 128
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Região variável da cadeia pesada de Mab30.35.2D8
<400> 57
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ile Ser
20 25 30
Asn Tyr Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Gly Gly Ile Tyr Leu Tyr Gly Ser Ser Ser Glu Tyr
50 55 60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
65 70 75
Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met
80 85 90
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
95 100 105
Glv Ser Gly Leu Arg Leu Gly Gly Leu Asp Tyr Ala Met Asp Tyr
110 H5 120
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
125
<210> 58
<211> 108
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Região variável da cadeia leve de Mab30.35.2D8<400> 58
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
20 25 30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Glu
80 85 90
Ser Thr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
95 100 105
Ile Lys Arg
<210> 59<211> 128<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Região variável da cadeia pesada de Mab30.35.2D12<400> 59
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser
20 25 30
Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Gly Gly Ile Tyr Leu Tyr Ser Gly Ser Arg Gly Tyr
50 55 60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
65 70 75
Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met
80 85 90
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
95 100 105Gly Ser Gly Leu Arg Leu Gly Gly Leu Asp Tyr Ala Met Asp Tyr110 115 120
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr125
<210> 60<211> 108<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Região variável da cadeia pesada de Mab30.35.2D12<400> 60
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
20 25 30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys
80 85 90
Ser Glu Thr Ile Pro Pro Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
95 100 105
Ile Lys Arg
<210> 61<211> 128<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Região variável da cadeia pesada Mab30.35.2D13<400> 61
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser
20 25 30
Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45Glu Trp Val Gly Gly Ile Tyr Leu Tyr Ser Gly Ser Thr Asp Tyr
50 55 60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
65 70 75
Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met
80 85 90
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
95 100 105
Gly Ser Gly Leu Arg Leu Gly Gly Leu Asp Tyr Ala Met Asp Tyr
110 115 120
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr125
<210> 62<211> 108<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Região variável da cadeia leve de Mab30.35.2D13<400> 62
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
15 10 15
Glv Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
20 25 30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
80 85 90
Thr Ala Gln Thr Pro Glu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
95 100 105
Ile Lys Arg

Claims (46)

1. ANTICORPO ANTI-EphB4 ISOLADO, compreendendo:(a) pelo menos um, dois, três, quatro ou cinco seqüências deregiões hipervariáveis (HVR) selecionadas a partir do grupo constituído pelosseguintes elementos:(i) HVR-L1 compreendendo a seqüência A1-A11, no qual, A1-A11é RASQDVSTAVA (SEQ ID No: 9).(ii) HVR-L2 compreendendo a seqüência B1-B7, no qual, B1-B7 éSASFLYS (SEQ ID No: 11)(iii) HVR-L3 compreendendo a seqüência C1-C9, no qual, C1-C9é QESTTTPPT (SEQ ID No: 15)(iv) HVR-H1 compreendendo a seqüência D1-D10, no qual, D1-D10 é GFSISNYYLH (SEQ ID No: 2)(v) HVR-H2 compreendendo a seqüência E1-E18, no qual, E1-E18 é GGIYLYGSSSEYADSVKG (SEQ ID No: 4) e;(vi) HVR-H3 compreendendo a seqüência F1-F17, no qual, F1-F17 é ARGSGLRLGGLDYAMDY (SEQ ID No: 7); e(b) pelo menos uma HVR variante, no qual a seqüência variantede HVR compreende a modificação de pelo menos um resíduo da seqüênciailustrado nas SEQ ID NOs:1-17.
2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato do variante de HVR-L1 possuir de 1-5 (1, 2, 3, 4 ou 5)substituições em qualquer combinação das seguintes posições: A6 (V ou S),A7 (S ou E), A8 (T ou I), A9 (A ou F) e A10 (V ou L).
3. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato do variante de HVR-L2 possuir de 1-2 (1 ou 2)substituições em qualquer combinação das seguintes posições: B4 (F ou N) eB6 (Y ou E).
4. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato do variante de HVR-L3 possuir de 1-7 (1. 2, 3, 4, 5, 6 ou 7) substituições em qualquer combinação das seguintes posições: C2 (Q, E ouK), C3 (S ou T), C4 (Y1 N, T, E ou A), C5 (T, A, ou Q), C6 (T, V1 ou I), C8 (P, L,ou E), e C9 (T ou S).
5. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato do variante de HVR-H1 possuir de 1-3 (1, 2 ou 3)substituições em qualquer combinação das seguintes posições: D3 (T ou S),D6 (G ou N), e D9 (I ou L ).
6 ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato do variante de HVR-H2 possuir de 1-5 (1, 2, 3, 4 ou 5)substituições em qualquer combinação das seguintes posições: E5 (P, ou L),E7 (S ou G), E8 ( G ou S), E10 (T, S, ou R) e E11 (D, E ou G).
7. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato do variante de HVR-H3 possuir 1 substituição nasseguintes posições: F3 (G ou S).
8. ANTICORPO ANTI- EphB4 ISOLADO, compreendendo um,dois, três, quatro, cinco ou seis HVRs, caracterizado pelo fato de possuir,consistir ou consistir essencialmente de uma seqüência selecionada de umgrupo consistindo das SEQ ID Nos: 1-17, e no qual a SEQ ID No: 9 ou 10correspondem a uma HVR-L1, SEQ ID No: 11 ou 12 correspondem a umaHVR-L2, SEQ ID No: 13, 14, 15, 16, ou 17 correspondem a uma HVR-L3, SEQID No: 1 ou 2 correspondem a uma HVR-H1, SEQ ID No: 3, 4, 5 ou 6correspondem a uma HVR-H2, e SEQ ID No: 7 ou 8 correspondem a umaHVR-H3.
9. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 8,caracterizado pelo fato do anticorpo compreender de HVR-L1, HVR-L2, L3-HVR, HVR-H1, HVR-H2, e HVR-H3, no qual cada, em ordem, compreende dasSEQ ID Nos: 9, 11, 13, 1, 3e7.
10. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 8,caracterizado pelo fato do anticorpo compreender de HVR-L1, HVR-L2, L3-HVR1 HVR-H1, HVR-H2, e HVR-H3, no qual cada, em ordem, compreende dasSEQ ID Nos: 10, 12, 14, 1, 3 e 8.
11. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 8,caracterizado pelo fato do anticorpo compreender de HVR-L1, HVR-L2, L3-HVR, HVR-H1, HVR-H2, e HVR-H3, no qual cada, em ordem, compreende dasSEQ ID Nos: 9, 11, 15, 2, 4 e 7.
12. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 8,caracterizado pelo fato do anticorpo compreender de HVR-L1, HVR-L2, L3-HVR, HVR-H1, HVR-H2, e HVR-H3, no qual cada, em ordem, compreende dasSEQ ID Nos: 9, 11, 16, 1, 5 e 7.
13. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 8,caracterizado pelo fato do anticorpo compreender de HVR-L1, HVR-L2, L3-HVR1 HVR-H1, HVR-H2, e HVR-H3, no qual cada, em ordem, compreende dasSEQ ID Nos: 9, 11, 17, 1, 6 e 7.
14. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações de 1a 13, caracterizado pelo fato de pelo menos uma porção da região estrutural éuma seqüência da região estrutural de consenso humano.
15. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a modificação é uma substituição, inserção oudeleção.
16. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações de 1a 15, caracterizado pelo fato do anticorpo compreender uma seqüência daregião estrutural de consenso humano subgrupo k.
17. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações de 1a 15, caracterizado pelo fato do anticorpo constar de uma seqüência da regiãoestrutural de consenso humano subgrupo III.
18. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 17,caracterizado pelo fato do anticorpo possuir uma substituição em uma ou maisdas posições 73, 73 ou 78.
19. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato do anticorpo possuir uma substituição em uma ou maisdas posições R71A, N73T ou N78A.
20. POLINUCLEOTÍDEO, que codifica um anticorpo de umadas reivindicações de 1 a 19.
21. VETOR, que possuí o ácido nucléico da reivindicação 20.
22. VETOR, de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de que o vetor é um vetor de expressão.
23. CÉLULA HOSPEDEIRA, contendo um vetor dasreivindicações 21 ou 22.
24. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 23,caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é procariótica.
25. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 23,caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é eucariótica.
26. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é de mamífero.
27. MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO ANTI-EphB4, caracterizado pelo fato do dito método compreender em (a) expressarum vetor da reivindicação 22, em uma célula hospedeira adequada, e (b)recuperar o anticorpo.
28. MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE UMIMUNOCONJUGADO ANTI-EphB4, caracterizado pelo fato do dito métodocompreender em (a) expressar um vetor da reivindicação 22, em uma célulahospedeira adequada, e (b) recuperar o anticorpo.
29. MÉTODO, de acordo a reivindicação 27 ou 28,caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é procariótica.
30. MÉTODO, de acordo a reivindicação 27 ou 28,caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é eucariótica.
31. MÉTODO PARA A DETECÇÃO DE EphB4,compreendendo o dito método de um complexo anticorpo anti-EphB4 - EphB4em uma amostra biológica, no qual o anticorpo anti-EphB4 do complexo é umanticorpo anti-EphB4 de qualquer uma das reivindicações de 1a19.
32. MÉTODO PARA DIAGNOSTICAR UM DISTÚRBIO,associado com a expressão de EphB4, compreendendo o dito método emdetectar o complexo anticorpo anti-EphB4 - EphB4 em uma amostra biológica ade um paciente com ou com suspeita de ter o distúrbio, no qual o anticorpoanti-EphB4 do complexo é um anticorpo anti-EphB4 de qualquer uma dasreivindicações de 1 a 19.
33. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações de 31 a-32, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-EphB4 é marcado para adetecção.
34. COMPOSIÇÃO, compreendendo um anticorpo de uma dasreivindicações de 1 a 19.
35. COMPOSIÇÃO, compreendendo um polinucleotídeo fieuma das reivindicações de 20 a 22.
36. COMPOSIÇÃO, de acordo a reivindicação 34 ou 35,caracterizada pelo fato da composição conter adicionalmente um veículo.
37. MÉTODO PARA INIBIR A ANGIOGÊNESE,compreendendo em administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz deum anticorpo anti-EphB4 de uma das reivindicações de 1 a 19 a um pacienteque necessite de tal tratamento.
38. MÉTODO, de acordo a reivindicação 37, caracterizado pelofato de compreender adicionalmente a administração de uma quantidade eficazde um agente anti-angiogênico ao paciente.
39. MÉTODO, de acordo a reivindicação 38, caracterizado pelofato de que o agente anti-angiogênico e administrado antes ousubseqüentemente a adminstração do anticorpo anti-EphB4.
40. MÉTODO, de acordo a reivindicação 38, caracterizado pelofato de que o agente anti-angiogênico é administrado concomitantemente como anticorpo anti-EphB4.
41. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações de 38 a-40, caracterizado pelo fato de que o agente anti-angiogênico é um antagonistado fator de crescimento endotelial vascular (VEGF).
42. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 41, caracterizadopelo fato de que o antagonista de VEGF é um anticorpo anti-VEGF.
43. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 42, caracterizadopelo fato de que o antagonista de VEGF é bevacizumab.
44. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações de 37 a-43, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente da administraçãode uma quantidade eficaz de um agente quimioterápico.
45. MÉTODO PARA TRATAR UM CÂNCER, TUMOR E/OUDISTÚRBIO DA PROLIFERAÇÃO CELULAR, no qual o método compreendeem administrar uma quantidade eficaz de anticorpo anti-EphB4 de uma dasreivindicações de 1 a 19 a um paciente que necessite de tal tratamento.
46. USO DE UM ANTICORPO, de uma das reivindicações de 1a 19 na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ouprofilático de um distúrbio.
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