TW201300415A - 抗ｅｐｈｂ４抗體及使用該抗體之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供抗EphB4抗體及包含此等抗體之組合物以及使用此等抗體之方法。

Description

抗EPHB4抗體及使用該抗體之方法
本發明一般而言係關於分子生物學領域。更特定言之，本發明係關於抗EphB4抗體及該等抗體之用途。
對於許多生理學及病理學過程而言，血管供應發育為一基礎需要。諸如胚胎及腫瘤之活躍生長的組織需要充分的血液供應。其藉由產生促進新血管經由稱為血管生成(angiogenesis)之過程形成之原血管生成因子滿足此需要。血管形成為涉及所有或多個以下步驟之複雜但有序的生物學事件：a)內皮細胞(EC)自存在的EC增生或自祖細胞分化；b)EC遷移且聚結以形成索樣結構；c)血管索接著經歷血管新生(tubulogenesis)以與中央腔形成血管；d)存在的索或血管長出萌芽以形成二級血管；e)初始血管叢經歷進一步重塑及整形；及f)末梢內皮細胞經募集以包裝內皮管，從而向血管提供維護及調節功能；該等細胞包括小毛細管之外被細胞、較大血管之平滑肌細胞及心臟中之心肌細胞。Hanahan,Science 277：48-50(1997)；Hogan及Kolodziej,Nat.Rev.Genet.3：513-23(2002)；Lubarsky及Krasnow,Cell 112：19-28(2003)。
現已完全確立：在各種病症之發病機制中涉及血管生成。此等病症包括實體腫瘤及轉移、動脈粥樣硬化、晶狀體後纖維組織增生、血管瘤、慢性炎症、諸如增生性視網膜病(例如糖尿病性視網膜病)之眼內新生血管性疾病、年 齡相關之黃斑部變性(AMD)、新生血管性青光眼、移植角膜組織及其他組織之免疫排斥反應、類風濕性關節炎及牛皮癬。Folkman等人，J.Biol.Chem.267：10931-34(1992)；Klagsbrun等人，Annu.Rev.Physiol.53：217-39(1991)；及Garner A.,"Vascular diseases"在：Pathobiology of Ocular Disease.A Dynamic Approach,Garner A.,Klintworth GK編輯，第2版(Marcel Dekker,NY,1994)，第1625-1710頁中。
在腫瘤生長狀況中，血管生成表現為對於自增生轉變為腫瘤形成而言及對於向腫瘤之生長及轉移提供滋養而言為至關重要的。Folkman等人，Nature 339：58(1989)。與正常細胞相比較，新血管生成允許腫瘤細胞獲得生長優勢及增生自主性。腫瘤通常作為單一異常細胞起始，由於與可利用的毛細管床之距離其可增生至數立方毫米尺寸，且其可保持"休眠"而長時期無進一步生長及擴散。接著，一些腫瘤細胞轉換為血管生成表型以活化內皮細胞，該等細胞增生且成熟為新毛細血管。此等新形成的血管不僅允許原發性腫瘤繼續生長，而且允許轉移性腫瘤細胞擴散及再菌落化。因此，在乳癌以及數種其他腫瘤中，已觀察到腫瘤切片中微血管密度與患者存活率之間的相互關係。Weidner等人，N.Engl.J.Med.324：1-6(1991)；Horak等人，Lancet 340：1120-24(1992)；Macchiarini等人，Lancet 340：145-46(1992)。雖然尚未完全瞭解控制血管生成轉換之精確機制，但吾人認為，腫瘤物質之新血管生成由眾多血管生成刺激劑及抑制劑之淨平衡產生(Folkman,Nat. Med.1(1)：27-31(1995))。
血管發育之過程受到嚴密調節。迄今，大量分子(大部分為周圍細胞產生的分泌因子)已顯示調節EC分化、增生、遷移及聚結為索樣結構。舉例而言，血管內皮生長因子(VEGF)已經識別為刺激血管生成及誘導血管滲透性所涉及的關鍵因子。Ferrara等人，Endocr.Rev.18：4-25(1997)。發現即使單一VEGF等位基因缺失亦導致胚胎死亡，指出此因子在血管系統發育及分化中所起的不可替代的作用。此外，VEGF已顯示為與腫瘤及眼內病症相關之新血管生成的關鍵介體。前述Ferrara等人，Endocr.Rev.。所檢查之大部分人類腫瘤過度表現VEGF mRNA。Berkman等人，J.Clin.Invest.91：153-59(1993)；Brown等人，Human Pathol.26：86-91(1995)；Brown等人，Cancer Res.53：4727-35(1993)；Mattern等人，Brit.J.Cancer 73：931-34(1996)；Dvorak等人，Am.J.Pathol.146：1029-39(1995)。
同樣，對於糖尿病性及其他缺血相關視網膜病而言，眼睛流體中VEGF之濃度水平與患者體內血管活性增生之存在高度相關。Aiello等人，N.Engl.J.Med.331：1480-87(1994)。此外，研究已證明，患者體內脈絡膜新生血管膜中VEGF之位置受AMD影響。Lopez等人，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.37：855-68(1996)。
抗VEGF中和抗體在裸鼠中抑制各種人類腫瘤細胞株之生長(Kim等人，Nature 362：841-44(1993)；Warren等人，J.Clin.Invest.95：1789-97(1995)；Borgström等人， Cancer Res.56：4032-39(1996)；Melnyk等人，Cancer Res.56：921-24(1996))且亦在缺血性視網膜病症模型中抑制眼內血管生成(Adamis等人，Arch.Ophthalmol.114：66-71(1996))。因此，抗VEGF單株抗體或VEGF作用之其他抑制劑為治療腫瘤及各種眼內新生血管性病症之有前途的候選者。該等抗體描述於(例如)公開於1998年1月14日之EP 817,648中；及均公開於1998年10月15日之WO 98/45331及WO 98/45332中。一種抗VEGF抗體，亦即貝伐單抗(bevacizumab)已由FDA核準與化學療法組合使用以治療轉移性結腸直腸癌(CRC)。且在多個正在進行的治療各種癌適應症之臨床試驗中研究貝伐單抗。
EphB4受體("EphB4"或"EphB4R")為eph受體家族之成員，其構成人類基因組中酪胺酸激酶受體之最大家族(評論於Dodelet,Oncogene,19：5614-5619,2000中)。人類eph受體酪胺酸激酶根據序列一致性分類為A類及B類，其中對應的A-型及B-型配位基稱為ephrin。信號傳輸可以轉遞方式發生，其中受體酪胺酸激酶由配位基活化；且可以逆轉方式發生，其中跨膜ephrinB配位基由與受體之相互作用活化。多種生物學功能已涉及Eph受體配位基相互作用，該等生物學功能包括軸突導向、組織邊界形成、血管發生及細胞活動性(Kullander等人，Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.,3：475-486,2002；Cheng等人，Cytokine Growth Factor Rev.,13：75-85,2002；Coulthard等人，Int.J.Dev.Biol.,46：375-384,2002)。EphB4結合諸如ephrin-B1、 ephrin-B2及ephrin-B3之配位基。EphB4受體具有細胞外區，其中一富含半胱胺酸之基元延伸超過其胺基末端一半，其後為兩個II型纖維結合蛋白基元。存在一細胞內域，其特徵在於一保守激酶區及一跨膜域。
顯然，仍然需要具有對於發展作為治療劑而言最佳的臨床屬性之藥劑。本文所述之本發明滿足此需要且提供其他優勢。
本文所引用之所有參考案均以全文引用方式併入本文中，包括專利案申請案及公開案。
本發明係部分基於各種EphB4結合劑(例如免疫結合物、抗體及其片段)之識別。EphB4表示一重要且有利的治療目標，且本發明基於結合EphB4提供組合物及方法。如本文所述之本發明EphB4結合劑對於以與EphB4-EphB4配位基途徑表現及/或活性相關的病理性病況為靶向中之用途而言，提供重要的治療劑及診斷劑。因此，本發明提供與EphB4結合相關的方法、組合物、套組及製造物品。
本發明提供結合(例如特異性結合)至EphB4之抗體。
在一態樣中，本發明提供一種經分離抗EphB4抗體，其中該抗體之全長IgG形式特異性結合人類EphB4，其中結合親和力為約50 pM或更佳。如此項技術中完全確立：配位基與其受體之結合親和力可使用各種檢定測定，且可以各種定量值為單位表述。因此，在一實施例中，結合親和力作為Kd值表述，且反映固有結合親和力(例如，具有最 小化的親和力效應)。一般而言且較佳地，無論在無細胞設定或在細胞相關設定中均於活體外量測結合親和力。此項技術中已知的數種檢定(包括本文所述之彼等檢定)中之任一種均可用於獲得結合親和力量測結果，該等檢定包括(例如)Biacore、放射免疫檢定(RIA)及ELISA。
在一態樣中，本發明提供一種結合EphB4之配位基結合區的經分離抗體。在一些實施例中，該經分離抗體結合包含EphB4細胞外域或由EphB4細胞外域組成或基本上由EphB4細胞外域組成之多肽。
在一態樣中，本發明提供一種與EphB4配位基競爭結合至EphB4之經分離抗EphB4抗體。
在一態樣中，本發明提供一種抑制、降低及/或阻斷EphB4活性之經分離抗EphB4抗體。在一些實施例中，EphB4自體磷酸化受抑制、降低及/或阻斷。
在一態樣中，本發明之抗EphB4抗體包含：(a)選自由以下序列組成之群的至少一個、兩個、三個、四個或五個高變區(HVR)序列：(i)包含序列A1-A11之HVR-L1，其中A1-A11為RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：9)，(ii)包含序列B1-B7之HVR-L2，其中B1-B7為SASFLYS(SEQ ID NO：11)，(iii)包含序列C1-C9之HVR-L3，其中C1-C9為QESTTTPPT(SEQ ID NO：15)，(iv)包含序列D1-D10之HVR-H1，其中D1-D10為 GFSISNYYLH(SEQ ID NO：2)，(v)包含序列E1-E18之HVR-H2，其中E1-E18為GGIYLYGSSSEYADSVKG(SEQ ID NO：4)及(vi)包含序列F1-F17之HVR-H3，其中F1-F17為ARGSGLRLGGLDYAMDY(SEQ ID NO：7)；及(b)至少一個變異HVR，其中該變異HVR序列包含在SEQ ID NO：1-17中所述的序列之至少一個殘基的改變。
在一態樣中，本發明提供一種包含一個、兩個、三個、四個、五個或六個HVR之抗體，其中各HVR包含選自由SEQ ID NO：1-17組成之序列或由該序列組成或基本上由該序列組成，且其中SEQ ID NO：9或10對應於HVR-L1，SEQ ID NO：11或12對應於HVR-L2，SEQ ID NO：13、14、15、16或17對應於HVR-L3，SEQ ID NO：1或2對應於HVR-H1，SEQ ID NO：3、4、5或6對應於HVR-H2且SEQ ID NO：7或8對應於HVR-H3。
在一實施例中，本發明抗體包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其中其各自依次包含SEQ ID NO：9、11、13、1、3、7。
在一實施例中，本發明抗體包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其中其各自依次包含SEQ ID NO：10、12、14、1、3、8。
在一實施例中，本發明抗體包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其中其各自依次包含SEQ ID NO：9、11、15、2、4、7。
在一實施例中，本發明抗體包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其中其各自依次包含SEQ ID NO：9、11、16、1、5、7。
在一實施例中，本發明抗體包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其中其各自依次包含SEQ ID NO：9、11、17、1、6、7。
在本發明抗體中之變異HVR可在HVR內具有一或多個(例如兩個、三個、四個、五個或五個以上)殘基之修飾。
在一實施例中，HVR-L1變異體包含在以下位置之任何組合處的1-5(1、2、3、4或5)個取代：A6(V或S)、A7(S或E)、A8(T或I)、A9(A或F)及A10(V或L)。
在一實施例中，HVR-L2變異體包含在以下位置之任何組合處的1-2(1或2)個取代：B4(F或N)及B6(Y或E)。
在一實施例中，HVR-L3變異體包含在以下位置之任何組合處的1-7(1、2、3、4、5、6或7)個取代：C2(Q、E或K)、C3(S或T)、C4(Y、N、T、E或A)、C5(T、A或Q)、C6(T、V或I)、C8(P、L或E)及C9(T或S)。
在一實施例中，HVR-H1變異體包含在以下位置之任何組合處的1-3(1、2或3)個取代：D3(T或S)、D6(G或N)及D9(I或L)。
在一實施例中，HVR-H2變異體包含在以下位置之任何組合處的1-5(1、2、3、4或5)個取代：E5(P或L)、E7(S或G)、E8(G或S)、E10(T、S或R)及E11(D、E或G)。
在一實施例中，HVR-H3變異體包含在以下位置之1個取 代：F3(G或S)。各位置後括號中的字母指示說明性取代(亦即置換)胺基酸；熟習此項技術者顯然應瞭解，可使用此項技術中已知及/或本文所述的的技術常規分析其他胺基酸作為本文所述的內容中之取代胺基酸的適應性。
在一態樣中，本發明提供一種包含HVR-H1區之抗體，該HVR-H1區包含SEQ ID NO：1或2之序列。在一態樣中，本發明提供一種包含HVR-H2區之抗體，該HVR-H2區包含SEQ ID NO：3、4、5或6之序列。在一態樣中，本發明提供一種包含HVR-H3區之抗體，該HVR-H3區包含SEQ ID NO：7或8之序列。在一實施例中，本發明提供一種包含HVR-L1區之抗體，該HVR-L1區包含SEQ ID NO：9或10之序列。在一實施例中，本發明提供一種包含HVR-L2區之抗體，該HVR-L2區包含SEQ ID NO：11或12之序列。在一實施例中，本發明提供一種包含HVR-L3區之抗體，該HVR-L3區包含SEQ ID NO：13、14、15、16或17之序列。
在一態樣中，本發明提供一種包含至少一種、至少兩種或所有三種以下序列之抗體：(i)包含SEQ ID NO：2之序列的HVR-H1序列；(ii)包含SEQ ID NO：4之序列的HVR-H2序列；(iii)包含SEQ ID NO：7之序列的HVR-H3序列。
在一態樣中，本發明提供一種包含至少一種、至少兩種或所有三種以下序列之抗體：(i)包含SEQ ID NO：9之序列的HVR-L1序列； (ii)包含SEQ ID NO：11之序列的HVR-L2序列；(iii)包含SEQ ID NO：15之序列的HVR-L3序列。
SEQ ID NO：1-17之胺基酸序列關於如圖1中所指示的個別HVR(亦即H1、H2或H3)編號，該編號方式與如下文所述的Kabat編號系統一致。
在一態樣中，本發明提供包含如圖1所述的重鏈HVR序列之抗體。
在一態樣中，本發明提供包含如圖1所述的輕鏈HVR序列之抗體。
本發明抗體之一些實施例包含如以下SEQ ID NO：18中所述的人化4D5抗體(huMAb4D5-8)(HERCEPTIN®,Genentech,Inc.,South San Francisco,CA,USA)(亦在美國專利第6,407,213號及Lee等人，J.Mol.Biol.(2004),340(5)：1073-93中提及)之輕鏈可變域。
1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107(SEQ ID NO：18)(HVR殘基有下劃線)。
在一實施例中，該huMAb4D5-8輕鏈可變域序列於位置30、66及91(分別為如以上粗體/斜體字所指示的Asn、Arg及His)之一或多個位置經修飾。在一實施例中，該經修飾huMAb4D5-8序列於位置30包含Ser，於位置66包含Gly及/或於位置91包含Ser。因此，在一實施例中，本發明抗體包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含以下SEQ ID NO：52中所述的序列：1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107(SEQ ID NO：52)(HVR殘基有下劃線)。
關於huMAb4D5-8之經取代殘基以以上粗體/斜體字指示。
本發明抗體可包含任何適當的框架可變域序列，其限制條件在於大體上保持與EphB4之結合活性。舉例而言，在一些實施例中，本發明抗體包含人類亞群III重鏈框架一致序列。在此等抗體之一實施例中，該框架一致序列包含於位置71、73及/或78之取代。在此等抗體之一些實施例 中，位置71為A，73為T及/或78為A。在一實施例中，此等抗體包含huMAb4D5-8(HERCEPTIN®,Genentech,Inc.,South San Francisco,CA,USA)(亦在美國專利第6,407,213號及第5,821,337號及Lee等人，J.Mol.Biol.(2004),340(5)：1073-93中提及)之重鏈可變域框架序列。在一實施例中，此等抗體另外包含一人類κI輕鏈框架一致序列。在一實施例中，此等抗體包含如美國專利第6,407,213號及第5,821,337號中所述之huMAb4D5-8的輕鏈HVR序列。在一實施例中，此等抗體包含huMAb4D5-8(HERCEPTIN®,Genentech,Inc.,South San Francisco,CA,USA)(亦在美國專利第6,407,213號及第5,821,337號及Lee等人，J.Mol.Biol.(2004),340(5)：1073-93中提及)之輕鏈可變域序列。
在一實施例中，本發明抗體包含重鏈可變域，其中該框架序列包含SEQ ID NO：19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36及/或37之序列，且HVR H1、H2及H3序列分別為SEQ ID NO：9、11及/或15。在一實施例中，本發明抗體包含輕鏈可變域，其中該框架序列包含SEQ ID NO：38、39、40及/或41之序列，且HVR L1、L2及L3序列分別為SEQ ID NO：2、4及/或7。
在一實施例中，本發明抗體包含重鏈可變域，其中該框架序列包含SEQ ID NO：46、47、48及/或49之序列，且HVR H1、H2及H3序列分別為SEQ ID NO：2、4及/或7。在一實施例中，本發明抗體包含輕鏈可變域，其中該框架序 列包含SEQ ID NO：42、43、44及/或45之序列，且HVR L1、L2及L3序列分別為SEQ ID NO：9、11及/或15。
在一實施例中，本發明抗體包含重鏈可變域，其中該框架序列包含SEQ ID NO：46、47、51及49之序列，且HVR H1、H2及H3序列分別為SEQ ID NO：2、4及/或7。在一實施例中，本發明抗體包含輕鏈可變域，其中該框架序列包含SEQ ID NO：42、43、50及45之序列，且HVR L1、L2及L3序列分別為SEQ ID NO：9、11及/或15。
在一實施例中，本發明抗體經親和力成熟以獲得所要之靶向結合親和力。在一實例中，本發明之親和力成熟抗體包含於胺基酸位置H28、H31、H34、H52a、H54、H55、H57、H58、H95、L29、L30、L31、L32、L33、L53、L55、L90、L91、L92、L93、L94、L96或L97之一或多個位置處的取代。在一實例中，本發明之親和力成熟抗體包含一或多個以下取代：(a)在重鏈中，T28S、G31N、I34L、P52aL、S54G、G55S、T57S或R、D58E或G、G95S；或(b)在輕鏈中，V29S、S30E、T31I、A32F、V33L、F53N、Y55E、Q90E或K、S91T、Y92N T E或A、T93V或I、T94V或I、P96L或E或T97S。
在一實施例中，本發明抗體包含重鏈可變域，該可變域包含SEQ ID NO：53之序列。在一實施例中，本發明抗體包含輕鏈可變域，該可變域包含SEQ ID NO：54之序列。在一實施例中，本發明抗體包含重鏈可變域及輕鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID NO：53之序列且該輕鏈可 變域包含SEQ ID NO：54之序列。
在一實施例中，本發明抗體包含重鏈可變域，該可變域包含SEQ ID NO：55之序列。在一實施例，本發明抗體包含輕鏈可變域，該可變域包含SEQ ID NO：56之序列。在一實施例中，本發明抗體包含重鏈可變域及輕鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID NO：55之序列且該輕鏈可變域包含SEQ ID NO：56之序列。
在一實施例中，本發明抗體包含重鏈可變域，該可變域包含SEQ ID NO：57之序列。在一實施例中，本發明抗體包含輕鏈可變域，該可變域包含SEQ ID NO：58之序列。在一實施例中，本發明抗體包含重鏈可變域及輕鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID NO：57之序列且該輕鏈可變域包含SEQ ID NO：58之序列。
在一實施例中，本發明抗體包含重鏈可變域，該可變域包含SEQ ID NO：59之序列。在一實施例中，本發明抗體包含輕鏈可變域，該可變域包含SEQ ID NO：60之序列。在一實施例中，本發明抗體包含重鏈可變域及輕鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID NO：59之序列且該輕鏈可變域包含SEQ ID NO：60之序列。
在一實施例中，本發明抗體包含重鏈可變域，該可變域包含SEQ ID NO：61之序列。在一實施例中，本發明抗體包含輕鏈可變域，該可變域包含SEQ ID NO：62之序列。在一實施例中，本發明抗體包含重鏈可變域及輕鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID NO：61之序列且該輕鏈可 變域包含SEQ ID NO：62之序列。
在一態樣中，本發明提供一種與任何上述抗體競爭結合至EphB4之抗體。在一態樣中，本發明提供一種如任何上述抗體一樣結合至EphB4上之同一抗原決定基之抗體。
如此項技術中已知且如下文更詳細描述，描繪抗體高變區之胺基酸位置/邊界可視上下文及此項技術中已知的各種定義(如下文所述)而變化。可變域內的一些位置可視為雜合高變位置，因為在一組標準下可認為此等位置在高變區內，而在另一組標準下可認為其在高變區外。亦可在延長高變區(如下文進一步定義)中發現此等位置中的一或多者。
在一些實施例中，該抗體為單株抗體。在一些實施例中，該抗體為多株抗體。在一些實施例中，該抗體係選自由嵌合抗體、親和力成熟抗體、人化抗體及人類抗體組成之群。在一些實施例中，該抗體為抗體片段。在一些實施例中，該抗體為Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2或scFv。
在一實施例中，該抗體為嵌合抗體，例如包含接枝至異種非人類、人類或人化序列(例如框架及/或恆定域序列)之來自非人類供體之抗原結合序列的抗體。在一實施例中，非人類供體為小鼠。在一實施例中，抗原結合序列為合成的，例如藉由突變誘發(例如噬菌體呈現篩檢等)獲得。在一實施例中，本發明嵌合抗體具有鼠類V區及人類C區。在一實施例中，鼠類輕鏈V區經融合至人類κ輕鏈。在一實施例中，鼠類重鏈V區經融合至人類IgG1 C區。
本發明人化抗體包括在FR中具有胺基酸取代之彼等抗體及在接枝CDR中具有改變之親和力成熟變異體。CDR或FR中之經取代胺基酸並不限於在供體或受體抗體中存在之彼等胺基酸。在其他實施例中，本發明抗體另外包含Fc區中胺基酸殘基的改變，其導致改良的效應功能，包括加強的CDC及/或ADCC功能及B-細胞殺死。本發明之其他抗體包括具有改良穩定性之特異性改變的彼等抗體。在其他實施例中，本發明抗體包含Fc區中胺基酸殘基的改變，其導致降低的效應功能，例如降低的CDC及/或ADCC功能及/或降低的B-細胞殺死。在一些實施例中，本發明抗體由對自然殺手(NK)細胞上之人類補體因子Clq及/或人類Fc受體的降低結合(例如，缺失結合)表徵。在一些實施例中，本發明抗體由對人類FcγRI、FcγRIIA及/或FcγRIIIA的降低結合(例如，缺失結合)表徵。在一些實施例中，本發明抗體為IgG類(例如IgG1或IgG4)且在E233、L234、G236、D265、D270、N297、E318、K320、K322、A327、A330、P331及/或P329(根據EU索引編號)中包含至少一個突變。在一些實施例中，該抗體包含突變L234A/L235A或D265A/N297A。
在一態樣中，本發明提供抗EphB4多肽，其包含本文所提供的任何抗原結合序列，其中該等抗EphB4多肽特異性結合至EphB4。
本發明抗體結合(例如特異性結合)EphB4，且在一些實施例中，可調節EphB4相關效應之一或多個態樣，包括(但不限於)EphB4活化、EphB4下游分子信號傳輸、EphB4配 位基活化、EphB4配位基下游分子信號傳輸、配位基(例如ephrin-B1、ephrin-B2及/或ephrin-B3)結合至EphB4之破壞、EphB4磷酸化及/或EphB4多聚化及/或EphB4配位基磷酸化及/或任何生物學相關EphB4及/或EphB4配位基生物學途徑之破壞、血管生成之抑制及/或腫瘤、細胞增生性病症或癌之治療及/或預防；及/或與EphB4表現及/或活性(例如增加的EphB4表現及/或活性)相關的病症之治療或預防。在一些實施例中，本發明抗體特異性結合至EphB4。在一些實施例中，該抗體特異性結合至EphB4細胞外域(ECD)。在一些實施例中，該抗體特異性結合至由EphB4細胞外域組成或基本上由EphB4細胞外域組成之多肽。在一些實施例中，該抗體特異性結合EphB4，其中KD為約50 pM或更強。在一些實施例中，本發明抗體於活體內及/或活體外降低、抑制及/或阻斷EphB4活性。在一些實施例中，該抗體降低、抑制及/或阻斷EphB4自體磷酸化。在一些實施例中，該抗體與EphB4配位基競爭結合(降低及/或阻斷EphB4配位基結合至EphB4)。
在一態樣中，本發明提供本發明抗體之用途，其係用於製備用於治療性及/或預防性治療諸如癌、腫瘤及/或細胞增生性病症之病症的藥劑。在一些實施例中，該病症為神經病變或神經退化性疾病。
在一態樣中，本發明提供本發明抗體之用途，其係用於製備用於抑制血管生成的藥劑。
在一態樣中，本發明提供包含一或多種本發明抗體及載 劑之組合物。在一實施例中，該載劑為醫藥學上可接受的。
在一態樣中，本發明提供編碼本發明抗EphB4抗體之核酸。
在一態樣中，本發明提供包含本發明核酸之載體。
在一態樣中，本發明提供包含一或多種本發明核酸及載劑之組合物。在一實施例中，該載劑為醫藥學上可接受的。
在一態樣中，本發明提供包含本發明核酸或載體之宿主細胞。載體可為任何類型的，例如，諸如表現載體之重組載體。可使用各種宿主細胞中之任一種。在一實施例中，宿主細胞為原核細胞，例如大腸桿菌(E.coli)。在一實施例中，宿主細胞為真核細胞，例如哺乳動物細胞(例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞)。
在一態樣中，本發明提供製造本發明抗體之方法。舉例而言，本發明提供製造抗EphB4抗體(如本文所定義，其包括全長及其片段)或免疫結合物之方法，該方法包含在適當宿主細胞中表現編碼該抗體(或其片段)之本發明重組載體，及回收該抗體。
在一態樣中，本發明提供一種製造物品，其包含容器；及容器內所含有的組合物，其中該組合物包含一或多種本發明抗EphB4抗體。在一實施例中，該組合物包含本發明核酸。在一實施例中，包含抗體之組合物另外包含載劑，其在一些實施例中為醫藥學上可接受的。在一實施例中， 本發明之製造物品另外包含向患者投與該組合物(例如抗體)之說明書(例如任何上述方法之說明書)。
在一態樣中，本發明提供一種包含一第一容器及一第二容器之套組；該第一容器包含組合物，該組合物包含一或多種本發明抗EphB4抗體；該第二容器包含緩衝劑。在一實施例中，該緩衝劑為醫藥學上可接受的。在一實施例中，包含抗體之組合物另外包含載劑，其在一些實施例中為醫藥學上可接受的。在一實施例中，套組另外包含用於向患者投與該組合物(例如該抗體)之說明書。
在一態樣中，本發明提供本發明抗EphB4抗體之用途，其係用於製備用於治療性及/或預防性治療諸如癌、腫瘤及/或細胞增生性病症之病症的藥劑。在一些實施例中，該病症為神經病變或神經退化性疾病。在一些實施例中，該病症為與血管生成相關的病理性病況。
在一態樣中，本發明提供本發明核酸之用途，其係用於製備用於治療性及/或預防性治療諸如癌、腫瘤及/或細胞增生性病症之病症的藥劑。在一些實施例中，該病症為神經病變或神經退化性疾病。在一些實施例中，該病症為與血管生成相關的病理性病況。
在一態樣中，本發明提供本發明表現載體之用途，其係用於製備用於治療性及/或預防性治療諸如癌、腫瘤及/或細胞增生性病症之病症的藥劑。在一些實施例中，該病症為神經病變或神經退化性疾病。在一些實施例中，該病症為與血管生成相關的病理性病況。
在一態樣中，本發明提供本發明宿主細胞之用途，其係用於製備用於治療性及/或預防性治療諸如癌、腫瘤及/或細胞增生性病症之病症的藥劑。在一些實施例中，該病症為神經病變或神經退化性疾病。在一些實施例中，該病症為與血管生成相關的病理性病況。
在一態樣中，本發明提供本發明製造物品之用途，其係用於製備用於治療性及/或預防性治療諸如癌、腫瘤及/或細胞增生性病症之病症的藥劑。在一些實施例中，該病症為神經病變或神經退化性疾病。在一些實施例中，該病症為與血管生成相關的病理性病況。
在一態樣中，本發明提供本發明套組之用途，其係用於製備用於治療性及/或預防性治療諸如癌、腫瘤及/或細胞增生性病症之病症的藥劑。在一些實施例中，該病症為神經病變或神經退化性疾病。在一些實施例中，該病症為與血管生成相關的病理性病況。
本發明提供可用於調節與EphB4表現及/或活性(例如增加的或降低的表現及/或活性或不良表現及/或活性)相關之疾病狀態的方法及組合物。
在一態樣中，本發明提供用於治療或預防與EphB4之增加的表現及/或活性相關的腫瘤、癌及/或細胞增生性病症之方法，該等方法包含向需要此治療之患者投與有效量之抗EphB4抗體。
在一態樣中，本發明提供用於殺死細胞(例如癌或腫瘤細胞)之方法，該等方法包含向需要此治療之患者投與有 效量之抗EphB4抗體。
在一態樣中，本發明提供用於降低、抑制、阻斷或預防腫瘤或癌生長之方法，該等方法包含向需要此治療之患者投與有效量之抗EphB4抗體。
在一態樣中，本發明提供用於治療或預防神經病變或神經退化性疾病或修復受損神經細胞之方法，該等方法包含向需要此治療之患者投與有效量之抗EphB4抗體。
在一態樣中，本發明提供用於促進神經元發育、增生、維護或再生之方法，該等方法包含向需要此治療之患者投與有效量之抗EphB4抗體。
在一態樣中，本發明提供用於抑制血管生成之方法，其包含向需要此治療之患者投與有效量之抗EphB4抗體。
在一態樣中，本發明提供用於治療與血管生成相關之病理性病況的方法，其包含向需要此治療之患者投與有效量之抗EphB4抗體。在一些實施例中，該與血管生成相關之病理性病況為腫瘤、癌及/或細胞增生性病症。在一些實施例中，該與血管生成相關之病理性病況為眼內新生血管性疾病。
本發明方法可用於影響任何適當的病理性狀態。例示性病症在本文中有所描述，且包括選自由小細胞肺癌、神經母細胞瘤、黑素瘤、乳癌、胃癌、結腸直腸癌(CRC)及肝細胞癌組成之群的癌。
在一實施例中，在本發明方法中所靶向的細胞為癌細胞。舉例而言，癌細胞可為選自由以下癌細胞組成之群的 癌細胞：乳癌細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、乳頭狀癌細胞、結腸癌細胞、胰腺癌細胞、卵巢癌細胞、子宮頸癌細胞、中樞神經系統癌細胞、成骨肉瘤細胞、腎癌細胞、肝細胞癌細胞、膀胱癌細胞、胃癌細胞、頭頸部鱗狀癌細胞、黑素瘤細胞、白血病細胞及結腸腺瘤細胞。在一實施例中，在本發明方法中所靶向的細胞為過度增生性及/或增殖性細胞。在一實施例中，在本發明方法中所靶向的細胞為發育不良細胞。在另一實施例中，在本發明方法中所靶向的細胞為轉移性細胞。
本發明方法可另外包含額外的治療步驟。舉例而言，在一實施例中，一方法另外包含其中使所靶向的細胞及/或組織(例如癌細胞)暴露於治療或化學治療劑之步驟。
在一態樣中，本發明提供包含投與有效量之抗EphB4抗體以及有效量的另一治療劑(例如抗血管生成劑)之方法。舉例而言，與抗癌劑或抗血管生成劑組合使用抗EphB4抗體以治療各種贅生性或非贅生性病況。在一實施例中，贅生性或非贅生性病況為與血管生成相關的病理性病況。在一些實施例中，另一治療性劑為抗血管生成劑、抗贅生劑及/或化學治療劑。
抗EphB4抗體可連續或與有效達成彼等目的的另一治療劑組合以同一組合物形式或作為獨立組合物來投與。使用相同或不同投藥途徑，可同時完成抗EphB4抗體及另一治療劑(例如抗癌劑、抗血管生成劑)(例如)作為單一組合物或作為兩種或兩種以上截然不同的組合物之投藥。另外或 其他，可以任何次序相繼完成投藥。另外或其他，可作為以任何次序相繼或同時投藥的組合執行該等步驟。在某些實施例中，在兩種或兩種以上組合物投藥之間，可存在介於幾分鐘至幾天至幾週至幾個月範圍內之時間間隔。舉例而言，可首先投與抗癌劑，接著投與抗EphB4抗體。然而，亦涵蓋同時投藥或首先投與抗EphB4抗體。因此，在一態樣中，本發明提供包含投與抗EphB4抗體、接著投與抗血管生成劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐單抗)之方法。在某些實施例中，在兩種或兩種以上組合物投藥之間，可存在介於幾分鐘至幾天至幾週至幾個月範圍內之時間間隔。
在某些態樣中，本發明提供一種藉由投與有效量之抗EphB4抗體及/或血管生成抑制劑及一或多種化學治療劑治療病症(例如腫瘤、癌及/或細胞增生性病症)之方法。在本發明之組合治療方法中可使用各種化學治療劑。在本文中"定義"下提供所涵蓋的化學治療劑之例示性及非限制性清單。使用相同或不同投藥途徑，可同時完成抗EphB4抗體及化學治療劑(例如)作為單一組合物或作為兩種或兩種以上截然不同的組合物之投藥。另外或其他，可以任何次序相繼完成投藥。另外或其他，可作為以任何次序相繼或同時投藥的組合執行該等步驟。在某些實施例中，在兩種或兩種以上組合物投藥之間，可存在介於幾分鐘至幾天至幾週至幾個月範圍內之時間間隔。舉例而言，可首先投與化學治療劑，接著投與抗EphB4抗體。然而，亦涵蓋同時投 藥或首先投與抗EphB4抗體。因此，在一態樣中，本發明提供包含投與抗EphB4抗體、接著投與化學治療劑之方法。在某些實施例中，在兩種或兩種以上組合物投藥之間，可存在介於幾分鐘至幾天至幾週至幾個月範圍內之時間間隔。
在一態樣中，本發明提供在具有與血管生成相關的病理性病況之患者中加強抗血管生成劑之功效的方法，其包含向患者投與有效量之抗EphB4抗體以及抗血管生成劑，藉此加強該抗血管生成劑的抑制活性。
在另一態樣中，本發明提供用於偵測EphB4之方法，該等方法包含在樣本中偵測EphB4-抗EphB4抗體複合物。如本文所用之術語"偵測"包括參考或不參考對照物進行之定性及/或定量偵測(量測含量)。
在另一態樣中，本發明提供用於診斷與EphB4表現及/或活性相關的病症之方法，該等方法包含在來自患有或懷疑患有該病症之患者的生物樣本中偵測EphB4-抗EphB4抗體複合物。在一些實施例中，EphB4表現為增加的表現或異常表現。在一些實施例中，該病症為腫瘤、癌及/或細胞增生性病症。
在另一態樣中，本發明提供任何本文所述的抗EphB4抗體，其中該抗EphB4抗體包含可偵測標記。
在另一態樣中，本發明提供任何本文所述的抗EphB4抗體及EphB4之複合物。在一些實施例中，該複合物在活體內或活體外。在一些實施例中，該複合物包含癌細胞。在 一些實施例中，該抗EphB4抗體係經可偵測標記的。
在本文中，本發明提供可用於(例如)治療或預防與EphB4表現及/或活性(例如增加的表現及/或活性或不良表現及/或活性)相關的疾病狀態之抗EphB4抗體。在一些實施例中，本發明抗體用於治療腫瘤、癌及/或細胞增生性病症。
在另一態樣中，本發明抗EphB4抗體可用作偵測及/或分離EphB4之試劑，例如在各種組織及細胞類型中偵測EphB4。
本發明另外提供用於製造抗EphB4抗體及編碼抗EphB4抗體之聚核苷酸的方法。
一般技術
本文所述或參考的技術及程序為一般熟知的且通常由熟習此項技術者使用習知方法加以使用，例如在Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual第3版(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等人編輯，(2003))；the series METHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press,Inc.)：PCR 2：A PRACTICAL APPROACH(M.J.MacPherson,B.D.Hames及G.R.Taylor編輯(1995)),Harlow及Lane編輯(1988)ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL,and ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney編輯(1987))中所述之廣泛 使用的方法。
定義
"經分離"抗體為已經識別且與天然環境之組份分離及/或自天然環境之組份中回收的抗體。其天然環境之污染組份為可干擾抗體之診斷性或治療性用途之材料，且可包括酶、激素及其他蛋白或非蛋白溶質。在較佳實施例中，該抗體將經純化(1)至如Lowry方法所測定大於抗體之95重量%，且最佳地大於99%；(2)至足以藉由使用旋轉杯式序列分析儀獲得N-末端或內部胺基酸序列的至少15個殘基之程度；或(3)至藉由在還原或非還原條件下使用庫馬斯藍(Coomassie blue)或較佳地銀染色由SDS-PAGE所顯示之均質性。經分離抗體包括重組細胞內之原位抗體，因為抗體天然環境之至少一種組份將不存在。然而，一般而言，經分離抗體將藉由至少一個純化步驟製備。
"經分離"核酸分子為已經識別且自至少一種污染核酸分子分離之核酸分子，在抗體核酸之天然來源中其通常與污染核酸分子相關。經分離核酸分子與其在自然界中的發現形式或設定不同。因此，經分離核酸分子區別於天然細胞中所存在之核酸分子。然而，經分離核酸分子包括在通常表現抗體之細胞中所含有的核酸分子，其中(例如)該核酸分子處於不同於天然細胞之染色體位置的染色體位置。
術語"如Kabat中之可變域殘基編號"或"如Kabat中之胺基酸位置編號"及其變化形式係指Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)中關於編譯抗體的重鏈可變域或輕鏈可變域所用之編號系統。使用此編號系統，對應於可變域之FR或CDR的縮短或插入其中，實際線性胺基酸序列可含有較少或額外胺基酸。舉例而言，重鏈可變域可在H2之殘基52後包括一單一胺基酸插入(根據Kabat之殘基52a)及在重鏈FR殘基82後包括插入的殘基(例如根據Kabat之殘基82a、82b及82c等)。可藉由使抗體序列之同源區與"標準"Kabat編號序列對準來確定給定抗體的殘基之Kabat編號。
如本文所用之短語"大體上類似"或"大體上相同"表示兩個數值(通常，一數值與本發明抗體相關且另一數值與參考/比較抗體相關)之間具有充分高程度的類似度，從而使熟習此項技術者認為，在藉由該等值(例如Kd值)所量測的生物學特徵內容中，該兩個值之間的差異將具有極小或不具有生物學及/或統計學意義。作為參考/比較抗體值之函數，該兩個值之間的差異較佳地小於約50%、較佳地小於約40%、較佳地小於約30%、較佳地小於約20%、較佳地小於約10%。
"結合親和力"通常係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間之非共價相互作用的總強度。除非另作指示，否則如本文所用之"結合親和力"係指反映結合對(例如，抗體及抗原)之成員之間的1：1相互作用之固有結合親和力。分子X與其搭配物Y之親和力通常可由解離常數(Kd)表示。親和力可藉由此項技術中已知之常 用方法(包括本文所述之彼等方法)量測。低親和力抗體通常與抗原緩慢結合且傾向於快速解離，而高親和力抗體通常與抗原結合較快且傾向於保持長期結合。此項技術中已知量測結合親和力之各種方法，該等方法中之任一者均可用於達成本發明之目的。下文描述特定說明性實施例。
在一實施例中，根據本發明之"Kd"或"Kd值"藉由以所關注抗體之Fab型式與其抗原執行放射性標記抗原結合檢定(RIA)來量測，如以下量測Fab對抗原的溶液結合親和力之檢定所述，該量測親和力之檢定包含下列步驟：在未經標記抗原之連續滴定存在下，使Fab與最小濃度的經(125I)標記之抗原平衡，隨後俘獲與經抗Fab抗體塗覆的培養盤結合之抗原(Chen等人，(1999)J.Mol Biol 293：865-881)。為確立檢定之條件，用50 mM碳酸鈉(pH 9.6)中之5 μg/ml俘獲抗Fab抗體(Cappel Labs)塗覆微量滴定盤(Dynex)隔夜，且隨後在室溫(約23℃)下用PBS中之2%(w/v)牛血清白蛋白阻斷二至五小時。在無吸附劑之滴定盤(Nunc #269620)中，使100 pM或26 pM[125I]抗原與連續稀釋之所關注Fab混合(例如，與抗VEGF抗體Fab-12之評定相符，Presta等人，(1997)Cancer Res.57：4593-4599)。隨後，培育所關注Fab隔夜；然而，培育可持續一段較長之時間(例如65小時)以確保達到平衡。此後，在室溫下將混合物轉移至俘獲培養盤(capture plate)以用於培育(例如，歷經1小時)。隨後，移除溶液且用PBS中之0.1%吐溫20(Twecn-20)洗滌該培養盤8次。當該等培養盤已經乾燥時，每孔添加150 μl 閃爍體(MicroScint-20；Packard)，且於Topcount γ計數器(Packard)上對該等培養盤計數10分鐘。選擇提供小於或等於20%最大結合之濃度的各Fab以用於競爭性結合檢定。根據另一實施例，藉由在25℃下使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)且使用表面電漿共振檢定(surface plasmon resonance assay)用約10個反應單元(RU)之固定抗原CM5晶片量測Kd或Kd值。簡言之，根據供應商之說明書用N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二醯亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物感應器晶片(CM5,BIAcore Inc.)。用10 mM乙酸鈉(pH 4.8)將抗原稀釋至5 μg/ml(約0.2 μM)，接著以5 μl/分鐘之流動速率進行注射以達成約10個反應單元(RU)之偶聯蛋白。在注射抗原後，注射1 M乙醇胺以阻斷未經反應之基團。對於動力學量測而言，在25℃下以約25 μl/min之流動速率注射在具有0.05%吐溫20之PBS(PBST)中兩倍連續稀釋之Fab(0.78 nM至500 nM)。使用簡易的一對一Langmuir結合模型(BIAcore Evaluation Software,3.2版)，藉由同時擬合締合及解離感應譜來計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。將平衡解離常數(Kd)計算為koff/kon之比率。例如，參看Chen,Y.等人，(1999)J.Mol Biol 293：865-881。若藉由上述表面電漿共振檢定獲得之締合速率大於106 M-1．S-1，則可在如光譜儀(諸如裝備有間歇流體之分光光度計(Aviv Instruments)或具有經攪拌比色管之8000系列SLM-Aminco光譜光度計(ThermoSpectronic))所 量測具有增加之濃度的抗原存在下，藉由使用量測螢光放射強度之增加或降低的螢光淬滅技術(fluorescent quenching technique)(激發=295 nm；放射=340 nm，16 nm帶通)於25℃下測定PBS中之20 nM抗抗原抗體(Fab形式)(pH 7.2)的締合速率。
亦可在25℃下使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)同樣以上述表面電漿共振技術用約10個反應單元(RU)之固定抗原CM5晶片測定"締合速率"或"kon"。簡言之，根據供應商之說明書用N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二醯亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物感應器晶片(CM5,BIAcore Inc.)。用10 mM乙酸鈉(pH 4.8)將抗原稀釋至5 μg/ml(約0.2 μM)，接著以5 μl/分鐘之流動速率進行注射以達成約10個反應單元(RU)之偶聯蛋白。在注射抗原後，注射1 M乙醇胺以阻斷未經反應之基團。對於動力學量測而言，在25℃下以約25 μl/min之流動速率注射在具有0.05%吐溫20之PBS(PBST)中兩倍連續稀釋之Fab(0.78 nM至500 nM)。使用簡易的一對一Langmuir結合模型(BIAcore Evaluation Software 3.2版)，藉由同時擬合締合及解離感應譜來計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。將平衡解離常數(Kd)計算為koff/kon之比率。例如，參看Chen,Y.等人，(1999)J.Mol Biol 293：865-881。然而，若藉由上述表面電漿共振檢定獲得之締合速率大於106 M-1．S-1，則可在如光譜儀(諸如裝備有間歇流體之分光光度計(Aviv Instruments) 或具有經攪拌比色管之8000系列SLM-Aminco光譜光度計(ThermoSpectronic))所量測具有增加之濃度的抗原存在下，藉由使用量測螢光放射強度之增加或降低的螢光淬滅技術(激發=295 nm；放射=340 nm，16 nm帶通)於25℃下測定PBS中之20 nM抗抗原抗體(Fab形式)(pH 7.2)的締合速率。
如本文所用之術語"載體"意欲指能夠轉運所連接之另一核酸分子之核酸分子。一類載體為"質體"，其係指其中可連接額外DNA區段之環形雙鏈DNA環。另一類載體為噬菌體載體。另一類載體為病毒載體，其中額外DNA區段可連接至病毒基因組中。某些載體能夠在引入該等載體之宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如非游離型哺乳動物載體)可在引入宿主細胞中之後整合至該宿主細胞之基因組中，且由此隨宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠引導其可操作性連接之基因之表現。此等載體在本文中稱為"重組表現載體"(或簡言之"重組載體")。一般而言，用於重組DNA技術中之表現載體通常為質體之形式。在本說明書中，"質體"及"載體"可交替使用，因為質體為最常用形式之載體。
如本文可交替使用之"聚核苷酸"或"核酸"係指任何長度之核苷酸之聚合物，且包括DNA及RNA。該等核苷酸可為脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾核苷酸或鹼基及/或其類似物，或可藉由DNA或RNA聚合酶或藉由合成反應 併入聚合物中之任何基質。聚核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。若存在對於核苷酸結構之修飾，則可在組裝聚合物之前或之後進行修飾。核苷酸序列可由非核苷酸組件中斷。聚核苷酸可於合成後(諸如)藉由與標記結合而進一步經修飾。其他類型之修飾包括(例如)"帽子"；一或多個天然存在之核苷酸經類似物取代；核苷酸間修飾，諸如具有不帶電荷之鍵者(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、磷醯胺酸、胺基甲酸酯等)及具有帶電荷之鍵者(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、含有附屬部分者(諸如蛋白(例如，核酸酶、毒素、抗體、信號肽、ply-L-離胺酸等))、具有插入劑者(例如吖啶、補骨脂素等)、含有螯合劑者(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)、含有烷化劑者、具有經修飾之鍵者(例如α變旋異構核酸等)；以及聚核苷酸之未經修飾形式。此外，通常存在於糖中之任何羥基均可經(例如)膦酸酯基、磷酸酯基置換、經標準保護基保護或經活化以製備與額外核苷酸連接之額外鍵，或可與固體或半固體支撐物結合。5'及3'末端OH可經磷酸化或經胺或具有1至20個碳原子之有機封端基團部分取代。其他羥基亦可衍生成標準保護基團。聚核苷酸亦可含有此項技術中通常已知之類似形式的核糖或脫氧核糖，包括(例如)2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基-、2'-氟-或2'-疊氮基-核糖、碳環糖類似物、α-變旋異構糖、差向異構糖(諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖(lyxose))、哌喃糖、呋喃糖、七碳糖、非環類似物及基礎核苷類似物(諸如甲基 核糖苷)。一或多種磷酸二酯鍵可經替代連接子置換。該等替代連接子包括(但不限於)其中磷酸酯經P(O)S("硫代酯")、P(S)S("二硫代酯")、(O)NR2("醯胺化物")、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2("甲縮醛")置換之實施例，其中R或R'各自獨立地為H或視情形含有醚(-O-)鍵之經取代或未經取代烷基(1-20個C)、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基(araldyl)。聚核苷酸中之所有鍵無需相同。上文之描述適用於本文所提及之所有聚核苷酸，包括RNA及DNA。
如本文所用之"寡核苷酸"通常係指長度通常(但非必需)小於約200個核苷酸之短的、通常為單鏈、通常為合成之聚核苷酸。術語"寡核苷酸"及"聚核苷酸"並不相互排除。上文關於聚核苷酸之描述同樣且完全適用於寡核苷酸。
關於肽或多肽序列之"胺基酸序列一致性百分比(%)"係定義為若需要對準特異性肽或多肽序列及引入間隔以達成最大序列一致性百分比，則在該等步驟之後在與該等序列中的胺基酸殘基相同之候選序列中存在之胺基酸殘基的百分比，且不應認為任何保守取代為序列一致性之部分。可以此項技術能力內之各種方式達成對準以確定胺基酸序列一致性百分比，例如使用諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體之可公開獲得的電腦軟體。熟習此項技術者可測定用於量測對準之適當參數，包括所需任何演算法以在所比較序列全長上達成最大對準。然而，為達成本文目的，使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生胺基酸序列一致性%值，其中在下表A中提供ALIGN-2程式 之完全源碼。ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech,Inc.創作，且下表A中所顯示之源碼已與用戶文件一起存檔於U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559，其中其以U.S.Copyright Registration第TXU510087號登記。ALIGN-2程式可經由Genentech,Inc.,South San Francisco,California公開獲得。ALIGN-2程式應經編譯以用於UNIX操作系統、較佳地數位UNIX V4.0D。所有序列比較參數均由ALIGN-2程式設定且並不變化。
在將ALIGN-2用於胺基酸序列比較之情形中，給定胺基酸序列A與給定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(其可另外稱為給定胺基酸序列A具有或包含與給定胺基酸序列B之特定胺基酸序列一致性%)如下計算：分數X/Y×100其中X為在A與B之彼程式對準中，由序列對準程式ALIGN-2記分為相同配對之胺基酸殘基數目，且其中Y為B中胺基酸殘基之總數。應瞭解，若胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度，則A與B之胺基酸序列一致性%將不等於B與A之胺基酸序列一致性%。
除非另外特別指出，否則本文所用之所有胺基酸序列一致性%值均如前一段落所述使用ALIGN-2電腦程式獲得。
除非另外特定或在上下文中指出，否則如本文所用之術語"EphB4"(可交替稱為"EphB4R")係指任何天然或變異(天然或合成的)EphB4多肽。術語"天然序列"特定涵蓋天然存在的截短或分泌形式(例如細胞外域序列)、天然存在的變 異形式(例如選擇性剪接形式)及天然存在的等位基因變異體。術語"野生型EphB4"一般係指包含天然存在的EphB4蛋白之胺基酸序列的多肽。術語"野生型EphB4序列"一般係指在天然存在的EphB4中發現之胺基酸序列。
術語"抗體"及"免疫球蛋白"就最廣泛之含義而言可交替使用，且包括單株抗體(例如，全長或完整單株抗體)、多株抗體、單價、多價抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體，只要其展現出所要生物學活性即可)，且亦可包括某些抗體片段(如本文更詳細地描述)。抗體可為人類抗體、人化抗體及/或親和力成熟抗體。
術語"可變"係指抗體間可變域之某些部分的序列普遍不同且該等部分用於各特定抗體對其特定抗原之結合及特異性。然而，變異性並非均勻分佈於抗體之整個可變域中。其集中於輕鏈與重鏈可變域中稱為互補判定區(complementarity-determining region)(CDR)或高變區之三個區段中。可變域中較高度保守之部分稱為框架(FR)。天然重鏈及輕鏈之可變域各包含在很大程度上採用β折疊組態的由三個CDR連接之四個FR區，其形成環連接，且在某些情形下形成部分β折疊結構。各鏈中之CDR係由FR區以緊密接近之方式固持在一起，且來自其他鏈之CDR有助於形成抗體之抗原結合位點(參看Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，National Institute of Health,Bethesda,MD(1991))。恆定域並不直接涉及抗體與抗原之結合，但展現出各種效應功能，諸如抗體參與 抗體依賴性細胞毒性。
由木瓜酵素消化抗體會產生各具有單一抗原結合位點之兩個相同的抗原結合片段，稱為"Fab"片段；及殘餘"Fc"片段，其名稱反映其易於結晶之能力。胃蛋白酶處理會產生具有兩個抗原組合位點且仍能夠交聯抗原之F(ab')2片段。
"Fv"為含有完整抗原識別位點及抗原結合位點之最小抗體片段。在兩鏈Fv種類中，此區係由緊密、非共價締合之一重鏈可變域及一輕鏈可變域之二聚體組成。在單鏈Fv種類中，一重鏈可變域與一輕鏈可變域可藉由彈性肽連接子共價連接，從而使輕鏈與重鏈可以與兩鏈Fv種類中的結構類似之"二聚"結構締合。各可變域之三個CDR在此組態中相互作用以界定VH-VL二聚體表面上之抗原結合位點。總之，六個CDR賦予抗體以抗原結合特異性。然而，甚至單一可變域(或半數僅包含三個抗原特異性CDR的Fv)亦具有識別且結合抗原之能力，儘管其與抗原之結合親和力比整個結合位點之親和力低。
Fab片段亦含有輕鏈之恆定域及重鏈之第一恆定域(CH1)。Fab'片段因在包括來自抗體鉸鏈區之一或多個半胱胺酸之重鏈CH1域的羧基末端添加有數個殘基而不同於Fab片段。Fab'-SH為Fab'在本文中之命名，其中恆定域之半胱胺酸殘基含有游離硫醇基。F(ab')2抗體片段最初作為其間具有鉸鏈半胱胺酸之Fab'片段對產生。亦已知抗體片段之其他化學偶聯。
可基於恆定域之胺基酸序列將來自任何脊椎動物物種之 抗體(免疫球蛋白)的"輕鏈"指定為兩種完全截然不同類型(稱為κ及λ)中之一者。
視重鏈恆定域之胺基酸序列而定，可將免疫球蛋白指定為不同種類。存在五種主要種類的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等種類中之數種可進一步分為子類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同種類之免疫球蛋白之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。不同種類免疫球蛋白之次單位結構及三維組態為熟知的。
"抗體片段"僅包含完整抗體的一部分，其中該部分較佳保持當存在於完整抗體中時通常與該部分相關的至少一種、較佳地大部分或所有功能。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及自抗體片段形成的多特異性抗體。在一實施例中，抗體片段包含完整抗體之抗原結合位點且因此保持結合抗原之能力。在另一實施例中，抗體片段(例如包含Fc區之抗體片段)保持當在完整抗體中存在時，與Fc區通常相關的至少一種生物學功能，例如FcRn結合、抗體半衰期調節、ADCC功能及補體結合。在一實施例中，抗體片段為一具有大體上與完整抗體類似的活體內半衰期之單價抗體。舉例而言，此類抗體片段可包含連接至Fc序列的能夠賦予該片段以活體內穩定性之抗原結合臂。
術語"高變區"、"HVR"或"HV"在本文中使用時係指序列高變且/或形成結構上界定之環的抗體可變域之區域。通 常，抗體包含六個高變區；三個在VH(H1、H2、H3)中，且三個在VL(L1、L2、L3)中。本文中使用且涵蓋許多高變區描繪。Kabat互補判定區(CDR)係基於序列變異性且最常使用(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunologicol Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。而Chothia指出結構環之位置(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。AbM高變區表示Kabat CDR與Chothia結構環之間的折衷，且用於Oxford Molecular的AbM抗體模型化軟體中。"接觸"高變區係基於對可用複合結晶結構之分析。來自該等高變區中之每一者之殘基如下所示。
高變區可包含如下"延長高變區"：VL中之24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)及89-97或89-96(L3)；及VH中之26-35(H1)、50-65或49-65(H2)及93-102、94-102或95-102(H3)。可變域殘基係根據上文Kabat等人關於該等定義中 之每一者所述編號。
"框架"或"FR"殘基為除如本文所定義之高變區殘基外之彼等可變域殘基。
"人化"形式之非人類(例如鼠類)抗體為含有來源於非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合抗體。人化抗體一般為人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體高變區之殘基經來自具有所要特異性、親和力及能力之非人類物種(供體抗體)高變區之殘基置換，該等非人類物種諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物。在某些情形下，人類免疫球蛋白之框架區(FR)殘基係經相應非人類殘基置換。此外，人化抗體可包含未見於受體抗體或供體抗體中之殘基。進行該等修飾以進一步改進抗體效能。一般地，人化抗體將包含至少一個且通常兩個可變域之大體上所有序列，其中所有或大體上所有高變環與非人類免疫球蛋白之彼等序列相對應，且所有或大體上所有FR為人類免疫球蛋白序列之彼等序列。人化抗體亦將視情形包含至少一部分免疫球蛋白恆定區(Fc)，通常為人類免疫球蛋白之恆定區。更詳細之內容，參看Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。亦參看下述文章綜述及其中所引用之參考文獻：Vaswani及Hamilton,Ann.Allergy,Asthma & Immunol.1：105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions 23：1035-1038(1995)；Hurle及Gross,Curr.Op.Biotech.5：428-433(1994)。
"嵌合"抗體(免疫球蛋白)具有與來源於特定物種或屬於特定抗體種類或子類的對應序列相同或同源之一部分重鏈及/或輕鏈，而該鏈之剩餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體種類或子類以及該等抗體之片段的對應序列相同或同源，只要其展示所要生物學活性(美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。如本文所用之人化抗體為嵌合抗體之子集。
"單鏈Fv"或"scFv"抗體片段包含抗體之VH及VL域，其中此等域存在於單一多肽鏈中。一般而言，scFv多肽另外在VH與VL域之間包含多肽連接子，其使scFv能形成抗原結合所要的結構。關於scFv之評論，參見Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編輯，Springer-Verlag,New York，第269-315頁(1994)。
"抗原"為抗體可選擇性結合之預定抗原。靶向抗原可為多肽、碳水化合物、核酸、脂質、半抗原或其他天然存在或合成的化合物。較佳地，靶向抗原為多肽。
術語"雙功能抗體"係指具有兩個抗原結合位點之小抗體片段，該等片段在同一多肽鏈(VH-VL)中包含連接至輕鏈可變域(VL)之重鏈可變域(VH)。藉由使用過短以致不能在同一鏈上兩個域之間配對之連接子，迫使該等域與另一鏈之互補域配對且產生兩個抗原結合位點。雙功能抗體更詳細描述於(例如)EP 404,097、WO 93/11161及Hollinger等 人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993)中。
"人類抗體"係具有與人類產生之抗體之胺基酸序列相應的胺基酸序列且/或已使用如本文所揭示之用於製造人類抗體之任何技術製得的抗體。此關於人類抗體之定義特別排除包含非人類抗原結合殘基之人化抗體。
"親和力成熟"之抗體係在一或多個HVR中具有一或多種變化之抗體，與不具有彼等變化之親本抗體相比，該等變化使得抗體對於抗原之親和力得以改良。較佳之親和力成熟抗體對於靶向抗原應具有數奈莫耳(nanomolar)或甚至皮莫耳(picomolar)之親和力。親和力成熟抗體係藉由此項技術中已知之程序產生。Marks等人，Bio/Technology 10：779-783(1992)描述由VH及VL域改組引起之親和力成熟。CDR及/或框架殘基之隨機突變誘發描述於下列文獻中：Barbas等人，Proc Nat.Acad.Sci.USA 91：3809-3813(1994)；Schier等人，Gene 169：147-155(1995)；Yelton等人，J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson等人，J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)；及Hawkins等人，J.Mol.Biol.226：889-896(1992)。
抗體"效應功能"係指可歸因於抗體之Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列變異Fc區)的彼等生物學活性且隨著抗體同型而變化。抗體效應功能之實例包括：Clq結合及補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)下調；及B細胞活化。
"抗體依賴性細胞介導的細胞毒性"或"ADCC"係指一種細胞毒性形式，其中所分泌Ig結合至存在於某些細胞毒性細胞(例如自然殺手(NK)細胞、嗜中性白血球及巨嗜細胞)上之Fc受體(FcR)，使得此等細胞毒性效應細胞特異性結合至載運抗原的靶向細胞且隨後以細胞毒素殺死該等靶向細胞。抗體"武裝"細胞毒性細胞，且對於此類殺死作用而言，抗體為絕對必需的。介導ADCC之初級細胞(NK細胞)僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上之FcR表現概述於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)第464頁表3中。為分析所關注分子之ADCC活性，可執行諸如美國專利第5,500,362號或第5,821,337號或Presta美國專利第6,737,056號中所述之活活體外ADCC檢定。適用於該等檢定之效應細胞包括末梢血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。另外或其他，所關注分子之ADCC活性可在諸如Clynes等人，PNAS(USA)95：652-656(1998)中所揭示之動物模型中於活體內分析。
"人類效應細胞"為表現一或多種FcR且執行效應功能之白血球。較佳地，該等細胞至少表現FcγRIII且執行ADCC效應功能。介導ADCC之人類白血球的實例包括末梢血液單核細胞(PBMC)、自然殺手(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞及嗜中性白血球；其中PBMC及NK細胞為較佳的。效應細胞可自天然來源(例如，血液)分離。
"Fc受體"或"FcR"描述結合至抗體Fc區之受體。較佳之 FcR為天然序列人類FcR。此外，較佳FcR為結合IgG抗體(γ受體)之FcR，且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII子類之受體，包括此等受體之等位基因變異體及選擇性剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA("活化受體")及FcγRIIB("抑制受體")，其具有主要在於細胞質域有所不同之類似的胺基酸序列。活化受體FcγRIIA在其細胞質域中含有免疫受體基於酪胺酸之活化基元(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其細胞質域中含有免疫受體基於酪胺酸之抑制基元(ITIM)。(參見M.Daëron,Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997)中之評論)。FcR評論於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)；Capel等人，Immunomethods 4：25-34(1994)；及de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)中。本文術語"FcR"涵蓋其他FcR，包括未來將識別的彼等FcR。該術語亦包括新生兒受體FcRn，其為造成母體IgG轉移至胎兒之原因(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))且調節免疫球蛋白之動態平衡。WO 00/42072(Presta)描述對FcR具有改良的或減小的結合之抗體變異體。彼專利公開案之內容以引用方式特定併入本文中。亦參見Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。
量測與FcRn之結合的方法為已知的(例如，參見Ghetie 1997,Hinton 2004)。舉例而言，可在轉殖基因小鼠或表現人類FcRn之經轉染人類細胞株中或在投與Fc變異多肽之靈長類動物中檢定對人類FcRn之活體內結合及人類FcRn高 親和力結合多肽之血清半衰期。
"補體依賴性細胞毒性"或"CDC"係指靶向細胞在補體存在下溶解。經典補體途徑之活化係藉由使補體系統之第一組份(Clq)結合至(適當子類之)抗體(其結合至其同源抗原)起始。為分析補體活化，可執行CDC檢定(例如，如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所述)。
具有改變的Fc區胺基酸序列及增加的或降低的Clq結合能力之多肽變異體描述於美國專利第6,194,551B1號及WO 99/51642中。彼等專利公開案之內容以引用方式特定併入本文中。亦參見Idusogie等人，J.Immunol.164：4178-4184(2000)。
術語"包含Fc區之多肽"係指包含Fc區之多肽，例如抗體或免疫黏附素(參見以下定義)。舉例而言，可在多肽純化期間或藉由重組性工程設計編碼多肽之核酸而移除Fc區的C末端離胺酸(根據EU編號系統之殘基447)。因此，包含具有Fc區之多肽的本發明組合物可包含具有K447之多肽、其中K447均已移除之多肽或具有及不具有K447殘基之混合物。
"阻斷"抗體或"拮抗劑"抗體為抑制或降低其所結合的抗原之生物活性之抗體。較佳之阻斷抗體或拮抗劑抗體大體上或完全抑制抗原之生物學活性。
如本文所用之"促效劑抗體"為模擬所關注多肽之至少一種功能活性之抗體。
用於達成本文目的之"受體人類框架"為包含來源於人類免疫球蛋白框架或來自人類一致框架的VL或VH框架之胺基酸序列的框架。"來源於"人類免疫球蛋白框架或人類一致框架之受體人類框架可包含其相同胺基酸序列，或可含有已存在的胺基酸序列改變。若存在已存在的胺基酸改變，則存在較佳地不超過5個且較佳地4個或4個以下或3個或3個以下已存在的胺基酸改變。若已存在的胺基酸改變存在於VH中，則較佳地彼等改變僅處於位置71H、73H及78H中之三個、兩個或一個位置；例如，彼等位置之胺基酸殘基可為71A、73T及/或78A。在一實施例中，VL受體人類框架之序列與VL人類免疫球蛋白框架序列或人類一致框架序列相同。
"人類一致框架"係表示在所選人類免疫球蛋白VL或VH框架序列中最常存在的胺基酸殘基之框架。一般而言，人類免疫球蛋白VL或VH序列係選自可變域序列之亞群。一般而言，序列之亞群為如Kabat等人所述之亞群。在一實施例中，對於VL而言，該亞群為如Kabat等人所述之亞群κI。在一實施例中，對於VH而言，該亞群為如Kabat等人所述之亞群III。
"VH亞群III一致框架"包含自Kabat等人之可變重鏈亞群III中之胺基酸序列獲得的一致序列。在一實施例中，VH亞群III一致框架胺基酸序列包含以下序列中之每一者之至少一部分或所有：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO：42)-H1-WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO：43)-H2- RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC(SEQ ID NO：44)-H3-WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：45)。
"VL亞群I一致框架"包含自Kabat等人之可變輕鏈κ亞群I中之胺基酸序列獲得的一致序列。在一實施例中，VL亞群I一致框架胺基酸序列包含以下序列中之每一者之至少一部分或所有：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO： 46)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：47)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：48)-L3-FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：49)。
"病症"或"疾病"為將自以本發明物質/分子或方法治療獲益之任何病況。此術語包括慢性及急性病症或疾病，包括傾向於使哺乳動物患有所探討病症之彼等病理性病況。本文待治療之病症之非限制性實例包括惡性及良性腫瘤、癌、胚細胞瘤及肉瘤。
術語"細胞增生性病症"及"增生性病症"係指與某一程度之異常細胞增生相關之病症。在一實施例中，細胞增生性病症為癌。
如本文所用之"腫瘤"係指所有惡性或良性贅生性細胞生長及增生及所有癌前及癌細胞及組織。術語"癌"、"癌的"、"細胞增生性病症"、"增生性病症"及"腫瘤"在本文中提及時並不相互排除。
術語"癌"及"癌的"係指或描述通常由不受調節的細胞生長/增生表徵之哺乳動物生理學病況。癌之實例包括(但不 限於)癌、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤及白血病。該等癌之更特定實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺部鱗狀癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、胰腺癌、神經膠母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘤、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、陰門癌、甲狀腺癌、肝癌、胃癌、黑素瘤及各種類型之頭頸部癌。血管生成之失調可導致多種可由本發明組合物及方法治療之病症。此等病症包括非贅生性及贅生性病況。贅生性病況包括(但不限於)以上描述之彼等病況。非贅生性病症包括(但不限於)不良或異常肥大、關節炎、類風濕性關節炎(RA)、牛皮癬、牛皮癬性斑塊、類肉瘤病、動脈粥樣硬化、動脈粥樣硬化斑塊、糖尿病性及其他增生性視網膜病(包括早產兒視網膜病、晶狀體後纖維組織增生、新生血管性青光眼、年齡相關之黃斑部變性、糖尿病性黃斑水腫、角膜新血管生成、角膜移植新血管生成、角膜移植排斥反應、視網膜/脈絡膜新血管生成、隅角新血管生成(虹膜紅變)、眼新生血管性疾病)、血管再狹窄、動靜脈畸形(AVM)、脊膜瘤、血管瘤、血管纖維瘤、甲狀腺增生(包括格雷氏病(Grave's disease))、角膜及其他組織移植、慢性炎症、肺炎症、急性肺損傷/ARDS、敗血症、原發性肺循環血壓過高、惡性肺滲出、腦水腫(例如與急性中風/封閉頭部損傷/外傷相關)、滑液炎症、RA中血管翳形成、骨化性肌炎、肥大骨形成、骨關節炎(OA)、難治癒的腹水、多 囊性卵巢疾病、子宮內膜異位、體液疾病之第3間隔(胰腺炎、隔室症候群、灼熱、腸病)、子宮纖維瘤、早產、諸如IBD(克羅恩氏病(Crohn's disease)及潰瘍性結腸炎)之慢性炎症、腎同種異體移植排斥反應、發炎性腸病、腎病症候群、不良或異常組織大量生長(非癌)、嗜血性關節、肥厚性瘢痕、毛髮生長抑制、奧韋症候群(Osler-Weber syndrome)、化膿性肉芽腫晶狀體後纖維組織增生、硬皮病、沙眼、血管黏著、滑膜炎、皮炎、子癇前期、腹水、心包滲出(例如與心包炎相關之滲出)及胸膜滲出。
如本文所用之"治療"係指嘗試改變所治療之個體或細胞之自然過程的臨床干預，且可於預防或臨床病理學過程中進行。所要治療作用包括預防疾病出現或復發、減輕症狀、減小疾病之任何直接或間接病理學結果、預防轉移、降低疾病進程速率、改善或緩和疾病狀態及緩解或改良預後。在一些實施例中，本發明抗體用於延遲疾病或病症發展。
術語"神經退化性疾病"及"神經退化性病症"以最廣泛含義使用以包括所有病理學涉及神經元退化及/或功能障礙之病症，包括(但不限於)末梢神經病變；運動神經元病症，例如澱粉樣沉著側索硬化症(ALS，盧．格裏格症(Lou Gehrig's disease))、貝爾麻痺(Bell's palsy)及各種涉及脊椎肌肉萎縮病或麻痺的病況；及其他人類神經退化性疾病，例如阿茲海默氏病、帕金森氏病、癲癇症、多發性硬化症、亨廷頓氏舞蹈病(Huntington's chorea)、唐氏症候群 (Down's Syndrome)、神經性耳聾及梅尼爾氏病。
"末梢神經病變"為一種影響末梢神經之神經退化性病症，最常表現為運動、感官、感覺運動或自主功能障礙之一者或組合。末梢神經病變可(例如)為遺傳學後天性疾病，可起因於全身性疾病或可由諸如神經毒性劑(例如抗贅生劑或工業或環境污染物)之毒性劑誘導。"末梢感官神經病變"由末梢感官神經元之退化表徵，其可為特發性的，可由於(例如)糖尿病(糖尿病性神經病變)、癌中細胞抑制性藥物療法(例如，以諸如長春新鹼、順鉑、甲胺喋呤、3'-疊氮基-3'-脫氧胸苷或紫杉烷(例如紫杉醇[TAXOL®,Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.]及多西他賽(doxetaxel)[TAXOTERE®,Rhône-PoulencRorer,Antony,France])之化學治療劑治療)、醇中毒、後天免疫缺乏症候群(AIDS)或遺傳傾向而發生。遺傳學後天性末梢神經病變包括(例如)雷福生氏病(Refsum's disease)、克拉培氏病(Krabbe's disease)、異染性腦白質障礙、法布瑞氏病(Fabry's disease)、代哲因-索他症候群(Dejerine-Sottas syndrome)、無β脂蛋白血症(Abetalipoproteinemia)及夏馬杜三氏(CMT)病(Charcot-Marie-Tooth Disease，亦稱為脛肌萎縮症或遺傳性運動感覺神經病變(HMSN))。大多數類型之末梢神經病變經數月或數年之過程緩慢發展。在臨床實踐中，該等神經病變稱為慢性的。有時，末梢神經病變經幾天之過程快速發展，且稱為急性的。末梢神經病變通常一起影響感官及運動神經，以引起混合的感官及運動神 經病變，但純感官及純運動神經病變亦為已知的。
"個體"為脊椎動物，較佳地為哺乳動物，更佳地為人類。哺乳動物包括(但不限於)家畜(諸如乳牛)、競技類動物(sport animal)、寵物(諸如貓、狗及馬)、靈長類動物、小鼠及大鼠。
出於治療之目的，"哺乳動物"係指歸類為哺乳動物之任何動物，包括人類、家畜(domestic and farm animal)及動物園動物、競技類動物或寵物，諸如狗、馬、貓、乳牛等。較佳地，哺乳動物為人類。
"有效量"係指有效達成所要治療或預防結果所必需之劑量及時間之量。
本發明物質/分子、促效劑或拮抗劑之"治療有效量"可根據諸如個體疾病狀態、年齡、性別及體重以及物質/分子、促效劑或拮抗劑在個體中引起所需反應的能力等因素而變化。治療有效量亦為物質/分子、促效劑或拮抗劑之有益療效勝於任何毒性或有害效應之量。"預防有效量"係指有效達成所欲預防結果所必需之劑量及時間之量。既然預防劑量於發病前或疾病早期使用，所以預防有效量通常(但非必須)小於治療有效量。
如本文所用之術語"細胞毒性劑"係指抑制或預防細胞功能及/或引起細胞破壞之物質。該術語意欲包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32及Lu之放射性同位素)、化學治療劑(例如甲胺喋呤、阿黴素(adriamicin)、長春鹼(vinca alkaloid)(長春新 鹼、長春鹼、依託泊苷(etoposide))、14-羥基柔紅黴素(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、道諾黴素(daunorubicin)或其他插入劑、酶及其片段(例如核分解酶)、抗生素及毒素(諸如細菌、真菌、植物或動物來源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段及/或變異體)及以下所揭示之各種抗腫瘤或抗癌劑。其他細胞毒性劑描述於下文中。殺腫瘤劑引起腫瘤細胞破壞。
"化學治療劑"為可用於治療癌之化學化合物。化學治療劑之實例包括烷基化劑，例如噻替派(thiotepa)及CYTOXAN®環磷醯胺；磺酸烷酯，諸如硫酸布他卡因(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，諸如苯幷多巴(benzodopa)、卡巴醌(carboquone)、麥曲多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；伸乙基亞胺及甲基艾穆爾胺(methylamelamine)，包括六甲嘧胺(altretamine)、三伸乙基三聚氰胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三羥甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine)；乙醯生(acetogenin)(尤其布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氫大麻酚(曲大麻酚(dronabinol)，MARINOL®)；β-拉帕酮(beta-lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙鹼(colchicine)；樺木酸(betulinic acid)；喜樹鹼(camptothecin)(包括合成類似物拓撲替康(synthetic analogue topotecan)(HYCAMTIN®)、CPT-11(伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR®)、乙醯喜樹 鹼、斯可波萊辛(scopolectin)及9-胺基喜樹鹼)；苔蘚抑素(bryostatin)；克利他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新合成類似物(bizelesin synthetic analogue))；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；足葉草酸(podophyllinic acid)；替尼泊甙(teniposide)；念珠藻環肽(cryptophycin)(特定言之，念珠藻環肽1及念珠藻環肽8)；海兔毒素(dolastatin)；多卡黴素(duocarmycin)(包括合成類似物，KW-2189及CB1-TM1)；艾榴素(eleutherobin)；潘卡替他汀(pancratistatin)；沙科地辛(sarcodictyin)；斯潘他汀(spongistatin)；氮芥子氣(nitrogen mustard)，諸如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、鉻磷醯胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、氧化氮芥鹽酸鹽(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖、新恩比興(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶芥子氣(uracil mustard)；硝基脲(nitrosurea)，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲黴素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，諸如烯二炔類抗生素(enediyne antibiotic)(例如，刺孢黴素(calicheamicin)，尤其刺孢黴素γ11及刺孢黴素ΩI1)(例如，參看Agnew,Chem Intl.Ed.Engl.,33：183-186(1994))；地尼黴素(dynemicin)，包括地尼黴素A(dynemicin A)；伊斯帕黴素 (esperamicin)；以及新製癌菌素發色團(neocarzinostatin chromophore)及相關色蛋白烯二確類抗生素發色團)，阿克萊諾黴素(aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、奧瑟黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博萊黴素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、卡洛比星(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycinis)、放線菌素D(dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-甘白胺酸、阿黴素®14-羥基柔紅黴素[ADRIAMYCIN®(doxorubicin)](包括嗎啉基-14-羥基柔紅黴素、氰基嗎啉基-14-羥基柔紅黴素、2-吡咯啉基-14-羥基柔紅黴素及14-羥基脫氧柔紅黴素-(deoxydoxorubicin))、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin)(諸如絲裂黴素C)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾拉黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、博替羅黴素(potfiromycin)、嘌黴素(puromycin)、奎拉黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、左柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺喋呤及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如迪諾特寧(denopterin)、甲胺喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉賓(fludarabine)、 6-巰嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-硫唑嘧啶、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氮尿苷(floxuridine)；雄激素，諸如卡普睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內酪(testolactone)；抗腎上腺素，諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑(folic acid replenisher)，諸如(frolinic acid)；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸(aminolevulinic acid)；5-乙炔尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；貝曲布辛(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；伊達曲仙(edatraxate)；德弗法明(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；伊弗尼辛(elfornithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；艾普塞隆(epothilone)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵(gallium nitrate)；羥基尿素(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；洛尼達寧(lonidainine)；美登辛諾(maytansinoid)，諸如美登素(maytansine)及安絲菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫吡丹莫(mopidanmol)；尼曲伊寧((nitraerine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；比柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌 (losoxantrone)；2-乙基醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK®多醣複合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；單端孢黴烯族毒素(trichothecene)(尤其T-2毒素、(verracurin A)、漆斑菌素A(roridin A)及(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)(ELDISINE®、FILDESIN®)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露糖醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；瓜西托辛(gacytosine)；阿糖苷(arabinoside)("Ara-C")；噻替派；紫杉醇類(taxoids)，例如TAXOL®紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、ABRAXANETM Cremophor-free、紫杉醇之白蛋白工程設計奈米顆粒調配物(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Illinois)及TAXOTERE®多西他賽(doxetaxel)(Rhône-Poulenc Rorer,Antony,France)；氯萊布辛(chloranbucil)；吉西他賓(gemcitabine)(GEMZAR®)；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲胺喋呤；鉑類似物，諸如順鉑(cisplatin)及卡鉑(carboplatin)；長春鹼(vinorelbine)(NAVELBINE®)；鉑；依託泊苷(etoposide)(VP-16)；異環磷醯胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新鹼(vincristine)(ONCOVIN®)；奧賽力鉑(oxaliplatin)；洛克沃新(leucovovin)；長春瑞賓(vinorelbine)(NAVELBINF®)； 諾凡特龍(novantrone)；依達曲沙(edatrexate)；道諾黴素(daunomycin)；胺基蝶呤(aminopterin)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(difluoromethylornithine(DMFO))；類視色素(retinoid)，諸如視黃酸；卡西他賓(capecitabine)(XELODA®)；上述任何物質的醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物；以及兩種或兩種以上上述物質之組合，諸如CHOP(亦即環磷醯胺、14-羥基柔紅黴素(doxorubicin)、長春新鹼及潑尼龍(prednisolone)之組合療法的縮寫)及FOLFOX(亦即具有奧賽力鉑(ELOXATINTM)與5-FU及洛克沃新組合之治療方案的縮寫)。
此定義亦包括抗激素劑，其用於調節、降低、阻斷或抑制可促進癌生長之激素的作用且其通常為全身性或整個身體治療之形式。其可為激素本身。實例包括抗雌激素及選擇性雌激素受體調節劑(SERM)，包括(例如)他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX®他莫昔芬)、EVISTA®雷諾昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、克沃昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及FARESTON®托瑞米芬(toremifene)；抗孕酮；雌激素受體下調劑(ERD)；用於抑制或阻止卵巢之藥劑，例如，黃體生成激素釋放激素(LHRH)促效劑，諸如LUPRON®及ELIGARD®乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、乙酸布舍瑞林(buserelin acetate)及崔普瑞林(tripterelin)；其他抗雄激素 劑，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯胺(nilutamide)及比卡魯胺(bicalutamide)；及抑制調節腎上腺中雌激素之產量之芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如4(5)-咪唑、胺魯米特(aminoglutethimide)、MEGASE®乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、AROMASIN®依西美坦(exemestane)、複美坦(formestanie)、法屈唑(fadrozole)、RIVISOR®伏羅唑(vorozole)、FEMARA®來曲唑(letrozole)及ARIMIDEX®安美達錠(anastrozole)。此外，此化學治療劑定義包括雙膦酸鹽，諸如氯屈膦酸鹽(clodronate)(例如，BONEFOS®或OSTAC®)、DIDROCAL®依替膦酸鹽(etidronate)、NE-58095、ZOMETA®唑來膦酸/唑來膦酸鹽(zoledronic acid/zoledronate)、FOSAMAX®阿侖膦酸鹽(alendronate)、AREDIA®帕米膦酸鹽(pamidronate)、SKELID®替魯膦酸鹽(tiludronate)或ACTONEL®利塞膦酸鹽(risedronate)；以及曲沙他濱(troxacitabine)(1,3-二氧戊環胞嘧啶核苷類似物)；反義寡核苷酸，尤其抑制與異常細胞增殖關聯之信號傳輸路徑中的基因表現者，諸如PKC-α、Raf、H-Ras及表皮生長因子受體(EGF-R)；疫苗，諸如THERATOPE®疫苗及基因療法疫苗(例如ALLOVECTIN®疫苗、LEUVECTIN®疫苗及VAXID®疫苗；LURTOTECAN®拓撲異構酶1抑制劑；ABARELIX® rmRH；拉帕替尼二甲苯磺酸鹽(lapatinib ditosylate)(ErbB-2及EGFR雙重酪胺酸激酶小分子抑制劑，亦稱為GW572016)；及上述物質中之任一者的醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。
"生長抑制劑"在本文中使用時係指於活體外或活體內抑制細胞(例如表現EphB4之細胞)生長之化合物或組合物。因此，生長抑制劑可為顯著降低S期中細胞(例如表現EphB4之細胞)百分比之抑制劑。生長抑制劑之實例包括(於非S期之位置)阻斷細胞週期進程之藥劑，例如誘導G1停滯及M期停滯之藥劑。傳統M期阻斷劑包括文卡司(vincas，長春新鹼及長春鹼)、紫杉烷及諸如14-羥基柔紅黴素、表柔比星、道諾黴素、依託泊苷及博萊黴素之拓撲異構酶II抑制劑。使G1停滯之彼等藥劑亦溢出進入S期停滯，舉例而言，諸如他莫西芬、潑尼松(prednisone)、達卡巴嗪、雙氯乙基甲胺、順鉑、甲胺喋呤、5-氟尿嘧啶及ara-C之DNA烷基化劑。可在Murakami等人之The Molecular Basis of Cancer,Mendelsohn及Israel編輯，第1章，標題"Cell cycle regulation,oncogenes,and antineoplastic drugs"(WB Saunders：Philadelphia,1995)尤其第13頁中發現進一步資訊。紫杉烷(太平洋紫杉醇及多烯紫杉醇(docetaxel)為均來自紫杉樹之抗癌藥物。多烯紫杉醇(TAXOTERE®,Rhone-Poulenc Rorer)來源於歐洲紫杉(European yew)，為太平洋紫杉醇(TAXOL®,Brist ol-Myers Squibb)之半合成類似物。太平洋紫杉醇及多烯紫杉醇促進自微管蛋白二聚體組裝微管且藉由預防解聚而穩定微管，導致抑制細胞中之有絲分裂。
"14-羥基柔紅黴素"為一種蒽環黴素抗生素。14-羥基柔紅黴素之完整化學名稱為(8S-順)-10-[(3-胺基-2,3,6-三脫 氧基-α-L-來蘇-六哌喃糖基)氧基]-7,8,9,10-四氫-6,8,11-三羥基-8-(羥基乙醯基)-1-甲氧基-5,12-幷四苯二酮。
術語"抗贅生性組合物"係指可用於治療癌之組合物，其包含至少一種活性治療劑，例如"抗癌劑"。治療劑(抗癌劑，在本文中亦稱為"抗贅生劑")之實例包括(但不限於，例如)化學治療劑、生長抑制劑、細胞毒性劑、輻射療法中使用的藥劑、抗血管生成劑、細胞凋亡劑、抗微管蛋白劑、毒素及治療癌之其他藥劑，例如抗VEGF中和抗體、VEGF拮抗劑、抗HER-2、抗CD20、表皮生長因子受體(EGFR)拮抗劑(例如酪胺酸激酶抑制劑)、HER1/EGFR抑制劑、埃羅替尼(erlotinib)、COX-2抑制劑(例如塞內昔布(celecoxib))、干擾素、細胞因子、結合至ErbB2、ErbB3、ErbB4或VEGF受體之一或多者的拮抗劑(例如中和抗體)、血小板來源的生長因子(PDGF)之受體酪胺酸激酶的抑制劑及/或幹細胞因子(SCF)(例如伊馬替尼(imatinib)甲磺酸鹽(Gleevec® Novartis))、TRAIL/Apo2及其他生物活性及有機化學劑等。
如本申請案中所用之術語"前藥"係指醫藥學活性物質之前驅體或衍生物形式，其對腫瘤細胞之細胞毒性與母體藥物相比較小，且能經酶活化或轉化為更具活性的母體藥物形式。舉例而言，參見Wilman,"Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions,14，第375-382頁，615th Meeting Belfast(1986)；及Stella等人，"Prodrugs：A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery,Borchardt等人，(編輯)，第247-267頁，Humana Press(1985)。本發明前藥包括(但不限於)含磷酸鹽前藥、含硫代磷酸鹽前藥、含硫酸鹽前藥、含肽前藥、經D-胺基酸修飾的前藥、糖基化前藥、含β-內醯胺前藥、含視情況經取代的苯氧基乙醯胺之前藥或含視情況經取代的苯基乙醯胺之前藥、5-氟胞嘧啶及其他5-氟尿苷前藥，其可轉化為更具活性的細胞毒性游離藥物。可衍生為用於本發明的前藥形式之細胞毒性藥物的實例包括(但不限於)上文所述之彼等化學治療劑。
"抗血管生成劑"或"血管生成抑制劑"係指一種小分子量物質、聚核苷酸、多肽、經分離蛋白、重組蛋白、抗體或結合物或其融合蛋白，其直接或間接抑制血管生成、血管發生或不良血管滲透性。舉例而言，抗血管生成劑為如上所定義的血管生成劑之抗體或其他拮抗劑，例如抗VEGF之抗體、抗VEGF受體之抗體、阻斷VEGF受體信號傳輸之小分子(例如PTK787/ZK2284、SU6668、SUTENT/SU11248(舒尼替尼(sunitinib)頻果酸鹽)、AMG706)。抗血管生成劑亦包括天然血管生成抑制劑，例如血管抑制素、內皮抑制素等。舉例而言，參見Klagsbrun及D'Amore,Annu.Rev.Physiol.,53：217-39(1991)；Streit及Detmar,Oncogene,22：3172-3179(2003)(例如表3，其列出惡性黑素瘤中的抗血管生成療法)；Ferrara及Alitalo,Nature Medicine 5(12)：1359-1364(1999)；Tonini等人，Oncogene,22：6549-6556(2003)(例如表2，其列出抗血管生成因子)；及Sato Int.J.Clin.Oncol.,8：200-206(2003)(例如表1，其列出臨床試驗中所用之抗血管生成劑)。
本發明組合物及其製造方法
本發明涵蓋組合物，其包括包含抗EphB4抗體之醫藥組合物及包含編碼抗EphB4抗體之序列的聚核苷酸。如本文所用，組合物包含一或多種結合至EphB4的抗體及/或一或多種包含編碼一或多種結合至EphB4的抗體之序列的聚核苷酸。此等組合物可另外包含適當的載劑，例如包括緩衝劑之醫藥學上可接受的賦形劑，其為此項技術中所熟知的。
本發明亦涵蓋經分離抗體及聚核苷酸實施例。本發明亦涵蓋大體上純的抗體及聚核苷酸實施例。
本發明之抗EphB4抗體較佳地為單株抗體。本文所提供之抗EphB4抗體之Fab、Fab'、Fab'-SH及F(ab')2片段亦涵蓋於本發明範疇內。此等抗體片段可藉由例如酶消化之傳統方式產生，或可由重組技術產生。該等抗體片段可為嵌合或人化的。此等片段可用於下文所陳述之診斷性及治療性目的。
單株抗體獲自大體上同源抗體之群體(亦即，除可以微量存在之可能天然存在的突變以外，包含該群體之個別抗體為相同的)。因此，修飾詞"單株"指示抗體之特徵在於其並非離散抗體之混合物。
本發明之抗EphB4單株抗體可使用Kohler等人，Nature, 256：495(1975)首先描述之融合瘤方法製得，或可由重組 DNA方法(美國專利第4,816,567號)製得。
在融合瘤方法中，使小鼠或諸如倉鼠之其他適當宿主動物免疫以引起產生或能產生將特異性結合至用於免疫的蛋白之抗體的淋巴細胞。EphB4之抗體通常藉由多次皮下(sc)或腹膜內(ip)注射EphB4及佐劑而在動物中產生。EphB4可使用此項技術中熟知的方法製備，其中一些方法在本文中另外描述。舉例而言，以下描述EphB4之重組產生。在一實施例中，以含有融合至免疫球蛋白重鏈Fc部分的EphB4細胞外域(ECD)之EphB4衍生物使動物免疫。在一較佳實施例中，以EphB4-IgG1融合蛋白使動物免疫。通常以具有單磷醯基脂質A(MPL)/海藻糖二可瑞米可酸鹽(dicrynomycolate)(TDM)(Ribi Immunochem.Research,Inc.,Hamilton,MT)之EphB4的免疫原性結合物或衍生物使動物免疫，且於多個位點處經真皮內注射該溶液。兩週後，對該等動物進行推注。7至14天後，將動物放血且分析血清之抗EphB4效價。對動物進行推注，直至效價達到平穩狀態。
或者，可在活體外使淋巴細胞免疫。接著使用諸如聚乙二醇之適當融合劑將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，以形成融合瘤細胞(Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，第59-103頁(Academic Press,1986))。
將由此製備的融合瘤細胞接種且生長於適當培養基中，該培養基較佳地含有一或多種抑制未經融合的親本骨髓瘤細胞之生長或存活的物質。舉例而言，若親本骨髓瘤細胞 缺乏次黃嘌啉鳥嘌啉磷酸核糖基轉移酶(HGPRT或HPRT)，則用於融合瘤之培養基通常應包括次黃嘌啉、胺基蝶呤及胸苷(HAT培養基)，該等物質防止HGPRT缺乏細胞之生長。
較佳之骨髓瘤細胞為有效融合、由所選產生抗體之細胞支持抗體的穩定高程度產生且對諸如HAT培養基之培養基敏感的彼等骨髓瘤細胞。在此等細胞中，較佳之骨髓瘤細胞株為鼠類骨髓瘤細胞株，例如來自MOPC-21及MPC-11小鼠腫瘤(可自Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,California USA獲得)之彼等鼠類骨髓瘤細胞株及SP-2或X63-Ag8-653細胞(可自American Type Culture Collection,Rockville,Maryland USA獲得)。人類骨髓瘤及小鼠-人類雜交骨髓瘤細胞株亦已經描述以用於產生人類單株抗體(Kozbor,J.Immunol.,133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63頁(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
關於針對EphB4之單株抗體的產生來檢定其中生長融合瘤細胞之培養基。由融合瘤細胞產生的單株抗體之結合特異性較佳應藉由免疫沉澱或藉由諸如放射免疫檢定(RIA)或酶聯免疫吸附檢定(ELISA)之活體外結合檢定來測定。
單株抗體之結合親和力可(例如)由Munson等人，Anal.Biochem.,107：220(1980)之Scatchard分析來測定。
在識別產生所要特異性、親和力及/或活性之抗體的融 合瘤細胞後，可藉由限制稀釋程序來次選殖該等純系且使其藉由標準方法生長(Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，第59-103頁(Academic Press,1986))。適用於達成此目的之培養基包括(例如)D-MEM或RPMI-1640培養基。另外，可使融合瘤細胞作為動物體內之腹水腫瘤在活體內生長。
根據諸如蛋白A-瓊脂糖、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析之習知免疫球蛋白純化程序，自培養基、腹水流體(ascites fluid)或血清中適當分離由該等次純系分泌之單株抗體。
本發明之抗EphB4抗體可藉由使用組合文庫篩檢具有所要活性之合成抗體純系來製備。原則上，藉由篩檢呈現融合至噬菌體鞘蛋白中之抗體可變區之各種片段(Fv)的含有噬菌體之噬菌體文庫來選擇合成抗體純系。此等噬菌體文庫係藉由對所要抗原進行親和層析而篩檢得到。表現能夠與所要抗原結合之Fv片段的純系係經抗原吸附，且因此與文庫中之非結合性純系分離。隨後，由抗原溶離結合純系，且可藉由額外抗原吸附/溶離循環進一步富集該等結合純系。設計適當之抗原篩檢程序來選擇所關注之噬菌體純系，隨後使用來自所關注噬菌體純系之Fv序列及Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991)，第1-3卷中所述之適當恆定區(Fc)序列來建構全長抗EphB4抗體純系，藉此可獲得本發明之任何抗EphB4抗體。
抗體之抗原結合域係由約110個胺基酸之兩個可變(V)區形成，該兩個可變區各來自輕鏈(VL)及重鏈(VH)，二者皆呈現三個高變環或互補判定區(CDR)。可變域可於噬菌體上功能性地呈現為其中VH及VL經由短、彎曲肽共價連接之單鏈Fv(ScFv)片段，或呈現為各自融合於恆定域且非共價相互作用之Fab片段，如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.,12：433-455(1994)中所述。如本文所用，編碼噬菌體純系之ScFv及編碼噬菌體純系之Fab統稱為"Fv噬菌體純系"或"Fv純系"。
可藉由聚合酶鏈反應(PCR)單獨地選殖VH及VL基因譜系且將其隨機重組於噬菌體文庫中，隨後可如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.,12：433-455(1994)中所述來尋求該等噬菌體文庫之抗原結合純系。來自經免疫來源之文庫無需建構融合瘤即提供與免疫原具高親和力之抗體。或者，可選殖天然譜系以在無任何免疫作用之情形下提供對抗各種非自體抗原以及自體抗原之人類抗體的單一來源，如Griffiths等人，EMBO J, 12：725-734(1993)中所述。最終，亦可藉由自幹細胞選殖未經重排之V基因片段且使用含有隨機序列之PCR引子來編碼高度可變CDR3區且實現活體外重排而合成性製得天然文庫，如Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227：381-388(1992)中所述。
使用絲狀噬菌體以藉由融合至微量鞘蛋白pIII來呈現抗體片段。抗體片段可呈現為單鏈Fv片段，其中VH及VL域係藉由彎曲多肽間隔物連接於同一多肽鏈上，例如，如 Marks等人，J.Mol.Biol.,222：581-597(1991)所述；或呈現為Fab片段，其中一條鏈係融合於pIII中且另一條鏈係分泌於細菌宿主細胞間質中，在細胞間質中組裝藉由移位某些野生型鞘蛋白而呈現於噬菌體表面的Fab鞘蛋白結構，例如，如Hoogenboom等人，Nucl.Acids Res.,19：4133-4137(1991)中所述。
一般而言，編碼抗體基因片段之核酸係由自人類或動物收集之免疫細胞獲得。若需要偏向於富含抗EphB4純系之文庫，則以EphB4使人類或動物免疫以產生抗體反應，且回收脾細胞及/或循環B細胞或其他末梢血液淋巴細胞(PBL)以用於文庫建構。在一較佳實施例中，於載運功能性人類免疫球蛋白基因陣列(且缺乏功能性內源性抗體產生系統)之轉殖基因小鼠體內產生抗EphB4抗體反應，從而使EphB4免疫作用引起B細胞產生抗EphB4之人類抗體，藉此獲得偏向於富含抗EphB4純系的人類抗體基因片段文庫。下文描述產生人類抗體之轉殖基因小鼠的產生。
可藉由使用適當篩檢程序(例如藉由用EphB4親和層析分離細胞，或使細胞吸附經螢光染料標記之EphB4，隨後進行流式活化細胞分選(FACS))分離表現EphB4特異性膜結合抗體之B細胞而獲得對於抗EphB4反應性細胞群體的額外富集。
或者，使用來自未經免疫供體之脾細胞及/或B細胞或其他PBL以使可能之抗體譜系得以更好呈現，且亦允許使用其中EphB4不具抗原性之任何動物(人類或非人類)物種來 建構抗體文庫。對於併入活體外抗體基因建構中之文庫而言，收集來自該等動物之幹細胞以提供編碼未經重排之抗體基因區段的核酸。所關注免疫細胞可自多種動物物種獲得，諸如人類、小鼠、大鼠、兔類、狼(lupine)、犬科、貓科、豬、牛、馬及鳥類物種等。
自所關注細胞中回收編碼抗體可變基因區段(包括VH及VL區段)之核酸並使其擴增。在經重排之VH及VL基因文庫的情形下，可自淋巴細胞中分離染色體組DNA或mRNA，隨後以與經重排VH及VL基因之5'及3'端匹配之引子進行聚合酶鏈反應(PCR)(如Orlandi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA), 86：3833-3837(1989)中所述)，藉此製得用於表現之不同V基因譜系，從而獲得所要DNA。V基因可由cDNA及染色體組DNA擴增，其中後向引子在編碼成熟V域之外顯子的5'端，且前向引子在J區段內，如Orlandi等人，(1989)及Ward等人，Nature,341：544-546(1989)中所述。然而，對於自cDNA擴增而言，後向引子亦可在前導序列之外顯子中，如Jones等人，Biotechnol.,9：88-89(1991)中所述；且前向引子在恆定區內，如Sastry等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA), 86：5728-5732(1989)中所述。為使互補最大化，可如Orlandi等人(1989)或Sastry等人(1989)所述將簡併性併入引子中。較佳地，藉由使用靶向各V基因家族之PCR引子而使文庫多樣性最大化，以致擴增存在於免疫細胞核酸樣本中之所有可用VH及VL排列，舉例而言，如Marks等人，J.Mol.Biol.,222：581-597(1991)之方法所述 或如Orum等人，Nucleic Acids Res.,21：4491-4498(1993)之方法所述。為將經擴增之DNA選殖至表現載體中，可在PCR引子內引入稀有限制性位點作為一端之標記(如Orlandi等人，(1989)所述)，或藉由另外用經標記引子進行PCR擴增而將其作為一端之標記引入(如Clackson等人，Nature,352：624-628(1991)中所述)。
合成性重排之V基因譜系可於活體外得自V基因區段。大部分人類VH基因區段已經選殖及定序(報導於Tomlinson等人，J.Mol.Biol., 227：776-798(1992)中)，且經繪製(報導於Matsuda等人，Nature Genet., 3：88-94(1993)中)；可使用該等經選殖之區段(包括H1及H2環中之所有主要構形)，從而以編碼不同序列及長度之H3環的PCR引子產生不同VH基因譜系，如Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol., 227：381-388(1992)中所述。亦可製得所有序列多樣性集中於具有單一長度之長H3環的VH譜系，如Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4457-4461(1992)中所述。人類Vκ及Vλ區段已經選殖及定序(報導於Williams及Winter,Eur.J.Immunol.,23：1456-1461(1993)中)且可用於製得合成輕鏈譜系。基於各種VH及VL折疊倍數及L3與H3長度的合成V基因譜系將編碼具有可觀結構多樣性之抗體。在擴增編碼V基因之DNA後，可根據Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol., 227：381-388(1992)之方法於活體外重排生殖系V基因區段。
可藉由以多種方式將VH及VL基因譜系組合在一起而建 構抗體片段之譜系。每一譜系可以不同載體建立，且該等載體藉由組合感染而於活體外(例如，如Hogrefe等人，Gene,128：119-126(1993)中所述)或活體內(例如，Waterhouse等人，Nucl.Acids Res., 21：2265-2266(1993)中所述之loxP系統)重組。活體內重組方法利用Fab片段之兩鏈性質來克服有關由大腸桿菌轉化效率強加之文庫大小的侷限。天然VH及VL譜系係經單獨選殖，一者選殖至噬菌粒(phagemid)中且另一者選殖至噬菌體載體中。隨後，藉由噬菌體感染含有噬菌粒之細菌而使兩種文庫組合，從而使各細胞含有不同組合且使文庫大小僅受所存在之細胞數目(約1012個純系)限制。兩種載體皆含有活體內重組信號，從而使VH及VL基因重組於單一複製子上且共同包裝於噬菌體病毒粒子中。該等巨型文庫提供大量具有良好親和力(Kd -1為約10-8 M)之不同抗體。
或者，可將該等譜系依次選殖至同一載體中，例如，如Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 88：7978-7982(1991)所述；或藉由PCR將其組裝在一起且隨後進行選殖，例如，如Clackson等人，Nature,352：624-628(1991)中所述。亦可使用PCR組裝來使VH及VL DNA與編碼彎曲肽間隔物之DNA連接在一起以形成單鏈Fv(scFv)譜系。在另一技術中，使用"細胞內PCR組裝"以藉由PCR使VH及VL基因組合於淋巴細胞內且隨後選殖經連接基因之譜系，如Embleton等人，Nucl.Acids Res.,20：3831-3837(1992)中所述。
由未處理文庫產生之抗體(天然或合成)可具有適度親和力(Kd -1為約106至107 M-1)，但亦可藉由建構次級文庫且從中進行再選擇而於活體外模擬親和力成熟，如前述Winter等人(1994)所述。舉例而言，可藉由使用易誤聚合酶(報導於Leung等人，Technique, 1：11-15(1989)中)以Hawkins等人，J.Mol.Biol., 226：889-896(1992)之方法或以Gram等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA,89：3576-3580(1992)之方法於活體外隨機引入突變。此外，亦可(例如)用載運跨越所關注CDR之隨機序列的引子使用PCR來隨機突變所選個別Fv純系中之一或多個CDR且篩檢具有較高親和力之純系，藉此進行親和力成熟。WO 9607754(於1996年3月14日公開)描述一種用於誘導免疫球蛋白輕鏈之互補判定區中的突變誘發以建立輕鏈基因文庫之方法。另一有效方法係使藉由噬菌體呈現而選擇之VH或VL域與獲自未經免疫之供體的天然存在V域變異體之譜系重組，且於數輪的鏈改組中篩檢具有較高親和力者，如Marks等人，Biotechnol., 10：779-783(1992)所述。此技術允許產生親和力在10-9 M範圍內之抗體及抗體片段。
EphB4核酸及胺基酸序列為此項技術中已知的。可使用所要EphB4區之胺基酸序列來設計編碼EphB4之核酸序列。或者，可使用GenBank Accession第NM_004444號之cDNA序列(或其片段)或美國專利第635,177號中所揭示者。編碼EphB4之DNA可由此項技術中已知之各種方法製備。此等方法包括(但不限於)根據Engels等人，Agnew. Chem.Int.Ed.Engl.,28：716-734(1989)中所述的任何方法進行化學合成，例如三酯、亞磷酸酯、胺基磷酸酯及H-膦酸酯方法。在一實施例中，宿主細胞表現所偏愛的密碼子用於設計編碼EphB4之DNA。或者，可自基因組或cDNA文庫分離編碼EphB4之DNA。
在構造編碼EphB4之DNA分子後，將該DNA分子可操作性連接至諸如質體之表現載體中的表現控制序列，其中該控制序列藉由以該載體轉型的宿主細胞識別。一般而言，質體載體含有來源於與宿主細胞相容的物種之複製及控制序列。載體一般載運複製位點以及編碼能在轉型細胞中提供表現型選擇之蛋白的序列。適於在原核及真核宿主細胞中表現之載體為此項技術中已知的且一些在本文中進一步描述。可使用諸如酵母之真核有機體或來源於諸如哺乳動物之多細胞有機體的細胞。
視情況，將編碼EphB4之DNA可操作性連接至分泌前導序列，導致表現產物由宿主細胞分泌至培養基中。分泌前導序列之實例包括stII、ecotin、lamB、疱疹性GD、lpp、鹼性磷酸酶、轉化酶及α因子。蛋白A之36胺基酸前導序列(Abrahmsen等人，EMBO J.,4：3901(1985))同樣適用於本文中。
以本發明之上述表現載體或選殖載體轉染宿主細胞且較佳地使其轉型，並在經修飾以適於誘導啟動子、選擇轉型子或擴增編碼所要序列之基因的習知營養培養基中培養該等細胞。
轉染係指由宿主細胞吸收表現載體，而與任何編碼序列實際上是否表現無關。多種轉染方法已為一般熟習此項技術者所知，例如CaPO4沉澱及電穿孔。當操作此載體之任何適應症出現於宿主細胞內時，通常識別為成功轉染。轉染方法為此項技術中熟知的，且一些方法在本文中進一步描述。
轉型意謂將DNA引入有機體中，從而使DNA可作為染色體外元件或由染色體要素複製。視所用之宿主細胞而定，使用適於此等細胞之標準技術進行轉型。轉型方法為此項技術中熟知的，且一些方法在本文中進一步描述。
可如前述Sambrook等人一般描述來培養用於產生EphB4之原核宿主細胞。
可在各種培養基中培養用於產生EphB4之哺乳動物宿主細胞，其為此項技術中熟知的且其中一些在本文中描述。
此揭示內容中所提及之宿主細胞涵蓋活體外培養基中之細胞以及宿主動物體內之細胞。
可使用此項技術中公認的方法達成EphB4之純化，其中一些方法在本文中描述。
可將經純化EphB4附著至諸如瓊脂糖珠粒、丙烯醯胺珠粒、玻璃珠粒、纖維素、各種丙烯酸系共聚物、甲基丙烯酸羥基酯凝膠、聚丙烯酸及聚甲基丙烯酸系共聚物、耐綸、中性及離子載劑及其類似物之適當基質，以用於噬菌體呈現純系之親和力層析分離。可由Methods in Enzymology，第44卷(1976)中所述之方法來達成使EphB4 蛋白附著至基質。將蛋白配位基附著至例如瓊脂糖、葡聚糖或纖維素之多醣基質之常用技術涉及以鹵化氰活化載劑，且隨後將肽配位基的初級脂族或芳族胺偶合至經活化的基質。
或者，EphB4可用於塗覆吸附盤之孔，表現於固定於吸附盤上之宿主細胞上或用於細胞分選，或與生物素結合以經抗生蛋白鏈菌素塗覆之珠粒俘獲，或用於任何其他用於篩檢噬菌體呈現文庫的技術中已知之方法中。
在適於使至少一部分噬菌體顆粒與吸附劑結合之條件下，使噬菌體文庫樣本與經固定之EphB4接觸。通常，選擇條件(包括pH值、離子強度、溫度及其類似條件)以模擬生理學條件。洗滌結合至固相之噬菌體，且隨後藉由酸進行溶離(例如，如Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA,88：7978-7982(1991)中所述)，或藉由鹼進行溶離(例如，如Marks等人，J.Mol.Biol., 222：581-597(1991)中所述)，或藉由EphB4抗原競爭進行溶離(例如，與Clackson等人，Nature,352：624-628(1991)之抗原競爭方法類似的程序)。可於單輪選擇中富集20-1,000倍之噬菌體。此外，所富集之噬菌體可於細菌培養物中生長且經受其他各輪選擇。
選擇效率視多種因子而定，包括洗滌期間之解離動力學及單一噬菌體上之多個抗體片段是否能同時與抗原接合。可藉由使用短時間洗滌、多價噬菌體呈現及抗原於固相中之高塗覆密度而保留具有快速解離動力學(及弱結合親和 力)之抗體。高密度不僅經由多價相互作用穩定噬菌體，且亦易使已解離之噬菌體再結合。可藉由使用長時間洗滌及單價噬菌體呈現(如Bass等人，Proteins,8：309-314(1990)及WO 92/09690中所述)及低抗原塗覆密度(如Marks等人，Biotechnol., 10：779-783(1992)所述)來促進對具有緩慢解離動力學之抗體的選擇。
有可能在對EphB4具有不同親和力、甚至具有略微不同之親和力的噬菌體抗體之間進行選擇。然而，所選抗體之隨機突變(例如，如於上文所述之某些親和力成熟技術中進行的突變)可能產生多種突變體，其中大部分與抗原結合，且一些突變體具有較高親和力。使用限制性EphB4可競爭淘汰少數高親和力噬菌體。為保留所有具有較高親和力之突變體，可用過量經結合生物素之EphB4培育噬菌體，但經結合生物素之EphB4具有莫耳濃度低於EphB4的恆定目標莫耳濃度親和力低之濃度。隨後，可藉由經抗生蛋白鏈菌素塗覆之順磁珠粒俘獲高親和力結合之噬菌體。此"平衡俘獲"使得能夠根據抗體之結合親和力以敏感性選擇抗體，該敏感性允許使具有僅兩倍高的親和力之突變體純系與具有較低親和力之大量過量噬菌體分離。亦可操控用於洗滌與固相結合之噬菌體的條件以基於解離動力學相區分。
抗EphB4純系可根據活性加以選擇。在一實施例中，本發明提供阻斷EphB4配位基(例如ephrin-B1、ephrin-B2及/或ephrin-B3)與EphB4之間之結合但不阻斷EphB4配位基與 第二蛋白(例如EphB1、EphB3、EphB4、EphB5及/或EphB6)之間之結合的抗EphB4抗體。與此等抗EphB4抗體相對應的Fv純系可藉由以下步驟選擇：(1)如上文所述，使抗EphB4純系與噬菌體文庫分離，且視情形藉由在適當細菌宿主中長成群體而擴增經分離之噬菌體純系群體；(2)選擇分別需要阻斷及非阻斷活性之EphB4及第二蛋白；(3)將抗EphB4噬菌體純系吸附至經固定EphB4；(4)使用過量第二蛋白以溶離任何不良純系，該等不良純系識別與該第二蛋白的結合決定子重疊或與該第二蛋白共有結合決定子之EphB4結合決定子；及(5)溶離在第(4)步驟後仍保持吸附之純系。視情形，可藉由重複本文所述之選擇程序一或多次而進一步富集具有所要阻斷/非阻斷特性之純系。
本發明之編碼融合瘤來源的單株抗體之DNA或噬菌體呈現Fv純系易於分離，且易於使用習知程序(例如，藉由使用經設計以由融合瘤或噬菌體DNA模板特異性擴增所關注重鏈及輕鏈編碼區之寡核苷酸引子)進行定序。分離後可將DNA置於表現載體內，隨後將該等表現載體轉染至不會另外產生免疫球蛋白之宿主細胞(諸如大腸桿菌細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞)中，以於重組宿主細胞中獲得所要單株抗體之合成。關於在編碼抗體之細菌DNA中重組表現之文獻綜述包括Skerra等人，Curr.Opinion in Immunol.,5：256(1993)及Pluckthun,Immunol.Revs,130：151(1992)。
編碼本發明Fv純系之DNA可與已知編碼重鏈及/或輕鏈 恆定區之DNA序列(例如，適當DNA序列可由Kabat等人上文所述而獲得)組合以形成編碼全長或部分長度之重鏈及/或輕鏈的純系。應瞭解，為達成此目的可使用任何同型之恆定區，包括IgG、IgM、IgA、IgD及IgE恆定區，且此等恆定區可由任何人類或動物物種獲得。如本文所用之定義"嵌合"抗體及"雜交"抗體中包括得自一種動物(諸如人類)物種之可變域DNA且隨後融合至另一動物物種之恆定區DNA中以形成"雜交"編碼序列(全長重鏈及/或輕鏈)的Fv純系。在一較佳實施例中，得自人類可變DNA之Fv純系係融合於人類恆定區DNA中以形成全人類編碼序列，即全長或部分長度之重鏈及/或輕鏈。
舉例而言，亦可藉由以人類重鏈及輕鏈恆定域之編碼序列取代來自融合瘤純系的同源鼠類序列而修飾來自本發明融合瘤之編碼抗EphB4抗體的DNA(例如，如Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855(1984)中之方法)。編碼融合瘤或Fv純系來源之抗體或片段的DNA可藉由共價接合至免疫球蛋白編碼序列(該編碼序列之全部或部分用於編碼非免疫球蛋白多肽)進一步修飾。以此方式，製備具有本發明Fv純系或融合瘤純系來源的抗體之結合特異性的"嵌合"或"雜合"抗體。
抗體片段
本發明涵蓋抗體片段。在某些情形下，使用抗體片段而非使用全抗體具有優勢。較小尺寸之片段可迅速清除且可導致對於實體腫瘤接取之改良。
已發展各種技術用於產生抗體片段。通常，經由蛋白水解性消化完整抗體獲得此等片段(例如，參見Morimoto等人，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992)；及Brennan等人，Science,229：81(1985))。然而，現可藉由重組宿主細胞直接產生此等片段。Fab、Fv及ScFv抗體片段均可在大腸桿菌中表現且由其分泌，因此可易於產生大量此等片段。可自以上討論的抗體噬菌體文庫分離抗體片段。或者，可自大腸桿菌直接回收Fab'-SH片段，且將其化學偶合以形成F(ab')2片段(Carter等人，Bio/Technology 10：163-167(1992))。根據另一種方法，可自重組宿主細胞培養物直接分離F(ab')2片段。具有增加之活體內半衰期的包含補救受體結合抗原決定基殘基之Fab及F(ab')2片段係描述於美國專利第5,869,046號中。其他用於產生抗體片段之技術對於熟習此項技術者而言應為顯而易見的。在其他實施例中，所選擇之抗體為單鏈Fv片段(scFv)。參看WO 93/16185、美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。Fv及sFv為唯一缺少恆定區但仍具有完整組合位點之種類；因此，其適於在活體內使用期間具有降低之非特異性結合。sFv融合蛋白可經建構以在sFv的胺基或羧基末端產生效應蛋白之融合。參看Antibody Engineering,Borrebaeck編輯，同上文。抗體片段亦可為"線性抗體"，例如，如美國專利第5,641,870號中所述。此等線性抗體片段可為單特異性或雙特異性。
人化抗體
本發明涵蓋人化抗體。各種用於人化非人類抗體之方法已為此項技術中所知。舉例而言，人化抗體可具有一或多個由非人類來源引入其中之胺基酸殘基。該等非人類胺基酸殘基通常被稱為"輸入"殘基，其通常自"輸入"可變域取得。可基本上根據Winter及其同事(Jones等人，(1986)Nature 321：522-525；Riechmann等人，(1988)Nature 332：323-327；Verhoeyen等人，(1988)Science 239：1534-1536)之方法藉由以高變區序列取代人類抗體之相應序列進行人化。因此，該等"人化"抗體為嵌合抗體(美國專利第4,816,567號)，其中大體上小於完整人類可變域之序列已由來自非人類物種之相應序列取代。實際上，人化抗體通常為其中某些高變區殘基及可能某些FR殘基經來自齧齒動物抗體之類似位點之殘基取代的人類抗體。
對用於製造人化抗體之人類可變域(輕鏈與重鏈)的選擇對於降低抗原性而言為極為重要的。根據所謂之"最佳擬合"方法，對已知人類可變域序列篩檢齧齒動物抗體之可變域序列。隨後，將與齧齒動物序列最接近之人類序列接受為人化抗體之人類框架(Sims等人，(1993)J.Immunol.151：2296；Chothia等人，(1987)J.Mol.Biol.196：901)。另一方法使用得自具有特定輕鏈或重鏈亞群之所有人類抗體之一致序列的特定框架。同一框架可用於數種不同之人化抗體(Carter等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4285；Presta等人，(1993)J.Immunol.,151：2623)。
更重要的是，通常需要經人化而保持對抗原之高親和力 及其他有利生物學特性的抗體。為達成此目標，根據一種方法，藉由使用親本序列及人化序列之三維模型來分析親本序列及各種概念上之人化產物的方法製備人化抗體。三維免疫球蛋白模型通常可用且為熟習此項技術者所熟知。可用描述且呈現所選擇之候選免疫球蛋白序列之大致三維構形結構的電腦程式。該等呈現之檢驗允許分析殘基對候選免疫球蛋白序列之功能可能起到的作用，亦即，分析會影響候選免疫球蛋白與其抗原結合之能力的殘基。以此方式，可自受體及輸入序列選擇FR殘基並使其組合，從而使所要抗體特徵(諸如對靶向抗原增加之親和力)得以達成。一般而言，對於抗原結合之影響直接且大體上完全涉及高變區殘基。
人類抗體
本發明之人類抗EphB4抗體可藉由將選自人類來源之噬菌體呈現文庫的Fv純系可變域序列與如上所述之已知人類恆定域序列組合來建構。或者，可藉由融合瘤方法製得本發明之人類單株抗EphB4抗體。用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類雜交骨髓瘤細胞株已由下列文獻加以描述：例如，Kozbor J.Immunol.,133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63頁(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；及Boerner等人，J.Immunol.,147：86(1991)。
現今有可能產生在免疫後隨即能夠在不產生內源免疫球蛋白之情形下產生全人類抗體譜系的轉殖基因動物(例如 小鼠)。舉例而言，已描述嵌合及生殖系突變體小鼠中抗體重鏈連接區(JH)基因的純合子缺失會導致對於內源抗體產生之完全抑制。將人類生殖系免疫球蛋白基因陣列轉移至此等生殖系突變體小鼠中將會於抗原激發後引起人類抗體之產生。例如，參看Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA, 90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature, 362：255(1993)；Bruggermann等人，Year in Immunol.,7： 33(1993)。
亦可使用基因改組以自非人類(例如齧齒動物)抗體得到人類抗體，其中人類抗體具有與初始非人類抗體類似之親和力及特異性。根據此方法(亦稱為"抗原決定基印記(epitope imprinting)")，以人類V域基因譜系置換藉由如上文所述之噬菌體呈現技術獲得的非人類抗體片段之重鏈或輕鏈可變區，從而產生非人類鏈/人類鏈scFv或Fab嵌合體群體。以抗原進行選擇會導致非人類鏈/人類鏈嵌合scFv或Fab之分離，其中人類鏈會恢復移除原代噬菌體呈現純系中之相應非人類鏈時損壞的抗原結合位點，亦即抗原決定基決定(印記)對於人類鏈搭配物之選擇。當重複該過程以置換剩餘非人類鏈時，獲得人類抗體(參看1993年4月1日公開之PCT WO 93/06213)。與傳統藉由CDR移植來人化非人類抗體不同，此技術提供不具有非人類來源之FR或CDR殘基的完全人類抗體。
雙特異性抗體
雙特異性抗體為對至少兩種不同抗原具有結合特異性之 單株抗體，較佳地為人類或人化抗體。在本發明情形中，結合特異性之一為對於EphB4之結合特異性且另一者為對於任何其他抗原之結合特異性。例示性雙特異性抗體可結合至EphB4蛋白之兩種不同抗原決定基。雙特異性抗體亦可用於將細胞毒性劑定位於表現EphB4之細胞。此等抗體具有EphB4結合臂及結合細胞毒性劑(例如沙泊寧(saporin)、抗干擾素-α、長春鹼類、蓖麻毒蛋白(ricin)A鏈、甲胺喋呤或放射性同位素半抗原)之臂。雙特異性抗體可製備為全長抗體或抗體片段(例如F(ab')2雙特異性抗體)。
用於製造雙特異性抗體之方法已為此項技術中所知。傳統上，重組產生雙特異性抗體係基於兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之共同表現，其中該兩個重鏈具有不同特異性(Milstein及Cuello,Nature,305：537(1983))。由於免疫球蛋白重鏈及輕鏈之隨機分組，該等融合瘤(雜交瘤)產生10種不同抗體分子之潛在混合物，其中僅一種具有恰當之雙特異性結構。通常藉由親和層析步驟進行之恰當分子的純化相當繁瑣，且產物產率低。類似程序揭示於1993年5月13日公開之WO 93/08829及Traunecker等人，EMBO J., 10：3655(1991)中。
根據一種不同且更佳之方法，將具有所要結合特異性(抗體抗原組合位點)之抗體可變域與免疫球蛋白恆定域序列融合。較佳地，與包含鉸鏈區、CH2及CH3區之至少部分之免疫球蛋白重鏈恆定域一起進行融合。含有輕鏈結合 所必需之位點之第一重鏈恆定區(CH1)最好存在於至少一種融合體中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合體及(若須要)免疫球蛋白輕鏈之DNA插入獨立表現載體中，且使其共轉染至適當之宿主有機體中。在建構時使用不等比率之三個多肽鏈來提供最佳產率之實施例中，此舉使對於三個多肽片段的相互比例之調節具有極大靈活性。然而，當至少兩個多肽鏈以相等比率表現會產生高產率或當該等比率並非特別重要時，有可能將兩個或所有三個多肽鏈之編碼序列插入一種表現載體中。
在此方法之一較佳實施例中，雙特異性抗體係由一臂中具有第一結合特異性之雜交免疫球蛋白重鏈及另一臂中之雜交免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)構成。已發現，由於免疫球蛋白輕鏈僅存在於一半雙特異性分子中會提供一種簡便之分離方式，故此不對稱結構會促進所要雙特異性化合物與不良免疫球蛋白組合分離。此方法揭示於WO 94/04690中。有關產生雙特異性抗體之其他細節，參看(例如)Suresh等人，Methods in Enzymology,121：210(1986)。
根據另一方法，可工程設計一對抗體分子之間之界面以使由重組細胞培養物回收的雜二聚體之百分比最大化。該較佳界面包含抗體恆定域之至少一部分CH3域。以此方法，使來自第一抗體分子界面之一或多個小胺基酸側鏈經較大側鏈(例如，酪胺酸或色胺酸)置換。藉由用小胺基酸側鏈(例如，丙胺酸或蘇胺酸)置換大胺基酸側鏈而於第二 抗體分子之界面上產生具有與大側鏈相同或類似的尺寸之補償性"空穴"。此舉提供一種使雜二聚體之產量增加超過其他不良最終產物(諸如均二聚體)之機制。
雙特異性抗體包括交聯或"雜結合"抗體。舉例而言，雜結合物中之一抗體可與抗生蛋白偶聯，其他抗體與生物素偶聯。例如，已建議該等抗體靶向針對不良細胞之免疫系統細胞(美國專利第4,676,980號)，且用於治療HIV感染(WO 91/00360、WO 92/00373及EP 03089)。可使用任何便利之交聯方法來製造雜結合抗體。適當之交聯劑已為此項技術中所熟知，且揭示於美國專利第4,676,980號以及大量交聯技術中。
自抗體片段產生雙特異性抗體之技術亦已描述於文獻中。舉例而言，可使用化學鍵製備雙特異性抗體。Brennan等人，Science,229：81(1985)中描述蛋白水解性裂解完整抗體以產生F(ab')2片段之程序。在二硫醇錯合劑亞砷酸鈉存在下還原該等片段以穩定鄰近二硫醇且防止分子間二硫化物形成。隨後，將所產生之Fab'片段轉化為硫代硝基苯甲酸鹽(TNB)衍生物。隨後，藉由用巰基乙胺還原將一種Fab'-TNB衍生物再轉化為Fab'-硫醇，且使其與等莫耳量之另一種Fab'-TNB衍生物混合以形成雙特異性抗體。所產生之雙特異性抗體可用作用於選擇性固定酶之試劑。
近期之發展已促進自大腸桿菌直接回收Fab'-SH片段，該等片段可化學偶聯以形成雙特異性抗體。Shalaby等 人，J.Exp.Med.,175：217-225(1992)描述完全人化雙特異性抗體F(ab')2分子之產生。由大腸桿菌單獨地分泌各Fab'片段且使其經受活體外定向化學偶聯以形成雙特異性抗體。因此所形成之雙特異性抗體能夠與過度表現HER2受體之細胞及正常人T細胞結合，且亦觸發人類細胞毒素淋巴細胞對人類乳腺腫瘤標靶之溶解活性。
亦已描述各種直接由重組細胞培養物製造並分離雙特異性抗體片段之技術。舉例而言，已使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體。Kostelny等人，J.Immunol.,148(5)：1547-1553(1992)。藉由基因融合將來自Fos及Jun蛋白之白胺酸拉鏈肽與兩種不同抗體之Fab'部分連接。還原鉸鏈區之抗體均二聚體以形成單體，且隨後使其再氧化以形成抗體雜二聚體。此方法亦可用於產生抗體均二聚體。Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993)所述之"雙功能抗體"技術已提供一種用於製造雙特異性抗體片段之替代機制。該等片段包含藉由連接子連接至輕鏈可變域(VL)之重鏈可變域(VH)，該連接子因過短而使得同一鏈上之兩個域無法配對。因此，迫使一片段之VH及VL域與另一片段之互補VL及VH域配對，藉此形成兩個抗原結合位點。亦已報導另一種藉由使用單鏈Fv(sFv)二聚體來製造雙特異性抗體片段之策略。參看Gruber等人，J.Immunol.,152：5368(1994)。
涵蓋大於兩價之抗體。舉例而言，可製備三特異性抗體。Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991)。
多價抗體
可藉由表現與抗體結合的抗原之細胞比二價抗體快地內化(及/或異化)多價抗體。本發明抗體可為具有三個或三個以上抗原結合位點之多價抗體(其與IgM種類之抗體不同)(例如四價抗體)，該等多價抗體可易於藉由重組表現編碼抗體多肽鏈之核酸來製造。多價抗體可包含二聚化域及三個或三個以上抗原結合位點。較佳之二聚化域包含(例如)Fc區或鉸鏈區(或由其組成)。在此情形下，抗體將包含Fc區及三個或三個以上在Fe區胺基末端之抗原結合位點。在本文中，較佳之多價抗體包含(例如)三至約八個但較佳四個抗原結合位點(或由其組成)。多價抗體包含至少一個多肽鏈(且較佳兩個多肽鏈)，其中多肽鏈包含兩個或兩個以上可變域。舉例而言，多肽鏈可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1為第一可變域，VD2為第二可變域，Fc為Fc區之一個多肽鏈，X1及X2表示胺基酸或多肽，且n為0或1。舉例而言，多肽鏈可包含：VH-CH1-彎曲連接子-VH-CH1-Fc區鏈或VH-CH1-VH-CH1-Fc區鏈。在本文中，多價抗體可另外包含至少兩個(且較佳四個)輕鏈可變域多肽。在本文中，多價抗體可(例如)包含約兩個至約八個輕鏈可變域多肽。本文所涵蓋之輕鏈可變域多肽包含輕鏈可變域且視情形另外包含CL域。
抗體變異體
在某些實施例中，涵蓋本文所述之抗體的胺基酸序列修飾。舉例而言，可需要改良抗體之結合親和力及/或其他 生物學特性。抗體之胺基酸序列變異體係藉由將適當之核苷酸改變引入抗體核酸中或藉由肽合成而製備。此等修飾包括(例如)抗體胺基酸序列內殘基之缺失及/或插入及/或取代。可進行缺失、插入及取代之任何組合以達成最終構築體，其限制條件在於最終構築體具有所要特徵。可在製造序列時將胺基酸變化引入標的抗體胺基酸序列中。
適用於識別抗體之某些殘基或區域(其為較佳突變誘發位置)之方法稱為"丙胺酸掃描突變誘發(alanine scanning mutagenesis)"，如Cunningham及Wells(1989)Science,244：1081-1085所述。由此，靶向殘基之殘基或基團得以識別(例如帶電殘基，諸如arg、his、lys及glu)且經帶中性電或負電胺基酸(大多數較佳為丙胺酸或聚丙胺酸)置換以影響胺基酸與抗原的相互作用。隨後，藉由在取代位點引入另外或其他變異體或引入另外或其他變異體作為取代位點來改進彼等證實對取代功能性敏感之胺基酸位置。因此，儘管已預定引入胺基酸序列變化之位點，但突變本身之性質無需預定。舉例而言，為分析指定位點處突變之效能，在靶向密碼子或區域處進行ala掃描或隨機突變誘發，並關於所要活性篩檢所表現之免疫球蛋白。
胺基酸序列插入包括長度在一個殘基至含有一百個或更多殘基之多肽之範圍內的胺基末端及/或羧基末端融合，以及單一或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N-末端甲硫胺醯基殘基之抗體或融合至細胞毒素多肽中之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括抗體之 N末端或C末端與酶(例如，用於ADEPT)之融合，或增加抗體的血清半衰期之多肽。
多肽糖基化通常為N-連接的或O-連接的。N-連接係指碳水化合物部分附著至天冬醯胺酸殘基之側鏈。三肽序列天冬醯胺酸-X-絲胺酸及天冬醯胺酸-X-蘇胺酸(其中X為除脯胺酸外的任何胺基酸)為碳水化合物部分酶促附著至天冬醯胺酸側鏈之識別序列。因此，多肽中此等三肽序列之任一者的存在均產生可能的糖基化位點。O-連接的糖基化係指糖類N-乙醯半乳胺糖、半乳糖或木糖中之一者附著至羥基胺基酸，該羥基胺基酸最常為絲胺酸或蘇胺酸，但亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。
改變胺基酸序列以使其含有一或多個上述三肽序列(對於N-連接糖基化位點而言)，藉此便於將糖基化位點添加至抗體。亦可藉由將一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基添加至初始抗體序列或取代該等殘基(對於O-連接糖基化位點而言)而作出改變。
若抗體包含Fc區，則亦可修飾其上附著之碳水化合物。舉例而言，具有缺乏附著至抗體Fc區的海藻糖之成熟碳水化合物結構的抗體描述於美國專利申請案第2003/0157108號中(Presta,L.)。亦參見US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。在附著至抗體Fc區之碳水化合物中具有對分N-乙醯葡糖胺(GlcNAc)的抗體，可參考Jean-Mairet等人之WO 2003/011878及Umana等人之美國專利第6,602,684號。在附著至抗體Fc區之寡醣中具有至少一個半乳糖殘基 的抗體報導於Patel等人之WO 1997/30087中。亦參見WO 1998/58964(Raju,S.)及WO 1999/22764(Raju,S.)，其關注具有附著至抗體Fc區之經改變碳水化合物之抗體。亦參見US 2005/0123546(Umana等人)，其關於具有經修飾糖基化之抗原結合分子。
在本文中，較佳之糖基化變異體包含Fc區，其中附著至Fc區之碳水化合物結構缺乏海藻糖。該等變異體具有改良ADCC功能。視情況，Fc區其中另外包含一或多個進一步改良ADCC之胺基酸取代，例如於Fc區位置298、333及/或334處之取代(殘基之Eu編號)。關於"去海藻糖基化"或"海藻糖缺乏"抗體之公開案的實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；Okazaki等人，J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87：614(2004)。產生去海藻糖基化抗體之細胞株的實例包括蛋白海藻糖基化缺乏之Lec13 CHO細胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108 A1號，Presta,L；及WO 2004/056312 A1,Adams等人，尤其於實例11)及基因剔除細胞株，例如α-1,6-海藻糖基轉移酶基因、FUT8、基因剔除CHO細胞(Yamane-Ohnuki等人， Biotech.Bioeng.87：614(2004))。
另一類型之變異體為胺基酸取代變異體。在此等變異體中，由一不同殘基置換抗體分子中之至少一個胺基酸殘基。取代性突變誘發之最關注位點包括高變區，但亦涵蓋FR改變。保守取代以"較佳取代"之標題顯示於表1中。若該等取代導致生物學活性改變，則可引入表1中稱為"例示性取代"或如下文參考胺基酸種類進一步描述之更實質性改變且篩檢產物。
對抗體生物學特性之實質修飾係藉由選擇取代來實現，該等取代顯著不同之處在於其對於維持下列各物之影響：(a)取代區域中多肽骨架之結構，例如，呈薄片或螺旋構形；(b)分子靶向位點處之電荷或疏水性；或(c)側鏈整體。可基於統統側鏈特性對天然存在之殘基分組：(1)疏水性殘基：正白胺酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性親水性殘基：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性殘基：asp、glu；(4)鹼性殘基：his、lys、arg；(5)影響鏈定向之殘基：gly、pro；及(6)芳族殘基：trp、tyr、phe。
非保守型取代將需要該等種類中之一者之成員與另一種類交換。
一類取代變異體涉及取代親本抗體(例如，人化抗體或人類抗體)之一或多個高變區殘基。一般而言，選擇用於進一步研發之所得變異體應已相對於產生其之親本抗體具有改良生物學特性。一種用於產生此等取代變異體之便利方式涉及使用噬菌體呈現進行之親和力成熟。簡言之，使若干高變區位點(例如，6-7個位點)突變以於各位點處產生所有可能之胺基酸取代。當融合至包裝於各絲狀噬菌體顆粒內之M13基因III產物時，呈現因此由該等顆粒產生之抗 體。隨後，關於如本文所揭示之抗體之生物學活性(例如，結合親和力)篩檢噬菌體呈現變異體。為識別用於修飾之候選高變區位點，可進行丙胺酸掃描突變誘發以識別顯著有助於抗原結合之高變區殘基。另外或其他，其可有益於分析抗原抗體複合物之晶體結構以識別抗體與抗原之間的接觸點。此等接觸殘基及相鄰殘基為根據本文詳細描述之技術進行取代之候選物。在產生此等變異體後，使變異體群體經受如本文所述之篩檢，且可在一或多個相關檢定中選擇具有優良特性之抗體以用於進一步發展。
編碼抗體胺基酸序列變異體之核酸分子係藉由此項技術中已知之多種方法製備。該等方法包括(但不限於)自天然來源分離(在天然存在之胺基酸序列變異體情形下)或藉由先前製備之抗體變異體或非變異體型式的寡核苷酸介導(或定點)突變誘發、PCR突變誘發及盒式突變誘發(cassette mutagenesis)製備。
可需要在本發明免疫球蛋白多肽之Fc區中引入一或多個胺基酸修飾，藉此產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含在一或多個胺基酸位置處(包括鉸鏈半胱胺酸之位置)包含胺基酸修飾(例如，取代)之人類Fc區序列(例如，人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。
根據此描述及此項技術之教示，預期在某些實施例中與野生型對應物抗體相比，用於本發明方法之抗體可包含一或多種改變，例如在Fc區中。然而，該等抗體將保持與其野生型對應物相比大體上相同之治療效用所需的特徵。舉 例而言，認為可於Fc區中進行將引起Clq結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)改變(亦即，改良或減小)之某些改變，例如，如WO 99/51642中所述。亦參看下列有關Fc區變異體之其他實例之文獻：Duncan & Winter Nature 322：738-40(1988)；美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及WO 94/29351。WO 00/42072(Presta)及WO 2004/056312(Lowman)描述對FcR具有改良或減小的結合之抗體變異體。此等專利公開案之內容以引用方式特定併入本文中。亦參見Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。具有增加的半壽期及對新生兒Fc受體(FcRn)具有改良結合(其為造成母體IgG轉移至胎兒(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等人)，J.Immunol.24：249(1994)之原因)之抗體描述於US 2005/0014934A1(Hinton等人)中。此等抗體包含Fc區，其中一或多個取代會改良Fc區與FcRn之結合。具有改變的Fc區胺基酸序列及增加或降低的Clq結合能力之多肽變異體描述於美國專利第6,194,551B1號、WO 99/51642中。彼等專利公開案之內容以引用方式特定併入本文中。亦參見Idusogie等人，J.Immunol.164：4178-4184(2000)。
抗體衍生物
可進一步修飾本發明抗體以使其含有此項技術中已知且可易於獲得之額外非蛋白部分。較佳地，適於衍生抗體之部分為水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲 基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三噪烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚乙氧基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛可因其於水中之穩定性而於製造時具有優勢。聚合物可具有任何分子量，且可具支鏈或不具支鏈。附著於抗體之聚合物的數目可變化，且若附著一種以上聚合物，則該等聚合物可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生作用之聚合物之數目及/或類型可基於包括(但不限於)待改良抗體之特定特性或功能、抗體衍生物是否將用於指定條件下之療法等考慮而確定。
篩檢具有所要特性之抗體
可藉由此項技術中已知之各種檢定來表徵本發明抗體之物理/化學特性及生物學功能。在一些實施例中，關於降低或阻斷EphB4活化、降低或阻斷EphB4下游分子信號傳輸、降低或阻斷EphB4配位基活化、降低或阻斷EphB4配位基下游分子信號傳輸、破壞或阻斷配位基(例如ephrin-B1、ephrin-B2及/或ephrin-B3)結合至EphB4、EphB4磷酸化及/或EphB4多聚化及/或EphB4配位基磷酸化及/或治療及/或預防腫瘤、細胞增生性病症或癌及/或治療或預防與EphB4表現及/或活性(例如增加的EphB4表現及/或活性)相關的病症中之任一者或多者來表徵抗體。
經純化抗體可由一系列檢定進一步表徵，該等檢定包括 (但不限於)N-末端定序、胺基酸分析、不變性尺寸排除高壓液相層析(HPLC)、質譜、離子交換層析及木瓜酵素消化。
在本發明之某些實施例中，分析本文產生之該等抗體的生物學活性。在一些實施例中，測試本發明抗體之抗原結合活性。此項技術中已知且可用於本文中之抗原結合檢定包括(但不限於)使用諸如western墨點法、放射免疫檢定、ELISA(酶聯免疫吸附檢定)、"夾心"免疫檢定、免疫沉澱檢定、螢光免疫檢定及蛋白A免疫檢定之技術的任何直接或競爭性結合檢定。以下在實例部分提供說明性抗原結合檢定。
在另一實施例中，本發明提供與30.35、30.35.1D2及/或30.35.2D8抗體競爭結合至EphB4之抗EphB4單株抗體。該等競爭抗體包括識別與由抗體30.35、30.35.1D2及/或30.35.2D8識別的EphB4抗原決定基相同或重疊之EphB4抗原決定基的抗體。可藉由篩檢抗EphB4融合瘤上清液而獲得該等競爭抗體，以與經標記30.35、30.35.1D2及/或30.35.2D8抗體競爭結合至固定化EphB4。與含有無關(或無)抗體之對照結合混合物中所偵測的經結合、經標記抗體量相比較，含有競爭抗體之融合瘤上清液將降低本發明競爭結合混合物中所偵測之經結合、經標記抗體之量。本文所述之任何競爭結合檢定均適用於前述程序中。
在另一態樣中，本發明提供一種包含30.35、30.35.1D2或30.35.2D8抗體之一或多種(例如2、3、4、5及/或6 種)HVR的抗EphB4單株抗體。將30.35、30.35.1D2或30.35.2D8之一或多種HVR移植至模板抗體序列(例如最接近親本抗體之對應鼠類序列的人類抗體序列，或親本抗體輕鏈或重鏈之特定亞群中的所有人類抗體之一致序列)上，且如本文所述在重組宿主細胞中表現具有或不具有伴隨恆定區序列之所得嵌合輕鏈及/或重鏈可變區序列，藉此可構造包含30.35、30.35.1D2或30.35.2D8之一或多種HVR的抗EphB4單株抗體。
可藉由根據任何便利的方法篩檢具有所要特性之抗EphB4融合瘤純系而獲得具有本文所述的獨特特性之本發明抗EphB4抗體。舉例而言，若需要阻斷或不阻斷EphB4配位基結合至EphB4之抗EphB4單株抗體，則可在諸如競爭性結合ELISA之結合競爭檢定中測試候選抗體，其中以EphB4塗佈培養盤孔，且使相對於所關注Eph配位基過量的抗體溶液於經塗佈之培養盤上分層，且酶促偵測經結合抗體，例如使經結合抗體與結合HRP的抗Ig抗體或生物素化抗Ig抗體接觸且發展HRP顏色發應，舉例而言，藉由以抗生蛋白鏈菌素-HRP及/或過氧化氫使培養盤顯影且藉由使用ELISA盤讀取器以分光光度計於490 nm下偵測HRP顏色反應而達成。
若需要抑制或活化EphB4活化作用之抗EphB4抗體，則可以EphB4磷酸化檢定測試候選抗體。該等檢定為此項技術中已知的且一種此類檢定描述於實例部分中。
若需要抑制細胞生長之抗EphB4抗體，則可在量測細胞 生長之抑制作用的活體內及/或活體外檢定中測試候選抗體。該等檢定為此項技術中已知的且在本文中進一步描述及例示。
在一實施例中，本發明涵蓋一種已改變之抗體，其具有某些但並非所有效應功能，此使其成為其中抗體在活體內之半衰期極其重要而某些效應功能(諸如補體及ADCC)卻並非必需或有害之多種應用中合乎需要之候選抗體。在某些實施例中，量測所產生之免疫球蛋白之Fc活性以確保僅所要特性得以保持。可進行活體外及/或活體內細胞毒性檢定以確定CDC及/或ADCC活性之降低/耗盡。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合檢定以確保抗體缺乏FcγR結合(由此可能缺乏ADCC活性)但仍保持FcRn結合能力。介導ADCC之原生細胞(NK細胞)僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞中之FcR表現概述於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)第464頁表3中。分析所關注分子之ADCC活性之活體外檢定的實例描述於美國專利第5,500,362號或第5,821,337號中。適用於此等檢定之效應細胞包括末梢血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。另外或其他，可(例如)在動物模型中(諸如Clynes等人，PNAS(USA)95：652-656(1998)中所揭示者)於活體內評定所關注分子之ADCC活性。亦可進行Clq結合檢定以確定抗體無法與Clq結合且因此缺乏CDC活性。為分析補體活化，可進行CDC檢定，例如，如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中 所述。亦可使用此項技術中已知之方法進行FcRn結合及活體內清除/半衰期測定。
載體、宿主細胞及重組方法
為重組產生本發明抗體，分離編碼該抗體之核酸且將其插入可複製之載體中以用於進一步選殖(DNA之擴增)或表現。編碼該抗體之DNA易於分離，且易於使用習知程序(例如，藉由使用能夠與編碼該抗體之重鏈及輕鏈之基因特異性結合的寡核苷酸探針)進行定序。多種載體均可用。載體之選擇部分地視待使用之宿主細胞而定。較佳之宿主細胞一般為原核或真核(通常為哺乳動物)來源之細胞。應瞭解，為達成此目的可使用任何同型之恆定區，包括IgG、IgM、IgA、IgD及IgE恆定區，且此等恆定區可由任何人類或動物物種獲得。
a.使用原核宿主細胞產生抗體：
i.載體建構
可使用標準重組技術獲得編碼本發明抗體之多肽組份的聚核苷酸序列。可自產生抗體之細胞(諸如融合瘤細胞)中分離所要聚核苷酸序列並進行定序。或者，可使用核苷酸合成器或PCR技術合成聚核苷酸。在獲得編碼多肽之序列後，將其插入能夠在原核宿主中複製並表現異源聚核苷酸之重組載體中。可使用可用且為此項技術中所知之多種載體來達成本發明之目的。對於適當載體之選擇將主要視插入載體中之核酸的大小及經載體轉型之特定宿主細胞而定。各載體視其功能(異源聚核苷酸之擴增或表現，或二 者)及其與其所滯留之特定宿主細胞的可相容性而含有多種組份。載體組份通常包括(但不限於)：複製起點、選擇標記基因、啟動子、核糖體結合位點(RBS)、信號序列、異源核酸插入物及轉錄終止序列。
一般而言，使用與該等宿主有關之含有複製子及得自可與宿主細胞相容的物種之控制序列的質體載體。載體一般具有複製位點，以及能夠於經轉型細胞中提供表型選擇之標記序列。舉例而言，通常使用pBR322(一種得自大腸桿菌物種之質體)使大腸桿菌轉型。pBR322含有編碼安比西林(ampicillin)(Amp)及四環素(tetracycline)(Tet)抗性之基因，且因此提供簡便的識別經轉型細胞之方式。pBR322、其衍生物或其他微生物質體或噬菌體亦可含有或經修飾而含有可由微生物有機體用於表現內源蛋白之啟動子。用於表現特定抗體之pBR322衍生物之實例詳細描述於Carter等人之美國專利第5,648,237號中。
此外，與該等宿主有關之含有複製子及可與宿主微生物相容之控制序列的噬菌體載體亦可用作轉型載體。舉例而言，諸如λGEM.TM.-11之噬菌體可用於製造可用於轉型易感宿主細胞(諸如大腸桿菌LE392)之重組載體。
本發明之表現載體可包含兩種或兩種以上編碼每一多肽組份之啟動子-順反子對。啟動子為一種位於調節其表現之順反子上游(5')之未經轉譯調節序列。原核啟動子通常分為兩類，亦即誘導型及組成型。誘導型啟動子係對培養條件之改變(例如養分之存在與否或溫度之改變)起反應而 在其控制下起始順反子以增加之水準轉錄的啟動子。
大量由多種潛在宿主細胞所識別之啟動子已為吾人所熟知。藉由經由限制酶消化將所選擇之啟動子自源DNA移除且將所分離之啟動子序列插入本發明之載體中可使該啟動子可操作性連接至編碼輕鏈或重鏈之順反子DNA。天然啟動子序列與多種異源啟動子可用於引導靶向基因之擴增及/或表現。在某些實施例中，因與天然靶向多肽啟動子相比，異源啟動子通常允許所表現之靶向基因較快地轉錄且具有較高之產量，所以利用異源啟動子。
適於與原核宿主一起使用之啟動子包括PhoA啟動子、β-半乳糖苷酶及乳糖啟動子系統、色胺酸(Trp)啟動子系統及雜合啟動子(諸如tac或trc啟動子)。然而，在細菌中起作用之其他啟動子(諸如其他已知之細菌或噬菌體啟動子)亦適用。其核苷酸序列已經公佈，由此使得熟習此項技術者能夠使用連接子或轉接子而使其可操作性與編碼靶向輕鏈及重鏈之順反子(Siebenlist等人，(1980)Cell 20：269)接合以供應任何所需之限制位點。
在本發明之一態樣中，重組載體內之各順反子均包含引導所表現之多肽跨膜轉位之分泌型信號序列組件。一般而言，信號序列可為載體之組件，或其可為插入載體中之部分靶向多肽DNA。為達成本發明目的而選擇之信號序列應為經宿主細胞識別及加工(亦即，由信號肽酶裂解)者。對於不識別及加工異源多肽之天然信號序列的原核宿主細胞而言，信號序列係經(例如)選自由以下物質組成之群之原 核信號序列取代：鹼性磷酸酶、青黴素酶(penicillinase)、Ipp或熱穩定性腸毒素II(STII)前導序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA及MBP。在本發明之一實施例中，用於表現系統之兩種順反子中之信號序列為STII信號序列或其變異體。
在另一態樣中，根據本發明之免疫球蛋白的產生可出現於宿主細胞之細胞質中，且因此無需各順反子內均存在分泌型信號序列。就此點而言，免疫球蛋白輕鏈及重鏈皆在細胞質內表現、折疊並經組裝以形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株(例如，大腸桿菌trxB-菌株)提供易於形成雙硫鍵之細胞質條件，藉此允許適當折疊及組裝所表現之蛋白次單元。Proba及Pluckthun Gene,159：203(1995)。
適於表現本發明抗體之原核宿主細胞包括原始細菌(Archaebacteria)及真細菌(Eubacteria)，諸如革蘭氏陰性(Gram-negative)或革蘭氏陽性有機體。有用細菌之實例包括埃希氏菌(Escherichia)(例如，大腸桿菌)、桿菌(Bacilli)(諸如枯草桿菌(B.subtilis))、腸內菌(Enterobacteria)、假單胞菌屬(Pseudomonas species)(例如綠膿桿菌(P.aeruginosa))、鼠傷寒沙門桿菌(Salmonella typhimurium)、黏質沙雷氏菌(Serratia marcescens)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、變形桿菌屬(Proteus)、志賀桿菌屬(Shigella)、根瘤菌(Rhizobia)、透明顫菌(Vitreoscilla)或副球菌(Paracoccus)。在一實施例中，使用革蘭氏陰性細胞。在一實施例中，將大腸桿菌細胞用作本發明之宿主。大腸桿菌菌株之實例包 括W3110菌株(Bachmann,Cellular and Molecular Biology，第2卷(Washington,D.C.：American Society for Microbiology,1987)，第1190-1219頁；ATCC寄存號27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110△fhuA(△tonA)ptr3 lac Iq lacL8△ompT△ (nmpc-fepE)degP41 kanR之33D3菌株(美國專利第5,639,635號)。其他菌株及其衍生物(諸如大腸桿菌294(ATCC 31,446)、大腸桿菌B、大腸桿菌λ 1776(ATCC 31,537)及大腸桿菌RV308(ATCC 31,608))亦適用。該等實例係出於說明而非限制之目的。用於建構任何上文所提及的具有已定義基因型之細菌的衍生物之方法已為此項技術中所知，且描述於(例如)Bass等人，Proteins,8：309-314(1990)中。通常需要考慮複製子在細菌細胞中之可複製性來選擇適當細菌。舉例而言，當使用熟知質體(諸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410)來供應複製子時，大腸桿菌、紅色桿菌屬(Serratia)或沙門氏菌屬(Salmonella)可適於用作宿主。通常，宿主細胞應分泌極少量蛋白水解酶，且可需要將額外蛋白酶抑制劑併入細胞培養物中。
ii.抗體產生
用上述表現載體使宿主細胞轉型，並將其培養於經適當修飾之習知營養培養基中以用於誘導啟動子、選擇轉型物或擴增編碼所要序列之基因。
轉型意謂將DNA引入原核宿主中，從而使DNA可作為染色體外元件或由染色體要素複製。視所用之宿主細胞而 定，使用適於此等細胞之標準技術進行轉型。使用氯化鈣進行之鈣處理通常用於含有基本細胞壁障壁之細菌細胞。另一轉型方法採用聚乙二醇/DMSO。所用之又一技術為電穿孔。
用於產生本發明多肽之原核細胞係生長於此項技術中已知且適於培養所選宿主細胞之培養基中。適當培養基之實例包括加有必需養分補充物之luria肉湯(LB)。在某些實施例中，培養基亦含有基於表現載體之建構而選擇之選擇劑，用以選擇性地允許含有表現載體之原核細胞生長。舉例而言，將安比西林添加至培養基中以用於表現安比西林抗性基因之細胞的生長。
亦可包括單獨或作為與其他補充物或基質(諸如複合氮源)之混合物以適當濃度引入的除碳、氮及無機磷酸鹽來源外之任何必需補充物。視情況，培養基可含有一或多種選自由以下物質組成之群的還原劑：麩胱甘肽、半胱胺酸、胱胺、硫代乙醇酸酯、二硫赤藻糖醇及二硫蘇糖醇。
原核宿主細胞係在適當溫度下培養。對於大腸桿菌生長而言，例如，較佳之溫度介於約20℃至約39℃、更佳約25℃至約37℃、甚至更佳約30℃之溫度範圍內。主要視宿主有機體而定，培養基之pH值可為介於約5至約9之範圍內的任何pH值。對於大腸桿菌而言，pH值較佳為約6.8至約7.4，且更佳為約7.0。
若將誘導型啟動子用於本發明之表現載體，則在適於活化啟動子之條件下誘導蛋白表現。在本發明之一態樣中， 使用PhoA啟動子來控制多肽之轉錄。因此，將經轉型之宿主細胞培養於磷酸鹽限制性培養基中以用於誘導。較佳地，磷酸鹽限制性培養基為C.R.A.P培養基(例如，參看Simmons等人，J.Immunol.Methods(2002),263：133-147)。如此項技術中已知，可根據所用之載體構築體使用多種其他誘導子。
在一實施例中，將本發明之經表現多肽分泌至宿主細胞間質中且由該宿主細胞間質加以回收。蛋白回收通常涉及通常藉由諸如滲壓猝震(osmotic shock)、超音波處理或溶解之方式分裂微生物。分裂細胞後，可藉由離心或過濾來移除細胞碎片或全細胞。舉例而言，接著可藉由親和樹脂層析純化蛋白。或者，可將蛋白轉運至培養基中並於其中進行分離。可將細胞自培養物中移出，並過濾培養物上清液且濃縮以進一步純化所產生之蛋白。可進一步分離所表現之多肽且使用諸如聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)及西方墨點檢定之通常已知的方法加以識別。
在本發明之一態樣中，藉由醱酵方法來進行大量抗體產生。多種大規模饋料分批醱酵程序可用於產生重組蛋白。大規模醱酵具有至少1000公升之容量，例如約1,000至100,000公升之容量。該等醱酵罐使用葉輪式攪拌器來分配氧氣及養分，尤其葡萄糖(較佳碳/能量源)。小規模醱酵通常係指在僅有約100公升之體積容量且可在約1公升至約100公升範圍內的醱酵罐中醱酵。
在醱酵過程中，通常在細胞已於適當條件下生長至所要 密度(例如，OD550為約180至220)後起始對於蛋白表現之誘導，在此階段內細胞處於穩定期早期。如此項技術中已知且如上文所述，可根據所用之載體構築體使用多種誘導子。可於誘導前使細胞生長較短時期。儘管可使用較長或較短之誘導時間，但通常誘導細胞歷經約12至50小時。
為改良本發明多肽之產量及品質，可改變多種醱酵條件。舉例而言，為改良對於所分泌抗體多肽之適當組裝及折疊，可使用過度表現伴隨蛋白之額外載體以與宿主原核細胞共轉型，該等伴隨蛋白諸如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD及/或DsbG)或FkpA(具有伴隨活性之肽基脯胺醯順反異構酶)。已證明伴隨蛋白會促進細菌宿主細胞中產生的異種蛋白之適當折疊及溶解。Chen等人，(1999)J Bio Chem 274：19601-19605；Georgiou等人，美國專利第6,083,715號；Georgiou等人，美國專利第6,027,888號；Bothmann及Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.275：17100-17105；Ramm及Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.275：17106-17113；Arie等人，(2001)Mol.Microbiol.39：199-210。
為使所表現之異源蛋白(尤其對於蛋白水解敏感者)之蛋白水解減至最少，可將缺乏蛋白水解酶之某些宿主菌株用於本發明中。舉例而言，可修飾宿主細胞菌株以實現編碼已知細菌蛋白酶(諸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其組合)之基因的基因突變。某些大腸桿菌蛋白酶缺乏菌株可用且描述於(例如)Joly等人，(1998)，同上文；Georgiou等人，美國專 利第5,264,365號；Georgiou等人，美國專利第5,508,192號；Hara等人，Microbial Drug Resistance,2：63-72(1996)中。
在一實施例中，將缺乏蛋白水解酶且經過度表現一或多種伴隨蛋白之質體轉型的大腸桿菌菌株用作本發明之表現系統中的宿主細胞。
iii.抗體純化
可使用此項方法中已知之標準蛋白純化方法。以下程序為適當之例示性純化程序：免疫親和管柱或離子交換管柱上之分級、乙醇沉澱、逆相HPLC、於矽石或陽離子交換樹脂(諸如DEAE)上進行之層析、色層聚集(chromatofocusing)、SDS-PAGE、硫酸銨沉澱及使用(例如)Sephadex G-75進行之凝膠過濾。
在一態樣中，將固定於固相上之蛋白A用於本發明全長抗體產物之免疫親和純化。蛋白A為來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)之41 kD細胞壁蛋白，其以高親和力結合至抗體Fc區。Lindmark等人，(1983)J.Immunol.Meth.62：1-13。固定蛋白A之固相較佳為包含玻璃或矽石表面之管柱，更佳為受控微孔玻璃管柱或矽酸管柱。在一些應用中，管柱經諸如甘油之試劑塗佈，以嘗試預防污染物之非特異性附著。
作為純化之第一步驟，可將如上文所述來自細胞培養物之製劑塗佈於固定蛋白A之固相上以使所關注抗體特異性結合至蛋白A。接著洗滌固相以移除非特異性結合至固相 之污染物。最終，藉由溶離自固相回收所關注抗體。
b.使用真核宿主細胞產生抗體：
載體組件通常包括(但不限於)一或多種以下組件：信號序列、複製起點、一或多種標記基因、強化子元件、啟動子及轉錄終止序列。
(i)信號序列組件
用於真核宿主細胞中之載體亦可含有在所關注的成熟蛋白或多肽之N末端具有特定裂解位點之信號序列或其他多肽。所選異源信號序列較佳係由宿主細胞識別及加工(亦即，經信號肽酶裂解)者。在哺乳動物細胞表現中，可用哺乳動物信號序列以及病毒分泌前導序列，例如單純疱疹gD信號。
此前驅體區之DNA係在閱讀框中與編碼抗體之DNA接合。
(ii)複製起點
通常，哺乳動物表現載體中無需複製起點組件。舉例而言，由於SV40起點含有早期啟動子，故通常可僅使用該起點。
(iii)選擇基因組件
表現及選殖載體可含有選擇基因，亦稱為可選標記。典型選擇基因編碼滿足以下條件之蛋白：(a)賦予對於例如安比西林、新黴素(neomycin)、甲胺喋呤或四環素之抗生素及其他毒素之抗性；(b)若相關，則補充營養缺失；或(c)供應自複合培養基不可獲得的關鍵養分。
選擇流程之一實例利用藥物使宿主細胞之生長停滯。以異種基因成功轉型之彼等細胞產生一種賦予藥物抗性之蛋白，且因此在選擇方案中存活。該等顯性選擇之實例使用藥物新黴素、黴酚酸及潮黴素(hygromycin)。
適用於哺乳動物細胞之可選標記的另一實例為致能識別能夠吸收抗體核酸之細胞者，諸如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I及-II(較佳地，靈長類動物金屬硫蛋白基因)、腺苷脫胺酶、鳥胺酸脫羧酶等。
舉例而言，首先藉由在含有甲胺喋呤(Mtx)(DHFR之競爭性拮抗劑)之培養基中培養所有轉型物來識別經DHFR選擇基因轉型的細胞。當使用野生型DHFR時，適當宿主細胞為缺乏DHFR活性之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株(例如，ATCC CRL-9096)。
或者，可藉由在含有用於可選標記(諸如胺基糖苷抗生素，例如康黴素(kanamycin)、新黴素或G418)之選擇劑的培養基中進行細胞生長來選擇經編碼抗體(野生型DHFR蛋白)之DNA序列及另一可選標記(諸如胺基糖苷3'-磷酸轉移酶(APH))轉型或與其共轉型之宿主細胞(尤其含有內源DHFR之野生型宿主)。參看美國專利第4,965,199號。
(iv)啟動子組件
表現及選殖載體通常含有由宿主有機體識別且可操作地連接至抗體多肽核酸之啟動子。已知真核生物之啟動子序列。事實上，所有真核基因均具有位於轉錄起始位點上游大約25至30個鹼基處之富AT區。另一見於多種基因之轉錄 起始點上游70至80個鹼基處之序列為CNCAAT區，其中N可為任何核苷酸。在大多數真核基因之3'端為AATAAA序列，其可為將聚A尾添加至編碼序列之3'端的信號。所有該等序列均適於插入至真核表現載體中。
舉例而言，藉由自病毒基因組(諸如多瘤性病毒(polyoma virus)、禽痘病毒(fowlpox virus)、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒(bovine papilloma virus)、肉瘤病病毒(avian sarcoma virus)、巨細胞病毒(cytomegalovirus)、反轉錄病毒、B型肝炎病毒及猴病毒40(Simian Virus 40)(SV40))、自異源哺乳動物啟動子(例如，肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子)、自熱休克啟動子獲得的啟動子來控制自哺乳動物宿主細胞中之載體進行之抗體多肽轉錄，其限制條件為該等啟動子可與宿主細胞系統相容。
便利地獲得SV40病毒之早期及晚期啟動子，其為亦含有SV40病毒複製起點之SV40限制片段。便利地獲得人類巨細胞病毒之即刻早期啟動子，其為HindIII E限制片段。使用牛乳頭瘤病毒作為載體於哺乳動物宿主中表現DNA之系統係揭示於美國專利第4,419,446號中。對於此系統之修飾描述於美國專利第4,601,978號中。或者，可將勞斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)之長末端重複序列用作啟動子。
(v)強化子元件組件
由較高級真核生物來轉錄編碼本發明抗體多肽之DNA通常可藉由將強化子序列插入載體中而得以增加。現已知來自哺乳動物基因(血球蛋白、彈性蛋白、白蛋白、α-胎蛋白 及胰島素)之多種強化子序列。然而，吾人通常將使用來自真核細胞病毒之強化子。實例包括複製起點(100-270個bp)後側之SV40強化子、巨細胞病毒早期啟動子強化子、複製起點後側之多瘤性強化子及腺病毒強化子。亦參看Yaniv,Nature 297：17-18(1982)，其關於用於活化真核啟動子之增強元件。可將強化子剪接至載體中編碼抗體多肽之序列的5'至3'位置處，但其通常位於啟動子之5'位置處。
(vi)轉錄終止組件
用於真核宿主細胞中之表現載體通常亦應含有終止轉錄且穩定mRNA所必需之序列。此等序列通常可獲自真核或病毒DNA或cDNA之未經轉譯區的5'且有時為3'位置。該等區含有轉錄為編碼抗體之mRNA的未經轉譯部分之多聚腺嘌呤化片段的核苷酸區段。一種有用之轉錄終止組件為牛生長激素多聚腺嘌呤化區。參看WO 94/11026及其中所揭示之表現載體。
(vii)宿主細胞之選擇及轉型
適用於在本文載體中選殖或表現DNA之宿主細胞包括本文所述之較高級真核生物細胞，包括脊椎動物宿主細胞。使脊椎動物細胞在培養物(組織培養物)中增殖已成為一種常規程序。有用的哺乳動物宿主細胞株之實例為經SV40(COS-7,ATCC CRL 1651)轉型之猴腎CV1株；人類胚腎細胞株(293或為在懸浮培養物中生長而經次選殖之293細胞，Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK,ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/ -DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；小鼠塞利特氏細胞(mouse sertoli cell)(TM4,Mather,Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(African green monkey kidney cell)(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人類宮頸癌細胞(HELA,ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK,ATCC CCL 34)；布法羅大鼠肝細胞(buffalo rat liver cell)(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138,ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2,HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562,ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝腫瘤細胞株(Hep G2)。
用上述用於產生抗體之表現或選殖載體使宿主細胞轉型，並將其培養於經適當修飾之習知營養培養基中以用於誘導啟動子、選擇轉型物或擴增編碼所要序列之基因。
(viii)培養宿主細胞
可將用於產生本發明抗體之宿主細胞培養於多種培養基中。諸如Ham's F10(Sigma)、最小必需培養基(Minimal Essential Medium(MEM))(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)及杜貝卡氏經修飾伊格氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)，Sigma)之常用培養基均適於培養宿主細胞。此外，可將下列文獻中所述之任何培養基用作宿主細胞之培養基：Ham等人，Meth.Enz.58：44(1979)；Barnes等人，Anal.Biochem.102：255(1980)；美國專利第4,767,704號、 第4,657,866號、第4,927,762號、第4,560,655號或第5,122,469號；WO 90/03430；WO 87/00195；或美國專利綜述30,985。該等培養基中之任一者均可視需要補充激素及/或其他生長因子(諸如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂及磷酸鹽)、緩衝劑(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷及胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCINTM藥物)、示蹤元素(定義為無機化合物，通常以在微莫耳範圍內之最終濃度存在)及葡萄糖或等效能源。亦.可包括將為熟習此項技術者所知之適當濃度的任何其他必需補充物。培養條件(諸如溫度、pH值及其類似條件)為選擇用於表現之宿主細胞先前所用者，且對於一般技術者為顯而易見的。
(ix)抗體純化
當使用重組技術時，可於細胞內產生抗體或直接將其分泌於培養基中。若以於細胞內產生抗體作為第一步驟，則通常(例如)藉由離心或超濾來移除宿主細胞或已溶解片段之微粒碎片。在將抗體分泌至培養基中之情形下，通常首先使用市售蛋白濃縮過濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾裝置)來濃縮來自該等表現系統之上清液。任何前述步驟中均可包括蛋白酶抑制劑(諸如PMSF)以抑制蛋白水解，且可包括抗生素以阻止外來污染物生長。
可使用(例如)羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析及親和層析來純化由細胞製備之抗體組合物，其中親和層析為較佳之純化技術。蛋白A作為親和配位基之適用性視物種及存在於抗體中之任何免疫球蛋白Fc域的同型而定。蛋白A可 用於純化基於人類γ1、γ2或γ4重鏈之抗體(Lindmark等人，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。蛋白G係推薦用於所有小鼠同型及人類γ3(Guss等人，EMBO J.5：15671575(1986))。親和配位基所附著之基質最常為瓊脂糖，但亦可用其他基質。諸如受控微孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯之機械穩定性基質允許比瓊脂糖可達成更快的流動速率及更短的加工時間。當抗體包含CH3域時，Bakerbond ABXTM樹脂(J.T.Baker,Phillipsburg,NJ)適用於純化。視待回收之抗體而定，亦可使用其它用於蛋白純化的技術，諸如離子交換管柱分級分離、乙醇沉澱、逆相HPLC、矽石層析、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬胺酸管柱)上進行之肝素SEPHAROSETM層析、色層聚集、SDS-PAGE及硫酸銨沉澱。
在任何初級純化步驟後，均可使包含所關注抗體及污染物之混合物經受使用pH值在約2.5-4.5之間的溶離緩衝劑、較佳在低鹽濃度(例如，約0-0.25 M鹽)下進行的低pH值疏水相互作用層析。
免疫結合物
本發明亦提供免疫結合物(可交替稱為"抗體-藥物結合物"或"ADC")，其包含與細胞毒性劑(諸如化學治療劑)、藥物、生長抑制劑、毒素(例如，細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素(亦即，放射結合物)結合之本文所述的任何抗OX40L抗體。
抗體藥物結合物用於局部傳遞細胞毒性劑或細胞生長抑 制劑(亦即，在治療癌時用於殺死或抑制腫瘤細胞的藥物(Syrigos及Epenetos(1999)Anticancer Research 19：605-614；Niculescu-Duvaz及Springer(1997)Adv.Drg Del.Rev.26：151-172；美國專利第4,975,278號))之用途允許將藥物部分靶向傳遞至腫瘤且於其中進行細胞內積累，其中該等非結合藥劑之全身投藥可於正常細胞以及意欲消除之腫瘤細胞中引起不可接受之毒性含量(Baldwin等人，(1986)Lancet，第(1986年3月15日)：603-05頁；Thorpe,(1985)"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review," in Monoclonal Antibodies '84：Biological And Clinical Applications,A.Pinchera等人(編輯)，第475-506頁)。因此，尋求最大效用及最小毒性。已報導將多株抗體與單株抗體用於該等策略中(Rowland等人，(1986)Cancer Immunol.Immunother.,21：183-87)。該等方法中所用之藥物包括道諾黴素、14-羥基柔紅黴素、甲胺喋呤及長春地辛(Rowland等人，(1986)，同上文)。抗體-毒素結合物中所用之毒素包括細菌毒素，諸如白喉毒素(diphtheria toxin)；植物毒素，諸如蓖麻毒素(ricin)；小分子毒素，諸如苯醌安莎黴素(geldanamycin)(Mandler等人，(2000)Jour.of the Nat.Cancer Inst.92(19)：1573-1581；Mandler等人，(2000)Bioorganic & Med.Chem.Letters 10：1025-1028；Mandler等人，(2002)Bioconjugate Chem.13：786-791)；美登辛諾(EP 1391213；Liu等人，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623)及刺孢黴素 (calicheamicin)(Lode等人，(1998)Cancer Res.58：2928；Hinman等人，(1993)Cancer Res.53：3336-3342)。該等毒素可藉由包括微管結合(tubulin binding)、DNA結合或拓撲異構酶抑制之機制來影響其細胞毒性及細胞生長抑制作用。當與大抗體或蛋白受體配位基結合時，某些細胞毒性藥物傾向於不具活性或具有較低活性。
ZEVALIN®(替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)，Biogen/Idec)為一種抗體-放射性同位素結合物，其係由針對見於正常及惡性B淋巴細胞表面上之CD20抗原的鼠類IgG1κ單株抗體及由硫脲連接子-螯合劑結合之111In或90Y放射性同位素構成(Wiseman等人，(2000)Eur.Jour.Nucl.Med.27(7)：766-77；Wiseman等人，(2002)Blood 99(12)：4336-42；Witzig等人，(2002)J.Clin.Oncol.20(10)：2453-63；Witzig等人，(2002)J.Clin.Oncol.20(15)：3262-69)。儘管ZEVALIN具有對抗B細胞非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)之活性，但投藥在大多數患者體內引起嚴重且長期之血球減少。MYLOTARGTM(吉妥單抗(gemtuzumab ozogamicin)，Wyeth Pharmaceuticals)是一種由連接至刺胞黴素之hu CD33抗體構成的抗體藥物結合物，其已於2000年批准用於注射治療急性骨髓白血病(Drugs of the Future(2000)25(7)：686；美國專利第4970198號、第5079233號、第5585089號、第5606040號、第5693762號、第5739116號、第5767285號、第5773001號)。Cantuzumab mertansine(Immunogen,Inc.)是一種由經由二硫化物連接子SPP連接至美登辛諾藥物 部分DM1之huC242抗體構成的抗體藥物結合物，其在II期試驗中用於治療表現CanAg之癌，諸如結腸癌、胰腺癌、胃癌及其他癌。MLN-2704(Millennium Pharm.,BZL Biologics,Immunogen Inc.)是一種由連接至美登辛諾藥物部分DM1之抗前列腺特異性膜抗原(PSMA)單株抗體構成之抗體藥物結合物，其已發展用於潛在治療前列腺腫瘤。將奧瑞他汀肽(auristatin peptide)(奧瑞他汀E(AE))及單甲基奧瑞他汀(MMAE)(海兔毒素(dolastatin)之合成類似物)與嵌合單株抗體cBR96(對癌之路易Y具特異性)及cAC10(對血液科惡性疾病之CD30具特異性)(Doronina等人，(2003)Nature Biotechnology 21(7)：778-784)結合且用於治療發展。
適用於產生免疫結合物之化學治療劑已於本文(例如，上文)中得以描述。可使用之酶活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌)、蓖麻毒素A鏈、相思子毒素A鏈、蒴蓮根毒蛋白(modeccin)A鏈、帚麴菌素(α-sarcin)、桐油樹蛋白(Aleurites fordii protein)、康乃馨蛋白(dianthin protein)、垂商陸蛋白(Phytolacca americana protein)(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻楓樹蛋白(curcin)、巴豆素(crotin)、葡萄纈草(sapaonaria officinalis)抑制劑、天堂果蛋白(gelonin)、有絲分裂素(mitogellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴索(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)及黴菌毒素(tricothecene)。例如，參看1993年 10月28日公開之WO 93/21232。多種放射核種可用於產生放射結合之抗體。實例包括212Bi、131I、131In、90Y及186Re。抗體與細胞毒性劑之結合物係使用多種雙功能蛋白偶聯劑製得，該等蛋白偶聯劑諸如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亞胺基硫雑環戊烷(IT)、醯亞胺酯(諸如己二亞胺酸二甲酯鹽酸鹽)之雙功能衍生物、活性酯(諸如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(諸如雙-(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙-重氮鹽衍生物(諸如雙-(對重氮鹽苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人，Science,238：1098(1987)中所述來製備。碳14標記之1-異硫代氰基苄基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)為一種用於使放射性核苷酸與抗體結合之例示性螯合劑。參看WO 94/11026。
本文亦涵蓋抗體與一或多種小分子毒素(諸如刺胞黴素、美登辛諾、海兔毒素、奧瑞他汀、單端孢黴烯族毒素及CC1065)之結合物，以及具有毒素活性的該等毒素之衍生物。
i.美登素及美登辛諾
在一些實施例中，該免疫結合物包含結合至一或多個美登辛諾分子之本發明抗體(全長或片段)。
美登辛諾為藉由抑制微管蛋白聚合而起效之有絲分裂抑制劑。美登素首先係自東非灌木齒葉美登木(east African shrub Maytenus serrata)分離(美國專利第3,896,111號)。隨後，發現某些微生物亦產生美登辛諾，諸如美登醇及C-3美登醇酯(美國專利第4,151,042號)。合成美登醇及其衍生物及類似物揭示於(例如)美國專利第4,137,2304號、第248,870號、第4,256,746號、第4,260,608號、第4,265,814號、第4,294,757號、第4,307,016號、第4,308,268號、第4,308,269號、第4,309,428號、第4,313,946號、第4,315,929號、第4,317,821號、第4,322,348號、第4,331,598號、第4,361,650號、第4,364,866號、第4,424,219號、第4,450,254號、第4,362,663號及第4,371,533號中。
美登辛諾藥物部分為抗體藥物結合物中最引人關注之藥物部分，此係因為其：(i)相對易於藉由醱酵或化學改質、醱酵產物之衍生作用製得；(ii)經受由適於經由非二硫化物連接子與抗體結合之官能基進行的衍生作用；(iii)在血漿中穩定；及(iv)有效對抗多種腫瘤細胞株。
含有美登辛諾之免疫結合物、其製造方法及其治療用途係揭示於(例如)美國專利第5,208,020號、第5,416,064號及歐洲專利EP 0 425 235 B1中，該等專利之揭示內容以引用的方式明確地併入本文中。Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623(1996)描述包含連接至針對人類結腸直腸癌之單株抗體C242之美登辛諾(稱為DM1)的免疫結合物。發現結合物對於所培養之結腸癌細胞具有高細胞毒性，且其在活體內腫瘤生長檢定中展示抗腫瘤活性。Chari等人，Cancer Research 52：127-131(1992)描述免疫結 合物，其中美登辛諾係經由二硫化物連接子與結合至人類結腸癌細胞株的抗原之鼠類抗體A7結合，或與結合HER-2/neu致癌基因之另一鼠類單株抗體TA.1結合。在活體外，於每個細胞表現3×105個HER-2表面抗原之人類乳癌細胞株SK-BR-3中測試TA.1-美登辛諾結合物的細胞毒性。藥物結合物達成與游離美登辛諾藥物類似之細胞毒性程度，該細胞毒性程度可藉由增加每個抗體分子美登辛諾分子之數目而增加。A7-美登辛諾結合物在小鼠中展示低全身性細胞毒性。
可藉由將抗體與美登辛諾分子化學連接來製備抗體-美登辛諾結合物，而不會顯著減小抗體或美登辛諾分子之生物學活性。例如，參看美國專利第5,208,020號(該專利之揭示內容係以引用的方式明確地併入本文中)。平均每個抗體分子結合3-4個美登辛諾分子已展示出增強靶向細胞的細胞毒性而對抗體功能或溶解性並無不利影響之效用，儘管預期甚至1分子毒素/抗體即可增強細胞毒性(優於使用純抗體)。美登辛諾已為此項技術中所熟知，且可藉由已知技術而合成或自天然來源分離。適當之美登辛諾揭示於(例如)美國專利第5,208,020號及上文提及之其他專利及非專利公開案中。較佳之美登辛諾為美登醇及在芳環中或美登素醇分子之其他位置處經修飾之美登醇類似物(諸如各種美登醇酯)。
此項技術中已知多種用於製造抗體-美登辛諾結合物之連接基，包括下列文獻中所揭示者：例如，美國專利第 5,208,020號；或EP專利0 425 235 B1；Chari等人，Cancer Research 52：127-131(1992)；及2004年10月8日公開之美國專利申請案第10/960,602號，該等專利之揭示內容係以引用的方式明確地併入本文中。可如2004年10月8日公開之美國專利申請案第10/960,602號中所揭示來製備包含連接子組份SMCC之抗體-美登辛諾結合物。連接基包括二硫化物基團、硫酯基團、酸不穩定基團、光不穩定基團、肽酶不穩定基團或酯酶不穩定基團，如上文所識別之專利中所揭示，二硫化物及硫酯基團為較佳的。額外連接基已於本文中得以描述且例示說明。
抗體與美登辛諾之結合物可使用多種雙功能蛋白偶聯劑製得，該等蛋白偶聯劑諸如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亞胺基硫雑環戊烷(IT)、醯亞胺酯(諸如己二亞胺酸二甲酯鹽酸鹽)之雙功能衍生物、活性酯(諸如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(諸如雙-(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙-重氮鹽衍生物(諸如雙-(對重氮鹽苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。尤佳偶聯劑包括用於提供雙硫鍵之N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等人，Biochem.J.173：723-737(1978))及4-(2-吡啶基硫基)戊酸N-琥珀醯亞胺酯(SPP)。
視連接類型而定，可將連接子附著於美登辛諾分子之各 位置處。舉例而言，可使用習知之偶聯技術藉由與羥基反應形成酯鍵。反應可發生於具有羥基之C-3位置、經羥甲基改質之C-14位置、經羥基改質之C-15位置及具有羥基之C-20位置。在一較佳實施例中，鍵結係形成於美登醇或美登醇類似物之C-3位置處。
ii.奧瑞他汀及海兔毒素
在一些實施例中，免疫結合物包含與海兔毒素或海兔毒素之肽類似物及衍生物奧瑞他汀結合之本發明抗體(美國專利第5635483號、第5780588號)。海兔毒素及奧瑞他汀已展示出會干擾微管動力學、GTP水解及核及細胞分裂(Woyke等人，(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12)：3580-3584)且具有抗癌(U.S.5663149)及抗真菌活性(Pettit等人，(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42：2961-2965)。可經由肽藥物部分之N(胺基)末端或C(羧基)末端使海兔毒素或奧瑞他汀藥物部分附著於抗體(WO 02/088172)。
例示性奧瑞他汀實施例包括連接N末端之單甲基奧瑞他汀藥物部分DE及DF，其揭示於"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"中，2004年11月5日公開，美國序列號第10/983,340號，其揭示內容係以全文引用的方式明確地併入本文中。
通常，基於肽之藥物部分可藉由在兩個或兩個以上胺基酸及/或肽片段之間形成肽鍵而製備。此等肽鍵可(例如)根據肽化學領域中熟知之液相合成方法(參看E.Schröder及K. Lübke,"The Peptides"，第1卷，第76-136頁，1965,Academic Press)製備。奧瑞他汀/海兔毒素藥物部分可根據以下文獻之方法製備：U.S.5,635,483；U.S.5,780,588；Pettit等人，(1989)J.Am.Chem.Soc.111：5463-5465；Pettit等人，(1998)Anti-Cancer Drug Design 13：243-277；Pettit,G.R.等人，Synthesis,1996,719-725；及Pettit等人，(1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.15：859-863。亦參看Doronina(2003)Nat Biotechnol 21(7)：778-784；"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands",2004年11月5日公開，美國序列號第10/983,340號，該文獻係以全文引用的方式併入本文(揭示(例如)連接子及用於製備與連接子結合的諸如MMAE及MMAF之單甲基纈胺酸化合物之方法)。
iii.刺孢黴素
在其他實施例中，免疫結合物包含與一或多個刺胞黴素分子結合之本發明抗體。抗生素之刺胞黴素家族能夠產生亞皮莫耳(sub-picomolar)濃度之雙鏈DNA斷裂。有關刺胞黴素家族結合物之製備，參看美國專利第5,712,374號、第5,714,586號、第5,739,116號、第5,767,285號、第5,770,701號、第5,770,710號、第5,773,001號及第5,877,296號(均讓渡於American Cyanamid Company)。可使用之刺胞黴素之結構類似物包括(但不限於)γ1 I、α2 I、α3 I、N-乙醯基-γ1 I、PSAG及θI 1(Hinman等人，Cancer Research 53：3336-3342(1993)；Lode等人，Cancer Research 58：2925-2928(1998)；及 上文所提及之讓渡於American Cyanamid的美國專利)。可與抗體結合之另一抗腫瘤藥物為QFA，其為抗葉酸物。刺胞黴素與QFA皆具有細胞內作用位點且不易於跨過質膜。因此，細胞經由抗體介導之內化作用攝取該等藥劑會顯著增強其細胞毒素作用。
iv.其他細胞毒性劑
可與本發明抗體結合之其他抗腫瘤劑包括BCNU、鏈脲佐菌素(streptozoticin)、長春新鹼及5-氟尿嘧啶(美國專利第5,053,394號、第5,770,710號中所述之共同稱為LL-E33288複合物的藥劑家族)，以及埃斯波黴素(esperamicin)(美國專利5,877,296)。
可使用之酶活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌)、蓖麻毒素A鏈、相思子毒素A鏈、蒴蓮根毒蛋白A鏈、帚麴菌素、桐油樹蛋白、康乃馨蛋白、垂商陸蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻楓樹蛋白、巴豆素、葡萄纈草抑制劑、天堂果蛋白、有絲分裂素、侷限麴菌素、酚黴索、伊諾黴素及黴菌毒素。例如，參看1993年10月28日公開之WO 93/21232。
本發明另外涵蓋抗體與具有核分解活性之化合物(例如，核糖核酸酶或DNA內切酶，諸如脫氧核糖核酸酶；DNA酶)之間所形成的免疫結合物。
為選擇性破壞腫瘤，抗體可包含高度放射性原子。多種放射性同位素可用於產生放射結合之抗體。實例包括 At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素。當使用結合物進行偵測時，其可包含：用於閃爍攝影研究(scintigraphic study)之放射性原子，例如Tc99m或I123；或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像，mri)之自旋標記，諸如碘-123及碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
可以已知方式將放射性標記或其他標記併入結合物中。舉例而言，可生物合成肽，或可藉由使用適當胺基酸前驅體進行化學胺基酸合成(例如，涉及以氟-19胺基酸替代氫)來合成肽。可經由半胱胺酸殘基將諸如Tc99m或I123、Re186、Re188及In111之標記附著於肽中。可經由離胺酸殘基附著釔-90。IODOGEN方法(Fraker等人，(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57)可用於併入碘-123。"Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy"(Chatal,CRC Press 1989)詳細描述其他方法。
抗體與細胞毒性劑之結合物可使用多種雙功能蛋白偶聯劑製得，該等蛋白偶聯劑諸如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亞胺基硫雑環戊烷(IT)、醯亞胺酯(諸如己二亞胺酸二甲酯鹽酸鹽)之雙功能衍生物、活性酯(諸如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(諸如雙-(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙-重氮鹽衍生物(諸如雙-(對重氮鹽苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟 化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人，Science,238：1098(1987)所述來製備。碳14標記之1-異硫代氰基苄基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)為一種用於使放射性核苷酸與抗體結合之例示性螯合劑。參看WO 94/11026。連接子可為促進細胞中之細胞毒性藥物釋放的"可裂解連接子"。舉例而言，可使用酸不穩定連接子、肽酶敏感性連接子、光不穩定連接子、二甲基連接子或含二硫化物之連接子(Chari等人，Cancer Research 52：127-131(1992)；美國專利第5,208,020號)。
本發明化合物明確涵蓋(但不限於)用如下交聯劑試劑製備之ADC：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺酸基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-KMUS、磺酸基-MBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMCC及磺酸基-SMPB及SVSB(琥珀醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯)，該等交聯劑試劑為市售的(例如，購自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)。參看2003-2004 Applications Handbook and Catalog，第467-498頁。
v.抗體藥物結合物之製備
在本發明之抗體藥物結合物(ADC)中，抗體(Ab)係經由連接子(L)與一或多種藥物部分(D)結合，例如每個抗體約1至約20種藥物部分。使用熟習此項技術者已知之有機化學反應、條件及試劑，可藉由若干途徑來製備式I之ADC， 該等途徑包括：(1)使抗體之親核基團與二價連接子試劑反應以經由共價鍵形成Ab-L，隨後與藥物部分D反應；及(2)使藥物部分之親核基團與二價連接子試劑反應以經由共價鍵形成D-L，隨後與抗體之親核基團反應。用於製備ADC之額外方法已描述於本文中。
Ab-(L-D)p I
連接子可由一或多種連接子組份構成。例示性連接子組份包括6-馬來醯亞胺基己醯基("MC")、馬來醯亞胺基丙醯基("MP")、纈胺酸-瓜胺酸("val-cit")、丙胺酸-苯丙胺酸("ala-phe")、對胺基苯甲氧基羰基("PAB")、4-(2-吡啶基硫基)戊酸N-琥珀醯亞胺酯("SPP")、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1羧酸N-琥珀醯亞胺酯("SMCC")及(4-碘-乙醯基)胺基苯甲酸N-琥珀醯亞胺酯("SIAB")。額外之連接子組份已為此項技術所知且某些已於本文中描述。亦參看"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"，2004年11月5日公開，美國序列號第10/983,340號，其內容係以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，連接子可包含胺基酸殘基。例示性胺基酸連接子組份包括二肽、三肽、四肽或五肽。例示性三肽包括：纈胺酸-瓜胺酸(vc或val-cit)、丙胺酸-苯丙胺酸(af或ala-phe)。例示性三肽包括：甘胺酸-纈胺酸-瓜胺酸(gly-val-cit)及甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸(gly-gly-gly)。包含胺基酸連接子組份之胺基酸殘基包括彼等天然存在者，以及少數胺基酸及非天然存在之胺基酸類似物，諸如瓜胺 酸。可設計胺基酸連接子組份且優化其對由特定酶(例如，腫瘤相關蛋白酶、組織蛋白酶B、C及D或纖溶蛋白酶)進行的酶裂解之選擇性。
抗體上之親核基團包括(但不限於)：(i)N-末端胺基；(ii)側鏈胺基，例如離胺酸；(iii)側鏈硫醇基，例如半胱胺酸；及(iv)糖羥基或胺基，其中抗體經糖基化。胺基、硫醇基及羥基為親核基團且能夠反應以與連接子部分及連接子試劑之親電子基團形成共價鍵，該等親電子試劑包括：(i)活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵基甲酸酯及酸鹵化物；(ii)烷基及苄基鹵化物，諸如鹵基乙醯胺；(iii)醛、酮、羧基及馬來醯亞胺基。某些抗體具有可還原之鏈內二硫化物，亦即半胱胺酸橋。可藉由用諸如DTT(二硫蘇糖醇)之還原劑進行處理而使抗體具有與連接子試劑結合之反應性。因此，理論上各半胱胺酸橋將形成兩個反應性硫醇親核試劑。可經由離胺酸與2-亞胺基硫雑環戊烷(Traut氏試劑)之反應將額外親核基團引入抗體中，從而使胺轉化為硫醇。可藉由引入一個、兩個、三個、四個或四個以上半胱胺酸殘基(例如，製備包含一或多個非天然半胱胺酸胺基酸殘基之突變體抗體)將反應性硫醇基團引入抗體(或其片段)中。
本發明之抗體藥物結合物亦可藉由修飾抗體以引入可與連接子試劑或藥物上的親核取代基反應之親電子部分而產生。糖基化抗體之糖可經(例如)過碘酸鹽氧化試劑氧化以形成可與連接子試劑或藥物部分之胺基反應的醛或酮基。 所得亞胺希夫鹼(Schiff base)基團可形成穩定鍵，或可經(例如)硼氫化物試劑還原以形成穩定胺鍵。在一實施例中，糖基化抗體之碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏高碘酸鈉的反應可於蛋白中得到可與藥物之適當基團反應的羰基(醛及酮)(Hermanson,Bioconjugate Techniques)。在另一實施例中，含有N-末端絲胺酸或蘇胺酸殘基之蛋白可與偏高碘酸鈉反應，導致產生替代第一胺基酸之醛(Geoghegan及Stroh,(1992)Bioconjugate Chem.3：138-146；U.S.5362852)。此類醛可與藥物部分或連接子親核試劑反應。
同樣，藥物部分之親核基團包括(但不限於)：胺、硫醇、羥基、醯肼、肟、肼、硫半卡(thiosemicarbazone)、羧酸肼及芳基醯肼基團，其能夠反應以與連接子部分及連接子試劑之親電子基團形成共價鍵，該等親電子試劑包括：(i)活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵基甲酸酯及酸鹵化物；(ii)烷基及苄基鹵化物，諸如鹵基乙醯胺；(iii)醛、酮、羧基及馬來醯亞胺基。
或者，包含抗體及細胞毒性劑之融合蛋白可(例如)藉由重組技術或肽合成製得。DNA之長度可包含編碼結合物之兩個部分的個別區域，該結合物之兩個部分彼此相鄰或由不損害結合物的所要特性之編碼連接子肽之區域分離。
在又一實施例中，抗體可與"受體"(諸如抗生蛋白鏈菌素)結合以用於預靶向腫瘤，其中將抗體-受體結合物投與至患者，隨後使用清除劑自循環中移除未結合之結合物， 且接著投用與細胞毒性劑(例如，放射性核苷酸)結合之"配位基"(例如，抗生物素蛋白)。
醫藥調配物
藉由將具有所要純度之抗體與生理學上可接受之可選載劑、賦形劑或穩定劑混合(Remington's：The Science and Practice of Pharmacy，第20版，編輯(2000))來製備呈水溶液、凍乾或其他乾燥調配物形式之包含本發明抗體的治療調配物以供儲存。在所用之劑量及濃度下，可接受之載劑、賦形劑或穩定劑對受體無毒，且包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、組胺酸及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八基二甲基苄基氯化銨；氯化六羥季銨；氯化苯甲烴銨；苄索氯銨；酚、丁基醇或苄基醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽反離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白錯合物)；及/或非離子界面活性劑，諸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
本文之調配物亦可視需要含有一種以上活性化合物以用 於所治療之特定適應症，較佳為具有彼此無不利影響之互補活性者。此等分子適於以有效用於達成預定目的之量存在於組合中。
亦可將活性成份截留於膠狀藥物傳遞系統(例如，脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)或巨乳液中(例如)藉由凝聚技術或界面聚合而製備之微膠囊(例如，分別為羥甲基纖維素或明膠-微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中。此等技術揭示於Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版(2000)中。
待用於活體內投藥之調配物必須無菌。此易於藉由經由無菌濾膜進行過濾來實現。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適當實例包括含有本發明免疫球蛋白之固體疏水性聚合物的半滲透基質，該等基質為成形物品之形式，例如薄膜或微膠囊。持續釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥基乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸交酯(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸及γ乙基-L-麩胺酸酯之共聚物、不可降解乙烯-乙酸乙烯酯、可降解乳酸-乙醇酸共聚物(諸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林構成的可注射微球體))及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。儘管諸如乙烯-乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸之聚合物使得分子能夠釋放超過100天，但某些水凝膠卻於較短時間內釋放蛋白。當經封裝免疫球蛋白長時間保持於體內時，其可因在37℃下暴露至濕氣而變性或凝集，導致生物學活性之喪失及免 疫原性之可能改變。視所涉及之機制而定，可關於穩定性來設計合理策略。舉例而言，若發現凝集機制為經由硫基-二硫化物互換形成分子間S-S鍵，則可藉由修飾氫硫基殘基、由酸性溶液凍乾、控制濕氣含量、使用適當添加劑且產生特定聚合物基質組合物來達成穩定性。
用途
本發明抗體可用於(例如)活體外、離體及活體內治療方法中。
在一態樣中，本發明提供用於治療或預防與EphB4之增加的表現及/或活性相關的腫瘤、癌及/或細胞增生性病症之方法，該方法包含向需要此治療之患者投與有效量之抗EphB4抗體。
在一態樣中，本發明提供用於降低、抑制或預防腫瘤或癌生長之方法，該方法包含向需要此治療之患者投與有效量之抗EphB4抗體。
在胚胎發育之運動軸突導向及神經脊細胞遷移中涉及EphB4。因此，本發明抗體亦適用於治療(包括預防)病理學涉及細胞退化或機能失調之病症，例如治療各種(慢性)神經退化性病症及急性神經細胞損傷。該等神經退化性病症包括(但不限於)末梢神經病變；運動神經元病症，例如澱粉樣沉著側索硬化症(ALS，盧．格裏格症)、貝爾麻痺及各種涉及脊椎肌肉萎縮病或麻痺的病況；及其他人類神經退化性疾病，例如阿茲海默氏病、帕金森氏病、癲癇症、多發性硬化症、亨廷頓氏舞蹈病、唐氏症候群、神經性耳 聾及梅尼爾氏病，以及因(例如)創傷或脊髓損傷而引起之急性神經細胞損傷。
本發明抗體亦適用於抑制血管生成。在一些實施例中，血管生成之位點為腫瘤或癌。
在一態樣中，本發明提供用於抑制血管生成之方法，其包含向需要此治療之患者投與有效量之抗EphB2抗體。
在一態樣中，本發明提供用於治療與血管生成相關的病理性病況之方法，其包含向需要此治療之患者投與有效量之抗EphB2抗體。在一些實施例中，與血管生成相關之病理性病況為腫瘤、癌及/或細胞增生性病症。在一些實施例中，與血管生成相關之病理性病況為眼內新生血管性疾病。
此外，至少一些本發明抗體可結合來自其他物種之抗原。因此，本發明抗體可用於在(例如)含有抗原之細胞培養物中、人類患者體內或具有與本發明抗體交叉反應的抗原之其他哺乳動物患者(例如，猩猩、狒狒、狨猴、獼猴及恆河猴、豬或小鼠)中結合特異性抗原活性。在一實施例中，可藉由使本發明抗體與抗原接觸從而抑制抗原活性而將該抗體用於抑制抗原活性。較佳地，抗原為人類蛋白分子。
在一實施例中，本發明抗體可用於結合罹患與增加的抗原表現及/或活性有關之病症的患者體內之抗原之方法中，該方法包含向患者投與本發明抗體，從而結合患者體內之抗原。較佳地，抗原為人類蛋白分子且患者為人類患 者。或者，患者可為表現與本發明抗體結合之抗原的哺乳動物。又，患者可為已引入(例如藉由投與抗原或藉由表現抗原轉殖基因)抗原之哺乳動物。可出於治療目的而將本發明抗體投與至人類患者。此外，可出於獸醫目的而將本發明抗體投與至表現與免疫球蛋白交叉反應之抗原的非人類哺乳動物(例如，靈長類動物、豬或小鼠)或將其作為人類疾病之動物模型。就後者而言，此等動物模型可用於分析本發明抗體之治療效用(例如，測試投藥劑量及時程)。
本發明抗體可用於治療、抑制、延遲與一或多種抗原分子之表現及/或活性相關的疾病、病症或病況之進程、預防/延遲該等疾病、病症或病況復發、改善或預防該等疾病、病症或病況。
例示性病症包括癌、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤及白血病或淋巴惡性疾病。該等癌之更特定實例包括鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及肺部鱗狀癌)、腹膜癌、肝細胞癌、包括胃腸癌之胃癌、胰腺癌、神經膠母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝腫瘤、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、陰門癌、甲狀腺癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌、黑素瘤、多發性骨髓瘤及B-細胞淋巴瘤、腦部以及頭頸部癌及相關轉移。在一些實施例中，癌係選自由小細胞肺癌、神經母細胞瘤、黑素瘤、乳癌、胃癌、結腸直腸癌 (CRC)及肝細胞癌組成之群。
在某些實施例中，向患者投與包含與一或多種細胞毒性劑結合之抗體的免疫結合物。在一些實施例中，免疫結合物及/或與其結合之抗原經細胞內化，引起免疫結合物殺死其所結合之靶向細胞的治療效用增加。在一實施例中，細胞毒性劑靶向或干擾靶向細胞中之核酸。在一實施例中，細胞毒性劑靶向或干擾微管聚合。該等細胞毒素劑之實例包括本文所註釋之任何化學治療劑(例如美登辛諾、奧瑞他汀、海兔毒素或刺孢黴素)、放射性同位素或核糖核酸酶或DNA核酸內切酶。
本發明抗體可單獨或與其他組合物組合用於療法中。例如，本發明抗體可與另一抗體、化學治療劑(包括化學治療劑之混合液)、其他細胞毒性劑、抗血管生成劑、細胞因子及/或生長抑制劑共投與。若本發明抗體抑制腫瘤生長，則尤其可需要將其與同樣抑制腫瘤生長之一或多種其他治療劑組合。另外或其他，患者可接受組合輻射療法(例如，外部射線照射或以諸如抗體之放射性標記藥劑治療)。以上註釋之該等組合療法包括組合投藥(其中相同或單獨調配物中包括兩種或兩種以上藥劑)及單獨投藥，在單獨投藥之情形下，投與本發明抗體可在投與佐劑療法之前及/或之後發生。
組合療法
如上所示，本發明提供其中將抗EphB4抗體與另一療法一起投與之組合療法。舉例而言，將抗EphB4抗體與抗癌 治療劑或抗新血管生成治療劑組合使用以治療各種贅生性或非贅生性病況。在一實施例中，贅生性或非贅生性病況之特徵在於與異常或不良血管生成相關之病理學病症。抗EphB4抗體可連續或與有效達成彼等目的的另一治療劑組合以同一組合物形式或作為獨立組合物來投與。另外或其他，可投與多種EphB4抑制劑。
使用相同或不同投藥途徑，可同時完成抗EphB4抗體(例如)作為單一組合物或作為兩種或兩種以上截然不同的組合物之投藥。另外或其他，可以任何次序相繼完成投藥。在某些實施例中，在兩種或兩種以上組合物之投藥之間，可存在介於幾分鐘至幾天至幾週至幾個月範圍內之時間間隔。舉例而言，可首先投與抗癌劑，接著投與EphB4抑制劑。然而，亦涵蓋同時投藥或首先投與抗EphB4抗體。
與抗EphB4抗體組合投與之治療劑的有效量將取決於醫師或獸醫的判斷。完成劑量投與及調節以達成待治療病況之最大處理。另外，劑量將視諸如待使用之治療劑類型及待治療的特定患者之因子而定。抗癌劑之適當劑量為目前使用之彼等劑量且可由於抗癌劑及抗EphB4抗體之組合作用(協同作用)而降低。在某些實施例中，抑制劑之組合會加強單一抑制劑之功效。術語"加強"係指常用或核準劑量之治療劑的功效改良。亦參見本文中標題為醫藥組合物之部分。
通常，抗EphB4抗體及抗癌劑適用於相同或類似疾病以阻斷或降低諸如腫瘤生長或癌細胞生長之病理學病症。在 一實施例中，抗癌劑為抗血管生成劑。
關於癌之抗血管生成療法係目標在於抑制提供養分以支持腫瘤生長所需要的腫瘤血管發育之癌治療策略。因為在原發性腫瘤生長及轉移中均涉及血管生成，所以本發明提供之抗血管生成治療能於原發性位點抑制腫瘤贅生性生長，且於繼發性位點預防腫瘤轉移，因此允許其他治療劑攻擊腫瘤。
已經識別且此項技術中已知許多抗血管生成劑，包括本文所列出之彼等抗血管生成劑，例如在定義部分所列出及(例如)Carmeliet及Jain,Nature 407：249-257(2000)；Ferrara等人，Nature Reviews：Drug Discovery,3：391-400(2004)；及Sato Int.J.Clin.Oncol.,8：200-206(2003)所列出之彼等抗血管生成劑。亦參見美國專利申請案US 20030055006。在一實施例中，與包括(但不限於，例如)可溶性VEGF受體(例如VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、神經纖毛蛋白(neuropillin，例如NRP1、NRP2))片段、能阻斷VEGF或VEGFR、中和抗VEGFR抗體之適體、VEGFR酪胺酸激酶(RTK)之低分子量抑制劑、VEGF之反義策略、對抗VEGF或VEGF受體之核糖核酸酶、VEGF之拮抗劑變異體及其組合之抗VEGF中和抗體(或片段)及/或另一種VEGF拮抗劑或VEGF受體拮抗劑組合使用抗EPHB4抗體。另外或其他，除VEGF拮抗劑及其他藥劑以外，亦可視情況向患者共投與兩種或兩種以上血管生成抑制劑。在某一實施例中，可與抗EphB4抗體、VEGF拮抗劑及抗血管生成劑組合投與一 或多種額外治療劑，例如抗癌劑。
在本發明之某些態樣中，可與抗EphB4抗體一起用於組合腫瘤療法之其他治療劑包括其他癌療法(例如手術、輻射治療(例如涉及照射或投與放射性物質)、化學療法、以本文所列出及此項技術中已知的抗癌劑治療或其組合)。另外或其他，可向患者共投與結合本文所揭示的相同抗原或兩種或兩種以上不同抗原之兩種或兩種以上抗體。有時，亦向患者投與一或多種細胞因子可為有益的。
化學治療劑
在某些態樣中，本發明提供一種藉由向易患或經診斷患有癌之患者投與有效量之EphB4拮抗劑及/或血管生成抑制劑及一或多種化學治療劑來阻斷或降低腫瘤生長或癌細胞生長之方法。在本發明之組合治療方法中可使用各種化學治療劑。在本文中，"定義"部分提供所涵蓋化學治療劑之例示性及非限制性清單。
一般熟習此項技術者應瞭解，化學治療劑之適當劑量通常應約為其中單獨或與其他化學治療劑組合投與該等化學治療劑之臨床療法中已使用的彼等劑量。視所治療之病況而定，劑量可能存在變化。投與治療之醫師將能決定個別患者之適當劑量。
本發明亦提供用於抑制或預防復發腫瘤生長或復發癌細胞生長之方法及組合物。復發腫瘤生長或復發癌細胞係用於描述其中患者經歷一或多種目前可獲得的療法(例如癌療法、例如化學療法、輻射療法、手術、激素療法及/或 生物學療法/免疫療法、抗VEGF抗體療法，尤其用於特定癌之標準治療方案)或以其治療在臨床上並不足以治療患者或患者不再自該療法受益，因此使得此等患者需要額外有效療法之病況。如本文所用，該短語亦可指"非反應性/難治癒的"患者之病況，例如，其描述對療法作出反應但罹患副作用之患者、發展抗性之患者、並不對療法作出反應之患者、並不對療法作出令人滿意的反應之患者等。在各種實施例中，癌為癌細胞數目並未顯著減少或已增加或腫瘤尺寸並未顯著減少或已增加或尺寸或癌細胞數目不再進一步減小之復發腫瘤生長或復發癌細胞生長。使用上下文中之此項技術中已接受的"復發"或"難治癒的"或"非反應性的"之含義，藉由此項技術中已知的用於檢定癌細胞治療有效性之任何方法可於活體內或活體外判定癌細胞是否復發腫瘤生長或復發癌細胞生長。抗VEGF治療之抗性腫瘤為復發腫瘤生長之實例。
本發明提供藉由投與一或多種抗EphB4抗體以阻斷或降低患者中復發腫瘤生長或復發癌細胞生長而在患者中阻斷或降低復發腫瘤生長或復發癌細胞生長之方法。在某些實施例中，可在癌治療劑後投與拮抗劑。在某些實施例中，抗EphB4抗體與癌療法同時投與。另外或其他，抗EphB4抗體療法與另一種癌療法交替，其可以任何次序執行。本發明亦涵蓋投與一或多種抑制性抗體以在傾向於患癌之患者中預防癌發作或復發之方法。一般而言，患者曾接受或正接受癌療法。在一實施例中，癌療法為用抗血管生成劑 (例如VEGF拮抗劑)治療。抗血管生成劑包括此項技術中已知之彼等抗血管生成劑及在本文定義部分發現之彼等抗血管生成劑。在一實施例中，抗血管生成劑為抗VEGF中和抗體或片段(例如人化A4.6.1、AVASTIN®(Genentech,South San Francisco,CA)、Y0317、M4、G6、B20、2C3等)。舉例而言，參見美國專利6,582,959、6,884,879、6,703,020；WO 98/45332；WO 96/30046；WO 94/10202；EP 0666868B1；美國專利申請案20030206899、20030190317、20030203409及20050112126；Popkov等人，Journal of Immunological Methods 288：149-164(2004)；及WO 2005012359。可與VEGF拮抗劑及抗EphB4抗體組合投與額外藥劑，以阻斷或減少復發腫瘤生長或復發癌細胞生長，例如參見本文中標題為組合療法之部分。
復發腫瘤生長
本發明亦提供用於抑制或預防復發腫瘤生長或復發癌細胞生長之方法及組合物。復發腫瘤生長或復發癌細胞係用於描述患者經歷一或多種目前可獲得的療法(例如癌療法、例如化學療法、輻射療法、手術、激素療法及/或生物學療法/免疫療法、抗VEGF抗體療法，尤其用於特定癌之標準治療療法)或以其治療在臨床上並不足以治療患者或患者不再自該療法受益，因此使得此等患者需要額外有效療法之病況。如本文所用，該短語亦可指"非反應性/難治癒的"患者之病況，例如，其描述對療法作出反應但罹患副作用之患者、發展抗性之患者、並不對療法作出反應 之患者、並不對療法作出令人滿意的反應之患者等。在各種實施例中，癌為癌細胞數目並未顯著減少或已增加或腫瘤尺寸並未顯著減少或已增加或尺寸或癌細胞數目不再進一步減小之復發腫瘤生長或復發癌細胞生長。使用上下文中之此項技術中已接受的"復發"或"難治癒的"或"非反應性的"之含義，藉由此項技術中已知的用於檢定癌細胞治療有效性之任何方法可於活體內或活體外判定癌細胞是否復發腫瘤生長或復發癌細胞生長。抗VEGF治療之抗性腫瘤為復發腫瘤生長之實例。
本發明提供藉由投與一或多種抗EphB4抗體以阻斷或降低患者中復發腫瘤生長或復發癌細胞生長而在患者中阻斷或降低復發腫瘤生長或復發癌細胞生長之方法。在某些實施例中，可在癌治療劑後投與拮抗劑。在某些實施例中，抗EphB4抗體與癌療法同時投與。另外或其他，抗EphB4抗體療法與另一種癌療法交替，其可以任何次序執行。本發明亦涵蓋投與一或多種抑制性抗體以在傾向於患癌之患者中預防癌發作或復發之方法。一般而言，患者曾接受或正接受癌療法。在一實施例中，癌療法為用抗血管生成劑(例如VEGF拮抗劑)治療。抗血管生成劑包括此項技術中已知之彼等抗血管生成劑及在本文定義部分發現之彼等抗血管生成劑。在一實施例中，抗血管生成劑為抗VEGF中和抗體或片段(例如人化A4.6.1、AVASTIN®(Genentech,South San Francisco,CA)、Y0317、M4、G6、B20、2C3等)。舉例而言，參見美國專利6,582,959、6,884,879、6,703,020；WO 98/45332； WO 96/30046；WO 94/10202；EP 0666868B1；美國專利申請案20030206899、20030190317、20030203409及20050112126；Popkov等人，Journal of Immunological Methods 288：149-164(2004)；及WO 2005012359。可與VEGF拮抗劑及抗EphB4抗體組合投與額外藥劑，以阻斷或減少復發腫瘤生長或復發癌細胞生長，例如參見本文中標題為組合療法之部分。
本發明抗體(及治療佐劑)可藉由任何適當之方式投與，包括非經腸、皮下、腹膜內、肺內及鼻內，且若有必要用於局部治療，則可於病灶內投藥。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投藥。此外，抗體亦適於藉由脈動輸注(pulse infusion)而投與，尤其以遞減劑量投與抗體。部分地視投藥之短期或長期性而定，可藉由任何適當途徑(例如，藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射)給藥。
本發明之抗體組合物應以與良好醫藥規範相符之方式經調配、給藥及投藥。在此情形下需考慮之因子包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病況、病症之病因、藥劑之傳遞位點、投藥方法、投藥時程及醫藥從業者已知之其他因子。抗體並非必需但視情形與一或多種當前用於預防或治療所論及之病症之藥劑一起調配。此等其他藥劑之有效量視存在於調配物中之本發明抗體的量、病症或治療之類型及上文所討論之其他因子而定。該等藥劑通常係以與上文所述相同之劑量及投藥途徑使用，或為迄今所用劑量之約1至99%。
為預防或治療疾病，本發明抗體之適當劑量(當單獨使用或與諸如化學治療劑之其他藥劑組合使用時)將視待治療之疾病類型、抗體類型、疾病之嚴重程度及病程、是否出於預防或治療目的而投與抗體、先前療法、患者臨床病史及對抗體之反應以及主治醫師之判斷而定。抗體適於一次性或經一系列治療投與至患者。視疾病類型及嚴重程度而定，約1 μg/kg至15 mg/kg(例如，0.1 mg/kg-10 mg/kg)之抗體為(例如)藉由一或多次單獨投藥或藉由連續輸注而投與至患者之初始候選劑量。一種典型之每日劑量可在約1 μg/kg至100 mg/kg或更高劑量之範圍內，視上文所提及之因子而定。對於經數天或更長時間重複投藥而言，視病況而定，通常將持續治療直至出現對於疾病症狀之所要抑制作用。抗體之一例示性劑量將在約0.05 mg/kg至約10 mg/kg之範圍內。因此，可以約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg或10 mg/kg(或其任何組合)之一或多個劑量向患者投藥。此等劑量可間歇投與，例如每週或每三週(例如，從而使患者接受約兩個劑量至約二十個劑量(例如約六個劑量)之抗體)。可以較高之初始負載劑量(loading dose)，隨後以一或多種較低劑量投藥。例示性給藥方案包含投與約4 mg/kg初始負載劑量之抗體，隨後投與約2 mg/kg之每週維持劑量的抗體。然而，其他劑量方案亦可用。此療法之進步之處在於易於藉由習知技術及檢定進行監測。
本發明之抗EphB4抗體可用於在特定細胞或組織中偵測EphB4表現之檢定中(例如診斷性或預後性檢定中)，其中 抗體如下所述經標記及/或固定於不溶性基質上。
在另一態樣中，本發明提供用於偵測EphB4之方法，該方法包含在樣本中偵測EphB4-抗EphB4抗體複合物。如本文所用之術語"偵測"包括參考或不參考對照物進行之定性及/或定量偵測(量測含量)。
在另一態樣中，本發明提供用於診斷與EphB4表現及/或活性相關的病症之方法，該方法包含在來自患有或懷疑患有該病症之患者的生物學樣本中偵測EphB4-抗EphB4抗體複合物。在一些實施例中，EphB4表現為增加的表現或異常(不良)表現。在一些實施例中，該病症為腫瘤、癌及/或細胞增生性病症。
在另一態樣中，本發明提供本文所述之任何抗EphB4抗體，其中抗EphB4抗體包含一可偵測標記。
在另一態樣中，本發明提供本文所述之任何抗EphB4抗體及EphB4之複合物。在一些實施例中，複合物在活體內或在活體外。在一些實施例中，複合物包含癌細胞。在一些實施例中，該抗EphB4抗體係經可偵測標記的。
抗EphB4抗體可在數種熟知偵測檢定方法之任一方法中用於偵測EphB4。舉例而言，自所要來源獲得樣本，將該樣本與抗EphB4抗體混雜以使抗體與存在於混合物中的任何EphB4形成抗體/EphB4複合物，且偵測存在於混合物中的任何抗體/EphB4複合物，藉此可檢定生物學樣本之EphB4。可藉由適用於特定樣本之此項技術中已知的方法製備用於檢定之生物學樣本。根據所用檢定之類型選擇使 樣本與抗體混雜之方法及偵測抗體/EphB4複合物之方法。該等檢定包括免疫組織化學、競爭性及夾心檢定及立體抑制檢定。
EphB4之分析方法均使用一或多種以下試劑：經標記EphB4類似物、經固定EphB4類似物、經標記抗EphB4抗體、經固定抗EphB4抗體及立體結合物。經標記試劑亦稱為"示蹤劑"。
所用標記為並不干擾EphB4與抗EphB4抗體之結合的任何可偵測官能基。已知各種用於免疫檢定之標記，實例包括諸如發色團、化學發光劑及放射性標記之可直接偵測的部分，以及諸如酶之必須經反應或衍生用於偵測的部分。該等標記之實例包括：放射性同位素32P、14C、125I、3H及131I、螢光團(例如稀土金屬螯合劑或螢光素及其衍生物)、若丹明(rhodamine)及其衍生物、丹醯基(dansyl)、繖酮、螢光素酶(例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶(美國專利第4,737,456號))、螢光素、2,3-二氫酞嗪二酮、辣根過氧化物酶(HRP)、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、溶菌酶、醣氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、與利用過氧化氫以氧化染料前驅體(例如HRP、乳過氧化物酶或微過氧化物酶)之酶偶合的雜環氧化酶(諸如尿酸酶及黃嘌啉氧化酶)、生物素/抗生物素蛋白、自旋標記、噬菌體標記、穩定自由基及其類似物。
可使用習知方法將此等標記共價結合至蛋白或多肽。舉 例而言，可使用諸如二醛、碳化二醯亞胺、二馬來醯亞胺、雙醯亞胺酯、雙-重氮化聯苯胺及其類似物之偶合劑來標記具有上述螢光、化學發光及酶標記之抗體。舉例而言，參見美國專利第3,940,475號(螢光測定法)及第3,645,090號(酶)；Hunter等人，Nature,144：945(1962)；David等人，Biochemistry, 13：1014-1021(1974)；Pain等人，J.Immunol.Methods,40：219-230(1981)；及Nygren,J.Histochem.及Cytochem., 30：407-412(1982)。本文中之較佳標記為諸如辣根過氧化物酶及鹼性磷酸酶之酶。將該標記(包括酶)結合至抗體為熟習免疫檢定技術者之標準操作程序。舉例而言，參見Methods in Enzymology,J.J.Langone及H.Van Vunakis編輯，第73卷(Academic Press,New York,New York,1981)，第147-166頁中之O'Sullivan等人，"Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay"。
某些檢定方法需要固化試劑。固化要求自於溶液中保持游離狀態之任何EphB4分離抗EphB4抗體。通常，藉由在檢定程序前使抗EphB4抗體或EphB4類似物不溶解(例如藉由吸附至水不溶性基質或表面(Bennich等人，U.S.3,720,760)、藉由共價共價偶合(例如，使用戊二醛交聯))或藉由之後使抗EphB4抗體或EphB4類似物不溶解(例如藉由免疫沉澱)來達成此目的。
可使用免疫組織化學及染色試驗方案來檢查樣本中蛋白之表現。組織切片之免疫組織化學染色已顯示為一種分析 或偵測樣本中是否存在蛋白之可靠方法。免疫組織化學("IHC")技術通常根據發色或螢光方法而使用抗體原位探測及顯現細胞抗原。對於樣本製備而言，可使用來自哺乳動物(通常人類患者)之組織或細胞樣本。樣本之實例包括(但不限於)癌細胞，諸如結腸、乳腺、前列腺、卵巢、肺、胃、胰腺、淋巴瘤及白血病癌細胞。可藉由此項技術中已知之各種程序獲得樣本，該等程序包括(但不限於)外科切除術、吸入或活組織檢查。組織可為新鮮的或經冷凍的。在一實施例中，將樣本固定且埋入石蠟或其類似物中。可藉由習知方法固定(亦即保存)組織樣本。一般熟習此項技術者應瞭解，固定劑之選擇由樣本將經組織學染色或經分析之目的決定。一般熟習此項技術者亦應瞭解，固定長度將視組織樣本之尺寸及所用之固定劑而定。
可與諸如形態學染色及/或螢光原位雜交之額外技術組合來執行IHC。可獲得IHC之兩種通用方法；直接及間接檢定。根據第一檢定，直接測定抗體與靶向抗原(例如EphB4)之結合。此直接檢定使用諸如螢光標籤或酶標記的原發性抗體之標記試劑，其可不經進一步抗體相互作用而顯現。在一典型間接檢定中，未經結合之原發性抗體結合至抗原，且經標記之二級抗體接著結合至該原發性抗體。若二級抗體結合至酶促標記，則添加發色或螢光基質以提供抗原顯現。因為若干二級抗體可與原發性抗體上之不同抗原決定基反應，所以發生信號擴增。
用於免疫組織化學之原發性及/或二級抗體通常應以可 偵測部分標記。可使用各種標記，其通常可分為以下類別：除以上討論之樣本製備程序外，可需要在IHC之前、期間或之後進一步處理組織切片。舉例而言，可執行抗原決定基提取方法，例如在檸檬酸鹽緩衝劑中加熱組織樣本(舉例而言，參見Leong等人，Appl.Immunohistochem.4(3)：201(1996))。
在可選之阻斷步驟後，於適當條件下將組織切片暴露於原發性抗體歷時充分時期，使得原發性抗體結合至組織樣本中之靶向蛋白抗原。可藉由常規試驗來測定用於達成此目的之適當條件。抗體結合至樣本之程度應藉由使用以上所討論之任一可偵測標記來測定。較佳地，該標記為催化諸如3,3'-二胺基聯苯胺發色團之發色基質的化學變化之酶促標記(例如HRPO)。酶促標記較佳應結合至特異性結合至原發性抗體之抗體(例如，原發性抗體為兔多株抗體且二級抗體為山羊抗兔抗體)。
可安裝由此製備之標本且蓋上蓋玻片。接著，(例如)使用顯微鏡來測定載玻片分析，且可使用此項技術中常規使用之染色強度標準。可如下分析染色強度標準：
IHC檢定中之約2+或更高之染色圖案記分通常為診斷性及/或預後性的。在一些實施例中，約1+或更高之染色圖案記分為診斷性及/或預後性的。在其他實施例中，約3或更高之染色圖案記分為診斷性及/或預後性的。應瞭解當使用IHC檢查來自腫瘤或結腸腺瘤之細胞及/或組織時，通常在腫瘤細胞及/或組織中測定或分析染色(與可存在於樣本中之基質或周圍組織成對比)。
稱為競爭性或夾心檢定之其他檢定方法已良好確立且廣泛用於商業診斷工業。
競爭性檢定取決於示蹤劑EphB4類似物與測試樣本EphB4競爭有限數目之抗EphB4抗體-抗原結合位點之能力。通常在競爭之前或之後使抗EphB4抗體不溶解，接著自未經結合示蹤劑及EphB4分離結合至抗EphB4抗體之示蹤劑及EphB4。藉由傾析(其中預先使結合搭配物不溶解)或藉由離心(其中在競爭反應後使結合搭配物沉澱)來達成此分離。如藉由標記物質之量所量測，測試樣本EphB4之量與經結合示蹤劑之量成反比。製備使用已知量的EphB4之劑量反應曲線，且將其與測試結果作比較以定量地確定存在於測試樣本中之EphB4的量。當將酶用作可偵測標記時，此等檢定稱為ELISA系統。
稱為"同源"檢定之另一種競爭性檢定並不需要相分離。因此，製備且使用酶與EphB4之結合物，使得當抗EphB4抗體結合至EphB4時，抗EphB4抗體之存在會改變酶活性。在此情形下，EphB4或其免疫學活性片段以一雙功能 有機橋結合至諸如過氧化酶之酶。選擇結合物以與抗EphB4抗體一起使用，使得抗EphB4抗體之結合會抑制或加強標記之酶活性。此方法本身以EMIT之名稱經廣泛實踐。
立體結合物用於同源檢定之位阻方法中。藉由將低分子量半抗原共價鍵聯至小EphB4片段而合成此等結合物，使得對抗半抗原之抗體大體上不能與抗EphB4抗體同時結合至結合物。在此檢定程序中，存在於測試樣本中之EphB4將結合抗EphB4抗體，藉此使抗半抗原結合該結合物，導致結合物半抗原之特徵改變，例如當半抗原為螢光團時存在螢光改變。
夾心檢定尤其可用於測定EphB4或抗EphB4抗體。在連續夾心檢定中，將經固定之抗EphB4抗體用於吸附測試樣本EphB4，藉由洗滌來移除測試樣本，將經結合EphB4用於吸附二級、經標記抗EphB4抗體，且接著自殘餘示蹤劑中分離經結合材料。經結合示蹤劑之量與測試樣本EphB4直接成正比。在"同時"夾心檢定中，在添加經標記抗EphB4之前並不分離測試樣本。將抗EphB4單株抗體用作一種抗體且將多株抗EphB4抗體用作另一抗體之連續夾心檢定可用於測試樣本中之EphB4。
前述僅為EphB4之例示性偵測檢定。現今或此後將發展的使用抗EphB4抗體來測定EphB4之其他方法包括於其範疇中，包括本文所描述之生物檢定。
製造物品
在本發明之另一態樣中，提供一種含有可用於治療、預防及/或診斷上文所述病症之材料的製造物品。該製造物品包含容器及容器上或與容器相關聯之標記或包裝插頁。適當之容器包括(例如)瓶子、小瓶、注射器等。該等容器可由多種材料(諸如玻璃或塑料)形成。容器容納單獨或與有效治療、預防及/或診斷病況之其他組合物組合之組合物，且可具有無菌接取口(例如，容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿的塞子之小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為本發明抗體。標記或包裝插頁指示組合物係用於治療所選擇之病況，諸如癌。此外，製造物品可包含：(a)其中含有組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明抗體；及(b)其中含有組合物之第二容器，其中該組合物包含另一細胞毒性劑。在本發明之此實施例中，製造物品可另外包含應指示第一及第二組合物可用於治療特定病況(諸如癌)之包裝插頁。另外或其他，製造物品可另外包含第二(或第三)容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝劑，諸如注射用抑菌水(BWFI)、經磷酸鹽緩衝之生理食鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可另外包括就商業及使用者之立場而言可要之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
以下為本發明方法及組合物之實例。應瞭解，給定以上提供之一般描述，可實施各種其他實施例。
實例 實例1：抗EphB4抗體之產生
使用噬菌體呈現，使用EphB4-His蛋白來選擇噬菌體以產生抗EphB4抗體。各種用於產生噬菌體呈現文庫之方法為此項技術中已知的，根據該等文庫可獲得所關注之抗體。一種產生所關注抗體之方法為如Lee等人，J.Mol.Biol.(2004),340(5)：1073-93中所述使用噬菌體抗體文庫。使用噬菌體ELISA，相對於EphB4-His蛋白來篩檢使用噬菌體呈現所選擇之純系。選擇獨特純系以藉由噬菌體競爭ELISA及阻斷檢定進行進一步表徵，以確定噬菌體抗體純系是否可阻斷EphB4-ephrinB2相互作用。較佳地執行純系30.35且選擇其用於進一步分析。為改良純系30.35之親和力，在YW30.35背景中產生噬菌體呈現文庫，其各自靶向用於軟或硬隨機化之所選HVR。藉由噬菌體ELISA來篩檢所選純系，且接著使其表現為Fab蛋白且使用Biacore測定其親和力。將所選純系重組為全長IgG且使用Biacore測定其親和力。親本純系30.35及親和力成熟純系之序列顯示於圖1中。
實例2：抗EphB4抗體之表徵
為測定抗EphB4 Mab之結合親和力，使用以BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)獲得之表面電漿共振(SRP)量測。簡言之，根據供應商說明書，以N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二醯亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物感應器晶片(CM5,BIAcore Inc.)。用10 mM乙酸鈉(pH 4.8)將抗EphB4抗體稀釋至5 μg/ml，接著以5微升每分鐘之流動速率注射 以達成約500個反應單位(RU)之偶聯抗體。接著，注射1 M乙醇胺以阻斷未反應基團。對於動力學量測而言，在25℃下以25 μl/min之流動速率注射在具有0.05% Tween 20之PBS中兩倍連續稀釋之人類或鼠類EphB4-His分子(0.7 nM至500 nM)。使用簡易的一對一Langmuir結合模型(BIAcore Evaluation Software,3.2版)，計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。將平衡解離常數(Kd)計算為koff/kon之比率。此試驗之結果顯示於圖3中。"NA"表示未執行量測。
在不同試驗中，相對於其他EphB受體來測試抗EphB4抗體純系30.35之交叉反應性。簡言之，以表現全長人類EphB1、人類EphB2、人類EphB4或人類EphB6之質體短暫轉染COS7細胞。轉染24小時後，使細胞經受FACS分析以由抗EphB4抗體偵測可能存在之結合。抗EphB4純系30.35並不與人類EphB1、人類EphB2、人類EphB3或人類EphB6交叉反應。
實例3：在基於細胞之檢定中由抗EphB4抗體阻斷的EphB4受體信號傳輸
為證明抗EphB4抗體阻斷膜結合EphrinB2及EphB4的相 互作用之能力，吾人執行基於細胞的檢定，其中EphB4及EphrinB2由不同細胞類型呈現。將過度表現人類EphrinB2之3T3細胞用於刺激表現高度EphB4及低度EphrinB2之HUVEC細胞，且測試抗EphB4抗體抑制EphB4活化之能力。
如下製備過度表現人類EphrinB2之3T3細胞：根據製造商手冊，將人類全長EphrinB2選殖於pcDNA5/FRT載體(Invitrogen)中且隨後用於以3T3.Flp細胞(Invitrogen)產生穩定細胞株。
在抗EphB4抗體存在或不存在下，將過度表現人類EphrinB2之3T3細胞上覆於HUVEC細胞上歷時15或30分鐘。使EphB4蛋白免疫況澱，接著使用抗磷醯基-酪胺酸抗體(抗體4G10；Upstate)，使用western墨點法偵測受體酪胺酸磷酸化存在與否，藉此分析EphB4受體之活化。簡言之，以RIPA緩衝劑溶解細胞。藉由離心對細胞溶胞物分類，且以每個樣本5 μg添加抗EphB4抗體35.2D8。於4℃下培育兩個小時後，使用蛋白A瓊脂糖拆分免疫複合物。使用濃度為1 μg/ml之抗磷醯基酪胺酸抗體4G10(Upstate)，由Western墨點法分析EphB4磷酸化。
此試驗之結果顯示於圖7中。將3T3細胞上覆於HUVEC細胞上會引起EphB4之急劇酪胺酸磷酸化(色帶4及5)。以抗EphB4抗體(純系35.2D8，5 μg/ml)預培育HUVEC歷時30分鐘，從而有效地消除由上覆3T3-EphrinB2細胞(色帶6)誘導的EphB4酪胺酸磷酸化。相反，以抗EphB4單獨處理 HUVEC細胞並不會引起HUVEC中之EphB4活化(色帶2及3)，且未經處理的HUVEC細胞並不能證明EphB4活化。此等結果確立：抗EphB4抗體在直接細胞-細胞接觸內容中阻斷配位基-受體相互作用。
雖然為清楚明白起見，已借助於說明及實例在一些細節中說明前述發明，但該等描述及實例不應理解為限制本發明之範疇。
圖1：抗EphB4抗體之重鏈及輕鏈HVR環序列。該圖顯示重鏈HVR序列H1、H2及H3及輕鏈HVR序列L1、L2及L3。序列編號係如下：純系30.35(HVR-H1為SEQ ID NO：1；HVR-H2為SEQ ID NO：3；HVR-H3為SEQ ID NO：7；HVR-L1為SEQ ID NO：9；HVR-L2為SEQ ID NO：11；HVR-L3為SEQ ID NO：13)；純系30.35.1D2(HVR-H1為SEQ ID NO：1；HVR-H2為SEQ ID NO：3；HVR-H3為SEQ ID NO：8；HVR-L1為SEQ ID NO：10；HVR-L2為SEQ ID NO：12；HVR-L3為SEQ ID NO：14)；純系30.35.2D8(HVR-H1為SEQ ID NO：2；HVR-H2為SEQ ID NO：4；HVR-H3為SEQ ID NO：7；HVR-L1為SEQ ID NO：9；HVR-L2為SEQ ID NO：11；HVR-L3為SEQ ID NO：15)；純系30.35.2D12(HVR-H1為SEQ ID NO：1；HVR-H2為SEQ ID NO：5；HVR-H3為SEQ ID NO：7；HVR-L1為SEQ ID NO：9；HVR-L2為SEQ ID NO：11；HVR-L3為SEQ ID NO：16)；及純系30.35.2D13(HVR-H1為SEQ ID NO：1；HVR- H2為SEQ ID NO：6；HVR-H3為SEQ ID NO：7；HVR-L1為SEQ ID NO：9；HVR-L2為SEQ ID NO：11；HVR-L3為SEQ ID NO：17)。
胺基酸位置根據如下所述之Kabat編號系統編號。
圖2A、2B及3描述用於實踐本發明之例示性受體人類一致框架序列，其中序列識別符如下：可變重鏈(VH)一致框架(圖2)
人類VH亞群I一致框架減去Kabat CDR(SEQ ID NO：19)
人類VH亞群I一致框架減去延長高變區(SEQ ID NO：20-22)
人類VH亞群II一致框架減去Kabat CDR(SEQ ID NO：23)
人類VH亞群II一致框架減去延長高變區(SEQ ID NO：24-26)
人類VH亞群III一致框架減去Kabat CDR(SEQ ID NO：27)
人類VH亞群III一致框架減去延長高變區(SEQ ID NO：28-30)
人類VH受體框架減去Kabat CDR(SEQ ID NO：31)
人類VH受體框架減去延長高變區(SEQ ID NO：32-33)
人類VH受體2框架減去Kabat CDR(SEQ ID NO：34)
人類VH受體2框架減去延長高變區(SEQ ID NO：35-37)
可變輕鏈(VL)一致框架(圖3)
人類VLκ亞群I一致框架(SEQ ID NO：38)
人類VLκ亞群II一致框架(SEQ ID NO：39)
人類VLκ亞群III一致框架(SEQ ID NO：40)
人類VLκ亞群IV一致框架(SEQ ID NO：41)
圖4描述huMAb4D5-8輕鏈及重鏈之框架區序列。上標/粗體的數字指示根據Kabat之胺基酸位置。
圖5描述huMAb4D5-8輕鏈及重鏈之經修飾/變異的框架區序列。上標/粗體的數字指示根據Kabat之胺基酸位置。
圖6描述抗體純系30.35、30.35.1D2、30.35.2D8、30.35.2D12及20.25.2D13之重鏈可變區及輕鏈可變區。
圖7在基於細胞之檢定中，抗EphB4單株抗體阻斷的EphB4受體信號傳輸。

Claims (1)

  1. 一種經分離之抗EphB4抗體，其包含：(a)選自由以下序列組成之群的至少一個、兩個、三個、四個或五個高變區(HVR)序列：(i)包含序列A1-A11之HVR-L1，其中A1-A11為RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：9)，(ii)包含序列B1-B7之HVR-L2，其中B1-B7為SASFLYS(SEQ ID NO：11)，(iii)包含序列C1-C9之HVR-L3，其中C1-C9為QESTTTPPT(SEQ ID NO：15)，(iv)包含序列D1-D10之HVR-H1，其中D1-D10為GFSISNYYLH(SEQ ID NO：2)，(v)包含序列E1-E18之HVR-H2，其中E1-E18為GGIYLYGSSSEYADSVKG(SEQ ID NO：4)，及(vi)包含序列F1-F17之HVR-H3，其中F1-F17為ARGSGLRLGGLDYAMDY(SEQ ID NO：7)；及(b)至少一個變異HVR，其中該變異HVR序列包含描述於SEQ ID NO：1-17中之序列的至少一個殘基之修飾。
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