JP2023532197A - 抗ｃｄ７０抗体及びその応用 - Google Patents

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Abstract

本開示は抗ＣＤ７０抗体及びその応用に関する。具体的に、本開示は、前記抗体軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含む抗ＣＤ７０抗体、及びその薬剤としての用途に関する。

Description

本開示は、生物医薬分野に属し、具体的には、ＣＤ７０に結合する抗体及びその応用に関する。
ここでの記載は、必ずしも従来技術を構成するものではなく、本開示に関連する背景情報のみを提供する。
ＣＤ７０は、細胞表面抗原の一つであり、腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ、ＴＮＦ）ファミリーメンバーに属し、１９３個のアミノ酸を含み、分子量が約５０ ｋＤのＩＩ型膜タンパク質である。体内では、ホモ三量体の形態でその受容体ＣＤ２７と相互作用し、そしてＣＤ２７の細胞内領域により腫瘍壊死因子受容体関連因子（ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ、ＴＲＡＦ）、例えば、ＴＲＡＦ２及びＴＲＡＦ５に結合することによりＮＦκＢとＪＮＫ経路を活性化し、最終的に生存と増殖を促進するシグナルを発生させる。ＣＤ７０により誘導されたＣＤ２７シグナル伝達により、ＣＤ２７を発現する制御性Ｔ細胞の産生と活性化の増加が引き起こされる。ＣＤ７０は更に、制御性Ｔ細胞を誘導し、免疫監視を回避することで、腫瘍の成長を促進する。生理的条件下、ＣＤ７０は、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞及び樹状細胞に一時的に発現されるが、リンパ以外の正常な組織にほとんど発現されない。しかし、ＣＤ７０は多種類の血液腫瘍と固形腫瘍、例えば、Ｂ細胞リンパ腫、腎がん及び乳がんなどに高く発現され、且つ予後と負の相関を示す。ＣＤ２７は血液腫瘍においてＣＤ７０と共に発現され、両者の結合によりＣＤ２７の細胞外領域が切り取られ、可溶性のＣＤ２７（ｓＣＤ２７）が形成され、診断用のバイオマーカーとなることができる。
現在、ＷＯ２０１２１２３５８６Ａ１、ＷＯ２００６０４４６４３Ａ３、ＷＯ２００７０３８６３７Ａ３、ＷＯ２０１７１３８４７１Ａ１などの複数の文献には、既に多種類の抗ＣＤ７０抗体が開示されている。現在、臨床に応用される効果的な抗ＣＤ７０抗体薬はまだ存在しておらず、新たな効果的な抗ＣＤ７０抗体薬は依然として開発する必要がある。
本開示は、新たな抗ＣＤ７０抗体を提供する。本開示に記載される抗ＣＤ７０抗体は、抗ＣＤ７０全長抗体及びその抗原結合断片を含む。
幾つかの実施形態において、本開示は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、そのうち、
ｉ）上記重鎖可変領域は、それぞれ配列番号９と配列番号１１で示されるＨＣＤＲ１とＨＣＤＲ３、及び配列番号１０又は配列番号４２で示されるＨＣＤＲ２を含み、上記軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号１２と配列番号１４で示されるＬＣＤＲ１とＬＣＤＲ３、及び配列番号１３又は配列番号４３で示されるＬＣＤＲ２を含み、
ｉｉ）上記重鎖可変領域は、それぞれ配列番号１５と配列番号１７で示されるＨＣＤＲ１とＨＣＤＲ３、及び配列番号１６又は配列番号５４で示されるＨＣＤＲ２を含み、上記軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、或いは
ｉｉｉ）上記重鎖可変領域は、それぞれ配列番号２１と配列番号２３で示されるＨＣＤＲ１とＨＣＤＲ３、及び配列番号２２又は配列番号７１で示されるＨＣＤＲ２を含み、上記軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号２４と配列番号２５で示されるＬＣＤＲ１とＬＣＤＲ３、及び配列番号１３又は配列番号４３で示されるＬＣＤＲ２を含む、
抗ＣＤ７０抗体を提供する。
幾つかの実施形態において、本開示の抗ＣＤ７０抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、そのうち、
上記重鎖可変領域は、それぞれ配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、上記軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号１２、配列番号１３及び配列番号１４で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、或いは
上記重鎖可変領域は、それぞれ配列番号９、配列番号４２及び配列番号１１で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、上記軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号１２、配列番号４３及び配列番号１４で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、或いは
上記重鎖可変領域は、それぞれ配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、上記軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、或いは
上記重鎖可変領域は、それぞれ配列番号１５、配列番号５４及び配列番号１７で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、上記軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、或いは
上記重鎖可変領域は、それぞれ配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、上記軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号２４、配列番号１３及び配列番号２５で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、或いは
上記重鎖可変領域は、それぞれ配列番号２１、配列番号７１及び配列番号２３に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、上記軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号２４、配列番号４３及び配列番号２５に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ７０抗体はマウス抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体であり、幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ７０抗体は全長抗体又はその抗原結合断片である。幾つかの実施形態において、上記抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、及びその二重抗体から選ばれる。
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ７０抗体はヒト化抗体であり、上記ヒト化抗体はヒト抗体のフレームワーク領域又はヒト抗体のフレームワーク領域変異体を含み、上記フレームワーク領域変異体はヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域及び／又は重鎖フレームワーク領域に対してそれぞれ多くとも１１個のアミノ酸の復帰変異を有する。
幾つかの実施形態において、上記抗体の重鎖フレームワーク領域には、４Ｍ、３７Ｉ、３８Ｋ、４８Ｉ、６７Ａ、６９Ｌ、７１Ａ、７３Ｒ、７８Ａ、８０Ｌ及び９４Ｔから選ばれる１つ又はそれ以上のアミノ酸復帰変異が含まれ、及び／又は上記抗体の軽鎖フレームワーク領域には、５Ｓと７０Ｎから選ばれる１つ又はそれ以上のアミノ酸復帰変異が含まれ、幾つかの実施形態において、上記抗体の軽鎖フレームワーク領域には、３８Ｒ、４３Ｓ、６９Ｒ、７０Ｑ及び７１Ｙから選ばれる１つ又はそれ以上のアミノ酸復帰変異が含まれ、及び／又は上記抗体の重鎖フレームワーク領域には、２Ｉ、２４Ｔ、４６Ｋ、７２Ｅ及び８２ａ Ｎから選ばれる１つ又はそれ以上のアミノ酸復帰変異が含まれ、幾つかの実施形態において、上記抗体の重鎖フレームワーク領域には、２７Ｄ、３０Ｐ、３７Ｌ、３８Ｋ、４８Ｉ、６６Ｋ、６７Ａ、６９Ｌ及び８２ａ Ｎから選ばれる１つ又はそれ以上のアミノ酸復帰変異が含まれ、及び／又は上記抗体の軽鎖フレームワーク領域には、４９Ｓというアミノ酸復帰変異が含まれ、そのうち、上記変異部位は、Ｋａｂａｔ番号付け規則によって番号付けられ、例えば、「４Ｍ」は、重鎖可変領域の４番目（Ｋａｂａｔ番号付け規則に従って番号付けられる）の残基が「Ｍ」であることを表す。
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ７０抗体は、ヒト抗体の重鎖フレームワーク領域に対して４Ｍ、３７Ｉ、３８Ｋ、４８Ｉ、６７Ａ、６９Ｌ、７１Ａ、７３Ｒ、７８Ａ、８０Ｌ及び９４Ｔから選ばれる１つ又はそれ以上のアミノ酸復帰変異を含むヒト抗体の重鎖フレームワーク領域変異体を含み、及び／又は上記抗ＣＤ７０抗体は、ヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域に対して５Ｓと７０Ｎから選ばれる１つ又はそれ以上のアミノ酸復帰変異を含むヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域変異体を含み、幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ７０抗体は、ヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域に対して、３８Ｒ、４３Ｓ、６９Ｒ、７０Ｑ及び７１Ｙから選ばれる１つ又はそれ以上のアミノ酸復帰変異を含むヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域変異体を含み、及び／又は上記抗ＣＤ７０抗体は、ヒト抗体の重鎖フレームワーク領域に対して２Ｉ、２４Ｔ、４６Ｋ、７２Ｅ及び８２ａ Ｎから選ばれる１つ又はそれ以上のアミノ酸復帰変異を含むヒト抗体の重鎖フレームワーク領域変異体を含み、幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ７０抗体は、ヒト抗体の重鎖フレームワーク領域に対して２７Ｄ、３０Ｐ、３７Ｌ、３８Ｋ、４８Ｉ、６６Ｋ、６７Ａ、６９Ｌ及び８２ａ Ｎから選ばれる１つ又はそれ以上のアミノ酸復帰変異を含むヒト抗体の重鎖フレームワーク領域変異体を含み、及び／又は上記抗ＣＤ７０抗体は、ヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域に対して４９Ｓというアミノ酸復帰変異を含むヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域変異体を含み、そのうち、上記変異部位は、Ｋａｂａｔ番号付け規則によって番号付けられ、例えば、「４Ｍ」は、重鎖可変領域の４番目（Ｋａｂａｔ番号付け規則に従って番号付けられる）の残基が「Ｍ」であることを表す。
幾つかの実施形態において、上記ヒト化抗体は、以下のａ）、ｂ）又はｃ）の記載から選ばれる軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含む：
上記ヒト化抗体は、
ａ）、それぞれ配列番号９と配列番号１１で示されるＨＣＤＲ１とＨＣＤＲ３、及び配列番号１０又は配列番号４２で示されるＨＣＤＲ２を含む重鎖可変領域と、それぞれ配列番号１２と配列番号１４で示されるＬＣＤＲ１とＬＣＤＲ３、及び配列番号１３又は配列番号４３で示されるＬＣＤＲ２を含む軽鎖可変領域とを含み、且つ上記重鎖可変領域は、ヒト抗体の重鎖フレームワーク領域に対して４Ｍ、３７Ｉ、３８Ｋ、４８Ｉ、６７Ａ、６９Ｌ、７１Ａ、７３Ｒ、７８Ａ、８０Ｌ及び９４Ｔから選ばれる１つ又はそれ以上のアミノ酸復帰変異を含むヒト抗体の重鎖フレームワーク領域変異体を含み、及び／又は上記軽鎖可変領域は、ヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域に対して５Ｓと７０Ｎから選ばれる１つ又はそれ以上のアミノ酸復帰変異を含むヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域変異体を含み、又は
ｂ）それぞれ配列番号１５と配列番号１７で示されるＨＣＤＲ１とＨＣＤＲ３、及び配列番号１６又は配列番号５４で示されるＨＣＤＲ２を含む重鎖可変領域と、それぞれ配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含み、且つ上記軽鎖可変領域は、ヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域に対して３８Ｒ、４３Ｓ、６９Ｒ、７０Ｑ及び７１Ｙから選ばれる１つ又はそれ以上のアミノ酸復帰変異を含むヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域変異体を含み、及び／又は上記重鎖可変領域は、ヒト抗体の重鎖フレームワーク領域に対して２Ｉ、２４Ｔ、４６Ｋ、７２Ｅ及び８２ａ Ｎから選ばれる１つ又はそれ以上のアミノ酸復帰変異を含むヒト抗体の重鎖フレームワーク領域変異体を含み、又は
ｃ）それぞれ配列番号２１と配列番号２３で示されるＨＣＤＲ１とＨＣＤＲ３、及び配列番号２２又は配列番号７１で示されるＨＣＤＲ２を含む重鎖可変領域と、それぞれ配列番号２４と配列番号２５で示されるＬＣＤＲ１とＬＣＤＲ３、及び配列番号１３又は配列番号４３で示されるＬＣＤＲ２を含む軽鎖可変領域とを含み、且つ上記重鎖可変領域は、ヒト抗体の重鎖フレームワーク領域に対して２７Ｄ、３０Ｐ、３７Ｌ、３８Ｋ、４８Ｉ、６６Ｋ、６７Ａ、６９Ｌ及び８２ａ Ｎから選ばれる１つ又はそれ以上のアミノ酸復帰変異を含むヒト抗体の重鎖フレームワーク領域変異体を含み、及び／又は上記軽鎖可変領域は、ヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域に対して４９Ｓというアミノ酸復帰変異を含むヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域変異体を含む。そのうち、上記変異部位は、Ｋａｂａｔ番号付け規則に従って番号付けられる。
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ７０抗体の重鎖可変領域は配列番号２６又は配列番号３４を基にして４Ｍ、３７Ｉ、３８Ｋ、４８Ｉ、６７Ａ、６９Ｌ、７１Ａ、７３Ｒ、７８Ａ、８０Ｌ及び９４Ｔから選ばれる１つ又はそれ以上のアミノ酸復帰変異を有する重鎖可変領域であり、及び上記軽鎖可変領域は、配列番号３２又は配列番号４０を基にして５Ｓと７０Ｎから選ばれる１つ又はそれ以上のアミノ酸復帰変異を有する軽鎖可変領域であり、幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ７０抗体の重鎖可変領域は、配列番号４４又は配列番号５１を基にして２Ｉ、２４Ｔ、４６Ｋ、７２Ｅ及び８２ａ Ｎから選ばれる１つ又はそれ以上のアミノ酸復帰変異を有する重鎖可変領域であり、及び上記軽鎖可変領域は、配列番号４７を基にして３８Ｒ、４３Ｓ、６９Ｒ、７０Ｑ及び７１Ｙから選ばれる１つ又はそれ以上のアミノ酸復帰変異を有する軽鎖可変領域であり、幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ７０抗体の重鎖可変領域は、配列番号５５又は配列番号６３を基にして２７Ｄ、３０Ｐ、３７Ｌ、３８Ｋ、４８Ｉ、６６Ｋ、６７Ａ、６９Ｌ及び８２ａ Ｎから選ばれる１つ又はそれ以上のアミノ酸復帰変異を有する重鎖可変領域であり、及び上記軽鎖可変領域は、配列番号６１又は配列番号６９を基にして４９Ｓというアミノ酸復帰変異を有する軽鎖可変領域である。そのうち、上記変異部位は、Ｋａｂａｔ番号付け規則に従って番号付けられる。
当業者は、上記アミノ酸復帰変異部位が、Ｋａｂａｔ以外の他の番号付け規則を採用する場合に、機能及び／又は構造で同等の地位を持つアミノ酸残基は、異なる番号が付けられ得るが、依然として本開示に限定された部位に対応すると理解すべきである。
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ７０抗体は重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、そのうち、
ｄ）上記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号３、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３４、３５、３６、３７、３８又は３９とそれぞれ少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、及び／又は上記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４、３２、３３、４０又は４１とそれぞれ少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、
ｅ）上記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号５、４４、４５、４６、５１、５２又は５３とそれぞれ少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、及び／又は上記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号６、４７、４８、４９又は５０とそれぞれ少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、又は
ｆ）上記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号７、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６３、６４、６５、６６、６７又は６８とそれぞれ少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、及び／又は上記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号８、６１、６２、６９又は７０とそれぞれ少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ７０抗体は、下記の表１、表２及び表３に示されるような重鎖可変領域と軽鎖可変領域との組み合わせを含む：
Figure 2023532197000001

備考：表中、例えば「ｈｕＢ１Ｖ００１」は、抗体の重鎖可変領域がそれと同じ行の配列番号２６であり、軽鎖可変領域がそれと同じ列の配列番号４０であり、その他がこのように類推することを示す。
Figure 2023532197000002
備考：表中、例えば「ｈｕＢ７Ｖ００１」は、抗体の重鎖可変領域がそれと同じ行の配列番号４４であり、軽鎖可変領域がそれと同じ列の配列番号４７であり、その他がこのように類推することを示す。
Figure 2023532197000003
備考：表中、例えば「ｈｕＦ４Ｖ００１」は、抗体の重鎖可変領域がそれと同じ行の配列番号５５であり、軽鎖可変領域がそれと同じ列の配列番号６９であり、その他がこのように類推することを示す。
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ７０抗体は重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、そのうち、
ｇ）上記重鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号３で示され、及び上記軽鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号４で示され、或いは
ｈ）上記重鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号２６、２７、２８、２９、３０、３１、３４、３５、３６、３７、３８又は３９で示され、及び上記軽鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号３２、３３、４０又は４１で示され、或いは
ｉ）上記重鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号５で示され、及び上記軽鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号６で示され、或いは
ｊ）上記重鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号４４、４５、４６、５１、５２又は５３で示され、及び上記軽鎖可変領域配列は、そのアミノ酸配列が配列番号４７、４８、４９又は５０で示され、或いは
ｋ）上記重鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号７で示され、及び上記軽鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号８で示され、或いは
ｌ）上記重鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号５５、５６、５７、５８、５９、６０、６３、６４、６５、６６、６７又は６８で示され、及び上記軽鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号６１、６２、６９又は７０で示される。
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ７０抗体は、下記のような重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む：
ｎ）上記重鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号３５で示され、及び上記軽鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号４０で示され、或いは
ｏ）上記重鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号５１で示され、及び上記軽鎖可変領域配列は、そのアミノ酸配列が配列番号４７で示され、或いは
ｐ）上記重鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号６５で示され、及び上記軽鎖可変領域配列が、そのアミノ酸配列が配列番号７０で示される。
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ７０抗体は、抗体重鎖定常領域と軽鎖定常領域を含み、好ましくは、上記重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３とＩｇＧ４定常領域及びその通常の変異体から選ばれ、上記軽鎖定常領域はヒト抗体κとλ鎖定常領域及びその通常の変異体から選ばれ、より好ましくは、上記抗体は、配列番号７２で示される重鎖定常領域及び配列番号７３で示される軽鎖定常領域を含む。
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ７０抗体は、
ｑ）配列番号７４と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖、及び／又は配列番号７５と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖、或いは
ｒ）配列番号７６と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖、及び／又は与配列番号７７と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する軽鎖、或いは
ｓ）配列番号７８と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖、及び／又は配列番号７９と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する軽鎖、
を含む。
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ７０抗体は、
ｔ）配列番号７４で示される重鎖及び配列番号７５で示される軽鎖、或いは
ｕ）配列番号７６で示される重鎖及び配列番号７７で示される軽鎖、或いは
ｖ）配列番号７８で示される重鎖及び配列番号７９で示される軽鎖、
を含む。
幾つかの実施形態において、本開示は、上記の何れか一項に記載の抗ＣＤ７０抗体と競合してヒトＣＤ７０、ヒトＣＤ７０抗原エピトープ、サルＣＤ７０又はサルＣＤ７０抗原エピトープに結合する、単離した抗ＣＤ７０抗体を更に提供する。幾つかの実施形態において、上記抗体は、上記の何れか一項に記載の抗ＣＤ７０抗体と、ヒトＣＤ７０において同じエピトープに結合する。
幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の抗ＣＤ７０抗体であって、上記抗ＣＤ７０抗体は低フコシル化抗体であり、幾つかの実施形態において、上記低フコシル化された抗ＣＤ７０抗体は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の抗体重鎖がフコースによりグリコシル化修飾されていない抗体である。幾つかの実施形態において、上記低フコシル化された抗ＣＤ７０抗体は、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の重鎖がフコースによりグリコシル化修飾されていない抗体である。幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ７０抗体は、１００％の重鎖がフコースによりグリコシル化修飾されていないＩｇＧ１抗体（非フコシル化ＩｇＧ１抗体とも呼ばれる）である。
幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の抗ＣＤ７０抗体であって、上記抗ＣＤ７０抗体は、
Ａ． 上記抗ＣＤ７０抗体は、１×１０－８ Ｍよりも小さく、好ましくは１×１０－９ Ｍよりも小さく、又は１×１０－１０ Ｍよりも小さく、又は６×１０－１１ Ｍよりも小さく、又は５×１０－１１ Ｍよりも小さく、又は４×１０－１１ Ｍよりも小さく、又は３×１０－１１ Ｍよりも小さいＫＤ値でヒトＣＤ７０に結合し、上記ＫＤ値は、表面プラズモン共鳴技術により測定され、例えば、本開示の試験例１に記載される方法により検出され、
Ｂ． 上記抗ＣＤ７０抗体は、ヒトＣＤ７０抗原と結合することもできるし、サルＣＤ７０抗原と結合することもできるが、マウスＣＤ７０抗原とは結合せず、
Ｃ． 上記抗ＣＤ７０抗体は、ＣＤ７０により誘導されるＣＤ２７シグナルの伝達を阻害することができ、好ましくは、上記抗ＣＤ７０抗体は、ヒトＣＤ２７発現細胞（例えば、ＨＴ１０８０／ＣＤ２７細胞）によるＩＬ－８の分泌を阻害する最大阻害百分率（Ｉｍａｘ（％））が７２％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以上、より好ましくは、９０％、９１％、９３％又は９８％以上であり、上記ＩＬ－８の分泌はＥｌｉｓａ方法により検出され、例えば、本開示の試験例５に記載される方法により検出され、
Ｄ． 上記抗ＣＤ７０抗体は、ヒトＣＤ７０発現細胞に対する抗体依存性細胞仲介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞仲介性貪食作用（ＡＤＣＰ）というエフェクター機能の１つ又はそれ以上を有し、好ましくは、上記抗ＣＤ７０抗体は、ＣＤＣエフェクター機能により、ヒトＣＤ７０発現細胞（例えば、Ｒａｊｉ細胞）の溶解される最大溶解率を７０％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９５％、又は１００％以上、より好ましくは、７４％、７８％、８４％又は８６％以上にすることができ、幾つかの形態において、ＣＤＣエフェクター機能は、本開示の試験例７に記載される方法により検出され、及び
Ｅ、上記抗ＣＤ７０抗体は、ヒトＣＤ７０発現細胞により内在化されることができ、好ましくは、細胞の内在化による溶解の最大溶解率は７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以上、より好ましくは、９６％又は９７％以上であり、幾つかの形態において、細胞の内在化は、本開示の試験例１０に記載される方法により検出される、
という特徴のうちの少なくとも１つを有する。
幾つかの実施形態において、本開示は、上記の何れか一項に記載の抗ＣＤ７０抗体をコードする核酸分子を更に提供する。
幾つかの実施形態において、本開示は、上記核酸分子を含む宿主細胞を更に提供する。上記宿主細胞は、原核細胞と真核細胞から選ばれることができ、好ましくは真核細胞で、より好ましくは哺乳動物細胞であり、好ましくはヒトを含まない哺乳動物細胞であり、そのうち、上記哺乳動物細胞は、ＣＨＯ、２９３、ＮＳＯ、及び哺乳動物細胞において遺伝子編集を行うことで抗体又はその抗原結合断片のグリコシル化修飾を変更し、更に抗体又はその抗原結合断片のＡＤＣＣ機能を変更することができ、例えば、Ｆｕｔ８又はＧｎＴ－ＩＩＩなどの遺伝子をノックアウトすることでグリコシル化修飾が行われる細胞を含むが、これらに限定されない。
幾つかの実施形態において、本開示は、上記抗ＣＤ７０抗体を調製する方法であって、上記宿主細胞を培養し、そして抗体を精製して回収するステップを含む方法を更に提供する。
幾つかの実施形態において、本開示は、上記の何れか一項に記載の抗ＣＤ７０抗体と、上記抗ＣＤ７０抗体に複合されるエフェクター分子とを含み、好ましくは、上記エフェクター分子は、放射性同位体、抗腫瘍剤、免疫調節剤、生物反応修飾剤、レクチン、細胞毒性薬物、発色団、蛍光団、化学発光化合物、酵素、金属イオン、及びそれらの任意の組み合わせから選ばれる免疫複合体を更に提供する。
幾つかの実施形態において、本開示は、治療有効量の上記の何れか一項に記載の抗ＣＤ７０抗体、又は上記核酸分子、又は上記免疫複合体と、１種又はそれ以上の薬学的に許容されるベクター、希釈剤又は賦形剤とを含む医薬組成物を更に提供する。
幾つかの実施形態において、本開示は、免疫検出又はＣＤ７０の測定に用いられる方法であって、上記の何れか一項に記載の抗ＣＤ７０抗体を対象又は対象からのサンプルに接触させるステップを含む方法を更に提供する。
幾つかの実施形態において、本開示は、上記の何れか一項に記載の抗ＣＤ７０抗体又は免疫複合体を含む試薬キットを更に提供する。
幾つかの実施形態において、本開示は、疾患又は病状を予防又は治療する方法であって、治療有効量の上記の何れか一項に記載の抗ＣＤ７０抗体、又は上記核酸分子、又は上記医薬組成物、又は上記免疫複合体を対象に投与することを含む方法を更に提供する。
幾つかの実施形態において、本開示は、疾患又は病状を予防又は治療するための薬剤の調製における上記の何れか一項に記載の抗ＣＤ７０抗体、又は上記核酸分子、又は上記医薬組成物、又は上記免疫複合体の用途を更に提供する。
幾つかの実施形態において、本開示は、疾患又は病状を予防又は治療するための薬剤としての上記の何れか一項に記載の抗ＣＤ７０抗体、又は上記核酸分子、又は上記医薬組成物、又は上記免疫複合体を提供する。
幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の疾患又は病状は、ＣＤ７０に関連する疾患又は病状である。幾つかの実施形態において、上記疾患又は病状は、ＣＤ７０の高発現が対象に有害な疾患又は病状である。幾つかの実施形態において、上記疾患又は病状は腫瘍、自己免疫性疾患又は感染性疾患である。幾つかの実施形態において、上記腫瘍は、頭頸部扁平上皮がん、頭頸部がん、脳がん、神経膠腫、多形性膠芽腫、神経芽細胞腫、中枢神経系がん、神経内分泌腫瘍、咽頭がん、鼻咽頭がん、食道がん、甲状腺がん、悪性胸膜中皮腫、肺がん、乳がん、肝がん、肝胆嚢がん、膵臓がん、胃がん、消化管がん、腸がん、結腸がん、大腸がん、腎がん、明細胞腎細胞がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膀胱がん、前立腺がん、精巣がん、皮膚がん、黒色腫、白血病、リンパ腫、骨がん、軟骨肉腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、クルッケンベルグ腫瘍、骨髄増殖性腫瘍、扁平上皮がん、ユーイング肉腫、全身性軽鎖アミロイド症及びメルケル細胞がんから選ばれ、別の幾つかの実施形態において、上記リンパ腫は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、縦隔原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、Ｔ細胞／組織球に富む大細胞型Ｂ細胞リンパ腫及びリンパ形質細胞性リンパ腫から選ばれ、上記肺がんは、非小細胞肺がんと小細胞肺がんから選ばれ、上記白血病は、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病及び骨髄細胞白血病から選ばれる。幾つかの実施形態において、上記自己免疫性疾患は関節リウマチ、乾癬、関節症性乾癬、乾癬、皮膚炎、全身性強皮症、全身性強皮症及び硬化症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、Ｃｒｏｈｎ病、潰瘍性結腸炎、呼吸窮迫症候群、髄膜炎、脳炎、ブドウ膜炎、糸球体腎炎、湿疹、喘息、動脈硬化、白血球接着不全症、多発性硬化症、Ｒａｙｎａｕｄ症候群、Ｓｊｏｇｒｅｎ症候群、若年性糖尿病、Ｒｅｉｔｅｒ病、Ｂｅｈｃｅｔ病、免疫複合体型腎炎、ＩｇＡ腎疾患、ＩｇＭ多発性神経症、免疫により仲介される血小板減少症（例えば、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病）、溶血性貧血、重症筋無力症、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ（ＲＡ）、アトピー性皮膚炎、天疱瘡、Ｇｒａｖｅｓ病、橋本甲状腺炎、Ｗｅｇｅｎｅｒ肉芽腫、Ｏｍｅｎｎ症候群、慢性腎不全、急性伝染性単球増加症、多発性硬化症、ＨＩＶ及び疱疹ウィルスに関連する疾患、重症急性呼吸器症候群と網脈絡膜炎（ｃｈｏｒｅｏｒｅｔｉｎｉｔｉｓ）、及びウィルス感染による免疫性疾患（例えば、Ｂ細胞がエボラウィルス（ＥＢＶ）で感染されることで引き起こされ、又は仲介される疾患）から選ばれる。幾つかの実施形態において、疾患又は病状は、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、腎細胞がん、転移性腎細胞がん、関節リウマチ及び乾癬である。
幾つかの実施形態において、上記治療有効量は、単位用量の組成物に０．１～３０００ ｍｇの上記抗ＣＤ７０抗体、又は上記核酸分子、又は上記免疫複合体、又は上記医薬組成物が含まれることである。幾つかの実施形態において、上記治療は、治療有効量の第２治療剤を対象に投与することを更に含む。
抗ＣＤ７０抗体がＣＤ７０陽性７８６－Ｏ細胞と結合する実験結果を示し、そのうち、図１Ａは、抗ＣＤ７０抗体がＣＤ７０陽性７８６－Ｏ細胞と結合する実験結果図であり、図１Ｂは、非フコシル化抗ＣＤ７０抗体がＣＤ７０陽性７８６－Ｏ細胞と結合する実験結果図である。 抗ＣＤ７０抗体がＣＤ７０陽性Ｒａｊｉ細胞と結合する実験結果を示し、そのうち、図２Ａは、抗ＣＤ７０抗体がＣＤ７０陽性Ｒａｊｉ細胞と結合する実験結果図であり、図２Ｂは、非フコシル化抗ＣＤ７０抗体がＣＤ７０陽性Ｒａｊｉ細胞と結合する実験結果図である。 ｈｕＢ７００２がヒト、サル及びマウスＣＤ７０タンパク質と結合するＥＬＩＳＡ実験結果を示す。 ｈｕＢ１０１０がヒト、サル及びマウスＣＤ７０タンパク質と結合するＥＬＩＳＡ実験結果を示す。 ｈｕＦ４０１１がヒト、サル及びマウスＣＤ７０タンパク質と結合するＥＬＩＳＡ実験結果を示す。 抗ＣＤ７０抗体がＣＤ２７とＣＤ７０陽性細胞との結合を遮断する実験結果を示す。 非フコシル化抗ＣＤ７０抗体がＣＤ２７とＣＤ７０陽性細胞との結合を遮断する実験結果を示す。 抗ＣＤ７０抗体がＨＴ１０８０／ＣＤ２７細胞によるＩＬ－８の分泌を阻害する実験結果を示す。 非フコシル化抗ＣＤ７０抗体がＨＴ１０８０／ＣＤ２７細胞によるＩＬ－８の分泌を阻害する実験結果を示す。 抗ＣＤ７０抗体の７８６－Ｏ細胞に対する体外ＡＤＣＣ（ＮＫ９２）の実験結果を示す。 抗ＣＤ７０抗体の７８６－Ｏ細胞に対する体外ＡＤＣＣ（ＰＢＭＣ）の実験結果を示す。 抗ＣＤ７０抗体のＲａｊｉ細胞に対する体外ＣＤＣの実験結果を示す。 非フコシル化抗ＣＤ７０抗体のＲａｊｉ細胞に対する体外ＣＤＣの実験結果を示す。 抗ＣＤ７０抗体の７８６－ＯとＲａｊｉ細胞に対する体外ＡＤＣＰの実験結果を示し、そのうち、図１４Ａは抗ＣＤ７０抗体の７８６－Ｏ細胞に対するＡＤＣＰの実験結果図であり、図１４Ｂは抗ＣＤ７０抗体のＲａｊｉ細胞に対するＡＤＣＰの実験結果図である。 抗ＣＤ７０抗体のＴｒｅｇ細胞に対する体外の阻害実験結果を示す。 ７８６－Ｏ細胞の抗ＣＤ７０抗体に対する内在化実験結果を示す。 抗ＣＤ７０抗体のマウスＲａｊｉモデルにおける体内薬効実験結果を示す。 非フコシル化の抗ＣＤ７０抗体のマウスＲａｊｉモデルにおける体内薬効実験結果を示す。
発明の詳細な説明
用語（定義）
本開示が更に容易に理解されるように、以下、幾つかの技術・科学用語を具体的に定義する。本明細書で別途明示的に定義されていない限り、本明細書に使用される他の技術・科学用語の全ては、当業者に通常理解されている意味を持っている。
本開示に用いられるアミノ酸の３文字コードと１文字コードは、Ｊ．ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ， ２４３， ｐ３５５８（１９６８）に記載される通りである。
本開示の「抗体」という用語は、所望の抗原結合活性が示されれば、最も広い意味で使用され、種々の抗体構造をカバーしており、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、全長抗体又はその抗原結合断片（「抗原結合部分」とも呼ばれる）を含むが、これらに限定されない。天然全長抗体は、ジスルフィド結合で互いに接続される少なくとも２つの重鎖と２つの軽鎖を含む免疫グロブリン（Ｉｇ）である。免疫グロブリンは、重鎖定常領域のアミノ酸組成と配列順序が異なるので、その抗原性も異なる。これにより、免疫グロブリンは、５種類に分けられ、又は、免疫グロブリンのアイソタイプ、即ち、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥと呼ばれることができ、その対応する重鎖は、それぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖及びε鎖である。同一種類のＩｇは、そのヒンジ領域のアミノ酸組成及び重鎖ジスルフィド結合の数と位置の差によって、更に異なるサブクラスに分けることができ、例えば、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に分けられてもよい。軽鎖は、定常領域によって、κ鎖又はλ鎖に分けられる。５種類のＩｇのそれぞれは、κ鎖又はλ鎖を有してもよい。
抗体重鎖及び軽鎖は、Ｎ末端に近い約１１０個のアミノ酸配列の変化が大きくて、可変領域（Ｆｖ領域と略す）となり、Ｃ末端に近い残りのアミノ酸配列が比較的に安定的で、定常領域となる。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨと略す）と重鎖定常領域（ＣＨと略す）からなる。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３という３つのドメインを含む。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬと略す）と軽鎖定常領域（ＣＬと略す）からなる。重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、超可変領域（相補性決定領域とも呼ばれ、ＣＤＲ又はＨＶＲと略す）と、配列が比較的保存的な骨格領域（フレームワーク領域とも呼ばれ、ＦＲと略す）とを含む。それぞれのＶＬとＶＨは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４という順に配列される３つのＣＤＲと４つのＦＲからなる。軽鎖の３つのＣＤＲ領域は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を指し、重鎖の３つのＣＤＲ領域は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を指す。
本開示の抗体は、マウス抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体を含む。
「マウス抗体」という用語は、本開示においてこの分野の知識と技術により調製された抗原（例えば、ヒトＣＤ７０）に対するマウスモノクローナル抗体である。例えば、ＣＤ７０抗原を試験対象に注射した後、所望の配列又は機能特性を持つ抗体を発現したハイブリドーマを単離する。本開示の一好ましい実施形態において、上記マウス抗ＣＤ７０抗体又はその抗原結合断片は、マウスκ、λ鎖若しくはその変異体の軽鎖定常領域を更に含み、又は、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはその変異体の重鎖定常領域を更に含んでもよい。
「キメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、マウス抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域と融合してなる抗体であり、マウス抗体により誘発された免疫応答反応を低減することができる。通常、キメラ抗体を作成するには、まず、マウス特異的モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作成してから、マウスハイブリドーマ細胞から可変領域遺伝子をクローニングし、更に必要に応じてヒト抗体の定常領域遺伝子をクローニングし、マウス可変領域遺伝子とヒト定常領域遺伝子とをキメラ遺伝子になるように連結した後、発現ベクターに挿入し、最後に真核細胞系又は原核細胞系においてキメラ抗体分子を発現する。本開示の一好ましい実施形態において、上記キメラ抗体の抗体軽鎖は、ヒトκ、λ鎖又はその変異体の軽鎖定常領域を更に含む。上記ＣＤ７０キメラ抗体の抗体重鎖は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はその変異体の重鎖定常領域を更に含み、好ましくはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４重鎖定常領域を含み、又はアミノ酸変異（例えば、Ｌ２３４Ａ及び／又はＬ２３５Ａ変異、及び／又はＳ２２８Ｐ変異、２６５Ａ及び／又は２９７Ａ）のＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４変異体を使用する。
「ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、ＣＤＲ移植抗体（ＣＤＲ－ｇｒａｆｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）とも呼ばれ、マウスのＣＤＲ配列をヒトの抗体可変領域フレームワーク、即ち、異なる種類のヒト生殖細胞系の抗体フレームワーク配列に移植して発生された抗体を指す。キメラ抗体が大量のマウスタンパク質成分を持つことにより誘導された異種反応性を克服することができる。このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系抗体遺伝子配列を含む共通ＤＮＡデータベース又は開示された参考文献から取得することができる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系配列データベースから取得し、及びＫａｂａｔ， Ｅ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， １９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎから見出すことができる。抗体免疫原性の低下に伴う活性の低下を回避するために、上記ヒト抗体可変領域フレームワーク配列に対して最も少ない逆変異又は復帰変異を行うことにより、活性を保ったり、向上させたりすることができる。本開示のヒト化抗体は、更に酵母菌で提示される、ＣＤＲに対して親和性成熟変異を行ったヒト化抗体も含む。
本開示の一実施形態において、上記抗体又はその抗原結合断片は、ヒト又はマウスκ、λ鎖又はその変異体の軽鎖定常領域を更に含み、或いはヒト又はマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はその変異体の重鎖定常領域を更に含んでもよく、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４重鎖定常領域を含み、或いは、アミノ酸変異（例えば、Ｌ２３４Ａ及び／又はＬ２３５Ａ変異、及び／又はＳ２２８Ｐ変異、２６５Ａ及び／又は２９７Ａ）のＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４変異体を使用してもよい。
本開示に記載されるヒト抗体重鎖定常領域及びヒト抗体軽鎖定常領域の「通常変異体」は、従来技術に開示された抗体可変領域の構造と機能を変更しないヒト由来の重鎖定常領域又は軽鎖定常領域の変異体を指し、例示的な変異体は、重鎖定常領域に対して部位特異的改変とアミノ酸置換を行ったＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４重鎖定常領域変異体を含み、具体的な置換は、例えば、従来技術における既知のＹＴＥ変異、Ｌ２３４Ａ及び／又はＬ２３５Ａ変異、Ｓ２２８Ｐ変異、２６５Ａ（例えば、Ｄ２６５Ａ）及び／又は２９７Ａ（例えば、Ｎ２９７Ａ）、及び／又はｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ構造を得た変異（抗体重鎖にｋｎｏｂ－Ｆｃとｈｏｌｅ－Ｆｃの組み合わせを付与する）であり、これらの変異は、抗体可変領域の機能を変更せずに、抗体に新しい性能を付与することが確認された。
「ヒト抗体」（ＨｕＭＡｂ）、「ヒト化抗体」、「全ヒト抗体」、「完全なヒト抗体」は互いに交換して使用してもよく、ヒト由来の抗体であってもよく、又は１種のトランスジェニック生体から得られた抗体であってもよく、当該トランスジェニック生体は、抗原の刺激に応答して特異性ヒト抗体が生成されるように「改変」されており、且つこの分野で知られている任意の方法で生成することができる。幾つかの技術において、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子座の要素が胚性幹細胞株に由来する生体の細胞株に導入され、これらの細胞株における内因性重鎖及び軽鎖遺伝子座が標的として破壊される。トランスジェニック生物は、ヒト抗原に対する特異的なヒト抗体を合成することができ、且つ当該生物は、ヒト抗体－分泌ハイブリドーマの産生に用いることができる。ヒト抗体は、重鎖と軽鎖が１つ又はそれ以上のヒトＤＮＡ由来のヌクレオチド配列によりコードされた抗体であってもよい。完全なヒト抗体は、遺伝子又は染色体トランスフェクション方法及びファージディスプレイ技術により構築されてもよく、或いは、体外で活性化されたＢ細胞で構築されてもよく、これらは全てこの分野で知られているものである。
「全長抗体」、「完全な抗体」、「完全抗体」及び「全抗体」という用語は、本明細書で互いに交換して使用してもよく、実質的に完全な形式の抗体を指し、以下定義される抗原結合断片と区別するものである。当該用語は、特に、軽鎖及び重鎖が定常領域を含む抗体を指す。
本開示の「抗体」は、「全長抗体」及びその「抗原結合断片」を含む。
幾つかの実施形態において、本開示の全長抗体は、上記表１、表２及び表３における軽、重鎖可変領域の組み合わせがそれぞれ軽、重鎖定常領域に接続されてから形成された全長抗体を含む。当業者は、実際の必要に応じて、異なる抗体由来の軽鎖定常領域、重鎖定常領域、例えば、ヒト抗体由来の軽鎖定常領域と重鎖定常領域を選択することができる。また、表１、表２及び表３における異なる軽鎖可変領域と重鎖可変領域の組み合わせは、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、又はｓｃＦｖやＦａｂを含む他の抗原結合断片形態を形成することができる。
「抗原結合断片」又は「機能断片」又は「抗原結合部分」という用語は、抗原（例えば、ＣＤ７０）に特異的に結合する能力が保たれた完全な抗体の１つ又はそれ以上の断片を指す。全長抗体の断片により抗体の抗原結合機能を果たすことができることが示されている。例示的に、「抗原結合断片」という用語に含まれる結合断片の実例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる１価断片であるＦａｂ断片と、（ｉｉ）ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む２価断片であるＦ（ａｂ’）２断片と、（ｉｉｉ）ＶＨとＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片と、（ｉｖ）抗体の単アームのＶＨとＶＬドメインからなるＦｖ断片と、（ｖ）ＶＨとＶＬにより鎖間ジスルフィド結合で形成された安定的な抗原結合断片であるｄｓＦｖと、（ｖｉ）ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂなどの断片を含む二重抗体、二重特異性抗体及び多重特異性抗体と、を含む。なお、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬとＶＨは、分離した遺伝子でコードされるが、組換え法により、この２つのドメインは、それらを単一のタンパク質鎖にすることが可能な人工ペプチドリンカーにより結合することができ、そのうち、ＶＬとＶＨ領域はペアになって１価分子を形成し、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と呼ばれる（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ． （１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２： ４２３－４２６、及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ８５： ５８７９－５８８３）を参照）。このような単鎖抗体も、抗体の「抗原結合断片」という用語に含まれる。このような抗体断片は、当業者に知られている従来の技術により得られ、また、完全な抗体と同じように、断片が機能性によってスクリーニングされる。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術により、又は、完全な免疫グロブリンを酵素的若しくは化学的に切断することにより産生することができる。抗体は、異なるアイソタイプの抗体であってもよく、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４アイソフォーム）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ抗体である。
「アミノ酸差異」又は「アミノ酸変異」という用語は、元のタンパク質又はポリペプチドと比べ、変異体のタンパク質又はポリペプチドに、元のタンパク質又はポリペプチドの配列に発生された１つ、２つ、３つ又はそれ以上のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を含むアミノ酸の変化又は変異があることを指す。
「抗体フレームワーク」又は「ＦＲ領域」という用語は、可変ドメインＶＬ又はＶＨの一部であって、当該可変ドメインの抗原結合環（ＣＤＲ）のステントとして用いられるものを指す。実質的に、それは、ＣＤＲを有しない可変ドメインである。
「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」又は「高変領域」という用語は、抗体の可変ドメインにおいて抗原結合を促進する主な６つの高変領域の１つを指す。通常、それぞれの重鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）があり、それぞれの軽鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）がある。「Ｋａｂａｔ」番号付け規則（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤを参照）、「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付け規則（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．、（１９９７）ＪＭＢ ２７３：９２７－９４８を参照）及びＩｍＭｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）番号付け規則（Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ．Ｐ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ、７、１３２－１３６（１９９９）；Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍ．Ｐ． ｅｔ ａｌ．、Ｄｅｖ． Ｃｏｍｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２７、５５－７７（２００３）を参照）などを含む様々な公知の方案の何れか１つによって、ＣＤＲのアミノ酸配列境界を決定することができる。例えば、典型的な書式では、Ｋａｂａｔ規則によれば、上記重鎖可変領域（ＶＨ）中のＣＤＲアミノ酸残基の番号は３１～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）であり、軽鎖可変領域（ＶＬ）中のＣＤＲアミノ酸残基の番号は２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）である。Ｃｈｏｔｈｉａ規則によれば、ＶＨ中のＣＤＲアミノ酸の番号は２６～３２（ＨＣＤＲ１）、５２～５６（ＨＣＤＲ２）及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）であり、且つ、ＶＬ中のアミノ酸残基の番号は２６～３２（ＬＣＤＲ１）、５０～５２（ＬＣＤＲ２）及び９１～９６（ＬＣＤＲ３）である。ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの両方を組み合わせたＣＤＲ定義によって、ＣＤＲは、ヒトＶＨ中のアミノ酸残基２６～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）と９５～１０２（ＨＣＤＲ３）及びヒトＶＬ中のアミノ酸残基２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）と８９～９７（ＬＣＤＲ３）により構成される。ＩＭＧＴ規則によれば、ＶＨ中のＣＤＲアミノ酸残基の番号は大体、２６～３５（ＣＤＲ１）、５１～５７（ＣＤＲ２）及び９３～１０２（ＣＤＲ３）であり、ＶＬ中のＣＤＲアミノ酸残基の番号は大体、２７～３２（ＣＤＲ１）、５０～５２（ＣＤＲ２）及び８９～９７（ＣＤＲ３）である。ＩＭＧＴ規則によれば、抗体のＣＤＲ領域は、プログラムＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐ Ａｌｉｇｎによって決定することができる。ＡｂＭ規則によれば、ＶＨ中のＣＤＲアミノ酸の番号は、２６～３２（ＨＣＤＲ１）、５０～５８（ＨＣＤＲ２）及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）であり、且つ、ＶＬ中のアミノ酸残基の番号は、２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）である。特に説明のない限り、本開示の抗体可変領域及びＣＤＲ配列は何れも、「Ｋａｂａｔ」番号付け規則に対応する。
「エピトープ」又は「抗原決定基」という用語は、抗原における抗体に特異的に結合する部位（例えば、ＣＤ７０分子における特定部位）を指す。エピトープは通常、独特な空間配座で少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個の連続的又は非連続的なアミノ酸を含む。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６６巻、Ｇ． Ｅ． Ｍｏｒｒｉｓ、Ｅｄ． （１９９６）を参照する。
「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合」及び「特異的に結合」という用語は、予め決定された抗原上のエピトープへの抗体の結合を指す。通常、抗体は、約１０－８ Ｍ未満、例えば、約１０－９ Ｍ、１０－１０ Ｍ、１０－１１ Ｍ、１０－１２ Ｍ未満又はそれ以下の親和性（ＫＤ）で結合される。
「ＫＤ」という用語は、特定の抗体－抗原が互いに作用する解離平衡定数を指す。通常、本開示の抗体は、約１０－８ Ｍ未満、例えば、約１０－９ Ｍ又は１０－１０ Ｍ未満の解離平衡定数（ＫＤ）でＣＤ７０に結合し、上記ＫＤ値は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によりＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器において測定される。
「競合」という用語は、同じエピトープの抗原結合タンパク質の競合（例えば、抗原結合タンパク質の中和又は抗体の中和）に利用される場合に、抗原結合タンパク質間の競合を指し、下記の測定法により測定される。上記測定法において、検出待ちの抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその免疫学的機能断片）により、参照抗原結合タンパク質（例えば、リガンド又は参照抗体）と共通抗原（例えば、ＣＤ７０抗原又はその断片）との特異的結合を防止又は阻害（例えば、低減）する。様々な競合的結合測定は、１つの抗原結合タンパク質が別の抗原結合タンパク質と競合しているかを確定するために利用することができ、これらの測定は、例えば、固相直接又は間接放射免疫測定（ＲＩＡ）、固相直接又は間接酵素免疫測定（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合測定（例えば、Ｓｔａｈｌｉ ｅｔ ａｌ．， １９８３， Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９： ２４２－２５３を参照）、固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（例えば、Ｋｉｒｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３７： ３６１４－３６１９を参照）、固相直接標識測定、固相直接標識サンドイッチ測定（例えば、ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ， １９８８， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（抗体、実習マニュアル）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照）、Ｉ－１２５マーカーを用いる固相直接標識ＲＩＡ（例えば、Ｍｏｒｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｍｏｌｅｃ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２５： ７－１５を参照）、固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（例えば、Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７６： ５４６－５５２を参照）、及び直接標識するＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３２： ７７－８２）である。通常、上記測定法は、未標識の検出抗原結合タンパク質及び標識した参照抗原結合タンパク質の何れか１つを担持した固相表面又は細胞に結合する精製した抗原の使用に関わっている。測定される抗原結合タンパク質の存在下で固相表面又は細胞に結合する標識量を測定することにより、競合的阻害を測定する。通常、測定される抗原結合タンパク質は過剰に存在する。競合的測定（競合的抗原結合タンパク質）により同定される抗原結合タンパク質は、参照抗原結合タンパク質と同一のエピトープに結合する抗原結合タンパク質と、参照抗原結合タンパク質の結合エピトープに十分に近い隣接エピトープに結合する抗原結合タンパク質とを含み、上記２つのエピトープは空間的に互いに干渉しながら結合を行う。本明細書の実施例には、競合的結合を測定するための方法の他の詳細な資料が提供される。通常、競合している抗原結合タンパク質は過剰に存在する場合に、少なくとも４０～４５％、４５～５０％、５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％又は７５％以上の参照抗原結合タンパク質と共通抗原との特異的結合を阻害（例えば、低減）することになる。ある場合に、結合は、少なくとも８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、９５～９７％又は９７％以上阻害される。
本明細書に使用される「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を指す。核酸分子は、単鎖又は二重鎖であってもよく、好ましくは、二重鎖ＤＮＡ又は単鎖ｍＲＮＡ又は修飾されたｍＲＮＡである。核酸が別の核酸配列と共に機能的関係に置かれる場合、核酸は「効果的に連結されている」。例えば、プロモーター又はエンハンサーがコード配列の転写に影響を与えると、プロモーター又はエンハンサーは、上記コード配列に効果的に連結されている。
アミノ酸配列の「同一性」とは、アミノ酸配列のアライメント過程において（必要に応じて、配列同一性の百分率が最も大きく達成されるようにギャップを導入し、且つ、何れの保存的置換も配列同一性の一部とは見なされない）、第１配列における第２配列中のアミノ酸残基と同様のアミノ酸残基の百分率である。アミノ酸の配列同一性の百分率を測定するために、アラインメントは、この分野で知られている複数の方式により実現することができ、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）などのソフトウェアが使用される。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、測定・アラインメントに適用されるパラメータを決定することができる。
「フコシル化」又は「フコシル化の」又は「フコースによるグリコシル化修飾」という用語は、抗体のペプチド鎖に付着されたオリゴ糖にフコース残基があることを指す。フコシル化は、糖タンパク質翻訳後修飾の一般的なプロセスの一つであり、コアフコシル化に関連する代表的な酵素遺伝子には、ＧＭＤ（ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼ）遺伝子とＦｕｔ８（ｆｕｔ８、ＦＵＴ８、α－１，６－フコシルトランスフェラーゼ）遺伝子があり、この２つの遺伝子の発現を阻害し、又はＦｕｔ８ノックアウト型ＣＨＯ宿主細胞を構築することにより、コアフコシル化レベルを効果的に調節することができる（ＹＡＭＡＮＥ－ＯＨＮＵＫＩ ｅｔ ａｌ．， 「Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ＦＵＴ８ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ： ａｎ ｉｄｅａｌ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌｌｉｎｅ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｄｅｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．」， ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＢＩＯＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ， ２００４， ｐ６１４～６２２）。通常、フコシル化抗体は、Ｆｃ領域のＮ－オリゴ糖において、コアＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基（例えば、ヒトＩｇＧ１ ＦｃのＡｓｎ２９７位置（ＥＵ番号付け規則に対応する））でα－１，６－フコースを含む。
「低フコシル化」の抗体は、Ｆｃ領域に付着した炭水化物の構造がフコースにより低くグリコシル化修飾された抗体を指し、「非フコシル化」又は「無フコシル化」は、Ｆｃ領域に付着した炭水化物の構造がフコースによりグリコシル化修飾されていない抗体を指す。抗体のフコシル化レベルは、この分野で知られている方法により全てのオリゴ糖を測定し、更にフコシル化オリゴ糖の百分率を確定することができる。この分野で知られているフコシル化測定方法は、ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、及び質量分析法などを含むが、これらに限定されない。例えば、親水性相互作用クロマトグラフィー（又は親水性相互作用液体クロマトグラフィー、ＨＩＬＩＣ）により抗体のフコシル化のレベルを測定し、例えば、ペプチド－Ｎ－デキストラナーゼＦにより試料に変性処理を行うことでＮ－で連結されたグリカンを切断し、その後、Ｎ－で連結されたグリカンにおけるフコースの含有量を分析する。本開示の幾つかの実施形態において、本開示の低フコシル化抗体は、少なくとも８０％の重鎖がフコースによりグリコシル化修飾されていない抗体であり、例えば、少なくとも８０～９５％、９０～９５％、９５～１００％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の抗体重鎖は、フコースによりグリコシル化修飾されていない。本開示において、特に説明のない限り、「非フコシル化」は１００％の重鎖がフコースによりグリコシル化修飾されていない抗体を指す。
低フコシル化又は非フコシル化の抗体は、この分野における公知の方法により調製することができる。例えば、抗体における１つ又は複数の炭水化物部分の添加、移動又は欠失により、例えば、フコシダーゼで抗体のフコース残基を切断する（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍ． １４：５５１６を参照）ことにより調製される。フコシル化が低減された抗体は、また、グリコシル化の組成を変更することによりグリコシル化のレベルを変更することができ、例えば、Ｎ２９７残基でそれぞれのＦｃ断片に取り付けられたグリカンモジュールを修飾することにより調製される（Ｎａｔｓｕｍｅ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． Ｄｅｖｅｌ． Ｔｈｅｒ． ３：７）。抗体配列を変更せずに調製してもよく、例えば、抗体のグリコシル化モードが変更された細胞により低フコシル化又は非フコシル化抗体を発現することができ、例えば、遺伝子工学で改変されたグリコシル化工学的な細胞により調製することを含む（例えば、Ｈｓｅ ｅｔ ａｌ．、（１９９７）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：９０６２－９０７０、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．、（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３， ８４２－８４４）。種々のグリコシル化工学的な細胞は、既にこの分野で開示されており、例えば、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＦＵＴ８、（α－（１，６）フコシルトランスフェラーゼ）無しの細胞系Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５及びＭｓ７０９など（Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ８７：６１４、米国特許２００４０１１０７０４を参照）、フコースをＡｓｎ（２９７）に連結された糖質に取り付ける能力が低減されたＣＨＯ細胞系Ｌｅｃ１３（ＷＯ ０３／０３５８３５を参照）、フコースをＮ－アセチルグルコサミン（抗体のＦｃ領域に結合する）に添加する活性が小さい又はないラット骨髄腫細胞株ＹＢ２／０（ＥＰ １１７６１９５を参照）、修飾されたグリコシル化モードを持つ抗体を製造するための植物細胞（米国特許ＵＳ２０１２０２７６０８６を参照）である。また、ＧＤＰ－６－デオキシ－Ｄ－リキソース－４－ヘキソースを基質とする酵素（例えば、ＧＤＰ－６－デオキシ－Ｄ－リキソース－４－ヘキソース還元酵素（ＲＭＤ））をコードする組換え遺伝子付きの細胞も、低フコシル化又は非フコシル化抗体を製造することができる（米国特許ＵＳ８６４２２９２を参照）。本開示の幾つかの具体的な実施形態において、例えば、実施例５に記載される方法により非フコシル化抗体が調製されて得られる。
「抗体依存性細胞仲介性の細胞毒性」又は「ＡＤＣＣ」は、細胞仲介性の反応を指し、ここで、ＦｃＲを発現した非特異的細胞毒性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ細胞）は、標的細胞に結合された抗体を認識し、その後、標的細胞の溶解を引き起こす。ＡＤＣＣを調節する初代細胞、ＮＫ細胞はＦｃｙＲＩＩＩしか発現しないが、単核細胞はＦｃｙＲＩ、ＦｃｙＲＩＩ及びＦＣＹＲＩＩＩを発現する。標的分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、体内外のＡＤＣＣの測定を行うことができる（例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（ＰＮＡＳＵＳＡ ９５：６５２－６５６（１９９８））、米国特許号ＵＳ５５００３６２、ＵＳ５８２１３３７などにおける記載）。本開示の幾つかの実施例において、上記ＡＤＣＣは、本開示の試験例６の方法によって検出される。
「抗体依存性細胞貪食作用」又は「ＡＤＣＰ」は、貪食細胞（例えば、マクロファージ細胞、好中球及び樹状細胞）の内在化により、抗体で被覆された標的細胞又はビリオンを取り除くメカニズムである。内在化された抗体で被覆された標的細胞又はビリオンは、ファゴソームという小嚢に含まれ、上記小嚢はその後、１つ又は複数のリソソームと融合することで、ファゴリソソームを形成する。ＡＤＣＰは、マクロファージ細胞をエフェクター細胞として使用する体外細胞毒性測定とビデオ顕微鏡法（ｖｉｄｅｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）により評価することができる（例えば、ｖａｎ ＢｉｊらによるＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、第５３巻、第４号、２０１０年１０月、６７７～６８５ページ）。本開示の幾つかの実施例において、上記ＡＤＣＰは、本開示の試験例８の方法によって検出される。
「補体依存性細胞毒性」又は「ＣＤＣ」は、補体が関与する細胞毒性作用を指し、即ち、抗体と細胞又はビリオンにおける対応する抗原との結合により、複合体を形成して補体を活性化する古典的経路であり、形成された細胞膜傷害複合体は、標的細胞に対して溶解効果を果たす。ＣＤＣは、体外測定により（例えば、正常なヒト血清を補体源としてＣＤＣを測定する）又はＣ１ｑ濃度シリーズで評価することができる。ＣＤＣ活性の低下（例えば、ポリペプチド又は抗体への第２変異の導入によるＣＤＣ活性の低下）は、同じ測定法でポリペプチド又は抗体のＣＤＣ活性と、第２変異を有しない親ポリペプチド又は抗体のＣＤＣ活性とを比較することにより測定することができる。抗体によるＣＤＣの誘導能力を評価するために、例えば、Ｒｏｍｅｕｆらにより記載された測定方法（Ｒｏｍｅｕｆ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ． ２００８Ｍａｒ， １４０（６）：６３５－４３）により測定することができる。本開示の幾つかの実施例において、上記ＣＤＣは、本開示の試験例７の方法によって検出される。
「複合体」、「薬物複合体」、「免疫複合体」という用語は、リガンドが安定的な連結ユニットにより生物活性を持つ薬物と連結してなる新規の薬物を指す。例えば、「抗体薬物複合体」（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）は、モノクローナル抗体又は抗体断片を安定的な連結ユニットにより生物活性を持つ毒性薬物と連結するものである。抗体は、直接的に、又はリンカーを介して薬物に複合されてもよい。それぞれの抗体の平均薬物モジュール数は、その範囲が例えば、１つの抗体あたり約０～約２０個の薬物モジュールであってもよく、幾つかの実施形態では、１つの抗体あたり１個～約１０個の薬物モジュールであり、特定の実施形態では、１つの抗体あたり１個～約８個の薬物モジュールである。本開示の抗体－薬物複合体の混合物の組成物は、１つの抗体あたりの平均薬物負荷が約２個～約５個又は約３個～約４個である。
幾つかの実施形態において、免疫複合体を提供する。幾つかの実施形態において、本明細書に開示される免疫複合体は、エフェクター分子に取り付けられる抗体であってもよく、そのうち、抗体は、重鎖と軽鎖を含む抗体であってもよい。幾つかの実施形態において、抗体は抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、二量体、マイクロ抗体、二官能性抗体、二重特異性抗体断片、多量体、及びそれらの任意の組み合わせであってもよい。
本明細書に記載される実施形態において、エフェクター分子は、放射性同位体、抗腫瘍剤、免疫調節剤、生物反応修飾剤、レクチン、細胞毒性薬物、発色団、蛍光団、化学発光化合物、酵素、金属イオン、及びそれらの任意の組み合わせであってもよい。
本開示に記載される抗体又は抗体断片は、任意の方式によりエフェクター分子に複合されてもよい。例えば、抗体又は抗体断片は、化学的方式又は組換えの方式により毒素に取り付けられてもよい。融合物又は複合体を調製する化学的方式は、この分野で知られており、且つ、免疫複合体の調製に用いることができる。複合抗体又は抗体断片及び毒素に用いられる方法は、抗体又は抗体断片の標的分子との結合能力を妨害することなく、抗体と毒素を接続する必要がある。
「細胞毒性薬物」という用語は、細胞の機能を抑制又は防止し、及び／又は細胞の死亡若しくは破壊を引き起こす物質を指す。毒素、化学療法薬などの腫瘍細胞の殺傷に適用可能な化合物を含む。
「毒素」という用語は、細胞の成長や増殖に悪影響を与えることができる任意の物質を指し、細菌、真菌、植物や動物由来の小分子毒素及びその誘導体であってもよく、エキサテカンなどのカンプトテシン誘導体、メイタンシンアルカロイド及びその誘導体（ＣＮ１０１５７３３８４）、例えばＤＭ１、ＤＭ３、ＤＭ４、ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ（ＡＦ）及びその誘導体、例えばＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、３０２４（ＷＯ ２０１６／１２７７９０ Ａ１、化合物７）、ジフテリア毒素、外毒素、リシン（ｒｉｃｉｎ）Ａ鎖、アブリン（ａｂｒｉｎ）Ａ鎖、ｍｏｄｅｃｃｉｎ、α－サルシナ（ｓａｒｃｉｎ）、アレウライツ・フォルディイ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）毒性タンパク質、ジアンシン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）毒性タンパク質、フィトラッカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）毒性タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩとＰＡＰ－Ｓ）、モモルディカ・キャランティア（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）インヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、マイトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）及びトリコセセンス（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）を含む。
「化学療法薬」という用語は、腫瘍の治療に利用可能な化学化合物である。この定義は、がんの成長を促進可能なホルモン効果作用を調節、低減、遮断又は阻害する抗ホルモン剤を更に含み、且つ常に系統的又は全身的治療の形式である。それ自体はホルモンであってもよい。化学療法薬の実例としては、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）などのアルキル化剤；シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）（ＣＹＴＯＸＡＮ(商標)）；ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、インプロスルファン（ｉｍｐｒｏｓｕｌｆａｎ）とピポスルファン（ｐｉｐｏｓｕｌｆａｎ）などのスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン（ｃａｒｂｏｑｕｏｎｅ）、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）とウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）などのアジリジン（ａｚｉｒｉｄｉｎｅ）；アルトレートアミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｍｅｌａｍｉｎｅ）、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドとトリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むアジリジンとｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ；クロラムブシル、クロルナファジン、チョロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、イフォスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード（ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄｓ）；カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、クロロゾトシン（ｃｈｌｏｒｏｚｏｔｏｃｉｎ）、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ニムスチン（ｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ラニムスチン（ｒａｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）などのニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシンＣ（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ｃａｒａｂｉｃｉｎ、カーミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン、アクチノマイシンＤ、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、マーセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎ）、ペプロマイシン（ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ）、ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）、ツベルシジン、ウベニメクス（ｕｂｅｎｉｍｅｘ）、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）などの抗生物質；メトトレキサート、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）などの代謝拮抗剤；デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）などの葉酸アナログ；フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリンアナログ；アンシタビン（ａｎｃｉｔａｂｉｎｅ）、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、６－アザウリジン、カルモフール（ｃａｒｍｏｆｕｒ）、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｔｌｕｒｉｄｉｎｅ）、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、フロキシウリジン、５－ＦＵなどのピリミジンアナログ；カルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、プロピオン酸ドロモスタノロン（ｄｒｏｍｏｓｔａｎｏｌｏｎｇ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、エピチオスタノール（ｅｐｉｔｉｏｓｔａｎｏｌ）、メピチオスタン（ｍｅｐｉｔｉｏｓｔａｎｅ）、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）などのアンドロゲン類；アミノグルテチミド（ａｍｉｎｏｇｌｕｔｅｔｈｉｍｉｄｅ）、ミトタン（ｍｉｔｏｔａｎｅ）、トリロスタン（ｔｒｉｌｏｓｔａｎｅ）などの抗アドレナリン類；ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄなどの葉酸補給剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸（ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）；ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ；デメコルシン；ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；ｅｌｆｏｍｉｔｈｉｎｅ；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）；エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン（ｌｅｎｔｉｎａｎ）；ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）；ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）；ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；モピダモール（ｍｏｐｉｄａｍｏｌ）；ニトラクリン（ｎｉｔｒａｃｒｉｎｅ）；ペントスタチン（ｐｉｎｔｏｓｔａｔｉｎ）；ｐｈｅｎａｍｅｔ；ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）；ポドフィロトキシン（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；２－アセチルヒドラジン；プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）；ＰＳＫ(登録商標)；ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）；シゾフィラン（ｓｉｚｏｆｉｒａｎ）；スピロゲルマニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍ）；テニュアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”－トリクロロトリエチルアミン（ｔｒｉｃｈｌｏｒｒｏｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）；ウレタン（ｕｒｅｔｈａｎ）；ビンデシン；ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）；マンノムスチン；ミトブロニトール（ｍｉｔｏｂｒｏｎｉｔｏｌ）；ミトラクトール；ピポブロマン（ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ）；ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）；パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ(登録商標)，Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）とｄｏｃｅｔａｘｅｌ（ＴＡＸＯＴＥＲＥ(登録商標)，Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）などのタキサン；クロラムブシル；ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンとカルボプラチンなどのプラチナアナログ；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）（ＶＰ－１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）；ナベルビン（ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）；ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ；テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）；ダウノルビシン；アミノプリン；ｘｅｌｏｄａ；イバンドロナート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）；ＣＰＴ－１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン（ＤＭＦＯ）；トレチノインｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎｓ；ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ；及び上記何れかの物質の薬学的に許容される塩、酸又は誘導体を含む。この定義は、ホルモンによる腫瘍への作用を調節又は阻害可能な抗ホルモン製剤を更に含み、例えば、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、ラロキシフェン（ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ）、アロマターゼ阻害剤４（５）－イミダゾリル、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ、ＬＹ１１７０１８、ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅとフェアストン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む抗エストロゲン製剤、フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ニルタミド（ｎｉｌｕｔａｍｉｄｅ）、ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ、ロイプロリド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）とゴセレリン（ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）などの抗アンドロゲン製剤、及び上記何れかの物質の薬学的に許容される塩、酸又は誘導体などである。
一実施形態において、抗体と毒素は何れもタンパク質であり、且つこの分野でよく知られている技術により複合することができる。この分野で開示されている、２つのタンパク質を複合可能な架橋剤が数百種ある。架橋剤は、一般的に、抗体又は毒素における使用又は挿入可能な反応官能基によって選択される。また、反応基がない場合、光反応性架橋剤を使用することができる。ある場合、抗体と毒素との間にイントロンを備える必要があり得る。この分野で知られている架橋剤は、グルタルアルデヒド、アジピミド酸ジメチルとビス（ジアゾベンジジン）のようなホモ二官能性剤、及びｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドとスルホ－ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドのようなヘテロ二官能性剤を含む。
エフェクター分子を抗体断片にカップリングすることに利用可能な架橋剤は、例えば、ＴＰＣＨ（Ｓ－（２－チオピリジニル）－Ｌ－システインヒドラジド）及びＴＰＭＰＨ（Ｓ－（２－チオピリジニル）メルカプト－プロピオニルヒドラジド）を含む。ＴＰＣＨとＴＰＭＰＨは、この前に既に適度な過ヨウ素酸塩処理により酸化された糖タンパク質の炭水化物と部分反応を行うので、架橋剤のヒドラジド部分と過ヨウ素酸塩によるアルデヒドとの間にヒドラゾン結合が形成される。ヘテロ二官能性架橋剤であるＧＭＢＳ（Ｎ－（γ－マレイミドブチリルオキシ）－スクシンイミド）とＳＭＣＣ（スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミド－メチル）シクロヘキサン）は第一アミンと反応するので、マレイミド基が成分に導入される。このマレイミド基は、その後、別の成分における、架橋剤により導入可能なスルフヒドリル基と反応することができるので、成分間に安定的なチオエーテル結合が形成される。成分間の立体障害が何れか１つの成分の活性を妨害する場合、架橋剤により、長いスペーサーアームを成分間に導入することができ、例えば、３－（２－ピリジニルジチオ）プロピオン酸ｎ－スクシンイミジルエステル（ＳＰＤＰ）である。従って、利用できる適当な架橋剤が多くあり、それぞれその最適な免疫複合体の収量への影響によって選択される。
「発現ベクター」という用語は、それに接続された別の核酸を輸送可能な核酸分子を指す。一実施形態において、ベクターは「プラスミド」であり、他のＤＮＡセグメントをそれに接続可能な環状二本鎖ＤＮＡ環を指す。別の実施形態において、ベクターは、他のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに接続可能なウイルスベクターである。本願に開示されるベクターは、それらを導入した宿主細胞において自己複製することができ（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーマル哺乳動物ベクター）、又は、宿主細胞に導入された後、宿主細胞のゲノムに整合されることで、宿主ゲノムと共に複製することができる（例えば、非エピソーマル哺乳動物ベクター）。
従来技術においてよく知られている抗体及び抗原結合断片の産生・精製方法は、例えば、冷泉港の抗体実験技術マニュアルの５～８章及び１５章の通りである。例えば、マウスはヒトＣＤ７０又はその断片により免疫可能であり、得られた抗体は復元、精製されることができると共に、通常の方法によりアミノ酸シークエンシングを行うことができる。抗原結合断片は、同じく通常の方法により調製することができる。開示に記載される抗体又は抗原結合断片は、遺伝子工学的方法により、非ヒトのＣＤＲ領域に１つ又はそれ以上のヒトＦＲ領域が加えられる。ヒトＦＲ生殖細胞系配列は、ＩＭＧＴヒト抗体可変領域生殖細胞系遺伝子データベースとＭＯＥソフトウェアをアラインメントすることにより、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）のホームページであるｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒから取得し、又は免疫グロブリン雑誌である２００１ＩＳＢＮ０１２４４１３５１から得ることができる。
「宿主細胞」という用語は、その中に発現ベクターが導入された細胞を指す。宿主細胞は、細菌、微生物、植物又は動物の細胞を含んでもよい。形質転換しやすい細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）やサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の菌株などの腸内細菌科（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）のメンバー、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのバシラス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）及びインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）を含む。好適な微生物は、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）を含む。好適な動物宿主細胞系は、ＣＨＯ（中国ハムスター卵巣細胞系）、２９３細胞及びＮＳ０細胞を含む。非フコシル化抗体を得るために、ＧｌｕｌとＦｕｔ８遺伝子をノックアウトした宿主細胞を使用することができ、ＧｌｕｌとＦｕｔ８遺伝子をノックアウトしたＣＨＯＫ１細胞を含むが、これらに限定されない。
本開示の工学的な抗体又は抗原結合断片は、通常の方法により調製・精製することができる。例えば、重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列は、クローンニングしてＧＳ発現ベクターに組換えることができる。組換えた免疫グロブリン発現ベクターは、ＣＨＯ細胞を安定してトランスフェクションすることができる。更に好ましい従来技術の一つとして、哺乳類発現系は、特にＦｃ領域の高度に保存的なＮ末端部位において、抗体のグリコシル化を引き起こすことになる。ヒトＣＤ７０に特異的に結合する抗体を発現することにより、安定的なクローンが得られる。陽性のクローンは、バイオリアクターの無血清培地において培養を拡大することで、抗体を製造する。抗体を分泌した培養液は、通常の技術により精製することができる。例えば、調整された緩衝液を含むＡ又はＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムで精製を行う。非特異的に結合された成分を洗い流す。更にｐＨ勾配法により、結合された抗体を溶出し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで抗体断片を検出し、収集する。抗体は、通常の方法によりろ過濃縮することができる。可溶性の混合物及び多量体は、分子ふるい、イオン交換などの通常の方法により除去されてもよい。得られた生成物は、直ちに例えば、－７０℃で冷凍し、又は凍結乾燥しなければならない。
「投与」、「与える」及び「処理」は、動物、ヒト、実験の対象、細胞、組織、器官や生物流体に適用される場合に、外因性薬剤、治療剤、診断薬又は組成物と、動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官や生物流体との接触を意味する。「投与」、「与える」及び「処理」は例えば、治療、薬物動態、診断、研究と実験方法を意味してもよい。細胞の処理は、試薬と細胞との接触、及び試薬と流体との接触を含み、そのうち、上記流体は細胞と接触する。「投与」、「与える」及び「処理」は、また、試薬、診断、結合組成物により、又は別種の細胞を通じて、体外及びインビトロで例えば細胞を処理することを意味する。「処理」はヒト、獣医学又は研究対象に適用される場合に、治療的処理、予防又は予防的措置、研究と診断的応用を意味する。
「治療」は、患者に内用又は外用治療剤、例えば、本開示の何れか１つの結合化合物を含む組成物を与えることを意味し、上記患者は１種又は複数種の疾患症状を有するが、既知の上記治療剤は、これらの症状に対して治療効果を有する。通常、治療される患者又はグループには、１種又は複数種の疾患症状を効果的に緩和する量で治療剤を与えることにより、これらの症状の解消を誘導し、又は臨床的に測定可能な任意の程度まで進行しないようにこれらの症状を抑制する。任意の具体的な疾患症状を効果的に緩和する治療剤の量（「治療有効量」とも呼ばれる）は、患者の疾患状態、年齢と体重、及び薬剤の患者で必要な治療効果を発生させる能力などの複数の要因によって、変化することができる。当該症状の重症度や進行状況を評価するために医者や他のプロのヘルスケアプロバイダによく用いられる何れかの臨床的検出方法により、疾患症状が低減されたか否かを評価することができる。本開示の実施形態（例えば、治療方法や製品）は、各目標疾患症状の緩和において無効であり得るが、この分野で知られている任意の統計学的検定方法、例えば、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定、カイ二乗検定、Ｍａｎｎ及びＷｈｉｔｎｅｙによるＵ検定、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定（Ｈ検定）、Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ－Ｔｅｒｐｓｔｒａ検定とＷｉｌｃｏｘｏｎ検定により、統計学的に有意な数の患者において目標疾患症状を低減可能であることが確認された。
「保存的修飾」又は「保存的置換又は置換」は、類似の特徴（例えば、電荷、側鎖の大きさ、疎水性／親水性、主鎖の立体配座と剛性など）を有する他のアミノ酸でタンパク質中のアミノ酸を置換することで、タンパク質の生物学的活性を変えずに頻繁に変化可能にすることを意味する。当業者は、一般的に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換によって、基本的に生物学的活性が変えられないと分かっている（例えば、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ、Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、第２２４ページ、（第４版）を参照）。また、構造又は機能が類似したアミノ酸の置換は、生物学的活性を破壊する可能性が低い。例示的な保存的置換は、以下の通りである。
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「有効量」又は「有効用量」は、何れか１種又は複数種の有益又は必要な治療結果を得るための必要な薬剤、化合物又は医薬組成物の量を指す。予防的使用に関しては、有益又は所望の結果は、病状、その合併症及び病状の進行中に現れた中間的な病理学的表現型の生化学的、組織学的及び／又は行動的症状を含め、リスクの解消や低減、重症度の軽減又は病状の発作の遅延を含む。治療的応用として、有益又は必要な結果は、様々な本開示の標的抗原関連病状の罹患率の低減又は上記病状の１つ又はそれ以上の症状の改善、病状の治療に必要なその他の薬剤の用量の低減、別の薬剤の治療効果の向上、及び／又は、患者の本開示の標的抗原関連病状の進行の遅延などの臨床的結果を含む。
「外因性」は、場合によって生物、細胞やヒトの体外で発生されたものを意味する。「内因性」は、場合によって細胞、生物やヒトの体内で発生されたものを意味する。
「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド配列間又は２つのポリペプチド間の配列の類似性である。２つの比較される配列における位置が同じ塩基又はアミノ酸モノマーサブユニットに占められる場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれの位置がアデニンに占められる場合、上記分子が当該位置で相同である。２つの配列間の相同性百分率は、２つの配列の共有するマッチング又は相同位置数を比較される位置数で割って１００をかける関数である。例えば、配列の最適アラインメントを行う際に、２つの配列中の１０個の位置に６個がマッチングし、又は相同である場合は、２つの配列が６０％相同であり、２つの配列中の１００個の位置に９５個がマッチングし、又は相同である場合は、２つの配列が９５％相同である。通常、２つの配列をアライメントする際に、最大百分率の相同性が得られるように、比較が行われる。例えば、各参照配列の全長にわたって各配列間の最大マッチングが得られるようにアルゴリズムのパラメータを選択するＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、比較を実行することができる。下記の参考文献は、配列分析によく用いられるＢＬＡＳＴアルゴリズムに言及している。ＢＬＡＳＴアルゴリズム（ＢＬＡＳＴ ＡＬＧＯＲＩＴＨＭＳ）： Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｔ．， （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３－４１０；Ｇｉｓｈ， Ｗ．ｅｔ ａｔ．， （１９９３） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ３：２６６－２７２；Ｍａｄｄｅｎ， Ｔ．Ｌ．ｅｔ ａｔ．， （１９９６） Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６６：１３１－１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｔ．， （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９－３４０２；Ｚｈａｎｇ， Ｊ．ｅｔ ａｔ．， （１９９７） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ７：６４９－６５６。その他、例えば、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴにより提供される通常のＢＬＡＳＴアルゴリズムも、当業者によく知られている。
本明細書に使用される記述である「細胞」、「細胞系」及び「細胞培養物」は互いに交換して使用してもよく、このような名称の全ては子孫を含む。従って、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という単語は、移転数を考慮せずに、初代被検細胞及びそれより誘導された培養物を含む。また、意図する又は意図しない変異のために、何れの子孫も、ＤＮＡ含有量で精確に同じであることがあり得ないと理解すべきである。最初の形質転換細胞からスクリーニングされたものと同様の機能又は生物学的活性を有する変異子孫が含まれる。異なる名称を指す場合は、文脈から明らかに分かる。
本明細書に使用される「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「ＰＣＲ」は、その中の微量の特定部分の核酸、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡが、例えばアメリカ特許番号４，６８３，１９５に記載されるように増幅するプログラム又は技術を指す。一般的に、オリゴヌクレオチドプライマーの設計が可能になるように、目標領域末端からの配列情報又はそれ以外の配列情報を取得する必要があり、これらのプライマーは配列において、増幅待ちのテンプレートの対応する鎖と同様又は類似である。２つのプライマーの５’末端ヌクレオチドは、増幅待ちの材料の末端と一致してもよい。ＰＣＲは、特定のＲＮＡ配列、全ゲノムＤＮＡからの特定ＤＮＡ配列、及び全細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ、ファージ又はプラスミド配列などの増幅に用いることができる。一般的に、Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８７） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｏｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ５１：２６３； ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｅｒｌｉｃｈ，（１９８９） ＰＣＲ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ （Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．）を参照する。本明細書に使用されるＰＣＲは、核酸試験試料を増幅するための核酸ポリメラーゼ反応法の一実例とされるが、唯一の実例ではなく、上記方法は、核酸の特定部分を増幅又は産生するために、プライマーとなる既知の核酸及び核酸ポリメラーゼを用いることを含む。
「単離した」とは、精製状態であり、且つ、この場合、指定された分子に、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物などの他の生物分子、又は、細胞破片や成長培地などの他の材料を実質的に含まないことを意味する。通常、「単離した」という用語は、本明細書に記載されるような化合物の実験や治療用途を顕著に邪魔する量で存在しない限り、これらの材料が全然存在しない、又は水、緩衝液や塩が存在しないことを意味する意図はない。
「任意選択的」又は「任意選択的に」とは、その後に記載されるイベントや環境が発生されてもよいが、必ずしもそうとは限らないことを意味し、この説明は、当該イベントや環境が発生され、又は発生されない場合を含む。
「医薬組成物」は、本明細書に記載される１種又は複数種の化合物又はその生理学的／薬学的に許容される塩又はプロドラッグと、他の化学成分とを含む混合物を表し、上記他の成分は例えば、生理学的／薬学的に許容されるベクターや賦形剤である。医薬組成物は、生体への投与を促進し、活性成分の吸収に寄与して更に生物活性を発揮するためのものである。
「薬学的に許容されるベクター」という用語は、薬剤（例えば、本開示に記載される抗ＣＤ７０抗体又は抗原結合断片）を送達するために製剤に適用される任意の不活性物質を指す。ベクターは、粘着防止剤、結合剤、コーティング、崩壊剤、充填剤や希釈剤、防腐剤（例えば、酸化防止剤、抗菌剤や抗真菌剤）、甘味剤、吸収遅延剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤などであってもよい。好適な薬学的に許容されるベクターの例は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）デキストロース、植物油（例えば、オリーブオイル）、塩水、緩衝液、緩衝塩水、及び糖、ポリオール、ソルビトールや塩化ナトリウムなどの等張剤を含む。
また、本開示は、目標抗原（例えば、ＣＤ７０）陽性細胞に関連する疾患を治療するための薬剤を含み、上記薬剤は、本開示の抗ＣＤ７０抗体又はその抗原結合断片を活性成分として含む。活性成分は、治療有効量で対象に投与され、対象のＣＤ７０陽性細胞に関連する疾患を治療することができる。上記治療有効量は、単位用量の組成物に０．１～３０００ ｍｇの上記のようなヒトＣＤ７０と特異的に結合する抗体を含むことである。
本開示においてＣＤ７０に関連する疾患又は病状は制限がなく、ＣＤ７０に関連する疾患又は病状であればよい。例えば、幾つかの実施形態において、本開示の分子は、例えば、関節リウマチ、自己免疫性脱髄疾患（例えば、多発性硬化、アレルギー性脳脊髄炎）、内分泌性眼症、ブドウ膜網膜炎、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、Ｇｒａｖｅ病、糸球体腎炎、自己免疫性肝（ｈｅｐａｔｏｌｏｇｉｃａｌ）疾患、炎症性腸疾患（例えば、Ｃｒｏｈｎ病、潰瘍性結腸炎、セリアック病）、アナフィラキシー反応、アレルギー反応、Ｓｊｏｇｒｅｎ症候群、１型糖尿病、原発性胆汁性肝硬変、ウェゲナー肉芽腫症、線維筋痛、多発性筋炎、皮膚筋炎、多内分泌機能不全、Ｓｃｈｍｉｄｔ症候群、自己免疫性ブドウ膜炎、Ａｄｄｉｓｏｎ病、腎上腺炎、甲状腺炎、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ甲状腺炎、自己免疫性甲状腺疾患、悪性貧血症、胃萎縮、慢性肝炎、ルポイド肝炎、アテローム性動脈硬化、亜急性皮膚エリテマトーデス、副甲状腺機能低下、Ｄｒｅｓｓｉｅｒ症候群、自己免疫性血小板減少症、特発性血小、板減少性紫斑病、溶血性貧血、尋常性天疱瘡、天疱瘡、疱疹状皮膚炎、円形脱毛症、類天疱瘡、強皮症、全身性進行性硬化症、ＣＲＥＳＴ症候群（石灰沈着、Ｒａｙｎａｕｄ現象、食道蠕動障害、手指硬化症と毛細血管拡張症）、男性と女性の自己免疫性不妊症、強直性脊椎炎、潰瘍性結腸炎、混合性結合組織病、結節性多発動脈炎（ｐｏｌｙａｔｅｒｉｔｉｓ ｎｏｄｏｓａ）、全身性壊死性血管炎、アトピー性皮膚炎、アトピー性鼻炎、Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ症候群、Ｃｈａｇａｓ病、サルコイドーシス、リウマチ熱、喘息、反復流産、抗リン脂質症候群、農夫肺、多形性紅斑、心術後症候群、Ｇｕｓｈｉｎｇ症候群、自己免疫性慢性活動性肝炎、鳥飼育者肺、中毒性表皮壊死症、Ａｌｐｏｒｔ症候群、肺胞炎、アレルギー性肺胞炎、線維化性肺胞炎、間質性肺疾患、結節性紅斑、壊疽性膿皮症、輸血反応、Ｔａｋａｙａｓｕ動脈炎、リウマチ性多発筋痛、側頭動脈炎、住血吸虫症、巨細胞動脈炎（ｇｉａｎｔ ｃｅｌｌ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、回虫症、アスペルギルス症、Ｓａｍｐｔｅｒ症候群、湿疹、リンパ腫様肉芽腫症、ベーチェット病、Ｃａｐｌａｎ症候群、川崎病、デング熱、脳脊髄炎、心内膜炎、心内膜心筋線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑（ｅｒｙｔｈｅｍａ ｅｌｅｖａｔｕｍ ｅｔ ｄｉｕｔｉｎｕｍ）、乾癬、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎、Ｓｈｕｌｍａｎ症候群、Ｆｅｌｔｙ症候群、糸状虫症、毛様体炎、慢性毛様体炎、異色性毛様体炎、Ｆｕｃｈ毛様体炎、ＩｇＡ腎症、Ｈｅｎｏｃｈ－Ｓｃｈｏｎｌｅｉｎ紫斑、移植片対宿主病、移植拒絶反応、心筋症、Ｅａｔｏｎ－Ｌａｍｂｅｒｔ症候群、再発性多発性軟骨炎、クリオグロブリン血症、Ｅｖａｎ症候群と自己免疫性性腺機能不全、Ｂリンパ球の病状（例えば、全身性エリテマトーデス、Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ症候群、関節リウマチと１型糖尿病）、Ｔｈ１リンパ球の病状（例えば、関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、Ｓｊｏｒｇｒｅｎ症候群、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ甲状腺炎、Ｇｒａｖｅ病、原発性胆汁性肝硬変、ウェゲナー肉芽腫症、肺結核又は移植片対宿主病）、又はＴｈ２リンパ球の病状（例えば、アトピー性皮膚炎、全身性エリテマトーデス、アトピー性喘息、鼻結膜炎、アレルギー性鼻炎、Ｏｍｅｎｎ症候群、システム性硬化症又は慢性移植片対宿主病）、Ｃｈｕｒｇ Ｓｔｒａｕｓｓ症候群、顕微鏡的多発性血管炎、及びＴａｋａｙａｓｕ動脈炎というようなＣＤ７０を発現した疾患又は病状に非常に有用である。別の幾つかの形態において、本開示の分子は、腎がん（例えば、腎細胞がん）、乳がん、脳腫瘍、慢性又は急性白血病（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病を含む）、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫、リンパ球性リンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫）、鼻咽頭がん、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、前立腺がん、結腸がん、肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部又は頸部のがん、皮膚又は眼内悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、精巣がん、子宮がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膣がん、外陰がん、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、小児固形腫瘍、膀胱がん、腎臓又は尿管がん、腎盂がん、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、腫瘍の血管新生、脊髄幹腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類上皮がん、扁平上皮がん、中皮腫を含むようなＣＤ７０を発現した疾患（例えば、がん）に非常に有用である。別の幾つかの形態において、本開示の分子は、例えば、透明細胞（ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）ＲＣＣなどの腎細胞がん（ＲＣＣ）、膠芽細胞腫、乳がん、脳腫瘍、鼻咽頭（ｎａｓｏｐｈａｒａｎｇｅａｌ）がん、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、多発性骨髄腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、結節性小開裂細胞型リンパ腫、リンパ球性リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、Ｌｅｎｎｅｒｔリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、成人Ｔ細胞白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、胚中心細胞／中心細胞性（ｃｂ／ｃｃ）濾胞性リンパ腫がん（ｅｎｔｒｏｂｌａｓｔｉｃ／ｃｅｎｔｒｏｃｙｔｉｃ（ｃｂ／ｃｃ）ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ ｃａｎｃｅｒｓ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節症（ＡＩＬＤ）様Ｔ細胞リンパ腫、ＨＩＶ関連体腔性リンパ腫、胚性がん、鼻咽頭の未分化がん（例えば、Ｓｃｈｍｉｎｃｋｅ腫）、Ｃａｓｔｌｅｍａｎ病、Ｋａｐｏｓｉ肉腫、多発性骨髄腫、Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍマクログロブリン血症、マントル細胞リンパ腫及び他のＢ細胞リンパ腫を含む、ＣＤ７０の発現があると特徴付けられた腫瘍細胞に対して、良好な作用を持つ。
また、本開示は、目標抗原（例えば、ＣＤ７０）の免疫検出又は測定に利用される方法、目標抗原（例えば、ＣＤ７０）の免疫検出又は測定に利用される試薬、目標抗原（例えば、ＣＤ７０）を発現した細胞の免疫検出又は測定に利用される方法、及び目標抗原（例えば、ＣＤ７０）陽性細胞に関連する疾患の診断に利用される診断剤に関し、本開示の目標抗原（例えば、ヒトＣＤ７０）を特異的に認識すると共に細胞外領域のアミノ酸配列又はその３次元構造に結合する抗体又は抗体断片を活性成分として含む。
本開示において、目標抗原（例えば、ＣＤ７０）の量を検出又は測定するための方法は、何れの既知の方法であってもよい。例えば、免疫検出又は測定方法である。
免疫検出又は測定方法は、標識された抗原又は抗体を用いて抗体量又は抗原量を検出又は測定する方法である。免疫検出又は測定方法の実例としては、放射性物質で標識する免疫抗体方法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ又はＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、発光免疫測定法、ウエスタンブロット法、物理化学的方法などが含まれる。
ＣＤ７０陽性細胞（例えば、ＣＤ７０高発現細胞）に関連する疾患は、本開示の抗体又は抗体断片によりＣＤ７０を発現した細胞を検出又は測定することで診断することができる。
ポリペプチドを発現した細胞を検出するために、既知の免疫検出方法、好ましくは、免疫沈降法、蛍光細胞染色法、免疫組織染色法などを利用することができる。更に、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）による蛍光抗体染色法などを利用することができる。
本開示において、目標抗原（例えば、ＣＤ７０）の検出又は測定に利用される生体試料は特に制限がなく、目標抗原（例えば、ＣＤ７０）を発現した細胞を含む可能性があるものであればよく、例えば、組織球、血液、血漿、血清、膵液、尿液、糞便、組織液又は培養液である。
必要な診断方法に応じて、本開示のモノクローナル抗体又はその抗体断片を含む診断剤は、抗原－抗体反応を実行するための試薬又は反応を検出するための試薬を更に含んでもよい。抗原－抗体反応を実行するための試薬は、緩衝剤、塩などを含む。検出するための試薬は、一般的に免疫検出又は測定方法に利用される試薬、例えば、上記モノクローナル抗体、その抗体断片又はその結合物の標識を認識する第２抗体と上記標識に対応する基質などを含む。
上記の明細書には、本開示の１つ又は複数の実施形態の詳細が提出されている。本開示は、本明細書の記載と類似又は同様の任意の方法と材料により実施又は試験することができるが、以下、好ましい方法と材料を説明する。明細書と特許請求の範囲により、本開示の他の特徴、目的及び利点は明らかになる。明細書と特許請求の範囲において、文脈で特に明記のない限り、単数形は複数の指示対象のことを含む。特に定義しない限り、本明細書に用いられる技術・科学用語の全ては、本開示の属する分野の当業者により理解されている一般的な意味を持っている。明細書に引用される特許と出版物の全ては、引用により組み込まれている。下記の実施例は、本開示の好ましい実施形態を更に全面的に説明するために提出される。これらの実施例は、決して本開示の範囲を限定するものとして理解すべきではない。
以下、実施例及び試験例に合わせて本開示を更に説明するが、これらの実施例及び試験例は、本開示の範囲を限定するものではない。本開示の実施例又は試験例において、具体的な条件が明記されていない実験方法は一般的に、通常の条件、例えば、冷泉港の抗体技術実験マニュアル、分子クローンマニュアルに従い、又は、原料や商品のメーカーにより勧められた条件に従い、具体的な供給源が明記されていない試薬材料は、市場から購入して得られた。
実施例
実施例１：ＣＤ７０抗原の調製
ＵｎｉＰｒｏｔ ＣＤ７０抗原（ヒトＣＤ７０タンパク質、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号：Ｐ３２９７０）をＣＤ７０のテンプレートとして、本開示に使用される抗原及び検出用タンパク質のアミノ酸配列を設計し、選択的に、ＣＤ７０タンパク質を基にしてＨｉｓタグ又はＦｃなどの異なるタグを融合した。それぞれｐＴＴ５ベクター（Ｂｉｏｖｅｃｔｏｒ、ＣＡＴ＃１０２７６２）にクローニングし、２９３細胞において一過性トランスフェクションして発現し、精製し、本開示の抗原及び検出用タンパク質を得た。
Ｈｉｓタグ付きのＣＤ７０タンパク質細胞外領域（Ｈｉｓ－ＴＮＣ－ＣＤ７０と略す）配列を、検出試薬とした。
Figure 2023532197000005
 注記：下線部は６×Ｈｉｓタグ、イタリック体の部分はＴＮＣタグ、残りの部分はＣＤ７０タンパク質細胞外領域である。
ＣＤ７０タンパク質細胞外領域とＨｕｍａｎ－ＩｇＧ１－Ｆｃ融合タンパク質（ＣＤ７０－Ｆｃと略す）配列を、免疫原とした。
Figure 2023532197000006
 注記：下線部はＨｕｍａｎ－ＩｇＧ１－Ｆｃ部分、無下線部はＣＤ７０タンパク質細胞外領域である。
実施例２：ＣＤ７０に関連する組換えタンパク質の精製
Ｈｉｓタグ付きの組換えタンパク質の精製工程：
細胞発現上清試料を高速で遠心分離して不純物を除去し、緩衝液をＰＢＳに置き換え、最終濃度が５ ｍＭになるようにイミダゾールを入れた。５ ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳ溶液によりニッケルカラムを平衡し、２～５倍のカラム体積で洗浄した。置き換えられた細胞上清試料をＮｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｅｘｃｅｌカラム（ＧＥ、１７－３７１２－０２）にかけた。Ａ２８０読取値が基線に低減されるまで、５ ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳ溶液によりカラムを洗浄した。その後、ＰＢＳ＋１０ ｍＭのイミダゾールによりクロマトグラフィーカラムを洗浄し、非特異的結合のヘテロタンパク質を除去し、流出液を収集した。更に３００ ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳ溶液により標的タンパク質を溶出し、溶出ピークを収集した。收集された溶出液を濃縮した後、ゲルクロマトグラフＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ、２８－９８９３－３５）で更に精製し、移動相はＰＢＳであった。量体ピークを除去し、溶出ピークを収集した。得られたタンパク質を電気泳動、ペプチドマッピング、ＬＣ－ＭＳにより正確であると同定してから、分注して使用に備えた。Ｈｉｓタグ付きのＨｉｓ－ＴＮＣ－ＣＤ７０を得て、本開示の抗体の検出試薬として用いた。
ＣＤ７０－Ｆｃ融合タンパク質の精製工程：
細胞発現上清試料を高速で遠心分離して不純物を除去し、上清に対してＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ（ＧＥ、１７－５４３８－０１）で親和性クロマトグラフィーを行った。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅクロマトグラフィーカラムを、まず０．２ ＭのＮａＯＨで再生し、純水で洗浄した後にＰＢＳによりカラムを平衡し、上清を結合した後、Ａ２８０読取値が基線に低減されるまでＰＢＳにより洗浄した。０．１ Ｍの酢酸緩衝液によりｐＨ３．５の条件下で標的タンパク質を溶出し、１ ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌで中和した。溶出試料を適当に濃縮した後、ＰＢＳで平衡されたゲルクロマトグラフＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ、２８－９８９３－３５）で更に精製し、標的タンパク質の存在する受取チューブを合わせて収集して適当な濃度に濃縮した。この方法はＣＤ７０－Ｆｃ融合タンパク質の精製に用いられたが、当該方法は本開示における抗体タンパク質の精製に用いられてもよい。
実施例３：マウス抗ＣＤ７０ファージライブラリー抗体のスクリーニング
マウスの免疫：
抗ヒトＣＤ７０抗体は、マウスを免疫することにより産生された。実験用Ｂａｌｂ／ｃ白いマウスは、雌で、６～８週齢（北京維通利華実験動物技術有限公司、動物生産ライセンス番号：ＳＣＸＫ（京）２０１２－０００１）であった。飼育環境：ＳＰＦ級。マウスを購入した後、１２／１２時間の明／暗周期で調節し、温度が２０～２５℃で、湿度が４０～６０％の実験室環境で１週間飼育した。環境に馴れたマウスは、以下の方案で免疫された。
タンパク質抗原（ＣＤ７０－Ｆｃ、配列番号２）及び細胞抗原（ヒト全長ＣＤ７０を発現したＣＨＯ－Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｒ８０００７））により交差免疫し、そのうち、タンパク質抗原は、ＴｉｔｅｒＭａｘ(登録商標) Ｇｏｌｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ Ｎｏ． Ｔ２６８４）とＴｈｅｒｍｏ Ｉｍｊｅｃｔ(登録商標) Ａｌｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｃａｔ Ｎｏ． ７７１６１）アジュバントを交互に使用した。タンパク質抗原とアジュバント（ＴｉｔｅｒＭａｘ(登録商標) Ｇｏｌｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ）の比率は１：１、タンパク質抗原とアジュバント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｉｍｊｅｃｔ(登録商標) Ａｌｕｍ）の比率は３：１であり、５０ μｇ／匹／回（タンパク質抗原免疫）、１×１０７ ｃｅｌｌｓ／匹／回（細胞抗原免疫）であった。タンパク質抗原は乳化された後に接種を行い、細胞抗原はリン酸緩衝溶液で再懸濁された後に接種を行った。接種時間は、０、１４、２８、４２、５６と７０日目であり、２１、４９、８２日目に採血し、ＥＬＩＳＡ方法でマウス血清中の抗体力価を決定した。血清中の抗体力価が高くて安定する傾向があるマウスを選択し、その脾臓を取って免疫ライブラリーの作成に用いた。
マウスファージ単鎖抗体ライブラリーの構築：
マウスの脾細胞を取って、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ Ｎｏ． １５５９６－０１８）により全ＲＮＡを抽出した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ(商標) ＩＩ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ試薬キット（Ｔａｋａｒａ Ｃａｔ Ｎｏ． ６２１０Ａ）により逆転写を行ってｃＤＮＡを得た。ＩＭＧＴデータベースに従ってライブラリーを構築するプライマー（ＧＥＮＥＷＩＺ社）を設計して合成した。３ラウンドのＰＣＲ反応により、単鎖抗体断片を得た。ＰＣＲ反応は何れもＬＡ Ｔａｇ（Ｔａｋａｒａ Ｃａｔ Ｎｏ． ＲＲ０２ＭＢ）を使用した。第１グランドのＰＣＲはｃＤＮＡをテンプレートとして、それぞれ増幅して重鎖可変領域及び軽鎖可変領域配列を得て、第２グランドのＰＣＲは第１グランドの生成物をテンプレートとして、重鎖可変領域５’末端と軽鎖可変領域３’末端にＳｆｉ１酵素切断部位配列を導入し、重鎖可変領域３’末端と軽鎖可変領域５’末端に連結配列を導入し、第３グランドのＰＣＲは、第２グランドのＰＣＲ生成物の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を共にテンプレートとして、ブリッジＰＣＲを行い、重鎖可変領域が前側、軽鎖可変領域が後側にある単鎖抗体断片を得た。
単鎖抗体断片及び改変されたライブラリー構築用のベクターｐＣａｎｔａｂ５Ｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／ＧＥ Ｃａｔ Ｎｏ． ２７－９４００－０１）をＳｆｉ１（ＮＥＢ Ｃａｔ Ｎｏ．＃Ｒ０１２３Ｌ）で酵素切断し、電気泳動後に、Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．(登録商標) Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｏｍｅｇａ Ｃａｔ Ｎｏ． Ｄ２５００－０２）で精製回収した。その後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ Ｃａｔ Ｎｏ．＃Ｍ０２０２Ｌ）により１６℃で１６～１８ ｈ連結し、そして上記試薬キットで精製回収し、最後に脱イオン水で溶出した。１ μｇの連結生成物を１本のエレクトロポレーションコンピテントＴＧ１（Ｌｕｃｉｇｅｎ Ｃａｔ Ｎｏ． ６０５０２－２）と混合し、エレクトロポレーター（Ｂｉｏ Ｒａｄ Ｍｉｃｒｏｐｕｌｓｅｒ）によりエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションを２０回繰り返し、プレートに塗布し、３７℃で１６～１８ ｈ倒置培養した。全てのコロニーを擦って洗い落として一緒に混合し、最終濃度が１５％であるグリセリンに入れ、－８０℃で保存して使用に備えた。
ファージ単鎖抗体ライブラリーのスクリーニングによる抗ＣＤ７０の陽性モノクローナル配列の取得：
ファージ単鎖抗体ライブラリーを包装して濃縮した後、まず、２グランドの水簸を行った。ファージライブラリー（１×１０１２～１×１０１３／ｐｆｕ）を１ ｍＬの２％ＭＰＢＳ（２％の脱脂粉乳を含むＰＢＳ）に懸濁させ、１００ μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ(登録商標) Ｍ－２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ Ｎｏ． １１２０６Ｄ）を加え、ターンテーブルに置いて、繰り返して反転し、室温で１ ｈブロッキングした。チューブを磁気ラックに２ ｍｉｎ置き、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを除去し、ファージライブラリーを新しいチューブに移した。ブロッキングされたファージライブラリーにビオチンで標識したＨｉｓ－ＴＮＣ－ＣＤ７０ ２ μｇ／ｍＬを加え、ターンテーブルに置いて、１ ｈ繰り返して反転した。同時に１００ μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓを取り、１ ｍＬの２％のＭＰＢＳに懸濁させ、ターンテーブルに置いて、繰り返して反転し、室温で１ ｈブロッキングした。チューブを磁気ラックに２ ｍｉｎ置き、ブロッキング液を吸い取った。ブロッキングされたＤｙｎａｂｅａｄｓをファージライブラリーとＨｉｓ－ＴＮＣ－ＣＤ７０との混合液に加え、ターンテーブルに置いて１５ ｍｉｎ繰り返して反転した。チューブを磁気ラックに２ ｍｉｎ置き、混合液を吸い取った。１ ｍＬのＰＢＳＴ（０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ）でＤｙｎａｂｅａｄｓを溶出し、更に１ ｍｇ／ ｍＬのトリプシン（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ Ｎｏ． Ｔ１４２６－２５０ＭＧ）０．５ ｍＬを加え、ターンテーブルに置いて１５ ｍｉｎ繰り返して反転しながらインキュベートし、溶出した。溶出されたファージを対数期の大腸菌ＴＧ１に直接感染させ、力価を測定して増幅濃縮を行い、次のグランドの水簸に用いた。ファージライブラリー（１×１０１１～１×１０１２／ｐｆｕ）の第２グランドの水簸を行い、ビオチンで標識したヒトＨｉｓ－ＴＮＣ－ＣＤ７０の濃度を１ μｇ／ｍＬに低減し、ＰＢＳＴによる洗浄回数を１５回に増加した。溶出されたファージを大腸菌ＴＧ１に感染してプレートに塗布し、モノクローンを無作為に選び出し、ファージによるＥＬＩＳＡに用いた。
クローンを９６ウェルのディープウェルプレート（Ｎｕｎｃ Ｃａｔ Ｎｏ． ２６０２５１）に接種し、３７℃で１６～１８ ｈ培養した。少量取り、ＯＤ６００が約０．５に達するまで、別の９６ウェルのディープウェルプレートに接種し、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（ＮＥＢ Ｃａｔ Ｎｏ．Ｎ０３１５Ｓ）を加えて包装した。４０００ ｇで１０ ｍｉｎ遠心分離し、菌細胞を除去し、培養液を吸い取り、ヒトＣＤ７０結合のＥＬＩＳＡ検出を行った。陽性クローン菌種を種としてタイムリーに凍結保存し、シークエンシング会社に送ってシークエンシングした。測定された陽性クローンＢ１、Ｂ７、Ｆ４のＤＮＡ配列の対応するアミノ酸配列は、下記の通りである。
＞ Ｂ１重鎖可変領域配列（Ｂ１ ｍＶＨ）：
Figure 2023532197000007
 ＞ Ｂ１軽鎖可変領域配列（Ｂ１ ｍＶＬ）：
Figure 2023532197000008
 ＞ Ｂ７重鎖可変領域配列（Ｂ７ ｍＶＨ）：
Figure 2023532197000009
 ＞ Ｂ７軽鎖可変領域配列（Ｂ７ ｍＶＬ）：
Figure 2023532197000010
 ＞ Ｆ４重鎖可変領域配列（Ｆ４ ｍＶＨ）：
Figure 2023532197000011
 ＞ Ｆ４軽鎖可変領域配列（Ｆ４ ｍＶＬ）：
Figure 2023532197000012
 注：上記配列において、順番は順にＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４であり、下線部はＫａｂａｔ番号付けシステムに従って決定されたＣＤＲ配列であり、イタリック体はＦＲ配列である。
マウス抗体Ｂ１、Ｂ７、Ｆ４の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ領域配列は、下記の表５に示される通りである。
Figure 2023532197000013
備考：表中、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って決定されたＣＤＲである
ファージディスプレイによる単鎖抗体のヒトＣＤ７０タンパク質との結合のＥＬＩＳＡ実験：
ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液によりヒトＨｉｓ－ＴＮＣ－ＣＤ７０タンパク質を２ μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、１００ μＬ／ウェルの体積で９６ウェルのマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ Ｎｏ． ＣＬＳ３５９０－１００ＥＡ）に加え、４℃の冷蔵庫に１６～１８ ｈ置いた。液体を捨てた後、ＰＢＳで希釈された５％の脱脂粉乳（生工生物、製品番号Ａ６００６６９－０２５０）ブロッキング液を２００ Ｌ／ウェルを加え、３７℃でインキュベーターμに２ ｈインキュベートしてブロッキングした。ブロッキングが終了した後、ブロッキング液を捨て、ＰＢＳＴ緩衝液（ｐＨ７．４ ０．１％のｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ）でプレートを３回洗浄した後、２％のＭＰＢＳ（ｐＨ７．４ ２％の脱脂粉乳を含むＰＢＳ）により１：１で希釈されたファージ培養液１００ μＬ／ウェルを加え、３７℃でインキュベーターに置いて１ ｈインキュベートした。インキュベートが終了した後、ＰＢＳＴでプレートを６回洗浄し、２％のＭＰＢＳで希釈された抗Ｍ１３ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＨＲＰ）二次抗体（ＳＢ、製品番号１１９７３－ＭＭ０５Ｔ－Ｈ）１００ μＬ／ウェルを加え、３７℃で１ ｈインキュベートした。ＰＢＳＴでプレートを６回洗浄した後、ＴＭＢ発色基質（ＫＰＬ、Ｃａｔ Ｎｏ． ５２－００－０３）５０ μＬ／ウェルを加え、室温で５～１０ ｍｉｎインキュベートし、１ ＭのＨ２ＳＯ４ ５０ μＬ／ウェルを加えて反応を中止し、ＶＥＲＳＡｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により波長４５０ ｎｍで吸収値を読み取った。実験結果は下記の表を参照する。
Figure 2023532197000014
実施例４：抗ＣＤ７０マウス抗体のヒト化
ＩＭＧＴヒト抗体重・軽鎖可変領域生殖細胞系遺伝子のデータベースとＭＯＥソフトウェアをアラインメントすることにより、テンプレートとしてＢ１、Ｂ７及びＦ４と相同性の高い重・軽鎖可変領域生殖細胞系遺伝子をそれぞれ選択し、この３つのマウス抗体のＣＤＲをそれぞれ対応するヒトテンプレートに移植し、順番がＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４である可変領域配列を形成した。例示的に、以下の具体的な実施例において、ＣＤＲのアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって決定されて注記されている。
Ｂ１マウス抗体のヒト化
マウス抗体Ｂ１のヒト化軽鎖テンプレートはＩＧＫＶ４－１＊０１とＩＧＫＪ４＊０１、ヒト化重鎖テンプレートはＩＧＨＶ１－４６＊０１とＩＧＨＪ１＊０１であり、マウス抗体Ｂ１のＣＤＲをそれぞれそのヒトテンプレートに移植し、更にヒト化抗体のＦＲ部分アミノ酸に対して復帰変異改変を行い、そのうち、軽鎖ＦＲ部分は、５Ｓ又は７０Ｎのうちの１つ又はそれ以上の復帰変異（そのうちの復帰変異部位の位置は、Ｋａｂａｔ番号付け規則によって決定される）を含み、重鎖ＦＲ部分は４Ｍ、３７Ｉ、３８Ｋ、４８Ｉ、６７Ａ、６９Ｌ、７１Ａ、７３Ｒ、７８Ａ、８０Ｌ、９４Ｔのうちの１つ又はそれ以上の復帰変異（そのうちの復帰変異部位の位置は、Ｋａｂａｔ番号付け規則によって決定される）を含み、抗体Ｂ１のヒト化抗体の復帰変異設計は、下記の表７に示されている。
Figure 2023532197000015
注：Ｇｒａｆｔは、マウス抗体ＣＤＲのヒト生殖細胞系ＦＲ領域への移植を表し、そのうち、復帰変異部位の位置は、Ｋａｂａｔ番号付け規則によって決定され、例えば、「Ｔ５Ｓ」は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って、５番目のＴをＳに変異したことを示す。
Ｂ１ヒト化抗体軽鎖可変領域／重鎖可変領域配列は、下記の通りである。
＞ ｈｕＢ１ＶＨ１（ｈｕＢ１ＶＨ－ ｇｒａｆｔ）
Figure 2023532197000016
 ＞ ｈｕＢ１ＶＨ２
Figure 2023532197000017
 ＞ ｈｕＢ１ＶＨ３
Figure 2023532197000018
 ＞ ｈｕＢ１ＶＨ４
Figure 2023532197000019
 ＞ ｈｕＢ１ＶＨ５
Figure 2023532197000020
 ＞ ｈｕＢ１ＶＨ６
Figure 2023532197000021
 ＞ ｈｕＢ１ＶＬ１（ｈｕＢ１ＶＬ－ ｇｒａｆｔ）
Figure 2023532197000022
 ＞ ｈｕＢ１ＶＬ２
Figure 2023532197000023
なお、軽鎖可変領域と重鎖可変領域のＣＤＲ部分の個別のアミノ酸に対して改変を行い、そのうち、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＤＩＹＰＧＮＧＤＡＳＹＮＱＫＦＲＤ（配列番号１０で示される）からＤＩＹＰＧＴＧＤＡＳＹＮＱＫＦＲＤ（配列番号４２で示される）に改変され、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列はＬＡＳＮＬＥＳ（配列番号１３で示される）からＬＡＤＮＬＥＳ（配列番号４３で示される）に改変され、改変されたＢ１ヒト化抗体の軽鎖可変領域／重鎖可変領域配列は、下記の通りである。
＞ ｈｕＢ１ＶＨ１－１
Figure 2023532197000024
 ＞ ｈｕＢ１ＶＨ２－１
Figure 2023532197000025
 ＞ ｈｕＢ１ＶＨ３－１
Figure 2023532197000026
 ＞ ｈｕＢ１ＶＨ４－１
Figure 2023532197000027
 ＞ ｈｕＢ１ＶＨ５－１
Figure 2023532197000028
 ＞ ｈｕＢ１ＶＨ６－１
Figure 2023532197000029
 ＞ ｈｕＢ１ＶＬ１－１
Figure 2023532197000030
 ＞ ｈｕＢ１ＶＬ２－１
Figure 2023532197000031
そのうち、上記配列において、順番は順にＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４であり、配列においてイタリック体はＦＲ配列、下線部はＫａｂａｔ番号付けシステムによって決定されたＣＤＲ配列である。
抗体ライブラリーｈｕＢ７ヒト化フレームワークの選択
マウス抗体Ｂ７のヒト化軽鎖テンプレートはＩＧＫＶ２７－１＊０１とＩＧＫＪ４＊０１、ヒト化重鎖テンプレートはＩＧＨＶ７－４－１＊０２とＩＧＨＪ６＊０１であり、マウス抗体Ｂ７のＣＤＲをそれぞれそのヒトテンプレートに移植し、更にヒト化抗体のＦＲ部分アミノ酸に対して復帰変異改変を行い、そのうち、軽鎖ＦＲ部分は、３８Ｒ、４３Ｓ、６９Ｒ、７０Ｑ又は７１Ｙのうちの１つ又はそれ以上の復帰変異（そのうちの復帰変異部位の位置は、Ｋａｂａｔ番号付け規則によって決定される）を含み、重鎖ＦＲ部分は、２Ｉ、２４Ｔ、４６Ｋ、７２Ｅ、８２ａ Ｎのうちの１つ又はそれ以上の復帰変異（そのうちの復帰変異部位の位置は、Ｋａｂａｔ番号付け規則によって決定される）を含む。抗体Ｂ７のヒト化抗体可変領域の復帰変異の設計は、下記の表８に示されている。
Figure 2023532197000032
注：Ｇｒａｆｔｅｄは、マウス抗体ＣＤＲのヒト生殖細胞系ＦＲ領域への移植を表し、そのうち、変異部位の位置は、Ｋａｂａｔ番号付け規則によって決定され、例えば、「Ｓ８２ａ Ｎ」は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って、８２ａ（８２Ａとも呼ばれる）番目のＳをＮに変異したことを示す。
Ｂ７ヒト化抗体軽／重鎖可変領域配列は、下記の通りである。
＞ ｈｕＢ７ＶＨ１ （ｈｕＢ７ＶＨ－ ｇｒａｆｔ）
Figure 2023532197000033
 ＞ ｈｕＢ７ＶＨ２
Figure 2023532197000034
 ＞ ｈｕＢ７ＶＨ３
Figure 2023532197000035
 ＞ ｈｕＢ７ＶＬ１（ｈｕＢ７ＶＬ－ ｇｒａｆｔ）
Figure 2023532197000036
 ＞ ｈｕＢ７ＶＬ２
Figure 2023532197000037
 ＞ ｈｕＢ７ＶＬ３
Figure 2023532197000038
 ＞ ｈｕＢ７ＶＬ４
Figure 2023532197000039
なお、更に重鎖可変領域のＣＤＲ部分の個別のアミノ酸に対して改変を行い、そのうち、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、元のＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号１６で示される）からＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＤＥＦＫＧ（配列番号５４で示される）に改変され、改変されたＢ７ヒト化抗体重鎖可変領域配列は、下記の通りである。
＞ ｈｕＢ７ＶＨ１－１
Figure 2023532197000040
 ＞ ｈｕＢ７ＶＨ２－１
Figure 2023532197000041
 ＞ ｈｕＢ７ＶＨ３－１
Figure 2023532197000042
そのうち、上記配列において、順番は順にＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４であり、配列においてイタリック体はＦＲ配列、下線部はＫａｂａｔ番号付けシステムによって決定されたＣＤＲ配列である。
抗体ライブラリーｈｕＦ４ヒト化フレームワークの選択
マウス抗体Ｆ４のヒト化軽鎖テンプレートはＩＧＫＶ４－１＊０１とＩＧＫＪ２＊０１、ヒト化重鎖テンプレートはＩＧＨＶ１－６９＊０８とＩＧＨＪ１＊０１であり、マウス抗体Ｆ４のＣＤＲをそれぞれそのヒト源テンプレートに移植し、更にヒト化抗体のＦＲ部分アミノ酸に対して復帰変異改変を行い、そのうち、軽鎖ＦＲ部分は、４９Ｓの復帰変異（そのうちの復帰変異部位の位置は、Ｋａｂａｔ番号付け規則によって決定される）を含み、重鎖ＦＲ部分は、２７Ｄ、３０Ｐ、３７Ｌ、３８Ｋ、４８Ｉ、６６Ｋ、６７Ａ、６９Ｌ、８２ａ Ｎのうちの１つ又はそれ以上の復帰変異（そのうちの復帰変異部位の位置は、Ｋａｂａｔ番号付け規則によって決定される）を含む。抗体Ｆ４のヒト化抗体可変領域の復帰変異の設計は、下記の表９に示されている。
Figure 2023532197000043

注：Ｇｒａｆｔｅｄは、マウス抗体ＣＤＲのヒト生殖細胞系ＦＲ領域への移植を表し、そのうちの復帰変異部位の位置は、Ｋａｂａｔ番号付け規則によって決定される。例えば、「Ｓ８２ａ Ｎ」は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って、８２ａ（８２Ａとも呼ばれる）番目のＳをＮに変異したことを示す
＞ ｈｕＦ４ＶＨ１（ｈｕＦ４ＶＨ－ ｇｒａｆｔ）
Figure 2023532197000044
 ＞ ｈｕＦ４ＶＨ２
Figure 2023532197000045
 ＞ ｈｕＦ４ＶＨ３
Figure 2023532197000046
 ＞ ｈｕＦ４ＶＨ４
Figure 2023532197000047
 ＞ ｈｕＦ４ＶＨ５
Figure 2023532197000048
 ＞ ｈｕＦ４ＶＨ６
Figure 2023532197000049
 ＞ ｈｕＦ４ＶＬ１（ｈｕＦ４ＶＬ－ｇｒａｆｔ）
Figure 2023532197000050
 ＞ ｈｕＦ４ＶＬ２
Figure 2023532197000051
なお、更に軽鎖可変領域と重鎖可変領域のＣＤＲ部分の個別のアミノ酸に対して改変を行い、そのうち、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、元のＡＩＦＰＧＮＧＥＴＳＹＮＱＮＦＫＧ（配列番号２２）からＡＩＦＰＧＴＧＥＴＳＹＮＱＮＦＫＧ（配列番号７１で示される）に改変され、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は、元のＬＡＳＮＬＥＳ（配列番号１３）からＬＡＤＮＬＥＳ（配列番号４３で示される）に改変された。
＞ ｈｕＦ４ＶＨ１－１
Figure 2023532197000052
 ＞ ｈｕＦ４ＶＨ２－１
Figure 2023532197000053
 ＞ ｈｕＦ４ＶＨ３－１
Figure 2023532197000054
 ＞ ｈｕＦ４ＶＨ４－１
Figure 2023532197000055
 ＞ ｈｕＦ４ＶＨ５－１
Figure 2023532197000056
 ＞ ｈｕＦ４ＶＨ６－１
Figure 2023532197000057
 ＞ ｈｕＦ４ＶＬ１－１
Figure 2023532197000058
 ＞ ｈｕＦ４ＶＬ２－１
Figure 2023532197000059
そのうち、上記配列において、順番は順にＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４であり、配列においてイタリック体はＦＲ配列、下線部はＫａｂａｔ番号付けシステムによって決定されたＣＤＲ配列である。
抗ＣＤ７０ヒト化抗体ＩｇＧ１形態の構築と発現
プライマーＰＣＲを設計して各ヒト化抗体ＶＨ／ＶＫ遺伝子断片を組立て、更に発現ベクターｐＴＴ５（シグナルペプチド及び定常領域付きの遺伝子（ＣＨ１－ＦＣ／ＣＬ）断片で、実験室で構築された）と相同組換えを行い、抗体全長発現ベクターＶＨ－ＣＨ１－ＦＣ－ｐＴＴ５／ＶＫ－ＣＬ－ｐＴＴ５を構築した。抗体の重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、又はその変異体の重鎖定常領域から選ばれることができ、軽鎖定常領域はヒトκ、λ鎖又はその変異体の軽鎖定常領域から選ばれることができる。例示的に、以下の実施例において、抗体重鎖定常領域は、配列番号７２で示されるヒトＩｇＧ１重鎖定常領域から選ばれ、軽鎖定常領域は、配列番号７３で示されるヒト軽鎖定常領域から選ばれる。
ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域配列：
Figure 2023532197000060
ヒト軽鎖定常領域配列：
Figure 2023532197000061
上記のスクリーニングされたマウス抗体Ｂ１、Ｂ７、Ｆ４の重鎖可変領域カルボキシ末端を配列番号７２で示されるヒト重鎖定常領域アミノ末端に連結すると共に、マウス抗体の軽鎖可変領域カルボキシ末端を配列番号７３で示されるヒト軽鎖定常領域アミノ末端に連結することで、その対応するキメラ抗体を得ることができ、Ｂ１、Ｂ７、Ｆ４のキメラ抗体は、それぞれＣＨＢ１、ＣＨＢ７、ＣＨＦ４と示されている。
上記の構築されたＢ１、Ｂ７、Ｆ４のヒト化抗体重鎖可変領域カルボキシ末端を配列番号７２で示されるヒト重鎖定常領域アミノ末端に連結して抗体全長重鎖を形成し、ヒト化抗体軽鎖可変領域カルボキシ末端を配列番号７３で示されるヒト軽鎖定常領域アミノ末端に連結して抗体全長軽鎖を形成することで、下記の表１０～１２に示されるようなヒト化抗体を得ることができる。
Figure 2023532197000062
備考：表中、「ｈｕＢ１００１」は、重鎖可変領域がｈｕＢ１ＶＨ１（配列番号２６）、軽鎖可変領域がｈｕＢ１ＶＬ１－１（配列番号４０）であり、且つ、重鎖定常領域が配列番号７２で示され、軽鎖定常領域が配列番号７３で示されるヒト化抗体を示し、その他はこのように類推する。
Figure 2023532197000063
備考：表中、「ｈｕＢ７００１」は、重鎖可変領域がｈｕＢ７ＶＨ１（配列番号４４）、軽鎖可変領域がｈｕＢ７ＶＬ１（配列番号４７）であり、且つ、重鎖定常領域が配列番号７２で示され、軽鎖定常領域が配列番号７３で示されるヒト化抗体を示し、その他はこのように類推する。
Figure 2023532197000064

備考：表中、「ｈｕＦ４００１」は、重鎖可変領域がｈｕＦ４ＶＨ１（配列番号５５）、軽鎖可変領域がｈｕＦ４ＶＬ１－１（配列番号６９）であり、且つ、重鎖定常領域が配列番号７２で示され、軽鎖定常領域が配列番号７３で示されるヒト化抗体を示し、その他はこのように類推する。
例示的なヒト化抗体軽鎖／重鎖全長配列は、下記の通りである。
ｈｕＢ１０１０重鎖配列：
Figure 2023532197000065
ｈｕＢ１０１０軽鎖配列：
Figure 2023532197000066
ｈｕＢ７００２重鎖配列：
Figure 2023532197000067
ｈｕＢ７００２軽鎖配列：
Figure 2023532197000068
ｈｕＦ４０１１重鎖配列：
Figure 2023532197000069
ｈｕＦ４０１１軽鎖配列：
Figure 2023532197000070
 備考：上記抗体全長配列において、下線部は抗体可変領域配列、無下線部は抗体定常領域配列である。
また、本開示の実施例における陽性対照抗体４１Ｄ１２（ＷＯ２０１２１２３５８６を参照）の軽重鎖配列は、下記の通りである。
４１Ｄ１２重鎖配列：
Figure 2023532197000071
 ４１Ｄ１２軽鎖配列：
Figure 2023532197000072
本開示の実施例に使用される他のタンパク質配列：
サルＣＤ７０タンパク質細胞外領域とＨｕｍａｎ－ＩｇＧ１－Ｆｃ融合タンパク質（サルＣＤ７０－Ｆｃと略す）配列：
Figure 2023532197000073
 注記：下線部はＨｕｍａｎ－ＩｇＧ１－Ｆｃ部分、無下線部はサルＣＤ７０タンパク質細胞外領域である

マウスＣＤ７０タンパク質細胞外領域とＨｕｍａｎ－ＩｇＧ１－Ｆｃ融合タンパク質（マウスＣＤ７０－Ｆｃと略す）配列：
Figure 2023532197000074
 注記：下線部はＨｕｍａｎ－ＩｇＧ１－Ｆｃ部分、無下線部はマウスＣＤ７０タンパク質細胞外領域である
ヒトＣＤ２７とＨｕｍａｎ－ＩｇＧ１－Ｆｃ融合タンパク質（ＣＤ２７－Ｆｃと略す）配列：
Figure 2023532197000075
注記：下線部はＨｕｍａｎ－ＩｇＧ１－Ｆｃ部分、無下線部はヒトＣＤ２７部分、イタリック体字の部分は連結配列である
実施例５：非フコシル化のヒト化抗体の調製 ＣＤ７０抗体をコードする重鎖と軽鎖アミノ酸配列を構築する二重遺伝子ベクターは、エレクトロポレーター（ＢｉｏＲａｄ）により二重遺伝子ベクターを電気穿孔で、ＧｌｕｌとＦｕｔ８遺伝子をノックアウトしたＣＨＯＫ１（ＥＣＡＣＣ、Ｃａｔ ＃８５０５１００５－１ＶＬ、Ｌｏｔ＃１２Ｇ００６）を安定してトランスフェクションし、エレクトロポレーションされた細胞を氷浴に５ ｍｉｎ入れた後、予熱された１％のＳＰ４（ＣＡＴ＃ ＢＥＳＰ１０７６Ｅ、Ｌｏｎｚａ）＋０．５％のＡｎｔｉ－Ｃｌｕｍｐｉｎｇ ａｇｅｎｔ（ＣＡＴ＃０１－００５７ＤＧ、Ｇｉｂｃｏ）を含むＣＤ ＣＨＯ培地（ＣＡＴ＃１０７４３－０２９、Ｇｉｂｃｏ）に移して軽く均一に混合し、細胞をシェーカーにおいて培養した（３６．５℃、６．０％のＣＯ２、１２０ ｒｐｍ、８０％の相対湿度）。
トランスフェクションの２４ ｈ後に、細胞をカウントし、且つｍｉｎｉｐｏｏｌ（微小細胞プール）への播種を行い、１ウェルあたり２０００個の細胞で９６ウェル細胞培養プレートに接種し、それぞれのウェルに０．５％のＡＣＦ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＣＡＴ＃３８２０、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）＋０．５％のＡｎｔｉ－Ｃｌｕｍｐｉｎｇ ａｇｅｎｔを含むＣＤ ＣＨＯ培地１００ μＬを加え、ｍｉｎｉｐｏｏｌのスクリーニングを開始し、播種後の１４日目に細胞形成状況を観察し、細胞被覆率が３０％を超えると、Ｏｃｔｅｔに基づく方法により上清中のタンパク質の発現量を測定し、そのうちの発現量が比較的良い細胞群を９６ウェル細胞プレートから２４ウェル細胞プレートに移し、２５ μＭのＭＳＸ（ＣＡＴ＃ Ｍ５３７９－５００ＭＧ、ＳＩＧＭＡ）＋０．５％のＡｎｔｉ－Ｃｌｕｍｐｉｎｇ ａｇｅｎｔを含むＣＤ ＣＨＯ培地１ ｍＬにおいて培養し、加圧スクリーニングの１４日後に、Ｏｃｔｅｔに基づく方法によりｍｉｎｉｐｏｏｌ細胞群上清中のタンパク質の発現量を測定し、発現量が比較的良い細胞群を取って１２５ ｍＬの細胞培養フラスコに移し、細胞培養シェーカーに置いて培養し（シェーカーの培養条件が３６．５℃、６．０％のＣＯ２、８０％の相対湿度、１２０ ｒｐｍである）、２～３日間培養した後に細胞をサンプリングしてカウントし、細胞が指数増殖期になるまで、希釈法で細胞継代を行い、次にその中の細胞株に対してＦｅｄ－Ｂａｔｃｈ培養を行い、約１４日間培養した後、上清試料を取ってＰｒｏｔｅｉｎ Ａで精製し、精製された試料に対してＳＥＣ、ＣＥ－ＳＤＳ純度の検出及び糖型の検出を行った。最後に、非フコシル化のヒト化抗体を得た。以下の試験例において、非フコシル化のヒト化抗体は「（ａｆｕｃ）」という接尾語で示され、例えば、ｈｕＢ７００２（ａｆｕｃ）、ｈｕＢ１０１０（ａｆｕｃ）、ｈｕＦ４０１１（ａｆｕｃ）と４１Ｄ１２（ａｆｕｃ）は、それぞれｈｕＢ７００２、ｈｕＢ１０１０、ｈｕＦ４０１１と４１Ｄ１２の非フコシル化抗体を示す。
試験例１：Ｂｉａｃｏｒｅによる抗ＣＤ７０抗体の親和性の検出実験
Ｂｉａｃｏｒｅ機器により本開示のキメラ抗体及びヒト化抗体のヒトＣＤ７０抗原に対する親和性を試験した。方法は下記の通りである。
ヒトＦｃ捕捉試薬キット（ＣＡＴ＃ＢＲ－１００８－３９、ＧＥ）の取扱説明書に記載される方法に従って、ヒトＦｃ捕捉分子をＣＭ５バイオセンサチップ（ＣＡＴ＃ＢＲ－１００５－３０、ＧＥ）に共有結合することで、検出待ちの抗体を親和的に捕捉した。その後、チップの表面においてヒトＨｉｓ－ＴＮＣ－ＣＤ７０抗原（配列番号１で示される）を流し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器により反応シグナルをリアルタイムで検出することで、結合と解離曲線を得た。実験において各リサイクルの解離が完了した後、ヒトＦｃ捕捉試薬キット（ＧＥ）に配置された再生溶液によりバイオチップを洗浄して再生した。データフィッテイングモデルは、１：１のＭｏｄｅｌを採用した。実験結果は表１３に示されている。
Figure 2023532197000076
実験結果によると、本開示の抗ＣＤ７０抗体とヒトＣＤ７０抗原は高い親和性を有する。
試験例２：抗ＣＤ７０抗体のＣＤ７０陽性細胞との結合実験 フローサイトメーターにより、抗ＣＤ７０抗体のＣＤ７０陽性細胞に結合する結合活性を検出した。方法は下記の通りである。
１×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの７８６－Ｏ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１９３２）又はＲａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－８６）を１％のＢＳＡ ＰＢＳ緩衝液でブロッキングした後、異なる濃度で希釈された抗ＣＤ７０抗体試料を加えて１ ｈインキュベートした。２回洗浄した後、更にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８－ヤギ抗ヒト（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡＴ＃Ａ１１０１３）を加えて１ ｈインキュベートした。２回洗浄した後、フローサイトメーターにより蛍光シグナル値を読み取った。実験結果は、図１Ａ、１Ｂ、２Ａと２Ｂに示されている。
実験結果によると、本開示の抗ＣＤ７０抗体は、何れもＣＤ７０陽性細胞と効果的に結合可能であり、且つ、ｈｕＢ７００２及びその非フコシル化抗体ｈｕＢ７００２（ａｆｕｃ）とｈｕＢ１０１０及びその非フコシル化抗体ｈｕＢ１０１０（ａｆｕｃ）の結合能力は、何れも陽性対照よりも強い。
試験例３：抗ＣＤ７０抗体のヒト、サル及びマウスＣＤ７０タンパク質との結合のＥＬＩＳＡ実験
抗ＣＤ７０抗体の結合力は、抗体と、ＥＬＩＳＡプレートに固定されたＣＤ７０抗原タンパク質との結合の量で検出された。１ μｇ／ｍＬのヒトＣＤ７０－Ｆｃ（配列番号２で示される）、サルＣＤ７０－Ｆｃ（配列番号８２で示される）とマウスＣＤ７０－Ｆｃ（配列番号８３で示される）を被覆し、インキュベートした後にブロッキングした。プレートを洗浄し後、異なる濃度で希釈された抗ＣＤ７０抗体を加え、更にプレートを洗浄した後にセイヨウワサビペルオキシダーゼ－ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ、ＣＡＴ＃１０９－０３６－０９７）を加え、更にプレートを洗浄してテトラメチルベンジジン溶液を加えて発色させ、最後に停止液を加え、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０値を測定した。実験結果は図３、４、５に示されている。
実験結果によると、本開示の抗ＣＤ７０抗体は、ヒトＣＤ７０抗原にもサルＣＤ７０抗原にも結合可能であるが、マウスＣＤ７０抗原には結合しない。
試験例４：抗ＣＤ７０抗体によるＣＤ２７のＣＤ７０陽性細胞との結合への遮断実験
抗ＣＤ７０抗体の細胞遮断活性は、フローサイトメーターにより検出された。１×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬのヒト全長ＣＤ７０を発現したＣＨＯ－Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｒ８０００７）を１％のＢＳＡ ＰＢＳ緩衝液でブロッキングした後、異なる濃度で希釈された抗ＣＤ７０抗体試料及びビオチンで標識したＣＤ２７－Ｆｃ（配列番号８４で示される）を加えて１ ｈインキュベートした。２回洗浄した後、更にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８－ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡＴ＃Ｓ１１２２３）を加えて１ ｈインキュベートした。２回洗浄した後、フローサイトメーターにより蛍光シグナル値を読み取った。実験結果は図６、７に示されている。
実験結果によると、本開示の抗ＣＤ７０抗体は、ＣＤ２７のＣＤ７０陽性細胞との結合への遮断能力を有する。
試験例５：抗ＣＤ７０抗体によるＣＤ７０／ＣＤ２７結合仲介性のＩＬ－８レポーターシステムへの阻害実験
ＣＤ７０がＣＤ２７に結合すると、ＣＤ２７細胞はＩＬ－８を分泌するようになり、本実験は、ＣＤ２７発現細胞のＩＬ－８分泌状況を検出することにより、抗ＣＤ７０抗体によるＣＤ７０誘導性のＣＤ２７シグナル伝達のレベルへの影響を検出した。
Ｕ２６６細胞（ＡＴＣＣ、ＴＩＢ－１９６）を収集し、１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、ＣＡＴ＃ １００９９－１４１）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、ＣＡＴ＃ １１８７５１１９）で再懸濁し、細胞を１×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈した。ＨＴ１０８０／ＣＤ２７細胞（ヒト全長ＣＤ２７を発現したＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－１２１））を収集し、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０で再懸濁し、細胞を２×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈した。
Ｕ２６６細胞及び異なる濃度の抗体（そのうち、陰性対照はＣＤ７０抗原と無関係のＩｇＧタンパク質である）を１：１の比率で、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣＡＴ＃３５９９）に５０ μＬずつ加え、６０ ｍｉｎ（３７℃、５％のＣＯ２）インキュベートした後、ＨＴ１０８０／ＣＤ２７細胞５０ μＬを加えた。
１８ ｈ（３７℃、５％のＣＯ２）インキュベートした後、上清を収集し、１０倍希釈し、そしてＩＬ－８ Ｅｌｉｓａ試薬キット（欣博盛、ＣＡＴ＃ ＥＨＣ００７．９６）でＥｌｉｓａ検出を行い、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０値を測定した。実験結果は図８、９及び表１４に示されている。
Figure 2023532197000077
備考：Ｉｍａｘは、抗ＣＤ７０抗体によるＣＤ２７細胞のＩＬ－８分泌への阻害の最大阻害率である
実験結果によると、本開示の抗ＣＤ７０抗体は、ＨＴ１０８０／ＣＤ２７細胞のＩＬ－８分泌への阻害能力が、対照抗体４１Ｄ１２と４１Ｄ１２（ａｆｕｃ）よりも優れている。本開示の抗ＣＤ７０抗体は、ＣＤ７０／ＣＤ２７結合を遮断することにより、ＣＤ７０誘導性のＣＤ２７シグナル伝達を効果的に阻害可能であることが示されている。
試験例６：抗ＣＤ７０抗体の７８６－Ｏ細胞に対する体外ＡＤＣＣの実験
７８６－Ｏ－Ｌｕｃ細胞（ルシフェラーゼを発現した７８６－Ｏ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－８６））を収集し、Ａｓｓａｙ ＢｕｆｆｅｒでＭＥＭα（Ｇｉｂｃｏ、ＣＡＴ＃ １２５６１－０５６）基礎培地（２ ｍＭのＬ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを含む）に１２．５％のウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、ＣＡＴ＃ １００９９－１４１）、１２．５％のウマ血清（碧曇天、ＣＡＴ＃ Ｃ０２６２）、０．２ ｍＭのイノシトール（ＳＩＧＭＡ、ＣＡＴ＃ Ｉ７５０８）、０．０２ ｍＭの葉酸（ＳＩＧＭＡ、ＣＡＴ＃ Ｆ８７５８）、０．１ ｍＭの２－メルカプトエタノール（ＭＥＲＣＫ、ＣＡＴ＃ Ｍ６２５０－１０ＭＬ）及び２００ Ｕ／ｍＬの組換えヒトＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ＣＡＴ＃ ２００－０２－１００）を加えて再懸濁し、細胞を２×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈した。
ＮＫ９２細胞（南京科佰、ＣＢＰ６０９８０）を収集し、Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで再懸濁し、細胞を１×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈した。
７８６－Ｏ－Ｌｕｃ及び異なる濃度の抗体を１：１の比率で、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣＡＴ＃３９０３）に２５ μＬずつ加え、３０ ｍｉｎ（３７℃、５％のＣＯ２）インキュベートした後、２５ μＬのエフェクター細胞ＮＫ９２を加えた。４ ｈ（３７℃、５％のＣＯ２）インキュベートした後、それぞれのウェルに５０ μＬのＯｎｅ－Ｇｌｏ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＣＡＴ＃Ｅ６１２０）を加え、常温で１０ ｍｉｎインキュベートし、マイクロプレートリーダーにより発光強度（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を検出し、実験結果は図１０及び表１５に示されている。
Figure 2023532197000078
７８６－Ｏ－Ｌｕｃ細胞を収集し、１０％の超低ＩｇＧウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、ＣＡＴ＃ １９２１００５ＰＪ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、ＣＡＴ＃ １１８７５１１９）で再懸濁し、細胞を１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈した。
Ｆｉｃｏｌｌ（ＧＥ、ＣＡＴ＃ １７－５４４２－０２）により新鮮なヒト血液から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、ＲＰＭＩ １６４０培地において再懸濁し、細胞を２×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈した。
７８６－Ｏ－Ｌｕｃ及び異なる濃度の抗体を１：１の比率で、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣＡＴ＃３９０３）に５０ μＬずつ加え、３０ ｍｉｎ（３７℃、５％のＣＯ２）インキュベートした後、５０ μＬのエフェクター細胞ＰＢＭＣを加えた。４ ｈ（３７℃、５％のＣＯ２）インキュベートした後、それぞれのウェルに５０ μＬのＯｎｅ－Ｇｌｏ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＣＡＴ＃Ｅ６１２０）を加え、常温で１０ ｍｉｎインキュベートし、マイクロプレートリーダーにより発光強度（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を検出した。実験結果は図１１及び表１６に示されている。
Figure 2023532197000079
実験結果によると、本開示の抗ＣＤ７０抗体は、７８６－Ｏ細胞に対する体外ＡＤＣＣの作用が比較的強く、非フコシル化のヒト化抗体は、ＡＤＣＣの作用を顕著に向上させている。
試験例７：抗ＣＤ７０抗体のＲａｊｉ細胞に対する体外ＣＤＣの実験
Ｒａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－８６）を収集した後に再懸濁し、細胞を１×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬで、１０％の超低ＩｇＧウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、ＣＡＴ＃ １９２１００５ＰＪ）を含むフェノールレッドフリーＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、ＣＡＴ＃ １１８３５－０３０）に再懸濁した。その後、細胞を５×１０４ ｃｅｌｌｓ／ウェル（５０ μＬ／ウェル）で９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣＡＴ＃３９０３）に播種した。その後、異なる濃度の抗体５０ μＬを加えた。３０ ｍｉｎ（３７℃、５％のＣＯ２）インキュベートした後、それぞれのウェルに５０ μＬのヒト血清（抽出直後）を加えた。２ ｈ（３７℃、５％のＣＯ２）インキュベートした後、それぞれのウェルに１６．６ μＬのＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ、ＣＡＴ＃ＤＡＬ１０２５）を加え、２０ ｈインキュベートし（３７℃、５％のＣＯ２）、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で発光波長５８５ ｎｍ（励起波長５７０ ｎｍ）を検出した。実験の結果は、表１７及び図１２と図１３に示されている。
Figure 2023532197000080
実験結果によると、本開示に係る抗ＣＤ７０抗体は、Ｒａｊｉ細胞に対する体外ＣＤＣの作用が対照抗体４１Ｄ１２よりも強い。
試験例８：抗ＣＤ７０抗体の７８６－ＯとＲａｊｉ細胞に対する体外ＡＤＣＰの実験
ＰＢＭＣはＦｉｃｏｌｌ（ＧＥ、ＣＡＴ＃ １７－５４４２－０２）によりヒト血液から単離され、その中からＣＤ１４磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ＣＡＴ＃１３０－０５０－２０１）によりＣＤ１４＋単核細胞がソーティングされた。１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、ＣＡＴ＃１００９１１４８）と５０ ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ＣＡＴ＃３００－２５）を含むＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、ＣＡＴ＃１１８７５１１９）において７日間培養し、単核細胞をマクロファージ細胞に分化した。実験当日に、セルスクレーパーでマクロファージ細胞を擦り落とし、マクロファージ細胞を収集した。１％のＢＳＡ ＰＢＳ緩衝液で再懸濁した後に１：４のＥ：Ｔ比率で０．１ μＭのＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインジアセタートスクシンイミジルエステル（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ）、ＢＤ、ＣＡＴ＃５６５０８２）で標識された７８６－Ｏ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１９３２）又はＲａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－８６）を加えて使用し、そして異なる濃度で希釈された抗ＣＤ７０抗体試料を加え、標的細胞に貪食作用を１．５ ｈ行った。貪食が終了した後、ＰＢＳで２回洗浄し、ＡＰＣに結合された抗ヒトＣＤ１４抗体（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＣＡＴ＃１７－０１４９－４２）を加え、氷上で３０ ｍｉｎインキュベートした後、ＰＢＳで２回洗浄した。最後に、フローサイトメトリーにより分析した。ＣＤ１４＋陽性の生細胞ゲートにおいてＣＦＳＥ＋陽性細胞の百分率を分析することにより、貪食作用を測定した。実験結果は、図１４Ａと図１４Ｂに示されている。
実験結果によると、本開示の抗ＣＤ７０抗体は、７８６－Ｏ細胞とＲａｊｉ細胞に良好な体外ＡＤＣＰ作用を有する。
試験例９：抗ＣＤ７０抗体のＴｒｅｇ細胞に対する体外の阻害実験
Ｕ２６６細胞（ＡＴＣＣ、ＴＩＢ－１９６）を収集し、１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、ＣＡＴ＃ １００９９－１４１）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、ＣＡＴ＃ １１８７５１１９）で再懸濁し、細胞を２×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈した。
Ｆｉｃｏｌｌ（ＧＥ、ＣＡＴ＃ １７－５４４２－０２）により新鮮なヒト血液から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、ＲＰＭＩ １６４０培地において再懸濁し、細胞を２×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈した。
Ｕ２６６細胞及びＰＢＭＣを１：１の比率で、９６ウェルプレート（Ｕ底プレート、ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣＡＴ＃３７８８）に５０ μＬずつ加え、その後、異なる濃度の抗体２５ μＬ及び最終濃度が３ μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＣＡＴ＃ １６－００３７－８５）及び抗ＣＤ２８（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＣＡＴ＃ １６－０２８９－８５）抗体２５ μＬを加え、４８ ｈ（３７℃、５％のＣＯ２）インキュベートした後、細胞を１．５ ｍＬのｅｐチューブ（Ａｘｙｇｅｎ、ＣＡＴ＃ＭＣＴ－１５０－Ｃ－Ｓ）に収集し、５００ μＬのフロー緩衝液で１回洗浄し、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ(商標)５．５ Ｍｏｕｓｅ抗ヒトＣＤ４（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ(商標)、ＣＡＴ＃ ５６０６５０）、ＣＤ２５モノクローナル抗体、ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＣＡＴ＃ １２－０２５７－４２）、ＣＤ１２７モノクローナル抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＣＡＴ＃ ５１－１２７８－４２）フロー抗体を加えて染色し（４℃、２０ ｍｉｎ）、ＢＤ ＦＡＣＳＶｅｒｓｅＴＭフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、６５１１５４）によりＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗのＴｒｅｇ細胞の比率を分析した。実験結果は図１５に示されている。
実験結果によると、本開示の抗ＣＤ７０抗体は、Ｔｒｅｇ細胞に良好な体外阻害能力を有する。
試験例１０：７８６－Ｏ細胞の抗ＣＤ７０抗体に対する内在化実験
７８６－Ｏ－Ｌｕｃ細胞（ルシフェラーゼを発現した７８６－Ｏ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１９３２））を収集し、１０％の超低ＩｇＧウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、ＣＡＴ＃ １９２１００５ＰＪ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、ＣＡＴ＃ １１８７５１１９）で再懸濁し、細胞を２×１０４細胞／ｍＬに希釈した。その後、細胞を１０００細胞／ウェル（５０ μＬ／ウェル）で９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣＡＴ＃３９０３）に播種した。１６ ｈ（３７℃、５％のＣＯ２）インキュベートした。
１０％の超低ＩｇＧウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地により４倍の濃度のＤＴ３Ｃ（ジフテリア毒素のＦｒａｇｍｅｎｔ ＡとＧ群連鎖球菌の３Ｃ断片を融合してなり、そのモル濃度は抗体のモル濃度の６倍である）に調製した。同じ培地で４倍の濃度の抗体を調製し、ＤＴ３Ｃ及び抗体を１：１の体積で均一に混合し、室温で静置して３０ ｍｉｎインキュベートした。その後、濃度勾配で希釈した。希釈された抗体を１：１の比率で細胞に加え、５０ μＬ／ウェルとした。３日間（３７℃、５％のＣＯ２）インキュベートした。それぞれのウェルに５０ μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＣＡＴ＃Ｇ７５７３）を加え、常温で１０ ｍｉｎインキュベートし、マイクロプレートリーダーで発光強度を検出した。実験結果は図１６及び表１８に示されている。
Figure 2023532197000081
実験結果によると、本開示の抗ＣＤ７０抗体は、７８６－Ｏ細胞により内在化され、細胞による内在化溶解の最大溶解率が９６％を超えた。
試験例１１：抗ＣＤ７０抗体のマウスＲａｊｉモデルにおける体内薬効実験
１、抗ＣＤ７０抗体のマウスＲａｊｉモデルにおける体内薬効実験
Ｌｕｃ－Ｒａｊｉ細胞（ルシフェラーゼを発現したＲａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－８６））（１×１０６ ｃｅｌｌｓ）２００ μＬを尾静脈からＣＢ１７ ＳＣＩＤマウス（維通利華から購入された）に注射し、接種した７日後、それぞれのマウスの腹腔に生物発光基質（１５ ｍｇ／ｍＬ）を注射し、１０ ｍＬ／ｋｇの体積で注射し、イソフルレンにより麻酔し、１０ ｍｉｎ注射した後、小動物イメージングシステムにより写真を撮って画像化し、体重、生物発光シグナル（Ｔｏｔａｌ Ｆｌｕｘ）値が大きすぎるもの及び小さすぎるものを除去し、生物発光シグナルによってマウスを無作為に、陰性対照ＩｇＧ（ＣＤ７０標的と無関係のＩｇＧタンパク質、投与量３０ ｍｇ／ｋｇ）群、陽性対照４１Ｄ１２（投与量１０ ｍｇ／ｋｇ）、ｈｕＢ７００２（投与量１０ ｍｇ／ｋｇ）、ｈｕＦ４０１１－１０（投与量１０ ｍｇ／ｋｇ）を含む４群に分け、１群あたり８匹であり、群分け当日に腹腔内に抗体を注射投与し始め、週２回、合計２週投与した。週２回で写真を撮って画像化し、体重を秤量し、データを記録した。Ｅｘｃｅｌ統計ソフトウェアによりデータを記録し、生物発光シグナル値はＴｏｔａｌ Ｆｌｕｘ（単位、ｐ／ｓ）で、平均値はａｖｇで算出され、ＳＤ値はＳＴＤＥＶで算出され、ＳＥＭ値はＳＴＤＥＶ／ＳＱＲＴ（１群あたりの動物数）で算出され、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアによりプロットし、Ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡによりデータの統計的分析を行った。
相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）＝（Ｔ－Ｔ０）／（Ｃ－Ｃ０）×１００で、そのうち、Ｔ、Ｃは、実験終了時の治療群と対照群の腫瘍光子数であり、Ｔ０、Ｃ０は実験開始時の腫瘍光子数である。
腫瘍阻害率（ＴＧＩ）（％）＝１００－Ｔ／Ｃ（％）。
実験結果は表１９及び図１７に示されている。
Figure 2023532197000082
実験結果によると、陰性対照ＩｇＧと比べ、１０ ｍｇ／ｋｇ用量の抗ＣＤ７０抗体は、何れもＬｕｃ－Ｒａｊｉ腫瘍モデルにおける腫瘍細胞の成長を顕著に阻害することができ（ｐ＜０．００１）、そのうち、ｈｕＢ７００２腫瘍阻害率は８１％にも達し、陽性対照４１Ｄ１２の腫瘍阻害率は６３％に過ぎない。
２、非フコシル化の抗ＣＤ７０抗体のマウスＲａｊｉモデルにおける体内薬効実験
Ｌｕｃ－Ｒａｊｉ細胞（ルシフェラーゼを発現したＲａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－８６））（１×１０６ ｃｅｌｌｓ）２００ μＬを尾静脈からＣＢ１７ ＳＣＩＤマウス（維通利華から購入された）に注射し、接種した７日後、それぞれのマウスの腹腔に生物発光基質（１５ ｍｇ／ｍＬ）を注射し、１０ ｍＬ／ｋｇの体積で注射し、イソフルレンにより麻酔し、１０ ｍｉｎ注射した後、小動物イメージングシステムにより写真を撮って画像化し、体重、生物発光シグナル（Ｔｏｔａｌ Ｆｌｕｘ）値が大きすぎるもの及び小さすぎるものを除去し、生物発光シグナルによってマウスを無作為に群分けし、１群あたり８匹であり、群分け当日に抗体を腹腔から注射投与し始め（陰性対照は標的と無関係のＩｇＧ型タンパク質）、２回投与し、初日及び３日目に投与した。７日目及び１４日目に写真を撮って画像化し、体重を秤量し、データを記録した。実験結果は図１８に示されている。
実験結果によると、陰性対照ＩｇＧ群と比べ、非フコシル化抗体群は、何れも腫瘍の成長を顕著に阻害することができる（ｐ＜０．００１）。投与後の７日目に、ｈｕＢ１０１０（ａｆｕｃ）は、１．５、５、１５ ｍｇ／ｋｇの用量での腫瘍阻害率がそれぞれ８２％、８５％、８４％であり、ｈｕＢ７００２（ａｆｕｃ）は、１．５、５、１５ ｍｇ／ｋｇの用量での腫瘍阻害率がそれぞれ８７％、８５％、８２％であり、投与後の１４日目に、各投与群は依然として高い腫瘍阻害活性を持っており、例えば、陰性対照ＩｇＧ群と比べ、ｈｕＢ１０１０（ａｆｕｃ）の５ ｍｇ／ｋｇ用量群は、１４日目の腫瘍阻害率が依然として６８％に達している。各用量群には用量効果が示されておらず、これにより、１．５ ｍｇ／ｋｇの用量でも腫瘍の成長への阻害に十分であることが明らかになる。
試験例１２：抗ＣＤ７０抗体の体内における薬物動態実験
３匹／群である雄のＳＤラット（維通利華から購入された）に、静脈内注射で投与し、投与量が３ ｍｐｋであり、投与群は、投与前及び投与後の５ ｍｉｎ（ｍｉｎは分間を示す）、８ ｈ（ｈは時間を示す）、１ ｄ（ｄは日間を示す）、２ ｄ、４ ｄ、７ ｄ、１０ ｄ、１４ ｄ、２１ ｄ、２８ ｄに全血０．１５ ｍＬを採血し、抗凝固剤を加えず、採血した後に４℃で３０ ｍｉｎ置き、１０００ ｇで１５ ｍｉｎ遠心分離し、上清（血清）を取ってＥＰチューブに置き、－８０℃で保存した。試験例３中のＣＤ７０抗体のＣＤ７０タンパク質との結合のＥＬＩＳＡ実験における方法によって異なる試料の標準曲線を作成し、ＯＤ４５０値から異なる時間のＣＤ７０抗体の血清における濃度を換算し、得られたデータをＰｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアにより分析して薬物動態関連パラメータを算出した。実験結果は表２０に示されている。
Figure 2023532197000083
実験結果によると、ｈｕＢ７００２とｈｕＢ１０１０は何れも良好なラット体内における薬物動態的表現を持っており、即ち、平均ｔ１／２はそれぞれ１７．２ ｄと１６．２ ｄであり、陽性対照４１Ｄ１２の１３．３ ｄよりも優れており、ラット体内における抗体の安定性が良いことが示唆されている。

Claims (16)

  1. 重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ７０抗体であって、
    ｉ）前記重鎖可変領域は、それぞれ配列番号１５と配列番号１７で示されるＨＣＤＲ１とＨＣＤＲ３、及び配列番号５４又は配列番号１６で示されるＨＣＤＲ２を含み、前記軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、
    ｉｉ）前記重鎖可変領域は、それぞれ配列番号９と配列番号１１で示されるＨＣＤＲ１とＨＣＤＲ３、及び配列番号１０又は配列番号４２で示されるＨＣＤＲ２を含み、前記軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号１２と配列番号１４で示されるＬＣＤＲ１とＬＣＤＲ３、及び配列番号１３又は配列番号４３で示されるＬＣＤＲ２を含み、或いは
    ｉｉｉ）前記重鎖可変領域は、それぞれ配列番号２１と配列番号２３で示されるＨＣＤＲ１とＨＣＤＲ３、及び配列番号２２又は配列番号７１で示されるＨＣＤＲ２を含み、前記軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号２４と配列番号２５で示されるＬＣＤＲ１とＬＣＤＲ３、及び配列番号１３又は配列番号４３で示されるＬＣＤＲ２を含み、
    好ましくは、
    ｉ）前記重鎖可変領域は、それぞれ配列番号１５、配列番号５４及び配列番号１７で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、
    ｉｉ）前記重鎖可変領域は、それぞれ配列番号９、配列番号４２及び配列番号１１で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号１２、配列番号４３及び配列番号１４で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、或いは
    ｉｉｉ）前記重鎖可変領域は、それぞれ配列番号２１、配列番号７１及び配列番号２３で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号２４、配列番号４３及び配列番号２５で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、
    抗ＣＤ７０抗体。
  2. 前記抗ＣＤ７０抗体はマウス抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１に記載の抗ＣＤ７０抗体。
  3. 前記抗ＣＤ７０抗体はヒト化抗体であり、前記ヒト化抗体は、ヒト抗体のフレームワーク領域又はヒト抗体のフレームワーク領域変異体を含み、前記フレームワーク領域変異体は、ヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域及び／又は重鎖フレームワーク領域に対してそれぞれ多くとも１１個のアミノ酸の復帰変異を有し、
    好ましくは、前記ヒト化抗体は、
    ａ）それぞれ配列番号１５と配列番号１７で示されるＨＣＤＲ１とＨＣＤＲ３、及び配列番号５４又は配列番号１６で示されるＨＣＤＲ２を含む重鎖可変領域と、それぞれ配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含み、且つ
    前記軽鎖可変領域は、ヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域に対して３８Ｒ、４３Ｓ、６９Ｒ、７０Ｑ及び７１Ｙから選ばれる１つ又はそれ以上のアミノ酸復帰変異を含むヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域変異体を含み、及び／又は前記重鎖可変領域は、ヒト抗体の重鎖フレームワーク領域に対して２Ｉ、２４Ｔ、４６Ｋ、７２Ｅ及び８２ａ Ｎから選ばれる１つ又はそれ以上のアミノ酸復帰変異を含むヒト抗体の重鎖フレームワーク領域変異体を含み、或いは
    ｂ）それぞれ配列番号９と配列番号１１で示されるＨＣＤＲ１とＨＣＤＲ３、及び配列番号１０又は配列番号４２で示されるＨＣＤＲ２を含む重鎖可変領域と、それぞれ配列番号１２と配列番号１４で示されるＬＣＤＲ１とＬＣＤＲ３、及び配列番号１３又は配列番号４３で示されるＬＣＤＲ２を含む軽鎖可変領域とを含み、且つ
    前記重鎖可変領域は、ヒト抗体の重鎖フレームワーク領域に対して４Ｍ、３７Ｉ、３８Ｋ、４８Ｉ、６７Ａ、６９Ｌ、７１Ａ、７３Ｒ、７８Ａ、８０Ｌ及び９４Ｔから選ばれる１つ又はそれ以上のアミノ酸復帰変異を含むヒト抗体の重鎖フレームワーク領域変異体を含み、及び／又は前記軽鎖可変領域は、ヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域に対して５Ｓと７０Ｎから選ばれる１つ又はそれ以上のアミノ酸復帰変異を含むヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域変異体を含み、或いは
    ｃ）それぞれ配列番号２１と配列番号２３で示されるＨＣＤＲ１とＨＣＤＲ３、及び配列番号２２又は配列番号７１で示されるＨＣＤＲ２を含む重鎖可変領域と、それぞれ配列番号２４と配列番号２５で示されるＬＣＤＲ１とＬＣＤＲ３、及び配列番号１３又は配列番号４３で示されるＬＣＤＲ２を含む軽鎖可変領域とを含み、且つ
    前記重鎖可変領域は、ヒト抗体の重鎖フレームワーク領域に対して２７Ｄ、３０Ｐ、３７Ｌ、３８Ｋ、４８Ｉ、６６Ｋ、６７Ａ、６９Ｌと８２ａ Ｎから選ばれる１つ又はそれ以上のアミノ酸復帰変異を含むヒト抗体の重鎖フレームワーク領域変異体を含み、及び／又は前記軽鎖可変領域は、ヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域に対して４９Ｓというアミノ酸復帰変異を含むヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域変異体を含む、
    請求項１又は２に記載の抗ＣＤ７０抗体。
  4. 重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、そのうち、
    ｄ）前記重鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号５、４４、４５、４６、５１、５２又は５３と少なくとも９０％の配列同一性を有し、及び／又は前記軽鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号６、４７、４８、４９又は５０と少なくとも９０％の配列同一性を有し、或いは
    ｅ）前記重鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号３、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３４、３５、３６、３７、３８又は３９と少なくとも９０％の配列同一性を有し、及び／又は前記軽鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号４、３２、３３、４０又は４１と少なくとも９０％の配列同一性を有し、或いは
    ｆ）前記重鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号７、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６３、６４、６５、６６、６７又は６８と少なくとも９０％の配列同一性を有し、及び／又は前記軽鎖可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号８、６１、６２、６９又は７０と少なくとも９０％の配列同一性を有し、
    好ましくは、前記抗ＣＤ７０抗体は重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、そのうち、
    ｇ）前記重鎖可変領域は配列番号４４、４５、４６、５１、５２又は５３で示され、及び前記軽鎖可変領域配列は配列番号４７、４８、４９又は５０で示され、或いは
    ｈ）前記重鎖可変領域は配列番号２６、２７、２８、２９、３０、３１、３４、３５、３６、３７、３８又は３９で示され、及び前記軽鎖可変領域は配列番号３２、３３、４０又は４１で示され、或いは
    ｉ）前記重鎖可変領域は配列番号５で示され、及び前記軽鎖可変領域は配列番号６で示され、或いは
    ｊ）前記重鎖可変領域は配列番号３で示され、及び前記軽鎖可変領域は配列番号４で示され、或いは
    ｋ）前記重鎖可変領域は配列番号７で示され、及び前記軽鎖可変領域は配列番号８で示され、或いは
    ｌ）前記重鎖可変領域は配列番号５５、５６、５７、５８、５９、６０、６３、６４、６５、６６、６７又は６８で示され、及び前記軽鎖可変領域は配列番号６１、６２、６９又は７０で示され、
    より好ましくは、前記抗ＣＤ７０抗体は下記のような重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、
    ｎ）前記重鎖可変領域は配列番号５１で示され、及び前記軽鎖可変領域は配列番号４７で示され、或いは
    ｏ）前記重鎖可変領域は配列番号３５で示され、及び前記軽鎖可変領域は配列番号４０で示され、或いは
    ｐ）前記重鎖可変領域は配列番号６５で示され、及び前記軽鎖可変領域は配列番号７０で示される、
    請求項１又は２に記載の抗ＣＤ７０抗体。
  5. 前記ＣＤ７０抗体は、抗体重鎖定常領域と軽鎖定常領域を含み、好ましくは、前記重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３とＩｇＧ４定常領域及びその通常の変異体から選ばれ、前記軽鎖定常領域はヒト抗体κとλ鎖定常領域及びその通常の変異体から選ばれ、より好ましくは、前記抗体は、配列番号７２で示される重鎖定常領域及び配列番号７３で示される軽鎖定常領域を含む、請求項１～４の何れか一項に記載の抗ＣＤ７０抗体。
  6. ｑ）配列番号７４と少なくとも８５％の配列同一性を有する重鎖、及び／又は配列番号７５と少なくとも８５％の配列同一性を有する軽鎖、或いは
    ｒ）配列番号７６と少なくとも８５％の配列同一性を有する重鎖、及び／又は配列番号７７と少なくとも８５％の同一性を有する軽鎖、或いは
    ｓ）配列番号７８と少なくとも８５％の配列同一性を有する重鎖、及び／又は配列番号７９と少なくとも８５％の同一性を有する軽鎖、
    を含み、
    好ましくは、前記抗ＣＤ７０抗体は、
    ｔ）配列番号７４で示される重鎖及び配列番号７５で示される軽鎖、或いは
    ｕ）配列番号７６で示される重鎖及び配列番号７７で示される軽鎖、或いは
    ｖ）配列番号７８で示される重鎖及び配列番号７９で示される軽鎖、
    を含む、
    請求項１～５の何れか一項に記載の抗ＣＤ７０抗体。
  7. 請求項１～６の何れか一項に記載の抗ＣＤ７０抗体と競合してヒトＣＤ７０又はサルＣＤ７０に結合する、単離した抗ＣＤ７０抗体。
  8. 前記抗ＣＤ７０抗体は低フコシル化抗体であり、好ましくは、前記低フコシル化抗体は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の抗体重鎖がフコースによりグリコシル化修飾されていない抗体であり、より好ましくは、前記抗体は、１００％の抗体重鎖がフコースによりグリコシル化修飾されていないＩｇＧ１抗体である、請求項１～７の何れか一項に記載の抗ＣＤ７０抗体。
  9. 前記抗ＣＤ７０抗体は、
    Ａ． 前記抗ＣＤ７０抗体は、１×１０－８ Ｍよりも小さく、好ましくは１×１０－９ Ｍよりも小さく、又は１×１０－１０ Ｍよりも小さく、又は６×１０－１１ Ｍよりも小さいＫＤ値でヒトＣＤ７０に結合し、前記ＫＤ値は、表面プラズモン共鳴技術により測定され、
    Ｂ． 前記抗ＣＤ７０抗体は、ヒトＣＤ７０抗原と結合することもできるし、サルＣＤ７０抗原と結合することもできるが、マウスＣＤ７０抗原とは結合せず、
    Ｃ． 前記抗ＣＤ７０抗体は、ＣＤ７０により誘導されるＣＤ２７シグナルの伝達を阻害することができ、好ましくは、前記抗ＣＤ７０抗体は、ヒトＣＤ２７発現細胞によるＩＬ－８の分泌を阻害する最大阻害百分率が７２％、９０％、９１％、９３％又は９８％よりも大きく、
    Ｄ． 前記抗ＣＤ７０抗体は、ヒトＣＤ７０発現細胞に対する抗体依存性細胞仲介性細胞毒性、補体依存性細胞毒性及び抗体依存性細胞仲介性貪食作用というエフェクター機能の１つ又はそれ以上を有し、或いは
    Ｅ． 前記抗ＣＤ７０抗体は、ヒトＣＤ７０を発現した細胞により内在化されることができる、
    という特徴のうちの少なくとも１つを有する、請求項１～８の何れか一項に記載の抗ＣＤ７０抗体。
  10. 請求項１～９の何れか一項に記載の抗ＣＤ７０抗体をコードする、核酸分子。
  11. 請求項１０に記載の核酸分子を含む宿主細胞であって、好ましくは、前記宿主細胞は微生物、植物又は動物細胞宿主細胞であり、より好ましくは、前記宿主細胞はＧｌｕｌ及びＦｕｔ８遺伝子をノックアウトした宿主細胞である、宿主細胞。
  12. 治療有効量の請求項１～９の何れか一項に記載の抗ＣＤ７０抗体、又は請求項１０に記載の核酸分子、及び１種又はそれ以上の薬学的に許容されるベクター、希釈剤又は賦形剤を含む、医薬組成物。
  13. 請求項１～９の何れか一項に記載の抗ＣＤ７０抗体と、前記抗ＣＤ７０抗体に複合されるエフェクター分子とを含む免疫複合体であって、好ましくは、前記エフェクター分子は、放射性同位体、抗腫瘍剤、免疫調節剤、生物反応修飾剤、レクチン、細胞毒性薬物、発色団、蛍光団、化学発光化合物、酵素及び金属イオンからなる群から選ばれる１種又はそれ以上である、免疫複合体。
  14. 免疫検出又はＣＤ７０の測定に用いられる方法であって、請求項１～９の何れか一項に記載の抗ＣＤ７０抗体を対象又は対象からのサンプルに接触させるステップを含む、方法。
  15. 請求項１～９の何れか一項に記載の抗ＣＤ７０抗体、又は請求項１３に記載の免疫複合体を含む、試薬キット。
  16. 疾患や病状を予防又は治療する方法であって、対象に治療有効量の下記のもの、即ち、
    Ａ． 請求項１～９の何れか一項に記載の抗ＣＤ７０抗体、
    Ｂ． 請求項１０に記載の核酸分子、
    Ｃ． 請求項１２に記載の医薬組成物、或いは
    Ｄ． 請求項１３に記載の免疫複合体、
    を投与することを含み、
    そのうち、前記疾患又は病状は腫瘍、自己免疫性疾患又は感染性疾患が好ましく、前記疾患又は病状は、ＣＤ７０に関連する疾患又は病状であることが好ましい、
    方法。
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