JP2018512377A - リガンド‐細胞傷害性薬物複合体、その製造方法、及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
現在、主として2つのADC薬物カップリング法がある:T-DM1で用いられる1つの方法は、細胞傷害性薬物と抗体のフリーアミノ基の間のランダム結合である;アドセトリスで用いられる他の方法は、細胞傷害性薬物と抗体のヒンジ領域の還元で得られるフリーチオールの間の結合である。両方のカップリング方法とも不定の薬物負荷を持った混合物が得られる。例えば、T-DM1の平均薬物負荷量は3.5であるが、薬物負荷量の分布は0〜8に亘る。低い薬物負荷量はADCの有効性に影響し、一方、高い薬物負荷量は組織のマクロファージ系により認識されて破壊されるADC薬物になる。これはADCの半減期を減少させるのみならず、標的でない組織における薬物の蓄積により有毒な副作用も増加させる。アドセトリスでは、還元剤が抗体のヒンジ領域におけるジスルフィド結合を還元するために用いられ、抗体自身の安定性に影響を与えた。関連するADCは、特許文献1〜7に開示されている。
R, R2-R7は、それぞれ水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択され;
R8-R11の少なくとも1つは、ハロゲン、アルケニル、アルキル及びシクロアルキルから成る群から選択され、R8-R11の残りは水素であり:
またはR8-R11のいずれか2つが結合してシクロアルキルを形成し、残りの2つが、それぞれ水素、アルキル及びシクロアルキルから成る群から選択され;
R12-R13は、それぞれ水素、アルキル及びハロゲンから成る群から選択され;
R14はアリールまたはヘテロアリールから選択され、該アリールまたはヘテロアリールは水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択される1以上の基で任意に置換されていてもよく;
yは1-8、好ましくは2-5であり;yは整数または十進数である正の実数であり;
PCはリガンド;Lはリンカーである。
R15は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択され;
R16は、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ及びヘテロシクリルから成る群から選択され;
nは2-6、好ましくは2-5であり;
mは0-5、好ましくは1-3であり;
PC, y, n, R, R2-R14は、式(PC-L-Dr)で定義した通りである。
R15, R16, mは、式(PC-L’-Dr)で定義した通りであり;
PC, y, n, R2-R14は、式(PC-L-Dr)で定義した通りである。
またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物が挙げられる。
またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物が挙げられる。
式中:
R, R1-R7は、それぞれ水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択され;
R8-R11の少なくとも1つは、ハロゲン、アルケニル、アルキル及びシクロアルキルから成る群から選択され、R8-R11の残りは水素であり:
またはR8-R11のいずれか2つが結合してシクロアルキルを形成し、残りの2つが、それぞれ水素、アルキル及びシクロアルキルから成る群から選択され;
R12-R13は、それぞれ水素、アルキル及びハロゲンから成る群から選択され;
R14はアリール及びヘテロアリールから選択され、該アリールまたはヘテロアリールはさらに水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択される1以上の基で任意に置換されていてもよい。
が挙げられる。
nは2-6、好ましくは2-5であり;
R, R1-R7は、それぞれ水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択され;
R8-R11の少なくとも1つは、ハロゲン、アルケニル、アルキル及びシクロアルキルから成る群から選択され、R8-R11の残りは水素であり:
またはR8-R11のいずれか2つが結合してシクロアルキルを形成し、残りの2つが、それぞれ水素、アルキル及びシクロアルキルから成る群から選択され;
R12-R13は、それぞれ水素、アルキル及びハロゲンから成る群から選択され;
R14はアリール及びヘテロアリールから選択され、該アリールまたはヘテロアリールはさらに水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択される1以上の基で任意に置換されていてもよい。
が挙げられる。
PCは、リガンドであり、好ましくは抗体、より好ましくはペルツズマブ、ニモツズマブ及びトラスツズマブから選択され;
R15は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択され;
R16は、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ及びヘテロシクリルから成る群から選択され;
mは、0-5、好ましくは1-3であり;
Xは、0-5、好ましくは1-3であり;Xは十進数及び整数などのである正の実数である。
から成る群から選択される。
2)式(PC-L2-B)の化合物に脱保護剤を加え、チオール基の保護基Tを除去して式(PC-L2)の化合物を得る、
ここで:Tは水素、t-ブチル、アセチル、n-プロピオニル、イソプロピオニル、トリフェニルメチル、メトキシメチル及び2-(トリメチルシリル)エトキシメチルから成る群から、好ましくは水素またはアセチルから選択され;
式(PC-L2-A)の化合物は、好ましくはS-(3-カルボニルプロピル)チオアセテートであり;
PC, R15, R16, m及びxは、式(PC-L2)で定義した通りである:
のステップを含む、式(PC-L2)の化合物を製造する方法に関する。
のステップを含む、式(PC-L’-D)の化合物を製造する方法に関する。
式中:
R8-R11のいずれか2つが結合してシクロアルキルを形成し、残りの2つが、それぞれ水素、アルキル及びシクロアルキルから成る群から任意に選択され;
R12は、それぞれ水素、アルキル及びハロゲンから成る群から選択され;
Pは、水素原子または保護基であり、保護基は、好ましくはBoc, Bn, Cbz、最も好ましくはBocであり;
Raは、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、シクロアルコキシ及びアルキルアミノから成る群から選択される。
式中:
R8-R12のいずれか2つとPが結合してシクロアルキルを形成し、残りの2つが、それぞれ水素、アルキル及びシクロアルキルから成る群から任意に選択され;
R’は、水素、アルキル及びシクロアルキルから成る群から選択される。
が挙げられる。
特に定義しない限り、本明細書で用いた全ての技術的及び科学的用語は本発明が属する技術分野における当業者の通常の理解と一致する。本発明は本明細書に記載したものと類似または同等の方法や物質を用いて実施または試験をすることができるが、本明細書には好ましい方法や物質を記載している。以下の用語は、以下の定義に従って本発明を記載し、保護するために用いられる。
本発明で商標名が用いられる場合、出願人は商標名の製品、ジェネリック医薬品及び製品の活性薬物部分の製造を含むことを意図している。
特に言及しない限り、本明細書及び特許請求の範囲で用いた用語は以下に述べる意味を有する。
該ヘテロシクリルは、アリール、ヘテロアリールまたはシクロアルキルの環に縮合してもよく、ここでは親構造に結合する環がヘテロシクリルである。代表例としては、これらに限定されないが、以下の基が挙げられる:
アリールは置換されていても、無置換であってもよい。置換されている場合、置換基は好ましくはアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ハロゲン、チオール、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルコキシ、複素環式アルコキシ、シクロアルキルチオ及びヘテロシクリルチオから成る群から独立して選択される1つ以上の基である。
該ヘテロアリール基は、置換されていても、無置換であってもよい。置換されている場合、置換基は好ましくはアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルスルホ、アルキルアミノ、ハロゲン、チオール、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルコキシ、複素環式アルコキシ、シクロアルキルチオ及び複素環式アルキルチオから成る群から独立して選択される1つ以上の基である。
「ヒドロキシ」とは、−OH基をいう。
「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子をいう。
「アルコキシカルボニル」とは、−C(O)O(アルキル)または(シクロアルキル)基をいい、ここでアルキル及びシクロアルキルは上記で定義した通りである。
(1)結合する試薬のモノクローナル抗体に対するモル比をコントロールする、
(2)反応時間と温度をコントロールする、
(3)異なる反応試薬を選択する。
本発明の合成の目的を達成するために、以下の合成スキームを採用した。
スキーム1
本発明による式(PC-L-DR)の化合物を製造するための方法は:
本発明による式(PC-L-DR1)の化合物を製造するための方法は:
式(PC-L2)の化合物をアセトニトリル溶液中で式(L1-D1)の化合物と反応させる。式(PC-L-DR)の化合物がSephadex G25ゲルカラムによる脱塩精製後に得られる;
式中、PC, m, n, y, R2〜R16は、式(PC-L-DR)で定義した通りである。
本発明を以下の実施例でさらに説明するが、実施例は発明の範囲を限定するものと考えてはならない。
実施例で特定されていない条件は、当該技術分野における通常の条件または製品製造者による原料物質の推奨条件である。示されていない試薬については、市販の慣用試薬である。
MSは、FINNIGAN LCQAd (ESI)マススペクトロメータ(製造者:Thermo、型:Finnigan LCQ advantage MAX)で測定した。
高速液体クロマトグラフィー(HPLC)は、Agilent 1200DAD高圧液体クロマトグラフィースペクトロメーター(Sunfire C18 150x4.6mmクロマトグラフィーカラム)及びWaters 2695-2996 高圧液体クロマトグラフィースペクトロメーター(Gimini C18 150x4.6mmクロマトグラフィーカラム)で測定した。
キナーゼの平均阻害率及びIC50値は、NovoStar ELISA (BMG Co., Germany) で測定した。
薄層シリカゲルクロマトグラフィー(TLC)については、Yantai Huanghai HSGF254またはQingdao GF254シリカゲルプレートを用いた。TLCに用いたシリカゲルプレートの厚さは0.15mm〜0.2mmで、生成物の精製に用いたシリカゲルプレートの厚さは0.4mm〜0.5mmである。
カラムクロマトグラフィーでは、担体としてYantai Huanghai 200〜300メッシュシリカゲルを用いた。
本発明の公知の原料物質は、技術分野で慣用の合成方法により調製するか、またはABCR GmbH & Co. KG、Acros Organics、Aldrich Chemical Company、Accela ChemBio Inc.、またはDari Chemical Companyなどから購入できる。
特に明示しない限り、全ての反応は、窒素雰囲気またはアルゴン雰囲気下で行った。
用語「窒素雰囲気」または「アルゴン雰囲気」は、反応フラスコが1Lの窒素またはアルゴンの風船を備えていたことをいう。
特に明記しない限り、反応で用いた溶液は水溶液をいう。
特に明示しない限り、反応における反応温度は室温をいう。室温は、20℃〜30℃の範囲にある最適の。反応温度である。
反応におけるpH = 6.5のPBSバッファーの調製:KH2PO4 8.5g, K2HPO4.3H2O 8.56g, NaCl 5.85g, EDTA 1.5gを2Lのボトルにセットし、次いで超音波処理に付してバッファーを得た。
反応におけるpH = 4.5の酢酸/酢酸ナトリウムバッファーの調製:無水酢酸ナトリウム9gをボトルに入れ、精製水を加えて2Lにし、次いで無水酢酸ナトリウム4.9 mLを加えて撹拌し、バッファーを得た。
反応におけるpH = 7.0のリン酸バッファーの調製:0.2M NaH2PO4 39mLを0.2M Na2HPO4 61mLに加えて撹拌し、pH = 7の0.2Mバッファーを得た。
反応過程は薄層クロマトグラフィー(TLC)でモニターし、そして溶出系としては:A:ジクロロメタンとメタノール、B:n−ヘキサンと酢酸エチル、C:石油エーテルと酢酸エチル、D:アセトンが挙げられる。溶媒の容積比は化合物の極性に従って調節した。
カラムクロマトグラフィーと薄層クロマトグラフィーによる化合物精製のため溶出系としては:A:ジクロロメタンとメタノール、B:n−ヘキサンと酢酸エチル、C:ジクロロメタンとアセトン、D:酢酸エチルとジクロロメタン、E:酢酸エチルとジクロロメタンとn−ヘキサン,F:酢酸エチルとジクロロメタンとアセトンが挙げられる。溶媒の容積は化合物の極性により調節し、そしてときには、トリエチルアミンなどの少量のアルカリ試薬または酸性試薬も添加した。
本発明の化合物の構造の幾つかはQ-TOF LC/MSにより測定した。Q-TOF LC/MSには、Agilent 6530 Accurate-Mass Quadrupole - Time of Flight Mass Spectrometer 及び Agilent 1290-Infinity UHPLC (Agilent Poroshell 300SB-C8 5μm, 2.1 X 75mm Column)が用いられた。
本発明の公知の出発物質は、先行技術で公知の方法を採用または用いることにより合成されるが、特定の条件が示されていない以下の実施例における実験方法は慣用の条件または製品製造者が推奨する条件に従って実施する。特定の供給源が示されていない実験試薬は、一般に市場から購入される慣用の試薬である。
以下の抗体を慣用の方法:例えば、ベクター作成、HEK293細胞トランスフェクション(Life Technologies Cat. No. 11625019)、精製及び発現に従って調製した。
抗体の配列
(1)ペルツズマブ、特異的に標的HER2に結合できる:
軽鎖の配列:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号1
重鎖の配列:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号2
軽鎖の配列:
Diqmtqspsslsasvgdrvtitcrssqnivhsngntyldwyqqtpgkapklliykvsnrfsgvpsrfsgsgsgtdftftisslqpediatyycfqyshvpwtfgqgtklqitrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
配列番号3
重鎖の配列:
Qvqlqqsgaevkkpgssvkvsckasgytftnyyiywvrqapgqglewigginptsggsnfnekfktrvtitadessttaymelsslrsedtafyfctrqglwfdsdgrgfdfwgqgttvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
配列番号4
軽鎖の配列:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号5
重鎖の配列:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号6
工程 1
(1S,3S,5S)-tert-ブチル3-((1R,2R)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボキシレート
アルゴン雰囲気下で(4R,5S)-4-メチル-5-フェニル-3-プロピオニルオキサゾリジン-2-オン1b(1.96 g, 9.26 mmol, 既知の方法“Journal of the American Chemical Society, 2003, 125(50), 15512-15520”に従って調製)を25 mLのジクロロメタンに溶解し、0℃まで冷却した。この反応溶液にトリエチルアミン(1.49 mL, 10.93 mmol)を加え、ジブチルボロントリフルオロメタンスルホネート(9.7 mL, 9.72 mmol)を滴下した後、0℃で50分間撹拌した。得られた混合物をドライアイス-アセトン浴の中で-75℃まで冷却した後、(1S,3S,5S)-tert-ブチル3-ホルミル-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボキシレート1a (2.16 g, 9.26 mmol, 既知の方法“US20100249190”に従って調製)のジクロロメタン溶液7 mLを加え、-75℃で1.5時間、そして0℃で2時間、更に室温で1時間それぞれ撹拌した。反応混合物にリン酸塩緩衝液(pH 7.0)及びメタノールの混合物(V/V=1:3)36 mLを加えた後、0℃でメタノール及び(30%)過酸化水素の混合液(V/V=2:1)36 mLを加え、室温で1時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、有機層を除去した。残渣に少量の水を加え、エーテル(50 mL x 3)で抽出し、5%重炭酸ナトリウム溶液及び塩化ナトリウムの飽和溶液(150 mL)で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(1S,3S,5S)-tert-ブチル3-((1R,2R)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボキシレート1c(2.4 g, 白色の泡沫状固体)を収率58.5%で得た。
MS m/z (ESI): 345.1 [M-100+1]
工程2
(1S,3S,5S)-tert-ブチル3-(1R,2R)-1-メトキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボキシレート
(1S,3S,5S)-tert-ブチル3-((1R,2R)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボキシレート1c(1.4 g, 3.15 mmol)をジクロロメタン20 mLに溶解し、粉砕した分子篩1.4 gを加えた。アルゴン雰囲気下及び0℃でこの混合物に1,8-ビスジメチルアミノナフタレン(1.75 g, 8.19 mmol)及びトリメチルオキソニウムテトラフルオロボロン(1.16 g, 7.87 mmol)を加えた。反応混合物を暗所に置き、室温で40時間撹拌した。反応終了後、反応混合物をろ過し、ろ過ケーキを塩化メチレンで洗浄した。合わせたろ液を塩化アンモニウムの飽和溶液(50 mL x 4)で洗浄し、過剰の1,8-ビスジメチルアミノナフタレンを除去し、塩化ナトリウムの飽和溶液(120 mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(1S,3S,5S)-tert-ブチル3-((1R,2R)-1-メトキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボキシレート1d(400 mg, 白色固体)を収率27.8%で得た。
MS m/z (ESI): 459.4 [M+1]
工程3
(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(tert-ブトキシカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸
アルゴン雰囲気下で(1S,3S,5S)-tert-ブチル3-((1R,2R)-1-メトキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボキシレート1d(400 mg, 0.87 mmol)をテトラヒドロフラン24 mLに溶解し、0℃まで冷却した。30%過酸化水素(0.34 mL/0.38 g, 3.31 mmol)をゆっくり滴下した後、水酸化リチウム一水和物(62 mg, 1.48 mmol)を加えた。この反応混合物は室温で20時間反応した。反応溶液に亜硫酸ナトリウム固体(440 mg, 3.48 mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。そして、水10 mLを加え、有機層を減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタン(40 mL x 2)で抽出した。氷浴中で分離した水層に2N塩酸を滴下し、溶液のpHを3〜4とした。そして、水層を酢酸エチル(25 mL x 3)で抽出し、合わせた酢酸エチル層を水(50 mL)及び塩化ナトリウムの飽和溶液(50 mL)で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、減圧下でろ液を濃縮し、標記生成物(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(tert-ブトキシカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸1e(230 mg, 無色の液体)を収率88.0%で得た。
MS m/z (ESI): 200.1 [M-100+1]
工程4
(1S,3S,5S)-tert-ブチル3-((1R,2R)-3-((S)-1-tert-ブトキシ-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イルアミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボキシレート
(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(tert-ブトキシカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸1e(100 mg, 0.334 mmol)をジクロロメタン及びジメチルホルムアミドの混合溶媒(V/V = 5: 1) 6 mLに溶解し、(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-フェニルプロパノエート1f(73.9 mg, 0.334 mmol, 既知の方法“Tetrahedron: Asymmetry, 2006, 17(4), 603-606”に従って調製)を加えた後、N,N-ジイソプロピルエチルアミン (0.29 mL, 67 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(152.3 mg, 0.40 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を室温で1時間攪拌した後、攪拌しながら水10 mLを加えた。ジクロロメタン層を塩化ナトリウムの飽和溶液(10 mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(1S,3S,5S)-tert-ブチル3-((1R,2R)-3-((S)-1-tert-ブトキシ-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イルアミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボキシレート1g(140 mg, 無色の粘稠性液体)を収率83.7%で得た。
MS m/z (ESI): 503.3 [M+1]
工程5
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート
(1S,3S,5S)-tert-ブチル3-((1R,2R)-3-((S)-1-tert-ブトキシ-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イルアミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボキシレート1g(140 mg, 0.28 mmol)をジオキサン溶液2 mLに溶解した後、5.6 M塩酸のジオキサン溶液(0.15 mL, 0.835 mmol)を加えた。反応系を密封した後、室温で8時間撹拌し、0℃の冷蔵庫に12時間放置した。反応後、ジクロロメタン3 mL、水3 mL及び重炭酸ナトリウムの飽和溶液3 mLを順次に加え、10分間撹拌した。ジクロロメタン層を塩化ナトリウムの飽和溶液(20 mL × 2)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート1h(86 mg, 黄色固体)を収率76.7%で得た。
MS m/z (ESI): 403.4 [M+1]
工程6
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート1h (86 mg, 0.213 mmol)及び(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-カルボン酸1i(136 mg, 0.213 mmol, 既知の方法“WO 2013072813”に従って調製)をジクロロメタン及びジメチルホルムアミドの混合溶媒(V/V = 5: 1)6 mLに溶解した後、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.19 mL, 1.065 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートヘキサフルオロリン酸塩(97.4 mg, 0.256 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を室温で1時間攪拌した後、水20 mLを加えた。ジクロロメタン層を塩化ナトリウムの飽和溶液 (20 mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14−オイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート1j(120 mg, 白色の泡沫状固体)を収率54.9%で得た。
MS m/z (ESI): 1023.1 [M+1]
工程7
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート1j(120 mg, 0.117 mmol)をジクロロメタン2 mLに溶解し、ジエチルアミン2 mLを加えた。アルゴン雰囲気下で反応液を室温で2時間攪拌した。反応溶液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート1kの粗製品(124 mg, 黄色の液体)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 801.5 [M+1].
工程8
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート1kの粗製品(90 mg, 0.112 mmol)をジオキサン1 mLに溶解した後、5.6 M塩酸のジオキサン溶液(3 mL)を加えた。反応系を密封し、室温で12時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣を高速液体クロマトグラフィーで精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸1(19 mg, 白色固体)を収率22.7%で得た。
MS m/z (ESI): 744.6 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD): d 7.34-7.21(m, 5H), 4.76-4.70(m, 2H), 4.26-4.19 (m, 1H), 4.14-4.06(m, 1H), 3.91-3.86(m, 1H), 3.85-3.77(m, 1H), 3.75-3.56(m, 2H), 3.44-3.10(m, 9H), 2.98-2.83(m, 1H), 2.71-2.57(m, 4H), 2.26-1.99(m, 4H), 1.92-1.77 (m, 1H), 1.75-1.58(m, 2H), 1.49-1.27(m,4H),1.21-0.95(m, 18H), 0.93-0.79(m, 4H), 0.76-0.61(m, 1H).
工程1
(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(2-クロロフェニル)プロパノエート
(S)-2-アミノ-3-(2-クロロフェニル)プロパン酸2a(400 mg, 2.0 mmol, 既知の方法“Journal of the American Chemical Society, 1940, 62, 565-8”に従って調製)を酢酸tert-ブチル10 mLに溶解し、過塩素酸(428 mg (70%), 3.00 mmol)を加えて、室温で16時間撹拌した。得られた混合物に水6 mLを加え、有機層を重炭酸ナトリウムの飽和溶液(3 mL)で洗浄した。重炭酸ナトリウムの飽和溶液で水層のpHを8に調整し、ジクロロメタン(5 mL ×3)で抽出した。有機層を合わせ、水(3 mL)及び塩化ナトリウムの飽和溶液(5 mL)で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(2-クロロフェニル)プロパノエート2b(400 mg, 白色固体)の粗製品を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
工程2
(1S,3S,5S)-tert-ブチル3-((1R,2R)-3-((S)-1-tert-ブトキシ-3-(2-クロロフェニル)-1-オキソプロパン-2-イルアミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボキシレート
(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(tert-ブトキシカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸1e(110 mg, 0.367 mmol)をジクロロメタン及びジメチルホルムアミドの混合溶媒(V/V = 5: 1)6 mLに溶解した後、(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(2-クロロフェニル)プロパノエート2b(94 mg, 0.367 mmol), N,N-ジイソプロピルエチルアミンの粗製品(0.32 mL, 1.835 mmol)及び2-(7-アザ-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(168 mg, 0.44 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を室温で1.5時間攪拌し、攪拌しながら水10 mLを加えた。有機層を塩化ナトリウムの飽和溶液(10 mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を洗浄し、標記生成物(1S,3S,5S)-tert-ブチル3-((1R,2R)-3-((S)-1-tert-ブトキシ-3-(2-クロロフェニル)-1-オキソプロパン-2-イルアミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボキシレート2c(112 mg, 白色の泡沫状固体)を収率56.8%で得た。
MS m/z (ESI): 537.3 [M+1]
工程3
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-クロロフェニル)プロパノエート
(1S,3S,5S)-tert-ブチル3-((1R,2R)-3-((S)-1-tert-ブトキシ-3-(2-クロロフェニル)-1-オキソプロパン-2-イルアミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボキシレート2c(110 mg, 0.205 mmol)をジオキサン2 mLに溶解した後、5.6 M塩酸のジオキサン溶液(0.13 mL, 0.717 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を室温で1時間攪拌した後、0℃の冷蔵庫に6時間放置した。その後、反応混合物に塩化メチレン5 mL及び重炭酸ナトリウムの飽和溶液10 mLを加え、10分間撹拌した。水層をジクロロメタン5 mLで抽出した。合わせた塩化メチレン層を塩化ナトリウムの飽和溶液(20 mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-クロロフェニル)プロパノエート2d(99 mg, 黄色の液体)の粗製品を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 437.2 [M+1]
工程4
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-sec-ブチル-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-クロロフェニル)プロパノエート
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-クロロフェニル)プロパノエート2dの粗製品(99 mg, 0.226 mmol)及び(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-カルボン酸1i (144.4 mg, 0.226 mmol)をジクロロメタン及びジメチルホルムアミドの混合溶媒(V/V = 5: 1)6 mLに溶解した後、N,N-ジイソプロピルエチルアミン (0.2 mL, 1.13 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(103.3 mg, 0.271 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を室温で1時間攪拌した後、攪拌しながら水10 mLを加えた。塩化メチレン層を塩化ナトリウムの飽和溶液(10 mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-sec-ブチル-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-クロロフェニル)プロパノエート2e(127mg, 白色の泡沫状固体)を収率53.1%で得た。
MS m/z (ESI): 1056.4 [M+1]
工程5
(S)-tert-ブチル3-(2-クロロフェニル)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)プロパノエート
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-sec-ブチル-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-クロロフェニル)プロパノエート2e(127 mg, 0.12 mmol)をジクロロメタン2 mLに溶解した後、ジエチルアミン2 mLを加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を室温で3時間攪拌した。その後、反応溶液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル3-(2-クロロフェニル)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)プロパノエート2fの粗製品(130 mg, 黄色の粘稠性物質)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 834.5 [M+1]
工程 6
(S)-3-(2-クロロフェニル)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)プロパン酸
(S)-tert-ブチル3-(2-クロロフェニル)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)プロパノエート2fの粗製品(100 mg, 0.12 mmol)をジオキサン1 mLに溶解した後、5.6 M塩酸のジオキサン溶液3 mLを加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を室温で12時間攪拌した。そして、反応溶液を減圧下で濃縮し、高速液体クロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-3-(2-クロロフェニル)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)プロパン酸2(35 mg, 白色固体)を収率35.7%で得た。
MS m/z (ESI): 778.7 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD): d 7.41-7.32(m, 2H), 7.31-7.16(m, 2H), 4.80-4.65(m, 2H), 4.22-4.13 (m, 1H), 4.10-4.03(m, 1H), 3.98-3.91(m, 1H), 3.87-3.82(m, 1H), 3.73-3.63(m, 2H), 3.47-3.12(m, 9H), 3.09-3.01(m, 1H), 2.67-2.57(m, 4H), 2.24-2.11 (m, 3H), 2.09-1.98(m, 1H), 1.89-1.67(m, 3H), 1.51-1.25 (m, 4H), 1.20-0.93(m, 18H), 0.92-0.79(m, 4H), 0.75-0.66(m, 1H).
工程1
(2S,5S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-5-メチルピロリジン-1-カルボキシレート
(4R,5S)-4-メチル-5-フェニル-3-プロピオニルオキサゾリジン-2-オン1b(0.992 g, 4.2 mmol)をジクロロメタン20 mLに溶解し、アルゴン雰囲気下で0℃まで冷却した。反応混合物にトリエチルアミン(0.69 mL, 4.96 mmol)を加えた後、ジブチルボロントリフルオロメタンスルホネート(4.4 mL, 4.4 mmol)を滴下した。この混合物を0℃で50分間攪拌した。反応溶液を-75℃まで冷却し、(2S,5S)-tert-ブチル2-ホルミル-5-メチルピロリジン-1-カルボキシレート3a(900 mg, 4.2 mmol, 既知の方法“US 20120195857”に従って調製)の塩化メチレン溶液5 mLを加えた。そして、-75℃で1.5時間、0℃で1.5時間、更に室温で1時間それぞれ攪拌した。その後、室温で反応混合物にリン酸塩緩衝液(pH = 7.0)及びメタノールの混合物(V/V = 1: 3)36 mLを加えた。反応混合物を0℃まで冷却し、メタノール及び(30%)過酸化水素の混合物(V/V = 2: 1)36 mLを加え、室温で1時間撹拌した。反応終了後、有機層を減圧下で濃縮し、水15 mLを加えた。水層をエーテル(30 mL × 3)で抽出し、合わせたエーテル層を5%重炭酸ナトリウム溶液、水及び塩化ナトリウムの飽和溶液(150 mL)で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(2S,5S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-5-メチルピロリジン-1-カルボキシレート3b(600 mg, 白色固体)を収率33%で得た。
工程2
(2S,5S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-メトキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-5-メチルピロリジン-1-カルボキシレート
(2S,5S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-5-メチルピロリジン-1-カルボキシレート3b(600 mg, 1.34 mmol)を塩化メチレン15 mLに溶解し、粉砕した分子篩1 gを加えた。アルゴン雰囲気下及び0oCでこの混合物に1,8-ビスジメチルアミノナフタレン(740 mg, 3.45 mmol)及びトリメチルオキソニウムテトラフルオロボレート(500 mg, 3.38 mmol)を加えた。反応混合物を錫箔で包み、室温で38時間撹拌した。反応終了後、得られた混合物をろ過し、ろ過ケーキをジクロロメタンで洗浄した。ろ液を合わせ、有機層を塩化アンモニウムの飽和溶液(20 mL × 3)で洗浄し、過剰の1,8-ビス-ジメチルアミノナフタレンを除去した後、塩化ナトリウムの飽和溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(2S,5S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-メトキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-5-メチルピロリジン-1-カルボキシレート3c(200 mg, 白色固体)を収率32%で得た。
工程3
(2R,3R)-3-((2S,5S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸
(2S、5S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-メトキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-5-メチルピロリジン-1-カルボキシレート3c(200 mg, 0.43 mmol)をテトラヒドロフラン22 mLに溶解し、アルゴン雰囲気下で0℃まで冷却した。この混合物に過酸化水素(186 mg, 1.6 mmol)及び水酸化リチウム一水和物(58 mg, 1.37 mmol)をゆっくり滴下した。0℃で反応混合物を10分間攪拌した後、氷浴を除き、室温で更に44時間攪拌した。反応終了後、反応溶液に亜硫酸ナトリウム固体(220 mg, 1.74 mmol)を加え、室温で1時間撹拌した後、水15 mLを加えた。有機層を減圧下で濃縮し、残渣をジクロロメタン(20 mL × 2)で抽出した。水層に2N 塩酸を滴下し、pHを3〜4にした。その後、酢酸エチル(20 mL × 3)で抽出し、酢酸エチル層を水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(2R,3R)-3-((2S,5S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸3dの粗製品(120 mg, 白色固体)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
工程4
(2S,5S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-3-((S)-1-tert-ブトキシ-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イルアミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-5-メチルピロリジン-1-カルボキシレート
(2R,3R)-3-((2S,5S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸3dの粗製品(106 mg, 0.35 mmol)をジクロロメタン及びジメチルホルムアミドの混合溶媒(V/V = 5: 1)4.8 mLに溶解した後、(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-フェニルプロパノエート1f(80 mg, 0.36 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下でこの混合物にN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.30 mL, 1.74 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(160 mg, 0.42 mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。反応終了後、反応混合物にジクロロメタン10 mLを加え、水(5 mL × 2)及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(2S,5S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-3-((S)-1-tert-ブトキシ-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イルアミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-5-メチルピロリジン-1-カルボキシレート3e(138 mg, 無色の粘稠性液体)を収率78%で得た。
工程5
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-メトキシ-2-メチル-3-((2S,5S)-5-メチルピロリジン-2-イル)プロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート
(2S,5S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-3-((S)-1-tert-ブトキシ-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イルアミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-5-メチルピロリジン-1-カルボキシレート3e(150 mg, 0.267 mmol)をジオキサン2.2 mLに溶解した後、4 M塩酸のジオキサン溶液(0.160 mL, 0.896 mmol)を加えた。反応系を密封し、室温で7時間撹拌した後、4℃の冷蔵庫に16時間放置した。反応溶液を減圧下で濃縮し、残渣にジクロロメタン15 mLを加え、0℃まで冷却し、重炭酸ナトリウムの飽和溶液を滴下し、pHを8に調整した。水層をジクロロメタン(8 mL × 2)で抽出し、有機層を合わせた。有機層を塩化ナトリウムの飽和溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-メトキシ-2-メチル-3-((2S,5S)-5-メチルピロリジン-2-イル)プロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート3f(80 mg, 無色の粘稠性固体)を収率74%で得た。
工程6
(S)-tert-ブチル2((2R,3R)-3-((2S、5S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-sec-ブチル-1-(9H-フルオレン)-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-メトキシ-2-メチル-3-((2S,5S)-5-メチルピロリジン-2-イル)プロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート3f(80 mg, 0.198 mmol)及び(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-カルボン酸1i(136 mg, 0.213 mmol)をジクロロメタン及びジメチルホルムアミドの混合溶媒(V/V = 5: 1)4.8 mLに溶解した後、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.170 mL, 0.98 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(100 mg, 0.263 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を室温で1時間攪拌した。反応終了後、反応混合物にジクロロメタン15 mLを加え、水(6 mL × 2)で洗浄した。水層をジクロロメタン(5 mL)で抽出し、合わせたジクロロメタン層を塩化ナトリウムの飽和溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-sec-ブチル-1-(9H-フルオレン)-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート3g(168 mg, 白色の泡沫状固体)を収率81%で得た。
工程7
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-sec-ブチル-1-(9H-フルオレン)-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート3g(167 mg, 0.16 mmol)をジクロロメタン2 mLに溶解し、ジエチルアミン2 mLを加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を室温で3時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((2S、5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート3hの粗製品(180 mg, 黄色の液体)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 802.6 [M+1]
工程8
(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-(S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート3hの粗製品(130 mg, 0.16 mmol)をジオキサン1 mLに溶解し、5.6 M塩酸のジオキサン溶液3 mLを加えた。反応系を密封し、室温で12時間撹拌した。反応終了後、反応溶液を減圧下で濃縮した。高速液体クロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸3(28 mg, 白色固体)を収率23%で得た。
MS m/z (ESI): 746.7 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD): d 7.31-7.14(m, 5H), 4.79-4.67(m, 2H), 4.25-4.13 (m, 1H), 4.10-3.97(m, 2H), 3.77-3.66(m, 1H), 3.60-3.52(m, 1H), 3.51-3.42(m, 1H), 3.41-3.12(m, 7H), 2.97-2.85(m, 1H), 2.67(d, 3H), 2.48-2.40(m, 2H), 2.30-2.02(m, 4H), 1.93-1.73(m, 2H), 1.70-1.55(m, 1H), 1.53-1.28(m, 5H),1.26-1.11(m, 7H), 1.10-0.99(m, 14H), 0.98-0.83(m, 4H).
工程1
6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイルクロリド
6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサン酸4a(1.5 g, 7.10 mmol, 既知の方法“Journal of Medcinal Chemistry, 2013, 56(24) 9955-9968”に従って調製)にN,N-ジメチルホルムアミド1滴を加え、これをドライアイス浴の中で冷却した後、アルゴン雰囲気下で激しく攪拌しながら塩化オキサリル15 mLを滴下した。そして、反応混合物を室温で1時間攪拌した。反応終了後、反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣を塩化メチレンに溶解し、減圧下で濃縮し、標記生成物6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイルクロリド4bの粗製品を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
工程2
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸1(17 mg, 0.023 mmol)をジクロロメタン1 mLに溶解し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(20 μL, 0.115 mmol)を加えた。そして、アルゴン雰囲気下及び氷浴中でこの混合物に6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイルクロリド4bのジクロロメタン溶液(7.9 mg, 0.034 mmol)を滴下し、室温で5時間攪拌した。反応終了後、メタノール10 mLを加え、反応混合物を減圧下で濃縮した。高速液体クロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸4(9 mg, 白色固体)を収率42%で得た。
MS m/z (ESI): 937.4 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD): d 7.37-7.17(m, 5H), 6.84-6.79(m, 2H), 4.80-4.71(m, 2H), 4.69-4.56(m, 2H), 4.26-4.19(m, 1H), 4.14-4.07(m, 1H), 3.92-3.86(m, 1H), 3.84-3.78(m, 1H), 3.77-3.60(m, 1H), 3.55-3.47(m, 2H), 3.42-3.23(m, 5H), 3.18-3.12 (m, 2H), 3.07-3.03(m, 2H), 3.02-2.82(m, 2H), 2.66-2.58(m, 2H), 2.54-2.46(m, 1H), 2.46-2.38(m, 2H), 2.30-2.14(m, 2H), 2.09-1.99(m, 1H), 1.90-1.78(m, 1H), 1.75-1.56 (m, 6H),1.48-1.28(m, 6H), 1.20-0.79(m, 22H), 0.77-0.69(m,1H).
(S)-3-(2-クロロフェニル)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)プロパン酸2(18 mg, 0.023 mmol)をジクロロメタン1 mLに溶解し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.02 mL, 0.115 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下及び氷浴中でこの混合物に6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイルクロリド4b(7.9 mg, 0.034 mmol)のジクロロメタン溶液を滴下した後、室温で4時間攪拌した。メタノール5 mLで反応を急冷した後、減圧下で濃縮した。高速液体クロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-3-(2-クロロフェニル)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)プロパン酸5(6 mg, 白色固体)を収率26.6%で得た。
MS m/z (ESI): 971.5 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD): d 7.42-7.34(m, 2H), 7.33-7.19(m, 2H), 6.83-6.78(m, 2H), 4.83-4.70(m, 2H), 4.68-4.56 (m, 2H), 4.24-4.16(m, 1H), 4.13-4.05(m, 1H), 4.03-3.95(m, 1H), 3.91-3.84(m, 1H), 3.76-3.65(m, 1H), 3.54-3.48(m, 2H), 3.47-3.18(m, 5H), 3.17-2.96(m, 6H), 2.67-2.58(m, 2H), 2.53-2.38(m, 3H), 2.28-2.18(m, 2H), 2.09-2.00(m, 1H), 1.92-1.57(m, 7H), 1.51-1.28(m, 6H), 1.21-0.82(m, 22H), 0.78-0.69(m, 1H).
(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-(S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸3(18 mg, 0.024 mmol)をジクロロメタン1 mLに溶解し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.02 mL, 0.12 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下及び氷浴中でこの混合物に6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイルクロリド4bのジクロロメタン溶液(8.3 mg, 0.036 mmol)を滴下した。この反応混合物を室温で4時間攪拌した。メタノール5 mLで反応を急冷した後、減圧下で濃縮した。高速液体クロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-(5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸6(7 mg, 白色固体)を収率30.9%で得た。
MS m/z (ESI): 939.5 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD): d 7.30-7.15(m, 5H), 6.83-6.78(m, 2H), 4.78-4.69(m, 2H), 4.69-4.56 (m, 2H), 4.24-4.12(m, 1H), 4.10-3.96(m, 2H), 3.60-3.44(m, 3H), 3.41-3.22(m, 4H), 3.16-3.10(m, 2H), 3.07-3.02(m, 2H), 3.01-2.86(m, 2H), 2.52-2.38(m, 4H), 2.31-2.15(m, 3H), 2.09-1.99(m, 1H), 1.91-1.77(m, 2H), 1.71-1.56(m, 5H), 1.52-1.28(m, 9H), 1.26-1.14(m, 6H), 1.11-0.77(m,18H).
工程1
(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート
(S)-ブチル2-アミノ-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート7a(400 mg, 2.18 mmol, 既知の方法“Advanced Synthesis & Catalysis, 2012, 354(17) 3327-3332”に従って調製)を酢酸tert-ブチル10 mLに溶解し、過塩素酸(300 mg(70%), 3.3 mmol)を加えた。この混合物を室温で16時間攪拌した。反応後、水6 mLを加え、有機層を重炭酸ナトリウムの飽和溶液(3 mL)で洗浄した。重炭酸ナトリウムの飽和溶液で水層のpHを8に調整し、ジクロロメタン(5 mL ×3)で抽出した。有機層を合わせ、水(3 mL)及び塩化ナトリウムの飽和溶液(5 mL)で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート7bの粗製品(390 mg, 黄色の油)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
工程 2
(1S,3S,5S)-tert-ブチル3-((1R,2R)-3-(((S)-1-(tert-ブトキシ)-3-(2-フルオロフェニル)-1-オキソプロパン-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボキシレート
(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(tert-ブトキシカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸1e(100 mg, 0.334 mmol)をジクロロメタン及びジメチルホルムアミドの混合溶媒(V/V = 5: 1)6 mLに溶解し、(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート7bの粗製品(80 mg, 0.334 mmol)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.29 mL, 1.67 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(152.3 mg, 0.40 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を室温で1時間攪拌した。反応終了後、攪拌しながら反応混合物に水10 mLを加え、ジクロロメタン層を塩化ナトリウムの飽和溶液 (10 mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(1S,3S,5S)-tert-ブチル3-((1R,2R)-3-(((S)-1-(tert-ブトキシ)-3-(2-フルオロフェニル)-1-オキソプロパン-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボキシレート7c(173 mg, 無色の液体)を収率99.5%で得た。
MS m/z (ESI): 521.2 [M+1]
工程 3
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート
(1S,3S,5S)-tert-ブチル3-((1R,2R)-3-(((S)-1-(tert-ブトキシ)-3-(2-フルオロフェニル)-1-オキソプロパン-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボキシレート7c(173 mg, 0.33 mmol)をジオキサン2 mLに溶解し、5.6 M塩酸のジオキサン溶液(0.21 mL, 1.16 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下でこの混合物を室温で1時間攪拌した後、0℃の冷蔵庫に12時間放置した。そして、反応溶液を減圧下で濃縮し、ジクロロメタン5 mL及び重炭酸ナトリウムの飽和溶液10 mLを加え、10分間撹拌した。水層をジクロロメタン(5 mL × 3)で抽出した。合わせたジクロロメタン層を塩化ナトリウムの飽和溶液(10 mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート7d(77 mg, 黄色の液体)の粗製品を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 421.2 [M+1]
工程 4
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S))-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート7dの粗製品(77 mg, 0.183 mmol)及び(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-カルボン酸1i (116.8 mg, 0.183 mmol)をジクロロメタン及びジメチルホルムアミドの混合溶媒(V/V = 5: 1)6 mLに溶解した後、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.16 mL, 0.915 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート (84 mg, 0.22 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を室温で1時間攪拌した。そして反応混合物に水6 mLを加え、ジクロロメタン層を塩化ナトリウムの飽和溶液(10 mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S))-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート7e(190.5 mg, 黄色の粘稠性物質)を収率100%で得た。
MS m/z (ESI): 1040.6 [M+1]
工程 5
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート7e(190.5 mg, 0.183 mmol)をジクロロメタン1.5 mLに溶解し、ジエチルアミン2 mLを加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を室温で3時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート7fの粗製品(150 mg, 黄色の粘稠性物質)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 818.5 [M+1]
工程 6
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート7fの粗製品(150 mg, 0.183 mmol)をジオキサン1 mLに溶解し、5.6 M塩酸のジオキサン溶液3 mLを加えた。アルゴン雰囲気下で得られた混合物を室温で12時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を減圧下で濃縮し、残留した溶媒を回転法によりエチルエーテルでコーティングした。高速液体クロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸7 (28 mg, 白色固体)を収率20%で得た。
MS m/z (ESI): 762.7 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD): d 7.38-7.18(m, 2H), 7.13-7.01(m, 2H), 4.80-4.67(m, 2H), 4.30-4.15(m, 1H), 4.13-4.01(m, 1H), 3.96-3.83(m, 2H), 3.75-3.60(m, 2H), 3.42-3.11(m, 9H), 3.06-2.95(m, 1H), 2.70-2.58(m, 4H), 2.28-2.01 (m, 4H), 1.88-1.70(m, 3H), 1.57-1.25 (m, 4H), 1.22-0.95(m, 18H), 0.92-0.80(m, 4H), 0.78-0.65(m, 1H).
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸7(25 mg, 0.033 mmol)をジクロロメタン3 mLに溶解し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.029 mL, 0.164 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下及び氷浴の中でこの混合物に6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイルクロリド4bのジクロロメタン溶液(11.3 mg, 0.049 mmol)を滴下し、室温で3時間攪拌した。反応混合物に水5 mLを加え、20分間撹拌した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。高速液体クロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸8(7 mg, 黄色の粘稠性物質)を収率22.4%で得た。
MS m/z (ESI): 955.4 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD): d 7.36-7.30(m, 1H), 7.29-7.21(m, 1H), 7.17-7.02(m, 2H), 6.83-6.79(m, 2H), 4.81-4.71(m, 2H), 4.69-4.55 (m, 2H), 4.25-4.15(m, 1H), 4.13-4.04(m, 1H), 3.96-3.85(m, 2H), 3.70-3.61(m, 1H), 3.55-3.46(m, 3H), 3.40-3.21 (m, 4H), 3.18-3.10(m, 2H), 3.07-2.96(m, 4H), 2.67-2.56(m, 2H), 2.54-2.34(m, 3H), 2.29-2.17(m, 2H), 2.10-1.99(m, 1H), 1.89-1.57(m, 7H), 1.52-1.28(m, 6H), 1.21-1.11 (m, 4H), 1.07-0.96(m, 6H), 0.95-0.81(m, 12H), 0.80-0.69(m, 1H).
工程1
(S)-tert-ブチル2-ホルミル-4-メチレンピロリジン-1-カルボキシレート
(S)-tert-ブチル2-(ヒドロキシメチル)-4-メチレンピロリジン-1-カルボキシレート9a(1.32 g, 6.19 mmol, 既知の方法“From Journal of Organic Chemistry, 2003, 68(10), 3923-3931”に従って調製)をジクロロメタン15 mLに溶解し、0℃まで冷却した。アルゴン雰囲気下でこの混合物にN,N-ジイソプロピルエチルアミン(5.38 mL, 30.9 mmol)、ジメチルスルホキシド(7.26 g, 92.9 mmol)及び三酸化硫黄-ピリジン複合体(7.26 g, 92.9 mmol)を加え、0℃で3時間撹拌した。リン酸塩緩衝液(pH = 7)で反応を急冷し、水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-ホルミル-4-メチレンピロリジン-1-カルボキシレート9b(1.1 g, 薄黄色の液体)を収率84.2%で得た。
工程2
(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-(5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-4-メチレンピロリジン-1-カルボキシレート
(4R,5S)-4-メチル-5-フェニル-3-プロピオニルオキサゾリジン-2-オン1b(1.43 g, 6.15 mmol)をジクロロメタン30 mLに溶解し、アルゴン雰囲気下で0℃まで冷却した。この溶液にトリエチルアミン(0.98 mL, 7.08 mmol)及びジブチルボロントリフルオロメタンスルホネート(6.65 mL, 6.65 Mmol)を滴下した後、0℃で50分間攪拌した。反応混合物を-78℃まで冷却し、用時調製された(S)-tert-ブチル2-ホルミル-4-メチレンピロリジン-1-カルボキシレート9b(1.43 g, 6.15 mmol)のジクロロメタン溶液を加えた。そして、この混合物を-78℃で2時間、0℃で1時間、更に室温で1時間それぞれ攪拌した。リン酸塩緩衝液(pH = 7)及びメタノールの混合物(V/V = 3: 1)36 mLで反応混合物を急冷した後、0℃でメタノール及び過酸化水素(V/V = 1: 2)の混合物を加え、室温で1時間撹拌した。反応終了後、メタノール及び有機層を除去した。残留した水層を塩化メチレンで抽出し、有機層を合わせ、水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-(5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-4-メチレンピロリジン-1-カルボキシレート9c(810 mg, 白色の泡沫状固体)を収率30%で得た。
MS m/z (ESI): 354.2 [M-100+1]
工程3
(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-メトキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-4-メチレンピロリジン-1-カルボキシレート
(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-4-メチレンピロリジン-1-カルボキシレート9c(810 mg, 1.82 mmol)をジクロロメタン15 mLに溶解し、粉砕した分子篩、炭酸カリウム(1.25 g, 9.11 mmol)及びメチルトリフルオロメタンスルホネート(897.7 mg, 5.47 mmol)を加えた。そして、この混合物を室温で12時間攪拌した。反応終了後、反応溶液をろ過し、ろ過ケーキをジクロロメタンで洗浄した。有機層を合わせ、減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-メトキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-4-メチレンピロリジン-1-カルボキシレート9d(280 mg, 白色の泡沫状固体)を収率33.5%で得た。
MS m/z (ESI): 359.2 [M-100+1]
工程4
(2R,3R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)-4-メチレンピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸
(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-メトキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-4-メチレンピロリジン-1-カルボキシレート9d(400 mg, 0.87 mmol)をテトラヒドロフラン20 mLに溶解し、水酸化リチウム一水和物(62.2 mg, 1.484 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を0℃まで冷却した後、30%過酸化水素(112.7 mg, 3.31 mmol)を滴下した。この混合物を室温で12時間反応させた。反応終了後、亜硫酸ナトリウム(416 mg, 3.3 mmol)を反応溶液に加えた。この混合物を室温で1時間攪拌した。テトラヒドロフランを減圧下で濃縮し、残渣を水に溶解し、ジクロロメタンで抽出した。薄い塩酸で水層を希釈し、pHを3〜4に調整した後、ジクロロメタン(30 mL × 3)で抽出した。合わせた有機層を水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(2R,3R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)-4-メチレンピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸9eの粗製品(230 mg, 無色の液体)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 298.2 [M-1]
工程5
(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(tert-ブトキシ)-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-4-メチレンピロリジン-1-カルボキシレート
(2R,3R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)-4-メチレンピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸9e(220 mg, 0.735 mmol)をジクロロメタン6 mLに溶解し、(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-フェニルプロパノエート1f(178.8 mg, 0.809 mmol)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.51 mL, 2.94 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(363 mg, 0.956 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を室温で3時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(tert-ブトキシ)-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-4-メチレンピロリジン-1-カルボキシレート9f(271 mg, 白色固体)を収率66%で得た。
MS m/z (ESI): 503.3 [M+1]
工程 6
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-メトキシ-2-メチル-3-((S)-4-メチレンピロリジン-2-イル)プロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート
(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(tert-ブトキシ)-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-4-メチレンピロリジン-1-カルボキシレート9f(270 mg, 0.537 mmol)を1,4-ジオキサン4 mLに溶解し、4 M塩酸のジオキサン溶液(0.335 mL, 1.881 mmol)を加えた。室温でこの混合物を1時間撹拌し、0〜4℃の冷蔵庫に12時間放置した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣を塩化メチレンに溶解し、重炭酸ナトリウムの飽和溶液を加え、pHを8〜9に調整した。水層を塩化メチレンで抽出した。有機層を合わせ、水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-メトキシ-2-メチル-3-((S)-4-メチレンピロリジン-2-イル)プロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート9gの粗製品(210 mg, 薄黄色の油)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 403.4 [M+1]
工程7
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)-4-メチレンピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-メトキシ-2-メチル-3-((S)-4-メチレンピロリジン-2-イル)プロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート9gの粗製品(210 mg, 0.521 mmol)及び(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-カルボン酸1i (365.9 mg, 0.547 mmol)をジクロロメタン6 mLに溶解し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.4537 mL, 2.609 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(257.8 mg, 0.678 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を室温で2時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)-4-メチレンピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート9h(345 mg, 白色の泡沫状固体)を収率64.7%で得た。
MS m/z (ESI): 1022.5 [M+1]
工程8
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-4-メチレンピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)-4-メチレンピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート9h(345 mg, 0.337 mmol)をジクロロメタン2 mLに溶解し、ジエチルアミン3 mLを加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を室温で2時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-4-メチレンピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート9iの粗製品(375 mg, 黄色の油)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 800.5 [M+1]
工程9
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-4-メチレンピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-4-メチレンピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート9iの粗製品(370 mg, 0.462mmol)に4M塩酸のジオキサン溶液7 mLを加えた。この反応系を密封し、室温で12時間撹拌した。反応終了後、反応溶液を減圧下で濃縮した。高速液体クロマトグラフィーで残渣を精製し、生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-4-メチレンピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸9(30 mg, 白色固体)を収率11.9%で得た。
MS m/z (ESI): 744.7 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CDCl3) d 10.57(s, 1H), 10.00(s, 1H), 8.41-8.26(m, 2H), 7.52-6.99(m, 5H), 5.34(s, 1H), 5.02-4.95(m, 4H), 4.38-4.33(m, 2H), 4.16(m, 2H), 3.93-3.75(m, 3H), 3.49-3.07(m, 6H), 2.94-2.32(m, 16H), 2.30-2.01(m, 4H), 1.75-1.65(m, 2H), 1.32-0.83(m, 16H).
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-4-メチレンピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸9(22 mg, 0.0295 mmol)をジクロロメタン3 mLに溶解し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(19 mg, 0.1479 mmol)を加えた。この混合物を0℃まで冷却し、用時調製された6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイルクロリド4bのジクロロメタン溶液(10.1 mg, 0.0443 mmol)を滴下した。アルゴン雰囲気下で反応混合物を室温で2.5時間攪拌した。メタノールで反応を急冷した後、減圧下で濃縮した。高速液体クロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-4-メチレンピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸10(1.3 mg, 白色の粘着性物質)を収率4.6%で得た。
MS m/z (ESI): 937.9 [M+1]
工程1
(S)-tert-ブチル6-ホルミル-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-5-カルボキシレート
(S)-tert-ブチル6-(ヒドロキシメチル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-5-カルボキシレート11a(2.37 g, 10.4 mmol, 既知の方法“Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2013, 23(9), 2653-2658”に従って調製)をジクロロメタン40 mLに溶解し、0℃まで冷却した。アルゴン雰囲気下でこの溶液にN,N-ジイソプロピルエチルアミン(10.8 mL, 62.5 mmol)、ジメチルスルホキシド(12.2 g, 156.4 mmol)及び三酸化硫黄-ピリジン複合体(6.63 g, 41.7 mmol)を加えた。反応混合物を0℃で3時間攪拌した。反応終了後、リン酸塩緩衝液(pH = 7)を加え、反応混合物を急冷し、水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル6-ホルミル-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-5-カルボキシレート11b(2 g, 黄色の液体)を収率88%で得た。
工程2
(S)-tert-ブチル6-((1R,2R)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-5-カルボキシレート
(4R,5S)-4-メチル-5-フェニル-3-プロピオニルオキサゾリジン-2-オン1b(2 g, 8.88 mmol)をジクロロメタン35 mLに溶解し、アルゴン雰囲気下でトリエチルアミン(1.42 mL, 10.2 mmol)を滴下した。この混合物を0℃まで冷却し、ジブチルボロントリフルオロメタンスルホネート(9.59 mL, 9.59 mmol)を滴下した後、0℃で50分間攪拌した。78℃で用時調製された(S)-tert-ブチル6-ホルミル-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-5-カルボキシレート11bのジクロロメタン溶液(2 g, 8.88 mmol)を加え、-78℃で2時間、0℃で1時間、更に室温で1時間それぞれ撹拌した。リン酸塩緩衝液(pH = 7.0)及びメタノールの混合物(V/V = 3: 1)を加え、反応混合物を急冷した。0℃でメタノール及び過酸化水素の混合物(V/V = 1: 2)を加え、混合物を室温で1時間攪拌した。減圧下で濃縮した後、残渣を水に溶解し、塩化メチレンで抽出した。有機層を合わせ、水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られた残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル6-((1R,2R)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-5-カルボキシレート11c(1.8g, 白色の泡沫状固体)を収率44.2%で得た。
MS m/z (ESI): 459.4 [M+1]
工程3
(S)-tert-ブチル6-((1R,2R)-1-メトキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-5-カルボキシレート
(S)-tert-ブチル6-((1R,2R)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-5-カルボキシレート11c(1.8 g, 3.92 mmol)をジクロロメタン30 mLに溶解し、粉砕した分子篩を加えた。アルゴン雰囲気下で炭酸カリウム(3.78 g, 27.48 mmol)及びメチルトリフルオロメタンスルホネート(3.22 g, 19.64 mmol)を加え、反応混合物を室温で12時間攪拌した。反応終了後、反応溶液をろ過し、ろ過ケーキをジクロロメタンで洗浄した。有機層を合わせ、減圧下で濃縮した。溶出系Aを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル6-((1R,2R)-1-メトキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-5-カルボキシレート11d(930 mg, 無色の油)を収率50.2%で得た。
MS m/z (ESI): 473.4 [M+1]
工程4
(2R,3R)-3-((S)-5-(tert-ブトキシカルボニル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸
(S)-tert-ブチル6-((1R,2R)-1-メトキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-5-カルボキシレート11d(1.03 g, 2.8 mmol)をテトラヒドロフラン20 mLに溶解し、水酸化リチウム一水和物(155 mg, 3.7 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下で30% 過酸化水素(939 mg, 8.28 mmol)を滴下した。室温で反応混合物を12時間攪拌した。反応終了後、亜硫酸ナトリウム(1.04 g, 8.28 mmol)を反応溶液に加え、室温でこの混合物を1時間攪拌した。テトラヒドロフランを減圧下で濃縮し、残渣を水に溶解し、ジクロロメタンで抽出した。水層を薄い塩酸で希釈し、pHを3〜4に調整した後、ジクロロメタン(30 mL x 5)で抽出した。合わせた有機層を水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(2R,3R)-3-((S)-5-(tert-ブトキシカルボニル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸11eの粗製品(700 mg, 無色の粘稠性液体)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 314.4 [M+1]
工程5
(S)-tert-ブチル6-((1R,2R)-3-(((S)-1-(tert-ブトキシ)-3-(2-フルオロフェニル)-1-オキソプロパン-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-5-カルボキシレート
(2R,3R)-3-((S)-5-(tert-ブトキシカルボニル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸11eの粗製品(350 mg, 1.117 mmol)をジクロロメタン6 mLに溶解し、(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート7b(267 mg, 1.117 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下でこの混合物にN,N-ジイソプロピルエチルアミン(720 mg, 5.587 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(509.8 mg, 1.341 mmol)を加えた後、室温で2時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル6-((1R,2R)-3-(((S)-1-(tert-ブトキシ)-3-(2-フルオロフェニル)-1-オキソプロパン-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-5-カルボキシレート11f(570 mg, 無色の油)を収率95.3%で得た。
MS m/z (ESI): 535.3 [M+1]
工程 6
(S)-tert-ブチル3-(2-フルオロフェニル)-2-((2R,3R)-3-メトキシ-2-メチル-3-((S)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)プロパンアミド)プロパノエート
(S)-tert-ブチル6-((1R,2R)-3-(((S)-1-(tert-ブトキシ)-3-(2-フルオロフェニル)-1-オキソプロパン-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-5-カルボキシレート11f(570 mg, 1.049 mmol)を1,4-ジオキサン8 mLに溶解し、4 M塩酸のジオキサン溶液(0.749 mL, 4.196 mmol)を加えた。室温でこの混合物を1時間撹拌し、0〜4℃の冷蔵庫に12時間放置した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣を塩化メチレンに溶解した。重炭酸ナトリウムの飽和溶液を滴下し、pHを8〜9に調整し、水層を塩化メチレンで抽出した。有機層を合わせ、水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル3-(2-フルオロフェニル)-2-((2R,3R)-3-メトキシ-2-メチル-3-((S)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)プロパンアミド)プロパノエート11gの粗製品(440 mg, 薄黄色の油)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 435.4 [M+1]
工程 7
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((S)-5-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート
(S)-tert-ブチル3-(2-フルオロフェニル)-2-((2R,3R)-3-メトキシ-2-メチル-3-((S)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)プロパンアミド)プロパノエート11gの粗製品(440 mg, 1.013 mmol)、(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-カルボン酸1i(645.8 mg, 1.013 mmol)をジクロロメタン10 mLに溶解し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.88 mL, 5.06 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(500.5 mg, 1.317 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を室温で2時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((S)-5-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート11h(570 mg, 白色固体)を収率53.4%で得た。
MS m/z (ESI): 1054.9 [M+1]
工程 8
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((S)-5-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート11h(560 mg, 0.531 mmol)をジクロロメタン2 mLに溶解し、ジエチルアミン6 mLを加えた。この混合物を室温で2.5時間撹拌した。反応終了後、反応溶液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート11i(550 mg, 白色の粘着性物質)の粗製品を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 832.5 [M+1]
工程9
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート11iの粗製品(450 mg, 0.541 mmol)に4M塩酸のジオキサン溶液7 mLを加えた。反応系を密封し、室温で12時間撹拌した。反応終了後、反応溶液を減圧下で濃縮した。高速液体クロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸11(403 mg, 白色固体)を収率96%で得た。
MS m/z (ESI): 776.7 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) d 7.30-7.22(m, 2H), 7.12-7.04(m, 2H), 4.72-4.68(m, 2H), 4.13-4.07(m, 2H), 3.96-3.94(m, 1H), 3.70-3.66(m, 2H), 3.50-3.47(m, 2H), 3.40-3.37(m, 3H), 3.34-3.28(m, 4H), 3.26-3.22(m, 2H), 3.11(s,1H), 3.05-2.91(m, 2H), 2.67-2.65(m, 3H), 2.57-2.43(m, 2H), 2.39-2.28(m, 2H), 2.25-2.16(m, 3H), 1.93-1.88 (m, 2H), 1.55-1.43(m, 2H), 1.23-1.21(d, 2H), 1.16-1.08(m, 3H), 1.08-0.97 (m, 10H), 0.89-0.83(m, 3H), 0.66-0.53(m, 3H), 0.46-0.43(m, 2H).
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸11(150 mg, 0.193 mmol)をジクロロメタン7 mLに溶解し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(87.3 mg, 0.677 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を0℃まで冷却し、用時調製された6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイルクロリド4b(57.6 mg, 0.251 mmol)のジクロロメタン溶液を滴下した後、室温で2時間撹拌した。この反応をメタノールで急冷し、減圧下で濃縮した。高速液体クロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸12(14.7 mg, 白色固体)を収率7.8%で得た。
MS m/z (ESI): 969.9 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) d 7.29-7.23(m, 2H), 7.10-7.04(m, 2H), 6.79-6.78(m, 2H), 4.69-4.54(m, 3H), 4.18-4.07(m, 3H), 3.98-3.92(m, 1H), 3.75-3.71(m, 2H), 3.50-3.47(m, 3H), 3.42-3.39(m, 2H), 3.34-3.32(m, 5H), 3.27-3.19(m, 4H), 3.09-2.95(m, 5H), 2.49-2.47(m, 2H), 2.41-2.36(m, 2H), 2.29-2.18(m, 3H), 2.09-2.02(m, 2H), 1.90-1.87(m, 2H), 1.63-1.59(m, 4H), 1.49(s, 2H), 1.32-1.28(m, 3H), 1.21-1.12(m, 3H), 1.00-0.81(m, 12H), 0.62-0.55(m, 3H), 0.46-0.40(m, 2H).
本調製法は実施例11と類似するが、工程5の原料の代替として(2R,3R)-3-((S)-5-(tert-ブトキシカルボニル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸11e及び(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-フェニルプロパノエート1fを用い、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸13(219 mg, 白色固体)を得た。
MS m/z (ESI): 758.7 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) d 7.31-7.19(m, 5H), 4.70-4.68(m, 2H), 4.14-4.03(m, 2H), 3.95-3.93(m, 1H), 3.69-3.66(m, 2H), 3.48-3.45(m, 2H), 3.43-3.38(m, 3H), 3.34-3.29 (m, 4H), 3.23-3.21(m, 2H), 3.11(s, 1H), 2.97-2.89(m, 2H), 2.67-2.65(m, 3H), 2.51-2.43(m, 2H), 2.39-2.27(m, 2H), 2.21-2.06(m, 3H), 1.88-1.82(m, 2H), 1.41-1.39 (m, 2H), 1.23-1.21(d, 2H), 1.16-1.10(m, 3H), 1.08-0.98(m, 10H), 0.89-0.84(m, 3H), 0.63-0.52(m, 3H), 0.46-0.43(m, 2H).
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸13(120 mg, 0.158 mmol)をジクロロメタン5 mLに溶解し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(71.5 mg, 0.554 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下でこの混合物を0℃まで冷却し、用時調製された6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイルクロリド4bのジクロロメタン溶液(47.1 mg, 0.2059 mmol)を滴下した後、室温で2時間撹拌した。反応終了後、メタノール1 mLを加え、10分間撹拌した。この混合物を減圧下で濃縮した。高速液体クロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸14(5.1 mg, 白色固体)を収率3.39%で得た。
MS m/z (ESI): 951.9 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) d 7.29-7.18(m, 5H), 6.80-6.79(m, 2H), 4.75-4.61(m, 3H), 4.21-3.99(m, 3H), 3.94-3.91(m, 1H), 3.74-3.70(m, 2H), 3.51-3.44(m, 3H), 3.42-3.37(m, 2H), 3.34-3.28(m, 5H), 3.23-3.21(m, 4H), 3.10-2.86(m, 5H), 2.49-2.36(m, 4H), 2.32-2.17(m, 3H), 2.12-2.03(m, 2H), 1.88-1.80(m, 2H), 1.67-1.58(m, 4H), 1.49(s, 2H), 1.37-1.26(m, 3H), 1.22-1.13(m, 3H), 1.00-0.83(m, 12H), 0.63-0.51(m, 3H), 0.43-0.40(m, 2H).
(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(p-トリル)プロパノエート
(S)-2-アミノ-3-(p-トリル)プロパン酸15a(400 mg, 2.23 mmol, 既知の方法“Organic & Biomolecular Chemistry, 2004, 2(18), 2684-2691”に従って調製)を酢酸tert-ブチル10 mLに溶解した。アルゴン雰囲気下でこの混合物に過塩素酸(336.3 mg(70%), 3.34 mmol)を加え、室温で16時間撹拌した。反応後、水10 mLを加えた。重炭酸ナトリウムの飽和溶液で水層のpHを8に調整し、ジクロロメタン(5 mL ×3)で抽出した。有機層を合わせ、塩化ナトリウムの飽和溶液(5 mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(p-トリル)プロパノエート15b(370 mg, 白色固体)を収率70%で得た。
本調製法は実施例1と類似するが、工程4の原料の代替として(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(tert-ブトキシカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸1e及び(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(p-トリル)プロパノエート15bを用い、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(p-トリル)プロパン酸15(30 mg, 白色固体)を得た。
MS m/z (ESI): 758.8 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD): d 7.19-7.07(m, 4H), 4.82-4.68(m, 2H), 4.30-4.18 (m, 1H), 4.15-4.05(m, 1H), 3.89-3.84(m, 1H), 3.83-3.76(m, 1H), 3.74-3.62(m, 2H), 3.47-3.12(m, 9H), 2.89-2.79(m, 1H), 2.70-2.59(m, 4H), 2.34-2.03(m, 7H), 1.91-1.75 (m, 1H), 1.73-1.53(m, 2H), 1.50-1.24(m,4H),1.22-0.92(m, 18H), 0.90-0.79(m, 4H), 0.75-0.64(m,1H).
工程1
(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(チオフェン-2-イル)プロパノエート
(S)-2-アミノ-3-(チオフェン-2-イル)プロパン酸16a(400 mg, 2.33 mmol, 既知の方法“European Journal of Organic Chemistry, 2006, (5), 1113-1116”に従って調製)を酢酸tert-ブチル10 mLに溶解した。アルゴン雰囲気下でこの混合物を0℃まで冷却し、過塩素酸(352 mg(70%), 3.5 mmol)を滴下した。反応混合物を室温で16時間撹拌した後、水を加え、重炭酸ナトリウムの飽和溶液でpHを8〜9に調整し、ジクロロメタンで抽出した。有機層を合わせ、水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(チオフェン-2-イル)プロパノエート16bの粗製品(370 mg, 薄黄色の油)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 228.3 [M+1].
本調製法は実施例1と類似するが、工程4の原料の代替として(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(tert-ブトキシカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸1e及び(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(チオフェン-2-イル)プロパノエート16bを用い、標記生成物 (S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(チオフェン-2-イル)プロパン酸16(18 mg, 白色固体)を得た。
MS m/z (ESI): 527.6 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CDCl3) d 11.00(s, 1H), 8.44(s, 1H), 7.17-7.15(d, 1H), 6.94-6.88 (d, 2H), 4.97-4.95(m, 2H), 4.10-4.08(m, 1H), 3.85-3.83(m, 2H), 3.71-3.69(m, 2H), 3.52-3.50(m, 2H), 3.37-3.34(m, 12H), 3.06-3.04(m, 2H), 2.80-2.78(m, 2H), 2.3-2.26 (m, 4H), 1.64-1.59(m, 3H), 1.48-1.46(m, 2H), 1.31-1.259(m, 12H), 1.08-0.98(m, 8H), 0.89-0.82(m, 4H).
工程1
(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(3-フルオロフェニル)プロパノエート
(S)-2-アミノ-3-(3-フルオロフェニル)プロパン酸17a(549 mg, 3 mmol, 既知の方法“Advanced Synthesis & Catalysis, 2012, 354(17), 3327- 3332”に従って調製)を酢酸tert-ブチル15 mLに溶解した。アルゴン雰囲気下及び0℃でこの混合物に過塩素酸(450 mg(70%), 4.5 mmol)を加えた後、室温で12時間撹拌した。反応後、水30 mLを加え、有機層を1N塩酸20 mL及び重炭酸ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄した。水層を合わせ、重炭酸ナトリウムの飽和溶液で pHを8〜9に調整し、ジクロロメタン(100 mL ×2)で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(3-フルオロフェニル)プロパノエート17bの粗製品(600 mg, 油)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
本調製法は実施例1と類似するが、工程4の原料の代替として(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(tert-ブトキシカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸1e 及び(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(3-フルオロフェニル)プロパノエート17bを用い、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(3-フルオロフェニル)プロパン酸17(25 mg, 白色固体)を得た。
MS m/z (ESI): 762.8 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD): d 7.29-7.21(m, 1H), 7.08-6.87(m, 3H), 4.81-4.73(m, 1H), 4.72-4.67(m, 1H), 4.61-4.53(m, 1H), 4.29-4.22(m, 1H), 4.15-4.06(m, 1H), 3.99-3.93(m, 1H), 3.75-3.58(m, 2H), 3.43-3.12(m, 9H), 2.99-2.90(m, 1H), 2.69-2.60 (m, 4H), 2.30-1.97(m, 4H), 1.87-1.77(m, 1H), 1.63-1.53(m, 1H), 1.49-1.36(m, 1H), 1.18-0.92(m, 22H), 0.91-0.82(m, 4H), 0.81-0.71(m,1H).
S-(3-オキソプロピル)エタンチオエート18a(0.35 mg, 2.65 mmol)をアセトニトリル0.45 mLに溶解した。ペルツズマブの酢酸/酢酸ナトリウム緩衝液(10.85 mg/ml, 4.5 mL, 0.488 mmol)溶液pH 4.5にS-(3-オキソプロピル)エタンチオエート18a のアセトニトリル溶液を加えた後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム水溶液(7.06 mg, 112mmol) 1.0 mLを滴下した。反応混合物を25℃で2時間撹拌した。反応終了後、残渣を脱塩し、Sephadex G25ゲルカラム(溶出液: 0.05 M PBS 溶液, pH 6.5)で精製し、標記生成物18bの溶液を得た。これを次の工程に直接に用いた。
工程 2
18bの溶液(15.0 mL)に2.0 M塩酸ヒドロキシルアミン溶液0.45 mLを加え、25℃で30分間撹拌した。Sephadex G25 ゲルカラム(溶出液: 0.05 M PBS 溶液, pH 6.5)を用いてこの反応溶液を脱塩し、ペルツズマブ-プロパンチオール溶液18c(濃度:1.65 mg/ml, 22.6 mL)を得た。
工程 3
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)4(1.09 mg, 1.16 mmol)をアセトニトリル1.1 mLに溶解し、ペルツズマブ-プロパンチオール溶液18c(1.65 mg/mL, 11.3 mL)を加えた。25℃で4時間撹拌した後、Sephadex G25ゲルカラム(溶出液: 0.05M PBS溶液、pH 6.5)を用いて反応混合物を脱塩し、無菌下で0.2 mmフィルターを通してろ過し、標記生成物18のPBS緩衝液(0.75 mg/mL, 19.5 mL)を得た。これを4℃で保管した。
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 148119.54(MAb+0D), 149331.45(MAb+1D), 150407.02 (MAb+2D, 151297.79(MAb+3D), 152448.85(MAb+4D), 153782.23(MAb+5D).
平均値: y=2.0.
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 148119.68(MAb+0D), 149308.79(MAb+1D), 150194.76 (MAb+ 2D), 151354.52(MAb+3D), 152410.57(MAb+4D), 153375.31(MAb+5D).
平均値:y=1.9.
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: Q-TOF LC/MS: 148253.27(MAb+0D), 149263.59 (MAb+1D), 150315.25(MAb+2D), 151334.45(MAb+3D), 152383.92(MAb+4D), 153446.37 (MAb+5D).
平均値:y=2.2.
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 148312.73(MAb+0D), 149515.61(MAb+1D), 150459.55 (MAb+ 2D), 151521.47(MAb+3D), 152580.02(MAb+4D).
平均値:y=1.7.
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 148411.82(MAb+0D), 149412.97(MAb+1D), 150468.08 (MAb+ 2D), 151496.41(MAb+3D), 152580.37(MAb+4D).
平均値: y=2.1.
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 148092.94(MAb+0D), 149296.82(MAb+1D), 150339.86 (MAb+ 2D), 151416.51(MAb+3D), 152516.25(MAb+4D), 153422.64(MAb+5D).
平均値: y=1.7.
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 148094.99(MAb+0D), 149277.83(MAb+1D), 150343.15 (MAb+ 2D), 151359.29(MAb+3D), 152478.14(MAb+4D), 153449.92(MAb+5D).
平均値: y=1.6.
工程 1
(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート
(4R,5S)-4-メチル-5-フェニル-3-プロピオニルオキサゾリジン-2-オン1b (4.6 g, 20.1 mmol)をジクロロメタン80 mLに溶解し、アルゴン雰囲気下で0℃まで冷却した。0℃でこの反応溶液にトリエチルアミン(3.2 mL, 23.1 mmol)及びジブチルボロントリフルオロメタンスルホネート(20 mL, 20.7 mmol)を滴下し、0℃で50分間撹拌した後、-75℃で(S)-tert-ブチル2-ホルミルピロリジン-1-カルボキシレート25a(4 g, 20.1 mmol, 既知の方法“Journal of the American Chemical Society, 2011, 133(42), 16901-16910”に従って調製)のジクロロメタン溶液5 mLを滴下し、-75℃で1時間撹拌した。その後、0℃で2時間、室温で1時間それぞれ撹拌した。リン酸塩緩衝液(pH = 7.0)及びメタノールの混合物(V/V = 1: 3) 60 mLを反応溶液に加えた。0℃でメタノール及び30%過酸化水素の混合物(V/V = 2: 1)60 mLを加えた。室温で1時間撹拌した。反応終了後、有機層を減圧下で濃縮し、水15 mLを加えた。水層をエーテル(30 mL × 3)で抽出し、エーテル層を合わせ、5%重炭酸ナトリウム溶液、水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート25b(2.26 g, 白色の泡沫状固体)を収率24.9%で得た。
MS m/z (ESI): 333.3 [M-100+1]
工程 2
(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-メトキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート
(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート25b(2 g, 4.62 mmol)をジクロロメタン20 mLに溶解し、粉砕した分子篩2 gを加えた。0oC及びアルゴン雰囲気下でこの混合物に1,8-ビスジメチルアミノナフタレン(2.57 g, 12 mmol)及びトリメチルオキソニウムテトラフルオロボレート(1.71 g, 11.5 mmol) を加え、室温で17時間撹拌した。この反応混合物をろ過し、ろ過ケーキをジクロロメタンで洗浄した。ろ液を合わせ、有機層を塩化アンモニウムの飽和溶液(20 mL x 3)及び塩化ナトリウムの飽和溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-メトキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート25c(1.3 g, 白色の泡沫状固体)を収率63%で得た。
MS m/z (ESI): 447.3 [M+1]
工程 3
(2R,3R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸
(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-メトキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート25c(1.3 g, 2.9 mmol)をテトラヒドロフラン80 mLに溶解した。アルゴン雰囲気下でこの溶液を0℃まで冷却し、30%過酸化水素(1.25 g, 11 mmol)を滴下し、水酸化リチウム一水和物(207 mg, 4.95 mmol)を加えた。室温で反応混合物を12時間撹拌した。反応終了後、亜硫酸ナトリウム固体(1.47 g, 11.6 mmol)を反応溶液に加え、室温でこの混合物を1時間撹拌した。その後、少量の水を加え、有機層を減圧下で濃縮した。少量の水を加え、残渣を溶解し、ジクロロメタン(50 mL × 2)で抽出した。水層に塩酸を加え、pHを3とし、ジクロロメタン(40 mL × 3)で抽出した。有機層を水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(2R,3R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸25dの粗製品(870 mg, 無色の油)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
工程4
(S)-tert-tert-ブチル2-((1R,2R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシ)-3-(2-フルオロフェニル)-1-オキソプロパン-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート
(2R,3R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸25d(100 mg, 0.368 mmol)をジクロロメタン6 mL及びジメチルホルムアミド1.8 mLに溶解し、(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート7b(97 mg, 0.405mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下でこの混合物にN,N-ジイソプロピルエチルアミン(237.8 mg, 2.844 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(168.2 mg, 0.442 mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。そして、反応混合物にジクロロメタン10 mLを加え、水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(tert-ブトキシ)-3-(2-フルオロフェニル)-1-オキソプロパン-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート25e(157 mg, 無色の油)を収率83.9%で得た。
MS m/z (ESI): 509.3 [M+1]
工程 5
(S)-tert-ブチル3-(2-フルオロフェニル)-2-((2R,3R)-3-メトキシ-2-メチル-3-((S)-ピロリジン-2-イル)プロパンアミド)プロパノエート
(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(tert-ブトキシ)-3-(2-フルオロフェニル)-1-オキソプロパン-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート25e(157 mg, 0.308 mmol)をジオキサン2 mLに溶解し、4 M塩酸のジオキサン溶液(0.193 mL, 1.08 mmol)を加えた。反応系を密封し、室温で1時間撹拌した後、4℃の冷蔵庫に12時間放置した。反応溶液を減圧下で濃縮し、残渣をジクロロメタンに溶解し、重炭酸ナトリウムの飽和溶液で洗浄した。水層をジクロロメタンで抽出した。有機層を合わせ、塩化ナトリウムの飽和溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル3-(2-フルオロフェニル)-2-((2R,3R)-3-メトキシ-2-メチル-3-((S)-ピロリジン-2-イル)プロパンアミド)プロパノエート25fの粗製品(100 mg, 淡黄色の油)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 407.2 [M-1]
工程 6
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート
(S)-tert-ブチル3-(2-フルオロフェニル)-2-((2R,3R)-3-メトキシ-2-メチル-3-((S)-ピロリジン-2-イル)プロパンアミド)プロパノエート25f(100 mg, 0.244 mmol)及び(5S、8S、11S、12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-カルボン酸1i(156.1 mg, 0.244 mmol)をジクロロメタン及びジメチルホルムアミドの混合溶媒(V/V = 4: 1)7.5 mLに溶解し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(158 mg, 1.224 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下でこの混合物に2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(121 mg, 0.318 mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。そして、反応混合物をジクロロメタンで希釈し、水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート25g(242 mg, pale 黄色の油)を収率96.5%で得た。
MS m/z (ESI): 1028.4 [M+1]
工程 7
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-(5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート25g(242 mg, 0.235 mmol)をジクロロメタン3 mLに溶解し、ジエチルアミン3 mLを加えた。この混合物を室温で3時間撹拌した後、減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-(5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート25hの粗製品(250 mg, 黄色の油)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 806.7[M+1]
工程 8
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸
(S)-tert-ブチル 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ -(5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート25hの粗製品(262 mg, 0.325mmol)を反応フラスコに入れ、4 M塩酸のジオキサン溶液7 mLを加えた。反応系を密封し、室温で12時間撹拌した後、この反応溶液を減圧下で濃縮し、高速液体クロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸25(50 mg, 白色固体)を収率28.4%で得た。
MS m/z (ESI): 750.7 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) d 7.35-7.30(m, 1H), 7.20-7.15(m, 1H), 7.09-6.09(m, 2H), 4.81-4.75(m, 1H), 4.70-4.64(m, 1H), 4.15-4.13(m, 1H), 4.05-4.03(m, 1H), 3.84-3.81 (m, 1H), 3.69-3.64(m, 1H), 3.55-3.51(m, 1H), 3.48-3.13(m, 13H), 3.03-2.91(m, 2H), 2.66-2.53(m, 3H), 2.47-2.45(m, 1H), 2.40-2.33(m, 2H), 2.27-2.23 (m, 1H), 2.17-2.11 (m, 2H), 1.96-1.85(m, 3H), 1.63-1.40(m, 4H), 1.21-1.14(m, 3H), 1.09-0.94(m, 12H), 0.87-0.84(m, 3H).
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸25(20 mg, 0.026 mmol)をジクロロメタン3 mLに溶解した後、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(13.7 mg, 0.106 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下でこの混合物を0℃まで冷却した後、用時調製された6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイルクロリド4b(10.1 mg, 0.0443 mmol) のジクロロメタン溶液を滴下し、室温で2時間撹拌した。メタノールで反応を急冷した後、減圧下で濃縮した。高速液体クロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-2-((R)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸26(7 mg, 白色固体)を収率28.5%で得た。
MS m/z (ESI): 941.6 [M-1]
1HNMR (400 MHz, CD3OD) d 7.32-7.21(m, 2H), 7.10-7.00(m, 2H), 6.80-6.78(m, 2H), 4.75-4.55(m, 3H), 4.12-4.06(m, 2H), 3.93-3.89(m, 1H), 3.87-3.78(m, 2H), 3.69-3.63(m, 1H), 3.52-3.47(m, 3H), 3.44-3.28(m, 3H), 3.21-3.10(m, 4H), 3.04-2.96 (m, 4H), 2.53-2.40(m, 4H), 2.35-2.18(m, 2H), 2.13-2.00(m, 2H), 1.94-1.75(m, 4H), 1.68-1.56(m, 5H), 1.37-1.27(m, 4H), 1.20-1.13(m, 3H), 1.05-0.81(m, 18H).
工程1
(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(2-メトキシフェニル)プロパノエート
(S)-2-アミノ-3-(2-メトキシフェニル)プロパン酸27a(250 mg, 1.28 mmol, 既知の方法“Chemical Communications (Cambridge, United Kingdom), 2013, 49(70), 7744-766”に従って調製)を酢酸tert-ブチル7 mLに溶解した。アルゴン雰囲気下でこの溶液に過塩素酸 (270 mg(70%), 1.88 mmol)を加え、室温で16時間撹拌した。そして、反応混合物にジクロロメタン10 mLを加え、重炭酸ナトリウムの飽和溶液でpHを8に調整した。水層を分離し、ジクロロメタン(10 mL ×3)で抽出した。有機層を合わせ、塩化ナトリウムの飽和溶液(10 mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(2-メトキシフェニル)プロパノエート27b(280 mg, 薄黄色の油)を収率87%で得た。
本調製法は実施例1と類似するが、工程4の原料の代替として(2R,3R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸25d及び(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(2-メトキシフェニル)プロパノエート27bを用い、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-メトキシフェニル)プロパン酸27(22 mg, 灰色かかった白色の固体)を得た。
MS m/z (ESI): 760.7[M-1].
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-メトキシフェニル)プロパン酸27(18 mg, 0.023 mmol)をジクロロメタン5 mLに溶解した。アルゴン雰囲気下でこの溶液にN,N-ジイソプロピルエチルアミン(12.19 mg, 0.29 mmol)を加えた後、0℃で用時調製された6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイルクロリド4b(6.5 mg, 0.028 mmol)のジクロロメタン溶液を滴下し、室温で2時間撹拌した。メタノールで反応を急冷した後、減圧下で濃縮した。高速液体クロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-2-((R)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-メトキシフェニル)プロパン酸28(4 mg, 白色固体)を収率18.2%で得た。
MS m/z (ESI): 955.5 [M+1]
本調製法は実施例25と類似するが、原料の代替として(2R,3R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸 25d及び(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(p-トリル)プロパノエート15bを用い、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-(5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(p-トリル)プロパン酸29(20 mg, 白色固体)を得た。
MS m/z (ESI): 746.6 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD): d 7.17-7.05(m, 4H), 4.84-4.67(m, 2H), 4.27-4.15 (m, 1H), 4.12-4.05(m, 1H), 3.89-3.82(m, 1H), 3.78-3.63(m, 2H), 3.57-3.47(m, 1H), 3.43-3.11(m, 7H), 2.92-2.79(m, 1H), 2.67(d, 3H), 2.52-2.44(m, 1H), 2.40-2.15(m, 7H), 2.12-2.01(m, 1H), 1.95-1.69(m, 3H), 1.67-1.49(m, 2H), 1.48-1.27(m,4H),1.23-1.12(m, 5H), 1.11-0.95(m, 14H), 0.94-0.84(m, 3H).
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-(5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(p-トリル)プロパン酸29(12 mg, 0.016 mmol)をジクロロメタン1 mLに溶解した。アルゴン雰囲気下でこの溶液にN, N-ジイソプロピルエチルアミン(0.014 mL, 0.08 mmol)を加えた後、0℃で用時調製された6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイルクロリド4b(5.54 mg, 0.024 mmol)のジクロロメタン溶液を滴下し、室温で4時間撹拌した。メタノールで反応を急冷し、減圧下で濃縮した。高速液体クロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(p-トリル)プロパン酸30(4 mg, 白色固体)を収率26.5%で得た。
MS m/z (ESI): 939.4 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD): d 7.22-7.03(m, 4H), 6.85-6.78(m, 2H), 4.83-4.55(m, 3H), 4.27-3.97(m, 3H), 3.90-3.62(m, 3H), 3.59-2.95(m, 14H), 2.94-2.79(m, 1H), 2.54-2.35(m, 3H), 2.34-2.12(m, 5H), 2.08-1.99(m, 1H), 1.93-1.72(m, 3H), 1.71-1.51 (m,5H),1.48-1.24(m, 8H), 1.23-1.12(m, 3H), 1.11-0.78(m, 17H).
工程1
(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(3-クロロフェニル)プロパノエート
(S)-2-アミノ-3-(3-クロロフェニル)プロパン酸31a(600 mg, 3 mmol)を酢酸tert-ブチル15 mLに溶解した。アルゴン雰囲気下及び0℃でこの溶液に過塩素酸(450 mg(70%), 4.5 mmol)を滴下し、室温で12時間撹拌した。そして、反応混合物に水10 mLを加え、有機層を1N 塩酸20 mL及び重炭酸ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄した。水層を合わせ、重炭酸ナトリウムの飽和溶液を滴下し、pHを8〜9に調整し、ジクロロメタン(100 mL ×2)で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(3-クロロフェニル)プロパン酸ブチル31bの粗製品(500 mg, 油)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
本調製法は実施例25と類似するが、工程4の原料の代替として (2R,3R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸25d及び(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(3-クロロフェニル)プロパノエート31bを用い、標記生成物(S)-3-(3-クロロフェニル)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-(5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)プロパン酸31(4 mg, 白色固体)を得た。
MS m/z (ESI): 766.6 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD): d 7.31-7.12(m, 4H), 4.73-4.51(m, 2H), 4.22-4.05(m, 1H), 3.92-3.83(m, 1H), 3.76-3.65(m, 1H), 3.62-3.51(m, 1H), 3.50-3.12(m, 9H), 3.09-2.98(m, 1H), 2.59-2.39(m, 4H), 2.38-2.24(m, 1H), 2.23-2.17(m, 1H), 2.16-2.01 (m, 3H), 2.00-1.85(m, 2H), 1.84-1.76(m, 1H), 1.73-1.57(m, 2H), 1.43-1.27(m, 5H), 1.25-1.14(m, 3H), 1.10-0.95(m, 13H), 0.94-0.83(m, 5H).
本調製法は実施例25と類似するが、工程4の原料の代替として (2R,3R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸25d及び(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(3-フルオロフェニル)プロパノエート17bを用い、標記生成物 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-(5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(3-フルオロフェニル)プロパン酸32(33.5 mg, 白色固体)を得た。
MS m/z (ESI): 750.7 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) d 7.31-7.28(m, 1H), 7.08-6.95(m, 3H),4.77-4.69(m, 2H), 4.09-3.94(m,3H), 3.69-3.66(m,2H),3.48-3.44(m, 2H), 3.38-3.36(m, 3H), 3.34-3.28(m, 6H), 3.26-3.19(m, 2H), 3.13(m,1H), 3.01-2.91(m, 2H), 2.67-2.65(m, 2H),2.54-2.47(m, 2H), 2.34-2.28(m, 2H), 2.18-2.00(m, 2H),1.98-1.77(m, 2H), 1.55-1.42(m, 2H), 1.08-0.98(m, 18H),0.88-0.83 (m, 3H).
工程1
(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(2,4-ジクロロフェニル)プロパノエート
(S)-2-アミノ-3-(2,4-ジクロロフェニル)プロパン酸33a(1.3 g, 5.57 mmol, 既知の方法“International Journal of Peptide & Protein Research, 1987, 30(1), 13-21”に従って調製)を酢酸tert-ブチル10 mLに溶解した。0℃及びアルゴン雰囲気下でこの溶液に過塩素酸(1.2 g(70%), 8.36 mmol)を滴下し、室温で12時間撹拌した。反応混合物を塩化メチレンで希釈し、重炭酸ナトリウムの飽和溶液を滴下し、pHを8〜9に調整した。水層を塩化メチレンで抽出した。 有機層を合わせ、水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(2,4-ジクロロフェニル)プロパノエート33bの粗製品(3.4 g, 薄黄色の油)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
本調製法は実施例25と類似するが、工程4の原料の代替として (2R,3R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸25d及び(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(2,4-ジクロロフェニル)プロパノエート33bを用い、標記生成物(S)-3-(2,4-ジクロロフェニル)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-(5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)プロパン酸33(23 mg, 白色固体)を得た。
MS m/z (ESI): 800.6 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) d 7.43-7.42(m, 1H), 7.26-7.23(m,2H), 4.75-4.67(m, 2H), 4.14-4.04(m, 2H), 4.00-3.98(m, 1H), 3.91-3.89(m, 1H), 3.68-3.67(m, 3H), 3.39-3.26(m, 12H), 3.21-3.12(m, 3H), 2.67-2.64(m, 3H), 2.50-2.46(m, 3H), 2.31-2.28 (m, 2H), 2.17-2.15(m, 2H), 2.02-2.00(m, 4H), 1.90-1.88(m, 2H), 1.74-1.72(m, 2H), 1.39-1.37(m, 2H), 1.06-0.98(m, 12H).
工程1
(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(o-トリル)プロパノエート
(S)-2-アミノ-3-(o-トリル)プロパン酸34a(100 mg, 0.55 mmol, 既知の方法“International Journal of Peptide & Protein Research, 1987, 30(1), 13-21”に従って調製)を酢酸tert-ブチル2.5 mLに溶解し、アルゴン雰囲気下で過塩素酸(107 mg(70%), 0.83 mmol)を滴下した。この混合物を室温で16時間撹拌した後、ジクロロメタン5 mLで希釈し、重炭酸ナトリウムの飽和溶液を滴下し、pHを8に調整した。水層をジクロロメタン(5 mL ×3)で抽出した。有機層を合わせ、水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(o-トリル)プロパノエート34bの粗製品(140 mg, 無色油)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
本調製法は実施例25と類似するが、工程4の原料の代替として(2R,3R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸25d及び(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(o-トリル)プロパノエート34bを用い、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(o-トリル)プロパン酸34(40 mg, 白色固体)を得た。
MS m/z (ESI): 746.8 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) d 8.41-8.39(d, 1H), 8.19-8.17(d, 1H), 7.18-7.05(m, 4H), 4.80-4.78(d, 1H), 4.71-4.69(d, 1H), 3.86-3.84(m, 1H), 3.76-3.72(m, 1H), 3.69-3.63 (m, 2H), 3.48-3.42(d, 2H), 3.38-3.23(m, 5H), 3.20-3.12(m, 4H), 2.98-2.87 (m, 2H), 2.66-2.65(d, 3H), 2.53-2.50(d, 1H), 2.46-2.44(d, 1H), 2.41-2.26(m, 4H), 2.21-2.14(m, 2H), 2.10-2.04(m, 1H), 1.87-1.85(m, 2H), 1.77-1.74(m, 1H), 1.62-1.53 (m, 2H), 1.33-1.28(m, 3H), 1.23-1.21(d, 2H), 1.16-1.14(d, 2H), 1.08-0.96(m, 14H), 0.90-0.84(m, 3H).
本調製法は実施例25と類似するが、工程4の原料の代替として(2R,3R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸25d及び(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(チオフェン-2-イル)プロパノエート16bを用い、標記生成物 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-(5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(チオフェン-2-イル)プロパン酸35(2.6 mg, 白色固体)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) d 7.21-7.19(m, 1H), 6.91-6.90(m, 2H), 4.80-4.65(m, 2H), 4.16-4.08(m, 2H), 3.93-3.90(m, 1H), 3.70-3.66(m, 2H), 3.55-3.52(m, 1H), 3.48-3.45(m, 2H), 3.40-3.26(m, 6H), 3.25-3.13(m, 4H), 2.96-2.82(t, 1H), 2.69-2.65(d, 3H), 2.52-2.47(m, 2H), 2.39-2.29(m, 1H), 2.21-2.14(m, 2H), 1.92-(s, 3H), 1.63-1.61(m, 2H), 1.40-1.29(m, 3H), 1.23-1.14(m, 3H), 1.10-0.98(m, 13H), 0.88-0.85 (t, 3H).
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 148094.39(MAb+0D), 149111.06(MAb+1D), 150167.12 (MAb+ 2D), 151188.93(MAb+3D), 152243.46(MAb+4D), 153272.96(MAb+5D).
平均値: y=1.9
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 148093.25(MAb+0D), 149281.78(MAb+1D), 150474.33 (MAb+ 2D), 151372.72(MAb+3D), 152373.24(MAb+4D), 153469.40(MAb+5D).
平均値: y=2.3.
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 148247.08(MAb+0D), 149265.32(MAb+1D), 150276.10 (MAb+ 2D), 151334.50(MAb+3D), 152392.21(MAb+4D), 153388.72(MAb+5D).
平均値: y=2.4.
S-(3-オキソプロピル)エタンチオエート18a(2.44 mg, 18.5 mmol)をアセトニトリル3.0 mLに溶解した。ニモツズマブの酢酸/酢酸ナトリウム緩衝液(10.22 mg/ml, 30 mL, 0.204 mmol)pH 4.3を、S-(3-オキソプロピル)エタンチオエート18aのアセトニトリル溶液とともに加えた後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム水溶液(49.86 mg, 793 mmol)1.2 mLを滴下した。反応混合物を25℃で2時間撹拌した。10% アセトニトリルを含有するPBS緩衝液(250 mL)を用いた30 KDa限外ろ過で反応溶液を精製した後、PBS緩衝液(200 mL)pH 6.5を用いた30 KDa限外ろ過パックで未反応のS-(3-オキソプロピル)エタンチオエート18a及びシアノ水素化ホウ素ナトリウムを除去し、標記生成物39bのPBS緩衝液(約75 mL)を得た。これを次の工程に直接に用いた。
工程 2
39bのPBS緩衝液(75.0 mL)に2.0 M塩酸ヒドロキシルアミン溶液2.0 mLを加え、25℃の水浴の中に設置された振動機に置き、30分間振動した。PBS緩衝液pH 6.5を用いた30 KDa 限外ろ過で反応溶液を精製し、標記生成物ニモツズマブ-プロパンチオール39cのPBS緩衝液(濃度:5.38 mg/ml, 55 mL)を得た。
工程3
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)4(4.48 mg, 4.78 mmol)をアセトニトリル1.1 mLに溶解し、ニモツズマブ-プロパンチオールのPBS緩衝液39c(5.38 mg/mL, 11 mL)を加えた。25℃の水浴中で4時間振動した後、反応を止めた。
得られた混合物をSephadex G25ゲルカラム(溶出液: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で脱塩して精製し、標記生成物39のPBS緩衝液の粗製品(2.96 mg/mL, 20.5 mL)を得た。これを遠心により約6 mLに濃縮し、再度Sephadex G25ゲルカラム(溶出液: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で脱塩して精製し、標記生成物39のPBS緩衝液(4.25 mg/mL, 11.8 mL)を得た。これを4℃で保管した。
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 150188.68(MAb+0D), 151234.76(MAb+1D), 152248.46 (MAb+ 2D), 153419.10(MAb+3D), 154312.17(MAb+4D), 155358.48 (MAb+5D).
平均値: y=2.2.
得られた混合物をSephadex G25ゲルカラム(溶出液: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で脱塩し、標記生成物40のPBS緩衝液の粗製品(2.92 mg/mL, 20 mL)を得た。これを更に約5.5 mLに濃縮し、再度Sephadex G25ゲルカラム(溶出液: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で脱塩し、標記生成物40のPBS緩衝液(4.25 mg/mL, 11.6 mL)を得た。これを4℃で保管した。
Q-TOF LC/MS:特徴ピーク: 150186.98(MAb+0D), 151374.09(MAb+1D), 152287.22 (MAb+ 2D), 153353.26(MAb+3D), 154501.80(MAb+4D), 155575.57(MAb+5D).
平均値: y=2.2.
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 150186.05(MAb+0D), 151362.44(MAb+1D), 152261.90 (MAb+ 2D), 153438.29(MAb+3D), 154339.30(MAb+4D), 155511.23(MAb+5D).
平均値: y=2.3.
反応混合物をSephadex G25ゲルカラム(溶出液: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で脱塩し、標記生成物42のPBS緩衝液の粗製品(0.74 mg/mL, 10 mL)を得た。これを更に遠心し、約5.5 mLに濃縮し、再度Sephadex G25ゲルカラム(溶出液: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で脱塩し、標記生成物42のPBS緩衝液(1.15 mg/mL, 6 mL)を得た。これを4℃で保管した。
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 150188.42(MAb+0D), 151387.82(MAb+1D), 152472.27 (MAb+ 2D), 153528.33(MAb+3D).
平均値: y=1.0.
反応混合物をSephadex G25ゲルカラム(溶出液: 0.05 M PB溶液, pH 6.5)でを脱塩し、標記生成物43のPBS緩衝液の粗製品(0.78 mg/mL, 9.5 mL)を得た。これを更に遠心し、約5.5 mLに濃縮し、再度Sephadex G25 ゲルカラム(溶出液: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で脱塩し、標記生成物43のPBS緩衝液(1.16 mg/mL, 6 mL)を得た。これを4℃で保管した。
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 150188.39(MAb+0D), 151251.46(MAb+1D), 152442.90 (MAb+ 2D), 153507.73(MAb+3D).
平均値: y=1.0.
工程1
(2S,4S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-3-((R)-4-ベンジル-2-オキソオキサゾリジン-3-イル)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-4-フルオロピロリジン-1-カルボキシレート
(R)-4-ベンジル-3-プロピオニルオキサゾリジン-2-オン44b(21 g, 90 mmol, 既知の方法“Tetrahedron Letters, 1999, 40(36), 6545-6547”に従って調製)をジクロロメタン300 mLに溶解し、アルゴン雰囲気下で0℃まで冷却した。0℃でこの反応溶液に四塩化チタン(9.8 mL, 1.1 mmol)を滴下し、この溶液は徐々に無色から黄色に変化し、黄色の固体が形成された。N,N-ジイソプロピルエチルアミン(40 mL, 225 mmol)をゆっくり滴下し、白煙が生じた。この溶液は黄色から赤褐色に変化した。この混合物を0℃で1時間撹拌した後、-78℃まで冷却し、(2S,4S)-tert-ブチル4-フルオロ-2-ホルミルピロリジン-1-カルボキシレート44a(21.27 g, 98 mmol, 既知の方法“Tetrahedron: Asymmetry, 2014, 25(3), 212-218”に従って調製)のジクロロメタン溶液50 mLを加え、更に-78℃で1.5時間撹拌した。TLCにより反応の完了をモニターした。反応溶液に5%重炭酸ナトリウム溶液200 mLを加え、水層をジクロロメタン(300 mL × 2)で抽出した。有機層を合わせ、水(200 mL)及び塩化ナトリウムの飽和溶液(200 mL)で順次に洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(2S,4S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-3-((R)-4-ベンジル-2-オキソオキサゾリジン-3-イル)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-4-フルオロピロリジン-1-カルボキシレート44c(19 g, 薄黄色の固体)を収率43.2%で得た。
MS m/z (ESI): 351.06 [M-100+1]
工程 2
(2R,3R)-3-((2S,4S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-ヒドロキシ-2-メチルプロパン酸
(2S,4S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-3-((R)-4-ベンジル-2-オキソオキサゾリジン-3-イル)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-4-フルオロピロリジン-1-カルボキシレート44c(19 g, 42 mmol)をテトラヒドロフラン200 mL及び水50 mLに溶解し、アルゴン雰囲気下で0℃まで冷却した。30%過酸化水素(17.2 mL, 147 mmol)をゆっくり滴下し、水酸化リチウム一水和物(2.86 g, 68 mmol)80 mLを加えた。反応混合物を0℃で5時間撹拌した。亜硫酸ナトリウム溶液(21.2 g, 168 mmol)100 mLを反応溶液に加え、更に25℃で16時間撹拌した。反応終了後、有機層を減圧下で濃縮し、残渣をジクロロメタン(200 mL × 3)で洗浄した。1N 塩酸で水層のpHを3に調整し、酢酸エチル(200 mL × 4)で抽出した。有機層を合わせ、減圧下で濃縮した。残渣を350 mLの重炭酸ナトリウム 溶液(5%)に溶解し、ジクロロメタン(200 mL × 2)で洗浄した。2N塩酸で水層のpHを3に調整し、酢酸エチル(200 mL × 5)で抽出し、有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(2R,3R)-3-((2S,4S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-ヒドロキシ-2-メチルプロパン酸44dの粗製品(11.6 g, 薄黄色の粘稠性液体)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 191.47 [M-100+1]
工程 3
(2R,3R)-3-((2S,4S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸
(2R,3R)-3-((2S,4S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-ヒドロキシ-2-メチルプロパン酸44d(11.6 g, 39.8 mmol)をテトラヒドロフラン200 mLに溶解し、窒素雰囲気下及び0℃でヨウ化メチル(91 g, 640 mmol)を加えた。その後、水素化ナトリウム(7.32 g (60%), 183 mmol)を数回に分けて加え、0℃で48時間撹拌した。氷水500 mLを加え、反応混合物を急冷し、酢酸エチル(150 mL)で抽出した。水層をエチルエーテル(150 mL x 2)で洗浄し、2N 塩酸でpHを3に調整し、酢酸エチル(250 mL x 3)で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(2R,3R)-3-((2S,4S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸44e(8.0 g, 薄黄色の粘稠性液体)を収率65.6%で得た。
MS m/z (ESI): 205.68 [M-100+1]
工程4
(2S,4S)-tert-ブチル4-フルオロ-2-((1R、2R)-1-メトキシ-3-(((S)-1-メトキシ-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イル)アミノ)-2-メチル-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート
(2R,3R)-3-((2S,4S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸44e(580 mg, 1.9 mmol)をアセトニトリル15 mLに溶解し、(S)-メチル2-アミノ-3-フェニルプロパノエート塩酸塩44f(480 mg, 2.2 mmol, 既知の方法“Journal of Heterocyclic Chemistry, 2013, 50(2), 320-325”に従って調製)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(1.42 mL, 8 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(1.07 g, 2.8 mmol)を加えた。反応混合物を室温で12 時間撹拌した。TLCで反応の完了を確認した後、反応混合物を40 mLの酢酸エチルで希釈し、塩化アンモニウムの飽和溶液(20 mL)及び塩化ナトリウムの飽和溶液(20 mL)で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(2S,4S)-tert-ブチル4-フルオロ-2-((1R、2R)-1-メトキシ-3-(((S)-1-メトキシ-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イル)アミノ)-2-メチル-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート44g(750 mg, 白色固体)を収率83.2%で得た。
MS m/z (ESI): 222.62 [M-100+1]
工程5
(S)-メチル2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエートトリフルオロアセテート
(2S,4S)-tert-ブチル4-フルオロ-2-((1R,2R)-1-メトキシ-3-(((S)-1-メトキシ-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イル)アミノ)-2-メチル-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート44g(738 mg, 1.58 mmol)をジクロロメタン15 mLに溶解し、トリフルオロ酢酸(3 mL, 30 mmol)を滴下した後、室温で12時間撹拌した。TLCで反応の完了を確認した後、反応溶液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-メチル2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエートトリフルオロアセテート44hの粗製品(1.24 g, 黄色の粘稠性液体)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 236.39 [M+1]
工程 6
(S)-メチル2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-1-フェニル-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート
(S)-メチル2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエートトリフルオロアセテート44h(572 mg, 1.56 mmol)及び(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-1-フェニル-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-カルボン酸44i(868 mg, 1.56 mmol, 既知の方法“WO2007008848”に従って調製)をアセトニトリル15 mLに溶解し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(2.0 mL, 12 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(890 mg, 2.34 mmol)を加えた。反応混合物を室温で12時間撹拌した。TLCで反応の完了を確認した後、反応混合物を50 mLの酢酸エチルで希釈し、塩化アンモニウムの飽和溶液(30 mL)及び塩化ナトリウムの飽和溶液(30 mL)で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系B及びAを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-メチル2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-1-フェニル-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート44j(1.4 g, 白色の泡沫状固体)を収率99.9%で得た。
MS m/z (ESI): 898.99 [M+1]
工程 7
(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-1-フェニル-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸
(S)-メチル2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-1-フェニル-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート44j(180 mg, 0.2 mmol)をメタノール0.5 mL、テトラヒドロフラン0.5 mL及び水0.5 mLに溶解した後、0℃まで冷却し、水酸化リチウム一水和物(34 mg, 0.8 mmol)を加えた。この混合物を23℃で2時間撹拌した。TLC及びMSモニターで反応の完了を確認した後、反応混合物を2 mLの水で希釈し、1N塩酸を加え、pHを約4.5に調整し、酢酸エチル(5 mL × 3)で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-1-フェニル-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸44k(160 mg, 薄黄色の泡沫状固体)の粗製品を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 883.73 [M-1].
工程8
(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸
(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-1-フェニル-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸44kの粗製品(160 mg, 0.2 mmol)を無水エタノールl10 mLに溶解し、10%Pd/Cを30 mg加えた。この反応系を水素で3回パージし、23℃で15時間撹拌した。TLCで反応の完了を確認した後、反応混合物をセライトに通してろ過し、炭素上のパラジウムを除去し、ろ液を減圧下で濃縮し、120 mgの残渣を得た。高速液体クロマトグラフィーでこの残渣を精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸44(29 mg, 白色固体)を収率21.5%で得た。
MS m/z (ESI): 749.94 [M+1].
1H NMR (400 MHz, CD3OD) d 7.29-7.14(m, 5H), 4.81-4.71(m, 2H), 4.18-4.13(m, 2H), 4.05-4.03(m, 2H), 3.84-3.81(m, 1H), 3.63-3.60(m, 1H), 3.58-3.52(m, 1H), 3.48-3.13(m, 14H), 3.00-2.91(m, 1H), 2.66-1.81(m, 11H), 1.63-1.38(m, 2H), 1.21-1.10(m, 5H), 1.09-0.94(m, 14H), 0.91-0.82(m, 3H).
(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸44(1.0 g, 1.34 mmol)をアセトニトリル20 mLに溶解し、N, N-ジイソプロピルエチルアミン(0.53 mL, 3.0 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N'N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(560 mg, 1.48 mmol)を加えた。反応混合物を23℃で30分間撹拌し、6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサン酸4a(300 mg, 1.41 mmol)を加えた。TLCで反応の完了を確認した後、反応混合物に50 mLの酢酸エチルを加え、減圧下で濃縮した。溶出系B及びAを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物の粗製品1.0 gを得た。高速液体クロマトグラフィーでこれを更に精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸45(140 mg, 白色固体)を収率11%で得た。
MS m/z (ESI): 942.67 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) d 7.34-7.14(m, 5H), 6.83-6.80(m, 2H), 5.20-5.10(m, 1H), 5.01-4.96(m, 1H), 4.78-4.57(m, 2H), 4.18-4.01(m, 2H), 4.00-3.80(m, 1H), 3.56-3.41(m, 5H), 3.35-3.24(m, 10H), 3.19-2.90(m, 4H), 2.60-2.40(m, 4H), 2.39-2.00(m, 4H), 1.93-1.58(m, 6H), 1.50-1.10(m, 7H), 1.09-0.82(m, 21H).
工程1
(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-3-(((S)-3-(4-フルオロフェニル)-1-メトキシ-1-オキソプロパン-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート
(2R,3R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸25d(1.0 g, 3.5 mmol)をアセトニトリル15 mLに溶解し、(S)-メチル2-アミノ-3-(4-フルオロフェニル)プロパノエート塩酸塩46a (820 mg, 4 mmol, 既知の方法“Tetrahedron, 2003, 59(21), 3719-3727”に従って調製)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(2.7 mL, 15 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(1.9 g, 5.0 mmol)を加えた。反応混合物を23℃で12時間撹拌した。TLCで反応の完了を確認した後、反応混合物を50 mLの酢酸エチルで希釈し、塩化アンモニウムの飽和溶液(30 mL)及び塩化ナトリウムの飽和溶液(30 mL)で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル 2-((1R,2R)-3-(((S)-3-(4-フルオロフェニル)-1-メトキシ-1-オキソプロパン-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート46b(1.35 g, 白色固体)を収率 82.6%で得た。
MS m/z (ESI): 366.46 [M-100-1].
工程2
(S)-メチル3-(4-フルオロフェニル)-2-((2R,3R)-3-メトキシ-2-メチル-3-((S)-ピロリジン-2-イル)プロパンアミド)プロパノエートトリフルオロ酢酸塩
(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-3-(((S)-3-(4-フルオロフェニル)-1-メトキシ-1-オキソプロパン-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート46b(1.34 g, 2.87 mmol)をジクロロメタン20 mLに溶解し、トリフルオロ酢酸(3 mL, 30 mmol)を滴下し、23℃で12時間撹拌した。TLCで反応の完了を確認した後、反応溶液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-メチル3-(4-フルオロフェニル)-2-((2R、3R)-3-メトキシ-2-メチル-3-((S)-ピロリジン-2-イル)プロパンアミド)プロパノエートトリフルオロ酢酸塩46cの粗製品(1.92 g, 黄色の粘稠性液体)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 366.85 [M+1]
工程3
(S)-メチル 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-1-フェニル-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(4-フルオロフェニル)プロパノエート
(S)-メチル3-(4-フルオロフェニル)-2-((2R,3R)-3-メトキシ-2-メチル-3-((S)-ピロリジン-2-イル)プロパンアミド)プロパノエートトリフルオロ酢酸塩46c(367 mg, 1.0 mmol)及び(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-1-フェニル-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-カルボン酸44i(549 mg, 1.0 mmol)をアセトニトリル10 mLに溶解し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(1.24 mL, 7 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(570 mg, 1.5 mmol)を加えた。反応混合物を23℃で12時間撹拌した。TLCで反応の完了を確認した後、反応混合物を30 mLの酢酸エチルで希釈し、塩化アンモニウムの飽和溶液(20 mL)及び塩化ナトリウムの飽和溶液(20 mL)で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系B及びAを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-メチル2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-1-フェニル-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(4-フルオロフェニル)プロパノエート46d(760 mg, 白色の泡沫状固体)を収率84.6%で得た。
MS m/z (ESI): 898.10 [M+1]
工程 4
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-1-フェニル-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(4-フルオロフェニル)プロパン酸
(S)-メチル2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-1-フェニル-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(4-フルオロフェニル)プロパノエート46d(180 mg, 0.2 mmol)をメタノール0.5 mL、テトラヒドロフラン0.5 mL 及び水0.5 mLに溶解し、0℃まで冷却した後、水酸化リチウム一水和物(34 mg, 0.8 mmol)を加え、23℃で2時間撹拌した。TLC及びMSモニターで反応の完了を確認した後、反応混合物を2 mLの水で希釈し、1N塩酸を加え、pHを約4.5に調整し、酢酸エチル(5 mL × 3)で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-1-フェニル-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(4-フルオロフェニル)プロパン酸46eの粗製品(160 mg, 白色固体)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 883.78 [M-1]
工程 5
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(4-フルオロフェニル)プロパン酸
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-1-フェニル-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(4-フルオロフェニル)プロパン酸 46eの粗製品(160 mg, 0.2 mmol)を無水エタノール10 mLに溶解し、10%Pd/C 30 mgを加えた。反応混合物を窒素で3回置換し、室温で15時間撹拌した。TLCで反応の完了を確認した後、反応混合物をセライトに通してろ過し、炭素上のパラジウムを除去し、ろ液を減圧下で濃縮し、残渣130 mgを得た。この残渣を高速液体クロマトグラフィーで精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(4-フルオロフェニル)プロパン酸46(34 mg, 白色固体)を収率25.2%で得た。
MS m/z (ESI): 749.94 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) d 7.31-7.24(m, 2H), 7.02-6.92(m, 2H), 4.48-4.58(m, 2H), 4.22-4.11(m, 1H), 3.85-3.40(m, 4H), 3.39-3.04(m, 14H), 3.00-2.90(m, 1H), 2.66-2.40(m, 5H), 2.39-2.02(m, 4H), 1.99-1.75(m, 3H), 1.73-1.24(m, 3H), 1.20-1.10(m, 4H), 1.09-0.95(m, 16H), 0.94-0.80(m, 3H).
6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサン酸4a(434 mg, 2.06 mmol)をアセトニトリル20 mLに溶解し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(844 mL, 6.55 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(781 mg, 1.87 mmol)を加えた。反応混合物を23℃で30分間撹拌し、(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-(5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(4-フルオロフェニル)プロパン酸46(1.4 g, 1.87 mmol)を加えた。TLCで反応の完了を確認した後、反応混合物を50 mLの酢酸エチルで希釈し、減圧下で濃縮した。溶出系B及びAを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物の粗製品1.2 gを得た。これを高速液体クロマトグラフィーで更に精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(4-フルオロフェニル)プロパン酸47(670 mg, 白色固体)を収率37.9%で得た。
MS m/z (ESI): 944.54 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) d 12.80(br.s, 1H), 8.56-8.52(m, 1H), 8.42-8.20(m, 1H), 8.18-8.10(m, 1H), 7.30-7.18(m, 2H), 7.07-6.75(m, 4H), 4.64-4.34(m, 3H), 4.08-3.94(m, 1H), 3.80-3.50(m, 2H), 3.46-2.70(m, 15H), 2.50-1.80(m, 6H), 1.73-1.38(m,7H), 1.30-1.10(m, 12H), 1.09-0.62(m, 20H).
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 150186.5(MAb+0D), 151364.1(MAb+1D), 152262.3 (MAb+2D), 153435.7(MAb+3D), 154499.6(MAb+4D), 155427.5(MAb+5D).
平均値: y=2.0.
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 150185.5(MAb+0D), 151364.7(MAb+1D), 152261.2 (MAb+2D), 153436.2(MAb+3D), 154499.9(MAb+4D), 155428.6(MAb+5D).
平均値: y=2.0.
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 148095.6(MAb+0D), 149111.5(MAb+1D), 150165.3 (MAb+2D), 151184.7(MAb+3D), 152255.2MAb+4D), 153297.5(MAb+5D).
平均値: y=2.0.
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 148096.2(MAb+0D), 149112.2(MAb+1D), 150165.4 (MAb+2D), 151184.8(MAb+3D), 152255.1(MAb+4D), 153297.6(MAb+5D).
平均値: y=2.0.
S-(3-オキソプロピル)エタンチオエート18a(0.35 mg, 2.65 mmol)をアセトニトリル0.45 mLに溶解した。トラスツズマブの酢酸/酢酸ナトリウム緩衝液(10.0 mg/ml, 4.5 mL, 0.304 mmol),pH 4.5をS-(3-オキソプロピル)エタンチオエート18aのアセトニトリル溶液とともに加えた後、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの水溶液(7.06 mg, 112mmol)1.0 mLを滴下した。反応混合物を25℃で2時間撹拌した。反応終了後、反応混合物をSephadex G25ゲルカラム(溶出液: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で脱塩して精製し、標記生成物52b溶液を得た。これを次の工程に直接に用いた。
工程 2
52bの溶液(約15.0 mL)に2.0 M塩酸ヒドロキシルアミン溶液0.45 mLを加え、シェーカーを用いて反応混合物を25℃で30分間振動した。Sephadex G25ゲルカラム(溶出液: 0.05 M PBS溶液)でこの反応溶液を脱塩し、標記生成物トラスツズマブ-プロパンチオール52cの溶液(濃度:1.65 mg/ml, 22.6 mL)を得た。
工程 3
(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-4-フルオロピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸45(1.1 mg, 1.2 mmol)をアセトニトリル1.1 mLに溶解し、トラスツズマブ-プロパンチオール溶液52c(1.65 mg/mL, 11.3 mL)を加えた。これをシェーカーに置き、25℃で4時間振動した後、Sephadex G25ゲルカラム(溶出液: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で反応混合物を脱塩し、無菌下で0.2 mmフィルターを通してろ過し、標記生成物52のPBS緩衝液(0.72 mg/mL, 20 mL)を得た。これを4℃で保管した。
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 148062.9(MAb+0D), 149235.2(MAb+1D), 150259.8 (MAb+2D), 151268.2(MAb+3D), 152341.9(MAb+4D), 153356.4(MAb+5D).
平均値: y=2.0.
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 148065.2(MAb+0D), 149244.6(MAb+1D), 150254.9 (MAb+2D), 151280.9(MAb+3D), 152301.6(MAb+4D), 153457.9(MAb+5D).
平均値: y=2.0.
1、試験目的
この試験の目的は、HepG2腫瘍細胞(ヒト肝細胞癌細胞、Chinese Academy of Sciences cell bank, No. #TCHu 72)及びA549腫瘍細胞(ヒト肺腺癌、Chinese Academy of Sciences cell bank, No. #TCHu150)の増殖に対する本発明による式(D)のin vitro阻害効果を試験することである。細胞はin vitroで化合物の異なる濃度で処理し、76時間のインキュベーション後、細胞増殖をCCK-8試薬(Cell Counting Kit-8, Dojindo, No. CK04)によって検出して、化合物のin vitro活性をIC50値により評価した。
2.試験プロトコール
以下は、in vitroでの腫瘍細胞に対する増殖阻害活性に関する本発明による化合物の試験を例証する目的でHepG2細胞のin vitro増殖阻害試験の方法の例である。この方法はまた、限定されないが、他の腫瘍細胞に対するin vitro増殖阻害試験にも適用できる。
2.1細胞調製
対数増殖期のHepG2細胞をPBS(リン酸緩衝液、ThermoFisher)で一回洗浄し、2-3mlのトリプシン(0.25% トリプシン-EDTA (1x)、Gibico, Life Technologies)を加えて2-3分間消化した。細胞が完全に消化された後に、10-15mlの細胞培養液(DMEM/F12培地、Invitrogen;10% (v/v))を加えた。消化HepG2細胞を溶出し、1000rpmで3分間遠心分離した。上澄み液を廃棄し、次いで10-20mlの細胞培養液を加えて細胞を再懸濁し、単細胞懸濁液を調製した。
2.2細胞の播種
HepG2単細胞懸濁液を混合して、細胞密度を細胞培養液で6×104 細胞/mlに調整した。密度調整細胞懸濁液を均一に混合して、96穴細胞培養プレートに100μl/ウェルで添加した。プレートは、5% CO2インキュベーター中で37 °Cで18-20時間培養した。
2.3化合物調製
化合物はDMSO(ジメチルスルホキシド、Shanghai Titan Technology Co., Ltd.)で溶解して、初期濃度10 mMを有する保存溶液を調製した。
10 mM化合物の10μlをU字型の底の96穴プレート(サンプルプレート1)の第1列のウェルに添加し、DMSO 90μlを第1列の各化合物サンプルウェルに添加した。即ち、保存溶液をスタート時点で10倍に希釈した。次いで、3倍グラジエント希釈を行い、各化合物濃度を10倍希釈した。希釈液はDMSO液であった。60μlの100% DMSを第12列に、20μlの1mM陽性薬物コントロールを第11列に添加した。
新しいU字底96穴プレート(サンプルプレート2)を取り、サンプルプレート1の各サンプルを完全培地で20倍希釈した。次いで、新しいU字底96穴プレート(サンプルプレート3)を取って、サンプルプレート2の各ウェルのサンプルを最終の10倍希釈に付した。
2.4サンプル負荷
細胞の前培養が完了した後、96穴細胞培養プレートを取り出し、上澄み液を廃棄した。96穴サンプルプレート3の各サンプル希釈液を続けて96穴細胞培養プレートに100μl/ウェルで添加した。各化合物サンプルは、各濃度で重複して試験を行った。負荷操作は30分を超えてはいけない。負荷操作の完了後、96穴培養プレートは37 °Cで約76時間、5% CO2インキュベーター中で培養した。
2.5発色操作
96穴細胞培養プレートを取り、各ウェルに100μl/ウェルでCCK-8を添加した。細胞培養プレートを10回以上穏やかにたたいて混合し、37 °Cで2時間5% CO2インキュベーター中で培養した。
2.6プレートの読み取り
96穴細胞培養プレートを取って、マイクロプレートリーダー(PerkinElmer, VICTOR 3)中に置き、450nmの吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて測定した。
上記の方法により、in vitroのA549腫瘍細胞の増殖に対する本発明による化合物の阻害活性を試験した。細胞培養液もDMEM/F12であった。
3.データ解析
データは、Microsoft Excel及びGraphpad Prism 5を用いて解析した。結果を表1に示す。
(表1)
この試験の目的は、SK-BR-3腫瘍細胞(ヒト乳癌細胞、ATCC, HTB-30)についての本発明によるHER2標的に対する抗体‐薬物複合体のin vitro増殖阻害効果を試験することである。細胞はin vitroで化合物の異なる濃度で処理し、76時間のインキュベーション後、細胞増殖をCCK-8試薬(Cell Counting Kit-8, Dojindo, No. CK04)によって検出して、化合物のin vitro活性をIC50値により評価した。
試験例1の試験方法に従い、試験細胞はSK-BR-3であり、細胞培養液は10% FBSを含むMcCoy's 5A 培地(Gibco, NO.16600-108)であった。適切な化合物を試験し、結果を表2に示した。
(表2)
結論:HER2標的に対する本発明の抗体‐薬物複合体は、SK-BR-3腫瘍細胞について顕著な増殖阻害効果を有している。
この試験の目的は、HCC827腫瘍細胞(非小細胞肺癌細胞、Chinese Academy of Sciences cell bank, No. #TCHu153)についての本発明によるEGFR標的に対する抗体‐薬物複合体のin vitro増殖阻害効果を試験することである。細胞はin vitroで化合物の異なる濃度で処理し、76時間のインキュベーション後、細胞増殖をCCK-8試薬(Cell Counting Kit-8, Dojindo, No. CK04)によって検出して、化合物のin vitro活性をIC50値により評価した。
試験例1の試験方法に従い、試験細胞はHCC827であり、細胞培養液は10% FBSを含むRPMI1640培地(Invitrogen)であった。適切な化合物を試験し、結果を表3に示した。
(表3)
結論:EGFR標的に対する本発明の抗体‐薬物複合体は、HCC827腫瘍細胞について顕著な増殖阻害効果を有している。
1.試験目的
ヌードマウスにおけるNCI-N87細胞(HER2を過剰発現するヒト胃癌細胞、ATCC、CRL-5822)の移殖腫瘍についての本発明の抗体−細胞毒複合体の効力を評価し、比較すること。
2.試験薬物
サンプル:化合物18、化合物21、化合物36
陽性コントロール:ペルツズマブ、トラスツズマブ
調製方法:全て生理食塩水で調製した。
3.試験動物
BALB/cA-ヌードマウス、6-7週令、雌、Shanghai Slack Experimental Animal Co., Ltd. Certificate number: SCXK (Shanghai) 2012-0002から購入。
居住環境:SPFレベル。
4.試験方法:
ヌードマウスにヒト胃癌NCI-N87細胞を皮下に接種し、腫瘍の増殖が100-200 mm3になった後、動物をランダムにグループに分けた(D0)。投与量と投与計画は表4に示した。マウスは腫瘍容積について週に2-3回測定し、体重を測定して、データを記録した。
腫瘍容積(V)の計算式は、次の通りである:
V=1/2×a×b2
式中:a及びbは、それぞれ長さと幅を表す。
T/C(%)=(T-T0)/(C-C0)×100%
式中、TとCは試験の終わりの腫瘍容積を表し、T0とC0は試験の最初の腫瘍容積を表す。
(表4)ヌードマウスにおけるヒト胃癌NCI-N87の移殖腫瘍に対する化合物(18,21,36)の効果
D0:最初の投与時;ペルツズマブ及びトラスツズマブ:最初の用量倍加;P値は溶媒コントロール群と比較した;Student’s tテストを用いた。試験開始時のマウスの数は次の通りであった:コントロール群n = 12、処置群n = 6。
5.結果
本発明化合物は、HER2を過剰発現するNCI-N87のヌードマウス皮下移植腫瘍の増殖を顕著に阻害し、腫瘍を持つマウスは上記薬物により耐性である。
1.試験目的
この試験において、Nude-nudeマウスを試験動物として用い、多剤(multi-dose)腹腔内注射後のヌードマウスにおけるヒト非小細胞肺癌HCC827の移植腫瘍に対する本発明のADC化合物39及び40の効力を評価した。
腫瘍抑制効果が、本発明のADC化合物39及び40の1回の多剤腹腔内注射後に観察され、試験は投与後38日で終了した。試験結果はADC化合物39(0.05 mg/マウス)の腫瘍抑制率は62.78%であり、差はコントロール群に比べて統計的に有意である(p<0.05)ことを示している。ADC化合物40(0.025 mg/マウス)の腫瘍抑制率は49.20%であり、これはブランクコントロール群のものと有意な差ではない。ADC化合物40(0.05 mg/マウス)の腫瘍抑制率は86.8%であり、これはブランクコントロール群のものと有意な差がある(p<0.01)。ADC化合物40(0.1 mg/マウス)の腫瘍抑制率は93.41%であり、これはブランクコントロール群のものと有意な差がある。(p<0.05)。
2.試験薬物及び材料
2.1試験薬物
本発明のADC化合物:ADC化合物39、ADC化合物40
2.2薬剤処方
全て生理食塩水で調製した。
2.3試験動物
Nude-nudeマウス, SPF, 16-20 g, ♀, Shanghai Xi Puer Bikai Experimental Animal Co., Ltd.より購入、Certificate number: SCXK (Shanghai) 2008-0016。
3.試験プロトコール
ヌードマウスを3日間実験環境に順化した後、腫瘍細胞の移植を行った。HCC827細胞をヌードマウスの右肋骨の皮下に接種した(4×106 + 50%マトリゲル/マウス)。接種後21日目、腫瘍が209.41 + 25.93 mm3 (d1)に増殖した時に、薬物を投与した。具体的な投与量と方法は表5に示した。
マウスは腫瘍容積について週に2回測定し、ヌードマウスの体重を測定して、データを記録した。
Excel統計ソフトウェア:平均値はavgとして計算する:SDはSTDEVとして計算する:SEMはSTDEV/SQRTとして計算する:異なる群間のP値はTTESTとして計算する。
式中、V0およびVTは、それぞれ試験の始めと試験の終わりの腫瘍容積を表す。CRTVおよびTRTVは、それぞれブランクコントロール群(ブランク)と試験の終わりの試験群の相対的腫瘍容積を表す。
腫瘍容積 (V)は:V=1/2×Llength×Lshort 2として計算する。
相対容積 (RTV) =VT/V0
腫瘍抑制率 (%) =(CRTV-TRTV)/CRTV (%)
式中、V0及びVTは、それぞれ試験の始めと試験の終わりの腫瘍容積を表す。CRTV及びTRTVは、それぞれブランクコントロール群(ブランク)と試験の終わりの試験群の相対的腫瘍容積を表す。
(表5)ヌードマウスにおけるHCC827異種移植に対する試験抗体の効果
4.結果
試験結果は、ADC化合物39(0.5 mg/マウス)の腫瘍抑制率は38日で62.78%であり、差はブランクコントロール群に比べて統計的に有意であった(p<0.05)ことを示している。ADC化合物40(0.025 mg/マウス)の腫瘍抑制率は49.20%であり、これはブランクコントロール群のものと有意な差ではない(p<0.05)。ADC化合物40(0.05 mg/マウス)とADC化合物40(0.1 mg/マウス)の腫瘍抑制率は、それぞれ86.8%及び93.41%であり、これはブランクコントロール群のものと有意な差である(p<0.01)。さらに、3つの異なる用量群におけるADC化合物40の抗腫瘍効果は、用量依存性である。
Claims (29)
- 式(PC-L-Dr)の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物:
R, R2-R7は、それぞれ水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択され;
R8-R11の少なくとも1つは、ハロゲン、アルケニル、アルキル及びシクロアルキルから成る群から選択され、R8-R11の残りはそれぞれ水素であり:
またはR8-R11のいずれか2つが結合してシクロアルキルを形成し、残りの2つが、それぞれ水素、アルキル及びシクロアルキルから成る群から選択され;
R12-R13は、それぞれ水素、アルキル及びハロゲンから成る群から選択され;
R14はアリール及びヘテロアリールから選択され、該アリールまたはヘテロアリールは水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択される1以上の基で任意に置換されていてもよく;
yは1-8、好ましくは2-5であり;
PCはリガンドであり;Lはリンカーである。 - 式(PC-L-D)の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物:
である、請求項1に記載の式(PC-L-Dr)の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物。 - 式(PC-L’-Dr)の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物:
R15は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択され;
R16は、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ及びヘテロシクリルから成る群から選択され;
nは2-6、好ましくは2-5であり;
mは0-5、好ましくは1-3であり;
PC, y, n, R, R2-R14は、請求項1で定義した通りである。)
である、請求項1に記載の式(PC-L-Dr)の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物。 - 式(PC-L’-D)の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物:
R15, R16, mは、請求項3で定義した通りであり;
PC, y, n, R2-R14は、請求項1で定義した通りである。)
である、請求項1に記載の式(PC-L-Dr)の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物。 - 式(PC-L’-D1)の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物:
である、請求項2に記載の式(PC-L’-D)の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物。 - 化合物が、
から成る群から選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の式(PC-L-Dr)の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物。 -
から成る群から選択される、リガンド‐細胞傷害性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物。 - PCが抗体、好ましくはペルツズマブ、ニモツズマブまたはトラスツズマブである、請求項1〜7のいずれか1項に記載の式(PC-L-Dr)の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物。
- 化合物が、
から成る群から選択される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の式(PC-L-Dr)の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物。 -
から成る群から選択される、リガンド‐細胞傷害性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物。 - 式(Dr)の化合物:
R, R1-R7は、それぞれ水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択され;
R8-R11の少なくとも1つは、ハロゲン、アルケニル、アルキル及びシクロアルキルから成る群から選択され、R8-R11の残りは水素であり:
またはR8-R11のいずれか2つが結合してシクロアルキルを形成し、残りの2つが、それぞれ水素、アルキル及びシクロアルキルから成る群から選択され;
R14はアリール及びヘテロアリールから選択され、該アリールまたはヘテロアリールは水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択される1以上の基で任意に置換されていてもよく;
R12-R13は、それぞれ水素、アルキル及びハロゲンから成る群から選択される。)
またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、または混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩。 - 式(D)の化合物:
またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、または混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩である、請求項11に記載の式(Dr)の化合物。 - 式(D1)の化合物:
またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、または混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩である、請求項11に記載の式(Dr)の化合物。 - 化合物が、
-
- 式(L1-Dr)の化合物:
nは2-6、好ましくは2-5であり;
R, R1-R7は、それぞれ水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択され;
R8-R11の少なくとも1つは、ハロゲン、アルケニル、アルキル及びシクロアルキルから成る群から選択され、R8-R11の残りは水素であり:
またはR8-R11のいずれか2つが結合してシクロアルキルを形成し、残りの2つが、それぞれ水素、アルキル及びシクロアルキルから成る群から選択され;
R12-R13は、それぞれ水素、アルキル及びハロゲンから成る群から選択され;
R14はアリール及びヘテロアリールから選択され、該アリールまたはヘテロアリールは水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択される1以上の基で任意に置換されていてもよい。 - 式(L1-D)の化合物:
である、請求項16に記載の式(L1-Dr)の化合物。 - 化合物が、
-
- 式(PC-L2)の化合物:
PCは、リガンドであり、好ましくは抗体、より好ましくはペルツズマブ、ニモツズマブまたはトラスツズマブであり;
R15は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択され;
R16は、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ及びヘテロシクリルから成る群から選択され;
mは、0-5、好ましくは1-3であり;
Xは、0-5、好ましくは1-3である。 - 化合物が、
- ステップ:
2)式(PC-L2-B)の化合物に脱保護剤を加えて、チオール基の保護基Tを除去し、式(PC-L2)の化合物を得る、
(ここで、Tは水素、tert-ブチル、アセチル、n-プロピオニル、イソプロピオニル、トリフェニルメチル、メトキシメチル及び2-(トリメチルシリル)エトキシメチルから成る群から、好ましくは水素またはアセチルから選択され、
PC, R15, R16, m及びxは、請求項20で定義した通りである。)
を含む、式(PC-L2)の化合物の製造方法。 - ステップ:
式(PC-L2)の化合物を式(L1-D1)の化合物と反応させて式(PC-L’-D)の化合物を得る;
を含む、請求項4に記載の式(PC-L’-D)の化合物の製造方法。 - 式(D-Aa)の化合物:
R8-R11のいずれか2つが結合してシクロアルキルを形成し、残りの2つは水素、アルキル及びシクロアルキルから成る群から任意に選択され;
R12は、水素、アルキル及びハロゲンから成る群から選択され;
Pは、水素原子または保護基であり、保護基は、好ましくはBoc, BnまたはCbz、最も好ましくはBocであり;
Raは、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、シクロアルコキシまたはアルキルアミノから成る群から選択される。)、
またはその互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、または混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩。 - 式(D-A)の化合物;
R’は、水素、アルキル及びシクロアルキルから成る群から選択される。)、
またはその互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、または混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩である、請求項24に記載の式(D-A a)の化合物。 - 化合物が、
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載のリガンド‐細胞傷害性薬物複合体、または請求項11〜19のいずれか1項に記載の薬物、またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物の治療有効量、及び1以上の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含有する医薬組成物。
- 癌がHER2, HER3またはEGFRの発現と関連している、該癌の治療薬の製造における、請求項1〜10のいずれか1項に記載のリガンド‐細胞傷害性薬物複合体、または請求項11〜19のいずれか1項に記載の薬物またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物、または請求項27に記載の医薬組成物の使用。
- 哺乳動物がヒトであり、癌が乳癌、卵巣癌、胃癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、肺癌、大腸癌、腎臓癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、前立腺癌、膀胱癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、慢性骨髄球性白血病、慢性リンパ性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫及び再発未分化大細胞リンパ腫から成る群から、好ましくは乳癌、ホジキンリンパ腫または再発未分化大細胞リンパ腫から、より好ましくは乳癌から選択される、該癌の治療薬の製造における使用のための、請求項1〜10のいずれか1項に記載のリガンド‐細胞傷害性薬物複合体、または請求項11〜19のいずれか1項に記載の薬物またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物、または請求項27に記載の医薬組成物。
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