CN111150851A - 配体-细胞毒性药物偶联物、其制备方法及其应用 - Google Patents

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许建烟
章瑛
屈博磊
张富尧
于秀招
梁金栋
蒋贵阳
张连山
李昂
王亚里
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Abstract

本发明提供了一种配体‑细胞毒性药物偶联物、其制备方法及其应用。特别地，提供了一种通式Dr所示的化合物：
Figure DDA0002066647620000011
或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐，其中：R，R1‑R7选自氢原子、卤素、羟基、氰基、烷基、烷氧基和环烷基；R8‑R11中至少一个选自卤素、烯基、烷基和环烷基，其余为氢原子；或者R8‑R11之中的任意两个形成环烷基，余下的两个基团任选自氢原子、烷基和环烷基；R14选自芳基或杂芳基，所述的芳基或杂芳基任选进一步被选自氢原子、卤素、羟基、烷基、烷氧基和环烷基的取代基所取代；R12‑R13选自氢原子、烷基或卤素。

Description

配体-细胞毒性药物偶联物、其制备方法及其应用
本申请是申请号为201680001840.7，申请日为2016年1月26日，发明名称为“配体-细胞毒性药物偶联物、其制备方法及其应用”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及一类全新结构的配体-细胞毒性药物偶联物。具体地说，本发明涉及抗体-细胞毒性药物偶联物，也涉及本发明偶联物的制备方法、包含所述偶联物的药物组合物以及所述偶联物或药物组合物的用途。
背景技术
化疗依然是包括手术、放疗、以及靶向治疗法在内的最重要的抗癌手段之一。尽管高效细胞毒素的种类很多，但是肿瘤细胞和正常细胞之间差别很小，限制了这些抗肿瘤化合物由于毒副作用在临床上的广泛应用。而抗肿瘤单克隆抗体对于肿瘤细胞表面抗原的特异性，抗体药物已成为抗肿瘤治疗的前线药物，但单独使用抗体作为抗肿瘤药物时，疗效经常不尽人意。
抗体药物偶联物(antibody drug conjugate，ADC)把单克隆抗体或者抗体片段通过稳定的化学接头化合物与具有生物活性的细胞毒素相连，充分利用了抗体对正常细胞和肿瘤细胞表面抗原结合的特异性和细胞毒素的高效性，同时又避免了前者疗效偏低和后者毒副作用过大等缺陷。这也就意味着，与以往传统的化疗药物相比，抗体药物偶联物能精准地结合肿瘤细胞并降低将对正常细胞的影响。
早期的ADC药物主要使用鼠源的单抗，因为人类的免疫反应造成一部分药物难以到达标靶。其次，早期使用的包括阿霉素(doxorubicin)在内的效应分子的生物活性较低，限制了第一代抗体药物偶联物的疗效。除此之外，抗体的来源、接头连接的方式和数目也未得到优化。
2013年2月，
Figure BDA0002066647610000011
(ado-trastuzumab emtansine，T-DM1)获得美国FDA批准，用于治疗HER2阳性同时对曲妥珠单抗(Trastuzumab，商品名：
Figure BDA0002066647610000012
和紫杉醇有抗药性的晚期或转移性乳腺癌患者。
Figure BDA0002066647610000013
和
Figure BDA0002066647610000014
都是针对血液肿瘤进行靶向治疗，和固体肿瘤相比组织结构相对简单。
Figure BDA0002066647610000015
是美国FDA批准的治疗固体肿瘤的第一个ADC药物。
Figure BDA0002066647610000016
采用ImmunoGen的技术将高活性的有丝分裂抑制剂DM1用一个稳定的硫醚健接头连到罗氏公司的曲妥珠单抗上，平均一个曲妥珠单抗结合大约3.5个DM1，曲妥珠单抗在病人体内特异性结合乳腺癌细胞，被细胞内吞后在细胞内断裂释放出DM1，DM1在细胞内的聚集浓度足以导致细胞因有丝分裂障碍而死亡，肿瘤灶随之消退。T-DM1既保留了
Figure BDA0002066647610000021
的抗体依赖性的细胞增殖抑制作用，同时又增加了潜在的细胞毒素药物的效应。而且因为其毒素靶向在肿瘤细胞内释放，药物毒副作用并没有随着疗效的增加而同步增大。
帕妥珠单抗(Pertuzumab，也被称作2C4，商品名Perjeta)是一种重组人源化单克隆抗体，它是第一个被称作“HER二聚化抑制剂”的单克隆抗体。通过结合HER2阻滞了HER2与其它HER受体的二聚化作用。帕妥珠单抗已经被证实在HER2高表达及低表达的前列腺癌等模型上均有抑制肿瘤生长的作用。
与曲妥珠单抗(Trastuzumab,商品名Herceptin)结合位点位于HER2胞外区的近膜区IV亚域上抑制下游信号通路不同，帕妥珠单抗则是通过结合在II域(二聚化域)有效抑制HER2的异源二聚化反应。因此，曲妥珠单抗只能对HER2过表达的癌症患者尤其是乳腺癌患者有一定疗效，而帕妥珠单抗虽然和曲妥珠单抗作用同一靶点，且二者有同样的内吞特点，但因其作用机理不同，在抑制二聚化后可以切断由ErbB家族受体介导的信号通路，可能会有比单独阻断HER2信号通路更广泛的应用范围。
目前ADC药物的偶联技术主要有两种：T-DM1采用的是将细胞毒性药物与抗体的自由氨基随机偶联；而
Figure BDA0002066647610000022
采用的是将细胞毒性药物和抗体铰链区还原后的自由巯基偶联。两种偶联方法都产出了载药量数不一致的混合物。如T-DM1虽然平均载药量是3.5，但载药量的分布可从0～8。过低的载药量影响了ADC的药效，而过高的载药量则更容易因对抗体的过分修饰而导致ADC药物被组织的巨噬细胞体系识别并破坏。这不仅减低了ADC的半衰期也因为毒素在非靶点组织的积累而增加毒性副作用；而
Figure BDA0002066647610000023
用还原剂将抗体铰链区的二硫键进行还原，对抗体本身的稳定性产生一定影响。相关的ADC药物专利有WO2007008603、WO2013173393、WO2005081711、WO2013173391、WO2013173392、WO2013173393和WO2012010287。本发明提供一种有新型连接方式，新的毒素与抗体组合，从而有更有益效果的新的ADC化合物。
发明内容
为了改进配体，特别是抗体和药物的偶联效果，本发明提供了一种包含改进的连接单元的通式化合物(PC-L-Dr)或其药学上可接受的盐或溶剂化合物：
Figure BDA0002066647610000024
其中：
R，R2-R7选自氢原子、卤素、羟基、氰基、烷基、烷氧基和环烷基；
R8-R11中至少一个选自卤素、烯基、烷基和环烷基，其余为氢原子；
或者R8-R11之中的任意两个形成环烷基，余下的两个基团任选自氢原子、烷基和环烷基；
R12-R13选自氢原子、烷基或卤素；
R14选自芳基或杂芳基，所述的芳基或杂芳基任选进一步被选自氢原子、卤素、羟基、烷基、烷氧基和环烷基的取代基所取代；
y为1-8，优选2-5；y为正实数，可以为整数或小数；
PC为配体；L为接头单元。
在本发明另一个优选方案中，一种通式(PC-L-Dr)所示的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其为通式(PC-L-D)所示的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物：
Figure BDA0002066647610000031
其中，R2-R14定义如通式(PC-L-Dr)中所定义。
在本发明另一个优选方案中，一种通式(PC-L-Dr)所示的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其为通式(PC-L’-Dr)所示的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物：
Figure BDA0002066647610000032
其中：
R15选自氢原子、卤素、羟基、氰基、烷基、烷氧基和环烷基；
R16选自烷基、环烷基、烷氧基和杂环基；
n为2-6，优选2-5；
m为0-5，优选1-3；
PC，y，n，R，R2-R14如通式(PC-L-Dr)中所定义。
在本发明另一个优选方案中，一种通式(PC-L-Dr)所示的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其为通式(PC-L’-D)所示的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物：
Figure BDA0002066647610000041
其中：
R15，R16，m如通式(PC-L’-Dr)中所定义；
PC，y，n，R2-R14如通式(PC-L-Dr)中所定义。
在本发明另一个优选方案中，一种通式(PC-L’-D)所示的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其为通式(PC-L’-D1)所示的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物：
Figure BDA0002066647610000042
其中PC，y，n，m，R2-R16如通式(PC-L’-D)中所定义。
本发明的配体药物偶联物ADC化合物包括，但不限于：
Figure BDA0002066647610000043
Figure BDA0002066647610000051
Figure BDA0002066647610000061
或其药学上可接受的盐或溶剂化合物。
在本发明另一个优选方案中，一种通式(PC-L-Dr)所示的化合物，其中PC为抗体，优选自帕妥珠单抗(Pertuzumab)、尼妥珠单抗(Nimotuzumab)和曲妥珠单抗(Trastuzumab)。
本发明的典型配体药物偶联物ADC化合物包括，但不限于：
Figure BDA0002066647610000062
Figure BDA0002066647610000071
Figure BDA0002066647610000081
或其药学上可接受的盐或溶剂化合物。
本发明进一步提供一种通式(Dr)所示的化合物：
Figure BDA0002066647610000082
或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐，可用于作为制备通式(PC-L-Dr)所示化合物的前药；其中：
R，R1-R7选自氢原子、卤素、羟基、氰基、烷基、烷氧基和环烷基；
R8-R11中至少一个选自卤素、烯基、烷基和环烷基，其余为氢原子；
或者R8-R11之中的任意两个形成环烷基，余下的两个基团任选自氢原子、烷基和环烷基；
R12-R13选自氢原子、烷基或卤素；
R14选自芳基或杂芳基，所述的芳基或杂芳基任选进一步被且选自氢原子、卤素、羟基、烷基、烷氧基和环烷基的取代基所取代。
在本发明另一个优选方案中，一种通式(Dr)所示的化合物，其为通式(D)所示的化合物：
Figure BDA0002066647610000091
或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐，其中：R1-R14如通式(Dr)中所定义。
在本发明另一个优选方案中，一种通式(Dr)所示的化合物，其为通式(D1)所示的化合物：
Figure BDA0002066647610000092
或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐，其中：R1-R14如通式(D)中所定义。
本发明的配体药物偶联物ADC的典型前药化合物包括，但不限于：
Figure BDA0002066647610000093
Figure BDA0002066647610000101
Figure BDA0002066647610000111
Figure BDA0002066647610000121
Figure BDA0002066647610000131
Figure BDA0002066647610000141
本发明进一步提供一种通式(L1-Dr)所示的化合物：
Figure BDA0002066647610000142
可用于制备通式(PC-L’-D)的中间体，其中
n为2-6，优选2-5；
R，R1-R7选自氢原子、卤素、羟基、氰基、烷基、烷氧基和环烷基；
R8-R11中至少一个选自卤素、烯基、烷基和环烷基，其余为氢原子；
或者R8-R11之中的任意两个形成环烷基，余下的两个基团任选自氢原子、烷基和环烷基；
R12-R13选自氢原子、烷基或卤素；
R14选自芳基或杂芳基，所述的芳基或杂芳基任选进一步被且选自氢原子、卤素、羟基、烷基、烷氧基和环烷基的取代基所取代。
在本发明另一个优选方案中，一种通式(L1-Dr)所示的化合物，其为通式(L1-D)所示的化合物：
Figure BDA0002066647610000143
其中n，R2-R14如通式(L1-Dr)中所定义。
在本发明另一个优选方案中，一种通式(L1-D)所示的化合物，其为一种通式(L1-D1)所示的化合物：
Figure BDA0002066647610000151
其中n，R1-R12如通式(L1-D)中所定义。
本发明的配体药物偶联物ADC的典型前药化合物(带部分接头单元)，可用于制备本发明配体药物偶联物的中间体，包括，但不限于下列化合物：
Figure BDA0002066647610000152
Figure BDA0002066647610000161
Figure BDA0002066647610000171
本发明进一步提供一种通式(PC-L2)所示的化合物：
Figure BDA0002066647610000172
其中
PC配体，优选为抗体，更优选为帕妥珠单抗(Pertuzumab)、尼妥珠单抗(Nimotuzumab)或曲妥珠单抗(Trastuzumab)；
R15选自氢原子、卤素、羟基、氰基、烷基、烷氧基和环烷基；
R16选自烷基、环烷基、烷氧基和杂环基；
m为0-5，优选1-3；
X为0-5，优选1-3，x为正实数，包括小数和整数。
在本发明另一个优选方案中，一种通式(PC-L2)所示的化合物，其选自：
Figure BDA0002066647610000181
本发明进一步提供一种制备如通式(PC-L2)所示的化合物的方法，其包括如下步骤：
Figure BDA0002066647610000182
1)向PC与通式(PC-L2-A)化合物中加入还原剂RA，进行反应，得到通式(PC-L2-B)化合物；RA优选为氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠，更优选为氰基硼氢化钠；
2)向通式(PC-L2-B)化合物中加入脱保护剂脱去巯基保护基，得到通式(PC-L2)化合物；
T选自H、叔丁基、乙酰基、正丙酰基、异丙酰基、三苯基甲基、甲氧基甲基、2-(三甲硅烷基)乙氧甲基，优选为H或乙酰基；
(PC-L2-A)化合物优选为硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯；
其中PC，R15，R16，m，x如通式(PC-L2)中所定义。
本发明进一步提供一种制备通式(PC-L’-D)所示的化合物的方法，该方法包括：
Figure BDA0002066647610000191
通式(PC-L2)化合物与通式(L1-D1)化合物反应，得到通式(PC-L’-D)化合物；
其中：PC，m，n，y，R2～R16如通式(PC-L’-D)中所定义。
本发明进一步提供一种通式(D-A a)所示的化合物：
Figure BDA0002066647610000192
或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐，可作为合成本发明的配体药物偶联物ADC的典型前药化合物的中间体，其中：
R8-R11之中的任意两个形成环烷基，余下的两个基团任选自氢原子、烷基和环烷基；
R12选自氢原子、烷基或卤素；
P为氢原子或保护基，所述的保护基优选Boc，Bn，Cbz，最优选Boc；
Ra选自羟基，氨基，烷氧基，环烷氧基或烷氨基。
本发明进一步提供一种通式(D-Aa)所示的化合物，其为通式(D-A)所示的化合物：
Figure BDA0002066647610000193
或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐，可作为合成本发明的配体药物偶联物ADC的典型前药化合物的中间体，其中：
R8-R12，P之中的任意两个形成环烷基，余下的两个基团任选自氢原子、烷基和环烷基；
R’选自氢原子，烷基，环烷基。
本发明的配体药物偶联物ADC的典型前药化合物的中间体(D-Aa)或(D-A)包括，但不限于：
Figure BDA0002066647610000201
本发明进一步提供一种药物组合物，其含有治疗有效量的如通式(PC-L-Dr)、通式(PC-L’-D)及其它如上所述的配体-细胞毒性药物偶联物，或包含如通式(Dr)、通式(L1-Dr)、通式(D)、通式(L1-D)及其它如上所述药物、其可药用盐或溶剂合物，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明进一步提供将如通式(PC-L-Dr)、通式(PC-L’-D)及其它如上所述的配体-细胞毒性药物偶联物，或如通式(Dr)、通式(L1-Dr)、通式(D)、通式(L1-D)及其它如上所述的药物或其可药用盐或溶剂合物，或如上所述的药物组合物在制备治疗哺乳动物癌症的药物的用途，所述的癌症为与HER2，HER3，EGFR表达相关的癌症。
本发明进一步涉及一种治疗哺乳动物癌症的方法，该方法包括对于哺乳动物施用有效剂量的如通式(PC-L-Dr)、通式(PC-L’-D)及其它如上所述的配体-细胞毒性药物偶联物或其可药用盐或溶剂合物，或如通式(Dr)、通式(L1-Dr)、通式(D)、通式(L1-D)及其它如上所述的药物或其可药用盐或溶剂合物，或包含其的药物组合物；其中所述的癌症为与HER2，HER3，EGFR表达相关的癌症。
本发明进一步提供将如通式(PC-L-Dr)、通式(PC-L’-D)及其它如上所述的配体-细胞毒性药物偶联物，或如通式(Dr)、通式(L1-Dr)、通式(D)、通式(L1-D)及其它如上所述的药物或其可药用盐或溶剂合物，或如上所述的药物组合物在制备治疗哺乳动物癌症的药物的用途，其中所述哺乳动物为人，所述癌症选自乳腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、结肠癌、肾癌、直肠癌、甲状腺癌、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、慢性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或复发性间变性大细胞淋巴瘤，优选乳腺癌症、霍奇金淋巴瘤或复发性间变性大细胞淋巴瘤；更优选为与HER2表达相关的乳腺癌。
本发明进一步涉及一种治疗哺乳动物癌症的方法，该方法包括对于哺乳动物施用有效剂量的如通式(PC-L-Dr)、通式(PC-L’-D)及其它如上所述的配体-细胞毒性药物偶联物或其可药用盐或溶剂合物，或如通式(Dr)、通式(L1-Dr)、通式(D)、通式(L1-D)及其它如上所述的药物或其可药用盐或溶剂合物，或包含其的药物组合物；其中所述哺乳动物优选为人；所述癌症选自乳腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、结肠癌、肾癌、直肠癌、甲状腺癌、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、慢性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或复发性间变性大细胞淋巴瘤，优选为乳腺癌、霍奇金淋巴瘤或复发性间变性大细胞淋巴瘤；更优选为2+或更高水平过表达HER2的乳腺癌；最优选为与HER2表达相关的乳腺癌。
本发明在抗体的N端氨基和/或赖氨酸残基的氨基上连接本发明含有游离巯基的连接单元L后，可避免对抗体铰链区进行还原反应，从而减少对抗体自身结构的影响，并且引入的碳-氮键结构稳定，不易在体内循环中分解，进一步通过控制反应条件，可使载药量在0～5范围内分布。
发明详述
除非另有限定，本文所用的所有技术和科学术语均与本发明所属领域普通技术人员的通常理解一致。虽然也可采用与本文所述相似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但本文描述了优选的方法和材料。描述和要求保护本发明时，依据以下定义使用下列术语。
当本发明中使用商品名时，申请人旨在包括该商品名产品的制剂、该商品名产品的非专利药和活性药物部分。
除非有相反陈述，在说明书和权利要求书中使用的术语具有下述含义。
术语“烷基”指饱和脂肪族烃基团，其为包含1至20个碳原子的直链或支链基团，优选含有1至12个碳原子的烷基，更优选含有1至10个碳原子的烷基，最优选含有1至6个碳原子的烷基。非限制性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基，及其各种支链异构体等。更优选的是含有1至6个碳原子的低级烷基，非限制性实施例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氧代基。
术语“环烷基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，环烷基环包含3至20个碳原子，优选包含3至12个碳原子，更优选包含3至10个碳原子，最优选包含3至8个碳原子。单环环烷基的非限制性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环己二烯基、环庚基、环庚三烯基、环辛基等；多环环烷基包括螺环、稠环和桥环的环烷基。
术语“杂环基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，其包含3至20个环原子，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或S(O)m(其中m是整数0至2)的杂原子，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-的环部分，其余环原子为碳。优选包含3至12个环原子，其中1～4个是杂原子；更优选环烷基环包含3至10个环原子。单环杂环基的非限制性实例包括吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、高哌嗪基等。多环杂环基包括螺环、稠环和桥环的杂环基。
所述杂环基环可以稠合于芳基、杂芳基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂环基，其非限制性实例包括：
Figure BDA0002066647610000231
等。
杂环基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氧代基。
术语“芳基”指具有共轭的π电子体系的6至14元全碳单环或稠合多环(也就是共享毗邻碳原子对的环)基团，优选为6至10元，例如苯基和萘基，优选苯基。所述芳基环可以稠合于杂芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为芳基环，其非限制性实例包括：
Figure BDA0002066647610000232
芳基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基。
术语“杂芳基”指包含1至4个杂原子、5至14个环原子的杂芳族体系，其中杂原子选自氧、硫和氮。杂芳基优选为5至10元，更优选为5元或6元，例如呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-烷基吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、四唑基等。所述杂芳基环可以稠合于芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂芳基环，其非限制性实例包括：
Figure BDA0002066647610000241
杂芳基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基。
术语“烷氧基”指-O-(烷基)和-O-(非取代的环烷基)，其中烷基或环烷基的定义如上所述。烷氧基的非限制性实例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基。烷氧基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基。
术语“烷氨基”指-N-(烷基)和-N-(非取代的环烷基)，其中烷基或环烷基的定义如上所述。烷氨基的非限制性实例包括：甲氨基、乙氨基、丙氨基、丁氨基、环丙氨基、环丁氨基、环戊氨基、环己氨基。烷氨基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基。
术语“键”指用“—”表示的共价键。
术语“羟基”指-OH基团。
术语“卤素”指氟、氯、溴或碘。
术语“羧酸酯基”指-C(O)O(烷基)或(环烷基)，其中烷基、环烷基如上所定义。“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选被烷基取代的杂环基团”意味着烷基可以但不必须存在，该说明包括杂环基团被烷基取代的情形和杂环基团不被烷基取代的情形。
“取代的”指基团中的一个或多个氢原子，优选为最多5个，更优选为1～3个氢原子彼此独立地被相应数目的取代基取代。不言而喻，取代基仅处在它们的可能的化学位置，本领域技术人员能够在不付出过多努力的情况下确定(通过实验或理论)可能或不可能的取代。例如，具有游离氢的氨基或羟基与具有不饱和(如烯属)键的碳原子结合时可能是不稳定的。
术语“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
术语“可药用盐”是指本发明配体-细胞毒性药物偶联物的盐，这类盐用于哺乳动物体内时具有安全性和有效性，且具有应有的生物活性，本发明抗体-抗体药物偶联化合物至少含有一个氨基，因此可以与酸形成盐，可药用盐的非限制性实例包括：盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、柠檬酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、抗坏血酸盐、草酸盐、硝酸盐、梨酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、水杨酸盐、柠檬酸氢盐、酒石酸盐、马来酸盐、富马酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐。
术语“溶剂合物”指本发明的配体-药物偶联化合物与一种或多种溶剂分子形成可药用的溶剂合物，溶剂分子的非限制性实例包括水、乙醇、乙腈、异丙醇、DMSO、乙酸乙酯。
术语“配体”是能识别和结合目标细胞相关的抗原或受体的大分子化合物。配体的作用是将药物呈递给与配体结合的目标细胞群，这些配体包括但不限于蛋白类激素、凝集素、生长因子、抗体或其他能与细胞结合的分子。在本发明实施方式中，配体表示为Pc，配体可通过配体上的杂原子与连接单元形成连接键，优选为抗体。
术语“配体-药物偶联化合物”，指配体通过稳定的化学接头化合物与具有生物活性的细胞毒素相连。本发明中配体优选为抗全，“配体-药物偶联化合物”优选为抗体药物偶联物(antibody drug conjugate，ADC)，指把单克隆抗体或者抗体片段通过稳定的化学接头化合物与具有生物活性的细胞毒素相连。
术语“抗原或受体”可供配体识别和结合目标细胞。本发明中优选针对在增生性疾病，例如癌症的靶细胞和/或组织上表达的细胞表面抗原或受体的配体；非限制性细胞表面受体实施例选自HER2，HER3，HER4，CD20，CD22，CD30，CD33，CD44，Lewis Y，CD56，CD105，VEGFR或GPNMB的细胞表面受体；最优选为选自HER2或EGFR的细胞表面受体。具体的优选的非限制性实施例为曲妥珠单抗(Trastuzumab)，可以和HER2靶标特异性结合；帕妥珠单抗(Pertuzumab)，可以和HER2靶标特异性结合；尼妥珠单抗(Nimotuzumab)，可以和EGFR靶标特异性结合。
本发明所述的“抗体”是指表现出所需生物学活性的任何形式的抗体。因此，它以最广义使用，具体地说，包括但不限于全长抗体，抗体结合片段或衍生物。抗体的来源包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、基因工程抗体(例如双特异性抗体)。
术语“全长抗体”是指包含4条多肽链即2条重链和2条轻链通过二硫键相互交联形成多聚体的免疫球蛋白分子(例如IgM)。每条重链包含一段重链可变区(简称VH)和一段重链恒定区，重链恒定区包含3个结构域：CH1、CH2和CH3。每条轻链包含一段轻链可变区(简称VL)和一段轻链恒定区，轻链恒定区包含1个结构域(CL1)。VH区和VL区可进一步分为高变区，术语为互补决定区(CDRs)，各互补决定区之间穿插着更加保守的结构域，称为框架区(FR)。
术语“抗体结合片段或衍生物”包括任何一种自然发生的，酶催化获得的，合成的，或是通过基因工程得到的可与抗原特异性结合形成复合物的多肽或糖蛋白；通常包括亲本抗体的至少部分抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)，其保留亲本抗体的至少某些结合特异性。“抗体结合片段或衍生物”可能由抗体衍生而来，例如通过适宜的标准技术包括蛋白水解或重组基因工程技术(包括对表达抗体可变区和部分恒定区的DNA进行操作和表达)对抗体全长进行改造而得。“抗体结合片段或衍生物”包括但不限于：(i)Fab片段；(ii)F(ab’)2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)；(vi)dAb片段；和(vii)模拟抗体高变区氨基酸残基的最小识别单元(如一个分离的互补决定区(CDR))。其它工程分子如双价抗体、三价抗体、四价抗体和微抗体也在“抗体结合片段或衍生物”范围内。
“Fab片段”由一条完整的轻链和重链的VH和CH1功能区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。
“Fc”区包含含有抗体的CH1与CH2结构域的两个重链片段。两个重链片段通过两个以上的二硫键和通过CH3结构域的疏水作用保持在一起。
“Fab’片段”包含一条轻链和重链的VH和CH1功能区，还包含在CH1与CH2结构域之间的区域，以致于可在两个Fab’片段的两条重链之间形成链间二硫键，以形成F(ab’)2分子。
“F(ab’)2片段”包含二条轻链和含有CH1与CH2结构域之间的部分恒定区的两条重链，以致于在两条重链之间形成链间二硫键。因此，F(ab’)2片段由通过两条重链之间的二硫键保持在一起的两个Fab’片段组成。
“Fv片段”包含轻链或/和重链的可变区VH功能区。
“Fc区”相当于IgG的CH2和CH3功能区，无抗原结合活性，是抗体分子与效应分子和细胞相互作用的部位。
“铰链区”用于连接抗体的Fab段和Fc段。在本发明中可以将双特异性融合蛋白与Fc段连接。
本发明所述的抗体优选为针对靶细胞上细胞表面抗原的特异性抗体，非限制性实施例为以下抗体：曲妥珠单抗，是用于治疗乳腺癌的人源化抗HER2抗体，适用于治疗HER2过度表达的转移性乳腺癌。帕妥珠单抗(Pertuzumab，也被称作2C4，商品名Perjeta)，是一种重组人源化单克隆抗体。它是第一个被称作“HER二聚化抑制剂”的单克隆抗体，通过结合HER2阻滞了HER2与其它HER受体的二聚化作用，从而减缓了肿瘤的生长。帕妥珠单抗已经被证实在HER2高表达及低表达的前列腺癌等模型上均有抑制肿瘤生长的作用。帕妥珠单抗已被美国FDA批准用于治疗HER2阳性的转移性乳腺癌。尼妥珠单抗(Nimotuzumab，商品名泰欣生)，是一个以表皮生长因子受体(EGFR)为靶点的单抗药物，可用于治疗恶性肿瘤的人源化单克隆抗体。EGFR在多种实体瘤中过度表达，如头颈癌、肺癌、结直肠癌中，都存在EGFR过度表达现象。
术语“细胞毒性药物”是指在肿瘤细胞内具有较强破坏其正常生长的化学分子。细胞毒性药物原则上在足够高的浓度下都可以杀死肿瘤细胞，但是由于缺乏特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时，也会导致正常细胞的凋亡，导致严重的副作用。在本发明的实施方式中，细胞毒性药物表示为D/D1。
术语“接头单元”在本发明中为L，指一端与配体共价连接而另一端与细胞毒性药物相连的化学结构片段或键。本发明中L的结构单元如：
Figure BDA0002066647610000271
其中R15，R16，m，n如通式(PC-L’-D)通式中所定义。
术语“载药量”是指式(I)分子中每个配体上加载的细胞毒性药物平均数量，也可以表示为药物量和抗体量的比值，药物载量的范围可以是每个配体(Pc)连接1-8个细胞毒性药物(D)，在本发明的实施方式中，载药量表示为y，可用常规方法如UV/可见光光谱法，质谱，ELISA试验和HPLC特征鉴定偶联反应后每个ADC分子的药物品均数量。
在本发明中，y可能受连接位点数量的限制。本发明的一个实施方式中，细胞毒性药物通过连接单元偶联在配体的N端氨基和/或赖氨酸残基的ε-氨基上，一般地，偶联反应中能与抗体偶联的药物分子数将小于理论上的最大值。
可以用以下非限制性方法控制配体细胞毒性药物偶联物的载量，包括：
(1)控制连接试剂和单抗的摩尔比，
(2)控制反应时间和温度，
(3)选择不同的反应试剂。
常规的药物组合物的制备见中国药典。
术语“载体”用于本发明的药物，是指能改变药物进入人体的方式和在体内的分布、控制药物的释放速度并将药物输送到靶向器官的体系。药物载体释放和靶向系统能够减少药物降解及损失，降低副作用，提高生物利用度。如可作为载体的高分子表面活性剂由于其独特的两亲性结构，可以进行自组装，形成各种形式的聚集体，优选的实例如胶束、微乳液、凝胶、液晶、囊泡等。这些聚集体具有包载药物分子的能力，同时又对膜有良好的渗透性，可以作为优良的药物载体。
术语“赋形剂”是在药物制剂中除主药以外的附加物，也可称为辅料。如片剂中的黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂；半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分；液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂等均可称为赋形剂。
术语“稀释剂”又称填充剂，其主要用途是增加片剂的重量和体积。稀释剂的加入不仅保证一定的体积大小，而且减少主要成分的剂量偏差，改善药物的压缩成型性等。当片剂的药物含有油性组分时，需加入吸收剂吸收油性物，使保持“干燥”状态，以利于制成片剂。如淀粉、乳糖、钙的无机盐、微晶纤维素等。
药物组合物可以是无菌注射水溶液形式。可在使用的可接受的溶媒和溶剂中有水、林格氏液和等渗氯化钠溶液。无菌注射制剂可以是其中活性成分溶于油相的无菌注射水包油微乳。例如将活性成分溶于大豆油和卵磷脂的混合物中。然后将油溶液加入水和甘油的混合物中处理形成微乳。可通过局部大量注射，将注射液或微乳注入患者的血流中。或者，最好按可保持本发明化合物恒定循环浓度的方式给予溶液和微乳。为保持这种恒定浓度，可使用连续静脉内递药装置。这种装置的实例是Deltec CADD-PLUS.TM.5400型静脉注射泵。
药物组合物可以是用于肌内和皮下给药的无菌注射水或油混悬液的形式。可按已知技术，用上述那些适宜的分散剂或湿润剂和悬浮剂配制该混悬液。无菌注射制剂也可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中制备的无菌注射溶液或混悬液，例如1,3-丁二醇中制备的溶液。此外，可方便地用无菌固定油作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可使用包括合成甘油单或二酯在内的任何调和固定油。此外，脂肪酸例如油酸也可以制备注射剂。
术语“还原剂”是在氧化还原反应里，失去电子或有电子偏离的物质。还原剂本身在广义上说也是抗氧化剂，具有还原性，被氧化，其产物叫氧化产物。在本发明的实施方式中，还原剂表示为RA，还原剂的非限制性实例包括：H2、碳(C)、一氧化碳(CO)、还原铁粉(Fe)、锌粉(Zn)、碱金属(常用的有Li、Na、K)、其他活泼金属(如Mg、Al、Ca、La等)、氯化亚锡(SnCl2)、草酸、硼氢化钾(KBH4)、硼氢化钠(NaBH4)、氰基硼氢化钠(NaCNBH3)、三乙酰氧基硼氢化钠((CH3COO)3BHNa)、氢化铝锂(LiAlH4)、次磷酸、次磷酸钠、硫代硫酸钠(Na2S2O3)，本发明优选的还原剂为氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠。
术语“巯基保护基”指当同时含有巯基和其他基团的化学分子参与反应的情况下，为使反应只发生在特定的基团处，而避免巯基遭受影响，将巯基加以保护，当反应完成后脱除的基团，在本发明的实施方式中，巯基保护基表示为T，巯基保护基的非限制性实例包括：-叔丁基、-乙酰基、-正丙酰基、-异丙酰基、-三苯基甲基、-甲氧基甲基、-2-(三甲硅烷基)乙氧甲基，本发明优选的巯基保护基为乙酰基。
本发明的合成方法
为了完成本发明的合成目的，本发明采用如下的合成技术方案：
方案一：
本发明通式(PC-L-DR)所示的化合物的制备方法，该方法包括：
Figure BDA0002066647610000291
方案二：
本发明通式(PC-L-DR1)所示的化合物的制备方法，该方法包括：
Figure BDA0002066647610000292
通式(PC-L2)化合物与通式(L1-D1)化合物在乙腈溶液中反应，经Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化后，得到通式(PC-L-DR)化合物；
其中：PC，m，n，y，R2～R16如通式(PC-L-DR)中所定义。
具体实施方式
以下结合实施例进一步描述本发明，但这些实施例并非限制本发明的范围。
本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例
化合物的结构是通过核磁共振(NMR)或/和质谱(MS)来确定的。NMR化学位移(δ)以10-6(ppm)的单位给出。NMR的测定是用Bruker AVANCE-400核磁仪，测定溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)，氘代氯仿(CDCl3)，氘代甲醇(CD3OD)，内标为四甲基硅烷(TMS)。
MS的测定用FINNIGAN LCQAd(ESI)质谱仪(生产商：Thermo，型号：Finnigan LCQadvantage MAX)。
HPLC的测定使用安捷伦1200DAD高压液相色谱仪(Sunfire C18 150×4.6mm色谱柱)和Waters 2695-2996高压液相色谱仪(Gimini C18 150×4.6mm色谱柱)。
激酶平均抑制率及IC50值的测定用NovoStar酶标仪(德国BMG公司)。
薄层层析硅胶板使用烟台黄海HSGF254或青岛GF254硅胶板，薄层色谱法(TLC)使用的硅胶板采用的规格是0.15mm～0.2mm，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm～0.5mm。
柱层析一般使用烟台黄海硅胶200～300目硅胶为载体。
本发明的已知的起始原料可以采用或按照本领域已知的方法来合成，或可购买自ABCR GmbH&Co.KG，Acros Organics，Aldrich Chemical Company，韶远化学科技(AccelaChemBio Inc)，达瑞化学品等公司。
实施例中无特殊说明，反应均能够在氩气氛或氮气氛下进行。
氩气氛或氮气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氩气或氮气气球。
实施例中无特殊说明，溶液是指水溶液。
实施例中无特殊说明，反应的温度为室温，为20℃～30℃。
实施例中pH＝6.5的PBS缓冲液的配制：取KH2PO4 8.5g，K2HPO4.3H2O 8.56g，NaCl5.85g，EDTA 1.5g置于瓶中，定容至2L，超声波使其全部溶解，摇匀即得。
实施例中pH＝4.5的乙酸/乙酸钠缓冲液的配制：取9g无水乙酸钠置于瓶中，加入纯化水，定容至2L，摇匀后，加入醋酸钠4.9mL，摇匀即得。
实施例中磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)的配制：0.2M的Na2HPO4 61mL中加入0.2M的NaH2PO4 39mL摇匀得0.2M pH＝7的缓冲液。
实施例中的反应进程的监测采用薄层色谱法(TLC)，反应所使用的展开剂的体系有：A：二氯甲烷和甲醇体系，B：正己烷和乙酸乙酯体系，C：石油醚和乙酸乙酯体系，D：丙酮，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节。
纯化化合物采用的柱层析的洗脱剂的体系和薄层色谱法的展开剂体系包括：A：二氯甲烷和甲醇体系，B：正己烷和乙酸乙酯体系，C：二氯甲烷和丙酮体系，D：乙酸乙酯和二氯甲烷体系，E：乙酸乙酯和二氯甲烷和正己烷，F：乙酸乙酯和二氯甲烷和丙酮，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节，也可以加入少量的三乙胺和醋酸等碱性或酸性试剂进行调节。
本发明部分化合物是通过Q-TOF LC/MS来表征的。Q-TOF LC/MS使用安捷伦6530精确质量数四级杆-飞行时间质谱仪和安捷伦1290-Infinity超高效液相色谱仪(安捷伦Poroshell 300SB-C8 5μm,2.1×75mm色谱柱)。
本发明的已知的起始原料可以采用或按照本领域已知的方法来合成，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
一、作为抗体的中间体的制备：
以下抗体按抗体常规方法进行制备：如可进行载体构建后，转染真核细胞如HEK293细胞(Life Technologies Cat.No.11625019)，纯化表达。
抗体序列
(1)帕妥珠单抗(Pertuzumab)，可以和HER2靶标特异性结合：
轻链序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO.1
重链序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO.2
(2)尼妥珠单抗(Nimotuzumab)，可以和EGFR靶标特异性结合：
轻链顺序：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQNIVHSNGNTYLDWYQQTPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCFQYSHVPWTFGQGTKLQITRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：3
重链顺序：
QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYYIYWVRQAPGQGLEWIGGINPTSGGSNFNEKFKTRVTITADESSTTAYMELSSLRSEDTAFYFCTRQGLWFDSDGRGFDFWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：4
(3)曲妥珠单抗(Trastuzumab)，可以和HER2靶标特异性结合：
轻链顺序:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：5
重链顺序
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：6
二、药物、药物连接体、配体药物偶联物(ADC)的制备
实施例1
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸
Figure BDA0002066647610000321
Figure BDA0002066647610000331
第一步
(1S,3S,5S)-叔丁酯3-((1R,2R)-1-羟基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基噁唑-3-基)-3-羰基丙基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-羧酸
将原料(4R,5S)-4-甲基-5-苯基-3-丙酰基噁唑烷酮1b(1.96g，9.26mmol，采用公知的方法“Journal of the American Chemical Society,2003,125(50),15512-15520”制备而得)溶于25mL二氯甲烷中，氩气氛下，降温至0℃。反应液于0℃下滴加三乙胺(1.49mL，10.93mmol)，再滴加三氟甲磺酸二丁硼(9.7mL，9.72mmol)，于0℃下搅拌50分钟，干冰丙酮浴下将反应液降温至-75℃，加入(1S,3S,5S)-叔丁酯3-甲酰基-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-羧酸1a(2.16g，9.26mmol，采用专利申请“US20100249190”公开的方法制备而得)溶于7mL二氯甲烷的溶液，于-75℃下搅拌1.5小时，于0℃搅拌2小时，于室温搅拌1小时。反应结束后，加入36mL磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)和甲醇(V/V＝1:3)的混合液。于0℃下加入36mL甲醇和双氧水(30％)(V/V＝2:1)的混合液，于室温搅拌1小时。减压浓缩除去有机相，加入少量水，用乙醚(50mL×3)萃取，依次用5％碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠溶液(150mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化残留物，得标题产物(1S,3S,5S)-叔丁酯3-((1R,2R)-1-羟基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基噁唑-3-基)-3-羰基丙基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-羧酸1c(2.4g，白色泡沫状固体)，产率58.5％。
MS m/z(ESI):345.1[M-100+1]
第二步
(1S,3S,5S)-叔丁酯3-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基噁唑-3-基)-3-羰基丙基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-羧酸
将原料(1S,3S,5S)-叔丁酯3-((1R,2R)-1-羟基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基噁唑-3-基)-3-羰基丙基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-羧酸1c(1.4g，3.15mmol)溶于20mL二氯甲烷，加入1.4g碾碎的分子筛，氩气氛下，于0℃下加入1,8-双二甲氨基萘(1.75g，8.19mmol)，三甲基氧鎓四氟硼酸盐(1.16g，7.87mmol)，反应避光，于室温搅拌40小时。反应结束后，过滤，滤饼用二氯甲烷洗涤，滤液用饱和氯化铵溶液(50mL×4)洗去过量1,8-双二甲氨基萘，再用饱和氯化钠溶液(120mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物(1S,3S,5S)-叔丁酯3-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基噁唑-3-基)-3-羰基丙基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-羧酸1d(400mg，白色固体)，产率27.8％。
MS m/z(ESI):459.4[M+1]
第三步
(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(叔丁氧羰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸
将原料(1S,3S,5S)-叔丁酯3-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基噁唑-3-基)-3-羰基丙基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-羧酸1d(400mg，0.87mmol)溶于24mL四氢呋喃，氩气氛下，降温至0℃，缓慢滴加30％的双氧水(0.34mL/0.38g，3.31mmol)，再加入一水合氢氧化锂(62mg,，1.48mmol)，反应体系于室温反应20小时。反应结束后，向反应液中加入亚硫酸钠固体(440mg，3.48mmol)，于室温搅拌1小时，加入10mL水，减压浓缩掉有机相，所得残余物用二氯甲烷萃取(40mL×2)。水相在冰浴下滴加2N盐酸至反应液pH为3～4，用乙酸乙酯萃取(25mL×3)，乙酸乙酯层依次用水(50mL)，饱和氯化钠溶液(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得标题产物(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(叔丁氧羰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸1e(230mg，无色液体)，收率88.0％。
MS m/z(ESI):200.1[M-100+1]
第四步
(1S,3S,5S)-叔丁酯3-((1R,2R)-3-((S)-1-叔丁氧基-1-羰基-3-苯丙基-2-基胺)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-羧酸
将原料(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(叔丁氧羰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸1e(100mg，0.334mmol)溶于6mL二氯甲烷和二甲基甲酰胺(V/V＝5:1)混合溶剂中，加入反应物(S)-叔丁酯2-氨基-3-苯丙酸1f(73.9mg，0.334mmol，采用公知的方法“Tetrahedron:Asymmetry,2006,17(4),603-606”制备而得),再加入N,N-二异丙基乙基胺(0.29mL，67mmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(152.3mg，0.40mmol)。反应体系在氩气氛下，于室温下搅拌1小时。反应结束后，加10mL水搅拌，分层，二氯甲烷层用饱和氯化钠溶液(10mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物(1S,3S,5S)-叔丁酯3-((1R,2R)-3-((S)-1-叔丁氧基-1-羰基-3-苯丙基-2-基胺)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-羧酸1g(140mg，无色粘稠液体)，收率83.7％。
MS m/z(ESI):503.3[M+1]
第五步
(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸
将原料(1S,3S,5S)-叔丁酯3-((1R,2R)-3-((S)-1-叔丁氧基-1-羰基-3-苯丙基-2-基胺)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-羧酸1g(140mg，0.28mmol)溶于2mL二氧六环中，加入5.6M的氯化氢二氧六环溶液(0.15mL，0.835mmol)后将反应体系密封。于室温搅拌8小时，置于0℃冰箱内12小时。反应结束后，依次加入3mL二氯甲烷，3mL水，3mL饱和碳酸氢钠溶液，搅拌10分钟。体系分层，二氯甲烷层用饱和氯化钠溶液(20mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得到标题产品(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸1h(86mg，黄色固体)，收率76.7％。MS m/z(ESI):403.4[M+1]
第六步
(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基-14-酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸
将原料(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸1h(86mg，0.213mmol)，(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-14-羧酸1i(136mg，0.213mmol，采用专利申请“WO 2013072813”公开的方法制备而得)溶于6mL二氯甲烷和二甲基甲酰胺(V/V＝5:1)混合溶剂中，加入N,N-二异丙基乙基胺(0.19mL，1.065mmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(97.4mg，0.256mmol)。反应体系在氩气氛下，于室温下搅拌1小时。反应结束后，加入20mL水搅拌，分层。二氯甲烷层用饱和氯化钠溶液(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化残留物，得到标题产品(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基-14-酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸1j(120mg，白色泡沫状固体)，收率54.9％。
MS m/z(ESI):1023.1[M+1]
第七步
(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸
将原料(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基-14-酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸1j(120mg，0.117mmol)溶于2mL二氯甲烷中，加入2mL二乙胺。反应体系在氩气氛下，于室温下搅拌2小时。反应结束后，将反应液减压浓缩，得到粗品标题产品(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸1k(124mg，黄色液体)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
MS m/z(ESI):801.5[M+1]
第八步
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸
将粗品(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸1k(90mg，0.112mmol)溶于1mL二氧六环中，加入5.6M的氯化氢二氧六环溶液3mL，将反应体系密封，于室温下搅拌12小时。反应结束后，减压浓缩，用高效液相色谱法纯化所得残留物得标题产品(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸1(19mg，白色固体)，收率22.7％。
MS m/z(ESI):744.6[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD):δ7.34-7.21(m,5H),4.76-4.70(m,2H),4.26-4.19(m,1H),4.14-4.06(m,1H),3.91-3.86(m,1H),3.85-3.77(m,1H),3.75-3.56(m,2H),3.44-3.10(m,9H),2.98-2.83(m,1H),2.71-2.57(m,4H),2.26-1.99(m,4H),1.92-1.77(m,1H),1.75-1.58(m,2H),1.49-1.27(m,4H),1.21-0.95(m,18H),0.93-0.79(m,4H),0.76-0.61(m,1H).
实施例2
(S)-3-(2-氯苯基)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)丙酸
Figure BDA0002066647610000371
第一步
(S)-叔丁酯2-氨基-3-(2-氯苯基)丙酸
将原料(S)-2-氨基-3-(2-氯苯基)丙酸2a(400mg，2.0mmol，采用公知的方法“Journal of the American Chemical Society,1940,62,565-8”制备而得)溶于10mL乙酸叔丁酯，加入高氯酸(428mg(70％)，3.00mmol)，于室温下搅拌16小时。反应结束后，加入6mL水，分液，有机相用饱和碳酸氢钠溶液(3mL)洗涤。水相用饱和碳酸氢钠溶液调节至pH＝8，二氯甲烷(5mL×3)萃取，合并有机相，依次用水(3mL)，饱和氯化钠溶液(5mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得粗品标题产物(S)-叔丁酯2-氨基-3-(2-氯苯基)丙酸2b(400mg，白色固体)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
第二步
(1S,3S,5S)-叔丁酯3-((1R,2R)-3-((S)-1-叔丁氧基-3-(2-氯苯基)-1-羰基丙基-2-基胺)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-羧酸
将原料(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(叔丁氧羰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸1e(110mg，0.367mmol)溶于6mL二氯甲烷和二甲基甲酰胺(V/V＝5:1)混合溶剂中，加入粗品(S)-叔丁酯2-氨基-3-(2-氯苯基)丙酸2b(94mg，0.367mmol)，再加入N,N-二异丙基乙基胺(0.32mL，1.835mmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(168mg，0.44mmol)，反应体系在氩气氛下，于室温下搅拌1.5小时。反应结束后，加10mL水搅拌，分层，有机相用饱和氯化钠溶液(10mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物(1S,3S,5S)-叔丁酯3-((1R,2R)-3-((S)-1-叔丁氧基-3-(2-氯苯基)-1-羰基丙基-2-基胺)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-羧酸2c(112mg，白色泡沫状固体)，收率56.8％。
MS m/z(ESI):537.3[M+1]
第三步
(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氯苯基)丙酸
将原料(1S,3S,5S)-叔丁酯3-((1R,2R)-3-((S)-1-叔丁氧基-3-(2-氯苯基)-1-羰基丙基-2-基胺)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-羧酸2c(110mg，0.205mmol)溶于2mL二氧六环中，加入5.6M的氯化氢二氧六环溶液(0.13mL，0.717mmol)，氩气氛下，于室温搅拌1小时，置于0℃冰箱内6小时。反应结束后加入5mL二氯甲烷稀释，加入10mL饱和碳酸氢钠溶液，搅拌10分钟。体系分层，水层用5mL二氯甲烷萃取。合并二氯甲烷层，用饱和氯化钠溶液(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得到粗品标题产品(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氯苯基)丙酸2d(99mg，黄色液体)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
MS m/z(ESI):437.2[M+1]
第四步
(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-仲丁基-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氯苯基)丙酸
将粗品(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氯苯基)丙酸2d(99mg，0.226mmol)，(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-14-羧酸1i(144.4mg，0.226mmol)溶于6mL二氯甲烷和二甲基甲酰胺(V/V＝5:1)混合溶剂中，加入N,N-二异丙基乙基胺(0.2mL，1.13mmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(103.3mg，0.271mmol)。反应体系在氩气氛下，于室温下搅拌1小时。反应结束后，加入10mL水搅拌，分层。二氯甲烷层用饱和氯化钠溶液(10mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化残留物，得到标题产品(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-仲丁基-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氯苯基)丙酸2e(127mg，白色泡沫状固体)，收率53.1％。
MS m/z(ESI):1056.4[M+1]
第五步
(S)-叔丁酯3-(2-氯苯基)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)丙酸
将原料(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-仲丁基-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氯苯基)丙酸2e(127mg，0.12mmol)溶于2mL二氯甲烷中，加入2mL二乙胺。反应体系在氩气氛下，于室温下搅拌3小时。反应结束后，将反应液减压浓缩，得到粗品标题产品(S)-叔丁酯3-(2-氯苯基)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)丙酸2f(130mg，黄色粘稠物)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
MS m/z(ESI):834.5[M+1]
第六步
(S)-3-(2-氯苯基)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)丙酸
将粗品(S)-叔丁酯3-(2-氯苯基)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)丙酸2f(100mg，0.12mmol)溶于1mL二氧六环中，加入5.6M的氯化氢二氧六环溶液3mL，氩气氛下，于室温下搅拌12小时。反应结束后，减压浓缩反应液，用高效液相色谱法纯化所得残留物，得标题产品(S)-3-(2-氯苯基)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)丙酸2(35mg，白色固体)，收率35.7％。
MS m/z(ESI):778.7[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD):δ7.41-7.32(m,2H),7.31-7.16(m,2H),4.80-4.65(m,2H),4.22-4.13(m,1H),4.10-4.03(m,1H),3.98-3.91(m,1H),3.87-3.82(m,1H),3.73-3.63(m,2H),3.47-3.12(m,9H),3.09-3.01(m,1H),2.67-2.57(m,4H),2.24-2.11(m,3H),2.09-1.98(m,1H),1.89-1.67(m,3H),1.51-1.25(m,4H),1.20-0.93(m,18H),0.92-0.79(m,4H),0.75-0.66(m,1H).
实施例3
(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-5-甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸
Figure BDA0002066647610000401
第一步
(2S,5S)-叔丁酯2-((1R,2R)-1-羟基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基噁唑-3-基)-3-羰基丙基)-5-甲基吡咯烷-1-羧酸
将原料(4R,5S)-4-甲基-5-苯基-3-丙酰基噁唑烷酮1b(0.992g，4.2mmol)溶于20mL二氯甲烷中，氩气氛下，降温至0℃。反应液于0℃下滴加三乙胺(0.69mL，4.96mmol)，再滴加三氟甲磺酸二正丁基化硼(4.4mL，4.4mmol)，于0℃下搅拌50分钟，将反应液降温至-75℃，加入(2S,5S)-叔丁酯2-甲酰基-5-甲基吡咯烷-1-羧酸3a(900mg，4.2mmol，采用专利申请“US20120195857”公开的方法制备而得)溶于5mL二氯甲烷的溶液，于-75℃下搅拌1.5小时，于0℃搅拌1.5小时，于室温搅拌1小时。于室温下加入36mL磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)和甲醇(V/V＝1:3)的混合液。冷却至0℃，于0℃下加入36mL甲醇和双氧水(30％)(V/V＝2:1)的混合液，于室温搅拌1小时。反应结束后，减压浓缩除去有机相，加入15mL水。水相用乙醚(30mL×3)萃取，合并乙醚相，依次用5％碳酸氢钠溶液，水，饱和氯化钠溶液(150mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化残留物，得标题产物(2S,5S)-叔丁酯2-((1R,2R)-1-羟基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基噁唑-3-基)-3-羰基丙基)-5-甲基吡咯烷-1-羧酸3b(600mg，白色固体)，产率33％。
第二步
(2S,5S)-叔丁酯2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基噁唑-3-基)-3-羰基丙基)-5-甲基吡咯烷-1-羧酸
将原料(2S,5S)-叔丁酯2-((1R,2R)-1-羟基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基噁唑-3-基)-3-羰基丙基)-5-甲基吡咯烷-1-羧酸3b(600mg，1.34mmol)溶于15mL二氯甲烷，加入1g磨成粉末的分子筛，氩气氛下，于0℃下加入1,8-双二甲氨基萘(740mg，3.45mmol)，三甲基氧鎓四氟硼酸盐(500mg，3.38mmol)，反应用锡箔纸包裹，于室温下反应38小时。反应结束后，过滤，滤饼用二氯甲烷洗涤。合并滤液，有机相用饱和氯化铵溶液(20mL×3)洗去过量1,8-双二甲氨基萘，再用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物(2S,5S)-叔丁酯2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基噁唑-3-基)-3-羰基丙基)-5-甲基吡咯烷-1-羧酸3c(200mg，白色固体)，产率32％。
第三步
(2R,3R)-3-((2S,5S)-1-(叔丁氧羰基)-5-甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸
将原料(2S,5S)-叔丁酯2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基噁唑-3-基)-3-羰基丙基)-5-甲基吡咯烷-1-羧酸3c(200mg，0.43mmol)溶于22mL四氢呋喃，氩气氛下，降温至0℃，缓慢滴加30％的双氧水(186mg，1.6mmol)，再加入一水合氢氧化锂(58mg，1.37mmol)，于0℃下反应10分钟后，撤去冰浴，反应体系于室温反应44小时。反应结束后，向反应液中加入亚硫酸钠固体(220mg，1.74mmol)，于室温搅拌1小时，加入15mL水。减压浓缩掉有机相，所得残余物用二氯甲烷萃取(20mL×2)。水相在冰浴下滴加2N盐酸至反应液pH为3～4，用乙酸乙酯萃取(20mL×3)，乙酸乙酯层依次用水，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得粗品标题产物(2R,3R)-3-((2S,5S)-1-(叔丁氧羰基)-5-甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸3d(120mg，白色固体)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
第四步
(2S,5S)-叔丁酯2-((1R,2R)-3-((S)-1-叔丁氧基-1-羰基-3-苯丙基-2-基胺)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-5-甲基吡咯烷-1-羧酸
将粗品(2R,3R)-3-((2S,5S)-1-(叔丁氧羰基)-5-甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸3d(106mg，0.35mmol)溶于4.8mL二氯甲烷和二甲基甲酰胺(V/V＝5:1)混合溶剂中，加入(S)-叔丁酯2-氨基-3-苯丙酸1f(80mg，0.36mmol)，反应体系在氩气氛下，加入N,N-二异丙基乙基胺(0.30mL，1.74mmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(160mg，0.42mmol)，于室温下搅拌2小时。反应结束后，加10mL二氯甲烷，依次用水(5mL×2)、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物(2S,5S)-叔丁酯2-((1R,2R)-3-((S)-1-叔丁氧基-1-羰基-3-苯丙基-2-基胺)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-5-甲基吡咯烷-1-羧酸3e(138mg，无色粘稠液体)，收率78％。
第五步
(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((2S,5S)-5-甲基吡咯烷-2-基)丙酰基)-3-苯丙酸
将原料(2S,5S)-叔丁酯2-((1R,2R)-3-((S)-1-叔丁氧基-1-羰基-3-苯丙基-2-基胺)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-5-甲基吡咯烷-1-羧酸3e(150mg，0.267mmol)溶于2.2mL二氧六环中，加入4M的氯化氢二氧六环溶液(0.160mL，0.896mmol)后将反应体系密封。于室温搅拌7小时，置于4℃冰箱内16小时。反应结束后，将反应液减压浓缩，加入15mL二氯甲烷，冷却至0℃，滴加饱和碳酸氢钠溶液调至pH为8，分层，水相用二氯甲烷萃取(8mL×2)，合并有机相。有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液减压浓缩，得到标题产品(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((2S,5S)-5-甲基吡咯烷-2-基)丙酰基)-3-苯丙酸3f(80mg，无色粘稠固体)，收率74％。
第六步
(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-仲丁基-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基)-5-甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸
将原料(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((2S,5S)-5-甲基吡咯烷-2-基)丙酰基)-3-苯丙酸3f(80mg，0.198mmol)，(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-14-羧酸1i(136mg，0.213mmol)溶于4.8mL二氯甲烷和二甲基甲酰胺(V/V＝5:1)混合溶剂中，加入N,N-二异丙基乙基胺(0.170mL，0.98mmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(100mg，0.263mmol)。反应体系在氩气氛下，于室温下搅拌反应1小时。反应结束后，加入15mL二氯甲烷，用水(6mL×2)洗涤。水相用二氯甲烷萃取(5mL)，合并二氯甲烷相，用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化残留物，得到标题产品(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-仲丁基-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基)-5-甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸3g(168mg，白色泡沫状固体)，收率81％。
第七步
(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-5-甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸
将原料(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-仲丁基-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基)-5-甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸3g(167mg，0.16mmol)溶于2mL二氯甲烷中，加入2mL二乙胺。反应体系在氩气氛下，于室温下搅拌3小时。反应结束后，将反应液减压浓缩，得到粗品标题产品(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-5-甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸3h(180mg，黄色液体)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
MS m/z(ESI):802.6[M+1]
第八步
(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-5-甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸
将粗品(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-5-甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸3h(130mg，0.16mmol)溶于1mL二氧六环中，加入3mL 5.6M的氯化氢二氧六环溶液，将反应体系密封，于室温下搅拌12小时。反应结束后，将反应液减压浓缩，用高效液相色谱法纯化所得残余物，得标题产品(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-5-甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸3(28mg，白色固体)，收率23％。
MS m/z(ESI):746.7[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD):δ7.31-7.14(m,5H),4.79-4.67(m,2H),4.25-4.13(m,1H),4.10-3.97(m,2H),3.77-3.66(m,1H),3.60-3.52(m,1H),3.51-3.42(m,1H),3.41-3.12(m,7H),2.97-2.85(m,1H),2.67(d,3H),2.48-2.40(m,2H),2.30-2.02(m,4H),1.93-1.73(m,2H),1.70-1.55(m,1H),1.53-1.28(m,5H),1.26-1.11(m,7H),1.10-0.99(m,14H),0.98-0.83(m,4H).
实施例4
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸
Figure BDA0002066647610000441
第一步
6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氯
在原料6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸4a(1.5g，7.10mmol，采用公知的方法“Journal of Medcinal Chemistry,2013,56(24),9955-9968”制备而得)中滴入一滴N,N-二甲基甲酰胺，氩气氛下，干冰浴降温后，缓慢滴入15mL草酰氯，滴加时剧烈搅拌，滴完于室温反应1小时。反应结束后，将反应液减压浓缩，用二氯甲烷溶解所得残留物，减压浓缩，得到粗品标题产物6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氯4b，产品不经纯化直接进行下一步反应。
第二步
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸
将原料(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸1(17mg，0.023mmol)溶于1mL二氯甲烷中，加入N,N-二异丙基乙基胺(20μL，0.115mmol)，反应体系在氩气氛下，冰浴下滴加预制的6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氯4b(7.9mg,0.034mmol)的二氯甲烷溶液，滴加完毕后于室温反应5小时。反应结束后，加入10mL甲醇淬灭，将反应液减压浓缩，用高效液相色谱法纯化所得残留物，得标题产物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸4(9mg，白色固体)，收率42％。
MS m/z(ESI):937.4[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD):δ7.37-7.17(m,5H),6.84-6.79(m,2H),4.80-4.71(m,2H),4.69-4.56(m,2H),4.26-4.19(m,1H),4.14-4.07(m,1H),3.92-3.86(m,1H),3.84-3.78(m,1H),3.77-3.60(m,1H),3.55-3.47(m,2H),3.42-3.23(m,5H),3.18-3.12(m,2H),3.07-3.03(m,2H),3.02-2.82(m,2H),2.66-2.58(m,2H),2.54-2.46(m,1H),2.46-2.38(m,2H),2.30-2.14(m,2H),2.09-1.99(m,1H),1.90-1.78(m,1H),1.75-1.56(m,6H),1.48-1.28(m,6H),1.20-0.79(m,22H),0.77-0.69(m,1H).
实施例5
(S)-3-(2-氯苯基)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)丙酸
Figure BDA0002066647610000451
将原料(S)-3-(2-氯苯基)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)丙酸2(18mg，0.023mmol)溶于1mL二氯甲烷中，加入N,N-二异丙基乙基胺(0.02mL，0.115mmol)，反应体系在氩气氛下，冰浴下滴加预制的6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氯4b(7.9mg，0.034mmol)的二氯甲烷溶液，滴加完毕后于室温反应4小时。反应结束后，加入5mL甲醇淬灭，将反应液减压浓缩，用高效液相色谱法纯化所得残留物，得标题产物(S)-3-(2-氯苯基)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)丙酸5(6mg，白色固体)，收率26.6％。
MS m/z(ESI):971.5[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD):δ7.42-7.34(m,2H),7.33-7.19(m,2H),6.83-6.78(m,2H),4.83-4.70(m,2H),4.68-4.56(m,2H),4.24-4.16(m,1H),4.13-4.05(m,1H),4.03-3.95(m,1H),3.91-3.84(m,1H),3.76-3.65(m,1H),3.54-3.48(m,2H),3.47-3.18(m,5H),3.17-2.96(m,6H),2.67-2.58(m,2H),2.53-2.38(m,3H),2.28-2.18(m,2H),2.09-2.00(m,1H),1.92-1.57(m,7H),1.51-1.28(m,6H),1.21-0.82(m,22H),0.78-0.69(m,1H).
实施例6
(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-5-甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸
Figure BDA0002066647610000461
将原料(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-5-甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸3(18mg，0.024mmol)溶于1mL二氯甲烷中，加入N,N-二异丙基乙基胺(0.02mL，0.12mmol)，反应体系在氩气氛下，冰浴下滴加预制的6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氯4b(8.3mg,0.036mmol)的二氯甲烷溶液，于室温搅拌反应4小时。反应结束后，加入5mL甲醇淬灭，将反应液减压浓缩，用高效液相色谱法纯化所得残留物，得标题产物(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-5-甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸6(7mg，白色固体)，收率30.9％。
MS m/z(ESI):939.5[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD):δ7.30-7.15(m,5H),6.83-6.78(m,2H),4.78-4.69(m,2H),4.69-4.56(m,2H),4.24-4.12(m,1H),4.10-3.96(m,2H),3.60-3.44(m,3H),3.41-3.22(m,4H),3.16-3.10(m,2H),3.07-3.02(m,2H),3.01-2.86(m,2H),2.52-2.38(m,4H),2.31-2.15(m,3H),2.09-1.99(m,1H),1.91-1.77(m,2H),1.71-1.56(m,5H),1.52-1.28(m,9H),1.26-1.14(m,6H),1.11-0.77(m,18H).
实施例7
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸
Figure BDA0002066647610000471
第一步
(S)-叔丁酯2-氨基-3-(2-氟苯基)丙酸
将原料((S)-2-氨基-3-(2-氟苯基)丙酸7a(400mg，2.18mmol，采用公知的方法“Advanced Synthesis&Catalysis,2012,354(17),3327-3332”制备而得)溶于10mL乙酸叔丁酯，加入高氯酸(300mg(70％)，3.3mmol)，于室温下搅拌16小时。反应完毕后加入6mL水，分液，有机相用饱和碳酸氢钠溶液(5mL)洗涤。水相用饱和碳酸氢钠溶液调节至pH＝8，二氯甲烷(5mL×3)萃取，合并有机相，依次用水(3mL)，饱和氯化钠溶液(5mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得粗品标题产物(S)-叔丁酯2-氨基-3-(2-氟苯基)丙酸7b(390mg，黄色油状物)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
第二步
(1S,3S,5S)-叔丁酯3-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-3-(2-氟苯基)-1-羰基丙基-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-羧酸
将原料(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(叔丁氧羰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸1e(100mg，0.334mmol)溶于6mL二氯甲烷和二甲基甲酰胺(V/V＝5:1)混合溶剂中，加入反应物粗品(S)-叔丁酯2-氨基-3-(2-氟苯基)丙酸7b(80mg，0.334mmol)。再加入N,N-二异丙基乙基胺(0.29mL，1.67mmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(152.3mg，0.40mmol)。反应体系在氩气氛下，于室温搅拌1小时。反应结束后，加10mL水搅拌，分层，二氯甲烷层用饱和氯化钠溶液(10mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物(1S,3S,5S)-叔丁酯3-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-3-(2-氟苯基)-1-羰基丙基-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-羧酸7c(173mg，无色液体)，收率99.5％。MS m/z(ESI):521.2[M+1]
第三步
(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸
将原料(1S,3S,5S)-叔丁酯3-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-3-(2-氟苯基)-1-羰基丙基-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-羧酸7c(173mg，0.33mmol)溶于2mL二氧六环中，加入5.6M的氯化氢二氧六环溶液(0.21mL，1.16mmol)，氩气氛下，于室温搅拌1小时，置于0℃冰箱内12小时。反应结束后，将反应液减压浓缩，加入5mL二氯甲烷稀释，加入10mL饱和碳酸氢钠溶液，搅拌10分钟。体系分层，水层用二氯甲烷萃取(5mL×3)。合并二氯甲烷层，用饱和氯化钠溶液(10mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液减压浓缩，得到粗品标题产品(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸7d(77mg，黄色液体)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
MS m/z(ESI):421.2[M+1]
第四步
(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧-4,7,10-三氮杂十四烷基-14-酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸
将粗品(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸7d(77mg，0.183mmol)，(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-14-羧酸1i(116.8mg，0.183mmol)溶于6mL二氯甲烷和二甲基甲酰胺(V/V＝5:1)混合溶剂中，加入N,N-二异丙基乙基胺(0.16mL，0.915mmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(84mg，0.22mmol)。反应体系在氩气氛下，于室温下搅拌1小时。反应结束后，加入10mL水搅拌，分层。二氯甲烷层用饱和氯化钠溶液(10mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液减压浓缩。用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化残留物，得到标题产品(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基-14-酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸7e(190.5mg，黄色粘稠物)，收率100％。
MS m/z(ESI):1040.6[M+1]
第五步
(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸
将原料(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基-14-酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸7e(190.5mg，0.183mmol)溶于1.5mL二氯甲烷中，加入2mL二乙胺。反应体系在氩气氛下，于室温搅拌3小时。反应结束后，将反应液减压浓缩，得到粗品标题产品(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸7f(150mg，黄色粘稠物)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
MS m/z(ESI):818.5[M+1]
第六步
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸
将粗品(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸7f(150mg，0.183mmol)溶于1mL二氧六环中，加入5.6M的氯化氢二氧六环溶液3mL，氩气氛下，于室温搅拌12小时。反应结束后，将反应液减压浓缩，用乙醚带旋溶剂。所得残余物用高效液相色谱法纯化得标题产品(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸7(28mg，白色粉末固体)，收率20％。
MS m/z(ESI):762.7[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD):δ7.38-7.18(m,2H),7.13-7.01(m,2H),4.80-4.67(m,2H),4.30-4.15(m,1H),4.13-4.01(m,1H),3.96-3.83(m,2H),3.75-3.60(m,2H),3.42-3.11(m,9H),3.06-2.95(m,1H),2.70-2.58(m,4H),2.28-2.01(m,4H),1.88-1.70(m,3H),1.57-1.25(m,4H),1.22-0.95(m,18H),0.92-0.80(m,4H),0.78-0.65(m,1H).
实施例8
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸
Figure BDA0002066647610000501
将原料(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸7(25mg，0.033mmol)溶于3mL二氯甲烷中，加入N,N-二异丙基乙基胺(0.029mL，0.164mmol)，反应体系在氩气氛下，冰浴下滴加预制的6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氯4b(11.3mg，0.049mmol)的二氯甲烷溶液，于室温反应3小时。反应结束后，加入5mL水，搅拌20分钟，分液，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，残留物用高效液相色谱法纯化得标题产物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸8(7mg，黄色粘稠物)，收率22.4％。MS m/z(ESI):955.4[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD):δ7.36-7.30(m,1H),7.29-7.21(m,1H),7.17-7.02(m,2H),6.83-6.79(m,2H),4.81-4.71(m,2H),4.69-4.55(m,2H),4.25-4.15(m,1H),4.13-4.04(m,1H),3.96-3.85(m,2H),3.70-3.61(m,1H),3.55-3.46(m,3H),3.40-3.21(m,4H),3.18-3.10(m,2H),3.07-2.96(m,4H),2.67-2.56(m,2H),2.54-2.34(m,3H),2.29-2.17(m,2H),2.10-1.99(m,1H),1.89-1.57(m,7H),1.52-1.28(m,6H),1.21-1.11(m,4H),1.07-0.96(m,6H),0.95-0.81(m,12H),0.80-0.69(m,1H).
实施例9
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰胺)-4-亚甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸
Figure BDA0002066647610000511
第一步
(S)-叔丁酯2-甲酰基-4-亚甲基吡咯烷-1-羧酸
将原料(S)-叔丁酯2-(羟甲基)-4-亚甲基吡咯烷-1-羧酸9a(1.32g，6.19mmol,采用公知的方法“From Journal of Organic Chemistry,2003,68(10),3923-3931”制备而得)溶于15mL二氯甲烷中，降温至0℃。反应体系于氩气氛下，加入N,N-二异丙基乙基胺(5.38mL，30.9mmol)，二甲基亚砜(7.26g，92.9mmol)，加入三氧化硫-吡啶络合物(7.26g，92.9mmol)，反应液于0℃下反应3小时。反应结束后，加入磷酸盐缓冲液(pH＝7)淬灭反应，依次用水，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化残留物，得标题产物(S)-叔丁酯2-甲酰基-4-亚甲基吡咯烷-1-羧酸9b(1.1g，淡黄色液体)，产率84.2％。
第二步
(S)-叔丁酯2-((1R,2R)-1-羟基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基噁唑-3-基)-3-羰基丙基)-4-亚甲基吡咯烷-1-羧酸
将原料(4R,5S)-4-甲基-5-苯基-3-丙酰基噁唑烷酮1b(1.43g，6.15mmol)溶于30mL二氯甲烷中，氩气氛下，降温至0℃，滴加三乙胺(0.98mL，7.08mmol)，再滴加三氟甲磺酸二正丁基化硼(6.65mL，6.65mmol)，于0℃下搅拌50分钟，将反应液降温至-78℃，加入预制的(S)-叔丁酯2-甲酰基-4-亚甲基吡咯烷-1-羧酸9b(1.43g，6.15mmol)的二氯甲烷溶液，于-78℃下搅拌2小时，于0℃搅拌1小时，于室温搅拌1小时。加入36mL磷酸盐缓冲液(pH＝7)和甲醇(V/V＝3:1)的混合液淬灭反应。于0℃下加入甲醇和双氧水(V/V＝1:2)的混合液，于室温搅拌1小时。反应结束后，旋除甲醇和有机相，残留水相用二氯甲烷萃取，合并有机相，依次用水洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化残留物，得标题产物(S)-叔丁酯2-((1R,2R)-1-羟基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基噁唑-3-基)-3-羰基丙基)-4-亚甲基吡咯烷-1-羧酸9c(810mg，白色泡沫状固体)，产率30％。
MS m/z(ESI):354.2[M-100+1]
第三步
(S)-叔丁酯2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基噁唑-3-基)-3-羰基丙基)-4-亚甲基吡咯烷-1-羧酸
将原料(S)-叔丁酯2-((1R,2R)-1-羟基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基噁唑-3-基)-3-羰基丙基)-4-亚甲基吡咯烷-1-羧酸9c(810mg，1.82mmol)溶于15mL二氯甲烷，加入碾碎的分子筛，加入碳酸钾(1.25g，9.11mmol)，三氟甲磺酸甲酯(897.7mg，5.47mmol)，于室温搅拌反应12小时。反应结束后，将反应液过滤，滤饼用二氯甲烷洗涤，合并有机相，将有机相减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物(S)-叔丁酯2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基噁唑-3-基)-3-羰基丙基)-4-亚甲基吡咯烷-1-羧酸9d(280mg，白色泡沫固体)，产率33.5％。
MS m/z(ESI):359.2[M-100+1]
第四步
(2R,3R)-3-((S)-1-(叔丁氧羰基)-4-亚甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸
将原料(S)-叔丁酯2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基噁唑-3-基)-3-羰基丙基)-4-亚甲基吡咯烷-1-羧酸9d(400mg，0.87mmol)溶于20mL四氢呋喃，加入一水合氢氧化锂(62.2mg,，1.484mmol)，反应体系在氩气氛下，降温至0℃，缓慢滴加30％的双氧水(112.7mg，3.31mmol)，反应体系于室温反应12小时。反应结束后，向反应液中加入亚硫酸钠(416mg，3.3mmol)，于室温搅拌1小时。将四氢呋喃旋干，残余物中加入水溶解，用二氯甲烷萃取。水相滴加稀盐酸调节反应液pH为3～4，用二氯甲烷萃取(30mL×3)，合并有机相，依次用水洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得得粗品标题产物(2R,3R)-3-((S)-1-(叔丁氧羰基)-4-亚甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸9e(230mg，无色液体)，产品不经纯化直接进行下一步。
MS m/z(ESI):298.2[M-1]
第五步
(S)-叔丁酯2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-1-羰基-3-苯丙基-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-4-亚甲基吡咯烷-1-羧酸
将粗品(2R,3R)-3-((S)-1-(叔丁氧羰基)-4-亚甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸9e(220mg，0.735mmol)溶于6mL二氯甲烷中，加入反应物(S)-叔丁酯2-氨基-3-苯丙酸1f(178.8mg，0.809mmol)。再加入N,N-二异丙基乙基胺(0.51mL，2.94mmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(363mg，0.956mmol)。反应体系在氩气氛下，于室温下反应3小时。反应结束后，反应液用水洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物(S)-叔丁酯2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-1-羰基-3-苯丙基-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-4-亚甲基吡咯烷-1-羧酸9f(271mg，白色固体)，收率66％。
MS m/z(ESI):503.3[M+1]
第六步
(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-4-亚甲基吡咯烷-2-基)丙酰胺)-3-苯丙酸
将原料(S)-叔丁酯2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-1-羰基-3-苯丙基-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-4-亚甲基吡咯烷-1-羧酸9f(270mg，0.537mmol)溶于4mL 1,4-二氧六环中，加入4M的氯化氢二氧六环溶液(0.335mL，1.881mmol)，于室温下搅拌1小时，置于0～4℃冰箱内12小时。将反应物减压浓缩，残留物用二氯甲烷溶解，滴加饱和碳酸氢钠溶液调节pH为8～9，分液，水相用二氯甲烷萃取。合并有机相，依次用水洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得到粗品标题产品(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-4-亚甲基吡咯烷-2-基)丙酰胺)-3-苯丙酸9g(210mg，淡黄色油状物)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
MS m/z(ESI):403.4[M+1]
第七步
(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基-14-酰基)-4-亚甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸
将粗品(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-4-亚甲基吡咯烷-2-基)丙酰胺)-3-苯丙酸9g(210mg，0.521mmol)，(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-14-羧酸1i(365.9mg，0.547mmol)溶于6mL二氯甲烷中，加入N,N-二异丙基乙基胺(0.4537mL，2.609mmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(257.8mg，0.678mmol)。反应体系在氩气氛下，室温下搅拌2小时。反应结束后，反应液依次用水洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化残留物，得到标题产品(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基-14-酰基)-4-亚甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸9h(345mg，白色泡沫状固体)，收率64.7％。
MS m/z(ESI):1022.5[M+1]
第八步
(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-4-亚甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸
将原料(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基-14-酰基)-4-亚甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸9h(345mg，0.337mmol)溶于2mL二氯甲烷中，加入3mL二乙胺。反应体系在氩气氛下，于室温下搅拌2小时。反应结束后将反应液减压浓缩，得到粗品标题产品(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-4-亚甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸9i(375mg，黄色油状物)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
MS m/z(ESI):800.5[M+1]
第九步
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-4-亚甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸
将粗品(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-4-亚甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸9i(370mg，0.462mmol)加入反应瓶中，加入4M的氯化氢二氧六环溶液7mL，将反应体系密封，于室温下搅拌12小时。反应结束后，将反应液减压浓缩，残留物用高效液相色谱法纯化得标题产物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-4-亚甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸9(30mg，白色粉末)，收率11.9％。
MS m/z(ESI):744.7[M+1]
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.57(s,1H),10.00(s,1H),8.41-8.26(m,2H),7.52-6.99(m,5H),5.34(s,1H)，5.02-4.95(m,4H),4.38-4.33(m,2H),4.16(m,2H),3.93-3.75(m,3H),3.49-3.07(m,6H),2.94-2.32(m,16H),2.30-2.01(m,4H),1.75-1.65(m,2H),1.32-0.83(m,16H).
实施例10
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-4-亚甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸
Figure BDA0002066647610000551
将原料(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-4-亚甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸9(22mg，0.0295mmol)溶于3mL二氯甲烷中，加入N,N-二异丙基乙基胺(19mg，0.1479mmol)，降温至0℃，滴加预制的6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氯4b(10.1mg，0.0443mmol)的二氯甲烷溶液，反应体系在氩气氛下，于室温反应2.5小时。反应结束后，加入甲醇淬灭，将反应液减压浓缩，用高效液相色谱法纯化所得残留物，得标题产物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-4-亚甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸10(1.3mg，白色粘稠物)，收率4.6％。
MS m/z(ESI):937.9[M+1]
实施例11
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸
Figure BDA0002066647610000561
第一步
(S)-叔丁酯6-甲酰基-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-5-羧酸
将原料(S)-叔丁酯6-(羟甲基)-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-5-羧酸11a(2.37g，10.4mmol,采用公知的方法“Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2013,23(9),2653-2658”制备而得)溶于40mL二氯甲烷中，降温至0℃。反应体系在氩气氛下，加入N,N-二异丙基乙基胺(10.8mL，62.5mmol)，二甲基亚砜(12.2g，156.4mmol)，加入三氧化硫-吡啶络合物(6.63g，41.7mmol)，反应液于0℃反应3小时。反应结束后，加入磷酸盐缓冲液(pH＝7)淬灭反应，依次用水，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化残留物，得标题产物(S)-叔丁酯6-甲酰基-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-5-羧酸11b(2g，黄色液体)，产率88％。
第二步
(S)-叔丁酯6-((1R,2R)-1-羟基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基噁唑-3-基)-3-羰基丙基)-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-5-羧酸
将原料(4R,5S)-4-甲基-5-苯基-3-丙酰基噁唑烷酮1b(2g，8.88mmol)溶于35mL二氯甲烷中，氩气氛下，滴加三乙胺(1.42mL，10.2mmol)，降温至0℃，滴加三氟甲磺酸二正丁基化硼(9.59mL，9.59mmol)，于0℃搅拌50分钟，于78℃加入预制的(S)-叔丁酯6-甲酰基-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-5-羧酸11b(2g，8.88mmol)的二氯甲烷溶液，于-78℃下搅拌2小时，于0℃搅拌1小时，于室温搅拌1小时。反应结束后，加入磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)和甲醇(V/V＝3:1)的混合液淬灭反应。于0℃加入甲醇和双氧水(V/V＝1:2)的混合液，于室温搅拌1小时。减压浓缩后，加水溶解残留物，用二氯甲烷萃取，合并有机相，依次用水洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化残留物，得标题产物(S)-叔丁酯6-((1R,2R)-1-羟基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基噁唑-3-基)-3-羰基丙基)-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-5-羧酸11c(1.8g，白色泡沫状固体)，产率44.2％。
MS m/z(ESI):459.4[M+1]
第三步
(S)-叔丁酯6-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基噁唑-3-基)-3-羰基丙基)-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-5-羧酸
将原料(S)-叔丁酯6-((1R,2R)-1-羟基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基噁唑-3-基)-3-羰基丙基)-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-5-羧酸11c(1.8g，3.92mmol)溶于30mL二氯甲烷，加入碾碎的分子筛，反应体系在氩气氛下，加入碳酸钾(3.78g，27.48mmol)，三氟甲磺酸甲酯(3.22g，19.64mmol)，于室温下搅拌反应12小时。反应结束后，将反应液过滤，滤饼用二氯甲烷洗涤，合并有机相，将有机相减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系A纯化所得残余物，得到标题产物(S)-叔丁酯6-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基噁唑-3-基)-3-羰基丙基)-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-5-羧酸11d(930mg，无色油状物)，产率50.2％。
MS m/z(ESI):473.4[M+1]
第四步
(2R,3R)-3-((S)-5-(叔丁氧羰基)-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸
将原料(S)-叔丁酯6-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基噁唑-3-基)-3-羰基丙基)-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-5-羧酸11d(1.03g，2.8mmol)溶于20mL四氢呋喃，加入一水合氢氧化锂(155mg,，3.7mmol)，反应体系在氩气氛下，滴加30％的双氧水(939mg，8.28mmol)，反应体系于室温反应12小时。反应结束后，向反应液中加入亚硫酸钠(1.04g，8.28mmol)，于室温搅拌1小时。将四氢呋喃旋干，残余物中加入水溶解，用二氯甲烷萃取。水相滴加稀盐酸调节反应液pH为3～4，用二氯甲烷萃取(30mL×5)，合并有机相，依次用水洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得得粗品标题产物(2R,3R)-3-((S)-5-(叔丁氧羰基)-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸11e(700mg，无色粘稠液体)，产品不经纯化直接进行下一步。
MS m/z(ESI):314.4[M+1]
第五步
(S)-叔丁酯6-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-3-(2-氟苯基)-1-羰基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-5-羧酸
将粗品(2R,3R)-3-((S)-5-(叔丁氧羰基)-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸11e(350mg，1.117mmol)溶于6mL二氯甲烷中，加入反应物(S)-叔丁酯2-氨基-3-(2-氟苯基)丙酸7b(267mg，1.117mmol)。反应体系在氩气氛下，加入N,N-二异丙基乙基胺(720mg，5.587mmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(509.8mg，1.341mmol)，于室温下反应2小时。反应结束后，反应液用水洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物(S)-叔丁酯6-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-3-(2-氟苯基)-1-羰基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-5-羧酸11f(570mg，无色油状物)，收率95.3％。MS m/z(ESI):535.3[M+1]
第六步
(S)-叔丁酯3-(2-氟苯基)-2-((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-6-基)丙酰胺)丙酸
将原料(S)-叔丁酯6-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-3-(2-氟苯基)-1-羰基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-5-羧酸11f(570mg，1.049mmol)溶于8mL 1,4-二氧六环中，加入4M的氯化氢二氧六环溶液(0.749mL，4.196mmol)，于室温下搅拌1小时，置于0～4℃冰箱内12小时。将反应物减压浓缩，残留物用二氯甲烷溶解，滴加饱和碳酸氢钠溶液调节pH为8～9，分液，水相用二氯甲烷萃取。合并有机相，依次用水洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得到粗品标题产品(S)-叔丁酯3-(2-氟苯基)-2-((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-6-基)丙酰胺)丙酸11g(440mg，淡黄色油状物)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
MS m/z(ESI):435.4[M+1]
第七步
(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((S)-5-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基-14-酰基-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸
将粗品(S)-叔丁酯3-(2-氟苯基)-2-((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-6-基)丙酰胺)丙酸11g(440mg，1.013mmol)，(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-14-羧酸1i(645.8mg，1.013mmol)溶于10mL二氯甲烷中，加入N,N-二异丙基乙基胺(0.88mL，5.06mmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(500.5mg，1.317mmol)。反应体系在氩气氛下，于室温下搅拌2小时。反应结束后，反应液依次用水洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化残留物，得到标题产品(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((S)-5-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基-14-酰基-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸11h(570mg，白色粉末)，收率53.4％。
MS m/z(ESI):1054.9[M+1]
第八步
(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸
将原料(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((S)-5-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基-14-酰基-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸11h(560mg，0.531mmol)溶于2mL二氯甲烷中，加入6mL二乙胺，于室温下搅拌2.5小时。反应结束后将反应液减压浓缩，得到粗品标题产品(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸11i(550mg，白色粘稠物)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
MS m/z(ESI):832.5[M+1]
第九步
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸
将粗品(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸11i(450mg，0.541mmol)加入反应瓶中，加入4M的氯化氢二氧六环溶液7mL，将反应体系密封，于室温下搅拌反应12小时。反应结束后，将反应液减压浓缩，残留物用高效液相色谱法纯化得标题产物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸11(403mg，白色固体)，收率96％。
MS m/z(ESI):776.7[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.30-7.22(m,2H),7.12-7.04(m,2H),4.72-4.68(m,2H),4.13-4.07(m,2H),3.96-3.94(m,1H),3.70-3.66(m,2H),3.50-3.47(m,2H),3.40-3.37(m,3H),3.34-3.28(m,4H),3.26-3.22(m,2H),3.11(s,1H),3.05-2.91(m,2H),2.67-2.65(m,3H),2.57-2.43(m,2H),2.39-2.28(m,2H),2.25-2.16(m,3H),1.93-1.88(m,2H),1.55-1.43(m,2H),1.23-1.21(d,2H),1.16-1.08(m,3H),1.08-0.97(m,10H),0.89-0.83(m,3H),0.66-0.53(m,3H),0.46-0.43(m,2H).
实施例12
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸
Figure BDA0002066647610000601
将原料(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸11(150mg，0.193mmol)溶于7mL二氯甲烷中，加入N,N-二异丙基乙基胺(87.3mg，0.677mmol)，反应体系在氩气氛下，降温至0℃，滴加预制的6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氯4b(57.6mg，0.251mmol)的二氯甲烷溶液，于室温反应2小时。反应结束后，加入甲醇淬灭，将反应液减压浓缩，用高效液相色谱法纯化所得残留物，得标题产物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸12(14.7mg，白色粉末)，收率7.8％。
MS m/z(ESI):969.9[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.29-7.23(m,2H),7.10-7.04(m,2H),6.79-6.78(m,2H),4.69-4.54(m,3H),4.18-4.07(m,3H),3.98-3.92(m,1H),3.75-3.71(m,2H),3.50-3.47(m,3H),3.42-3.39(m,2H),3.34-3.32(m,5H),3.27-3.19(m,4H),3.09-2.95(m,5H),2.49-2.47(m,2H),2.41-2.36(m,2H),2.29-2.18(m,3H),2.09-2.02(m,2H),1.90-1.87(m,2H),1.63-1.59(m,4H),1.49(s,2H),1.32-1.28(m,3H),1.21-1.12(m,3H),1.00-0.81(m,12H),0.62-0.55(m,3H),0.46-0.40(m,2H).
实施例13
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯基丙酸
Figure BDA0002066647610000611
采用实施例11的合成路线，将第五步原料替换为(2R,3R)-3-((S)-5-(叔丁氧羰基)-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸11e和(S)-叔丁酯2-氨基-3-苯丙酯1f制得标题产物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯基丙酸13(219mg，白色粉末)。
MS m/z(ESI):758.7[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.31-7.19(m,5H),4.70-4.68(m,2H),4.14-4.03(m,2H),3.95-3.93(m,1H),3.69-3.66(m,2H),3.48-3.45(m,2H),3.43-3.38(m,3H),3.34-3.29(m,4H),3.23-3.21(m,2H),3.11(s,1H),2.97-2.89(m,2H),2.67-2.65(m,3H),2.51-2.43(m,2H),2.39-2.27(m,2H),2.21-2.06(m,3H),1.88-1.82(m,2H),1.41-1.39(m,2H),1.23-1.21(d,2H),1.16-1.10(m,3H),1.08-0.98(m,10H),0.89-0.84(m,3H),0.63-0.52(m,3H),0.46-0.43(m,2H).
实施例14
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸
Figure BDA0002066647610000612
Figure BDA0002066647610000621
将原料(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯基丙酸13(120mg，0.158mmol)溶于5mL二氯甲烷中，加入N,N-二异丙基乙基胺(71.5mg，0.554mmol)，反应体系在氩气氛下，于0℃滴加预制的6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氯4b(47.1mg，0.2059mmol)的二氯甲烷溶液，于室温反应2小时。反应结束后，加入1mL甲醇，搅拌10分钟，将反应液减压浓缩，用高效液相色谱法纯化所得残留物，得标题产物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸14(5.1mg，白色粉末)，收率3.39％。
MS m/z(ESI):951.9[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.29-7.18(m,5H),6.80-6.79(m,2H),4.75-4.61(m,3H),4.21-3.99(m,3H),3.94-3.91(m,1H),3.74-3.70(m,2H),3.51-3.44(m,3H),3.42-3.37(m,2H),3.34-3.28(m,5H),3.23-3.21(m,4H),3.10-2.86(m,5H),2.49-2.36(m,4H),2.32-2.17(m,3H),2.12-2.03(m,2H),1.88-1.80(m,2H),1.67-1.58(m,4H),1.49(s,2H),1.37-1.26(m,3H),1.22-1.13(m,3H),1.00-0.83(m,12H),0.63-0.51(m,3H),0.43-0.40(m,2H).
实施例15
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(对-甲苯基)丙酸
Figure BDA0002066647610000622
(S)-tert-butyl 2-amino-3-(p-tolyl)propanoate
(S)-叔丁酯2-氨基-3-(对甲苯基)丙酸
将原料(S)-2-氨基-3-(对甲苯基)丙酸15a(400mg，2.23mmol，采用公知的方法“Organic&Biomolecular Chemistry,2004,2(18),2684-2691”制备而得)溶于10mL乙酸叔丁酯，反应体系在氩气氛下，加入高氯酸(336.3mg(70％)，3.34mmol)，于室温下搅拌16小时。反应完毕后加入10mL水，分液，水相用饱和碳酸氢钠溶液调节pH＝8，二氯甲烷(5mL×3)萃取，合并有机相，用饱和氯化钠溶液(5mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得标题产物(S)-叔丁酯2-氨基-3-(p-甲苯基)丙酸15b(370mg，白色固体)，收率70％。
采用实施例1的合成路线，将第四步原料替换为(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(叔丁氧羰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-异丁酸1e和(S)-叔丁酯2-氨基-3-(p-甲苯基)丙酸15b，制得标题产物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(对-甲苯基)丙酸15(30mg，白色粉末)。
MS m/z(ESI):758.8[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD):δ7.19-7.07(m,4H),4.82-4.68(m,2H),4.30-4.18(m,1H),4.15-4.05(m,1H),3.89-3.84(m,1H),3.83-3.76(m,1H),3.74-3.62(m,2H),3.47-3.12(m,9H),2.89-2.79(m,1H),2.70-2.59(m,4H),2.34-2.03(m,7H),1.91-1.75(m,1H),1.73-1.53(m,2H),1.50-1.24(m,4H),1.22-0.92(m,18H),0.90-0.79(m,4H),0.75-0.64(m,1H).
实施例16
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(噻吩-2-基)丙酸
Figure BDA0002066647610000631
第一步
(S)-叔丁酯2-氨基-3-(噻吩-2-基)丙酸
将原料(S)-2-氨基-3-(噻吩-2-基)丙酸16a(400mg，2.33mmol，采用公知的方法“European Journal of Organic Chemistry,2006,(5),1113-1116”制备而得)溶于10mL乙酸叔丁酯，反应体系在氩气氛下，冷却至0℃，滴加高氯酸(352mg(70％)，3.5mmol)，于室温搅拌反应16小时。反应结束后，加入水，加饱和碳酸氢钠溶液调节pH为8～9，用二氯甲烷萃取，合并有机相，依次用水洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得粗品标题产物(S)-叔丁酯2-氨基-3-(噻吩-2-基)丙酸16b(370mg，淡黄油状物)，产品不经纯化直接进行下一步反应。MS m/z(ESI):228.3[M+1]
采用实施例1的合成路线，将第四步原料替换为(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(叔丁氧羰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-异丁酸1e和(S)-叔丁酯2-氨基-3-(噻吩-2-基)丙酸16b，制得标题产物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(噻吩-2-基)丙酸16(18mg，白色粉末)。
MS m/z(ESI):527.6[M+1]
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ11.00(s,1H),8.44(s,1H),7.17-7.15(d,1H),6.94-6.88(d,2H),4.97-4.95(m,2H),4.10-4.08(m,1H),3.85-3.83(m,2H),3.71-3.69(m,2H),3.52-3.50(m,2H),3.37-3.34(m,12H),3.06-3.04(m,2H),2.80-2.78(m,2H),2.3-2.26(m,4H),1.64-1.59(m,3H),1.48-1.46(m,2H),1.31-1.259(m,12H),1.08-0.98(m,8H),0.89-0.82(m,4H).
实施例17
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(3-氟苯基)丙酸
Figure BDA0002066647610000641
第一步
(S)-叔丁酯2-氨基-3-(3-氟苯基)丙酸
将原料(S)-2-氨基-3-(3-氟苯基)丙酸17a(549mg，3mmol，采用公知的方法“Advanced Synthesis&Catalysis,2012,354(17),3327-3332”制备而得)溶于15mL乙酸叔丁酯，反应体系在氮气氛下，于0℃滴加高氯酸(450mg(70％)，4.5mmol)，滴完于室温反应12小时。反应完毕后加入30mL水，分液，有机相依次用20mL1N的盐酸洗涤，饱和碳酸氢钠溶液洗涤，合并水相。水相用饱和碳酸氢钠溶液调节pH为8～9，二氯甲烷(100mL×2)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得粗品标题产物(S)-叔丁酯2-氨基-3-(3-氟苯基)丙酸17b(600mg，油状物)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
采用实施例1的合成路线，将第四步原料替换为((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(叔丁氧羰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-异丁酸1e和(S)-叔丁酯2-氨基-3-(3-氟苯基)丙酸17b，制得标题产物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(3-氟苯基)丙酸17(25mg，白色粉末)。
MS m/z(ESI):762.8[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD):δ7.29-7.21(m,1H),7.08-6.87(m,3H),4.81-4.73(m,1H),4.72-4.67(m,1H),4.61-4.53(m,1H),4.29-4.22(m,1H),4.15-4.06(m,1H),3.99-3.93(m,1H),3.75-3.58(m,2H),3.43-3.12(m,9H),2.99-2.90(m,1H),2.69-2.60(m,4H),2.30-1.97(m,4H),1.87-1.77(m,1H),1.63-1.53(m,1H),1.49-1.36(m,1H),1.18-0.92(m,22H),0.91-0.82(m,4H),0.81-0.71(m,1H).
实施例18
Figure BDA0002066647610000651
第一步
将硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯18a(0.35mg，2.65μmol)，溶解于0.45mL乙腈溶液，备用；向帕妥珠单抗(Pertuzumab)pH＝4.5的乙酸/乙酸钠缓冲液(10.85mg/ml，4.5mL，0.488mmol)加入上述预制的硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯18a的乙腈溶液，然后滴加1.0mL的氰基硼氢化钠(7.06mg,112μmol)的水溶液，于25℃下振荡反应2小时。反应结束后用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS溶液)后得标题产物18b溶液，直接进行下一步反应。
第二步
向18b溶液(15.0mL)中加入0.45mL的2.0M盐酸羟胺溶液，于25℃下振荡反应30分钟后将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS溶液)后得标题产物帕妥珠单抗-丙硫醇18c溶液(浓度1.65mg/ml，22.6mL)。
第三步
将化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸4(1.09mg，1.16μmol)溶解于1.1mL乙腈中，加入帕妥珠单抗-丙硫醇溶液18c(1.65mg/mL，11.3mL)中，于25℃下振荡反应4小时后将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的含0.05M的PBS溶液)，在无菌条件下通过0.2μm滤器过滤后得标题产物18的PBS缓冲液(0.75mg/mL，19.5mL)，于4℃冷冻储存。
Q-TOF LC/MS:特征峰：148119.54(MAb+0D)、149331.45(MAb+1D)、150407.02(MAb+2D)、151297.79(MAb+3D)、152448.85(MAb+4D)、153782.23(MAb+5D)。
平均值：y＝2.0。
实施例19
Figure BDA0002066647610000661
将化合物(S)-3-(2-氯苯基)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)丙酸5(1.39mg，1.43μmol)溶解于1.1mL乙腈中，加入帕妥珠单抗-丙硫醇溶液18c(1.65mg/mL，11.3mL)中，于25℃下振荡反应4小时后将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS溶液)，在无菌条件下通过0.2μm滤器过滤后得标题产物19的PBS缓冲液(0.78mg/mL，20.0mL)，于4℃冷冻储存。
Q-TOF LC/MS:特征峰：148119.68(MAb+0D)、149308.79(MAb+1D)、150194.76(MAb+2D)、151354.52(MAb+3D)、152410.57(MAb+4D)、153375.31(MAb+5D)。
平均值：y＝1.9。
实施例20
Figure BDA0002066647610000671
将化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-5-甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸6(1.08mg，1.15μmol)溶解于1.25mL乙腈中，加入帕妥珠单抗-丙硫醇溶液18c(1.50mg/mL，12.5mL)中，于25℃下振荡反应4小时后将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS溶液)，在无菌条件下通过0.2μm滤器过滤后得标题产物20的PBS缓冲液(0.74mg/mL，19.0mL)，于4℃冷冻储存。
Q-TOF LC/MS:特征峰：Q-TOF LC/MS:148253.27(MAb+0D)、149263.59(MAb+1D)、150315.25(MAb+2D)、151334.45(MAb+3D)、152383.92(MAb+4D)、153446.37(MAb+5D)。
平均值：y＝2.2。
实施例21
Figure BDA0002066647610000672
Figure BDA0002066647610000681
将化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸8(3.0mg，3.0μmol)溶解于1.0mL乙腈中，加入帕妥珠单抗-丙硫醇溶液18c(2.11mg/mL，10.0mL)中，于25℃下振荡反应4小时后将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的.05M的PBS溶液)，在无菌条件下通过0.2μm滤器过滤后得标题产物21的PBS缓冲液(1.31mg/mL，12.5mL)，于4℃冷冻储存。
Q-TOF LC/MS:特征峰：148312.73(MAb+0D)、149515.61(MAb+1D)、150459.55(MAb+2D)、151521.47(MAb+3D)、152580.02(MAb+4D)。
平均值：y＝1.7。
实施例22
Figure BDA0002066647610000682
将化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-4-亚甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸10(1.50mg，1.60μmol)溶解于1.0ml乙腈中，加入帕妥珠单抗-丙硫醇溶液18c(2.11mg/mL，10.0mL)中，于25℃下振荡反应4小时后将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS溶液)，在无菌条件下通过0.2μm滤器过滤后得标题产物22的PBS缓冲液(1.28mg/mL，13.0mL)，于4℃冷冻储存。
Q-TOF LC/MS:特征峰：148411.82(MAb+0D)、149412.97(MAb+1D)、150468.08(MAb+2D)、151496.41(MAb+3D)、152580.37(MAb+4D)。
平均值：y＝2.1。
实施例23
Figure BDA0002066647610000691
将化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸12(0.86mg，0.89μmol)溶解于0.6mL乙腈中，加入帕妥珠单抗-丙硫醇溶液18c(2.06mg/mL，6.0mL)中，于25℃下振荡反应4小时后将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS溶液)，在无菌条件下通过0.2μm滤器过滤后得标题产物23的PBS缓冲液(0.70mg/mL，15mL)，于4℃冷冻储存。
Q-TOF LC/MS:特征峰：148092.94(MAb+0D)、149296.82(MAb+1D)、150339.86(MAb+2D)、151416.51(MAb+3D)、152516.25(MAb+4D)、153422.64(MAb+5D)。
平均值：y＝1.7。
实施例24
Figure BDA0002066647610000692
将化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸14(0.73mg，0.78μmol)溶解于0.6mL乙腈中，加入帕妥珠单抗-丙硫醇溶液18c(2.06mg/mL，6.0mL)中，于25℃下振荡反应4小时后将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS溶液)，在无菌条件下通过0.2μm滤器过滤后得标题产物24的PBS缓冲液(0.68mg/mL，15.5mL)，于4℃冷冻储存。
Q-TOF LC/MS:特征峰：148094.99(MAb+0D)、149277.83(MAb+1D)、150343.15(MAb+2D)、151359.29(MAb+3D)、152478.14(MAb+4D)、153449.92(MAb+5D)。
平均值：y＝1.6。
实施例25
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸
Figure BDA0002066647610000701
第一步
(S)-叔丁酯2-((1R,2R)-1-羟基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基噁唑-3-基)-3-羰基丙基)吡咯烷-1-羧酸
将原料(4R,5S)-4-甲基-5-苯基-3-丙酰基噁唑烷酮1b(4.6g，20.1mmol)溶于80mL二氯甲烷中，在氩气氛下，降温至0℃。反应液于0℃下滴加三乙胺(3.2mL，23.1mmol)，再滴加三氟甲磺酸二正丁基化硼(20mL，20.7mmol)，于0℃下搅拌50分钟，于-75℃滴加5mL预制的(S)-叔丁酯2-甲酰基吡咯烷-1-羧酸25a(4g，20.1mmol，采用公知的方法“Journal ofthe American Chemical Society,2011,133(42),16901-16910”制备而得)的二氯甲烷溶液，于-75℃下搅拌1小时，于0℃搅拌2小时，于室温搅拌1小时。反应液中加入60mL磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)和甲醇(V/V＝1:3)的混合液。于0℃加入60mL甲醇和双氧水(30％)(V/V＝2:1)的混合液，于室温搅拌1小时。反应结束后，减压浓缩除去有机相，加入15mL水。水相用乙醚(30mL×3)萃取，合并乙醚相，依次用5％碳酸氢钠溶液，水，饱和氯化钠溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化残留物，得标题产物(S)-叔丁酯2-((1R,2R)-1-羟基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基噁唑-3-基)-3-羰基丙基)吡咯烷-1-羧酸25b(2.26g，白色泡沫固体)，产率24.9％。MS m/z(ESI):333.3[M-100+1]
第二步
(S)-叔丁酯2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基噁唑-3-基)-3-羰基丙基)吡咯烷-1-羧酸
将原料(S)-叔丁酯2-((1R,2R)-1-羟基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基噁唑-3-基)-3-羰基丙基)吡咯烷-1-羧酸25b(2g，4.62mmol)溶于20mL二氯甲烷，加入2g磨成粉末的分子筛，在氩气氛下，于0℃加入1,8-双二甲氨基萘(2.57g，12mmol)，三甲基氧鎓四氟硼酸盐(1.71g，11.5mmol)，于室温搅拌17小时。反应结束后，过滤，滤饼用二氯甲烷洗涤，合并滤液，有机相用饱和氯化铵溶液(20mL×3)洗涤，再用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物(S)-叔丁酯2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基噁唑-3-基)-3-羰基丙基)吡咯烷-1-羧酸25c(1.3g，白色泡沫固体)，产率63％。
MS m/z(ESI):447.3[M+1]
第三步
(2R,3R)-3-((S)-1-(叔丁氧羰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸
将原料(S)-叔丁酯2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基噁唑-3-基)-3-羰基丙基)吡咯烷-1-羧酸25c(1.3g，2.9mmol)溶于80mL四氢呋喃，反应体系在氩气氛下，降温至0℃，缓慢滴加30％的双氧水(1.25g，11mmol)，再加入一水合氢氧化锂(207mg，4.95mmol)，于室温反应12小时。反应结束后，向反应液中加入亚硫酸钠固体(1.47g，11.6mmol)，于室温搅拌1小时，加入少量水，减压浓缩除去有机相，加入少量水溶解残留物，用二氯甲烷萃取(50mL×2)。水相滴加盐酸至pH为3，用二氯甲烷萃取(40mL×3)，有机相用水洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得粗品标题产物(2R,3R)-3-((S)-1-(叔丁氧羰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸25d(870mg，无色油状)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
第四步
(S)-叔丁酯2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-3-(2-氟苯基)-1-羰基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)吡咯烷-1-羧酸
将粗品(2R,3R)-3-((S)-1-(叔丁氧羰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸25d(100mg，0.368mmol)溶于6mL二氯甲烷与1.8mL二甲基甲酰胺中，加入反应物(S)-叔丁酯2-氨基-3-(2-氟苯基)丙酸7b(97mg，0.405mmol)，反应体系在氩气氛下。再加入N,N-二异丙基乙基胺(237.8mg，2.844mmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(168.2mg，0.442mmol)，于室温搅拌2小时。反应结束后，加10mL二氯甲烷，依次用水，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物(S)-叔丁酯2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-3-(2-氟苯基)-1-羰基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)吡咯烷-1-羧酸25e(157mg，无色油状)，收率83.9％。
MS m/z(ESI):509.3[M+1]
第五步
(S)-叔丁酯3-(2-氟苯基)-2-((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-吡咯烷-2-基)丙酰胺)丙酸
将原料(S)-叔丁酯2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-3-(2-氟苯基)-1-羰基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)吡咯烷-1-羧酸25e(157mg，0.308mmol)溶于2mL二氧六环中，加入4M的氯化氢二氧六环溶液(0.193mL，1.08mmol)后将反应体系密封。于室温搅拌1小时，置于4℃冰箱内12小时。反应结束后，将反应液减压浓缩，加入二氯甲烷溶解残留物，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，水相用二氯甲烷萃取，合并有机相，用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得到粗品标题产品(S)-叔丁酯3-(2-氟苯基)-2-((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-吡咯烷-2-基)丙酰胺)丙酸25f(100mg，淡黄色油状)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
MS m/z(ESI):407.2[M-1]
第六步
(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧-4,7,10-三氮杂十四烷基-14-酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸
将产品(S)-叔丁酯3-(2-氟苯基)-2-((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-吡咯烷-2-基)丙酰胺)丙酸25f(100mg，0.244mmol)，(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-14-羧酸1i(156.1mg，0.244mmol)溶于7.5mL二氯甲烷和二甲基甲酰胺(V/V＝4:1)混合溶剂中，加入N,N-二异丙基乙基胺(158mg，1.224mmol)，反应体系在氩气氛下，加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(121mg，0.318mmol)，于室温下搅拌1小时。反应结束后，加入二氯甲烷稀释，依次用水洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化残留物，得到标题产品(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基-14-酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸25g(242mg，淡黄色油状)，收率96.5％。MS m/z(ESI):1028.4[M+1]
第七步
(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸
将原料(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧-4,7,10-三氮杂十四烷基-14-酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸25g(242mg，0.235mmol)溶于3mL二氯甲烷中，加入3mL二乙胺，于室温下搅拌3小时。反应结束后，将反应液减压浓缩，得到粗品标题产品(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸25h(250mg，黄色油状)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
MS m/z(ESI):806.7[M+1]
第八步
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸
将粗品(S)-叔丁酯2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸25h(262mg，0.325mmol)置于反应瓶中，加入4M的氯化氢二氧六环溶液7mL，将反应体系密封，于室温下搅拌12小时。反应结束后，将反应液减压浓缩，用高效液相色谱法纯化所得残余物，得标题产品(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸25(50mg，白色固体)，收率28.4％。
MS m/z(ESI):750.7[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.35-7.30(m,1H),7.20-7.15(m,1H),7.09-6.09(m,2H),4.81-4.75(m,1H),4.70-4.64(m,1H),4.15-4.13(m,1H),4.05-4.03(m,1H),3.84-3.81(m,1H),3.69-3.64(m,1H),3.55-3.51(m,1H),3.48-3.13(m,13H),3.03-2.91(m,2H),2.66-2.53(m,3H),2.47-2.45(m,1H),2.40-2.33(m,2H),2.27-2.23(m,1H),2.17-2.11(m,2H),1.96-1.85(m,3H),1.63-1.40(m,4H),1.21-1.14(m,3H),1.09-0.94(m,12H),0.87-0.84(m,3H).
实施例26
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸
Figure BDA0002066647610000741
将原料(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸25(20mg，0.026mmol)溶于3mL二氯甲烷中，加入N,N-二异丙基乙基胺(13.7mg，0.106mmol)，降温至0℃，反应体系在氩气氛下，滴加预制的6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氯4b(9.1mg，0.040mmol)的二氯甲烷溶液，于室温反应2小时。反应结束后，加入甲醇淬灭，将反应液减压浓缩，残留物用高效液相色谱法纯化，得标题产物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸26(7mg，白色粉末)，收率28.5％。
MS m/z(ESI):941.6[M-1]
1HNMR(400MHz,CD3OD)δ7.32-7.21(m,2H),7.10-7.00(m,2H),6.80-6.78(m,2H),4.75-4.55(m,3H),4.12-4.06(m,2H),3.93-3.89(m,1H),3.87-3.78(m,2H),3.69-3.63(m,1H),3.52-3.47(m,3H),3.44-3.28(m,3H),3.21-3.10(m,4H),3.04-2.96(m,4H),2.53-2.40(m,4H),2.35-2.18(m,2H),2.13-2.00(m,2H),1.94-1.75(m,4H),1.68-1.56(m,5H),1.37-1.27(m,4H),1.20-1.13(m,3H),1.05-0.81(m,18H).
实施例27
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-3-(2-甲氧基苯基)丙酸
Figure BDA0002066647610000751
第一步
(S)-tert-butyl 2-amino-3-(2-methoxyphenyl)propanoate
(S)-叔丁酯2-氨基-3-(2-甲氧基苯基)丙酸
将原料(S)-2-氨基-3-(2-甲氧基苯基)丙酸27a(250mg，1.28mmol，采用公知的方法“Chemical Communications(Cambridge,United Kingdom),2013,49(70),7744-766”制备而得)溶于7mL乙酸叔丁酯，反应体系在氩气氛下，加入高氯酸(270mg(70％)，1.88mmol)，于室温下搅拌16小时。反应结束后，加入10mL二氯甲烷，滴加饱和碳酸氢钠溶液调节pH为8，分液，水相用二氯甲烷(10mL×3)萃取，合并有机相。有机相用饱和氯化钠溶液(10mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得标题产物(S)-叔丁酯2-氨基-3-(2-甲氧基苯基)丙酸27b(280mg，浅黄色油状物)，收率87％。
采用实施例25的合成路线，将第四步原料替换为(2R,3R)-3-((S)-1-(叔丁氧羰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸25d和(S)-叔丁酯2-氨基-3-(2-甲氧基苯基)丙酸27b，制得标题产物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-3-(2-甲氧基苯基)丙酸27(22mg，灰白色粉末)。
MS m/z(ESI):760.7[M-1]
实施例28
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-甲氧基苯基)丙酸
Figure BDA0002066647610000752
Figure BDA0002066647610000761
将原料(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-3-(2-甲氧基苯基)丙酸27(18mg，0.023mmol)溶于5mL二氯甲烷中，反应体系在氩气氛下，加入N,N-二异丙基乙基胺(12.19mg，0.29mmol)，于0℃滴加预制的6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氯4b(6.5mg，0.028mmol)的二氯甲烷溶液，于室温反应2小时。反应结束后，加入甲醇淬灭，将反应液减压浓缩，残留物用高效液相色谱法纯化，得标题产物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-甲氧基苯基)丙酸28(4mg，白色固体)，收率18.2％。
MS m/z(ESI):955.5[M+1]
实施例29
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(对甲苯基)丙酸
Figure BDA0002066647610000762
采用实施例25的合成路线，(2R,3R)-3-((S)-1-(叔丁氧羰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸25d和(S)-叔丁酯2-氨基-3-(对甲苯基)丙酸15b，制得标题产物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(对甲苯基)丙酸29(20mg，白色粉末)。
MS m/z(ESI):746.6[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD):δ7.17-7.05(m,4H),4.84-4.67(m,2H),4.27-4.15(m,1H),4.12-4.05(m,1H),3.89-3.82(m,1H),3.78-3.63(m,2H),3.57-3.47(m,1H),3.43-3.11(m,7H),2.92-2.79(m,1H),2.67(d,3H),2.52-2.44(m,1H),2.40-2.15(m,7H),2.12-2.01(m,1H),1.95-1.69(m,3H),1.67-1.49(m,2H),1.48-1.27(m,4H),1.23-1.12(m,5H),1.11-0.95(m,14H),0.94-0.84(m,3H).
实施例30
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(对甲苯基)丙酸
Figure BDA0002066647610000771
将原料(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(对甲苯基)丙酸29(12mg，0.016mmol)溶于1mL二氯甲烷中，反应体系在氩气氛下，加入N,N-二异丙基乙基胺(0.014mL，0.08mmol)，于0℃滴加预制的6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氯4b(5.54mg，0.024mmol)的二氯甲烷溶液，于室温反应4小时。反应结束后，加入甲醇淬灭，将反应液减压浓缩，残留物用高效液相色谱法纯化，得标题产物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(对甲苯基)丙酸30(4mg，白色固体)，收率26.5％。
MS m/z(ESI):939.4[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD):δ7.22-7.03(m,4H),6.85-6.78(m,2H),4.83-4.55(m,3H),4.27-3.97(m,3H),3.90-3.62(m,3H),3.59-2.95(m,14H),2.94-2.79(m,1H),2.54-2.35(m,3H),2.34-2.12(m,5H),2.08-1.99(m,1H),1.93-1.72(m,3H),1.71-1.51(m,5H),1.48-1.24(m,8H),1.23-1.12(m,3H),1.11-0.78(m,17H).
实施例31
(S)-3-(3-氯苯基)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)丙酸
Figure BDA0002066647610000781
第一步
(S)-tert-butyl 2-amino-3-(3-chlorophenyl)propanoate
(S)-叔丁酯2-氨基-3-(3-氯苯基)丙酸
将原料(S)-2-氨基-3-(3-氯苯基)丙酸31a(600mg，3mmol)溶于15mL乙酸叔丁酯，在氩气氛下，于0℃滴加高氯酸(450mg(70％)，4.5mmol)，滴完于室温反应12小时。反应完毕后加入10mL水，分液，有机相依次用20mL 1N的盐酸洗涤，饱和碳酸氢钠溶液洗涤，合并水相。水相滴加饱和碳酸氢钠溶液调节pH为8～9，二氯甲烷(100mL×2)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得粗品标题产物(S)-叔丁酯2-氨基-3-(3-氯苯基)丙酸31b(500mg，油状物)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
采用实施例25的合成路线，将第四步原料替换为(2R,3R)-3-((S)-1-(叔丁氧羰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸25d和(S)-叔丁酯2-氨基-3-(3-氯苯基)丙酸31b，制得标题产物(S)-3-(3-氯苯基)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)丙酸31(4mg，白色粉末)。
MS m/z(ESI):766.6[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD):δ7.31-7.12(m,4H),4.73-4.51(m,2H),4.22-4.05(m,1H),3.92-3.83(m,1H),3.76-3.65(m,1H),3.62-3.51(m,1H),3.50-3.12(m,9H),3.09-2.98(m,1H),2.59-2.39(m,4H),2.38-2.24(m,1H),2.23-2.17(m,1H),2.16-2.01(m,3H),2.00-1.85(m,2H),1.84-1.76(m,1H),1.73-1.57(m,2H),1.43-1.27(m,5H),1.25-1.14(m,3H),1.10-0.95(m,13H),0.94-0.83(m,5H).
实施例32
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(3-氟苯基)丙酸
Figure BDA0002066647610000791
采用实施例25的合成路线，将第四步原料替换为(2R,3R)-3-((S)-1-(叔丁氧羰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸25d和(S)-叔丁酯2-氨基-3-(3-氟苯基)丙酸17b，制得标题产物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(3-氟苯基)丙酸32(33.5mg，白色粉末)。
MS m/z(ESI):750.7[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.31-7.28(m,1H),7.08-6.95(m,3H),4.77-4.69(m,2H),4.09-3.94(m,3H),3.69-3.66(m,2H),3.48-3.44(m,2H),3.38-3.36(m,3H),3.34-3.28(m,6H),3.26-3.19(m,2H),3.13(m,1H),3.01-2.91(m,2H),2.67-2.65(m,2H),2.54-2.47(m,2H),2.34-2.28(m,2H),2.18-2.00(m,2H),1.98-1.77(m,2H),1.55-1.42(m,2H),1.08-0.98(m,18H),0.88-0.83(m,3H).
实施例33
(S)-3-(2,4-二氯苯基)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)丙酸
Figure BDA0002066647610000792
第一步
(S)-tert-butyl 2-amino-3-(2,4-dichlorophenyl)propanoate
(S)-叔丁酯2-氨基-3-(2,4-二氯苯基)丙酸
将原料(S)-2-氨基-3-(2,4-二氯苯基)丙酸33a(1.3g，5.57mmol，采用公知的方法“International Journal of Peptide&Protein Research,1987,30(1),13-21”制备而得)溶于10mL乙酸叔丁酯，反应体系在氩气氛下，于0℃滴加高氯酸(1.2g(70％)，8.36mmol)，滴完于室温反应12小时。反应结束后，加入二氯甲烷稀释，滴加饱和碳酸氢钠溶液至pH为8～9，分液，水相用二氯甲烷萃取，合并有机相，依次用水洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得粗品标题产物(S)-叔丁酯2-氨基-3-(2,4-二氯苯基)丙酸33b(3.4g，淡黄油状物)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
采用实施例25的合成路线，将第四步原料替换为(2R,3R)-3-((S)-1-(叔丁氧羰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸25d和(S)-叔丁酯2-氨基-3-(2,4-二氯苯基)丙酸33b，制得标题产物(S)-3-(2,4-二氯苯基)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)丙酸33(23mg，白色粉末)。
MS m/z(ESI):800.6[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.43-7.42(m,1H),7.26-7.23(m,2H),4.75-4.67(m,2H),4.14-4.04(m,2H),4.00-3.98(m,1H),3.91-3.89(m,1H),3.68-3.67(m,3H),3.39-3.26(m,12H),3.21-3.12(m,3H),2.67-2.64(m,3H),2.50-2.46(m,3H),2.31-2.28(m,2H),2.17-2.15(m,2H),2.02-2.00(m,4H),1.90-1.88(m,2H),1.74-1.72(m,2H),1.39-1.37(m,2H),1.06-0.98(m,12H).
实施例34
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(邻甲苯基)丙酸
Figure BDA0002066647610000801
第一步
(S)-tert-butyl 2-amino-3-(o-tolyl)propanoate
(S)-叔丁酯2-氨基-3-(邻甲苯基)丙酸
将原料(S)-2-氨基-3-(o-甲苯基)丙酸34a(100mg，0.55mmol，采用公知的方法“International Journal of Peptide&Protein Research,1987,30(1),13-21”制备而得)溶于2.5mL乙酸叔丁酯，在氩气氛下，滴加高氯酸(107mg(70％)，0.83mmol)，于室温反应16小时。反应结束后，加入5mL二氯甲烷稀释，滴加饱和碳酸氢钠溶液调节pH为8。分液，水相用二氯甲烷(5mL×3)萃取，合并有机相，依次用水洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得粗品标题产物(S)-叔丁酯2-氨基-3-(邻甲苯基)丙酸34b(140mg，无色油状物)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
采用实施例25的合成路线，将第四步原料替换为(2R,3R)-3-((S)-1-(叔丁氧羰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸25d和(S)-叔丁酯2-氨基-3-(邻甲苯基)丙酸34b，制得标题产物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(邻甲苯基)丙酸34(40mg，白色粉末)。
MS m/z(ESI):746.8[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.41-8.39(d,1H),8.19-8.17(d,1H),7.18-7.05(m,4H),4.80-4.78(d,1H),4.71-4.69(d,1H),3.86-3.84(m,1H),3.76-3.72(m,1H),3.69-3.63(m,2H),3.48-3.42(d,2H),3.38-3.23(m,5H),3.20-3.12(m,4H),2.98-2.87(m,2H),2.66-2.65(d,3H),2.53-2.50(d,1H),2.46-2.44(d,1H),2.41-2.26(m,4H),2.21-2.14(m,2H),2.10-2.04(m,1H),1.87-1.85(m,2H),1.77-1.74(m,1H),1.62-1.53(m,2H),1.33-1.28(m,3H),1.23-1.21(d,2H),1.16-1.14(d,2H),1.08-0.96(m,14H),0.90-0.84(m,3H).
实施例35
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰基)丁酰基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(噻吩-2-基)丙酸
Figure BDA0002066647610000811
采用实施例25的合成路线，将第四步原料替换为(2R,3R)-3-((S)-1-(叔丁氧羰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸25d和(S)-叔丁酯2-氨基-3-(噻吩-2-基)丙酸16b，制得标题产物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰基)丁酰基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(噻吩-2-基)丙酸35(2.6mg，白色粉末)。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.21-7.19(m,1H),6.91-6.90(m,2H),4.80-4.65(m,2H),4.16-4.08(m,2H),3.93-3.90(m,1H),3.70-3.66(m,2H),3.55-3.52(m,1H),3.48-3.45(m,2H),3.40-3.26(m,6H),3.25-3.13(m,4H),2.96-2.82(t,1H),2.69-2.65(d,3H),2.52-2.47(m,2H),2.39-2.29(m,1H),2.21-2.14(m,2H),1.92-(s,3H),1.63-1.61(m,2H),1.40-1.29(m,3H),1.23-1.14(m,3H),1.10-0.98(m,13H),0.88-0.85(t,3H).
实施例36
Figure BDA0002066647610000812
Figure BDA0002066647610000821
将化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸26(5.45mg，5.78μmol)溶解于1.2mL乙腈中，加入帕妥珠单抗-丙硫醇溶液18c(7.56mg/mL，12mL)中，于25℃下振荡反应4小时后将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS溶液)，在无菌条件下通过0.2μm滤器过滤后得标题产物36的PBS缓冲液(3.51mg/mL，27.5mL)，于4℃冷冻储存。
Q-TOF LC/MS:特征峰：148094.39(MAb+0D)、149111.06(MAb+1D)、150167.12(MAb+2D)、151188.93(MAb+3D)、152243.46(MAb+4D)、153272.96(MAb+5D)。
平均值：y＝1.9
实施例37
Figure BDA0002066647610000822
将化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-甲氧基苯基)丙酸28(1.75mg，1.83μmol)溶解于0.9mL乙腈中，加入帕妥珠单抗-丙硫醇溶液18c(2.31mg/mL，9.0mL)中，于25℃下振荡反应6小时后将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS溶液)，在无菌条件下通过0.2μm滤器过滤后得标题产物37的PBS缓冲液(1.35mg/mL，13.0mL)，于4℃冷冻储存。
Q-TOF LC/MS:特征峰：148093.25(MAb+0D)、149281.78(MAb+1D)、150474.33(MAb+2D)、151372.72(MAb+3D)、152373.24(MAb+4D)、153469.40(MAb+5D)。
平均值：y＝2.3。
实施例38
Figure BDA0002066647610000831
将化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(对甲苯基)丙酸30(1.07mg，1.14μmol)溶解于1.25mL乙腈中，加入帕妥珠单抗-丙硫醇溶液18c(1.5mg/mL，12.5mL)中，于25℃下振荡反应4.5小时后将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS溶液)，在无菌条件下通过0.2μm滤器过滤后得标题产物38的PBS缓冲液(0.74mg/mL，17.5mL)，于4℃冷冻储存。
Q-TOF LC/MS:特征峰：148247.08(MAb+0D)、149265.32(MAb+1D)、150276.10(MAb+2D)、151334.50(MAb+3D)、152392.21(MAb+4D)、153388.72(MAb+5D)。
平均值：y＝2.4。
实施例39
Figure BDA0002066647610000832
第一步
将硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯18a(2.44mg，18.5μmol)，溶解于3.0mL乙腈溶液，备用；向尼妥珠单抗pH＝4.3的乙酸/乙酸钠缓冲液(10.22mg/ml，30mL，0.204mmol)加入上述预制的硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯18a的乙腈溶液，然后滴加1.2mL的氰基硼氢化钠(49.86mg,793μmol)的水溶液，于25℃下振荡反应2小时。将反应液先用含10％乙腈的PBS缓冲液(250mL)通过30KDa超滤包进行纯化，再改用pH＝6.5的PBS缓冲液(200mL)通过30KDa超滤包进行纯化，除去未反应的硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯18a以及氰基硼氢化钠，得到标题产物39b的PBS缓冲溶液(约75mL)，直接进行下一步反应。
第二步
向39b的PBS缓冲溶液(75.0mL)中加入2.0mL的2.0M盐酸羟胺溶液，加毕，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应30分钟，停止反应。将反应液用pH＝6.5的PBS缓冲液通过30KDa超滤包进行纯化，得到标题产物尼妥珠单抗-丙硫醇39c的PBS缓冲溶液(浓度5.38mg/ml，55mL)。
第三步
将化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸4(4.48mg，4.78μmol)溶解于1.1mL乙腈中，加入尼妥珠单抗-丙硫醇PBS缓冲溶液39c(5.38mg/mL，11mL)中，置于水浴振荡器中，于25℃下振荡反应4小时后停止反应。
将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS溶液)，得到粗品标题产物39的PBS缓冲液(2.96mg/mL，20.5mL)，进一步离心浓缩至6mL左右，再用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS溶液)，得到标题产物39的PBS缓冲液(4.25mg/mL，11.8mL)，于4℃冷冻储存。
Q-TOF LC/MS:特征峰：150188.68(MAb+0D)、151234.76(MAb+1D)、152248.46(MAb+2D)、153419.10(MAb+3D)、154312.17(MAb+4D)、155358.48(MAb+5D)。
平均值：y＝2.2。
实施例40
Figure BDA0002066647610000841
Figure BDA0002066647610000851
将化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸8(4.32mg，4.52μmol)溶解于1.1mL乙腈中，加入尼妥珠单抗-丙硫醇PBS缓冲溶液39c(5.38mg/mL，11mL)中，置于水浴振荡器中，于25℃下振荡反应4小时后停止反应。
将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS溶液)，得到粗品标题产物40的PBS缓冲液(2.92mg/mL，20mL)，进一步离心浓缩至5.5mL左右，再用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS溶液)，得到标题产物40的PBS缓冲液(4.25mg/mL，11.6mL)，于4℃冷冻储存。
Q-TOF LC/MS:特征峰：150186.98(MAb+0D)、151374.09(MAb+1D)、152287.22(MAb+2D)、153353.26(MAb+3D)、154501.80(MAb+4D)、155575.57(MAb+5D)。
平均值：y＝2.2。
实施例41
Figure BDA0002066647610000852
将化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸26(4.45mg，4.72μmol)溶解于1.1mL乙腈中，加入尼妥珠单抗-丙硫醇PBS缓冲溶液39c(5.38mg/mL，11mL)中，置于水浴振荡器中，于25℃振荡反应4小时后停止反应。
将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的.05M的PBS溶液)，得到粗品标题产物41的PBS缓冲液(2.96mg/mL，20mL)，进一步离心浓缩至6mL左右，再用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS溶液)，得到标题产物41的PBS缓冲液(4.33mg/mL，11mL)，于4℃冷冻储存。
Q-TOF LC/MS:特征峰：150186.05(MAb+0D)、151362.44(MAb+1D)、152261.90(MAb+2D)、153438.29(MAb+3D)、154339.30(MAb+4D)、155511.23(MAb+5D)。
平均值：y＝2.3。
实施例42
Figure BDA0002066647610000861
将化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸12(0.56mg，0.58μmol)溶解于0.42mL乙腈中，加入尼妥珠单抗-丙硫醇溶液39c(2.06mg/mL，4.2mL)中，置于水浴振荡器中，于25℃振荡反应5小时后停止反应。
将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS溶液)，得到粗品标题产物42的PBS缓冲液(0.74mg/mL，10mL)，进一步离心浓缩，再用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS溶液)，得到标题产物42的PBS缓冲液(1.15mg/mL，6mL)，于4℃冷冻储存。
Q-TOF LC/MS:特征峰：150188.42(MAb+0D)、151387.82(MAb+1D)、152472.27(MAb+2D)、153528.33(MAb+3D)。
平均值：y＝1.0。
实施例43
Figure BDA0002066647610000862
Figure BDA0002066647610000871
将化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸14(0.60mg，0.63μmol)溶解于0.42mL乙腈中，加入尼妥珠单抗-丙硫醇溶液39c(2.06mg/mL，4.2mL)中，置于水浴振荡器中，于25℃下振荡反应5小时后停止反应。
将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS溶液)，得到粗品标题产物43的PBS缓冲液(0.78mg/mL，9.5mL)，进一步离心浓缩，再用SephadexG25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS溶液)，得到标题产物43的PBS缓冲液(1.16mg/mL，6mL)，于4℃冷冻储存。
Q-TOF LC/MS:特征峰：150188.39(MAb+0D)、151251.46(MAb+1D)、152442.90(MAb+2D)、153507.73(MAb+3D)。
平均值：y＝1.0。
实施例44
(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯基丙酸
Figure BDA0002066647610000872
Figure BDA0002066647610000881
第一步
(2S,4S)-叔丁酯2-((1R,2R)-3-((R)-4-苄基-2-羰基噁唑-3-基)-1-羟基-2-甲基-3-羰基丙基)-4-氟吡咯烷-1-羧酸
将原料(R)-4-苄基-3-丙酰基噁唑-2-酮44b(21g，90mmol，采用公知的方法“Tetrahedron Letters,1999,40(36),6545-6547”制备而得)溶于300mL二氯甲烷中，氮气氛下，降温至0℃。反应液于0℃下滴加四氯化钛(9.8mL，1.1mmol)，溶液由无色逐渐变为黄色，并且有黄色固体出现。再缓慢滴加N,N-二异丙基乙基胺(40mL，225mmol)，有白烟生成，溶液由黄色变为红棕色，于0℃下搅拌1小时，将反应液降温至-78℃，加入50mL(2S,4S)-叔丁酯4-氟-2-甲酰基吡咯烷-1-羧酸44a(21.27g，98mmol，采用公知的方法“Tetrahedron:Asymmetry,2014,25(3),212-218”制备而得)的二氯甲烷溶液，-78℃下搅拌1.5小时。TLC监测反应的完成情况。反应完毕后，加入200mL碳酸氢钠溶液(5％)，分液，水相用二氯甲烷萃取(300mL×2)，合并有机相，依次用水(200mL)、饱和氯化钠溶液(200mL)洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化所得残余物，得标题产物(2S,4S)-叔丁酯2-((1R,2R)-3-((R)-4-苄基-2-羰基噁唑-3-基)-1-羟基-2-甲基-3-羰基丙基)-4-氟吡咯烷-1-羧酸44c(19g，淡黄色固体)，收率43.2％。
MS m/z(ESI):351.06[M-100+1]
第二步
(2R,3R)-3-((2S,4S)-1-(叔丁氧羰基)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-羟基-2-甲基丙酸
将原料(2S,4S)-叔丁酯2-((1R,2R)-3-((R)-4-苄基-2-羰基噁唑-3-基)-1-羟基-2-甲基-3-羰基丙基)-4-氟吡咯烷-1-羧酸44c(19g，42mmol)溶于200mL四氢呋喃与50mL水中，氮气氛下，降温至0℃，缓慢滴加30％的双氧水(17.2mL，147mmol)，再加入80mL一水合氢氧化锂(2.86g，68mmol)溶液，反应体系于0℃反应5小时。向反应液中加入100mL亚硫酸钠(21.2g，168mmol)溶液，于25℃反应16小时。反应结束后，减压浓缩除去有机相，所得残留物用二氯甲烷洗涤(200mL×3)；水相用1N盐酸调节pH为3左右，用乙酸乙酯萃取(200mL×4)。合并有机相，减压浓缩，所得残留物用350mL碳酸氢钠溶液(5％)溶解，用二氯甲烷洗涤(200mL×2)，水相用2N盐酸调节pH为3左右，用乙酸乙酯萃取(200mL×5)，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得粗品标题产物(2R,3R)-3-((2S,4S)-1-(叔丁氧羰基)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-羟基-2-甲基丙酸44d(11.6g，淡黄色粘稠液体)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
MS m/z(ESI):191.47[M-100+1]
第三步
(2R,3R)-3-((2S,4S)-1-(叔丁氧羰基)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸
将原料(2R,3R)-3-((2S,4S)-1-(叔丁氧羰基)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-羟基-2-甲基丙酸44d(11.6g，39.8mmol)溶于200mL四氢呋喃中，氮气氛下，在0℃下加入碘甲烷(91g，640mmol)，分批加入氢化钠(7.32g(60％)，183mmol)，于0℃下反应48小时。反应结束后，加入500mL冰水淬灭反应，加入乙酸乙酯萃取(150mL)。水相用乙醚(150mL×2)洗涤，用2N盐酸调节pH为3，再用乙酸乙酯萃取(250mL×3)。合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物(2R,3R)-3-((2S,4S)-1-(叔丁氧羰基)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸44e(8.0g，淡黄色粘稠液体)，产率65.6％。
MS m/z(ESI):205.68[M-100+1]
第四步
(2S,4S)-叔丁酯4-氟-2-((1R,2R)-1-甲氧基-3-(((S)-1-甲氧基-1-羰基-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-2-甲基-3-羰基丙基)吡咯烷-1-羧酸
将原料(2R,3R)-3-((2S,4S)-1-(叔丁氧羰基)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸44e(580mg，1.9mmol)溶于15mL乙腈中，加入(S)-2-氨基-3-苯基丙酸甲酯盐酸盐44f(480mg，2.2mmol，采用公知的方法“Journal of Heterocyclic Chemistry,2013,50(2),320-325”制备而得)，再加入N,N-二异丙基乙基胺(1.42mL，8mmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(1.07g，2.8mmol)，反应体系于室温下反应12小时。TLC显示反应完全，停止反应，加入40mL乙酸乙酯稀释，依次用饱和氯化铵溶液(20mL)、饱和氯化钠溶液(20mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物(2S,4S)-叔丁酯4-氟-2-((1R,2R)-1-甲氧基-3-(((S)-1-甲氧基-1-羰基-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-2-甲基-3-羰基丙基)吡咯烷-1-羧酸44g(750mg，白色固体)，收率83.2％。
MS m/z(ESI):222.62[M-100+1]
第五步
(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯基丙酸甲酯三氟乙酸盐
将原料(2S,4S)-叔丁酯4-氟-2-((1R,2R)-1-甲氧基-3-(((S)-1-甲氧基-1-羰基-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-2-甲基-3-羰基丙基)吡咯烷-1-羧酸44g(738mg，1.58mmol)溶于15mL二氯甲烷中，逐滴加入三氟乙酸(3mL，30mmol)，于室温反应12小时。TLC检测反应完全后，将反应液减压浓缩得粗品标题产物(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯基丙酸甲酯三氟乙酸盐44h(1.24g，黄色粘稠液体)，产品不经纯化直接进行下一步反应。MS m/z(ESI):236.39[M+1]
第六步
(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-1-苯基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-14-酰基-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯基丙酸甲酯
将原料(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯基丙酸甲酯三氟乙酸盐44h(572mg，1.56mmol)，(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-1-苯基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-14-羧酸44i(868mg，1.56mmol，采用专利申请“WO2007008848”公开的方法制备而得)溶于15mL乙腈中，加入N,N-二异丙基乙基胺(2.0mL，12mmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(890mg，2.34mmol)，反应体系于室温下反应12小时。TLC显示反应完全，停止反应，加入50mL乙酸乙酯稀释，依次用饱和氯化铵溶液(30mL)、饱和氯化钠溶液(30mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B和A纯化所得残余物，得到标题产品(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-1-苯基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-14-酰基-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯基丙酸甲酯44j(1.4g，白色泡沫状固体)，收率99.9％。
MS m/z(ESI):898.99[M+1]
第七步
(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-1-苯基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-14-酰基)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯基丙酸
将原料(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-1-苯基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-14-酰基-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯基丙酸甲酯44j(180mg，0.2mmol)溶于0.5mL甲醇、0.5mL四氢呋喃与0.5mL水中，冷却至0℃，加入一水合氢氧化锂(34mg，0.8mmol)，于23℃下反应2小时。TLC及Ms显示反应完毕，加入2mL水稀释，用1N盐酸调节pH为4.5左右，用乙酸乙酯萃取(5mL×3)，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压浓缩得粗品标题产品(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-1-苯基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-14-酰基)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯基丙酸44k(160mg，淡黄色泡沫状固体)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
MS m/z(ESI):883.73[M-1]
第八步
(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯基丙酸
将粗品(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-1-苯基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-14-酰基)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯基丙酸44k(160mg，0.2mmol)溶于10mL无水乙醇中，加入30mg钯碳(10％)，将反应体系用氢气置换三次，于23℃反应15小时。TLC显示反应完全，通过硅藻土过滤除去钯碳，滤液减压浓缩得残留物120mg，用高效液相色谱法纯化所得残留物得标题产品(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯基丙酸44(29mg，白色固体)，收率21.5％。
MS m/z(ESI):749.94[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.29-7.14(m,5H),4.81-4.71(m,2H),4.18-4.13(m,2H),4.05-4.03(m,2H),3.84-3.81(m,1H),3.63-3.60(m,1H),3.58-3.52(m,1H),3.48-3.13(m,14H),3.00-2.91(m,1H),2.66-1.81(m,11H),1.63-1.38(m,2H),1.21-1.10(m,5H),1.09-0.94(m,14H),0.91-0.82(m,3H).
实施例45
(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯基丙酸
Figure BDA0002066647610000921
将原料(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯基丙酸44(1.0g，1.34mmol)溶于20mL乙腈中，加入N,N-二异丙基乙基胺(0.53mL，3.0mmol)，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(560mg，1.48mmol)，反应体系于23℃反应30分钟，加入6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸4a(300mg，1.41mmol)。待TLC显示反应完全后，停止反应，加入50mL乙酸乙酯，减压浓缩，用硅胶柱色谱法先后以洗脱剂体系B和A纯化所得残余物，得粗品标题产物1.0g，然后用高效液相色谱法纯化所得残留物，得标题产物(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯基丙酸45(140mg，白色固体)，收率11％。
MS m/z(ESI):942.67[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.34-7.14(m,5H),6.83-6.80(m,2H),5.20-5.10(m,1H),5.01-4.96(m,1H),4.78-4.57(m,2H),4.18-4.01(m,2H),4.00-3.80(m,1H),3.56-3.41(m,5H),3.35-3.24(m,10H),3.19-2.90(m,4H),2.60-2.40(m,4H),2.39-2.00(m,4H),1.93-1.58(m,6H),1.50-1.10(m,7H),1.09-0.82(m,21H).
实施例46
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(4-氟苯基)丙酸
Figure BDA0002066647610000922
Figure BDA0002066647610000931
第一步
(S)-叔丁酯2-((1R,2R)-3-(((S)-3-(4-氟苯基)-1-甲氧基-1-羰基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)吡咯烷-1-羧酸
将(2R,3R)-3-((S)-1-(叔丁氧羰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸25d(1.0g，3.5mmol)溶于15mL乙腈中，加入(S)-2-氨基-3-(4-氟苯基)丙酸甲酯盐酸盐46a(820mg，4mmol，采用公知的方法“Tetrahedron,2003,59(21),3719-3727”制备而得)，再加入N,N-二异丙基乙基胺(2.7mL，15mmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(1.9g，5.0mmol)，反应体系于23℃反应12小时。TLC显示反应完全，停止反应，加入50mL乙酸乙酯稀释，依次用饱和氯化铵溶液(30mL)、饱和氯化钠溶液(30mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物(S)-叔丁酯2-((1R,2R)-3-(((S)-3-(4-氟苯基)-1-甲氧基-1-羰基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)吡咯烷-1-羧酸46b(1.35g，白色固体)，收率82.6％。
MS m/z(ESI):366.46[M-100-1]
第二步
(S)-3-(4-氟苯基)-2-((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-吡咯烷-2-基)丙酰胺)丙酸甲酯三氟乙酸盐
将原料(S)-叔丁酯2-((1R,2R)-3-(((S)-3-(4-氟苯基)-1-甲氧基-1-羰基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)吡咯烷-1-羧酸46b(1.34g，2.87mmol)溶于20mL二氯甲烷中，逐滴加入三氟乙酸(3mL，30mmol)，于23℃反应12小时。TLC检测反应完全后，将反应液减压浓缩得粗品标题产物(S)-3-(4-氟苯基)-2-((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-吡咯烷-2-基)丙酰胺)丙酸甲酯三氟乙酸盐46c(1.92g，黄色粘稠液体)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
MS m/z(ESI):366.85[M+1]
第三步
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-1-苯基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基-14-酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(4-氟苯基)丙酸甲酯
将原料(S)-3-(4-氟苯基)-2-((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-吡咯烷-2-基)丙酰胺)丙酸甲酯三氟乙酸盐46c(367mg，1.0mmol)，(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-1-苯基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-14-羧酸44i(549mg，1.0mmol)溶于10mL乙腈中，加入N,N-二异丙基乙基胺(1.24mL，7mmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(570mg，1.5mmol)，反应体系于23℃下反应12小时。TLC显示反应完全，停止反应，加入30mL乙酸乙酯稀释，依次用饱和氯化铵溶液(20mL)、饱和氯化钠溶液(20mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法先后以洗脱剂体系B和A纯化所得残留物，得到标题产品(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-1-苯基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基-14-酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(4-氟苯基)丙酸甲酯46d(760mg，白色泡沫状固体)，收率84.6％。
MS m/z(ESI):898.10[M+1]
第四步
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-1-苯基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基-14-酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(4-氟苯基)丙酸
将原料(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-1-苯基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基-14-酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(4-氟苯基)丙酸甲酯46d(180mg，0.2mmol)溶于0.5mL甲醇、0.5mL四氢呋喃与0.5mL水中，冷却至0℃，加入一水合氢氧化锂(34mg，0.8mmol)，于23℃下反应2小时。TLC及Ms显示反应完毕，加入2mL水稀释，用1N盐酸调节pH为4.5左右，用乙酸乙酯萃取(5mL×3)，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压浓缩得粗品标题产品(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-1-苯基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基-14-酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(4-氟苯基)丙酸46e(160mg，白色固体)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
MS m/z(ESI):883.78[M-1]
第五步
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(4-氟苯基)丙酸
将粗品(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-1-苯基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基-14-酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(4-氟苯基)丙酸46e(160mg，0.2mmol)溶于10mL无水乙醇中，加入30mg钯碳(10％)，将反应体系用氢气置换三次，于室温反应15小时。TLC显示反应完全，通过硅藻土过滤除去钯碳，滤液减压浓缩得残留物130mg，用高效液相色谱法纯化所得残留物得标题产品(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(4-氟苯基)丙酸46(34mg，白色粉末)，收率25.2％。
MS m/z(ESI):749.94[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.31-7.24(m,2H),7.02-6.92(m,2H),4.48-4.58(m,2H),4.22-4.11(m,1H),3.85-3.40(m,4H),3.39-3.04(m,14H),3.00-2.90(m,1H),2.66-2.40(m,5H),2.39-2.02(m,4H),1.99-1.75(m,3H),1.73-1.24(m,3H),1.20-1.10(m,4H),1.09-0.95(m,16H),0.94-0.80(m,3H).
实施例47
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(4-氟苯基)丙酸
Figure BDA0002066647610000951
将6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸4a(434mg，2.06mmol)溶于20mL乙腈中，加入N,N-二异丙基乙基胺(844mL，6.55mmol)，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(781mg，1.87mmol)，反应体系于23℃反应30分钟，加入(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(4-氟苯基)丙酸46(1.4g，1.87mmol)。待TLC显示完全后，停止反应，加入50mL乙酸乙酯稀释，减压浓缩，用硅胶柱色谱法先后以洗脱剂体系B和A纯化所得残余物，得标题产物粗品1.2g，然后用高效液相色谱法纯化所得残留物，得标题产物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(4-氟苯基)丙酸47(670mg，白色固体)，收率37.9％。
MS m/z(ESI):944.54[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ12.80(br.s,1H),8.56-8.52(m,1H),8.42-8.20(m,1H),8.18-8.10(m,1H),7.30-7.18(m,2H),7.07-6.75(m,4H),4.64-4.34(m,3H),4.08-3.94(m,1H),3.80-3.50(m,2H),3.46-2.70(m,15H),2.50-1.80(m,6H),1.73-1.38(m,7H),1.30-1.10(m,12H),1.09-0.62(m,20H).
实施例48
Figure BDA0002066647610000961
将化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯基丙酸45(1.1mg，1.16μmol)溶解于1.1mL乙腈中，加入尼妥珠单抗-丙硫醇PBS缓冲液39c(1.63mg/mL，11.4mL)中，于25℃下振荡反应4小时后将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的含0.05M的PBS溶液)，在无菌条件下通过0.2μm滤器过滤后得标题产物48的PBS缓冲液(0.75mg/mL，19.8mL)，于4℃冷冻储存。
Q-TOF LC/MS:特征峰：150186.5(MAb+0D)、151364.1(MAb+1D)、152262.3(MAb+2D)、153435.7(MAb+3D)、154499.6(MAb+4D)、155427.5(MAb+5D)。
平均值：y＝2.0。
实施例49
Figure BDA0002066647610000971
将化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(4-氟苯基)丙酸47(1.1mg，1.16μmol)溶解于1.1mL乙腈中，加入尼妥珠单抗-丙硫醇PBS缓冲液39c(1.63mg/mL，11.4mL)中，于25℃下振荡反应4小时后将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的含0.05M的PBS溶液)，在无菌条件下通过0.2μm滤器过滤后得标题产物49的PBS缓冲液(0.75mg/mL，19.8mL)，于4℃冷冻储存。
Q-TOF LC/MS:特征峰：150185.5(MAb+0D)、151364.7(MAb+1D)、152261.2(MAb+2D)、153436.2(MAb+3D)、154499.9(MAb+4D)、155428.6(MAb+5D)。。
平均值：y＝2.0。
实施例50
Figure BDA0002066647610000972
将化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯基丙酸45(1.09mg，1.16μmol)溶解于1.1mL乙腈中，加入帕妥珠单抗-丙硫醇溶液18c(1.65mg/mL，11.3mL)中，于25℃下振荡反应4小时后将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的含0.05M的PBS溶液)，在无菌条件下通过0.2μm滤器过滤后得标题产物50的PBS缓冲液(0.75mg/mL，19.5mL)，于4℃冷冻储存。
Q-TOF LC/MS:特征峰：148095.6(MAb+0D)、149111.5(MAb+1D)、150165.3(MAb+2D)、151184.7(MAb+3D)、152255.2MAb+4D)、153297.5(MAb+5D)。
平均值：y＝2.0。
实施例51
Figure BDA0002066647610000981
将化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(4-氟苯基)丙酸47(1.09mg，1.16μmol)溶解于1.1mL乙腈中，加入帕妥珠单抗-丙硫醇溶液47c(1.65mg/mL，11.3mL)中，于25℃下振荡反应4小时后将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的含0.05M的PBS溶液)，在无菌条件下通过0.2μm滤器过滤后得标题产物51的PBS缓冲液(0.75mg/mL，19.5mL)，于4℃冷冻储存。
Q-TOF LC/MS:特征峰：148096.2(MAb+0D)、149112.2(MAb+1D)、150165.4(MAb+2D)、151184.8(MAb+3D)、152255.1(MAb+4D)、153297.6(MAb+5D)。
平均值：y＝2.0。
实施例52
Figure BDA0002066647610000982
Figure BDA0002066647610000991
第一步
将硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯18a(0.35mg，2.65μmol)，溶解于0.45mL乙腈溶液，备用；向曲妥珠单抗pH＝4.5的乙酸/乙酸钠缓冲液(10.0mg/ml，4.5mL，0.304μmol)加入上述预制的硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯18a的乙腈溶液，然后滴加1.0mL的氰基硼氢化钠(7.06mg,112μmol)溶液，于25℃下振荡反应2小时。反应结束后用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS溶液)后得标题产物52b溶液，直接进行下一步反应。
第二步
向52b溶液(约15.0mL)中加入0.45mL的2.0M盐酸羟胺溶液，于25℃下振荡反应30分钟后将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS溶液)后得标题产物曲妥珠单抗-丙硫醇52c溶液(浓度1.65mg/ml，22.6mL)。
第三步
将化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯基丙酸45(1.1mg，1.2μmol)溶解于1.1mL乙腈中，加入曲妥珠单抗-丙硫醇溶液52c(1.65mg/mL，11.3mL)中，于25℃下振荡反应4小时后将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的含0.05M的PBS溶液)，在无菌条件下通过0.2μm滤器过滤后得标题产物52的PBS缓冲液(0.72mg/mL，20mL)，于4℃冷冻储存。
Q-TOF LC/MS:特征峰：148062.9(MAb+0D)、149235.2(MAb+1D)、150259.8(MAb+2D)、151268.2(MAb+3D)、152341.9(MAb+4D)、153356.4(MAb+5D)。
平均值：y＝2.0。
实施例53
Figure BDA0002066647610001001
将化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(4-氟苯基)丙酸47(1.12mg，1.2μmol)溶解于1.1mL乙腈中，加入曲妥珠单抗-丙硫醇溶液52c(1.65mg/mL，11.3mL)中，于25℃下振荡反应4小时后将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的含0.05M的PBS溶液)，在无菌条件下通过0.2μm滤器过滤后得标题产物53的PBS缓冲液(0.70mg/mL，20.5mL)，于4℃冷冻储存。
Q-TOF LC/MS:特征峰：148065.2(MAb+0D)、149244.6(MAb+1D)、150254.9(MAb+2D)、151280.9(MAb+3D)、152301.6(MAb+4D)、153457.9(MAb+5D)。
平均值：y＝2.0。
生物学评价
测试例1：细胞毒素通式(D)化合物对肿瘤细胞体外增殖抑制测试
一、测试目的
本实验的目的是为了检测本发明通式(D)药物化合物，对HepG2肿瘤细胞(人肝癌细胞，中科院细胞库，货号#TCHu 72)和A549肿瘤细胞(人肺腺癌细胞中科院细胞库，货号#TCHu150)体外增殖的抑制活性。以不同浓度的化合物体外处理细胞，经76小时培养后，采用CCK-8(Cell Counting Kit-8，Dojindo，货号：CK04)试剂对细胞的增值进行检测，根据IC50值评价该化合物的体外活性。
二、实验方法
下面以对HepG2细胞体外增殖抑制测试方法为例，用于举例说明本发明中测试本发明化合物对肿瘤细胞进行体外增殖抑制活性测试的方法。本方法同样适用于，但不限于对其它肿瘤细胞进行体外增殖抑制活性测试。
1、细胞准备。取对数生长期的HepG2细胞，用PBS(磷酸缓冲液，ThermoFisher)洗涤1次之后，加入2-3ml胰蛋白酶(0.25％Trypsin-EDTA(1x)，Gibico,Life Technologies公司)消化2-3min，待细胞消化完全后，加入10-15ml细胞培养液(DMEM/F12培养基，Invitrogen；10％(v/v)灭活的胎牛血清)，将经过消化的HepG2细胞洗脱下来，1000rpm离心3min，弃上清，接着加入10-20ml细胞培养液将细胞重悬，制成单细胞悬液。
2、细胞铺板。将HepG2单细胞悬液混匀，用细胞培养液调整活细胞密度至6×104cells/ml，将密度调整过后的细胞悬液混匀，以100μl/孔加入96孔细胞培养板。将培养板置于37℃，5％CO2恒温培养箱内培养18-20小时。
3、化合物准备
用DMSO(二甲基亚砜，上海泰坦科技股份有限公司)溶解化合物，配制成初始浓度为10mM的存储液。
加入10μl 10mM的化合物样品至U型底96孔板(样品板1)第一列各孔。，在第一列各化合物样品孔内加入90μl DMSO，即对原液稀释10倍，作为起始浓度点，接下来进行3倍梯度稀释，每种化合物稀释10个浓度点。稀释液为DMSO溶液。第12列加入60μl 100％DMSO。第11列加入20μl 1mM的阳性药物参考品。
取一新的U型底96孔板(样品板2)，用完全培养基对样品板1内的各孔样品进行20倍稀释。接着再取一新的U型底96孔板(样品板3)，将样品板2内的各孔样品进行最终的10倍稀释。
4、加样操作。细胞预培养完成后，取出96孔细胞培养板，弃上清。以100μl/孔，将96孔样品板3中的各样品稀释液依次加入到96孔细胞培养板内。各化合物样品每种浓度点作2复孔检测。加样操作不应超过30min。完成加样操作后，将96孔细胞培养板置于37℃，5％CO2二氧化碳恒温培养箱中培养76小时左右。
5、显色操作。取出96孔细胞培养板，向各孔中以10μl/孔加入CCK-8显色液。轻轻拍板混匀10次以上，将细胞培养板置于37℃，5％CO2二氧化碳恒温培养箱继续孵育2.0小时。
6、读板操作。取出96孔细胞培养板，置于酶标仪(PerkinElmer，VICTOR 3)中，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
按照以上步骤，测试本发明药物化合物对A549肿瘤细胞体外增殖的抑制活性。细胞培养液同样为DMEM/F12培养基。
三、数据分析
用Microsoft Excel，Graphpad Prism 5对数据进行处理分析。实施例结果参见表1。
表1
Figure BDA0002066647610001011
Figure BDA0002066647610001021
测试例2：针对HER2靶标的本发明抗体药物偶联物对肿瘤细胞的体外增殖抑制测试
本实验的目的是为了检测本发明针对HER2靶标的抗体药物偶联物，对SK-BR-3肿瘤细胞(人乳腺癌细胞，ATCC，货号HTB-30)体外增殖的抑制活性。以不同浓度的化合物体外处理细胞，经76小时培养后，采用CCK-8(Cell Counting Kit-8，Dojindo，货号：CK04)试剂对细胞的增值进行检测，根据IC50值评价该化合物的体外活性。
按照测试例1的测试方法，测试细胞为SK-BR-3，细胞培养液为含10％FBS的McCoy's 5A培养基(Gibco，货号16600-108)。对相关化合物进行测试，得到结果见表2:
表2
Figure BDA0002066647610001022
Figure BDA0002066647610001031
结论：本发明针对HER2靶标的抗体药物偶联物对SK-BR-3细胞具有明显的增殖抑制活性。
测试例3：针对EGFR靶标的本发明抗体药物偶联物对肿瘤细胞的体外增殖抑制测试
本实验的目的是为了检测本发明针对EGFR靶标的抗体药物偶联物，对HCC827肿瘤细胞(非小细胞肺癌细胞，中科院细胞库，货号#TCHu153)体外增殖的抑制活性。以不同浓度的化合物体外处理细胞，经76小时培养后，采用CCK-8(Cell Counting Kit-8，Dojindo，货号：CK04)试剂对细胞的增值进行检测，根据IC50值评价该化合物的体外活性。
按照测试例1的测试方法，测试细胞为HCC827，细胞培养液为RPMI1640培养基(Invitrogen)，10％(v/v)灭活的胎牛血清。对相关化合物进行测试，得到结果见表3:
表3
Figure BDA0002066647610001032
结论：本发明针对EGFR靶标的抗体药物偶联物对HCC827细胞具有明显的增殖抑制活性。
测试例4：NCI-N87抑瘤率实验
一、试验目的
评价并比较本发明抗体细胞毒素偶联物对NCI-N87细胞(HER2过表达的人胃癌细胞，ATCC，CRL-5822)裸小鼠移植瘤的疗效。
二、受试药物
本发明样品：化合物18，化合物21，化合物36。
阳性对照：Pertuzumab帕妥珠单抗，Trastuzumab曲妥珠单抗。
配制方法：均用生理盐水配制。
三.试验动物
BALB/cA-nude裸小鼠，6-7周，雌性，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。合格证号：SCXK(沪)2012-0002。饲养环境：SPF级。
四、试验步骤
裸小鼠皮下接种人胃癌NCI-N87细胞，待肿瘤生长至100-200mm3后，将动物随机分组(D0)。给药剂量和给药方案见表4。每周测2-3次瘤体积，称鼠重，记录数据。肿瘤体积(V)计算公式为：
V＝1/2×a×b2
其中：a、b分别表示长、宽。
T/C(％)＝(T-T0)/(C-C0)×100％其中T、C为实验结束时的肿瘤体积；T0、C0为实验开始时的肿瘤体积。
表4.化合物(18、21、36)对人胃癌NCI-N87裸小鼠移植瘤的疗效
Figure BDA0002066647610001041
D0:第一次给药时间；Pertuzumab和Trastuzumab:首剂加倍；P值指与溶剂对照组相比；采用Student’s t检验。实验开始时小鼠数目：对照组n＝12，治疗组n＝6。
五、试验结果
本发明典型化合物显著抑制HER2高表达胃癌NCI-N87裸小鼠皮下移植瘤的生长，并且荷瘤小鼠对以上药物均能较好耐受。
测试例5：EGFRV3抗体及包含其的ADC对HCC827移植瘤裸小鼠疗效测试
一、试验目的
本实验以Nude-nude裸小鼠为受试动物，评价本发明ADC化合物39、40多剂量腹腔注射给药后，对人非小细胞肺癌HCC827移植瘤裸小鼠的疗效。
本次实验结果显示，发明ADC化合物39、40多剂腹腔注射给药一次后观察抑瘤效果，并给药后第38天时结束实验，ADC化合物39(0.05mg/mouse)的抑瘤率为62.78％，与空白组相比差异有统计学意义(p<0.05)；ADC化合物40(0.025mg/mouse)的抑瘤率为49.20％，与空白组相比差异不显著；ADC化合物40(0.05mg/mouse)的抑瘤率为86.8％，与空白组相比有显著差异(p<0.01)；ADC化合物40(0.1mg/mouse)的抑瘤率为93.41％；与空白组相比差异有统计学意义(p<0.05)
二、受试药物及材料
1、受试药物
本发明ADC化合物：ADC化合物39，ADC化合物40，
2、配制方法：均用PBS稀释配制。
3、试验动物
Nude-nude裸小鼠，SPF，16-20g，♀，购自上海西普尔·必凯实验动物有限责任公司。合格证号：SCXK(沪)2008－0016。
三、试验方法
裸小鼠实验室环境适应三天后，进行肿瘤细胞移植。在裸小鼠右肋部皮下接种HCC827细胞(4×106+50％matrigel/mouse)，接种后第21天，肿瘤长至209.41±25.93mm3(d1)开始给药。给药剂量及方法具体见表5。
每周测定2次移植瘤体积，称量裸小鼠体重并记录数据。
使用Excel统计软件：平均值以avg计算；SD值以STDEV计算；SEM值以STDEV/SQRT计算；组间差异P值以TTEST计算。
肿瘤体积(V)计算公式为：V＝1/2×L长×L短 2
相对体积(RTV)＝VT/V0
抑瘤率(％)＝(CRTV-TRTV)/CRTV(％)
其中V0、VT分别为实验开始时及实验结束时的肿瘤体积。CRTV、TRTV分别为实验结束时的空白对照组(Blank)及实验组的相对肿瘤体积。
表5.受试抗体对HCC827裸小鼠移植瘤的疗效
Figure BDA0002066647610001051
四、试验结果
本次实验结果显示抑瘤效果至第38天，ADC化合物39(0.05mg/mouse)的抑瘤率为62.78％，与空白组相比差异有统计学意义(p<0.05)；ADC化合物40(0.025mg/mouse)的抑瘤率为49.20％，与空白组相比差异无统计学意义(p＞0.05)；ADC化合物40(0.05mg/mouse)的抑瘤率为86.8％，ADC化合物40(0.1mg/mouse)的抑瘤率为93.41％，与空白组相比均有显著差异(p<0.01)；此外，ADC化合物40三个不同剂量组的抑瘤效果具剂量依赖关系。
序列表
<110> 江苏恒瑞医药股份有限公司、上海恒瑞医药有限公司
<120> 配体-细胞毒性药物偶联物、其制备方法及其应用
<130> 390129CG-750051
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗（Pertuzumab）轻链
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 2
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗（Pertuzumab）重链
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 3
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 尼妥珠单抗（Nimotuzumab）轻链
<400> 3
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Tyr
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 4
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 尼妥珠单抗（Nimotuzumab）重链
<400> 4
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Thr Ser Gly Gly Ser Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Thr Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Arg Gln Gly Leu Trp Phe Asp Ser Asp Gly Arg Gly Phe Asp Phe
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 5
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗（Trastuzumab）轻链
<400> 5
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 6
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗（Trastuzumab）重链
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450

Claims (30)

1.一种通式Dr所示的化合物：
Figure FDA0002066647600000011
或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐，其中：
R，R1-R7选自氢原子、卤素、羟基、氰基、烷基、烷氧基和环烷基；
R8-R11中至少一个选自卤素、烯基、烷基和环烷基，其余为氢原子；
或者R8-R11之中的任意两个形成环烷基，余下的两个基团任选自氢原子、烷基和环烷基；
R14选自芳基或杂芳基，所述的芳基或杂芳基任选进一步被选自氢原子、卤素、羟基、烷基、烷氧基和环烷基的取代基所取代；
R12-R13选自氢原子、烷基或卤素。
2.根据权利要求1所述的通式Dr所示的化合物，其为通式D所示的化合物：
Figure FDA0002066647600000012
或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐，其中：R1-R14如权利要求1中所定义。
3.根据权利要求1所述的通式Dr所示的化合物，其为通式D1所示的化合物：
Figure FDA0002066647600000013
或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐，其中：R1-R14如权利要求1中所定义。
4.根据权利要求1至3任一项所述的通式Dr所示的化合物，其选自：
Figure FDA0002066647600000021
5.如下所示的化合物，其选自：
Figure FDA0002066647600000022
6.一种通式PC-L-Dr所示的配体-细胞毒性药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物：
Figure FDA0002066647600000031
其中：
R，R2-R7选自氢原子、卤素、羟基、氰基、烷基、烷氧基和环烷基；
R8-R11中至少一个选自卤素、烯基、烷基和环烷基，其余为氢原子；
或者R8-R11之中的任意两个形成环烷基，余下的两个基团任选自氢原子、烷基和环烷基；
R12-R13选自氢原子、烷基或卤素；
R14选自芳基或杂芳基，所述的芳基或杂芳基任选进一步被选自氢原子、卤素、羟基、烷基、烷氧基和环烷基的取代基所取代；
y为1-8，优选2-5；
PC为配体；L为接头单元。
7.根据权利要求6所述的通式PC-L-Dr所示的配体-细胞毒性药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其为通式PC-L-D所示的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物：
Figure FDA0002066647600000032
其中，R2-R14定义如权利要求6中所述。
8.根据权利要求6所述的通式PC-L-Dr所示的配体-细胞毒性药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其为通式PC-L’-Dr所示的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物：
Figure FDA0002066647600000033
其中：
R15选自氢原子、卤素、羟基、氰基、烷基、烷氧基和环烷基；
R16选自烷基、环烷基、烷氧基和杂环基；
n为2-6，优选2-5；
m为0-5，优选1-3；
PC，y，R，R2-R14如权利要求6中所定义。
9.根据权利要求6所述的通式PC-L-Dr所示的配体-细胞毒性药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其为通式PC-L’-D所示的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物：
Figure FDA0002066647600000041
其中：
R15，R16，m如权利要求8中所定义；
PC，y，n，R2-R14如权利要求6中所定义。
10.根据权利要求9所述的通式PC-L’-D所示的配体-细胞毒性药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其为通式PC-L’-D1所示的化合物：
Figure FDA0002066647600000042
其中PC，y，n，m，R2-R16如权利要求9中所定义。
11.根据权利要求6至10任一项所述的通式PC-L-Dr所示的配体-细胞毒性药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述Dr选自权利要求4或5所示的化合物。
12.根据权利要求6至10任一项所述的通式PC-L-Dr所示的配体-细胞毒性药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其选自：
Figure FDA0002066647600000051
其中PC，y如权利要求6所定义。
13.如下所述的配体-细胞毒性药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其选自：
Figure FDA0002066647600000052
其中PC、y如权利要求6所述。
14.根据权利要求6至13中任一所述的通式PC-L-Dr所示的配体-细胞毒性药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中PC为抗体，优选自帕妥珠单抗(Pertuzumab)、尼妥珠单抗(Nimotuzumab)和曲妥珠单抗(Trastuzumab)。
15.根据权利要求6至14任一项所述的通式PC-L-Dr所示的配体-细胞毒性药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其选自：
Figure FDA0002066647600000061
其中y如权利要求6所述。
16.如下所述的配体-细胞毒性药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其选自：
Figure FDA0002066647600000062
Figure FDA0002066647600000071
其中y如权利要求6所述。
17.一种通式L1-Dr所示的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0002066647600000072
其中
n为2-6，优选2-5；
R，R2-R7选自氢原子、卤素、羟基、氰基、烷基、烷氧基和环烷基；
R8-R11中至少一个选自卤素、烯基、烷基和环烷基，其余为氢原子；
或者R8-R11之中的任意两个形成环烷基，余下的两个基团任选自氢原子、烷基和环烷基；
R12-R13选自氢原子、烷基或卤素；
R14选自芳基或杂芳基，所述的芳基或杂芳基任选进一步被选自氢原子、卤素、羟基、烷基、烷氧基和环烷基的取代基所取代。
18.根据权利要求17所述的通式L1-Dr所示的化合物或其药学上可接受的盐，其为通式L1-D所示的化合物：
Figure FDA0002066647600000073
其中n，R2-R14如权利要求17中所定义。
19.根据权利要求17或18所述的通式L1-D所示的化合物或其药学上可接受的盐，其选自：
Figure FDA0002066647600000081
20.制备如权利要求16所述的配体药物偶联物的中间体化合物，其选自：
Figure FDA0002066647600000082
21.一种通式PC-L2所示的化合物：
Figure FDA0002066647600000083
其中
PC配体，优选为抗体，更优选为帕妥珠单抗(Pertuzumab)、尼妥珠单抗(Nimotuzumab)或曲妥珠单抗(Trastuzumab)；
R15选自氢原子、卤素、羟基、氰基、烷基、烷氧基和环烷基；
R16选自烷基、环烷基和杂环基；
m为0-5，优选1-3；
X为0-5，优选1-3。
22.根据权利要求21所述的通式PC-L2所示的化合物，其选自：
Figure FDA0002066647600000091
23.一种制备如通式PC-L2所示的化合物的方法，其包括如下步骤：
Figure FDA0002066647600000092
1)向PC与通式PC-L2-A化合物中加入还原剂RA，进行反应，得到通式PC-L2-B化合物；RA优选为氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠；
2)向通式PC-L2-B化合物中加入脱保护剂脱去巯基保护基，得到通式PC-L2化合物；
T选自H、叔丁基、乙酰基、正丙酰基、异丙酰基、三苯基甲基、甲氧基甲基、2-(三甲硅烷基)乙氧甲基，优选为H或乙酰基；
其中PC，R15，R16，m，x如权利要求21中所定义。
24.一种制备根据权利要求9所述的通式PC-L’-D所示的化合物的方法，该方法包括：
Figure FDA0002066647600000101
通式PC-L2化合物与通式L1-D1化合物在反应，得到通式PC-L’-D化合物；
其中：PC，m，n，y，R2～R16如权利要求8中所定义。
25.一种通式D-Aa所示的化合物：
Figure FDA0002066647600000102
或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐，其中：
R8-R11之中的任意两个形成环烷基，余下的两个基团任选自氢原子、烷基和环烷基；
R12选自氢原子、烷基或卤素；
P为氢原子或保护基，所述的保护基优选Boc，Bn，Cbz，最优选Boc；
Ra选自羟基，氨基，烷氧基，环烷氧基或烷氨基。
26.根据权利要求25所述的通式D-Aa所示的化合物，其为通式D-A所示的化合物：
Figure FDA0002066647600000103
或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐，其中：
P，R8-R12，如权利要求25中所定义；
R’选自氢原子，烷基，环烷基。
27.根据权利要求26所述的通式D-A所示的化合物，为如下所示的化合物：
Figure FDA0002066647600000111
28.一种药物组合物，其含有治疗有效量的根据权利要求1-5中所述化合物、其可药用盐或其溶剂合物，或根据权利要求6-16任意一项所述的配体-细胞毒性药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
29.根据权利要求1-5中所述化合物、其可药用盐或其溶剂合物，或根据权利要求6-16任意一项所述的配体-细胞毒性药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，或根据权利要求28所述的药物组合物在制备治疗哺乳动物癌症的药物的用途，所述的癌症为与HER2，HER3，EGFR表达相关的癌症。
30.根据权利要求1-5中所述化合物、其可药用盐或其溶剂合物，或根据权利要求6-16任意一项所述的配体-细胞毒性药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，或根据权利要求28所述的药物组合物在制备治疗哺乳动物癌症的药物的用途，其中所述哺乳动物为人，所述癌症选自乳腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、结肠癌、肾癌、直肠癌、甲状腺癌、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、慢性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或复发性间变性大细胞淋巴瘤，优选乳腺癌症、霍奇金淋巴瘤或复发性间变性大细胞淋巴瘤；更优选为乳腺癌。
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