TWI735448B - 包含可酶解之基團的結合劑-活性物質共軛物（ａｄｃ）及結合劑-前藥共軛物（ａｐｄｃ） - Google Patents

包含可酶解之基團的結合劑-活性物質共軛物（ａｄｃ）及結合劑-前藥共軛物（ａｐｄｃ） Download PDF

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Abstract

本發明係有關於新型的結合劑-前藥共軛物(APDC)，其中使得結合劑與紡錘體驅動蛋白抑制劑之非活性前驅體化合物軛合，亦有關於抗體-活性物質共軛物ADC，以及製造此等APDC或ADC的方法。

Description

包含可酶解之基團的結合劑-活性物質共軛物(ADC)及結合劑-前藥共軛物(APDC)
本發明係有關於新型的結合劑-前藥共軛物(APDC)，其中使得結合劑與紡錘體驅動蛋白(Kinesin Spindel Protein)抑制劑之非活性前驅體化合物軛合，亦有關於結合劑-活性物質共軛物ADC，此等結合劑-前藥共軛物及結合劑-活性物質共軛物之活性代謝物，製備此等APDC或ADC的方法，此等共軛物在疾病治療及/或預防中的應用，以及此等共軛物在用於疾病(特別是高度增生及/或血管生成性疾病，例如癌症)治療及/或預防之藥物的製備中的應用。此類治療可作為單一療法，亦可與其他藥物或其他治療措施相結合。根據本發明，該結合劑較佳為抗體。
癌症係各種組織之不受控制的細胞生長的後果。在許多情形下，新細胞侵入現有組織(侵襲性生長)，或者轉移至遠距離器官。癌症發生於各種器官中，且常具有因組織而異的疾病進展。因此，作為上位概念的「癌症」描述了由各種器官、組織及細胞類型之特定疾病構成的較大群組。
視具體情況，早期腫瘤能夠藉由外科及放射治療措施移除。而對於經轉移之腫瘤，通常僅藉由化學療法進行舒減治療。在此情形下的目的在於，最大程度地兼顧生活品質的改善與壽命的延長。
包含一或多個活性物質分子之結合蛋白的共軛物已為吾人所 知，特別是所謂之「抗體藥物共軛物」(antibody drug conjugates)，ADC，其中針對腫瘤相關抗原的內化抗體係以共價方式透過連接單元「連接子」與具細胞毒作用的藥劑連接。在ADC滲入腫瘤細胞，且隨後共軛物裂解後，在腫瘤細胞內釋放此細胞毒性藥劑本身或另一由此形成之具細胞毒作用的代謝物，並可就地直接及選擇性地發揮其作用。藉此，與傳統的癌症化學療法相比，能夠將正常組織的損傷保持在大幅縮小的界限內[例如參閱J.M.Lambert,Curr.Opin.Pharmacol. 5,543-549(2005)；A.M.Wu與P.D.Senter,Nat.Biotechnol. 23,1137-1146(2005)；P.D.Senter,Curr.Opin.Chem.Biol. 13,235-244(2009)；L.Ducry與B.Stump,Bioconjugate Chem. 21,5-13(2010)]。例如，WO2012/171020描述過ADC，其中多個毒性基團分子透過一聚合物連接子連接至一抗體。作為可採用之毒性基團，WO2012/171020主要提及以下物質：SB 743921、SB 715992(Ispinesib)、MK-0371、AZD8477、AZ3146以及ARRY-520。
最後述及之物質係所謂之「紡錘體驅動蛋白抑制劑」。紡錘體驅動蛋白(KSP，亦稱作Eg5、HsEg5、KNSL1或KIF11)係類似驅動蛋白的馬達蛋白，其對雙極有絲分裂紡錘體的功能至關重要。KSP之抑制導致有絲分裂停止，並在較長之時間段內導致細胞凋亡(Tao等人，Cancer Cell 2005 Jul 8(1),39-59)。在第一個細胞穿透KSP抑制劑Monastrol被發現後，KSP抑制劑已被確立為一新的化學療法類別(Mayer等人，Science 286：971-974,1999)，並被作為一系列專利申請案之標的(例如WO2006/044825；WO2006/002236；WO2005/051922；WO2006/060737；WO03/060064；WO03/040979；以及WO03/049527)。但KSP僅在有絲分裂階段的較短時間段內具活性，故在此階段內必須存在具足夠高濃度的KSP抑制劑。WO2014/151030公開過包含特定KSP抑制劑的ADC。
豆蛋白酶係腫瘤相關的天冬醯胺內肽酶(S.Ishii,Methods Enzymol.1994,244,604；J.M.Chen等人J.Biol.Chem.1997,272,8090)，並被用於處理較小之細胞毒性分子的前藥，例如Doxorubicin及Etoposide衍生物(W.Wu等人Cancer Res.2006,66,970；L.Stern等人Bioconjugate Chem.2009,20,500；K.M.Bajjuri等人ChemMedChem 2011,6,54)。
其他溶酶體酶例如為組織蛋白酶或醣苷酶(例如ß-葡萄醣醛酸酶)，其亦被用於透過前藥之酶解釋放具活性的活性物質。可在活體內酶解之基團特別是為2-8-寡肽基團或醣苷。Bioconjugate Chem. 2002,13,855-869，以及Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 8(1998)3341-3346，以及Bioconjugate Chem. 1998, 9,618-626公開過肽裂解切點。其中例如包括纈胺酸-丙胺酸、纈胺酸-離胺酸、纈胺酸-瓜胺酸、丙胺酸-離胺酸以及苯丙胺酸-離胺酸(視情況包含附加的醯胺基)。
為進一步改善ADC及其代謝物之腫瘤選擇性，為結合劑共軛物配設若干肽衍生物，其可透過腫瘤相關的酶(如豆蛋白酶或組織蛋白酶)釋放。藉此，腫瘤選擇性不僅由抗體之選擇，亦由該肽衍生物之酶解，例如由腫瘤相關的豆蛋白酶決定。
根據本發明，該肽衍生物可存在於將該結合劑與該KSP抑制劑連接的連接子中。此為本發明之結合劑-活性物質共軛物(ADC)。
本發明所採用之紡錘體驅動蛋白抑制劑具有對作用至關重要的胺基。透過用肽衍生物修飾此胺基，將相對該紡錘體驅動蛋白的作用阻斷，進而亦抑制細胞毒作用的發揮。但此肽殘基可透過腫瘤相關的酶(如豆蛋白酶)釋放，故能夠在腫瘤組織中重新針對性地發揮作用。在此情形下，該胺基之修飾並非該連接子的一部分。因此，本發明係 關於包含紡錘體驅動蛋白抑制劑之非活性前驅體分子的結合劑共軛物，其在腫瘤中方透過腫瘤相關的溶酶體酶豆蛋白酶被處理成活性的代謝物，以在腫瘤中重新針對性地發揮其細胞毒活性。在本發明中，包含自由胺基被相應阻斷之KSP抑制劑的結合劑共軛物亦稱作APDC。APDC係特別有利。
因此，本發明提供根據以下式I的、結合劑或其衍生物與一或多個活性物質分子或者其一或多個前藥的共軛物：
Figure 105119613-A0202-12-0004-2411
其中BINDER表示結合劑或其衍生物(較佳表示抗體)，L表示連接子，n表示1至50、較佳2至20、尤佳2至8的數字，KSP表示紡錘體驅動蛋白抑制劑或其前藥，其中L-KSP具有以下式(IIa)：
Figure 105119613-A0202-12-0004-2412
其中X1表示N，X2表示N，且X3表示C；或者X1表示N，X2表示C，且X3表示N；或者X1表示CH或CF，X2表示C，且X3表示N；或者X1表示NH，X2表示C，且X3表示C；或者X1表示CH，X2表示N，且X3表示C；(其中X1較佳為CH，X2較佳為C，且X3較佳為N)；R1表示H、-L-#1、-MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、-NHY3、- OY3、-SY3、鹵素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1與Y2相互獨立地表示-H、-NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'(例如-(CH2)0-3Z')或-CH(CH2W)Z'，且Y3表示-H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示-H、-NH2、-SO3H、-COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH；其中W表示-H或-OH，其中Y4表示直鏈或支鏈的、視情況經-NHCONH2取代的C1-6烷基，或者視情況經-NH2取代的芳基或苄基；R2表示-L-#1、H、-MOD、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1與Y2相互獨立地表示-H、-NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示-H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示-H、-SO3H、-NH2或-COOH；其中Y4表示直鏈或支鏈的、視情況經-NHCONH2取代的C1-6烷基，或者視情況經-NH2取代的芳基或苄基，且Y5表示H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6表示直鏈或支鏈的C1-6烷基；R4表示-L-#1、-H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1與Y2相互獨立地表示-H、-NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示-H、-SO3H、-NH2或-COOH；其中Y4表示直鏈或支鏈的、視情況經-NHCONH2取代的C1-6烷基，或者視情況經-NH2取代的芳基或苄基，且Y5表示H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6表示直鏈或支鏈的C1-6烷基；或者，R4表示式為R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-或R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2COOH)-CO-之基團，或表示可透過組織蛋白酶裂解的式為R21-(CO)(0-1)-(P3)(1-2)-P2-的基團， 其中R21表示C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-雜烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-雜環烷基、雜芳基、雜芳基-烷基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-雜烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-雜環烷氧基基團，其可經-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、-NH-CO-烷基、-N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH單取代或多重取代，以及表示-H或-Ox-(CH2CH2O)y-R22基團，其中x表示0或1，v表示1至20的數字，且R22表示-H、烷基(較佳為C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2；P2為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸；P3為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸，或者為相應N-烷基-胺基酸中的一個，較佳為N-甲基-胺基酸(在存在多於一個P3的情況下，P3可具有不同含義)；或者，R2與R4共同(在形成吡咯啶環的情況下)表示-CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10為-H、-NH2、-SO3H、-COOH、-SH、鹵素(特別是F或Cl)、C1-4烷基、C1-4鹵烷基、C1-4烷氧基、羥基取代的C1-4烷基、COO(C1-4烷基)、-OH，且其中，吡咯啶環中之二級胺基的氫原子可被R21-CO-P3(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-SIG-替代，其中SIG表示一自我分解型基團，其在CO-SIG鍵結裂解後釋放二級胺；A表示-C(=O)-、-S(=O)-、-S(=O)2-、-S(=O)2NH-或-C(=N-NH2)-；R3表示-L-#1、-MOD或視情況經取代的烷基、環烷基、芳基、雜芳基、雜烷基、雜環烷基基團，較佳表示-L-#1或C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-雜烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-雜環 烷基基團，其可經以下取代：1-3個-OH基團、1-3個鹵素原子、1-3個鹵化烷基(分別具有1-3個鹵素原子)、1-3個O-烷基基團、1-3個-SH基團、1-3個-S-烷基基團、1-3個-O-C(=O)-烷基基團、1-3個-O-C(=O)-NH-烷基基團、1-3個-NH-C(=O)-烷基基團、1-3個-NH-C(=O)-NH-烷基基團、1-3個-S(=O)n-烷基基團、1-3個-S(=O)2-NH-烷基基團、1-3個-NH-烷基基團、1-3個-N(烷基)2基團、1-3個-NH2基團或1-3個-(CH2)0-3Z基團，其中Z表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，n表示0、1或2，Y1與Y2相互獨立地表示-H、-NH2或-(CH2)0-3Z'，以及Y3表示-H、-(CH2)0-3-CH(NHC(=O)CH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示-H、-SO3H、-NH2或-COOH，(其中「烷基」較佳表示C1-10-烷基)；R5表示-H、-NH2、-NO2、鹵素(特別是-F、-Cl、-Br)、-CN、-CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、-SH或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、-OY3、-SY3、鹵素、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1與Y2相互獨立地表示-H、-NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示-H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示-H、-SO3H、-NH2或-COOH；R6與R7相互獨立地表示-H、氰基、(視情況氟化的)C1-10-烷基、(視情況氟化的)C2-10-烯基、(視情況氟化的)C2-10-炔基、羥基、-NO2、-NH2、-COOH或鹵素(特別是-F、-Cl、-Br)，R8表示(視情況氟化的)C1-10-烷基，(視情況氟化的)C2-10-烯基、(視情況氟化的)C2-10-炔基、(視情況氟化的)C4-10-環烷基或-(CH2)0-2-(HZ2)，其中HZ2表示一4至7員雜環，其包含至多兩個選自N、O及S的雜原子，其中此等基團中的每個皆可經-OH、-CO2H、-NH2或-L-#1取代； R9表示-H、-F、-CH3、-CF3、-CH2F或-CHF2；其中取代基R1、R2、R3、R4及R8中的一個表示或(就R8而言)具有-L-#1，-L-表示連接子，且-#1表示與結合劑或其衍生物的鍵結，其中-MOD表示-(NR10)n-(G1)o-G2-G3，其中R10表示H、鹵素或C1-C3-烷基； G1表示-NHCO-、-CONH-或
Figure 105119613-A0202-12-0008-2413
(其中在G1表示-NHCO- 或
Figure 105119613-A0202-12-0008-2414
的情況下，R10並非NH2)；n為0或1；o為0或1；以及G2為包含1至10個碳原子之直鏈及/或支鏈烴基，其可單次或多重間雜有以下基團中的一或多個：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry表示H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其皆可經-NHC(=O)NH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-(CH=N-NH2)、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代)、-CO-、-CRx=N-O-(其中Rx表示H、C1-C3-烷基或苯基)，其中包括側鏈(若存在)之烴鏈可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，以及G3表示-H或-COOH；其中-MOD基團較佳具有至少一-COOH基團；其中滿足以下條件(i)至(iii)中的一個或多個：(i)-L-#1包括一式為-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2COX)-CO-之基團，其中X表示-NH2或-COOH，較佳表示-NH2；P2為選自Gly、Pro、 Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸；P3為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸；(ii)R4表示式為R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-之基團，或表示可透過組織蛋白酶裂解的式為R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-的基團，其中P2為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸；P3為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸，或者為相應N-烷基-胺基酸中的一個，較佳為N-甲基-胺基酸；(iii)R2與R4共同(在形成吡咯啶環的情況下)表示-CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中吡咯啶環中之二級胺基的二級氫原子被R21-CO-P3(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-SIG-替代，其中SIG表示一自我分解型基團，其在CO-SIG鍵結裂解後釋放二級胺；以及其鹽、溶劑合物、溶劑合物之鹽及差向異構體。
在本發明之ADC中，-L-#1係或包括式為-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2COX)-CO-之基團。尤佳採用式為-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-之基團，其被證實能夠在實驗部分所描述的豆蛋白酶檢定中裂解。該等取代基R1、R3或R4中的一個尤佳表示-L-#1。在R4表示-L-#1的情況下，天冬醯胺或天冬胺酸之羰基直接結合在氮原子上，其在上述式中結合在R4上。
在本發明之APDC中，R4係R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2COX)-CO-或可透過組織蛋白酶裂解的式為R21-(CO)(0-1)-(P3)(1-2)-P2-的基團，或者，吡咯啶環中之NH的氫原子係被R21-CO-P3(0-2)-P2-NH-CH(CH2COX)-CO-SIG-替代。
R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2COX)-CO-或R21-CO-P3-P2-NH-CH(CH2COX)-CO-SIG-基團在活體中或透過酶「豆蛋白酶」裂解。故下文亦將此等基團稱作「可透過豆蛋白酶裂解之基團」。該可透過豆蛋白酶裂解之基團具有式-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONX)-CO-。在本發明之APDC中，該基團較佳具有式R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2COX)-CO-#，意即，該可透過豆蛋白酶裂解之基團在一端具有R21基團，在另一端(-#)上根據式IIa中之位置R4與胺基結合。
在此，NH-CH(CH2COX)-CO-(即天冬醯胺或天冬胺酸)具有天然的L構型。尤佳採用被證實能夠在實驗部分所描述的豆蛋白酶檢定中裂解的基團。除可透過豆蛋白酶或組織蛋白酶裂解之基團R4以外，本發明之APDC可具有包含一可透過豆蛋白酶或組織蛋白酶裂解之基團的連接子-L-#1。
該可透過豆蛋白酶裂解之基團中的-NH-CH(CH2CONH2)-CO-係天冬醯胺，該可透過豆蛋白酶裂解之基團中的-NH-CH(CH2COOH)-CO-係天冬胺酸。在此，天冬醯胺及天冬胺酸呈現為L(-)-天冬醯胺或L-天冬胺酸。除天冬醯胺或天冬胺酸外，該可透過豆蛋白酶裂解之基團具有1至3個其他胺基酸(就天冬醯胺而言即-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-；-P3-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO；-(P3)(2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-)，即二肽、三肽、四肽或其衍生物(二肽：-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-；三肽：-P3-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO；四肽：-(P3)2-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-，其中該二胺基酸P3可不同)。
P2為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸，較佳選自Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Pro、Ser、Thr、瓜胺酸以及Asn。P2通常具有天然的L構型。尤佳採用L-Ala。
P3為選自Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸的胺基酸，或者為相應N-烷基-胺基酸中的一個，較佳為N-甲基-胺基酸。P3較佳選自His、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Gly、Ser、Phe、瓜胺酸以及Gln。P3通常具有天然的L構型。尤佳採用L-Ala。在存在多於一個胺基酸P3的情況下，此等胺基酸可在上述定義之範圍內有所區別。
該可透過豆蛋白酶裂解之基團尤佳為-L-Ala-L-Ala-L-Asn-(就APDC而言即R21-L-Ala-L-Ala-L-Asn-#)。
R21較佳表示-H、C1-5-烷基、C5-10-芳烷基、C1-5-烷氧基、C6-10-芳氧基、C5-10-雜烷基、C5-10-雜環烷基、雜芳基、雜芳基-烷基、C5-10-雜烷氧基或C5-10-雜環烷氧基基團，其皆可經-COOH、COO烷基、COONH2、NH2或N(烷基)2取代，或者表示-Ox-(CH2CH2O)y-R22基團(其中x表示0或1，v表示1至20的數字，且R22表示-H、烷基、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)，「烷基」在此表示包含至多20個碳原子之烷基；較佳為C1-12-烷基。
該可透過組織蛋白酶裂解之基團具有式-(CO)(0-1)-(P3)(1-2)-P2-。在本發明之APDC中，該基團具有式R21-(CO)(0-1)-(P3)(1-2)-P2-#，意即，該可透過組織蛋白酶裂解之基團在一端具有R21基團，在另一端(-#)上根據式IIa中之位置R4與胺基結合。在此，R21、P2及P3之含義與在可透過豆蛋白酶裂解之基團中的含義相同。式R21-(CO)(0-1)-(P3)(1-2)-P2--#之基團是否可透過組織蛋白酶裂解係根據實驗部分所描述之組 織蛋白酶檢定確定。在尤佳的可透過組織蛋白酶裂解之基團中，P2選自丙胺酸、離胺酸以及瓜胺酸，且P3選自纈胺酸以及苯丙胺酸，其式特別是為R21-(CO)(0-1)-P3-P2-。
圖1為不同物種之TWEAKR富半胱胺酸域(胺基酸34至68)的比對。(數字揭示包括訊息序列之全長結構中的胺基酸位置；SEQ ID NO：169)；圖2中A為TWEAKR之結構的示意圖表(SEQ ID NO：169)。此圖表揭示包含富半胱胺酸域(36-67)之胞外域(胺基酸28-80)(SEQ ID NO：168)、跨膜域-TM(81-101)以及胞內域(102-129)。TPP-2202-完整的胞外域(28-80)，融合至hIgG1之Fc域。TPP-2203-含N端及C端縮短之胞外域(34-68)，融合至hIgG1之Fc域。二硫橋鍵Cys36-Cys49、Cys52-Cys67以及Cys55-Cys64係透過黑條顯示。與純粹之富半胱胺酸域相比，TPP-2203在N端多含兩個胺基酸且在C端多含一個胺基酸，以實現適宜之摺疊。TPP-1984-含C端縮短之胞外域(28-68)，融合至一HIS6標籤。就所有三個結構而言，皆相似地結合至本發明之抗體及PDL-192(TPP-1104)。P4A8(TPP-1324)僅結合至全長胞外域(TPP-2202)；B為胞外域之胺基酸序列：已為吾人所知的是，胺基酸64對TWEAK配體結合至關重要；且正如在此所確定的，胺基酸47對本發明之抗體的結合至關重要；圖3為非糖基化抗體之經轉麩醯胺酸酶催化的共軛位點特異的官能化的示意圖；圖4示出連續的用於透過組蛋白脫乙醯基酶及組織蛋白酶L釋放活性物質的酶步驟(根據Nat.Commun.,2013,4,2735)。
本發明提供結合劑或其衍生物與一或多個活性物質分子或其前 藥的共軛物，其中該活性物質分子係紡錘體驅動蛋白抑制劑(KSP抑制劑)。
下文對本發明可採用之結合劑、本發明可採用之KSP抑制劑或其前藥，以及本發明可採用之連接子進行描述，其可不受限制地組合使用。特別是可將較佳或尤佳之結合劑與較佳或尤佳之KSP抑制劑或前藥，視情況與較佳或尤佳之連接子組合使用。
KSP抑制劑及其結合劑共軛物
根據本發明，式I中之KSP-L具有以下式(IIa)：
Figure 105119613-A0202-12-0013-2415
其中X1表示N，X2表示N，且X3表示C；或者X1表示N，X2表示C，且X3表示N；或者X1表示CH或CF，X2表示C，且X3表示N；或者X1表示NH，X2表示C，且X3表示C；或者X1表示CH，X2表示N，且X3表示C；(其中X1較佳為CH，X2較佳為C，且X3較佳為N)；R1表示-H、-L-#1、-MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、-NHY3、-OY3、-SY3、鹵素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1與Y2相互獨立地表示-H、-NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'(例如-(CH2)0-3Z')或-CH(CH2W)Z'，且Y3表示-H或-(CH2)0-3Z'，其中 Z'表示-H、-NH2、-SO3H、-COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W表示-H或-OH，其中Y4表示直鏈或支鏈的、視情況經-NHCONH2取代的C1-6烷基，或者視情況經-NH2取代的芳基或苄基；R2表示-L-#1、-H、-MOD、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1與Y2相互獨立地表示-H、-NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示-H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示-H、-SO3H、-NH2或-COOH；其中Y4表示直鏈或支鏈的、視情況經-NHCONH2取代的C1-6烷基，或者視情況經-NH2取代的芳基或苄基，且Y5表示H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6表示直鏈或支鏈的C1-6烷基；R4表示-L-#1、H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1與Y2相互獨立地表示-H、-NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示-H、-SO3H、-NH2或-COOH；其中Y4表示直鏈或支鏈的、視情況經-NHCONH2取代的C1-6烷基，或者視情況經-NH2取代的芳基或苄基，且Y5表示H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6表示直鏈或支鏈的C1-6烷基；或者，R4表示式為R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-或R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2COOH)-CO-之基團，或表示可透過組織蛋白酶裂解的式為R21-(CO)(0-1)-(P3)(1-2)-P2-的基團，其中R21表示C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-雜烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-雜環烷基、雜芳基、雜芳基-烷基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-雜烷氧基、 C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-雜環烷氧基基團，其可經-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、-NH-CO-烷基、-N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH單取代或多重取代，以及表示-H或-Ox-(CH2CH2O)y-R22基團，其中x表示0或1，v表示1至20的數字，且R22表示-H、烷基(較佳為C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2；P2為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸；P3為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸，或者為相應N-烷基-胺基酸中的一個，較佳為N-甲基-胺基酸；或者，R2與R4共同(在形成吡咯啶環的情況下)表示-CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10為H、NH2、SO3H、COOH、SH、鹵素(特別是F或Cl)、C1-4烷基、C1-4鹵烷基、C1-4烷氧基、羥基取代的C1-4烷基、COO(C1-4烷基)、OH或R21-CO-P3-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-SIG-，其中SIG表示一自我分解型基團，其在CO-SIG鍵結裂解後釋放二級胺；A表示-C(=O)-、-S(=O)-、-S(=O)2-、-S(=O)2NH-或-C(=N-NH2)-；R3表示-L-#1、-MOD或視情況經取代的烷基、環烷基、芳基、雜芳基、雜烷基、雜環烷基基團，較佳表示-L-#1或C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-雜烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-雜環烷基基團，其可經以下取代：1-3個-OH基團、1-3個鹵素原子、1-3個鹵化烷基(分別具有1-3個鹵素原子)、1-3個O-烷基基團、1-3個-SH基團、1-3 個-S-烷基基團、1-3個-O-CO-烷基基團、1-3個-O-CO-NH-烷基基團、1-3個-NH-CO-烷基基團、1-3個-NH-CO-NH-烷基基團、1-3個-S(O)n-烷基基團、1-3個-SO2-NH-烷基基團、1-3個-NH-烷基基團、1-3個-N(烷基)2基團、1-3個-NH2基團或1-3個-(CH2)0-3Z基團，其中Z表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，n表示0、1或2，Y1與Y2相互獨立地表示H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、SO3H、NH2或COOH，(其中「烷基」較佳表示C1-10-烷基)；R5表示-H、-NH2、-NO2、鹵素(特別是F、Cl、Br)、-CN、-CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、-SH或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、-OY3、-SY3、鹵素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1與Y2相互獨立地表示-H、-NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示-H、-SO3H、-NH2或-COOH；R6與R7相互獨立地表示-H、氰基、(視情況氟化的)C1-10-烷基、(視情況氟化的)C2-10-烯基、(視情況氟化的)C2-10-炔基、羥基、-NO2、-NH2、-COOH或鹵素(特別是-F、-Cl、-Br)，R8表示(視情況氟化的)C1-10-烷基，(視情況氟化的)C2-10-烯基、(視情況氟化的)C2-10-炔基、(視情況氟化的)C4-10-環烷基或-(CH2)0-2-(HZ2)，其中HZ2表示一4至7員雜環，其包含至多兩個選自N、O及S的雜原子，其中此等基團中的每個皆可經-OH、-CO2H、-NH2或-L-#1取代；R9表示-H、-F、-CH3、-CF3、-CH2F或-CHF2；其中取代基R1、R2、R3、R4及R8中的一個表示或(就R8而言)具有-L-#1，-L表示連接子，且-#1表示與該結合劑或其衍生物的鍵結， 其中-MOD表示-(NR10)n-(G1)o-G2-G3，其中R10表示-H或C1-C3-烷基； G1表示-NHCO-、-CONH-或
Figure 105119613-A0202-12-0017-2417
(其中在G1表示-NHCO- 或
Figure 105119613-A0202-12-0017-2416
的情況下，R10並非-NH2)；n為0或1；o為0或1；以及G2為包含1至10個碳原子之直鏈及/或支鏈烴基，其可單次或多重間雜有以下基團中的一或多個：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、-CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry表示H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其皆可經NHC(=O)NH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代)、-C(=O)-、-CRx=N-O-(其中Rx表示H、C1-C3-烷基或苯基)，其中包括側鏈(若存在)之烴鏈可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-C(=NNH2)、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，G3表示-H或-COOH；其中-MOD基團較佳具有至少一-COOH基團；其中滿足以下條件(i)至(iii)中的一個或多個：(i)-L-#1包括式為-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2COX)-CO-之基團，其中X表示-NH2或-COOH，較佳表示-NH2；P2為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸；P3為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺 酸以及His的胺基酸；(ii)R4表示式為R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-之基團，或表示可透過組織蛋白酶裂解的式為R21-(CO)(0-1)-(P3)(1-2)-P2-的基團，其中P2為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸；P3為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸；(iii)R2與R4共同(在形成吡咯啶環的情況下)表示-CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中吡咯啶環中之二級胺基的二級氫原子被R21-CO-P3-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-SIG-替代，其中SIG表示一自我分解型基團，其在CO-SIG鍵結裂解後釋放二級胺；以及其鹽、溶劑合物、溶劑合物之鹽及差向異構體。
定義
術語「經取代」表示，述及之原子或述及之基團上的一或多個氫被指定基團中的一個替代，要求在於，在當前情況下不超出述及之原子的正常原子價。允許取代基及/或可變基團的組合。
術語「視情況經取代」表示，取代基之數目可等於或不等於零。在未另作說明的情況下，視情況取代之基團可被一定數目之兼性取代基取代，此數目係透過將氫原子置換成非氫取代基而位於任意可用之碳原子或氮原子或硫原子上之兼性取代基的數目。兼性取代基(若存在)之數目通常可為1、2、3、4或5，特別是為1、2或3。
因此，如本文所用，例如在本發明之通式化合物的取代基定義中，表述「單或多重」表示「1、2、3、4或5，較佳1、2、3或4，尤 佳1、2或3，最佳1或2」。
若本發明之化合物中的殘基係經取代，在未另作說明的情況下，該等殘基可經單取代或多重取代。在本發明之保護範圍內，多次出現之所有殘基的含義係相互獨立。較佳透過一個、兩個或三個相同或不同的取代基進行取代。尤佳透過一個取代基進行取代。
烷基
烷基表示直鏈或支鏈的、包含1至10個碳原子(C1-C10-烷基)的飽和的單價烴殘基，通常包含1至6個碳原子(C1-C6-烷基)，較佳1至4個碳原子(C1-C4-烷基)，尤佳1至3個碳原子(C1-C3-烷基)。
例如且較佳為：甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、異丙基、異丁基、第二丁基、第三丁基、異戊基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、1,2-二甲基丙基、新戊基、1,1-二甲基丙基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、2-乙基丁基、1-乙基丁基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基，以及1,2-二甲基丁基。
尤佳為甲基、乙基、丙基、異丙基以及第三丁基殘基。
雜烷基
雜烷基表示直鏈及/或支鏈的、包含1至10個碳原子的烴鏈，其可單次或多重間雜有-O-、-S-、-C(=O)-、-S(=O)-、-S(=O)2-、-NRy-、-NRyC(=O)-、-C(=O)-NRy-、-NRyNRy-、-S(=O)2-NRyNRy-、-C(=O)-NRyNRy-、-CRx=N-O-基團中的一或多個，且其中，包括側鏈(若存在)之烴鏈可經-NH-C(=O)-NH2、-C(=O)-OH、-OH、-NH2、-NH-C(=NNH2)-、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代。
在此，Ry表示-H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其又可經-NH-C(=O)-NH2、-C(=O)-OH、-OH、-NH2、-NH- C(=NNH2)-、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代。在此，Rx表示-H、C1-C3-烷基或苯基。
烯基
烯基表示直鏈或支鏈的單價烴鏈，其包含一或兩個雙鍵以及2、3、4、5、6、7、8、9或10個碳原子(C2-C10-烯基)，特別是2或3個碳原子(C2-C3-烯基)，其中，在烯基含有多於一個雙鍵的情況下，此等雙鍵可彼此孤立或共軛。烯基例如為乙烯基、丙-2-烯-1-基(或「烯丙基」)、丙-1-烯-1-基、丁-3-烯基、丁-2-烯基、丁-1-烯基、戊-4-烯基、戊-3-烯基、戊-2-烯基、戊-1-烯基、己-5-烯基、己-4-烯基、己-3-烯基、己-2-烯基、己-1-烯基、丙-1-烯-2-基(或「異丙烯基」)、2-甲基丙-2-烯基、1-甲基丙-2-烯基、2-甲基丙-1-烯基、1-甲基丙-1-烯基、3-甲基丁-3-烯基、2-甲基丁-3-烯基、1-甲基丁-3-烯基、3-甲基丁-2-烯基、2-甲基丁-2-烯基、1-甲基丁-2-烯基、3-甲基丁-1-烯基、2-甲基丁-1-烯基、1-甲基丁-1-烯基、1-,1-二甲基丙-2-烯基、1-乙基丙-1-烯基、1-丙基乙烯基、1-異丙基乙烯基、4-甲基戊-4-烯基、3-甲基戊-4-烯基、2-甲基戊-4-烯基、1-甲基戊-4-烯基、4-甲基戊-3-烯基、3-甲基戊-3-烯基、2-甲基戊-3-烯基、1-甲基戊-3-烯基、4-甲基戊-2-烯基、3-甲基戊-2-烯基、2-甲基戊-2-烯基、1-甲基戊-2-烯基、4-甲基戊-1-烯基、3-甲基戊-1-烯基、2-甲基戊-1-烯基、1-甲基戊-1-烯基、3-乙基丁-3-烯基、2-乙基丁-3-烯基、1-乙基丁-3-烯基、3-乙基丁-2-烯基、2-乙基丁-2-烯基、1-乙基丁-2-烯基、3-乙基丁-1-烯基、2-乙基丁-1-烯基、1-乙基丁-1-烯基、2-丙基丙-2-烯基、1-丙基丙-2-烯基、2-異丙基丙-2-烯基、1-異丙基丙-2-烯基、2-丙基丙-1-烯基、1-丙基丙-1-烯基、2-異丙基丙-1-烯基、1-異丙基丙-1-烯基、3,3-二甲基丙-1-烯基、1-(1,1-二甲基乙基)乙烯基、丁-1,3-二烯基、戊-1,4-二烯基，或者己-1-5-二烯基。此基團特別是指乙烯基或烯丙基。
炔基
炔基表示直鏈或支鏈的單價烴鏈，其包含一個三鍵以及2、3、4、5、6、7、8、9或10個碳原子(C2-C10-炔基)，特別是2或3個碳原子(C2-C3-炔基)。C2-C6-炔基例如為乙炔基、丙-1-炔基、丙-2-炔基(或炔丙基)、丁-1-炔基、丁-2-炔基、丁-3-炔基、戊-1-炔基、戊-2-炔基、戊-3-炔基、戊-4-炔基、己-1-炔基、己-2-炔基、己-3-炔基、己-4-炔基、己-5-炔基、1-甲基丙-2-炔基、2-甲基丁-3-炔基、1-甲基丁-3-炔基、1-甲基丁-2-炔基、3-甲基丁-1-炔基、1-乙基丙-2-炔基、3-甲基戊-4-炔基、2-甲基戊-4-炔基、1-甲基戊-4-炔基、2-甲基戊-3-炔基、1-甲基戊-3-炔基、4-甲基戊-2-炔基、1-甲基戊-2-炔基、4-甲基戊-1-炔基、3-甲基戊-1-炔基、2-乙基丁-3-炔基、1-乙基丁-3-炔基、1-乙基丁-2-炔基、1-丙基丙-2-炔基、1-異丙基丙-2-炔基、2,2-二甲基丁-3-炔基、1,1-二甲基丁-3-炔基、1,1-二甲基丁-2-炔基，或者3,3-二甲基丁-1-炔基。炔基特別是指乙炔基、丙-1-炔基或丙-2-炔基。
環烷基
環烷基表示飽和的、包含3-12個碳原子(C3-C12-環烷基)的、單環或雙環的單價烴殘基。
在此，單環烴殘基表示含有通常3至10個碳原子(C3-C10-環烷基)，較佳3至8個碳原子(C3-C8-環烷基)，尤佳3至7個碳原子(C3-C7-環烷基)的單價烴殘基。單環烴殘基例如且較佳為：環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基及環辛基。尤佳為環丙基、環丁基、環戊基、環己基以及環庚基。
在此，雙環烴殘基表示含有通常3至12個碳原子的烴殘基(C3-C12-環烷基)，其中需將其理解為兩個飽和環系統之融合，該二環系統共享兩個直接相鄰之原子。雙環烴殘基例如且較佳為：雙環[2.2.0]己基、雙環[3.3.0]辛基、雙環[4.4.0]癸基、雙環[5.4.0]十一基、雙環 [3.2.0]庚基、雙環[4.2.0]辛基、雙環[5.2.0]壬基、雙環[6.2.0]癸基、雙環[4.3.0]壬基、雙環[5.3.0]癸基、雙環[6.3.0]十一基，以及雙環[5.4.0]十一基。
雜環烷基
雜環烷基表示含有一、二、三或四個雜原子的非芳族單環或雙環環系統，此等雜原子可相同或不同。雜原子可為氮原子、氧原子或硫原子。
本發明中之單環環系統可具有3至8個，較佳4至6個，尤佳5至6個環原子。
包含3個環原子之雜環烷基例如且較佳為：吖丙啶基。
包含4個環原子之雜環烷基例如且較佳為：吖丁啶基、氧雜環丁烷基。
包含5個環原子之雜環烷基例如且較佳為：吡咯啶基、咪唑啶基、吡唑啶基、吡咯啉基、二氧戊環基以及四氫呋喃基。
包含6個環原子之雜環烷基例如且較佳為：哌啶基、哌嗪基、嗎啉基、二氧雜環己烷基、四氫哌喃基以及硫代嗎啉基。
包含7個環原子之雜環烷基例如且較佳為：氮雜環庚烷基、氧雜環庚烷基、1,3-二氮雜環庚烷基、1,4-二氮雜環庚烷基。
包含8個環原子之雜環烷基例如且較佳為：氧雜環辛基、氮雜環辛基。
單環雜環烷基較佳為包含至多兩個選自O、N及S之雜原子的、4至7員的飽和雜環殘基。尤佳為嗎啉基、哌啶基、吡咯啶基以及四氫呋喃基。
根據本發明，包含一、二、三或四個(可相同或不同)雜原子之雙環環系統可具有6至12個，較佳6至10個環原子，其中一、二、三或四個碳原子可置換成選自O、N、S的相同或不同的雜原子。
例如：氮雜雙環[3.3.0]辛基、氮雜雙環[4.3.0]壬基、二氮雜雙環[4.3.0]壬基、氧雜雙環[4.3.0]壬基、三氮雜雙環[4.3.0]壬基或者氮雜雙環[4.4.0]癸基，以及根據定義自其他可能之組合派生出的殘基。
尤佳為全氫環戊并[c]吡咯基、全氫呋[3,2-c]吡啶基、全氫吡咯并[1,2-a]吡嗪基、全氫吡咯并[3,4-c]吡咯基以及3,4-亞甲基二氧基苯基。
芳基
芳基表示單價的、單環或雙環的、由碳原子構成之芳族環系統。實例為萘基及苯基；較佳為苯基或苯殘基。
C 6 -C 10 -芳烷基
在本發明中，C6-10-芳烷基表示單環的芳族芳基，例如結合有C1-C4烷基的苯基。
示例性的C6-10芳烷基基團為苄基。
雜芳基
雜芳基表示一單環、雙環或三環的單價芳族環系統，其包含5、6、8、9、10、11、12、13或14個環原子(「5至14員雜芳基」基團)，特別是5、6、9或10個環原子，其中雜芳基包含至少一環雜原子，且視情況包含一、二或三個其他選自N、O以及S的環雜原子，且其透過一環碳原子或視情況(在原子價允許的情況下)透過一環氮原子結合。
雜芳基可為5員雜芳基，例如噻吩基、呋喃基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、異噁唑基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基或四唑基；或者為6員雜芳基，例如吡啶基、噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基或三嗪基；或者為三環雜芳基，例如咔唑基、吖啶基或啡嗪基；或者為9員雜芳基，例如苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并異噁唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并三唑基、吲唑基、吲哚基、異吲哚基、吲哚嗪基或嘌呤基；或者為10員雜芳基，例 如喹啉基、喹唑啉基、異喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹喏啉基或喋啶基。
一般而言，在未另作說明的情況下，雜芳基殘基包含所有可能之異構體形式，例如互變異構體，以及就分子之殘基的結合位點而言的位置異構體。因此，作為並非全部列舉的說明用示例，術語「吡啶基」包含吡啶-2-基，吡啶-3-基以及吡啶-4-基；或者，術語「噻吩基」包括噻吩-2-基以及噻吩-3-基。
C 5 -C 10 -雜芳基
在本發明中，C5-10雜芳基表示包含一、二、三或四個(可相同或不同)雜原子之單環或雙環的芳族環系統。雜原子可為：N、O、S、S(=O)及/或S(=O)2。鍵價可位於任意芳族碳原子上或氮原子上。
本發明中之單環的雜芳基殘基具有5或6個環原子。較佳為包含一或兩個雜原子的雜芳基殘基。在此尤佳為一或兩個氮原子。
包含5個環原子之雜芳基殘基例如包括以下環：噻吩基、噻唑基、呋喃基、吡咯基、噁唑基、咪唑基、吡唑基、異噁唑基、異噻唑基、噁二唑基、三唑基、四唑基以及噻二唑基。
包含6個環原子之雜芳基殘基例如包括以下環：吡啶基、噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基以及三嗪基。
本發明中之雙環的雜芳基殘基具有9或10個環原子。
包含9個環原子之雜芳基殘基例如包括以下環：酞基、硫代酞基、吲哚基、異吲哚基、吲唑基、苯并噻唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、吖辛因基、吲哚嗪基、嘌呤基、吲哚啉基。
包含10個環原子之雜芳基殘基例如包括以下環：異喹啉基、喹啉基、喹嗪基、喹唑啉基、喹喏啉基、噌啉基、酞嗪基、1,7-及1,8-萘啶基、喋啶基、色滿基。
雜烷氧基
雜烷氧基表示包含1至10個碳原子之直鏈及/或支鏈烴鏈，其透過-O-與分子之殘基結合，並可單次或多重間雜有以下基團中的一或多個：-O-、-S-、-C(=O)-、-S(=O)-、-S(=O)2-、-NRy-、-NRyC(=O)-、-C(=O)-NRy-、-NRyNRy-、-S(=O)2-NRyNRy-、-C(=O)-NRyNRy-、-CRx=N-O-，且其中，包括側鏈(若存在)之烴鏈可經-NH-C(=O)-NH2、-C(=O)-OH、-OH、-NH2、-NH-C(=NNH2)-、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代。
在此，Ry表示-H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其又可經-NH-C(=O)-NH2、-C(=O)-OH、-OH、-NH2、-NH-C(=NNH2)-、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代。在此，Rx表示-H、C1-C3-烷基或苯基。
在本發明中，鹵素或鹵素原子表示氟(-F)、氯(-Cl)、溴(-Br)或碘(-I)。
氟-烷基、氟-烯基以及氟-炔基表示，烷基、烯基以及炔基可被氟單取代或多重取代。
紡錘體驅動蛋白抑制劑前藥較佳具有以下式(III)：
Figure 105119613-A0202-12-0025-2418
其中X1表示N，X2表示N，且X3表示C；或者 X1表示N，X2表示C，且X3表示N；或者X1表示CH或CF，X2表示C，且X3表示N；或者X1表示NH，X2表示C，且X3表示C；或者X1表示CH，X2表示N，且X3表示C；(其中X1較佳為CH，X2較佳為C，且X3較佳為N)；R1表示-H、-MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、-NHY3、-OY3、-SY3、鹵素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1與Y2相互獨立地表示-H、-NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'(例如-(CH2)0-3Z')或-CH(CH2W)Z'，且Y3表示-H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示-H、-NH2、-SO3H、-COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W表示-H或-OH，其中Y4表示直鏈或支鏈的、視情況經-NHCONH2取代的C1-6烷基，或者視情況經-NH2取代的芳基或苄基；R2表示-H、-MOD、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1與Y2相互獨立地表示-H、-NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示-H、-SO3H、-NH2或-COOH；其中Y4表示直鏈或支鏈的、視情況經-NHC(=O)NH2取代的C1-6烷基，或者視情況經-NH2取代的芳基或苄基，且Y5表示H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6表示直鏈或支鏈的C1-6烷基；R4表示式為R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-或R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2COOH)-CO-之基團，或表示可透過組織蛋白酶裂解的式為R21-(CO)(0-1)-(P3)(1-2)-P2-的基團，其中R21表示C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-雜烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-雜環烷基、雜芳基、雜芳基-烷 基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-雜烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-雜環烷氧基基團，其可經-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、-NH-CO-烷基、-N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH單取代或多重取代，以及表示-H或-Ox-(CH2CH2O)y-R22基團，其中x表示0或1，v表示1至20的數字，且R22表示-H、烷基(較佳為C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2；P2為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸；P3為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸，或者為相應N-烷基-胺基酸中的一個，較佳為N-甲基-胺基酸；A表示-C(=O)-、-S(=O)-、-S(=O)2-、-S(=O)2NH-或-C(=NNH2)-；R3表示-MOD或視情況經取代的烷基、環烷基、芳基、雜芳基、雜烷基、雜環烷基基團，表示C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-雜烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-雜環烷基基團，其可經以下取代：1-3個-OH基團、1-3個鹵素原子、1-3個鹵化烷基(分別具有1-3個鹵素原子)、1-3個O-烷基基團、1-3個-SH基團、1-3個-S-烷基基團、1-3個-O-CO-烷基基團、1-3個-O-CO-NH-烷基基團、1-3個-NH-CO-烷基基團、1-3個-NH-CO-NH-烷基基團、1-3個-S(O)n-烷基基團、1-3個-SO2-NH-烷基基團、1-3個-NH-烷基基團、1-3個-N(烷基)2基團、1-3個-NH2基團或1-3個-(CH2)0-3Z基團，其中Z表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，n表示0、1或2，Y1與Y2相互獨立地表示H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示H、- (CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示-H、-SO3H、-NH2或-COOH，(其中「烷基」較佳表示C1-10-烷基)；R5表示-H、-NH2、-NO2、鹵素(特別是F、Cl、Br)、-CN、-CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、-SH或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、-OY3、-SY3、鹵素、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1與Y2相互獨立地表示-H、-NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示-H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示-H、-SO3H、-NH2或-COOH；R6與R7相互獨立地表示-H、氰基、(視情況氟化的)C1-10-烷基、(視情況氟化的)C2-10-烯基、(視情況氟化的)C2-10-炔基、羥基、-NO2、-NH2、-COOH或鹵素(特別是-F、-Cl、-Br)，R8表示(視情況氟化的)C1-10-烷基，(視情況氟化的)C2-10-烯基、(視情況氟化的)C2-10-炔基、(視情況氟化的)C4-10-環烷基或-(CH2)0-2-(HZ2)，其中HZ2表示一4至7員雜環，其包含至多兩個選自N、O及S的雜原子，其中此等基團中的每個皆可經-OH、-CO2H或-NH2取代；R9表示-H、-F、-CH3、-CF3、-CH2F或-CHF2；其中-MOD表示-(NR10)n-(G1)o-G2-G3，其中R10表示-H或C1-C3-烷基； G1表示-NHC(=O)-、-C(=O)NH-或
Figure 105119613-A0202-12-0028-2419
(其中在G1表示- NHCO-或
Figure 105119613-A0202-12-0028-2420
的情況下，R10並非NH2)；n為0或1；o為0或1；以及G2為包含1至10個碳原子之直鏈及/或支鏈烴基，其可單次或多重間雜有以下基團中的一或多個：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、- NRyCO-、-CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry表示H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其皆可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代)、-C(=O)-、-CRx=N-O-(其中Rx表示H、C1-C3-烷基或苯基)，其中包括側鏈(若存在)之烴鏈可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，以及G3表示H或COOH；其中-MOD基團較佳具有至少一-COOH基團；以及其鹽、溶劑合物、溶劑合物之鹽。
透過將R1、R2、R3、R4、R5或R8上的，或者將透過R2及R4形成之吡咯啶環(R10)上的H原子取代，便能以為該領域之一般執業者所知的方式，將式(III)化合物與一連接子連接。藉此獲得式(IIa)共軛物，其中取代基R1、R2、R3、R4、R5、R8或R10中的一個表示-L-#1，L表示連接子，且#1表示與結合劑或其衍生物的鍵結。在式為(IIa)之KSP抑制劑(或KSP-L)與一結合劑共軛的情況下，取代基R1、R2、R3、R4、R5、R8或R10中的一個表示-L-#1，其中L表示連接子，且#1表示與該結合劑或其衍生物的鍵結。意即，就共軛物而言，取代基R1、R2、R3、R4、R5、R8及R10中的一個表示-L-#1，其中-L-#1與結合劑(例如抗體)連接。尤佳地，取代基R1、R3或R4中的一個表示-L-#1。該結合劑較佳為人類的、人類化的或嵌合的單株抗體或者其抗原結合片段，特別是為抗TWEAKR抗體或其抗原結合片段，或者抗EGFR抗體或其抗原結合片段，或者抗HER2抗體。尤佳為抗TWEAKR抗體，其特異地與TWEAKR(SEQ ID NO：169)之位置47中之胺基酸D(D47)結合，特別是為抗TWEAKR抗體TPP-2090及TPP-2658，或者抗EGFR抗體西妥昔單抗(Cetuximab)或尼妥珠單抗(Nimotuzumab)，或者HER-2抗體曲妥珠單抗(Trastuzumab)。
作為-L-#1之替代，在式IIa中，化合物中亦可存在-L-#3基團，其中L表示連接子，且#3表示用於與結合劑或其衍生物結合的反應性基團。包含-L-#3之化合物係反應性化合物，其與結合劑或其衍生物進行反應。較佳地，#3係在形成共價鍵結的情況下與胺基或硫醇基發生反應，較佳與蛋白質中之半胱胺酸殘基發生反應的基團。蛋白質中之半胱胺酸殘基可天然存在於蛋白質中，透過生化方法插入，或者較佳透過結合劑之二硫化物的預先還原產生。
在R1不表示H的情況下，結合有R1之碳原子係立構中心，其可具有L構型及/或D構型，較佳具有L構型。
在R2不表示H的情況下，結合有R2之碳原子係立構中心，其可具有L構型及/或D構型。
尤佳採用式(IIa)化合物，其中取代基R1、R3及R4中的一個表示-L-#1，且其中X1表示N，X2表示N，且X3表示C；X1表示CH或CF，X2表示C，且X3表示N；X1表示NH，X2表示C，且X3表示C；或者X1表示CH，X2表示N，且X3表示C；特別是下類化合物，其中X1表示N，X2表示N，且X3表示C；或者，X1表示CH，X2表示C，且X3表示N。特定言之，較佳採用X1表示CH，X2表示C，且X3表示N的化合物。
A較佳為CO(羰基)。
R1較佳為-L-#1、-MOD、-H、-COOH、-CONHNH2、-(CH2)1-3NH2、-CONZ"(CH2)1-3NH2以及-CONZ"CH2COOH，其中Z"表示-H或-NH2。在R4表示-L-#1的情況下，R1較佳為-MOD(特別是在R3不表示-MOD的情況下)。
R2較佳為-H。
R4較佳為-H、-L-#1或者可透過豆蛋白酶裂解的式為R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-的基團。如上文所述，-L-#1在此具有式為-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2COX)-CO*-之基團，其中(L-)天冬醯胺或(L-)天冬胺酸之羰基(用*表示)直接結合在氮原子上，此氮原子在上述式中結合在R4上。在R4表示-L-#1的情況下，R1或R3較佳為-MOD。
R3較佳為-L-#1、-MOD或C1-10-烷基，其可視情況經-OH、-O-烷基、-SH、-S-烷基、-O-CO-烷基、-O-C(=O)-NH-烷基、NH-C(=O)-烷基、NH-C(=O)-NH-烷基、S(O)n-烷基、SO2-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2或NH2取代，n表示0、1或2(其中烷基較佳表示C1-3烷基)。在R4表示-L-#1的情況下，R3較佳為-MOD(特別是在R1不表示-MOD的情況下)。
R5較佳為-H或-F。
相互獨立地，R6與R7較佳為-H、(視情況氟化的)C1-3-烷基、(視情況氟化的)C2-4-烯基、(視情況氟化的)C2-4-炔基、羥基或鹵素。
R8較佳為支鏈的C1-5-烷基基團，特別是式為-C(CH3)2-(CH2)0-2-Ry之基團，其中Ry為-H、-OH、-CO2H或-NH2。尤佳採用式為-C(CH3)2-(CH2)-Ry之基團，其中Ry為-H。
R9較佳為-H或-F。
-MOD較佳為HOOC-(CHX)x-AM-CH2-CH2-NH-CO-，其中x為2至6的數字，X表示-H、-NH2、-COOH，以及表示AM-CO-NH-或-NH-CO-(尤佳為HOOC-CH2-CH2-CH(COOH)-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-；HOOC-CH(NH2)-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-NH-CO-；HOOC-CH(NH2)-(CH2)4-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-)。
尤佳採用式(IIa)化合物，其中取代基R1與R3中的一個表示-L- #1，以及其中X1表示N，X2表示N，且X3表示C；X1表示CH或CF，X2表示C，且X3表示N；X1表示NH，X2表示C，且X3表示C；或者X1表示CH，X2表示N，且X3表示C；A為-C=(O)-；R1為-H、-COOH、-CONHNH2、-(CH2)1-3NH2、-CONZ"(CH2)1-3NH2及-CONZ"CH2COOH，其中Z"為-H或-NH2；R2表示-H；R4表示可透過豆蛋白酶裂解的式為R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-的基團；R3表示苯基，其可經鹵素(特別是-F)或視情況氟化的C1-3烷基單取代或多重取代，或者表示視情況氟化的C1-10-烷基基團，其可視情況經-OY4、-SY4、-O-CO-Y4、-O-CO-NH-Y4、NH-CO-Y4、-NH-CO-NH-Y4、S(O)n-Y4(其中n表示0、1或2)、-SO2-NH-Y4、NH-Y4或N(Y4)2取代，其中Y4表示H、苯基(視情況經鹵素(特別是F)或視情況氟化的C1-3烷基單取代或多重取代)，或者烷基(其中烷基基團可經-OH、-COOH及/或-NHCO-C1-3-烷基取代，且其中烷基較佳表示C1-3烷基)；其中尤佳地，R3可經-OH、-O-烷基、-SH、-S-烷基、-O-CO-烷基、-O-CO-NH-烷基、-NH-CO-烷基、-NH-CO-NH-烷基、-S(O)n-烷基、-SO2-NH-烷基、-NH-烷基、-N(烷基)2或-NH2取代，n表示0、1或2(其中烷基較佳表示C1-3烷基)；R5為-H或-F；R6與R7相互獨立地表示-H、(視情況氟化的)C1-3-烷基、(視情況氟化的)C2-4-烯基、(視情況氟化的)C2-4-炔基、羥基或鹵素； R8為支鏈的C1-5-烷基基團；以及R9為-H或-F。
此外，尤佳採用式(IIa)化合物，其中取代基R4表示-L-#1，以及其中X1表示N，X2表示N，且X3表示C；X1表示CH或CF，X2表示C，且X3表示N；X1表示NH，X2表示C，且X3表示C；或者X1表示CH，X2表示N，且X3表示C；A為CO(羰基)；R1表示-H、-COOH、-CONHNH2、-(CH2)1-3NH2、-CONZ"(CH2)1-3NH2、-CONZ"CH2COOH，其中Z"為-H或-NH2，或者表示HOOC-(CHX)x-AM-CH2-CH2-NH-CO-，其中x為2至6的數字，X表示-H、-NH2或-COOH，以及表示AM-CO-NH-或-NH-CO-(尤佳為HOOC-CH2-CH2-CH(COOH)-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-；HOOC-CH(NH2)-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-NH-CO-；HOOC-CH(NH2)-(CH2)4-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-)。
R2表示-H；R3表示-(CH2)OH、-CH(CH3)OH、-CH2SCH2CH(COOH)NHCOCH3、-CH(CH3)OCH3,、苯基，其可經1-3個鹵素原子、1-3個胺基或1-3個烷基(其可視情況鹵化)取代，或者表示HOOC-(CHX)x-AM-CH2-CH2-NH-CO-，其中x為2至6的數字，X表示H、NH2或COOH，以及表示AM-CO-NH-或-NH-CO-(尤佳為HOOC-CH2-CH2-CH(COOH)-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-；HOOC-CH(NH2)-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-NH-CO-；HOOC-CH(NH2)-(CH2)4-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-)，或者表示-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH，其中x為0或1，且Y5表示-H或-NHY6，其中Y6為-H或-COCH3； R5為-H或-F；R6與R7相互獨立地表示-H、(視情況氟化的)C1-3-烷基、(視情況氟化的)C2-4-烯基、(視情況氟化的)C2-4-炔基、羥基或鹵素；R8為支鏈的C1-5-烷基基團；以及R9為-H或-F。
此外，以下係較佳方案(單獨或組合)●R1表示-L-#1、-COOH、HOOC-CH2-CH2-CH(COOH)-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-；HOOC-CH(NH2)-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-NH-CO-；HOOC-CH(NH2)-(CH2)4-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-或-H，●R2表示-H，●R4表示可透過豆蛋白酶裂解的式為R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-的基團，●A表示-C(=O)-，●R3表示-(CH2)OH、-CH(CH3)OH、-CH2SCH2CH(COOH)NHCOCH3、-CH(CH3)OCH3、苯基(其可經1-3個鹵素原子、1-3個胺基或1-3個烷基(其可視情況鹵化)取代)、HOOC-CH2-CH2-CH(COOH)-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-；HOOC-CH(NH2)-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-NH-CO-；HOOC-CH(NH2)-(CH2)4-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-、-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH，其中x為0或1，且Y5表示-H或-NHY6，其中Y6表示-H或-COCH3，或者表示-L-#1，●R5表示-H，●R6與R7相互獨立地表示-H、C1-3-烷基或鹵素，特定言之，R6與R7表示-F；●R8表示C1-4-烷基(較佳為第三丁基)；以及/或者●R9表示-H，●其中取代基R1與R3中的一個表示-L-#1。
此外，根據本發明，以下係較佳方案●R1表示-L-#1、COOH、HOOC-CH2-CH2-CH(COOH)-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-；HOOC-CH(NH2)-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-NH-CO-；HOOC-CH(NH2)-(CH2)4-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-或H，●R2表示-H，●R4表示-H或者可透過豆蛋白酶裂解的式為R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-的基團，●A表示-C(=O)，●R3表示-(CH2)OH、-CH(CH3)OH、-CH2SCH2CH(COOH)NHCOCH3、-CH(CH3)OCH3、苯基，其可經1-3個鹵素原子、1-3個胺基或1-3個烷基(其可視情況鹵化)取代，或者表示-L-#1，●R5表示-H，●R6與R7相互獨立地表示-H、C1-3-烷基或鹵素，特定言之，R6與R7表示-F；●R8表示C1-4-烷基(較佳為第三丁基)；以及●R9表示-H，●其中取代基G1與R3中的一個表示-L-#1。
此外，根據本發明，較佳採用以下ADC或APDC：式(IIb)：
Figure 105119613-A0202-12-0035-2421
其中X1、X2、X3之含義與式(IIa)相同(較佳地，X1表示CH，X2表示C，且X3表示N)，R1、R2、R4、R5、R6、R7、R8及R9之含義與式(IIa)相同，A表示-C(=O)-，B表示單鍵、-O-CH2-或-CH2-O-，R20表示-NH2、-F、-CF3或-CH3，且n表示0、1或2。
式(IIc)：
Figure 105119613-A0202-12-0036-2422
其中X1、X2、X3之含義與式(IIIa)或(III)相同(較佳地，X1表示CH，X2表示C，且X3表示N)，A、R1、R3、R6、R7、R8及R9之含義與式(IIa)相同，其中A較佳表示-C(=O)-，R3表示-CH2OH、-CH2OCH3、-CH(CH3)OH或-CH(CH3)OCH3，且LEG表示可透過豆蛋白酶裂解的基團R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-，其中R21、P2及P3之含義與式(IIa)相同。
式(IId)：
Figure 105119613-A0202-12-0036-2423
其中X1、X2、X3之含義與式(IIa)相同(較佳地，X1表示CH，X2表示C，且X3表示N)，A、R3、R6、R7、R8及R9之含義與式(IIa)相同，其中A較佳表示-C(=O)-，R3為-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH，其中x 為0或1，且Y5表示-H或-NHY6，其中Y6表示-H或-COCH3，且LEG表示可透過豆蛋白酶裂解的基團R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-，其中R21、P2及P3之含義與式(IIa)相同。
式(IIe)：
Figure 105119613-A0202-12-0037-2424
其中X1表示CH，X2表示C，且X3表示N，A、R3、R6、R7、R8及R9之含義與式(IIIa)或(III)相同，且R1表示-L-#。
此外，在式為(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)及(IIe)之化合物中，以下為較佳方案(單獨或組合)：●Z表示-Cl或-Br；●R1表示-(CH2)0-3Z，其中Z表示-CO-NY1Y2，其中Y2表示-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'，且Y1表示-H、-NH2或-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'；●Y1表示-H，Y2表示-(CH2CH2O)3-CH2CH2Z'，且Z'表示-COOH；●Y1表示-H，Y2表示-CH2CH2Z'，且Z'表示-(CONHCHY4)2COOH；●Y1表示-H，Y2表示-CH2CH2Z'，Z'表示-(CONHCHY4)2COOH，且一個Y4表示異丙基，另一個表示-(CH2)3-NHCONH2；●Y1表示-H，Y2表示-CH2CH2Z'，Z'表示-(CONHCHY4)2COOH，且一個Y4表示-CH3，另一個表示-(CH2)3-NHCONH2；●Y4表示直鏈或支鏈的，視情況經-NHCONH2取代的C1-6烷基；●Y4的至少一代表物選自異丙基或-CH3。
●Y1表示-H，Y2表示-CH2CH2Z'，Z'表示-CONHCHY4COOH，且 Y4表示視情況經-NH2取代的芳基或苄基；●Y4表示胺基苄基；●R2表示-(CH2)0-3Z，且Z表示-SY3；●R4表示-CO-CHY4-NHY5，且Y5表示-H；●R4表示-CO-CHY4-NHY5，且Y5表示-CO-CHY6-NH2；●Y4表示直鏈或支鏈的，視情況經-NHCONH2取代的C1-6烷基。
此外較佳地，式(IIa)中之R1、R2或R3表示-MOD，特別是在R4表示-L-#1的情況下(特別是在-L係可直接在-N-R4或-N-L-#1上裂解之連接子，使得R4或L被H替代的情況下)。
尤佳地，R3表示-MOD，R1或R4表示-L-#1或-L-BINDER，其中-MOD表示-(NR10)n-(G1)o-G2-G3，其中R10表示-H或C1-C3-烷基； G1表示-NHCO-、-CONH-或
Figure 105119613-A0202-12-0038-2426
(其中在G1表示-NHCO- 或
Figure 105119613-A0202-12-0038-2425
的情況下，R10並非-NH2)；n為0或1；o為0或1；以及G2為包含1至10個碳原子之直鏈及/或支鏈烴基，其可單次或多重間雜有以下基團中的一或多個：-O-、-S-、-SO-、-SO2、-NRy-、-NRyCO-、-CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry表示H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其皆可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代)、-C(=O)-、-CRx=N-O-(其中Rx表示H、C1-C3-烷基或苯基)，其中包括側鏈(若存在)之烴鏈可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，G3表示-H或-COOH，以及 其中-MOD基團較佳具有至少一-COOH基團。
-MOD基團尤佳具有一(較佳末端的)-COOH基團，例如在甜菜鹼基團中。-MOD基團較佳具有式-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH，其中x為0或1，且Y5表示-H或-NHY6，其中Y6表示-H或-COCH3。
此外，在式(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIIe)中，以下為較佳方案(單獨或組合)：●Z表示-Cl或-Br；●R1表示-(CH2)0-3Z，其中Z表示-CO-NY1Y2，其中Y2表示-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'，且Y1表示-H、-NH2或-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'；●Y1表示-H，Y2表示-(CH2CH2O)3-CH2CH2Z'，且Z'表示-COOH；●Y1表示-H，Y2表示-CH2CH2Z'，且Z'表示-(CONHCHY4)2COOH；●Y1表示-H，Y2表示-CH2CH2Z'，Z'表示-(CONHCHY4)2COOH，且Y4的一個代表物表示異丙基，另一個表示-(CH2)3-NHCONH2；●Y1表示-H，Y2表示-CH2CH2Z'，Z'表示-(CONHCHY4)2COOH，且Y4的一個代表物表示-CH3，另一個表示-(CH2)3-NHCONH2；●Y4表示直鏈或支鏈的，視情況經-NHCONH2取代的C1-6烷基；●Y4的至少一代表物選自異丙基或-CH3。
●Y1表示-H，Y2表示-CH2CH2Z'，Z'表示-CONHCHY4COOH，且Y4表示視情況經-NH2取代的芳基或苄基；●Y4表示胺基苄基；●R2表示-(CH2)0-3Z，且Z表示-SY3；●R4表示-CO-CHY4-NHY5，且Y5表示-H；●R4表示-CO-CHY4-NHY5，且Y5表示-CO-CHY6-NH2；●Y4表示直鏈或支鏈的，視情況經-NHCONH2取代的C1-6烷基。
此外，以下式為(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIIe)之化合物係較佳， 其中X1表示N，X2表示N，且X3表示C；或者X1表示N，X2表示C，且X3表示N；或者X1表示CH或CF，X2表示C，且X3表示N；或者X1表示NH，X2表示C，且X3表示C；或者X1表示CH或CF，X2表示N，且X3表示C；(其中X1較佳為CH，X2較佳為C，且X3較佳為N)；R1表示-H、-L-#1、-MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、-NHY3、-OY3、-SY3、鹵素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1與Y2相互獨立地表示-H、-NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'(例如-(CH2)0-3Z')或-CH(CH2W)Z'，且Y3表示H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示-H、-NH2、-SO3H、-COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W表示-H或-OH，其中Y4表示直鏈或支鏈的、視情況經-NHCONH2取代的C1-6烷基，或者視情況經-NH2取代的芳基或苄基；R2表示-H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1與Y2相互獨立地表示-H、-NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示-H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示-H、-SO3H、-NH2或-COOH；其中Y4表示直鏈或支鏈的、視情況經-NHCONH2取代的C1-6烷基，或者視情況經-NH2取代的芳基或苄基，且Y5表示H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6表示直鏈或支鏈的C1-6烷基；R4表示-H或者可透過豆蛋白酶裂解的基團R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-；A表示-C(=O)-、S(=O)-、S(=O)2、S(=O)2NH或C(=NNH2)-； R3表示-L-#1、-MOD或視情況經取代的烷基、環烷基、芳基、雜芳基、雜烷基、雜環烷基基團，較佳為C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-雜烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-雜環烷基基團，其可被以下取代：1-3個-OH基團、1-3個鹵素原子、1-3個鹵化烷基(分別具有1-3個鹵素原子)、1-3個O-烷基基團、1-3個-SH基團、1-3個-S-烷基基團、1-3個-O-CO-烷基基團、1-3個-O-CO-NH-烷基基團、1-3個-NH-CO-烷基基團、1-3個-NH-CO-NH-烷基基團、1-3個-S(O)n-烷基基團、1-3個-SO2-NH-烷基基團、1-3個-NH-烷基基團、1-3個-N(烷基)2基團、1-3個-NH((CH2CH2O)1-20H)基團、1-3個-NH2基團或1-3個-(CH2)0-3Z基團，其中n表示0、1或2，Z表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1與Y2相互獨立地表示-H、-NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示-H、-SO3H、-NH2或-COOH(其中「烷基」較佳表示C1-10-烷基)；R5表示-H、-MOD、-NH2、-NO2、鹵素(特別是-F、-Cl、-Br)、-CN、-CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、-SH或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、-OY3、-SY3、鹵素、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1與Y2相互獨立地表示-H、-NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示-H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示-H、-SO3H、-NH2或-COOH；R6與R7相互獨立地表示-H、氰基、(視情況氟化的)C1-10-烷基、(視情況氟化的)C2-10-烯基、(視情況氟化的)C2-10-炔基、羥基、-NO2、-NH2、-COOH或鹵素(特別是-F、-Cl、-Br)，R8表示(視情況氟化的)C1-10-烷基、(視情況氟化的)C2-10-烯基、(視情況氟化的)C2-10-炔基或(視情況氟化的)C4-10-環烷基；其中取代基R1與R3中的一個表示，或者皆不表示-L-#1，L表示連接子，且#1表示與結合劑或其衍生物的鍵結， R9表示-H、-F、-CH3、-CF3、-CH2F或-CHF2；其中-MOD表示-(NR10)n-(G1)o-G2-G3，其中R10表示-H或C1-C3-烷基； G1表示-NHCO-、-CONH-或
Figure 105119613-A0202-12-0042-2427
(其中在G1表示-NHCO- 或
Figure 105119613-A0202-12-0042-2428
的情況下，R10並非-NH2)；n為0或1；o為0或1；以及G2為包含1至10個碳原子之直鏈及/或支鏈烴基，其可單次或多重間雜有以下基團中的一或多個：-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-NRy-、-NRyCO-、-CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry表示-H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其皆可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代)、-CO-、-CRx=N-O-(其中Rx表示H、C1-C3-烷基或苯基)，其中包括側鏈(若存在)之烴鏈可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，G3表示-H或-COOH，其中-MOD基團較佳具有至少一-COOH基團；以及其鹽、溶劑合物、溶劑合物之鹽。
此外，以下式為(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIIe)之化合物係較佳，其中X1表示N，X2表示N，且X3表示C；或者X1表示N，X2表示C，且X3表示N；或者X1表示CH或CF，X2表示C，且X3表示N；或者X1表示NH，X2表示C，且X3表示C；或者X1表示CH或CF，X2表示N，且X3表示C； (其中X1較佳為CH，X2較佳為C，且X3較佳為N)；R1表示-H、-L-#1、-MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、-NHY3、-OY3、-SY3、鹵素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1與Y2相互獨立地表示-H、-NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'(例如-(CH2)0-3Z')或-CH(CH2W)Z'，且Y3表示-H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示-H、-NH2、-SO3H、-COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W表示-H或-OH，其中Y4表示直鏈或支鏈的、視情況經-NHCONH2取代的C1-6烷基，或者視情況經-NH2取代的芳基或苄基；R2表示-H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1與Y2相互獨立地表示-H、-NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示-H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示-H、-SO3H、-NH2或-COOH；其中Y4表示直鏈或支鏈的、視情況經-NHCONH2取代的C1-6烷基，或者視情況經-NH2取代的芳基或苄基，且Y5表示H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6表示直鏈或支鏈的C1-6烷基；R4表示-H或者可透過豆蛋白酶裂解的基團R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-，A表示-C(=O)、S(=O)、S(=O)2、S(=O)2NH或C(=NNH2)-；R3表示-L-#1、-MOD或視情況經取代的烷基、環烷基、芳基、雜芳基、雜烷基、雜環烷基基團，較佳為C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-雜烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-雜環烷基基團，其可經以下取代：1-3個-OH基團、1-3個鹵素原子、1-3個鹵化烷基(分別具有1-3個鹵素原子)、1-3個-O-烷基基團、1-3個-SH基團、1-3個-S-烷基基團、1-3個-O-CO-烷基基團、1-3個-O-CO-NH-烷基基 團、1-3個-NH-CO-烷基基團、1-3個-NH-CO-NH-烷基基團、1-3個-S(O)n-烷基基團、1-3個-SO2-NH-烷基基團、1-3個-NH-烷基基團、1-3個-N(烷基)2基團、1-3個-NH((CH2CH2O)1-20H)基團、1-3個-NH2基團或1-3個-(CH2)0-3Z基團，其中n表示0、1或2，Z表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1與Y2相互獨立地表示H、-NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示-H、-SO3H、-NH2或-COOH(其中「烷基」較佳表示C1-10-烷基)；R5表示-H、-MOD、-NH2、-NO2、鹵素(特別是-F、-Cl、-Br)、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、-SH或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、-OY3、-SY3、鹵素、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1與Y2相互獨立地表示-H、-NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示-H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示-H、-SO3H、-NH2或-COOH；R6與R7相互獨立地表示-H或鹵素(特別是-F、-Cl、-Br)，R8表示(視情況氟化的)C1-10-烷基；其中取代基R1與R3中的一個表示，或者皆不表示-L-#1，L表示連接子，且#1表示與結合劑或其衍生物的鍵結，R9表示-H、-F、-CH3、-CF3、-CH2F或-CHF2；其中-MOD較佳具有式-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH，其中x為0或1，且Y5表示-H或-NHY6，其中Y6表示-H或-COCH3，以及其鹽、溶劑合物、溶劑合物之鹽及差向異構體。
根據本發明，以下式為V、VI或VII之化合物係尤佳，其中R1、R2、R3、R4及R5具有上述含義(例如就式(IIa)給出的含義)：
Figure 105119613-A0202-12-0045-2429
Figure 105119613-A0202-12-0045-2430
Figure 105119613-A0202-12-0045-2431
尤佳採用式為V、VI、VII之化合物，其中R1與R5表示H或-L-#1；R2表示H；R4表示式為R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-之基團，或表示可透過組織蛋白酶裂解的式為R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-的基團，其中P2為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸；P3為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸；其中取代基R1與R3中的一個表示-L-#1。尤佳採用式VI之化合物。
本發明之抗體-藥物共軛物(ADC)較佳具有以下式VIII：
Figure 105119613-A0202-12-0046-2432
其中m為0至2的數字；n為0或1；X為-CONH2或-COOH；La表示一自我分解型連接子；Lc表示一連接子；A1為自胺基酸Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His中之一個派生的殘基；A2為自胺基酸Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His中之一個派生的殘基，或者為相應的N-烷基-胺基酸中的一個，較佳為N-甲基-胺基酸(在存在多於一個P3的情況下，P3可具有不同含義)；D1係式為III的化合物；R表示Z1-(CO)q-，其中q為0或1，以及，Z1表示C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-雜烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-雜環烷基、雜芳基、雜芳基-烷基、C5-10-雜芳基-烷氧基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-雜烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-雜環烷氧基基團，其可被-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、-NH-CO-烷基、-N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2- N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH單取代或多重取代，以及表示-H或-Ox-(CH2CH2O)y-R1基團(其中x表示0或1，v表示1至20的數字，且R1表示-H、烷基(較佳為C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)，AB表示抗體，且s表示1至20，較佳2至8，尤佳3至5(例如4)的數字。
本發明之抗體-前藥共軛物(APDC)較佳具有以下式IX：
Figure 105119613-A0202-12-0047-2433
其中m為0至2的數字；n為0或1；o為0或1；X為-CONH2或-COOH；La表示一自我分解型連接子；Lb表示一連接子；A1為自胺基酸Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His中之一個派生的殘基；A2為自胺基酸Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、.瓜胺酸以及His中之一個派生的殘基，或者為相應的N-烷基-胺基酸中的一個，較佳為N-甲基-胺基酸(在存在多於一個P3的情況下，P3可具 有不同含義)；D1係式III之化合物；R表示Z1-(CO)q-，其中q為0或1，以及，Z1表示C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-雜烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-雜環烷基、雜芳基、雜芳基-烷基、C5-10-雜芳基-烷氧基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-雜烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-雜環烷氧基基團，其可經-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、-NH-CO-烷基、-N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH單取代或多重取代，以及表示-H或-Ox-(CH2CH2O)y-R1基團(其中x表示0或1，v表示1至20的數字，且R1表示-H、烷基(較佳為C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)，AB表示抗體，且s表示1至20，較佳2至8，尤佳3至5(例如4)的數字。
連接子
自文獻已知各種將有機分子與諸如抗體的結合劑共價偶聯(共軛)的方案(例如參閱K.Lang與J.W.Chin.Chem.Rev. 2014,114,4764-4806,M.Rashidian等人Bioconjugate Chem. 2013,24,1277-1294)。根據本發明，KSP抑制劑或前藥較佳透過抗體之半胱胺酸殘基的一或多個硫原子實現與抗體的共軛，該等硫原子要麼已作為自由硫醇存在，要麼透過二硫橋鍵之還原產生，以及/或者，透過抗體之離胺酸殘基的一或多個NH基團實現共軛。但該KSP抑制劑或前藥亦可透過酪胺酸殘基，透過麩醯胺酸殘基，透過非天然胺基酸之殘基，透過自由的羧基，或透過抗體之糖殘基結合至該抗體。
根據本發明，亦可使得活性物質分子與結合劑之特異性共軛位點軛合，從而改善產物均勻性。文獻描述過各種用於共軛位點特異的共軛的方法(Agarwal等人，Bioconjug.Chem. 26,176-192(2015)；Cal等 人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 53,10585-10587(2014)；Behrens等人，MAbs 6,46-53(2014)；Panowski等人，MAbs 6,34-45(2014))。此等方法特別是亦包含酶共軛法，其例如採用轉麩醯胺酸酶(TGase)、糖基轉移酶或甲醯甘胺酸所產生之酶(Sochaj等人，Biotechnology Advances 33,775-784,(2015))。
根據本發明，可提供紡錘體驅動蛋白抑制劑之共軛位點特異的結合劑共軛物，其中該等紡錘體驅動蛋白抑制劑係與該結合劑之麩醯胺酸側鏈軛合。
在此結合劑為抗體的情況下，其含有一受體麩醯胺酸，較佳在恆定區內。此類受體麩醯胺酸可透過使適合位置突變成麩醯胺酸來插入(例如重鏈之N297Q突變，Kabat EU編號)，或者透過生成去糖基化或非糖基化抗體實現(例如藉由透過PNGase F實施之酶去糖基化，或透過重鏈之N297X突變，Kabat EU編號，X在此可為除N以外之任何胺基酸)。在後一採用去糖基化或非糖基化抗體的情形下，重鏈之麩醯胺酸殘基Q295(Kabat EU編號)變成受體麩醯胺酸。尤佳採用包含N297A或N297Q突變(Kabat EU編號)的抗體。因此，本發明所描述之抗體亦包含此等抗體之非糖基化變異體，其要麼藉由透過PNGase F實施之去糖基化，要麼透過使重鏈之N297(Kabat EU編號)(Kabat numbering system of antibodies，參閱Kabat等人，Sequences of Proteins of Immulological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))突變成除N以外之任何胺基酸生成。此外，此處描述之所有抗體亦包含所述抗體之變異體，其藉由工程設計而含有一或多個針對轉麩醯胺酸酶催化反應的受體麩醯胺酸殘基。
一用於此類共軛位點特異之共軛的途徑為文獻所描述之配方，其涉及：藉由轉麩醯胺酸酶實現結合劑之共軛位點特異的共軛。亦包 含細菌轉麩醯胺酸酶(BTG)(EC 2.3.2.13)之轉麩醯胺酸酶(TGase)係一酶系，其對麩醯胺酸之γ-羰基-醯胺基團與離胺酸之一級胺基之間的共價鍵結的形成進行催化。此類轉麩醯胺酸酶亦接受其他作為胺基供體的、不同於離胺酸的基質，故其被用於在適宜之受體麩醯胺酸上對包含抗體之蛋白質進行修飾(Jeger等人，Angewandte Chemie Int.Ed.Engl 49,9995-9997(2010)；Josten等人，J.Immunol.Methods 240,47-54(2000)；Mindt等人，Bioconjugate Chem. 19,271-278(2008)；Dennler等人，in Antibody Drug Conjuagtes(Ducry,L.,Ed.),pp 205-215,Humana Press.(2013))。另一方面，轉麩醯胺酸酶被用於使活性物質與抗體軛合，其含有係受體麩醯胺酸殘基的人造麩醯胺酸標籤，此等殘基透過遺傳工程插入抗體(Strop等人，Chem.Biol. 20,161-167(2013))。另一方面提出，在非糖基化IgG1分子之主鏈中，抗體之重鏈之恆定區的保留的麩醯胺酸殘基Q295(Kabat EU編號)係針對細菌轉麩醯胺酸酶(EC 2.3.2.13)的唯一γ-羰基-醯胺基供體，並藉此呈現受體麩醯胺酸，而在抗體在重鏈之位置N297(Kabat EU編號)上糖基化的情況下，IgG1之主鏈中不存在受體麩醯胺酸(Jeger等人，Angewandte Chemie Int.Ed.Engl 49,9995-9997(2010))。概括言之，可使用細菌轉麩醯胺酸酶來使胺基供體基質，例如活性物質-連接子結構，與抗體之受體麩醯胺酸殘基共軛。可藉由透過突變實現之抗體工程設計，或透過生成非糖基化抗體來插入此類受體麩醯胺酸。可在使用N-醣苷酶F(PNGase F)的情況下，透過使重鏈之糖基化位點的N297(Kabat EU編號)突變成除N以外之任意胺基酸來插入此類非糖基化抗體。針對包含N297D、N297Q突變(Jeger等人，Angewandte Chemie Int.Ed.Engl 49,9995-9997(2010))或N297S突變(參閱專利申請案WO2013092998A1以及WO2013092983A2)的非糖基化抗體變異體，已公開過在使用細菌轉麩醯胺酸酶的情況下使此類非糖基化抗體酶共軛的方案。藉由轉麩醯 胺酸酶實現的此類去糖基化抗體的酶共軛通常提供DAR為2的ADC，其中兩個重鏈特異地在位置Q295(Kabat EU編號)上官能化。僅重鏈之N297Q突變針對每個重鏈提供一附加的共軛位點。此類變異體之共軛導致DAR為4之ADC，其中兩個重鏈特異地在位置Q295與Q297上官能化。
在重鏈具有Q295N及N297Q突變的抗體變異體中，針對每個重鏈在位置Q297(Kabat編號)上僅有一個受體麩醯胺酸殘基(Simone Jeger,Site specific conjugation of tumour targeting antibodies using transglutaminase,Dissertation at ETH Zurich(2009))。文獻中存在多個實例，其對在使用細菌轉麩醯胺酸酶的情況下非糖基化抗體之共軛位點特異的共軛進行描述(例如Dennler等人，Bioconjugate Chemistry 19,569-578(2014)；Lhospice等人，Molecular Pharmaceutics 12,1863-1871(2015))。非糖基化抗體之經轉麩醯胺酸酶催化的共軛位點特異的官能化策略參閱圖3。
為實現偶聯(既具共軛位點特異性，亦不具共軛位點特異性)，使用所謂之連接子。連接子分為可在活體內裂解之連接子以及在活體內穩定之連接子(參閱L.Ducry與B.Stump,Bioconjugate Chem. 21,5-13(2010))。可在活體內裂解之連接子具有可在活體內裂解之基團，其中又可分為可在活體內化學裂解之基團與可在活體內酶解之基團。「可在活體內化學裂解」或「可在活體內酶解」表示，連接子或基團在血液循環中保持穩定，在靶細胞上或在靶細胞中方因該處發生變化的化學或酶環境(減小之pH值；增大之麩胱甘肽濃度；溶酶體酶之存在，如豆蛋白酶、組織蛋白酶或纖維蛋白溶酶，或諸如ß-葡萄醣醛酸酶之醣苷酶)裂解，以便釋放低分子KSP抑制劑或其衍生物。可在活體內化學裂解之基團特別是為二硫化物、腙、縮醛及縮醛胺；可在活體內酶解之基團特別是為2-8-寡肽基團，特別是二肽基團或醣苷。 Bioconjugate Chem. 2002, 13,855-869，以及Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 8(1998)3341-3346，以及Bioconjugate Chem. 1998, 9,618-626公開過肽裂解切點。其中例如包括丙胺酸-丙胺酸-天冬醯胺、纈胺酸-丙胺酸、纈胺酸-離胺酸、纈胺酸-瓜胺酸、丙胺酸-離胺酸以及苯丙胺酸-離胺酸(視情況包含附加的醯胺基)。
為高效地釋放自由的活性物質，在酶裂解切點與活性物質之間亦可視情況嵌入所謂之自我分解型連接子元素(例如上述式IIa中之SIG或上述式VIII及IX中之La)(Anticancer Agents in Medicinal Chemistry,2008,8,618-637)。其中可根據不同的機制釋放活性物質，例如在親核基團之初始酶釋放後透過電子級聯進行消除(Bioorg.Med.Chem.,1999,7,1597；J.Med.Chem.,2002,45,937；Bioorg.Med.Chem.,2002,10,71)，或者透過相應連接子元素之環化(Bioorg.Med.Chem.,2003,11,2277；Bioorg.Med.Chem.,2007,15,4973；Bioorg.Med.Chem.Lett.,2007,17,2241)，或者透過二者之組合(Angew.Chem.Inter.Ed.,2005,44,4378)實現。此類連接子元素之實例如圖所示：
Figure 105119613-A0202-12-0052-2434
Nat.Commun.,2013,4,2735描述過連續的用於透過組蛋白脫乙醯基酶及組織蛋白酶L釋放活性物質的酶步驟的實例(參閱圖4)。
在活體內穩定之連接子的特徵在於高穩定性(24小時後血漿中之代謝物小於5%)，並且不具有上述可在活體內化學裂解或酶解之基團。
連接子-L-(式VIII中之Lc，以及式IX中之Lb)較佳具有以下基本結 構(i)至(iv)中的一個：
(i)-(C=O)m-SG1-L1-L2-
(ii)-(C=O)m-L1-SG-L1-L2-
(iii)-(C=O)m-L1-L2-
(iv)-(C=O)m-L1-SG-L2
其中m為0或1；SG為可在活體內(化學或酶)裂解之基團(特別是二硫化物、腙、縮醛及縮醛胺；或者為可透過豆蛋白酶、組織蛋白酶或纖維蛋白溶酶裂解之2-8-寡肽基團)，SG1為寡肽基團或較佳為二肽基團，L1表示在活體內穩定之有機基團，且L2表示結合至結合劑的偶聯基團或單鍵。在此，較佳與抗體之半胱胺酸殘基或離胺酸殘基偶聯。作為替代方案，可與抗體之酪胺酸殘基、麩醯胺酸殘基或非天然胺基酸偶聯。此等非天然胺基酸例如可含有醛基或酮基(例如甲醯甘胺酸)或者疊氮基團或炔基(為此參閱Lan & Chin,Cellular Incorporation of Unnatural Amino Acids and Bioorthogonal Labeling of Proteins,Chem.Rev.2014,114,4764-4806)。
根據本發明，尤佳採用連接子基本結構(iii)。本發明之具有連接子基本結構(iii)的，且連接子與抗體之半胱胺酸或離胺酸殘基偶聯的共軛物的投藥透過代謝導致具以下式的半胱胺酸或離胺酸衍生物。
Figure 105119613-A0202-12-0053-2435
其中L1結合至低分子KSP抑制劑，例如式為(III)或(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)或(IV)之化合物，其中-L-#1表示上述兩個自離胺酸或半胱胺酸派生之殘基中的一個。
根據本發明，連接子結構(ii)及(iv)亦較佳，特別是在結合至位置R1的情況下，特別是當基團L1具有以下結構中的一個時：
(a)-NH-(CH2)0-4-(CHCH3)0-4-CHY5-CO-Y7，其中Y5表示-H或- NHY6，其中Y6表示-H或-COCH3，且Y7表示單鍵或-NH-(CH2)0-4-CHNH2-CO-，從而在裂解後獲得相應結構-NH-(CH2)0-4-(CHCH3)0-4-CHY5-COOH或-NH-(CH2)0-4-(CHCH3)0-4-CHY5-CO-NH-(CH2)0-4-CHNH2-COOH。
(b)-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-CO-，其中x為0或1，且Y5表示-H或-NHY6，其中Y6表示-H或-COCH3，從而在裂解後獲得相應結構-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH。
根據本發明，在結合至位置R4的情況下，連接子基本結構(i)亦較佳，特別是當m=0時。
在連接子與半胱胺酸側鏈或半胱胺酸殘基結合的情況下，L2較佳自與半胱胺酸之硫氫基反應的基團派生出。其中包括鹵乙醯基、順丁烯二醯亞胺、氮丙碇、丙烯醯基、芳基化化合物、乙烯碸、吡啶基二硫、TNB-硫醇以及使得二硫化物還原的媒介。此等基團通常以親電的方式在形成硫(例如硫醚)或二硫橋鍵的情況下與硫氫鍵結發生反應。較佳為穩定的硫橋鍵。L2較佳為
Figure 105119613-A0202-12-0054-2436
其中#1 表示與抗體之硫原子的連接位點，#2 表示與L1基團的連接位點，以及R22 表示-COOH、-COOR、-COR、-CONHR、-CONR2(其中R皆表示C1-3-烷基)、-CONH2，較佳表示-COOH。L2尤佳為：
Figure 105119613-A0202-12-0055-2437
 或
Figure 105119613-A0202-12-0055-2438
其中#1表示與抗體之硫原子的連接位點，#2表示與活性物質的連接位點，x表示1或2，且R22表示-COOH、-COOR、-COR、-CONR2、-CONHR(其中R皆表示C1-3-烷基)、-CONH2，較佳表示-COOH。較佳地，x=1且R22表示-COOH。
在本發明之共軛物中，或在本發明之共軛物的混合物中，與抗體之半胱胺酸殘基的鍵結較佳超過80%，尤佳超過90%(皆相對連接子與抗體的鍵結總數而言)，尤佳存在於式為A3或A4之兩個結構中的一個中。在此，式A3或A4之結構通常共同存在，其比例較佳為60：40至40：60(相對與抗體的鍵結數目而言)。其餘鍵結存在於以下結構中
Figure 105119613-A0202-12-0056-2439
根據本發明，L1較佳透過以下式表示#1-(NR10)n-(G1)o-G2-#2
其中R10表示-H、-NH2或C1-C3-烷基； G1表示-NHCO-、-CONH-或
Figure 105119613-A0202-12-0056-2441
(其中在G1為-NHCO-或
Figure 105119613-A0202-12-0056-2440
的情況下，R10較佳非-NH2)；n為0或1；o為0或1；以及G2為來自芳基以及/或者直鏈及/或支鏈及/或環狀烷基的，包含1至100個碳原子之直鏈或支鏈烴鏈，其可單次或多重間雜有以下基團中的一或多個：-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-NRy-、-NRyCO-、-C(NH)NRy-、-CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry表示-H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其皆可經NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代)、-CO-、-CRx=N-O-(其中Rx表示H、C1-C3-烷基或苯基)，以及/或者一3至10員的含有至多4個選自N、O、S的雜原子、- SO-或-SO2-的芳族或非芳族雜環(較佳為
Figure 105119613-A0202-12-0056-2442
)，其中包括側鏈(若存在)之烴鏈可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代。
G2為來自芳基以及/或者直鏈及/或支鏈及/或環狀烷基的，包含1至100個碳原子之直鏈或支鏈烴鏈，其可單次或多重間雜有以下基團中的一或多個：-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-NH-、-CO-、-NHCO-、- CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-，以及一5至10員的含有至多4個選自N、O、S的雜原子或-SO-的芳族或非芳族雜環 (較佳為
Figure 105119613-A0202-12-0057-2443
)，其中側鏈(若存在)可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代。G2較佳為來自芳基以及/或者直鏈及/或支鏈及/或環狀烷基的，包含1至100個碳原子之直鏈或支鏈烴鏈，其可單次或多重間雜有以下基團中的一或多個：-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-、-CRx=N-O-(其中Rx表示H、C1-C3-烷基或苯基)，以及一3至10員的(例如5至10員的)含有至多4個選自N、O、S的雜原子、-SO-或-SO2-的芳族或非芳 族雜環(較佳為
Figure 105119613-A0202-12-0057-2444
)，其中包括側鏈(若存在)之烴鏈可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代。
G2中之其他間雜基團較佳為
Figure 105119613-A0202-12-0057-2445
其中Rx表示H、C1-C3-烷基或苯基。
在此，#1係與KSP抑制劑或前藥之鍵結，#2係與抗體之偶聯基團的鍵結(例如L2)。
來自芳基以及/或者直鏈及/或支鏈及/或環狀烷基的直鏈或支鏈烴鏈通常包括一α,ω-二價烷基殘基，其包含相應數目之碳原子。例如且 較佳為：亞甲基、乙烷-1,2-二基(1,2-乙烯基)、丙烷-1,3-二基(1,3-丙烯基)、丁烷-1,4-二基(1,4-丁烯基)、戊烷-1,5-二基(1,5-戊烯基)、己烷-1,6-二基(1,6-己烯基)、庚烷-1,7-二基(1,7-庚烯基)、辛烷-1,8-二基(1,8-辛烯基)、壬烷-1,9-二基(1,9-壬烯基)、癸烷-1,10-二基(1,10-癸烯基)。但烴鏈中之烷基亦可分枝，意即，上述直鏈烷基的一或多個H原子可視情況經C1-10-烷基取代，從而形成側鏈。此等烴鏈還可含有環狀烷基(環二烷基)，例如1,4-環己二基或1,3-環戊二基。此等環狀基團可不飽和。烴基中特別是可存在芳族基團(芳基)，例如苯基。在此等環狀烷基以及芳基中，一或多個H原子亦可視情況經C1-10-烷基取代。如此形成視情況分枝的烴鏈。此烴鏈具有總共0至100個，較佳1至50個，尤佳2至25個碳原子。
側鏈(若存在)可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸以相同或不同的方式單取代或多重取代。
烴鏈可以相同或不同的方式單次或多重間雜有以下基團：-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-、以及一5至10員的含有至多4個選自N、O、S的雜原子、-SO-或-SO2-的芳族或非芳族雜環(較佳為
Figure 105119613-A0202-12-0058-2446
)。
G2中之其他間雜基團較佳為
Figure 105119613-A0202-12-0059-2447
連接子較佳對應以下式：§-(CO)m-L1-L2-§§
其中m為0或1；§表示與活性物質分子或前藥的鍵結，以及 §§表示與結合肽或結合蛋白的鍵結，以及L1與L2具有上述含義。
L1尤佳具有式-NR11B-，其中R11表示-H或-NH2；B表示-[(CH2)x-(X4)y]w-(CH2)z-，w=0至20；x=0至5；x=0至5；y=0或1；z=0至5；以及 X4表示-O-、-CONH-、-NHCO-或
Figure 105119613-A0202-12-0060-2448
。
根據本發明，連接子L較佳具有以下式：
Figure 105119613-A0202-12-0060-2449
其中#3表示與活性物質分子或前藥的鍵結，#4表示與結合肽或結合蛋白的鍵結，R11表示-H或-NH2；B表示-[(CH2)x-(X4)y]w-(CH2)z-，w=0至20；x=0至5；y=0或1；z=1至5；以及 X4表示-O-、-CONH-、-NHCO-或
Figure 105119613-A0202-12-0061-2450
。
以下連接子亦較佳，其中連接子L1表示以下基團中的一個：§-NH-(CH2)2-§§；§-NH-(CH2)6-§§；§-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-§§；§-NH-CH(COOH)-(CH2)4-§§；§-NH-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-NH-(CH2)2-C(=O)-O-(CH2)2-§§；§-NH-(CH2)2-C(=O)-NH-(CH2)2-§§；§-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-(CH2)3-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)2-§§；§-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH(CH3)-§§；§-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-CH(COOH)-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=O)-(CH2)2-§§；§-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH(C2H4COOH)-§§；§-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-((CH2)2-O)3-(CH2)2-§§；§-NH-(CH2)2-S(=O)2-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-(CH2)3-NH-C(=O)-CH2-NH-C(=O)-CH2-§§； §-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=O)-CH(CH2COOH)-§§；§-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH(C2H4COOH)-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=O)-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)2-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=O)-CH(CH2OH)-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-CH[C(=O)-NH-(CH2)2-O)4-(CH2)2COOH]-CH2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(isoC3H7)-§§；§-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(isoC3H7)-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-NH-(CH2)2-C(=O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(isoC3H7)-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-(CH2)2-C(=O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(isoC3H7)-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH[(CH2)3-NH-C(=O)-NH2]-NH-C(=O)-CH(isoC3H7)-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)2-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(isoC3H7)-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-NH-CH(CH3)-C(=O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(isoC3H7)-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-NH-(CH2)2-C(=O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH[(CH2)3-NH-C(=O)-NH2]-NH-C(=O)-CH(isoC3H7)-NH-C(=O)-(CH2)5- §§；§-NH
Figure 105119613-A0202-12-0063-2451
C(=O)-NH-(CH2)2-§§；§-NH
Figure 105119613-A0202-12-0063-2452
C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH
Figure 105119613-A0202-12-0063-2453
C(=O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH[(CH2)3-NH-C(=O)-NH2]-NH-C(=O)-CH(isoC3H7)-NH-C(=O)-(CH2)5-§§； §-NH
Figure 105119613-A0202-12-0063-2454
C(=O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH[(CH2)3-NH-C(=O)-NH2]-NH-C(=O)-CH(isoC3H7)-NH-C(=O)-(CH2)5-§§； §-NH
Figure 105119613-A0202-12-0063-2455
C(=O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(isoC3H7)-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-NH-(CH2)2-C(=O)-NH-CH(isoC3H7)-C(=O)-NH-CH[(CH2)3-NH- C(=O)-NH2]-C(=O)-O
Figure 105119613-A0202-12-0063-2456
C(=O)-CH2-§§；§-NH-(CH2)2-C(=O)-NH-CH(isoC3H7)-C(=O)-NH-CH(CH3)-C(=O)- O
Figure 105119613-A0202-12-0063-2457
C(=O)-CH2-§§； §-NH-(CH2)2-NH-C(=O)
Figure 105119613-A0202-12-0063-2458
§§； §-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=O)
Figure 105119613-A0202-12-0063-2459
§§；§-NH-(CH2)2-C(=O)-NH-CH(CH3)-C(=O)-NH-CH[(CH2)3-NH- C(=O)-NH2]-C(=O)-NH
Figure 105119613-A0202-12-0063-2460
§§；§-(CH2)2-C(=O)-NH-(CH2)2-§§；§-(CH2)2-C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(isoC3H7)-§§；§-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(isoC3H7)-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(isoC3H7)-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-(CH2)2-C(=O)-NH-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(isoC3H7)-NH-C(=O)-((CH2)2-O)4- (CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)2-§§； §
Figure 105119613-A0202-12-0064-2461
NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(isoC3H7)-NH-C(=O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)2-§§；§-CH2-S-(CH2)2-C(=O)-NH-(CH2)2-§§；§-CH2-S-(CH2)5-C(=O)-NH-(CH2)2-§§；§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-CH2-S-(CH2)2-C(=O)-NH-((CH2)2-O)2-(CH2)2-§§；§-CH2-S-(CH2)2-C(=O)-NH-((CH2)2-O)2-(CH2)5-§§；§-CH2-S-(CH2)2-C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-(CH2)2-C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH5-§§；§-CH2-S-(CH2)2-C(=O)-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-CH2CH(NH2)-C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-CH2-S-(CH2)2-C(=O)-NH-((CH2)2-O)2-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-(CH2)2-C(=O)-NH-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-(CH2)2-C(=O)-NH-((CH2)2-O)2-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-CH2-S-(CH2)2-C(=O)-NH-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=O)-((CH2)2-O)2-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§； §-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)2-§§；§-CH2-S-(CH2)2-CH(COOH)-NH-C(=O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)2-§§；§-CH2-S-(CH2)2-C(=O)-NH-CH(C2H4COOH)-C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-CH2CH[NH-C(=O)-(CH2)2-COOH]-C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-CH2CH[NH-C(=O)-((CH2)2-O)4-CH3]-C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(isoC3H7)-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-CH2CH[NH-C(=O)-(CH2)2-COOH]-C(=O)-NH-(CH2)2-S(=O)2-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-CH2CH[NH-C(=O)-(CH2)2-COOH]-C(=O)-NH-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-CH2CH[C(=O)-NH-(CH2)2-COOH]-NH-C(=O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-CH2CH[C(=O)-NH-(CH2)2-COOH]-NH-C(=O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)2-§§；§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=O)-(CH2)2CH(COOH)-NH-C(=O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§
或者§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=O)-CH[(CH2)2-COOH]-NH-C(=O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)2-§§，其中 § 表示與活性物質分子的鍵結，以及§§ 表示與抗體的鍵結，以及isoC3H7 表示一異丙基殘基，上述連接子尤佳在式(IIa)之共軛物中，其中此連接子透過取代H原子與R1結合，或者透過與可裂解之連接子SG1連接與R4結合，即R1表示-L-#1或R4表示-SG1-L-#1，其中#1表示與抗體的鍵結。
此外，根據本發明，以下連接子係較佳：在本發明之共軛物中，或在本發明之共軛物的混合物中，與抗體之半胱胺酸殘基的鍵結較佳超過80%，尤佳超過90%(皆相對連接子與抗體的鍵結總數而言)，尤佳存在於式為A5或A6之兩個結構中的一個中：
Figure 105119613-A0202-12-0066-2462
Figure 105119613-A0202-12-0066-2463
其中#1 表示與抗體之硫原子的連接位點，#2 表示與L1基團的連接位點，以及R22 表示-COOH、-COOR、-COR、-CONR2、-CONHR、(其中R皆表示C1-3-烷基)，-CONH2，較佳表示-COOH。
在此，式為A5或A6之結構通常共同存在，其比例較佳為60：40至40：60(相對與抗體的鍵結數目而言)。其餘鍵結存在於以下結構中
Figure 105119613-A0202-12-0067-2464
與半胱胺酸側鏈或半胱胺酸殘基結合的其他連接子-L-具有以下式：
Figure 105119613-A0202-12-0067-2465
其中§表示與活性物質分子或前藥的鍵結，以及§§表示與結合肽或結合蛋白的鍵結，m為0、1、2或3；n為0、1或2；p為0至20；以及L3表示
Figure 105119613-A0202-12-0067-2466
 其中o為0或1；以及G3為來自芳基以及/或者直鏈及/或支鏈及/或環狀烷基的，包含1至100個碳原子之直鏈或支鏈烴鏈，其可單次或多重間雜有以下基團中的一或多個：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-，以及一3至10 員的(較佳5至10員的)含有至多4個選自N、O、S的雜原子、-SO-或- SO2-的芳族或非芳族雜環(較佳為
Figure 105119613-A0202-12-0068-2467
)，其中側鏈(若存在)可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代。
較佳地，在上述式中m為1；p為0；n為0；且L3表示
Figure 105119613-A0202-12-0068-2468
 其中o為0或1；以及G3表示-(CH2CH2O)s(CH2)t(CONH)uCH2CH2O)v(CH2)w-，其中s、t、v及w相互獨立地為0至20，且u為0或1。
在上述式§-(CO)m-L1-L2-§§中，較佳之L1基團為以下基團，其中r為0至20，較佳0至15，尤佳1至20，特別是1至10的數字：
Figure 105119613-A0202-12-0068-2469
Figure 105119613-A0202-12-0069-2470
Figure 105119613-A0202-12-0070-2471
Figure 105119613-A0202-12-0071-2472
Figure 105119613-A0202-12-0072-2473
Figure 105119613-A0202-12-0073-2474
Figure 105119613-A0202-12-0074-2475
Figure 105119613-A0202-12-0075-2476
Figure 105119613-A0202-12-0076-2477
Figure 105119613-A0202-12-0077-2478
Figure 105119613-A0202-12-0078-2479
Figure 105119613-A0202-12-0079-2480
L1的其他實例在表C中列出，其中此基團係在方框中突出顯示。
下表A及A'中列出了連接子L1的若干實例。該表還列出了可與L1之此等實例組合的較佳L2基團，以及較佳之偶聯位點(R1或R3或R4)，以及m的較佳值，即在L1前是否存在羰基(參閱§-(CO)m-L1-L2-§§)。較佳使得此等連接子與半胱胺酸殘基偶聯。在L2為琥珀酸醯亞胺或其派生物的情況下，此醯亞胺可完全或部分地以水解開鏈琥珀酸醯胺的形式存在，如上文所述。根據L1，水解成開鏈琥珀酸醯胺的程度可或多或少，或者完全不明顯。
Figure 105119613-A0202-12-0079-2481
Figure 105119613-A0202-12-0080-2482
Figure 105119613-A0202-12-0081-2483
Figure 105119613-A0202-12-0082-2484
Figure 105119613-A0202-12-0083-2485
**尤佳將此等行中列出的連接子L1與選自以下的連接子L2連接：
Figure 105119613-A0202-12-0084-2486
以及/或者
Figure 105119613-A0202-12-0084-2487
其中#1表示與結合劑之硫原子的連接位點，#2表示與L1基團的連接位點，R22較佳表示COOH。在本發明之共軛物中，或在本發明之共軛物的混合物中，與結合劑之半胱胺酸殘基的鍵結較佳超過80%，尤佳超過90%(皆相對連接子與結合劑的鍵結總數而言)，尤佳存在於式為A7或A8之兩個結構中的一個中。在此，式為A7或A8之結構通常共同存在，其比例較佳為60：40至40：60(相對與結合劑的鍵結數目而言)。其餘鍵結存在於以下結構中
Figure 105119613-A0202-12-0084-2488
Figure 105119613-A0202-12-0084-2489
Figure 105119613-A0202-12-0085-2490
Figure 105119613-A0202-12-0086-2491
Figure 105119613-A0202-12-0087-2492
Figure 105119613-A0202-12-0088-2493
Figure 105119613-A0202-12-0089-2494
Figure 105119613-A0202-12-0090-2495
Figure 105119613-A0202-12-0091-2496
Figure 105119613-A0202-12-0092-2497
Figure 105119613-A0202-12-0093-2498
Figure 105119613-A0202-12-0094-2499
Figure 105119613-A0202-12-0095-2500
Figure 105119613-A0202-12-0096-2501
Figure 105119613-A0202-12-0097-2502
Figure 105119613-A0202-12-0098-2503
Figure 105119613-A0202-12-0099-2504
Figure 105119613-A0202-12-0100-2505
Figure 105119613-A0202-12-0101-2506
Figure 105119613-A0202-12-0102-2507
**：參閱表A的註釋**。
***：在存在此L2結構的情況下，可同時存在具以下式的L2結構：
Figure 105119613-A0202-12-0103-2508
包含相應連接子之共軛物的實例具有以下結構，其中X1表示CH，X2表示C，X3表示N，且L1具有上文給出的含義，L2及L3之含義與L1相同，AK1表示一透過半胱胺酸殘基結合的抗體，且n為1至10的數字。AK1尤佳為人類的、人類化的或嵌合的單株抗體。尤佳採用特異地與TWEAKR(SEQ ID NO：169)之位置47(D47)中的胺基酸D結合的非糖基化抗TWEAKR抗體，特別是為抗TWEAKR抗體TPP-2658。
Figure 105119613-A0202-12-0103-2509
Figure 105119613-A0202-12-0103-2510
Figure 105119613-A0202-12-0104-2511
在連接子與離胺酸側鏈或離胺酸殘基結合的情況下，同樣可採用上文就與半胱胺酸側鏈之偶聯所描述的連接子，但其中L2較佳為羰基(例如透過相應的活化羧酸實現偶聯)。
具基本結構(i)之共軛物的實例具有以下結構中的一個，其中X1表示CH，X2表示C，X3表示N，L4之含義與L1相同，AK1表示透過半胱胺酸殘基結合的非糖基化抗TWEAKR抗體，n為1至10的數字，且式IIa中之位置R4中(即-NH2基團中)的氫原子被可透過豆蛋白酶裂解的式為R21-CO-P3-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-的基團替代。
Figure 105119613-A0202-12-0104-2512
其中R21表示C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-雜烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-雜環烷基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-雜烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、 C5-10-雜環烷氧基基團，其可經-NH2、-SO3H、-COOH、-SH或-OH單取代或多重取代；P2為單鍵，或選自Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg以及His的胺基酸； P3為單鍵，或選自Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg以及His的胺基酸。
尤佳採用特異地與TWEAKR(SEQ ID NO：169)之位置47中的胺基酸D(D47)結合的抗TWEAKR抗體，特別是非糖基化之抗TWEAKR抗體TPP-2658。
就轉麩醯胺酸酶催化的共軛而言，文獻中公開過各種以共軛位點特異的方式使得有機分子與結合劑(例如抗體)共價偶聯(共軛)的方案(例如參閱Sochaj等人.,Biotechnology Advances, 33,775-784,(2015),Panowski等人，MAbs 6,34-45(2014))。根據本發明，KSP抑制劑或前藥較佳在使用轉麩醯胺酸酶的情況下透過抗體之受體麩醯胺酸殘基與抗體軛合。可透過抗體之工程設計，或透過產生非糖基化抗體的突變來生成此類受體麩醯胺酸殘基。抗體中之此等受體麩醯胺酸的數目較佳為2或4。使用適合的連接子來實現偶聯(共軛)。適合的連接子結構為具有自由的胺基供體官能性的結構，其為轉麩醯胺酸酶之適合的基質。其中，連接子可以各種方式與抗體連接。
就轉麩醯胺酸酶催化的共軛而言，連接子較佳具有上述基本結構(i)至(iv)中的一個，其中L1、SG、SG1以及m具有上述含義，但L2較佳表示以下基團中的一個：
Figure 105119613-A0202-12-0105-2513
其中Ry為-H、NHCO烷基、-NH2或者
Figure 105119613-A0202-12-0106-2514
其中Ry為-CONH烷基、-CONH2，其中#1表示與L1的連接位點，#2表示與結合劑之麩醯胺酸殘基的連接位點。
Ry較佳為H或-NHCOMe。
相應共軛物的實例具有以下結構，其中X1、X2、X3、Ry及L1之含義如上文所述，AK表示結合劑，較佳表示抗體，其中n較佳為2或4。
Figure 105119613-A0202-12-0106-2515
Figure 105119613-A0202-12-0107-2516
尤佳之KSP抑制劑共軛物
根據本發明，尤佳採用以下KSP抑制劑共軛物，其中AK(AK1；AK2；AK3)表示結合劑或其衍生物(較佳表示抗體)，且n表示1至50，較佳1、2至20，尤佳2至8的數字。AK1較佳表示透過半胱胺酸殘基與KSP抑制劑結合的抗體；AK2較佳表示透過離胺酸殘基與KSP抑制劑結合的抗體；AK3較佳表示透過麩醯胺酸殘基與KSP抑制劑結合的抗體。在此，較佳將述及的較佳結合劑或抗體用作結合劑或抗體。
Figure 105119613-A0202-12-0107-2517
Figure 105119613-A0202-12-0108-2518
Figure 105119613-A0202-12-0108-2519
Figure 105119613-A0202-12-0109-2520
Figure 105119613-A0202-12-0109-2521
Figure 105119613-A0202-12-0110-2522
Figure 105119613-A0202-12-0110-2523
Figure 105119613-A0202-12-0111-2524
Figure 105119613-A0202-12-0111-2525
Figure 105119613-A0202-12-0112-2526
Figure 105119613-A0202-12-0112-2527
Figure 105119613-A0202-12-0113-2528
Figure 105119613-A0202-12-0113-2529
Figure 105119613-A0202-12-0114-2530
Figure 105119613-A0202-12-0114-2531
Figure 105119613-A0202-12-0115-2532
Figure 105119613-A0202-12-0115-2533
Figure 105119613-A0202-12-0116-2534
Figure 105119613-A0202-12-0116-2535
Figure 105119613-A0202-12-0117-2536
Figure 105119613-A0202-12-0118-2537
Figure 105119613-A0202-12-0119-2538
Figure 105119613-A0202-12-0119-2539
Figure 105119613-A0202-12-0120-2540
Figure 105119613-A0202-12-0120-2541
Figure 105119613-A0202-12-0121-2542
Figure 105119613-A0202-12-0121-2543
Figure 105119613-A0202-12-0122-2544
Figure 105119613-A0202-12-0122-2545
Figure 105119613-A0202-12-0122-2546
Figure 105119613-A0202-12-0123-2547
Figure 105119613-A0202-12-0123-2548
Figure 105119613-A0202-12-0124-2549
Figure 105119613-A0202-12-0124-2550
Figure 105119613-A0202-12-0125-2551
Figure 105119613-A0202-12-0125-2552
Figure 105119613-A0202-12-0126-2553
Figure 105119613-A0202-12-0126-2554
Figure 105119613-A0202-12-0127-2555
Figure 105119613-A0202-12-0127-2556
Figure 105119613-A0202-12-0128-2557
Figure 105119613-A0202-12-0128-2558
Figure 105119613-A0202-12-0129-2559
Figure 105119613-A0202-12-0129-2560
KSP抑制劑-連接子中間物或前藥-連接子中間物，以及共軛物的製備
製備本發明之共軛物，其中首先為低分子KSP抑制劑或其前藥提供連接子。隨後使得如此獲得之中間物與結合劑(較佳為抗體)發生反應。
為與半胱胺酸殘基偶聯，較佳使得以下化合物中的一個與含半胱胺酸之結合劑(例如，為此視情況部分還原的抗體)反應：
Figure 105119613-A0202-12-0130-2561
Figure 105119613-A0202-12-0130-2562
Figure 105119613-A0202-12-0130-2563
Figure 105119613-A0202-12-0131-2564
Figure 105119613-A0202-12-0131-2565
Figure 105119613-A0202-12-0131-2566
Figure 105119613-A0202-12-0132-2567
Figure 105119613-A0202-12-0132-2568
Figure 105119613-A0202-12-0132-2569
Figure 105119613-A0202-12-0133-2570
Figure 105119613-A0202-12-0133-2571
其中R表示-H或-COOH，其中K表示直鏈或支鏈的，視情況經C1-C6烷氧基或-OH取代的C1-C6烷基，以及其中X1表示CH，X2表示C，X3表示N，SG1、L1、L2、L3及L4之含義如上文所述。
在前述式以及以下反應示意圖或結構式中，式IIa之位置R4(即-NH2基團)中的氫原子可被式為R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-之基團或可透過組織蛋白酶裂解的式為R21-(CO)(0-1)-(P3)(1-2)-P2-的基團替代，其中P2為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、 瓜胺酸以及His的胺基酸；P3為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸。
其中R21表示C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-雜烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-雜環烷基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-雜烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-雜環烷氧基基團，其可經-NH2、-SO3H、-COOH、-SH或-OH單取代或多重取代。
在上述化合物以及下列化合物中的任一個中，第三丁基皆可被環己基替代。
例如可採用此化合物之三氟乙酸鹽。為與結合劑(例如抗體)反應，與結合劑相比，較佳採用莫耳過剩為2至12倍的化合物。
為與離胺酸殘基偶聯，較佳使得以下化合物中的一個與含離胺酸之結合劑(例如抗體)反應：
Figure 105119613-A0202-12-0134-2572
其中X1表示CH，X2表示C，X3表示N，L4之含義與L1相同，且L1之含義如上文所述。
對於與半胱胺酸殘基偶聯的中間物而言，可對反應作如下圖示：
Figure 105119613-A0202-12-0135-2573
可使得其他中間物與其他抗體發生相應反應。
對於與離胺酸殘基偶聯的中間物而言，可對反應作如下圖示：
Figure 105119613-A0202-12-0136-2574
根據連接子，可在共軛後將丁二醯亞胺連接的ADC轉化成開鏈琥珀酸醯胺，其具有較佳之穩定性。
Figure 105119613-A0202-12-0137-2575
可在7.5至9，較佳為8之pH下，以及在25℃至37℃的溫度下，例如透過攪拌進行此反應(開環)。較佳之攪拌時間為8至30小時。
在上述式中，X1表示CH，X2表示C，X3表示N；SG1及L1之含義如上文所述，且L2、L3及L4之含義與L1相同；R及K之含義如上文所述。AK1係透過半胱胺酸殘基偶聯的非糖基化抗TWEAKR抗體，且AK2係透過離胺酸殘基偶聯的非糖基化抗TWEAKR抗體。AK1及AK2尤佳表示特異地與TWEAKR(SEQ ID NO：169)之位置47中的胺基酸D(D47)結合的非糖基化抗TWEAKR抗體，特別是非糖基化之抗TWEAKR抗體TPP-2658。
其他定義
表述「轉麩醯胺酸酶」(亦作為「TGase」或「TG」)係指一種酶，其能夠透過肽結合麩醯胺酸之γ-羧醯胺基團與離胺酸或結構相關 之一級胺(例如胺基戊基或例如肽結合離胺酸)的ε-胺基之間的醯基轉移反應連接蛋白質，從而產生8-(γ-麩胺醯基)-離胺酸-異肽鍵。TGase還包括細菌轉麩醯胺酸酶(BTG)，例如EC參考編號2.3.2.13的酶(蛋白質-麩醯胺酸-γ-麩胺醯轉移酶)。
就抗體之胺基酸殘基而言，表述「受體麩醯胺酸」表示一麩醯胺酸殘基，其能在適合之條件下被轉麩醯胺酸酶識別，並透過前述麩醯胺酸與離胺酸或結構相關之一級胺(例如胺基戊基)之間的反應，以經轉麩醯胺酸酶催化的方式連接。視具體情況，此受體麩醯胺酸為表面曝露的麩醯胺酸。
「胺基酸修飾」或「突變」在此係指多肽序列中之胺基酸取代、插入及/或缺失。在此，較佳之胺基酸修飾為取代。「胺基酸取代」或「取代」在此係指，蛋白質序列中之給定位置上的一胺基酸被置換成另一胺基酸。舉例而言，Y50W取代係描述親本多肽的一變異體，其中位置50上的酪胺酸被置換成色胺酸。多肽之「變異體」係描述一多肽，其具有與參考多肽(通常為天然或「親本」多肽)大體相同的胺基酸序列。多肽變異體可具有一或多個位於天然胺基酸序列之特定位置上的胺基酸交換、缺失及/或插入。
表述「共軛位點特異之共軛物」係描述結合劑(較佳為抗體)與殘基(較佳為連接子-活性物質殘基)之共軛物，其中此結合劑在一或多個既定的位置上，較佳在麩醯胺酸殘基上官能化。包括細菌轉麩醯胺酸酶(BTG)(EC 2.3.2.13)之轉麩醯胺酸酶(TGase)在麩醯胺酸-蛋白質基質之識別中顯示出較強的特異性，並能對「共軛位點特異的共軛」進行催化。
表述「均勻共軛物」或「均勻ADC」係描述共軛位點特異之共軛物的混合物，其中結合劑中之至少60、70、80或90%具有相同數目的共軛殘基。就抗體而言，此數目應為偶數，較佳為2或4。
結合劑
廣義而言，術語「結合劑」係指一分子，其與待用結合劑-活性物質共軛物定址之靶細胞群體上的靶分子結合。術語「結合劑」應取其廣義，其例如亦包括凝集素，能夠結合特定糖鏈的蛋白質，以及與磷脂結合的蛋白質。此類結合劑例如包括高分子蛋白質(結合蛋白)、多肽或肽(結合肽)、非肽的(例如適體(US5,270,163)Keefe AD等人之概述文章，Nat.Rev.Drug Discov.2010；9：537-550)，或者維生素)以及所有其他與細胞結合的分子或物質。結合蛋白例如為抗體、抗體片段或抗體模擬劑，例如Affibodies、Adnectins、Anticalins、DARPins、Avimers、Nanobodies(Gebauer M.等人之概述文章，Curr.Opinion in Chem.Biol.2009；13：245-255；Nuttall S.D.等人，Curr.Opinion in Pharmacology 2008；8：608-617))。結合肽例如為一配體-受體對中之配體，例如配體-受體對「VEGF/KDR」中之VEGF，配體-受體對「運鐵蛋白/運鐵蛋白受體」對中之運鐵蛋白，或者「細胞因子/細胞因子受體」，以及配體-受體對「TNFalpha/TNFalpha受體」中之TNFalpha。
「結合劑」可包括受體麩醯胺酸殘基，其可透過包括細菌轉麩醯胺酸酶(BTG)(EC 2.3.2.13)的轉麩醯胺酸酶(TGase)官能化。此受體麩醯胺酸既可天然存在於結合劑中，亦可額外生成。可透過在適合之位置上插入麩醯胺酸殘基來產生受體麩醯胺酸(例如透過一含有受體麩醯胺酸的融合標籤，或者使適合位置突變成麩醯胺酸殘基)，或者透過任意胺基酸之突變產生受體麩醯胺酸，此突變使得先前不被轉麩醯胺酸酶識別的特定麩醯胺酸殘基變成受體麩醯胺酸，或者透過轉譯後修飾(例如去糖基化)的改變來產生受體麩醯胺酸，其中此改變使得先前不被轉麩醯胺酸酶識別的天然麩醯胺酸變成受體麩醯胺酸。在此結合劑為抗體的情況下，其含有一受體麩醯胺酸，較佳在恆定區內。可透過使適合位置突變成麩醯胺酸(例如N297Q突變，Kabat EU編號)， 或透過生成去糖基化或非糖基化之抗體(例如藉由透過PNGase F實施之去糖基化，或透過N297X突變，Kabat EU編號)來產生此類受體麩醯胺酸。在後一採用去糖基化或非糖基化抗體的情形下，重鏈之麩醯胺酸殘基Q295(Kabat EU編號)變成受體麩醯胺酸。尤佳採用包含N297A或N297Q突變(Kabat EU編號)的抗體。
術語「非糖基化抗體」或「去糖基化抗體」在此用於定義一抗體或抗體衍生物，其包含缺少與CH2域中保留之N-糖基化位點結合的聚糖的FC域。例如可透過重鏈之糖基化位點N297(Kabat EU編號)之突變，或者透過在缺少糖基化能力之表現系統中表現抗體，來製備非糖基化抗體。用於抗體去糖基化的方法已為吾人所知(例如Winkelhake & Nicolson(1976),J Biol Chem.251(4)：1074-80))。例如可透過PNGase F實施酶去糖基化來產生去糖基化抗體。根據本發明的一種實施方式，可透過原核宿主中之表現獲得非糖基化抗體。適合之原核宿主包括大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、鼠傷寒沙門桿菌(Salmonella typhimurium)，以及假單胞菌(Pseudomonas)、鏈黴菌(Streptomyces)以及葡萄球菌(Staphylococcus)屬中的一些種類。根據本發明的另一實施方式，可將哺乳動物細胞表現系統與糖基化抑制劑Tunicamycin組合使用(Nose & Wigzell(1983),Proc Natl Acad Sci USA,80(21)：6632-6)來獲得非糖基化抗體。在此，修飾為在抗體之Fc部分之CH2域中之重鏈的保留的N-糖基化位點N297(Kabat編號)上阻止糖基化。
文獻中亦公開過各種使得有機分子與抗體以共軛位點特異的方式共價偶聯(共軛)的方案。其中本發明特別關注以下內容：毒性基團透過抗體之二或四個受體麩醯胺酸殘基與抗體共軛。
自文獻已知各種使得有機分子與抗體共價偶聯(共軛)的方案。根據本發明，毒性基團較佳透過抗體之半胱胺酸殘基的一或多個硫原 子，以及/或者透過抗體之離胺酸殘基的一或多個NH基團與抗體共軛。但毒性基團亦可透過自由的羧基，或透過抗體之糖殘基與抗體結合。
廣義而言，「靶分子」係指一分子，其存在於靶細胞群體中，並可為蛋白質(例如生長因子之受體)或非肽分子(例如糖或磷脂)。其較佳為受體或抗原。
術語「胞外」靶分子係描述一與細胞結合的靶分子，其位於細胞之外側上，或者描述靶分子之位於細胞外側上的部分，意即，結合劑可在一完整的細胞上與其胞外靶分子結合。胞外靶分子可錨定在細胞膜中，或者為細胞膜之組成部分。用於識別胞外靶分子的方法已為本領域技術人員所知。對於蛋白質而言，可透過確定跨膜域或蛋白質在膜中的定向實現此點。此等資料通常儲存在蛋白質資料庫(例如SwissProt)中。
術語「癌症靶分子」係描述一靶分子，在一或多個癌細胞類型上，與相同組織類型之非癌細胞相比，其具備增殖性。較佳地，在一或多個癌細胞類型上，與相同組織類型之非癌細胞相比，癌症靶分子具備選擇性，其中選擇性表示，與相同組織類型之非癌細胞相比，癌細胞之富集度至少為兩倍(「選擇性的癌症靶分子」)。藉由使用癌症靶分子，能夠透過本發明之共軛物實現對癌細胞的選擇性療法。
可透過鍵結使結合劑與連接子連接。可透過結合劑之雜原子來連接結合劑。在本發明中，結合劑之可用於連接的雜原子為硫(在一透過結合劑之硫氫基實現的實施方式中)、氧(在本發明中透過結合劑之羧基或羥基)以及氮(在一透過結合劑之一級或二級胺基或者醯胺基實現的實施方式中)。此等雜原子可存在於天然結合劑中，或者透過化學或分子生物學方法插入。根據本發明，結合劑與毒性基團的連接僅對結合劑相對靶分子之結合活性產生較小影響。根據一種較佳實施 方式，此連接對結合劑相對靶分子之結合活性無影響。
根據本發明，術語「抗體」取其廣義，並包括免疫球蛋白分子，例如完整的或經修飾的單株抗體、多株抗體或多特異性抗體(例如雙特異性抗體)。免疫球蛋白分子較佳包括具四個多肽鏈之分子，其中含兩個重鏈(H鏈)及兩個輕鏈(L鏈)，其通常透過二硫橋鍵連接。每個重鏈包括一重鏈之可變域(縮寫VH)以及一重鏈之恆定域。重鏈之恆定域例如可包括三個域CH1、CH2及CH3。每個輕鏈包括一可變域(縮寫VL)以及一恆定域。輕鏈之恆定域包括一個域(縮寫CL)。VH及VL域還可進一步細分成高變區域，其亦稱作互補決定區(「complementarity determining region」，縮寫CDR)，以及具較低之序列可變性的區域(「framework region」，縮寫FR)。每個VH及VL區域通常由三個CDR以及至多四個FR組成。舉例而言，自胺基末端至羧基末端的順序為FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。抗體可自任意適合之物種獲取，例如家兔、駱馬、駱駝、小鼠或大鼠。根據一種實施方式，此抗體係人源或鼠源抗體。抗體例如可為人類的、人類化的或嵌合的抗體。
術語「單株」抗體係指自大體均勻之抗體的群體獲取的抗體，意即，除天然出現的、數目極小的突變以外，群體中之單個抗體皆相同。單株抗體以較高之特異性識別單獨一個抗原結合位點。術語「單株抗體」並不涉及特定的製備方法。
術語「完整」抗體係指既包括抗原結合域，亦包括輕鏈及重鏈之恆定域的抗體。恆定域可為天然存在之域，或者為其變異體(其中多個胺基酸位置發生改變)，且亦可非糖基化。
術語「經修飾之完整」抗體係指藉由共價鍵結(例如肽鍵)透過胺基末端或羧基末端，與另一並非源自抗體之多肽或蛋白質融合的完整抗體。此外還可對抗體作如下修飾：在既定之位點上插入反應性的半 胱胺酸，以簡化與毒性基團的偶聯(參閱：Junutula等人，Nat Biotechnol.2008 Aug；26(8)：925-32)。
術語「人類」抗體係指可自人獲取的抗體，或者合成的人類抗體。「合成」人類抗體係指局部或完全以生物模擬方式(in silico)自合成序列獲得的抗體，此等合成序列係基於對人類抗體序列的分析。人類抗體例如可透過自抗體序列(人源)之庫分離出的核酸編碼。此類抗體之實例見於：Söderlind等人，Nature Biotech.2000,18：853-856。此類「人類」及「合成」抗體亦包括非糖基化變異體，其要麼藉由透過PNGaseF實施之去糖基化，要麼透過使重鏈之N297(kabat編號)突變成其他任意其他胺基酸來產生。
「人類化」或「嵌合」抗體係指由一非人類序列組分與一人類序列組分構成的抗體。在此抗體中，人類免疫球蛋白(受體)之序列的一部分被非人類免疫球蛋白(供體)之序列組分替代。在許多情形下，此供體為鼠類免疫球蛋白。在人類化抗體中，受體之CDR的胺基酸被供體之胺基酸替代。骨架域之胺基酸有時亦被供體之相應胺基酸替代。在某些情形下，人類化抗體含有既不包含在受體中亦不包含在供體中之胺基酸，其在抗體最佳化期間插入。在嵌合抗體中，供體免疫球蛋白之可變域與人類抗體之恆定區融合。此類「人類化」及「嵌合」抗體亦包括非糖基化變異體，其要麼藉由透過PNGaseF實施之去糖基化，要麼透過使重鏈之N297(kabat編號)突變成任意其他胺基酸來產生。
如本文所用，術語「互補決定區(CDR)」係指可變抗體域之為與抗原結合而需要的胺基酸。每個可變區通常具有三個CDR區域，其稱作CDR1、CDR2以及CDR3。每個CDR區域可包括若干符合Kabat定義的胺基酸，以及若干符合Chotia定義的高變環的胺基酸。Kabat定義例如包括可變輕鏈之胺基酸位置24-34(CDR1)、50-56(CDR2)及89- 97(CDR3)的區域，以及可變重鏈之31-35(CDR1)、50-65(CDR2)及95-102(CDR3)的區域(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。Chotia定義例如包括可變輕鏈之胺基酸位置26-32(CDR1)、50-52(CDR2)及91-96(CDR3)的區域，以及可變重鏈之26-32(CDR1)、53-55(CDR2)及96-101(CDR3)的區域(Chothia與Lesk；J Mol Biol 196：901-917(1987))。在某些情形下，一個CDR可能包括Kabat及Chotia所定義的CDR區域中的若干胺基酸。
根據重鏈之恆定域的胺基酸序列，可將抗體劃分成不同類別。完整抗體有五個主要類別：IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM，其中的多個可進一步細分成若干子類別。(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1以及IgA2。重鏈之與不同類別對應的恆定域被稱作[alpha/α]、[delta/δ]、[epsilon/ε]、[gamma/γ]以及[my/μ]。抗體之三維結構及次單元結構皆已為吾人所知。
抗體/免疫球蛋白之「功能片段」或「抗原結合抗體片段」係定義為抗體/免疫球蛋白之片段(例如IgG之可變域)，其還包括抗體/免疫球蛋白之抗原結合域。抗體之「抗原結合域」通常包括抗體之一或多個高變區域，例如CDR、CDR2及/或CDR3區域。但抗體之骨架(Framework)區域亦可起到使抗體與抗原結合的作用。骨架區域形成針對CDR的骨架。此抗原結合域較佳至少包括可變輕鏈之胺基酸4至103以及可變重鏈之胺基酸5至109，更佳包括可變輕鏈之胺基酸3至107以及可變重鏈之胺基酸4至111，尤佳包括完整的可變輕鏈及重鏈，即VL之胺基酸1至109以及VH之胺基酸1至113(根據WO97/08320的編號)。
本發明之「功能片段」或「抗原結合抗體片段」不僅限於此的 包括Fab、Fab'、F(ab')2以及Fv片段、二體、單域抗體(Dabs)、線性抗體、單鏈抗體(single-chain Fv，縮寫scFv)；以及由抗體片段構成之多特異性抗體，例如雙特異性或三特異性抗體(C.A.K Borrebaeck,editor(1995)Antibody Engineering(Breakthroughs in Molecular Biology),Oxford University Press；R.Kontermann & S.Duebel,editors(2001)Antibody Engineering(Springer Laboratory Manual),Springer Verlag)。其他「多特異性」或「多功能」抗體係具有相同結合位點的抗體。多特異性抗體可具備針對一個抗原之不同抗原決定基的特異性，或針對超過一個抗原之抗原決定基的特異性(例如參閱WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt等人，1991,J.Immunol.147：60 69；U.S.Pat.Nos.4,474,893；4,7 14,68 1；4,925,648；5,573,920；5,601,8 19；或者Kostelny等人，1992,J.Immunol.148：1547 1553)。F(ab')2或Fab可具有如此的構造，使得在Ch1與CL域之間發生的分子間二硫交互作用的數目減小，或者完全予以避免。
「抗原決定基」係指可與免疫球蛋白或T細胞受體特異性結合的蛋白質決定基。抗原決定基通常由分子之具化學活性的表面基團，如胺基酸或糖側鏈，或者上述之組合構成，且抗原決定基通常具有特異性的3維結構特性以及特異性的電荷特性。
「功能片段」或「抗原結合抗體片段」可藉由共價鍵結(例如肽鍵)透過胺基末端或羧基末端與另一並非源自抗體之多肽或蛋白質融合。此外還可對抗體及抗原結合片段作如下修飾：在既定之位點上插入反應性的半胱胺酸，以簡化與毒性基團的偶聯(參閱：Junutula等人，Nat Biotechnol.2008 Aug；26(8)：925-32)。
多株抗體可透過為該領域之一般執業者所知的方法製備。單株抗體可透過為該領域之一般執業者所知的方法製備(Köhler與Milstein, Nature,256,495-497,1975)。人類或人類化單株抗體可透過為該領域之一般執業者所知的方法製備(Olsson等人，Meth Enzymol.92,3-16,或者Cabilly等人，US 4,816,567，或者Boss等人，US 4,816,397)。
該領域之一般執業者已知各種用於製備人類抗體及其片段的方法，例如透過轉殖基因鼠(N Lonberg與D Huszar,Int Rev Immunol.1995；13(1)：65-93)或者噬菌體呈現技術(Clackson等人，Nature.1991 Aug 15；352(6336)：624-8)。本發明之抗體可自重組抗體庫獲取，其例如以大量抗體之胺基酸序列為基礎，此等胺基酸序列係根據大量健康志願者而創建。亦可透過習知的重組DNS技術來製備抗體。抗體之核算序列可透過常規定序(Routinesequenzierung)獲取，或者自公開資料庫獲取。
「分離」的抗體或結合劑被細胞之其他組分純化。細胞之透過診斷或治療應用起干擾作用的污染性組分例如為酶、激素，或者細胞之其他肽或非肽組分。較佳採用超過95wt%(相對抗體或結合劑而言)被純化的抗體或結合劑(例如藉由Lowry法、UV-Vis光譜或SDS毛細管凝膠電泳法確定)。此外採用具以下純化程度的抗體：能夠確定胺基末端之至少15個胺基酸或者內部胺基酸序列，或者在純化後具均勻性，其中藉由SDS-PAGE在還原或非還原條件下確定此均勻性(可藉由庫馬斯亮藍染色或較佳透過銀染色來進行偵測)。但通常透過一或多個純化步驟來製備抗體。
術語「特異性鍵結」或「特異性結合」係描述與預定之抗原/靶分子結合的抗體或結合劑。抗體或結合劑之特異性鍵結通常描述親和性至少為10-7M(作為Kd值；即其Kd值較佳小於10 -7 M)的抗體或結合劑，其中與相對非特異性抗原/靶分子(例如牛血清白蛋白，或者酪蛋白，其並非預定之抗原/靶分子或緊密相關的抗原/靶分子)的親和性相比，與預定之抗原/靶分子的親和性至少為兩倍。較佳地，抗體之親 和性為至少10-7M(作為Kd值；即Kd值較佳小於10-7M)，較佳為10-8M，尤佳為10-9M至10-11M。例如可透過表面電漿子共振光譜來確定Kd值。
本發明之抗體-活性物質共軛物的親和性亦處於此範圍內。活性物質之軛合較佳不對親和性產生顯著影響(親和性之減小程度通常小於一個數量級，即例如最多自10-8M至10-7M)。
本發明採用的抗體的另一特徵較佳為較高的選擇性。在與其他獨立抗原(例如人類血清白蛋白)相比，本發明之抗體在靶蛋白上的親和性至少為2倍，較佳為5倍或尤佳為10倍的情況下，便具備較高的選擇性(例如可透過表面電漿子共振光譜來確定親和性)。
此外，本發明採用的抗體較佳具備交叉反應性。為簡化及更好地解譯前臨床研究，例如毒理及療效研究(例如在異體移植鼠中)，較佳方案為，本發明採用的抗體不僅與人類靶蛋白結合，亦在用於研究的物種中與物種靶蛋白結合。根據一種實施方式，除與人類靶蛋白以外，本發明採用的抗體亦具備與至少另一物種之靶蛋白的交叉反應性。對於毒理及療效研究，較佳採用嚙齒類、犬類及非人靈長類物種。較佳之嚙齒類物種為小鼠及大鼠。較佳之非人靈長類為恆河猴、黑猩猩及長尾獼猴。
根據一種實施方式，除與人類靶蛋白以外，本發明採用的抗體亦具備與至少另一物種之靶蛋白的交叉反應性，該至少另一物種係選自由小鼠、大鼠及長尾獼猴(Macaca fascicularis)構成之物種群。尤佳地，除與人類靶蛋白以外，本發明採用的抗體亦具備與小鼠靶蛋白的交叉反應性。較佳採用以下交叉反應性抗體：與相對人類靶蛋白之親和性相比，此抗體的相對其他非人類物種之靶蛋白的親和性不超過50倍，特別是不超過十倍。
針對癌症靶分子的抗體
結合劑(例如抗體或其抗原結合片段)較佳針對的靶分子為癌症靶分子。術語「癌症靶分子」係描述一靶分子，在一或多個癌細胞類型上，與相同組織類型之非癌細胞相比，其具備增殖性。較佳地，在一或多個癌細胞類型上，與相同組織類型之非癌細胞相比，癌症靶分子具備選擇性，其中選擇性表示，與相同組織類型之非癌細胞相比，癌細胞之富集度至少為兩倍(「選擇性的癌症靶分子」)。藉由使用癌症靶分子，能夠透過本發明之共軛物實現對癌細胞的選擇性療法。
本領域之一般執業者能夠藉由習知的方法(例如重組表現)製備，或者購買(例如自Merck KgaA，德國)特定針對某一抗原(例如癌細胞抗原)的抗體。習知的用於癌症治療的市售抗體例如有Erbitux®(西妥昔單抗，Merck KgaA)、Avastin®(貝伐單抗(Bevacizumab)，Roche)以及Herceptin®(曲妥珠單抗，Genentech)。曲妥珠單抗係IgG1kappa類別的重組人類化單株抗體，其在細胞檢定中以較高的親和性(Kd=5nM)與人類表皮生長因子受體之胞外域結合。以重組的方式在CHO細胞中製備此抗體。此等所有抗體皆可藉由透過PNGaseF實施之去糖基化，或者透過使重鏈之N297(Kabat編號)突變成任意胺基酸，而被作為此等抗體之變異體製備。
根據一種較佳實施方式，該靶分子為選擇性的癌症靶分子。
根據一種尤佳實施方式，該靶分子為蛋白質。
根據一種實施方式，該靶分子為胞外靶分子。根據一種較佳實施方式，該胞外靶分子為蛋白質。
癌症靶分子已為本領域技術人員所知。其實例將在下文中列舉。
癌症靶分子之實例為：
(1)EGF受體(NCBI參考序列NP_005219.2)，SEQ ID NO：213(1210胺基酸)：
>gi|29725609|ref|NP_005219.2| EGFR受體前驅體[智人]
Figure 105119613-A0202-12-0149-2576
胞外域係透過下劃線標示。
(2)間皮素(Mesothelin)(SwissProt參考Q13421-3)，SEQ ID NO：214(622個胺基酸)：
>sp|Q13421-3|MSLN_HUMAN間皮素的同功異型物2 OS=智人GN=MSLN
Figure 105119613-A0202-12-0149-2577
其中間皮素由胺基酸296-598編碼。胺基酸37-286為「巨核細胞增效因子」編碼。間皮素係透過GPI錨錨定在細胞膜中，以及定位在胞外。
(3)碳酸酐酶IX(SwissProt參考Q16790)，SEQ ID NO：215(459個胺基酸)：
>sp|Q16790|CAH9_HUMAN碳酸酐酶9 OS=智人GN=CA9 PE=1 SV=2
Figure 105119613-A0202-12-0150-2578
胞外域係透過下劃線標示。
(4)C4.4a(NCBI參考序列NP_055215.2；同物異名LYPD3)，SEQ ID NO：216(346個胺基酸)：
>gi|93004088|ref|NP_055215.2|含1y6/PLAUR域蛋白質3前驅體[智人]
Figure 105119613-A0202-12-0150-2579
胞外域係透過下劃線標示。
(5)CD52(NCBI參考序列NP_001794.2)，SEQ ID NO：217
>gi|68342030|ref|NP_001794.2| CAMPATH-1抗原前驅體[智人]
Figure 105119613-A0202-12-0150-2605
(6)Her2(NCBI參考序列NP_004439.2)，SEQ ID NO：218
>gi|54792096|ref|NP_004439.2|受體酪胺酸蛋白激酶erbB-2同功異型物a[智人]
Figure 105119613-A0202-12-0151-2580
(7)CD20(NCBI參考序列NP_068769.2)，SEQ ID NO：219
>gi|23110987|ref|NP_068769.2| B淋巴細胞抗原CD20[智人]
Figure 105119613-A0202-12-0151-2581
(8)淋巴細胞活化抗原CD30(SwissProt ID P28908)，SEQ ID NO：220
>gi|68348711|ref|NP_001234.2|腫瘤壞死因子受體超家族成員8同功異型物1前驅體[智人]
Figure 105119613-A0202-12-0151-2582
(9)淋巴細胞黏著分子CD22(SwissProt ID P20273)，SEQ ID NO：221
>gi|157168355|ref|NP_001762.2| B細胞受體CD22同功異型物1前驅體[智人]
Figure 105119613-A0202-12-0152-2583
(10)骨髓細胞表面抗原CD33(SwissProt ID P20138)，SEQ ID NO：222
>gi|130979981|ref|NP_001763.3|骨髓細胞表面抗原CD33同功異型物1前驅體[智人]
Figure 105119613-A0202-12-0152-2584
(11)跨膜糖蛋白NMB(SwissProt ID Q14956)，SEQ ID NO：223
>gi|52694752|ref|NP_001005340.1|跨膜糖蛋白NMB同功異型物a前驅體[智人]
Figure 105119613-A0202-12-0152-2585
(12)黏著分子CD56(SwissProt ID P13591)，SEQ ID NO：224
>gi|94420689|ref|NP_000606.3|神經細胞黏著分子1同功異型物1[智人]
Figure 105119613-A0202-12-0153-2586
(13)表面分子CD70(SwissProt ID P32970)，SEQ ID NO：225
>gi|4507605|ref|NP_001243.1| CD70抗原[智人]
Figure 105119613-A0202-12-0153-2587
(14)表面分子CD74(SwissProt ID P04233)，SEQ ID NO：226
>gi|10835071|ref|NP_004346.1| HLA II類組織相容性抗原γ鏈同功異型物b[智人]
Figure 105119613-A0202-12-0153-2588
(15)B淋巴細胞抗原CD19(SwissProt ID P15391)，SEQ ID NO：227
>gi|296010921|ref|NP_001171569.1| B淋巴細胞抗原CD19同功異型物1前驅體[智人]
Figure 105119613-A0202-12-0153-2589
(16)表面蛋白黏液素-1(Mucin-1)(SwissProt ID P15941)，SEQ ID NO：228
>gi|65301117|ref|NP_002447.4|黏液素-1同功異型物1前驅體[智人]
Figure 105119613-A0202-12-0154-2590
(17)表面蛋白CD138(SwissProt ID P18827)，SEQ ID NO：229
>gi|29568086|ref|NP_002988.3|黏結蛋白聚糖-1(syndecan-1)前驅體[智人]
Figure 105119613-A0202-12-0154-2591
(18)Integrin alpha V(Genbank登記號：NP_002201.1)，SEQ ID NO；230
>gi|4504763|ref|NP_002201.1| integrin alpha-V同功異型物1前驅體[智人]
Figure 105119613-A0202-12-0154-2592
(19)畸胎上皮癌衍生生長因子1蛋白質TDGF1(Genbank登記號：NP_003203.1)，SEQ ID NO：231
>gi|4507425|ref|NP_003203.1|畸胎上皮癌衍生生長因子1同功異型物1前驅體[智人]
Figure 105119613-A0202-12-0155-2593
(20)前列腺特異膜抗原PSMA(Swiss Prot ID：Q04609)，SEQ ID NO：232
>gi|4758398|ref|NP_004467.1|麩胺酸酯羧肽酶2同功異型物1[智人]
Figure 105119613-A0202-12-0155-2594
(21)酪胺酸蛋白激酶EPHA2(Swiss Prot ID：P29317)，SEQ ID NO：233
>gi|32967311|ref|NP_004422.2| A型腎上腺素受體2前驅體[智人]
Figure 105119613-A0202-12-0155-2595
(22)表面蛋白SLC44A4(Genbank登記號：NP_001171515)，SEQ ID NO：234
>gi|295849282|ref|NP_001171515.1|膽鹼轉運體樣蛋白4同功異 型物2[智人]
Figure 105119613-A0202-12-0156-2596
(23)表面蛋白BMPR1B(SwissProt：O00238)
(24)轉運蛋白SLC7A5(SwissProt：Q01650)
(25)上皮前列腺抗原STEAP1(SwissProt：Q9UHE8)
(26)卵巢癌抗原MUC16(SwissProt：Q8WXI7)
(27)轉運蛋白SLC34A2(SwissProt：O95436)
(28)表面蛋白SEMA5b(SwissProt：Q9P283)
(29)表面蛋白LYPD1(SwissProt：Q8N2G4)
(30)B型內皮素受體EDNRB(SwissProt：P24530)
(31)環指蛋白RNF43(SwissProt：Q68DV7)
(32)前列腺癌相關蛋白質STEAP2(SwissProt：Q8NFT2)
(33)陽離子通道TRPM4(SwissProt：Q8TD43)
(34)互補受體CD21(SwissProt：P20023)
(35)B細胞抗原受體錯合物相關蛋白質CD79b(SwissProt：P40259)
(36)細胞黏著抗原CEACAM6(SwissProt：P40199)
(37)二肽酶DPEP1(SwissProt：P16444)
(38)介白素受體IL20Ralpha(SwissProt：Q9UHF4)
(39)蛋白多糖BCAN(SwissProt：Q96GW7)
(40)腎上腺素受體EPHB2(SwissProt：P29323)
(41)前列腺幹細胞相關蛋白質PSCA(Genbank登記號： NP_005663.2)
(42)表面蛋白LHFPL3(SwissProt：Q86UP9)
(43)受體蛋白TNFRSF13C(SwissProt：Q96RJ3)
(44)B細胞抗原受體錯合物相關蛋白質CD79e(SwissProt：P11912)
(45)受體蛋白CXCR5(SwissProt：P32302)
(46)離子通道P2X5(SwissProt：Q93086)
(47)淋巴細胞抗原CD180(SwissProt：Q99467)
(48)受體蛋白FCRL1(SwissProt：Q96LA6)
(49)受體蛋白FCRL5(SwissProt；Q96RD9)
(50)II類MHC分子Ia抗原HLA-DOB(Genbank登記號：NP_002111.1)
(51)T細胞蛋白質VTCN1(SwissProt：Q7Z7D3)
(52)TWEAKR(SEQ ID NO：169(蛋白質)；SEQ ID NO：170(DNA))
(53)淋巴細胞抗原CD37(Swiss Prot：P11049)
(54)FGF受體2；FGFR2(Gene ID：2263；公認符號：FGFR2)。FGFR2受體存在各種剪接變異體(alpha、beta、IIIb、IIIc)。所有剪接變異體皆可用作靶分子。
(55)跨膜糖蛋白B7H3(CD276；Gene ID：80381)
(56)B細胞受體BAFFR(CD268；Gene ID：115650)
(57)受體蛋白ROR 1(Gene ID：4919)
(58)表面受體IL3RA(CD123；Gene ID：3561)
(59)CXC趨化因子受體CXCR5(CD185；Gene ID 643)
(60)受體蛋白Syncytin(Gene ID 30816)
根據本發明的一種較佳標的，該癌症靶分子係選自由癌症靶分 子(1)-(60)，特別是由(1)、(6)及(52)構成的群。
根據本發明的另一尤佳標的，該結合劑與一選自由癌症靶分子(1)-(60)，特別是由(1)、(6)及(52)構成的群的胞外癌症靶分子結合。
根據本發明的另一尤佳標的，該結合劑特異地與一選自由癌症靶分子(1)-(60)，特別是由(1)、(6)及(52)構成的群的胞外癌症靶分子結合。根據一種較佳實施方式，在靶細胞上與胞外靶分子結合後，該結合劑透過鍵結被該靶細胞內化。此點使得該結合劑-活性物質共軛物(可為免疫共軛物或ADC)被靶細胞吸收。隨後較佳在胞內，較佳以溶酶體的方式對該結合劑進行處理。
根據一種實施方式，該結合劑為結合蛋白。根據一種較佳實施方式，該結合劑為抗體、非糖基化抗體、抗原結合抗體片段、多特異性抗體或抗體模擬劑。
較佳之抗體模擬劑為Affibodies、Adnectins、Anticalins、DARPins、Avimers或Nanobodies。較佳之多特異性抗體為雙特異性或三特異性抗體。
根據一種較佳實施方式，該結合劑為抗體或抗原結合抗體片段，尤佳為分離的抗體或分離的抗原結合抗體片段。
較佳之抗原結合抗體片段為Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二體、Dabs、線性抗體及scFv。尤佳為Fab、二體及scFv。
根據一種尤佳實施方式，該結合劑為抗體。尤佳為單株抗體或其抗原結合抗體片段。進一步較佳地，該抗體為人類、人類化或嵌合抗體，或其抗原結合抗體片段。
本領域之一般執業者能夠藉由習知的方法，例如化學合成或重組表現，來製備與癌症靶分子結合的抗體或抗原結合抗體片段。針對癌症靶分子之結合劑係可購得，或者由本領域之一般執業者藉由習知的方法(例如化學合成或重組表現)製備，其他用於製備抗體或抗原結 合抗體片段的方法見於WO 2007/070538(參閱第22頁，「Antibodies」)。本領域技術人員已知若干方法，例如創建所謂之噬菌體呈現庫(例如Morphosys HuCAL Gold)，並使用其來發現抗體或抗原結合抗體片段(參閱WO 2007/070538，第24頁起，以及第70頁的抗體實例1，第72頁的抗體實例2)。使用B細胞DNA庫來製備抗體的其他方法例如見於第26頁(WO 2007/070538)。用於抗體之人類化的方法見於WO2007070538的第30-32頁，詳細描述參閱Queen等人，.Pros.Natl.Acad.Sci.USA 86：10029-10033,1989，或者WO 90/0786。此外，本領域技術人員已知通用的以及特別針對抗體的蛋白質重組表現方法(例如參閱Berger與Kimrnel(Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology，第152卷，Academic Press,Inc.)；Sambrook等人，(Molecular Cloning：A Laboratory Manual,(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Cold Spring Harbor,N.Y.；1989)第1-3卷)；Current Protocols in Molecular Biolony,(F.M.Ausabel等人[Eds.],Current Protocols,Green Publishing Associates,Inc./John Wiley & Sons,Inc.)；Harlow等人，(MonocIonal Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(19881,Paul[Ed.])；Fundamental Immunology,(Lippincott Williams & Wilkins(1998))；以及Harlow等人，(Using Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998))。本領域技術人員已知蛋白質/抗體表現所需的相應載體、啟動子及訊息肽。WO 2007/070538的第41-45頁亦描述過常用方法。WO 2007/070538的第74頁起的實例6中例如描述過製備IgG1抗體的方法。用於在與抗原結合後確定抗體之內化的方法已為本領域技術人員所知，例如見於WO 2007/070538的第80頁。本領域技術人員可使用WO 2007/070538中描述的製備碳酸酐酶IX(Mn)抗體的方法，以類似的方式製備具其他靶分子特異性的抗體。
抗EGFR抗體
與癌症靶分子EGFR結合之抗體的實例為西妥昔單抗(INN編號7906)、帕尼單抗(Panitumumab)(INN編號8499)及尼妥珠單抗(INN編號8545)。西妥昔單抗(Drug Bank登記號DB00002)係嵌合型抗EGFR1抗體，其在SP2/0小鼠骨髓瘤細胞中產生，並由ImClone Systems Inc/Merck KgaA/Bristol-Myers Squibb Co銷售。西妥昔單抗主治轉移性的、EGFR表現的、具野生型K-Ras基因的結腸直腸癌。此抗體之親和性為10-10M。
序列：
西妥昔單抗輕鏈(kappa)，SEQ ID NO：235：
Figure 105119613-A0202-12-0160-2597
西妥昔單抗重鏈，SEQ ID NO：236：
Figure 105119613-A0202-12-0160-2598
帕尼單抗(INN編號8499)(Drug Bank登記號DB01269)係重組單株人類IgG2抗體，其特異地與人類EGF受體1結合，並由Abgenix/Amgen銷售。帕尼單抗源自轉殖基因鼠(XenoMouse)之免疫。此等鼠能夠產生人類免疫球蛋白(輕鏈及重鏈)。選擇特異性的、產生針對EGFR之抗體的B細胞克隆，並透過CHO細胞(中國倉鼠卵巢細胞)使其永生化。此等細胞目前被用於製備乃至100%的人類抗體。帕尼單抗主治EGFR表現的、難以藉由採用氟嘧啶，奧沙利鉑(Oxaliplatin)及伊立替康(Irinotecan)之化學治療治癒的轉移性結腸直腸癌。該抗體之親和性為10-11M。
序列：
帕尼單抗輕鏈(kappa)，SEQ ID NO：237：
Figure 105119613-A0202-12-0161-2599
帕尼單抗重鏈，SEQ ID NO：238：
Figure 105119613-A0202-12-0161-2600
尼妥珠單抗(INN編號8545)(EP 00586002，EP 0071286)係人類化單株IgG1抗體，其特異地與人類EGF受體1結合，並由YM BioScienecs Inc.(Mississauga Canada)銷售。該抗體在非分泌的NSO細胞(哺乳動物細胞株)中產生。尼妥珠單抗被批准用於治療頭頸部腫瘤、高度惡性的星形細胞瘤及多形神經膠胚細胞瘤(不包括歐盟及美國)以及胰臟癌(罕用藥，EMA)。該抗體之親和性為10-8M。
尼妥珠單抗輕鏈(SEQ ID NO：239)：
Figure 105119613-A0202-12-0161-2601
尼妥珠單抗重鏈(SEQ ID NO：240)：
Figure 105119613-A0202-12-0161-2602
EGFR抗體之其他實施方式為：
●紮魯目單抗(Zalutumumab)/2F8/HuMax-EGFR,Genmab A/S公司(WO 02/100348,WO 2004/056847,INN編號8605)
●內西目單抗(Necitumumab)/11F8,ImClone/IMC-11F8,ImClone Systems Inc公司[Eli Lilly & Co](WO 2005/090407(EP 01735348-A1,US 2007/0264253-A1,US 7,598,350,WO 2005/090407-A1),INN編號9083)
●馬妥珠單抗(Matuzumab)/anti-EGFR MAb,Merck KGaA/anti-EGFR MAb,Takeda/EMD 72000/EMD-6200/EMD-72000與EMD-55900/MAb 425/單株抗體425,Merck KGaA/Takeda公司(WO 92/15683,INN編號8103(Matuzumab))
●RG-7160/GA-201/GA201/R-7160/R7160/RG7160/RO-4858696/RO-5083945/RO4858696/RO5083945,Glycart Biotechnology AG公司(Roche Holding AG)(WO 2010/112413-A1,WO 2010/115554)
●GT-MAB 5.2-GEX/CetuGEX,Glycotope GmbH公司(WO 2008/028686-A2(EP 01900750-A1,EP 01911766-A1,EP 02073842-A2,US 2010/0028947-A1)
●ISU-101,Isu Abxis Inc公司(ISU Chemical Co Ltd)/Scancell(WO 2008/004834-A1)
●ABT-806/mAb-806/ch-806/抗EGFR單株抗體806,Ludwig Institute for Cancer Research/Abbott/Life Science Pharmaceuticals(WO 02/092771,WO 2005/081854及WO 2009/023265)
●SYM-004(由兩個嵌合IgG1抗體(992與1024)組成)，Symphogen A/S公司(WO 2010/022736-A2)
●MR1-1/MR1-1KDEL,IVAX Corp公司(Teva Pharmaceutical Industries Ltd)(Duke University),(專利：WO2001/062931-A2)
●抗缺失突變體抗體，EGFRvIII,Amgen/Abgenix公司(WO 2005/010151,US 7,628,986)
●SC-100,Scancell Ltd公司(WO 01/088138-A1)
●MDX-447/EMD 82633/BAB-447/H 447/MAb,EGFR,Medarex/Merck KgaA,Bristol-Myers Squibb(US)/Merck KGaA(DE)/Takeda(JP),(WO 91/05871,WO 92/15683)
●anti-EGFR-Mab,Xencor公司(WO 2005/056606)
●DXL-1218/抗EGFR單株抗體(癌症)，InNexus,InNexus Biotechnology Inc公司，Pharmaprojects PH048638
根據一種較佳實施方式，此抗EGFR抗體較佳選自由西妥昔單抗、帕尼單抗、尼妥珠單抗、紮魯目單抗、內西目單抗、馬妥珠單抗、RG-716、GT-MAB 5.2-GEX、ISU-101、ABT-806、SYM-004、MR1-1、SC-100、MDX-447及DXL-1218構成之群。
根據一種尤佳實施方式，此抗EGFR抗體係選自由西妥昔單抗、帕尼單抗、尼妥珠單抗、紮魯目單抗、內西目單抗及馬妥珠單抗構成之群。
本領域技術人員已知若干方法，以透過序列變異自上述抗體之CDR區域製備更多抗體，其親和性及/或相對靶分子之特異性相似或更佳。
根據另一實施方式，抗EGFR抗體或抗原結合抗體片段係選自由以下構成之群
抗體或抗原結合抗體片段，其包括以下抗體中之一個的三個輕鏈CDR區域及三個重鏈CDR區域：西妥昔單抗、帕尼單抗、尼妥珠單抗、紮魯目單抗、內西目單抗、馬妥珠單抗、RG-716、GT-MAB 5.2-GEX、ISU-101、ABT-806、SYM-004、MR1-1、SC-100、MDX-447及DXL-1218。
根據另一實施方式，抗EGFR抗體或抗原結合抗體片段係選自由以下構成之群
抗體或抗原結合抗體片段，其包括以下抗體中之一個的三個輕鏈CDR區域及三個重鏈CDR區域：西妥昔單抗、帕尼單抗、尼妥珠單抗、紮魯目單抗、內西目單抗、馬妥珠單抗。此等抗體及其抗原結合片段係透過引述納入本發明，並可在本發明之範圍內使用。
抗碳酸酐酶IX抗體
與癌症靶分子碳酸酐酶IX結合的抗體的實例見於WO 2007/070538-A2(例如請求項1-16)。
根據一種較佳實施方式，抗碳酸酐酶IX抗體或抗原結合抗體片段係選自由以下構成之群：抗碳酸酐酶IX抗體，或者抗原結合抗體片段3ee9(WO 2007/070538-A2中之請求項4(a))、3ef2(WO 2007/070538-A2中之請求項4(b))、1e4(WO 2007/070538-A2中之請求項4(c))、3a4(WO 2007/070538-A2中之請求項4(d))、3ab4(WO 2007/070538-A2中之請求項4(e))、3ah10(WO 2007/070538-A2中之請求項4(f))、3bb2(WO 2007/070538-A2中之請求項4(g))、1aa1(WO 2007/070538-A2中之請求項4(h))、5a6(WO 2007/070538-A2中之請求項4(i))以及5aa3(WO 2007/070538-A2中之請求項4(j))。
抗C4.4a抗體：
根據本發明，可採用C4.4a抗體。
C4.4a抗體及抗原結合片段的實例見於WO2012/143499 A2。WO2012/143499 A2之所有抗體皆透過引述納入本發明，並可在本發明中使用。此等抗體之序列在WO2012/143499 A2之表1中給出，其中每行皆反映列1中列出之抗體之可變輕鏈或可變重鏈的相應CDR胺基酸序列。
根據一種實施方式，在與C4.4a表現細胞結合後，此抗C4.4a抗體 或其抗原結合抗體片段被該細胞內化。
根據另一實施方式，抗C4.4a抗體或抗原結合抗體片段包括WO2012/143499 A2之表1或WO2012/143499 A2之表2中列出之抗體的至少一個、兩個或三個CDR胺基酸序列。此種抗體之較佳實施方式亦在WO2012/143499 A2中列舉，並透過引述納入本發明。
抗HER2抗體：
與癌症靶分子Her2結合之抗體的實例為曲妥珠單抗(Genentech)。曲妥珠單抗係主治乳腺癌的人類化抗體。
除曲妥珠單抗(INN 7637，CAS號：RN：180288-69-1)與帕妥珠單抗(Pertuzumab)(Cas號：380610-27-5)以外，與HER2結合之抗體的其他實例為WO 2009/123894-A2、WO 200/8140603-A2或WO 2011/044368-A2中公開過的抗體。抗HER2共軛物的實例為曲妥珠單抗-埃姆坦辛(Trastuzumab-Emtansine)(INN編號9295)。此等抗體及其抗原結合片段係透過引述納入本發明，並可在本發明之範圍內使用。此外，亦可使用曲妥珠單抗之非糖基化變異體，其要麼藉由透過PNGaseF實施之去糖基化，要麼透過使重鏈之N297(Kabat編號)突變成任意胺基酸來產生。此外亦可使用抗體之以下變異體：其經過工程設計，從而含有一或多個用於經轉麩醯胺酸酶促進之反應的受體麩醯胺酸。
抗CD20抗體：
與癌症靶分子CD20結合之抗體的實例為利妥昔單抗(Rituximab)(Genentech)。利妥昔單抗(CAS號：174722-31-7)係用於治療非霍奇金淋巴瘤的嵌合抗體。此等抗體及其抗原結合片段係透過引述納入本發明，並可在本發明之範圍內使用。
抗CD52抗體：
與癌症靶分子CD52結合之抗體的實例為阿侖單抗(Alemtuzumab) (Genzyme)。阿侖單抗(CAS號：216503-57-0)係用於治療慢性淋巴球性白血病的人類化抗體。此等抗體及其抗原結合片段係透過引述納入本發明，並可在本發明之範圍內使用。
抗間皮素抗體：
抗間皮素抗體的實例例如見於WO 2009/068204。
WO 2009/068204中描述的所有抗體皆透過引述納入本發明，故此等抗體可在本發明之範圍內使用。
本發明採用之抗間皮素抗體較佳還具有以下特徵：與間皮素的不變鍵結。不變鍵結的特徵例如在於，本發明採用之抗體與間皮素之無法透過另一胞外蛋白質掩蓋的抗原決定基結合。此另一胞外蛋白質例如為卵巢癌抗原125(CA125)。較佳採用之抗體的特徵在於，其與間皮素的結合不被CA125阻斷。
抗CD30抗體
能夠與癌症靶分子CD30結合並用於治療癌症(例如霍奇金淋巴瘤)的抗體的實例為布妥昔單抗(Brentuximab)、伊妥木單抗(Iratumumab)，以及例如WO 2008/092117、WO 2008/036688或WO 2006/089232所公開之抗體。抗CD30共軛物的實例為布妥昔單抗維多亭(Brentuximab Vedotin)(INN編號9144)。此等抗體及其抗原結合片段係透過引述納入本發明，並可在本發明之範圍內使用。
抗CD22抗體
能夠與癌症靶分子CD22結合並用於治療癌症(例如淋巴瘤)的抗體的實例為伊珠單抗(Inotuzumab)或依帕珠單抗(Epratuzumab)。抗CD22共軛物的實例為伊珠單抗奧加米星(Inotuzumab Ozagamycin)(INN編號8574)，或者抗CD22 MMAE，以及抗CD22 MC-MMAE(CAS RN：139504-50-0及474645-27-7)。此等抗體及其抗原結合片段係透過引述納入本發明，並可在本發明之範圍內使用。
抗CD33抗體
能夠與癌症靶分子CD33結合並用於治療癌症(例如白血病)的抗體的實例為吉妥珠單抗(Gemtuzumab)或林妥珠單抗(Lintuzumab)(INN 7580)。抗CD33共軛物的實例為吉妥珠單抗奧加米星(Gemtuzumab-Ozagamycin)。此等抗體及其抗原結合片段係透過引述納入本發明，並可在本發明之範圍內使用。
抗NMB抗體
能夠與癌症靶分子NMB結合並用於治療癌症(例如黑素瘤或乳腺癌)的抗體的實例為格雷巴目單抗(Glembatumumab)(INN 9199)。抗NMB共軛物的實例為格雷巴目單抗維多亭(Glembatumumab Vedotin)(CAS RN：474645-27-7)。此等抗體及其抗原結合片段係透過引述納入本發明，並可在本發明之範圍內使用。
抗CD56抗體
能夠與癌症靶分子CD56結合並用於治療癌症(例如多發性骨髓瘤、小細胞肺癌、MCC或卵巢癌)的抗體的實例為洛沃珠單抗(Lorvotuzumab)。抗CD56共軛物的實例為洛沃珠單抗美登素(Lorvotuzumab Mertansine)(CAS RN：139504-50-0)。此等抗體及其抗原結合片段係透過引述納入本發明，並可在本發明之範圍內使用。
抗CD70抗體
能夠與癌症靶分子CD70結合並用於治療癌症(例如非霍奇金淋巴瘤或腎細胞癌)的抗體的實例見於WO 2007/038637-A2或WO 2008/070593-A2。抗CD70共軛物的實例為SGN-75(CD70 MMAF)。此等抗體及其抗原結合片段係透過引述納入本發明，並可在本發明之範圍內使用。
抗CD74抗體
能夠與癌症靶分子CD74結合並用於治療癌症(例如多發性骨髓 瘤)的抗體的實例為米拉圖珠單抗(Milatuzumab)。抗CD74共軛物的實例為米拉圖珠單抗-阿黴素(Milatuzumab-Doxorubicin)(CAS RN：23214-92-8)。此等抗體及其抗原結合片段係透過引述納入本發明，並可在本發明之範圍內使用。
抗CD19抗體
能夠與癌症靶分子CD19結合並用於治療癌症(例如非霍奇金淋巴瘤)的抗體的實例見於WO 2008/031056-A2。其他抗體以及抗CD19共軛物的實例(SAR3419)見於WO 2008/047242-A2。此等抗體及其抗原結合片段係透過引述納入本發明，並可在本發明之範圍內使用。
抗黏液素抗體
能夠與癌症靶分子黏液素-1(Mucin-1)結合並用於治療癌症(例如非霍奇金淋巴瘤)的抗體的實例為克立伐珠單抗(Clivatuzumab)，或者WO 2003/106495-A2、WO 2008/028686-A2所公開之抗體。抗黏液素共軛物的實例見於WO 2005/009369-A2。此等抗體及其抗原結合片段係透過引述納入本發明，並可在本發明之範圍內使用。
抗CD138抗體
能夠與癌症靶分子CD138結合並用於治療癌症(例如多發性骨髓瘤)的抗體及其共軛物的實例見於WO 2009/080829-A1、WO 2009/080830-A1。此等抗體及其抗原結合片段係透過引述納入本發明，並可在本發明之範圍內使用。
抗Integrin-alphaV抗體
能夠與癌症靶分子Integrin alphaV結合並用於治療癌症(例如黑素瘤、肉瘤或癌瘤)的抗體的實例為英妥木單抗(Intetumumab)(Cas RN：725735-28-4)、阿昔單抗(Abciximab)(Cas-RN：143653-53-6)、埃達珠單抗(Etaracizumab)(Cas-RN：892553-42-3)，或者US 7,465,449、EP 719859-A1、WO 2002/012501-A1或WO2006/062779-A2所公開的抗 體。抗Integrin AlphaV共軛物的實例為Intetumumab-DM4，以及WO 2007/024536-A2公開的其他ADC。此等抗體及其抗原結合片段係透過引述納入本發明，並可在本發明之範圍內使用。
抗TDGF1抗體
能夠與癌症靶分子TDGF1結合並用於治療癌症的抗體的實例為WO 02/077033-A1、US 7,318,924、WO 2003/083041-A2以及WO 2002/088170-A2所公開的抗體。抗TDGF1共軛物的實例見於WO 2002/088170-A2。此等抗體及其抗原結合片段係透過引述納入本發明，並可在本發明之範圍內使用。
抗PSMA抗體
能夠與癌症靶分子PSMA結合並用於治療癌症(例如前列腺癌)的抗體的實例為WO 97/35616-A1、WO 99/47554-A1、WO 01/009192-A1及WO2003/034903所公開的抗體。抗PSMA共軛物的實例見於WO 2009/026274-A1及WO 2007/002222。此等抗體及其抗原結合片段係透過引述納入本發明，並可在本發明之範圍內使用。
抗EPHA2抗體
能夠與癌症靶分子EPHA2結合並用於製備共軛物及治療癌症的抗體的實例見於WO 2004/091375-A2。此等抗體及其抗原結合片段係透過引述納入本發明，並可在本發明之範圍內使用。
抗SLC44A4抗體
能夠與癌症靶分子SLC44A4結合並用於製備共軛物及治療癌症(例如胰臟癌或前列腺癌)的抗體的實例見於WO2009/033094-A2及US2009/0175796-A1。此等抗體及其抗原結合片段係透過引述納入本發明，並可在本發明之範圍內使用。
抗HLA-DOB抗體
與癌症靶分子HLA-DOB結合的抗體的實例為Lym-1(Cas-RN： 301344-99-00)，其可用於治療癌症，例如非霍奇金淋巴瘤。抗HLA-DOB共軛物的實例例如見於WO 2005/081711-A2。此等抗體及其抗原結合片段係透過引述納入本發明，並可在本發明之範圍內使用。
抗VTCN1抗體
能夠與癌症靶分子VTCN1結合並用於製備共軛物及治療癌症(例如卵巢癌、胰臟癌、肺癌或乳腺癌)的抗體的實例見於WO 2006/074418-A2。此等抗體及其抗原結合片段係透過引述納入本發明，並可在本發明之範圍內使用。
抗FGFR2抗體
根據本發明，可採用抗FGFR2抗體。
抗FGFR2抗體及抗原結合片段的實例見於WO2013076186。WO2013076186之所有抗體皆透過引述納入本發明，並可在本發明中使用。此等抗體之序列在WO2013076186的表9及表10中給出。較佳採用自稱作M048-D01及M047-D08之抗體派生的抗體、抗原結合片段以及抗體變異體。較佳之抗FGFR2抗體與各種習知的FGFR2剪接變異體結合。
根據一種實施方式，在與FGFR2表現細胞結合後，抗FGFR2抗體或其抗原結合抗體片段被該細胞內化。
根據另一實施方式，抗FGFR2抗體或抗原結合抗體片段包括WO2013076186之表9或表10中列出之抗體的至少一個、兩個或三個CDR胺基酸序列。此類抗體之較佳實施方式亦在WO2013076186中列舉，並透過引述納入本發明。
抗TWEAKR抗體
根據一種較佳實施方式，如在本發明之方法中使用抗TWEAKR抗體或其抗原結合片段，則其係自下文描述之抗體/抗原結合片段中選取(亦見於WO2014/198817(A1))。此外，與TWEAKR結合的抗體係 為本領域技術人員所知，例如參閱WO2009/020933(A2)或WO2009140177(A2)。此外，亦可使用所述抗TweakR抗體之非糖基化變異體，其要麼藉由透過PNGaseF實施之去糖基化，要麼透過使重鏈之N297(Kabat編號)突變成任意胺基酸來產生。此外亦可使用抗體之以下變異體：其經過工程設計，從而含有一或多個用於經轉麩醯胺酸酶促進之反應的受體麩醯胺酸。
本發明特別是關於包含抗體或其抗原結合抗體片段或其變異體的共軛物，其導致TWEAKR(SEQ ID NO：169(蛋白質)；SEQ ID NO：170(DNA))的高度活化，進而在各種呈現TWEAKR過表現的癌細胞中引起對細胞凋亡的高度誘導。
就細胞凋亡之誘導以及前述抗TWEAKR抗體(例如PDL-192)的增殖抑制而言，TWEAKR之激發活性有限，達不到內源性配體TWEAK之效果。激發活性的不足並非歸因於親和性的減小，因為與內源性配體TWEAK相比，此等抗體與TWEAKR結合時的親和性處於相似範圍內(Michaelson JS等人，MAbs.2011 Jul-Aug；3(4)：362-75；Culp PA等人，Clin Cancer Res.2010 Jan 15；16(2)：497-508)，以及，具更高親和性之抗體亦並不一定呈現更加有效的發信活性(Culp PA等人，Clin Cancer Res.2010 Jan 15；16(2)：497-508)。此外事實表明，前述抗體之抗腫瘤活性取決於Fc效應子功能，以及，ADCC對小鼠模型中的活體內效果起重要作用。
抗TWEAKR抗體的製備
使用完整的人類抗體-噬菌體庫(Hoet RM等人，Nat Biotechnol 2005；23(3)：344-8)，以透過將人類及小鼠TWEAKR之二聚且Fc官能化的胞外域作為靶的蛋白質篩選(Hoogenboom H.R.,Nat Biotechnol 2005；23(3)：1105-16)，將TWEAK特異的人類單株抗體分離。對11個不同的Fab噬菌體進行識別，並將相應抗體克隆至一哺乳動物EgG表現 載體，其提供可溶之Fab中缺少的CH2-CH3域。在識別較佳之抗體後，將其作為全長IgG表現。透過引入相應抗體之重鏈的N297A或N297Q突變，製備所述抗體之非糖基化變異體。例如短暫地在哺乳動物細胞中表現此等結構，例如參閱Tom等人，Methods Express：Expression Systems herausgegeben von Micheal R.Dyson and Yves Durocher,Scion Publishing Ltd,2007，第12章(參閱抗體實例1)。透過蛋白A層析法將抗體純化，並如抗體實例2所述，透過ELISA及BIAcore分析確定其與可溶之單體TWEAKR的親和性特徵。為確定抗TWEAKR抗體之細胞結合特徵，在一系列細胞株(HT29，HS68，HS578)上透過流動式細胞測量術對結合特性進行檢驗。實施NF κ B報導基因檢定，以檢測識別的所有11個抗體的激發活性(人類IgG1)。選擇活體外效果最強的抗體(TPP-883)，以作進一步的效果及親和性成熟(詳細信息參閱抗體實例1)。對激發活性有所改進的單取代變異體進行驗證：CDR-H3之G102T。最後基於有所改進之親和性，以與最佳單取代變異體G102T比較的方式選擇7個變異體。將其相應的DNA克隆至一哺乳動物IgG表現載體，並在上述NF-kappaB報導基因檢定中對官能活性進行檢驗。最後將獲得的序列與人類生殖系序列比較，並在不顯著影響親和性及效果的情況下對偏差進行調整。透過抗體庫篩選，以及透過親和性及/或效果成熟獲得以下抗體：「TPP-2090」、「TPP-2149」、「TPP-2093」、「TPP-2148」、「TPP-2084」、「TPP-2077」、「TPP-1538」、「TPP-883」、「TPP-1854」、「TPP-1853」、「TPP-1857」及「TPP-1858」。
可進一步藉由習知的方法，例如抗體噬菌體呈現篩選(例如參閱Hoet RM等人，Nat Biotechnol 2005；23(3)：344-8)，良好建立的融合瘤技術(例如參閱Köhler與Milstein,Nature.1975 Aug 7；256(5517)：495-7)，或者透過小鼠之免疫，主要是hMAb小鼠(例如VelocImmune mouse®)之免疫獲得本發明之抗體。
抗TWEAKR抗體之特殊實施方式
根據本發明的一種實施方式，製備抗體或其抗原結合抗體片段或其變異體，其在一或多個TWEAKR表現細胞株中呈現對卡斯蛋白酶3/7的高度誘導。根據一種較佳實施方式，該一或多個TWEAKR表現細胞株包含在由WiDr、A253、NCI-H322、HT29及786-O組成之群中。可藉由習知的常用方法，包括在此描述的方法，對「卡斯蛋白酶3/7之誘導」進行量測。根據一種實施方式，在此發明中，在使用藉由卡斯蛋白酶3/7溶液(Promega，#G8093)實施的活性測定，以及在VICTOR V(Perkin Elmer)上讀出發光的情況下，確定「卡斯蛋白酶3/7之誘導」。在培育時間之末尾確定卡斯蛋白酶3/7之活性，並與未經處理之細胞比較卡斯蛋白酶3/7之誘導係數。在此誘導係數大於1.2，較佳大於1.5，尤佳大於1.8，尤佳大於2.1，尤佳大於2.5的情況下，抗體便具有對卡斯蛋白酶3/7之「高度誘導」。製備與前述激發抗體[例如PDL-192(TPP-1104)，P4A8(TPP-1324)，136.1(TPP-2194)]相比，以及與300ng/ml重組人類TWEAK相比，在HT29細胞中實現對卡斯蛋白酶3/7之更高程度誘導的抗TWEAKR抗體。在WiDr-、A253-、NIC-H322-及786-O-細胞中，亦觀測到此在癌細胞中高度誘導卡斯蛋白酶3/7的效果，其中與參考抗體[PDL-192(TPP-1104)，P4A8(TPP-1324)]以及與300ng/ml TWEAK相比，本發明研究的抗體在多數實驗中誘導更高的變化係數。本發明的一些抗體僅以適度的親和性與TWEAKR結合，此親和性遠低於內源性配體TWEAK之親和性，亦低於其他習知的激發抗體。此特性實現更多優點，例如更深地進入腫瘤的潛力。
就此而言，根據本發明的一種實施方式，製備抗體或其抗原結合抗體片段，其在一新的抗原決定基上特異地與TWEAKR結合，此抗 原決定基之特徵在於，與TWEAKR(SEQ ID NO：169；另見圖1)之位置47(D47)上的天冬胺酸鹽(D)選擇性結合。為抗體相互作用識別的特定TWEAKR胺基酸的關聯性係與為此等抗體確定的激發活性相關。天然配體TWEAK呈現TWEAKR的有效活化，並根據TWEAKR之富半胱胺酸域中的白胺酸46結合(Pellegrini等人，FEBS 280：1818-1829)。P4A8呈現極低的激發活性，並至少部分地與TWEAKR之富半胱胺酸域外的域進行相互作用。PDL-192呈現適度的激發活性，並根據R56與富半胱胺酸域結合，但與TWEAK配體位點相對。本發明之抗體(例如TPP-2090)根據D47進行結合，且TWEAK根據L46進行結合。故TWEAK與一相似但可區分的結合位點結合(圖7)。因此，本發明之呈現高激發活性的抗體與一針對抗體的新抗原決定基(D47相關)結合，此抗原決定基與極高的激發活性關聯。
TWEAKR(SEQ ID NO：169)之位置47上的胺基酸(D47)被視作：對與本發明之抗體的結合而言具關鍵性的胺基酸，意即，在抗體因此殘基在丙胺酸中之變化而失去多於20%，或者多於30%，或者多於40%，或者多於50%，或者多於60%，或者多於70%，或者多於80%，或者多於90%，或者100%的ELISA訊號的情況下(如抗體實例2及圖6所述)，此抗體特異地與TWEAKR(SEQ ID NO：169)之位置47上的D(D47)結合。作為替代方案，在與TPP-2203相比時抗體在TPP-2614上失去多於20%，或者多於30%，或者多於40%，或者多於50%，或者多於60%，或者多於70%，或者多於80%，或者多於90%，或者100%的ELISA訊號的情況下，此抗體特異地與TWEAKR(SEQ ID NO：169)之位置47上的D(D47)結合。較佳地，在與TPP-2203相比時抗體在TPP-2614上失去多於80%的ELISA訊號的情況下，此抗體特異地與TWEAKR(SEQ ID NO：169)之位置47上的D(D47)結合。
在本申請案中，將下表示出的本發明之較佳抗體作為參考： 「TPP-2090」、「TPP-2149」、「TPP-2093」、「TPP-2148」、「TPP-2084」、「TPP-2077」、「TPP-1538」、「TPP-883」、「TPP-1854」、「TPP-1853」、「TPP-1857」、「TPP-1858」、「TPP-2658」。
Figure 105119613-A0202-12-0175-2603
TPP-2090為包括與SEQ ID NO：2對應之重鏈區域以及與SEQ ID NO：1對應之輕鏈區域的抗體。
TPP-2658為包括與SEQ ID NO：241對應之重鏈區域以及與SEQ ID NO：1對應之輕鏈區域的抗體。
TPP-5442為包括與SEQ ID NO：242對應之重鏈區域以及與SEQ ID NO：1對應之輕鏈區域的抗體。
TPP-8825為包括與SEQ ID NO：243對應之重鏈區域以及與SEQ ID NO：1對應之輕鏈區域的抗體。
TPP-2149為包括與SEQ ID NO：12對應之重鏈區域以及與SEQ ID NO：11對應之輕鏈區域的抗體。
TPP-2093為包括與SEQ ID NO：22對應之重鏈區域以及與SEQ ID NO：21對應之輕鏈區域的抗體。
TPP-2148為包括與SEQ ID NO：32對應之重鏈區域以及與SEQ ID NO：31對應之輕鏈區域的抗體。
TPP-2084為包括與SEQ ID NO：42對應之重鏈區域以及與SEQ ID NO：41對應之輕鏈區域的抗體。
TPP-2077為包括與SEQ ID NO：52對應之重鏈區域以及與SEQ ID NO：51對應之輕鏈區域的抗體。
TPP-1538為包括與SEQ ID NO：62對應之重鏈區域以及與SEQ ID NO：61對應之輕鏈區域的抗體。
TPP-883為包括與SEQ ID NO：72對應之重鏈區域以及與SEQ ID NO：71對應之輕鏈區域的抗體。
TPP-1854為包括與SEQ ID NO：82對應之重鏈區域以及與SEQ ID NO：81對應之輕鏈區域的抗體。
TPP-1853為包括與SEQ ID NO：92對應之重鏈區域以及與SEQ ID NO：91對應之輕鏈區域的抗體。
TPP-1857為包括與SEQ ID NO：102對應之重鏈區域以及與SEQ ID NO：101對應之輕鏈區域的抗體。
TPP-1858為包括與SEQ ID NO：112對應之重鏈區域以及與SEQ ID NO：111對應之輕鏈區域的抗體。
TPP-2090為包括與SEQ ID NO：10對應之重鏈可變區域以及與SEQ ID NO：9對應之輕鏈可變區域的抗體。
TPP-2658為包括與SEQ ID NO：10對應之重鏈可變區域以及與SEQ ID NO：9對應之輕鏈可變區域的抗體。
TPP-5442為包括與SEQ ID NO：10對應之重鏈可變區域以及與SEQ ID NO：9對應之輕鏈可變區域的抗體。
TPP-8825為包括與SEQ ID NO：10對應之重鏈可變區域以及與SEQ ID NO：9對應之輕鏈可變區域的抗體。
TPP-2149為包括與SEQ ID NO：20對應之重鏈可變區域以及與SEQ ID NO：19對應之輕鏈可變區域的抗體。
TPP-2093為包括與SEQ ID NO：30對應之重鏈可變區域以及與SEQ ID NO：29對應之輕鏈可變區域的抗體。
TPP-2148為包括與SEQ ID NO：40對應之重鏈可變區域以及與SEQ ID NO：39對應之輕鏈可變區域的抗體。
TPP-2084為包括與SEQ ID NO：50對應之重鏈可變區域以及與SEQ ID NO：49對應之輕鏈可變區域的抗體。
TPP-2077為包括與SEQ ID NO：60對應之重鏈可變區域以及與SEQ ID NO：59對應之輕鏈可變區域的抗體。
TPP-1538為包括與SEQ ID NO：70對應之重鏈可變區域以及與SEQ ID NO：69對應之輕鏈可變區域的抗體。
TPP-883為包括與SEQ ID NO：80對應之重鏈可變區域以及與SEQ ID NO：79對應之輕鏈可變區域的抗體。
TPP-1854為包括與SEQ ID NO：90對應之重鏈可變區域以及與SEQ ID NO：89對應之輕鏈可變區域的抗體。
TPP-1853為包括與SEQ ID NO：100對應之重鏈可變區域以及與SEQ ID NO：99對應之輕鏈可變區域的抗體。
TPP-1857為包括與SEQ ID NO：110對應之重鏈可變區域以及與SEQ ID NO：109對應之輕鏈可變區域的抗體。
TPP-1858為包括與SEQ ID NO：120對應之重鏈可變區域以及與SEQ ID NO：119對應之輕鏈可變區域的抗體。
表：抗體之DNA序列
Figure 105119613-A0202-12-0178-2604
抗TWEAKR抗體之較佳實施方式如下：非糖基化抗TWEAKR抗體或其抗原結合片段，此抗體/抗原結合片段特異地與TWEAKR(SEQ ID NO：169)之位置47上的D(D47)結合。
根據實施方式1的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為激發抗體。
根據實施方式1或2的抗體或其抗原結合片段，此抗體/抗原結合片段包括：一可變重鏈，包括：重鏈之CDR1，其由包括式PYPMX(SEQ ID NO：171)之胺基酸序列編碼，其中X為I或M；重鏈之CDR2，其由包括式YISPSGGXTHYADSVKG(SEQ ID NO：172)之胺基酸序列編碼，其中X為S或K；以及重鏈之CDR3，其由包括式GGDTYFDYFDY(SEQ ID NO：173)之胺基酸序列編碼；以及一可變輕鏈，包括： 輕鏈之CDR1，其由包括式RASQSISXYLN(SEQ ID NO：174)之胺基酸序列編碼，其中X為G或S；輕鏈之CDR2，其由包括式XASSLQS(SEQ ID NO：175)之胺基酸序列編碼，其中X為Q、A或N；以及輕鏈之CDR3，其由包括式QQSYXXPXIT(SEQ ID NO：176)之胺基酸序列編碼，其中位置5上之X為T或S，位置6上之X為T或S，且位置8上之X為G或F。
根據上述實施方式中任一個的抗體或其抗原結合片段包括：一可變重鏈，包括如SEQ ID NO：6所示之重鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：7所示之重鏈可變CDR2序列、如SEQ ID NO：8所示之重鏈可變CDR3序列，以及一可變輕鏈，包括如SEQ ID NO：3所示之輕鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：4所示之輕鏈可變CDR2序列、如SEQ ID NO：5所示之輕鏈可變CDR3序列，或者一可變重鏈，包括如SEQ ID NO：16所示之重鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：17所示之重鏈可變CDR2序列、如SEQ ID NO：18所示之重鏈可變CDR3序列，以及一可變輕鏈，包括如SEQ ID NO：13所示之輕鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：14所示之輕鏈可變CDR2序列、如SEQ ID NO：15所示之輕鏈可變CDR3序列，或者一可變重鏈，包括如SEQ ID NO：26所示之重鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：27所示之重鏈可變CDR2序列、如SEQ ID NO：28所示之重鏈可變CDR3序列，以及一可變輕鏈，包括如SEQ ID NO：23所示之輕鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：24所示之輕鏈可變CDR2序列、如SEQ ID NO：25所示之輕鏈可變CDR3序列，或者 一可變重鏈，包括如SEQ ID NO：36所示之重鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：37所示之重鏈可變CDR2序列、如SEQ ID NO：38所示之重鏈可變CDR3序列，以及一可變輕鏈，包括如SEQ ID NO：33所示之輕鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：34所示之輕鏈可變CDR2序列、如SEQ ID NO：35所示之輕鏈可變CDR3序列，或者一可變重鏈，包括如SEQ ID NO：46所示之重鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：47所示之重鏈可變CDR2序列、如SEQ ID NO：48所示之重鏈可變CDR3序列，以及一可變輕鏈，包括如SEQ ID NO：43所示之輕鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：44所示之輕鏈可變CDR2序列、如SEQ ID NO：45所示之輕鏈可變CDR3序列，或者一可變重鏈，包括如SEQ ID NO：56所示之重鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：57所示之重鏈可變CDR2序列、如SEQ ID NO：58所示之重鏈可變CDR3序列，以及一可變輕鏈，包括如SEQ ID NO：53所示之輕鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：54所示之輕鏈可變CDR2序列、如SEQ ID NO：55所示之輕鏈可變CDR3序列，或者一可變重鏈，包括如SEQ ID NO：66所示之重鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：67所示之重鏈可變CDR2序列、如SEQ ID NO：68所示之重鏈可變CDR3序列，以及一可變輕鏈，包括如SEQ ID NO：63所示之輕鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：64所示之輕鏈可變CDR2序列、如SEQ ID NO：65所示之輕鏈可變CDR3序列，或者一可變重鏈，包括如SEQ ID NO：76所示之重鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：77所示之重鏈可變CDR2序列、如SEQ ID NO：78所示 之重鏈可變CDR3序列，以及一可變輕鏈，包括如SEQ ID NO：73所示之輕鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：74所示之輕鏈可變CDR2序列、如SEQ ID NO：75所示之輕鏈可變CDR3序列，或者一可變重鏈，包括如SEQ ID NO：86所示之重鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：87所示之重鏈可變CDR2序列、如SEQ ID NO：88所示之重鏈可變CDR3序列，以及一可變輕鏈，包括如SEQ ID NO：83所示之輕鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：84所示之輕鏈可變CDR2序列、如SEQ ID NO：85所示之輕鏈可變CDR3序列，或者一可變重鏈，包括如SEQ ID NO：96所示之重鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：97所示之重鏈可變CDR2序列、如SEQ ID NO：98所示之重鏈可變CDR3序列，以及一可變輕鏈，包括如SEQ ID NO：93所示之輕鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：94所示之輕鏈可變CDR2序列、如SEQ ID NO：95所示之輕鏈可變CDR3序列，或者一可變重鏈，包括如SEQ ID NO：106所示之重鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：107所示之重鏈可變CDR2序列、如SEQ ID NO：108所示之重鏈可變CDR3序列，以及一可變輕鏈，包括如SEQ ID NO：103所示之輕鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：104所示之輕鏈可變CDR2序列、如SEQ ID NO：105所示之輕鏈可變CDR3序列，或者一可變重鏈，包括如SEQ ID NO：116所示之重鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：117所示之重鏈可變CDR2序列、如SEQ ID NO：118所示之重鏈可變CDR3序列，以及一可變輕鏈，包括如SEQ ID NO：113所示之輕鏈可變CDR1序 列、如SEQ ID NO：114所示之輕鏈可變CDR2序列、如SEQ ID NO：115所示之輕鏈可變CDR3序列。
根據上述實施方式中任一個的抗體或其抗原結合片段，包括：如SEQ ID NO：10所示之重鏈可變序列以及如SEQ ID NO：9所示之輕鏈可變序列，或者如SEQ ID NO：20所示之重鏈可變序列以及如SEQ ID NO：19所示之輕鏈可變序列，或者如SEQ ID NO：30所示之重鏈可變序列以及如SEQ ID NO：29所示之輕鏈可變序列，或者如SEQ ID NO：40所示之重鏈可變序列以及如SEQ ID NO：39所示之輕鏈可變序列，或者如SEQ ID NO：50所示之重鏈可變序列以及如SEQ ID NO：49所示之輕鏈可變序列，或者如SEQ ID NO：60所示之重鏈可變序列以及如SEQ ID NO：59所示之輕鏈可變序列，或者如SEQ ID NO：70所示之重鏈可變序列以及如SEQ ID NO：69所示之輕鏈可變序列，或者如SEQ ID NO：80所示之重鏈可變序列以及如SEQ ID NO：79所示之輕鏈可變序列，或者如SEQ ID NO：90所示之重鏈可變序列以及如SEQ ID NO：89所示之輕鏈可變序列，或者如SEQ ID NO：100所示之重鏈可變序列以及如SEQ ID NO：99所示之輕鏈可變序列，或者如SEQ ID NO：110所示之重鏈可變序列以及如SEQ ID NO：109所示之輕鏈可變序列，或者如SEQ ID NO：120所示之重鏈可變序列以及如SEQ ID NO：119所 示之輕鏈可變序列。
根據上述實施方式中任一個的抗體，其為IgG抗體。
根據上述實施方式中任一個的抗體，包括：如SEQ ID NO：2所示之重鏈序列以及如SEQ ID NO：1所示之輕鏈序列，或者如SEQ ID NO：12所示之重鏈序列以及如SEQ ID NO：11所示之輕鏈序列，或者如SEQ ID NO：22所示之重鏈序列以及如SEQ ID NO：21所示之輕鏈序列，或者如SEQ ID NO：32所示之重鏈序列以及如SEQ ID NO：31所示之輕鏈序列，或者如SEQ ID NO：42所示之重鏈序列以及如SEQ ID NO：41所示之輕鏈序列，或者如SEQ ID NO：52所示之重鏈序列以及如SEQ ID NO：51所示之輕鏈序列，或者如SEQ ID NO：62所示之重鏈序列以及如SEQ ID NO：61所示之輕鏈序列，或者如SEQ ID NO：72所示之重鏈序列以及如SEQ ID NO：71所示之輕鏈序列，或者如SEQ ID NO：82所示之重鏈序列以及如SEQ ID NO：81所示之輕鏈序列，或者如SEQ ID NO：92所示之重鏈序列以及如SEQ ID NO：91所示之輕鏈序列，或者如SEQ ID NO：102所示之重鏈序列以及如SEQ ID NO：101所示之輕鏈序列，或者如SEQ ID NO：112所示之重鏈序列以及如SEQ ID NO：111所示之 輕鏈序列，或者如SEQ ID NO：241所示之重鏈序列以及如SEQ ID NO：1所示之輕鏈序列，或者如SEQ ID NO：242所示之重鏈序列以及如SEQ ID NO：1所示之輕鏈序列，或者如SEQ ID NO：243所示之重鏈序列以及如SEQ ID NO：1所示之輕鏈序列。
根據上述實施方式中任一個的抗原結合片段，或者根據上述實施方式中任一個的抗體的抗原結合片段，其為scFv片段、Fab片段、Fab'片段、或F(ab')2片段。
根據上述實施方式中任一個的抗體或抗原結合片段，其為單株抗體或其抗原結合片段。
根據上述實施方式中任一個的抗體或抗原結合片段，其為人類的、人類化的或嵌合的抗體或抗原結合片段。
尤佳採用抗TWEAKR抗體TPP-2658。
根據本發明的一種實施方式，製備適用於紡錘體驅動蛋白抑制劑之經轉麩醯胺酸酶促進的共軛的抗體。
人類同型之野生型全長抗體具有在重鏈之位置295(kabat EU編號)上保留的受體麩醯胺酸，其在存在轉麩醯胺酸酶的情況下具有可及性及反應性，從而在該抗體以非糖基化形式存在的情況下，形成抗體之共軛物以及適合的化合物。此類非糖基化抗體或去糖基化抗體缺少聚糖，其與Fc區之CH2域中保留之糖基化位點N297連接。例如可透過重鏈之糖基化位點N297(Kabat EU編號)之突變，或者透過在缺少糖基化能力之表現系統中表現抗體，來製備非糖基化抗體。用於抗體去糖基化的方法已為吾人所知(例如Winkelhake & Nicolson(1976),J Biol Chem.251(4)：1074-80))。例如可透過PNGase F實施酶去糖基化來產生 去糖基化抗體。根據本發明的一種實施方式，可透過原核宿主中之表現實現非糖基化抗體。適合之原核宿主包括大腸桿菌、枯草桿菌、鼠傷寒沙門桿菌，以及假單胞菌、鏈黴菌以及葡萄球菌屬中的一些種類。根據本發明的另一實施方式，可將哺乳動物細胞表現系統與糖基化抑制劑衣黴素(Tunicamycin)組合使用(Nose & Wigzell(1983),Proc Natl Acad Sci USA,80(21)：6632-6)來獲得非糖基化抗體。在此，修飾為在抗體之Fc部分之CH2域中之重鏈的保留的N-糖基化位點N297(Kabat編號)上阻止糖基化。
根據本發明的另一實施方式，透過重鏈之糖基化位點N297(kabat編號)的突變來製備非糖基化抗體。針對包含N297D、N297Q突變(Jeger等人，Angewandte Chemie Int.Ed.Engl 49,9995-9997(2010))或N297S突變(參閱專利申請案WO2013092998A1以及WO2013092983A2)的抗體變異體，已公開過此類經工程設計之非糖基化抗體的酶共軛方案。本發明還揭示，轉麩醯胺酸酶能夠有效地對與具有N297A突變(Kabat EU編號)之非糖基化抗體變異體的軛合進行催化。
可在存在轉麩醯胺酸酶的情況下，藉由抗體工程設計產生附加或替代性的反應性殘基。本發明之化合物包括經麩醯胺酸工程設計的抗體，其中野生型或親本抗體的一或多個胺基酸被麩醯胺酸替代，或者，其中將一麩醯胺酸殘基(可選地包含另一胺基酸，例如一含有受體麩醯胺酸的標籤)插入該親本或野生型分子。
抗體之在存在轉麩醯胺酸酶的情況下具反應性的麩醯胺酸殘基位於重鏈中，通常位於恆定域內。根據一種實施方式，位置N297(Kabat編號)上之天冬醯胺被置換成不同於麩醯胺酸的殘基。較佳為N297D、N297Q、N297S或N297A，尤佳為N297A。因此，包含N297X取代以及位於位置295(kabat編號)上之麩醯胺酸的抗體針對每 個重鏈具有一個受體麩醯胺酸。故完整的IgG針對每個抗體具有兩個共軛位點。
抗體之在存在轉麩醯胺酸酶的情況下具反應性的麩醯胺酸殘基位於重鏈中，通常位於恆定域內。根據一種實施方式，位置N297(Kabat編號)上之天冬醯胺被置換成麩醯胺酸。該抗體因而具有N297Q取代。因此，包含N297Q取代以及位於位置295(kabat編號)上之麩醯胺酸的抗體針對每個重鏈具有兩個受體麩醯胺酸，進而具有兩個共軛位點。故完整的IgG針對每個抗體具有四個共軛位點。
抗體之在存在轉麩醯胺酸酶的情況下具反應性的麩醯胺酸殘基位於重鏈中，通常位於恆定域內。根據一種實施方式，位置N297(Kabat編號)上之天冬醯胺被置換成麩醯胺酸，且位置295上之麩醯胺酸被置換。該抗體因而具有N297Q取代及Q295X取代。較佳為Q295N取代。因此，包含N297Q取代且位置295(kabat編號)上無麩醯胺酸的抗體針對每個重鏈具有一個受體麩醯胺酸，進而具有一個共軛位點。故完整的IgG針對每個抗體具有兩個共軛位點。
意即，適用於經轉麩醯胺酸酶促進的共軛的較佳抗體包含：
i. N297X取代，其中X為除天冬醯胺以外之任意胺基酸；較佳為N297D、N297Q、N297S或N297A，尤佳為N297A及N297Q。
ii. N297Q取代及Q295X取代，其中X為除麩醯胺酸以外之任意胺基酸，較佳為Q295N。
同位素，鹽，溶劑合物，同位素變異體
本發明亦包括本發明之化合物的所有適合的同位素變異體。在此，本發明之化合物的同位素變異體係指一化合物，其中本發明之化合物內的至少一原子被置換成序數相同的另一原子，而此另一原子之原子質量不同於自然界中通常或主要存在的原子質量。可納入本發明之化合物中的同位素的實例為氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯、溴 及碘之同位素，如2H(氘)、3H(氚)、13C、14C、15N、17O、18O、32P、33P、33S、34S、35S、36S、18F、36Cl、82Br、123I、124I、129I及131I。本發明之化合物的特定同位素變異體，特別是其中納入一或多個放射性同位素的變異體，例如可用於作用機理以及活性物質在身體內的分佈；由於相對易於製備及偵測，經3H-或14C同位素標記之化合物尤其適用。此外，同位素(例如氘)能夠增強化合物之代謝穩定性，進而在治療方面實現某些優點，例如延長在身體中之半衰期，或減少所需有效劑量；因此，對本發明之化合物的此等修飾視情況亦可為本發明之較佳實施方式。可藉由為本領域技術人員所知的方法來製備本發明之化合物的同位素變異體，例如根據下文描述的方法以及實施方式中給出的規定，具體方式為，對試劑及/或主導化合物作相應的同位素修飾。
在本發明中，鹽較佳為本發明之化合物的生理無害的鹽。亦包括本身不適用於製藥應用，但例如可用於將本發明之化合物分離或純化的鹽。
本發明之化合物的生理無害的鹽包括無機酸、羧酸及磺酸之酸加成鹽，例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、延胡索酸、順丁烯二酸及苯甲酸之鹽。
本發明之化合物的生理無害的鹽亦包括常見鹼之鹽，例如且較佳為鹼金屬鹽(例如鈉鹽及鉀鹽)，鹼土金屬鹽(例如鈣鹽及鎂鹽)，以及自氨或含1至16個C原子之有機胺派生的氨鹽，有機胺例如且較佳為乙胺、二乙胺、三乙胺、乙基二異丙胺、單乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二環己胺、二甲基乙醇胺、普魯卡因(Prokain)、二苄胺、N-甲基哌啶、N-甲基嗎啉、精胺酸、離胺酸及1,2-乙二胺。
在本發明中，溶劑合物表示本發明之化合物的以下形式：其在 固體或液體狀態下透過與溶劑分子整合形成一錯合物。水合物為溶劑合物之一特殊形式，其中與水進行整合。本發明中之溶劑合物較佳為水合物。
此外，本發明亦包括本發明之化合物的前藥。術語「前藥」在此係指本身具生物活性或無生物活性之化合物，其在停留於身體中期間轉化成本發明之化合物(例如以代謝或水解的方式)。
特殊實施方式
以下為尤佳實施方式：
實施方式A：
根據以下式之APDC
Figure 105119613-A0202-12-0188-2223
其中KSP-L-係式(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)或以下式(IIf)之化合物，結合劑為人類的、人類化的或嵌合的單株抗體或其抗原結合片段(較佳為抗HER2抗體、抗EGFR抗體或抗TWEAKR抗體，尤佳為特異地與TWEAKR(SEQ ID NO：169)之位置47中的胺基酸D(D47)結合的抗TWEAKR抗體，特別是抗TWEAKR抗體TPP-2658)，且n為1至10的數字： 式(IIf)：
Figure 105119613-A0202-12-0188-2224
其中X1表示N，X2表示N，且X3表示C；X1表示CH，X2表示C，且X3表示N；X1表示NH，X2表示C，且X3表示C；或者X1表示CH，X2表示N，且X3表示C；A為-C=(O)-(羰基)；R1為-L-#1、-H、-COOH、-CONHNH2、-(CH2)1-3NH2、-CONZ"(CH2)1-3NH2及-CONZ"CH2COOH，其中Z"為-H或-NH2；R2為-H；R4表示式為R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-之基團，或表示可透過組織蛋白酶裂解的式為R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-的基團，其中R21表示C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-雜烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-雜環烷基、雜芳基、雜芳基-烷基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-雜烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-雜環烷氧基基團，其可經-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、-NH-CO-烷基、-N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH單取代或多重取代，以及表示-H或-Ox-(CH2CH2O)y-R22基團，其中x表示0或1，v表示1至20的數字，且R22表示-H、烷基(較佳為C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2；P2為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸；P3為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺 酸以及His的胺基酸，或者為相應N-烷基-胺基酸中的一個，較佳為N-甲基-胺基酸；R3為-L-#1或C1-10-烷基，其可視情況經-OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)n-烷基、SO2-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2或NH2取代，n表示0、1或2(其中烷基較佳表示C1-3烷基)；R5為-H或-F；R6與R7相互獨立地表示-H、(視情況氟化的)C1-3-烷基、(視情況氟化的)C2-4-烯基、(視情況氟化的)C2-4-炔基、羥基或鹵素；R8為支鏈的C1-5-烷基基團；以及R9為-H或-F，其中取代基R1與R3中的一個表示-L-#1，以及-L-表示連接子，且#1表示與抗體的鍵結，以及該APDC之鹽、溶劑合物、溶劑合物之鹽。
該連接子較佳為以下連接子§-(CO)m-L1-L2-§§
其中m為0或1；§表示與KSP的鍵結，以及§§表示與抗體的鍵結，以及L2表示
Figure 105119613-A0202-12-0191-2225
其中#1表示與抗體之硫原子的連接位點，#2表示與L1基團的連接位點，且L1透過以下式表示#1-(NR10)n-(G1)o-G2-#2
其中R10表示-H、-NH2或C1-C3-烷基； G1表示-NHCO-或
Figure 105119613-A0202-12-0191-2226
；n為0或1；o為0或1；以及G2為來自芳基以及/或者直鏈及/或支鏈及/或環狀烷基的，包含1至100個碳原子之直鏈或支鏈烴鏈，其可單次或多重間雜有以下基團中的一或多個：-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-，以及一3至10員的含有至多4個選自N、O、S的雜原子或-SO-的芳族或非芳族雜環 (較佳為
Figure 105119613-A0202-12-0191-2227
)，其中側鏈(若存在)可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代。
在此，#1係與KSP抑制劑之鍵結，#2係與結合劑之偶聯基團的鍵結(例如L2)。
實施方式B：
根據以下式之APDC
Figure 105119613-A0202-12-0192-2228
其中KSP-L-為式(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)或以下式(IIg)之化合物，結合劑為抗體，且n為1至10的數字：式(IIg)：
Figure 105119613-A0202-12-0192-2229
其中X1表示N，X2表示N，且X3表示C；X1表示CH，X2表示C，且X3表示N；X1表示NH，X2表示C，且X3表示C；或者X1表示CH，X2表示N，且X3表示C；A為CO(羰基)；R1為-L-#1、-H、-COOH、-CONHNH2、-(CH2)1-3NH2、-CONZ"(CH2)1-3NH2及-CONZ"CH2COOH，其中Z"為-H或-NH2；R2為-H；R4表示可透過豆蛋白酶裂解的式為R21-(CO)(0-1)-(P3)(02)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-的基團，其中R21表示C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-雜烷 基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-雜環烷基、雜芳基、雜芳基-烷基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-雜烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-雜環烷氧基基團，其可經-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、-NH-CO-烷基、-N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH單取代或多重取代，以及表示-H或-Ox-(CH2CH2O)y-R22基團，其中x表示0或1，v表示1至20的數字，且R22表示-H、烷基(較佳為C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2；P2為選自Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg以及His的胺基酸；P3為選自Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg以及His的胺基酸，或者為相應N-烷基-胺基酸中的一個，較佳為N-甲基-胺基酸；R3為-L-#1或C1-10-烷基，其可視情況經-OH、O-烷基、-SH、-S-烷基、-O-CO-烷基、-O-CO-NH-烷基、-NH-CO-烷基、-NH-CO-NH-烷基、-S(O)n-烷基、-SO2-NH-烷基、-NH-烷基、-N(烷基)2或-NH2取代，n表示0、1或2(其中烷基較佳表示C1-3烷基)；R5為-H或-F；R6與R7相互獨立地表示-H、(視情況氟化的)C1-3-烷基、(視情況氟化的)C2-4-烯基、(視情況氟化的)C2-4-炔基、羥基或鹵素；R8為支鏈的C1-5-烷基基團；以及R9為-H或-F，其中取代基R1與R3中的一個表示-L-#1，以及-L-表示連接子，且#1表示與抗體的鍵結。
-L-較佳透過以下表示 §-(CO)m-L1-L2-§§
其中m為0或1；§表示與KSP的鍵結，以及§§表示與抗體的鍵結，以及L2表示
Figure 105119613-A0202-12-0194-2230
其中#1表示與抗體之硫原子的連接位點，#2表示與L1基團的連接位點，且L1透過以下式表示#1-(NR10)n-(G1)o-G2-#2
其中R10表示-H、-NH2或C1-C3-烷基； G1表示-NHCO-或
Figure 105119613-A0202-12-0194-2231
；n為0或1；o為0或1；以及G2為來自芳基以及/或者直鏈及/或支鏈及/或環狀烷基的，包含1至100個碳原子之直鏈或支鏈烴鏈，其可單次或多重間雜有以下基團中的一或多個：-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-NH-、-CO-、-NHCO-、- CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-，以及一3至10員的含有至多4個選自N、O、S的雜原子或-SO-的芳族或非芳族雜環 (較佳為
Figure 105119613-A0202-12-0195-2233
)，其中側鏈(若存在)可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，#1係與KSP抑制劑之鍵結，#2係與抗體之偶聯基團的鍵結(例如L2)，以及該APDC之鹽、溶劑合物、溶劑合物之鹽。
作為替代方案，該連接子可與離胺酸側鏈或離胺酸殘基連接。
實施方式C：
根據以下式之APDC
Figure 105119613-A0202-12-0195-2234
其中KSP-L-為式(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(IIg)或以下式(IIh)之化合物，結合劑為抗體，且n為1至10的數字：式(IIh)：
Figure 105119613-A0202-12-0195-2232
其中X1表示N，X2表示N，且X3表示C；X1表示CH，X2表示C，且X3表示N；X1表示NH，X2表示C，且X3表示C；或者 X1表示CH，X2表示N，且X3表示C；A為-C=(O)-(羰基)；R1為-L-#1；R2為-H；R4表示式為R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-之基團，或表示可透過組織蛋白酶裂解的式為R21-(CO)(0-1)-(P3)(1-2)-P2-的基團，其中R21表示C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-雜烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-雜環烷基、雜芳基、雜芳基-烷基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-雜烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-雜環烷氧基基團，其可經-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、-NH-CO-烷基、-N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH單取代或多重取代，以及表示-H或-Ox-(CH2CH2O)y-R22基團，其中x表示0或1，v表示1至20的數字，且R22表示-H、烷基(較佳為C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2；P2為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ilc、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸；P3為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸，或者為相應N-烷基-胺基酸中的一個，較佳為N-甲基-胺基酸；R3為C1-10-烷基，其可視情況經-OH、-O-烷基、-SH、-S-烷基、-O-CO-烷基、-O-CO-NH-烷基、-NH-CO-烷基、-NH-CO-NH-烷基、-S(O)n-烷基、-SO2-NH-烷基、-NH-烷基、-N(烷基)2或-NH2取代，n表 示0、1或2(其中烷基較佳表示C1-3烷基)，或者為-MOD；其中-MOD表示-(NR10)n-(G1)o-G2-H，其中R10表示-H或C1-C3-烷基； G1表示-NHCO-、-CONH-或
Figure 105119613-A0202-12-0197-2235
(其中在G1表示-NHCO- 或
Figure 105119613-A0202-12-0197-2236
的情況下，R10並非NH2)；n為0或1；o為0或1；以及G2為包含1至10個碳原子之直鏈及/或支鏈烴基，其可單次或多重間雜有以下基團中的一或多個：-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-NRy-、-NRyCO-、-CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry表示-H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其皆可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代)、-CO-、-CRx=N-O-(其中Rx表示H、C1-C3-烷基或苯基)，其中包括側鏈(若存在)之烴鏈可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，其中-MOD基團較佳具有至少一-COOH基團；R5為H或F；R6與R7相互獨立地表示H、(視情況氟化的)C1-3-烷基、(視情況氟化的)C2-4-烯基、(視情況氟化的)C2-4-炔基、羥基或鹵素；R8為支鏈的C1-5-烷基基團；以及R9為H或F，其中-L-表示連接子，且#1表示與抗體的鍵結，其中-L-透過以下表示§-(CO)m-L1-L2-§§
其中 m為0或1；§表示與KSP的鍵結，以及§§表示與抗體的鍵結，以及L2表示
Figure 105119613-A0202-12-0198-2237
其中#1表示與抗體之硫原子的連接位點，#2表示與L1基團的連接位點，且L1透過以下式表示#1-(NR10)n-(G1)o-G2-#2
其中R10表示-H、-NH2或C1-C3-烷基； G1表示-NHCO-或
Figure 105119613-A0202-12-0198-2238
；n為0或1；o為0或1；以及G2為來自芳基以及/或者直鏈及/或支鏈及/或環狀烷基的，包含1至100個碳原子之直鏈或支鏈烴鏈，其可單次或多重間雜有以下基團中的一或多個：-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-、-CRx=N-O-(其中Rx表示H、C1-C3-烷基或苯基)，以及一3至10員的含有至多4個選 自N、O、S的雜原子、-SO-或-SO2-的芳族或非芳族雜環(較佳為
Figure 105119613-A0202-12-0199-2239
)，其中包括側鏈(若存在)之烴鏈可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，#1係與KSP抑制劑之鍵結，#2係與抗體之偶聯基團的鍵結(例如L2)，以及該APDC之鹽、溶劑合物、溶劑合物之鹽。
實施方式D：
根據以下式之抗體共軛物
Figure 105119613-A0202-12-0199-2240
其中R2與R5表示-H；R4表示式為R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-之基團，或表示可透過組織蛋白酶裂解的式為R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-的基團，其中R21表示C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-雜烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-雜環烷基、雜芳基、雜芳基-烷基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-雜烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-雜環烷氧基基團，其可經-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、-NH-CO-烷基、-N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH單取代或多重取代，以及表示-H或-Ox-(CH2CH2O)y-R22基團，其中x表示0或1，v表示1至20的數字，且R22表示-H、烷基(較佳為C1-12-烷基)、- CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2；P2為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸；P3為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸，或者為相應N-烷基-胺基酸中的一個，較佳為N-甲基-胺基酸；R3表示-CH2OH；R1表示-L1-L2-BINDER，其中L1表示
Figure 105119613-A0202-12-0200-2241
其中#2表示與L2的連接，#1表示與L1的連接；且L2表示以下式A5及A6之結構中的一或兩個：
Figure 105119613-A0202-12-0200-2242
Figure 105119613-A0202-12-0200-2243
其中#1表示與結合劑之硫原子的連接位點，#2表示與L1基團的連接位點，以及 R22表示-COOH、-COOR、-COR、-CONHR(其中R皆表示C1-3-烷基)、-CONH2，較佳表示-COOH。
在本發明之共軛物中，或在本發明之共軛物的混合物中，與結合劑之半胱胺酸殘基的鍵結較佳超過80%，尤佳超過90%(皆相對連接子與結合劑的鍵結總數而言)，尤佳存在於式為A5或A6之兩個結構中的一個中： 在此，式A5或A6之結構通常共同存在，其比例較佳為60：40至40：60(相對與結合劑的鍵結數目而言)。其餘鍵結存在於以下結構中
Figure 105119613-A0202-12-0201-2244
該結合劑較佳為結合蛋白或結合肽，尤佳為人類的、人類化的或嵌合的單株抗體或者其抗原結合片段，特別是為抗TWEAKR抗體或其抗原結合片段，或者抗EGFR抗體或其抗原結合片段。尤佳為抗TWEAKR抗體，其特異地與TWEAKR(SEQ ID NO：169)之位置47中之胺基酸D(D47)結合，特別是為抗TWEAKR抗體TPP-2658，或者抗EGFR抗體西妥昔單抗或尼妥珠單抗。作為結合劑之替代方案，亦可存在半胱胺酸殘基。
實施方式E：
根據以下式之APDC
Figure 105119613-A0202-12-0201-2245
其中KSP-L-為式(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(IIg)、(IIh)或以下式(IIi)之化合物，結合劑為抗體，且n為1至10的數字：式(IIi)：
Figure 105119613-A0202-12-0202-2246
其中X1表示N，X2表示N，且X3表示C；X1表示CH，X2表示C，且X3表示N；X1表示NH，X2表示C，且X3表示C；或者X1表示CH，X2表示N，且X3表示C；A為CO(羰基)；R1表示-H或-COOH；R2為-H；R4表示式為R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-之基團，或表示可透過組織蛋白酶裂解的式為R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-的基團，其中R21表示C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-雜烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-雜環烷基、雜芳基、雜芳基-烷基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-雜烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-雜環烷氧基基團，其可經-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、-NH-CO-烷基、-N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH單取代或多重取代，以及表示-H或-Ox-(CH2CH2O)y-R22基團，其中x表示0或1，v表示1至20的數字，且R22表示-H、烷基(較佳為C1-12-烷基)、- CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2；P2為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸；P3為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸，或者為相應N-烷基-胺基酸中的一個，較佳為N-甲基-胺基酸；R3為-L-#1；R5為H或F；R6與R7相互獨立地表示H、(視情況氟化的)C1-3-烷基、(視情況氟化的)C2-4-烯基、(視情況氟化的)C2-4-炔基、羥基或鹵素；R8為支鏈的C1-5-烷基基團；以及R9為-H或-F，其中-L-表示連接子，且#1表示與抗體的鍵結，其中-L-透過以下表示§-(C=O)m-L1-L2-§§
其中m為0或1；§表示與KSP的鍵結，以及§§表示與抗體的鍵結，以及L2表示
Figure 105119613-A0202-12-0204-2247
其中#1表示與抗體之硫原子或氮原子的連接位點，#2表示與L1基團的連接位點，且L1透過以下式表示#1-(NR10)n-(G1)o-G2-#2
其中R10表示-H、-NH2或C1-C3-烷基； G1表示-NHCO-或
Figure 105119613-A0202-12-0204-2248
；n為0或1；o為0或1；以及G2為來自芳基以及/或者直鏈及/或支鏈及/或環狀烷基的，包含1至100個碳原子之直鏈或支鏈烴鏈，其可單次或多重間雜有以下基團中的一或多個：-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-、-CRx=N-O-(其中Rx表示H、C1-C3-烷基或苯基)，以及一3至10員的含有至多4個選自N、O、S的雜原子、-SO-或-SO2-的芳族或非芳族雜環(較佳為
Figure 105119613-A0202-12-0204-2249
)，其中包括側鏈(若存在)之烴鏈可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，#1係與KSP抑制劑之鍵結，#2係與抗體之偶聯基團的鍵結(例如 L2)，以及該APDC之鹽、溶劑合物、溶劑合物之鹽。
治療應用
可使用本發明之化合物進行治療的高度增生性疾病特別是包括癌症及腫瘤疾病。在本發明之範圍內尤指以下疾病，但不僅限於此：乳腺癌及乳腺腫瘤(包括乳腺管型及小葉型之乳腺癌，亦包括原位)、呼吸道腫瘤(小細胞及非小細胞癌、支氣管癌)、腦腫瘤(例如腦幹及下視丘腫瘤、星形細胞瘤、室管膜瘤、神經膠胚細胞瘤、膠質瘤、神經管胚細胞瘤、腦膜瘤、神經外胚層及松果體腫瘤)、消化器官腫瘤(食道癌、胃癌、膽囊癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌及肛門癌)、肝臟腫瘤(主要為肝細胞癌、膽管癌、混合型肝細胞膽管癌)、頭頸部腫瘤(喉癌、下咽癌、鼻咽癌、口咽癌、唇癌及口腔癌、口部黑素瘤)、皮膚腫瘤(基底細胞癌、棘細胞癌、鱗狀細胞癌、Kaposi氏肉瘤、惡性黑素瘤、非黑素瘤皮膚癌、梅克爾細胞皮膚癌、肥大細胞腫瘤)、支持組織及結締組織腫瘤(軟組織肉瘤、骨肉瘤、惡性纖維性組織細胞瘤、軟骨肉瘤、纖維肉瘤、血管肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肉瘤、淋巴肉瘤及橫紋肌肉瘤)、眼部腫瘤(主要為眼內黑素瘤及視網膜胚細胞瘤)、內分泌腺及外分泌腺腫瘤(例如甲狀腺及副甲狀腺腫瘤、胰腺癌及唾液腺癌、腺癌)、尿路腫瘤(膀胱腫瘤、陰莖腫瘤、腎臟腫瘤、腎盂腫瘤及輸尿管腫瘤)、以及生殖器官腫瘤(女性的子宮內膜癌、子宮頸癌、卵巢癌、陰道癌、外陰癌、子宮癌，以及男性的前列腺癌及睾丸癌)。亦包括血液、淋巴組織及脊髓(固體形式或作為循環細胞)之增生性疾病，如白血病、淋巴瘤，以及骨髓增生性疾病，例如急性骨髓性白血病、急性淋巴胚細胞性白血病、慢性淋巴球性白血病、慢性骨髓性白血病及毛細胞白血病，以及AIDS關聯淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤及中樞神經系統 中之淋巴瘤。
此等經定性的人類疾病亦可能因相似之病因而出現於其他哺乳動物中，且亦可用本發明之化合物治療。
藉由本發明之化合物對前述癌症進行的治療既包括對硬瘤的治療，亦包括對硬瘤之經轉移或循環形式的治療。
在本發明中，術語「治療」取其傳統含義，表示對患者之支持、護理及照料，目的在於克服、減小、削弱或緩和疾病或不健康狀態，以及改善例如受到疾病(例如癌症)之負面影響的生存狀況。
因此，本發明亦關於：本發明之化合物在疾病，特別是前述疾病之治療及/或預防中的應用。
本發明亦關於：本發明之化合物在用於治療及/或預防疾病，特別是前述疾病的藥物的製備中的應用。
本發明亦關於：本發明之化合物在用於治療及/或預防疾病，特別是前述疾病的方法中的應用。
本發明亦關於：一種在使用本發明之化合物中的至少一個的有效量的情況下治療及/或預防疾病，特別是前述疾病的方法。
本發明之化合物可單獨使用，或視需要與一或多個其他具藥理作用的物質組合使用，前提在於此等組合不會導致非期望的及不可接受的副作用。因此，本發明亦關於若干藥物，其包含本發明之化合物中的至少一個，並包含一或多個其他活性物質，特別是用於治療及/或預防前述疾病。
例如可將本發明之化合物與習知之用於治療癌症治療的抗高度增生的細胞抑制或細胞毒性物質組合使用。適合的組合活性物質例如為：131I-chTNT、阿巴瑞克(Abarelix)、阿比特龍(Abiraterone)、阿柔比星(Aclarubicin)、Ado-曲妥珠單抗埃姆坦辛(Ado-Trastuzumab Emtansine)、阿法替尼(Afatinib)、阿柏西普(Aflibercept)、阿地白介素(Aldesleukin)、阿倫單抗(Alemtuzumab)、阿侖膦酸(Alendronic acid)、亞利崔托寧(Alitretinoin)、六甲蜜胺(Altretamine)、氨磷汀(Amifostine)、氨魯米特(Aminoglutethimide)、己基-5-胺基乙醯丙酸酯、氨柔比星(Amrubicin)、安吖啶(Amsacrin)、阿那曲唑(Anastrozol)、安塞司亭(Ancestim)、茴香腦二硫醇硫酮、血管收縮素II(Angiotensin II)、血管收縮素III(Antithrombin III)、阿瑞吡坦(Aprepitant)、阿西莫單抗(Arcitumomab)、小白菊內酯衍生物(Arglabin)、三氧化二砷、天冬醯胺酸酶(Asparaginase)、阿西替尼(Axitinib)、阿紮胞苷(Azacitidine)、貝洛替康(Belotecan)、苯達莫司汀(Bendamustine)、貝利司他(Belinostat)、貝伐單抗(Bevacizumab)、貝瑟羅汀(Bexarotene)、比卡魯胺(Bicalutamide)、比生群(Bisantrene)、博萊黴素(Bleomycin)、硼替佐米(Bortezomib)、布舍瑞林(Buserelin)、博舒替尼(Bosutinib)、布妥昔單抗維多亭(Brentuximab Vedotin)、硫酸布他卡因(Busulfan)、卡巴他賽(Cabazitaxel)、卡博替尼(Cabozantinib)、亞葉酸鈣、左亞葉酸鈣、卡培他濱(Capecitabine)、卡羅單抗(Capromab)、卡鉑(Carboplatin)、卡非佐米(Carfilzomib)、卡莫氟(Carmofur)、卡莫司汀(Carmustine)、卡妥索單抗(Catumaxomab)、塞內昔布(Celecoxib)、西莫白介素(Celmoleukin)、色瑞替尼(Ceritinib)、西妥昔單抗(Cetuximab)、氯芥苯丁酸(Chlorambucil)、氯地孕酮(Chlormadinone)、氮芥(Chlormethine)、西多福韋(Cidofovir)、西那卡塞(Cinacalcet)、順鉑(Cisplatin)、克拉屈濱(Cladribine)、氯膦酸(Clodronic acid)、克羅拉濱(Clofarabine)、克帕利昔布(Copanlisib)、克立他酶(Crisantaspase)、克唑替尼(Crizotinib)、環磷醯胺(Cyclophosphamide)、環丙孕酮(Cyproterone)、阿糖胞苷(Cytarabine)、達卡巴嗪(Dacarbazine)、放線 菌素(Dactinomycin)、達拉菲尼(Dabrafenib)、達沙替尼(Dasatinib)、道諾黴素(Daunorubicin)、地西他濱(Decitabine)、地加瑞克(Degarelix)、地尼白介素(Denileukin-Diftitox)、地諾單抗(Denosumab)、地普奧肽(Depreotide)、德舍瑞林(Deslorelin)、右雷佐生(Dexrazoxane)、二溴螺氯銨、雙去水半乳糖醇(Dianhydrogalactitol)、雙氯芬酸(Diclofenac)、多西他賽(Docetaxel)、多拉司瓊(Dolasetron)、多西氟尿啶(Doxifluridine)、阿黴素(Doxorubicin)、阿黴素+雌酮(Doxorubicin+Estrone)、屈大麻酚(Dronabinol)、依決洛單抗(Edrecolomab)、依利醋銨、內皮抑制素(Endostatin)、依諾他濱(Enocitabine)、恩雜魯胺(Enzalutamide)、表柔比星(Epirubicin)、環硫雄醇(Epitiostanol)、依泊汀α(Epoetin-alfa)、依泊汀β(Epoetin-beta)、依泊汀ζ(Epoetin-zeta)、依鉑(Eptaplatin)、艾瑞布林(Eribulin)、埃羅替尼(Erlotinib)、埃索美拉唑(Esomeprazole)、雌莫司汀(Estramustine)、依託泊苷(Etoposide)、依維莫司(Everolimus)、依西美坦(Exemestane)、法屈唑(Fadrozole)、芬太尼(Fentanyl)、氟羥甲基睪酮(Fluoxymesterone)、氟尿苷(Floxuridine)、氟達拉賓(Fludarabine)、氟尿嘧啶(Fluoruracil)、氟他胺(Flutamide)、醛葉酸、福美司坦(Formestane)、福沙吡坦(Fosaprepitant)、福莫司汀(Fotemustine)、氟維司群(Fulvestrant)、釓布醇(Gadobutrol)、釓特醇(Gadoteridol)、釓特酸-葡甲胺鹽、釓弗塞胺(Gadoversetamide)、釓塞酸二鈉鹽(Gd-EOB-DTPA二鈉鹽)、硝酸鎵、加尼瑞克(Ganirelix)、吉非替尼(Gefitinib)、吉西他濱(Gemcitabine)、吉妥珠單抗(Gemtuzumab)、穀卡匹酶(Glucarpidase)、氧化型谷胱甘肽(Glutoxim)、戈舍瑞林(Goserelin)、格拉司瓊(Granisetron)、顆粒球集落刺激因子(G-CSF)、顆粒球巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、二鹽酸組胺、組胺瑞林(Histrelin)、羥基脲、I-125-種籽、伊班膦酸 (Ibandronic aicd)、替伊莫單抗(Ibritumomab-Tiuxetan)、依魯替尼(Ibrutinib)、艾達黴素(Idarubicin)、異環磷醯胺(Ifosfamide)、伊馬替尼(Imatinib)、咪喹莫特(Imiquimod)、英丙舒凡(Improsulfan)、吲地司瓊(Indisetron)、英卡膦酸(Incadronic acid)、巨大戟醇甲基丁烯酸酯、干擾素α(Interferon-alfa)、干擾素β(Interferon-beta)、干擾素γ(Interferon-gamma)、碘比醇(Iobitridol)、碘苄胍(123I)、碘美普爾(Iomeprol)、易普利單抗(Ipilimumab)、伊立替康(Irinotecan)、伊曲康唑(Itraconazole)、伊沙匹隆(Ixabepilone)、蘭瑞肽(Lanreotide)、蘭索拉唑(Lansoprazole)、拉帕替尼(Lapatinib)、拉索膽鹼(Lasocholine)、來那度胺(Lenalidomide)、香菇多糖(Lentinan)、來曲唑(Letrozole)、亮丙瑞林(Leuprorelin)、左旋咪唑(Levamisole)、左炔諾孕酮(Levonorgestrel)、左旋甲狀腺素鈉、利普非格司亭(Lipegfilgrastim)、麥角乙脲(Lisuride)、洛鉑(Lobaplatin)、洛莫司汀(Lomustine)、氯尼達明(Lonidamine)、馬索羅酚(Masoprocol)、甲羥孕酮(Medroxyprogesterone)、甲地孕酮(Megestrol)、美拉胂醇(Melarsoprol)、美法侖(Melphalan)、美雄烷(Mepitiostane)、巰基嘌呤(Mercaptopurine)、美司鈉(Mesna)、持殺酮(Methadone)、甲胺喋呤(Methotrexate)、甲氧沙林(Methoxsalen)、甲基胺基乙醯丙酸酯、甲潑尼龍(Methylprednisolone)、甲基睪固酮(Methyltestosterone)、甲酪氨酸(Metirosine)、米法莫肽(Mifamurtide)、米替福新(Miltefosine)、米鉑(Miriplatin)、二溴甘露醇(Mitobronitol)、米托胍腙(Mitoguazone)、二溴衛矛醇(Mitolactol)、絲裂黴素(Mitomycin)、米托坦(Mitotane),、米托蒽醌(Mitoxantrone)、莫加目單抗(Mogamulizumab)、莫拉司亭(Molgramostim)、莫哌達醇(Mopidamol)、鹽酸嗎啡、硫酸嗎啡、大麻隆(Nabilone)、納比西莫(Nabiximols)、那法瑞林(Nafarelin)、納洛酮+戊唑星(Naloxone+Pentazocine)、納曲酮(Naltrexone)、那托司亭 (Nartograstim)、奈達鉑(Nedaplatin)、奈拉濱(Nelarabine)、奈立膦酸(Neridronic acid)、納武單抗噴曲肽(Nivolumab pentetreotide)、尼洛替尼(Nilotinib)、尼魯米特(Nilutamide)、尼莫唑(Nimorazole)、尼妥珠單抗(Nimotuzumab)、尼莫司汀(Nimustine)、二胺硝吖啶(Nitracrine)、納武單抗(Nivolumab)、阿托珠單抗(Obinutuzumab)、奧曲肽(Octreotide)、奧法木單抗(Ofatumumab)、高三尖杉酯鹼(Omacetaxine-Mepesuccinate)、奧美拉唑(Omeprazole)、昂丹司瓊(Ondansetron)、奧古蛋白(Orgotein)、奧瑞莫德(Orilotimod)、奧沙利鉑(Oxaliplatin)、羥考酮(Oxycodone)、羥甲烯龍(Oxymetholone)、奧唑米星(Ozogamicin)、p53-基因療法、太平洋紫杉醇(Paclitaxel)、鈀-103-種籽、帕洛諾司瓊(Palonosetron)、帕米膦酸(Pamidronic acid)、帕尼單抗(Panitumumab)、潘托拉唑(Pantoprazole)、帕唑帕尼(Pazopanib)、培門冬酶(Pegaspargase)、派姆單抗(Pembrolizumab)、PEG干擾素α-2b(Peg-interferon-alfa-2b)、培美曲塞(Pemetrexed)、噴司他丁(Pentostatin)、培洛黴素(Peplomycin)、全氟丁烷、培磷醯胺(Perfosfamide)、帕妥珠單抗(Pertuzumab)、必醫你舒(Picibanil)、毛果芸香素(Pilocarpine)、吡柔比星(Pirarubicin)、匹杉瓊(Pixantrone)、普樂沙福(Plerixafor)、普卡黴素(Plicamycin)、聚胺葡糖(Poliglusam)、聚雌二醇磷酸酯、聚乙烯吡咯啶酮+玻尿酸鈉、多醣-K、泊馬度胺(Pomalidomide)、普納替尼(Ponatinib)、卟吩姆鈉(Porfimer-Natrium)、普拉曲沙(Pralatrexate)、潑尼莫司汀(Prednimustine)、潑尼松(Prednisone)、鹽酸丙卡巴肼(Procarbazine)、丙考達唑(Procodazole)、普萘洛爾(Propranolol)、喹高利特(Quinagolide)、雷貝拉唑(Rabeprazole)、雷科圖單抗(Racotumomab)、鐳-223-氯化物、拉多替尼(Radotinib)、雷諾昔酚(Raloxifene)、雷替曲塞(Raltitrexed)、拉莫司瓊(Ramosetron)、雷莫蘆單抗(Ramucirumab)、雷莫司汀 (Ranimustine)、拉布立酶(Rasburicase)、雷佐生(Razoxane)、瑞法美替尼(Refametinib)、瑞格非尼(Regorafenib)、利塞膦酸(Risedronic acid)、錸-186依替膦酸鹽(Rhenium-186 Etidronate)、利妥昔單抗(Rituximab)、羅米地辛(Romidepsin)、羅莫肽(Romurtide)、羅尼昔利布(Roniciclib)、來昔決南釤(153Sm)(Samarium(153Sm)lexidronam)、沙妥莫單抗(Satumomab)、胰泌素(Secretin)、西普羅瑟T(Sipuleucel-T)、西佐喃(Sizofiran)、索布佐生(Sobuzoxane)、甘氨雙唑鈉、索拉非尼(Sorafenib)、司坦唑醇(Stanozolol)、鏈脲佐菌素(Streptozocin)、舒尼替尼(Sunitinib)、他拉泊芬(Talaporfin)、他米巴羅汀(Tamibarotene)、他莫昔芬(Tamoxifen)、他噴他多(Tapentadol)、他索納明(Tasonermin)、替西白介素(Teceleukin)、鎝(99mTc)巰諾莫單抗(Technetium(99mTc)Nofetumomab Merpentan)、99mTc-HYNIC-[Tyr3]-奧曲肽(99mTc-HYNIC-[Tyr3]-octreotide)、喃氟啶(Tegafur)、替吉奧(Tegafur+Gimeracil+Oteracil)、替莫泊芬(Temoporfin)、替莫唑胺(Temozolomide)、替西羅莫司(Temsirolimus)、替尼泊甙(Teniposide)、睪固酮(Testosterone)、替曲膦(Tetrofosmin)、沙立度胺(Thalidomide)、塞替派(Thiotepa)、胸腺法新(Thymalfasin)、促甲狀腺素α(Thyrotropin alfa)、硫鳥嘌呤(Tioguanine)、托珠單抗(Tocilizumab)、拓朴替康(Topotecan)、托瑞米芬(Toremifene)、托西莫單抗(Tositumomab)、曲貝替定(Trabectedin)、曲馬多(Tramadol)、曲妥珠單抗(Trastuzumab)、曲奧舒凡(Treosulfan)、維甲酸(Tretinoin)、三氟胸苷+替比拉西(Trifluridine+Tipiracil)、曲美替尼(Trametinib)、曲洛司坦(Trilostane)、曲普瑞林(Triptorelin)、曲磷胺(Trofosfamide)、血小板生成素(Thrombopoietin)、烏苯美司(Ubenimex)、戊柔比星(Valrubicin)、凡德他尼(Vandetanib)、伐普肽(Vapreotide)、瓦他拉尼(Valatinib)、威羅菲尼(Vemurafenib)、長春鹼 (Vinblastine)、長春新鹼(Vincristin)、長春地辛(Vindesine)、長春氟寧(Vinflunine)、長春瑞濱(Vinorelbine)、維莫德吉(Vismodegib)、伏立諾他(Vorinostat)、釔-90-玻璃微球、淨司他丁(Zinostatin)、淨司他丁斯酯(Zinostatin-Stimalamer)、唑來膦酸(Zoledronic acid)、佐柔比星(Zorubicin)。
此外，抗體可選自MPS1抑制劑之類別，或者選自針對靶OX-40、CD137/4-1BB、DR3、IDO1/IDO2、LAG-3及CD40的抗體。
此外，本發明之化合物亦可與放射線療法及/或外科手術組合使用。
概括言之，將本發明之化合物與其他具細胞抑制或細胞毒作用的藥劑結合能夠實現以下目的：‧與採用單一活性物質的治療相比，在延緩腫瘤生長、減小腫瘤尺寸乃至完全消除腫瘤方面實現更佳的效果；‧與單一療法相比，減小所使用的化學療法的劑量；‧與單一給藥相比，增強療法之順應性，減小副作用；‧能夠對範圍更廣的腫瘤疾病進行治療；‧提高對療法的反應率；‧與目前之標準療法相比延長患者的存活時間。
此外，本發明之化合物亦可與放射線療法及/或外科手術組合使用。
本發明亦關於若干藥物，其包含至少一本發明之化合物，通常結合以一或多個惰性的非毒性的適合藥用的輔助物質，以及該等藥物之針對上述目的的應用。
本發明之化合物可系統性及/或局部起作用。為此，可以適合的方式進行給藥，例如採用非經腸給藥、吸入給藥，或者作為植入體或血管支架。
針對此等給藥途徑，可藉由適合的給藥形式來投與本發明之化合物。
非經腸給藥可在繞過再吸收步驟(例如以靜脈內、動脈內、心內或腰髓內的方式)或啟用再吸收(例如以肌肉內、皮下、皮內、經皮或腹膜內的方式)的情況下進行。對於非經腸給藥而言，適合之給藥方式主要為溶液、懸浮液、乳液或凍乾劑形式的注射及輸注投與。較佳採用非經腸給藥，特別是靜脈內給藥。
通常而言以下為有利方案：在非經腸給藥中，相對體重之給藥量約為0.001至1mg/kg，較佳約為0.01至0.5mg/kg，以實現有效之結果。
儘管如此，視情況可能需要不同於上述量的投藥量，具體視以下因素而定：體重、給藥途徑、個體對活性物質的反應、投與方式、以及給藥的時間點或時間間隔。因此，在某些情形下，小於上述最小量的給藥量便已足夠，而在其他情形下則需要超出所述上限。在給藥量較大的情況下，建議在一日內分多次投與。
實例
以下實例用於對本發明進行說明。本發明不僅限於此等實例。
在未另行說明的情況下，以下試驗及實例中的百分比值為重量百分比，份數為重量份數。液體/液體溶液之溶劑比例、稀釋比例及濃度皆係相對體積而言。
合成途徑：
針對實施例，以下示意圖示範性示出此等實施例之合成途徑。在此等示意圖中，式IIa之位置R4中(即-NH2基團中)的氫原子可被式為R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-之基團或可透過組織蛋白酶裂解的式為R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-的基團替代，其中P2為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、 Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸；P3為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸。
其中R21表示C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-雜烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-雜環烷基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-雜烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-雜環烷氧基基團，其可經-NH2、-SO3H、-COOH、-SH或-OH單取代或多重取代。
示意圖1：經半胱胺酸連接之ADC的合成
Figure 105119613-A0202-12-0214-2250
示意圖2：經半胱胺酸連接之ADC的合成
Figure 105119613-A0202-12-0214-2251
示意圖3：經半胱胺酸連接之ADC的合成
Figure 105119613-A0202-12-0215-2252
示意圖4：經半胱胺酸連接之ADC的合成
Figure 105119613-A0202-12-0215-2253
示意圖5：經離胺酸連接之ADC的合成
Figure 105119613-A0202-12-0215-2254
a)三光氣，THF，氬氛圍下
示意圖6：經離胺酸連接之ADC的合成
Figure 105119613-A0202-12-0215-2255
示意圖7：ADC前驅體分子的合成
Figure 105119613-A0202-12-0216-2256
[a)：EDCI、HOBT、二異丙基乙胺、室溫；b)：乙醇、哌啶、甲胺、水、室溫；c)：HATU、二異丙基乙胺、室溫；d)：TFA、DCM、室溫]
示意圖8：ADC前驅體分子的合成
Figure 105119613-A0202-12-0217-2257
[a)：例如EDCI、HOBT、二異丙基乙胺、DMF、室溫；b)：例如DCM/TFA 20：1、室溫；c)：例如HATU、二異丙基乙胺、DMF、室溫；d)：例如TFA、DCM、室溫]
示意圖9：ADC前驅體分子的合成
Figure 105119613-A0202-12-0218-2258
[a)：例如2-溴-1-乙基吡啶四氟硼酸鹽、二異丙基乙胺、DCM、室溫；b)：例如2M LiOH溶液、THF、水、室溫、位置異構體之HPLC分離；c)：例如EDCI、HOBT、二異丙基乙胺、DMF、室溫；d)：例如TFA、DCM、室溫]
示意圖10：ADC前驅體分子的合成
Figure 105119613-A0202-12-0219-2259
[a)：例如H2,、Pd-C、EtOH、室溫；b)：例如對硝基苄溴、K2CO3、DMF；c)：例如乙醇、40%甲胺水溶液、50℃；d)：例如連二亞硫酸二鈉、THF、水、50℃；e)：例如HATU、二異丙基乙胺、DMF、室溫；f)：例如哌啶、40%甲胺水溶液、乙醇、50℃；g)：例如二異丙基乙胺、DMF、室溫；h)：例如哌啶、DMF、室溫；i)：TFA、DCM、室溫]
示意圖11：ADC前驅體分子的合成
Figure 105119613-A0202-12-0220-2260
[a)：例如Et3N、DMF、室溫；b)：例如H2、Pd-C、EtOH/乙酸乙酯/THF(1：1：1)、室溫；c)：例如4-甲基嗎啉、DMF、室溫；d)：例如HATU、HOAt、二異丙基乙胺、DMF、室溫；e)：例如TFA、室溫]
示意圖12：ADC前驅體分子的合成
Figure 105119613-A0202-12-0221-2261
[a)：例如NaBH(OAc)3、HOAc、二氯甲烷、室溫；b)：例如氯乙醯氯、NEt3、DCM、室溫；c)：例如Cs2CO3、DMF、50℃；d)：例如1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮鹽酸鹽(1：1)、T3P(R)、二異丙基乙胺、MeCN、室溫；e)：例如TFA、室溫]
示意圖13：ADC前驅體分子的合成
Figure 105119613-A0202-12-0222-2262
[a)：例如甲磺酸氯、NEt3、二氯甲烷、0℃；b)：例如NaN3、DMF、40℃；c)：例如H2、Pd-C、EtOH/乙酸乙酯(1：1)、室溫；d)：例如TBAF、THF、室溫；e)：例如1-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮、NEt3、CaCO3、1,4-二噁烷、室溫；f)：例如N-氯代丁二醯亞胺、TEMPO、四正丁基氯化銨、氯仿、0.05N碳酸鉀/0.05N碳酸氫鈉溶液(1：1)；g)：NaBH(OAc)3、HOAc、二氯甲烷、室溫；h)：例如氯乙醯氯、NEt3、DCM、室溫；i)：例如TBAF、THF、水、室溫；j)：例如4-甲基嗎啉、DMF、室溫；k)：例如TFA、室溫]
示意圖14：ADC前驅體分子的合成
Figure 105119613-A0202-12-0223-2263
[a)：例如甲醛、Na2CO3、水、室溫；b)：例如Ac2O、吡啶、THF、室溫；c)：例如二第三丁基丙二酸酯、KotBu、THF、室溫；d)：例如LiBH4、THF、室溫；e)：例如TBDMSCl、咪唑、DCM、室溫；f)：例如戴斯-馬丁高碘烷、DCM；g)：例如三乙醯氧基硼氫化鈉、AcOH、DCM、室溫；h)：例如nBu4NF、THF、室溫；i)：例如SOCl2、THF、室溫；j)：例如AcSK、nBu4NI、DMF、90℃；k)：例如NaOH、MeOH、THF、室溫；l)：例如TCEP、二噁烷、室溫；m)：例如差向異構體之分離；n)：例如6N鹽酸、THF、室溫；o)：例 如Mal-dPEG(3)-Mal、PBS緩衝液、ACN、室溫]
示意圖15：ADC前驅體分子的合成
Figure 105119613-A0202-12-0224-2264
[a)：例如Mal-dPEG(3)-Mal、PBS緩衝液、ACN、室溫]
示意圖16：ADC前驅體分子的合成
Figure 105119613-A0202-12-0224-2265
[a)：例如BF3OEt2、THF、0℃；b)：例如亞硝酸異戊酯、-10℃、0.5h；c)：例如甲基-2-氯-3-氧代丁酸酯、吡啶、水、-5℃；d)：例如NEt3、甲苯、RT；e)：例如Et3SiH、TFA、室溫；f)：例如LiBH4、 THF、60℃；g)：例如戴斯-馬丁高碘烷、DCM、室溫；h)：例如(R)-(+)-甲基-2-丙磺酸醯胺、異丙醇鈦(IV)、THF、室溫；i)：例如第三丁基鋰、戊烷、THF、-78℃；j)：例如HCl的二噁烷溶液、THF、MeOH、室溫；k)：例如3-(1,3-二氧代-1,3-二氫-2H-異吲哚-2-基)丙醛、NaB(OAc)3H、AcOH、DCM、室溫；l)：例如2-氯-2-氧代乙酸乙酯、NEt3、DCM、室溫；m)：例如甲胺、水、EtOH、50℃]
示意圖17：ADC前驅體分子的合成
Figure 105119613-A0202-12-0225-2266
[a)：例如第三丁基-N-(第三丁氧基羰基)-5-氧代-L-正纈胺酸酯、NaB(OAc)3H、AcOH、DCM、室溫；b)：例如2-氯-2-氧代乙酸乙酯、NEt3、DCM、室溫；c)：例如甲胺、水、EtOH、60℃；d)：例如THF、DCM、50℃；e)：例如Boc2O、NEt3、DCM、室溫；f)：例如三氟乙酸-1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)、HATU、二異丙基乙胺、DMF、室溫；f)：例如TFA、DCM、室溫]
示意圖18：經半胱胺酸連接之ADC的合成
Figure 105119613-A0202-12-0226-2267
示意圖19：經半胱胺酸連接之ADC的合成
Figure 105119613-A0202-12-0226-2268
示意圖20：經半胱胺酸連接之ADC的合成
Figure 105119613-A0202-12-0226-2269
示意圖21：經半胱胺酸連接之ADC的合成
Figure 105119613-A0202-12-0227-2270
示意圖22：中間物的合成
Figure 105119613-A0202-12-0227-2271
[a)：例如三乙醯氧基硼氫化鈉、乙酸、DCM、室溫；b)：例如乙醯氧基乙醯氯、NEt3、DCM、室溫；c)：例如LiOH、THF/水、室溫；d)：例如H2、Pd-C、EtOH、室溫；e)例如Teoc-Osu、NEt3、二噁烷、室溫；f)：例如Fmoc-Cl、二異丙基乙胺、二噁烷/水2：1、室溫]
示意圖23：中間物的合成
Figure 105119613-A0202-12-0228-2272
[a)：例如三乙醯氧基硼氫化鈉、乙酸、DCM、室溫；b)：例如乙醯氧基乙醯氯、NEt3、DCM、室溫；c)：例如LiOH、甲醇、室溫；d)：例如TFA、DCM、室溫；e)：例如Boc2O、二異丙基乙胺、DCM、室溫]
示意圖24：中間物的合成
Figure 105119613-A0202-12-0229-2273
[a)：例如溴化苄、Cs2CO3、DMF、室溫；b)：例如Pd(dppf)2Cl2、DMF、Na2CO3、85℃；c)：例如LiAlH4、THF、0℃；MnO2、DCM、室溫；d)：例如Ti(iOPr)4、THF、室溫；e)：例如tBuLi、THF、-78℃；MeOH、NH4Cl；f)：例如HCl/1,4-二噁烷]
示意圖25：經半胱胺酸連接之ADC的合成
Figure 105119613-A0202-12-0229-2274
示意圖26：經半胱胺酸連接之ADC的合成，透過水解琥珀酸醯胺實現
此方法特別是應用於L1=CH2的ADC，以使此ADC轉化成開鏈連接形式。
Figure 105119613-A0202-12-0229-2275
示意圖27：ADC前驅體分子的合成
Figure 105119613-A0202-12-0230-2276
[a)：三乙醯氧基硼氫化鈉、乙酸、DCM、室溫；b)：乙醯氧基乙醯氯、二異丙基乙胺、DCM、室溫；c)：LiOH、MeOH、室溫；d)：三氟乙酸-1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)、HATU、DMF、二異丙基乙胺、室溫；e)：氯化鋅、三氟乙醇、50℃、EDTA]
示意圖28：ADC前驅體分子的合成
Figure 105119613-A0202-12-0230-2277
[a)：HATU、DMF、二異丙基乙胺、室溫；b)：氯化鋅、三氟乙醇、50℃、EDTA]
示意圖29：ADC前驅體分子的合成
Figure 105119613-A0202-12-0231-2278
[a)：三乙醯氧基硼氫化鈉、乙酸、DCM、RT；b)：乙醯氧基乙醯氯、三乙胺、DCM、室溫；c)：LiOH、MeOH、室溫；d)：三氟乙酸-1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)、HATU、DMF、二異丙基乙胺、室溫；e)：氯化鋅、三氟乙醇、50℃、EDTA]
示意圖30：用於合成中間物及ADC前驅體的通用方法
Figure 105119613-A0202-12-0232-2279
[a)：HATU、DMF、N,N-二異丙基乙胺、室溫或者EDCI、HOBT、N,N-二異丙基乙胺、DMF、室溫；b)：H2、10% Pd-C、MeOH、室溫；c)：R21-COOH、EDCI、HOBT、N,N-二異丙基乙胺、DMF、室溫或者R21-COOH、HATU、N,N-二異丙基乙胺、DMF、室溫或者R21-COOSu、N,N-二異丙基乙胺、DMF、室溫]
示意圖31：ADC前驅體分子與可豆蛋白酶裂解之連接子的合成
Figure 105119613-A0202-12-0233-2280
[a)：HATU、DMF、N,N-二異丙基乙胺、室溫或者EDCI、HOBT、N,N-二異丙基乙胺、DMF、室溫；b)：H2、10% Pd-C、MeOH、室溫；c)：1,1'-[(1,5-二氧代戊烷-1,5-二基)雙(氧基)]二吡咯啶-2,5-二酮、N,N-二異丙基乙胺、DMF、室溫]
示意圖32：ADC前驅體分子與可豆蛋白酶裂解之連接子的合成
Figure 105119613-A0202-12-0234-2281
[a)：HATU、DMF、N,N-二異丙基乙胺、室溫或者EDCI、HOBT、N,N-二異丙基乙胺、DMF、室溫；b)：H2、10% Pd-C、MeOH、室溫；c)：1,1'-[(1,5-二氧代戊烷-1,5-二基)雙(氧基)]二吡咯啶-2,5-二酮、N,N-二異丙基乙胺、DMF、室溫]
此外可如示意圖32、33及34所示將其他中間物轉化成可豆蛋白酶裂解之ADC及APDC前驅體。
作為示意圖32-34所示之苄氧基羰基基團的替代方案，亦可採用其他在肽化學中確立的保護基團，並根據習知的方法將其脫除。根據為本領域技術人員所知的要求來選擇保護基團，從而與分子中存在之其他結構元素相容。在最後一步中將分子中可能尚存在之其他保護基團脫除。
可視情況調整此等合成之序列。
示意圖33：經半胱胺酸連接之ADC與可豆蛋白酶裂解之首基的合成
Figure 105119613-A0202-12-0235-2282
[a)：HATU、DMF、N,N-二異丙基乙胺、室溫；b)：2-5Eq TCEP、PBS pH 7.2、在室溫下攪拌30min；c)：在氬氛圍下在室溫下攪拌90min，隨後透過PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)重新緩衝至pH 8，並且在氬氛圍下在室溫下攪拌一夜，隨後藉由超速離心進行濃縮，並藉由PBS在pH 7.2下調節至所需濃度]
示意圖34：經離胺酸連接之ADC與可豆蛋白酶裂解之首基的合成
Figure 105119613-A0202-12-0236-2283
[a)：HATU、DMF、N,N-二異丙基乙胺、室溫；b)：H2、10% Pd-C、甲醇、1.5h、室溫；c)：1,1'-[(1,5-二氧代戊烷-1,5-二基)雙(氧基)]二吡咯啶-2,5-二酮、N,N-二異丙基乙胺、DMF、在室溫下攪拌一夜；d)：AK2在PBS中的溶液，添加5當量之溶解於DMSO中的活化酯，在氬氛圍下在室溫下攪拌60min，重新補充添加5當量之溶解於DMSO中的活化酯，在氬氛圍下在室溫下攪拌60min，隨後透過經PBS緩衝液(pH 7.2)平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)進行純化，隨後藉由超速離心進行濃縮，並藉由PBS緩衝液(pH 7.2)調節至所需濃度]
示意圖35：ADC前驅體與可豆蛋白酶裂解之首基的合成
Figure 105119613-A0202-12-0237-2284
[a)：NaBH(OAc)3、HOAc、二氯甲烷、室溫；b)：氯乙醯氯、NEt3、DCM、RT；c)：L-半胱胺酸、NaHCO3、DBU、異丙醇/水、50℃；d)：HATU、DMF、二異丙基乙胺、室溫；e)：氯化鋅、三氟乙醇、50℃；f)：HATU、DMF、二異丙基乙胺、室溫]
示意圖36：透過轉麩醯胺酸酶偶聯實現的ADC的合成
Figure 105119613-A0202-12-0237-2285
[a：添加5mg溶解於DPBS pH 7.4中之AK3(c~10mg/mL)，6當量之毒性基團-連接子前驅體(例如中間物Q31-Q34)，以及50μL溶液，其由12.5μL(1.25U)重組細菌轉麩醯胺酸酶水溶液(100U/mL)及37.5μL DPBS pH 7.4構成，在37℃下保溫24h]
A.實例
Figure 105119613-A0202-12-0238-2606
Figure 105119613-A0202-12-0239-2607
Figure 105119613-A0202-12-0240-2608
胺基酸縮寫
Ala=丙胺酸
Arg=精胺酸
Asn=天冬醯胺
Asp=天冬胺酸
Cys=半胱胺酸
Glu=麩胺酸
Gln=麩醯胺酸
Gly=甘胺酸
His=組胺酸
Ile=異白胺酸
Leu=白胺酸
Lys=離胺酸
Met=甲硫胺酸
Nva=正纈胺酸
Phe=苯丙胺酸
Pro=脯胺酸
Ser=絲胺酸
Thr=蘇胺酸
Trp=色胺酸
Tyr=酪胺酸
Val=纈胺酸
HPLC方法以及LC-MS方法：
方法1(LC-MS)：
儀器：Waters ACQUITY SQD UPLC系統；柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8μ 50 x 1mm；溶離劑A：1l水+0.25mL 99%甲酸，溶離劑B：1l乙腈+0.25mL 99%甲酸；梯度：0.0min 90% A→1.2min 5% A→2.0min 5% A；爐子：50℃；流量：0.40mL/min；UV偵測：208-400nm
方法2(LC-MS)：
MS設備型號：Waters Synapt G2S；UPLC設備型號：Waters Acquity I-CLASS；柱：Waters，BEH300，2.1 x 150mm，C18 1.7μm；溶離劑A：1l水+0.01%甲酸；溶離劑B：1l乙腈+0.01%甲酸；梯度：0.0min 2% B→1.5min 2% B→8.5min 95% B→10.0min 95% B；爐子：50℃；流量：0.50mL/min；UV偵測：220nm
方法3(LC-MS)：
MS儀器：Waters(Micromass)QM；HPLC儀器：Agilent 1100系 列；柱：Agient ZORBAX Extend-C18 3.0x50mm 3.5-Micron；溶離劑A：1l水+0.01mol碳酸銨，溶離劑B：1l乙腈；梯度：0.0min 98% A→0.2min 98% A→3.0min 5% A→4.5min 5% A；爐子：40℃；流量：1.75mL/min；UV偵測：210nm
方法4(LC-MS)：
MS設備型號：Waters Synapt G2S；UPLC設備型號：Waters Acquity I-CLASS；柱：Waters，HSST3，2.1 x 50mm，C18 1.8μm；溶離劑A：1l水+0.01%甲酸；溶離劑B：1l乙腈+0.01%甲酸；梯度：0.0min 10% B→0.3min 10% B→1.7min 95% B→2.5min 95% B；爐子：50℃；流量：1.20mL/min；UV偵測：210nm
方法5(LC-MS)：
儀器：Waters ACQUITY SQD UPLC系統；柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8μ 50 x 1mm；溶離劑A：1l水+0.25mL 99%甲酸，溶離劑B：1l乙腈+0.25mL 99%甲酸；梯度：0.0min 95% A→6.0min 5% A→7.5min 5% A；爐子：50℃；流量：0.35mL/min；UV偵測：210-400nm
方法6(LC-MS)：
儀器：Micromass Quattro Premier與Waters UPLC Acquity；柱：Thermo Hypersil GOLD 1.9μ 50 x 1mm；溶離劑A：1l水+0.5mL 50%甲酸，溶離劑B：1l乙腈+0.5mL 50%甲酸；梯度：0.0min 97% A→0.5min 97% A→3.2min 5% A→4.0min 5% A；爐子：50℃；流量：0.3mL/min；UV偵測：210nm
方法7(LC-MS)：
儀器：Agilent MS Quad 6150；HPLC：Agilent 1290；柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8μ 50 x 2.1mm；溶離劑A：1l水+0.25mL 99%甲酸，溶離劑B：1l乙腈+0.25mL 99%甲酸；梯度： 0.0min 90% A→0.3min 90% A→1.7min 5% A→3.0min 5% A；爐子：50℃；流量：1.20mL/min；UV偵測：205-305nm
方法8(LC-MS)：
MS設備型號：Waters Synapt G2S；UPLC設備型號：Waters Acquity I-CLASS；柱：Waters，HSST3，2.1 x 50mm，C18 1.8μm；溶離劑A：1l水+0.01%甲酸；溶離劑B：1l乙腈+0.01%甲酸；梯度：0.0min 2% B→2.0min 2% B→13.0min 90% B→15.0min 90% B；爐子：50℃；流量：1.20ml/min；UV偵測：210nm
方法9：針對實例181-191的LC-MS-Prep純化方法(LIND-LC-MS-Prep方法)
MS儀器：Waters，HPLC儀器：Waters(柱：Waters X-Bridge C18，19mm x 50mm，5μm，溶離劑A：水+0.05%氨，溶離劑B：乙腈(ULC)，具梯度；流量：40ml/min；UV-偵測：DAD；210-400nm)
或 MS儀器：Waters，HPLC儀器：Waters(柱：Phenomenex Luna 5μ C18(2)100A，AXIA Tech.50 x 21.2mm，溶離劑A：水+0.05%甲酸，溶離劑B：乙腈(ULC)，具梯度；流量：40ml/min；UV-偵測：DAD；210-400nm)
方法10：針對實例181-191的LC-MS分析法(LIND_SQD_SB_AQ)
MS儀器：Waters SQD；HPLC儀器：Waters UPLC；柱：Zorbax SB-Aq(Agilent)，50mm x 2.1mm，1.8μm；溶離劑A：水+0.025%甲酸，溶離劑B：乙腈(ULC)+0.025%甲酸；梯度：0.0min 98%A-0.9min 25%A-1.0min 5%A-1.4min 5%A-1.41min 98%A-1.5min 98%A；爐子：40℃；流量：0.600ml/min；UV偵測：DAD；210nm
方法11(HPLC)：
設備：HP1100系列
柱：Merck Chromolith SpeedROD RP-18e，50-4.6mm，訂貨號1.51450.0001，前置柱Chromolith Guard Cartridge Kit，RP-18e，5-4.6mm，訂貨號1.51470.0001
梯度：流量5mL/Min注入體積5μl溶劑A：HCLO4(70%)水溶液(4mL/1)溶劑B：乙腈初始20% B 0.50Min 20% B 3.00Min 90% B 3.50Min 90% B 3.51Min 20% B 4.00Min 20% B柱溫度：40℃
波長：210nm
方法12(LC-MS)：
MS設備型號：Thermo Scientific FT-MS；UHPLC+設備型號：Thermo Scientific UltiMate 3000；柱：Waters，HSST3，2.1 x 75mm，C18 1.8μm；溶離劑A：1l水+0.01%甲酸；溶離劑B：1l乙腈+0.01%甲酸；梯度：0.0min 10% B→2.5min 95% B→3.5min 95% B；爐子：50℃；流量：0.90ml/min；UV偵測：210nm/最佳整合路徑210-300nm
方法13：(LC-MS)：
MS儀器：Waters(Micromass)Quattro Micro；儀器：Waters UPLC Acquity；柱：Waters BEH C18 1.7μ 50 x 2.1mm；溶離劑A：1l水+0.01mol甲酸銨，溶離劑B：1l乙腈；梯度：0.0min 95% A→0.1min 95% A→2.0min 15% A→2.5min 15% A→2.51min 10% A→3.0min 10% A；爐子：40℃；流量：0.5ml/min；UV偵測：210nm
製備過程未在下文中明確描述的反應物或試劑中的一部分係購自常見之來源。針對製備過程未在下文中描述的，並且並非市售或不 能自常見來源購得的其餘反應物或試劑，則註明對描述其製備過程的公開文獻的引用。
方法14：(LC-MS)(MCW-LTQ-POROSHELL-TFA98-10min)
MS設備型號：ThermoFisherScientific LTQ-Orbitrap-XL；HPLC設備型號：Agilent 1200SL；柱：Agilent，POROSHELL 120，3 x 150mm，SB-C18 2.7μm；溶離劑A：1l水+0.1%三氟乙酸；溶離劑B：1l乙腈+0.1%三氟乙酸；梯度：0.0min 2% B→0.3min 2% B→5.0min 95% B→10.0min 95%B；爐子：40℃；流量：0.75ml/min；UV偵測：210nm
先導化合物及中間物： 中間物C1 三氟乙酸--(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙烷-1-胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0245-2289
目標化合物以WO2006/002326中描述的方式製備。
中間物C2 第三丁基-(2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0246-2290
將4.22g(14.5mmol)第三丁基-N-(第三丁氧基羰基)-L-高絲胺酸酯溶解在180mL二氯甲烷中，隨後摻入3.5mL吡啶以及9.2g(21.7mmol)1,1,1-三乙醯氧基-1λ5,2-苯并碘氧雜戊環-3(1H)-酮。在室溫下將混合物攪拌1小時，隨後用500mL二氯甲烷將其稀釋並用10%的硫代硫酸鈉溶液進行兩次振搖萃取，且隨後依次用5%的檸檬酸進行兩次以及用10%的碳酸氫鈉溶液進行兩次振搖萃取。將有機相分離，透過硫酸鎂對其進行乾燥，隨後在真空中將其濃縮。將殘餘物置於DCM中，並摻入二乙醚與正戊烷的混合物。將沈澱物濾出，隨後將濾液濃縮，並自乙腈/水凍乾。獲得3.7g(93%)第三丁基-(2S)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-4-氧代丁酸酯，其不經進一步純化便被用於下一階段。(Rf值：0.5(DCM/甲醇95/5)。
將3.5g(9.85mmol)中間物C1溶解在160mL DCM中，並摻入3.13g(14.77mmol)三乙醯氧基硼氫化鈉以及0.7mL乙酸。在室溫下攪拌5分鐘後，添加3.23g(11.85mmol)第三丁基-(2S)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-4-氧代丁酸酯，並在室溫下將混合物再攪拌30分鐘。在真空中對溶劑進行蒸發，並將殘餘物置於乙腈/水中。將析出之固體濾出並對其進行乾燥，獲得5.46g(84%)的目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=2.5min； LC-MS(方法1)：Rt=1.13min；MS(ESIpos)：m/z=613(M+H)+。
中間物C3 (2S)-4-[(乙醯氧基乙醯基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁酸
Figure 105119613-A0202-12-0247-2291
將5.46g(8.24mmol)中間物C2溶解在160mL DCM中，隨後摻入4.8mL三乙胺以及2.2mL(20.6mmol)乙醯氧基乙醯氯。在室溫下將混合物攪拌一夜，隨後在真空中將其濃縮。將殘餘物置於乙酸乙酯中，並用飽和碳酸氫鈉溶液進行三次振搖萃取，隨後用飽和氯化鈉溶液進行振搖萃取。透過硫酸鈉對有機相進行乾燥，隨後將其濃縮。藉由透過Biotage/Isolera(SNAP 340g)實現的柱層析，藉由作為溶離劑的環己烷/乙酸乙酯2：1將殘餘物純化。獲得4.57g(75%)的醯化中間體。
LC-MS(方法1)：Rt=1.49min；MS(ESIpos)：m/z=713(M+H)+。
將1g(1.36mmol)此中間體溶解在20mL DCM中，並摻入20mL TFA。在室溫下攪拌5小時後進行濃縮，並用正戊烷攪拌兩次。對正戊烷進行傾析，並在高真空中對殘餘的固體進行乾燥。獲得1.1g(2S)-4-[(乙醯氧基乙醯基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-胺基丁酸-三氟乙酸(1：1)。LC-MS(方法1)：Rt=0.93min；MS(ESIpos)：m/z=557(M+H)+。
將0.91g(1.57mmol)此中間體溶解在70mL DCM中，並摻入3.43g(15.7mmol)二碳酸二第三丁基酯及4.1mL N,N-二異丙基乙胺。在室溫下攪拌30分鐘後，用DCM將混合物稀釋，並用5%的檸檬酸進行振搖萃取。透過硫酸鈉對有機相進行乾燥，並將其濃縮。用正戊烷將殘餘物攪拌兩次，並對其進行傾析。將殘餘的固體自乙腈/水1：1凍乾，如此獲得1.11g目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=2.55min； LC-MS(方法1)：Rt=1.3min；MS(ESIpos)：m/z=657(M+H)+。
中間物C4 (2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0248-2292
將5.46g(8.24mmol)中間物C2溶解在160mL DCM中，隨後摻入4.8mL三乙胺以及2.2mL(20.6mmol)乙醯氧基乙醯氯。在室溫下將混合物攪拌一夜，隨後在真空中將其濃縮。將殘餘物置於乙酸乙酯中，並用飽和碳酸氫鈉溶液進行三次振搖萃取，隨後用飽和氯化鈉溶液進行振搖萃取。透過硫酸鈉對有機相進行乾燥，隨後將其濃縮。藉由透過Biotage/Isolera(SNAP 340g)實現的柱層析，藉由作為溶離劑的環己烷/乙酸乙酯2：1將殘餘物純化。獲得4.57g(75%)的醯化中間體。
LC-MS(方法1)：Rt=1.49min；MS(ESIpos)：m/z=713(M+H)+。
將1.5g(2.035mmol)此中間體置於50mL乙醇中，並摻入5.8mL 40%的甲烷胺水溶液。在50℃下將混合物攪拌4小時，隨後將其濃縮。將殘餘物置於DCM中，並用水將其洗滌兩次。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，隨後將其濃縮。在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得1.235mg此中間體，其毋需進一步純化便繼續進行轉化。
將1.235mg(1.5mmol)此中間體溶解在15mL DCM中，並摻入15mL TFA。在室溫下攪拌4小時後進行濃縮。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。將相應的溶離份濃縮，並將殘餘物自乙腈凍乾。獲得1.04g(定量)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.9min； LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(ESIpos)：m/z=515(M+H)+。
中間物C5 (2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁酸
Figure 105119613-A0202-12-0249-2293
將0.9g(1.24mmol)中間物C4溶解在60mL DCM中，並摻入2.7g(12.5mmol)二碳酸二第三丁基酯及3.3mL N,N-二異丙基乙胺。在室 溫下攪拌45分鐘後，將混合物濃縮，將殘餘物置於二乙醚中，並摻入正戊烷直至出現渾濁。將混合物冷卻至0℃，隨後對其進行傾析。重新為殘餘物摻入正戊烷，並對其進行傾析。將殘餘的固體自乙腈/水1：1凍乾，如此獲得0.95g(定量)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=2.5min； LC-MS(方法1)：Rt=1.27min；MS(ESIpos)：m/z=615(M+H)+。
中間物C6 三氟乙酸--第三丁基-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-肼基-1-氧代丁烷-2-基}胺基甲酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0250-2294
將150mg(0.16mmol)中間物C3溶解在21mL DMF中，隨後摻入37.2mg(0.19mmol)N-(3-二甲胺基丙基)-N'-乙基碳化二亞胺-鹽酸鹽(EDC)、37mg(0.243mmol)1-羥基苯并三唑、85μl N,N-二異丙基乙胺，最後摻入45mg(0.18mmol)市售的9H-茀-9-基甲基胼羧酸酯。在室溫下將混合物攪拌一夜，隨後在真空中將其濃縮。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。將相應的溶離份濃縮，並將殘餘物自乙腈/水凍乾。獲得60mg(理論之41%)受保護的中間體。
HPLC(方法11)：Rt=2.9min； LC-MS(方法1)：Rt=1.47min；MS(ESIpos)：m/z=893(M+H)+。
將60mg(0.067mmol)此中間體溶解在19mL乙醇中，並摻入681μl哌啶以及386μl 40%的甲烷胺水溶液。在50℃下將混合物攪拌18小時，隨後將其濃縮。將殘餘物置於乙腈/水2：1中，並用TFA調整至pH 2。隨後重新進行濃縮，並藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。將相應的溶離份濃縮，並將殘餘物自乙腈/水凍乾。獲得25mg(理論之51%)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=2.2min； LC-MS(方法1)：Rt=1.27min；MS(ESIpos)：m/z=629(M+H)+。
中間物C7 1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁醯基}肼基)乙酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0251-2295
將0.2g(0.305mmol)中間物C3溶解在80mL DCM中，並摻入0.125g(0.46mmol)2-溴-1-乙基吡錠-四氟硼酸鹽(BEP)、94mg(0.61mmol)市售的肼基乙酸乙酯鹽酸鹽以及159μl N,N-二異丙基乙胺，隨後在室溫下將混合物攪拌1小時。隨後為反應混合物摻入乙酸乙酯及水，使得相彼此分離。用飽和氯化鈉溶液對有機相進行振搖萃取，隨 後透過硫酸鎂對其進行乾燥，並對其進行過濾及濃縮。在真空中對殘餘物進行乾燥，並在不執行純化的情況下將其進一步轉化。為此，將其置於20mL四氫呋喃中，並摻入10mL水及3.2mL 2N-氫氧化鋰溶液。在室溫下將混合物攪拌1小時，隨後用TFA調整至pH 7。隨後將混合物濃縮，並藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。如此便將目標化合物自其更先溶離的區位異構體分離。在將相應的溶離份合併，並進行凍乾及乾燥後，獲得形式為無色泡沫的19.7mg(理論之8%，歷經2小時)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=2.4min； LC-MS(方法1)：Rt=1.22min；MS(ESIpos)：m/z=687(M+H)+。
在受保護之中間體上將區位異構體分離後，在一獨立實驗中藉由NMR譜法進行對區位異構體的結構指定。目標化合物之受保護的中間體乙基-(1-{(2S)-4-[(乙醯氧基乙醯基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁醯基}肼基)乙酸酯具有以下1H-NMR譜： 1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)：δ=7.8(m,2H),7.4-7.2(m,6H),7.08(m,1H),6.73(d,1H),5.6(s,1H),5.25及4,89(2d,2H),4.89及4.77(2d,2H),4.62(t,1H),4.32及3.78(2d,2H),4.1(t,2H),3.62-3.47(m),2.13(s,3H),1.41及0.72(2m,2H),1.3(s,9H),1.18(t,3H),0.92(s,9H).
中間物C8 N-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁醯基}-beta-丙胺酸
Figure 105119613-A0202-12-0253-2296
將293mg(0.41mmol)中間物C3溶解在25mL DMF中，隨後摻入144mg(0.75mmol)N-(3-二甲胺基丙基)-N'-乙基碳化二亞胺-鹽酸鹽(EDC)、128mg(0.83mmol)1-羥基苯并三唑、218μl N,N-二異丙基乙胺，最後摻入70mg(0.5mmol)市售的3-甲氧基-3-氧代丙烷-1-氯化銨。在室溫下將混合物攪拌4小時，隨後在真空中將其濃縮。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。將相應的溶離份濃縮，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得177mg(理論之53%)受保護的中間體。
HPLC(方法11)：Rt=2.6min； LC-MS(方法1)：Rt=1.33min；MS(ESIpos)：m/z=742(M+H)+。
將177mg(0.22mmol)此中間體置於20mL甲醇中，並摻入2.8mL 2N-氫氧化鋰溶液。在室溫下將混合物攪拌18小時。隨後進行濃縮，將殘餘物置於水中，並用5%的檸檬酸將溶液調整至pH 5。隨後用DCM進行兩次萃取，透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，並進行濃縮。最後將殘餘物自乙腈/水凍乾，獲得133mg(理論之81%)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=2.3min； LC-MS(方法3)：Rt=7.4min；MS(ESIpos)：m/z=686(M+H)+。
中間物C9 (6S)-6-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲 基丙基}(乙二醇醯基)胺基]乙基}-2,2-二甲基-4,7-二氧代-3,11,14,17-四氧雜-5,8-二氮雜二十烷-20-酸
Figure 105119613-A0202-12-0254-2297
在第一步中，在15mL DMF中，在有44mg(0.228mmol)1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺-鹽酸鹽、35mg(0.228mmol)1-羥基-1H-苯并三唑-水合物及60μl N,N-二異丙基乙胺的情況下，將70mg(0.114mmol)中間物C5與32mg(0.114mmol)第三丁基-3-{2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸酯偶聯。
在室溫下將混合物攪拌一夜，並藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。分離出33mg(理論之33%)的受保護的中間物。藉由11mL二氯甲烷中之1.1mL三氟乙酸，將此中間體攪拌1小時，處理後獲得26mg(98%)完全去保護的化合物。
最後將中間物置於2mL DCM中，透過兩次添加10mg二碳酸二第三丁基酯及79μl N,N-二異丙基乙胺，在室溫下攪拌3日後插入第三丁氧基羰基保護基。在透過製備性HPLC對產物進行純化後，獲得16.4mg(理論之66%)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=2.3min； LC-MS(方法1)：Rt=1.22min；MS(ESIpos)：m/z=818(M+H)+。
中間物C10 第三丁基-{3-[{(1R)-1-[1-(3-胺基苄基)-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}胺基甲酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0255-2298
以中間物C1為基礎歷經6個階段製備目標化合物。在第一步中，將1g(2.77mmol)中間體C1及0.864g(5mmol)第三丁基-(3-氧代丙基)胺基甲酸酯混合在100mL甲醇中，並摻入400mL乙酸及1.288g(13.9mmol)硼烷-吡啶錯合物。在室溫下將混合物攪拌3日。隨後在真空中進行濃縮，並藉由急驟層析在矽膠上對殘餘物進行純化(溶離劑：二氯甲烷/乙酸乙酯9：1->二氯甲烷/甲醇95：5)。在將相應的溶離份濃縮並在高真空中進行乾燥後，獲得1255g(理論之80%)經N-烷基化之中間體。
LC-MS(方法1)：Rt=1.0min；MS(ESIpos)：m/z=513(M+H)+。
將1.255g(2.2mmol)此中間體溶解在50mL DCM中，隨後摻入1.2mL三乙胺以及0.52mL(4.85mmol)乙醯氧基乙醯氯。在室溫下將混合物攪拌一夜，隨後在真空中將其濃縮。將殘餘物置於乙酸乙酯中，並用飽和碳酸氫鈉溶液進行三次振搖萃取，隨後用飽和氯化鈉溶液進行振搖萃取。透過硫酸鈉對有機相進行乾燥，隨後將其濃縮。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。
獲得593mg(理論之41%)醯化中間體。
LC-MS(方法1)：Rt=1.4min；MS(ESIpos)：m/z=613 (M+H)+。
將993mg(0.91mmol)此中間體溶解在100mL乙醇中，在添加60mg 10%的鈀-活性炭後，在室溫下在氫正常壓力下進行3小時的氫化。隨後將催化劑濾出，並在真空中將溶劑移除。獲得494mg(理論之91%)形式為近乎無色之油的經脫苄基的咪唑衍生物。LC-MS(方法1)：Rt=1.17min；MS(ESIpos)：m/z=523(M+H)+。
將150mg(0.25mmol)此中間體置於15mL DMF中，並摻入69.2mg(0.5mmol)碳酸鉀。在室溫下攪拌15分鐘後，添加60mg(0.28mmol)對硝基苄溴並攪拌一夜。隨後在真空中將溶劑移除，將殘餘物置於乙酸乙酯中，並用飽和碳酸氫鈉溶液進行萃取。用飽和氯化鈉溶液對有機相進行洗滌，對其進行旋轉蒸發，並藉由製備性HPLC將其純化。對相應的溶離份進行旋轉蒸發，並將殘餘物自1,4-二噁烷凍乾。獲得169mg(定量)中間體。
LC-MS(方法1)：Rt=1.39min；MS(ESIpos)：m/z=658(M+H)+。
將165mg(0.251mmol)此中間體置於30mL乙醇中，並摻入0.72mL 40%的甲胺水溶液。在50℃下將混合物攪拌5小時，隨後再次添加相同量的甲胺溶液。在進一步攪拌10小時後，在真空中將混合物濃縮。用二乙醚進行兩次再蒸餾，隨後將殘餘物自乙腈/水凍乾。殘餘148mg(89%)此中間體。
LC-MS(方法6)：Rt=2.97min；MS(ESIpos)：m/z=616(M+H)+。
將98mg(0.15mmol)前體溶解在15mL THF中，隨後在室溫下添加一由6mL水中之569mg(3.27mmol)連二亞硫酸二鈉構成的溶液。在50℃下攪拌8小時後，再次添加相同量的(溶解於1mL H2O中的)連二亞硫酸鹽。在50℃下進一步攪拌16小時後，將混合物冷卻至室溫，並 用乙酸乙酯對其進行萃取。將有機相濃縮，並藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。在將殘餘物自1,4-二噁烷凍乾後，獲得44.5mg(理論之47%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.24min；MS(ESIpos)：m/z=586(M+H)+。
中間物C11 R/S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-高半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0257-2299
將990.0mg(2.79mmol)(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙烷-1-胺置於15.0mL二氯甲烷中，並摻入828.8mg(3.91mmol)三乙醯氧基硼氫化鈉及129.9mg(3.21mmol)乙酸，並在室溫下攪拌5min。將698.1mg(3.21mmol)2-(三甲基矽基)乙基-(3-氧代丙基)胺基甲酸酯(中間物L58)溶解在15.0mL二氯甲烷中，在室溫下將反應混合物攪拌一夜。用乙酸乙酯將反應混合物稀釋，並用飽和碳酸鈉溶液及飽和NaCl溶液分別將有機相洗滌兩次。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，並在真空中將溶劑蒸發。藉由矽膠(溶離劑：二氯甲烷/甲醇100：2)對殘餘物進行純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高 真空中對殘餘物進行乾燥。獲得1.25g(理論之73%)2-(三甲基矽基)乙基-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺基甲酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.09min；MS(ESIpos)：m/z=556(M+H)+。
為400.0mg(0.65mmol)2-(三甲基矽基)乙基-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺基甲酸酯摻入151.4mg(1.5mmol)三乙胺及161.6mg(1.43mmol)氯乙醯氯。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。為反應混合物摻入乙酸乙酯，並用水將有機相洗滌三次，以及用飽和NaCl溶液洗滌一次。透過硫酸鎂進行乾燥，並在真空中將溶劑蒸發。藉由矽膠(溶離劑：環己烷/乙酸乙酯3：1)對殘餘物進行純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得254.4mg(理論之57%)2-(三甲基矽基)乙基-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺基甲酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.49min；MS(ESIneg)：m/z=676(M+HCOO-)-。
將117：4mg(0.19mmol)2-(三甲基矽基)乙基-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺基甲酸酯溶解在10.0mL二異丙基乙胺中，並摻入928.4μL 1M NaOH及50.2mg(0.37mmol)DL-高半胱胺酸。在50℃下將反應混合物攪拌4.5小時。為反應混合物摻入乙酸乙酯，並用飽和碳酸氫鈉溶液及飽和NaCl溶液洗滌有機相。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，並在真空中將溶劑蒸發。藉由製備性RP-HPLC對殘餘物進行純化(柱：Reprosil 250x40；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得75.3 mg(理論之48%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.24min；MS(ESIpos)：m/z=731(M+H)+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=0.03(s,9H),0.40(m,1H),0.75-0.91(m,11H),1.30(m,1H),1.99-2.23(m,2H),2.63-2.88(m,4H),3.18-3.61(m,5H),3.79-4.10(m,3H),4.89(d,1H),4.89(d,1H),5.16(d,1H),5.56(s,1H),6.82(m,1H),6.91(s,1H),6.97(m,1H),7.13-7.38(m,6H),7.49(s,1H),7.63(m,1H),8.26(s,3H)
中間物C12 R/S-[(8S)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8-羧基-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基]高半胱胺酸
Figure 105119613-A0202-12-0259-2300
藉由甲基-(2S)-4-氧代-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丁酸酯(中間物L57)與充當離析劑之中間物C52，以與中間物C11之合成類似的方式進行合成。
LC-MS(方法1)：Rt=1.18min；MS(ESIpos)：m/z=775(M+H)+。
中間物C13 9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3-氧雜-12-硫雜-5,9-二氮雜十八烷-18-酸
Figure 105119613-A0202-12-0260-2301
將90.0mg(0.15mmol)中間物C16與43.6mg(0.23mmol)6-(乙醯基巰基)己酸溶解在9.0mL甲醇中，並摻入一滴水以及73.9mg(0.54mmol)碳酸鉀。在50℃下將反應混合物攪拌4小時，並用乙酸乙酯將其稀釋。用水/飽和NaCl溶液以及飽和NaCl溶液洗滌有機相，隨後透過硫酸鎂對其進行乾燥。在真空中將溶劑蒸發，並在矽膠上對殘餘物進行層析(溶離劑：二氯甲烷/甲醇=100：2)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得理論之83%的目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.44min；MS(ESIpos)：m/z=701(M+H)+。
中間物C14 R/S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(第三丁氧基羰基)胺基]丙基}胺基)-2-氧代乙基]高半胱胺酸
Figure 105119613-A0202-12-0261-2302
將100.0mg(0.17mmol)第三丁基-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺基甲酸酯(中間物C16)置於4.0mL異丙醇中，並摻入276.5mg(0.85mmol)1M NaOH溶液及45.9mg(0.34mmol)D/L-高半胱胺酸。在50℃下將反應混合物攪拌1小時。用乙酸乙酯將反應混合物稀釋。用飽和碳酸氫鈉溶液及飽和NaCl溶液洗滌有機相。透過硫酸鎂進行乾燥，並在真空中將溶劑蒸發。藉由製備性RP-HPLC對殘餘物進行純化(柱：Reprosil 250x40；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。
獲得92.6mg(理論之66%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.07min；MS(ESIpos)：m/z=688(M+H)+。
中間物C15 第三丁基-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺基甲酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0262-2303
將750.0mg(2.11mmol)N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(中間物C1)溶解在15.0mL二氯甲烷中，並摻入626.0mg(2.95mmol)三乙醯氧基硼氫化鈉以及139μL(2.43mmol)HOAc，並在室溫下攪拌5分鐘。隨後添加420.3mg(2.43mmol)第三丁基-(3-氧代丙基)胺基甲酸酯(合成參閱J.Med.Chem.2003,46,3536.)，並在室溫下攪拌一夜。為反應混合物摻入乙酸乙酯，並用飽和碳酸鈉溶液將其萃取兩次。用飽和NaCl溶液洗滌有機相，並透過硫酸鎂對其進行乾燥。在真空中將溶劑蒸發，並在矽膠上對殘餘物進行層析(溶離劑：環己烷/乙酸乙酯=4：1)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得881.0mg(理論之82%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.07min；MS(ESIpos)：m/z=513[M+H]+。
中間物C16 第三丁基-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺基甲酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0263-2304
將373.4mg(0.73mmol)第三丁基-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺基甲酸酯(中間物C15)置於5.0mL二氯甲烷中，並摻入169.5mg(1.68mmol)三乙胺以及181.0mg(1.60mmol)氯乙醯氯。在室溫下將反應混合物攪拌一夜，隨後為其摻入乙酸乙酯，並用水多次萃取。用飽和NaCl溶液洗滌有機相，並透過硫酸鎂對其進行乾燥。在真空中將溶劑蒸發，並在矽膠上對殘餘物進行層析(溶離劑：二氯甲烷/甲醇=100：0.5)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得336.0mg(理論之75%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.48min；MS(ESIpos)：m/z=589[M+H]+。
中間物C17 9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3,15,18,21,24-五氧雜-12-硫雜-5,9-二氮雜二十七烷-27-酸
Figure 105119613-A0202-12-0264-2305
將50.0mg(0.09mmol)第三丁基-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺基甲酸酯(中間物C16)置於2.0mL DMF中，並摻入69.1mg(0.21mmol)碳酸銫以及28.8mg(0.10mmol)1-巰基-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-酸。在50℃下攪拌一夜。為反應混合物摻入水，並直接藉由製備性RP-HPLC對其進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得25.1mg(理論之35%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.42min；MS(ESIpos)：m/z=835[M+H]+。
中間物C18 第三丁基-[22-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-4,21-二氧代-7,10,13,16-四氧雜-19-硫雜-3,22-二氮雜二十五烷-25-基]胺基甲酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0265-2306
將21.0mg(0.03mmol)9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3,15,18,21,24-五氧雜-12-硫雜-5,9-二氮雜二十七烷-27-酸(中間物C17)與5.8mg(0.0.3mmol)1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮鹽酸鹽(1：1)置於1.0mL乙腈中，並摻入26.1mg(0.20mmol)N,N-二異丙基乙胺以及20.9mg(0.03mmol)T3P(50%，乙酸乙酯中)。在室溫下攪拌一夜。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得19.7mg(理論之79%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.42min；MS(ESIpos)：m/z=835[M+H]+。
中間物C19 第三丁基-(13-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-10-硫雜-7,13-二氮雜-2-矽雜十六烷-16-基)胺基甲酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0266-2307
將58.5mg(0.10mmol)第三丁基-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺基甲酸酯(中間物C16)置於2.0mL DMF中，並摻入44.0mg(0.20mmol)2-(三甲基矽基)乙基-(2-巰基乙基)胺基甲酸酯(中間物L39)及64.7mg(0.20mmol)碳酸銫。在50℃下攪拌4小時。藉由46.6mg(0.079mmol)中間物C16重複此反應。將該二反應混合物合併，並直接藉由製備性RP-HPLC對其進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得98.0mg(理論之71%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.62min；MS(ESIpos)：m/z=774[M+H]+。
中間物C20 三氟乙酸--第三丁基-[3-({[(2-胺基乙基)硫基]乙醯基}{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-yl]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺基甲酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0267-2308
將98.0mg(0.13mmol)第三丁基-(13-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-10-硫雜-7,13-二氮雜-2-矽雜十六烷-16-基)胺基甲酸酯(中間物C19)置於2.0mL DMF/第三丁醇(9：1)中，並摻入96.2mg(0.63mmol)CsF。在90℃下攪拌16小時。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並將殘餘物凍乾。獲得57.1mg(理論之61%)目標化合物。此化合物亦包含相應的亞碸。
LC-MS(方法1)：Rt=1.08min；MS(ESIpos)：m/z=630[M+H]+。
中間物C21 第三丁基-[38-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,31,37-三氧代-7,10,13,16,19,22,25,28-八氧雜-35-硫雜-4,32,38-三氮雜四十一烷-41-基]胺基甲酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0268-2309
將57.1mg(0.08mmol)三氟乙酸--第三丁基-[3-({[(2-胺基乙基)硫基]乙醯基}{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺基甲酸酯(中間物C20)置於3.0mL DMF中，並摻入53.0mg(0.08mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜二十七碳-1-基}丙醯胺以及15.5mg(0.15mmol)三乙胺。在室溫下攪拌16小時。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並將殘餘物凍乾。獲得49.7mg(理論之49%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.34min；MS(ESIpos)：m/z=1204[M+H]+。
中間物C22 第三丁基-[38-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-35-氧離子基-3,31,37-三氧代-7,10,13,16,19,22,25,28-八氧雜-35λ4-硫雜-4,32,38-三氮雜四十一烷-41-yl]胺基甲酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0269-2310
此目標化合物係中間物C21之合成過程中的副產物。獲得15.5mg(理論之15%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.25min；MS(ESIpos)：m/z=1220[M+H]+。
中間物C23 第三丁基-3-胺基-4-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]甲基}吡咯啶-1-羧酸酯
由立體異構體構成之混合物。
Figure 105119613-A0202-12-0269-2311
將411.2mg(1.15mmol)第三丁基-3-甲醯基-4-({[2-(三甲基矽基) 乙氧基]羰基}胺基)-吡咯啶-1-羧酸酯(中間物L28)與339.7mg(0.96mmol)N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(中間物C1)置於6.0mL二氯甲烷中，並摻入68.9mg(1.15mmol)HOAc，並在室溫下攪拌1小時。添加405.2mg(1.91mmol)三乙醯氧基硼氫化鈉，並在室溫下攪拌2小時。在真空中將溶劑蒸發，並為殘餘物摻入乙酸乙酯及水。用乙酸乙酯對水相進行三次萃取。用飽和NaCl溶液將經合併之有機相洗滌一次，並透過硫酸鎂對其進行乾燥。在真空中將溶劑蒸發，並藉由Biotage Isolera對殘餘物進行純化(矽膠，柱50g SNAP，流量40mL/min，石油醚/乙酸乙酯)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得541.5mg(理論之81%)第三丁基-3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)甲基]-4-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)吡咯啶-1-羧酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.24及1.29min；MS(ESIpos)：m/z=698[M+H]+。
將541.5mg(0.78mmol)第三丁基-3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)甲基]-4-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)吡咯啶-1-羧酸酯溶解在13.0mL二氯甲烷中，並摻入180.6mg(1.78mmol)三乙胺。將反應溶液冷卻至0℃並摻入233.1mg(1.71mmol)乙醯氧基乙醯氯，並在室溫下攪拌16小時。再添加180.6mg(1.78mmol)三乙胺以及233.1mg(1.71mmol)乙醯氧基乙醯氯，並在室溫下再攪拌80小時。在真空中將溶劑蒸發，並將殘餘物分佈於水及乙酸乙酯之間。用乙酸乙酯對水相進行三次萃取。用飽和NaCl溶液將經合併之有機相洗滌一次，並透過硫酸鎂對其進行乾燥。在真空中將溶劑蒸發，並藉由Biotage Isolera對殘餘物進行純化(矽膠，柱50g SNAP，流量40mL/min，石油醚/乙酸乙酯)。在真空中 將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得529.2mg(理論之86%)第三丁基-3-{[(乙醯氧基乙醯基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]甲基}-4-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)吡咯啶-1-羧酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.53及1.56min；MS(ESIpos)：m/z=798[M+H]+。
將529.2mg(0.66mmol)第三丁基-3-{[(乙醯氧基乙醯基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]甲基}-4-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)吡咯啶-1-羧酸酯置於10.0mL DMF/第三丁醇(9：1)中，並摻入503.7mg(3.32mmol)CsF。在90℃下將反應混合物攪拌16小時。將反應混合物分佈於水及乙酸乙酯之間。用乙酸乙酯對水相進行三次萃取。用飽和NaCl溶液將經合併之有機相洗滌一次，並透過硫酸鎂對其進行乾燥。在真空中將溶劑蒸發，並藉由Biotage Isolera對殘餘物進行純化(矽膠，柱50g SNAP，流量25mL/min，二氯甲烷/甲醇)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得172.4mg(理論之40%)第三丁基-3-{[(乙醯氧基乙醯基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]甲基}-4-胺基吡咯啶-1-羧酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.05及1.35min；MS(ESIpos)：m/z=654[M+H]+。
將172.4mg(0.26mmol)第三丁基-3-{[(乙醯氧基乙醯基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]甲基}-4-胺基吡咯啶-1-羧酸酯置於4.5mL甲醇/水(2：1)中，並摻入80.2mg(0.58mmol)碳酸鉀，並在室溫下攪拌16小時。將反應混合物分佈於水及乙酸乙酯之間。用乙酸乙酯對水相進行三次萃取。用飽和NaCl溶液將經合併之有機相洗滌一次，並透過硫酸鎂對其進行乾燥。在真空中 將溶劑蒸發，並藉由製備性RP-HPLC對殘餘物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得116.0mg(理論之72%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.01min及1.03min；MS(ESIpos)：m/z=612[M+H]+。
中間物C24 三氟乙酸--第三丁基-3-(胺基甲基)-4-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]甲基}吡咯啶-1-羧酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0272-2312
將26.8mg(2.11mmol)(N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(中間物C1)溶解在3.0mL二氯甲烷中，並摻入5.2mg(0.09mmol)HOAc以及22.4mg(0.11mmol)三乙醯氧基硼氫化鈉，並在室溫下攪拌5分鐘。添加62.4mg(0.09mmol)第三丁基-3-甲醯基-4-[({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)甲基]吡咯啶-1-羧酸酯(中間物L29)，並在室溫下攪拌一 夜。在真空中將溶劑蒸發，並藉由製備性RP-HPLC對殘餘物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得57.6mg(理論之91%)三氟乙酸--第三丁基-3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)甲基]-4-[({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)甲基]吡咯啶-1-羧酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.25及1.27min；MS(ESIpos)：m/z=712[M+H]+。
將77.0mg(0.11mmol)第三丁基-3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)甲基]-4-[({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)甲基]吡咯啶-1-羧酸酯置於1.5mL二氯甲烷中，並摻入21.9mg(0.22mmol)三乙胺。隨後在0℃下添加29.5mg(0.22mmol)乙醯氧基乙醯氯，並在室溫下將反應混合物攪拌一夜。在真空中將溶劑蒸發，並將殘餘物置於乙酸乙酯中。分別用水、飽和碳酸氫鈉溶液及飽和NaCl溶液將有機相洗滌一次。在透過硫酸鎂進行乾燥後，在真空中將溶劑蒸發。獲得包含77.0mg(0.11mmol)第三丁基-3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)甲基]-4-[({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)甲基]之混合物。藉由矽膠(溶離劑：環己烷/乙酸乙酯=2：1)對經合併之殘餘物進行純化。獲得171.1mg(理論之85%)第三丁基-3-{[(乙醯氧基乙醯基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]甲基}-4-[({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)甲基]吡咯啶-1-羧酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.56及1.57min；MS(ESIpos)：m/z=812[M+H]+。
將30.0mg(0.04mmol)第三丁基-3-{[(乙醯氧基乙醯基){(1R)-1- [1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]甲基}-4-[({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)甲基]吡咯啶-1-羧酸酯溶解在0.5mL TBAF溶液(1M，THF溶液)。在室溫下攪拌一夜。在真空中將溶劑蒸發，並藉由製備性RP-HPLC對殘餘物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得25.0mg(理論之92%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.98min；MS(ESIpos)：m/z=626[M+H]+。
中間物C25 4-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]甲基}-1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-羧酸
Figure 105119613-A0202-12-0274-2313
將171.4mg(0.48mmol)N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(中間物C1)置於4.0mL二氯甲烷中，並摻入248.5mg(0.72mmol)第三丁基-3-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)-4-甲醯基吡咯啶-1-羧酸酯(中間物L30)以及34.8mg(0.58mmol)HOAc。在室溫下將反應混合物攪拌1小時。添加204.4mg(0.97mmol)三乙醯氧基硼氫化鈉，並在室溫下攪拌60小時。在真空中將溶劑移除，並藉由Biotage Isolera對殘餘物 進行純化(矽膠，柱25g SNAP，流量25mL/min，石油醚/乙酸乙酯)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得267.0mg(理論之77%)第三丁基-3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)甲基]-4-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)吡咯啶-1-羧酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.49min；MS(ESIpos)：m/z=683[M+H]+。
將267.0mg(0.39mmol)第三丁基-3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)甲基]-4-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)吡咯啶-1-羧酸酯溶解在5.0mL二氯甲烷中，並摻入91.0mg(0.90mmol)三乙胺，並冷卻至0℃。添加117.4mg(0.86mmol)乙醯氧基乙醯氯，並在室溫下攪拌16小時。再添加593.4mg(5.87mmol)三乙胺以及427.0mg(3.13mmol)乙醯氧基乙醯氯，並在室溫下再攪拌10小時。在真空中將溶劑蒸發，並藉由製備性RP-HPLC對殘餘物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。隨後在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得216.3mg(理論之71%)第三丁基-3-{[(乙醯氧基乙醯基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]甲基}-4-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)吡咯啶-1-羧酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.70及1.72min；MS(ESIpos)：m/z=783[M+H]+。
將216.3mg(0.28mmol)第三丁基-3-{[(乙醯氧基乙醯基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)甲基]-4-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)吡咯啶-1-羧酸酯置於4.0mL THF中，並摻入16.6mg(0.28mmol)HOAc以及361.1mg(1.38mmol) TBAF溶液(1M，THF溶液)。在室溫下將反應溶液攪拌4小時。在真空中將溶劑蒸發，並藉由製備性RP-HPLC對殘餘物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。隨後在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得94.0mg(理論之51%)第三丁基-3-{[(乙醯氧基乙醯基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]甲基}-4-(羥甲基)吡咯啶-1-羧酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.34min；MS(ESIpos)：m/z=669[M+H]+。
將52.0mg(0.08mmol)第三丁基-3-{[(乙醯氧基乙醯基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]甲基}-4-(羥甲基)吡咯啶-1-羧酸酯置於4.0mL PBS緩衝液/乙腈(1：1)中，並摻入1.2mg(0.01mmol)TEMPO。同時添加14.1mg(0.16mmol)溶解於1.0mL水中的亞氯酸鈉以及115.8μL(0.16mmol)10%的次氯酸鈉溶液。在室溫下將反應混合物攪拌16小時。將反應混合物注入10%的亞硫酸鈉溶液中，並摻入乙酸乙酯。用乙酸乙酯對水相進行三次萃取，並用飽和NaCl溶液將經合併之有機相洗滌一次，並透過硫酸鎂對其進行乾燥。在真空中將溶劑蒸發，並將殘餘物應用於下一合成階段，而不對其作進一步純化。
LC-MS(方法1)：Rt=1.34min；MS(ESIpos)：m/z=683[M+H]+。
將103.0mg(0.15mmol)4-{[(乙醯氧基乙醯基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]甲基}-1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-羧酸置於4.5mL甲醇/水(2：1)中，並摻入45.9mg(0.33mmol)碳酸鉀，並在室溫下攪拌3小時。將反應混合物分佈於水及乙酸乙酯之間。用乙酸乙酯對水相進行三次萃取，並用飽和NaCl溶 液將經合併之有機相洗滌一次，並透過硫酸鎂對其進行乾燥。在真空中將溶劑蒸發，並將目標化合物應用於下一合成階段，而不對其作進一步純化。
LC-MS(方法1)：Rt=1.35min；MS(ESIpos)：m/z=641[M+H]+。
中間物C26 第三丁基-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)-2-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)丙基]胺基甲酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0277-2314
將590mg(1.69mmol)三乙醯氧基硼氫化鈉及155μl(2.70mmol，162mg)乙酸置於30mL二氯甲烷中，並在室溫下將混合物攪拌30分鐘。隨後將600mg(1.687mmol)(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙烷-1-胺(透過相對1N苛性鈉振搖自三氟乙酸--(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙烷-1-胺(1：1)獲取)以及750mg(2.362mmol)第三丁基-(3-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}-2-甲醯基丙基)胺基甲酸酯滴入溶解在40mL二氯甲烷中。在室溫下攪拌2小時。隨後添加乙酸乙酯，用飽和碳酸鈉溶液洗滌混合物，並將有機相濃縮。藉由製備性HPLC(溶離劑：ACN/ 水，梯度)將殘餘物分離。獲得510mg(理論之46%)形式為非對映異構體混合物的目標化合物。
異構體1：
LC-MS(方法1)：Rt=1.36min(51%)；MS(EIpos)：m/z=657[M+H]+。
異構體2：
LC-MS(方法1)：Rt=1.41min(49%)；MS(EIpos)：m/z=657[M+H]+。
中間物C27 2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(第三丁氧基羰基)胺基]-2-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)丙基}胺基)-2-氧代乙酸乙酯
Figure 105119613-A0202-12-0278-2315
將510mg(0.776mmol)第三丁基-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)-2-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)丙基]胺基甲酸酯置於30mL二氯甲烷中，並在室溫下摻入181mg(249μl，1.786mmol)三乙胺以及219mg(1.553mmol)2-氯-2-氧代乙酸乙酯。在室溫下將反應混合物攪拌2小時，隨後用飽和碳酸氫鈉溶液對其進行洗滌。透過硫酸鈉對有機相進行乾燥，並在旋 轉蒸發器上將其濃縮。藉由製備性HPLC(溶離劑：ACN/水，梯度)將殘餘物分離。獲得290mg(理論之49%)形式為差向異構體混合物的目標化合物。
異構體1：
LC-MS(方法1)：Rt=1.70min；MS(EIpos)：m/z=757[M+H]+。
異構體2：
LC-MS(方法1)：Rt=1.72min；MS(EIpos)：m/z=757[M+H]+。
中間物C28 2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(第三丁氧基羰基)胺基]-2-(羥甲基)丙基}胺基)-2-氧代乙酸乙酯
Figure 105119613-A0202-12-0279-2316
將285mg(0.376mmol)2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(第三丁氧基羰基)胺基]-2-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)丙基}胺基)-2-氧代乙酸乙酯溶解在5mL THF中。添加452μl(0.452mmol)的四正丁基氟化銨之1M THF溶液，並在室溫下將反應混合物攪拌3小時。藉由製備性HPLC(溶離劑： ACN/水，梯度)將反應混合物分離及凍乾。獲得214mg(理論之81%，LC/MS純度=92%)形式為差向異構體混合物的目標化合物。
異構體1：
LC-MS(方法1)：Rt=1.37min；MS(EIpos)：m/z=643[M+H]+。
異構體2：
LC-MS(方法1)：Rt=1.40min；MS(EIpos)：m/z=643[M+H]+。
中間物C29 2-([3-(乙醯基硫基)-2-{[(第三丁氧基羰基)胺基]甲基}丙基]{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)-2-氧代乙酸乙酯
Figure 105119613-A0202-12-0280-2317
將210mg(0.301mmol)2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(第三丁氧基羰基)胺基]-2-(羥甲基)丙基}胺基)-2-氧代乙酸乙酯置於8mL無水THF中，在室溫下逐滴摻入178mg(1.503mmol，109μl)溶解於8mL無水THF中的亞硫醯氯，並在室溫下攪拌40分鐘。在旋轉蒸發器上將反應混合物濃縮，並在高真空中對其進行乾燥。將殘餘物置於16mL無水DMF中，摻入172mg (1.503mmol)硫代乙酸酯以及133mg(0.361mmol)四正丁基碘化銨，並在90℃下攪拌2小時。在冷卻後添加水，並用乙酸乙酯對混合物進行萃取。在旋轉蒸發器上將有機相濃縮，並藉由製備性HPLC(溶離劑：ACN/水，梯度)將殘餘物分離及凍乾。獲得155mg(理論之69%，LC/MS純度=94%)形式為差向異構體混合物的目標化合物。
異構體1：
LC-MS(方法1)：Rt=1.50min；MS(EIpos)：m/z=701[M+H]+。
異構體2：
LC-MS(方法1)：Rt=1.51min；MS(EIpos)：m/z=701[M+H]+。
中間物C30 二第三丁基-[二硫烷二基雙(2-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]甲基}丙烷-3,1-二基)]雙胺基甲酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0281-2318
將1.220g(1.010mmol,LC/MS純度=58%)2-([3-(乙醯基硫基)-2-{[(第三丁氧基羰基)胺基]甲基}丙基]{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)-2-氧代乙酸乙酯置於30mL THF及30mL甲醇中，摻入10mL 1N苛性鈉，並在室溫下攪拌2小時。為反應混合物摻入水，並用二氯甲烷對其進行萃取。透過硫酸鈉對有機相進行乾燥，並在旋轉蒸發器上將其濃縮。藉由製備性HPLC(溶離劑：ACN/水，梯度)將殘餘物純化。獲得390mg(理論之54%，LC/MS純度=86%)形式為非對映異構體混合物的目標化合物。
異構體：
LC-MS(方法1)：Rt=1.81min；MS(EIpos)：m/z=1232[M+H]+。
中間物C31 第三丁基-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-2-(巰基甲基)丙基}胺基甲酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0282-2319
將390mg(0.272mmol，LC/MS純度=86%)二第三丁基-[二硫烷二基雙(2-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]甲基}-丙烷-3,1-二基)]雙胺基甲酸酯置於20mL 1.4-二噁烷以及10mL PBS緩衝液中，並摻入234mg(0.817mmol)3,3',3"-磷脂醯基三丙酸鹽酸鹽(1：1)。在室溫下攪拌16小時。隨後在旋轉蒸發器上將反應混合物濃縮，透過二氯甲烷進行澱析，將濾液濃縮並在高真空中對其進行乾燥。將殘餘物溶解在8mL異丙醇中，並藉 由對掌性層析法(柱：250x30mm填入Daicel Chiralpak AZ-H，溶離劑：異己烷/異丙醇=90：10)將其純化。獲得目標化合物之兩個溶離份。溶離份1包含181.2mg(理論之50%)異構體1，而溶離份2包含90.2mg(理論之25%)異構體2。
異構體1：
對掌性HPLC(柱：250x4.6mm，填有Diacel Chiralpak AZ-H，溶離劑：異己烷/乙醇90：10)：Rt=6.98min。
LC-MS(方法1)：Rt=1.47min；MS(EIpos)：m/z=617[M+H]+。
異構體2：
對掌性HPLC(柱：250x4.6mm，填有Diacel Chiralpak AZ-H，溶離劑：異己烷/乙醇90：10)：Rt==9.39min。
LC-MS(方法1)：Rt=1.47min；MS(EIpos)：m/z=617[M+H]+。
中間物C32 N-[3-胺基-2-(巰基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺鹽酸鹽(1：1)(異構體1)
Figure 105119613-A0202-12-0283-2320
將123mg(199.42μmol)第三丁基-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-2-(巰基甲 基)丙基}胺基甲酸酯(異構體1)溶解在2mL THF中，並用半濃縮鹽酸在室溫下攪拌1小時。在氬氛圍下對反應溶液進行去揮發物，隨後將其凍乾。獲得108mg(理論之98%)目標化合物。
異構體1
LC-MS(方法1)：Rt=0.95min；MS(EIpos)：m/z=517[M+H]+。
中間物C33 N-[3-胺基-2-(巰基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺鹽酸鹽(1：1)(異構體2)
Figure 105119613-A0202-12-0284-2321
將123mg(199.42μmol)第三丁基-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-2-(巰基甲基)丙基}胺基甲酸酯(異構體2)溶解在2mL THF中，並用半濃縮鹽酸在室溫下攪拌1小時。在氬氛圍下對反應溶液進行去揮發物，隨後將其凍乾。獲得58mg(理論之63%，LC/MS純度=91%)目標化合物。
異構體2
LC-MS(方法1)：Rt=0.97min；MS(EIpos)：m/z=517[M+H]+。
中間物C34 第三丁基-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二 甲基丙基}胺基)丙基]胺基甲酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0285-2322
將3.790g(10.02mmol)(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙烷-1-胺(透過相對1N苛性鈉振搖自三氟乙酸--(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二苯基丙烷-1-胺(1：1)獲取)及3.186g(15.04mmol)三乙醯氧基硼氫化鈉，以及690μl(12.03mmol，722mg)置於100mL二氯甲烷中。在室溫下攪拌5分鐘。
隨後添加4.687g(27.06mmol)第三丁基-(3-氧代丙基)胺基甲酸酯，並在室溫下攪拌16小時。用二氯甲烷將反應混合物稀釋，並用飽和碳酸氫鈉溶液進行洗滌。透過硫酸鈉對有機相進行乾燥，並在旋轉蒸發器上將其濃縮。藉由層析法在矽膠上對殘餘物進行純化(溶離劑：二氯甲烷/乙酸乙酯，梯度=4：1→1：1)。獲得2.57g(理論之48%，LC/MS純度=96%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.00min；MS(EIpos)：m/z=513[M+H]+。
中間物C35 第三丁基-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(4-硝基苯甲醯基)胺基]丙基}胺基甲酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0286-2323
將200mg(0.38mmol)第三丁基-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺基甲酸酯置於9mL決對性二氯甲烷中，並在室溫下摻入120μl(0.86mmol，87mg)三乙胺。在室溫下逐滴添加83mg(0.45mmol)溶解於1mL無水二氯甲烷中的4-硝基苯甲醯氯，並在室溫下攪拌1小時。添加水，並在旋轉蒸發器上將混合物濃縮。藉由製備性HPLC(溶離劑：ACN/水+0.1% TFA，梯度)將殘餘物純化及乾燥。獲得181mg(理論之73%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.47min；MS(EIpos)：m/z=662[M+H]+。
中間物C36 第三丁基-{3-[(4-胺基苯甲醯基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]丙基}胺基甲酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0286-2324
將170mg(0.26mmol)第三丁基-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(4-硝基苯甲醯基)胺基]丙基}胺基甲酸酯置於10mL乙酸中。添加143mg(2.57mmol)鐵粉，並在50℃下攪拌16小時。在冷卻後添加水，並用乙酸乙酯對混合物進行萃取。透過硫酸鈉對有機相進行乾燥，並在旋轉蒸發器上將其濃縮。在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得154mg(理論之77%，LC/MS純度=82%)目標化合物。
LC-MS(方法5)：Rt=4.73min；MS(EIpos)：m/z=632[M+H]+。
中間物C37 N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-[4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(第三丁氧基羰基)胺基]丙基}胺甲醯基)苯基]-L-丙胺醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0287-2325
將38.6mg(0.05mmol，LC/MS純度=82%)第三丁基-{3-[(4-胺基苯甲醯基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]丙基}胺基甲酸酯溶解在無水DMF中，並摻入24.8mg(0.06mmol)HATU以及13.0mg(0.10mmol)N,N-二異丙基乙胺。在室溫下將混合物攪拌5分鐘，隨後摻入63mg(0.06mmol)N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九 烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸，並在室溫下攪拌3小時。添加7.5mg(0.06mmol)3H-[1,2,3]三唑[4,5-b]吡啶-3-醇(HOAt)，並攪拌16小時。添加19.1mg(0.05mmol)HATU，並在50℃下攪拌2小時。在冷卻後，直接藉由製備性HPLC將反應混合物純化(溶離劑：ACN/水+0.1% TFA，梯度)。獲得6.5mg(理論之9%，LC/MS純度=83%)目標化合物。
LC-MS(方法2)：Rt=7.89min；MS(EIpos)：m/z=1200.6[M+H]+。
中間物C38 2-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]-1H-異吲哚-1,3(2H)-二酮
Figure 105119613-A0202-12-0288-2326
將300.0mg(0.84mmol)2-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]-1H-異吲哚-1,3(2H)-二酮(中間物C1)置於4.0mL二氯甲烷中，並摻入58.3mg(0.97mmol)HOAc以及250.4mg(1.18mmol)三乙醯氧基硼氫化鈉，並在室溫下攪拌5分鐘。添加197.2mg(0.97mmol)3-(1,3-二氧代-1,3-二氫-2H-異吲哚-2-基)丙醛。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。用乙酸乙酯將反應混合物稀釋，並用飽和碳酸鈉溶液將有機相洗滌兩次，並用飽和NaCl溶液將其洗滌一次。在透過硫酸鎂進行乾燥後，在真空中將溶劑蒸發，並透過矽膠(溶離劑：乙酸乙酯/環己烷1：5)將殘餘物純化。在真 空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得333.3mg(70%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.05min；MS(ESIpos)：m/z=543[M+H]+。
中間物C39 2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-(1,3-二氧代-1,3-二氫-2H-異吲哚-2-基)丙基]胺基)-2-氧代乙酸乙酯
Figure 105119613-A0202-12-0289-2327
將332.3mg(0.61mmol)2-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]-1H-異吲哚-1,3(2H)-二酮(中間物C38)置於8.0mL二氯甲烷中，並摻入142.5mg(1.35mmol)三乙胺。在0℃下添加184.0mg(1.35mmol)乙醯氧基乙醯氯，並在室溫下將反應混合物攪拌一夜。用乙酸乙酯將反應混合物稀釋，並用飽和碳酸氫鈉溶液將有機相洗滌兩次，並用飽和NaCl溶液將其洗滌一次。在透過硫酸鎂進行乾燥後，在真空中將溶劑蒸發，並透過矽膠(溶離劑：乙酸乙酯/環己烷1：3)將殘餘物純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得367.1mg(63%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.42min；MS(ESIpos)：m/z=643[M+H]+。
中間物C40 N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0290-2328
將583.1mg(0.91mmol)2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-(1,3-二氧代-1,3-二氫-2H-異吲哚-2-基)丙基]胺基)-2-氧代乙酸乙酯(中間物C39)置於15.0mL乙醇中，並摻入1.41g(18.15mmol)甲烷胺(40%水溶液)。在50℃下將反應混合物攪拌一夜。在真空中將溶劑蒸發，並用甲苯將殘餘物共蒸餾三次。透過矽膠(溶離劑：二氯甲烷/甲醇=100：5)對殘餘物進行純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得324.9mg(73%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.97min；MS(ESIpos)：m/z=471[M+H]+。
中間物C41 三氟乙酸--L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0291-2329
將50.0mg(0.11mol)N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(中間物C40)以及30.4mg(0.11mmol)2,5-二氧代吡咯啶-1-基-N-(第三丁氧基羰基)-L-丙胺酸酯置於2.0mL DMF中，並摻入32.2mg(0.32mmol)4-甲基嗎啉。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。添加19.1mg(0.32mmol)HOAc，並直接藉由製備性RP-HPLC將反應混合物純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得38.0mg(56%)第三丁基-[(2S)-1-({3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}胺基)-1-氧代丙烷-2-基]胺基甲酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.26min；MS(ESIpos)：m/z=642[M+H]+。
將33.6mg(0.05mmol)第三丁基-[(2S)-1-({3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}胺基)-1-氧代丙烷-2-基]胺基甲酸酯化合物置於3.0mL二氯甲烷中。為反應混合物摻入119.4mg(1.05mmol)TFA，並在室溫下攪拌一夜。在真空中將溶劑蒸發，並直接藉由製備性RP-HPLC對殘餘物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水， 0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得32.8mg(96%)三氟乙酸--N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺(1：1)化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.93min；MS(ESIpos)：m/z=542[M+H]+。
將29.5mg(0.05mmol)三氟乙酸--N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺(1：1)以及14.1mg(0.05mmol)2,5-二氧代吡咯啶-1-基-N-(第三丁氧基羰基)-L-纈胺酸酯置於1.0mL DMF中，並摻入18.2mg(0.18mmol)4-甲基嗎啉。在室溫下將反應混合物攪拌一夜，並直接藉由製備性RP-HPLC對其進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得23.1mg(69%)N-(第三丁氧基羰基)-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.30min；MS(ESIpos)：m/z=741[M+H]+。
將19.4mg(0.03mmol)N-(第三丁氧基羰基)-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺化合物溶解在1.5mL二氯甲烷中，並摻入59.7mg(0.52mmol)TFA。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。添加119.4mg(1.04mmol)TFA，並在室溫下再攪拌一夜。在真空中將溶劑蒸發，並直接藉由製備性RP-HPLC對殘餘物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得19.2 mg(97%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.96min；MS(ESIpos)：m/z=641[M+H]+。
中間物C42 2,5-二氯重氮苯四氟硼酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0293-2330
準備3.00g(21.16mmol,2.68ml)三氟化硼-二乙醚錯合物，並在0℃下緩慢滴入1.37g(10.58mmol)溶解於27ml決對性THF中的2,5-二氟苯胺。在-10℃下滴入1.61g(13.75mmol,1.85ml)溶解於3ml無水THF中之亞硝酸異戊酯的溶液，並在相同溫度下進一步攪拌30分鐘。添加15ml二乙醚，將析出之重氮鹽濾出，用少許二乙醚對其進行洗滌，並在高真空中將其乾燥。獲得2.27g(理論之94%)目標化合物。
LC-MS(方法6)：Rt=0.24min；MS(ESIpos)：m/z=141[M]+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=8.11-8.17(m,1H),8.36-8.43(m,1H),8.69-8.73(m,1H).
中間物C43 甲基-氯[2-(2,5-二氟苯基)亞肼基]乙酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0293-2331
在氬氛圍下將3.63g(24.13mmol)甲基-2-氯-3-氧代丁酸酯置於100ml水中，並在-5℃下摻入48.90g(618.19mmol，50.00ml)吡啶，並在此溫度下攪拌10分鐘。隨後在-5℃下添加5.00g(21.94mmol) 2,5-二氯重氮苯四氟硼酸酯，其中形成橙色懸浮液。在此溫度下攪拌30分鐘，用水將混合物稀釋，並用二氯甲烷將其萃取三次。用飽和氯化鈉溶液對經合併之有機相進行洗滌，透過硫酸鈉對其進行乾燥，在旋轉蒸發器上將其濃縮，並在高真空中進行乾燥。獲得5.52g目標化合物(理論之97%，LC/MS純度=96%)。
LC-MS(方法1)：Rt=1.03min；MS(ESIpos)：m/z=249[M+H]+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=3.85(s,3H),6.88-6.94(m,1H),7.16-7.21(m,1H),7.31-7.37(m,1H),10.00(s,1H).
中間物C44 甲基-4-苯甲醯基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-羧酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0294-2332
3.50g(13.52mmol)甲基-氯[2-(2,5-二氟苯基)亞肼基]乙酸酯(LC/MS純度96%)溶解在9ml無水甲苯中，摻入2.61g(14.87mmol)(2E)-3-(二甲基胺基)-1-苯基丙-2-烯-1-酮以及3.01g(29.73mmol，4.14ml)三乙胺，並在室溫下攪拌16小時。在旋轉蒸發器上將反應混合物濃縮，並藉由製備性HPLC(溶離劑：包含0.1%甲酸的ACN/水，梯度)將殘餘物分離。獲得1.79g(理論之39%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.07min；MS(ESIpos)：m/z=343[M+H]+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=3.86(s,3H),7.44-7.50(m,1H),7.55-7.72(m,4H),7.81-7.87(m,3H),8.80(d,1H).
中間物C45 [4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]甲醇
Figure 105119613-A0202-12-0295-2333
將3.18g(8.92mmol)甲基-4-苯甲醯基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-羧酸酯(LC/MS純度=96%)置於50ml三氟乙酸中，逐滴摻入8.74g(75.13mmol，12ml)三乙基矽烷，並在室溫下攪拌1小時。在旋轉蒸發器上將反應混合物濃縮，並在高真空中對其進行乾燥。將獲得的殘餘物置於120ml無水THF中，並在0℃下逐滴摻入2.89g(33.63mmol,33.63ml)硼烷-四氫呋喃錯合物。攪拌一夜。由於轉化程度較低，再添加12.33ml(12.33mmol)的硼氫化鋰之1M THF溶液。在室溫下攪拌1小時，在60℃下攪拌30分鐘，並在80℃下攪拌兩小時。在0℃下用60ml飽和碳酸氫鈉溶液小心地進行淬滅。分別用100ml乙酸乙酯將混合物萃取兩次，透過硫酸鈉對經合併之有機相進行乾燥，在旋轉蒸發器上將其濃縮，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得2.67g(理論之76%，純度=96%)目標化合物。
LC-MS(方法3)：Rt=2.79min；MS(ESIpos)：m/z=329[M+H]+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=3.91(s,2H),4.45(d,2H),6.51(s,1H),7.18-7.23(m,2H),7.27-7.32(m,4H),7.46-7.53(m,1H),7.60-7.65(m,1H),7.95(d,1H).
中間物C46 4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-醛
Figure 105119613-A0202-12-0296-2334
將2.66g(8.50mmol)[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]甲醇(純度96%)溶解在150ml二氯甲烷中，並逐份摻入4.33g(10.20mmol)戴斯-馬丁高碘烷。在室溫下將混合物攪拌2小時，隨後摻入100ml半濃縮碳酸氫鈉溶液以及100ml 10%的硫代硫酸鈉溶液，並攪拌20分鐘。將有機相分離，透過硫酸鈉對其進行乾燥，並在高真空中將其濃縮。獲得2.35g(理論之88%，純度=95%)目標化合物。
LC-MS(方法7)：Rt=1.49min；MS(ESIpos)：m/z=299[M+H]+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=4.12(s,2H),7.17-7.21(m,1H),7.27-7.31(m,4H),7.37-7.42(m,1H),7.57-7.62(m,1H),7.75-7.78(m,1H),8.22(d,1H),10.06(s,1H).
中間物C47 (1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙烷-1-胺
Figure 105119613-A0202-12-0296-2335
將2.35g(7.56mmol)4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-醛溶解在25ml無水THF中，並摻入1.10g(9.08mmol)(R)-(+)-2-甲基-2-丙磺 酸醯胺以及4.73g(16.64mmol)異丙醇鈦(IV)。在室溫下將反應混合物攪拌16小時，隨後摻入20ml飽和氯化鈉溶液以及30ml乙酸乙酯。隨後添加約3g矽藻土，並在回流下沸騰1小時。進行過濾，並將有機相自濾液分離。用乙酸乙酯對水相進行萃取，用飽和氯化鈉溶液對經合併之有機相進行洗滌，透過硫酸鈉對其進行乾燥，在旋轉蒸發器上將其濃縮，並在高真空中進行乾燥。將殘餘物用於後續操作，不對其作進一步純化。
在氬氛圍下，將殘餘物溶解在60ml無水THF中並冷卻至-78℃，並滴入14.5ml(23.24mmol)的第三丁基鋰之戊烷溶液(c=1.6mol/l)。在-78℃下攪拌3小時，並用5ml甲醇以及15ml飽和氯化銨溶液進行淬滅。邊攪拌邊待反應混合物回到室溫(約30分鐘)。用乙酸乙酯進行萃取，用飽和氯化鈉溶液對有機相進行萃取，在旋轉蒸發器上將其濃縮，並在高真空中進行乾燥。將殘餘物用於後續操作，不對其作進一步純化。
將殘餘物置於30ml THF及6ml甲醇中，摻入6ml(24.00mmol)的氯化氫之二噁烷溶液，並在室溫下攪拌1小時。隨後添加15ml碳酸鈉溶液，並用乙酸乙酯進行萃取。將有機相分離，在旋轉蒸發器上將其濃縮，並在高真空中進行乾燥。藉由製備性HPLC(溶離劑：ACN/水，梯度)將殘餘物分離。獲得目標化合物之兩個溶離份。第一溶離份產生1.31g(理論之72%，LC/MS純度=97%)產物，第二溶離份產生0.37g(理論之17%，LC/MS純度=83%)產物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m/z=356[M+H]+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=0.91(s,9H),1.71(s,2H),3.59(s,1H),3.87(s,2H),7.17-7.32(m,6H),7.45-7.51(m,1H),7.61-7.65(m,1H),7.84(s br,1H).
中間物C48 第三丁基-(2S)-4-({(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0298-2336
將1.28g(3.35mmol，LC/MS純度93%)(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基-1-胺溶解在100ml無水二氯甲烷中，並在室溫下摻入261mg(4.35mmol，250μl)乙酸以及1.14g(4.34mmol)三乙醯氧基硼氫化鈉，並在攪拌5分鐘後添加1.19g(4.35mmol)第三丁基-(2S)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-4-氧代丁酸酯。在室溫下攪拌15分鐘，在旋轉蒸發器上進行濃縮，置於乙腈及水中，並藉由製備性HPLC(溶離劑：ACN/水+0.1% TFA，梯度)進行純化。獲得1.64g(理論之80%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.10min；MS(ESIpos)：m/z=613[M+H]+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=1.01(s,9H),1.32(s,9H),1.35(s,9H),1.80-1.89(m,1H),2.01-2.11(m,1H),2.54-2.71(m,2H),3.75-3.81(m,1H),3.90(s,2H),4.18(d,1H),7.13(d,1H),7.20-7.24(m,1H),7.28-7.34(m,5H),7.52-7.58(m,1H),7.76-7.80(m,1H),8.10(s br,1H),8.23(s br,1H).
中間物C49 (2S)-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁酸
Figure 105119613-A0202-12-0299-2337
將225mg(0.37mmol)第三丁基-(2S)-4-({(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁酸酯溶解在10ml無水二氯甲烷中，摻入156mg(1.54mmol)三乙胺。在0℃下添加125mg(0.92mmol)乙醯氧基乙醯氯，並在室溫下攪拌16小時。重新添加251mg(1.84mmol)乙醯氧基乙醯氯以及186mg(1.84mmol)三乙胺，並在室溫下攪拌3小時。添加少許二氯甲烷，用飽和碳酸氫鈉溶液及飽和氯化鈉溶液進行洗滌。透過硫酸鈉對有機相進行乾燥，在旋轉蒸發器上將其濃縮，並在高真空中進行乾燥。將殘餘物置於10ml乙醇中，並摻入0.91ml(12.67mmol)40%的甲胺水溶液，並在50℃下攪拌3小時。在旋轉蒸發器上將混合物濃縮，將殘餘物置於二氯甲烷中，用水將有機相洗滌兩次。透過硫酸鈉對有機相進行乾燥，在旋轉蒸發器上將其濃縮，並在高真空中進行乾燥。將殘餘物置於2ml二氯甲烷中，摻入2ml(25.96mmol)三氟乙酸，並在50℃下攪拌4小時。在旋轉蒸發器上將混合物濃縮，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。將殘餘物置於10ml無水二氯甲烷中，摻入298mg(2.95mmol)三乙胺以及429mg(1.97mmol)二碳酸二第三丁基酯，並在室溫下攪拌1小時。在旋轉蒸發器上將混合物濃縮，並藉由製備性HPLC (ACN/水，梯度)將殘餘物純化。獲得62mg(理論之27%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.32min；MS(ESIpos)：m/z=615[M+H]+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=0.91(s,9H),1.32(s,9H),2.64-2.72(m,4H),3.50-3.58(m,1H),3.72(dd,2H),4.07-4.22(m,2H),4.47-4.54(m,1H),5.75(s,1H),6.84-6.89(m,1H),7.15-7.30(m,6H),7.47-7.53(m,1H),7.70-7.75(m,1H),8.09-8.13(m,1H),11.66(s br,1H).
中間物C50 第三丁基-[(2S)-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-1-氧代丁烷-2-基]胺基甲酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0300-2338
將60mg(0.1mmol)(2S)-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁酸溶解在10ml無水DMF中，並摻入74mg(0.20mmol)HATU。將74mg(0.29mmol)三氟乙酸-1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)單獨溶解在2ml無水DMF中並摻入38mg(0.29mmol)N,N-二異丙基乙胺，並將其逐滴加入反應混合物。在室溫下攪拌3日。直接藉 由製備性HPLC將混合物純化(溶離劑：ACN/水+0.1% TFA，梯度)。獲得9.3mg(理論之13%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.34min；MS(ESIpos)：m/z=737[M+H]+。
中間物C51 N-{(2S)-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁醯基}-beta-丙胺酸
Figure 105119613-A0202-12-0301-2339
首先，以與中間物C2類似的方式，藉由苄基-N-{(2S)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-4-氧代丁醯基}-beta-丙胺酸酯將中間物C47還原性烷基化。隨後如就中間物C27所述，藉由2-氯-2-氧代乙酸乙酯將二級胺基醯化，最後藉由氫氧化鋰之2M甲醇溶液使得兩個酯基水解。獲得23mg目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.24min；MS(ESIpos)：m/z=686(M+H)+。
中間物C52 (1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基-1-胺
Figure 105119613-A0202-12-0302-2340
將10.00g(49.01mmol)甲基-4-溴-1H-吡咯-2-羧酸酯置於100.0mL DMF中，並摻入20.76g(63.72mmol)碳酸銫以及9.22g(53.91mmol)溴化苄。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。將反應混合物分佈於水及乙酸乙酯之間，並用乙酸乙酯對水相進行萃取。透過硫酸鎂對經合併之有機相進行乾燥，並在真空中將溶劑蒸發。藉由90.0g甲基-4-溴-1H-吡咯-2-羧酸酯重複此反應。
藉由製備性RP-HPLC對經合併的該二混合物進行純化(柱：Daiso 300x100；10μ，流量：250mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得125.15g(理論之87%)甲基-1-苄基-4-溴-1H-吡咯-2-羧酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.18min；MS(ESIpos)：m/z=295[M+H]+。
在氬氛圍下將4.80g(16.32mmol)甲基-1-苄基-4-溴-1H-吡咯-2-羧酸酯置於DMF中，並摻入3.61g(22.85mmol)(2,5-二氟苯基)硼酸及19.20mL飽和碳酸鈉溶液及1.33g(1.63mmol)[1,1'-雙-(二苯基膦基)-二茂鐵]-二氯鈀(II)：二氯甲烷。在85℃下將反應混合物攪拌一夜。藉由矽藻土對反應混合物進行過濾，並用乙酸乙酯對濾渣進行洗滌。用水對有機相進行萃取，隨後用飽和NaCl溶液對其進行洗滌。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，並在真空中將溶劑蒸發。藉由矽膠(溶離劑：環己烷/乙酸乙酯100：3)對殘餘物進行純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得3.60g(理論之67%)甲基-1-苄 基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-羧酸酯化合物。
LC-MS(方法7)：Rt=1.59min；MS(ESIpos)：m/z=328[M+H]+。
將3.60g(11.00mmol)甲基-1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-羧酸酯置於90.0mL THF中，並在0℃下摻入1.04g(27.50mmol)氫化鋰鋁(2.4M THF溶液)。在0℃下將反應混合物攪拌30分鐘。在0℃下添加飽和酒石酸鉀鈉溶液，並為反應混合物摻入乙酸乙酯。用飽和酒石酸鉀鈉溶液對有機相進行三次萃取。用飽和NaCl溶液將有機相洗滌一次，並透過硫酸鎂對其進行乾燥。在真空中將溶劑蒸發，並將殘餘物溶解在30.0mL二氯甲烷中。添加3.38g(32.99mmol)氧化錳(IV)，並在室溫下攪拌48小時。再添加2.20g(21.47mmol)氧化錳(IV)，並在室溫下攪拌一夜。藉由矽藻土對反應混合物進行過濾，並用二氯甲烷對濾渣進行洗滌。在真空中將溶劑蒸發，並將2.80g殘餘物(1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-醛)應用於下一合成階段，而不對其作進一步純化。
LC-MS(方法7)：Rt=1.48min；MS(ESIpos)：m/z=298[M+H]+。
將28.21g(94.88mmol)1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-醛與23.00g(189.77mmol)(R)-2-甲基丙烷-2-亞磺醯胺一同置於403.0mL無水THF中，並摻入67.42g(237.21mmol)異丙醇鈦(IV)，並在室溫下攪拌一夜。添加500.0mL飽和NaCl溶液以及1000.0mL乙酸乙酯，並在室溫下攪拌1小時。透過矽藻土進行過濾，並用飽和NaCl溶液將濾液洗滌兩次。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥並在真空中將溶劑蒸發，並藉由Biotage Isolera對殘餘物進行純化(矽膠，柱1500+340g SNAP，流量200mL/min，乙酸乙酯/環己烷1：10)。
LC-MS(方法7)：Rt=1.63min；MS(ESIpos)：m/z=401 [M+H]+。
在氬氛圍下將25.00g(62.42mmol)(R)-N-{(E/Z)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-2-甲基丙烷-2-亞磺醯胺置於無水THF中，並冷卻至-78℃。在-78℃下添加12.00g(187.27mmol)第三丁基鋰(1.7M戊烷溶液)，並在此溫度下攪拌3小時。隨後在-78℃下依次添加71.4mL甲醇以及214.3mL飽和氯化銨溶液，待反應混合物回到室溫，並在室溫下攪拌1小時。用乙酸乙酯進行稀釋，並用水進行洗滌。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，並在真空中將溶劑蒸發。將殘餘物(R)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-甲基丙烷-2-亞磺醯胺應用於下一同步階段，而不對其作進一步純化。
LC-MS(方法6)：Rt=2.97min；MS(ESIpos)：m/z=459[M+H]+。
將28.00g(61.05mmol)(R)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-甲基丙烷-2-亞磺醯胺置於186.7mL 1,4-二噁烷中，隨後摻入45.8mL的HCl的1,4-二噁烷溶液(4.0M)。在室溫下將反應混合物攪拌2小時，並在真空中將溶劑蒸發。藉由製備性RP-HPLC對殘餘物進行純化(柱：Kinetix 100x30；流量：60mL/min，MeCN/水)。在真空中將乙腈蒸發，並為水性殘餘物摻入二氯甲烷。用碳酸氫鈉溶液洗滌有機相，並透過硫酸鎂對其進行乾燥。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得16.2g(理論之75%)目標化合物。
LC-MS(方法6)：Rt=2.10min；MS(ESIpos)：338[M-NH2]+，709[2M+H]+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=0.87(s,9H),1.53(s,2H),3.59(s,1H),5.24(d,2H),6.56(s,1H),6.94(m,1H),7.10(d,2H), 7.20(m,1H),7.26(m,2H),7.34(m,2H),7.46(m,1H).
中間物C53 (2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-2-{[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]胺基}丁酸
Figure 105119613-A0202-12-0305-2341
首先，以與中間物C2類似的方式，藉由苄基-(2S)-2-{[(苄氧基)羰基]胺基}-4-氧代丁酸酯將中間物C52還原性烷基化。隨後如就中間物C27所述，藉由2-氯-2-氧代乙酸乙酯將二級胺基醯化，最後藉由氫氧化鋰之2M甲醇溶液使得兩個酯基水解。將如此獲得之中間物溶解在乙醇中，摻入鈀炭(10%)，並在室溫下藉由氫在正常壓力下進行1小時的氫化。將經去保護的化合物置於二噁烷/水2：1中，並在最後一步中，在有N,N-二異丙基乙胺的情況下藉由9H-茀-9-基甲基氯碳酸酯插入Fmoc保護基團。
LC-MS(方法1)：Rt=1.37min；MS(ESIpos)：m/z=734(M-H)-。
中間物C54 N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-2-{[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]胺基}丁醯基]-beta-丙胺酸
Figure 105119613-A0202-12-0306-2342
首先，以與中間物C2類似的方式，藉由苄基-N-[(2S)-2-{[(苄氧基)羰基]胺基}-4-氧代丁醯基]-beta-丙胺酸酯將中間物C52還原性烷基化。隨後如就中間物C27所述，藉由2-氯-2-氧代乙酸乙酯將二級胺基醯化。將如此獲得之中間物溶解在甲醇中，摻入鈀炭(10%)，並藉由氫在正常壓力下進行1小時的氫化。隨後藉由氫氧化鋰之2M甲醇溶液使得酯基水解。將經去保護的化合物置於二噁烷/水2：1中，並在最後一步中，在有N,N-二異丙基乙胺的情況下藉由9H-茀-9-基甲基氯碳酸酯插入Fmoc保護基團。獲得48mg目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.38min；MS(ESIpos)：m/z=807(M+H)+。
中間物C55 2-[3-({(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]-1H-異吲哚-1,3(2H)-二酮
Figure 105119613-A0202-12-0307-2343
將340mg(0.96mmol)(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙烷-1-胺溶解在7ml無水DCM中，並在室溫下摻入69mg(1.15mmol，60μl)乙酸以及284mg(1.34mmol)三乙醯氧基硼氫化鈉。攪拌15分鐘，隨後添加233mg(1.15mmol)3-(1,3-二氧代-1,3-二氫-2H-異吲哚-2-基)丙醛。在室溫下將混合物攪拌4.5小時。重新添加233mg(1.15mmol)3-(1,3-二氧代-1,3-二氫-2H-異吲哚-2-基)丙醛、69mg(1.15mmol、60μl)乙酸以及284mg(1.34mmol)三乙醯氧基硼氫化鈉，並在室溫下攪拌7小時。將乙酸乙酯添加至反應混合物，並用飽和碳酸鈉溶液洗滌。將有機相濃縮，並藉由製備性HPLC對殘餘物進行兩次純化[1.)溶離劑：ACN/水+0.1% TFA，梯度；2.)溶離劑：ACN/水+1% TFA+1.0% NEt3)]。獲得108mg(理論之21%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.96min；MS(ESIpos)：m/z=543[M+H]+。
中間物C56 2-({(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}[3-(1,3-二氧代-1,3-二氫-2H-異吲哚-2-基)丙基]胺基)-2-氧代乙酸乙酯
Figure 105119613-A0202-12-0308-2344
將102mg(0.19mmol)2-[3-({(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]-1H-異吲哚-1,3(2H)-二酮置於2ml無水DCM中，並在室溫下摻入44mg(0.43mmol)三乙胺。在0℃下添加31mg(0.23mmol)溶解於1ml無水DCM中的2-氯-2-氧代乙酸乙酯。在室溫下將混合物攪拌40分鐘。重新添加26mg溶解於0.5ml無水DCM中的2-氯-2-氧代乙酸乙酯以及19mg(0.19mmol)三乙胺，並在室溫下攪拌60分鐘。
添加水，在旋轉蒸發器上將混合物濃縮，並藉由製備性HPLC(ACN/水+0.1% TFA，梯度)將殘餘物純化。獲得106mg(理論之88%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.37min；MS(ESIpos)：m/z=643[M+H]+。
中間物C57 三氟乙酸--第三丁基-{(2S)-1-[(2-胺基乙基)胺基]-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}胺基甲酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0309-2345
按照標準方法如下製備目標化合物：在有HATU的情況下將中間物C49與9H-茀-9-基甲基-(2-胺基乙基)胺基甲酸酯偶聯，隨後藉由哌啶將Fmoc保護基團脫除。獲得14mg目標化合物(理論之40%，歷經2個階段)。
LC-MS(方法1)：Rt=0.98min；MS(ESIpos)：m/z=657(M+H)+。
中間物C58 (2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丁酸
Figure 105119613-A0202-12-0309-2346
將4.3g(12.2mmol)中間物C52溶解在525mL DCM中，並摻入 3.63g(17.12mmol)三乙醯氧基硼氫化鈉以及8.4mL乙酸。在室溫下攪拌5分鐘後，添加8.99g(24.5mmol)溶解於175mL DCM中的中間物L57，並在室溫下將混合物再攪拌45分鐘。隨後用300mL DCM將混合物稀釋，並用100mL碳酸氫鈉溶液將其洗滌兩次，以及用飽和NaCl溶液洗滌一次。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。隨後藉由製備性RP-HPLC(柱：Chromatorex C18)將殘餘物純化。在將相應的溶離份合併後，在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。如此獲得4.6g(理論之61%)甲基-(2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丁酸酯。
LC-MS(方法12)：Rt=1.97min；MS(ESIpos)：m/z=614(M+H)+。
將2.06g(3.36mmol)此中間物置於76mL DCM中，並在有2.1ml三乙胺的情況下藉由0.81mL(7.17mmol)2-氯-2-氧代乙酸乙酯進行醯化。在室溫下攪拌20小時後，再添加0.36mL 2-氯-2-氧代乙酸乙酯以及0.94ml三乙胺，並在室溫下將混合物再攪拌15分鐘。隨後用500mL乙酸乙酯進行稀釋，並且依次用300mL 5%的檸檬酸振搖萃取兩次、用300mL飽和碳酸氫鈉溶液振搖萃取兩次，以及用100mL飽和氯化鈉溶液振搖萃取一次，隨後透過硫酸鎂進行乾燥以及進行濃縮。在高真空中乾燥後，獲得2.17g(理論之79%)受保護的中間物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.48min；MS(ESIpos)：m/z=714(M+H)+。
將2.17g(2.64mmol)此中間物溶解在54mL THF及27mL水中，並摻入26mL的氫氧化鋰之2M溶液。在室溫下將混合物攪拌30分鐘，隨後藉由1.4mL TFA將pH值調節至3與4之間。在真空中將混合物濃 縮。在最大程度地將THF蒸餾分離後，用DCM對水性溶液進行兩次萃取，隨後在真空中將其濃縮至乾燥程度。藉由製備性HPLC(柱：Chromatorex C18)將殘餘物純化。在相應的溶離份合併後，在真空中將溶劑蒸發，並將殘餘物自乙腈/水凍乾。如此獲得1.1g(理論之63%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.34min；MS(ESIpos)：m/z=656(M-H)-。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=0.03(s,9H),0.58(m,1H),0.74-0.92(m,11H),1.40(m,1H),3.3(m,2H),3.7(m,1H),3.8-4.0(m,2H),4.15(q,2H),4.9及5.2(2d,2H),5.61(s,1H),6.94(m,2H),7.13-7.38(m,7H),7.48(s,1H),7.60(m,1H),12.35(s,1H).
中間物C59 (2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2S)-2-甲氧基丙醯基]胺基)-2-{[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]胺基}丁酸
Figure 105119613-A0202-12-0311-2347
首先，如就中間物C53所述，在有三乙胺的情況下，藉由(2S)-2-甲氧基丙醯氯(中間物C53之中間體)將苄基-(2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4- (2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)-2-{[(苄氧基)羰基]胺基}丁酸酯之二級胺基醯化。將如此獲得之中間物置於乙醇中，摻入鈀炭(10%)，並在室溫下藉由氫在正常壓力下進行1小時的氫化。將經去保護的化合物置於二噁烷/水2：1中，並在最後一步中，在有N,N-二異丙基乙胺的情況下藉由9H-茀-9-基甲基氯碳酸酯插入Fmoc保護基團。
LC-MS(方法1)：Rt=1.39min；MS(ESIpos)：m/z=764(M-H)-。
中間物C60 (2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2S)-2-甲氧基丙醯基]胺基)-2-{[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]胺基}丁酸
Figure 105119613-A0202-12-0312-2348
以與中間物C53類似的方式進行合成。
LC-MS(方法1)：Rt=1.41min；MS(ESIpos)：m/z=750(M+H)+。
中間物C61 N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丁醯基]-beta-丙胺酸
Figure 105119613-A0202-12-0313-2349
透過以下方式製備目標化合物：將60mg(0.091mmol)中間物C58與ß-丙胺酸甲酯偶聯，隨後藉由2m氫氧化鋰溶液進行酯分解。歷經2個階段獲得67mg(理論之61%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.29min；MS(ESIpos)：m/z=729(M+H)+。
中間物C62 N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丁醯基]-D-丙胺酸
Figure 105119613-A0202-12-0314-2350
以與中間物C61類似的方式，用中間物C58與甲基-D-丙胺酸酯製備目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.32min；MS(ESIpos)：m/z=729(M+H)+。
中間物C63 三氟乙酸--第三丁基-{(2S)-1-[(2-胺基乙基)胺基]-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}胺基甲酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0314-2351
在此中間物之合成的第一步中，在有28.7mg(0.15mmol)1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺-鹽酸鹽、22.9mg(0.15mmol)1-羥 基-1H-苯并三唑-水合物以及39μl N,N-二異丙基乙胺的情況下，將50mg(0.075mmol)中間物C3與26.2mg(0.082mmol)9H-茀-9-基甲基-(2-胺基乙基)胺基甲酸酯鹽酸鹽(1：1)偶聯。在室溫下攪拌18小時後進行濃縮，並藉由製備性HPLC將殘餘物純化。獲得45mg(理論之65%)此中間體。
LC-MS(方法1)：Rt=1.51min；MS(ESIpos)：m/z=921(M+H)+。
將45mg(0.049mmol)此中間體置於10mL乙醇中，並摻入176μmL 40%的甲烷胺水溶液。在50℃下攪拌混合物，其中在6小時後及9小時後分別添加相同量的甲烷胺溶液。在50℃下進一步攪拌14小時後，再添加700μl甲烷胺溶液，並在進一步攪拌20小時後進行濃縮。將殘餘物置於DCM中，並用水對其進行洗滌。將有機相濃縮，並藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。在將相應的溶離份濃縮並在高真空中對殘餘物進行乾燥後，獲得32mg(理論之99%)第三丁基-{(2S)-1-[(2-胺基乙基)胺基]-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}胺基甲酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt=0.95min；MS(ESIpos)：m/z=657(M+H)+。
中間物C64 三氟乙酸--2-(三甲基矽基)乙基-{(2S)-1-[(2-胺基乙基)胺基]-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}胺基甲酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0316-2352
以中間物C58為基礎，以與中間物C63類似的方式製備目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=2.4min； LC-MS(方法1)：Rt=1.01min；MS(ESIpos)：m/z=700(M+H)+。
中間物C65 (8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]乙基}-2,2-二甲基-6,11-二氧代-5-氧雜-7,10-二氮雜-2-矽雜十四烷-14-酸
Figure 105119613-A0202-12-0317-2353
將215mg(0.59mmol)中間物L66置於25mL二氯甲烷中，並摻入377mg(0.89mmol)戴斯-馬丁高碘烷以及144μL(1.78mmol)吡啶。在室溫下攪拌30分鐘。隨後用300ml二氯甲烷將混合物稀釋，並用10%的Na2S2O3溶液、10%的檸檬酸溶液以及飽和碳酸氫鈉溶液分別將有機相洗滌兩次。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，並在真空中將溶劑蒸發。獲得305mg醛，在不作進一步純化的情況下將其轉化。
將175mg(0.49mmol)中間物C52溶解在50ml二氯甲烷中，並摻入147mg(0.69mmol)三乙醯氧基硼氫化鈉以及32.5μL乙酸。在室溫下攪拌5分鐘後，添加214mg(0.593mmol)上述醛，並在室溫下將混合物攪拌一夜。其中作為期望產物之替代，產生2-(三甲基矽基)乙基-[(2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)-1-(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)丁烷-2-基]胺基甲酸酯。此醯亞胺亦需要進一步轉化成目標化合物，故將混合物濃縮，並藉由製備性HPLC將殘餘物純化。在將相應之含醯亞胺的溶離份合併後，在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。如此獲得195mg(58%)上述醯亞胺。
LC-MS(方法5)：Rt=3.32min；MS(ESIpos)：m/z=667 (M+H)+。
將65mg(97.5μmol)此醯亞胺置於15ml二氯甲烷中，並摻入367μL(3.4mmol)乙醯氧基乙醯氯以及595μL N,N-二異丙基乙胺。在室溫下攪拌30分鐘後，以不加熱的方式在真空中將混合物濃縮，並藉由製備性HPLC將殘餘物純化。將相應的溶離份合併，以及，在將溶劑蒸發以及在高真空中進行乾燥後，殘餘28mg(理論之37%)(8S)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基-乙酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.44min；MS(ESIpos)：m/z=767(M+H)+。
將28mg(37μmol)此中間物溶解在3mL甲醇中，並摻入548μL的2M氫氧化鋰溶液。在室溫下攪拌10分鐘後，用三氟乙酸將混合物調節至pH 4，隨後將其濃縮。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。在將相應的溶離份合併、將溶劑蒸發以及在高真空中對殘餘物進行乾燥後，獲得26mg(理論之96%)形式為白色固體的目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.33min；MS(ESIpos)：m/z=743(M+H)+。
中間物C66 2-(三甲基矽基)乙基-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-{[2-(甘胺醯基胺基)乙基]胺基}-1-氧代丁烷-2-基]胺基甲酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0319-2354
首先，按照經典的肽化學方法(HATU偶聯及Boc脫除)，用N-[(苄氧基)羰基]甘胺酸與第三丁基(2-胺基乙基)胺基甲酸酯製備三氟乙酸-苄基-{2-[(2-胺基乙基)胺基]-2-氧代乙基}胺基甲酸酯(1：1)。
將13mg(0.036mmol)此中間物乙基25mg(0.033mmol)中間物C58置於3mL DMF中，並摻入19mg(0.05mmol)HATU以及17μl N,N-二異丙基乙胺。在室溫下攪拌10分鐘後進行濃縮，並藉由製備性HPLC將殘餘物純化。獲得17.8mg(理論之60%)中間體。
LC-MS(方法1)：Rt=1.36min；MS(ESIpos)：m/z=891(M+H)+。
將17mg(0.019mmol)此中間體溶解在10ml乙醇中，摻入鈀炭(10%)，並在室溫下藉由氫在正常壓力下進行2小時的氫化。將催化劑濾出，在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得9mg(理論之62%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt==1.03min；MS(ESIpos)：m/z=757(M+H)+。
中間物C67 9H-茀-9-基甲基-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺基甲酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0320-2355
將605.3mg(1.71mmol)(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙烷-1-胺(中間物C52)置於10.0mL二氯甲烷中，並摻入506.7mg(2.39mmol)三乙醯氧基硼氫化鈉以及117.9mg(1.96mmol)乙酸，並在室溫下攪拌5分鐘。添加580.0mg(1.96mmol)的溶解於10.0mL二氯甲烷中的9H-茀-9-基甲基-(3-氧代丙基)胺基甲酸酯(中間物L70)，並在室溫下將反應混合物攪拌一夜。用乙酸乙酯將反應混合物稀釋，並用飽和碳酸鈉溶液及飽和NaCl溶液分別將有機相洗滌兩次。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，並在真空中將溶劑蒸發。藉由矽膠(溶離劑：環己烷/乙酸乙酯3：1)對殘餘物進行純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得514.7mg(理論之46%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.10min；MS(ESIpos)：m/z=634(M+H)+。
中間物C68 第三丁基-[3-({(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺基甲酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0321-2356
以與中間物C67之合成類似的方式進行合成。
1000.0mg(2.81mmol)(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙烷-1-胺(中間物C47)
835.0mg(3.94mmol)三乙醯氧基硼氫化鈉
194.0mg(3.24mmol)乙酸
560.0mg(3.24mmol)第三丁基-(3-氧代丙基)胺基甲酸酯
獲得695.8mg(理論之48%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.02min；MS(ESIpos)：m/z=513(M+H)+。
中間物C69 11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-酸
Figure 105119613-A0202-12-0322-2357
將117.0mg(0.19mmol)2-(三甲基矽基)乙基-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺基甲酸酯(中間物C70)以及21.6mg(0.20mmol)3-巰基丙酸置於3.0mL甲醇中，並摻入89.5mg(0.65mmol)碳酸鉀，並在50℃下攪拌4小時。用乙酸乙酯將反應混合物稀釋，並用水及飽和NaCl溶液對有機相進行洗滌。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。將殘餘物應用於下一合成階段，而不對其作進一步純化。獲得106.1mg(理論之73%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.42min；MS(ESIneg)：m/z=700(M-H)-。
中間物C70 (2-(三甲基矽基)乙基-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺基甲酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0323-2358
將908.1mg(1.63mmol)2-(三甲基矽基)乙基-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺基甲酸酯(參閱中間物C11之合成)以及545.6mg(5.39mmol)三乙胺置於10.0mL二氯甲烷中，並冷卻至0℃。在此溫度下添加590.5mg(5.23mmol)氯乙醯氯，並在室溫下攪拌一夜。用乙酸乙酯將反應混合物稀釋，並用飽和碳酸氫鈉溶液及飽和氯化銨溶液分別將有機相洗滌三次。用飽和NaCl溶液洗滌有機相，並透過硫酸鎂對其進行乾燥。藉由製備性RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)對殘餘物進行純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得673.8mg(理論之65%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.53min；MS(ESIneg)：m/z=676(M+HCOO-)-。
中間物C71 S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0324-2359
將536.6mg(4.43mmol)L-半胱胺酸與531.5mg(6.33mmol)碳酸氫鈉一起懸浮於2.5mL水中。為此添加400.0mg(0.63mmol)的溶解於25.0mL異丙醇中的(2-(三甲基矽基)乙基-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺基甲酸酯(中間物C70)，以及1.16g(7.59mmol)1,8-二氮雜雙環(5.4.0)十一碳-7-烯。在50℃下將反應混合物攪拌1.5小時。為反應混合物摻入乙酸乙酯，用飽和碳酸氫鈉溶液將有機相洗滌多次，並用飽和NaCl溶液將其洗滌一次。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。藉由製備性RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)對殘餘物進行純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得449.5mg(理論之86%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.20min；MS(ESIpos)：m/z=717(M+H)+。
中間物C72 (9S)-9-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]甲基}-2,2-二甲基-6,11-二氧代-5-氧雜-7,10-二氮雜-2-矽雜十四烷-14-酸
Figure 105119613-A0202-12-0325-2360
將90mg(0.212mmol)中間物L72置於6mL二氯甲烷中，並摻入86μL(1.06mmol)吡啶以及135mg(0.318mmol)戴斯-馬丁高碘烷。在室溫下攪拌30分鐘。隨後用30ml二氯甲烷將混合物稀釋，並用10%的Na2S2O3溶液將有機相洗滌兩次，以及用5%的檸檬酸溶液將其洗滌一次。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，並在真空中將溶劑蒸發。在不作進一步純化的情況下對如此獲得之醛進行轉化。
將63mg(0.177mmol)中間物C52溶解在15ml二氯甲烷中，並摻入52.4mg(0.247mmol)三乙醯氧基硼氫化鈉以及20.2μL乙酸。在室溫下攪拌5分鐘後，添加89.6mg(0.212mmol)上述醛，並在室溫下將混合物攪拌20分鐘。在真空中將混合物濃縮，並藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。在相應的溶離份合併後，在真空中將溶劑蒸發，並將殘餘物自乙腈/水凍乾。如此獲得71mg(理論之53%，歷經2個階段)苄基-(9R)-9-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)甲基]-2,2-二甲基-6,11-二氧代-5-氧雜-7,10-二氮雜-2-矽雜十四烷-14-酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.21min；MS(ESIpos)：m/z=761(M+H)+。
將70mg(92μmol)此中間物置於15ml二氯甲烷中，冷卻至10℃， 並摻入54μL三乙胺以及25.5μL(0.23mmol)乙醯氧基乙醯氯。在室溫下攪拌1小時後，再次添加相同量的醯氯以及三乙胺，並在室溫下再重新攪拌一小時。隨後在室溫下將混合物再攪拌30分鐘，並在真空中將其濃縮，並藉由製備性HPLC將殘餘物純化。將相應的溶離份合併，以及，在將溶劑蒸發以及將殘餘物自乙腈/水凍乾後，殘餘46.5mg(理論之59%)經醯化之中間物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.53min；MS(ESIpos)：m/z=861(M+H)+。
將46mg(53μmol)此中間物溶解在5mL甲醇中，並摻入2.7mL的2M氫氧化鋰溶液。在室溫下攪拌10分鐘後，用乙酸將混合物調節至pH 3-4，隨後用15ml水將其稀釋。用乙酸乙酯對水性相進行萃取，透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，並進行濃縮。將殘餘物自乙腈/水凍乾，以及，在高真空中對殘餘物進行乾燥後，獲得37mg(理論之90%)形式為白色固體的目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.32min；MS(ESIpos)：m/z=729(M+H)+。
中間物C73 S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[3-(三甲基矽基)丙醯基]-L-半胱胺酸
Figure 105119613-A0202-12-0327-2361
將619mg(0.86mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)(中間物C71)置於8.8ml二氯甲烷中，並摻入87mg(0.86mmol)三乙胺以及224mg(0.86mmol)N-[2-(三甲基矽基)-乙氧基羰氧基]-吡咯啶-2,5-二酮。1小時後，添加45mg(0.17mmol)N-[2-(三甲基矽基)-乙氧基羰氧基]-吡咯啶-2,5-二酮。在室溫下將反應混合物攪拌1小時。在真空中對混合物進行蒸發，並將殘餘物置於二氯甲烷中，隨後用水及飽和碳酸氫鈉溶液將有機相洗滌兩次。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，在旋轉蒸發器上將其濃縮，並在高真空中進行乾燥。將殘餘物用於後續操作，不對其作進一步純化。獲得602mg(71%，純度87%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.58min；MS(ESIpos)：m/z=861(M+H)+。
中間物C74 三氟乙酸--2-(三甲基矽基)乙基-3-胺基-N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丁醯基]-D-丙胺酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0328-2362
將75mg(0.114mmol)中間物C58置於12.5ml DMF中，並在有65mg(0.11mmol)HATU以及79μL N,N-二異丙基乙胺的情況下，與78mg(0.171mmol)中間物L75偶聯。在藉由製備性HPLC進行純化後，將中間物置於20ml乙醇中，並在室溫下藉由10%的鈀-活性炭在氫正常壓力下進行1小時的氫化。隨後將催化劑濾出，在真空中將溶劑移除，並藉由製備性HPLC將產物純化。在自乙腈/水1：1凍乾後，獲得63mg(理論之64%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.16min；MS(EIpos)：m/z=844[M+H]+。
中間物C75 甲基-(2S)-4-[(乙醯氧基乙醯基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丁酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0329-2363
將4.3g(12.2mmol)中間物C52溶解在525mL DCM中，並摻入3.63g(17.12mmol)三乙醯氧基硼氫化鈉以及8.4mL乙酸。在室溫下攪拌5分鐘後，添加3.23g(11.85mmol)溶解於175mL DCM中的甲基-(2S)-4-氧代-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丁酸酯(按照經典方法用(3S)-3-胺基-4-甲氧基-4-氧代丁酸製備)，並在室溫下將混合物再攪拌45分鐘。隨後用DCM將混合物稀釋，並用100mL飽和碳酸氫鈉溶液將其洗滌兩次，隨後用飽和氯化鈉溶液進行振搖萃取。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，對其進行過濾，隨後將其濃縮。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。在將相應的溶離份合併、進行濃縮以及在高真空中對殘餘物進行乾燥後，獲得4.6g(理論之61%)中間物。
LC-MS(方法12)：Rt=1.97min；MS(ESIpos)：m/z=614.32(M+H)+。
將200mg(0.33mmol)此中間物溶解在10mL DCM中，隨後摻入105μL三乙胺以及77μL(0.717mmol)乙醯氧基乙醯氯。在室溫下將配方攪拌一夜，隨後在真空中將其濃縮。將殘餘物置於乙酸乙酯中，並用飽和碳酸氫鈉溶液進行兩次振搖萃取，隨後用飽和氯化鈉溶液進行振搖萃取。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，隨後將其濃縮。獲得 213mg(75%)形式為米色泡沫的目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.46min；MS(ESIpos)：m/z=714(M+H)+。
中間物C76 N-[(苄氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-羧基丙基}-L-丙胺醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0330-2364
以中間物C75為基礎，按照經典的肽化學方法(藉由氯化鋅將Teoc保護基團脫除，在有HATU的情況下藉由N-[(苄氧基)羰基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸進行醯化，藉由氫氧化鋰的THF/水溶液進行酯分解)製備目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.23min；MS(ESIpos)：m/z=818(M+H)+。
中間物C77 S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-(4-第三丁氧基-4-氧代丁醯基)-L-半胱胺酸
Figure 105119613-A0202-12-0331-2365
將4-第三丁氧基-4-氧代丁酸(8.39mg，48.1μmol)置於1.0mL DMF中，摻入7.37mg(48.1μmol)1-羥基-1H-苯并三唑水合物、15.5mg(48.1μmol)(苯并三唑-1-基氧基)雙二甲基胺基甲基氟硼酸酯、以及8.60μl(48.1μmol)N,N-二異丙基乙胺，並在室溫下攪拌10分鐘。將40.0mg(0.048mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)(中間物C71)置於1.0mL DMF中，並摻入5.4μl(141.9μmol)N,N-二異丙基乙胺，添加至混合物，並在室溫下攪拌4小時。直接藉由製備性RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)對反應混合物進行純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得35.0mg(理論之83%)目標化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=2.76min；MS(ESIpos)：m/z=873[M+H]+
中間物C78 11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十五烷-15-酸
Figure 105119613-A0202-12-0332-2366
將197mg(0.354mmol)2-(三甲基矽基)乙基-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺基甲酸酯(參閱中間物C11之合成)置於5.0mL二氯甲烷中，並加熱至40℃。在此溫度下添加240μl(3.0mmol)吡啶以及220μl(1.8mmol)甲基-4-氯-4-氧代丁酸酯，並在室溫下攪拌1小時。隨後添加240μl(3.0mmol)吡啶以及220μl(1.8mmol)甲基-4-氯-4-氧代丁酸酯，並在室溫下攪拌1小時。隨後添加240μl(3.0mmol)吡啶以及220μl(1.8mmol)甲基-4-氯-4-氧代丁酸酯，並在室溫下攪拌1小時。用乙酸乙酯將反應混合物稀釋，並用5%的KHSO4溶液將有機相萃取三次。用飽和NaCl溶液洗滌有機相，並透過硫酸鎂對其進行乾燥。在真空中將溶劑蒸發。藉由製備性RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)對殘餘物進行純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得74.1mg(理論之31%)甲基-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十五烷-15-酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.49min；MS(ESIpos)：m/z=670[M+H]+
將78.3mg(117μmol)甲基-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十五烷-15-酸酯置於4.0mL THF中，摻入800μl甲醇、 160μl水以及230μl(230μmol)LiOH水溶液(1M)。在室溫下將反應混合物攪拌3小時，用乙酸進行淬滅，並直接藉由製備性RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)將其純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得64.8mg(理論之85%)目標化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=2.61min；MS(ESIneg)：m/z=654[M-H]-。
中間物C79 三氟乙酸2-(三甲基矽基)乙基-3-胺基-N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-基)-D-丙胺酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0333-2367
將57.4mg(81.8μmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-酸(中間物C69)置於5.7mL DMF中，摻入74.0mg(164μmol)三氟乙酸2-(三甲基矽基)乙基-3-{[(苄氧基)羰基]胺基}-D-丙胺酸酯(1：1)(中間物L75)、43μl(250μmol)N,N-二異丙基乙胺以及62.2mg(164μmol)HATU，並在室溫下攪拌1小時。在室溫 下將反應混合物攪拌1小時，用乙酸進行淬滅，並直接藉由製備性RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)將其純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得52.4mg(理論之63%)2-(三甲基矽基)乙基-N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-基)-3-{[(苄氧基)羰基]胺基}-D-丙胺酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.64min；MS(ESIpos)：m/z=1022[M]+
在氬氛圍下將6.23mg(27.7μmol)乙酸鈀(II)置於3.0ml二氯甲烷中，摻入12μL(83μmol)三乙胺以及89μL(550μmol)三乙基矽烷，並攪拌5分鐘。隨後添加56.7mg(55.5μmol)的溶解於3.0mL二氯甲烷中的2-(三甲基矽基)乙基-N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-基)-3-{[(苄氧基)羰基]胺基}-D-丙胺酸酯，並在室溫下攪拌一夜。將混合物濃縮至近乎乾燥程度，摻入乙腈/水，對其進行過濾，並藉由製備性RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)將其純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得37.4mg(理論之67%)目標化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=2.15min；MS(ESIpos)：m/z=888 [M+H]+
中間物C80 S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[15-(甘胺醯基胺基)-4,7,10,13-四氧雜十五烷-1-醯基]-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0335-2368
在氬氛圍下，將43.4mg(95.1μmol)1-({N-[(苄氧基)羰基]甘胺醯基}胺基)-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-酸(中間物L90)置於2.5ml DMF中，摻入14.6mg(95.1μmol)1-羥基-1H-苯并三唑水合物、30.5mg(95.1μmol)(苯并三唑-1-基氧基)雙二甲基胺基甲基氟硼酸酯以及16.5μl(95.1μmol)N,N-二異丙基乙胺，並攪拌10分鐘。將79.0mg(95.1μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)(中間物C71)溶解在2.5ml DMF中，並摻入49.5μl(285.3μmol)N,N-二異丙基乙胺，添加至混合物。在室溫下將反應混合物攪拌2小時，並直接藉由製備性RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)將其純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得44.2mg(理論之40%)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[15-({N-[(苄氧基)羰基]甘胺醯基}胺基)-4,7,10,13-四氧雜十五烷-1-醯基]-L-半胱胺酸化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=2.57min；MS(ESIpos)：m/z=1156[M+H]+
將60.2mg(52.1μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[15-({N-[(苄氧基)羰基]甘胺醯基}胺基)-4,7,10,13-四氧雜十五烷-1-醯基]-L-半胱胺酸懸浮在3.0mL乙醇中，並摻入6.0mg鈀-活性炭(10%)，並在室溫下藉由氫在正常壓力下進行1小時的氫化。兩次摻入6.0mg鈀-活性炭(10%)，並在室溫下藉由氫在正常壓力下進行1小時的氫化。將催化劑濾出，在真空中為反應混合物去除溶劑，並在高真空中對其進行乾燥。藉由製備性RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)對殘餘物進行純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得29.4mg(理論之50%)目標化合物。
LC-MS(方法5)：Rt=3.77min；MS(ESIpos)：m/z=1021 [M+H]+
中間物C81 (R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-1-環己基甲烷胺
Figure 105119613-A0202-12-0336-2369
在氬氛圍下，在-78℃下，為3.12ml(6.24mmol)二甲基鋅之甲苯溶液(2.0M)摻入18.7ml(37.45mmol)的環己基氯化鎂之二乙醚溶液(2M)，並在-78℃下將混合物攪拌30分鐘。隨後在-78℃下添加5.0g(12.48mmol)的(R)-N-{(E/Z)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-2-甲基丙烷-2-亞磺醯胺之THF溶液，並在此溫度下將反應混 合物攪拌1小時，隨後在室溫下攪拌4小時。隨後在-78℃下添加飽和氯化銨溶液，並待反應混合物回到室溫。用乙酸乙酯進行稀釋，並用水進行洗滌。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，並在真空中將溶劑蒸發。藉由Biotage Isolera將殘餘物純化(矽膠，乙酸乙酯/環己烷25：75)。獲得1.59g(理論之26%)中間體。
LC-MS(方法12)：Rt=2.76min；MS(ESIneg)：m/z=483[M-H]-
在氬氛圍下，將264.0mg(0.54mmol)此中間體置於0.5mL 1,4-二噁烷中，隨後摻入1.36mL的HCl之1,4-二噁烷溶液(4.0M)。在室溫下將反應混合物攪拌1小時。為反應混合物摻入二氯甲烷，並用1M氫氧化鈉水溶液對其進行洗滌。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，並在真空中將溶劑蒸發。藉由Biotage Isolera將殘餘物純化(矽膠，甲醇/二氯甲烷98：2)。在真空中將溶劑蒸發，並將殘餘物溶解在二氯甲烷中，用碳酸氫鈉溶液對其進行洗滌，以及透過硫酸鈉對其進行乾燥。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得148mg(理論之72%)目標化合物。
LC-MS(方法13)：Rt=2.07min；MS(ESIpos)：m/z=364[M- NH2]+
中間物C82 2-(三甲基矽基)乙基-(3-{[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](環己基)甲基]胺基}丙基)胺基甲酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0338-2370
在氬氛圍下，為503.0mg(1.32mmol)1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-1-環己基甲烷胺(中間物C81)在1.4ml二氯甲烷中的溶液摻入392.2mg(1.85mmol)三乙醯氧基硼氫化鈉以及91.29mg(1.52mmol)乙酸，並在室溫下將反應混合物攪拌10分鐘。隨後添加574.6(2.38mmol)2-(三甲基矽基)乙基-(3-氧代丙基)胺基甲酸酯在二氯甲烷中的溶液，並在室溫下將混合物攪拌一夜。在添加143mg(0.66mmol)2-(三甲基矽基)乙基-(3-氧代丙基)胺基甲酸酯後，將混合物再攪拌2小時。用二氯甲烷將反應混合物稀釋，用飽和碳酸鈉溶液以及飽和NaCl溶液分別將有機相洗滌兩次，並透過硫酸鈉對其進行乾燥，以及進行濃縮。藉由製備性HPLC將殘餘物純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得488g(理論之63%)目標化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=1.89min；MS(ESIpos)：m/z=582(M+H)+。
中間物C83 2-(三甲基矽基)乙基-(3-{[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](環己基)甲基](氯乙醯基)胺基}丙基)胺基甲酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0339-2371
為487.9mg(0.84mmol)2-(三甲基矽基)乙基-(3-{[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](環己基)甲基]胺基}丙基)胺基甲酸酯(中間物C82)在8.40ml二氯甲烷中的溶液(分子篩4Å)添加280.0mg(2.77mmol)三乙胺以及397.8mg(3.52mmol)氯乙醯氯，並在室溫下將反應混合物攪拌6小時。用二氯甲烷將反應混合物稀釋，並用飽和碳酸氫鈉溶液及飽和氯化銨溶液洗滌有機相。透過硫酸鈉對有機相進行乾燥，並將其濃縮。將殘餘物用於後續操作，不對其進行純化。獲得470mg(理論之85%)目標化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=2.88min；MS(ESIpos)：m/z=680(M+Na)+。
中間物C84 S-{11-[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](環己基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基}-L-半胱胺酸
Figure 105119613-A0202-12-0340-2372
將322.1mg(2.66mmol)L-半胱胺酸與319.0mg(3.80mmol)碳酸氫鈉一起懸浮於0.19mL水中。為此添加250.0mg(0.38mmol)的溶解於1.90mL異丙醇中的2-(三甲基矽基)-乙基-(3-{[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基-1H-吡咯-2-基](環己基)甲基](氯乙醯)-胺基}丙基)胺基甲酸酯(中間物C83)，以及693.8mg(4.56mmol)1,8-二氮雜雙環(5.4.0)十一碳-7-烯。在50℃下將反應混合物攪拌3.5小時。為反應混合物摻入乙酸乙酯，並用飽和碳酸氫鈉溶液及飽和NaCl溶液將有機相洗滌多次。透過硫酸鈉對有機相進行乾燥，並在真空中將溶劑蒸發。將殘餘物用於後續操作，不對其作進一步純化。獲得276mg(理論之97%)目標化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=2.34min；MS(ESIpos)：m/z=744(M+H)+。
中間物C85 S-{11-[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](環己基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基}-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-半胱胺酸
Figure 105119613-A0202-12-0341-2373
為100mg(0.13mmol)S-{11-[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](環己基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基}-L-半胱胺酸(1：1)(中間物C84)與41.5mg(0.13mmol)1-{6-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮在4.0ml DMF中的混合物添加34.8mg(0.27mmol)N,N-二異丙基乙胺，並在室溫下將反應混合物攪拌3小時。在不進行處理的情況下，藉由製備性HPLC將混合物純化。獲得88mg(理論之70%)目標化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=2.71min；MS(ESIpos)：m/z=936(M+H)+。
中間物C86 11-[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](環己基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-酸
Figure 105119613-A0202-12-0342-2374
為220.0mg(0.33mmol)2-(三甲基矽基)乙基-(3-{[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](環己基)甲基](氯乙醯基)胺基}丙基)胺基甲酸酯(中間物C83)與39.02mg(0.37mmol)3-巰基丙酸在7.45ml甲醇及數滴水中的混合物摻入161.65mg(1.17mmol)碳酸鉀。在50℃下將反應混合物攪拌4小時。為反應混合物摻入乙酸乙酯，並用水及飽和NaCl溶液對有機相進行多次洗滌。透過硫酸鈉對有機相進行乾燥，並在真空中將溶劑蒸發。將殘餘物用於後續操作，不對其進行處理。獲得201mg(理論之83%)目標化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=2.72min；MS(ESIneg)：m/z=726(M-H)-。
中間物C87 2-(三甲基矽基)乙基-{13-[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](環己基)甲基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,7,12-三氧代-10-硫雜-3,6,13-三氮雜十六烷-16-基}胺基甲酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0343-2375
為100mg(0.14mmol)11-[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](環己基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-酸(中間物C86)在1.37ml DMF中的溶液添加54.18mg(0.28mmol)N-(2-胺基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺(中間物L1)、71.01mg(0.50mmol)N,N-二異丙基乙胺、104.46mg(0.27mmol)HATU、以及0.23ml(0.14mmol)1-羥基-7-氮雜苯并三唑的0.5M DMF溶液。在室溫下將反應混合物攪拌5小時。在不作進一步處理的情況下，藉由製備性HPLC將混合物純化。獲得41mg(理論之33%)目標化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=2.61min；MS(ESIpos)：m/z=907(M+H)+。
中間物C88 第三丁基-3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)甲基]吡咯啶-1-羧酸酯-三氟乙酸(1：1)
由立體異構體構成之混合物
Figure 105119613-A0202-12-0344-2376
為2.04g(5.75mmol)(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙烷-1-胺(中間物C52)在51ml二氯甲烷中的溶液摻入1.71g(8.05mmol)三乙醯氧基硼氫化鈉以及0.40g(6.61mmol)乙酸，並在室溫下將反應混合物攪拌5分鐘。隨後添加1.32g(6.61mmol)第三丁基-3-甲醯基吡咯啶-1-羧酸酯在20ml二氯甲烷中的溶液，並在室溫下將混合物攪拌一夜。用乙酸乙酯將反應混合物稀釋，用飽和碳酸鈉溶液以及飽和NaCl溶液分別將有機相洗滌兩次，並透過硫酸鎂對其進行乾燥，以及進行濃縮。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得1.86g(理論之50%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.99min；MS(ESIpos)：m/z=538(M+H-CF3CO2H)+。
中間物C89 第三丁基-3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]甲基}吡咯啶-1-羧酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0345-2377
為2.89g(4.19mmol，純度80)第三丁基-3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)甲基]吡咯啶-1-羧酸酯(中間物C88)在42ml二氯甲烷中的溶液(分子篩4Å)摻入1.36g(13.42mmol)三乙胺以及2.13g(18.87mmol)氯乙醯氯。在室溫下將反應混合物攪拌5小時。對混合物進行旋轉蒸發，並藉由製備性HPLC將殘餘物純化。獲得449mg(理論之17%)目標化合物異構體1，以及442mg(理論之17%)目標化合物異構體2。
異構體1 LC-MS(方法1)：Rt=2.74min；MS(ESIpos)：m/z=614(M+H)+。
異構體2 LC-MS(方法1)：Rt=2.78min；MS(ESIpos)：m/z=614(M+H)+。
中間物C90 S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-氧代乙基]-L-半胱胺酸(異構體1)
Figure 105119613-A0202-12-0346-2378
將357.3mg(0.58mmol)L-半胱胺酸與488.7mg(4.07mmol)碳酸氫鈉一起懸浮於2.3mL水中。為此添加357.0mg(0.58mmol)的溶解於23.0mL異丙醇中的第三丁基-3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]甲基}吡咯啶-1-羧酸酯(異構體1)(中間物C89，異構體1)，以及1.06g(6.98mmol)1,8-二氮雜雙環(5.4.0)十一碳-7-烯。在50℃下將反應混合物攪拌3小時。為反應混合物摻入乙酸乙酯，用飽和碳酸氫鈉溶液將有機相洗滌多次，並用飽和NaCl溶液將其洗滌一次。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，並在真空中將溶劑蒸發。將殘餘物用於後續操作，不對其進行純化。獲得255.0mg(理論之62%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.09min；MS(ESIpos)：m/z=699(M+H)+。
中間物C91 S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-氧代乙基]-L-半胱胺酸(異構體2)
Figure 105119613-A0202-12-0347-2379
將453.5mg(3.74mmol)L-半胱胺酸與449.2mg(5.35mmol)碳酸氫鈉一起懸浮於2.1mL水中。為此添加3287.4mg(0.54mmol)的溶解於21.1mL異丙醇中的第三丁基-3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]甲基}吡咯啶-1-羧酸酯(中間物C89，異構體2)，以及0.98g(6.42mmol)1,8-二氮雜雙環(5.4.0)十一碳-7-烯。在50℃下將反應混合物攪拌3小時。為反應混合物摻入乙酸乙酯，用飽和碳酸氫鈉溶液將有機相洗滌多次，並用飽和NaCl溶液將其洗滌一次。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，並在真空中將溶劑蒸發。將殘餘物用於後續操作，不對其進行純化。獲得221.0mg(理論之59%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.12min；MS(ESIpos)：m/z=699(M+H)+。
中間物C92 S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-氧代乙基]-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-半胱胺酸(異構體1)
Figure 105119613-A0202-12-0348-2380
為50mg(0.07mmol)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-氧代乙基]-L-半胱胺酸(中間物C90)與22.06mg(0.07mmol)1-{6-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮在3.3ml DMF中的混合物摻入18.49mg(0.14mmol)N,N-二異丙基乙胺，並在室溫下將反應混合物攪拌45分鐘。在不進行處理的情況下，藉由製備性HPLC將混合物純化。獲得65mg(理論之100%，純度71%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.31min；MS(ESIpos)：m/z=892(M+H)+。
中間物C93 S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-氧代乙基]-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-半胱胺酸(異構體2)
Figure 105119613-A0202-12-0349-2381
為50.0mg(0.07mmol)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-氧代乙基]-L-半胱胺酸(中間物C91)與22.06mg(0.07mmol)1-{6-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮在3.0ml DMF中的混合物摻入18.49mg(0.14mmol)N,N-二異丙基乙胺，並在室溫下將反應混合物攪拌90分鐘。在不進行處理的情況下，藉由製備性HPLC將混合物純化。獲得63mg(理論之98%，純度73%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.34min；MS(ESIpos)：m/z=892(M+H)+。
中間物C94 S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-氧代乙基]-N-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-半胱胺酸(異構體1)
Figure 105119613-A0202-12-0350-2382
為(50.0mg，0.07mmol)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3R)-1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-氧代乙基]-L-半胱胺酸(中間物C90)與18.0mg(0.07mmol)-{2-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮在3.3ml DMF中的混合物摻入18.5mg(0.14mmol)N,N-二異丙基乙胺，並在室溫下將反應混合物攪拌30分鐘。為反應混合物摻入乙酸乙酯，並用飽和NH4Cl溶液及飽和NaCl溶液將有機相洗滌多次。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，並在真空中將溶劑蒸發。使用殘餘物，不對其作進一步純化。獲得57mg(理論之81%，純度85%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.96min；MS(ESIpos)：m/z=836(M+H)+。
中間物C95 3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-氧代乙基]硫基}丙酸(異構體1)
Figure 105119613-A0202-12-0351-2383
為384.0mg(0.62mmol)第三丁基-3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]甲基}吡咯啶-1-羧酸酯(中間物C89，異構體1)與73.0mg(0.69mmol)3-巰基丙酸在14ml甲醇及數滴水中的混合物摻入302.5mg(2.19mmol)碳酸鉀。在50℃下將反應混合物攪拌2.5小時。為反應混合物摻入乙酸乙酯，並用水及飽和NaCl溶液對有機相進行多次洗滌。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。將殘餘物用於後續操作，不對其進行處理。獲得358.0mg(理論之84%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.33min；MS(ESIpos)：m/z=684(M+H)+。
中間物C96 3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-氧代乙基]硫基}丙酸(異構體2)
Figure 105119613-A0202-12-0352-2384
為287.0mg(0.45mmol)第三丁基-3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]甲基}吡咯啶-1-羧酸酯(中間物C89，異構體2)與54.6mg(0.51mmol)3-巰基丙酸在14ml甲醇及數滴水中的混合物摻入226.0mg(1.64mmol)碳酸鉀。在50℃下將反應混合物攪拌2.5小時。為反應混合物摻入乙酸乙酯，並用水及飽和NaCl溶液對有機相進行多次洗滌。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。將殘餘物用於後續操作，不對其進行處理。獲得318.7mg(理論之88%，純度88%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.36min；MS(ESIpos)：m/z=684(M+H)+。
中間物C97 第三丁基-3-[2-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-14-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,8,13-三氧代-5-硫雜-2,9,12-三氮雜十四碳-1-基]吡咯啶-1-羧酸酯(異構體2)
Figure 105119613-A0202-12-0353-2385
在氬氛圍下，為25.0mg(0.04mmol)3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-氧代乙基]硫基}丙酸(中間物C96)在2.81ml DMF中的溶液添加14.17mg(0.11mmol)N,N-二異丙基乙胺以及27.80mg(0.07mmol)HATU。在室溫下將反應混合物攪拌10分鐘。隨後添加22.75mg(0.07mmol)N-(2-胺基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺-乙烷(1：1)三氟乙酸(中間物L1)在1.4ml DMF中的溶液以及5mg(0.04mmol)N,N-二異丙基乙胺，並在室溫下將混合物攪拌一夜。為混合物摻入水，並用二氯甲烷對其進行萃取。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，並在真空中將溶劑蒸發。將殘餘物用於後續操作，不對其進行處理。獲得26mg(理論之84%)目標化合物。LC-MS(方法5)：Rt=4.39min；MS(ESIpos)；m/z=863(M+H)+。
中間物C98 第三丁基-3-[2-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-18-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,8,13-三氧代-5-硫雜-2,9,12-三氮雜十八碳-1-基]吡咯啶-1-羧酸酯(異構體2)
Figure 105119613-A0202-12-0354-2386
在氬氛圍下，為25.0mg(0.04mmol)3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-氧代乙基]硫基}丙酸(中間物C96)在2.81ml DMF中的溶液添加14.17mg(0.11mmol)N,N-二異丙基乙胺以及27.80mg(0.07mmol)HATU。在室溫下將反應混合物攪拌10分鐘。隨後添加37.30mg(0.07mmol)N-(2-胺基乙基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺-乙烷(1：1)三氟乙酸在1.4ml DMF中的溶液以及5mg(0.04mmol)N,N-二異丙基乙胺，並在室溫下將混合物攪拌一夜。為混合物摻入水，並用二氯甲烷對其進行萃取。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，並在真空中將溶劑蒸發。使用殘餘物，不對其作進一步純化。獲得22mg(理論之63%)目標化合物。
LC-MS(方法5)：Rt=4.54min；MS(ESIpos)：m/z=919(M+H)+。
中間物C99 第三丁基-3-[2-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-24-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,8,19-三氧代- 12,15-二氧雜-5-硫雜-2,9,18-三氮雜二十四碳-1-基]吡咯啶-1-羧酸酯(異構體2)
Figure 105119613-A0202-12-0355-2387
在氬氛圍下，為25.0mg(0.04mmol)3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-氧代乙基]硫基}丙酸(中間物C96)在2.81ml DMF中的溶液添加14.17mg(0.11mmol)N,N-二異丙基乙胺以及27.80mg(0.07mmol)HATU。在室溫下將反應混合物攪拌10分鐘。隨後添加35.05mg(0.07mmol)N-{2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙基}-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺-乙烷(1：1)三氟乙酸(中間物L82)在1.4ml DMF中的溶液以及5mg(0.04mmol)N,N-二異丙基乙胺，並在室溫下將混合物攪拌一夜。為混合物摻入水，並用二氯甲烷對其進行萃取。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。藉由製備性HPLC將殘餘物純化。獲得25mg(理論之60%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=4.52min；MS(ESIpos)：m/z=1007(M+H)+。
中間物C100 2-(三甲基矽基)乙基-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-[(2-{[(2R)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯基]胺基}乙基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}胺基甲酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0356-2388
為45mg(0.068mmol)(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丁酸(中間物C58)在5.8ml DMF中的溶液添加22.2mg(0.068mmol)(2R)-N-(2-胺基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯胺(1：1)三氟乙酸。在室溫下攪拌30分鐘後，為混合物摻入39mg(0.10mmol)HATU以及36mg(0.27mmol)N,N-二異丙基乙胺。在室溫下將反應混合物攪拌1小時。在不進行處理的情況下，藉由製備性HPLC將混合物純化。獲得7mg(理論之12%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.41min；MS(ESIpos)：m/z 851(M+H)+。
中間物C101 三氟乙酸-甲基-(2S)-4-[(乙醯氧基乙醯基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-胺基丁酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0357-2389
將4.3g(12.2mmol)中間物C52溶解在525mL DCM中，並摻入3.63g(17.12mmol)三乙醯氧基硼氫化鈉以及8.4mL乙酸。在室溫下攪拌5分鐘後，添加3.23g(11.85mmol)溶解於175mL DCM中的甲基-(2S)-4-氧代-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丁酸酯(按照經典方法用(3S)-3-胺基-4-甲氧基-4-氧代丁酸製備)，並在室溫下將混合物再攪拌45分鐘。隨後用DCM將混合物稀釋，並用100mL飽和碳酸氫鈉溶液將其洗滌兩次，隨後用飽和氯化鈉溶液進行振搖萃取。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，對其進行過濾，隨後將其濃縮。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。在將相應的溶離份合併、進行濃縮以及在高真空中對殘餘物進行乾燥後，獲得4.6g(理論之61%)中間物。
LC-MS(方法12)：Rt=1.97min；MS(ESIpos)：m/z=614.32(M+H)+。
將2.06g(3.36mmol)此中間物置於76mL DCM中，並在有2.1ml三乙胺的情況下藉由0.81mL(7.17mmol)2-氯-2-氧代乙酸乙酯進行醯化。在室溫下攪拌20小時後，再添加0.36mL 2-氯-2-氧代乙酸乙酯以及0.94ml三乙胺，並在室溫下將混合物再攪拌15分鐘。隨後用500 mL乙酸乙酯進行稀釋，並且依次用300mL 5%的檸檬酸振搖萃取兩次、用300mL飽和碳酸氫鈉溶液振搖萃取兩次，以及用100mL飽和氯化鈉溶液振搖萃取一次，隨後透過硫酸鎂進行乾燥以及進行濃縮。在高真空中乾燥後，獲得2.17g(理論之79%)受保護的中間物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.48min；MS(ESIpos)：m/z=714(M+H)+。
將321mg(0.342mmol)此中間物溶解在7mL 2,2,2-三氟乙醇中。添加279.5mg(2.05mmol)氯化鋅，並在50℃下將混合物攪拌2小時。隨後添加599mg(2.05mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸以及2mL 0.1%的四氟乙酸水溶液，隨後在真空中將混合物濃縮。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。在將相應的溶離份濃縮以及將殘餘物自乙腈/水凍乾後，獲得60mg(理論之26%)目標化合物，其部分尚且包含經去乙醯之化合物的一部分。
LC-MS(方法1)：Rt=0.91min及0.95min；MS(ESIpos)：m/z=528及570(M+H)+。
中間物C102 (2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-2-{[(苄氧基)羰基]胺基}丁酸
Figure 105119613-A0202-12-0358-2390
首先，以與中間物C2類似的方式，藉由苄基-(2S)-2-{[(苄氧基)羰基]胺基}-4-氧代丁酸酯將中間物C52還原性烷基化。隨後藉由2-氯-2-氧代乙酸乙酯將二級胺基醯化，最後藉由氫氧化鋰之2M甲醇溶液使得兩個酯基水解。
LC-MS(方法1)：Rt=1.31min；MS(ESIpos)：m/z=646(M-H)-。
中間物C103 2-(三甲基矽基)乙基-N-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-N2-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-麩醯胺酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0359-2391
首先，在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下，透過在DMF中將151mg(0.23mmol)中間物C102與128mg(0.234mmol)中間物L98偶聯製備目標化合物。隨後在室溫下藉由10%的鈀-活性炭在氫正常壓力下進行30分鐘的氫化，以將Z保護基團脫除，其中獲得目標化合物。
產率：理論之30%，歷經2個階段
LC-MS(方法1)：Rt=1.14min；MS(ESIpos)：m/z=929(M+H)+。
中間物C104 2-(三甲基矽基)乙基-(3R,4R)-3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)甲基]-4-氟吡咯啶-1-羧酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0360-2392
為2.24g(6.31mmol)(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙烷-1-胺在56.0ml二氯甲烷中的溶液(分子篩4Å)摻入1.87g(8.84mmol)三乙醯氧基硼氫化鈉，並在室溫下將混合物攪拌15分鐘。隨後添加2.20g(7.58mmol)2-(三甲基矽基)乙基-(3R,4S)-3-氟-4-甲醯基吡咯啶-1-羧酸酯(參考：WO 2014/151030A1)，並在室溫下將反應混合物攪拌3.5小時。用二氯甲烷將混合物稀釋，並用飽和碳酸氫鈉溶液以及水對有機相進行洗滌。透過硫酸鈉對有機相進行乾燥，並將其濃縮。藉由製備性HPLC將殘餘物純化。獲得1.39g(理論之24%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.15min；MS(ESIpos)：m/z=600(M+H)+。
中間物C105 2-(三甲基矽基)乙基-(3R,4R)-3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]甲基}-4-氟吡咯啶-1-羧酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0361-2393
為692.8mg(0.88mmol)2-(三甲基矽基)乙基-(3R,4R)-3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)甲基]-4-氟吡咯啶-1-羧酸酯(中間物C104)在8.7ml二氯甲烷中的溶液(分子篩4Å)添加295.0mg(2.91mmol)三乙胺乙基418.9mg(3.71mmol)氯乙醯氯，並在室溫下將反應混合物攪拌2.5小時。用二氯甲烷將反應混合物稀釋，並用飽和碳酸氫鈉溶液及飽和氯化銨溶液洗滌有機相。透過硫酸鈉對有機相進行乾燥，並將其濃縮。將殘餘物再次溶解在8.7ml二氯甲烷中(分子篩4Å)，添加295.0mg(2.91mmol)三乙胺以及418.9mg(3.71mmol)氯乙醯氯，並在室溫下將反應混合物攪拌3小時。用二氯甲烷將反應混合物稀釋，並用飽和碳酸氫鈉溶液及飽和氯化銨溶液洗滌有機相。透過硫酸鈉對有機相進行乾燥，並將其濃縮。透過硫酸鈉對有機相進行乾燥，將其濃縮並用於後續操作，不對其進行純化。獲得691mg(理論之74%，純度64%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.78min；MS(ESIpos)：m/z=676(M+H)+。
中間物C106 3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3R,4R)-4-氟-1-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-氧代乙基]硫基}丙酸
Figure 105119613-A0202-12-0362-2394
為691.0mg(0.65mmol)2-(三甲基矽基)乙基-(3R,4R)-3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]甲基}-4-氟吡咯啶-1-羧酸酯(中間物C105)與76.3mg(0.72mmol)3-巰基丙酸在15ml甲醇及數滴水中的混合物摻入316mg(2.29mmol)碳酸鉀。在50℃下將反應混合物攪拌1.5小時。為反應混合物摻入乙酸乙酯，並用水及飽和NaCl溶液對有機相進行多次洗滌。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。將殘餘物用於後續操作，不對其進行處理。獲得502mg(理論之67%，純度65%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.48min；MS(ESIneg)：m/z=744(M-H)-。
中間物C107 S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3R,4R)-4-氟-1-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-氧代乙基]-L-半胱胺酸
Figure 105119613-A0202-12-0363-2395
將203.6mg(1.68mmol)L-半胱胺酸與201.7mg(2.40mmol)碳酸氫鈉一起懸浮於0.95mL水中。為此添加170.0mg(0.24mmol)的溶解於9.5mL異丙醇中的2-(三甲基矽基)乙基-(3R,4R)-3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]甲基}-4-氟吡咯啶-1-羧酸酯(中間物105)，以及438.5mg(2.40mmol)1,8-二氮雜雙環(5.4.0)十一碳-7-烯。在50℃下將反應混合物攪拌3小時。為混合物摻入乙酸乙酯，並用飽和碳酸氫鈉溶液及飽和NaCl溶液將有機相洗滌多次。透過硫酸鈉對有機相進行乾燥，並在真空中將溶劑蒸發。將殘餘物用於後續操作，不對其作進一步純化。獲得152mg(理論之83%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.26min；MS(ESIpos)：m/z=762(M+H)+。
中間物C108 2-(三甲基矽基)乙基N6-(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-beta-丙胺醯基)-N2-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-離胺酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0364-2396
在有EDCI、HOBT及N,N-二異丙基乙胺的情況下，在DMF中將103mg(0.16mmol)中間物C102與110mg(0.175mmol)2-(三甲基矽基)乙基N6-beta-丙胺醯基-N2-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-離胺酸酯偶聯來製備目標化合物。隨後在室溫下藉由10%的鈀-活性炭(二氯甲烷/甲醇1：1溶液)在氫正常壓力下進行1小時的氫化，以將Z保護基團脫除，其中獲得目標化合物，產量為113mg(理論之75%，歷經2個階段)。
LC-MS(方法1)：Rt=1.17min；MS(ESIpos)：m/z=957(M+H)+。
按照經典的肽化學方法製備在此採用的中間體：在有HATU的情況下將市售之N-(第三丁氧基羰基)-beta-丙胺酸與2-(三甲基矽基)乙基N2-[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸酯偶聯，將Z保護基團氫解脫除，藉由1-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮插入三甲基矽基-乙氧基羰基(Teoc)保護基團，最後藉由在7.5%的三氟乙酸之二氯甲烷溶液中攪拌45分鐘將Boc保護基團溫和地脫除。
LC-MS(方法1)：Rt=0.83min；MS(ESIpos)：m/z=462(M+H)+。
中間物C109 二第三丁基-N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-beta-丙胺醯基-L-麩胺酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0365-2397
首先按照經典的肽化學方法製備二肽衍生物：在有HATU的情況下將市售之N-[(苄氧基)羰基]-beta-丙胺酸與二第三丁基L-麩胺酸酯鹽酸鹽(1：1)偶聯，隨後將Z保護基團氫解脫除。隨後如下製備目標化合物：在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下將此中間物與中間物C102偶聯，隨後在室溫下藉由10%的鈀-活性炭甲醇溶液在氫正常壓力下進行45分鐘的氫化，以將Z保護基團脫除。
LC-MS(方法1)：Rt=0.99min；MS(ESIpos)：m/z=826[M+H]+。
中間物C110 二苄基-N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-beta-丙胺醯基-L-麩胺酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0366-2398
如下製備目標化合物：在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下，將透過分佈於乙酸乙酯及5%碳酸氫鈉溶液之間而自其對甲苯磺酸鹽釋放的二苄基-L-麩胺酸酯與中間物C61偶聯，隨後藉由氯化鋅之三氟乙醇溶液將Teoc保護基團脫除。
LC-MS(方法1)：Rt=1.09min；MS(ESIpos)：m/z=894[M+H]+。
中間物C111 二第三丁基-N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-beta-丙胺醯基-D-麩胺酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0366-2399
以與中間物C109類似的方式合成目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.06min；MS(ESIpos)：m/z=826[M+H]+。
中間物C112 N2-乙醯基-N-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0367-2400
如下製備目標化合物：在DMF中在有N,N-二異丙基乙胺的情況下將中間物C102與中間物L108 HATU偶聯，隨後在DCM/甲醇1：1中藉由10%的鈀-活性炭在正常壓力下進行氫化，以將Z保護基團脫除。
LC-MS(方法1)：Rt=0.96min；MS(ESIpos)：m/z=826(M+H)+。
中間物C113 三氟乙酸-苄基-N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基}2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-3-{[(苄氧基)羰基]胺基}-D-丙胺酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0367-2401
首先以市售之3-{[(苄氧基)羰基]胺基}-N-(第三丁氧基羰基)-D-丙胺酸為基礎如下製備三氟乙酸-苄基-3-{[(苄氧基)羰基]胺基}-D-丙胺酸酯(1：1)：在有EDC/DMAP的情況下藉由苄醇進行酯化，隨後藉由三氟乙酸將Boc保護基團脫除。隨後在DMF中在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下將此胺基酸區塊與中間物C58偶聯。在最後一步中，在包含6當量氯化鋅的三氟乙醇中攪拌2小時並藉由製備性HPLC進行純化，從而獲得目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.05min；MS(ESIpos)：m/z=824[M+H]+。
中間物C114 三氟乙酸--第三丁基-4-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)丁酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0368-2402
首先在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下將中間物C102與第三丁基-4-胺基丁酸酯鹽酸鹽(1：1)偶聯。隨後在室溫下藉由10%的鈀-活性炭在DCM-甲醇1：1中在氫正常壓力下進行1小時的氫化，從而獲得目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.0min；MS(ESIpos)：m/z=655[M+H]+。
中間物C115 三氟乙酸(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-甲基丁醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0369-2403
首先，以與中間物C2類似的方式，藉由苄基-(2S)-2-{[(苄氧基)羰基]胺基}-4-氧代丁酸酯將中間物C52還原性烷基化。隨後如就中間物C27所述，藉由2-氯-2-氧代乙酸乙酯將二級胺基醯化。
將190mg(0.244mmol)此中間體置於7.5ml乙醇中，並摻入0.35mL 40%的甲烷胺水溶液。在50℃下將混合物攪拌3小時，隨後再次添加相同量的甲烷胺溶液。在50℃下再攪拌5小時後將混合物濃縮，並藉由製備性HPLC將殘餘物純化。獲得78mg(理論之48%)此中間體。
LC-MS(方法1)：Rt=1.32min；MS(EIpos)：m/z=661[M+H]+。
將78mg(0.118mmol)此中間體溶解在8mL乙醇中，在添加15mg 10%的鈀-活性炭後，在室溫下在氫正常壓力下進行歷經3小時的氫化。隨後將催化劑濾出，在真空中將溶劑移除，並藉由製備性HPLC將產物純化。在自乙腈/水凍乾後，獲得33mg(理論之44%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m/z=527(M+H)+。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)：δ=8.1(m,1H),8.0(m,3H),7.9 (m,1H),7.65(m,1H),7.5(s,1H),7.15-7.35(m,5H)7.0(m,1H),6.85(m,1H),5.6(s,1H),4.9及5.2(2d,2H),4.02及4.22(2d,2H),3.2-3.5(m,6H),0.7及1.46(2m,2H),0.8(s,9H).
中間物C116 三氟乙酸N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}-L-天冬醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0370-2404
將三氟乙酸(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)丁醯胺(1：1)(81.0mg，100μmol)(中間物F104)以及2,5-二氧代吡咯啶-1-基-N2-(第三丁氧基羰基)-L-天冬醯胺酸酯(43.0mg,131μmol)溶解在5.0ml DMF中。為反應混合物摻入N,N-二異丙基乙胺(61μl，350μmol)，在室溫下攪拌1小時，隨後直接藉由製備性RP-HPLC(柱：Chromatorex 125x30；10μ，流量：75mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)將其純化。在真空中將溶劑蒸發，並將殘餘物凍乾。獲得84mg(理論之88%)第三丁基-[(2S)-4- 胺基-1-({(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}胺基)-1,4-二氧代丁烷-2-基]胺基甲酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.09min；MS(ESIpos)：m/z=907[M+H]+
將第三丁基-[(2S)-4-胺基-1-({(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}胺基)-1,4-二氧代丁烷-2-基]胺基甲酸酯(83.0mg，91.5μmol)溶解在5.0ml三氟乙醇中。為反應混合物摻入氯化鋅(74.8mg，549μmol)，並在50℃下攪拌15分鐘。為混合物摻入乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(160mg，549μmol)，用5.0ml乙腈/水進行稀釋，摻入TFA(20μl)，並攪拌10分鐘。藉由針筒過濾器對混合物進行過濾，並藉由製備性RP-HPLC(柱：Chromatorex 125x30；10μ，流量：75mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)將其純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得50mg(理論之58%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.81min；MS(ESIpos)：m/z=807[M+H]+
中間物L1 三氟乙酸--N-(2-胺基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0371-2405
按照經典的肽化學方法，用市售之(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯 -1-基)乙酸以及第三丁基-(2-胺基乙基)胺基甲酸酯製備目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=0.19min；LC-MS(方法1)：Rt=0.17min；MS(ESIpos)：m/z=198(M+H)+。
中間物L2 三氟乙酸--rel-(1R,2S)-2-胺基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊烷羧醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0372-2406
以50mg(0.214mmol)市售之順-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-1-環戊烷羧酸與60mg(0.235mmol)市售之三氟乙酸--1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)為基礎，透過藉由EDC/HOBT偶聯以及隨後藉由TFA去保護，製備目標化合物。獲得36mg(理論之38%，歷經2個階段)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=0.2min；LC-MS(方法1)：Rt=0.17min；MS(ESIpos)：m/z=252(M+H)+。
中間物L3 三氟乙酸--(1S,2R)-2-胺基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊烷羧醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0372-2407
以50mg(0.214mmol)市售之(1S,2R)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基] 環戊烷羧酸與72mg(0.283mmol)市售之三氟乙酸--1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)為基礎，透過藉由EDC/HOBT偶聯以及隨後藉由TFA去保護，製備目標化合物。獲得13mg(理論之16%，歷經2個階段)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=0.2min；LC-MS(方法1)：Rt=0.2min；MS(ESIpos)：m/z=252(M+H)+。
中間物L4 三氟乙酸--N-(2-胺基乙基)-4-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)環己烷羧醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0373-2408
按照經典的肽化學方法，用市售之1-[(4-{[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]羰基}環己基)甲基]-1H-吡咯-2,5-二酮以及第三丁基-(2-胺基乙基)胺基甲酸酯製備目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=0.26min；LC-MS(方法1)：Rt=0.25min；MS(ESIpos)：m/z=280(M+H)+。
中間物L5 三氟乙酸--N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)苯基]-beta-丙胺醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0373-2409
按照經典的肽化學方法，用市售之1-(4-胺基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮以及N-(第三丁氧基羰基)-beta-丙胺酸製備目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=0.22min；LC-MS(方法1)：Rt=0.22min；MS(ESIpos)：m/z=260(M+H)+。
中間物L6 三氟乙酸--第三丁基-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-L-離胺酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0374-2410
如下製備目標化合物：首先在有EDC/HOBT的情況下，將市售之6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸與按照經典的肽化學方法製備的部分受保護的肽第三丁基-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸酯偶聯。隨後在溫和條件下，藉由在室溫下在5%的三氟乙酸的DCM溶液中攪拌實現胺基上之去保護，其中以37%的產量獲得目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.29min；LC-MS(方法1)：Rt=0.62min；MS(ESIpos)：m/z=566(M+H)+。
中間物L7 三氟乙酸--beta-丙胺醯基-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鳥胺醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0375-2011
按照經典的肽化學方法，以市售之1-(4-胺基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮為基礎，如下製備目標化合物：在有HATU的情況下依次與N2-(第三丁氧基羰基)-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸偶聯，藉由TFA去保護，與2,5-二氧代吡咯啶-1-基-N-(第三丁氧基羰基)-L-纈胺酸酯偶聯，藉由TFA去保護，與2,5-二氧代吡咯啶-1-基-N-(第三丁氧基羰基)-beta-丙胺酸酯偶聯，再藉由TFA去保護。獲得32mg目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=0.31min；LC-MS(方法1)：Rt=0.47min；MS(ESIpos)：m/z=516(M+H)+。
中間物L8 三氟乙酸--L-丙胺醯基-N5-胺甲醯基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鳥胺醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0375-2012
按照經典的肽化學方法，以市售之1-(4-胺基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮為基礎，如下製備目標化合物：在有HATU的情況下依次與N2- (第三丁氧基羰基)-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸偶聯，藉由TFA去保護，與2,5-二氧代吡咯啶-1-基-N-(第三丁氧基羰基)-L-丙胺酸酯偶聯，並再藉由TFA去保護。獲得171mg目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=0.23min；LC-MS(方法7)：Rt=0.3min；MS(ESIpos)：m/z=417(M+H)+。
中間物L9 三氟乙酸--beta-丙胺醯基-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-N-[4-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基]-L-鳥胺醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0376-2013
以市售之甲基-(4-胺基苯基)乙酸酯為基礎，以與中間物L7類似的方式製備目標化合物。獲得320mg目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=0.45min；LC-MS(方法1)：Rt=0.48min；MS(ESIpos)：m/z=493(M+H)+。
中間物L10 N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-rel-N6-{[(1R,2S)-2-胺基環戊基]羰基}-L-離胺酸-三氟乙酸(1：2)
Figure 105119613-A0202-12-0377-2014
以中間物L6為基礎，透過藉由EDC/HOBT與順-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-1-環戊烷羧酸偶聯以及隨後藉由TFA去保護，製備目標化合物。獲得12mg(理論之52%，歷經2個階段)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.45min；LC-MS(方法1)：Rt=0.73min；MS(ESIpos)：m/z=677(M+H)+。
中間物L11 N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6-{[(1S,2R)-2-胺基環戊基]羰基}-L-離胺酸-三氟乙酸(1：2)
Figure 105119613-A0202-12-0377-2015
以中間物L6為基礎，透過藉由EDC/HOBT與(1S,2R)-2-[(第三丁 氧基羰基)胺基]環戊烷羧酸偶聯以及隨後藉由TFA去保護，製備目標化合物。獲得11mg(理論之39%，歷經2個階段)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.45min；LC-MS(方法1)：Rt=0.74min；MS(ESIpos)：m/z=677(M+H)+。
中間物L12 三氟乙酸--1-[2-(2-胺基乙氧基)乙基]-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0378-2016
為228mg(1.12mmol)溶解於7mL二噁烷/水1：1中之第三丁基-[2-(2-胺基乙氧基)乙基]胺基甲酸酯添加381mg(2.46mmol)甲基-2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-羧酸酯。添加1.2mL飽和碳酸氫鈉溶液，並在室溫下攪拌混合物。在再添加2次相同量的碳酸氫鈉溶液的情況下總共攪拌5日後，藉由三氟乙酸進行酸化，進行旋轉蒸發，以及藉由製備性HPLC將殘餘物純化，從而對混合物進行處理。將相應的溶離份合併，在真空中將溶劑移除，並將殘餘物自乙腈/水1：1凍乾。
將殘餘物置於3mL二氯甲烷中，並摻入1mL三氟乙酸。在室溫下攪拌15分鐘後，在真空中將溶劑移除，並將殘餘物自乙腈/水1：1凍乾。如此獲得70mg(理論之67%，歷經2個階段)形式為樹脂狀殘餘物的目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=0.2min；LC-MS(方法1)：Rt=0.18min；MS(ESIpos)：m/z=185(M+H)+。
中間物L13 三氟乙酸--第三丁基-N2-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-離胺酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0379-2017
以與中間物L6類似的方式，在有EDC/HOBT的情況下將(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸與第三丁基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸酯鹽酸鹽(1：1)偶聯，隨後將第三丁氧基羰基保護基團溫和地脫除，藉此製備目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=0.42min；LC-MS(方法1)：Rt=0.43min；MS(ESIpos)：m/z=340(M+H)+。
中間物L14 三氟乙酸--1-[2-(4-胺基哌嗪-1-基)-2-氧代乙基]-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0379-2018
以與中間物L2類似的方式，用第三丁基-哌嗪-1-基胺基甲酸酯與(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸歷經2個階段製備目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=0.2min；LC-MS(方法3)：Rt=0.25min；MS(ESIpos)：m/z=239(M+H)+。
中間物L15 三氟乙酸--N-(2-胺基乙基)-3-(2-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯- 1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0380-2019
將2.93g(10.58mmol)第三丁基-3-{2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸酯溶解在100mL二噁烷/水1：1中，並摻入3.28g(21.15mmol)甲基-2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-羧酸酯以及飽和碳酸氫鈉溶液，直至達到6-7的pH值。在室溫下將溶液攪拌30分鐘，隨後在真空中將1,4-二噁烷蒸發。隨後添加200mL水，並分別用300mL乙酸乙酯對混合物進行三次振搖萃取。將有機萃取物合併，透過硫酸鎂對其進行乾燥，並進行過濾。在濃縮後，獲得形式為棕色油的第三丁基-3-(2-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸酯，隨後在高真空中對其進行乾燥。
HPLC(方法11)：Rt=1.5min；LC-MS(方法3)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m/z=375(M+NH4)+。
按照標準方法(藉由TFA去保護，與第三丁基-(2-胺基乙基)胺基甲酸酯偶聯，並再藉由TFA去保護)將此中間物轉化成目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=0.2min；LC-MS(方法3)：Rt=0.25min；MS(ESIpos)：m/z=344(M+H)+。
中間物L16 N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸
Figure 105119613-A0202-12-0381-2020
為266mg(1.33mmol)L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸在24mL DMF中的溶液添加535mg(1.73mmol)市售之1-{6-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮以及930mL N,N-二異丙基乙胺。在超音波浴中對混合物進行24小時的處理，隨後在真空中將其濃縮至乾燥程度。藉由製備性HPCL將殘留之殘餘物純化，在將相應的溶離份濃縮以及在高真空中對殘餘物進行乾燥後，殘餘337mg(理論之50%)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=0.4min；LC-MS(方法3)：Rt=0.58min；MS(ESIpos)：m/z=468(M+H)+。
中間物L17 三氟乙酸--第三丁基-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯基-L-離胺酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0381-2021
如下製備目標化合物：首先在有EDC/HOBT及N,N-二異丙基乙胺的情況下，將172mg(0.37mmol)中間物L16與125mg(0.37mmol)第三丁基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸酯鹽酸鹽(1：1)偶聯，隨後在溫 和條件下，藉由在室溫下在10%的三氟乙酸的DCM溶液中攪拌2小時實現對胺基的去保護。在自乙腈/水凍乾後，歷經2個階段獲得194mg(理論之49%)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.1min；LC-MS(方法1)：Rt=0.58min；MS(ESIpos)：m/z=652(M+H)+。
中間物L18 三氟乙酸--beta-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N5-胺甲醯基-N-[4-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基]-L-鳥胺醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0382-2022
以與中間物L7類似的方式，按照經典的肽化學方法，以甲基-(4-胺基苯基)乙酸酯為基礎，如下製備目標化合物：在有HATU的情況下與N2-(第三丁氧基羰基)-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸連接，藉由TFA去保護，與2,5-二氧代吡咯啶-1-基-N-(第三丁氧基羰基)-L-丙胺酸酯偶聯，藉由TFA去保護，與2,5-二氧代吡咯啶-1-基-N-(第三丁氧基羰基)-beta-丙胺酸酯偶聯，並再藉由TFA去保護。獲得330mg目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=0.29min；LC-MS(方法1)：Rt=0.41min；MS(ESIpos)：m/z=465(M+H)+。
中間物L19 三氟乙酸--L-丙胺醯基-N5-胺甲醯基-N-(4-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}苯基)-L-鳥胺醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0383-2023
以1,4苯二胺為基礎，按照經典的肽化學方法製備目標化合物。在第一步中，在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下，藉由0.8g(2.9mmol)N2-(第三丁氧基羰基)-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸將942mg(8.72mmol)1,4苯二胺單醯化。在第二步中，在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下，以類似的方式藉由(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸將第二苯胺的胺基醯化。在隨後之三個合成步驟中藉由TFA去保護，與2,5-二氧代吡咯啶-1-基-N-(第三丁氧基羰基)-L-丙胺酸酯偶聯，並再藉由TFA去保護，藉此獲得148mg目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.21min；MS(ESIpos)：m/z=474(M+H)+。
LC-MS(方法4)：Rt=0.2min；MS(ESIpos)：m/z=474(M+H)+。
中間物L20 三氟乙酸--L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鳥胺醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0383-2024
以與中間物L8類似的方式，按照經典的肽化學方法，以市售之1-(4-胺基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮為基礎，如下製備目標化合物：在有 HATU的情況下依次與N2-(第三丁氧基羰基)-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸偶聯，藉由TFA去保護，與2,5-二氧代吡咯啶-1-基-N-(第三丁氧基羰基)-L-纈胺酸酯偶聯，並再藉由TFA去保護。獲得171mg目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=0.28min；LC-MS(方法1)：Rt=0.39min；MS(ESIpos)：m/z=445(M+H)+。
中間物L21 L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-N-[4-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基]-L-離胺醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0384-2025
按照經典的肽化學方法，以0.42g(2.56mmol)市售之甲基-(4-胺基苯基)乙酸酯為基礎，如下製備目標化合物：在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下依次與N6-(第三丁氧基羰基)-N2-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-離胺酸偶聯，藉由哌啶去保護，在有N,N-二異丙基乙胺的情況下與2,5-二氧代吡咯啶-1-基-N-[(苄氧基)羰基]-L-纈胺酸酯偶聯，隨後藉由10%的鈀-活性炭將苄氧羰基保護基團氫解脫除。獲得360mg(理論之32%，歷經4個階段)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.5min；LC-MS(方法1)：Rt=0.73min；MS(ESIpos)：m/z=493(M+H)+。
中間物L22 三氟乙酸--N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{4-[(2S)-2-胺 基-3-甲氧基-3-氧代丙基]苯基}-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0385-2026
以N-(第三丁氧基羰基)-4-硝基-L-苯丙胺酸為基礎，按照經典的肽化學方法製備目標化合物。在第一步中，首先將2.5g(8.06mmol)此離析劑轉化成銫鹽，隨後藉由碘甲烷之DMF溶液將其轉化成甲酯。
隨後在甲醇中以氫解的方式藉由10%的鈀-活性炭將硝基轉換成胺基。
隨後在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下，在DMF中藉由N5-胺甲醯基-N2-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-鳥胺酸將如此生成之胺基醯化。在下一步中，在DMF中藉由哌啶將Fmoc基團脫除。
隨後在有1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺-鹽酸鹽、1-羥基-1H-苯并三唑-水合物及N,N-二異丙基乙胺的情況下，在DMF中與N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-纈胺酸偶聯，最後藉由三氟乙酸將第三丁氧基羰基基團脫除。
HPLC(方法11)：Rt=1.6min；LC-MS(方法1)：Rt=0.77min；MS(ESIpos)：m/z=673(M+H)+。
中間物L23 三氟乙酸--N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]-beta-丙胺醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0386-2027
以市售之三氟乙酸--1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)為基礎，在有EDCI/HOBT及N,N-二異丙基乙胺的情況下與N-(第三丁氧基羰基)-beta-丙胺酸偶聯，隨後藉由三氟乙酸進行去保護，藉此製備目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=0.19min。
中間物L24 三氟乙酸--1-胺基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環丙烷羧醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0386-2028
將114mg(0.67mmol)市售之1-[(第三丁氧基羰基)胺基]環丙烷羧酸溶解在25mL DCM中，並摻入110mg(0.623mmol)市售之三氟乙酸--1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)以及395μl N,N-二異丙基乙胺，並冷卻至-10℃。隨後添加217mg(0.793mmol)2-溴-1-乙基吡錠四氟硼酸鹽，並在室溫下將混合物攪拌2小時。隨後用乙酸乙酯進行稀釋，並依次用10%的檸檬酸、飽和碳酸氫鈉溶液及飽和氯化鈉溶液進行振搖萃取，隨後透過硫酸鎂進行乾燥，以及進行濃縮。在高真空中進行乾燥後，獲得152mg受保護的中間物。
隨後將此中間物置於10mL DCM中，並藉由1mL三氟乙酸對其進行去保護。在自乙腈/水凍乾後，獲得158mg(理論之71%，歷經2個階段)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=0.19min。
LC-MS(方法3)：Rt=0.98min；MS(ESIpos)：m/z=224(M+H)+。
中間物L25 N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸
Figure 105119613-A0202-12-0387-2029
將31.4mg(0.17mmol)纈胺醯基-L-丙胺酸溶解在3.0mL DMF中，並摻入115.0mg(0.17mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜二十七碳-1-基}丙醯胺以及33.7mg(0.0.33mmol)三乙胺。在室溫下攪拌一夜。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得74.1mg(理論之58%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.61min；MS(ESIpos)：m/z=763[M+H]+。
中間物L26 L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸
Figure 105119613-A0202-12-0388-2030
將600.0mg(1.58mmol)N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸懸浮在25.0mL水/乙醇/THF(1：1：0.5)中並摻入鈀炭(10%)，並在室溫下藉由氫在正常壓力下進行5小時的氫化。將催化劑濾出，並在真空中將溶劑蒸發。將獲得之化合物應用於下一階段，不對其作進一步純化。
LC-MS(方法1)：Rt=0.42min；MS(ESIpos)：m/z=247[M+H]+。
將180mg(0.73mmol)N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸溶解在5.0mL DMF中，並摻入74.0mg(0.73mmol)三乙胺。隨後添加254.6mg(0.73mmol)2,5-二氧代吡咯啶-1-基-N-[(苄氧基)羰基]-L-纈胺酸酯以及74.0mg(0.73mmol)三乙胺。在室溫下將反應混合物攪拌3.5小時。直接藉由製備性RP-HPLC對反應溶液進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得294.1mg(理論之76%)N-[(苄氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸。
LC-MS(方法1)：Rt=0.97min；MS(ESIpos)：m/z=480[M+H]+。
將272.2mg(0.57mmol)N-[(苄氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸置於20.0mL乙酸乙酯/乙醇/THF(1：1：1)中，並 摻入27.2mg鈀-活性炭。在室溫下藉由氫在正常壓力下進行5小時的氫化。藉由Celite(R)進行過濾，並用乙酸乙酯/乙醇/THF(1：1：1)洗滌濾渣。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。將目標化合物(182mg，理論之72%)應用於下一反應階段，不對其作進一步純化。
LC-MS(方法1)：Rt=0.53min；MS(ESIpos)：m/z=346[M+H]+。
中間物L27 N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸
Figure 105119613-A0202-12-0389-2609
將30mg(0.07mmol)L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸(中間物L26)以及46.1mg(0.07mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜二十七碳-1-基}丙醯胺置於1.5mL DMF中，並摻入6.8mg(0.07mmol)4-甲基嗎啉。在室溫下將反應溶液攪拌一夜。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得55.6mg(理論之90%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.77min；MS(ESIpos)：m/z=920[M+H]+。
中間物L28 第三丁基-3-甲醯基-4-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)吡咯啶-1-羧酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0390-2032
將461.7mg(1.15mmol)1-第三丁基-3-乙基-4-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)吡咯啶-1,3-二羧酸酯(根據文獻WO 2006/066896製備此化合物)置於5.0mL無水二氯甲烷中，並冷卻至-78℃。隨後緩慢滴加326.2mg(2.29mmol)二異丁基氫化鋁(1M THF溶液)，並在-78℃下攪拌2小時(薄層層析控制，石油醚/乙酸乙酯=3：1)。滴加1.3g(4.59mmol)溶解於60mL水中的酒石酸鉀鈉，並待反應混合物回到室溫。為反應混合物摻入乙酸乙酯，並用乙酸乙酯對水相進行三次萃取。用飽和NaCl溶液將經合併之有機相洗滌一次，並透過硫酸鎂對其進行乾燥。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得629.0mg形式為粗製產物的目標化合物，其不經進一步純化便被立即應用於下一反應階段。
中間物L29 第三丁基-3-甲醯基-4-[({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)甲基]吡咯啶-1-羧酸酯
由非對映異構體構成之混合物。
Figure 105119613-A0202-12-0391-2033
將807.1mg(2.34mmol)第三丁基-3-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)-4-(羥甲基)吡咯啶-1-羧酸酯(根據文獻WO 2006/100036製備)置於8.0mL二氯甲烷中，並添加236.4mg(2.34mmol)三乙胺。在0℃下滴加267.6mg(2.34mmol)甲磺酸氯，並在室溫下將反應混合物攪拌一夜。再添加133.8mg(1.17mmol)甲磺酸氯以及118.2mg(1.17mmol)三乙胺。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。用二氯甲烷進行稀釋，並用飽和碳酸氫鈉溶液、5%的硫酸氫鉀溶液以及飽和NaCl溶液分別將有機相洗滌一次。在透過硫酸鎂進行乾燥後，在真空中將溶劑蒸發，並藉由Biotage Isolera對殘餘物進行純化(矽膠，柱50g SNAP，流量66mL/min，環己烷/乙酸乙酯)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得402.0mg(理論之41%)第三丁基-3-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)-4-{[(甲磺醯基)氧基]甲基}吡咯啶-1-羧酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.38min；MS(ESIpos)：m/z=424[M+H]+。
將400.0mg(0.94mmol)第三丁基-3-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)-4-{[(甲磺醯基)氧基]甲基}吡咯啶-1-羧酸酯置於5.0mL DMF中，並摻入98.2mg(1.51mmol)疊氮化鈉。在40℃下將反應混合物攪 拌10小時。隨後再添加30.7mg(0.47mmol)疊氮化鈉，並在40℃下再攪拌10小時。添加乙酸乙酯，並用水將有機相洗滌多次。在透過硫酸鎂對有機相進行乾燥後，在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得309.5mg(理論之89%)第三丁基-3-(疊氮甲基)-4-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)吡咯啶-1-羧酸酯化合物。將化合物應用於下一合成階段，而不對其作進一步純化。
LC-MS(方法1)：Rt=1.50min；MS(ESIpos)：m/z=371[M+H]+。
將250mg(0.68mmol)第三丁基-3-(疊氮甲基)-4-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)吡咯啶-1-羧酸酯溶解在10.0mL乙酸乙酯/乙醇(1：1)中，並摻入25.0mg鈀-活性炭(10%)。在室溫下藉由氫在正常壓力下進行8小時的氫化。藉由Celite(R)對反應物進行過濾，並用乙酸乙酯對濾渣進行充分洗滌。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得226.2mg(理論之82%)第三丁基-3-(胺基甲基)-4-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)吡咯啶-1-羧酸酯化合物。將化合物應用於下一合成階段，而不對其作進一步純化。
LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(ESIpos)：m/z=345[M+H]+。
將715.0mg(2.08mmol)第三丁基-3-(胺基甲基)-4-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)-吡咯啶-1-羧酸酯溶解在15.0mL THF中，並摻入2.28mL(2.28mmol)TBAF溶液(1M THF溶液)。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。在真空中將溶劑蒸發，並將殘餘物(1.54g)應用於下一合成階段，而不對其作進一步純化。
LC-MS(方法1)：Rt=0.41min；MS(ESIpos)：m/z=231[M+H]+。
將1.54g(4.88mmol)第三丁基-3-(胺基甲基)-4-(羥甲基)吡咯啶- 1-羧酸酯置於1,4-二噁烷中，摻入541.8mg(4.88mmol)氯化鈣(無水)以及488.6mg(4.88mmol)碳酸鈣，並充分攪拌。隨後添加592.8mg(5.86mmol)三乙胺以及1.52g(5.86mmol)1-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮，並在室溫下將反應混合物攪拌一夜。添加644.9mg(10.7mmol)HOAc以及乙酸乙酯。用水將有機相洗滌兩次，並用飽和NaCl溶液將其洗滌一次。在透過硫酸鎂進行乾燥後，在真空中將溶劑蒸發，並透過矽膠(溶離劑：二氯甲烷/甲醇=100：1)將殘餘物純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得346.9mg(理論之19%)第三丁基-3-(羥甲基)-4-[({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)甲基]吡咯啶-1-羧酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.08min；MS(ESIpos)：m/z=375[M+H]+。
將804.0mg(2.15mmol)第三丁基-3-(羥甲基)-4-[({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)甲基]吡咯啶-1-羧酸酯置於20.0mL氯仿以及20.0mL 0.05N碳酸鉀/0.05N碳酸氫鈉溶液(1：1)中。隨後添加59.7mg(0.22mmol)四正丁基氯化銨、429.9mg(3.22mmol)N-氯代丁二醯亞胺以及33.5mg(0.22mmol)TEMPO，並在室溫下將反應混合物充分攪拌一夜。將有機相分離，並在真空中為其去除溶劑。藉由矽膠(溶離劑：環己烷/乙酸乙酯=3：1)對殘餘物進行純化。獲得517.0mg(理論之46%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.13min；MS(ESIpos)：m/z=373[M+H]+。
中間物L30 第三丁基-3-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)-4-甲醯基吡咯啶-1-羧酸酯
由立體異構體構成之混合物
Figure 105119613-A0202-12-0394-2034
將250.0mg(0.72mmol)第三丁基-3-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)-4-(羥甲基)吡咯啶-1-羧酸酯(根據文獻WO 2006/100036製備此化合物)置於12.5mL二氯甲烷/DMSO(4：1)中，並摻入219.6mg(2.17mmol)三乙胺。在2℃下逐份添加345.5mg(2.17mmol)三氧化硫-吡啶錯合物，並在2℃下攪拌3小時。再逐份添加345.5mg(2.17mmol)三氧化硫-吡啶錯合物，並在室溫下攪拌17小時。將反應混合物分佈於二氯甲烷及水之間。用二氯甲烷對水相進行三次萃取，並用水將經合併之有機相洗滌一次，並透過硫酸鎂對其進行乾燥。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。將殘餘物應用於下一合成階段，而不對其作進一步純化(薄層層析法：石油醚/乙酸乙酯7：3)。
中間物L31 二第三丁基-{[(第三丁氧基羰基)胺基]甲基}丙二酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0394-2035
為600mL水添加57.2g(488.27mmol)第三丁基胺基甲酸酯、51.2mL(683.57mmol)37%的甲醛水溶液以及25.9g(244.13mmol)碳 酸鈉。將混合物加熱直至產生溶液，隨後在室溫下攪拌16小時。用500mL二氯甲烷對產生的懸浮液進行萃取，將有機相分離，用飽和氯化鈉溶液對其進行洗滌，並透過硫酸鈉對其進行乾燥。在旋轉蒸發器上進行濃縮，並在高真空中對殘餘物進行乾燥，其中沈積晶質固體。將殘餘物置於1000mL無水THF中，並在室溫下滴加由322mL(3.414mol)乙酸酐與138mL(1.707mol)吡啶構成之混合物。在室溫下將反應混合物攪拌16小時，隨後在旋轉蒸發器上進行濃縮，其中水浴具有室溫。將殘餘物置於二乙醚中，並用飽和碳酸氫鈉溶液將其洗滌三次，以及用飽和氯化鈉溶液將其洗滌一次。透過硫酸鈉對有機相進行乾燥，在旋轉蒸發器上將其濃縮，並在高真空中將殘餘物乾燥2日。將殘餘物置於2000mL無水THF中，並在冰冷卻下摻入456mL(456.52mmol)的第三丁醇鉀之1M THF溶液。在0℃下攪拌20分鐘，隨後滴加100.8g(456.52mmol)溶解於200mL無水THF中的二第三丁基丙二酸酯。在室溫下攪拌48小時，隨後添加水。在旋轉蒸發器上將反應混合物濃縮，並將其置於500mL乙酸乙酯中。用500mL水以及100mL飽和氯化鈉溶液洗滌混合物，並透過硫酸鎂對有機相進行乾燥。在旋轉蒸發器上將有機相濃縮，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。藉由矽膠(溶離劑：環己烷/乙酸乙酯，梯度=30：1→5：1)對殘餘物進行過濾以將其純化。獲得37.07g(理論之22%)目標化合物。
LC-MS(方法6)：Rt=2.87min；MS(ESIpos)：m/z=346[M+H]+。
中間物L32 第三丁基-[3-羥基-2-(羥甲基)丙基]胺基甲酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0396-2036
將37.0g(107.11mmol)二第三丁基-(乙醯氧基甲基)丙二酸酯溶解在1000mL無水THF中，並在冰冷卻下逐滴摻入535.5mL(1071.10mmol)的硼氫化鋰之2M THF溶液。滴加19.3mL(1071.10mmol)水，並在室溫下攪拌4.5小時。在旋轉蒸發器上將反應混合物濃縮，並在高真空中對其進行乾燥。將殘餘物置於1500mL乙酸乙酯中並摻入100mL水，並在水冷下攪拌30分鐘(輕微放熱)。將有機相分離，並用500mL乙酸乙酯對水相進行兩次萃取。在旋轉蒸發器上將有機相濃縮，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得20.7g(理論之94%)目標化合物。
LC-MS(方法6)：Rt=1.49min；MS(ESIpos)：m/z=106[M-C5H8O2]+。
中間物L33 第三丁基-[3-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}-2-(羥甲基)丙基]胺基甲酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0396-2037
將20.00g(97.44mmol)第三丁基-[3-羥基-2-(羥甲基)丙基]胺基甲酸酯溶解在1000mL無水二氯甲烷中，並在室溫下摻入6.63g(97.44 mmol)咪唑以及16.16g(107.18mmol)第三丁基(氯)二甲基矽烷。在室溫下攪拌16小時，並用半濃縮的氯化鈉溶液對反應混合物進行洗滌。用乙酸乙酯對水相進行萃取，透過硫酸鈉對經合併之有機相進行乾燥，在旋轉蒸發器上將其濃縮，並在高真空中進行乾燥。獲得28.50g(理論之92%)目標化合物。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=0.02(s,6H),0.86(s,9H),1.37(s,9H),1.58-1.73(m,1H),2.91(q,2H),3.33-3.36[m,(2H,遮蓋)],3.53-3.58(m,2H),6.65-6.72(m,1H).
中間物L34 第三丁基-(3-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}-2-甲醯基丙基)胺基甲酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0397-2038
將12.65g(39.591mmol)第三丁基-[3-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}-2-(羥甲基)丙基]胺基甲酸酯溶解在200mL二氯甲烷中，並在室溫下逐滴摻入19.31g(45.53mmol)溶解於150mL二氯甲烷中的戴斯-馬丁高碘烷。在室溫下將混合物攪拌2小時，隨後摻入250mL半濃縮碳酸氫鈉溶液以及250mL 10%的硫代硫酸鈉溶液，並攪拌20分鐘。將有機相分離，並用乙酸乙酯對水相進行萃取。用300mL水對經合併之有機相進行洗滌，透過硫酸鈉對其進行乾燥，在旋轉蒸發器上將其濃縮，並在高真空中進行乾燥。獲得11.35g(理論之90%)目標化合物。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=0.02(s,6H),0.84(s,9H),1.36(s,9H),1.48-1.51(m,1H),3.08-3.32[m,(1H，遮蓋)],3.50-3.58(m,2H),3.81-3.91(m,1H),6.71(t,1H),9.60(d,1H).
中間物L35 第三丁基-(3-氧代丙基)胺基甲酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0398-2039
按照文獻中揭示的方法製備目標化合物(例如參閱Jean Bastide等人，J.Med.Chem. 2003,46(16),3536-3545)。
中間物L36 N-[(苄氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸
Figure 105119613-A0202-12-0398-2040
將100mg(0.57mmol)N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸置於4.0mL DMF中，並摻入0.08mL(0.57mmol)三乙胺。隨後添加199.0mg(0.57mmol)2,5-二氧代吡咯啶-1-基-N-[(苄氧基)羰基]-L-纈胺酸以及0.08mL(0.57mmol)三乙胺。在室溫下攪拌48小時。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，包含0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得75.7mg(理論之33%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.69min；MS(ESIpos)：m/z=409[M+H]+。
中間物L37 L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸
Figure 105119613-A0202-12-0399-2041
將75.7mg(0.19mmol)中間物L36懸浮在25mL水/乙醇/THF中，摻入7.5mg鈀-活性炭(10%)，並在室溫下藉由氫在正常壓力下進行4.5小時的氫化。將催化劑濾出，在真空中為反應混合物去除溶劑，並在高真空中對其進行乾燥。將殘餘物應用於下一階段，而不對其作進一步純化。獲得64.9mg(理論之93%)目標化合物。
LC-MS(方法6)：Rt=0.25min；MS(ESIpos)：m/z=275[M+H]+。
中間物L38 N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸
Figure 105119613-A0202-12-0399-2042
將38.3mg(0.14mmol)中間物L37置於3.0mL DMF中，並摻入96.4mg(0.14mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜 二十七碳-1-基}丙醯胺以及39.0μL(0.28mmol)三乙胺。在室溫下攪拌一夜。隨後為反應混合物摻入16.0μL(0.28mmol)HOAc，並直接藉由製備性RP-HPLC對其進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得58.9mg(理論之45%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.61min；MS(ESIpos)：m/z=849[M+H]+。
中間物L39 2-(三甲基矽基)乙基-(2-巰基乙基)胺基甲酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0400-2043
將300mg(2.64mmol)2-胺基乙硫醇鹽酸鹽(1：1)置於3.0mL二氯甲烷中，並摻入668.0mg(6.60mmol)三乙胺以及719.1mg(2.77mmol)1-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮。在室溫下攪拌2日(薄層層析控制：二氯甲烷/甲醇=100：1.5)。為反應混合物摻入乙酸乙酯，並用水將其洗滌三次。用飽和NaCl溶液將有機相洗滌兩次，並透過硫酸鎂對其進行乾燥。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。將化合物應用於下一合成階段，而不對其作進一步純化。
中間物L40 N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸
Figure 105119613-A0202-12-0401-2044
將600mg(1.58mmol)N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸置於25.0mL水/乙醇/THF(1：1：0.5)中並摻入鈀炭(10%)，並在室溫下藉由氫在正常壓力下進行氫化。將N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸化合物應用於下一合成階段，而不對其作進一步純化。
LC-MS(方法1)：Rt=0.99min；MS(ESIpos)：m/z=247[M+H]+。
將180mg(0.73mmol)N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸溶解在5.0mL DMF中，並摻入74.0mg(0.73mmol)三乙胺。添加254.6mg(0.73mmol)2,5-二氧代吡咯啶-1-基-N-[(苄氧基)羰基]-L-纈胺酸酯以及74.0mg(0.73mmol)三乙胺。在室溫下將反應混合物攪拌3.5小時。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得294.1mg(理論之76%)N-[(苄氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.97min；MS(ESIpos)：m/z=480[M+H]+。
將272.2mg(0.57mmol)N-[(苄氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸溶解在20.0mL乙酸乙酯/乙醇/THF(1：1：1)中並摻入27.2mg鈀-活性炭，並在室溫下藉由氫在正常壓力下進行氫化。藉由Celite(R)進行過濾，並用乙酸乙酯/乙醇/THF(1：1：1)對濾渣進行充 分洗滌。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得182.0mg(理論之72%)L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.53min；MS(ESIpos)：m/z=346[M+H]+。
將30.0mg(0.07mmol)L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸以及46.1mg(0.07mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜二十七碳-1-基}丙醯胺溶解在1.5mL DMF中，並摻入6.8mg(0.07mmol)4-甲基嗎啉。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得55.6mg(理論之90%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.77min；MS(ESIpos)：m/z=920[M+H]+。
中間物L41 N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸
Figure 105119613-A0202-12-0403-2045
將600mg(1.58mmol)N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸置於25.0mL水/乙醇/THF(1：1：0.5)中並摻入鈀炭(10%)，並在室溫下藉由氫在正常壓力下進行氫化。將N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸化合物應用於下一合成階段，而不對其作進一步純化。
LC-MS(方法1)：Rt=0.99min；MS(ESIpos)：m/z=247[M+H]+。
將180mg(0.73mmol)N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸溶解在5.0mL DMF中，並摻入74.0mg(0.73mmol)三乙胺。添加254.6mg(0.73mmol)2,5-二氧代吡咯啶-1-基-N-[(苄氧基)羰基]-L-纈胺酸酯以及74.0mg(0.73mmol)三乙胺。在室溫下將反應混合物攪拌3.5小時。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。隨後在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得294.1mg(理論之76%)N-[(苄氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.97min；MS(ESIpos)：m/z=480 [M+H]+。
將272.2mg(0.57mmol)N-[(苄氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸溶解在20.0mL乙酸乙酯/乙醇/THF(1：1：1)中並摻入27.2mg鈀-活性炭，並在室溫下藉由氫在正常壓力下進行氫化。藉由Celite(R)進行過濾，並用乙酸乙酯/乙醇/THF(1：1：1)對濾渣進行充分洗滌。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得182.0mg(理論之72%)L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.53min；MS(ESIpos)：m/z=346[M+H]+。
將30.0mg(0.07mmol)L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸以及34.3mg(0.07mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧雜十五碳-1-基}丙醯胺溶解在1.5mL DMF中，並摻入6.8mg(0.07mmol)4-甲基嗎啉。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得40.6mg(理論之82%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.73min；MS(ESIpos)：m/z=744[M+H]+。
中間物L42 N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸
Figure 105119613-A0202-12-0405-2046
將50.0mg(0.18mmol)L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸(中間物L37)置於DMF中，並摻入93.6mg(0.18mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧雜十五碳-1-基}丙醯胺以及36.9mg(0.37mmol)三乙胺。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。添加21.9mg(0.37mmol)HOAc，並直接藉由製備性RP-HPLC將反應混合物純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得20.6mg(理論之14%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.55min；MS(ESIpos)：m/z=673[M+H]+。
中間物L43 N-[67-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-65-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61-二十氧雜-64-氮雜六十七烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸
Figure 105119613-A0202-12-0406-2047
將11.3mg(0.04mmol)L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸(中間物L37)置於DMF中，並摻入50.0mg(0.04mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{63-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-63-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60-二十氧雜六十三碳-1-基}丙醯胺以及8.3mg(0.08mmol)三乙胺。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。添加4.9mg(0.08mmol)HOAc，並直接藉由製備性RP-HPLC將反應混合物純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得15.8mg(理論之20%)目標化合物。
LC-MS(方法4)：Rt=0.94min；MS(ESIpos)：m/z=1377[M+H]+。
中間物L44 N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸
Figure 105119613-A0202-12-0407-2048
將73.3mg(0.39mmol)L-纈胺醯基-L-丙胺酸溶解在7.0mL DMF中，並摻入200.0mg(0.39mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧雜十五碳-1-基}丙醯胺以及78.8mg(0.78mmol)三乙胺。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得103.3mg(理論之45%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.58min；MS(ESIpos)：m/z=587[M+H]+。
中間物L45 第三丁基-(2S)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-4-氧代丁酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0407-2049
將2.00g(7.26mmol)第三丁基-N-(第三丁氧基羰基)-L-高絲胺酸酯溶解在90ml二氯甲烷中，隨後摻入1.76ml吡啶以及4.62g(10.90mmol)1,1,1-三乙醯氧基-1λ5,2-苯并碘氧雜戊環-3(1H)-酮(戴斯-馬丁高碘烷)。在室溫下將混合物攪拌2小時，隨後用200ml二氯甲烷將其稀 釋並用10%的硫代硫酸鈉溶液進行兩次振搖萃取，且隨後依次用5%的檸檬酸進行兩次以及用飽和碳酸氫鈉溶液進行兩次振搖萃取。將有機相分離，透過硫酸鈉對其進行乾燥，隨後在真空中將其濃縮。為殘餘物摻入100ml二乙醚及環己烷(體積/體積比=1：1)，並略加濃縮，其中產生白色沈澱物。將此沈澱物吸出。在旋轉蒸發器上將濾液濃縮，並在高真空中對其進行乾燥，其中獲得1.74g(理論之88%)形式為淺黃色油的目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.85min；MS(ESIpos)：m/z=274[M+H]+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=1.38(s,18H),2.64-2.81(m,2H),4.31-4.36(m,1H),7.23(d,1H),9.59(s,1H).
中間物L46 三氟乙酸--第三丁基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-麩醯胺酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0408-2050
如下製備目標化合物：首先在有EDC/HOBT及N,N-二異丙基乙胺的情況下將200mg(0.79mmol)三氟乙酸--1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)與263mg(0.87mmol)(4S)-5-第三丁氧基-4-[(第三丁氧基羰基)胺基]-5-氧代戊酸-三氟乙酸(1：1)偶聯，隨後在溫和條件下，藉由在室溫下在10%的三氟乙酸的DCM溶液中攪拌1小時實現對胺基的去保護在自乙腈/水凍乾後，歷經2個階段獲得85mg(理論之20%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.37min；MS(ESIpos)：m/z=326[M+H]+。
中間物L47 三氟乙酸--beta-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N5-胺甲醯基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鳥胺醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0409-2051
透過將中間物L8與2,5-二氧代吡咯啶-1-基-N-(第三丁氧基羰基)-beta-丙胺酸酯偶聯以及隨後藉由TFA去保護，製備目標化合物。
LC-MS(方法3)：Rt=1.36min；MS(ESIpos)：m/z=488(M+H)+。
中間物L48 三氟乙酸--(1R,2S)-2-胺基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊烷羧醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0409-2052
以市售之(1R,2S)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]環戊烷羧酸為基礎，以與中間物L2類似的方式製備目標化合物。
LC-MS(方法3)：Rt=1.22min；MS(ESIpos)：m/z=252 (M+H)+。
中間物L49 三氟乙酸--第三丁基-N-(溴乙醯基)-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-L-離胺酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0410-2053
如下製備目標化合物：首先在有N,N-二異丙基乙胺的情況下，在二氯甲烷中將市售之溴乙酸酐與按照經典的肽化學方法製備的部分受保護的肽第三丁基-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸酯偶聯。隨後在溫和條件下，藉由在室溫下在10%的三氟乙酸的DCM溶液中攪拌實現胺基上之去保護，其中歷經2個階段以49%的產量獲得目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.09min；MS(ESIpos)：m/z=593及595(M+H)+。
中間物L50 三氟乙酸--(1S,3R)-3-胺基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊烷羧醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0410-2054
以市售之(1S,3R)-3-[(第三丁氧基羰基)胺基]環戊烷羧酸與市售之三氟乙酸--1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)為基礎，透過在有N,N-二異丙基乙胺的情況下藉由HATU偶聯以及隨後藉由TFA去保護，製備目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=0.2min； LC-MS(方法3)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m/z=252(M+H)+。
中間物L51 三氟乙酸--(1R,3R)-3-胺基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊烷羧醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0411-2055
以市售之(1R,3R)-3-[(第三丁氧基羰基)胺基]環戊烷羧酸與市售之三氟乙酸--1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)為基礎，透過在有N,N-二異丙基乙胺的情況下藉由HATU偶聯以及隨後藉由TFA去保護，製備目標化合物。
LC-MS(方法3)：Rt=0.98min；MS(ESIpos)：m/z=250(M-H)-。
中間物L52 三氟乙酸--N-(2-胺基乙基)-2-溴乙醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0411-2056
將420mg(2.62mmol)第三丁基-(2-胺基乙基)胺基甲酸酯置於50 ml二氯甲烷中，並摻入817mg(3.15mmol)溴乙酸酐以及913μl(5.24mmol)N,N-二異丙基乙胺。在室溫下將混合物攪拌1小時，隨後在真空中將其濃縮。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。
獲得577mg受保護的中間體，隨後將其置於50ml二氯甲烷中並摻入10ml三氟乙酸。在室溫下攪拌1小時後，在真空中將混合物濃縮，並將殘餘物自乙腈/水凍乾。如此獲得705mg(理論之65%)目標化合物。
LC-MS(方法3)：Rt=0.34min；MS(ESIpos)：m/z=181及183(M+H)+。
中間物L53 三氟乙酸--(1S,3S)-3-胺基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊烷羧醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0412-2057
以市售之(1S,3S)-3-[(第三丁氧基羰基)胺基]環戊烷羧酸與市售之三氟乙酸--1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)為基礎，透過在有N,N-二異丙基乙胺的情況下藉由HATU偶聯以及隨後藉由TFA去保護，製備目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=0.19min；LC-MS(方法3)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m/z=250(M-H)-。
中間物L54 三氟乙酸--(1R,3S)-3-胺基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基) 乙基]環戊烷羧醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0413-2058
以市售之(1R,3S)-3-[(第三丁氧基羰基)胺基]環戊烷羧酸與市售之三氟乙酸--1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)為基礎，透過在有N,N-二異丙基乙胺的情況下藉由HATU偶聯以及隨後藉由TFA去保護，製備目標化合物。
LC-MS(方法3)：Rt=0.89min；MS(ESIpos)：m/z=252(M+H)+。
中間物L55 三氟乙酸--第三丁基-N6-D-丙胺醯基-N2-{N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基}-L-離胺酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0413-2059
如下製備目標化合物：首先在有HATU的情況下將中間物L6與N-(第三丁氧基羰基)-D-丙胺酸偶聯，隨後在溫和條件下，藉由在室溫下在5%的三氟乙酸的DCM溶液中攪拌90分鐘實現胺基上之去保護。
HPLC(方法11)：Rt=1.35min； LC-MS(方法1)：Rt=0.67min；MS(ESIpos)：m/z=637(M+H)+。
中間物L56 三氟乙酸--第三丁基-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6-{[(1R,3S)-3-胺基環戊基]羰基}-L-離胺酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0414-2610
如下製備目標化合物：首先在有HATU的情況下將中間物L6與(1R,3S)-3-[(第三丁氧基羰基)胺基]環戊烷羧酸偶聯，隨後在溫和條件下，藉由在室溫下在25%的三氟乙酸的DCM溶液中攪拌15分鐘實現胺基上之去保護。
HPLC(方法11)：Rt=1.4min；LC-MS(方法1)：Rt=0.7min；MS(ESIpos)：m/z=677(M+H)+。
中間物L57 甲基-(2S)-4-氧代-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丁酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0414-2061
將500.0mg(2.72mmol)L-天冬胺酸甲酯鹽酸鹽以及706.3mg (2.72mmol)2-(三甲基矽基)乙基-2,5-二氧代吡咯啶-1-羧酸酯置於5.0mL 1,4-二噁烷中，並摻入826.8mg(8.17mmol)三乙胺。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x40；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。隨後在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得583.9mg(理論之74%)(3S)-4-甲氧基-4-氧代-3-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丁酸化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(ESIneg)：m/z=290(M-H)-。
將592.9mg(3S)-4-甲氧基-4-氧代-3-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丁酸置於10.0mL 1,2-二甲氧基乙烷中並冷卻至-15℃，並摻入205.8mg(2.04mmol)4-甲基嗎啉以及277.9mg(2.04mmol)異丁基氯甲酸酯。在15分鐘後將沈澱物吸出，並分別用10.0mL 1,2-二甲氧基乙烷將其洗滌兩次。將濾液冷卻至-10℃，一邊充分攪拌一邊摻入115.5mg(3.05mmol)的溶解於10mL水中的硼氫化鈉。將相分離，並用飽和碳酸氫鈉溶液及飽和NaCl溶液分別將有機相洗滌一次。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得515.9mg(理論之91%)甲基-N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-高絲胺酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.87min；MS(ESIpos)：m/z=278(M+H)+。
將554.9mg(2.00mmol)甲基-N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-高絲胺酸酯置於30.0mL二氯甲烷中，並摻入1.27g(3.0mmol)戴斯-馬丁高碘烷以及474.7mg(6.00mmol)吡啶。在室溫下攪拌一夜。4小時後，用二氯甲烷將混合物稀釋，並用10%的Na2S2O3溶液、10%的檸檬酸溶液以及飽和碳酸氫鈉溶液分別將有機相洗滌三次。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，並在真空中將溶劑蒸發。獲得565.7mg(理論之 97%)目標化合物。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=0.03(s,9H),0.91(m,2H),2.70-2.79(m,1H),2.88(dd,1H),3.63(s,3H),4.04(m,2H),4.55(m,1H),7.54(d,1H),9.60(t,1H).
中間物L58 2-(三甲基矽基)乙基-(3-氧代丙基)胺基甲酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0416-2062
將434.4mg(5.78mmol)3-胺基-1-丙醇以及1.50g(5.78mmol)2-(三甲基矽基)乙基-2,5-二氧代吡咯啶-1-羧酸酯溶解在10.0mL二氯甲烷中，摻入585.3mg(5.78mmol)三乙胺，並在室溫下攪拌一夜。用二氯甲烷將反應混合物稀釋，並用水及飽和碳酸氫鈉溶液洗滌有機相，隨後透過硫酸鎂對其進行乾燥。在真空中將溶劑蒸發。在高真空中對殘餘物2-(三甲基矽基)乙基-(3-羥丙基)胺基甲酸酯(996.4mg，理論之79%)進行乾燥，並將其應用於下一合成階段，而不對其作進一步純化。
將807.0mg(3.68mmol)2-(三甲基矽基)乙基-(3-羥丙基)胺基甲酸酯置於15.0mL氯仿以及15.0mL 0.05N碳酸鉀/0.05N碳酸氫鈉溶液(1：1)中。隨後添加102.2mg(0.37mmol)四正丁基氯化銨、736.9mg(5.52mmol)N-氯代丁二醯亞胺以及57.5mg(0.37mmol)TEMPO，並在室溫下將反應混合物充分攪拌一夜。用二氯甲烷將反應混合物稀釋，並用水及飽和NaCl溶液對有機相進行洗滌。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，並在真空中將溶劑蒸發。在高真空中對殘餘物進行乾燥，並將其應用於下一合成階段(890.3mg)，而不對其作進一步純化。
中間物L59 三氟乙酸--1-{2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0417-2063
將300.0mg(0.91mmol)第三丁基-(2-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙基)胺基甲酸酯置於二氯甲烷中，摻入4.2g(36.54mmol)TFA，並在室溫下攪拌1小時(DC控制：二氯甲烷/甲醇10：1)。在真空中將揮發性組分蒸發，並用二氯甲烷將殘餘物共蒸餾四次。在高真空中對殘餘物進行乾燥，並將其應用於下一合成階段，而不對其作進一步純化。
LC-MS(方法1)：Rt=0.19min；MS(ESIpos)：m/z=229(M+H)+。
中間物L60 6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯氯
Figure 105119613-A0202-12-0417-2064
將200.0mg(0.95mmol)6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸溶解在4.0mL二氯甲烷中，並摻入338.0mg(2.84mmol)亞硫醯氯。在室溫下將反應混合物攪拌3小時，隨後摻入一滴DMF。再攪拌1小時。在真空中將溶劑蒸發，並用二氯甲烷進行三次共蒸餾。將粗製產物應用於下一合成階段，而不對其作進一步純化。
中間物L61 三氟乙酸--2-(三甲基矽基)乙基-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1- 基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-L-離胺酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0418-2065
首先以N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸為基礎，按照經典的肽化學方法(用2-(三甲基矽基)乙醇藉由EDCI/DMAP進行酯化，氫解，在有HATU的情況下與N-[(苄氧基)羰基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸偶聯，再氫解)製備三肽衍生物2-(三甲基矽基)乙基-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸酯。在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下將此經部分保護之肽衍生物與市售之6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸偶聯，藉此製備目標化合物。隨後在溫和條件下，藉由在室溫下在5%的三氟乙酸的DCM溶液中攪拌2.5小時實現胺基上之去保護，保留酯保護基團。在處理及藉由製備性HPLC純化後，獲得438mg目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.69min；LC-MS(方法1)：Rt=0.78min；MS(ESIpos)：m/z=610(M+H)+。
中間物L62 三氟乙酸--2-(三甲基矽基)乙基-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯基-L-離胺酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0419-2066
首先以N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸為基礎，按照經典的肽化學方法製備2-(三甲基矽基)乙基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸酯。隨後在有195mg(0.51mmol)HATU及149μL N,N-二異丙基乙胺的情況下，將148mg(0.43mmol)此中間物與200mg(0.43mmol)中間物L16偶聯。在進行濃縮以及藉由製備性HPLC將殘餘物純化後，將受保護之中間物置於20mL DCM中，並藉由添加2mL三氟乙酸以及在室溫下攪拌1小時，將第三丁氧基羰基保護基團脫除。在進行濃縮以及將殘餘物自乙腈/水凍乾後，獲得254mg(理論之63%，歷經2個階段)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.51min；LC-MS(方法1)：Rt=0.68min；MS(ESIpos)：m/z=696(M+H)+。
中間物L63 (4S)-4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}-3-甲基丁醯基]胺基}丙醯基]胺基}-5-氧代-5-[2-(三甲基矽基)乙氧基]戊酸
Figure 105119613-A0202-12-0420-2067
首先以(2S)-5-(苄氧基)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-5-氧代戊酸為基礎，按照經典的肽化學方法(用2-(三甲基矽基)乙醇藉由EDCI/DMAP進行酯化，藉由三氟乙酸將Boc保護基團脫除，在有HATU的情況下與N-[(苄氧基)羰基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸偶聯，以及在甲醇中藉由10%的鈀-活性炭氫解)製備三肽衍生物(4S)-4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯基]胺基}丙醯基]胺基}-5-氧代-5-[2-(三甲基矽基)乙氧基]戊酸。透過將此經部分保護之肽衍生物與市售之1-{6-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮偶聯來製備目標化合物。在處理及藉由製備性HPLC純化後，獲得601mg目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.96min；MS(ESIpos)：m/z=611(M+H)+。
中間物L64 (4S)-4-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}-5-氧代-5-[2-(三甲基矽基)乙氧基]戊酸
Figure 105119613-A0202-12-0420-2068
以(2S)-5-(苄氧基)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-5-氧代戊酸為基 礎，按照經典的肽化學方法(用2-(三甲基矽基)乙醇藉由EDCI/DMAP進行酯化，藉由三氟乙酸將Boc保護基團脫除，在甲醇中藉由10%的鈀-活性炭將苄基酯氫解，以及在有N,N-二異丙基乙胺的情況下與1-{2-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮偶聯)製備目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.84min；MS(ESIpos)：m/z=385(M+H)+。
中間物L65 三氟乙酸--2-(三甲基矽基)乙基-3-{[(苄氧基)羰基]胺基}-L-丙胺酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0421-2069
以3-{[(苄氧基)羰基]胺基}-N-(第三丁氧基羰基)-L-丙胺酸為基礎，按照經典的肽化學方法(用2-(三甲基矽基)乙醇藉由EDCI/DMAP進行酯化，以及藉由三氟乙酸將Boc保護基團脫除)製備目標化合物。獲得373mg(理論之79%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.72min；MS(ESIpos)：m/z=339(M+H)+。
中間物L66 甲基-(8S)-8-(2-羥乙基)-2,2-二甲基-6,11-二氧代-5-氧雜-7,10-二氮雜-2-矽雜十四烷-14-酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0422-2070
將1000mg(2.84mmol)(3S)-3-{[(苄氧基)羰基]胺基}-4-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁酸置於10.0mL 1,2-二甲氧基乙烷中，並摻入344.4mg(3.4mmol)4-甲基嗎啉以及504mg(3.69mmol)異丁基氯甲酸酯。在室溫下攪拌10分鐘後，將混合物冷卻至5℃，一邊充分攪拌一邊逐份摻入161mg(4.26mmol)的溶解於3mL水中的硼氫化鈉。1小時後，再次添加相同量的硼氫化鈉，隨後將混合物緩慢加熱至室溫。添加170ml水，隨後分別用200ml乙酸乙酯對混合物進行四次萃取。將相分離，並用檸檬酸將有機相洗滌一次，隨後用飽和碳酸氫鈉溶液對其進行洗滌。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得760mg(理論之78%)苄基-第三丁基-[(2S)-4-羥基丁烷-1,2-二基]雙胺基甲酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt=0.84min；MS(ESIpos)：m/z=339(M+H)+。
將760mg(2.16mmol)此中間物溶解在13ml氯化氫/二噁烷中，在室溫下攪拌20分鐘。隨後將混合物濃縮至5ml，並摻入二乙醚。將沈澱物濾出，並自乙腈/水1：1凍乾。
將如此獲得之產物溶解在132ml DMF中，並摻入345.5mg(2.35mmol)4-甲氧基-4-氧代丁酸、970mg(2.55mmol)HATU以及1025μl N,N-二異丙基乙胺。在室溫下將混合物攪拌5分鐘。在真空中將溶劑移除，並藉由製備性HPLC將殘留之殘餘物純化。將相應的溶離份合併，並在真空中將乙腈蒸發。用乙酸乙酯對殘餘的水相進行兩次萃取，隨後將有機相濃縮，並在高真空中對其進行乾燥。
將如此獲得之中間產物置於甲醇中，並在室溫下藉由0%的鈀-活 性炭在氫正常壓力下進行1小時的氫化。隨後將催化劑濾出，並在真空中將溶劑移除。
將247mg此經去保護的化合物置於20ml DMF中，並摻入352mg(1.36mmol)1-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮以及592μL N,N-二異丙基乙胺。在室溫下將反應混合物攪拌1小時，隨後將其濃縮，並藉由製備性HPLC將殘餘物純化。隨後在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。歷經上述5個反應步驟，以21%的總產量獲得218mg目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.74min；MS(ESIpos)：m/z=363(M+H)+。
中間物L67 三氟乙酸--2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基-beta-丙胺酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0423-2071
如下製備目標化合物：以50mg(0.354mmol)市售之1-(2-羥乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮為基礎，在10ml二氯甲烷中在有1.5當量EDCI及0.1當量4-N,N-二甲胺基吡啶的情況下與134mg(0.71mmol)N-(第三丁氧基羰基)-beta-丙胺酸偶聯，隨後藉由三氟乙酸進行去保護。
產量：56mg(理論之48%，歷經2個階段)
LC-MS(方法3)：Rt=1.15min；MS(ESIpos)：m/z=213(M+H)+。
中間物L68 三氟乙酸--N-(2-胺基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯 胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0424-2072
以與中間物L1類似的方式，按照經典的肽化學方法，用市售之(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙酸以及第三丁基-(2-胺基乙基)胺基甲酸酯製備目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.17min；MS(ESIpos)：m/z=212(M+H)+。
中間物L69 三氟乙酸--1-[(苄氧基)羰基]哌啶-4-基-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0424-2073
按照經典的肽化學方法，用市售之苄基-4-羥基哌啶-1-羧酸酯如下製備目標化合物：用N2-(第三丁氧基羰基)-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸藉由EDCI/DMAP進行酯化，隨後藉由TFA將Boc脫除，隨後在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下與N-[(第三丁氧基)羰基]-L-纈胺酸偶聯，最後再次藉由TFA將Boc脫除。
LC-MS(方法1)：Rt=0.62min；MS(ESIpos)：m/z=492(M+H)+。
中間物L70 9H-茀-9-基甲基-(3-氧代丙基)胺基甲酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0425-2074
將1,000.0mg(3.36mmol)9H-茀-9-基甲基-(3-羥丙基)胺基甲酸酯置於15.0mL氯仿以及15.0mL 0.05N碳酸鉀/0.05N碳酸氫鈉溶液(1：1)中。隨後添加93.5mg(0.34mmol)四正丁基氯化銨、673.6mg(5.04mmol)N-氯代丁二醯亞胺以及52.5mg(0.34mmol)TEMPO，並在室溫下將反應混合物充分攪拌一夜。用二氯甲烷將反應混合物稀釋，並用水及飽和NaCl溶液對有機相進行洗滌。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，並在真空中將溶劑蒸發。在高真空中對殘餘物進行乾燥，並藉由矽膠(溶離劑：環己烷/乙酸乙酯3：1-1：1)將其純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得589.4mg(理論之58%)目標化合物。
LC-MS(方法6)：Rt=2.15min；MS(ESIpos)：m/z=296(M-H)+。
中間物L71 第三丁基-[4-(氯羰基)苯基]胺基甲酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0426-2075
將100.0mg(0.42mmol)4-[(第三丁氧基羰基)胺基]苯甲酸置於2.0mL二氯甲烷中，並摻入64.2mg(0.51mmol)草酸二氯。在室溫下將反應混合物攪拌30分鐘(DC控制：二氯甲烷/甲醇)。隨後再添加192.6mg(1.53mmol)草酸二氯以及一滴DMF，並在室溫下攪拌1小時。在真空中將溶劑蒸發，並用二氯甲烷將殘餘物共蒸餾多次。將殘餘物應用於下一合成階段，而不對其作進一步純化。
中間物L72 苄基-(9S)-9-(羥甲基)-2,2-二甲基-6,11-二氧代-5-氧雜-7,10-二氮雜-2-矽雜十四烷-14-酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0426-2076
以市售之苄基-第三丁基-[(2S)-3-羥基丙烷-1,2-二基]雙胺基甲酸酯為基礎，按照經典的肽化學方法如下製備目標化合物：將Z保護基團氫解脫除，隨後在有EDCI/HOBT的情況下與4-(苄氧基)-4-氧代丁酸偶聯，隨後藉由TFA將Boc保護基團脫除，最後在有三乙胺的情況下與1-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮反應。
LC-MS(方法1)：Rt=0.94min；MS(ESIpos)：m/z=425[M+H]+。
中間物L73 N-(2-胺基乙基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0427-2077
為300mg(1.87mmol)第三丁基(2-胺基乙基)胺基甲酸酯在20ml二甲基甲醯胺中的溶液添加395.5mg(1.87mmol)6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸、1.21g(9.36mmol)N,N-二異丙基乙胺以及854.3mg(2.25mmol)HATU。在室溫下將反應混合物攪拌5分鐘。在將混合物濃縮中，將殘餘物置於DCM中，並用水對其進行洗滌。用鹽水洗滌有機相，透過硫酸鎂對其進行乾燥，對其進行過濾並將其濃縮。獲得408mg(33%，純度53%)目標化合物，其不經進一步純化便被用於後續操作。
LC-MS(方法1)：Rt=0.75min；MS(ESIpos)：m/z=354(M+H)+。
為第三丁基(2-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}乙基)胺基甲酸酯(408mg,0.365mmol)在7ml二氯甲烷中的溶液添加1ml TFA。在室溫下將反應混合物攪拌0.5小時。在真空中對反應混合物進行蒸發，並用二氯甲烷將殘餘物共蒸餾兩次。將殘餘物用於後續操作，不對其作進一步純化。獲得384mg(94%，純度57%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.26min；MS(ESIpos)：m/z=254(M+H)+。
中間物L74 3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-二氧代吡咯-1-yl)乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸
Figure 105119613-A0202-12-0428-2078
將107mg(0.335mmol)第三丁基3-[2-[2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸酯以及93mg(0.369mmol)(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙酸酯溶解在5ml二甲基甲醯胺中，並摻入0.074mL(0.671mmol)N-甲基嗎啉。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。添加0.048mL(0.838mmol)乙酸，並直接藉由製備性RP-HPLC將反應混合物純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水/0.1%TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得133mg(86%，純度100%)第三丁基3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt=0.82min；MS(ESIpos)：m/z=459(M+H)+。
為第三丁基3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸酯(130mg，0.284mmol)在5ml二氯甲烷中的溶液添加0.5ml TFA。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。在真空中對反應混合物進行蒸發，將殘餘物置於水中並凍乾。將殘餘物用於後續操作，不對其作進一步純化。獲得102mg(90%，純度100%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.52min；MS(ESIpos)：m/z=402(M+H)+。
中間物L75 三氟乙酸--2-(三甲基矽基)乙基-3-{[(苄氧基)羰基]胺基}-D-丙胺酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0429-2079
以3-{[(苄氧基)羰基]胺基}-N-(第三丁氧基羰基)-D-丙胺酸為基礎，按照經典的肽化學方法(用2-(三甲基矽基)乙醇藉由EDCI/DMAP進行酯化，以及藉由三氟乙酸將Boc保護基團脫除)製備目標化合物。獲得405mg(理論之58%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.75min；MS(ESIpos)：m/z=339(M+H)+。
中間物L76 (2S)-2-溴-4-氧代-4-[2-(三甲基矽基)乙氧基]丁酸
Figure 105119613-A0202-12-0429-2080
首先以(3S)-4-(苄氧基)-3-{[(苄氧基)羰基]胺基}-4-氧代丁酸為基礎，按照經典的肽化學方法(用2-(三甲基矽基)乙醇藉由EDCI/DMAP進行酯化，以及將Z保護基團及苄基酯氫解脫除)製備經適當保護的天冬胺酸衍生物。
將470mg(1.8mmol)如此獲得之(2S)-2-胺基-4-氧代-4-[2-(三甲基矽基)乙氧基]丁酸懸浮在10ml水中，並摻入1.8mL 1M鹽酸以及0.5ml濃縮硫酸，隨後摻入863mg(7.25mmol)溴化鉀。隨後在10℃下在30分鐘的時間段內滴加150mg(2.175mmol)亞硝酸鈉在1ml水中的溶液，並在10-15℃下將混合物攪拌2小時。隨後用50mL乙酸乙酯對混合物進行振搖萃取。用飽和氯化鈉溶液洗滌有機相，並透過硫酸鎂對其進行乾燥。在將溶劑蒸發以及藉由製備性HPLC進行純化後，獲得 260mg(理論之48%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.03min；MS(ESIneg)：m/z=295及297(M-H)-。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ[ppm]=0.03(s,9H),0.95(t,2H),2.94 und 3.2(2dd,2H),4.18(t,2H),4.57(t,1H).
中間物L77 三氟乙酸--N-[2-(2-胺基乙氧基)乙基]-2-溴乙醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0430-2081
首先將418mg(2.05mmol)第三丁基-[2-(2-胺基乙氧基)乙基]胺基甲酸酯與638mg(2.46mmol)溴乙酸酐反應，隨後藉由三氟乙酸將Boc保護基團脫除。獲得551mg(理論之63%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法)：Rt=0.32min；MS(ESIpos)：m/z=227及225(M+H)+。
中間物L78 N-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-beta-丙胺酸
Figure 105119613-A0202-12-0430-2082
以市售之(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸為基礎，在有EDCI/HOBt及N,N-二異丙基乙胺的情況下與第三丁基-beta-丙胺酸酯鹽酸鹽(1：1)偶聯，隨後藉由三氟乙酸進行去保護，藉此製備目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.32min；MS(ESIpos)：m/z=227 (M+H)+。
中間物L79 N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-beta-丙胺酸
Figure 105119613-A0202-12-0431-2083
將64.8mg(0.357mmol)第三丁基-beta-丙胺酸酯鹽酸鹽(1：1)以及100mg(0.324mmol)1-{6-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮溶解在4ml二甲基甲醯胺中，並摻入65.6mg(0.649mmol)N-甲基嗎啉。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。添加0.048mL(0.838mmol)乙酸，並直接藉由製備性RP-HPLC將反應混合物純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水/0.1%TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得84.5mg(77%，純度100%)第三丁基-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-beta-丙胺酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt=0.78min；MS(ESIpos)：m/z=339(M+H)+。
為第三丁基-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-beta-丙胺酸酯(82.8mg,0.244mmol)在8ml二氯甲烷中的溶液添加1.62ml TFA。在室溫下將反應混合物攪拌2小時。在真空中對反應混合物進行蒸發，將殘餘物置於水中並凍乾。將殘餘物用於後續操作，不對其作進一步純化。獲得62.7mg(87%，純度95%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.75min；MS(ESIpos)：m/z=283(M+H)+。
中間物L80 2-(三甲基矽基)乙基-3-[(15-胺基-4,7,10,13-四氧雜十五烷-1-醯基)胺基]-N-(第三丁氧基羰基)-D-丙胺酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0432-2084
以市售之3-{[(苄氧基)羰基]胺基}-N-(第三丁氧基羰基)-D-丙胺酸--N-環己基環己胺(1：1)為基礎，按照經典的肽化學方法(自鹽釋放並用2-(三甲基矽基)乙醇藉由EDCI/DMAP進行酯化，將Z保護基團氫解脫除，在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下與市售之3-氧代-1-苯基-2,7,10,13,16-五氧雜-4-氮雜十九烷-19-酸偶聯，以及再次將Z保護基團氫解脫除)製備目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.70min；MS(ESIpos)：m/z=552(M+H)+。
中間物L81 三氟乙酸-苄基-{2-[(2-胺基乙基)磺醯基]乙基}胺基甲酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0432-2085
在DMF中在有N,N-二異丙基乙胺的情況下將250mg(1.11mmol)2,2'-磺醯基二乙胺與92.3mg(0.37mmol)1-{[(苄氧基)羰基]氧基}吡咯啶-2,5-二酮偶聯。在隨後的HPLC純化後，獲得70mg(理論之47%)目 標化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=0.64min；MS(ESIpos)：m/z=257.11(M+H)+。
中間物L82 三氟乙酸N-{2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙基}-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0433-2086
將88.6mg(0.357mmol)N-Boc-2,2'-(伸乙二氧基)二乙胺以及100mg(0.324mmol)N-丁二醯亞胺醯基6-馬來醯亞胺己酸酯溶解在4.0ml二甲基甲醯胺中，並摻入0.071mL(0.650mmol)N-甲基嗎啉。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。添加0.048mL(0.838mmol)乙酸，並直接藉由製備性RP-HPLC將反應混合物純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：75mL/min，MeCN/水/0.1%TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得127mg(理論之81%)第三丁基-{2-[2-(2-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}乙氧基)乙氧基]乙基}胺基甲酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt=0.78min；MS(ESIpos)：m/z=442(M+H)+。
為123mg(225μmol)第三丁基-{2-[2-(2-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}乙氧基)乙氧基]乙基}胺基甲酸酯在7.5ml二氯甲烷中的溶液添加2.0ml TFA。在室溫下將反應混合物攪拌2小時。在真空中對反應混合物進行蒸發，將殘餘物置於水中並凍乾。將 殘餘物用於後續操作，不對其作進一步純化。獲得111mg(理論之100%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.31min；MS(ESIpos)：m/z=342(M+H)+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=1.17(m,2H),1.47(m,4H),2.04(m,2H),2.98(m,2H),3.19(m,2H),3.39(m,4H),3,56(m,6H),7.01(s,2H),7.72(bs,3H),7.80(m,1H).
中間物L83 三氟乙酸N-{2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙基}-2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0434-2087
將200mg(0.805mmol)第三丁基-{2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙基}胺基甲酸酯、150mg(0.966mmol)(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸以及560μl(3.2mmol)N,N-二異丙基乙胺溶解在10ml二甲基甲醯胺中，並摻入459mg(1,21mmol)HATU。在室溫下將反應混合物攪拌30分鐘。在真空中將溶劑蒸發，並將殘餘物溶解在二氯甲烷中。用5%的檸檬酸溶液將有機相洗滌兩次，透過硫酸鎂對其進行乾燥，並在真空中將溶劑蒸發。藉由Biotage Isolera對殘餘物進行純化(矽膠，柱25g SNAP，二氯甲烷：甲醇98：2)。獲得276mg(理論之89%)第三丁基-{2-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙氧基)乙氧基]乙基}胺基甲酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt=0.67min；MS(ESIpos)：m/z=386(M+H)+。
為第三丁基-{2-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯 基]胺基}乙氧基)乙氧基]乙基}胺基甲酸酯(275mg，714μmol)在15ml二氯甲烷中的溶液添加4ml TFA。在室溫下將反應混合物攪拌30分鐘。在真空中對反應混合物進行蒸發，將殘餘物置於水中並凍乾。獲得281mg(理論之99%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.17min；MS(ESIpos)：m/z=286(M+H)+。
中間物L84 三氟乙酸N-(14-胺基-3,6,9,12-四氧雜十四碳-1-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0435-2088
將200mg(0.594mmol)第三丁基-(14-胺基-3,6,9,12-四氧雜十四碳-1-基)胺基甲酸酯以及202mg(0.654mmol)1-{6-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮溶解在4.0ml二甲基甲醯胺中，並摻入0.130mL(1.2mmol)N-甲基嗎啉。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。添加0.085ml(1.5mmol)乙酸，並直接藉由製備性RP-HPLC將反應混合物純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水/0.1%TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得275mg(理論之73%)第三丁基-[21-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-16-氧代-3,6,9,12-四氧雜-15-氮雜二十一碳-1-基]胺基甲酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt=0.81min；MS(ESIpos)：m/z=530(M+H)+。
為第三丁基-[21-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-16-氧代-3,6,9,12-四氧雜-15-氮雜二十一碳-1-基]胺基甲酸酯(268mg，505μmol)在5.0ml二氯甲烷中的溶液添加780μl(10mmol)TFA。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。在真空中對反應混合物進行蒸發，將殘餘物置於水中並凍乾。將殘餘物用於後續操作，不對其作進一步純化。獲得266mg(理論之97%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.46min；MS(ESIpos)：m/z=430(M+H)+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=1.17(m,2H),1.47(m,4H),2.03(m,2H),2.99(m,2H),3.18(m,2H),3.38(m,4H),3,52(m,8H),3,58(m,6H),7.01(s,2H),7.73(bs,3H),7.80(m,1H).
中間物L85 三氟乙酸N-(14-胺基-3,6,9,12-四氧雜十四碳-1-基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0436-2089
將200mg(0.594mmol)第三丁基-(14-胺基-3,6,9,12-四氧雜十四碳-1-基)胺基甲酸酯、111mg(0.713mmol)(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸以及410μl(2.4mmol)N,N-二異丙基乙胺溶解在6ml二甲基甲醯胺中，並摻入339mg(0.892mmol)HATU。在室溫下將反應混合物攪拌1小時，並直接藉由製備性RP-HPLC對其進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水/0.1%TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得130mg (理論之43%)第三丁基-[17-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-16-氧代-3,6,9,12-四氧雜-15-氮雜十七碳-1-基]胺基甲酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt=0.71min；MS(ESIpos)：m/z=474(M+H)+。
為第三丁基-[17-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-16-氧代-3,6,9,12-四氧雜-15-氮雜十七碳-1-基]胺基甲酸酯(126mg，267μmol)在4.0ml二氯甲烷中的溶液添加410μl(5.3mmol)TFA。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。在真空中對反應混合物進行蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得124mg(理論之95%)目標化合物。
LC-MS(方法13)：Rt=0.74min；MS(ESIpos)：m/z=374(M+H)+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=2.99(m,2H),3.22(m,2H),3.41(m,2H),3,53(m,8H),3,58(m,6H),4.02(s,2H),7.09(s,2H),7.73(bs,3H),8.21(m,1H).
中間物L86 N-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸
Figure 105119613-A0202-12-0437-2090
將100mg(0.531mmol)L-纈胺醯基-L-丙胺酸以及134mg(0.531mmol)1-{2-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮溶解在3ml二甲基甲醯胺中，並摻入0.150mL(1.1mmol)三乙胺。在室溫下將反應混合物攪拌8小時。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物 進行乾燥。獲得71.5mg(理論之41%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.42min；MS(ESIpos)：m/z=326(M+H)+。
中間物L87 3-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙氧基)乙氧基]丙酸
Figure 105119613-A0202-12-0438-2091
將250mg(1.07mmol)第三丁基-3-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]丙酸酯、151mg(0.974mmol)2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸、224mg(1.46mmol)1-羥基-1H-苯并三唑水合物以及224mg(1.17mmol)1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽溶解在5.0ml二甲基甲醯胺中。在室溫下將反應混合物攪拌1小時。為混合物摻入乙酸乙酯，用5%的檸檬酸溶液及飽和碳酸氫鈉溶液將其萃取兩次。用飽和氯化鈉溶液將有機相洗滌兩次，透過硫酸鎂對其進行乾燥，並在真空中將溶劑蒸發。藉由製備性RP-HPLC對殘餘物進行純化(柱：Reprosil 250x40；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水/0.1%TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得267mg(理論之64%)第三丁基-3-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙氧基)乙氧基]丙酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt=0.73min；MS(ESIpos)：m/z=371(M+H)+。
為第三丁基-3-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙氧基)乙氧基]丙酸酯(263mg,710μmol)在10ml二氯甲烷中的溶液添加1.1ml(14mmol)TFA。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。在真空中對反應混合物進行蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得240mg(理論之94%)目標化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=0.57min；MS(ESIpos)：m/z=315(M+H)+。
中間物L88 2,5-二氧代吡咯啶-1-基-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0439-2092
將150mg(0.797mmol)L-纈胺醯基-L-丙胺酸以及246mg(0.797mmol)1-{6-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮溶解在4.0ml二甲基甲醯胺中，並摻入0.220mL(1.6mmol)三乙胺。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得302mg(理論之97%)N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸。
LC-MS(方法12)：Rt=1.02min；MS(ESIpos)：m/z=382(M+H)+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=0.82(dd,6H),1.17(m,2H),1.27(d,3H),1.48(m,4H),1.94(m,1H),2.13(m,2H),3.38(t, 2H),4.17(m,2H),7.00(s,2H),7.75(d,1H),8.19(d,1H).
將130mg(0.531mmol)N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸溶解在6.5ml二氯甲烷中，並摻入58.8mg(0.511mmol)1-羥基吡咯啶-2,5-二酮以及78.4mg(0.409mmol)1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽。再添加58.8mg(0.511mmol)1-羥基吡咯啶-2,5-二酮以及78.4mg(0.409mmol)1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽。為混合物摻入二氯甲烷，並用水將其洗滌三次。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得172mg(理論之87%)目標化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=1.28min；MS(ESIpos)：m/z=479(M+H)+。
中間物L89 1-苄基-5-[2-(三甲基矽基)乙基]-L-麩胺酸酯鹽酸鹽(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0440-2611
將1.00g(2.96mmol)(4S)-5-(苄氧基)-4-[(第三丁氧基羰基)胺基]-5-氧代戊酸置於13.0ml THF中，並摻入510μl(3.6mmol)2-(三甲基矽基)乙醇以及109mg(889μmol)4-二甲胺基吡啶。將反應混合物冷卻至0℃，並摻入682mg(3.56mmol)N-乙基-N'-3-(二甲胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。在真空中將溶劑蒸發，並將殘餘物溶解在乙酸乙酯中。用0.1N HCl溶液以及飽和氯化鈉溶液將有機相洗滌兩次，透過硫酸鎂對其進行乾燥，並在真空中將溶劑蒸發。藉由Biotage Isolera對殘餘物進行純化(矽膠，柱25g SNAP，環己烷：乙酸乙酯80：20)。獲得649mg(理論之50%)1-苄基-5-[2-(三甲基矽基)乙基]-N-(第三丁氧基羰基)-L-麩胺酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=4.6min；MS(ESIpos)：m/z=438(M+H)+。
將649mg(1.48mmol)1-苄基-5-[2-(三甲基矽基)乙基]-N-(第三丁氧基羰基)-L-麩胺酸酯溶解在7.0ml二噁烷中，並在冰浴冷卻下添加14ml(59mmol)的HCl之4N二噁烷溶液。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。在真空中對反應混合物進行蒸發，在高真空中對殘餘物進行乾燥，並藉由Biotage Isolera將其純化(矽膠，柱25g SNAP，二氯甲烷：甲醇90：10)。獲得320mg(理論之57%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.79min；MS(ESIpos)：m/z=338(M+H)+。
中間物L90 1-({N-[(苄氧基)羰基]甘胺醯基}胺基)-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-酸
Figure 105119613-A0202-12-0441-2094
將118mg(566μmol)N-[(苄氧基)羰基]甘胺酸置於5.0ml DMF中，摻入200mg(622μmol)第三丁基-1-胺基-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-酸酯、130mg(849μmol)1-羥基-1H-苯并三唑水合物以及130mg(679μmol)1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽，並在室溫下攪拌1小時。為混合物摻入乙酸乙酯，用5%的檸檬酸溶液及飽和碳酸氫鈉溶液將其萃取兩次。用飽和氯化鈉溶液將有機相洗滌兩次，並透過硫酸鎂對其進行乾燥。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得274mg(理論之95%)第三丁基-1-({N-[(苄氧基)羰基]甘胺醯基}胺基)-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-酸酯。
LC-MS(方法12)：Rt=1.69min；MS(ESIpos)：m/z=513(M+H)+。
為274mg(535μmol)第三丁基-1-({N-[(苄氧基)羰基]甘胺醯基}胺基)-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-酸酯在5.0ml二氯甲烷中的溶液添加820μl(11mmol)TFA。在室溫下將反應混合物攪拌3小時。在真空中對反應混合物進行蒸發，將殘餘物置於水中並凍乾。獲得262mg(理論之100%)目標化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=1.12min；MS(ESIpos)：m/z=457(M+H)+。
中間物L91 三氟乙酸--2-(三甲基矽基)乙基-1-{[3-胺基-N-(第三丁氧基羰基)-D-丙胺醯基]胺基}-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0442-2095
以市售之3-氧代-1-苯基-2,7,10,13,16-五氧雜-4-氮雜十九烷-19-酸為基礎，按照經典的肽化學方法(用2-三甲基矽基乙醇藉由EDCI/DMAP進行酯化，將Z保護基團氫解脫除，與市售之N-(第三丁氧基羰基)-3-{[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]胺基}-D-丙胺酸偶聯，以及將Fmoc保護基團脫除)製備目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.74min；MS(ESIpos)：m/z=552 (M+H)+。
中間物L92 N-[(苄氧基)羰基]-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0443-2096
按照經典的肽化學方法如下製備目標化合物：在有N,N-二異丙基乙胺的情況下為市售之N-[(苄氧基)羰基]-L-丙胺醯基-L-丙胺酸與第三丁基-L-天冬醯胺酸酯建立HATU偶聯，隨後藉由三氟乙酸將羧基去保護。
LC-MS(方法1)：Rt=0.5min；MS(ESIpos)：m/z=409(M+H)+。
中間物L93 N-乙醯基-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0443-2097
按照經典的肽化學方法如下製備目標化合物：在有N,N-二異丙基乙胺的情況下為市售之N-[(苄氧基)羰基]-L-丙胺醯基-L-丙胺酸與第三丁基-L-天冬醯胺酸酯建立HATU偶聯，隨後藉由10%的鈀-活性炭在DCM-甲醇中氫化以將Z保護基團脫除，隨後在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下藉由乙酸在DMF中進行乙醯化，最後藉由三氟乙酸將羧基去保護。
LC-MS(方法1)：Rt=0.16min；MS(ESIpos)：m/z=317(M+H)+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=1.19(2d,6H),1.82(s,3H),2.5(m,2H),4.26(m,2H),4.48(q,1H),6.9(s,1H),7.36(s,1H),8.0(m,3H),12.54(s,1H).
中間物L94 N-{4-氧代-4-[2-(三甲基矽基)乙氧基]丁醯基}-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0444-2098
首先在有EDCI/DMAP的情況下在DCM中使4-(苄氧基)-4-氧代丁酸與2-(三甲基矽基)乙醇發生反應，隨後將苄基酯氫解，藉此製備4-氧代-4-[2-(三甲基矽基)乙氧基]丁酸。
LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(ESIpos)：m/z=217(M-H)-。
此外，在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下在DMF中將N-(第三丁氧基羰基)-L-丙胺醯基-L-丙胺酸與4-硝基苄基-L-天冬醯胺酸酯氫溴化物(1：1)偶聯，隨後在DCM中藉由三氟乙酸將胺基去保護，藉此製備三氟乙酸--4-硝基苄基-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-L-天冬醯胺酸酯(1：1)。
LC-MS(方法1)：Rt=0.43min；MS(ESIpos)：m/z=410(M+H)+。
隨後在DMF中在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下將上述兩個中間物偶聯，隨後藉由10%的鈀-活性炭在DCM-甲醇1：9中氫化以將 對硝基-苄基酯脫除，藉此製備目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.79min；MS(ESIpos)：m/z=475(M+H)+。
中間物L95 N-[(苄氧基)羰基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸
Figure 105119613-A0202-12-0445-2099
以N-[(苄氧基)羰基]-L-纈胺酸以及第三丁基-L-丙胺酸酯鹽酸鹽(1：1)為基礎，用經典的肽化學方法製備此中間物。
LC-MS(方法12)：Rt=1.34min；MS(ESIpos)：m/z=323.16(M+H)+。
中間物L96 N-乙醯基-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0445-2100
按照經典的肽化學方法如下製備此中間物：首先將2,5-二氧代吡咯啶-1-基-N-[(苄氧基)羰基]-L-纈胺酸酯與N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸偶聯，隨後藉由10%的鈀-活性炭在乙醇中將Z保護基團氫解脫除，最後使獲得之二肽與1-乙醯氧基吡咯啶-2,5-二酮反應。
LC-MS(方法1)：Rt=0.25min；MS(ESIpos)：m/z=317(M+H)+。
中間物L97 1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧雜-3-氮雜三十烷-30-酸
Figure 105119613-A0202-12-0446-2101
將第三丁基-1-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜二十七烷-27-酸酯(100mg，201μmol)置於1.0ml DMF中，並摻入(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸(46.8mg，301μmol)、1-羥基-1H-苯并三唑水合物(76.9mg，502μmol)以及1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(77.0mg，402μmol)。在室溫下將反應混合物攪拌一夜，隨後摻入乙酸乙酯。用5%的檸檬酸溶液、飽和碳酸氫鈉溶液將有機相洗滌兩次，隨後用飽和氯化鈉溶液進行洗滌。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥。在真空中將溶劑蒸發，並藉由製備性RP-HPLC對殘餘物進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水/0.1%TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得19.1mg(理論之13%)第三丁基-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2-氧雜-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧雜-3-氮雜三十烷-30-酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt=0.87min；MS(ESIpos)：m/z=635[M+H]+
為第三丁基-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧雜-3-氮雜三十烷-30-酸酯(19.1mg，30.1μmol)在1.0ml DCM中的溶液添加TFA(62μl，600μmol)。在室溫下將反應混合物攪拌3小時。在真空中對反應混合物進行蒸發，將殘餘 物置於水中並凍乾。將殘餘物用於後續操作，不對其作進一步純化。獲得10.8mg(理論之46%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.55min；MS(ESIneg)：m/z=577[M-H]-。
中間物L98 2,2-二甲基丙酸--2-(三甲基矽基)乙基-N-(2-胺基乙基)-N2-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-麩醯胺酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0447-2102
首先在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下將(4S)-5-第三丁氧基-4-[(第三丁氧基羰基)胺基]-5-氧代戊酸與苄基-(2-胺基乙基)胺基甲酸酯偶聯。隨後在DCM中藉由三氟乙酸將Boc保護基團及第三丁基酯脫除。隨後，先在DMF/水中在有N,N-二異丙基乙胺的情況下與1-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮反應來保護胺基，再在DCM中在有EDCI/DMAP的情況下與2-(三甲基矽基)乙醇反應來保護羧基。在最後一步中，在正常壓力下在乙醇中藉由10%的鈀-活性炭進行氫解，以將末端胺基去保護。在將催化劑濾出、濃縮、藉由製備性HPLC純化以及將殘餘物自乙腈/水凍乾後，獲得目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.82min；MS(ESIpos)：m/z=434(M+H)+。
中間物L99 三氟乙酸--2-(三甲基矽基)乙基-N-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-beta-丙胺醯基-L-離胺酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0448-2103
首先以N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸為基礎，按照經典的肽化學方法製備2-(三甲基矽基)乙基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸酯。隨後在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下，將此中間物與按標準方法製備的三肽N-[(苄氧基)羰基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-beta-丙胺酸偶聯。隨後透過甲醇中之氫化將Z保護基團脫除，並在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下將獲得之中間物與(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸偶聯。在最後一步中，在溫和條件下，藉由在室溫下在10%的三氟乙酸的DCM溶液中攪拌1小時對側鏈胺基進行去保護。在濃縮以及自乙腈/水凍乾後，獲得目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.64min；MS(ESIpos)：m/z=625(M+H)+。
中間物L100 3-[5-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)-1,2,4-噁二唑-3-基]丙酸
Figure 105119613-A0202-12-0448-2104
為甲基-3-氰基丙酸酯(4g，35.4mmol)在120ml乙醇中的溶液添加3.69g(53mmol)羥胺鹽酸鹽以及15ml(110mmol)三乙胺。在50℃下將反應混合物攪拌3小時。將混合物濃縮並將殘餘物溶解在乙酸乙 酯中，隨後用水及鹽水對其進行洗滌。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，並將其濃縮。使用殘餘物，不對其作進一步純化。獲得5g(理論之97%)甲基-(4Z)-4-胺基-4-(羥亞胺基)丁酸酯。
為甲基-(4Z)-4-胺基-4-(羥亞胺基)丁酸酯(4.85g，33.19mmol)在120.0ml二噁烷中的溶液添加6.91g(36.50mmol)N-(第三丁氧基羰基)-beta-丙胺酸以及8.22g(39.82mmol)1,3-二環己基碳化二亞胺。在室溫下將反應混合物攪拌3小時。將混合物濃縮，將殘餘物溶解在水中，並用乙酸乙酯進行萃取。透過硫酸鈉對有機相進行乾燥，並將其濃縮。藉由急驟層析處理殘餘物。獲得6.0g(理論之57%)甲基-(4E)-4-{[N-(第三丁氧基羰基)-beta-丙胺醯基]胺基}-4-(羥亞胺基)丁酸酯。
在120℃下將甲基-(4E)-4-{[N-(第三丁氧基羰基)-beta-丙胺醯基]胺基}-4-(羥亞胺基)丁酸酯(6.0g，18.9mmol)在100ml DMF中的溶液攪拌5小時。為混合物摻入水，並用乙酸乙酯對其進行萃取。透過硫酸鈉對有機相進行乾燥，並將其濃縮。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。獲得4g(理論之71%)甲基-3-(5-{2-[(第三丁氧基羰基)胺基]乙基}-1,2,4-噁二唑-3-基)丙酸酯。
為甲基-(4E)-4-{[N-(第三丁氧基羰基)-beta-丙胺醯基]胺基}-4-(羥亞胺基)丁酸酯(4.00g，13.4mmol)在60ml THF中的溶液添加LiOH(1.60g，66.8mmol)在10ml水中的溶液。在60℃下將反應混合物攪拌一夜。為混合物摻入水，並用乙酸乙酯對其進行萃取。透過硫酸鈉對有機相進行乾燥，並將其濃縮。使用殘餘物，不對其作進一步純化。獲得3.60g(理論之87%)3-(5-{2-[(第三丁氧基羰基)胺基]乙基}-1,2,4-噁二唑-3-基)丙酸。
為3-(5-{2-[(第三丁氧基羰基)胺基]乙基}-1,2,4-噁二唑-3-基)丙酸(2.0g，7.01mmol)在30ml二氯甲烷中的溶液添加2.0ml(26mmol)三氟乙酸。在室溫下將反應混合物攪拌1小時。為混合物摻入水，並用 二氯甲烷對其進行萃取。透過硫酸鈉對有機相進行乾燥，並將其濃縮。使用殘餘物，不對其作進一步純化。獲得1.50g(理論之72%)3-[5-(2-胺基乙基)-1,2,4-噁二唑-3-基]丙酸-三氟乙酸(1：1)。
為3-[5-(2-胺基乙基)-1,2,4-噁二唑-3-基]丙酸(1.5g，5.01mmol)在25ml DMF中的溶液添加1.30g(5.52mmol)1-[2-(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)-2-氧代乙基]-1H-吡咯-2,5-二酮以及1.52g(15.04mmol)三乙胺。在室溫下將反應混合物攪拌1小時。為混合物摻入水，並用二氯甲烷對其進行萃取。透過硫酸鈉對有機相進行乾燥，並將其濃縮。藉由製備性HPLC將殘餘物純化。獲得774mg(理論之47%)目標化合物。
1H-NMR(300MHZ,DMSO-d6)：δ[ppm]=2.67(t,2H),2.91(t,2H),3.03(t,2H),3.46(q,2H),4.28(s,2H),7.01(s,2H),8.37(t,1H),12.28(bs,1H).
中間物L101 第三丁基-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-L-天冬醯胺酸酯
Figure 105119613-A0202-12-0450-2105
按照經典的肽化學方法如下製備目標化合物：在有N,N-二異丙基乙胺的情況下為市售之N-[(苄氧基)羰基]-L-丙胺醯基-L-丙胺酸與第三丁基-L-天冬醯胺酸酯鹽酸鹽建立HATU偶聯，隨後藉由10%的鈀-活性炭在甲醇中將Z保護基團氫解。
LC-MS(方法7)：Rt=0.23min；MS(ESIneg)：m/z=329(M-H)-。
中間物L102 N-(38-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧雜三十八烷-38-基）-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0451-2106
將215mg2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧雜三十八烷-38-酸(365μmol)以及133mg中間物L101(402μmol)置於1.4ml DMF中，摻入146mg HATU(384μmol)以及160μl N,N-二異丙基乙胺(910μmol)，並在室溫下攪拌3小時。添加水(1.5mL)及ACN(0.5mL)。藉由製備性HPLC將反應溶液純化(溶離劑：ACN/水+0.1% TFA，梯度=1：9→3：2)，隨後在2mL DCM中藉由2mL TFA將第三丁氧基羰基保護基團脫除(在室溫下攪拌3小時)。
LC-MS(方法1)：Rt=0.56min；MS(ESIneg)：m/z=844.5(M+H)+。
中間物L103 N-(吡啶-4-基乙醯基)-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-L-天冬醯胺三氟乙酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0451-2107
按照經典的肽化學方法如下製備目標化合物：首先在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下將4-吡啶乙酸與市售之第三丁基-L-丙胺醯基-L-丙胺酸酯偶聯，隨後藉由三氟乙酸去保護，與第三丁基-L-天 冬醯胺酸酯偶聯，隨後藉由三氟乙酸將羧基去保護。
LC-MS(方法1)：Rt=0.15min；MS(ESIpos)：m/z=394(M+H)+。
中間物L104 N-異菸鹼醯基-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-L-天冬醯胺三氟乙酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0452-2108
以與中間物L103類似的方式製備目標化合物，其中先將異菸酸與市售之第三丁基-L-丙胺醯基-L-丙胺酸酯偶聯。
LC-MS(方法1)：Rt=0.17min；MS(ESIpos)：m/z=380(M+H)+。
中間物L105 第三丁基N-{[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙醯基}-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-L-天冬醯胺酸酯三氟乙酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0452-2109
以與中間物L103類似的方式製備目標化合物，其中先將[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酸與市售之第三丁基-L-丙胺醯基-L-丙胺酸酯偶聯。
LC-MS(方法1)：Rt=0.17min；MS(ESIpos)：m/z=380(M+H)+。
中間物L106 N-[(苄氧基)羰基]-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0453-2110
按照經典的肽化學方法，在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下，將市售之N-[(苄氧基)羰基]-L-丙胺醯基-L-丙胺酸酯與1-第三丁基4-[2-(三甲基矽基)乙基]L-天冬胺酸酯偶聯，藉此製備目標化合物。用(3S)-4-第三丁氧基-3-[(第三丁氧基羰基)胺基]-4-氧代丁酸如下製備此胺基酸區塊：在有EDCI及DMAP的情況下藉由2-(三甲基矽基)乙醇進行酯化，隨後藉由5%的三氟乙酸在DCM中將第三丁氧基羰基保護基團溫和地脫除。隨後將745mg(1.317mmol)經完全保護的中間物溶解在43.5ml DCM中，並藉由添加3.5ml三氟乙酸以及在室溫下攪拌5小時，溫和地將第三丁基酯脫除。在藉由製備性HPLC純化後，自產生之產物混合物分離出168mg(理論之25%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.95min；MS(ESIpos)：m/z=510(M+H)+。
中間物L107 N-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0453-2111
按照經典的肽化學方法如下製備目標化合物：在有N,N-二異丙 基乙胺的情況下為市售之N-[(苄氧基)羰基]-L-丙胺醯基-L-丙胺酸與第三丁基-L-天冬醯胺酸酯建立HATU偶聯，隨後藉由10%的鈀-活性炭在甲醇中氫化以將Z保護基團脫除，隨後在有N,N-二異丙基乙胺的情況下藉由1-{2-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮在DMF中進行醯化，最後藉由三氟乙酸將羧基去保護。
LC-MS(方法1)：Rt=0.35min；MS(ESIpos)：m/z=412(M+H)+。
中間物L108 N2-乙醯基-N-(2-胺基乙基)-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0454-2112
按照經典的肽化學方法如下製備目標化合物：在有N,N-二異丙基乙胺的情況下為市售之N2-乙醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸與苄基(2-胺基乙基)胺基甲酸酯鹽酸鹽(1：1)建立HATU偶聯，隨後藉由10%的鈀-活性炭在DCM/甲醇1：1中氫化以將Z保護基團脫除。
LC-MS(方法1)：Rt=0.43min；MS(ESIpos)：m/z=331(M+H)+。
中間物L109 N2-乙醯基-N6-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-離胺酸
Figure 105119613-A0202-12-0454-2113
透過在DMF/水1：1中在有N,N-二異丙基乙胺的情況下使市售之N2-乙醯基-L-離胺酸與1-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶- 2,5-二酮發生反應，獲得此中間物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.87min；MS(ESIpos)：m/z=333(M+H)+。
中間物L110 N2-乙醯基-N6-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-離胺醯基-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0455-2114
如下合成目標化合物：首先在DMF中在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下將N-[(苄氧基)羰基]-L-丙胺醯基-L-丙胺酸與第三丁基L-天冬醯胺酸酯偶聯，隨後在正常壓力下藉由10%的鈀-活性炭在甲醇中氫化以將Z保護基團脫除。隨後在DMF中在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下，將此經去保護之中間物與中間物L109偶聯。隨後藉由在7.5%的三氟乙酸的DCM溶液中攪拌1小時實現完全去保護。在最後一步中，在DMF/水1：1中在有N,N-二異丙基乙胺的情況下與1-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮，從而重新對自由胺基進行保護，藉此製備目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.71min；MS(ESIpos)：m/z=589(M+H)+。
中間物L111 N-(吡啶-4-基乙醯基)-L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺醯基-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0456-2115
按照經典的肽化學方法如下合成目標化合物：首先在有N,N-二異丙基乙胺的情況下為N-[(苄氧基)羰基]-L-丙胺酸與第三丁基-N-甲基-L-丙胺酸酯鹽酸鹽(1：1)建立HATU偶聯，隨後在DCM中藉由三氟乙酸將羧基去保護。隨後在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下與第三丁基-L-天冬醯胺酸酯偶聯，隨後在室溫下在DCM/甲醇1：1中藉由10%的鈀-活性炭在氫正常壓力下將Z保護基團氫解脫除。最後透過在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下與4-吡啶乙酸偶聯，以及在DCM中藉由三氟乙酸將羧基去保護，將獲得之中間物轉化成目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.16min；MS(ESIpos)：m/z=408(M+H)+。
中間物L112 N-(吡啶-4-基乙醯基)-L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺醯基-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0456-2116
按照經典的肽化學方法如下合成目標化合物：首先在有N,N-二異丙基乙胺的情況下為N-[(苄氧基)羰基]-L-丙胺酸與第三丁基-N-甲基-L-丙胺酸酯鹽酸鹽(1：1)建立HATU偶聯，隨後在DCM中藉由三氟乙酸將羧基去保護。隨後在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下與第 三丁基-L-天冬醯胺酸酯偶聯，隨後在室溫下在DCM/甲醇1：1中藉由10%的鈀-活性炭在氫正常壓力下將Z保護基團氫解脫除。最後透過在有N,N-二異丙基乙胺的情況下與1-乙醯氧基吡咯啶-2,5-二酮偶聯，以及在DCM中藉由三氟乙酸將羧基去保護，將獲得之中間物轉化成目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.16min；MS(ESIpos)：m/z=331(M+H)+。
中間物L113 N-甲基-N-(吡啶-4-基乙醯基)-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-L-天冬醯胺-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0457-2117
按照經典的肽化學方法如下合成目標化合物：首先在有N,N-二異丙基乙胺的情況下為吡啶-4-基乙酸與第三丁基-N-甲基-L-丙胺酸酯鹽酸鹽(1：1)建立HATU偶聯，隨後在DCM中藉由三氟乙酸將羧基去保護。隨後在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下與第三丁基-L-丙胺酸酯偶聯，並在DCM中藉由三氟乙酸重新將羧基去保護。隨後在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下與第三丁基-L-天冬醯胺酸酯偶聯，最後在DCM中藉由三氟乙酸將羧基去保護。在HPLC純化後獲得目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.16min；MS(ESIpos)：m/z=408(M+H)+。
中間物L114 N-{[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙醯基}-L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺醯基-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0458-2118
按照經典的肽化學方法如下合成目標化合物：首先在有N,N-二異丙基乙胺的情況下為N-[(苄氧基)羰基]-L-丙胺酸與第三丁基-N-甲基-L-丙胺酸酯鹽酸鹽(1：1)建立HATU偶聯，隨後在DCM中藉由三氟乙酸將羧基去保護。隨後在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下與第三丁基-L-天冬醯胺酸酯偶聯，隨後在室溫下在DCM/甲醇1：1中藉由10%的鈀-活性炭在氫正常壓力下將Z保護基團氫解脫除。最後透過在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下與[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酸偶聯，以及在DCM中藉由三氟乙酸將羧基去保護，將獲得之中間物轉化成目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.36min；MS(ESIpos)：m/z=449(M+H)+。
中間物L115 三氟乙酸二苄基-beta-丙胺醯基-L-麩胺酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0459-2119
以市售之4-甲基苯磺酸-二苄基-L-麩胺酸酯(1：1)為基礎，按照經典的肽化學方法，在有HATU的情況下與N-(第三丁氧基羰基)-beta-丙胺酸偶聯，隨後藉由TFA將Boc保護基團脫除，藉此製備目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.72min；MS(ESIpos)：m/z=399[M+H]+
中間物F2 三氟乙酸(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]丁醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0459-2120
將55mg(0.089mmol)(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁酸(中間物C5)置於12mL DMF中，並依次摻入68mg(0.268 mmol)市售之三氟乙酸--1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)、34.3mg(0.18mmol)1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽、27.4mg(0.18mmol)1-羥基-1H-苯并三唑-水合物、以及47μl(0.27mmol)N,N-二異丙基乙胺。在室溫下將混合物攪拌一夜。在真空中將溶劑移除，並藉由製備性HPLC將殘留之殘餘物純化。將相應的溶離份濃縮，在自1,4-二噁烷凍乾後獲得20mg(理論之30%)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=2.48min；LC-MS(方法1)：Rt=1.29min；MS(ESIpos)：m/z=737(M+H)+。
將20mg(0.027mmol)此中間物置於5mL二氯甲烷中，摻入1mL三氟乙酸，並在室溫下攪拌1小時。隨後在真空中將反應混合物濃縮，並將殘留之殘餘物自乙腈/水1：1凍乾。如此獲得19mg(理論之95%)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=2.0min；LC-MS(方法1)：Rt=0.9min；MS(ESIpos)：m/z=637(M+H)+。
1H-NMR(500MHZ,DMSO-d6)：δ=8.28(t,1H),7.9-8.1(m,3H),7.7-7.8(m,2H),7.2-7.4(m,6H)7.0-7.1(m,3H),5.7(s,1H),5.0及5.3(2d,2H),4.08及4.25(2d,2H),3.3-3.65(m,5H),3.1-3.25(m,2H),0.75及1.45(2m,2H),0.9(s,9H).
中間物F3 三氟乙酸--N-[(3S)-3-胺基-4-{2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]肼基}-4-氧代丁基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0461-2121
將13mg(0.021mmol)(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁酸(中間物C5)置於5mL DMF中，隨後摻入33mg(86μmol)O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸酯、15μL N,N-二異丙基乙胺以及22mg(64μmol)市售之6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己烷醯肼。在室溫下將反應混合物攪拌1小時。隨後在高真空中進行濃縮，並藉由製備性HPLC將殘留之殘餘物純化。如此獲得9.5mg(理論之53%)形式為無色泡沫的受保護的中間物。
HPLC(方法11)：Rt=2.1min；LC-MS(方法1)：Rt=1.33min；MS(ESIpos)：m/z=822(M+H)+。
將9.5mg(0.011mmol)此中間物置於3mL二氯甲烷中，摻入1mL三氟乙酸，並在室溫下攪拌2小時。隨後在真空中將反應混合物濃縮，並將殘留之殘餘物自乙腈/水1：1凍乾。如此獲得7mg(理論之70%)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.75min；LC-MS(方法1)：Rt=0.91min；MS(ESIpos)：m/z=722(M+H)+。
中間物F4 三氟乙酸--(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-(6-{[(2R)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯基]胺基}己基)丁醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0462-2122
首先以與中間物F3類似的方式，在有HATU的情況下將30mg(0.049mmol)(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁酸(中間物C5)與三氟乙酸--9H-茀-9-基甲基-(6-胺基己基)胺基甲酸酯(1：1)偶聯。隨後按照標準方法用哌啶將Fmoc保護基團脫除。隨後在有N,N-二異丙基乙胺的情況下，將此胺組分與藉由亞硫醯氯用自由酸製備的(2R)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯氯偶聯。在最後一步中，在DCM中藉由三氟乙酸將Boc保護基團脫除。獲得1.1mg(3%，歷經4個階段)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.83min；LC-MS(方法1)：Rt=0.96min；MS(ESIpos)：m/z=764(M+H)+。
中間物F5 三氟乙酸--(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(丙醯基)胺基]-N-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫- 1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙基}丁醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0463-2123
以與中間物F2類似的方式，用16mg(0.026mmol)中間物C5與8.5mg(0.03mmol)中間物L12製備目標化合物。獲得3mg(理論之13%，歷經2個階段)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=2.0min；LC-MS(方法1)：Rt=0.96min；MS(ESIpos)：m/z=681(M+H)+。
中間物F6 三氟乙酸--N-[(16S)-16-胺基-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-12,15-二氧代-3,6,9-三氧雜-13,14-二氮雜十八烷-18-基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0463-2124
將8mg(12.7μmol)三氟乙酸--第三丁基-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-肼基-1-氧代丁烷-2-基}胺基甲酸酯(1：1)(中間物C6)置於8mL DMF中，並摻入市售之3-(2-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸、5.8mg(15μmol)O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸酯(HATU)以及7μl(38μmol)N,N-二異丙基乙胺。在室溫下將混合物攪拌15分鐘。隨後在真空中將溶劑移除，將殘餘物置於乙腈/水1：1中，並藉由三氟乙酸調整至pH 2。藉由製備性HPLC進行純化。在將相應的溶離份合併、濃縮以及自乙腈/水1：1凍乾後，獲得5mg(理論之41%)經Boc保護的中間物。在藉由三氟乙酸將Boc基團脫除後，獲得4mg(理論之32%，歷經2個階段)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.89min；LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(ESIpos)：m/z=812(M+H)+。
中間物F7 三氟乙酸--(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)丁醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0465-2125
以與中間物F2類似的方式，用25mg(0.037mmol)中間物C5與35mg(0.112mmol)中間物L1製備目標化合物。獲得14.4mg(理論之29%，歷經2個階段)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=2.0min；LC-MS(方法1)：Rt=0.9min；MS(ESIpos)：m/z=694(M+H)+。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)：δ=8.2(m,1H),7.9-8.1(m,3H),7.7-7.8(m,2H),7.2-7.4(m,6H),7.0-7.12(m,3H),5.7(s,1H),4.95及5.3(2d,2H),4.1及4.25(2d,2H),4.0(s,2H),3.3-3.65(m,5H),3.0-3.15(m,2H),0.7及1.45(2m,2H),0.88(s,9H).
中間物F8 N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-L-離胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0466-2126
以與中間物F2類似的方式，用10mg(0.016mmol)中間物C5與13mg(0.018mmol)中間物L6製備目標化合物。獲得10mg(理論之49%，歷經2個階段)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.97min；LC-MS(方法1)：Rt=0.93min；MS(ESIpos)：m/z=1006(M+H)+。
中間物F9 三氟乙酸--N-{(3S)-3-胺基-4-[1-(2-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-2-氧代乙基)肼基]-4-氧代丁基}-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0466-2127
以與中間物F2類似的方式，用1.5mg(0.002mmol)中間物C7以及0.95mg(0.004mmol)市售之三氟乙酸--1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5- 二酮(1：1)製備目標化合物。獲得1.1mg(理論之52%，歷經2個階段)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.9min；LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(ESIpos)：m/z=709(M+H)+。
中間物F10 三氟乙酸--(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-(3-{[4-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)苯基]胺基}-3-氧代丙基)丁醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0467-2128
以與中間物F2類似的方式，用14mg(0.022mmol)中間物C5與10mg(0.025mmol)中間物L5製備目標化合物。獲得4.5mg(理論之22%，歷經2個階段)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=2.0min；LC-MS(方法1)：Rt=0.93min；MS(ESIpos)：m/z=756(M+H)+。
中間物F11 三氟乙酸--N-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-4-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)環己烷羧醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0468-2129
以與中間物F2類似的方式，用12mg(0.019mmol)中間物C5與10mg(0.021mmol)中間物L4製備目標化合物。獲得7mg(理論之38%，歷經2個階段)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=2.04min；LC-MS(方法1)：Rt=0.93min；MS(ESIpos)：m/z=776(M+H)+。
中間物F12 三氟乙酸--(1R,2S)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊烷羧醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0468-2130
以與中間物F2類似的方式，用43mg(0.071mmol)中間物C5與30mg(0.071mmol)中間物L2製備目標化合物。在經Boc保護之中間體 上，藉由製備性HPLC(Chromatorex C18-10/125x30/12mL/min)將產生的非對映異構體彼此分離。透過與用市售之(1S,2R)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]環戊烷羧酸以類似方式製備之單非對映異構體進行比較，便能指定經分離之非對映異構體的立體化學結構：
溶離份1：1S2R非對映異構體
Figure 105119613-A0202-12-0469-2131
產量：13mg(22%)
HPLC(方法11)：Rt=2.52min；LC-MS(方法1)：Rt=1.31min；MS(ESIpos)：m/z=848(M+H)+。
溶離份2：1R2S非對映異構體
Figure 105119613-A0202-12-0470-2132
產量：10mg(17%)
HPLC(方法11)：Rt=2.56min；LC-MS(方法1)：Rt=1.33min；MS(ESIpos)：m/z=848(M+H)+。
藉由TFA對10mg(0.011mmol)的1R2S非對映異構體進行去保護，進而獲得8mg(理論之75%)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=2.04min；LC-MS(方法1)：Rt=0.92min；MS(ESIpos)：m/z=748(M+H)+。
中間物F13 三氟乙酸--(1S,2R)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊烷羧醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0471-2133
以與中間物F13類似的方式進行合成，並透過將1S2R非對映異構體去保護獲得目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=2.1min；LC-MS(方法1)：Rt=0.94min；MS(ESIpos)：m/z=748(M+H)+。
中間物F14 三氟乙酸--N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-beta-丙胺醯基-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鳥胺醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0471-2134
在有HATU的情況下將20mg(0.028mmol)中間物C5與18mg(0.028mmol)中間物L7偶聯，隨後藉由TFA進行去阻斷，藉此製備目標化合物。獲得15mg(理論之49%，歷經2個階段)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.97min；LC-MS(方法1)：Rt=0.91min；MS(ESIpos)：m/z=1012(M+H)+。
中間物F15 三氟乙酸--N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-beta-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N5-胺甲醯基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鳥胺醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0472-2135
在有HATU的情況下將15mg(0.022mmol)中間物C8與14mg(0.026mmol)中間物L8偶聯，隨後藉由TFA進行去阻斷，藉此製備此中間物。獲得7mg(理論之27%，歷經2個階段)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.85min；LC-MS(方法1)：Rt=0.87min；MS(ESIpos)：m/z=984(M+H)+。
中間物F16 三氟乙酸--N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-beta-丙胺醯基-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-N-[4-(2-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-2-氧代乙基)苯基]-L-鳥胺醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0473-2136
首先以與中間物F3類似的方式，在有HATU的情況下將20mg(0.03mmol)中間物C3與三氟乙酸--beta-丙胺醯基-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-N-[4-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基]-L-鳥胺醯胺(1：1)偶聯(產量：15mg，理論之44%)。
將26mg(0.023mmol)此中間體N-{(2S)-4-[(乙醯氧基乙醯基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁醯基}-beta-丙胺醯基-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-N-[4-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基]-L-鳥胺醯胺溶解在5mL甲醇中，摻入1mL的2M氫氧化鋰溶液，並在室溫下將混合物攪拌90分鐘。隨後在真空中將溶劑移除，將殘餘物置於乙腈/水中，並藉由TFA將混合物調整至pH 2。隨後再進行濃縮，在藉由製備性HPLC將殘餘物純化後，獲得20mg(81%)羰基化合物。
隨後將此中間體置於5mL DMF中，並在有8.4mg(0.022mmol)HATU及16μl N,N-二異丙基乙胺的情況下，使其與6mg(0.022mmol)市售之三氟乙酸--1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)偶聯。在藉由 製備性HPLC純化後，獲得17mg(理論之76%)受保護的中間體。將此中間體置於3mL DCM中，並摻入1mL TFA。在室溫下攪拌45分鐘後進行濃縮，並藉由二乙醚對殘餘物進行浸提。在高真空中將殘餘物吸出及乾燥後，殘餘15mg(81%)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.9min；LC-MS(方法1)：Rt=0.9min；MS(ESIpos)：m/z=1097(M+H)+。
中間物F17 N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6-{[(1R,2S)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)環戊基]羰基}-L-離胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0474-2137
以與中間物F12類似的方式，用6mg(0.01mmol)中間物C5與8mg(0.01mmol)中間物L10製備目標化合物。在經Boc保護之中間體上，藉由製備性HPLC(Chromatorex C18-10/125x30/12mL/min)將產 生的非對映異構體彼此分離。透過與用市售之(1S,2R)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]環戊烷羧酸以類似方式製備之單非對映異構體進行比較，便能指定經分離之非對映異構體的立體化學結構：
溶離份1：1S2R非對映異構體
Figure 105119613-A0202-12-0475-2138
產量：1mg
HPLC(方法11)：Rt=2.73min；LC-MS(方法1)：Rt=1.37min；MS(ESIpos)：m/z=1274(M+H)+。
溶離份2：1R2S非對映異構體
Figure 105119613-A0202-12-0476-2139
產量：0.7mg
HPLC(方法11)：Rt=2.81min；LC-MS(方法1)：Rt=1.41min；MS(ESIpos)：m/z=1274(M+H)+。
透過溶解在1mL DCM中、添加1mL TFA以及在室溫下攪拌1小時，實現對0.7mg(0.001mmol)1R2S非對映異構體的完全去保護。在真空中濃縮以及將殘餘物自乙腈/水凍乾後，獲得0.68mg(理論之94%)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=2.1min；LC-MS(方法1)：Rt=0.97min；MS(ESIpos)：m/z=1117(M+H)+。
中間物F18 N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6-{[(1S,2R)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基) 環戊基]羰基}-L-離胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0477-2140
以與中間物F17類似的方式，用8.9mg(0.014mmol)中間物C5與13mg(0.014mmol)中間物L11製備目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=2.2min；LC-MS(方法1)：Rt=1.01min；MS(ESIpos)：m/z=1117(M+H)+。
中間物F19 N6-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-N2-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-離胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0478-2141
以與中間物F2類似的方式，將25mg(0.041mmol)中間物C5與55mg(0.122mmol)中間物L13偶聯，隨後進行去保護，藉此製備目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.84min；LC-MS(方法1)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m/z=780(M+H)+。
中間物F20 三氟乙酸--(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-{4-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]哌嗪-1-基}丁醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0478-2142
以與中間物F2類似的方式，將10mg(0.015mmol)中間物C5與55mg(0.122mmol)中間物L14偶聯，隨後進行去保護，藉此製備目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.9min；LC-MS(方法1)：Rt=0.87min；MS(ESIpos)：m/z=735 (M+H)+。
中間物F21 三氟乙酸--(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-12-氧代-3,6,9-三氧雜-13-氮雜十五烷-15-基]丁醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0479-2143
以與中間物F2類似的方式，將10mg(0.015mmol)中間物C5與7mg(0.015mmol)中間物L15偶聯，隨後進行去保護，藉此製備目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(ESIpos)：m/z=840(M+H)+。
中間物F22 三氟乙酸--N-[(3S)-3-胺基-4-(1-{2-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)胺基]-2-氧代乙基}肼基)-4-氧代丁基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0480-2144
以與中間物F9類似的方式，將13.7mg(0.017mmol)中間物C7與5.9mg(0.017mmol)中間物L1偶聯，隨後進行去保護，藉此製備目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=2.3min；LC-MS(方法1)：Rt=1.2min；MS(ESIpos)：m/z=866(M+H)+。
中間物F23 N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯基-N6-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-L-離胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0480-2145
以與中間物F2類似的方式，在有EDC/HOBT以及N,N-二異丙基乙胺的情況下將10mg(0.016mmol)中間物C5與16.8mg(0.016mmol)中間物L17偶聯，隨後進行去保護，藉此製備目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.9min； LC-MS(方法1)：Rt=0.9min；MS(ESIpos)：m/z=1092(M+H)+。
中間物F24 三氟乙酸--N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-beta-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N5-胺甲醯基-N-[4-(2-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-2-氧代乙基)苯基]-L-鳥胺醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0481-2146
以與中間物F16類似的方式製備目標化合物。
首先以與中間物F3類似的方式，在有HATU的情況下將30mg(0.046mmol)中間物C3與中間物L18偶聯(產量：25mg，理論之47%)。
將27mg(0.024mmol)此中間體溶解在5mL甲醇中，摻入1mL 2M氫氧化鋰溶液，並在室溫下將混合物攪拌30分鐘，其中將甲酯以及乙醯基分解。隨後在真空中將溶劑移除，將殘餘物置於乙腈/水中，並藉由TFA將混合物調整至pH 2。隨後再進行濃縮，在藉由製備性HPLC將殘餘物純化後，獲得15mg(58%)羰基化合物。
隨後將此中間體置於3mL DMF中，並在有6.5mg(0.017mmol)HATU及12μl N,N-二異丙基乙胺的情況下，使其與4.4mg(0.017mmol)市售之三氟乙酸--1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)偶聯。在藉由製備性HPLC純化後，獲得12mg(理論之72%)受保護的中間 體。將此中間體置於2mL DCM中，並摻入1mL TFA。在室溫下攪拌30分鐘後進行濃縮，並自乙腈/水1：1凍乾。在高真空中對殘餘物進行乾燥後，殘餘11mg(91%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.83min；MS(ESIpos)：m/z=1069(M+H)+。
中間物F25 三氟乙酸--N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-beta-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N5-胺甲醯基-N-(4-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}苯基)-L-鳥胺醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0482-2147
在有6.4mg(0.017mmol)HATU及72μl N,N-二異丙基乙胺的情況下將9.6mg(0.014mmol)中間物C8與10.8mg(0.015mmol)中間物L19偶聯，隨後藉由TFA進行去阻斷，藉此製備此中間物。獲得5mg(理論之31%，歷經2個階段)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.8min；LC-MS(方法1)：Rt=0.85min；MS(ESIpos)：m/z=1041(M+H)+。
中間物F26 三氟乙酸--N-{(15S,19R)-15-胺基-19-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪 唑-2-基]-18-乙二醇醯基-20,20-二甲基-14-氧代-4,7,10-三氧雜-13,18-二氮雜二十一烷-1-醯基}-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鳥胺醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0483-2148
在有8mg(0.04mmol)1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺-鹽酸鹽、6mg(0.04mmol)1-羥基-1H-苯并三唑-水合物以及11μl(0.06mmol)N,N-二異丙基乙胺的情況下將16.4mg(0.02mmol)中間物C9與11.2mg(0.02mmol)中間物L20偶聯，隨後藉由TFA進行去阻斷，藉此製備此中間物。獲得10mg(理論之37%，歷經2個階段)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=2.0min；LC-MS(方法1)：Rt=0.91min；MS(ESIpos)：m/z=1144(M+H)+。
中間物F27 三氟乙酸--N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-beta-丙胺醯基-L-纈胺醯基-N-[4-(2-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-2-氧代乙基)苯基]-L-離胺醯胺(2：1)
Figure 105119613-A0202-12-0484-2149
分4個階段製備此中間物：在第一步中，在有11mg(0.057mmol)1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺-鹽酸鹽、8.7mg(0.057mmol)1-羥基-1H-苯并三唑-水合物以及15μl(0.085mmol)N,N-二異丙基乙胺的情況下，在5mL DMF中將20mg(0.028mmol)中間物C8與16.7mg(0.031mmol)中間物L21偶聯。在室溫下攪拌4日後，將混合物濃縮，並藉由製備性HPLC對產物進行純化。產量：18mg(理論之54.5%)
將18mg(0.016mmol)此中間體溶解在4mL甲醇中，摻入194μl的2M氫氧化鋰溶液，並在室溫下將混合物攪拌一夜。再補加116μl氫氧化鋰溶液，並在室溫下將混合物再攪拌4小時。隨後在真空中將溶劑移除，將殘餘物置於水中，並藉由5%的檸檬酸將混合物調整至pH 5。用二氯甲烷振搖萃取兩次，並透過硫酸鈉對有機相進行乾燥。對有機相進行過濾、濃縮，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得10.5mg(58%)羰基化合物。
將10.5mg(0.009mmol)此中間體置於4mL DMF中，並在有3.5mg(0.018mmol)1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺-鹽酸鹽、2.8mg(0.018mmol)1-羥基-1H-苯并三唑-水合物及6μl N,N-二異丙基乙胺的情況下使其與3mg(0.012mmol)市售之三氟乙酸--1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)偶聯。在攪拌一夜後，再次補加相同量的 偶聯試劑，並在室溫下將混合物再攪拌3日。隨後進行濃縮，並藉由製備性HPLC對產物進行純化。產量：6mg(理論之52%)
隨後在3mL DCM中藉由1mL三氟乙酸對6mg(0.005mmol)此中間物進行去保護。在自乙腈/水凍乾後，獲得6mg(理論之83%)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.84min；LC-MS(方法4)：Rt=0.93min；MS(ESIpos)：m/z=1068(M+H)+。
中間物F28 N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-beta-丙胺醯基-4-({N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯基}胺基)-L-苯丙胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0485-2150
分5個階段製備此中間物：在第一步中，在有44.3mg(0.117mmol)HATU及30μl N,N-二異丙基乙胺的情況下將40mg(0.058mmol)中間物C8與46mg(0.058mmol)中間物L22偶聯。在室溫下攪拌1小時後，將混合物濃縮，並藉由製備性HPLC對產物進行純化。產量：53mg(理論之62.5%)
在下一步中，在3mL DMF中藉由0.6mL哌啶將Fmoc基團脫除。在室溫下攪拌1小時後，將混合物濃縮，並藉由製備性HPLC對產物進行純化。產量：42mg(理論之82%)
為使甲酯分解，將42mg(0.033mmol)此中間體溶解在2mL THF及1mL水中，摻入330μl的2M氫氧化鋰溶液，並在室溫下將混合物攪拌1小時。隨後藉由TFA將混合物調整至中性，將其濃縮，並藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。在高真空中進行乾燥後，殘餘32mg(78%)羰基化合物。
隨後在2.3mL DMF中，在有18μl N,N-二異丙基乙胺的情況下將32mg(0.026mmol)此中間物與14.6mg(0.047mmol)市售之1-{6-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮偶聯。在超音波浴中處理4小時後，將混合物濃縮，並藉由製備性HPLC對產物進行純化。產量：20.4mg(理論之60%)
在最後一步中，在DCM中藉由三氟乙酸對20.4mg(0.016mmol)此中間物進行去保護。在自乙腈/水凍乾後，獲得20mg(理論之85%)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.9min；LC-MS(方法5)：Rt=2.84min；MS(ESIpos)：m/z=1197(M+H)+。
中間物F29 N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-beta-丙胺醯基-4-({N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基}胺基)-L-苯丙胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0486-2151
以與中間物F28類似的方式製備目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=2.0min；LC-MS(方法1)：Rt=0.92min；MS(ESIpos)：m/z=1111(M+H)+。
中間物F30 三氟乙酸--(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-{2-[(3-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-3-氧代丙基)亞磺醯基]乙基}丁醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0487-2152
分4個階段製備此中間物：在第一步中，在有25mg(0.066mmol)HATU及29μl N,N-二異丙基乙胺的情況下，在DMF中將37.5mg(0.055mmol)中間物C3與15mg(0.066mmol)市售之甲基-3-[(2-胺基乙基)巰基]丙酸酯鹽酸鹽(1：1)偶聯。在室溫下攪拌15分鐘後，再次補加此等偶聯試劑。在室溫下將混合物再攪拌15分鐘，隨後將其濃縮，並藉由製備性HPLC對產物進行純化。產量：21mg(理論之48%)
LC-MS(方法1)：Rt=1.41min；MS(ESIpos)：m/z=802(M+H)+。
為使甲酯分解，將21mg(0.026mmol)此中間體溶解在5mL甲醇中，摻入655μl的2M氫氧化鋰溶液，並在室溫下將混合物攪拌一夜。 其中硫上局部發生氧化。將混合物濃縮，並將殘餘物置於水中，隨後藉由乙酸將其調整至pH 3。用50mL乙酸乙酯萃取兩次，隨後透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，並進行過濾及濃縮。在高真空中對殘餘物進行乾燥後，不作進一步純化便將獲得之混合物應用於下一階段，以在有11.6mg(0.031mmol)HATU及22μl N,N-二異丙基乙胺的情況下與8.4mg(0.033mmol)市售之三氟乙酸--1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)偶聯。在室溫下將混合物攪拌5分鐘，隨後將其濃縮。將殘餘物置於乙酸乙酯中，並用5%的檸檬酸以及隨後用水對溶液進行振搖萃取。隨後透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，並進行過濾及濃縮。在高真空中對殘餘物進行乾燥後，不作進一步純化便將獲得之混合物應用於下一階段。
隨後將22mg此原料溶解在2mL DCM中，並藉由0.5mL三氟乙酸進行去保護。在室溫下攪拌10分鐘後，將混合物濃縮，並藉由製備性HPLC將殘餘物純化。在高真空中進行乾燥後，獲得2.1mg目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.8min；LC-MS(方法1)：Rt=0.83min；MS(ESIpos)：m/z=784(M+H)+。
中間物F31 三氟乙酸--N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N-(3-{[2-{(1R)-1-[(3-胺基丙基)(乙二醇醯基)胺基]-2,2-二甲基丙基}-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-1-基]甲基}苯基)-L-丙胺醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0489-2153
以中間物C10為基礎，按照經典的肽化學方法歷經6個階段構建此中間物。
在第一步中，在5mL DMF中在有100mg(0.266mmol)HATU及46μl N,N-二異丙基乙胺的情況下將42mg(0.066mmol)中間物C10與20.7mg(0.066mmol)N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-丙胺酸偶聯。在室溫下將混合物攪拌一夜，並藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。獲得16mg(理論之27%)N-醯化的化合物以及9mg(理論之12%)N-,O-雙醯化的化合物。
在DMF中藉由哌啶對N-醯化的化合物進行去保護。在乙醇中藉由哌啶及甲胺水溶液對雙醯化的化合物進行處理。在兩種情形下皆產生第三丁基-(3-{[(1R)-1-{1-[3-(L-丙胺醯基胺基)苄基]-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基}-2,2-二甲基丙基](乙二醇醯基)胺基}丙基)胺基甲酸酯，並在藉由製備性HPLC純化後分離出13mg(純度95%)。
LC-MS(方法1)：Rt=0.95min；MS(ESIpos)：m/z=657(M+H)+。
在2mL DMF中，在有7μl N,N-二異丙基乙胺的情況下將13mg(0.019mmol)此中間物與9.1mg(0.021mmol)2,5-二氧代吡咯啶-1-基-N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-纈胺酸酯偶聯。在室溫下攪拌20小時後進行濃縮，並藉由製備性HPLC將殘餘物純化。在自1,4-1,4-二噁烷/ 水凍乾後，殘餘10mg(理論之54%)。
在隨後在DMF中藉由哌啶將Fmoc保護基團脫除時，獲得9mg(定量)經部分去保護的中間物。
隨後在2mL DMF中，在有5μl N,N-二異丙基乙胺的情況下將9mg(0.01mmol)此中間物與3.2mg(0.01mmol)市售之1-{6-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮偶聯。在室溫下攪拌一夜後，將混合物濃縮，並藉由製備性HPLC對產物進行純化。在自乙腈/水及數滴1,4-二噁烷凍乾後，殘餘3mg(理論之32%)，在最後一步中在2mL DCM中藉由0.5mL三氟乙酸對其進行去保護。在自乙腈/水凍乾後，獲得3.8mg(定量)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.9min；LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(ESIpos)：m/z=849(M+H)+。
中間物F32 三氟乙酸--(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-(3-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-3-氧代丙基)丁醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0490-2154
在有10.5mg(0.055mmol)1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺-鹽酸鹽、8.4mg(0.055mmol)1-羥基-1H-苯并三唑-水合物以及14μl(0.08mmol)N,N-二異丙基乙胺的情況下將15mg(0.041mmol)中間 物C5與16.8mg(0.027mmol)中間物L23偶聯，隨後藉由TFA進行去阻斷，藉此製備此中間物。獲得3.4mg(理論之15%，歷經2個階段)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.9min；LC-MS(方法1)：Rt=0.85min；MS(ESIpos)：m/z=708(M+H)+。
中間物F33 三氟乙酸--(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-{2-[(溴乙醯基)胺基]乙基}丁醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0491-2155
在此中間物之合成的第一步中，在有28.7mg(0.15mmol)1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺-鹽酸鹽、22.9mg(0.15mmol)1-羥基-1H-苯并三唑-水合物以及39μl N,N-二異丙基乙胺的情況下，將50mg(0.075mmol)中間物C3與26.2mg(0.082mmol)9H-茀-9-基甲基-(2-胺基乙基)胺基甲酸酯鹽酸鹽(1：1)偶聯。在室溫下攪拌18小時後進行濃縮，並藉由製備性HPLC將殘餘物純化。獲得45mg(理論之65%)此中間體。
LC-MS(方法1)：Rt=1.51min；MS(ESIpos)：m/z=921(M+H)+。
將45mg(0.049mmol)此中間體置於10mL乙醇中，並摻入176μ mL 40%的甲烷胺水溶液。在50℃下攪拌混合物，其中在6小時後及9小時後分別添加相同量的甲烷胺溶液。在50℃下進一步攪拌14小時後，再添加700μl甲烷胺溶液，並在進一步攪拌20小時後進行濃縮。將殘餘物置於DCM中，並用水對其進行洗滌。將有機相濃縮，並藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。在將相應的溶離份濃縮並在高真空中對殘餘物進行乾燥後，獲得32mg(理論之99%)第三丁基-{(2S)-1-[(2-胺基乙基)胺基]-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}胺基甲酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt=0.95min；MS(ESIpos)：m/z=657(M+H)+。
將8.3mg(0.013mmol)此中間體溶解在4mL二氯甲烷中，並摻入3.3mg(0.013mmol)溴乙酸酐以及2μl N,N-二異丙基乙胺。在室溫下攪拌1小時後進行濃縮，並藉由製備性HPLC將殘餘物純化。將相應的溶離份濃縮，並將殘餘物自乙腈/水凍乾。將殘餘物置於1mL二氯甲烷中，並藉由0.5mL三氟乙酸對其進行去保護。在濃縮以及自乙腈/水凍乾後，獲得1.1mg(理論之9%，歷經2個階段)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.9min；LC-MS(方法1)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m/z=677/679(M+H)+。
中間物F34 三氟乙酸--N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-L-丙胺醯基-N5-胺甲醯基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鳥胺醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0493-2156
透過在有9.9mg(0.026mmol)HATU及19μl N,N-二異丙基乙胺的情況下將14mg(0.022mmol)中間物C5與12.7mg(0.024mmol)中間物L8偶聯來製備此中間物。在室溫下將混合物攪拌30分鐘，並藉由製備性HPLC將產物純化，隨後將其自乙腈/水凍乾。
將獲得之中間物置於3mL二氯甲烷中，並藉由1mL三氟乙酸進行去阻斷。在室溫下攪拌30分鐘後，將混合物濃縮，並將殘餘物自乙腈/水凍乾。獲得8.2mg(理論之36%，歷經2個階段)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.8min；LC-MS(方法1)：Rt=0.87min；MS(ESIpos)：m/z=913(M+H)+。
中間物F35 N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0494-2157
在氬氛圍下，在0℃下為4.0mL DMF中的31.8mg(0.07mmol)N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(中間物C40)摻入57.3mg(0.07mmol)N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸(中間物L38)、9.2mg(0.07mmol)HOAt以及32mg(0.08mmol)HATU。隨後添加23.5μL(0.14mmol)N,N-二異丙基乙胺，並在室溫下攪拌一夜。為反應混合物摻入7.7μL HOAc，並直接藉由製備性RP-HPLC對其進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得33.4mg(理論之38%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.12min；MS(ESIpos)：m/z=651[M+2H]2+。
中間物F36 N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0495-2158
以與中間物F35之製備類似的方式合成目標化合物。
15.4mg(0.03mmol)N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(中間物C40)。
25.0mg(0.03mmol)N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸(中間物L25)。
獲得10.7mg(理論之27%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.13min；MS(ESIpos)：m/z=1215[M+H]+。
中間物F37 三氟乙酸--N-(4-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]甲基}吡咯啶-3-基)-31-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一烷-1-醯胺(1：1)
由非對映異構體構成之混合物。
Figure 105119613-A0202-12-0496-2159
以與中間物C21之合成類似的方式，製備第三丁基-3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]甲基}-4-{[31-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一烷-1-醯基]胺基}吡咯啶-1-羧酸酯化合物。
8.0(0.01mmol)及13.0mg(0.02mmol)第三丁基-3-胺基-4-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]甲基}吡咯啶-1-羧酸酯(中間物C23)。
9.0mg(0.01mmol)及14.7mg(0.02mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)醯基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜二十七碳-1-基}丙醯胺。
產量(兩個混合物合併後)：
10.5mg(42%)非對映異構體1
11.6mg(46%)非對映異構體2
以與中間物F38之合成類似的方式製備目標化合物。
10.5mg(0.01mmol)第三丁基-3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]甲基}-4-{[31-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八 氧雜-28-氮雜三十一烷-1-醯基]胺基}吡咯啶-1-羧酸酯(非對映異構體1)。
60.6mg(0.54mmol)TFA。
獲得7.4mg(理論之70%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.09min；MS(ESIpos)：m/z=1086[M+H]+。
中間物F38 三氟乙酸--N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-37-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-7,35-二氧代-10,13,16,19,22,25,28,31-八氧雜-3-硫雜-6,34-二氮雜三十七烷-1-醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0497-2160
將24.8mg(0.02mmol)第三丁基-[38-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,31,37-三氧代-7,10,13,16,19,22,25,28-八氧雜-35-硫雜-4,32,38-三氮雜四十一烷-41-基]胺基甲酸酯(中間物C21)置於1.0mL二 氯甲烷中，並摻入85.8mg(0.75mmol)TFA。在室溫下攪拌16小時。在真空中將溶劑蒸發，並直接藉由製備性RP-HPLC對殘餘物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得23.0mg(理論之95%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.96min；MS(ESIpos)：m/z=1104[M+H]+。
中間物F39 N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0498-2612
以與中間物F35之合成類似的方式製備目標化合物。
56.1mg(0.10mmol)N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸(中間物L44)。
45.0mg(0.10mmol)N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(中間物C40)。
獲得20.9mg(理論之21%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.16min；MS(ESIpos)：m/z=1040[M+H]+。
中間物F40 三氟乙酸--N-[(4-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]甲基}吡咯啶-3-基)甲基]-31-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-氧雜-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一烷-1-醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0499-2162
以與中間物C21之合成類似的方式，製備第三丁基-3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]甲基}-4-[33-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,31-二氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧雜-2,30-二氮雜三十三碳-1-基]吡咯啶-1-羧酸酯。
25.0mg(0.04mmol)三氟乙酸--第三丁基-3-(胺基甲基)-4-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]甲基}吡咯啶-1-羧酸酯(1：1)(中間物C24)。
27.6mg(0.04mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)醯基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜二十七碳-1-基}丙醯胺。
產量：20.6mg(理論之39%)
LC-MS(方法1)：Rt=1.23min；MS(ESIpos)：m/z=1200 [M+H]+。
以與中間物F37之合成類似的方式製備目標化合物。
26.1mg(0.02mmol)(第三丁基-3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]甲基}-4-[33-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,31-二氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧雜-2,30-二氮雜三十三碳-1-基]吡咯啶-1-羧酸酯。
90.6mg(0.80mmol)TFA。
獲得22.9mg(理論之95%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.91及0.92min；MS(ESIpos)：m/z=1100[M+H]+。
中間物F41 三氟乙酸--N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-37-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-7,35-二氧代-10,13,16,19,22,25,28,31-八氧雜-3-硫雜-6,34-二氮雜三十七烷-1-醯胺-3-氧化物(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0501-2163
以與中間物F38類似的方式，用15.5mg(0.01mmol)中間物C22製備目標化合物。獲得4.0mg(理論之27%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.90min；MS(ESIpos)：m/z=1120[M+H]+。
中間物F42 三氟乙酸--4-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]甲基}-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]吡咯啶-3-羧醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0502-2164
將40.5mg(0.06mmol)4-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]甲基}-1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-羧酸(中間物C25)以及14.5mg(0.08mmol)1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮鹽酸鹽(1：1)置於1.0mL乙腈中，並摻入64.4mg(0.51mmol)N,N-二異丙基乙胺以及50.0mg(0.08mmol)T3P，並在室溫下攪拌16小時。再添加相同量的1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮鹽酸鹽(1：1)、N,N-二異丙基乙胺及T3P，並在室溫下再攪拌4小時。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得7.2mg(理論之15%)第三丁基-3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]甲基}-4-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺甲醯基}吡咯啶-1-羧酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.30min；MS(ESIpos)：m/z=763[M+H]+。
將7.2mg(0.01mmol)第三丁基-3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]甲基}-4-{[2- (2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺甲醯基}吡咯啶-1-羧酸酯置於1.0mL二氯甲烷中，並摻入43.0mg(0.38mmol)TFA。在室溫下將反應混合物攪拌16小時。在真空中將溶劑蒸發，並藉由製備性RP-HPLC對殘餘物進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得4.5mg(理論之50%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.92min；MS(ESIpos)：m/z=663[M+H]+。
中間物F43 N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0503-2165
將22.4mg(0.03mmol)N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸(中間物L42)溶解在2.0mL DMF中，並摻入4.5mg(0.03mmol)HOAt、15.8mg(0.04mmol)HATU以及15.7mg(0.03mmol)N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(中間物C40)。添加8.6mg(0.07mmol)N,N-二異丙基乙胺，並在室溫下將反應混合物攪拌一夜。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30； 10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得16.7mg(理論之45%)目標化合物。
LC-MS(方法4)：Rt=1.34min；MS(ESIpos)：m/z=1125[M+H]+。
中間物F44 三氟乙酸--N-[(4-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]甲基}吡咯啶-3-基)甲基]-19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0504-2613
以與中間物F40之合成類似的方式製備目標化合物。
25.0mg(0.04mmol)三氟乙酸--第三丁基-3-(胺基甲基)-4-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]甲基}吡咯啶-1-羧酸酯(1：1)(中間物C24)。
20.5mg(0.04mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧雜十五碳-1-基}丙醯胺。
獲得21.8mg(理論之48%)第三丁基-3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]甲基}-4-[21-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,19-二氧代-6,9,12,15-四氧雜-2,18-二氮雜二十一碳-1-基]吡咯啶-1-羧酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.22min；MS(ESIpos)：m/z=1025[M+H]+。
21.0mg(0.02mmol)第三丁基-3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]甲基}-4-[21-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,19-二氧代-6,9,12,15-四氧雜-2,18-二氮雜二十一碳-1-基]吡咯啶-1-羧酸酯。
168.3mg(1.48mmol)TFA。
獲得17.3mg(理論之90%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.92及0.94min；MS(ESIpos)：m/z=924[M+H]+。
中間物F45 三氟乙酸--N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}-L-離胺醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0505-2167
以與中間物F46之合成類似的方式進行合成。
22.9mg(0.05mmol)N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二 氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(中間物C40)。
36.2mg(0.05mmol)N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸(中間物L41)。
獲得19.8mg(34%)N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺醯胺化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.20min；MS(ESIpos)：m/z=1196[M+H]+。
17.0mg(0.01mmol)N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺醯胺。
獲得13.6mg(理論之79%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.94min；MS(ESIpos)：m/z=1096[M+H]+。
中間物F46 三氟乙酸--N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}-L-離胺醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0507-2168
在氬氛圍下，在0℃下為2.0mL DMF中的25.1mg(0.05mmol)N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(中間物C40)摻入49.0mg(0.05mmol)N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸(中間物L40)、7.3mg(0.05mmol)HOAt以及25.3mg(0.07mmol)HATU。隨後添加18.6μL(0.11mmol)N,N-二異丙基乙胺，並在室溫下攪拌一夜。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得29.2mg(理論之37%)N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺醯胺化合物。
LC-MS(方法4)：Rt=1.51min；MS(ESIpos)：m/z=1372[M+H]+。
將25.2mg(0.02mmol)N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離 胺醯胺置於3.0mL二氯甲烷中，並摻入83.7mg(0.73mmol)TFA。在室溫下將反應溶液攪拌48小時。在真空中將溶劑蒸發，並藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得24.5mg(理論之96%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.95min；MS(ESIpos)：m/z=1272[M+H]+。
中間物F47 N-[67-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-65-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61-二十氧雜-64-氮雜六十七烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0508-2614
將15.2mg(0.01mmol)N-[67-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-65-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61-二十氧雜-64-氮雜六十七烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸(中間物L43)溶解在1.0mL DMF中，並摻入1.5mg(0.01mmol)HOAt、5.2mg(0.01mmol)HATU以及5.2mg(0.01mmol)N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(中間物C40)。添加2.9mg(0.02mmol)N,N-二異丙基乙胺，並在室溫下將反應混合物攪拌一夜。直接藉由製備性RP- HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得6.8mg(理論之33%)目標化合物。
LC-MS(方法4)：Rt=1.37min；MS(ESIpos)：m/z=1831[M+H]+。
中間物F48 三氟乙酸--N1-(3-胺基丙基)-N1-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-N18-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]-6,9,12,15-四氧雜-3-硫雜十八烷-1,18-二醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0509-2170
將16.1mg(0.02mmol)第三丁基-[22-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-4,21-二氧代-7,10,13,16-四氧雜-19-硫雜-3,22-二氮雜二十五烷-25-基]胺基甲酸酯(中間物C18)置於1.5mL二氯甲烷中，並摻入26μL(0.34mmol)TFA。在室溫下攪拌一夜，隨後再添加26μL(0.34mmol)TFA。在室溫下再攪拌一夜。在真空中將溶劑蒸發，並藉由製 備性RP-HPLC對殘餘物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，將殘餘物置於水中並凍乾。獲得10.8mg(理論之66%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.98min；MS(ESIpos)：m/z=857[M+H]+。
中間物F49 (25S)-25-胺基-22-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-4,21-二氧代-7,10,13,16-四氧雜-19-硫雜-3,22-二氮雜二十六烷-26-酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0510-2171
以與中間物C16之合成類似的方式，合成第三丁基-(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁酸酯化合物。
50.0mg(0.08mmol)中間物C2
20.3mg(0.18mmol)氯乙醯氯
19.0mg(0.19mmol)三乙胺
獲得43.1mg(理論之77%)第三丁基-(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醯基)胺基]-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.55min；MS(ESIpos)：m/z=689[M+H]+。
以與中間物C17之合成類似的方式，合成(6S)-9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-6-(第三丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3,15,18,21,24-五氧雜-12-硫雜-5,9-二氮雜二十七烷-27-酸化合物。
38.8mg(0.06mmol)第三丁基-(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁酸酯。
19.1mg(0.07mmol)1-硫基-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-酸
45.9mg(0.14mmol)碳酸銫。
獲得40.7mg(理論之77%)(6S)-9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-6-(第三丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3,15,18,21,24-五氧雜-12-硫雜-5,9-二氮雜二十七烷-27-酸。
LC-MS(方法1)：Rt=1.45min；MS(ESIpos)：m/z=935[M+H]+。
以與中間物C18之合成類似的方式合成第三丁基-(25S)-22-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-25-[(第三丁氧基羰基)胺基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-4,21-二氧代-7,10,13,16-四氧雜-19-硫雜-3,22-二氮雜二十六烷-26-酸酯化合物。
獲得37.4mg(0.04mmol)(6S)-9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-6-(第三丁氧基羰基)-2,2-二甲基- 4,10-二氧代-3,15,18,21,24-五氧雜-12-硫雜-5,9-二氮雜二十七烷-27-酸。
9.2mg(0.05mmol)1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮鹽酸鹽(1：1)。
獲得3.4mg(理論之49%)第三丁基-(25S)-22-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-25-[(第三丁氧基羰基)胺基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-4,21-二氧代-7,10,13,16-四氧雜-19-硫雜-3,22-二氮雜二十六烷-26-酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.47min；MS(ESIpos)：m/z=1057[M+H]+。
以與中間物F38之合成類似的方式製備目標化合物。
20.8mg(0.02mmol)第三丁基-(25S)-22-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-25-[(第三丁氧基羰基)胺基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-4,21-二氧代-7,10,13,16-四氧雜-19-硫雜-3,22-二氮雜二十六烷-26-酸酯。
157.0mg(1.37mmol)TFA。
獲得13.0mg(65%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.93min；MS(ESIpos)：m/z=901[M+H]+。
中間物F50 三氟乙酸--1-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環丙烷羧醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0513-2172
將15mg(0.024mmol)中間物C5溶解在6.5mL DCM中，並摻入19mg(0.049mmol)中間物L24、13μl N,N-二異丙基乙胺以及10mg(0.037mmol)2-溴-1-乙基吡錠四氟硼酸鹽。在室溫下將混合物攪拌3小時，隨後在真空中將其濃縮。藉由製備性HPLC將殘餘物純化，獲得2.4mg受保護的中間體。
隨後將此中間體置於1mL DCM中，並藉由0.1mL三氟乙酸對其進行去保護。在自乙腈/水凍乾後，獲得2.6mg(理論之11%，歷經2個階段)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=2.4min。
LC-MS(方法1)：Rt=1.25min；MS(ESIpos)：m/z=819[M+H]+。
中間物F51 3-{3-[(3-胺基-2-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]甲基}丙基)硫基]-2,5-二氧代吡咯啶-1-基}-N-[17-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-15-氧代-4,7,10-三氧雜-14-氮雜十七碳-1-基]丙醯胺(異構體1)
Figure 105119613-A0202-12-0514-2173
將10.0mg(18.079μmol)N-[3-胺基-2-(巰基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺鹽酸鹽(1：1)(異構體1)置於100μl PBS緩衝液(Sigma D8537)及200μl ACN中。添加17.1mg(32.543μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-[17-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-15-氧代-4,7,10-四氧雜-14-氮雜十七碳-1-基]丙醯胺，並在室溫下攪拌16小時。藉由製備性HPLC(溶離劑：ACN/水+0.1% TFA，梯度)將反應溶液純化，並進行凍乾。獲得14.0mg(理論之75%)目標化合物。
異構體1
LC-MS(方法1)：Rt=0.94min；MS(ESIpos)：m/z=1039[M+H]+。
中間物F52 3-{3-[(3-胺基-2-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]甲基}丙基)硫基]-2,5-二氧代吡咯啶-1-基}-N-[17-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-15-氧代-4,7,10-三氧雜-14-氮雜十七碳-1-基]丙醯胺(異構體2)
Figure 105119613-A0202-12-0515-2174
6.5mg(10.694μmol，LC/MS純度=91%)N-[3-胺基-2-(巰基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺鹽酸鹽(1：1)(異構體2)置於100μl PBS緩衝液(Sigma D8537)及200μl ACN中。添加10.1mg(19.249μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-[17-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-15-氧代-4,7,10-三氧雜-14-氮雜十七碳-1-基]丙醯胺，並在室溫下攪拌16小時。藉由製備性HPLC(溶離劑：ACN/水+0.1% TFA，梯度)將反應溶液純化，並進行凍乾。獲得5.0mg(理論之45%)目標化合物。
異構體2
LC-MS(方法5)：Rt=2.87min；MS(ESIpos)：m/z=1039[M+H]+。
中間物F53 N-{3-胺基-2-[({1-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丁基]-2,5-二氧代吡咯啶-3-基}硫基)甲基]丙基}-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(異構體1)
Figure 105119613-A0202-12-0516-2175
將10.0mg(18.079μmol)N-[3-胺基-2-(巰基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺鹽酸鹽(1：1)(異構體1)置於200μl PBS緩衝液(Sigma D8537)及400μl ACN中。添加8.1mg(32.543μmol)1,1'-丁烷-1,4-二基雙(1H-吡咯-2,5-二酮)，並在室溫下攪拌1小時。隨後添加300μl DMF，並再攪拌1.5小時。藉由製備性HPLC(溶離劑：ACN/水+0.1% TFA，梯度)將反應溶液純化，並進行凍乾。獲得4.0mg(理論之29%)目標化合物。
異構體1
LC-MS(方法1)：Rt=0.97min；MS(ESIpos)：m/z=765[M+H]+。
中間物F54 N-{3-胺基-2-[({1-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丁基]-2,5-二氧代吡咯啶-3-基}硫基)甲基]丙基}-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(異構體2)
Figure 105119613-A0202-12-0517-2176
將5.0mg(9.040μmol)N-[3-胺基-2-(巰基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺鹽酸鹽(1：1)(異構體2)置於500μl DMF中。添加4.0mg(16.271μmol)1,1'-丁烷-1,4-二基雙(1H-吡咯-2,5-二酮)，並在室溫下攪拌16小時。藉由製備性HPLC(溶離劑：ACN/水+0.1% TFA，梯度)將反應溶液純化，並進行凍乾。獲得1.1mg(理論之16%)目標化合物。
異構體2
LC-MS(方法6)：Rt=2.41min；MS(ESIpos)：m/z=765[M+H]+。
中間物F55 N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-{4-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺甲醯基]苯基}-L-丙胺醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0517-2177
將6.5mg(4.5μmol)N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-[4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(第三丁氧基羰基)胺基]丙基}胺甲醯基)苯基]-L-丙胺醯胺溶解在441μl二氯甲烷中，並摻入44μl(573.1μmol)三氟乙酸。在室溫下在旋轉蒸發器上將混合物濃縮，將其置於水及ACN中並凍乾。獲得5,6mg(理論之94%，LC/MS純度=92%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.01min；MS(ESIpos)：m/z=1100.6[M+H]+。
中間物F56 三氟乙酸--(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-[(2S)-1-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-1-氧代丙烷-2-基]丁醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0518-2178
以與中間物F50類似的方式製備目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.9min；MS(EIpos)：m/z=708[M+H]+。
中間物F57 三氟乙酸--(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-[(2R)-1-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-1-氧代丙烷-2-基]丁醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0519-2179
以與中間物F56類似的方式製備目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.91min；MS(EIpos)：m/z=708[M+H]+。
中間物F58 N-{5-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-5-氧代戊醯基}-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0519-2180
將16.2mg(0.02mmol)三氟乙酸--L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺(1：1)(中間物C41)置於1.0mL DMF中，並摻入8.3mg(0.06mmol)N,N-二異丙基乙胺以及12.6mg(0.04mmol)1,1'-[(1,5-二氧代戊烷-1,5-二基)雙(氧基)]二吡咯啶-2,5-二酮。在室溫下將反應混合物攪拌一夜，並直接藉由製備性RP-HPLC對其進行純化 (柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得11.0mg(理論之60%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.18min；MS(ESIpos)：m/z=852[M+H]+。
中間物F82 N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-{3-[{1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0520-2615
以與中間物F83之合成類似的方式製備目標化合物。以與相應之R異構體類似的方式獲得其中採用的外消旋中間物。
LC-MS(方法2)：Rt=7.07min；MS(EIpos)：m/z=1236[M+Na]+。
中間物F83 N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0521-2182
將30.0mg(0.06mmol)N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(實例98)以及26.1mg(0.06mmol)2,5-二氧代吡咯啶-1-基-N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-丙胺酸酯置於2.0mL DMF中，並摻入19.4mg(0.19mmol)4-甲基嗎啉。在室溫下將反應混合物攪拌一夜，並摻入11.5mg(0.19mmol)HOAc。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得41.9mg(理論之79%)9H-茀-9-基甲基-[(2S)-1-({3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}胺基)-1-氧代丙烷-2-基]胺基甲酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.44min；MS(ESIpos)：m/z=763[M+H]+。
將37.2mg(0.05mmol)9H-茀-9-基甲基-[(2S)-1-({3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}胺基)-1-氧代丙烷-2-基]胺基甲酸酯溶解在1.5mL DMF中，並摻入124.6mg(1.46mmol)2-胺基乙醇。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。將反應混合物分佈於乙酸乙酯及水之間，用水將有機相洗滌兩次，並用飽和NaCl溶液將其洗滌一次。在透過硫酸鎂進行乾燥後，在真空中將溶劑蒸發，並透過矽膠(溶離劑：二氯甲烷/甲醇10：1)將殘餘物純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得14.2mg(理論之50%)N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二 氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.92min；MS(ESIpos)：m/z=541[M+H]+。
將14.1mg(0.03mmol)N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺以及11.4(0.03mmol)2,5-二氧代吡咯啶-1-基-N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-纈胺醯基溶解在1.5mL DMF中，並摻入7.9mg(0.08mmol)4-甲基嗎啉。在室溫下將反應混合物攪拌一夜，隨後摻入4.7mg(0.08mmol)HOAc。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得15.9mg(理論之71%)N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.46min；MS(ESIpos)：m/z=862(M+H)+。
將14.9mg(0.02mmol)N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺溶解在1.5mL DMF中，並摻入44.2mg(0.52mmol)2-胺基乙醇。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。將反應混合物分佈於乙酸乙酯及水之間，用水將有機相洗滌兩次，並用飽和NaCl溶液將其洗滌一次。在透過硫酸鎂進行乾燥後，在真空中將溶劑蒸發，並透過矽膠(溶離劑：二氯甲烷/甲醇10：1)將殘餘物純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得5.7mg(理論之52%)L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二 氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.92min；MS(ESIpos)：m/z=640(M+H)+。
將5.5mg(8.6μmol)L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺以及6.5mg(6.5μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜二十七碳-1-基}丙醯胺溶解在1.0mL DMF中，並摻入0.9mg(8.6mmol)4-甲基嗎啉。在室溫下將反應混合物攪拌一夜，並摻入0.8mg(0.01mmol)HOAc。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得7.7mg(理論之74%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.10min；MS(ESIpos)：m/z=1214(M+H)+。
中間物F84 三氟乙酸--(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-(3-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-3-氧代丙基)丁醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0524-2183
首先將16.5mg(0.02mmol)中間物C54置於5ml DMF中，並在有11.7mg(0.03mmol)HATU及18μl N,N-二異丙基乙胺的情況下使其與10.4mg(0.041mmol)三氟乙酸--1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)發生反應。在室溫下攪拌5分鐘後進行濃縮，並將殘餘物置於乙腈/水1：1中。用三氟乙酸將pH值調節至2，並重新將混合物濃縮。藉由製備性HPLC對殘留之殘餘物進行純化。獲得8mg(理論之42%)受保護的中間物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.38min；MS(EIpos)：m/z=929[M+H]+。
將7.6mg(0.008mmol)此中間物置於3ml DMF中，並摻入92mg(0.82mmol)1,4-二氮雜雙環(2.2.2)辛烷。在超音波浴中對混合物進行1小時的處理。隨後添加31μl乙酸，並在高真空中將混合物濃縮。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。獲得3mg(理論之45%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(EIpos)：m/z=707[M+H]+。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)：δ=8.15(t,1H),7.9-8.1(m,4H),7.6(m,1H),7.5(s,1H),7.15-7.35(m,6H),6.9-7.0(m,3H),6.85(s,1H),5.6(s,1H),4.9及5.2(2d,2H),4.05及4.2(2d,2H),3.1-3.2(m, 4H),2.15(m,2H),0.7及1.45(2m,2H),0.8(s,9H).
中間物F85 三氟乙酸--(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]丁醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0525-2184
首先將10mg(0.014mmol)中間物C53置於3.4ml DMF中，並在有7.8mg(0.02mmol)HATU及12μl N,N-二異丙基乙胺的情況下使其與7mg(0.027mmol)三氟乙酸--1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)發生反應。在室溫下攪拌15分鐘後進行濃縮，並藉由製備性HPLC將殘餘物純化。獲得6.6mg(理論之57%)受保護的中間物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.4min；MS(EIpos)：m/z=858[M+H]+。
將6.6mg(0.008mmol)此中間物置於2ml DMF中，並摻入86mg(0.77mmol)1,4-二氮雜雙環(2.2.2)辛烷。在超音波浴中對混合物進行2小時的處理。隨後添加44μl乙酸，並在高真空中將混合物濃縮。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。獲得3.3mg(理論之53%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.88min；MS(EIpos)：m/z=636[M+H]+。
中間物F86 三氟乙酸--(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑- 3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-(3-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-3-氧代丙基)丁醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0526-2185
以8mg(0.012mmol)中間物C51為基礎，在有5.8mg(0.015mmol)HATU及10μl N,N-二異丙基乙胺的情況下與4.5mg(0.017mmol)三氟乙酸--1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)反應，隨後藉由三氟乙酸進行去保護，藉此製備目標化合物。獲得7mg(理論之78%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.83min；MS(EIpos)：m/z=708[M+H]+。
中間物F87 三氟乙酸--(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-(3-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-3-氧代丙基)丁醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0526-2186
以與中間物F2類似的方式，以16mg(0.025mmol)中間物C49為 基礎，在有EDCI/HOBT及N,N-二異丙基乙胺的情況下與24mg(0.076mmol)中間物L1反應，隨後藉由三氟乙酸進行去保護，藉此製備目標化合物。獲得3mg(理論之14%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.88min；MS(EIpos)：m/z=694[M+H]+。
中間物F88
Figure 105119613-A0202-12-0527-2187
以與中間物F8類似的方式製備目標化合物。
LC-MS(方法5)：Rt=2.97min；MS(EIpos)：m/z=1006[M+H]+。
中間物F89 三氟乙酸--N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-beta-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N5-胺甲醯基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鳥胺醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0528-2188
以8mg(0.012mmol)中間物C51為基礎，在有5.8mg(0.015mmol)HATU及10μl N,N-二異丙基乙胺的情況下與7.4mg(0.014mmol)中間物L8反應，隨後藉由三氟乙酸進行去保護，藉此製備目標化合物。獲得10mg(理論之78%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.87min；MS(EIpos)：m/z=984[M+H]+。
中間物F90 N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯基-N6-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-L-離胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0528-2189
以11mg(0.018mmol)中間物C49為基礎，在有34mg(0.089mmol)HATU及19μl N,N-二異丙基乙胺的情況下與13.7mg(0.018 mmol)中間物L17反應，隨後藉由三氟乙酸進行去保護，藉此製備目標化合物。獲得7.5mg(理論之35%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法8)：Rt=6.78min；MS(EIpos)：m/z=1092[M+H]+。
中間物F91 三氟乙酸--(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]丁醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0529-2190
將9.3mg(0.01mmol)第三丁基-[(2S)-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-1-氧代丁烷-2-基]胺基甲酸酯溶解在2ml二氯甲烷中，摻入740mg(6.49mmol，0.50ml)三氟乙酸，並在室溫下攪拌1.5小時。隨後將反應混合物濃縮，將殘餘物置於乙腈及水中並凍乾。獲得9.2mg(理論之96%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.88min；MS(EIpos)：m/z=637[M+H]+。
中間物F103 N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-(3-{[(1R)-1-(3-苄基-7-氯-4-氧 代-3,4-二氫喹唑啉-2-基)-2-甲基丙基](4-甲基苯甲醯基)胺基}丙基)-L-丙胺醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0530-2191
以10mg(0.019mmol)N-(3-胺基丙基)-N-[(1R)-1-(3-苄基-7-氯-4-氧代-3,4-二氫喹唑啉-2-基)-2-甲基丙基]-4-甲基苄醯胺為基礎，透過在有8.8mg(0.023mmol)HATU及10μl N,N-二異丙基乙胺的情況下與11.3mg(0.019mmol)中間物L44反應獲得目標化合物。藉由製備性HPLC進行純化。
產量：8.5mg(理論之35%)
LC-MS(方法5)：Rt=3.82min；MS(EIpos)：m/z=1085[M+H]+。
中間物F104 三氟乙酸--(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)丁醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0531-2192
首先在有13mg(0.034mmol)HATU及10μl N,N-二異丙基乙胺的情況下，使15mg(0.023mmol)中間物C58與11mg(0.036mmol)中間物L1發生反應。在室溫下攪拌60分鐘後進行濃縮，並藉由製備性HPLC將殘餘物純化。獲得12.3mg(理論之63%)受保護的中間物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.3min；MS(EIpos)：m/z=837[M+H]+。
在第二步中，將此中間物溶解在3mL 2,2,2-三氟乙醇中。添加12mg(0.088mmol)氯化鋅，並在50℃下將混合物攪拌2小時。隨後添加26mg(0.088mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸以及2mL 0.1%的三氟乙酸水溶液。藉由製備性HPLC對混合物進行純化。在將相應的溶離份濃縮以及將殘餘物自乙腈/水凍乾後，獲得8.1mg(理論之68%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(ESIpos)：m/z=693(M+H)+。
中間物F105 N2-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-麩醯胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0532-2193
以中間物C5與中間物L46為基礎，以與中間物F32類似的方式製備目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.82min；MS(EIpos)：m/z=766[M+H]+。
中間物F106 三氟乙酸--N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-beta-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N5-胺甲醯基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鳥胺醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0532-2194
以中間物C53與中間物L47為基礎，以與中間物F104類似的方式製備目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.85min； LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(ESIpos)：m/z=983(M+H)+。
中間物F107 三氟乙酸--(1R,2S)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊烷羧醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0533-2616
以15mg(0.024mmol)中間物C49為基礎，在有14mg(0.037mmol)HATU及21μl N,N-二異丙基乙胺的情況下與22.3mg(0.049mmol)中間物L48反應，隨後藉由三氟乙酸進行去保護，藉此製備目標化合物。獲得13mg(理論之60%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.9min；MS(EIpos)：m/z=748[M+H]+。
中間物F108 三氟乙酸--(1R,2S)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊烷羧醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0534-2196
以與中間物F104類似的方式，用20mg(0.027mmol)中間物C53與24mg(0.054mmol)中間物L48製備目標化合物。獲得3mg(理論之14%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.93min；MS(EIpos)：m/z=747[M+H]+。
中間物F109 三氟乙酸--(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-{2-[(溴乙醯基)胺基]乙基}丁醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0534-2197
將17mg(0.026mmol)中間物C57置於3mL DMF中，並在有14μl N,N-二異丙基乙胺的情況下與7mg(0.027mmol)市售之1-(2-溴乙醯氧 基)吡咯啶-2,5-二酮反應。在室溫下攪拌15分鐘後進行濃縮，並藉由製備性HPLC將殘餘物純化。獲得7mg(理論之33%)此中間體。
LC-MS(方法1)：Rt=1.29min；MS(ESIpos)：m/z=777及779(M+H)+。
將此中間物置於1mL二氯甲烷中，並藉由1mL三氟乙酸進行去保護。在進行濃縮以及自乙腈/水凍乾後，獲得6mg(理論之88%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(ESIpos)：m/z=677/679(M+H)+。
中間物F110 N-(溴乙醯基)-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-L-離胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0535-2198
以與中間物F109類似的方式，用16mg(0.023mmol)中間物C5與17mg(0.025mmol)中間物L49製備目標化合物。獲得6mg(理論之24%，歷經2個階段)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.93min；LC-MS(方法1)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m/z=933及935(M+H)+。
中間物F111 三氟乙酸--(1S,3R)-3-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊烷羧醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0536-2199
以15mg(0.022mmol)中間物C5為基礎，在有12.5mg(0.032mmol)HATU及19μl N,N-二異丙基乙胺的情況下與16mg(0.044mmol)中間物L50反應，隨後藉由三氟乙酸進行去保護，藉此製備目標化合物。獲得13mg(理論之67%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(EIpos)：m/z=748[M+H]+。
中間物F112 三氟乙酸--(1S,3R)-3-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊烷羧醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0537-2200
以15mg(0.024mmol)中間物C49為基礎，在有14mg(0.037mmol)HATU及21μl N,N-二異丙基乙胺的情況下與18mg(0.049mmol)中間物L50反應，隨後藉由三氟乙酸進行去保護，藉此製備目標化合物。獲得12mg(理論之51%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(EIpos)：m/z=748[M+H]+。
中間物F113 三氟乙酸--(1S,3R)-3-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊烷羧醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0538-2201
以15mg(0.019mmol)中間物C53為基礎，在有11mg(0.029mmol)HATU及17μl N,N-二異丙基乙胺的情況下與14mg(0.038mmol)中間物L50反應，隨後在2ml DMF中藉由133mg DABCO進行去保護，藉此製備目標化合物。在HPLC純化後，獲得4mg(理論之24%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法5)：Rt=2.77min；MS(EIpos)：m/z=747[M+H]+。
中間物F114 三氟乙酸--(1R,3R)-3-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊烷羧醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0539-2202
以15mg(0.022mmol)中間物C5為基礎，在有12.6mg(0.032mmol)HATU及19μl N,N-二異丙基乙胺的情況下與16mg(0.044mmol)中間物L51反應，隨後藉由三氟乙酸進行去保護，藉此製備目標化合物。獲得11mg(理論之53%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(EIpos)：m/z=748[M+H]+。
中間物F115 三氟乙酸--(1R,3R)-3-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊烷羧醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0540-2203
以15mg(0.024mmol)中間物C49為基礎，在有13mg(0.035mmol)HATU及21μl N,N-二異丙基乙胺的情況下與18mg(0.047mmol)中間物L51反應，隨後藉由三氟乙酸進行去保護，藉此製備目標化合物。獲得12mg(理論之51%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.87min；MS(EIpos)：m/z=748[M+H]+。
中間物F116 三氟乙酸--(1R,3R)-3-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊烷羧醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0541-2204
以11mg(0.014mmol)中間物C53為基礎，在有8mg(0.021mmol)HATU及12μl N,N-二異丙基乙胺的情況下與11mg(0.028mmol)中間物L51反應，隨後在2ml DMF中藉由87mg DABCO進行去保護，藉此製備目標化合物。在HPLC純化後，獲得3.3mg(理論之28%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.92min；MS(EIpos)：m/z=747[M+H]+。
中間物F117 三氟乙酸--N-[(3S)-3-胺基-4-{2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]肼基}-4-氧代丁基]-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-3-羥基乙醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0542-2205
以中間物C49為基礎，按照經典的肽化學方法製備目標化合物。首先在有HATU的情況下將C49與9H-茀-9-基甲基-肼羧酸酯偶聯。隨後在DMF中藉由哌啶將Fmoc保護基團脫除，並在有HATU的情況下將獲得之醯肼與6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸偶聯。在最後一步中，在二氯甲烷中藉由TFA將Boc保護基團脫除。
LC-MS(方法1)：Rt=0.93min；MS(EIpos)：m/z=722[M+H]+。
中間物F118 三氟乙酸--N-[(3S)-3-胺基-4-{2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]肼基}-4-氧代丁基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0542-2206
如下製備目標化合物：在第一步中，以與中間物F3類似的方式，將15mg(0.019mmol)中間物C53與市售之6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己烷醯肼偶聯。隨後在DMF中藉由142mg DABCO將Fmoc保護基團脫除。在HPLC純化後，獲得3mg(理論之19%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.90min；MS(EIpos)：m/z=721[M+H]+。
中間物F119 三氟乙酸--(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-{2-[(溴乙醯基)胺基]乙基}丁醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0543-2207
將29mg(0.044mmol)中間物C58置於3.4mL DMF中，並摻入36mg(0.087mmol)中間物L52、25mg(0.065mmol)HATU以及19μl N,N-二異丙基乙胺。在室溫下攪拌60分鐘後進行濃縮，並藉由製備性HPLC將殘餘物純化。獲得26.4mg(理論之73%)中間體。
LC-MS(方法1)：Rt=1.34min；MS(ESIpos)：m/z=820及822(M+H)+。
將此中間物溶解在3mL 2,2,2-三氟乙醇中。添加6.5mg(0.048mmol)氯化鋅，並在50℃下將混合物攪拌4小時。隨後添加13.9mg (0.048mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸以及2mL 0.1%的三氟乙酸水溶液。藉由製備性HPLC對混合物進行純化。在將相應的溶離份濃縮以及將殘餘物自乙腈/水凍乾後，獲得14.4mg(理論之58%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m/z=676及678(M+H)+。
中間物F120 三氟乙酸--(1S,3S)-3-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊烷羧醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0544-2208
以10mg(0.015mmol)中間物C5為基礎，在有8.4mg(0.022mmol)HATU及13μl N,N-二異丙基乙胺的情況下與11mg(0.03mmol)中間物L53反應，隨後藉由三氟乙酸進行去保護，藉此製備目標化合物。獲得7.5mg(理論之59%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.85min；MS(EIpos)：m/z=748[M+H]+。
中間物F121 三氟乙酸--(1S,3S)-3-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊烷羧醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0545-2209
以10mg(0.016mmol)中間物C49為基礎，在有9mg(0.024mmol)HATU及14μl N,N-二異丙基乙胺的情況下與11.5mg(0.031mmol)中間物L53反應，隨後藉由三氟乙酸進行去保護，藉此製備目標化合物。獲得9mg(理論之61%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.84min；MS(EIpos)：m/z=748[M+H]+。
中間物F122 三氟乙酸--(1S,3S)-3-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊烷羧醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0546-2210
以15mg(0.019mmol)中間物C53為基礎，在有11mg(0.029mmol)HATU及17μl N,N-二異丙基乙胺的情況下與14mg(0.038mmol)中間物L53反應，隨後在3ml DMF中藉由202mg DABCO進行去保護，藉此製備目標化合物。在HPLC純化後，獲得4mg(理論之24%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.87min；MS(EIpos)：m/z=747[M+H]+。
中間物F123 三氟乙酸--(1R,3S)-3-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊烷羧醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0547-2211
以10mg(0.015mmol)中間物C5為基礎，在有8.4mg(0.022mmol)HATU及13μl N,N-二異丙基乙胺的情況下與11mg(0.030mmol)中間物L54反應，隨後藉由三氟乙酸進行去保護，藉此製備目標化合物。獲得4mg(理論之31%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(EIpos)：m/z=748[M+H]+。
中間物F124 三氟乙酸--(1R,3S)-3-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊烷羧醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0548-2212
以10mg(0.016mmol)中間物C49為基礎，在有9mg(0.024mmol)HATU及14μl N,N-二異丙基乙胺的情況下與11.5mg(0.031mmol)中間物L54反應，隨後藉由三氟乙酸進行去保護，藉此製備目標化合物。獲得9mg(理論之66%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.84min；MS(EIpos)：m/z=748[M+H]+。
中間物F125 三氟乙酸--(1R,3S)-3-({(2S)-2-胺基-4-[{(lR)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊烷羧醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0549-2213
以15mg(0.019mmol)中間物C53為基礎，在有11mg(0.029mmol)HATU及17μl N,N-二異丙基乙胺的情況下與14mg(0.038mmol)中間物L54反應，隨後在3ml DMF中藉由127mg DABCO進行去保護，藉此製備目標化合物。在HPLC純化後，獲得3mg(理論之17%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法4)：Rt=1.08min；MS(EIpos)：m/z=769[M+Na]+。
中間物F126 N-(溴乙醯基)-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6-{(2S)-2-胺基-4-[{(4R)-1-[1-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-L-離胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0549-2214
以與中間物F110類似的方式，用18mg(0.027mmol)中間物C49與21mg(0.027mmol)中間物L49製備目標化合物。獲得8.7mg(理論之30%，歷經2個階段)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.94min；LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(ESIpos)：m/z=933及935(M+H)+。
中間物F127 三氟乙酸--(2S)-2-胺基-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2S)-2-甲氧基丙醯基]胺基)-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)丁醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0550-2215
將12mg(0.015mmol)中間物C59溶解在2.4mL DMF中，並摻入14.6mg(0.046mmol)中間物L1、6mg(0.031mmol)1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺-鹽酸鹽、5.9mg(0.039mmol)1-羥基-1H-苯并三唑-水合物以及8μl N,N-二異丙基乙胺。在室溫下攪拌1小時後進行濃縮，並藉由製備性HPLC將殘餘物純化。獲得11mg(理論之70%)此中間體。
LC-MS(方法1)：Rt=1.34min；MS(ESIpos)：m/z=942(M+H)+。
將11mg(0.011mmol)此中間物置於2ml DMF中，並摻入123mg (1.1mmol)1,4-二氮雜雙環(2.2.2)辛烷。在超音波浴中對混合物進行2小時的處理。隨後添加63μl乙酸，並在高真空中將混合物濃縮。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。獲得2mg(理論之22%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(EIpos)：m/z=721[M+H]+。
HPLC(方法11)：Rt=1.95min。
中間物F128 N6-(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-D-丙胺醯基)-N2-{N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基}-L-離胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0551-2216
以3mg(0.005mmol)中間物C5為基礎，在有2.5mg(0.007mmol)HATU及3μl N,N-二異丙基乙胺的情況下與2.5mg(0.003mmol)中間物L55反應，隨後藉由三氟乙酸進行去保護，藉此製備目標化合物。獲得1.4mg(理論之32%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.93min；MS(EIpos)：m/z=1077[M+H]+。
中間物F129 N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺 醯基-N6-{[(1R,3S)-3-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)環戊基]羰基}-L-離胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0552-2217
以10mg(0.016mmol)中間物C49為基礎，以與中間物F128類似的方式，在有12mg(0.031mmol)HATU及14μl N,N-二異丙基乙胺的情況下與19mg(0.024mmol)中間物L56反應，隨後藉由三氟乙酸進行去保護，藉此製備目標化合物。獲得13.5mg(理論之70%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.9min；MS(EIpos)：m/z=1117[M+H]+。
中間物F142 R/S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基}2-氧代乙基}-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-高半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0553-2218
將20.0mg(23.7μmol)R/S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基]--2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-高半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)以及13.4mg(26.04mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧雜十五碳-1-基}丙醯胺溶解在1.0mL DMF中，並摻入4.8mg(47.34μmol)4-甲基嗎啉。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。添加3.6mg(0.06mmol)乙酸，並直接藉由製備性RP-HPLC將反應混合物純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得12.4mg(理論之44%)R/S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-高半胱胺酸化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.30min；MS(ESIpos)：m/z=1129(M+H)+。
將10.0mg(8.85μmol)R/S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-高半胱胺酸溶解在三氟乙醇中，並摻入3.1mg(22.71μmol)二氯化鋅。在50℃下將反應混合物攪拌一夜。為反應混合物摻入3.9mg(0.01mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，短暫攪拌，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並藉由少許水將殘餘物凍乾。獲得7.6mg(理論之78%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.94min；MS(ESIpos)：m/z=983(M+H)+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=0.50(m,1H),0.81(s,9H),1.49(m,1H),1.89(m,1H),2.05(m,1H),2.29-2.43(m,4H),2.45-2.55(m,2H),2.58-2.74(m,2H),3.10-3.20(m,2H),3.21-3.40(m,2H),3.42-3.54(m,16H),3.55-3.65(m,4H),4.28(m,1H),4.91(dd,1H),5.18(dd,1H),5.60(s,1H),6.95(m,1H),7.00(s,2H),7.15-7.38(m,7H),7.53(s,1H),7.68(m,1H),8.00(m,2H).
中間物F143 三氟乙酸--6-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}硫基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]己醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0555-2219
將30.0mg(0.05mmol)2-(三甲基矽基)乙基-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺基甲酸酯以及13.5mg(0.07mmol)6-(乙醯基巰基)己酸置於含一滴水的2.0mL甲醇中。添加23.0mg(0.17mmol)碳酸鉀。在50℃下將反應混合物攪拌4小時。為反應混合物摻入乙酸乙酯。用飽和NaCl溶液洗滌有機相，並透過硫酸鎂對其進行乾燥。在真空中將溶劑蒸發。藉由製備性RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)對殘餘物進行純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得54.2mg(理論之90%)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜二十烷-20-酸化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.49min；MS(ESIpos)：m/z=1106(M+H)+。
將54.0mg(0.07mmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-14-硫雜- 7,11-二氮雜-2-矽雜二十烷-20-酸以及16.7mg(0.09mmol)1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮鹽酸鹽(1：1)置於3.0mL乙腈中，並摻入75.0mg(0.58mmol)N,N-二異丙基乙胺。添加60.0mg(0.09mmol)T3P(50%，乙腈溶液)，並在室溫下攪拌一夜。用水進行淬滅，並直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得42.8mg(理論之68%)2-(三甲基矽基)乙基-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(6-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-6-氧代己基)硫基]乙醯基}胺基)丙基]胺基甲酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.48min；MS(ESIpos)：m/z=866(M+H)+。
將20.0mg(0.02mmol)2-(三甲基矽基)乙基-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(6-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-6-氧代己基)硫基]乙醯基}胺基)丙基]胺基甲酸酯溶解在2.0ml三氟乙醇中，並摻入4.7mg(0.04mmol)二氯化鋅。在50℃下將反應混合物攪拌一夜，隨後摻入10.1mg(0.04mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸並攪拌10分鐘。添加水(0.1% TFA)，並藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得9.2mg(理論之48%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.98min；MS(ESIpos)：m/z=722(M+H)+。
中間物F144 三氟乙酸--N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪 唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0557-2220
將50.0mg(0.1mmol)第三丁基-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺基甲酸酯(中間物C15)置於2.0mL二氯甲烷中，並摻入22.7mg(0.22mmol)三乙胺以及49.3mg(0.22mmol)6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯氯(中間物L60)WISV1648-1-1。
在室溫下將反應混合物攪拌一夜。隨後以2小時為間隔添加三次1當量的中間物L60及1.2當量的三乙胺，隨後在室溫下攪拌一夜。再將上述操作重複兩次在真空中將溶劑移除，並藉由製備性RP-HPLC對殘餘物進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得30.9mg(理論之43%)第三丁基-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基)丙基]胺基甲酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.51min；MS(ESIpos)：m/z=706 (M+H)+。
將24.6mg(0.04mmol)第三丁基-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基)丙基]胺基甲酸酯溶解在3.0mL二氯甲烷中，摻入79.5mg(0.7mmol)TFA，並在室溫下攪拌6小時。再添加79.5mg(0.7mmol)TFA，並在室溫下攪拌一夜。在真空中將溶劑移除，並用二氯甲烷將殘餘物共蒸餾三次。藉由製備性RP-HPLC對殘餘物進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得24.2mg(理論之97%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.02min；MS(ESIpos)：m/z=606(M+H)+。
中間物F145 三氟乙酸--6-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}硫基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]己醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0558-2221
將90.0mg(0.15mmol)第三丁基-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺基甲酸酯(中間物C16)以及43.6mg(0.23mmol)6-(乙醯基巰基)己酸置於含一滴水的9.0mL甲醇中，並摻入73.9mg(0.54mmol)碳酸鉀。在室溫下將反應混合物攪拌4小時，隨後摻入乙酸乙酯。用水/飽和NaCl溶液以及用飽和NaCl溶液洗滌有機相。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，並在真空中將溶劑蒸發。透過矽膠(溶離劑：二氯甲烷/甲醇100：2)對殘餘物進行純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得98.7mg(理論之83%)9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3-氧雜-12-硫雜-5,9-二氮雜十八烷-18-酸化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.44min；MS(ESIpos)：m/z=701(M+H)+。
將20.0mg(0.03mmol)9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3-氧雜-12-硫雜-5,9-二氮雜十八烷-18-酸以及6.5(0.04mmol)1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮鹽酸鹽(1：1)置於1.5mL乙腈中，並摻入23.6mg(0.04mmol)T3P以及29.5mg(0.23mmol)N,N-二異丙基乙胺。在室溫下將反應混合物攪拌一夜，隨後摻入水。藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得16.7mg(理論之99%)第三丁基-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(6-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-6-氧代己基)硫基]乙醯基}胺基)丙基]胺基甲酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.40min；MS(ESIpos)：m/z=823(M+H)+。
將14.8mg(0.02mmol)第三丁基-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(6-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-6-氧代己基)硫基]乙醯基}胺基)丙基]胺基甲酸酯溶解在1.5mL二氯甲烷中，並摻入41.0mg(0.36mmol)TFA。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。
再添加兩次41.0mg(0.36mmol)TFA，並在室溫下攪拌一夜。在真空中將溶劑蒸發，並藉由製備性RP-HPLC對殘餘物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，將殘餘物置於1,4-二噁烷及水中並凍乾。獲得2.9mg(理論之19%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.93min；MS(ESIpos)：m/z=723(M+H)+。
中間物F146 R/S-[2-([(3S)-3-胺基-3-羧基丙基]{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)-2-氧代乙基]-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]高半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0561-2222
將25.0mg(28.12μmol)R/S-[(8S)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8-羧基-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基]高半胱胺酸(中間物C12)以及15.9mg(30.93μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧雜十五碳-1-基}丙醯胺溶解在2.0mL DMF中，並摻入11.4mg(112.48μmol)4-甲基嗎啉。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。添加7.6mg(0.13mmol)乙酸，並直接藉由製備性RP-HPLC將反應混合物純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得23.9mg(理論之59%)R/S-[(8S)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8-羧基-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基]-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]高半胱胺酸化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.26min；MS(ESIpos)：m/z=1173(M+H)+。
將11.8mg(8.23μmol)R/S-[(8S)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8-羧基-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基]-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]高半胱胺酸溶解在三氟乙醇中，並摻入1.7mg(12.35μmol)二氯化鋅。在50℃下將反應混合物攪拌一夜。為反應混合物摻入3.6mg(0.01mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，短暫攪拌，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得5.8mg(理論之62%)目標化合物。
LC-MS(方法4)：Rt=1.20min；MS(ESIpos)：m/z=1029(M+H)+。
中間物F147 三氟乙酸--N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-10-氧代-3,6-二氧雜-16-硫雜-9-氮雜十八烷-18-醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0563-1851
將15.0mg(0.03mmol)9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3-氧雜-12-硫雜-5,9-二氮雜十八烷-18-酸(中間物C13)置於1.5mL乙腈中，並摻入22.1mg(0.17mmol)N,N-二異丙基乙胺，隨後摻入17.7mg(0.03mmol)T3P。在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加9.5mg(0.03mmol)三氟乙酸--1-{2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)(中間物L59)。在室溫下將反應混合物攪拌一夜，並用水對其進行淬滅。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得14.8mg(理論之57%)第三丁基-[19-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-10,18-二氧代-3,6-二氧雜-16-硫雜-9,19-二氮雜二十二烷-22-基]胺基甲酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.40min；MS(ESIpos)：m/z=911 (M+H)+。
將14.2mg(0.02mmol)第三丁基-[19-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-10,18-二氧代-3,6-二氧雜-16-硫雜-9,19-二氮雜二十二烷-22-基]胺基甲酸酯溶解在1.5mL二氯甲烷中，摻入35.5mg(0.31mmol)TFA，並在室溫下攪拌一夜。再添加71.0mg(0.62mmol)TFA，並在室溫下攪拌一夜。在真空中將溶劑蒸發，並藉由製備性RP-HPLC對殘餘物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，將殘餘物置於少量水中並凍乾。獲得14.0mg(理論之97%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.01min；MS(ESIpos)：m/z=811(M+H)+。
中間物F148 三氟乙酸--6-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}硫基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]己醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0564-1852
此目標化合物係中間物F145之合成過程中的副產物。獲得8.1mg(理論之53%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.25min；MS(ESIpos)：m/z=739[M+H]+。
中間物F149 三氟乙酸--R/S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]高半胱胺酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0565-1853
將20.0mg(24.94μmol)R/S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(第三丁氧基羰基)胺基]丙基}胺基)-2-氧代乙基]高半胱胺酸(中間物C14)以及14.1mg(27.44μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧雜十五碳-1-基}丙醯胺置於1.0mLDMF中，並摻入5.1mg(49.88μmol)4-甲基嗎啉。將反應混合物攪拌一夜。添加3.7mg(0.06mmol)乙酸，並直接藉由製備性RP-HPLC將反應混合物純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min， MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得18.2mg(理論之67%)R/S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(第三丁氧基羰基)胺基]丙基}胺基)-2-氧代乙基]-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]高半胱胺酸化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.23min；MS(ESIpos)：m/z=1086(M+H)+。
將17.6mg(0.02mmol)R/S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(第三丁氧基羰基)胺基]丙基}胺基)-2-氧代乙基]-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]高半胱胺酸溶解在1.5mL二氯甲烷中，摻入37.0mg(0.32mmol)TFA，並在室溫下攪拌一夜。再添加74.0mg(0.64mmol)TFA，並在室溫下攪拌一夜。在真空中將溶劑蒸發，並藉由製備性RP-HPLC對殘餘物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，將殘餘物置於少量水中並凍乾。獲得16.0mg(理論之90%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.92min；MS(ESIpos)：m/z=986(M+H)+。
中間物F150 三氟乙酸--N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-[2-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}硫基)乙基]-L-丙胺醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0567-1854
在氬氛圍下，在0℃下為1.0mL DMF中的10.0mg(0.02mmol)三氟乙酸--第三丁基-[3-({[(2-胺基乙基)硫基]乙醯基}{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺基甲酸酯(中間物C20)摻入12.1mg(0.02mmol)N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸(中間物L25)、2.2mg(0.02mmol)HOAt以及7.6mg(0.02mmol)HATU。隨後添加5.5μL(0.03mmol)N,N-二異丙基乙胺，並在室溫下攪拌一夜。為反應混合物摻入1.8μL HOAc，並直接藉由製備性RP-HPLC對其進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得10.4mg(理論之48%)N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-(9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3-氧雜-12-硫雜-5,9-二氮雜十四烷-14-基)-L-丙胺醯胺化合物。
LC-MS(方法4)：Rt=1.60min；MS(ESIpos)：m/z=687.5[M+2H]2+。
將9.5mg(0.01mmol)N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-(9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二 甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3-氧雜-12-硫雜-5,9-二氮雜十四烷-14-基)-L-丙胺醯胺置於1.0mL二氯甲烷中，摻入15.8mg(0.14mmol)TFA，並攪拌一夜。再添加31.6mg(0.28mmol)TFA，並攪拌一夜。在真空中將溶劑蒸發，並藉由製備性RP-HPLC對殘餘物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，將殘餘物置於少量水中並凍乾。獲得10.2mg(理論之98%)目標化合物。
LC-MS(方法4)：Rt=1.13min；MS(ESIpos)：m/z=637.5[M+2H]2+。
中間物F151 N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-(3-{(2S)-5-(2,5-二氟苯基)-3-[甲氧基(甲基)胺甲醯基]-2-苯基-2,3-二氫-1,3,4-噻二唑-2-基}丙基)-L-丙胺醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0568-2617
將5.0mg(0.01mmol)(2S)-2-(3-胺基丙基)-5-(2,5-二氟苯基)-N-甲氧基-N-甲基-2-苯基-1,3,4-噻二唑-3(2H)-羧醯胺置於1.0mL乙腈中，並摻入7.7mg(0.06mmol)N,N-二異丙基乙胺以及9.8(0.02mmol)T3P。在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加9.1mg(0.02mmol)N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸(中間物L44)。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。添加水，並直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進 行純化(柱：Reprosil 250x40；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得4.3mg(理論之35%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.02min；MS(ESIpos)：m/z=989[M+H]+。
中間物F152 N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-(3-{(2S)-5-(2,5-二氟苯基)-3-[甲氧基(甲基)胺甲醯基]-2-苯基-2,3-二氫-1,3,4-噻二唑-2-基}丙基)-L-丙胺醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0569-2618
將5.0mg(0.01mmol)(2S)-2-(3-胺基丙基)-5-(2,5-二氟苯基)-N-甲氧基-N-甲基-2-苯基-1,3,4-噻二唑-3(2H)-羧醯胺置於1.0mL乙腈中，並摻入7.7mg(0.06mmol)N,N-二異丙基乙胺以及9.8(0.02mmol)T3P。在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加11.8mg(0.02mmol)N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸(中間物L25)。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。添加水，並直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得4.7mg(理論之34%)目標化合物。
LC-MS(方法4)：Rt=1.34min；MS(ESIpos)：m/z=1165 [M+H]+。
中間物F153 三氟乙酸--(2S)-2-胺基-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2S)-2-羥基丙醯基]胺基)-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)丁醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0570-1857
以中間物C60為基礎，以與中間物F104類似的方式進行合成。
LC-MS(方法1)：Rt=1.1min；MS(ESIpos)：m/z=707(M+H)+。
中間物F154 N6-(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-beta-丙胺醯基)-N2-{N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基}-L-離胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0570-1858
以與中間物F2類似的方式，用10mg(0.015mmol)中間物C8與15mg(0.022mmol)中間物L6製備目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.91min；LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(ESIpos)：m/z=1077(M+H)+。
中間物F155 N6-(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-beta-丙胺醯基)-N2-{N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基}-L-離胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0571-1859
在有8.7mg(0.023mmol)HATU及17μl N,N-二異丙基乙胺的情況下將14mg(0.019mmol)中間物C61與15mg(0.021mmol)中間物L61偶聯，隨後如就中間物F119所述，在三氟乙醇中藉由氯化鋅進行去保護，藉此製備目標化合物。在藉由製備性HPLC純化後，獲得13mg(理論之59%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(ESIpos)：m/z=1076(M+H)+。
中間物F156 N-(溴乙醯基)-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基) 胺基]丁醯基}-L-離胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0572-1860
首先以N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸為基礎，按照經典的肽化學方法(用2-(三甲基矽基)乙醇藉由EDCI/DMAP進行酯化，氫解，在有HATU的情況下與N-[(苄氧基)羰基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸偶聯，再氫解)製備三肽衍生物2-(三甲基矽基)乙基-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸酯。
將84mg(0.163mmol)此中間物置於2.5ml DMF中，並摻入58mg(0.244mmol)1-(2-溴乙醯氧基)吡咯啶-2,5-二酮。在室溫下攪拌10分鐘後進行濃縮，將殘餘物置於乙腈/水1：1中，藉由三氟乙酸調整至pH 2，並藉由製備性HPLC進行純化。在將相應的溶離份濃縮後，將殘餘物置於5%的三氟乙酸的DCM溶液中，並在室溫下攪拌2小時。隨後在輕微冷卻的情況下進行濃縮，並將殘餘物自乙腈/水1：1凍乾。歷經2個階段獲得53mg(理論之50%)此中間物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.72min；MS(ESIpos)：m/z=537及539(M+H)+。
為合成目標化合物，將18mg(0.027mmol)此中間物置於4ml DMF中，摻入16mg(0.025mmol)中間物C61，以及19mg HATU及9μL N,N-二異丙基乙胺。在室溫下攪拌5分鐘後添加數滴水，並藉由製 備性HPLC將混合物純化。在將相應的溶離份濃縮以及自乙腈/水1：1凍乾後，將獲得之中間物溶解在3mL 2,2,2-三氟乙醇中。在添加4.8mg(0.035mmol)氯化鋅後，在50℃下將混合物攪拌2.5小時。隨後添加10mg(0.035mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，用乙腈/水將混合物稀釋，並進行過濾。藉由製備性HPLC進行純化。在將相應的溶離份濃縮以及將殘餘物自乙腈/水凍乾後，歷經2個階段獲得3.2mg(理論之13%)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.94min； LC-MS(方法5)：Rt=2.79min；MS(ESIpos)：m/z=932及934(M+H)+。
中間物F163 N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-L-離胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0573-1861
在有HATU的情況下將37mg(0.056mmol)中間物C58與41mg(0.056mmol)中間物L61偶聯，隨後如就中間物F119所述，藉由氯化鋅進行去阻斷，藉此製備目標化合物。獲得12mg(理論之19%，歷經2個階段)目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.49min； LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(ESIpos)：m/z=1005(M+H)+。
中間物F164 N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯基-N6-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-L-離胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0574-1862
以與中間物F155類似的方式，在有HATU以及N,N-二異丙基乙胺的情況下將20mg(0.030mmol)中間物C58與27mg(0.033mmol)中間物L62偶聯，隨後在三氟乙醇中藉由氯化鋅進行去保護，藉此製備目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.92min；LC-MS(方法1)：Rt=0.87min；MS(ESIpos)：m/z=1091(M+H)+。
中間物F165 N6-(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-beta-丙胺醯基)-N2-{N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯基}-L-離胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0575-1863
以與中間物F155類似的方式，在有HATU的情況下將15mg(0.021mmol)中間物C61與18mg(0.023mmol)中間物L62偶聯，隨後在三氟乙醇中藉由氯化鋅進行去保護，藉此製備目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m/z=1162(M+H)+。
中間物F166 N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯基-N6-{[(1R,3S)-3-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)環戊基]羰基}-L-離胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0575-1864
首先以市售之(1R,3S)-3-[(第三丁氧基羰基)胺基]環戊烷羧酸為基礎，按照傳統的肽化學方法用苄醇藉由EDCI/DMAP進行酯化，隨後在DCM中藉由TFA將第三丁氧基羰基保護基團脫除，藉此製備三氟乙酸-苄基-(1R,3S)-3-胺基環戊烷羧酸酯(1：1)。
將51mg(0.076mmol)此中間物置於6ml DMF中，並在有HATU及 N,N-二異丙基乙胺的情況下與50mg(0.076mmol)中間物C58偶聯。在藉由製備性HPLC進行純化後，將中間物置於甲醇中，並在室溫下藉由10%的鈀-活性炭在氫正常壓力下進行2小時的氫化。隨後將催化劑濾出，在真空中將溶劑移除，並藉由製備性HPLC將產物純化。在自二噁烷凍乾後，獲得21mg(理論之34%，歷經2個階段)(1R,3S)-3-{[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丁醯基]胺基}環戊烷羧酸。
隨後以與中間物F155類似的方式，在有HATU的情況下將10.5mg(0.013mmol)此中間物與11.4mg(0.014mmol)中間物L62偶聯，隨後在三氟乙醇中藉由氯化鋅進行去保護，藉此製備目標化合物。在藉由製備性HPLC純化後，獲得8.6mg(理論之48%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m/z=1203(M+H)+。
中間物F167 N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6-{[(1R,3S)-3-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-4-[1-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)環戊基]羰基}-L-離胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0576-1865
以11mg(0.016mmol)中間物C5為基礎，以與中間物F129類似的方式，在有12mg(0.032mmol)HATU及14μl N,N-二異丙基乙胺的情況下與20mg(0.024mmol)中間物L56反應，隨後藉由三氟乙酸進行去保護，藉此製備目標化合物。獲得11mg(理論之46%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法4)：Rt=1.13min；MS(EIpos)：m/z=1117[M+H]+。
中間物F168 N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6-{[(1R,2S)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)環戊基]羰基}-L-離胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0577-1866
首先以市售之(1R,2S)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]環戊烷羧酸為基礎，按照傳統的肽化學方法用苄醇藉由EDCI/DMAP進行酯化，隨後在DCM中藉由TFA將第三丁氧基羰基保護基團脫除，藉此製備三氟乙 酸-苄基-(1R,2S)-2-胺基環戊烷羧酸酯(1：1)。
將102mg(0.305mmol)此中間物置於12ml DMF中，並在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下與100mg(0.152mmol)中間物C58偶聯。在藉由製備性HPLC進行純化後，將中間物置於甲醇中，並在室溫下藉由10%的鈀-活性炭在氫正常壓力下進行2小時的氫化。隨後將催化劑濾出，在真空中將溶劑移除，並藉由製備性HPLC將產物純化。在自乙腈/水1：1凍乾後，獲得70mg(理論之59%，歷經2個階段)(1R,2S)-2-{[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丁醯基]胺基}環戊烷羧酸。
在有9.5mg(0.025mmol)HATU及18μl N,N-二異丙基乙胺的情況下將20mg(0.013mmol)此中間物與16.6mg(0.023mmol)中間物L61偶聯，隨後如就中間物F119所述，在三氟乙醇中藉由氯化鋅進行去保護，藉此製備目標化合物。在藉由製備性HPLC純化後，獲得9.3mg(理論之30%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.98min；MS(ESIpos)：m/z=1116(M+H)+。
中間物F169 N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯基-N6-{[(1R,2S)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)環戊基]羰基}-L-離胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0579-1867
以中間物C58與L62為基礎，以與中間物F168類似的方式合成目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.91min；MS(ESIpos)：m/z=1202(M+H)+。
中間物F170 N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯基-N6-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-D-離胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0579-1868
以與非對映異構體中間物F23類似的方式製備目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.9min；LC-MS(方法1)：Rt=0.83min；MS(ESIpos)：m/z=1092(M+H)+。
中間物F171 N6-(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-D-丙胺醯基)-N2-{N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基}-L-離胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0580-1869
以中間物C62與L62為基礎，以與中間物F155類似的方式合成目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.93min；MS(ESIpos)：m/z=1076(M+H)+。
中間物F172 N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-L-麩醯胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0580-1870
以10mg(0.013mmol)中間物C63為基礎，在有5.5mg(0.014mmol)HATU及11μl N,N-二異丙基乙胺的情況下與9mg(0.014mmol)中間物L63偶聯，隨後透過在三氟乙酸/二氯甲烷1：1溶液中攪拌2.5小時進行去保護，藉此製備目標化合物。獲得11mg(理論之72%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.9min；MS(Elpos)：m/z=1049[M+H]+。
中間物F173 N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-L-麩醯胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0581-1871
以15mg(0.018mmol)中間物C64為基礎，在有7.7mg(0.02mmol)HATU及16μl N,N-二異丙基乙胺的情況下與12mg(0.02mmol)中間物L63偶聯，隨後如就中間物F119所述，在三氟乙醇中藉由氯化鋅進行去保護，藉此製備目標化合物。在藉由製備性HPLC純化後，獲得12mg(理論之58%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.91min；MS(EIpos)：m/z=1048[M+H]+。
中間物F174 N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-L-麩醯胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0582-1872
以中間物C57與L63為基礎，以與中間物F172類似的方式製備目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.9min；MS(EIpos)：m/z=1049[M+H]+。
中間物F175 三氟乙酸--N-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0582-1873
在有6.7mg(0.018mmol)HATU及9μl N,N-二異丙基乙胺的情況下將11mg(0.013mmol)中間物C64與3.4mg(0.016mmol)6-(2,5-二氧 代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸偶聯，隨後如就中間物F119所述，在三氟乙醇中藉由氯化鋅進行去保護，藉此製備目標化合物。在藉由製備性HPLC純化後，獲得8mg(理論之69%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.35min；MS(EIpos)：m/z=893[M+H]+。
中間物F176 三氟乙酸--(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-12-氧代-3,6,9-三氧雜-13-氮雜十五烷-15-基]丁醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0583-1874
在有3.5mg(0.009mmol)HATU及4μl N,N-二異丙基乙胺的情況下將5mg(0.006mmol)中間物C64與2mg(0.007mmol)3-(2-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸(其製備參閱就中間物L15所作描述)偶聯，隨後如就中間物F119所述，在三氟乙醇中藉由氯化鋅進行去保護，藉此製備目標化合物。在藉由製備性HPLC純化後，獲得2mg(理論之35%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(EIpos)：m/z=839[M+H]+。
中間物F177 三氟乙酸--(1R,2S)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)環戊烷羧醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0584-1875
以與中間物F168類似的方式製備目標化合物，其中用中間物L1取代中間物L61。
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(EIpos)：m/z=804[M+H]+。
中間物F178 三氟乙酸--(1R,2S)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)-N-{2-[(溴乙醯基)胺基]乙基}環戊烷羧醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0585-1876
以與中間物F177類似的方式製備目標化合物，其中用中間物L52取代中間物L1。
LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(EIpos)：m/z=787及789[M+H]+。
中間物F179 三氟乙酸--(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己基]丁醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0585-1877
在有13mg(0.034mmol)HATU及16μl N,N-二異丙基乙胺的情況下將15mg(0.023mmol)中間物C58與6mg(0.025mmol)1-(6-胺基己基)-1H-吡咯-2,5-二酮偶聯，隨後如就中間物F119所述，在三氟乙醇中藉由氯化鋅進行去保護，藉此製備目標化合物。在藉由製備性 HPLC純化後，獲得8.5mg(理論之46%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法6)：Rt=2.22min；MS(EIpos)：m/z=692[M+H]+。
中間物F180 N-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-N2-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-麩醯胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0586-1878
在有7mg(0.018mmol)HATU及6μl N,N-二異丙基乙胺的情況下將9.6mg(0.012mmol)中間物C64與5mg(0.013mmol)中間物L64偶聯，隨後如就中間物F119所述，在三氟乙醇中藉由氯化鋅進行去保護，藉此製備目標化合物。在藉由製備性HPLC純化後，獲得3.1mg(理論之28%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.85min；MS(EIpos)：m/z=822[M+H]+。
中間物F192 N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}-L-丙胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0587-1879
將60mg(0.091mmol)中間物C58置於8ml DMF中，並在有42mg(0.11mmol)HATU以及64μL N,N-二異丙基乙胺的情況下，與45mg(0.100mmol)中間物L65偶聯。在藉由製備性HPLC進行純化後，將中間物置於10ml乙醇中，並在室溫下藉由10%的鈀-活性炭在氫正常壓力下進行45分鐘的氫化。隨後將催化劑濾出，在真空中將溶劑移除，並藉由製備性HPLC將產物純化。在自乙腈/水1：1凍乾後，獲得24.5mg(理論之31%，歷經2個階段)2-(三甲基矽基)乙基-3-胺基-N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丁醯基]-L-丙胺酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.17min；MS(EIpos)：m/z=844[M+H]+。
在有5.4mg(0.014mmol)HATU及8μl N,N-二異丙基乙胺的情況下將10mg(0.012mmol)此中間物與2mg(0.013mmol)市售之(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸中間物偶聯，隨後如就中間物F119所述，在三氟乙醇中藉由氯化鋅進行去保護，藉此製備目標化合物。在藉由製備性HPLC純化後，獲得3.5mg(理論之33%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.81min；MS(ESIpos)：m/z=737(M+H)+。
中間物F193 N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}-D-丙胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0588-1880
以3-{[(苄氧基)羰基]胺基}-N-(第三丁氧基羰基)-D-丙胺酸-N-環己基環己胺(1：1)為基礎，以與中間物F192類似的方式合成目標化合物2
LC-MS(方法1)：Rt=0.87min；MS(ESIpos)：m/z=7-37(M+H)+。
中間物F194 N-{5-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-5-氧代戊醯基}-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0588-1881
如下製備目標化合物：首先以實例98為基礎，在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下與N-[(苄氧基)羰基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸偶聯。在下一步中，在室溫下藉由10%的鈀-活性炭在氫正常壓力下進行1小時的氫化，以將Z保護基團脫除，隨後如就中間物F58所述，藉由與1,1'-[(1,5-二氧代戊烷-1,5-二基)雙(氧基)]二吡咯啶-2,5-二酮反應將經去保護之中間物轉化成目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.19min；MS(ESIpos)：m/z=851[M+H]+。
中間物F195 三氟乙酸--N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁基}-N'-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]丁二醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0589-1882
在8ml DMF中在有40mg(0.1054mmol)HATU及61μl N,N-二異丙基乙胺的情況下將26mg(0.035mmol)中間物C65與18mg(0.07mmol)市售之三氟乙酸--1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)偶聯，隨後如就中間物F119所述，在三氟乙醇中藉由氯化鋅進行去保護，藉此製備目標化合物。在藉由製備性HPLC純化後，獲得16mg(理論之43%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.85min；MS(ESIpos)：m/z=721(M+H)+。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)：δ=7.99(t,1H),7.95(t,1H),7.6-7.75(m,4H),7.5(s,1H)7.2-7.4(m,6H),6.8-7.0(m,4H),5.63(s,1H),4.9及5.2(2d,2H),4.26及4.0(2d,2H),3.3-3.6(m,4H),3.15-3.25(m,3H),2.85-3.0(m,2H),2.2-2.3(m,4H),0.64及1,49(2m,2H),0.81(s,9H).
中間物F196 三氟乙酸--2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基-N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-beta-丙胺酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0590-1883
首先將15mg(0.023mmol)中間物C58置於4ml DMF中，並在有13.0mg(0.034mmol)HATU以及16μL N,N-二異丙基乙胺的情況下，與8.2mg(0.025mmol)中間物L67反應。在室溫下攪拌30分鐘後進行濃縮，並藉由製備性HPLC將殘餘物純化。在將相應的溶離份合併以及將溶劑濃縮後，將殘餘物自乙腈/水1：1凍乾。獲得4.3mg(理論之20%)受保護的中間物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.35min；MS(EIpos)：m/z=852[M+H]+。
將4.3mg(4.5μmol)中間體溶解在1ml三氟乙醇中，並且如就中間物F119所述，藉由3.65mg(27μmol)氯化鋅進行去保護。在藉由製備性HPLC純化後，獲得1mg(理論之25%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m/z=708(M+H)+
中間物F204 三氟乙酸--(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-(2-{[3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯基]胺基}乙基)丁醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0591-1884
首先在有17mg(0.046mmol)HATU及20μl N,N-二異丙基乙胺的情況下，使25mg(0.038mmol)中間物C58與16.5mg(75%)(0.038mmol)中間物L68發生反應。在室溫下攪拌60分鐘後進行濃縮，並藉由製備性HPLC將殘餘物純化。獲得18.3mg(理論之56%)受保護的中間物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.32min；MS(EIpos)：m/z=851[M+H]+。
在第二步中，將此中間物溶解在3mL 2,2,2-三氟乙醇中。添加12mg(0.086mmol)氯化鋅，並在50℃下將混合物攪拌2小時。隨後添加25mg(0.086mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸以及2mL 0.1%的三氟乙 酸水溶液。藉由製備性HPLC對混合物進行純化。在將相應的溶離份濃縮以及將殘餘物自乙腈/水凍乾後，獲得11mg(理論之62%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.85min；MS(ESIpos)：m/z=707(M+H)+。
中間物F205 三氟乙酸--1-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]哌啶-4-基-N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-beta-丙胺醯基-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0592-1885
如下進行合成：在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下將25mg(0.034mmol)中間物C61與29mg(0.041mmol)中間物L69偶聯，隨後在正常壓力下藉由鈀-活性炭(10%)進行氫化，隨後在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下與(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸偶聯，最後藉由氯化鋅將2-(三甲基矽基)乙氧基羰基保護基團脫除。在HPLC純化後，獲得11mg(理論之26%，歷經4個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(ESIpos)：m/z=1061 (M+H)+。
中間物F206 三氟乙酸--1-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]哌啶-4-基-N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-beta-丙胺醯基-L-纈胺醯基-L-丙胺酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0593-1886
以與中間物F205類似的方式進行合成。
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(ESIpos)：m/z=975(M+H)+。
中間物F207 N6-(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-beta-丙胺醯基)-N2-{N-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基}-L-離胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0593-1887
以與中間物F155類似的方式製備目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.81min；MS(ESIpos)：m/z=1020(M+H)+。
中間物F209 R-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0594-1888
將93.9mg(0.78mmol)L-半胱胺酸懸浮在由93.0mg(1.11mmol)碳酸氫鈉與0.9mL水構成的溶液中。添加70.0mg(0.11mmol)的溶解於6.0mL異丙醇中的2-(三甲基矽基)乙基-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺基甲酸酯(中間物C70)，以及202.3mg(1.33mmol)1,8-二氮雜雙環(5.4.0)十一碳-7-烯。在50℃下將反應混合物攪拌90分鐘。為混合物摻入水(0.1% TFA)，並藉由製備性RP-HPLC將其純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得53.9mg(理論之59%)R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.24min；MS(ESIpos)：m/z=717(M+H)+。
將86.0mg(0.1mmol)R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)以及58.5mg(0.11mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧雜十五碳-1-基}丙醯胺溶解在4.0mL DMF中，並摻入20.9mg(0.21mmol)4-甲基嗎啉。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。添加15.5mg(0.26mmol)HOAc，並直接藉由製備性RP-HPLC將反應混合物純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水；0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得68.6mg(理論之59%)R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-半胱胺酸化合物。
LC-MS(方法6)：Rt=2.88min；MS(ESIpos)：m/z=1115(M+H)+。
將46.4mg(0.04mmol)R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-半胱胺酸溶解在2.0mL三氟乙醇中，並摻入17.0mg(0.13mmol)二氯化鋅。在50℃下將反應混合物攪拌一夜。再添加8.5mg(0.07mmol)二氯化鋅，並在50℃下攪拌一夜。為反應混合物摻入36.5mg(0.13mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由 製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得19.4mg(理論之43%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.94min；MS(ESIpos)：m/z=971(M+H)+。
中間物F210 S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-D-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0596-1889
以與中間物F209之合成類似的方式，用D-半胱胺酸製備目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.91min；MS(ESIpos)：m/z=971(M+H)+。
中間物F211 三氟乙酸--3-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}硫基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]丙醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0597-1890
將30.0mg(0.05mmol)2-(三甲基矽基)乙基-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺基甲酸酯(中間物C70)與5.5mg(0.05mmol)3-巰基丙酸一起置於包含一滴水的0.5mL甲醇中。隨後添加23.0mg(0.17mmol)碳酸鉀，並在50℃下將反應混合物攪拌4小時。添加乙酸乙酯，並用水以及用飽和NaCl溶液分別將有機相洗滌一次。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，並在真空中將溶劑蒸發。將殘餘物應用於下一合成階段，而不對其作進一步純化。獲得30.3mg(理論之86%)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-酸化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.39min；MS(ESIpos)：m/z=702(M+H)+。
將30.0mg(0.04mol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-酸以及9.8mg(0.06mmol)1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮鹽酸鹽(1：1)置於2.0mL乙腈中，並摻入44.2mg (0.34mmol)N,N-二異丙基乙按。添加35.4mg(0.06mmol)T3P(50%，乙酸乙酯溶液)，並在室溫下將反應混合物攪拌一夜。添加水，並直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得22.0mg(理論之63%)2-(三甲基矽基)乙基-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-3-氧代丙基)硫基]乙醯基}胺基)丙基]胺基甲酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.41min；MS(ESIpos)：m/z=824(M+H)+。
將22.0mg(0.03mol)2-(三甲基矽基)乙基-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-3-氧代丙基)硫基]乙醯基}胺基)丙基]胺基甲酸酯溶解在1.0mL三氟乙醇中，並摻入9.1mg(0.07mmol)二氯化鋅。在50℃下將反應混合物攪拌5小時。為反應混合物摻入19.5mg(0.07mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得15.0mg(理論之71%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m/z=680(M+H)+。
中間物F212 三氟乙酸--N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-10-氧代-3,6-二氧雜-13-硫雜-9-氮雜十五烷-15-醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0599-1891
將28.8mg(0.04mmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-酸(中間物C69)與18.3mg(0.05mmol)三氟乙酸--1-{2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)(中間物L59)一起置於1.9mL乙腈中隨後添加42.4mg(0.33mmol)N,N-二異丙基乙胺，並滴加33.9mg(0.05mmol)T3P(50%，乙酸乙酯溶液)。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得10.7mg(理論之26%)2-(三甲基矽基)乙基-[16-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-10,15-二氧代-3,6-二氧雜-13-硫雜-9,16-二氮雜十九烷-19-基]胺基甲酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.44min；MS(ESIpos)：m/z=812(M+H)+。
將10.7mg(0.01mol)2-(三甲基矽基)乙基-[16-{(1R)-1-[1-苄基-4- (2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-10,15-二氧代-3,6-二氧雜-13-硫雜-9,16-二氮雜十九烷-19-基]胺基甲酸酯溶解在0.8mL三氟乙醇中，並摻入8.0mg(0.06mmol)二氯化鋅。在50℃下將反應混合物攪拌5小時。為反應混合物摻入17.1mg(0.06mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。
LC-MS(方法1)：Rt=1.03min；MS(ESIpos)：m/z=768(M+H)+。
中間物F213 三氟乙酸--3-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基1-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}硫基)-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)丙醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0600-1892
將27.5mg(0.04mmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-14-硫雜- 7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-酸(中間物C69)與15.9mg(0.05mmol)三氟乙酸--N-(2-胺基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺(1：1)(中間物L1)一起置於1.8mL乙腈中。隨後添加32.4mg(0.31mmol)N,N-二異丙基乙胺，並滴加32.4mg(0.05mmol)T3P(50%，乙酸乙酯溶液)。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得11.9mg(理論之35%)2-(三甲基矽基)乙基-[13-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,7,12-三氧代-10-硫雜-3,6,13-三氮雜十六烷-16-基]胺基甲酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.39min；MS(ESIpos)：m/z=881(M+H)+。
將11.9mg(0.01mol)2-(三甲基矽基)乙基-[13-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,7,12-三氧代-10-硫雜-3,6,13-三氮雜十六烷-16-基]胺基甲酸酯溶解在1.0mL三氟乙醇中，並摻入5.5mg(0.04mmol)二氯化鋅。在50℃下將反應混合物攪拌一夜。為反應混合物摻入11.8mg(0.04mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得7.4mg(理論之60%)目標化合物。
LC-MS(方法5)：Rt=2.75min；MS(ESIpos)：m/z=737(M+H)+。
中間物F214 N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-alpha-麩胺醯基-S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0602-2619
將111.7mg(0.30mmol)(2S)-5-(苄氧基)-2-{[(苄氧基)羰基]胺基}-5-氧代戊酸置於3.0mL DMF中，並摻入46.1(0.30mmol)HOBt、96.6mg(0.30mmol)TBTU以及38.9mg(0.30mmol)N,N-二異丙基乙胺。在室溫下將反應混合物攪拌10分鐘。隨後添加250.0mg(0.30mmol)溶解於116.3mg(0.9mmol)N,N-二異丙基乙胺及3.0mL DMF中的S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)(中間物C71)。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得257.0mg(理論之80%)(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16-{[(2S)-5-(苄氧基)-2-{[(苄氧基)羰基]胺基}-5-氧代戊醯基]胺基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-酸化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.55min；MS(ESIpos)：m/z=1071 (M+H)+。
在氬氛圍下將24.6mg(0.11mmol)乙酸鈀(II)置於5.0mL二氯甲烷中，並摻入33.2mg(0.33mmol)三乙胺以及254.3mg(2.19mmol)三乙基矽烷。在室溫下將反應混合物攪拌5分鐘，並摻入234.1mg(0.22mmol)的溶解於5.0mL二氯甲烷中的(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16-{[(2S)-5-(苄氧基)-2-{[(苄氧基)羰基]胺基}-5-氧代戊醯基]胺基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-酸。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。藉由紙板過濾器對反應混合物進行過濾，並用二氯甲烷對濾渣進行洗滌。以不加熱的方式在真空中將溶劑蒸發。藉由製備性RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)對殘餘物進行純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得177.5mg(理論之85%)L-alpha-麩胺醯基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.07min；MS(ESIpos)：m/z=846(M+H)+。
將20.0mg(20.83μmol)L-alpha-麩胺醯基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)與11.8mg(22.91μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧雜十五碳-1-基}丙醯胺一起置於1.5mL DMF中，並摻入6.3mg(62.49μmol)4-甲基嗎啉。在室溫下將反應混合物攪拌一夜，隨後摻入4.4mg(0.07mmol)乙酸。直接藉由製備性RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ， 流量：50mL/min，MeCN/水)對反應混合物進行純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得19.1mg(理論之74%)N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-alpha-麩胺醯基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.24min；MS(ESIpos)：m/z=1244(M+H)+。
將17.5mg(14.06μmol)N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-alpha-麩胺醯基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺溶解在1.5mL三氟乙醇中，並摻入11.5mg(84.37μmol)二氯化鋅。在50℃下將反應混合物攪拌4小時。為反應混合物摻入24.7mg(0.08mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得10.8mg(理論之63%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(ESIpos)：m/z=1100(M+H)+。
中間物F215 N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-{3-[({[(2R)-2-乙醯胺基-2-羧乙基]硫基}乙醯基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]丙基}-L-丙胺醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0605-1894
將14.9mg(0.02mmol)N-乙醯基-S-[2-([3-(L-丙胺醯基胺基)丙基]{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)-2-氧代乙基]-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)(實例229)以及7.1mg(0.02mmol)2,5-二氧代吡咯啶-1-基-N-[(苄氧基)羰基]-L-纈胺酸酯置於1.0mL DMF中，並摻入5.7mg(0.06mmol)4-甲基嗎啉。在室溫下將反應混合物攪拌一夜，隨後摻入4.5mg(0.08mmol)乙酸。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得13.3mg(理論之78%)N-[(苄氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{3-[({[(2R)-2-乙醯胺基-2-羧乙基]硫基}乙醯基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]丙基}-L-丙胺醯胺化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.24min；MS(ESIpos)：m/z=919(M+H)+。
將11.1mg(0.01mmol)N-[(苄氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{3-[({[(2R)-2-乙醯胺基-2-羧基-乙基]硫基}乙醯基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基-丙基}胺基]丙基}-L-丙胺醯胺溶解在5.0mL乙醇中，摻入1.0mg鈀-活性炭(10%)，並在室溫及正常壓力下氫化一夜。藉由矽藻土對反應混合物進行過濾，並用乙醇 /THF/水之混合物對濾渣進行洗滌。在真空中將溶劑蒸發，並藉由製備性RP-HPLC對殘餘物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並將殘餘物凍乾。獲得7.5mg(理論之69%)L-纈胺醯基-N-{3-[({[(2R)-2-乙醯胺基-2-羧乙基]硫基}乙醯基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]丙基}-L-丙胺醯胺-三氟乙酸(1：1)化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(ESIpos)：m/z=785(M+H)+。
將7.3mg(8.12μmol)L-纈胺醯基-N-{3-[({[(2R)-2-乙醯胺基-2-羧乙基]硫基}乙醯基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]丙基}-L-丙胺醯胺-三氟乙酸(1：1)與4.6mg(8.93μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧雜十五碳-1-基}丙醯胺一起置於0.5mL DMF中，並摻入2.5mg(24.36μmol)4-甲基嗎啉。在室溫下將反應混合物攪拌一夜，隨後摻入4.4mg(0.03mmol)乙酸。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得4.9mg(理論之50%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.07min；MS(ESIpos)：m/z=1183(M+H)+。
中間物F216 S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-半胱 胺醯基-beta-丙胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0607-1895
在氬氛圍下將30.2mg(0.06mmol)N,N'-雙[(苄氧基)羰基]-L-半胱胺酸置於2.0mL水及2.0mL異丙醇中，並摻入56.7mg(0.20mmol)TCEP。在室溫下將反應混合物攪拌30分鐘。隨後添加50.0mg(0.08mmol)的溶解於2.0mL異丙醇中的2-(三甲基矽基)乙基-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺基甲酸酯(中間物C70)以及122.2mg(0.48mmol)1,8-二氮雜雙環(5.4.0)十一碳-7-烯，並在50℃下將反應混合物攪拌7小時。隨後再添加122.2mg(0.48mmol)1,8-二氮雜雙環(5.4.0)十一碳-7-烯，並在50℃下將反應混合物攪拌1小時。用乙酸乙酯進行稀釋，用水及飽和碳酸氫鈉溶液對有機相進行萃取，並用飽和NaCl溶液對其進行洗滌。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，並在真空中將溶劑蒸發。藉由製備性RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)對殘餘物進行純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得43.1mg(理論之64%)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[(苄氧基)羰基]-L-半胱胺酸化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.46min；MS(ESIpos)：m/z=851 (M+H)+。
將16.5mg(0.05mmol)4-甲基苯磺酸-苄基-beta-丙胺酸酯(1：1)與14.0mg(0.11mmol)N,N-二異丙基乙胺一起置於1.5mL乙腈中。在室溫下將反應混合物攪拌3分鐘，隨後摻入30.8mg(0.04mmol)溶解於1.5mL乙腈中的S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[(苄氧基)羰基]-L-半胱胺酸、23.4mg(0.18mmol)N,N-二異丙基乙胺以及29.9mg(0.05mmol)T3P(50%，乙酸乙酯溶液)。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。添加水，並直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得苄基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[(苄氧基)羰基]-L-半胱胺醯基-beta-丙胺酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.59min；MS(ESIpos)：m/z=1012(M+H)+。
將43.8mg(43.3μmol)苄基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[(苄氧基)羰基]-L-半胱胺醯基-beta-丙胺酸酯溶解在8.0mL乙醇中，摻入4.4mg鈀-活性炭(10%)，並在室溫及正常壓力下氫化一夜。藉由紙板過濾器對反應混合物進行過濾，並用乙醇對濾渣進行洗滌。在真空中將溶劑蒸發。以上述方式再對殘餘物進行兩次處理。藉由製備性RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)對殘餘物進行純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲 得14.5mg(理論之37%)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺醯基-beta-丙胺酸-三氟乙酸(1：1)化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.08min；MS(ESIpos)：m/z=788(M+H)+。
將14.5mg(16.1μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺醯基-beta-丙胺酸-三氟乙酸(1：1)與9.1mg(17.7μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧雜十五碳-1-基}丙醯胺一起置於1.0mL DMF中，並摻入4.9mg(48.2μmol)4-甲基嗎啉。在室溫下將反應混合物攪拌一夜，隨後摻入3.4mg(0.06mmol)乙酸。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得4.9mg(理論之50%)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺醯基-beta-丙胺酸-三氟乙酸(1：1)化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.28min；MS(ESIpos)：m/z=1186(M+H)+。
將14.1mg(11.9μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-半胱胺醯基-beta-丙胺酸-三氟乙酸(1：1)溶解在1.5mL三氟乙醇中，並摻入9.7mg (71.3μmol)二氯化鋅。在50℃下將反應混合物攪拌3小時。再添加9.7mg(71.3μmol)二氯化鋅，並在50℃下將反應混合物攪拌3小時。再添加9.7mg(71.3μmol)二氯化鋅，並在70℃下攪拌4小時。為反應混合物摻入20.8mg(0.07mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並將殘餘物凍乾。獲得6.2mg(理論之44%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.82min；MS(ESIpos)：m/z=1042(M+H)+。
中間物F217 S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}-N-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0610-1896
在氬氛圍下，將7.5mg(0.05mmol)(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸置於1.5mL DMF中，並摻入7.5mg(0.05mmol)HOBt、15.5mg(0.05mmol)TBTU以及6.2mg(0.05mmol)N,N-二異丙基乙胺。在室溫下將反應混合物攪拌10分鐘。隨後添加40.0mg(0.05 mmol)溶解於1.5mL DMF中的S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)(中間物C71)以及18.7mg(0.14mmol)N,N-二異丙基乙胺，並在室溫下將反應混合物攪拌一夜。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得11.2mg(理論之25%)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-半胱胺酸化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.37min；MS(ESIpos)：m/z=854(M+H)+。
將10.9mg(12.8μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基-丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-半胱胺酸溶解在2.0mL三氟乙醇中，並摻入10.4mg(76.6μmol)二氯化鋅。在50℃下將反應混合物攪拌4小時。為反應混合物摻入22.4mg(0.08mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並將殘餘物凍乾。獲得7.5mg(理論之65%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.92min；MS(ESIpos)：m/z=710(M+H)+。
中間物F218 N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-gamma-麩胺醯基-S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0612-1897
在氬氛圍下將22.9mg(0.06mmol)(4S)-5-(苄氧基)-4-{[(苄氧基)羰基]胺基}-5-氧代戊酸置於2.0mL DMF中，並摻入9.4mg(0.05mmol)HOBt、19.8mg(0.06mmol)TBTU以及8.0mg(0.06mmol)N,N-二異丙基乙胺。在室溫下將反應混合物攪拌10分鐘。隨後添加51.2mg(0.06mmol)溶解於1.0mL DMF中的S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸(中間物C71)以及23.9mg(0.19mmol)N,N-二異丙基乙胺，並在室溫下將反應混合物攪拌一夜。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得11.2mg(理論之25%)(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16-{[(4S)-5-(苄氧基)-4-{[(苄氧基)羰基]胺基}-5-氧代戊醯基]胺基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-4-矽雜十七烷-17-酸化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.52min；MS(ESIpos)：m/z=1070 (M+H)+。
在氬氛圍下將3.9mg(0.02mmol)乙酸鈀(H)置於1.0mL二氯甲烷中，並摻入5.3mg(0.05mmol)三乙胺以及254.3mg(2.19mmol)三乙基矽烷。在室溫下將反應混合物攪拌5分鐘，並摻入18.6mg(0.02mmol)的溶解於1.0mL二氯甲烷中的(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16-{[(4S)-5-(苄氧基)-4-{[(苄氧基)羰基]胺基}-5-氧代戊醯基]胺基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-4-矽雜十七烷-17-酸。以不加熱的方式在真空中將溶劑蒸發。將殘餘物置於乙腈中，藉由針筒過濾器對其進行過濾，並藉由製備性RP-HPLC將其純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得11.0mg(理論之66%)L-gamma-麩胺醯基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.14min；MS(ESIpos)：m/z=846(M+H)+。
將15.0mg(15.6μmol)L-gamma-麩胺醯基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)與8.8mg(17.2μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧雜十五碳-1-基}丙醯胺一起置於1.0mL DMF中，並摻入4.7mg(46.9μmol)4-甲基嗎啉。在室溫下將反應混合物攪拌一夜，隨後摻入3.3mg(0.06mmol)乙酸。直接藉由製備性RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)對反應混合物進行純化。在真空中將溶 劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得14.2mg(理論之70%)N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-gamma-麩胺醯基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸化合物。
LC-MS(方法4)：Rt=1.24min；MS(ESIpos)：m/z=1244(M+H)+。
將13.8mg(11.1μmol)N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-gamma-麩胺醯基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺溶解在2.0mL三氟乙醇中，並摻入9.1mg(66.5μmol)二氯化鋅。在50℃下將反應混合物攪拌4小時。為反應混合物摻入19.4mg(0.07mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得6.9mg(理論之50%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(ESIpos)：m/z=1100(M+H)+。
中間物F235 三氟乙酸--N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-{4-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺甲醯基]苯基}-L-丙胺醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0615-1898
將120.0mg(0.22mmol)2-(三甲基矽基)乙基-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺基甲酸酯(參閱中間物C11之合成)以及52.1mg(0.28mmol)4-硝基苯甲醯氯溶解在8.0mL二氯甲烷中，並摻入28.4mg(0.28mmol)三乙胺。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。在真空中將溶劑蒸發，並藉由製備性RP-HPLC對殘餘物進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。獲得97.7mg(理論之64%)2-(三甲基矽基)乙基-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(4-硝基苯甲醯基)胺基]丙基}胺基甲酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.54min；MS(ESIpos)：m/z=705(M+H)+。
將97.0mg(0.14mmol)2-(三甲基矽基)乙基-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(4-硝基苯甲醯基)胺基]丙基}胺基甲酸酯溶解在5.0mL乙醇中，摻入9.7mg鈀-活性炭(10%)，並在正常壓力下氫化5小時。藉由紙過濾器對反應混合物進行過濾，並用乙醇對濾渣進行洗滌。在真空中將溶劑蒸發。將殘餘物應 用於下一合成階段，不對其作進一步純化。獲得87.4mg(理論之88%)2-(三甲基矽基)乙基-{3-[(4-胺基苯甲醯基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]丙基}胺基甲酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.47min；MS(ESIpos)：m/z=675(M+H)+。
將59.3mg(0.09mmol)2-(三甲基矽基)乙基-{3-[(4-胺基苯甲醯基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]丙基}胺基甲酸酯、25.5mg(0.11mmol)N-[(苄氧基)羰基]-L-丙胺酸與68.1mg(0.53mmol)N,N-二異丙基乙胺一起置於5.0mL乙腈中。緩慢添加72.7mg(0.11mmol)T3P(50%，乙酸乙酯溶液)。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。直接藉由製備性RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)對反應混合物進行純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得52.2mg(理論之68%)苄基-[(2S)-1-{[4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丙基]胺甲醯基)苯基]胺基}-1-氧代丙烷-2-基]胺基甲酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.48min；MS(ESIpos)：m/z=880(M+H)+。
將23.9mg(0.03mmol)苄基-[(2S)-1-{[4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丙基]胺甲醯基)苯基]胺基}-1-氧代丙烷-2-基]胺基甲酸酯溶解在3.0mL乙酸乙酯中，摻入2.4mg鈀-活性炭(10%)，並在正常壓力下氫化2小時。藉由紙過濾器對反應混合物進行過濾，並用乙酸乙酯對濾渣進行洗滌。在真空中將溶劑蒸發。將殘餘物應用於下一合 成階段，不對其作進一步純化。獲得20.1mg(理論之90%)2-(三甲基矽基)乙基-[3-([4-(L-丙胺醯基胺基)苯甲醯基]{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺基甲酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.13min；MS(ESIpos)：m/z=746(M+H)+。
將20.0mg(0.03mmol)2-(三甲基矽基)乙基-[3-([4-(L-丙胺醯基胺基)苯甲醯基]{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺基甲酸酯與14.9mg(0.04mmol)2,5-二氧代吡咯啶-1-基-N-[(苄氧基)羰基]-L-纈胺酸酯一起置於2.0mL DMF中，並摻入5.4mg(0.05mmol)4-甲基嗎啉。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得N-[(苄氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-[4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丙基]胺甲醯基)苯基]-L-丙胺醯胺化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.49min；MS(ESIpos)：m/z=979(M+H)+。
將17.0mg(17.4μmol)N-[(苄氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-[4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丙基]胺甲醯基)苯基]-L-丙胺醯胺溶解在2.5mL乙酸乙酯中，摻入1.7mg鈀-活性炭(10%)，並在正常壓力下氫化一夜。藉由紙過濾器對反應混合物進行過濾，並用乙酸乙酯對濾渣進行洗滌。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得15.3mg(理論之60%)L-纈胺醯基-N-[4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基矽 基)乙氧基]羰基}胺基)丙基]胺甲醯基)苯基]-L-丙胺醯胺化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.15min；MS(ESIpos)：m/z=845(M+H)+。
將15.3mg(0.01mmol)L-纈胺醯基-N-[4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丙基]胺甲醯基)苯基]-L-丙胺醯胺與7.9mg(0.02mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧雜十五碳-1-基}丙醯胺一起置於2.4mL DMF中，並摻入1.9mg(0.02mmol)4-甲基嗎啉。在室溫下將反應混合物攪拌一夜，隨後摻入1.4mg(0.02mmol)乙酸。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得11.7mg(理論之70%)N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-[4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丙基]胺甲醯基)苯基]-L-丙胺醯胺化合物。
將11.7mg(0.01mmol)N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-gamma-麩胺醯基-S-(11-{(1R)-1-[1-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-[4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丙基]胺甲醯基)苯基]-L-丙胺醯胺溶解在2.0mL三氟乙醇中，並摻入3.9mg(0.03mmol)二氯化鋅。在50℃下將反應混合物攪拌一夜。為反應混合物摻入8.3mg(0.03mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得5.4mg(理論之47%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.94min；MS(ESIpos)：m/z=1100(M+H)+。
中間物F236 (2R)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)-4-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}丁酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0619-1899
以(2R)-4-{[(苄氧基)羰基]胺基}-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁酸--N-環己基環己胺(1：1)為基礎，以與中間物F192類似的方式合成目標化合物。
LC-MS(方法4)：Rt=1.1min；MS(ESIpos)：m/z=751(M+H)+。
中間物F238 三氟乙酸--N-{(2S)-1-胺基-3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙烷-2-基}-N'-[2-(2,5-二 氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]丁二醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0620-1900
將18mg(0.025mmol)中間物C72置於6ml DMF中，並在有11.3mg(0.03mmol)HATU以及22μL N,N-二異丙基乙胺的情況下與7.5mg (0.03mmol)三氟乙酸--1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)偶聯。在室溫下攪拌1小時後，將混合物濃縮，並藉由製備性HPLC將殘餘物純化。將相應的溶離份濃縮，並將殘餘物自乙腈/水1：1凍乾。獲得15mg(理論之67%)中間物。
LC-MS(方法4)：Rt=1.71min；MS(EIpos)：m/z=873[M+Na]+。
隨後如就中間物F119所述在4ml三氟乙醇中藉由氯化鋅進行去保護，從而用此中間物製備目標化合物。在藉由製備性HPLC純化後，獲得8.5mg(理論之63%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(ESIpos)：m/z=707(M+Na)+。
中間物F239 S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}-N-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0621-1901
在氬氛圍下，將7.5mg(0.05mmol)(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸置於1.5mL DMF中，並摻入7.5mg(0.05mmol)HOBt、15.5mg(0.05mmol)TBTU以及6.2mg(0.05mmol)N,N-二異丙基乙胺。在室溫下將反應混合物攪拌10分鐘。隨後添加40.0mg(0.05mmol)溶解於1.5mL DMF中的S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)(中間物C71)以及18.7mg(0.14mmol)N,N-二異丙基乙胺，並在室溫下將反應混合物攪拌一夜。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得11.2mg(理論之25%)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-半胱胺酸化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.37min；MS(ESIpos)：m/z=854(M+H)+。
將10.9mg(12.8μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基) 乙醯基]-L-半胱胺酸溶解在2.0mL三氟乙醇中，並摻入10.4mg(76.6μmol)二氯化鋅。在50。℃下將反應混合物攪拌4小時。為反應混合物摻入22.4mg(0.08mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並將殘餘物凍乾。獲得7.5mg(理論之65%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.92min；MS(ESIpos)：m/z=710(M+H)+。
中間物F240 三氟乙酸--3-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}硫基)-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)丙醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0622-1902
將27.5mg(0.04mmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-酸(中間物C69)與15.9mg(0.05mmol)三 氟乙酸--N-(2-胺基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺(1：1)(中間物L1)一起置於1.8mL乙腈中。隨後添加32.4mg(0.31mmol)N,N-二異丙基乙胺，並滴加32.4mg(0.05mmol)T3P(50%，乙酸乙酯溶液)。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得11.9mg(理論之35%)2-(三甲基矽基)乙基-[13-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,7,12-三氧代-10-硫雜-3,6,13-三氮雜十六烷-16-基]胺基甲酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.39min；MS(ESIpos)：m/z=881(M+H)+。
將11.9mg(0.01mol)2-(三甲基矽基)乙基-[13-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,7,12-三氧代-10-硫雜-3,6,13-三氮雜十六烷-16-基]胺基甲酸酯溶解在1.0mL三氟乙醇中，並摻入5.5mg(0.04mmol)二氯化鋅。在50℃下將反應混合物攪拌一夜。為反應混合物摻入11.8mg(0.04mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得7.4mg(理論之60%)目標化合物。
LC-MS(方法5)：Rt=2.75min；MS(ESIpos)：m/z=737(M+H)+。
中間物F241 三氟乙酸--(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯- 2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-(2-{[N-(溴乙醯基)甘胺醯基]胺基}乙基)丁醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0624-1903
以與中間物C66類似的方式，與市售之1-(2-溴乙醯氧基)吡咯啶-2,5-二酮偶聯，隨後藉由氯化鋅進行去阻斷，藉此製備目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.84min；MS(EIpos)：m/z=733及735[M+H]+。
中間物F242 三氟乙酸--(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-(3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}丙基)丁醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0624-1904
以與中間物F104類似的方式合成目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.84min；MS(ESIpos)：m/z=707 (M+H)+。
中間物F243 三氟乙酸--(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙氧基)乙基]丁醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0625-1905
以與中間物F242類似的方式合成目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.81min；MS(ESIpos)：m/z=737(M+H)+。
中間物F244 N-{2-[(S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}-L-半胱胺醯基)胺基]乙基}-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0626-1906
將100mg(約0.101mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[3-(三甲基矽基)并醯基]-L-半胱胺酸(中間物C73)置於88ml二甲基甲醯胺中，並摻入107mg(約0.15mmol)N-(2-胺基乙基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺(中間物L73)、46mg(0.12mmol)HATU以及88μl(0.50mmol)。在室溫下將反應混合物攪拌15分鐘。為混合物摻入水/二氯甲烷，用水及鹽水洗滌有機相，透過硫酸鎂對其進行乾燥，在旋轉蒸發器上將其濃縮，並在高真空中對其進行乾燥。將殘餘物用於後續操作，不對其作進一步純化。獲得92mg(59%，純度72%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.59min；MS(ESIpos)：m/z=1096(M+H)+。
在氬氛圍下，為91mg(約0.06mmol)2-(三甲基矽基)乙基-[(9R)-4-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-20-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-5,10,15-三氧代-9-{[3-(三甲基矽基)丙醯基]胺基}-7-硫雜-4,11,14-三氮雜二十碳-1-基]胺基甲酸酯在1.45ml三氟乙醇中的溶液添加40mg(0.30mmol)氯化鋅。在50℃下將 反應混合物攪拌2小時。隨後添加30mg(0.22mmol)氯化鋅，並在室溫下將混合物再攪拌1小時。為混合物摻入52mg(0.18mmol)EDTA，在室溫下攪拌10分鐘後，用水/乙腈稍加稀釋，並藉由製備性HPLC(溶離劑：ACN/水+0.1%TFA，梯度)進行純化。獲得17mg(31%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.80min；MS(ESIpos)：m/z=808(M+H)+。
中間物F245 三氟乙酸--N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁基}-N'-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)丁二醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0627-1907
在有15mg(0.04mmol)HATU以及9μl N,N-二異丙基乙胺的情況下，在8ml DMF中將10mg(0.0135mmol)中間物C65與8mg(0.027mmol)中間物L1偶聯，隨後如就中間物F119所述，在三氟乙醇中藉由氯化鋅進行去保護，藉此製備目標化合物。在藉由製備性HPLC純化後，獲得8.8mg(理論之58%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.84min；MS(ESIpos)：m/z=778(M+H)+。
中間物F247 三氟乙酸-甲基-4-[(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-氧代乙基)胺基]-2-溴-4-氧代丁酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0628-1908
將14mg(0.018mmol)中間物C66溶解在14mL DCM中，摻入10.1mg(0.037mmol)2-溴-1-乙基吡錠-四氟硼酸鹽(BEP)，並逐份摻入總共250μl吡啶，其中將pH值保持在5與6之間。隨後藉由乙酸將pH值調整至4，將混合物濃縮，並藉由製備性HPLC將殘餘物純化。在將相應的溶離份濃縮、凍乾及乾燥後，獲得4mg(理論之21%)受保護的中間體，隨後藉由氯化鋅在胺基上進行去保護。在HPLC純化及凍乾後，獲得3mg(理論之72%)形式為無色泡沫的目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m/z=805及807(M+H)+。
中間物F248 三氟乙酸--(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙基}丁醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0629-1909
在有HATU的情況下將10mg(0.015mmol)中間物C58與5mg(0.017mmol)中間物L12偶聯，隨後藉由氯化鋅進行去保護，藉此製備目標化合物。獲得6.5mg(理論之52%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.91min；MS(ESIpos)：m/z=680(M+H)+。
中間物F254 三氟乙酸-甲基-(3S)-4-[(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-氧代乙基)胺基]-3-溴-4-氧代丁酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0629-1910
以與中間物F254類似的方式，透過將15mg(0.02mmol)中間物C66與21mg(0.099mmol)(2S)-2-溴-4-甲氧基-4-氧代丁酸(如(J.Org.Chem.200,65,517-522)所述用(2S)-2-胺基-4-甲氧基-4-氧代丁 酸鹽酸鹽(1：1)合成)偶聯來製備目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(ESIpos)：m/z=805及807(M+H)+。
中間物F255 R/S-(N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-alpha-麩胺醯基-S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基})-高半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0630-1911
將13.1mg(0.04mmol)(2S)-5-(苄氧基)-2-{[(苄氧基)羰基]胺基}-5-氧代戊酸置於1.0mL DMF中，並摻入5.4mg(0.04mmol)HOBt、11.4mg(0.04mmol)TBTU以及4.6mg(0.04mmol)N,N-二異丙基乙胺。在室溫下將反應混合物攪拌10分鐘。隨後添加30.0mg(0.04mmol)溶解於12.9mg(0.1mmol)N,N-二異丙基乙胺及1mL DMF中的R/S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-高半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)(中間物C11)。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱： Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水/0.1%TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得32mg(73%)4-[2-[[(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)吡咯-2-基]-2,2-二甲基-丙基]-[3-(2-三甲基矽基乙氧基羰基胺基)丙基]胺基]-2-氧代-乙基]硫基-2-[[(2S)-5-苄氧基-2-(苄氧基羰基胺基)-5-氧代-戊醯基]胺基]丁酸化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.53min；MS(ESIpos)：m/z=1084(M+H)+。
將41.4mg(0.038mmol)4-[2-[[(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)吡咯-2-基]-2,2-二甲基-丙基]-[3-(2-三甲基矽基乙氧基羰基胺基)丙基]胺基]-2-氧代-乙基]硫基-2-[[(2S)-5-苄氧基-2-(苄氧基羰基胺基)-5-氧代-戊醯基]胺基]丁酸置於10mL乙醇中，摻入4.2mg Pd/C，並在正常壓力下進行氫化。藉由紙板過濾器對反應混合物進行過濾，並用乙醇對濾渣進行洗滌。以不加熱的方式在真空中將溶劑蒸發。藉由製備性RP-HPLC(柱：Reprosil 250x40；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)對殘餘物進行純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得21.1mg(理論之56%)R/S-(L-alpha-麩胺醯基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基))-高半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.11min；MS(ESIpos)：m/z=860(M+H)+。
將20.4mg(20.94μmol)R/S-(L-alpha-麩胺醯基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基))-高半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)與11.8mg(23.04μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯 -1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧雜十五碳-1-基}丙醯胺一起置於1.0mL DMF中，並摻入4.2mg(41.88μmol)4-甲基嗎啉。在室溫下將反應混合物攪拌一夜，隨後摻入3.1mg(0.05mmol)乙酸。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水/0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得9.5mg(36%)R/S-(N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-alpha-麩胺醯基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基))-高半胱胺酸化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.66min；MS(ESIpos)：m/z=1259(M+H)+。
將9.4mg(7.47μmol)R/S-(N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-alpha-麩胺醯基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基))-高半胱胺酸溶解在1.5mL三氟乙醇中，並摻入6.1mg(44.81μmol)二氯化鋅。在50℃下將反應混合物攪拌3小時。為反應混合物摻入13.1mg(0.05mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得6.9mg(75%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.87min；MS(ESIpos)：m/z=1114(M+H)+。
中間物F256 三氟乙酸--N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁基}-N'-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙氧基)乙基]丁二醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0633-1912
在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下將10mg(0.014mmol)中間物C65與9.6mg(0.027mmol)三氟乙酸--N-[2-(2-胺基乙氧基)乙基]-2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺(1：1)偶聯，隨後如就中間物F119所述，在三氟乙醇中藉由氯化鋅進行去保護，藉此製備目標化合物。在藉由製備性HPLC純化後，獲得8mg(理論之64%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.84min；MS(ESIpos)：m/z=822(M+H)+。
中間物F257 R-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}-N-[18-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十八烷-1-醯基]-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0634-1913
將50.0mg(0.06mmol)R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)(中間物C71)以及29mg(0.07mmol)3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(中間物L74)溶解在3.0mL DMF中，並摻入27.3mg(0.07mmol)HATU以及23.3mg(0.18mmol)N,N-二異丙基乙胺。在室溫下將反應混合物攪拌2小時。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得17.4mg(26%)R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[18-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十八烷-1-醯基]-L-半胱胺酸化合物。
LC-MS(方法6)：Rt=1.34min；MS(ESIpos)：m/z=1101(M+H)+。
將17mg(0.02mmol)R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[18-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十八烷-1-醯基]-L-半胱胺酸溶 解在1.0mL三氟乙醇中，並摻入6.3mg(0.05mmol)二氯化鋅。在50℃下將反應混合物攪拌一夜。為反應混合物摻入13.5mg(0.05mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得7.6mg(46%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.91min；MS(ESIpos)：m/z=957(M+H)+。
中間物F258 三氟乙酸--(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-[3-({2-[(溴乙醯基)胺基]乙基}胺基)-3-氧代丙基]丁醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0635-1914
藉由HATU將中間物C58與三氟乙酸-苄基-[2-(beta-丙胺醯基胺基)乙基]胺基甲酸酯(1：1)偶聯，隨後進行氫解，隨後與1-(2-溴乙醯氧基)吡咯啶-2,5-二酮偶聯，最後藉由氯化鋅進行去保護，藉此製備目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min：MS(ESIpos)：m/z=747及749(M+H)+。
中間物F259 N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]- 2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-3-{[N-(溴乙醯基)甘胺醯基]胺基}-D-丙胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0636-1915
將75mg(0.114mmol)中間物C58置於12.5ml DMF中，並在有65mg(0.11mmol)HATU以及79μL N,N-二異丙基乙胺的情況下，與78mg(0.171mmol)中間物L75偶聯。在藉由製備性HPLC進行純化後，將中間物置於20ml乙醇中，並在室溫下藉由10%的鈀-活性炭在氫正常壓力下進行1小時的氫化。隨後將催化劑濾出，在真空中將溶劑移除，並藉由製備性HPLC將產物純化。在自乙腈/水1：1凍乾後，獲得63mg(理論之64%，歷經2個階段)2-(三甲基矽基)乙基-3-胺基-N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丁醯基]-D-丙胺酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.16min；MS(EIpos)：m/z=844[M+H]+。
隨後如上文所述，在有HATU的情況下將40mg(0.047mmol)此中間物與N-[(苄氧基)羰基]甘胺酸偶聯，隨後重新以氫解的方式去保護。
在有4μl N,N-二異丙基乙胺的情況下將10mg(0.012mmol)此中間物與7.7mg(0.032mmol)市售之1-(2-溴乙醯氧基)吡咯啶-2,5-二酮偶 聯，隨後如就中間物F119所述，在三氟乙醇中藉由氯化鋅進行去保護，藉此製備目標化合物。在藉由製備性HPLC純化後，獲得1.3mg目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.83min；MS(ESIpos)：m/z=777及779(M+H)+。
中間物F260 N6-(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-beta-丙胺醯基)-N2-{N-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基}-L-離胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0637-1916
以與中間物F155類似的方式製備目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.81min；MS(ESIpos)：m/z=1020(M+H)+。
中間物F261 三氟乙酸--(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-(2-{2-[(溴乙醯基)胺基]乙氧基}乙基)丁醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0638-1917
在有HATU的情況下將20mg(0.03mmol)中間物C58與25.8mg(0.061mmol)中間物L77偶聯，隨後藉由氯化鋅進行去保護，藉此製備目標化合物。獲得11.9mg(理論之47%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.84min；MS(ESIpos)：m/z=722及720(M+H)+。
中間物F262 S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}-N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯基]胺基}乙氧基)乙氧基]丙醯基}-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0638-1918
將30mg(36μmol)S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)(中間物C71)與16.9mg(40μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-[2-(2-{3-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-3-氧代丙氧基}乙氧基)乙基]丙醯胺置於1.5mL DMF中，並摻入10.9mg(108μmol)4-甲基嗎啉。在室溫下將反應混合物攪拌一夜，隨後摻入7.58mg(0.13mmol)乙酸。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得33.4mg(理論之80%)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯基]胺基}乙氧基)乙氧基]丙醯基}-L-半胱胺酸化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.34min；MS(ESIpos)：m/z=1027(M+H)+。
將32.8mg(32μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯基]胺基}乙氧基)乙氧基]丙醯基}-L-半胱胺酸溶解在3.0mL三氟乙醇中，並摻入26.1mg(192μmol)二氯化鋅。在50℃下將反應混合物攪拌2小時。為反應混合物摻入56.0mg(0.192mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並將殘餘物凍乾。獲得22.9mg(理論之71%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m/z=883 (M+H)+。
中間物F263 N-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-beta-丙胺醯基-S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0640-1919
將30.0mg(0.036mmol)R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)(中間物C71)以及9.8mg(0.04mmol)N-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-beta-丙胺酸(中間物L78)溶解在1.0mL DMF中，並摻入16.4mg(0.04mmol)HATU以及14.0mg(0.11mmol)N,N-二異丙基乙胺。在室溫下將反應混合物攪拌2小時。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得4.2mg(理論之13%)N-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-beta-丙胺醯基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸化合物。
LC-MS(方法6)：Rt=1.31min；MS(ESIpos)：m/z=925(M+H)+。
將11.3mg(0.011mmol)N-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-beta-丙胺醯基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸溶解在2.0mL三氟乙醇中，並摻入5.0mg(0.04mmol)二氯化鋅。在50℃下將反應混合物攪拌2小時。為反應混合物摻入10.7mg(0.04mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得4.4mg(40%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.91min；MS(ESIpos)：m/z=781(M+H)+。
中間物F264 N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-beta-丙醯基-S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0641-1920
將30.0mg(0.036mmol)R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)(中間物C71)以及12.2mg(0.04mmol)N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己 醯基]-beta-丙胺酸(中間物L79)溶解在1.0mL DMF中，並摻入16.4mg(0.04mmol)HATU以及14.0mg(0.11mmol)N,N-二異丙基乙胺。在室溫下將反應混合物攪拌2小時。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得8.9mg(24%)N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-beta-丙胺醯基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸化合物。
LC-MS(方法6)：Rt=1.38min；MS(ESIpos)：m/z=981(M+H)+。
將15.3mg(0.015mmol)N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-beta-丙胺醯基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸溶解在2.0mL三氟乙醇中，並摻入6.3mg(0.045mmol)二氯化鋅。在50℃下將反應混合物攪拌2小時。為反應混合物摻入13.5mg(0.045mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得9.1mg(62%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.92min；MS(ESIpos)：m/z=837(M+H)+。
中間物F265 三氟乙酸N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-22-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)- 6,17-二氧代-10,13-二氧雜-3-硫雜-7,16-二氮雜二十二烷-1-醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0643-1921
將30.0mg(42.7μmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-酸(中間物C69)與25.3mg(55.6μmol)三氟乙酸N-{2-[2-(2-胺基乙氧基)-乙氧基]乙基}-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺(1：1)(中間物L82)置於1.9mL乙腈中，並摻入60μl(340μmol)N,N-二異丙基乙胺以及33μl(56μmol)2,4,6-三丙基-1,3,5,2,4,6-三噁三磷雜環己烷-2,4,6-三氧化物(50%，乙酸乙酯溶液)。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。添加水(2.0mL)，並直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得26.7mg(理論之60%)2-(三甲基矽基)乙基-[4-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-26-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-5,10,21-三氧代-14,17-二氧雜-7-硫雜-4,11,20-三氮雜二十六碳-1-基]胺基甲酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.40min；MS(ESIpos)：m/z=1025(M+H)+。
將25.3mg(24.7μmol)2-(三甲基矽基)乙基-[4-{(1R)-1-[1-苄基-4- (2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-26-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-5,10,21-三氧代-14,17-二氧雜-7-硫雜-4,11,20-三氮雜二十六碳-1-基]胺基甲酸酯溶解在2.0mL三氟乙醇中，並摻入20.2mg(148μmol)二氯化鋅。在50℃下將反應混合物攪拌1小時。為反應混合物摻入43.3mg(148μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得23.4mg(理論之95%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(ESIpos)：m/z=881(M+H)+。
中間物F266 三氟乙酸N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,13-二氧代-6,9-二氧雜-16-硫雜-3,12-二氮雜十八烷-18-醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0644-1922
將30.0mg(0.043mmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-酸(中間物C69)與22.2mg(0.056mmol) 三氟乙酸N-{2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙基}-2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺(1：1)(中間物L83)一起置於1.9mL乙腈中。隨後添加60μl(0.34mmol)N,N-二異丙基乙胺，並滴加33μl(0.056mmol)T3P(50%，乙酸乙酯溶液)。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。添加水(2.0mL)。直接藉由製備性RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)對反應混合物進行純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得20.5mg(理論之49%)2-(三甲基矽基)乙基-[19-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,13,18-三氧代-6,9-二氧雜-16-硫雜-3,12,19-三氮雜二十二烷-22-基]胺基甲酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.38min；MS(ESIpos)：m/z=969(M+H)+。
將19.1mg(19.7μmol)2-(三甲基矽基)乙基-[19-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,13,18-三氧代-6,9-二氧雜-16-硫雜-3,12,19-三氮雜二十二烷-22-基]胺基甲酸酯溶解在2.0mL三氟乙醇中，並摻入16.1mg(118μmol)二氯化鋅。在50℃下將反應混合物攪拌1小時。為反應混合物摻入34.6mg(118μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得13.9mg(理論之75%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(ESIpos)：m/z=825(M+H)+。
中間物F267 S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-18H-吡咯-1-基)-2.18-二氧代-6,9,12,15-四氧雜-3-氮雜十八烷-18-基]-L-半胱胺醯基-beta-丙胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0646-1923
在氬氛圍下將13.4mg(33.3μmol)1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2-氧代-6,9,12,15-四氧雜-3-氮雜十八烷-18-酸(中間物L74)置於1.0ml DMF中，摻入9.3μl(54.4μmol)N,N-二異丙基乙胺以及12.6mg(33.3μmol)HATU。在室溫下將反應混合物攪拌10分鐘。隨後添加25.0mg(27.7μmol)溶解於4.7μl(27.7μmol)N,N-二異丙基乙胺及1.0mL DMF中的S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺醯基-beta-丙胺酸-三氟乙酸(1：1)(參閱中間物F216之合成)。在室溫下將反應混合物攪拌90分鐘。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得6.90mg(理論之19%)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧雜-3-氮雜十 八烷-18-基]-L-半胱胺醯基-beta-丙胺酸化合物。
LC-MS(方法5)：Rt=4.44min；MS(ESIpos)：m/z=1172(M+H)+。
將6.70mg(5.71μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧雜-3-氮雜十八烷-18-基]-L-半胱胺醯基-beta-丙胺酸溶解在1.0mL三氟乙醇中，並摻入4.67mg(34.3μmol)二氯化鋅。在50℃下將反應混合物攪拌1小時。為反應混合物摻入10mg(34.3μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得4.4mg(理論之67%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.85min；MS(ESIpos)：m/z=1028(M+H)+。
中間物F268 三氟乙酸N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-28-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-6.23-二氧代-10,13,16,19-四氧雜-3-硫雜-7.22-二氮雜二十八烷-1-醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0648-1924
將30.0mg(0.043mmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-酸(中間物C69)與30.2mg(0.056mmol)三氟乙酸N-(14-胺基-3,6,9,12-四氧雜十四碳-1-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺(1：1)(中間物L84)一起置於2.0mL乙腈中。隨後添加60μl(0.34mmol)N,N-二異丙基乙胺，並滴加33μl(0.056mmol)T3P(50%，乙酸乙酯溶液)。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。添加水(2.0mL)。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得27.9mg(理論之59%)2-(三甲基矽基)乙基-[4-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-32-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-5,10,27-三氧代-14,17,20,23-四氧雜-7-硫雜-4,11,26-三氮雜三十二碳-1-基]胺基甲酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.41min；MS(ESIpos)：m/z=1114(M+H)+。
將25.6mg(23.0μmol)2-(三甲基矽基)乙基-[4-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-32-(2,5-二氧代-2,5-二 氫-1H-吡咯-1-基)-5,10,27-三氧代-14,17,20,23-四氧雜-7-硫雜-4,11,26-三氮雜三十二碳-1-基]胺基甲酸酯溶解在2.5mL三氟乙醇中，並摻入18.8mg(138μmol)二氯化鋅。在50℃下將反應混合物攪拌1小時。為反應混合物摻入40.3mg(138μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得22.2mg(理論之88%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.94min；MS(ESIpos)：m/z=969(M+H)+。
中間物F269 4-{[(8R,14R)-13-(3-胺基丙基)-14-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-15,15-二甲基-2,7,12-三氧代-10-硫雜-3,6,13-三氮雜十六烷-8-基]胺基}-4-氧代丁酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0649-1925
將17.0mg(0.0195mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-(4-第三丁氧基-4-氧代丁醯基)-L-半胱胺酸(中間物C77)與4.99mg(0.0253mmol)N-(2-胺基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺(中間物L1)一起置於1.0mL乙腈中。隨後添加27μl(0.16mmol)N,N-二異丙基乙胺，並滴加15μl(0.025mmol)T3P(50%，乙酸乙酯溶液)。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。添加水(2.0mL)。直接藉由製備性RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)對反應混合物進行純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得9.5mg(理論之46%)第三丁基-4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-23-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11,18,21-四氮雜-2-矽雜二十三烷-16-基]胺基}-4-氧代丁酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.47min；MS(ESIpos)：m/z=1052(M+H)+。
將8.3mg(7.89μmol)第三丁基-4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-23-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11,18,21-四氮雜-2-矽雜二十三烷-16-基]胺基}-4-氧代丁酸酯溶解在1.0mL三氟乙醇中，並摻入6.45mg(47.3μmol)二氯化鋅。在50℃下將反應混合物攪拌6小時。添加6.45mg(47.3μmol)二氯化鋅，並在50℃下將反應混合物攪拌一夜。為反應混合物摻入27.7mg(94.6μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50 mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得1.10mg(理論之14%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(ESIpos)：m/z=852(M+H)+。
中間物F270 三氟乙酸--N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-N'-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)丁二醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0651-1926
在氬氛圍下將15.0mg(22.9μmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十五烷-15-酸(中間物C78)置於1.0ml DMF中，摻入8.0μl(45.8μmol)N,N-二異丙基乙胺以及10.4mg(27.4μmol)HATU。在室溫下將反應混合物攪拌10分鐘。隨後添加溶解於4.0μl(22.9μmol)N,N-二異丙基乙胺及1.0mL DMF中的8.54mg(27.4μmol)三氟乙酸N-(2-胺基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺(1：1)(中間物L1)。在室溫下將反應混合物攪拌1小時。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在 高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得14.7mg(理論之77%)2-(三甲基矽基)乙基-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{4-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)胺基]-4-氧代丁醯基}胺基)丙基]胺基甲酸酯化合物。
LC-MS(方法5)：Rt=1.33min；MS(ESIpos)：m/z=835(M+H)+。
將13.2mg(15.8μmol)2-(三甲基矽基)乙基-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{4-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)胺基]-4-氧代丁醯基}胺基)丙基]胺基甲酸酯溶解在2.0mL三氟乙醇中，並摻入12.9mg(94.8μmol)二氯化鋅。在50℃下將反應混合物攪拌1小時。為反應混合物摻入27.7mg(94.6μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得10.9mg(理論之83%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.83min；MS(ESIpos)：m/z=691(M+H)+。
中間物F271 4-{[(20R,26R)-25-(3-胺基丙基)-26-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-27,27-二甲基-2,19,24-三氧代-6,9,12,15-四氧雜-22-硫雜-3,18,25-三氮雜二十八烷-20-基]胺基}-4-氧代丁酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0653-1927
在氬氛圍下將19.4mg(22.2μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-(4-第三丁氧基-4-氧代丁醯基)-L-半胱胺酸(中間物C77)置於2.0ml DMF中，並摻入21.7mg(44.4μmol)三氟乙酸--N-(14-胺基-3,6,9,12-四氧雜十四碳-1-基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺(1：1)(中間物L74)、12μl(67μmol)N,N-二異丙基乙胺以及16.9mg(44.4μmol)HATU。在室溫下將反應混合物攪拌1小時。直接藉由製備性RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)對反應混合物進行純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得18.1mg(理論之66%)第三丁基-4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-35-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,2-二甲基-6,12,17,34-四氧代-5,21,24,27,30-五氧雜-14-硫雜-7,11,18,33-四氮雜-2-矽雜三十五烷-16-基]胺基}-4-氧代丁酸酯化合物。
LC-MS(方法4)：Rt=1.79min；MS(ESIpos)：m/z=1250(M+Na)+。
將18.1mg(14.7μmol)第三丁基-4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-35-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,2-二甲基-6,12,17,34-四氧代-5,21,24,27,30-五氧雜-14-硫雜-7,11,18,33-四氮雜-2-矽雜三十五烷-16-基]胺基}-4-氧代丁酸酯溶解在2.0mL三氟乙醇中，並摻入12.0mg(88.4μmol)二氯化鋅。在50℃下將反應混合物攪拌4小時。為反應混合物摻入25.8mg(88.4μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得12.3mg(理論之73%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.87min；MS(ESIpos)：m/z=1028(M+H)+。
中間物F272 三氟乙酸--N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-N'-[17-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-16-氧代-3,6,9,12-四氧雜-15-氮雜十七碳-1-基]丁二醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0654-1928
在氬氛圍下將15.0mg(22.9μmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧 雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十五烷-15-酸(中間物C78)置於1.0ml DMF中，摻入8.0μl(45.8μmol)N,N-二異丙基乙胺以及10.4mg(27.4μmol)HATU。在室溫下將反應混合物攪拌10分鐘。隨後添加溶解於4.0μl(22.9μmol)N,N-二異丙基乙胺及1.0mL DMF中的13.4mg(27.4μmol)三氟乙酸N-(14-胺基-3,6,9,12-四氧雜十四碳-1-基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺(1：1)(中間物L85)。在室溫下將反應混合物攪拌1小時。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得15.8mg(理論之68%)2-(三甲基矽基)乙基-[23-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,19,22-三氧代-6,9,12,15-四氧雜-3,18,23-三氮雜二十六烷-26-基]胺基甲酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.35min；MS(ESIpos)：m/z=1011(M+H)+。
將15.1mg(14.9μmol)2-(三甲基矽基)乙基-[23-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,19,22-三氧代-6,9,12,15-四氧雜-3,18,23-三氮雜二十六烷-26-基]胺基甲酸酯溶解在2.0mL三氟乙醇中，並摻入12.2mg(89.6μmol)二氯化鋅。在50℃下將反應混合物攪拌1小時。為反應混合物摻入26.2mg(89.6μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得10.3mg(理論之70%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m/z=867 (M+H)+。
中間物F273 三氟乙酸N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,19-二氧代-6,9,12,15-四氧雜-22-硫雜-3,18-二氮雜二十四烷-24-醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0656-1929
在氬氛圍下將20.0mg(28.5μmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-酸(中間物C69)置於1.0ml DMF中，摻入10.0μl(57.0μmol)N,N-二異丙基乙胺以及13.0mg(34.2μmol)HATU。在室溫下將反應混合物攪拌10分鐘。隨後添加溶解於5.0μl(28.5μmol)N,N-二異丙基乙胺及1.0mL DMF中的16.7mg(34.2μmol)三氟乙酸N-(14-胺基-3,6,9,12-四氧雜十四碳-1-基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺(1：1)(中間物L85)。在室溫下將反應混合物攪拌1小時。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾 燥。獲得18.6mg(理論之62%)2-(三甲基矽基)乙基-[25-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,19,24-三氧代-6,9,12,15-四氧雜-22-硫雜-3,18,25-三氮雜二十八烷-28-基]胺基甲酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.37min；MS(ESIpos)：m/z=1057(M+H)+。
將17.1mg(16.2μmol)2-(三甲基矽基)乙基-[25-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,19,24-三氧代-6,9,12,15-四氧雜-22-硫雜-3,18,25-三氮雜二十八烷-28-基]胺基甲酸酯溶解在2.0mL三氟乙醇中，並摻入13.2mg(97.0μmol)二氯化鋅。在50℃下將反應混合物攪拌1小時。為反應混合物摻入28.4mg(97.0μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得9.80mg(理論之59%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m/z=913(M+H)+。
中間物F274 N-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0658-1930
將13.9mg(0.0167mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)(中間物C71)與7.07mg(0.0217mmol)N-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸(中間物L86)一起置於2.0mL乙腈中。隨後添加23μl(0.13mmol)N,N-二異丙基乙胺，並滴加13μl(0.022mmol)T3P(50%，乙酸乙酯溶液)。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。直接藉由製備性RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)對反應混合物進行純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得3.70mg(理論之19%)N-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.34min；MS(ESIpos)：m/z=1024(M+H)+。
將10.6mg(10.3μmol)N-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸溶解在2.0mL三氟乙醇中，並摻入8.46mg(62.1μmol)二氯化鋅。在50℃下將反應混合物攪拌1小時。為反應混合物摻入18.1mg(62.1μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得5.60mg(理論之54%)目標化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=1.69min；MS(ESIpos)：m/z=880(M+H)+。
中間物F275 N-[3-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}硫基)丙醯基]-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)-L-alpha-麩醯胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0660-1931
將39.0mg(55.6μmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-酸(中間物C69)置於4.0mL DMF中，摻入41.6mg(111μmol)1-苄基-5-[2-(三甲基矽基)乙基]-L--麩胺酸酯鹽酸鹽(1：1)(中間物L89)、29μl(170μmol)N,N-二異丙基乙胺以及42.3mg(111μmol)HATU，並在室溫下攪拌1小時。在室溫下將反應混合物攪拌1小時，用乙酸進行淬滅，並直接藉由製備性RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)將其純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得53.1mg(理論之93%)1-苄基-5-[2-(三甲基矽基)乙基]-N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-基)-L-麩胺酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.71min；MS(ESIpos)：m/z=1021[M+H]+
在氬氛圍下將7.60mg(33.9μmol)乙酸鈀(II)置於3.0ml二氯甲烷中，並摻入14μl(100μmol)三乙胺以及110μl(680μmol)三乙基矽烷。在室溫下將反應混合物攪拌5分鐘，並摻入69.2mg(67.7μmol)溶解於3.0mL二氯甲烷中的1-苄基-5-[2-(三甲基矽基)乙基]-N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-基)-L-麩胺酸酯。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。藉由紙板過濾器對反應混合物進行過濾，並用二氯甲烷對濾渣進行洗滌。在真空中將溶劑蒸發。藉由製備性RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)對殘餘物進行純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得38.4mg(理論之61%)(19S)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-19-{3-氧代-3-[2-(三甲基矽基)乙氧基]丙基}-5-氧雜-14-硫雜-7,11,18-三氮雜-2-矽雜二十烷-20-酸化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.53min；MS(ESIpos)：m/z=931(M+H)+。
將10.0mg(10.7μmol)(19S)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-19-{3-氧代-3-[2-(三甲基矽基)乙氧基]丙基}-5-氧雜-14-硫雜-7,11,18-三氮雜-2-矽雜二十烷-20-酸置於1.0mL DMF中，摻入6.73mg(21.5μmol)N-(2-胺基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺2,2,2-三氟乙烷-1,1-二醇(1：1)(中間物L1)、5.6μl(32μmol)N,N-二異丙基乙胺以及8.17mg(21.5μmol)HATU，並在室溫下攪拌1小時。在室溫下將反應混合物攪拌3小時，用乙酸進行淬滅，並直接藉由製備性RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水， 0.1% TFA)將其純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得6.90mg(理論之58%)2-(三甲基矽基)乙基-N2-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-基)-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)-L-alpha-麩醯胺酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.57min；MS(ESIpos)：m/z=1110[M+H]+
將6.90mg(6.21μmol)2-(三甲基矽基)乙基-N2-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-基)-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)-L-alpha-麩醯胺酸酯溶解在2.0mL三氟乙醇中，並摻入5.1mg(37.2μmol)二氯化鋅。在50℃下將反應混合物攪拌3小時。添加5.1mg(37.2μmol)二氯化鋅，並在50℃下將反應混合物攪拌3小時。添加5.1mg(37.2μmol)二氯化鋅，並在50℃下將反應混合物攪拌3小時。添加10.1mg(74.4μmol)二氯化鋅，並在50℃下將反應混合物攪拌一夜以及在室溫下將其攪拌72小時。為反應混合物摻入54.5mg(186μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得2.4mg(理論之39%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(ESIpos)：m/z=866(M+H)+。
中間物F276 S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]- 2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}-N-{3-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙氧基)乙氧基]丙醯基}-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0663-1932
在氬氛圍下將9.08mg(28.9μmol)3-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙氧基)乙氧基]丙酸(中間物L87)置於1.0ml DMF中，摻入8.33μl(48.2μmol)N,N-二異丙基乙胺以及11.0mg(28.9μmol)HATU。在室溫下將反應混合物攪拌10分鐘。隨後添加20.0mg(27.7μmol)溶解於4.67μl(24.1μmol)N,N-二異丙基乙胺及1.0mL DMF中的S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)(中間物C71)。在室溫下將反應混合物攪拌1小時。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得4.70mg(理論之19%)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-{3-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙氧基)乙氧基]丙醯基}-L-半胱胺酸化合 物。
LC-MS(方法12)：Rt=2.47min；MS(ESIpos)：m/z=1013(M+H)+。
將13.9mg(13.7μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-{3-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙氧基)乙氧基]丙醯基}-L-半胱胺酸溶解在2.0mL三氟乙醇中，並摻入5.6mg(41.2μmol)二氯化鋅。在50℃下將反應混合物攪拌1小時。添加5.6mg(41.2μmol)二氯化鋅，並在50℃下將反應混合物攪拌30分鐘。為反應混合物摻入24.1mg(82.4μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得10.8mg(理論之80%)目標化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=1.58min；MS(ESIpos)：m/z=869(M+H)+。
中間物F277 N-[3-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}硫基)丙醯基]-3-[(溴乙醯基)胺基]-D-丙胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0665-1933
將8.90mg(8.88μmol)三氟乙酸2-(三甲基矽基)乙基-3-胺基-N-(l1-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,1.1-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-基)-D-丙胺酸酯(1：l)(中間物C80)以及2.31mg(9.77μmol)1-(2-溴乙醯氧基)吡咯啶-2,5-二酮溶解在1ml二甲基甲醯胺中，並摻入2.9μl(27μmol)N-甲基嗎啉。在室溫下將反應混合物攪拌1小時。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水/0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得5.80mg(理論之65%)2-(三甲基矽基)乙基-N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-基)-3-[(溴乙醯基)胺基]-D-丙胺酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.57min；MS(ESIpos)：m/z=1008(M+H)+。
將5.80mg(5.75μmol)2-(三甲基矽基)乙基-N-(11-{(1R)-1-[1-苄 基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-基)-3-[(溴乙醯基)胺基]-D-丙胺酸酯溶解在2.0mL三氟乙醇中，並摻入4.70mg(34.5μmol)二氯化鋅。在50℃下將反應混合物攪拌3小時。添加4.70mg(34.5μmol)二氯化鋅，並在50℃下將反應混合物攪拌5小時。為反應混合物摻入20.2mg(69.0μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得1.70mg(理論之34%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.90min；MS(ESIpos)：m/z=764(M+H)+。
中間物F278 N-[3-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}硫基)丙醯基]-3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}-D-丙胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0667-1934
將10.0mg(9.98μmol)三氟乙酸2-(三甲基矽基)乙基-3-胺基-N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-基)-D-丙胺酸酯(1：1)(中間物C80)以及2.77mg(11.0μmol)1-{2-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮溶解在1ml二甲基甲醯胺中，並摻入3.3μl(30μmol)N-甲基嗎啉。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。為反應混合物摻入2.0μl(35μmol)乙酸，並直接藉由製備性RP-HPLC將其純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水/0.1%TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得5.50mg(理論之54%)2-(三甲基矽基)乙基-N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-基)-3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}-D-丙胺酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.51min；MS(ESIpos)：m/z=1024 (M+H)+。
將5.50mg(5.36μmol)2-(三甲基矽基)乙基-N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-基)-3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}-D-丙胺酸酯溶解在1.0mL三氟乙醇中，並摻入4.39mg(32.2μmol)二氯化鋅。在50℃下將反應混合物攪拌1小時。添加4.39mg(32.2μmol)二氯化鋅，並在50℃下將反應混合物攪拌1小時。添加4.39mg(32.2μmol)二氯化鋅，並在50℃下將反應混合物攪拌4小時。為反應混合物摻入28.2mg(96.5μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得2.70mg(理論之56%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(ESIpos)：m/z=781(M+H)+。
中間物F279 N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[({(2R)-2-羧基-2-[(3-羧基丙醯基)胺基]乙基}硫基)乙醯基]胺基)丙基]-L-丙胺醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0669-1935
將12.2mg(14μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-(4-第三丁氧基-4-氧代丁醯基)-L-半胱胺酸(中間物C77)溶解在2.0mL三氟乙醇中，並摻入11.4mg(83.8μmol)二氯化鋅。在50℃下將反應混合物攪拌3小時。為反應混合物摻入24.5mg(83.8μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得4.60mg(理論之42%)4-{[(1R)-2-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}硫基)-1-羧乙基]胺基}-4-氧代丁酸-三氟乙酸(1：1)化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m/z=673(M+H)+。
將10.0mg(12.7μmol)4-{[(1R)-2-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}硫基)-1-羧乙基]胺基}-4-氧代丁酸-三氟乙酸(1：1)以及7.41mg (12.7μmol)2,5-二氧代吡咯啶-1-基-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸酯(中間物L88)溶解在1.5ml二甲基甲醯胺中，並摻入4.4μl(25μmol)N,N-二異丙基乙胺。在室溫下將反應混合物攪拌2小時。為反應混合物摻入2.0μl(35μmol)乙酸，並直接藉由製備性RP-HPLC將其純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水/0.1%TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得5.20mg(理論之39%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.11min；MS(ESIpos)：m/z=1036(M+H)+。
中間物F280 三氟乙酸--N-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)苄醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0670-1936
以中間物C64為基礎，透過與市售之1-(3-{[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]羰基}苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮偶聯並於隨後藉由氯化鋅去保護，製備目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m/z=755(M+H)+。
中間物F281 N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-3-{[N-(溴乙醯基)-beta-丙胺醯基]胺基}-D-丙胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0671-1937
首先按照經典的肽化學方法製備經修飾之胺基酸區塊N-(溴乙醯基)-beta-丙胺酸以及2-(三甲基矽基)乙基-3-胺基-N-(第三丁氧基羰基)-D-丙胺酸酯。隨後在有HATU及嗎啉的情況下將上述相互偶聯。隨後藉由10%的三氟乙酸在二氯甲烷中將第三丁氧基羰基保護基團脫除，藉此獲得中間物2-(三甲基矽基)乙基-3-{[N-(溴乙醯基)-beta-丙胺醯基]胺基}-D-丙胺酸酯。
最後在有HATU及4-甲基嗎啉的情況下將此中間物與中間物C58偶聯，隨後藉由氯化鋅進行去保護，藉此製備目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.87min；MS(ESIpos)：m/z=791及793(M+H)+。
中間物F282 三氟乙酸--(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-(3-{[N-(溴乙醯基)甘胺醯基]胺基}丙基)丁醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0672-1938
首先以第三丁基甘胺酸酯與溴乙酸酐為基礎，按照經典的肽化學方法製備中間物三氟乙酸--N-(3-胺基丙基)-N2-(溴乙醯基)甘胺醯胺(1：1)。
最後在有HATU及4-甲基嗎啉的情況下將此中間物與中間物C58偶聯，隨後藉由氯化鋅進行去保護，藉此製備目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.83min；MS(ESIpos)：m/z=747及749(M+H)+。
中間物F283 N-[(2R)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)-2-羧乙基]-N2-(溴乙醯基)-L-alpha-天冬醯胺-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0672-1939
首先以(2S)-2-胺基-4-氧代-4-[2-(三甲基矽基)乙氧基]丁酸與溴乙 酸酐為基礎，製備經修飾之胺基酸區塊(2S)-2-[(溴乙醯基)胺基]-4-氧代-4-[2-(三甲基矽基)乙氧基]丁酸，以及以市售之3-{[(苄氧基)羰基]胺基}-N-(第三丁氧基羰基)-D-丙胺酸--N-環己基環己胺(1：1)為基礎，製備胺基酸區塊2-(三甲基矽基)乙基-3-胺基-N-(第三丁氧基羰基)-D-丙胺酸酯。在有HATU及嗎啉的情況下將該二區塊相互偶聯，隨後藉由5%的三氟乙酸在二氯甲烷中在保留矽基乙酯保護基團的情況下將第三丁氧基羰基保護基團脫除，藉此獲得中間物三氟乙酸--2-(三甲基矽基)乙基-N-{(2R)-2-胺基-3-氧代-3-[2-(三甲基矽基)乙氧基]丙基}-N2-(溴乙醯基)-L-alpha-天冬醯胺酸酯(1：1)。
最後在有HATU及4-甲基嗎啉的情況下將此中間物與中間物C58偶聯，隨後藉由氯化鋅進行去保護，藉此製備目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.84min；MS(ESIpos)：m/z=835及837(M+H)+。
中間物F284 N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-3-{[1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧雜-3-氮雜十八烷-18-基]胺基}-D-丙胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0673-1940
首先在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下將中間物L80與市售之(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸偶聯，隨後藉由16%的 三氟乙酸在二氯甲烷中在保留矽基乙酯保護基團的情況下將第三丁氧基羰基保護基團脫除。
最後在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下將此中間物與中間物C58偶聯，隨後藉由氯化鋅進行去保護，藉此製備目標化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=1.46min；MS(ESIpos)：m/z=984.45(M+H)+。
中間物F285 N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-3-[(18-溴-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十八烷-1-醯基)胺基]-D-丙胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0674-1941
首先藉由市售之溴乙酸酐將中間物L80醯化，隨後藉由20%的三氟乙酸在二氯甲烷中在保留矽基乙酯保護基團的情況下將第三丁氧基羰基保護基團脫除。
最後在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下將此中間物與中間物C58偶聯，隨後藉由氯化鋅進行去保護，藉此製備目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.85min；MS(ESIpos)：m/z=967及969(M+H)+。
中間物F286 1-[(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}-D-丙胺醯基)胺基]-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0675-1942
首先在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下將中間物L91與(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸偶聯，隨後藉由12.5%的TFA在DCM中將Boe保護基團脫除。在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下將如此獲得之中間物與中間物C58偶聯，隨後藉由氯化鋅進行去保護，以將其轉化成目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.84min；MS(ESIpos)：m/z=984(M+H)+。
中間物F288 N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-3-({N-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-絲胺醯基}胺基)-D-丙胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0676-1943
在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下，將35mg(39μmol)中間物C74與N-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-絲胺酸(預先以第三丁基-O-第三丁基-L-絲胺酸酯與(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸為基礎製備)偶聯。在藉由氯化鋅去保護以及進行HPLC純化後，獲得14mg(理論之38%)目標化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=1.43min；MS(ESIpos)：m/z=824.34(M+H)+。
中間物F289 N2-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-N6-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-D-離胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0676-1944
首先以N6-[(苄氧基)羰基]-N2-(第三丁氧基羰基)-D-離胺酸為基 礎，按照經典的肽化學方法製備三氟乙酸--2-(三甲基矽基)乙基-N6-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-D-離胺酸酯(1：1)。
在有HATU及4-甲基嗎啉的情況下，將12.5mg(25μmol)此中間物與15mg(23μmol)中間物C58偶聯。在藉由氯化鋅去保護以及進行HPLC純化後，獲得14mg(理論之53%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.83min；MS(ESIpos)：m/z=779(M+H)+。
中間物F290 N2-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-N6-(溴乙醯基)-D-離胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0677-1945
首先以N6-[(苄氧基)羰基]-N2-(第三丁氧基羰基)-D-離胺酸為基礎，按照經典的肽化學方法製備三氟乙酸--2-(三甲基矽基)乙基-N6-(溴乙醯基)-D-離胺酸酯(1：1)。
在有HATU及4-甲基嗎啉的情況下，將12mg(25μmol)此中間物與15mg(23μmol)中間物C58偶聯。在藉由氯化鋅去保護以及進行HPLC純化後，獲得7mg(理論之36%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(ESIpos)：m/z=762及764(M+H)+。
中間物F291 N-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0678-1946
如下製備目標化合物：首先以實例M9為基礎，在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下與N-[(苄氧基)羰基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸偶聯。在下一步中，在室溫下藉由10%的鈀-活性炭在氫正常壓力下進行1小時的氫化，以將Z保護基團脫除，隨後在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下與(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸偶聯，以將經去保護之中間物轉化成目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.21min；MS(ESIpos)：m/z=777(M+H)+。
中間物F293 N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-3-{[3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)苯甲醯基]胺基}-D-丙胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0679-1947
將35mg(39μmol)中間物C74溶解在4ml DMF中，並在有N,N-二異丙基乙胺的情況下與13.5mg(43μmol)市售之1-(3-{[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]羰基}苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮偶聯。在藉由氯化鋅去保護以及進行HPLC純化後，獲得12mg(理論之34%)目標化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=0.93min；MS(ESIpos)：m/z=799(M+H)+。
中間物F294 N-{5-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-5-氧代戊醯基}-L-纈胺醯基-N-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-羧基丙基}-L-丙胺醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0679-1948
將41mg(0.05mmol)中間物C76溶解在12mL甲醇中，並在室溫下藉由10mg 10%的鈀-活性炭在氫正常壓力下進行1小時的氫化。隨後將催化劑濾出，並在真空中將溶劑移除。獲得32mg(理論之92%) 經去保護之中間物。
將15mg(0.022mmol)此中間物溶解在DMF中，並摻入13mg(0.039mmol)1,1'-[(1,5-二氧代戊烷-1,5-二基)雙(氧基)]二吡咯啶-2,5-二酮以及7μL N,N-二異丙基乙胺。在室溫下攪拌1小時後，將混合物濃縮，並藉由HPLC將殘餘物純化。如此獲得9mg(理論之45%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.08min；MS(ESIpos)：m/z=895(M+H)+。
中間物F295 N-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-纈胺醯基-N-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-羧基丙基}-L-丙胺醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0680-1949
將41mg(0.05mmol)中間物C76溶解在12mL甲醇中，並在室溫下藉由10mg 10%的鈀-活性炭在氫正常壓力下進行1小時的氫化。隨後將催化劑濾出，並在真空中將溶劑移除。獲得32mg(理論之92%)經去保護之中間物。
將15mg(0.022mmol)此中間物溶解在4mL DMF中，並摻入10mg(0.039mmol)1-{2-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮以及7μL N,N-二異丙基乙胺。在室溫下攪拌2小時後，將混合物濃縮，並藉由HPLC將殘餘物純化。如此獲得10mg(理 論之56%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.08min；MS(ESIpos)：m/z=821(M+H)+。
中間物F296 三氟乙酸--(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-{2-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)磺醯基]乙基}丁醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0681-1950
以中間物L81為基礎，透過在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下與中間物C58偶聯製備目標化合物。在下一步中，在室溫下藉由10%的鈀-活性炭在DCM/甲醇1：1中在氫正常壓力下進行30分鐘的氫化，以將Z保護基團脫除。隨後在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下與(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸偶聯，最後藉由氯化鋅進行去保護，以將經去保護之中間物轉化成目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.83min；MS(ESIpos)：m/z=785(M+H)+。
中間物F297 S-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(吡咯啶-3-基甲基)胺基]-2-氧代乙基}-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)(異構體1)
Figure 105119613-A0202-12-0682-1951
在氬氛圍下為36mg(0.03mmol，純度68%)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-氧代乙基]-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-半胱胺酸(中間物C92)在0.74ml 2,2,2-三氟乙醇中的溶液摻入15mg(0.11mmol)氯化鋅，並在50℃下將反應混合物攪拌7小時。隨後添加32mg(0.11mmol)EDTA，並將混合物攪拌15分鐘。為反應混合物摻入乙酸乙酯，並用水及飽和NaCl溶液對有機相進行多次洗滌。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，並在真空中將溶劑蒸發。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。獲得6.4mg(理論之25%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.95min；MS(ESIpos)：m/z=792(M+H-CF3CO2H)+。
中間物F298 S-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(吡咯啶-3-基甲基)胺基]-2-氧代乙基}-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)(異構體2)
Figure 105119613-A0202-12-0683-1952
在氬氛圍下為45mg(0.04mmol，純度71%)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-氧代乙基]-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-半胱胺酸(中間物C91)在0.94ml 2,2,2-三氟乙醇中的溶液摻入19mg(0.14mmol)氯化鋅，並在50℃下將反應混合物攪拌3小時。隨後添加42mg(0.14mmol)EDTA，並將混合物攪拌15分鐘。為反應混合物摻入乙酸乙酯，並用水及飽和NaCl溶液對有機相進行多次洗滌。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，並在真空中將溶劑蒸發。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。獲得5.7mg(理論之18%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.96min；MS(ESIpos)：m/z=791(M+H-CF3CO2H)+。
中間物F299 S-(2-{(3-胺基丙基)[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](環己基)甲基]胺基}-2-氧代乙基)-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0684-1953
為88.0mg(0.09mmol)S-{11-[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](環己基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基}-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-半胱胺酸(中間物C84)在1.88ml 2,2,2-三氟乙醇中的溶液摻入76.8mg(0.57mmol)氯化鋅，並在50℃下將反應混合物攪拌3小時。隨後添加164.6mg(0.57mmol)EDTA，並將混合物攪拌15分鐘。為反應混合物摻入乙酸乙酯，並用水及飽和NaCl溶液對有機相進行多次洗滌。透過硫酸鈉對有機相進行乾燥，並在真空中將溶劑蒸發。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。獲得31mg(理論之35%)目標化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=1.82min；MS(ESIpos)：m/z=792(M+H)+。
中間物F300 (2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-(2-{[(2R)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯基]胺基}乙基)丁醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0685-1954
在氬氛圍下為7mg(0.08mmol)2-(三甲基矽基)乙基-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-[(2-{[(2R)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯基]胺基}乙基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}胺基甲酸酯(中間物C100)在0.2ml 2,2,2-三氟乙醇中的溶液摻入11mg(0.08mmol)氯化鋅，並在50℃下將反應混合物攪拌8小時。隨後添加14mg(0.05mmol)EDTA，並將混合物攪拌15分鐘。為反應混合物摻入乙酸乙酯，並用水及飽和NaCl溶液對有機相進行多次洗滌。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，並在真空中將溶劑蒸發。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。獲得1.6mg(理論之27%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m/z=707(M+H-CF3CO2H)+。
中間物F302 S-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(吡咯啶-3-基甲基)胺基]-2-氧代乙基}-N-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)(異構體1)
Figure 105119613-A0202-12-0686-1955
在氬氛圍下為56.9mg(58.2mmol，純度85%)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-氧代乙基]-N-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-半胱胺酸(中間物C94)在1.4ml 2,2,2-三氟乙醇中的混合物摻入31.7mg(0.23mmol)氯化鋅，並在50℃下將反應混合物攪拌3小時。隨後添加68.0mg(0.23mmol)EDTA，並將混合物攪拌15分鐘。為反應混合物摻入乙酸乙酯，並用水及飽和NaCl溶液對有機相進行多次洗滌。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，並在真空中將溶劑蒸發。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。獲得7mg(理論之13%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.91min；MS(ESIpos)：m/z=736(M+H-CF3CO2H)+。
中間物F305 N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-22-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-6,17-二氧代-N-(吡咯啶-3-基甲基)-10,13-二氧雜-3-硫雜-7,16-二氮雜二十二烷-1-醯胺三氟乙酸(1：1)(異構體2)
Figure 105119613-A0202-12-0687-1956
為24.80mg(0.02mmol)第三丁基-3-[2-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-24-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,8,19-三氧代-12,15-二氧雜-5-硫雜-2,9,18-三氮雜二十四碳-1-基]吡咯啶-1-羧酸酯(中間物C99)在0.65ml 2,2,2-三氟乙醇中的溶液摻入13.42mg(0.10mmol)氯化鋅，並在50℃下將反應混合物攪拌8小時。隨後添加28.78mg(0.10mmol)EDTA，並將混合物攪拌15分鐘。為反應混合物摻入乙酸乙酯，並用水及飽和NaCl溶液對有機相進行多次洗滌。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，並在真空中將溶劑蒸發。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。獲得10mg(理論之44%)目標化合物。
LC-MS(方法5)：Rt=3.11min；MS(ESIpos)：m/z=907(M+H-CF3CO2H)+。
中間物F306 N6-(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-beta-丙胺醯基)-N2-{N-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺 醯基-beta-丙胺醯基}-L-離胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0688-1957
在有16.7mg(0.044mmol)HATU及15μl N,N-二異丙基乙胺的情況下將24mg(0.029mmol)中間物C61與30mg(0.035mmol)中間物L99偶聯，隨後如就中間物F119所述，在三氟乙醇中藉由氯化鋅進行去保護，藉此製備目標化合物。在藉由製備性HPLC純化後，獲得19mg(理論之52%，歷經2個階段)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.84min；MS(ESIpos)：m/z=1091(M+H)+。
中間物F307 N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-S-{(5R,14R)-13-(3-胺基丙基)-14-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-5-羧基-15,15-二甲基-2,7,12-三氧代-10-硫雜-3,6,13-三氮雜十六碳-1-基}-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0689-1958
將8.90mg(8.88μmol)三氟乙酸2-(三甲基矽基)乙基-3-胺基-N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-基)-D-丙胺酸酯(1：1)(中間物C80)以及2.31mg(9.77μmol)1-(2-溴乙醯氧基)吡咯啶-2,5-二酮溶解在1ml二甲基甲醯胺中，並摻入2.9μl(27μmol)N-甲基嗎啉。在室溫下將反應混合物攪拌1小時。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水/0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得5.80mg(理論之65%)2-(三甲基矽基)乙基-N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-基)-3-[(溴乙醯基)胺基]-D-丙胺酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.57min；MS(ESIpos)：m/z=1008(M+H)+。
將2-(三甲基矽基)乙基-N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)- 1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-基)-3-[(溴乙醯基)胺基]-D-丙胺酸酯(31.9mg，31.6μmol)與L-半胱胺酸(7.66mg，63.2μmol)溶解在3.0ml DMF中，並在室溫下攪拌一夜。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水/0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得28.1mg(理論之76%)S-[(19R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-19-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-5-氧雜-14-硫雜-7,11,18,21-四氮雜-2-矽雜二十三烷-23-基]-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=2.52min；MS(ESIpos)：m/z=1049[M+H]+
將S-[(19R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-19-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-5-氧雜-14-硫雜-7,11,18,21-四氮雜-2-矽雜二十三烷-23-基]-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)(13.5mg，11.6μmol)溶解在1.0mlDMF中，摻入2,5-二氧代吡咯啶-1-基-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸酯(6.76mg，11.6μmol)(中間物L88)以及N,N-二異丙基乙胺(4.0μl，23μmol)，並在室溫下攪拌1小時。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水/0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得11.1mg(理論之68%)N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-S-[(19R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-19-{[2-(三甲基矽 基)乙氧基]羰基}-5-氧雜-14-硫雜-7,11,18,21-四氮雜-2-矽雜二十三烷-23-基]-L-半胱胺酸化合物。
LC-MS(方法14)：Rt=7.38min；MS(ESIpos)：m/z=1412[M+H]+
將N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-S-[(19R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-19-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-5-氧雜-14-硫雜-7,11,18,21-四氮雜-2-矽雜二十三烷-23-基]-L-半胱胺酸(9.40mg，6.65μmol)溶解在2.0ml三氟乙醇中，摻入二氯化鋅(5.44mg，39.9μmol)。在50℃下將反應混合物攪拌1小時。添加二氯化鋅(5.44mg，39.9μmol)，並在50℃下將反應混合物攪拌1小時。為反應混合物摻入乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(23.4mg，79.8μmol)，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1%TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得5.60mg(理論之66%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.93min；MS(ESIpos)：m/z=1168(M+H)+。
中間物F308 N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N-[(12R,19R)-19-胺基-4-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-12,19-二羧基-5,10,15-三氧代-7,17-二硫雜-4,11,14-三氮雜十九碳-1-基]-L-丙胺醯胺-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0692-1959
將N-[3-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}硫基)丙醯基]-3-[(溴乙醯基)胺基]-D-丙胺酸-三氟乙酸(1：1)(12.7mg，14.5μmol)與N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸(3.84mg，14.5μmol)溶解在1.5ml DMF中，並在室溫下攪拌一夜。
隨後添加N,N-二異丙基乙胺(2.5μl，14μmol)。在室溫下將反應混合物攪拌3小時，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得7.40mg(理論之48%)S-{(5R,14R)-13-(3-胺基丙基)-14-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-5-羧基-15,15-二甲基-2,7,12-三氧代-10-硫雜-3,6,13-三氮雜十六碳-1-基}-N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.03min；MS(ESIpos)：m/z=949[M+H]+
將S-{(5R,14R)-13-(3-胺基丙基)-14-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-5-羧基-15,15-二甲基-2,7,12-三氧代-10-硫雜-3,6,13-三氮雜 十六碳-1-基}-N-{[2-(三甲基矽基)-乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)(7.50mg，7.05μmol)溶解在1.0ml DMF中，並摻入2,5-二氧代吡咯啶-1-基-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸酯(4.11mg，純度82%，7.05μmol)(中間物L88)以及N,N-二異丙基乙胺(2.5μl，14μmol)。在室溫下將反應混合物攪拌1小時，隨後直接藉由製備性RP-HPLC將其純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水/0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得4.30mg(46%)N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N-[(8R,15R)-23-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8,15-二羧基-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-5-氧雜-10,20-二硫雜-7,13,16,23-四氮雜-2-矽雜二十六烷-26-基]-L-丙胺醯胺化合物。
LC-MS(方法14)：Rt=6.47min；MS(ESIpos)：m/z=1312[M+H]+
將N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N-[(8R,15R)-23-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8,15-二羧基-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-5-氧雜-10,20-二硫雜-7,13,16,23-四氮雜-2-矽雜二十六烷-26-基]-L-丙胺醯胺(4.00mg，3.05μmol)溶解在1.0ml三氟乙醇中，並摻入二氯化鋅(2.49mg，18.3μmol)。在50℃下將反應混合物攪拌1小時。為反應混合物摻入乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(5.34mg，18.3μmol)，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得2.50mg(理論之64%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.00min；MS(ESIpos)：m/z=1168[M+H]+
中間物F309 4-{[(11R,17R)-16-(3-胺基丙基)-17-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-18,18-二甲基-6,6-二氧離子基-2,10,15-三氧代-6λ6,13-二硫雜-3,9,16-三氮雜十九烷-11-基]胺基}-4-氧代丁酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0694-1960
將S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-(4-第三丁氧基-4-氧代丁醯基)-L-半胱胺酸(50.0mg，57.3μmol)(中間物C77)與三氟乙酸-苄基-{2-[(2-胺基乙基)磺醯基]乙基}胺基甲酸酯(1：1)(27.5mg，68.7μmol)(中間物L81)置於4.0ml DMF中，摻入HATU(26.1mg，68.7μmol)以及N,N-二異丙基乙胺(30μl，170μmol)。在室溫下將反應混合物攪拌10分鐘，隨後直接藉由製備性RP-HPLC將其純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水/0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得53.9mg(81%)第三丁基-4-{[(12R)-17-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-26,26-二甲基-7,7- 二氧離子基-3,11,16,22-四氧代-1-苯基-2,23-二氧雜-7λ6,14-二硫雜-4,10,17,21-四氮雜-26-矽雜二十七烷-12-基]胺基}-4-氧代丁酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.54min；MS(ESIpos)：m/z=1141[M+H]+
在氬氛圍下將乙酸鈀(II)(5.12mg，22.8μmol)置於3.0ml DCM中，摻入三乙胺(9.5μl，68μmol)以及三乙基矽烷(73μl，460μmol)，並攪拌5分鐘。隨後添加溶解於2.0ml DCM中的第三丁基-4-{[(12R)-17-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-26,26-二甲基-7,7-二氧離子基-3,11,16,22-四氧代-1-苯基-2,23-二氧雜-7λ6,14-二硫雜-4,10,17,21-四氮雜-26-矽雜二十七烷-12-基]胺基}-4-氧代丁酸酯(52.1mg，45.6μmol)。在室溫下將反應混合物攪拌一夜，並摻入2.0ml水。在真空中將溶劑蒸發。為殘餘物摻入乙腈，對其進行過濾，並藉由製備性RP-HPLC將其純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水/0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得43.4mg(85%)三氟乙酸-第三丁基-4-{[(16R)-23-胺基-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-21,21-二氧離子基-6,12,17-三氧代-5-氧雜-14,21λ6-二硫雜-7,11,18-三氮雜-2-矽雜二十三烷-16-基]胺基}-4-氧代丁酸酯(1：1)化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.21min；MS(ESIpos)：m/z=1007[M+H]+
將三氟乙酸-第三丁基-4-{[(16R)-23-胺基-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-21,21-二氧離子基-6,12,17-三氧代-5-氧雜-14,21λ6-二硫雜-7,11,18-三氮雜-2-矽雜二十三烷-16-基]胺基}-4-氧代丁酸酯(1：1)(20.0mg，17.8μmol)以 及(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸(3.32mg，21.4μmol)置於2.0ml DMF中，並摻入HATU(8.14mg，21.4μmol)以及N,N-二異丙基乙胺(9.3μl，54μmol)。
在室溫下將反應混合物攪拌10分鐘。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水/0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得17.4mg(理論之85%)第三丁基-4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-26-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,2-二甲基-21,21-二氧離子基-6,12,17,25-四氧代-5-氧雜-14,21λ6-二硫雜-7,11,18,24-四氮雜-2-矽雜二十六烷-16-基]胺基}-4-氧代丁酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.46min；MS(ESIpos)：m/z=1144[M+H]+
將第三丁基-4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-26-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,2-二甲基-21,21-二氧離子基-6,12,17,25-四氧代-5-氧雜-14,21λ6-二硫雜-7,11,18,24-四氮雜-2-矽雜二十六烷-16-基]胺基}-4-氧代丁酸酯(15.9mg，13.9μmol)溶解在2.0ml三氟乙醇中，摻入二氯化鋅(11.4mg，83.4μmol)。在50℃下將反應混合物攪拌1小時。添加二氯化鋅(11.4mg，83.4μmol，並在50℃下將反應混合物攪拌1小時。添加二氯化鋅(11.4mg，83.4μmol，並在50℃下將反應混合物攪拌1小時。為反應混合物摻入乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(73.2mg，250μmol)，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得10mg(理論之68%)目標化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=1.45min；MS(ESIpos)：m/z=944[M+H]+
中間物F310 三氟乙酸-N-[(8R,14R)-13-(3-胺基丙基)-14-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-15,15-二甲基-2,7,12-三氧代-10-硫雜-3,6,13-三氮雜十六烷-8-基]-2,5,8,11-四氧雜十四烷-14-醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0697-1961
將S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)(100mg，120μmol)(中間物C70)與1-[(14-氧代-2,5,8,11-四氧雜十四烷-14-基)氧基]吡咯啶-2,5-二酮(44.1mg，132μmol)置於3.0ml DMF中，並摻入4-甲基嗎啉(40μl，360μmol)。在室溫下將反應混合物攪拌一夜，用乙酸(420μmol)進行淬滅，並直接藉由製備性RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水/0.1% TFA)將其純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得69.4mg(理論之62%)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13- 基)-N-(14-氧代-2,5,8,11-四氧雜十四烷-14-基)-L-半胱胺酸化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=2.61min；MS(ESIneg)：m/z=933[M-H]-
將S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-(14-氧代-2,5,8,11-四氧雜十四烷-14-基)-L-半胱胺酸(27.0mg，28.9μmol)置於2.0ml DMF中，並摻入N-(2-胺基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺(11.4mg，57.7μmol)(中間物L1)、N,N-二異丙基乙胺(15μl，87μmol)以及HATU(22.0mg，57.7μmol)。在室溫下將反應混合物攪拌3小時，並直接藉由製備性RP-HPLC將其純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水/0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得13.7mg(理論之43%)2-(三甲基矽基)乙基-{(16R)-21-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)胺甲醯基]-14,20-二氧代-2,5,8,11-四氧雜-18-硫雜-15,21-二氮雜二十四烷-24-基}胺基甲酸酯化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=2.54min；MS(ESIpos)：m/z=1114[M+H]+
將2-(三甲基矽基)乙基-{(16R)-21-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)胺甲醯基]-14,20-二氧代-2,5,8,11-四氧雜-18-硫雜-15,21-二氮雜二十四烷-24-基}胺基甲酸酯(13.7mg，12.3μmol)溶解在2.0ml三氟乙醇中，摻入二氯化鋅(10.1mg，73.8μmol)。在50℃下將反應混合物攪拌4小時。為反應混合物摻入乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(21.6mg，73.8μmol)，攪拌10分鐘，隨後摻入水 (0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得7.30mg(理論之47%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.01min；MS(ESIpos)：m/z=970[M+H]+
中間物F311 S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,30-二氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧雜-3-氮雜三十烷-30-基]-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0699-1962
將1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧雜-3-氮雜三十烷-30-酸(10.8mg，18.7μmol)(中間物L97)置於1.0ml DMF中，摻入N,N-二異丙基乙胺(5.4μl，31.2μmol)以及HATU(7.10mg，18.7μmol)，並攪拌10分鐘。隨後添加溶解於1.0ml DMF及N,N-二異丙基乙胺(2.7μl，15.6μmol)中 的S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)(12.9mg,15.6μmol)(中間物C71)。在室溫下將反應混合物攪拌2小時，隨後直接藉由製備性RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水/0.1% TFA)將其純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得3.5mg(18%)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,30-二氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧雜-3-氮雜三十烷-30-基]-L-半胱胺酸化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.30min；MS(ESIneg)：m/z=1276[M-H]-
將S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,30-二氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧雜-3-氮雜三十烷-30-基]-L-半胱胺酸(3.50mg，2.74μmol)溶解在1.0ml三氟乙醇中，摻入二氯化鋅(6.25mg，16.4μmol)。在50℃下將反應混合物攪拌4小時。為反應混合物摻入乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(47μl，16μmol)，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1% TFA)。直羧藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得2.0mg(理論之59%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.94min；MS(ESIpos)：m/z=1133(M+H)+。
中間物F312 N-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-纈胺醯基-N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-{[2-(L-gamma-麩胺醯基胺基)乙基]胺基}-1-氧代丁烷-2-基]-L-丙胺醯胺-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0701-1963
以中間物C103為基礎，透過在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下與N-[(苄氧基)羰基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸偶聯來製備目標化合物。在下一步中，在室溫下藉由10%的鈀-活性炭在DCM/甲醇1：1中在氫正常壓力下進行1小時的氫化，以將Z保護基團脫除。隨後在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下將經去保護之中間物與(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸偶聯，最後藉由氯化鋅進行去保護以及藉由製備性HPLC進行純化，以將中間物轉化成目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.9min；MS(ESIpos)：m/z=992(M+H)+。
中間物F313 S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙 基}{[(3R,4R)-4-氟吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-氧代乙基]-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧雜-3-氮雜十八烷-18-基]-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0702-1964
在氬氛圍下為55.0mg(0.14mmol)1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2-氧代-6,9,12,15-四氧雜-3-氮雜十八烷-18-酸在2.60ml DMF中的溶液添加16.9mg(0.13mmol)N,N-二異丙基乙胺以及50.0mg(0.13mmol)HATU。在室溫下將反應混合物攪拌10分鐘。隨後添加40.0mg(0.05mmol)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3R,4R)-4-氟-1-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-氧代乙基]-L-半胱胺酸(中間物C107)的溶液，並在室溫下將混合物攪拌一夜。為混合物摻入水，並用二氯甲烷對其進行萃取。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。藉由製備性HPLC將殘餘物純化。獲得10mg(理論之13%，純度82%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.36min；MS(ESIpos)：m/z=1145(M+H)+。
為10.9mg(7.8mmol，純度82%)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3R,4R)-4-氟-1-{[2-(三甲基 矽基)乙氧基]羰基}吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-氧代乙基]-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧雜-3-氮雜十八烷-18-基]-L-半胱胺酸在0.85ml 2,2,2-三氟乙醇中的溶液摻入4.3mg(0.03mmol)氯化鋅，並在50℃下將反應混合物攪拌2.5小時。隨後添加9.1mg(0.03mmol)EDTA，並將混合物攪拌15分鐘。藉由製備性HPLC將反應混合物純化。獲得2.3mg(理論之26%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(ESIpos)：m/z=781(M+H-CF3CO2H)+。
中間物F314 三氟乙酸-3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-氧代乙基]硫基}-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)丙醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0703-1965
在氬氛圍下，為50.0mg(0.04mmol)3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3R,4R)-4-氟-1-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-氧代乙基]硫基}丙酸(中間物106)在3.14ml DMF中的溶液添加16.89mg(0.13mmol) N,N-二異丙基乙胺以及33.13mg(0.087mmol)HATU。在室溫下將反應混合物攪拌10分鐘。隨後添加27.29mg(0.09mmol)N-(2-胺基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺三氟乙酸(1：1)(中間物L1)的溶液，並在室溫下將混合物攪拌15分鐘。為混合物摻入水，並用二氯甲烷對其進行萃取。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。藉由製備性HPLC將殘餘物純化。獲得41mg(理論之68%，純度66%)目標化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=2.55min；MS(ESIneg)：m/z=959(M-H+Na)-。
為41.1mg(0.03mmol,，純度66%)2-(三甲基矽基)乙基-(3R,4R)-3-[2-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-14-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,8,13-三氧代-5-硫雜-2,9,12-三氮雜十四碳-1-基]-4-氟吡咯啶-1-羧酸酯在2.54ml 2,2,2-三氟乙醇中的溶液摻入24.7mg(0.18mmol)氯化鋅，並在50℃下將反應混合物攪拌2.5小時。隨後添加53.0mg(0.18mmol)EDTA，並將混合物攪拌15分鐘。藉由製備性HPLC將反應混合物純化。獲得10mg(理論之36%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(ESIpos)：m/z=781(M+H-CF3CO2H)+。
中間物F315 S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}-N-{3-[5-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)-1,2,4-噁二唑-3-基]丙醯基}-L-半胱胺酸
Figure 105119613-A0202-12-0705-1966
在氬氛圍下，為50.0mg(0.07mmol)3-[5-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)-1,2,4-噁二唑-3-基]丙酸(中間物L100)在3.5ml DMF中的溶液添加18.02mg(0.14mmol)N,N-二異丙基乙胺以及31.82mg(0.09mmol)HATU。在室溫下將反應混合物攪拌10分鐘。隨後添加50.0mg(0.07mmol)N-(2-胺基乙基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺乙酸酯(1：1)(中間物C107)的溶液，並在室溫下將混合物攪拌2小時。為混合物摻入水，並用二氯甲烷對其進行萃取。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。將殘餘物用於後續操作，不對其進行純化。獲得49mg(理論之21%，純度31%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.30min；MS(ESIpos)：m/z=1022(M+H)+。
為49.0mg(0.015mmol，純度31%)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-{3-[5-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)-1,2,4-噁二唑-3-基]丙醯基}-L- 半胱胺酸在0.5ml 2,2,2-三氟乙醇中的溶液摻入8.0mg(0.06mmol)氯化鋅，並在50℃下將反應混合物攪拌2小時。隨後添加17.2mg(0.06mmol)EDTA，並將混合物攪拌15分鐘。藉由製備性HPLC將反應混合物純化。獲得3mg(理論之21%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.91min；MS(ESIpos)：m/z=877(M+H-CF3CO2H)+。
中間物F316 三氟乙酸-N-{2-[(3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-氧代乙基]硫基}丙醯基)胺基]乙基}-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0706-1967
在氬氛圍下，為50.0mg(0.04mmol，純度65%)3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3R,4R)-4-氟-1-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-氧代乙 基]硫基}丙酸(中間物106)在3.0ml DMF中的溶液添加16.89mg(0.13mmol)N,N-二異丙基乙胺以及33.13mg(0.087mmol)HATU。在室溫下將反應混合物攪拌10分鐘。隨後添加37.2mg(0.09mmol，純度70%)N-(2-胺基乙基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺乙酸酯(1：1)(中間物L73)的溶液，並在室溫下將混合物攪拌7分鐘。為混合物摻入水，並用二氯甲烷對其進行萃取。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。將殘餘物用於後續操作，不對其進行純化。獲得57mg(理論之77%，純度59%)目標化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=2.60min；MS(ESIpos)：m/z=981(M+H)+。
為56.0mg(0.03mmol,，純度59%)2-(三甲基矽基)乙基-(3R,4R)-3-[2-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-18-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,8,13-三氧代-5-硫雜-2,9,12-三氮雜十八碳-1-基]-4-氟吡咯啶-1-羧酸酯在2.8ml 2,2,2-三氟乙醇中的溶液摻入36.0mg(0.27mmol)氯化鋅，並在50℃下將反應混合物攪拌2小時。隨後添加78.3mg(0.27mmol)EDTA，並將混合物攪拌15分鐘。藉由製備性HPLC將反應混合物純化。獲得16mg(理論之44%，純度85%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(ESIpos)：m/z=837(M+H-AcOH)+。
針對APDC或ADC前驅體(中間物系列Q)之合成的一般規程
可根據示意圖1將先前描述之F系列中間物(F1-F305)轉換成APDC前驅體Q。在釋放APDC前驅體分子中之可豆蛋白酶裂解之三肽的N端胺基的情況下，可在最後一步中藉由結構各異的經取代之醯基殘基或烷基殘基對其進行修飾，以改善特性曲線。
在此示出示範性的規程：將0.037mmol適合的中間物F1-F305(除F194及F294以外)或其受保護的前體置於1-20mL，較佳5-10mL適合的溶劑(例如DMF、DMSO、DCM、氯仿、甲苯、THF、甲醇或其混合物)中，並摻入0.039mmol N端經修飾之三肽衍生物(例如中間物L92)，以及0.041mmol常用的偶聯試劑(例如HATU、EDCI/HOBT、BEP等)，以及0.11mmol常用的鹼(例如N,N-二異丙基乙胺、三乙胺、4-甲基嗎啉等)。在室溫下攪拌5分鐘後，用2滴三氟乙酸將混合物酸化，並將其濃縮。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。在真空中將相應的溶離份濃縮，並將殘餘物自乙腈/水凍乾。
若述及之對結合之三肽衍生物的N端修飾為保護基團，隨後可根據習知的方法將此保護基團以及前驅體分子中視情況存在的其他保護基團脫除，例如較佳藉由氫解將Z保護基團脫除，藉由酸式分解將Boc保護基團脫除，藉由鹼式分解將Fmoc保護基團脫除，或者藉由氟化物或氯化鋅將Teoc基團脫除。
最後可將如此釋放之胺基醯化或烷基化，例如藉由胺反應性基團(如活性酯、醯氯、異氰酸酯等)實現，或者透過在有常用偶聯試劑(例如HATU、EDCI/HOBT、BEP等)以及常用鹼(例如N,N-二異丙基乙胺、三乙胺、4-甲基嗎啉等)的情況下與羧酸衍生物偶聯。在最後一步中將分子中可能尚存在的其他保護基團脫除。
示意圖1：
Figure 105119613-A0202-12-0709-1968
[a)：HATU、DMF、N,N-二異丙基乙胺、室溫，或者EDCI、HOBT、N,N-二異丙基乙胺、DMF、室溫；b)：H2、10% Pd-C、MeOH、室溫；c)：R22-COOH、EDCI、HOBT、N,N-二異丙基乙胺、DMF、室溫，或者R22-COOH、HATU、N,N-二異丙基乙胺、DMF、室溫，或者R22-COOSu、N,N-二異丙基乙胺、DMF、室溫]
此外可如示意圖2及3所示將其他中間物轉化成可豆蛋白酶裂解之ADC前驅體。
示意圖2：
Figure 105119613-A0202-12-0710-1969
[a)：HATU、DMF、N,N-二異丙基乙胺、室溫，或者EDCI、HOBT、N,N-二異丙基乙胺、DMF、室溫；b)：H2、10% Pd-C、MeOH、室溫；c)：1,1'-[(1,5-二氧代戊烷-1,5-二基)雙(氧基)]二吡咯啶-2,5-二酮、N,N-二異丙基乙胺、DMF、室溫]
示意圖3：
Figure 105119613-A0202-12-0711-1970
[a)：HATU、DMF、N,N-二異丙基乙胺、室溫，或者EDCI、HOBT、N,N-二異丙基乙胺、DMF、室溫；b)：H2、10% Pd-C、MeOH、室溫；c)：1,1'-[(1,5-二氧代戊烷-1,5-二基)雙(氧基)]二吡咯啶-2,5-二酮、N,N-二異丙基乙胺、DMF、室溫]
作為示意圖1-3所示之苄氧基羰基基團的替代方案，亦可採用其他在肽化學中確立的保護基團，並根據習知的方法將其脫除。根據為本領域技術人員所知的要求來選擇保護基團，從而與分子中存在之其他結構元素相容。在最後一步中將分子中可能尚存在之其他保護基團脫除。
可視情況調整此等合成之序列。
此外，在申請專利範圍內，就連接子結構L1-L2而言，蛋白質反應性基團可不同。
中間物Q1 N-[(苄氧基)羰基]-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0712-1971
將30mg(0.037mmol)中間物F104置於6mL DMF中，並摻入16mg(0.039mmol)中間物L92，以及15.5mg(0.041mmol)HATU及0.11mmol N,N-二異丙基乙胺。在室溫下攪拌5分鐘後，用2滴三氟乙酸將混合物酸化，並將其濃縮。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。將相應的溶離份濃縮，並將殘餘物自乙腈/水凍乾。獲得21.5mg(理論之53%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.08min；MS(ESIpos)：m/z=1083(M+H)+。
中間物Q2 N-乙醯基-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0713-1972
將30mg(0.037mmol)中間物F104置於6mL DMF中，並摻入14mg(0.045mmol)中間物L93，以及15.5mg(0.041mmol)HATU及0.112mmol N,N-二異丙基乙胺。在室溫下攪拌5分鐘後，再添加1.5mg HATU及0.01mmol N,N-二異丙基乙胺，並在室溫下再攪拌10分鐘。隨後用2滴三氟乙酸將混合物酸化，並在真空中將其濃縮。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。將相應的溶離份濃縮，並將殘餘物自乙腈/水凍乾。獲得12.2mg(理論之33%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.94min；MS(ESIpos)：m/z=991(M+H)+。
中間物Q3 N-(3-羧基丙醯基)-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基1-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0714-1973
將15mg(0.019mmol)中間物F104置於5mL DMF中，並摻入9.7mg(0.02mmol)中間物L94，以及8.5mg(0.022mmol)HATU及0.056mol N,N-二異丙基乙胺，並在室溫下攪拌5分鐘。隨後在真空中進行濃縮，並藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。將相應的溶離份濃縮，並將殘餘物自乙腈/水凍乾。獲得5.7mg(理論之27%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.17min；MS(ESIpos)：m/z=1149(M+H)+。
將此中間物溶解在2mL 2,2,2-三氟乙醇中。添加2.6mg(0.019mmol)氯化鋅，並在50℃下將混合物攪拌45分鐘。隨後添加5.6mg(0.019mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，並用3mL乙腈/水9：1將混合物稀釋。隨後添加10μL三氟乙酸，在室溫下攪拌10分鐘，隨後在真空中將混合物濃縮。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。在將相應的溶離份濃縮以及將殘餘物自乙腈/水凍乾後，獲得3.1mg(理論之62%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.93min；MS(ESIpos)：m/z=1049 (M+H)+。
中間物Q4 三氟乙酸--N-[(苄氧基)羰基]-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-[(11S,15R)-15-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-14-乙二醇醯基-16,16-二甲基-6,6-二氧離子基-2,10-二氧代-6λ6-硫雜-3,9,14-三氮雜十七烷-11-基]-L-天冬醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0715-2620
將5mg(0.006mmol)中間物F296置於3mL DMF中，並摻入2.8mg(0.007mmol)中間物L92，以及2.3mg(0.006mmol)HATU及0.017mmol N,N-二異丙基乙胺。在室溫下攪拌15分鐘後，用2滴三氟乙酸將混合物酸化，並將其濃縮。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。將相應的溶離份濃縮，並將殘餘物自乙腈/水凍乾。獲得0.93mg(理論之13%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.07min；MS(ESIpos)：m/z=1175(M+H)+。
中間物Q5 N-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2- 二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-羧基丙基}-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0716-1975
將55mg中間物C101置於33mL DMF中，並摻入27.5mg(0.067mmol)中間物L92，以及28mg(0.073mmol)HATU及32μL N,N-二異丙基乙胺。在室溫下攪拌10分鐘後，將混合物濃縮，並藉由製備性HPLC將殘餘物純化。
將如此獲得之粗製產物置於4mL THF中，並摻入2mL水以及0.375mL 2M氫氧化鋰溶液。在室溫下將混合物攪拌1小時，隨後藉由1N鹽酸將其調整至中性，並在真空中將其濃縮。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。將相應的溶離份濃縮，並將殘餘物自乙腈/水凍乾。獲得10.2mg N-[(苄氧基)羰基]-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-羧基丙基}-L-天冬醯胺。
LC-MS(方法1)：Rt=1.09min；MS(ESIpos)：m/z=904(M+H)+。
在下一步中，在室溫下藉由10%的鈀-活性炭在甲醇中在氫正常壓力下進行1小時的氫化，以將Z保護基團脫除，藉此獲得7.5mg(理 論之87%)L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-羧基丙基}-L-天冬醯胺。
LC-MS(方法1)：Rt=0.80min；MS(ESIpos)：m/z=770(M+H)+。
將3.75mg(0.005mmol)L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-羧基丙基}-L-天冬醯胺置於4mL DMF中，並摻入1.72mg(0.007mmol)1-{2-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮以及1.2μL(0.007mmol)N,N-二異丙基乙胺。在室溫下將反應混合物攪拌1小時，在真空中將其濃縮，並藉由製備性RP-HPLC對殘餘物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得1.3mg(理論之29%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.03min；MS(ESIpos)：m/z=907(M+H)+。
中間物Q6 N-{5-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-5-氧代戊醯基}-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-羧基丙基}-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0718-1976
將3.75mg(0.005mmol)在F5下描述的中間物L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-羧基丙基}-L-天冬醯胺置於4mL DMF中，並摻入2.2mg(0.007mmol)1,1'-[(1,5-二氧代戊烷-1,5-二基)雙(氧基)]二吡咯啶-2,5-二酮以及1.2μL(0.007mmol)N,N-二異丙基乙胺。在室溫下將反應混合物攪拌1小時，在真空中將其濃縮，並藉由製備性RP-HPLC對殘餘物進行純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得1.9mg(理論之27%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.04min；MS(ESIpos)：m/z=981(M+H)+。
中間物Q7 N-乙醯基-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-({3-[(溴乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1-氧代丁烷-2-基]-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0719-1977
將4.1mg(0.005mmol)中間物F282置於1mL DMF中，並摻入1.7mg(0.005mmol)中間物L93，以及2.2mg(0.006mmol)HATU及0.6μl 4-甲基嗎啉。在室溫下攪拌60分鐘後，將混合物濃縮，並藉由製備性HPLC將殘餘物純化。將相應的溶離份濃縮，並將殘餘物自乙腈/水凍乾。獲得1.2mg(理論之24%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.98min；MS(ESIpos)：m/z=1045及1047(M+H)+。
中間物Q8 N-[(苄氧基)羰基]-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-[(20R)-25-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-20-羧基-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,18,24-三氧代-6,9,12,15-四氧雜-22-硫雜-3,19,25-三氮雜二十八烷-28-基]-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0720-1978
將6.80mg(6.35μmol)S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧雜-3-氮雜十八烷-18-基]-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)(中間物F257)與2.71mg(6.63μmol)N-[(苄氧基)羰基]-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-L-天冬醯胺(中間物L92)溶解在1.0mL DMF中，並摻入2.66mg(6.98μmol)HATU及3.3μl(19μmol)N,N-二異丙基乙胺。在室溫下攪拌45分鐘後，用4μl三氟乙酸將混合物酸化，並藉由製備性HPLC將其純化。將相應的溶離份濃縮，並將殘餘物自乙腈/水凍乾。獲得1.20mg(理論之14%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.08min；MS(ESIpos)：m/z=1346(M+H)+。
中間物Q9
Figure 105119613-A0202-12-0721-1979
將5mg(0.0062mmol)中間物F104置於2mL DMF中，並摻入2.2mg(0.0068mmol)中間物L95，以及4.7mg(0.012mmol)HATU及5當量的N,N-二異丙基乙胺。在室溫下攪拌1小時後，在真空中將混合物濃縮，並藉由製備性HPLC將殘餘物純化。將相應的溶離份濃縮，並將殘餘物自乙腈/水凍乾。獲得2mg(理論之32%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.28min；MS(ESIpos)：m/z=997(M+H)+。
中間物Q10
Figure 105119613-A0202-12-0722-1980
將5mg(0.0062mmol)中間物F104置於2mL DMF中，並摻入2.2mg(0.0068mmol)中間物L96，以及5.9mg(0.016mmol)HATU及4當量的4-甲基嗎啉。在室溫下攪拌2小時後，在真空中將混合物濃縮，並藉由製備性HPLC將殘餘物純化。將相應的溶離份濃縮，並將殘餘物自乙腈/水凍乾。獲得2.5mg(理論之41%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.99min；MS(ESIpos)：m/z=991(M+H)+。
中間物Q11 N-(吡啶-4-基乙醯基)-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}-L-天冬醯胺三氟乙酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0723-1981
以與中間物Q9類似的方式，將7mg(0.0087mmol)中間物F104與中間物L103偶聯。獲得3.5mg(理論之34%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.83min；MS(ESIpos)：m/z=1068(M+H)+。
中間物Q12 N-異菸鹼醯基-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}-L-天冬醯胺三氟乙酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0724-1982
以與中間物Q9類似的方式，將8mg(0.0092mmol)中間物F104與中間物L104偶聯。獲得6mg(理論之46%)目標化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=1.71min；MS(ESIpos)：m/z=1054(M+H)+。
中間物Q13 N-{[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙醯基}-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0725-1983
以與中間物Q9類似的方式，將7mg(0.0087mmol)中間物F104與中間物L105偶聯。獲得4.6mg(理論之47%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.97min；MS(ESIpos)：m/z=1109(M+H)+。
中間物Q14 N-[(苄氧基)羰基]-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}-L-麩胺醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0726-1984
LC-MS(方法1)：Rt=1.15min；MS(ESIpos)：m/z=1097(M+H)+。
以與中間物Q1類似的方式製備此中間物。
中間物Q15 N-[(苄氧基)羰基]-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}-L-alpha-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0726-1985
以與中間物Q1類似的方式，將10mg(0.012mmol)中間物F104與中間物L106偶聯。隨後藉由氯化鋅將三甲基矽基乙酯分解，以製備目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.1min；MS(ESIpos)：m/z=1085(M+H)+。
以與中間物Q1類似的方式，用相應的中間物前體製備以下中間物Q16-Q22：
中間物Q16 N-[(苄氧基)羰基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0727-1986
LC-MS(方法1)：Rt=1.13min；MS(ESIpos)：m/z=1111(M+H)+。
中間物Q17 N-[(苄氧基)羰基]-L-丙胺醯基-L-纈胺醯基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺 基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0728-1987
LC-MS(方法1)：Rt=1.13min；MS(ESIpos)：m/z=1111(M+H)+。
中間物Q18 N-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-[(3-{[(1S)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-氧代丙基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0729-1988
以化合物C111為基礎，首先在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下與中間物L107偶聯，隨後在三氟乙醇中藉由氯化鋅進行去保護，藉此製備目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(ESIpos)：m/z=1107[M+H]+。
中間物Q19 N-[(苄氧基)羰基]-L-丙胺醯基-甘胺醯基-N1-{(2S)-4-[{((R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0730-1989
LC-MS(方法1)：Rt=1.06min；MS(ESIpos)：m/z=1069(M+H)+。
中間物Q20 N-(38-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧雜三十八烷-38-基)-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-[(20R)-25-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-20-羧基-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,18,24-三氧代-6,9,12,15-四氧雜-22-硫雜-3,19,25-三氮雜二十八烷-28-基]-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0731-1990
在0℃下將47.2mg(0.0559mmol)中間物L102置於0.50mL DMF中，並摻入7.2mg(0.053mmol)HOAt、20.2mg(0.0532mmol)HATU以及74.1μl(0.425mmol)N,N-二異丙基乙胺。在0℃下攪拌5分鐘後，添加溶解於DMF(0.5mL)中的57.0mg(0.0532mmol)中間物F257。在0℃下攪拌2小時後，添加水(1.0mL)以及ACN(1.5mL)。藉由製備性HPLC將混合物純化兩次(溶離劑：ACN/水+0.1% TFA，梯度=1：2→2：1)。將相應的溶離份濃縮，並將殘餘物自乙腈/水凍乾。獲得9.0mg(理論之9.5%)目標化合物。
LC-MS(方法14)：Rt=5.43min；MS(ESIpos)：m/z=1783.8643(M+H)+。
中間物Q21 N-(38-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧雜三十八烷-38-基)-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0732-1991
在0℃下將57.5mg(0.0713mmol)中間物F104置於0.80mL DMF中，並摻入61.2mg(0.0727mmol)中間物L102，以及27.6mg(0.0727mmol)HATU及74.5μl(0.428mmol)N,N-二異丙基乙胺。在0℃下攪拌30分鐘後，添加水(1.0mL)以及ACN(1.5mL)。藉由製備性HPLC將混合物純化(溶離劑：ACN/水+0.1% TFA，梯度=45%→85%)。將相應的溶離份濃縮，並將殘餘物自乙腈/水凍乾。獲得39mg(理論之36%)目標化合物。
LC-MS(方法14)：Rt=5.44min；MS(ESIpos)：m/z=1519.7598 (M+H)+。
中間物Q22 N-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-{[2-(L-gamma-麩胺醯基胺基)乙基]胺基}-1-氧代丁烷-2-基]-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0733-1992
如下製備目標化合物：以化合物C103為基礎，首先在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下與中間物L92偶聯。在下一步中，在室溫下藉由10%的鈀-活性炭在乙醇中在氫正常壓力下進行30分鐘的氫化，以將Z保護基團脫除，隨後在DMF中在有N,N-二異丙基乙胺的情況下使經去保護之中間物與1-{6-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮反應。在最後一步中，藉由氯化鋅進行去保護。
LC-MS(方法1)：Rt=0.84min；MS(ESIpos)：m/z=1078[M+H]+。
中間物Q23 N-{5-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-5-氧代戊醯基}-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0734-1993
如下製備目標化合物：以化合物M9為基礎，首先在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下與中間物L92偶聯。在下一步中，在室溫下藉由10%的鈀-活性炭在乙醇中在氫正常壓力下進行30分鐘的氫化，以將Z保護基團脫除，隨後如就中間物Q6所述，藉由與1,1'-[(1,5-二氧代戊烷-1,5-二基)雙(氧基)]二吡咯啶-2,5-二酮反應將經去保護之中間物轉化成目標化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=1.89min；MS(ESIpos)：m/z=938[M+H]+。
中間物Q24 N-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}-L-天冬醯胺三氟乙酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0734-1994
如下製備目標化合物：以化合物M9為基礎，首先在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下與中間物L92偶聯。在下一步中，在室溫下藉由10%的鈀-活性炭在乙醇中在氫正常壓力下進行30分鐘的氫化，以將Z保護基團脫除，隨後藉由在有N,N-二異丙基乙胺的情況下與1-{2-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮反應，將經去保護之中間物轉化成目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.01min；MS(ESIpos)：m/z=863[M+H]+。
中間物Q25 N-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-{(2S)-1-[(3-{[(5S)-5-胺基-5-羧基戊基]胺基}-3-氧代丙基)胺基]-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}-L-天冬醯胺三氟乙酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0735-1995
如下製備目標化合物：以化合物C108為基礎，首先在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下與中間物L92偶聯。在下一步中，在室溫下藉由10%的鈀-活性炭在DCM-甲醇1：1中在氫正常壓力下進行1小時 的氫化，以將Z保護基團脫除，隨後藉由在有N,N-二異丙基乙胺的情況下與1-{2-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮反應，以及最後藉由用氯化鋅去保護，將經去保護之中間物轉化成目標化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=1.46min；MS(ESIpos)：m/z=1106[M+H]+。
中間物Q26 N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-{(2S)-1-[(3-{[(5S)-5-胺基-5-羧基戊基]胺基}-3-氧代丙基)胺基]-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}-L-天冬醯胺三氟乙酸酯(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0736-1996
以與中間物Q25類似的方式製備目標化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=1.55min；MS(ESIpos)：m/z=1162[M+H]+。
中間物Q27 N-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-丙胺醯基-L-丙胺醯 基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-[(3-{[(1S)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-氧代丙基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0737-1997
以化合物C109為基礎，首先在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下與中間物L107偶聯，隨後藉由氯化鋅進行去保護，藉此製備目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.95min；MS(ESIpos)：m/z=1107[M+H]+。
中間物Q28 N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-[(3-{[(1S)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-氧代丙基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0738-1998
如下製備目標化合物：以化合物C110為基礎，首先在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下與中間物L92偶聯。在下一步中，在室溫下藉由10%的鈀-活性炭在DCM-甲醇1：1中在氫正常壓力下進行1小時的氫化，以將所有保護基團脫除，隨後藉由在有N,N-二異丙基乙胺的情況下與1-{6-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮反應，將經去保護之中間物轉化成目標化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=1.74min；MS(ESIneg)：m/z=1161[M-H]-。
中間物Q29 N-{5-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-5-氧代戊醯基}-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-[(3-{[(1S)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-氧代丙基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0739-1999
在9mL DMF中，在有30mg HATU及34μL N,N-二異丙基乙胺的情況下將40mg(39μmol)中間物C110與19.6mg(47mmol)中間物L92偶聯。隨後在室溫下藉由10%的鈀-活性炭在甲醇中在氫正常壓力下進行1小時的氫化，以將所有保護基團脫除，隨後藉由在有N,N-二異丙基乙胺的情況下與1-{6-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮反應，將經去保護之中間物轉化成目標化合物(藉由製備性HPLC將其純化)。
LC-MS(方法1)：Rt=0.9min；MS(ESIpos)：m/z=1181(M+H)+。
中間物Q30 N-{6-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-6-氧代己基}-N-甲基-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-[(3-{[(1S)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-氧代丙基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0740-2000
首先在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下在DMF中將N-(第三丁氧基羰基)-L-丙胺醯基-L-丙胺酸與4-硝基苄基-L-天冬醯胺酸酯氫溴化物(1：1)偶聯，隨後在DCM中藉由三氟乙酸將胺基去保護，藉此製備三氟乙酸--4-硝基苄基-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-L-天冬醯胺酸酯(1：1)。
LC-MS(方法1)：Rt=0.43min；MS(ESIpos)：m/z=410(M+H)+。
在DMF中在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下將此中間物與N-(第三丁氧基羰基)-N-甲基-L-丙胺酸偶聯。隨後在DCM-甲醇1：1中藉由10%的鈀-活性炭進行氫化，以將對硝基-苄基酯脫除。
LC-MS(方法1)：Rt=0.55min；MS(ESIpos)：m/z=460(M+H)+。
在DMF中在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下將如此獲得之中間物與中間物C110偶聯。隨後透過在50℃下攪拌1小時，在三氟乙醇中藉由4當量的氯化鋅將Boc保護基團脫除。
LC-MS(方法1)：Rt=1.07min；MS(ESIpos)：m/z=1235(M+H)+。
將44mg(32μmol)此中間物與25.4mg(195μmol)6-氧代己酸(根據文獻(J.Org.Chem.1993,58,2196)預先製備)混合在20mL甲醇中，並摻入7.8μL乙酸以及29mg(313μmol)硼烷-吡啶錯合物。在室溫下將混合物攪拌1小時，隨後在真空中將其濃縮，並藉由製備性HPLC將其純化。獲得25mg(理論之56%)(6S,13S,16S,19S,22S,25S)-16-(2-胺基-2-氧代乙基)-13-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]乙基}-6-[(苄氧基)羰基]-19,22,25,26-四甲基-3,8,12,15,18,21,24-七氧代-1-苯基-2-氧雜-7,11,14,17,20,23,26-七氮雜三十二烷-32-酸。
將24.5mg(0.018mmol)此中間物置於6ml DMF中，並摻入34mg(0.27mmol)1-羥基吡咯啶-2,5-二酮及16μL N,N-二異丙基乙胺，以及逐份摻入總共50mg(0.13mmol)HATU。在室溫下攪拌2小時後，用TFA將反應溶液調整至3-4的pH值，隨後將其濃縮，並藉由製備性HPLC將其純化。獲得23mg(87%)受保護的中間物，隨後將其置於10ml乙醇中。在添加10%的鈀-活性炭後，在氫正常壓力下以氫解的方式將苄基酯基團脫除，以及，在將催化劑濾出、將殘餘之溶液濃縮以及將殘餘物自乙腈/水9：1凍乾後，獲得20mg(理論之95%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.82min；MS(ESIpos)：m/z=1266(M+H)+。
中間物Q31 三氟乙酸--N-(吡啶-4-基乙醯基)-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-{(2S)-1-({2-[(N2-乙醯基-L-離胺醯基)胺基]乙基}胺基)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}-L-天冬醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0742-2001
在DMF中在有N,N-二異丙基乙胺的情況下為中間物C112與中間物L103建立HATU偶聯，隨後在三氟乙醇中藉由6當量的氯化鋅透過在50℃下攪拌30分鐘將Boc保護基團脫除，藉此製備目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.76min；MS(ESIpos)：m/z=1101(M+H)+。
中間物Q32 N2-乙醯基-L-離胺醯基-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-{(2S)-1-[(3-{[(5S)-5-胺基-5-羧基戊基]胺基}-3-氧代丙基)胺基]-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}-L-天冬醯胺-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0743-2002
首先在DMF中在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下將中間物C108與中間物L92偶聯。在下一步中，在室溫下藉由10%的鈀-活性炭在DCM-甲醇1：1中在氫正常壓力下進行1小時的氫化，以將Z保護基團脫除。隨後在DMF中在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下與中間物L109偶聯，且隨後在三氟乙醇中藉由2當量的氯化鋅透過在50℃下攪拌90分鐘進行去保護，以將經去保護之中間物轉化成目標化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=1.17min；MS(ESIneg)：m/z=1137(M-H)-。
中間物Q33 N2-乙醯基-L-離胺醯基-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-{[2-(L-gamma-麩胺醯基胺基)乙基]胺基}-1-氧代丁烷-2-基]-L-天冬醯胺-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0744-2003
在DMF中在有N,N-二異丙基乙胺的情況下為中間物C103與中間物L110建立HATU偶聯，隨後在三氟乙醇中藉由10當量的氯化鋅透過在50℃下攪拌6小時實現完全去保護，藉此製備目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.72min；MS(ESIpos)：m/z=1111(M+H)+。
中間物Q34 N2-乙醯基-L-離胺醯基-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-[(3-{[(1S)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-氧代丙基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}-L-天冬醯胺-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0745-2004
如下合成目標化合物：首先在DMF中在有N,N-二異丙基乙胺的情況下為中間物C110與中間物L110建立HATU偶聯。在下一步中，在室溫下藉由10%的鈀-活性炭在DCM-甲醇1：1中在氫正常壓力下進行1.5小時的氫化，以將苄基酯保護基團脫除。在最後一步中，在三氟乙醇中藉由8當量的氯化鋅透過在50℃下攪拌6小時將Teoc保護基團脫除。
LC-MS(方法12)：Rt=1.31min；MS(ESIpos)：m/z=1140(M+H)+。
中間物Q35 N-(吡啶-4-基乙醯基)-L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺醯基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0746-2005
以與中間物Q1類似的方式，將15mg(0.019mmol)中間物F104與10mg(0.024mmol)中間物L111偶聯。在藉由製備性HPLC進行純化後，獲得4mg(理論之17%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.82min；MS(ESIpos)：m/z=1082(M+H)+。
中間物Q36 N-乙醯基-L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺醯基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0747-2006
以與中間物Q1類似的方式，將15mg(0.019mmol)中間物F104與8mg(0.024mmol)中間物L112偶聯。在藉由製備性HPLC進行純化後，獲得5.8mg(理論之28%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.95min；MS(ESIpos)：m/z=1005(M+H)+。
中間物Q37 N-(吡啶-4-基乙醯基)-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-({4-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-4-氧代丁基}胺基)-1-氧代丁烷-2-基]-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0748-2007
將20mg(31μmol)中間物C114與11.6mg(22.9μmol)N-(吡啶-4-基乙醯基)-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-L-天冬醯胺-三氟乙酸(1：1)(中間物L104)一起置於5.0mL DMF中。隨後添加11μl N,N-二異丙基乙胺以及21mg(55μmol)HATU。在室溫下將反應混合物攪拌60分鐘。直接藉由製備性RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)對反應混合物進行純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。隨後在三氟乙醇中藉由6當量的氯化鋅透過在50℃下攪拌2小時將第三丁基酯基團脫除。在添加6當量的EDTA後，藉由製備性HPLC進行純化。在最後一步中，將獲得之中間物置於DMF中，摻入15當量的1-羥基吡咯啶-2,5-二酮，並透過在有5當量HATU及5當量N,N-二異丙基乙胺的情況下攪拌60分鐘，將此中間物轉化成目標化合物。藉由製備性HPLC對其進行純化。
LC-MS(方法1)：Rt=0.87min；MS(ESIpos)：m/z=1071(M+H)+。
中間物Q38 N-甲基-N-(吡啶-4-基乙醯基)-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0749-2008
以與中間物Q1類似的方式，將15mg(0.019mmol)中間物F104與12.5mg(0.024mmol)中間物L113偶聯。在藉由製備性HPLC進行純化後，獲得4mg(理論之19%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.83min；MS(ESIpos)：m/z=1082(M+H)+。
中間物Q39 N-[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-(甲基胺基)-1-氧代丁烷-2-基]-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0750-2009
以化合物C115為基礎，透過在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下與中間物L107偶聯來製備目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.97min；MS(ESIpos)：m/z=920[M+H]+。
中間物Q40 N-{[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙醯基}-L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺醯基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0751-2010
以與中間物Q1類似的方式，將15mg(0.019mmol)中間物F104與12.5mg(0.024mmol)中間物L114偶聯。在藉由製備性HPLC進行純化後，獲得10.8mg(理論之50%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.99min；MS(ESIpos)：m/z=1123(M+H)+。
中間物Q41 N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-[(16S)-4-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16,18-二羧基-5,10,14-三氧代-7-硫雜-4,11,15-三氮雜十八碳-1-基]-L-天冬醯胺-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0752-1583
在氬氛圍下，將11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-酸(174mg,，純度94%，234μmol)(中間物C69)以及三氟乙酸 二苄基-beta-丙胺醯基-L-麩胺酸酯(1：1)(144mg，281μmol)(中間物L115)置於4.0ml DMF中。為反應混合物摻入HATU(107mg，281μmol)以及N,N-二異丙基乙胺(120μl，700μmol)，並在室溫下攪拌10分鐘。用乙酸乙酯將混合物稀釋，並用水及用飽和NaCl溶液洗滌有機相。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，並在真空中將溶劑蒸發。藉由製備性RP-HPLC(柱：Reprosil 250x40；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)對殘餘物進行純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得229mg(理論之85%)二苄基-N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-基)-beta-丙胺醯基-L-麩胺酸酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.55min；MS(ESIpos)：m/z=1082 [M+H]+
將二苄基-N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-基)-beta-丙胺醯基-L-麩胺酸酯(226mg，209μmol)溶解在10ml三氟乙醇中。為反應混合物摻入氯化鋅(171mg，1.25mmol)，並在50℃下攪拌1小時。再分別添加兩次6當量的ZnCl2，並分別在50℃下攪拌1小時。為混合物摻入乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(1.10g，3.75mmol)，並短暫攪拌。將反應混合物置於乙腈中，藉由針筒過濾器對其進行過濾，並藉由製備性RP-HPLC將其純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得182mg(理論之83%)三氟乙酸二苄基-N-[3-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}硫基)丙醯基]-beta-丙胺醯基-L-麩胺酸酯(1：1)化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.07min；MS(ESIpos)：m/z=938[M+H]+在氬氛圍下，將三氟乙酸二苄基-N-[3-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}硫基)丙醯基]-beta-丙胺醯基-L-麩胺酸酯(1：1)(55.0mg，52.3μmol)與N-[(苄氧基)羰基]-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-L-天冬醯胺(26.0mg，62.7μmol)(中間物L92)置於2.5ml DMF中。為反應混合物摻入HATU(23.9mg，62.7μmol)及N,N-二異丙基乙胺(27μl，160μmol)，並在室溫下攪拌10分鐘。為混合物摻入1ml水(0.1% TFA)，並直接藉由製備性RP-HPLC將其純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得54.6mg(理論之79%)二苄基-(2S)-2-{[(5S,8S,11S)-11-(2-胺基-2-氧代乙基)-17-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟 苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-5,8-二甲基-3,6,9,12,18,23,27-七氧代-1-苯基-2-氧雜-20-硫雜-4,7,10,13,17,24-六氮雜二十七烷-27-基]胺基}戊酸二酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.32min；MS(ESIpos)：m/z=1328[M+H]+
將二苄基-(2S)-2-{[(5S,8S,11S)-11-(2-胺基-2-氧代乙基)-17-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-5,8-二甲基-3,6,9,12,18,23,27-七氧代-1-苯基-2-氧雜-20-硫雜-4,7,10,13,17,24-六氮雜二十七烷-27-基]胺基}戊酸二酯(53.3mg，40.1μmol)溶解在3.0ml乙酸乙酯及3.0ml乙醇中，並摻入10%的鈀-活性炭(5.37mg)。在室溫及正常壓力下將反應混合物氫化一夜，隨後藉由紙板過濾器進行過濾。用乙酸乙酯及乙醇對濾渣進行洗滌。在真空中將溶劑蒸發。藉由製備性RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)對殘餘物進行純化。在真空中將溶劑蒸發，並將殘餘物凍乾。獲得5.6mg(理論之11%)L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-[(16S)-4-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16,18-二羧基-5,10,14-三氧代-7-硫雜-4,11,15-三氮雜十八碳-1-基]-L-天冬醯胺-三氟乙酸(1：1)化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.81min；MS(ESIpos)：m/z=1014[M+H]+
將L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-[(16S)-4-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16,18-二羧基-5,10,14-三氧代-7-硫雜-4,11,15-三氮雜十八碳-1-基]-L-天冬醯胺-三氟乙酸(1：1)(5.40mg，4.30μmol)與1-{6-[(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮(1.46mg,4.73μmol)置於0.49ml DMF中。為反應混合物摻入N,N-二異丙基乙胺(2.2μl，13μmol)，並在室溫下攪拌4小時 30分鐘。為混合物摻入0.5ml水(0.1% TFA)，並直接藉由製備性RP-HPLC將其純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得43.1mg 4.10mg(理論之72%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.97min；MS(ESIpos)：m/z=1207[M+H]+
中間物Q42 三氟乙酸N-[(苄氧基)羰基]-L-丙胺醯基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}-L-天冬醯胺(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0755-1584
將三氟乙酸N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}-L-天 冬醯胺(1：1)(10.0mg，10.9μmol)(中間物C116)與N-[(苄氧基)羰基]-L-丙胺酸(2.42mg，10.9μmol)置於1.0ml DMF中。為反應混合物摻入HATU(4.95mg，13.0μmol)及N,N-二異丙基乙胺(9.5μl，54μmol)，並在室溫下攪拌10分鐘。為混合物摻入1.0ml水(0.1% TFA)，並直接藉由製備性RP-HPLC將其純化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並將殘餘物凍乾。獲得5.6mg(理論之46%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.11min；MS(ESIpos)：m/z=1012[M+H]+
中間物Q43 N-[(苄氧基)羰基]-L-alpha-天冬醯胺醯基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}-L-天冬醯胺-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0756-1585
將10mg(0.011mmol)中間物C116置於4mL DMF中，並摻入3.9mg(0.012mmol)(2S)-2-{[(苄氧基)羰基]胺基}-4-第三丁氧基-4-氧代 丁酸，以及6.2mg(0.016mmol)HATU及6μL N,N-二異丙基乙胺。在室溫下攪拌15分鐘後，將混合物濃縮，並藉由製備性HPLC將殘餘物純化。將相應的溶離份濃縮，並將殘餘物自乙腈/水凍乾。獲得8.2mg(理論之68%)受保護的中間物，隨後在4ml三氟乙醇中藉由6mg(0.044mmol)氯化鋅在50℃下將此中間物去保護。在添加13mg(0.044mmol)EDTA並於隨後進行HPLC純化後，獲得3mg(理論之35%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.05min；MS(ESIpos)：m/z=1056(M+H)+。
中間物Q44 N-[(苄氧基)羰基]-L-丙胺醯基-L-alpha-天冬醯胺醯基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)胺基]-1-氧代丁烷-2-基}-L-天冬醯胺-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0757-1586
將10mg(0.011mmol)中間物C116置於4mL DMF中，並摻入5.3mg(0.013mmol)(2S)-2-{[(2S)-2-{[(苄氧基)羰基]胺基}丙醯基]胺基}-4-第三丁氧基-4-氧代丁酸，以及6.2mg(0.016mmol)HATU及6μL N,N-二異丙基乙胺。在室溫下攪拌15分鐘後，將混合物濃縮，並藉由製備性HPLC將殘餘物純化。將相應的溶離份濃縮，並將殘餘物自乙腈/水凍乾。獲得8mg(理論之57%)受保護的中間物，隨後在2ml三氟乙醇中藉由5mg(0.037mmol)氯化鋅在50℃下將此中間物去保護。在添加11mg(0.037mmol)EDTA並於隨後進行HPLC純化後，獲得3.5mg(理論之46%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.04min；MS(ESIpos)：m/z=1127(M+H)+。
B：抗體-活性物質共軛物(ADC)的製備 B-1. 生成抗體的一般方法
使用完整的人類抗體-噬菌體庫(Hoet RM等人，Nat Biotechnol 2005；23(3)：344-8)，以透過將人類及小鼠TWEAKR之二聚且Fc官能化的胞外域作為靶的蛋白質篩選(Hoogenboom H.R.,Nat Biotechnol 2005；23(3)：1105-16)，將TWEAK特異的人類單株抗體分離。對Fab噬菌體進行識別，並將相應抗體重組成人類IgG1形式。透過在TPP-2090之重鏈中引入N297A突變(免疫球蛋白之Kabat編號系統)生成非糖基化抗體TPP-2658。將如此獲得之抗體應用於在此描述的實施例。此外，與TWEAKR結合的抗體係為本領域技術人員所知，例如參閱WO2009/020933(A2)或WO2009140177(A2)將市售之抗體西妥昔單抗(商標名：Erbitux)、曲妥珠單抗(商標名：Herceptin；INN 7637，CAS NR：RN：180288-69-1)以及尼妥珠單抗(商標名：CIMAher)應用於在此描述的實施例。
對於曲妥珠單抗-HC-N297A(Trastuzumab-HC-N297A)(對應TPP-7510)，使用SEQ ID NO：244的重鏈。輕鏈與曲妥珠單抗中之輕鏈相同。
對於曲妥珠單抗-HC-N297Q(Trastuzumab-HC-N297Q)(對應TPP- 7511)，使用SEQ ID NO：245的重鏈。輕鏈與曲妥珠單抗中之輕鏈相同。
B-2. 在哺乳動物細胞中表現抗體的一般方法
在短暫的哺乳細胞培養中產生抗體，例如TPP-2658、TPP-7510或TPP-7511，例如參閱Tom等人，Methods Express：Expression Systems herausgegeben von Micheal R.Dyson and Yves Durocher,Scion Publishing Ltd,2007，第12章。
B-3. 自細胞上澄液提純抗體的一般方法
自細胞培養上澄液獲取抗體，例如TPP-2658、TPP-7510或TPP-7511。透過細胞之離心分離提純細胞上澄液。隨後在MabSelect Sure(GE Healthcare)層析柱上藉由親和層析將細胞上澄液純化。為此，在DPBS pH 7.4(Sigma/Aldrich)中對柱進行平衡，施覆細胞上澄液，並用體積約為10個柱的DPBS pH 7.4+500mM氯化鈉對柱進行洗滌。在50mM乙酸鈉pH 3.5+500mM Natriumchlorid中對抗體進行溶離，隨後藉由凝膠過濾層析在Superdex 200柱(GE Healthcare)上在DPBS pH 7.4中將抗體進一步純化。
市售之抗體係藉由標準層析法自產品提取(蛋白質A層析，製備性凝膠過濾層析(SEC-尺寸排外層析))。
B-4. 與半胱胺酸側鏈偶聯的一般方法
將以下抗體應用於偶聯反應：
實例a：西妥昔單抗(抗EGFR抗體)
實例e：曲妥珠單抗(抗Her2抗體)
實例i：尼妥珠單抗(抗EGFR抗體)
實例k：TPP-2658(抗TWEAKR抗體)
通常在氬氛圍下進行偶聯反應。
為相應抗體在PBS緩衝液中的溶液(濃度為1mg/mL至20mg/mL， 較佳約為10mg/ml至15mg/ml)添加2至5個當量的溶解於PBS緩衝液中的三(2-羧乙基)膦-鹽酸鹽(TCEP)，並在室溫下攪拌1小時。為此，所採用之相應抗體的溶液可具有實施例中給出的濃度，或者，亦可視情況用PBS緩衝液最多稀釋至起始濃度的一半，以處於較佳的濃度範圍內。隨後以DMSO溶液的形式，添加2至12個當量，較佳5至10個當量的待偶聯的馬來醯亞胺前驅體化合物或鹵化物前驅體化合物，具體視追求的抗體負荷而定。其中DMSO的量不應超出總體積的10%。就馬來醯亞胺前驅體而言，在室溫下將混合物攪拌60-240分鐘，就鹵化物前驅體而言，在室溫下將混合物攪拌8至24小時，隨後透過在PBS中經平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)上樣，並用PBS緩衝液溶離。在未另作說明的情況下，通常使用PBS緩衝液中的5mg相應抗體來實現還原以及隨後之偶聯。在透過PD10柱提純後，獲得相應ADC在3.5mL PBS緩衝液中的溶液。隨後藉由超離心進行濃縮，以及視情況用PBS緩衝液將試樣再稀釋。如必要，在用PBS緩衝液再稀釋後藉由超濾重新濃縮，以更佳地將低分子組分分離。針對生物試驗，在最終ADC試樣中視情況藉由再稀釋將濃度調節至0.5-15mg/mL，視具體需要而定。針對ADC溶液，確定實施例中分別給出的蛋白質濃度。此外，按照B-7描述的方法測定抗體負荷(藥物/mAb比)。
根據連接子，實例中揭示的ADC亦可或多或少地呈現與抗體連接的水解開鏈琥珀酸醯胺。
特別是就透過以下連接子子結構
Figure 105119613-A0202-12-0760-1587
與抗體之硫醇基連接的KSP-I-ADC而言，亦可視情況透過在偶聯 後重新緩衝以及在pH 8下攪拌約20-24小時，根據示意圖28針對性地製備透過開鏈琥珀酸醯胺連接的ADC。
#1表示與抗體連接的硫橋鍵，且#2表示與經修飾之KSP抑制劑的連接位點。
就此類連接子透過水解開鏈琥珀酸醯胺與抗體連接的ADC而言，亦可按照示範性規程如下表現：
小規模偶聯：
為2-5mg相應抗體在PBS緩衝液中的溶液(濃度為1mg/mL至20mg/mL，較佳約為5mg/ml至15mg/ml)添加2至5個當量的溶解於PBS緩衝液中的三(2-羧乙基)膦-鹽酸鹽(TCEP)，並在室溫下攪拌30分鐘至1小時。為此，所採用之相應抗體的溶液可具有實施例中給出的濃度，或者，亦可視情況用PBS緩衝液最多稀釋至起始濃度的一半，以處於較佳的濃度範圍內。隨後以DMSO溶液的形式，添加2至12個當量，較佳5至10個當量的待偶聯的馬來醯亞胺前驅體化合物，具體視追求的抗體負荷而定。其中DMSO的量不應超出總體積的10%。在室溫下將混合物攪拌60-240分鐘，隨後用預先調節至pH 8的PBS緩衝液稀釋至3-7ml的體積，並在氬氛圍下在室溫下攪拌一夜。隨後透過經PBS緩衝液pH 7.2平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對溶液進行上樣，並用PBS緩衝液pH 7.2溶離。隨後藉由超離心進行濃縮，以及用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。
中規模偶聯：
在氬氛圍下為60mg相應抗體在5ml PBS緩衝液的溶液(c~12mg/mL)添加0.344mg TCEP在100μl PBS緩衝液中的溶液。在室溫下將混合物攪拌30分鐘，隨後添加0.003mmol溶解於600μl DMSO中的馬來醯亞胺前驅體化合物。在室溫下進一步攪拌1.5小時至2小時後，用1075μl預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋。
隨後透過經PBS緩衝液pH8平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對溶液進行上樣，並用PBS緩衝液pH8溶離。用PBS緩衝液pH8將溶離液稀釋至14ml的總體積。在氬氛圍下，在室溫下將此溶液攪拌一夜。隨後視情況重新緩衝至pH 7.2。藉由超離心將ADC溶液濃縮，用PBS緩衝液(pH 7.2)將其再稀釋，隨後視情況重新濃縮至約10mg/mL的濃度。
其他與實施例中之抗體連接的具潛在水解敏感性的噻烷基丁二醯亞胺橋鍵包含以下連接子子結構，其中#1表示與抗體的硫醚連接，#2表示與經修飾之KSP抑制劑的連接位點：
Figure 105119613-A0202-12-0762-1588
此等連接子子結構表示與抗體的連接單元，並(除進一步的連接子組成外)對結構及腫瘤細胞中形成之代謝物的特性有重大影響。
其中在所示結構式中，AK1之含義為
實例a：西妥昔單抗(部分還原)-S§1
實例e：曲妥珠單抗(部分還原)-S§1
實例i：尼妥珠單抗(部分還原)-S§1
實例k：抗TWEAKR抗體TPP-2658(部分還原)-S§1
其中§1 表示與丁二醯亞胺基團，或者與視情況由此產生之水解開鏈琥珀酸醯胺或烷基殘基之異構體的連接，以及S 表示經部分還原之抗體的半胱胺酸殘基的硫原子。
B-5. 與離胺酸側鏈偶聯的一般方法
將以下抗體應用於偶聯反應：
實例a：西妥昔單抗(抗EGFR抗體)
實例e：曲妥珠單抗(抗Her2抗體)
實例i：尼妥珠單抗(抗EGFR抗體)
實例k：TPP-2658(抗TWEAKR抗體)
通常在氬氛圍下進行偶聯反應。
以DMSO溶液的形式，為相應抗體在PBS緩衝液的溶液(濃度為1mg/mL至20mg/mL，較佳約為10mg/mL)添加2至8個當量的待偶聯的前驅體化合物，具體視所追求的負荷而定。在室溫下攪拌30分鐘至6小時後，再次添加相同量的溶解於DMSO中的前驅體化合物。其中DMSO的量不應超出總體積的10%。在室溫下進一步攪拌30分鐘至6小時後，透過在PBS中經平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對混合物進行上樣，並用PBS緩衝液溶離。在未另作說明的情況下，通常使用PBS緩衝液中的5mg相應抗體來實現偶聯。在透過PD10柱提純後，獲得相應ADC在3.5mL PBS緩衝液中的溶液。隨後藉由超離心進行濃縮，以及視情況用PBS緩衝液將試樣再稀釋。如必要，在用PBS緩衝液再稀釋後藉由超濾重新濃縮，以更佳地將低分子組分分離。針對生物試驗，在最終ADC試樣中視情況藉由再稀釋將濃度調節至0.5-15mg/mL，視具體需要而定。
針對ADC溶液，確定實施例中分別給出的蛋白質濃度。此外，按照B-7描述的方法測定抗體負荷(藥物/mAb比)。
其中在所示結構式中，AK2之含義為
實例a：西妥昔單抗-NH§2
實例e：曲妥珠單抗-NH§2
實例i：尼妥珠單抗-NH§2
實例k：抗TWEAKR抗體TPP-2658-NH-§2
其中§2 表示與羰基的連接，以及NH 表示抗體之離胺酸殘基的側鏈胺基。
B-5a. 藉由細菌轉麩醯胺酸酶合成ADC的一般方法
將以下抗體應用在實例系列t中的偶聯反應中，以下術語「抗體-HC-N297Z」表示兩個重鏈上之胺基酸N297(Kabat編號)皆被置換成胺基酸Z的抗體，術語「TPP-XXXX-HC-Q295N-HC-N297Q」表示具有TPP-XXXX之抗體，其中兩個重鏈上之胺基酸Q295(Kabat編號)皆被置換成胺基酸N，且胺基酸N297(Kabat編號)被置換成胺基酸Q。其中源抗體之抗體名可能以名稱(例如曲妥珠單抗)或TPP-XXXX(具TPP編號XXXX的抗體)的形式給出：
AK3a：抗TWEAKR抗體TPP-2658(對應TPP-2090-HC-N297A)
AK3b：抗TWEAKR抗體TPP-5442(對應TPP-2090-HC-N297Q)
AK3c：抗TWEAKR抗體TPP-8825(對應TPP-2090-HC-Q295N-HC-N297Q)
AK3d：TPP-7510(對應曲妥珠單抗-HC-N297A)
AK3e：TPP-7511(對應曲妥珠單抗-HC-N297Q)
用以實現最大DAR 2的一般規程：
為5mg相應非糖基化抗體變異體(HC-N297A，或HC-Q295N-HC-N297Q)在DPBS pH 7.4中的溶液(c~5-15mg/mL)添加20μL(6當量)適合毒性基團-連接子前驅體的溶液(例如中間物Q31-Q34；10mM DMSO溶液)。在37℃下培育5分鐘後，添加50μL重組細菌轉麩醯胺酸酶水溶液(產品編號T001，Zedira GmbH，達木士塔，德國)(25U/mL)，並在37℃下進一步培育24小時。隨後用DPBS pH 7.4將反應混合物稀釋至2.5mL的總體積，並透過凝膠過濾藉由經DPBS平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)上樣，並用DPBS緩衝液在pH 7.4下進行溶離。隨後藉由Amicon Ultracel-30K離心(Millipore)將ADC溶液濃縮，並用DPBS再稀釋至約2.5mL的體積。最後再為溶液添加0.00625μmol溶解於12.5μL DPBS中的細菌轉麩醯胺酸酶阻斷劑Zedira C100。針對ADC溶液，確定實施例中分別給出的蛋白質濃度。此外，按照B-7描述的方法測定抗體負荷(藥物/mAb比)。
用以實現最大DAR 4的一般規程：
為5mg相應非糖基化抗體變異體(HC-N297Q)在DPBS pH 7.4中的溶液(c~5-15mg/mL)添加16-24當量的適合毒性基團-連接子前驅體的溶液(例如中間物Q31-Q34；10mM DMSO溶液)。在37℃下培育5分鐘後，添加400μL(10U)重組細菌轉麩醯胺酸酶水溶液(產品編號T001，Zedira GmbH，達木士塔，德國)(25U/mL)，並在37℃下進一步培育24小時。隨後用DPBS pH 7.4將反應混合物稀釋至2.5mL的總體積，並透過凝膠過濾藉由經DPBS平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)上樣，並用DPBS緩衝液在pH 7.4下進行溶離。隨後藉由Amicon Ultracel-30K離心(Millipore)將ADC溶液濃縮，並用DPBS再稀釋至約2.5mL的體積。最後再為溶液添加0.1μmol溶解於200μL DPBS中的細菌轉麩醯胺酸酶阻斷劑Zedira C100。針對ADC溶液，確定實施例中分別給出的蛋白質濃度。此外，按照B-7描述的方 法測定抗體負荷(藥物/mAb比)。
針對較大規模之經轉麩醯胺酸酶促進的偶聯的，用以實現最大DAR 2的一般規程
為30mg相應抗體之非糖基化變異體(HC-N297A，HC-Q295N-HC-N297Q)在DPBS pH 7.4中的溶液(c~5-15mg/mL)添加6當量的相應毒性基團-連接子前驅體的溶液(10mM DMSO溶液)。在37℃下培育5分鐘後，添加200μL(7.5U)重組細菌轉麩醯胺酸酶水溶液(產品編號T001，Zedira GmbH，達木士塔，德國)(25U/mL)，並在37℃下進一步培育24小時。透過凝膠過濾層析在Superdex 200柱(GE Healthcare)上在DPBS pH 7.4中對反應混合物進行純化，以將小分子及轉麩醯胺酸酶自ADC分離。隨後藉由Amicon Ultracel-30K離心管(Millipore)將ADC溶液濃縮至5-25mg/mL的最終濃度。隨後對溶液進行無菌過濾。
確定實施例中相應給出的ADC溶液濃度。按照章節B7中描述的方法確定負荷。ADC之特性如實施例中所示。
針對較大規模之經轉麩醯胺酸酶促進的偶聯的，用以實現最大DAR 4的一般規程
為30mg相應抗體之非糖基化變異體(HC-N297Q)在DPBS pH 7.4中的溶液(c~5-15mg/mL)添加16-24當量的相應毒性基團-連接子前驅體的溶液(10mM DMSO溶液)。在37℃下培育5分鐘後，添加2400μL(60U)重組細菌轉麩醯胺酸酶水溶液(產品編號T001，Zedira GmbH，達木士塔，德國)(25U/mL)，並在37℃下進一步培育24小時。透過凝膠過濾層析在Superdex 200柱(GE Healthcare)上在DPBS pH 7.4中對反應混合物進行純化，以將小分子及轉麩醯胺酸酶自ADC分離。隨後藉由Amicon Ultracel-30K離心管(Millipore)將ADC溶液濃縮至5-25mg/mL的最終濃度。隨後對溶液進行無菌過濾。
確定實施例中相應給出的ADC溶液濃度。按照章節B7中描述的 方法確定負荷。ADC之特性如實施例中所示。
在所示實例系列t之結構式中，AK3之含義分別為
AK3a：抗TWEAKR抗體(TPP-2658)(對應TPP-2090-HC-N297A)-CO-§2
AK3b：抗TWEAKR抗體(TPP-5442)(對應TPP-2090-HC-N297Q)-CO-§2
AK3c：抗TWEAKR抗體(TPP-8825)(對應TPP-2090-HC-Q295N-HC-N297Q)-CO-§2
AK3d：TPP-7510(對應曲妥珠單抗-HC-N297A)-CO-§2
AK3e：TPP-7511(對應曲妥珠單抗-HC-N297Q)-CO-§2
其中§2 表示與毒性基團-連接子前驅體之胺基的連接，以及CO 表示抗體之麩醯胺酸殘基的側鏈羰基。
B-6a. 製備封閉丁二醯亞胺-半胱胺酸加合物的一般方法：
根據一種示例性實施方案，將10μmol上述馬來醯亞胺前驅體化合物置於3-5mL DMF中，並摻入2.1mg(20μmol)L-半胱胺酸。在室溫下將反應混合物攪拌2小時至24小時，隨後在真空中將其濃縮，並藉由製備性HPLC將其純化。
B-6aa. 製備開鏈琥珀酸醯胺-半胱胺酸加合物之異構體的一般方法：
根據一種示例性實施方案，將68μmol上述馬來醯亞胺前驅體化合物置於15mL DMF中，並摻入36mg(136μmol)N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸。在室溫下將反應混合物攪拌20小時，隨後在真空中將其濃縮，並藉由製備性HPLC將其純化。在將相應的溶離份合併，以及在真空中將溶劑蒸發後，將殘餘物溶解在15mL THF/水1：1中。添加131μL 2M氫氧化鋰水溶液，並在室溫下將混合物攪拌 1小時。隨後用1M鹽酸將混合物調節至中性，在真空中將溶劑蒸發，並藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。獲得理論之50%的區位異構的受保護中間物，其形式為無色泡沫。
在最後一步中，將0.023mmol此區位異構的水解產物溶解在3mL 2,2,2-三氟乙醇中。添加12.5mg(0.092mmol)氯化鋅，並在50℃下將混合物攪拌4小時。隨後添加27mg(0.092mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，並在真空中將溶劑蒸發。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。在將相應的溶離份濃縮以及將殘餘物自乙腈/水凍乾後，獲得形式為區位異構體混合物的水解開鏈巰基琥珀酸醯胺。
對本發明之共軛物的進一步提純及特性化
反應完畢後，在某些情形下例如藉由超濾將反應混合物濃縮，隨後藉由層析，例如藉由Sephadex® G-25進行脫鹽及純化。例如藉由磷酸緩衝鹽溶液(PBS)進行溶離。隨後對溶液進行無菌過濾及冷凍。作為替代方案，可將共軛物凍乾。
B-7. 確定抗體、毒性基團負荷以及開鏈半胱胺酸加合物之比例
為進行蛋白質識別，除確定分子量以外，在去糖基化及/或變性後執行胰蛋白酶消化，其在變性、還原及衍生後根據經驗證之胰蛋白酶肽識別蛋白質。
針對實施例中描述之共軛物在PBS緩衝液中的溶液，如下確定毒性基團負荷：在以質譜方式確定各共軛物種類之分子量後，確定經離胺酸連接之ADC的毒性基團負荷。在此情形下，預先藉由PNGaseF將抗體共軛物去糖基化，將試樣酸化，並在HPLC分離/脫鹽後以質譜方式藉由ESI-MicroTofQ(Bruker Daltonik)進行分析。將TIC(Total Ion Chromatogramm，總離子色層譜)中之訊號範圍內的所有譜疊加，並以最大熵解迴旋(MaxEnt Deconvolution)為基礎計算各共軛物種類之 分子量。在對各種類進行訊號整合後，計算出DAR(=Drug/Antibody Ratio，藥物/抗體比)。
透過經還原及變性之ADC的逆相層析確定經半胱胺酸連接之共軛物的毒性基團負荷。為ADC溶液(1mg/mL，50μL)添加鹽酸胍(GuHCl)(28.6mg)以及DL-二硫蘇糖醇(DTT)溶液(500mM，3μL)。在55℃下將混合物培育一小時，並藉由HPLC對其進行分析。
在Agilent 1260 HPLC系統上藉由220nm偵測執行HPLC分析。在1mL/min的流速下使用Polymer Laboratories PLRP-S聚合逆相柱(產品編號PL1912-3802)(2.1 x 150mm,8μm粒度，1000Å)，並採用以下梯度：0min，25%B；3min，25%B；28min，50%B。溶離劑A由0.05%的三氟乙酸(TFA)水溶液構成，溶離劑B由0.05%的三氟乙酸乙腈溶液構成。
透過與未軛合之抗體的輕鏈(L0)及重鏈(H0)進行滯留時間對比，分配偵測到的峰。將僅在經軛合之試樣中偵測到的峰分配給包含一毒性基團的輕鏈(L1)以及包含一、二及三個毒性基團的重鏈(H1、H2、H3)。
根據透過整合確定的峰面積，將包含毒性基團之抗體的平均負荷作為HC負荷與LC負荷之和的兩倍加以確定，其中，將所有LC峰之經毒性基團數目加權的整合結果的和除以所有LC峰之經單倍加權的整合結果的和計算出LC負荷，且其中，將所有HC峰之經毒性基團數目加權的整合結果的和除以所有HC峰之經單倍加權的整合結果的和計算出HC負荷。在某些情形下，毒性基團負荷可能因若干峰之共溶離而不精確。
在無法將輕鏈與重鏈充分HPLC分離的情況下，以質譜方式確定輕鏈及重鏈上之各共軛物種類的分子量，藉此確定經半胱胺酸連接之共軛物的毒性基團負荷。
為ADC溶液(1mg/mL，50μL)添加鹽酸胍(GuHCl)(28.6mg)以及DL-二硫蘇糖醇(DTT)溶液(500mM，3μL)。在55℃下將混合物培育一小時，並在脫鹽後以質譜方式藉由ESI-MicroTofQ(Bruker Daltonik)進行分析。
為確定DAR，將TIC(Total Ion Chromatogramm，總離子色層譜)中之訊號範圍內的所有譜疊加，並以最大熵解迴旋(MaxEnt Deconvolution)為基礎計算輕鏈及重鏈上之各共軛物種類之分子量。根據透過整合確定的峰面積，將包含毒性基團之抗體的平均負荷作為HC負荷與LC負荷之和的兩倍加以確定，其中，將所有LC峰之經毒性基團數目加權的整合結果的和除以所有LC峰之經單倍加權的整合結果的和計算出LC負荷，且其中，將所有HC峰之經毒性基團數目加權的整合結果的和除以所有HC峰之經單倍加權的整合結果的和計算出HC負荷。
為確定開鏈半胱胺酸加合物的比例，確定所有經單軛合之輕鏈及重鏈變異體的封閉與開鏈半胱胺酸加合物(分子量delta 18Dalton)的分子量比。根據所有變異體之平均值得出開鏈半胱胺酸加合物的比例。
透過經還原及變性之ADC的逆相層析確定經麩醯胺酸連接之共軛物的毒性基團負荷。為ADC溶液(1mg/mL，50μL)添加鹽酸胍(GuHCl)(28.6mg)以及DL-二硫蘇糖醇(DTT)溶液(500mM，3μL)。在55℃下將混合物培育一小時，並藉由HPLC對其進行分析。
在Agilent 1260 HPLC系統上藉由220nm偵測執行HPLC分析。在1mL/min的流速下使用Polymer Laboratories PLRP-S聚合逆相柱(產品編號PL1912-3802)(2.1 x 150mm,8μm粒度，1000Å)，並採用以下梯度：0min，31%B；1min，31%B；14min，38%B；6min,95%B。溶離劑A由0.05%的三氟乙酸(TFA)水溶液構成，溶離劑B由0.05%的三 氟乙酸乙腈溶液構成。
透過與未軛合之抗體的輕鏈(L0)及重鏈(H0)進行滯留時間對比，分配偵測到的峰。將僅在經軛合之試樣中偵測到的峰分配給包含一毒性基團的輕鏈(L1)以及包含一及兩個毒性基團的重鏈(H1、H2)。
根據透過整合確定的峰面積，將包含毒性基團之抗體的平均負荷作為HC負荷與LC負荷之和的兩倍加以確定，其中，將所有LC峰之經毒性基團數目加權的整合結果的和除以所有LC峰之經單倍加權的整合結果的和計算出LC負荷，且其中，將所有HC峰之經毒性基團數目加權的整合結果的和除以所有HC峰之經單倍加權的整合結果的和計算出HC負荷。
作為替代方案，在以質譜方式確定各共軛物種類之分子量後，確定經麩醯胺酸連接之ADC的毒性基團負荷。在此情形下，預先藉由PNGaseF將抗體共軛物去糖基化，將試樣酸化，並在HPLC分離/脫鹽後以質譜方式藉由ESI-MicroTofQ(Bruker Daltonik)進行分析。將TIC(Total Ion Chromatogramm，總離子色層譜)中之訊號範圍內的所有譜疊加，並以最大熵解迴旋(MaxEnt Deconvolution)為基礎計算各共軛物種類之分子量。在對各種類進行訊號整合後，計算出DAR(=Drug/Antibody Ratio，藥物/抗體比)。
B-8. 檢驗ADC之抗原結合
在偶聯完畢後，檢驗結合劑與靶分子的結合能力。為此，本領域技術人員已知各種方法，例如可藉由ELISA技術或表面電漿子共振分析(BIAcoreTM量測)對共軛物之親和性進行檢驗。本領域技術人員可藉由常用方法量測共軛物濃度，例如針對抗體共軛物採用蛋白質測定。(另見Doronina等人；Nature Biotechnol.2003；21：778-784以及Polson等人，Blood 2007；1102：616-623)。
代謝物實施例 實例M1 S-[1-(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-氧代乙基)-2,5-二氧代吡咯啶-3-基]-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0772-1589
將1.8mg(2μmol)中間物F104置於1ml DMF中，並摻入2.7mg(22μmol)L-半胱胺酸。在室溫下將反應混合物攪拌20小時，隨後在真空中將其濃縮，並藉由製備性HPLC將其純化。殘餘0.6mg(理論之26%)形式為無色泡沫的目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.80min；MS(EIpos)：m/z=814[M+H]+。
實例M2 4-[(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-氧代乙基)胺基]-3-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫基}-4-氧代丁酸-三氟乙酸(1：1)以及4-[(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2- 氧代乙基)胺基]-2-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫基}-4-氧代丁酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0773-1590
LC-MS(方法1)：Rt=0.80min；MS(EIpos)：m/z=814[M+H]+。
首先在DMF中在有N,N-二異丙基乙胺的情況下將1-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮轉化成N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸。
將406mg(1.53mmol)N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸溶解在10ml DMF中，摻入157.5mg(1.606mmol)馬來酸酐，並在室溫下將混合物攪拌1小時。為130μL此溶液摻入7.5mg(0.01mmol)中間物C66，並在室溫下將混合物攪拌5分鐘。隨後在真空中進行濃縮，並藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得10mg(89%)受保護的中間物，其中在HPLC中或者在LC-MS中皆無法將區位異構體分離。
LC-MS(方法1)：Rt=1.38min；MS(EIpos)：m/z=1120[M+H]+。
在最後一步中，將10mg此中間物溶解在2mL 2,2,2-三氟乙醇中。添加12mg(0.088mmol)氯化鋅，並在50℃下將混合物攪拌30分鐘。隨後添加26mg(0.088mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，並在真空中將溶劑蒸發。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。在將相應的溶離份濃縮以及將殘餘物自乙腈/水凍乾後，獲得8.3mg(理論之99%) 目標化合物，其形式為比例為87：13的區位異構體混合物。
LC-MS(方法5)：Rt=2.3min及2.43min；MS(ESIpos)：m/z=832(M+H)+。
1H-NMR主區位異構體：(500MHz,DMSO-d6)：δ=8.7(m,1H),8.5(m,2H),8.1(m,1H),7.6(m,1H),7.5(s,1H)7.4-7.15(m,6H),6.9-7.0(m,1H),6.85(s,1H),5.61(s,1H),4.9及5.2(2d,2H),4.26及4.06(2d,2H),3.5-3.8(m,5H),3.0-3.4(m,5H),2.75-3.0(m,3H),2.58及2.57(dd,1H),0.77及1,5(2m,2H),0.81(s,9H).
作為替代方案，如下製備區位異構目標化合物：首先在DMF中在有N,N-二異丙基乙胺的情況下將1-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮轉化成N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸。
將55mg(0.068mmol)中間物F104以及36mg(0.136mmol)N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸溶解在15ml DMF中，並在室溫下將混合物攪拌20小時。隨後進行濃縮，並藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。在將相應的溶離份合併，以及在真空中將溶劑蒸發後，將殘餘物溶解在15mL THF/水1：1中。添加131μL 2M氫氧化鋰水溶液，並在室溫下將混合物攪拌1小時。隨後用1M鹽酸將混合物調節至中性，在真空中將溶劑蒸發，並藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。獲得37mg(理論之50%)的區位異構的受保護中間物，其形式為無色泡沫。
LC-MS(方法5)：Rt=3.33min及3.36min；MS(ESIpos)：m/z=976(M+H)+。
在最後一步中，將25mg(0.023mmol)此中間物溶解在3mL 2,2,2-三氟乙醇中。添加12.5mg(0.092mmol)氯化鋅，並在50℃下將混合物攪拌4小時。隨後添加27mg(0.092mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四 乙酸，並在真空中將溶劑蒸發。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。在將相應的溶離份濃縮以及將殘餘物自乙腈/水凍乾後，獲得18.5mg(理論之85%)目標化合物，其形式為比例為21：79的區位異構體混合物。
LC-MS(方法5)：Rt=2.37min及3.44min；MS(ESIpos)：m/z=832(M+H)+。
實例M3 4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)-2-羧乙基]胺基}-2-氧代乙基)胺基]-3-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫基}-4-氧代丁酸-三氟乙酸(1：1)以及4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)-2-羧乙基]胺基}-2-氧代乙基)胺基]-2-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫基}-4-氧代丁酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0775-1591
首先在DMF中在有N,N-二異丙基乙胺的情況下將1-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮轉化成N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸。
將11mg(0.013mmol)中間物F193以及8mg(0.016mmol)N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸溶解在3ml DMF中，並在室溫 下將混合物攪拌20小時。隨後進行濃縮，並藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。
在將相應的溶離份合併，以及在真空中將溶劑蒸發後，將殘餘物溶解在2mL THF/水1：1中。添加19μL 2M氫氧化鋰水溶液，並在室溫下將混合物攪拌1小時。隨後再添加19μL 2M氫氧化鋰水溶液，並在室溫下將混合物攪拌一夜。隨後用1M鹽酸調節至中性，在真空中將溶劑蒸發，並藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。獲得4.1mg(理論之38%)的區位異構的受保護中間物，其形式為無色泡沫。
LC-MS(方法1)：Rt=1.03min(寬)；MS(ESIpos)：m/z=1020(M+H)+。
在最後一步中，將4.1mg(0.004mmol)此中間物溶解在3mL 2,2,2-三氟乙醇中。添加3mg(0.022mmol)氯化鋅，並在50℃下將混合物攪拌1小時。隨後添加6mg(0.022mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸以及2ml 0.1%的三氟乙酸水溶液，並在真空中將溶劑蒸發。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。在將相應的溶離份濃縮以及將殘餘物自乙腈/水凍乾後，獲得5mg(定量)目標化合物，其形式為比例為20：80的區位異構體混合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.78min(寬)；MS(ESIpos)：m/z=876(M+H)+。
LC-MS(方法5)：Rt=2.36min及2.39min；MS(ESIpos)：m/z=876(M+H)+。
實例M4 S-(1-{2-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙氧基]乙基}-2,5-二氧代吡咯啶-3-基)-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0777-1592
將3mg(4μmol)中間物F248置於2ml DMF中，並摻入0.9mg(8μmol)L-半胱胺酸。在室溫下將反應混合物攪拌18小時，隨後在真空中將其濃縮。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。將相應的溶離份濃縮，以及，在將殘餘物自乙腈/水凍乾後，殘餘1.1mg(理論之32%)形式為白色固體的目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.78min；MS(EIpos)：m/z=801[M+H]+。
實例M5 (3R,7S)-7-胺基-17-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫基}-3-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-4-乙二醇醯基-2,2-二甲基-8,16-二氧代-12-氧雜-4,9,15-三氮雜十九烷-19-酸-三氟乙酸(1：1)以及(3R,7S)-7-胺基-18-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫基}-3-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-4-乙二醇醯基-2,2-二甲基-8,16-二氧代-12-氧雜-4,9,15-三氮雜十九烷-19-酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0777-1593
將8mg(0.010mmol)中間物F248之受保護的中間體以及5.1mg (0.02mmol)N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸溶解在3ml DMF中，並在室溫下將混合物攪拌18小時，隨後在超音波浴中對其進行2小時的處理。隨後進行濃縮，並藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。在將相應的溶離份合併，以及在真空中將溶劑蒸發後，將殘餘物溶解在2mL THF/水1：1中。添加15μL 2M氫氧化鋰水溶液，並在室溫下將混合物攪拌15分鐘。隨後用1M鹽酸將混合物的pH值調節至3，用20ml食鹽溶液進行稀釋，並用20ml乙酸乙酯萃取兩次。透過硫酸鎂對有機相進行乾燥，將其濃縮，並將殘餘物自乙腈/水凍乾。獲得8.4mg(理論之78%，歷經2個階段)的區位異構的受保護中間物，其形式為無色泡沫。
LC-MS(方法1)：Rt=1.44min及3.43min；MS(ESIpos)：m/z=1107(M+H)+。
在最後一步中，將8mg(0.007mmol)此中間物溶解在5mL 2,2,2-三氟乙醇中。添加9.8mg(0.072mmol)氯化鋅，並在50℃下將混合物攪拌1.5小時。隨後添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，並在真空中將溶劑蒸發。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。在將相應的溶離份濃縮以及將殘餘物自乙腈/水凍乾後，獲得4mg(理論之59%)目標化合物，其形式為比例為31：67的區位異構體混合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.79min及0.81min；MS(ESIpos)：m/z=819(M+H)+。
實例M6 2-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫基}-4-({(14R)-13-(3-胺基丙基)-14-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-15,15-二甲基-2,7,12-三氧代-10-硫雜-3,6,13-三氮雜十六碳-1-基}胺基)-4-氧代丁酸-三氟乙酸(1：2)，以及3-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫基}-4-({(14R)-13-(3-胺基丙基)-14-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-15,15-二甲基-2,7,12-三氧代-10-硫 雜-3,6,13-三氮雜十六碳-1-基}胺基)-4-氧代丁酸-三氟乙酸(1：2)
Figure 105119613-A0202-12-0779-1594
將18mg(0.021mmol)中間物F213以及11.2mg(0.04mmol)N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸溶解在2ml DMF中，並在室溫下將混合物攪拌18小時。在真空中對反應混合物進行蒸發。將殘餘物(21.2mg)溶解在3mL THF/水1：1中。添加0.04mL 2M氫氧化鋰水溶液，並在室溫下將混合物攪拌3小時。添加0.02mL 2M氫氧化鋰水溶液，並在室溫下將混合物攪拌1小時。隨後用7.2mg(0.12mmol)乙酸將混合物的pH值調節至7。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得13mg(57%，歷經2個階段)的區位異構的受保護中間物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.03min；MS(ESIpos)：m/z=1020(M+H)+。
在最後一步中，將13mg(0.01mmol)此中間物溶解在2mL 2,2,2-三氟乙醇中。添加6.2mg(0.05mmol)氯化鋅，並在50℃下將混合物攪拌7小時。隨後添加13.3mg(0.05mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，並藉由製備性HPLC對溶劑進行純化。在將相應的溶離份濃縮以及將殘餘物自乙腈/水凍乾後，獲得10.3mg(81.4%)形式為區位異構體混合物的目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.03min；MS(ESIpos)：m/z=875 (M+H)+。
實例M7 S-(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-氧代乙基)-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0780-1595
將6mg(8μmol)中間物F119置於3mL DMF中，並摻入1.8mg(15μmol)L-半胱胺酸。在室溫下將反應混合物攪拌6小時，隨後在室溫下靜置3日。隨後在真空中將混合物濃縮，並藉由製備性HPLC將產物純化。
LC-MS(方法1)：Rt=0.81min；MS(ESIpos)：m/z=717(M+H)+。
實例M8 (3R)-6-{(11S,15R)-11-胺基-15-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-14-乙二醇醯基-16,16-二甲基-2,5,10-三氧代-3,6,9,14-四氮雜十七碳-1-基}-5-氧代硫代嗎啉-3-羧酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0781-1596
將4mg(0.004mmol)實例135中之化合物溶解在4mL THF/水中，並摻入48μL的2M氫氧化鋰水溶液。在室溫下將混合物攪拌1小時，隨後將其濃縮，並藉由製備性HPLC將其純化。在將相應的溶離份合併、濃縮以及自乙腈/水凍乾後，獲得2.4mg(理論之60%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(EIpos)：m/z=814[M+H]+。
實例M9 N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0781-1597
將150.0mg(0.42mmol)(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙烷-1-胺(中間物C52)置於2.0mL二氯甲烷中，並摻入29.2mg(0.49mmol)HOAc以及125.6mg(0.59mmol)三乙醯氧基硼氫化鈉，並在室溫下攪拌5分鐘。添加98.9mg(0.49mmol)3-(1,3- 二氧代-1,3-二氫-2H-異吲哚-2-基)丙醛。在室溫下將反應混合物攪拌一夜。用乙酸乙酯將反應混合物稀釋，並用飽和碳酸鈉溶液將有機相洗滌兩次，並用飽和NaCl溶液將其洗滌一次。在透過硫酸鎂進行乾燥後，在真空中將溶劑蒸發，並透過矽膠(溶離劑：二氯甲烷/甲醇100：1)將殘餘物純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得188.6mg(74%)2-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]-1H-異吲哚-1,3(2H)-二酮化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.00min；MS(ESIpos)：m/z=541[M+H]+。
將171.2mg(0.32mmol)2-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]-1H-異吲哚-1,3(2H)-二酮置於5.0mL二氯甲烷中，並摻入73.6mg(0.73mmol)三乙胺。在0℃下添加94.9mg(0.70mmol)乙醯氧基乙醯氯，並在室溫下將反應混合物攪拌一夜。用乙酸乙酯將反應混合物稀釋，並用飽和碳酸氫鈉溶液將有機相洗滌兩次，並用飽和NaCl溶液將其洗滌一次。在透過硫酸鎂進行乾燥後，在真空中將溶劑蒸發，並藉由Biotage Isolera對殘餘物進行純化(矽膠，柱10g SNAP，流量12mL/min，乙酸乙酯/環己烷1：3)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得159.0mg(77%)2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-(1,3-二氧代-1,3-二氫-2H-異吲哚-2-基)丙基]胺基)-2-氧代乙酸乙酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.35min；MS(ESIpos)：m/z=642[M+H]+。
將147.2mg(0.23mmol)2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-(1,3-二氧代-1,3-二氫-2H-異吲哚-2-基) 丙基]胺基)-2-氧代乙酸乙酯置於4.0mL乙醇中，並摻入356.2mg(4.59mmol)甲烷胺(40%水溶液)。在50℃下將反應混合物攪拌一夜。在真空中將溶劑蒸發，並用甲苯將殘餘物共蒸餾三次。透過矽膠(溶離劑：二氯甲烷/甲醇10：1)對殘餘物進行純化。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得67.4mg(63%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.91min；MS(ESIpos)：m/z=470[M+H]+。
實例M10 (2R,28R)-28-胺基-2-[({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}硫基)甲基]-25-(羧基甲基)-4,20,24-三氧代-7,10,13,16-四氧雜-26-硫雜-3,19,23-三氮雜二十九烷-1,29-二酸-三氟乙酸(1：2)，以及(1R,28R,34R)-1-胺基-33-(3-胺基丙基)-34-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-35,35-二甲基-6,10,26,32-四氧代-14,17,20,23-四氧雜-3,30-二硫雜-7,11,27,33-四氮雜三十六烷-1,4,28-三羧酸-三氟乙酸(1：2)
Figure 105119613-A0202-12-0784-1598
將20mg(0.018mmol)R-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)(中間物F209)以及9.78mg(0.036mmol)N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸溶解在2ml DMF中，並在室溫下將混合物攪拌18小時。在真空中對反應混合物進行蒸發。將殘餘物(47.7mg)溶解在3mL THF/水1：1中。添加0.08mL 2M氫氧化鋰水溶液，並在室溫下將混合物攪拌1小時。隨後用9.26mg(0.15mmol)乙酸將混合物的pH值調節至7。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得15.3mg(29%，歷經2個階段)的區位異構的受保護中間物。
LC-MS(方法6)：Rt=12.26min及12.30min；MS(ESIpos)：m/z=1254(M+H)+。
在最後一步中，將15.3mg(0.01mmol)此中間物溶解在2mL 2,2,2-三氟乙醇中。添加6.1mg(0.05mmol)氯化鋅，並在50℃下將混合物攪拌2小時。隨後添加13.1mg(0.05mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，並藉由製備性HPLC對溶劑進行純化。在將相應的溶離份濃縮以及將殘餘物自乙腈/水凍乾後，獲得11.9mg(79.5%)形式為區位異構體混合物的目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.85min；MS(ESIpos)：m/z=1110(M+H)+。
實例M11 S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：2)
Figure 105119613-A0202-12-0785-2621
將15.0mg(0.018mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)(中間物C71)溶解在1.0mL三氟乙醇中，並摻入7.4mg(0.054mmol)氯化鋅。在50℃下將反應混合物攪拌一夜。為反應混合物摻入15.8mg(0.054mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 125x30； 10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得11.1mg(77%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.83min；MS(ESIpos)：m/z=573(M+H)+。
實例M12 4-{[(1R)-2-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}硫基)-1-羧乙基]胺基}-4-氧代丁酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0786-1600
將12.2mg(0.014mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-(4-第三丁氧基-4-氧代丁醯基)-L-半胱胺酸(中間物C77)溶解在2.0mL三氟乙醇中，並摻入11.4mg(0.084mmol)二氯化鋅。在50℃下將反應混合物攪拌3小時。為反應混合物摻入24.5mg(0.084mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌10分鐘，隨後摻入水(0.1% TFA)。直接藉由製備性RP-HPLC進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得4.6mg (42%)目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m/z=673(M+H)+。
實例M13 4-[(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-氧代乙基)胺基]-2-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫基}-4-氧代丁酸-三氟乙酸(1：1) 區位異構體1，差向異構體1(2R)或(2S)
Figure 105119613-A0202-12-0787-1601
LC-MS(方法5)：Rt=2.44min；MS(ESIpos)：m/z=832[M+H]+。
首先在DMF中在有N,N-二異丙基乙胺的情況下將甲基-L-半胱胺酸酯鹽酸鹽(1：1)與1-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮轉化成甲基-N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸酯。
將408mg(1.93mmol)市售之3-溴-4-甲氧基-4-氧代丁酸與180mg(0.644mmol)甲基-N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸酯溶解在8ml DMF中，並摻入147mg(0.97mmol)1,8-二氮雜雙環(5.4.0)十一碳-7-烯。在室溫下攪拌18小時後，再添加136mg(0.64mmol)3-溴-4-甲氧基-4-氧代丁酸以及147mg(0.97mmol)1,8-二氮雜雙環(5.4.0)十一碳-7-烯，並在室溫下將混合物再攪拌12小時，隨後在真空 中將其濃縮。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。在將相應的溶離份合併，以及在真空中將溶劑蒸發後，獲得151mg(理論之57%)4-甲氧基-3-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丙基]硫基}-4-氧代丁酸。
LC-MS(方法12)：Rt=1.74min；MS(ESIneg)：m/z=408(M-H)-。
藉由超臨界液相層析透過對掌性柱將145mg此中間物分離成單非對映異構體(SFC；柱：DAICEL，AD-H 5u 250x20mm；流量：80mL/min；方法：AD-25%ETOH-80ml；壓力：100bar；波長：210nM)，其中獲得63mg(43%)差向異構體1以及58mg(40%)差向異構體2。
如下確定差向異構體1的特性：LC-MS(方法5)：Rt=2.94min；MS(ESIneg)：m/z=408(M-H)-。
1H-NMR：(400MHz,DMSO-d6)：δ=7.57(d,1H),4.24(m,1H),4.05(t,2H),3.67(t,1H),3.65(s,3H),3.62(s,3H),3.05(dd,1H),2.70-2.88(m,2H),2.59(dd,1H),0.93(t,2H),0.02(s,9H).
如下確定差向異構體2的特性：LC-MS(方法5)：Rt=2.95min；MS(ESIneg)：m/z=408(M-H)-。
1H-NMR：(400MHz,DMSO-d6)：δ=7.58(d,1H),4.16-4.23(m,1H),4.05(t,2H),3.67(dd,1H),3.65(s,3H),3.64(s,3H),3.04(dd,1H),2.88(dd,1H),2.77(dd,1H),2.61(dd,1H),0.92(t,2H),0.02(s,9H).
在有30mg(0.079mmol)HATU及13.4mg(0.132mmol)4-甲基嗎啉的情況下將32.5mg(0.079mmol)差向異構體1與50mg(0.066mmol)中間物C66偶聯，其中在HPLC純化後獲得43mg(理論之57%)經完全去保護的中間物甲基-4-{[(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯 基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]乙基}-2,2-二甲基-6,9,14-三氧代-5-氧雜-7,10,13-三氮雜-2-矽雜十五烷-15-基]胺基}-2-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丙基]硫基}-4-氧代丁酸酯。
隨後在室溫下在11ml甲醇中藉由0.9mL的2M氫氧化鋰溶液將40mg(0.035mmol)此中間物攪拌20分鐘，其中將兩個甲酯基團脫除。在HPLC純化後，獲得12mg(理論之31%)二羧酸衍生物。
LC-MS(方法5)：Rt=4.74min；MS(ESIpos)：m/z=1120[M+H]+。
最後如上文所述，在三氟乙醇中藉由氯化鋅將10mg(0.009mmol)此中間物完全去保護。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。在將相應的溶離份濃縮以及將殘餘物自乙腈/水凍乾後，獲得2.6mg(理論之30%)目標化合物。
LC-MS(方法5)：Rt=2.44min；MS(ESIpos)：m/z=832[M+H]+。
實例M14 4-[(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-氧代乙基)胺基]-2-([(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫基}-4-氧代丁酸-三氟乙酸(1：1) 區位異構體1，差向異構體2(2R或2S)
Figure 105119613-A0202-12-0790-1602
LC-MS(方法5)：Rt=2.44min；MS(EIpos)：m/z=832[M+H]+。
與就實例M13所作描述類似的方式，對實例M13中描述之中間物差向異構體2進行轉化：在有30mg(0.079mmol)HATU及13.4mg(0.132mmol)4-甲基嗎啉的情況下將32.5mg(0.079mmol)差向異構體2與50mg(0.066mmol)中間物C66偶聯，其中在HPLC純化後獲得43mg(理論之57%)經完全去保護的中間物甲基-4-{[(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]乙基}-2,2-二甲基-6,9,14-三氧代-5-氧雜-7,10,13-三氮雜-2-矽雜十五烷-15-基]胺基}-2-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丙基]硫基}-4-氧代丁酸酯。
隨後在室溫下在11ml甲醇中藉由0.9mL的2M氫氧化鋰溶液將40mg(0.035mmol)此中間物攪拌20分鐘，其中將兩個甲酯基團脫除。在HPLC純化後，獲得11mg(理論之28%)二羧酸衍生物。
LC-MS(方法5)：Rt=4.74min；MS(ESIpos)：m/z=1120[M+H]+。
最後如上文所述，在三氟乙醇中藉由氯化鋅將10mg(0.009mmol)此中間物完全去保護。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。在將相應的溶離份濃縮以及將殘餘物自乙腈/水凍乾後，獲得4.4mg (理論之52%)目標化合物。
LC-MS(方法5)：Rt=2.44min；MS(ESIpos)：m/z=832[M+H]+。
實例M15 4-[(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-氧代乙基)胺基]-3-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫基}-4-氧代丁酸-三氟乙酸(1：1) 區位異構體2，差向異構體1(3R或3S)
Figure 105119613-A0202-12-0791-1603
LC-MS(方法5)：Rt=2.45min；MS(EIpos)：m/z=832[M+H]+。
將742.8mg(3.3mmol)市售之2-溴-4-乙氧基-4-氧代丁酸與802mg(2.87mmol)甲基-N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸酯溶解在32ml DMF中，並摻入655.4mg(4.31mmol)1,8-二氮雜雙環(5.4.0)十一碳-7-烯。在室溫下攪拌20小時後，在真空中將混合物濃縮，並藉由製備性HPLC將殘餘物純化。在將相應的溶離份合併，以及在真空中將溶劑蒸發後，獲得151mg(理論之43%)4-乙氧基-2-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丙基]硫基}-4-氧 代丁酸。
LC-MS(方法5)：Rt=3.13min；MS(ESIpos)：m/z=424(M+H)+。
藉由超臨界液相層析透過對掌性柱將510mg此中間物分離成單非對映異構體(SFC；柱：DAICEL，AD-H 5u 250x20mm；流量：80mL/min；方法：AD-10%ETOH-80ml；壓力：100bar；波長：210nM)，其中獲得100mg(20%)差向異構體1以及141mg(28%)差向異構體2。
如下確定差向異構體1的特性：LC-MS(方法1)：Rt=0.99min；MS(ESIneg)：m/z=422(M-H)-。
1H-NMR：(400MHz,DMSO-d6)：δ=7.60(d,1H),4.18-4.26(m,1H),4.01-4.08(m,4H),3.63(s,3H),3.59(dd,1H),3.04(dd,1H),2.92(dd,1H),2.80(dd,1H),2.63(dd,1H),1.17(t,3H),0.92(t,2H),0.02(s,9H).
如下確定差向異構體2的特性：LC-MS(方法5)：Rt=2.95min；MS(ESIneg)：m/z=408(M-H)-。
1H-NMR：(400MHz,DMSO-d6)：δ=7.56(d,1H),4.21-4.29(m,1H),4.01-4.1(m,4H),3.64(s,3H),3.58(dd,1H),3.08(dd,1H),2.85(dd,1H),2.78(dd,1H),2.60(dd,1H),1.17(t,3H),0.93(t,2H),0.02(s,9H).
在有30mg(0.079mmol)HATU及13.4mg(0.132mmol)4-甲基嗎啉的情況下將33.6mg(0.079mmol)差向異構體1與50mg(0.066mmol)中間物C66偶聯，其中在HPLC純化後獲得51mg(理論之63%)經完全去保護的中間物乙基-4-{[(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]乙基}-2,2-二甲基-6,9,14-三氧代-5-氧雜-7,10,13-三氮雜-2-矽雜十五烷-15-基]胺基}- 3-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丙基]硫基}-4-氧代丁酸酯。
隨後在室溫下在12ml THF/水1：1中藉由0.5mL的2M氫氧化鋰溶液將49mg(0.042mmol)此中間物攪拌30分鐘，其中將兩個甲酯基團脫除。在酸化以及HPLC純化後，獲得11mg(理論之24%)二羧酸衍生物。
LC-MS(方法5)：Rt=4.68min；MS(ESIpos)：m/z=1120[M+H]+。
最後如上文所述，在三氟乙醇中藉由氯化鋅將11mg(0.01mmol)此中間物完全去保護。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。在將相應的溶離份濃縮以及將殘餘物自乙腈/水凍乾後，獲得3.7mg(理論之39%)目標化合物。
LC-MS(方法5)：Rt=2.45min；MS(ESIpos)：m/z=832[M+H]+。
實例M16 4-[(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-氧代乙基)胺基]-3-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫基}-4-氧代丁酸-三氟乙酸(1：1) 區位異構體2，差向異構體2(3R或3S)
Figure 105119613-A0202-12-0794-1604
LC-MS(方法5)：Rt=2.44min；MS(EIpos)：m/z=832[M+H]+。
與就實例M15所作描述類似的方式，對實例M15中描述之中間物差向異構體2進行轉化：在有30mg(0.079mmol)HATU及13.4mg(0.132mmol)4-甲基嗎啉的情況下將33.6mg(0.079mmol)差向異構體2與50mg(0.066mmol)中間物C66偶聯，其中在HPLC純化後獲得51mg(理論之63%)經完全去保護的中間物乙基-4-{[(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]乙基}-2,2-二甲基-6,9,14-三氧代-5-氧雜-7,10,13-三氮雜-2-矽雜十五烷-15-基]胺基}-3-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丙基]硫基}-4-氧代丁酸酯。
隨後在室溫下在12ml THF/水1：1中藉由0.5mL的2M氫氧化鋰溶液將49mg(0.042mmol)此中間物攪拌30分鐘，其中將兩個甲酯基團脫除。在酸化以及HPLC純化後，獲得13.4mg(理論之28%)二羧酸衍生物。
LC-MS(方法5)：Rt=4.66min；MS(ESIpos)：m/z=1120[M+H]+。
最後如上文所述，在三氟乙醇中藉由氯化鋅將13.4mg(0.012mmol)此中間物完全去保護。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。在將相應的溶離份濃縮以及將殘餘物自乙腈/水凍乾後，獲得7.5mg(理論之66%)目標化合物。
LC-MS(方法5)：Rt=2.44min；MS(ESIpos)：m/z=832[M+H]+。
實例M17 (2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁酸鹽酸鹽(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0795-1605
將150mg(0.2mmol)中間物C53溶解在15mL DMF中，並摻入2.29g(20.39mmol)DABCO。在超音波浴中對混合物進行30分鐘的處理。隨後添加1.17ml乙酸，以將混合物調節至pH 3-4，並在真空中將其濃縮。藉由製備性HPLC將殘餘物純化，並在室溫下在真空中將相應的溶離份濃縮。將殘餘物置於乙腈/水1：1中，摻入5mL 4N鹽酸，隨後進行凍乾。如此獲得81mg(理論之68%)目標化合物。
LC-MS(方法5)：Rt=2.69min；MS(EIpos)：m/z=514[M+H]+。
實例M18 N-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-L-麩醯胺 酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0796-1606
首先按照經典的肽化學方法製備三氟乙酸-苄基-N-(2-胺基乙基)-N2-[(苄氧基)羰基]-L-麩醯胺酸酯(1：1)。隨後在有HATU的情況下將此中間物與中間物C58偶聯。隨後先透過氫解將苄氧基羰基保護基團以及苄基酯脫除，再藉由氯化鋅將2-(三甲基矽基)乙氧基羰基保護基團脫除。
LC-MS(方法6)：Rt=1.91min；MS(EIpos)：m/z=685[M+H]+。
實例M19 N6-(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-beta-丙胺醯基)-L-離胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0796-1607
首先藉由肽化學中已知的保護基團操作製備三氟乙酸--2-(三甲基矽基)乙基-N2-[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸酯(1：1)。隨後在有HATU的情況下將此中間物與中間物C61偶聯。隨後藉由氯化鋅將2-(三甲基矽 基)乙氧基羰基保護基團以及2-(三甲基矽基)乙酯脫除。最後，在透過氫解將苄氧基羰基保護基團脫除以及藉由製備性HPLC純化後，獲得目標化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.65min；
實例M20 (1R,4R,27R,33R)-1-胺基-32-(3-胺基丙基)-33-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-34,34-二甲基-6,9,25,31-四氧代-13,16,19,22-四氧雜-3,29-二硫雜-7,10,26,32-四氮雜三十五烷-1,4,27-三羧酸-三氟乙酸(1：2)
Figure 105119613-A0202-12-0797-1608
首先在DMF中在有N,N-二異丙基乙胺的情況下將甲基-L-半胱胺酸酯鹽酸鹽(1：1)與1-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮轉化成甲基-N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸酯。
將408mg(1.93mmol)市售之3-溴-4-甲氧基-4-氧代丁酸與180mg(0.644mmol)甲基-N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸酯溶解在8ml DMF中，並摻入147mg(0.97mmol)1,8-二氮雜雙環(5.4.0)十一碳-7-烯。在室溫下攪拌18小時後，再添加136mg(0.64mmol)3- 溴-4-甲氧基-4-氧代丁酸以及147mg(0.97mmol)1,8-二氮雜雙環(5.4.0)十一碳-7-烯，並在室溫下將混合物再攪拌12小時，隨後在真空中將其濃縮。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。在將相應的溶離份合併，以及在真空中將溶劑蒸發後，獲得151mg(理論之57%)4-甲氧基-3-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丙基]硫基}-4-氧代丁酸。
LC-MS(方法12)：Rt=1.74min；MS(ESIneg)：m/z=408(M-H)-。
在有3.66mg(8.93μmol)HATU及1.6μl(15μmol)4-甲基嗎啉的情況下，將3.66mg(8.93μmol)4-甲氧基-3-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]-羰基}胺基)丙基]硫基}-4-氧代丁酸與13.0mg(7.44μmol)von S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[15-(甘胺醯基胺基)-4,7,10,13-四氧雜十五烷-1-醯基]-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)(中間物C80)偶聯，其中在HPLC純化後獲得3.9mg(理論之37%)經完全去保護的中間物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[15-({N-[(8R,11R)-8,11-雙(甲氧基羰基)-2,2-二甲基-6,13-二氧代-5-氧雜-10-硫雜-7-氮雜-2-矽雜十三烷-13-基]甘胺醯基}胺基)-4,7,10,13-四氧雜十五烷-1-醯基]-L-半胱胺酸。
隨後在室溫下在1.0ml THF/水3：1中藉由35μl的2M氫氧化鋰溶液將3.90mg(2.76μmol)此中間物攪拌15分鐘，其中將兩個甲酯基團脫除。在HPLC純化後，獲得3.60mg(理論之94%)二羧酸衍生物。
LC-MS(方法5)：Rt=4.83min；MS(ESIpos)：m/z=1385[M+H]+。
最後如上文所述，在三氟乙醇中藉由氯化鋅將3.6mg(2.6μmol)此中間物完全去保護。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。在將相應的溶離份濃縮以及將殘餘物自乙腈/水凍乾後，獲得1.92mg(理論之55%)目標化合物。
LC-MS(方法5)：Rt=2.72min；MS(ESIneg)：m/z=1094[M-H]-。
實例M21 (2R,24S,27R)-27-胺基-2-[({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}硫基)甲基]-24-(羧基甲基)-4,20,23-三氧代-7,10,13,16-四氧雜-25-硫雜-3,19,22-三氮雜二十八烷-1,28-二酸-三氟乙酸(1：2)
Figure 105119613-A0202-12-0799-1609
將742.8mg(3.3mmol)市售之2-溴-4-乙氧基-4-氧代丁酸與802mg(2.87mmol)甲基-N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸酯溶解在32ml DMF中，並摻入655.4mg(4.31mmol)1,8-二氮雜雙環(5.4.0)十一碳-7-烯。在室溫下攪拌20小時後，在真空中將混合物濃縮，並藉由製備性HPLC將殘餘物純化。在將相應的溶離份合併，以及在真空中將溶劑蒸發後，獲得521mg(理論之43%)4-乙氧基-2-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丙基]硫基}-4-氧 代丁酸。
LC-MS(方法5)：Rt=3.13min；MS(ESIpos)：m/z=424(M+H)+。
在有3.92mg(10.3μmol)HATU及1.9μl(17μmol)4-甲基嗎啉的情況下，將4.36mg(10.3μmol)4-乙氧基-2-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]-羰基}胺基)丙基]硫基}-4-氧代丁酸與15.0mg(8.59μmol)von S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[15-(甘胺醯基胺基)-4,7,10,13-四氧雜十五烷-1-醯基]-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)(中間物C80)偶聯，其中在HPLC純化後獲得3.6mg(理論之26%)經完全去保護的中間物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[15-({N-[(8R,11S)-11-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-8-(甲氧基羰基)-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧雜-10-硫雜-7-氮雜-2-矽雜十二烷-12-基]甘胺醯基}胺基)-4,7,10,13-四氧雜十五烷-1-醯基]-L-半胱胺酸。
隨後在室溫下在1.0ml THF/水1：1中藉由35μl的2M氫氧化鋰溶液將6.20mg(2.82μmol)此中間物攪拌15分鐘，其中將兩個酯基團脫除。在酸化以及HPLC純化後，獲得3.60mg(理論之92%)二羧酸衍生物。
LC-MS(方法5)：Rt=4.71min；MS(ESIpos)：m/z=1385[M+H]+。
最後如上文所述，在三氟乙醇中藉由氯化鋅將3.60mg(1.69μmol)此中間物完全去保護。藉由製備性HPLC對殘餘物進行純化。在將相應的溶離份濃縮以及將殘餘物自乙腈/水凍乾後，獲得0.88mg(理論之39%)目標化合物。
LC-MS(方法5)：Rt=2.72min；MS(ESIneg)：m/z=1094[M-H]-。
實例M22 (2R,27R)-27-胺基-2-[({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}硫基)甲基]-24-(羧基甲基)-4,20,23-三氧代-7,10,13,16-四氧雜-25-硫雜-3,19,22-三氮雜二十八烷-1,28-二酸-三氟乙酸(1：2)，以及(1R,27R,33R)-1-胺基-32-(3-胺基丙基)-33-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-34,34-二甲基-6,9,25,31-四氧代-13,16,19,22-四氧雜-3,29-二硫雜-7,10,26,32-四氮雜三十五烷-1,4,27-三羧酸-三氟乙酸(1：2)
Figure 105119613-A0202-12-0801-1610
將16.5mg(0.015mmol)S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-氧代乙基}-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧雜-3-氮雜十八烷-18-基]-L-半胱胺酸-三氟乙酸(1：1)(中間物F257)以及8.18mg(0.031mmol)N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸溶解在2ml DMF中，並在室溫下將混合物攪拌18小時。在真空中對反應混合物進行蒸發。將殘餘物(28.9mg)溶解在3mL THF/水1：1中。添 加0.046mL 2M氫氧化鋰水溶液，並在室溫下將混合物攪拌3小時。隨後用5.2μl(0.092mmol)乙酸將混合物的pH值調節至7。直接藉由製備性RP-HPLC對反應混合物進行純化(柱：Reprosil 125x30；10μ，流量：50mL/min，MeCN/水，0.1% TFA)。在真空中將溶劑蒸發，並在高真空中對殘餘物進行乾燥。獲得12.1mg(58%，歷經2個階段)的區位異構的受保護中間物。
LC-MS(方法12)：Rt=1.82min；MS(ESIpos)：m/z=1240(M+H)+。
在最後一步中，將12.1mg(0.009mmol)此中間物溶解在2mL 2,2,2-三氟乙醇中。添加7.3mg(0.054mmol)氯化鋅，並在50℃下將混合物攪拌2小時。隨後添加15.7mg(0.054mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，並藉由製備性HPLC對溶劑進行純化。在將相應的溶離份濃縮以及將殘餘物自乙腈/水凍乾後，獲得6.4mg(59%)形式為區位異構體混合物的目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(ESIpos)：m/z=1096(M+H)+。
實例M23 N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-beta-丙胺醯基-L-麩胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0802-1611
首先在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下將二第三丁基L-麩胺酸酯鹽酸鹽(1：1)與中間物C61偶聯。隨後將受保護之中間物置於三氟乙醇中，並在有氯化鋅的情況下在50℃下攪拌一夜，以實現完全去保護。在添加EDTA後，藉由製備性HPLC作純化處理。
LC-MS(方法12)：Rt=1.45min；MS(ESIpos)：m/z=714[M+H]+。
實例M24 N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-beta-丙胺醯基-D-麩胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0803-1612
首先在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下將二第三丁基D-麩胺酸酯鹽酸鹽(1：1)與中間物C61偶聯。隨後將受保護之中間物置於三氟乙醇中，並在有氯化鋅的情況下在50℃下攪拌，以實現完全去保護。在添加EDTA後，藉由製備性HPLC作純化處理。
LC-MS(方法12)：Rt=1.41min；MS(ESIpos)：m/z=714[M+H]+。
實例M25 N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-L-麩胺酸-三氟乙酸(1：1)
Figure 105119613-A0202-12-0804-1613
首先在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下將二第三丁基L-麩胺酸酯鹽酸鹽(1：1)與中間物C61偶聯。在下一步中，在室溫下藉由10%的鈀-活性炭在甲醇中在氫正常壓力下進行45分鐘的氫化，以將Z保護基團脫除。隨後將經部分去保護之中間物置於三氟乙醇中，並在有氯化鋅的情況下在50℃下攪拌7小時，以實現完全去保護。在添加EDTA後，藉由製備性HPLC作純化處理。
LC-MS(方法12)：Rt=1.44min；MS(ESIpos)：m/z=643[M+H]+。
實例M26 4-[(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-氧代乙基)胺基]-2-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫基}-4-氧代丁酸-三氟乙酸(1：1) 區位異構體1，差向異構體混合物
Figure 105119613-A0202-12-0804-1614
此實例描述實例13及實例14中之化合物的差向異構體混合物。以與實例13類似的方式進行合成，其中不透過超臨界液相層析將該二 差向異構體分離，而是將目標化合物作為差向異構體混合物製備。
LC-MS(方法5)：Rt=2.43min；MS(ESIpos)：m/z=832[M+H]+。
實例M27 4-[(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-氧代乙基)胺基]-3-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫基}-4-氧代丁酸-三氟乙酸(1：1) 區位異構體2，差向異構體混合物
Figure 105119613-A0202-12-0805-1615
此實例描述實例15及實例16中之化合物的差向異構體混合物。以與實例15類似的方式進行合成，其中不透過超臨界液相層析將該二差向異構體分離，而是將目標化合物作為差向異構體混合物製備。
LC-MS(方法5)：Rt=2.45min；MS(EIpos)：m/z=832[M+H]+。
APDC及ADC實施例
根據連接子以及偶聯協定，實施例之結構式中所揭示的、透過馬來醯亞胺與抗體之半胱胺酸側鏈偶聯的APDC及ADC主要呈現為所示的開環或封閉形式。但製備中亦可能包含一小部分其他形式。
在氬氛圍下進行偶聯反應。
實例1a
Figure 105119613-A0202-12-0806-1616
在氬氛圍下，為5mg西妥昔單抗在0.5ml PBS中的溶液(c=10mg/mL)摻入0.029mg TCEP在0.05ml PBS緩衝液中的溶液。在室溫下將混合物攪拌30分鐘，隨後添加0.25mg(0.00023mmol)溶解於50μl DMSO中的中間物Q1。在室溫下進一步攪拌90分鐘後，用1.95ml預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋，並在氬氛圍下在室溫下攪拌一夜。
隨後透過經PBS緩衝液pH 7.2平衡的PD 10-柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對此溶液進行上樣，並用PBS緩衝液pH 7.2溶離。
隨後藉由超離心進行濃縮，以及用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.46mg/mL
藥物/mAb比：2.7
實例1e
以類似的方式將中間物Q1與5mg曲妥珠單抗偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.61mg/mL
藥物/mAb比：3.3
實例1i
以類似的方式將中間物Q1與5mg尼妥珠單抗偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.75mg/mL
藥物/mAb比：3.1
實例1k
以類似的方式將中間物Q1與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.26mg/mL
藥物/mAb比：3.0
實例1k*
以類似的方式將中間物Q1與50mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。
在氬氛圍下為50mg抗TWEAKR抗體TPP-2658在3.07ml PBS中的溶液(c=16.3mg/mL)摻入0.29mg TCEP在0.682ml PBS緩衝液中的溶液。在室溫下將混合物攪拌30分鐘，隨後添加2.53mg(0.0023mmol)溶解於357μl DMSO中的中間物Q1。在室溫下進一步攪拌90分鐘後，用3.391ml預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋至7.5ml，隨後透過經PBS緩衝液pH 8平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)上樣，並用PBS緩衝液pH 8溶離。在氬氛圍下，在室溫下將溶離液攪拌一夜。隨後透過經PBS緩衝液pH 7.2平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對此溶液進行上樣，並用PBS緩衝液pH 7.2溶離。隨後藉由超離心進行濃縮，用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋，並重新濃縮。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：9.56mg/mL
藥物/mAb比：3.3
實例2a
Figure 105119613-A0202-12-0808-1617
在氬氛圍下，為5mg西妥昔單抗在0.5ml PBS中的溶液(c=10mg/mL)摻入0.029mg TCEP在0.05ml PBS緩衝液中的溶液。在室溫下將混合物攪拌30分鐘，隨後添加0.23mg(0.00023mmol)溶解於50μl DMSO中的中間物Q2。在室溫下進一步攪拌90分鐘後，用1.9ml預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋，並在氬氛圍下在室溫下攪拌一夜。
隨後透過經PBS緩衝液pH 7.2平衡的PD 10-柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對此溶液進行上樣，並用PBS緩衝液pH 7.2溶離。
隨後藉由超離心進行濃縮，以及用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.87mg/mL
藥物/mAb比：3.2
實例2e
以類似的方式將中間物Q2與5mg曲妥珠單抗偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.41mg/mL
藥物/mAb比：3.3
實例2k
以類似的方式將中間物Q2與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.79mg/mL
藥物/mAb比：3.3
實例2k*
以與實例1k*類似的方式，將2.775mg(0.0028mmol)中間物Q2與60mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：9.97mg/mL
藥物/mAb比：3.7
實例3k
Figure 105119613-A0202-12-0809-2622
在氬氛圍下，為5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658在0.5ml PBS中的溶液(c=10mg/mL)摻入0.029mg TCEP在0.05ml PBS緩衝液中的溶液。在室溫下將混合物攪拌30分鐘，隨後添加0.25mg(0.00023mmol)溶解於50μl DMSO中的中間物Q3。在室溫下進一步攪拌90分鐘 後，用1.9ml預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋，並在氬氛圍下在室溫下攪拌一夜。
隨後透過經PBS緩衝液pH 7.2平衡的PD 10-柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對此溶液進行上樣，並用PBS緩衝液pH 7.2溶離。
隨後藉由超離心進行濃縮，以及用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.15mg/mL
藥物/mAb比：4.3
實例4a
Figure 105119613-A0202-12-0810-1619
在氬氛圍下，為5mg西妥昔單抗在0.5ml PBS中的溶液(c=10mg/mL)摻入0.029mg TCEP在0.05ml PBS緩衝液中的溶液。在室溫下將混合物攪拌30分鐘，隨後添加0.25mg(0.00023mmol)溶解於50μl DMSO中的中間物Q4。在室溫下進一步攪拌90分鐘後，用1.9ml預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋。隨後透過經PBS緩衝液pH 8平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對此溶液進行上樣，並用PBS緩衝液pH 8溶離。在氬氛圍下，在室溫下將溶離液攪拌一 夜。隨後藉由超離心進行濃縮，以及用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.98mg/mL
藥物/mAb比：2.0
實例4k
以類似的方式將中間物Q4與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.65mg/mL
藥物/mAb比：3.3
實例5a
Figure 105119613-A0202-12-0811-1620
在氬氛圍下，為5mg西妥昔單抗在0.458ml PBS中的溶液(c=10mg/mL)摻入0.029mg TCEP在0.05ml PBS緩衝液中的溶液。在室溫下將混合物攪拌30分鐘，隨後添加0.21mg(0.00023mmol)溶解於50μl DMSO中的中間物Q5。在室溫下進一步攪拌90分鐘後，用1.9ml預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋。隨後透過經PBS緩衝液pH 8平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對此溶液進行上樣， 並用PBS緩衝液pH 8溶離。在氬氛圍下，在室溫下將溶離液攪拌一夜。隨後藉由超離心進行濃縮，以及用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.91mg/mL
藥物/mAb比：2.4
實例5e
以類似的方式將中間物Q5與5mg曲妥珠單抗偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.55mg/mL
藥物/mAb比：3.3
實例5k
以類似的方式將中間物Q5與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.54mg/mL
藥物/mAb比：3.5
實例6a
Figure 105119613-A0202-12-0813-1621
為與中間物Q6偶聯，在此採用5mg西妥昔單抗在PBS中的溶液(c=10mg/mL)。首先添加5當量(0.24mg)溶解於50μL DMSO中的中間物Q6，在室溫下攪拌1小時後再添加相同的量，並在室溫下將混合物再攪拌一小時。隨後用PBS緩衝液(pH 7.2)將混合物稀釋至2.5mL，透過Sephadex柱將其純化，隨後藉由超離心進行濃縮，並用PBS(pH 7.2)再稀釋。
蛋白質濃度：2.26mg/mL
藥物/mAb比：3.7
實例6e
以類似的方式將中間物Q6與5mg曲妥珠單抗偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.97mg/mL
藥物/mAb比：5.4
實例6k
以類似的方式將中間物Q6與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶 聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：2.07mg/mL
藥物/mAb比：6.7
實例7a
Figure 105119613-A0202-12-0814-1622
在氬氛圍下，為5mg西妥昔單抗在0.5ml PBS中的溶液(c=10mg/mL)摻入0.029mg TCEP在0.05ml PBS緩衝液中的溶液。在室溫下將混合物攪拌30分鐘。隨後添加0.24mg(0.00023mmol)溶解於50μl DMSO中的中間物Q7，並在室溫下將混合物攪拌一夜。隨後用PBS緩衝液(pH 7.2)將混合物稀釋至2.5mL，透過Sephadex柱將其純化，隨後藉由超離心進行濃縮，並用PBS(pH 7.2)再稀釋。
蛋白質濃度：1.91mg/mL
藥物/mAb比：1.6
實例7k
以類似的方式將中間物Q7與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.66mg/mL
藥物/mAb比：2.4
實例8a
Figure 105119613-A0202-12-0815-1623
在氬氛圍下，為5mg西妥昔單抗在458μL PBS中的溶液(c=10.9mg/mL)摻入0.029mg TCEP在50μl PBS緩衝液中的溶液。用1892μl預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋，並在室溫下攪拌1小時。隨後添加0.314mg(0.00023mmol)溶解於100μl DMSO中的中間物Q8。在室溫下進一步攪拌90分鐘後，透過經PBS緩衝液pH 8平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對混合物進行上樣，並用PBS緩衝液pH 8溶離。在氬氛圍下在室溫下將溶離液攪拌一夜，隨後藉由超離心進行濃縮，以及用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。在此等條件下，ADC的一部分亦可能呈現為閉環形式。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.15mg/mL
藥物/mAb比：2.1
實例8e
以類似的方式將中間物Q8與5mg曲妥珠單抗偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.21mg/mL
藥物/mAb比：1.9
實例8k
以類似的方式將中間物Q8與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：0.65mg/mL
藥物/mAb比：2.5
實例9k
Figure 105119613-A0202-12-0816-1624
在氬氛圍下，為5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658在0.450ml PBS中的溶液(c=11.1mg/mL)摻入0.029mg TCEP在0.05ml PBS緩衝液中的溶液。在室溫下將混合物攪拌30分鐘，隨後添加0.24mg(0.00023mmol)溶解於50μl DMSO中的中間物Q9。在室溫下進一步攪拌90分鐘後，用1.95ml預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋，隨後透過經PBS緩衝液pH 8平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)進行上樣，並用PBS緩衝液pH 8溶離。在室溫下將溶離液攪拌一夜，隨後藉由超離心進行濃縮，以及用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。獲得之 ADC的特性如下：
蛋白質濃度：0.86mg/mL
藥物/mAb比：3.1
實例10a
Figure 105119613-A0202-12-0817-1625
在氬氛圍下，為5mg抗TWEAKR抗體在0.458ml PBS中的溶液(c=10.9mg/mL)摻入0.029mg TCEP在0.05ml PBS緩衝液中的溶液。在室溫下將混合物攪拌30分鐘，隨後添加0.23mg(0.00023mmol)溶解於50μl DMSO中的中間物Q10。在室溫下進一步攪拌90分鐘後，用1.95ml預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋，隨後透過經PBS緩衝液pH 8平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)進行上樣，並用PBS緩衝液pH 8溶離。在室溫下將溶離液攪拌一夜，隨後藉由超離心進行濃縮，以及用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.92mg/mL
藥物/mAb比：2.9
實例10k
以類似的方式將中間物Q10與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.65mg/mL
藥物/mAb比：3.3
實例11a
Figure 105119613-A0202-12-0818-1626
在氬氛圍下，為5mg西妥昔單抗在0.458ml PBS中的溶液(c=10.92mg/mL)摻入0.029mg TCEP在0.05ml PBS緩衝液中的溶液。在室溫下將混合物攪拌30分鐘，隨後添加0.28mg(0.00023mmol)溶解於50μl DMSO中的中間物Q11。在室溫下進一步攪拌90分鐘後，用1.942ml預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋。隨後透過經PBS緩衝液pH 8平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對此溶液進行上樣，並用PBS緩衝液pH 8溶離。在氬氛圍下，在室溫下將溶離液攪拌一夜。
隨後藉由超離心將此溶液濃縮，以及用PBS緩衝液(pH 7.2)將其 再稀釋。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.99mg/mL
藥物/mAb比：2.6
實例11e
以類似的方式將中間物Q11與5mg曲妥珠單抗偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.70mg/mL
藥物/mAb比：3.3
實例11k
以類似的方式將中間物Q11與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.71mg/mL
藥物/mAb比：3.1
實例12a
Figure 105119613-A0202-12-0819-1627
在氬氛圍下，為5mg西妥昔單抗在0.458ml PBS中的溶液(c=10.92mg/mL)摻入0.029mg TCEP在0.05ml PBS緩衝液中的溶液。在室溫下將混合物攪拌30分鐘，隨後添加0.305mg(0.00023mmol)溶 解於50μl DMSO中的中間物Q12。在室溫下進一步攪拌90分鐘後，用1.942ml預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋。隨後透過經PBS緩衝液pH 8平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對此溶液進行上樣，並用PBS緩衝液pH 8溶離。在氬氛圍下，在室溫下將溶離液攪拌一夜。隨後藉由超離心進行濃縮，以及用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：2.23mg/mL
藥物/mAb比：2.5
實例12e
以類似的方式將中間物Q12與5mg曲妥珠單抗偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.73mg/mL
藥物/mAb比：3.1
實例12k
以類似的方式將中間物Q12與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.91mg/mL
藥物/mAb比：2.8
實例13a
Figure 105119613-A0202-12-0821-1628
在氬氛圍下，為5mg西妥昔單抗在0.5ml PBS中的溶液(c=10mg/mL)摻入0.029mg TCEP在0.05ml PBS緩衝液中的溶液。在室溫下將混合物攪拌30分鐘，隨後添加0.26mg(0.00023mmol)溶解於50μl DMSO中的中間物Q13。在室溫下進一步攪拌90分鐘後，用1.9ml預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋。隨後透過經PBS緩衝液pH 8平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對此溶液進行上樣，並用PBS緩衝液pH 8溶離。在氬氛圍下，在室溫下將溶離液攪拌一夜。隨後藉由超離心進行濃縮，以及用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.98mg/mL
藥物/mAb比：2.1
實例13e
以類似的方式將中間物Q13與5mg曲妥珠單抗偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.83mg/mL
藥物/mAb比：3.1
實例13k
以類似的方式將中間物Q13與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.54mg/mL
藥物/mAb比：3.2
實例14a
Figure 105119613-A0202-12-0822-2623
在氬氛圍下，為5mg西妥昔單抗在0.458ml PBS中的溶液(c=10.92mg/mL)摻入0.029mg TCEP在0.05ml PBS緩衝液中的溶液。在室溫下將混合物攪拌30分鐘，隨後添加0.29mg(0.00023mmol)溶解於50μl DMSO中的中間物Q14。在室溫下進一步攪拌90分鐘後，用1.9ml預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋。隨後透過經PBS緩衝液pH 8平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對此溶液進行上樣，並用PBS緩衝液pH 8溶離。在氬氛圍下，在室溫下將溶離液攪拌一夜。隨後藉由超離心進行濃縮，以及用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.92mg/mL
藥物/mAb比：2.9
實例14e
以類似的方式將中間物Q14與5mg曲妥珠單抗偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.72mg/mL
藥物/mAb比：3.4
實例14k
以類似的方式將中間物Q14與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.80mg/mL
藥物/mAb比：2.9
實例15a
Figure 105119613-A0202-12-0823-1630
在氬氛圍下，為5mg西妥昔單抗在0.458ml PBS中的溶液(c=10.92mg/mL)摻入0.029mg TCEP在0.05ml PBS緩衝液中的溶液。在室溫下將混合物攪拌30分鐘，隨後添加0.25mg(0.00023mmol)溶解於50μl DMSO中的中間物Q15。在室溫下進一步攪拌90分鐘後，用1.9ml預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋。隨後透過經PBS緩衝液pH 8平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對此溶液進行上樣，並用PBS緩衝液pH 8溶離。在氬氛圍下，在室溫下將溶離液 攪拌一夜。隨後藉由超離心進行濃縮，以及用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.90mg/mL
藥物/mAb比：2.8
實例15k
以類似的方式將中間物Q15與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.74mg/mL
藥物/mAb比：2.9
實例16a
Figure 105119613-A0202-12-0824-1631
在氬氛圍下，為5mg西妥昔單抗在0.5ml PBS中的溶液(c=10mg/mL)摻入0.029mg TCEP在0.05ml PBS緩衝液中的溶液。在室溫下將混合物攪拌30分鐘，隨後添加0.26mg(0.00023mmol)溶解於50μl DMSO中的中間物Q16。在室溫下進一步攪拌90分鐘後，用1.9ml預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋。隨後透過經PBS緩衝液pH 8平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對此溶液進行上樣，並用PBS緩衝液pH 8溶離。在氬氛圍下，在室溫下將溶離液攪拌一 夜。隨後藉由超離心進行濃縮，以及用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.74mg/mL
藥物/mAb比：2.7
實例16e
以類似的方式將中間物Q16與5mg曲妥珠單抗偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.61mg/mL
藥物/mAb比：3.3
實例16k
以類似的方式將中間物Q16與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.75mg/mL
藥物/mAb比：3.2
實例17a
Figure 105119613-A0202-12-0825-1632
在氬氛圍下，為5mg西妥昔單抗在0.5ml PBS中的溶液(c=10 mg/mL)摻入0.029mg TCEP在0.05ml PBS緩衝液中的溶液。在室溫下將混合物攪拌30分鐘，隨後添加0.26mg(0.00023mmol)溶解於50μl DMSO中的中間物Q17。在室溫下進一步攪拌90分鐘後，用1.9ml預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋。隨後透過經PBS緩衝液pH 8平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對此溶液進行上樣，並用PBS緩衝液pH 8溶離。在氬氛圍下，在室溫下將溶離液攪拌一夜。隨後藉由超離心進行濃縮，以及用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.93mg/mL
藥物/mAb比：2.8
實例17e
以類似的方式將中間物Q17與5mg曲妥珠單抗偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.83mg/mL
藥物/mAb比：2.9
實例17k
以類似的方式將中間物Q17與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.34mg/mL
藥物/mAb比：2.8
實例18a
Figure 105119613-A0202-12-0827-1633
在氬氛圍下，為5mg西妥昔單抗在0.5ml PBS中的溶液(c=10mg/mL)摻入0.029mg TCEP在0.05ml PBS緩衝液中的溶液。在室溫下將混合物攪拌30分鐘，隨後添加0.26mg(0.00023mmol)溶解於50μl DMSO中的中間物Q18。在室溫下進一步攪拌90分鐘後，用1.9ml預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋。隨後透過經PBS緩衝液pH 8平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對此溶液進行上樣，並用PBS緩衝液pH 8溶離。在氬氛圍下，在室溫下將溶離液攪拌一夜。隨後藉由超離心進行濃縮，以及用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.57mg/mL
藥物/mAb比：2.4
實例18e
以類似的方式將中間物Q18與5mg曲妥珠單抗偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.79mg/mL
藥物/mAb比：3.1
實例18k
以類似的方式將中間物Q18與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：0.68mg/mL
藥物/mAb比：2.8
實例19a
Figure 105119613-A0202-12-0828-1634
在氬氛圍下，為5mg西妥昔單抗在0.5ml PBS中的溶液(c=10mg/mL)摻入0.029mg TCEP在0.05ml PBS緩衝液中的溶液。在室溫下將混合物攪拌30分鐘，隨後添加0.25mg(0.00023mmol)溶解於50μl DMSO中的中間物Q19。在室溫下進一步攪拌90分鐘後，用1.95ml預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋，並在氬氛圍下在室溫下攪拌一夜。
隨後透過經PBS緩衝液pH 7.2平衡的PD 10-柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對此溶液進行上樣，並用PBS緩衝液pH 7.2溶離。
隨後藉由超離心進行濃縮，以及用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.85mg/mL
藥物/mAb比：2.3
實例19e
以類似的方式將中間物Q19與5mg曲妥珠單抗偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.88mg/mL
藥物/mAb比：2.5
實例19k
以類似的方式將中間物Q19與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.80mg/mL
藥物/mAb比：1.8
實例20k
Figure 105119613-A0202-12-0829-1635
在氬氛圍下，為5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658在0.239ml PBS中的溶液(c=20.90mg/mL)摻入0.131mg TCEP在0.20ml PBS緩衝液中的溶液。用0.461mL PBS將混合物溶解，在室溫下攪拌30分鐘，隨後添加0.833mg(0.00040mmol)溶解於100μl DMSO中的中間物Q20。在室 溫下進一步攪拌120分鐘後，用1.50ml預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋。隨後透過經PBS緩衝液pH 8平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對此溶液進行上樣，並用PBS緩衝液pH 8溶離。在氬氛圍下，在室溫下將溶離液攪拌一夜。隨後藉由超離心進行濃縮，以及用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.96mg/mL
藥物/mAb比：4.6
實例20k*
在氬氛圍下，為5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658在0.239ml PBS中的溶液(c=20.90mg/mL)摻入0.076mg TCEP在0.05ml PBS緩衝液中的溶液。用0.20mL PBS將混合物溶解，在室溫下攪拌150分鐘，隨後添加0.833mg(0.00040mmol)溶解於50μl DMSO中的中間物Q20。在室溫下進一步攪拌120分鐘後，用1.96ml預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋。隨後透過經PBS緩衝液pH 8平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對此溶液進行上樣，並用PBS緩衝液pH 8溶離。在氬氛圍下，在室溫下將溶離液攪拌一夜。隨後藉由超離心進行濃縮，以及用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：2.17mg/mL
藥物/mAb比：7.3
實例21a
Figure 105119613-A0202-12-0831-1636
在氬氛圍下，為5mg西妥昔單抗抗體在0.427ml PBS中的溶液(c=11.7mg/mL)摻入0.076mg TCEP在0.20ml PBS緩衝液中的溶液。在室溫下將混合物攪拌150分鐘，隨後添加0.811mg(0.000533mmol)溶解於40μl DMSO中的中間物Q21。在室溫下進一步攪拌120分鐘後，用1.98ml預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋。隨後透過經PBS緩衝液pH 8平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對此溶液進行上樣，並用PBS緩衝液pH 8溶離。在氬氛圍下，在室溫下 將溶離液攪拌一夜。隨後藉由超離心進行濃縮，以及用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：2.37mg/mL
藥物/mAb比：8.1
實例21e
以類似的方式將中間物Q21與5mg曲妥珠單抗偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：2.27mg/mL
藥物/mAb比：8.0
實例21k
以類似的方式將中間物Q21與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：2.73mg/mL
藥物/mAb比：7.9
實例22a
Figure 105119613-A0202-12-0832-1637
在氬氛圍下，為5mg西妥昔單抗在0.458ml PBS中的溶液 (c=10.92mg/mL)摻入0.029mg TCEP在0.05ml PBS緩衝液中的溶液。在室溫下將混合物攪拌30分鐘，隨後添加0.28mg(0.00023mmol)溶解於50μl DMSO中的中間物Q22。在室溫下進一步攪拌90分鐘後，用1.9ml預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋。隨後透過經PBS緩衝液pH 8平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對此溶液進行上樣，並用PBS緩衝液pH 8溶離。在氬氛圍下，在室溫下將溶離液攪拌一夜。隨後藉由超離心進行濃縮，以及用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.91mg/mL
藥物/mAb比：2.2
實例22e
以類似的方式將中間物Q22與5mg曲妥珠單抗偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.59mg/mL
藥物/mAb比：1.7
實例22k
以類似的方式將中間物Q22與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.89mg/mL
藥物/mAb比：2.8
實例23a
Figure 105119613-A0202-12-0834-1638
為與中間物Q23偶聯，在此採用5mg西妥昔單抗在PBS中的溶液(c=10mg/mL)。首先添加5當量(0.2mg)溶解於50μL DMSO中的中間物Q23，在室溫下攪拌1小時後再添加相同的量，並在室溫下將混合物再攪拌一小時。隨後用PBS緩衝液(pH 7.2)將混合物稀釋至2.5mL，透過Sephadex柱將其純化，隨後藉由超離心進行濃縮，並用PBS(pH 7.2)再稀釋。
蛋白質濃度：1.88mg/mL
藥物/mAb比：2.6
實例23e
以類似的方式將中間物Q23與5mg曲妥珠單抗偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.68mg/mL
藥物/mAb比：3.7
實例23k
以類似的方式將中間物Q23與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶 聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.23mg/mL
藥物/mAb比：3.9
實例24a
Figure 105119613-A0202-12-0835-1639
在氬氛圍下，為5mg西妥昔單抗在0.458ml PBS中的溶液(c=10.92mg/mL)摻入0.029mg TCEP在0.05ml PBS緩衝液中的溶液。在室溫下將混合物攪拌30分鐘，隨後添加0.23mg(0.00023mmol)溶解於50μl DMSO中的中間物Q24。在室溫下進一步攪拌90分鐘後，用1.9ml預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋。隨後透過經PBS緩衝液pH 8平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對此溶液進行上樣，並用PBS緩衝液pH 8溶離。在氬氛圍下，在室溫下將溶離液攪拌一夜。隨後藉由超離心進行濃縮，以及用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.80mg/mL
藥物/mAb比：2.2
實例24e
以類似的方式將中間物Q24與5mg曲妥珠單抗偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.49mg/mL
藥物/mAb比：2.3
實例24k
以類似的方式將中間物Q24與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.73mg/mL
藥物/mAb比：2.2
實例25a
Figure 105119613-A0202-12-0836-1640
在氬氛圍下，為5mg西妥昔單抗在0.5ml PBS中的溶液(c=10mg/mL)摻入0.029mg TCEP在0.05ml PBS緩衝液中的溶液。在室溫下將混合物攪拌30分鐘，隨後添加0.21mg(0.00023mmol)溶解於50μl DMSO中的中間物Q25。在室溫下進一步攪拌90分鐘後，用1.9ml預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋。隨後透過經PBS緩衝液pH 8平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對此溶液進行上樣， 並用PBS緩衝液pH 8溶離。在氬氛圍下，在室溫下將溶離液攪拌一夜。隨後藉由超離心進行濃縮，以及用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.59mg/mL
藥物/mAb比：2.9
實例25e
以類似的方式將中間物Q25與5mg曲妥珠單抗偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.42mg/mL
藥物/mAb比：3.5
實例25k
以類似的方式將中間物Q25與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.44mg/mL
藥物/mAb比：3.2
實例26a
Figure 105119613-A0202-12-0837-1641
在氬氛圍下，為5mg西妥昔單抗在0.498ml PBS中的溶液(c=10mg/mL)摻入0.029mg TCEP在0.05ml PBS緩衝液中的溶液。在室溫下將混合物攪拌30分鐘，隨後添加0.3mg(0.00023mmol)溶解於50μl DMSO中的中間物Q26。在室溫下進一步攪拌90分鐘後，用1.9ml PBS緩衝液將混合物稀釋。隨後透過經PBS緩衝液(pH 7.2)平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對此溶液進行上樣，並用PBS緩衝液(pH 7.2)溶離。隨後藉由超離心進行濃縮，以及用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：2.0mg/mL
藥物/mAb比：2.9
實例26e
以類似的方式將中間物Q26與5mg曲妥珠單抗偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.66mg/mL
藥物/mAb比：2.9
實例26k
以類似的方式將中間物Q26與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.83mg/mL
藥物/mAb比：3.4
實例27a
Figure 105119613-A0202-12-0839-1642
在氬氛圍下，為5mg西妥昔單抗在0.458ml PBS中的溶液(c=10.92mg/mL)摻入0.029mg TCEP在0.05ml PBS緩衝液中的溶液。在室溫下將混合物攪拌30分鐘，隨後添加0.26mg(0.00023mmol)溶解於50μl DMSO中的中間物Q27。在室溫下進一步攪拌90分鐘後，用1.9ml預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋。隨後透過經PBS緩衝液pH 8平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對此溶液進行上樣，並用PBS緩衝液pH 8溶離。在氬氛圍下，在室溫下將溶離液攪拌一夜。隨後藉由超離心進行濃縮，以及用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：2.02mg/mL
藥物/mAb比：3.5
實例27e
以類似的方式將中間物Q27與5mg曲妥珠單抗偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.72mg/mL
藥物/mAb比：4.2
實例27k
以類似的方式將中間物Q27與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.79mg/mL
藥物/mAb比：3.1
實例28a
Figure 105119613-A0202-12-0840-1643
在氬氛圍下，為5mg西妥昔單抗在0.458ml PBS中的溶液(c=10.92mg/mL)摻入0.029mg TCEP在0.05ml PBS緩衝液中的溶液。在室溫下將混合物攪拌30分鐘，隨後添加0.32mg(0.00023mmol)溶解於50μl DMSO中的中間物Q28。在室溫下進一步攪拌90分鐘後，用1.9ml PBS緩衝液將混合物稀釋。隨後透過經PBS緩衝液(pH 7.2)平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對此溶液進行上樣，並用PBS緩衝液(pH 7.2)溶離。隨後藉由超離心進行濃縮，以及用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：2.01mg/mL
藥物/mAb比：2.0
實例28e
以類似的方式將中間物Q28與5mg曲妥珠單抗聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.86mg/mL
藥物/mAb比：3.1
實例28k
以類似的方式將中間物Q28與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：2.03mg/mL
藥物/mAb比：2.6
實例29a
Figure 105119613-A0202-12-0841-1644
為與中間物Q29偶聯，在此採用5mg西妥昔單抗在PBS中的溶液(c=9.1mg/mL)。首先在氬氛圍下添加5當量(0.21mg)溶解於50μL DMSO中的中間物Q29，在室溫下攪拌1小時後再添加相同的量，並在室溫下將混合物再攪拌一小時。隨後用PBS緩衝液(pH 7.2)將混合物稀釋至2.5mL，透過Sephadex柱將其純化，隨後藉由超離心進行濃縮，並用PBS(pH 7.2)再稀釋。
蛋白質濃度：2.14mg/mL
藥物/mAb比：2.6
實例29e
以類似的方式將中間物Q29與5mg曲妥珠單抗偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：2.05mg/mL
藥物/mAb比：3.8
實例29k
以類似的方式將中間物Q29與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：2.09mg/mL
藥物/mAb比：3.9
實例30a
Figure 105119613-A0202-12-0842-1645
為與中間物Q30偶聯，在此採用5mg西妥昔單抗在PBS中的溶液(c=9.1mg/mL)。首先在氬氛圍下添加5當量(0.22mg)溶解於50μL DMSO中的中間物Q30，在室溫下攪拌1小時後再添加相同的量，並在室溫下將混合物再攪拌一小時。隨後用PBS緩衝液(pH 7.2)將混合物稀釋至2.5mL，透過Sephadex柱將其純化，隨後藉由超離心進行濃 縮，並用PBS(pH 7.2)再稀釋。
蛋白質濃度：2.1mg/mL
藥物/mAb比：4.5
實例30e
以類似的方式將中間物Q30與5mg曲妥珠單抗偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.96mg/mL
藥物/mAb比：5.6
實例30k
以類似的方式將中間物Q30與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：2.07mg/mL
藥物/mAb比：5.8
實例31t
Figure 105119613-A0202-12-0843-1646
為5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658(對應TPP-2090-HC-N297A)在 530μl DPBS pH 7.4中的溶液(c~10mg/mL)添加20μL中間物Q31之10mMol DMSO溶液。在37℃下培育5分鐘後，添加50μL重組細菌轉麩醯胺酸酶水溶液(產品編號T001，Zedira GmbH，達木士塔，德國)(25U/mL)，並在37℃下進一步培育24小時。隨後用DPBS pH 7.4將反應混合物稀釋至2.5mL的體積，並藉由凝膠過濾透過經DPBS平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)上樣，並用DPBS緩衝液在pH 7.4下進行溶離。隨後藉由Amicon Ultracel-30K離心(Millipore)將ADC溶液濃縮，並用DPBS再稀釋。最後再為溶液添加0.00625μmol溶解於12.5μL DPBS中的細菌轉麩醯胺酸酶阻斷劑Zedira C100。獲得之ADC溶液的特性如下：
蛋白質濃度：2.11mg/mL
藥物/mAb比：1.8
實例31t-4
Figure 105119613-A0202-12-0844-1647
為30mg抗TWEAKR抗體TPP-5442(對應TPP-2090-HC-N297Q)在DPBS pH 7.4中的溶液(c=10mg/mL)添加480μL中間物Q31之10mMol DMSO溶液。在37℃下培育5分鐘後，添加2400μL重組細菌轉麩醯胺酸酶水溶液(產品編號T001，Zedira GmbH，達木士塔，德國)(25U/mL)，並在37℃下進一步培育24小時。透過凝膠過濾層析在Superdex 200柱(GE Healthcare)上在DPBS pH 7.4中對反應混合物進行純化，以將小分子及轉麩醯胺酸酶自ADC分離。隨後藉由Amicon Ultracel-30K離心管(Millipore)將ADC溶液濃縮至約12mg/mL的最終濃度。隨後對溶液進行無菌過濾。獲得之ADC溶液的特性如下：
蛋白質濃度：12.0mg/mL
藥物/mAb比：3.8
實例32t
Figure 105119613-A0202-12-0845-1648
為5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658(對應TPP-2090-HC-N297A)在530μl DPBS pH 7.4中的溶液(c~10mg/mL)添加20μL中間物Q32之10mMol DMSO溶液。在37℃下培育5分鐘後，添加50μL重組細菌轉麩醯胺酸酶水溶液(產品編號T001，Zedira GmbH，達木士塔，德國)(25U/mL)，並在37℃下進一步培育24小時。隨後用DPBS pH 7.4將反應 混合物稀釋至2.5mL的體積，並藉由凝膠過濾透過經DPBS平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)上樣，並用DPBS緩衝液在pH 7.4下進行溶離。隨後藉由Amicon Ultracel-30K離心(Millipore)將ADC溶液濃縮，並用DPBS再稀釋。最後再為溶液添加0.00625μmol溶解於12.5μL DPBS中的細菌轉麩醯胺酸酶阻斷劑Zedira C100。獲得之ADC溶液的特性如下：
蛋白質濃度：1.8mg/mL
藥物/mAb比：2.0
實例33t
Figure 105119613-A0202-12-0846-1649
為5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658(對應TPP-2090-HC-N297A)在530μl DPBS pH 7.4中的溶液(c~10mg/mL)添加20μL中間物Q33之10mMol DMSO溶液。在37℃下培育5分鐘後，添加50μL重組細菌轉麩醯胺酸酶水溶液(產品編號T001，Zedira GmbH，達木士塔，德國)(25U/mL)，並在37℃下進一步培育24小時。隨後用DPBS pH 7.4將反應混合物稀釋至2.5mL的體積，並藉由凝膠過濾透過經DPBS平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)上樣，並用DPBS緩衝液在pH 7.4下進行溶離。隨後藉由Amicon Ultracel-30K離心(Millipore)將ADC溶液濃縮，並用DPBS再稀釋。最後再為溶液添加0.00625μmol溶解於12.5μL DPBS中的細菌轉麩醯胺酸酶阻斷劑Zedira C100。獲得之ADC溶液的特性如下：
蛋白質濃度：1.68mg/mL
藥物/mAb比：1.9
實例34t
Figure 105119613-A0202-12-0847-1650
為5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658(對應TPP-2090-HC-N297A)在530μl DPBS pH 7.4中的溶液(c~10mg/mL)添加20μL中間物Q34之10mMol DMSO溶液。在37℃下培育5分鐘後，添加50μL重組細菌轉麩醯胺酸酶水溶液(產品編號T001，Zedira GmbH，達木士塔，德國)(25U/mL)，並在37℃下進一步培育24小時。隨後用DPBS pH 7.4將反應混合物稀釋至2.5mL的體積，並藉由凝膠過濾透過經DPBS平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)上樣，並用DPBS緩衝液在pH 7.4下進行溶離。隨後藉由Amicon Ultracel-30K離心(Millipore)將ADC溶液濃縮，並用DPBS再稀釋。最後再為溶液添加0.00625μmol溶解於 12.5μL DPBS中的細菌轉麩醯胺酸酶阻斷劑Zedira C100。獲得之ADC溶液的特性如下：
蛋白質濃度：1.73mg/mL
藥物/mAb比：1.8
實例34t-4
Figure 105119613-A0202-12-0848-1651
為5mg抗TWEAKR抗體TPP-5442(對應TPP-2090-HC-N297Q)在DPBS pH 7.4中的溶液(c=7.4mg/mL)添加83μL中間物Q34之10mMol DMSO溶液。在37℃下培育5分鐘後，添加400μL重組細菌轉麩醯胺酸酶水溶液(產品編號T001，Zedira GmbH，達木士塔，德國)(25U/mL)，並在37℃下進一步培育24小時。隨後用DPBS pH 7.4將反應混合物稀釋至2.5mL的總體積，並透過凝膠過濾藉由經DPBS平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)上樣，並用DPBS緩衝液在pH 7.4下進行溶離。隨後藉由Amicon Ultracel-30K離心(Millipore)將ADC溶液濃縮，並用DPBS再稀釋至約2.5mL的體積。最後再為溶液添加0.1μmol溶解於200μL DPBS中的細菌轉麩醯胺酸酶阻斷劑Zedira C100。獲得之ADC溶液的特性如下：
蛋白質濃度：1.76mg/mL
藥物/mAb比：3.9
實例34te-4
Figure 105119613-A0202-12-0849-1652
以與實例34t-4類似的方式，亦採用TPP-7511(對應曲妥珠單抗-HC-N297Q)並對其進行偶聯。獲得之ADC溶液的特性如下：
蛋白質濃度：1.56mg/mL
藥物/mAb比：3.9
實例35a
Figure 105119613-A0202-12-0850-1653
在氬氛圍下，為5mg西妥昔單抗在0.5ml PBS中的溶液(c=10mg/mL)摻入0.029mg TCEP在0.05ml PBS緩衝液中的溶液。在室溫下將混合物攪拌30分鐘，隨後添加0.28mg(0.00023mmol)溶解於50μl DMSO中的中間物Q35。在室溫下進一步攪拌90分鐘後，用預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋至2.5mL的體積。隨後透過經PBS緩衝液pH 8平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對此溶液進行上樣，並用PBS緩衝液pH 8溶離。在氬氛圍下，在室溫下將溶離液攪拌一夜。
隨後藉由超離心將此溶液濃縮，以及用PBS緩衝液(pH 7.2)將其再稀釋。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.94mg/mL
藥物/mAb比：3.3
實例35e
以類似的方式將中間物Q35與5mg曲妥珠單抗偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.89mg/mL
藥物/mAb比：3.5
實例35k
以類似的方式將中間物Q35與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.78mg/mL
藥物/mAb比：3.5
實例36a
Figure 105119613-A0202-12-0851-1654
在氬氛圍下，為5mg西妥昔單抗在0.5ml PBS中的溶液(c=10mg/mL)摻入0.029mg TCEP在0.05ml PBS緩衝液中的溶液。在室溫下將混合物攪拌30分鐘，隨後添加0.26mg(0.00023mmol)溶解於50μl DMSO中的中間物Q36。在室溫下進一步攪拌90分鐘後，用預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋至2.5mL的體積。隨後透過經PBS緩衝液pH 8平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對此溶液進行上樣，並用PBS緩衝液pH 8溶離。在氬氛圍下，在室溫下將溶離液攪拌一夜。
隨後藉由超離心將此溶液濃縮，以及用PBS緩衝液(pH 7.2)將其 再稀釋。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：2.0mg/mL
藥物/mAb比：3.2
實例36e
以類似的方式將中間物Q36與5mg曲妥珠單抗偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.84mg/mL
藥物/mAb比：3.6
實例36k
以類似的方式將中間物Q36與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.75mg/mL
藥物/mAb比：3.4
實例37a
Figure 105119613-A0202-12-0852-1655
在氬氛圍下為5mg西妥昔單抗在0.5ml PBS中的溶液(c=10 mg/mL)摻入5當量(0.2mg)中間物Q37在50μL DMSO中的溶液，在室溫下攪拌1小時後再添加相同的量，並在室溫下將混合物再攪拌一小時。隨後用PBS緩衝液(pH 7.2)將混合物稀釋至2.5mL，透過Sephadex柱將其純化，隨後藉由超離心進行濃縮，並用PBS(pH 7.2)再稀釋。
蛋白質濃度：2.2mg/mL
藥物/mAb比：4.1
實例37e
以類似的方式將中間物Q37與5mg曲妥珠單抗偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.64mg/mL
藥物/mAb比：4.5
實例37k
以類似的方式將中間物Q37與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.6mg/mL
藥物/mAb比：6.2
實例38a
Figure 105119613-A0202-12-0854-1656
在氬氛圍下，為5mg西妥昔單抗在0.458ml PBS中的溶液(c=11mg/mL)摻入0.029mg TCEP在0.05ml PBS緩衝液中的溶液。在室溫下將混合物攪拌30分鐘，隨後添加0.26mg(0.00023mmol)溶解於50μl DMSO中的中間物Q38。在室溫下進一步攪拌90分鐘後，用預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋至2.5mL的體積。隨後透過經PBS緩衝液pH 8平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對此溶液進行上樣，並用PBS緩衝液pH 8溶離。在氬氛圍下，在室溫下將溶離液攪拌一夜。
隨後藉由超離心將此溶液濃縮，以及用PBS緩衝液(pH 7.2)將其再稀釋。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.94mg/mL
藥物/mAb比：2.9
實例38e
以類似的方式將中間物Q38與5mg曲妥珠單抗偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.82mg/mL
藥物/mAb比：3.5
實例38k
以類似的方式將中間物Q38與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：2.01mg/mL
藥物/mAb比：3.3
實例39a
Figure 105119613-A0202-12-0855-1657
在氬氛圍下，為5mg西妥昔單抗在0.5ml PBS中的溶液(c=10mg/mL)摻入0.029mg TCEP在0.05ml PBS緩衝液中的溶液。在室溫下將混合物攪拌30分鐘，隨後添加0.23mg(0.00023mmol)溶解於50μl DMSO中的中間物Q39。在室溫下進一步攪拌90分鐘後，用1.9ml預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋。隨後透過經PBS緩衝液pH 8平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對此溶液進行上樣，並用PBS緩衝液pH 8溶離。在氬氛圍下，在室溫下將溶離液攪拌一夜。隨後藉由超離心進行濃縮，以及用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。 獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.97mg/mL
藥物/mAb比：2.8
實例39e
以類似的方式將中間物Q39與5mg曲妥珠單抗偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.77mg/mL
藥物/mAb比：3.3
實例39k
以類似的方式將中間物Q39與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.74mg/mL
藥物/mAb比：3.4
實例40a
Figure 105119613-A0202-12-0856-1658
在氬氛圍下，為5mg西妥昔單抗在0.5ml PBS中的溶液(c=10mg/mL)摻入0.029mg TCEP在0.05ml PBS緩衝液中的溶液。在室溫下 將混合物攪拌30分鐘，隨後添加0.26mg(0.00023mmol)溶解於50μl DMSO中的中間物Q40。在室溫下進一步攪拌90分鐘後，用預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋至2.5mL的體積。隨後透過經PBS緩衝液pH 8平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對此溶液進行上樣，並用PBS緩衝液pH 8溶離。在氬氛圍下，在室溫下將溶離液攪拌一夜。
隨後藉由超離心將此溶液濃縮，以及用PBS緩衝液(pH 7.2)將其再稀釋。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.95mg/mL
藥物/mAb比：2.4
實例40e
以類似的方式將中間物Q40與5mg曲妥珠單抗偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.84mg/mL
藥物/mAb比：2.9
實例40k
以類似的方式將中間物Q40與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.93mg/mL
藥物/mAb比：3.0
實例41a
Figure 105119613-A0202-12-0858-1659
在氬氛圍下，為5mg西妥昔單抗在0.458ml PBS中的溶液(c=10.9mg/mL)摻入0.029mg TCEP在0.05ml PBS緩衝液中的溶液。在室溫下將混合物攪拌30分鐘，隨後添加0.308mg(0.00023mmol)溶解於50μl DMSO中的中間物Q41。在室溫下進一步攪拌90分鐘後，用PBS緩衝液將混合物稀釋至2.5mL的體積。隨後藉由PD 10-柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)對此溶液進行純化。隨後藉由超離心將此溶液濃縮，以及用PBS緩衝液將其再稀釋。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：2.26mg/mL
藥物/mAb比：3.9
實例41e
以類似的方式將中間物Q41與5mg曲妥珠單抗偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：2.0mg/mL
藥物/mAb比：4.3
實例41k
以類似的方式將中間物Q41與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：2.15mg/mL
藥物/mAb比：4.0
實例42a
Figure 105119613-A0202-12-0859-1660
在氬氛圍下，為5mg西妥昔單抗在0.458ml PBS中的溶液(c=10.9mg/mL)摻入0.029mg TCEP在0.05ml PBS緩衝液中的溶液。在室溫下將混合物攪拌30分鐘，隨後添加0.263mg(0.00023mmol)溶解於50μl DMSO中的中間物Q42。在室溫下進一步攪拌90分鐘後，用預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋至2.5mL的體積。隨後透過經PBS緩衝液pH 8平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對此溶液進行上樣，並用PBS緩衝液pH 8溶離。在氬氛圍下，在室溫下將溶離液攪拌一夜。
隨後藉由超離心將此溶液濃縮，以及用PBS緩衝液(pH 7.2)將其再稀釋。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：0.93mg/mL
藥物/mAb比：3.5
實例42e
以類似的方式將中間物Q42與5mg曲妥珠單抗偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：0.53mg/mL
藥物/mAb比：4.2
實例42k
以類似的方式將中間物Q42與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：0.88mg/mL
藥物/mAb比：3.7
實例43a
Figure 105119613-A0202-12-0860-1661
在氬氛圍下，為5mg西妥昔單抗在0.458ml PBS中的溶液(c=10.9mg/mL)摻入0.029mg TCEP在0.05ml PBS緩衝液中的溶液。在室溫下 將混合物攪拌30分鐘，隨後添加0.27mg(0.00023mmol)溶解於50μl DMSO中的中間物Q43。在室溫下進一步攪拌90分鐘後，用預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋至2.5mL的體積。隨後透過經PBS緩衝液pH 8平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對此溶液進行上樣，並用PBS緩衝液pH 8溶離。在氬氛圍下，在室溫下將溶離液攪拌一夜。
隨後藉由超離心將此溶液濃縮，以及用PBS緩衝液(pH 7.2)將其再稀釋。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.91mg/mL
藥物/mAb比：2.6
實例43e
以類似的方式將中間物Q43與5mg曲妥珠單抗偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.56mg/mL
藥物/mAb比：3.6
實例43k
以類似的方式將中間物Q43與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.89mg/mL
藥物/mAb比：3.6
實例44a
Figure 105119613-A0202-12-0862-1662
在氬氛圍下，為5mg西妥昔單抗在0.458ml PBS中的溶液(c=10.9mg/mL)摻入0.029mg TCEP在0.05ml PBS緩衝液中的溶液。在室溫下將混合物攪拌30分鐘，隨後添加0.29mg(0.00023mmol)溶解於50μl DMSO中的中間物Q44。在室溫下進一步攪拌90分鐘後，用預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋至2.5mL的體積。隨後透過經PBS緩衝液pH 8平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對此溶液進行上樣，並用PBS緩衝液pH 8溶離。在氬氛圍下，在室溫下將溶離液攪拌一夜。
隨後藉由超離心將此溶液濃縮，以及用PBS緩衝液(pH 7.2)將其再稀釋。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.82mg/mL
藥物/mAb比：2.6
實例44e
以類似的方式將中間物Q44與5mg曲妥珠單抗偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.79mg/mL
藥物/mAb比：3.4
實例44k
以類似的方式將中間物Q44與5mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.72mg/mL
藥物/mAb比：3.7
C：對生物效果的評估
可透過下文描述之檢定來揭示本發明之化合物的生物作用：
a)C-1a 確定ADC之細胞毒作用
在各種細胞株上對ADC之細胞毒作用進行分析：
NCI-H292：人類黏液表皮樣肺癌細胞，ATCC-CRL-1848，標準培養基：RPMI 1640(Biochrom；#FG1215，穩定麩醯胺酸)+10% FCS(Sigma #F2442)，TWEAKR陽性；EGFR陽性。
BxPC3：人類胰腺癌細胞，ATCC-CRL-1687，標準培養基：RPMI 1640(Biochrom；#FG1215，穩定麩醯胺酸)+10% FCS(Sigma #F2442)，TWEAKR陽性
LoVo人類結腸直腸癌細胞，ATCC No.CCL-229，針對MTT檢定的培養：標準培養基：Kaighn's+L-麩醯胺酸(Invitrogen 21127)+10%熱不活化FCS(Gibco公司，No.10500-064)。針對CTG檢定的培養：RPMI 1640(Biochrom；#FG1215，穩定麩醯胺酸)+10% FCS(Sigma #F2442)。TWEAKR陽性。
KPL4：人類乳腺癌細胞株，Bayer Pharma AG(於2012年7月19日在DSMZ經過識別檢查及確認)，標準培養基：RPMI 1640(Gibco公司；#21875-059，穩定L-麩醯胺酸)+10%熱不活化FCS(Gibco公司，No.10500-064)；HER2陽性。
SK-HEP-1：人類肝癌細胞株，ATCC No.HTB-52，標準培養 基：包含Earle's鹽之MEM+Glutamax I(Invitrogen 41090)+10%熱不活化FCS(Gibco公司，No.10500-064)；EGFR-陽性，TWEAKR陽性
按照American Tissue Culture Collection(ATCC)就相應細胞株給出的標準方法培養細胞。
CTG檢定
按照標準方法，用C-1下給出的生長培養基培養細胞。為進行培養，用胰蛋白酶(0.05%)及EDTA(0.02%)在PBS(Biochrom AG #L2143)中的溶液將細胞洗脫，將其成團，在培養基中再懸浮，對其進行計數，將其種入一具有白色底部的96孔培養板(Costar #3610)(75μl/孔，每孔之細胞數如下：NCI-H292：2500細胞/孔，BxPC3 2500細胞/孔，LoVo 3000細胞/孔)，並在培育箱中在37℃及5%二氧化碳的條件下進行培育。在24小時後，將溶解於25μl培養基中之抗體-活性物質共軛物(四倍濃縮)加至細胞，使得細胞上之抗體-活性物質共軛物的最終濃度為3 x 10-7M至3 x 10-11M(三份)。隨後在培育箱中在37℃及5%二氧化碳的條件下對細胞進行培育。在一平行的板中，藉由Cell Titer Glow(CTG)發光細胞存活檢定(Promega #G7573及#G7571)確定活性物質治療開始時(第0日)的細胞活力。為此，針對每個細胞混合物添加100μl基質，隨後用鋁箔將板覆蓋，並用板振盪器以180rpm振盪2分鐘，在試驗台上靜置8分鐘，隨後用照度計(Victor X2，Perkin Elmer)進行量測。基質對存活細胞中之ATP含量進行檢測，其中產生發光訊號，其大小與細胞活力成比例。在藉由抗體-活性物質共軛物培育72小時後，亦如上文所述藉由Cell Titer Glow發光細胞存活檢定確定此等細胞中之活力。根據測得之資料，使用DRC(Dose Response Curve，劑量感應曲線)分析試算表依據4參數適配計算出與第0日相比之生長抑制的IC50。DRC分析試算表係由Bayer Pharma AG及Bayer Business Services在IDBS E-WorkBook Suite平台上開發的Biobook試算 表(IDBS：ID Business Solutions Ltd.，基爾德福，英國)。
下表1a中列出了根據此檢定確定的代表性實施例之IC50值：
Figure 105119613-A0202-12-0865-1663
Figure 105119613-A0202-12-0866-1664
列出之效果資料係基於本發明之實驗部分描述的實施例以及所給出之藥物/mAB比。在藥物/mAB比不同的情況下，此等值亦可能不同。IC50值係多個獨立實驗之平均值，或者為單次值。針對包含相應連接子及毒性基團之同型對照，抗體-活性物質共軛物之效果具選擇性。
作為參考化合物，以與實例1k類似的方式將中間物Q1之D-天冬醯胺差向異構體與抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。
實例1k之對照實例
Figure 105119613-A0202-12-0866-1665
在此，以與實例1k類似的方式，將Q1之D-天冬醯胺差向異構體與60mg抗TWEAKR抗體TPP-2658偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：11.56mg/mL
藥物/mAb比：3.6
如表1a所示，此對照ADC在3個細胞株上無明顯的細胞毒作用。
MTT檢定
按照標準方法，用C-1下給出的生長培養基培養細胞。為進行培養，用細胞消化液在PBS(Biochrom AG公司#L2143)中的溶液將細胞洗脫，將其成團，在培養基中再懸浮，對其進行計數，並將其種入一具有白色底部的96孔培養板(Costar公司#3610)(NCI H292：2500細胞/孔；SK-HEP-1：1000細胞/孔；KPL-4：1200細胞/孔；100μL總體積)。隨後在培育箱中在37℃及5%二氧化碳的條件下對細胞進行培育。在48小時後更換培養基。隨後將溶解於10μl培養基中的抗體-活性物質共軛物(濃度10-5M至10-13M)吸移至細胞(三份)，隨後在培育箱中在37℃及5%二氧化碳的條件下對混合物進行培育。在96小時後，藉由MTT檢定(ATCC，馬納沙斯，維吉尼亞，美國，目錄號30-1010K)對細胞增殖進行偵測。為此，用細胞將MTT試劑培育4小時，隨後透過添加清潔劑對細胞進行一夜的細胞溶解。在570nm(Infinite M1000 pro，Tecan公司)下對形成的色素進行偵測。根據測得之資料，使用DRC(Dose Response Curve，劑量感應曲線)計算出生長抑制的IC50。將不採用試驗物質，其餘處理方式相同的細胞的增殖定義為值100%。
下表1b中列出了根據此檢定確定的代表性實施例之IC50值：
Figure 105119613-A0202-12-0867-1666
Figure 105119613-A0202-12-0868-1667
Figure 105119613-A0202-12-0868-1668
Figure 105119613-A0202-12-0869-1669
列出之效果資料係基於本發明之實驗部分描述的實施例以及所給出之藥物/mAB比。在藥物/mAB比不同的情況下，此等值亦可能不同。IC50值係多個獨立試驗之平均值，或者為單次值。針對包含相應連接子及毒性基團之同型對照，抗體-活性物質共軛物之效果具選擇性。
在此，以與實例1e類似的方式，將Q1之D-天冬醯胺差向異構體與5mg曲妥珠單抗偶聯。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：1.68mg/mL
藥物/mAb比：3.6
如表1c所示，此對照ADC在KPL4細胞株上亦無明顯的細胞毒作用。
C-1b 透過選擇的實例確定紡錘體驅動蛋白的抑制
在室溫下在15mM PIPES，pH 6.8(5mM MgCl2及10mM DTT，Sigma公司)中，在濃度為10nM的經50μg/ml紫杉醇(Sigma公司No.T7191-5MG)穩定化的微小管(牛或豬，tebu-bio/Cytoskeleton Inc公司)中對人類紡錘體驅動蛋白KSP/Eg5(tebu-bio/Cytoskeleton Inc公司，No.027EG01-XL)之馬達結構域進行培育。將新製備的混合物置於384 MTP(Corning公司)中。隨後添加待研究之抑制劑(濃度1.0x10-6M至1.0x10-13M)以及ATP(最終濃度500μM；Sigma公司)。在室溫下培育2小時。藉由驗證產生的無機磷酸鹽，透過孔雀綠(Biomol公司)偵測ATP酶活性。添加試劑後，在室溫下培育50分鐘，隨後在620nm的波長下對吸收進行偵測。將Monastrol(Sigma公司，M8515-1mg)及Ispinesib(AdooQ Bioscience公司，A10486)用作陽性對照。劑量效應曲線之各資料為八倍。IC50值係兩個獨立實驗之平均值。將未經抑制劑處理的試樣用作100%對照。
下表2中整合了根據所述檢定確定的代表性實施例的IC50值以及對應的細胞毒性資料(MTT檢定)：
Figure 105119613-A0202-12-0870-1670
Figure 105119613-A0202-12-0871-1671
列出之效果資料係基於本發明之實驗部分描述的實施例。
C-1c 酶檢定 a：組織蛋白酶B檢定
針對每個待研究之可透過組織蛋白酶B裂解的前藥，將混合物置於一微試管(0.5ml，Eppendorf公司)中。在此採用的酶係自人類肝臟組織獲取。準備2μg組織蛋白酶B(Sigma C8571 25μg)，並用50mM磷酸鈉緩衝液(pH 6.0)、2mM DTT填充至200μL的總體積。隨後吸移50μL待研究之基質溶液。在加熱塊中(Thermo Fisher Scientific公司)中，在40℃下在300rpm的穩定振盪下對混合物進行培育。對酶反應進行動態控制。為此，在不同的時間點上提取10μL試樣。立即為提取的試樣摻入20μL冰冷的甲醇，以使酶反應停止，隨後在-20℃下進行凍結。選擇的用於試樣提取的時間點為10分鐘後、2小時後、4小時後及24小時後。對RP-HPLC分析進行研究(逆相HPLC，Agilent Technologies公司1200er系列)。藉由確定釋放的毒性基團，確定酶反應之半衰期t1/2。
b：豆蛋白酶檢定
藉由重組人類酶執行豆蛋白酶檢定。在50mM乙酸鈉緩衝液/100mM NaCl(pH 4.0)中將rhLegumain酶溶液(目錄# 2199-CY，R&D Systems)稀釋至期望的濃度，並在37℃下預培育2小時，隨後在50mM MES緩衝液及250mM NaCl(pH 5.0)中將rhLegumain調節至最終濃度1ng/μL。針對每個待研究之可透過豆蛋白酶裂解的前藥，將混合物置於一微試管(0.5ml，Eppendorf公司)中。為此，用50mM MES緩衝液及250mM NaCl(pH 5.0)將基質溶液調節至期望濃度(2倍濃縮)。為對酶反應進行動態量測，首先準備250μL豆蛋白酶溶液，並透過添加250μL基質溶液(最終濃度單倍濃縮)開始酶反應。在不同的時間點上分別提取50μL試樣。立即為此等試樣摻入100μL冰冷的甲醇，以使酶反應停止，隨後在-20℃下進行凍結。選擇的用於試樣提取的時間點為0.5小時後、1小時後、3小時後及24小時後。隨後藉由RP-HPLC分析及LC-MS分析對試樣進行研究。藉由確定釋放的毒性基團，確定酶反應之半衰期t1/2。
作為用於揭示經豆蛋白酶促進之裂解的代表性實例，在豆蛋白酶檢定中製備模型化合物A及B作為基質。
參考示例模型化合物A N-(吡啶-4-基乙醯基)-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-(甲基胺基)-1-氧代丁烷-2-基]-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0872-2624
首先如WO 2015096982 A1所述製備三氟乙酸--(2S)-2-胺基-4- [{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-甲基丁醯胺(1：1)隨後在DMF中在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下將此中間物與中間物L103偶聯，藉此製備目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(ESIpos)：m/z=902[M+H]+。
參考實例模型化合物B N-(吡啶-4-基乙醯基)-L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺醯基-N1-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-(甲基胺基)-1-氧代丁烷-2-基]-L-天冬醯胺
Figure 105119613-A0202-12-0873-2625
首先如WO 2015096982 A1所述製備三氟乙酸(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-甲基丁醯胺(1：1)。隨後在DMF中在有HATU及N,N-二異丙基乙胺的情況下將此中間物與中間物L119偶聯，藉此製備目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.83min；MS(ESIpos)：m/z=916[M+H]+。
在上述條件下，藉由豆蛋白酶以1.1小時的半衰期將化合物A裂解 成目標化合物。
Figure 105119613-A0202-12-0874-1674
C-2 內化檢定
內化係透過抗體-藥物共軛物(ADC)在抗原表現癌細胞中特異且高效實現細胞毒性酬載的關鍵過程。透過特異性抗體及同型對照抗體之螢光標記對此過程進行跟蹤。為此，首先將螢光色素與抗體之離胺酸軛合。在pH 8.3下，藉由兩倍莫耳過剩的CypHer 5E mono NHS ester(Batch 357392，GE Healthcare)進行軛合。在偶聯完畢後，以凝膠層析的方式將反應混合物純化(Zeba Spin Desalting Columns，40K，Thermo Scientific公司，No.87768；溶離緩衝液：DULBECCO′S PBS，Sima-Aldrich公司，No.D8537)，以將過剩的色素排除以及對pH值進行調節。藉由VIVASPIN 500柱(Sartorius stedim biotec公司)將蛋白質溶液濃縮。藉由分光光度分析(NanoDrop公司)及隨後之計算(D/P=A染料 ε蛋白質：(A280-0.16A染料)ε染料)確定抗體之染料負荷。
此處研究之抗體以及同型對照之染料負荷處於相似的數量級。在細胞結合檢定中，確定偶聯不導致抗體之親和性變化。
將經標記之抗體應用於內化檢定。在處理開始前，將100μL培養基中之細胞(2x104/孔)種在96-MTP中(寬型，黑色，透明底部，No 4308776，Applied Biosystems公司)。在37℃/5% CO2條件下培育18小 時後，更換培養基，並以不同的濃度添加經標記之抗體(10，5，2.5，1，0.1μg/mL)。對經標記之同型對照(陰性對照)進行相同的處理。選擇的培育時間為0小時、0.25小時、0.5小時、1小時、1.5小時、2小時、3小時、6小時及24小時。藉由InCellAnalyzer 1000(GE Healthcare公司)進行螢光量測。透過量測顆粒數/細胞(granule counts/cell)及總顆粒強度/細胞(totale granule intensity/cell)參數進行動態評估。
在與受體結合後，對抗體之內化能力進行研究。為此，選擇具不同受體表現級的細胞。可以發現藉由抗體實現的經靶促進的特異性內化，而同型對照則不呈現內化。
C-3 用於確定細胞通透性的體外試驗
可藉由體外試驗，在通量檢定中使用Caco-2細胞對細胞通透性進行研究[M.D.Troutman與D.R.Thakker,Pharm.Res.20(8),1210-1224(2003)]。為此，在24孔過濾板上將細胞培育15-16日。為確定通透性，將溶解於HEPES緩衝液中的相應試驗物質以頂部(A)或基部(B)的方式加至細胞，並培育2小時。在0小時及2小時後，自順式及反式區室提取試樣。藉由HPLC(Agilent 1200，伯布林根，德國)使用逆相柱將試樣分離。透過Turbo Ion Spray介面將HPLC系統與三四極質譜儀API 4000(AB SCIEX Deutschland GmbH，達木士塔，德國)耦合。根據用由Schwab等人公佈之式[D.Schwab等人，J.Med.Chem.46,1716-1725(2003)]計算出的Papp值對通透性進行評估。在Papp(B-A)與Papp(A-B)之比例(外排比率)>2或<0.5的情況下，將物質歸類為主動輸送。
對胞內釋放之毒性基團而言，自B向A之通透性[Papp(B-A)]以及Papp(B-A)與Papp(A-B)之比例(外排比率)有重要意義：此通透性愈低，物質之穿過Caco-2細胞之單層的主動及被動輸送過程便愈緩慢。若外排比率不對應主動輸送，則物質在胞內釋放後能夠較長時間地停 留在細胞內。藉此，可供與生化靶(在此為紡錘體驅動蛋白，KSP/Eg5)交互作用的時間亦有所增加。
下表3中列出了根據此檢定確定的代表性實施例之通透性資料：
Figure 105119613-A0202-12-0876-1675
C-4 用於確定針對P-糖蛋白(P-gp)之基質特性的體外試驗
許多腫瘤細胞表現針對活性物質的轉運蛋白，其常伴隨與細胞生長抑制相對的抗性發展。因此，非此類轉運蛋白(例如P-糖蛋白(P-gp)或BCRP)之基質的物質能夠呈現較佳之效果曲線。
藉由通量檢定，使用過表現P-gp的LLC-PK1細胞(L-MDR1細胞)來確定物質針對P-gp(ABCB1)的基質特性[A.H.Schinkel等人，J.Clin.Invest.96,1698-1705(1995)]。為此，在96孔過濾板上將LLC-PK1或L-MDR1細胞培育3-4日。為確定通透性，在有抑制劑(例如Ivermectin 或Verapamil)的情況下或單獨將溶解於HEPES緩衝液中的相應試驗物質以頂部(A)或基部(B)的方式加至細胞，並培育2小時。在0小時及2小時後，自順式及反式區室提取試樣。藉由HPLC使用逆相柱將試樣分離。透過Turbo Ion Spray介面將HPLC系統與三四極質譜儀API 3000(Applied Biosystems Applera，達木士塔，德國)耦合。根據用由Schwab等人公佈之式[D.Schwab等人，J.Med.Chem.46,1716-1725(2003)]計算出的Papp值對通透性進行評估。在Papp(B-A)與Papp(A-B)之比例(外排比率)>2的情況下，將物質歸類為P-gp基質。
亦可對L-MDR1及LLC-PK1細胞中的外排比例，或者有/無抑制劑的情況下的外排比例進行對比，以作為評估P-gp基質特性的準則。在此等值的差異係數大於2的情況下，相應物質為P-gp基質。
C-5 藥物動力學 C5a：在體外內化後識別ADC代謝物 方法描述
藉由抗體共軛物進行內化研究，以對胞內產生之代謝物進行分析。為此，將人類肺腫瘤細胞NCI H292(3x105/孔)種入6孔板，並培育一夜(37℃，5% CO2)。用10μg/mL(66nM)待研究之ADC進行處理。在37℃及5% CO2條件下進行內化。在不同的時間點上(0，4，24，48，72小時)提取細胞試樣，以作進一步分析。首先提取上澄液(約5mL)，並在離心(2分鐘，室溫，1000rpm，Heraeus Variofuge 3.0R)完畢後放置於-80℃下。用PBS洗滌細胞，用細胞消化液將其洗脫，並確定細胞數。在再次洗滌後，為定義的細胞數(2x105)摻入100mL溶胞緩衝液(Mammalian Cell Lysis Kit，Sigma MCL1)，並在蛋白質LoBind試管(eppendorf，目錄號0030 108.116)中在穩定振盪下(Thermomixer，15分鐘，4℃，650rpm)進行培育。在培育後對溶胞產物進行離心(10分鐘，4℃，12000g，eppendorf 5415R)，並提取上澄 液。將獲得之上澄液置於-80℃下。隨後對所有試樣作以下分析。
在藉由甲醇或乙腈將蛋白質沈澱後，以與三四極質譜儀(MS)耦合的方式，透過高壓液相層析(HPLC)對培養上澄液或細胞溶胞產物進行量測。
為處理50μL培養上澄液/細胞溶胞液，為其摻入150μL沈澱劑(通常為乙腈)，並將其振盪10秒。沈澱劑包含具適宜濃度(通常為20-100ng/mL)的內標物(ISTD)。在16000g條件下離心3分鐘後，將上澄液移入自動上樣瓶，用500μL與溶離劑匹配的緩衝液進行填充，並重新振盪。
最後，在與HPLC耦合的三四極質譜儀API6500(AB SCIEX Deutschland GmbH公司)上對兩個基質試樣進行量測。
為進行校準，摻入濃度為0.5-2000μg/L的血漿試樣。定量限(LOQ)約為2μg/L。線性範圍為2至1000μg/L。
為對腫瘤試樣進行校準，摻入濃度為0.5-200μg/L的未經治療之腫瘤的上澄液。定量限為4μg/L。線性範圍為4至200μg/L。
用於有效性校驗的品質管制包含5及50μg/L。
C5b：識別活體內之ADC代謝物
在活體內投予3-30mg/kg不同ADC後，可對ADC之血藥濃度及腫瘤濃度，以及潛在出現之代謝物進行量測，並計算出藥物動力參數，如清除率(CL)、曲線下面積(AUC)及半衰期(t1/2)。
製備包含具不可裂解連接子之激發抗體TPP-265的ADC，作為參考實例(R10k)。
參考實例R10k
Figure 105119613-A0202-12-0879-1676
在氬氛圍下為150mg抗TWEAKR抗體TPP-2658在10.5mL PBS中的溶液(c=14.28mg/mL)摻入0.86mg TCEP在2ml PBS緩衝液中的溶液。對抗體TPP-2658及其製備的詳細描述參閱WO 2015/189143 A1。
在室溫下將混合物攪拌30分鐘，隨後添加6.63mg(0.008mmol)溶解於1250μl DMSO中的中間物F104。在室溫下進一步攪拌90分鐘後，用1250μl預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋。
隨後透過經PBS緩衝液pH 8平衡的PD 10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)對此溶液進行上樣，並用PBS緩衝液pH 8溶離。用PBS緩衝液pH 8將溶離液稀釋至22.5ml的總體積。在氬氛圍下在室溫下將此溶液攪拌一夜，隨後藉由PD-10柱重新緩衝至pH 7.2。隨後藉由超離心進行濃縮，用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋，並重新濃縮。獲得之ADC的特性如下：
蛋白質濃度：14.06mg/mL
藥物/mAb比：3.4
用於將潛在出現之代謝物定量的分析
在藉由甲醇或乙腈將蛋白質沈澱後，以與三四極質譜儀(MS)耦合的方式，透過高壓液相層析(HPLC)對腫瘤及組織中之化合物進行 量測。
在處理腫瘤或組織時，為其摻入3倍量的提取緩衝液。該提取緩衝液包含50mL組織蛋白提取試劑(Pierce，洛克福，伊利諾)、兩片Complete-Protease-Inhibitor-Cocktail(Roche Diagnostics GmbH，曼汗，德國)，以及苯甲基磺醯氟(Sigma，聖路易，密蘇里)，最終濃度1mM。在Tissuelyser II(Qiagen)中，在最大速率下將試樣均勻化兩次，每次20分鐘。將50μL均質物移入自動上樣瓶，並用包含ISTD的150μL甲醇進行填充。在16000g條件下離心3分鐘後，用180μl與溶離劑匹配的緩衝液對10μL上澄液進行填充，並重新振盪。隨後腫瘤試樣便可供量測。
最後，在與HPLC耦合的三四極質譜儀API6500(AB SCIEX Deutschland GmbH公司)上對兩個基質試樣進行量測。
為對腫瘤及組織試樣進行校準，摻入濃度為0.5-200μg/L的未經治療之腫瘤或組織的上澄液。定量限為3μg/L。線性範圍為3至200μg/L。
用於有效性校驗的品質管制包含5及50μg/L，在血漿中還包括500μg/L。
表：在投予10mg/kg實例1k*(n=3)中之ADC以及10mg/kg參考實例R10k(n=2)中之ADC後，NCI H292異體移植鼠腫瘤、肝臟及腎臟中之分解代謝物濃度。兩種情形下測得之分解代謝物皆為：M26。
Figure 105119613-A0202-12-0880-1677
在投予本發明之實例1k*中的包含可豆蛋白酶裂解之前藥殘基的 ADC後，與投予包含相同抗體但無可豆蛋白酶裂解之前藥殘基的ADC後的情形相比，在腫瘤中測得之活性分解代謝物M26的濃度相似。而與投予參考ADC R10k後的情形相比，特別是在肝臟中，投予實例1k*中之ADC後，測得之活性代謝物的濃度低得多。在活性物質上採用可豆蛋白酶裂解之前藥殘基的情況下，與其他器官相比，目標組織(腫瘤)上的活性物質釋放的選擇性顯著提昇。
用於將使用之抗體定量的分析
藉由配體結合檢定(ELISA)，以血漿試樣及腫瘤溶胞產物中之總IgG濃度的形式確定ADC的抗體部分。其中使用夾層式ELISA形式。針對血漿及腫瘤試樣中之測定，此ELISA已經過認證及批准。為ELISA板塗覆山羊之抗人類IgG-Fc抗體。在用試樣培育後，對板進行洗滌，並用由猴之抗人類IgG(H+L)抗體與辣根過氧化酶(HRP)構成之檢測物共軛物進行培育。在另一洗滌步驟後，添加HRP基質OPD，並在490nm波長下透過吸收對顯色進行跟蹤。藉由4參數方程式對IgG濃度已知的標準試樣進行匹配。在下定量限(LLOQ)與上定量限(ULOQ)內，透過內插測定未知濃度。
C-6 活體內之效果試驗
在活體內例如藉由異種移植模型對本發明之共軛物的效果進行檢驗。先前技術中可用於檢驗本發明之化合物的效果的方法已為本領域技術人員所知(例如參閱WO 2005/081711；Polson等人，Cancer Res.2009 Mar 15；69(6)：2358-64)。為此，例如為嚙齒類(例如小鼠)接種表現結合劑之靶分子的腫瘤細胞株。隨後為經接種之動物投予本發明之共軛物、同型抗體對照共軛物或對照抗體，或者等張鹽溶液。一次性或更頻繁地進行投藥。在數日的培育時間後，以將經共軛物治療之動物與對照組對比的方式確定腫瘤尺寸。經共軛物治療之動物的腫瘤尺寸相對較小。
C-6a. 小鼠內之實驗性腫瘤的生長抑制/消退
將表現針對抗體-活性物質共軛物之抗原的人類腫瘤細胞以皮下方式接種至經免疫抑制之小鼠(例如NMRi裸小鼠或SCID小鼠)的側腹。自細胞培養物洗脫100-1000萬個細胞，對其進行離心，並用培養基或培養基/基質膠將其再懸浮。將細胞懸浮液注射至小鼠的皮膚下。
在數日內，腫瘤發生生長。在腫瘤建立後，大約在腫瘤尺寸為40mm2的情況下開始治療。為就對較大腫瘤的效果進行研究，亦可在腫瘤尺寸達50-100mm2時方開始治療。
透過進入小鼠之尾靜脈的靜脈內(活體內)路徑用APDC及ADC進行治療。以5mL/kg的體積投予ADC。
治療方案以抗體之藥物動力學為基準。默認每週用本發明之共軛物治療一次，治療2或3週。為及時評估，採用一次性治療的方案亦適用。但亦可繼續治療，或者在未來的一時間點上延續一為期三個治療日的第二週期。
每個治療組默認採用8個動物。除獲得活性物質的組以外，按照相同的方案僅用緩衝液對充當對照組的另一組進行處理。
在實驗過程中，定期用卡尺在兩個維度(長度/寬度)上量測腫瘤面積。藉由長度x寬度確定腫瘤面積。將治療組之平均腫瘤面積與控制組的對比給定為T/C面積。
若實驗之所有組在治療結束後同時結束，可將腫瘤取出並對其進行稱重。將治療組之平均腫瘤重量與控制組的對比給定為T/C重量。
C-6b. 本發明之APDC及ADC在各腫瘤模型中的效果
以皮下的方式將腫瘤細胞接種至雌性NMRI裸小鼠(Janvier)的側腹。在腫瘤尺寸為40mm2的情況下，以靜脈內的方式用抗體-活性物 質共軛物進行治療。在治療後視情況對腫瘤生長作進一步跟蹤。
與對照組及經軛合之同型對照抗體相比，用本發明之APDC進行的治療能夠顯著且部分更為持久地抑制腫瘤生長。表8給出在相應的試驗結束日(自開始治療起計算)透過腫瘤重量及腫瘤面積測定的T/C值。
Figure 105119613-A0202-12-0883-1678
<110> 德商拜耳製藥公司
<120> 包含可酶解之基團的結合劑-活性物質共軛物(ADC)及結合劑-前藥共軛物(APDC)
<130> BHC 15 1 031 A
<160> 245
<170> BiSSAP 1.3
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<213> 智人
<400> 52
Figure 105119613-A0202-12-0903-1742
Figure 105119613-A0202-12-0904-1743
<210> 53
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 53
Figure 105119613-A0202-12-0904-1744
<210> 54
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 54
Figure 105119613-A0202-12-0904-1745
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 55
Figure 105119613-A0202-12-0904-1746
<210> 56
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 56
Figure 105119613-A0202-12-0904-1747
<210> 57
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 57
Figure 105119613-A0202-12-0905-1748
<210> 58
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 58
Figure 105119613-A0202-12-0905-1751
<210> 59
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人
<400> 59
Figure 105119613-A0202-12-0905-1749
<210> 60
<211> 121
<212> PRT
<213> 智人
<400> 60
Figure 105119613-A0202-12-0905-1750
Figure 105119613-A0202-12-0906-1752
<210> 61
<211> 217
<212> PRT
<213> 智人
<400> 61
Figure 105119613-A0202-12-0906-1754
<210> 62
<211> 449
<212> PRT
<213> 智人
<400> 62
Figure 105119613-A0202-12-0906-1753
Figure 105119613-A0202-12-0907-1755
<210> 63
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 63
Figure 105119613-A0202-12-0907-1756
Figure 105119613-A0202-12-0908-1757
<210> 64
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 64
Figure 105119613-A0202-12-0908-1758
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 65
Figure 105119613-A0202-12-0908-1759
<210> 66
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 66
Figure 105119613-A0202-12-0908-1760
<210> 67
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 67
Figure 105119613-A0202-12-0908-1761
<210> 68
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 68
Figure 105119613-A0202-12-0908-1762
<210> 69
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 69
Figure 105119613-A0202-12-0909-1763
<210> 70
<211> 121
<212> PRT
<213> 智人
<400> 70
Figure 105119613-A0202-12-0909-1764
<210> 71
<211> 217
<212> PRT
<213> 智人
<400> 71
Figure 105119613-A0202-12-0909-1765
Figure 105119613-A0202-12-0910-1766
<210> 72
<211> 449
<212> PRT
<213> 智人
<400> 72
Figure 105119613-A0202-12-0910-1767
Figure 105119613-A0202-12-0911-1768
<210> 73
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 73
Figure 105119613-A0202-12-0911-1769
<210> 74
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 74
Figure 105119613-A0202-12-0911-1770
<210> 75
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 75
Figure 105119613-A0202-12-0911-1771
<210> 76
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 76
Figure 105119613-A0202-12-0912-1772
<210> 77
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 77
Figure 105119613-A0202-12-0912-1773
<210> 78
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 78
Figure 105119613-A0202-12-0912-1774
<210> 79
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 79
Figure 105119613-A0202-12-0912-1775
<210> 80
<211> 121
<212> PRT
<213> 智人
<400> 80
Figure 105119613-A0202-12-0913-1776
<210> 81
<211> 217
<212> PRT
<213> 智人
<400> 81
Figure 105119613-A0202-12-0913-1777
<210> 82
<211> 449
<212> PRT
<213> 智人
<400> 82
Figure 105119613-A0202-12-0914-1778
Figure 105119613-A0202-12-0915-1779
<210> 83
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 83
Figure 105119613-A0202-12-0915-1780
<210> 84
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 84
Figure 105119613-A0202-12-0915-1781
<210> 85
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 85
Figure 105119613-A0202-12-0915-1782
<210> 86
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 86
Figure 105119613-A0202-12-0915-1783
<210> 87
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 87
Figure 105119613-A0202-12-0915-1784
<210> 88
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 88
Figure 105119613-A0202-12-0916-1785
<210> 89
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 89
Figure 105119613-A0202-12-0916-1786
<210> 90
<211> 121
<212> PRT
<213> 智人
<400> 90
Figure 105119613-A0202-12-0916-1787
<210> 91
<211> 217
<212> PRT
<213> 智人
<400> 91
Figure 105119613-A0202-12-0917-1788
<210> 92
<211> 449
<212> PRT
<213> 智人
<400> 92
Figure 105119613-A0202-12-0917-1789
Figure 105119613-A0202-12-0918-1790
<210> 93
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 93
Figure 105119613-A0202-12-0918-1791
<210> 94
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 94
Figure 105119613-A0202-12-0919-1792
<210> 95
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 95
Figure 105119613-A0202-12-0919-1793
<210> 96
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 96
Figure 105119613-A0202-12-0919-1794
<210> 97
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 97
Figure 105119613-A0202-12-0919-1795
<210> 98
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 98
Figure 105119613-A0202-12-0919-1796
<210> 99
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 99
Figure 105119613-A0202-12-0919-1797
Figure 105119613-A0202-12-0920-1798
<210> 100
<211> 121
<212> PRT
<213> 智人
<400> 100
Figure 105119613-A0202-12-0920-1800
<210> 101
<211> 217
<212> PRT
<213> 智人
<400> 101
Figure 105119613-A0202-12-0920-1799
Figure 105119613-A0202-12-0921-1801
<210> 102
<211> 449
<212> PRT
<213> 智人
<400> 102
Figure 105119613-A0202-12-0921-1802
Figure 105119613-A0202-12-0922-1803
<210> 103
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 103
Figure 105119613-A0202-12-0922-1804
<210> 104
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 104
Figure 105119613-A0202-12-0922-1805
<210> 105
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 105
Figure 105119613-A0202-12-0922-1806
<210> 106
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 106
Figure 105119613-A0202-12-0923-1807
<210> 107
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 107
Figure 105119613-A0202-12-0923-1809
<210> 108
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 108
Figure 105119613-A0202-12-0923-1808
<210> 109
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 109
Figure 105119613-A0202-12-0923-1810
<210> 110
<211> 121
<212> PRT
<213> 智人
<400> 110
Figure 105119613-A0202-12-0923-1811
Figure 105119613-A0202-12-0924-1812
<210> 111
<211> 217
<212> PRT
<213> 智人
<400> 111
Figure 105119613-A0202-12-0924-1813
<210> 112
<211> 449
<212> PRT
<213> 智人
<400> 112
Figure 105119613-A0202-12-0924-1814
Figure 105119613-A0202-12-0925-1815
Figure 105119613-A0202-12-0926-1816
<210> 113
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 113
Figure 105119613-A0202-12-0926-1817
<210> 114
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 114
Figure 105119613-A0202-12-0926-1818
<210> 115
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 115
Figure 105119613-A0202-12-0926-1819
<210> 116
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 116
Figure 105119613-A0202-12-0926-1820
<210> 117
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 117
Figure 105119613-A0202-12-0926-1821
<210> 118
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 118
Figure 105119613-A0202-12-0927-1822
<210> 119
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 119
Figure 105119613-A0202-12-0927-1823
<210> 120
<211> 121
<212> PRT
<213> 智人
<400> 120
Figure 105119613-A0202-12-0927-1824
<210> 121
<211> 218
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 121
Figure 105119613-A0202-12-0927-1825
Figure 105119613-A0202-12-0928-1826
<210> 122
<211> 450
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 122
Figure 105119613-A0202-12-0928-1827
Figure 105119613-A0202-12-0929-1828
<210> 123
<211> 218
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 123
Figure 105119613-A0202-12-0929-1829
Figure 105119613-A0202-12-0930-1830
<210> 124
<211> 448
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 124
Figure 105119613-A0202-12-0930-1831
Figure 105119613-A0202-12-0931-1832
<210> 125
<211> 218
<212> PRT
<213> 智人
<400> 125
Figure 105119613-A0202-12-0931-1833
Figure 105119613-A0202-12-0932-1834
<210> 126
<211> 450
<212> PRT
<213> 智人
<400> 126
Figure 105119613-A0202-12-0932-1835
Figure 105119613-A0202-12-0933-1836
<210> 127
<211> 218
<212> PRT
<213> 智人
<400> 127
Figure 105119613-A0202-12-0933-1837
<210> 128
<211> 449
<212> PRT
<213> 智人
<400> 128
Figure 105119613-A0202-12-0934-1838
Figure 105119613-A0202-12-0935-1839
<210> 129
<211> 218
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 129
Figure 105119613-A0202-12-0935-1840
<210> 130
<211> 448
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 130
Figure 105119613-A0202-12-0935-1841
Figure 105119613-A0202-12-0936-1842
<210> 131
<211> 218
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 131
Figure 105119613-A0202-12-0937-1843
<210> 132
<211> 451
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 132
Figure 105119613-A0202-12-0937-1844
Figure 105119613-A0202-12-0938-1845
<210> 133
<211> 282
<212> PRT
<213> 長尾獼猴
<400> 133
Figure 105119613-A0202-12-0938-1846
Figure 105119613-A0202-12-0939-1847
<210> 134
<211> 282
<212> PRT
<213> 褐家鼠
<400> 134
Figure 105119613-A0202-12-0939-1848
Figure 105119613-A0202-12-0940-1849
<210> 135
<211> 282
<212> PRT
<213> 豬
<400> 135
Figure 105119613-A0202-12-0940-1850
Figure 105119613-A0202-12-0941-1173
<210> 136
<211> 282
<212> PRT
<213> 狼
<400> 136
Figure 105119613-A0202-12-0941-1174
<210> 137
<211> 282
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 137
Figure 105119613-A0202-12-0942-1175
<210> 138
<211> 282
<212> PRT
<213> 智人
<400> 138
Figure 105119613-A0202-12-0942-1176
Figure 105119613-A0202-12-0943-1177
<210> 139
<211> 296
<212> PRT
<213> 智人
<400> 139
Figure 105119613-A0202-12-0943-1178
Figure 105119613-A0202-12-0944-1179
<210> 140
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 140
Figure 105119613-A0202-12-0944-1181
Figure 105119613-A0202-12-0945-1182
<210> 141
<211> 47
<212> PRT
<213> 智人
<400> 141
Figure 105119613-A0202-12-0945-1183
<210> 142
<211> 282
<212> PRT
<213> 智人
<400> 142
Figure 105119613-A0202-12-0945-1184
Figure 105119613-A0202-12-0946-1185
<210> 143
<211> 282
<212> PRT
<213> 智人
<400> 143
Figure 105119613-A0202-12-0946-1186
<210> 144
<211> 282
<212> PRT
<213> 智人
<400> 144
Figure 105119613-A0202-12-0946-1188
Figure 105119613-A0202-12-0947-1189
<210> 145
<211> 282
<212> PRT
<213> 智人
<400> 145
Figure 105119613-A0202-12-0947-1190
Figure 105119613-A0202-12-0948-1191
<210> 146
<211> 282
<212> PRT
<213> 智人
<400> 146
Figure 105119613-A0202-12-0948-1192
Figure 105119613-A0202-12-0949-1193
<210> 147
<211> 282
<212> PRT
<213> 智人
<400> 147
Figure 105119613-A0202-12-0949-1194
<210> 148
<211> 282
<212> PRT
<213> 智人
<400> 148
Figure 105119613-A0202-12-0950-1195
<210> 149
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 149
Figure 105119613-A0202-12-0950-1196
Figure 105119613-A0202-12-0951-1197
<210> 150
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 150
Figure 105119613-A0202-12-0951-1198
Figure 105119613-A0202-12-0952-1199
<210> 151
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 151
Figure 105119613-A0202-12-0952-1200
Figure 105119613-A0202-12-0953-1201
<210> 152
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 152
Figure 105119613-A0202-12-0953-1202
<210> 153
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 153
Figure 105119613-A0202-12-0954-1203
<210> 154
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 154
Figure 105119613-A0202-12-0954-1204
Figure 105119613-A0202-12-0955-1207
<210> 155
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 155
Figure 105119613-A0202-12-0955-1208
Figure 105119613-A0202-12-0956-1209
<210> 156
<211> 240
<212> PRT
<213> 智人
<400> 156
Figure 105119613-A0202-12-0956-1210
<210> 157
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 157
Figure 105119613-A0202-12-0957-1211
<210> 158
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 158
Figure 105119613-A0202-12-0957-1212
Figure 105119613-A0202-12-0958-1213
<210> 159
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 159
Figure 105119613-A0202-12-0958-1214
Figure 105119613-A0202-12-0959-1215
<210> 160
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 160
Figure 105119613-A0202-12-0959-1216
Figure 105119613-A0202-12-0960-1217
<210> 161
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 161
Figure 105119613-A0202-12-0960-1218
<210> 162
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 162
Figure 105119613-A0202-12-0960-1219
Figure 105119613-A0202-12-0961-1220
<210> 163
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 163
Figure 105119613-A0202-12-0961-1221
Figure 105119613-A0202-12-0962-1222
<210> 164
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 164
Figure 105119613-A0202-12-0962-1223
Figure 105119613-A0202-12-0963-1224
<210> 165
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 165
Figure 105119613-A0202-12-0963-1225
<210> 166
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 166
Figure 105119613-A0202-12-0964-1226
<210> 167
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 167
Figure 105119613-A0202-12-0964-1227
Figure 105119613-A0202-12-0965-1228
<210> 168
<211> 53
<212> PRT
<213> 智人
<400> 168
Figure 105119613-A0202-12-0965-1229
<210> 169
<211> 129
<212> PRT
<213> 智人
<400> 169
Figure 105119613-A0202-12-0965-1230
Figure 105119613-A0202-12-0966-1232
<210> 170
<211> 959
<212> DNA
<213> 智人
<400> 170
Figure 105119613-A0202-12-0966-1233
<210> 171
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> SITE
<222> 5..5
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<400> 171
Figure 105119613-A0202-12-0967-1234
<210> 172
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> SITE
<222> 8..8
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<400> 172
Figure 105119613-A0202-12-0967-1235
<210> 173
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 173
Figure 105119613-A0202-12-0967-1236
<210> 174
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> SITE
<222> 8..8
<223> xaa可為任何天然胺基酸
<400> 174
Figure 105119613-A0202-12-0967-1237
<210> 175
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> SITE
<222> 1..1
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<400> 175
Figure 105119613-A0202-12-0968-1238
<210> 176
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> SITE
<222> 5..6
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<220>
<221> SITE
<222> 8..8
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<400> 176
Figure 105119613-A0202-12-0968-1239
<210> 177
<211> 645
<212> DNA
<213> 智人
<400> 177
Figure 105119613-A0202-12-0968-1240
Figure 105119613-A0202-12-0969-1241
<210> 178
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 178
Figure 105119613-A0202-12-0969-1242
Figure 105119613-A0202-12-0970-1243
<210> 179
<211> 645
<212> DNA
<213> 智人
<400> 179
Figure 105119613-A0202-12-0970-1244
<210> 180
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 180
Figure 105119613-A0202-12-0970-1245
Figure 105119613-A0202-12-0971-1246
<210> 181
<211> 645
<212> DNA
<213> 智人
<400> 181
Figure 105119613-A0202-12-0971-1248
Figure 105119613-A0202-12-0972-1249
<210> 182
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 182
Figure 105119613-A0202-12-0972-1250
<210> 183
<211> 645
<212> DNA
<213> 智人
<400> 183
Figure 105119613-A0202-12-0973-1253
<210> 184
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 184
Figure 105119613-A0202-12-0973-1254
Figure 105119613-A0202-12-0974-1255
<210> 185
<211> 645
<212> DNA
<213> 智人
<400> 185
Figure 105119613-A0202-12-0974-1256
Figure 105119613-A0202-12-0975-1257
<210> 186
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 186
Figure 105119613-A0202-12-0975-1258
<210> 187
<211> 645
<212> DNA
<213> 智人
<400> 187
Figure 105119613-A0202-12-0976-1259
<210> 188
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 188
Figure 105119613-A0202-12-0976-1261
Figure 105119613-A0202-12-0977-1262
<210> 189
<211> 651
<212> DNA
<213> 智人
<400> 189
Figure 105119613-A0202-12-0977-1263
<210> 190
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 190
Figure 105119613-A0202-12-0978-1264
<210> 191
<211> 651
<212> DNA
<213> 智人
<400> 191
Figure 105119613-A0202-12-0979-1265
<210> 192
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 192
Figure 105119613-A0202-12-0979-1268
Figure 105119613-A0202-12-0980-1269
<210> 193
<211> 651
<212> DNA
<213> 智人
<400> 193
Figure 105119613-A0202-12-0980-1270
<210> 194
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 194
Figure 105119613-A0202-12-0981-1273
<210> 195
<211> 651
<212> DNA
<213> 智人
<400> 195
Figure 105119613-A0202-12-0982-1274
<210> 196
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 196
Figure 105119613-A0202-12-0982-1275
Figure 105119613-A0202-12-0983-1276
<210> 197
<211> 651
<212> DNA
<213> 智人
<400> 197
Figure 105119613-A0202-12-0983-1277
<210> 198
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 198
Figure 105119613-A0202-12-0984-1278
<210> 199
<211> 651
<212> DNA
<213> 智人
<400> 199
Figure 105119613-A0202-12-0985-1279
<210> 200
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 200
Figure 105119613-A0202-12-0985-1280
Figure 105119613-A0202-12-0986-1281
<210> 201
<211> 654
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 201
Figure 105119613-A0202-12-0986-1282
<210> 202
<211> 1350
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 202
Figure 105119613-A0202-12-0987-1284
<210> 203
<211> 654
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 203
Figure 105119613-A0202-12-0988-1285
<210> 204
<211> 1344
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 204
Figure 105119613-A0202-12-0988-1286
Figure 105119613-A0202-12-0989-1287
<210> 205
<211> 654
<212> DNA
<213> 智人
<400> 205
Figure 105119613-A0202-12-0989-1288
<210> 206
<211> 1350
<212> DNA
<213> 智人
<400> 206
Figure 105119613-A0202-12-0990-1289
<210> 207
<211> 654
<212> DNA
<213> 智人
<400> 207
Figure 105119613-A0202-12-0991-1291
<210> 208
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 208
Figure 105119613-A0202-12-0991-1293
Figure 105119613-A0202-12-0992-1294
<210> 209
<211> 654
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 209
Figure 105119613-A0202-12-0992-1295
<210> 210
<211> 1344
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 210
Figure 105119613-A0202-12-0993-1296
<210> 211
<211> 654
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 211
Figure 105119613-A0202-12-0994-1299
<210> 212
<211> 1353
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 212
Figure 105119613-A0202-12-0994-1300
Figure 105119613-A0202-12-0995-1301
<210> 213
<211> 1210
<212> PRT
<213> 智人
<400> 213
Figure 105119613-A0202-12-0995-1302
Figure 105119613-A0202-12-0996-1303
Figure 105119613-A0202-12-0997-1304
Figure 105119613-A0202-12-0998-1305
<210> 214
<211> 622
<212> PRT
<213> 智人
<400> 214
Figure 105119613-A0202-12-0998-1308
Figure 105119613-A0202-12-0999-1309
<210> 215
<211> 459
<212> PRT
<213> 智人
<400> 215
Figure 105119613-A0202-12-0999-1310
Figure 105119613-A0202-12-1000-1311
<210> 216
<211> 346
<212> PRT
<213> 智人
<400> 216
Figure 105119613-A0202-12-1001-1312
<210> 217
<211> 61
<212> PRT
<213> 智人
<400> 217
Figure 105119613-A0202-12-1002-1313
<210> 218
<211> 1255
<212> PRT
<213> 智人
<400> 218
Figure 105119613-A0202-12-1002-1314
Figure 105119613-A0202-12-1003-1315
Figure 105119613-A0202-12-1004-1316
Figure 105119613-A0202-12-1005-1317
<210> 219
<211> 297
<212> PRT
<213> 智人
<400> 219
Figure 105119613-A0202-12-1005-1319
Figure 105119613-A0202-12-1006-1320
<210> 220
<211> 595
<212> PRT
<213> 智人
<400> 220
Figure 105119613-A0202-12-1006-1322
Figure 105119613-A0202-12-1007-1323
<210> 221
<211> 847
<212> PRT
<213> 智人
<400> 221
Figure 105119613-A0202-12-1007-1324
Figure 105119613-A0202-12-1008-1325
Figure 105119613-A0202-12-1009-1326
<210> 222
<211> 364
<212> PRT
<213> 智人
<400> 222
Figure 105119613-A0202-12-1009-1329
Figure 105119613-A0202-12-1010-1330
<210> 223
<211> 572
<212> PRT
<213> 智人
<400> 223
Figure 105119613-A0202-12-1010-1331
Figure 105119613-A0202-12-1011-1332
<210> 224
<211> 848
<212> PRT
<213> 智人
<400> 224
Figure 105119613-A0202-12-1012-1333
Figure 105119613-A0202-12-1013-1334
Figure 105119613-A0202-12-1014-1335
<210> 225
<211> 193
<212> PRT
<213> 智人
<400> 225
Figure 105119613-A0202-12-1014-1336
<210> 226
<211> 232
<212> PRT
<213> 智人
<400> 226
Figure 105119613-A0202-12-1014-1337
Figure 105119613-A0202-12-1015-1338
<210> 227
<211> 557
<212> PRT
<213> 智人
<400> 227
Figure 105119613-A0202-12-1015-1339
Figure 105119613-A0202-12-1016-1340
<210> 228
<211> 273
<212> PRT
<213> 智人
<400> 228
Figure 105119613-A0202-12-1016-1341
Figure 105119613-A0202-12-1017-1342
<210> 229
<211> 310
<212> PRT
<213> 智人
<400> 229
Figure 105119613-A0202-12-1017-1344
Figure 105119613-A0202-12-1018-1345
<210> 230
<211> 1048
<212> PRT
<213> 智人
<400> 230
Figure 105119613-A0202-12-1018-1347
Figure 105119613-A0202-12-1019-1348
Figure 105119613-A0202-12-1020-1349
<210> 231
<211> 188
<212> PRT
<213> 智人
<400> 231
Figure 105119613-A0202-12-1021-1350
<210> 232
<211> 750
<212> PRT
<213> 智人
<400> 232
Figure 105119613-A0202-12-1021-1352
Figure 105119613-A0202-12-1022-1353
Figure 105119613-A0202-12-1023-1354
<210> 233
<211> 976
<212> PRT
<213> 智人
<400> 233
Figure 105119613-A0202-12-1023-1355
Figure 105119613-A0202-12-1024-1356
Figure 105119613-A0202-12-1025-1357
<210> 234
<211> 668
<212> PRT
<213> 智人
<400> 234
Figure 105119613-A0202-12-1025-1358
Figure 105119613-A0202-12-1026-1359
Figure 105119613-A0202-12-1027-1360
<210> 235
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體組分
<400> 235
Figure 105119613-A0202-12-1027-1361
Figure 105119613-A0202-12-1028-1362
<210> 236
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體組分
<400> 236
Figure 105119613-A0202-12-1028-1363
Figure 105119613-A0202-12-1029-1364
<210> 237
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體組分
<400> 237
Figure 105119613-A0202-12-1029-1366
<210> 238
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體組分
<400> 238
Figure 105119613-A0202-12-1030-1368
Figure 105119613-A0202-12-1031-1369
<210> 239
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體組分
<400> 239
Figure 105119613-A0202-12-1031-1370
<210> 240
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體組分
<400> 240
Figure 105119613-A0202-12-1032-1371
Figure 105119613-A0202-12-1033-1372
<210> 241
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體組分
<400> 241
Figure 105119613-A0202-12-1033-1373
Figure 105119613-A0202-12-1034-1374
<210> 242
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體組分
<400> 242
Figure 105119613-A0202-12-1034-1375
Figure 105119613-A0202-12-1035-1376
<210> 243
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體組分
<400> 243
Figure 105119613-A0202-12-1035-1377
Figure 105119613-A0202-12-1036-1378
<210> 244
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體組分
<400> 244
Figure 105119613-A0202-12-1036-1379
Figure 105119613-A0202-12-1037-1380
Figure 105119613-A0202-12-1038-1381
<210> 245
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體組分
<400> 245
Figure 105119613-A0202-12-1038-1382
Figure 105119613-A0202-12-1039-1383

Claims (39)

  1. 一種根據以下式的抗體與一或多個活性物質分子的共軛物：
    Figure 105119613-A0305-02-1042-1
     其中BINDER 表示抗體，L 表示連接子，n 表示1至50的數字，以及KSP 表示紡錘體驅動蛋白抑制劑，其中-L-KSP具有以下式(IIa)：
    Figure 105119613-A0305-02-1042-2
     其中X1表示CH，X2表示C，且X3表示N；R1 表示-H、-L-#1、-MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z 表示-H、-NHY3、-OY3、-SY3、鹵素、-C(=O)-NY1Y2，或者-CO-OY3，其中Y1與Y2 相互獨立地表示-H、-NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'，或者-CH(CH2W)Z'Y3表示-H或-(CH2)0-3Z'，其中Z' 表示-H、-NH2、-SO3H、-COOH、-NH-C(=O)- CH2-CH2-CH(NH2)COOH或者-(C(=O)-NH-CHY4)1-3COOH；其中W 表示-H或者-OH，其中Y4 表示直鏈或支鏈的、視情況經-NH-C(=O)-NH2取代的C1-6烷基，或者視情況經-NH2取代的芳基或苄基；R2 表示-L-#1、-H、-MOD、-C(=O)-CHY4-NHY5或者-(CH2)0-3Z，其中Z 表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、-NHY3、-C(=O)-NY1Y2，或者-C(=O)-OY3，其中Y1與Y2 相互獨立地表示-H、-NH2或者-(CH2)0-3Z'，其中Y3 表示-H或-(CH2)0-3Z'，其中Z' 表示-H、-SO3H、-NH2或者-COOH；其中Y4 表示直鏈或支鏈的、視情況經-NH-C(=O)-NH2取代的C1-6烷基，或者視情況經-NH2取代的芳基或苄基，其中Y5 表示-H或者-C(=O)-CHY6-NH2，其中Y6 表示直鏈或支鏈的C1-6烷基；R4 表示-L-#1、-H、-C(=O)-CHY4-NHY5或者-(CH2)0-3Z，其中Z 表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、-NHY3、-C(=O)-NY1Y2，或者-C(=O)-OY3，其中Y1與Y2 相互獨立地表示-H、-NH2或者-(CH2)0-3Z'，其中Y3 表示-H或-(CH2)0-3Z'，其中Z' 表示-H、-SO3H、-NH2或者-COOH；其中Y4 表示直鏈或支鏈的、視情況經-NH-C(=O)-NH2取代的C1-6烷基，或者視情況經-NH2取代的芳基或苄基，其中Y5 表示-H或者-C(=O)-CHY6-NH2，其中Y6 表示直鏈或支鏈的C1-6烷基；或者R4 表示式為R21-(C(=O))(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2C(=O)- NH2)-C(=O)-或R21-(C(=O))(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2COOH)-C(=O)-之基團，或表示可透過組織蛋白酶裂解的式為R21-(C=O)(0-1)-(P3)(1-2)-P2-的基團，其中R21 表示C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-雜烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-雜環烷基、雜芳基、雜芳基-烷基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-雜烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-雜環烷氧基基團，其可經-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、-NH-C(=O)-烷基、-N(烷基)-C(=O)-烷基、-SO3H、-S(=O)2-NH2、-S(=O)2-N(烷基)2、-COOH、-C(=O)-NH2、-C(=O)-N(烷基)2或-OH單取代或多重取代，以及表示-H或-Ox-(CH2CH2O)y-R22基團，其中x 為0或1其中v 表示1至20的數字，以及其中R22 表示-H、-烷基、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或者-CH2-CH2-NH2)，其中P2 為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸；其中P3 為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸，或者為相應N-烷基-胺基酸；或者R2與R4 共同表示-CH2-CHR10-或者#-CHR10-CH2-，其中R10 表示-H、-NH2、-SO3H、-COOH、-SH、鹵素、C1-4烷基、C1-4鹵烷基、C1-4烷氧基、羥基取代的C1-4烷基、 COO(C1-4烷基)、-OH或者R21-C(=O)-P3-P2-NH-CH(CH2C(=O)-NH2)-C(=O)-SIG-，其中SIG 表示一自我分解型基團，其在C(=O)-SIG鍵結裂解後釋放二級胺；A 表示-(C=O)-、-S(=O)-、-S(=O)2-、-S(=O)2NH-或者-C(=N-NH2)-；R3 表示-L-#1、-MOD或視情況經取代的烷基、環烷基、芳基、雜芳基、雜烷基、雜環烷基基團，其分別可經1-3個-OH基團、1-3個鹵素原子、1-3個鹵化烷基(分別具有1-3個鹵素原子)，1-3個O-烷基基團、1-3個-SH基團、1-3個-S-烷基基團、1-3個-O-C(=O)-烷基基團、1-3個-O-C(=O)-NH-烷基基團、1-3個-NH-C(=O)-烷基基團、1-3個-NH-C(=O)-NH-烷基基團、1-3個-S(O)n-烷基基團、1-3個-S(=O)2-NH-烷基基團、1-3個-NH-烷基基團、1-3個-N(烷基)2基團、1-3個-NH2基團或者1-3個-(CH2)0-3Z基團取代，其中Z 表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、-NHY3、-C(=O)-NY1Y2，或者-C(=O)-OY3，其中n 表示0、1或2，其中Y1與Y2 相互獨立地表示-H、-NH2或者-(CH2)0-3Z'，其中Y3 表示-H、-(CH2)0-3-CH(NHOCH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或者-(CH2)0-3Z'，其中Z' 表示-H、-SO3H、-NH2或者-COOH，可經取代；R5 表示-H、-NH2、-NO2、鹵素、-CN、-CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、-SH或-(CH2)0-3Z，其中Z 表示-H、-OY3、-SY3、鹵素、-NHY3、-C(=O)-NY1Y2或者-C(=O)-OY3， 其中Y1與Y2 相互獨立地表示-H、-NH2或者-(CH2)0-3Z'，其中Y3 表示-H或-(CH2)0-3Z'，其中Z' 表示-H、-SO3H、-NH2或者-COOH；R6與R7 相互獨立地表示-H、氰基、C1-10-烷基、氟-C1-10-烷基、C2-10-烯基、氟-C2-10-烯基、C2-10-炔基、氟-C2-10-炔基、羥基、-NO2、-NH2、-COOH或鹵素，R8 表示C1-10-烷基、氟-C1-10-烷基、C2-10-烯基、氟-C2-10-烯基、C2-10-炔基、氟-C2-10-炔基、C4-10-環烷基、氟-C4-10-環烷基、或者-(CH2)0-2-(HZ2)，其中HZ2 表示一4至7員雜環，其包含至多兩個選自N、O及S的雜原子，其中此等基團中的每個皆可經-OH、-COOH、-NH2或-L-#1取代；R9 表示-H、-F、-CH3、-CF3、-CH2F或-CHF2；其中取代基R1、R2、R3、R4及R8中的一個表示或具有-L-#1，-L-表示連接子，且-#1表示與抗體的鍵結，其中-MOD表示-(NR10)n-(G1)o-G2-G3，其中其中R10 表示-H或C1-C3-烷基； 其中G1 表示-NH-C(=O)-、-C(=O)-NH-或
    Figure 105119613-A0305-02-1046-3
    ；n 為0或1；o 為0或1；以及其中G2 為包含1至10個碳原子之直鏈及/或支鏈烴基，其可單次或多重間雜有以下基團中的一或多個：-O-、-S-、-S(=O)-、-S(=O)2-、-NRy-、-NRyC(=O)-、-C(=O)-NRy-、-NRyNRy-、-S(=O)2-NRyNRy-、-C(=O)-NRyNRy-、-C(=O)-、- CRx=N-O-，其中Ry Ry表示-H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其分別可經-NH-C(=O)-NH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CN-NH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，其中Rx 表示-H、C1-C3-烷基或苯基，其中包括視情況在烴基上經取代之C1-C3-烷基(作為側鏈)的烴鏈可經-NH-C(=O)-NH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CN-NH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，其中G3 表示-H或-COOH；其中-MOD 具有至少一-COOH基團；其中滿足以下條件(i)至(ii)中的一個或多個：(i)-L-#1包括式為(C=O)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2C(=O)-NH2)-C(=O)-之可透過豆蛋白酶(Legumain)裂解的基團，其中P2 為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸，其中P3 為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸；或(ii)R4 表示式為R21-(C=O)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2C(=O)-NH2)-C(=O)-之可透過豆蛋白酶裂解的基團，其中R21 表示C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-雜烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-雜環烷基、雜芳基、雜芳基-烷基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-雜烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-雜環烷氧基基團，其可經-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、-NH- C(=O)-烷基、-N(烷基)-C(=O)-烷基、-SO3H、-S(=O)2-NH2、-S(=O)2-N(烷基)2、-COOH、-C(=O)-NH2、-C(=O)-N(烷基)2或-OH單取代或多重取代，以及表示-H或-Ox-(CH2CH2O)y-R22基團，其中x 為0或1其中v 表示1至20的數字，以及其中R22 表示-H、-烷基、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或者-CH2-CH2-NH2)，其中P2 為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸；其中P3 為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸，或者為相應N-烷基-胺基酸中；以及其鹽及差向異構體。
  2. 如請求項1之共軛物，其中R4表示式為R21-(C=O)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2C(=O)NH2)-C(=O)-之可透過豆蛋白酶裂解的基團。
  3. 如請求項1之共軛物，其中P2選自Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Pro、Ser、Thr以及Asn。
  4. 如請求項1之共軛物，其中P3選自Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Gly、Ser以及Gln。
  5. 如請求項3之共軛物，其中P2為Ala。
  6. 如請求項4之共軛物，其中P3為Ala。
  7. 如請求項1之共軛物，其中R21 表示-H、C1-5-烷基、C5-10-芳烷基、C1-5-烷氧基、C6-10- 芳氧基、C5-10-雜烷基、C5-10-雜環烷基、雜芳基、雜芳基-烷基、C5-10-雜烷氧基或C5-10-雜環烷氧基基團，其皆可經-COOH、-C(=O)-O烷基、-C(=O)O-NH2、-NH2或-N(烷基)2取代，或者表示-Ox-(CH2CH2O)y-R22基團，其中x 為0或1，其中v 表示1至20的數字，以及R22 表示-H、-烷基、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或者-CH2-CH2-NH2。
  8. 如請求項1之共軛物，其中R4 表示-L-#1，且包括式為-(C=O)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2C(=O)-NH2)-C(=O)-之可透過豆蛋白酶裂解的基團，其中P2 為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸，以及其中P3 為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸，或者為相應N-烷基-胺基酸。
  9. 如請求項1之共軛物，其中R4 表示式為R21-(C=O)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2C(=O)-NH2)-C(=O)-之可透過豆蛋白酶裂解的基團，其中R21 表示C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-雜烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-雜環烷基、雜芳基、雜芳基-烷基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-雜烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-雜環烷氧基基團，其可經-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、-NH-C(=O)-烷 基、-N(烷基)-C(=O)-烷基、-SO3H、-S(=O)2-NH2、-S(=O)2-N(烷基)2、-COOH、-C(=O)-NH2、-C(=O)-N(烷基)2或-OH單取代或多重取代，或者表示-H或-Ox-(CH2CH2O)v-R22基團，其中x 為0或1；其中v 表示1至20的數字，以及其中R22 表示-H、-烷基、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或者-CH2-CH2-NH2)，其中P2 為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸；其中P3 為相應獨立選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸，或者為相應N-烷基-胺基酸。
  10. 如請求項1之共軛物，其中R1或R3表示-L-#1。
  11. 如請求項1之共軛物，其中R6與R7相互獨立地表示-H、C1-3-烷基或鹵素。
  12. 如請求項11之共軛物，其中R6與R7表示-F。
  13. 如請求項1之共軛物，其中R8表示C1-4-烷基或環己基。
  14. 如請求項1之共軛物，其中R9表示H。
  15. 如請求項1之共軛物，其中每個活性物質分子透過連接子與抗體之不同胺基酸結合。
  16. 如請求項1之共軛物，其中針對每個抗體，該共軛物平均具有1、2至20個活性物質分子。
  17. 如請求項1之共軛物，其中該抗體與一癌症靶分子結合。
  18. 如請求項17之共軛物，其中該抗體與一胞外靶分子結合。
  19. 如請求項18之共軛物，其中在與胞外靶分子結合後，該抗體被表現該靶分子之細胞內化，並在胞內經受處理。
  20. 如請求項1之共軛物，其中該抗體為人類的、人類化的或嵌合的單株抗體或者其抗原結合片段。
  21. 如請求項20之共軛物，其中該抗體為抗HER2抗體、抗EGFR抗體、抗TWEAKR抗體，或者其抗原結合片段。
  22. 如請求項21之共軛物，其中該抗TWEAKR抗體特異地與TWEAKR(SEQ ID NO：169)之位置47中的胺基酸D(D47)結合。
  23. 如請求項22之共軛物，其中該抗TWEAKR抗體特異地與TWEAKR(SEQ ID NO：169)之位置47中的胺基酸D(D47)結合，其中該抗TWEAKR抗體為TPP-2658或TPP-2090。
  24. 如請求項21之共軛物，其中該抗體為抗EGFR抗體，以及，R3表示-L-#1。
  25. 如請求項1之共軛物，其中該連接子與半胱胺酸側鏈或半胱胺酸殘基結合，並具有以下式：§-(C=O)m-L1-L2-§§其中m 為0或1；§表示與活性物質分子的鍵結，以及§§表示與結合肽或結合蛋白的鍵結，以及-L2-表示
    Figure 105119613-A0305-02-1052-4
     其中#1 表示與結合劑之硫原子的連接位點，#2 表示與L1基團的連接位點，L1 表示-(NR10)n-(G1)o-G2-，其中R10 表示-H或C1-C3-烷基； G1 表示-NH-C(=O)-或
    Figure 105119613-A0305-02-1052-5
    ；n 為0或1；o 為0或1；以及G2 為來自芳基以及/或者直鏈及/或支鏈及/或環狀烷基的，包含1至100個碳原子之直鏈或支鏈烴鏈，其可單次或多重間雜有以下基團中的一或多個：-O-、-S-、-SO-、-S(=O)2-、-NH-、-C(=O)-、-NMe-、-NHNH-、-S(=O)2-NHNH-、-NH-C(=O)-、-C(=O)-NH-、-C(=O)-NHNH-，以及一5至10員的含有至多4個選自N、O、S的雜原子、-S(=O)-或-S(=O)2-的芳族或非芳族雜環，其中可能存在之側鏈可經-NH-C(=O)-NH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CN-NH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，或者表示以下基團中的一個：
    Figure 105119613-A0305-02-1053-6
     其中Rx表示-H、-C1-C3-烷基或苯基。
  26. 如請求項25之共軛物，其中透過以下式中的一或兩個表示L2：
    Figure 105119613-A0305-02-1053-7
     其中#1 表示與結合劑之硫原子的連接位點，#2 表示與L1基團的連接位點，R22 表示-COOH，以及，與該抗體之硫原子的鍵結中的超過80%(相對連接子與結合劑的鍵結總數而言)存在於此二結構中的一個中。
  27. 如請求項1之共軛物，其中R2或R3表示-L-#1。
  28. 如請求項21之共軛物，其中該抗TWEAKR抗體為激發抗體。
  29. 如請求項21之共軛物，其中該抗TWEAKR抗體或其抗原結合片段包括：一可變重鏈，包括：a.重鏈之CDR1，其由包括式PYPMX(SEQ ID NO：171)之胺基酸序列編碼，其中X為I或M；b.重鏈之CDR2，其由包括式YISPSGGXTHYADSVKG(SEQ ID NO：172)之胺基酸序列編碼，其中X為S或K；以及 c.重鏈之CDR3，其由包括式GGDTYFDYFDY(SEQ ID NO：173)之胺基酸序列編碼；以及一可變輕鏈，包括：d.輕鏈之CDR1，其由包括式RASQSISXYLN(SEQ ID NO：174)之胺基酸序列編碼，其中X為G或S；e.輕鏈之CDR2，其由包括式XASSLQS(SEQ ID NO：175)之胺基酸序列編碼，其中X為Q、A或N；以及f.輕鏈之CDR3，其由包括式QQSYXXPXIT(SEQ ID NO：176)之胺基酸序列編碼，其中位置5上之X為T或S，位置6上之X為T或S，且位置8上之X為G或F。
  30. 如請求項21之共軛物，其中該抗TWEAKR抗體或其抗原結合片段包括：a.如SEQ ID NO：10所示之重鏈可變序列以及如SEQ ID NO：9所示之輕鏈可變序列，或者b.如SEQ ID NO：20所示之重鏈可變序列以及如SEQ ID NO：19所示之輕鏈可變序列，或者c.如SEQ ID NO：30所示之重鏈可變序列以及如SEQ ID NO：29所示之輕鏈可變序列，或者d.如SEQ ID NO：40所示之重鏈可變序列以及如SEQ ID NO：39所示之輕鏈可變序列，或者e.如SEQ ID NO：50所示之重鏈可變序列以及如SEQ ID NO：49所示之輕鏈可變序列，或者f.如SEQ ID NO：60所示之重鏈可變序列以及如SEQ ID NO：59所示之輕鏈可變序列，或者g.如SEQ ID NO：70所示之重鏈可變序列以及如SEQ ID NO：69所示之輕鏈可變序列，或者 h.如SEQ ID NO：80所示之重鏈可變序列以及如SEQ ID NO：79所示之輕鏈可變序列，或者i.如SEQ ID NO：90所示之重鏈可變序列以及如SEQ ID NO：89所示之輕鏈可變序列，或者j.如SEQ ID NO：100所示之重鏈可變序列以及如SEQ ID NO：99所示之輕鏈可變序列，或者k.如SEQ ID NO：110所示之重鏈可變序列以及如SEQ ID NO：109所示之輕鏈可變序列，或者l.如SEQ ID NO：120所示之重鏈可變序列以及如SEQ ID NO：119所示之輕鏈可變序列。
  31. 如請求項1之共軛物，其中該抗體為IgG抗體。
  32. 如請求項21之共軛物，其中該抗TWEAKR抗體包括：a.如SEQ ID NO：2所示之重鏈序列，以及如SEQ ID NO：1所示之輕鏈序列，或者b.如SEQ ID NO：12所示之重鏈序列，以及如SEQ ID NO：11所示之輕鏈序列，或者c.如SEQ ID NO：22所示之重鏈序列，以及如SEQ ID NO：21所示之輕鏈序列，或者d.如SEQ ID NO：32所示之重鏈序列，以及如SEQ ID NO：31所示之輕鏈序列，或者e.如SEQ ID NO：42所示之重鏈序列，以及如SEQ ID NO：41所示之輕鏈序列，或者f.如SEQ ID NO：52所示之重鏈序列，以及如SEQ ID NO：51所示之輕鏈序列，或者g.如SEQ ID NO：62所示之重鏈序列，以及如SEQ ID NO：61所示之輕鏈序列，或者 h.如SEQ ID NO：72所示之重鏈序列，以及如SEQ ID NO：71所示之輕鏈序列，或者i.如SEQ ID NO：82所示之重鏈序列，以及如SEQ ID NO：81所示之輕鏈序列，或者j.如SEQ ID NO：92所示之重鏈序列，以及如SEQ ID NO：91所示之輕鏈序列，或者k.如SEQ ID NO：102所示之重鏈序列，以及如SEQ ID NO：101所示之輕鏈序列，或者l.如SEQ ID NO：112所示之重鏈序列，以及如SEQ ID NO：111所示之輕鏈序列。
  33. 如請求項1之共軛物，其中針對每個抗體，該共軛物具有1至10個活性物質分子。
  34. 如請求項1之共軛物，其中該共軛物符合以下式中的一個：
    Figure 105119613-A0305-02-1056-8
    Figure 105119613-A0305-02-1057-9
    Figure 105119613-A0305-02-1058-10
    Figure 105119613-A0305-02-1059-12
    Figure 105119613-A0305-02-1060-13
    Figure 105119613-A0305-02-1061-14
    Figure 105119613-A0305-02-1062-15
    Figure 105119613-A0305-02-1063-16
    Figure 105119613-A0305-02-1064-17
    Figure 105119613-A0305-02-1065-18
    Figure 105119613-A0305-02-1066-19
    Figure 105119613-A0305-02-1067-20
    Figure 105119613-A0305-02-1068-21
    Figure 105119613-A0305-02-1069-22
    Figure 105119613-A0305-02-1070-24
    Figure 105119613-A0305-02-1071-25
    Figure 105119613-A0305-02-1072-26
    Figure 105119613-A0305-02-1073-27
    Figure 105119613-A0305-02-1074-28
    Figure 105119613-A0305-02-1075-29
    Figure 105119613-A0305-02-1076-30
     其中n 為1至20的數字，AK1 表示透過半胱胺酸連接的抗體，以及AK2 表示透過離胺酸連接的抗體； AK3 表示透過麩醯胺酸連接的抗體。
  35. 如請求項1至34中任一項之共軛物，其中n 為1至20的數字，AK1 表示透過半胱胺酸連接的抗體，以及AK2 表示透過離胺酸連接的抗體；其中在具有以下基團的情況下
    Figure 105119613-A0305-02-1077-31
     該共軛物係與該抗體連接，作為此基團之替代，亦可至少部分以水解開鏈琥珀酸醯胺的形式與抗體連接。
  36. 一種藥物組合，包括如請求項1至34中任一項之共軛物，其與一惰性的非毒性的適合藥用的輔助物質組合。
  37. 如請求項1之共軛物，其被應用在一治療及/或預防疾病的方法中。
  38. 如請求項1之共軛物，其被應用在一治療高度增生及/或血管生成性疾病的方法中。
  39. 一種具有以下式(III)之紡錘體驅動蛋白抑制劑-前藥：
    Figure 105119613-A0305-02-1077-32
     其中 X1表示CH，X2表示C，且X3表示N；R1 表示-H、-MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z 表示-H、-NHY3、-OY3、-SY3、鹵素、-C(=O)-NY1Y2或者-C(=O)-OY3，其中Y1與Y2 相互獨立地表示-H、-NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'，或者-CH(CH2W)Z'其中Y3 表示-H或-(CH2)0-3Z'，其中Z' 表示-H、-NH2、-SO3H、-COOH、-NH-C(=O)-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或者-(C(=O)-NH-CHY4)1-3COOH；其中W 表示-H或者-OH，其中Y4 表示直鏈或支鏈的、視情況經-NH-C(=O)-NH2取代的C1-6烷基，或者視情況經-NH2取代的芳基或苄基；R2 表示-H、-MOD、-C(=O)-CHY4-NHY5或者-(CH2)0-3Z，其中Z 表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、-NHY3、-C(=O)-NY1Y2，或者-C(=O)-OY3，其中Y1與Y2 相互獨立地表示-H、-NH2或者-(CH2)0-3Z'，其中Y3 表示-H或-(CH2)0-3Z'，其中Z' 表示-H、-SO3H、-NH2或者-COOH；其中Y4 表示直鏈或支鏈的、視情況經-NH-C(=O)-NH2取代的C1-6烷基，或者視情況經-NH2取代的芳基或苄基，其中Y5 表示-H或者-C(=O)-CHY6-NH2，其中Y6 表示直鏈或支鏈的C1-6烷基；R4 表示式為R21-(C=O)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2C(=O)-NH2)-C(=O)-之可透過豆蛋白酶裂解的基團，其中R21 表示C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-雜烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-雜環烷基、雜芳基、 雜芳基-烷基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-雜烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-雜環烷氧基基團，其可經-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、-NH-C(=O)-烷基、-N(烷基)-C(=O)-烷基、-SO3H、-S(=O)2-NH2、-S(=O)2-N(烷基)2、-COOH、-C(=O)-NH2、-C(=O)-N(烷基)2或-OH單取代或多重取代，以及表示-H或-Ox-(CH2CH2O)v-R22基團，其中x 為0或1，其中v 表示1至20的數字，其中R22 表示-H、-烷基、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或者-CH2-CH2-NH2；P2 為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸；P3 為選自Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜胺酸以及His的胺基酸，或者為相應N-烷基-胺基酸中的一個；A 表示-C(=O)-、-S(=O)-、-S(=O)2-、-S(=O)2-NH-或-C(=N-NH2)-；R3 表示-MOD或視情況經取代的烷基、環烷基、芳基、雜芳基、雜烷基、雜環烷基基團，表示C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-雜烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-雜環烷基基團，其分別可被1-3個-OH基團、1-3個鹵素原子、1-3個鹵化烷基(分別具有1-3個鹵素原子)，1-3個-O-烷基基團、1-3個-SH基團、1-3個-S-烷基基團、1-3個-O-CO-烷基基團、1-3個-O-C(=O)-NH-烷基基團、1-3個-NH-C(=O)-烷基基團、1-3個-NH-C(=O)- NH-烷基基團、1-3個-S(=O)n-烷基基團、1-3個-S(=O)2-NH-烷基基團、1-3個-NH-烷基基團、1-3個-N(烷基)2基團、1-3個-NH2基團或者1-3個-(CH2)0-3Z基團取代，其中Z 表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、-NHY3、-C(=O)-NY1Y2，或者-C(=O)-OY3，其中n 表示0、1或2，其中Y1與Y2 相互獨立地表示-H、-NH2或者-(CH2)0-3Z'，其中Y3 表示-H、-(CH2)0-3-CH(NH-C(=O)-CH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'，或者-(CH2)0-3Z'，其中Z' 表示-H、-SO3H、-NH2或者-COOH，R5 表示-H、-NH2、-NO2、鹵素、-CN、-CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、-SH或-(CH2)0-3Z，其中Z 表示-H、-OY3、-SY3、鹵素、-NHY3、-C(=O)-NY1Y2或者-C(=O)-OY3，其中Y1與Y2 相互獨立地表示-H、-NH2或者-(CH2)0-3Z'，其中Y3 表示-H或-(CH2)0-3Z'，其中Z' 表示-H、-SO3H、-NH2或者-COOH；R6與R7 相互獨立地表示-H、氰基、C1-10-烷基、氟-C1-10-烷基、C2-10-烯基、氟-C2-10-烯基、C2-10-炔基、氟-C2-10-炔基、羥基、-NO2、-NH2、-COOH或鹵素，R8 表示C1-10-烷基、氟-C1-10-烷基、C2-10-烯基、氟-C2-10-烯基、C2-10-炔基、氟-C2-10-炔基、C4-10-環烷基、氟-C4-10-環烷基或者-(CH2)0-2-(HZ2)，其中HZ2 表示一4至7員雜環，其包含至多兩個選自N、O及S的雜原子，其中此等基團中的每個皆可經-OH、-COOH或-NH2取代； R9 表示-H、-F、-CH3、-CF3、-CH2F或-CHF2；-MOD 表示-(NR10)n-(G1)o-G2-H，其中R10 表示-H或C1-C3-烷基； G1 表示-NH-C(=O)-、-C(=O)-NH-或
    Figure 105119613-A0305-02-1081-33
    ；n 為0或1；o 為0或1；以及G2 為包含1至10個碳原子之直鏈及/或支鏈烴基，其可單次或多重，相同或不同地間雜有以下基團中的一或多個：-O-、-S-、-S(=O)-、S(=O)2、-NRy-、-NRyC(=O)-、-C(=O)NRy-、-NRyNRy-、-S(=O)2-NRyNRy-、-C(=O)-NRyNRy-C(=O)-、-CRx=N-O-，其中Rx 表示-H、C1-C3-烷基或苯基，其中Ry 表示-H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其分別可經-NH-C(=O)-NH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CN-NH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，其中包括可能存在之側鏈的烴鏈可經-NH-C(=O)-NH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CN-NH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，其中-MOD基團具有至少一-COOH基團；以及其鹽及差向異構體。
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