CN108472371B - Egfr抗体-药物偶联物及其在医药上的应用 - Google Patents
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Abstract
提供一种EGFR抗体‑细胞毒性药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，以及包含前述偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物的药物组合物，以及其作为抗癌药物的用途；尤其在制备用于治疗EGFR介导的疾病或病症的药物中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及一类全新结构的抗体-药物偶联物。具体地说，本发明涉及EGFR抗体变体-细胞毒性药物偶联物，包含所述偶联物的药物组合物，以及所述偶联物或药物组合物在医药上的应用。
背景技术
表皮生长因子受体(EGFR)是一个巨大的跨膜糖蛋白，分子量约为170KDa，属于ErbB受体家族的一个成员。EGFR受体本身是一种酪氨酸激酶，当与配体如EGF、TNF-a等结合后可形成二聚体，通过传递磷酸化作用激活下游信号(如MAPK，PI3K，Stat等通路)，从而维持细胞生长，促进细胞分裂增殖。由于ErbB家族受体的保守性，EGFR还能与家族其他蛋白(如Her2，Her3，Her4)形成异源二聚体，从而更广泛的调控细胞的生长。
EGFR的基因突变或过表达常见于多种表皮细胞起源的恶性肿瘤，如头颈癌，结直肠癌，肺癌，胰腺癌，皮肤癌等，被认为是导致这些癌症的驱动基因。因此针对EGFR为靶点的抗癌药物的研发一直以来是医学界的热点。目前为止，EGFR的小分子酪氨酸激酶抑制剂(如吉非替尼(Gefitinib)，厄洛替尼(Erlotinib))和EGFR单克隆抗体(如西妥昔单抗(Cetuximab)，帕尼单抗(Panitumumab)尼妥珠单抗(Nimotuzumab，EP0699755，EP0712863))等都已经上市，并在临床上取得了显著的效果。不过，这些EGFR靶向药物也并非完美，分别只适用于较小的病人群体。比如小分子抑制剂通常只对拥有特异的EGFR突变型的肺癌患者有效，且在使用一段时间后，常出现耐药性；EGFR单抗通常只对下游KRAS、BRAF、PIK3CA等基因没有产生突变的结直肠癌，头颈癌等病人群体比较有效。不仅如此，这些药物还会部分抑制普通细胞的EGFR正常生理功能，常伴随着皮疹，腹泻等靶点相关的副作用。因此能否找到一种能更有效的针对EGFR的新型抗癌药物，来克服现有EGFR靶向治疗造成的耐药性，扩大适应症，且减少正常组织靶点相关副作用，是我们急需攻克的一个难题。除此之外，抗体的稳定性，药物活性也十分重要，有文献报道可以通过抗体恒定区和框架区的改造来提高抗体的稳定性或ADCC、CDC活性，如CN1237076C、EP2203180等。
抗体药物偶联物(Antibody-Drug Conjugate or ADC)，俗称为“生物导弹”，是一种利用单克隆抗体的特异性，将ADC分子蓄积到到肿瘤微环境，并通过抗体-肿瘤抗原介导的内吞作用将毒素分子定向的输送到癌细胞内部来杀死癌细胞的革命性技术。相对于传统化疗，ADC的毒素分子使用量大大降低，且较多的聚集于病灶，对于正常组织的毒副作用更小；另外，ADC主要是利用毒素分子直接结合于微管束来抑制癌细胞的分裂和增殖，而与单克隆抗体通过抑制受体信号通路起作用的作用机理不同，因此，下游信号蛋白是否存在基因突变对ADC发挥抑制癌细胞的作用不会起到太大影响，所以从理论上讲，ADC可以有比传统疗法更广的适应症，药效也更加强大。。ADC相关文献有WO2007008603、WO2013173393、WO2005081711、WO2013173391、WO2013173392、WO2013173393和WO2012010287等。
发明人的在先申请PCT/CN2016/072129涉及一类新的毒素分子及偶联物，但未公开特定的EGFR抗体的相关偶联物。
仍然需要寻找药效显著、毒副作用小的抗体偶联物；同时，在达到相同药效的情况下降低给药频率，提高依从性，减少治疗费用也是本领域需要解决的一个重要的问题。
发明内容
为了改进配体，特别是抗体和药物的偶联效果，本发明提供了一种通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物：
其中：
L1，L2是接头单元；
y为1-8，优选2-5；
Ab为抗EGFR抗体或其抗原结合片段，所述的抗EGFR抗体或其抗原结合片段包含以下的CDR区：
LCDR1：RSSQNIVHSNGNTYLD SEQ ID NO：7；
LCDR2：KVSNRFS SEQ ID NO：8；
LCDR3：FQYSHVPWT SEQ ID NO：9；
HCDR1：NYYIY SEQ ID NO：10；
HCDR2：GINPTSGGSNFNEKFKT SEQ ID NO：11；
HCDR3：QGLWFDSDGRGFDF； SEQ ID NO：12；
所述的Ab在重链上有M258Y/S260T/T262E(YTE)三个位点突变。
在本发明一个优选的实施方案中，一种通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述的抗EGFR抗体或其抗原结合片段为人源化抗体或其片段。
在本发明一个优选的实施方案中，一种通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述人源化抗体重链可变区进一步包含人源IgG1，IgG2，IgG3或IgG4或其变体的重链FR区，优选包含人源IgG1重链FR区，和/或人源化抗体的轻链可变区进一步包含人源κ链或人源κ链变体的轻链FR区、或者人源λ链或人源λ链变体的轻链FR区。
在本发明一个优选的实施方案中，一种通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述的人源化抗体的重链恒定区包含人源IgG1或其变体、人源IgG2或其变体、人源IgG3或其变体或人源IgG4或其变体的恒定区，优选包含人源IgG1或其变体的恒定区，和/或所述人源化抗体的轻链进一步包含人源κ链或人源κ链变体的轻链恒定区、或人源λ链或人源λ链变体的轻链恒定区。
在本发明一个优选的实施方案中，一种通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中抗EGFR抗体包含：
轻链
重链
在本发明一个优选的实施方案中，一种通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中L2如以下通式(L2)所示：
其中
X1选自氢原子、卤素、羟基、氰基、烷基、烷氧基和环烷基；
X2选自烷基、环烷基和杂环基；
m为0-5，优选1-3；S为硫原子。
在本发明一个优选的实施方案中，一种通式(L2)所示的化合物优选如下结构：
在本发明一个优选的实施方案中，一种通式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中L1为以下通式(L1)所示的化合物：
其中
X3为烷基，所述的烷基任选进一步被卤素、羟基、氰基、烷基的取代基所取代；
n为0-5，优选1-3。
在本发明一个优选的实施方案中，一种通式(L1)所示的化合物优选如下结构：
其中
X3为烷基，所述的烷基任选进一步被卤素、羟基、氰基、烷基的取代基所取代；
n为0-5，优选1-3。
在本发明一个优选的实施方案中，一种通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其选自通式(II)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物：
其中，Ab、L2、y如通式(I)中所定义。
在本发明一个优选的实施方案中，一种通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其选自通式(III)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物：
其中，Ab、L1、y如通式(I)中所定义。
在本发明一个优选的实施方案中，一种通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其具有如下的通式结构：
其中，mAb002包括氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的轻链，和如SEQ ID NO：4所示的重链，y如通式(I)中所定义。
本发明的另一方面涉及一种EGFR抗体，可用于制备如本发明通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，包含序列如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及其变体所示的LCDR1，LCDR2，LCDR3区，及如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及其变体所示的HCDR1，HCDR2，HCDR3区，其特征在于，在重链上具有M258Y/S260T/T262E(YTE)三个位点突变。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种EGFR抗体，可用于制备如本发明通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，所述EGFR抗体包括氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的轻链，和如SEQ ID NO：4所示的重链。
本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其包含如本发明通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，和一种或多种可药用的赋形剂、稀释剂或载体。
本发明进一步提供一种通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，或本发明所述的药物组合物，在制备用于治疗癌症的药物中的用途；优选所述癌症为高表达EGFR的癌症、在EGFR多肽上有突变的癌症和在EGFR信号通路下游基因中有突变的癌症；更优选为胃癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、肠癌、肾癌、黑素瘤、非小细胞肺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌或头颈癌；最优选为肺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌或头颈癌。
本发明进一步提供一种通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，或如上所述包含其的药物组合物，在制备治疗哺乳动物癌症的药物的用途；优选所述癌症为高表达EGFR的癌症、在EGFR多肽上有突变的癌症和在EGFR信号通路下游基因中有突变的癌症；更优选为胃癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、肠癌、肾癌、黑素瘤、非小细胞肺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌或头颈癌；最优选为肺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌或头颈癌。
本发明进一步提供一种治疗哺乳动物癌症的方法，该方法包括对哺乳动物施用有效量的如通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，或包含其的药物组合物；其中所述哺乳动物优选为人；所述癌症优选为高表达EGFR的癌症、在EGFR多肽上有突变的癌症和在EGFR信号通路下游基因中有突变的癌症；更优选为胃癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、肠癌、肾癌、黑素瘤、非小细胞肺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌或头颈癌；最优选为肺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌或头颈癌。
本发明进一步提供一种通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，或本发明所述的药物组合物，在制备用于治疗癌症的药物中的用途；优选所述癌症为在EGFR多肽上有突变的癌症，所述EGFR突变多肽至少包含一个选自以下的EGFR突变：L858R，L858R/T790M，L858R/T790M/C797S，Del19，Del19/T790M，Del19/T790M/C797S，T790M，G719X，L861Q，S768I，Exon 18 indel/E709X，Exon 19 insertion，Exon20insertion，A763_Y764insFQEA，Exon 18-25 duplication和EGFR-RAD51 rearrangement；更优选为EGFR多肽上有突变的胃癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、肠癌、肾癌、黑素瘤、非小细胞肺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌或头颈癌；最优选为肺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌或头颈癌。
本发明进一步提供一种通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，或如上所述包含其的药物组合物，在制备治疗哺乳动物癌症的药物的用途；优选所述癌症为在EGFR多肽上有突变的癌症，所述EGFR突变多肽至少包含一个选自以下的EGFR突变：L858R，L858R/T790M，L858R/T790M/C797S，Del19，Del19/T790M，Del19/T790M/C797S，T790M，G719X，L861Q，S768I，Exon 18 indel/E709X，Exon 19 insertion，Exon20insertion，A763_Y764insFQEA，Exon 18-25 duplication和EGFR-RAD51 rearrangement；更优选为EGFR多肽上有突变的胃癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、肠癌、肾癌、黑素瘤、非小细胞肺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌或头颈癌；最优选为肺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌或头颈癌。
本发明进一步提供一种治疗哺乳动物癌症的方法，该方法包括对哺乳动物施用有效量的如通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，或包含其的药物组合物；其中所述哺乳动物优选为人；优选所述癌症为在EGFR多肽上有突变的癌症，所述EGFR突变多肽至少包含一个选自以下的EGFR突变：L858R，L858R/T790M，L858R/T790M/C797S，Del19，Del19/T790M，Del19/T790M/C797S，T790M，G719X，L861Q，S768I，Exon 18indel/E709X，Exon 19 insertion，Exon20 insertion，A763_Y764insFQEA，Exon 18-25duplication和EGFR-RAD51 rearrangement；更优选为EGFR多肽上有突变的胃癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、肠癌、肾癌、黑素瘤、非小细胞肺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌或头颈癌；最优选为肺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌或头颈癌。
本发明进一步提供一种通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，或本发明所述的药物组合物，在制备用于治疗癌症的药物中的用途；优选所述癌症为EGFR信号通路下游基因有突变的癌症，所述下游基因至少包含一个选自以下的基因Ras，B-Raf，PI3K，其中所述的下游基因突变至少包含选自以下的突变：K-Ras G12V，K-Ras G13D，N-Ras Q61K，H-Ras G12S；B-Raf V600E，B-Raf G468A；PIK3CA H1047R，PIK3CBE633K和p110γE1021K；更优选为EGFR信号通路下游基因有突变的胃癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、肠癌、肾癌、黑素瘤、非小细胞肺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌或头颈癌；最优选为肺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌或头颈癌。
本发明进一步提供一种通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，或如上所述包含其的药物组合物，在制备治疗哺乳动物癌症的药物的用途；优选所述癌症为EGFR信号通路下游基因有突变的癌症，所述下游基因至少包含一个选自以下的基因Ras，B-Raf，PI3K，其中所述的下游基因突变至少包含选自以下的突变：K-RasG12V，K-Ras G13D，N-Ras Q61K，H-Ras G12S；B-Raf V600E，B-Raf G468A；PIK3CA H1047R，PIK3CB E633K和p110γE1021K；更优选为EGFR信号通路下游基因有突变的胃癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、肠癌、肾癌、黑素瘤、非小细胞肺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌或头颈癌；最优选为肺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌或头颈癌。
本发明进一步提供一种治疗哺乳动物癌症的方法，该方法包括对哺乳动物施用有效量的如通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，或包含其的药物组合物；其中所述哺乳动物优选为人；优选所述癌症为EGFR信号通路下游基因有突变的癌症，所述下游基因至少包含一个选自以下的基因Ras，B-Raf，PI3K，其中所述的下游基因突变至少包含选自以下的突变：K-Ras G12V，K-Ras G13D，N-Ras Q61K，H-Ras G12S；B-Raf V600E，B-Raf G468A；PIK3CA H1047R，PIK3CB E633K和p110γE1021K；更优选为EGFR信号通路下游基因有突变的胃癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、肠癌、肾癌、黑素瘤、非小细胞肺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌或头颈癌；最优选为肺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌或头颈癌。
发明详述
除非另有限定，本文所用的所有技术和科学术语均与本发明所属领域普通技术人员的通常理解一致。虽然也可采用与本文所述相似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但本文描述了优选的方法和材料。描述和要求保护本发明时，依据以下定义使用下列术语。
当本发明中使用商品名时，申请人旨在包括该商品名产品的制剂、该商品名产品的非专利药和活性药物部分。
除非有相反陈述，在说明书和权利要求书中使用的术语具有下述含义。
术语“烷基”指饱和脂肪族烃基团，其为包含1至20个碳原子的直链或支链基团，优选含有1至12个碳原子的烷基，更优选含有1至10个碳原子的烷基，最优选含有1至6个碳原子的烷基。非限制性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1，1，2-三甲基丙基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2，3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2，3-二甲基戊基、2，4-二甲基戊基、2，2-二甲基戊基、3，3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2，3-二甲基己基、2，4-二甲基己基、2，5-二甲基己基、2，2-二甲基己基、3，3-二甲基己基、4，4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2，2-二乙基戊基、正癸基、3，3-二乙基己基、2，2-二乙基己基，及其各种支链异构体等。更优选的是含有1至6个碳原子的低级烷基，非限制性实施例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1，1，2-三甲基丙基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2，3-二甲基丁基等。烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氧代基。
术语“环烷基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，环烷基环包含3至20个碳原子，优选包含3至12个碳原子，更优选包含3至10个碳原子，最优选包含3至8个碳原子。单环环烷基的非限制性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环己二烯基、环庚基、环庚三烯基、环辛基等；多环环烷基包括螺环、稠环和桥环的环烷基。
术语“杂环基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，其包含3至20个环原子，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或S(O)m(其中m是整数0至2)的杂原子，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-的环部分，其余环原子为碳。优选包含3至12个环原子，其中1～4个是杂原子；更优选环烷基环包含3至10个环原子。单环杂环基的非限制性实例包括吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、高哌嗪基等。多环杂环基包括螺环、稠环和桥环的杂环基。
术语“烷氧基”指-O-(烷基)和-O-(非取代的环烷基)，其中烷基的定义如上所述。烷氧基的非限制性实例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基。烷氧基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基。
术语“键”指用“-”表示的共价键。
术语“羟基”指-OH基团。
术语“卤素”指氟、氯、溴或碘。
术语“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
术语“药学上可接受的盐”是指本发明抗体-药物偶联物的盐，这类盐用于哺乳动物体内时具有安全性和有效性，且具有应有的生物活性，本发明的抗体-药物偶联物至少含有一个氨基，因此可以与酸形成盐，药学上可接受的盐的非限制性实例包括：盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、柠檬酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、抗坏血酸盐、草酸盐、硝酸盐、梨酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、水杨酸盐、柠檬酸氢盐、酒石酸盐、马来酸盐、富马酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐。
术语“溶剂化合物”指本发明的抗体-药物偶联物与一种或多种溶剂分子形成可药用的溶剂化合物，溶剂分子的非限制性实例包括水、乙醇、乙腈、异丙醇、DMSO、乙酸乙酯。
术语抗体-药物偶联物(antibody drug conjugate，ADC)，指单克隆抗体或者抗体片段通过稳定的化学接头化合物与具有生物活性的细胞毒素相连。
术语“抗原或受体”指存在于目标细胞上可供配体识别和结合目标细胞。本发明中优选在增生性疾病，例如癌症的靶细胞和/或组织上表达的细胞表面抗原或受体。
本发明所述的“抗体”是指表现出所需生物学活性的任何形式的抗体。因此，它以最广义使用，具体地说，包括但不限于全长抗体，抗体结合片段或衍生物。抗体的来源包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、基因工程抗体(例如双特异性抗体)。
术语“全长抗体”是指包含4条多肽链即2条重链和2条轻链通过二硫键相互交联形成多聚体的免疫球蛋白分子(例如IgM)。每条重链包含重链可变区(简称VH)和重链恒定区，重链恒定区包含3个结构域：CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(简称VL)和轻链恒定区，轻链恒定区包含1个结构域(CL1)。VH区和VL区可进一步分为高变区，术语为互补决定区(CDR)，各互补决定区之间穿插着更加保守的结构域，称为框架区(FR)。
术语“抗原结合片段或衍生物”包括任何一种自然发生的，酶催化获得的，合成的，或是通过基因工程得到的可与抗原特异性结合形成复合物的多肽或糖蛋白；通常包括亲本抗体的至少部分抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)，其保留亲本抗体的至少某些结合特异性。“抗体结合片段或衍生物”可能由抗体衍生而来，例如通过适宜的标准技术包括蛋白水解或重组基因工程技术(包括对表达抗体可变区和部分恒定区的DNA进行操作和表达)对抗体全长进行改造而得。“抗原结合片段或衍生物”包括但不限于：(i)Fab片段；(ii)F(ab’)2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)；(vi)dAb片段；和(vii)模拟抗体高变区氨基酸残基的最小识别单元(如一个分离的互补决定区(CDR))。其它工程分子如双价抗体、三价抗体、四价抗体和微抗体也在“抗原结合片段或衍生物”范围内。
术语“EGFR”根据本发明尤其是指人表皮生长因子受体1，也被称为ErbB-1或HER1。EGFR是包含细胞外配体结合结构域，膜-跨结构域和细胞内激酶结构域的受体酪氨酸激酶。结合其配体(例如表皮生长因子(EGF)及转化生长因子α(TGFα))之后，EGFR形成同源二聚体或与其他ErbB受体形成异源二聚体，和其激酶功能活化，导致细胞内结构域的几个酪氨酸的自磷酸化。抗-EGFR抗体是能特异性结合EGFR的抗体。在特定实施方式中，抗-EGFR抗体能干扰或抑制EGFR的活化，例如通过预防配体结合和/或受体二聚化。EGFR活化后可将信号传递至下游效应因子，包括PI3-K，RAS-RAF-MAPK P44/P42和蛋白激酶C信号通路，最终可把信号传递至细胞核，调节细胞增殖。
本发明所述的抗体优选为针对靶细胞上细胞表面抗原的特异性抗体，非限制性实施例为尼妥珠单抗(Nimotuzumab，商品名泰欣生)，是一个以表皮生长因子受体(EGFR)为靶点的单抗药物，可用于治疗恶性肿瘤的人源化单克隆抗体。EGFR在多种实体瘤中过度表达，如头颈癌、肺癌、结直肠癌中，都存在EGFR过度表达现象。
术语“Ras基因”是指人Ras基因家族，该家族包括3种功能性基因，即H-ras、K-ras和N-ras基因((Adjei，2001，J.Nat.Cancer Instit.93：1062-1073)，均含有1个5′非编码外显子和4个编码外显子，编码的产物相对分子质量为均21 000的G蛋白单体，这些蛋白质具有三磷酸岛嘌呤结合位点，在许多各种细胞内信号传递通路中起着重要作用。
术语“Raf基因”是指Raf家族，包括三种细胞同系物，被分别称作A-raf、B-raf和C-raf(也被称为raf-1)。该基因编码高度保守的丝氨酸-苏氨酸-特异的蛋白质激酶，是Ras的效应因子之一，在调节细胞增殖的信号的转导过程中起重要的调节作用。其中，B-Raf具有如基因登记号No.NP_004324所示的完整氨基酸序列。
术语“PI3K基因”是指磷脂酰肌醇-3-激酶基因(phosphoinositide-3-kinase，简称PI3K，也称为磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶)，属于原癌基因，在本发明中，“PI3K”包括PI3K家族的所有成员，所述PI3K家族包括IA类(例如PI3Kα、β和δ)，IB类(例如PI3Kγ)、II类(例如PI3KC2α、β和γ)和III类(例如Vps34酵母同源物)。
术语“细胞毒性药物”是指在肿瘤细胞内具有较强破坏其正常生长的化学分子。细胞毒性药物原则上在足够高的浓度下都可以杀死肿瘤细胞，但是由于缺乏特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时，也会导致正常细胞的凋亡，导致严重的副作用。
术语“接头单元”在本发明中为L1和L2，指一端与抗体共价连接而另一端与细胞毒性药物相连的化学结构片段或键。
术语“载药量”是指分子中每个配体上加载的细胞毒性药物平均数量，也可以表示为药物量和抗体量的比值，药物载量的范围可以是每个配体(Pc)连接1-8个细胞毒性药物，在本发明的实施方式中，载药量表示为y，可用常规方法如UV/可见光光谱法，质谱，ELISA试验和HPLC特征鉴定偶联反应后每个ADC分子的药物品均数量。
在本发明中，y可能受连接位点数量的限制。本发明的一个实施方式中，细胞毒性药物通过接头单元偶联在配体的N端氨基和/或赖氨酸残基的ε-氨基上，一般地，偶联反应中能与抗体偶联的药物分子数将小于理论上的最大值。
可以用以下非限制性方法控制抗体细胞毒性药物偶联物的载量，包括：
(1)控制连接试剂和单抗的摩尔比，
(2)控制反应时间和温度，
(3)选择不同的反应试剂。
术语“载体”用于本发明的药物，是指能改变药物进入人体的方式和在体内的分布、控制药物的释放速度并将药物输送到靶向器官的体系。药物载体释放和靶向系统能够减少药物降解及损失，降低副作用，提高生物利用度。如可作为载体的高分子表面活性剂由于其独特的两亲性结构，可以进行自组装，形成各种形式的聚集体，优选的实例如胶束、微乳液、凝胶、液晶、囊泡等。这些聚集体具有包载药物分子的能力，同时又对膜有良好的渗透性，可以作为优良的药物载体。
术语“赋形剂”是在药物制剂中除主药以外的附加物，也可称为辅料。如片剂中的黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂；半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分；液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂等均可称为赋形剂。
术语“稀释剂”又称填充剂，其主要用途是增加片剂的重量和体积。稀释剂的加入不仅保证一定的体积大小，而且减少主要成分的剂量偏差，改善药物的压缩成型性等。当片剂的药物含有油性组分时，需加入吸收剂吸收油性物，使保持“干燥”状态，以利于制成片剂。如淀粉、乳糖、钙的无机盐、微晶纤维素等。
药物组合物可以是无菌注射水溶液形式。可在使用的可接受的溶媒和溶剂中有水、林格氏液和等渗氯化钠溶液。无菌注射制剂可以是其中活性成分溶于油相的无菌注射水包油微乳。例如将活性成分溶于大豆油和卵磷脂的混合物中。然后将油溶液加入水和甘油的混合物中处理形成微乳。可通过局部大量注射，将注射液或微乳注入患者的血流中。或者，最好按可保持本发明化合物恒定循环浓度的方式给予溶液和微乳。为保持这种恒定浓度，可使用连续静脉内递药装置。这种装置的实例是Deltec CADD-PLUS.TM.5400型静脉注射泵。
药物组合物可以是用于肌内和皮下给药的无菌注射水或油混悬液的形式。可按已知技术，用上述那些适宜的分散剂或湿润剂和悬浮剂配制该混悬液。无菌注射制剂也可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中制备的无菌注射溶液或混悬液，例如1，3-丁二醇中制备的溶液。此外，可方便地用无菌固定油作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可使用包括合成甘油单或二酯在内的任何调和固定油。此外，脂肪酸例如油酸也可以制备注射剂。
附图说明
图1：食蟹猴单次静脉注射5mg/kg的尼妥珠单抗(mAb001)和尼妥珠单抗的IgG1-YTE变体(mAb002)后，两个剂量组动物平均药代动力学参数。
图2：比较本发明ADC-9相对于ADC-8和裸抗mAb002在裸鼠肺癌移植瘤HCC827模型上的体内药效。
具体实施方式
以下结合实施例进一步描述本发明，但这些实施例并非限制本发明的范围。
本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例
化合物的结构是通过核磁共振(NMR)或/和质谱(MS)来确定的。NMR位移(δ)以10-6(ppm)的单位给出。NMR的测定是用Bruker AVANCE-400核磁仪，测定溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)，氘代氯仿(CDCl3)，氘代甲醇(CD3OD)，内标为四甲基硅烷(TMS)。
MS的测定用FINNIGAN LCQAd(ESI)质谱仪(生产商：Thermo，型号：Finnigan LCQadvantage MAX)。
HPLC的测定使用安捷伦1200DAD高压液相色谱仪(Sunfire C18 150×4.6mm色谱柱)和Waters 2695-2996高压液相色谱仪(Gimini C18 150×4.6mm色谱柱)。
手性HPLC分析测定使用LC-10A vp(Shimadzu)或者SFC-analytical(BergerInstruments Inc.)。
薄层层析硅胶板使用烟台黄海HSGF254或青岛GF254硅胶板，薄层色谱法(TLC)使用的硅胶板采用的规格是0.15mm～0.2mm，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm～0.5mm。
柱层析一般使用烟台黄海硅胶200～300目硅胶为载体。
手性制备柱层析使用Prep Star SD-1(Varian Instruments Inc.)或SFC-multigram(Berger Instruments Inc.)。
激酶平均抑制率及IC50值的测定用NovoStar酶标仪(德国BMG公司)。
本发明的已知的起始原料可以采用或按照本领域已知的方法来合成，或可购买自ABCR GmbH&Co.KG、Acros Organics、Aldrich Chemical Company、韶远化学科技(AccelaChemBio Inc)、达瑞化学品等公司。
实施例中无特殊说明，反应能够均在氩气氛或氮气氛下进行。
氩气氛或氮气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氩气或氮气气球。
氢气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氢气气球。
加压氢化反应使用Parr 3916EKX型氢化仪和清蓝QL-500型氢气发生器或HC2-SS型氢化仪。
氢化反应通常抽真空，充入氢气，反复操作3次。
微波反应使用CEM Discover-S 908860型微波反应器。
实施例中无特殊说明，溶液是指水溶液。
实施例中无特殊说明，反应的温度为室温，为20℃～30℃。
实施例中pH＝6.5的PBS缓冲液的配制：取KH2PO48.5g，K2HPO4.3H2O 8.56g，NaCl5.85g，EDTA 1.5g置于瓶中，定容至2L，超声波使其全部溶解，摇匀即得。
实施例中pH＝4.5的乙酸/乙酸钠缓冲液的配制：取9g无水乙酸钠置于瓶中，加入纯化水，定容至2L，摇匀后，加入醋酸钠4.9mL，摇匀即得。
实施例中磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)的配制：0.2M的Na2HPO461mL中加入0.2M的NaH2PO439mL摇匀得0.2M pH＝7的缓冲液。
实施例中的反应进程的监测采用薄层色谱法(TLC)，反应所使用的展开剂的体系有：A：二氯甲烷和甲醇体系，B：正己烷和乙酸乙酯体系，C：石油醚和乙酸乙酯体系，D：丙酮，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节。
纯化化合物采用的柱层析的洗脱剂的体系和薄层色谱法的展开剂体系包括：A：二氯甲烷和甲醇体系，B：正己烷和乙酸乙酯体系，C：二氯甲烷和丙酮体系，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节，也可以加入少量的三乙胺和醋酸等碱性或酸性试剂进行调节。
本发明部分化合物是通过Q-TOF LC/MS来表征的。Q-TOF LC/MS使用安捷伦6530精确质量数四级杆-飞行时间质谱仪和安捷伦1290-Infinity超高效液相色谱仪(安捷伦Poroshell 300SB-C8 5μm，2.1×75mm色谱柱)。
本发明的已知的起始原料可以采用或按照本领域已知的方法来合成，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例1、mAb001抗体的构建和表达
mAb001抗体，为尼妥珠单抗(Nimotuzumab，EGFR抗体)，可以和EGFR靶标特异性结合。可按抗体常规方法进行制备：如可进行载体构建后，转染真核细胞如HEK293细胞(LifeTechnologies Cat.No.11625019)，纯化表达。
序列如下：
mAb001的轻链氨基酸序列：
mAb001的重链氨基酸序列：
其CDR区序列如下：
LCDR1：RSSQNIVHSNGNTYLD SEQ ID NO：7；
LCDR2：KVSNRFS SEQ ID NO：8；
LCDR3：FQYSHVPWT SEQ ID NO：9；
HCDR1：NYYIY SEQ ID NO：10；
HCDR2：GINPTSGGSNFNEKFKT SEQ ID NO：11；
HCDR3：QGLWFDSDGRGFDF SEQ ID NO：12。
实施例2、mAb002抗体的构建和表达
mAb002抗体为尼妥珠单抗通过点突变获得的尼妥珠单抗修饰IgG1-YTE变体。
设计引物PCR搭建抗体VH/VK基因片段，再与表达载体pHr(带信号肽及恒定区基因(CH1-FC/CL)片段)进行同源重组，构建抗体全长表达载体VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr。质粒原始形式为IgG1，通过点突变获得IgG1-YTE抗体形式即M258Y/S260T/T262E(YTE)三个位点突变。最终mAb002抗体序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。质粒经过测序验证后通过领域内熟知的方法提取并进行293细胞瞬转表达获得含有目的抗体蛋白的培养上清供分离纯化。
mAb002的抗体序列：
mAb002轻链氨基酸序列：
mAb002重链氨基酸序列：
注：双下划线即代表YTE突变位点。
在实施例中设计的轻重链DNA序列如下：
mAb002轻链DNA序列：
注：下划线部分为信号肽
mAb002重链DNA序列：
注：下划线部分为信号肽
mAb002抗体纯化分析：
将上述细胞培养上清高速离心去除杂质后上Protein A柱亲和层析。用PBS冲洗柱子，至A280读数降至基线。用100mM乙酸钠pH3.0洗脱目的蛋白，用1M Tris-HCl中和。洗脱样品适当浓缩后进一步利用PBS平衡好的凝胶层析柱Superdex200(GE)进行分子筛提纯，合并收集抗体单体所在吸收峰样品。通过领域内熟知的超滤方法可以对样品进行浓缩或者缓冲液置换，获得最终合适浓度的样品。
实施例3
(S)-2-((2R，3R)-3-((S)-1-((3R，4R，5S)-4-((S)-N，3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯基丙酸
本实施例化合物采用专利申请“WO2005081711”公开的方法制备而得。
MS m/z(ESI)：732.8[M+1]
1H NMR(400MHz，DMSO)δ7.30-7.19(m，5H)，4.71-4.69(m，2H)，4.16-4.15(m，1H)，4.07-4.06(m，1H)，3.86-3.84(m，1H)，3.70-3.66(m，3H)，3.52-3.48(m，1H)，3.41-3.40(m，1H)，3.34(s，4H)，3.28(s，1H)，3.27-3.26(m，1H)，3.22(s，2H)，3.13(s，1H)，295-2.88(m，2H)，2.67-2.65(m，3H)，2.47-2.45(m，2H)，2.33-2.31(m，1H)，2.19-2.18(m，2H)，2.08-2.05(m，1H)，1.89-1.86(m，2H)，1.78-1.76(m，2H)，1.57-1.52(m，2H)，1.43-1.38(m，2H)，1.30-1.261(m，1H)，1.21-1.19(dd，2H)，1.15-1.11(m，3H)，1.07-0.97(m，13H)，0.88-0.85(m，3H)。
实施例4
(S)-2-((2R，3R)-3-((S)-1-((3R，4R，5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2，5-二氧-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N，3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酸
本实施例化合物采用专利申请“WO2005081711”公开的方法制备而得。
MS m/z(ESI)：925.8[M+1]
1H NMR(400MHz，DMSO)δ8.54-8.51(m，1H)，8.35-8.34(m，1H)，8.13-8.11(m，1H)，7.22-7.19(m，5H)，7.00-6.99(m，2H)，4.73-4.68(m，1H)，4.62-4.58(m，2H)，4.45-4.40(m，1H)，3.98-3.94(m，2H)，3.74-3.72(m，1H)，3.62-3.59(m，1H)，3.45-3.43(m，1H)，3.38-3.35(m，2H)，3.27-3.26(m，1H)，3.23(s，1H)，3.18-3.14(m，4H)，3.05-3.03(m，2H)，2.96-2.94(m，1H)，2.90-2.89(m，1H)，2.83-2.81(m，3H)，2.35-2.28(m，2H)，2.24-2.19(m，2H)，2.00-1.98(m，2H)，1.78-1.72(m，2H)，1.51-1.43(m，5H)，1.25-1.21(m，11H)，0.92-0.70(m，18H)。
实施例5
(S)-2-((2R，3R)-3-((1S，3S，5S)-2-((3R，4S，5S)-4-((S)-N，3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸
第一步
(1S，3S，5S)-叔丁酯3-((1R，2R)-1-羟基-2-甲基-3-((4R，5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基噁唑-3-基)-3-羰基丙基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-羧酸5c
将原料(4R，5S)-4-甲基-5-苯基-3-丙酰基噁唑烷酮5b(1.96g，9.26mmol，采用公知的方法“Journal of the American Chemical Society，2003，125(50)，15512-15520”制备而得)溶于25mL二氯甲烷中，氩气氛下，降温至0℃。反应液于0℃下滴加三乙胺(1.49mL，10.93mmol)，再滴加三氟甲磺酸二丁硼(9.7mL，9.72mmol)，于0℃下搅拌50分钟，干冰丙酮浴下将反应液降温至-75℃，加入(1S，3S，5S)-叔丁酯3-甲酰基-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-羧酸5a(2.16g，9.26mmol，采用专利申请“US20100249190”公开的方法制备而得)溶于7mL二氯甲烷的溶液，于-75℃下搅拌1.5小时，于0℃搅拌2小时，于室温搅拌1小时。反应结束后，加入36mL磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)和甲醇(V/V＝1∶3)的混合液。于0℃下加入36mL甲醇和双氧水(30％)(V/V＝2∶1)的混合液，于室温搅拌1小时。减压浓缩除去有机相，加入少量水，用乙醚(50mL×3)萃取，依次用5％碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠溶液(150mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化残留物，得标题产物5c(2.4g，白色泡沫状固体)，产率58.5％。
MS m/z(ESI)：345.1[M-100+1]
第二步
(1S，3S，5S)-叔丁酯3-((1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-((4R，5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基噁唑-3-基)-3-羰基丙基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-羧酸5d
将原料5c(1.4g，3.15mmol)溶于20mL二氯甲烷，加入1.4g碾碎的分子筛，氩气氛下，于0℃下加入1，8-双二甲氨基萘(1.75g，8.19mmol)，三甲基氧鎓四氟硼酸盐(1.16g，7.87mmol)，反应避光，于室温搅拌40小时。反应结束后，过滤，滤饼用二氯甲烷洗涤，滤液用饱和氯化铵溶液(50mL×4)洗去过量1，8-双二甲氨基萘，再用饱和氯化钠溶液(120mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物5d(400mg，白色固体)，产率27.8％。
MS m/z(ESI)：459.4[M+1]。
第三步
(2R，3R)-3-((1S，3S，5S)-2-(叔丁氧羰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸5e
将原料5d(400mg，0.87mmol)溶于24mL四氢呋喃，氩气氛下，降温至0℃，缓慢滴加30％的双氧水(0.34mL/0.38g，3.31mmol)，再加入一水合氢氧化锂(62mg，，1.48mmol)，反应体系于室温反应20小时。反应结束后，向反应液中加入亚硫酸钠固体(440mg，3.48mmol)，于室温搅拌1小时，加入10mL水，减压浓缩掉有机相，所得残余物用二氯甲烷萃取(40mL×2)。水相在冰浴下滴加2N盐酸至反应液pH为3～4，用乙酸乙酯萃取(25mL×3)，乙酸乙酯层依次用水(50mL)，饱和氯化钠溶液(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得标题产物5e(230mg，无色液体)，收率88.0％。
MS m/z(ESI)：200.1[M-100+1]。
第四步
(S)-叔丁酯2-氨基-3-(2-氟苯基)丙酸5g
将原料((S)-2-氨基-3-(2-氟苯基)丙酸5f(400mg，2.18mmol，采用公知的方法“Advanced Synthesis&Catalysis，2012，354(17)，3327-3332”制备而得)溶于10mL乙酸叔丁酯，加入高氯酸(300mg(70％)，3.3mmol)，于室温下搅拌16小时。反应完毕后加入6mL水，分液，有机相用饱和碳酸氢钠溶液(5mL)洗涤。水相用饱和碳酸氢钠溶液调节至pH＝8，二氯甲烷(5mL×3)萃取，合并有机相，依次用水(3mL)，饱和氯化钠溶液(5mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得粗品标题产物5g(390mg，黄色油状物)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
第五步
(1S，3S，5S)-叔丁酯3-((1R，2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-3-(2-氟苯基)-1-羰基丙基-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-羧酸5h
将原料5e(100mg，0.334mmol)溶于6mL二氯甲烷和二甲基甲酰胺(V/V＝5∶1)混合溶剂中，加入反应物粗品5g(80mg，0.334mmol)。再加入N，N-二异丙基乙基胺(0.29mL，1.67mmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(152.3mg，0.40mmol)。反应体系在氩气氛下，于室温搅拌1小时。反应结束后，加10mL水搅拌，分层，二氯甲烷层用饱和氯化钠溶液(10mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物5h(173mg，无色液体)，收率99.5％。
MS m/z(ESI)：521.2[M+1]。
第六步
(S)-叔丁酯2-((2R，3R)-3-((1S，3S，5S)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸5i
将原料5h(173mg，0.33mmol)溶于2mL二氧六环中，加入5.6M的氯化氢二氧六环溶液(0.21mL，1.16mmol)，氩气氛下，于室温搅拌1小时，置于0℃冰箱内12小时。反应结束后，将反应液减压浓缩，加入5mL二氯甲烷稀释，加入10mL饱和碳酸氢钠溶液，搅拌10分钟。体系分层，水层用二氯甲烷萃取(5mL×3)。合并二氯甲烷层，用饱和氯化钠溶液(10mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液减压浓缩，得到粗品标题产品5i(77mg，黄色液体)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
MS m/z(ESI)：421.2[M+1]。
第七步
(S)-叔丁酯2-((2R，3R)-3-((1S，3S，5S)-2-((5S，8S，11S，12R)-11-((S)-仲丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5，8-二异丙基-12-甲氧基-4，10-二甲基-3，6，9-三羰基-2-氧-4，7，10-三氮杂十四烷基-14-酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸5k
将粗品5i(77mg，0.183mmol)，(5S，8S，11S，12R)-11-((S)-仲丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5，8-二异丙基-12-甲氧基-4，10-二甲基-3，6，9-三羰基-2-氧杂-4，7，10-三氮杂十四烷-14-羧酸5j(116.8mg，0.183mmol，采用专利申请“WO 2013072813”公开的方法制备而得)溶于6mL二氯甲烷和二甲基甲酰胺(V/V＝5∶1)混合溶剂中，加入N，N-二异丙基乙基胺(0.16mL，0.915mmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(84mg，0.22mmol)。反应体系在氩气氛下，于室温下搅拌1小时。反应结束后，加入10mL水搅拌，分层。二氯甲烷层用饱和氯化钠溶液(10mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液减压浓缩。用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化残留物，得到标题产品5k(190.5mg，黄色粘稠物)，收率100％。
MS m/z(ESI)：1040.6[M+1]。
第八步
(S)-叔丁酯2-((2R，3R)-3-((1S，3S，5S)-2-((3R，4S，5S)-4-((S)-N，3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸5l
将原料5k(190.5mg，0.183mmol)溶于1.5mL二氯甲烷中，加入2mL二乙胺。反应体系在氩气氛下，于室温搅拌3小时。反应结束后，将反应液减压浓缩，得到粗品标题产品5l(150mg，黄色粘稠物)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
MS m/z(ESI)：818.5[M+1]。
第九步
(S)-2-((2R，3R)-3-((1S，3S，5S)-2-((3R，4S，5S)-4-((S)-N，3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸5
将粗品5l(150mg，0.183mmol)溶于1mL二氧六环中，加入5.6M的氯化氢二氧六环溶液3mL，氩气氛下，于室温搅拌12小时。反应结束后，将反应液减压浓缩，用乙醚带旋溶剂。所得残余物用高效液相色谱法纯化得标题产品5(28mg，白色粉末固体)，收率20％。
MS m/z(ESI)：762.7[M+1]
1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ7.38-7.18(m，2H)，7.13-7.01(m，2H)，4.80-4.67(m，2H)，4.30-4.15(m，1H)，4.13-4.01(m，1H)，3.96-3.83(m，2H)，3.75-3.60(m，2H)，3.42-3.11(m，9H)，3.06-2.95(m，1H)，2.70-2.58(m，4H)，2.28-2.01(m，4H)，1.88-1.70(m，3H)，1.57-1.25(m，4H)，1.22-0.95(m，18H)，0.92-0.80(m，4H)，0.78-0.65(m，1H)。
实施例6
(S)-2-((2R，3R)-3-((1S，3S，5S)-2-((3R，4S，5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2，5-二羰基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N，3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸
第一步
6-(2，5-二羰基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氯6b
在原料6-(2，5-二羰基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸6a(1.5g，7.10mmol，采用公知的方法“Journal of Medcinal Chemistry，2013，56(24)，9955-9968”制备而得)中滴入一滴N，N-二甲基甲酰胺，氩气氛下，干冰浴降温后，缓慢滴入15mL草酰氯，滴加时剧烈搅拌，滴完于室温反应1小时。反应结束后，将反应液减压浓缩，用二氯甲烷溶解所得残留物，减压浓缩，得到粗品标题产物6b，产品不经纯化直接进行下一步反应。
第二步
(S)-2-((2R，3R)-3-((1S，3S，5S)-2-((3R，4S，5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2，5-二羰基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺)-3-甲基丁酰胺)-N，3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-(2-氟苯基)丙酸6
将原料5(25mg，0.033mmol)溶于3mL二氯甲烷中，加入N，N-二异丙基乙基胺(0.029mL，0.164mmol)，反应体系在氩气氛下，冰浴下滴加预制的6b(11.3mg，0.049mmol)的二氯甲烷溶液，于室温反应3小时。反应结束后，加入5mL水，搅拌20分钟，分液，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，残留物用高效液相色谱法纯化得标题产物6(7mg，黄色粘稠物)，收率22.4％。
MS m/z(ESI)：955.4[M+1]
1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ7.36-7.30(m，1H)，7.29-7.21(m，1H)，7.17-7.02(m，2H)，6.83-6.79(m，2H)，4.81-4.71(m，2H)，4.69-4.55(m，2H)，4.25-4.15(m，1H)，4.13-4.04(m，1H)，3.96-3.85(m，2H)，3.70-3.61(m，1H)，3.55-3.46(m，3H)，3.40-3.21(m，4H)，3.18-3.10(m，2H)，3.07-2.96(m，4H)，2.67-2.56(m，2H)，2.54-2.34(m，3H)，2.29-2.17(m，2H)，2.10-1.99(m，1H)，1.89-1.57(m，7H)，1.52-1.28(m，6H)，1.21-1.11(m，4H)，1.07-0.96(m，6H)，0.95-0.81(m，12H)，0.80-0.69(m，1H)。
实施例7 ADC-7的制备
第一步
将硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯(1.61mg，12.2μmol)，溶解于3.0mL乙腈溶液，备用；向含抗体mAb001的pH＝4.3的乙酸/乙酸钠缓冲液(10.22mg/ml，30mL，2.04mmol)加入上述预制的硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯的乙腈溶液，然后滴加1.2mL的氰基硼氢化钠(49.86mg，793μmol)的水溶液，于25℃下振荡反应2小时。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS溶液)，除去未反应的硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯以及氰基硼氢化钠，再浓缩到浓度约为10mg/ml，得到标题产物7a的PBS缓冲溶液(约35mL)，直接进行下一步反应。
第二步
向7a的PBS缓冲溶液(35.0mL)中加入约0.4mL的2.0M盐酸羟胺溶液，加毕，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应30分钟，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱纯化，得到标题产物mAb001-丙硫醇7b的PBS缓冲溶液(浓度5.38mg/ml，55mL)。
第三步
将化合物6(4.32mg，4.52μmol)溶解于1.1mL乙腈中，加入mAb001-丙硫醇PBS缓冲溶液7b(5.38mg/mL，11mL)中，置于水浴振荡器中，于25℃下振荡反应4小时后停止反应。
将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS溶液)，得到粗品标题产物7的PBS缓冲液(2.92mg/mL，20mL)，进一步离心浓缩至5.5mL左右，再用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS溶液)，得到标题结构式产物7的PBS缓冲液(4.25mg/mL，11.6mL)，于4℃冷冻储存。
Q-TOF LC/MS：特征峰：150186.98(MAb+0D)、151374.09(MAb+1D)、152287.22(MAb+2D)、153353.26(MAb+3D)、154501.80(MAb+4D)、155575.57(MAb+5D)。
平均值：y＝2.2。
实施例8 ADC-8的制备
第一步
将硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯(0.7mg，5.3μmol)，溶解于0.9mL乙腈溶液，备用；向含抗体mAb002的pH＝4.3的乙酸/乙酸钠缓冲液(10.13mg/ml，9.0mL，0.95mmol)加入上述预制的硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯的乙腈溶液，然后滴加1.0mL的氰基硼氢化钠(14.1mg，224μmol)的水溶液，于25℃下振荡反应2小时。反应结束后用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS溶液)后得标题产物8a溶液，浓缩到约10mg/ml后直接进行下一步反应。
第二步
向8a溶液(10.0mL)中加入0.3mL的2.0M盐酸羟胺溶液，于25℃下振荡反应30分钟后将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS溶液)后得标题产物mAb002-丙硫醇8b溶液(浓度6.2mg/ml，14mL)。
第三步
将原料4(1.1mg，1.2μmol)溶解于0.3mL乙腈中，加入8b溶液(6.2mg/mL，3.0mL)中，于25℃下振荡反应4小时后将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的含0.05M的PBS溶液)，在无菌条件下通过0.2μm滤器过滤后得标题结构式产物8的PBS缓冲液(3.5mg/mL，4.8mL)，于4℃冷冻储存。
Q-TOF LC/MS：特征峰：150332.9(MAb+0D)、1514911.2(MAb+1D)、152374.3(MAb+2D)、153530.1(MAb+3D)、154450.7(MAb+4D)。
平均值：y＝2.0。
实施例9 ADC-9的制备
将原料6(1.1mg，1.2μmol)溶解于0.3mL乙腈中，加入8b溶液(6.2mg/mL，3.0mL)中，于25℃下振荡反应4小时后将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的含0.05M的PBS溶液)，在无菌条件下通过0.2μm滤器过滤后得标题结构式产物9的PBS缓冲液(3.4mg/mL，4.7mL)，于4℃冷冻储存。
Q-TOF LC/MS：特征峰：150336.6(MAb+0D)、151530.5(MAb+1D)、152436.1(MAb+2D)、153625.1(MAb+3D)、154607.5(MAb+4D)。
平均值：y＝2.0。
生物学评价
测试例1：HCC827细胞增殖实验
一、试验目的：
检测本发明样品对HCC827细胞增殖的抑制作用。
二、试验材料：
本发明样品：ADC-9
阳性对照药：ADC-8
HCC827细胞：中科院细胞库，货号#TCHu153；
CCK-8：Cell Counting Kit-8，购于Dojindo，货号：CK04；
FBS：Fetal Bovine Serum，购于Gibco，货号：10099-141；
RPMI1640：购于Hyclone，货号：SH30809.01B；
VICTOR 3多功能酶标仪(PerkinElmer公司)。
三、试验方法：
1. 96孔板中，每孔加入100μl含5000个HCC827细胞的10％FBS的RPMI1640培养基，培养板放在37℃、5％CO2培养箱中培养16h。
2.将样品用含10％FBS的RPMI1640培养基进行三倍梯度稀释，共稀释10个点，起始稀释浓度为10μg/ml。
3.将前一天铺好的HCC827细胞培养板从培养箱取出，丢弃上层培养液，加入含稀释样品的培养基100μl/孔。每个浓度设置两个复孔，同时设置不加任何药物的对照孔。在37℃、5％CO2条件下连续培养细胞。
4. 72小时后，每孔加入10μl CCK-8溶液显色，放入37℃、5％CO2培养箱中孵育显色2小时，在酶标仪上读取OD450，经Graphpad Prism 5软件处理后即可得IC50。
四、试验结果：
本发明样品的生物活性由上述分析所得，计算所得的IC50值列于下表1：
表1.本发明样品对HCC827细胞的增殖抑制的IC50
| 样品编号 | IC<sub>50</sub>(HCC827)/ng/ml |
| ADC-9 | 92 |
| ADC-8 | 148.7 |
结论：本发明优选样品对HCC827细胞具有明显的增殖抑制活性。
测试例2：Lovo细胞增殖实验
一、试验目的：
检测本发明样品对Lovo细胞增殖的抑制作用。
二、试验材料：
本发明样品：ADC-9
阳性对照药：ADC-8
Lovo细胞：中科院细胞库，货号#TCHu82；
CCK-8：Cell Counting Kit-8，购于Dojindo，货号：CK04；
FBS：Fetal Bovine Serum，购于Gibco，货号：10099-141；
DMEM/F12：购于Hyclone，货号：SH30023.01；
VICTOR 3多功能酶标仪(PerkinElmer公司)。
三、试验方法：
1. 96孔板中，每孔加入100μl含4000个Lovo细胞的10％FBS的DMEM/F12培养基，培养板放在37℃、5％CO2培养箱中培养16h。
2.将样品用含10％FBS的DMEM/F12培养基进行三倍梯度稀释，共稀释10个点，起始稀释浓度为100μg/ml。
3.将前一天铺好的Lovo细胞培养板从培养箱取出，丢弃上层培养液，加入含稀释样品的培养基100μl/孔。每个浓度设置两个复孔，同时设置不加任何药物的对照孔。在37℃、5％CO2条件下连续培养细胞。
4. 72小时后，每孔加入10μl CCK-8溶液显色，放入37℃、5％CO2培养箱中孵育显色2小时，在酶标仪上读取OD450，经Graphpad Prism 5软件处理后即可得IC50。
四、试验结果：
本发明样品的生物活性由上述分析所得，计算所得的IC50值列于下表2：
表2.本发明样品对Lovo细胞的增殖抑制的IC50
| 样品编号 | IC<sub>50</sub>(Lovo)/ng/ml |
| ADC-9 | 934 |
| ADC-8 | 2202 |
结论：本发明优选样品对Lovo细胞具有明显的增殖抑制活性。
测试例3：HCC827-Del19/T790M/C797S(DTC)细胞增殖实验
一、试验目的：
检测本发明样品对HCC827-DTC细胞增殖的抑制作用。
二、试验材料：
本发明样品：ADC-9
对照药：mAb002，AZD-9291
HCC827细胞：中科院细胞库，货号#TCHu153；
HCC827-DTC细胞：在293T细胞中(ATCC，CRL-3216)转染pCDH-EGFR Del19/T790M/C797S(DTC)，ΔR8.9和VSVG，48小时后收集病毒上清，0.45μm滤膜过滤弃掉细胞碎片，50000g离心2小时重悬，将病毒进行10倍浓缩。在前一天铺板的HCC827细胞中加入浓缩病毒，同时加入8μg/ml polybrene，24小时后更换新鲜培养基，48小时后加入2μg/mlpuromycin进行筛选，得到HCC827-DTC细胞。
CCK-8：Cell Counting Kit-8，购于Dojindo，货号：CK04；
FBS：Fetal Bovine Serum，购于Gibco，货号：10099-141；
RPMI1640：购于Hyclone，货号：SH30809.01B；
VICTOR 3多功能酶标仪(PerkinElmer公司)。
三、试验方法：
1. 96孔板中，每孔加入100μl含5000个HCC827-DTC细胞的10％FBS的RPMI1640培养基(puromycin 2μg/ml)，培养板放在37℃、5％CO2培养箱中培养16h。
2.将样品用含10％FBS的RPMI1640培养基进行梯度稀释，共稀释10个点。抗体和ADC起始稀释浓度为10ug/ml(66.7nM)，进行3倍稀释。AZD-9291起始稀释浓度为2500nM，进行4倍稀释。
3.将前一天铺好的HCC827-DTC细胞培养板从培养箱取出，丢弃上层培养液，加入含稀释样品的培养基100μl/孔。每个浓度设置两个复孔，同时设置不加任何药物的对照孔。在37℃、5％CO2条件下连续培养细胞。
4. 72小时后，每孔加入10μl CCK-8溶液显色，放入37℃、5％CO2培养箱中孵育显色2小时，在酶标仪上读取OD450，经Graphpad Prism 5软件处理后即可得IC50。
四、试验结果：
本发明样品的生物活性由上述分析所得，计算所得的IC50值列于下表3：
表3.本发明样品对HCC827-DTC细胞的增殖抑制的IC50
结论：非小细胞肺癌HCC827细胞在表达EGFR-DTC基因之后，对AZD-9291产生明显耐药性；裸抗mAb002对该细胞也只有部分抑制效果。但是本发明样品ADC-9对耐药株HCC827-DTC有很强的增殖抑制活性。
测试例4：H1975-L858R/T790M/C797S(LTC)细胞增殖实验
一、试验目的：
检测本发明样品对H1975-LTC细胞增殖的抑制作用。
二、试验材料：
本发明样品：ADC-9
对照药：mAb002，AZD-9291
H1975细胞：中科院细胞库，货号#TCHu193；
H1975-LTC细胞：293T细胞(ATCC，CRL-3216)转染pCDH-EGFR L858R/T790M/C797S(LTC)，ΔR8.9和VSVG，48小时后收集病毒上清，0.45μm滤膜过滤弃掉细胞碎片，50000g离心2小时重悬，将病毒进行10倍浓缩。在前一天铺板的H1975细胞中加入浓缩病毒，同时加入8μg/ml polybrene，24小时后更换新鲜培养基，48小时后加入2μg/ml puromycin进行筛选，得到H1975-LTC细胞。
CCK-8：Cell Counting Kit-8，购于Dojindo，货号：CK04；
FBS：Fetal Bovine Serum，购于Gibco，货号：10099-141；
RPMI1640：购于Hyclone，货号：SH30809.01B；
VICTOR 3多功能酶标仪(PerkinElmer公司)。
三、试验方法：
1. 96孔板中，每孔加入100μl含5000个H1975-LTC细胞的10％FBS的RPMI1640培养基(puromycin 2μg/ml)，培养板放在37℃、5％CO2培养箱中培养16h。
2.将样品用含10％FBS的RPMI1640培养基进行梯度稀释，共稀释10个点。抗体和ADC起始稀释浓度为10ug/ml(66.7nM)，进行3倍稀释。AZD-9291起始稀释浓度为2500nM，进行4倍稀释。
3.将前一天铺好的H1975-LTC细胞培养板从培养箱取出，丢弃上层培养液，加入含稀释样品的培养基100μl/孔。每个浓度设置两个复孔，同时设置不加任何药物的对照孔。在37℃、5％CO2条件下连续培养细胞。
4. 72小时后，每孔加入10μl CCK-8溶液显色，放入37℃、5％CO2培养箱中孵育显色2小时，在酶标仪上读取OD450，经Graphpad Prism 5软件处理后即可得IC50。
四、试验结果：
本发明样品的生物活性由上述分析所得，计算所得的IC50值列于下表4：
表4.本发明样品对H1975-LTC细胞的增殖抑制的IC50
| 样品编号 | IC<sub>50</sub>(H1975-LTC)/nM |
| ADC-9 | 5.96 |
| mAb002 | No inhibition |
| AZD-9291 | ＞2500 |
结论：非小细胞肺癌H1975细胞在表达EGFR-LTC基因之后，对AZD-9291产生明显耐药性；裸抗mAb002对该细胞也几乎没有任何抑制效果。但是本发明样品ADC-9对耐药株H1975-LTC有很强的增殖抑制活性。
测试例5：EGFR抗体食蟹猴药代动力学测试
一、试验目的：
比较mAb002相对于尼妥珠单抗(mAb001)在食蟹猴体内的药代动力学变化。
二、试验材料：
本发明样品：mAb002(尼妥珠单抗的IgG1-YTE变体)
阳性对照药：mAb001，尼妥珠单抗注射液，购于百泰生物，货号0120131240
PBS：购于生工生物，货号PD0100
BSA：购于Amresco，货号0332
Proclin300：购于Supelco，货号48912-U
EGFR：购于Sino Biological，货号10001-H08H
Anti-Human IgG(Fc)-过氧化物酶：购于Sigma，货号A0170
人IgG：购于R&D；货号1-001-A
酶标仪：购于Thermo Scientific，型号Multiskan FC，货号EQP-LI-030
三、试验方法：
ELISA是一个常用于生物血清样本检测药代动力学的方法。本研究采用ELISA方法检测食蟹猴血清中待测抗体的浓度。
2组食蟹猴(每组3只)分别采用恒流泵静脉推注5mg/kg的mAb001和mAb002抗体，于给药前(0h)及给药结束后5min(±10s)、2h(±2min)、4h(±5min)、8h(±5min)、1d(±10min)、2d(±10min)、3d(±10min)、5d(±10min)、7d(±10min)、10d(±10min)、13d(±10min)、17d(±10min)、21d(±10min)、28d(±10min)从下肢隐静脉采集约1mL全血，将血液样本于室温静置1h～2h至充分凝结后，4℃ 4000g离心5分钟分离得到血清。
采用EGFR包被微孔板，以捕获稀释后血清样本中的待测抗体。检测抗体为HRP标记的羊抗人IgG抗体(针对Fc段)。HRP催化TMB底物产生可溶性蓝色化合物，盐酸溶液终止反应，并于工作波长450nm、参比波长620nm处检测吸光值，OD值的大小与样品中的待测抗体的浓度正相关。采用SoftMax Pro v5.4.1软件，分别对待测抗体浓度对数值(X轴)和OD值(Y轴)绘制标准曲线，并进行四参数Logistic模型拟合，采用权重1/y的加权方式得到曲线参数。未知样品通过其OD值于标准曲线回归计算得到样品血药浓度。
四、实验结果：
食蟹猴单次静脉注射5mg/kg的mAb001和mAb002后，两个剂量组动物平均药代动力学参数见下表5和图1。
表5
mAb002组与mAb001组平均Cmax基本一致，说明进入动物体内的药量基本一致，但mAb002组较mAb001组在食蟹猴体内的药代动力学特征存在明显差异，表现为AUC(0-28d)高、末端消除半衰期长、清除率低、平均滞留时间长，说明经过突变后的抗体mAb002(尼妥珠单抗的IgG1-YTE变体)的猴药代特性得到了显著提升。
测试例6：EGFR-ADC体内药效实验
一、试验目的：
比较本发明ADC-9相对于ADC-8和裸抗mAb002在裸鼠肺癌移植瘤HCC827模型上的体内药效。
二、试验材料：
本发明样品：ADC-9
ADC-8
mAb002
HCC827细胞：中科院细胞库，货号#TCHu153；
受试动物：裸小鼠，SPF，16-20g，♀，北京维通利华实验动物技术有限公司。
三、试验方法：
1裸小鼠实验室环境适应三天，随机分成5组，每组9只。
2肿瘤细胞移植
裸小鼠右肋部皮下接种HCC827细胞(5×106+50％matrigel/mouse)，接种后第7天，肿瘤长至202.07±6.22mm3(d1)开始给药。
3给药剂量及方法
给药途径腹腔注射(ip)，一周一次，共3次，具体给药方案见表1。
4移植瘤体积及裸小鼠体重测定
每周测定2次瘤体积，称量体重并记录数据。
5数据统计
使用Excel统计软件：平均值以avg计算；SD值以STDEV计算；SEM值以STDEV/SQRT计算；组间差异P值以TTEST计算。
肿瘤体积(V)计算公式为：V＝1/2×L长×L短 2
相对体积(RTV)＝VT/V0
抑瘤率(％)＝(CRTV-TRTV)/CRTV(％)
其中V0、VT分别为实验开始时及实验结束时的肿瘤体积。CRTV、TRTV分别为实验结束时的空白对照组(Blank)及实验组的相对肿瘤体积。
四、实验结果：
抑瘤效果见下表6和图2
表6
本次实验结果显示mAb002(尼妥珠单抗的IgG1-YTE变体，见实施例2)，ADC-8(见实施例8)和ADC-9(见实施例9)对小鼠肺癌移植瘤HCC827都有显著的抑瘤效果。其中ADC-9在同剂量(0.1mg/只)或更低剂量(0.03mg/只)下，都显示出比裸抗mAb002(0.1mg/只)更明显的抑瘤效果，说明ADC-9相比裸抗在药效上的优势。另外，不同的ADC在相同剂量下(0.03mg/只)进行对比，ADC-9显示出比ADC-8更好的药效，在给药34天的抑瘤率分别为65.33％vs.48.96％，说明带有毒素化合物6(原形为化合物5)的ADC比带有毒素化合物4(MC-MMAF，其原形为化合物3)的ADC显示出更强的抑瘤活性。
Claims (16)
1.一种通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐：
其中：
L1如以下通式所示：
其中X3为C1-6烷基；n为0-5；
L2如以下通式所示：
其中X1选自氢原子、C1-6烷基和C1-6烷氧基；X2为C1-6烷基；m为0-5；S为硫原子；
y为1-8；
Ab为抗EGFR抗体或其抗原结合片段，所述的抗EGFR抗体或其抗原结合片段包含以下的CDR区：
其中所述的Ab在重链上具有M258Y/S260T/T262E三个位点突变。
2.如权利要求1所述的通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的y为2-5。
3.如权利要求1所述的通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的抗EGFR抗体或其抗原结合片段为人源化抗体或其片段。
4.如权利要求1所述的通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述人源化抗体的重链可变区进一步包含人源IgG1,IgG2,IgG3或IgG4的重链FR区，和/或人源化抗体的轻链可变区进一步包含人源κ链或人源λ链的轻链FR区。
5.如权利要求1所述的通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述人源化抗体的重链可变区进一步包含人源IgG1的重链FR区,和/或人源化抗体的轻链可变区进一步包含人源κ链或人源λ链的轻链FR区。
6.如权利要求1所述的通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述人源化抗体的重链包含人源IgG1、人源IgG2、人源IgG3或人源IgG4的恒定区，和/或所述人源化抗体的轻链进一步包含人源κ链或人源λ链的轻链恒定区。
7.如权利要求1所述的通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述人源化抗体的重链包含人源IgG1的恒定区，和/或所述人源化抗体的轻链进一步包含人源κ链或人源λ链的轻链恒定区。
8.如权利要求1所述的通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中抗EGFR抗体包括氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的轻链，和如氨基酸序列SEQ ID NO:4所示的重链。
9.如权利要求1所述的通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中m为1-3。
10.如权利要求1所述的通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中n为1-3。
11.如权利要求1所述的通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其为通式(II)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐：
其中，Ab、L2、y如权利要求1中所定义。
12.如权利要求1所述的通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其为通式(III)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐：
其中，Ab、L1、y如权利要求1中所定义。
13.如权利要求1所述的通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其为如下式所示的化合物：
其中，mAb002包括氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的轻链，和如SEQ ID NO:4所示的重链，y如权利要求1中所定义。
14.一种药物组合物，其包含如权利要求1所述的通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，和一种或多种可药用的赋形剂、稀释剂或载体。
15.如权利要求1所述的通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或如权利要求14所述的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述的癌症选自肺癌、结肠癌、直肠癌和结直肠癌。
16.如权利要求1所述的通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或如权利要求14所述的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述的癌症为肺腺癌或非小细胞肺癌。
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