TW201801752A - Ｅｇｆｒ抗體－藥物偶聯物及其在醫藥上的應用 - Google Patents

Abstract

本發明涉及EGFR抗體-藥物偶聯物及其在醫藥上的應用。具體而言，本發明涉及EGFR抗體變體-細胞毒性藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，以及包含前述偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物的醫藥組成物，以及其作為抗癌藥物的用途；尤其在製備用於治療EGFR介導的疾病或病症的藥物中的用途。

Description

EGFR抗體-藥物偶聯物及其在醫藥上的應用

本發明涉及一類全新結構的抗體-藥物偶聯物。具體地說，本發明涉及EGFR抗體變體-細胞毒性藥物偶聯物，包含所述偶聯物的醫藥組成物，以及所述偶聯物或醫藥組成物在醫藥上的應用。

表皮生長因子受體(EGFR)是一個巨大的跨膜糖蛋白，分子量約為170KDa，屬於ErbB受體家族的一個成員。EGFR受體本身是一種酪胺酸激酶，當與配體如EGF、TNF-a等結合後可形成二聚體，藉由傳遞磷酸化作用激活下游信號(如MAPK、PI3K、Stat等通路)，從而維持細胞生長，促進細胞分裂增殖。由於ErbB家族受體的保守性，EGFR還能與家族其他蛋白(如Her2,Her3,Her4)形成異源二聚體，從而更廣泛的調控細胞的生長。

EGFR的基因突變或過表達常見於多種表皮細胞起源的惡性腫瘤，如頭頸癌、結直腸癌、肺癌、胰腺癌、皮膚癌等，被認為是導致這些癌症的驅動基因。因此針對EGFR為靶點的抗癌藥物的研發一直以來是醫學界的熱點。目前 為止，EGFR的小分子酪胺酸激酶抑制劑(如吉非替尼(Gefitinib)、厄洛替尼(Erlotinib))和EGFR單株抗體(如西妥昔單抗(Cetuximab)、帕尼單抗(Panitumumab)、尼妥珠單抗(Nimotuzumab、EP0699755、EP0712863))等都已經上市，並在臨床上取得了顯著的效果。不過，這些EGFR靶向藥物也並非完美，分別只適用於較小的病人群體。比如小分子抑制劑通常只對擁有特異的EGFR突變型的肺癌患者有效，且在使用一段時間後，常出現耐藥性；EGFR單抗通常只對下游KRAS、BRAF、PIK3CA等基因没有產生突變的結直腸癌，頭頸癌等病人群體比較有效。不僅如此，這些藥物還會部分抑制普通細胞的EGFR正常生理功能，常伴隨著皮疹，腹瀉等靶點相關的副作用。因此能否找到一種能更有效的針對EGFR的新型抗癌藥物，來克服現有EGFR靶向治療造成的耐藥性，擴大適應症，且減少正常組織靶點相關副作用，是我們急需攻克的一個難題。除此之外，抗體的穩定性，藥物活性也十分重要，有文獻報導可以藉由抗體恒定區和框架區的改造來提高抗體的穩定性或ADCC、CDC活性，如CN1237076C、EP2203180等。

抗體藥物偶聯物(Antibody-Drug Conjugate or ADC)，俗稱為“生物導彈”，是一種利用單株抗體的特異性，將ADC分子蓄積到到腫瘤微環境，並藉由抗體-腫瘤抗原介導的內吞作用將毒素分子定向的輸送到癌細胞內部來殺死癌細胞的革命性技術。相對於傳統化療，ADC的毒素分子使用量大大降低，且較多的聚集於病灶，對於正常組織的毒副作 用更小；另外，ADC主要是利用毒素分子直接結合於微管束來抑制癌細胞的分裂和增殖，而與單株抗體藉由抑制受體信號通路起作用的作用機理不同，因此，下游信號蛋白是否存在基因突變對ADC發會抑制癌細胞的作用不會起到太大影響，所以從理論上講，ADC可以有比傳統療法更廣的適應症，藥效也更加强大。。ADC相關文獻有WO2007008603、WO2013173393、WO2005081711、WO2013173391、WO2013173392、WO2013173393和WO2012010287等。

發明人的在先申請PCT/CN2016/072129涉及一類新的毒素分子及偶聯物，但未公開特定的EGFR抗體的相關偶聯物。

仍然需要尋找藥效顯著、毒副作用小的抗體偶聯物；同時，在達到相同藥效的情况下降低給藥頻率，提高依從性，減少治療費用也是本領域需要解決的一個重要的問題。

為了改進配體，特別是抗體和藥物的偶聯效果，本發明提供了一種通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物：

其中： L₁，L₂是接頭單元；y為1-8，較佳為2-5；Ab為抗EGFR抗體或其抗原結合片段，該抗EGFR抗體或其抗原結合片段包含以下的CDR區：LCDR1：RSSQNIVHSNGNTYLD SEQ ID NO：7；LCDR2：KVSNRFS SEQ ID NO：8；LCDR3：FQYSHVPWT SEQ ID NO：9；HCDR1：NYYIY SEQ ID NO：10；HCDR2：GINPTSGGSNFNEKFKT SEQ ID NO：11；HCDR3：QGLWFDSDGRGFDF；SEQ ID NO：12；所述的Ab在重鏈上有M258Y/S260T/T262E(YTE)三個位點突變。

在本發明一個較佳的實施方案中，一種通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中該抗EGFR抗體或其抗原結合片段為人源化抗體或其片段。

在本發明一個較佳的實施方案中，一種通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中該人源化抗體重鏈可變區進一步包含人源IgG1,IgG2,IgG3或IgG4或其變體的重鏈FR區，較佳包含人源IgG1重鏈FR區，和/或人源化抗體的輕鏈可變區進一步包含人源κ鏈或人源κ鏈變體的輕鏈FR區、或者人源λ鏈或人源λ鏈變體的輕鏈FR區。

在本發明一個較佳的實施方案中，一種通式(I)所示的 抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中該人源化抗體的重鏈恒定區包含人源IgG1或其變體、人源IgG2或其變體、人源IgG3或其變體或人源IgG4或其變體的恒定區，較佳包含人源IgG1或其變體的恒定區，和/或該人源化抗體的輕鏈進一步包含人源κ鏈或人源κ鏈變體的輕鏈恒定區、或人源λ鏈或人源λ鏈變體的輕鏈恒定區。

在本發明一個較佳的實施方案中，一種通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中抗EGFR抗體包含：輕鏈

SEQ ID NO：3；重鏈

SEQ ID NO：4。

在本發明一個較佳的實施方案中，一種通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中L₂如以下通式(L₂)所示：

其中X₁選自氫原子、鹵素、羥基、氰基、烷基、烷氧基和環烷基；X₂選自烷基、環烷基和雜環基；m為0-5，較佳為1-3；S為硫原子。

在本發明一個較佳的實施方案中，一種通式(L₂)所示的化合物較佳如下結構：

在本發明一個較佳的實施方案中，一種通式(I)所示的化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中L1為以下通式(L₁)所示的化合物：

其中X₃為烷基，該的烷基視需要進一步被鹵素、羥基、氰基、烷基的取代基所取代；n為0-5，較佳為1-3。

在本發明一個較佳的實施方案中，一種通式(L₁)所示的化合物較佳如下結構：

其中X₃為烷基，該的烷基視需要進一步被鹵素、羥基、氰基、烷基的取代基所取代；n為0-5，較佳為1-3。

在本發明一個較佳的實施方案中，一種通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其選自通式(II)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物：

其中，Ab、L₂、y如通式(I)中所定義。

在本發明一個較佳的實施方案中，一種通式(I)所示的 抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其選自通式(III)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物：

其中，Ab、L₁、y如通式(I)中所定義。

在本發明一個較佳的實施方案中，一種通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其具有如下的通式結構：

其中，mAb002包括胺基酸序列如SEQ ID NO：3所示的輕鏈，和如SEQ ID NO：4所示的重鏈，y如通式(I)中所定義。

本發明的另一方面涉及一種EGFR抗體，可用於製備如本發明通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，包含序列如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及其變體所示的LCDR1，LCDR2，LCDR3區，及如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及其變體所示的HCDR1，HCDR2，HCDR3區，其特徵在於，在重鏈上具有M258Y/S260T/T262E(YTE)三個位點突變。

在本發明一個較佳的實施方案中，提供一種EGFR抗體，可用於製備如本發明通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，該EGFR抗體包括胺基酸序列如SEQ ID NO：3所示的輕鏈，和如SEQ ID NO：4所示的重鏈。

本發明的另一方面涉及一種醫藥組成物，其包含如本發明通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，和一種或多種可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。

本發明進一步提供一種通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，或本發明所述的醫藥組成物，在製備用於治療癌症的藥物中的用途；較佳地，該癌症為高表達EGFR的癌症、在EGFR多肽上有突變的癌症和在EGFR信號通路下游基因中有突變的癌症；更佳為胃癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、腸癌、腎癌、黑素瘤、非小細胞肺癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌或頭頸癌；最佳為肺癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌或頭頸癌。

本發明進一步提供一種通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，或如上所述包含其的醫藥組成物，在製備治療哺乳動物癌症的藥物的用途；較佳地，該癌症為高表達EGFR的癌症、在EGFR多肽上有突變的癌症和在EGFR信號通路下游基因中有突變的癌症；更佳為胃癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、腸癌、腎癌、黑素瘤、非小細胞肺癌、結腸癌、直腸癌、結 直腸癌或頭頸癌；最佳為肺癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌或頭頸癌。

本發明進一步提供一種治療哺乳動物癌症的方法，該方法包括對哺乳動物施用有效量的如通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥学上可接受的鹽或溶劑化合物，或包含其的醫藥組成物；其中該哺乳動物較佳為人；該癌症較佳為高表達EGFR的癌症、在EGFR多肽上有突變的癌症和在EGFR信號通路下游基因中有突變的癌症；更佳為胃癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、腸癌、腎癌、黑素瘤、非小細胞肺癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌或頭頸癌；最佳為肺癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌或頭頸癌。

本發明進一步提供一種通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，或本發明所述的醫藥組成物，在製備用於治療癌症的藥物中的用途；較佳地，該癌症為在EGFR多肽上有突變的癌症，該EGFR突變多肽至少包含一個選自以下的EGFR突變：L858R、L858R/T790M、L858R/T790M/C797S、Del19、Del19/T790M、Del19/T790M/C797S、T790M、G719X、L861Q、S768I、外顯子(Exon)18 indel/E709X、外顯子19插入(insertion)、外顯子20插入、A763_Y764insFQEA、外顯子18-25重複(duplication)和EGFR-RAD51重排(rearrangement)；更佳為EGFR多肽上有突變的胃癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、腸癌、腎癌、黑素瘤、非小細胞肺癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌或頭頸癌；最佳為肺癌、結腸癌、直腸癌、 結直腸癌或頭頸癌。

本發明進一步提供一種通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，或如上所述包含其的醫藥組成物，在製備治療哺乳動物癌症的藥物的用途；較佳地，該癌症為在EGFR多肽上有突變的癌症，該EGFR突變多肽至少包含一個選自以下的EGFR突變：L858R、L858R/T790M、L858R/T790M/C797S、Del19、Del19/T790M、Del19/T790M/C797S、T790M、G719X、L861Q、S768I、外顯子18 indel/E709X、外顯子19插入、外顯子20插入、A763_Y764insFQEA、外顯子18-25重複和EGFR-RAD51重排；更佳為EGFR多肽上有突變的胃癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、腸癌、腎癌、黑素瘤、非小細胞肺癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌或頭頸癌；最佳為肺癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌或頭頸癌。

本發明進一步提供一種治療哺乳動物癌症的方法，該方法包括對哺乳動物施用有效量的如通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥学上可接受的鹽或溶劑化合物，或包含其的醫藥組成物；其中該哺乳動物較佳為人；較佳地，該癌症為在EGFR多肽上有突變的癌症，該EGFR突變多肽至少包含一個選自以下的EGFR突變：L858R、L858R/T790M、L858R/T790M/C797S、Del19、Del19/T790M、Del19/T790M/C797S、T790M、G719X、L861Q、S768I、外顯子18 indel/E709X、外顯子19插入、外顯子20插入、A763_Y764insFQEA、外顯子18-25重複和EGFR-RAD51 重排；更佳為EGFR多肽上有突變的胃癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、腸癌、腎癌、黑素瘤、非小細胞肺癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌或頭頸癌；最佳為肺癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌或頭頸癌。

本發明進一步提供一種通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥学上可接受的鹽或溶劑化合物，或本發明所述的醫藥組成物，在製備用於治療癌症的藥物中的用途；較佳地，該癌症為EGFR信號通路下游基因有突變的癌症，該下游基因至少包含一個選自以下的基因Ras、B-Raf、PI3K，其中該下游基因突變至少包含選自以下的突變：K-Ras G12V、K-Ras G13D、N-Ras Q61K、H-Ras G12S；B-Raf V600E、B-Raf G468A；PIK3CA H1047R、PIK3CB E633K和p110 γ E1021K；更佳為EGFR信號通路下游基因有突變的胃癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、腸癌、腎癌、黑素瘤、非小細胞肺癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌或頭頸癌；最佳為肺癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌或頭頸癌。

本發明進一步提供一種通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥学上可接受的鹽或溶劑化合物，或如上所述包含其的醫藥組成物，在製備治療哺乳動物癌症的藥物的用途；較佳地，該癌症為EGFR信號通路下游基因有突變的癌症，該下游基因至少包含一個選自以下的基因Ras，B-Raf，PI3K，其中該下游基因突變至少包含選自以下的突變：K-Ras G12V,K-Ras G13D,N-Ras Q61K,H-Ras G12S；B-Raf V600E,B-Raf G468A；PIK3CA H1047R,PIK3CB E633K 和p110 γ E1021K；更較佳為EGFR信號通路下游基因有突變的胃癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、腸癌、腎癌、黑素瘤、非小細胞肺癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌或頭頸癌；最佳為肺癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌或頭頸癌。

本發明進一步提供一種治療哺乳動物癌症的方法，該方法包括對哺乳動物施用有效量的如通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥学上可接受的鹽或溶劑化合物，或包含其的醫藥組成物；其中該哺乳動物較佳為人；較佳地，該癌症為EGFR信號通路下游基因有突變的癌症，該下游基因至少包含一個選自以下的基因Ras、B-Raf、PI3K，其中該下游基因突變至少包含選自以下的突變：K-Ras G12V、K-Ras G13D、N-Ras Q61K、H-Ras G12S；B-Raf V600E、B-Raf G468A；PIK3CA H1047R、PIK3CB E633K和p110 γ E1021K；更佳為EGFR信號通路下游基因有突變的胃癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、腸癌、腎癌、黑素瘤、非小細胞肺癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌或頭頸癌；最佳為肺癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌或頭頸癌。

[發明詳述]

除非另有限定，本文所用的所有技術和科學術語均與本發明所屬領域普通技術人員的通常理解一致。雖然也可採用與本文所述相似或等同的任何方法和材料實施或測試本發明，但本文描述了較佳的方法和材料。描述和要求保護本發明時，依據以下定義使用下列術語。

當本發明中使用商品名時，申請人旨在包括該商品名 產品的製劑、該商品名產品的非專利藥和活性藥物部分。

除非有相反陳述，在說明書和申請專利範圍書中使用的術語具有下述含義。

術語“烷基”指飽和脂肪族烴基團，其為包含1至20個碳原子的直鏈或支鏈基團，較佳含有1至12個碳原子的烷基，更佳含有1至10個碳原子的烷基，最佳含有1至6個碳原子的烷基。非限制性實例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、第二丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基，及其各種支鏈異構體等。更佳的是含有1至6個碳原子的低級烷基，非限制性實施例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、第二丁基、正戊基、 1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。烷基可以是取代的或非取代的，當被取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上被取代，該取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、酮基。

術語“環烷基”指飽和或部分不飽和單環或多環環狀烴取代基，環烷基環包含3至20個碳原子，較佳包含3至12個碳原子，更佳包含3至10個碳原子，最佳包含3至8個碳原子。單環環烷基的非限制性實例包括環丙基、環丁基、環戊基、環戊烯基、環己基、環己烯基、環己二烯基、環庚基、環庚三烯基、環辛基等；多環環烷基包括螺環、稠環和橋環的環烷基。

術語“雜環基”指飽和或部分不飽和單環或多環環狀烴取代基，其包含3至20個環原子，其中一個或多個環原子為選自氮、氧或S(O)_m(其中m是整數0至2)的雜原子，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-的環部分，其餘環原子為碳。較佳包含3至12個環原子，其中1~4個是雜原子；更佳環烷基環包含3至10個環原子。單環雜環基的非限制 性實例包括吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、嗎啉基、硫代嗎啉基、高哌嗪基等。多環雜環基包括螺環、稠環和橋環的雜環基。

術語“烷氧基”指-O-(烷基)和-O-(非取代的環烷基)，其中烷基的定義如上所述。烷氧基的非限制性實例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、環丙氧基、環丁氧基、環戊氧基、環己氧基。烷氧基可以是視需要取代的或非取代的，當被取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基。

術語“鍵”指用“-”表示的共價鍵。

術語“羥基”指-OH基團。

術語“鹵素”指氟、氯、溴或碘。

術語“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，以及其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。

術語“藥學上可接受的鹽”是指本發明抗體-藥物偶聯物的鹽，這類鹽用於哺乳動物體內時具有安全性和有效性，且具有應有的生物活性，本發明的抗體-藥物偶聯物至少含有一個胺基，因此可以與酸形成鹽，藥學上可接受的 鹽的非限制性實例包括：鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、琥珀酸鹽、抗壞血酸鹽、草酸鹽、硝酸鹽、梨酸鹽、磷酸氫鹽、磷酸二氫鹽、水楊酸鹽、檸檬酸氫鹽、酒石酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽。

術語“溶劑化合物”指本發明的抗體-藥物偶聯物與一種或多種溶劑分子形成可藥用的溶劑化合物，溶劑分子的非限制性實例包括水、乙醇、乙腈、異丙醇、DMSO、乙酸乙酯。

術語抗體-藥物偶聯物(antibody drug conjugate，ADC)，指單株抗體或者抗體片段藉由穩定的化學接頭化合物與具有生物活性的細胞毒素相連。

術語“抗原或受體”指存在於目標細胞上可供配體識別和結合目標細胞。本發明中較佳在增生性疾病，例如癌症的靶細胞和/或組織上表達的細胞表面抗原或受體。

本發明所述的“抗體”是指表現出所需生物學活性的任何形式的抗體。因此，它以最廣義使用，具體地說，包括但不限於全長抗體，抗體結合片段或衍生物。抗體的來源包括但不限於單株抗體、多株抗體、基因工程抗體(例如雙特異性抗體)。

術語“全長抗體”是指包含4條多肽鏈即2條重鏈和2條輕鏈藉由二硫鍵相互交聯形成多聚體的免疫球蛋白分子(例如IgM)。每條重鏈包含重鏈可變區(簡稱VH)和 重鏈恒定區，重鏈恒定區包含3個結構域：CH1、CH2和CH3。每條輕鏈包含輕鏈可變區(簡稱VL)和輕鏈恒定區，輕鏈恒定區包含1個結構域(CL1)。VH區和VL區可進一步分為高變區，術語為互補決定區(CDR)，各互補決定區之間穿插著更加保守的結構域，稱為框架區(FR)。

術語“抗原結合片段或衍生物”包括任何一種自然發生的，酶催化獲得的，合成的，或是藉由基因工程得到的可與抗原特異性結合形成複合物的多肽或糖蛋白；通常包括親本抗體的至少部分抗原結合區或可變區(例如一個或多個CDR)，其保留親本抗體的至少某些結合特異性。“抗體結合片段或衍生物”可能由抗體衍生而來，例如藉由適宜的標準技術包括蛋白水解或重組基因工程技術(包括對表達抗體可變區和部分恒定區的DNA進行操作和表達)對抗體全長進行改造而得。“抗原結合片段或衍生物”包括但不限於：(i)Fab片段；(ii)F(ab’)₂片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)單鏈Fv(scFv)；(vi)dAb片段；和(vii)模擬抗體高變區胺基酸殘基的最小識別單元(如一個分離的互補決定區(CDR))。其它工程分子如雙價抗體、三價抗體、四價抗體和微抗體也在“抗原結合片段或衍生物”範圍內。

術語“EGFR”根據本發明尤其是指人表皮生長因子受體1，也被稱為ErbB-1或HER1。EGFR是包含細胞外配體結合結構域，膜-跨結構域和細胞內激酶結構域的受體酪胺酸激酶。結合其配體(例如表皮生長因子(EGF)及轉化生 長因子α(TGF α))之後，EGFR形成同源二聚體或與其他ErbB受體形成異源二聚體，和其激酶功能活化，導致細胞內結構域的幾個酪胺酸的自磷酸化。抗-EGFR抗體是能特異性結合EGFR的抗體。在特定實施方式中，抗-EGFR抗體能干擾或抑制EGFR的活化，例如藉由預防配體結合和/或受體二聚化。EGFR活化後可將信號傳遞至下游效應因子，包括PI3-K,RAS-RAF-MAPK P44/P42和蛋白激酶C信號通路，最終可把信號傳遞至細胞核，調節細胞增殖。

本發明所述的抗體較佳為針對靶細胞上細胞表面抗原的特異性抗體，非限制性實施例為尼妥珠單抗(Nimotuzumab，商品名泰欣生)，是一個以表皮生長因子受體(EGFR)為靶點的單抗藥物，可用於治療惡性腫瘤的人源化單株抗體。EGFR在多種實體瘤中過度表達，如頭頸癌、肺癌、結直腸癌中，都存在EGFR過度表達現象。

術語“Ras基因”是指人Ras基因家族，該家族包括3種功能性基因，即H-ras、K-ras和N-ras基因((Adjei,2001,J.Nat.Cancer Instit.93：1062-1073)，均含有1個5'非編碼外顯子和4個編碼外顯子，編碼的產物相對分子品質為均21 000的G蛋白單體，這些蛋白質具有三磷酸島嘌呤結合位點，在許多各種細胞內信號傳遞通路中發揮重要作用。

術語“Raf基因”是指Raf家族，包括三種細胞同系物，被分別稱作A-raf、B-raf和C-raf(也被稱為raf-1)。該基因編碼高度保守的絲胺酸-蘇胺酸-特異的蛋白質激酶，是Ras的效應因子之一，在調節細胞增殖的信號的轉 導過程中起重要的調節作用。其中，B-Raf具有如基因登記號No.NP_004324所示的完整胺基酸序列。

術語“PI3K基因”是指磷脂醯肌醇-3-激酶基因(phosphoinositide-3-kinase，簡稱PI3K，也稱為磷脂醯肌醇-4,5-二磷酸3-激酶)，屬於原癌基因，在本發明中，“PI3K”包括PI3K家族的所有成員，該PI3K家族包括IA類(例如PI3K α、β和δ)，IB類(例如PI3K γ)、II類(例如PI3KC2 α、β和γ)和III類(例如Vps34酵母同源物)。

術語“細胞毒性藥物”是指在腫瘤細胞內具有較強破壞其正常生長的化學分子。細胞毒性藥物原則上在足夠高的濃度下都可以殺死腫瘤細胞，但是由於缺乏特異性，在殺傷腫瘤細胞的同時，也會導致正常細胞的凋亡，導致嚴重的副作用。

術語“接頭單元”在本發明中為L1和L2，指一端與抗體共價連接而另一端與細胞毒性藥物相連的化學結構片段或鍵。

術語“載藥量”是指分子中每個配體上載入的細胞毒性藥物平均數量，也可以表示為藥物量和抗體量的比值，藥物載量的範圍可以是每個配體(Pc)連接1-8個細胞毒性藥物，在本發明的實施方式中，載藥量表示為y，可用常規方法如UV/可見光光譜法、質譜、ELISA試驗和HPLC特徵鑒定偶聯反應後每個ADC分子的藥物品均數量。

在本發明中，y可能受連接位點數量的限制。本發明 的一個實施方式中，細胞毒性藥物藉由接頭單元偶聯在配體的N端胺基和/或賴胺酸殘基的ε-胺基上，一般地，偶聯反應中能與抗體偶聯的藥物分子數將小於理論上的最大值。

可以用以下非限制性方法控制抗體細胞毒性藥物偶聯物的載量，包括：(1)控制連接試劑和單抗的莫耳比，(2)控制反應時間和溫度，(3)選擇不同的反應試劑。

術語“載體”用於本發明的藥物，是指能改變藥物進入人體的方式和在體內的分佈、控制藥物的釋放速度並將藥物輸送到靶向器官的體系。藥物載體釋放和靶向系統能夠減少藥物降解及損失，降低副作用，提高生物利用度。如可作為載體的高分子表面活性劑由於其獨特的兩親性結構，可以進行自組裝，形成各種形式的聚集體，較佳的實例如膠束、微乳液、凝膠、液晶、囊泡等。這些聚集體具有包載藥物分子的能力，同時又對膜有良好的滲透性，可以作為優良的藥物載體。

術語“賦形劑”是在藥物製劑中除主藥以外的附加物，也可稱為輔料。如片劑中的黏合劑、填充劑、崩解劑、潤滑劑；半固體製劑軟膏劑、霜劑中的基質部分；液體製劑中的防腐劑、抗氧劑、矯味劑、芳香劑、助溶劑、乳化劑、增溶劑、滲透壓調節劑、著色劑等均可稱為賦形劑。

術語“稀釋劑”又稱填充劑，其主要用途是增加片劑 的重量和體積。稀釋劑的加入不僅保證一定的體積大小，而且減少主要成分的劑量偏差，改善藥物的壓縮成型性等。當片劑的藥物含有油性組分時，需加入吸收劑吸收油性物，使保持“乾燥”狀態，以利於製成片劑。如澱粉、乳糖、鈣的無機鹽、微晶纖維素等。

醫藥組成物可以是無菌注射水溶液形式。可在使用的可接受的溶媒和溶劑中有水、林格氏液和等滲氯化鈉溶液。無菌注射製劑可以是其中活性成分溶於油相的無菌注射水包油微乳。例如將活性成分溶於大豆油和卵磷脂的混合物中。然後將油溶液加入水和甘油的混合物中處理形成微乳。可藉由局部大量注射，將注射液或微乳注入患者的血流中。或者，最好按可保持本發明化合物恒定迴圈濃度的方式給予溶液和微乳。為保持這種恒定濃度，可使用連續靜脈內遞藥裝置。這種裝置的實例是Deltec CADD-PLUS.TM.5400型靜脈注射泵。

醫藥組成物可以是用於肌內和皮下給藥的無菌注射水或油混懸液的形式。可按已知技術，用上述那些適宜的分散劑或濕潤劑和懸浮劑配製該混懸液。無菌注射製劑也可以是在無毒腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中製備的無菌注射溶液或混懸液，例如1,3-丁二醇中製備的溶液。此外，可方便地用無菌固定油作為溶劑或懸浮介質。為此目的，可使用包括合成甘油單或二酯在內的任何調和固定油。此外，脂肪酸例如油酸也可以製備注射劑。

第1圖為食蟹猴單次靜脈注射5mg/kg的尼妥珠單抗(mAb001)和尼妥珠單抗的IgG1-YTE變體(mAb002)後，兩個劑量組動物平均藥物代謝動力學參數圖。

第2圖為比較本發明ADC-9相對於ADC-8和裸抗mAb002在裸鼠肺癌移植瘤HCC827模型上的體內藥效圖。

以下結合實施例進一步描述本發明，但這些實施例並非限制本發明的範圍。

本發明實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未注明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。

實施例

化合物的結構是藉由核磁共振(NMR)或/和質譜(MS)來確定的。NMR位移(δ)以10^-6(ppm)的單位給出。NMR的測定是用Bruker AVANCE-400核磁儀，測定溶劑為氘代二甲基亞碸(DMSO-d ₆)，氘代氯仿(CDCl₃)，氘代甲醇(CD₃OD),內標為四甲基矽烷(TMS)。

MS的測定用FINNIGAN LCQAd(ESI)質譜儀(生產商：Thermo,型號：Finnigan LCQ advantage MAX)。

HPLC的測定使用安捷倫1200DAD高壓液相色譜儀(Sunfire C18 150×4.6mm色譜管柱)和Waters 2695-2996高壓液相色譜儀(Gimini C18 150×4.6mm色譜管柱)。

手性HPLC分析測定使用LC-10A vp(Shimadzu)或者SFC-analytical(Berger Instruments Inc.)。

薄層層析矽膠板使用煙臺黃海HSGF254或青島GF254矽膠板，薄層色譜法(TLC)使用的矽膠板採用的規格是0.15mm~0.2mm，薄層層析分離純化產品採用的規格是0.4mm~0.5mm。

管柱層析一般使用煙臺黃海矽膠200~300目矽膠為載體。

手性製備管柱層析使用Prep Star SD-1(Varian Instruments Inc.)或SFC-multigram(Berger Instruments Inc.)。

激酶平均抑制率及IC₅₀值的測定用NovoStar酶標儀(德國BMG公司)。

本發明的已知的起始原料可以採用或按照本領域已知的方法來合成，或可購買自ABCR GmbH & Co.KG、Acros Organics、Aldrich Chemical Company、韶遠化學科技(Accela ChemBio Inc)、達瑞化學品等公司。

實施例中無特殊說明，反應能夠均在氬氣氛或氮氣氛下進行。

氬氣氛或氮氣氛是指反應瓶連接一個約1L容積的氬氣或氮氣氣球。

氫氣氛是指反應瓶連接一個約1L容積的氫氣氣球。

加壓氫化反應使用Parr 3916EKX型氫化儀和清藍QL-500型氫氣發生器或HC2-SS型氫化儀。

氫化反應通常抽真空，充入氫氣，重複操作3次。

微波反應使用CEM Discover-S 908860型微波反應器。

實施例中無特殊說明，溶液是指水溶液。

實施例中無特殊說明，反應的溫度為室溫，為20℃~30℃。

實施例中pH=6.5的PBS緩衝液的配製：取KH₂PO₄8.5g，K₂HPO₄.3H₂O 8.56g，NaCl 5.85g，EDTA 1.5g置於瓶中，定容至2L，超聲波使其全部溶解，搖勻即得。

實施例中pH=4.5的乙酸/乙酸鈉緩衝液的配製：取9g無水乙酸鈉置於瓶中，加入純化水，定容至2L，搖勻後，加入醋酸鈉4.9mL，搖勻即得。

實施例中磷酸鹽緩衝液(pH=7.0)的配製：0.2M的Na₂HPO₄ 61mL中加入0.2M的NaH₂PO₄ 39mL搖勻得0.2M pH=7的緩衝液。

實施例中的反應進程的監測採用薄層色譜法(TLC)，反應所使用的展開劑的體系有：A：二氯甲烷和甲醇體系，B：正己烷和乙酸乙酯體系，C：石油醚和乙酸乙酯體系，D：丙酮，溶劑的體積比根據化合物的極性不同而進行調節。

純化化合物採用的管柱層析的洗脫劑的體系和薄層色譜法的展開劑體系包括：A：二氯甲烷和甲醇體系，B：正己烷和乙酸乙酯體系，C：二氯甲烷和丙酮體系，溶劑的體積比根據化合物的極性不同而進行調節，也可以加入少量的三乙胺和醋酸等鹼性或酸性試劑進行調節。

本發明部分化合物是藉由Q-TOF LC/MS來表徵的。Q-TOF LC/MS使用安捷倫6530精確質量數四級杆-飛行時間質譜儀和安捷倫1290-Infinity超高效液相色譜儀(安捷倫 Poroshell 300SB-C8 5μm,2.1×75mm色譜管柱)。

本發明的已知的起始原料可以採用或按照本領域已知的方法來合成，實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未注明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。

實施例1、mAb001抗體的構建和表達

mAb001抗體，為尼妥珠單抗(Nimotuzumab，EGFR抗體)，可以和EGFR靶標特異性結合。可按抗體常規方法進行製備：如可進行載體構建後，轉染真核細胞如HEK293細胞(Life Technologies Cat.No.11625019)，純化表達。

序列如下：mAb001的輕鏈胺基酸序列：

SEQ ID NO：1；mAb001的重鏈胺基酸序列：

SEQ ID NO：2。其CDR區序列如下：LCDR1：RSSQNIVHSNGNTYLD SEQ ID NO：7；LCDR2：KVSNRFS SEQ ID NO：8；LCDR3：FQYSHVPWT SEQ ID NO：9；HCDR1：NYYIY SEQ ID NO：10；HCDR2：GINPTSGGSNFNEKFKT SEQ ID NO：11；HCDR3：QGLWFDSDGRGFDF SEQ ID NO：12。

實施例2、mAb002抗體的構建和表達

mAb002抗體為尼妥珠單抗藉由位點突變獲得的尼妥珠單抗修飾IgG1-YTE變體。

設計引物PCR搭建抗體VH/VK基因片段，再與表達載體pHr(帶信號肽及恒定區基因(CH1-FC/CL)片段)進行同源重組,構建抗體全長表達載體VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr。質粒原始形式為IgG1，藉由點突變獲得IgG1-YTE抗體形式即M258Y/S260T/T262E(YTE)三個位點突變。最終mAb002抗體序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。質粒經過測序驗證後藉由領域內熟知的方法提取並進行293細胞瞬轉 表達獲得含有目的抗體蛋白的培養上清供分離純化。mAb002的抗體序列：mAb002輕鏈胺基酸序列：

SEQ ID NO：3；mAb002重鏈胺基酸序列：

SEQ ID NO：4。注：雙底線即代表YTE突變位點。在實施例中設計的輕重鏈DNA序列如下：mAb002輕鏈DNA序列：

SEQ ID NO：5；注：底線部分為信號肽mAb002重鏈DNA序列：

SEQ ID NO：6。注：底線部分為信號肽

mAb002抗體純化分析：

將上述細胞培養上清高速離心去除雜質後上Protein A管柱親和層析。用PBS沖洗管柱，至A280讀數降至基線。用100mM乙酸鈉pH3.0洗脫目的蛋白，用1M Tris-HCl中和。洗脫樣品適當濃縮後進一步利用PBS平衡好的凝膠層析管柱Superdex200(GE)進行分子篩提純，合併收集抗體單體所在吸收峰樣品。藉由領域內熟知的超濾方法可以對樣品進行濃縮或者緩衝液置換，獲得最終合適濃度的樣品。

實施例3 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯基丙酸

本實施例化合物採用專利申請“WO2005081711”公開的方法製備而得。

MS m/z(ESI)：732.8[M+1]

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ 7.30-7.19(m,5H),4.71-4.69(m,2H),4.16-4.15(m,1H),4.07-4.06(m,1H),3.86-3.84(m,1H),3.70-3.66(m,3H),3.52-3.48(m,1H),3.41-3.40(m,1H),3.34(s,4H),3.28(s,1H),3.27-3.26(m,1H),3.22(s,2H),3.13(s,1H),295-2.88(m,2H),2.67-2.65(m,3H),2.47-2.45(m,2H),2.33-2.31(m,1H),2.19-2.18(m,2H),2.08-2.05(m,1H),1.89-1.86(m,2H),1.78-1.76(m,2H),1.57-1.52(m,2H),1.43-1.38(m,2H),1.30-1.261(m,1H),1.21-1.19(dd,2H),1.15-1.11(m,3H),1.07-0.97(m,13H),0.88-0.85(m,3H)。

實施例4 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸

本實施例化合物採用專利申請“WO2005081711”公開的方法製備而得。

MS m/z(ESI)：925.8[M+1]

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ 8.54-8.51(m,1H),8.35-8.34(m,1H),8.13-8.11(m,1H),7.22-7.19(m,5H),7.00-6.99(m,2H),4.73-4.68(m,1H),4.62-4.58(m,2H),4.45-4.40(m,1H),3.98-3.94(m,2H),3.74-3.72(m,1H),3.62-3.59(m,1H),3.45-3.43(m,1H),3.38-3.35(m,2H),3.27-3.26(m,1H),3.23(s,1H),3.18-3.14(m,4H),3.05-3.03(m,2H),2.96-2.94(m,1H),2.90-2.89(m,1H),2.83-2.81(m,3H),2.35-2.28(m,2H),2.24-2.19(m,2H),2.00-1.98(m,2H),1.78-1.72(m,2H),1.51-1.43(m,5H),1.25-1.21(m,11H),0.92-0.70(m,18H)。

實施例5 (S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸

第一步 (1S,3S,5S)-3-((1R,2R)-1-羥基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基噁唑-3-基)-3-羰基丙基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-2-羧酸第三丁酯5c

將原料(4R,5S)-4-甲基-5-苯基-3-丙醯基噁唑烷酮5b(1.96g，9.26mmol，採用公知的方法“Journal of the American Chemical Society,2003,125(50),15512-15520”製備而得)溶於25mL二氯甲烷中，氬氣氛下，降溫至0℃。反應液於0℃下滴加三乙胺(1.49mL，10.93mmol)，再滴加三氟甲磺酸二丁硼(9.7mL，9.72mmol)，於0℃下攪拌50分鐘，乾冰丙酮浴下將反應液降溫至-75℃，加入(1S,3S,5S)-3-甲醯基-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-2-羧酸第三丁酯5a(2.16g，9.26mmol，採用專利申請“US20100249190” 公開的方法製備而得)溶於7mL二氯甲烷的溶液，於-75℃下攪拌1.5小時，於0℃攪拌2小時，於室溫攪拌1小時。反應結束後，加入36mL磷酸鹽緩衝液(pH=7.0)和甲醇(V/V=1：3)的混合液。於0℃下加入36mL甲醇和雙氧水(30%)(V/V=2：1)的混合液，於室溫攪拌1小時。減壓濃縮除去有機相，加入少量水，用乙醚(50mL×3)萃取，依次用5%碳酸氫鈉溶液，飽和氯化鈉溶液(150mL)洗滌，用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠管柱色譜法以洗脫劑體系B純化殘留物，得標題產物5c(2.4g，白色泡沫狀固體)，產率58.5%。

MS m/z(ESI)：345.1[M-100+1]

第二步 (1S,3S,5S)-3-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基噁唑-3-基)-3-羰基丙基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-2-羧酸第三丁酯5d

將原料5c(1.4g，3.15mmol)溶於20mL二氯甲烷，加入1.4g碾碎的分子篩，氬氣氛下，於0℃下加入1,8-雙二甲胺基萘(1.75g，8.19mmol)，三甲基氧鎓四氟硼酸鹽(1.16g，7.87mmol)，反應避光，於室溫攪拌40小時。反應結束後，過濾，濾餅用二氯甲烷洗滌，濾液用飽和氯化銨溶液(50mL×4)洗去過量1,8-雙二甲胺基萘，再用飽和氯化鈉溶液(120mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠管柱色譜法以洗脫劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物5d(400mg，白色固體)，產率27.8%。

MS m/z(ESI)：459.4[M+1]。

第三步 (2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(第三丁氧羰基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸5e

將原料5d(400mg，0.87mmol)溶於24mL四氫呋喃，氬氣氛下，降溫至0℃，緩慢滴加30%的雙氧水(0.34mL/0.38g，3.31mmol)，再加入一水合氫氧化鋰(62mg,，1.48mmol)，反應體系於室溫反應20小時。反應結束後，向反應液中加入亞硫酸鈉固體(440mg，3.48mmol)，於室溫攪拌1小時，加入10mL水，減壓濃縮掉有機相，所得殘餘物用二氯甲烷萃取(40mL×2)。水相在冰浴下滴加2N鹽酸至反應液pH為3~4，用乙酸乙酯萃取(25mL×3)，乙酸乙酯層依次用水(50mL)，飽和氯化鈉溶液(50mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮得標題產物5e(230mg，無色液體)，收率88.0%。

MS m/z(ESI)：200.1[M-100+1]。

第四步 (S)-2-胺基-3-(2-氟苯基)丙酸第三丁酯5g

將原料((S)-2-胺基-3-(2-氟苯基)丙酸5f(400mg，2.18mmol，採用公知的方法“Advanced Synthesis & Catalysis,2012,354(17),3327-3332”製備而得)溶於10mL乙酸第三丁酯，加入高氯酸(300mg(70%)，3.3mmol)，於室溫下攪拌16小時。反應完畢後加入6mL水，分液，有機相用飽和碳酸氫鈉溶液(5mL)洗滌。水相用飽和碳酸氫鈉溶液調 節至pH=8，二氯甲烷(5mL×3)萃取，合併有機相，依次用水(3mL)，飽和氯化鈉溶液(5mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮得粗製品標題產物5g(390mg，黃色油狀物)，產品不經純化直接進行下一步反應。

第五步 (1S,3S,5S)-3-((1R,2R)-3-(((S)-1-(第三丁氧基)-3-(2-氟苯基)-1-羰基丙基-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-2-羧酸第三丁酯5h

將原料5e(100mg，0.334mmol)溶於6mL二氯甲烷和二甲基甲醯胺(V/V=5：1)混合溶劑中，加入反應物粗製品5g(80mg，0.334mmol)。再加入N,N-二異丙基乙基胺(0.29mL，1.67mmol)和2-(7-偶氮苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽(152.3mg，0.40mmol)。反應體系在氬氣氛下，於室溫攪拌1小時。反應結束後，加10mL水攪拌，分層，二氯甲烷層用飽和氯化鈉溶液(10mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用矽膠管柱色譜法以洗脫劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物5h(173mg，無色液體)，收率99.5%。

MS m/z(ESI)：521.2[M+1]。

第六步 (S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸第三丁酯5i

將原料5h(173mg，0.33mmol)溶於2mL二噁烷中， 加入5.6M的氯化氫二噁烷溶液(0.21mL，1.16mmol)，氬氣氛下，於室溫攪拌1小時，置於0℃冰箱內12小時。反應結束後，將反應液減壓濃縮，加入5mL二氯甲烷稀釋，加入10mL飽和碳酸氫鈉溶液，攪拌10分鐘。體系分層，水層用二氯甲烷萃取(5mL×3)。合併二氯甲烷層，用飽和氯化鈉溶液(10mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥。過濾，濾液減壓濃縮，得到粗製品標題產品5i(77mg，黃色液體)，產品不經純化直接進行下一步反應。

MS m/z(ESI)：421.2[M+1]。

第七步 (S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧-4,7,10-三氮雜十四烷基-14-醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸第三丁酯5k

將粗製品5i(77mg，0.183mmol)，(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷-14-羧酸5j(116.8mg，0.183mmol，採用專利申請“WO 2013072813”公開的方法製備而得)溶於6mL二氯甲烷和二甲基甲醯胺(V/V=5：1)混合溶劑中，加入N,N-二異丙基乙基胺(0.16mL，0.915mmol)和2-(7-偶氮苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽(84mg，0.22mmol)。反應體系在氬氣氛下，於室溫下攪拌1小時。反應結束後， 加入10mL水攪拌，分層。二氯甲烷層用飽和氯化鈉溶液(10mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥。過濾，濾液減壓濃縮。用矽膠管柱色譜法以洗脫劑體系B純化殘留物，得到標題產品5k(190.5mg，黃色黏稠物)，收率100%。

MS m/z(ESI)：1040.6[M+1]。

第八步 (S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸第三丁酯51

將原料5k(190.5mg，0.183mmol)溶於1.5mL二氯甲烷中，加入2mL二乙胺。反應體系在氬氣氛下，於室溫攪拌3小時。反應結束後，將反應液減壓濃縮，得到粗製品標題產品51(150mg，黃色黏稠物)，產品不經純化直接進行下一步反應。

MS m/z(ESI)：818.5[M+1]。

第九步 (S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸5

將粗製品51(150mg，0.183mmol)溶於1mL二噁烷中，加入5.6M的氯化氫二噁烷溶液3mL，氬氣氛下，於室溫攪拌12小時。反應結束後，將反應液減壓濃縮，用乙 醚帶旋溶劑。所得殘餘物用高效液相色譜法純化得標題產品5(28mg，白色粉末固體)，收率20%。

MS m/z(ESI)：762.7[M+1]

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)：δ 7.38-7.18(m,2H),7.13-7.01(m,2H),4.80-4.67(m,2H),4.30-4.15(m,1H),4.13-4.01(m,1H),3.96-3.83(m,2H),3.75-3.60(m,2H),3.42-3.11(m,9H),3.06-2.95(m,1H),2.70-2.58(m,4H),2.28-2.01(m,4H),1.88-1.70(m,3H),1.57-1.25(m,4H),1.22-0.95(m,18H),0.92-0.80(m,4H),0.78-0.65(m,1H)。

實施例6 (S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸

第一步 6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯氯6b

在原料6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸6a(1.5g，7.10mmol，採用公知的方法“Journal of Medcinal Chemistry,2013,56(24),9955-9968”製備而得)中滴入一滴N,N-二甲基甲醯胺，氬氣氛下，乾冰浴降溫後，緩慢滴入15mL草醯氯，滴加時劇烈攪拌，滴完於室溫反應1小時。反應結束後，將反應液減壓濃縮，用二氯甲烷溶解所得殘留物，減壓濃縮，得到粗製品標題產物6b，產品不經純化直接進行下一步反應。

第二步 (S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸6

將原料5(25mg，0.033mmol)溶於3mL二氯甲烷中，加入N,N-二異丙基乙基胺(0.029mL，0.164mmol)，反應體系在氬氣氛下，冰浴下滴加預製的6b(11.3mg，0.049mmol)的二氯甲烷溶液，於室溫反應3小時。反應結束後，加入5mL水，攪拌20分鐘，分液，有機層用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，殘留物用高效液相色譜法純化得標題產物6(7mg，黃色黏稠物)，收率22.4%。

MS m/z(ESI)：955.4[M+1]

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)：δ 7.36-7.30(m,1H),7.29-7.21(m,1H),7.17-7.02(m,2H),6.83-6.79(m,2H),4.81-4.71(m,2H),4.69-4.55(m,2H),4.25-4.15(m,1H),4.13-4.04(m,1H),3.96-3.85(m,2H),3.70-3.61(m,1H),3.55-3.46(m,3H),3.40-3.21(m,4H),3.18-3.10(m,2H),3.07-2.96(m,4H),2.67-2.56(m,2H),2.54-2.34(m,3H),2.29-2.17(m,2H),2.10-1.99(m,1H),1.89-1.57(m,7H),1.52-1.28(m,6H),1.21-1.11(m,4H),1.07-0.96(m,6H),0.95-0.81(m,12H),0.80-0.69(m,1H)。

實施例7 ADC-7的製備

第一步

將硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯(1.61mg，12.2μmol)，溶解於3.0mL乙腈溶液，備用；向含抗體mAb001的pH=4.3的乙酸/乙酸鈉緩衝液(10.22mg/ml，30mL，2.04mmol)加入上述預製的硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯的乙腈溶液，然後滴加1.2mL的氰基硼氫化鈉(49.86mg,793μmol)的水溶液，於25℃下振盪反應2小時。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS溶液)，除去未反應的硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯以及氰基硼氫化鈉，再濃縮到濃度約為10mg/ml，得到標題產物7a的PBS緩衝溶液(約35mL)，直接進行下一步反應。

第二步

向7a的PBS緩衝溶液(35.0mL)中加入約0.4mL的2.0M鹽酸羥胺溶液，加畢，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應30分鐘，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱純化，得到標題產物mAb001-丙硫醇7b的PBS緩衝溶液(濃度5.38mg/ml，55mL)。

第三步

將化合物6(4.32mg，4.52μmol)溶解於1.1mL乙腈中，加入mAb001-丙硫醇PBS緩衝溶液7b(5.38mg/mL，11mL)中，置於水浴振盪器中，於25℃下振盪反應4小時後停止反應。

將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS溶液)，得到粗製品標題產物7的PBS緩衝液(2.92mg/mL，20mL)，進一步離心濃縮至5.5mL左右，再用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS溶液)，得到標題結構式產物7的PBS緩衝液(4.25mg/mL，11.6mL)，於4℃冷凍儲存。

Q-TOF LC/MS：特徵峰：150186.98(M_Ab+0D)、151374.09(M_Ab+1D)、152287.22(M_Ab+2D)、153353.26(M_Ab+3D)、154501.80(M_Ab+4D)、155575.57(M_Ab+5D)。

平均值：y=2.2。

實施例8 ADC-8的製備

第一步

將硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯(0.7mg，5.3μmol)，溶解於0.9mL乙腈溶液，備用；向含抗體mAb002的pH=4.3的乙酸/乙酸鈉緩衝液(10.13mg/ml，9.0mL，0.95mmol)加入上述預製的硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯的乙腈溶液，然後滴加1.0mL的氰基硼氫化鈉(14.1mg,224μmol)的水溶液，於25℃下振盪反應2小時。反應結束後用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS溶液)後得標題產物8a溶液，濃縮到約10mg/ml後直接進行下一步反應。

第二步

向8a溶液(10.0mL)中加入0.3mL的2.0M鹽酸羥胺溶液，於25℃下振盪反應30分鐘後將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS溶液)後得標題產物mAb002-丙硫醇8b溶液(濃度6.2mg/ml，14mL)。

第三步

將原料4(1.1mg，1.2μmol)溶解於0.3mL乙腈中，加入8b溶液(6.2mg/mL，3.0mL)中，於25℃下振盪反應4 小時後將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的含0.05M的PBS溶液)，在無菌條件下藉由0.2μm濾器過濾後得標題結構式產物8的PBS緩衝液(3.5mg/mL，4.8mL)，於4℃冷凍儲存。

Q-TOF LC/MS：特徵峰：150332.9(M_Ab+0D)、1514911.2(M_Ab+1D)、152374.3(M_Ab+2D)、153530.1(M_Ab+3D)、154450.7(M_Ab+4D)。

平均值：y=2.0。

實施例9 ADC-9的製備

將原料6(1.1mg，1.2μmol)溶解於0.3mL乙腈中，加入8b溶液(6.2mg/mL，3.0mL)中，於25℃下振盪反應4小時後將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的含0.05M的PBS溶液)，在無菌條件下藉由0.2μm濾器過濾後得標題結構式產物9的PBS緩衝液(3.4mg/mL，4.7mL)，於4℃冷凍儲存。

Q-TOF LC/MS：特徵峰：150336.6(M_Ab+0D)、151530.5(M_Ab+1D)、152436.1(M_Ab+2D)、153625.1(M_Ab+3D)、154607.5(M_Ab+4D)。

平均值：y=2.0。

生物學評價 測試例1：HCC827細胞增殖實驗

一、試驗目的：

檢測本發明樣品對HCC827細胞增殖的抑制作用。

二、試驗材料：

本發明樣品：ADC-9

楊性對照藥：ADC-8

HCC827細胞：中科院細胞庫，貨號#TCHu153；CCK-8：Cell Counting Kit-8，購於Dojindo，貨號：CK04；FBS：Fetal Bovine Serum，購於Gibco，貨號：10099-141；RPMI1640：購於Hyclone，貨號：SH30809.01B；VICTOR 3多功能酶標儀(PerkinElmer公司)。

三、試驗方法：

1.96孔板中，每孔加入100μl含5000個HCC827細胞的10%FBS的RPMI1640培養基，培養板放在37℃、5%CO₂培養箱中培養16h。

2.將樣品用含10%FBS的RPMI1640培養基進行三倍梯度稀釋，共稀釋10個點，起始稀釋濃度為10μg/ml。

3.將前一天鋪好的HCC827細胞培養板從培養箱取出，丟棄上層培養液，加入含稀釋樣品的培養基100μl/孔。每個濃度設置兩個複孔，同時設置不加任何藥物的對照孔。在37℃、5% CO₂條件下連續培養細胞。

4.72小時後，每孔加入10μl CCK-8溶液顯色，放入37℃、5% CO₂培養箱中孵育顯色2小時，在酶標儀上讀取 OD₄₅₀，經Graphpad Prism 5軟體處理後即可得IC₅₀。

四、試驗結果：

本發明樣品的生物活性由上述分析所得，計算所得的IC₅₀值列於下表1：

結論：本發明較佳樣品對HCC827細胞具有明顯的增殖抑制活性。

測試例2：Lovo細胞增殖實驗

一、試驗目的：

檢測本發明樣品對Lovo細胞增殖的抑制作用。

二、試驗材料：

本發明樣品：ADC-9

陽性對照藥：ADC-8

Lovo細胞：中科院細胞庫，貨號#TCHu82；CCK-8：Cell Counting Kit-8，購於Dojindo，貨號：CK04；FBS：Fetal Bovine Serum，購於Gibco，貨號：10099-141；DMEM/F12：購於Hyclone，貨號：SH30023.01；VICTOR 3多功能酶標儀(PerkinElmer公司)。

三、試驗方法：

1.96孔板中，每孔加入100μl含4000個Lovo細胞的10%FBS的DMEM/F12培養基，培養板放在37℃、5%CO₂培養箱中培養16h。

2.將樣品用含10%FBS的DMEM/F12培養基進行三倍梯度稀釋，共稀釋10個點，起始稀釋濃度為100μg/ml。

3.將前一天鋪好的Lovo細胞培養板從培養箱取出，丟棄上層培養液，加入含稀釋樣品的培養基100μl/孔。每個濃度設置兩個複孔，同時設置不加任何藥物的對照孔。在37℃、5% CO₂條件下連續培養細胞。

4.72小時後，每孔加入10μl CCK-8溶液顯色，放入37℃、5% CO₂培養箱中孵育顯色2小時，在酶標儀上讀取OD₄₅₀，經Graphpad Prism 5軟體處理後即可得IC₅₀。

四、試驗結果：

本發明樣品的生物活性由上述分析所得，計算所得的IC₅₀值列於下表2：

結論：本發明較佳樣品對Lovo細胞具有明顯的增殖抑制活性。

測試例3：HCC827-Del19/T790M/C797S(DTC)細胞增殖實驗

一、試驗目的：

檢測本發明樣品對HCC827-DTC細胞增殖的抑制作用。

二、試驗材料：

本發明樣品：ADC-9

對照藥：mAb002,AZD-9291

HCC827細胞：中科院細胞庫，貨號#TCHu153；HCC827-DTC細胞：在293T細胞中(ATCC，CRL-3216)轉染pCDH-EGFR Del19/T790M/C797S(DTC)，△R8.9和VSVG，48小時後收集病毒上清，0.45μm濾膜過濾棄掉細胞碎片，50000g離心2小時重懸，將病毒進行10倍濃縮。在前一天鋪板的HCC827細胞中加入濃縮病毒，同時加入8μg/ml polybrene，24小時後更換新鮮培養基，48小時後加入2μg/ml puromycin進行篩選，得到HCC827-DTC細胞。

CCK-8：Cell Counting Kit-8，購於Dojindo，貨號： CK04；FBS：Fetal Bovine Serum，購於Gibco，貨號：10099-141；RPMI1640：購於Hyclone，貨號：SH30809.01B；VICTOR 3多功能酶標儀(PerkinElmer公司)。

三、試驗方法：

1.96孔板中，每孔加入100μl含5000個HCC827-DTC細胞的10%FBS的RPMI1640培養基(puromycin 2μg/ml)，培養板放在37℃、5%CO₂培養箱中培養16h。

2.將樣品用含10%FBS的RPMI1640培養基進行梯度稀釋，共稀釋10個點。抗體和ADC起始稀釋濃度為10ug/ml(66.7nM),進行3倍稀釋。AZD-9291起始稀釋濃度為2500nM，進行4倍稀釋。

3.將前一天鋪好的HCC827-DTC細胞培養板從培養箱取出，丟棄上層培養液，加入含稀釋樣品的培養基100μl/孔。每個濃度設置兩個複孔，同時設置不加任何藥物的對照孔。在37℃、5% CO₂條件下連續培養細胞。

4.72小時後，每孔加入10μl CCK-8溶液顯色，放入37℃、5% CO₂培養箱中孵育顯色2小時，在酶標儀上讀取OD₄₅₀，經Graphpad Prism 5軟體處理後即可得IC₅₀。

四、試驗結果：

本發明樣品的生物活性由上述分析所得，計算所得的IC₅₀值列於下表3：表3.本發明樣品對HCC827-DTC細胞的增殖抑制的 IC₅₀

結論：非小細胞肺癌HCC827細胞在表達EGFR-DTC基因之後，對AZD-9291產生明顯耐藥性；裸抗mAb002對該細胞也只有部分抑制效果。但是本發明樣品ADC-9對耐藥株HCC827-DTC有很強的增殖抑制活性。

測試例4：H1975-L858R/T790M/C797S(LTC)細胞增殖實驗

一、試驗目的：

檢測本發明樣品對H1975-LTC細胞增殖的抑制作用。

二、試驗材料：

本發明樣品：ADC-9

對照藥：mAb002,AZD-9291

H1975細胞：中科院細胞庫，貨號#TCHu193；

H1975-LTC細胞：293T細胞(ATCC，CRL-3216)轉染pCDH-EGFR L858R/T790M/C797S(LTC)，△R8.9和VSVG，48小時後收集病毒上清，0.45μm濾膜過濾棄掉細胞碎片，50000g離心2小時重懸，將病毒進行10倍濃縮。在前一天鋪板的H1975細胞中加入濃縮病毒，同時加入8μg/ml polybrene，24小時後更換新鮮培養基，48小時後加入2μg/ml puromycin進行篩選，得到H1975-LTC細胞。

CCK-8：Cell Counting Kit-8，購於Dojindo，貨號：CK04；FBS：Fetal Bovine Serum，購於Gibco，貨號：10099-141；RPMI1640：購於Hyclone，貨號：SH30809.01B；VICTOR 3多功能酶標儀(PerkinElmer公司)。

三、試驗方法：

1.96孔板中，每孔加入100μl含5000個H1975-LTC細胞的10%FBS的RPMI1640培養基(puromycin 2μg/ml)，培養板放在37℃、5%CO₂培養箱中培養16h。

2.將樣品用含10%FBS的RPMI1640培養基進行梯度稀釋，共稀釋10個點。抗體和ADC起始稀釋濃度為10ug/ml(66.7nM),進行3倍稀釋。AZD-9291起始稀釋濃度為2500nM,進行4倍稀釋。

3.將前一天鋪好的H1975-LTC細胞培養板從培養箱取出，丟棄上層培養液，加入含稀釋樣品的培養基100μl/孔。每個濃度設置兩個複孔，同時設置不加任何藥物的對照孔。在37℃、5% CO₂條件下連續培養細胞。

4.72小時後，每孔加入10μl CCK-8溶液顯色，放入37℃、5% CO₂培養箱中孵育顯色2小時，在酶標儀上讀取OD₄₅₀，經Graphpad Prism 5軟體處理後即可得IC₅₀。

四、試驗結果：

本發明樣品的生物活性由上述分析所得，計算所得的IC₅₀值列於下表4：

結論：非小細胞肺癌H1975細胞在表達EGFR-LTC基因之後，對AZD-9291產生明顯耐藥性；裸抗mAb002對該細胞也幾乎沒有任何抑制效果。但是本發明樣品ADC-9對耐藥株H1975-LTC有很強的增殖抑制活性。

測試例5：EGFR抗體食蟹猴藥物代謝動力學測試

一、試驗目的：

比較mAb002相對於尼妥珠單抗(mAb001)在食蟹猴體內的藥物代謝動力學變化。

二、試驗材料：

本發明樣品：mAb002(尼妥珠單抗的IgG1-YTE變體)

陽性對照藥：mAb001，尼妥珠單抗注射液，購於百泰生物，貨號0120131240

PBS：購於生工生物，貨號PD0100

BSA：購於Amresco，貨號0332

Proclin300：購於Supelco，貨號48912-U

EGFR：購於Sino Biological，貨號10001-H08H

Anti-Human IgG(Fc)-過氧化物酶：購於Sigma，貨號A0170

人IgG：購於R&D；貨號1-001-A

酶標儀：購於Thermo Scientific，型號Multiskan FC，貨號EQP-LI-030

三、試驗方法：

ELISA是一個常用於生物血清樣本檢測藥物代謝動力學的方法。本研究採用ELISA方法檢測食蟹猴血清中待測抗體的濃度。

2組食蟹猴(每組3隻)分別採用恒流泵靜脈推注5mg/kg的mAb001和mAb002抗體，於給藥前(0h)及給藥結束後5min(±10s)、2h(±2min)、4h(±5min)、8h(±5min)、1d(±10min)、2d(±10min)、3d(±10min)、5d(±10min)、7d(±10min)、10d(±10min)、13d(±10min)、17d(±10min)、21d(±10min)、28d(±10min)從下肢隱靜脈採集約1mL全血，將血液樣本於室溫靜置1h~2h至充分凝結後，4℃ 4000g離心5分鐘分離得到血清。

採用EGFR包被微孔板，以捕獲稀釋後血清樣本中的待測抗體。檢測抗體為HRP標記的羊抗人IgG抗體(針對Fc段)。HRP催化TMB受質產生可溶性藍色化合物，鹽酸溶液終止反應，並於工作波長450nm、參比波長620nm處檢測吸光值，OD值的大小與樣品中的待測抗體的濃度正相關。採用SoftMax Pro v5.4.1軟體，分別對待測抗體濃度對數值(X軸)和OD值(Y軸)繪製標準曲線，並進行四參數Logistic模型擬合，採用權重1/y的加權方式得 到曲線參數。未知樣品藉由其OD值於標準曲線回歸計算得到樣品血藥濃度。

四、實驗結果：

食蟹猴單次靜脈注射5mg/kg的mAb001和mAb002後，兩個劑量組動物平均藥物代謝動力學參數見下表5和第1圖。

mAb002組與mAb001組平均C_max基本一致，說明進入動物體內的藥量基本一致，但mAb002組較mAb001組在食蟹猴體內的藥物代謝動力學特徵存在明顯差異，表現為AUC(_0-28d)高、末端消除半衰期長、清除率低、平均滯留時間長，說明經過突變後的抗體mAb002(尼妥珠單抗的IgG1-YTE變體)的猴藥物代謝特性得到了顯著提升。

測試例6：EGFR-ADC體內藥效實驗

一、試驗目的：

比較本發明ADC-9相對於ADC-8和裸抗mAb002在裸鼠肺癌移植瘤HCC827模型上的體內藥效。

二、試驗材料：

本發明樣品：ADC-9 ADC-8 mAb002

HCC827細胞：中科院細胞庫，貨號#TCHu153；受試動物：裸小鼠，SPF，16-20g，♀，北京維通利華實驗動物技術有限公司。

三、試驗方法：

1裸小鼠實驗室環境適應三天，隨機分成5組，每組9隻。

2腫瘤細胞移植

裸小鼠右肋部皮下接種HCC827細胞(5×10⁶+50% matrigel/mouse)，接種後第7天，腫瘤長至202.07±6.22mm3(d1)開始給藥。

3給藥劑量及方法

給藥途徑腹腔注射(ip)，一週一次，共3次，具體給藥方案見表6。

4移植瘤體積及裸小鼠體重測定

每週測定2次瘤體積，稱量體重並記錄資料。

5資料統計

使用Excel統計軟體：平均值以avg計算；SD值以STDEV計算；SEM值以STDEV/SQRT計算；組間差異P值 以TTEST計算。

腫瘤體積(V)計算公式為：V=1/2×L_長×L_短 ²

相對體積(RTV)=V_T/V₀

抑瘤率(%)=(C_RTV-T_RTV)/C_RTV(%)

其中V₀、V_T分別為實驗開始時及實驗結束時的腫瘤體積。C_RTV、T_RTV分別為實驗結束時的空白對照組(Blank)及實驗組的相對腫瘤體積。

四、實驗結果：

抑瘤效果見下表6和第2圖

本次實驗結果顯示mAb002(尼妥珠單抗的IgG1-YTE變體，見實施例2)，ADC-8(見實施例8)和ADC-9(見實施例9)對小鼠肺癌移植瘤HCC827都有顯著的抑瘤效果。其 中ADC-9在同劑量(0.1mg/隻)或更低劑量(0.03mg/隻)下，都顯示出比裸抗mAb002(0.1mg/隻)更明顯的抑瘤效果，說明ADC-9相比裸抗在藥效上的優勢。另外，不同的ADC在相同劑量下(0.03mg/隻)進行對比，ADC-9顯示出比ADC-8更好的藥效，在給藥34天的抑瘤率分別為65.33% vs.48.96%，說明帶有毒素化合物6(原形為化合物5)的ADC比帶有毒素化合物4(MC-MMAF，其原形為化合物3)的ADC顯示出更强的抑瘤活性。

<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司、上海恆瑞醫藥有限公司

<120> EGFR抗體-藥物偶聯物及其在醫藥上的應用

<130> 770048CPCT-360160

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb001的輕鏈胺基酸序列

<400> 1

<210> 2

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb001的重鏈胺基酸序列

<400> 2

<210> 3

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb002輕鏈胺基酸序列

<400> 3

<210> 4

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb002重鏈胺基酸序列

<400> 4

<210> 5

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb002輕鏈DNA序列

<400> 5

<210> 6

<211> 1419

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb002重鏈DNA序列

<400> 6

<210> 7

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb001的LCDR1序列

<400> 7

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb001的LCDR2序列

<400> 8

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb001的LCDR3序列

<400> 9

<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb001的HCDR1序列

<400> 10

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb001的HCDR2序列

<400> 11

<210> 12

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb001的HCDR3序列

<400> 12

由於本案的圖為實驗數據，並非本案的代表圖。故本案無指定代表圖。

Claims (26)

1. 一種通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，

   

   其中：L₁、L₂是接頭單元；y為1至8；Ab為抗EGFR抗體或其抗原結合片段，該抗EGFR抗體或其抗原結合片段包含以下的CDR區：LCDR1：RSSQNIVHSNGNTYLD SEQ ID NO：7；LCDR2：KVSNRFS SEQ ID NO：8；LCDR3：FQYSHVPWT SEQ ID NO：9；HCDR1：NYYIY SEQ ID NO：10；HCDR2：GINPTSGGSNFNEKFKT SEQ ID NO：11；HCDR3：QGLWFDSDGRGFDF；SEQ ID NO：12；其中該Ab在重鏈上具有M258Y/S260T/T262E(YTE)三個位點突變。
2. 如申請專利範圍第1項所述的通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中y為2至5。
3. 如申請專利範圍第1項所述的通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中該抗EGFR抗體或其抗原結合片段為人源化抗體或其片段。
4. 如申請專利範圍第3項所述的通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中該人源化抗體的重鏈可變區進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈FR區，和/或該人源化抗體的輕鏈可變區進一步包含人源κ鏈或人源κ鏈變體的輕鏈FR區、或者人源λ鏈或人源λ鏈變體的輕鏈FR區。
5. 如申請專利範圍第4項所述的通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中該人源化抗體的重鏈可變區進一步包含人源IgG1的重鏈FR區。
6. 如申請專利範圍第3項所述的通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中該人源化抗體的重鏈包含人源IgG1或其變體、人源IgG2或其變體、人源IgG3或其變體或人源IgG4或其變體的恒定區，和/或該人源化抗體的輕鏈進一步包含人源κ鏈或人源κ鏈變體的輕鏈恒定區、或人源λ鏈或人源λ鏈變體的輕鏈恒定區。
7. 如申請專利範圍第6項所述的通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中該人源化抗體的重鏈可變區包含人源IgG1或其變體的恒定 區。
8. 如申請專利範圍第1所述的通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中該抗EGFR抗體包括胺基酸序列如SEQ ID NO：3所示的輕鏈，和如胺基酸序列SEQ ID NO：4所示的重鏈。
9. 如申請專利範圍第1至8項中任一項所述的通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中L₂如以下通式(L₂)所示：

   

   其中X₁選自氫原子、鹵素、羥基、氰基、烷基、烷氧基和環烷基；X₂選自烷基、環烷基和雜環基；m為0至5；S為硫原子。
10. 如申請專利範圍第9項所述的通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中m為1至3。
11. 如申請專利範圍第1至8項中任一項所述的通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中L₁為以下通式(L₁)所示的化合物：

    

    其中 X₃為烷基，該烷基視需要進一步被鹵素、羥基、氰基、烷基的取代基所取代；n為0至5。
12. 如申請專利範圍第11項所述的通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中n為1至3。
13. 如申請專利範圍第1至8項中任一項所述的通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其選自通式(II)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，

    

    其中，Ab、L₂、y如申請專利範圍第1項中所定義。
14. 如申請專利範圍第1至8項中任一項所述的通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其選自通式(III)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，

    

    其中，Ab、L₁、y如申請專利範圍第1項中所定義。
15. 如申請專利範圍第1至8項中任一項所述的通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其為如下式所示的化合物：

    

    其中，mAb002包括胺基酸序列如SEQ ID NO：3所示的輕鏈，和如SEQ ID NO：4所示的重鏈，y如申請專利範圍第1項中所定義。
16. 一種EGFR抗體，包含序列如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及其變體所示的LCDR1，LCDR2，LCDR3區，及如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及其變體所示的HCDR1，HCDR2，HCDR3區，其中，在重鏈上具有M258Y/S260T/T262E(YTE)三個位點突變。
17. 如申請專利範圍第16項所述的EGFR抗體，其中該EGFR抗體包括胺基酸序列如SEQ ID NO：3所示的輕鏈，和如SEQ ID NO：4所示的重鏈。
18. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1項所述的通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，和一種或多種可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。
19. 一種申請專利範圍第1項所述的通式(I)所示的抗體-藥 物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，或申請專利範圍第18項所述的醫藥組成物的用途，其用在製備用於治療癌症的藥物；該癌症包括高表達EGFR的癌症、在EGFR多肽上有突變的癌症和在EGFR信號通路下游基因中有突變的癌症。
20. 如申請專利範圍第19項所述的用途，其中該癌症為胃癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、腸癌、腎癌、黑素瘤、非小細胞肺癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌或頭頸癌。
21. 如申請專利範圍第19項所述的用途，其中該癌症為肺癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌或頭頸癌。
22. 一種治療癌症的方法，包括給予所需患者治療有效量的根據申請專利範圍第1項所述的通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，或如申請專利範圍第18項所述的醫藥組成物；該癌症為高表達EGFR的癌症、在EGFR多肽上有突變的癌症和在EGFR信號通路下游基因中有突變的癌症。
23. 如申請專利範圍第22項所述的方法，其中該癌症為在EGFR多肽上有突變的癌症，該EGFR突變多肽至少包含一個選自以下的EGFR突變：L858R、L858R/T790M、L858R/T790M/C797S、Del19、Del19/T790M、Del19/T790M/C797S、T790M、G719X、L861Q、S768I、外顯子18 indel/E709X、外顯子19插入、外顯子20插入、A763_Y764insFQEA、外顯子18至25重複和 EGFR-RAD51重排。
24. 如申請專利範圍第22項所所述的方法，其中該癌症為EGFR信號通路下游基因有突變的癌症，該下游基因至少包含一個選自以下的基因Ras、B-Raf、PI3K，其中該下游基因突變至少包含選自以下的突變：K-Ras G12V、K-Ras G13D、N-Ras Q61K、H-Ras G12S；B-Raf V600E、B-Raf G468A；PIK3CA H1047R、PIK3CB E633K和p110 γ E1021K。
25. 如申請專利範圍第22至24項中任一項所述的方法，其中該癌症為胃癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、腸癌、腎癌、黑素瘤、非小細胞肺癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌或頭頸癌。
26. 如申請專利範圍第22至24項中任一項所述的方法，其中該癌症為肺癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌或頭頸癌。