BR112016017893B1 - Conjugado de anticorpo-fármaco, medicamento antitumoral e/ou anticancerígeno, e composição farmacêutica - Google Patents

Conjugado de anticorpo-fármaco, medicamento antitumoral e/ou anticancerígeno, e composição farmacêutica Download PDF

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Abstract

CONJUGADO DE ANTICORPO-FÁRMACO ANTI-HER3. Proporcionar um fármaco antitumor tendo excelente efeito terapêutico, o qual é excelente em termos de efeito antitumor e segurança. É fornecido um conjugado de anticorpo-fármaco no qual um composto antitumor representado pela fórmula a seguir é conjugado a um anticorpo anti-HER3 através de um ligante tendo uma estrutura representada pela fórmula: -L(1)-L(2)-L(P)-NH-(CH(2))n(1)-L(a)-(CH(2))n(2)-C(=O)- ou -L(1)-L(2)-L(P)- (o anticorpo anti-HER3 é conectado ao término de L(1), o composto antitumor é conectado ao grupo carbonila da porção -(CH(2))n (2)-C(=O)- ou ao C-término de L(P), com o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 como uma posição de conexão).

Description

Campo Técnico
[001] A presente invenção se refere a um conjugado de anticor- po-fármaco tendo um anticorpo anti-HER3 e um fármaco antitumor conjugados um ao outro através de uma porção de estrutura ligante, o conjugado sendo útil como um fármaco antitumor.
Técnica Antecedente
[002] Um conjugado de anticorpo-fármaco (Antibody-Drug Conju gate - ADC) tendo um fármaco com citotoxicidade conjugado a um anticorpo o qual se liga a um antígeno expresso sobre uma superfície das células cancerosas e capaz de internalização celular (o anticorpo o qual se liga ao antígeno também é capaz de internalização celular) pode administrar o fármaco seletivamente a células cancerosas e, assim, espera-se que cause o acúmulo do fármaco nas células cancerosas e mate as células cancerosas (vide Literaturas Não Patentárias 1 a 3). Como um ADC, o Mylotarg (marca registrada; Gentuzumabe ozo- gamicina), no qual a caliqueamicina está conjugada a um anticorpo anti-CD33, é aprovado como um agente terapêutico para leucemia mi- eloide aguda. Além disso, o Adcetris (marca registrada; Brentuximabe vedotina), no qual a auristatina E está conjugada a um anticorpo anti- CD30, foi recentemente aprovado como um agente terapêutico para linfoma de Hodgkin e linfoma de células grandes anaplásicas (vide Literatura Não Patente 4). Os fármacos contidos nos ADCs que foram aprovados até agora objetivam o DNA ou tubulina.
[003] Como um antitumor, compostos de baixo peso molecular, derivados de camptotecina, os quais inibem a topoisomerase I para exibir um efeito antitumor, são conhecidos. Dentre eles, um composto antitumor representado pela fórmula abaixo (exatecano, nome químico: (1S,9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2,3-di-hidro-9-hidróxi-4-metil- 1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin- 10,13(9H,15H)-diona) é um derivado de camptotecina solúvel em água (Literaturas de Patente 1 e 2). Química 1
Figure img0001
[004] Ao contrário do irinotecano atualmente usado na prática clínica, este composto não requer ativação por uma enzima para exercer seu efeito antitumor. Além disso, em comparação com o SN-38 como um ingrediente farmaceuticamente ativo principal do irinotecano e topotecano também usados na prática clínica, ele apresenta uma maior atividade inibidora sobre a topoisomerase I e apresenta maior atividade citocida in vitro contra várias células cancerosas. Em particular, ele exibe o efeito contra células cancerosas que tenham resistência ao SN-38 ou similar em virtude da expressão de P-glicoproteína. Além disso, em um modelo com camundongos com um tumor humano subcutaneamente transplantado, ele exibiu um efeito antitumor potente e, assim, foi submetido a estudos clínicos, mas ainda não foi colocado no mercado (vide Literaturas Não Patentárias 5 a 10). Ainda não está claro se o exatecano funciona ou não eficazmente como um ADC.
[005] O DE-310 é um complexo no qual o exatecano é conjugado a um polímero de poliálcool de carboximetildextrana biodegradável através de um espaçador peptídico GGFG (Patente Literatura 3). Ao produzir o exatecano em uma forma de profármaco polimérico, uma elevada propriedade de retenção de sangue pode ser mantida e também uma elevada propriedade de penetração em uma área de tumor é passivamente aumentada através de uso da permeabilidade aumentada de vasos tumorais recentemente formados e propriedade de retenção em tecidos tumorais. Com o DE-310, o espaçador peptídico é clivado por uma enzima para liberar continuamente o exatecano como principal ingrediente ativo e o exatecano com glicina ligado a um grupo amino e, como um resultado, a farmacocinética é aprimorada. De acordo com diferentes modelos de avaliação de tumor em estudos não clínicos, verificou-se que a eficácia maior foi obtida pelo DE-310 do que o exatecano administrado individualmente, embora a quantidade total de exatecano contido no mesmo fosse menor do que no caso da administração de exatecano individualmente. Um estudo clínico foi conduzido para o DE-310 e casos efetivos foram confirmados. Há também um relatório sugerindo que o principal ingrediente ativo se acumula em um tumor em vez de em tecidos normais. No entanto, há também um relatório indicando que o acúmulo de DE-310 e do principal ingrediente ativo em um tumor não é muito diferente do acúmulo em tecidos normais e, assim, nenhuma objetivação passiva é observada em seres humanos (vide Literaturas Não Patentárias 11 a 14). Como um resultado, o DE-310 também não foi comercializado e ainda não está claro se o exatecano funciona efetivamente ou não como um fármaco orientado para tal objetivação.
[006] Como um composto relacionado ao DE-310, um complexo no qual uma porção de estrutura representada por -NH-(CH2)4-C(=O)- é inserida entre o espaçador -GGFG- e o exatecano para formar - GGFG-NH-(CH2)4-C(=O)- usado como uma estrutura espaçadora, também é conhecido (Literatura de Patente 4). No entanto, o efeito antitumor do complexo não é conhecido em geral.
[007] O receptor 3 de fator de crescimento epidérmico humano (também conhecido como HER3 e ErbB3) é uma proteína tirosina qui- nase receptora e pertence à subfamília de proteínas tirosina quinase receptora do receptor de fator de crescimento epidérmico (Epidermal Growth Factor Receptor - EGFR), a qual também inclui HER1 (também conhecido como EGFR), HER2 e HER4 (vide Literaturas Não Patentá- rias 15 a 17). Tal como acontece com o receptor de fator de crescimento epidérmico prototípico, o receptor transmembrana HER3 consiste em um domínio de ligação a ligante extracelular (EDC), um domínio de dimerização dentro do ECD, um domínio transmembrana e um domínio de fosforilação no carbóxi término. O HER1, HER2 e HER4 trazem um domínio intracelular de proteína tirosina quinase (Tyrosine Kinase Domain - TKD) além destes domínios, enquanto que o HER3 carece deste domínio e, assim, é incapaz de ser autofosforila- do.
[008] O ligante de herregulina (HRG) se liga ao domínio extrace- lular do HER3 e ativa a via de sinalização mediada por receptores, promovendo a dimerização com outros membros da família do receptor de fator de crescimento epidérmico humano (Human Epidermal Receptor - HER) e transfosforilação de seu domínio intracelular. A formação de dímeros de HER3 com outros membros da família HER expande o potencial de sinalização de HER3 e serve como meio não apenas para diversificação de sinal, mas também para amplificação do sinal. Por exemplo, o heterodímero HER2/HER3 induz a um dos sinais mitogênicos mais importantes dentre os membros da família HER. O HER3 é expresso excessivamente em vários tipos de cânceres, tais como cânceres de mama, gastrintestinal e pancreáticos. Curiosamente, uma correlação entre a expressão de HER2/HER3 e a progressão de um estágio não invasivo para um estágio invasivo foi mostrada (vide Literaturas Não Patentárias 18 a 20). Consequentemente, agentes que interferem com a sinalização mediada por HER3 são desejáveis. Os anticorpos anti-HER3 e imunoconjugados dos mesmos foram reportados, por exemplo, nas Literaturas de Patente 5 a 10, respectivamente.
Lista de Citações Literatura de Patente
[009] [PTL 1] Patente Japonesa Depositada Em-Aberto N° 5 59061
[0010] [PTL 2] Patente Japonesa Depositada Em-Aberto N° 8 337584
[0011] [PTL 3] Publicação Internacional N° WO 1997/46260
[0012] [PTL 4] Publicação Internacional N° WO 2000/25825
[0013] [PTL 5] Patente dos Estados Unidos No 5.968.511
[0014] [PTL 6] Patente dos Estados Unidos No 5.480.968
[0015] [PTL 7] Publicação Internacional N° WO 2003/013602
[0016] [PTL 8] Publicação Internacional N° WO 2007/077028
[0017] [PTL 9] Publicação Internacional N° WO 2008/100624
[0018] [PTL 10] Publicação Internacional N° WO 2012/019024
Literatura Não Patentária
[0019] [NPL 1] Ducry, L. et al., Bioconjugate Chem. (2010) 21, 5 13.
[0020] [NPL 2] Alley, S. C. et al., Current Opinion in Chemical Biol ogy (2010) 14, 529-537.
[0021] [NPL 3] Damle N.K. Expert Opin. Biol. Ther. (2004) 4, 1445 1452.
[0022] [NPL 4] Senter P. D. et al., Nature Biotechnology (2012) 30, 631-637.
[0023] [NPL 5] Kumazawa, E., Tohgo, A., Exp. Opin. Invest. Drugs (1998) 7, 625-632.
[0024] [NPL 6] Mitsui, I. et al., Jpn J. Cancer Res. (1995) 86, 776 786.
[0025] [NPL 7] Takiguchi, S. et al., Jpn J. Cancer Res. (1997) 88, 760-769.
[0026] [NPL 8] Joto, N. et al., Int J Cancer (1997) 72, 680-686.
[0027] [NPL 9] Kumazawa, E. et al., Cancer Chemother. Pharma col. (1998) 42, 210-220.
[0028] [NPL 10] De Jager, R. et al., Ann N Y Acad Sci (2000) 922, 260-273.
[0029] [NPL 11] Inoue, K. et al. Polymer Drugs in the Clinical Stage, Editado por Maeda et al. (2003) 145-153.
[0030] [NPL 12] Kumazawa, E. et al., Cancer Sci (2004) 95, 168 175.
[0031] [NPL 13] Soepenberg, O. et al., Clinical Cancer Research, (2005) 11, 703-711.
[0032] [NPL 14] Wente M. N. et al., Investigational New Drugs (2005) 23, 339-347.
[0033] [NPL 15] Plowman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1990) 87, 4905-4909.
[0034] [NPL 16] Kraus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1989) 86, 9193-9197.
[0035] [NPL 17] Kraus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1993) 90, 2900-2094.
[0036] [NPL 18] Alimandi et al., Oncogene (1995) 10, 1813-1821.
[0037] [NPL 19] DeFazio et al., Int. J. Cancer (2000) 87, 487-498.
[0038] [NPL 20] Nadiu et al., Br. J. Cancer (1998) 78, 1385-1390.
Sumário da Invenção Problema Técnico
[0039] Em relação ao tratamento de tumor usando um anticorpo, um efeito antitumor insuficiente pode ser observado mesmo quando o anticorpo reconhece um antígeno e se liga às células tumorais e, assim, algumas vezes é necessário um anticorpo antitumor mais eficaz. Além disso, muitos compostos antitumor de baixo peso molecular têm um problema em segurança, tal como efeito colateral e toxicidade, mesmo embora os compostos tenham um efeito antitumor excelente. Como tal, permanece como um objetivo atingir um efeito terapêutico superior ao aumentar ainda mais a segurança. Assim, um objetivo da presente invenção consiste em fornecer um fármaco antitumor tendo um excelente efeito terapêutico, o qual é excelente em termos de efeito antitumor e segurança.
Solução para o Problema
[0040] Os inventores acreditam que, uma vez que o anticorpo anti- HER3 é um anticorpo capaz de objetivar células tumorais, isto é, é um anticorpo que apresenta uma propriedade de reconhecimento de células tumorais, uma propriedade de ligação a células tumorais, uma propriedade de internalização em células tumorais, uma atividade citocida contra células tumorais, ou similar, quando o exatecano como um composto antitumor é convertido em um conjugado de anticorpo- fármaco por meio de conjugação ao anticorpo através de uma porção de estrutura ligante, o composto antitumor pode ser mais seguramente distribuído às células tumorais para exibir especificamente o efeito antitumor do composto em células tumorais e, assim, o efeito antitumor pode ser exibido com segurança e também é esperado um efeito cito- cida aprimorado do anticorpo anti-HER3, e a dose do composto antitumor pode ser reduzida comparado com um caso de administração do composto individualmente e, assim, a influência do composto antitumor sobre células normais pode ser aliviada, de modo que uma maior segurança possa ser alcançada.
[0041] A este respeito, os inventores criaram um ligante com uma estrutura específica e tiveram sucesso na obtenção de um conjugado de anticorpo-fármaco no qual o anticorpo anti-HER3 e o exatecano são conjugados um ao outro através do ligante, e confirmaram um excelen- te efeito antitumor exibido pelo conjugado para, deste modo, completar a presente invenção.
[0042] Especificamente, a presente invenção se refere ao seguin te.
[0043] [1] Um conjugado de anticorpo-fármaco em que um com posto antitumor representado pela fórmula a seguir: Química 2
Figure img0002
é conjugado a um anticorpo anti-HER3 através de uma ligação de tioé- ter, a qual é formada em uma porção de ligação de dissulfureto presente em uma parte de dobradiça do anticorpo anti-HER3 através de um ligante tendo uma estrutura representada pela fórmula a seguir:
[0044]
Figure img0003
[0045] Aqui, o anticorpo anti-HER3 é conectado à extremidade de L1, o composto antitumor é conectado ao grupo carbonila da porção - (CH2)n2-C(=O)- ou o C-término de LP, com o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 como uma posição de conexão.
[0046] Na fórmula, n1 representa um número inteiro de 0 a 6,
[0047] n2 representa um número inteiro de 0 a 5,
[0048] L1 representa -(Succinimid-3-il -N)-(CH2)n3-C(=O)-,
[0049] em que n3 representa um número inteiro de 2 a 8,
[0050] L2 representa -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- ou uma ligação simples,
[0051] em que n4 representa um número inteiro de 1 a 6,
[0052] LP representa um resíduo peptídico que consiste em 2 a 7 aminoácidos,
[0053] La representa -O- ou uma ligação simples,
[0054] -(Succinimid-3-il-N)- apresenta uma estrutura representada pela fórmula a seguir: Química 3
Figure img0004
a qual está conectada ao anticorpo anti-HER3 na posição 3 do mesmo e está conectada sobre o átomo de nitrogênio na posição 1 como um grupo metileno na estrutura ligante que contém esta estrutura.
[0055] A presente invenção se refere ainda a cada um dos seguin tes.
[0056] [2] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [1], em que o resíduo peptídico de LP é um resíduo peptídico que compreende um aminoácido selecionado de fenilalanina, glicina, valina, lisina, citrulina, serina, ácido glutâmico e ácido aspártico.
[0057] [3] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [1] ou [2], em que LP é um resíduo peptídico selecionado do seguinte grupo:
[0058] -GGF-,
[0059] -DGGF-,
[0060] -(D-)D-GGF-,
[0061] -EGGF-,
[0062] -GGFG-,
[0063] -SGGF-,
[0064] -KGGF-,
[0065] -DGGFG-,
[0066] -GGFGG-,
[0067] -DDGGFG-,
[0068] -KDGGFG- e
[0069] -GGFGGGF-;
[0070] (em que, "(D-)D" representa Ácido D-aspártico).
[0071] [4] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [1] ou [2], em que LP é um resíduo peptídico que compreende 4 ou 5 amino- ácidos.
[0072] [5] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qual quer um de [1] a [4], em que LP é -GGFG- ou -DGGFG-.
[0073] [6] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qual quer um de [1] a [4], em que LP é -GGFG-.
[0074] [7] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qual quer um de [1] a [6], em que n3 é um número inteiro de 2 a 5 e L2 é uma ligação simples.
[0075] [8] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qual quer um de [1] a [7], em que o ligante é -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La- (CH2)n2-C(=O)-.
[0076] [9] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [8], em que n3 é um número inteiro de 2 a 5, L2 é -NH-(CH2CH2-O)n4- CH2CH2-C(=O)- e n4 é 2 ou 4.
[0077] [10] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [8] ou [9], em que -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- é uma estrutura parcial tendo um comprimento de cadeia de 4 a 7 átomos.
[0078] [11] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [8] ou [9], em que -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- é uma estrutura parcial tendo um comprimento de cadeia de 5 ou 6 átomos.
[0079] [12] O conjugado de anticorpo-fármaco descrito em [10] ou [11], em que -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- é:
[0080] -NH-CH2CH2-C(=O)-,
[0081] -NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
[0082] -NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
[0083] -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
[0084] -NH-CH2-O-CH2-C(=O)- ou
[0085] -NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-.
[0086] [13] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [12], em que -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- é qualquer um dos seguintes:
[0087] -NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
[0088] -NH-CH2-O-CH2-C(=O)- ou
[0089] -NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-.
[0090] [14] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [5], em que o ligante é -L1-L2-LP-.
[0091] [15] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [14], em que LP é -DGGFG-.
[0092] [16] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [15], em que n3 é um número inteiro de 2 a 5 e L2 é uma ligação simples.
[0093] [17] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [1], em que a porção de estrutura fármaco-ligante na qual o fármaco está ligado a -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- ou -L1-L2-LP- é uma estrutura de fármaco-ligante selecionada do seguinte grupo:
[0094] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-(NH-DX),
[0095] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[0096] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[0097] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[0098] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[0099] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00100] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00101] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG- NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00102] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG- NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00103] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG- NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00104] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00105] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00106] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX),
[00107] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX),
[00108] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX),
[00109] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX),
[00110] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- (NH-DX),
[00111] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG- (NH-DX).
[00112] No acima, -(Succinimid-3-il-N)- apresenta uma estrutura representada pela fórmula a seguir: Química 4
Figure img0005
a qual está conectada ao anticorpo anti-HER3 na posição 3 e está co- nectada a um grupo metileno na estrutura ligante que contém a mesma sobre o átomo de nitrogênio na posição 1,
[00113] -(NH-DX) representa um grupo representado pela fórmula a seguir, em que o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 é a posição de conexão, Química 5
Figure img0006
[00114] -GGFG- representa um resíduo tetrapeptídico de -Gly-Gly- Phe-Gly- e -DGGFG- representa um resíduo pentapeptídico de -Asp- Gly-Gly-Phe-Gly-.
[00115] [18] O conjugado de anticorpo-fármaco descrito em [1], em que a porção de estrutura fármaco-ligante tendo um fármaco ligado a - L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- é uma estrutura de fármaco- ligante selecionada do seguinte grupo:
[00116] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00117] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG- NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00118] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00119] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00120] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG- (NH-DX).
[00121] Aqui, -(Succinimid-3-il-N)-, -(NH-DX), -GGFG- e -DGGFG- são conforme descrito acima.
[00122] [19] Um conjugado de anticorpo-fármaco que compreende um composto antitumor representado pela fórmula a seguir: Química 6
Figure img0007
conjugado a um anticorpo anti-HER3 através de uma ligação de tioé- ter, a qual é formada em uma porção de ligação de dissulfureto presente em uma parte de dobradiça do anticorpo anti-HER3 através de um ligante tendo uma estrutura representada pela fórmula a seguir:
[00123] -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-.
[00124] Aqui, o anticorpo anti-HER3 é conectado à extremidade de L1 e o composto antitumor é conectado ao grupo carbonila da porção - (CH2)n2-C(=O)-.
[00125] Na fórmula, n1 representa um número inteiro de 0 a 6,
[00126] n2 representa um número inteiro de 0 a 5,
[00127] L1 representa -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n3-C(=O)-,
[00128] em que n3 representa um número inteiro de 2 a 8,
[00129] L2 representa -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- ou uma ligação simples,
[00130] em que n4 representa um número inteiro de 1 a 6,
[00131] LP representa um resíduo tetrapeptídico de -GGFG-,
[00132] La representa -O- ou uma ligação simples,
[00133] -(Succinimid-3-il-N)- apresenta uma estrutura representada pela fórmula a seguir: Química 7
Figure img0008
a qual está conectada ao anticorpo anti-HER3 na posição 3 do mesmo e se liga sobre o átomo de nitrogênio na posição 1 como um grupo metileno em uma estrutura ligante que contém esta estrutura.
[00134] [20] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [19], em que n1 é 3, n2 é 0, n3 é 2, L2 é -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-,
[00135] n4 é 2 e La é uma ligação simples, ou
[00136] n1 é 1, n2 é 1, n3 é 5, L2 é uma ligação simples e La é -O- ou
[00137] n1 é 2, n2 é 1, n3 é 5, L2 é uma ligação simples e La é -O-.
[00138] [21] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [19] ou [20], em que n3 é 2 ou 5 e L2 é uma ligação simples.
[00139] [22] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [19] ou [20], em que n3 é 2 ou 5, L2 é -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- e n4 é 2 ou 4.
[00140] [23] O conjugado de anticorpo-fármaco descrito em qual quer um de [19] a [22], em que -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- é:
[00141] -NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
[00142] -NH-CH2-O-CH2-C(=O)- ou
[00143] -NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-.
[00144] [24] O conjugado de anticorpo-fármaco descrito em qual quer um de [19] a [23], em que a porção de estrutura fármaco-ligante tendo um fármaco ligado a -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- é uma estrutura de fármaco-ligante selecionada do seguinte grupo:
[00145] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-(NH-DX),
[00146] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00147] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00148] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00149] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00150] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00151] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00152] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00153] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00154] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX);
[00155] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX).
[00156] No acima, -(Succinimid-3-il-N)- apresenta uma estrutura representada pela fórmula a seguir: Química 8
Figure img0009
a qual está conectada ao anticorpo anti-HER3 na posição 3 do mesmo e está conectada sobre o átomo de nitrogênio na posição 1 como um grupo metileno em uma estrutura ligante que contém esta estrutura.
[00157] -(NH-DX) representa um grupo representado pela fórmula a seguir, em que o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 é a posição de conexão: Química 9
Figure img0010
[00158] -GGFG- representa um resíduo tetrapeptídico de -Gly-Gly- Phe-Gly-.
[00159] [25] O conjugado de anticorpo-fármaco descrito em qual quer um de [19] a [23], em que a porção de estrutura fármaco-ligante tendo um fármaco conectado a -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- C(=O)- é uma estrutura de fármaco-ligante selecionada do seguinte grupo:
[00160] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00161] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00162] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
[00163] No acima, -(Succinimid-3-il-N)-, -(NH-DX) e -GGFG- são conforme definido acima.
[00164] [26] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [25], em que o número médio de unidades da es-trutura de um fármaco-ligante selecionada por conjugado de anticorpo está em uma faixa de 1 a 10.
[00165] [27] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [25], em que o número médio de unidades da estrutura de um fármaco-ligante selecionada por conjugado de anticorpo está em uma faixa de 2 a 8.
[00166] [28] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [25], em que o número médio de unidades da estrutura de um fármaco-ligante selecionado por conjugado de anticorpo está em uma faixa de 3 a 8.
[00167] [29] Um medicamento que compreende o conjugado de an- ticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [28], um sal do mesmo ou um hidrato do mesmo.
[00168] [30] Um medicamento antitumor e/ou medicamento anti- câncer compreendendo o conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [28], um sal do mesmo ou um hidrato do mesmo.
[00169] [31] O medicamento antitumor e/ou medicamento anticân- cer de acordo com [30], o qual é aplicado a câncer de pulmão, câncer de rim, câncer urotelial, câncer colorretal, câncer de próstata, glioblastoma multiforme, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer de mama, melanoma, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer de estômago, tumor estromal gastrintestinal, câncer de colo do útero, câncer de cabeça e pescoço, câncer de esôfago, câncer epidermoide, câncer peritoneal, glioblastoma multiforme em adultos, câncer hepático, carcinoma hepatocelular, câncer de cólon, câncer retal, câncer de cólon e retal, câncer de endométrio, câncer de útero, câncer salivar, câncer renal, câncer vulvar, câncer de tiroide, carcinoma hepático, carcinoma do ânus ou câncer de pênis.
[00170] [32] Uma composição farmacêutica que compreende o con jugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [28], um sal do mesmo ou um hidrato do mesmo como um componente ativo e um componente de formulação farmaceuticamente aceitável.
[00171] [33] A composição farmacêutica de acordo com [32], a qual é aplicada a câncer de pulmão, câncer de rim, câncer urotelial, câncer colorretal, câncer de próstata, glioblastoma multiforme, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer de mama, melanoma, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer de estômago, tumor estromal gastrintestinal, câncer de colo do útero, câncer de cabeça e pescoço, câncer de esôfago, câncer epidermoide, câncer peritoneal, glioblastoma multiforme em adultos, câncer hepático, carcinoma hepatocelular, câncer de cólon, câncer retal, câncer de cólon e retal, câncer de endométrio, câncer de útero, câncer salivar, câncer renal, câncer vulvar, câncer de tiroide, carcinoma hepático, carcinoma do ânus ou câncer de pênis.
[00172] [34] Um método para o tratamento de um tumor e/ou câncer que compreende administração do conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [28], um sal do mesmo ou um hidrato do mesmo.
[00173] [35] O medicamento de acordo com [29], o medicamento antitumor e/ou medicamento anticâncer de acordo com [30] ou [31], a composição farmacêutica de acordo com [32] ou [33], o método de tratamento de acordo com [34], o qual é usado na administração em combinação com um medicamento adicional.
[00174] [36] A composição farmacêutica de acordo com [32] ou [33] ainda compreendendo um medicamento adicional como um ingrediente ativo.
[00175] [35] Um método para produção de um conjugado de anti- corpo-fármaco que compreende reação de um composto representado pela fórmula a seguir:
[00176] (maleimid-N-il)-(CH2)n3-C(=O)-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- C(=O)-(NH-DX) ou (maleimid-N-il)-(CH2)n3-C(=O)-L2-LP-(NH-DX)
[00177] com um anticorpo anti-HER3 ou um derivado reativo do mesmo e conjugação de uma porção de fármaco-ligante ao anticorpo por meio de um método para formação de uma ligação de tioéter sobre uma porção de ligação de dissulfureto presente em uma parte de do- bradiça do anticorpo.
[00178] Na fórmula, n3 representa um número inteiro de 2 a 8,
[00179] L2 representa -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- ou uma ligação simples em que n4 representa um número inteiro de 1 a 6,
[00180] LP representa um resíduo peptídico que consiste em 2 a 7 aminoácidos selecionados de fenilalanina, glicina, valina, lisina, citruli- na, serina, ácido glutâmico e ácido aspártico,
[00181] n1 representa um número inteiro de 0 a 6,
[00182] n2 representa um número inteiro de 0 a 5,
[00183] La representa -O- ou uma ligação simples,
[00184] (maleimid-N-il)- é um grupo representado pela fórmula a seguir e apresenta um átomo de nitrogênio como uma posição de conexão. Química 10
Figure img0011
[00185] -(NH-DX) representa um grupo representado pela fórmula a seguir, em que o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 é a posição de conexão: Química 11
Figure img0012
[00186] [36] O método de produção descrito em [35], em que o mé todo para conjugação de uma porção de fármaco-ligante a um anticor- po anti-HER3 é um método de redução do anticorpo para conversão em um derivado reativo.
[00187] [37] O método de produção descrito em [35] ou [36], em que o número médio de unidades da estrutura de fármaco-ligante selecionada conjugadas por anticorpo está na faixa de 1 a 10.
[00188] [38] O método de produção descrito em [35] ou [36], em que o número médio de unidades da estrutura de fármaco-ligante selecionada conjugadas por anticorpo está na faixa de 2 a 8.
[00189] [39] O método de produção descrito em [35] ou [36], em que o número médio de unidades da estrutura de fármaco-ligante selecionada conjugadas por anticorpo está na faixa de 3 a 8.
[00190] [40] Um conjugado de anticorpo-fármaco obtido por meio do método de produção de acordo com qualquer um de [35] a [39].
[00191] [41] Um conjugado de anticorpo-fármaco obtido por meio de formação de uma ligação de tioéter em um sítio de ligação de dissulfu- reto presente em uma parte de dobradiça de um anticorpo anti-HER3, em que o anticorpo anti-HER3 é tratado em uma condição redutora e depois reagido com um composto selecionado do grupo de compostos mostrados abaixo:
[00192] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX),
[00193] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-(NH-DX),
[00194] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-(NH-DX),
[00195] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00196] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX),
[00197] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX),
[00198] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00199] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00200] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00201] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00202] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00203] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00204] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH- CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00205] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00206] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00207] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX),
[00208] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX),
[00209] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00210] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2- O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00211] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX),
[00212] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00213] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00214] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00215] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00216] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00217] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH- DX),
[00218] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00219] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00220] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX),
[00221] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00222] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00223] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- (NH-DX),
[00224] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00225] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00226] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX),
[00227] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX),
[00228] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX),
[00229] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX),
[00230] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX),
[00231] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX),
[00232] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX),
[00233] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX), ou
[00234] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH- DX).
[00235] No acima, (maleimid-N-il)- é um grupo representado pela fórmula a seguir: Química 12
Figure img0013
a qual apresenta um átomo de nitrogênio como uma posição de conexão.
[00236] -(NH-DX) representa um grupo representado pela fórmula a seguir, o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 sendo uma posição de conexão. Química 13
Figure img0014
[00237] -GGFG- representa um resíduo tetrapeptídico de -Gly-Gly- Phe-Gly- e -DGGFG- representa um resíduo pentapeptídico de -Asp- Gly-Gly-Phe-Gly-.
[00238] [42] Um conjugado de anticorpo-fármaco obtido por meio de formação de uma ligação de tioéter em um sítio de ligação de dissulfu- reto presente em uma parte de dobradiça de um anticorpo anti-HER3 e caracterizado por tratamento do anticorpo anti-HER3 sob uma condição redutora e depois reação com um composto selecionado do grupo de compostos mostrados abaixo:
[00239] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00240] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2- O-CH2-C(=O)-(NH-DX), ou
[00241] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).
[00242] No acima, (maleimid-N-il)-, -(NH-DX) e -GGFG- são conforme definido acima.
[00243] [43] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [41] ou [42], em que um número médio conjugado da estrutura de fármaco- ligante selecionada por anticorpo está em uma faixa de 1 a 10.
[00244] [44] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [41] ou [42], em que um número médio conjugado da estrutura de fármaco- ligante selecionada por anticorpo está em uma faixa de 2 a 8.
[00245] [45] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [41] ou [42], em que um número médio conjugado da estrutura de fármaco- ligante selecionada por anticorpo está em uma faixa de 3 a 8.
[00246] [46] Um medicamento que compreende o conjugado de an- ticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [40] a [45], um sal do mesmo ou um hidrato do mesmo.
[00247] [47] Um medicamento antitumor e/ou medicamento anti- câncer compreendendo o conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [40] a [45], um sal do mesmo ou um hidrato do mesmo.
[00248] [48] O medicamento antitumor e/ou medicamento anticân- cer de acordo com [47], o qual é aplicado a câncer de pulmão, câncer de rim, câncer urotelial, câncer colorretal, câncer de próstata, glioblastoma multiforme, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer de mama, melanoma, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer de estômago, tumor estromal gastrintestinal, câncer de colo do útero, câncer de cabeça e pescoço, câncer de esôfago, câncer epidermoide, câncer peritoneal, glioblastoma multiforme em adultos, câncer hepático, carcinoma hepatocelular, câncer de cólon, câncer retal, câncer de cólon e retal, câncer de endométrio, câncer de útero, câncer salivar, câncer renal, câncer vulvar, câncer de tiroide, carcinoma hepático, carcinoma do ânus ou câncer de pênis.
[00249] [49] Uma composição farmacêutica que compreende o con jugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [40] a [45], um sal do mesmo ou um hidrato do mesmo como um componente ativo e um componente de formulação farmaceuticamente aceitável.
[00250] [50] A composição farmacêutica de acordo com [49], a qual é aplicada a câncer de pulmão, câncer de rim, câncer urotelial, câncer colorretal, câncer de próstata, glioblastoma multiforme, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer de mama, melanoma, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer de estômago, tumor estromal gastrintes- tinal, câncer de colo do útero, câncer de cabeça e pescoço, câncer de esôfago, câncer epidermoide, câncer peritoneal, glioblastoma multiforme em adultos, câncer hepático, carcinoma hepatocelular, câncer de cólon, câncer retal, câncer de cólon e retal, câncer de endométrio, câncer de útero, câncer salivar, câncer renal, câncer vulvar, câncer de tiroide, carcinoma hepático, carcinoma do ânus ou câncer de pênis.
[00251] [51] Um método para o tratamento de um tumor e/ou câncer que compreende administração do conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [40] a [45], um sal do mesmo ou um hidrato do mesmo.
[00252] [52] O medicamento de acordo com [46], o medicamento antitumor e/ou medicamento anticâncer de acordo com [47] ou [48], a composição farmacêutica de acordo com [49] ou [50] ou o método de tratamento de acordo com [51], o qual é usado em combinação com a administração de um medicamento adicional.
[00253] [53] A composição farmacêutica de acordo com [49] ou [50], ainda compreendendo um medicamento adicional como um ingrediente ativo.
Efeitos Vantajosos da Invenção
[00254] Com um conjugado de anticorpo anti-HER3-fármaco tendo um composto antitumor exatecano conjugado através de um ligante com uma estrutura específica, um excelente efeito antitumor e segurança podem ser obtidos.
Breve Descrição dos Desenhos
[00255] A Figura 1 mostra a sequência de aminoácidos de comprimento completo de uma cadeia pesada de um anticorpo anti-HER3 humano U1-59 (SEQ ID NO: 583).
[00256] A Figura 2 mostra a sequência de aminoácidos de comprimento completo de uma cadeia leve de um anticorpo anti-HER3 humano U1-59 (SEQ ID NO: 584).
[00257] A Figura 3 mostra a intensidade média de fluorescência de HCC1569 tratada com diluições em série de U1-59 ou cada conjugado de anticorpo-fármaco. Os valores de KD e Bmax foram calculados usando o software GraphPad Prism.
[00258] A Figura 4 mostra células A549 que foram cultivadas durante 2 dias com U1-59 ou vários conjugados de anticorpo-fármaco. O HER3 ou HER3 fosforilado foi avaliado por Western blotting. Pan- actina foi detectada como um controle de eletroforese.
[00259] A Figura 5 mostra um valor médio de redução na expressão de HER3 sobre a superfície de células HCC1569 tratadas com U1-59 ou cada conjugado de anticorpo-fármaco (37 °C ( "°C" representa "graus Celsius"), 1 h).
[00260] A Figura 6 mostra os resultados de um teste sobre a inibição de sinais mitogênicos ou de sobrevivência para cada conjugado de anticorpo HER3-fármaco em uma linhagem de câncer de mama humano (HCC1569). A Figura 6A mostra o crescimento ou sobrevivência celular derivado a partir do conjugado de anticorpo-fármaco na presença de FBS a 10%. Os dados são indicados pela média +/- desvio padrão de triplicatas. A ordenada representa um valor de luminescência que indica a atividade de ATP de cada amostra. A abcissa representa a concentração de cada conjugado de anticorpo-fármaco. A Figura 6B mostra a taxa de redução de luminescência provocada pelo tratamento com o conjugado de anticorpo-fármaco, em que a luminescência de um grupo não tratado foi definida como 100%.
[00261] A Figura 7 mostra resultados de um teste sobre a inibição de sinais mitogênicos ou de sobrevivência para cada conjugado de anticorpo HER3-fármaco em uma linhagem de câncer de mama humano (MDA MB-453). A Figura 7A mostra o crescimento celular ou a sobrevivência derivada do conjugado de anticorpo-fármaco na presença de FBS a 10%. A ordenada representa um valor de luminescência que indica a atividade de ATP de cada amostra. A abcissa representa a concentração de cada conjugado de anticorpo-fármaco. Os dados são indicados pela média +/- desvio padrão de triplicatas. A Figura 7B mostra a taxa de redução de luminescência provocada pelo tratamento com o conjugado de anticorpo-fármaco, em que a luminescência de um grupo não tratado foi definida como 100%.
[00262] A Figura 8 mostra resultados de um teste sobre a inibição de sinais mitogênicos ou de sobrevivência para cada conjugado de anticorpo HER3-fármaco em uma linhagem de melanoma humano (A375). A Figura 8A mostra o crescimento ou sobrevivência de células derivadas do conjugado de anticorpo-fármaco na presença de FBS a 10%. A ordenada representa um valor de luminescência que indica a atividade de ATP de cada amostra. A abcissa representa a concentração de cada conjugado de anticorpo-fármaco. Os dados são indicados pela média +/- desvio padrão de triplicatas. A Figura 8B mostra a taxa de redução de luminescência provocada pelo tr atamento com o conjugado de anticorpo-fármaco, em que a luminescência de um grupo não tratado foi definida como 100%.
[00263] A Figura 9 mostra resultados de um teste sobre a inibição de sinais mitogênicos ou de sobrevivência para cada conjugado de anticorpo HER3-fármaco em uma linhagem de câncer colorretal humano (HT29). A Figura 9A mostra o crescimento celular ou a sobrevivência derivada do conjugado de anticorpo-fármaco na presença de FBS a 10%. A ordenada representa um valor de luminescência que indica a atividade de ATP de cada amostra. A abcissa representa a concentração de cada conjugado de anticorpo-fármaco. Os dados são indicados pela média +/- desvio padrão de triplicatas. A Figura 9B mostra a taxa de redução de luminescência provocada pelo tratamento com o conjugado de anticorpo-fármaco, em que a luminescência de um grupo não tratado foi definida como 100%.
[00264] A Figura 10 mostra resultados de um teste sobre a inibição de sinais mitogênicos ou de sobrevivência para cada conjugado de anticorpo HER3-fármaco em uma linhagem de câncer de pulmão humano (A549). A Figura 10A mostra o crescimento celular ou a sobrevivência derivada do conjugado de anticorpo-fármaco na presença de FBS a 10%. A ordenada representa um valor de luminescência que indica a atividade de ATP de cada amostra. A abcissa representa a concentração de cada conjugado de anticorpo-fármaco. Os dados são indicados pela média +/- desvio padrão de triplicatas. A Figura 10B mostra a taxa de redução de luminescência provocada pelo tratamento com o conjugado de anticorpo-fármaco, em que a luminescência de um grupo não tratado foi definida como 100%.
[00265] A Figura 11 mostra os resultados de comparação da taxa de inibição de crescimento celular ou sobrevivência entre o conjugado de anticorpo-fármaco (3) e o conjugado de anticorpo-fármaco (4). O diagrama da esquerda mostra a taxa de inibição de crescimento celular ou sobrevivência derivada do conjugado de anticorpo-fármaco na presença de FBS a 10%. A ordenada descreve a luminescência que indica a atividade de ATP de cada amostra. A abcissa representa a concentração de cada conjugado de anticorpo-fármaco. Os dados são indicados pela média +/- desvio padrão de triplicatas. O diagrama da direita mostra a comparação entre a taxa de redução de luminescência provocada pelo tratamento com o conjugado de anticorpo-fármaco entre um carregamento elevado de fármaco (High Drug Loading - HDL) e um carregamento mediano de fármaco (Middle Drug Loading - MDL) quando a luminescência de um grupo não tratado foi definida como 100%.
[00266] A Figura 12 mostra os resultados de comparação da taxa de inibição de crescimento celular ou sobrevivência entre o conjugado de anticorpo-fármaco (10) e o conjugado de anticorpo-fármaco (11). O diagrama da esquerda mostra a taxa de inibição de crescimento celular ou sobrevivência derivada do conjugado de anticorpo-fármaco na presença de FBS a 10%. A ordenada descreve a luminescência que indica a atividade de ATP de cada amostra. A abcissa representa a concentração de cada conjugado de anticorpo-fármaco. Os dados são indicados pela média +/- desvio padrão de triplicatas. O diagrama da direita mostra a comparação entre a taxa de redução de luminescência provocada pelo tratamento com o conjugado de anticorpo-fármaco entre um carregamento elevado de fármaco (HDL) e um carregamento mediano de fármaco (MDL) quando a luminescência de um grupo não tratado foi definida como 100%.
[00267] A Figura 13 mostra os resultados de comparação da taxa de inibição de crescimento celular ou sobrevivência entre o conjugado de anticorpo-fármaco (13) e o conjugado de anticorpo-fármaco (14). O diagrama da esquerda mostra a taxa de inibição de crescimento celular ou sobrevivência derivada do conjugado de anticorpo-fármaco na presença de FBS a 10%. A ordenada descreve a luminescência que indica a atividade de ATP de cada amostra. A abcissa representa a concentração de cada conjugado de anticorpo-fármaco. Os dados são indicados pela média +/- desvio padrão de triplicatas. O diagrama da direita mostra a comparação entre a taxa de redução de luminescência provocada pelo tratamento com o conjugado de anticorpo-fármaco entre um carregamento elevado de fármaco (HDL) e um carregamento mediano de fármaco (MDL) quando a luminescência de um grupo não tratado foi definida como 100%.
[00268] A Figura 14 mostra resultados de um teste antitumor em câncer de mama humano (HCC1569) usando o conjugado de anticor- po-fármaco (3), (10) ou (13). O eixo das ordenadas mostra o volume médio do tumor. A abcissa representa o número de dias de transplante de células. Todos os valores são indicados pela média +/- desvio pa- drão. O volume inicial do tumor e o peso inicial do camundongo foram analisados com base em dados descritivos (média e desvio padrão) usando o Microsoft Excel 2009.
[00269] A Figura 15 mostra os resultados de um teste antitumor em melanoma humano (HT-144) usando o conjugado de anticorpo- fármaco (3), (10) ou (13). O eixo das ordenadas mostra o volume médio do tumor. A abcissa representa o número de dias de transplante de células. Todos os valores são indicados pela média +/- desvio padrão. O volume inicial do tumor e o peso inicial do camundongo foram analisados com base em dados descritivos (média e desvio padrão) usando o Microsoft Excel 2009.
[00270] A Figura 16 mostra resultados de um teste antitumor em câncer de mama humano (MDA-MB-453) usando o conjugado de anti- corpo-fármaco (3), (10) ou (13). O eixo das ordenadas mostra o volume médio do tumor. A abcissa representa o número de dias de administração. Todos os valores são indicados pela média +/- desvio padrão. O volume inicial do tumor e o peso inicial do camundongo foram analisados com base em dados descritivos (média e desvio padrão) usando o Microsoft Excel 2009.
[00271] A Figura 17 mostra os resultados de um teste antitumor em linhagem de câncer colorretal humano (HT-29) usando o conjugado de anticorpo-fármaco (3), (10) ou (13). O eixo das ordenadas mostra o volume médio do tumor. A abcissa representa o número de dias de administração. Todos os valores são indicados pela média +/- desvio padrão. O volume inicial do tumor e o peso inicial do camundongo foram analisados com base em dados descritivos (média e desvio padrão) usando o Microsoft Excel 2009.
[00272] A Figura 18 mostra os resultados de um teste antitumor em linhagem de câncer de pulmão humano (A549) usando o conjugado de anticorpo-fármaco (3), (10) ou (13). O eixo das ordenadas mostra o volume médio do tumor. A abcissa representa o número de dias de transplante de células. Todos os valores são indicados pela média +/- desvio padrão. O volume inicial do tumor e o peso inicial do camundongo foram analisados com base em dados descritivos (média e desvio padrão) usando o Microsoft Excel 2009.
[00273] A Figura 19 mostra os resultados de um teste antitumor em linhagem de câncer de mama triplo negativo humano (MDA-MB-468) usando o conjugado de anticorpo-fármaco (13). O eixo das ordenadas mostra o volume médio do tumor. A abcissa representa o número de dias de transplante de células. Todos os valores são indicados pela média +/- desvio padrão. O volume inicial do tumor e o peso inicial do camundongo foram analisados com base em dados descritivos (média e desvio padrão) usando o Microsoft Excel 2009.
[00274] A Figura 20 mostra os resultados de um teste antitumor em linhagem de câncer de mama luminal humano (MCF-7) usando o conjugado de anticorpo-fármaco (16a). O eixo das ordenadas mostra o volume médio do tumor. A abcissa representa o número de dias de transplante de células. Todos os valores são indicados pela média +/- desvio padrão. O volume inicial do tumor e o peso inicial do camundongo foram analisados com base em dados descritivos (média e desvio padrão) usando o Microsoft Excel 2009.
[00275] A Figura 21 mostra os resultados de um teste antitumor em linhagem de melanoma humano (WM-266-4) usando o conjugado de anticorpo-fármaco (16a). O eixo das ordenadas mostra o volume médio do tumor. A abcissa representa o número de dias de transplante de células. Todos os valores são indicados pela média +/- desvio padrão. O volume inicial do tumor e o peso inicial do camundongo foram analisados com base em dados descritivos (média e desvio padrão) usando o Microsoft Excel 2009.
[00276] A Figura 22 mostra os resultados de um teste antitumor em linhagem de câncer de ovário humano (OVCAR-8) usando o conjugado de anticorpo-fármaco (16a). O eixo das ordenadas mostra o volume médio do tumor. A abcissa representa o número de dias de transplante de células. Todos os valores são indicados pela média +/- desvio padrão. O volume inicial do tumor e o peso inicial do camundongo foram analisados com base em dados descritivos (média e desvio padrão) usando o Microsoft Excel 2009.
[00277] A Figura 23 mostra os resultados de um teste antitumor em linhagem de câncer de bexiga humano (SW-780) usando o conjugado de anticorpo-fármaco (16a). O eixo das ordenadas mostra o volume médio do tumor. A abcissa representa o número de dias de transplante de células. Todos os valores são indicados pela média +/- desvio padrão. O volume inicial do tumor e o peso inicial do camundongo foram analisados com base em dados descritivos (média e desvio padrão) usando o Microsoft Excel 2009.
[00278] A Figura 24 mostra os resultados de um teste antitumor em linhagem de câncer de mama humano (MDA-MB-453) usando o conjugado de anticorpo-fármaco (16a). O eixo das ordenadas mostra o volume médio do tumor. A abcissa representa o número de dias de transplante de células. Todos os valores são indicados pela média +/- desvio padrão. O volume inicial do tumor e o peso inicial do camundongo foram analisados com base em dados descritivos (média e desvio padrão) usando o Microsoft Excel 2009.
[00279] A Figura 25 mostra os resultados de um teste antitumor em linhagem de câncer de mama humano (MDA-MB-453) usando o conjugado de anticorpo-fármaco (16a). O eixo das ordenadas mostra o volume médio do tumor. A abcissa representa o número de dias de transplante de células. Todos os valores são indicados pela média +/- desvio padrão. O volume inicial do tumor e o peso inicial do camundongo foram analisados com base em dados descritivos (média e des- vio padrão) usando o Microsoft Excel 2009.
[00280] A Figura 26 mostra os resultados de um teste antitumor em linhagem de câncer de mama humano (JIMT-1) usando o conjugado de anticorpo-fármaco (15). O eixo das ordenadas mostra o volume médio do tumor. A abcissa representa o número de dias de transplante de células. Todos os valores são indicados pela média +/- desvio padrão. O volume inicial do tumor e o peso inicial do camundongo foram analisados com base em dados descritivos (média e desvio padrão) usando o Microsoft Excel 2009.
[00281] A Figura 27 mostra os resultados de um teste antitumor em linhagem de câncer de pulmão humano (PC9) usando o conjugado de anticorpo-fármaco (16a). O eixo das ordenadas mostra o volume médio do tumor. A abcissa representa o número de dias de transplante de células. Todos os valores são indicados pela média +/- desvio padrão. O volume inicial do tumor e o peso inicial do camundongo foram analisados com base em dados descritivos (média e desvio padrão) usando o Microsoft Excel 2009.
[00282] A Figura 28 mostra os resultados de um teste antitumor em linhagem de câncer de mama triplo negativo humano (MDA-MB-468) usando o conjugado de anticorpo-fármaco (16a). O eixo das ordenadas mostra o volume médio do tumor. A abcissa representa o número de dias de transplante de células. Todos os valores são indicados pela média +/- desvio padrão. O volume inicial do tumor e o peso inicial do camundongo foram analisados com base em dados descritivos (média e desvio padrão) usando o Microsoft Excel 2009.
[00283] Figura 29 mostra os resultados de um teste antitumor em linhagem de câncer de cabeça e pescoço humano (Fadu) usando o conjugado de anticorpo-fármaco (16a). O eixo das ordenadas mostra o volume médio do tumor. A abcissa representa o número de dias de transplante de células. Todos os valores são indicados pela média +/- desvio padrão. O volume inicial do tumor e o peso inicial do camundongo foram analisados com base em dados descritivos (média e desvio padrão) usando o Microsoft Excel 2009.
[00284] A Figura 30 mostra os resultados de um teste antitumor usando uma seção de câncer de estômago humano derivada de pacientes com tumor (NIBIO-G016) e o conjugado de anticorpo-fármaco (16a). O eixo das ordenadas mostra o volume médio do tumor. A ab- cissa representa o número de dias de transplante de células. Todos os valores são indicados pela média +/- desvio padrão. O volume inicial do tumor e o peso inicial do camundongo foram analisados com base em dados descritivos (média e desvio padrão) usando o Microsoft Excel 2009.
Descrição de Modalidades
[00285] Daqui em diante, as modalidades preferidas para realização da presente invenção são explicadas em função dos desenhos. Entretanto, as modalidades explicadas abaixo são exemplos de modalidades representativas da presente invenção e o escopo da presente invenção não deverá ser interpretado com base nos mesmos.
[00286] A presente invenção fornece um conjugado de proteína- fármaco que se liga ao HER3. De preferência, a proteína de ligação ao HER3 da invenção é uma proteína de andaime tendo uma atividade de ligação similar a um anticorpo ou um anticorpo, isto é, um anticorpo anti-HER3.
[00287] O conjugado de anticorpo anti-HER3-fármaco da presente invenção é um medicamento antitumor, no qual um anticorpo anti- HER3 é conjugado com um composto antitumor através de uma porção de estrutura ligante e explicada em detalhes a seguir.
[00288] Dentro do contexto da presente invenção, o termo "proteína de andaime", conforme usado aqui, significa um polipeptídeo ou proteína com áreas de superfície exposta na qual inserções, substituições ou eliminações de aminoácidos são altamente toleráveis. Exemplos de proteínas de andaime que podem ser usadas de acordo com a presente invenção são proteína A de Staphylococcus aureus, a proteína de ligação à bilina de Pieris brassicae ou outras lipocalinas, proteínas de repetição anquirina e fibronectina humana (revisto em Binz e Pluckthun, Curr Opin Biotechnol, 16, 459-69). A manipulação de uma proteína de andaime pode ser considerada como enxertia ou integração de uma função de afinidade sobre ou dentro da "framework" estrutural de uma proteína estavelmente dobrada. Função de afinidade significa uma afinidade de ligação da proteína de acordo com a presente invenção. Um andaime pode ser estruturalmente separável das sequências de aminoácidos que conferem a especificidade de ligação. Em geral, as proteínas que parecem adequadas para o desenvolvimento de tais reagentes de afinidade artificiais podem ser obtidas por meio de técnicas de engenharia racionais ou, mais comumente, técnicas de engenharia combinatória de proteínas, tal como panning contra HER3, quer proteína purificada ou proteína exibida sobre a superfície da célula, para agentes de ligação em uma biblioteca de andaime artificial exibida in vitro, capacidades as quais são conhecidas na técnica (Skerra, J. Mol Recog, 2000; Binz e Pluckthun, 2005). Além disso, uma proteína de andaime tendo uma atividade de ligação similar a um anticorpo pode ser derivada de um polipeptídeo receptor que contém o domínio de andaime, o qual pode ser enxertado com domínios de ligação de um polipeptídeo doador para conferir a especificidade de ligação do polipeptídeo doador ao domínio de andaime contendo o poli- peptídeo aceitador. Os ditos domínios de ligação podem ser inseridos, por exemplo, a região determinante de complementaridade (Complementarity Determining Region - CDR) de um anticorpo, em particular um anticorpo anti-HER3. A inserção pode ser conseguida por meio de vários métodos conhecidos por aqueles versados na técnica incluindo, por exemplo, síntese de polipeptídeos, síntese de ácido nucleico de um aminoácido de codificação, bem como várias formas de métodos recombinantes bem conhecidos por aqueles versados na técnica.
Anticorpo
[00289] Além disso, o termo "anticorpo" ou "anticorpo anti-HER3", conforme usado aqui, significa um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo humanizado (Jones et al., Nature 321 (1986), 522-525; Riechmann et al., Nature 332 (1988), 323-329; e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 (1992), 593-596), um anticorpo quimérico (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81 (1984), 6851-6855), um anticorpo humano e um anticorpo totalmente humano (Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, pp. 133143; Kuroiwa, Y. et al., Nucl. Acids Res. (1998) 26, pp. 3447-3448; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol.10, pp. 69-73 (Kitagawa, Y., Matsuda, T. e Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, pp. 722-727, Publicação Internacional N° WO 2007/077028 e assim por diante), um anticorpo multiespecífico (por exemplo, um anticorpo biespecífico) formado a partir de pelo menos dois anticorpos ou um fragmento de anticorpo dos mesmos. O termo "fragmento de anticorpo" compreende qualquer parte dos anticorpos mencionados acima, de preferência sua região de ligação ao antígeno ou regiões variáveis. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos Fv, diacorpos (Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 64446448), moléculas de anticorpo com uma única cadeia (Pluckthun em: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113, Rosenburg e Moore, EDS, Springer Verlag, New York (1994), 269-315) e outros fragmentos, contato que eles exibam a capacidade desejada de se ligar ao HER3.
[00290] Além disso, o termo "anticorpo" ou "anticorpo anti-HER3", conforme usado aqui, pode incluir moléculas de tipo anticorpo que contêm subdomínios manipulados de anticorpos ou variantes de anticorpos que ocorrem naturalmente. Essas moléculas de tipo anticorpo podem ser anticorpos com um único domínio, tal como domínios apenas de VH ou domínios apenas de VL derivados de fontes naturais, tais como camelídeos (Muyldermans et al., Reviews in Molecular Biotechnology 74, 277-302) ou por meio de exposição in vitro de bibliotecas de seres humanos, camelídeos ou outras espécies (Holt et al., Trends Biotechnol., 21, 484-90).
[00291] De acordo com a presente invenção, o "fragmento Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítio de reconhecimento e ligação a antígeno completo. Esta região consiste em um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um de cadeia leve em associação não covalente estreita. É nesta configuração que as três CDRs de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação a antígeno na superfície do dímero VH-VL. Coletivamente, as seis CDRs conferem especificidade de ligação a antígeno ao anticorpo. No entanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três CDR específicas para um antígeno) apresenta a capacidade de reconhecer e se ligar ao antígeno, embora normalmente com uma afinidade menor do que todo o sítio de ligação.
[00292] O "fragmento Fab" também contém o domínio constante de cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) de cadeia pesada. O "fragmento Fab" difere do "fragmento Fab1" pela adição de alguns resíduos ao carbóxi termino do domínio CH1 da cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas na região de dobradiça do anticorpo. O "fragmento F(ab')2" é originalmente produzido como um par de "fragmentos Fab'" que possuem cisteínas na dobradiça entre eles. Métodos de preparo de tais fragmentos de anticorpo, tal como digestão com papa- ína ou pepsina, são conhecidos por aqueles versados na técnica.
[00293] Em outra modalidade preferida da presente invenção, o anticorpo anti-HER3 da invenção é um anticorpo anti-HER3 dirigido contra o domínio extracelular (ExtraCellular Domain - ECD) do HER3.
[00294] O anticorpo anti-HER3 usado em um conjugado de anticorpo anti-HER3-fármaco da presente invenção pode ser derivado de qualquer espécie. Exemplos preferidos de espécies podem incluir seres humanos, ratos, camundongos e coelhos. O anticorpo anti-HER3 derivado de outra espécie que não humana é, de preferência, quimeri- zado ou humanizado usando uma técnica bem conhecida. O anticorpo da presente invenção pode ser um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal e é, de preferência, um anticorpo monoclonal.
[00295] O anticorpo anti-HER3 pode ser aqueles que são capazes de objetivação de células tumorais e, assim, possuem a propriedade de serem capazes de reconhecer células tumorais, a propriedade de serem capazes de se ligar a células tumorais, a propriedade de serem internalizados em células tumorais e atividade citocida contra células tumorais, etc. O anticorpo anti-HER3 pode ser conjugado com um composto tendo atividade antitumor através de um ligante para formar um conjugado de anticorpo-fármaco.
[00296] A atividade de ligação do anticorpo contra células tumorais pode ser confirmada usando citometria de fluxo. A internalização do anticorpo nas células tumorais pode ser confirmada usando (1) um ensaio de visualização de um anticorpo incorporado em células sob um microscópio de fluorescência usando um anticorpo secundário (marcado por fluorescência) que se liga ao anticorpo terapêutico (Cell Death and Differentiation (2008) 15, 751-761), (2) um ensaio de medição da quantidade de fluorescência incorporada em células usando um anticorpo secundário (marcado por fluorescência) que se liga ao anticorpo terapêutico (Molecular Biology of the Cell, Vol. 15, 5268-5282, Dezembro de 2004) ou (3) um ensaio de Mab-ZAP usando uma imu- notoxina que se liga ao anticorpo terapêutico, em que a toxina é liberada após incorporação em células para inibir o crescimento celular (Bio Techniques 28: 162-165, Janeiro de 2000). Uma proteína complexa recombinante de um domínio catalítico de toxina da difteria e proteína G pode ser usada como a imunotoxina.
[00297] A atividade antitumor do anticorpo pode ser confirmada in vitro ao determinar a atividade inibidora contra o crescimento de células. Por exemplo, uma linhagem de células de câncer que expressam excessivamente uma proteína alvo para o anticorpo é cultivada e o anticorpo é adicionado em várias concentrações ao sistema de cultura para determinar a atividade inibidora contra a formação de foco, formação de colônias e crescimento de esferoides. A atividade antitumor pode ser confirmada in vivo, por exemplo, ao administrar o anticorpo a um camundongo nu com uma linhagem de células de tumor transplantadas que expressa grandemente a proteína alvo e determinar a mu-dança nas células cancerosas (tumorais).
[00298] Uma vez que o composto conjugado no conjugado de anti- corpo-fármaco exerce um efeito antitumor, é preferível, mas não essencial, que o próprio anticorpo tenha um efeito antitumor. Para fins de exercer a citotoxicidade do composto antitumor específica e seletivamente para as células tumorais, é importante e também preferido que o anticorpo tenha a propriedade de ser internalizado para migrar para as células tumorais.
[00299] O anticorpo anti-HER3 pode ser obtido usando um método geralmente realizado na técnica, o qual envolve a imunização de animais com um polipeptídeo antigênico e coleta e purificação de anticorpos produzidos in vivo. A origem do antígeno não se limita a seres humanos e os animais podem ser imunizados com um antígeno derivado de um animal não humano, tal como um camundongo ou um rato e similares. Nesse caso, a reatividade cruzada de anticorpos que se ligam ao antígeno heterólogo obtido com antígenos humanos pode ser testada para rastrear um anticorpo aplicável a uma doença humana.
[00300] Alternativamente, células produtoras de anticorpos que produzem anticorpos contra o antígeno são fundidas com células de mieloma de acordo com um método conhecido na técnica (por exemplo, Kohler e Milstein, Nature (1975) 256, pp. 495-497; Kennet, R. ed ., Monoclonal Antibodies, pp. 365-367, Plenum Press, New York (1980)) para estabelecer hibridomas, a partir dos quais anticorpos monoclo- nais podem, por sua vez, ser obtidos.
[00301] O antígeno pode ser obtido por meio de engenharia genética de células hospedeiras para produzir um gene que codifica a proteína antigênica. Especificamente, vetores que permitam a expressão do gene antigênico são preparados e transferidos para células hospedeiras, de modo que o gene seja expresso. O antígeno assim expresso pode ser purificado. O anticorpo também pode ser obtido usando um método o qual envolve imunização de animais com células que expressam os antígenos geneticamente modificados ou uma linhagem de células com um antígeno expresso.
[00302] O anticorpo anti-HER3 pode ser obtido por meios conhecidos na técnica.
[00303] O anticorpo anti-HER3 que pode ser usado na presente invenção não está particularmente limitado e é, desejavelmente, por exemplo, qualquer um dos anticorpos tendo propriedades conforme descrito abaixo.
[00304] (1) Um anticorpo anti-HER3 tendo as seguintes proprieda des:
[00305] (a) ligação específica ao HER3, e/ou
[00306] (b) ter a atividade de ser internalizado em células que ex pressam HER3 através de ligação ao HER3.
[00307] (2) O anticorpo de acordo com (1), em que o anticorpo se liga ao domínio extracelular de HER3.
[00308] (3) O anticorpo de acordo com (1) ou (2), em que o anticor po é um anticorpo monoclonal.
[00309] (4) O anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (3), em que o anticorpo apresenta atividade de citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpos (Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity - ADCC) e/ou atividade de citotoxicidade dependente de complemento (Complement-Dependent Cytotoxicity - CDC).
[00310] (5) O anticorpo de acordo com qualquer de (1) a (4), em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal de camundongo, um anticorpo monoclonal quimérico, um anticorpo monoclonal humanizado ou um anticorpo humano ou totalmente humano (anticorpo monoclonal).
[00311] (6) O anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (5), em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal humanizado que compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoáci- dos representada por SEQ ID NO: 1 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2.
[00312] (7) O anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (6), em que o anticorpo carece de um resíduo de lisina no carbóxi termino da cadeia pesada.
[00313] (8) O anticorpo de acordo com (7), em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada representada pela sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 70 e uma região variável de cadeia leve representada pela sequência de amino- ácidos representada por SEQ ID NO: 72.
[00314] (9) Um anticorpo obtido através de um método para produ zir o anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (8), o método compreendendo as etapas de: cultura de uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão compreendendo um polinucleotí- deo que codifica o anticorpo; e coleta do anticorpo de interesse das culturas obtidas na etapa precedente.
[00315] Daqui em diante, será descrito o anticorpo anti-HER3 usado na presente invenção.
[00316] No presente relatório descritivo, os termos "câncer" e "tu mor" são usados alternadamente.
[00317] No presente relatório descritivo, o termo "gene" inclui não apenas DNA, mas mRNA, cDNA e cRNA dos mesmos.
[00318] No presente relatório descritivo, o termo "polinucleotídeo" é usado alternadamente com ácido nucleico e também inclui DNA, RNA, sondas, oligonucleotídeos e iniciadores.
[00319] No presente relatório descritivo, os termos "polipeptídeo" e "proteína" são usados alternadamente.
[00320] No presente relatório descritivo, o termo "célula" também inclui células em indivíduos animais e células cultivadas.
[00321] No presente relatório descritivo, o termo "HER3" é usado alternadamente com proteína HER3.
[00322] No presente relatório descritivo, o termo "CDR" significa uma região determinante de complementaridade (Complementarity Determining Region - CDR). Uma molécula de anticorpo é conhecida por ter três CDRs em cada uma das cadeias pesadas e leves. CDRs, também denominadas domínios hipervariáveis, estão localizadas nas regiões variáveis de cadeias pesadas e leves do anticorpo. Esses sítios têm uma estrutura primária particularmente altamente variável e são separados em três posições nas respectivas estruturas primárias polipeptídicas das cadeias pesadas e cadeias leves. No presente relatório descritivo, as CDRs de anticorpos são ditas como CDRH1, CDRH2 e CDRH3 a partir do amino término da sequência de aminoá- cidos de cadeia pesada como as CDRs de cadeia pesada e como CDRL1, CDRL2 e CDRL3 a partir do amino término da sequência de aminoácidos de cadeia leve como as CDRs de cadeia leve. Estes sítios estão próximos um do outro na estrutura tridimensional e determinam a especificidade para o antígeno a ser ligado. Na presente invenção, a frase "hibridizar sob condições rigorosas" se refere à hibridiza- ção a 68 °C em uma solução de hibridização comercialmente disponível ExpressHyb Hybridization Solution (fabricada pela Clontech Laboratories, Inc.) ou hibridização identificável sob condições que envolvem a hibridização a 68 °C na presença de NaCl a 0,7 a 1,0 M usando um filtro imobilizado-DNA, seguido por lavagem a 68 °C usando 0,1 a 2X solução de SSC (1X SSC é composto por NaCl a 150 mM e citrato de sódio a 15 mM) ou hibridização sob condições equivalentes. 1. HER3
[00323] O receptor 3 de fator de crescimento epidérmico humano 3 (HER3, também conhecido como ErbB3) é uma proteína tirosina qui- nase receptora que pertence à subfamília de proteínas tirosina quinase receptora do receptor de fator de crescimento epidérmico (Epidermal Growth Factor Receptor - EGFR), a qual também inclui HER1 (também conhecido como EGFR), HER2 e HER4. O HER3 é um receptor transmembrana e é composto por um domínio extracelular de ligação a ligante (ECD), um domínio de dimerização dentro do ECD, um domínio transmembrana, um domínio intracelular de proteína tirosina qui- nase (Tyrosine Kinase Domain - TKD) e um domínio de fosforilação C- terminal. Verificou-se que o HER3 é excessivamente expresso em vários tipos de câncer, tal como cânceres de mama, gastrintestinal e de pâncreas. Uma correlação entre a expressão de HER2/HER3 e a progressão de um estágio não invasivo para um estágio invasivo foi demonstrada.
[00324] A proteína HER3 usada na presente invenção pode ser usada após purificação direta a partir de células de mamíferos que expressam HER3 humana ou não humana (rato, camundongo, etc.) ou podem ser usadas preparando frações de membrana celular das células. Alternativamente, o HER3 pode ser sintetizado in vitro ou pode ser produzido a partir de células hospedeiras por meio de engenharia genética. Em engenharia genética, especificamente, o cDNA do HER3 é integrado em vetores que permitam a expressão do mesmo e o HER3 pode, então, ser expresso através de síntese em uma solução que contém as enzimas necessárias para transcrição e tradução, substratos e substâncias energéticas, ou por meio de transformação de outras células hospedeiras procariotas ou células hospedeiras eucariotas para produzir a proteína. Alternativamente, as células que expressam HER3 geneticamente modificadas descritas acima ou uma linhagem de células com HER3 expressa pode ser usada como a proteína HER3.
[00325] Uma sequência de RNA, uma sequência de cDNA e uma sequência de aminoácidos de HER3 estão disponíveis em bancos de dados públicos e podem ser citadas por um número de acesso, tal como AAA35979 (precursor que inclui uma sequência sinalizadora que consiste em um resíduo de 19 aminoácidos no amino término), M34309 (NCBI), por exemplo.
[00326] A sequência de aminoácidos de HER3 acima consiste em uma sequência de aminoácidos que está sujeita a substituições, eliminações, adições e/ou inserções de pelo menos um aminoácido e proteínas tendo uma atividade biológica equivalente àquela da proteína também estão incluídas na HER3.
2. Produção de Anticorpos Anti-HER3
[00327] O anticorpo contra HER3 da presente invenção pode ser obtido por meio de imunização de um animal com HER3 ou um poli- peptídeo arbitrário selecionado dentre a sequência de aminoácidos de HER3 e coleta e purificação do anticorpo produzido in vivo de acordo com um método geralmente realizado na técnica. As espécies biológi- cas de HER3 a serem usadas como um antígeno não se limitam ao ser humano e um animal pode ser imunizado com HER3 derivado de um animal não humano, tal como um rato ou um camundongo. Nesse caso, ao examinar a reatividade cruzada entre um anticorpo que se liga ao HER3 heterólogo obtido e o HER3 humano, um anticorpo aplicável a uma doença humana pode ser selecionado.
[00328] Além disso, um anticorpo monoclonal pode ser obtido a partir de um hibridoma estabelecido através de fusão de células produtoras de anticorpos que produzem um anticorpo contra o HER3 com células de mieloma de acordo com um método conhecido (por exemplo, Kohler e Milstein, Nature (1975) 256, pp. 495-497; Kennet, R. ed, Monoclonal Antibodies, pp. 365-367, Plenum Press, New York (1980)).
[00329] O HER3 a ser usado como um antígeno pode ser obtido através de expressão do gene de HER3 em uma célula hospedeira usando técnicas de engenharia genética.
[00330] Especificamente, um vetor capaz de expressar o gene de HER3 é produzido e o vetor resultante é transfectado em uma célula hospedeira para expressar o gene e, então, a HER3 expressa é purificada.
[00331] Também é possível usar células que expressam HER3 obtidas por meio de engenharia genética ou uma linhagem de células que expressa HER3 como proteína HER3. Daqui em diante, um método para obtenção de um anticorpo contra HER3 é explicado especificamente.
(1) Preparo de Antígeno
[00332] Exemplos do antígeno a usar para a produção do anticorpo anti-HER3 incluem HER3, um polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos parcial que compreende pelo menos 6 ami- noácidos consecutivos de HER3 e um derivado obtido mediante adição de uma determinada sequência de aminoácidos ou veículo ao mesmo.
[00333] O HER3 pode ser purificado diretamente a partir de tecidos tumorais humanos ou células tumorais e usado. Além disso, o HER3 pode ser obtido ao sintetizá-lo in vitro ou através de produção do mesmo em uma célula hospedeira por meio de engenharia genética.
[00334] Em relação à engenharia genética, especificamente, após o cDNA de HER3 ser integrado em um vetor capaz de expressar cDNA de HER3, o HER3 pode ser obtido sintetizando-o em uma solução contendo uma enzima, um substrato e uma substância energética necessária para transcrição e tradução ou expressando HER3 em outra célula hospedeira procariota ou eucariota transformada.
[00335] Além disso, o antígeno também pode ser obtido como uma proteína secretora ao expressar uma proteína de fusão obtida por meio de ligação ao domínio extracelular de HER3, a qual é uma proteína da membrana, com a região constante de um anticorpo de um sistema hospedeiro-vetor apropriado.
[00336] O cDNA de HER3 pode ser obtido, por exemplo, através do assim denominado método de PCR, em que uma reação em cadeia de polimerase (designada como "PCR"; vide Saiki, R.K. et al., Science (1988) 239, pp. 487-489) é realizada usando uma biblioteca de cDNA que expressa cDNA de HER3 como um modelo e iniciadores que amplificam especificamente o cDNA de HER3.
[00337] Como a síntese in vitro do polipeptídeo, por exemplo, Rapid Translation System (RTS) fabricado pela Roche Diagnostics, Inc., pode ser exemplificado, porém sem limitações ao mesmo.
[00338] Exemplos de células hospedeiras procariotas incluem Escherichia coli e Bacillus subtilis. Para transformar as células hospedeiras com um gene alvo, as células hospedeiras são transformadas por um vetor de plasmídeo que compreende um replicon, isto é, uma origem de replicação derivada de uma espécie compatível com o hospe- deiro e uma sequência reguladora. Além disso, o vetor tem, de preferência, uma sequência capaz de impor seletividade fenotípica à célula transformada.
[00339] Exemplos de células hospedeiras eucariotas incluem células de vertebrados, células de insetos e células de levedura. Como as células de vertebrados, por exemplo, células COS de símio (Gluzman, Y., Cell (1981) 23, pp. 175-182, ATCC CRL-1650; ATCC: American Type Culture Collection), fibroblastos NIH3T3 de murino (ATCC N° CRL-1658) e cepas deficientes em di-hidrofolato redutase (Urlaub, G. e Chasin, L.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, pp. 4126-4220) de células de ovário de hamster chinês (células CHO; ATCC: CCL-61); e similares são, muitas vezes, usadas; no entanto, as células não estão limitadas às mesmas.
[00340] O transformante assim obtido pode ser cultivado de acordo com um método comumente realizado na técnica e cultura do trans- formante, um polipeptídeo alvo é produzido intracelular ou extracelu- larmente.
[00341] Um meio adequado a ser usado para cultura pode ser selecionado de vários meios de cultura comumente usados, dependendo das células hospedeiras empregadas. Se Escherichia coli é empregada, por exemplo, um meio LB suplementado com antibióticos, tais como ampicilina ou IPMG, pode ser usado quando necessário.
[00342] Uma proteína recombinante produzida intracelular ou extra- celularmente pelo transformante de tal cultura pode ser separado e purificado através de qualquer um dos vários métodos de separação conhecidos usando a propriedade física ou química da proteína.
[00343] Exemplos específicos de métodos incluem o tratamento com um precipitante de proteína comum, ultrafiltração, vários tipos de cromatografia de líquido, tal como cromatografia em peneira molecular (filtração em gel), cromatografia de adsorção, cromatografia de permu- ta iônica, cromatografia de afinidade, diálise e uma combinação dos mesmos.
[00344] Além disso, ao fixar um marcador de histidina de seis resíduos a uma proteína recombinante a ser expressa, a proteína pode ser eficientemente purificada com uma coluna de afinidade de níquel. Alternativamente, ao ligar a região Fc de IgG a uma proteína recombi- nante a ser expressa, a proteína pode ser eficientemente purificada com uma coluna de proteína A.
[00345] Ao combinar os métodos anteriormente descritos, uma grande quantidade de um polipeptídeos alvo podem ser facilmente produzidos com um rendimento elevado e pureza elevada.
[00346] Também é possível usar o transformante mencionado acima como um antígeno. Também é possível usar uma linhagem de células que expressa HER3 como um antígeno. Exemplos da linhagem de células incluem. No entanto, contanto que HER3 seja expresso, elas não estão limitadas a estas linhagens de células.
(2) Produção de Anticorpo Monoclonal Anti-HER3
[00347] Exemplos de ligação específica do anticorpo ao HER3 incluem uma de ligação específica de anticorpo monoclonal ao HER3 e um método de obtenção do anticorpo conforme descrito abaixo.
[00348] A produção de um anticorpo monoclonal geralmente requer as seguintes etapas operacionais de:
[00349] (a) purificação de um biopolímero usado como um antígeno ou preparo de células que expressam os antígenos;
[00350] (b) preparo de células produtoras de anticorpos através da imunização de um animal por meio de injeção do antígeno, coleta do sangue, ensaio de sua titulação de anticorpos para determinar quando o baço é excisado;
[00351] (c) preparo de células de mieloma (daqui em diante desig nadas como "mieloma");
[00352] (d) fusão das células produtoras de anticorpos com o mi- eloma;
[00353] (e) rastreio de um grupo de hibridomas que produzem um anticorpo desejado;
[00354] (f) divisão dos hibridomas em clones de células individuais (clonagem);
[00355] (g) opcionalmente, cultura do hibridoma ou criação de ani mal implantado com o hibridoma para produção de uma grande quantidade de um anticorpo monoclonal;
[00356] (h) exame do anticorpo monoclonal assim produzido quanto à atividade biológica e especificidade de ligação ou ensaio do mesmo quanto a propriedades como um reagente marcado; e similares.
[00357] Daqui em diante, o método de produção de um anticorpo monoclonal será descrita em detalhes seguindo as etapas acima, no entanto, o método não está limitado ao mesmo e, por exemplo, células produtoras de anticorpos diferentes das células de baço e células de mieloma podem ser usadas.
(a) Purificação do antígeno
[00358] Como o antígeno, o HER3 preparado através do método conforme descrito acima ou um peptídeo parcial do mesmo pode ser usado.
[00359] Além disso, uma fração de membrana preparada a partir de células recombinantes que expressam HER3 ou células recombinan- tes que expressam HER3 em si, bem como um peptídeo parcial da proteína da invenção quimicamente sintetizado por meio de um método conhecido por aqueles versados na técnica também pode ser usado como o antígeno.
[00360] Além disso, uma linhagem de células que expressa HER3 também pode ser usada como um antígeno.
(b) Preparo das células produtoras de anticorpos
[00361] O antígeno obtido na etapa (a) é misturado com um adjuvante, tal como sulfato de potássio alumínio ou adjuvante completo ou incompleto de Freund, e a mistura resultante é usada como um imu- nogênio para imunizar um animal experimental. Em um método alternativo, um animal de teste é imunizado com células que expressam os antígenos como um imunogênio. Como animal experimental, qualquer animal usado em um método conhecido de produção de hibridoma pode ser usado sem qualquer dificuldade. Especificamente, por exemplo, um camundongo, um rato, uma cabra, ovelha, gado, um cavalo ou similar pode ser usado. No entanto, do ponto de vista de facilidade de disponibilidade de células de mieloma a serem fundidas com as células produtoras de anticorpos extraídas, um camundongo ou um rato é, de preferência, usado como o animal a ser imunizado.
[00362] Além disso, a cepa de um camundongo ou um rato a ser usado não está particularmente limitada e, no caso de um rato, por exemplo, várias cepas, tais como A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BL, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB e 129 e similares podem ser usadas e, no caso de um rato, por exemplo, Wistar, Low, Lewis, Sprague, Dawley, ACI, BN, Fischer e similares podem ser usados.
[00363] Estes camundongos e ratos estão comercialmente disponíveis a partir de criadores/distribuidores de animais experimentais, por exemplo, CLEA Japan, Inc. e Charles River Laboratories Japan, Inc.
[00364] Como o animal a ser imunizado, levando em consideração a compatibilidade de fusão com as células de mieloma descritas a seguir, no caso de um camundongo, BALB/c e, no caso de um rato, as cepas Wistar e Low são particularmente preferidas.
[00365] Além disso, levando em consideração a homologia antigê- nica entre seres humanos e camundongos, também é preferido usar um camundongo tendo uma diminuição da função biológica para elimi- nar autoanticorpos, isto é, um camundongo com uma doença autoimu- ne.
[00366] A idade de tais camundongo ou ratos, no momento da imunização é, de preferência, de 5 a 12 semanas de idade, mais preferivelmente de 6 a 8 semanas de idade.
[00367] De modo a imunizar um animal com um HER3 ou um re- combinante do mesmo, por exemplo, um método conhecido descrito em detalhes, por exemplo, em Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987); Kabat, E. A. e Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964) ou similares podem ser usados.
[00368] Dentre esses métodos de imunização, um método específico preferido da invenção é, por exemplo, como segue.
[00369] Isto é, primeiro, uma fração de proteína da membrana que serve como o antígeno ou células que vão expressar o antígeno são administradas por via intradérmica ou intraperitoneal a um animal. No entanto, a combinação de ambas as vias de administração é preferida para aumentar a eficiência de imunização e quando administração in- tradérmica é realizada na primeira metade e administração intraperitoneal é realizada na última metade ou apenas na última dosagem, a eficiência de imunização pode ser particularmente aumentada.
[00370] O esquema de administração do antígeno varia dependendo do tipo de animal a ser imunizado, da diferença individual ou similar. No entanto, em geral, um regime de administração no qual a frequência de administração do antígeno é de 3 a 6 vezes e o intervalo de dosagem é de 2 a 6 semanas é preferido, e um esquema de administração no qual a frequência de administração do antígeno é de 3 a 4 vezes e o intervalo de dosagem é de 2 a 4 semanas é mais preferido.
[00371] Além disso, a dose do antígeno varia dependendo do tipo de animal, das diferenças individuais ou similar; no entanto, a dose é, em geral, de 0,05 a 5 mg, de preferência cerca de 0,1 a 0,5 mg.
[00372] Uma imunização de reforço é realizada de 1 a 6 semanas, de preferência de 1 a 4 semanas, mais preferivelmente de 1 a 3 semanas após administração do antígeno, conforme descrito acima. Quando o imunogênio é uma célula, 1x106 a 1x107 células são usadas.
[00373] A dose do antígeno no momento de executar a imunização de reforço varia de acordo com o tamanho ou tipo de animal ou similar, contudo, no caso, por exemplo, de um camundongo, a dose é geralmente de 0,05 a 5 mg, de preferência de 0,1 a 0,5 mg, mais preferivelmente cerca de 0,1 a 0,2 mg. Quando o imunogênio é uma célula, 1x106 a 1x107 células são usadas.
[00374] As células do baço ou linfócitos, incluindo as células produtoras de anticorpos, são removidas assepticamente do animal imunizado 1 a 10 dias, de preferência 2 a 5 dias, mais preferivelmente 2 a 3 dias após a imunização de reforço. Neste ponto, a titulação de anticorpo é medida e, se um animal com uma titulação suficientemente aumentada de anticorpos é usado como uma fonte de células produtoras de anticorpos, o procedimento subsequente pode ser realizado de forma mais eficiente.
[00375] Exemplos do método de medição da titulação de anticorpos a ser usado aqui incluem um método RIA e um método ELISA, mas o método não está limitado aos mesmos. Por exemplo, se um método ELISA é usado, a medição da titulação de anticorpo na invenção pode ser realizada de acordo com os procedimentos conforme descrito abaixo.
[00376] Primeiro, um antígeno purificado ou parcialmente purificado é adsorvido à superfície de uma fase sólida, tal como uma placa com 96 cavidades, para ELISA e a superfície da fase sólida não tendo o antígeno adsorvido na mesma é coberta com uma proteína não relaci- onada ao antígeno, tal como albumina sérica bovina (daqui em diante dita como "BSA"). Após lavagem da superfície, a superfície é contatada com uma amostra diluída em série (por exemplo, soro de camundongo) como anticorpo primário, para permitir que o anticorpo na amostra se ligue ao antígeno.
[00377] Além disso, como um anticorpo secundário, é adicionado um anticorpo marcado com uma enzima contra um anticorpo de camundongo e é deixado se ligar ao anticorpo de camundongo. Após lavagem, é adicionado um substrato para a enzima e uma alteração na absorbância que ocorre em virtude do desenvolvimento de cor induzido pela degradação do substrato ou similar é medida e a titulação do anticorpo é calculada com base na medição.
[00378] A separação das células produtoras de anticorpos a partir de células do baço ou linfócitos do animal imunizado pode ser realizada de acordo com um método conhecido (por exemplo, Kohler et al., Nature (1975), 256, página 495; Kohler et al., Eur J. Immunol (1977), 6, página 511; Milstein et al., Nature (1977), 266, p. 550; Walsh, Nature (1977), 266, p. 495). Por exemplo, no caso de células de baço, um método geral no qual as células produtoras de anticorpos são separadas por homogeneização do baço para produzir as células por meio de filtração com uma peneira de aço inoxidável e suspensão das células em meio de Eagle Essencial Mínimo (Eagle's Minimum Essential Medium - MEM) pode ser empregado.
(c) Preparo de células de mieloma (daqui em diante designado como "mieloma")
[00379] As células de mieloma a serem usadas para a fusão celular não estão particularmente limitadas e células adequadas podem ser selecionadas a partir de linhagens de células conhecidas. No entanto, levando em consideração a conveniência, quando um hibridoma é selecionado a partir de células fundidas, é preferido usar uma cepa defi- ciente em HGPRT (hipoxantina-guanina-fosforibosil-transferase), cujo procedimento de seleção foi estabelecido.
[00380] Mais especificamente, exemplos da cepa deficiente em HGPRT incluem X63-Ag8 (X63), NS1-ANS/1 (NS1), P3X63-Ag8.U1 (P3U1), X63-Ag8.653 (X63.653), SP2/0-Ag14 (SP2/0), MPC11- 45.6TG1.7 (45.6TG), FO, S149/5XXO e BU.1 derivadas de camundongos; 210.RSY3.Ag.1.2.3 (Y3) derivadas de camundongos; e U266AR (SKO-007), GM1500 x GTG-A12 (GM1500), UC729-6, LICR- LOW-HMy2 (HMy2) e 8226AR/NIP4-1 (NP41) derivadas de seres humanos. Estas cepas deficientes em HGPRT estão disponíveis, por exemplo, da ATCC ou similar.
[00381] Estas cepas de células são subcultivadas em um meio adequado, tal como um meio de 8-azaguanina [um meio obtido mediante adição de 8-azaguanina a um meio RPMI 1640 suplementado com glutamina, 2-mercaptoetanol, gentamicina e soro fetal de vitelo (daqui em diante designado como "FBS")], Meio de Dulbecco Modificado por Iscove; IMDM) ou Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (daqui em diante dito como "DMEM"). Neste caso, 3 a 4 dias antes de realizar a fusão celular, as células são subcultivadas em um meio normal [por exemplo, um meio ASF104 (fabricado pela Ajinomoto Co., Ltda.) contendo FCS a 10%] para assegurar não menos do que 2x107 células no dia da fusão celular.
(d) Fusão celular
[00382] A fusão entre as células produtoras de anticorpos e as células de mieloma pode ser realizada de forma adequada de acordo com um método conhecido (Weir, D.M. Handbook of Experimental Immunology Vol I. II III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987); Kabat, E.A. e Mayer, M.M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher, Springfield, Illinois (1964), etc.), sob condições tais que a taxa de sobrevivência de células não seja excessivamente reduzida.
[00383] Como tal, um método, por exemplo, um método químico no qual as células produtoras de anticorpos e as células de mieloma são misturadas com uma solução contendo um polímero, tal como polieti- leno glicol em uma alta concentração, um método físico que utiliza estimulação elétrica ou similar pode ser usado. Dentre estes métodos, um exemplo específico do método químico é conforme descrito abaixo.
[00384] Isto é, no caso onde polietileno glicol é usado na solução contendo um polímero em uma concentração elevada, as células produtoras de anticorpos e as células de mieloma são misturadas em uma solução de polietileno glicol com um peso molecular de 1500 a 6000, mais preferivelmente 2000 a 4000, em uma temperatura de 30 a 40°C, de preferência de 35 a 38 °C durante 1 a 10 minutos, de preferência 5 a 8 minutos.
(e) Seleção de um grupo de hibridomas
[00385] O método de seleção dos hibridomas obtidos por fusão celular descrita acima não está particularmente limitado. Normalmente, um método de seleção com HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina) (Kohler et al., Nature (1975), 256, p. 495; Milstein et al., Nature (1977), 266, p. 550) é usado.
[00386] Este método é eficaz quando hibridomas são obtidos utilizando células de mieloma de uma cepa deficiente em HGPRT que não pode sobreviver na presença de aminopterina. Isto é, ao cultivar células não fundidas e hibridomas em meio HAT, apenas hibridomas resistentes à aminopterina conseguem sobreviver e proliferar seletivamente.
(f) Divisão em clone celular individual (clonagem)
[00387] Como um método de clonagem de hibridomas, um método conhecido, tal como um método de metil celulose, um método de agarose macia ou um método de diluição limitativa, pode ser usado (vide, por exemplo, Barbara, B.M. e Stanley, M.S.: Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman e Company, São Francisco (1980)). Dentre esses métodos, particularmente, um método de cultura tridimensional, tal como um método de metil celulose, é preferido. Por exemplo, o grupo de hibridomas produzidos por fusão de células é suspenso em um meio de metil celulose, tal como ClonaCell-HY Selection Medium D (fabricado pela StemCell Technologies, Inc., #03804) e cultivado. Então, as colônias de hibridomas formadas são coletadas, pelo que hibridomas monoclonais podem ser obtidos. As respectivas colônias de hibridoma coletadas são cultivadas e um hibridoma que tenha sido confirmado como tendo uma titulação de anticorpo estável em um sobrenadante de cultura de hibridoma obtido é selecionado como uma cepa de hibridoma produtora de anticorpo monoclonal anti- HER3.
(g) Preparo de anticorpo monoclonal por cultura de hibridoma
[00388] Através da cultura do hibridoma assim selecionado, um anticorpo monoclonal pode ser obtido eficientemente. No entanto, antes da cultura, é preferível realizar o rastreio de um hibridoma que produz um anticorpo monoclonal alvo.
[00389] Em tal rastreio, um método conhecido pode ser empregado.
[00390] A medição da titulação de anticorpo na invenção pode ser realizada, por exemplo, através de um método ELISA explicado no item (b) descrito acima.
[00391] O hibridoma obtido por meio do método descrito acima, pode ser armazenado em um estado congelado em nitrogênio líquido ou em um congelador a -80C ou abaixo.
[00392] Após completar a clonagem, o meio é trocado de um meio HT para um meio normal e o hibridoma é cultivado.
[00393] A cultura em larga escala é realizada através de cultura rotativa usando um grande frasco de cultura ou cultura em uma centrífuga. Do sobrenadante obtido pela cultura em larga escala, um anticorpo monoclonal que se liga especificamente à proteína da invenção pode ser obtido através de purificação usando um método conhecido por aqueles versados na técnica, tal como filtração em gel.
[00394] Além disso, o hibridoma é injetado na cavidade abdominal de um camundongo da mesma cepa que o hibridoma (por exemplo, o camundongo BALB/c descrito acima) ou um camundongo Nu/Nu para proliferar o hibridoma, pelo que a ascite contendo uma grande quantidade do anticorpo monoclonal da invenção pode ser obtida.
[00395] No caso onde o hibridoma é administrado na cavidade abdominal, se um óleo mineral, tal como 2,6,10,14-tetrametil pentadecano (pristano), é administrado de 3 a 7 dias antes, pode ser obtida uma maior quantidade de ascite.
[00396] Por exemplo, um imunossupressor é previamente injetado na cavidade abdominal de um camundongo da mesma cepa que o hi- bridoma para inativar as células T. 20 dias depois, 106 a 107 células de clone de hibridoma são suspensas em um meio isento de soro (0,5 mL) e a suspensão é administrada na cavidade abdominal do camundongo. Em geral, quando o abdômen é expandido e preenchido com a ascite, a ascite é coletada do camundongo. Por esse método, o anticorpo monoclonal pode ser obtido em uma concentração que é cerca de 100 vezes ou muito mais elevada do que na solução de cultura.
[00397] O anticorpo monoclonal obtido por meio do método descrito acima pode ser purificado através de um método descrito, por exemplo, em Weir, D. M.: Handbook of Experimental Immunology Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978).
[00398] O anticorpo monoclonal assim obtido apresenta elevada especificidade antigênica pelo HER3.
(h) Ensaio de anticorpo monoclonal
[00399] O isotipo e a subclasse do anticorpo monoclonal assim obtidos podem ser determinados como segue.
[00400] Primeiro, exemplos do método de identificação incluem um método de Ouchterlony, um método ELISA e um método RIA.
[00401] Um método de Ouchterlony é simples, mas quando a concentração do anticorpo monoclonal é baixa, é necessária uma operação de condensação.
[00402] Por outro lado, quando um método ELISA ou um método RIA é usado, ao reagir diretamente o sobrenadante de cultura com o antígeno adsorvido em uma fase sólida e usar anticorpos que correspondem a vários tipos de isotipos e subclasses de imunoglobulina como anticorpos secundários, o isotipo e a subclasse do anticorpo monoclonal podem ser identificados.
[00403] Além disso, como um método mais simples, um kit de identificação comercialmente disponível (por exemplo, Mouse Typer Kit fabricado pela Bio-Rad Laboratories, Inc.) e similares também podem ser usados.
[00404] Ainda, a determinação quantitativa de uma proteína pode ser realizada por meio do método de Folin de Lowry e um método de cálculo com base na absorbância a 280 nm [1,4 (OD 280) = 1 mg/mL de imunoglobulina].
[00405] Além disso, mesmo quando o anticorpo monoclonal é separado e independentemente obtido realizando novamente as etapas de (a) a (h) em (2), é possível obter um anticorpo tendo uma atividade ci- totóxica equivalente àquela do anticorpo anti-HER3. Como um exemplo de tal anticorpo, um anticorpo que se liga ao mesmo epitopo que o anticorpo anti-HER3 pode ser exemplificado. Se um anticorpo monoclonal recém produzido se liga a um peptídeo parcial ou uma estrutura terciária parcial à qual o anticorpo anti-HER3 se liga, pode ser determinado que o anticorpo monoclonal se liga ao mesmo epitopo que o anticorpo anti-HER3. Além disso, ao confirmar a competição pelo anticorpo monoclonal pela ligação do anticorpo anti-HER3 ao HER3 (liga- ção entre o anticorpo anti-HER3 e HER3 sofre interferência pelo anticorpo monoclonal), pode ser determinado que o anticorpo monoclonal se liga ao mesmo epitopo que o anticorpo anti-HER3, apesar de a sequência ou estrutura específica de epitopo não ter sido identificada. Uma vez que o epitopo é confirmado como sendo o mesmo, é altamente esperado que o anticorpo monoclonal tenha a mesma capacidade de ligação ao antígeno ou atividade biológica que o anticorpo an- ti-HER3.
(3) Outros Anticorpos
[00406] O anticorpo da invenção inclui não apenas o anticorpo monoclonal contra HER3 descrito acima, mas também um anticorpo re- combinante obtido por meio de modificação artificial com a finalidade de diminuir a antigenicidade heteróloga para seres humanos, tais como um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado e um anticorpo humano. Estes anticorpos podem ser produzidos através de um método conhecido.
[00407] Como o anticorpo quimérico, um anticorpo no qual as regiões variáveis e constantes de anticorpo são derivadas de espécies diferentes, por exemplo, um anticorpo quimérico, no qual uma região variável de anticorpo derivada de camundongo ou rato está ligada a uma região constante derivada de ser humano, pode ser exemplificado (vide Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855 (1984)).
[00408] Como o anticorpo humanizado, um anticorpo obtido pela integração de uma única região determinante de complementaridade (CDR) em um anticorpo derivado de ser humano (vide Nature (1986) 321, pp. 522-525) e um anticorpo obtido através de enxertia de uma parte dos resíduos de aminoácido da "framework", bem como a sequência de CDR de um anticorpo humano por meio de um método de enxertia de CDR (documento WO 90/07861) podem ser exemplificados.
[00409] O termo "vários", conforme usado aqui, se refere a 1 a 10, 1 a 9, 1 a 8, 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3 ou 1 ou 2.
[00410] De acordo com a presente invenção, deverá ser entendido que a sequência de aminoácidos da proteína de ligação da invenção não se limita aos vinte aminoácidos convencionais (vide Immunology - A Synthesis (2a Edição, E. S. Golub e D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), o qual é aqui incorporado por referência). Por exemplo, os aminoácidos podem incluir estereoisômeros (por exemplo, D-aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais, aminoácidos não naturais, tais como aminoácidos alfa-,alfa- dissubstituídos, N-alquil aminoácidos, ácido láctico e outros aminoáci- dos não convencionais. Exemplos de aminoácidos não convencionais que podem igualmente ser componentes adequados para a proteína de ligação da invenção incluem: 4-hidroxiprolina, gama- carboxiglutamato, épsilon-N,N,N-trimetil lisina, épsilon-N-acetil-lisina, O-fosfo-serina, N-acetil serina, N-formilmetionina, 3-metil-histidina, 5- hidroxilisina, sigma-N-metilarginina e outros aminoácidos similares e imino ácidos, por exemplo, 4-hidroxiprolina.
[00411] Como a substituição de aminoácido no presente relatório descritivo, é preferida uma substituição de aminoácidos conservativa. Uma substituição de aminoácido conservativa se refere a uma substituição que ocorre dentro de um grupo de aminoácidos relacionados com cadeias laterais de aminoácidos. Grupos de aminoácidos preferidos são os seguintes: um grupo ácido (ácido aspártico e ácido glutâ- mico); um grupo básico (lisina, arginina e histidina); um grupo não polar (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina e triptofano); e uma família polar não carregada (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina e tirosina). Grupos de aminoácidos mais preferidos são os seguintes: um grupo hidroxila alifático (serina e treonina); um grupo contendo amida (asparagina e glutamina); um grupo alifático (alanina, valina, leucina e isoleucina); e um grupo aromático (fenilalanina, triptofano e tirosina). Tal substituição de aminoá- cido é, de preferência, realizada dentro de um intervalo que não prejudica as propriedades de uma substância tendo a sequência de amino- ácidos inicial. Quando as cadeias pesada e leve do anticorpo da presente invenção têm glutamato como o aminoácido N-terminal, ele pode ser ciclizado (na forma de piroglutamato). Na presente invenção, tal piroglutamato não se distingue da glutamina normal em sequências de aminoácidos. Nas cadeias pesada e leve do anticorpo da presente invenção, a cisteína pode estar na forma de cisteinila. Na presente invenção, tal forma de cisteinila não se distingue da cisteína normal em sequências de aminoácidos.
[00412] Além disso, o anticorpo da invenção inclui um anticorpo humano que se liga ao HER3. Um anticorpo anti-HER3 humano se refere a um anticorpo humano tendo apenas uma sequência genética de um anticorpo derivado de um cromossoma humano. O anticorpo anti- HER3 humano pode ser obtido por meio de um método que usa um camundongo produtor de anticorpo humano tendo um fragmento de cromossoma humano que compreende os genes de cadeia pesada e leve de um anticorpo humano (vide Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, pp. 133-143; Kuroiwa, Y. et al., Nucl. Acids Res. (1998) 26, pp. 3447-3448; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, pp. 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. e Iiji- ma, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, pp. 722-727, etc.).
[00413] Tal camundongo produtor de anticorpo humano pode ser criado especificamente como se segue. Um animal geneticamente modificado em que a imunoglobulina endógena loci de cadeia pesada e leve do gene tenha sido interrompida e em vez disso, a imunoglobu- lina humana loci de cadeia pesada e leve do gene tenha sido introdu- zida através de um cromossoma artificial de levedura (YAC) vetor ou similar, é criado através da produção de um nocaute animal e um animal transgênico e do acasalamento desses animais.
[00414] Além disso, de acordo com uma técnica de DNA recombi- nante, usando os cDNA que codifica cada uma de tais cadeia pesada e cadeia leve de um anticorpo humano e, de preferência, um vetor compreendendo tal cDNA, células eucariotas são transformadas e uma célula transformante que produz um anticorpo monoclonal humano recombinante é cultivada, pelo que o anticorpo também pode ser obtido a partir do sobrenadante da cultura.
[00415] Aqui, como o hospedeiro, por exemplo, células eucariotas, de preferência células de mamíferos, tais como células CHO, linfócitos ou células de mieloma, podem ser usados.
[00416] Em relação ao preparo de um anticorpo humano, descrições detalhadas são apresentadas na Publicação Internacional N° WO 2007/077028. O conteúdo da Publicação Internacional N° WO 2007/077028 é aqui incorporado por referência.
[00417] Além disso, um método de obtenção de um anticorpo humano através de visualização em fago selecionado a partir de uma biblioteca de anticorpos humanos (vide Wormstone, I. M. et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), pp. 2301-2308; Carmen, S. et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), pp. 189-203; Siriwardena, D. et al., Ophthalmology (2002) 109 (3), pp. 427-431, etc.) também é conhecida.
[00418] Por exemplo, um método de visualização em fago, em que uma região variável de um anticorpo humano é expressa na superfície de um fago como um anticorpo com uma única cadeia (scFv) e um fa- go que se liga a um antígeno é selecionado (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), pp. 1105-1116) pode ser usado.
[00419] Ao analisar o gene do fago selecionado com base na liga- ção a um antígeno, pode ser determinada uma sequência de DNA que codifica a região variável de um anticorpo humano que se liga a um antígeno.
[00420] Se a sequência de DNA de scFv que se liga a um antígeno é determinada, um anticorpo humano pode ser obtido por meio de preparo de um vetor de expressão compreendendo a sequência e introdução do vetor em um hospedeiro adequado para expressá-lo (documentos WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388; Annu Rev. Immunol (1994) 12, pp. 433-455; Nature Biotechnology (2005) 23 (9), pp. 11051116).
[00421] Um aspecto da presente invenção se refere a uma proteína isolada que se liga ao HER3. Em uma modalidade da presente invenção, uma proteína de ligação ao HER3 isolada da invenção compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada que compreende: (a) CDRH1 compreendida na sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 ou 230, (b) CDRH2 compreendida na sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 ou 230 e (c) CDRH3 compreendida na sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 ou 230 e uma sequência de região variável de aminoácidos da cadeia leve que compreende: (d) CDRL1 compreendida na sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 ou 232, (e) CDRL2 compreendida na sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 ou 232 e (f) CDRL3 compreendida na sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 ou 232.
[00422] A proteína de ligação ao HER3 isolada da presente invenção compreende, de preferência, uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada que compreende (a) CDRH1 compreendendo a sequência de aminoácidos representada por uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 236, 251, 252 e 256; (b) CDRH2 compreendendo a sequência de aminoácidos representada por uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 258, 278, 280 e 282; e (c) CDRH3 compreendendo a sequência de aminoácidos representada por uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 283, 285, 309, 313 e 315 e uma se-quência de aminoácidos de cadeia leve compreendendo (d) CDRL1 compreendendo a sequência de aminoácidos representada por uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 320, 334, 337 e 340; (e) CDRL2 compreendendo a sequência de aminoáci- dos representada por uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 343, 356, 351 e 344; e (f) CDRL3 compreendendo a sequência de aminoácidos representada por uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 360, 381, 385 e 387.
[00423] Em outra modalidade da presente invenção, uma proteína de ligação isolada da invenção compreende uma sequência de amino- ácidos de região variável de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 e 230 e/ou uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 e 232.
[00424] Em ainda outra modalidade da presente invenção, uma proteína de ligação isolada da invenção compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 2 e 4, 6 e 8, 10 e 12, 14 e 16, 18 e 20, 22 e 24, 26 e 28, 30 e 32, 36 e 38, 42 e 44, 46 e 48, 50 e 52, 54 e 56, 60 e 58, 62 e 64, 66 e 68, 70 e 72, 74 e 76, 78 e 82, 80 e 82, 84 e 86, 88 e 90, 92 e 94, 96 e 98, 100 e 102, 104 e 106, 108 e 110, 112 e 114, 116 e 118, 122 e 124, 126 e 128, 130 e 132, 134 e 136, 138 e 140, 142 e 144, 146 e 148, 150 e 152, 154 e 156, 158 e 160, 162 e 164, 166 e 168, 170 e 172, 174 e 176, 178 e 180, 182 e 184, 186 e 188, 190 e 192, 194 e 196, 198 e 200, 202 e 204, 206 e 208, 210 e 212, 214 e 216, 218 e 220, 222 e 224, 226 e 228 ou 230 e 232 ou uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 34, 40, 60, 62 ou 120 e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representada por SEQ ID NO: 58 ou 64, respectivamente.
[00425] A proteína de ligação ao HER3 isolada da presente invenção compreende, mais preferivelmente, uma sequência de aminoáci- dos de região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 42, 54, 70, 92 ou 96 e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representada por SEQ ID NO: 44, 56, 72, 94 ou 98.
[00426] Um anticorpo que compreende uma sequência de aminoá- cidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de amino- ácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 2 e 4 é designado como "U1-39", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 6 e 8, é designado como "U1-40", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 10 e 12, é designado como "U1-38", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 14 e 16, é designado como "U1-41", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 18 e 20, é designado como "U1-42", um anticorpo que compreende uma sequência de amino- ácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de ami- noácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 22 e 24, é designado como "U1-43", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 26 e 28, é designado como "U1- 44", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 30 e 32 é designado como "U1-45", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 36 e 38 é designado como "U1-47", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 42 e 44 é designado como "U1-49", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada sequência e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 46 e 48 é designado como "U1-50", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 50 e 52 é designado como "U1-51", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 54 e 56 é designado como "U1-53", um anticorpo que com-preende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 60 e 58 é designado como "U1- 55", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada de e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 62 e 64 é designado como "U1-57", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 66 e 68 é designado como "U1-58", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 70 e 72 é designado como "U1-59", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 74 e 76 é designado como "U1-52", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 78 e 82 é designado como "U1- 61", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 80 e 82 é designado como "U1-61.1", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 84 e 86 é designado como "U1-62", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 88 e 90 é designado como "U1-2", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 92 e 94 é designado como "U1-7", um anticorpo que compre- ende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 96 e 98 é designado como "U1- 9", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 100 e 102 é designado como "U1-10", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs : 104 e 106 é designado como "U1-12", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 108 e 110 é designado como "U1-13 ", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 112 e 114 é designado como "U1-14", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 116 e 118 é designado como "U1-15", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 122 e 124 é designado como "U1-20", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 126 e 128 é designado como "U1-21", um anticorpo que compreende uma sequência de ami- noácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 130 e 132 é designado como "U1-22", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 134 e 136 é designado como "U1-23", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoáci- dos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoá- cidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 138 e 140 é designado como "U1-24", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 142 e 144 é designado como "U1-25", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoáci- dos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoá- cidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 146 e 148 é designado como "U1 -26", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 150 e 152 é designado como "U1-27", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoáci- dos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoá- cidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 154 e 156 é designado como "U1-28", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pe-sada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 158 e 160 é designado como "U1-31", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoáci- dos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoá- cidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 162 e 164 é designado como "U1-32", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pe- sada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 166 e 168 é designado como "U1-35", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoáci- dos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoá- cidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 170 e 172 é designado como "U1-36", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 174 e 176 é designado como "U1-37", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoáci- dos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoá- cidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 178 e 180 é designado como "U1-34", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 182 e 184 é designado como " U1-1 ", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 186 e 188 é designado como "U1-3", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 190 e 192 é designado como "U1-4", um anti-corpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 194 e 196 é designado como "U1-5", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 198 e 200 é designado como "U1-6", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 202 e 204 é designado como "U1-8", um anticorpo que compreende uma sequência de ami- noácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 206 e 208 é designado como "U1-11", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 210 e 212 é designado como "U1-16", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoáci- dos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoá- cidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 214 e 216 é designado como "U1-17", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 218 e 220 é designado como "U1-18", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoáci- dos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoá- cidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 222 e 224 é designado como "U1-33", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pe-sada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 226 e 228 é designado como "U1-29", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoáci- dos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoá- cidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 230 e 232 é designado como "U1-30", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 34 é designado como "U1-46", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 40 é designado como "U1-48", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 60 e 58 é designado como "U1-55.1", um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 120 é designado como "U1-19" e um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 62 e 64 é designado como "U1-57.1". Estes anticorpos são descritos em detalhes nos Exemplos. A proteína de ligação ao HER3 isolada da presente invenção compreende, ainda mais preferivelmente, uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 42 e 44, respectivamente, uma sequência de aminoáci- dos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoá- cidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 54 e 56, respectivamente, uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representadas por SEQ ID NOs: 70 e 72, respectivamente, uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representada por SEQ ID NOs: 92 e 94, respectivamente ou uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve representada por SEQ ID NOs: 96 e 98, respectivamente e, ainda mais preferivelmente, as proteínas de ligação do HER3 são U1-49, U1-53, U1-59, U1-7 ou U1-9, os quais são um anticorpo anti- HER3. Química 14 LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
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[00427] Quando um anticorpo monoclonal recém-produzido se liga a um peptídeo parcial ou a uma estrutura terciária parcial a qual o anticorpo U1-49, U1-53, U1-59, U1-7 ou U1-9 se liga, pode ser determinado que o anticorpo se liga ao mesmo epitopo que o anticorpo U1-49, U1-53, U1-59, U1-7 ou U1-9. Além disso, confirmando que o anticorpo compete com o anticorpo U1-49, U1-53, U1-59, U1-7 ou U1-9 pela ligação ao HER3 (isto é, o anticorpo inibe a ligação entre o anticorpo U1-49, U1-53, U1-59, U1-7 ou U1-9 e o HER3), pode ser determinado que o anticorpo se liga ao mesmo epitopo que o anticorpo U1-49, U1- 53, U1-59, U1-7 ou U1-9 mesmo quando a sequência específica ou estrutura de um epitopo não está definida. Uma vez que o epitopo é confirmado como sendo o mesmo, é altamente esperado que o anti-corpo tenha uma atividade biológica equivalente àquela do anticorpo U1-49, U1-53, U1-59, U1-7 ou U1-9.
[00428] De acordo com a presente invenção, a proteína de ligação da invenção interage com pelo menos um epitopo na parte extracelular de HER3. Os epitopos estão, de preferência, localizados no domínio L1 (aa 19-184), o qual é o domínio do amino término, nos domínios S1 (aa 185-327) e S2 (aa 500-632), os quais são os dois domínios ricos em cisteína, no domínio L2 (328-499), o qual é flanqueado pelos dois domínios ricos em cisteína ou em uma combinação de domínios HER3. Os epitopos também podem estar localizados em combinações de domínios tais como, porém não limitados a um epitopo composto por partes de L1 e S1. Além disso, a proteína de ligação da invenção é ainda caracterizada pelo fato de que sua ligação ao HER3 reduz a transdução de sinal mediada por HER3. De acordo com a presente invenção, uma redução na transdução de sinal mediada por HER3 pode, por exemplo, ser causada por uma regulação negativa de HER3, resultando em um desaparecimento, pelo menos parcial, das moléculas de HER3 da superfície da célula ou em uma estabilização de HER3 na superfície da célula em uma forma substancialmente inativa, isto é, uma forma que exibe uma transdução de sinal menor em comparação com a forma não estabilizada. Alternativamente, uma redução de transdução de sinal mediada por HER3 também pode ser causada pela influência, por exemplo, redução ou inibição, sobre a ligação de um ligante ou outro membro da família HER ao HER3, de GRB2 ao HER-2 ou de GRB2 à SHC, por meio de inibição da fosforilação da tirosina do receptor, fosforilação de AKT, fosforilação de tirosina PYK2 ou fosfori- lação de ERK2 ou através de diminuição da invasividade do tumor. Alternativamente, uma redução na transdução de sinal mediada por HER3 também pode ser causada pela influência, por exemplo, redução ou inibição, da formação de dímeros contendo HER3 com outros membros da família HER. Um exemplo, dentre outros, pode ser a diminuição ou a inibição da formação de complexos de proteína HER3- EGFR .
[00429] Além disso, de acordo com a presente invenção, pequenas variações nas sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOs: 1-232 são consideradas como estando abrangidas pela presente invenção, contanto que as variações na sequência de aminoácidos continuem a reter pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, 90%, 95% e, ainda mais preferivelmente, 99% das sequências apresentadas em SEQ ID NOs: 1-232. As variações podem ocorrer dentro das regiões de "framework" (isto é, fora das CDRs), dentro das CDRs ou dentro das regiões de "framework" e das CDRs. Variações preferidas nas sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOs: 1-232, isto é, eliminações, inserções e/ou substituições de pelo menos um aminoácido ocorrem próximo de limites de domínios funcionais. Domínios estruturais e funcionais podem ser identificados ao comparar dados da sequência de nucleotídeos e/ou aminoácidos em bancos de dados de sequências públicas ou particulares. Métodos de comparação computadorizados podem ser usados para identificar motivos de sequências ou domínios de conformação de proteína previstos que ocorrem em outras proteínas de ligação de estrutura e/ou função conhecida. Métodos para identificar sequências de proteína que se dobram em uma estrutura tridimensional conhecida são conhecidos. Vide, por exemplo, Bowie et al., Science 253, 164 (1991); Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed, W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden e J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, NY (1991)); e Thornton et al., Nature 354, 105 (1991), os quais são todos aqui incorporados por referência. Assim, aqueles versados na técnica podem reconhecer motivos de sequência e conformações estruturais que po-dem ser usados para definir os domínios estruturais e funcionais de acordo com a invenção. Dentre os anticorpos obtidos através da combinação de cadeias pesadas e leves que possuem variações em tais sequências de aminoácidos, um anticorpo equivalente ao anticorpo original (anticorpo progenitor) ou mais excelente do que um anticorpo progenitor pode ser selecionado. Conforme mencionado acima, a pro- teína de ligação ao HER3, o anticorpo anti-HER3 e similares da presente invenção retêm a atividade de ligação ao HER3, mesmo se tiver variações em suas sequências de aminoácidos.
[00430] Na presente invenção, o termo "homologia" apresenta o mesmo significado que "identidade. A homologia entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinada usando os parâmetros de default do algoritmo Blast versão 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaeffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller e David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI- BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389- 3402). O algoritmo Blast pode ser usado também através da Internet, acessando o site www.ncbi.nlm.nih.gov/blast.
[00431] O anticorpo quimérico, o anticorpo humanizado ou o anticorpo humano obtido por meio do método mencionado acima pode ser submetido a um método conhecido para avaliar a propriedade de ligação a um antígeno para selecionar anticorpos preferidos.
[00432] No anticorpo anti-HER3 da presente invenção, MEHD- 7945A (ou duligotuzumabe), RG-7116, MM-111, MM-121 (ou seriban- tumabe), MM-141, LJM-716, huHER3-8, "zybody" anti-EGFR/ErbB3 triespecífico, GSK-2849330, REGN-1400, KTN-3379, AV-203, "surro- body" monoespecífico (ErbB3), lumretuzumabe, MP-EV-20, ZW-9, Di- merceptTM, "surrobody" anti-Erb3 (SL-175 ou SL-176), SYM-013, variantes, fragmentos ativos, produtos modificados dos mesmos e similares também estão incluídos.
[00433] Como um exemplo de outro índice para uso na comparação das propriedades dos anticorpos, a estabilidade de anticorpos pode ser exemplificada. A calorimetria de varredura diferencial (Differential Scanning Calorimetry - DSC) é um dispositivo capaz de medir, rápida e precisamente, uma temperatura de desnaturação térmica mediana (Tm) a ser usada como um índice favorável de estabilidade conforma- cional relativa de proteínas. Ao medir os valores de Tm usando DSC e comparando os valores, diferenças na estabilidade térmica podem ser comparadas. Sabe-se que a estabilidade ao armazenamento de anticorpos mostra alguma correlação com a estabilidade térmica de anticorpos (Lori Burton, et al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, pp. 265-273) e um anticorpo preferido pode ser selecionado usando tal estabilidade térmica como um índice. Exemplos de outros índices para seleção de anticorpos incluem as seguintes propriedades: o rendimento em uma célula hospedeira apropriada é elevado; e a agregação em uma solução aquosa é baixa. Por exemplo, um anticorpo que mostra maior rendimento nem sempre mostra uma maior estabilidade térmica e, portanto, é necessário selecionar um anticorpo mais adequado para administração a seres humanos através de avaliação global com base nos índices descritos acima.
[00434] O anticorpo da presente invenção abrange um produto modificado do anticorpo. A variante modificada se refere a uma variante obtida submetendo o anticorpo da invenção à modificação química ou biológica. Exemplos da variante quimicamente modificada incluem variantes quimicamente modificadas por meio de ligação de uma porção química a um esqueleto de aminoácidos, variantes quimicamente modificadas com uma cadeia de carboidrato N-ligada ou O-ligada, etc. Exemplos da variante biologicamente modificada incluem variantes obtidas por meio de modificação após tradução (tal como glicosilação N-ligada ou O-ligada, processamento N- ou C-terminal, desamidação, isomerização de ácido aspártico ou oxidação de metionina) e variantes nas quais um resíduo de metionina foi adicionado ao N-término, sendo expressa em uma célula hospedeira procariota. Além disso, um anti-corpo marcado de modo a permitir detecção ou isolamento do anticorpo ou um antígeno da invenção, por exemplo, um anticorpo marcado com enzima, um anticorpo marcado por fluorescência e um anticorpo marcado por afinidade, também estão incluídos no significado da variante modificada. Tal variante modificada do anticorpo da presente invenção é útil para melhorar a estabilidade e a retenção sanguínea do anticorpo, reduzir a antigenicidade do mesmo, detectar ou isolar o anticorpo ou o antígeno e assim por diante.
[00435] Além disso, ao regular a modificação de uma glicana que está ligada ao anticorpo da invenção (glicosilação, defucosilação, etc.), é possível aumentar uma atividade citotóxica celular dependente de anticorpo. Como a técnica para regulação da modificação de uma gli- cana de anticorpos, as Publicações Internacionais WO 1999/54342, WO 2000/61739, WO 2002/31140, etc. são conhecidas. No entanto, a técnica não se limita às mesmas. No anticorpo da invenção, um anticorpo no qual a modificação de uma glicana é regulada também está incluído.
[00436] No caso onde um anticorpo é produzido primeiro isolando um gene de anticorpo e, então, introduzindo o gene em um hospedeiro adequado, uma combinação de um hospedeiro adequado e um vetor de expressão adequado pode ser usada. Exemplos específicos do gene de anticorpo incluem uma combinação de um gene que codifica uma sequência de cadeia pesada de um anticorpo e um gene que codifica para uma sequência da cadeia leve do mesmo descrito na presente relatório descritivo. Quando uma célula hospedeira é transformada, é possível inserir a sequência de gene de cadeia pesada e o gene da sequência de cadeia leve no mesmo vetor de expressão e também em diferentes vetores de expressão separados.
[00437] No caso onde células eucariotas são usadas como o hospedeiro, células animais, células vegetais e micro-organismos eucario- tas podem ser usados. Como as células animais, células de mamíferos, por exemplo, células COS de símio (Gluzman, Y., Cell (1981) 23, pp. 175-182, ATCC CRL-1650), fibroblastos de murino NIH3T3 (ATCC N° CRL-1658) e cepas deficientes em reductase di-hidrofolato (Urlaub, G. e Chasin, L.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, pp. 41264220), células de ovário de hamster Chinês (células CHO; ATCC: CCL-61) podem ser exemplificadas.
[00438] No caso onde células procariotas são usadas, por exemplo, Escherichia coli e Bacillus subtilis podem ser exemplificadas.
[00439] Ao introduzir um gene de anticorpo desejado nessas células através de transformação e cultura das células assim transformadas in vitro, o anticorpo pode ser obtido. No método de cultura descrito acima, o rendimento pode, algumas vezes, variar dependendo da sequência do anticorpo e, portanto, é possível selecionar um anticorpo que é facilmente produzido como um produto farmacêutico usando o rendimento como um índice entre os anticorpos que possuem uma atividade de ligação equivalente. Portanto, no anticorpo da invenção, um anticorpo obtido através de um método de produção de um anticorpo caracterizado por incluir uma etapa de cultura da célula hospedeira transformada e uma etapa de coleta de um anticorpo desejado ou um fragmento funcional do anticorpo a partir de um produto cultivado obtido na etapa de cultura também está incluído.
[00440] Sabe-se que um resíduo de lisina no carbóxi término da cadeia pesada de um anticorpo produzido em uma célula de mamífero em cultura pode ser suprimido/eliminado (Journal of Chromatography, 705: 129-134 (1995)) e sabe-se também que os resíduos de dois ami- noácidos (glicina e lisina) no carbóxi término da cadeia pesada de um anticorpo produzido em uma célula de mamífero em cultura podem ser suprimidos/eliminados e um resíduo de prolina recentemente localizado no carbóxi término pode ser amidado (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)). No entanto, tal supressão e/ou eliminação e modificação da sequência de cadeia pesada não afetam a afinidade de ligação ao antígeno e a função efetuadora (ativação de complemento, citotoxi- cidade celular dependente de anticorpos, etc.) do anticorpo. Portanto, no anticorpo da invenção, um anticorpo e um fragmento funcional do anticorpo que sofreu tais modificações estão também incluídos e uma variante com eliminação, na qual um ou dois aminoácidos foram suprimidos do carbóxi término da cadeia pesada, uma variante obtida pela amidação da variante com eliminação (por exemplo, uma cadeia pesada na qual o resíduo de prolina carbóxi terminal foi amidado) e similares também estão incluídos. O tipo de variante com eliminação que possui uma supressão no carbóxi termino da cadeia pesada do anticorpo de acordo com a invenção não está limitado às variantes acima, contanto que a afinidade de ligação ao antígeno e a função efe- tuadora sejam preservadas. As duas cadeias pesadas que constituem o anticorpo de acordo com a invenção podem ser de um tipo selecionado do grupo que consiste em uma cadeia pesada de comprimento total e a variante com eliminação descrita acima ou podem ser de dois tipos selecionados em uma combinação dos mesmos. A proporção entre a quantidade de cada variante com eliminação pode ser afetada pelo tipo de células de mamíferos em cultura que produzem o anticorpo de acordo com a invenção e as condições de cultura, no entanto, um caso onde um resíduo de aminoácido no carbóxi término foi eliminado em ambas as duas cadeias pesadas contidas como componentes principais do anticorpo de acordo com a invenção pode ser exemplificado. O escopo de aplicação do anticorpo completo (na presente invenção, também simplesmente dito como um "anticorpo") da presente invenção inclui também variantes com eliminação, misturas contendo uma ou duas ou mais variantes com eliminação, etc. O "anticorpo" da presente invenção inclui um anticorpo que compreende uma cadeia pesada ou leve na qual o glutamato N-terminal está na forma de piro- glutamato por meio de ciclização e/ou uma cadeia pesada ou leve na qual uma parte dos resíduos de cisteína estão na forma de cisteinila.
[00441] Em uma modalidade preferida da presente invenção, o anticorpo anti-HER3 da invenção é do tipo IgA, IgD, IgE1 IgG ou IgM, de preferência do tipo IgG ou IgM incluindo, porém sem limitações, do tipo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM1 e IgM2. Em modalidades mais preferidas, o anticorpo é do tipo IgG1, IgG2 ou tipo IgG4.
[00442] Como a atividade biológica do anticorpo, geralmente, uma atividade de ligação ao antígeno, atividade de internalização de um antígeno em células que expressam o antígeno através de ligação com o antígeno, uma atividade de neutralização de atividade de um antígeno, uma atividade de aumentar a atividade de um antígeno, uma atividade de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (AntibodyDependent Cell Cytotoxicity-ADCC), uma atividade de citotoxicidade dependente de complemento (Complement-Dependent Cytotoxicity - CDC) e uma atividade de fagocitose mediada por células dependente de anticorpo (Antibody Dependent Cell Mediated Phagocytosis - ADCP) podem ser exemplificadas. A função do anticorpo de acordo com a invenção é uma atividade de ligação ao HER3, de preferência atividade de internalização de HER3 em células que expressam HER3 por meio de ligação com HER3. Além disso, o anticorpo da invenção pode ter uma atividade de ADCC, uma atividade de CDC e/ou uma atividade de ADCP, além de atividade de internalização celular.
[00443] Em certos aspectos, por exemplo, em relação à geração de anticorpos como candidatos terapêuticos contra o HER3, pode ser desejável que o anticorpo anti-HER3 da invenção seja capaz de fixar o complemento e participar em citotoxicidade dependente de complemento (Complement-Dependent Cytotoxicity - CDC). Há uma série de isotipos de anticorpos que são capazes disso incluindo, sem limitações, os seguintes: IgM de murino, IgG2a de murino, IgG2b de murino, IgG3 de murino, IgM humana, IgG1 humana, IgG3 humana e IgA hu mana. Será apreciado que anticorpos os quais são gerados não precisam inicialmente possuir tal isotipo, mas em vez do anticorpo conforme gerado, pode possuir qualquer isotipo e o anticorpo pode ter o iso- tipo trocado ao ligar genes da região V molecularmente clonados ou cDNA a genes da região constante molecularmente clonados ou cDNA em vetores de expressão apropriados usando métodos de biologia molecular convencionais os quais são bem conhecidos na técnica e, então, expressando os anticorpos em células hospedeiras usando métodos conhecidos na técnica. O anticorpo com isotipo trocado pode também possuir uma região Fc que tenha sido molecularmente manipulada para possuir CDC superior em relação a variantes que ocorrem naturalmente (Idusogie et al., J. Immunol., 166, 2571-2575) e expresso de forma recombinante em células hospedeiras usando métodos co-nhecidos na técnica. Tais técnicas incluem o uso de técnicas recombi- nantes diretas (vide, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No 4.816.397), técnicas de fusão de célula-célula (vide, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos 5.916.771 e 6.207.418), dentre outras. Na técnica de fusão de célula-célula, é preparado um mieloma ou outra linhagem de células, tal como CHO, que possui uma cadeia pesada com qualquer isotipo desejado e é preparado outro mieloma ou outra linhagem de células, tal como CHO, que possui a cadeia leve. Tais células podem, então, ser fundidas e uma linhagem de células que expressa um anticorpo intacto pode ser isolada. A título de exemplo, um anticorpo de IgG4 anti-HER3 humano que possui a ligação desejada ao antígeno HER3 poderia ter o isotipo prontamente trocado para ge-rar um isotipo de IgM humana, IgG1 humana ou IgG3 humana, ao mesmo tempo em que continua a possuir a mesma região variável (a qual define a especificidade do anticorpo e parte de sua afinidade). Tal molécula pode, então, ser capaz de fixar o complemento e participar na CDC.
[00444] Além disso, também pode ser desejável que o anticorpo anti-HER3 da invenção seja capaz de se ligar a receptores de Fc em células efetuadoras, tais como monócitos e células assassinas naturais (Natural Killer - NK) e participar em citotoxicidade celular dependente de anticorpo (Antibody-Dependent Cell Cytotoxicity- ADCC). Há uma série de isotipos de anticorpos que são capazes disso incluindo, sem limitações, os seguintes: IgG2a de murino, IgG2b de murino, IgG3 de murino, IgG1 humana e IgG3 humana. Será apreciado que anticorpos os quais são gerados não precisam inicialmente possuir tal isotipo, mas em vez do anticorpo conforme gerado, pode possuir qualquer iso- tipo e o anticorpo pode ter o isotipo trocado ao ligar genes da região V molecularmente clonados ou cDNA a genes da região constante molecularmente clonados ou cDNA em vetores de expressão apropriados usando métodos de biologia molecular convencionais os quais são bem conhecidos na técnica e, então, expressando os anticorpos em células hospedeiras usando métodos conhecidos na técnica. O anticorpo com isotipo trocado pode também possuir uma região Fc que tenha sido molecularmente manipulada para ter ADCC superior em relação a variantes que ocorrem naturalmente (Shields et al. J Biol. Chem., 276, 6.591-6.604) e expresso de forma recombinante em células hospedeiras usando métodos conhecidos na técnica. Tais técnicas incluem o uso de técnicas recombinantes diretas (vide, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No 4.816.397), técnicas de fusão de célula-célula (vide, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos 5.916.771 e 6.207.418), dentre outras. Na técnica de fusão de célula- célula, é preparado um mieloma ou outra linhagem de células, tal como CHO, que possui uma cadeia pesada com qualquer isotipo desejado e é preparado outro mieloma ou outra linhagem de células, tal como CHO, que possui a cadeia leve. Tais células podem, então, ser fundidas e uma linhagem de células que expressa um anticorpo intacto pode ser isolada. A título de exemplo, um anticorpo de IgG4 anti-HER3 humano que possui a ligação desejada ao antígeno HER3 poderia ter o isotipo prontamente trocado para gerar um isotipo de IgG1 humana ou IgG3 humana, ao mesmo tempo em que continua a possuir a mesma região variável (a qual define a especificidade do anticorpo e parte de sua afinidade). Tal molécula pode, então, ser capaz de se ligar ao FcyR em células efetuadoras e participar na ADCC.
[00445] O anticorpo obtido pode ser purificado até estar homogêneo. A separação e a purificação do anticorpo podem ser realizadas empregando um método convencional de separação e purificação de proteínas. Por exemplo, o anticorpo pode ser separado e purificado ao selecionar e combinar apropriadamente cromatografia em coluna, filtração em filtro, ultrafiltração, precipitação de sal, diálise, eletroforese em gel de poliacrilamida preparativa, eletroforese de focagem isoelé- trica e similares (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow e David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), mas o método não está limitado aos mesmos.
[00446] Exemplos de tal cromatografia incluem cromatografia de afinidade, cromatografia de permuta iônica, cromatografia hidrofóbica, cromatografia de filtração em gel, cromatografia de fase reversa e cromatografia de adsorção.
[00447] Tal cromatografia pode ser realizada usando cromatografia de líquido, tal como HPLC ou FPLC.
[00448] Como coluna a ser usada em cromatografia de afinidade, uma coluna de Proteína A e uma coluna de Proteína G podem ser exemplificadas. Por exemplo, como uma coluna usando Proteína A, Hyper D, POROS, Sepharose FF (Pharmacia Corp.) e similares podem ser exemplificadas.
[00449] Além disso, ao usar um veículo que possui um antígeno imobilizado no mesmo, o anticorpo também pode ser purificado usando a propriedade de ligação ao antígeno do anticorpo.
Composto antitumor
[00450] O composto antitumor a ser conjugado com o conjugado de anticorpo anti-HER3-fármaco da presente invenção é explicado. O composto antitumor usado na presente invenção não está particularmente limitado, contanto que ele seja um composto que tenha um efeito antitumor e um substituinte ou uma estrutura parcial que permita ligação a uma estrutura ligante. Quando uma parte ou todo ligante do composto antitumor é clivado em células de tumor, a fração de composto antitumor é liberada para expor o efeito antitumor. À medida que o ligante é clivado em uma posição de ligação com um medicamento, o composto antitumor é liberado em sua estrutura não modificada para exibir seu efeito antitumor intrínseca.
[00451] Como um composto antitumor usado na presente invenção, exatecano, um derivado de camptotecina ((1S,9S)-1-amino-9-etil-5- fluoro-2,3-di-hidro-9-hidróxi-4-metil-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-10,13(9H,15H)-diona mostrado na fórmula a seguir) pode, de preferência, ser usado. Química 16
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[00452] Apesar de ter um efeito antitumor excelente, o exatecano não apresenta sido comercializado como um medicamento antitumor. O composto pode ser facilmente obtido através de um método conhe- cido e o grupo amino na posição 1 pode, de preferência, ser usado como uma posição de ligação com a estrutura de ligante. Além disso, o exatecano também pode ser liberado em células tumorais enquanto parte do ligante ainda está ligado ao mesmo. No entanto, ele é um excelente composto que exibe um efeito antitumor excelente, mesmo em tal estrutura.
[00453] Uma vez que o exatecano apresenta uma estrutura de camptotecina, sabe-se que o equilíbrio se desloca para uma estrutura com um anel de lactona fechado (anel fechado) em meio aquoso ácido (por exemplo, pH de 3 ou mais), mas se desloca para uma estrutura com um anel de lactona aberto (anel aberto) em um meio aquoso básico (por exemplo, pH de 10 ou menos). Espera-se também que um conjugado de fármaco a ser introduzido com um resíduo de exatecano que corresponde à estrutura de anel fechado e à estrutura de anel aberto tenha o mesmo efeito antitumor e é desnecessário dizer que qualquer um deles está dentro do escopo da presente invenção.
[00454] Exemplos de outros compostos antitumorais incluem doxor- rubicina, daunorrubicina, mitomicina C, bleomicina, ciclocitidina, vin- cristina, vinblastina, metotrexato, agentes antitumor com base em platina (cisplatina ou derivados da mesma), taxol ou derivados do mesmo e outros compostos de camptotecina ou derivados dos mesmos (agente antitumor descrito na Patente Japonesa Depositada Em-Aberto N° 6-87746).
[00455] Em relação ao conjugado de anticorpo-fármaco, o número de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticorpo é um fator chave que apresenta uma influência sobre a eficácia e segurança. A produção do conjugado de anticorpo-fármaco é realizada ao definir as condições de reação, incluindo as quantidades de uso de matérias-primas e reagentes para a reação, de modo a ter um número constante de moléculas de fármaco conjugadas. Uma mistura conten- do diferentes números de moléculas de fármaco conjugadas é, em geral, obtida ao contrário da reação química de um composto de baixo peso molecular. O número de fármacos conjugados em uma molécula de anticorpo é expresso ou especificado pelo valor médio, isto é, o número médio de moléculas de fármaco conjugadas. A menos que especificamente descrito de outro modo, como um princípio, o número de moléculas de fármaco conjugadas significa um valor médio, exceto em um caso no qual ele representa um conjugado de anticorpo-fármaco que tenha um determinado número de moléculas de fármaco conjugadas que está incluído em uma mistura de conjugado de anticorpo- fármaco tendo um número de moléculas do fármaco conjugadas diferente.
[00456] O número de moléculas de exatecano conjugadas a uma molécula de anticorpo é controlável e, como o número médio de moléculas de conjugados de fármaco por anticorpo, cerca de 1 a 10 moléculas de exatecano podem ser ligadas, de preferência, de 2 a 8 e, mais preferivelmente, de 3 a 8.
[00457] Ao mesmo tempo, aqueles versados na técnica podem criar uma reação para a conjugação de um número desejado de moléculas de fármaco a uma molécula de anticorpo com base na descrição dos exemplos do presente pedido e é possível obter um conjugado de an- ticorpo-fármaco com um número controlado de moléculas de exateca- no conjugadas.
[00458] É improvável que o conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção tenha uma ocorrência de agregação, insolubilidade, fragmentação ou similar, mesmo quando o número de moléculas de fármacos conjugadas por molécula de anticorpo é aumentado.
Estrutura de Ligante
[00459] Em relação ao conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER3 da presente invenção, a estrutura do ligante para conjugação de um composto antitumor ao anticorpo anti-HER3 é explicada. O ligante apresenta a seguinte estrutura:
[00460] -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- ou -L1-L2-LP-
[00461] O anticorpo é ligado à extremidade de L1 (extremidade oposta a qual L2 está ligado) e o composto antitumor é ligado ao grupo carbonila da porção -La-(CH2)n2-C(=O)- ou ao C-término da porção LP.
[00462] n1 representa um número inteiro de 0 a 6, de preferência um número inteiro de 1 a 5 e, mais preferivelmente, de 1 a 3. 1. L1
[00463] L1 é representado por uma estrutura mostrada abaixo:
[00464] -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n3-C(=O)-
[00465] No exemplo acima, n3 é um número inteiro de 2 a 8 e "- (Succinimid-3-il-N)-" apresenta uma estrutura representada pela seguinte fórmula: Química 17
Figure img0049
[00466] A posição 3 da estrutura parcial acima representa a posição de ligação ao anticorpo anti-HER3. A ligação ao anticorpo na posição 3 é caracterizada pela formação de uma ligação de tioéter. O átomo de nitrogênio na posição 1 da porção de estrutura está ligado ao átomo de carbono de metileno, o qual está presente no ligante que inclui a estrutura. Especificamente, -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n3-C(=O)-L2- é uma estrutura representada pela fórmula a seguir (aqui, "anticorpo-S-" é derivado de um anticorpo). Química 18
Figure img0050
[00467] Na fórmula, n3 é um número inteiro de 2 a 8 e, de preferência, de 2 a 5.
[00468] Exemplos específicos de L1 incluem os seguintes.
[00469] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-,
[00470] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-,
[00471] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
[00472] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- 2. L2
[00473] L2 apresenta uma estrutura representada pela fórmula a seguir:
[00474] -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-
[00475] L2 pode não estar presente e, em tal caso, L2 é uma ligação simples. Na estrutura de fármaco-ligante da presente invenção, em particular, LP pode ser diretamente conectado a um fármaco e, em tal caso, L2 é, particularmente de preferência, uma ligação simples. n4 é um número inteiro de 1 a 6 e, de preferência, de 2 a 4. L2 é conectado a L1 em seu grupo amino terminal e é conectado a LP no grupo carbonila da extremidade oposta.
[00476] Exemplos específicos de L2 incluem os seguintes.
[00477] -NH-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-,
[00478] -NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-,
[00479] -NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-,
[00480] -NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2- C(=O)-,
[00481] -NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-,
[00482] -NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)- 3. LP
[00483] LP é um resíduo peptídico que consiste em 2 a 7 aminoáci- dos. Especificamente, ele consiste em um resíduo de oligopeptídeo no qual 2 a 7 aminoácidos estão ligados por uma ligação peptídica. LP é conectado a L2 no N-término e está conectado ao grupo amino da porção -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- do ligante no C-término.
[00484] O aminoácido que constitui LP não está particularmente limitado e exemplos do mesmo incluem um L- ou a D-aminoácido, de preferência um L-aminoácido. Ainda, ele pode ser um aminoácido tendo uma estrutura tal como beta-alanina, ácido épsilon-aminocaproico ou ácido gama-aminobutírico, além de um alfa-aminoácido. Além disso, ele pode ser um aminoácido de tipo não natural, tal como um ami- noácido N-metilado.
[00485] A sequência do aminoácido de LP não está particularmente limitada, mas exemplos dos aminoácidos constituintes incluem fenila- lanina (Phe; F), tirosina (Tyr; Y), leucina (Leu; L), glicina (Gly; G), ala- nina (Ala; A), valina (Val; V), lisina (Lys; K), citrulina (Cit), serina (Ser; S), ácido glutâmico (Glu; E) e ácido aspártico (Asp; D). Dentre eles, exemplos preferidos incluem fenilalanina, glicina, valina, lisina, citruli- na, serina, ácido glutâmico e ácido aspártico. Dependendo do tipo de aminoácido, o padrão de liberação de fármaco pode ser controlado. O número do aminoácido pode estar entre 2 a 7.
[00486] Exemplos específicos de LP incluem os seguintes.
[00487] -GGF-,
[00488] -DGGF-,
[00489] -(D-)D-GGF-,
[00490] -EGGF-,
[00491] -GGFG-,
[00492] -SGGF-,
[00493] -KGGF-,
[00494] -DGGFG-,
[00495] -GGFGG-,
[00496] -DDGGFG-,
[00497] -KDGGFG-,
[00498] -GGFGGGF-
[00499] O "(D-)D" descrito acima significa Ácido D-aspártico. Exem plos de LP particularmente preferidos do conjugado de anticorpo- fármaco da presente invenção incluem os resíduos peptídicos -GGFG- e -DGGFG-. Ainda, na estrutura de fármaco-ligante da presente invenção, LP pode ser diretamente conectado ao fármaco e, em tal caso, exemplos preferidos de LP incluem um resíduo pentapeptídico de - DGGFG-. 4. La-(CH2)n2-C(=O)-
[00500] La em La-(CH2)n2-C(=O)- é uma estrutura de -O- ou uma ligação simples. n2 é um número inteiro de 0 a 5, de preferência de 0 a 3 e, mais preferivelmente, de 0 ou 1.
[00501] Exemplos de La-(CH2)n2-C(=O)- incluem os seguintes.
[00502] -O-CH2-C(=O)-,
[00503] -O-CH2CH2-C(=O)-,
[00504] -O-CH2CH2CH2-C(=O)-,
[00505] -O-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
[00506] -O-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
[00507] -CH2-C(=O)-,
[00508] -CH2CH2-C(=O)-,
[00509] -CH2CH2CH2-C(=O)-,
[00510] -CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
[00511] -CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-.
[00512] Dentre eles, aqueles com:
[00513] -O-CH2-C(=O)-,
[00514] -O-CH2CH2-C(=O)-
[00515] ou aqueles nos quais La é uma ligação simples e n2 é 0 são preferíveis.
[00516] Exemplos específicos da estrutura de ligante representada por -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- incluem os seguintes.
[00517] -NH-CH2-C(=O)-,
[00518] -NH-CH2CH2-C(=O)-,
[00519] -NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
[00520] -NH-CH2CH2-O-C(=O)-,
[00521] -NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
[00522] -NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
[00523] -NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
[00524] -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-
[00525] Dentre eles, os exemplos são, mais preferivelmente, os se guintes.
[00526] -NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
[00527] -NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
[00528] -NH-CH2CH2-O-C(=O)-
[00529] Como o ligante -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-, um comprimento de cadeia de 4 a 7 átomos é preferível e mais preferíveis são aqueles tendo um comprimento de cadeia de 5 ou 6 átomos.
[00530] Com relação ao conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER3 da presente invenção, quando ele é transferido para dentro de células tumorais, acredita-se que a porção ligante seja clivada e o derivado de fármaco tendo uma estrutura representada por NH2-(CH2)n1-La- (CH2)n2-C(=O)-(NH-DX) é liberado para expressar uma ação antitumor. Exemplos do derivado antitumor que exibe um efeito antitumor ao ser liberado do conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção incluem um derivado antitumor tendo uma porção de estrutura na qual a extremidade da estrutura representada por -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- C(=O)- do ligante é um grupo amino e inclui, particularmente de preferência, os seguintes.
[00531] NH2-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00532] NH2-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00533] NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00534] NH2-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).
[00535] Entretanto, no caso de NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), foi confirmado que, uma vez que a estrutura de amina na molécula é instável, ele sofre novamente autodegradação para liberar HO-CH2- C(=O)-(NH-DX). Estes compostos também podem ser, de preferência, usados como um intermediário de produção do conjugado de anticor- po-fármaco da presente invenção.
[00536] Ainda, na estrutura de fármaco-ligante da presente invenção, surge um caso no qual LP pode ser diretamente conectado ao fármaco. Em tal caso, quando o C-término de LP é glicina, o fármaco antitumor a ser liberado é o próprio exatecano ou um composto tendo glicina ligada ao grupo amino do exatecano.
[00537] Para o conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção no qual exatecano é usado como um fármaco, a porção de estrutura fármaco-ligante tendo a estrutura a seguir:
[00538] -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-(NH-DX) ou -L1-L2- LP-(NH-DX)
[00539] a qual o anticorpo está conectado é preferível. O número conjugado dessa porção de estrutura de fármaco-ligante pode ser de 1 a 10 como o número médio conjugado por anticorpo, de preferência, de 2 a 8 e, mais preferivelmente, de 3 a 8.
[00540] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-(NH-DX),
[00541] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00542] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00543] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00544] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00545] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG- NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00546] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG- NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00547] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG- NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00548] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00549] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00550] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00551] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00552] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX),
[00553] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX),
[00554] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX),
[00555] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX),
[00556] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- (NH-DX),
[00557] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG- (NH-DX).
[00558] Dentre elas, as mais preferidas são as seguintes.
[00559] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00560] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00561] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG- NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00562] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00563] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00564] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00565] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX),
[00566] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX),
[00567] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG- (NH-DX).
[00568] As mais preferidas são as seguintes.
[00569] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00570] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00571] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00572] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG- (NH-DX).
[00573] As particularmente preferidas são as seguintes.
[00574] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00575] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00576] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
[00577] Com relação à estrutura de ligante para conjugação do anticorpo anti-HER3 e um fármaco no conjugado de anticorpo-fármaco do presente pedido, o ligante preferido pode ser construído ao conectar estruturas preferidas mostradas para cada parte do ligante explicado acima. Como a estrutura ligante, aquelas com a estrutura a seguir podem, de preferência, ser usadas. Entretanto, a extremidade esquerda da estrutura é uma posição de conexão ao anticorpo e a extremidade direita é uma posição de conexão ao fármaco.
[00578] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-,
[00579] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-,
[00580] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-C(=O)-,
[00581] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-,
[00582] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
[00583] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG- NH-CH2CH2-C(=O)-,
[00584] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG- NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
[00585] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG- NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
[00586] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=O)-,
[00587] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
[00588] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,
[00589] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
[00590] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,
[00591] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-,
[00592] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-,
[00593] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-,
[00594] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-,
[00595] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-.
[00596] Dentre elas, são mais preferidas as seguintes.
[00597] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-,
[00598] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-,
[00599] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG- NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
[00600] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=O)-,
[00601] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
[00602] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
[00603] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-,
[00604] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-,
[00605] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-.
[00606] Ainda mais preferidas são as seguintes.
[00607] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=O)-,
[00608] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
[00609] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
[00610] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-.
[00611] Particularmente preferidas são as seguintes.
[00612] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=O)-,
[00613] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
[00614] -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.
Método de produção
[00615] Em seguida, são fornecidas explicações para o método representativo para produzir o conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção ou um intermediário de produção dos mesmos. Entretanto, os compostos fornecidos aqui abaixo são descritos com o número mostrado em cada fórmula de reação. Especificamente, eles são ditos como um "composto de fórmula (1)", um "composto (1)" ou similar. Os compostos com os outros números que não estes também são descritos de forma similar.
1. Método de Produção 1
[00616] O conjugado de anticorpo-fármaco representado pela fórmula (1) em que o anticorpo é conjugado com a estrutura de fármaco- ligante através de tioéter pode ser produzido por meio do método a seguir, por exemplo. Química 19
Figure img0051
[na fórmula, AB representa um anticorpo com um grupo sulfidrila e L1' corresponde a L1 tendo uma estrutura na qual o ligante terminal é convertido a um grupo maleimidila (fórmula mostrada abaixo). Química 20
Figure img0052
(na fórmula, o átomo de nitrogênio está na posição de conexão).
[00617] Especificamente, ele representa um ligante tendo uma estrutura a qual, dentro da estrutura de L1 representada como - (Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)-, a dita porção -(Succinimid-3-il-N)- é convertida em um grupo maleimidila. Ainda, -(NH-DX) representa uma estrutura representada pela fórmula a seguir: Química 21
Figure img0053
e representa um grupo que é derivado através de remoção de um átomo de hidrogênio do grupo amino na posição 1 do exatecano].
[00618] Além disso, o composto da fórmula (1) na fórmula de reação acima pode ser interpretado como uma estrutura na qual uma porção da estrutura de fármaco à extremidade do ligante está ligada a um anticorpo. No entanto, a descrição é fornecida apenas por uma questão de conveniência e, na verdade, há muitos casos onde uma pluralidade das ditas porções de estrutura estão ligadas a uma molécula de anticorpo. O mesmo se aplica à explicação do método de produção descrito abaixo.
[00619] Especificamente, o conjugado de anticorpo-fármaco (1) pode ser produzido por meio de reação do composto (2), o qual pode ser obtido por meio do método descrito abaixo, com o anticorpo (3a) que apresenta um grupo sulfidrila.
[00620] O anticorpo (3a) que apresenta um grupo sulfidrila pode ser obtido por meio de um método bem conhecido na técnica (Hermanson, G.T, Bioconjugate Techniques, pp. 56-136, pp. 456-493, Academic Press (1996)). Exemplos incluem: reação do reagente de Traut com o grupo amino do anticorpo; N-succinimidil S-acetiltioalcanoatos são reagidos com o grupo amino do anticorpo seguido por reação com hidro- xilamina; após reação com N-succinimidil-3- propionato de etila (piridil- ditio), reação com um agente redutor; reação do anticorpo com um agente redutor, tal como ditiotreitol, 2-mercaptoetanol e tris (2- carboxietil) fosfina (TCEP) para reduzir a ligação de dissulfureto em uma porção de dobradiça no anticorpo para formar um grupo sulfidrila, porém sem limitações ao mesmo.
[00621] Especificamente, usando-se 0,3 a 3 equivalentes molares de TCEP como um agente redutor por ligações de dissulfureto na parte de dobradiça no anticorpo e reação do anticorpo em uma solução tampão contendo um agente de quelação, o anticorpo no qual as ligações de dissulfureto na parte de dobradiça do anticorpo é parcial ou completamente reduzida pode ser obtido. Exemplos do agente de que- lação incluem ácido etileno diamina tetra acético (EDTA) e ácido dieti- leno triamina penta acético (DTPA). Ele pode ser usado na concentração de 1 mM a 20 mM. Exemplos da solução tampão que podem ser usados incluem uma solução de fosfato de sódio, borato de sódio ou acetato de sódio. Especificamente, ao reagir o anticorpo com TCEP a 4 °C a 37 °C durante 1 a 4 horas, pode ser obtido o anticorpo (3a) tendo grupos sulfidrila parcial ou completamente reduzidos.
[00622] Entretanto, ao realizar uma reação de adição de um grupo sulfidrila a uma molécula de fármaco-ligante, a porção de fármaco- ligante pode ser conjugada por uma ligação de tioéter.
[00623] Usando 2 a 20 equivalentes molares do composto (2) por anticorpo (3a) com um grupo sulfidrila, o conjugado de anticorpo- fármaco (1) no qual 2 a 8 moléculas de fármaco são conjugadas por anticorpo pode ser produzido. Especificamente, basta que a solução contendo o composto (2) dissolvido na mesma seja adicionada a uma solução tampão contendo o anticorpo (3a) que apresenta um grupo sulfidrila para reação. Aqui, exemplos de solução tampão que podem ser usadas incluem a solução de acetato de sódio, fosfato de sódio e borato de sódio. O pH para a reação é de 5 a 9 e, mais preferivelmente, a reação é realizada próxima de um pH de 7. Exemplos do solvente para dissolver o composto (2) incluem um solvente orgânico, tal como sulfóxido de dimetila (DMSO), dimetilformamida (DMF), dimetilaceta- mida ( DMA) e N-metil-2-pirrolidona (NMP).
[00624] A reação pode ser realizada mediante adição da solução de solvente orgânico contendo o composto (2) dissolvido na mesma em 1 a 20% v/v a uma solução tampão contendo o anticorpo (3a) que apresenta um grupo sulfidrila. A temperatura da reação é de 0 a 37 °C, mais preferivelmente de 10 a 25 °C e o tempo de reação é de 0,5 a 2 horas. A reação pode ser terminada por desativação da reatividade do composto (2) que não reagiu com um reagente contendo tiol. Exem- plos do reagente contendo tiol incluem cisteína e N-acetil-L-cisteína (NAC). Mais especificamente, através da adição de 1 a 2 equivalentes molares de NAC ao composto (2) usado e incubação em temperatura ambiente durante 10 a 30 minutos, a reação pode ser terminada.
[00625] O conjugado de anticorpo-fármaco (1) produzido pode ser submetido, após concentração, à troca de tampão, purificação e medição da concentração de anticorpos e o número médio de moléculas de fármacos conjugadas por molécula de anticorpo de acordo com procedimentos comuns descritos abaixo para fazer uma identificação do conjugado de anticorpo-fármaco (1).
Procedimento comum A: Concentração de uma solução aquosa de anticorpo ou conjugado de anticorpo-fármaco
[00626] A um recipiente Amicon Ultra (50.000 MWCO, Millipore Corporation), uma solução de anticorpo ou conjugado de anticorpo- fármaco foi adicionada e a solução de anticorpo ou conjugado de anti- corpo-fármaco foi concentrada por meio de centrifugação (centrifugar durante 5 a 20 minutos a 2000 G até 3800 G) usando uma centrífuga (Allegra X-15R, Beckman Coulter, Inc.)
Procedimento comum B: Medição da concentração de anticorpos
[00627] Usando um detector de UV (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific Inc.), a medição da concentração de anticorpos foi realizada de acordo com o método definido pelo fabricante. Aqui, o coeficiente de absorção a 280 nm pode ser estimado a partir da sequência de aminoácidos de um anticorpo usando um método de cálculo conhecido (Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423) e diferentes coeficientes de absorção a 280 nm para cada anticorpo foram usados (1,3 mL/mg-1cm-1 a 1,8 mL/mg-1cm-1). No caso de U1-59, o coeficiente de absorção a 280 nm de 1,768 mL/mg-1cm-1 foi usado como um valor estimado de acordo com sua sequência de aminoácidos.
Procedimento comum C: Troca de tampão do anticorpo.
[00628] Uma coluna NAP-25 (Cat. N° 17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation) usando veículo Sephadex G-25 foi equilibrada com tampão de fosfato (10 mM, pH de 6,0, o qual é designado como PBS6.0/EDTA no relatório descritivo) contendo cloreto de sódio (137 mM) e ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, 5 mM) de acordo com o método definido pelo fabricante. A solução aquosa do anticorpo foi aplicada em uma quantidade de 2,5 mL a uma única coluna NAP-25 e, então, a fração (3,5 mL) eluída com 3,5 mL de PBS6.0/EDTA foi coletada. A fração resultante foi concentrada por meio do procedimento comum A. Após medição da concentração de anticorpo usando o procedimento comum B, a concentração de anticorpo foi ajustada para 10 mg/ml usando PBS6.0/EDTA.
Procedimento comum D: Purificação do conjugado de anticorpo- fármaco.
[00629] A coluna NAP-25 foi equilibrada com tampão contendo sorbitol (5%) (10 mM, pH de 5,5, o qual é designado como ABS no relatório descritivo). Uma solução de reação aquosa do conjugado de anti- corpo-fármaco (aproximadamente 2,5 mL) foi aplicada à coluna NAP- 25 e, então, eluída com o tampão em uma quantidade conforme definido pelo fabricante para coletar a fração de anticorpo. Ao realizar um processo de purificação através de filtração em gel, no qual a dita fração coletada foi novamente aplicada à coluna de NAP-25 e eluída com tampão, foi repetido de 2 a 3 vezes no total, o conjugado de anticorpo- fármaco excluindo o ligante de fármaco não conjugado e um composto de baixo peso molecular (tris(2-carboxietil) fosfina (TCEP), N-acetil-L- cisteína (NAC) e sulfóxido de dimetila) foi obtido.
Procedimento comum E: Medição da concentração de anticorpo no conjugado de anticorpo-fármaco e do número médio de moléculas de fármaco por molécula de anticorpo conjugada (1).
[00630] A concentração de fármaco conjugado no conjugado de an- ticorpo-fármaco pode ser calculada medindo-se a absorbância de UV de uma solução aquosa do conjugado de anticorpo-fármaco em dois comprimentos de onda, 280 nm e 370 nm, realizando o cálculo mostrado abaixo.
[00631] Uma vez que a absorbância total em qualquer comprimento de onda é igual à soma da absorbância de todas as espécies químicas que absorvem luz presentes em um sistema [aditividade de absorbân- cia], quando os coeficientes de absorção molar do anticorpo e do fár- maco permanecem os mesmos antes e após a conjugação entre o anticorpo e o fármaco, a concentração do anticorpo e a concentração de fármaco no conjugado de anticorpo-fármaco são expressas com as equações a seguir.
Figure img0054
[00632] No exemplo acima, A280 representa a absorbância de uma solução aquosa do conjugado de anticorpo-fármaco a 280 nm, A370 representa a absorbância de uma solução aquosa do conjugado de anticorpo-fármaco a 370 nm, AA,280 representa a absorbância de um anticorpo a 280 nm, AA,370 representa a absorbância de um anticorpo a 370 nm, AD,280 representa a absorbância de um precursor do conjugado a 280 nm, AD,370 representa a absorbância de um precursor do conjugado a 370 nm, EA,280 representa o coeficiente de absorção molar de um anticorpo a 280 nm, EA,370 representa o coeficiente de absorção molar de um anticorpo a 370 nm, ED,280 representa o coeficiente de absorção molar de um precursor do conjugado a 280 nm, ED,370 representa o coeficiente de absorção molar de um precursor do conjugado a 370 nm, CA representa a concentração de anticorpo em um conjugado de anticorpo-fármaco e CD representa a concentração de fármaco em um conjugado de anticorpo-fármaco.
[00633] Quanto a EA,280, EA,370, ED,280 e ED,370 no acima, valores pre- viamente preparados (valor estimado com base em cálculos ou valores de medição obtidos através de medição por UV do composto) são usados. Por exemplo, EA,280 pode ser estimado a partir da sequência de aminoácidos de um anticorpo usando um método de cálculo conhecido (Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423). EA,370 é geralmente zero. No caso de U1-59, uma EA,280 de 259400 foi usada como um valor estimado de acordo com sua sequência de aminoácidos. ED,280 e ED,370 podem ser obtidas com base na lei de Lambert-Beer (Absorbân- cia = concentração molar x coeficiente de absorção molar x comprimento de trajetória da célula) medindo-se a absorbância de uma solução na qual o precursor do conjugado a ser usado está dissolvido em uma determinada concentração molar. Ao medir a A280 e A370 de uma solução aquosa do conjugado de anticorpo-fármaco e resolvendo as equações simultâneas (1) e (2) usando os valores, a CA e CD podem ser obtidas. Além disso, ao dividir a CD pela CA, o número médio de ligação de fármaco por anticorpo pode ser obtido.
[00634] Na presente invenção, o método para determinação do número médio de moléculas de conjugados de fármaco por anticorpo, conforme descrito acima, é designado como um "método por UV".
Procedimento Comum F: Medição do número médio de moléculas de fármacos conjugadas por molécula de anticorpo no conjugado de anticorpo-fármaco (2).
[00635] O número médio de moléculas de fármaco por molécula de anticorpo conjugadas do conjugado de anticorpo-fármaco também pode ser determinado através de análise por cromatografia de líquido de alto desempenho (High Performance Liquid Chromatography - HPLC) usando o método a seguir, além do Procedimento Comum E mencionado acima.
F-1. Preparo da amostra para análise por HPLC (Redução do conjugado de anticorpo-fármaco)
[00636] Uma solução de conjugado de anticorpo-fármaco (cerca de 1 mg/mL, 60μ ( "μ" representa "micro")L) é misturada com uma solução aquosa de ditiotreitol (DTT) (100 mM, 15 μL). Ao incubar a mistura a 37 °C durante 30 minutos, a ligação de dissulfureto entre as cadeias L e H do conjugado de anticorpo-fármaco é clivada. A amostra resultante é usada na análise de HPLC.
F-2. Análise por HPLC
[00637] A análise por HPLC é realizada sob as seguintes condições de medição.
[00638] Sistema de HPLC: sistema de HPLC Agilent 1290 (Agilent Technologies)
[00639] Detector: espectrômetro de absorção de ultravioleta (comprimento de onda de medição: 280 nm)
[00640] Coluna: PLRP-S (2,1 x 50 mm, 8 μm, 1000 angstroms; Agilent Technologies, P/N PL1912-1802)
[00641] Temperatura da coluna: 80 °C
[00642] Fase móvel A: solução aquosa de ácido trifluoroacético (TFA) a 0,04%
[00643] Fase móvel B: solução de acetonitrila contendo TFA a 0,04%
[00644] Programa de gradiente: 29%-36% (0 min.-12,5 min.), 36%- 42% (12,5-15 min.), 42%- 29% (15 min.-15,1 min.), 29%-29% (15,1 min.-25 min.)
[00645] Injeção de amostra: 15 μL
F-3. Análise de dados
[00646] [F-3-1] Em comparação com as cadeias de anticorpo não conjugadas L (L0) e H (H0), as cadeias L (cadeia L ligada a uma molécula de fármaco: L1) e H (cadeia H ligada a uma molécula de fármaco: H1, cadeia H ligada a duas moléculas de fármaco: H2, cadeia H ligada a três moléculas de fármaco: H3) do fármaco conjugado exibem maior hidrofobicidade em proporção ao número de moléculas de fármaco conjugadas e, portanto, apresenta um tempo de retenção maior. Estas cadeias são, consequentemente, eluídas na ordem de L0 e L1 ou H0, H1, H2 e H3. Os picos de detecção podem ser atribuídos a qualquer uma de L0, L1, H0, H1, H2 e H3 ao comparar os tempos de retenção com L0 e H0.
[00647] [F-3-2] Uma vez que o ligante de fármaco apresenta absor ção de UV, os valores de área de pico são corrigidos em resposta ao número de moléculas de ligante de fármaco conjugadas de acordo com a expressão a seguir usando os coeficientes de absorção molar da cadeia L ou H e o ligante de fármaco. Mat. 1
Figure img0055
Coeficiente de absorção molar da cadeia H + O número de molé- culas de fármaco conjugadas X Coeficiente de absorção molar do ligante de fármaco
[00648] Aqui, um valor estimado a partir da sequência de aminoáci- dos de cadeia L ou H de cada anticorpo usando um método de cálculo conhecido (Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423) pode ser usado como o coeficiente de absorção molar (280 nm) da cadeia L ou H de cada anticorpo. No caso de U1-59, um coeficiente de absorção molar de 34690 e um coeficiente de absorção molar de 95000 foram usados como valores previstos para as cadeias L e H, respectivamente, de acordo com sua sequência de aminoácidos. O coeficiente de absorção molar (280 nm) realmente medido de um composto no qual o grupo maleimida foi convertido em tioéter de succinimida pela reação de cada ligante de fármaco com mercaptoetanol ou N-acetilcisteína foi usado como o coeficiente de absorção molar (280 nm) do ligante de fár- maco.
[00649] [F-3-3] A proporção de área de pico (%) de cada cadeia é calculada para o total dos valores corrigidos das áreas de pico. Mat. 3
Figure img0056
[00650] Valores corrigidos das respectivas áreas de pico de ALi, AHi: Li, Hi
[00651] [F-3-4] O número médio de moléculas de fármaco por mo lécula de anticorpo conjugadas no conjugado de anticorpo-fármaco é calculado de acordo com a expressão a seguir.
[00652] Número médio de moléculas de fármaco conjugadas = (proporção de área de pico L0 x 0 + proporção de área de pico L0 x 1 + proporção de área de pico H0 x 0 + proporção de área de pico H1 x 1 + proporção de área de pico H2 x 2 + proporção de área de pico H3 x 3)/100 x 2
[00653] Daqui em diante, os compostos intermediários de produção usados no Método de Produção 1 são descritos. O composto representado pela fórmula (2) no método de produção 1 é um composto representado pela seguinte fórmula:
[00654] (maleimid-N-il)-(CH2)n3-C(=O)-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- C(=O)-(NH-DX) ou (maleimid-N-il)-(CH2)n3-C(=O)-L2-LP-(NH-DX).
[00655] Na fórmula,
[00656] n3 representa um número inteiro de 2 a 8,
[00657] L2 representa -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- ou uma ligação simples,
[00658] em que n4 representa um número inteiro de 1 a 6,
[00659] LP representa um resíduo peptídico que consiste em 2 a 7 aminoácidos selecionado de fenilalanina, glicina, valina, lisina, citruli- na, serina, ácido glutâmico e ácido aspártico,
[00660] n1 representa um número inteiro de 0 a 6,
[00661] n2 representa um número inteiro de 0 a 5,
[00662] La representa -O- ou uma ligação simples,
[00663] (maleimid-N-il)- é um grupo maleimidila (grupo 2,5-dioxo- 2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il) representado pela fórmula a seguir: Química 22
Figure img0057
em que o átomo de nitrogênio está na posição de conexão, e
[00664] -(NH-DX) é um grupo representado pela fórmula a seguir: Química 23
Figure img0058
em que o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 está na posição de conexão.
[00665] Como o resíduo peptídico LP, aqueles que consistem em um aminoácido selecionado de fenilalanina, glicina, valina, lisina, citru- lina, serina, ácido glutâmico e ácido aspártico são preferidos como um intermediário de produção. Dentre o resíduo peptídico LP, aqueles que consistem em 4 ou 5 aminoácidos são preferidos como um intermediário de produção. Mais especificamente, aqueles nos quais LP é um resíduo tetrapeptídico de -GGFG- ou um pentapeptídeo de -DGGFG- é preferido como um intermediário de produção, mais preferivelmente - GGFG-.
[00666] Ainda, como o -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-, aqueles tendo -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ou -NH-CH2CH2-O-CH2- são preferidos como um intermediário de produção. Um composto de -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ou -NH-CH2CH2-O-CH2 é mais preferido.
[00667] Como n3, aqueles nos quais ele é um número inteiro de 2 a 8 são preferidos como um intermediário de produção.
[00668] Como L2, aqueles nos quais ele é uma ligação simples ou - NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- e n4 é um número inteiro de 2 a 4 são preferidos como um intermediário de produção.
[00669] Ainda, aqueles nos quais n3 é um número inteiro de 2 a 5, L2 é uma ligação simples e -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- é -NH-CH2CH2-, - NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, - NH-CH2-O-CH2-, ou -NH-CH2CH2-O-CH2- são preferidos como um in-termediário de produção. Ainda, mais preferidos dentre eles são aqueles nos quais -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- é -NH-CH2CH2-, -NH- CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ou -NH-CH2CH2-O-CH2-. Ainda, aqueles nos quais n3 é um número inteiro de 2 ou 5 são preferidos.
[00670] Ainda, aqueles nos quais n3 é um número inteiro de 2 a 5, L2 é -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-, n4 é um número inteiro de 2 a 4 e -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- é -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH- CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ou - NH-CH2CH2-O-CH2- são preferidos como um intermediário de produção. Mais preferidos dentre eles são aqueles nos quais n4 é um número inteiro de 2 ou 4. Ainda, aqueles nos quais -NH-(CH2)n1-La- é -NH- CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ou -NH-CH2CH2-O-CH2- são preferidos.
[00671] Exemplos preferidos dos intermediários que são uteis para produção do composto da presente invenção incluem aqueles exemplificados abaixo:
[00672] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX),
[00673] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-(NH-DX),
[00674] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-(NH-DX),
[00675] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00676] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX),
[00677] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX),
[00678] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00679] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00680] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX),
[00681] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00682] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00683] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00684] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00685] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00686] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00687] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00688] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00689] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH- CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00690] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00691] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX),
[00692] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX),
[00693] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00694] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2- O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00695] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX),
[00696] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00697] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00698] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00699] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00700] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00701] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX),
[00702] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX),
[00703] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX),
[00704] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX),
[00705] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX),
[00706] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX),
[00707] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX),
[00708] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX), ou
[00709] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH- DX).
[00710] Através da reação do composto de fármaco-ligante selecionado do grupo supracitado de compostos intermediários com um anticorpo anti-HER3 ou um derivado reativo do mesmo, uma ligação de tioéter pode ser formada em uma porção de ligação de dissulfureto presente em uma parte de dobradiça do anticorpo anti-HER3 e, como um resultado, o conjugado de anticorpo anti-HER3-fármaco da presente invenção pode ser produzido. Neste caso, é preferível usar um derivado reativo de um anticorpo anti-HER3. Um derivado reativo obtido por meio de redução de um anticorpo anti-HER3 é particularmente preferido.
[00711] Os seguintes são compostos os quais são mais preferidos como um intermediário de produção.
[00712] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX),
[00713] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX),
[00714] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00715] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00716] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00717] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00718] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2- O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00719] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00720] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00721] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00722] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX),
[00723] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX),
[00724] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX),
[00725] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX),
[00726] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH- DX).
[00727] Ainda, dentre o grupo de compostos intermediários supracitados, os intermediários representados pela fórmula a seguir são compostos mais preferidos:
[00728] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00729] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2- O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00730] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00731] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), ou
[00732] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH- DX).
[00733] Particularmente preferidos são os compostos que são representados pela fórmula a seguir:
[00734] (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
[00735] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2- O-CH2-C(=O)-(NH-DX), ou
[00736] (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).
2. Método de Produção 2
[00737] O composto representado pela fórmula (2) ou um sal far- macologicamente aceitável do mesmo usado como um intermediário no método de produção anterior pode ser produzido através do método a seguir, por exemplo. Química 24
Figure img0059
[na fórmula, L1' corresponde a L1 tendo uma estrutura na qual o término é convertido em um grupo maleimidila e P1, P2 e P3 representam um grupo de proteção].
[00738] O composto (6) pode ser produzido por meio de derivatiza- ção do ácido carboxílico (5) em um éster ativo, anidrido ácido misto, halogeneto ácido ou similar e, na presença de uma base, reação do mesmo com NH2-DX [que indica exatecano; nome químico: (1S,9S)-1- amino-9-etil-5-fluoro-2,3-di-hidro-9-hidróxi-4-metil-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-10,13(9H,15H)-diona] (4) ou um sal farmacologicamente aceitável do mesmo.
[00739] Reagentes e condições de reação que são comumente usados para síntese peptídica podem ser empregados para a reação. Aqui, há vários tipos de éster ativo, por exemplo, ele pode ser produzido por meio de reação de fenóis, tais como p-nitrofenol, N-hidroxi benzotriazol, N-hidroxi succinimida ou similar, com o ácido carboxílico (5) usando um agente de condensação, tal como N,N'-diciclo-hexilcarbodi- imida ou cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodi-imida; ainda, o éster ativo também pode ser produzido por meio de uma reação do ácido carboxílico (5) com trifluoroacetato de pentafluorofenila ou similar; uma reação do ácido carboxílico (5) com hexafluorofosfita de 1-benzotriazolil oxitripirrolidinofosfônio; uma reação do ácido carboxí- lico (5) com cianofosfonato de dietil (método de Shioiri); uma reação do ácido carboxílico (5) com trifenilfosfina e dissulfureto de 2,2'- dipiridila (método de Mukaiyama); uma reação do ácido carboxílico (5) com um derivado de triazina, tal como cloreto de 4-(4,6-dimetóxi-1,3,5- triazin-2-il)-4-metilmorfolínio (DMTMM); ou similar. Ainda, a reação também pode ser realizada, por exemplo, através de um método com halogeneto ácido pelo qual o ácido carboxílico (5) é tratado com halo- geneto ácido, tal como cloreto de tionila e cloreto de oxalila, na presença de uma base.
[00740] Por meio de reação do éster ativo, anidrido ácido misto ou halogeneto ácido do ácido carboxílico (5) obtido conforme acima com o composto (4) na presença de uma base adequada em um solvente inerte em uma temperatura de reação de -78 °C a 150 °C, o composto (6) pode ser produzido. Entretanto, "solvente inerte" indica um solvente o qual não inibe uma reação desejada para a qual o solvente é usado.
[00741] Exemplos específicos da base usada para cada etapa descrita acima incluem um carbonato, um alcóxido, um hidróxido ou um hidreto de um metal alcalino ou um metal alcalino terroso, tais como carbonato de sódio, carbonato de potássio, etóxido de sódio, butóxido de potássio, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidreto de sódio ou hidreto de potássio; uma base organometálica representada por um alquil lítio, tal como n-butil lítio ou dialquilamino lítio, tal como di- isopropilamida de lítio; uma base organometálica, tal como bissililami- na, incluindo bis(trimetil-silil)amida de lítio; e uma base orgânica, tal como piridina, 2,6-lutidina, colidina, 4-dimetilaminopiridina, trietilamina, N-metil morfolina, di-isopropiletilamina e diazabiciclo[5.4.0]undec-7- eno (DBU).
[00742] Exemplos do solvente inerte o qual é usado para a reação da presente invenção incluem um solvente de hidrocarboneto haloge- nado, tal como diclorometano, clorofórmio e tetracloreto de carbono; um solvente de éter, tal como tetra-hidrofurano, 1,2-dimetoxietano e dioxano; um solvente de hidrocarboneto aromático, tal como benzeno e tolueno; e um solvente de amida, tal como N,N-dimetilformamida, N,N-dimetilacetamida e N-metilpirrolidin-2-ona. Além destes, um solvente de sulfóxido, tais como sulfóxido de dimetila e sulfolano; um solvente de cetona, tal como acetona e metil etil cetona; e um solvente de álcool, tal como metanol e etanol pode ser usado em alguns casos. Alternativamente, esses solventes podem ser usados como um solvente misto.
[00743] Como o grupo de proteção P1 para o grupo amino terminal do composto (6), um grupo de proteção para um grupo amino o qual é geralmente usado para síntese peptídica, por exemplo, um grupo terc- butilóxi carbonila, um grupo 9-fluorenilmetilóxi carbonila e um grupo benzilóxi carbonila, pode ser usado. Exemplos do outro grupo de proteção para um grupo amino incluem um grupo alcanoíla, tal como um grupo acetila; um grupo alcoxicarbonila, tal como um grupo metoxicar- bonila e um grupo etoxicarbonila; um grupo arilmetóxi carbonila, tal como um grupo parabenzilóxi carbonila e um grupo para (ou or- to)nitrobenzilóxi carbonila; um grupo arilmetila, tal como um grupo benzila e um grupo trifenil metila; um grupo aroíla, tal como um grupo benzoíla; e um grupo aril sulfonila, tal como um grupo 2,4- dinitrobenzeno sulfonila e um grupo ortonitrobenzeno sulfonila. O grupo de proteção P1 pode ser selecionado dependendo, por exemplo, das propriedades de um composto tendo um grupo amino a ser protegido.
[00744] Ao desproteger o grupo de proteção P1 para o grupo amino terminal do composto (6) obtido, o composto (7) pode ser produzido. Nesta desproteção, os reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo de proteção.
[00745] O composto (9) pode ser produzido por meio de derivatiza- ção do ácido carboxílico peptídico (8) tendo o N-término protegido com P2 em um éster ativo, anidrido ácido misto ou similar e reação do mesmo com o composto (7) obtido. As condições de reação, reagentes, base e solvente inerte usados para formação de uma ligação pep- tídica entre o ácido carboxílico peptídico (8) e o composto (7) podem ser adequadamente selecionadas daqueles descritos para a síntese do composto (6). O grupo de proteção P2 pode ser adequadamente selecionado daqueles descritos para o grupo de proteção do composto (6) e a seleção pode ser feita com base, por exemplo, nas propriedades do composto tendo um grupo amino a ser protegido. Conforme é geralmente usado para síntese peptídica, ao repetir sequencialmente a reação e desproteção do aminoácido ou peptídeo que constitui o ácido carboxílico peptídico (8) para alongamento, o composto (9) também pode ser produzido.
[00746] Ao desproteger P2 como o grupo de proteção para o grupo amino do composto (9) obtido, o composto (10) pode ser produzido. Nesta desproteção, os reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo de proteção.
[00747] É possível produzir o composto (2) por meio de derivatiza- ção do ácido carboxílico (11) em um éster ativo, anidrido ácido misto, halogeneto ácido ou similar e reação do mesmo com o composto (10) obtido. As condições de reação, reagentes, base e solvente inerte usados para a formação de uma ligação peptídica entre o ácido carbo- xílico (11) e o composto (10) podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6).
[00748] O composto (9) também pode ser produzido através do método a seguir, por exemplo.
[00749] O composto (13) pode ser produzido por meio de derivati- zação do ácido carboxílico peptídico (8) tendo o N-término protegido com P2 no éster ativo, anidrido ácido misto ou similar e reação do mesmo com o composto de amina (12) tendo o grupo carbóxi protegido com P3 na presença de uma base. As condições de reação, reagentes, base e solvente inerte usados para a formação de uma ligação peptídica entre o ácido carboxílico peptídico (8) e o composto (12) podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6).
[00750] O grupo de proteção P2 para o grupo amino do composto (13) não está particularmente limitado, contanto que ele seja um grupo de proteção o qual é comumente usado. Especificamente, exemplos do grupo de proteção para um grupo hidroxila incluem um grupo alco- ximetila, tal como um grupo metoximetila; um grupo arilmetila, tal como um grupo benzila, um grupo 4-metóxi benzila e um grupo trifenilmetila; um grupo alcanoíla, tal como um grupo acetila; um grupo aroíla, tal como um grupo benzoíla; e um grupo silila, tal como um grupo terc- butil difenil-silila. O grupo carbóxi pode ser protegido por um éster com um grupo alquila, tal como um grupo metila, um grupo etila e um grupo terc-butila, um grupo alila ou um grupo arilmetila, tal como um grupo benzila. Como o grupo amino, um grupo alquilóxi carbonila, tal como um grupo terc-butilóxi carbonila, um grupo metoxicarbonila e um grupo etoxicarbonila; um grupo arilmetóxi carbonila, tal como um grupo alilóxi carbonila, um grupo 9-fluorenilmetilóxi carbonila, um grupo benzilóxi carbonila, um grupo parametoxibenzilóxi carbonila e um grupo para (ou orto)nitrobenzilóxi carbonila; um grupo alcanoíla, tal como um grupo acetila; um grupo arilmetila, tal como um grupo benzila e um grupo trifenil metila; um grupo aroíla, tal como um grupo benzoíla; e um grupo aril sulfonila, tal como um grupo 2,4-dinitrobenzeno sulfonila ou um grupo ortonitrobenzeno sulfonila podem ser mencionados.
[00751] Como o grupo de proteção P3 para um grupo carbóxi, um grupo de proteção comumente usado como um grupo de proteção para um grupo carbóxi em química sintética orgânica, em particular, síntese peptídica pode ser usado. Um grupo carboxila pode ser protegido como um éster com um grupo alquila, tal como um grupo metila, um grupo etila ou um grupo terc-butila, um grupo alila e um grupo arilmeti- la, tal como um grupo benzila.
[00752] Em tal caso, é preferível que o grupo de proteção para um grupo amino e o grupo de proteção para um grupo carbóxi possam ser removidos por meio de um método diferente ou condições diferentes. Por exemplo, um exemplo representativo inclui uma combinação na qual P2 é um grupo terc-butilóxi carbonila e P3 é um grupo benzila. Os grupos de proteção podem ser selecionados daqueles supracitados dependendo, por exemplo, das propriedades de um composto tendo um grupo amino e um grupo carbóxi a ser protegido. Para remoção dos grupos de proteção, os reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo de proteção.
[00753] Ao desproteger o grupo de proteção P3 para o grupo carbó- xi do composto (13) obtido, o composto (14) pode ser produzido. Nesta desproteção, os reagentes e condições são selecionados dependendo do grupo de proteção.
[00754] O composto (9) pode ser produzido por meio de derivatiza- ção do composto (14) obtido no éster ativo, anidrido ácido misto, halo- geneto ácido ou similar e reação com o composto (4) na presença de uma base. Para a reação, reagentes e condições de reação que são geralmente usados para síntese peptídica também podem ser usados e as condições de reação, reagentes, base e solvente inerte usados para a reação podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6).
[00755] O composto (2) também pode ser produzido através do método a seguir, por exemplo.
[00756] Ao desproteger o grupo de proteção P2 para o grupo amino do composto (13), o composto (15) pode ser produzido. Nesta desproteção, os reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo de proteção.
[00757] O composto (16) pode ser produzido por meio de derivati- zação do derivado de ácido carboxílico (11) no éster ativo, anidrido ácido misto, halogeneto ácido ou similar e reação do mesmo com o composto (15) obtido na presença de uma base. As condições de reação, reagentes, base e solvente inerte usados para a formação de uma ligação de amida entre o ácido carboxílico peptídico (11) e o composto (15) podem ser adequadamente selecionadas daqueles descritos para a síntese do composto (6).
[00758] Ao desproteger o grupo de proteção para o grupo carbóxi do composto (16) obtido, o composto (17) pode ser produzido. Nesta desproteção, ela pode ser realizada similar à desproteção do grupo carbóxi para produção do composto (14).
[00759] O composto (2) pode ser produzido por meio de derivatiza- ção do composto (17) no éster ativo, anidrido ácido misto, halogeneto ácido ou similar e reação do mesmo com o composto (4) na presença de uma base. Para a reação, reagentes e condições de reação que são geralmente usados para síntese peptídica também podem ser usados e as condições de reação, reagentes, base e solvente inerte usados para a reação podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6).
3. Método de Produção 3
[00760] O composto representado pela fórmula (2) usado como um intermediário também pode ser produzido através do método a seguir. Química 25
Figure img0060
[na fórmula, L1' corresponde a L1 tendo uma estrutura na qual o término é convertido a um grupo maleimidila e P4 representa um grupo de proteção].
[00761] O composto (19) pode ser produzido por meio de derivati- zação do composto (11) no éster ativo, anidrido ácido misto ou similar e reação do mesmo com o ácido carboxílico peptídico (18) tendo o C- término protegido com P4 na presença de uma base. As condições de reação, reagentes, base e solvente inerte usados para a formação de uma ligação peptídica entre o ácido carboxílico peptídico (18) e o composto (11) podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6). O grupo de proteção P4 para o grupo carbóxi do composto (18) pode ser adequadamente selecionado dos grupos de proteção supracitados.
[00762] Ao desproteger o grupo de proteção para o grupo carbóxi do composto (19) obtido, o composto (20) pode ser produzido. Nesta desproteção, ela pode ser realizada similar à desproteção do grupo carbóxi para produção do composto (14).
[00763] O composto (2) pode ser produzido por meio de derivatiza- ção do composto (20) obtido no éster ativo, anidrido ácido misto ou similar e reação do mesmo com o composto (7). Para a reação, reagentes e condições de reação que são geralmente usados para síntese peptídica também podem ser usados e as condições de reação, reagentes, base e solvente inerte usados para a reação podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6).
4. Método de Produção 4
[00764] Aqui abaixo, dentro do intermediário de produção (10) descrito em Método de Produção 2, o método para produção do composto (10b) tendo n1 = 1 e La = 0 é descrito em detalhes. O composto representado pela fórmula (10b), um sal ou um solvato do mesmo pode ser produzido de acordo com o método a seguir, por exemplo.
Figure img0061
[na fórmula, LP é conforme definido acima, L representa um grupo aci- la, incluindo um grupo alcanoíla, tal como um grupo acetila ou um grupo aroíla, tal como um grupo benzoíla ou representa um átomo de hidrogênio ou similar, X e Y representa um oligopeptídeo que consiste em 1 a 3 aminoácidos, P5 e P7 representam um grupo de proteção para um grupo amino e P6 representa um grupo de proteção para um grupo carbóxi].
[00765] Um composto representado pela fórmula (21) pode ser produzido usando ou aplicando o método descrito na Patente Japonesa Depositada Em-Aberto N° 2002-60351 ou na literatura (J. Org. Chem., Vol. 51, página 3196, 1986) e, se necessário, removendo os grupos de proteção ou modificando os grupos funcionais. Alternativamente, ele também pode ser obtido por meio de tratamento de um aminoácido com um grupo amino terminal protegido ou amida ácida do oligopeptí- deo com um grupo amino protegido com aldeído ou cetona.
[00766] Por meio de reação do composto (21) com o composto (22) tendo um grupo hidroxila sob condições de temperatura que variam de sob resfriamento para a temperatura ambiente em um solvente inerte na presença de um ácido ou uma base, o composto (23) pode ser produzido.
[00767] Aqui, exemplos do ácido o qual pode ser usado incluem um ácido inorgânico, tal como ácido fluorídrico, ácido clorídrico, ácido sul- fúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e ácido bórico; um ácido orgânico, tal como ácido acético, ácido cítrico, ácido paratolueno sulfônico e ácido metano sulfônico; e um ácido de Lewis, tal como tetrafluoroborato, cloreto de zinco, cloreto de estanho, cloreto de alumínio e cloreto de ferro. Dentre eles, ácidos sulfônicos são preferíveis e ácido paratolue- no sulfônico é particularmente preferível. Como a base, qualquer uma das bases supracitadas pode ser adequadamente selecionada e usada. Exemplos preferidos das mesmas incluem um alcóxidos de metal alcalino, tal como terc-butóxido de potássio, um hidróxido de metal alcalino ou metal alcalino terroso, tal como hidróxido de sódio e hidróxido de potássio; hidreto de metal alcalino, tal como hidreto de sódio e hidreto de potássio; uma base organometálica representada por dial- quilamino lítio, tal como di-isopropilamida de lítio; e uma base organo- metálica de bissililamina, tal como lítio bis(trimetil-silil)amida.
[00768] Exemplos do solvente a ser usado para a reação incluem um solvente de éter, tal como tetra-hidrofurano e 1,4-dioxano; e um solvente de hidrocarboneto aromático, tal como benzeno e tolueno. Estes solventes podem ser preparados como uma mistura com água.
[00769] Ainda, o grupo de proteção para um grupo amino conforme representado como P5 não está particularmente limitado, contanto que ele seja um grupo comumente usado para proteção de um grupo amino. Exemplos representativos podem incluir grupos de proteção para um grupo amino que são descritos no Método de Produção 2. No entanto, o grupo de proteção para um grupo amino representado como P5 pode ser clivado no curso da reação. Em tal caso, um grupo de proteção pode ser reintroduzido ao realizar apropriadamente uma reação com um reagente adequado para proteção de um grupo amino conforme requerido.
[00770] O composto (24) pode ser derivado por meio de remoção do grupo de proteção P6 do composto (23). Aqui, embora os exemplos representativos do grupo de proteção para um grupo carbóxi conforme representado como P6 são descritos no Método de Produção 2, ele pode ser apropriadamente selecionado desses exemplos. No composto (23), é desejável que o grupo de proteção P5 para um grupo amino e o grupo de proteção P6 para um grupo carbóxi sejam os grupos de proteção que podem ser removidos por meio de um método diferente ou condições diferentes. Por exemplo, um exemplo representativo pode incluir uma combinação na qual P5 é um grupo 9-fluorenilmetilóxi car-bonila e P6 é um grupo benzila. Os grupos de proteção podem ser se-lecionados dependendo, por exemplo, das propriedades de um composto tendo um grupo amino e um grupo carbóxi a ser protegido. Para remoção dos grupos de proteção, os reagentes e condições são selecionados dependendo do grupo de proteção.
[00771] O composto (26) pode ser produzido por meio de derivati- zação do composto (24) no éster ativo, anidrido ácido misto, halogene- to ácido ou similar e reação do mesmo com o composto (4) ou um sal farmacologicamente aceitável do mesmo na presença de uma base produzir o composto (25) seguido por remoção do grupo de proteção P5 do composto (25) obtido. Para a reação entre o composto (4) e o ácido carboxílico (24) e a reação para remoção do grupo de proteção P6, os mesmos reagentes e condições reação conforme aqueles descritos para o Método de Produção 2 podem ser usados.
[00772] O composto (10b) pode ser produzido por meio de reação do composto (26) com um aminoácido com protegido terminal grupo amino ou o oligopeptídeo (27) com protegido grupo amino produzir o composto (9b) e remoção do grupo de proteção P7 do composto (9b) obtido. O grupo de proteção para um grupo amino conforme representado como P7 não está particularmente limitado, contanto que ele seja geralmente usado para proteção de um grupo amino. Exemplos representativos do mesmo incluem grupos de proteção para um grupo amino que são descritos no Método de Produção 2. Para remoção do grupo de proteção, os reagentes e condições são selecionados dependendo do grupo de proteção. Para a reação entre o composto (26) e o composto (27), reagentes e condições de reação que são comumente usados para síntese peptídica podem ser empregados. O composto (10b) produzido por meio do método supracitado pode ser derivatizado no composto (1) da presente invenção de acordo com o método descrita acima.
5. Método de Produção 5
[00773] O composto representado pela fórmula (2) como um intermediário também pode ser produzido por meio do método mostrado abaixo. Química 27
Figure img0062
[na fórmula, L1' corresponde a L1 tendo uma estrutura na qual o término é convertido a um grupo maleimidila, LP representa uma estrutura que consiste em -Lp1-Lp2- e P3, P8, P9, P10, P11 e P12 representam um grupo de proteção].
[00774] Uma vez que LP é formado por meio de conexão de Lp1 a Lp2, o aminoácido hidrofílico no N-término de LP é derivado de Lp1 e, assim, aqueles que tendo um aminoácido hidrofílico no N-término são adequadamente empregados como Lp1. Entretanto, múltiplos aminoá- cidos hidrofílicos podem estar presentes aqui. Ainda, quando Lp2 com um aminoácido hidrofílico é empregado, Lp tendo múltiplos aminoáci- dos hidrofílicos no N-término de LP ou no N-término e nas outras posições pode ser produzido, dependendo da localização do aminoácido hidrofílico.
[00775] O composto (29) pode ser produzido por meio de derivati- zação do peptídeo ou aminoácido (28) tendo o N-término protegido com P2 no éster ativo, anidrido ácido misto ou similar e reação do mesmo com o composto (7) obtido. As condições de reação, reagentes, base e solvente usado para a formação de uma ligação de amida entre o peptídeo ou aminoácido (28) e o composto (7) podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6). O grupo de proteção P8 para um grupo amino pode ser adequadamente selecionado daqueles descritos para o grupo de proteção do composto (6) e a seleção pode ser feita com base nas propriedades do composto ou similar. Conforme é geralmente usado para síntese peptídica, ao repetir sequencialmente a reação e desproteção do ami- noácido ou peptídeo que constitui o peptídeo ou aminoácido (28) para alongamento, o composto (29) também pode ser produzido.
[00776] Ao desproteger de P8 como um grupo de proteção do grupo amino do composto (29) obtido, o composto (23) pode ser produzido. Nesta desproteção, os reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo de proteção.
[00777] O composto (32) pode ser produzido por meio de derivati- zação do aminoácido ou peptídeo (31) tendo o N-término protegido com P8 e o grupo carbóxi, grupo hidróxi ou grupo amino protegido na cadeia lateral protegida no éster ativo, anidrido ácido misto ou similar e reação do mesmo com o composto (30) obtido. As condições de reação, reagentes, base e solvente inerte usados para a formação de uma ligação peptídica entre o aminoácido ou peptídeo (31) e o composto (30) podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6). Quanto aos grupos de proteção P8 e P9, os grupos de proteção podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos como grupo de proteção para um grupo amino, grupo carbóxi ou grupo hidróxi do composto (6). No entanto, em tal caso, é necessário que o grupo de proteção P9 para um grupo amino e o grupo de proteção P10 para um grupo funcional na cadeia lateral pode ser removido por meio de um método diferente ou condições diferentes. Por exemplo, um exemplo representativo inclui uma combinação no caso P9 é um grupo 9-fluorenilmetilóxi carbonila e P10 é um grupo terc-butila ou similar como um grupo de proteção para um grupo carbóxi, um grupo metoximetila ou similar como um grupo de proteção para um grupo hidróxi ou um grupo terc-butilóxi carbonila ou similar como um grupo de proteção para um grupo amino. O grupo de proteção P10 para um grupo funcional em uma cadeia lateral é, de preferência, um grupo de proteção o qual pode ser desprotegido por meio de um tratamento sob condições ácidas. No entanto, ele não está limitado aos mesmos e pode ser selecionado daqueles supracitados dependendo, por exemplo, das propriedades do grupo amino, grupo carbóxi ou grupo hidróxi de um composto a ser protegido. Para remoção dos grupos de proteção, os reagentes e condições são selecionados dependendo do grupo de proteção. Conforme é geralmente usado para síntese peptídica, ao repetir sequencialmente a reação e desproteção do aminoácido ou peptídeo constituinte para alongamento, o composto (32) também pode ser produzido.
[00778] Ao desproteger de P9 como um grupo de proteção de o término grupo amino do composto (32) obtido, o composto (33) pode ser produzido. Nessa desproteção, os reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo de proteção.
[00779] É possível produzir o composto (34) por meio de derivatiza- ção do derivado de ácido carboxílico (11) no éster ativo, anidrido ácido misto, halogeneto ácido ou similar e reação do mesmo com o composto (33) obtido. Aqui, o derivado de ácido carboxílico (11) é um composto com uma estrutura na qual o ligante terminal de L1' apresenta um grupo maleimidila.
[00780] As condições de reação, reagentes, base e solvente usa- dos para a formação de uma ligação peptídica entre o derivado de ácido carboxílico (11) e o composto (33) podem ser adequadamente se-lecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6).
[00781] Ao desproteger o grupo de proteção P10 para o grupo car- bóxi, grupo hidróxi ou grupo amino na cadeia lateral de aminoácido da porção peptídica do composto (34) obtido, o composto (2) pode ser produzido. Reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo de proteção.
[00782] O composto (29) também pode ser produzido através do método a seguir, por exemplo.
[00783] O composto (35) pode ser produzido por meio de derivati- zação do peptídeo ou aminoácido (28) tendo o N-término protegido com P8 no éster ativo, anidrido ácido misto ou similar e reação do mesmo com o composto de amina (12) tendo o término grupo carbóxi protegido com P3 na presença de uma base. As condições de reação, reagentes, base e solvente usados para a formação de uma ligação peptídica entre o peptídeo ou aminoácido (28) e o composto (12) podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6). O grupo de proteção P8 para um grupo amino do composto (35) pode ser adequadamente selecionado e usado a partir daqueles descritos como um grupo de proteção para o composto (6). Quanto ao grupo de proteção P3 para um grupo carbóxi, um grupo de proteção comumente usado como um grupo de proteção para um grupo carbóxi em química sintética orgânica, em particular, síntese peptí- dica pode ser usado. Exemplos específicos incluem alquil éster, tal como um grupo metila, um grupo etila e um grupo terc-butila, alil éster e benzil éster e podem ser adequadamente selecionados e usados a partir dos grupos de proteção que são descritos para o composto (6). Em tal caso, é necessário que o grupo de proteção P8 para um grupo amino e o grupo de proteção P3 para um grupo carbóxi podem ser re- movidos por meio de um método diferente ou condições diferentes. Por exemplo, um exemplo representativo inclui uma combinação na qual P8 é um grupo terc-butilóxi carbonila e P3 é um grupo benzila. Os grupos de proteção podem ser selecionados daqueles supracitados dependendo, por exemplo, das propriedades de um composto tendo um grupo amino e um grupo carbóxi a serem protegidos. Para remoção dos grupos de proteção, os reagentes e condições são selecionados dependendo do grupo de proteção.
[00784] Ao desproteger o grupo de proteção P3 para o grupo carbó- xi do composto (35) obtido, o composto (36) pode ser produzido. Nesta desproteção, os reagentes e condições são selecionados dependendo do grupo de proteção.
[00785] O composto (29) pode ser produzido por meio de derivati- zação do composto (36) obtido no éster ativo, anidrido ácido misto, halogeneto ácido ou similar e reação do mesmo com o composto (4) na presença de uma base. Para a reação, reagentes e condições de reação que são geralmente usados para síntese peptídica também podem ser usados e as condições de reação, reagentes, base e solvente usados para a reação podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6).
[00786] O composto (32) também pode ser produzido através do método a seguir, por exemplo.
[00787] Ao desproteger o grupo de proteção P8 para o grupo amino do composto (35), o composto (37) pode ser produzido. Nesta desproteção, os reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo de proteção.
[00788] O composto (38) pode ser produzido por meio de derivati- zação do aminoácido ou peptídeo (31) no éster ativo, anidrido ácido misto, halogeneto ácido ou similar e reação do mesmo com o composto (37) obtido na presença de uma base. As condições de reação, rea- gentes, base e solvente usados para a formação de uma ligação de amida entre o aminoácido ou peptídeo (31) e o composto (37) podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6). Em tal caso, é necessário que o grupo de proteção P9 e P10 para o aminoácido ou peptídeo (31) e o grupo de proteção P3 para o composto (37) possam ser removidos por meio de um método diferente ou condições diferentes. Por exemplo, um exemplo representativo inclui uma combinação na qual P9 é um grupo 9-fluorenilmetilóxi carbonila, P10 é um grupo terc-butilóxi carbonila, um grupo terc-butila ou a um grupo metoximetila e P3 é um grupo benzila. Ainda, o grupo de proteção P10 para um grupo funcional em uma cadeia lateral é, de preferência, um grupo de proteção o qual pode ser desprotegido por meio de um tratamento sob condições ácidas conforme descrito acima. No entanto, ele não está limitado aos mesmos e pode ser selecionado daqueles supracitados dependendo, por exemplo, das propriedades do grupo amino, grupo carbóxi ou grupo hidróxi de um composto a ser protegido. Para remoção dos grupos de proteção, os reagentes e condições são selecionados dependendo do grupo de proteção.
[00789] Ao desproteger o grupo de proteção P3 para o grupo carbó- xi do composto (38) obtido, o composto (39) pode ser produzido. Nesta desproteção, os reagentes e condições podem ser selecionados de-pendendo do grupo de proteção.
[00790] O composto (32) pode ser produzido por meio de derivati- zação do composto (39) no éster ativo, anidrido ácido misto, halogene- to ácido ou similar e reação do mesmo com o composto (4) na presença de uma base. Para a reação, reagentes e condições de reação que são geralmente usados para síntese peptídica também podem ser usados e as condições de reação, reagentes, base e solvente usados para a reação podem ser adequadamente selecionados daqueles des- critos para a síntese do composto (6).
[00791] O composto (34) também pode ser produzido através do método a seguir, por exemplo.
[00792] Ao desproteger o grupo de proteção P9 para o grupo amino do composto (38), o composto (40) pode ser produzido. Nesta desproteção, os reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo de proteção.
[00793] O composto (41) pode ser produzido por meio de derivati- zação do derivado de ácido carboxílico (11) no éster ativo, anidrido ácido misto, halogeneto ácido ou similar e reação do mesmo com o composto (40) obtido na presença de uma base. As condições de reação, reagentes, base e solvente usados para a formação de uma ligação de amida entre o derivado de ácido carboxílico (11) e o composto (40) podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6).
[00794] Ao desproteger o grupo de proteção P3 para o grupo carbó- xi do composto (41) obtido, o composto (42) pode ser produzido. Nesta desproteção, os reagentes e condições podem ser selecionados de-pendendo do grupo de proteção.
[00795] O composto (34) pode ser produzido por meio de derivati- zação do composto (42) no éster ativo, anidrido ácido misto, halogene- to ácido ou similar e reação do mesmo com o composto (4) na presença de uma base. Para a reação, reagentes e condições de reação que são geralmente usados para síntese peptídica também podem ser usados e as condições de reação, reagentes, base e solvente usados para a reação podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6).
[00796] O composto (34) também pode ser produzido através do método a seguir, por exemplo.
[00797] O composto (44) pode ser produzido por meio de derivati- zação do derivado de ácido carboxílico (11) no éster ativo, anidrido ácido misto, halogeneto ácido ou similar e reação do mesmo com o aminoácido ou peptídeo (43) tendo o grupo carbóxi protegido com P11 e o grupo carbóxi, grupo hidróxi ou grupo amino na cadeia lateral protegida com P10 na presença de uma base. As condições de reação, reagentes, base e solvente usados para a formação de uma ligação de amida entre o derivado de ácido carboxílico (11) e o composto (43) podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6). Como os grupos de proteção P10 e P11 do composto (44), grupos de proteção podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos como grupo de proteção para um grupo carbóxi, grupo hidróxi ou grupo amino do composto (6). Entretanto, em tal caso, é necessário que o grupo de proteção P11 para um grupo car- bóxi e o grupo de proteção P10 para um grupo funcional na cadeia lateral podem ser removidos por meio de um método diferente ou condições diferentes. Por exemplo, um exemplo representativo inclui uma combinação na qual P11 é um grupo benzila e P10 é um grupo terc- butila ou similar como um grupo de proteção para um grupo carbóxi, um grupo metoximetila ou similar como um grupo de proteção para um grupo hidróxi ou um grupo terc-butilóxi carbonila ou similar como um grupo de proteção para um grupo amino. O grupo de proteção P10 para um grupo funcional em uma cadeia lateral é, de preferência, um grupo de proteção o qual pode ser desprotegido por meio de um tratamento sob condições ácidas. No entanto, ele não está limitado aos mesmos e pode ser selecionado daqueles supracitados dependendo, por exemplo, das propriedades do grupo amino, grupo carbóxi ou grupo hidróxi de um composto a ser protegido. Para remoção do grupo de proteção, os reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo de proteção.
[00798] Ao desproteger o grupo de proteção P11 para o grupo car- bóxi do composto (44) obtido, o composto (45) pode ser produzido. Nesta desproteção, os reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo de proteção.
[00799] O composto (34) pode ser produzido por meio de derivati- zação do composto (45) no éster ativo, anidrido ácido misto, halogene- to ácido ou similar e reação do mesmo com o composto (30) na presença de uma base. Para a reação, reagentes e condições de reação que são geralmente usados para síntese peptídica também podem ser usados e as condições de reação, reagentes, base e solvente usados para a reação podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6).
[00800] O composto (47) pode ser produzido por meio de derivati- zação do composto (45) no éster ativo, anidrido ácido misto, halogene- to ácido ou similar e reação do mesmo com o aminoácido ou peptídeo (46) tendo o grupo carbóxi protegido com P12 na presença de uma base. Para a reação, os reagentes e as condições de reação comumente usados para síntese peptídica podem ser usados e as condições de reação, reagentes, base e solvente podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6). Como os grupos de proteção P10 e P12 do composto (47), os grupos de proteção podem ser adequadamente selecionados e usados a partir daqueles descritos as grupo de proteção para um grupo carbóxi, grupo hidróxi ou grupo amino do composto (6). Entretanto, em tal caso, é necessário que o grupo de proteção P12 para um grupo carbóxi e o grupo de proteção P10 para um grupo funcional na cadeia lateral podem ser removidos por meio de um método diferente ou condições diferentes. Por exemplo, um exemplo representativo inclui uma combinação na qual P12 é um grupo benzila e P10 é um grupo terc-butila ou similar como um grupo de proteção para um grupo carbóxi, um grupo metoximetila ou similar como um grupo de proteção para um grupo hidróxi ou um grupo terc-butilóxi carbonila ou similar como um grupo de proteção para um grupo amino. O grupo de proteção P10 para um grupo funcional em uma cadeia lateral é, de preferência, um grupo de proteção o qual pode ser desprotegido por meio de um tratamento sob condições ácidas. No entanto, ele não está limitado aos mesmos e pode ser selecionado daqueles supracitados dependendo, por exemplo, das propriedades do grupo amino, grupo carbóxi ou grupo hidróxi de um composto a ser protegido. Para remoção do grupo de proteção, os reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo de proteção. Ainda, o composto (47) também pode ser produzido ao repetir sequencialmente a reação e desproteção do aminoácido ou peptídeo constituinte para alongamento.
[00801] Ao desproteger o grupo de proteção P12 para o grupo car- bóxi do composto (47) obtido, o composto (48) pode ser produzido. Reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo de proteção.
[00802] O composto (34) pode ser produzido por meio de derivati- zação do composto (48) no éster ativo, anidrido ácido misto, halogene- to ácido ou similar e reação do mesmo com o composto (7) na presença de uma base. Para a reação, reagentes e condições de reação que são geralmente usados para síntese peptídica também podem ser usados e as condições de reação, reagentes, base e solvente usados para a reação podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6).
[00803] O composto (47) também pode ser produzido através do método a seguir, por exemplo.
[00804] O peptídeo (49) pode ser produzido por meio de derivatiza- ção do aminoácido ou peptídeo (46) no éster ativo, anidrido ácido misto, halogeneto ácido ou similar e reação do mesmo com o aminoácido ou peptídeo (31) tendo o N-término protegido com P9 e o grupo carbó- xi, grupo hidróxi ou grupo amino na cadeia lateral protegida com P10 na presença de uma base. As condições de reação, reagentes, base e solvente usados para a formação de uma ligação peptídica entre o aminoácido ou peptídeo (46) e o aminoácido ou peptídeo (31) podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6). Entretanto, neste caso, é necessário que o grupo de proteção P12 para um grupo carbóxi do aminoácido ou peptídeo (46) e o grupo de proteção P9 e P10 para o aminoácido ou peptídeo (31) possam ser removidos da mesma maneira conforme descrito acima, mas através de um método diferente ou condições diferentes. Por exemplo, um exemplo representativo inclui uma combinação na qual P9 é um grupo 9-fluorenilmetilóxi carbonila, P10 é um grupo terc-butila ou similar como um grupo de proteção para um grupo carbóxi, um grupo meto- ximetila ou similar como um grupo de proteção para um grupo hidróxi ou um grupo terc-butilóxi carbonila como um grupo de proteção ou similar para um grupo amino e P12 é um grupo benzila. O grupo de proteção P10 para um grupo funcional em uma cadeia lateral é, de preferência, um grupo de proteção o qual pode ser desprotegido por meio de um tratamento sob condições ácidas. No entanto, ele não está limitado aos mesmos e pode ser selecionado daqueles supracitados dependendo, por exemplo, das propriedades do grupo amino, grupo car- bóxi ou grupo hidróxi de um composto a ser protegido. Para remoção do grupo de proteção, os reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo de proteção.
[00805] Ao desproteger o grupo de proteção P9 para o N-terminal do peptídeo (49) obtido, o composto (50) pode ser produzido. Reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo de proteção.
[00806] O composto (47) pode ser produzido por meio de derivati- zação do derivado de ácido carboxílico (11) no éster ativo, anidrido ácido misto, halogeneto ácido ou similar e reação do mesmo com o peptídeo (50) obtido na presença de uma base. As condições de reação, reagentes, base e solvente usados para a formação de uma ligação de amida entre o derivado de ácido carboxílico (11) e o peptídeo (50) podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6).
6. Método de Produção 6
[00807] Dentro do intermediário de produção (2), aqueles nos quais o ligante apresenta uma estrutura representada por -L1-L2-LP- e o dito LP é o resíduo peptídico que contém um aminoácido hidrofílico no N- término e o dito aminoácido hidrofílico localizado no N-término é outro que não glicina, também pode ser produzido através do método a seguir. Química 28
Figure img0063
[na fórmula, L1' corresponde a L1 tendo uma estrutura na qual o término é modificado em um grupo maleimidila, LP representa uma estrutura que consiste em -Lp1-Lp2- e P8, P9, P10 e P12 representam um grupo de proteção].
[00808] Uma vez que LP é formado por meio de conexão Lp1 a Lp2, o aminoácido hidrofílico no N-término de LP é derivado a partir de Lp1 e, assim, aqueles que tendo um aminoácido hidrofílico no N-término são adequadamente empregados como Lp1. Entretanto, múltiplos aminoá- cidos hidrofílicos podem estar presentes no mesmo. Ainda, quando Lp2 com o aminoácido hidrofílico é empregado, Lp tendo múltiplos aminoá- cidos hidrofílicos no N-término de LP ou no N-término e em outras po-sições pode ser produzido dependendo da localização do aminoácido hidrofílico.
[00809] O composto (51) pode ser produzido por meio de derivati- zação do peptídeo ou aminoácido (28) descrito no Método de Produção 5, o qual apresenta o N-término protegido com P8, no éster ativo, anidrido ácido misto ou similar e reação de com o composto (4) e um sal do mesmo. As condições de reação, reagentes, base e solvente usados para a formação de uma ligação peptídica entre o peptídeo ou aminoácido (28) e o composto (4) podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6). O grupo de proteção P8 podem ser adequadamente selecionados e usados a partir daqueles descritos como o grupo de proteção para o composto (6) e ele pode ser selecionado dependendo, por exemplo, a propriedade do composto tendo um grupo amino a ser protegido. Ainda, conforme é geralmente usado para síntese peptídica, ao repetir sequencialmente a reação e desproteção do aminoácido ou peptídeo que constitui o pep- tídeo ou aminoácido (28) para alongamento, o composto (51) também pode ser produzido.
[00810] Ao desproteger o grupo de proteção P8 para o grupo amino do composto (51) obtido, o composto (52) pode ser produzido. Nesta desproteção, os reagentes e condições podem ser selecionados de-pendendo do grupo de proteção.
[00811] O composto (53) pode ser produzido por meio de derivati- zação do aminoácido ou peptídeo (31) tendo o N-término protegido com P9 e o grupo carbóxi, grupo hidróxi ou grupo amino na cadeia lateral protegida com P10 conforme descrito no Método de Produção 4 no éster ativo, anidrido ácido misto ou similar e reação do mesmo com o composto (52) obtido. As condições de reação, reagentes, base e solvente usados para a formação de uma ligação peptídica entre o ami- noácido ou peptídeo (31) e o composto (52) podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6). O grupo de proteção P9 e P10 são os mesmos conforme aqueles descri- tos no Método de Produção 5. Ainda, conforme é geralmente usado para síntese peptídica, ao repetir sequencialmente a reação e desproteção do aminoácido ou peptídeo constituinte para alongamento, o composto (53) também pode ser produzido.
[00812] Ao desproteger de P9 como o grupo de proteção do grupo amino do composto (53) obtido, o composto (54) pode ser produzido. Nesta desproteção, os reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo de proteção.
[00813] É possível produzir o composto (55) por meio de derivatiza- ção do derivado de ácido carboxílico (11) no éster ativo, anidrido ácido misto, halogeneto ácido ou similar e reação do mesmo com o composto (54) obtido. As condições de reação, reagentes, base e solvente usados para a formação de uma ligação peptídica entre o derivado de ácido carboxílico (11) e o composto (54) podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6).
[00814] Ao desproteger o grupo de proteção P10 para o grupo car- bóxi, grupo hidróxi ou grupo amino do composto (55) obtido, o composto (2) pode ser produzido. Nesta desproteção, os reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo de proteção.
[00815] O composto (53) também pode ser produzido através do método a seguir, por exemplo.
[00816] Ao desproteger o grupo de proteção P12 para o grupo car- bóxi do composto (49) descrito no Método de Produção 5, o peptídeo (56) pode ser produzido. Nesta desproteção, os reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo de proteção.
[00817] O composto (53) pode ser produzido por meio de derivati- zação do peptídeo (56) obtido no éster ativo, anidrido ácido misto, ha- logeneto ácido ou similar e reação do mesmo com o composto (4) ou um sal do mesmo. As condições de reação, reagentes, base e solvente usados para a formação de uma ligação peptídica entre o composto (56) e o composto (4) podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6).
[00818] O composto (55) também pode ser produzido através do método a seguir, por exemplo.
[00819] O composto (55) pode ser produzido por meio de derivati- zação do composto (48) descrito no Método de Produção 5 no éster ativo, anidrido ácido misto ou similar e reação do mesmo com o composto (4) na presença de uma base ou derivatização do aminoácido ou peptídeo (45) descrito no Método de Produção 5 no éster ativo, anidri- do ácido misto ou similar e reação do mesmo com o composto (52) na presença de uma base. As condições de reação, reagentes, base e solvente usados para a formação de cada ligação peptídica podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6).
7. Método de Produção 7
[00820] Dentro do intermediário de produção representado pela fórmula (2), aqueles tendo a estrutura ligante de -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1- La-NH-(CH2)n2-C(=O)- e o dito LP é o resíduo peptídico tendo um ami- noácido hidrofílico no N-término e o dito aminoácido hidrofílico localizado no N-término é outro que não glicina também pode ser produzido através do método a seguir. Química 29
Figure img0064
[na fórmula, L1' corresponde a L1 tendo uma estrutura na qual o térmi- no é modificado em um grupo maleimidila, LP representa uma estrutura que consiste em -Lp1-Lp2- e P9 e P13 representam um grupo de proteção].
[00821] O intermediário de produção representado pela fórmula (2) inclui os dois modos a seguir, isto é, uma estrutura na qual o ligante é representado por -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-NH-(CH2)n2-C(=O)- e uma estrutura na qual o ligante é representado por -L1-L2-LP-.
[00822] O composto (2) com uma estrutura na qual o ligante é re-presentado por -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-NH-(CH2)n2-C(=O)- pode ser produzido como segue.
[00823] O composto (57) pode ser sintetizado da mesma maneira as o composto (32) descrito no Método de Produção 5. No entanto, diferente do composto (32), não é necessário que o grupo de proteção P9 para o grupo amino e o grupo de proteção P13 para o grupo funcional na cadeia lateral possam ser removidos por meio de um método diferente ou condições diferentes. O grupo funcional na cadeia lateral é um grupo carbóxi ou grupo hidróxi e o grupo de proteção P9 para o grupo amino e o grupo de proteção P13 para o grupo carbóxi ou grupo hidróxi na cadeia lateral podem ser simultaneamente desprotegidos. Por exemplo, um exemplo representativo inclui uma combinação na qual P9 é um grupo terc-butilóxi carbonila e P13 é um grupo terc-butila ou um grupo tritila ou P3 é um grupo benzilóxi carbonila e P13 é um grupo benzila. Os grupos de proteção podem ser adequadamente selecionados daqueles supracitados com relação aos grupos de proteção para o composto (6) dependendo, por exemplo, das propriedades de um grupo amino, um grupo carbóxi ou grupo hidróxi do composto a ser protegido. Para remoção dos grupos de proteção, os reagentes e condições são selecionados dependendo do grupo de proteção. Usando o aminoácido ou peptídeo protegido que satisfaz as propriedades acima, o composto (57) pode ser sintetizado da mesma maneira conforme o Método de Produção 5.
[00824] Através de desproteção sequencial ou simultânea do grupo de proteção P9 e P13 do composto (57), o composto (51) pode ser produzido. Reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo de proteção.
[00825] Um grupo funcional na cadeia lateral hidrofílica de LP no composto (58) não está particularmente protegido, no entanto, através de reação com o composto (11) derivatizado no éster ativo, anidrido ácido misto ou similar na presença de uma base, o composto (2) pode ser produzido. As condições de reação, reagentes, base e solvente usados para a formação de cada ligação peptídica podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6).
[00826] O composto (2) com uma estrutura na qual o ligante é re-presentado por -L1-L2-LP- pode ser produzido como segue.
[00827] O composto (59) também pode ser sintetizado da mesma maneira as o composto (53) descrito no Método de Produção 6. No entanto, diferente do composto (53), pode não ser necessário que o grupo de proteção P3 para o grupo amino e o grupo de proteção P8 para o grupo funcional na cadeia lateral possam ser removidos por meio de um método diferente ou condições diferentes. O grupo funcional na cadeia lateral é um grupo carbóxi ou grupo hidróxi e o grupo de proteção P9 para o grupo amino e o grupo de proteção P13 para o grupo carbóxi ou grupo hidróxi na cadeia lateral podem ser simultaneamente desprotegidos. Por exemplo, um exemplo representativo inclui uma combinação na qual P9 é um grupo terc-butilóxi carbonila e P13 é um grupo terc-butila ou um grupo tritila ou P3 é um grupo benzilóxi carbonila e P13 é um grupo benzila. Os grupos de proteção podem ser adequadamente selecionados daqueles supracitados com relação aos grupos de proteção para o composto (6) dependendo, por exemplo, das propriedades de um grupo amino, um grupo carbóxi ou grupo hi- dróxi do composto a ser protegido. Para remoção dos grupos de proteção, os reagentes e condições são selecionados dependendo do grupo de proteção. Usando o aminoácido protegido ou peptídeo que satisfaz as propriedades acima, o composto (59) pode ser sintetizado da mesma maneira conforme o Método de Produção 6.
[00828] Através de desproteção simultânea ou sequencial do grupo de proteção P9 e P13 do composto (59), o composto (53) pode ser produzido. Reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo de proteção.
[00829] Um grupo funcional na cadeia lateral hidrofílica de LP no composto (60) não está particularmente protegido. No entanto, através de reação com o composto (11) derivatizado no éster ativo, anidrido ácido misto ou similar na presença de uma base, o composto (2) pode ser produzido. As condições de reação, reagentes, base e solvente usados para a formação de cada ligação peptídica podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6).
8. Método de Produção 8
[00830] O composto (43) mostrado no Método de Produção 5 no qual o ligante -LP- apresenta uma estrutura de -Lp1-Gly-Gly-Phe-Gly- também pode ser produzido através do método a seguir. Química 30
Figure img0065
[na fórmula, P9 e P10 representam um grupo de proteção].
[00831] O composto (62) pode ser produzido por meio de derivati- zação do aminoácido ou peptídeo (31) descrito no Método de Produção 5 no éster ativo, anidrido ácido misto, halogeneto ácido ou similar e reação do mesmo com glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5- fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida (isto é, forma livre do composto farmacêutico descrito na Publicação Inter-nacional N° WO 1997/46260) (61) ou um sal do mesmo na presença de uma base. As condições de reação, reagentes, base e solvente usados para a formação de uma ligação peptídica entre o aminoácido ou peptídeo (31) e o composto (61) podem ser adequadamente selecionadas daquelas descritas para a síntese do composto (6). O grupo de proteção P3 para N-terminal e o grupo de proteção P10 para o grupo funcional na cadeia lateral são os mesmos conforme aqueles descritos no Método de Produção 5. Entretanto, o grupo de proteção P10 para o grupo funcional na cadeia lateral pode não estar presente e realizando a reação usando o aminoácido ou peptídeo (31) com o N-término protegido apenas, o composto (62) pode ser obtido.
9. Método de Produção 9
[00832] Dentre os compostos representados pela fórmula (2), um composto, no qual o ligante apresenta uma estrutura representada por -L1-L2-LP- e o dito LP é o oligopeptídeo no qual o C-término é composto de 2 ou 3 ou mais glicinas e é conectado a um fármaco e o N-terminal do dito resíduo peptídico é glicina no caso um aminoácido hidrofílico é presente em N-terminal, também pode ser produzido de acordo com o método a seguir. Química 31
Figure img0066
[na fórmula, L1' corresponde a L1 tendo uma estrutura na qual o término é convertido um grupo maleimidila, LP representa uma estrutura que consiste em Lp1-Lp2 e P12 e P14 representam um grupo de proteção].
[00833] Uma vez que LP é formado ao conectar Lp1 a Lp2, o número de glicinas que constituem o C-término de LP contido no mesmo pode ser designado considerando-se o número de glicinas no C-término em LP e o número de uso repetido do mesmo durante a reação.
[00834] O peptídeo (63) é um oligopeptídeo no qual o C-término é composto de 2 ou 3 ou mais glicinas e o N-terminal é glicina no caso o N-terminal do dito resíduo peptídico é um aminoácido hidrofílico e ainda, o dito N-término é protegido com P14. Como comumente empregado para síntese peptídica, o peptídeo (63) pode ser sintetizado ao repetir sequencialmente a reação de condensação do aminoácido ou peptídeo constituinte e desproteção. O composto (64) pode ser produzido por meio de derivatização do peptídeo (63) no éster ativo, anidrido ácido misto ou similar e reação do mesmo com o composto (4) ou um sal do mesmo. As condições de reação, reagentes, base e solvente usados para a formação de uma ligação peptídica entre peptídeo (63) e o composto (4) podem ser ade-quadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do com- posto (6). O grupo de proteção P14 podem ser adequadamente seleci-onados e usados a partir daqueles descritos para síntese do composto (6).
[00835] O composto (64) também pode ser produzido por meio de derivatização do aminoácido ou peptídeo (65) com o N-término protegido com P14 no éster ativo, anidrido ácido misto ou similar e reação do mesmo com o composto (52) descrito no Método de Produção 6. As condições de reação, reagentes, base e solvente usados para a formação de uma ligação peptídica entre aminoácido ou peptídeo (65) e o composto (52) podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6). O grupo de proteção P14 pode ser adequadamente selecionado e usado a partir daqueles descritos para síntese do composto (6).
[00836] Ao desproteger o grupo de proteção P14 para o grupo amino do composto (64) obtido, o composto (66) pode ser produzido. Reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo de proteção.
[00837] O composto (2) pode ser produzido por meio de derivatiza- ção do derivado de ácido carboxílico (11) no éster ativo, anidrido ácido misto, halogeneto ácido ou similar e reação do mesmo com o composto (66) obtido. As condições de reação, reagentes, base e solvente usados para a formação de uma ligação de amida entre o derivado de ácido carboxílico (11) e o composto (66) podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6).
[00838] O composto (2) também pode ser produzido através do método a seguir.
[00839] No composto (67), do qual a glicina no N-término de Lp1 é conectado a L2 e ele pode ser produzido da mesma maneira as o composto (45) descrito no Método de Produção 5. O composto (68) pode ser produzido por meio de derivatização do aminoácido ou peptí- deo (46) descrito no Método de Produção 5 no éster ativo, anidrido ácido misto, halogeneto ácido ou similar e reação do mesmo com o composto (67). Aqui, o aminoácido ou peptídeo (46) é um oligopeptí- deo que consiste em glicina ou tendo um C-término que consiste em 2 ou 3 ou mais glicinas, no qual o C-término é protegido com P12. As condições de reação, reagentes, base e solvente usados para a formação de uma ligação de amida entre aminoácido ou peptídeo (46) e o composto (67) podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6).
[00840] O composto (68) também pode ser produzido por meio de derivatização do composto (11) no éster ativo, anidrido ácido misto ou similar e reação do mesmo com o peptídeo (69) tendo o C-término pro-tegido com P12. Aqui, o peptídeo (69) é um oligopeptídeo no qual o C- término é composto de 2 ou 3 ou mais glicinas e o N-terminal é glicina no caso o N-terminal do dito resíduo peptídico é um aminoácido hidro- fílico. Como comumente empregado para síntese peptídica, o peptídeo (69) pode ser produzido ao repetir sequencialmente a reação de condensação do aminoácido ou peptídeo constituinte e desproteção. As condições de reação, reagentes, base e solvente usados para a formação de uma ligação peptídica entre o peptídeo (69) e o composto (11) podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6). O grupo de proteção P12 é, de preferência, um grupo de proteção o qual pode ser desprotegido sob condições ácidas, mas ele não está limitado aos mesmos e podem ser adequadamente selecionados e usados a partir daqueles descritos para síntese do composto (6).
[00841] Ao desproteger o grupo de proteção P12 para o grupo car- bóxi do composto (68) obtido, o composto (70) pode ser produzido. Nesta desproteção, os reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo de proteção.
[00842] O composto (2) pode ser produzido por meio de derivatiza- ção do composto (70) no éster ativo, anidrido ácido misto ou similar e reação do mesmo com o composto (4) ou um sal do mesmo. As condições de reação, reagentes, base e solvente usados para a formação de uma ligação peptídica entre o composto (70) e o composto (4) podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6).
[00843] Além do acima, o composto (2) também pode ser produzido de acordo com o método a seguir.
[00844] O composto (2) pode ser produzido por meio de derivatiza- ção do composto (52) descrito no Método de Produção 6 no éster ativo, anidrido ácido misto ou similar e reação do mesmo com o composto (67) na presença de uma base. As condições de reação, reagentes, base e solvente usados para a formação de uma ligação peptídica entre o composto (67) e o composto (52) podem ser adequadamente se-lecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6).
[00845] Entretanto, também é possível que todos os compostos in-termediários do Método de Produção 1 ao Método de Produção 9 possam estar presentes na forma de sal e/ou hidrato.
[00846] O conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção pode absorver a umidade para ter adsorção de água, por exemplo, ou se transformar em um hidrato quando ele é deixado em ar ou submetido a procedimentos de purificação, tal como recristalização. Tal composto ou um sal contendo água também estão incluídos na presente invenção.
[00847] Um composto marcado com vários isótopos radioativos ou não radioativos também está incluído na presente invenção. Um ou mais átomos que constituem o conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção podem conter um isótopo atômico em uma proporção não natural. Exemplos do isótopo atômico podem incluir deutério (2H), trítio (3H), iodo-125 (125I) e carbono-14 (14C). Ainda, o composto da presente invenção pode ser radioativamente marcado com um isótopo radioativo, tal como trítio (3H), iodo-125 (125I), carbono-14 (14C), cobre-64 (64Cu), zircônio-89 (89Zr), iodo-124 (124I), flúor-18 (18F), índio- 111 (111I), carbono-11 (11C) ou iodo-131 (131I). O composto marcado com um isótopo radioativo é útil como um agente terapêutico ou profilático, um reagente para pesquisa, tal como um reagente de ensaio e como um agente para diagnóstico, tal como um agente de imagiologia diagnóstica in vivo. Sem estar relacionado com a radioatividade, qualquer tipo de isótopo variante do conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção está dentro do escopo da presente invenção.
Produtos Farmacêuticos/Medicamentos
[00848] O conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER3 da presente invenção exibe uma atividade citotóxica contra células cancerosas, e, assim, como um medicamento, ele pode ser particularmente usado como um agente terapêutico e/ou agente profiláctico para o câncer.
[00849] Especificamente, o conjugado de anticorpo-fármaco anti- HER3 da presente invenção pode ser usado de forma seletiva como um medicamento para a quimioterapia, que é um método importante para o tratamento do câncer e como um resultado, pode retardar o de-senvolvimento de células cancerosas, inibir o crescimento das mesmas e ainda destruir as células cancerosas. Isso pode permitir que pacientes com câncer fiquem livres de sintomas causados pelo câncer ou alcançar a melhoria na qualidade de vida de pacientes com câncer e atingir um efeito terapêutico, sustentando a vida dos pacientes com câncer. Mesmo se o conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER3 da presente invenção não atingir a destruição de células cancerosas, ele pode atingir uma maior QOL (qualidade de vida) de pacientes com câncer e alcançar a sobrevivência a longo prazo, por inibir ou controlar o crescimento das células cancerosas.
[00850] O conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER3 da presente invenção pode ser usado como um medicamento sozinho nesta terapia medicinal. Além disso, o conjugado de anticorpo-fármaco anti- HER3 da presente invenção pode ser usado como um medicamento, em combinação com uma terapia adicional na terapia adjuvante e pode ser combinado com a operação cirúrgica, radioterapia, terapia hormonal ou similar. Além disso, o conjugado de anticorpo anti-HER3- fármaco da presente invenção também pode ser usado como um medicamento para a terapia de fármacos na terapia neoadjuvante.
[00851] Em adição ao uso terapêutico como descrito acima, o efeito de suprimir o crescimento de pequenas células cancerosas metastáti- cas e mais em destruí-los, também pode ser esperado. Particularmente, quando a expressão de HER3 é confirmada em células cancerosas primárias, a inibição de metástases de câncer ou um efeito profilático pode ser esperado por administração do conjugado de anticorpo- fármaco anti-HER3 da presente invenção. Por exemplo, o efeito de inibir e destruir as células cancerosas em um fluido corporal no decurso de metástases ou o efeito, por exemplo, de inibir e destruir as células cancerosas minúsculas imediatamente após a implantação em qualquer tecido pode ser esperado. Por conseguinte, a inibição de me- tástases de câncer ou um efeito profilático pode ser previsto, em particular, após a remoção cirúrgica do câncer.
[00852] Pode-se esperar que o conjugado de anticorpo -fármaco anti-HER3 da presente invenção produza um efeito terapêutico por meio de administração como terapia sistêmica aos pacientes, bem como por administração local a tecidos cancerosos.
[00853] O conjugado de anticorpo-fármaco (1) teve uma excelente atividade antitumor, segurança e propriedades físicas e exibiu efeitos anticâncer de mama, anticâncer de pulmão e antimelanoma in vitro.
[00854] O conjugado de anticorpo-fármaco (2) teve uma excelente atividade antitumor, segurança e propriedades físicas e exibiu efeitos anticâncer de mama, anticâncer de pulmão, anticâncer colorretal e efeitos antimelanoma in vitro e efeitos anticâncer de mama e antimelanoma in vivo mais fortes do que aqueles do U1-59.
[00855] O conjugado de anticorpo-fármaco (3) teve uma excelente atividade antitumor, segurança e propriedades físicas e exibiu efeitos anticâncer de mama, anticâncer de pulmão, anticâncer de ovário, anti- câncer colorretal e antimelanoma in vitro e efeitos anticâncer de mama, anticâncer de pulmão, , anticâncer de estômago e antimelanoma in vivo mais fortes do que aqueles do U1-59.
[00856] O conjugado de anticorpo-fármaco (4) teve uma excelente atividade antitumor, segurança e propriedades físicas e exibiu um efeito anticâncer de mama in vitro.
[00857] O conjugado de anticorpo-fármaco (5) teve uma excelente atividade antitumor, segurança e propriedades físicas e exibiu efeitos anticâncer de mama, anticâncer de pulmão e antimelanoma in vitro.
[00858] O conjugado de anticorpo-fármaco (6) teve uma excelente atividade antitumor, segurança e propriedades físicas e exibiu efeitos anticâncer de mama, anticâncer de pulmão e antimelanoma in vitro e um efeito anticâncer de mama mais fortes in vivo do que a de U1-59.
[00859] O conjugado de anticorpo-fármaco (7) teve uma excelente atividade antitumor, segurança e propriedades físicas e exibiu efeitos anticâncer de mama, anticâncer de pulmão e antimelanoma in vitro.
[00860] O conjugado de anticorpo-fármaco (8) teve uma excelente atividade antitumor, segurança e propriedades físicas e exibiu efeitos anticâncer de mama, anticâncer de pulmão e antimelanoma in vitro e efeitos anticâncer de mama in vivo mais fortes do que aqueles do U1- 59.
[00861] O conjugado de anticorpo-fármaco (9) teve uma excelente atividade antitumor, segurança e propriedades físicas e exibiu efeitos anticâncer de mama, anticâncer de pulmão, anticâncer de ovário, anti- câncer colorretal e antimelanoma in vitro.
[00862] O conjugado de anticorpo-fármaco (10) teve uma excelente atividade antitumor, segurança e propriedades físicas e exibiu efeitos anticâncer de mama, anticâncer de pulmão, anticâncer colorretal e an-timelanoma in vitro e efeitos anticâncer de mama, anticâncer de pulmão, anticâncer colorretal, anticâncer de estômago e antimelanoma in vivo mais fortes do que aqueles do U1-59.
[00863] O conjugado de anticorpo-fármaco (11) teve uma excelente atividade antitumor, segurança e propriedades físicas e exibiu um efeito anticâncer de mama in vitro.
[00864] O conjugado de anticorpo-fármaco (12) teve uma excelente atividade antitumor, segurança e propriedades físicas e exibiu efeitos anticâncer de mama, anticâncer de pulmão, anticâncer de ovário, anti- câncer colorretal e antimelanoma in vitro.
[00865] O conjugado de anticorpo-fármaco (13) teve uma excelente atividade antitumor, segurança e propriedades físicas e exibiu efeitos anticâncer de mama, anticâncer de pulmão, anticâncer colorretal e an-timelanoma in vitro e efeitos anticâncer de mama (incluindo do câncer de mama triplo-negativo), anticâncer de pulmão, anticâncer de estômago, anticâncer pancreático e antimelanoma in vivo mais fortes do que aqueles do U1-59.
[00866] O conjugado de anticorpo-fármaco (14) teve uma excelente atividade antitumor, segurança e propriedades físicas e exibiu um efeito anticâncer de mama in vitro.
[00867] O conjugado de anticorpo-fármaco (16a) teve uma excelente atividade antitumor, segurança e propriedades físicas e exibiram um anticâncer de mama (incluindo luminal e triplo negativo), antimelanoma, anticâncer de ovário, anticâncer de bexiga, anticâncer de pulmão, anticâncer de cabeça e pescoço e os efeitos anticâncer gástrico in vivo quando foi administrado sozinho ou em combinação com trastuzuma- be, gefinitibe, cetuximabe, panitumumabe ou pertuzumabe.
[00868] Exemplos do tipo de câncer para o qual é aplicado o conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER3 da presente invenção incluem o câncer de pulmão, câncer de rim, câncer urotelial, câncer colorretal, câncer de próstata, glioblastoma multiforme, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer de mama, metastáticos câncer de mama, câncer luminal de mama, melanoma, câncer de fígado, câncer de bexiga, gástrico (estômago) câncer, tumor estromal gastrintestinal, o câncer de colo do útero, câncer de cabeça e pescoço, câncer de esôfago, câncer epidermoide, câncer peritoneal, glioblastoma multiforme em adultos, câncer hepático, hepatocelular carcinoma, câncer de cólon, câncer retal, câncer de cólon e retal, câncer de endométrio, câncer do útero, câncer salivar, câncer renal, câncer vulvar, câncer de tiroide, carcinoma hepático, carcinoma de ânus, câncer de pênis. A quimioterapia é o único tratamento atual indicado para câncer de mama negativo particularmente triplo (que não apresenta a expressão de HER2, o estrogênio e receptores de progesterona) entre os cânceres de mama, que se diz ter um mau prognóstico. apresenta havido quase nenhum relato de expressão HER3 no câncer de mama triplo negativo. No entanto, se a expressão HER3 é observada em pacientes com câncer de mama negativo tripla, então o conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER3 da presente invenção pode ser usado como um agente terapêutico e/ou um agente de prevenção. No entanto, ela não se limita a eles contanto que é uma célula de câncer que expressam, em uma célula de câncer, como um objeto de tratamento, uma proteína que o anticorpo do conjugado de anticorpo-fármaco é capaz de reconhecer.
[00869] O tratamento com o conjugado de anticorpo -fármaco anti- HER3 da presente invenção pode ter como alvo uma célula de câncer que expressa, em uma célula de câncer, como um objeto de tratamen- to, proteína HER3 qual o anticorpo do conjugado de anticorpo-fármaco é capaz de reconhecer. Na presente relatório descritivo, o "câncer que expressa a proteína HER3" é que compreendem células cancerosas com proteína HER3 na sua superfície ou proteínas secretoras de câncer HER3 em sangue. A proteína HER3 é excessivamente expressa em vários tumores humanos e pode ser avaliada usando um método geralmente levada a cabo, tal como método de coloração imuno- histoquímica (IHC) para avaliar a expressão excessiva da proteína HER3 em espécimes de tumor (primário metastático), fluorescência no método de hibridização in situ (FISH) para a avaliação da amplificação do gene HER3 ou ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) para avaliar a expressão excessiva da proteína HER3 em amostras de sangue.
[00870] O conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER3 da presente invenção exibe um efeito antitumor, reconhecendo e ainda internali- zando a proteína HER3 expressa na superfície de células cancerosas. Assim, o objeto de tratamento do conjugado de anticorpo -fármaco an- ti-HER3 da presente invenção não está limitado ao "câncer que expressa a proteína HER3" e também pode ser, por exemplo, leucemia, linfoma maligno, plasmacitoma, mieloma ou sarcoma.
[00871] O conjugado de anticorpo -fármaco anti-HER3 da presente invenção pode ser administrado de preferência a um mamífero, mas é administrado mais preferivelmente a um ser humano.
[00872] Substâncias usadas em uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER3 da presente invenção podem ser adequadamente selecionadas e aplicadas a partir de aditivos de formulação ou similar, que são geralmente usados na técnica, tendo em conta a concentração de dosagem ou administração.
[00873] O conjugado de anticorpo -fármaco anti-HER3 da presente invenção pode ser administrado como uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um ingrediente farmaceuticamente com-patível. Por exemplo, a composição farmacêutica compreende, tipica-mente, pelo menos, um portador farmacêutico (por exemplo, líquido esterilizado). Tal como aqui descrito, exemplos do líquido incluem (óleo de petróleo e óleo de origem animal, de origem vegetal ou de origem sintética) água e óleo. O óleo pode ser, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de sésamo ou similar. A água é um veículo mais típico, quando a composição farmacêutica é administrada intravenosamente. A solução salina, uma solução aquosa de dextrose, glicerol e uma solução aquosa podem também ser usados como um veículo líquido, em especial, para uma solução para injeção. Um veículo farmacêutico adequado pode ser selecionado apropriadamente daqueles conhecidos na técnica. Se desejado, a composição também pode compreender uma quantidade vestigial de um agente hidratante, um agente emulsionante ou um agente de tampo- namento do pH. Exemplos de veículo farmacêutico apropriado são descritos em "Remington 's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. As formulações correspondem a um modo de administração.
[00874] Vários sistemas de liberação são conhecidos e podem ser usados para administrar o conjugado de anticorpo -fármaco anti-HER3 da presente invenção. Exemplos da via de administração pode incluir a via intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa e subcutânea, mas não limitada aos mesmos. A administração pode ser feita por injeção de bolus ou por injeção, por exemplo. De acordo com uma modalidade especifica preferida, a administração do conjugado de fármaco ligante- é realizada por injeção. A administração parentérica é uma via de administração preferida.
[00875] De acordo com uma modalidade representativa, a composição farmacêutica é prescrita, como uma composição farmacêutica adequada para administração intravenosa a humanos, de acordo com os procedimentos convencionais. A composição para administração intravenosa é normalmente uma solução, em uma solução tampão aquosa isotônica e esterilizada. Se necessário, o medicamento pode conter um solubilizante e anestésicos locais para aliviar a dor no local da injeção (por exemplo, lignocaína). Geralmente, o ingrediente é fornecido individualmente como qualquer um de pó liofilizado ou um concentrado anidro contido em um recipiente, que é obtido por meio de selagem em uma ampola ou um sachê que apresenta uma quantidade de agente ativo ou como uma mistura em uma forma de dosagem unitária. Quando o fármaco é a forma a ser administrada por injeção, pode ser administrado a partir de um frasco de injeção contendo água ou soro fisiológico de grau farmacêutico estéril. Quando a farmacêutica é administrada por injeção, uma ampola de água estéril ou solução salina para injeção pode ser fornecido de modo a que os ingredientes acima mencionados são misturados uns com os outros antes da administração.
[00876] A composição farmacêutica da presente invenção pode compreender apenas o conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER3 do presente pedido de patente como um ingrediente ativo ou pode com-preender o conjugado de anticorpo -fármaco anti-HER3 e, pelo menos, um medicamento (por exemplo, agente de tratamento de câncer) que não seja o conjugado. O conjugado de anticorpo -fármaco anti-HER3 da presente invenção podem ser administrados com um outro agente de tratamento de câncer e o efeito anticâncer pode ser aumentada em conformidade. Por exemplo, um outro medicamento, tal como um agente anticâncer usado para o efeito pode ser administrado antes da administração da composição farmacêutica que compreende o conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER3 da presente invenção como um ingrediente ativo ou após a administração da composição farmacêutica que compreende o conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER3 como um ingrediente ativo ou pode ser administrada simultaneamente com, separadamente (individualmente) a partir de ou subsequentemente ao conjugado de anticorpo-fármaco e pode ser administrada ao mesmo tempo variando o intervalo de administração para cada um. Na presente invenção, o caso onde o conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER3 da presente invenção é administrado simultaneamente com outro me-dicamento como uma única formulação que contém o conjugado de anticorpo-fármaco e o medicamento e o caso onde o anticorpo anti- HER3 anticorpo-fármaco conjugado da presente invenção e outro medicamento são administrados simultaneamente ou subsequentemente, tal como formulações separadas administradas ao mesmo tempo ou variando o intervalo de administração para cada um estão ambos incluídos no escopo da "composição farmacêutica que compreende o conjugado de anticorpo-fármaco e um outro medicamento". Exemplos do agente de tratamento de câncer incluem 5-FU, trastuzumabe, tras- tuzumabe, entansina (T-DM1), cetuximabe, gefitinibe, panitumumabe, pertuzumabe, Abraxane, erlotinibe, carboplatina, cisplatina, gencitabi- na, capecitabina, irinotecano (CPT-11), paclitaxel, docetaxel, peme- trexede, sorafenibe, vinblastina, vinorelbina, vemurafenibe, medicamentos descritos na Publicação Internacional No. WO 2003/038043 análogos, LH-RH (leuprorelina, goserelina ou similar), fosfato de es- tramustina, antagonista de estrogénios (tamoxifeno, raloxifeno ou outros semelhantes) e um inibidor de aromatase (anastrozol, letrozol, exemestano ou similar), porém sem limitações, contanto que ele seja um medicamento possuindo uma atividade antitumor. Estes agentes de tratamento do câncer podem ser classificados, de acordo com os seus objetivos, em: agentes anti-EGFR, tais como cetuximabe, gefiti- nibe e panitumumabe; agentes anti-HER2, tais como trastuzumabe, t- DM1 e pertuzumabe; agentes anti-HER3 como patritumabe, MM-121 e MM-111; agentes anti-VEGF, tais como o infliximabe e adalimumabe; etc. Além disso, eles podem ser classificados em: anticorpos anti- EGFR, tais como cetuximabe e panitumumabe; anti-HER2 anticorpos, tais como trastuzumabe e pertuzumabe; anticorpos anti-HER3 como patritumabe, MM-121 e MM-111; Os anticorpos anti-VEGF, tais como o infliximabe e adalimumabe; etc. O conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER3 da presente invenção exerce um excelente efeito terapêutico quando administrado em combinação com um agente anti-HER2 ou um anticorpo anti-HER2 em i) o tratamento do câncer de estômago, câncer de mama, triplo negativo câncer de mama ou similar ou quando administrado em combinação com um agente anti-EGFR ou um anticorpo anti-EGFR em ii) o tratamento de câncer de pulmão, câncer de cabeça e pescoço, câncer de estômago, câncer de mama, o câncer de mama triplo-negativo ou similar. Um ou dois ou mais diferentes do conjugado de medicamentos pode ser usada e estes medicamentos podem ser agentes anticâncer ou podem ser medicamentos para aliviar efeitos colaterais causados por medicamentos complementares.
[00877] Na presente invenção, a "composição farmacêutica que compreende o conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER3 e outro me-dicamento" apresenta o mesmo significado que uma "composição far-macêutica em que o conjugado de anticorpo -fármaco anti-HER3 é para ser administrado em combinação com outro medicamento". Na presente invenção, a frase "administrado em combinação" usado para o conjugado de anticorpo -fármaco anti-HER3 e outro medicamento significa que o conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER3 e outro medicamento são incorporados no corpo de um recipiente dentro de um determinado período. Uma única formulação que contém o conjugado de anticorpo -fármaco anti-HER3 e um outro medicamento pode ser administrado ou o conjugado de anticorpo -fármaco anti-HER3 e um outro medicamento pode ser formulado e administrado como formula- ções separadas separadamente. No caso das formulações separadas, os intervalos de administração do mesmo não são particularmente limitados e as formulações podem ser administradas ao mesmo tempo ou podem ser administrados em tempos diferentes ou em dias diferentes de uma maneira escalonada. No caso onde o conjugado de anticorpo - fármaco anti-HER3 e outro medicamento são administrados separadamente em tempos diferentes ou diferentes dias, a ordem de administração do mesmo não é particularmente limitado. Uma vez que as formulações separadas são geralmente administradas de acordo com os respectivos métodos de administração, a frequência de administração das mesmas pode ser a mesma ou pode ser diferente. Além disso, tais formulações separadas podem ser administradas pelo mesmo método de administração (via de administração) ou métodos de administração diferentes (vias de administração). Não é necessário que o conjugado de anticorpo -fármaco anti-HER3 e outro medicamento existam no corpo, ao mesmo tempo e é suficiente que o conjugado de anticor- po-fármaco anti-HER3 e outro medicamento sejam incorporados no corpo dentro de um certo período (por exemplo, 1 mês, preferivelmente uma semana, mais preferivelmente vários dias, ainda mais preferivelmente de 1 dia). Alternativamente, quando um dos ingredientes ativos é administrado, o outro ingrediente ativo podem já ter desaparecido a partir do corpo.
[00878] Exemplos da forma de dosagem da "composição farmacêutica em que o conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER3 é para ser administrado em combinação com outro medicamento" pode incluir: 1) a administração de uma única formulação que compreende um conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER3 e outro medicamento, 2) a administração simultânea através da mesma via de administração de duas formulações obtidas por formulação separadamente o conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER3 e um outro medicamento, 3) a adminis- tração de uma forma escalonada, através da mesma via de administração de duas formulações obtidas formulando separadamente o conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER3 e um outro medicamento, 4) a administração simultânea através de diferentes vias de administração de duas formulações obtidas por formulação separadamente o conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER3 e outro medicamento e 5) a administração em uma maneira escalonada, através de diferentes vias de administração de duas formulações obtidas por formulação separadamente o conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER3 e um outro medicamento. A dose, intervalo de, forma de dosagem, formulação, etc., da "composição farmacêutica em que o conjugado de anticorpo- fármaco anti-HER3 é para ser administrado em combinação com outro medicamento" permanecer por aqueles da composição farmacêutica contendo uma dosagem do conjugado de anticorpo-fármaco anti- HER3 da presente invenção, mas não se limitam a estes.
[00879] Uma tal composição farmacêutica formulada em duas for-mulações diferentes pode estar na forma de um kit contendo-os.
[00880] Na presente invenção, a "combinação" do conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER3 e outro medicamento significa que o conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER3 e o medicamento são "administrados em combinação".
[00881] A composição farmacêutica pode ser formulada em uma formulação de liofilização ou uma formulação líquida como uma formu-lação com a composição desejada e necessária pureza. Quando for-mulado como uma formulação de liofilização, pode ser uma formulação contendo aditivos de formulação adequados que são usados na técnica. Também para uma formulação líquida, pode ser formulada como uma formulação líquida contendo vários aditivos de formulação que são usados na técnica.
[00882] Os constituintes e a concentração da composição farma- cêutica podem variar dependendo do método de administração. No entanto, o conjugado de anticorpo-fármaco anti-HER3 compreendido na composição farmacêutica da presente invenção pode exibir o efeito farmacêutico mesmo em uma dose pequena, quando o conjugado de anticorpo-fármaco possui uma afinidade mais elevada por um antíge- no, isto é, uma afinidade mais elevada (= abaixo do valor de Kd), em termos da constante de dissociação (isto é, valor de Kd) para o antí- geno. Assim, para a determinação de dosagem do conjugado de anti- corpo-fármaco, a dosagem pode ser determinada tendo em conta uma situação relativa à afinidade entre o conjugado de anticorpo-fármaco e antígeno. Quando o conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção é administrado a um ser humano, por exemplo, cerca de 0,001 a 100 mg/kg podem ser administradas uma vez ou administrado várias vezes com um intervalo de uma hora durante 1 a 180 dias.
Exemplos
[00883] A presente invenção é especificamente descrita em vista dos Exemplos apresentados abaixo. No entanto, a presente invenção não está limitado a eles. Além disso, eles não devem, de modo algum, ser interpretados em um sentido limitativo. Além disso, a menos que especificamente descrito de outro modo, o reagente, solvente e material de iniciação descritos no relatório descritivo podem ser facilmente obtidos a partir de um fornecedor comercial.
Exemplo de Referência 1. Produção de U1-59
[00884] U1-59 foi produzido com base no método descrito na Publi cação Internacional N° WO 2007/077028, Exemplo 1. Conjugado de anticorpo-fármaco (1) Química 32
Figure img0067
Processo 1: (4-{[(1S19S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4- oxobutil)carbamato de terc-Butila
[00885] Ácido 4-(terc-Butoxicarbonilamino)butanoico (0,237 g, 1,13 mmol) foi dissolvido em diclorometano (10 mL), carregado com N- hidroxissuccinimida (0,130 g, 1,13 mmol) e cloridrato de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodi-imida (0,216 g, 1,13 mmol) e agitado durante 1 hora. A solução de reação foi adicionada gota a gota a uma solução de N,N-dimetilformamida (10 mL) carregada com mesilato de exa- tecano (0,500 g, 0,94 mmol) e trietilamina (0,157 mL, 1,13 mmol) e agitada em temperatura ambiente durante 1 dia. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel [clorofórmio - clorofórmio : metanol = 8 : 2 (v/v)] para proporcionar o composto do título (0,595 g, quantitativo).
[00886] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) delta: 0,87 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,31 (9H, s), 1,58 (1H, t, J = 7,2 Hz), 1,66 (2H, t, J = 7,2 Hz), 1,89-1,82 (2H, m), 2,12-2,21 (3H, m), 2,39 (3H, s), 2,92 (2H, t, J = 6,5 Hz), 3,17 (2H, s), 5,16 (1H, d, J = 19,2 Hz), 5,24 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,59-5,55 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,78 (1H, t, J = 6,3 Hz), 7,30 (1H, s), 7,79 (1H, d, J = 11,0 Hz), 8,40 (1H, d, J = 8,6 Hz). MS (APCI) m/z: 621 (M+H)+.
Processo 2: trifluoroacetato de 4-Amino-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]butanamida
[00887] O composto (0,388 g, 0,61 mmol) obtido no Processo 1 acima foi dissolvido em diclorometano (9 mL). Após adição de ácido trifluoroacético (9 mL), ele foi agitado durante 4 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel [clorofórmio - camada orgânica dividida de clorofórmio : metanol : água = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para proporcionar o composto do título (0,343 g, quantitativo).
[00888] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,79 1,92 (4H, m), 2,10-2,17 (2H, m), 2,27 (2H, t, J=7,0 Hz), 2,40 (3H, s), 2,80-2,86 (2H, m), 3,15-3,20 (2H, m), 5,15 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,26 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,54-5,61 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,32 (1H, s), 7,72 (3H, brs), 7,82 (1H, d, J=11,0 Hz), 8,54 (1H, d, J=8,6 Hz).
[00889] MS (APCI) m/z: 521 (M+H)+. Processo 3: N-(terc-butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4- {[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin- 1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
[00890] N-(terc-butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanilglicina (0,081 g, 0,19 mmol) foi dissolvida em diclorometano (3 mL), carregado com N- hidroxissuccinimida (0,021 g, 0,19 mmol) e cloridrato de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodi-imida (0,036 g, 0,19 mmol) e agitado durante 3,5 horas. A solução de reação foi adicionada gota a gota a uma solução de N,N-dimetilformamida (1,5 mL) carregado com o composto (0,080 g, 0,15 mmol) o qual tinha sido obtido no Processo 2 acima e agitada em temperatura ambiente durante 4 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel [clorofórmio - clorofórmio : metanol = 8 : 2 (v/v)] para proporcionar o composto do título (0,106 g, 73%).
[00891] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) delta: 0,87 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,36 (9H, s), 1,71 (2H, m), 1,86 (2H, t, J = 7,8 Hz), 2,15-2,19 (4H, m), 2,40 (3H, s), 2,77 (1H, dd, J = 12,7, 8,8 Hz), 3,02 (1H, dd, J = 14,1, 4,7 Hz), 3,08-3,11 (2H, m), 3,16-3,19 (2H, m), 3,54 (2H, d, J = 5,9 Hz), 3,57-3,77 (4H, m), 4,46-4,48 (1H, m), 5,16 (1H, d, J = 19,2 Hz), 5,25 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,55-5,60 (1H, m), 6,53 (1H, s), 7,00 (1H, t, J = 6,3 Hz), 7,17-7,26 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,71 (1H, t, J = 5,7 Hz), 7,80 (1H, d, J = 11,0 Hz), 7,92 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,15 (1H, d, J = 8,2 Hz), 8,27 (1H, t, J = 5,5 Hz), 8,46 (1H, d, J = 8,2 Hz).
[00892] MS (APCI) m/z: 939 (M+H)+.
Processo 4: trifluoroacetato de glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9- etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro- 1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4- oxobutil)glicinamida
[00893] O composto (1,97 g, 2,10 mmol) obtido no Processo 3 acima foi dissolvido em diclorometano (7 mL). Após adição de ácido tri- fluoroacético (7 mL), ele foi agitado durante 1 hora. O solvente foi re-movido sob pressão reduzida e foi carregado com tolueno para destilação azeotrópica. Os resíduos obtidos foram purificados por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel [clorofórmio - camada orgânica dividida de clorofórmio : metanol : água = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para propor-cionar o composto do título (1,97 g, 99%).
[00894] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) delta: 0,87 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,71-1,73 (2H, m), 1,82-1,90 (2H, m), 2,12-2,20 (4H, m), 2,40 (3H, s), 2,75 (1H, dd, J = 13,7, 9,4 Hz), 3,03-3,09 (3H, m), 3,18-3,19 (2H, m), 3,58-3,60 (2H, m), 3,64 (1H, d, J = 5,9 Hz), 3,69 (1H, d, J = 5,9 Hz), 3,72 (1H, d, J = 5,5 Hz), 3,87 (1H, dd, J = 16,8, 5,9 Hz), 4,50-4,56 (1H, m), 5,16 (1H, d, J = 19,2 Hz), 5,25 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,55-5,60 (1H, m), 7,17-7,27 (5H, m), 7,32 (1H, s), 7,78-7,81 (2H, m), 7,95-7,97 (3H, m), 8,33-8,35 (2H, m), 8,48-8,51 (2H, m).
[00895] MS (APCI) m/z: 839 (M+H)+. Processo 5 N-[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi- 4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4- oxobutil)glicinamida
[00896] A uma solução em N,N-dimetilformamida (1,2 mL) do composto (337 mg, 0,353 mmol) obtido no Processo 4 acima, trietilamina (44,3 mL, 0,318 mmol) e 6-maleimida-hexanoato de N-succinimidila (119,7 mg, 0,388 mmol) foram adicionada e agitada em temperatura ambiente durante 1 hora. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel [clorofórmio - clorofórmio : metanol = 5 : 1 (v/v)] para proporcionar o composto do título como um sólido amarelo claro (278,0 mg, 76%).
[00897] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) delta: 0,87 (3H, t, J=7,3 Hz), 1,12-1,22 (2H, m), 1,40-1,51 (4H, m), 1,66-1,76 (2H, m), 1,80-1,91 (2H, m), 2,05-2,21 (6H, m), 2,39 (3H, s), 2,79 (1H, dd, J=14,0, 9,8 Hz), 2,98-3,21 (5H, m), 3,55-3,77 (8H, m), 4,41-4,48 (1H, m), 5,15 (1H, d, J=18,9 Hz), 5,24 (1H, d, J=18,9 Hz), 5,40 (1H, d, J=17,1 Hz), 5,44 (1H, d, J=17,1 Hz), 5,54-5,60 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,20-7,27 (5H, m), 7,30 (1H, s), 7,70 (1H, t, J=5,5 Hz), 7,80 (1H, d, J=11,0 Hz), 8,03 (1H, t, J=5,8 Hz), 8,08 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,14 (1H, d, J=7,9 Hz), 8,25 (1H, t, J=6,1 Hz), 8,46 (1H, d, J=8,5 Hz).
[00898] MS (APCI) m/z: 1032 (M+H)+.
Processo 6: Conjugado de anticorpo-fármaco (1)
[00899] Redução do anticorpo: U1-59 produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter uma concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio por PBS6.0/EDTA usando o Procedimento Comum B e o Procedimento Comum C descrito no Método de Produção 1. A solução (1,00 mL) foi adicionada a um tubo de polipropileno de 2,0 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltda.) (0,0307 mL; 4,6 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa a 1 M de hidrogeno fosfato de dipotássio (Nacalai Tesque, Inc.; 0,050 mL). Após confirmar que a solução apresenta um pH de 7,4 +/- 0,1, a ligação de dissulfure- to na parte de dobradiça no anticorpo foi reduzida por meio de incubação a 37 °C durante 1 hora.
[00900] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Após incubação da solução em um banho de água a 22 °C durante 10 minutos, sulfóxido de dimetila (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,0586 mL) e uma solução de sulfóxido de dimetila (0,0615 mL; 9,2 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 10 mM do composto obtido no Processo 5 acima foram adicionados à mesma e incubados em um banho de água a 22 °C durante 40 minutos para conjugação do ligante de fár- maco ao anticorpo. Em seguida, uma solução aquosa (0,0123 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada ao mesmo e agitada usando um rotator tubular (MTR-103, fabricado pela AS ONE Corporation) em temperatura ambiente durante 20 minutos para termi- nar a reação do ligante de fármaco.
[00901] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento Comum D (ABS é usado como solução tampão) descrito no Método de Produção 1 para proporcionar 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco do título.
[00902] Caracterização físico-química: Usando o Procedimento Comum E descrito no Método de Produção 1 (como coeficiente de absorção molar do ligante de fármaco, ED,280 = 7280 e ED,370 = 23400 foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00903] Concentração de anticorpo: 1,29 mg/mL, rendimento de anticorpo: 7,74 mg (77%) e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido por meio do Procedimento Comum E: 4,9. Exemplo 2. Conjugado de anticorpo-fármaco (2) Química 33
Figure img0068
Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (2)
[00904] Usando U1-59 produzido no Exemplo de Referência 1 e o composto obtido no Processo 5 acima do Exemplo 1, o conjugado de anticorpo-fármaco do título foi obtido da mesma maneira conforme no Processo 6 do Exemplo 1.
[00905] Concentração de anticorpo: 12,0 mg/mL, rendimento de anticorpo: 226,8 mg (91%) e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido por meio do Proce- dimento Comum E: 4,9. Exemplo 3. Conjugado de anticorpo-fármaco (3) Química 34
Figure img0069
Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (3)
[00906] Usando U1-59 produzido no Exemplo de Referência 1 e o composto obtido no Processo 5 do Exemplo 1, o conjugado de anti- corpo-fármaco do título foi obtido da mesma maneira conforme no Processo 6 do Exemplo 1.
[00907] Concentração de anticorpo: 16,9 mg/mL, rendimento de anticorpo: 219,7 mg (88%) e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido por meio do Procedimento Comum E: 4,9. Exemplo 4. Conjugado de anticorpo-fármaco (4) Química 35
Figure img0070
Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (4)
[00908] Redução do anticorpo: U1-59 produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter uma concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio por PBS6.0/EDTA usando o Procedimento Comum B e o Procedimento Comum C descrito no Método de Produção 1. A solução (1,00 mL) foi adicionada a um tubo de polipropileno de 1,5 mL e carregado com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltda.) (0,0187 mL; 2,8 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa a 1 M de hidrogeno fosfato de dipotássio (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0170 mL). Após confirmar que a solução apresenta um pH de 7,0 +/- 0,1, a ligação de dissulfure- to na parte de dobradiça no anticorpo foi reduzida por meio de incubação a 37 °C durante 1 hora.
[00909] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Após adição de uma solução de sulfóxido de dimetila (0,0314 mL; 4,7 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 10 mM do composto obtido no Processo 5 acima à solução em temperatura ambiente, ela foi incubada a 15 °C durante 1 hora para conjugação do ligante de fármaco ao anticorpo. Em seguida, uma solução aquosa (0,0123 mL; 18,4 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada ao mesmo e incubada em temperatura ambi- ente durante mais 20 minutos para terminar a reação do ligante de fármaco.
[00910] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento Comum D (ABS é usado como solução tampão) descrito no Método de Produção 1 para proporcionar 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco do título. Após o que, a solução foi concentrada por meio do Procedimento Comum A.
[00911] Caracterização físico-química: Usando o Procedimento Comum E descrito no Método de Produção 1 (como coeficiente de absorção molar do ligante de fármaco, ED,280 = 5000 e ED,370 = 19000 foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00912] Concentração de anticorpo: 1,02 mg/mL, rendimento de anticorpo: 6,1 mg (61%) e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido por meio do Procedimento Comum E: 2,9; e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido por meio do Procedimento Comum F (como coeficiente de absorção molar do ligante de fármaco, ED,280 = 5000 foram usados): 3,2. Exemplo 5. Conjugado de anticorpo-fármaco (5) Química 36
Figure img0071
Processo 1: (5S,14S)-5-benzil-1-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4- metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-14-{[(9H- fluoren-9-il-metóxi)carbonil]amino}-1,4,7,10,13-pentaoxo-3,6,9,12-tetra- aza-hexadecan-16-oato de terc-butila
[00913] Sob resfriamento com gelo, a uma solução em N,N- dimetilformamida (10,0 mL) de glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil- 5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro- 1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1- il]glicinamida (forma livre do composto farmacêutico descrito na Publi-cação Internacional N° WO 1997/46260; 0,250 g, 0,332 mmol), N- hidroxissuccinimida (57,2 mg, 0,497 mmol) e ácido 4-terc-butil N-[(9H- fluoren-9-il metóxi)carbonil]-L-aspártico (0,205 g, 0,497 mmol), N,N'- diciclo-hexilcarbodi-imida (0,123 g, 0,497 mmol) foi adicionada e agitada em temperatura ambiente durante 2 dias. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel [clorofórmio - clorofórmio : metanol = 9 : 1 (v/v)] para proporcionar o composto do título como um sólido amarelo claro (0,278 g, 73%).
[00914] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) delta: 0,86 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,35 (9H, s), 1,79-1,90 (2H, m), 2,03-2,25 (2H, m), 2,40 (3H, s), 2,40-2,51 (2H, m), 2,64-2,82 (2H, m), 2,98 (1H, dd, J = 13,7, 4,6 Hz), 3,16 (2H, brs), 3,55 (1H, dd, J = 16,7, 5,7 Hz), 3,63-3,80 (4H, m), 4,16-4,34 (3H, m), 4,36-4,50 (2H, m), 5,23 (2H, s), 5,37 (1H, d, J = 16,5 Hz), 5,43 (1H, d, J = 16,5 Hz), 5,51-5,62 (1H, m), 6,52 (1H, s), 7,10-7,25 (5H, m), 7,26-7,33 (3H, m), 7,39 (2H, t, J = 7,3 Hz), 7,65-7,72 (3H, m), 7,80 (1H, d, J = 11,0 Hz), 7,86 (2H, d, J = 7,3 Hz), 7,98 (1H, t, J = 5,5 Hz), 8,07 (1H, d, J = 7,8 Hz), 8,15 (1H, t, J = 5,5 Hz), 8,31 (1H, t, J = 5,5 Hz), 8,41 (1H, d, J = 8,7 Hz).
[00915] MS (ESI) m/z: 1147 (M+H)+. Processo 2: (5S,14S)-14-amino-5-benzil-1-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}- 1,4,7,10,13-pentaoxo-3,6,9,12-tetra-aza-hexadecan-16-oato de terc- butila
[00916] A uma solução em N,N-dimetilformamida (2,00 mL) do composto (0,279 g, 0,242 mmol) obtido no Processo 1 acima, piperidi- na (0,240 mL, 2,42 mmol) foi adicionada e agitada em temperatura ambiente durante 1 hora. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel [clorofórmio - clorofórmio : metanol = 2 : 1 (v/v)] para proporcionar o composto do título como um sólido amarelo claro (0,265 g, quantitativo).
[00917] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) delta: 0,88 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,39 (9H, s), 1,81-1,94 (1H, m), 2,07-2,28 (2H, m), 2,37 (1H, dd, J = 15,8, 8,0 Hz), 2,43 (3H, s), 2,60 (1H, dd, J = 15,8, 4,9 Hz), 2,75-2,82 (1H, m), 3,00 (1H, dd, J = 13,9, 4,5 Hz), 3,16-3,25 (2H, m), 3,50-3,61 (2H, m), 3,65-3,81 (5H, m), 4,40-4,51 (1H, m), 5,27 (2H, dd, J = 24,1, 19,0 Hz), 5,43 (2H, dd, J = 21,3, 16,2 Hz), 5,56-5,65 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,15-7,28 (5H, m), 7,33 (1H, s), 7,83 (1H, d, J = 11,0 Hz), 8,04 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,09 (1H, d, J = 8,2 Hz), 8,26-8,39 (2H, m), 8,44 (1H, d, J = 8,2 Hz). Processo 3: (5S,14S)-5-benzil-14-{[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol- 1 -il)hexanoil]amino}-1-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}- 1,4,7,10,13-pentaoxo-3,6,9,12-tetra-aza-hexadecan-16-oato de terc- Butila
[00918] A uma solução em N,N-dimetilformamida (2,00 mL) do composto (0,100 g, 0,108 mmol) obtido no Processo 2 acima, 6- maleimida hexanoato de N-succinimidila e (40,0 mg, 0,130 mmol) foi adicionado e agitado em temperatura ambiente durante 2 dias. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel [clorofórmio - clorofórmio : metanol = 9 : 1 (v/v)] para proporcionar o composto do título como um sólido amarelo claro (80,0 mg, 66%).
[00919] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) delta: 0,88 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,13-1,23 (2H, m), 1,37 (9H, s), 1,42-1,54 (4H, m), 1,80-1,96 (2H, m), 2,08-2,25 (4H, m), 2,35-3,76 (15H, m), 2,43 (3H, s), 4,39-4,49 (1H, m), 4,55-4,67 (1H, m), 5,21-5,34 (2H, m), 5,43 (2H, dd, J = 21,1, 16,4 Hz), 5,56-5,64 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,01 (2H, d, J = 0,8 Hz), 7,16-7,26 (5H, m), 7,33 (1H, s), 7,83 (1H, d, J = 11,3 Hz), 8,04-8,18 (3H, m), 8,30-8,37 (1H, m), 8,43 (1H, d, J = 8,6 Hz).
[00920] MS (ESI) m/z: 1118 (M+H)+. Processo 4: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-alfa- aspartilglicilglicil-L-fenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4- metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
[00921] Sob resfriamento com gelo, ácido trifluoroacético (4,00 mL) foi adicionada a o composto (70,0 mg, 62,6 μmoL) obtido no Processo 3 acima e agitada em temperatura ambiente durante 1 hora. O solvente foi removido sob pressão reduzida para proporcionar o composto do título como um sólido amarelo claro (55,0 mg, 83%).
[00922] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) delta: 0,88 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,14-1,24 (2H, m), 1,41-1,53 (4H, m), 1,79-1,95 (2H, m), 2,08-2,28 (4H, m), 2,37-2,60 (2H, m), 2,42 (3H, s), 2,63-2,82 (2H, m), 2,99 (1H, dd, J = 14,1, 5,1 Hz), 3,12-3,25 (2H, m), 3,29-3,44 (1H, m), 3,52-3,80 (6H, m), 4,38-4,48 (1H, m), 4,56 (1H, dd, J = 13,7, 7,4 Hz), 5,27 (2H, dd, J = 24,3, 18,8 Hz), 5,43 (2H, dd, J = 21,5, 16,4 Hz), 5,57-5,62 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,01 (2H, s), 7,15-7,26 (5H, m), 7,33 (1H, s), 7,82 (1H, d, J = 11,0 Hz), 7,98 (1H, brs), 8,08 (1H, d, J = 6,7 Hz), 8,15 (1H, d, J = 7,8 Hz), 8,34 (1H, brs), 8,44 (1H, d, J = 8,6 Hz), 12,26 (1H, brs).
[00923] MS (ESI) m/z: 1062 (M+H)+. Processo 5: Conjugado de anticorpo-fármaco (5)
[00924] Usando U1-59 produzido no Exemplo de Referência 1 e o composto obtido no Processo 4 acima, o conjugado de anticorpo- fármaco do título foi obtido da mesma maneira conforme no Processo 6 do Exemplo 1.
[00925] Concentração de anticorpo: 1,36 mg/mL, rendimento de anticorpo: 8,16 mg (82%) e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido por meio do Procedimento Comum E (como coeficiente de absorção molar do ligante de fármaco, ED,280 = 7620, ED,370 = 23700 foram usados): 5,0. Exemplo 6: Conjugado de anticorpo-fármaco (6) Química 37
Figure img0072
Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (6)
[00926] Usando U1-59 produzido no Exemplo de Referência 1 e o composto obtido no Processo 4 acima do Exemplo 5, o conjugado de anticorpo-fármaco do título foi obtido da mesma maneira conforme no Processo 6 do Exemplo 1.
[00927] Concentração de anticorpo: 11,5 mg/mL, rendimento de anticorpo: 224,2 mg (90%) e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido por meio do Procedimento Comum E (como coeficiente de absorção molar do ligante de fármaco, ED,280 = 7620, ED,370 = 23700 foram usados): 4,6. Exemplo 7. Conjugado de anticorpo-fármaco (7) Química 38
Figure img0073
Processo 1: (3S,12S)-12-benzil-21-{r(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4- metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-3-{[(9H- fluoren-9-il-metóxi)carbonil]amino}-4,7,10,13,16,21-hexaoxo- 5,8,11,14,17-penta-aza-henicosan-1-oato de terc-Butila
[00928] Ácido (2S)-4-terc-Butóxi-2-{[(9H-fluoren-9-il- metóxi)carbonil]amino}-4-oxobutanoico (0,625 g, 1,52 mmol) foi dissolvido em diclorometano (10,0 mL), carregado com N- hidroxissuccinimida (0,175 g, 1,52 mol) e cloridrato de 1-(3- dimetilaminopropil)-3-etilcarbodi-imida (0,291 g, 1,52 mmol) e agitado durante 1 hora. A solução de reação foi adicionada gota a gota a uma solução de N,N-dimetilformamida (10,0 mL) carregado com o composto (1,00 g, 1,01 mmol) obtido no Processo 4 acima do Exemplo 1 e agi- tada em temperatura ambiente durante 20 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel [clorofórmio - clorofórmio : metanol = 8 : 2 (v/v)] para proporcionar o composto do título como um sólido amarelo claro (0,873 g, 70%).
[00929] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) delta: 0,88 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,37 (9H, s), 1,68-1,78 (2H, m), 1,81-1,93 (2H, m), 2,10-2,23 (4H, m), 2,41 (3H, s), 2,68-2,85 (3H, m), 2,99-3,22 (5H, m), 3,58-3,81 (6H, m), 4,19-4,36 (3H, m), 4,38-4,52 (2H, m), 5,17 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,25 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,43 (2H, s), 5,54-5,62 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,157,34 (8H, m), 7,41 (2H, t, J=7,2 Hz), 7,66-7,75 (4H, m), 7,81 (1H, d, J=11,0 Hz), 7,88 (2H, d, J=7,4 Hz), 8,01-8,06 (1H, m), 8,14 (1H, d, J=8,2 Hz), 8,17-8,22 (1H, m), 8,25-8,30 (1H, m), 8,47 (1H, d, J=8,6 Hz).
[00930] MS (APCI) m/z: 1232 (M+H)+. Processo 2: (3S,12S)-12-benzil-3-{[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol- 1 -il)hexanoil]amino}-21-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}- 4,7,10,13,16,21-hexaoxo-5,8,11,14,17-penta-aza-henicosan-1-oato de terc-Butila
[00931] O composto (0,800 g, 0,649 mmol) obtido no Processo 1 acima foi dissolvido em N,N-dimetilformamida (3,00 mL), carregado com piperidina (0,643 mL, 6,49 mmol) e agitado durante 1 hora. O solvente foi removido até secagem sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram dissolvidos em N,N-dimetilformamida (10 mL). Após adição de 6-maleimida hexanoato de N-succinimidila (0,300 g, 0,974 mmol), ele foi agitado durante 20 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel [clorofórmio - clorofórmio : meta- nol = 8 : 2 (v/v)] para proporcionar o composto do título como um sólido amarelo claro (0,224 g, 29%).
[00932] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) delta: 0,87 (3H, t, J = 7,6 Hz), 1,15-1,22 (2H, m), 1,35 (9H, s), 1,44-1,47 (4H, m), 1,71-1,73 (2H, m), 1,80-1,91 (2H, m), 2,08 (2H, t, J = 7,6 Hz), 2,13-2,20 (4H, m), 2,40 (3H, s), 2,67 (1H, dt, J = 11,1, 4,8 Hz), 2,78 (1H, dd, J = 13,6, 9,4 Hz), 2,99-3,17 (6H, m), 3,31-3,36 (2H, m), 3,57-3,76 (6H, m), 4,45-4,47 (1H, m), 4,57-4,60 (1H, m), 5,16 (1H, d, J = 18,7 Hz), 5,25 (1H, d, J = 18,7 Hz), 5,42 (2H, s), 5,55-5,60 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,157,27 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,70 (1H, t, J = 5,4 Hz), 7,80 (1H, d, J = 10,9 Hz), 7,99 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,09-8,12 (3H, m), 8,25 (1H, t, J = 6,0 Hz), 8,45 (1H, d, J = 9,1 Hz).
[00933] MS (APCI) m/z: 1203 (M+H)+.
Processo 3: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-alfa- aspartilglicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4- metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4- oxobutil)glicinamida
[00934] O composto (0,224 g, 0,186 mmol) obtido no Processo 2 acima foi reagido da mesma maneira conforme no Processo 2 do Exemplo 1 para proporcionar o composto do título como um sólido amarelo claro (21,2 mg, 10%).
[00935] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) delta: 0,87 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,13-1,21 (2H, m), 1,42-1,45 (6H, m), 1,70-1,72 (2H, m), 1,85-1,88 (2H, m), 2,06-2,20 (6H, m), 2,39 (3H, s), 2,63-2,67 (1H, m), 2,78-2,81 (1H, m), 3,04-3,12 (6H, m), 3,63-3,70 (6H, m), 4,46-4,52 (2H, m), 5,16 (1H, d, J = 19,2 Hz), 5,25 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,55-5,58 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,18-7,23 (6H, m), 7,30 (1H, s), 7,71 (1H, t, J = 5,5 Hz), 7,79 (1H, d, J = 10,9 Hz), 7,99-8,02 (1H, m), 8,108,11 (3H, m), 8,27-8,30 (1H, m), 8,47-8,50 (1H, m). MS (APCI) m/z: 1147 (M+H)+.
Processo 4: Conjugado de anticorpo-fármaco (7)
[00936] Usando U1-59 produzido no Exemplo de Referência 1 e o composto obtido no Processo 3 acima, o conjugado de anticorpo- fármaco do título foi obtido da mesma maneira conforme no Processo 6 do Exemplo 1.
[00937] Concentração de anticorpo: 1,39 mg/mL, rendimento de anticorpo: 8,34 mg (83%) e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido por meio do Procedimento Comum E (como coeficiente de absorção molar do ligante de fármaco, ED,280 = 7670, ED,370 = 24800 foram usados): 4,7. Exemplo 8. Conjugado de anticorpo-fármaco (8) Química 39
Figure img0074
Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (8)
[00938] Usando U1-59 produzido no Exemplo de Referência 1 e o composto obtido no Processo 3 acima do Exemplo 7, o conjugado de anticorpo-fármaco do título foi obtido da mesma maneira conforme no Processo 6 do Exemplo 1.
[00939] Concentração de anticorpo: 11,2 mg/mL, rendimento de anticorpo: 228,5 mg (91%) e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido por meio do Procedimento Comum E (como coeficiente de absorção molar do ligante de fármaco, ED,280 = 7670, ED,370 = 24800 foram usados): 4,7. Exemplo 9. Conjugado de anticorpo-fármaco (9) Química 40
Figure img0075
Processo 1: N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)propanoil]amino}etóxi)etóxi]propanoil}glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4- {[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin- 1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
[00940] O composto (100 mg, 0,119 mmol) obtido no Processo 4 acima do Exemplo 1 foi reagido da mesma maneira conforme no Processo 5 do Exemplo 1 usando 3-(2-(2-(3- maleinimidapropanamida)etóxi)etóxi)propanoato de N-succinimidila (50,7 mg, 0,119 mmol) em vez de 6-maleimida hexanoato de N- succinimidila para proporcionar o composto do título como um sólido amarelo claro (66,5 mg, 48%).
[00941] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) delta: 0,85 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,65-1,74 (2H, m), 1,77-1,90 (2H, m), 2,07-2,19 (4H, m), 2,30 (2H, t, J = 7,2 Hz), 2,33-2,36 (2H, m), 2,38 (3H, s), 2,76 (1H, dd, J = 13,7, 9,8 Hz), 2,96-3,18 (9H, m), 3,42-3,44 (4H, m), 3,53-3,76 (10H, m), 4,43 (1H, td, J = 8,6, 4,7 Hz), 5,14 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,23 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,38 (1H, d, J = 17,2 Hz), 5,42 (1H, d, J = 17,2 Hz), 5,52-5,58 (1H, m), 6,52 (1H, s), 6,98 (2H, s), 7,12-7,17 (1H, m), 7,18-7,25 (4H, m), 7,29 (1H, s), 7,69 (1H, t, J = 5,5 Hz), 7,78 (1H, d, J = 11,3 Hz), 7,988,03 (2H, m), 8,11 (1H, d, J = 7,8 Hz), 8,16 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,23 (1H, t, J = 5,9 Hz), 8,44 (1H, d, J = 9,0 Hz).
[00942] MS (APCI) m/z: 1149 (M+H)+.
Processo 2: Conjugado de anticorpo-fármaco (9)
[00943] Usando U1-59 produzido no Exemplo de Referência 1 e o composto obtido no Processo 1 acima, o conjugado de anticorpo- fármaco do título foi obtido da mesma maneira conforme no Processo 6 do Exemplo 1.
[00944] Concentração de anticorpo: 2,08 mg/mL, rendimento de anticorpo: 18,7 mg (94%) e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido por meio do Procedimento Comum E (como coeficiente de absorção molar do ligante de fármaco, ED,280 = 4964, ED,370 = 18982 foram usados): 5,6. Exemplo 10. Conjugado de anticorpo-fármaco (10) Química 41
Figure img0076
Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (10)
[00945] Usando U1-59 produzido no Exemplo de Referência 1 e o composto obtido no Processo 1 acima do Exemplo 9, o conjugado de anticorpo-fármaco do título foi obtido da mesma maneira conforme no Processo 6 do Exemplo 1.
[00946] Concentração de anticorpo: 19,7 mg/mL, rendimento de anticorpo: 236,4 mg (95%) e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido por meio do Procedimento Comum E (como coeficiente de absorção molar do ligante de fármaco, ED,280 = 4964, ED,370 = 18982 foram usados): 6,2; e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido por meio do Procedimento Comum F (como coeficiente de absorção molar do ligante de fármaco, ED,280 = 4964 foram usados): 6,4. Exemplo 11. Conjugado de anticorpo-fármaco (11) Química 42
Figure img0077
Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (11)
[00947] Usando U1-59 produzido no Exemplo de Referência 1 e o composto obtido no Processo 1 acima do Exemplo 9, o conjugado de anticorpo-fármaco do título foi obtido da mesma maneira conforme no Processo 1 do Exemplo 4.
[00948] Concentração de anticorpo: 0,88 mg/mL, rendimento de anticorpo: 5,28 mg (53%) e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido por meio do Procedimento Comum E (como coeficiente de absorção molar do ligante de fármaco, ED,280 = 4964, ED,370 = 18982 foram usados): 3,0; e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido por meio do Procedimento Comum F (como coeficiente de absorção molar do ligante de fármaco, ED,280 = 4964 foram usados): 3,3. Exemplo 12. Conjugado de anticorpo-fármaco (12) Química 43
Figure img0078
Processo 1 acetato de({N-[(9H-fluoren-9-il- metóxi)carbonil]glicil}amino)metila
[00949] A uma mistura contendo N-9- fluorenilmetoxicarbonilglicilglicina (4,33 g, 12,2 mmol), tetra- hidrofurano (120 ml) e tolueno (40,0 ml), piridina (1,16 mL, 14,7 mmol) e tetra-acetato de chumbo (6,84 g, 14,7 mmol) foram adicionados e submetidos a refluxo sob aquecimento durante 5 horas. Após a solução de reação ser esfriada para a temperatura ambiente, o material insolúvel foi removido por meio de filtração através de Celite e o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. Os resíduos obtidos foram dissolvidos em acetato de etila, lavados com água e salmoura saturada e, então, a camada orgânica foi seca sobre sulfato de magnésio anidro. Após o solvente ser removido sob pressão reduzida, os resíduos obtidos foram purificados por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel [hexano : acetato de etila = 9 : 1 (v/v) - acetato de etila] para proporcionar o composto do título como um sólido incolor (3,00 g, 67%).
[00950] 1H-RMN (400 MHz, CDCl3) delta: 2,07 (3H, s), 3,90 (2H, d, J = 5,1 Hz), 4,23 (1H, t, J = 7,0 Hz), 4,46 (2H, d, J = 6,6 Hz), 5,26 (2H, d, J = 7,0 Hz), 5,32 (1H, brs), 6,96 (1H, brs), 7,32 (2H, t, J = 7,3 Hz), 7,41 (2H, t, J = 7,3 Hz), 7,59 (2H, d, J = 7,3 Hz), 7,77 (2H, d, J = 7,3 Hz). Processo 2: [({N-[(9H-fluoren-9-il-metóxi)carbonil]glicil}amino)metóxi]- acetato de benzila
[00951] A uma solução em tetra-hidrofurano (40,0 mL) do composto (3,68 g, 10,0 mmol) obtido no Processo 1 acima e glicolato de benzila (4,99 g, 30,0 mmol), terc-butóxido de potássio (2,24 g, 20,0 mmol) foi adicionado a 0 °C e agitada em temperatura ambiente durante 15 minutos. A solução de reação foi carregada com acetato de etila e água a 0 °C e extraída com acetato de etila e clorofórmio. A camada orgânica obtida foi seca sobre sulfato de sódio e filtrado. O solvente foi re- movido sob pressão reduzida. Os resíduos obtidos foram dissolvidos em dioxano (40,0 mL) e água (10,0 mL), carregado com hidrogeno carboneto de sódio (1,01 g, 12,0 mmol) e cloroformato de 9- fluorenilmetila (2,59 g, 10,0 mmol) e agitada em temperatura ambiente durante 2 horas. A solução de reação foi carregado com água e extraída com acetato de etila. A camada orgânica obtida foi seca sobre sulfato de sódio e filtrado. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel [hexano : acetato de etila = 100 : 0 (v/v) - 0 : 100] para proporcionar o composto do título como uma substância oleosa incolor (1,88 g, 40%).
[00952] 1H-RMN (400 MHz, CDCl3) delta: 3,84 (2H, d, J = 5,5 Hz), 4,24 (3H, t, J = 6,5 Hz), 4,49 (2H, d, J = 6,7 Hz), 4,88 (2H, d, J = 6,7 Hz), 5,15-5,27 (1H, m), 5,19 (2H, s), 6,74 (1H, brs), 7,31-7,39 (7H, m), 7,43 (2H, t, J = 7,4 Hz), 7,61 (2H, d, J = 7,4 Hz), 7,79 (2H, d, J = 7,4 Hz). Processo 3: ácido [({N-[(9H-fluoren-9-il-metóxi)carbonil]glicil}amino)- metóxi]acético
[00953] O composto (1,88 g, 3,96 mmol) obtido no Processo 2 acima foi dissolvido em etanol (40,0 mL) e acetato de etila (20,0 mL). Após adição de catalisador de paládio sobre carbono (376 mg), ele foi agitada em temperatura ambiente sob uma atmosfera de hidrogênio durante 2 horas. O material insolúvel foi removido por meio de filtração através de Celite e o solvente de o filtrado foi removido sob pressão reduzida para proporcionar o composto do título como um sólido incolor (1,52 g, quantitativo).
[00954] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) delta: 3,62 (2H, d, J = 6,3 Hz), 3,97 (2H, s), 4,18-4,32 (3H, m), 4,60 (2H, d, J = 6,7 Hz), 7,29-7,46 (4H, m), 7,58 (1H, t, J = 5,9 Hz), 7,72 (2H, d, J = 7,4 Hz), 7,90 (2H, d, J = 7,4 Hz), 8,71 (1H, t, J = 6,5 Hz). Processo 4: (2-{[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetóxi)metil]amino}-2-oxoetil)carbamato de 9H-Fluoren-9-ilmetila
[00955] Sob resfriamento com gelo, a uma solução em N,N- dimetilformamida (10,0 mL) de mesilato de exatecano (0,283 g, 0,533 mmol), N-hidroxissuccinimida (61,4 mg, 0,533 mmol) e o composto (0,205 g, 0,533 mmol) obtido no Processo 3 acima, N,N-di- isopropiletilamina (92,9 μL, 0,533 mmol) e N,N'-diciclo-hexilcarbodi- imida (0,143 g, 0,693 mmol) foram adicionados e agitados em temperatura ambiente durante 3 dias. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por meio de cromato- grafia em coluna de sílica-gel [clorofórmio - camada orgânica dividida de clorofórmio : metanol : água = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para proporcionar o composto do título como um sólido marrom claro (0,352 g, 82%).
[00956] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) delta: 0,81 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,73-1,87 (2H, m), 2,06-2,20 (2H, m), 2,34 (3H, s), 3,01-3,23 (2H, m), 3,58 (2H, d, J = 6,7 Hz), 3,98 (2H, s), 4,13-4,25 (3H, m), 4,60 (2H, d, J = 6,7 Hz), 5,09-5,22 (2H, m), 5,32-5,42 (2H, m), 5,50-5,59 (1H, m), 6,49 (1H, s), 7,24-7,30 (3H, m), 7,36 (2H, t, J = 7,4 Hz), 7,53 (1H, t, J = 6,3 Hz), 7,66 (2H, d, J = 7,4 Hz), 7,75 (1H, d, J = 11,0 Hz), 7,84 (2H, d, J = 7,4 Hz), 8,47 (1H, d, J = 8,6 Hz), 8,77 (1H, t, J = 6,7 Hz).
[00957] MS (ESI) m/z: 802 (M+H)+. Processo 5: N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetóxi)metil]glicinamida
[00958] A uma solução de N,N-dimetilformamida (11,0 mL) do composto (0,881 g, 1,10 mmol) obtido no Processo 4 acima, piperidina (1,1 mL) foi adicionada e agitada em temperatura ambiente durante 2 ho- ras. O solvente foi removido sob pressão reduzida para proporcionar uma mistura contendo o composto do título. A mistura foi usada para a próxima reação sem outra purificação.
Processo 6: N-[(9H-fluoren-9-il-metóxi)carbonil]glicilglicil-L-fenilalanil- N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetóxi)metil]glicinamida
[00959] Sob resfriamento com gelo, a uma solução em N,N- dimetilformamida (50,0 mL) da mistura (0,439 mmol) obtido no Processo 5 acima, N-hidroxissuccinimida (0,101 g, 0,878 mmol) e N-[(9H- fluoren-9-il-metóxi)carbonil]glicilglicil-L-fenilalanina (o composto descrito na Patente Japonesa Depositada Em-Aberto N° 2002-60351; 0,440 g, 0,878 mmol), N,N'-diciclo-hexilcarbodi-imida (0,181 g, 0,878 mmol) foi adicionada e agitada em temperatura ambiente durante 4 dias. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por meio de cromatografia em coluna de sílica- gel [clorofórmio - clorofórmio : metanol = 9 : 1 (v/v)] para proporcionar o composto do título como um sólido laranja claro (0,269 g, 58%).
[00960] MS (ESI) m/z: 1063 (M+H)+. Processo 7: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetóxi)metil]glicinamida
[00961] A uma solução de N,N-dimetilformamida (4,00 mL) do composto (0,269 g, 0,253 mmol) obtido no Processo 6 acima, piperidina (0,251 mL, 2,53 mmol) foi adicionada e agitada em temperatura ambiente durante 2 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida para proporcionar uma mistura contendo o composto do título. A mistura foi usada para a próxima reação sem outra purificação.
Processo 8 N-[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetóxi)metil]glicinamida
[00962] A uma solução em N,N-dimetilformamida (10,0 mL) do composto (0,253 mmol) obtido no Processo 7 acima, 6-maleimida he- xanoato de N-succinimidila (0,156 g, 0,506 mmol) foi adicionado e agitado em temperatura ambiente durante 3 dias. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por meio de cromatografia em coluna de sílica-gel [clorofórmio - clorofórmio : metanol = 9 : 1 (v/v)] para proporcionar o composto do título como um sólido amarelo claro (0,100 g, 38%).
[00963] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) delta: 0,83 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,09-1,21 (2H, m), 1,33-1,47 (4H, m), 1,75-1,90 (2H, m), 2,00-2,23 (4H, m), 2,36 (3H, s), 2,69-2,81 (1H, m), 2,94-3,03 (1H, m), 3,06-3,22 (2H, m), 3,23-3,74 (6H, m), 3,98 (2H, s), 4,39-4,50 (1H, m), 4,60 (2H, d, J = 6,7 Hz), 5,17 (2H, s), 5,39 (2H, s), 5,53-5,61 (1H, m), 6,50 (1H, s), 6,96 (2H, s), 7,11-7,24 (5H, m), 7,28 (1H, s), 7,75 (1H, d, J = 11,0 Hz), 7,97 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,03 (1H, t, J = 5,9 Hz), 8,09 (1H, d, J = 7,8 Hz), 8,27 (1H, t, J = 6,5 Hz), 8,48 (1H, d, J = 9,0 Hz), 8,60 (1H, t, J = 6,5 Hz).
[00964] MS (ESI) m/z: 1034 (M+H)+.
Processo 9: Conjugado de anticorpo-fármaco (12)
[00965] Usando U1-59 produzido no Exemplo de Referência 1 e o composto obtido no Processo 8 acima, o conjugado de anticorpo- fármaco do título foi obtido da mesma maneira conforme no Processo 6 do Exemplo 1.
[00966] Concentração de anticorpo: 2,11 mg/mL, rendimento de anticorpo: 19,0 mg (95%) e número médio de moléculas de fármaco con- jugadas (n) por molécula de anticorpo medido por meio do Procedimento Comum E (como coeficiente de absorção molar do ligante de fármaco, ED,280 = 5178, ED,370 = 20217 foram usados): 4,9. Exemplo 13. Conjugado de anticorpo-fármaco (13) Química 44
Figure img0079
Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (13)
[00967] Usando U1-59 produzido no Exemplo de Referência 1 e o composto obtido no Processo 8 acima do Exemplo 12, o conjugado de anticorpo-fármaco do título foi obtido da mesma maneira conforme no Processo 6 do Exemplo 1.
[00968] Concentração de anticorpo: 22,2 mg/mL, rendimento de anticorpo: 244,2 mg (98%) e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido por meio do Procedimento Comum E (como coeficiente de absorção molar do ligante de fármaco, ED,280 = 5178, ED,370 = 20217 foram usados): 6,2; e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido por meio do Procedimento Comum F (como coeficiente de absorção molar do ligante de fármaco, ED,280 = 5178 foram usados): 7,0. Exemplo 14. Conjugado de anticorpo-fármaco (14) Química 45
Figure img0080
Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (14)
[00969] Redução do anticorpo: U1-59 produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter uma concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio por PBS6.0/EDTA usando o Procedimento Comum B e o Procedimento Comum C descrito no Método de Produção 1. A solução (1,00 mL) foi adicionada a um tubo de polipropileno de 2,0 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltda.) (0,0160 mL; 2,4 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa a 1 M de hidrogeno fosfato de dipotássio (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0150 mL). Após confirmar que a solução apresenta um pH de 7,0 +/- 0,1, a ligação de dissulfure- to na parte de dobradiça no anticorpo foi reduzida por meio de incubação a 37 °C durante 1 hora.
[00970] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Após incubação da solução em um banho de água a 15oC durante 10 minutos, sulfóxido de dimetila (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,0209 mL) e uma solução de sulfóxido de dimetila (0,0315 mL; 5,0 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 10 mM do composto obtido no Processo 8 acima do Exemplo 12 foi adicionada ao mesmo e incubada em um banho de água a 15oC durante 60 minutos para conjugação do ligante de fármaco ao anticorpo. Em seguida, uma solução aquosa (0,0050 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada ao mesmo e agitada usando um rotator tubular (MTR-103, fabricado pela AS ONE Corporation) em temperatura ambiente durante mais 20 minutos para terminar a reação do ligante de fármaco.
[00971] De acordo com os mesmos processos de purificação e ca-racterização físico-química conforme o Processo 6 do Exemplo 1, os valores característicos a seguir foram obtidos.
[00972] Concentração de anticorpo: 1,46 mg/mL, rendimento de anticorpo: 8,76 mg (88%) e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido por meio do Procedimento Comum E (como coeficiente de absorção molar do ligante de fármaco, ED,280 = 5178, ED,370 = 20217 foram usados): 2,5; e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido por meio do Procedimento Comum F (como coeficiente de absorção molar do ligante de fármaco, ED,280 = 5178 foram usados): 2,9. Exemplo 15. Conjugado de anticorpo-fármaco (15) Química 46
Figure img0081
Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (15)
[00973] Redução do anticorpo: U1-59 produzido no Exemplo de Re- ferência 1 foi preparado para ter uma concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio por PBS6.0/EDTA usando o Procedimento Comum B e o Procedimento Comum C descrito no Método de Produção 1. A solução (100 mL) foi adicionada a um frasco de Erlenmeyer de policarbonato de 250 mL e carregado com uma solução aquosa a 1 M de hidrogeno fosfato de dipotássio (1,70 mL) e, então, uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (4,010 mL; 6,0 equivalentes por molécula de anticorpo) em temperatura ambiente com agitação usando um agitador magnético. Após confirmar que a solução apresenta um pH de 7,0 +/- 0,1, a agitação foi cessada e a ligação de dissulfureto na parte de dobradiça no anticorpo foi reduzida por meio de incubação a 37 °C durante 1 hora.
[00974] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Após resfriar a solução acima para 15 °C, uma solução de DMSO (6,684 mL; 10,0 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 10 mM do composto obtido no Processo 8 acima do Exemplo 12 foi gradualmente adicionada ao mesmo com agitação. A mistura foi agitada a 15 °C durante os primeiros 30 minutos e, após interromper a agitação, incubada durante mais 1 hora para conjugação do ligante de fármaco ao anticorpo. Em seguida, uma solução aquosa (0,862 mL; 12,9 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM foi adicionada ao mesmo com agitação e incubada em temperatura ambiente durante 20 minutos para terminar a reação do ligante de fármaco não reagido.
[00975] Purificação: Uma solução de ácido acético a 20% (cerca de0,6 mL) e ABS (100 mL) foi gradualmente adicionada à solução com agitação para ajustar o pH da solução para 5,5 +/- 0,1. Esta solução foi submetida à microfiltração (filtro Millex-HV da Millipore Corp., 0,45 μm, Membrana de PVDF) para remover a matéria esbranquiçada. Esta solução foi submetida à purificação por ultrafiltração usando um aparelho de ultrafiltração constituído por uma membrana de ultrafiltração (Merck Japan, Ltda., Pellicon XL Cassette, Biomax 50 KDa), uma bomba de tubo (Cole-Parmer International, USA, MasterFlex modelo de bomba 77521-40, modelo da cabeça de bomba 7518-00) e um tubo (Cole- Parmer International, USA, MasterFlex Tube L/S16). Especificamente, mediante adição de ABS gota a gota (um total de 1600 mL) como uma solução tampão para purificação à solução de reação enquanto se realizava purificação por ultrafiltração, ligantes de fármaco não conjugados e outros reagentes de baixo peso molecular foram removidos enquanto a solução tampão era substituída por ABS e a solução foi adicionalmente concentrada. A solução purificada obtida foi submetida à microfiltração (0,22 μm (Millipore Corp. Millex-GV filter, Membrana de PVDF) para proporcionar 37,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco do título.
[00976] Concentração de anticorpo: 26,5 mg/mL, rendimento de anticorpo: 993,0 mg (90%), número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido por meio do Procedimento Comum E (como coeficiente de absorção molar do ligante de fármaco, ED,280 = 5178 e ED,370 = 20217 foram usados): 6,3 e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido por meio do Procedimento Comum F (como coeficiente de absorção molar do ligante de fármaco, ED,280 = 5178 foi usado): 7,3. Exemplo 16a. Conjugado de anticorpo-fármaco (16a) Química 47
Figure img0082
Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (16a)
[00977] Redução do anticorpo: U1-59 produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter uma concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio por PBS6.0/EDTA usando o Procedimento Comum B e o Procedimento Comum C descrito no Método de Produção 1. A solução (15 mL) foi adicionada a um recipiente de tereftalato de polietileno de 50 mL e carregado com uma solução aquosa a 1 M de hidrogeno fosfato de dipotássio (0,255 mL) e, então, uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (0,601 mL; 6,0 equivalentes por molécula de anticorpo) em temperatura ambiente com agitação usando um agitador magnético. Após confirmar que a solução apresenta um pH de 7,0 +/- 0,1, a ligação de dissulfureto na parte de dobradiça no anticorpo foi reduzida por meio de incubação a 37 °C durante 2 horas.
[00978] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Após resfriar a solução acima para 15 °C, uma solução de DMSO (1,002 mL; 10,0 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 10 mM do composto obtido no Processo 8 acima do Exemplo 12 foi gradualmente adicionada ao mesmo com agitação. A mistura foi agitada a 15 °C durante 30 minutos para conjugação do ligante de fármaco ao anticorpo. Em seguida, uma solução aquosa (0,129 mL; 12,9 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM foi adicionada ao mesmo com agitação e incubada em temperatura ambiente durante 20 minutos para terminar a reação do ligante de fármaco não reagido. De acordo com os mesmos processos de purificação e caracterização físico-química conforme o Processo 6 do Exemplo 1, os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00979] Concentração de anticorpo: 2,36 mg/mL, rendimento de anticorpo: 140 mg (59,5 mL) (94%), número médio de moléculas de fár- maco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido por meio do Procedimento Comum E (como coeficiente de absorção molar do li- gante de fármaco, ED,280 = 5178 e ED,370 = 20217 foram usados): 6,4 e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido por meio do Procedimento Comum F (como coeficiente de absorção molar do ligante de fármaco, ED,280 = 5178 foi usado): 7,7. Exemplo 16b. Conjugado de anticorpo-fármaco (16b) Química 48
Figure img0083
[00980] Redução do anticorpo: U1-59 produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter uma concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio por PBS6.0/EDTA usando o Procedimento Comum B e o Procedimento Comum C descrito no Método de Produção 1. A solução (900 mL) foi adicionada a um frasco de Erlenmeyer de 2000 mL e carregado com uma solução aquosa a 1 M de hidrogeno fosfato de dipotássio (15,3 mL) e, então, uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (36,1 mL; 6,0 equivalentes por molécula de anticorpo) em temperatura ambiente com agitação usando um agitador magnético. Após confirmar que a solução apresenta um pH de 7,0 +/- 0,1, a agitação foi cessada e a ligação de dissulfureto na parte de dobradiça no anticorpo foi reduzida por meio de incubação a 37 °C durante 2 ho- ras.
[00981] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Após resfriar a solução acima para 15 °C, uma solução de DMSO (60,16 mL; 10,0 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 10 mM do composto obtido a partir do Processo 8 do Exemplo 12 foi gradualmente adicionada ao mesmo com agitação. A mistura foi agitada a 15 °C durante 30 minutos para conjugação do ligante de fármaco ao anticorpo. Em seguida, uma solução aquosa (7,76 mL; 12,9 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM foi adicionada ao mesmo com agitação e incubada em temperatura ambiente durante 20 minutos para terminar a reação do ligante de fármaco não reagido.
[00982] Purificação: Uma solução de ácido acético a 20% (cerca de5 mL) e ABS (1000 mL) foi gradualmente adicionada à solução com agitação para ajustar o pH da solução para 5,5 +/- 0,1. Esta solução foi submetida à microfiltração (Millipore Corp. Stericup, 0,45 μm, Membrana de PVDF) para remover a matéria esbranquiçada. Esta solução foi submetida à purificação por ultrafiltração usando um aparelho de ultrafiltração constituído por uma membrana de ultrafiltração (Merck Japan, Ltda., Pellicon 2 Mini Cassette, Ultracel 30 KDa, 0,1 m2), uma bomba de tubo (Cole-Parmer International, USA, MasterFlex modelo de bomba 7528-20, modelo da cabeça de bomba 77800-62) e um tubo (Cole-Parmer International, USA, MasterFlex Tubes L/S24 e 25). Especificamente, mediante adição de ABS gota a gota (um total de 16 L) como uma solução tampão para purificação à solução de reação enquanto se realizava purificação por ultrafiltração, ligantes de fármaco não conjugados e outros reagentes de baixo peso molecular foram removidos enquanto a solução tampão era substituída por ABS e a solução foi adicionalmente concentrada para proporcionar cerca de500 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco do título.
[00983] Concentração de anticorpo: 19,66 mg/mL, rendimento de anticorpo: 9830 mg (109%) e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido por meio do Proce-dimento Comum E (como coeficiente de absorção molar do ligante de fármaco, ED,280 = 5178 e ED,370 = 20217 foram usados): 6,5. Exemplo 16c. Conjugado de anticorpo-fármaco (16c) Química 49
Figure img0084
[00984] Usando U1-59 produzido no Exemplo de Referência 1 e o composto obtido no Processo 8 acima do Exemplo 12, o conjugado de anticorpo-fármaco do título foi obtido da mesma maneira as Exemplo 16b.
[00985] Concentração de anticorpo: 16,21 mg/mL, rendimento de anticorpo: 9726 mg (600 mL, 108%) e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido por meio do Procedimento Comum E (como coeficiente de absorção molar do li- gante de fármaco, ED,280 = 5178 e ED,370 = 20217 foram usados): 6,5. Exemplo 16d. Conjugado de anticorpo-fármaco (16d) Química 50
Figure img0085
[00986] Os conjugados de anticorpo-fármaco (16a), (16b) e (16c) produzidos nos Exemplos 16a, 16b e 16c, respectivamente, foram mis-turados (um total de cerca de18 g) e ainda submetidos à ultrafiltração da mesma maneira conforme no Exemplo 16b (11 L de ABS foram usados). A solução purificada obtida foi submetida à microfiltração (Millipore Corp. Stericup, 0,45 um e 0,22 μm, Membrana de PVDF) para proporcionar 745 mL de uma solução contendo o conjugado de an- ticorpo-fármaco do título. By ainda adição de 110 mL de ABS, 855 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco do título foi obtido.
[00987] Concentração de anticorpo: 20,0 mg/mL, rendimento de anticorpo: 17,1 g (94%), número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido por meio do Procedimento Comum E (como coeficiente de absorção molar do ligante de fármaco, ED,280 = 5178 e ED,370 = 20217 foram usados): 6,5 e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido por meio do Procedimento Comum F (como coeficiente de absorção molar do ligante de fármaco, ED,280 = 5178 foi usado): 7,8. Exemplo de Teste 1. Afinidade de ligação HER3 de conjugado de anti-corpo-fármaco comparado com U1-59 Método:
[00988] Uma linhagem de células de câncer de mama humano HCC1569 (CRL-2330) da ATCC foi cultivada em um meio RPMI1640 (adquirido da Invitrogen Corp., que contém 10% de albumina sérica bovina (produzida pela Invitrogen Corporation) e L-glutamina a 2 mM (fabricada pela Invitrogen Corp.)). As células foram dissociadas da placa de cultura usando ACCUTASE(R) SOLUTION (Millipore Corp., SCR005) ou EDTA (5 mM, solução salina tamponada com fosfato (PBS, cloreto de sódio a 137 mM, cloreto de potássio a 2,7 mM, di- hidrogenofosfato de potássio a 1,47 mM e hidrogenofosfato dissódico a 10,5 mM)) e o número de células vivas foi medido por meio de tratamento com azul de tripano. Os mesmos números de células suspensas em tampão para seleção de células ativada por fluorescência (Fluorescence Activated Cell Sorting - FACS) (PBS contendo FBS a 3% e azida de sódio a 0,004%) foram inoculados em placas com 96 cavidades de fundo em U e as células foram precipitadas por centrifugação e suspensas em 100 μL de uma diluição de anticorpo ou conjugado de anticorpo-fármaco esfriada com gelo ou tampão de FACS. O anticorpo ou cada conjugado de anticorpo-fármaco foi diluído em série em uma proporção de 03/01, com um tampão de FACS e ajustado para 30 μg/ml a 5 ng/mL (200 nM a 0,03 nM). As células tratadas com um tampão de FACS sem a adição de um anticorpo primário foram usadas como um grupo de controle.
[00989] U1-59, o conjugado de anticorpo-fármaco (3), o conjugado de anticorpo-fármaco (10) ou o conjugado de anticorpo-fármaco (13) foi avaliado como o anticorpo ou conjugados de anticorpo-fármaco.
[00990] As células de cada grupo foram reagidas com uma diluição de anticorpo primário durante 45 minutos sobre gelo e depois lavadas com um tampão de FACS. Além disso, 100 μL de um tampão de FACS ou uma solução de reação de um anticorpo secundário diluída a 1/100 (anticorpo anti-humano acoplado à ficoeritrina (PE), Dianova #709- 116-149 GmbH) foi adicionada aos mesmos. As células foram tratadas durante 45 minutos sobre gelo no escuro e depois lavadas com um tampão de FACS e as células mortas foram excluídas usando um tampão de FACS ou um tampão de FACS suplementado com 7- aminoactinomicina D (7AAD, Sigma-Aldrich Co. LLC, #A9400, 1,1 μg/mL). Os sinais de fluorescência das células vivas foram avaliados usando o Citômetro de fluxo Accuri C6 (BD Biosciences/Accuri (R) Cytometers Inc., número de série 1424) e o software CFlow (CFlow Sampler Version 1.0.264.13).
[00991] Para a correção de sinais derivados de PE- e 7-AAD-, os sinais de fluorescência de U1-59 (30 μg/ml) e das células marcadas com o anticorpo secundário marcado com PE ou 7-AAD foram avaliados.
[00992] De modo a quantificar os sinais de fluorescência específica para U1-59 nas células, os valores obtidos pela subtração dos sinais de FL-2 de células tratadas com o anticorpo secundário apenas ou 7- AAD foram usados. A afinidade de ligação em equilíbrio (KD) e a força de ligação máxima (Bmax) foram calculados usando o software GraphPad Prism (Versão 5.04 para Windows(R) (ligação específica em um sítio)).
[00993] Os resultados são mostrados na Figura 3 e na Tabela 1. A Figura 3 e a Tabela 1 mostram a intensidade de fluorescência média de HCC1569 tratadas com diluições em série de U1-59 ou cada conjugado de anticorpo-fármaco. A afinidade de ligação em equilíbrio KD e a força máxima de ligação Bmax foram calculadas usando o software GraphPad Prism. Tabela 1
Figure img0086
[00994] O conjugado de anticorpo-fármaco (3) ou o conjugado de anticorpo-fármaco (10) exibiu uma afinidade de ligação média KD pelas células HCC-1569 equivalente à KD do anticorpo anti-HER3 U1-59 não conjugado. O conjugado de anticorpo-fármaco (13) também exibiu uma afinidade de ligação média KD equivalente à KD do anticorpo an- ti-HER3 U1-59 não conjugado (2,7 nM vs. 1,6 nM). Os valores de KD dos diferentes conjugados de anticorpo-fármaco sugeriram que os processos de conjugação de anticorpo-fármaco não afetam significativamente a afinidade de ligação do U1-59.
Exemplo de Teste 2. Inibição de sinal de HER3 por conjugados de anticorpo-fármaco anti-HER3 Método:
[00995] Uma linhagem de células de câncer de pulmão humano A549 (SIR-300114) do Cell Lines Service foi dissociada por meio de tratamento com tripsina e 50.000 células vivas foram inoculadas com 3 ml de DMEM/F12 (Invitrogen Corp, #21331-020) + FBS a 10% ( Invi- trogen Corp., #10270-106) em cada uma de 6 cavidades. Após cultura das células durante 3 dias, o meio foi substituído por 2 ml de um meio fresco.
[00996] O anticorpo ou cada conjugado de anticorpo-fármaco foi adicionado diretamente a 2 ml de um meio em cada uma de 6 cavidades, de modo que a concentração final fosse de 10 μg/mL (20 μL de uma solução de estoque de anticorpo ou conjugado de anticorpo- fármaco a 1 μg/μL foram adicionados).
[00997] U1-59, o conjugado de anticorpo-fármaco (3), o conjugado de anticorpo-fármaco (10) ou o conjugado de anticorpo-fármaco (13) foi usado como o anticorpo ou o conjugado de anticorpo-fármaco. Um grupo não tratado foi usado como um controle.
[00998] As células foram cultivadas durante 2 dias, lavadas uma vez com PBS e tratadas com 100 μL de um tampão gelado (ácido 4-(2- hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfônico (HEPES) a 50 mM, pH de 7,5, cloreto de sódio a 150 mM, ácido etileno diamina tetra acético (EDTA) a 1 mM, glicerina a 12,5%, Triton X-100 a 1% e pirofosfato de sódio tetrabásico a 10 mM de suplementado com inibidores de protease (Roche Diagnostics, Inc., #11697 498 001), fluoreto de sódio a 10 mM, vanadato de sódio a 1 mM, fluoreto de fenil-metano-sulfonila (PMSF) a 1 mM e 10 μg/ml de aprotinina (Sigma-Aldrich Co. LLC, A1153)) durante 30 minutos a 4 °C durante lise. O lisato foi lavado durante 20 minutos a 13000 rpm a 4 °C e o sobrenadante foi usado na medição da concentração de proteína pelo ensaio de Bradford (Sigma-Aldrich Co. LLC, #B6916, padrão de BSA era da Thermo Fisher Scientific Inc., #23209). Para cada amostra (quantidade de proteínas: 120 μg), uma concentração quatro vezes de um tampão LDS (Invitrogen Corp., contendo DTT (concentração final: 166,67 mM)) foi adicionada e seu volume foi finalmente ajustado para 40 μL com água. A amostra foi fervida durante 10 minutos a 70 °C e adicionada a cavidades de gel BisTris Mini NuPage (4% - 12%, 1,5 mm de espessura, 10 ranhuras/gel, Invitrogen Corp.). Como padrões de proteína, 7,5 μL de Sharp Ladder Novex(R) (Invitrogen Corp., P/N 57318) foram adicionados. A amostra foi submetida à eletroforese durante 70 minutos a 175 V, com 1 x tampão contínuo de MOPS (Invitrogen Corp.) contendo antioxidante NuPage (Invitrogen Corp., NP0005, Lote 1356629; adicionado à câmara interna). As proteínas separadas por eletroforese em gel foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose (GE Healthcare Life Sciences) tendo um tamanho de poro de 0,45 μm usando tampão de transferência NuPage (Invitrogen Corp.) contendo metanol a 10% e antioxidante NuPage (Invitrogen Corp., NP0005, Lote 1356629, diluição de 1:1000). As proteínas foram transferidas durante 80 minutos em um volume constante de 30 V.
[00999] A membrana de transferência foi cortada, separada em frações de 100 kDa ou maior e 30 a 100 kDa, lavadas duas vezes com PBS contendo Tween-20 a 0,1% e bloqueadas por meio de agitação durante 1 hora em temperatura ambiente, usando Odyssey Blocking Solution (LI-COR, Inc., #927-40000). A membrana de transferência assim bloqueada foi tratada durante a noite a 4 °C com uma solução de um anticorpo primário diluído (mistura de Odyssey Blocking Solution e PBS em quantidades iguais).
[001000] Um anticorpo anti-HER3 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., SC-81455, diluição de 1:500) e um anticorpo anti-HER fosforilado (Cell Signaling Technology, Inc., #4791, 1: 1000) foram usados como o anti-corpo primário e um anticorpo antiactina (Neomarkers, #MS1295, diluição de 1:3333) foi usado como um controle de eletroforese.
[001001] A membrana de transferência foi lavada três vezes (5 minutos para cada) com PBS contendo Tween-20 a 0,1% e reagida com uma diluição que contém um anticorpo secundário (mistura de Odyssey Blocking Solution e PBS em quantidades iguais) durante 1 hora em temperatura ambiente em uma sala escura.
[001002] Anticorpo de cabra anticamundongo IRDye 680RD (LICOR, Inc., #926-68070, diluição de 1:25.000) ou anticorpo de cabra anticoelho IR Dye 800CW (LI-COR, Inc., #926-32211, diluição de 1:10000) foi usado como o anticorpo secundário. A membrana de transferência foi lavada três vezes (6 minutos para cada) com PBS contendo Tween-20 a 0,1%, seguido de detecção do sinal usando o Odyssey Infrared Imager (LI-COR, Inc.).
[001003] Os resultados são mostrados na Figura 4. As células A549 foram cultivadas durante 2 dias com U1-59 ou diferentes conjugados de anticorpo-fármaco. HER3 ou HER3 fosforilado foi avaliado por Western blotting. Pan-actina foi detectada como um controle de eletroforese.
[001004] Como um resultado de cultura de A549 durante 2 dias com 10 μg/mL de U1-59 ou conjugado de anticorpo-fármaco, a fosforilação de HER3 foi reduzida comparado com células não tratadas. Esta redução na fosforilação de HER3 foi equivalente entre U1-59 e o conjugado de anticorpo-fármaco, sugerindo que uma pluralidade de processos de conjugação de fármaco não prejudicou a função de inibição de um sinal de HER3 derivado de U1-59.
[001005] Quando as células A549 foram tratadas com U1-59 ou cada conjugado de anticorpo-fármaco durante 2 dias, uma redução na ex-pressão de HER3 também foi observada comparado com as células não tratadas. O grau desta redução na expressão foi equivalente entre U1-59 e o conjugado de anticorpo-fármaco. Isto sugere que uma pluralidade de processos de conjugação de fármaco não prejudicou a inter- nalização mediada por U1-59 (vide Exemplo de Teste sobre a interna- lização) e a regulação negativa de HER induzida por U1-59 (vide Exemplo de Teste em relação à inibição de sinal).
Exemplo de Teste 3. Redução na expressão de HER3 sobre a superfície celular por U1-59 e um conjugado de anticorpo-fármaco Método:
[001006] Internalização de HER3 por U1-59 e cada conjugado de anticorpo-fármaco foi avaliada por meio de citometria de fluxo. 70.000 células vivas HCC1569 (da ATCC) foram suspensas em 0,5 mL de RPMI 1640 (Invitrogen Corp., #31870-025) (contendo FBS a 10% (Invi- trogen Corp, #10270-106 ou PAN Biotech GmbH, #1505-P131304) e glutamina a 2 mM (Invitrogen Corp., #25030-024)) e inoculadas em cada cavidade de uma placa com 24 cavidades. As células foram cultivadas durante 4 dias e o meio foi substituído por 0,5 ml de um meio fresco antes de início do teste de internalização. 5 μg do anticorpo ou cada conjugado de anticorpo-fármaco foram adicionados a 0,5 ml em cada cavidade da placa com 24 cavidades, de modo que a concentração final fosse de 10 μg/mL. As células foram cultivadas durante uma hora a 37 °C na presença do anticorpo ou conjugado de anticorpo- fármaco. U1-59, o conjugado de anticorpo-fármaco (3), o conjugado de anticorpo-fármaco (10) ou o conjugado de anticorpo-fármaco (13) foi usado como o anticorpo ou o conjugado de anticorpo-fármaco. Células como um controle positivo ou um controle negativo não foram tratadas em alguns procedimentos.
[001007] Para análise de citometria de fluxo, as células foram lavadas uma vez com PBS e dissociadas da placa usando EDTA a 5 mM (100 μL/cavidade) dissolvido em ACCUTASE(R) SOLUTION (Millipore Corp., SCR005) ou PBS. As células foram suspensas em 200 μL de um tampão de FACS gelado (PBS contendo FBS a 3% e azida de sódio a 0,004%), então, adicionadas a cada cavidade de uma placa com 96 cavidades com fundo em U e deixadas sobre gelo. As células foram lavadas uma vez com um tampão de FACS. Para cada amostra, 100 μL de U1-59 (10 μg/ml) diluído com um tampão de FACS ou tampão de FACS apenas foram adicionados. As células foram tratadas durante 45 minutos com agitação sobre gelo e, então, lavadas com um tampão de FACS e 100 μL de um anticorpo secundário anti-humano marcado com PE (Dianova GmbH, 709-116-149) dissolvido na proporção de 1:100 em um tampão de FACS ou tampão de FACS apenas foi adicionado a cada cavidade. As células foram tratadas durante 45 minutos em uma sala escura com agitação sobre gelo. As células foram lavadas com tampão de FACS e tratadas com um tampão de FACS ou um tampão de FACS contendo 7AAD (Sigma-Aldrich Co. LLC, A9400, 1,1 μg e 1,25 μg/ml) para corar as células mortas. Os sinais de fluorescência de células vivas foram medidos usando o citômetro Accuri C6 Flow. Para correção dos sinais de PE e 7-AAD, U1-59 (10 μg/mL) e células coradas com o anticorpo secundário marcado com PE ou 7-AAD apenas foram usadas.
[001008] De modo a quantificar os sinais específicos de HER3, os valores de células coradas com o anticorpo secundário ou 7-AAD apenas foram subtraídos dos valores FL-2 de células coradas com o anticorpo primário e o anticorpo secundário e 7-AAD.
[001009] Quando os sinais de FL-2 de células não tratadas com U1- 59 ou o conjugado de anticorpo-fármaco (sem internalização) foram definidos como o valor máximo, a redução de HER3 (internalização) sobre a superfície das células tratadas com o U1-59 ou conjugado de anticorpo-fármaco a 37 °C foi calculada.
[001010] Um valor médio calculado a partir de 2 a 3 cavidades foi usado para o controle positivo (sem tratamento a 37 °C) e controle negativo (sem a adição do anticorpo primário) e a internalização nas cavidades de cada grupo de tratamento foi quantificada.
[001011] Os resultados são mostrados na Figura 5. Este diagrama mostra um valor médio de redução na expressão de HER3 sobre a superfície de células HCC1569 tratadas com U1-59 ou cada conjugado de anticorpo-fármaco (37 °C, 1 h). A expressão de HER3 de um grupo sem a adição de U1-59 ou o conjugado de anticorpo-fármaco foi definida como o valor máximo da expressão de HER3 nas células. Os valores dos grupos tratados com o anticorpo secundário ou 7-AAD apenas foram usados como base. Os grupos tratados com U1-59 ou cada conjugado de anticorpo-fármaco durante 1 hora foram usados como grupos de tratamento. Os valores de FL-2 eram quase os mesmos entre U1-59 e o conjugado de anticorpo-fármaco.
[001012] A redução na fluorescência gerada causada pelo tratamento de células HCC-1569 com U1-59 ou cada conjugado de anticorpo- fármaco indica uma redução na expressão de HER3. Comparado com uma redução de cerca de 50% na expressão de HER3 pelo U1-59, a redução na expressão de HER3 por cada conjugado de anticorpo- fármaco também exibiu um valor equivalente ou maior, o que sugere que os processos de conjugação de fármaco ao anticorpo não prejudicaram a função de internalização se HER3 do anticorpo.
Exemplo de Teste 4. Inibição de sinal mitogênico ou de sobrevivência in vitro por conjugado de anticorpo-fármaco HER3 na linhagem de células de câncer humano Método:
[001013] A atividade inibidora de cada conjugado de anticorpo - fármaco HER3 contra sinais mitogênicos ou de sobrevivência foi medida na presença de FBS a 10%. O crescimento e o desenvolvimento das células foram avaliados medindo-se a atividade de adenosina- trifosfato (ATP) em grupos não tratados e tratados com conjugado de fármaco-anticorpo. Linhagens de células de câncer aderentes (linhagem de células de câncer de mama humano HCC1569 (CRL-2330) da ATCC, linhagem de células de câncer de mama humano MDA-MB-453 (CLB-22) da ATCC e linhagem de células de câncer colorretal humano HT-29 (CPQ-57 ) da ProQinase GmbH) foram cultivadas em sistemas de cultura 2D e linhagens de células de câncer flutuantes (não aderentes) (linhagem de células de melanoma humano A375 (CRL-1619) da ATCC e linhagem de células de câncer de pulmão humano A549 (CRS-300114) da Cell Lines Service) foram cultivadas em sistemas de cultura 3D.
Tratamento de Células Aderentes
[001014] Cada linhagem de células cancerosas foi suspensa em 100 μL de cada meio em uma densidade baixa (500 células/cavidade para HT-29, 800 células/cavidade para MDA-MB-453 e 1000 célu- las/cavidade para HCC-1569) e inoculadas em uma placa 96- MicroWell Optical Bottom (Thermo Fisher Scientific Inc./Nunc, #165306, parede branca e fundo claro). Para HCC-1569 e MDA-MB- 453, as células foram cultivadas em um meio RPMI1640 (Invitrogen Corp., 31870-025) contendo FBS a 10% (Invitrogen Corp., 10270-106) e glutamina a 2 mM (Invitrogen Corp., 25030-024). Para HT-29, as células foram cultivadas em meio 5A de McCoy (Invitrogen Corp., 26600023) contendo FBS a 10% (Invitrogen Corp., 10270-106) e glutamina a 2 mM (Invitrogen Corp., 25030-024). As cavidades de borda de cada placa foram enchidas com 100 μL de um meio.
[001015] As células foram cultivadas durante 3 dias e o meio foi substituído por 95 μL de um meio fresco antes de tratamento com o conjugado de anticorpo-fármaco.
[001016] O conjugado de anticorpo-fármaco (3), o conjugado de anti- corpo-fármaco (10) e o conjugado de anticorpo-fármaco (13) foram usados. Um grupo não tratado foi definido como um controle para medir o crescimento celular normal.
[001017] Mediante adição de 5 μL de cada conjugado de anticorpo- fármaco concentrado para uma concentração de 20 vezes a 95 μL de meio de cultura (FBS a 10%) contido em cada uma das cavidades da placa com 96 cavidades, a concentração final foi estabelecida. Apenas 5 μL de meio foram adicionados a cada cavidade de controle. O teste foi realizado em triplicata por amostra.
[001018] De modo a calcular a concentração do conjugado de anti- corpo-fármaco na qual o crescimento ou a sobrevivência das células foi reduzida em 50%, as concentrações do conjugado de anticorpo- fármaco foram preparadas por diluições de 4 vezes (10 μg/ml a 0,15 ng/mL ou 40 μg/mL a 0,15 ng/mL) e as células foram tratadas com estas concentrações do conjugado de anticorpo-fármaco e comparadas com o grupo não tratado em termos de atividade de ATP. A avaliação foi realizada por meio de cultura de 5 dias de HT-29 e a cultura de 7 dias de HCC-1569 e MDA-MB-453 assim suplementado com o conju- gado de anticorpo-fármaco. O Ensaio CellTiter-Glo(R) Luminescent Cell Viability foi usado para avaliar a atividade do conjugado de anti- corpo-fármaco. Este método envolve a medição de células vivas tendo atividade metabólica com base na atividade de ATP e, finalmente, a estimativa do número de células vivas e empregando CellTiter-Glo(R) Luminescent Cell (Promega K.K., G7573) como um kit.
[001019] 100 μL de reagente CellTiter-Glo(R) foram adicionados a cada cavidade da placa com 96 cavidades e armazenados durante 25 minutos a 65 minutos em temperatura ambiente em um quarto escuro antes de medição usando Wallac Victor2 1420 Multilabel Counter (pro-grama de luminescência, tempo de medição: 0,5 s). As cavidades con-tendo apenas uma solução de cultura sem inoculação das células foram ensaiadas como "em branco". De modo a medir a redução na atividade de ATP, um valor médio de luminescência de 3 cavidades foi calculado em cada condição (Microsoft Excel 2010). De modo a eliminar os sinais independente de células, o valor médio de luminescência das cavidades "em branco" foi subtraído do valor médio de luminescência das células tratadas com o conjugado de anticorpo-fármaco (Microsoft Excel 2010). A taxa de redução (%) na luminescência foi calculada comparando com as células do grupo não tratado (Microsoft Excel 2010). Este valor foi interpretado como a taxa de inibição (%) de crescimento celular ou sobrevivência.
Tratamento de Células Flutuantes
[001020] Uma vez que A375 e A549 têm uma taxa de crescimento mais rápida do que aquela de outras linhagens de células, a medição de crescimento foi realizada em sistemas de cultura 3D não aderentes.
[001021] Cada linhagem de células cancerosas foi suspensa em 75 μL de cada meio em uma densidade baixa (500 células/cavidade para A375 e 1500 células/cavidade para A549) e inoculadas em uma placa de cultura 3D de fundo redondo com placa 96 cavidades não aderente (Prime Surface 96U; Sumitomo Bakelite Co, Ltda.; pedido n° MS- 9096U). Para A375, as células foram cultivadas em um meio DMEM (Invitrogen Corp., 41965-039) contendo FBS a 10% (Invitrogen Corp., 10270-106) e glutamina a 2 mM (Invitrogen Corp., 25030-024). Para A549, as células foram cultivadas em um meio DMEM/F12 (Invitrogen Corp., 21331-020) contendo FBS a 10% (Invitrogen Corp., 10270-106) e glutamina a 2 mM (Invitrogen Corp., 25030-024). As cavidades de borda de cada placa foram enchidas com 150 μL de um meio. As células foram cultivadas durante 3 dias e a dose final foi ajustada para 142,5 μL ou de 150 μL mediante adição de 67,5 ou 75 μL de meio fresco antes da adição do conjugado de anticorpo-fármaco. O conjugado de anticorpo-fármaco (3), o conjugado de anticorpo-fármaco (10) e o conjugado de anticorpo-fármaco (13) foram usados. Um grupo não tratado foi definido como um controle para medir o crescimento celular normal.
[001022] Mediante adição de 7,5 ou 8 μL de cada conjugado de anti- corpo-fármaco concentrado para uma concentração de 20 vezes a 142,5 ou 150 μL de um meio de cultura (FBS a 10%) contido em cada uma das cavidades da placa com 96 cavidades, a concentração final foi estabelecida. A dose final foi ajustada para 150 μL ou 158 μL. Apenas 7,5 ou 8 μL de meio foram adicionados a cada cavidade de controle. O teste foi realizado em triplicata por amostra.
[001023] De modo a calcular a concentração do conjugado de anti- corpo-fármaco na qual o crescimento ou a sobrevivência das células foi reduzido em 50%, as concentrações do conjugado de anticorpo- fármaco foram preparadas por diluições de 4 vezes (10 μg/ml a 0,15 ng/mL ou 40 μg/mL a 0,15 ng/mL) e as células foram tratadas com estas concentrações do conjugado de anticorpo-fármaco e comparadas com o grupo não tratado em termos de atividade de ATP. A avaliação foi realizada por meio de cultura das células 7 dias assim suplementa- das com o conjugado de anticorpo-fármaco. O ensaio CellTiter-Glo(R) Luminescent Cell Viability foi usado para avaliar a atividade do conjugado de anticorpo-fármaco. Este método envolve a medição de células vivas tendo atividade metabólica com base na atividade de ATP e, finalmente, a estimativa do número de células vivas e empregando CellTiter-Glo(R) Luminescent Cell (Promega K.K., G7573) como um kit.
[001024] Antes da medição, 50 μL do meio foram removidos de cada cavidade e 100 μL de reagente CellTiter-Glo(R) foram adicionados a cada cavidade da placa com 96 cavidades e armazenados durante 30 minutos a 55 minutos em temperatura ambiente em uma sala escura antes de medição usando Wallac Victor2 1420 Multilabel Counter (programa de luminescência, tempo de medição: 0,5 s). Antes da medição, 180 μL foram coletados de cada cavidade e transferidos para uma placa branca 96-MicroWell Optical Bottom. As cavidades contendo solução de cultura apenas sem inoculação das células foram ensaiadas como "em branco". O método para calcular a concentração do conjugado de anticorpo-fármaco na qual o crescimento ou a sobrevivência das células foi inibida em 50% foi descrito no método de avaliação para as células aderentes.
[001025] Os resultados sobre as linhagens de câncer de mama humano HCC1569 e MDA-MB453 são mostrados nas Figuras 6 e 7, res-pectivamente. Os resultados sobre a linhagem de melanoma humano A375 são mostrados na Figura 8. Os resultados sobre a linhagem de câncer colorretal humano HT29 são mostrados na Figura 9. Os resultados sobre a linhagem de câncer de pulmão humano A549 são mostrados na Figura 10. A. Cada figura mostra o crescimento ou sobrevivência celular derivada do conjugado de anticorpo-fármaco na presença de FBS a 10%. A ordenada representa um valor de luminescência que indica a atividade de ATP de cada amostra. A abcissa representa a concentração de cada conjugado de anticorpo-fármaco. Os dados são indicados pela média +/- desvio padrão de triplicatas. B. Cada figura mostra a taxa de redução na luminescência provocada pelo tratamento com o conjugado de anticorpo-fármaco, em que a luminescência de um grupo não tratado foi definida como 100%.
[001026] Três tipos de conjugados de anticorpo-fármaco foram adici-onados a várias linhagens de células de câncer humano na presença de FBS a 10% e avaliados quanto ao crescimento in vitro em sistemas 2D ou 3D. A taxa de inibição de crescimento ou desenvolvimento celular no grupo não tratado por cada conjugado de anticorpo-fármaco foi calculada a partir do ensaio de atividade de ATP CellTiter-Glo(R). Na avaliação da atividade de ATP, tais conjugados de anticorpo-fármaco inibiram fortemente o crescimento ou sobrevivência celular de dois tipos de linhagens de células de câncer de mama (HCC-1569 e MDA- MB-453) e um tipo de linhagem de melanoma humano (A375).
[001027] A adição de cada conjugado de anticorpo-fármaco e cultura (na presença de FBS a 10%) durante 7 dias diminuiu a atividade de ATP em 55 a 75% em HCC1569, em 60 a 83% em MDA-MB-453 e em 60 a 70% em A375. A atividade inibidora do conjugado de anticorpo- fármaco contra o crescimento ou sobrevivência celular não era forte na linhagem de câncer colorretal humano HT-29 e na linhagem de câncer de pulmão A549 humano comparado com as linhagens de câncer de mama humano e melanoma humano. Em HCC-1569 e MDA-MB-453, o conjugado de anticorpo-fármaco (10) exibiu forte atividade inibidora, a qual não difere muito da atividade inibidora do conjugado de anticor- po-fármaco (3) in vitro. Em contraste, em ambas as linhagens de câncer de mama humano, o conjugado de anticorpo-fármaco (13) exibiu baixa atividade e foi necessária uma concentração de 15 nM para alcançar 50% de inibição de crescimento ou sobrevivência celular, embora o conjugado de anticorpo-fármaco (3) ou o conjugado de anticor- po-fármaco (10) tenham alcançado esta inibição a 1 nM ou menos. Na linhagem de melanoma humano comparado com as linhagens de câncer de mama humano, a atividade do conjugado de anticorpo-fármaco (13) foi equivalente àquela do conjugado de anticorpo-fármaco (3) ou do conjugado de anticorpo-fármaco (10).
[001028] Todos os conjugados de anticorpo-fármaco suportaram uma taxa máxima de inibição da ordem de 61 a 68%. Os conjugados de anticorpo-fármaco alcançaram 50% de inibição de atividade de ATP em uma concentração de 1 a 4 nM.
[001029] Além do teste mencionado acima, a atividade inibidora do conjugado de anticorpo-fármaco (13) contra o crescimento ou sobrevi-vência celular de uma linhagem de células de câncer de ovário humano OVCAR-8 também foi confirmada in vitro (dados não mostrados). Exemplo de Teste 5. Comparação de taxa de inibição de crescimento ou sobrevivência celular in vitro na linhagem de células de câncer humano dependendo do número de moléculas (alto ou médio) de fárma- co carregadas no conjugado de anticorpo-fármaco Método:
[001030] Os conjugados de anticorpo-fármaco que diferem quanto ao número de moléculas carregadas com fármaco foram avaliados quanto à atividade inibidora in vitro contra o crescimento ou sobrevivência celular. A elevada carga de fármaco representa o estado no qual 5 a 7 moléculas de fármaco são conjugadas com um anticorpo e uma carga média de fármaco representa o estado no qual cerca de 3 moléculas de fármaco são conjugadas com um anticorpo. O número médio de moléculas de fármaco conjugadas com um anticorpo foi medido por meio do método de UV (descrito em outras partes da presente invenção).
[001031] Número médio de moléculas de fármacos conjugadas com um anticorpo:
[001032] Elevada Carga de Fármaco <HDL>
[001033] conjugado de anticorpo-fármaco (3): 4,9
[001034] conjugado de anticorpo-fármaco (10): 6,2
[001035] conjugado de anticorpo-fármaco (13): 6,2
[001036] Carga Média de Fármaco <MDL>
[001037] conjugado de anticorpo-fármaco (4): 2,9
[001038] conjugado de anticorpo-fármaco (11): 3,0
[001039] conjugado de anticorpo-fármaco (14): 2,5
[001040] A atividade inibidora de cada conjugado de anticorpo - fármaco HER3 contra sinais mitogênicos ou de sobrevivência foi medida na presença de FBS a 10%. O crescimento e o desenvolvimento das células foram avaliados medindo-se a atividade de adenosina- trifosfato (ATP) em grupos tratados com conjugado não tratados com o fármaco e o anticorpo. A linhagem de células de câncer foi suspensa em 100 μL de cada meio em uma densidade baixa (750 célu- las/cavidade para uma linhagem de células de câncer de mama humano MDA-MB-453 (CLB-22)) da ATCC) e inoculadas em uma placa branca 96-MicroWell Optical Bottom (Thermo Fisher Scientific Inc./Nunc, #165306). As células foram cultivadas em um meio RPMI1640 (Invitrogen Corp., 31870-025) contendo FBS a 10% (Invi- trogen Corp., 10270-106) e glutamina a 2 mM (Invitrogen Corp., 25030-024). As cavidades de borda de cada placa foram enchidas com 100 μL de um meio.
[001041] As células foram cultivadas durante 3 dias e o meio foi substituído por 95 μL de um meio fresco antes da adição do conjugado de anticorpo-fármaco. O conjugado de anticorpo-fármaco (3), o conjugado de anticorpo-fármaco (10), o conjugado de anticorpo-fármaco (13), o conjugado de anticorpo-fármaco (4), o conjugado de anticorpo- fármaco (11) e o conjugado de anticorpo-fármaco (14) foram usados. Um grupo não tratado foi definido como um controle para medir o crescimento celular normal.
[001042] Mediante adição de 5 μL de cada conjugado de anticorpo- fármaco concentrado para uma concentração de 20 vezes a 95 μL de meio de cultura (FBS a 10%) contido em cada uma das cavidades da placa com 96 cavidades, a concentração final foi estabelecida. Apenas 5 μL de um meio foram adicionados a cada cavidade de controle. O teste foi realizado em triplicata por amostra. De modo a calcular a concentração do conjugado de anticorpo-fármaco na qual o crescimento ou sobrevivência celular foi reduzido em 50%, as concentrações do conjugado de anticorpo-fármaco foram preparadas por diluições de 4 vezes (10 μg/ml a 0,15 ng/mL ) e as células foram tratadas com estas concentrações do conjugado de anticorpo-fármaco e comparadas com o grupo não tratado em termos de atividade de ATP. A avaliação foi realizada por meio de cultura 7 dias das células assim suplementadas com o conjugado de anticorpo-fármaco. O ensaio CellTiter-Glo(R) Luminescent Cell Viability foi usado para avaliar a atividade do conjugado de anticorpo-fármaco. Este método envolve a medição de células vivas tendo atividade metabólica com base na atividade de ATP e, finalmente, a estimativa do número de células vivas e empregando CellTiter- Glo(R) Luminescent Cell (Promega K.K., G7573) como um kit. 100 μL de reagente CellTiter-Glo(R) foram adicionados a cada cavidade da placa com 96 cavidades e armazenados durante 25 minutos a 55 minutos em temperatura ambiente em uma sala escura antes de medição usando Wallac Victor2 1420 Multilabel Counter (programa de luminescência, tempo de medição: 0,5 s). As cavidades contendo apenas uma solução de cultura sem inoculação das células foram ensaiadas como "em branco". De modo a medir a redução na atividade de ATP, um valor médio de luminescência de 3 cavidades foi calculado em cada condição (Microsoft Excel 2010). De modo a eliminar os sinais independentes de células, o valor médio de luminescência das cavidades "em branco" foi subtraído do valor médio de luminescência das células tratadas com o conjugado de anticorpo-fármaco (Microsoft Excel 2010). A taxa de redução (%) na luminescência foi calculada comparando com as células do grupo não tratado (Microsoft Excel 2010). Este valor foi interpretado como a taxa de inibição (%) de crescimento ou sobrevivência celular.
[001043] Os resultados são mostrados nas Figuras 11 a 13. A Figura 11 mostra os resultados da comparação do conjugado de anticorpo- fármaco (3) com o conjugado de anticorpo-fármaco (4). A Figura 12 mostra os resultados da comparação do conjugado de anticorpo- fármaco (10) com o conjugado de anticorpo-fármaco (11). A Figura 13 mostra os resultados da comparação do conjugado de anticorpo- fármaco (13) com o conjugado de anticorpo-fármaco (14). Em cada figura, o diagrama da esquerda mostra a taxa de inibição de crescimento ou sobrevivência celular derivada do conjugado de anticorpo- fármaco na presença de FBS a 10% em um dos ensaios em triplicata. A ordenada descreve a luminescência que indica a atividade de ATP de cada amostra. A abcissa representa a concentração de cada conjugado de anticorpo-fármaco. O diagrama da direita mostra a comparação entre a taxa de redução de luminescência provocada pelo tratamento com o conjugado de anticorpo-fármaco entre um carregamento elevado de fármaco (HDL) e um carregamento mediano de fármaco (MDL) quando a luminescência de um grupo não tratado foi definida como 100%.
[001044] Os conjugados de anticorpo-fármaco em uma carga elevada de fármaco e em uma carga média de fármaco inibiram o crescimento ou sobrevivência celular através de tratamento e 7 dias de cultura de células MDA-MB-453. Conforme já foi mostrado nos resultados sobre a carga de fármaco elevada, a carga média de fármaco do conjugado de anticorpo-fármaco (11) exibiu atividade elevada ao mesmo nível conforme aquela do conjugado de anticorpo-fármaco (4). Na comparação entre o número de moléculas carregadas com fármaco, os conjugados de anticorpo-fármaco tendo um elevado número de moléculas carregadas com fármaco exibiu maior redução do ATP do que a das médias aqueles carga de fármaco. O conjugado de anticorpo- fármaco (3), o conjugado de anticorpo-fármaco (10) e o conjugado de anticorpo-fármaco (13) que apresenta um elevado número de moléculas de fármacos carregadas taxas de inibição de 68%, 76% exibiram e 56%, respectivamente, a uma concentração de 10 μg/mL, aa etapa que o conjugado de anticorpo-fármaco (4), o conjugado de anticorpo- fármaco (11) e o conjugado de anticorpo-fármaco (14) que apresenta um número do meio de moléculas carregadas com fármaco meramente taxas exibiram de inibição de 44%, 47% e 27%, respectivamente, com esta concentração. Os conjugados de anticorpo-fármaco que possuem um elevado número de moléculas carregadas com fármaco foram superiores em concentração de inibição de 50% do crescimento das células do câncer ou de sobrevivência para os conjugados de an- ticorpo-fármaco tendo um número de meio de moléculas carregadas com fármaco. O conjugado de anticorpo-fármaco (3) ou o conjugado de anticorpo-fármaco (10) que apresenta um elevado número de moléculas carregadas com fármaco necessária de 15 ng/mL (1 nM) do conjugado de anticorpo-fármaco para reduzir o valor de atividade de ATP em 50%. O conjugado de anticorpo-fármaco (13) reduziu a atividade de ATP em 50%, pelo menos na maior concentração testada. Em contraste, a redução da atividade de ATP correspondente a esta não foi observada a 1000 ng/mL (67 nM) ou inferior dentro da gama de concentrações dos conjugados de anticorpo-fármaco avaliadas tendo um número do meio de moléculas carregadas com fármaco. A comparação in vitro entre o elevado número de moléculas carregadas com fármaco e o número do meio de moléculas carregadas com fármaco sugerido que um conjugado de anticorpo-fármaco tendo um elevado número de moléculas carregadas com fármaco é também superior em atividade inibidora in vivo contra o crescimento de células cancerosas.
Exemplo de Teste 6. Conjugados de anticorpo-fármaco (3), (10) e (13) exibiram efeito antitumor no ensaio antitumor in vivo usando câncer de mama humano
[001045] Camundongos sem pelo BALB/C fêmeas de cinco semanas de idade com um peso corporal de 15 a 20 g foram usados após aclimatação. Os camundongos foram colocados em gaiolas individualmente ventiladas (IVC, 4 camundongos por gaiola no máximo), as quais foram mantidas em temperatura ambiente e umidade constante. Após a randomização, os pesos corporais dos camundongos foram medidos a cada dois dias e os comportamentos dos animais foram registrados todos os dias. 5 x 106 células de uma linhagem de células de câncer de mama humano HCC1569 (CRL-2330) da ATCC foram suspensas em uma solução preparada a partir de 50 μL de PBS e Matrigel (PBS: PAA #H21-002, Matrigel: BD #354230) misturados em uma proporção de 1:1 e transplantadas subcutaneamente para a região lateral direita do corpo de cada camundongo sem pelo BALB/C usando uma agulha de 29 G.
[001046] Os pesos corporais foram medidos usando uma escala de peso (Mettler Toledo PB602-L). O eixo maior e o eixo menor do tumor foram medidos duas vezes por semana usando um calibrador eletrônico digital (calibrador manual, OMC Fontana) e o volume do tumor calculado (mm3). O cálculo foi realizado de acordo com a expressão a seguir (o mesmo é válido para os Exemplos de Teste descritos a seguir).
[001047] Volume do tumor (mm3) = 1/2 x eixo maior (mm) x [eixo menor (mm)]2
[001048] No dia 19 quando o tamanho do tumor atingiu cerca de 150 mm3, 70 animais foram aleatoriamente divididos em 7 grupos com base nas dimensões de seus tumores. No mesmo dia, o conjugado de anticorpo-fármaco (3), (10) ou (13) ou PBS para um grupo de controle foram administrados na veia da cauda de cada animal nas doses a seguir.
[001049] Grupo de Administração: PBS foi injetado por via intravenosa uma vez por semana na mesma dose que o conjugado de anticor- po-fármaco.
[001050] Grupo de Administração: O conjugado de anticorpo- fármaco (3) foi injetado por via intravenosa uma vez por semana a 3 ou 10 mg/kg.
[001051] Grupo de Administração: O conjugado de anticorpo- fármaco (10) foi injetado por via intravenosa uma vez por semana a 3 ou 10 mg/kg.
[001052] Grupo de Administração: O conjugado de anticorpo- fármaco (13) foi injetado por via intravenosa uma vez por semana a 3 ou 10 mg/kg.
[001053] Todos os dados foram indicados pela média +/- SEM. Os tamanhos dos tumores e os pesos corporais foram avaliados pela média +/- SEM. Todos os dados foram analisados usando Microsoft Excel 2009 (o mesmo vale para os Exemplos de Teste descritos abaixo).
[001054] Os resultados são mostrados na Figura 14. O Grupo de Administração de PBS foi sacrificado no dia 53 após o transplante porque os tamanhos dos tumores excederam o nível máximo aceitável. Inibição de crescimento do tumor da linhagem de células de câncer de mama humano foi observada em todos os grupos de administração do conjugado de anticorpo-fármaco comparado com o grupo de controle. Nenhuma perda de peso foi observada nos camundongos dos grupos tratados.
Exemplo de Teste 7. Conjugados de anticorpo-fármaco (3), (10) e (13) exibiram efeito antitumor no ensaio antitumor usando melanoma humano
[001055] Camundongos sem pelo NMRI fêmeas de 5 a 6 semanas de idade tendo um peso corporal de 22 a 26 g foram usados após aclimatação. Os camundongos foram colocados em gaiolas individu-almente ventiladas (IVC, 4 camundongos por gaiola no máximo), as quais foram mantidas em temperatura ambiente e umidade constante. Após a randomização, os pesos corporais dos camundongos foram medidos a cada dois dias e os comportamentos dos animais foram registrados todos os dias.
[001056] 5 x 106 células de uma linhagem de células de melanoma humano HT-144 (HTB-63) da ATCC foram suspensas em uma solução preparada a partir de 50 μL de PBS e Matrigel (PBS: PAA #H21-002, Matrigel: BD #354230) misturados em uma proporção de 1:1 e trans-plantadas subcutaneamente para a região lateral direita do corpo de cada camundongo sem pelo NMRI usando uma agulha de 29 G.
[001057] A medição dos pesos corporais e dos tamanhos dos tumores e a medição e o cálculo dos volumes dos tumores foram realizados do mesmo modo conforme no Exemplo de Teste 6.
[001058] No dia 22 quando o tamanho do tumor atingiu cerca de 150 mm3, 80 animais foram aleatoriamente divididos em 8 grupos com base no tamanho de seus tumores. No mesmo dia, U1-59 ou o conjugado de anticorpo-fármaco (3), (10) ou (13) ou PBS para um grupo de controle foram administrados na veia da cauda de cada animal nas doses a seguir.
[001059] Grupo de Administração: PBS foi injetado por via intravenosa uma vez por semana na mesma dose que o conjugado de anticor- po-fármaco.
[001060] Grupo de Administração: U1-59 foi injetada subcutanea- mente duas vezes por semana a 25 mg/kg.
[001061] Grupo de Administração: O conjugado de anticorpo- fármaco (3) foi injetado por via intravenosa uma vez por semana a 3 ou 10 mg/kg.
[001062] Grupo de Administração: O conjugado de anticorpo- fármaco (10) foi injetado por via intravenosa uma vez por semana a 3 ou 10 mg/kg.
[001063] Grupo de Administração: O conjugado de anticorpo- fármaco (13) foi injetado por via intravenosa uma vez por semana a 3 ou 10 mg/kg.
[001064] Os resultados são mostrados na Figura 15. Os grupos de administração de PBS e U1-59 foram sacrificados aos dias 48 e 52, respectivamente, após o transplante porque os tamanhos dos tumores excederam o nível máximo aceitável. Inibição de crescimento do tumor da linhagem de células de melanoma humano foi observada em todos os grupos de administração do conjugado de anticorpo-fármaco comparado com o grupo de controle e do Grupo de Administração de U1- 59.
Exemplo de Teste 8. Conjugados de anticorpo-fármaco (3), (10) e (13) exibiram efeito antitumor no ensaio antitumor usando a linhagem de câncer de mama humano
[001065] Foram usados camundongos sem pelo SCID fêmeas de dezesseis semanas de idade com um peso corporal entre 17 e 25,5 g após aclimatação. Os camundongos foram colocados em gaiolas indi-vidualmente ventiladas, as quais foram mantidas em temperatura am-biente e umidade constante.
[001066] Para tumores sólidos derivados a partir de uma linhagem de células de câncer de mama humano MDA-MB-453 (CLB-22) da ATCC, MDA-MB-453 na primeira passagem (lote 1089) foi transplantada para 3 camundongos (duas áreas por camundongo: áreas dos lados direito e esquerdo do corpo). Após 13 a 17 semanas, as seções de tumor foram coletadas e criopreservadas. Para a segunda passagem, a seção do tumor (2 x 2 x 2 mm) da primeira passagem foi depois transplantada subcutaneamente (10 camundongos, duas áreas por camundongo: áreas dos lados direito e esquerdo do corpo) e deixadas crescer para formação do tumor durante 7 semanas. O tumor assim formado foi preparado para uma seção do tumor (2 x 2 x 2 mm, a segunda passagem) e transplantado para a área do lado direito do corpo de cada camundongo sem pelo SCID.
[001067] Os pesos corporais foram medidos usando uma escala de peso. O eixo maior (comprimento) e o diâmetro do tumor foram medidos usando um calibrador eletrônico digital (Pro-Max 150 mm, calibrador manual, Fred V. Fowler Co., Inc.) e o volume do tumor calculado (mm3). O cálculo foi realizado de acordo com a expressão a seguir.
[001068] Volume do tumor (mm3) = pi/6 x eixo maior (mm) x [Diâmetro (mm)]2
[001069] No dia 40 quando o tamanho do tumor atingiu cerca de 143 mm3, 72 animais foram aleatoriamente divididos em 8 grupos com base no tamanho de seus tumores. No mesmo dia, U1-59 ou o conjugado de anticorpo-fármaco (3), (10) ou (13) ou PBS para um grupo de controle foram administrados na veia da cauda de cada animal nas doses a seguir.
[001070] Grupo de Administração: PBS foi injetado por via intravenosa uma vez por semana na mesma dose que o conjugado de anticor- po-fármaco.
[001071] Grupo de Administração: U1-59 foi injetada subcutanea- mente duas vezes por semana a 25 mg/kg.
[001072] Grupo de Administração: O conjugado de anticorpo- fármaco (3) foi injetado por via intravenosa uma vez por semana a 3 ou 10 mg/kg.
[001073] Grupo de Administração: O conjugado de anticorpo- fármaco (10) foi injetado por via intravenosa uma vez por semana a 3 ou 10 mg/kg.
[001074] Grupo de Administração: O conjugado de anticorpo- fármaco (13) foi injetado por via intravenosa uma vez por semana a 3 ou 10 mg/kg.
[001075] Os resultados são mostrados na Figura 16. A inibição de crescimento do tumor da linhagem de células de câncer de mama humano foi observada em todos os grupos de administração do conjugado de anticorpo-fármaco comparado com o grupo de controle e o Grupo de Administração de U1-59. Nenhuma perda de peso foi observada nos camundongos dos grupos tratados. Além disso, em outro ensaio antitumor usando a linhagem de células de câncer de mama humano HCC1954 ou JIMT1-PR10 (T-DM1 resistente ao trastuzumabe e per- tuzumabe), inibição de crescimento do tumor também foi observada no Grupo de Administração de conjugado de anticorpo-fármaco (16a) comparado com o grupo de controle. Exemplo de Teste 9. Conjugados de anticorpo-fármaco (3), (10) e (13) exibiram efeito antitumor no ensaio antitumor usando a linhagem de câncer colorretal humano
[001076] Camundongos sem pelo NMRI fêmeas de 5 a 6 semanas de idade com um peso corporal de 15 a 20 g foram usados após aclimatação. Os camundongos foram colocados em gaiolas individualmente ventiladas (IVC, 4 camundongos por gaiola no máximo), as quais foram mantidas em temperatura ambiente e umidade constante. Após a randomização, os pesos corporais dos camundongos foram medidos a cada dois dias e os comportamentos dos animais foram registrados todos os dias.
[001077] 4 x 106 células de uma linhagem de células de câncer color- retal humano HT-29 (CPQ-57) da ProQinase GmbH foram suspensas em uma solução preparada a partir de PBS e Matrigel (PBS: PAA #H21-002, Matrigel: BD #354230) misturados em uma proporção de 1:1 e transplantadas subcutaneamente para a região lateral direita do corpo de cada camundongo sem pelo NMRI usando uma agulha de 29 G.
[001078] A medição dos pesos corporais e dos tamanhos dos tumores e a medição e o cálculo dos volumes dos tumores foram realizados do mesmo modo conforme no Exemplo de Teste 6.
[001079] No dia 8, quando o tamanho do tumor atingiu cerca de 150 mm3, 70 animais foram aleatoriamente divididos em 7 grupos com base nas dimensões de seus tumores. No mesmo dia, o conjugado de anticorpo-fármaco (3), (10) ou (13) ou PBS para um grupo de controle foram administrados na veia da cauda de cada animal nas doses a seguir.
[001080] Grupo de Administração: PBS foi injetado por via intravenosa uma vez por semana na mesma dose que o conjugado de anticor- po-fármaco.
[001081] Grupo de Administração: O conjugado de anticorpo- fármaco (3) foi injetado por via intravenosa uma vez por semana a 3 ou 10 mg/kg.
[001082] Grupo de Administração: O conjugado de anticorpo- fármaco (10) foi injetado por via intravenosa uma vez por semana a 3 ou 10 mg/kg.
[001083] Grupo de Administração: O conjugado de anticorpo- fármaco (13) foi injetado por via intravenosa uma vez por semana a 3 ou 10 mg/kg.
[001084] Os resultados são mostrados na Figura 17. O Grupo de Administração de PBS (6 dos 10 camundongos), os grupos que rece-beram o conjugado de anticorpo-fármaco (3) a 3 mg/kg (3 dos 10 ca-mundongos) e a 10 mg/kg (4 dos 10 camundongos), os grupos que receberam o conjugado de anticorpo-fármaco (10) a 3 mg/kg (2 dos 10 camundongos) e a 10 mg/kg (2 dos 10 camundongos) e o grupo que recebeu o conjugado de anticorpo-fármaco (13) a 3 mg/kg (2 dos 10 camundongos) foram sacrificados no dia 50 após o transplante porque os tamanhos dos tumores excederam o nível máximo aceitável ou uma úlcera se formou. A inibição de crescimento do tumor da linhagem de células de câncer colorretal humano foi observada em todos os grupos de administração do conjugado de anticorpo-fármaco comparado com o grupo de controle. O conjugado de anticorpo-fármaco (13) exibiu uma atividade antitumor mais forte do que aquela do conjugado de an- ticorpo-fármaco (3) ou o conjugado de anticorpo-fármaco (10). Nenhuma perda de peso foi observada nos camundongos dos grupos tratados. Exemplo de Teste 10. Conjugados de anticorpo-fármaco (3), (10) e (13) exibiram efeito antitumor no ensaio antitumor usando a linhagem de câncer de pulmão humano
[001085] Camundongos sem pelo CD1 fêmeas de 5 a 6 semanas de idade com um peso corporal de 24 a 28 g foram usados após aclimatação. Os camundongos foram colocados em gaiolas individualmente ventiladas (IVC, 4 camundongos por gaiola no máximo), as quais foram mantidas em temperatura ambiente e umidade constante. Após a randomização, os pesos corporais dos camundongos foram medidos a cada dois dias e os comportamentos dos animais foram registrados todos os dias.
[001086] 5 x 106 células de um pulmão humano linhagem de células de câncer A549 (SIR-300114) do Cell Lines Service foram suspensas em uma solução preparada a partir de 200 μL de PBS e Matrigel (PBS: PAA #H21-002, Matrigel: BD #354230) misturados em uma proporção de 1:1 e transplantadas subcutaneamente para a região lateral direita do corpo de cada camundongo sem pelo CD1 usando uma agulha de 29 G.
[001087] A medição dos pesos corporais e dos tamanhos dos tumores e a medição e o cálculo dos volumes dos tumores foram realizados do mesmo modo conforme no Exemplo de Teste 6.
[001088] No dia 38 quando o tamanho do tumor atingiu cerca de 200 mm3, 70 animais foram aleatoriamente divididos em 7 grupos com base nas dimensões de seus tumores. No mesmo dia, o conjugado de anticorpo-fármaco (3), (10) ou (13) ou PBS para um grupo de controle foram administrados na veia da cauda de cada animal nas doses a seguir.
[001089] Grupo de Administração: PBS foi injetado por via intravenosa uma vez por semana na mesma dose que o conjugado de anticor- po-fármaco.
[001090] Grupo de Administração: O conjugado de anticorpo- fármaco (3) foi injetado por via intravenosa uma vez por semana a 3 ou 10 mg/kg.
[001091] Grupo de Administração: O conjugado de anticorpo- fármaco (10) foi injetado por via intravenosa uma vez por semana a 3 ou 10 mg/kg.
[001092] Grupo de Administração: O conjugado de anticorpo- fármaco (13) foi injetado por via intravenosa uma vez por semana a 3 ou 10 mg/kg.
[001093] Os resultados são mostrados na Figura 18. A inibição de crescimento do tumor da linhagem de células de câncer de pulmão humano foi observada em todos os grupos de administração do conjugado de anticorpo-fármaco comparado com o grupo de controle. Nenhuma perda de peso foi observada nos camundongos dos grupos tratados.
Exemplo de Teste 11. Conjugado de anticorpo-fármaco (13) exibiu efeito antitumor no ensaio antitumor in vivo usando a linhagem de câncer de mama humano triplo-negativo
[001094] O câncer de mama triplo-negativo se refere a um câncer de mama que não expressa receptores hormonais (receptor de estrogênio e receptor de progesterona), nem HER2. Uma vez que estes receptores não são expressos, tratamento hormonal (tamoxifeno, etc.) ou tratamento anti-HER2 (trastuzumabe, entansina trastuzumabe ou per- tuzumabe) não pode ser aplicado ao câncer. Portanto, esse tipo de câncer de mama leva a baixas taxas de sobrevivência e muitos agentes terapêuticos ainda estão sob estudo clínico. Uma vez que a expressão de HER3 foi confirmada em uma linhagem de câncer de mama humano triplo-negativo MDA-MB-468 (dados não apresentados), a atividade antitumor do conjugado de anticorpo-fármaco foi avaliada.
[001095] Camundongos CAnN.Cg-Foxn1/CrlCrlj [Sem pelo] (Foxn1nu/Foxn1nu) fêmeas de cinco a seis semanas de idade foram usados (Charles River Laboratories Japan, Inc.) com um peso corporal de 15 a 20 g após aclimatação. Os camundongos foram colocados em gaiolas individualmente ventiladas (IVC, 4 camundongos por gaiola no máximo), as quais foram mantidas em temperatura ambiente e umidade constante. Após a randomização, os pesos corporais dos camundongos foram medidos a cada dois dias e os comportamentos dos animais foram registrados todos os dias.
[001096] 5 x 106 células de uma linha humana triplo negativo de cé lulas cancerosas da mama MDA-MB-468 (CRL-2322) da ATCC foram suspensas em uma solução preparada a partir de 200 μL de PBS e Matrigel (PBS: PAA #10010-023, Matrigel: BD #354234), misturada em uma proporção de 1:1 e transplantadas subcutaneamente para a região lateral direita do corpo de cada camundongo sem pelo usando uma agulha de 29 G. Os pesos corporais foram medidos usando uma escala de peso (Mettler Toledo PB602-L).
[001097] O eixo maior e o eixo menor do tumor foram medidos usando um calibrador eletrônico digital (CD-15CX, Mitsutoyo Corp) e o vo- lume do tumor calculado (mm3). O cálculo foi realizado de acordo com a expressão a seguir.
[001098] Volume do tumor (mm3) = 1/2 x eixo maior (mm) x [eixo menor (mm)]2
[001099] No dia 20, quando o tamanho do tumor atingiu cerca de 170 mm3, 18 animais foram aleatoriamente divididos em 3 grupos com base nas dimensões de seus tumores. No mesmo dia, U1-59 ou o conjugado de anticorpo-fármaco (13) ou PBS para um grupo de controle foram administrados na veia da cauda de cada animal nas doses a seguir.
[001100] Grupo de Administração: PBS foi injetado por via intravenosa uma vez por semana na mesma dose que o conjugado de anticor- po-fármaco.
[001101] Grupo de Administração: U1-59 foi injetado por via intravenosa uma vez por semana a 10 mg/kg.
[001102] Grupo de Administração: O conjugado de anticorpo- fármaco (13) foi injetado por via intravenosa uma vez por semana a 10 mg/kg.
[001103] Os resultados são mostrados na Figura 19. A inibição de crescimento do tumor da linhagem de câncer de mama humano triplo- negativo foi observada no Grupo de Administração do conjugado de anticorpo-fármaco comparado com o grupo de controle e do Grupo de Administração de U1-59. Nenhuma perda de peso foi observada nos camundongos dos grupos tratados. Exemplo de Teste 12. Conjugado de anticorpo-fármaco (16a) exibiu efeito antitumor no ensaio antitumor in vivo usando a linhagem de câncer de mama luminal humano
[001104] O câncer de mama luminal humano se refere a um câncer de mama que expressa receptores hormonais (receptor de estrogê- nio), mas não expressa HER2. Uma vez que estes receptores não são expressos, o tratamento anti-HER2 (trastuzumabe, entansina tras- tuzumabe, pertuzumabe) não pode ser aplicado ao câncer. Portanto, esse tipo de câncer de mama leva a baixas taxas de sobrevivência e muitos agentes terapêuticos ainda estão sob estudo clínico. Uma vez que a expressão de HER3 foi confirmada em uma linhagem de câncer de mama luminal humano MCF-7 (dados não mostrados), a atividade antitumor do conjugado de anticorpo-fármaco foi avaliada.
[001105] Camundongos nu-Foxn1nu sem pelo fêmea de 5 a 6 semanas de idade atímicos (ProQinase GmbH) com um peso corporal de 15 a 20 g foram usados após aclimatação. Os camundongos foram colocados em gaiolas individualmente ventiladas (IVC, 4 camundongos por gaiola no máximo), as quais foram mantidas em temperatura ambiente e umidade constante. Após a randomização, os pesos corporais dos camundongos foram medidos a cada dois dias e os comportamentos dos animais foram registrados todos os dias.
[001106] 5 x 106 células de uma linhagem de células de câncer de mama humano MCF-luminal 7 (CRQ- #327) foram suspensas em uma solução preparada a partir de 200 μL de PBS e Matrigel (PBS: PAA #10010-023, Matrigel: BD #354234) misturados em uma proporção de 1:1 e transplantadas subcutaneamente para a região lateral direita do corpo de cada camundongo sem pelo usando uma agulha de 29 G. Os pesos corporais foram medidos usando uma escala de peso (Mettler Toledo PB602-L).
[001107] O eixo maior e o eixo menor do tumor foram medidos usando um calibrador eletrônico digital (CD-15CX, Mitsutoyo Corp) e o volume do tumor calculado (mm3). O cálculo foi realizado de acordo com a expressão a seguir.
[001108] Volume do tumor (mm3) = 1/2 x eixo maior (mm) x [eixo menor (mm)]2
[001109] No dia 11 quando o tamanho do tumor atingiu cerca de 250 mm3, 20 animais foram aleatoriamente divididos em 2 grupos com base no tamanho de seus tumores. No mesmo dia, o conjugado de anti- corpo-fármaco (16a) ou PBS para um grupo de controle foram administrados nas doses seguintes.
[001110] Grupo de Administração: PBS foi injetada intravenosamente na mesma dose única como o conjugado de anticorpo-fármaco.
[001111] Grupo de Administração: O conjugado de anticorpo- fármaco (16a) foi injetado por via intravenosa em uma dose única de 10 mg/kg.
[001112] Os resultados são mostrados na Figura 20. A inibição de crescimento do tumor da linhagem de câncer de mama humano luminal foi observada no Grupo de Administração do conjugado de anticor- po-fármaco comparado com o grupo de controle. Nenhuma perda de peso foi observada nos camundongos dos grupos tratados.
Exemplo de Teste 13. Conjugado de anticorpo-fármaco (16a) exibiu efeito antitumor no ensaio antitumor in vivo usando a linhagem de melanoma humano
[001113] Camundongos sem pelo CAnN.Cg-Foxn1 [Nu]/CrlCrlj (Foxn1nu/Foxn1nu)fêmeas de cinco a seis semanas de idade foram usados (Charles River Laboratories Japan, Inc.) com um peso corporal de 15 a 20 g após aclimatação. Os camundongos foram colocados em gaiolas individualmente ventiladas (IVC, 4 camundongos por gaiola no máximo), as quais foram mantidas em temperatura ambiente e umidade constante. Após a randomização, os pesos corporais dos camundongos foram medidos a cada dois dias e os comportamentos dos animais foram registrados todos os dias.
[001114] 3 x 106 células de uma linhagem de células de melanoma humano WM-266-4 (CRL-1676) da ATCC foram misturados e suspensos em Matrigel (BD #354234) e transplantadas subcutaneamente para a região lateral direita do corpo de cada camundongo sem pelo usando um 29 G agulha. Os pesos corporais foram medidos usando uma escala de peso (Mettler Toledo PB602-L).
[001115] O eixo maior e o eixo menor do tumor foram medidos usando um calibrador eletrônico digital (CD-15CX, Mitsutoyo Corp) e o volume do tumor calculado (mm3). O cálculo foi realizado de acordo com a expressão a seguir.
[001116] Volume do tumor (mm3) = 1/2 x eixo maior (mm) x [eixo menor (mm)]2
[001117] No dia 19 quando o tamanho do tumor atingiu cerca de 220 mm3, 8 animais foram divididos aleatoriamente em 2 grupos com base nas dimensões de seus tumores. No mesmo dia, o conjugado de anti- corpo-fármaco (16a) ou PBS para um grupo de controle foram administrados nas doses seguintes.
[001118] Grupo de Administração: PBS foi injetada intravenosamente na mesma dose única como o conjugado de anticorpo-fármaco.
[001119] Grupo de Administração: O conjugado de anticorpo- fármaco (16a) foi injetado por via intravenosa em uma dose única de 10 mg/kg.
[001120] Os resultados são mostrados na Figura 21. A inibição de crescimento do tumor da linhagem de melanoma humano foi observada no Grupo de Administração do conjugado de anticorpo-fármaco comparado com o grupo de controle. Nenhuma perda de peso foi observada nos camundongos dos grupos tratados. Em outro modelo de melanoma humano C32, a inibição de crescimento do tumor também foi observada no Grupo de Administração do conjugado de anticorpo- fármaco (16-A) comparado com o grupo de controle. Exemplo de Teste 14. Conjugado de anticorpo-fármaco (16a) exibiu efeito antitumor no ensaio antitumor in vivo usando a linhagem de câncer de ovário humano
[001121] Camundongos CAnN.Cg-Foxn1 [Nu]/CrlCrlj (Foxn1nu/Foxn1nu)fêmeas de cinco a seis semanas de idade foram usados (Charles River Laboratories Japan, Inc.) com um peso corporal de 15 a 20 g após aclimatação. Os camundongos foram colocados em gaiolas individualmente ventiladas (IVC, 4 camundongos por gaiola no máximo), as quais foram mantidas em temperatura ambiente e umidade constante. Após a randomização, os pesos corporais dos camundongos foram medidos a cada dois dias e os comportamentos dos animais foram registrados todos os dias.
[001122] 5 x 106 células de uma linhagem de células de câncer de ovário humano OVCAR-8 (HTB-161) da ATCC foram misturados e suspensos em Matrigel (BD #354234) e transplantadas subcutanea- mente para a região lateral direita do corpo de cada camundongo sem pelo usando um 29 agulha G. Os pesos corporais foram medidos usando uma escala de peso (Mettler Toledo PB602-L).
[001123] O eixo maior e o eixo menor do tumor foram medidos usando um calibrador eletrônico digital (CD-15CX, Mitsutoyo Corp) e o volume do tumor calculado (mm3). O cálculo foi realizado de acordo com a expressão a seguir.
[001124] Volume do tumor (mm3) = 1/2 x eixo maior (mm) x [eixo menor (mm)]2
[001125] No dia 21 quando o tamanho do tumor atingiu cerca de 140 mm3, 8 animais foram divididos aleatoriamente em 2 grupos com base nas dimensões de seus tumores. No mesmo dia, o conjugado de anti- corpo-fármaco (16a) ou PBS para um grupo de controle foi administrado nas doses seguintes.
[001126] Grupo de Administração: PBS foi injetada intravenosamente na mesma dose única como o conjugado de anticorpo-fármaco.
[001127] Grupo de Administração: O conjugado de anticorpo- fármaco (16a) foi injetado por via intravenosa em uma dose única de 10 mg/kg.
[001128] Os resultados são mostrados na Figura 22. A inibição de crescimento do tumor da linhagem de câncer de ovário humano foi ob-servada no Grupo de Administração do conjugado de anticorpo- fármaco comparado com o grupo de controle. Nenhuma perda de peso foi observada nos camundongos dos grupos tratados. Exemplo de Teste 15. Conjugado de anticorpo-fármaco (16a) exibiu efeito antitumor no ensaio antitumor in vivo usando a linhagem de câncer de bexiga humana
[001129] Camundongos CAnN.Cg-Foxn1 [Nu] /CrlCrlj (Foxn1nu/Foxn1nu) fêmeas de cinco a seis semanas de idade foram usados (Charles River Laboratories Japan, Inc.) com um peso corporal de 15 a 20 g após aclimatação. Os camundongos foram colocados em gaiolas individualmente ventiladas (IVC, 4 camundongos por gaiola no máximo), as quais foram mantidas em temperatura ambiente e umidade constante. Após a randomização, os pesos corporais dos camundongos foram medidos a cada dois dias e os comportamentos dos animais foram registrados todos os dias.
[001130] 8 x 106 células de uma linhagem de células de câncer de bexiga humano SW-780 (CRL-2169) da ATCC foram misturados e suspensos em Matrigel (BD #354234) e transplantadas subcutanea- mente para a região lateral direita do corpo de cada camundongo sem pelo usando um 29 agulha G. Os pesos corporais foram medidos usando uma escala de peso (Mettler Toledo PB602-L).
[001131] O eixo maior e o eixo menor do tumor foram medidos usando um calibrador eletrônico digital (CD-15CX, Mitsutoyo Corp) e o volume do tumor calculado (mm3). O cálculo foi realizado de acordo com a expressão a seguir.
[001132] Volume do tumor (mm3) = 1/2 x eixo maior (mm) x [eixo menor (mm)]2
[001133] No Dia 7, quando o tamanho do tumor atingiu cerca de 190 mm3, 10 animais foram aleatoriamente divididos em 2 grupos com base no tamanho de seus tumores. No mesmo dia, o conjugado de anti- corpo-fármaco (16a) ou PBS para um grupo de controle foi administrado nas doses a seguir.
[001134] Grupo de Administração: PBS foi injetada intravenosamente na mesma dose única como o conjugado de anticorpo-fármaco.
[001135] Grupo de Administração: O conjugado de anticorpo- fármaco (16a) foi injetado por via intravenosa em uma dose única de 10 mg/kg.
[001136] Os resultados são mostrados na Figura 23. A inibição de crescimento do tumor da linhagem de câncer de bexiga humana foi observada no Grupo de Administração do conjugado de anticorpo- fármaco comparado com o grupo de controle. Nenhuma perda de peso foi observada nos camundongos dos grupos tratados. Exemplo de Teste 16. Conjugado de anticorpo-fármaco (16a) exibiu efeito antitumor dependente de HER3 em ensaio antitumor in vivo usando a linhagem de câncer de mama humano
[001137] A linhagem de câncer de mama humano MDA-MB-453 expressa HER3 e responde ao conjugado de anticorpo-fármaco (13), conforme descrito no Exemplo de Teste 8. No entanto, uma vez que não tinha sido demonstrado que este efeito farmacêutico foi mediado por HER3, HER3 foi testada pela administração de U1-59 antecipadamente e foi avaliado se ele reduz ou não o efeito farmacêutico.
[001138] Camundongos CAnN.Cg-Foxn1 [Nu] /CrlCrlj (Foxn1nu/Foxn1nu)sem pelo fêmeas de cinco a seis semanas de idade foram usados (Charles River Laboratories Japan, Inc.) com um peso corporal de 15 a 20 g após aclimatação. Os camundongos foram colocados em gaiolas individualmente ventiladas (IVC, 4 camundongos por gaiola no máximo), as quais foram mantidas em temperatura ambiente e umidade constante. Após a randomização, os pesos corporais dos camundongos foram medidos a cada dois dias e os comportamentos dos animais foram registrados todos os dias.
[001139] 1 x 107 células de uma linhagem de células de câncer de mama humano MDA-MB-453 (CLB-22) da ATCC foram misturados e suspensos em Matrigel (BD #354234) e transplantadas subcutanea- mente para a região lateral direita do corpo de cada camundongo sem pelo usando uma agulha G 29. Os pesos corporais foram medidos usando uma escala de peso (Mettler Toledo PB602-L).
[001140] O eixo maior e o eixo menor do tumor foram medidos usando um calibrador eletrônico digital (CD-15CX, Mitsutoyo Corp) e o volume do tumor calculado (mm3). O cálculo foi realizado de acordo com a expressão a seguir.
[001141] Volume do tumor (mm3) = 1/2 x eixo maior (mm) x [eixo menor (mm)]2
[001142] No dia 11 quando o tamanho do tumor atingiu cerca de 130 mm3, 16 animais foram aleatoriamente divididos em 4 grupos com base no tamanho de seus tumores. No mesmo dia, o conjugado de anti- corpo-fármaco (16a) e/ou U1-59 ou PBS para um grupo de controle foram administrados nas doses a seguir.
[001143] Grupo de Administração: PBS foi injetada intravenosamente na mesma dose única como o conjugado de anticorpo-fármaco.
[001144] Grupo de Administração: U1-59 foi injetado por via intravenosa em uma dose única de 30 mg/kg.
[001145] Grupo de Administração: O conjugado de anticorpo- fármaco (16a) foi injetado por via intravenosa em uma dose única de 3 mg/kg.
[001146] Grupo de Administração: 30 minutos após a administração (injeção intravenosa em uma dose única) de U1-59, o conjugado de anticorpo-fármaco (16a) foi injetado por via intravenosa em uma única dose de 3 mg/kg.
[001147] Os resultados são mostrados na Figura 24. A inibição de crescimento do tumor da linhagem de câncer de mama humano foi ob-servada no Grupo de Administração do conjugado de anticorpo- fármaco comparado com o grupo de controle, enquanto que o efeito inibidor do tumor foi atenuada por administração de U1-59 antemão. Estes resultados demonstraram que o efeito inibidor do tumor do conjugado de anticorpo-fármaco é um efeito farmacêutico mediada por HER3. Nenhuma perda de peso foi observada nos camundongos dos grupos tratados. Exemplo de Teste 17. Conjugado de anticorpo-fármaco (16a) exibiu efeito antitumor em uso combinado com trastuzumabe em ensaio antitumor in vivo usando a linhagem de câncer de mama humano
[001148] Trastuzumabe foi aprovado como um agente terapêutico para o câncer de mama humano HER2-positivo. No entanto, a resistência ao trastuzumabe é conhecida e foi reportado que uma mutação em PIK3CA <H1047R ou H420R> participa em um dos mecanismos subjacentes a esta resistência. Neste teste, foi avaliado se o conjugado de anticorpo-fármaco com ou sem o uso combinado de trastuzu- mabe era eficaz para uma linhagem de câncer de mama resistente ao trastuzumabe.
[001149] Camundongos CAnN.Cg-Foxn1 [Nu] /CrlCrlj (Foxn1nu/Foxn1nu)sem pelo fêmeas de cinco a seis semanas de idade foram usados (Charles River Laboratories Japan, Inc.) com um peso corporal de 15 a 20 g após aclimatação. Os camundongos foram colocados em gaiolas individualmente ventiladas (IVC, 4 camundongos por gaiola no máximo), as quais foram mantidas em temperatura ambiente e umidade constante. Após a randomização, os pesos corporais dos camundongos foram medidos a cada dois dias e os comportamentos dos animais foram registrados todos os dias.
[001150] 1 x 107 células de uma linhagem de células de câncer de mama humano MDA-MB-453 (CLB-22, H1047R mutação em PIK3CA) da ATCC foram misturados e suspensos em Matrigel (PBS: PAA #10010-023, Matrigel: BD #354234) e transplantadas subcutaneamen- te para a região lateral direita do corpo de cada camundongo sem pelo usando uma agulha de 29 G. Os pesos corporais foram medidos usando uma escala de peso (Mettler Toledo PB602-L).
[001151] O eixo maior e o eixo menor do tumor foram medidos usando um calibrador eletrônico digital (CD-15CX, Mitutoyo Corp.) e o volume do tumor calculado (mm3). O cálculo foi realizado de acordo com a expressão a seguir.
[001152] Volume do tumor (mm3) = 1/2 x eixo maior (mm) x [eixo menor (mm)]2
[001153] No dia 11 quando o tamanho do tumor atingiu cerca de 130 mm3, 16 animais foram aleatoriamente divididos em 4 grupos com base no tamanho de seus tumores. No mesmo dia, o conjugado de anti- corpo-fármaco (16a), trastuzumabe, o uso combinada do conjugado e trastuzumabe ou PBS para um grupo de controle foram administrados nas doses a seguir.
[001154] Grupo de Administração: PBS foi injetada intravenosamente na mesma dose única como o conjugado de anticorpo-fármaco.
[001155] Grupo de Administração: trastuzumabe (Roche Diagnostics, Inc.) foi injetado por via intravenosa em uma dose única de 1 mg/kg.
[001156] Grupo de Administração: O conjugado de anticorpo- fármaco (16a) foi injetado por via intravenosa em uma dose única de 3 mg/kg.
[001157] Grupo de Administração: 30 minutos após a administração (injeção intravenosa em uma dose única) de trastuzumabe (Roche Di-agnostics, Inc.), o conjugado de anticorpo-fármaco (16a) foi injetado por via intravenosa em uma única dose de 3 mg/kg.
[001158] Os resultados são mostrados na Figura 25. Observou-se um efeito antitumor provocado pelo uso combinado na linhagem de câncer de mama humano (PIK3CA H1047R) quando de administração de trastuzumabe e do conjugado de anticorpo-fármaco comparado com a administração de cada medicamento individualmente. Estes resultados demonstraram que o efeito farmacêutico do conjugado de an- ticorpo-fármaco é potencializado pelo uso combinado de ambos com trastuzumabe. Nenhuma perda de peso foi observada nos camundongos dos grupos tratados. Em outro teste antitumor usando uma linhagem de células de câncer de mama humano HCC1954 (PIK3CA H1047R), também foi observado o efeito antitumor combinado quando de administração de trastuzumabe e do conjugado de anticorpo- fármaco (16-A) comparado com a administração de cada medicamento individualmente. Exemplo de Teste 18. Conjugado de anticorpo-fármaco (15) exibiu efeito antitumor em uso combinado com trastuzumabe em ensaio antitumor in vivo usando a linhagem de câncer de mama humano
[001159] Trastuzumabe foi aprovado como um agente terapêutico para o câncer de mama humano HER2-positivo. No entanto, a resistência ao trastuzumabe é conhecida e foi reportado que uma mutação em PIK3CA <H1047R ou H420R> participa em um dos mecanismos subjacentes a esta resistência. Neste teste, foi avaliado se o conjugado de anticorpo-fármaco com ou sem o uso combinado de trastuzu- mabe era eficaz para uma linhagem de câncer de mama resistente ao trastuzumabe.
[001160] Camundongos CAnN.Cg-Foxn1 [Nu]/CrlCrlj (Foxn1nu/Foxn1nu)sem pelo fêmeas de cinco a seis semanas de idade foram usados (Charles River Laboratories Japan, Inc.) com um peso corporal de 15 a 20 g após aclimatação. Os camundongos foram colocados em gaiolas individualmente ventiladas (IVC, 4 camundongos por gaiola no máximo), as quais foram mantidas em temperatura am- biente e umidade constante. Após a randomização, os pesos corporais dos camundongos foram medidos a cada dois dias e os comportamentos dos animais foram registrados todos os dias.
[001161] 5 x 106 células de uma linhagem de células de câncer de mama humano JIMT-1 (ACC-589, H420R mutação em PIK3CA) da ATCC foram suspensos em PBS (PAA #10010-023) e transplantadas subcutaneamente para a região lateral direita do corpo de cada ca-mundongo sem pelo usando uma agulha 29 G. Os pesos corporais foram medidos usando uma escala de peso (Mettler Toledo PB602-L).
[001162] O eixo maior e o eixo menor do tumor foram medidos usando um calibrador eletrônico digital (CD-15CX, Mitsutoyo Corp) e o volume do tumor calculado (mm3). O cálculo foi realizado de acordo com a expressão a seguir.
[001163] Volume do tumor (mm3) = 1/2 x eixo maior (mm) x [eixo menor (mm)]2
[001164] No dia 10, quando o tamanho do tumor atingiu cerca de 200 mm3, 24 animais foram aleatoriamente divididos em 4 grupos com base no tamanho de seus tumores. No mesmo dia, o conjugado de anti- corpo-fármaco (15), trastuzumabe, uso combinado do conjugado e trastuzumabe ou PBS para um grupo de controle foram administrados nas doses a seguir.
[001165] Grupo de Administração: PBS foi injetado por via intravenosa uma vez por semana na mesma dose que o conjugado de anticor- po-fármaco.
[001166] Grupo de Administração: trastuzumabe (Roche Diagnostics, Inc.) foi injetado por via intravenosa uma vez por semana a 10 mg/kg.
[001167] Grupo de Administração: O conjugado de anticorpo- fármaco (15) foi injetado por via intravenosa uma vez por semana a 10 mg/kg.
[001168] Grupo de Administração: 30 minutos após a administração (injeção intravenosa, uma vez por semana) de trastuzumabe (Roche Diagnostics, Inc.), o conjugado de anticorpo-fármaco (15) foi injetado por via intravenosa uma vez por semana a 10 mg/kg.
[001169] Os resultados são mostrados na Figura 26. Observou-se um efeito antitumor provocado pelo uso combinado na linhagem de câncer de mama humano (PIK3CA H420R) quando de administração de trastuzumabe e do conjugado de anticorpo-fármaco comparado com a administração de cada medicamento individualmente. Estes resultados demonstraram que o efeito farmacêutico do conjugado de an- ticorpo-fármaco é potencializado pelo uso combinado de ambos com trastuzumabe. Nenhuma perda de peso foi observada nos camundongos dos grupos tratados. Exemplo de Teste 19. Conjugado de anticorpo-fármaco (16a) exibiu efeito antitumor em uso combinado com gefitinibe no ensaio antitumor in vivo usando a linhagem de câncer de pulmão humano
[001170] Gefitinibe foi aprovado como um agente terapêutico para o câncer de pulmão humano. Neste teste, foi avaliado se o uso combinado de tratamento com gefitinibe e o conjugado de anticorpo-fármaco era ou não eficaz.
[001171] Camundongos CAnN.Cg-Foxn1 [Nu] /CrlCrlj (Foxn1nu/Foxn1nu)sem pelo fêmeas de cinco a seis semanas de idade foram usados (Charles River Laboratories Japan, Inc.) com um peso corporal de 15 a 20 g após aclimatação. Os camundongos foram colocados em gaiolas individualmente ventiladas (IVC, 4 camundongos por gaiola no máximo), as quais foram mantidas em temperatura ambiente e umidade constante. Após a randomização, os pesos corporais dos camundongos foram medidos a cada dois dias e os comportamentos dos animais foram registrados todos os dias.
[001172] 3 x 106 células de uma linhagem de células humana do câncer de pulmão de PC-9 (RCB0446) da ATCC foram suspensos em PBS (PAA #10010-023) e transplantadas subcutaneamente para a região lateral direita do corpo de cada camundongo sem pelo usando uma agulha G 29. Os pesos corporais foram medidos usando uma escala de peso (Mettler Toledo PB602-L).
[001173] O eixo maior e o eixo menor do tumor foram medidos usando um calibrador eletrônico digital (CD-15CX, Mitsutoyo Corp) e o volume do tumor calculado (mm3). O cálculo foi realizado de acordo com a expressão a seguir.
[001174] Volume do tumor (mm3) = 1/2 x eixo maior (mm) x [eixo menor (mm)]2
[001175] No dia 14 quando o tamanho do tumor atingiu cerca de 270 mm3, 16 animais foram aleatoriamente divididos em 4 grupos com base no tamanho de seus tumores. No mesmo dia, o conjugado de anti- corpo-fármaco (16a), gefitinibe, uso combinado do conjugado e gefiti- nibe ou PBS para um grupo de controle foram administrados nas doses a seguir.
[001176] Grupo de Administração: PBS foi injetado por via intravenosa uma vez por semana na mesma dose que o conjugado de anticor- po-fármaco.
[001177] Grupo de Administração: Gefitinibe (AstraZeneca) foi admi-nistrado oralmente uma vez por dia a 6 mg/kg.
[001178] Grupo de Administração: O conjugado de anticorpo- fármaco (16a) foi injetado por via intravenosa uma vez por semana a 10 mg/kg.
[001179] Grupo de Administração: 30 minutos após a administração (administração oral uma vez por dia) de gefitinibe (AstraZeneca), o conjugado de anticorpo-fármaco (16a) foi injetado por via intravenosa uma vez por semana a 10 mg/kg.
[001180] Os resultados são mostrados na Figura 27. Observou-se um efeito antitumor provocado pelo uso combinado na linhagem de câncer de pulmão humano quando de administração de gefitinibe e do conjugado de anticorpo-fármaco comparado com a administração de cada medicamento individualmente. Estes resultados demonstraram que o efeito farmacêutico do conjugado de anticorpo-fármaco é potencializado pelo uso combinado com gefitinibe. Nenhuma perda de peso foi observada nos camundongos dos grupos tratados. Exemplo de Teste 20. Conjugado de anticorpo-fármaco (16a) exibiu efeito antitumor em uso combinado com cetuximabe ou panitumumabe em ensaio antitumor in vivo usando a linhagem de câncer de mama humano triplo-negativo
[001181] Um anticorpo anti-EGFR cetuximabe ou panitumumabe está sob ensaio clínico contra o câncer de mama triplo-negativo humano. Neste teste, foi avaliado se o uso combinado de cetuximabe ou pani- tumumabe e o conjugado de anticorpo-fármaco era eficaz.
[001182] Camundongos CAnN.Cg-Foxn1 [Nu] /CrlCrlj (Foxn1nu/Foxn1nu)sem pelo fêmeas de cinco a seis semanas de idade foram usados (Charles River Laboratories Japan, Inc.) com um peso corporal de 15 a 20 g após aclimatação. Os camundongos foram colocados em gaiolas individualmente ventiladas (IVC, 4 camundongos por gaiola no máximo), as quais foram mantidas em temperatura ambiente e umidade constante. Após a randomização, os pesos corporais dos camundongos foram medidos a cada dois dias e os comportamentos dos animais foram registrados todos os dias.
[001183] 5 x 106 células de uma linhagem de câncer de mama hu mano triplo negativo MDA-MB-468 (CRL-2322) da ATCC foram suspensas em uma solução preparada a partir de 200 μL de PBS e Matri- gel (PBS: PAA #10010-023, Matrigel: BD #354234), misturada em uma proporção de 1:1 e transplantadas subcutaneamente para a região lateral direita do corpo de cada camundongo sem pelo usando uma agulha de 29 G. Os pesos corporais foram medidos usando uma escala de peso (Mettler Toledo PB602-L).
[001184] O eixo maior e o eixo menor do tumor foram medidos usando um calibrador eletrônico digital (CD-15CX, Mitsutoyo Corp) e o volume do tumor calculado (mm3). O cálculo foi realizado de acordo com a expressão a seguir.
[001185] Volume do tumor (mm3) = 1/2 x eixo maior (mm) x [eixo menor (mm)]2
[001186] No dia 21 quando o tamanho do tumor atingiu cerca de 160 mm3, 30 animais foram aleatoriamente divididos em 6 grupos com base no tamanho de seus tumores. No mesmo dia, o conjugado de anti- corpo-fármaco (16a), cetuximabe ou panitumumabe, uso combinado do conjugado e cetuximabe ou panitumumabe ou PBS para um grupo de controle foram administrados nas doses a seguir.
[001187] Grupo de Administração: PBS foram administrados na mesma dose única como o conjugado de anticorpo-fármaco.
[001188] Grupo de Administração: Cetuximabe (Bristol-Myers Squibb Company) foi administrado em uma dose única de 10 mg/kg.
[001189] Grupo de Administração: panitumumabe (Amgen Inc.) foi administrado em uma dose única de 10 mg/kg.
[001190] Grupo de Administração: O conjugado de anticorpo- fármaco (16a) foi administrado em uma dose única de 10 mg/kg.
[001191] Grupo de Administração: 30 minutos após a administração (administração de uma dose única) do cetuximabe (Bristol-Myers Squibb Company), o conjugado de anticorpo-fármaco (16a) foi administrado em uma dose única de 10 mg/kg.
[001192] Grupo de Administração: 30 minutos após a administração (administração de uma dose única) do panitumumabe (Amgen Inc.), o conjugado de anticorpo-fármaco (16a) foi administrado em uma dose única de 10 mg/kg.
[001193] Os resultados são mostrados na Figura 28. Observou-se um efeito antitumor provocado pelo uso combinado na linhagem de câncer de mama humano triplo negativo quando de administração de cetuximabe (Figura 28A) ou panitumumabe (Figura 28B) e o conjugado de anticorpo-fármaco comparado com a administração de cada medicamento individualmente. Estes resultados demonstraram que o efeito farmacêutico do conjugado de anticorpo-fármaco é potencializado pelo uso combinado de ambos com cetuximabe ou panitumumabe. Nenhuma perda de peso foi observada nos camundongos dos grupos tratados. O efeito antitumor provocado pelo uso combinado em outra linhagem de células de câncer de mama humano triplo negativo MDA- MB-231 também foi observado quando de administração de cetuxima- be ou panitumumabe e o conjugado de anticorpo-fármaco (16a) comparado com a administração de cada medicamento individualmente. Exemplo de Teste 21. Conjugado de anticorpo-fármaco (16a) exibiu efeito antitumor em uso combinado com cetuximabe ou panitumumabe em ensaio antitumor in vivo usando a linhagem de câncer de pescoço e cabeça humano
[001194] Um anticorpo anti-EGFR cetuximabe foi aprovado contra o câncer de cabeça e pescoço humano, embora o panitumumabe esteja sob ensaio clínico contra esse tipo de câncer. Neste teste, foi avaliado se o uso combinado de cetuximabe ou panitumumabe e o conjugado de anticorpo-fármaco era eficaz.
[001195] Camundongos CAnN.Cg-Foxn1 [Nu] /CrlCrlj (Foxn1nu/Foxn1nu)sem pelo fêmeas de cinco a seis semanas de idade foram usados (Charles River Laboratories Japan, Inc.) com um peso corporal de 15 a 20 g após aclimatação. Os camundongos foram colocados em gaiolas individualmente ventiladas (IVC, 4 camundongos por gaiola no máximo), as quais foram mantidas em temperatura ambiente e umidade constante. Após a randomização, os pesos corporais dos camundongos foram medidos a cada dois dias e os comportamen- tos dos animais foram registrados todos os dias.
[001196] 4 x 106 células de uma linha da cabeça e pescoço de célu las de câncer humano FaDu (HTB-43) da ATCC foram suspensas em 200 DL de PBS (PAA #10010-023) e subcutaneamente transplantado para a área do lado direito do corpo de cada camundongo sem pelo usando uma agulha de 29 G. Os pesos corporais foram medidos usando uma escala de peso (Mettler Toledo PB602-L).
[001197] O eixo maior e o eixo menor do tumor foram medidos usando um calibrador eletrônico digital (CD-15CX, Mitsutoyo Corp) e o volume do tumor calculado (mm3). O cálculo foi realizado de acordo com a expressão a seguir.
[001198] Volume do tumor (mm3) = 1/2 x eixo maior (mm) x [eixo menor (mm)]2
[001199] No Dia 6, quando o tamanho do tumor atingiu aproximadamente 330 mm3, 30 animais foram aleatoriamente divididos em 6 grupos com base no tamanho de seus tumores. No mesmo dia, o conjugado de anticorpo-fármaco (16a), cetuximabe ou panitumumabe, uso combinado do conjugado e cetuximabe ou panitumumabe ou PBS para um grupo de controle foram administrados nas doses a seguir.
[001200] Grupo de Administração: PBS foram administrados na mesma dose única como o conjugado de anticorpo-fármaco.
[001201] Grupo de Administração: Cetuximabe (Bristol-Myers Squibb Company) foi administrado em uma dose única de 5 mg/kg.
[001202] Grupo de Administração: panitumumabe (Amgen Inc.) foi administrado em uma dose única de 5 mg/kg.
[001203] Grupo de Administração: O conjugado de anticorpo- fármaco (16a) foi administrado em uma dose única de 10 mg/kg.
[001204] Grupo de Administração: 30 minutos após a administração (administração de uma dose única) do cetuximabe (Bristol-Myers Squibb Company), o conjugado de anticorpo-fármaco (16a) foi admi- nistrado em uma dose única de 10 mg/kg.
[001205] Grupo de Administração: 30 minutos após a administração (administração de uma dose única) do panitumumabe (Amgen Inc.), o conjugado de anticorpo-fármaco (16a) foi administrado em uma dose única de 10 mg/kg.
[001206] Os resultados são mostrados na Figura 29. Observou-se um efeito antitumor provocado pelo uso combinado na linhagem de câncer da cabeça e pescoço humano quando de administração de ce- tuximabe (Figura 29A) ou panitumumabe (Figura 29B) e o conjugado de anticorpo-fármaco comparado com o administração de cada medicamento individualmente. Estes resultados demonstraram que o efeito farmacêutico do conjugado de anticorpo-fármaco é potencializado pelo uso combinada de ambos, com cetuximabe ou panitumumabe. Nenhuma perda de peso foi observada nos camundongos dos grupos tratados. Exemplo de Teste 22. Conjugado de anticorpo-fármaco (16a) exibiu efeito antitumor em uso combinado com cetuximabe ou pertuzumabe no ensaio antitumor in vivo pelo transplante de tumor de um paciente com câncer de estômago
[001207] Um anticorpo anti-EGFR cetuximabe e um anticorpo anti- HER2 pertuzumabe estão sob ensaio clínico contra o câncer de estômago humano. Neste teste, foi avaliado se o uso combinado de cetu- ximabe ou pertuzumabe e o conjugado de anticorpo-fármaco era eficaz. A avaliação foi realizada executando um teste antitumor próximo de condições clínicas envolvendo o estroma de um paciente usando os tumores derivados de pacientes transplantados em murinos, em vez do sistema de avaliação em geral usando uma linhagem de câncer humano.
[001208] Camundongos CAnN.Cg-Foxn1 [Nu] /CrlCrlj (Foxn1nu/Foxn1nu)sem pelo fêmeas de cinco a seis semanas de ida- de foram usados (Charles River Laboratories Japan, Inc.) com um peso corporal de 15 a 20 g após aclimatação. Os camundongos foram colocados em gaiolas individualmente ventiladas (IVC, 4 camundongos por gaiola no máximo), as quais foram mantidas em temperatura ambiente e umidade constante. Após a randomização, os pesos corporais dos camundongos foram medidos a cada dois dias e os comportamentos dos animais foram registrados todos os dias.
[001209] Um tumor derivado do paciente com câncer do estômago NIBIO-G016 do Instituto Nacional de Inovação Biomédica foi transplantado subcutaneamente para a área do lado direito do corpo de cada camundongo nu. Os pesos corporais foram medidos usando uma escala de peso (Mettler Toledo PB602-L).
[001210] O eixo maior e o eixo menor do tumor foram medidos usando um calibrador eletrônico digital (CD-15CX, Mitsutoyo Corp) e o volume do tumor calculado (mm3). O cálculo foi realizado de acordo com a expressão a seguir.
[001211] Volume do tumor (mm3) = 1/2 x eixo maior (mm) x [eixo menor (mm)]2
[001212] No dia 56 quando o tamanho do tumor atingiu cerca de 220 mm3, 30 animais foram aleatoriamente divididos em 6 grupos com base no tamanho de seus tumores. No mesmo dia, o conjugado de anti- corpo-fármaco (16a), cetuximabe ou pertuzumabe, uso combinado do conjugado e cetuximabe ou pertuzumabe ou PBS para um grupo de controle foram administrados nas doses a seguir.
[001213] Grupo de Administração: PBS foram administrados na mesma dose única como o conjugado de anticorpo-fármaco.
[001214] Grupo de Administração: Cetuximabe (Bristol-Myers Squibb Company) foi administrado em uma dose única de 10 mg/kg.
[001215] Grupo de Administração: pertuzumabe (Roche Diagnostics, Inc.) foi administrado em uma dose única de 10 mg/kg.
[001216] Grupo de Administração: O conjugado de anticorpo- fármaco (16a) foi administrado em uma dose única de 10 mg/kg.
[001217] Grupo de Administração: 30 minutos após a administração (administração de uma dose única) do cetuximabe (Bristol-Myers Squibb Company), o conjugado de anticorpo-fármaco (16a) foi administrado em uma dose única de 10 mg/kg.
[001218] Grupo de Administração: 30 minutos após a administração (administração de uma dose única) de pertuzumabe (Roche Diagnostics, Inc.), o conjugado de anticorpo-fármaco (16a) foi administrado em uma dose única de 10 mg/kg.
[001219] Os resultados são mostrados na Figura 30. Observou-se um efeito antitumor provocado pelo uso combinado no modelo de tumor derivado de um paciente com câncer de estômago quando de administração de cetuximabe (Figura 30A) ou pertuzumabe (Figura 30B) e o conjugado de anticorpo-fármaco comparado com a administração de cada medicamento individualmente. Estes resultados demonstraram que o efeito farmacêutico do conjugado de anticorpo- fármaco é potencializado pelo uso combinada de ambos com cetuxi- mabe ou panitumumabe no modelo de tumor derivado de um paciente. Nenhuma perda de peso foi observada nos camundongos dos grupos tratados. Além disso, em um ensaio de antitumor usando uma linhagem de células de câncer pancreático humano BxPC3, o conjugado de anticorpo-fármaco (13) exibiu um efeito antitumor mais forte comparado com o Grupo de Administração de PBS ou o Grupo de Administração de U1-59. O conjugado de anticorpo-fármaco também exibiu um efeito antitumor forte no modelo antitumor in vivo usando uma linhagem de células de câncer de mama JIMT1 positivo para HER2 que tinha adquirido resistência uso combinado de trastuzumabe e per- tuzumabe ou entansina trastuzumabe. Exemplo de Teste 23. Segurança de conjugado de anticorpo-fármaco para animais não humanos
[001220] O conjugado de anticorpo -fármaco anti-HER3 da presente invenção e a composição farmacêutica que contém este conjugado de anticorpo -fármaco anti-HER3 apresenta excelente segurança como um agente terapêutico ou profilático para uma doença. Por exemplo, quando o conjugado de anticorpo-fármaco (5), (10) ou (13) foi administrado até 30 mg/kg a um camundongo mestiço, duas vezes no total, com um intervalo de uma vez por semana, nenhum achado grave de toxicidade foram observados a partir de qualquer um dos conjugados de anticorpo-fármaco como um resultado de observação até ao dia 7 após a administração final. Além disso, quando o conjugado de anti- corpo-fármaco (5), (10) ou (13) foi administrado até 30 mg/kg a um macaco mestiço, nenhuma toxicidade acentuada foi observada a partir de qualquer um dos conjugados de anticorpo-fármaco como um resultado de observação durante 7 dias.
[001221] Além disso, quando o conjugado de anticorpo-fármaco (5), (10) ou (13) foi administrado em uma pluralidade de doses a um macaco (intervalos de 3 semanas), nenhuma toxicidade acentuada foi observada a partir de qualquer um dos conjugados de anticorpo-fármaco como um resultado da observação. Consequentemente, o conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção apresenta uma excelente segurança como uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de uma doença. Texto Livre de Listagem de Sequência
[001222] SEQ ID NO: 1 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-39
[001223] SEQ ID NO: 2 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-39
[001224] SEQ ID NO: 3 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-39
[001225] SEQ ID NO: 4 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-39
[001226] SEQ ID NO: 5 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-40
[001227] SEQ ID NO: 6 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-40
[001228] SEQ ID NO: 7 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-40
[001229] SEQ ID NO: 8 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-40
[001230] SEQ ID NO: 9 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-38
[001231] SEQ ID NO: 10 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-38
[001232] SEQ ID NO: 11 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-38
[001233] SEQ ID NO: 12 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-38
[001234] SEQ ID NO: 13 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-41
[001235] SEQ ID NO: 14 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-41
[001236] SEQ ID NO: 15 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-41
[001237] SEQ ID NO: 16 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-41
[001238] SEQ ID NO: 17 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-42
[001239] SEQ ID NO: 18 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-42
[001240] SEQ ID NO: 19 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-42
[001241] SEQ ID NO: 20 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-42
[001242] SEQ ID NO: 21 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-43
[001243] SEQ ID NO: 22 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-43
[001244] SEQ ID NO: 23 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-43
[001245] SEQ ID NO: 24 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-43
[001246] SEQ ID NO: 25 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-44
[001247] SEQ ID NO: 26 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-44
[001248] SEQ ID NO: 27 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-44
[001249] SEQ ID NO: 28 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-44
[001250] SEQ ID NO: 29 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-45
[001251] SEQ ID NO: 30 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-45
[001252] SEQ ID NO: 31 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-45
[001253] SEQ ID NO: 32 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-45
[001254] SEQ ID NO: 33 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-46
[001255] SEQ ID NO: 34 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-46
[001256] SEQ ID NO: 35 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-47
[001257] SEQ ID NO: 36 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-47
[001258] SEQ ID NO: 37 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-47
[001259] SEQ ID NO: 38 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-47
[001260] SEQ ID NO: 39 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-48
[001261] SEQ ID NO: 40 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-48
[001262] SEQ ID NO: 41 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-49
[001263] SEQ ID NO: 42 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-49
[001264] SEQ ID NO: 43 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-49
[001265] SEQ ID NO: 44 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-49
[001266] SEQ ID NO: 45 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-50
[001267] SEQ ID NO: 46 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-50
[001268] SEQ ID NO: 47 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-50
[001269] SEQ ID NO: 48 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-50
[001270] SEQ ID NO: 49 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-51
[001271] SEQ ID NO: 50 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-51
[001272] SEQ ID NO: 51 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-51
[001273] SEQ ID NO: 52 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-51
[001274] SEQ ID NO: 53 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-53
[001275] SEQ ID NO: 54 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-53
[001276] SEQ ID NO: 55 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-53
[001277] SEQ ID NO: 56 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-53
[001278] SEQ ID NO: 57 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-55
[001279] SEQ ID NO: 58 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-55
[001280] SEQ ID NO: 59 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-55.1
[001281] SEQ ID NO: 60 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-55.1
[001282] SEQ ID NO: 61 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-57
[001283] SEQ ID NO: 62 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-57
[001284] SEQ ID NO: 63 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-57.1
[001285] SEQ ID NO: 64 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-57.1
[001286] SEQ ID NO: 65 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-58
[001287] SEQ ID NO: 66 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-58
[001288] SEQ ID NO: 67 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-58
[001289] SEQ ID NO: 68 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-58
[001290] SEQ ID NO: 69 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-59
[001291] SEQ ID NO: 70 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-59
[001292] SEQ ID NO: 71 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-59
[001293] SEQ ID NO: 72 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-59
[001294] SEQ ID NO: 73 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-52
[001295] SEQ ID NO: 74 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-52
[001296] SEQ ID NO: 75 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-52
[001297] SEQ ID NO: 76 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-52
[001298] SEQ ID NO: 77 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-61
[001299] SEQ ID NO: 78 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-61
[001300] SEQ ID NO: 79 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-61.1
[001301] SEQ ID NO: 80 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-61.1
[001302] SEQ ID NO: 81 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-61.1
[001303] SEQ ID NO: 82 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-61.1
[001304] SEQ ID NO: 83 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-62
[001305] SEQ ID NO: 84 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-62
[001306] SEQ ID NO: 85 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-62
[001307] SEQ ID NO: 86 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-62
[001308] SEQ ID NO: 87 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-2
[001309] SEQ ID NO: 88 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-2
[001310] SEQ ID NO: 89 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-2
[001311] SEQ ID NO: 90 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-2
[001312] SEQ ID NO: 91 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-7
[001313] SEQ ID NO: 92 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-7
[001314] SEQ ID NO: 93 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-7
[001315] SEQ ID NO: 94 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-7
[001316] SEQ ID NO: 95 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-9
[001317] SEQ ID NO: 96 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-9
[001318] SEQ ID NO: 97 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-9
[001319] SEQ ID NO: 98 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-9
[001320] SEQ ID NO: 99 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-10
[001321] SEQ ID NO: 100 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-10
[001322] SEQ ID NO: 101 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-10
[001323] SEQ ID NO: 102 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-10
[001324] SEQ ID NO: 103 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-12
[001325] SEQ ID NO: 104 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-12
[001326] SEQ ID NO: 105 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-12
[001327] SEQ ID NO: 106 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-12
[001328] SEQ ID NO: 107 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-13
[001329] SEQ ID NO: 108 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-13
[001330] SEQ ID NO: 109 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-13
[001331] SEQ ID NO: 110 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-13
[001332] SEQ ID NO: 111 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-14
[001333] SEQ ID NO: 112 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-14
[001334] SEQ ID NO: 113 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-14
[001335] SEQ ID NO: 114 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-14
[001336] SEQ ID NO: 115 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-15
[001337] SEQ ID NO: 116 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-15
[001338] SEQ ID NO: 117 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-15
[001339] SEQ ID NO: 118 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-15
[001340] SEQ ID NO: 119 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-19
[001341] SEQ ID NO: 120 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-19
[001342] SEQ ID NO: 121 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-20
[001343] SEQ ID NO: 122 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-20
[001344] SEQ ID NO: 123 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anti-corpo anti-HER3 humano U1-20
[001345] SEQ ID NO: 124 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-20
[001346] SEQ ID NO: 125 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-21
[001347] SEQ ID NO: 126 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-21
[001348] SEQ ID NO: 127 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-21
[001349] SEQ ID NO: 128 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-21
[001350] SEQ ID NO: 129 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-22
[001351] SEQ ID NO: 130 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-22
[001352] SEQ ID NO: 131 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-22
[001353] SEQ ID NO: 132 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-22
[001354] SEQ ID NO: 133 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-23
[001355] SEQ ID NO: 134 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-23
[001356] SEQ ID NO: 135 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anti-corpo anti-HER3 humano U1-23
[001357] SEQ ID NO: 136 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-23
[001358] SEQ ID NO: 137 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-24
[001359] SEQ ID NO: 138 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-24
[001360] SEQ ID NO: 139 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-24
[001361] SEQ ID NO: 140 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-24
[001362] SEQ ID NO: 141 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-25
[001363] SEQ ID NO: 142 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-25
[001364] SEQ ID NO: 143 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-25
[001365] SEQ ID NO: 144 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-25
[001366] SEQ ID NO: 145 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-26
[001367] SEQ ID NO: 146 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-26
[001368] SEQ ID NO: 147 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anti-corpo anti-HER3 humano U1-26
[001369] SEQ ID NO: 148 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-26
[001370] SEQ ID NO: 149 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-27
[001371] SEQ ID NO: 150 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-27
[001372] SEQ ID NO: 151 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-27
[001373] SEQ ID NO: 152 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-27
[001374] SEQ ID NO: 153 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-28
[001375] SEQ ID NO: 154 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-28
[001376] SEQ ID NO: 155 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-28
[001377] SEQ ID NO: 156 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-28
[001378] SEQ ID NO: 157 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-31
[001379] SEQ ID NO: 158 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-31
[001380] SEQ ID NO: 159 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anti-corpo anti-HER3 humano U1-31
[001381] SEQ ID NO: 160 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-31
[001382] SEQ ID NO: 161 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-32
[001383] SEQ ID NO: 162 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-32
[001384] SEQ ID NO: 163 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-32
[001385] SEQ ID NO: 164 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-32
[001386] SEQ ID NO: 165 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-35
[001387] SEQ ID NO: 166 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-35
[001388] SEQ ID NO: 167 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-35
[001389] SEQ ID NO: 168 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-35
[001390] SEQ ID NO: 169 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-36
[001391] SEQ ID NO: 170 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-36
[001392] SEQ ID NO: 171 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anti-corpo anti-HER3 humano U1-36
[001393] SEQ ID NO: 172 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-36
[001394] SEQ ID NO: 173 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-37
[001395] SEQ ID NO: 174 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-37
[001396] SEQ ID NO: 175 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-37
[001397] SEQ ID NO: 176 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-37
[001398] SEQ ID NO: 177 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-34
[001399] SEQ ID NO: 178 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-34
[001400] SEQ ID NO: 179 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-34
[001401] SEQ ID NO: 180 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-34
[001402] SEQ ID NO: 181 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-1
[001403] SEQ ID NO: 182 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-1
[001404] SEQ ID NO: 183 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anti-corpo anti-HER3 humano U1-1
[001405] SEQ ID NO: 184 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-1
[001406] SEQ ID NO: 185 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-3
[001407] SEQ ID NO: 186 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-3
[001408] SEQ ID NO: 187 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-3
[001409] SEQ ID NO: 188 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-3
[001410] SEQ ID NO: 189 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-4
[001411] SEQ ID NO: 190 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-4
[001412] SEQ ID NO: 191 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-4
[001413] SEQ ID NO: 192 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-4
[001414] SEQ ID NO: 193 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-5
[001415] SEQ ID NO: 194 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-5
[001416] SEQ ID NO: 195 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anti-corpo anti-HER3 humano U1-5
[001417] SEQ ID NO: 196 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-5
[001418] SEQ ID NO: 197 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-6
[001419] SEQ ID NO: 198 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-6
[001420] SEQ ID NO: 199 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-6
[001421] SEQ ID NO: 200 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-6
[001422] SEQ ID NO: 201 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-8
[001423] SEQ ID NO: 202 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-8
[001424] SEQ ID NO: 203 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-8
[001425] SEQ ID NO: 204 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-8
[001426] SEQ ID NO: 205 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-11
[001427] SEQ ID NO: 206 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-11
[001428] SEQ ID NO: 207 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anti-corpo anti-HER3 humano U1-11
[001429] SEQ ID NO: 208 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-11
[001430] SEQ ID NO: 209 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-16
[001431] SEQ ID NO: 210 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-16
[001432] SEQ ID NO: 211 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-16
[001433] SEQ ID NO: 212 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-16
[001434] SEQ ID NO: 213 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-17
[001435] SEQ ID NO: 214 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-17
[001436] SEQ ID NO: 215 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-17
[001437] SEQ ID NO: 216 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-17
[001438] SEQ ID NO: 217 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-18
[001439] SEQ ID NO: 218 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-18
[001440] SEQ ID NO: 219 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anti-corpo anti-HER3 humano U1-18
[001441] SEQ ID NO: 220 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-18
[001442] SEQ ID NO: 221 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-33
[001443] SEQ ID NO: 222 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-33
[001444] SEQ ID NO: 223 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-33
[001445] SEQ ID NO: 224 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-33
[001446] SEQ ID NO: 225 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-29
[001447] SEQ ID NO: 226 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-29
[001448] SEQ ID NO: 227 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-29
[001449] SEQ ID NO: 228 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-29
[001450] SEQ ID NO: 229 - Sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-30
[001451] SEQ ID NO: 230 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-30
[001452] SEQ ID NO: 231 - Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anti-corpo anti-HER3 humano U1-30
[001453] SEQ ID NO: 232 - Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-30
[001454] SEQ ID NO: 233 - Iniciador
[001455] SEQ ID NO: 234 - Iniciador
[001456] SEQ ID NO: 235 - Sequência de aminoácidos de CDRH1 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-1
[001457] SEQ ID NO: 236 - Sequência de aminoácidos de CDRH2 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-1
[001458] SEQ ID NO: 237 - Sequência de aminoácidos de CDRH3 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-1
[001459] SEQ ID NO: 238 - Sequência de aminoácidos de CDRL1 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-1
[001460] SEQ ID NO: 239 - Sequência de aminoácidos de CDRL2 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-1
[001461] SEQ ID NO: 240 - Sequência de aminoácidos de CDRL3 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-1
[001462] SEQ ID NO: 241 - Sequência de aminoácidos de CDRH1 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-2
[001463] SEQ ID NO: 242 - Sequência de aminoácidos de CDRH2 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-2
[001464] SEQ ID NO: 243 - Sequência de aminoácidos de CDRH3 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-2
[001465] SEQ ID NO: 244 - Sequência de aminoácidos de CDRL1 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-2
[001466] SEQ ID NO: 245 - Sequência de aminoácidos de CDRL2 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-2
[001467] SEQ ID NO: 246 - Sequência de aminoácidos de CDRL3 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-2
[001468] SEQ ID NO: 247 - Sequência de aminoácidos de CDRH1 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-3
[001469] SEQ ID NO: 248 - Sequência de aminoácidos de CDRH2 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-3
[001470] SEQ ID NO: 249 - Sequência de aminoácidos de CDRH3 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-3
[001471] SEQ ID NO: 250 - Sequência de aminoácidos de CDRL1 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-3
[001472] SEQ ID NO: 251 - Sequência de aminoácidos de CDRL2 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-3
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[001631] SEQ ID NO: 410 - Sequência de aminoácidos de CDRL2 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-30
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[001635] SEQ ID NO: 414 - Sequência de aminoácidos de CDRH3 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-31
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[001639] SEQ ID NO: 418 - Sequência de aminoácidos de CDRH1 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-32
[001640] SEQ ID NO: 419 - Sequência de aminoácidos de CDRH2 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-32
[001641] SEQ ID NO: 420 - Sequência de aminoácidos de CDRH3 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-32
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[001645] SEQ ID NO: 424 - Sequência de aminoácidos de CDRH1 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-33
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[001656] SEQ ID NO: 435 - Sequência de aminoácidos de CDRL3 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-34
[001657] SEQ ID NO: 436 - Sequência de aminoácidos de CDRH1 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-35
[001658] SEQ ID NO: 437 - Sequência de aminoácidos de CDRH2 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-35
[001659] SEQ ID NO: 438 - Sequência de aminoácidos de CDRH3 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-35
[001660] SEQ ID NO: 439 - Sequência de aminoácidos de CDRL1 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-35
[001661] SEQ ID NO: 440 - Sequência de aminoácidos de CDRL2 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-35
[001662] SEQ ID NO: 441 - Sequência de aminoácidos de CDRL3 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-35
[001663] SEQ ID NO: 442 - Sequência de aminoácidos de CDRH1 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-36
[001664] SEQ ID NO: 443 - Sequência de aminoácidos de CDRH2 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-36
[001665] SEQ ID NO: 444 - Sequência de aminoácidos de CDRH3 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-36
[001666] SEQ ID NO: 445 - Sequência de aminoácidos de CDRL1 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-36
[001667] SEQ ID NO: 446 - Sequência de aminoácidos de CDRL2 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-36
[001668] SEQ ID NO: 447 - Sequência de aminoácidos de CDRL3 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-36
[001669] SEQ ID NO: 448 - Sequência de aminoácidos de CDRH1 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-37
[001670] SEQ ID NO: 449 - Sequência de aminoácidos de CDRH2 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-37
[001671] SEQ ID NO: 450 - Sequência de aminoácidos de CDRH3 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-37
[001672] SEQ ID NO: 451 - Sequência de aminoácidos de CDRL1 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-37
[001673] SEQ ID NO: 452 - Sequência de aminoácidos de CDRL2 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-37
[001674] SEQ ID NO: 453 - Sequência de aminoácidos de CDRL3 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-37
[001675] SEQ ID NO: 454 - Sequência de aminoácidos de CDRH1 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-38
[001676] SEQ ID NO: 455 - Sequência de aminoácidos de CDRH2 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-38
[001677] SEQ ID NO: 456 - Sequência de aminoácidos de CDRH3 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-38
[001678] SEQ ID NO: 457 - Sequência de aminoácidos de CDRL1 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-38
[001679] SEQ ID NO: 458 - Sequência de aminoácidos de CDRL2 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-38
[001680] SEQ ID NO: 459 - Sequência de aminoácidos de CDRL3 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-38
[001681] SEQ ID NO: 460 - Sequência de aminoácidos de CDRH1 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-39
[001682] SEQ ID NO: 461 - Sequência de aminoácidos de CDRH2 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-39
[001683] SEQ ID NO: 462 - Sequência de aminoácidos de CDRH3 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-39
[001684] SEQ ID NO: 463 - Sequência de aminoácidos de CDRL1 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-39
[001685] SEQ ID NO: 464 - Sequência de aminoácidos de CDRL2 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-39
[001686] SEQ ID NO: 465 - Sequência de aminoácidos de CDRL3 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-39
[001687] SEQ ID NO: 466 - Sequência de aminoácidos de CDRH1 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-40
[001688] SEQ ID NO: 467 - Sequência de aminoácidos de CDRH2 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-40
[001689] SEQ ID NO: 468 - Sequência de aminoácidos de CDRH3 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-40
[001690] SEQ ID NO: 469 - Sequência de aminoácidos de CDRL1 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-40
[001691] SEQ ID NO: 470 - Sequência de aminoácidos de CDRL2 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-40
[001692] SEQ ID NO: 471 - Sequência de aminoácidos de CDRL3 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-40
[001693] SEQ ID NO: 472 - Sequência de aminoácidos de CDRH1 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-41
[001694] SEQ ID NO: 473 - Sequência de aminoácidos de CDRH2 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-41
[001695] SEQ ID NO: 474 - Sequência de aminoácidos de CDRH3 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-41
[001696] SEQ ID NO: 475 - Sequência de aminoácidos de CDRL1 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-41
[001697] SEQ ID NO: 476 - Sequência de aminoácidos de CDRL2 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-41
[001698] SEQ ID NO: 477 - Sequência de aminoácidos de CDRL3 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-41
[001699] SEQ ID NO: 478 - Sequência de aminoácidos de CDRH1 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-42
[001700] SEQ ID NO: 479 - Sequência de aminoácidos de CDRH2 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-42
[001701] SEQ ID NO: 480 - Sequência de aminoácidos de CDRH3 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-42
[001702] SEQ ID NO: 481 - Sequência de aminoácidos de CDRL1 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-42
[001703] SEQ ID NO: 482 - Sequência de aminoácidos de CDRL2 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-42
[001704] SEQ ID NO: 483 - Sequência de aminoácidos de CDRL3 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-42
[001705] SEQ ID NO: 484 - Sequência de aminoácidos de CDRH1 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-43
[001706] SEQ ID NO: 485 - Sequência de aminoácidos de CDRH2 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-43
[001707] SEQ ID NO: 486 - Sequência de aminoácidos de CDRH3 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-43
[001708] SEQ ID NO: 487 - Sequência de aminoácidos de CDRL1 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-43
[001709] SEQ ID NO: 488 - Sequência de aminoácidos de CDRL2 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-43
[001710] SEQ ID NO: 489 - Sequência de aminoácidos de CDRL3 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-43
[001711] SEQ ID NO: 490 - Sequência de aminoácidos de CDRH1 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-44
[001712] SEQ ID NO: 491 - Sequência de aminoácidos de CDRH2 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-44
[001713] SEQ ID NO: 492 - Sequência de aminoácidos de CDRH3 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-44
[001714] SEQ ID NO: 493 - Sequência de aminoácidos de CDRL1 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-44
[001715] SEQ ID NO: 494 - Sequência de aminoácidos de CDRL2 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-44
[001716] SEQ ID NO: 495 - Sequência de aminoácidos de CDRL3 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-44
[001717] SEQ ID NO: 496 - Sequência de aminoácidos de CDRH1 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-45
[001718] SEQ ID NO: 497 - Sequência de aminoácidos de CDRH2 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-45
[001719] SEQ ID NO: 498 - Sequência de aminoácidos de CDRH3 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-45
[001720] SEQ ID NO: 499 - Sequência de aminoácidos de CDRL1 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-45
[001721] SEQ ID NO: 500 - Sequência de aminoácidos de CDRL2 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-45
[001722] SEQ ID NO: 501 - Sequência de aminoácidos de CDRL3 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-45
[001723] SEQ ID NO: 502 - Sequência de aminoácidos de CDRH1 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-46
[001724] SEQ ID NO: 503 - Sequência de aminoácidos de CDRH2 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-46
[001725] SEQ ID NO: 504 - Sequência de aminoácidos de CDRH3 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-46
[001726] SEQ ID NO: 505 - Sequência de aminoácidos de CDRH1 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-47
[001727] SEQ ID NO: 506 - Sequência de aminoácidos de CDRH2 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-47
[001728] SEQ ID NO: 507 - Sequência de aminoácidos de CDRH3 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-47
[001729] SEQ ID NO: 508 - Sequência de aminoácidos de CDRL1 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-47
[001730] SEQ ID NO: 509 - Sequência de aminoácidos de CDRL2 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-47
[001731] SEQ ID NO: 510 - Sequência de aminoácidos de CDRL3 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-47
[001732] SEQ ID NO: 511 - Sequência de aminoácidos de CDRH1 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-48
[001733] SEQ ID NO: 512 - Sequência de aminoácidos de CDRH2 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-48
[001734] SEQ ID NO: 513 - Sequência de aminoácidos de CDRH3 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-48
[001735] SEQ ID NO: 514 - Sequência de aminoácidos de CDRH1 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-49
[001736] SEQ ID NO: 515 - Sequência de aminoácidos de CDRH2 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-49
[001737] SEQ ID NO: 516 - Sequência de aminoácidos de CDRH3 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-49
[001738] SEQ ID NO: 517 - Sequência de aminoácidos de CDRL1 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-49
[001739] SEQ ID NO: 518 - Sequência de aminoácidos de CDRL2 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-49
[001740] SEQ ID NO: 519 - Sequência de aminoácidos de CDRL3 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-49
[001741] SEQ ID NO: 520 - Sequência de aminoácidos de CDRH1 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-50
[001742] SEQ ID NO: 521 - Sequência de aminoácidos de CDRH2 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-50
[001743] SEQ ID NO: 522 - Sequência de aminoácidos de CDRH3 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-50
[001744] SEQ ID NO: 523 - Sequência de aminoácidos de CDRL1 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-50
[001745] SEQ ID NO: 524 - Sequência de aminoácidos de CDRL2 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-50
[001746] SEQ ID NO: 525 - Sequência de aminoácidos de CDRL3 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-50
[001747] SEQ ID NO: 526 - Sequência de aminoácidos de CDRH1 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-51
[001748] SEQ ID NO: 527 - Sequência de aminoácidos de CDRH2 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-51
[001749] SEQ ID NO: 528 - Sequência de aminoácidos de CDRH3 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-51
[001750] SEQ ID NO: 529 - Sequência de aminoácidos de CDRL1 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-51
[001751] SEQ ID NO: 530 - Sequência de aminoácidos de CDRL2 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-51
[001752] SEQ ID NO: 531 - Sequência de aminoácidos de CDRL3 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-51
[001753] SEQ ID NO: 532 - Sequência de aminoácidos de CDRH1 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-52
[001754] SEQ ID NO: 533 - Sequência de aminoácidos de CDRH2 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-52
[001755] SEQ ID NO: 534 - Sequência de aminoácidos de CDRH3 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-52
[001756] SEQ ID NO: 535 - Sequência de aminoácidos de CDRL1 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-52
[001757] SEQ ID NO: 536 - Sequência de aminoácidos de CDRL2 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-52
[001758] SEQ ID NO: 537 - Sequência de aminoácidos de CDRL3 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-52
[001759] SEQ ID NO: 538 - Sequência de aminoácidos de CDRH1 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-53
[001760] SEQ ID NO: 539 - Sequência de aminoácidos de CDRH2 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-53
[001761] SEQ ID NO: 540 - Sequência de aminoácidos de CDRH3 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-53
[001762] SEQ ID NO: 541 - Sequência de aminoácidos de CDRL1 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-53
[001763] SEQ ID NO: 542 - Sequência de aminoácidos de CDRL2 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-53
[001764] SEQ ID NO: 543 - Sequência de aminoácidos de CDRL3 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-53
[001765] SEQ ID NO: 544 - Sequência de aminoácidos de CDRH1 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-55.1
[001766] SEQ ID NO: 545 - Sequência de aminoácidos de CDRH2 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-55.1
[001767] SEQ ID NO: 546 - Sequência de aminoácidos de CDRH3 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-55.1
[001768] SEQ ID NO: 547 - Sequência de aminoácidos de CDRL1 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-55
[001769] SEQ ID NO: 548 - Sequência de aminoácidos de CDRL2 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-55
[001770] SEQ ID NO: 549 - Sequência de aminoácidos de CDRL3 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-55
[001771] SEQ ID NO: 550 - Sequência de aminoácidos de CDRL1 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-57.1
[001772] SEQ ID NO: 551 - Sequência de aminoácidos de CDRL2 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-57.1
[001773] SEQ ID NO: 552 - Sequência de aminoácidos de CDRL3 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-57.1
[001774] SEQ ID NO: 553 - Sequência de aminoácidos de CDRH1 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-57
[001775] SEQ ID NO: 554 - Sequência de aminoácidos de CDRH2 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-57
[001776] SEQ ID NO: 555 - Sequência de aminoácidos de CDRH3 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-57
[001777] SEQ ID NO: 556 - Sequência de aminoácidos de CDRH1 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-58
[001778] SEQ ID NO: 557 - Sequência de aminoácidos de CDRH2 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-58
[001779] SEQ ID NO: 558 - Sequência de aminoácidos de CDRH3 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-58
[001780] SEQ ID NO: 559 - Sequência de aminoácidos de CDRL1 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-58
[001781] SEQ ID NO: 560 - Sequência de aminoácidos de CDRL2 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-58
[001782] SEQ ID NO: 561 - Sequência de aminoácidos de CDRL3 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-58
[001783] SEQ ID NO: 562 - Sequência de aminoácidos de CDRH1 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-59
[001784] SEQ ID NO: 563 - Sequência de aminoácidos de CDRH2 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-59
[001785] SEQ ID NO: 564 - Sequência de aminoácidos de CDRH3 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-59
[001786] SEQ ID NO: 565 - Sequência de aminoácidos de CDRL1 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-59
[001787] SEQ ID NO: 566 - Sequência de aminoácidos de CDRL2 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-59
[001788] SEQ ID NO: 567 - Sequência de aminoácidos de CDRL3 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-59
[001789] SEQ ID NO: 568 - Sequência de aminoácidos de CDRH1 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-61.1
[001790] SEQ ID NO: 569 - Sequência de aminoácidos de CDRH2 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-61.1
[001791] SEQ ID NO: 570 - Sequência de aminoácidos de CDRH3 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-61.1
[001792] SEQ ID NO: 571 - Sequência de aminoácidos de CDRL1 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-61.1
[001793] SEQ ID NO: 572 - Sequência de aminoácidos de CDRL2 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-61.1
[001794] SEQ ID NO: 573 - Sequência de aminoácidos de CDRL3 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-61.1
[001795] SEQ ID NO: 574 - Sequência de aminoácidos de CDRH1 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-61
[001796] SEQ ID NO: 575 - Sequência de aminoácidos de CDRH2 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-61
[001797] SEQ ID NO: 576 - Sequência de aminoácidos de CDRH3 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-61
[001798] SEQ ID NO: 577 - Sequência de aminoácidos de CDRH1 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-62
[001799] SEQ ID NO: 578 - Sequência de aminoácidos de CDRH2 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-62
[001800] SEQ ID NO: 579 - Sequência de aminoácidos de CDRH3 de cadeia pesada do anticorpo anti-HER3 humano U1-62
[001801] SEQ ID NO: 580 - Sequência de aminoácidos de CDRL1 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-62
[001802] SEQ ID NO: 581 - Sequência de aminoácidos de CDRL2 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-62
[001803] SEQ ID NO: 582 - Sequência de aminoácidos de CDRL3 de cadeia leve do anticorpo anti-HER3 humano U1-62
[001804] SEQ ID NO: 583 - Sequência de aminoácidos de comprimento completo de uma cadeia pesada de anticorpo anti-HER3 humamp U1-59
[001805] SEQ ID NO: 584 - Sequência de aminoácidos de comprimento completo de uma cadeia leve de anticorpo anti -HER3 humano U1-59.

Claims (19)

1. Conjugado de anticorpo-fármaco, caracterizado pelo fato de que um composto antitumor representado pela fórmula a seguir:
Figure img0087
é conjugado a um anticorpo anti-HER3 através de uma li-gação de tioéter a qual é formada em uma porção de ligação de dissul- fureto presente em uma parte de dobradiça do anticorpo anti-HER3 através de um ligante tendo uma estrutura representada pela fórmula a seguir:
Figure img0088
sendo que o anticorpo anti-HER3 é conectado à extremidade de L1, sendo que o composto antitumor é conectado ao grupo carbonila da porção -(CH2)n2-C(=O)- ou o C-término de LP, com o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 como uma posição de conexão, n1 representa um número inteiro de 0 a 6, n2 representa um número inteiro de 0 a 5, L1 representa -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n3-C(=O)-, n3 representa um número inteiro de 2 a 8, L2 representa -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- ou uma ligação simples, n4 representa um número inteiro de 1 a 6, LP representa um resíduo tetrapeptídico -GGFG- ou um re- síduo pentapeptídico -DGGFG-, La representa -O- ou uma ligação simples, -(Succinimid-3-il-N)- apresenta uma estrutura representada pela fórmula a seguir:
Figure img0089
a qual está conectada ao anticorpo anti-HER3 na posição 3 do mesmo e está conectada a um grupo metileno na estrutura ligante que contém esta estrutura sobre o átomo de nitrogênio na posição 1.
2. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a rei-vindicação 1, caracterizado pelo fato de que a porção de estrutura fármaco-ligante na qual um fármaco é conectado a -L1-L2-LP-NH- (CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- ou -L1-L2-LP- é uma estrutura de fármaco- ligante selecionada do seguinte grupo: -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG- NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG- NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG- NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- (NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG- (NH-DX); em que, -(Succinimid-3-il-N)- apresenta uma estrutura re-presentada pela fórmula a seguir: [Fórmula 3]
Figure img0090
a qual está conectada ao anticorpo anti-HER3 na posição 3 do mesmo e é conectada a um grupo metileno na estrutura ligante que contém esta estrutura sobre o átomo de nitrogênio na posição 1, -(NH-DX) representa um grupo representado pela fórmula a seguir, com o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 sendo uma posição de conexão, [Fórmula 4]
Figure img0091
-GGFG- representa um resíduo tetrapeptídico de -Gly-Gly- Phe-Gly- e -DGGFG- representa um resíduo pentapeptídico de -Asp- Gly-Gly-Phe-Gly-.
3. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a rei-vindicação 2, caracterizado pelo fato de que uma porção de estrutura de fármaco-ligante é uma estrutura de fármaco-ligante selecionada do seguinte grupo: -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG- NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG- (NH-DX).
4. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a rei-vindicação 3, caracterizado pelo fato de que uma porção de estrutura de fármaco-ligante é: -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
5. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a rei-vindicação 3, caracterizado pelo fato de que a estrutura de fármaco- ligante é: -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG- NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
6. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a rei-vindicação 3, caracterizado pelo fato de que a estrutura de fármaco- ligante é: -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).
7. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a rei-vindicação 3, caracterizado pelo fato de que a estrutura de fármaco- ligante é: -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
8. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a rei-vindicação 3, caracterizado pelo fato de que a estrutura de fármaco- ligante é: -(Succinimid-3-il-N)- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG- (NH-DX).
9. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-HER3 compreende CDRH1 a CDRH3 e CDRL1 a CDRL3 de U1-49, U1-53, U1-59, U1-7 ou U1-9 nas cadeias pesada e leve, respectivamente.
10. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-HER3 compreende a região variável da cadeia pesada e a cadeia variável da cadeia leve de U1-49, U1-53, U1-59, U1-7 ou U1-9 nas cadeias pesada e leve, respectivamente.
11. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-HER3 compreende as sequências de aminoácidos representadas por ou compreendendo SEQ ID NO: 42 e 44, SEQ ID NO: 54 e 56, SEQ ID NO: 70 e 72, SEQ ID NO: 92 e 94, ou SEQ ID NO: 96 e 98, nas cadeias pesada e leve, respectivamente.
12. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-HER3 compreende as sequências de aminoácidos representadas por ou compreendendo SEQ ID NO: 583 e 584 nas cadeias pesada e leve, respectivamente.
13. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-HER3 carece de um resíduo de lisina no terminal carboxilo da cadeia pesada.
14. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que um número médio de unidades da estrutura selecionada de fár- maco-ligante conjugada por anticorpo está em uma faixa de 2 a 8.
15. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que um número médio de unidades da estrutura selecionada de fármaco-ligante conjugada por anticorpo está em uma faixa de 3 a 8.
16. Medicamento antitumoral e/ou medicamento anticancerígeno, caracterizado pelo fato de que compreende o conjugado anticorpo-fármaco, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, um sal do mesmo ou um hidrato do mesmo.
17. Medicamento antitumoral e/ou medicamento anticancerígeno, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que é aplicado ao câncer de pulmão, câncer de rim, câncer urotelial, câncer colorretal, câncer de próstata, glioblastoma multiforme, câncer de ovário, câncer de pâncreas, câncer de mama, melanoma, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer gástrico, tumor estromático gastrointestinal, câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço, câncer de esôfago, câncer epidermoide, câncer peritoneal, glioblastoma multiforme adulto, câncer hepático, carcinoma hepatocelular, câncer de cólon, câncer de reto, câncer de cólon e reto, câncer de endométrio, câncer de útero, câncer salivar, câncer renal, câncer de vulva, câncer de tireóide, carcinoma hepático, carcinoma do ânus, ou câncer de pênis.
18. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o conjugado anticorpo-fármaco, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, um sal do mesmo ou um hidrato do mesmo como ingrediente ativo, e um ingrediente de formulação farmaceuticamente aceitável.
19. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que é aplicada ao câncer de pulmão, câncer de rim, câncer urotelial, câncer colorretal, câncer de próstata, glioblastoma multiforme, câncer de ovário, câncer de pâncreas, câncer de mama, melanoma, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer gástrico, tumor de estroma gastrointestinal, câncer de colo do útero, câncer de cabeça e pescoço, câncer de esôfago, câncer epidermoide, câncer peritoneal, glioblastoma multiforme adulto, câncer hepático, carcinoma hepatocelular, câncer de cólon, câncer de reto, câncer de cólon e reto, câncer de endométrio, câncer de útero, câncer salivar, câncer renal, câncer de vulva, câncer de tireóide, carcinoma hepático, carcinoma do ânus, ou câncer de pênis.
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