TWI704929B - 配體-細胞毒性藥物偶聯物、其製備方法及其應用 - Google Patents

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章瑛
屈博磊
張富堯
于秀招
梁金棟
蔣貴陽
張連山
李昂
王亞里
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Abstract

本發明涉及配體-細胞毒性藥物偶聯物、其製備方法及其應用。具體而言，本發明提供了一種通式為PC-L-Dr的配體-細胞毒性藥物偶聯物，其製備方法以及該配體-細胞毒性藥物偶聯物及含有其的藥物組成物藉由受體調節在製備治療癌症的藥物中的用途，其中通式(PC-L-Dr)中的各取代基與說明書中的定義相同。

Description

配體-細胞毒性藥物偶聯物、其製備方法及其應用
本發明涉及一類全新結構的配體-細胞毒性藥物偶聯物。具體地說，本發明涉及抗體-細胞毒性藥物偶聯物，也涉及本發明偶聯物的製備方法、包含所述偶聯物的藥物組成物以及所述偶聯物或藥物組成物的用途。
化療依然是包括手術、放射線治療、以及靶向治療法在內的最重要的抗癌手段之一。盡管高效細胞毒素的種類很多，但是腫瘤細胞和正常細胞之間差别很小，限制了這些抗腫瘤化合物由於毒副作用在臨床上的廣泛應用。而抗腫瘤單株抗體對於腫瘤細胞表面抗原的特異性，抗體藥物已成為抗腫瘤治療的前線藥物，但單獨使用抗體作為抗腫瘤藥物時，療效經常不盡人意。
抗體藥物偶聯物(antibody drug conjugate，ADC)把單株抗體或者抗體片段藉由穩定的化學接頭化合物與具有生物活性的細胞毒素相連，充分利用了抗體對正常細胞和腫瘤細胞表面抗原結合的特異性和細胞毒素的高效性，同時 又避免了前者療效偏低和後者毒副作用過大等缺陷。這也就意味着，與以往傳統的化療藥物相比，抗體藥物偶聯物能精準地結合腫瘤細胞並降低將對正常細胞的影響。
早期的ADC藥物主要使用鼠源的單株抗體，因為人類的免疫反應造成一部分藥物難以到達標靶。其次，早期使用的包括阿黴素(doxorubicin)在內的效應分子的生物活性較低，限制了第一代抗體藥物偶聯物的療效。除此之外，抗體的來源、接頭連接的方式和數目也未得到優化。
2013年2月，Kadcyla®(ado-trastuzumab emtansine，T-DM1)獲得美國FDA批准，用於治療HER2陽性同時對曲妥珠單株抗體(Trastuzumab，商品名：Herceptin®和紫杉醇有抗藥性的晚期或轉移性乳腺癌患者。Mylotarg®和Adcetris®都是針對血液腫瘤進行靶向治療，和固體腫瘤相比組織結構相對簡單。Kadcyla®是美國FDA批准的治療固體腫瘤的第一個ADC藥物。
Kadcyla®採用ImmunoGen的技術將高活性的有絲分裂抑制劑DM1用一個穩定的硫醚健接頭連到羅氏公司的曲妥珠單株抗體上，平均一個曲妥珠單株抗體結合大約3.5個DM1，曲妥珠單株抗體在病人體內特異性結合乳腺癌細胞，經細胞內吞後在細胞內斷裂釋放出DM1，DM1在細胞內的聚集濃度足以導致細胞因有絲分裂障礙而死亡，腫瘤病灶隨之消退。T-DM1既保留了Herceptin®的抗體依賴性的細胞增殖抑制作用，同時又增加了潛在的細胞毒素藥物的效應。而且因為其毒素靶向在腫瘤細胞內釋放，藥物毒 副作用並沒有隨著療效的增加而同步增大。
帕妥珠單株抗體(Pertuzumab，也稱作2C4，商品名Perjeta)是一種重組人源化單株抗體，它是第一個被稱作“HER二聚化抑制劑”的單株抗體。藉由結合HER2阻滯了HER2與其他HER受體的二聚化作用。帕妥珠單株抗體已經證實在HER2高表現及低表現的前列腺癌等模型上均有抑制腫瘤生長的作用。
與曲妥珠單株抗體(Trastuzumab，商品名Herceptin)結合位點位於HER2胞外區的近膜區IV亞域上抑制下游信號路徑不同，帕妥珠單株抗體則是藉由結合在II域(二聚化域)有效抑制HER2的異源二聚化反應。因此，曲妥珠單株抗體只能對HER2過度表現的癌症患者尤其是乳腺癌患者有一定療效，而帕妥珠單株抗體雖然和曲妥珠單株抗體作用同一靶點，且二者有同樣的內吞特點，但因其作用機制不同，在抑制二聚化後可以切斷由ErbB家族受體介導的信號路徑，可能会有比單獨阻斷HER2信號路徑更廣泛的應用範圍。
目前ADC藥物的偶聯技術主要有兩種：T-DM1採用的是將細胞毒性藥物與抗體的自由胺基隨機偶聯；而Adcetris®採用的是將細胞毒性藥物和抗體鉸鏈區還原後的自由巰基偶聯。兩種偶聯方法都產出了載藥量數不一致的混合物。如T-DM1雖然平均載藥量是3.5，但載藥量的分布可從0~8。過低的載藥量影響了ADC的藥效，而過高的載藥量則更容易因對抗體的過分修飾而導致ADC藥物 經組織的巨噬細胞體系識別並破壞。這不僅減低了ADC的半衰期也因為毒素在非靶點組織的累積而增加毒性副作用；而Adcetris®用還原劑將抗體鉸鏈區的二硫鍵進行還原，對抗體本身的穩定性產生一定影響。相關的ADC藥物專利有WO2007008603、WO2013173393、WO2005081711、WO2013173391、WO2013173392、WO2013173393和WO2012010287。本發明提供一種有新型連接方式，新的毒素與抗體組合，從而有更有益效果的新的ADC化合物。
為了改進配體，特別是抗體和藥物的偶聯效果，本發明提供了一種包含改進的連接單元的通式化合物(PC-L-Dr)或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物：
Figure 105104041-A0101-12-0004-6
其中：R、R2-R7選自氫原子、鹵素、羥基、氰基、烷基、烷氧基和環烷基；R8-R11中至少一個選自鹵素、烯基、烷基和環烷基，其餘為氫原子；或者R8-R11之中的任意兩個形成環烷基，其餘的兩個基團視需要選自氫原子、烷基和環烷基；R12-R13選自氫原子、烷基或鹵素； R14選自芳基或雜芳基，所述的芳基或雜芳基視需要進一步經選自氫原子、鹵素、羥基、烷基、烷氧基和環烷基的取代基所取代；y為1-8，較佳係2-5；y為正實數，可以為整數或小數；PC為配體；L為接頭單元。
在本發明另一個較佳方案中，一種通式(PC-L-Dr)所示的化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其為通式(PC-L-D)所示的化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物：
Figure 105104041-A0101-12-0005-7
其中，R2-R14定義如通式(PC-L-Dr)中所定義。
在本發明另一個較佳方案中，一種通式(PC-L-Dr)所示的化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其為通式(PC-L’-Dr)所示的化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物：
Figure 105104041-A0101-12-0005-8
其中： R15選自氫原子、鹵素、羥基、氰基、烷基、烷氧基和環烷基；R16選自烷基、環烷基、烷氧基和雜環基；n為2-6，較佳係2-5；m為0-5，較佳係1-3；PC、y、n、R、R2-R14如通式(PC-L-Dr)中所定義。
在本發明另一個較佳方案中，一種通式(PC-L-Dr)所示的化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其為通式(PC-L’-D)所示的化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物：
Figure 105104041-A0101-12-0006-9
其中：R15、R16、m如通式(PC-L’-Dr)中所定義；PC、y、n、R2-R14如通式(PC-L-Dr)中所定義。
在本發明另一個較佳方案中，一種通式(PC-L’-D)所示的化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其為通式(PC-L’-D1)所示的化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物：
Figure 105104041-A0101-12-0007-11
 其中PC、y、n、m、R2-R16如通式(PC-L’-D)中所定義。
本發明的配體藥物偶聯物ADC化合物包括，但不限於：
Figure 105104041-A0101-12-0007-12
Figure 105104041-A0101-12-0008-13
Figure 105104041-A0101-12-0009-14
或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物。
在本發明另一個較佳方案中，一種通式(PC-L-Dr)所示的化合物，其中PC為抗體，較佳選自帕妥珠單株抗體(Pertuzumab)、尼妥珠單株抗體(Nimotuzumab)和曲妥珠單株抗體(Trastuzumab)。
本發明的典型配體藥物偶聯物ADC化合物包括，但不限於：
Figure 105104041-A0101-12-0009-15
Figure 105104041-A0101-12-0010-16
Figure 105104041-A0101-12-0011-17
Figure 105104041-A0101-12-0012-18
或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物。
本發明進一步提供一種通式(Dr)所示的化合物：
Figure 105104041-A0101-12-0012-19
或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，可用於作為製備通式(PC-L-Dr)所示化合物的前藥；其中：R、R1-R7選自氫原子、鹵素、羥基、氰基、烷基、烷氧基和環烷基；R8-R11中至少一個選自鹵素、烯基、烷基和環烷基，其餘為氫原子； 或者R8-R11之中的任意兩個形成環烷基，其餘的兩個基團視需要選自氫原子、烷基和環烷基；R12-R13選自氫原子、烷基或鹵素；R14選自芳基或雜芳基，所述的芳基或雜芳基視需要進一步經且選自氫原子、鹵素、羥基、烷基、烷氧基和環烷基的取代基所取代。
在本發明另一個較佳方案中，一種通式(Dr)所示的化合物，其為通式(D)所示的化合物：
Figure 105104041-A0101-12-0013-20
或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，其中：R1-R14如通式(Dr)中所定義。
在本發明另一個較佳方案中，一種通式(Dr)所示的化合物，其為通式(D1)所示的化合物：
Figure 105104041-A0101-12-0013-22
或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，其中：R1-R14如通式(D)中所定義。
本發明的配體藥物偶聯物ADC的典型前藥化合物包括，但不限於：
Figure 105104041-A0101-12-0014-23
Figure 105104041-A0101-12-0015-24
Figure 105104041-A0101-12-0016-25
Figure 105104041-A0101-12-0017-26
Figure 105104041-A0101-12-0018-27
Figure 105104041-A0101-12-0019-28
Figure 105104041-A0101-12-0020-29
本發明進一步提供一種通式(L1-Dr)所示的化合物：
Figure 105104041-A0101-12-0020-30
可用於製備通式(PC-L’-D)的中間體，其中n為2-6，較佳係2-5；R、R1-R7選自氫原子、鹵素、羥基、氰基、烷基、烷氧基和環烷基； R8-R11中至少一個選自鹵素、烯基、烷基和環烷基，其餘為氫原子；或者R8-R11之中的任意兩個形成環烷基，其餘的兩個基團視需要選自氫原子、烷基和環烷基；R12-R13選自氫原子、烷基或鹵素；R14選自芳基或雜芳基，所述的芳基或雜芳基視需要進一步經且選自氫原子、鹵素、羥基、烷基、烷氧基和環烷基的取代基所取代。
在本發明另一個較佳方案中，一種通式(L1-Dr)所示的化合物，其為通式(L1-D)所示的化合物：
Figure 105104041-A0101-12-0021-32
其中n、R2-R14如通式(L1-Dr)中所定義。
在本發明另一個較佳方案中，一種通式(L1-D)所示的化合物，其為一種通式(L1-D1)所示的化合物：
Figure 105104041-A0101-12-0021-33
其中n、R1-R12如通式(L1-D)中所定義。
本發明的配體藥物偶聯物ADC的典型前藥化合物(帶部分接頭單元)，可用於製備本發明配體藥物偶聯物的中間 體，包括，但不限於下列化合物：
Figure 105104041-A0101-12-0022-34
Figure 105104041-A0101-12-0023-35
Figure 105104041-A0101-12-0024-36
Figure 105104041-A0101-12-0025-37
本發明進一步提供一種通式(PC-L2)所示的化合物：
Figure 105104041-A0101-12-0026-38
其中PC配體，較佳係抗體，更佳係帕妥珠單株抗體(Pertuzumab)、尼妥珠單株抗體(Nimotuzumab)或曲妥珠單株抗體(Trastuzumab)；R15選自氫原子、鹵素、羥基、氰基、烷基、烷氧基和環烷基；R16選自烷基、環烷基、烷氧基和雜環基；m為0-5，較佳係1-3；X為0-5，較佳係1-3，x為正實數，包括小數和整數。
在本發明另一個較佳方案中，一種通式(PC-L2)所示的化合物，其選自：
Figure 105104041-A0101-12-0026-39
本發明進一步提供一種製備如通式(PC-L2)所示的化合物的方法，其包括如下步驟：
Figure 105104041-A0101-12-0026-40
1)向PC與通式(PC-L2-A)化合物中加入還原劑RA，進行反應，得到通式(PC-L2-B)化合物；RA較佳係氰基硼氫化鈉或三乙醯氧基硼氫化鈉，更佳係氰基硼氫化鈉；2)向通式(PC-L2-B)化合物中加入脫保護劑脫去巰基保護基，得到通式(PC-L2)化合物；T選自H、第三丁基、乙醯基、正丙醯基、異丙醯基、三苯基甲基、甲氧基甲基、2-(三甲矽烷基)乙氧甲基，較佳為H或乙醯基；(PC-L2-A)化合物較佳係硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯；其中PC、R15、R16、m、x如通式(PC-L2)中所定義。
本發明進一步提供一種製備通式(PC-L’-D)所示的化合物的方法，該方法包括：
Figure 105104041-A0101-12-0027-41
通式(PC-L2)化合物與通式(L1-D1)化合物反應，得到通式(PC-L’-D)化合物；其中：PC、m、n、y、R2~R16如通式(PC-L’-D)中所定義。
本發明進一步提供一種通式(D-Aa)所示的化合物：
Figure 105104041-A0101-12-0028-42
或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，可作為合成本發明的配體藥物偶聯物ADC的典型前藥化合物的中間體，其中：R8-R11之中的任意兩個形成環烷基，其餘的兩個基團視需要選自氫原子、烷基和環烷基；R12選自氫原子、烷基或鹵素；P為氫原子或保護基，所述的保護基較佳係Boc、Bn、Cbz，最佳係Boc；Ra選自羥基、胺基、烷氧基、環烷氧基或烷胺基。
本發明進一步提供一種通式(D-Aa)所示的化合物，其為通式(D-A)所示的化合物：
Figure 105104041-A0101-12-0028-43
或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，可作為合成本發明的配體藥物偶聯物ADC的典型前藥化合物的中間體，其中：R8-R12、P之中的任意兩個形成環烷基，其餘的兩個基團視需要選自氫原子、烷基和環烷基； R’選自氫原子，烷基，環烷基。
本發明的配體藥物偶聯物ADC的典型前藥化合物的中間體(D-Aa)或(D-A)包括，但不限於：
Figure 105104041-A0101-12-0029-45
Figure 105104041-A0101-12-0030-46
本發明進一步提供一種藥物組成物，其含有治療有效量的如通式(PC-L-Dr)、通式(PC-L’-D)及其它如上所述的配體-細胞毒性藥物偶聯物，或包含如通式(Dr)、通式(L1-Dr)、通式(D)、通式(L1-D)及其它如上所述藥物、其可藥用鹽或溶劑合物，以及藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
本發明進一步提供將如通式(PC-L-Dr)、通式(PC-L’-D)及其它如上所述的配體-細胞毒性藥物偶聯物，或如通式(Dr)、通式(L1-Dr)、通式(D)、通式(L1-D)及其它如上所述的藥物或其可藥用鹽或溶劑合物，或如上所述的藥物組成物在製備治療哺乳動物癌症的藥物的用途，所述的癌症為與HER2，HER3，EGFR表現相關的癌症。
本發明進一步涉及一種治療哺乳動物癌症的方法，該方法包括對於哺乳動物施用有效劑量的如通式(PC-L-Dr)、通式(PC-L’-D)及其它如上所述的配體-細胞毒性藥物偶聯物或其可藥用鹽或溶劑合物，或如通式(Dr)、通式(L1-Dr)、通式(D)、通式(L1-D)及其它如上所述的藥物 或其可藥用鹽或溶劑合物，或包含其的藥物組成物；其中所述的癌症為與HER2，HER3，EGFR表現相關的癌症。
本發明進一步提供將如通式(PC-L-Dr)、通式(PC-L’-D)及其它如上所述的配體-細胞毒性藥物偶聯物，或如通式(Dr)、通式(L1-Dr)、通式(D)、通式(L1-D)及其它如上所述的藥物或其可藥用鹽或溶劑合物，或如上所述的藥物組成物在製備治療哺乳動物癌症的藥物的用途，其中所述哺乳動物為人，所述癌症選自乳腺癌、卵巢癌、胃癌、子宮內膜癌、唾液腺癌、肺癌、結腸癌、腎癌、直腸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、急性淋巴細胞白血病、急性骨髓細胞白血病、急性前骨髓球白血病、慢性骨髓細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤或復發性退行性大細胞淋巴瘤，較佳係乳腺癌症、霍奇金氏淋巴瘤或復發性退行性大細胞淋巴瘤；更佳為與HER2表現相關的乳腺癌。
本發明進一步涉及一種治療哺乳動物癌症的方法，該方法包括對於哺乳動物施用有效劑量的如通式(PC-L-Dr)、通式(PC-L’-D)及其它如上所述的配體-細胞毒性藥物偶聯物或其可藥用鹽或溶劑合物，或如通式(Dr)、通式(L1-Dr)、通式(D)、通式(L1-D)及其它如上所述的藥物或其可藥用鹽或溶劑合物，或包含其的藥物組成物；其中所述哺乳動物較佳為人；所述癌症選自乳腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫內膜癌、唾液腺癌、肺癌、結腸癌、腎癌、直腸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、急性淋巴 細胞白血病、急性骨髓細胞白血病、急性前骨髓球細胞白血病、慢性骨髓細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤或復發性退行性大細胞淋巴瘤，較佳為乳腺癌、霍奇金氏淋巴瘤或復發性退行性大細胞淋巴瘤；更佳為2+或更高水準過度表現HER2的乳腺癌；最佳係與HER2表現相關的乳腺癌。
本發明在抗體的N端胺基和/或離胺酸殘基的胺基上連接本發明含有游離巰基的連接單元L後，可避免對抗體鉸鏈區進行還原反應，從而減少對抗體自身結構的影響，並且引入的碳-氮鍵結構穩定，不易在體內循環中分解，進一步藉由控制反應條件，可使載藥量在0~5範圍內分布。
除非另有限定，本文所用的所有技術和科學術語均與本發明所屬領域具有通常知識者的理解一致。雖然也可採用與本文所述相似或等同的任何方法和材料實施或測試本發明，但本文描述了較佳的方法和材料。描述和要求保護本發明時，依據以下定義使用下列術語。
當本發明中使用商品名時，申請人旨在包括該商品名產品的製劑、該商品名產品的非專利藥和活性藥物部分。
除非有相反陳述，在說明書和申請專利範圍中使用的術語具有下述含義。
術語“烷基”指飽和脂肪族烴基團，其為包含1至20 個碳原子的直鏈或支鏈基團，較佳係含有1至12個碳原子的烷基，更佳係含有1至10個碳原子的烷基，最佳係含有1至6個碳原子的烷基。非限制性實例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、第二丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基，及其各種支鏈異構體等。更佳的是含有1至6個碳原子的低級烷基，非限制性實施例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、第二丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁 基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。烷基可以是取代的或非取代的，當經取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上經取代，所述取代基較佳係一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、氧代基。
術語“環烷基”指飽和或部分不飽和單環或多環環狀烴取代基，環烷基環包含3至20個碳原子，較佳係包含3至12個碳原子，更佳係包含3至10個碳原子，最佳係包含3至8個碳原子。單環環烷基的非限制性實例包括環丙基、環丁基、環戊基、環戊烯基、環己基、環己烯基、環己二烯基、環庚基、環庚三烯基、環辛基等；多環環烷基包括螺環、稠環和橋環的環烷基。
術語“雜環基”指飽和或部分不飽和單環或多環環狀烴取代基，其包含3至20個環原子，其中一個或多個環原子為選自氮、氧或S(O)m(其中m是整數0至2)的雜原子，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-的環部分，其餘環原子為碳。較佳係包含3至12個環原子，其中1~4個是雜原子；更佳係環烷基環包含3至10個環原子。單環雜環基的非限制性實例包括吡咯烷基、哌啶基、哌
Figure 105104041-A0101-12-0034-199
基、嗎福林基、硫代嗎福林基、高哌
Figure 105104041-A0101-12-0034-200
基等。多環雜環基包括螺環、稠環和橋環的雜環基。
所述雜環基環可以稠合於芳基、雜芳基或環烷基環 上，其中與母體結構連接在一起的環為雜環基，其非限制性實例包括：
Figure 105104041-A0101-12-0035-246
和
Figure 105104041-A0101-12-0035-247
等。
雜環基可以是視需要取代的或非取代的，當經取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、氧代基。
術語“芳基”指具有共軛的π電子體系的6至14員全碳單環或稠合多環(也就是共用毗鄰碳原子對的環)基團，較佳係6至10員，例如苯基和萘基，較佳係苯基。所述芳基環可以稠合於雜芳基、雜環基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為芳基環，其非限制性實例包括：
Figure 105104041-A0101-12-0035-48
芳基可以是取代的或非取代的，當經取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧 基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基。
術語“雜芳基”指包含1至4個雜原子、5至14個環原子的雜芳族體系，其中雜原子選自氧、硫和氮。雜芳基較佳係5至10員，更佳係5員或6員，例如呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-烷基吡咯基、嘧啶基、吡
Figure 105104041-A0101-12-0036-201
基、咪唑基、四唑基等。所述雜芳基環可以稠合於芳基、雜環基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為雜芳基環，其非限制性實例包括：
Figure 105104041-A0101-12-0036-49
雜芳基可以是視需要取代的或非取代的，當經取代時，取代基較佳係一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基。
術語“烷氧基”指-O-(烷基)和-O-(非取代的環烷基)，其中烷基或環烷基的定義如上所述。烷氧基的非限制性實例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、環丙氧基、環丁氧基、環戊氧基、環己氧基。烷氧基可以是視需要取代的或非取代的，當經取代時，取代基較佳係一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環 烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基。
術語“烷胺基”指-N-(烷基)和-N-(非取代的環烷基)，其中烷基或環烷基的定義如上所述。烷胺基的非限制性實例包括：甲胺基、乙胺基、丙胺基、丁胺基、環丙胺基、環丁胺基、環戊胺基、環己胺基。烷胺基可以是視需要取代的或非取代的，當經取代時，取代基較佳係一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基。
術語“鍵”指用“一”表示的共價鍵。
術語“羥基”指-OH基團。
術語“鹵素”指氟、氯、溴或碘。
術語“羧酸酯基”指-C(O)O(烷基)或(環烷基)，其中烷基、環烷基如上所定義。“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述的事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生地場合。例如，“視需要經烷基取代的雜環基團”意味著烷基可以但不必須存在，該說明包括雜環基團經烷基取代的情形和雜環基團不經烷基取代的情形。
“取代的”指基團中的一個或多個氫原子，較佳為最多5個，更佳為1~3個氫原子彼此獨立地經相應數目的取代基取代。不言而喻，取代基僅處在它們的可能的化學位 置，本領域技術人員能夠在不付出過多努力的情況下確定(藉由實驗或理論)可能或不可能的取代。例如，具有游離氫的胺基或羥基與具有不飽和(如烯屬)鍵的碳原子結合時可能是不穩定的。
術語“藥物組成物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前驅藥物與其他化學組分的混合物，以及其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。藥物組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
術語“可藥用鹽”是指本發明配體-細胞毒性藥物偶聯物的鹽，這類鹽用於哺乳動物體內時具有安全性和有效性，且具有應有的生物活性，本發明抗體-抗體藥物偶聯化合物至少含有一個胺基，因此可以與酸形成鹽，可藥用鹽的非限制性實例包括：鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、琥珀酸鹽、抗壞血酸鹽、草酸鹽、硝酸鹽、梨酸鹽、磷酸氫鹽、磷酸二氫鹽、水楊酸鹽、檸檬酸氫鹽、酒石酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽。
術語“溶劑合物”指本發明的配體-藥物偶聯化合物與一種或多種溶劑分子形成可藥用的溶劑合物，溶劑分子的非限制性實例包括水、乙醇、乙腈、異丙醇、DMSO、乙酸乙酯。
術語“配體”是能識別和結合目標細胞相關的抗原或 受體的大分子化合物。配體的作用是將藥物呈遞給與配體結合的目標細胞群，這些配體包括但不限於蛋白類激素、凝集素、生長因子、抗體或其他能與細胞結合的分子。在本發明實施方式中，配體表示為Pc，配體可藉由配體上的雜原子與連接單元形成連接鍵，較佳為抗體。
術語“配體-藥物偶聯化合物”，指配體藉由穩定的化學接頭化合物與具有生物活性的細胞毒素相連。本發明中配體較佳為抗原，“配體-藥物偶聯化合物”較佳係抗體藥物偶聯物(antibody drug conjugate，ADC)，指把單株抗體或者抗體片段藉由穩定的化學接頭化合物與具有生物活性的細胞毒素相連。
術語“抗原或受體”可供配體識別和結合目標細胞。本發明中較佳係針對在增生性疾病，例如癌症的靶細胞和/或組織上表現的細胞表面抗原或受體的配體；非限制性細胞表面受體實施例選自HER2，HER3，HER4，CD20，CD22，CD30，CD33，CD44，Lewis Y，CD56，CD105，VEGFR或GPNMB的細胞表面受體；最佳係選自HER2或EGFR的細胞表面受體。具體的較佳的非限制性實施例為曲妥珠單株抗體(Trastuzumab)，可以和HER2標靶特異性結合；帕妥珠單株抗體(Pertuzumab)，可以和HER2標靶特異性結合；尼妥珠單株抗體(Nimotuzumab)，可以和EGFR標靶特異性結合。
本發明所述的“抗體”是指表現出所需生物學活性的任何形式的抗體。因此，它以最廣義使用，具體地說，包 括但不限於全長抗體，抗體結合片段或衍生物。抗體的來源包括但不限於單株抗體、多株抗體、基因工程抗體(例如雙特異性抗體)。
術語“全長抗體”是指包含4條多肽鏈即2條重鏈和2條輕鏈藉由二硫鍵相互交聯形成多聚體的免疫球蛋白分子(例如IgM)。每條重鏈包含一段重鏈可變區(簡稱VH)和一段重鏈恆定區，重鏈恆定區包含3個結構域：CH1、CH2和CH3。每條輕鏈包含一段輕鏈可變區(簡稱VL)和一段輕鏈恆定區，輕鏈恆定區包含1個結構域(CL1)。VH區和VL區可進一步分為高變區，術語為互補決定區(CDRs)，各互補決定區之間穿插著更加保守的結構域，稱為框架區(FR)。術語“抗體結合片段或衍生物”包括任何一種自然發生的，酶催化獲得的，合成的，或是藉由基因工程得到的可與抗原特異性結合形成複合物的多肽或糖蛋白；通常包括親本抗體的至少部分抗原結合區或可變區(例如一個或多個CDR)，其保留親本抗體的至少某些結合特異性。“抗體結合片段或衍生物”可能由抗體衍生而來，例如藉由適宜的標準技術包括蛋白水解或重組基因工程技術(包括對表現抗體可變區和部分恆定區的DNA進行操作和表現)對抗體全長進行改造而得。“抗體結合片段或衍生物”包括但不限於：(i)Fab片段；(ii)F(ab’)2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)單鏈Fv(scFv)；(vi)dAb片段；和(vii)模擬抗體高變區胺基酸殘基的最小識別單元(如一個分離的互補決定區(CDR))。其他工程分子如雙價抗體、三價抗體、四 價抗體和微抗體也在“抗體結合片段或衍生物”範圍內。
“Fab片段”由一條完整的輕鏈和重鏈的VH和CH1功能區組成。Fab分子的重鏈不能與另一個重鏈分子形成二硫鍵。
“Fc”區包含含有抗體的CH1與CH2結構域的兩個重鏈片段。兩個重鏈片段藉由兩個以上的二硫鍵和藉由CH3結構域的疏水作用保持在一起。
“Fab’片段”包含一條輕鏈和重鏈的VH和CH1功能區，還包含在CH1與CH2結構域之間的區域，以致於可在兩個Fab’片段的兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵，以形成F(ab’)2分子。
“F(ab’)2片段”包含二條輕鏈和含有CH1與CH2結構域之間的部分恆定區的兩條重鏈，以致於在兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵。因此，F(ab’)2片段由藉由兩條重鏈之間的二硫鍵保持在一起的兩個Fab’片段組成。
“Fv片段”包含輕鏈或/和重鏈的可變區VH功能區。
“Fc區”相當於IgG的CH2和CH3功能區，無抗原結合活性，是抗體分子與效應分子和細胞相互作用的部位。
“鉸鏈區”用於連接抗體的Fab段和Fc段。在本發明中可以將雙特異性融合蛋白與Fc段連接。
本發明所述的抗體較佳係針對靶細胞上細胞表面抗原的特異性抗體，非限制性實施例為以下抗體：曲妥珠單株抗體，是用於治療乳腺癌的人源化抗HER2抗體，適用於治療HER2過度表現的轉移性乳腺癌。帕妥珠單株抗體 (Pertuzumab，也稱作2C4，商品名Perjeta)，是一種重組人源化單株抗體。它是第一個稱作“HER二聚化抑制劑”的單株抗體，藉由結合HER2阻滯了HER2與其他HER受體的二聚化作用，從而減緩了腫瘤的生長。帕妥珠單株抗體已經證實在HER2高表現及低表現的前列腺癌等模型上均有抑制腫瘤生長的作用。帕妥珠單株抗體已經美國FDA批準用於治療HER2陽性的轉移性乳腺癌。尼妥珠單株抗體(Nimotuzumab，商品名泰欣生)，是一個以表皮生長因子受體(EGFR)為靶點的單株抗體藥物，可用於治療惡性腫瘤的人源化單株抗體。EGFR在多種實體瘤中過度表現，如頭頸癌、肺癌、結直腸癌中，都存在EGFR過度表現現象。
術語“細胞毒性藥物”是指在腫瘤細胞內具有較強破壞其正常生長的化學分子。細胞毒性藥物原則上在足夠高的濃度下都可以殺死腫瘤細胞，但是由於缺乏特異性，在殺傷腫瘤細胞的同時，也會導致正常細胞的凋亡，導致嚴重的副作用。在本發明的實施方式中，細胞毒性藥物表示為D/D1。
術語“接頭單元”在本發明中為L，指一端與配體共價連接而另一端與細胞毒性藥物相連的化學結構片段或鍵。本發明中L的結構單元如：
Figure 105104041-A0305-02-0045-1
 其中R15、R16、m、n如通式(PC-L’-D)通式中所定義。
術語“載藥量”是指式(I)分子中每個配體上載入的細胞毒性藥物平均數量，也可以表示為藥物量和抗體量的比值，藥物載量的範圍可以是每個配體(Pc)連接1-8個細胞毒性藥物(D)，在本發明的實施方式中，載藥量表示為y，可用常規方法如UV/可見光光譜法，質譜，ELISA試驗和HPLC特徵鑒定偶聯反應後每個ADC分子的藥物品均數量。
在本發明中，y可能受連接位點數量的限制。本發明的一個實施方式中，細胞毒性藥物藉由連接單元偶聯在配體的N端胺基和/或離胺酸殘基的ε-胺基上，一般地，偶聯反應中能與抗體偶聯的藥物分子數將小於理論上的最大值。
可以用以下非限制性方法控制配體細胞毒性藥物偶聯物的載量，包括：(1)控制連接試劑和單株抗體的莫耳比，(2)控制反應時間和溫度，(3)選擇不同的反應試劑。
常規的藥物組成物的製備見中國藥典。
術語“載體”用於本發明的藥物，是指能改變藥物進入人體的方式和在體內的分佈、控制藥物的釋放速度並將藥物輸送到靶向器官的體系。藥物載體釋放和靶向系統能夠減少藥物降解及損失，降低副作用，提高生物利用度。如可作為載體的高分子表面活性劑由於其獨特的兩親性結 構，可以進行自組裝，形成各種形式的聚集體，較佳的實例如膠束、微乳液、凝膠、液晶、囊泡等。這些聚集體具有包載藥物分子的能力，同時又對膜有良好的滲透性，可以作為優良的藥物載體。
術語“賦形劑”是在藥物製劑中除主藥以外的附加物，也可稱為輔料。如片劑中的黏合劑、填充劑、崩解劑、潤滑劑；半固體製劑軟膏劑、霜劑中的基質部分；液體製劑中的防腐劑、抗氧劑、矯味劑、芳香劑、助溶劑、乳化劑、增溶劑、滲透壓調節劑、著色劑等均可稱為賦形劑。
術語“稀釋劑”又稱填充劑，其主要用途是增加片劑的重量和體積。稀釋劑的加入不僅保證一定的體積大小，而且減少主要成分的劑量偏差，改善藥物的壓縮成型性等。當片劑的藥物含有油性組分時，需加入吸收劑吸收油性物，使保持“乾燥”狀態，以利於製成片劑。如澱粉、乳糖、鈣的無機鹽、微晶纖維素等。
藥物組成物可以是無菌注射水溶液形式。可在使用的可接受的溶媒和溶劑中有水、林格氏液和等滲氯化鈉溶液。無菌注射製劑可以是其中活性成分溶於油相的無菌注射水包油微乳。例如將活性成分溶於大豆油和卵磷脂的混合物中。然後將油溶液加入水和甘油的混合物中處理形成微乳。可藉由局部大量注射，將注射液或微乳注入患者的血流中。或者，最好按可保持本發明化合物恆定循環濃度的方式給予溶液和微乳。為保持這種恆定濃度，可使用連續靜脈內遞藥裝置。這種裝置的實例是Deltec CADD-PLUS. TM.5400型靜脈注射泵。
藥物組成物可以是用於肌內和皮下給藥的無菌注射水或油懸浮液的形式。可按已知技術，用上述那些適宜的分散劑或濕潤劑和懸浮劑配製該懸浮液。無菌注射製劑也可以是在無毒腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中製備的無菌注射溶液或懸浮液，例如1,3-丁二醇中製備的溶液。此外，可方便地用無菌固定油作為溶劑或懸浮介質。為此目的，可使用包括合成甘油單或二酯在內的任何調和固定油。此外，脂肪酸例如油酸也可以製備注射劑。
術語“還原劑”是在氧化還原反應裏，失去電子或有電子偏離的物質。還原劑本身在廣義上說也是抗氧化劑，具有還原性，經氧化，其產物叫氧化產物。在本發明的實施方式中，還原劑表示為RA，還原劑的非限制性實例包括：H2、碳(C)、一氧化碳(CO)、還原鐵粉(Fe)、鋅粉(Zn)、鹼金屬(常用的有Li、Na、K)、其他活潑金屬(如Mg、Al、Ca、La等)、氯化亞錫(SnCl2)、草酸、硼氫化鉀(KBH4)、硼氫化鈉(NaBH4)、氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)、三乙醯氧基硼氫化鈉((CH3COO)3BHNa)、氫化鋁鋰(LiAlH4)、次磷酸、次磷酸鈉、硫代硫酸鈉(Na2S2O3)，本發明較佳的還原劑為氰基硼氫化鈉或三乙醯氧基硼氫化鈉。
術語“巰基保護基”指當同時含有巰基和其他基團的化學分子參與反應的情況下，為使反應只發生在特定的基團處，而避免巰基遭受影響，將巰基加以保護，當反應完成後脫除的基團，在本發明的實施方式中，巰基保護基表 示為T，巰基保護基的非限制性實例包括：-第三丁基、-乙醯基、-正丙醯基、-異丙醯基、-三苯基甲基、-甲氧基甲基、-2-(三甲矽烷基)乙氧甲基，本發明較佳的巰基保護基為乙醯基。
本發明的合成方法
為了完成本發明的合成目的，本發明採用如下的合成技術方案：
方案一：本發明通式(PC-L-DR)所示的化合物的製備方法，該方法包括：
Figure 105104041-A0101-12-0046-51
方案二：本發明通式(PC-L-DR1)所示的化合物的製備方法，該方法包括：
Figure 105104041-A0101-12-0047-52
通式(PC-L2)化合物與通式(L1-D1)化合物在乙腈溶液中反應，經Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化後，得到通式(PC-L-DR)化合物；其中：PC、m、n、y、R2~R16如通式(PC-L-DR)中所定義。
具體實施方式
以下結合實施例進一步描述本發明，但這些實施例並非限制本發明的範圍。
本發明實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
實施例
化合物的結構是藉由核磁共振(NMR)或/和質譜(MS)來確定的。NMR化學位移(δ)以10-6(ppm)的單位給定。NMR的測定是用Bruker AVANCE-400核磁儀，測定溶劑為氘代二甲基亞碸(DMSO-d6)，氘代氯仿(CDCl3)，氘代甲醇(CD3OD)，內標為四甲基矽烷(TMS)。
MS的測定用FINNIGAN LCQAd(ESI)質譜儀(生產商：Thermo，型號：Finnigan LCQ advantage MAX)。
HPLC的測定使用安捷倫1200DAD高壓液相層析儀(Sunfire C18 150×4.6mm層析柱)和Waters 2695-2996高壓液相層析儀(Gimini C18 150×4.6mm層析柱)。
激酶平均抑制率及IC50值的測定用NovoStar酶標儀(德國BMG公司)。
薄層層析矽膠板使用煙臺黃海HSGF254或青島GF254矽膠板，薄層層析法(TLC)使用的矽膠板採用的規格是0.15mm~0.2mm，薄層層析分離純化產物採用的規格是0.4mm~0.5mm。
柱層析一般使用煙臺黃海矽膠200~300目矽膠為載體。
本發明的已知的起始原料可以採用或按照本領域已知的方法來合成，或可購買自ABCR GmbH & Co.KG，Acros Organics，Aldrich Chemical Company，韶遠化學科技(Accela ChemBio Inc)，達瑞化學品等公司。
實施例中無特殊說明，反應均能夠在氬氣氛或氮氣氛下進行。
氬氣氛或氮氣氛是指反應瓶連接一個約1L容積的氬氣或氮氣氣球。
實施例中無特殊說明，溶液是指水溶液。
實施例中無特殊說明，反應的溫度為室溫，為20℃~30℃。
實施例中pH=6.5的PBS緩衝液的配製：取KH2PO4 8.5g，K2HPO4.3H2O 8.56g，NaCl 5.85g，EDTA 1.5g置於瓶中，定容至2L，超聲波使其全部溶解，搖勻即得。
實施例中pH=4.5的乙酸/乙酸鈉緩衝液的配製：取9g無水乙酸鈉置於瓶中，加入純化水，定容至2L，搖勻後，加入醋酸鈉4.9mL，搖勻即得。
實施例中磷酸鹽緩衝液(pH=7.0)的配製：0.2M的Na2HPO4 61mL中加入0.2M的NaH2PO4 39mL搖勻得0.2M pH=7的緩衝液。
實施例中的反應進程的監測採用薄層層析法(TLC)，反應所使用的展開劑的體系有：A：二氯甲烷和甲醇體系，B：正己烷和乙酸乙酯體系，C：石油醚和乙酸乙酯體系，D：丙酮，溶劑的體積比根據化合物的極性不同而進行調節。
純化化合物採用的柱層析的沖提劑的體系和薄層層析法的展開。劑體系包括：A：二氯甲烷和甲醇體系，B：正己烷和乙酸乙酯體系，C：二氯甲烷和丙酮體系，D：乙酸乙酯和二氯甲烷體系，E：乙酸乙酯和二氯甲烷和正己烷，F：乙酸乙酯和二氯甲烷和丙酮，溶劑的體積比根據化合物的極性不同而進行調節，也可以加入少量的三乙胺和醋酸等鹼性或酸性試劑進行調節。
本發明部分化合物是藉由Q-TOF LC/MS來表徵的。Q-TOF LC/MS使用安捷倫6530精確質量數四級杆-飛行時間質譜儀和安捷倫1290-Infinity超高效液相層析儀(安捷倫Poroshell 300SB-C8 5μm,2.1×75mm層析柱)。
本發明的已知的起始原料可以採用或按照本領域已知的方法來合成，實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
一、作為抗體的中間體的製備：
以下抗體按抗體常規方法進行製備：如可進行載體構建後，轉染真核細胞如HEK293細胞(Life Technologies Cat.No.11625019)，純化表現。
抗體序列 (1)帕妥珠單株抗體(Pertuzumab)，可以和HER2標靶特異性結合：
輕鏈序列：
Figure 105104041-A0101-12-0050-53
SEQ ID NO.1
重鏈序列：
Figure 105104041-A0101-12-0050-54
Figure 105104041-A0101-12-0051-55
SEQ ID NO.2
(2)尼妥珠單株抗體(Nimotuzumab)，可以和EGFR標靶特異性結合：
輕鏈順序：
Figure 105104041-A0101-12-0051-56
SEQ ID NO：3
重鏈順序：
Figure 105104041-A0101-12-0051-57
Figure 105104041-A0101-12-0052-58
SEQ ID NO：4
(3)曲妥珠單株抗體(Trastuzumab)，可以和HER2標靶特異性結合：
輕鏈順序：
Figure 105104041-A0101-12-0052-59
SEQ ID NO：5
重鏈順序
Figure 105104041-A0101-12-0052-60
SEQ ID NO：6
二、藥物、藥物連接體、配體藥物偶聯物(ADC)的製備 實施例1 (S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸
Figure 105104041-A0101-12-0053-61
第一步 (1S,3S,5S)-第三丁酯3-((1R,2R)-1-羥基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基
Figure 105104041-A0101-12-0054-202
唑-3-基)-3-羰基丙基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-2-羧酸
將原料(4R,5S)-4-甲基-5-苯基-3-丙醯基
Figure 105104041-A0101-12-0054-204
唑烷酮1b(1.96g，9.26mmol，採用習知的方法“Journal of the American Chemical Society,2003,125(50),15512-15520”製備而得)溶於25mL二氯甲烷中，氬氣氛下，降溫至0℃。反應液於0℃下滴加三乙胺(1.49mL，10.93mmol)，再滴加三氟甲磺酸二丁硼(9.7mL，9.72mmol)，於0℃下攪拌50分鐘，乾冰丙酮浴下將反應液降溫至-75℃，加入(1S,3S,5S)-第三丁酯3-甲醯基-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-2-羧酸1a(2.16g，9.26mmol，採用專利申請“US20100249190”公開的方法製備而得)溶於7mL二氯甲烷的溶液，於-75℃下攪拌1.5小時，於0℃攪拌2小時，於室溫攪拌1小時。反應結束後，加入36mL磷酸鹽緩衝液(pH=7.0)和甲醇(V/V=1：3)的混合液。於0℃下加入36mL甲醇和雙氧水(30%)(V/V=2：1)的混合液，於室溫攪拌1小時。減壓濃縮除去有機相，加入少量水，用乙醚(50mL×3)萃取，依次用5%碳酸氫鈉溶液，飽和氯化鈉溶液(150mL)洗滌，用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱層析法以沖提劑體系B純化殘留物，得標題產物(1S,3S,5S)-第三丁酯3-((1R,2R)-1-羥基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基
Figure 105104041-A0101-12-0054-205
唑-3-基)-3-羰基丙基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-2-羧酸1c(2.4g， 白色泡沫狀固體)，產率58.5%。
MS m/z(ESI)：345.1[M-100+1]
第二步 (1S,3S,5S)-第三丁酯3-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基
Figure 105104041-A0101-12-0055-206
唑-3-基)-3-羰基丙基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-2-羧酸
將原料(1S,3S,5S)-第三丁酯3-((1R,2R)-1-羥基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基
Figure 105104041-A0101-12-0055-207
唑-3-基)-3-羰基丙基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-2-羧酸1c(1.4g，3.15mmol)溶於20mL二氯甲烷，加入1.4g碾碎的分子篩，氬氣氛下，於0℃下加入1,8-雙二甲胺基萘(1.75g，8.19mmol)，三甲基氧鎓四氟硼酸鹽(1.16g，7.87mmol)，反應避光，於室溫攪拌40小時。反應結束後，過濾，濾餅用二氯甲烷洗滌，濾液用飽和氯化銨溶液(50mL×4)洗去過量1,8-雙二甲胺基萘，再用飽和氯化鈉溶液(120mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱層析法以沖提劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物(1S,3S,5S)-第三丁酯3-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基
Figure 105104041-A0101-12-0055-208
唑-3-基)-3-羰基丙基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-2-羧酸1d(400mg，白色固體)，產率27.8%。
MS m/z(ESI)：459.4[M+1]
第三步 (2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(第三丁氧羰基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸
將原料(1S,3S,5S)-第三丁酯3-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基
Figure 105104041-A0101-12-0056-209
唑-3-基)-3-羰基丙基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-2-羧酸1d(400mg，0.87mmol)溶於24mL四氫呋喃，氬氣氛下，降溫至0℃，緩慢滴加30%的雙氧水(0.34mL/0.38g，3.31mmol)，再加入一水合氫氧化鋰(62mg，1.48mmol)，反應體系於室溫反應20小時。反應結束後，向反應液中加入亞硫酸鈉固體(440mg，3.48mmol)，於室溫攪拌1小時，加入10mL水，減壓濃縮掉有機相，所得殘餘物用二氯甲烷萃取(40mL×2)。水相在冰浴下滴加2N鹽酸至反應液pH為3~4，用乙酸乙酯萃取(25mL×3)，乙酸乙酯層依次用水(50mL)，飽和氯化鈉溶液(50mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮得標題產物(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(第三丁氧羰基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸1e(230mg，無色液體)，產率88.0%。
MS m/z(ESI)：200.1[M-100+1]
第四步 (1S,3S,5S)-第三丁酯3-((1R,2R)-3-((S)-1-第三丁氧基-1-羰基-3-苯丙基-2-基胺)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-2-羧酸
將原料(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(第三丁氧羰基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸1e(100mg，0.334mmol)溶於6mL二氯甲烷和二甲基甲醯胺(V/V=5：1)混合溶劑中，加入反應物(S)-第三丁酯2-胺基-3- 苯丙酸1f(73.9mg，0.334mmol，採用習知的方法“Tetrahedron：Asymmetry,2006,17(4),603-606”製備而得)，再加入N,N-二異丙基乙基胺(0.29mL，67mmol)和2-(7-偶氮苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(152.3mg，0.40mmol)。反應體系在氬氣氛下，於室溫下攪拌1小時。反應結束後，加10mL水攪拌，分層，二氯甲烷層用飽和氯化鈉溶液(10mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱層析法以沖提劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物(1S,3S,5S)-第三丁酯3-((1R,2R)-3-((S)-1-第三丁氧基-1-羰基-3-苯丙基-2-基胺)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-2-羧酸1g(140mg，無色黏稠液體)，產率83.7%。
MS m/z(ESI)：503.3[M+1]
第五步 (S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸
將原料(1S,3S,5S)-第三丁酯3-((1R,2R)-3-((S)-1-第三丁氧基-1-羰基-3-苯丙基-2-基胺)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-2-羧酸1g(140mg，0.28mmol)溶於2mL二氧六環中，加入5.6M的氯化氫二氧六環溶液(0.15mL，0.835mmol)後將反應體系密封。於室溫攪拌8小時，置於0℃冰箱內12小時。反應結束後，依次加入3mL二氯甲烷，3mL水，3mL飽和碳酸氫鈉溶液，攪拌10分鐘。體系分層，二氯甲烷層用飽和氯化鈉溶液(20mL×2) 洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，得到標題產物(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸1h(86mg，黃色固體)，產率76.7%。
MS m/z(ESI)：403.4[M+1]
第六步 (S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷基-14-醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸
將原料(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸1h(86mg，0.213mmol)，(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷-14-羧酸1i(136mg，0.213mmol，採用專利申請“WO 2013072813”公開的方法製備而得)溶於6mL二氯甲烷和二甲基甲醯胺(V/V=5：1)混合溶劑中，加入N,N-二異丙基乙基胺(0.19mL，1.065mmol)和2-(7-偶氮苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(97.4mg，0.256mmol)。反應體系在氬氣氛下，於室溫下攪拌1小時。反應結束後，加入20mL水攪拌，分層。二氯甲烷層用飽和氯化鈉溶液(20mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱層析法 以沖提劑體系B純化殘留物，得到標題產物(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷基-14-醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸1j(120mg，白色泡沫狀固體)，產率54.9%。
MS m/z(ESI)：1023.1[M+1]
第七步 (S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸
將原料(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷基-14-醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸1j(120mg，0.117mmol)溶於2mL二氯甲烷中，加入2mL二乙胺。反應體系在氬氣氛下，於室溫下攪拌2小時。反應結束後，將反應液減壓濃縮，得到粗製品標題產物(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸1k(124mg，黃色液體)，產物不經純化 直接進行下一步反應。
MS m/z(ESI)：801.5[M+1]
第八步 (S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸
將粗製品(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸1k(90mg，0.112mmol)溶於1mL二氧六環中，加入5.6M的氯化氫二氧六環溶液3mL，將反應體系密封，於室溫下攪拌12小時。反應結束後，減壓濃縮，用高效液相層析法純化所得殘留物得標題產物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸1(19mg，白色固體)，產率22.7%。
MS m/z(ESI)：744.6[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)：δ 7.34-7.21(m,5H),4.76-4.70(m,2H),4.26-4.19(m,1H),4.14-4.06(m,1H),3.91-3.86(m,1H),3.85-3.77(m,1H),3.75-3.56(m,2H),3.44-3.10(m,9H),2.98-2.83(m,1H),2.71-2.57(m,4H),2.26-1.99(m,4H), 1.92-1.77(m,1H),1.75-1.58(m,2H),1.49-1.27(m,4H),1.21-0.95(m,18H),0.93-0.79(m,4H),0.76-0.61(m,1H).
實施例2 (S)-3-(2-氯苯基)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)丙酸
Figure 105104041-A0101-12-0061-62
Figure 105104041-A0101-12-0062-64
第一步 (S)-第三丁酯2-胺基-3-(2-氯苯基)丙酸
將原料(S)-2-胺基-3-(2-氯苯基)丙酸2a(400mg，2.0mmol，採用習知的方法“Journal of the American Chemical Society,1940,62,565-8”製備而得)溶於10mL乙酸第三丁酯，加入高氯酸(428mg(70%)，3.00mmol)，於室溫下攪拌16小時。反應結束後，加入6mL水，分液，有機相用飽和碳酸氫鈉溶液(3mL)洗滌。水相用飽和碳酸氫鈉溶液調節至pH=8，二氯甲烷(5mL×3)萃取，合併有機相，依次用水(3mL)，飽和氯化鈉溶液(5mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮得粗製品標題產物(S)-第三丁酯2-胺基-3-(2-氯苯基)丙酸2b(400mg，白色固體)，產物不經純化直接進行下一步反應。
第二步 (1S,3S,5S)-第三丁酯3-((1R,2R)-3-((S)-1-第三丁氧基-3-(2- 氯苯基)-1-羰基丙基-2-基胺)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-2-羧酸
將原料(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(第三丁氧羰基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸1e(110mg，0.367mmol)溶於6mL二氯甲烷和二甲基甲醯胺(V/V=5：1)混合溶劑中，加入粗製品(S)-第三丁酯2-胺基-3-(2-氯苯基)丙酸2b(94mg，0.367mmol)，再加入N,N-二異丙基乙基胺(0.32mL，1.835mmol)和2-(7-偶氮苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(168mg，0.44mmol)，反應體系在氬氣氛下，於室溫下攪拌1.5小時。反應結束後，加10mL水攪拌，分層，有機相用飽和氯化鈉溶液(10mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱層析法以沖提劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物(1S,3S,5S)-第三丁酯3-((1R,2R)-3-((S)-1-第三丁氧基-3-(2-氯苯基)-1-羰基丙基-2-基胺)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-2-羧酸2c(112mg，白色泡沫狀固體)，產率56.8%。
MS m/z(ESI)：537.3[M+1]
第三步 (S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氯苯基)丙酸
將原料(1S,3S,5S)-第三丁酯3-((1R,2R)-3-((S)-1-第三丁氧基-3-(2-氯苯基)-1-羰基丙基-2-基胺)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-2-羧酸2c(110mg， 0.205mmol)溶於2mL二氧六環中，加入5.6M的氯化氫二氧六環溶液(0.13mL，0.717mmol)，氬氣氛下，於室溫攪拌1小時，置於0℃冰箱內6小時。反應結束後加入5mL二氯甲烷稀釋，加入10mL飽和碳酸氫鈉溶液，攪拌10分鐘。體系分層，水層用5mL二氯甲烷萃取。合併二氯甲烷層，用飽和氯化鈉溶液(20mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，得到粗製品標題產物(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氯苯基)丙酸2d(99mg，黃色液體)，產物不經純化直接進行下一步反應。
MS m/z(ESI)：437.2[M+1]
第四步 (S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-第二丁基-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氯苯基)丙酸
將粗製品(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氯苯基)丙酸2d(99mg，0.226mmol)，(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷-14-羧酸1i(144.4mg，0.226mmol)溶於6mL二氯甲烷和二甲基甲醯胺(V/V=5：1)混合溶劑中，加入N,N-二異丙基乙基胺(0.2 mL，1.13mmol)和2-(7-偶氮苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(103.3mg，0.271mmol)。反應體系在氬氣氛下，於室溫下攪拌1小時。反應結束後，加入10mL水攪拌，分層。二氯甲烷層用飽和氯化鈉溶液(10mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥。過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱層析法以沖提劑體系B純化殘留物，得到標題產物(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-第二丁基-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氯苯基)丙酸2e(127mg，白色泡沫狀固體)，產率53.1%。
MS m/z(ESI)：1056.4[M+1]
第五步 (S)-第三丁酯3-(2-氯苯基)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)丙酸
將原料(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-第二丁基-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氯苯基)丙酸2e(127mg，0.12mmol)溶於2mL二氯甲烷中，加入2mL二乙胺。反應體系在氬氣氛下，於室溫下攪拌3小時。反應結束後，將反應液減壓濃 縮，得到粗製品標題產物(S)-第三丁酯3-(2-氯苯基)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)丙酸2f(130mg，黃色黏稠物)，產物不經純化直接進行下一步反應。
MS m/z(ESI)：834.5[M+1]
第六步 (S)-3-(2-氯苯基)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)丙酸
將粗製品(S)-第三丁酯3-(2-氯苯基)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)丙酸2f(100mg，0.12mmol)溶於1mL二氧六環中，加入5.6M的氯化氫二氧六環溶液3mL，氬氣氛下，於室溫下攪拌12小時。反應結束後，減壓濃縮反應液，用高效液相層析法純化所得殘留物，得標題產物(S)-3-(2-氯苯基)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)丙酸2(35mg，白色固體)，產率35.7%。
MS m/z(ESI)：778.7[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)：δ 7.41-7.32(m,2H),7.31-7.16(m,2H),4.80-4.65(m,2H),4.22-4.13(m,1H),4.10-4.03(m,1H),3.98-3.91(m,1H),3.87-3.82(m,1H),3.73-3.63(m,2H),3.47-3.12(m,9H),3.09-3.01(m,1H),2.67-2.57(m,4H),2.24-2.11(m,3H),2.09-1.98(m,1H),1.89-1.67(m,3H),1.51-1.25(m,4H),1.20-0.93(m,18H),0.92-0.79(m,4H),0.75-0.66(m,1H).
實施例3 (S)-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-5-甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸
Figure 105104041-A0101-12-0067-65
Figure 105104041-A0101-12-0068-66
第一步 (2S,5S)-第三丁酯2-((1R,2R)-1-羥基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基
Figure 105104041-A0101-12-0068-211
唑-3-基)-3-羰基丙基)-5-甲基吡咯烷-1-羧酸
將原料(4R,5S)-4-甲基-5-苯基-3-丙醯基
Figure 105104041-A0101-12-0068-212
唑烷酮1b(0.992g，4.2mmol)溶於20mL二氯甲烷中，氬氣氛下，降溫至0℃。反應液於0℃下滴加三乙胺(0.69mL，4.96mmol)，再滴加三氟甲磺酸二正丁基化硼(4.4mL，4.4mmol)，於0℃下攪拌50分鐘，將反應液降溫至-75℃，加入(2S,5S)-第三丁酯2-甲醯基-5-甲基吡咯烷-1-羧酸3a(900mg，4.2mmol，採用專利申請“US20120195857”公開的方法製備而得)溶於5mL二氯甲烷的溶液，於-75℃下攪 拌1.5小時，於0℃攪拌1.5小時，於室溫攪拌1小時。於室溫下加入36mL磷酸鹽緩衝液(pH=7.0)和甲醇(V/V=1：3)的混合液。冷卻至0℃，於0℃下加入36mL甲醇和雙氧水(30%)(V/V=2：1)的混合液，於室溫攪拌1小時。反應結束後，減壓濃縮除去有機相，加入15mL水。水相用乙醚(30mL×3)萃取，合併乙醚相，依次用5%碳酸氫鈉溶液，水，飽和氯化鈉溶液(150mL)洗滌，用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱層析法以沖提劑體系B純化殘留物，得標題產物(2S,5S)-第三丁酯2-((1R,2R)-1-羥基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基
Figure 105104041-A0101-12-0069-213
唑-3-基)-3-羰基丙基)-5-甲基吡咯烷-1-羧酸3b(600mg，白色固體)，產率33%。
第二步 (2S,5S)-第三丁酯2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基
Figure 105104041-A0101-12-0069-214
唑-3-基)-3-羰基丙基)-5-甲基吡咯烷-1-羧酸
將原料(2S,5S)-第三丁酯2-((1R,2R)-1-羥基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基
Figure 105104041-A0101-12-0069-215
唑-3-基)-3-羰基丙基)-5-甲基吡咯烷-1-羧酸3b(600mg，1.34mmol)溶於15mL二氯甲烷，加入1g磨成粉末的分子篩，氬氣氛下，於0℃下加入1,8-雙二甲胺基萘(740mg，3.45mmol)，三甲基氧鎓四氟硼酸鹽(500mg，3.38mmol)，反應用錫箔紙包裹，於室溫下反應38小時。反應結束後，過濾，濾餅用二氯甲烷洗滌。合併濾液，有機相用飽和氯化銨溶液(20mL×3)洗去過量1,8-雙二甲胺基萘，再用飽和氯化鈉溶液洗滌， 無水硫酸鈉乾燥。過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱層析法以沖提劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物(2S,5S)-第三丁酯2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基
Figure 105104041-A0101-12-0070-216
唑-3-基)-3-羰基丙基)-5-甲基吡咯烷-1-羧酸3c(200mg，白色固體)，產率32%。
第三步 (2R,3R)-3-((2S,5S)-1-(第三丁氧羰基)-5-甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸
將原料(2S,5S)-第三丁酯2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基
Figure 105104041-A0101-12-0070-217
唑-3-基)-3-羰基丙基)-5-甲基吡咯烷-1-羧酸3c(200mg，0.43mmol)溶於22mL四氫呋喃，氬氣氛下，降溫至0℃，緩慢滴加30%的雙氧水(186mg，1.6mmol)，再加入一水合氫氧化鋰(58mg，1.37mmol)，於0℃下反應10分鐘後，撤去冰浴，反應體系於室溫反應44小時。反應結束後，向反應液中加入亞硫酸鈉固體(220mg，1.74mmol)，於室溫攪拌1小時，加入15mL水。減壓濃縮掉有機相，所得殘餘物用二氯甲烷萃取(20mL×2)。水相在冰浴下滴加2N鹽酸至反應液pH為3~4，用乙酸乙酯萃取(20mL×3)，乙酸乙酯層依次用水，飽和氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮得粗製品標題產物(2R,3R)-3-((2S,5S)-1-(第三丁氧羰基)-5-甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸3d(120mg，白色固體)，產物不經純化直接進行下一步反應。
第四步 (2S,5S)-第三丁酯2-((1R,2R)-3-((S)-1-第三丁氧基-1-羰基-3-苯丙基-2-基胺)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-5-甲基吡咯烷-1-羧酸
將粗製品(2R,3R)-3-((2S,5S)-1-(第三丁氧羰基)-5-甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸3d(106mg，0.35mmol)溶於4.8mL二氯甲烷和二甲基甲醯胺(V/V=5：1)混合溶劑中，加入(S)-第三丁酯2-胺基-3-苯丙酸1f(80mg，0.36mmol)，反應體系在氬氣氛下，加入N,N-二異丙基乙基胺(0.30mL，1.74mmol)和2-(7-偶氮苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(160mg，0.42mmol)，於室溫下攪拌2小時。反應結束後，加10mL二氯甲烷，依次用水(5mL×2)、飽和氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱層析法以沖提劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物(2S,5S)-第三丁酯2-((1R,2R)-3-((S)-1-第三丁氧基-1-羰基-3-苯丙基-2-基胺)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-5-甲基吡咯烷-1-羧酸3e(138mg，無色黏稠液體)，產率78%。
第五步 (S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((2S,5S)-5-甲基吡咯烷-2-基)丙醯基)-3-苯丙酸
將原料(2S,5S)-第三丁酯2-((1R,2R)-3-((S)-1-第三丁氧基-1-羰基-3-苯丙基-2-基胺)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-5-甲基吡咯烷-1-羧酸3e(150mg，0.267mmol)溶於2.2mL二氧六環中，加入4M的氯化氫二氧六環溶液(0.160 mL，0.896mmol)後將反應體系密封。於室溫攪拌7小時，置於4℃冰箱內16小時。反應結束後，將反應液減壓濃縮，加入15mL二氯甲烷，冷卻至0℃，滴加飽和碳酸氫鈉溶液調至pH為8，分層，水相用二氯甲烷萃取(8mL×2)，合併有機相。有機相用飽和氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉乾燥。過濾，濾液減壓濃縮，得到標題產物(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((2S,5S)-5-甲基吡咯烷-2-基)丙醯基)-3-苯丙酸3f(80mg，無色黏稠固體)，產率74%。
第六步 (S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-第二丁基-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷基)-5-甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸
將原料(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((2S,5S)-5-甲基吡咯烷-2-基)丙醯基)-3-苯丙酸3f(80mg，0.198mmol)，(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷-14-羧酸1i(136mg，0.213mmol)溶於4.8mL二氯甲烷和二甲基甲醯胺(V/V=5：1)混合溶劑中，加入N,N-二異丙基乙基胺(0.170mL，0.98mmol)和2-(7-偶氮苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(100mg，0.263mmol)。反應體系在氬氣氛下，於室溫下攪拌反應1小時。反應結束後，加入15mL二氯甲烷，用水(6mL×2)洗滌。水相用二氯甲烷萃取(5mL)，合併二氯甲烷 相，用飽和氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉乾燥。過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱層析法以沖提劑體系B純化殘留物，得到標題產物(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-第二丁基-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷基)-5-甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸3g(168mg，白色泡沫狀固體)，產率81%。
第七步 (S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-5-甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸
將原料(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-第二丁基-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷基)-5-甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸3g(167mg，0.16mmol)溶於2mL二氯甲烷中，加入2mL二乙胺。反應體系在氬氣氛下，於室溫下攪拌3小時。反應結束後，將反應液減壓濃縮，得到粗製品標題產物(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-5-甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸3h(180mg，黃色液體)，產物不經純化直接進行下一步反應。
MS m/z(ESI)：802.6[M+1]
第八步 (S)-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-5-甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸
將粗製品(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-5-甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸3h(130mg，0.16mmol)溶於1mL二氧六環中，加入3mL 5.6M的氯化氫二氧六環溶液，將反應體系密封，於室溫下攪拌12小時。反應結束後，將反應液減壓濃縮，用高效液相層析法純化所得殘餘物，得標題產物(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-5-甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸3(28mg，白色固體)，產率23%。
MS m/z(ESI)：746.7[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)：δ 7.31-7.14(m,5H),4.79-4.67(m,2H),4.25-4.13(m,1H),4.10-3.97(m,2H),3.77-3.66(m,1H),3.60-3.52(m,1H),3.51-3.42(m,1H),3.41-3.12(m,7H),2.97-2.85(m,1H),2.67(d,3H),2.48-2.40(m,2H),2.30-2.02(m,4H),1.93-1.73(m,2H),1.70-1.55(m,1H),1.53-1.28(m, 5H),1.26-1.11(m,7H),1.10-0.99(m,14H),0.98-0.83(m,4H).
實施例4 (S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸
Figure 105104041-A0101-12-0075-67
第一步 6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯氯
在原料6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸4a(1.5g，7.10mmol，採用習知的方法“Journal of Medcinal Chemistry,2013,56(24),9955-9968”製備而得)中滴入一滴 N,N-二甲基甲醯胺，氬氣氛下，乾冰浴降溫後，緩慢滴入15mL草醯氯，滴加時劇烈攪拌，滴完於室溫反應1小時。反應結束後，將反應液減壓濃縮，用二氯甲烷溶解所得殘留物，減壓濃縮，得到粗製品標題產物6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯氯4b，產物不經純化直接進行下一步反應。
第二步 (S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸
將原料(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸1(17mg，0.023mmol)溶於1mL二氯甲烷中，加入N,N-二異丙基乙基胺(20μL，0.115mmol)，反應體系在氬氣氛下，冰浴下滴加預製的6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯氯4b(7.9mg，0.034mmol)的二氯甲烷溶液，滴加完畢後於室溫反應5小時。反應結束後，加入10mL甲醇淬滅，將反應液減壓濃縮，用高效液相層析法純化所得殘留物，得標題產物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3- 甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸4(9mg，白色固體)，產率42%。
MS m/z(ESI)：937.4[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)：δ 7.37-7.17(m,5H),6.84-6.79(m,2H),4.80-4.71(m,2H),4.69-4.56(m,2H),4.26-4.19(m,1H),4.14-4.07(m,1H),3.92-3.86(m,1H),3.84-3.78(m,1H),3.77-3.60(m,1H),3.55-3.47(m,2H),3.42-3.23(m,5H),3.18-3.12(m,2H),3.07-3.03(m,2H),3.02-2.82(m,2H),2.66-2.58(m,2H),2.54-2.46(m,1H),2.46-2.38(m,2H),2.30-2.14(m,2H),2.09-1.99(m,1H),1.90-1.78(m,1H),1.75-1.56(m,6H),1.48-1.28(m,6H),1.20-0.79(m,22H),0.77-0.69(m,1H).
實施例5 (S)-3-(2-氯苯基)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)丙酸
Figure 105104041-A0101-12-0077-69
Figure 105104041-A0101-12-0078-70
將原料(S)-3-(2-氯苯基)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)丙酸2(18mg，0.023mmol)溶於1mL二氯甲烷中，加入N,N-二異丙基乙基胺(0.02mL，0.115mmol)，反應體系在氬氣氛下，冰浴下滴加預製的6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯氯4b(7.9mg，0.034mmol)的二氯甲烷溶液，滴加完畢後於室溫反應4小時。反應結束後，加入5mL甲醇淬滅，將反應液減壓濃縮，用高效液相層析法純化所得殘留物，得標題產物(S)-3-(2-氯苯基)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)丙酸5(6mg，白色固體)，產率26.6%。
MS m/z(ESI)：971.5[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)：δ 7.42-7.34(m,2H),7.33-7.19(m,2H),6.83-6.78(m,2H),4.83-4.70(m,2H),4.68-4.56(m,2H),4.24-4.16(m,1H),4.13-4.05(m,1H),4.03-3.95(m,1H),3.91-3.84(m,1H),3.76-3.65(m,1H),3.54-3.48(m,2H), 3.47-3.18(m,5H),3.17-2.96(m,6H),2.67-2.58(m,2H),2.53-2.38(m,3H),2.28-2.18(m,2H),2.09-2.00(m,1H),1.92-1.57(m,7H),1.51-1.28(m,6H),1.21-0.82(m,22H),0.78-0.69(m,1H).
實施例6 (S)-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-5-甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸
Figure 105104041-A0101-12-0079-71
將原料(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-5-甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸3(18mg，0.024mmol)溶於1mL二氯甲烷中，加入N,N-二異丙基乙基胺(0.02mL，0.12mmol)，反應體系在氬氣氛下，冰浴下滴加預製的6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯氯4b(8.3mg,0.036mmol)的二氯甲烷溶液，於室溫攪拌反應4小時。反應結束後，加入5mL 甲醇淬滅，將反應液減壓濃縮，用高效液相層析法純化所得殘留物，得標題產物(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-5-甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸6(7mg，白色固體)，產率30.9%。
MS m/z(ESI)：939.5[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)：δ 7.30-7.15(m,5H),6.83-6.78(m,2H),4.78-4.69(m,2H),4.69-4.56(m,2H),4.24-4.12(m,1H),4.10-3.96(m,2H),3.60-3.44(m,3H),3.41-3.22(m,4H),3.16-3.10(m,2H),3.07-3.02(m,2H),3.01-2.86(m,2H),2.52-2.38(m,4H),2.31-2.15(m,3H),2.09-1.99(m,1H),1.91-1.77(m,2H),1.71-1.56(m,5H),1.52-1.28(m,9H),1.26-1.14(m,6H),1.11-0.77(m,18H).
實施例7 (S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸
Figure 105104041-A0101-12-0080-72
Figure 105104041-A0101-12-0081-73
第一步 (S)-第三丁酯2-胺基-3-(2-氟苯基)丙酸
將原料((S)-2-胺基-3-(2-氟苯基)丙酸7a(400mg，2.18mmol，採用習知的方法“Advanced Synthesis & Catalysis,2012,354(17),3327-3332”製備而得)溶於10mL乙酸第三丁酯，加入高氯酸(300mg(70%)，3.3mmol)，於室溫下攪拌16小時。反應完畢後加入6mL水，分液，有機相用飽和碳酸氫鈉溶液(5mL)洗滌。水相用飽和碳酸氫鈉溶液調節至pH=8，二氯甲烷(5mL×3)萃取，合併有機相，依次用水(3mL)，飽和氯化鈉溶液(5mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮得粗製品標題產物(S)-第三丁酯2-胺基-3-(2-氟苯基)丙酸7b(390mg，黃色油狀物)，產物不經純化直接進行下一步反應。
第二步 (1S,3S,5S)-第三丁酯3-((1R,2R)-3-(((S)-1-(第三丁氧基)-3-(2-氟苯基)-1-羰基丙基-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-2-羧酸
將原料(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(第三丁氧羰基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸1e(100mg，0.334mmol)溶於6mL二氯甲烷和二甲基甲醯胺(V/V=5：1)混合溶劑中，加入反應物粗製品(S)-第三丁酯2-胺基-3-(2-氟苯基)丙酸7b(80mg，0.334mmol)。再加入N,N-二異丙基乙基胺(0.29mL，1.67mmol)和2-(7-偶氮苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(152.3mg，0.40mmol)。反應體系在氬氣氛下，於室溫攪拌1小時。反應結束後，加10mL水攪拌，分層，二氯甲烷層用飽和氯化鈉溶液(10mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用矽膠柱層析法以沖提劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物(1S,3S,5S)-第三丁酯3-((1R,2R)-3-(((S)-1-(第三丁氧基)-3-(2-氟苯基)-1-羰基丙基-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-2-羧酸7c(173mg，無色液體)，產率99.5%。
MS m/z(ESI)：521.2[M+1]
第三步 (S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸
將原料(1S,3S,5S)-第三丁酯3-((1R,2R)-3-(((S)-1-(第 三丁氧基)-3-(2-氟苯基)-1-羰基丙基-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-2-羧酸7c(173mg，0.33mmol)溶於2mL二氧六環中，加入5.6M的氯化氫二氧六環溶液(0.21mL，1.16mmol)，氬氣氛下，於室溫攪拌1小時，置於0℃冰箱內12小時。反應結束後，將反應液減壓濃縮，加入5mL二氯甲烷稀釋，加入10mL飽和碳酸氫鈉溶液，攪拌10分鐘。體系分層，水層用二氯甲烷萃取(5mL×3)。合併二氯甲烷層，用飽和氯化鈉溶液(10mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥。過濾，濾液減壓濃縮，得到粗製品標題產物(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸7d(77mg，黃色液體)，產物不經純化直接進行下一步反應。
MS m/z(ESI)：421.2[M+1]
第四步 (S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧-4,7,10-三氮雜十四烷基-14-醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸
將粗製品(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸7d(77mg，0.183mmol)，(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二 甲基-3,6,9-三羰基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷-14-羧酸1i(116.8mg，0.183mmol)溶於6mL二氯甲烷和二甲基甲醯胺(V/V=5：1)混合溶劑中，加入N,N-二異丙基乙基胺(0.16mL，0.915mmol)和2-(7-偶氮苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(84mg，0.22mmol)。反應體系在氬氣氛下，於室溫下攪拌1小時。反應結束後，加入10mL水攪拌，分層。二氯甲烷層用飽和氯化鈉溶液(10mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥。過濾，濾液減壓濃縮。用矽膠柱層析法以沖提劑體系B純化殘留物，得到標題產物(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷基-14-醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸7e(190.5mg，黃色黏稠物)，產率100%。
MS m/z(ESI)：1040.6[M+1]
第五步 (S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸
將原料(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷基-14-醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷 -3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸7e(190.5mg，0.183mmol)溶於1.5mL二氯甲烷中，加入2mL二乙胺。反應體系在氬氣氛下，於室溫攪拌3小時。反應結束後，將反應液減壓濃縮，得到粗製品標題產物(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸7f(150mg，黃色黏稠物)，產物不經純化直接進行下一步反應。
MS m/z(ESI)：818.5[M+1]
第六步 (S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸
將粗製品(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸7f(150mg，0.183mmol)溶於1mL二氧六環中，加入5.6M的氯化氫二氧六環溶液3mL，氬氣氛下，於室溫攪拌12小時。反應結束後，將反應液減壓濃縮，用乙醚帶旋溶劑。所得殘餘物用高效液相層析法純化得標題產物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2- ((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸7(28mg，白色粉末固體)，產率20%。
MS m/z(ESI)：762.7[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)：δ 7.38-7.18(m,2H),7.13-7.01(m,2H),4.80-4.67(m,2H),4.30-4.15(m,1H),4.13-4.01(m,1H),3.96-3.83(m,2H),3.75-3.60(m,2H),3.42-3.11(m,9H),3.06-2.95(m,1H),2.70-2.58(m,4H),2.28-2.01(m,4H),1.88-1.70(m,3H),1.57-1.25(m,4H),1.22-0.95(m,18H),0.92-0.80(m,4H),0.78-0.65(m,1H).
實施例8 (S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸
Figure 105104041-A0101-12-0086-74
將原料(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸7(25mg，0.033mmol)溶於3mL二氯甲烷中，加入N,N-二異丙基乙基胺(0.029mL，0.164mmol)，反應體系在氬氣氛下，冰浴下滴加預製的6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯氯4b(11.3mg，0.049mmol)的二氯甲烷溶液，於室溫反應3小時。反應結束後，加入5mL水，攪拌20分鐘，分液，有機層用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，殘留物用高效液相層析法純化得標題產物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸8(7mg，黃色黏稠物)，產率22.4%。
MS m/z(ESI)：955.4[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)：δ 7.36-7.30(m,1H),7.29-7.21(m,1H),7.17-7.02(m,2H),6.83-6.79(m,2H),4.81-4.71(m,2H),4.69-4.55(m,2H),4.25-4.15(m,1H),4.13-4.04(m,1H),3.96-3.85(m,2H),3.70-3.61(m,1H),3.55-3.46(m,3H),3.40-3.21(m,4H),3.18-3.10(m,2H),3.07-2.96(m,4H),2.67-2.56(m,2H),2.54-2.34(m,3H),2.29-2.17(m,2H),2.10-1.99(m,1H),1.89-1.57(m,7H),1.52-1.28(m,6H), 1.21-1.11(m,4H),1.07-0.96(m,6H),0.95-0.81(m,12H),0.80-0.69(m,1H).
實施例9 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯胺)-4-亞甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸
Figure 105104041-A0101-12-0088-76
Figure 105104041-A0101-12-0089-77
第一步 (S)-第三丁酯2-甲醯基-4-亞甲基吡咯烷-1-羧酸
將原料(S)-第三丁酯2-(羥甲基)-4-亞甲基吡咯烷-1-羧酸9a(1.32g，6.19mmol，採用習知的方法“From Journal of Organic Chemistry,2003,68(10),3923-3931”製備而得)溶於15mL二氯甲烷中，降溫至0℃。反應體系於氬氣氛下，加入N,N-二異丙基乙基胺(5.38mL，30.9mmol)，二甲基亞碸(7.26g，92.9mmol)，加入三氧化硫-吡啶絡合物(7.26g，92.9mmol)，反應液於0℃下反應3小時。反應結束後，加 入磷酸鹽緩衝液(pH=7)淬滅反應，依次用水，飽和氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱層析法以沖提劑體系B純化殘留物，得標題產物(S)-第三丁酯2-甲醯基-4-亞甲基吡咯烷-1-羧酸9b(1.1g，淡黃色液體)，產率84.2%。
第二步 (S)-第三丁酯2-((1R,2R)-1-羥基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基
Figure 105104041-A0101-12-0090-218
唑-3-基)-3-羰基丙基)-4-亞甲基吡咯烷-1-羧酸
將原料(4R,5S)-4-甲基-5-苯基-3-丙醯基
Figure 105104041-A0101-12-0090-220
唑烷酮1b(1.43g，6.15mmol)溶於30mL二氯甲烷中，氬氣氛下，降溫至0℃，滴加三乙胺(0.98mL，7.08mmol)，再滴加三氟甲磺酸二正丁基化硼(6.65mL，6.65mmol)，於0℃下攪拌50分鐘，將反應液降溫至-78℃，加入預製的(S)-第三丁酯2-甲醯基-4-亞甲基吡咯烷-1-羧酸9b(1.43g，6.15mmol)的二氯甲烷溶液，於-78℃下攪拌2小時，於0℃攪拌1小時，於室溫攪拌1小時。加入36mL磷酸鹽緩衝液(pH=7)和甲醇(V/V=3：1)的混合液淬滅反應。於0℃下加入甲醇和雙氧水(V/V=1：2)的混合液，於室溫攪拌1小時。反應結束後，旋除甲醇和有機相，殘留水相用二氯甲烷萃取，合併有機相，依次用水洗滌，飽和氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱層析法以沖提劑體系B純化殘留物，得標題產物(S)-第三丁酯2-((1R,2R)-1-羥基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基
Figure 105104041-A0101-12-0090-221
唑-3-基)-3-羰 基丙基)-4-亞甲基吡咯烷-1-羧酸9c(810mg，白色泡沫狀固體)，產率30%。
MS m/z(ESI)：354.2[M-100+1]
第三步 (S)-第三丁酯2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基
Figure 105104041-A0101-12-0091-222
唑-3-基)-3-羰基丙基)-4-亞甲基吡咯烷-1-羧酸
將原料(S)-第三丁酯2-((1R,2R)-1-羥基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基
Figure 105104041-A0101-12-0091-223
唑-3-基)-3-羰基丙基)-4-亞甲基吡咯烷-1-羧酸9c(810mg，1.82mmol)溶於15mL二氯甲烷，加入碾碎的分子篩，加入碳酸鉀(1.25g，9.11mmol)，三氟甲磺酸甲酯(897.7mg，5.47mmol)，於室溫攪拌反應12小時。反應結束後，將反應液過濾，濾餅用二氯甲烷洗滌，合併有機相，將有機相減壓濃縮，用矽膠柱層析法以沖提劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物(S)-第三丁酯2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基
Figure 105104041-A0101-12-0091-224
唑-3-基)-3-羰基丙基)-4-亞甲基吡咯烷-1-羧酸9d(280mg，白色泡沫固體)，產率33.5%。
MS m/z(ESI)：359.2[M-100+1]
第四步 (2R,3R)-3-((S)-1-(第三丁氧羰基)-4-亞甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸
將原料(S)-第三丁酯2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基
Figure 105104041-A0101-12-0091-225
唑-3-基)-3-羰基丙基)-4- 亞甲基吡咯烷-1-羧酸9d(400mg，0.87mmol)溶於20mL四氫呋喃，加入一水合氫氧化鋰(62.2mg,，1.484mmol)，反應體系在氬氣氛下，降溫至0℃，緩慢滴加30%的雙氧水(112.7mg，3.31mmol)，反應體系於室溫反應12小時。反應結束後，向反應液中加入亞硫酸鈉(416mg，3.3mmol)，於室溫攪拌1小時。將四氫呋喃旋乾，殘餘物中加入水溶解，用二氯甲烷萃取。水相滴加稀鹽酸調節反應液pH為3~4，用二氯甲烷萃取(30mL×3)，合併有機相，依次用水洗滌，飽和氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮得粗製品標題產物(2R,3R)-3-((S)-1-(第三丁氧羰基)-4-亞甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸9e(230mg，無色液體)，產物不經純化直接進行下一步。
MS m/z(ESI)：298.2[M-1]
第五步 (S)-第三丁酯2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(第三丁氧基)-1-羰基-3-苯丙基-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-4-亞甲基吡咯烷-1-羧酸
將粗製品(2R,3R)-3-((S)-1-(第三丁氧羰基)-4-亞甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸9e(220mg，0.735mmol)溶於6mL二氯甲烷中，加入反應物(S)-第三丁酯2-胺基-3-苯丙酸1f(178.8mg，0.809mmol)。再加入N,N-二異丙基乙基胺(0.51mL，2.94mmol)和2-(7-偶氮苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(363mg，0.956mmol)。反應體系在氬氣氛下，於室溫下反應3小時。反應結束後， 反應液用水洗滌，飽和氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱層析法以沖提劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物(S)-第三丁酯2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(第三丁氧基)-1-羰基-3-苯丙基-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-4-亞甲基吡咯烷-1-羧酸9f(271mg，白色固體)，產率66%。
MS m/z(ESI)：503.3[M+1]
第六步 (S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-4-亞甲基吡咯烷-2-基)丙醯胺)-3-苯丙酸
將原料(S)-第三丁酯2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(第三丁氧基)-1-羰基-3-苯丙基-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-4-亞甲基吡咯烷-1-羧酸9f(270mg，0.537mmol)溶於4mL 1,4-二氧六環中，加入4M的氯化氫二氧六環溶液(0.335mL，1.881mmol)，於室溫下攪拌1小時，置於0~4℃冰箱內12小時。將反應物減壓濃縮，殘留物用二氯甲烷溶解，滴加飽和碳酸氫鈉溶液調節pH為8~9，分液，水相用二氯甲烷萃取。合併有機相，依次用水洗滌，飽和氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮得到粗製品標題產物(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-4-亞甲基吡咯烷-2-基)丙醯胺)-3-苯丙酸9g(210mg，淡黃色油狀物)，產物不經純化直接進行下一步反應。
MS m/z(ESI)：403.4[M+1]
第七步 (S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷基-14-醯基)-4-亞甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸
將粗製品(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-4-亞甲基吡咯烷-2-基)丙醯胺)-3-苯丙酸9g(210mg，0.521mmol)，(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷-14-羧酸1i(365.9mg，0.547mmol)溶於6mL二氯甲烷中，加入N,N-二異丙基乙基胺(0.4537mL，2.609mmol)和2-(7-偶氮苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(257.8mg，0.678mmol)。反應體系在氬氣氛下，室溫下攪拌2小時。反應結束後，反應液依次用水洗滌，飽和氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱層析法以沖提劑體系B純化殘留物，得到標題產物(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷基-14-醯基)-4-亞甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸9h(345mg，白色泡沫狀固體)，產率64.7%。
MS m/z(ESI)：1022.5[M+1]
第八步 (S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-4-亞甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸
將原料(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷基-14-醯基)-4-亞甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸9h(345mg，0.337mmol)溶於2mL二氯甲烷中，加入3mL二乙胺。反應體系在氬氣氛下，於室溫下攪拌2小時。反應結束後將反應液減壓濃縮，得到粗製品標題產物(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-4-亞甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸9i(375mg，黃色油狀物),產物不經純化直接進行下一步反應。
MS m/z(ESI)：800.5[M+1]
第九步 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-4-亞甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸
將粗製品(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁 醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-4-亞甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸9i(370mg，0.462mmol)加入反應瓶中，加入4M的氯化氫二氧六環溶液7mL，將反應體系密封，於室溫下攪拌12小時。反應結束後，將反應液減壓濃縮，殘留物用高效液相層析法純化得標題產物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-4-亞甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸9(30mg，白色粉末)，產率11.9%。
MS m/z(ESI)：744.7[M+1]
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 10.57(s,1H),10.00(s,1H),8.41-8.26(m,2H),7.52-6.99(m,5H),5.34(s,1H),5.02-4.95(m,4H),4.38-4.33(m,2H),4.16(m,2H),3.93-3.75(m,3H),3.49-3.07(m,6H),2.94-2.32(m,16H),2.30-2.01(m,4H),1.75-1.65(m,2H),1.32-0.83(m,16H).
實施例10 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-4-亞甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸
Figure 105104041-A0101-12-0096-78
Figure 105104041-A0101-12-0097-79
將原料(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-4-亞甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸9(22mg，0.0295mmol)溶於3mL二氯甲烷中，加入N,N-二異丙基乙基胺(19mg，0.1479mmol)，降溫至0℃，滴加預製的6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯氯4b(10.1mg，0.0443mmol)的二氯甲烷溶液，反應體系在氬氣氛下，於室溫反應2.5小時。反應結束後，加入甲醇淬滅，將反應液減壓濃縮，用高效液相層析法純化所得殘留物，得標題產物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-4-亞甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸10(1.3mg，白色黏稠物)，產率4.6%。
MS m/z(ESI)：937.9[M+1]
實施例11 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙 醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸
Figure 105104041-A0101-12-0098-80
第一步 (S)-第三丁酯6-甲醯基-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-5-羧酸
將原料(S)-第三丁酯6-(羥甲基)-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-5-羧酸11a(2.37g，10.4mmol，採用習知的方法 “Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,2013,23(9),2653-2658”製備而得)溶於40mL二氯甲烷中，降溫至0℃。反應體系在氬氣氛下，加入N,N-二異丙基乙基胺(10.8mL，62.5mmol)，二甲基亞碸(12.2g，156.4mmol)，加入三氧化硫-吡啶絡合物(6.63g，41.7mmol)，反應液於0℃反應3小時。反應結束後，加入磷酸鹽緩衝液(pH=7)淬滅反應，依次用水，飽和氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱層析法以沖提劑體系B純化殘留物，得標題產物(S)-第三丁酯6-甲醯基-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-5-羧酸11b(2g，黃色液體)，產率88%。
第二步 (S)-第三丁酯6-((1R,2R)-1-羥基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基
Figure 105104041-A0101-12-0099-227
唑-3-基)-3-羰基丙基)-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-5-羧酸
將原料(4R,5S)-4-甲基-5-苯基-3-丙醯基
Figure 105104041-A0101-12-0099-228
唑烷酮1b(2g，8.88mmol)溶於35mL二氯甲烷中，氬氣氛下，滴加三乙胺(1.42mL，10.2mmol)，降溫至0℃，滴加三氟甲磺酸二正丁基化硼(9.59mL，9.59mmol)，於0℃攪拌50分鐘，於78℃加入預製的(S)-第三丁酯6-甲醯基-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-5-羧酸11b(2g，8.88mmol)的二氯甲烷溶液，於-78℃下攪拌2小時，於0℃攪拌1小時，於室溫攪拌1小時。反應結束後，加入磷酸鹽緩衝液(pH=7.0)和甲醇(V/V=3：1)的混合液淬滅反應。於0℃加入甲醇和雙氧水(V/V=1：2)的混合液，於室溫攪拌1小時。減壓濃縮後，加水溶解殘留 物，用二氯甲烷萃取，合併有機相，依次用水洗滌，飽和氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱層析法以沖提劑體系B純化殘留物，得標題產物(S)-第三丁酯6-((1R,2R)-1-羥基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基
Figure 105104041-A0101-12-0100-229
唑-3-基)-3-羰基丙基)-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-5-羧酸11c(1.8g，白色泡沫狀固體)，產率44.2%。
MS m/z(ESI)：459.4[M+1]
第三步 (S)-第三丁酯6-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基
Figure 105104041-A0101-12-0100-230
唑-3-基)-3-羰基丙基)-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-5-羧酸
將原料(S)-第三丁酯6-((1R,2R)-1-羥基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基
Figure 105104041-A0101-12-0100-231
唑-3-基)-3-羰基丙基)-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-5-羧酸11c(1.8g，3.92mmol)溶於30mL二氯甲烷，加入碾碎的分子篩，反應體系在氬氣氛下，加入碳酸鉀(3.78g，27.48mmol)，三氟甲磺酸甲酯(3.22g，19.64mmol)，於室溫下攪拌反應12小時。反應結束後，將反應液過濾，濾餅用二氯甲烷洗滌，合併有機相，將有機相減壓濃縮，用矽膠柱層析法以沖提劑體系A純化所得殘餘物，得到標題產物(S)-第三丁酯6-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基
Figure 105104041-A0101-12-0100-232
唑-3-基)-3-羰基丙基)-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-5-羧酸11d(930mg，無色油狀物)，產率50.2%。
MS m/z(ESI)：473.4[M+1]
第四步 (2R,3R)-3-((S)-5-(第三丁氧羰基)-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸
將原料(S)-第三丁酯6-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基
Figure 105104041-A0101-12-0101-233
唑-3-基)-3-羰基丙基)-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-5-羧酸11d(1.03g，2.8mmol)溶於20mL四氫呋喃，加入一水合氫氧化鋰(155mg,，3.7mmol)，反應體系在氬氣氛下，滴加30%的雙氧水(939mg，8.28mmol)，反應體系於室溫反應12小時。反應結束後，向反應液中加入亞硫酸鈉(1.04g，8.28mmol)，於室溫攪拌1小時。將四氫呋喃旋乾，殘餘物中加入水溶解，用二氯甲烷萃取。水相滴加稀鹽酸調節反應液pH為3~4，用二氯甲烷萃取(30mL×5)，合併有機相，依次用水洗滌，飽和氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮得粗製品標題產物(2R,3R)-3-((S)-5-(第三丁氧羰基)-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸11e(700mg，無色黏稠液體)，產物不經純化直接進行下一步。
MS m/z(ESI)：314.4[M+1]
第五步 (S)-第三丁酯6-((1R,2R)-3-(((S)-1-(第三丁氧基)-3-(2-氟苯基)-1-羰基丙烷-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-5-羧酸
將粗製品(2R,3R)-3-((S)-5-(第三丁氧羰基)-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸11e(350mg，1.117 mmol)溶於6mL二氯甲烷中，加入反應物(S)-第三丁酯2-胺基-3-(2-氟苯基)丙酸7b(267mg，1.117mmol)。反應體系在氬氣氛下，加入N,N-二異丙基乙基胺(720mg，5.587mmol)和2-(7-偶氮苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(509.8mg，1.341mmol)，於室溫下反應2小時。反應結束後，反應液用水洗滌，飽和氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱層析法以沖提劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物(S)-第三丁酯6-((1R,2R)-3-(((S)-1-(第三丁氧基)-3-(2-氟苯基)-1-羰基丙烷-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-5-羧酸11f(570mg，無色油狀物)，產率95.3%。
MS m/z(ESI)：535.3[M+1]
第六步 (S)-第三丁酯3-(2-氟苯基)-2-((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-6-基)丙醯胺)丙酸
將原料(S)-第三丁酯6-((1R,2R)-3-(((S)-1-(第三丁氧基)-3-(2-氟苯基)-1-羰基丙烷-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-5-羧酸11f(570mg，1.049mmol)溶於8mL 1,4-二氧六環中，加入4M的氯化氫二氧六環溶液(0.749mL，4.196mmol)，於室溫下攪拌1小時，置於0~4℃冰箱內12小時。將反應物減壓濃縮，殘留物用二氯甲烷溶解，滴加飽和碳酸氫鈉溶液調節pH為8~9，分液，水相用二氯甲烷萃取。合併有機相，依次用水洗滌，飽和氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾 液減壓濃縮得到粗製品標題產物(S)-第三丁酯3-(2-氟苯基)-2-((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-6-基)丙醯胺)丙酸11g(440mg，淡黃色油狀物)，產物不經純化直接進行下一步反應。
MS m/z(ESI)：435.4[M+1]
第七步 (S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((S)-5-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷基-14-醯基-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸
將粗製品(S)-第三丁酯3-(2-氟苯基)-2-((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-6-基)丙醯胺)丙酸11g(440mg，1.013mmol)，(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷-14-羧酸1i(645.8mg，1.013mmol)溶於10mL二氯甲烷中，加入N,N-二異丙基乙基胺(0.88mL，5.06mmol)和2-(7-偶氮苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(500.5mg，1.317mmol)。反應體系在氬氣氛下，於室溫下攪拌2小時。反應結束後，反應液依次用水洗滌，飽和氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱層析法以沖提劑體系B純化殘留物，得到標題產物(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((S)-5-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-1- (9H-芴-9-基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷基-14-醯基-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸11h(570mg，白色粉末)，產率53.4%。
MS m/z(ESI)：1054.9[M+1]
第八步 (S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸
將原料(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((S)-5-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷基-14-醯基-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸11h(560mg，0.531mmol)溶於2mL二氯甲烷中，加入6mL二乙胺，於室溫下攪拌2.5小時。反應結束後將反應液減壓濃縮，得到粗製品標題產物(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸11i(550mg，白色黏稠物)，產物不經純化直接進行下一步反應。
MS m/z(ESI)：832.5[M+1]
第九步 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸
將粗製品(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸11i(450mg，0.541mmol)加入反應瓶中，加入4M的氯化氫二氧六環溶液7mL，將反應體系密封，於室溫下攪拌反應12小時。反應結束後，將反應液減壓濃縮，殘留物用高效液相層析法純化得標題產物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸11(403mg，白色固體)，產率96%。
MS m/z(ESI)：776.7[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ 7.30-7.22(m,2H),7.12-7.04(m,2H),4.72-4.68(m,2H),4.13-4.07(m,2H),3.96-3.94(m,1H),3.70-3.66(m,2H),3.50-3.47(m,2H),3.40-3.37(m,3H),3.34-3.28(m,4H),3.26-3.22(m,2H),3.11(s,1H),3.05-2.91(m,2H),2.67-2.65(m,3H),2.57-2.43(m,2H),2.39-2.28(m,2H),2.25-2.16(m,3H),1.93-1.88(m,2H),1.55-1.43(m,2H),1.23-1.21(d,2H),1.16-1.08(m,3H),1.08-0.97(m,10H), 0.89-0.83(m,3H),0.66-0.53(m,3H),0.46-0.43(m,2H).
實施例12 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸
Figure 105104041-A0101-12-0106-81
將原料(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸11(150mg，0.193mmol)溶於7mL二氯甲烷中，加入N,N-二異丙基乙基胺(87.3mg，0.677mmol)，反應體系在氬氣氛下，降溫至0℃，滴加預製的6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯氯4b(57.6mg，0.251mmol)的二氯甲烷溶液，於室溫反應2小時。反應結束後，加入甲醇淬滅，將反應液減壓濃縮，用高效液 相層析法純化所得殘留物，得標題產物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸12(14.7mg，白色粉末)，產率7.8%。
MS m/z(ESI)：969.9[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ 7.29-7.23(m,2H),7.10-7.04(m,2H),6.79-6.78(m,2H),4.69-4.54(m,3H),4.18-4.07(m,3H),3.98-3.92(m,1H),3.75-3.71(m,2H),3.50-3.47(m,3H),3.42-3.39(m,2H),3.34-3.32(m,5H),3.27-3.19(m,4H),3.09-2.95(m,5H),2.49-2.47(m,2H),2.41-2.36(m,2H),2.29-2.18(m,3H),2.09-2.02(m,2H),1.90-1.87(m,2H),1.63-1.59(m,4H),1.49(s,2H),1.32-1.28(m,3H),1.21-1.12(m,3H),1.00-0.81(m,12H),0.62-0.55(m,3H),0.46-0.40(m,2H).
實施例13 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯基丙酸
Figure 105104041-A0101-12-0108-82
採用實施例11的合成路徑，將第五步原料替換為(2R,3R)-3-((S)-5-(第三丁氧羰基)-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸11e和(S)-第三丁酯2-胺基-3-苯丙酯1f製得標題產物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯基丙酸13(219mg，白色粉末)。
MS m/z(ESI)：758.7[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ 7.31-7.19(m,5H),4.70-4.68(m,2H),4.14-4.03(m,2H),3.95-3.93(m,1H),3.69-3.66(m,2H),3.48-3.45(m,2H),3.43-3.38(m,3H),3.34-3.29(m,4H),3.23-3.21(m,2H),3.11(s,1H),2.97-2.89(m,2H),2.67-2.65(m,3H),2.51-2.43(m,2H),2.39-2.27(m,2H),2.21-2.06(m,3H),1.88-1.82(m,2H),1.41-1.39(m,2H),1.23-1.21(d,2H),1.16-1.10(m,3H),1.08-0.98(m,10H),0.89-0.84(m,3H),0.63-0.52(m,3H),0.46-0.43(m,2H).
實施例14 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-5-氮雜 螺環[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸
Figure 105104041-A0101-12-0109-84
將原料(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯基丙酸13(120mg，0.158mmol)溶於5mL二氯甲烷中，加入N,N-二異丙基乙基胺(71.5mg，0.554mmol)，反應體系在氬氣氛下，於0℃滴加預製的6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯氯4b(47.1mg，0.2059mmol)的二氯甲烷溶液，於室溫反應2小時。反應結束後，加入1mL甲醇，攪拌10分鐘，將反應液減壓濃縮，用高效液相層析法純化所得殘留物，得標題產物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸14(5.1mg，白色粉末)，產率3.39%。
MS m/z(ESI)：951.9[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ 7.29-7.18(m,5H),6.80-6.79(m,2H),4.75-4.61(m,3H),4.21-3.99(m,3H),3.94-3.91(m,1H),3.74-3.70(m,2H),3.51-3.44(m,3H),3.42-3.37(m,2H),3.34-3.28(m,5H),3.23-3.21(m,4H),3.10-2.86(m,5H),2.49-2.36(m,4H),2.32-2.17(m,3H),2.12-2.03(m,2H),1.88-1.80(m,2H),1.67-1.58(m,4H),1.49(s,2H),1.37-1.26(m,3H),1.22-1.13(m,3H),1.00-0.83(m,12H),0.63-0.51(m,3H),0.43-0.40(m,2H).
實施例15 (S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(對-甲苯基)丙酸
Figure 105104041-A0101-12-0110-85
(S)-tert-butyl 2-amino-3-(p-tolyl)propanoate (S)-第三丁酯2-胺基-3-(對甲苯基)丙酸
將原料(S)-2-胺基-3-(對甲苯基)丙酸15a(400mg，2.23mmol，採用習知的方法“Organic & Biomolecular Chemistry,2004,2(18),2684-2691”製備而得)溶於10mL乙酸第三丁酯，反應體系在氬氣氛下，加入高氯酸(336.3mg(70%)，3.34mmol)，於室溫下攪拌16小時。反應完畢後加入10mL水，分液，水相用飽和碳酸氫鈉溶液調節pH=8，二氯甲烷(5mL×3)萃取，合併有機相，用飽和氯化鈉溶液(5mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮得標題產物(S)-第三丁酯2-胺基-3-(p-甲苯基)丙酸15b(370mg，白色固體)，產率70%。
採用實施例1的合成路徑，將第四步原料替換為(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(第三丁氧羰基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-異丁酸1e和(S)-第三丁酯2-胺基-3-(p-甲苯基)丙酸15b，製得標題產物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(對-甲苯基)丙酸15(30mg，白色粉末)。
MS m/z(ESI)：758.8[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)：δ 7.19-7.07(m,4H),4.82-4.68(m,2H),4.30-4.18(m,1H),4.15-4.05(m,1H),3.89-3.84(m,1H),3.83-3.76(m,1H),3.74-3.62(m,2H),3.47-3.12(m,9H),2.89-2.79(m,1H),2.70-2.59(m,4H),2.34-2.03(m,7H),1.91-1.75(m,1H),1.73-1.53(m,2H),1.50-1.24(m,4H), 1.22-0.92(m,18H),0.90-0.79(m,4H),0.75-0.64(m,1H).
實施例16 (S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(噻吩-2-基)丙酸
Figure 105104041-A0101-12-0112-86
第一步 (S)-第三丁酯2-胺基-3-(噻吩-2-基)丙酸
將原料(S)-2-胺基-3-(噻吩-2-基)丙酸16a(400mg，2.33mmol，採用習知的方法“European Journal of Organic Chemistry,2006,(5),1113-1116”製備而得)溶於10mL乙酸第三丁酯，反應體系在氬氣氛下，冷卻至0℃，滴加高氯酸(352mg(70%)，3.5mmol)，於室溫攪拌反應16小時。反應結束後，加入水，加飽和碳酸氫鈉溶液調節pH為8~9，用二氯甲烷萃取，合併有機相，依次用水洗滌，飽和氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮 得粗製品標題產物(S)-第三丁酯2-胺基-3-(噻吩-2-基)丙酸16b(370mg，淡黃油狀物)，產物不經純化直接進行下一步反應。
MS m/z(ESI)：228.3[M+1]
採用實施例1的合成路徑，將第四步原料替換為(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(第三丁氧羰基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-異丁酸1e和(S)-第三丁酯2-胺基-3-(噻吩-2-基)丙酸16b，製得標題產物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(噻吩-2-基)丙酸16(18mg，白色粉末)。
MS m/z(ESI)：527.6[M+1]
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 11.00(s,1H),8.44(s,1H),7.17-7.15(d,1H),6.94-6.88(d,2H),4.97-4.95(m,2H),4.10-4.08(m,1H),3.85-3.83(m,2H),3.71-3.69(m,2H),3.52-3.50(m,2H),3.37-3.34(m,12H),3.06-3.04(m,2H),2.80-2.78(m,2H),2.3-2.26(m,4H),1.64-1.59(m,3H),1.48-1.46(m,2H),1.31-1.259(m,12H),1.08-0.98(m,8H),0.89-0.82(m,4H).
實施例17 (S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲 基丙醯胺)-3-(3-氟苯基)丙酸
Figure 105104041-A0101-12-0114-87
第一步 (S)-第三丁酯2-胺基-3-(3-氟苯基)丙酸
將原料(S)-2-胺基-3-(3-氟苯基)丙酸17a(549mg，3mmol，採用習知的方法“Advanced Synthesis & Catalysis,2012,354(17),3327-3332”製備而得)溶於15mL乙酸第三丁酯，反應體系在氮氣氛下，於0℃滴加高氯酸(450mg(70%)，4.5mmol)，滴完於室溫反應12小時。反應完畢後加入30mL水，分液，有機相依次用20mL1N的鹽酸洗滌，飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，合併水相。水相用飽和碳酸氫鈉溶液調節pH為8~9，二氯甲烷(100mL×2)萃取，合併有機相，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮得粗製品標題產物(S)-第三丁酯2-胺基-3-(3-氟苯基)丙酸17b(600mg，油狀物)，產物不經純化直接進行下一步反應。
採用實施例1的合成路徑，將第四步原料替換為((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(第三丁氧羰基)-2-氮雜雙環[3.1.0] 己烷-3-基)-3-甲氧基-2-異丁酸1e和(S)-第三丁酯2-胺基-3-(3-氟苯基)丙酸17b，製得標題產物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(3-氟苯基)丙酸17(25mg，白色粉末)。
MS m/z(ESI)：762.8[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)：δ 7.29-7.21(m,1H),7.08-6.87(m,3H),4.81-4.73(m,1H),4.72-4.67(m,1H),4.61-4.53(m,1H),4.29-4.22(m,1H),4.15-4.06(m,1H),3.99-3.93(m,1H),3.75-3.58(m,2H),3.43-3.12(m,9H),2.99-2.90(m,1H),2.69-2.60(m,4H),2.30-1.97(m,4H),1.87-1.77(m,1H),1.63-1.53(m,1H),1.49-1.36(m,1H),1.18-0.92(m,22H),0.91-0.82(m,4H),0.81-0.71(m,1H).
實施例18
Figure 105104041-A0101-12-0115-88
Figure 105104041-A0101-12-0116-89
第一步
將硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯18a(0.35mg，2.65μmol)，溶解於0.45mL乙腈溶液，備用；向帕妥珠單株抗體(Pertuzumab)pH=4.5的乙酸/乙酸鈉緩衝液(10.85mg/ml，4.5mL，0.488mmol)加入上述預製的硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯18a的乙腈溶液，然後滴加1.0mL的氰基硼氫化鈉(7.06mg,112μmol)的水溶液，於25℃下振盪反應2小時。反應結束後用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS溶液)後得標題產物18b溶液，直接進行下一步反應。
第二步
向18b溶液(15.0mL)中加入0.45mL的2.0M鹽酸羥胺溶液，於25℃下振盪反應30分鐘後將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS溶液)後得標題產物帕妥珠單株抗體-丙硫醇18c溶液(濃度1.65mg/ml，22.6mL)。
第三步
將化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸4(1.09mg，1.16μmol)溶解於1.1mL乙腈中，加入帕妥珠單株抗體-丙硫醇溶液18c(1.65mg/mL，11.3mL)中，於25℃下振盪反應4小時後將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的含0.05M的PBS溶液)，在無菌條件下藉由0.2μm濾器過濾後得標題產物18的PBS緩衝液(0.75mg/mL，19.5mL)，於4℃冷凍儲存。
Q-TOF LC/MS：特徵峰：148119.54(MAb+0D)、149331.45(MAb+1D)、150407.02(MAb+2D)、151297.79(MAb+3D)、152448.85(MAb+4D)、153782.23(MAb+5D)。
平均值：y=2.0。
實施例19
Figure 105104041-A0101-12-0117-91
將化合物(S)-3-(2-氯苯基)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)丙酸5(1.39mg，1.43μmol)溶解於1.1mL乙腈中，加入帕妥珠單株抗體-丙硫醇溶液18c(1.65mg/mL，11.3mL)中，於25℃下振盪反應4小時後將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS溶液)，在無菌條件下藉由0.2μm濾器過濾後得標題產物19的PBS緩衝液(0.78mg/mL，20.0mL)，於4℃冷凍儲存。
Q-TOF LC/MS：特徵峰：148119.68(MAb+0D)、149308.79(MAb+1D)、150194.76(MAb+2D)、151354.52(MAb+3D)、152410.57(MAb+4D)、153375.31(MAb+5D)。
平均值：y=1.9。
實施例20
Figure 105104041-A0101-12-0118-92
將化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-5-甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸6(1.08mg，1.15μmol)溶解於1.25mL乙腈中，加入帕妥珠單株抗體-丙硫醇溶液18c(1.50mg/mL，12.5mL)中，於25℃下振盪反應4小時後將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS溶液)，在無菌條件下藉由0.2μm濾器過濾後得標題產物20的PBS緩衝液(0.74mg/mL，19.0mL)，於4℃冷凍儲存。
Q-TOF LC/MS：特徵峰：Q-TOF LC/MS：148253.27(MAb+0D)、149263.59(MAb+1D)、150315.25(MAb+2D)、151334.45(MAb+3D)、152383.92(MAb+4D)、153446.37(MAb+5D)。
平均值：y=2.2。
實施例21
Figure 105104041-A0101-12-0119-93
將化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸8(3.0mg，3.0μmol)溶解於1.0mL乙腈中，加入帕妥珠單株抗體-丙硫醇溶液18c(2.11mg/mL，10.0mL)中，於25℃下振盪反應4小時後將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的.05M的PBS溶液)，在無菌條件下藉由0.2μm濾器過濾後得標題產物21的PBS緩衝液(1.31mg/mL，12.5mL)，於4℃冷凍儲存。
Q-TOF LC/MS：特徵峰：148312.73(MAb+0D)、149515.61(MAb+1D)、150459.55(MAb+2D)、151521.47(MAb+3D)、152580.02(MAb+4D)。
平均值：y=1.7。
實施例22
Figure 105104041-A0101-12-0120-94
將化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-4-亞甲基吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸10(1.50mg，1.60μmol)溶解於1.0ml乙腈中，加入帕妥珠單株抗體-丙硫醇溶液18c(2.11mg/mL，10.0mL)中，於25℃下振盪反應4小時後將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS溶液)，在無菌條件下藉由0.2μm濾器過濾後得標題產物22的PBS緩衝液(1.28mg/mL，13.0mL)，於4℃冷凍儲存。
Q-TOF LC/MS：特徵峰：148411.82(MAb+0D)、149412.97(MAb+1D)、150468.08(MAb+2D)、151496.41(MAb+3D)、152580.37(MAb+4D)。
平均值：y=2.1。
實施例23
Figure 105104041-A0101-12-0121-95
將化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-2- ((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸12(0.86mg，0.89μmol)溶解於0.6mL乙腈中，加入帕妥珠單株抗體-丙硫醇溶液18c(2.06mg/mL，6.0mL)中，於25℃下振盪反應4小時後將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS溶液)，在無菌條件下藉由0.2μm濾器過濾後得標題產物23的PBS緩衝液(0.70mg/mL，15mL)，於4℃冷凍儲存。
Q-TOF LC/MS：特徵峰：148092.94(MAb+0D)、149296.82(MAb+1D)、150339.86(MAb+2D)、151416.51(MAb+3D)、152516.25(MAb+4D)、153422.64(MAb+5D)。
平均值：y=1.7。
實施例24
Figure 105104041-A0101-12-0122-96
將化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-2- ((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸14(0.73mg，0.78μmol)溶解於0.6mL乙腈中，加入帕妥珠單株抗體-丙硫醇溶液18c(2.06mg/mL，6.0mL)中，於25℃下振盪反應4小時後將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS溶液)，在無菌條件下藉由0.2μm濾器過濾後得標題產物24的PBS緩衝液(0.68mg/mL，15.5mL)，於4℃冷凍儲存。
Q-TOF LC/MS：特徵峰：148094.99(MAb+0D)、149277.83(MAb+1D)、150343.15(MAb+2D)、151359.29(MAb+3D)、152478.14(MAb+4D)、153449.92(MAb+5D)。
平均值：y=1.6。
實施例25 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸
Figure 105104041-A0101-12-0123-97
Figure 105104041-A0101-12-0124-98
第一步 (S)-第三丁酯2-((1R,2R)-1-羥基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基
Figure 105104041-A0101-12-0124-234
唑-3-基)-3-羰基丙基)吡咯烷-1-羧酸
將原料(4R,5S)-4-甲基-5-苯基-3-丙醯基
Figure 105104041-A0101-12-0124-235
唑烷酮1b(4.6g，20.1mmol)溶於80mL二氯甲烷中，在氬氣氛下，降溫至0℃。反應液於0℃下滴加三乙胺(3.2mL，23.1mmol)，再滴加三氟甲磺酸二正丁基化硼(20mL，20.7mmol)，於0℃下攪拌50分鐘，於-75℃滴加5mL預製的(S)-第三丁酯2-甲醯基吡咯烷-1-羧酸25a(4g，20.1mmol，採用習知的方法“Journal of the American Chemical Society,2011,133(42),16901-16910”製備而得)的二氯甲烷溶液，於-75℃下攪拌1小時，於0℃攪拌2小時，於室溫攪拌1小時。反應液中加入60mL磷酸鹽緩衝液(pH=7.0)和甲醇(V/V=1：3)的混合液。於0℃加入60mL甲醇和雙氧水(30%)(V/V=2：1)的混合液，於室溫攪拌1小時。反應結束後，減 壓濃縮除去有機相，加入15mL水。水相用乙醚(30mL×3)萃取，合併乙醚相，依次用5%碳酸氫鈉溶液，水，飽和氯化鈉溶液洗滌，用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱層析法以沖提劑體系B純化殘留物，得標題產物(S)-第三丁酯2-((1R,2R)-1-羥基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基
Figure 105104041-A0101-12-0125-236
唑-3-基)-3-羰基丙基)吡咯烷-1-羧酸25b(2.26g，白色泡沫固體)，產率24.9%。
MS m/z(ESI)：333.3[M-100+1]
第二步 (S)-第三丁酯2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基
Figure 105104041-A0101-12-0125-237
唑-3-基)-3-羰基丙基)吡咯烷-1-羧酸
將原料(S)-第三丁酯2-((1R,2R)-1-羥基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基
Figure 105104041-A0101-12-0125-238
唑-3-基)-3-羰基丙基)吡咯烷-1-羧酸25b(2g，4.62mmol)溶於20mL二氯甲烷，加入2g磨成粉末的分子篩，在氬氣氛下，於0℃加入1,8-雙二甲胺基萘(2.57g，12mmol)，三甲基氧鎓四氟硼酸鹽(1.71g，11.5mmol)，於室溫攪拌17小時。反應結束後，過濾，濾餅用二氯甲烷洗滌，合併濾液，有機相用飽和氯化銨溶液(20mL×3)洗滌，再用飽和氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉乾燥。過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱層析法以沖提劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物(S)-第三丁酯2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基
Figure 105104041-A0101-12-0125-239
唑-3-基)-3-羰基丙基)吡咯烷-1-羧酸25c(1.3g，白色泡沫固體)，產率63%。
MS m/z(ESI)：447.3[M+1]
第三步 (2R,3R)-3-((S)-1-(第三丁氧羰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸
將原料(S)-第三丁酯2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-((4R,5S)-4-甲基-2-羰基-5-苯基
Figure 105104041-A0101-12-0126-240
唑-3-基)-3-羰基丙基)吡咯烷-1-羧酸25c(1.3g，2.9mmol)溶於80mL四氫呋喃，反應體系在氬氣氛下，降溫至0℃，緩慢滴加30%的雙氧水(1.25g，11mmol)，再加入一水合氫氧化鋰(207mg，4.95mmol)，於室溫反應12小時。反應結束後，向反應液中加入亞硫酸鈉固體(1.47g，11.6mmol)，於室溫攪拌1小時，加入少量水，減壓濃縮除去有機相，加入少量水溶解殘留物，用二氯甲烷萃取(50mL×2)。水相滴加鹽酸至pH為3，用二氯甲烷萃取(40mL×3)，有機相用水洗滌，飽和氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮得粗製品標題產物(2R,3R)-3-((S)-1-(第三丁氧羰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸25d(870mg，無色油狀)，產物不經純化直接進行下一步反應。
第四步 (S)-第三丁酯2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(第三丁氧基)-3-(2-氟苯基)-1-羰基丙烷-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)吡咯烷-1-羧酸
將粗製品(2R,3R)-3-((S)-1-(第三丁氧羰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸25d(100mg，0.368mmol)溶於6 mL二氯甲烷與1.8mL二甲基甲醯胺中，加入反應物(S)-第三丁酯2-胺基-3-(2-氟苯基)丙酸7b(97mg，0.405mmol)，反應體系在氬氣氛下。再加入N,N-二異丙基乙基胺(237.8mg，2.844mmol)和2-(7-偶氮苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(168.2mg，0.442mmol)，於室溫攪拌2小時。反應結束後，加10mL二氯甲烷，依次用水，飽和氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱層析法以沖提劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物(S)-第三丁酯2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(第三丁氧基)-3-(2-氟苯基)-1-羰基丙烷-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)吡咯烷-1-羧酸25e(157mg，無色油狀)，產率83.9%。
MS m/z(ESI)：509.3[M+1]
第五步 (S)-第三丁酯3-(2-氟苯基)-2-((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-吡咯烷-2-基)丙醯胺)丙酸
將原料(S)-第三丁酯2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(第三丁氧基)-3-(2-氟苯基)-1-羰基丙烷-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)吡咯烷-1-羧酸25e(157mg，0.308mmol)溶於2mL二氧六環中，加入4M的氯化氫二氧六環溶液(0.193mL，1.08mmol)後將反應體系密封。於室溫攪拌1小時，置於4℃冰箱內12小時。反應結束後，將反應液減壓濃縮，加入二氯甲烷溶解殘留物，用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，水相用二氯甲烷萃取，合併有機相，用飽和氯化鈉溶液洗滌， 無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，得到粗製品標題產物(S)-第三丁酯3-(2-氟苯基)-2-((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-吡咯烷-2-基)丙醯胺)丙酸25f(100mg，淡黃色油狀)，產物不經純化直接進行下一步反應。
MS m/z(ESI)：407.2[M-1]
第六步 (S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧-4,7,10-三氮雜十四烷基-14-醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸
將產物(S)-第三丁酯3-(2-氟苯基)-2-((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-吡咯烷-2-基)丙醯胺)丙酸25f(100mg，0.244mmol)，(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷-14-羧酸1i(156.1mg，0.244mmol)溶於7.5mL二氯甲烷和二甲基甲醯胺(V/V=4：1)混合溶劑中，加入N,N-二異丙基乙基胺(158mg，1.224mmol)，反應體系在氬氣氛下，加入2-(7-偶氮苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(121mg，0.318mmol)，於室溫下攪拌1小時。反應結束後，加入二氯甲烷稀釋，依次用水洗滌，飽和氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱層析法以沖提劑體系B純化殘留物，得到標題產物(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二異丙基-12-甲氧 基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷基-14-醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸25g(242mg，淡黃色油狀)，產率96.5%。
MS m/z(ESI)：1028.4[M+1]
第七步 (S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸
將原料(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧-4,7,10-三氮雜十四烷基-14-醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸25g(242mg，0.235mmol)溶於3mL二氯甲烷中，加入3mL二乙胺，於室溫下攪拌3小時。反應結束後，將反應液減壓濃縮，得到粗製品標題產物(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸25h(250mg，黃色油狀)，產物不經純化直接進行下一步反應。
MS m/z(ESI)：806.7[M+1]
第八步 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基 -2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸
將粗製品(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸25h(262mg，0.325mmol)置於反應瓶中，加入4M的氯化氫二氧六環溶液7mL，將反應體系密封，於室溫下攪拌12小時。反應結束後，將反應液減壓濃縮，用高效液相層析法純化所得殘餘物，得標題產物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸25(50mg，白色固體)，產率28.4%。
MS m/z(ESI)：750.7[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ 7.35-7.30(m,1H),7.20-7.15(m,1H),7.09-6.09(m,2H),4.81-4.75(m,1H),4.70-4.64(m,1H),4.15-4.13(m,1H),4.05-4.03(m,1H),3.84-3.81(m,1H),3.69-3.64(m,1H),3.55-3.51(m,1H),3.48-3.13(m,13H),3.03-2.91(m,2H),2.66-2.53(m,3H),2.47-2.45(m,1H),2.40-2.33(m,2H),2.27-2.23(m,1H),2.17-2.11(m,2H),1.96-1.85(m,3H),1.63-1.40(m,4H),1.21-1.14(m,3H),1.09-0.94(m,12H),0.87-0.84(m,3H).
實施例26 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-2-((R)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸
Figure 105104041-A0101-12-0131-100
將原料(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸25(20mg，0.026mmol)溶於3mL二氯甲烷中，加入N,N-二異丙基乙基胺(13.7mg，0.106mmol)，降溫至0℃，反應體系在氬氣氛下，滴加預製的6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯氯4b(9.1mg，0.040mmol)的二氯甲烷溶液，於室溫反應2小時。反應結束後，加入甲醇淬滅，將反應液減壓濃縮，殘留物用高效液相層析法純化，得標題產物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-2-((R)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲 基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸26(7mg，白色粉末)，產率28.5%。
MS m/z(ESI)：941.6[M-1]
1HNMR(400MHz,CD3OD)δ 7.32-7.21(m,2H),7.10-7.00(m,2H),6.80-6.78(m,2H),4.75-4.55(m,3H),4.12-4.06(m,2H),3.93-3.89(m,1H),3.87-3.78(m,2H),3.69-3.63(m,1H),3.52-3.47(m,3H),3.44-3.28(m,3H),3.21-3.10(m,4H),3.04-2.96(m,4H),2.53-2.40(m,4H),2.35-2.18(m,2H),2.13-2.00(m,2H),1.94-1.75(m,4H),1.68-1.56(m,5H),1.37-1.27(m,4H),1.20-1.13(m,3H),1.05-0.81(m,18H).
實施例27 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯基)-3-(2-甲氧基苯基)丙酸
Figure 105104041-A0101-12-0132-101
第一步 (S)-tert-butyl 2-amino-3-(2-methoxyphenyl)propanoate (S)-第三丁酯2-胺基-3-(2-甲氧基苯基)丙酸
將原料(S)-2-胺基-3-(2-甲氧基苯基)丙酸27a(250mg，1.28mmol，採用習知的方法“Chemical Communications(Cambridge,United Kingdom),2013,49(70),7744-766”製備而得)溶於7mL乙酸第三丁酯，反應體系在氬氣氛下，加入高氯酸(270mg(70%)，1.88mmol)，於室溫下攪拌16小時。反應結束後，加入10mL二氯甲烷，滴加飽和碳酸氫鈉溶液調節pH為8，分液，水相用二氯甲烷(10mL×3)萃取，合併有機相。有機相用飽和氯化鈉溶液(10mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮得標題產物(S)-第三丁酯2-胺基-3-(2-甲氧基苯基)丙酸27b(280mg，淺黃色油狀物)，產率87%。
採用實施例25的合成路徑，將第四步原料替換為(2R,3R)-3-((S)-1-(第三丁氧羰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸25d和(S)-第三丁酯2-胺基-3-(2-甲氧基苯基)丙酸27b，製得標題產物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯基)-3-(2-甲氧基苯基)丙酸27(22mg，灰白色粉末)。
MS m/z(ESI)：760.7[M-1]
實施例28 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-2-((R)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁 醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-甲氧基苯基)丙酸
Figure 105104041-A0101-12-0134-103
將原料(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯基)-3-(2-甲氧基苯基)丙酸27(18mg，0.023mmol)溶於5mL二氯甲烷中，反應體系在氬氣氛下，加入N,N-二異丙基乙基胺(12.19mg，0.29mmol)，於0℃滴加預製的6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯氯4b(6.5mg，0.028mmol)的二氯甲烷溶液，於室溫反應2小時。反應結束後，加入甲醇淬滅，將反應液減壓濃縮，殘留物用高效液相層析法純化，得標題產物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-2-((R)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-甲氧基苯基)丙酸28(4mg，白色固體)，產率18.2%。
MS m/z(ESI)：955.5[M+1]
實施例29 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(對甲苯基)丙酸
Figure 105104041-A0101-12-0135-104
採用實施例25的合成路徑，(2R,3R)-3-((S)-1-(第三丁氧羰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸25d和(S)-第三丁酯2-胺基-3-(對甲苯基)丙酸15b，製得標題產物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(對甲苯基)丙酸29(20mg，白色粉末)。
MS m/z(ESI)：746.6[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)：δ 7.17-7.05(m,4H),4.84-4.67(m,2H),4.27-4.15(m,1H),4.12-4.05(m,1H),3.89-3.82(m,1H),3.78-3.63(m,2H),3.57-3.47(m,1H),3.43-3.11(m,7H),2.92-2.79(m,1H),2.67(d,3H),2.52-2.44(m,1H),2.40-2.15(m,7H),2.12-2.01(m,1H),1.95-1.69(m,3H),1.67-1.49(m,2H),1.48-1.27(m,4H),1.23-1.12(m,5H),1.11-0.95(m,14H),0.94-0.84(m,3H).
實施例30 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(對甲苯基)丙酸
Figure 105104041-A0101-12-0136-105
將原料(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(對甲苯基)丙酸29(12mg，0.016mmol)溶於1mL二氯甲烷中，反應體系在氬氣氛下，加入N,N-二異丙基乙基胺(0.014mL，0.08mmol)，於0℃滴加預製的6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯氯4b(5.54mg，0.024mmol)的二氯甲烷溶液，於室溫反應4小時。反應結束後，加入甲醇淬滅，將反應液減壓濃縮，殘留物用高效液相層析法純化，得標題產物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲 基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(對甲苯基)丙酸30(4mg，白色固體)，產率26.5%。
MS m/z(ESI)：939.4[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)：δ 7.22-7.03(m,4H),6.85-6.78(m,2H),4.83-4.55(m,3H),4.27-3.97(m,3H),3.90-3.62(m,3H),3.59-2.95(m,14H),2.94-2.79(m,1H),2.54-2.35(m,3H),2.34-2.12(m,5H),2.08-1.99(m,1H),1.93-1.72(m,3H),1.71-1.51(m,5H),1.48-1.24(m,8H),1.23-1.12(m,3H),1.11-0.78(m,17H).
實施例31 (S)-3-(3-氯苯基)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)丙酸
Figure 105104041-A0101-12-0137-106
第一步 (S)-tert-butyl 2-amino-3-(3-chlorophenyl)propanoate (S)-第三丁酯2-胺基-3-(3-氯苯基)丙酸
將原料(S)-2-胺基-3-(3-氯苯基)丙酸31a(600mg，3mmol)溶於15mL乙酸第三丁酯，在氬氣氛下，於0℃滴加高氯酸(450mg(70%)，4.5mmol)，滴完於室溫反應12小時。反應完畢後加入10mL水，分液，有機相依次用20mL 1N的鹽酸洗滌，飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，合併水相。水相滴加飽和碳酸氫鈉溶液調節pH為8~9，二氯甲烷(100mL×2)萃取，合併有機相，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮得粗製品標題產物(S)-第三丁酯2-胺基-3-(3-氯苯基)丙酸31b(500mg，油狀物)，產物不經純化直接進行下一步反應。
採用實施例25的合成路徑，將第四步原料替換為(2R,3R)-3-((S)-1-(第三丁氧羰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸25d和(S)-第三丁酯2-胺基-3-(3-氯苯基)丙酸31b，製得標題產物(S)-3-(3-氯苯基)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)丙酸31(4mg，白色粉末)。
MS m/z(ESI)：766.6[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)：δ 7.31-7.12(m,4H),4.73-4.51(m,2H),4.22-4.05(m,1H),3.92-3.83(m,1H),3.76-3.65(m,1H),3.62-3.51(m,1H),3.50-3.12(m,9H),3.09-2.98(m,1H),2.59-2.39(m,4H),2.38-2.24(m,1H),2.23-2.17(m,1H),2.16-2.01(m,3H),2.00-1.85(m,2H),1.84-1.76(m,1H), 1.73-1.57(m,2H),1.43-1.27(m,5H),1.25-1.14(m,3H),1.10-0.95(m,13H),0.94-0.83(m,5H).
實施例32 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(3-氟苯基)丙酸
Figure 105104041-A0101-12-0139-107
採用實施例25的合成路徑，將第四步原料替換為(2R,3R)-3-((S)-1-(第三丁氧羰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸25d和(S)-第三丁酯2-胺基-3-(3-氟苯基)丙酸17b，製得標題產物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(3-氟苯基)丙酸32(33.5mg，白色粉末)。
MS m/z(ESI)：750.7[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ 7.31-7.28(m,1H),7.08-6.95(m,3H),4.77-4.69(m,2H),4.09-3.94(m,3H),3.69-3.66(m,2H),3.48-3.44(m,2H),3.38-3.36(m,3H),3.34-3.28(m,6H),3.26-3.19(m,2H),3.13(m,1H),3.01-2.91(m,2H),2.67-2.65(m,2H),2.54-2.47(m,2H),2.34-2.28(m,2H), 2.18-2.00(m,2H),1.98-1.77(m,2H),1.55-1.42(m,2H),1.08-0.98(m,18H),0.88-0.83(m,3H).
實施例33 (S)-3-(2,4-二氯苯基)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)丙酸
Figure 105104041-A0101-12-0140-121
第一步 (S)-tert-butyl 2-amino-3-(2,4-dichlorophenyl)propanoate (S)-第三丁酯2-胺基-3-(2,4-二氯苯基)丙酸
將原料(S)-2-胺基-3-(2,4-二氯苯基)丙酸33a(1.3g，5.57mmol，採用習知的方法“International Journal of Peptide & Protein Research,1987,30(1),13-21”製備而得)溶於10mL乙酸第三丁酯，反應體系在氬氣氛下，於0℃滴加高氯酸(1.2g(70%)，8.36mmol)，滴完於室溫反應12小時。反應結束後，加入二氯甲烷稀釋，滴加飽和碳酸氫 鈉溶液至pH為8~9，分液，水相用二氯甲烷萃取，合併有機相，依次用水洗滌，飽和氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮得粗製品標題產物(S)-第三丁酯2-胺基-3-(2,4-二氯苯基)丙酸33b(3.4g，淡黃油狀物)，產物不經純化直接進行下一步反應。
採用實施例25的合成路徑，將第四步原料替換為(2R,3R)-3-((S)-1-(第三丁氧羰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸25d和(S)-第三丁酯2-胺基-3-(2,4-二氯苯基)丙酸33b，製得標題產物(S)-3-(2,4-二氯苯基)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)丙酸33(23mg，白色粉末)。
MS m/z(ESI)：800.6[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ 7.43-7.42(m,1H),7.26-7.23(m,2H),4.75-4.67(m,2H),4.14-4.04(m,2H),4.00-3.98(m,1H),3.91-3.89(m,1H),3.68-3.67(m,3H),3.39-3.26(m,12H),3.21-3.12(m,3H),2.67-2.64(m,3H),2.50-2.46(m,3H),2.31-2.28(m,2H),2.17-2.15(m,2H),2.02-2.00(m,4H),1.90-1.88(m,2H),1.74-1.72(m,2H),1.39-1.37(m,2H),1.06-0.98(m,12H).
實施例34 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(鄰甲苯 基)丙酸
Figure 105104041-A0101-12-0142-122
第一步 (S)-tert-butyl 2-amino-3-(o-tolyl)propanoate (S)-第三丁酯2-胺基-3-(鄰甲苯基)丙酸
將原料(S)-2-胺基-3-(o-甲苯基)丙酸34a(100mg，0.55mmol，採用習知的方法“International Journal of Peptide & Protein Research,1987,30(1),13-21”製備而得)溶於2.5mL乙酸第三丁酯，在氬氣氛下，滴加高氯酸(107mg(70%)，0.83mmol)，於室溫反應16小時。反應結束後，加入5mL二氯甲烷稀釋，滴加飽和碳酸氫鈉溶液調節pH為8。分液，水相用二氯甲烷(5mL×3)萃取，合併有機相，依次用水洗滌，飽和氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮得粗製品標題產物(S)-第三丁酯2-胺基-3-(鄰甲苯基)丙酸34b(140mg，無色油狀物)，產物不經純化直接進行下一步反應。
採用實施例25的合成路徑，將第四步原料替換為 (2R,3R)-3-((S)-1-(第三丁氧羰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸25d和(S)-第三丁酯2-胺基-3-(鄰甲苯基)丙酸34b，製得標題產物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(鄰甲苯基)丙酸34(40mg，白色粉末)。
MS m/z(ESI)：746.8[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ 8.41-8.39(d,1H),8.19-8.17(d,1H),7.18-7.05(m,4H),4.80-4.78(d,1H),4.71-4.69(d,1H),3.86-3.84(m,1H),3.76-3.72(m,1H),3.69-3.63(m,2H),3.48-3.42(d,2H),3.38-3.23(m,5H),3.20-3.12(m,4H),2.98-2.87(m,2H),2.66-2.65(d,3H),2.53-2.50(d,1H),2.46-2.44(d,1H),2.41-2.26(m,4H),2.21-2.14(m,2H),2.10-2.04(m,1H),1.87-1.85(m,2H),1.77-1.74(m,1H),1.62-1.53(m,2H),1.33-1.28(m,3H),1.23-1.21(d,2H),1.16-1.14(d,2H),1.08-0.96(m,14H),0.90-0.84(m,3H).
實施例35 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯基)丁醯基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(噻吩-2-基)丙酸
Figure 105104041-A0101-12-0143-113
採用實施例25的合成路徑，將第四步原料替換為(2R,3R)-3-((S)-1-(第三丁氧羰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸25d和(S)-第三丁酯2-胺基-3-(噻吩-2-基)丙酸16b，製得標題產物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯基)丁醯基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(噻吩-2-基)丙酸35(2.6mg，白色粉末)。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ 7.21-7.19(m,1H),6.91-6.90(m,2H),4.80-4.65(m,2H),4.16-4.08(m,2H),3.93-3.90(m,1H),3.70-3.66(m,2H),3.55-3.52(m,1H),3.48-3.45(m,2H),3.40-3.26(m,6H),3.25-3.13(m,4H),2.96-2.82(t,1H),2.69-2.65(d,3H),2.52-2.47(m,2H),2.39-2.29(m,1H),2.21-2.14(m,2H),1.92-(s,3H),1.63-1.61(m,2H),1.40-1.29(m,3H),1.23-1.14(m,3H),1.10-0.98(m,13H),0.88-0.85(t,3H).
實施例36
Figure 105104041-A0101-12-0144-123
將化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-2-((R)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸26(5.45mg，5.78μmol)溶解於1.2mL乙腈中，加入帕妥珠單株抗體-丙硫醇溶液18c(7.56mg/mL，12mL)中，於25℃下振盪反應4小時後將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS溶液)，在無菌條件下藉由0.2μm濾器過濾後得標題產物36的PBS緩衝液(3.51mg/mL，27.5mL)，於4℃冷凍儲存。
Q-TOF LC/MS：特徵峰：148094.39(MAb+0D)、149111.06(MAb+1D)、150167.12(MAb+2D)、151188.93(MAb+3D)、152243.46(MAb+4D)、153272.96(MAb+5D)。
平均值：y=1.9
實施例37
Figure 105104041-A0101-12-0145-120
將化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-2- ((R)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-甲氧基苯基)丙酸28(1.75mg，1.83μmol)溶解於0.9mL乙腈中，加入帕妥珠單株抗體-丙硫醇溶液18c(2.31mg/mL，9.0mL)中，於25℃下振盪反應6小時後將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS溶液)，在無菌條件下藉由0.2μm濾器過濾後得標題產物37的PBS緩衝液(1.35mg/mL，13.0mL)，於4℃冷凍儲存。
Q-TOF LC/MS：特徵峰：148093.25(MAb+0D)、149281.78(MAb+1D)、150474.33(MAb+2D)、151372.72(MAb+3D)、152373.24(MAb+4D)、153469.40(MAb+5D)。
平均值：y=2.3。
實施例38
Figure 105104041-A0101-12-0146-119
將化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯 胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(對甲苯基)丙酸30(1.07mg，1.14μmol)溶解於1.25mL乙腈中，加入帕妥珠單株抗體-丙硫醇溶液18c(1.5mg/mL，12.5mL)中，於25℃下振盪反應4.5小時後將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS溶液),在無菌條件下藉由0.2μm濾器過濾後得標題產物38的PBS緩衝液(0.74mg/mL，17.5mL)，於4℃冷凍儲存。
Q-TOF LC/MS：特徵峰：148247.08(MAb+0D)、149265.32(MAb+1D)、150276.10(MAb+2D)、151334.50(MAb+3D)、152392.21(MAb+4D)、153388.72(MAb+5D)。
平均值：y=2.4。
實施例39
Figure 105104041-A0101-12-0147-124
第一步
將硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯18a(2.44mg，18.5μmol)，溶解於3.0mL乙腈溶液，備用；向尼妥珠單株抗體pH=4.3的乙酸/乙酸鈉緩衝液(10.22mg/ml，30mL，0.204mmol)加入上述預製的硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯18a的乙腈溶液，然後滴加1.2mL的氰基硼氫化鈉(49.86mg,793μmol)的水溶液，於25℃下振盪反應2小時。將反應液先用含10%乙腈的PBS緩衝液(250mL)藉由30KDa超濾薄膜進行純化，再改用pH=6.5的PBS緩衝液(200mL)藉由30KDa超濾薄膜進行純化，除去未反應的硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯18a以及氰基硼氫化鈉，得到標題產物39b的PBS緩衝溶液(約75mL)，直接進行下一步反應。
第二步
向39b的PBS緩冲溶液(75.0mL)中加入2.0mL的2.0M鹽酸羥胺溶液，加畢，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應30分鐘，停止反應。將反應液用pH=6.5的PBS緩冲液藉由30KDa超濾薄膜進行純化，得到標題產物尼妥珠單株抗體-丙硫醇39c的PBS緩衝溶液(濃度5.38mg/ml，55mL)。
第三步
將化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸4(4.48mg，4.78μmol)溶解於1.1mL乙腈中，加入尼妥珠單株抗體-丙硫醇PBS緩衝溶液39c (5.38mg/mL，11mL)中，置於水浴振盪器中，於25℃下振盪反應4小時後停止反應。
將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS溶液)，得到粗製品標題產物39的PBS緩衝液(2.96mg/mL，20.5mL)，進一步離心濃縮至6mL左右，再用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS溶液)，得到標題產物39的PBS緩衝液(4.25mg/mL，11.8mL)，於4℃冷凍儲存。
Q-TOF LC/MS：特徵峰：150188.68(MAb+0D)、151234.76(MAb+1D)、152248.46(MAb+2D)、153419.10(MAb+3D)、154312.17(MAb+4D)、155358.48(MAb+5D)。
平均值：y=2.2。
實施例40
Figure 105104041-A0101-12-0149-125
將化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2- 甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸8(4.32mg，4.52μmol)溶解於1.1mL乙腈中，加入尼妥珠單株抗體-丙硫醇PBS緩衝溶液39c(5.38mg/mL，11mL)中，置於水浴振盪器中，於25℃下振盪反應4小時後停止反應。
將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS溶液)，得到粗製品標題產物40的PBS緩衝液(2.92mg/mL，20mL)，進一步離心濃縮至5.5mL左右，再用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS溶液)，得到標題產物40的PBS緩衝液(4.25mg/mL，11.6mL)，於4℃冷凍儲存。
Q-TOF LC/MS：特徵峰：150186.98(MAb+0D)、151374.09(MAb+1D)、152287.22(MAb+2D)、153353.26(MAb+3D)、154501.80(MAb+4D)、155575.57(MAb+5D)。
平均值：y=2.2。
實施例41
Figure 105104041-A0101-12-0150-126
將化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4R,5S)-4-((S)-2- ((R)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸26(4.45mg，4.72μmol)溶解於1.1mL乙腈中，加入尼妥珠單株抗體-丙硫醇PBS緩衝溶液39c(5.38mg/mL，11mL)中，置於水浴振盪器中，於25℃振盪反應4小時後停止反應。
將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的.05M的PBS溶液)，得到粗製品標題產物41的PBS緩衝液(2.96mg/mL，20mL)，進一步離心濃縮至6mL左右，再用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS溶液)，得到標題產物41的PBS緩衝液(4.33mg/mL，11mL)，於4℃冷凍儲存。
Q-TOF LC/MS：特徵峰：150186.05(MAb+0D)、151362.44(MAb+1D)、152261.90(MAb+2D)、153438.29(MAb+3D)、154339.30(MAb+4D)、155511.23(MAb+5D)。
平均值：y=2.3。
實施例42
Figure 105104041-A0101-12-0151-127
Figure 105104041-A0101-12-0152-128
將化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸12(0.56mg，0.58μmol)溶解於0.42mL乙腈中，加入尼妥珠單株抗體-丙硫醇溶液39c(2.06mg/mL，4.2mL)中，置於水浴振盪器中，於25℃振盪反應5小時後停止反應。
將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS溶液)，得到粗製品標題產物42的PBS緩衝液(0.74mg/mL，10mL)，進一步離心濃縮，再用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS溶液)，得到標題產物42的PBS緩衝液(1.15mg/mL，6mL)，於4℃冷凍儲存。
Q-TOF LC/MS：特徵峰：150188.42(MAb+0D)、151387.82(MAb+1D)、152472.27(MAb+2D)、153528.33(MAb+3D)。
平均值：y=1.0。
實施例43
Figure 105104041-A0101-12-0153-129
將化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-5-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-6-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯丙酸14(0.60mg，0.63μmol)溶解於0.42mL乙腈中，加入尼妥珠單株抗體-丙硫醇溶液39c(2.06mg/mL，4.2mL)中，置於水浴振盪器中，於25℃下振盪反應5小時後停止反應。
將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS溶液)，得到粗製品標題產物43的PBS緩衝液(0.78mg/mL，9.5mL)，進一步離心濃縮，再用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS溶液)，得到標題產物43的PBS緩衝液(1.16mg/mL，6mL)，於4℃冷凍儲存。
Q-TOF LC/MS：特徵峰：150188.39(MAb+0D)、151251.46(MAb+1D)、152442.90(MAb+2D)、153507.73(MAb+3D)。
平均值：y=1.0。
實施例44 (S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯基丙酸
Figure 105104041-A0101-12-0154-131
第一步 (2S,4S)-第三丁酯2-((1R,2R)-3-((R)-4-苄基-2-羰基
Figure 105104041-A0101-12-0155-241
唑-3-基)-1-羥基-2-甲基-3-羰基丙基)-4-氟吡咯烷-1-羧酸
將原料(R)-4-苄基-3-丙醯基
Figure 105104041-A0101-12-0155-242
唑-2-酮44b(21g，90mmol，採用習知的方法“Tetrahedron Letters,1999,40(36),6545-6547”製備而得)溶於300mL二氯甲烷中，氮氣氛下，降溫至0℃。反應液於0℃下滴加四氯化鈦(9.8mL，1.1mmol)，溶液由無色逐漸變為黃色，並且有黃色固體出現。再緩慢滴加N,N-二異丙基乙基胺(40mL，225mmol)，有白煙生成，溶液由黃色變為紅棕色，於0℃下攪拌1小時，將反應液降溫至-78℃，加入50mL(2S,4S)-第三丁酯4-氟-2-甲醯基吡咯烷-1-羧酸44a(21.27g，98mmol，採用習知的方法“Tetrahedron：Asymmetry,2014,25(3),212-218”製備而得)的二氯甲烷溶液，-78℃下攪拌1.5小時。TLC監測反應的完成情況。反應完畢後，加入200mL碳酸氫鈉溶液(5%)，分液，水相用二氯甲烷萃取(300mL×2)，合併有機相，依次用水(200mL)、飽和氯化鈉溶液(200mL)洗滌，無水硫酸鎂乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱層析法以沖提劑體系B純化所得殘餘物，得標題產物(2S,4S)-第三丁酯2-((1R,2R)-3-((R)-4-苄基-2-羰基
Figure 105104041-A0101-12-0155-243
唑-3-基)-1-羥基-2-甲基-3-羰基丙基)-4-氟吡咯烷-1-羧酸44c(19g，淡黃色固體)，產率43.2%。
MS m/z(ESI)：351.06[M-100+1]
第二步 (2R,3R)-3-((2S,4S)-1-(第三丁氧羰基)-4-氟吡咯烷-2-基)-3- 羥基-2-甲基丙酸
將原料(2S,4S)-第三丁酯2-((1R,2R)-3-((R)-4-苄基-2-羰基
Figure 105104041-A0101-12-0156-244
唑-3-基)-1-羥基-2-甲基-3-羰基丙基)-4-氟吡咯烷-1-羧酸44c(19g，42mmol)溶於200mL四氫呋喃與50mL水中，氮氣氛下，降溫至0℃，緩慢滴加30%的雙氧水(17.2mL，147mmol)，再加入80mL一水合氫氧化鋰(2.86g，68mmol)溶液，反應體系於0℃反應5小時。向反應液中加入100mL亞硫酸鈉(21.2g，168mmol)溶液，於25℃反應16小時。反應結束後，減壓濃縮除去有機相，所得殘留物用二氯甲烷洗滌(200mL×3)；水相用1N鹽酸調節pH為3左右，用乙酸乙酯萃取(200mL×4)。合併有機相，減壓濃縮，所得殘留物用350mL碳酸氫鈉溶液(5%)溶解，用二氯甲烷洗滌(200mL×2)，水相用2N鹽酸調節pH為3左右，用乙酸乙酯萃取(200mL×5)，合併有機相，用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，得粗製品標題產物(2R,3R)-3-((2S,4S)-1-(第三丁氧羰基)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-羥基-2-甲基丙酸44d(11.6g，淡黃色黏稠液體)，產物不經純化直接進行下一步反應。
MS m/z(ESI)：191.47[M-100+1]
第三步 (2R,3R)-3-((2S,4S)-1-(第三丁氧羰基)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸
將原料(2R,3R)-3-((2S,4S)-1-(第三丁氧羰基)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-羥基-2-甲基丙酸44d(11.6g，39.8mmol)溶於 200mL四氫呋喃中，氮氣氛下，在0℃下加入碘甲烷(91g，640mmol)，分批加入氫化鈉(7.32g(60%)，183mmol)，於0℃下反應48小時。反應結束後，加入500mL冰水淬滅反應，加入乙酸乙酯萃取(150mL)。水相用乙醚(150mL×2)洗滌，用2N鹽酸調節pH為3，再用乙酸乙酯萃取(250mL×3)。合併有機相，用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱層析法以沖提劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物(2R,3R)-3-((2S,4S)-1-(第三丁氧羰基)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸44e(8.0g，淡黃色黏稠液體)，產率65.6%。
MS m/z(ESI)：205.68[M-100+1]
第四步 (2S,4S)-第三丁酯4-氟-2-((1R,2R)-1-甲氧基-3-(((S)-1-甲氧基-1-羰基-3-苯基丙烷-2-基)胺基)-2-甲基-3-羰基丙基)吡咯烷-1-羧酸
將原料(2R,3R)-3-((2S,4S)-1-(第三丁氧羰基)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸44e(580mg，1.9mmol)溶於15mL乙腈中，加入(S)-2-胺基-3-苯基丙酸甲酯 鹽酸鹽44f(480mg，2.2mmol，採用習知的方法“Journal of Heterocyclic Chemistry,2013,50(2),320-325”製備而得)，再加入N,N-二異丙基乙基胺(1.42mL，8mmol)和2-(7-偶氮苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(1.07g，2.8mmol)，反應體系於室溫下反應12小時。TLC顯示反應完全，停止反應，加入40mL乙酸乙酯稀釋，依次用飽和氯 化銨溶液(20mL)、飽和氯化鈉溶液(20mL)洗滌，用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱層析法以沖提劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物(2S,4S)-第三丁酯4-氟-2-((1R,2R)-1-甲氧基-3-(((S)-1-甲氧基-1-羰基-3-苯基丙烷-2-基)胺基)-2-甲基-3-羰基丙基)吡咯烷-1-羧酸44g(750mg，白色固體)，產率83.2%。
MS m/z(ESI)：222.62[M-100+1]
第五步 (S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯基丙酸甲酯 三氟乙酸鹽
將原料(2S,4S)-第三丁酯4-氟-2-((1R,2R)-1-甲氧基-3-(((S)-1-甲氧基-1-羰基-3-苯基丙烷-2-基)胺基)-2-甲基-3-羰基丙基)吡咯烷-1-羧酸44g(738mg，1.58mmol)溶於15mL二氯甲烷中，逐滴加入三氟乙酸(3mL，30mmol)，於室溫反應12小時。TLC檢測反應完全後，將反應液減壓濃縮得粗製品標題產物(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯基丙酸甲酯 三氟乙酸鹽44h(1.24g，黃色黏稠液體)，產物不經純化直接進行下一步反應。
MS m/z(ESI)：236.39[M+1]
第六步 (S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-1-苯基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷-14-醯基-4-氟吡咯烷 -2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯基丙酸甲酯
將原料(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯基丙酸甲酯 三氟乙酸鹽44h(572mg，1.56mmol)，(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-1-苯基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷-14-羧酸44i(868mg，1.56mmol，採用專利申請“WO2007008848”公開的方法製備而得)溶於15mL乙腈中，加入N,N-二異丙基乙基胺(2.0mL，12mmol)和2-(7-偶氮苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(890mg，2.34mmol)，反應體系於室溫下反應12小時。TLC顯示反應完全，停止反應，加入50mL乙酸乙酯稀釋，依次用飽和氯化銨溶液(30mL)、飽和氯化鈉溶液(30mL)洗滌，用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱層析法以沖提劑體系B和A純化所得殘餘物，得到標題產物(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-1-苯基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷-14-醯基-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯基丙酸甲酯44j(1.4g，白色泡沫狀固體)，產率99.9%。
MS m/z(ESI)：898.99[M+1]
第七步 (S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-1-苯基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷-14-醯基)-4-氟吡咯烷 -2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯基丙酸
將原料(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-1-苯基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷-14-醯基-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯基丙酸甲酯44j(180mg，0.2mmol)溶於0.5mL甲醇、0.5mL四氫呋喃與0.5mL水中，冷卻至0℃，加入一水合氫氧化鋰(34mg，0.8mmol)，於23℃下反應2小時。TLC及Ms顯示反應完畢，加入2mL水稀釋，用1N鹽酸調節pH為4.5左右，用乙酸乙酯萃取(5mL×3)，合併有機相，用無水硫酸鎂乾燥，過濾，濾液減壓濃縮得粗製品標題產物(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-1-苯基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷-14-醯基)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯基丙酸44k(160mg，淡黃色泡沫狀固體)，產物不經純化直接進行下一步反應。
MS m/z(ESI)：883.73[M-1]
第八步 (S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯基丙酸
將粗製品(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基 -3,6,9-三羰基-1-苯基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷-14-醯基)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯基丙酸44k(160mg，0.2mmol)溶於10mL無水乙醇中，加入30mg鈀碳(10%)，將反應體系用氫氣置換三次，於23℃反應15小時。TLC顯示反應完全，藉由矽藻土過濾除去鈀碳，濾液減壓濃縮得殘留物120mg，用高效液相層析法純化所得殘留物得標題產物(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯基丙酸44(29mg，白色固體)，產率21.5%。
MS m/z(ESI)：749.94[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ 7.29-7.14(m,5H),4.81-4.71(m,2H),4.18-4.13(m,2H),4.05-4.03(m,2H),3.84-3.81(m,1H),3.63-3.60(m,1H),3.58-3.52(m,1H),3.48-3.13(m,14H),3.00-2.91(m,1H),2.66-1.81(m,11H),1.63-1.38(m,2H),1.21-1.10(m,5H),1.09-0.94(m,14H),0.91-0.82(m,3H).
實施例45 (S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯基丙酸
Figure 105104041-A0101-12-0162-132
將原料(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯基丙酸44(1.0g，1.34mmol)溶於20mL乙腈中，加入N,N-二異丙基乙基胺(0.53mL，3.0mmol)，2-(7-偶氮苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(560mg，1.48mmol)，反應體系於23℃反應30分鐘，加入6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸4a(300mg，1.41mmol)。待TLC顯示反應完全後，停止反應，加入50mL乙酸乙酯，減壓濃縮，用矽膠柱層析法先後以沖提劑體系B和A純化所得殘餘物，得粗製品標題產物1.0g，然後用高效液相層析法純化所得殘留物，得標題產物(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯基丙酸45(140mg， 白色固體)，產率11%。
MS m/z(ESI)：942.67[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ 7.34-7.14(m,5H),6.83-6.80(m,2H),5.20-5.10(m,1H),5.01-4.96(m,1H),4.78-4.57(m,2H),4.18-4.01(m,2H),4.00-3.80(m,1H),3.56-3.41(m,5H),3.35-3.24(m,10H),3.19-2.90(m,4H),2.60-2.40(m,4H),2.39-2.00(m,4H),1.93-1.58(m,6H),1.50-1.10(m,7H),1.09-0.82(m,21H).
實施例46 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(4-氟苯基)丙酸
Figure 105104041-A0101-12-0163-133
Figure 105104041-A0101-12-0164-134
第一步 (S)-第三丁酯2-((1R,2R)-3-(((S)-3-(4-氟苯基)-1-甲氧基-1-羰基丙烷-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)吡咯烷-1-羧酸
將(2R,3R)-3-((S)-1-(第三丁氧羰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸25d(1.0g，3.5mmol)溶於15mL乙腈中，加入(S)-2-胺基-3-(4-氟苯基)丙酸甲酯 鹽酸鹽46a(820mg，4mmol，採用習知的方法“Tetrahedron,2003,59(21),3719-3727”製備而得)，再加入N,N-二異丙基乙基胺(2.7mL，15mmol)和2-(7-偶氮苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(1.9g，5.0mmol)，反應體系於23℃反應12小時。TLC顯示反應完全，停止反應，加入50mL乙酸乙酯稀釋，依次用飽和氯化銨溶液(30mL)、飽和氯化鈉溶液(30 mL)洗滌，用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱層析法以沖提劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物(S)-第三丁酯2-((1R,2R)-3-(((S)-3-(4-氟苯基)-1-甲氧基-1-羰基丙烷-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)吡咯烷-1-羧酸46b(1.35g，白色固體)，產率82.6%。
MS m/z(ESI)：366.46[M-100-1]
第二步 (S)-3-(4-氟苯基)-2-((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-吡咯烷-2-基)丙醯胺)丙酸甲酯 三氟乙酸鹽
將原料(S)-第三丁酯2-((1R,2R)-3-(((S)-3-(4-氟苯基)-1-甲氧基-1-羰基丙烷-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)吡咯烷-1-羧酸46b(1.34g，2.87mmol)溶於20mL二氯甲烷中，逐滴加入三氟乙酸(3mL，30mmol)，於23℃反應12小時。TLC檢測反應完全後，將反應液減壓濃縮得粗製品標題產物(S)-3-(4-氟苯基)-2-((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-吡咯烷-2-基)丙醯胺)丙酸甲酯 三氟乙酸鹽46c(1.92g，黃色黏稠液體)，產物不經純化直接進行下一步反應。
MS m/z(ESI)：366.85[M+1]
第三步 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-1-苯基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷基-14-醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(4-氟苯基)丙酸甲酯
將原料(S)-3-(4-氟苯基)-2-((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-吡咯烷-2-基)丙醯胺)丙酸甲酯 三氟乙酸鹽46c(367mg，1.0mmol)，(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-1-苯基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷-14-羧酸44i(549mg，1.0mmol)溶於10mL乙腈中，加入N,N-二異丙基乙基胺(1.24mL，7mmol)和2-(7-偶氮苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(570mg，1.5mmol)，反應體系於23℃下反應12小時。TLC顯示反應完全，停止反應，加入30mL乙酸乙酯稀釋，依次用飽和氯化銨溶液(20mL)、飽和氯化鈉溶液(20mL)洗滌，用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱層析法先後以沖提劑體系B和A純化所得殘留物，得到標題產物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-1-苯基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷基-14-醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(4-氟苯基)丙酸甲酯46d(760mg，白色泡沫狀固體)，產率84.6%。
MS m/z(ESI)：898.10[M+1]
第四步 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-1-苯基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷基-14-醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(4-氟苯基)丙酸
將原料(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11- ((S)-第二丁基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-1-苯基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷基-14-醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(4-氟苯基)丙酸甲酯46d(180mg，0.2mmol)溶於0.5mL甲醇、0.5mL四氫呋喃與0.5mL水中，冷卻至0℃，加入一水合氫氧化鋰(34mg，0.8mmol)，於23℃下反應2小時。TLC及Ms顯示反應完畢，加入2mL水稀釋，用1N鹽酸調節pH為4.5左右，用乙酸乙酯萃取(5mL×3)，合併有機相，用無水硫酸鎂乾燥，過濾，濾液減壓濃縮得粗製品標題產物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-1-苯基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷基-14-醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(4-氟苯基)丙酸46e(160mg，白色固體)，產物不經純化直接進行下一步反應。
MS m/z(ESI)：883.78[M-1]
第五步 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(4-氟苯基)丙酸
將粗製品(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-1-苯基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷基-14-醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(4-氟苯基)丙 酸46e(160mg，0.2mmol)溶於10mL無水乙醇中，加入30mg鈀碳(10%)，將反應體系用氫氣置換三次，於室溫反應15小時。TLC顯示反應完全，藉由矽藻土過濾除去鈀碳，濾液減壓濃縮得殘留物130mg，用高效液相層析法純化所得殘留物得標題產物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(4-氟苯基)丙酸46(34mg，白色粉末)，產率25.2%。
MS m/z(ESI)：749.94[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ 7.31-7.24(m,2H),7.02-6.92(m,2H),4.48-4.58(m,2H),4.22-4.11(m,1H),3.85-3.40(m,4H),3.39-3.04(m,14H),3.00-2.90(m,1H),2.66-2.40(m,5H),2.39-2.02(m,4H),1.99-1.75(m,3H),1.73-1.24(m,3H),1.20-1.10(m,4H),1.09-0.95(m,16H),0.94-0.80(m,3H).
實施例47 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(4-氟苯基)丙酸
Figure 105104041-A0101-12-0168-135
Figure 105104041-A0101-12-0169-136
將6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸4a(434mg，2.06mmol)溶於20mL乙腈中，加入N,N-二異丙基乙基胺(844mL，6.55mmol)，2-(7-偶氮苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(781mg，1.87mmol)，反應體系於23℃反應30分鐘，加入(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(4-氟苯基)丙酸46(1.4g，1.87mmol)。待TLC顯示完全後，停止反應，加入50mL乙酸乙酯稀釋，減壓濃縮，用矽膠柱層析法先後以沖提劑體系B和A純化所得殘餘物，得標題產物粗製品1.2g，然後用高效液相層析法純化所得殘留物，得標題產物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(4-氟苯基)丙酸47(670mg，白色固體)，產率37.9%。
MS m/z(ESI)：944.54[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ 12.80(br.s,1H),8.56-8.52(m,1H),8.42-8.20(m,1H),8.18-8.10(m,1H),7.30-7.18(m,2H), 7.07-6.75(m,4H),4.64-4.34(m,3H),4.08-3.94(m,1H),3.80-3.50(m,2H),3.46-2.70(m,15H),2.50-1.80(m,6H),1.73-1.38(m,7H),1.30-1.10(m,12H),1.09-0.62(m,20H).
實施例48
Figure 105104041-A0101-12-0170-137
將化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯基丙酸45(1.1mg，1.16μmol)溶解於1.1mL乙腈中，加入尼妥珠單株抗體-丙硫醇PBS緩衝液39c(1.63mg/mL，11.4mL)中，於25℃下振盪反應4小時後將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的含0.05M的PBS溶液)，在無菌條件下藉由0.2μm濾器過濾後得標題產物48的PBS緩冲液(0.75mg/mL，19.8mL)，於4℃冷凍儲存。
Q-TOF LC/MS：特徵峰：150186.5(MAb+0D)、151364.1 (MAb+1D)、152262.3(MAb+2D)、153435.7(MAb+3D)、154499.6(MAb+4D)、155427.5(MAb+5D)。
平均值：y=2.0。
實施例49
Figure 105104041-A0101-12-0171-138
將化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(4-氟苯基)丙酸47(1.1mg，1.16μmol)溶解於1.1mL乙腈中，加入尼妥珠單株抗體-丙硫醇PBS緩衝液39c(1.63mg/mL，11.4mL)中，於25℃下振盪反應4小時後將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的含0.05M的PBS溶液)，在無菌條件下藉由0.2μm濾器過濾後得標題產物49的PBS緩冲液(0.75mg/mL，19.8mL)，於4℃冷凍儲存。
Q-TOF LC/MS：特徵峰：150185.5(MAb+0D)、151364.7(MAb+1D)、152261.2(MAb+2D)、153436.2(MAb+3D)、 154499.9(MAb+4D)、155428.6(MAb+5D)。
平均值：y=2.0。
實施例50
Figure 105104041-A0101-12-0172-139
將化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯基丙酸45(1.09mg，1.16μmol)溶解於1.1mL乙腈中，加入帕妥珠單株抗體-丙硫醇溶液18c(1.65mg/mL，11.3mL)中，於25℃下振盪反應4小時後將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的含0.05M的PBS溶液)，在無菌條件下藉由0.2μm濾器過濾後得標題產物50的PBS緩冲液(0.75mg/mL，19.5mL)，於4℃冷凍儲存。
Q-TOF LC/MS：特徵峰：148095.6(MAb+0D)、149111.5(MAb+1D)、150165.3(MAb+2D)、151184.7(MAb+3D)、152255.2(MAb+4D)、153297.5(MAb+5D)。
平均值：y=2.0。
實施例51
Figure 105104041-A0101-12-0173-140
將化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(4-氟苯基)丙酸47(1.09mg，1.16μmol)溶解於1.1mL乙腈中，加入帕妥珠單株抗體-丙硫醇溶液47c(1.65mg/mL，11.3mL)中，於25℃下振盪反應4小時後將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的含0.05M的PBS溶液)，在無菌條件下藉由0.2μm濾器過濾後得標題產物51的PBS緩冲液(0.75mg/mL，19.5mL)，於4℃冷凍儲存。
Q-TOF LC/MS：特徵峰：148096.2(MAb+0D)、149112.2(MAb+1D)、150165.4(MAb+2D)、151184.8(MAb+3D)、152255.1(MAb+4D)、153297.6(MAb+5D)。
平均值：y=2.0。
實施例52
Figure 105104041-A0101-12-0174-141
第一步
將硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯18a(0.35mg，2.65μmol)，溶解於0.45mL乙腈溶液，備用；向曲妥珠單株抗體pH=4.5的乙酸/乙酸鈉緩衝液(10.0mg/ml，4.5mL，0.304μmol)加入上述預製的硫代乙酸S-(3-羰基丙基)酯18a的乙腈溶液，然後滴加1.0mL的氰基硼氫化鈉(7.06mg,112μmol)溶液，於25℃下振盪反應2小時。反應結束後用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS溶液)後得標題產物52b溶液，直接進行下一步反應。
第二步
向52b溶液(約15.0mL)中加入0.45mL的2.0M鹽酸羥胺溶液，於25℃下振盪反應30分鐘後將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS 溶液)後得標題產物曲妥珠單株抗體-丙硫醇52c溶液(濃度1.65mg/ml，22.6mL)。
第三步
將化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,4S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-4-氟吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-苯基丙酸45(1.1mg，1.2μmol)溶解於1.1mL乙腈中，加入曲妥珠單株抗體-丙硫醇溶液52c(1.65mg/mL，11.3mL)中，於25℃下振盪反應4小時後將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的含0.05M的PBS溶液)，在無菌條件下藉由0.2μm濾器過濾後得標題產物52的PBS緩冲液(0.72mg/mL，20mL)，於4℃冷凍儲存。
Q-TOF LC/MS：特徵峰：148062.9(MAb+0D)、149235.2(MAb+1D)、150259.8(MAb+2D)、151268.2(MAb+3D)、152341.9(MAb+4D)、153356.4(MAb+5D)。
平均值：y=2.0。
實施例53
Figure 105104041-A0101-12-0175-142
Figure 105104041-A0101-12-0176-143
將化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(4-氟苯基)丙酸47(1.12mg，1.2μmol)溶解於1.1mL乙腈中，加入曲妥珠單株抗體-丙硫醇溶液52c(1.65mg/mL，11.3mL)中，於25℃下振盪反應4小時後將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的含0.05M的PBS溶液)，在無菌條件下藉由0.2μm濾器過濾後得標題產物53的PBS緩冲液(0.70mg/mL，20.5mL)，於4℃冷凍儲存。
Q-TOF LC/MS：特徵峰：148065.2(MAb+0D)、149244.6(MAb+1D)、150254.9(MAb+2D)、151280.9(MAb+3D)、152301.6(MAb+4D)、153457.9(MAb+5D)。
平均值：y=2.0。
生物學評價
測試例1：細胞毒素通式(D)化合物對腫瘤細胞體外增殖抑制測試
一、測試目的
本實驗的目的是為了檢測本發明通式(D)藥物化合物，對HepG2腫瘤細胞(人肝癌細胞，中科院細胞庫，貨 號#TCHu 72)和A549腫瘤細胞(人肺腺癌細胞中科院細胞庫，貨號#TCHu150)體外增殖的抑制活性。以不同濃度的化合物體外處理細胞，經76小時培養後，採用CCK-8(Cell Counting Kit-8，Dojindo，貨號：CK04)試劑對細胞的增殖進行檢測，根據IC50值評價該化合物的體外活性。
二、實驗方法
下面以對HepG2細胞體外增殖抑制測試方法為例，用於舉例說明本發明中測試本發明化合物對腫瘤細胞進行體外增殖抑制活性測試的方法。本方法同樣適用於，但不限於對其他腫瘤細胞進行體外增殖抑制活性測試。
1、細胞準備。取對數生長期的HepG2細胞，用PBS(磷酸緩冲液，ThermoFisher)洗滌1次之後，加入2-3ml胰蛋白酶(0.25% Trypsin-EDTA(1x)，Gibico,Life Technologies公司)消化2-3min，待細胞消化完全後，加入10-15ml細胞培養液(DMEM/F12培養基，Invitrogen；10%(v/v)去活化的胎牛血清)，將經過消化的HepG2細胞沖提下来，1000rpm離心3min，棄上清液，接着加入10-20ml細胞培養液將細胞重新懸浮，製成單細胞懸浮液。
2、細胞鋪板。將HepG2單細胞懸浮液混勻，用細胞培養液調整活細胞密度至6×104cells/ml，將密度調整過後的細胞懸浮液混勻，以100μl/孔加入96孔細胞培養板。將培養板置於37℃，5% CO2恆溫培養箱內培養18-20小時。
3、化合物準備
用DMSO(二甲基亞碸，上海泰坦科技股份有限公司) 溶解化合物，配製成初始濃度為10mM的存儲液。
加入10μl 10mM的化合物樣品至U型底96孔板(樣品板1)第一列各孔。，在第一列各化合物樣品孔內加入90μl DMSO，即對原液稀釋10倍，作為起始濃度點，接下来進行3倍梯度稀釋，每種化合物稀釋10個濃度點。稀釋液為DMSO溶液。第12列加入60μl 100% DMSO。第11列加入20μl 1mM的陽性藥物參考品。
取一新的U型底96孔板(樣品板2)，用完全培養基對樣品板1內的各孔樣品進行20倍稀釋。接着再取一新的U型底96孔板(樣品板3)，將樣品板2內的各孔樣品進行最终的10倍稀釋。
4、加樣操作。細胞预培養完成後，取出96孔細胞培養板，棄上清液。以100μl/孔，將96孔樣品板3中的各樣品稀釋液依次加入到96孔細胞培養板內。各化合物樣品每種濃度點作2復孔檢測。加樣操作不應超過30min。完成加樣操作後，將96孔細胞培養板置於37℃，5% CO2二氧化碳恆溫培養箱中培養76小時左右。
5、顯色操作。取出96孔細胞培養板，向各孔中以10μl/孔加入CCK-8顯色液。輕輕拍板混勻10次以上，將細胞培養板置於37℃，5%CO2二氧化碳恆溫培養箱繼續培養2.0小時。
6、讀板操作。取出96孔細胞培養板，置於酶標儀(PerkinElmer，VICTOR 3)中，用酶標儀測定在450nm處的吸光度。
按照以上步驟，測試本發明藥物化合物對A549腫瘤細胞體外增殖的抑制活性。細胞培養液同樣為DMEM/F12培養基。
三、資料分析
用Microsoft Excel，Graphpad Prism 5對資料進行處理分析。實施例結果參見表1。
Figure 105104041-A0101-12-0179-144
測試例2：針對HER2標靶的本發明抗體藥物偶聯物對腫瘤細胞的體外增殖抑制測試
本實驗的目的是為了檢測本發明針對HER2標靶的抗體藥物偶聯物，對SK-BR-3腫瘤細胞(人乳腺癌細胞，ATCC，貨號HTB-30)體外增殖的抑制活性。以不同濃度的化合物體外處理細胞，經76小時培養後，採用CCK-8(Cell Counting Kit-8，Dojindo，貨號：CK04)試劑對細胞的增殖進行檢測，根據IC50值評價該化合物的體外活性。
按照測試例1的測試方法，測試細胞為SK-BR-3，細胞培養液為含10%FBS的McCoy's 5A培養基(Gibco，貨號16600-108)。對相關化合物進行測試，得到結果見表2：
Figure 105104041-A0101-12-0180-146
結論：本發明針對HER2標靶的抗體藥物偶聯物對SK-BR-3細胞具有明顯的增殖抑制活性。
測試例3：針對EGFR標靶的本發明抗體藥物偶聯物對腫瘤細胞的體外增殖抑制測試
本實驗的目的是為了檢測本發明針對EGFR標靶的抗體藥物偶聯物，對HCC827腫瘤細胞(非小細胞肺癌細胞，中科院細胞庫，貨號#TCHu153)體外增殖的抑制活性。以不同濃度的化合物體外處理細胞，經76小時培養後，採用CCK-8(Cell Counting Kit-8，Dojindo，貨號：CK04)試劑對細胞的增殖進行檢測，根據IC50值評價該化合物的體外活性。
按照測試例1的測試方法，測試細胞為HCC827，細胞培養液為RPMI1640培養基(Invitrogen)，10%(v/v)去活化的胎牛血清。對相關化合物進行測試，得到結果見表3：
Figure 105104041-A0101-12-0181-147
結論：本發明針對EGFR標靶的抗體藥物偶聯物對HCC827細胞具有明顯的增殖抑制活性。
測試例4：NCI-N87抑瘤率實驗一、試驗目的
評價並比較本發明抗體細胞毒素偶聯物對NCI-N87細胞(HER2過表現的人胃癌細胞，ATCC，CRL-5822)裸小鼠移植瘤的療效。
二、受試藥物
本發明樣品：化合物18，化合物21，化合物36。
陽性對照：Pertuzumab帕妥珠單株抗體，Trastuzumab曲妥珠單株抗體。
配製方法：均用生理鹽水配製。
三、試驗動物
BALB/cA-nude裸小鼠，6-7周，雌性，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。合格證號：SCXK(滬)2012-0002。飼養環境：SPF級。
四、試驗步驟
裸小鼠皮下接種人胃癌NCI-N87細胞，待腫瘤生長至100-200mm3後，將動物隨機分組(D0)。給藥劑量和給藥方案見表4。每周測2-3次瘤體積，秤鼠重，記錄數據。腫瘤體積(V)計算公式為：V=1/2×a×b2
其中：a、b分別表示長、寬。
T/C(%)=(T-T0)/(C-C0)×100%其中T、C為實驗結束時的腫瘤體積；T0、C0為實驗開始時的腫瘤體積。
Figure 105104041-A0101-12-0183-148
五、試驗結果
本發明典型化合物顯著抑制HER2高表現胃癌NCI-N87裸小鼠皮下移植瘤的生長，並且荷瘤小鼠對以上藥物均能較好耐受。
測試例5：EGFRV3抗體及包含其的ADC對HCC827移植瘤裸小鼠療效測試
一、試驗目的
本實驗以Nude-nude裸小鼠為受試動物，評價本發明ADC化合物39、40多劑量腹腔注射給藥後，對人非小細胞肺癌HCC827移植瘤裸小鼠的療效。
本次實驗結果顯示，發明ADC化合物39、40多劑腹腔注射給藥一次後觀察抑瘤效果，並給藥後第38天時結束 實驗，ADC化合物39(0.05mg/mouse)的抑瘤率為62.78%，與空白組相比差異有統計學意義(p<0.05)；ADC化合物40(0.025mg/mouse)的抑瘤率為49.20%，與空白組相比差異不顯著；ADC化合物40(0.05mg/mouse)的抑瘤率為86.8%，與空白組相比有顯著差異(p<0.01)；ADC化合物40(0.1mg/mouse)的抑瘤率為93.41%；與空白組相比差異有統計學意義(p<0.05)
二、受試藥物及材料
1、受試藥物
本發明ADC化合物：ADC化合物39，ADC化合物40，
2、配製方法：均用PBS稀釋配製。
3、試驗動物
Nude-nude裸小鼠，SPF，16-20g，♀，購自上海西普爾．必凱實驗動物有限責任公司。合格證號：SCXK(滬)2008-0016。
三、試驗方法
裸小鼠實驗室環境適應三天後，進行腫瘤細胞移植。在裸小鼠右肋部皮下接種HCC827細胞(4×106+50% matrigel/mouse)，接種後第21天，腫瘤長至209.41±25.93mm3(d1)開始給藥。給藥劑量及方法具體見表5。
每週測定2次移植瘤體積，稱量裸小鼠體重並記錄資料。
使用Excel統計軟體：平均值以avg計算；SD值以STDEV計算；SEM值以STDEV/SQRT計算；組間差異P值 以TTEST計算。
腫瘤體積(V)計算公式為：V=1/2×L長×L短2
相對體積(RTV)=VT/V0
抑瘤率(%)=(CRTV-TRTV)/CRTV(%)
其中V0、VT分別為實驗開始時及實驗結束時的腫瘤體積。CRTV、TRTV分別為實驗結束時的空白對照組(Blank)及實驗組的相對腫瘤體積。
Figure 105104041-A0101-12-0185-149
四、試驗結果
本次實驗結果顯示抑瘤效果至第38天，ADC化合物39(0.05mg/mouse)的抑瘤率為62.78%，與空白組相比差異有統計學意義(p<0.05)；ADC化合物40(0.025mg/mouse)的抑瘤率為49.20%，與空白組相比差異無統計學意義(p>0.05)；ADC化合物40(0.05mg/mouse)的抑瘤率為86.8%，ADC化合物40(0.1mg/mouse)的抑瘤率為93.41%，與空白組相比均有顯著差異(p<0.01)；此外，ADC化合物40三個不同劑量組的抑瘤效果具劑量依賴關係。
<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司、上海恆瑞醫藥有限公司
<120> 配體-細胞毒性藥物偶聯物、其製備方法及其應用
<130> 97011
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠單株抗體(Pertuzumab)輕鏈
<400> 1
Figure 105104041-A0101-12-0187-150
Figure 105104041-A0101-12-0188-151
<210> 2
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠單株抗體(Pertuzumab)重鏈
<400> 2
Figure 105104041-A0101-12-0189-152
Figure 105104041-A0101-12-0190-153
Figure 105104041-A0101-12-0191-154
Figure 105104041-A0101-12-0192-155
<210> 3
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 尼妥珠單株抗體(Nimotuzumab)輕鏈
<400> 3
Figure 105104041-A0101-12-0192-156
Figure 105104041-A0101-12-0193-157
Figure 105104041-A0101-12-0194-158
<210> 4
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 尼妥珠單株抗體(Nimotuzumab)重鏈
<400> 4
Figure 105104041-A0101-12-0194-159
Figure 105104041-A0101-12-0195-160
Figure 105104041-A0101-12-0196-161
Figure 105104041-A0101-12-0197-162
<210> 5
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠單株抗體(Trastuzumab)輕鏈
<400> 5
Figure 105104041-A0101-12-0197-163
Figure 105104041-A0101-12-0198-164
Figure 105104041-A0101-12-0199-165
<210> 6
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠單株抗體(Trastuzumab)重鏈
<400> 6
Figure 105104041-A0101-12-0199-166
Figure 105104041-A0101-12-0200-167
Figure 105104041-A0101-12-0201-168
Figure 105104041-A0101-12-0202-169
Figure 105104041-A0101-11-0003-4

Claims (25)

  1. 一種通式(PC-L-D)所示的化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，
    Figure 105104041-A0305-02-0206-2
     其中：R2-R7係選自氫原子、鹵素、羥基、氰基、烷基、烷氧基和環烷基；R8-R11中至少一個為烯基，其餘為氫原子；或者R8-R11之中的任意兩個形成環烷基，其餘的兩個基團視需要選自氫原子、烷基和環烷基；R12至R13係選自氫原子、烷基或鹵素；R14係選自芳基或雜芳基，所述的芳基或雜芳基視需要進一步經選自氫原子、鹵素、羥基、烷基、烷氧基和環烷基的取代基所取代；y為1至8；PC為抗體；L為接頭單元。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中，y為2至5。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其為通式(PC-L’-D)所示的化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物：
    Figure 105104041-A0305-02-0207-3
     其中：R15係選自氫原子、鹵素、羥基、氰基、烷基、烷氧基和環烷基；R16係選自烷基、環烷基、烷氧基和雜環基；n為2至6；m為0至5；PC、y、n、R、R2至R14係如申請專利範圍第1項中所定義。
  4. 如申請專利範圍第3項所述的化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中，n為2至5。
  5. 如申請專利範圍第3項所述的化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中，m為1至3。
  6. 如申請專利範圍第1項所述的化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其為通式(PC-L’-D1)所示的化合物：
    Figure 105104041-A0305-02-0207-4
     其中PC、y、n、m、R2至R16係如申請專利範圍 第3項中所定義。
  7. 如申請專利範圍第1至6項任一項所述的化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其係選自：
    Figure 105104041-A0305-02-0208-5
     其中PC、y係如申請專利範圍第1項所定義。
  8. 如申請專利範圍第1至6項中任一項所述的化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中PC係選自帕妥珠單株抗體(Pertuzumab)、尼妥珠單株抗體(Nimotuzumab)和曲妥珠單株抗體(Trastuzumab)。
  9. 如申請專利範圍第1至6項任一項所述的化合物或其 藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其係選自：
    Figure 105104041-A0305-02-0209-6
     其中y係如申請專利範圍第1項所述。
  10. 一種通式(D)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式或其可藥用的鹽，
    Figure 105104041-A0305-02-0209-7
     其中：R1至R7係選自氫原子、鹵素、羥基、氰基、烷基、烷氧基和環烷基；R8至R11中至少一個係烯基，其餘為氫原子；或者R8至R11之中的任意兩個形成環烷基，其餘的兩個基團視需要選自氫原子、烷基和環烷基；R14係選自芳基或雜芳基，所述的芳基或雜芳基視需要進一步經選自氫原子、鹵素、羥基、烷基、烷氧基和環烷基的取代基所取代；R12至R13係選自氫原子、烷基或鹵素。
  11. 如申請專利範圍第10項所述的通式(D)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式或其可藥用的鹽，其為通式(D1)所示的化合物：
    Figure 105104041-A0305-02-0210-8
     或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，其中：R1至R14係如申請專利範圍第10項中所定義。
  12. 如申請專利範圍第10至11項任一項所述的通式(D)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式或其可藥用 的鹽，其係選自：
    Figure 105104041-A0305-02-0211-9
  13. 一種通式(L1-D)所示的化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，
    Figure 105104041-A0305-02-0211-10
     其中n為2至6；R2至R7係選自氫原子、鹵素、羥基、氰基、烷基、烷氧基和環烷基；R8至R11中至少一個為烯基，其餘為氫原子；或者R8至R11之中的任意兩個形成環烷基，其餘的兩個基團視需要選自氫原子、烷基和環烷基；R12至R13係選自氫原子、烷基或鹵素； R14係選自芳基或雜芳基，所述的芳基或雜芳基視需要進一步經選自氫原子、鹵素、羥基、烷基、烷氧基和環烷基的取代基所取代。
  14. 如申請專利範圍第13項所述的通式(L1-D)所示的化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中，n為2至5。
  15. 如申請專利範圍第13項所述的通式(L1-D)所示的化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其係選自：
    Figure 105104041-A0305-02-0212-11
  16. 一種製備如申請專利範圍第3項所述的化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物的方法，該方法包括：
    Figure 105104041-A0305-02-0212-12
     通式(PC-L2)化合物與通式(L1-D1)化合物反應，得到通式(PC-L’-D)化合物； 其中：PC、m、n、y、R2~R16係如申請專利範圍第3項中所定義。
  17. 一種通式(D-A)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式或其可藥用的鹽，
    Figure 105104041-A0305-02-0213-13
     其中：R8至R11之中的任意兩個形成環烷基，其餘的兩個基團視需要選自氫原子、烷基和環烷基；R12係選自氫原子、烷基或鹵素；P為氫原子或保護基；R’係選自氫原子、烷基、環烷基。
  18. 如申請專利範圍第17項所述的通式(D-A)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式或其可藥用的鹽，其中，P為係選自Boc、Bn或Cbz。
  19. 如申請專利範圍第17項所述的通式(D-A)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式或其可藥用的鹽，其中，P為Boc。
  20. 如申請專利範圍第17項所述的通式(D-A)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、 非對映異構體、或其混合物形式或其可藥用的鹽，為如下所示的化合物：
    Figure 105104041-A0305-02-0214-14
  21. 一種藥物組成物，其含有治療有效量的如申請專利範圍第1至9項中任意一項所述的化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，或如申請專利範圍第10至12項中任意一項所述的通式(D)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式或其可藥用的鹽，或如申請專利範圍的13至15項中任意一項所述的通式(L1-D)所示的化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，以及藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
  22. 一種申請專利範圍第1至9項中任意一項所述的化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物、或如申請專利範圍第10至12項中任意一項所述的通式(D)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式或其可藥用的鹽、或如申請專利範圍的13至15項中任意一項所述的通式(L1-D)所示的化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物、或如申請專利範圍第21項所述的藥物組成物在製備治療哺乳動物癌症的藥物的用途，所述的癌症為與HER2、HER3、EGFR表現相關的癌症。
  23. 一種申請專利範圍第1至9項中任意一項所述的化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物、或如申請專利範圍第10至12項中任意一項所述的通式(D)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式或其可藥用的鹽、或如申請專利範圍的13至15項中任意一項所述的通式(L1-D)所示的化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物、或如申請專利範圍第21項所述的藥物組成物在製備治療哺乳動物癌症的藥物的用途，其中所述哺乳動物為人，所述癌症係選自乳腺癌、卵巢癌、胃癌、子宮內膜癌、唾液腺癌、肺癌、結腸癌、腎癌、直腸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、急性淋巴細胞白血病、急性骨髓細胞白血病、急性前骨髓球白血病、慢性骨髓細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤或復發性退行性大細胞淋巴瘤。
  24. 如申請專利範圍第23項所述的用途，其中，該癌症係選自乳腺癌症、霍奇金氏淋巴瘤或復發性退行性大細胞淋巴瘤。
  25. 如申請專利範圍第23項所述的用途，其中，該癌症係乳腺癌。
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