CN116712563A - N-卤代烷基取代的喜树碱衍生物的抗体偶联药物 - Google Patents

N-卤代烷基取代的喜树碱衍生物的抗体偶联药物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种卤代烷基取代的喜树碱衍生物作为药物毒性部分的式(I)所示的抗体‑药物偶联物，式中各基团定义见说明书，该抗体‑药物偶联物具有显著的抗肿瘤效果。

Description

N-卤代烷基取代的喜树碱衍生物的抗体偶联药物
技术领域
本发明涉及医药领域。具体地说，本发明提供一系列N-氟烷基取代的喜树碱衍生物的抗体偶联药物、其制备方法及其在抗肿瘤领域中的应用。
背景技术
喜树碱及其衍生物是一种广谱的抗肿瘤药物，已有多种喜树碱衍生物再很多国家获批用于各种癌症的治疗。
抗体-药物偶联物(antibody-drug conjugate，ADC)是通过一个化学链接将具有生物活性的小分子药物连接到单抗上，单抗作为载体将小分子药物靶向运输到目标细胞中。近年来多种喜树碱衍生物被用于抗体偶联药物的小分子药物，并且取得了非常好的抗肿瘤效果，如专利文献201380053256.2公开了一类用依沙替康作为其小分子药物payload的抗体－药物偶联物，其对黑色素瘤、非小细胞肺癌等显示出明显的抑制效果，但上次ADC药物数量有限，目前仍然需要对作为ADC payloadde喜树碱衍生物结构及适宜的连接子结构等进行探究，开发更多具有抗肿瘤活性的药物偶联抗体药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种卤代烷基取代的喜树碱衍生物作为药物毒性部分的抗体偶联药物，尤其涉及一种氟烷基取代的喜树碱衍生物作为药物毒性部分的抗体偶联药物，该些抗体-药物偶联物具有显著的抗肿瘤效果。
本发明的一方面，提供一种式(I)所示的抗体-药物偶联物，
式中，
R1选自卤素取代的甲基；
Ra选自氢和-L1-NH-Lp-Z-Ab，Rb选自氢、-L2-NH-Lp-Z-Ab和-L3-NH-Z-Ab，条件是，Ra、Rb不同时为氢；
其中，
L1选自-C(＝O)-L11-L12-L13-和-CH2-NR2-L14-CHR3-；
L11、L12、L13各自独立地选自-O-、C1-C3亚烷基和苯基；
R2选自氢、氘、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、酰基、磺酰基；
L14选自-C(＝O)-和C1-C3亚烷基；
R3选自氢、氘、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基和苯基取代的C1-C6烷基；
L2选自-C(＝O)-NH-L21-CHR4-；
L21选自-C(＝O)-和-NH-C(＝O)-；
R4选自氢、氘、C1-C6烷基和苯基取代的C1-C6烷基；
L3选自-C(＝O)-NR5-NR6-L31-L32-；
R5、R6各自独立地选自氢、氘和C1-C6烷基；
L31选自-C(＝O)、-(C1-C3亚烷基)-C(＝O)、-5-8元芳环基-C(＝O)-、-5-8元氮杂芳环基-C(＝O)-和-O-(C1-C3亚烷基)-C(＝O)-；
L32选自-NH-(C1-C3亚烷基)、-N(CH3)2-(C1-C3亚烷基)和-NH-(C1-C3亚烷基)-NH-；
LP为由2-7个氨基酸构成的肽残基；
Z选自-Lz-Lj-，其中，Lz选自-C(＝O)-C1-C8亚烷基或-C(＝O)-(CH2CH2O)2-6-CH2CH2NH-，Lj为可偶联抗体的接头；
n选自1-3的整数；
Ab为抗体。
在一些具体实施方式中，R1选自氟、氯或溴取代的甲基；
优选地，R1选自氟取代的甲基；
优选地，R1选自一氟甲基、二氟甲基和三氟甲基；
优选地，R1选自二氟甲基和三氟甲基；
优选地，n为1。
在一些具体实施方式中，L11、L12、L13各自独立地选自-O-、亚甲基和苯基；
优选地，L11-L12-L13选自-O-CH2-苯基-和-CH2-O-CH2-。
在一些具体实施方式中，R2选自氢、氘、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、-C(＝O)C1-C6烷基或-S(＝O)2C1-C6烷基；
优选地，R2选自氢、氘、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基、-C(＝O)C1-C3烷基和-S(＝O)2C1-C3烷基；
优选地，R2选自氢、氘、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、甲酰基、乙酰基、甲磺酰基和乙磺酰基；
优选地，R2选自氢、甲基、甲氧基、甲酰基和甲磺酰基；
优选地，R2为氢；
优选地，L14选自-C(＝O)-和C1-C3亚烷基；
优选地，L14选自-C(＝O)-和亚甲基；
优选地，R3选自氢、氘、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基和苯基取代的C1-C6烷基；
优选地，R3选自氢、C1-C6烷基和苯基取代的C1-C6烷基；
优选地，R3选自氢、C1-C4烷基和苯基取代的C1-C3烷基；
优选地，R3选自氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、苯基甲基和苯基乙基；
优选地，R3选自氢、甲基、异丙基、异丁基和苯基甲基；
优选地，R3为氢。
在一些具体实施方式中，L1选自-C(＝O)-O-CH2-苯基-、-C(＝O)-CH2-O-CH2-、-CH2-NH-C(＝O)-CH2-和-CH2-NH-CH2-CH2-；
优选地，L1选自-C(＝O)-O-CH2-苯基-、-C(＝O)-CH2-O-CH2-和-CH2-NH-C(＝O)-CH2-。
优选地，L1选自-C(＝O)-O-CH2-苯基-和-C(＝O)-CH2-O-CH2-。
在一些具体实施方式中，R4选自氢、氘、C1-C6烷基和苯基取代的C1-C6烷基；
优选地，R4选自氢、氘、C1-C3烷基和苯基取代的C1-C3烷基；
优选地，R4选自氢、氘、甲基、异丙基、异丁基和苯基甲基；
优选地，R4选为氢；
优选地，L2选自-C(＝O)-NH-C(＝O)-CH2-和-CH2-NH-NH-C(＝O)-CH2-；
优选地，L2为-CH2-NH-NH-C(＝O)-CH2-。
在一些具体实施方式中，R5、R6各自独立地选自氢、氘和C1-C3烷基；
优选地，R5、R6各自独立地选自氢、氘和甲基；
优选地，R5为氢，R6为氢；
优选地，L31选自-C(＝O)、-亚甲基-C(＝O)、-苯基-C(＝O)-、-吡啶基-C(＝O)-和-O-CH2-C(＝O)-；
优选地，L32选自-NH-CH2-CH2-、-N(CH3)2-CH2-CH2-和-NH-CH2-NH-；
优选地，L3为-C(＝O)-NH-NH-苯基-C(＝O)-NH-CH2-CH2-。
在一些具体实施方式中，所述氨基酸选自苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、缬氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、瓜氨酸(Cit)和天冬氨酸(Asn)；
优选地，Lp选自由2-5个选自氨基酸选自苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、缬氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、瓜氨酸(Cit)和天冬氨酸(Asn)的氨基酸构成的肽残基；
优选地，Lp选自由2-5个选自苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、缬氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)和赖氨酸(Lys)的氨基酸构成的肽残基；
优选地，Lp选自由2、3或4个选自苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、缬氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)和赖氨酸(Lys)的氨基酸构成的肽残基；
优选地，Lp选自-Val-Cit-、-Val-Ala-、-Gly-Val-Ala-、-Gly-Val-Ala-Gly-、-Gly-Lys-、-Gly-Gly-Lys-、-Gly-Gly-Lys-Gly-、-Val-Ala-、-Ala-Ala-Asn-、-Gly-Leu-、-Gly-Gly-Leu-、-Gly-Gly-Leu-Gly-、-Gly-Phe-、-Gly-Gly-Phe-和-Gly-Gly-Phe-Gly-；
优选地，Lp选自 其羰基端连接-NH-，另一端连接Z。
优选地，Lp选自 其羰基端连接-NH-，另一端连接Z。
在一些具体实施方式中，Lj选自所示位置表示与抗体相连，/>所示位置表示与Lz基团相连；
优选地，Lz选自-C(＝O)-C1-C8亚烷基、-C(＝O)-CH2O-(CH2CH2O)2-5-CH2CH2NH-和-C(＝O)-(CH2CH2O)2-6-CH2CH2NH-；
优选地，Lz选自-C(＝O)-C1-C6亚烷基、-C(＝O)-CH2O-(CH2CH2O)2-3-CH2CH2NH-和-C(＝O)-(CH2CH2O)2-4-CH2CH2NH-；
优选地，Lz选自-C(＝O)-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-、-C(＝O)-CH2O-CH2CH2O-CH2CH2NH-和-C(＝O)-CH2O-(CH2CH2O)3-CH2CH2NH；
优选地，Z选自
所示位置表示与抗体相连；/>所示位置表示与Lp基团或L3基团相连。
在一些具体实施方式中，所述抗体为肿瘤相关抗原抗体；
优选地，所述肿瘤相关抗原抗体选自抗Her2抗体、抗Trop2抗体、抗B7H3抗体、抗5T4、抗Nectin-4抗体、抗CD20抗体和抗ROR1抗体。
在一些具体实施方式中，式(I)所示的抗体-药物偶联物具有如式(I-1)或式(I-2)所示的结构，
式中，R1、n、Lp、Z、Ab各自定义同式(I)化合物。
在一些具体实施方式中，式(I)所示的抗体-药物偶联物具有如式(I-3)或式(I-4)所示的结构，
式中，R1、R2、n、Lp、Z、Ab各自定义同式(I)化合物。
在一些具体实施方式中，式(I)所示的抗体-药物偶联物具有如式(I-5)所示的结构，
式中，R1、R5、R6、n、Ab各自定义同式(I)化合物；
Z选自-Lz-Lj-，其中，Lj选自所示位置表示与抗体相连，/>所示位置表示与LZ基团相连；
优选地，Lz选自-C(＝O)-CH2O-(CH2CH2O)1-5-CH2CH2NH-；
优选地，Lz选自-C(＝O)-CH2O-(CH2CH2O)3-5-CH2CH2NH-；
优选地，Lz选自-C(＝O)-CH2O-(CH2CH2O)3-CH2CH2NH-；
优选地，Z选自所示位置表示与抗体相连；/>所示位置表示与Lp基团或L3基团相连。
在一些具体实施方式中，式(I)所示的抗体-药物偶联物具有如式(I-6)所示的结构，
式中，R1、R5、R6、n、Lp、Z、Ab各自定义同式(I)化合物。本发明提供以下抗体-药物偶联物：
其中，Ab定义同式(I)化合物；
优选地，Ab为HS627抗体或IP140B抗体，所述HS627的重链氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示，其轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述IP140B抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，其轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明提供以下抗体-药物偶联物：
其中，Ab定义同式(I)化合物；
优选地，Ab为HS627抗体或IP140B抗体，所述HS627的重链氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示，其轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述IP140B抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，其轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明的另一方面，提供上述抗体-药物偶联物的制备方法，其选自以下合成路线：
合成路线1：
式(a)化合物与HO-Lz-Lj’缩合反应得到式(b)化合物，式(b)化合物与抗体连接得到式(I)化合物，其中，Ra为-L1-NH-Lp-Z-Ab，Rb为氢；
合成路线2：
式(c)化合物与HO-Lz-Lj’缩合反应得到式(d)化合物，式(d)化合物与抗体连接得到式(I)化合物，其中，Ra为氢，Rb选自-L2-NH-Lp-Z-Ab；
合成路线3：
式(e)化合物与HO-Lz-Lj’缩合反应得到式(f)化合物，式(f)化合物与抗体连接得到式(I)化合物，其中，Ra为氢，Rb选自-L3-NH-Z-Ab；
上述合成路线中，R1、n、L1、L2、L3、Lp、Lz、Ab各自定义同式(I)化合物；
Lj’选自
本发明的另一方面，提供一种药物组合物，其包括前述抗体-药物偶联物或上述方法制备得到的抗体-药物偶联物与药学上可接受的载体。
本发明的另一方面，提供前述抗体-药物偶联物、上述方法制备得到的抗体-药物偶联物或上述药物组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
本发明的另一方面，提供一种抑制有需要患者肿瘤疾病的方法，其包括向有需要的患者施用上述抗体-药物偶联物或药物组合物。
在一些具体实施方案中，上述抗体-药物偶联物或药物组合物的施用量为治疗有效量。
在一些具体实施方式中，所述肿瘤选自实体瘤。
在一些具体实施方式中，所述肿瘤选自管癌、肺癌、非小细胞肺癌、食管鳞癌、卵巢癌、肺癌或乳腺癌。
附图说明
图1为测试例2中Calu-6人非小细胞肺癌CDX模型肿瘤生长曲线图。
图2为测试例2中Calu-6人非小细胞肺癌CDX模型解剖后肿瘤照片。
图3为测试例2中KYSE-150人食管鳞癌CDX模型肿瘤生长曲线图。
图4为测试例2中KYSE-150人食管鳞癌CDX模型解剖后肿瘤照片。
图5为测试例2中ES-2人卵巢癌CDX模型肿瘤生长曲线图。
图6为测试例2中ES-2人卵巢癌CDX模型解剖后肿瘤照片。
图7为测试例2中NCI-H1975肺癌CDX模型肿瘤生长曲线图。
图8为测试例2中NCI-H1975肺癌CDX模型解剖后肿瘤照片。
图9为测试例2中MDA-MB-231三阴性人乳腺癌CDX模型肿瘤生长曲线图。
图10为测试例2中MDA-MB-231三阴性人乳腺癌CDX模型解剖后肿瘤照片。
具体实施方式
I定义：
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文使用的和除非另作说明，术语“包含”，“包括”，“具有”，“含有”，包括其语法上的等同形式，通常应当理解为开放式且非限制性的，例如，不排除其他未列举的要素或步骤。
本公开化合物可以是不对称的，例如，具有一个或多个立体异构体。除非另有说明，所有立体异构体都包括，如对映异构体和非对映异构体。所述的立体异构体包括几何异构(如顺式、反式结构)和光学异构(如对映异构体)，以单体、消旋体、外消旋混合物及其药学上可接受的盐组成的治疗物。本公开的含有不对称碳原子的化合物可以以光学活性纯的形式或外消旋形式被分离出来。光学活性纯的形式可以从外消旋混合物拆分，或通过使用手性原料或手性试剂合成。外消旋体、非对映异构体、对映异构体都包括在本公开的范围之内。
本文中的数字范围，是指给定范围中的各个整数。例如，“C1-C6”是指该基团可具有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子或6个碳原子。
当任何变量(例如Rn)在化合物的组成或结构中出现一次以上时，其在每一种情况下的定义都是独立的。因此，例如，如果一个基团被1-5个R所取代，则所述基团可以任选地至多被5个R所取代，并且每种情况下的R都有独立的选项。此外，取代基和/或其变体的组合只有在这样的组合会产生稳定的化合物的情况下才是被允许的。
术语“C1-C6烷基”指具有1到6个碳原子的直链或支链烷基。烷基具体实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基，及其各种支链异构体等。
术语“烷氧基”指-O-(烷基)和-O-(非取代的环烷基)，其中烷基的定义如上所述。烷氧基的非限制性实例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基。烷氧基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、疏基、氢基、硝基、氯基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、羧基或羧酸酯基。
术语“酰基”意指-C(＝O)R，其中R是经取代的或未经取代的烷基、经取代的或未经取代的环烷基、经取代的或未经取代的杂烷基。
术语“磺酰基”意指-S(＝O)2R，其中R是经取代的或未经取代的烷基、经取代的或未经取代的环烷基、经取代的或未经取代的杂烷基。
是指化学键连接处。需要说明的是，本发明所记载的结构片段(例如-Lz-Lj-)，在无特别说明的时候，代表由左到右的顺序连接相应基团，例如当-L12-为C1-C2亚烷基-O-时，其表示C1-C2亚烷基-O-的左侧连接-L11-，右端连接-L13-。
药物或药物组合物
本公开的药物或药物组合物可以经口地、局部地、肠胃外地或粘膜地(例如，含服地、通过吸入或直肠地)以包含常规的非-毒性药学可接受的载体的剂量单位配制剂施用。通常希望使用口服途径。所述活性试剂可以经口地以胶囊、片剂等形式(参见Remington：The Science and Practice of Pharmacy，20th Edition)施用。
术语“治疗”包括抑制、缓解、预防或消除与所治疗的疾病、病症或失调相关的一种或多种症状或副作用。
术语“抑制”的使用是相对于对照的。本领域技术人员将容易地确定用于每个实验的适当对照。例如，将用化合物处理的受试者或细胞中的降低了的反应与未用化合物处理的受试者或细胞中的反应进行比较。
术语“药物组合物”意指包含本公开所述化合物或其药学上可接受的盐，以及依施用方式和剂型的性质而定的至少一种选自以下药学上可接受的成分的组合物，包括但不限于：载体、稀释剂、佐剂、赋形剂、防腐剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、矫味剂、香味剂、抗菌剂、抗真菌剂、润滑剂、分散剂、温敏材料、温度调节剂、黏附剂、稳定剂、助悬剂等。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指无毒的但能达到预期效果的药物或药剂的足够用量。在本发明的实施方式中，在根据本发明对患者进行治疗时，给定药物的量取决于诸多因素，如具体的给药方案、疾病或病症类型及其严重性、需要治疗的受治疗者或宿主的独特性(例如体重)，但是，根据特定的周围情况，包括例如已采用的具体药物、给药途径、治疗的病症、以及治疗的受治疗者或宿主，施用剂量可由本领域已知的方法常规决定。通常，就成人治疗使用的剂量而言，施用剂量典型地在0.02-5000mg/天，例如约1-1500mg/天的范围。该所需剂量可以方便地被表现为一剂、或同时给药的(或在短时间内)或在适当的间隔的分剂量，例如每天二、三、四剂或更多分剂。本领域技术人员可以理解的是，尽管给出了上述剂量范围，但具体的有效量可根据患者的情况并结合医师诊断而适当调节。
本文所述“抗体偶联药物”含义同抗体-药物偶联物。
缩写：
Fmoc：9-芴甲氧羰基；
构成所述肽残基LP的氨基酸，Val：缬氨酸，其结构式为Ala：丙氨酸，其结构式为/>Gly：甘氨酸，其结构式为/>Phe：苯丙氨酸，其结构式为
LP可通过本领公知的氨基酸缩合方法得到。
PABC：ha：/>m：/>
本发明中，抗体和用于连接抗体的接头Lj可以通过本领域公知的方法连接得到。例如，当Lj结构为(或/>)时，其可以是通过/>(或/>)与抗体上的硫醇等可反应基团反应连接得到，本发明对此不做特别限定。
II实施例：
本实施例中制备ADC使用但不限于帕妥珠单抗和IP140B抗体，帕妥珠单抗(HS627，PERTUZUMAB)重链氨基酸序列如下(SEQ ID NO:1)：
轻链氨基酸序列如下(SEQ ID NO:2)：
IP140B抗体的重链氨基酸序列如下(SEQ ID NO:3)：
轻链氨基酸序列如下(SEQ ID NO:4)：
如无特别说明，本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
中间体HX-16a：N-(2’,2’-二氟乙基)胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱
向反应瓶中加入二氟乙胺(1.0g,12mmol)，盐酸(1.4mL,16mmol)和7-甲基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(1.0g,2.46mmol)和DMSO(5mL)，搅拌加热至120℃反应1h，冷却，加异丙醇，抽滤，硅胶柱层析纯化得到标题化合物(393mg,产率32％,HPLC 95％)；1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.68(s,1H),7.52(s,1H),7.28(s,1H),6.58(s,1H),6.33(s,2H),6.02(t,J＝56.6Hz,1H),5.47(s,2H),5.26(s,2H),3.26(s,3H),2.94(s,4H),1.92(s,2H),0.93(s,3H)；LC-MS(M+H)+500.13(理论值499.16)。
中间体HX-22e：N-(2’,2’,2’-三氟乙基)]胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱
将三氟乙胺盐酸盐(100mg,0.74mmol)和7-甲基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(100mg,0.25mmol)溶于DMSO(3mL)中，搅拌加热至120℃反应1h，冷却后加入甲基叔丁基醚，过滤，硅胶柱层析纯化得到标题化合物(49mg,产率38％,HPLC 99％)；1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.71(s,1H),7.54(s,1H),7.29(s,1H),6.55(s,1H),6.34(d,J＝2.0Hz,2H),5.48(d,J＝3.0Hz,2H),5.30(s,2H),3.42(s,2H),3.42(s,2H),3.29(s,2H),1.92(dd,J＝14.4,7.3Hz,2H),0.94(t,J＝7.3Hz,4H)；LC-MS(M+H)+518.34(理论值517.15)。
实施例1：7-[N-(HS627-Ac-PEG2-Gly-Gly-Leu-Gly-ha-Ac),N-(2’,2’-二氟乙基)]胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(1)
向反应瓶中加入HX-11b(0.1g,0.16mmol)，3mL DMF，HATU(74.6mg,0.2mmol)，DIPEA(25.3mg.0.2mmol)和HX-16a(82mg,0.16mmol),室温反应1.5h，硅胶柱层析纯化得黄色固体HX-16b(153mg,产率85％)；LCMS:(M+1)+1093.11(理论值：1092.40)。
在10ml反应瓶中，依次加入HX-16b(153mg,0.14mmol)，哌啶(140mg,1.6mmol)，室温下搅拌反应1h，在反应液中加入30ml甲基叔丁基醚，离心(5min,10000r/min),去除上清液，再次加入甲醇1ml，超声溶清，再次加入30ml甲基叔丁基醚，离心(5min,10000r/min)，去除上清液，减压下去除溶剂，得到HX-16c固体(103.5mg，产率72.7％)；LCMS:(M+1)+871.21(理论值：870.34)，不进行纯化直接用于下一步反应。
在50ml的单口瓶中,依次加入DCM(20mL),3-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]-丙酸(2g,11.3mmol),溴乙酰溴(2.27g,11.3mmol),搅拌30min,反应液中加入10ml饱和氯化钠萃取，DCM相用无水硫酸镁干燥，得到中间体HX-3b(3.1g,产率89％),LCMS:(M+1)+298.00(理论值：297.02)。
在10ml的单口瓶中依次加入DCM(3mL),HX-16c(60mg,0.069mmol),HX-3b(25mg,0.083mmol)和DIC(10.5mg,0.083mmol),室温搅拌反应30min后，将反应液注射入25g C18预柱(先用乙腈平衡，然后用水平衡，水相含0.1％HCOOH)，然后通过中压反相C18色谱法(梯度：5％至40％乙腈在水中，时间30min)洗脱，冻干，得到黄色固体产物HX-16(24.5mg，产率30.9％)；LCMS:(M+1)+1150.35(理论值：1149.35)。
取HS627抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物HX-16(0.92mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM L-组氨酸醋酸盐缓冲液，pH6.0，120mM蔗糖，0.2g/L聚山梨酯20，得到抗体偶联物ADC 1(3.0mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝6.8。
实施例2：7-[N-(IP140B-Ac-PEG2-Gly-Gly-Leu-Gly-ha-Ac),N-(2’,2’-二氟乙基)]胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(2)
取IP140B抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物HX-16(0.92mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM组氨酸溶液，250mM山梨醇，0.02％吐温80，pH5.7，得到抗体偶联物ADC 2(3.2mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.0。
实施例3：7-[N-(HS627-Ac-PEG2-Gly-Val-Ala-Gly-ha-Ac),N-(2’,2’-二氟乙基)]胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(3)
取HX-9b(3g，6.32mmol)，加入100mL乙腈，再加入DBU(0.48g,3.16mmol)，室温反应2h,依次加入PPTS(0.79g,3.16mmol)、HOBT(0.85g6.32mmol)、Fmoc-Gly-Val-Ala-OH(2.61g,5.36mmol)和EDCI(1.21g,6.32mmol)，加毕，室温反应。室温反应15h,减压下旋干，硅胶柱层析纯化，得白色粉末状固体HX-17a(2.75g,产率62％)；LCMS:(M+1)+702.15(理论值：701.31)。
在500ml的单口瓶中，将HX-17a(2.75g,3.9mmol)溶于50ml甲醇和25ml的DCM混合溶剂中，加入10％的钯碳1g,氢气置换后，室温常压反应2h,反应完，过滤浓缩得到产品HX-17b(2.2g,产率92％)；LCMS:(M+1)+612.18(理论值：611.26)。
取HX-16a(50mg,0.1mmol)，加入2mL DMF，HATU(38mg,0.1mmol)，DIPEA(26mg.0.2mmol)和HX-17b(61mg,0.1mmol),室温反应15h，加入200mL DCM稀释，饱和氯化钠溶液洗涤,无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析纯化得黄色固体HX-17c(85mg,产率78％)；LCMS:(M+1)+1093.11(理论值：1092.40)。
将HX-17c(78mg,0.07mmol)溶于0.2ml的DMF中，然后加入哌啶(55mg,0.7mmol)，室温搅拌反应1h，在反应液中加入30ml甲基叔丁基醚，离心(5min,10000r/min),去除上清液，减压下去除溶剂，得到HX-17d固体(56mg，产率73.4％)；LCMS:(M+1)+871.32计算值：870.34)，中间体不经进一步纯化直接用于下一步反应。
在10ml的单口瓶中,依次加入DCM(3mL),HX-17d(56mg,0.064mmol),HX-3b(18.6mg,0.064mmol)和DIC(8.1mg,0.064mmol),室温搅拌反应90min，将反应液注射入25gC18预柱(先用乙腈平衡，然后用水平衡，水相含0.1％TFA)，然后通过中压反相C18色谱法(梯度：5％至40％乙腈在水中，时间30min)洗脱，冻干，得到黄色固体HX-17(23mg，产率31％)；LCMS:(M+1)+1150.33(理论值：1149.35)。
取HS627抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物HX-17(0.92mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM L-组氨酸醋酸盐缓冲液，pH6.0，120mM蔗糖，0.2g/L聚山梨酯20，得到抗体偶联物ADC 3(3.1mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.4。
实施例4：7-[N-(IP140B-Ac-PEG2-Gly-Val-Ala-Gly-ha-Ac),N-(2’,2’-二氟乙基)]胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(4)
取IP140B抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物HX-17(0.92mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM组氨酸溶液，250mM山梨醇，0.02％吐温80，pH5.7，得到抗体偶联药物ADC 4(3.2mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.5.
实施例5：7-[N-(HS627-Ac-PEG2-Gly-Gly-Phe-Gly-m),N-(2’,2’-二氟乙基)]胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(5)
100ml三口瓶中，HX-9a(1g,2.7mmol)溶于10ml DCM中，加入TMSCl 8ml，氩气保护反应体系，常温搅拌2小时，减压浓缩得到白色固体HX-18a,投入下一步直接使用；LCMS:(M+1)+344.80(理论值：344.09)。
将HX-16a(100mg，0.2mmol)溶于5ml无水DCM中，加入HX-18a(0.93g,2.7mmol)，反应液室温反应2小时，加水(10ml)用DCM(20ml*3)萃取三次，有机相直接浓缩，硅胶柱层析纯化，得到化合物HX-18b(121mg,产率75％)；LCMS:(M+1)+808.13(理论值：807.28)。
在10ml的单口瓶中，加入HX-18b(121mg,0.149mg)，用1ml的DMF溶解，然后加入100μl的哌啶，室温下反应1h反应完，将反应液滴加入20ml甲基叔丁基醚中，离心，去除上清液，干燥，得到HX-18c(68mg,产率78％)；LCMS:(M+1)+586.21(理论值：585.20)。
称取HX-18c(68mg,0.11mmol)溶于2ml DMF中，DIPEA(15mg,0.11mmol)搅拌溶清，依次加入0.138gFmoc-Gly-Gly-Phe-OH(56mg,0.11mmol)，HATU(42mg,0.11mmol),室温搅拌反应,柱层析纯化，得到产品HX-18d(107mg,产率86％)；LCMS:(M+1)+1069.09(理论值：1068.38)。
在10ml的单口瓶中，加入HX-18d(107mg,0.1mmol)，用1ml的DMF溶解，然后加入100μl的哌啶，室温下反应1h反应完，将反应液滴加入20ml甲基叔丁基醚中，离心，去除上清液，干燥，得到HX-18e(56mg,产率66％)；LCMS:(M+1)+847.23(理论值：846.31)。
在10ml的单口瓶中,依次加入DCM(3mL),HX-18e(56mg,0.066mmol),HX-3b(19.2mg,0.066mmol)和DIC(8.4mg,0.066mmol),室温搅拌反应90min，浓缩，硅胶柱层析纯化,得到黄色固体产物HX-18(12mg，产率16％)；LCMS:(M+1)+1126.24(理论值：1125.33)。
取HS627抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物HX-18(0.90mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM L-组氨酸醋酸盐缓冲液，pH6.0，120mM蔗糖，0.2g/L聚山梨酯20，得到抗体偶联物ADC 5(3.4mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.5。
实施例6：7-[N-(IP140B-Ac-PEG2-Gly-Gly-Phe-Gly-m),N-(2’,2’-二氟乙基)]胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(6)
取IP140B抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物HX-18(0.90mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM组氨酸溶液，250mM山梨醇，0.02％吐温80，pH5.7，得到抗体偶联物ADC 6(3.1mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.6。
实施例7：7-[N-(HS627-Ac-PEG2-Gly-Lys-PABC),N-(2’,2’-二氟乙基)]胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(7)
在10ml单口瓶中，依次加入HX-16a(100mg,0.2mmol),1ml NMP,DIPEA(129mg,1mmol),Fmoc-GK-PAB-PNP(187mg,0.2mmol),HOBt(27mg,0.2mmol),室温搅拌反应4h，得到HX-19a直接投入至下一步反应；LCMS:(M+1)+1298.41(理论值：1297.50)。
在上述HX-19a反应液中，加入0.1ml的哌啶(V:V＝10％)，室温反应0.5h，在反应液中加入20ml甲基叔丁基醚，离心(5min,10000r/min),去除上清液，减压下去除溶剂，得到HX-19b固体(155mg，产率72％)；LCMS:(M+1)+1076.39(理论值：1075.43)，中间体不需进一步纯化直接用于下一步反应。
在10ml的单口瓶中,依次加入DCM(2mL),HX-19b(50mg,0.046mmol),HX-3b(13.4mg,0.046mmol)和DIC(5.85mg,0.046mmol),室温搅拌反应90min，加入0.1ml的TFA，继续反应30min,将反应液注射入25g C18预柱(先用乙腈平衡，然后用水平衡，水相含0.1％TFA)，然后通过中压反相C18色谱法(梯度：5％至40％乙腈在水中，时间30min)洗脱，冻干，得到黄色固体产物HX-19(21mg，产率40％)；LCMS:(M+1)+1113.24(理论值：1112.33)。
取HS627抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物HX-19(0.89mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM L-组氨酸醋酸盐缓冲液，pH6.0，120mM蔗糖，0.2g/L聚山梨酯20，得到抗体偶联物ADC 7(3.0mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.1。
实施例8：7-[N-(IP140B-Ac-PEG2-Gly-Lys-PABC),N-(2’,2’-二氟乙基)]胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(8)
取IP140B抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物HX-19(0.89mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM组氨酸溶液，250mM山梨醇，0.02％吐温80，pH5.7，得到抗体偶联物ADC 8(3.3mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.2。
实施例9：7-[N-(HS627-异烟酰-PEG2-Gly-Lys-PABC),N-(2’,2’-二氟乙基)]胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(9)
在10ml单口瓶中，依次加入HX-16a(100mg,0.2mmol),1ml NMP,DIPEA(129mg,1mmol),Fmoc-GK-PAB-PNP(187mg,0.2mmol),HOBt(27mg,0.2mmol),室温搅拌反应4h，得到HX-20a LCMS:(M+1)+1298.41(理论值：1297.50)，直接投入至下一步。
在上述HX-20a反应液中，加入0.1ml的哌啶(V:V＝10％)，室温反应0.5h，在反应液中加入20ml甲基叔丁基醚，离心(5min,10000r/min),去除上清液，减压下去除溶剂，得到HX-20b固体(155mg，产率72％)；LCMS:(M+1)+1076.42(理论值：1075.43)，直接投入至下一步。
称取HX-20b(155mg,0.14mmol)溶于2ml DMF中，DIPEA(18.6mg,0.14mmol)搅拌溶清，依次加入Fmoc-NH-PEG2-CH2CH2-COOH(57mg,0.14mmol)，HATU(55mg,0.14mmol),室温搅拌反应,柱层析纯化，得到固体产物HX-20c(168mg,产率81％)；LCMS:(M+1)+1443.57(理论值：1442.57)。
在10ml的单口瓶中，加入HX-20c(168mg,0.11mmol)，用1ml的DMF溶解，然后加入100μl的哌啶，室温下反应1h反应完，将反应液滴加入20ml甲基叔丁基醚中，离心，去除上清液，干燥，得固体产物HX-20d(126mg,产率88％)；LCMS:(M+1)+1221.31(理论值：1220.50)。
在10ml的单口瓶中,依次加入DCM(2mL),HX-20d(126mg,0.10mmol),2-(溴甲基)异烟酸(22mg,0.10mmol)和DIC(13mg,0.10mmol),室温搅拌反应90min,加入0.1ml的TFA，继续反应30min,将反应液注射入25gC18预柱(先用乙腈平衡，然后用水平衡，水相含0.1％TFA)，然后通过中压反相C18色谱法(梯度：5％至40％乙腈在水中，时间30min)洗脱，冻干，得到黄色固体产物HX-20(32mg，产率25％)；LCMS:(M+1)+1176.28(理论值：1175.34)。
取HS627抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物HX-20(0.94mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM L-组氨酸醋酸盐缓冲液，pH6.0，120mM蔗糖，0.2g/L聚山梨酯20，得到抗体偶联药物ADC 9(3.1mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.3
实施例10：7-[N-(IP140B-异烟酰-PEG2-Gly-Lys-PABC),N-(2’,2’-二氟乙基)]胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(10)
取IP140B抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物HX-20(0.94mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM组氨酸溶液，250mM山梨醇，0.02％吐温80，pH5.7，得到抗体偶联药物ADC 10(3.4mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.2。
实施例11：7-[N-(HS627-Ac-PEG2-Val-Ala-PABC),N-(2’,2’-二氟乙基)]胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(11)
在10ml单口瓶中，依次加入HX-16a(100mg,0.20mmol),0.5ml NMP,DIPEA(130mg,1mmol),Fmoc-VA-PAB-PNP(138mg,0.20mmol),HOBt(27.4mg,0.20mmol),室温搅拌反应4h，得到HX-21a，不经纯化直接投入至下一步；LCMS:(M+1)+1041.07(理论值：1040.38)。
在上述HX-21a反应液中，加入0.5ml的哌啶(V:V＝10％)，室温反应30min，在反应液中加入20ml甲基叔丁基醚，离心(5min,10000r/min)，去除上清液，减压下去除溶剂，得到固体产物HX-21b(123mg，产率75％)；LCMS:(M+1)+819.22(理论值：818.31)。
在10ml的单口瓶中,依次加入DCM(1mL),HX-17b(123mg,0.15mmol),HX-3b(43.45mg,0.15mmol)和DIC(18.9mg,0.15mmol),室温搅拌反应90min，将反应液注射入25gC18预柱(先用乙腈平衡，然后用水平衡，水相含0.1％TFA)，通过中压反相C18色谱法(梯度：5％至40％乙腈在水中，时间30min)洗脱，冻干，得到黄色固体产物HX-21(44mg，产率26％)；LCMS:(M+1)+1098.21(理论值：1097.32)。
取HS627抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物HX-21(0.88mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM L-组氨酸醋酸盐缓冲液，pH6.0，120mM蔗糖，0.2g/L聚山梨酯20，得到抗体偶联药物ADC 11(3.2mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.5。
实施例12：7-[N-(IP140B-Ac-PEG2-Val-Ala-PABC),N-(2’,2’-二氟乙基)]胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(12)
取IP140B抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物HX-21(0.88mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM组氨酸溶液，250mM山梨醇，0.02％吐温80，pH5.7，得到抗体偶联药物ADC 12(3.1mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.6。
实施例13：7-[N-(HS627-Ac-PEG2-Gly-Leu-Gly-m),N-(2’,2’,2’-三氟乙基)]胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(13)
在1000ml的单口瓶中，加入二氯甲烷500ml,搅拌情况下，依次加入Fmoc-NH-PEG2-CH2CH2-COOH(30g,75mmol)；HOBT(12.15g,90mmol),EDCI(17.25g,90mmol),甘氨酸叔丁酯(10.32g,78.75mmol),DIPEA(10.16g,90mmol)，室温搅拌过夜,反应液用饱和氯化钠洗(300ml*3)，相依次用饱和碳酸氢钠(300ml*3)萃取，0.5M盐酸(300ml*3)萃取，分相，DCM相用无水硫酸镁干燥，过滤，除去无水硫酸镁，浓缩得到产品HX-22a(36.2g,收率94％)；LCMS:(M+1)+513.14(理论值：512.25)。
在1000ml的单口瓶中，加入二氯甲烷400ml,加入HX-22a(36.2g,70mmol),搅拌均匀后，滴加100ml三氟乙酸，室温搅拌反应过夜,浓缩得到产品HX-22b(32.2g,产率100％)；LCMS:(M+1)+457.08(理论值：456.19)。
在1000ml的单口瓶中，加入二氯甲烷300ml,搅拌情况下，依次加入HX-22b(32.2g,70mmol),HOBT(11.34g,84mmol),EDCI(16.10g,84mmol),甘氨酸叔丁酯(9.62g,73.5mmol),DIPEA(10.84g,84mmol)，室温搅拌过夜，反应液用饱和氯化钠洗(150ml*3)，然后相依次用饱和碳酸氢钠(150ml*3)萃取，0.5M盐酸(150ml*3)萃取，分相，DCM相用无水硫酸镁干燥，过滤，除去无水硫酸镁，浓缩得到产品HX-22c(42g,产率95％)；LCMS:(M+1)+626.18(理论值：625.34)。
在1000ml的单口瓶中，加入二氯甲烷400ml,加入HX-22c(42g,67.2mmol),搅拌均匀后，滴加100ml三氟乙酸，室温搅拌反应过夜，浓缩得到产品HX-22d(38.23g,产率100％)；LCMS:(M+1)+570.14(理论值：569.27)。
HX-22e(100mg，0.19mmol)溶于5ml无水DCM中，加入HX-18a(665.3mg,1.9mmol)，反应液室温下搅拌2小时，浓缩，硅胶柱层析纯化，得到化合物HX-22f(47mg,产率30％)；LCMS:(M+1)+826.19(理论值：825.26)。
在10ml的单口瓶中，加入HX-22f(47mg,0.056mmol)，用1ml的DMF溶解，然后加入100μl的哌啶，室温下反应1h反应完，将反应液滴加入20ml甲基叔丁基醚中，离心，去除上清液，干燥后获得HX-22g(21mg,产率60％)；LCMS:(M+1)+604.03(理论值：603.19)。
称取HX-22g(21mg,0.034mmol)溶于2ml DMF中，DIPEA(4.49mg,0.034mmol)，搅拌均匀，依次加入HX-22d(19.8mg,0.034mmol)，HATU(13.23mg,0.034mmol),室温搅拌1h,浓缩，硅胶柱层析纯化，得到化合物HX-22h(35mg,产率87.5％)；LCMS:(M+1)+1155.22(理论值：1154.46)。
在10ml的单口瓶中，加入HX-22h(35mg,0.03mmol)，用1ml的DMF溶解，然后加入100μl的哌啶，室温下反应1h反应完，将反应液滴加入20ml甲基叔丁基醚中，离心，去除上清液，干燥，得到HX-22i(22mg,产率78.9％)；LCMS:(M+1)+933.65(理论值：932.95)。
在10ml的单口瓶中,依次加入DCM(3mL),HX-22i(22mg,0.023mmol),HX-3b(7mg,0.023mmol)和DIC(2.97mg,0.023mmol),室温搅拌反应90min，浓缩，硅胶柱层析纯化,得到黄色固体产物HX-22(19mg，产率77％)；LCMS:(M+1)+1053.27(理论值：1052.31)。
取HS627抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物HX-22(0.84mg，0.8mmol)溶于0.08ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM L-组氨酸醋酸盐缓冲液，pH6.0，120mM蔗糖，0.2g/L聚山梨酯20，得到抗体偶联药物ADC 13(3.3mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.1。
实施例14：7-[N-(IP140B-Ac-PEG2-Gly-Leu-Gly-m),N-(2’,2’,2’-三氟乙基)]胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(14)
取IP140B抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物HX-22(0.84mg，0.8mmol)溶于0.08ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM组氨酸溶液，250mM山梨醇，0.02％吐温80，pH5.7，得到抗体偶联药物ADC 14(3.1mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.0。
实施例15：7-[N-(HS627-Ac-PEG2-Gly-Gly-Phe-Gly-ha-Ac),N-(2’,2’,2’-三氟乙基)]胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(15)
取HX-22e(70mg,0.11mmol)，加入2mL DMF，HATU(41.8mg,0.11mmol)，DIPEA(14.19mg.0.11mmol)和Fmoc-Gly-Gly-Phe-OH(55.11mg,0.11mmol),室温搅拌6h，加入200mL DCM稀释，饱和氯化钠溶液洗涤,无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析纯化得黄色固体产物HX-23a(108mg,产率85％)；LCMS:(M+1)+1087.25(理论值：1086.37)。
将HX-23a(108mg,0.099mmol)溶于0.2ml的DMF中，然后加入哌啶(77mg,0.99mmol)，室温搅拌反应1h，在反应液中加入30ml甲基叔丁基醚，离心(5min,10000r/min),去除上清液，减压下去除溶剂，得到固体产物HX-23b(43mg，产率50％)，不经纯化直接用于下一步反应；LCMS:(M+1)+865.29(理论值：864.31)。
在10ml的单口瓶中,依次加入DCM(2mL),HX-23b(43mg,0.049mmol),HX-3b(15mg,0.049mmol)和DIC(6.27mg,0.049mmol),室温搅拌反应90min，将反应液注射入25g C18预柱(先用乙腈平衡，然后用水平衡，水相含0.1％TFA)，然后通过中压反相C18色谱法(梯度：5％至40％乙腈在水中，时间30min)洗脱，冻干，得到黄色固体产物HX-23(21mg，产率37.5％)；LCMS:(M+1)+1144.28(理论值：1143.32)。
取HS627抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物HX-23(0.92mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM L-组氨酸醋酸盐缓冲液，pH6.0，120mM蔗糖，0.2g/L聚山梨酯20，得到抗体偶联药物ADC 15(3.2mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝6.2。
实施例16：7-[N-(IP140B-Ac-PEG2-Gly-Gly-Phe-Gly-ha-Ac),N-(2‘,2’,2’-三氟乙基)]胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(16)
取IP140B抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物HX-23(0.92mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM组氨酸溶液，250mM山梨醇，0.02％吐温80，pH5.7，得到抗体偶联药物ADC 16(3.3mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝6.5。
实施例17：7-[N-(HS627-Ac-PEG2-Gly-Val-Ala-Gly-m),N-(2’,2’,2’-三氟乙基)]胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(17)
取HX-22e(70mg,0.11mmol)，加入2mL DMF，HATU(41.8mg,0.11mmol)，DIPEA(14.19mg.0.11mmol)和Fmoc-Gly-Val-Ala-OH(51.37mg,0.11mmol),室温反应6h，加入200mL DCM稀释，饱和氯化钠溶液洗涤,无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析纯化得黄色固体产物HX-25a(100.1mg,产率87％)；LCMS:(M+1)+1053.06(理论值：1052.39)。
将HX-25a(100.1mg,0.095mmol)溶于0.2ml的DMF中，加入哌啶(74mg,0.95mmol)，室温搅拌反应1h，加入30ml甲基叔丁基醚，离心(5min,10000r/min),去除上清液，减压下去除溶剂，得到固体产物HX-24b(49mg，产率62％)直接用于下一步反应；LCMS:(M+1)+831.27(理论值：830.32)。
在10ml的单口瓶中,依次加入DCM(2mL),HX-24b(49mg,0.059mmol),HX-3b(17.6mg,0.059mmol)和DIC(7.43mg,0.059mmol),室温搅拌反应90min，将反应液注射入25gC18预柱(先用乙腈平衡，然后用水平衡，水相含0.1％TFA)，然后通过中压反相C18色谱法(梯度：5％至40％乙腈在水中，时间30min)洗脱，冻干，得到黄色固体产物HX-24(15mg，产率22％)；LCMS:(M+1)+1110.28(理论值：1109.33)。
取HS627抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物HX-24(0.89mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM L-组氨酸醋酸盐缓冲液，pH6.0，120mM蔗糖，0.2g/L聚山梨酯20，得到抗体偶联药物ADC 17(3.1mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝6.3。
实施例18：7-[N-(IP140B-Ac-PEG2-Gly-Val-Ala-Gly-m),N-(2’,2’,2’-三氟乙基)]胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(18)
取IP140B抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物HX-24(0.89mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM组氨酸溶液，250mM山梨醇，0.02％吐温80，pH5.7，得到抗体偶联药物ADC 18(3.3mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝6.6。
实施例19：7-[N-(HS627-Ac-PEG2-Gly-Val-Ala-Gly-ha-Ac),N-(2’,2’,2’-三氟乙基)]胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(19)
取HX-22e(50mg,0.096mmol)，加入2mL DMF，HATU(36.7mg,0.096mmol)，DIPEA(25mg.0.193mmol)和HX-17b(118mg,0.096mmol),室温反应15h，加入200mL DCM稀释，饱和氯化钠溶液洗涤,无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析纯化得黄色固体HX-25a(92mg,产率85％)；LCMS:(M+1)+1111.10(理论值：1110.39)。
将HX-25a(92mg,0.082mmol)溶于0.2ml的DMF中，然后加入哌啶(64mg,0.82mmol)，室温搅拌反应1h，加入30ml甲基叔丁基醚，离心(5min,10000r/min)，去除上清液，减压下去除溶剂，得到固体产物HX-25b(52mg，产率71％)直接用于下一步反应；LCMS:(M+1)+889.72(理论值：888.86)。
在10ml的单口瓶中,依次加入DCM(2mL),HX-25b(52mg,0.058mmol),HX-3b(17.74mg,0.058mmol)和DIC(7.4mg,0.058mmol),室温搅拌反应90min，将反应液注射入25gC18预柱(先用乙腈平衡，然后用水平衡，水相含0.1％TFA)，然后通过中压反相C18色谱法(梯度：5％至40％乙腈在水中，时间30min)洗脱，冻干，得到黄色固体产物HX-25(15mg，产率22％)；LCMS:(M+1)+1168.27(理论值：1167.34)。
取HS627抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物HX-25(0.93mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM L-组氨酸醋酸盐缓冲液，pH6.0，120mM蔗糖，0.2g/L聚山梨酯20，得到抗体偶联药物ADC 19(3.0mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.3。
实施例20：7-[N-(IP140B-Ac-PEG2-Gly-Val-Ala-Gly-ha-Ac),N-(2’,2’,2’-三氟乙基)]胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(20)
取IP140B抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物HX-25(0.93mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM组氨酸溶液，250mM山梨醇，0.02％吐温80，pH5.7，得到抗体偶联药物ADC 20(3.3mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.5。
实施例21：20-O-(HS627-Ac-PEG2-Gly-Val-Ala-Gly-NHNHC)-7-N-(2’,2’,2’-三氟乙基)胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(21)
在50ml单口瓶中，加入HX-22e(200mg,0.386mmol)和3mL二氯甲烷,然后依次加入Boc酸酐(92.8mg,0.425mmol)和TEA(86.1mg,0.851mmol),室温搅拌反应6h，减压下去除溶剂，硅胶柱层析纯化得浅黄色固体产物HX-28a(213.2mg,产率89.3％)；LCMS:(M+1)+618.20(理论值：617.58)。
在50ml单口瓶中，依次加入HX-28a(100mg,0.162mmol)，DMAP(98.9mg,0.81mmol)和2mL二氯甲烷，0℃搅拌反应5分钟，加入2mL二氯甲烷和三光气(38.6mg,0.131mmol)，室温反应2h，得到HX-28b黄色澄清溶液，加入HX-26c(82.3mg,0.324mmol)室温搅拌反应3h,胶柱层析纯化得浅黄色固体产物HX-28d(123.5mg,产率85.3％)；LCMS:(M+1)+898.29(理论值：897.27)。
在10ml的单口瓶中，加入HX-28d(100mg,0.11mmol)，用1ml的DMF溶解，然后加入哌啶(94.8mg,1.1mmol)，室温下反应0.5h，将反应液滴加入20ml甲基叔丁基醚中，离心，去除上清液，干燥后得到HX-28e(65.5mg,产率87％)；LCMS:(M+1)+676.22(理论值：675.22)。
取HX-28e(50mg,0.074mmol)，加入2mL DMF，HATU(33.8mg,0.089mmol)，DIPEA(11.5mg.0.089mmol)和Fmoc-Gly-Val-Ala-Gly-OH(38.8mg,0.074mmol),室温反应2h，加入200mL DCM稀释，饱和氯化钠溶液洗涤,无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析纯化得黄色固体HX-28f(51.3mg,产率58.7％)；LCMS:(M+1)+1181.19(理论值：1180.44)。
在10ml的单口瓶中，加入HX-28f(40mg,0.034mmol)，用1ml的DMF溶解，然后加入哌啶(28.7mg,0.34mmol)，室温下反应0.5h，加入20ml甲基叔丁基醚，离心，去除上清液，干燥后得到HX-28g(25.8mg,产率79.5％)；LCMS:(M+1)+958.37(理论值：959.37)。
在10ml的单口瓶中,依次加入DCM(1mL),HX-28g(20.2mg,0.021mmol),HX-3b(7.6mg,0.026mmol)和DIC(3.2mg,0.026mmol),室温搅拌反应30min，得到HX-28h黄色澄清溶液，加入100微升三氟乙酸，室温搅拌反应30min，将反应液注射入25g C18预柱(先用乙腈平衡，然后用水平衡，水相含0.1％TFA)，然后通过中压反相C18色谱法(梯度：5％至40％乙腈在水中，时间30min)洗脱，冻干，得到黄色固体产物HX-28(4.1mg，产率17％)；LCMS:(M+1)+1138.95(理论值：1137.33)。
取HS627抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物HX-28(0.91mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM L-组氨酸醋酸盐缓冲液，pH6.0，120mM蔗糖，0.2g/L聚山梨酯20，得到抗体偶联药物ADC 21(3.2mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.1。
实施例22：20-O-(IP140B-Ac-PEG2-Gly-Val-Ala-Gly-NHNHC)-7-N-(2’,2’,2’-三氟乙基)胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(22)
取IP140B抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物HX-28(0.91mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM组氨酸溶液，250mM山梨醇，0.02％吐温80，pH5.7，得到抗体偶联药物ADC 22(3.1mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.0。
实施例23：20-O-(HS627-Ac-PEG4-daP-NHNHC)-7-N-(2’,2’,2’-三氟乙基)胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(23)
在HX-28b黄色澄清溶液直接加入HX-27a(113.8mg,0.274mmol)室温搅拌反应3h,胶柱层析纯化得浅黄色固体HX-29a(125.6mg,产率86.7％)LCMS:(M+1)+1060.05(理论值：1059.36)。
在10ml的单口瓶中，加入HX-27b(125.6mg,0.118mmol)，用1ml的DMF溶解，然后加入哌啶(100.9mg,1.18mmol)，室温下反应0.5h，加入20ml甲基叔丁基醚中，离心，去除上清液，干燥后得到HX-29b(93.5mg,94.2％)；LCMS:(M+1)+838.30(理论值：837.29)。
在10ml的单口瓶中,依次加入DCM(2mL),HX-29b(70mg,0.084mmol),HX-4a(37.3mg,0.1mmol)和DIC(12.6mg,0.1mmol),室温搅拌反应30min，得到黄色澄清溶液HX-29c，再加入200微升三氟乙酸，室温搅拌反应30min，将反应液注射入25g C18预柱(先用乙腈平衡，然后用水平衡，水相含0.1％TFA)，然后通过中压反相C18色谱法(梯度：5％至40％乙腈在水中，时间30min)洗脱，冻干，得到黄色固体产物HX-29(20.2mg，产率22.1％)；LCMS:(M+1)+1092.29(理论值：1091.89)。
取HS627抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物HX-29(0.87mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM L-组氨酸醋酸盐缓冲液，pH6.0，120mM蔗糖，0.2g/L聚山梨酯20，得到抗体偶联药物ADC 23(3.3mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.3。
实施例24：20-O-(IP140B-Ac-PEG4-daP-NHNHC)-7-N-(2’,2’,2’-三氟乙基)胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(24)
取IP140B抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物HX-29(0.87mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM组氨酸溶液，250mM山梨醇，0.02％吐温80，pH5.7，得到抗体偶联药物ADC 24(3.2mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.5。
实施例25：7-[N-(HS627-Qx-PEG2-Gly-Lys-PABC),N-(2’,2’-二氟乙基)]胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(25)
取N-(2’,2’-二氟乙基)胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(0.05g,0.1mmol)，1mlNMP,DIPEA(25.9mg,0.2mmol),Fmoc-GK-PAB-PNP(93.9mg,0.1mmol),HOBt(20.3mg,0.15mmol),室温搅拌反应4h，得到HX-36a反应液直接投入至下一步；LCMS:(M+1)+1298.41(理论值：1297.50)。
在10ml反应瓶中，依次加入HX-36a(130mg,0.1mmol)，哌啶(85.3mg,1mmol)，室温搅拌反应1h，加入30ml甲基叔丁基醚，离心，去除上清液，减压下去除溶剂，得到固体产物HX-36b(78.2mg，产率72.6％)直接用于下一步反应；LCMS:(M+1)+LCMS:(M+1)+1076.39(理论值：1075.43)。
在10ml的单口瓶中,依次加入DCM(2mL),HX-36b(78.2mg,0.073mmol),2-溴甲基-3-氧-二氢喹喔啉-6-甲酰-3,6-氧杂辛酸(38.6mg,0.087mmol)和DIC(11mg,0.087mmol),室温搅拌反应90min，加入0.1ml的TFA，继续反应30min,将反应液注射入25g C18预柱(先用乙腈平衡，然后用水平衡，水相含0.1％TFA)，然后通过中压反相C18色谱法(梯度：5％至40％乙腈在水中，时间30min)洗脱，冻干，得到黄色固体产物HX-36(46.3mg，产率50.5％)；LCMS:(M+1)+1258.10(理论值：1256.33)。
取HS627抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物HX-36(1mg，0.8mmol)溶于0.1ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM L-组氨酸醋酸盐缓冲液，pH6.0，120mM蔗糖，0.2g/L聚山梨酯20，得到抗体偶联药物ADC 25(3.2mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝6.3。
实施例26：7-[N-(IP140B-Qx-PEG2-Gly-Lys-PABC),N-(2’,2’-二氟乙基)]胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(26)
取IP140B抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物HX-36(1mg，0.8mmol)溶于0.1ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM组氨酸溶液，250mM山梨醇，0.02％吐温80，pH5.7，得到抗体偶联药物ADC 26(3.2mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝6.6。
测试例1：ADC体外抑制肿瘤细胞生长活性
ADC体外抑制活性测试方法：将作为活性检测的人食管癌细胞OE-33、人肺癌细胞NCI-H1975和人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞分别在含有10％胎牛血清(Cellmax)的RPMI1640(Cellmax)、RPMI1640(Cellmax)和DMEM(Cellmax)培养基中培养至指数增长期，胰酶消化后，离心弃上清，用培养基稀释至分别稀释至3×104cells/mL、0.5×104cells/mL和1.5×104cells/mL，以每孔100μL加入到96孔细胞培养板中，放回37℃，5％ CO2的培养箱中过夜培养。第二天，使用培养基将待测ADC稀释至2000nM、400nM、80nM、16nM、3.2nM、0.64nM、0.128nM、0.026nM，并以每孔100μL将稀释后的ADC加入到96孔细胞培养板中，每个浓度设置3个复孔，未添加ADC的阴性对照和空白对照组每孔加入100μL的培养基。加样完成后，放回37℃，5％ CO2的培养箱中继续孵育6天。孵育完成后，取出细胞培养板，用移液器将培养板中的培养基吸弃，每孔加入100μL含有10％ CCK-8的培养基，37℃孵育3h。孵育完成后，取出培养板，避光，置于酶标板中，选择630nm为参比波长，450nm为测定波长测定吸光度。根据吸光值，使用GraphPad中四参数回归计算IC50(表2)。以Dxd的相应ADC药物为阳性对照药物，其具有以下结构：
其中，Ab为IP140B抗体。
表1：ADC药物对NCI-H1975、MDA-MB-231和OE-33细胞的抑制活性IC50(nM)
对于IC50值，其中“++++”表示IC50<50nM；“+++”表示IC50介于50nM-100nM之间；“++”表示IC50介于100-250nM之间；“+”表示IC50>250nM。
本发明的实施例ADC化合物，对NCI-H1975、MDA-MB-231和OE-33细胞均具有较好的抑制活性，其对该些细胞的抑制活性IC50均低于250nM，部分ADC化合物例如ADC2、14、16、18对该些癌细胞的抑制活性IC50甚至均低于50nM。
测试例2：ADC体内抑制肿瘤生长活性
ADC体外抑制活性测试方法：人肺癌细胞NCI-H292、人非小细胞肺癌细胞Calu-6、人肺癌细胞NCI-H1975、人食管鳞癌细胞KYSE-150、人卵巢癌细胞ES-2和人乳腺癌细胞MDA-MB-231于体外单层培养，细胞饱和度为80％-90％时，用胰酶-EDTA消化，离心弃上清，PBS重悬细胞，将细胞悬液调整至合适浓度，将NCI-H292、Calu-6、NCI-H1975、KYSE-150和MDA-MB-231细胞(2-10×106cells/0.1ml)皮下接种于BALB/c裸小鼠ES-2细胞皮下接种于NOD-SCID小鼠，定期观察动物及移植瘤生长情况，待瘤体积长到100-200mm3左右，根据瘤体积和体重进行随机分组，即溶媒对照组(生理盐水)和ADC给药组(溶于生理盐水)，每组6只动物。静脉注射给药，给药频率为Q4D，共给药2次(第一次给药的时间记为Day 1、Day 5第二次给药)。每周2次用游标卡尺测量肿瘤长径a(mm)、短径b(mm)和小鼠体重，根据以下公式计算肿瘤体积(tumor volume,V)：V＝1/2×a×b2(mm3)，其中a和b分别表示肿瘤长和宽，并绘制生长曲线，最后剥取肿瘤并称重。统计分析基于试验结束时肿瘤体积和荷瘤鼠体重的数据运用GraphPad Prism软件进行分析得到抑瘤结果。图中对照组“\”表示该组无结果，未测肿瘤状况，实验组无对应肿瘤、“肿瘤缩小为0”“肿瘤消失为0”表示在相应解剖动物体内没有发现肿瘤残留。
表2：小鼠分组及给药设置
/>

Claims (10)

1.式(I)所示的抗体-药物偶联物，
式中，
R1选自卤素取代的甲基；
Ra选自氢和-L1-NH-Lp-Z-Ab，
Rb选自氢、-L2-NH-Lp-Z-Ab和-L3-NH-Z-Ab，条件是，Ra、Rb不同时为氢；
其中，
L1选自-C(＝O)-L11-L12-L13-和-CH2-NR2-L14-CHR3-；
L11、L12、L13各自独立地选自-O-、C1-C3亚烷基和苯基；
R2选自氢、氘、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、酰基、磺酰基；
L14选自-C(＝O)-和C1-C3亚烷基；
R3选自氢、氘、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基和苯基取代的C1-C6烷基；
L2选自-C(＝O)-NH-L21-CHR4-；
L21选自-C(＝O)-和-NH-C(＝O)-；
R4选自氢、氘、C1-C6烷基和苯基取代的C1-C6烷基；
L3选自-C(＝O)-NR5-NR6-L31-L32-；
R5、R6各自独立地选自氢、氘和C1-C6烷基；
L31选自-C(＝O)、-(C1-C3亚烷基)-C(＝O)、-5-8元芳环基-C(＝O)-、-5-8元氮杂芳环基-C(＝O)-和-O-(C1-C3亚烷基)-C(＝O)-；
L32选自-NH-(C1-C3亚烷基)、-N(CH3)2-(C1-C3亚烷基)和-NH-(C1-C3亚烷基)-NH-；
LP为由2-7个氨基酸构成的肽残基；
Z选自-Lz-Lj-，其中，Lz选自-C(＝O)-C1-C8亚烷基、-C(＝O)-CH2O-(CH2CH2O)2-5-CH2CH2NH-或-C(＝O)-(CH2CH2O)2-6-CH2CH2NH-，Lj为可偶联抗体的接头；
n选自1-3的整数；
Ab为抗体。
2.根据权利要求1所述的抗体-药物偶联物，其中，R1选自氟、氯或溴取代的甲基；
优选地，R1选自氟取代的甲基；
优选地，R1选自一氟甲基、二氟甲基和三氟甲基；
优选地，R1选自二氟甲基和三氟甲基；
优选地，n为1。
3.根据权利要求1或2所述的抗体-药物偶联物，其中，L11、L12、L13各自独立地选自-O-、亚甲基和苯基；
优选地，L11-L12-L13选自-O-CH2-苯基-和-CH2-O-CH2-；优选地，R2选自氢、氘、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、-C(＝O)C1-C6烷基或-S(＝O)2C1-C6烷基；
优选地，R2选自氢、氘、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基、-C(＝O)C1-C3烷基和-S(＝O)2C1-C3烷基；
优选地，R2选自氢、氘、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、甲酰基、乙酰基、甲磺酰基和乙磺酰基；
优选地，R2选自氢、甲基、甲氧基、甲酰基和甲磺酰基；
优选地，R2为氢；
优选地，L14选自-C(＝O)-和C1-C3亚烷基；
优选地，L14选自-C(＝O)-和亚甲基；
优选地，R3选自氢、氘、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基和苯基取代的C1-C6烷基；
优选地，R3选自氢、C1-C6烷基和苯基取代的C1-C6烷基；
优选地，R3选自氢、C1-C4烷基和苯基取代的C1-C3烷基；
优选地，R3选自氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、苯基甲基和苯基乙基；
优选地，R3选自氢、甲基、异丙基、异丁基和苯基甲基；
优选地，R3为氢；
优选地，L1选自-C(＝O)-O-CH2-苯基-、-C(＝O)-CH2-O-CH2-、-CH2-NH-C(＝O)-CH2-和-CH2-NH-CH2-CH2-；
优选地，L1选自-C(＝O)-O-CH2-苯基-、-C(＝O)-CH2-O-CH2-和-CH2-NH-C(＝O)-CH2-；
优选地，L1选自-C(＝O)-O-CH2-苯基-和-C(＝O)-CH2-O-CH2-。
4.根据权利要求1-3任一项所述的抗体-药物偶联物，其中，R4选自氢、氘、C1-C6烷基和苯基取代的C1-C6烷基；
优选地，R4选自氢、氘、C1-C3烷基和苯基取代的C1-C3烷基；
优选地，R4选自氢、氘、甲基、异丙基、异丁基和苯基甲基；
优选地，R4选为氢；
优选地，L2选自-C(＝O)-NH-C(＝O)-CH2-和-CH2-NH-NH-C(＝O)-CH2-；
优选地，L2为-CH2-NH-NH-C(＝O)-CH2-；
优选地，R5、R6各自独立地选自氢、氘和C1-C3烷基；
优选地，R5、R6各自独立地选自氢、氘和甲基；
优选地，R5为氢，R6为氢；
优选地，L31选自-C(＝O)、-亚甲基-C(＝O)、-苯基-C(＝O)-、-吡啶基-C(＝O)-和-O-CH2-C(＝O)-；
优选地，L32选自-NH-CH2-CH2-、-N(CH3)2-CH2-CH2-和-NH-CH2-NH-；
优选地，L3为-C(＝O)-NH-NH-苯基-C(＝O)-NH-CH2-CH2-。
5.根据权利要求1-4任一项所述的抗体-药物偶联物，其中，所述氨基酸选自苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、缬氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、瓜氨酸(Cit)和天冬氨酸(Asn)；
优选地，Lp选自由2-5个选自氨基酸选自苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、缬氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、瓜氨酸(Cit)和天冬氨酸(Asn)的氨基酸构成的肽残基；
优选地，Lp选自由2-5个选自苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、缬氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)和赖氨酸(Lys)的氨基酸构成的肽残基；
优选地，Lp选自-Val-Cit-、-Val-Ala-、-Gly-Val-Ala-、-Gly-Val-Ala-Gly-、-Gly-Lys-、-Gly-Gly-Lys-、-Gly-Gly-Lys-Gly-、-Val-Ala-、-Ala-Ala-Asn-、-Gly-Leu-、-Gly-Gly-Leu-、-Gly-Gly-Leu-Gly-、-Gly-Phe-、-Gly-Gly-Phe-和-Gly-Gly-Phe-Gly-；
优选地，Lp选自 其羰基端连接-NH-，另一端连接Z；
优选地，Lj选自 所示位置表示与抗体相连，/>所示位置表示与Lz基团相连；
优选地，Lz选自-C(＝O)-C1-C8亚烷基、-C(＝O)-CH2O-(CH2CH2O)2-5-CH2CH2NH-和-C(＝O)-(CH2CH2O)2-6-CH2CH2NH-；
优选地，Lz选自-C(＝O)-C1-C6亚烷基、-C(＝O)-CH2O-(CH2CH2O)2-3-CH2CH2NH-和-C(＝O)-(CH2CH2O)2-4-CH2CH2NH-；
优选地，Lz选自-C(＝O)-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-、-C(＝O)-CH2O-CH2CH2O-CH2CH2NH-和-C(＝O)-CH2O-(CH2CH2O)3-CH2CH2NH；
优选地，Z选自
所示位置表示与抗体相连；/>所示位置表示与Lp基团或L3基团相连。
6.根据权利要求1-5任一项所述的抗体-药物偶联物，其中，所述抗体为肿瘤相关抗原抗体；
优选地，所述肿瘤相关抗原抗体选自抗Her2抗体、抗Trop2抗体、抗B7H3抗体、抗5T4、抗Nectin-4抗体、抗CD20抗体和抗ROR1抗体。
7.根据权利要求1-6任一项所述的抗体-药物偶联物，式(I)所示的抗体-药物偶联物具有如式(I-1)、式(I-2)、式(I-3)、式(I-4)、式(I-5)或式(I-6)所示的结构，
式(I-1)、式(I-2)、式(I-3)、式(I-4)中，R1、R2、n、Lp、Z、Ab出现时，各自定义同式(I)化合物；
式(I-5)中，R1、R5、R6、n、Ab各自定义同式(I)化合物；
Z选自-Lz-Lj-，其中，Lj选自 所示位置表示与抗体相连，/>所示位置表示与LZ基团相连；
优选地，Lz选自-C(＝O)-CH2O-(CH2CH2O)1-5-CH2CH2NH-；
优选地，Lz选自-C(＝O)-CH2O-(CH2CH2O)3-5-CH2CH2NH-；
优选地，Lz选自-C(＝O)-CH2O-(CH2CH2O)3-CH2CH2NH-；
优选地，Z选自 所示位置表示与抗体相连；/>所示位置表示与Lp基团或L3基团相连；/>
式(I-6)中，R1、R5、R6、n、Lp、Z、Ab各自定义同式(I)化合物。
8.以下抗体-药物偶联物：
其中，Ab定义同式(I)化合物；
优选地，Ab为HS627抗体或IP140B抗体，所述HS627的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述IP140B抗体的重链氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示，其轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
9.药物组合物，其包括权利要求1-8任一项所述的抗体-药物偶联物与药学上可接受的载体。
10.权利要求1-8任一项所述的抗体-药物偶联物或权利要求9所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的用途；优选地，所述肿瘤选自实体瘤，更优选自食管癌、肺癌、非小细胞肺癌、食管鳞癌、卵巢癌、肺癌或乳腺癌。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2024051502A1 (zh) * 2022-09-09 2024-03-14 杭州爱科瑞思生物医药有限公司 喜树碱-7-乙基胺衍生物及其制备方法和应用

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