BR112019008335A2 - conjugado de um anticorpo, composição farmacêutica e método para o tratamento e/ou a prevenção de um câncer - Google Patents

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Abstract

a presente invenção se refere a um conjugado de um anticorpo ou um seu fragmento ligado a um ativador imune, em que o anticorpo ou o seu fragmento possui a reatividade imunológica com uma proteína caprin-1 e a uma composição farmacêutica que compreende o conjugado como um ingrediente ativo para o tratamento e/ou a prevenção de um câncer que é superior na atividade antitumoral aos anticorpos convencionais ou aos conjugados de um anticorpo e um ativador imune.

Description

“CONJUGADO DE UM ANTICORPO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E MÉTODO PARA O TRATAMENTO E/OU A PREVENÇÃO DE UM CÂNCER” Campo da Invenção [001]A presente invenção se refere a um conjugado de um anticorpo contra uma proteína CAPRIN-1 e um ativador imune, e à sua utilização médica como agente terapêutico e/ou preventivo para um câncer, e similares.
Antecedentes da Invenção [002]Diversas drogas de anticorpo direcionadas às proteínas antigênicas específicas em células de câncer são aplicadas como drogas terapêuticas para os cânceres com menos reações adversas ao tratamento de câncer devido à sua especificidade para o câncer. Por exemplo, a ativação citoplasmática e a proteína 1 associada à proliferação (CAPRIN-1) são expressas na superfície da membrana de células de uma grande quantidade de cânceres sólidos, e se acredita que os anticorpos contra esta proteína CAPRIN1 sejam promissores em utilização médica para o tratamento e/ou a prevenção de cânceres (Literatura de Patente 1).
[003]Nos últimos anos, foram realizados estudos para intensificar os efeitos farmacológicos das drogas de anticorpos. Especialmente, os conjugados de anticorpo-droga (ADCs) em que um anticorpo é conjugado com uma droga que possui a intensa capacidade de diretamente matar as células que foram ativamente desenvolvidas (Literaturas de Não Patentes 1 e 2). Como exemplos de ADCs, a Kadcyla(R) (emtansina de trastuzumab) que compreende um anticorpo existente de droga trastuzumab ligado a uma droga de emtansina (DM1), que exibe uma atividade de matar as células, e a Adcetris(R) (vedotina de brentuximab) que compreende um anticorpo monoclonal anti-CD30 ligado à auristatina de monometila E (MMAE) são utilizados no tratamento de alguns tipos de câncer. Foi descoberto que estes ADCs prolongam as taxas de sobrevivência em comparação com os métodos de tratamento convencionais e são úteis em
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2/117 relação aos métodos existentes para o tratamento de cânceres (Literaturas de Não Patentes 3 e 4).
[004]Em outros casos, também foram realizados estudos em uma tentativa para intensificar os efeitos farmacológicos através da conjugação de ativadores imunes às drogas de anticorpos contra os cânceres. Por exemplo, foi descoberto que um conjugado de um anticorpo existente de trastuzumab ou cetuximab com o resiquimod, um dos ativadores imunes ou conjugados de um anticorpo droga de rituximab contra CD20 como um antígeno alvo com diversos ativadores imunes possui um efeito de intensificar o efeito farmacológico do anticorpo em modelos de animais (Literaturas de Patentes 2 e 3).
[005]Conforme descrito acima, foram realizadas tentativas para intensificar os efeitos farmacológicos de drogas de anticorpos contra os cânceres, através da conjugação de diversos fatores para diversos anticorpos. No entanto, os efeitos antitumorais fortes o suficiente para regredir completamente diversos tipos de câncer ainda não foram obtidos. Além disso, os efeitos da prevenção do câncer da recorrência ou metástase, e similares, não foram encontrados.
Literatura de Patente
- Literatura de Patente 1: WO 2010/016526
- Literatura de Patente 2: WO 2014/012479
- Literatura de Patente 3: Patente US 8.951.528
Literatura de Não Patente
- Literatura de não Patente 1: Lancet Onco/2016; 17: e254-62
- Literatura de não Patente 2: Pharm Fies. 2015 nov; 32 (11): 3.52640
- Literatura de não Patente 3: New England Journal of Medicine 367; 19 (8), 2012, p. 1783 - 1791
- Literatura de não Patente 4: MAbs 2012; 4 (4): 458-65
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3/117
Descrição Resumida da Invenção [006]Um objeto da presente invenção é fornecer uma solução para intensificar o efeito antitumoral de um anticorpo ou um seu fragmento contra uma proteína CAPRIN-1 expressa na superfície da membrana de células de células de câncer.
[007]O presente Depositante conduziu estudos diligentes e consequentemente completou a presente invenção ao descobrir que: um conjugado de um anticorpo ou um seu fragmento contra uma proteína CAPRIN1 e um ativador imune exerce um efeito antitumoral muito mais intenso do que aquele do anticorpo contra a proteína CAPRIN-1 ou o seu fragmento utilizado isoladamente; e o efeito de intensificar o efeito antitumoral através da conjugação do anticorpo contra a proteína CAPRIN-1 ou o seu fragmento ao ativador imune é muito superior ao efeito de intensificar o efeito antitumoral através da conjugação de uma droga de anticorpo existente para um câncer ao ativador imune.
[008]Especificamente, a presente invenção possui as seguintes características de (1) a (14):
(1) Um conjugado de um anticorpo ou um seu fragmento ligado a um ativador imune, em que o anticorpo ou o seu fragmento possui a reatividade imunológica com uma proteína CAPRIN-1 que possui uma sequência de amino ácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs de números pares entre as SEQ ID NOs: de 2 a 30 ou uma sequência de amino ácidos que possui 80% ou superior de identidade de sequência com a sequência de amino ácidos.
(2) O conjugado, de acordo com (1), em que o anticorpo ou seu fragmento possui a reatividade imunológica com um polipeptídeo parcial da proteína CAPRIN-1, em que o polipeptídeo parcial possui uma sequência de amino ácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: de 31 a 35 e de 296 a 299, 308 e 309 ou uma sequência de amino ácidos que possui 80% ou
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4/117 superior de identidade de sequência com a sequência de amino ácidos.
(3) O conjugado, de acordo com (1) ou (2), em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal.
(4) O conjugado, de acordo com qualquer um de (1) a (3), em que o anticorpo ou o seu fragmento é qualquer um dos seguintes de (A) a (M):
(A) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 36, 37 e 38 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 40, 41 e 42 (CDR1, CDR2 e CD3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1, (B) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 44, 45 e 46 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 48, 49 e 50 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1, (C) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 52, 53 e 54 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 56, 57 e 58 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1, (D) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de
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5/117 complementaridade de SEQ ID NOs: 60, 61 e 62 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 64, 65 e 66 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1, (E) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 170, 171 e 172 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 173, 174 e 175 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1, (F) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 176, 177 e 178 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 179, 180 e 181 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1, (G) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 182, 183 e 184 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 185, 186 e 187 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1, (H) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de
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6/117 complementaridade de SEQ ID NOs: 188, 189 e 190 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 191, 192 e 193 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1, (I) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 146, 147 e 148 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 149, 150 e 151 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1, (J) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 272, 273 e 274 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 275, 276 e 277 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1, (K) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 290, 291 e 292 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 293, 294 e 295 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1, (L) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de
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7/117 complementaridade de SEQ ID NOs: 301, 302 e 303 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 305, 306 e 307 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1, (M) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 134, 135 e 136 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 137, 138 e 139 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1, (5) O conjugado, de acordo com qualquer um de (1) a (4), em que o anticorpo ou o seu fragmento é qualquer um dos seguintes de (a) a (ak):
(a) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 39 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 43, (b) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 47 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 51, (c) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 55 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 59, (d) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos
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8/117 de SEQ ID NO: 63 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 67, (e) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 68 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 69, (f) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 70 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 71, (g) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 72 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 73, (h) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 74 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 75, (i) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 76 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 77, (j) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 78 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 79, (k) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos
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9/117 de SEQ ID NO: 80 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 81, (l) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 82 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 83;
(m) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 84 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 85;
(n) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 86 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 87, (o) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 88 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 89, (p) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 90 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 91, (q) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 92 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 93, (r) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos
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10/117 de SEQ ID NO: 94 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 95;
(s) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 96 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 97, (t) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 98 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 99, (u) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 100 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 101, (v) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 102 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 103, (w) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 104 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 105, (x) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 106 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 107;
(y) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos
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11/117 de SEQ ID NO: 108 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 109, (z) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 110 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 111, (aa) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 112 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 113, (ab) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 114 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 115, (ac) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 116 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 117, (ad) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 118 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 119, (ae) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 120 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 121, (af) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos
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12/117 de SEQ ID NO: 122 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 123, (ag) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NOs: 124 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 125, (ah) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 126 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 127, (ai) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NOs: 128 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 129, (ai) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 130 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 131, (aj) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 132 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 133 e (ak) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 300 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 304.
(6) O conjugado, de acordo com qualquer um de (1) a (5), em que o anticorpo é um anticorpo de humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo
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13/117 quimérico ou um anticorpo de cadeia única.
(7) O conjugado, de acordo com qualquer um de (1) a (6), em que o ativador imune um ligante ou um agonista que se une ao receptor do tipo Toll (TLR), receptor do tipo NOD (NLR), receptor do tipo RIG, ou receptor de lectina do tipo C (CLR).
(8) O conjugado, de acordo com (7), em que o receptor do tipo Toll (TLR) é OTLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, TLR9 ou TLR10.
(9) O conjugado, de acordo com (7) ou (8), em que o ligante ou o agonista que se une ao receptor do tipo Toll (TLR), ou um seu derivado, é qualquer um dos seguintes de (i) a (vii):
(i) um ligante ou agonista que se une ao TLR2 selecionado a partir do grupo que consiste em pepeptideoglicano, lipoproteína, lipopolissacarídeo e zimosan, (ii) um ligante ou agonista que se une ao TLR3 selecionado a partir do grupo que consiste em poli(l:C) e poli(A:U), (iii) um ligante ou agonista que se une ao TLR4 selecionado a partir do grupo que consiste em lipopolissacarídeo (LPS), HSP60, RS09 e MPLA, (iv) um ligante ou agonista que se une ao TLR5 selecionado a partir do grupo que consiste em flagelina e FLA, (v) um ligante ou agonista que se une ao TLR7 ou TLR8 selecionado a partir do grupo que consiste em um composto de imidazoquinolina e RNA de cadeia simples, (vi) um ligante ou agonista que se une ao TLR9 selecionado a partir do grupo que consiste em DNA bacteriano, DNA de CpG não metilado, hemozoína, ODN1585, ODN1668, ODN1668 e ODN1826, e (vii) um ligante ou agonista que se une ao TLR10 selecionado a partir do grupo que consiste em profilina e uma bactéria uropatogênica.
(10) O conjugado, de acordo com qualquer um de (1) a (9), em que
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14/117 o anticorpo ou o seu fragmento está ligado ao ativador imune por meio de um ligante.
(11) Uma composição farmacêutica para o tratamento e/ou a prevenção de um câncer, que compreende o conjugado, de acordo com qualquer um de (1) a (10), como um ingrediente ativo.
(12) A composição farmacêutica, de acordo com (11), em que o câncer é um câncer que expressa a proteína CAPRIN-1 na superfície da membrana de células.
(13) A composição farmacêutica, de acordo com (11) ou (12), em que o câncer é um câncer selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de mama, câncer de rim, câncer de pâncreas, câncer de colo e reto, câncer de pulmão, tumor de cérebro, câncer de estômago, câncer de útero, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de bexiga, câncer de esôfago, leucemia, linfoma, câncer de fígado, câncer de vesícula biliar, sarcoma, mastocitoma, melanoma, câncer de córtex adrenal, tumor de Ewing, linfoma de Hodgkin, mesotelioma, mieloma múltiplo, câncer de testículo, câncer de tireoide e câncer de cabeça e pescoço.
(14) Um método para o tratamento e/ou a prevenção de um câncer, que compreende a administração do conjugado, de acordo com qualquer de (1) a (10) ou da composição farmacêutica, de acordo com qualquer um de (11) a (13) a um indivíduo.
[009]0 conjugado, de acordo com a presente invenção, não exerce apenas um efeito antitumoral muito mais intenso do que aquele de um anticorpo contra uma proteína CAPRIN-1 utilizado isoladamente, mas é superior no efeito antitumoral para um conjugado conhecido de uma droga de anticorpo para um câncer e um ativador imune. Além disso, o efeito de intensificar o efeito antitumoral através do conjugado, de acordo com a presente invenção, é superior ao efeito de intensificar o efeito antitumoral através da conjugação de
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15/117 uma droga de anticorpo existente para um câncer com o ativador imune. Por conseguinte, o conjugado, de acordo com a presente invenção, é eficaz para o tratamento ou prevenção de um câncer.
Descrição das Realizações [010]O conjugado de um anticorpo ou um seu fragmento contra uma proteína CAPRIN-1 (daqui em diante referido como um anticorpo antiCAPRIN-1) e um ativador imune utilizado na presente invenção pode ser avaliado quanto à sua atividade antitumoral, conforme mencionado posteriormente, através do exame in vivo da inibição do crescimento do tumor em um animal portador de câncer.
[011]Na presente invenção, o termo conjugado se refere a um anticorpo ligado a um ativador imune por meio de uma união covalente. A ligação entre o anticorpo e o ativador imune pode ser realizada através de um ligante.
[012]O anticorpo anti-CAPRIN-1 que é um constituinte do conjugado, de acordo com a presente invenção, pode ser um anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal e, de preferência, é um anticorpo monoclonal. O anticorpo anti-CAPRIN-1 pode ser qualquer tipo de anticorpo desde que o conjugado da presente invenção possa exercer a atividade antitumoral. O anticorpo é um anticorpo recombinante, um anticorpo de humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico ou um anticorpo de animal não humano.
[013]O ativador imune que é um constituinte do conjugado, de acordo com a presente invenção, pode ser qualquer fator de ativador imune e, de preferência, é um ligante ou um agonista, ou um seu derivado, que se une ao receptor do tipo Toll (TLR), receptor do tipo NOD (NLR), receptor tipo RIG ou receptor de lectina do tipo C (CLR), de maior preferência, um ligante ou um agonista, ou um seu derivado, que se une ao receptor do tipo Toll (TLR).
[014]O indivíduo a ser tratado e/ou prevenido para o câncer de
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16/117 acordo com a presente invenção, é um mamífero tal como um ser humano, um animal de estimação, gado ou um animal de esporte, e um indivíduo de preferência, é um ser humano.
[015]Daqui em diante, o anticorpo anti-CAPRIN-1, o ativador imune, o conjugado do anticorpo anti-CAPRIN-1 e o ativador imune, a composição farmacêutica que compreende o conjugado e o método para o tratamento e/ou a prevenção de um câncer utilizando o conjugado, de acordo com a presente invenção, serão descritos.
<Anticorpo anti-CAPRIN-1 >
[016]Entre as proteínas CAPRIN-1 que possuem uma sequência de amino ácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs de números pares entre as SEQ ID NOs: de 2 a 30 e que possuem a reatividade imunológica com o anticorpo anti-CAPRIN-1 utilizado na presente invenção, as sequências de amino ácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 6, 8, 10, 12 e 14 são as sequências de amino ácidos das proteínas CAPRIN-1 de cães; a sequência de amino ácidos representada pelas SEQ ID NOs: 2 e 4 são as sequências de amino ácidos das proteínas CAPRIN-1 de humanos; a sequência de amino ácidos representada por SEQ ID NO: 16 é a sequência de amino ácidos de uma proteína CAPRIN-1 de bovinos; a sequência de amino ácidos representada pela SEQ ID NO: 18 é a sequência de amino ácidos de uma proteína CAPRIN-1 de equinos; as sequências de amino ácidos representadas pelas SEQ ID NOs: de 20 a 28 são as sequências de amino ácidos das proteínas de CAPRIN-1 de camundongos; e a sequência de amino ácidos representada pela SEQ ID NO: 30 é a sequência de amino ácidos de uma proteína CAPRIN-1 de galinhas.
[017]Q anticorpo anti-CAPRIN-1 utilizado na presente invenção pode possuir a reatividade imunológica com uma variante da proteína CAPRIN1 que possui 80% ou superior, de preferência, 90% ou superior, de maior preferência, 95% ou superior, de maior preferência ainda, 99% ou superior de
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17/117 identidade de sequência para a sequência de amino ácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs de números pares entre SEQ ID NOs: de 2 a 30. Neste contexto, o termo porcentagem (%) de identidade de sequência significa uma porcentagem (%) do número de amino ácidos idênticos (ou bases) para o número total de amino ácidos (ou bases) quando duas sequências estão alinhadas, de maneira que o grau máximo de similaridade possa ser alcançado com ou sem introdução de uma lacuna.
[018]Na presente invenção, o anticorpo anti-CAPRIN-1 que é utilizado para a preparação do conjugado significa um anticorpo ou um seu fragmento que possui a reatividade imunológica com uma proteína CAPRIN-1 no seu comprimento completo ou um seu fragmento. Neste contexto, o termo reatividade imunológica significa a propriedade do anticorpo que se liga à proteína CAPRIN-1 ou a um seu polipeptídeo parcial in vivo.
[019]Q anticorpo anti-CAPRIN-1 utilizado na presente invenção pode ser um anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal.
[020]Q anticorpo policlonal que possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1 no seu comprimento completo ou o seu fragmento (anticorpo policlonal anti-CAPRIN-1) pode ser obtido, por exemplo, através da imunização de um camundongo, um camundongo produtor de anticorpo de humano, um rato, um coelho, uma galinha ou similares com uma proteína CAPRIN-1 de ocorrência natural, ou uma sua proteína de fusão com o GST ou similares, ou um seu peptídeo parcial e obtendo o soro e aplicando o soro obtido à precipitação com o sulfato de amônio, proteína A, proteína G, uma coluna de troca iônica DEAE, uma coluna de afinidade ligada a uma proteína CAPRIN-1 ou um peptídeo parcial, ou similar.
[021]Quanto à proteína CAPRIN-1 no seu comprimento completo ou o seu fragmento a ser utilizado na imunização, as sequências de nucleotídeos e sequências de amino ácidos de CAPRIN-1 e seus homólogos estão
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18/117 disponíveis, por exemplo, acessando o GenBank (NCBI, EUA) e utilizando um algoritmo tal como BLAST ou FASTA (Karlin e Altschul, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 5.873-5.877,1993; e Altschul etal, Nucleic Acids Res. 25:3.389-3.402, 1997). Além disso, um método para a preparação da proteína CAPRIN-1 está disponível com referência à publicação WO 2014/012479, ou pode ser realizado utilizando, por exemplo, as células que expressam a proteína CAPRIN-1.
[022]O anticorpo monoclonal que possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1 no seu comprimento completo ou o seu fragmento (anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1) pode ser obtido, por exemplo, por: administração de SK-BR-3 (células de câncer de mama expressando a CAPRIN1) ou a proteína CAPRIN-1 no seu comprimento completo ou o seu fragmento, ou similar a um camundongo para a imunização; células de baço de fusão separadas do camundongo com as células de mieloma; e selecionando um clone produtor de anticorpos monoclonais anti-CAPRIN-1 entre as células de fusão obtidas (hibridomas). O anticorpo produzido a partir do hibridoma selecionado dessa maneira pode ser preparado da mesma maneira que o método de purificação do anticorpo policlonal mencionado acima.
[023]O anticorpo utilizado na presente invenção inclui os anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos e anticorpos animais não humanos.
[024]O anticorpo de humano pode ser obtido através de : sensibilização de linfócitos humanos infectados com vírus EB, com a proteína, células que expressam as proteínas ou seus lisados; fusão dos linfócitos sensibilizados com as células derivadas de mieloma humano, tais como as células U266; e obtenção de um anticorpo que possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1 no seu comprimento completo ou o seu fragmento a partir das células de fusão obtidas.
[025]O anticorpo humanizado, também denominado de anticorpo
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19/117 de humano remodelado, é um anticorpo manipulado. O anticorpo humanizado é construído por regiões determinantes de complementaridade de enxerto de um anticorpo derivado de um animal imunizado em regiões determinantes de complementaridade de um anticorpo de humano. Uma técnica de engenharia genética comumente utilizada para construir os anticorpos humanizados também é bem conhecida. Especificamente, as sequências de DNA projetadas para ligar as regiões determinantes de complementaridade, por exemplo, de um anticorpo de camundongo ou coelho, para as regiões de estrutura de um anticorpo de humano são sintetizadas por PCR a partir de diversos oligonucleotídeos preparados que possuem as porções terminais sobrepostas. Os DNAs obtidos são ligados com os DNAs que codificam as regiões constantes de anticorpos humanos. Os produtos de ligação resultantes são incorporados em vetores de expressão que, em seguida, são transferidos para os hospedeiros para a produção de anticorpos para a obtenção do anticorpo de interesse. Vide, a Publicação do Pedido de Patente Européia EP 239.400 e Publicação Internacional WO 1996/02576). As regiões de estrutura de um anticorpo de humano conectadas por meio das regiões determinantes de complementaridade são selecionadas de maneira que as regiões determinantes de complementaridade formem um local de união favorável ao antígeno. Caso necessário, um amino ácido nas regiões de estrutura das regiões variáveis do anticorpo pode ser substituído de maneira que as regiões determinantes de complementaridade de um anticorpo de humano remodelado formem um local de união ao antígeno adequado (Sato K. etal, Cancer Research 1993, 53: 851 856). De maneira adicional, estas regiões de estrutura podem ser substituídas por regiões de estrutura derivadas de diversos anticorpos humanos (vide publicação WO 1999/51743).
[026]Os anticorpos normalmente são as glicoproteínas heteromultiméricas que, cada uma, compreende, pelo menos, duas cadeias
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20/117 pesadas e duas cadeias leves. Os anticorpos são compostos de duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas. Cada cadeia pesada possui uma região variável da cadeia pesada em uma extremidade, seguida por uma série de regiões constantes. Cada cadeia leve possui uma região variável da cadeia leve em uma extremidade, seguida por uma série de regiões constantes. As regiões variáveis contêm determinadas regiões variáveis denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDRs) e conferem especificidade de união ao anticorpo. As porções relativamente conservadas nas regiões variáveis são denominadas de regiões de estrutura (FRs). Cada uma das regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve completas contém quatro FRs conectadas por meio de três CDRs (de CDR1 a CDR3).
[027]As sequências de regiões constantes e regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve derivadas de humano estão disponíveis, por exemplo, em NCBI (EUA; GenBank, UniGene e similares). Por exemplo, as seguintes sequências podem ser referidas: número de acesso J00228 para uma região constante da cadeia pesada de IgG 1 humana; número de acesso J00230 para uma região constante da cadeia pesada de lgG2 humana; números de acesso V00557, X64135, X64133 e similares, para uma região constante κ da cadeia leve humana; e os números de acesso X64132, X64134 e similares, para uma região constante λ da cadeia leve humana.
[028]Um anticorpo quimérico um anticorpo preparado a partir de uma combinação de sequências derivadas de diferentes animais e, por exemplo, pode ser um anticorpo composto por regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve de um anticorpo de camundongo e regiões constantes de regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve de um anticorpo de humano. O anticorpo quimérico pode ser preparado utilizando um método conhecido no estado da técnica e é obtido, por exemplo, por: ligando os DNAs codificando as regiões V do anticorpo aos DNAs codificando as regiões C do anticorpo de
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21/117 humano; incorporando os produtos de ligação resultantes em vetores de expressão; e transferindo os vetores para os hospedeiros para a produção de anticorpos.
[029]O anticorpo de animal não humano obtido através de imunização de um animal com um antígeno de sensibilização, de acordo com um método conhecido no estado da técnica e, como um método geral, por injeção intraperitoneal, intracutânea ou subcutânea de um antígeno de sensibilização a um animal tal como um camundongo. Para a injeção do antígeno de sensibilização, o antígeno é misturado em uma quantidade adequada com diversos adjuvantes incluindo o CFA (adjuvante completo de Freund), e a mistura é administrada ao animal uma pluralidade de vezes. O animal é imunizado e, em seguida, verificado se contém os anticorpos anti-CAPRIN-1 no soro. O soro pode ser obtido e aplicado, conforme mencionado acima, para a precipitação com o sulfato de amônio, proteína A, proteína G, uma coluna de troca iônica DEAE, uma coluna de afinidade ligada a uma proteína CAPRIN-1 ou um peptídeo parcial, ou similares, para obter a obtenção do anticorpo de animal não humano. No caso da obtenção de um anticorpo monoclonal de um animal não humano, os imunócitos podem ser coletados de um animal imunizado e submetidos à fusão de células com as células de mieloma para a obtenção do anticorpo monoclonal. A fusão de células entre os imunócitos e as células do mieloma pode ser realizada de acordo com um método conhecido no estado da técnica (vide Kohler, G. e Milstein, C. Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).
[030]G anticorpo utilizado na presente invenção também pode ser obtido como um anticorpo recombinante produzido utilizando uma técnica de engenharia genética por clonagem de genes do anticorpo a partir de um hibridoma; incorporando os genes do anticorpo em vetores adequados; e transferindo os vetores para os hospedeiros (vide Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies, publicado no Reino Unido por
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Macmillan Publishers LTD, 1990).
[031 ]O anticorpo anti-CAPRIN-1 que é utilizado para a obtenção do conjugado da presente invenção pode ser um anticorpo em que um amino ácido em uma região variável (por exemplo, FR) ou em uma região constante é substituído por outro amino ácido. A substituição de amino ácidos é a substituição de um ou mais, por exemplo, inferior a 15, inferior a 10, 8 ou inferior, 6 ou inferior, 5 ou inferior, 4 ou inferior, 3 ou inferior, ou 2 ou inferior de amino ácidos, de preferência, de 1 a 9 amino ácidos. O anticorpo substituído deve ser um anticorpo que possua a propriedade de se unir especificamente ao antígeno e à afinidade de união ao antígeno equivalente ou superior daquele anticorpo não substituído correspondente e não provoca nenhuma rejeição quando aplicado aos humanos.
[032]É esperado que o anticorpo anti-CAPRIN-1 utilizado na presente invenção possua um efeito antitumoral mais forte, a maior afinidade de união para a proteína CAPRIN-1 na superfície de células do câncer que o anticorpo possui. A sua associação constante (constante de afinidade) Ka (kon/koff), de preferência, é pelo menos, 107 M’1, pelo menos, 108 M’1, pelo menos, 5 x 108 M’1, pelo menos, 109 M’1, pelo menos, 5 x 109 M’1, pelo menos, 101° M’1, pelo menos, 5 x 1010 M’1, pelo menos, 1011 M’1, pelo menos, 5 x 1011 M’1, pelo menos, 1012 M’1, ou pelo menos, 1013 M’1.
[033]A atividade de união do anticorpo anti-CAPRIN-1 utilizado na presente invenção contra as células efetoras pode ser aprimorada substituindo um, dois ou diversos amino ácidos na região constante da cadeia pesada do anticorpo ou removendo a fucose adicionada à N-acetilglucosamina em uma cadeia de açúcar ligada ao N-glicosídeo anexada à região constante da cadeia pesada. Um tal anticorpo pode possuir a substituição de amino ácidos isoladamente ou pode estar em uma composição que compreende um anticorpo fucosilado.
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23/117 [034]O anticorpo em que um, dois ou diversos amino ácidos na região constante da cadeia pesada são substituídos pode ser preparado com referência, por exemplo, às publicações WO 2004/063351, WO 2011/120135, patente US 8.388.955, WO 2011/005481, patente US 6.737.056 e/ou WO 2005/063351.
[035]O anticorpo sem fucose adicionado à N-acetilglucosamina em uma cadeia de açúcar ligada ao N-glicosídeo na região constante da cadeia pesada foi removido, ou as células produtoras do anticorpo, podem ser preparadas com referência às patentes US 6.602.684, patente Européia 1.914.244, e/ou patente US 7.579.170. Uma composição do anticorpo sem fucose adicionada à N-acetilglucosamina em cadeia de açúcar ligada ao Nglicosídeo conectada à região constante da cadeia pesada, e o anticorpo que possui a fucose, ou as células produtoras da composição podem ser preparadas com referência, por exemplo, à patente US 8.642.292.
[036]Os métodos para a preparação e purificação do anticorpo policlonal anti-CAPRIN-1, o anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 e o anticorpo utilizado na presente invenção, e um método para a preparação da proteína CAPRIN-1 ou o seu polipeptídeo parcial a ser utilizado na imunização podem ser realizados com referência às publicações WO 2010/016526, WO 2011/096517, WO 2011/096528, WO 2011/096519, WO 2011/096533, WO 2011/096534, WO 2011/096535, WO 2013/018886, WO 2013/018894, WO 2013/018892, WO
2013/018891, WO 2013/018889, WO 2013/018883, WO 2013/125636, WO
2013/125654, WO 2013/125630, WO 2013/125640, WO 2013/147169, WO
2013/147176 e WO 2015/020212.
[037]Os exemplos específicos do anticorpo anti-CAPRIN-1, de acordo com a presente invenção, incluem os anticorpos anti-CAPRIN-1 descritos nas publicações WO 2010/016526, WO 2011/096517, WO 2011/096528, WO 2011/096519, WO 2011/096533, WO 2011/096534, WO 2011/096535, WO
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2013/018886, WO 2013/018894, WO 2013/018892, WO 2013/018891, WO 2013/018889, WO 2013/018883, WO 2013/125636, WO 2013/125654, WO 2013/125630, WO 2013/125640, WO 2013/147169, WO 2013/147176 e WO 2015/020212 mencionadas acima. Os exemplos de preferência, do anticorpo anti-CAPRIN-1 incluem os seguintes.
[038]Um anticorpo ou um seu fragmento que possui a reatividade imunológica com a sequência de amino ácidos representada pela SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 ou um polipeptídeo parcial da proteína CAPRIN-1 que possui uma sequência de amino ácidos que possui 80% ou superior (de preferência, 85% ou superior, de maior preferência, 90% ou superior, de maior preferência ainda, 95% ou superior, ainda de maior preferência, 99% ou superior) da identidade de sequência com a sequência de amino ácidos representada pela SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[039]Um anticorpo ou um seu fragmento que possui a reatividade imunológica com um polipeptídeo parcial da proteína CAPRIN-1 que possui a sequência de amino ácidos representada pela SEQ ID NO: 31 ou uma sequência de amino ácidos que possui 80% ou superior (de preferência, 85% ou superior, de maior preferência, 90% ou superior, de maior preferência, 95% ou superior) da identidade de sequência com a sequência de amino ácidos. De preferência, um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 36, 37 e 38 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 40, 41 e 42 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1; um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 140, 141 e 142 (CDR1,
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CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade das SEQ ID NOs: 143, 144 e 145 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1; ou um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 164, 165 e 166 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 167, 168 e 169 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1. De maior preferência, um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 39 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 43; um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 70 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 71; ou um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 78 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 79.
[040]Um anticorpo ou um seu fragmento que possui a reatividade imunológica com um polipeptídeo parcial da proteína CAPRIN-1 que possui a sequência de amino ácidos representada pela SEQ ID NO: 33 ou uma sequência de amino ácidos que possui 80% ou superior (de preferência, 85% ou superior, de maior preferência, 90% ou superior, de maior preferência, 95% ou superior) da identidade de sequência com a sequência de amino ácidos. De preferência, um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da
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26/117 cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NO: 60, 61 e 62 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 64, 65 e 66 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1; ou um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 63 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 67.
[041]Um anticorpo ou um seu fragmento que possui a reatividade imunológica com um polipeptídeo parcial da proteína CAPRIN-1 que possui a sequência de amino ácidos representada pela SEQ ID NO: 32 ou uma sequência de amino ácidos que possui 80% ou superior (de preferência, 85% ou superior, de maior preferência, 90% ou superior, de maior preferência, 95% ou superior) da identidade de sequência com a sequência de amino ácidos. De preferência, um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 52, 53 e 54 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 56, 57 e 58 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1. De maior preferência, um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 55 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 59.
[042]Um anticorpo ou um seu fragmento que possui a reatividade imunológica com um polipeptídeo parcial da proteína CAPRIN-1 que possui a
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27/117 sequência de amino ácidos representada pela SEQ ID NO: 34 ou uma sequência de amino ácidos que possui 80% ou superior (de preferência, 85% ou superior, de maior preferência, 90% ou superior, de maior preferência, 95% ou superior) da identidade de sequência com a sequência de amino ácidos. De preferência, um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 170, 171 e 172 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 173, 174 e 175 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1; ou um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 176, 177 e 178 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 179, 180 e 181 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1. De maior preferência, um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 80 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 81; ou um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 82 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 83.
[043]Um anticorpo ou um seu fragmento que possui a reatividade imunológica com um polipeptídeo parcial da proteína CAPRIN-1 que possui a sequência de amino ácidos representada pela SEQ ID NO: 35 ou uma sequência de amino ácidos que possui 80% ou superior (de preferência, 85% ou superior,
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28/117 de preferência, 90% ou superior, de maior preferência, 95% ou superior) da identidade de sequência com a sequência de amino ácidos. De preferência, um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 182, 183 e 184 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 185, 186 e 187 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1; ou um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 188, 189 e 190 (CDR1, CDR2, e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 191, 192 e 193 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1. De maior preferência, um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 84 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 85; ou um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 86 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 87.
[044]Um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 44, 45 e 46 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 48, 49 e 50 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica
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29/117 com a proteína CAPRIN-1. De preferência, um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 47 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 51.
[045]Um anticorpo ou um seu fragmento que possui a reatividade imunológica com um polipeptídeo parcial da proteína CAPRIN-1 que possui a sequência de amino ácidos representada pela SEQ ID NO: 296 ou uma sequência de amino ácidos que possui 80% ou superior (de preferência, 85% ou superior, de maior preferência, 90% ou superior, de maior preferência, 95% ou superior) da identidade de sequência com a sequência de amino ácidos. De preferência, um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 146, 147 e 148 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 149, 150 e 151 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1. De maior preferência, um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 72 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 73.
[046]Um anticorpo ou um seu fragmento que possui a reatividade imunológica com um polipeptídeo parcial da proteína CAPRIN-1 que possui a sequência de amino ácidos representada pela SEQ ID NO: 297 ou uma sequência de amino ácidos que possui 80% ou superior (de preferência, 85% ou superior, de maior preferência, 90% ou superior, de maior preferência, 95% ou superior) da identidade de sequência com a sequência de amino ácidos. De preferência, um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região
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30/117 variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 272, 273 e 274 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 275, 276 e 277 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1. De maior preferência, um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 114 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 115.
[047]Um anticorpo ou um seu fragmento que possui a reatividade imunológica com um polipeptídeo parcial da proteína CAPRIN-1 que possui a sequência de amino ácidos representada pela SEQ ID NO: 298 ou uma sequência de amino ácidos que possui 80% ou superior (de preferência, 85% ou superior, de maior preferência, 90% ou superior, de maior preferência, 95% ou superior) da identidade de sequência com a sequência de amino ácidos. De preferência, um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 290, 291 e 292 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 293, 294 e 295 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1. De maior preferência, um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 120 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 121.
[048]Um anticorpo ou um seu fragmento que possui a reatividade
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31/117 imunológica com um polipeptídeo parcial da proteína CAPRIN-1 que possui a sequência de amino ácidos representada pela SEQ ID NO: 299 ou uma sequência de amino ácidos que possui 80% ou superior (de preferência, 85% ou superior, de maior preferência, 90% ou superior, de maior preferência, 95% ou superior) da identidade de sequência com a sequência de amino ácidos. De preferência, um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NO: 301, 302 e 303 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 305, 306 e 307 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1. De maior preferência, um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 300 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 304.
[049]Um anticorpo ou um seu fragmento que possui a reatividade imunológica com um polipeptídeo parcial da proteína CAPRIN-1 que possui a sequência de amino ácidos representada pela SEQ ID NO: 308 ou uma sequência de amino ácidos que possui 80% ou superior (de preferência, 85% ou superior, de maior preferência, 90% ou superior, de maior preferência, 95% ou superior) da identidade de sequência com a sequência de amino ácidos. De preferência, um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 134, 135 e 136 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 137, 138 e 139 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica
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32/117 com a proteína CAPRIN-1. De maior preferência, um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 68 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 69.
[050]Um anticorpo ou um seu fragmento que possui a reatividade imunológica com um polipeptídeo parcial da proteína CAPRIN-1 que possui a sequência de amino ácidos representada pela SEQ ID NO: 309 ou uma sequência de amino ácidos que possui 80% ou superior (de preferência, 85% ou superior, de maior preferência, 90% ou superior, de maior preferência, 95% ou superior) da identidade de sequência com a sequência de amino ácidos. De preferência, um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 134, 135 e 136 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 137, 138 e 139 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1. De maior preferência, um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 68 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 69.
[051]Também, os seguintes anticorpos anti-CAPRIN-1, de preferência, são utilizados.
[052]Um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 68 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 69.
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33/117 [053]Um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 70 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 71.
[054]Um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 72 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 73.
[055]Um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 74 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 75.
[056]Um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 76 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 77.
[057]Um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 78 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 79.
[058]Um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 80 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 81.
[059]Um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 82 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 83.
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34/117 [060]Um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 84 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 85.
[061]Um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 86 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 87.
[062]Um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 88 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 89.
[063]Um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 90 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 91.
[064]Um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 92 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 93.
[065]Um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 94 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 95.
[066]Um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 96 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 97.
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35/117 [067]Um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 98 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 99.
[068]Um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 100 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 101.
[069]Um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 102 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 103.
[070]Um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 104 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 105.
[071]Um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 106 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 107.
[072]Um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 108 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 109.
[073]Um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 110 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 111.
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36/117 [074]Um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 112 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 113.
[075]Um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 114 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 115.
[076]Um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 116 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 117.
[077]Um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 118 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 119.
[078]Um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 120 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 121.
[079]Um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 122 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 123.
[080]Um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 124 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 125.
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37/117 [081]Um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 126 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 127.
[082]Um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 128 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 129.
[083]Um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 130 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 131.
[084]Um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 132 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 133.
[085]Um anticorpo ou um seu fragmento que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 300 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 304.
[086]Nos Exemplos mencionados posteriormente, os conjugados com um ativador imune foram preparados utilizando o anticorpo policlonal ou o anticorpo monoclonal contra a proteína CAPRIN-1 de comprimento completo ou um polipeptídeo de uma sua região parcial expresso na superfície da membrana de células das células de câncer, e foi descoberto que possui um efeito antitumoral intenso.
<Ativador Imune>
[087]No presente, o ativador imune, de acordo com a presente
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38/117 invenção, é um fator que ativa diversos imunócitos e significa um composto de ocorrência natural, um ácido nucleico ou um composto de ocorrência natural capaz de manter ou intensificar as funções imunes das células. Neste contexto, os imunócitos são os linfócitos T, linfócitos B, células NK, monócitos, células dendríticas, granulócitos, macrófagos, células supressoras derivadas de mieloides, células de Langerhans e seus grupos precursores de células, e estes grupos de imunócitos presentes no tumor.
[088]Os exemplos específicos do ativador imune utilizado na presente invenção incluem, mas não estão especialmente limitados aos ligantes ou agonistas que se unem ao receptor do tipo Toll (TLR), receptor do tipo NOD (NLR), receptor do tipo RIG ou tipo C receptor de lectina (CLR).
[089]Os exemplos específicos do ligante ou agonista que se une ao receptor do tipo Toll (TLR) incluem os ligantes ou agonistas que se unem ao TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, TLR9 ou TLR10.
[090]Gs exemplos específicos do ligante ou agonista que se une ao TLR2 incluem as substâncias selecionadas a partir do grupo que consiste em pepeptideoglicano, lipoproteína, lipopolissacarídeo e zimosan.
[091 ]Os exemplos específicos do ligante ou agonista que se une ao TLR3 incluem as substâncias selecionadas a partir do grupo que consiste em poli (l:C), poli (A:U) polilCLC (Hiltonol) e Ampligen.
[092]Os exemplos específicos do ligante ou agonista que se une ao TLR4 incluem as substâncias selecionadas a partir do grupo que consiste em lipopolissacarídeo (LPS), HSP60, RS09, MPLA (monofosforil-lipídeoA de Salmonella minnesota R595), GLA-SE, G100 e MPLA.
[093]Os exemplos específicos do ligante ou agonista que se une ao TLR5 incluem as substâncias selecionadas a partir do grupo que consiste em flagelina e FLA.
[094]Os exemplos específicos do ligante ou agonista que se une
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39/117 ao TLR7 ou TLR8 incluem os compostos de peso molecular baixo, tais como os compostos de imidazoquinolina e RNA de cadeia simples. Os seus exemplos específicos incluem o Imiquimod, Resiquimod, Loxorbine, 852A, 854A, S-34240, Motolimod (VTX-2337), DSR-6434, GS-9620, ANA773, AZD8848/DSP-3025, GSK2245035, Gardiquimod, CL264, UC-1V150, CL075, CL097, CL307, CL347, 3M-003, 3M-0043, 3M-052, CL264, IV209, ORN R-2176-dT, Poli(dT), ORN R0006, ORN R-0002, ORN R-2336, PolyU, ORN R-1886, polyG3, DSR6434, RWJ21757, SM324405, p-IMDQ, m-IMDQ e GSK2245035.
[095]Os exemplos específicos do ligante ou agonista que se une ao TLR9 incluem as substâncias selecionadas a partir do grupo que consiste em DNA bacteriano, DNA CpG não metilado, hemozoína, ODN1585, ODN1668, ODN1668, lefitolimod (MGN1703), SD-101, CYT003, CPG7909, DUK-CPG-001 eODN1826.
[096]Os exemplos específicos do ligante ou agonista que se une ao TLR10 incluem as substâncias selecionadas a partir do grupo que consiste em profilina e bactérias uropatogênicas.
[097]Entre os ligantes ou os agonistas que se unem ao receptor do tipo Toll (TLR), o ligante ou o agonista que se une ao TLR7 ou TLR8, de preferência, é utilizado na presente invenção. Um ligando ou agonista que se une ao TLR7 ou TLR8 selecionado a partir do grupo que consiste em compostos de imidazoquinolina e RNA de cadeia simples, de maior preferência, é utilizado como ligante ou o agonista que se une ao TLR7 ou TLR8 e um ligante ou agonista que se une ao TLR7 ou TLR8 selecionado a partir de compostos de imidazoquinolina, ainda de maior preferência, é utilizado.
[098]Os exemplos específicos de preferência, do composto de imidazoquinolina incluem os compostos descritos na Patente US 8951528 e os compostos descritos na publicação WO 2015/103989, por exemplo, o 1-(2metilpropi I)-1 H-imidazo[4,5-c]quinolina-4-amina (Imiquimod), 1 -(4-amino-2Petição 870190038878, de 25/04/2019, pág. 151/243
40/117 etilaminometilimidazo-[4,5-c]quinolin-1 -il)-2-metilpropan-2-ol (Gardiquimod), N[4-(4-amino-2-etil-1 H-imidazo[4,5-c]quinolin-1 -il)butil-]metanosulfonamida (PF4878691), 4-amino-2-(etoximetil)-a,a-dimetil-1 H-imidazo[4,5-c]quinolina-1 etanol (Resiquimod), 4-amino-aa-dimetil-2-metoxietil-1 H-imidazo[4,5c]quinolina-1 -etanol, 1 -(2-(3-(benziloxi)propoxi)etil)-2-(etoximetil)-1 Himidazo[4,5-c]quinolin-4-amina, 4-amino-2-etoximetil-aa-dimetil-6,7,8,9tetraidro-1 H-imidazo[4,5-c]quinolina-1 -etanol, N-(2-{2-[4-amino-2-(2-metoxietil)1 H-imidazo[4,5-c]quinolin-1 -il]eihoxi}eti l)-n'-pheni lurea, 1 -2-amino-2-metilpropil)2-(etoximetil)-1 H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina, 1 -{4-[(3,5diclorophenil)sulfonil]butil}-2-etil-1 H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina, N-(2-{2-[4amino-2-(etoximetil)-1 H-imidazo[4,5-c]quinolin-1 -il]etoxi}etil)-n'-cicloexilurea, N{3-[4-amino-2-(etoximetil)-1 H-imidazo[4,5-c]quinolin-1 -il]propil}-n'-(3cianophenil)tiourea, N-[3-(4-amino-2-butil-1 H-imidazo[4,5-c]quinolin-1 -il)-2,2dimetilpropil]benzamida, 2-buti I-1 -[3-(meti Isu Ifon i I) propi I]-1 H-imidazo[4,5c]quinolin-4-amina, embora o composto de imidazoquinolina não esteja limitado a estes desde que o composto de imidazoquinolina se uma ao TLR7 ou TLR8.
[099]Os exemplos específicos do ligante ou agonista que se une ao receptor do tipo NOD (NLR) incluem o M-TriDAP e PGN. Outros exemplos incluem os ligantes ou agonistas contra o NOD1, por exemplo, o Tri-DAP, iEDAP e 012-iE. Outros exemplos incluem os ligantes ou agonistas contra o NOD2, por exemplo, o MDP, N-glicosil-MDP, murabutido, M-TriLyS-D-ASN, MTriLYSe L18-MDP.
[0100]0s exemplos específicos do ligante ou agonista que se une ao receptor tipo RIG incluem o 5'ppp-dsRNA, poli(dA:dT), poli(dG:dC) e poli(l:C).
[0101 ]Os exemplos específicos do ligante ou agonista que se une ao receptor da lectina do tipo C (CLR) incluem o 6,6-dibehenato de trealose, zimosan, WGP, HKSC, HKCA e curdlan AL.
<CONJUGADO DE ANTICORPO ANTI-CAPRIN-1 E ATIVADOR lMUNE>
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41/117 [0102] Na presente invenção, o modo de união entre o anticorpo anti-CAPRIN-1 e o ativador imune no conjugado do anticorpo anti-CAPRIN-1 e o ativador imune não estão especialmente limitados desde que permitam a atividade antitumoral contra um câncer para ser mantido. O modo de união, de preferência, possui uma estrutura ligante formada entre o anticorpo antiCAPRIN-1 e o ativador imune.
[0103] Neste contexto, o ligante significa um composto capaz de ligar o anticorpo anti-CAPRIN-1 ao ativador imune. Pode ser utilizado qualquer um de diversos ligantes conhecidos no estado da técnica, ou pode ser utilizada uma modificação química adequada à estrutura do ativador para diretamente unir o anticorpo ao ativador.
[0104]0s detalhes do tipo do ligante e do método de união podem ser basicamente de acordo com um método conhecido no estado da técnica (vide, por exemplo, Greg T. Hermanson Bioconjugate Techniques, terceira edição, publicações WO 2004/010957 e WO 2014/012479).
[0105] Em uma realização da presente invenção, os exemplos de grupos reativos conectados ao anticorpo anti-CAPRIN-1, o ativador imune e o ligante incluem os seguintes.
[0106]Os exemplos do grupo reativo anexado à sequência de amino ácidos do anticorpo ou uma glicoproteína modificando um amino ácido incluem a amina primária (grupo 8-amino), carboxila, tiol (sulfidrila), carbonila (cetona ou aldeído) e hidroxila, a menos que uma modificação química especial seja realizada. A amina primária existe no terminal N de um polipeptídeo ou na cadeia secundária de um resíduo de lisina e é carregada positivamente sob condições fisiológicas. A amina primária, em geral, existe fora da proteína e, por conseguinte, pode ser utilizada na união sem desnaturar a estrutura da proteína. A carboxila existe no terminal C de um polipeptídeo ou na cadeia secundária de ácido aspártico ou ácido glutâmico. A sulfidrila existe na cadeia secundária da
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42/117 cisteína e forma uma união de dissulfureto que mantém a estrutura de ordem superior da proteína. O grupo cetona ou aldeído é gerado em uma glicoproteína através da oxidação de glicosila com o metaperiodato de sódio.
[0107]O conjugado da presente invenção é preparado por união do ligante ao grupo reativo do anticorpo, se unindo ao ativador imune unido ao ligante ou diretamente unindo o ativador imune ao anticorpo.
[0108]Os exemplos dos grupos reativos anexados ao ligante e ao ativador imune incluem os seguintes.
[0109]O grupo reativo capaz de reagir com a amina: o éster de Nhidroxissuccinimida (NHS), éster de imida, éster de pentafluorofenila, fosfina de hidroximetila, isotiocianato, isocianato, azidade acila, éster N-hidroxílico, cloreto de sulfonila, aldeído, glioxal, epóxido, oxirano, carbonato, arila, éster de imida, carbodiimida e anidrido carboxílico.
[0110]O grupo reativo capaz de reagir com a carboxila e a amina: a carbodiimida, diazoalcano, compostos de diazoacetila e carbonildiimidazol.
[0111]O grupo reativo capaz de reagir com o tiol: a maleimida, haloacetamida, dissulfureto de piridila, tiosulfona, sulfona de vinila, haloacetila, aziridina, acriloil e arila.
[0112]O grupo reativo capaz de reagir com o aldeído: hidrazida e alcoxiamina. O grupo reativo capaz de reagir com a hidroxila: o epóxi, oxirano, carbonildiimidazol, carbonato de Ν,Ν'-dissuccinimidila, cloroformato de Nhidroxisuccinimidila e isocianato.
[0113]O grupo reativo capaz de reagir com a hidroxila: o isocianato.
[0114]O grupo reativo fotorreativo: adiaziridina, azidade arila, arila, benzofenol e compostos de diazo.
[0115]Os exemplos específicos do ligante que possui o grupo reativo incluem o seguinte.
[0116]Como um ligante que possui o mesmo grupo reativo, um
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43/117 ligante que possui o éster de N-hidroxisuccinimida como um grupo reativo (por exemplo, o glutarato de disuccinimidila (DSG), suberato de dissuccinimidila (DSS), bis(sulfossuccinimidil)suberato (BS3), tris-(succinimidila)aminotriacetato (TSAT), bis(sulfossuccinimidil)suberato PEGilado (BS(PEG)s, BS(PEG)g), ditiobis (propionato de succinimidil) (DSP), (DTSSP), (EGS), (Sulfo-EGS), (DMA), (DMP), (DMS), (DTBP), (DFDNB), (DST), (BSOCOES), (EGS), (SulfoEGS)) e um ligante que possui a maleimida como grupo reativo (por exemplo, (BMOE), (BMB), (BMH), (TMEA), (BM(PEG)2), (BM(PEG)3), (DTME) e (DMDB)).
[0117]Como um ligante que possui diferentes extremidades de grupos reativos, um ligante que possui o éster de NHS e maleimida como grupos reativos (por exemplo, AMAS, BMPS, GMBS, Sulfo-MBS, MBS, Sulfo-MBS, SMCC, Sulfo-SMCC, EMCS, Sulfo-EMCS, SMPB, Sulfo-SMPB, SMPF, LCSMCC, Sulfo-KMUS, SM(PEG)2, SM(PEG)4, SM(PEG)6, SM(PEG)s, SM(PEG)i2 e SM(PEG)24), um ligante que possui o éster de NHS e piridilditiol como grupos reativos (por exemplo, SPDP, LC-SPDP, Sulfo-LC-SPDP, SMPT, PEG4-SPDP e PEG12-SPDP), um ligante que possui o éster de NHS e haloacetila como grupos reativos (por exemplo, SIA, SBAP, SIAB e Sulfo-SIAB), um ligante que possui o éster de NHS e azida de arila como grupos reativos (por exemplo, ANB-NOS, Sulfo-SANPAH e ATFB), um ligante que possui o éster de NHS e diaziridina como grupos reativos (por exemplo, SDA, Sulfo-SDA, LC-SDA, SDAD e SulfoSDAD), um ligante que possui a carbodiimida como grupos reativos (por exemplo, DCC, EDC, EDAC, NHS e Sulfo-NHS), um ligante que possui a maleimida e hidrazida como grupos reativos (por exemplo, BMPH, EMCH, MPBH e KMUH), um ligante que possui o piridilditiol e hidrazida como grupo ativo (por exemplo, PDPH), um ligante que possui o isocianato e maleimida como grupos reativos (por exemplo, PMPI), e um ligante que possui o éster de NHS e psoraleno como grupos reativos (por exemplo, SPB).
[0118]Como outros ligantes, um ligante que contém um
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44/117 polipeptídeo, por exemplo, o Fmoc-Ala-Ala-Asn-PAB, Fmoc-Ala-Ala-Asn(Trt)PAB, Fmoc-PEG3-Ala-Ala-Asn(Trt)-PAB, Fmoc-PEG4-Ala-Ala-Asn(Trt)-PAB, Fmoc-Ala-Ala-Asn-PAB-PNP, Fmoc-Ala-Ala-Asn(Trt)-PAB-PNP, Fmoc-PEGaAla-Ala-Asn(Trt)-PAB-PNP, Azide-PEG4-Ala-Ala-Asn(Trt)-PAB-PNP, Mal-PEG4Ala-Ala-Asn(Trt)-PAB-PNP, Fmoc-Val-Cit-PAB-OH, Val-Cit-PAB-OH, Fmoc-ValCit-PAB-PNP, MC-Val-Cit-PAB, MC-Val-Cit-PAB-PNP.
[0119]Também o ácido de Bis-PEG, ácido de PEG (por exemplo, o ácido-PEG-TEMPO, ácido de Amino-PEG, Amino-PEG-CH2C02H, ácido de Aminoxi-PEG, ácido de Azido-PEG, ácido de Carboxi-PEG-sulfônico, ácido de Fmoc-N-amido-PEG, Fmoc-N-amido-PEG-CH2C02H, ácido de Fmoc-aminooxiPEG, ácido de Hidroxi-PEG, Hidroxi-PEG-CH2C02H, ácido de m-PEG, ácido de m-PEG-(CH2)3, ácido de Metoxitritil-N-PEG, ácido de N-metil-N-(t-Boc)-PEG, ácido de Propargil-PEG, Propargil-PEG-CH2C02H, ácido de Propargil-PEG(CH2)3, ácido de t-Boc-N-amido-PEG, t-Boc-N-amido-PEG-CH2C02H, ácido de t-Boc-Aminooxi-PEG, ésterde ácido-PEG-PFP, ácido de PEG miscelânea), éster de PEG PFP (por exemplo, o éster de ácido-PEG-PFP, éster de Bis-PEG-PFP), Bis-PEG-NHS, aldeído de PEG (por exemplo, o aldeído m-PEG, benzaldeído de m-PEG, ácido de Ald-PEG, Ald-PEG-amina, Ald-PEG-azida, Ald-PEG-NH-Boc, éster de Ald-PEG-NHS, éster de Ald-PEG-TFP, éster de Ald-PEG-t-butila), Tosilato de PEG (por exemplo, o Azido-PEG-Tos, Hidroxi-PEG-Tos, m-PEG-Tos, t-Boc-Aminooxi-PEG-Tos, Trifluoroetil-PEG-Tos, ácido de Tos-PEG, Tos-PEGCH2CO2H, Tos-PEG-alquino, éster de Tos-PEG-t-butila, Tos-PEG-CH2C02tBu, Tos-PEG-Tos, S-acetil-PEG6-Tos, N-Tos-N-(t-butoxicarbonil)-aminooxi-PEG4Tos, Ms-PEG-Ms, éster de Ms-PEG-t-butila, PEG-Ms, Propargil-PEG-Ms), BocPEG (por exemplo, a Amino-PEG-t-Boc-Hidrazida, Azido-PEG-t-Boc-Hidrazida, Boc-NH-PEG-NH-Boc, Bromoacetamido-PEG-Boc-amina, m-PEG-ONHBoc, Mal-Alquil-t-Boc-amina, álcool de N-Boc-PEG, N-Boc-PEG-bromida, ácido de Nmetil-N-(t-Boc)-PEG, ácido de t-Boc-N-amido-PEG, t-Boc-N-amido-PEG
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CH2CO2H, t-Boc-N-Amido-PEG-amina, t-Boc-N-amido-PEG-azida, éster de tBoc-N-amido-PEG-NHS, ácido t-Boc-N-amido-PEG-sulfônico), éster de PEG NHS (por exemplo, 0 éster de ácido de PEG-NHS, éster de Azido-PEG-NHS, Bis-PEG-NHS, éster de Fmoc-PEG-NHS, éster de m-PEG-NHS, carbonato de m-PEG-NHS, éster de Mal-PEG-NHS, éster de Propargil-PEG-NHS, éster de tBoc-N-amido-PEG-NHS, éster de t-Butoxicarbonil-PEG-NHS), Fmoc-PEG (por exemplo, 0 ácido de Fmoc-N-amido-PEG, Fmoc-NH-PEG-CFhCCteH, éster de Fmoc-PEG-NHS), PEG de biotina (por exemplo, 0 ácido de PEG de biotina, álcool de PEG de biotina, PEG-alquino de biotina, PEG-amina de biotina, PEGazida de biotina, PEG-DBCO de biotina, PEG-hidrazida de biotina, biotin-PEGMal, biotin-PEG-NHS, biotin-EDA-PEG-NHS, biotin-PEG-oxiamina, biotin-PEGPFP, biotin-EDA-PEG-PFP, biotin-PEG-Tetrazina, biotin-PEG-TFP, azida-SSbiotina, biotin-PEG3-SS-azida, DBCO-S-S-PEG3-biotina, Dde biotin-PEG4Alquino, Dde biotin-PEG4-azida, Dde biotin-PEG4-DBCO, Diazo biotin-PEG3Alquino, Diazo biotin-PEG3-azida, Diazo biotin-PEG3-DBCO, Diol biotin-PEG3Alquino, Diol biotin-PEG3-azida, PC biotin-PEG3-Alquino, PC-biotin-PEG4PEG4-Alquino, PC-biotin-PEG4-PEG4-Alquino, PC biotin-PEGa-azida, PC-biotinPEG4-PEG3-azida, carbonato de PC-biotin-PEG4-NHS, PC DBCO-PEGs-biotina, WSPC biotin-PEGa-DBCO, Fmoc-Lis (biotin-PEG)-OH, ácido de Fmoc-N-amido(PEG-biotina), TAMRA-azida-PEG-biotina), fosfanato de PEG, Aminooxi PEG (por exemplo, 0 ácido de Aminooxi-PEG, álcool de Aminooxi-PEG, AminooxiPEG-azida, Aminooxi-PEG-bromida, Aminooxi-PEG-metano, Aminooxi-PEGPropargila, éster de Aminooxi-PEG-t-butila, Aminooxi-PEG-Tiol, Bis-(Aminooxi)PEG, ácido de t-Boc-Aminooxi-PEG, álcool de t-Boc-Aminooxi-PEG, t-BocAminooxi-PEG-amina, t-Boc-Aminooxi-PEG-azida, t-Boc-Aminooxi-PEGBromida, t-Boc-aminooxi-PEG-Metano, t-Boc-aminooxi-PEG-Propargila, t-Bocaminooxi-PEG-S-Ac, t-Boc-Aminooxi-PEG-Tiol, t-Boc-Aminooxi-PEG-Tos, ácido de Fmoc-aminooxi-PEG, Trifluoroetil-PEG-Aminooxi), Alquino PEG (por
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46/117 exemplo, o endo-BCN-PEG, ácido de exo-BCN-PEG, Propargil-PEG, PropargilPEG-CH2CO2H, ácido de Propargil-PEG-(CH2)3, ésterde Propargil-PEG-(CH2)3metila, Propargil-PEG-Acrilato, álcool de Propargil-PEG, Propargil-PEG-amina, Propargil-PEG-metilamina, Aminooxi-PEG-Propargila, Propargil-PEG-azida, Propargil-PEG-bromida, Propargil-PEG-Maleimida, Propargil-PEG-Ms, éster de Propargil-PEG-NHS, ácido Propargil-PEG-sulfônico, éster de Propargil-PEG-tbutila, Propargil-PEG-CH2C02tBu, Propargil-PEG-tiol, carbonato de PropargilPEG-5-nitrofenil, t-Boc-aminooxi-PEG-Propargil, Bis-Propargil-PEG, m-PEGPropargil), Azido PEG (por exemplo, 0 ácido de Azido-PEG, Azido-PEGCH2CO2H, éster de Azido-PEG-(CH2)3-metila, Azido-PEG-Acrilato, álcool de Azido-PEG, Azido-PEG-(CH2)30H, Azido-PEG-amina, Azido-PEG-azida, AzidoPEG-Maleimida, Azido-PEG-metilamina, éster de Azido-PEG-metila, éster de Azido-PEG-NHS, Azido-PEG-CHhCCte-NHS, Azido-PEG-oxazolidin-2-ona, éster de Azido-PEG-PFP, ácido Azido-PEG-fosfônico, éster de etila de ácido AzidoPEG-fosfônico, ácido Azido-PEG-sulfônico, Azido-PEG-t-Boc-Hidrazida, éster de Azido-PEG-t-butila, éster de Azido-PEG-CH2C02-t-butila, éster de AzidoPEG-TFP, Azido-PEG-Tos, Aminooxi-PEG-azida, Bromo-PEG-azida, Bromoacetamido-PEG-azida, 110-PEG-azida de Carboxirhodamina, Isotiocianato-PEG-azida, Isotiocianato-PEG-azida, m-PEG-azida, PropargilPEG-azida, TAMRA-PEG-azida, t-Boc-N-Amido-PEG-azida, t-Boc-AminooxiPEG-azida, Thiol-PEG-azida, Trifluoroetil-PEG-azida, ácido de Azido-PEGamino, carbonato de Azido-PEG4-4-nitrofenila, S-Acetil-PEGs-Azido, azida, TritilPEG10-azida), Alquino PEG, DBCO-PEG, BCN-PEG, Propargil-PEG, ácido de Bis-PEG, Bis-PEG-NHS, Bis-PEG-PFP, Bis-Propargil-PEG, Amina-PEG-Amina, Azido-PEG-azida, Bromo-PEG ou Mai PEG podem ser utilizados.
[0120]O ligante entre 0 anticorpo anti-CAPRIN-1 e 0 ativador imune pode ser composto por um ligante único ou composto por uma pluralidade de ligantes.
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47/117 [0121] Um método para a preparação do conjugado do anticorpo anti-CAPRIN-1 e o ativador imune, de acordo com a presente invenção, inclui um método que envolve a união do ativador imune utilizando um grupo S-Amino na cadeia secundária da lisina do anticorpo e um método que envolve a união do ativador imune utilizando o tiol formado através do tratamento de redução de um resíduo de cisteína constituindo a união de dissulfureto do anticorpo.
[0122] No caso da utilização de um grupo 8-Amino no resíduo de lisina do anticorpo, por exemplo, utilizado um método que envolve a reação do éster ativo (por exemplo, o éter de N-hidroxisuccinimida) com este para formar uma união de amida. Neste caso, uma vez que o anticorpo contém uma grande quantidade de resíduos de lisina, a reação de união prossegue de maneira não específica.
[0123] No caso da utilização de tiol constituindo uma união de dissulfureto presente na cadeia secundária de cisteína do anticorpo, é utilizado um método que envolve a formação de tiol a partir da união de dissulfureto no anticorpo utilizando um agente de redução tal como o mercaptoetanol e a reação do tiol com a maleimida ou a-haloamida. Por exemplo, um método utilizando o feniloxadiazol de sulfona, um derivado 4-cianoetiniloxi, ou similar é utilizado para estabilizar uma união mediada por tiol. Estas uniões são estáveis por mais tempo do que a união com base na reação de adição conjugada de cisteína com a maleimida. Também pode ser utilizado um ligante que possui um grupo amino próximo de um grupo imida uma vez que um anel imida com um grupo tiol adicionado à maleimida é aberto através da hidrólise, de maneira que a estabilidade é aprimorada devido à união de amida resultante. No anticorpo, os tióis das cisteínas formam uma união de dissulfureto. Por conseguinte, um método alternativo envolve a união do ativador imune e similares entre dois tióis por meio dos tióis. Como exemplo, uma união reticulada pode ser formada utilizando um ligante que possui dois locais de união de dissulfureto que podem
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48/117 ser formados a partir de um grupo amida que possui duas sulfonas na posição β ou dibromomaleimida.
[0124]O conjugado da presente invenção pode ser obtido através de um método utilisando, por exemplo, a técnica THIOMAB™, que é um método capaz de introduzir um número determinado de grupos tiol em um local especial de um anticorpo (vide Nature Biotechnology 26, 925-932). (2008)).
[0125]O conjugado da presente invenção pode ser formado, por exemplo, através da redução do anticorpo utilizando um agente de redução de ditiotreitol (DTT) em um tampão de fosfato para obter um anticorpo que possui um grupo tiol reativo, que, em seguida, conjugado com o ativador imune. O conjugado pode ser obtido através da adição de um grupo tiol à amina primária no resíduo de lisina do anticorpo através da introdução de um reagente de Traut (2-iminotiolano ou S-acetil-tioacetato de N-succinimidila (SATA)), em vez do método utilizando um agente de redução.
[0126]A quantidade de tiol adicionada ao anticorpo pode ser determinada, por exemplo, através da mistura de uma solução de amostra contendo o 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB) e um grupo SH com uma solução de tampão de fosfato (pH 8,0) e água destilada, adicionando uma solução de DTNB dissolvida em um tampão de fosfato, um tampão de Good ou um tampão de mistura Tris e incubando a mistura resultante durante um determinado tempo, seguido da medição da absorvância a 412 nm (vide GL Ellman, Arch Biochem Biophys, 82, 70 (1959)).
[0127]O grupo tiol adicionado através da divagem da união de dissulfureto do anticorpo através de tratamento de redução, de preferência, é tratado (tapado) de maneira a prevenir a formação de uma união de dissulfureto novamente. O nivelamento, por exemplo, pode empregar a N-etilmaleimida (NEM) ou 2-iodoacetamida (IAA).
[0128]O conjugado pode ser construído unindo o ativador imune ao
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49/117 anticorpo utilizando o grupo tiol adicionado ao anticorpo, de acordo com um método conhecido no estado da técnica. Especificamente, a união pode ser realizada utilizando, por exemplo, um reagente ligante que possui um grupo maleimida ou um grupo bromoacetamida como um reagente ligante que se liga especificamente ao grupo tiol do anticorpo reduzido. Por exemplo, o Nsuccinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclo-hexano-1-carboxilato (SMCC) é utilizado como o ligante que possui um grupo maleimida. Neste caso, o grupo Nsuccinimida de SMCC pode formar uma união de amida com um grupo amino presente no ativador imune para a obtenção do conjugado.
[0129] Em outra realização, uma união de amida em primeiro lugar é formada em um grupo amino presente no ativador utilizando o SMCC. Em seguida, o grupo maleimida do SMCC unido ao ativador imune pode reagir com o grupo tiol adicionado ao anticorpo para a obtenção do conjugado.
[0130] Em uma realização alternativa, o conjugado do anticorpo e o ativador imune podem ser formados utilizando dois ligantes. Por exemplo, um grupo amino primário presente no resíduo de lisina do anticorpo está unido ao grupo N succinimida de SATA (N-succinimidil-S-acetiltioacetato) por meio de uma união de amida para adicionar um grupo tiol ao anticorpo. A SMCC reage com o ativador imune contendo um grupo amino ou com o ativador imune que possui um grupo amino adicionado, de acordo com um método comum para formar uma união de amida com o grupo N-succinimida de SMCC. O grupo maleimida de SMCC unido ao ativador imune pode reagir com o grupo tiol do SATA unido ao anticorpo para a obtenção do conjugado.
[0131] Em uma outra realização alternativa, os exemplos da preparação do conjugado do anticorpo e do ativador imune incluem um método utilizando o maleimidocaproil-valina-citrulina-p-aminobenziloxicarbonila (MCVal-Cit-PAB) como um ligante. O MC-val-Cit-PAB é um ligante clivável através da proteinase intracelular (por exemplo, a catepsina B). Um grupo tiol é
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50/117 adicionado ao anticorpo dissolvido em um tampão de fosfato utilizando o DTT ou similar. No entanto, o ativador imune que possui um grupo amino é reagido com a benziloxicarbonila (PAB) em MC-Val-Cit-PAB para a preparação de um ativador imune ligado ao MC-val-Cit-PAB que, em seguida, pode reagir com o anticorpo de tiol adicionado mencionado acima para a obtenção do conjugado.
[0132] Em uma outra realização alternativa, o SATA está unido a um grupo amino primário no resíduo de lisina do anticorpo para adicionar um grupo tiol ao mesmo. No entanto, o 3-(2-piridilditio)propionato de succinimidil (SPDP) é reagido com o ativador imune que possui um grupo amino para formar uma união de amida com o grupo N-succinimida de SPDP. De maneira a obter uma composição que compreende o anticorpo unido ao ligante, por exemplo, uma fração de pico de um peso molecular mais elevado em comparação com o anticorpo antes da união do ligante pode ser separada através da aplicação de cromatografia de filtração em gel ou similar.
[0133]O número de moléculas do ativador imune unido por molécula de anticorpo no conjugado do anticorpo anti-CAPRIN-1 e o ativador imune da presente invenção podem ser caracterizados utilizando um método tal como a espectrometria de massa, ELISA, electroforese ou HPLC com base em um método conhecido no estado da técnica.
<Efeito Antitumoral do Conjugadc» [0134]O conjugado do anticorpo anti-CAPRIN-1 e o ativador imune da presente invenção possuem a atividade citotóxica in vitro ou in vivo. Consequentemente, o efeito antitumoral do conjugado da presente invenção pode ser determinado através do exame da sua atividade citotóxica contra um câncer. A atividade citotóxica pode ser avaliada através de: administração do conjugado a um organismo com câncer; e exame do tamanho do tumor ao longo do tempo através da medição do tamanho do tumor após a administração. O efeito antitumoral da presente invenção também pode ser avaliado através do
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51/117 exame de uma taxa de sobrevivência. De maneira alternativa, o efeito antitumoral da presente invenção pode ser avaliado através do exame da capacidade de produzir uma citocina ou uma quimiocina. O efeito antitumoral do conjugado da presente invenção ainda pode ser determinado através do exame da prevenção de um câncer, da prevenção de metástases ou da prevenção da recorrência.
[0135]É esperado que o conjugado da presente invenção possua um efeito antitumoral mais forte, a maior afinidade de união para a proteína CAPRIN-1 na superfície de células do câncer que o conjugado possui. A sua associação constante (constante de afinidade) Ka (kon/koff) de preferência, pelo menos, 107 M’1, pelo menos, 108 M’1, pelo menos, 5 x 108 M’1, pelo menos, 109 M’1, pelo menos, 5 x 109 M’1, pelo menos, 1010 M’1, pelo menos, 5 x 1010 M’1, pelo menos, 1011 M’1, pelo menos, 5 x 1011 M’1, pelo menos, 1012 M’1, ou pelo menos, 1013 M’1.
[0136]A capacidade do conjugado da presente invenção para se unir à CAPRIN-1 pode ser identificada através da utilização de análise de união utilizando, por exemplo, a ELISA, Western blot, imunofluorescência ou citometria de fluxo.
[0137]O conjugado da presente invenção intensifica o efeito antitumoral em comparação com o anticorpo anti-CAPRIN-1 isoladamente, conforme mencionado acima. A taxa de intensificação de preferência, é 30% ou superior, de maior preferência, 40% ou superior, de maior preferência ainda, 50% ou superior, ainda de maior preferência, 55% ou superior, ainda de maior preferência, 60% ou superior, ainda de maior preferência, 65% ou superior, ainda de maior preferência, 70% ou superior. A taxa de intensificação no efeito antitumoral através do conjugado da presente invenção em relação ao anticorpo anti-CAPRIN-1 isoladamente pode ser calculada administrando as respectivas quantidades eficazes aos camundongos portadores de câncer nas mesmas
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52/117 condições, e comparando os volumes dos tumores 10 dias ou posteriormente, após o início da administração.
<Composição Farmacêutica e Método para Tratamento e/ou Prevenção do Câncer>
[0138]O alvo da composição farmacêutica para o tratamento e/ou a prevenção de um câncer da presente invenção não está especialmente limitado desde que o alvo seja o câncer (células) expressando a proteína CAPRIN-1.
[0139]Os termos tumor e câncer utilizados na presente invenção significam o neoplasma maligno e são utilizados indistintamente entre si.
[0140]0 câncer direcionado na presente invenção pode ser qualquer câncer que expresse a proteína CAPRIN-1 na superfície da membrana de células. O câncer, de preferência, é o câncer de mama, câncer de rim, câncer de pâncreas, câncer de colo e reto, câncer de pulmão, tumor de cérebro, câncer de estômago, câncer de útero, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de bexiga, câncer de esôfago, leucemia, linfoma, câncer de fígado, câncer de vesícula biliar, sarcoma, mastocitoma, melanoma, câncer de córtex adrenal, tumor de Ewing, linfoma de Hodgkin, mesotelioma, mieloma múltiplo, câncer de testículo, câncer de tireoide e câncer de cabeça e pescoço, conforme mencionado acima.
[0141] Mais especificamente, os exemplos destes cânceres incluem, mas não estão limitados à adenocarcinoma de mama, adenocarcinoma de mama do tipo complexo, tumor maligno misto da glândula mamaria, adenocarcinoma papilar intraductal, adenocarcinoma de pulmão, câncer de células escamosas, câncer de células pequenas, câncer de células grandes, glioma que é tumor de tecido neuroepitelial, glioblastoma, neuroblastoma, ependimoma, tumor neuronal, tumor neuroectodérmico embrionário,
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53/117 neurilemoma, neurofibroma, meningioma, leucemia linfocítica crônica, linfoma, linfoma gastrointestinal, linfoma alimentar, linfoma de tipo pequeno a médio, câncer cecal, câncer de cólon ascendente, câncer de cólon descendente, câncer de cólon transverso, câncer de cólon sigmoide, câncer do reto, câncer epitelial de ovário, tumor de células germinativas, tumor de células estromais, carcinoma ductal de pâncreas, carcinoma ductal de pâncreas invasivo, adenocarcinoma de pâncreas, carcinoma de células acinares, carcinoma adenoescamoso, tumor de células gigantes, neoplasia papilar-mucinosa intraductal, mucinous neoplasia cistica, pancreatoblastoma, adenoma de células das ilhotas, tumor de Frants, cistoadenocarcinoma seroso, tumor pseudopapilar sólido, gastrinoma, glucagonoma, insulinoma, neoplasia endócrina múltipla tipo 1 (síndrome de Wermer), tumor não funcional de células das ilhotas, somatostatinoma, VIPoma, câncer de colo de útero, câncer de corpo de útero, fibrossarcoma, sarcoma de ossos ou articulações, sarcoma de Ewing, tumor de Wilms, hepatoblastoma, sarcoma de partes moles, leucemia aguda, leucemia crônica, tumor da medula espinhal, tumor maligno de partes moles, tumor do grupo teratoma e câncer de cabeça e pescoço incluindo o câncer de hipofaringe, câncer de orofaringe, câncer de língua, câncer de epifaringe, câncerde boca, câncer de lábio, câncer de seio e câncer de garganta.
[0142]Os indivíduos (pacientes) a serem alvo, de preferência, são os mamíferos, por exemplo, os mamíferos, incluindo os primatas, animais de estimação, gado e animais de esporte e, de especialmente de preferência, são os humanos, cães e gatos.
[0143] No caso da utilização do conjugado utilizado na presente invenção em uma composição farmacêutica, a composição farmacêutica pode ser formulada através de um método conhecido dos técnicos no assunto. Por exemplo, a composição farmacêutica pode ser utilizada na forma de uma injeção parentérica de uma solução ou suspensão asséptica com água ou qualquer outro
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54/117 líquido farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, o conjugado pode ser formulado em uma forma de dosagem unitária necessária para a prática farmacêutica em geral aceita, através da mistura com veículos ou meios farmacologicamente aceitáveis, especificamente, a água esterilizada, solução salina fisiológica, um óleo vegetal, um emulsionante, um agente de suspensão, um tensoativo, um estabilizante, uma fragrância, um excipiente, um aglutinante, e similares em combinação adequada. A quantidade eficaz do ingrediente ativo em tal preparação é determinada de maneira que uma dose adequada dentro do intervalo prescrito possa ser alcançada.
[0144] Uma composição asséptica para a injeção pode ser formulada de acordo com a prática farmacêutica convencional utilizando um veículo tal como a água destilada injetável. Os exemplos de soluções aquosas para a injeção incluem o soro fisiológico, soluções isotônicas contendo a glicose e outros agentes auxiliares, por exemplo, o D-sorbitol, D-manose, D-manitol e cloreto de sódio. Estas soluções podem ser utilizadas em combinação com um solubilizante adequado, por exemplo, um álcool (especificamente, o etanol) ou um poliálcool (por exemplo, o propileno glicol e polietileno glicol), ou um tensoativo não iônico, por exemplo, o Polysorbate 80™ ou HCO-60. Os exemplos de soluções de óleo incluem o óleo de gergelim e óleo de soja. Estas soluções podem ser utilizadas em combinação com o benzoato de benzila ou álcool de benzila como um solubilizante. As soluções ainda podem ser misturadas com um tampão (por exemplo, uma solução tampão de fosfato e uma solução tampão de acetato de sódio), um agente calmante (por exemplo, o cloridrato de procaína), um estabilizante (por exemplo, o álcool de benzila e fenol) e um antioxidante. As soluções injetáveis preparadas dessa maneira normalmente são introduzidas em ampolas adequadas. Os exemplos de soluções de óleo incluem o óleo de gergelim e óleo de soja. Estas soluções podem ser utilizadas em combinação com o benzoato de benzila ou álcool de
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55/117 benzila como um solubilizante.
[0145] A administração é realizada de maneira oral ou parentérica, de preferência, de maneira parentérica. Os exemplos específicos das suas formas de dosagem incluem as injeções, preparações de administração intranasal, preparações de administração transpulmonares e preparações de administração percutânea. Os exemplos das injeções incluem a injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal, injeção subcutânea e administração intratumoral, através da qual a composição farmacêutica pode ser administrada de maneira sistêmica ou local.
[0146]Além disso, o método de administração pode ser adequadamente selecionado em vista da idade, peso, sexo, sintomas, e assim por diante de um paciente. A dose de uma composição farmacêutica contendo o anticorpo ou um polinucleotídeo que codifica o anticorpo pode ser selecionada dentro de um intervalo, por exemplo, a partir de 0,0001 a 1.000 mg/kg de peso corporal por dose. De maneira alternativa, a dose pode ser selecionada dentro de um intervalo, por exemplo, a partir de 0,001 a 100.000 mg/corpo de um paciente, embora a dose não esteja necessariamente limitada a estes valores numéricos. Embora a dose e o método de administração variem dependendo do peso, idade, sexo, sintomas, e assim por diante de um paciente, os técnicos no assunto podem selecionar adequadamente a dose e o método.
[0147]A composição farmacêutica para o tratamento e/ou a prevenção de um câncer que compreende o conjugado da presente invenção como um ingrediente ativo pode ser administrada a um indivíduo para o tratamento e/ou a prevenção do câncer mencionado acima expressando a CAPRIN-1 na superfície da membrana de células, de preferência, o câncer de mama, câncer de rim, câncer de pâncreas, câncer de colo e reto, câncer de pulmão, tumor de cérebro, câncer de estômago, câncer de útero, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de bexiga, câncer de esôfago, leucemia,
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56/117 linfoma, câncer de fígado, câncer de vesícula biliar, sarcoma, mastocitoma, melanoma, câncer de cortex adrenal, tumor de Ewing, linfoma de Hodgkin, mesotelioma, mieloma múltiplo, câncer de testículo, câncer de tireoide e câncer de cabeça e pescoço.
Exemplos [0148] Daqui em diante, a presente invenção será especificamente descrita com referência aos Exemplos. No entanto, o âmbito da presente invenção não se destina a ser limitado por estes Exemplos específicos.
Exemplo 1 Anticorpo Policlonal anti-CAPRIN-1 [0149]De maneira a obter os anticorpos policlonais anti-CAPRIN-1 que possuem a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1 a ser utilizada em conjugados, 1 mg de uma proteína humana recombinante de CAPRIN-1 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 produzida de acordo ao Exemplo 3 da publicação WO 2010/016526 foi misturado com um volume igual de solução incompleta de adjuvante de Freund (IFA) e esta mistura foi administrada por via subcutânea aos coelhos quatro vezes a cada 2 semanas. Em seguida, o sangue foi coletado para obter o anti-soro contendo os anticorpos policlonais. O anti-soro obtido foi purificado utilizando um (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) para a preparação de um anticorpo policlonal contra a proteína CAPRIN-1 (anticorpo policlonal antiCAPRIN-1 #1). Além disso, o soro de um coelho obtido sem administrar um antígeno foi purificado utilizando um veículo de proteína G da mesma maneira, conforme descrito acima e utilizado como um anticorpo de controle de coelho.
[0150]Qs seguintes anticorpos policlonais #2 a #6 contra os polipeptídeos parciais de CAPRIN-1 foram obtidos da mesma maneira que no método para a preparação do anticorpo policlonal contra a proteína CAPRIN-1.
[0151]Q anticorpo policlonal anti-CAPRIN-1 #2 contra um polipeptídeo de CAPRIN-1 parcial representado pela SEQ ID NO: 37 descrito na
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57/117 publicação WO 2011/096528 (SEQ ID NO: 31 da presente especificação), anticorpo policlonal anti-CAPRIN-1 #3 contra um polipeptídeo parcial representado pela SEQ ID NO: 5 descrito na publicação WO 2013/018894 (SEQ ID NO: 32 da presente descrição), anticorpo policlonal anti-CAPRIN-1 #4 contra um polipeptídeo parcial representado pela SEQ ID NO: 5 descrito na publicação WO 2013/125654 (SEQ ID NO: 33 da presente especificação), anticorpo policlonal anti-CAPRIN-1 #5 contra um polipeptídeo parcial representado pela SEQ ID NO: 37 descrito na publicação WO 2011/096533 (SEQ ID NO: 34 da presente especificação) e o anticorpo policlonal anti-CAPRIN-1 #6 contra um polipeptídeo parcial representado pela SEQ ID NO: 37 descrito na publicação WO 2011/096534 (SEQ ID NO: 35 da presente especificação).
Exemplo 2
Anticorpo Monoclonal anti-CAPRIN-1 [0152]Os seguintes anticorpos monoclonais anti-CAPRIN-1 foram utilizados no conjugado da presente invenção.
[0153]O anticorpo monoclonal contra a CAPRIN-1 descrito na publicação WO 2011/096528, em que o anticorpo compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia pesada que consiste nas sequências de amino ácidos de SEQ ID NOs: 36, SEQ ID NOs: 37 e SEQ ID NO: 38, respectivamente, e CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia leve que consiste nas sequências de amino ácidos de SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 e SEQ ID NO: 42, respectivamente (por exemplo, um anticorpo que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela SEQ ID NO: 39 que compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia pesada e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela SEQ ID NO: 43 que compreende o CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia leve).
[0154]O anticorpo monoclonal contra a CAPRIN-1 descrito na
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58/117 publicação WO 2015/020212, em que o anticorpo compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia pesada que consiste nas sequências de amino ácidos de SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 e SEQ ID NO: 46, respectivamente, e CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia leve que consiste nas sequências de amino ácidos de SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO: 50, respectivamente (por exemplo, um anticorpo que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela SEQ ID NO: 47 que compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia pesada e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela SEQ ID NO: 51 que compreende as CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia leve).
[0155]Q anticorpo monoclonal contra a CAPRIN-1 descrito na publicação WO 2011/096519, em que o anticorpo compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia pesada que consiste nas sequências de amino ácidos de SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 54, respectivamente, e CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia leve que consiste nas sequências de amino ácidos de SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 58, respectivamente (por exemplo, um anticorpo que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela SEQ ID NO: 55 que compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia pesada e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela SEQ ID NO: 59 que compreende as CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia leve).
[0156]Q anticorpo monoclonal contra a CAPRIN-1 descrito na publicação WO 2013/125654, em que o anticorpo compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia pesada que consiste nas sequências de amino ácidos de SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61 e SEQ ID NO: 62, respectivamente, e CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia leve que
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59/117 consiste nas sequências de amino ácidos de SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65 e SEQ ID NO: 66, respectivamente (por exemplo, um anticorpo que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela SEQ ID NO: 63 que compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia pesada e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela SEQ ID NO: 67 que compreende as CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia leve).
[0157]Q anticorpo monoclonal contra a CAPRIN-1 descrito na publicação WO 2011/096517, em que o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 68 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 69.
[0158]Q anticorpo monoclonal contra a CAPRIN-1 descrito na publicação WO 2011/096528, em que o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 70 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 71; o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 72 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 73; o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 74 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 75; o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 76 e a
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60/117 sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 77; ou o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 78 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 79.
[0159]O anticorpo monoclonal contra a CAPRIN-1 descrito na publicação WO 2011/096533, em que o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 80 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 81, ou o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 82 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 83.
[0160]0 anticorpo monoclonal contra a CAPRIN-1 descrito na publicação WO 2011/096534, em que o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 84 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 85, ou o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 86 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 87.
[0161]O anticorpo monoclonal contra a CAPRIN-1 descrito na publicação WO 2010/016526, em que o anticorpo compreende a sequência de
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61/117 amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 88 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 89; o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 90 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 91; o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 92 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 93; o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 94 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 95; o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 96 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 97; o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 98 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 99; ou o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 100 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 101.
[0162]Q anticorpo monoclonal contra a CAPRIN-1 descrito na
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62/117 publicação WO 2013/018894, em que o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 102 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 103, ou o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 104 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 105.
[0163]O anticorpo monoclonal contra a CAPRIN-1 descrito na publicação WO 2013/018892, em que o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 106 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 107.
[0164]O anticorpo monoclonal contra a CAPRIN-1 descrito na publicação WO 2013/018891, em que o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 108 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 109.
[0165]O anticorpo monoclonal contra a CAPRIN-1 descrito na publicação WO 2013/018889, em que o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 110 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 111.
[0166]O anticorpo monoclonal contra a CAPRIN-1 descrito na
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63/117 publicação WO 2013/018883, em que o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 112 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 113.
[0167]O anticorpo monoclonal contra a CAPRIN-1 descrito na publicação WO 2013/125636, em que o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 114 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 115.
[0168]O anticorpo monoclonal contra a CAPRIN-1 descrito na publicação WO 2013/125654, em que o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 116 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 117, ou o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 118 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 119.
[0169]O anticorpo monoclonal contra a CAPRIN-1 descrito na publicação WO 2013/125630, em que o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 120 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 121.
[0170]0 anticorpo monoclonal contra a CAPRIN-1 descrito na
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64/117 publicação WO 2015/020212, em que o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 122 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 123; o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 124 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 125; o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 126 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 127; o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 128 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 129; o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 130 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 131; ou o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 132 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 133.
[0171] Uma sequência de nucleotídeos foi projetada para expressar uma região variável da cadeia pesada que compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 que consiste nas sequências de amino ácidos de SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 38, respectivamente, que são de um dos anticorpos
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65/117 monoclonais anti-CAPRIN-1 mencionados acima e as sequências da região de estrutura de um anticorpo de humano. A sequência de nucleotídeos foi inserida em um vetor de expressão de mamífero com uma inserção que codifica uma região constante da cadeia pesada de lgG1 humana. De maneira similar, uma sequência de nucleotídeos foi projetada para expressar uma região variável da cadeia leve que compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 que consiste nas sequências de amino ácidos de SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 e SEQ ID NO: 42, respectivamente, e nas sequências da região de estrutura de um anticorpo de humano; e a sequência de nucleotídeos foi inserida em um vetor de expressão de mamífero com uma inserção que codifica uma região constante da cadeia leve de lgG1 humana. Estes dois vetores de expressão recombinantes foram transferidos para as células de mamífero, de acordo com um método convencional e um sobrenadante de cultura que contém o anticorpo monoclonal humanizado #1 (anticorpo humanizado #1) contra a CAPRIN-1 que compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia pesada as sequências de amino ácidos de SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 38, respectivamente, e CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia leve que consiste nas sequências de amino ácidos de SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 e SEQ ID NO: 42, respectivamente, foram obtidos a partir das células.
[0172] De uma maneira similar, uma sequência de nucleotídeos foi projetada para expressar uma região variável da cadeia pesada representada pela SEQ ID NO: 47 que compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 que consiste nas sequências de amino ácidos de SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 e SEQ ID NO: 46, respectivamente, e nas sequências da região de estrutura de um anticorpo de humano; e a sequência de nucleotídeos foi inserida em um vetor de expressão de mamífero com uma inserção que codifica uma região constante da cadeia pesada de lgG1 humana. De uma maneira similar, uma sequência de nucleotídeos foi projetada para expressar uma região variável da cadeia leve
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66/117 representada pela SEQ ID NO: 51 que compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 que consiste nas sequências de amino ácidos de SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO: 50, respectivamente, e nas sequências da região de estrutura de um anticorpo de humano; e a sequência de nucleotídeos foi inserida em um vetor de expressão de mamífero com uma inserção que codifica uma região constante da cadeia pesada de lgG1 humana. Estes dois vetores de expressão recombinantes foram transferidos para as células de mamífero, de acordo com um método convencional e um sobrenadante de cultura que contém o anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 humanizado #2 (anticorpo humanizado #2) que compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia pesada das sequências de amino ácidos de SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 e SEQ ID NO: 46, respectivamente, e CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia leve que consiste nas sequências de amino ácidos de SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO: 50, respectivamente, foram obtidos das células.
[0173] Um sobrenadante de cultura que contém o anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 humanizado #3 (anticorpo humanizado #3) que compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia pesada que consiste nas sequências de amino ácidos de SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 54, respectivamente, e CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia leve que consiste nas sequências de amino ácidos de SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 58, respectivamente, foi preparado de maneira similar.
[0174] Um sobrenadante de cultura que contém o anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 humanizado #4 (anticorpo humanizado #4) que compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia pesada que consiste nas sequências de amino ácidos de SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61 e SEQ ID N62, respectivamente, e CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia leve que consiste nas sequências de amino ácidos de SEQ ID NO: 64,
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SEQ ID NO: 65 e SEQ ID NO: 66, respectivamente, foi preparado de maneira similar.
[0175]Qs sobrenadantes de cultura que contém os seguintes anticorpos monoclonais anti-CAPRIN-1 humanizados de #9 a #41 (anticorpos humanizados de #9 a #41) foram preparados de uma maneira similar.
[0176]Q anticorpo monoclonal humanizado #9 (anticorpo humanizado #9) que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 68 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 69.
[0177]Q anticorpo monoclonal humanizado #10 (anticorpo humanizado #10) que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 70 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 71.
[0178]Q anticorpo monoclonal humanizado #11 (anticorpo humanizado #11) que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 72 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 73.
[0179]Q anticorpo monoclonal humanizado #12 (anticorpo humanizado #12) que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 74 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 75.
[0180]Q anticorpo monoclonal humanizado #13 (anticorpo humanizado #13) que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ
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ID NO: 76 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 77.
[0181]Q anticorpo monoclonal humanizado #14 (anticorpo humanizado #14) que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 78 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 79.
[0182]Q anticorpo monoclonal humanizado #15 (anticorpo humanizado #15) que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 80 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 81.
[0183]Q anticorpo monoclonal humanizado #16 (anticorpo humanizado #16) que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 82 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 83.
[0184]Q anticorpo monoclonal humanizado #17 (anticorpo humanizado #17) que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 84 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 85.
[0185]Q anticorpo monoclonal humanizado #18 (anticorpo humanizado #18) que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 86 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 87.
[0186]Q anticorpo monoclonal humanizado #19 (anticorpo
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69/117 humanizado #19) que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 88 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 89.
[0187]Q anticorpo monoclonal humanizado #20 (anticorpo humanizado #20) que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 90 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 91.
[0188]Q anticorpo monoclonal humanizado #21 (anticorpo humanizado #21) que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 92 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 93.
[0189]Q anticorpo monoclonal humanizado #22 (anticorpo humanizado #22) que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 94 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 95.
[0190]Q anticorpo monoclonal humanizado #23 (anticorpo humanizado #23) que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 96 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 97.
[0191]Q anticorpo monoclonal humanizado #24 (anticorpo humanizado #24) que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 98 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve
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70/117 representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 99.
[0192]O anticorpo monoclonal humanizado #25 (anticorpo humanizado #25) que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 100 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 101.
[0193]O anticorpo monoclonal humanizado #26 (anticorpo humanizado #26) que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 102 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 103.
[0194]O anticorpo monoclonal humanizado #27 (anticorpo humanizado #27) que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 104 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 105.
[0195]O anticorpo monoclonal humanizado #28 (anticorpo humanizado #28) que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 106 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 107.
[0196]O anticorpo monoclonal humanizado #29 (anticorpo humanizado #29) que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 108 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 109.
[0197]O anticorpo monoclonal humanizado #30 (anticorpo humanizado #30) que compreende a sequência de amino ácidos de uma região
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71/117 variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 110 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 111.
[0198]Q anticorpo monoclonal humanizado #31 (anticorpo humanizado #31) que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 112 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 113.
[0199]Q anticorpo monoclonal humanizado #32 (anticorpo humanizado #32) que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 114 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 115.
[0200]Q anticorpo monoclonal humanizado #33 (anticorpo humanizado #33) que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 116 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 117.
[0201 ]O anticorpo monoclonal humanizado #34 (anticorpo humanizado #34) que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 118 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 119.
[0202]Q anticorpo monoclonal humanizado #35 (anticorpo humanizado #35) que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 120 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 121.
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72/117 [0203]0 anticorpo monoclonal humanizado #36 (anticorpo humanizado #36) que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 122 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 123.
[0204]Q anticorpo monoclonal humanizado #37 (anticorpo humanizado #37) que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 124 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 125.
[0205]0 anticorpo monoclonal humanizado #38 (anticorpo humanizado #38) que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 126 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 127.
[0206]0 anticorpo monoclonal humanizado #39 (anticorpo humanizado #39) que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 128 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 129.
[0207]Q anticorpo monoclonal humanizado #40 (anticorpo humanizado #40) que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 130 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 131.
[0208]0 anticorpo monoclonal humanizado #41 (anticorpo humanizado #41) que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ
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ID NO: 132 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 133.
[0209]Com base no anticorpo humanizado #1 entre estes anticorpos monoclonais anti-CAPRIN-1, uma sequência de nucleotídeos foi projetada para expressar uma região variável da cadeia pesada que compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 que consiste nas sequências de amino ácidos de SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 38, respectivamente, e nas sequências da região de estrutura de um anticorpo de humano. Esta sequência de nucleotídeos foi inserida em um vetor de expressão de mamífero com uma inserção codificando uma região constante de cadeia pesada de IgG 1 humana em que a serina (Ser) na posição de amino ácido 239 em numeração UE é substituída por ácido aspártico (Asp) e a isoleucina (He) na posição de amino ácido 332 na numeração UE é substituída por ácido glutâmico (Glu). Além disso, uma sequência de nucleotídeos foi projetada para expressar a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve que compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 que consiste nas sequências de amino ácidos de SEQ ID NOs: 40, SEQ ID NOs: 41 e SEQ ID N: 42, respectivamente, e nas sequências da região de estrutura de um anticorpo de humano, e a sequência de nucleotídeos foi inserida em um vetor de expressão de mamífero com uma inserção que codifica uma região constante da cadeia leve da lgG1 humana. Estes dois vetores de expressão recombinantes foram transferidos para as células de mamífero, de acordo com um método convencional; e um sobrenadante de cultura que contém o anticorpo monoclonal humanizado #5 (anticorpo humanizado #5) contra a CAPRIN-1 composta de sequência de amino ácidos de cadeia pesada de comprimento completo que consiste na região variável da cadeia pesada projetada acima e a região constante da cadeia pesada de lgG1 humana em que a serina (Ser) na posição de amino ácido 239 em numeração UE é substituída por ácido aspártico (Asp), e a isoleucina (He) na posição de
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74/117 amino ácido 332 em numeração UE é substituída por ácido glutâmico (Glu), e a sequência de amino ácidos de cadeia leve de comprimento completo que consiste na região variável da cadeia leve projetada acima e na região constante da cadeia leve humana, foi obtida a partir das células.
[0210] Um sobrenadante de cultura que contém o anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 humanizado #6 (anticorpo humanizado #6) que compreende a sequência de amino ácidos da região variável da cadeia pesada e a sequência de amino ácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo humanizado #2 produzido acima foi preparado de maneira similar.
[0211] Um sobrenadante de cultura que contém o anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 humanizado #7 (anticorpo humanizado #7) que compreende a sequência de amino ácidos da região variável da cadeia pesada e a sequência de amino ácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo humanizado #3 produzido acima foi preparado de maneira similar.
[0212] Um sobrenadante de cultura que contém o anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 humanizado #8 (anticorpo humanizado #8) que compreende a sequência de amino ácidos da região variável da cadeia pesada e a sequência de amino ácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo humanizado #4 produzido acima foi preparado de maneira similar.
[0213]Os sobrenadantes de cultura contendo cada um os anticorpos anti-CAPRIN-1 humanizados #42 a #74 (anticorpos humanizados #42 a #74) que compreendem a sequência de amino ácidos da região variável da cadeia pesada e a sequência de amino ácidos da região variável da cadeia leve de cada dos anticorpos humanizados de #9 a #41 produzidos acima foram preparados de uma maneira similar.
[0214]Os sobrenadantes de cultura obtidos contendo cada um os anticorpos monoclonais anti-CAPRIN-1 humanizados de #1 a #74 foram submetidos à purificação utilizando a Proteína A de Sepharose Frap de Hitrap
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75/117 (GE Healthcare) de acordo com um método convencional. O tampão foi substituído por PBS (-). O resultante foi filtrado através de um filtro de 0,22 pm (Merck Millipore Corp.) para a preparação dos anticorpos humanizados.
Exemplo 3
Preparação do Conjugado de Anticorpo anti-CAPRIN-1 e Ativador Imune [0215]Os conjugados dos anticorpos policlonais anti-CAPRIN-1 de #1 a #6 descritos no Exemplo 1 com o resiquimod, um ativador imune, foram preparados utilizando a maleimidocaproil-valina-citrulina-paminobenziloxicarbonila (MC-val-Cit-PAB-PNP) como um ligante. A preparação destes conjugados foi realizada com referência ao método descrito na publicação WO 2014/012479.
[0216]20 mg/mL do anticorpo policlonal anti-CAPRIN-1 #0 descrito no Exemplo 1 dissolvido em PBS (-) foi submetido à substituição de tampão com uma solução de 500 mM de borato de sódio e 500 mM de cloreto de sódio (pH 8,0). Após a incubação da solução de anticorpo a 37s C durante 30 minutos com o ditiotreitol 100 mM (DTT), o tampão foi substituído por uma solução de PBS () contendo o ácido dietilenotriaminopentacético a 1 mM (DTPA) utilizando o Sephadex G25, e o resultante foi resfriado em gelo para a preparação do anticorpo policlonal anti-CAPRIN-1 #0reduzido.
[0217] Foi determinada a quantidade de tiol por molécula de anticorpo (raz tiol/anticorpo) através da reação do anticorpo com o DTNB e medindo a absorvância a 412 nm e a absorvância a 280 nm.
[0218]O Resiquimod (Enzo Life Sciences, Inc.) e MC-Val-CitPABC-PNP (Medchem Express) foram misturados em DMSO para possibilitar que o grupo amino do resiquimod reagisse com a benziloxicarbonila de MC-ValCit-PABC-PNP, por conseguinte, preparando uma solução de resiquimod unida ao MC-val-Cit-PAB que, em seguida, foi adicionada ao anticorpo policlonal antiCAPRIN-1 reduzido #1 preparado acima para a sua reação. Após a reação, foi
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76/117 adicionada uma quantidade em excesso de maleimida para terminar a reação, por conseguinte, preparando uma solução que contém um conjugado de anticorpo policlonal anti-CAPRIN-1 #1 descrito no Exemplo 1 com o resiquimod. O conjugado obtido foi concentrado através de ultrafiltração e dessalinizado utilizando o Sephadex G25 em uma solução de PBS (-). O resultante foi esterilizado através da filtração através de um filtro de 0,22 pm para a preparação de uma solução que contém o conjugado de anticorpo policlonal anti-CAPRIN-1 #1 e resiquimod (Conjugado 1).
[0219] Uma solução que contém um conjugado de anticorpo policlonal anti-CAPRIN-1 #2 e resiquimod (Conjugado 2), uma solução de um conjugado de anticorpo policlonal anti-CAPRIN-1 #3 e resiquimod (Conjugado 3), uma solução de um conjugado de anticorpo policlonal anti-CAPRIN-1 #4 e resiquimod (Conjugado 4), uma solução de um conjugado de anticorpo policlonal anti-CAPRIN-1 #5 e resiquimod (Conjugado 5), e uma solução de um conjugado de anticorpo policlonal anti-CAPRIN-1 #6 e o resiquimod (conjugado 6) foram preparadas da mesma maneira, conforme descrito acima.
[0220]Tal como para o anticorpo de controle de coelho descrito no Exemplo 1 não reativo com a proteína CAPRIN-1, uma solução que contém um conjugado do anticorpo de controle de coelho e resiquimod (conjugado de controle 1) também foi preparada da mesma maneira, conforme descrito acima.
[0221] Uma solução que contém um conjugado de anticorpo humanizado #1, que é um anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 descrito no Exemplo 2, com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 7) foi preparada utilizando o anticorpo humanizado #1 da mesma maneira, conforme descrito acima.
[0222] Uma solução que contém um conjugado de anticorpo humanizado #2, que é um anticorpo anti-CAPRIN-1 descrito no Exemplo 2, com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 8), foi preparada utilizando o
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[0223] Uma solução que contém um conjugado de anticorpo humanizado #3 descrito no Exemplo 2 com o ativador imune de resiquimod (conjugado 9); uma solução que contém um conjugado de anticorpo humanizado #4 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 10); uma solução que contém um conjugado de anticorpo humanizado #5 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 11); uma solução que contém um conjugado de anticorpo humanizado #6 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 12); uma solução que contém um conjugado de anticorpo humanizado #7 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 13); uma solução que contém um conjugado de anticorpo humanizado #8 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 14); e as soluções que contêm os conjugados de anticorpos humanizados #9 a #74 com o resiquimod ativador imune (Conjugados de 45 a 110), cada um foi preparado conforme descrito acima.
[0224]As soluções preparadas que contêm os Conjugados de 1 a 14, Conjugados de 45 a 110 e Conjugado de Controle 1 foram cada uma filtrada através de um filtro de 0,22 pm (Merck Millipore Corp.) para a preparação dos conjugados.
Exemplo 4
Preparação do Conjugado de Anticorpo anti-CAPRIN-1 e Ativador Imune [0225]Os conjugados dos anticorpos policlonais anti-CAPRIN-1 descritos no Exemplo 1 com um ativador imune foram preparados através do método seguinte. A 1-(2(2-aminoetoxi)-2-metilpropil)-2-(etoximetil)-1 Himidazo[4,5-c] quinolin-4-amina, um derivado de resiquimod produzido através de homologação de dois carbonos do grupo terciário de hidróxi de resiquimod e a adição de um grupo amino a este, foi preparada como um ativador imune através de síntese, de acordo com um método comum.
[0226] Especificamente, a acetonitrila seca, trietilamina e cloreto de
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78/117 tritilo foram adicionados ao resiquimod e reagidos em uma atmosfera de árgon. Após a reação, o resíduo foi purificado através da cromatografia em coluna de gel de silica. O produto purificado foi dissolvido em DMF desidratada e é reagido com o 2,2-dióxido de 3-Boc-1,2,3-oxatiazolidina adicionado. A fase aquosa foi submetida à extração com oacetato de etila, de acordo com um método comum. A fase orgânica obtida, em seguida, foi purificada através da cromatografia em coluna para a preparação do derivado de resiquimod mencionado acima.
[0227] Em seguida, o seguinte procedimento foi realizado com referência ao método descrito em J. Med. Chem. (2008) 51, 6.916-6.926 de maneira a unir o derivado de resiquimod obtido ao 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidil (SMCC), como ligante.
[0228]O derivado de resiquimod foi dissolvido em diclorometano desidratado em uma atmosfera de árgon. À solução, a diisopropiletilamina e SMCC foram adicionados. A mistura foi deixada reagir à temperatura ambiente durante 2 horas. A mistura de reação foi submetida à purificação para obter um condensado de resiquimod com o SMCC.
[0229] Um conjugado do condensado de resiquimod com o ligante SMCC e anticorpo anti-CAPRIN-1 foi preparado de acordo com um método comum com referência aos métodos descritos na patente US 8.951.528 e JIMD Reports-Case e Research Reports, 2012/5.
[0230]Especificamente, para o anticorpo policlonal anti-CAPRIN-1 #1 dissolvido em um tampão de fosfato, o S-acetiltioacetato de N-succinimidil (SATA) (Thermo Fischer Scientific, Inc.) dissolvido em uma massa molar de 10 vezes de DMSO relativamente ao anticorpo foi adicionado e reagiu à temperatura ambiente durante 30 minutos a pH 8. Em seguida, o tampão foi substituído por um tampão de fosfato contendo 10 mM de EDTA utilizando uma coluna de dessalinizao (Thermo Fischer Scientific, Inc.) para obter uma solução que contém o anticorpo policlonal anti-CAPRIN-1 #1 unido ao SATA. À solução, foi
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79/117 adicionado um tampão de fosfato contendo a hidroxilamina a 0,5 M e EDTA a 25 mM em um volume de 10% em relação à solução, e a mistura foi desacetilada através de reação à temperatura ambiente durante 2 horas. O tampão na solução que contém o anticorpo policlonal anti-CAPRIN-1 #1 unido ao SATAdesacetilado foi substituído por um tampão de fosfato utilizando uma coluna de dessalinização, conforme descrito acima para a preparação de uma solução que contém um anticorpo anti-CAPRIN-1 adicionado ao grupo tiol.
[0231 ]O condensado preparado acima, dissolvido em uma massa molar de 10 a 50 vezes de DMSO relativamente a esse anticorpo, foi adicionado à solução e a mistura foi reagida à temperatura ambiente durante 1 hora. Após a reação, o tampão foi substituído por uma solução de PBS (-) utilizando uma coluna de dessalinização, e o resultante foi concentrado utilizando uma coluna de ultrafiltração e esterilizado através da filtração através de um filtro de 0,2 pm para obter uma solução que contém um conjugado de anticorpo policlonal antiCAPRIN-1 #1 descrito no Exemplo 1 com o derivado de resiquimod (Conjugado 15).
[0232]De maneira similar que acima, uma solução que contém um conjugado de anticorpo policlonal anti-CAPRIN-1 #2 com o derivado de resiquimod (Conjugado 16), uma solução que contém um conjugado de anticorpo policlonal anti-CAPRIN-1 #3 com o ativador imune (Conjugado 17), uma solução que contém um conjugado de anticorpo policlonal anti-CAPRIN-1 #4 com o ativador imune (Conjugado 18), uma solução que contém um conjugado de anticorpo policlonal anti-CAPRIN-1 #5 com o ativador imune (Conjugado 19), e uma solução que contém um conjugado do anticorpo policlonal anti-CAPRIN-1 #6 com o ativador imune (Conjugado 20) foram preparadas.
[0233] Como para o anticorpo de controle de coelho descrito no Exemplo 1 não reativo com a proteína CAPRIN-1, uma solução que contém um
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80/117 conjugado (Conjugado de controle 2) também foi preparada da mesma maneira, conforme descrito acima utilizando o anticorpo de controle de coelho.
[0234] Uma solução que contém um conjugado de anticorpo humanizado #1, que é um dos anticorpos monoclonais anti-CAPRIN-1 descritos no Exemplo 2, com o derivado de resiquimod (Conjugado 21) foi preparada da mesma maneira, conforme descrito acima.
[0235]Uma solução que contém um conjugado de anticorpo humanizado #2, que é um dos anticorpos anti-CAPRIN-1 descritos no Exemplo 2, com o derivado de resiquimod (Conjugado 22) foi obtida da mesma maneira.
[0236] Da mesma maneira, conforme descrito acima, uma solução que contém um conjugado de anticorpo humanizado #3, que é um anticorpo antiCAPRIN-1 descrito no Exemplo 2, com o ativador imune (Conjugado 23); uma solução que contém um conjugado do anticorpo humanizado #4 com o ativador imune (Conjugado 24); uma solução que contém um conjugado de anticorpo humanizado #5 com o ativador imune (Conjugado 25); uma solução que contém um conjugado de anticorpo humanizado #6 com o ativador imune (Conjugado 26); uma solução que contém um conjugado de anticorpo humanizado #7 com o ativador imune (Conjugado 27); e uma solução que contém um conjugado de anticorpo humanizado #8 com o ativador imune (Conjugado 28) foram preparadas.
[0237]De maneira similar que acima, as soluções que contêm os Conjugados de anticorpos humanizados de #9 a #74 com o ativador imune (Conjugados de 111 a 176) foram, cada uma, preparadas.
[0238] As soluções preparadas que contêm os Conjugados de 15 a 28, os Conjugados de 111 a 176 e o Conjugado de Controle 2 foram, cada uma, filtradas através de um filtro de 0,22 pm (Merck Millipore Corp.) para a preparação dos conjugados.
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Exemplo 5 Reatividade Específica do Conjugado com a Proteína CAPRIN-1 e a Célula de Câncer que Expressa CAPRIN-1 [0239] Os Conjugados de 1 a 14 e os Conjugados de 45 a 110 preparados no Exemplo 3 e os Conjugados de 15 a 28 e Conjugados de 111 a 176 preparados no Exemplo 4 foram analisados quanto à sua reatividade específica com uma proteína CAPRIN-1 e à sua reatividade com a superfície da membrana de células das células de câncer de humano e células de câncer de camundongo que expressam uma proteína CAPRIN-1.
[0240]A reatividade específica com a proteína CAPRIN-1 foi determinada por ELISA. Uma solução de proteína CAPRIN-1 a 1 pg/mL foi adicionada a 100 pL/cavidade a uma placa de 96 cavidades e a placa foi deixada em repouso a 4s C durante 18 horas. Cada cavidade foi lavada com o PBS-T três vezes. Em seguida, foi adicionada uma solução de albumina de soro bovino a 0,5% (BSA) a 400 pL/cavidade e a placa foi deixada em repouso à temperatura ambiente durante 3 horas. A solução foi removida e as cavidades foram lavadas com 400 pL/cavidade de PBS-T três vezes. Em seguida, cada uma das soluções que contêm os Conjugados de 1 a 6, Conjugados de 15 a 20, Conjugado de Controle 1 e Conjugado de Controle 2 foi adicionada a 100 pL/cavidade e a placa foi deixada em repouso à temperatura ambiente durante 2 horas. Cada cavidade foi lavada com o PBS-T três vezes. Em seguida, um anticorpo anti-coelho marcado com HRP diluído 5.000 vezes com o PBS foi adicionado a 100 pL/cavidade e deixado em repouso à temperatura ambiente durante 1 hora. Cada cavidade foi lavada com o PBS-T três vezes. Em seguida, uma solução de substrato TMB foi adicionada a 100 pL/cavidade e deixada em repouso durante 15 a 30 minutos para a reação cromogênica. Após o desenvolvimento da cor, a reação foi terminada através da adição de ácido sulfúrico a 1 N a 100 pL/cavidade, e os valores de absorvância a 450 nm e 595 nm foram medidos
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82/117 utilizando um espectrômetro de absorção. Como resultado, os Conjugados de 1 a 6 e os Conjugados de 15 a 20 exibiram um valor de absorvência superior àquele dos conjugados de Controle 1 e 2 como controles negativos e foi descoberto que reagem especificamente com a proteína CAPRIN-1.
[0241 ] Em seguida, a reatividade com a superfície da membrana de células de células de câncer que expressam a CAPRIN-1 foi verificada através da citometria de fluxo. As células de câncer de mama de humano BT-474 (a partir de ATCC) ou células de câncer de mama de camundongo 4T1 (a partir de ATCC) foram centrifugadas em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL (2 x 105 células por tubo). 100 μΙ_ das soluções que contêm cada um dos Conjugados de 1 a 6, Conjugados de 15 a 20, Conjugado de Controle 1, e Conjugado de Controle 2, em seguida, foram cada uma adicionada aos tubos separados. O tubo foi deixado em gelo durantel hora. Após a lavagem com o PBS, IgG anti-coelho marcado com Alexa 488 (H + L) diluído 100 vezes com o PBS (-) contendo 0,5% de FBS (0,5% de FBS-PBS (-)), e o tubo foi deixado em repouso no gelo durantel hora. Após a lavagem com 0,5% de FBS-PBS (-), as células foram suspensas em 0,2 pg/mL de iodeto de propídio e 0,5% de FBS-PBS (-) e a intensidade de fluorescência foi medida utilizando o FACSVerse™ (Becton, Dickinson and Company). Como resultado, foi descoberto que os Conjugados de 1 a 6 e os Conjugados de 15 a 20, que eram os conjugados dos anticorpos policlonais antiCAPRIN-1 e o ativador imune, exibiam uma intensidade de fluorescência mais elevada que aquela do Controle 1 e Controle 2 como controles negativos, isto é, para reagir fortemente com a superfície de células das células de câncer de humano BT474 e as células de câncer de camundongo 4T1 expressando a CAPRIN-1.
[0242]A reatividade dos conjugados com as seguintes células de câncer de humano e células de câncer de camundongo foi verificada de maneira similar: as células de câncer de mama (BT-474), células de câncer de colo e reto
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83/117 (HT-29), células de câncer de pulmão (QG56 e H1650), células de câncer de estômago (NCI-N87), células de câncer de útero (HEC-1-A), células de câncer de próstata (22Rv1), células de câncer de pâncreas (Panel 0,5), células de câncer de fígado (Hep3B), células de câncer de ovário (SKOV3) células de câncer de rim (Caki-2), células de tumor de cérebro (U-87MG), células de câncer de bexiga (T24), células de câncer de estômago (OE33), células de leucemia (OCI-AML5), células de linfoma (Ramos), células de câncer da vesícula biliar TGBC14TKB), células de fibrossarcoma (HT-1080) e células de melanoma (G361), que são as células de câncer de humano que expressam o gene da CAPRIN-1; e as células de câncer de rim de camundongo (Renca) e células de câncer de mama de camundongo (4T1), que são as células de câncer de camundongo que expressam o gene CAPRIN-1. Como resultado da verificação, os Conjugados de 1 a 6 e os Conjugados de 15 a 20, que eram os conjugados dos anticorpos anti-CAPRIN-1 e o ativador imune, exibiram intensidades de fluorescência mais fortes para todas as células de câncer do que aquelas do Conjugado de Controle 1 e Conjugado de Controle 2 como controles negativos e, por conseguinte, mostraram reagir fortemente com a superfície da membrana de células das células de câncer acima expressando a CAPRIN-1.
[0243]Além disso, os anticorpos policlonais anti-CAPRIN-1 de #1 a #6 preparados no Exemplo 1 que não estão conjugados com o ativador imune foram testados de maneira similar. Como resultado da análise da sua reatividade com as células de câncer acima expressando a CAPRIN-1 através da citometria de fluxo, estes anticorpos exibiram intensidades de fluorescência equivalentes àquelas dos Conjugados de 1 a 6 e dos Conjugados de 15 a 20.
[0244] Em seguida, os Conjugados de 7 a 14 e os Conjugados de 45 a 110, que eram os conjugados dos anticorpos monoclonais anti-CAPRIN-1 com o ativador imune preparado no Exemplo 3, e os Conjugados de 21 a 28 e os Conjugados de 111 a 176 preparados no Exemplo 4 foram analisados para a
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84/117 sua reatividade específica com a proteína CAPRIN-1 e a sua reatividade com a superfície da membrana de células de células de câncer de humano e células de câncer de camundongo expressando a CAPRIN-1, de maneira similar que acima. Como resultado, os Conjugados de 7 a 14 e os Conjugados de 21 a 28 exibiram valores de absorvância significativamente mais elevados do que um controle negativo com o PBS (-) adicionado e, por conseguinte, mostraram reagir especificamente com a proteína CAPRIN-1.
[0245]Os Conjugados de 7 a 14, os Conjugados de 45 a 110, os Conjugados de 21 a 28 e os Conjugados de 111 a 176 ainda foram avaliados quanto à sua reatividade com a superfície da membrana de células das células de câncer que expressam a proteína CAPRIN-1. Como resultado, estes conjugados exibiram reatividade significantemente mais intensa que aquela de um conjugado do ativador imune e IgG humana não reativa com a proteína CAPRIN-1, e também exibiram reatividade intensa equivalente àquela dos anticorpos monoclonais anti-CAPRIN-1 de #1 a #74 descrito no Exemplo 2 que não estão conjugados com o ativador imune.
[0246] Estes resultados demonstraram que os conjugados dos anticorpos anti-CAPRIN-1 e o ativador imune preparado acima (Conjugados de 7 a 14, Conjugados de 45 a 110, Conjugados de 21 a 28 e Conjugados de 111 a 176) especificamente se unem à proteína CAPRIN-1 e a superfície de membrana de células de células de câncer que expressam a CAPRIN-1.
Exemplo 6
Efeito Antitumoral do Conjugado 1 [0247] Em seguida, os Conjugados de 1 a 6 e os Conjugados de 15 a 20 preparados utilizando os anticorpos policlonais anti-CAPRIN-1 de #1 a #6 e os Conjugados de 7 a 14 e Conjugados de 21 a 28 preparados utilizando os anticorpos monoclonais anti-CAPRIN-1 nos Exemplos 3 e 4 foram avaliados quanto aos seus efeitos antitumorais in vivo em camundongos portadores de
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85/117 câncer.
[0248]Especificamente, os conjugados da presente invenção foram examinados quanto ao seu efeito antitumoral utilizando os camundongos NOD-SCID em que foram transplantadas as células de câncer derivadas de humanos que expressam a proteína CAPRIN-1. As células de câncer de mama de humano BT474 foram misturadas com o Matrigel (Sigma-Aldrich Corp.) e transplantadas de maneira subcutânea a 107 células/camundongo para os camundongos que, em seguida, foram cultivadas até o tumor se tornar 180 mm3 ou superior para preparar os camundongos portadores de câncer. Ο BT474 expressa a proteína CAPRIN1 na superfície da membrana de células. Conforme mostrado no Exemplo 5, os Conjugados de 1 a 6 e os Conjugados de 15 a 20 preparados utilizando os anticorpos policlonais de #1 a #6 anti-CAPRIN-1 e os Conjugados de 7 a 14 e Conjugados de 21 a 28 preparados utilizando os anticorpos monoclonais anti-CAPRIN-1 especificamente se unem à superfície da membrana de células. Os Conjugados 1 a 28 foram, cada um, administrados a 10 mg/kg nas veias da cauda de 10 camundongos portadores de câncer.
[0249] Uma solução que contém um conjugado de trastuzumab e resiquimod foi preparada através do método descrito no Exemplo 3 e administrada como um controle comparativo na mesma quantidade que acima para os camundongos portadores de câncer. Ο BT474 expressa a proteína HER2, que é um antígeno alvo de trastuzumab, na superfície da membrana de células. O conjugado de trastuzumab e resiquimod especificamente se une ao BT474. A administração aos camundongos portadores de câncer foi realizada uma vez por semana.
[0250]0 PBS (-) foi administrado aos camundongos portadores de câncer, para um controle negativo.
[0251 ]Os tamanhos dos tumores dos camundongos portadores de
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86/117 câncer após a administração foram medidos utilizando os calibradores ao longo do tempo, e os volumes dos tumores foram calculados, de acordo com um método comum com base na expressão: (Comprimento do eixo maior do tumor) x (Comprimento do eixo menor de tumor)2 x 0,5. Como resultado da avaliação, todos os camundongos que receberam os Conjugados de 1 a 6 preparados no Exemplo 3 e os Conjugados de 15 a 20 preparados no Exemplo 4 possuíam inferior a 37% dos volumes de tumor 50 dias após o início da administração em relação ao volume do tumor do controle negativo (100%). Todos os camundongos que receberam os Conjugados de 7 a 14 e os Conjugados de 21 a 28 possuíam inferior a 15% dos volumes dos tumores. O crescimento do câncer nos camundongos que receberam os Conjugados de 11 a 14 e os Conjugados de 25 a 28 foi suprimido precocemente quando comparado com os cânceres nos camundongos que receberam os Conjugados de 7 a 10 e Conjugados de 21 a 24. Como resultado da avaliação similar dos efeitos antitumorais in vivo dos Conjugados de 45 a 176 em camundongos portadores de câncer, todos os camundongos possuíam inferior a 20% dos volumes dos tumores.
[0252]Por outro lado, o volume do tumor dos camundongos que receberam a solução que contém o conjugado de trastuzumab e resiquimod como controle comparativo foi de 54% em relação ao controle negativo.
[0253]Estes resultados de avaliação demonstraram que os Conjugados de 1 a 28 e os Conjugados de 45 a 176 preparados nos Exemplos 3 e 4 utilizando os anticorpos contra a CAPRIN-1 exercem um efeito antitumoral significativamente mais intenso do que aquele do controle negativo. Estes resultados também demonstraram que os Conjugados de 1 a 28 e os Conjugados de 45 a 176 possuem um efeito antitumoral significativamente mais intenso que aquele do conjugado de trastuzumab e resiquimod preparados como controle comparativo.
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Exemplo 7
Efeito Antitumoral do Conjugado 2 [0254]Os conjugados dos anticorpos anti-CAPRIN-1 e do ativador imune (Conjugados de 1 a 28) preparados nos Exemplos 3 e 4 foram avaliados quanto aos seus efeitos antitumorais in vivo em camundongos portadores de câncer.
[0255] Especificamente, os conjugados da presente invenção foram examinados quanto ao seu efeito antitumoral utilizando os camundongos nus Balb/c em que foram transplantadas as células de câncer derivadas de humanos que expressam a CAPRIN-1. As células de câncer de pulmão humano H1650 foram transplantadas de maneira subcutânea para as regiões ventrais dos camundongos que, em seguida, foram cultivadas até o tumor se tornar 180 mm3 ou superior para preparar os camundongos portadores de câncer. As células de câncer de pulmão H1650 expressam a proteína CAPRIN-1 na superfície da membrana de células. Conforme mostrado no Exemplo 5, os Conjugados de 1 a 28 especificamente se unem à CAPRIN-1 na superfície da membrana de células das células de câncer de pulmão H1650. Os Conjugados de 1 a 14 preparados no Exemplo 3 e os Conjugados de 15 a 28 preparados no Exemplo 4 foram cada um administrado a 10 mg/kg para as veias da cauda de 10 camundongos portadores de câncer.
[0256] Foi preparada uma solução que contém um conjugado de cetuximab e resiquimod através do método descrito no Exemplo 3 e foi administrada como um controle comparativo na mesma quantidade que acima aos camundongos portadores de câncer. A administração foi realizada uma vez por semana, em um total de três vezes.
[0257] O PBS (-) foi administrado aos camundongos portadores de câncer, para um controle negativo.
[0258] Os tamanhos dos tumores dos camundongos portadores de câncer após a administração foram medidos utilizando os calibradores ao longo do tempo, e os volumes dos tumores foram calculados, de acordo com um método
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88/117 comum com base na expressão: (Comprimento do eixo maior do tumor) x (Comprimento do eixo menor de tumor)2 x 0,5. Como resultado, os camundongos que receberam os Conjugados de 1 a 6 e os Conjugados de 15 a 20 possuíam inferior a 22% dos volumes dos tumores 25 dias após o início da administração, em relação ao volume do tumor do controle negativo (100%). Todos os camundongos que receberam os Conjugados de 7 a 14 e os Conjugados de 21 a 28 apresentaram inferior a 12% dos volumes dos tumores. O crescimento do câncer nos camundongos que receberam os Conjugados de 11 a 14 e os Conjugados de 25 a 28 foi suprimido precocemente quando comparado com os cânceres nos camundongos que receberam os Conjugados de 7 a 10 e Conjugados de 21 a 24. Como resultado da avaliação similar dos efeitos antitumorais in vivo dos Conjugados de 45 a 176 em camundongos portadores de câncer, os camundongos possuíam inferior a 16% de volumes dos tumores.
[0259] Por outro lado, o volume do tumor dos camundongos que receberam a solução que contém o conjugado de cetuximab e resiquimod como controle comparativo foi de 32% em relação ao controle negativo.
[0260] Estes resultados da avaliação demonstraram que os Conjugados de 1 a 28 e os Conjugados de 45 a 176 exercem um efeito antitumoral significativamente mais intenso que aquele do controle negativo. Esses resultados também demonstraram que os Conjugados de 1 a 28 e os Conjugados de 45 a 176 possuem efeito antitumoral significativamente mais intenso que aquele do conjugado de cetuximab e resiquimod como controle comparativo.
Exemplo 8
Preparação de Conjugado de Anticorpo Monoclonal Quimérico antiCAPRIN-1 de Camundongo e Ativador imune [0261 ]O anticorpos quiméricos de camundongo compostos por uma cadeia pesada que compreende a região variável da cadeia pesada de cada anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 e a região constante da cadeia pesada de
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IgG de camundongo, e uma cadeia leve que compreende a região variável da cadeia leve do anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo foram preparados e, em seguida, os conjugados dos anticorpos com o resiquimod ativador imune foram preparados da mesma maneira que no Exemplo 3. Além disso, os anticorpos quiméricos de camundongo foram preparados e, em seguida, os conjugados do anticorpo com os anticorpos com o derivado de resiquimod foram preparados da mesma maneira que no Exemplo 4.
[0262] Especificamente, os seguintes anticorpos foram utilizados neste Exemplo como anticorpos quiméricos de camundongo que compreendem as regiões variáveis de cadeia leve dos anticorpos monoclonais anti-CAPRIN-1 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo.
[0263]O anticorpo monoclonal contra a CAPRIN-1 descrito na publicação WO 2011/096528, em que o anticorpo compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia pesada que consiste nas sequências de amino ácidos de SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 38, respectivamente, e CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia leve que consiste nas sequências de amino ácidos de SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 e SEQ ID NO: 42, respectivamente, e em que o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela SEQ ID NO: 39 que compreende as CDR1, CDR2 e CDR3 mencionadas acima da região variável da cadeia pesada e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela SEQ ID NO: 43 que compreende as CDR1, CDR2 e CDR3 mencionadas acima da região variável da cadeia leve.
[0264]O anticorpo monoclonal contra a CAPRIN-1 descrito na publicação WO 2015/020212, em que o anticorpo compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia pesada que consiste nas sequências de
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90/117 amino ácidos de SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 e SEQ ID NO: 46, respectivamente, e CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia leve que consiste nas sequências de amino ácidos de SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO: 50, respectivamente, e em que o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela SEQ ID NO: 47 que compreende as CDR1, CDR2 e CDR3 mencionadas acima da região variável da cadeia pesada e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela SEQ ID NO: 51 que compreende as CDR1, CDR2 e CDR3 mencionadas acima da região variável da cadeia leve.
[0265]O anticorpo monoclonal contra a CAPRIN-1 descrito na publicação WO 2011/096519, em que o anticorpo compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia pesada que consiste nas sequências de amino ácidos de SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 54, respectivamente, e CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia leve que consiste nas sequências de amino ácidos de SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 58, respectivamente, e em que o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela SEQ ID NO: 55 que compreende as CDR1, CDR2 e CDR3 mencionadas acima da região variável da cadeia pesada e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela SEQ ID NO: 59 que compreende as CDR1, CDR2 e CDR3 mencionadas acima da região variável da cadeia leve.
[0266]O anticorpo monoclonal contra a CAPRIN-1 descrito na publicação WO 2013/125654, em que o anticorpo compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia pesada que consiste nas sequências de amino ácidos de SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61 e SEQ ID NO: 62, respectivamente, e CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia leve que
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91/117 consiste nas sequências de amino ácidos de SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65 e SEQ ID NO: 66, respectivamente, e em que o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela SEQ ID NO: 63 que compreende as CDR1, CDR2 e CDR3 mencionadas acima da região variável da cadeia pesada e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela SEQ ID NO: 67 que compreende as CDR1, CDR2 e CDR3 mencionadas acima da região variável da cadeia leve.
[0267]O anticorpo monoclonal contra a CAPRIN-1 descrito na publicação WO 2011/096517, o anticorpo que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 68 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 69.
[0268]O anticorpo monoclonal contra a CAPRIN-1 descrito na publicação WO 2011/096528, em que o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 70 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 71; o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 72 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 73; o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 74 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 75; o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia
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92/117 pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 76 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 77; ou o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 78 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 79.
[0269]Q anticorpo monoclonal contra a CAPRIN-1 descrito na publicação WO 2011/096533, em que o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 80 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 81, ou o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 82 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 83.
[0270]Q anticorpo monoclonal contra a CAPRIN-1 descrito na publicação WO 2011/096534, em que o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 84 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 85, ou o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 86 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 87.
[0271 ]O anticorpo monoclonal contra a CAPRIN-1 descrito na
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93/117 publicação WO 2010/016526, em que o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 88 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 89; o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 90 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 91; o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 92 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 93; o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 94 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 95; o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 96 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 97; o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 98 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 99; ou o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 100 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 101.
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94/117 [0272]O anticorpo monoclonal contra a CAPRIN-1 descrito na publicação WO 2013/018894, em que o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 102 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 103, ou o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 104 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 105.
[0273]O anticorpo monoclonal contra a CAPRIN-1 descrito na publicação WO 2013/018892, o anticorpo que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 106 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 107.
[0274]O anticorpo monoclonal contra a CAPRIN-1 descrito na publicação WO 2013/018891, o anticorpo que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 108 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 109.
[0275]O anticorpo monoclonal contra a CAPRIN-1 descrito na publicação WO 2013/018889, o anticorpo que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 110 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 111.
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95/117 [0276]O anticorpo monoclonal contra a CAPRIN-1 descrito na publicação WO 2013/018883, o anticorpo que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 112 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 113.
[0277]O anticorpo monoclonal contra a CAPRIN-1 descrito na publicação WO 2013/125636, o anticorpo que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 114 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 115.
[0278]O anticorpo monoclonal contra a CAPRIN-1 descrito na publicação WO 2013/125654, em que o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 116 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 117, ou o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 118 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 119.
[0279]O anticorpo monoclonal contra a CAPRIN-1 descrito na publicação WO 2013/125630, o anticorpo que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 120 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 121.
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96/117 [0280]0 anticorpo monoclonal contra a CAPRIN-1 descrito na publicação WO 2015/020212, em que o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 122 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 123; o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 124 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 125; o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 126 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 127; o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 128 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 129; o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 130 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 131; ou o anticorpo compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 132 e a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 133.
[0281 ]Os anticorpos quiméricos de camundongo foram preparados pelo seguinte método.
[0282] Especificamente, um fragmento de amplificação de um gene
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97/117 que codifica uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos representada pela SEQ ID NO: 39, de acordo com a presente invenção, foi tratada nas suas duas extremidades com as enzimas de restrição, em seguida, purificada e inserida em um vetor que compreende as inserções de uma sequência líder derivada de anticorpo de humano e a região constante de cadeia pesada de IgG de camundongo, de acordo com um método comum. Além disso, um fragmento de amplificação de um gene que codifica uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos representada pela SEQ ID NO: 43 foi tratado nas suas duas extremidades com as enzimas de restrição, em seguida, purificado e inserido em um vetor que já inclui as inserções de uma sequência líder derivada de anticorpo de humano, e a região constante de cadeia leve de IgG de camundongo, de acordo com um método comum.
[0283] Em seguida, o vetor recombinante que possui uma inserção de gene da região variável da cadeia pesada do anticorpo contra a CAPRIN-1, conforme descrito acima, e o vetor recombinante que possui uma inserção de gene da região variável da cadeia leve do anticorpo, foram transferidos para as células de mamífero, de acordo com um método comum e uma solução que contém o anticorpo quimérico de camundongo #1 composto por uma cadeia pesada que compreende a região variável da cadeia pesada do anticorpo contra a CAPRIN-1 representada pela SEQ ID NO: 39 e a região constante da cadeia pesada de IgG de camundongo e a cadeia leve que compreende a região variável da cadeia leve representada pela SEQ ID NO: 43 do anticorpo contra a CAPRIN-1 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo.
[0284] Uma solução que contém o anticorpo quimérico #2 de camundongo composto por uma cadeia pesada que compreende uma região variável da cadeia pesada que possui a sequência de amino ácidos representada pela SEQ ID NO: 47 e a região constante da cadeia pesada de IgG de
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98/117 camundongo, e uma cadeia leve que compreende uma região variável da cadeia leve que possui a sequência de amino ácidos representada pela SEQ ID NO: 51 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo foi preparada de uma maneira similar.
[0285] Uma solução que contém o anticorpo quimérico de camundongo #3 composto por uma cadeia pesada que compreende uma região variável da cadeia pesada que possui a sequência de amino ácidos representada pela SEQ ID NO: 55 e a região constante de cadeia pesada de IgG de camundongo, e uma cadeia leve que compreende uma região variável da cadeia leve que possui a sequência de amino ácidos representada pela SEQ ID NO: 59 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo foi preparada de uma maneira similar.
[0286] Uma solução que contém o anticorpo quimérico de camundongo #4 composto por uma cadeia pesada que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos representada pela SEQ ID NO: 63 e a região constante da cadeia pesada de IgG de camundongo, e uma cadeia leve que compreende uma região variável da cadeia leve que possui a sequência de amino ácidos representada pela SEQ ID NO: 67 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo foi preparada de uma maneira similar.
[0287]As soluções que contêm os seguintes anticorpos quiméricos de camundongo #5 a #37 foram preparadas de uma maneira similar.
[0288]Q anticorpo quimérico de camundongo #5 composto por uma cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 68 e a região constante da cadeia pesada de IgG de camundongo e uma cadeia leve que compreende a sequência de amino ácido de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 69
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99/117 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo.
[0289]O anticorpo quimérico de camundongo #6 composto por uma cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 70 e a região constante da cadeia pesada de IgG de camundongo e uma cadeia leve que compreende a sequência de amino ácido de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 71 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo.
[0290] Uma solução que contém o anticorpo quimérico de camundongo #7 composto por uma cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 72 e a região constante da cadeia pesada de IgG de camundongo e uma cadeia leve que compreende a sequência de amino ácido de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 73 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo.
[0291 ]O anticorpo quimérico de camundongo #8 composto por uma cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 74 e a região constante da cadeia pesada de IgG de camundongo e uma cadeia leve que compreende a sequência de amino ácido de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 75 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo.
[0292]Q anticorpo quimérico de camundongo #9 composto por uma cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 76 e a região constante da cadeia pesada de IgG de camundongo e uma cadeia leve que compreende a sequência de amino ácido de uma região variável
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100/117 da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 77 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo.
[0293]Q anticorpo quimérico de camundongo #10 composto por uma cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 78 e a região constante da cadeia pesada de IgG de camundongo e uma cadeia leve que compreende a sequência de amino ácido de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 79 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo.
[0294]Q anticorpo quimérico de camundongo #11 composto por uma cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 80 e a região constante da cadeia pesada de IgG de camundongo e uma cadeia leve que compreende a sequência de amino ácido de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 81 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo.
[0295]Q anticorpo quimérico de camundongo #12 composto por uma cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 82 e a região constante da cadeia pesada de IgG de camundongo e uma cadeia leve que compreende a sequência de amino ácido de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 83 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo.
[0296]Q anticorpo quimérico de camundongo #13 composto por uma cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 84 e a região constante da cadeia pesada de IgG de camundongo e uma cadeia leve que compreende a sequência de amino ácido de uma região
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101/117 variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 85 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo.
[0297]O anticorpo quimérico de camundongo #14 composto por uma cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 86 e a região constante da cadeia pesada de IgG de camundongo e uma cadeia leve que compreende a sequência de amino ácido de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 87 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo.
[0298]O anticorpo quimérico de camundongo #15 composto por uma cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 88 e a região constante da cadeia pesada de IgG de camundongo e uma cadeia leve que compreende a sequência de amino ácido de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 89 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo.
[0299]O anticorpo quimérico de camundongo #16 composto por uma cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 90 e a região constante da cadeia pesada de IgG de camundongo e uma cadeia leve que compreende a sequência de amino ácido de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 91 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo.
[0300]0 anticorpo quimérico de camundongo #17 composto por uma cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 92 e a região constante da cadeia pesada de IgG de camundongo e uma cadeia leve que compreende a sequência de amino ácido de uma região
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102/117 variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 93 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo.
[0301 ]O anticorpo quimérico de camundongo #18 composto por uma cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 94 e a região constante da cadeia pesada de IgG de camundongo e uma cadeia leve que compreende a sequência de amino ácido de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 95 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo.
[0302]Q anticorpo quimérico de camundongo #19 composto por uma cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 96 e a região constante da cadeia pesada de IgG de camundongo e uma cadeia leve que compreende a sequência de amino ácido de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ SEQ ID NO: 97 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo.
[0303]0 anticorpo quimérico de camundongo #20 composto por uma cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 98 e a região constante da cadeia pesada de IgG de camundongo e uma cadeia leve que compreende a sequência de amino ácido de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 99 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo.
[0304]Q anticorpo quimérico de camundongo #21 composto por uma cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 100 e a região constante da cadeia pesada de IgG de camundongo e uma cadeia leve que compreende a sequência de amino ácido
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103/117 de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 101 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo.
[0305]0 anticorpo quimérico de camundongo #22 composto por uma cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 102 e a região constante da cadeia pesada de IgG de camundongo e uma cadeia leve que compreende a sequência de amino ácido de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 103 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo.
[0306]0 anticorpo quimérico de camundongo #23 composto por uma cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 104 e a região constante da cadeia pesada de IgG de camundongo e uma cadeia leve que compreende a sequência de amino ácido de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 105 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo.
[0307]0 anticorpo quimérico de camundongo #24 composto por uma cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 106 e a região constante da cadeia pesada de IgG de camundongo e uma cadeia leve que compreende a sequência de amino ácido de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 107 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo.
[0308]0 anticorpo quimérico de camundongo #25 composto por
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104/117 uma cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 108 e a região constante da cadeia pesada de IgG de camundongo e uma cadeia leve que compreende a sequência de amino ácido de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 109 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo.
[0309]Q anticorpo quimérico de camundongo #26 composto por uma cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 110 e a região constante da cadeia pesada de IgG de camundongo e uma cadeia leve que compreende a sequência de amino ácido de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 111 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo.
[0310]Q anticorpo quimérico de camundongo #27 composto por uma cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 112 e a região constante da cadeia pesada de IgG de camundongo e uma cadeia leve que compreende a sequência de amino ácido de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 113 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo.
[0311]O anticorpo quimérico de camundongo #28 composto por uma cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 114 e a região constante da cadeia pesada de IgG de camundongo e uma cadeia leve que compreende a sequência de amino ácido
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105/117 de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 115 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo.
[0312]O anticorpo quimérico de camundongo #29 composto por uma cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 116 e a região constante da cadeia pesada de IgG de camundongo e uma cadeia leve que compreende a sequência de amino ácido de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 117 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo.
[0313]O anticorpo quimérico de camundongo #30 composto por uma cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 118 e a região constante da cadeia pesada de IgG de camundongo e uma cadeia leve que compreende a sequência de amino ácido de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 119 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo.
[0314]O anticorpo quimérico de camundongo #31 composto por uma cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 120 e a região constante da cadeia pesada de IgG de camundongo e uma cadeia leve que compreende a sequência de amino ácido de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 121 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo.
[0315]O anticorpo quimérico de camundongo #32 composto por
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106/117 uma cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 122 e a região constante da cadeia pesada de IgG de camundongo e uma cadeia leve que compreende a sequência de amino ácido de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 123 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo.
[0316]O anticorpo quimérico de camundongo #33 composto por uma cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 124 e a região constante da cadeia pesada de IgG de camundongo e uma cadeia leve que compreende a sequência de amino ácido de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 125 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo.
[0317]O anticorpo quimérico de camundongo #34 composto por uma cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 126 e a região constante da cadeia pesada de IgG de camundongo e uma cadeia leve que compreende a sequência de amino ácido de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 127 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo.
[0318]O anticorpo quimérico de camundongo #35 composto por uma cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 128 e a região constante da cadeia pesada de IgG de camundongo e uma cadeia leve que compreende a sequência de amino ácido
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107/117 de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 129 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo.
[0319]O anticorpo quimérico de camundongo #36 composto por uma cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 130 e a região constante da cadeia pesada de IgG de camundongo e uma cadeia leve que compreende a sequência de amino ácido de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 131 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo.
[0320]0 anticorpo quimérico de camundongo #37 composto por uma cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de uma região variável da cadeia pesada representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 132 e a região constante da cadeia pesada de IgG de camundongo e uma cadeia leve que compreende a sequência de amino ácido de uma região variável da cadeia leve representada pela sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 133 e a região constante da cadeia leve de IgG de camundongo.
[0321 ]O sobrenadante da cultura preparada contendo cada um dos anticorpos quiméricos de camundongo de #1 a #37 foi purificado de acordo com um método convencional utilizando a Proteína A da Sepharose Hitrap FF (GE Healthcare Japan Corp.). O tampão foi substituído por PBS (-) e o resultante foi filtrado através de um filtro de 0,22 pm (Merck Millipore Corp.) para a preparação dos anticorpos quiméricos de camundongo.
[0322]Os conjugados com o resiquimod foram preparados da mesma maneira que o método descrito no Exemplo 3 utilizando os anticorpos quiméricos de camundongo de #1 a #37 preparados acima. As soluções que
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108/117 contêm um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #1 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 29), um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #2 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 30), um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #3 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 31), um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #4 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 32), um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #5 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 177), um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #6 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 178), um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #7 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 179), um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #8 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 180), um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #9 (Conjugado 181), um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #10 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 182), um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #11 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 183), um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #12 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 184), um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #13 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 185), um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #14 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 186), um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #15 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 187), um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #16 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 188), um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #17 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 189), um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #18 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 190), um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #19 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 191), um
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109/117 conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #20 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 192), um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #21 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 193), um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #22 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 194), um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #23 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 195), um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #24 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 196), um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #25 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 197), um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #26 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 198), um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #27 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 199), um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #28 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 200), um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #29 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 201), um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #30 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 202), um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #31 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 203), um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #32 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 204), um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #33 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 205), um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #34 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 206), um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #35 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 207), um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #36 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 208) e um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #37 com o ativador imune de resiquimod (Conjugado 209) foram preparados.
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110/117 [0323]Além disso, os conjugados com o derivado de resiquimod foram preparados da mesma maneira que o método descrito no Exemplo 4 utilizando os anticorpos quiméricos de camundongo de #1 a #37 preparados acima. As soluções que contêm um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #1 com o derivado de resiquimod (Conjugado 33), um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #2 com o derivado de resiquimod (Conjugado 34), um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #3 com o derivado de resiquimod (Conjugado 34) 35), e um conjugado de anticorpo quimérico de camundongo #4 com o derivado de resiquimod (Conjugado 36) foram preparadas. As soluções que contêm os conjugados de anticorpos quiméricos de camundongo #5 a #37 com o derivado de resiquimod (Conjugados de 210 a 242) foram preparadas de uma maneira similar.
[0324]As soluções preparadas que contêm os Conjugados de 29 a 36, os Conjugados de 177 a 242 e o Conjugado de Controle 2 foram, cada uma, filtradas através de um filtro de 0,22 pm (fabricado por Merck Millipore Corp.) para a preparação dos conjugados.
[0325] Os Conjugados de 29 a 36 e os Conjugados de 177 a 242 foram analisados quanto à sua reatividade específica com a proteína CAPRIN-1 de maneira similar que no Exemplo 5 utilizando as soluções preparadas que contêm os Conjugados de 29 a 36 e os Conjugados de 177 a 242. Como resultado, as soluções que contêm os Conjugados de 29 a 36 e os Conjugados de 177 a 242 exibiram cada um uma reatividade específica com a proteína CAPRIN-1.
[0326] De maneira adicional, os Conjugados de 29 a 36 e os Conjugados de 177 a 242 foram analisados quanto à sua reatividade com as células de câncer através da citometria de fluxo utilizando as células de câncer que expressam a CAPRIN-1 na superfície da membrana de células. Como resultado, todos os conjugados exibiram intensidade de fluorescência mais
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111/117 intensa que aquela do controle negativo. Também, foi descoberto que os conjugados exibiam uma reatividade intensa equivalente àquela dos anticorpos monoclonais anti-CAPRIN-1 descritos nos anticorpos quiméricos de camundongo de #1 a #37 preparados acima, não conjugados com o ativador imune.
Exemplo 9
Efeito antitumoral do Conjugado de Anticorpo Monoclonal Quimérico anti-CAPRIN-1 de Camundongo e Ativador Imune [0327]Os conjugados dos anticorpos monoclonais quiméricos antiCAPRIN-1 de camundongo e do ativador imune (Conjugados de 29 a 36 e Conjugados de 177 a 242) preparados no Exemplo 8 foram avaliados quanto aos seus efeitos antitumorais in vivo dos anticorpos em camundongos portadores de câncer.
[0328]Especificamente, os conjugados da presente invenção foram examinados quanto ao seu efeito antitumoral utilizando os camundongos Balb/c em que foram transplantadas as células de câncer derivadas de camundongo que expressam a CAPRIN-1. As células 4T1 de câncer de mama de camundongo foram transplantadas de maneira subcutânea a 104 células/camundongo para as regiões ventrais dos camundongos que, em seguida, foram cultivadas até o tumor se tornar 30 mm3 ou superior para preparar os camundongos portadores de câncer. Conforme mostrado no Exemplo 5, as células de câncer de mama 4T1 são células que expressam a proteína CAPRIN-1 na superfície da membrana de células. As soluções que contêm os Conjugados de 29 a 36 preparadas no Exemplo 8 especificamente se unem à CAPRIN-1 na superfície da membrana de células das células de câncer de mama 4T1. Os Conjugados de 29 a 36 preparados no Exemplo 8 foram cada um administrados a 8 mg/kg nas veias da cauda de 10 camundongos portadores de câncer. Os anticorpos
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112/117 quiméricos de camundongo de #1 a #4 foram cada um administrados como um controle comparativo na mesma quantidade que acima para os camundongos portadores de câncer. A administração foi realizada duas vezes por semana, em um total de quatro vezes. O PBS (-) foi administrado aos camundongos portadores de câncer, para um controle negativo. Os tamanhos dos tumores dos camundongos portadores de câncer após a administração foram medidos utilizando os calibradores ao longo do tempo, e os volumes dos tumores foram calculados, de acordo com um método comum com base na expressão: (Comprimento do eixo maior do tumor) x (Comprimento do eixo menor de tumor)2 x 0,5. Como resultado, todos os camundongos que receberam os Conjugados de 29 a 36 possuíam 0% do volume do tumor 20 dias após o início da administração em relação ao volume do tumor do controle negativo (100%). Além disso, os camundongos que receberam os anticorpos quiméricos de camundongo de #1 a #4 apenas possuíam 69% do volume do tumor em média em relação ao volume do tumor dos camundongos de controle negativos (100%). Estes resultados da avaliação demonstraram que os conjugados de resiquimod e os anticorpos quiméricos anti-CAPRIN-1 de camundongo (anticorpos quiméricos de camundongo) (Conjugados de 29 a 32) e os conjugados do derivado de resiquimod e estes anticorpos (Conjugados de 33 a 36) preparados no Exemplo 8 exercem um efeito antitumoral mais intenso quando comparado com o controle negativo e no caso de administrar o anticorpo anti-CAPRIN1 isoladamente aos camundongos portadores de câncer. Como resultado da avaliação similar dos Conjugados de 177 a 242 quanto aos seus efeitos antitumorais, todos os camundongos que receberam os Conjugados de 29 a 36 possuíam 0% do volume do tumor em relação ao volume do tumor do controle negativo (100%). Os camundongos que receberam os anticorpos quiméricos de camundongo de #5 a #37 isoladamente possuíam 69% do
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113/117 volume do tumor em média em relação ao volume do tumor do controle negativo (100%).
Exemplo 10
Efeito antitumoral do Conjugado 3 [0329]Um efeito antitumoral in vivo em camundongos portadores de câncer foi comparado entre os Conjugados de 7 a 14, Conjugados de 21 a 28, e Conjugados de 45 a 179 preparados no Exemplo 4 utilizando os anticorpos monoclonais anti-CAPRIN-1, e um conjugado de trastuzumab preparado na mesma maneira como no Exemplo 4, utilizando ο anticorpo existente de droga trastuzumab para um câncer, ou trastuzumab.
[0330]0 conjugado de trastuzumab é um conjugado preparado da mesma maneira que no Exemplo 4 utilizando o trastuzumab e o ativador imune. O conjugado de trastuzumab e o ativador imune foram preparados através do método seguinte.
[0331 ]Com referência a J. Med. Chem. 2008, 51, 6.916-6.926, o 4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato de succinimidil (SMCC) foi condensado com a 1-(2(2-aminoetoxi)-2-metilpropil)-2-(etoximetil)-1 Himidazo[4,5-c]quinolin-4-amina, um derivado de resiquimod produzido através de homologação de dois carbonos do grupo terciário hidróxi de resiquimod e a adição de um grupo amino ao mesmo para obter um condensado de resiquimod unido ao SMCC, como o ativador imune.
[0332]No entanto, o trastuzumab foi utilizado na preparação do conjugado após a remoção de uma composição de formulação contida em uma solução utilizando um ultrafiltro, ou apenas o trastuzumab purificador de afinidade utilizando um veículo de proteína A e adicionando o trastuzumab a um tampão de fosfato. Um conjugado do condensado de resiquimod com o ligante SMCC, conforme descrito acima, e um anticorpo anti-CAPRIN-1 foi preparado de acordo com um método comum com
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114/117 referência aos métodos descritos na patente US 8.951.528 e nos Relatórios de Casos e Pesquisa de JIMD, 2012/5. Utilizando o trastuzumab dissolvido em um tampão de fosfato, foi obtida uma solução que contém o trastuzumab adicionado com o SATA da mesma maneira que no Exemplo 4. Esta solução ainda foi reagida com o condensado preparado acima para a preparação de uma solução que contém um conjugado de trastuzumab e o derivado de resiquimod. (Conjugado de trastuzumab). O conjugado de trastuzumab obtido foi verificado através da citometria de fluxo para exibir a reatividade com as células de câncer de mama de humano utilizadas na avaliação do efeito antitumoral. Foi ainda verificado através da espectrometria de massa que o conjugado de trastuzumab preparado para ser comparado, e os Conjugados de 7 a 14, Conjugados de 21 a 28, e Conjugados de 45 a 179 preparados no Exemplo 4 utilizando os anticorpos monoclonais antiCAPRIN-1, possuem números de moléculas comparáveis do ativador imune unido nesse local e os conjugados verificados foram utilizados na avaliação seguinte.
[0333] Para a comparação do efeito antitumoral, as células de câncer de mama de humano BT474 foram misturadas com o Matrigel (Sigma-Aldrich Corp.) e transplantadas de maneira subcutânea a 107 células/camundongo para os camundongos, que foram cultivados até que o tumor se tornasse 150 mm3 ou superior para a preparação dos camundongos portadores de câncer. Foi descoberto que ο BT474 expressa a proteína CAPRIN-1 e o HER2, que é um antígeno alvo do trastuzumab, na superfície da membrana de células.
[0334]Os conjugados do anticorpo anti-CAPRIN-1 (Conjugados de 7 a 14, Conjugados de 21 a 28 e Conjugados de 45 a 179) e o conjugado trastuzumab preparado acima foram administrados cada um a 10 mg/kg às veias da cauda de 10 camundongos portadores de câncer. A administração
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115/117 foi realizada duas vezes por semana, em um total de 13 vezes. Para comparação, os anticorpos anti-CAPRIN-1 utilizados na preparação dos conjugados do anticorpo anti-CAPRIN-1 (Conjugados de 7 a 14, Conjugados de 21 a 28 e Conjugados de 45 a 179) e trastuzumab foram administrados na mesma maneira como acima. O PBS (-) foi administrado aos camundongos portadores de câncer, para um controle negativo.
[0335]Os tamanhos dos tumores dos camundongos portadores de câncer após a administração foram medidos utilizando os calibradores ao longo do tempo, e os volumes dos tumores foram calculados, de acordo com um método comum com base na expressão: (Comprimento do eixo maior do tumor) x (Comprimento do eixo menor de tumor)2 x 0,5. Como resultado da avaliação, todos os camundongos que receberam os Conjugados de 11 e 25 possuíam inferior a 15% dos volumes dos tumores 45 dias após o início da administração, em relação ao volume do tumor do controle negativo (100%). Os camundongos que receberam os anticorpos anti-CAPRIN-1 não conjugados a serem comparados possuíam inferior a 50% do volume do tumor. A partir desses resultados, foi demonstrado que a conjugação do ativador imune ao anticorpo anti-CAPRIN-1 intensificou o efeito antitumoral do anticorpo em 77%. A taxa de intensificação foi calculada com base na expressão: 1 - (Volume do tumor determinado com o conjugado / Volume do tumor determinado com o anticorpo isoladamente) x 100 (%).
[0336] Por outro lado, os camundongos que receberam o conjugado de trastuzumab e os camundongos que receberam o trastuzumab não conjugado a ser comparado apresentaram volumes dos tumores de 53% e 74%, respectivamente, em relação ao volume do tumor do controle negativo (100%). Por conseguinte, a taxa de intensificação do efeito antitumoral através da conjugação do ativador imune ao trastuzumab foi apenas inferior a 29%.
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Exemplo 11
Preparação do Conjugado de Anticorpo anti-CAPRIN-1 e Ativador imune e Efeito antitumoral do Conjugado [0337]Os conjugados de anticorpos humanizados de #1 a #8 que eram os anticorpos monoclonais anti-CAPRIN-1 descritos no Exemplo 2 com um ativador imune DSR-6434 (6-amino-2(butilamino)-9-[[6-[2-(dimetilamino)etoxi]-3piridinil]metil]-7,9-diidro-8H-purina-8-ona) (Conjugados de 37 a 44) foram preparados. Especificamente, um condensado de DSR-6434 com o succinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato (SMCC) por meio do grupo amino de DSR-6434, em primeiro lugar, foi sintetizado e, em seguida, as soluções que contêm os conjugados de anticorpos humanizados de #1 a #8 e o ativador imune RSR-6434 (Conjugados de 37 a 44) foram preparadas basicamente de acordo com o método descrito no Exemplo 4.
[0338]Cada uma das soluções preparadas que contêm os Conjugados de 37 a 44 foi filtrada através de um filtro de 0,22 pm (Merck Millipore Corp.) para a preparação dos conjugados. Os conjugados foram analisados quanto à sua reatividade específica com a proteína CAPRIN-1 da mesma maneira que no Exemplo 5. Como resultado, as soluções que contêm os Conjugados de 37 a 44 exibiram, cada uma, a reatividade específica com a proteína CAPRIN-1.
[0339]Os Conjugados de 37 a 44 ainda foram analisados quanto à sua reatividade com as células de câncer através da citometria de fluxo utilizando as células de câncer que expressam a proteína CAPRIN-1 na superfície da membrana de células. Como resultado, todos os conjugados exibiram intensidade de fluorescência mais intensa que aquela do controle negativo. Foi descoberto que os conjugados exibem intensidade de fluorescência similar àquela dos anticorpos utilizados isoladamente nos conjugados.
[0340] Os Conjugados de 37 a 44 foram avaliados quanto a seus
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117/117 efeitos antitumorais em camundongos portadores de câncer. Os conjugados do anticorpo anti-CAPRIN-1 (Conjugados de 37 a 44) foram administrados cada um a 10 mg/kg às veias da cauda de 10 camundongos portadores de câncer de maneira similar que o método descrito no Exemplo 10. A administração foi realizada duas vezes por semana em um total de 16 vezes. Os anticorpos antiCAPRIN-1 utilizados na preparação dos conjugados e o trastuzumab foram administrados de maneira similar que acima. O PBS (-) foi administrado aos camundongos portadores de câncer, para um controle negativo.
[0341 ]Os tamanhos dos tumores dos camundongos portadores de câncer após a administração foram medidos utilizando os calibradores ao longo do tempo, e os volumes dos tumores foram calculados, de acordo com um método comum com base na expressão: (Comprimento do eixo maior do tumor) x (Comprimento do eixo menor de tumor)2 x 0,5. Como resultado da avaliação, todos os camundongos que receberam os Conjugados de 37 a 44 apresentaram inferior a 32% dos volumes dos tumores, 50 dias após o início da administração, em relação ao volume do tumor do controle negativo (100%). Os camundongos que receberam os anticorpos anti-CAPRIN-1 não conjugados a serem comparados possuíam inferior a 50% do volume do tumor. A partir desses resultados, a conjugação do ativador imune com o anticorpo anti-CAPRIN-1 mostrou intensificar o efeito antitumoral em mais de 35%. A taxa de intensificação foi calculada com base na expressão: 1 - (Volume do tumor determinado com o conjugado / Volume do tumor determinado com o anticorpo isoladamente) x 100 (%).

Claims (14)

  1. Reivindicações
    1. CONJUGADO DE UM ANTICORPO ou um seu fragmento ligado a um ativador imune, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou o seu fragmento possui a reatividade imunológica com uma proteína CAPRIN-1 que possui uma sequência de amino ácidos representada por qualquer SEQ ID NOs de números pares entre as SEQ ID NOs: de 2 a 30 ou uma sequência de amino ácidos que possui 80% ou superior de identidade de sequência com a sequência de amino ácidos.
  2. 2. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento possui a reatividade imunológica com um polipeptídeo parcial da proteína CAPRIN-1, em que o polipeptídeo parcial possui uma sequência de amino ácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: de 31 a 35 e de 296 a 299, 308 e 309 ou uma sequência de amino ácidos que possui 80% ou superior de identidade de sequência com a sequência de amino ácidos.
  3. 3. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal.
  4. 4. CONJUGADO, de acordo com as reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou o seu fragmento é qualquer um dos seguintes de (A) a (M):
    (A) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 36, 37 e 38 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 40, 41 e 42 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1,
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    2/12 (B) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 44, 45 e 46 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 48, 49 e 50 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1, (C) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 52, 53 e 54 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 56, 57 e 58 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1, (D) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 60, 61 e 62 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 64, 65 e 66 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1, (E) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 170, 171 e 172 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 173, 174 e 175 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1,
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    3/12 (F) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 176, 177 e 178 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 179, 180 e 181 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1, (G) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 182, 183 e 184 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 185, 186 e 187 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1, (H) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 188, 189 e 190 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 191, 192 e 193 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1, (I) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 146, 147 e 148 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 149, 150 e 151 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1,
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    4/12 (J) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 272, 273 e 274 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 275, 276 e 277 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1, (K) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 290, 291 e 292 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 293, 294 e 295 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1, (L) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 301, 302 e 303 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 305, 306 e 307 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1, (M) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 134, 135 e 136 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável da cadeia leve que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 137, 138 e 139 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui a reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1.
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  5. 5/12
    5. CONJUGADO, de acordo com as reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou o seu fragmento é qualquer um dos seguintes de (a) a (al):
    (a) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 39 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 43, (b) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 47 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 51, (c) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 55 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 59, (d) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 63 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 67, (e) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 68 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 69, (f) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 70 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 71, (g) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma
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  6. 6/12 região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 72 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 73, (h) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 74 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 75, (i) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 76 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 77, (j) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 78 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 79, (k) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 80 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 81, (l) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 82 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 83;
    (m) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 84 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 85;
    (n) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma
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  7. 7/12 região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 86 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 87, (o) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 88 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 89, (p) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 90 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 91, (q) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 92 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 93, (r) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 94 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 95;
    (s) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 96 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 97, (t) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 98 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 99, (u) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma
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  8. 8/12 região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 100 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 101, (v) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 102 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 103, (w) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 104 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 105, (x) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 106 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 107;
    (y) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 108 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 109, (z) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 110 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 111, (aa) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 112 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 113, (ab) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma
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  9. 9/12 região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 114 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 115, (ac) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 116 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 117, (ad) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 118 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 119, (ae) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 120 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 121, (af) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 122 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 123, (ag) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NOs: 124 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NOs: 125, (ah) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 126 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 127, (ai) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma
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  10. 10/12 região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NOs: 128 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NOs: 129, (aj) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 130 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 131, (ak) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 132 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 133 e (al) um anticorpo ou um seu fragmento, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 300 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 304.
    6. CONJUGADO, de acordo com as reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo de humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico ou um anticorpo de cadeia única.
    7. CONJUGADO, de acordo com as reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o ativador imune é um ligante ou um agonista que se une ao receptor do tipo Toll (TLR), receptor do tipo NOD (NLR), receptor do tipo RIG ou C- tipo receptor de lectina (CLR).
    8. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o receptor do tipo Toll (TLR) é um ligante ou um agonista que se une ao TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, TLR9 ou TLR10.
    9. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que o ligante ou o agonista que se une ao receptor do tipo Toll (TLR) é qualquer um dos seguintes de (i) a (vii):
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  11. 11/12 (i) um ligante ou agonista que se une ao TLR2 selecionado a partir do grupo que consiste em pepeptideoglicano, lipoproteína, lipopolissacarídeo e zimosan, (ii) um ligante ou agonista que se une ao TLR3 selecionado a partir do grupo que consiste em poli(l:C) e poli(A:U), (iii) um ligante ou agonista que se une ao TLR4 selecionado a partir do grupo que consiste em lipopolissacarídeo (LPS), HSP60, RS09 e MPLA, (iv) um ligante ou agonista que se une ao TLR5 selecionado a partir do grupo que consiste em flagelina e FLA, (v) um ligante ou agonista que se une ao TLR7 ou TLR8 selecionado a partir do grupo que consiste em um composto de imidazoquinolina e RNA de cadeia simples, (vi) um ligante ou agonista que se une ao TLR9 selecionado a partir do grupo que consiste em DNA bacteriano, DNA de CpG não metilado, hemozoína, ODN1585, ODN1668 e ODN1826, e (vii) um ligante ou agonista que se une ao TLR10 selecionado a partir do grupo que consiste em profilina e uma bactéria uropatogênica.
    10. CONJUGADO, de acordo com as reivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou o seu fragmento está ligado ao ativador imune por meio de um ligante.
    11. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA para o tratamento e/ou a prevenção de um câncer, caracterizada pelo fato de que compreende o conjugado, de acordo com as reivindicações de 1 a 10, como ingrediente ativo.
  12. 12. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o câncer é um câncer que expressa uma proteína CAPRIN-1 na superfície da membrana de células.
  13. 13. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizada pelo fato de que o câncer é o câncer de
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    12/12 mama, câncer de rim, câncer de pâncreas, câncer de colo e reto, câncer de pulmão, tumor de cérebro, câncer de estômago, câncer de útero, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de bexiga, câncer de esôfago, leucemia, linfoma, câncer de fígado, câncer de vesícula biliar, sarcoma, mastocitoma, melanoma, câncer de córtex adrenal, tumor de Ewing, linfoma de Hodgkin, mesotelioma, mieloma múltiplo, câncer de testículo, câncer de tireoide e câncer de cabeça e pescoço.
  14. 14. MÉTODO PARA O TRATAMENTO E/OU A PREVENÇÃO DE UM CÂNCER, caracterizado pelo fato de que compreende a administração do conjugado, de acordo com as reivindicações de 1 a 10, ou da composição farmacêutica, de acordo com as reivindicações de 11 a 13, a um indivíduo.
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