JP2024511414A - 腫瘍浸潤リンパ球のｃｉｓｈ遺伝子編集及び免疫療法におけるその使用 - Google Patents

腫瘍浸潤リンパ球のｃｉｓｈ遺伝子編集及び免疫療法におけるその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、本明細書に記載のＣＩＳＨ及び任意選択によりＰＤ－１の発現が低下した遺伝子修飾ＴＩＬの治療用集団を調製するための、ＴＩＬを調製するための改善及び／または短縮されたプロセス及び方法を提供する。【選択図】図１

Description

本出願は、２０２１年３月２３日に出願された米国仮特許出願第６３／１６５，０６６号の優先権を主張し、これはすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質は、ヒトでは、ＣＩＳＨ遺伝子によってコードされるタンパク質である。Ｕｃｈｉｄａ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，７８：２０９－２１２を参照されたい。ＣＩＳＨオルソログは、配列決定されたゲノムを有するほとんどの哺乳類において特定されている。ＣＩＳＨは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達を制御し、特定のＳＮＰを伴うＣＩＳＨの変異は、菌血症、結核、及びマラリアに対する感受性に関連している。Ｋｈｏｒ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３６２（２２）：２０９２－１０１を参照されたい。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、ＳＨ２ドメイン及びＳＯＣＳボックスドメインを含む。したがって、タンパク質は、サイトカインシグナル伝達のサプレッサー（ＳＯＣＳ）またはＳＴＡＴ誘導性ＳＴＡＴ阻害剤（ＳＳＩ）としても知られる、サイトカイン誘導性ＳＴＡＴ阻害剤（ＣＩＳ）のタンパク質ファミリーに属する。ＣＩＳファミリーメンバーは、サイトカインシグナル伝達のサイトカイン誘導性陰性調節因子であることが知られている。
ＣＩＳＨ発現は、適切な細胞型において、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、ＩＬ－３、及び顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）によって誘導され得る。免疫沈降分析は、ＣＩＳＨタンパク質がＩＬ－３Ｒベータ鎖及びＥＰＯＲ（エリスロポエチン受容体）に安定して結合するが、リガンド結合後にのみ結合することを実証し、受容体のチロシンリン酸化が必要であることを示唆している。ＣＩＳＨタンパク質の過剰発現は細胞増殖を抑制し、ＣＩＳＨがシグナル伝達に悪影響を及ぼしたことを示した。その後、ＣＩＳＨ発現は、ＳＴＡＴ５活性化に依存することが示され、いくつかのＳＴＡＴ５結合部位がＣＩＳＨプロモーター領域に見出された。Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｂｌｏｏｄ ８９（９）：３１４８－５４を参照されたい。さらに、ＣＩＳＨは、ＥＰＯ依存性のＳＴＡＴ５の活性化を阻害し、他のＳＴＡＴ５依存性受容体の活性の抑制し、ＣＩＳＨがＳＴＡＴ５に対するフィードバックモジュレーターであることを示す。
多種多様なＳＴＡＴ５依存性受容体は、成長ホルモン（ＧＨ）、プロラクチン（ＰＲＬ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、レプチン、ＩＬ－２、ＩＬ－５及びＩＬ－９を含む（これらに限定されない）ＣＩＳＨ発現を誘導する。Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２４（３）：３１２－６を参照されたい。ＣＩＳＨは、ＧＨ受容体（ＧＨＲ）、ＰＲＬ受容体、及びＩＬ－２受容体ベータ鎖からのシグナル伝達に結合し、阻害し、ＧＨＲの内在化及び不活性化を促進することが示されている。Ｒａｍ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７４（５０）：３５５５３－６１、Ｅｎｄｏ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ１３３（１）：１０９－１３、Ａｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２７４（４２）：３０２６６－７２、Ｌａｎｄｓｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２８０（４５）：３７４７１－８０を参照されたい。ＣＩＳＨ ｍＲＮＡの発現は、いくつかの組織（肝臓、腎臓、心臓、胃、肺、卵巣及び骨格筋）に見出される。Ｐａｌｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００９）３０（１２）：５９２－６０２、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２００９）１３８（３）：５３７－４４、Ｃｌａｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＪＬｉｐｉｄＲｅｓ５４（７）：１９８８－９７を参照されたい。多数の重要なサイトカイン及び成長因子のシグナル伝達装置に明らかに関与しているにもかかわらず、ＣＩＳＨノックアウトマウスは、（免疫応答におけるわずかな変化を除いて）最小限の欠陥を有する。Ｐａｌｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３０（１２）：５９２－６０２、Ｔｒｅｎｇｏｖｅ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２（１）：１－２９を参照されたい。これは、他のＳＯＣＳファミリータンパク質の代償活性によるものであり得る。ベータアクチンプロモーターから駆動されるＣＩＳＨを構成的に発現するトランスジェニックマウスで、推定される標的遺伝子の生物学に対するＣＩＳＨの効果が観察された。これらのマウスは、体重減少、乳腺発達の欠損、及びガンマ／デルタＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ならびにＮＫＴ細胞の数の減少を有し、これらは、ＳｔａｔＳａ及び／またはＳｔａｔＳｂ欠損マウスに類似する表現型であった。Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ１９（９）：６３９６－４０７を参照されたい。
ＣＩＳＨは、多くのサイトカイン及び成長因子によるシグナル伝達に潜在的に影響を及ぼし、ＣＩＳＨ活性及び変異体は、感染症及びがんに関連することが見出されている。いくつかの研究は、マラリア、レプトスピラ症、Ｂ型肝炎ウイルス及び結核を含む特定のＣＩＳＨ多型を有する対象における様々な感染病原体に対する感受性の増加を示している。Ｋｈｏｒ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３６２（２２）：２０９２－１０１、Ｅｓｔｅｖｅｓ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，９（９）：ｅ１０８５３４、Ｈｕ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，９（６）：ｅ１００８２６、Ｔｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，６４（４）：２６１－５、Ｊｉ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｉｎｆｅｃｔ Ｇｅｎｅｔ Ｅｖｏｌ，２８：２４０－４、Ｓｕｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＰＬｏＳ，９（３）：ｅ９２０２０を参照されたい。すべての研究に共通する１つのリスク対立遺伝子（ｒｓ４１４１７１、転写の開始から－２９２）は、代替対立遺伝子と比較して、末梢血単核細胞において低いレベルのＣＩＳＨ発現を示した。Ｋｈｏｒ ａｎｄ Ｓｕｎ，上記、を参照されたい。ＣＩＳＨの発現レベルは、正常組織と比較して、乳癌及びがん細胞株において上昇し、ＣＩＳＨが、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）を活性化する能力によって、腫瘍形成に寄与する可能性があるという推測につながった。Ｒａｃｃｕｒｔ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８９（３）：５２４－３２。ＣＩＳＨ変異体はまた、乳牛の乳生産特性と関連している。Ａｒｕｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｆｒｏｎｔ Ｇｅｎｅｔ，６：３４２を参照されたい。
ＴＡＬＥＮを含む操作されたヌクレアーゼは、標的ＤＮＡ部位に特異的に結合するように設計され、内在性遺伝子の遺伝子発現を調節する能力を有し、ゲノム操作、遺伝子治療、及びがん及び炎症等の障害の治療に有用であり得る。例えば、米国特許第９，８７７，９８８号、同第９，３９４，５４５号、同第９，１５０，８４７号、同第９，２０６，４０４号、同第９，０４５，７６３号、同第９，００５，９７３号、同第８，９５６，８２８号、同第８，９３６，９３６号、同第８，９４５，８６８号、同第８，８７１，９０５号、同第８，５８６，５２６号、同第８，５６３，３１４号、同第８，３２９，９８６号、同第８，３９９，２１８号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，６８９，５５８号、同第７，０６７，３１７号、同第７，２６２，０５４号、同第７，８８８，１２１号、同第７，９７２，８５４号、同第７，９１４，７９６号、同第７，９５１，９２５号、同第８，１１０，３７９号、同第８，４０９，８６１号、同第２００３／０２３２４１０号、同第２００５／０２０８４８９号、同第２００５／００２６１５７号、同第２００５／００６４４７４号、同第２００６／００６３２３１号、同第２００８／０１５９９９６号、同第２０１０／０２１８２６４号、同第２０１２／００１７２９０号、同第２０１１／０２６５１９８号、同第２０１３／０１３７１０４号、同第２０１３／０１２２５９１号、同第２０１３／０１７７９８３号、同第２０１３／０１７７９６０号、同第２０１５／００５６７０５号を参照されたい（これらの開示は、参照により、それらの全体がすべての目的のために取り込まれる）。さらに、標的化ヌクレアーゼは、Ａｒｇｏｎａｕｔｅシステムに基づいて開発されており（例えば、「ＴｔＡｇｏ」として知られるＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから、Ｓｗａｒｔｓ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ ５０７（７４９１）：２５８－２６１を参照されたい）、これはまた、ゲノム編集及び遺伝子治療における使用の可能性を有し得る。
ＴＡＬＥ媒介遺伝子療法は、１つ以上の不活性化遺伝子を有するように細胞を遺伝子操作するために、及び／またはその細胞に、その細胞内で以前に産生されていない産物を発現させるために（例えば、導入遺伝子挿入及び／または内因性配列の修正を介して）使用することができる。これらのヌクレアーゼを使用する臨床試験は、これらの分子が、がん、ＨＩＶ及び／または血液障害（ヘモグロビン異常症及び／または血友病など）を含む、様々な状態を治療することができることを示した。例えば、Ｙｕ，ｅｔ ａｌ．（２００６）ＦＡＳＥＢ Ｊ．２０：４７９－４８１、Ｔｅｂａｓ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎｅｗ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ ３７０（１０）：９０１を参照されたい。したがって、これらのアプローチは、疾患の治療に使用することができる。しかしながら、ＣＩＳＨの調節が望まれる、がん、炎症性障害、及び他の疾患の治療及び／または予防のためのＣＩＳＨ ＴＡＬＥＮ媒介遺伝子不活性化／欠失のための追加の方法及び組成物の必要性が残っている。
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の養子移入を使用した巨大な難治性がんの治療は、予後不良の患者の治療に対する強力なアプローチとなる。Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６，６，３８３－３９３。複数の臨床センターでヒト患者に使用するための商業規模の製造及び規制当局の承認に適したかかるプロセスに基づく遺伝子組換えＴＩＬの製造プロセス及び治療を提供することが緊急に必要である。特に、当技術分野では、ＣＩＳＨ及び／またはＰＤ－１調節が望まれ、本発明がその必要性を満たす、がん、炎症性障害、及び他の疾患の治療及び／または予防のためのＴＩＬベースの療法と組み合わせた、ＣＩＳＨ及び／またはＰＤ－１遺伝子の不活性化／欠失のための追加の方法及び組成物の必要性が残っている。
本発明は、ＣＩＳＨ及び任意選択でＰＤ－１の発現の低減を含む、遺伝子修飾腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の調製方法を提供し、方法は、
（ａ）ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化することができる１つ以上の第１の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）をコードする核酸（複数可）を、ＴＩＬに導入することであって、１つ以上の第１のＴＡＬＥヌクレアーゼが、配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む、導入すること、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断することによって選択的に不活性化することができる１つ以上の第２のＴＡＬＥヌクレアーゼ導入することと、
（ｂ）ＴＩＬを拡張させることと、を含む。
いくつかの実施形態では、方法は、エレクトロポレーションステップを含む、１つ以上の第１のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするＴＩＬ核酸（複数可）に導入することを含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上の第１のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードする核酸（複数可）は、ＲＮＡであり、ＲＮＡは、エレクトロポレーションによってＴＩＬに導入される。
いくつかの実施形態では、方法は、導入ステップの前に、ＴＩＬを、ＯＫＴ－３の存在下で細胞培養培地中で約１～３日間培養することによって、ＴＩＬを活性化するステップをさらに含む。
いくつかの実施形態では、方法は、導入するステップの後、及び拡張するステップの前に、ＩＬ－２を含む細胞培養培地中でＴＩＬを約１日間静置するステップをさらに含む。
いくつかの実施形態では、方法は、導入するステップの前に、ＴＩＬを凍結保存し、その後、解凍し、ＴＩＬを、ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で約１～３日間培養するステップをさらに含む。
いくつかの実施形態では、静置ステップにおけるＩＬ－２は、約３０００ＩＵ／ｍｌの濃度である。
いくつかの実施形態では、１つ以上の第１のＴＡＬＥヌクレアーゼは、それぞれ、第１の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼ及び第２の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼによって構成される。
いくつかの実施形態では、第１の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼは、第１のヌクレアーゼ触媒ドメインに融合した第１のＴＡＬＥ核酸結合ドメインで構成される第１の融合タンパク質であり、第２の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼは、第２のヌクレアーゼ触媒ドメインに融合した第２のＴＡＬＥ核酸結合ドメインで構成される第２の融合タンパク質である。
いくつかの実施形態では、第１のＴＡＬＥ核酸結合ドメインは、第１のアミノ酸配列を有し、第２のＴＡＬＥ核酸結合ドメインは、第２のアミノ酸配列を有し、第１のアミノ酸配列は、第２のアミノ酸配列とは異なる。
いくつかの実施形態では、第１のヌクレアーゼ触媒ドメインは、第１のアミノ酸配列を有し、第２のヌクレアーゼ触媒ドメインは、第２のアミノ酸配列を有し、第１のアミノ酸配列は、第２のアミノ酸配列と同じである。
いくつかの実施形態では、第１のヌクレアーゼ触媒ドメイン及び第２のヌクレアーゼ触媒ドメインは、両方とも、Ｆｏｋ－Ｉのアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、第１の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼ及び第２の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ヘテロ二量体ＤＮＡ切断複合体を形成して、ＣＩＳＨをコードする遺伝子の標的部位でＤＮＡ切断を行うことができ、ＣＩＳＨをコードする遺伝子の標的部位は、配列番号１７５の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨをコードする遺伝子の標的部位内の第１の位置に位置する第１の半分の標的を認識し、第２の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼは、第１の位置と重複しないＣＩＳＨをコードする遺伝子の標的部位内の第２の位置に位置する第２の半分の標的を認識する。
いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥヌクレアーゼは、配列番号１６５及び配列番号１６７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９７．５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥヌクレアーゼは、配列番号１６５及び配列番号１６７からなる群から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼは、配列番号１６５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９７．５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼは、配列番号１６７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９７．５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼは、配列番号１６５のアミノ酸配列を含み、第２の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼは、配列番号１６７のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、拡張されたＴＩＬは、治療上有効な投与量のＴＩＬを、それを治療を必要とする対象に投与するのに十分なＴＩＬを含む。
いくつかの実施形態では、拡張されたＴＩＬの治療上有効な投与量が、約１×１０９～約９×１０１０個のＴＩＬを含む。
本発明はまた、ＣＩＳＨ及び任意選択でＰＤ－１の低減された発現を含む拡張された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団であって、拡張ＴＩＬの集団は、請求項１～２０のいずれかに記載の方法によって得ることができる、集団を提供する。
本発明はまた、ＣＩＳＨをコードする遺伝子の標的部位でＤＮＡ切断を認識し、その結果をもたらす転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）であって、配列番号１６５及び配列番号１６７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９７．５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＴＡＬＥヌクレアーゼも提供する。
いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥヌクレアーゼは、配列番号１６５及び配列番号１６７からなる群から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥヌクレアーゼは、第１の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼ及び第２の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼによって構成され、第１の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼは、配列番号１６５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９７．５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼは、配列番号１６７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９７．５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼは、配列番号１６５のアミノ酸配列を含み、第２の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼは、配列番号１６７のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼは、第１のヌクレアーゼ触媒ドメインに融合した第１のＴＡＬＥ核酸結合ドメインで構成される第１の融合タンパク質であり、第２の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼは、第２のヌクレアーゼ触媒ドメインに融合した第２のＴＡＬＥ核酸結合ドメインで構成される第２の融合タンパク質である。
いくつかの実施形態では、第１のＴＡＬＥ核酸結合ドメインは、第１のアミノ酸配列を有し、第２のＴＡＬＥ核酸結合ドメインは、第２のアミノ酸配列を有し、第１のアミノ酸配列は、第２のアミノ酸配列とは異なる。
いくつかの実施形態では、第１のヌクレアーゼ触媒ドメインは、第１のアミノ酸配列を有し、第２のヌクレアーゼ触媒ドメインは、第２のアミノ酸配列を有し、第１のアミノ酸配列は、第２のアミノ酸配列と同じである。
いくつかの実施形態では、第１のヌクレアーゼ触媒ドメイン及び第２のヌクレアーゼ触媒ドメインは、両方とも、Ｆｏｋ－Ｉのアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、第１の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼ及び第２の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ヘテロ二量体ＤＮＡ切断複合体を形成して、ＣＩＳＨをコードする遺伝子の標的部位でＤＮＡ切断を行うことができ、標的部位は、配列番号１７５の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨをコードする遺伝子の標的部位内の第１の位置に位置する第１の半分の標的を認識し、第２の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼは、第１の位置と重複しないＣＩＳＨをコードする遺伝子の標的部位内の第２の位置に位置する第２の半分の標的を認識する。
本発明は、遺伝子修飾腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的なＴＩＬ集団に拡張するための方法であって、ＣＩＳＨ及び任意選択でＰＤ－１の発現の低減を含み、方法は、
（ａ）対象から取得された腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することによって、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を取得する、及び／または受け取ることと、
（ｂ）第１のＴＩＬ集団を閉鎖系に添加することと、
（ｃ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行い、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、第１の拡張が、約３～１４日間行われることにより第２のＴＩＬ集団を取得し、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、系を開放することなく起こる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、
（ｄ）ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化することができる１つ以上の第１の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）をコードする核酸（複数可）を、ＴＩＬに導入することであって、１つ以上の第１のＴＡＬＥヌクレアーゼが、ＣＩＳＨをコードする遺伝子中の標的部位を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含み、標的部位が、配列番号１７５の核酸配列を含み、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断することによって選択的に不活性化することができる１つ以上の第２のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードする核酸（複数可）をＴＩＬに導入する、導入することと、
（ｅ）ステップ（ｄ）から得られたＴＩＬを、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で培養することによって第２の拡張を行い、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第２の拡張が、約７～１４日間行われることにより第３のＴＩＬ集団を取得し、第３のＴＩＬ集団は、治療的なＴＩＬ集団であり、第２の拡張は、第２のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われる、第３のＴＩＬ集団を産生することと、
（ｆ）ステップ（ｅ）から取得された治療的なＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行が、系を開放することなく起こる、採取することと、
（ｇ）ステップ（ｆ）からの採取されたＴＩＬ集団を注入バッグに移送することであって、ステップ（ｆ）から（ｇ）への移送が、系を開放することなく起こる、移送することと、を含む、方法を提供する。
本発明は、遺伝子修飾腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的なＴＩＬ集団に拡張するための方法であって、ＣＩＳＨ及び任意選択でＰＤ－１の発現の低減を含み、方法は、
（ａ）対象から取得された腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することによって、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を取得することと、
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に付加することと、
（ｃ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行い、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、第１の拡張が、約３～１１日間行われることにより第２のＴＩＬ集団を取得し、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、系を開放することなく起こる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、
（ｄ）ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化することができる１つ以上の第１の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）をコードする核酸（複数可）を、ＴＩＬに導入することであって、１つ以上の第１のＴＡＬＥヌクレアーゼが、ＣＩＳＨをコードする遺伝子中の標的部位を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含み、標的部位が、配列番号１７５の核酸配列を含み、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断することによって選択的に不活性化することができる１つ以上の第２のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードする核酸（複数可）をＴＩＬに導入する、導入することと、
（ｅ）ステップ（ｄ）から得られたＴＩＬを、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で培養することによって第２の拡張を行い、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第２の拡張が、約７～１１日間行われて第３のＴＩＬ集団を取得し、第３のＴＩＬ集団は、治療的なＴＩＬ集団であり、第２の拡張は、第２のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われる、第３のＴＩＬ集団を産生することと、
（ｆ）ステップ（ｅ）から取得された治療的なＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行が、系を開放することなく起こる、採取することと、
（ｇ）ステップ（ｆ）からの採取された治療的なＴＩＬ集団を注入バッグに移送することであって、ステップ（ｆ）から（ｇ）への移送が、系を開放することなく起こる、移送することと、を含む、方法を提供する。
本発明は、遺伝子修飾腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的なＴＩＬ集団に拡張するための方法であって、ＣＩＳＨ及び任意選択でＰＤ－１の発現の低減を含み、方法は、
（ａ）対象の黒色腫からの腫瘍及びＴＩＬ細胞との混合物を含有する試料を取得するために、外科的切除、針生検、コア生検、小生検、または他の手段から第１のＴＩＬ集団を取得及び／または受け取ることと、
（ｂ）第１のＴＩＬ集団を閉鎖系に添加することと、
（ｃ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行い、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、第１の拡張が、約３～１４日間行われることにより第２のＴＩＬ集団を取得し、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、系を開放することなく起こる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、
（ｄ）ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化することができる１つ以上の第１の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）をコードする核酸（複数可）を、ＴＩＬに導入することであって、１つ以上の第１のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨをコードする遺伝子中の標的部位を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含み、標的部位が、配列番号１７５の核酸配列を含み、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断することによって選択的に不活性化することができる１つ以上の第２のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードする核酸をＴＩＬに導入する、導入することと、
（ｅ）ステップ（ｄ）から得られたＴＩＬを、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で培養することによって第２の拡張を行い、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第２の拡張が、約７～１４日間行われて第３のＴＩＬ集団を取得し、第３のＴＩＬ集団が、治療的なＴＩＬ集団であり、第２の拡張が、第２のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われる、第３のＴＩＬ集団を産生することと、
（ｆ）ステップ（ｅ）から取得された治療的なＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行が、系を開放することなく起こる、採取することと、
（ｇ）ステップ（ｆ）からの採取された治療的なＴＩＬ集団を注入バッグに移送することであって、ステップ（ｆ）から（ｇ）への移送が、系を開放することなく起こる、移送することと、を含む、方法を提供する。
本発明は、遺伝子修飾腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的なＴＩＬ集団に拡張するための方法であって、ＣＩＳＨ及び任意選択でＰＤ－１の発現の低減を含み、方法は、
（ａ）対象から腫瘍を切除することであって、腫瘍が、任意選択で、腫瘍及びＴＩＬ細胞との混合物を含有する試料を取得するために、外科的切除、針生検、コア生検、小生検、または他の手段からの第１のＴＩＬ集団を含む、切除することと、
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に付加することと、
（ｃ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行い、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、第１の拡張が、約３～１１日間行われることにより第２のＴＩＬ集団を取得し、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、系を開放することなく起こる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、
（ｄ）ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化することができる１つ以上の第１の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）をコードする核酸（複数可）を、ＴＩＬに導入することであって、１つ以上の第１のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨをコードする遺伝子中の標的部位を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含み、標的部位が、配列番号１７５の核酸配列を含み、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断することによって選択的に不活性化することができる１つ以上の第２のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードする核酸を、ＴＩＬに導入する、導入することと、
（ｅ）ステップ（ｄ）から得られたＴＩＬを、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で培養することによって第２の拡張を行い、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第２の拡張が、約７～１１日間行われて第３のＴＩＬ集団を取得し、第３のＴＩＬ集団は、治療的なＴＩＬ集団であり、第２の拡張は、第２のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われる、第３のＴＩＬ集団を産生することと、
（ｆ）ステップ（ｅ）から取得された第３のＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行が、系を開放することなく起こる、採取することと、
（ｇ）ステップ（ｆ）からの採取された第３のＴＩＬ集団を注入バッグに移送することであって、ステップ（ｆ）から（ｇ）への移送が、系を開放することなく起こる、移送することと、を含む、方法を提供する。
本発明は、遺伝子修飾腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的なＴＩＬ集団に拡張するための方法であって、ＣＩＳＨ及び任意選択でＰＤ－１の発現の低減を含み、方法は、
（ａ）対象から取得された腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することによって、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を取得することと、
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に付加することと、
（ｃ）ＩＬ－２、及び任意選択でＯＫＴ－３を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行い、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、第１の拡張が、約３～１４日間行われて、第２のＴＩＬ集団を取得し、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、系を開放することなく起こる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、
（ｄ）ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化することができる１つ以上の第１の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）をコードする核酸（複数可）を、ＴＩＬに導入することであって、１つ以上の第１のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨをコードする遺伝子中の標的部位を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含み、標的部位が、配列番号１７５の核酸配列を含み、任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断することによって選択的に不活性化することができる１つ以上の第２のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードする核酸を、ＴＩＬに導入する、導入することと、
（ｄ）ステップ（ｄ）から得られたＴＩＬを、ＩＬ－２、任意選択でＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で培養することによって第２の拡張を行い、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第２の拡張が、約４～６日間行われて、第３のＴＩＬ集団を取得し、第３のＴＩＬ集団が、治療的なＴＩＬ集団であり、第２の拡張が、第２のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われる、第３のＴＩＬ集団を産生することと、
（ｅ）第３のＴＩＬ集団を、第１の複数の２～５のＴＩＬ亜集団に分割することであって、少なくとも１．０×１０９個のＴＩＬが各亜集団に存在し、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行が、系を開放することなく起こる、分割することと、
（ｆ）各ＴＩＬ亜集団の細胞培養培地を追加のＩＬ－２、任意選択でＯＫＴ－３で補充することによって、第１の複数のＴＩＬ亜集団の第３の拡張を行い、第２の複数のＴＩＬ亜集団を産生することであって、第３の拡張が、約５～７日間行われ、各亜集団の第３の拡張が、第３のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行が、系を開放することなく起こる、第２の複数のＴＩＬのサブ集団を産生することと、
（ｇ）ステップ（ｆ）から取得された第２の複数のＴＩＬ亜集団を採取することと、
（ｈ）ステップ（ｇ）からの採取されたＴＩＬ亜集団を１つ以上の注入バッグに移送することであって、ステップ（ｇ）から（ｈ）への移行である、移すことと、を含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、方法は、凍結保存プロセスを使用して採取されたＴＩＬを凍結保存するステップをさらに含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上の第１のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードする核酸（複数可）は、ＲＮＡである。
方法のいくつかの実施形態では、１つ以上の第１のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードする核酸（複数可）を導入することは、エレクトロポレーションによってＴＩＬに導入される。
いくつかの実施形態では、方法は、導入ステップの前に、ＴＩＬを、ＯＫＴ－３の存在下で細胞培養培地中で約１～３日間培養することによって、ＴＩＬを活性化するステップをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ＯＫＴ－３は、約３００ｎｇ／ｍｌの濃度である。
いくつかの実施形態では、方法は、導入するステップの後及び第２の拡張するステップの前に、ＴＩＬを、ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で約１日間静置するステップをさらに含む。
いくつかの実施形態では、静置するステップは、約３０００ＩＵ／ｍｌの濃度においてである。
いくつかの実施形態では、方法は、ＴＩＬを凍結保存し、その後、解凍し、ＴＩＬを、ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で約１～３日間培養することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）～（ｇ）は、約１３日～約２９日間、任意選択で約１５日、約１６日、約１７日、約１８日、約１９日、約２０日、約２１日、約２２日、約２３日、約２４日、または約２５日間行われる。
いくつかの実施形態では、１つ以上の第１のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードする核酸（複数可）は、ＲＮＡであり、ＲＮＡは、エレクトロポレーションによってＴＩＬに導入される。
いくつかの実施形態では、１つ以上の第１のＴＡＬＥヌクレアーゼは、それぞれ、第１の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼ及び第２の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼによって構成される。
いくつかの実施形態では、第１の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼは、第１のヌクレアーゼ触媒ドメインに融合した第１のＴＡＬＥ核酸結合ドメインで構成される第１の融合タンパク質であり、第２の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼは、第２のヌクレアーゼ触媒ドメインに融合した第２のＴＡＬＥ核酸結合ドメインで構成される第２の融合タンパク質である。
いくつかの実施形態では、第１のＴＡＬＥ核酸結合ドメインは、第１のアミノ酸配列を有し、第２のＴＡＬＥ核酸結合ドメインは、第２のアミノ酸配列を有し、第１のアミノ酸配列は、第２のアミノ酸配列とは異なる。
いくつかの実施形態では、第１のヌクレアーゼ触媒ドメインは、第１のアミノ酸配列を有し、第２のヌクレアーゼ触媒ドメインは、第２のアミノ酸配列を有し、第１のアミノ酸配列は、第２のアミノ酸配列と同一である。
いくつかの実施形態では、第１のヌクレアーゼ触媒ドメイン及び第２のヌクレアーゼ触媒ドメインは、両方とも、Ｆｏｋ－Ｉのアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、第１の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼ及び第２の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ヘテロ二量体ＤＮＡ切断複合体を形成して、標的部位でＤＮＡ切断を行うことができる。
いくつかの実施形態では、第１の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼは、標的部位内の第１の位置に位置する第１の半分の標的を認識し、第２の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼは、第１の位置と重複しない標的部位内の第２の位置に位置する第２の半分の標的を認識する。
いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥヌクレアーゼは、配列番号１６５及び配列番号１６７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９７．５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥヌクレアーゼは、配列番号１６５及び配列番号１６７からなる群から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼは、配列番号１６５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９７．５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼは、配列番号１６７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９７．５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼは、配列番号１６５のアミノ酸配列を含み、第２の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼは、配列番号１６７のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、採取されたＴＩＬは、治療上有効な投与量のＴＩＬをそれを必要とする対象に投与するのに十分なＴＩＬを含む。
いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量のＴＩＬは、約１×１０９～約９×１０１０個のＴＩＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＡＰＣは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、約１：２５のＴＩＬ：ＰＢＭＣの比で補充される。
いくつかの実施形態では、治療用ＴＩＬ集団は、対象に投与されると、増加した有効性、増加したインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）産生、増加したポリクローン性、増加した平均ＩＰ－１０、及び／または増加した平均ＭＣＰ－１を提供する。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２は、第１の拡張において、細胞培養培地中に１０００ＩＵ／ｍＬ～６０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で存在する。
いくつかの実施形態では、第２の拡張するステップにおいて、ＩＬ－２は、１０００ＩＵ／ｍＬ～６０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で存在し、ＯＫＴ－３抗体は、約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度で存在する。
いくつかの実施形態では、第２及び／または第３の拡張するステップにおいて、ＩＬ－２は、１０００ＩＵ／ｍＬ～６０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で存在し、任意選択で、ＯＫＴ－３抗体は、約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度で存在する。
いくつかの実施形態では、第１の拡張は、ガス透過性容器を使用して行われる。
いくつかの実施形態では、第２の拡張は、ガス透過性容器を使用して行われる。
いくつかの実施形態では、第２及び／または第３の拡張は、ガス透過性容器を使用して行われる。
いくつかの実施形態では、第１の細胞培養培地は、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるサイトカインをさらに含む。
いくつかの実施形態では、第２の細胞培養培地は、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるサイトカインをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）及び／または（ｆ）の細胞培養培地は、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるサイトカインをさらに含む。
いくつかの実施形態では、第２の拡張の細胞培養培地は、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるサイトカインをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）における第１の拡張及び／またはステップ（ｅ）における第２の拡張は、１１日の期間内で個別に行われる。
本発明は、ＣＩＳＨ及び／またはＰＤ－１の発現の低減を含む遺伝子修飾腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団または組成物を提供し、ＴＩＬの集団またはＴＩＬを含む組成物は、請求項１～２０及び３２～７３のいずれかに記載の方法によって得ることができる。
本発明は、がんの治療を必要とする対象においてがんを治療する方法を提供し、この方法は、対象に、ＣＩＳＨ及び／またはＣＩＳＨ及びＰＤ－１の発現の低減を含む遺伝子修飾腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団を投与することを含み、遺伝子修飾ＴＩＬの治療的集団は、請求項１～２０及び３２～７３のいずれかに記載の方法によって得ることができる。
いくつかの実施形態では、がんは、黒色腫（転移性黒色腫を含む）、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされるがん、頭頸部癌（頭頸部扁平細胞癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、腎癌、及び腎細胞癌からなる群から選択される。
ＴＩＬにおけるダブルＫＯの評価。 シングル及びダブルＣＩＳＨ ＫＯの効率。 ダブルＣＩＳＨ／ＰＤ－１ ＫＯ ＴＩＬにおけるＰＤ－１ ＫＯ効率。 対照と比較して、ＣＩＳＨ ＫＯ ＴＩＬの倍率増殖は減少した。 ＣＩＳＨ ＫＯ ＴＩＬにおけるＴ細胞系統及びメモリサブセット。 ＣＩＳＨ：ＣＩＳＨ ＫＯ ＴＩＬにおける分化ならびに活性化／枯渇。 配列番号１７５の核酸配列を含む、ＣＩＳＨ遺伝子の標的配列を対象とする１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードする核酸をＴＩＬに導入することによって、遺伝子修飾ＴＩＬを拡張するための例示的なプロセスを示す。
配列表の簡単な説明
配列番号１は、ムロモナブの重鎖のアミノ酸配列である。
配列番号２は、ムロモナブの軽鎖のアミノ酸配列である。
配列番号３は、組換えヒトＩＬ－２タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号４は、アルデスロイキンのアミノ酸配列である。
配列番号５は、組換えヒトＩＬ－４タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号６は、組換えヒトＩＬ－７タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号７は、組換えヒトＩＬ－１５タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号８は、組換えヒトＩＬ－２１タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号９～１２６は、現在割り当てられていない。
配列番号１２７は、標的ＰＤ－１配列である。
配列番号１２８は、標的ＰＤ－１配列である。
配列番号１２９は、反復ＰＤ－１左反復配列である。
配列番号１３０は、反復ＰＤ－１右反復配列である。
配列番号１３１は、反復ＰＤ－１左反復配列である。
配列番号１３２は、反復ＰＤ－１右反復配列である。
配列番号１３３は、ＰＤ－１左ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ配列である。
配列番号１３４は、ＰＤ－１右ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ配列である。
配列番号１３５は、ＰＤ－１左ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ配列である。
配列番号１３６は、ＰＤ－１右ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ配列である。
配列番号１３７は、ＩＬ－２配列である。
配列番号１３８は、ＩＬ－２変異タンパク質配列である。
配列番号１３９は、ＩＬ－２変異タンパク質配列である。
配列番号１４０は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＨＣＤＲ１＿ＩＬ－２である。
配列番号１４１は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＨＣＤＲ２である。
配列番号１４２は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＨＣＤＲ３である。
配列番号１４３は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＨＣＤＲ１＿ＩＬ－２ ｋａｂａｔである。
配列番号１４４は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＨＣＤＲ２ ｋａｂａｔである。
配列番号１４５は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＨＣＤＲ３ ｋａｂａｔである。
配列番号１４６は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＨＣＤＲ１＿ＩＬ－２ ｃｌｏｔｈｉａである。
配列番号１４７は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＨＣＤＲ２ ｃｌｏｔｈｉａである。
配列番号１４８は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＨＣＤＲ３ ｃｌｏｔｈｉａである。
配列番号１４９は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＨＣＤＲ１＿ＩＬ－２ ＩＭＧＴである。
配列番号１５０は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＨＣＤＲ２ ＩＭＧＴである。
配列番号１５１は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＨＣＤＲ３ ＩＭＧＴである。
配列番号１５２は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＶＨ鎖である。
配列番号１５３は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１の重鎖である。
配列番号１５４は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＬＣＤＲ１ ｋａｂａｔである。
配列番号１５５は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＬＣＤＲ２ ｋａｂａｔである。
配列番号１５６は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＬＣＤＲ３ ｋａｂａｔである。
配列番号１５７は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＬＣＤＲ１ ｃｈｏｔｈｉａである。
配列番号１５８は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＬＣＤＲ２ ｃｈｏｔｈｉａである。
配列番号１５９は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＬＣＤＲ３ ｃｈｏｔｈｉａである。
配列番号１６０は、ＶＬ鎖である。
配列番号１６１は、軽鎖である。
配列番号１６２は、軽鎖である。
配列番号１６３は、軽鎖である。
配列番号１６４は、左ＣＩＳＨ ＫＯ ＴＡＬＥヌクレアーゼのヌクレオチド配列である。
配列番号１６５は、左ＣＩＳＨ ＫＯ ＴＡＬＥヌクレアーゼのアミノ酸配列である。
配列番号１６６は、右ＣＩＳＨ ＫＯ ＴＡＬＥヌクレアーゼのヌクレオチド配列である。
配列番号１６７は、右ＣＩＳＨ ＫＯ ＴＡＬＥヌクレアーゼのアミノ酸配列である。
配列番号１６８は、ＣＩＳＨ ＴＡＬＥＮ ＫＯのヒトＣＩＳＨ遺伝子における切断部位のヌクレオチド配列である。
配列番号１６９は、左ＰＤ－１ ＫＯ ＴＡＬＥヌクレアーゼのｍＲＮＡ配列である。
配列番号１７０は、左ＰＤ－１ ＫＯ ＴＡＬＥヌクレアーゼのアミノ酸配列である。
配列番号１７１は、右ＰＤ－１ ＫＯ ＴＡＬＥヌクレアーゼのｍＲＮＡ配列である。
配列番号１７２は、右ＰＤ－１ ＫＯ ＴＡＬＥヌクレアーゼのアミノ酸配列である。
配列番号１７３は、ＣＩＳＨフォワードプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１７４は、ＣＩＳＨリバースプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１７５は、ＣＩＳＨ ＴＡＬＥＮ ＫＯのヒトＣＩＳＨ遺伝子における標的部位のヌクレオチド配列である。
Ｉ．序説
現在の拡張プロトコルは、患者に注入されるＴＩＬの健康についてほとんど洞察を与えていない。Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞からエフェクターＴ細胞への成熟の過程で、重大な代謝シフトを起こす（特に嫌気性及び好気性代謝に関する考察及びマーカーについて、Ｃｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６，１７，３６４（その全体が本明細書に明示的に組み込まれる）を参照されたい）。例えば、ナイーブＴ細胞は、ＡＴＰを産生するミトコンドリア呼吸に依存するが、ＴＩＬなどの成熟した健康なエフェクターＴ細胞は、高度に解糖的であり、好気性解糖に依存して増殖、遊走、活性化、及び抗腫瘍効果に必要な生体エネルギー基質を提供する。
以前の論文では、解糖に大きく依存している細胞は、移入された細胞の大部分が死滅する結果となる養子移入時に栄養素の枯渇に見舞われるため、移入前にＴＩＬにおける解糖を制限し、ミトコンドリア代謝を促進することが望ましいと報告されている。したがって、当該技術分野は、ミトコンドリア代謝を促進することがインビボの長寿命を促進する可能性があることを教示し、実際には免疫応答の誘導前に解糖の阻害剤を使用することを示唆している。Ｃｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６，１７（３６４）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、本発明は、遺伝子編集技術の使用によるＴＩＬの治療効果の増強をさらに目的とする。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の養子移入は、有望で効果的な治療法を提供するが、患者の応答及び応答の堅牢性を高めることができるより効果的なＴＩＬ療法が強く必要とされている。本明細書に記載されるように、本発明の実施形態は、ＴＩＬを、増強された治療効果を提供するために遺伝子編集される治療用集団に拡張するための方法を提供する。
ＩＩ．定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じである。本明細書で参照されるすべての特許及び刊行物は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。
本明細書で使用される「同時投与」、「同時投与すること」、「組み合わせて投与される」、「組み合わせて投与すること」、「同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）」、及び「同時（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ）」という用語は、対象への２つ以上の医薬品有効成分（本発明の好ましい実施形態では、例えば、複数のＴＩＬ）の投与を包含し、医薬品有効成分及び／またはそれらの代謝物の両方が、対象において同時に存在する。同時投与には、別々の組成物での同時投与、別々の組成物での異なる時間での投与、または２つ以上の医薬品有効成分が存在する組成物での投与が含まれる。別々の組成物での同時投与及び両方の薬剤が存在する組成物での投与が好ましい。
「インビボ」という用語は、対象の体内で起こる事象を指す。
「インビトロ」という用語は、対象の体外で起こる事象を指す。インビトロアッセイには、生きている細胞または死んでいる細胞が用いられる細胞ベースのアッセイが包含され、無傷の細胞が用いられない無細胞アッセイも含み得る。
「エクスビボ」という用語は、対象の体から除去された細胞、組織、及び／または器官に対する治療または処置の実施を伴う事象を指す。適切には、細胞、組織、及び／または器官は、外科手術または治療の方法で対象の体に戻され得る。
本明細書の「腫瘍浸潤リンパ球」または「ＴＩＬ」とは、本明細書で使用される場合、対象の血流を離れて腫瘍に遊走した白血球として元来得られた細胞の集団を意味する。ＴＩＬには、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（リンパ球）、Ｔｈ１及びＴｈ１７ ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、ならびにＭ１マクロファージが含まれるが、これらに限定されない。ＴＩＬは、一般に、細胞表面マーカーを使用して生化学的に定義されるか、または腫瘍に浸潤して治療を達成するそれらの能力によって機能的に定義されるかのいずれかであり得る。ＴＩＬは、一般に、以下のバイオマーカー：ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲαβ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５６、ＣＣＲ７、ＣＤ４５Ｒａ、ＣＤ９５、ＰＤ－１、及びＣＤ２５のうちの１つ以上を発現することよって分類され得る。追加的及び代替的に、ＴＩＬは、患者への再導入時に固形腫瘍に浸潤する能力により機能的に定義され得る。ＴＩＬには、一次ＴＩＬ及び二次ＴＩＬの両方が含まれる。「一次ＴＩＬ」は、本明細書に概説される患者組織試料から得られるもの（「新たに採取された」と称されることもある）であり、「二次ＴＩＬ」は、本明細書で考察されるように拡張または増殖された任意のＴＩＬ細胞集団であり、バルクＴＩＬ及び拡張ＴＩＬ（「ＲＥＰ ＴＩＬ」または「ｐｏｓｔ－ＲＥＰ ＴＩＬ」）が含まれるが、これらに限定されず、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断することによって選択的に不活性化することができる１つ以上の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）を含むように遺伝子修飾され、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨをコードする遺伝子の標的部位を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含み、その標的部位は、配列番号１７５の核酸配列を含み、ＴＩＬ細胞集団は、これらの遺伝子修飾ＴＩＬを含むことができる。
本明細書で使用する場合、本明細書における「細胞の集団」（ＴＩＬを含む）とは、共通の形質を共有するいくつかの細胞を意味する。一般に、集団は、数にして、概して１×１０６～１×１０１０の範囲であり、異なるＴＩＬ集団は、異なる数を含む。例えば、ＩＬ－２の存在下での一次ＴＩＬの初期成長は、およそ１×１０８細胞のバルクＴＩＬの集団をもたらす。ＲＥＰ拡張は、一般に、注入用の１．５×１０９～１．５×１０１０個の細胞の集団を提供するために行われる。集団内の少なくとも複数のＴＩＬは、１つ以上の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）によって遺伝子修飾されて、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化され、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む。
本明細書における「凍結保存されたＴＩＬ」とは、１つ以上の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）によって遺伝子修飾され、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する遺伝子修飾ＴＩＬを含む、一次、バルク、または拡張のいずれかのＴＩＬを意味し、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とし、約－１５０℃～－６０℃の範囲で処理及び保管されるＴＡＬＥヌクレアーゼを含む。凍結保存のための一般的な方法も、実施例を含む本明細書の他の箇所に記載されている。明確にするために、「凍結保存されたＴＩＬ」は、一次ＴＩＬの供給源として使用され得る凍結組織試料と区別することができる。
本明細書における「解凍された凍結保存ＴＩＬ」とは、以前に凍結保存され、その後、細胞培養温度またはＴＩＬが患者に投与され得る温度を含むがこれらに限定されない、室温以上に戻るように処理されたＴＩＬの集団を意味する。
「凍結保存培地（ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａ）」または「凍結保存培地（ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）」という用語は、細胞の凍結保存に使用できる任意の培地を指す。かかる培地は、７％～１０％のＤＭＳＯを含む培地を含むことができる。例示的な培地には、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０、Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍａｓｏｌ、及びそれらの組み合わせが含まれる。「ＣＳ１０」という用語は、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＢｉｏｌｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓから入手した凍結保存培地を指す。ＣＳ１０培地は、商品名「ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０」と称され得る。ＣＳ１０培地は、ＤＭＳＯを含む無血清の動物成分を含まない培地である。
「セントラルメモリーＴ細胞」という用語は、ヒトではＣＤ４５Ｒ０＋であり、ＣＣＲ７（ＣＣＲ７ｈｉ）及びＣＤ６２Ｌ（ＣＤ６２ｈｉ）を構成的に発現するＴ細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーＴ細胞の表面表現型には、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ１２７（ＩＬ－７Ｒ）、及びＩＬ－１５Ｒも含まれる。セントラルメモリーＴ細胞の転写因子には、ＢＣＬ－６、ＢＣＬ－６Ｂ、ＭＢＤ２、及びＢＭＩ１が含まれる。セントラルメモリーＴ細胞は、ＴＣＲトリガー後、エフェクター分子としてＩＬ－２及びＣＤ４０Ｌを主に分泌する。セントラルメモリーＴ細胞は、血液中のＣＤ４コンパートメントで顕著であり、ヒトではリンパ節及び扁桃において比例して濃縮される。
「エフェクターメモリーＴ細胞」という用語は、セントラルメモリーＴ細胞と同様にＣＤ４５Ｒ０＋であるが、ＣＣＲ７の構成的発現を失い（ＣＣＲ７ｌｏ）、ＣＤ６２Ｌ発現が不均一であるかまたは低い（ＣＤ６２Ｌｌｏ）、ヒトまたは哺乳動物Ｔ細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーＴ細胞の表面表現型には、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ１２７（ＩＬ－７Ｒ）、及びＩＬ－１５Ｒも含まれる。セントラルメモリーＴ細胞の転写因子には、ＢＬＩＭＰ１が含まれる。エフェクターメモリーＴ細胞は、インターフェロンγ、ＩＬ－４、及びＩＬ－５を含む、抗原刺激後に高レベルの炎症性サイトカインを急速に分泌する。エフェクターメモリーＴ細胞は、血液中のＣＤ８コンパートメントで顕著であり、ヒトでは肺、肝臓、及び腸において比例して濃縮される。ＣＤ８＋エフェクターメモリーＴ細胞は、大量のパーフォリンを有する。
腫瘍を破壊するためのプロセスを説明するために本明細書で使用される「断片化すること」、「断片」、及び「断片化された」という用語は、腫瘍組織を破砕、スライス、分割、及び細分化するなどの機械的断片化法、ならびに腫瘍組織の物理的構造を破壊するための任意の他の方法を含む。
「末梢血単核細胞」及び「ＰＢＭＣ」という用語は、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）及び単球を含む、円形の核を有する末梢血細胞を指す。抗原提示細胞として使用される場合（ＰＢＭＣは抗原提示細胞の一種である）、末梢血単核細胞は、好ましくは、照射された同種異系末梢血単核細胞である。
「末梢血リンパ球」及び「ＰＢＬ」という用語は、末梢血から拡張されたＴ細胞を指す。いくつかの実施形態では、ＰＢＬは、ドナーからの全血またはアフェレーシス産物から分離される。いくつかの実施形態では、ＰＢＬは、ＣＤ３＋ ＣＤ４５＋のＴ細胞表現型などのＴ細胞表現型の正または負の選択によって、ドナー由来の全血またはアフェレーシス産物から分離される。
「抗ＣＤ３抗体」という用語は、成熟Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体におけるＣＤ３受容体を対象とするヒト、ヒト化、キメラ、またはマウス抗体を含む、抗体またはそのバリアント、例えば、モノクローナル抗体を指す。抗ＣＤ３抗体には、ムロモナブとしても知られるＯＫＴ－３が含まれる。抗ＣＤ３抗体には、Ｔ３及びＣＤ３εとしても知られるＵＨＣＴ１クローンも含まれる。他の抗ＣＤ３抗体には、例えば、オテリキシズマブ、テプリズマブ、及びビシリズマブが含まれる。
「ＯＫＴ－３」（本明細書では「ＯＫＴ３」とも称される）という用語は、成熟Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体におけるＣＤ３受容体を対象とするヒト、ヒト化、キメラ、またはマウス抗体を含む、モノクローナル抗体またはそのバイオシミラーもしくはバリアントを指し、市販の形態、例えば、ＯＫＴ－３（３０ｎｇ／ｍＬ、ＭＡＣＳ ＧＭＰ ＣＤ３ ｐｕｒｅ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）及びムロモナブ、またはそれらのバリアント、保存的アミノ酸置換物、グリコフォーム、またはバイオシミラーを含む。ムロモナブの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を表１に示す（配列番号１及び配列番号２）。ＯＫＴ－３を産生することができるハイブリドーマは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ ８００１が割り当てられている。ＯＫＴ－３を産生することができるハイブリドーマは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）にも寄託され、カタログ番号８６０２２７０６が割り当てられている。

Figure 2024511414000002
「ＩＬ－２」（本明細書では「ＩＬ２」とも称される）という用語は、インターロイキン－２として知られるＴ細胞成長因子を指し、ヒト及び哺乳動物形態、その保存的アミノ酸置換物、グリコフォーム、バイオシミラー、及びバリアントを含む、ＩＬ－２のすべての形態を含む。ＩＬ－２は、例えば、Ｎｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４，１７２，３９８３－８８及びＭａｌｅｋ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８，２６，４５３－７９に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ－２のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号３）。例えば、ＩＬ－２という用語は、アルデスロイキン（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ、単回使用バイアル当たり２２００万ＩＵで複数の供給業者から市販されている）などのヒト組換えＩＬ－２形態、ならびにＣｅｌｌＧｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＮＨ，ＵＳＡ（ＣＥＬＬＧＲＯ ＧＭＰ）またはＰｒｏＳｐｅｃ－Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ．，Ｅａｓｔ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ，ＵＳＡによって市販されている組換えＩＬ－２形態（カタログ番号ＣＹＴ－２０９－ｂ）及び他のベンダーからの他の同等商品を包含する。アルデスロイキン（デス－アラニル－１、セリン－１２５ヒトＩＬ－２）は、およそ１５ｋＤａの分子量を有する非グリコシル化ヒト組換えＩＬ－２形態である。本発明での使用に適したアルデスロイキンのアミノ酸配列を表２に示す（配列番号４）。ＩＬ－２という用語はまた、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手可能なペグ化ＩＬ２プロドラッグであるＮＫＴＲ－２１４を含む、本明細書に記載されるペグ化形態のＩＬ－２を包含する。本発明での使用に適したＮＫＴＲ－２１４及びペグ化ＩＬ－２は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／０３２８７９１Ａ１号及び国際特許出願公開第ＷＯ２０１２／０６５０８６Ａ１号に記載されており、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。本発明での使用に適したコンジュゲートＩＬ－２の代替形態は、米国特許第４，７６６，１０６号、同第５，２０６，３４４号、同第５，０８９，２６１号、及び同第４，９０２，５０２号に記載されており、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。本発明での使用に好適なＩＬ－２の製剤は、米国特許第６，７０６，２８９号に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。

Figure 2024511414000003
「ＩＬ－４」（本明細書では「ＩＬ４」とも称される）という用語は、インターロイキン４として知られるサイトカインを指し、これは、Ｔｈ２Ｔ細胞、ならびに好酸球、好塩基球、及び肥満細胞によって産生される。ＩＬ－４は、ナイーブヘルパーＴ細胞（Ｔｈ０細胞）からＴｈ２ Ｔ細胞への分化を調節する。Ｓｔｅｉｎｋｅ ａｎｄ Ｂｏｒｉｓｈ，Ｒｅｓｐｉｒ．Ｒｅｓ．２００１，２，６６－７０。ＩＬ－４によって活性化されると、Ｔｈ２Ｔ細胞は、その後、正のフィードバックループでさらなるＩＬ－４を産生する。ＩＬ－４は、Ｂ細胞増殖及びクラスＩＩ ＭＨＣ発現も刺激し、Ｂ細胞からのＩｇＥ及びＩｇＧ１発現へのクラススイッチを誘導する。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ－４は、ＰｒｏＳｐｅｃ－Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ．，Ｅａｓｔ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ，ＵＳＡ（カタログ番号ＣＹＴ－２１１）及びＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ（ヒトＩＬ－１５組換えタンパク質、カタログ番号Ｇｉｂｃｏ ＣＴＰ００４３）を含む、複数の供給業者から市販されている。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ－４のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号５）。
「ＩＬ－７」（本明細書では「ＩＬ７」とも称される）という用語は、インターロイキン７として知られるグリコシル化された組織由来のサイトカインを指し、これは、間質細胞及び上皮細胞、ならびに樹状細胞から得ることができる。Ｆｒｙ ａｎｄ Ｍａｃｋａｌｌ，Ｂｌｏｏｄ ２００２，９９，３８９２－９０４。ＩＬ－７は、Ｔ細胞の発達を刺激することができる。ＩＬ－７は、ＩＬ－７受容体アルファ及び共通のガンマ鎖受容体からなるヘテロ二量体であるＩＬ－７受容体に結合し、これは、胸腺内でのＴ細胞の発達及び末梢内での生存に重要な一連のシグナルである。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ－７は、ＰｒｏＳｐｅｃ－Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ．，Ｅａｓｔ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ，ＵＳＡ（カタログ番号ＣＹＴ－２５４）及びＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ（ヒトＩＬ－１５組換えタンパク質、カタログ番号Ｇｉｂｃｏ ＰＨＣ００７１）を含む、複数の供給業者から市販されている。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ－７のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号６）。
「ＩＬ－１５」（本明細書では「ＩＬ１５」とも称される）という用語は、インターロイキン－１５として知られるＴ細胞成長因子を指し、ヒト及び哺乳動物形態、保存的アミノ酸置換物、グリコフォーム、バイオシミラー、及びそのバリアントを含む、ＩＬ－２のすべての形態を含む。ＩＬ－１５は、例えば、Ｆｅｈｎｉｇｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｉｇｉｕｒｉ，Ｂｌｏｏｄ ２００１，９７，１４－３２に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ－１５は、β及びγシグナル伝達受容体サブユニットをＩＬ－２と共有する。組換えヒトＩＬ－１５は、１２．８ｋＤａの分子量を有する１１４個のアミノ酸（及びＮ末端メチオニン）を含む単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトＩＬ－１５は、ＰｒｏＳｐｅｃ－Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ．，Ｅａｓｔ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ，ＵＳＡ（カタログ番号ＣＹＴ－２３０－ｂ）及びＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ（ヒトＩＬ－１５組換えタンパク質、カタログ番号３４－８１５９－８２）を含む、複数の供給業者から市販されている。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ－１５のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号７）。
「ＩＬ－２１」（本明細書では「ＩＬ２１」とも称される）という用語は、インターロイキン－２１として知られる多面発現性サイトカインタンパク質を指し、ヒト及び哺乳動物形態、その保存的アミノ酸置換物、グリコフォーム、バイオシミラー、及びバリアントを含む、ＩＬ－２１のすべての形態を含む。ＩＬ－２１は、例えば、Ｓｐｏｌｓｋｉ ａｎｄ Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃ．２０１４，１３，３７９－９５に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ－２１は、主にナチュラルキラーＴ細胞及び活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞によって産生される。組換えヒトＩＬ－２１は、１５．４ｋＤａの分子量を有する１３２個のアミノ酸を含む単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトＩＬ－２１は、ＰｒｏＳｐｅｃ－Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ．，Ｅａｓｔ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ，ＵＳＡ（カタログ番号ＣＹＴ－４０８－ｂ）及びＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ（ヒトＩＬ－２１組換えタンパク質、カタログ番号１４－８２１９－８０）を含む、複数の供給業者から市販されている。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ－２１のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号８）。
「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」、または「治療量」が示された場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染または転移の程度、及び状態の個人差を考慮して、医師によって決定することができる。本明細書に記載される腫瘍浸潤リンパ球（例えば、二次ＴＩＬまたは遺伝子修飾細胞傷害性リンパ球）を含む薬学的組成物が、１０４～１０１１細胞／ｋｇ体重（例えば、１０５～１０６、１０５～１０１０、１０５～１０１１、１０６～１０１０、１０６～１０１１、１０７～１０１１、１０７～１０１０、１０８～１０１１、１０８～１０１０、１０９～１０１１、または１０９～１０１０細胞／ｋｇ体重）（それらの範囲内のすべての整数値を含む）の投与量で投与され得ると一般的に言える。腫瘍浸潤リンパ球（すべての事例で、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断することによって選択的に不活性化するために、１つ以上の転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）をコードするｍＲＮＡなどの核酸を細胞傷害性リンパ球に導入することであって、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼが、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む、導入することによって遺伝子修飾された少なくとも複数の細胞傷害性リンパ球を含む）組成物も、これらの投与量で複数回投与され得る。腫瘍浸潤リンパ球（すべての場合において、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断することによって選択的に不活性化するために、１つ以上の転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）をコードするｍＲＮＡなどの核酸を細胞傷害性リンパ球に導入することであって、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼが、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む、導入することによって遺伝子修飾された少なくとも複数の細胞傷害性リンパ球を含む）は、免疫療法で一般的に知られている注入技法を使用することによって投与することができる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．，３１９：１６７６，１９８８を参照されたい）。特定の患者に最適な投薬量及び治療レジーム（ｒｅｇｉｍｅ）は、患者を疾患の兆候について監視し、それに従って治療を調整することによって、医学分野の当業者によって容易に決定され得る。
本明細書で使用される「微小環境」という用語は、全体としての固形もしくは血液学的腫瘍微小環境、または微小環境内の細胞の個々のサブセットを指し得る。本明細書で使用される腫瘍微小環境は、Ｓｗａｒｔｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２０１２，７２，２４７３に記載されるように、「腫瘍性形質転換を促進し、腫瘍成長及び侵襲を支持し、腫瘍を宿主免疫から保護し、治療抵抗性を助長し、かつ優勢な転移を成功させるニッチを提供する、細胞、可溶性因子、シグナル伝達分子、細胞外マトリックス、及び機械的手がかり」の複合混合物を指す。微小環境による免疫抑制のため、Ｔ細胞によって認識されるべき抗原を発現する腫瘍はであっても、微小環境による免疫抑制のため、免疫系による腫瘍クリアランスは稀である。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＩＬの集団（ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化するために、ＴＩＬに１つ以上の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）をコードするｍＲＮＡなどの核酸を導入することであって、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼが、ＣＩＳＨ標的遺伝子配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む、導入することによって集団が遺伝子修飾された少なくとも複数のＴＩＬ）でがんを治療する方法を含み、患者は、本発明によるそのようなＴＩＬの注入前に、骨髄非破壊的化学療法で前治療される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬの集団が提供され得、患者は、本発明によるそのようなＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前治療される。いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的化学療法は、シクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日で２日間（そのようなＴＩＬの注入の２７日前及び２６日前）、ならびにフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日で５日間（そのようなＴＩＬの注入の２７日前～２３日前）である。いくつかの実施形態では、本発明による骨髄非破壊的化学療法及びＴＩＬ注入（０日目）後、患者は、生理学的寛容まで８時間毎に７２０，０００ＩＵ／ｋｇでＩＬ－２の静脈内注入を受ける。
「有効量」または「治療有効量」という用語は、疾患治療を含むが、これに限定されない、意図された用途を達成するのに十分である、本明細書に記載の化合物または化合物の組み合わせの量を指す。治療有効量は、意図される用途（インビトロもしくはインビボ）、または治療される対象及び病状（例えば、対象の体重、年齢、及び性別）、病状の重症度、または投与方法に応じて異なり得る。この用語は、標的細胞において特定の応答（例えば、血小板粘着及び／または細胞遊走の低減）を誘導する用量にも適用される。特定の用量は、選択された特定の化合物、従うべき投薬レジメン、化合物が他の化合物と組み合わせて投与されるか、投与のタイミング、それが投与される組織、及び化合物が運ばれる物理的送達系に応じて異なる。
「治療」、「治療すること」、「治療する」などの用語は、所望の薬理学的及び／または生理学的効果を得ることを指す。その効果は、その疾患または症状を完全にまたは部分的に予防するという観点において予防的であり得、及び／または疾患及び／またはその疾患に起因する副作用の部分的または完全な治癒という観点において治療的であり得る。本明細書で使用される「治療」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患のあらゆる治療を包含し、（ａ）疾患にかかりやすい可能性があるが、まだ疾患を有すると診断されていない対象に疾患が生じるのを予防すること、（ｂ）疾患を抑制すること、すなわち、その発症または進行を抑止すること、及び（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患の退行を引き起こし、及び／または１つ以上の疾患症状を軽減することを含む。「治療」は、疾患または状態がない場合でさえも、薬理学的効果を提供するための薬剤の送達を包含するようにも意図されている。例えば、「治療」は、病状がない場合、例えば、ワクチンの場合に免疫応答を誘発するか、または免疫を与えることができる組成物の送達を包含する。
「異種」という用語は、核酸またはタンパク質の一部に関して使用される場合、核酸またはタンパク質が、自然界では互いに同じ関係では見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、核酸は、典型的には、組換え的に産生され、新たな機能的核酸、例えば、ある供給源からのプロモーター及び別の供給源からのコード領域、または異なる供給源からのコード領域を作製するように配置された無関係の遺伝子由来の２つ以上の配列を有する。同様に、異種タンパク質は、そのタンパク質が、自然界では互いに同じ関係では見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す（例えば、融合タンパク質）。
２つ以上の核酸またはポリペプチドの文脈における「配列同一性」、「同一性パーセント」、及び「配列同一性パーセント」（もしくはそれらの同義語、例えば「９９％同一」）という用語は、同じであるか、または配列同一性の一部としていかなる保存的アミノ酸置換も考慮せずに、最大一致のために比較し整列させた場合（必要に応じてギャップを導入する）、同一である、または同一である特定の割合のヌクレオチドもしくはアミノ酸残基を有する２つ以上の配列または部分配列を指す。同一性パーセントは、配列比較ソフトウェアもしくはアルゴリズムを使用して、または目視検査によって測定することができる。アミノ酸またはヌクレオチド配列のアラインメントを取得するために使用され得る様々なアルゴリズム及びソフトウェアが当該技術分野で知られている。配列同一性パーセントの決定に好適なプログラムには、例えば、米国政府の国立生物工学情報センターのＢＬＡＳＴウェブサイトから入手可能なＢＬＡＳＴプログラム一式が含まれる。２つの配列間の比較は、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して実行することができる。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列を比較するために使用され、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列を比較するために使用される。ＤＮＡＳＴＡＲから入手可能なＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、またはＭｅｇＡｌｉｇｎは、配列を整列させるために使用することができる追加の公的に入手可能なソフトウェアプログラムである。当業者であれば、特定のアラインメントソフトウェアによって最大アラインメントに適切なパラメータを決定することができる。ある特定の実施形態では、アラインメントソフトウェアのデフォルトパラメータが使用される。
本明細書で使用される場合、「バリアント」という用語は、参照抗体のアミノ酸配列内または隣接する特定の位置における１つ以上の置換、欠失、及び／または付加により参照抗体のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む抗体または融合タンパク質を包含するが、これらに限定されない。バリアントは、参照抗体のアミノ酸配列と比較して、そのアミノ酸配列に１つ以上の保存的置換を含み得る。保存的置換は、例えば、同様に荷電したまたは非荷電のアミノ酸の置換を含み得る。バリアントは、参照抗体の抗原に特異的に結合する能力を保持している。バリアントという用語は、ペグ化抗体またはタンパク質も含む。ＴＩＬは、一般に、細胞表面マーカーを使用して生化学的に定義されるか、または腫瘍に浸潤して治療を達成するそれらの能力によって機能的に定義されるかのいずれかであり得る。ＴＩＬは、一般に、以下のバイオマーカー：ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲαβ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５６、ＣＣＲ７、ＣＤ４５Ｒａ、ＣＤ９５、ＰＤ－１、及びＣＤ２５のうちの１つ以上を発現することよって分類され得る。追加的及び代替的に、ＴＩＬは、患者への再導入時に固形腫瘍に浸潤する能力により機能的に定義され得る。ＴＩＬは、効力によってさらに特徴付けられ得、例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）の放出が、約５０ｐｇ／ｍＬを超える、約１００ｐｇ／ｍＬを超える、約１５０ｐｇ／ｍＬを超える、または約２００ｐｇ／ｍＬを超える場合、ＴＩＬは強力であるとみなされ得る。
「デオキシリボヌクレオチド」という用語は、天然及び合成の、未修飾及び修飾デオキシリボヌクレオチドを包含する。修飾には、糖部分、塩基部分、及び／またはオリゴヌクレオチド中のデオキシリボヌクレオチド間の結合への変更が含まれる。
「ＲＮＡ」という用語は、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を定義する。「リボヌクレオチド」という用語は、ｂ－Ｄ－リボフラノース部分の２′位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを定義する。ＲＮＡという用語には、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的に精製されたＲＮＡなどの単離されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え的に産生されたＲＮＡ、ならびに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換、及び／または改変によって天然に存在するＲＮＡとは異なる改変されたＲＮＡが含まれる。本明細書に記載のＲＮＡ分子のヌクレオチドはまた、天然に存在しないヌクレオチドまたは化学的に合成されたヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドを含み得る。これらの改変されたＲＮＡは、類似体または天然に存在するＲＮＡの類似体と称され得る。
「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、ならびに不活性成分を含むよう意図されている。医薬品有効成分のためのかかる薬学的に許容される担体または薬学的に許容される賦形剤の使用は、当該技術分野で周知である。任意の従来の薬学的に許容される担体または薬学的に許容される賦形剤が医薬品有効成分と適合しない場合を除いて、本発明の治療用組成物におけるその使用が企図される。他の薬物などの追加の医薬品有効成分を、記載された組成物及び方法に組み込むこともできる。
「約」及び「およそ」という用語は、値の統計的に有意な範囲内を意味する。かかる範囲は、所与の値または範囲の１桁以内、好ましくは５０％以内、より好ましくは２０％以内、なおより好ましくは１０％以内、さらにより好ましくは５％以内であり得る。「約」または「およそ」という用語によって包含される許容偏差は、研究中の特定のシステムに依存し、当業者によって容易に理解され得る。さらに、本明細書で使用される場合、「約」及び「およそ」という用語は、寸法、サイズ、配合、パラメータ、形状、ならびに他の量及び特徴が正確でなく、かつ正確である必要はないが、公差、変換係数、四捨五入、測定誤差など、及び当業者に知られている他の要因を反映して、必要に応じて、およそであってもよく、及び／またはそれよりも大きくても小さくてもよいことを意味する。一般に、寸法、サイズ、配合、パラメータ、形状、または他の量もしくは特徴は、そのように明示的に述べられているかにかかわらず、「約」または「およそ」である。非常に異なるサイズ、形状、及び寸法の実施形態が、記載された配置を採用し得ることに留意されたい。
添付の特許請求の範囲で使用される場合、「含む」、「から本質的になる」、及び「からなる」という移行用語は、元の形式及び補正された形式で、存在する場合、列挙されていない追加のクレーム要素またはステップが特許請求（複数可）の範囲から除外されるかに関して特許請求の範囲を定義する。「含む」という用語は、包括的またはオープンエンドであるよう意図されており、いずれの追加的な列挙されていない要素、方法、ステップ、または材料も除外しない。「からなる」という用語は、特許請求の範囲で指定されたもの以外のいずれの要素、ステップ、または材料も除外し、後者の場合、指定された材料（複数可）に通常関連する不純物も除外する。「から本質的になる」という用語は、特許請求の範囲を、特定の要素、ステップ、または材料（複数可）、及び特許請求された本発明の基本的及び新規の特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼさないに限定する。本発明を具体化する本明細書に記載のすべての組成物、方法、及びキットは、代替の実施形態では、「含む」、「から本質的になる」、及び「からなる」という移行用語のうちのいずれかによってより具体的に定義され得る。
「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」及びその複数形の「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、免疫グロブリン全体及び任意の抗原結合断片（「抗原結合部分」）またはその一本鎖を指す。「抗体」はさらに、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重鎖（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、またはその抗原結合部分を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略される）及び重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３の３つのドメインで構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略される）及び軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬで構成される。抗体のＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域（ＨＶＲ）と称され、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が点在し得る、超可変性の領域にさらに細分化することができる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序で配列された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖及び軽鎖の可変領域は、１つまたは複数の抗原エピトープと相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的な補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
「抗原」という用語は、免疫応答を誘導する物質を指す。いくつかの実施形態では、抗原は、主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）分子によって提示される場合、抗体またはＴＣＲによって結合されることができる分子である。本明細書で使用される「抗原」という用語はまた、Ｔ細胞エピトープを包含する。抗原は、追加的に、免疫系によって認識されることができる。いくつかの実施形態では、抗原は、体液性免疫応答または細胞性免疫応答を誘導することができ、Ｂリンパ球及び／またはＴリンパ球の活性化につながる。場合によっては、これは、抗原がＴｈ細胞エピトープを含むか、またはそれに結合されることを必要とし得る。抗原はまた、１つ以上のエピトープ（例えば、Ｂ－及びＴ－エピトープ）を有し得る。いくつかの実施形態では、抗原は、好ましくは、典型的には非常に特異的かつ選択的な方法で、対応する抗体またはＴＣＲと反応し、他の抗原によって誘導され得る多数の他の抗体またはＴＣＲとは反応しない。
「モノクローナル抗体」、「ｍＡｂ」、「モノクローナル抗体組成物」という用語、またはそれらの複数形は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を示す。特定の受容体に特異的なモノクローナル抗体は、試験対象に好適な抗原を注入し、次いで、所望の配列または機能的特徴を有する抗体を発現するハイブリドーマを単離するという当該技術分野における知識及び技術を使用して作製することができる。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの好ましい供給源として機能する。一旦単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに入れられ、次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞に形質移入されて、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を取得することができる。抗体の組換え産生については、以下でより詳細に説明する。
本明細書で使用される、抗体の「抗原結合部分」または「抗原結合断片」（または単に「抗体部分」もしくは「断片」）という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって行われ得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価断片である、Ｆａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合された２つのＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ′）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨまたはＶＬドメインからなり得るドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ｗａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３４１，５４４－５４６）、ならびに（ｖｉ）単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、これらは、組換え方法を使用して、ＶＬ及びＶＨ領域が対合して、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる一価分子を形成する単一タンパク質鎖としてそれらを作製することを可能にする合成リンカーによって接合され得、例えば、Ｂｉｒｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ１９８８，２４２，４２３－４２６、及びＨｕｓｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９８８，８５，５８７９－５８８３）を参照されたい。かかるｓｃＦｖ抗体はまた、抗体の「抗原結合部分」または「抗原結合断片」という用語に包含されることを意図している。これらの抗体断片は、当業者に知られている従来の技法を使用して得られ、断片は、無傷の抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。
本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク及びＣＤＲ領域の両方が、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことを意図している。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域はまた、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含み得る（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発によって、またはインビボでの体細胞変異によって導入される変異）。本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含むことを意図しない。
「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する単一の結合特異性を示す抗体を指す。いくつかの実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合したヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから取得されたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
本明細書で使用される「組換えヒト抗体」という用語は、組換え手段によって調製、発現、作成、または単離されるすべてのヒト抗体、例えば（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子またはそれから調製されたハイブリドーマ（以下でさらに説明される）についてトランスジェニックまたはトランス染色体である動物（マウスなど）から単離された抗体、（ｂ）ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、及び（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを含む、任意の他の手段によって調製、発現、作成、または単離された抗体を含む。かかる組換えヒト抗体は、フレームワーク及びＣＤＲ領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかしながら、ある特定の実施形態では、かかる組換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックな動物が使用される場合、インビボ体細胞変異誘発）に供され得、したがって、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系ＶＨ及びＶＬ配列に由来し、関連しているが、インビボでヒト抗体生殖細胞系レパートリー内に自然に存在しない可能性がある配列である。
本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を指す。
「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」という句は、本明細書では「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と交換可能に使用される。
「ヒト抗体誘導体」という用語は、抗体と別の医薬品有効成分または抗体とのコンジュゲートを含む、ヒト抗体の任意の修飾形態を指す。「コンジュゲート」、「抗体薬物コンジュゲート」、「ＡＤＣ」、または「免疫コンジュゲート」という用語は、別の治療部分にコンジュゲートされた抗体またはその断片を指し、これは当該技術分野において使用可能な方法を使用して、本明細書に記載の抗体にコンジュゲートされ得る。
「ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」、「ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」、及び「ヒト化」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を指すことを意図している。追加のフレームワーク領域の修飾は、ヒトフレームワーク配列内で行うことができる。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの超可変領域からの残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）または非ヒト霊長類の１５の超可変領域からの残基によって置き換えられる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体には見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の性能を改良するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、超可変ループのすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的すべてを含むことになる。ヒト化抗体はまた、任意選択で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含むであろう。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ１９８６，３２１，５２２－５２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ１９８８，３３２，３２３－３２９、及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９２，２，５９３－５９６を参照されたい。本明細書に記載される抗体はまた、エフェクター機能及び／またはＦｃＲ結合の改善（例えば、低減）を与えることが知られている任意のＦｃバリアントを用いるように修飾され得る。Ｆｃバリアントは、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ１９８８／０７０８９Ａ１号、同第ＷＯ１９９６／１４３３９Ａ１号、同第ＷＯ１９９８／０５７８７Ａ１号、同第ＷＯ１９９８／２３２８９Ａ１号、同第ＷＯ１９９９／５１６４２Ａ１号、同第ＷＯ９９／５８５７２Ａ１号、同第ＷＯ２０００／０９５６０Ａ２号、同第ＷＯ２０００／３２７６７Ａ１号、同第ＷＯ２０００／４２０７２Ａ２号、同第ＷＯ２００２／４４２１５Ａ２号、同第ＷＯ２００２／０６０９１９Ａ２号、同第ＷＯ２００３／０７４５６９Ａ２号、同第ＷＯ２００４／０１６７５０Ａ２号、同第ＷＯ２００４／０２９２０７Ａ２号、同第ＷＯ２００４／０３５７５２Ａ２号、同第ＷＯ２００４／０６３３５１Ａ２号、同第ＷＯ２００４／０７４４５５Ａ２号、同第ＷＯ２００４／０９９２４９Ａ２号、同第ＷＯ２００５／０４０２１７Ａ２号、同第ＷＯ２００５／０７０９６３Ａ１号、同第ＷＯ２００５／０７７９８１Ａ２号、同第ＷＯ２００５／０９２９２５Ａ２号、同第ＷＯ２００５／１２３７８０Ａ２号、同第ＷＯ２００６／０１９４４７Ａ１号、同第ＷＯ２００６／０４７３５０Ａ２号、及び同第ＷＯ２００６／０８５９６７Ａ２号、ならびに米国特許第５，６４８，２６０号、同第５，７３９，２７７号、同第５，８３４，２５０号、同第５，８６９，０４６号、同第６，０９６，８７１号、同第６，１２１，０２２号、同第６，１９４，５５１号、同第６，２４２，１９５号、同第６，２７７，３７５号、同第６，５２８，６２４号、同第６，５３８，１２４号、同第６，７３７，０５６号、同第６，８２１，５０５号、同第６，９９８，２５３号、及び同第７，０８３，７８４号（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるアミノ酸置換のうちのいずれか１つを含み得る。
「キメラ抗体」という用語は、可変領域配列が１つの種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体、例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体を指すことを意図している。
「二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）」は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片である。断片は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＨ）中に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメインを対合させるには短すぎるリンカーを使用すると、ドメインは別のチェーンの相補ドメインと対合させられ、２つの抗原結合部位が作成される。二重特異性抗体は、例えば、欧州特許第ＥＰ４０４，０９７号、国際特許公開第ＷＯ９３／１１１６１号、及びＢｏｌｌｉｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９９３，９０，６４４４－６４４８により完全に記載されている。
「グリコシル化」という用語は、抗体の修飾誘導体を指す。非グリコシル化抗体は、グリコシル化を欠いている。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加させるように変化され得る。かかる炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１つ以上のグリコシル化部位を変化させることによって達成され得る。例えば、１つ以上の可変領域フレームワークのグリコシル化部位の排除をもたらす、１つ以上のアミノ酸置換を行い、それによってその部位でのグリコシル化を排除することができる。米国特許第５，７１４，３５０号及び同第６，３５０，８６１号に記載されているように、修飾されたグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を高める可能性がある。追加的または代替的に、修飾した種類のグリコシル化を有する抗体、例えば、フコシル残基の量が低減した低フコシル化抗体または二分ＧｌｃＮａｃ構造が増加した抗体が作製され得る。かかるグリコシル化パターンの変化は、抗体の能力を増加させることが実証されている。かかる炭水化物修飾は、例えば、抗体をグリコシル化機構が変化した宿主細胞で発現させることによって達成され得る。グリコシル化機構が変化した細胞については、当該技術分野で説明されており、本発明の組換え抗体を発現させ、それによりグリコシル化が変化した抗体を産生する宿主細胞として使用され得る。例えば、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９細胞株で発現される抗体が、それらの炭水化物上のフコースを欠くように、細胞株Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９は、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８（アルファ（１，６）フコシルトランスフェラーゼ）を欠く。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９ＦＵＴ８－／－細胞株は、２つの置換ベクターを使用したＣＨＯ／ＤＧ４４細胞中のＦＵＴ８遺伝子の標的破壊によって作成された（例えば、米国特許公開第２００４／０１１０７０４号またはＹａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００４，８７，６１４－６２２を参照されたい）。別の例として、欧州特許第ＥＰ１，１７６，１９５号は、フコシルトランスフェラーゼをコードし、それによりかかる細胞株で発現される抗体が、アルファ１，６結合関連酵素を低減または排除することによって低フコシル化を示す、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を有する細胞株を説明しており、抗体のＦｃ領域に結合するＮ－アセチルグルコサミンにフコースを付加するための酵素活性が低いか、または酵素活性を有しない細胞株、例えばラット骨髄腫細胞株ＹＢ２／０（ＡＴＣ ＣＣＲ Ｌ１６６２）についても説明している。国際特許公開第ＷＯ０３／０３５８３５号は、フコースをＡｓｎ（２９７）結合型炭水化物に付着させる能力が低減し、さらにその宿主細胞で発現される抗体の低フコシル化ももたらすバリアントＣＨＯ細胞株であるＬｅｃ１３細胞について説明している（Ｓｈｉｅｌｄｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２，２７７，２６７３３－２６７４０も参照されたい）。国際特許公開第ＷＯ９９／５４３４２号は、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作され、それにより操作された細胞株で発現される抗体が、二分性ＧｌｃＮａｃ構造の増加を示し、抗体のＡＤＣＣ活性の増加をもたらす、細胞株について記載している（Ｕｍａｎａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９９９，１７，１７６－１８０も参照されたい）。代替的に、フコシダーゼ酵素を使用して、抗体のフコース残基を切断でき得る。例えば、フコシダーゼアルファ－Ｌ－フコシダーゼは、Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７５，１４，５５１６－５５２３に記載されているように、抗体からフコシル残基を除去する。
「ペグ化」は、通常、１つ以上のＰＥＧ基が抗体または抗体断片に付着する条件下で、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と反応させる、修飾された抗体またはその断片を指す。ペグ化は、例えば、抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を増加させることができる。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実行される。本明細書で使用される場合、「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ１～Ｃ１０）アルコキシ－もしくはアリールオキシ－ポリエチレングリコール、またはポリエチレングリコール－マレイミドなどの、他のタンパク質を誘導体化するために使用されている任意の形態のＰＥＧを包含することが意図される。ペグ化される抗体は、非グリコシル化抗体であり得る。ペグ化のための方法は、当該技術分野で知られており、例えば欧州特許第ＥＰ０１５４３１６号及び同第ＥＰ０４０１３８４号、ならびに米国特許第５，８２４，７７８号（各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、本発明の抗体に適用することができる。
「バイオシミラー」という用語は、モノクローナル抗体またはタンパク質を含む、臨床的に不活性な成分にわずかな違いがあるにもかかわらず、米国で認可された参照バイオ製品と非常に類似しており、製品の安全性、純度、及び効力に関してバイオ製品と参照製品との間に臨床的に意味のある差異がない、バイオ製品を意味する。さらに、類似のバイオまたは「バイオシミラー」医薬品は、欧州医薬品庁によって既に使用が許可されている別のバイオ医薬品に類似したバイオ医薬品である。「バイオシミラー」という用語は、他の国及び地域の規制機関によっても同義的に使用されている。バイオ製品またはバイオ医薬品は、細菌または酵母などの生物源によって作製された、またはそれに由来する医薬品である。それらは、ヒトインスリンもしくはエリスロポエチンなどの比較的小さな分子、またはモノクローナル抗体などの複雑な分子からなり得る。例えば、参照ＩＬ－２タンパク質がアルデスロイキン（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ）である場合、アルデスロイキンに関して薬物規制当局によって承認されたタンパク質は、アルデスロイキンの「バイオシミラー」であるか、またはアルデスロイキンの「そのバイオシミラー」である。欧州では、類似のバイオまたは「バイオシミラー」医薬品は、欧州医薬品庁（ＥＭＡ）によって既に使用が許可されている別のバイオ医薬品に類似したバイオ医薬品である。欧州における同様の生物学的用途に関連する法的根拠は、補正された規制（ＥＣ）Ｎｏ７２６／２００４の第６条及び指針２００１／８３／ＥＣの第１０（４）条であり、したがって欧州では、バイオシミラーは、規制（ＥＣ）Ｎｏ７２６／２００４の第６条及びＤｉｒｅｃｔｉｖｅ２００１／８３／ＥＣの第１０（４）条の下で、認可または認可申請の対象について認可、承認され得る。既に認可されているオリジナルのバイオ医薬品は、欧州では「参照医薬品」と称されることがある。バイオシミラーとみなされる製品に対する要件のうちのいくつかは、同様な生物学的製剤に関するＣＨＭＰガイドラインに概説されている。さらに、モノクローナル抗体バイオシミラーに関連するガイドラインを含む製品固有のガイドラインは、ＥＭＡによって製品毎に提供され、そのウェブサイトで公開されている。本明細書に記載のバイオシミラーは、品質特徴、生物活性、作用機序、安全性プロファイル、及び／または有効性の点で、参照医薬品に類似している可能性がある。さらに、バイオシミラーは、参照医薬品と同じ状態を治療するために使用され得るか、または使用を意図され得る。したがって、本明細書に記載のバイオシミラーは、参照医薬品と類似または非常に類似した品質特徴を有するとみなされ得る。代替的に、または追加的に、本明細書に記載のバイオシミラーは、参照医薬品と類似または非常に類似した生物活性を有するとみなされ得る。代替的に、または追加的に、本明細書に記載のバイオシミラーは、参照医薬品と類似または非常に類似した安全性プロファイルを有するとみなされ得る。代替的に、またはさらに、本明細書に記載のバイオシミラーは、参照医薬品と類似または非常に類似した効力を有するとみなされ得る。本明細書に記載されているように、欧州におけるバイオシミラーは、ＥＭＡによって認可された参照医薬品と比較される。しかしながら、場合によっては、バイオシミラーは、特定の研究で欧州経済領域外で認可されたバイオ医薬品（ＥＥＡ認可されていない「コンパレーター」）と比較される場合がある。かかる研究には、例えば、特定の臨床研究及びインビボ非臨床研究が含まれる。本明細書で使用される場合、「バイオシミラー」という用語は、ＥＥＡ認可されていないコンパレーターと比較された、または比較され得るバイオ医薬品にも関する。特定のバイオシミラーは、抗体、抗体断片（例えば、抗原結合部分）、及び融合タンパク質などのタンパク質である。タンパク質バイオシミラーは、ポリペプチドの機能に有意な影響を及ぼさない、アミノ酸構造にわずかな修飾（例えば、アミノ酸の欠失、付加、及び／または置換を含む）を有するアミノ酸配列を有し得る。バイオシミラーは、その参照医薬品のアミノ酸配列に対して９７％以上、例えば、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。バイオシミラーは、その違いが医薬品の安全性及び／または有効性の変化をもたらさない限り、１つ以上の翻訳後修飾、例えば、限定されないが、参照医薬品の翻訳後修飾とは異なる、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び／または切断を含み得る。バイオシミラーは、参照医薬品と同一または異なるグリコシル化パターンを有し得る。特に、排他的ではないが、バイオシミラーは、その違いが参照医薬品に関連する安全性の懸念に対処するか、対処することを意図している場合、異なるグリコシル化パターンを有し得る。加えて、バイオシミラーは、医薬品の安全性及び有効性が損なわれないならば、例えば、その強度、薬学的剤型、製剤、賦形剤、及び／または提示において参照医薬品から逸脱する可能性がある。バイオシミラーは、参照医薬品と比較して、例えば薬物動態（ＰＫ）及び／または薬力学的（ＰＤ）プロファイルの違いを含み得るが、それでも、認可される、または認可に適しているとみなされるように、参照医薬品と十分に類似しているとみなされる。特定の状況において、バイオシミラーは、参照医薬品と比較して異なる結合特性を示し、異なる結合特性は、ＥＭＡなどの規制当局によって類似のバイオ製品としての認可の障壁ではないとみなされる。「バイオシミラー」という用語は、他の国及び地域の規制機関によっても同義的に使用されている。
ＩＩＩ．ＴＡＬＥＮ遺伝子編集及び拡張プロセス
Ａ．概要：ＴＩＬ拡張＋ＴＡＬＥＮ遺伝子編集
本発明の実施形態は、ＴＩＬ集団を拡張するための方法に関し、方法は、ＴＩＬに、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上の転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）をコードするｍＲＮＡなどの核酸を導入することによる、ＴＩＬの少なくとも一部をＴＡＬＥＮ遺伝子編集する１つ以上のステップを含み、ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、それらの治療効果を増強するために、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む。本明細書で使用される場合、「ＴＡＬＥＮ遺伝子編集」、「遺伝子編集」、及び「ゲノム編集」は、ＤＮＡが細胞のゲノム内で永続的に修飾され、例えば、ＤＮＡが細胞のゲノム内で挿入、欠失、修飾、または置換される遺伝子修飾のタイプを指す。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集は、ＤＮＡ配列の発現をサイレンシング（遺伝子ノックアウトと称されることもある）または阻害／低減（遺伝子ノックダウンと称されることもある）させる。他の実施形態では、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集は、ＤＮＡ配列の発現を増強させる（例えば、過剰発現を引き起こすことによって）。本発明の実施形態によれば、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集技術は、ＴＩＬの治療用集団の有効性を増強するために使用される。
本発明の遺伝子修飾ＴＩＬは、ＴＩＬの集団を含み、その少なくとも一部が、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化するように向けられる１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸をＴＩＬに導入することによって遺伝子修飾され、ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、配列番号１７５の核酸配列を含む核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含み、そのＴＩＬの集団は、本明細書の図７に記載の方法のいずれかの実施形態に従って、またはＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５８６１０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１２６０５、もしくはＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１２６３３に記載されるように、治療用集団に拡張することができる。
Ｂ．ＴＩＬ拡張中のＴＡＬＥＮ遺伝子編集のタイミング
いくつかの実施形態によれば、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的なＴＩＬ集団に拡張するための方法を提供し、
（ａ）患者から取得された腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することによって、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を取得することと、
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に付加することと、
（ｃ）ＩＬ－２及び任意選択でＯＫＴ－３（例えば、ＯＫＴ－３は拡張プロセスの開始日に開始して細胞培地中に存在し得る）を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行い、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、第１の拡張が、約３～１４日間行われて、第２のＴＩＬ集団を取得し、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、系を開くことなく起こる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）で補充することによって第２の拡張を行い、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第２の拡張が、約７～１４日間行われて、第３のＴＩＬ集団を取得し、第３のＴＩＬ集団が、治療的なＴＩＬ集団であり、第２の拡張が、第２のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行が、系を開放することなく起こる、第３のＴＩＬ集団を産生することと、
（ｅ）ステップ（ｄ）から取得された治療的なＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行が、系を開放することなく起こる、採取することと、
（ｆ）ステップ（ｅ）からの採取されたＴＩＬ集団を注入バッグに移送することであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移送が、系を開放することなく起こる、移送することと、
（ｇ）ステップ（ｆ）の注入バッグへの移送前の方法中の任意の時点で、ＴＩＬ細胞の少なくとも一部を、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に非活性化することを対象とする１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードする核酸、任意選択でｍＲＮＡをＴＩＬ細胞に導入することによる遺伝子編集に供し、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、配列番号１７５の核酸配列を含む核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む。
上記の実施形態のステップ（ｇ）に記載されるように、遺伝子編集プロセスは、ステップ（ｆ）における注入バッグへの移送前のＴＩＬ拡張方法中の任意の時点で実行されてもよく、これは、遺伝子編集が、拡張方法のステップのうちのいずれかの前、最中、または後に、例えば、上記の方法で概説されたステップ（ａ）～（ｆ）のうちのいずれかの間、または上記の方法で概説されたステップ（ａ）～（ｅ）のうちのいずれかの前もしくは後に、ＴＩＬ上で実行されてもよいことを意味する。ある特定の実施形態によれば、ＴＩＬは、拡張する方法中に収集され（例えば、拡張する方法は、ＴＩＬの少なくとも一部について「一時停止」され）、収集されたＴＩＬは、遺伝子編集プロセスに供され、場合によっては、その後、拡張プロセスを継続するために拡張方法に再導入され（例えば、培地に戻され）、それにより最終的に注入バッグに移送される治療的なＴＩＬ集団の少なくとも一部が永続的に遺伝子編集される。いくつかの実施形態では、遺伝子編集プロセスは、ＴＩＬを活性化し、活性化されたＴＩＬに対して遺伝子編集ステップを行い、本明細書に記載のプロセスに従って遺伝子編集ＴＩＬを拡張することによって、拡張の前に実行されてもよい。
拡張するプロセスの代替実施形態は、上記に示される方法とは異なり得ることに留意されたく、例えば、代替実施形態は、同じステップ（ａ）～（ｇ）を有し得ないか、または異なる数のステップを有し得る。特定の実施形態にかかわらず、遺伝子編集プロセスは、ＴＩＬ拡張方法中の任意の時点で実行されてもよい。例えば、代替実施形態は、３つ以上の拡張を含み得、第３または第４の拡張中にＴＩＬに対して遺伝子編集が行われ得ることなどが可能である。
一実施形態によれば、遺伝子編集プロセスは、第１の集団、第２の集団、及び第３の集団のうちの１つ以上からのＴＩＬに対して実行される。例えば、遺伝子編集は、第１のＴＩＬ集団に対して、または第１の集団から収集されたＴＩＬの一部に対して実行されてもよく、遺伝子編集プロセスに続いて、それらのＴＩＬをその後、拡張するプロセスに戻してもよい（例えば、培養培地に戻してもよい）。あるいは、遺伝子編集は、第２もしくは第３の集団からのＴＩＬに対して、または第２もしくは第３の集団から収集されたＴＩＬの一部に対してそれぞれ実行されてもよく、遺伝子編集プロセスに続いて、それらのＴＩＬをその後、拡張するプロセスに戻してもよい（例えば、培養培地に戻してもよい）。他の実施形態によれば、遺伝子編集は、ＴＩＬがまだ培養培地中にある間、及び拡張が実行されている間に行われ、すなわち、遺伝子編集を実施するために必ずしも拡張から「移動」されるわけではない。
他の実施形態によれば、遺伝子編集プロセスは、第１の拡張からのＴＩＬ、または第２の拡張からのＴＩＬ、またはその両方で実行される。例えば、第１の拡張または第２の拡張中に、遺伝子編集は、培養培地から収集されたＴＩＬに対して実行され得、遺伝子編集プロセスの後、それらのＴＩＬは、その後、例えば、それらを培養培地に再導入することによって、拡張方法に戻され得る。
他の実施形態によれば、遺伝子編集プロセスは、第１の拡張後及び第２の拡張前にＴＩＬの少なくとも一部に対して実行される。例えば、第１の拡張後に、遺伝子編集は、培養培地から収集されたＴＩＬに対して実行され得、遺伝子編集プロセスの後、それらのＴＩＬは、その後、例えば、それらを第２の拡張のための培養培地に再導入することによって、拡張方法に戻され得る。
代替実施形態によれば、遺伝子編集プロセスは、ステップ（ｃ）の前（例えば、ステップ（ａ）～（ｂ）のうちのいずれかの前、最中、もしくは後）、ステップ（ｄ）の前（例えば、ステップ（ａ）～（ｃ）のうちのいずれかの前、最中、もしくは後）、ステップ（ｅ）の前（例えば、ステップ（ａ）～（ｄ）のうちのいずれかの前、最中、もしくは後）、またはステップ（ｆ）の前（例えば、ステップ（ａ）～（ｅ）のうちのいずれかの前、最中、もしくは後）に実行される。
ＯＫＴ－３に関しては、ある特定の実施形態によれば、細胞培養培地は、開始日（０日目）、または第１の拡張の１日目に開始するＯＫＴ－３を含んでもよく、その結果、遺伝子編集は、０日目及び／または１日目に細胞培養培地中でＯＫＴ－３に曝露した後にＴＩＬに対して実行される。他の実施形態によれば、細胞培養培地は、第１の拡張中及び／または第２の拡張中にＯＫＴ－３を含み、ＯＫＴ－３が細胞培養培地に導入される前に、遺伝子編集が実行される。あるいは、細胞培養培地は、第１の拡張中及び／または第２の拡張中にＯＫＴ－３を含み、ＯＫＴ－３が細胞培養培地中に導入された後に遺伝子編集が実行される。
４－１ＢＢアゴニストに関しては、ある特定の実施形態によれば、細胞培養培地は、開始日（０日目）、または第１の拡張の１日目に開始する４－１ＢＢアゴニストを含んでもよく、その結果、遺伝子編集は、０日目及び／または１日目に細胞培養培地中で４－１ＢＢアゴニストに曝露した後にＴＩＬに対して実行されることも留意されたい。他の実施形態によれば、細胞培養培地は、第１の拡張中及び／または第２の拡張中に４－１ＢＢアゴニストを含み、４－１ＢＢアゴニストが細胞培養培地に導入される前に、遺伝子編集が実行される。あるいは、細胞培養培地は、第１の拡張中及び／または第２の拡張中に４－１ＢＢアゴニストを含み、４－１ＢＢアゴニストが細胞培養培地中に導入された後に遺伝子編集が実行される。
ＩＬ－２に関しては、ある特定の実施形態によれば、細胞培養培地は、開始日（０日目）、または第１の拡張の１日目に開始するＩＬ－２を含んでもよく、その結果、遺伝子編集は、０日目及び／または１日目に細胞培養培地中でＩＬ－２に曝露した後にＴＩＬに対して実行されることも留意されたい。他の実施形態によれば、細胞培養培地は、第１の拡張中及び／または第２の拡張中にＩＬ－２を含み、ＩＬ－２が細胞培養培地に導入される前に、遺伝子編集が実行される。あるいは、細胞培養培地は、第１の拡張中及び／または第２の拡張中にＩＬ－２を含み、ＩＬ－２が細胞培養培地中に導入された後に遺伝子編集が実行される。
上述のように、ＯＫＴ－３、４－１ＢＢアゴニスト及びＩＬ－２のうちの１つ以上は、第１の拡張の０日目または１日目に開始する細胞培地中に含まれてもよい。一実施形態によれば、ＯＫＴ－３は、第一の拡張の０日目または１日目に開始する細胞培地中に含まれ、及び／または４－１ＢＢアゴニストは、第一の拡張の０日目または１日目に開始する細胞培地中に含まれ、及び／またはＩＬ－２は、第一の拡張の０日目または１日目に開始する細胞培地中に含まれる。実施例によれば、細胞培養培地は、第１の拡張の０日目または１日目に開始するＯＫＴ－３及び４－１ＢＢアゴニストを含む。別の実施例によれば、細胞培養培地は、第１の拡張の０日目または１日目に開始するＯＫＴ－３、４－１ＢＢアゴニスト、及びＩＬ－２を含む。当然のことながら、本明細書に記載の様々な実施形態に記載されるように、ＯＫＴ－３、４－１ＢＢアゴニスト及びＩＬ－２のうちの１つ以上を、拡張するプロセス中の１つ以上の追加の時点で細胞培地に添加してもよい。
いくつかの実施形態によれば、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的なＴＩＬ集団に拡張するための方法は、
（ａ）患者から取得された腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することによって、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を取得することと、
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に付加することと、
（ｃ）ＩＬ－２を含み、任意選択でＯＫＴ－３及び／または４－１ＢＢアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を約３～１１日間培養することによって第１の拡張を行い、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、
（ｄ）ＯＫＴ－３を添加し、第２のＴＩＬ集団を刺激し、約１～３日間培養することであって、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行が、系を開放することなく起こる、培養することと、
（ｅ）第２のＴＩＬ集団を無菌エレクトロポレーションして、第２のＴＩＬ集団の細胞の一部に、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断することによって選択的に不活性化するように向けられる１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードする１つ以上の核酸、任意選択でｍＲＮＡを移入させ、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、配列番号１７５の核酸配列を含む核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含むことと、
（ｆ）第２のＴＩＬ集団を約１日間静置することと、
（ｇ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を追加のＩＬ－２、任意選択でＯＫＴ－３抗体、任意選択でＯＸ４０抗体、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）で補充することによって第２の拡張を行い、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第２の拡張が、約７～１１日間行われて、第３のＴＩＬ集団を取得し、第２の拡張が、第２のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、ステップ（ｆ）からステップ（ｇ）への移行が、系を開放することなく起こる、第３のＴＩＬ集団を産生することと、
（ｈ）ステップ（ｇ）から取得された治療的なＴＩＬ集団を採取して、採取されたＴＩＬ集団を提供することであって、ステップ（ｇ）からステップ（ｈ）への移行が、系を開放することなく起こり、採取されたＴＩＬ集団が、治療的なＴＩＬ集団である、提供することと、
（ｉ）採取されたＴＩＬ集団を注入バッグに移送することであって、ステップ（ｈ）から（ｉ）への移送が、系を開放することなく起こる、移送することと、を含み、
第２のＴＩＬ集団の細胞の一部への１つ以上の核酸の無菌エレクトロポレーションが、複数の細胞を修飾して、細胞におけるＣＩＳＨの発現を低減させる、ことを含む。
いくつかの実施形態では、核酸は、ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸は、ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡである。
いくつかの実施形態によれば、前述の方法は、凍結保存培地を使用して採取されたＴＩＬ集団を凍結保存することをさらに含む。いくつかの実施形態では、凍結保存培地はジメチルスルホキシド系凍結保存培地である。他の実施形態では、凍結保存培地は、ＣＳ１０である。
１．ＣＩＳＨ
サイトカインシグナル伝達（ＳＯＣＳ）ファミリーのサプレッサーのメンバーであるＣＩＳＨは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＴＣＲ刺激によって誘導され、腫瘍に対するそれらの機能的親和性を阻害する。ＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＣＩＳＨの遺伝的欠失は、それらの拡張、機能的親和性、及びサイトカイン多機能性を増強し得、確立された腫瘍の顕著で持続的な退縮をもたらす。例えば、Ｐａｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２１２（１２）：２０９５（２０１５）を参照されたい。
特定の実施形態によれば、ＴＩＬ中のＣＩＳＨの発現は、図７に示されるように、Ｇｅｎ２またはＧｅｎ３として記載される方法を使用して、本発明の組成物及び方法に従ってサイレンシングまたは減少され、遺伝子修飾されたＴＩＬは、ＴＩＬ中に、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断することによって選択的に不活性化することができる１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードする核酸、任意選択でｍＲＮＡを導入することによって産生され、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、配列番号１７５の核酸配列を含む核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含み、方法は、ＣＩＳＨの発現をサイレンシングまたは抑制することによるＴＩＬの少なくとも一部のＴＡＬＥＮ遺伝子編集を含む。
２．ＰＤ－１
チェックポイント遮断の誘導のために最も研究されている標的のうちの１つは、Ｔ細胞調節因子のＣＤ２８スーパーファミリーのメンバーであるプログラム死受容体（ＰＤ１またはＰＤ－１、ＰＤＣＤ１としても知られている）である。そのリガンドであるＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２は、黒色腫を含む様々な腫瘍細胞上で発現する。ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用は、Ｔ細胞エフェクター機能を阻害し、慢性刺激の設定においてＴ細胞疲弊をもたらし、腫瘍微小環境においてＴ細胞アポトーシスを誘導する。ＰＤ１はまた、免疫監視からの腫瘍特異的エスケープにおいても役割を果たし得る。
特定の実施形態によれば、本発明は、遺伝子修飾腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的なＴＩＬ集団に拡張するための方法を提供し、この拡張は、図７に示されるようにＧｅｎ２として記載の方法に従って実行することができ、遺伝子修飾ＴＩＬは、ＴＩＬに、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活性化することができる１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードする核酸、任意選択でｍＲＮＡを導入することによって産生され、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、配列番号１７５の核酸配列を含むＣＩＳＨの遺伝子標的配列のうちの１つを対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含み、方法は、任意選択で、ＰＤ１の発現をサイレンシングまたは抑制することによって、ＴＩＬの少なくとも一部をＴＡＬＥＮ遺伝子編集することをさらに含む。例えば、このＴＡＬＥ法を使用して、ＣＩＳＨに加えて、ＴＩＬ中のＰＤ１の発現をサイレンシングまたは減少させることができる。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１遺伝子を標的とするＴＡＬＥＮは、ＷＯ２０１３／１７６９１５Ａ１、ＷＯ２０１４／１８４７４４Ａ１、ＷＯ２０１４／１８４７４１Ａ１、ＷＯ２０１８／００７２６３Ａ１、及びＷＯ２０１８／０７３３９１Ａ１に記載されているものであり、ＷＯ２０１３／１７６９１５Ａ１の６２～６３ページの表１０に記載されているＰＤ－１ ＴＡＬＥＮのいずれか、ＷＯ２０１４／１８４７４４Ａ１の７８ページの表１１に記載されているＰＤ－１ ＴＡＬＥＮのいずれか、ＷＯ２０１４／１８４７４１Ａ１の７５ページの表１１に記載されているＰＤ－１ ＴＡＬＥＮのいずれか、ＷＯ２０１８／００７２６３Ａ１の４８～５２ページの表３に記載されているＰＤ－１ ＴＡＬＥＮのいずれか、ならびにＷＯ２０１８／０７３３９１Ａ１の６２～６８ページの表４及び／または７３～９９ページの表５に記載されているＰＤ－１ ＴＡＬＥＮのいずれかを含む。
Ｃ．ＴＡＬＥ遺伝子編集方法
部位特異的ゲノム編集を可能にするために開発されたヌクレアーゼの主要なクラスには、タンパク質－ＤＮＡ相互作用を介して特異的なＤＮＡ結合を達成する転写活性化因子様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が含まれる。例えば、Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１５，Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．２を参照されたい。ＴＡＬＥ法（その実施形態は以下でより詳細に説明される）は、本発明の遺伝子編集法として使用することができる。
上で考察されたように、本発明の実施形態は、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化するために１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬに導入することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を介して遺伝子修飾された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を提供し、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含み、任意選択で、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬに導入して、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断して不活性化し、それらの治療効果を増強する。本発明の実施形態は、そのような遺伝子編集されたＴＩＬをＴＩＬ集団に拡張する方法を包含する。本発明の実施形態は、そのような遺伝的に編集されたＴＩＬを治療用集団に拡張するための方法も提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化するために１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードする、ｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬにエレクトロポレーションすることによって、ＴＩＬ集団を遺伝子修飾する方法を提供し、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として、配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む。エレクトロポレーション法は、当該技術分野で知られており、例えば、Ｔｓｏｎｇ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．１９９１，６０，２９７－３０６及び米国特許出願公開第２０１４／０２２７２３７Ａ１号に記載されており、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。米国特許第５，０１９，０３４号、同第５，１２８，２５７号、同第５，１３７，８１７号、同第５，１７３，１５８号、同第５，２３２，８５６号、同第５，２７３，５２５号、同第５，３０４，１２０号、同第５，３１８，５１４号、同第６，０１０，６１３号、及び同第６，０７８，４９０号（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものなどの、当該技術分野で知られている他のエレクトロポレーション法が使用されている。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション法は、滅菌エレクトロポレーション法である。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション法は、パルスエレクトロポレーション法である。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション法は、ＴＩＬをパルス電場で処理して、ＴＩＬの定義及び制御された永続的または一時的変更を変える、操作する、または引き起こすステップを含むパルスエレクトロポレーション法であり、１００Ｖ／ｃｍ以上の電界強度を有する、少なくとも３つの単一のオペレーターが制御する、独立してプログラムされたＤＣ電気パルス列をＴＩＬに適用するステップを含み、少なくとも３つのＤＣ電気パルス列は、以下の特徴のうちの１つ、２つ、または３つを有する：（１）少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つのパルス振幅が互いに異なる、（２）少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つのパルス幅が互いに異なる、及び（３）少なくとも３つのパルスのうちの２つの第１のセットの第１のパルス間隔が、少なくとも３つのパルスのうちの２つの第２のセットの第２のパルス間隔とは異なる。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション法は、ＴＩＬをパルス電場で処理して、ＴＩＬの定義及び制御された永続的または一時的変更を変える、操作する、または引き起こすステップを含むパルスエレクトロポレーション法であり、１００Ｖ／ｃｍ以上の電界強度を有する、少なくとも３つの単一のオペレーターが制御する、独立してプログラムされたＤＣ電気パルス列をＴＩＬに適用するステップを含み、少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つのパルス振幅が互いに異なる。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション法は、ＴＩＬをパルス電場で処理して、ＴＩＬの定義及び制御された永続的または一時的変更を変える、操作する、または引き起こすステップを含むパルスエレクトロポレーション法であり、１００Ｖ／ｃｍ以上の電界強度を有する、少なくとも３つの単一オペレーターが制御する、独立してプログラムされたＤＣ電気パルス列をＴＩＬに適用するステップを含み、少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つのパルス幅が互いに異なる。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション法は、ＴＩＬをパルス電場で処理して、ＴＩＬの定義及び制御された永続的または一時的変更を変える、操作する、または引き起こすステップを含むパルスエレクトロポレーション法であり、１００Ｖ／ｃｍ以上の電界強度を有する、少なくとも３つの単一のオペレーターが制御する、独立してプログラムされたＤＣ電気パルス列をＴＩＬに適用するステップを含み、少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つの第１のセットの第１のパルス間隔が、少なくとも３つのパルスのうちの２つの第２のセットの第２のパルス間隔とは異なる。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション法は、ＴＩＬをパルス電場で処理して、ＴＩＬにおける細孔形成を誘導するステップを含むパルスエレクトロポレーション法であり、１００Ｖ／ｃｍ以上の電界強度を有する、少なくとも３つのＤＣ電気パルス列をＴＩＬに適用するステップを含み、少なくとも３つのＤＣ電気パルス列は、以下の特徴のうちの１つ、２つ、または３つを有する：（１）少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つのパルス振幅が互いに異なる、（２）少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つのパルス幅が互いに異なる、及び（３）少なくとも３つのパルスのうちの２つの第１のセットの第１のパルス間隔が、少なくとも３つのパルスのうちの２つの第２のセットの第２のパルス間隔とは異なり、これにより、誘導された細孔が比較的長期間にわたって持続され、ＴＩＬの生存率が維持される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ集団を遺伝子修飾する方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションステップを含む。リン酸カルシウム形質導入法（リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿、細胞表面コーティング、及びエンドサイトーシス）は、当該技術分野で知られており、Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９７３，５２，４５６－４６７、Ｗｉｇｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９７９，７６，１３７３－１３７６、及びＣｈｅｎ ａｎｄ Ｏｋａｙａｒｅａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９８７，７，２７４５－２７５２、ならびに米国特許第５，５９３，８７５号に記載されており、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ集団を遺伝子修飾する方法は、リポソームトランスフェクションステップを含む。リポソームトランスフェクション法、例えば、濾過水中でカチオン性脂質Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－ｎ，ｎ，ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）及びジオレオイルホスホチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の１：１（ｗ／ｗ）リポソーム製剤を用いる方法は、当該技術分野において既知であり、Ｒｏｓｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９９１，１０，５２０－５２５及びＦｅｌｇｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８７，８４，７４１３－７４１７、ならびに米国特許第５，２７９，８３３号、同第５，９０８，６３５号、同第６，０５６，９３８号、同第６，１１０，４９０号、同第６，５３４，４８４号、及び同第７，６８７，０７０号に記載されており、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ集団を遺伝子修飾する方法は、米国特許第５，７６６，９０２号、同第６，０２５，３３７号、同第６，４１０，５１７号、同第６，４７５，９９４号、及び同第７，１８９，７０５号に記載の方法を使用する形質導入するステップを含み、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明のいくつかの実施形態では、エレクトロポレーションは、ＴＡＬＥＮをコードするＲＮＡ及び／またはＤＮＡを含む所望のＴＡＬＥＮをコードする核酸の送達のために使用される。本発明のいくつかの実施形態では、エレクトロポレーションシステムは、フローエレクトロポレーションシステムである。本発明のいくつかの実施形態での使用に好適な、好適なフローエレクトロポレーションシステムの例は、市販のＭａｘＣｙｔｅ ＳＴＸシステムである。本発明との使用に好適であり得る、ＢＴＸ－Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓから入手可能なＡｇｉｌｅＰｕｌｓｅシステムもしくはＥＣＭ８３０、Ｃｅｌｌａｘｅｓｓ Ｅｌｅｋｔｒａ（Ｃｅｌｌｅｃｔｒｉｃｏｎ）、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ／Ａｍａｘａ）、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ ＭＸｃｅｌｌ（ＢＩＯＲＡＤ）、ｉＰｏｒａｔｏｒ－９６（Ｐｒｉｍａｘ）、またはｓｉＰＯＲＴｅｒ９６（Ａｍｂｉｏｎ）などのいくつかの代替の市販エレクトロポレーション機器が存在する。本発明のいくつかの実施形態では、エレクトロポレーションシステムは、ＴＩＬ拡張法の残りとともに、閉鎖滅菌系を形成する。本発明のいくつかの実施形態では、エレクトロポレーションシステムは、本明細書に記載のパルスエレクトロポレーションシステムであり、ＴＩＬ拡張法の残りとともに、閉鎖滅菌系を形成する。
任意の適切な方法は、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸をＴＩＬに導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）ことによって、及び、任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸をＴＩＬに導入することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を介して遺伝的に改変されたＴＩＬを拡張させるために使用することができる。本発明のいくつかの方法では、そのような遺伝子編集されたＴＩＬの治療用集団への拡張は、本明細書の図７に記載される方法のいずれかの実施形態に従って、またはＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５８６１０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１２６０５、もしくはＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１２６３３に記載されるように実行することができる。
ＴＡＬＥは、ＴＡＬＥＮ（「転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ」）を含む、「転写活性化因子様エフェクター」タンパク質の略語である。遺伝子編集のためにＴＡＬＥシステムを使用する方法は、本明細書ではＴＡＬＥ法とも称され得る。ＴＡＬＥは、植物病原菌Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属由来の天然に存在するタンパク質であり、各々単一の塩基対を認識する一連の３３～３５アミノ酸反復ドメインで構成されるＤＮＡ結合ドメインを含む。ＴＡＬＥ特異性は、反復可変二残基（ＲＶＤ）として知られる２つの超可変アミノ酸によって決定される。モジュラーＴＡＬＥ反復は、連続するＤＮＡ配列を認識するために一緒に結合される。ＤＮＡ結合ドメイン内の特定のＲＶＤは、標的遺伝子座内の塩基を認識し、予測可能なＤＮＡ結合ドメインを組み立てるための構造的特徴を提供する。ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインは、ＩＩＳ型ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの触媒ドメインに融合して、標的化可能なＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を作製する。ＴＡＬＥヌクレアーゼは、切断ドメインＦｏｋ－１の二量体化を得るために、必須のヘテロ二量体形態で対によってＤＮＡに結合する必要があるため、非常に特異的な試薬である。左及び右のヘテロ二量体メンバーはそれぞれ、約１４～２０ｂｐの異なる核配列を認識し、ともに３０～５０ｂｐの全体的な特異性の標的配列に及ぶ。部位特異的変異を誘導するために、１４～２０塩基対のスペーサー領域によって分離された２つの個々のＴＡＬＥＮアームがＦｏｋＩモノマーを密接に接近させて二量体化し、標的の二本鎖切断を産生する。
様々な組み立て方法を利用したいくつかの大規模な系統的研究により、ＴＡＬＥ反復を組み合わせて、実質的にすべてのユーザ定義配列を認識することができることが示されている。カスタムＴＡＬＥアレイの迅速な組み立てを可能にする戦略には、ゴールデンゲート分子クローニング、高スループット固相組み立て、及びライゲーション非依存性クローニング技術が含まれる。カスタム設計されたＴＡＬＥアレイも、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＫＹ，ＵＳＡ）、及びＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）から市販されている。追加として、所望の標的のためのカスタムＴＡＬエフェクター反復アレイの設計を可能にし、また、予測されるＴＡＬエフェクター結合部位を提供する、ＴＡＬエフェクター－ヌクレオチドターゲット２．０などのウェブベースのツールが利用可能である。Ｄｏｙｌｅ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１２，Ｖｏｌ．４０，Ｗ１１７－Ｗ１２２を参照されたい。本発明での使用に好適なＴＡＬＥ法及びＴＡＬＥＮ法の例は、米国特許公開第ＵＳ２０１１／０２０１１１８Ａ１号、同第ＵＳ２０１３／０１１７８６９Ａ１号、同第ＵＳ２０１３／０３１５８８４Ａ１号、同第ＵＳ２０１５／０２０３８７１Ａ１号、同第ＵＳ２０１６／０１２０９０６Ａ１号に記載されており、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＴＡＬＥ法は、標的遺伝子（複数可）の転写を阻害または防止することによって、１つ以上の遺伝子の発現をサイレンシングまたは減少させることを含む。例えば、ＴＡＬＥ法は、ＫＲＡＢ－ＴＡＬＥを利用することを含み得、この方法は、転写Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメインを、遺伝子の転写開始部位を標的とするＤＮＡ結合ドメインに融合することを含み、遺伝子の転写の阻害または防止につながる。
他の実施形態によれば、ＴＡＬＥ法は、標的遺伝子（複数可）に変異を導入することによって１つ以上の遺伝子の発現をサイレンシングまたは減少させることを含む。例えば、ＴＡＬＥ法は、ＦｏｋｌなどのヌクレアーゼエフェクタードメインをＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインに融合させ、ＴＡＬＥＮをもたらすことを含み得る。Ｆｏｋｌは、二量体として活性であり、したがって、この方法は、ＦＯＫＬヌクレアーゼドメインを隣接するゲノム標的部位に位置決めするためのＴＡＬＥＮ対を構築することを含み、それによりＤＮＡ二本鎖切断を導入する。Ｆｏｋｌの正しい位置決め及び二量体化後、二本鎖切断が完了し得る。二本鎖切断が導入されると、ＤＮＡ修復は、高忠実度相同組換え対（ＨＲＲ）（相同性指向修復またはＨＤＲとしても知られる）またはエラーが発生しやすい非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）の２つの異なる機序を介して達成することができる。ＮＨＥＪを介した二本鎖切断の修復は、好ましくは、ＤＮＡ標的部位の欠失、挿入または置換をもたらす、すなわち、ＮＨＥＪは、典型的には、切断部位での小さな挿入及び欠失の導入をもたらし、多くの場合、遺伝子機能をノックアウトするフレームシフトを誘導する。特定の実施形態によれば、ＴＡＬＥＮ対は、遺伝子の最も５’のエクソンを標的とし、早期フレームシフト変異または早期停止コドンを促進する。ＴＡＬＥＮによって導入される遺伝子変異（複数可）は、好ましくは永続的である。したがって、いくつかの実施形態によれば、この方法は、二量体化ＴＡＬＥＮを利用して、エラーが発生しやすいＮＨＥＪを介して修復される部位特異的二本鎖切断を誘導し、標的遺伝子に１つ以上の変異をもたらすことによって、標的遺伝子の発現をサイレンシングまたは減少させることを含む。
他の実施形態によれば、米国特許公開第２０１１／０２０１１１８号に開示されているように、ＦｏｋＩ及びＡｖｒＸａ７に由来するハイブリッドタンパク質であるＴＡＬＥＮを、本発明の実施形態に従って使用してもよい。このＴＡＬＥＮは、ＡｖｒＸａ７の標的ヌクレオチド及びＦｏｋＩの二本鎖ＤＮＡ切断活性に対する認識特異性を保持する。同じ方法を使用して、異なる認識特異性を有する他のＴＡＬＥＮを調製することができる。例えば、コンパクトＴＡＬＥＮは、ＤＮＡ結合特異性を変化させ、特定の単一のｄｓＤＮＡ標的配列を標的とするために、ＲＶＤの異なるセットを有するコアＴＡＬＥ足場を操作することによって生成され得る。米国特許公開第２０１３／０１１７８６９号を参照されたい。触媒ドメインの選択は、ＤＮＡ処理をもたらすために足場に付着させることができ、これは、触媒ドメインが、コアＴＡＬＥ足場に融合されたときに、単一のｄｓＤＮＡ標的配列の近くでＤＮＡを処理することができることを確実にするように操作され得る。ペプチドリンカーはまた、触媒ドメインを足場に融合させて、特定の単一のｄｓＤＮＡ配列を標的とするために二量体化を必要としない単一のポリペプチド鎖からなるコンパクトなＴＡＬＥＮを作製するように操作されてもよい。コアＴＡＬＥ足場はまた、ＴＡＬモノマーであり得る触媒ドメインをそのＮ末端に融合させることによって修飾され得、この触媒ドメインが別のＴＡＬモノマーに融合された別の触媒ドメインと相互作用する可能性を可能にし、それによって標的配列の近傍でＤＮＡを処理する可能性が高い触媒エンティティを作製する。米国特許公開第２０１５／０２０３８７１号を参照されたい。このアーキテクチャは、１つのＤＮＡ鎖のみを標的とすることを可能にするが、これは古典的なＴＡＬＥＮアーキテクチャの選択肢ではない。
本発明のいくつかの実施形態によれば、従来のＲＶＤを使用して、遺伝子発現を大幅に低減することができるＴＡＬＥＮを作製してもよい。いくつかの実施形態では、４つのＲＶＤである、ＮＩ、ＨＤ、ＮＮ、及びＮＧを使用して、それぞれ、アデニン、シトシン、グアニン、及びチミンを標的とする。これらの従来のＲＶＤを使用して、例えば、ＰＤ－１遺伝子を標的とするＴＡＬＥＮを作製することができる。従来のＲＶＤを使用するＴＡＬＥＮの例としては、Ｇａｕｔｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｄｅｃ．２０１７，Ｖｏｌ．９：３１２－３２１（Ｇａｕｔｒｏｎ）（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているＴ３ｖ１及びＴ１ ＴＡＬＥＮが挙げられる。Ｔ３ｖ１及びＴ１ ＴＡＬＥＮは、ＰＤ－Ｌ１結合部位が位置するＰＤＣＤ１遺伝子座の第２のエクソンを標的とし、ＰＤ－１産生を著しく低減することができる。いくつかの実施形態では、Ｔ１ ＴＡＬＥＮは、標的配列番号１２７を使用することによってそれを行い、Ｔ３ｖ１ ＴＡＬＥＮは、標的配列番号１２８、及び実施例１に記載の配列を使用することによってそれを行う。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１遺伝子を標的とするＴＡＬＥＮは、ＷＯ２０１３／１７６９１５Ａ１、ＷＯ２０１４／１８４７４４Ａ１、ＷＯ２０１４／１８４７４１Ａ１、ＷＯ２０１８／００７２６３Ａ１、及びＷＯ２０１８／０７３３９１Ａ１に記載されているものであり、ＷＯ２０１３／１７６９１５Ａ１の６２～６３ページの表１０に記載されているＰＤ－１ ＴＡＬＥＮのいずれか、ＷＯ２０１４／１８４７４４Ａ１の７８ページの表１１に記載されているＰＤ－１ ＴＡＬＥＮのいずれか、ＷＯ２０１４／１８４７４１Ａ１の７５ページの表１１に記載されているＰＤ－１ ＴＡＬＥＮのいずれか、ＷＯ２０１８／００７２６３Ａ１の４８～５２ページの表３に記載されているＰＤ－１ ＴＡＬＥＮのいずれか、ならびにＷＯ２０１８／０７３３９１Ａ１の６２～６８ページの表４及び／または７３～９９ページの表５に記載されているＰＤ－１ ＴＡＬＥＮのいずれかを含む。
他の実施形態によれば、ＴＡＬＥＮは、Ｇａｕｔｒｏｎに開示されるような、標的遺伝子に対するそれらの活性及び特異性を改善するために、非従来型ＲＶＤを使用して修飾される。天然に存在するＲＶＤは、高頻度可変性アミノ酸位置の潜在的な多様性レパートリーのごく一部のみをカバーする。非従来型ＲＶＤは、天然のＲＶＤの代替物を提供し、ＴＡＬＥＮによるオフサイト標的（標的配列に対していくつかのミスマッチを含むゲノム内の配列）の標的化を除外するために使用され得る、新規の固有の標的化特異性特徴を有する。非従来型ＲＶＤは、Ｊｕｉｌｌｅｒａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ５，Ａｒｔｉｃｌｅ Ｎｕｍｂｅｒ８１５０（２０１５）（これは参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるようなアレイの定義された位置における２つの高頻度可変性アミノ酸位置にアミノ酸の代替組み合わせを含むＴＡＬＥＮの集合を生成及びスクリーニングすることによって同定され得る。次に、ミスマッチの位置に存在するヌクレオチドを区別する非従来型ＲＶＤを選択してもよく、これにより、標的位置の適切な処理を依然として可能にしながら、オフサイト配列でのＴＡＬＥＮ活性を防止することができる。次いで、選択された非従来型ＲＶＤは、ＴＡＬＥＮ内の従来のＲＶＤを置き換えるために使用され得る。従来のＲＶＤが非従来型ＲＶＤに置き換えられたＴＡＬＥＮの例としては、Ｇａｕｔｒｏｎによって産生されたＴ３ｖ２及びＴ３ｖ３ ＰＤ－１ ＴＡＬＥＮが挙げられる。これらのＴＡＬＥＮは、従来のＲＶＤを使用したＴＡＬＥＮと比較した場合、特異性が増加していた。
他の実施形態によれば、ＴＡＬＥＮは特異的に設計されてもよく、これにより、遺伝子の特異的選択を標的とすることができる標的細胞（複数可）内の、より高い割合のＤＳＢ事象が可能になる。米国特許公開第２０１３／０３１５８８４号を参照されたい。そのような稀な切断エンドヌクレアーゼの使用は、形質導入された細胞内で標的遺伝子の二重不活性化を得る可能性を高め、Ｔ細胞などの操作された細胞の産生を可能にする。さらに、変異誘発を増加させ、標的遺伝子不活性化を強化するために、追加の触媒ドメインをＴＡＬＥＮで導入することができる。米国特許公開第２０１３／０３１５８８４号に記載されているＴＡＬＥＮは、免疫療法に適するようにＴ細胞を操作するために首尾よく使用された。ＴＡＬＥＮを使用して、単一のＴ細胞内の少なくとも２つの遺伝子の不活性化を含む、Ｔ細胞内の様々な免疫チェックポイント遺伝子を不活性化することもできる。米国特許公開第２０１６／０１２０９０６号を参照されたい。追加として、ＴＡＬＥＮを使用して、参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１８／００２１３７９号に開示されるように、免疫抑制剤及びＴ細胞受容体の標的をコードする遺伝子を不活性化することができる。さらに、ＴＡＬＥＮは、米国特許公開第２０１９／００１０５１４号（これは参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるように、ベータ２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）及び／またはクラスＩＩ主要組織適合抗原複合体トランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）の発現を阻害するために使用され得る。
ＰＤ－１遺伝子を標的とするＴＡＬＥヌクレアーゼの例を、以下の表、ならびに実施例１の表５、及びＷＯ２０１８／００７２６３Ａ１に提供される。これらの実施例では、標的化ゲノム配列は、１５ｂｐのスペーサー（小文字で示される）によって分離された２つの１７塩基対（ｂｐ）の長い配列（大文字で示される、半分の標的と称される）を含有する。右半分及び左半分の標的の各対は、表に列挙される右の半分及び左の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼの対応する対の反復配列によって認識される。したがって、特定の実施形態によれば、本発明によるＴＡＬＥヌクレアーゼは、配列番号１２７及び配列番号１２８を含むからなる群から選択される標的配列を認識し、切断する。ＴＡＬＥＮ配列及びＴＡＬＥＮ遺伝子編集方法はまた、上述のＧａｕｔｒｏｎに記載されている。
Figure 2024511414000004
ＰＤ－１遺伝子を標的とするＴＡＬＥヌクレアーゼの追加の例は、ＷＯ２０１３／１７６９１５Ａ１、ＷＯ２０１４／１８４７４４Ａ１、ＷＯ２０１４／１８４７４１Ａ１、ＷＯ２０１８／００７２６３Ａ１、及びＷＯ２０１８／０７３３９１Ａ１に提供され、ＷＯ２０１３／１７６９１５Ａ１の６２～６３ページの表１０に記載されるＰＤ－１ ＴＡＬＥＮのいずれか、ＷＯ２０１４／１８４７４４Ａ１の７８ページの表１１に記載されるＰＤ－１ ＴＡＬＥＮのいずれか、ＷＯ２０１４／１８４７４１Ａ１の７５ページの表１１に記載されるＰＤ－１ ＴＡＬＥＮのいずれか、ＷＯ２０１８／００７２６３Ａ１の４８～５２ページの表３に記載されるＰＤ－１ ＴＡＬＥＮのいずれか、ならびにＷＯ２０１８／０７３３９１Ａ１の６２～６８ページの表４及び／または７３～９９ページの表５に記載されるＰＤ－１ ＴＡＬＥＮのいずれかを含む。
ＴＡＬＥ法によって標的遺伝子配列の発現を変化させるための、本発明の実施形態に従って使用され得るシステム、方法、及び組成物の例は、米国特許第８，５８６，５２６号に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。これらの開示される例は、反復ＲＶＤを含有する２つ以上のＴＡＬＥ反復単位を有する天然に存在しないＤＮＡ結合ポリペプチド、ＴＡＬＥタンパク質の残基からなるＮ－キャップポリペプチド、及びＴＡＬＥタンパク質の全長Ｃ末端領域の断片からなるＣ－キャップポリペプチドの使用を含む。
ＴＡＬＥＮ介在性遺伝子組み込み及び不活性化を効率的に行うために使用することができ、本発明の実施形態に従って使用することができるＴＡＬＥＮ設計及び設計戦略、活性評価、スクリーニング戦略、ならびに方法の例は、Ｖａｌｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１４，６９，１５１－１７０（これは参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
ＩＶ．ＴＩＬ製造プロセス－２Ａ（Ｇｅｎ２）
本発明の遺伝子修飾ＴＩＬの産生及び拡張のための例示的なプロセスが図７に示されており、拡張されたＴＩＬは、ＴＩＬに、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードする、ｍＲＮＡなどの核酸を導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨ遺伝子配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）ことによって、任意選択で、ＴＩＬに、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードする、ｍＲＮＡなどの核酸を導入することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を介して遺伝子修飾されている。本明細書で考察されるように、本発明は、患者への移植前に遺伝子修飾された凍結保存されたＴＩＬを再刺激して、それらの代謝活性、ひいては相対的健康を向上させることに関するステップ、及び当該代謝の健康を試験する方法を含み得る。本明細書で一般に概説されるように、ＴＩＬは、一般に、患者試料から採取され、遺伝子修飾され、患者への移植前にそれらの数を拡張するように操作される。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子修飾ＴＩＬは、凍結保存され得る。解凍した時点で、それらが再刺激されて、患者への注入前に代謝を高めることができる。
いくつかの実施形態では、以下ならびに実施例及び図７で詳細に考察されるように、これらの遺伝子修飾ＴＩＬの調製における第１の拡張（ｐｒｅｐ－ＲＥＰ前と称されるプロセス、ならびに図７にステップＢ１として示されるプロセスを含む）は、３～１４日に短縮され、第２の拡張（ＲＥＰと称されるプロセス、ならびに図７にステップＣとして示されるプロセスを含む）は、７～１４日に短縮される。ここで、拡張されたＴＩＬは、ＴＩＬに、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードする、ｍＲＮＡなどの核酸を導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）ことによって、及び、任意選択で、ＴＩＬに、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードする、ｍＲＮＡなどの核酸を導入することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を介して遺伝子修飾されている。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾ＴＩＬの調製における第１の拡張（例えば、図７においてステップＢ１として記載される拡張）は、１１日に短縮され、第２の拡張（例えば、図７においてステップＣに記載される拡張）は、１１日に短縮され、ここで、拡張されたＴＩＬは、ＴＩＬに、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼが、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）ことによって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬに導入することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を介して遺伝子修飾されている。いくつかの実施形態では、第１の拡張と第２の拡張との組み合わせ（例えば、図７においてステップＢ１及びステップＣとして記載される拡張）は、以下及び実施例ならびに図７において詳細に考察されるように、２２日間に短縮され、ここで、拡張されたＴＩＬは、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬに導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）ことによって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸をＴＩＬに導入することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を介して遺伝子修飾されている。
以下の「ステップ」表記Ａ、Ｂ、Ｃなどは、図７を参照し、本明細書に記載のある特定の実施形態を参照する。以下及び図７におけるステップの順序は例示であり、ステップの任意の組み合わせまたは順序、ならびに追加のステップ、ステップの繰り返し、及び／またはステップの省略は、本出願及び本明細書に開示される方法によって企図される。
Ａ．ステップＡ：患者の腫瘍試料を取得する
一般に、ＴＩＬは、最初に患者の腫瘍試料（「一次ＴＩＬ」）から取得され、次いで、本明細書に記載されるように、さらなる操作のためにより大きな集団に拡張され、任意選択で凍結保存され、本明細書に概説されるように再刺激され、任意選択でＴＩＬの健康の指標として表現型及び代謝パラメータについて評価され、拡張されたＴＩＬは、ＴＩＬに、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）ことによって、及び任意選択で、ＴＩＬに、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を導入することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を介して遺伝子修飾されている。
患者の腫瘍試料は、腫瘍細胞とＴＩＬ細胞との混合物を含有する試料を取得するために、一般に外科的切除、針生検、コア生検、小生検、または他の手段を介して、当該技術分野で知られている方法を使用して取得することができる。いくつかの実施形態では、多病変サンプリングが使用される。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞とＴＩＬ細胞との混合物を含有する試料を取得するために、外科的切除、針生検、コア生検、小生検、または他の手段は、多病変サンプリングを含む（すなわち、患者の１つ以上の腫瘍部位及び／または場所、ならびに同じ場所または近接した１つ以上の腫瘍から試料を取得する）。一般に、腫瘍試料は、原発腫瘍、浸潤性腫瘍、または転移性腫瘍を含む、任意の固形腫瘍に由来し得る。腫瘍試料は、血液系悪性腫瘍から取得された腫瘍などの液体腫瘍であり得る。固形腫瘍は、皮膚組織のものであり得る。いくつかの実施形態では、有用なＴＩＬは、黒色腫から取得される。
取得された時点で、腫瘍試料は、一般に、鋭い解剖を使用して１～約８ｍｍ３の小片に断片化され、約２～３ｍｍ３が特に有用である。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、酵素腫瘍消化物を使用してこれらの断片から培養される。かかる腫瘍消化物は、酵素培地（例えば、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０緩衝液、２ｍＭグルタメート、１０ｍｃｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０単位／ｍＬのＤＮａｓｅ、及び１．０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ）中でのインキュベーション、続いて、機械的解離（例えば、組織解離機を使用する）によって産生され得る。腫瘍消化物は、腫瘍を酵素培地に入れ、腫瘍をおよそ１分間機械的に解離させ、その後、５％ＣＯ２中３７℃で３０分間インキュベートし、続いて、小さい組織片しか存在しなくなるまで、前述の条件下で機械的解離及びインキュベーションのサイクルを繰り返すことによって産生され得る。このプロセスの最後に、細胞懸濁液中に多数の赤血球または死細胞が含まれている場合、ＦＩＣＯＬＬ分岐親水性多糖類を使用した密度勾配分離が行われて、これらの細胞を除去することができる。米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３Ａ１号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものなど、当該技術分野で知られている代替の方法を使用することができる。前述の方法のうちのいずれかが、ＴＩＬを拡張する方法またはがんを治療する方法について本明細書に記載される実施形態のうちのいずれかにおいて使用され得る。
上に示されるように、いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、固形腫瘍に由来する。いくつかの実施形態では、固形腫瘍は、断片化されない。いくつかの実施形態では、固形腫瘍は断片化されず、全腫瘍として酵素消化に供される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、コラゲナーゼ、ＤＮａｓｅ、及び中性プロテアーゼを含む酵素混合物中で消化される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、コラゲナーゼ、ＤＮａｓｅ、及び中性プロテアーゼを含む酵素混合物中で１～２時間消化される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、コラゲナーゼ、ＤＮａｓｅ、及び中性プロテアーゼを含む酵素混合物中で１～２時間、３７℃、５％ＣＯ２で消化される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、コラゲナーゼ、ＤＮａｓｅ、及び中性プロテアーゼを含む酵素混合物中で１～２時間、３７℃、５％ＣＯ２で回転を伴って消化される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、一定の回転を伴って一晩消化される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、３７℃、５％ＣＯ２で一定の回転を伴って一晩消化される。いくつかの実施形態では、全腫瘍が酵素と組み合わされて、腫瘍消化反応混合物が形成される。
いくつかの実施形態では、腫瘍は、滅菌緩衝液中の凍結乾燥酵素で再構成される。いくつかの実施形態では、緩衝液は、滅菌ＨＢＳＳである。
いくつかの実施形態では、酵素混合物は、コラゲナーゼを含む。いくつかの実施形態では、コラゲナーゼは、コラゲナーゼＩＶである。いくつかの実施形態では、コラゲナーゼの作業ストックは、１００ｍｇ／ｍｌの１０倍作業ストックである。
いくつかの実施形態では、酵素混合物は、ＤＮＡｓｅを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡｓｅの作業ストックは、１０，０００ＩＵ／ｍｌの１０倍作業ストックである。
いくつかの実施形態では、酵素混合物は、ヒアルロニダーゼを含む。いくつかの実施形態では、ヒアルロニダーゼの作業ストックは、１０ｍｇ／ｍｌの１０倍作業ストックである。
いくつかの実施形態では、酵素混合物は、１０ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ、１０００ＩＵ／ｍｌのＤＮＡｓｅ、及び１ｍｇ／ｍＬのヒアルロニダーゼを含む。
いくつかの実施形態では、酵素混合物は、１０ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ、５００ＩＵ／ｍｌのＤＮＡｓｅ、及び１ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼを含む。
いくつかの実施形態では、酵素混合物は、中性プロテアーゼを含む。いくつかの実施形態では、中性プロテアーゼの作業ストックは、１７５ＤＭＣ Ｕ／ｍＬの濃度で再構成される。
いくつかの実施形態では、酵素混合物は、中性プロテアーゼ、ＤＮａｓｅ、及びコラゲナーゼを含む。
いくつかの実施形態では、酵素混合物は、１０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ、１０００ＩＵ／ｍＬのＤＮａｓｅ、及び０．３１ＤＭＣ Ｕ／ｍＬの中性プロテアーゼを含む。いくつかの実施形態では、酵素混合物は、１０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ、５００ＩＵ／ｍＬのＤＮａｓｅ、及び０．３１ＤＭＣ Ｕ／ｍＬの中性プロテアーゼを含む。
一般に、採取された細胞懸濁液は、「一次細胞集団」または「新たに採取された」細胞集団と呼ばれる。
いくつかの実施形態では、断片化は、例えば、解剖及び消化を含む物理的断片化を含む。いくつかの実施形態では、断片化は、物理的断片化である。いくつかの実施形態では、断片化は、解剖である。いくつかの実施形態では、断片化は、消化によるものである。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、最初に、患者から取得された酵素腫瘍消化物及び腫瘍断片から培養され得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活性する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの遺伝子を、ＴＩＬに導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列としての配列番号１７５の核酸配列を対象としたＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）ことによって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの遺伝子をＴＩＬに導入することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を介した遺伝子修飾前に患者から取得された酵素腫瘍消化物及び腫瘍断片から最初に培養され得る。
腫瘍が固形腫瘍であるいくつかの実施形態では、腫瘍試料が、例えば、ステップＡ（図７に提供される）で取得された後、腫瘍は物理的断片化を受ける。いくつかの実施形態では、断片化は、凍結保存前に起こる。いくつかの実施形態では、断片化は、凍結保存後に起こる。いくつかの実施形態では、断片化は、腫瘍を得た後、凍結保存がない場合に起こる。いくつかの実施形態では、腫瘍は断片化され、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個またはそれ以上の断片または小片が、第１の拡張のために各容器内に配置される。いくつかの実施形態では、腫瘍は断片化され、３０または４０個の断片または小片が、第１の拡張のために各容器内に配置される。いくつかの実施形態では、腫瘍は断片化され、４０個の断片または小片が、第１の拡張のために各容器内に配置される。いくつかの実施形態では、複数の断片は、約４～約５０個の断片を含み、各断片は、約２７ｍｍ３の体積を有する。いくつかの実施形態では、複数の断片は、約１３００ｍｍ３～約１５００ｍｍ３の総体積を伴う約３０～約６０個の断片を含む。いくつかの実施形態では、複数の断片は、約１３５０ｍｍ３の総体積を伴う約５０個の断片を含む。いくつかの実施形態では、複数の断片は、約１グラム～約１．５グラムの総質量を伴う約５０個の断片を含む。いくつかの実施形態では、複数の断片は、約４個の断片を含む。いくつかの実施形態では、複数の断片は、約１００個までの断片を含む。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、腫瘍断片から取得される。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、鋭い解剖によって取得される。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約１ｍｍ３～１０ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約１ｍｍ３～８ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約１ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約２ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約３ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約４ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約５ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約６ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約７ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約８ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約９ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約１０ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、腫瘍は、１～４ｍｍ×１～４ｍｍ×１～４ｍｍである。いくつかの実施形態では、腫瘍は、１ｍｍ×１ｍｍ×１ｍｍである。いくつかの実施形態では、腫瘍は、２ｍｍ×２ｍｍ×２ｍｍである。いくつかの実施形態では、腫瘍は、３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍである。いくつかの実施形態では、腫瘍は、４ｍｍ×４ｍｍ×４ｍｍである。
いくつかの実施形態では、腫瘍は、各小片上の出血性、壊死性、及び／または脂肪性組織の量を最小化するために切除される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、各小片上の出血性組織の量を最小化するために切除される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、各小片上の壊死性組織の量を最小化するために切除される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、各小片上の脂肪性組織の量を最小化するために切除される。
いくつかの実施形態では、腫瘍の断片化は、腫瘍の内部構造を維持するために行われる。いくつかの実施形態では、腫瘍の断片化は、メスでのこ引き動作を行うことなく行われる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、腫瘍消化物から取得される。いくつかの実施形態では、腫瘍消化物は、例えば、ＲＰＭＩ１６４０、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ、１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０Ｕ／ｍＬ ＤＮａｓｅ、及び１．０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼであるが、これに限られない酵素媒体中でのインキュベーション、続いて、機械的解離（ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）によって生成された。腫瘍を酵素培地に入れた後、腫瘍は、およそ１分間機械的に解離され得る。その後、溶液が５％ＣＯ２中３７℃で３０分間インキュベートされ、その後、およそ１分間再び機械的に破壊され得る。５％ＣＯ２中３７℃で３０分間再びインキュベートした後、腫瘍には、３回目の機械的破壊がおよそ１分間行われ得る。いくつかの実施形態では、大きい組織片が存在する場合、３回目の機械的破壊後、５％ＣＯ２中３７℃でさらに３０分間インキュベートするか否かにかかわらず、１回または２回の追加の機械的解離が試料に適用された。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液が多数の赤血球または死細胞を含む場合、最終インキュベーションの終わりに、Ｆｉｃｏｌｌを使用した密度勾配分離が行われて、これらの細胞を除去することができる。
いくつかの実施形態では、第１の拡張ステップの前に採取された細胞懸濁液は、「一次細胞集団」または「新たに採取された」細胞集団と呼ばれる。
いくつかの実施形態では、細胞は、試料採取後に任意に凍結され、ステップＢに記載される拡張に入る前に凍結保存され得、これは、以下でさらに詳細に記載されるとともに、図７に例示される。
Ｂ．ステップＢ１：第１の拡張
いくつかの実施形態では、本方法は、対象／患者への投与時に複製サイクルを増加させることができ、したがって、より古いＴＩＬ（すなわち、対象／患者への投与前により多くの複製ラウンドをさらに受けたＴＩＬ）よりも追加の治療的利益を提供し得る、若いＴＩＬを得ることを提供する。若いＴＩＬの特徴は、文献、例えば、Ｄｏｎｉａ，ａｔ ａｌ．，Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７５：１５７－１６７（２０１２）、Ｄｕｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１６：６１２２－６１３１（２０１０）、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２８（３）：２５８－２６７（２００５）、Ｂｅｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９（１７）：ＯＦ１－ＯＦ９（２０１３）、Ｂｅｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ３２：４１５－４２３（２００９）、Ｒｏｂｂｉｎｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００４； １７３：７１２５－７１３０、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，３０：１２３－１２９（２００７）、Ｚｈｏｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２８：５３－６２（２００５）、及びＴｒａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，３１：７４２－７５１（２００８）に記載されており、これらはすべて、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
Ｔリンパ球及びＢリンパ球の多様な抗原受容体は、限られた数であるが、多数の遺伝子セグメントの体細胞組換えによって産生される。これらの遺伝子セグメント：Ｖ（可変）、Ｄ（多様性）、Ｊ（接合）、及びＣ（一定）は、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合特異性及び下流での適用を決定する。本発明は、Ｔ細胞レパートリー多様性を示し、かつ増加させる拡張ＴＩＬを生成するための方法を提供し、拡張ＴＩＬは、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬに導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼが、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）ことによって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬに導入することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を介して遺伝子修飾されている。いくつかの実施形態では、本方法によって得られた拡張ＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性を示し、かつ増加させ、拡張ＴＩＬは、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬに導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼが、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）ことによって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬに導入することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を介して遺伝子修飾されている。いくつかの実施形態では、本発明で得られる拡張されたＴＩＬ（ここで、拡張ＴＩＬは、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬに導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼが、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼをむ）ことによって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断することによって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬに導入することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を介して遺伝子修飾されている）は、本方法によって得られた、新たに採取されたＴＩＬ及び／または例えば、図７に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの方法を使用して調製されるＴＩＬと比較して、Ｔ細胞レパートリーの多様性の増加を示す。いくつかの実施形態では、第１の拡張で得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示し、拡張ＴＩＬは、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬに導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼが、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）ことによって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬに導入することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を介して遺伝子修飾されている。いくつかの実施形態では、多様性の増加は、免疫グロブリン多様性及び／またはＴ細胞受容体多様性の増加である。いくつかの実施形態では、多様性は、免疫グロブリンにあり、免疫グロブリン重鎖にある。いくつかの実施形態では、多様性は、免疫グロブリンにあり、免疫グロブリン軽鎖にある。いくつかの実施形態では、多様性は、Ｔ細胞受容体にある。いくつかの実施形態では、多様性は、アルファ、ベータ、ガンマ、及びデルタ受容体からなる群から選択されるＴ細胞受容体のうちの１つにある。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及び／またはベータの発現が増加する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファの発現が増加する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータの発現が増加する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲａｂ（すなわち、ＴＣＲα／β）の発現が増加する。
例えば、図７のステップＡに記載されるものなどの腫瘍断片の解剖または消化後に、結果として得られた細胞は、腫瘍及び他の細胞よりもＴＩＬの成長を好む条件下で、ＩＬ－２を含む血清中で培養される。いくつかの実施形態では、腫瘍消化物は、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を有する不活性化ヒトＡＢ血清を含む培地中２ｍＬのウェル中でインキュベートされる。この一次細胞集団は、数日間、一般に３～１４日間培養され、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞を生じ、拡張されたＴＩＬは、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬに導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼが、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）ことによって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子を選択的にＤＮＡ切断して不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬに導入することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を介して遺伝子修飾されているか、遺伝子修飾される。いくつかの実施形態では、この一次細胞集団は、７～１４日間培養され、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞を生じ、ここで、拡張されたＴＩＬは、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ等の核酸を、ＴＩＬに導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として、配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）ことによって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子を選択的にＤＮＡ切断して不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードしするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬに導入することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を介して、遺伝子修飾されているか、または遺伝子修飾される。いくつかの実施形態では、この一次細胞集団は、１０～１４日間培養され、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞を生じる。いくつかの実施形態では、この一次細胞集団は、約１１日間培養され、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０８のバルクＴＩＬ細胞を生じ、ここで、拡張されたＴＩＬは、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬに導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として、配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）ことによって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードする、例えば、ｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬに導入することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を介して遺伝子修飾されているか、または遺伝子修飾される。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬの拡張は、以下及び本明細書に記載の初期バルクＴＩＬの拡張ステップ（例えば、ｐｒｅーＲＥＰと称されるプロセスを含むことができる、図７のステップＢ１に記載されるものなど）を使用して行われ得、拡張されたＴＩＬは、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬ中に導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼが、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）ことによって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬに導入することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を介して遺伝子修飾されているか、または遺伝子修飾される。このプロセスから取得されたＴＩＬは、本明細書に記載の表現型特徴及び代謝パラメータについて任意選択で特徴付けられ得る。
ＴＩＬ培養物が２４ウェルプレートで開始される実施形態では、例えば、Ｃｏｓｔａｒ２４ウェル細胞培養クラスター、平底（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を使用して、各ウェルを、ＩＬ－２（６０００ＩＵ／ｍＬ、Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）を含む２ｍＬの完全培地（ＣＭ）中の１×１０６個の腫瘍消化細胞または１つの腫瘍断片で播種することができ、拡張されたＴＩＬは、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬに導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼが、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）ことによって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬに導入することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を介して、遺伝子修飾されているか、または遺伝子修飾される。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約１ｍｍ３～１０ｍｍ３である。
いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、培養培地の略語である「ＣＭ」と称される。いくつかの実施形態では、ステップＢのＣＭは、１０％のヒトＡＢ血清、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、及び１０ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシンを補充した、ＧｌｕｔａＭＡＸを含むＲＰＭＩ１６４０からなる。培養物が４０ｍＬの容量及び１０ｃｍ２ガス透過性シリコン底部（例えば、Ｇ－Ｒｅｘ１０、Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｂｒｉｇｈｔｏｎ，ＭＮ）を有するガス透過性フラスコ内で開始される実施形態では、各フラスコは、ＩＬ－２を含む１０～４０ｍＬのＣＭ中に１０～４０×１０６個の生きた腫瘍消化細胞または５～３０個の腫瘍断片を装填してもよい。Ｇ－Ｒｅｘ１０及び２４ウェルプレートの両方を、５％ＣＯ２中３７℃の加湿インキュベーター内でインキュベートしてもよく、培養開始から５日後、培地の半分を取り除き、新たなＣＭ及びＩＬ－２と交換してもよく、５日後、培地の半分を２～３日毎に交換してもよい。
腫瘍断片の調製後、結果として得られた細胞（すなわち、断片）は、腫瘍及び他の細胞よりもＴＩＬの成長を好む条件下で、ＩＬ－２を含む血清中で培養され、その成長が好まれるＴＩＬは、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬに導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）ことによって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬに導入することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を介して遺伝子修飾されているか、または遺伝子修飾される。いくつかの実施形態では、腫瘍消化物は、２ｍＬウェルにおいて、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む不活化ヒトＡＢ血清を含む培地中（または、場合によっては、本明細書で概説されるように、ＡＰＣ細胞集団の存在下）でインキュベートされる。この一次細胞集団は、数日間、一般に１０～１４日間培養され、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞を生じる。いくつかの実施形態では、第１の拡張中の成長培地は、ＩＬ－２またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬは、組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、１ｍｇバイアルにつき２０～３０×１０６ ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、１ｍｇバイアルにつき２０×１０６ ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、１ｍｇバイアルにつき２５×１０６ ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、１ｍｇバイアルにつき３０×１０６ ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、４～８×１０６ ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、５～７×１０６ ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、６×１０６ ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、実施例５に記載されるように調製される。いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約１０，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約９，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約８，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約７，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、または約５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約９，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２～約５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約８，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２～約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約７，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２～約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、さらにＩＬ－２含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、さらにＩＬ－２含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ、または約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、１０００～２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００～３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００～４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００～５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００～６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００～７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００～８０００ＩＵ／ｍＬ、または約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。
いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、ＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ、または約１μｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇ、２０ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、及び５０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、ＯＫＴ－３抗体を含まない。いくつかの実施形態では、ＯＫＴ－３抗体は、ムロモナブである（表１を参照）。
いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、細胞培養培地中に１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４－１ＢＢアゴニストを含む。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４－１ＢＢアゴニストであり、４－１ＢＢアゴニストは、ウレルマブ、ウトミルマブ、ＥＵ－１０１、融合タンパク質、ならびにそれらの断片、誘導体、バリアント、バイオシミラー、及び組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、０．１μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬの細胞培養培地中濃度を達成するのに十分な濃度で追加される。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、２０μｇ／ｍＬ～４０μｇ／ｍＬの細胞培養培地中濃度を達成するのに十分な濃度で追加される。
いくつかの実施形態では、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストに加えて、細胞培養培地は、ＩＬ－２を約３０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で、及びＯＫＴ－３を約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度でさらに含み、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストが、４－１ＢＢアゴニストを含む。
いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、培養培地の略語である「ＣＭ」と称される。いくつかの実施形態では、それは、ＣＭ１（培養培地１）と称される。いくつかの実施形態では、ＣＭは、１０％のヒトＡＢ血清、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、及び１０ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシンを補充した、ＧｌｕｔａＭＡＸを含むＲＰＭＩ１６４０からなる。培養が４０ｍＬの容量及び１０ｃｍ２のガス透過性シリコン底部（例えば、Ｇ－Ｒｅｘ１０、Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｂｒｉｇｈｔｏｎ，ＭＮ）を有するガス透過性フラスコ内で開始される実施形態では（図１）、各フラスコは、ＩＬ－２を含む１０～４０ｍＬのＣＭ中の１０～４０×１０６個の生きた腫瘍消化細胞または５～３０個の腫瘍断片を装填してもよい。Ｇ－Ｒｅｘ１０及び２４ウェルプレートの両方を、５％ＣＯ２中３７℃の加湿インキュベーター内でインキュベートしてもよく、培養開始から５日後、培地の半分を取り除き、新たなＣＭ及びＩＬ－２と交換してもよく、５日後、培地の半分を２～３日毎に交換してもよい。いくつかの実施形態では、ＣＭは、実施例に記載されるＣＭ１であり、実施例１を参照されたい。いくつかの実施形態では、第１の拡張は、初期細胞培養培地または第１の細胞培養培地中で起こる。いくつかの実施形態では、初期細胞培養培地または第１の細胞培養培地は、ＩＬ－２を含む。
いくつかの実施形態では、実施例及び図で考察されるように、第１の拡張（例えばｐｒｅ－ＲＥＰと称されることもあるものを含み得る、図７のステップＢ１に記載されるものなどのプロセスを含む）プロセスは、３～１４日に短縮される。いくつかの実施形態では、実施例で考察され、図７のステップＢ１に記載される拡張に示されるように、第１の拡張（例えば、ｐｒｅ－ＲＥＰと称されることもあるものを含み得る、図７のステップＢ１に記載されるものなどのプロセスを含む）は、７～１４日に短縮される。いくつかの実施形態では、ステップＢ１の第１の拡張は、１０～１４日に短縮される。いくつかの実施形態では、第１の拡張は、例えば、図７のステップＢ１に記載される拡張において考察されるように、１１日に短縮される。
いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、または１４日間進行することができ、拡張されたＴＩＬは、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬに導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として、配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）ことによって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬに導入することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を介して遺伝子修飾されているか、または遺伝子修飾される。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、１日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、２日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、３日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、４日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、５日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、６日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、７日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、８日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、９日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、１０日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、１１日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、１２日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、１３日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、１日～１１日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、２日～１１日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、３日～１１日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、４日～１１日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、５日～１１日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、６日～１１日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、７日～１１日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、８日～１１日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、９日～１１日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、１０日～１１日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、１１日間続行することができる。
いくつかの実施形態では、第１の拡張、例えば、図７によるステップＢ１は、閉鎖系バイオリアクター内で行われる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、閉鎖系がＴＩＬ拡張のために用いられる。いくつかの実施形態では、単一のバイオリアクターが用いられる。いくつかの実施形態では、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１０またはＧ－ＲＥＸ－１００である。いくつかの実施形態では、閉鎖系バイオリアクターは、単一のバイオリアクターである。
Ｃ．ステップＢ２：活性化
いくつかの実施形態では、ｐｒｅ－ＲＥＰステップの後（図７のステップＢ２）、ＴＩＬは、ＯＫＴ－３を培地に添加し、約１～３日間培養することによって活性化され、ＴＩＬは、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬに導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として、配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）ことによって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬに導入することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を介して遺伝子修飾されているか、または遺伝子修飾される。いくつかの実施形態では、活性化ステップ（例えば、図７のステップＢ２）は、約２日間行われる。
いくつかの実施形態では、活性化ステップ（例えば、図７のステップＢ２）は、ＴＩＬを３００ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ－３の存在下で約１～３日間培養することによって行われる。
いくつかの実施形態では、活性化ステップ（例えば、図７のステップＢ２）の細胞培養培地は、約３００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、活性化ステップ（例えば、図７のステップＢ２）における細胞培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ、約７００ｎｇ／ｍＬ、約８００ｎｇ／ｍＬ、約９００ｎｇ／ｍＬ、または約１μｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、活性化ステップ（例えば、図７のステップＢ２）の細胞培養培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ～４００ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ～３５０ｎｇ／ｍＬ、または２７５ｎｇ／ｍＬ～３２５ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、ＯＫＴ－３抗体は、ムロモナブである（表１を参照）。
いくつかの実施形態では、活性化ステップ（例えば、図７のステップＢ２）は、系を開放することなく、培養中のＴＩＬにＯＫＴ－３を添加することによって行われる。
Ｄ．ステップＢ３：ＴＡＬＥＮ遺伝子修飾ステップ
いくつかの実施形態では、活性化ステップ（例えば、図７のステップＢ３）には、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬに導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）ことによって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬに導入することによって、ＴＩＬを遺伝子修飾するステップ（例えば、図８のステップＢ３）が続く。
いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥＮ遺伝子修飾ステップ（例えば、図７のステップＢ３）は、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断することによって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬにエレクトロポレーションする（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼが、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）によって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬにエレクトロポレーションすることによって、活性化ステップ（例えば、図７のステップＢ２）から得られたＴＩＬを遺伝子修飾することによって実行される。
いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥＮ遺伝子修飾ステップ（例えば、図７のステップＢ３）は、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断することによって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬにでエレクトロポレーションする（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼが、配列番号１６４を含むアミノ酸配列を有するＴＡＬＥヌクレアーゼと、配列番号１６６を含むアミノ酸配列を有するＴＡＬＥヌクレアーゼとを含む）ことによって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬにエレクトロポレーションすることによって、活性化ステップ（例えば、図７のステップＢ２）から得られたＴＩＬを遺伝子修飾することによって行われる。
いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥＮ遺伝子修飾ステップ（例えば、図７のステップＢ３）は、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬにエレクトロポレーションする（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼが、配列番号１６５を含むアミノ酸配列を有するＴＡＬＥヌクレアーゼと、配列番号１６７を含むアミノ酸配列を有するＴＡＬＥヌクレアーゼとを含む）ことによって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬにエレクトロポレーションすることによって、活性化ステップ（例えば図７のステップＢ２）から得られるＴＩＬを遺伝子修飾することによって行われる。
いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥＮ遺伝子修飾ステップ（例えば、図７のステップＢ３）は、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断することによって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬにエレクトロポレーションする（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼが、配列番号１６４を含むアミノ酸配列を有するＴＡＬＥヌクレアーゼと、配列番号１６７を含むアミノ酸配列を有するＴＡＬＥヌクレアーゼとを含む）ことによって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断することによって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬにエレクトロポレーションすることによって、活性化ステップ（例えば、図７のステップＢ２）から得られたＴＩＬを遺伝子修飾することによって行われる。
いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥＮ遺伝子修飾ステップ（例えば、図７のステップＢ３）は、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断することによって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬにエレクトロポレーションする（ここで、所望のＴＡＬＥヌクレアーゼが、配列番号１６５を含むアミノ酸配列を有するＴＡＬＥヌクレアーゼと、配列番号１６６を含むアミノ酸配列を有するＴＡＬＥヌクレアーゼとを含む）ことによって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断することによって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬにエレクトロポレーションすることによって、活性化ステップ（例えば、図７のステップＢ２）から得られたＴＩＬを遺伝子修飾することによって行われる。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬのエレクトロポレーションに使用されるｍＲＮＡなどの核酸が、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断することによって選択的に不活性化するように、ＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を含むように、上記の該当する前の段落のうちのいずれかに記載のＴＡＬＥＮ遺伝子修飾ステップが改変される。
いくつかの実施形態では、上記の該当する先行する段落のうちのいずれかに記載のＴＡＬＥＮ遺伝子修飾ステップは、ＴＩＬのエレクトロポレーションに使用されるｍＲＮＡなどの核酸が、配列番号１７０を含むアミノ酸配列を有するＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を含み、さらに、配列番号１７２を含むアミノ酸配列を有するＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を含むように改変される。
いくつかの実施形態では、上記の該当する先行する段落のうちのいずれかに記載のＴＡＬＥＮ遺伝子修飾ステップは、ＣＩＳＨ遺伝子を選択的に不活性化するために１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸、ＰＤ－１遺伝子を選択的に不活性化するために１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸、及びエレクトロポレーション緩衝液が一緒に混合され、ＴＩＬが、混合物の存在下で単一のエレクトロポレーションステップに供されるように改変される。
エレクトロポレーション法は、当該技術分野で知られており、例えば、Ｔｓｏｎｇ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．１９９１，６０，２９７－３０６及び米国特許出願公開第２０１４／０２２７２３７Ａ１号に記載されており、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。米国特許第５，０１９，０３４号、同第５，１２８，２５７号、同第５，１３７，８１７号、同第５，１７３，１５８号、同第５，２３２，８５６号、同第５，２７３，５２５号、同第５，３０４，１２０号、同第５，３１８，５１４号、同第６，０１０，６１３号、及び同第６，０７８，４９０号（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものなどの、当該技術分野で知られている他のエレクトロポレーション法が使用され得る。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション法は、滅菌エレクトロポレーション法である。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション法は、パルスエレクトロポレーション法である。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション法は、ＴＩＬをパルス電場で処理して、ＴＩＬの定義及び制御された永続的または一時的変更を変える、操作する、または引き起こすステップを含むパルスエレクトロポレーション法であり、１００Ｖ／ｃｍ以上の電界強度を有する、少なくとも３つの単一のオペレーターが制御する、独立してプログラムされたＤＣ電気パルス列をＴＩＬに適用するステップを含み、少なくとも３つのＤＣ電気パルス列は、以下の特徴のうちの１つ、２つ、または３つを有する：（１）少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つのパルス振幅が互いに異なる、（２）少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つのパルス幅が互いに異なる、及び（３）少なくとも３つのパルスのうちの２つの第１のセットの第１のパルス間隔が、少なくとも３つのパルスのうちの２つの第２のセットの第２のパルス間隔とは異なる。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション法は、ＴＩＬをパルス電場で処理して、ＴＩＬの定義及び制御された永続的または一時的変更を変える、操作する、または引き起こすステップを含むパルスエレクトロポレーション法であり、１００Ｖ／ｃｍ以上の電界強度を有する、少なくとも３つの単一のオペレーターが制御する、独立してプログラムされたＤＣ電気パルス列をＴＩＬに適用するステップを含み、少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つのパルス振幅が互いに異なる。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション法は、ＴＩＬをパルス電場で処理して、ＴＩＬの定義及び制御された永続的または一時的変更を変える、操作する、または引き起こすステップを含むパルスエレクトロポレーション法であり、１００Ｖ／ｃｍ以上の電界強度を有する、少なくとも３つの単一のオペレーターが制御する、独立してプログラムされたＤＣ電気パルス列をＴＩＬに適用するステップを含み、少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つのパルス幅が互いに異なる。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション法は、ＴＩＬをパルス電場で処理して、ＴＩＬの定義及び制御された永続的または一時的変更を変える、操作する、または引き起こすステップを含むパルスエレクトロポレーション法であり、１００Ｖ／ｃｍ以上の電界強度を有する、少なくとも３つの単一のオペレーターが制御する、独立してプログラムされたＤＣ電気パルス列をＴＩＬに適用するステップを含み、少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つの第１のセットの第１のパルス間隔が、少なくとも３つのパルスのうちの２つの第２のセットの第２のパルス間隔とは異なる。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション法は、ＴＩＬをパルス電場で処理して、ＴＩＬにおける細孔形成を誘導するステップを含むパルスエレクトロポレーション法であり、１００Ｖ／ｃｍ以上の電界強度を有する、少なくとも３つのＤＣ電気パルス列をＴＩＬに適用するステップを含み、少なくとも３つのＤＣ電気パルス列は、以下の特徴のうちの１つ、２つ、または３つを有する：（１）少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つのパルス振幅が互いに異なる、（２）少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つのパルス幅が互いに異なる、及び（３）少なくとも３つのパルスのうちの２つの第１のセットの第１のパルス間隔が、少なくとも３つのパルスのうちの２つの第２のセットの第２のパルス間隔とは異なり、これにより、誘導された細孔が比較的長期間にわたって持続され、ＴＩＬの生存率が維持される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ集団を遺伝子修飾する方法は、リン酸カルシウム形質導入テップを含む。リン酸カルシウム形質導入法（リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿、細胞表面コーティング、及びエンドサイトーシス）は、当該技術分野で知られており、Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９７３，５２，４５６－４６７、Ｗｉｇｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９７９，７６，１３７３－１３７６、及びＣｈｅｎ ａｎｄ Ｏｋａｙａｒｅａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９８７，７，２７４５－２７５２、ならびに米国特許第５，５９３，８７５号に記載されており、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ集団を遺伝子修飾する方法は、リポソーム形質導入ステップを含む。リポソーム形質導入法、例えば、濾過水中でカチオン性脂質Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－ｎ，ｎ，ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）及びジオレオイルホスホチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の１：１（ｗ／ｗ）リポソーム製剤を用いる方法は、当該技術分野において既知であり、Ｒｏｓｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９９１，１０，５２０－５２５及びＦｅｌｇｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８７，８４，７４１３－７４１７、ならびに米国特許第５，２７９，８３３号、同第５，９０８，６３５号、同第６，０５６，９３８号、同第６，１１０，４９０号、同第６，５３４，４８４号、及び同第７，６８７，０７０号に記載されており、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ集団を遺伝子修飾する方法は、米国特許第５，７６６，９０２号、同第６，０２５，３３７号、同第６，４１０，５１７号、同第６，４７５，９９４号、及び同第７，１８９，７０５号に記載の方法を使用する形質導入するステップを含み、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明のいくつかの実施形態では、エレクトロポレーションは、ＴＡＬＥＮコードＲＮＡ及び／またはＤＮＡを含む所望のＴＡＬＥＮコード核酸の送達のために使用される。本発明のいくつかの実施形態では、エレクトロポレーションシステムは、フローエレクトロポレーションシステムである。本発明のいくつかの実施形態との使用に好適な、好適なフローエレクトロポレーションシステムの例は、市販のＭａｘＣｙｔｅ ＳＴＸシステムである。本発明との使用に好適であり得る、ＢＴＸ－Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓから入手可能なＡｇｉｌｅＰｕｌｓｅシステムもしくはＥＣＭ８３０、Ｃｅｌｌａｘｅｓｓ Ｅｌｅｋｔｒａ（Ｃｅｌｌｅｃｔｒｉｃｏｎ）、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ／Ａｍａｘａ）、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ ＭＸｃｅｌｌ（ＢＩＯＲＡＤ）、ｉＰｏｒａｔｏｒ－９６（Ｐｒｉｍａｘ）、またはｓｉＰＯＲＴｅｒ９６（Ａｍｂｉｏｎ）などのいくつかの代替の市販エレクトロポレーション機器が存在する。本発明のいくつかの実施形態では、エレクトロポレーションシステムは、ＴＩＬ拡張法の残りとともに、閉鎖滅菌系を形成する。本発明のいくつかの実施形態では、エレクトロポレーションシステムは、本明細書に記載のパルスエレクトロポレーションシステムであり、ＴＩＬ拡張法の残りとともに、閉鎖滅菌系を形成する。
Ｅ．ステップＢ４：静置ステップ
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾ステップ（例えば、図７のステップＢ３）の後に、ＴＩＬを静止させるステップ（例えば、図８のステップＢ４）が続き、静止したＴＩＬは、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ等の核酸を導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）ことによって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸をＴＩＬにｍＲＮＡなどの核酸を導入することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を介して遺伝子修飾されている。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、約１日間静置される。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾ステップ（例えば、図７のステップＢ３）におけるエレクトロポレーションの直後に、ＴＩＬを約１６時間静置する。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾ステップ（例えば、図７のステップＢ３）におけるエレクトロポレーションの直後に、ＴＩＬをＣＭ１培地中に再懸濁し、３７℃で１時間、続いて３０℃で１５時間インキュベートする。
Ｆ．ステップＣ：第１の拡張から第２の拡張への移行
いくつかの事例では、例えば、図７に示されるステップＢ１から得られるＴＩＬ集団を含む、第１の拡張から得られる遺伝子修飾ＴＩＬ集団は、以下で考察されるプロトコルを使用して、直ちに凍結保存され得、ここで、遺伝子修飾は、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸をＴＩＬに導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として、配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）ことによって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬに導入することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を含む。あるいは、第２のＴＩＬ集団と称される第１の拡張から取得されたＴＩＬ集団は、上記のように中間凍結保存なしで遺伝子修飾を受けることができ、続いて第２の拡張（ＲＥＰと称されることもある拡張を含み得る）を受け、次いで以下で考察されるように凍結保存することができ、遺伝子修飾は、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸をＴＩＬに導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）ことによる、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子のＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸をＴＩＬに導入することによる、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を含む。
Ｇ．ステップＤ：第２の拡張
いくつかの実施形態では、ＴＩＬ細胞集団は、例えば、図７に示されるように、ステップＡ及びステップＢ、ならびにステップＣと称される移行後に、初期バルク処理、ｐｒｅ－ＲＥＰ拡張、及び遺伝子修飾後に数が拡張され、拡張されたＴＩＬは、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸をＴＩＬに導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）ことによって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子がＤＮＡ切断により選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸をＴＩＬに導入することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を介して遺伝子修飾される。このさらなる拡張は、本明細書では第２の拡張と称され、これは、当該技術分野で一般に急速拡張プロセス（ＲＥＰ、ならびに図７のステップＤに示されるプロセス）と称される拡張プロセスを含み得る。第２の拡張は、一般に、フィーダー細胞、サイトカイン源、及び抗ＣＤ３抗体を含むいくつかの成分を含む培養培地を使用して、ガス透過性容器内で達成される。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬの第２の拡張または第２のＴＩＬ拡張（ＲＥＰと称されることもある拡張、ならびに図７のステップＤに示されるプロセスを含み得る）は、当業者に知られている任意のＴＩＬフラスコまたは容器を使用して行うことができ、拡張ＴＩＬは、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断することによって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬに導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼが、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）ことによって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を、ＴＩＬに導入することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を介して遺伝子修飾されている。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、または１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、約７日～約１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、約８日～約１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、約９日～約１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、約１０日～約１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、約１１日～約１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、約１２日～約１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、約１３日～約１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、約１４日間続行することができる。
いくつかの実施形態では、第２の拡張は、本開示の方法（例えば、ＲＥＰと称される拡張、ならびに図７のステップＤに示されるプロセスを含む）を使用して、ガス透過性容器内で行われ得る。例えば、ＴＩＬは、インターロイキン－２（ＩＬ－２）またはインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）の存在下で非特異的Ｔ細胞受容体刺激を使用して、急速に拡張され得る。非特異的Ｔ細胞受容体刺激物には、例えば、抗ＣＤ３抗体、例えば、約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３、マウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体（Ｏｒｔｈｏ－ＭｃＮｅｉｌ，Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪまたはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡから市販されている）、またはＵＨＣＴ－１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡから市販されている）が含まれ得る。ＴＩＬは、がんのエピトープ（複数可）などのその抗原性部分を含む、第２の拡張中に１つ以上の抗原を含むことによって、インビトロでＴＩＬのさらなる刺激を誘導するように拡張することができ、これは、例えば、ヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ－Ａ２）結合ペプチドなどのベクター、例えば、０．３μＭ ＭＡＲＴ－１：２６－３５（２７Ｌ）またはｇｐｌ ００：２０９－２１７（２１０Ｍ）から、任意選択で、３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２またはＩＬ－１５などのＴ細胞成長因子の存在下で任意で発現され得る。他の好適な抗原には、例えば、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、チロシナーゼがん抗原、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＳＳＸ－２、及びＶＥＧＦＲ２、またはそれらの抗原性部分が含まれ得る。ＴＩＬは、ＨＬＡ－Ａ２を発現する抗原提示細胞にパルスされたがんの同じ抗原（複数可）で再刺激することによっても急速に拡張され得る。あるいは、ＴＩＬは、例えば、例として放射線照射された自己リンパ球または放射線照射されたＨＬＡ－Ａ２＋同種異系リンパ球及びＩＬ－２でさらに再刺激され得る。いくつかの実施形態では、再刺激は、第２の拡張の一部として起こる。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、放射線照射された自己リンパ球の存在下で、または放射線照射されたＨＬＡ－Ａ２＋同種異系リンパ球及びＩＬ－２を用いて起こる。
いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、さらにＩＬ－２含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ、または約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、１０００～２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００～３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００～４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００～５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００～６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００～７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００～８０００ＩＵ／ｍＬ、または８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。
いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、ＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ、または約１μｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇ、２０ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、及び５０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、ＯＫＴ－３抗体を含まない。いくつかの実施形態では、ＯＫＴ－３抗体は、ムロモナブである。
いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、細胞培養培地中に１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４－１ＢＢアゴニストを含む。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４－１ＢＢアゴニストであり、４－１ＢＢアゴニストは、ウレルマブ、ウトミルマブ、ＥＵ－１０１、融合タンパク質、ならびにそれらの断片、誘導体、バリアント、バイオシミラー、及び組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、０．１μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬの細胞培養培地中濃度を達成するのに十分な濃度で追加される。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、２０μｇ／ｍＬ～４０μｇ／ｍＬの細胞培養培地中濃度を達成するのに十分な濃度で追加される。
いくつかの実施形態では、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストに加えて、細胞培養培地は、ＩＬ－２を約３０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で、及びＯＫＴ－３を約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度でさらに含み、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストが、４－１ＢＢアゴニストを含む。
いくつかの実施形態では、抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）は、ＰＢＭＣである。いくつかの実施形態では、急速拡張及び／または第２の拡張におけるＴＩＬのＰＢＭＣ及び／または抗原提示細胞に対する比は、約１：２５、約１：５０、約１：１００、約１：１２５、約１：１５０、約１：１７５、約１：２００、約１：２２５、約１：２５０、約１：２７５、約１：３００、約１：３２５、約１：３５０、約１：３７５、約１：４００、または約１：５００である。いくつかの実施形態では、急速拡張及び／または第２の拡張におけるＴＩＬのＰＢＭＣに対する比は、１：５０～１：３００である。いくつかの実施形態では、急速拡張及び／または第２の拡張におけるＴＩＬのＰＢＭＣに対する比は、１：１００～１：２００である。
いくつかの実施形態では、ＲＥＰ及び／または第２の拡張は、バルクＴＩＬが１５０ｍＬの培地中の１００倍または２００倍過剰の不活性化フィーダー細胞、３０ｍｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体、及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と混合されているフラスコ内で行われる。細胞が代替の成長チャンバに移されるまで、培地交換が行われる（一般に、新鮮な培地での吸入による３分の２の培地交換）。代替の成長チャンバには、以下でより完全に考察されるように、Ｇ－ＲＥＸフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。
いくつかの実施形態では、第２の拡張（ＲＥＰプロセスと称されるプロセスを含み得る）は、実施例及び図で考察されるように、７～１４日に短縮され、そのような第２の拡張によって拡張されたＴＩＬは、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸をＴＩＬに導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）ことによって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子のＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸をＴＩＬに導入することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を介して遺伝子修飾されている。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、１１日に短縮される。
いくつかの実施形態では、ＲＥＰ及び／または第２の拡張は、以前に記載されたＴ－１７５フラスコ及びガス透過性バッグ（Ｔｒａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００８，３１，７４２－５１、Ｄｕｄｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００３，２６，３３２－４２）またはガス透過性培養器具（Ｇ－Ｒｅｘフラスコ）を使用して実施され、そのような第２の拡張によって拡張されたＴＩＬは、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸をＴＩＬに導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）ことによって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子切断のＤＮＡ切断により選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをエンコードするｍＲＮＡなどの核酸をＴＩＬに導入することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を介して遺伝子修飾されている。いくつかの実施形態では、第２の拡張（急速拡張と称される拡張を含む）は、Ｔ－１７５フラスコ内で行われ、１５０ｍＬの培地に懸濁された約１×１０６個のＴＩＬが、各Ｔ－１７５フラスコに添加され得る。ＴＩＬは、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３で補充された、ＣＭ及びＡＩＭ－Ｖ培地の１対１の混合物中で培養することができる。Ｔ－１７５フラスコは、５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートされ得、そのような第２の拡張によって拡張されたＴＩＬは、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸をＴＩＬに導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）ことによって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸をＴＩＬに導入することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を介して遺伝子修飾されている。培地の半分が、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む５０／５０培地を使用して５日目に交換され得る。いくつかの実施形態では、７日目に、２つのＴ－１７５フラスコからの細胞を３Ｌバッグ内で組み合わせることができ、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む３００ｍＬのＡＩＭ Ｖを、３００ｍＬのＴＩＬ懸濁液に添加した。各バッグ内の細胞の数を、毎日または隔日カウントし、新鮮な培地を添加して、０．５～２．０×１０６細胞／ｍＬの間に細胞数を維持した。
いくつかの実施形態では、第２の拡張（ＲＥＰと称される拡張、ならびに図７のステップＤで参照される拡張を含み得る）は、１００ｃｍのガス透過性シリコン底部（Ｇ－Ｒｅｘ１００、Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｂｒｉｇｈｔｏｎ，ＭＮ，ＵＳＡから市販されている）を有する５００ｍＬ容量のガス透過性フラスコ内で行われ得る。５×１０６または１０×１０６個のＴＩＬは、５％ヒトＡＢ血清、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）を補充した４００ｍＬの５０／５０培地中でＰＢＭＣで培養され得、そのような第２の拡張によって拡張されたＴＩＬは、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断することによって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸をＴＩＬに導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）ことによって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子のＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸をＴＩＬに導入することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を介して遺伝子修飾されている。Ｇ－Ｒｅｘ１００フラスコは、５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートされ得る。５日目に、２５０ｍＬの上清を除去して遠心分離ボトルに入れ、１５００ｒｐｍ（４９１×ｇ）で１０分間遠心分離する。ＴＩＬペレットを、５％のヒトＡＢ血清、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬの新鮮な培地で再懸濁し、元のＧ－Ｒｅｘ１００フラスコに戻すことができる。ＴＩＬがＧ－Ｒｅｘ１００フラスコ内で連続的に拡張される場合、７日目に、各Ｇ－Ｒｅｘ１００内のＴＩＬを、各フラスコに存在する３００ｍＬの培地に懸濁することができ、細胞懸濁液を３つの１００ｍＬアリコートに分割することができ、それを使用して３つのＧ－Ｒｅｘ１００フラスコに播種することができる。次いで、５％のヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬのＡＩＭ－Ｖを、各フラスコに添加することができる。Ｇ－Ｒｅｘ１００フラスコを、５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートし、４日後に３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬのＡＩＭ－Ｖを、各Ｇ－ＲＥＸ１００フラスコに添加することができる。培養１４日目に、細胞が採取され得る。
いくつかの実施形態では、第２の拡張（ＲＥＰと称される拡張を含む）は、バルクＴＩＬが１５０ｍＬの培地中の１００倍または２００倍過剰の不活性化フィーダー細胞、３０ｍｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体、及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と混合されているフラスコで行われる。いくつかの実施形態では、培地交換は、細胞が代替の成長チャンバに移されるまで行われ、そのような第２の拡張によって拡張されたＴＩＬは、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ等の核酸をＴＩＬに導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）ことによって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子のＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ等の核酸をＴＩＬに導入、することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集によって遺伝子修飾されている。いくつかの実施形態では、培地の３分の２は、使用済み培地の吸引、続いて新鮮な培地の注入によって交換される。いくつかの実施形態では、代替の成長チャンバには、以下でより完全に考察されるように、Ｇ－ＲＥＸフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。
いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地（例えば、ＣＭ２または第２の細胞培養培地と称されることもある）は、以下でさらに詳細に考察されるように、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、ならびに抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）を含む。
いくつかの実施形態では、第２の拡張、例えば、図７によるステップＤは、閉鎖系バイオリアクター内で行われる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、閉鎖系がＴＩＬ拡張のために用いられる。いくつかの実施形態では、単一のバイオリアクターが用いられる。いくつかの実施形態では、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１０またはＧ－ＲＥＸ－１００である。いくつかの実施形態では、閉鎖系バイオリアクターは、単一のバイオリアクターである。
１．フィーダー細胞及び抗原提示細胞
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の第２の拡張手順（例えば、図７のステップＤに記載されるような拡張、ならびにＲＥＰと称されるものを含む）は、ＲＥＰ ＴＩＬ拡張中及び／または第２の拡張中に過剰のフィーダー細胞を必要とし、そのような第２の拡張手順によって拡張されたＴＩＬは、ＣＩＳＨをコードする遺伝子ＤＮＡ切断によりを選択的に不活性化し１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸をＴＩＬに導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）ことによって、及び任意選択で、ＴＩＬにｍＲＮＡなどの核酸を導入することによって、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードし、ＰＤ－１をコードする遺伝子ＤＮＡ切断によりを選択的に不活性化することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を介して遺伝子修飾されている。多くの実施形態では、フィーダー細胞は、健康な血液提供者由来の標準の全血単位から得られる末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ勾配分離などの標準の方法を使用して取得される。
一般に、同種異系ＰＢＭＣは、放射線照射または熱処理のいずれかによって不活性化され、実施例に記載されるように、ＲＥＰ手順で使用され、これは、放射線照射された同種異系ＰＢＭＣの無複製能力を評価するための例示的なプロトコルを提供する。
いくつかの実施形態では、１４日目の生細胞の総数が、ＲＥＰの０日目及び／または第２の拡張の０日目（すなわち、第２の拡張の開始日）に培養開始された初期の生細胞数よりも少ない場合、ＰＢＭＣは、複製能力がないとみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡張手順での使用が認められる。
いくつかの実施形態では、７日目及び１４日目のＯＫＴ３及びＩＬ－２の存在下で培養された生細胞の総数が、ＲＥＰの０日目及び／または第２の拡張の０日目（すなわち、第２の拡張の開始日）に培養開始された初期の生細胞数から増加しなかった場合、ＰＢＭＣは、複製能力がないとみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡張手順での使用が認められる。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。
いくつかの実施形態では、７日目及び１４日目のＯＫＴ３及びＩＬ－２の存在下で培養された生細胞の総数が、ＲＥＰの０日目及び／または第２の拡張の０日目（すなわち、第２の拡張の開始日）に培養開始された初期の生細胞数から増加しなかった場合、ＰＢＭＣは、複製能力がないとみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡張手順での使用が認められる。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、５～６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び１０００～６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、１０～５０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び２０００～５０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、２０～４０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び２０００～４０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、２５～３５ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び２５００～３５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。
いくつかの実施形態では、抗原提示フィーダー細胞は、ＰＢＭＣである。いくつかの実施形態では、抗原提示フィーダー細胞は、人工抗原提示フィーダー細胞である。いくつかの実施形態では、第２の拡張におけるＴＩＬ対抗原提示フィーダー細胞の比率は、約１：２５、約１：５０、約１：１００、約１：１２５、約１：１５０、約１：１７５、約１：２００、約１：２２５、約１：２５０、約１：２７５、約１：３００、約１：３２５、約１：３５０、約１：３７５、約１：４００、または約１：５００である。いくつかの実施形態では、第２の拡張におけるＴＩＬ対抗原提示フィーダー細胞の比率は、１：５０～１：３００である。いくつかの実施形態では、第２の増殖におけるＴＩＬ対抗原提示フィーダー細胞の比率は、１：１００～１：２００である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の第２の拡張手順は、約２．５×１０９個のフィーダー細胞：約１００×１０６個のＴＩＬの比を必要とする。他の実施形態では、本明細書に記載の第２の拡張手順は、約２．５×１０９個のフィーダー細胞対約５０×１０６個のＴＩＬの比を必要とする。さらに他の実施形態では、本明細書に記載の第２の拡張手順は、約２．５×１０９個のフィーダー細胞：約２５×１０６個のＴＩＬを必要とする。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の第２の拡張手順は、第２の拡張中に過剰のフィーダー細胞を必要とする。多くの実施形態では、フィーダー細胞は、健康な血液提供者由来の標準の全血単位から得られる末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ勾配分離などの標準の方法を使用して取得される。いくつかの実施形態では、人工抗原提示（ａＡＰＣ）細胞がＰＢＭＣの代わりに使用される。
一般に、同種異系ＰＢＭＣは、放射線照射または熱処理のいずれかによって不活性化され、図及び実施例に記載される例示的な手順を含む、本明細書に記載のＴＩＬ拡張手順で使用される。
いくつかの実施形態では、人工抗原提示細胞は、ＰＢＭＣの代替物として、またはＰＢＭＣと組み合わせて、第２の拡張において使用される。
Ｈ．ステップＥ：ＴＩＬの採取
第２の拡張ステップ後、細胞が採取され得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、図７に提供されるように、１、２、３、４つ、またはそれ以上の拡張ステップ後に採取される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、図７に提供されるように、２つの拡張ステップ後に採取され、そのような拡張ステップによって拡張されたＴＩＬは、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸をＴＩＬに導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）ことによって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸をＴＩＬに導入することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を介して遺伝子修飾されている。
ＴＩＬは、例えば、遠心分離を含む、任意の適切な滅菌様式で採取され得る。ＴＩＬを採取するための方法は、当該技術分野で周知であり、いずれかのかかる既知の方法が本プロセスで用いられ得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、自動化されたシステムを使用して採取される。
細胞採取機及び／または細胞処理システムは、例えば、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ、Ｔｏｍｔｅｃ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、及びＩｎｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃを含む、様々な供給源から市販されている。任意の細胞ベースの採取機が本方法とともに用いられ得る。いくつかの実施形態では、細胞採取機及び／または細胞処理システムは、膜ベースの細胞採取機である。いくつかの実施形態では、細胞採取は、ＬＯＶＯシステム（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉによって製造）などの細胞処理システムによるものである。「ＬＯＶＯ細胞処理システム」という用語は、細胞を含む溶液を、滅菌及び／または閉鎖系環境で回転膜または回転フィルターなどの膜またはフィルターを通してポンプ輸送し、連続フロー及び細胞処理を可能にして、ペレット化せずに上清または細胞培養培地を除去する、任意のベンダーによって製造された任意の機器または装置も指す。いくつかの実施形態では、細胞採取機及び／または細胞処理システムは、滅菌閉鎖系内で、細胞分離、洗浄、流体交換、濃縮、及び／または他の細胞処理ステップを行うことができる。
いくつかの実施形態では、採取、例えば、図７によるステップＥは、閉鎖系バイオリアクターから行われる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、閉鎖系がＴＩＬ拡張のために用いられる。いくつかの実施形態では、単一のバイオリアクターが用いられる。いくつかの実施形態では、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１０またはＧ－ＲＥＸ－１００である。いくつかの実施形態では、閉鎖系バイオリアクターは、単一のバイオリアクターである。いくつかの実施形態では、閉鎖系は、系の無菌性及び閉鎖性を維持するために、滅菌条件下でシリンジを介してアクセスされる。
Ｉ．ステップＦ：最終製剤／注入バッグへの移送
図７に例示的な順序で提供され、上記及び本明細書で詳細に概説されるステップＡ～Ｅが完了した後、遺伝子修飾ＴＩＬは、患者への投与に使用するために容器に移送され、遺伝子修飾ＴＩＬは、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸をＴＩＬに導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）ことによって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸をＴＩＬに導入することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を介して遺伝子修飾されている。いくつかの実施形態では、治療的に十分な数の遺伝子修飾ＴＩＬが上記の拡張方法を使用して得られると、それらは、患者への投与に使用するために容器に移送され、遺伝子修飾されたＴＩＬは、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸をＴＩＬに導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）ことによって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸をＴＩＬに導入することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を介して遺伝子改変されている。
いくつかの実施形態では、本開示のＡＰＣを使用して拡張したＴＩＬは、薬学的組成物として患者に投与され、拡張ＴＩＬは、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸をＴＩＬに導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）ことによって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸をＴＩＬに導入することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を介して遺伝子修飾されている。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、滅菌緩衝液中の遺伝子修飾ＴＩＬ懸濁液である。本開示の方法を使用して拡張されたＴＩＬは、当該技術分野で知られている任意の好適な経路によって投与され得、そのようなＴＩＬは、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸をＴＩＬに導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）ことによって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸をＴＩＬに導入することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を介して遺伝子修飾されている。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、単回の動脈内または静脈内注入として投与され、これは、好ましくは、およそ３０～６０分続き、そのようなＴＩＬは、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸をＴＩＬに導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む）ことによって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸をＴＩＬに導入することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を介して遺伝子修飾されている。投与他の好適な投与経路には、腹腔内、髄腔内、及びリンパ内が含まれる。
ＩＶ．薬学的組成物、投与量、及び投薬レジメン
いくつかの実施形態では、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化するために、ＴＩＬに１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を導入することであって、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼが、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む、導入すること、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活性化するために、ＴＩＬに１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸を導入することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を介して遺伝子修飾されており、本開示の方法（本明細書では「ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ」と称される）を使用して拡張されたＴＩＬが、薬学的組成物として患者に投与される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、滅菌緩衝液中のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの懸濁液である。いくつかの実施形態では、本開示のＰＢＭＣを使用して拡張されたＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬは、当該技術分野で知られている任意の好適な経路によって投与され得る。いくつかの実施形態では、ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬは、単回の動脈内または静脈内注入として投与され、これは、好ましくは、およそ３０～６０分続く。他の好適な投与経路には、腹腔内、髄腔内、及びリンパ内投与が含まれる。
任意の好適な用量のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬが投与され得る。いくつかの実施形態では、特にがんが黒色腫である場合、約２．３×１０１０～約１３．７×１０１０個のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬが投与され、平均は約７．８×１０１０個のＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約１．２×１０１０～約４．３×１０１０個のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約３×１０１０～約１２×１０１０個のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約４×１０１０～約１０×１０１０個のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約５×１０１０～約８×１０１０個のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約６×１０１０～約８×１０１０個のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約７×１０１０～約８×１０１０個のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約２．３×１０１０～約１３．７×１０１０個である。いくつかの実施形態では、特にがんが黒色腫である場合、治療上有効な投与量は、約７．８×１０１０個のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約１．２×１０１０～約４．３×１０１０個のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約３×１０１０～約１２×１０１０個のＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約４×１０１０～約１０×１０１０個のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約５×１０１０～約８×１０１０個のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約６×１０１０～約８×１０１０個のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約７×１０１０～約８×１０１０個のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬである。
いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物で提供されるＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの数は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、及び９×１０１３個である。いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物に提供されるＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの数は、１×１０６～５×１０６、５×１０６～１×１０７、１×１０７～５×１０７、５×１０７～１×１０８、１×１０８～５×１０８、５×１０８～１×１０９、１×１０９～５×１０９、５×１０９～１×１０１０、１×１０１０～５×１０１０、５×１０１０～１×１０１１、５×１０１１～１×１０１２、１×１０１２～５×１０１２、及び５×１０１２～１×１０１３個の範囲内である。
いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物に提供されるＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの濃度は、例えば、１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％または０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖまたはｖ／ｖ未満である。
いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物に提供されるＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの濃度は９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９．７５％、１９．５０％、１９．２５％１９％、１８．７５％、１８．５０％、１８．２５％１８％１７．７５％、１７．５０％、１７．２５％、１７％、１６．７５％、１６．５０％、１６．２５％、１６％、１５．７５％、１５．５０％、１５．２５％、１５％、１４．７５％、１４．５０％、１４．２５％、１４％、１３．７５％、１３．５０％、１３．２５％、１３％、１２．７５％、１２．５０％、１２．２５％、１２％、１１．７５％、１１．５０％、１１．２５％、１１％、１０．７５％、１０．５０％、１０．２５％、１０％、９．７５％、９．５０％、９．２５％、９％、８．７５％、８．５０％、８．２５％、８％、７．７５％、７．５０％、７．２５％、７％、６．７５％、６．５０％、６．２５％、６％、５．７５％、５．５０％、５．２５％、５％、４．７５％、４．５０％、４．２５％、４％、３．７５％、３．５０％、３．２５％、３％、２．７５％、２．５０％、２．２５％、２％、１．７５％、１．５０％、１２５％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％または０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ、またはｖ／ｖを超える薬学的組成物である。
いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物中に提供されるＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの濃度は、約０．０００１％～約５０％、約０．００１％～約４０％、約０．０１％～約３０％、約０．０２％～約２９％、約０．０３％～約２８％、約０．０４％～約２７％、約０．０５％～約２６％、約０．０６％～約２５％、約０．０７％～約２４％、約０．０８％～約２３％、約０．０９％～約２２％、約０．１％～約２１％、約０．２％～約２０％、約０．３％～約１９％、約０．４％～約１８％、約０．５％～約１７％、約０．６％～約１６％、約０．７％～約１５％、約０．８％～約１４％、約０．９％～約１２％または約１％～約１０％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ、またはｖ／ｖの薬学的組成物の範囲内である。
いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物中に提供されるＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの濃度は、約０．００１％～約１０％、約０．０１％～約５％、約０．０２％～約４．５％、約０．０３％～約４％、約０．０４％～約３．５％、約０．０５％～約３％、約０．０６％～約２．５％、約０．０７％～約２％、約０．０８％～約１．５％、約０．０９％～約１％、約０．１％～約０．９％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ、またはｖ／ｖの薬学的組成物の範囲内である。
いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物中に提供されるＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの量は１０ｇ、９．５ｇ、９．０ｇ、８．５ｇ、８．０ｇ、７．５ｇ、７．０ｇ、６．５ｇ、６．０ｇ、５．５ｇ、５．０ｇ、４．５ｇ、４．０ｇ、３．５ｇ、３．０ｇ、２．５ｇ、２．０ｇ、１．５ｇ、１．０ｇ、０．９５ｇ、０．９ｇ、０．８５ｇ、０．８ｇ、０．７５ｇ、０．７ｇ、０．６５ｇ、０．６ｇ、０．５５ｇ、０．５ｇ、０．４５ｇ、０．４ｇ、０．３５ｇ、０．３ｇ、０．２５ｇ、０．２ｇ、０．１５ｇ、０．１ｇ、０．０９ｇ、０．０８ｇ、０．０７ｇ、０．０６ｇ、０．０５ｇ、０．０４ｇ、０．０３ｇ、０．０２ｇ、０．０１ｇ、０．００９ｇ、０．００８ｇ、０．００７ｇ、０．００６ｇ、０．００５ｇ、０．００４ｇ、０．００３ｇ、０．００２ｇ、０．００１ｇ、０．０００９ｇ、０．０００８ｇ、０．０００７ｇ、０．０００６ｇ、０．０００５ｇ、０．０００４ｇ、０．０００３ｇ、０．０００２ｇ、または０．０００１ｇ以下である。
いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物中に提供されるＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの量は、０．０００１ｇ、０．０００２ｇ、０．０００３ｇ、０．０００４ｇ、０．０００５ｇ、０．０００６ｇ、０．０００７ｇ、０．０００８ｇ、０．０００９ｇ、０．００１ｇ、０．００１５ｇ、０．００２ｇ、０．００２５ｇ、０．００３ｇ、０．００３５ｇ、０．００４ｇ、０．００４５ｇ、０．００５ｇ、０．００５５ｇ、０．００６ｇ、０．００６５ｇ、０．００７ｇ、０．００７５ｇ、０．００８ｇ、０．００８５ｇ、０．００９ｇ、０．００９５ｇ、０．０１ｇ、０．０１５ｇ、０．０２ｇ、０．０２５ｇ、０．０３ｇ、０．０３５ｇ、０．０４ｇ、０．０４５ｇ、０．０５ｇ、０．０５５ｇ、０．０６ｇ、０．０６５ｇ、０．０７ｇ、０．０７５ｇ、０．０８ｇ、０．０８５ｇ、０．０９ｇ、０．０９５ｇ、０．１ｇ、０．１５ｇ、０．２ｇ、０．２５ｇ、０．３ｇ、０．３５ｇ、０．４ｇ、０．４５ｇ、０．５ｇ、０．５５ｇ、０．６ｇ、０．６５ｇ、０．７ｇ、０．７５ｇ、０．８ｇ、０．８５ｇ、０．９ｇ、０．９５ｇ、１ｇ、１．５ｇ、２ｇ、２．５、３ｇ、３．５、４ｇ、４．５ｇ、５ｇ、５．５ｇ、６ｇ、６．５ｇ、７ｇ、７．５ｇ、８ｇ、８．５ｇ、９ｇ、９．５ｇ、または１０ｇを超える。
本発明の薬学的組成物中に提供されるＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬは、広い投与量範囲にわたって有効である。正確な投与量は、投与経路、化合物が投与される形態、治療される対象の性別及び年齢、治療される対象の体重、ならびに主治医の選好及び経験に依存するであろう。適切な場合、ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの臨床的に確立された投与量が使用される場合もある。ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの投与量などの本明細書の方法を使用して投与される薬学的組成物の量は、治療されるヒトまたは哺乳動物、障害または状態の重症度、投与速度、医薬品有効成分の性質、及び処方医師の裁量に依存するであろう。
いくつかの実施形態では、ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬは、単回用量で投与され得る。かかる投与は、注射、例えば、静脈内注射によるものであり得る。いくつかの実施形態では、ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬは、複数回用量で投与され得る。投薬は、１年に１回、２回、３回、４回、５回、６回、または６回超であり得る。投薬は、月１回、２週間に１回、週１回、または隔日に１回であり得る。ＴＩＬの投与は、必要な限り継続することができる。
いくつかの実施形態では、ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの有効投与量は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、及び９×１０１３である。いくつかの実施形態では、ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの有効投与量は、１×１０６～５×１０６、５×１０６～１×１０７、１×１０７～５×１０７、５×１０７～１×１０８、１×１０８～５×１０８、５×１０８～１×１０９、１×１０９～５×１０９、５×１０９～１×１０１０、１×１０１０～５×１０１０、５×１０１０～１×１０１１、５×１０１１～１×１０１２、１×１０１２～５×１０１２、及び５×１０１２～１×１０１３の範囲内である。
いくつかの実施形態では、ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの有効投与量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約４．３ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約３．６ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約３．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３５ｍｇ／ｋｇ～約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ～約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ～約１．７ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約１．３ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約１．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．５５ｍｇ／ｋｇ～約０．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．６５ｍｇ／ｋｇ～約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ～約０．７５ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ～約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．８５ｍｇ／ｋｇ～約２ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約１．８５ｍｇ／ｋｇ、約１．１５ｍｇ／ｋｇ～約１．７ｍｇ／ｋｇ、約１．３ｍｇ／ｋｇ～約１．６ｍｇ／ｋｇ、約１．３５ｍｇ／ｋｇ～約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２．１５ｍｇ／ｋｇ～約３．６ｍｇ／ｋｇ、約２．３ｍｇ／ｋｇ～約３．４ｍｇ／ｋｇ、約２．４ｍｇ／ｋｇ～約３．３ｍｇ／ｋｇ、約２．６ｍｇ／ｋｇ～約３．１５ｍｇ／ｋｇ、約２．７ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇ、約２．８ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇ、または約２．８５ｍｇ／ｋｇ～約２．９５ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
いくつかの実施形態では、ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの有効投与量は、約１ｍｇ～約５００ｍｇ、約１０ｍｇ～約３００ｍｇ、約２０ｍｇ～約２５０ｍｇ、約２５ｍｇ～約２００ｍｇ、約１ｍｇ～約５０ｍｇ、約５ｍｇ～約４５ｍｇ、約１０ｍｇ～約４０ｍｇ、約１５ｍｇ～約３５ｍｇ、約２０ｍｇ～約３０ｍｇ、約２３ｍｇ～約２８ｍｇ、約５０ｍｇ～約１５０ｍｇ、約６０ｍｇ～約１４０ｍｇ、約７０ｍｇ～約１３０ｍｇ、約８０ｍｇ～約１２０ｍｇ、約９０ｍｇ～約１１０ｍｇ、または約９５ｍｇ～約１０５ｍｇ、約９８ｍｇ～約１０２ｍｇ、約１５０ｍｇ～約２５０ｍｇ、約１６０ｍｇ～約２４０ｍｇ、約１７０ｍｇ～約２３０ｍｇ、約１８０ｍｇ～約２２０ｍｇ、約１９０ｍｇ～約２１０ｍｇ、約１９５ｍｇ～約２０５ｍｇ、または約１９８～約２０７ｍｇの範囲内である。
ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの有効量は、鼻腔内経路及び経皮経路を含む、同様の有用性を有する薬剤の認められた投与様式のうちのいずれかによって、動脈内注射によって、静脈内、腹腔内、非経口、筋肉内、皮下、局所、移植によって、または吸入によって、単回用量または複数回用量のいずれかで投与され得る。
他の実施形態では、本発明は、上記の前の段落のうちのいずれかに記載のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの治療用集団を含む注入バッグを提供する。
他の実施形態では、本発明は、上記の前の段落のうちのいずれかに記載のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの治療用集団及び薬学的に許容される担体を含む腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）組成物を提供する。
他の実施形態では、本発明は、上記の前の段落のうちのいずれかに記載のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ組成物を含む注入バッグを提供する。
他の実施形態では、本発明は、上記の前の段落のうちのいずれかに記載のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの治療用集団の凍結保存された調製物を提供する。
他の実施形態では、本発明は、上記の前の段落のうちのいずれかに記載のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの治療用集団及び冷凍保存媒体を含む腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）組成物を提供する。
他の実施形態では、本発明は、凍結保存培地がＤＭＳＯを含むように修正された、上記の前の段落のうちのいずれかに記載のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ組成物を提供する。
他の実施形態では、本発明は、凍結保存培地が７～１０％のＤＭＳＯを含むように修正された、上記の前の段落のうちのいずれかに記載のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ組成物を提供する。
他の実施形態では、本発明は、上記の前の段落のうちのいずれかに記載のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ組成物の凍結保存された調製物を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示の方法を使用して拡張されたＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬは、薬学的組成物として患者に投与される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、滅菌緩衝液中のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ懸濁液である。本開示のＰＢＭＣを使用して拡張されたＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬは、当該技術分野で知られている任意の好適な経路によって投与され得る。いくつかの実施形態では、ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬは、単回の動脈内または静脈内注入として投与され、これは、好ましくは、およそ３０～６０分続く。他の好適な投与経路には、腹腔内、髄腔内、及びリンパ内投与が含まれる。
任意の好適な用量のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬが投与され得る。いくつかの実施形態では、特にがんが黒色腫である場合、約２．３×１０１０～約１３．７×１０１０個のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬが投与され、平均は約７．８×１０１０個のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約１．２×１０１０～約４．３×１０１０個のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約３×１０１０～約１２×１０１０個のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約４×１０１０～約１０×１０１０個のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約５×１０１０～約８×１０１０個のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約６×１０１０～約８×１０１０個のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約７×１０１０～約８×１０１０個のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約２．３×１０１０～約１３．７×１０１０個である。いくつかの実施形態では、特にがんが黒色腫である場合、治療上有効な投与量は、約７．８×１０１０個のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約１．２×１０１０～約４．３×１０１０個のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約３×１０１０～約１２×１０１０個のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約４×１０１０～約１０×１０１０個のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約５×１０１０～約８×１０１０個のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約６×１０１０～約８×１０１０個のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約７×１０１０～約８×１０１０個のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬである。
いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物で提供されるＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの数は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、及び９×１０１３個である。いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物に提供されるＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの数は、１×１０６～５×１０６、５×１０６～１×１０７、１×１０７～５×１０７、５×１０７～１×１０８、１×１０８～５×１０８、５×１０８～１×１０９、１×１０９～５×１０９、５×１０９～１×１０１０、１×１０１０～５×１０１０、５×１０１０～１×１０１１、５×１０１１～１×１０１２、１×１０１２～５×１０１２、及び５×１０１２～１×１０１３個の範囲内である。
いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物に提供されるＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの濃度は、例えば、１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％または０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖまたはｖ／ｖ未満である。
いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物に提供されるＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの濃度は９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９．７５％、１９．５０％、１９．２５％１９％、１８．７５％、１８．５０％、１８．２５％１８％１７．７５％、１７．５０％、１７．２５％、１７％、１６．７５％、１６．５０％、１６．２５％、１６％、１５．７５％、１５．５０％、１５．２５％、１５％、１４．７５％、１４．５０％、１４．２５％、１４％、１３．７５％、１３．５０％、１３．２５％、１３％、１２．７５％、１２．５０％、１２．２５％、１２％、１１．７５％、１１．５０％、１１．２５％、１１％、１０．７５％、１０．５０％、１０．２５％、１０％、９．７５％、９．５０％、９．２５％、９％、８．７５％、８．５０％、８．２５％、８％、７．７５％、７．５０％、７．２５％、７％、６．７５％、６．５０％、６．２５％、６％、５．７５％、５．５０％、５．２５％、５％、４．７５％、４．５０％、４．２５％、４％、３．７５％、３．５０％、３．２５％、３％、２．７５％、２．５０％、２．２５％、２％、１．７５％、１．５０％、１２５％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％または０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ、またはｖ／ｖを超える薬学的組成物である。
いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物中に提供されるＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの濃度は、約０．０００１％～約５０％、約０．００１％～約４０％、約０．０１％～約３０％、約０．０２％～約２９％、約０．０３％～約２８％、約０．０４％～約２７％、約０．０５％～約２６％、約０．０６％～約２５％、約０．０７％～約２４％、約０．０８％～約２３％、約０．０９％～約２２％、約０．１％～約２１％、約０．２％～約２０％、約０．３％～約１９％、約０．４％～約１８％、約０．５％～約１７％、約０．６％～約１６％、約０．７％～約１５％、約０．８％～約１４％、約０．９％～約１２％または約１％～約１０％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ、またはｖ／ｖの薬学的組成物の範囲内である。
いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物中に提供されるＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの濃度は、約０．００１％～約１０％、約０．０１％～約５％、約０．０２％～約４．５％、約０．０３％～約４％、約０．０４％～約３．５％、約０．０５％～約３％、約０．０６％～約２．５％、約０．０７％～約２％、約０．０８％～約１．５％、約０．０９％～約１％、約０．１％～約０．９％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ、またはｖ／ｖの薬学的組成物の範囲内である。
いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物中に提供されるＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの量は１０ｇ、９．５ｇ、９．０ｇ、８．５ｇ、８．０ｇ、７．５ｇ、７．０ｇ、６．５ｇ、６．０ｇ、５．５ｇ、５．０ｇ、４．５ｇ、４．０ｇ、３．５ｇ、３．０ｇ、２．５ｇ、２．０ｇ、１．５ｇ、１．０ｇ、０．９５ｇ、０．９ｇ、０．８５ｇ、０．８ｇ、０．７５ｇ、０．７ｇ、０．６５ｇ、０．６ｇ、０．５５ｇ、０．５ｇ、０．４５ｇ、０．４ｇ、０．３５ｇ、０．３ｇ、０．２５ｇ、０．２ｇ、０．１５ｇ、０．１ｇ、０．０９ｇ、０．０８ｇ、０．０７ｇ、０．０６ｇ、０．０５ｇ、０．０４ｇ、０．０３ｇ、０．０２ｇ、０．０１ｇ、０．００９ｇ、０．００８ｇ、０．００７ｇ、０．００６ｇ、０．００５ｇ、０．００４ｇ、０．００３ｇ、０．００２ｇ、０．００１ｇ、０．０００９ｇ、０．０００８ｇ、０．０００７ｇ、０．０００６ｇ、０．０００５ｇ、０．０００４ｇ、０．０００３ｇ、０．０００２ｇ、または０．０００１ｇ以下である。
いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物中に提供されるＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの量は、０．０００１ｇ、０．０００２ｇ、０．０００３ｇ、０．０００４ｇ、０．０００５ｇ、０．０００６ｇ、０．０００７ｇ、０．０００８ｇ、０．０００９ｇ、０．００１ｇ、０．００１５ｇ、０．００２ｇ、０．００２５ｇ、０．００３ｇ、０．００３５ｇ、０．００４ｇ、０．００４５ｇ、０．００５ｇ、０．００５５ｇ、０．００６ｇ、０．００６５ｇ、０．００７ｇ、０．００７５ｇ、０．００８ｇ、０．００８５ｇ、０．００９ｇ、０．００９５ｇ、０．０１ｇ、０．０１５ｇ、０．０２ｇ、０．０２５ｇ、０．０３ｇ、０．０３５ｇ、０．０４ｇ、０．０４５ｇ、０．０５ｇ、０．０５５ｇ、０．０６ｇ、０．０６５ｇ、０．０７ｇ、０．０７５ｇ、０．０８ｇ、０．０８５ｇ、０．０９ｇ、０．０９５ｇ、０．１ｇ、０．１５ｇ、０．２ｇ、０．２５ｇ、０．３ｇ、０．３５ｇ、０．４ｇ、０．４５ｇ、０．５ｇ、０．５５ｇ、０．６ｇ、０．６５ｇ、０．７ｇ、０．７５ｇ、０．８ｇ、０．８５ｇ、０．９ｇ、０．９５ｇ、１ｇ、１．５ｇ、２ｇ、２．５、３ｇ、３．５、４ｇ、４．５ｇ、５ｇ、５．５ｇ、６ｇ、６．５ｇ、７ｇ、７．５ｇ、８ｇ、８．５ｇ、９ｇ、９．５ｇ、または１０ｇを超える。
本発明の薬学的組成物中に提供されるＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬは、広い投与量範囲にわたって有効である。正確な投与量は、投与経路、化合物が投与される形態、治療される対象の性別及び年齢、治療される対象の体重、ならびに主治医の選好及び経験に依存するであろう。適切な場合、ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの臨床的に確立された投与量が使用される場合もある。ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの投与量などの本明細書の方法を使用して投与される薬学的組成物の量は、治療されるヒトまたは哺乳動物、障害または状態の重症度、投与速度、医薬品有効成分の性質、及び処方医師の裁量に依存するであろう。
いくつかの実施形態では、ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬは、単回用量で投与され得る。かかる投与は、注射、例えば、静脈内注射によるものであり得る。いくつかの実施形態では、ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬは、複数回用量で投与され得る。投薬は、１年に１回、２回、３回、４回、５回、６回、または６回超であり得る。投薬は、月１回、２週間に１回、週１回、または隔日に１回であり得る。ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの投与は、必要な限り継続することができる。
いくつかの実施形態では、ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの有効投与量は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、及び９×１０１３である。いくつかの実施形態では、ＴＩＬの有効な投与量は、１×１０６～５×１０６、５×１０６～１×１０７、１×１０７～５×１０７、５×１０７～１×１０８、１×１０８～５×１０８、５×１０８～１×１０９、１×１０９～５×１０９、５×１０９～１×１０１０、１×１０１０～５×１０１０、５×１０１０～１×１０１１、５×１０１１～１×１０１２、１×１０１２～５×１０１２、及び５×１０１２～１×１０１３の範囲内である。
いくつかの実施形態では、ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの有効投与量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約４．３ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約３．６ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約３．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３５ｍｇ／ｋｇ～約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ～約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ～約１．７ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約１．３ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約１．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．５５ｍｇ／ｋｇ～約０．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．６５ｍｇ／ｋｇ～約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ～約０．７５ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ～約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．８５ｍｇ／ｋｇ～約２ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約１．８５ｍｇ／ｋｇ、約１．１５ｍｇ／ｋｇ～約１．７ｍｇ／ｋｇ、約１．３ｍｇ／ｋｇ～約１．６ｍｇ／ｋｇ、約１．３５ｍｇ／ｋｇ～約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２．１５ｍｇ／ｋｇ～約３．６ｍｇ／ｋｇ、約２．３ｍｇ／ｋｇ～約３．４ｍｇ／ｋｇ、約２．４ｍｇ／ｋｇ～約３．３ｍｇ／ｋｇ、約２．６ｍｇ／ｋｇ～約３．１５ｍｇ／ｋｇ、約２．７ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇ、約２．８ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇ、または約２．８５ｍｇ／ｋｇ～約２．９５ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
いくつかの実施形態では、ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの有効投与量は、約１ｍｇ～約５００ｍｇ、約１０ｍｇ～約３００ｍｇ、約２０ｍｇ～約２５０ｍｇ、約２５ｍｇ～約２００ｍｇ、約１ｍｇ～約５０ｍｇ、約５ｍｇ～約４５ｍｇ、約１０ｍｇ～約４０ｍｇ、約１５ｍｇ～約３５ｍｇ、約２０ｍｇ～約３０ｍｇ、約２３ｍｇ～約２８ｍｇ、約５０ｍｇ～約１５０ｍｇ、約６０ｍｇ～約１４０ｍｇ、約７０ｍｇ～約１３０ｍｇ、約８０ｍｇ～約１２０ｍｇ、約９０ｍｇ～約１１０ｍｇ、または約９５ｍｇ～約１０５ｍｇ、約９８ｍｇ～約１０２ｍｇ、約１５０ｍｇ～約２５０ｍｇ、約１６０ｍｇ～約２４０ｍｇ、約１７０ｍｇ～約２３０ｍｇ、約１８０ｍｇ～約２２０ｍｇ、約１９０ｍｇ～約２１０ｍｇ、約１９５ｍｇ～約２０５ｍｇ、または約１９８～約２０７ｍｇの範囲内である。
ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの有効量は、鼻腔内経路及び経皮経路を含む、同様の有用性を有する薬剤の認められた投与様式のうちのいずれかによって、動脈内注射によって、静脈内、腹腔内、非経口、筋肉内、皮下、局所、移植によって、または吸入によって、単回用量または複数回用量のいずれかで投与され得る。
Ｖ．患者を治療する方法
治療の方法は、最初のＴＩＬ収集及びＴＩＬの培養から始まる。かかる方法は両方とも、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１２，３５（３）：２８３－２９２によって当該技術分野で説明されている。治療の方法の実施形態は、実施例を含む以下の節全体に記載されている。
本発明の拡張されたＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬは、本明細書の図７に記載される、またはＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５８６１０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１２６０５、またはＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１２６３３に記載される方法の任意の実施形態に従って拡張することができ、がんを有する患者の治療（例えば、Ｇｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１６，３４（２０）：２３８９－２３９、ならびに補足内容に用途を見出し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、以前に記載されたように、転移性黒色腫の切除された沈着物から増殖される（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｄｕｄｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２００３，２６：３３２－３４２を参照されたい）。
注入バッグＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの凍結保存試料の細胞表現型は、表面マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＣＲ７、及びＣＤ４５ＲＡ（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）のフローサイトメトリー（例えば、ＦｌｏｗＪｏ）、ならびに本明細書に記載の方法のうちのいずれかによって分析され得る。血清サイトカインは、標準的な酵素結合免疫吸着アッセイ技術を使用することにより測定された。血清ＩＦＮ－γの上昇は、＞１００ｐｇ／ｍＬと定義され得る。
有効性の尺度には、当該技術分野で知られており、本明細書にも記載されている、疾患制御率（ＤＣＲ）ならびに全応答率（ＯＲＲ）が含まれ得る。
Ａ．がん及び他の疾患を治療する方法
本明細書に記載の組成物及び方法は、疾患を治療するための方法で使用され得る。いくつかの実施形態では、それらは、過剰増殖性障害の治療に使用するためのものである。それらは、本明細書及び以下の段落に記載される他の障害の治療にも使用され得る。
いくつかの実施形態では、過剰増殖性障害は、がんである。いくつかの実施形態では、過剰増殖性障害は、固形腫瘍癌である。いくつかの実施形態では、，固体腫瘍がんは、神経膠芽腫（ＧＢＭ）、消化器癌、黒色腫、卵巣癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、腎臓癌、腎細胞癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、過剰増殖性障害は、血液学的悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、固形腫瘍癌は、慢性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、及びマントル細胞リンパ腫からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、がんは、高頻度変異癌表現型である。高頻度変異癌は、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ，１７１：１０４２－１０５６（２０１７）、参照により全体がすべての目的のために本明細書に組み込まれる）に広範に記載されている。いくつかの実施形態では、高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）当たり９～１０個の変異を含む。いくつかの実施形態では、小児高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）当たり９．９１個の変異を含む。いくつかの実施形態では、成人高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）当たり９個の変異を含む。いくつかの実施形態では、増強された高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）当たり１０～１００個の変異を含む。いくつかの実施形態では、増強された小児高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）当たり１０～１００個の変異を含む。いくつかの実施形態では、増強された成人高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）当たり１０～１００個の変異を含む。いくつかの実施形態では、超高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）当たり１００個を超える変異を含む。いくつかの実施形態では、小児超高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）当たり１００個を超える変異を含む。いくつかの実施形態では、成人超高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）当たり１００個を超える変異を含む。
いくつかの実施形態では、高頻度変異腫瘍は、複製修復経路に変異を有する。いくつかの実施形態では、高頻度変異腫瘍は、複製修復関連ＤＮＡポリメラーゼに変異を有する。いくつかの実施形態では、高頻度変異腫瘍は、マイクロサテライト不安定性を有する。いくつかの実施形態では、超高頻度変異腫瘍は、複製修復関連ＤＮＡポリメラーゼに変異を有し、マイクロサテライト不安定性を有する。いくつかの実施形態では、腫瘍における高頻度変異は、免疫チェックポイント阻害剤への応答と相関している。いくつかの実施形態では、高頻度変異腫瘍は、免疫チェックポイント阻害剤での治療に耐性を示す。いくつかの実施形態では、高頻度変異腫瘍は、本発明のＴＩＬを使用して治療され得る。いくつかの実施形態では、腫瘍における高頻度変異は、環境要因（外因性曝露）によって引き起こされる。例えば、紫外線光は、悪性黒色腫における多数の変異の主な原因であり得る（例えば、Ｐｆｅｉｆｅｒ，Ｇ．Ｐ．，Ｙｏｕ，Ｙ．Ｈ．，ａｎｄ Ｂｅｓａｒａｔｉｎｉａ，Ａ．（２００５）．Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．５７１，１９－３１．、Ｓａｇｅ，Ｅ．（１９９３）．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．５７，１６３－１７４を参照されたい）。いくつかの実施形態では、腫瘍における超変異は、直接変異原曝露に起因する、肺及び喉頭の腫瘍、ならびに他の腫瘍のタバコの煙中の６０を超える発がん物質によって引き起こされ得る（例えば、Ｐｌｅａｓａｎｃｅ，Ｅ．Ｄ．，Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｐ．Ｊ．，Ｏ’Ｍｅａｒａ，Ｓ．，ＭｃＢｒｉｄｅ，Ｄ．Ｊ．，Ｍｅｙｎｅｒｔ，Ａ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．，Ｌｉｎ，Ｍ．Ｌ．，Ｂｅａｒｅ，Ｄ．，Ｌａｕ，Ｋ．Ｗ．，Ｇｒｅｅｎｍａｎ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ｎａｔｕｒｅ４６３，１８４－１９０を参照されたい）。いくつかの実施形態では、腫瘍における高頻度変異は、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーメンバーの調節不全によって引き起こされ、これは、広範囲のがんにおいてＣからＴへの移行のレベルの増加をもたらすことが示されている（例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｓ．Ａ．，Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｍ．Ｓ．，Ｋｌｉｍｃｚａｋ，Ｌ．Ｊ．，Ｇｒｉｍｍ，Ｓ．Ａ．，Ｆａｒｇｏ，Ｄ．，Ｓｔｏｊａｎｏｖ，Ｐ．，Ｋｉｅｚｕｎ，Ａ．，Ｋｒｙｕｋｏｖ，Ｇ．Ｖ．，Ｃａｒｔｅｒ，Ｓ．Ｌ．，Ｓａｋｓｅｎａ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４５，９７０－９７６を参照されたい）。いくつかの実施形態では、腫瘍における高頻度変異は、主要な複製酵素Ｐｏｌ３及びＰｏｌｄ１によって実行される校正を損なう変異による欠陥のあるＤＮＡ複製修復によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、腫瘍における高頻度変異は、結腸直腸癌、子宮内膜癌、及び他のがんの高頻度変異に関連するＤＮＡミスマッチ修復の欠陥によって引き起こされる（例えば、Ｋａｎｄｏｔｈ，Ｃ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｎ．，Ｃｈｅｒｎｉａｃｋ，Ａ．Ｄ．，Ａｋｂａｎｉ，Ｒ．，Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｓｈｅｎ，Ｈ．，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ａ．Ｇ．，Ｐａｓｈｔａｎ，Ｉ．，Ｓｈｅｎ，Ｒ．，Ｂｅｎｚ，Ｃ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．；（２０１３）．Ｎａｔｕｒｅ４９７，６７－７３．、Ｍｕｚｎｙ，Ｄ．Ｍ．，Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ，Ｍ．Ｎ．，Ｃｈａｎｇ，Ｋ．，Ｄｉｎｈ，Ｈ．Ｈ．，Ｄｒｕｍｍｏｎｄ，Ｊ．Ａ．，Ｆｏｗｌｅｒ，Ｇ．，Ｋｏｖａｒ，Ｃ．Ｌ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｌ．Ｒ．，Ｍｏｒｇａｎ，Ｍ．Ｂ．，Ｎｅｗｓｈａｍ，Ｉ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．；（２０１２）．Ｎａｔｕｒｅ４８７，３３０－３３７を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ複製修復変異は、構成的または二対立遺伝子ミスマッチ修復欠損症（ＣＭＭＲＤ）、リンチ症候群、及びポリメラーゼ校正関連ポリポーシス（ＰＰＡＰ）などのがん素因性症候群にも見られる。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの集団でがんを治療する方法を含み、がんは、高頻度変異癌である。いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ集団でがんを治療する方法を含み、がんは、増強された高頻度変異癌である。いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ集団でがんを治療する方法を含み、がんは、超高頻度変異癌である。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ集団でがんを治療する方法を含み、患者は、本開示によるＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの注入前に、非骨髄破壊的（ｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅ）化学療法で前治療される。いくつかの実施形態では、非骨髄破壊的化学療法は、シクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日で２日間（ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ注入の２７日前及び２６日前）、ならびにフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日で５日間（ＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ注入の２７日前～２３日前）である。いくつかの実施形態では、非骨髄破壊的化学療法は、シクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日で２日間（ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ注入の２７日前及び２６日前）、ならびにフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日で３日間（ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ注入の２７日前～２５日前）である。いくつかの実施形態では、非骨髄破壊的（ｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅ）化学療法は、シクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日で２日間（ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ注入の２７日前及び２６日前）、続いてフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日で３日間（ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ注入の２５日前～２３日前）である。いくつかの実施形態では、本開示による非骨髄破壊的化学療法及びＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ注入（０日目）後、患者は、生理学的寛容まで８時間毎に７２００００ＩＵ／ｋｇのＩＬ－２の静脈内注入を受ける。
１．患者の任意のリンパ球枯渇プレコンディショニング
いくつかの実施形態では、本発明は、、ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸をＴＩＬに導入する（ここで、１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＣＩＳＨ遺伝子標的配列として配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含）ことによって、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化する１つ以上のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどの核酸をＴＩＬに導入することによって、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を介して遺伝子修飾されている遺伝子修飾ＴＩＬ集団でがんを治療する方法を含み、患者は、本開示によるそのようなＴＩＬの注入前に非骨髄破壊的化学療法で前治療される。いくつかの実施形態では、本発明は、非骨髄破壊的化学療法で前治療された患者のがんの治療に使用するためのＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ集団を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ集団は注入による投与用である。いくつかの実施形態では、非骨髄破壊的化学療法は、シクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日で２日間（ＴＩＬ注入の２７日前及び２６日前）、ならびにフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日で５日間（ＴＩＬ注入の２７日前～２３日前）である。いくつかの実施形態では、非骨髄破壊的化学療法は、シクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日で２日間（ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ注入の２７日前及び２６日前）、ならびにフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日で３日間（ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ注入の２７日前～２５日前）である。いくつかの実施形態では、非骨髄破壊的（ｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅ）化学療法は、シクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日で２日間（ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ注入の２７日前及び２６日前）、続いてフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日で３日間（ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ注入の２５日前～２３日前）である。いくつかの実施形態では、本開示による非骨髄破壊的化学療法及びＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ注入（０日目）後、患者は、生理学的寛容まで８時間毎に７２００００ＩＵ／ｋｇで静脈内的にＩＬ－２（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮとして市販されている、アルデスロイキン）の静脈内注入を受ける。ある特定の実施形態では、ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ集団は、ＩＬ－２と組み合わせてがんを治療する際に使用するためのものであり、ＩＬ－２は、そのようなＴＩＬ集団の後に投与される。
実験結果は、腫瘍特異的Ｔリンパ球の養子移入前のリンパ球枯渇が、調節性Ｔ細胞及び免疫系の競合要素（「サイトカインシンク」）を排除することによって治療有効性を増強する上で重要な役割を果たすことを示している。したがって、本発明のいくつかの実施形態は、本発明のＴＩＬを導入する前に、患者に対してリンパ球枯渇ステップ（「免疫抑制コンディショニング」と称されることもある）を利用する。
一般に、リンパ球枯渇は、フルダラビンまたはシクロホスファミド（マホスファミドと称される活性物質）及びそれらの組み合わせの投与を使用して達成される。かかる方法は、Ｇａｓｓｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１１，６０，７５－８５、Ｍｕｒａｎｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ．Ｏｎｃｏｌ．，２００６，３，６６８－６８１、Ｄｕｄｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００８，２６，５２３３－５２３９、及びＤｕｄｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００５，２３，２３４６－２３５７に記載されており、これらはすべて、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、フルダラビンは、０．５μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬのフルダラビンの濃度で投与される。いくつかの実施形態では、フルダラビンは、１μｇ／ｍＬのフルダラビンの濃度で投与される。いくつかの実施形態では、フルダラビン治療は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、または７日以上投与される。いくつかの実施形態では、フルダラビンは、１０ｍｇ／ｋｇ／日、１５ｍｇ／ｋｇ／日、２０ｍｇ／ｋｇ／日、２５ｍｇ／ｋｇ／日、３０ｍｇ／ｋｇ／日、３５ｍｇ／ｋｇ／日、４０ｍｇ／ｋｇ／日、または４５ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で投与される。いくつかの実施形態では、フルダラビン治療は、３５ｍｇ／ｋｇ／日で２～７日間投与される。いくつかの実施形態では、フルダラビン治療は、３５ｍｇ／ｋｇ／日で４～５日間投与される。いくつかの実施形態では、フルダラビン治療は、２５ｍｇ／ｋｇ／日で４～５日間投与される。
いくつかの実施形態では、シクロホスファミドの活性形態であるマホスファミドは、シクロホスファミドの投与により、０．５μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬの濃度で得られる。いくつかの実施形態では、シクロホスファミドの活性形態であるマホスファミドは、シクロホスファミドの投与により、１μｇ／ｍＬの濃度で得られる。いくつかの実施形態では、シクロホスファミド治療は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、または７日以上投与される。いくつかの実施形態では、シクロホスファミドは、１００ｍｇ／ｍ２／日、１５０ｍｇ／ｍ２／日、１７５ｍｇ／ｍ２／日、２００ｍｇ／ｍ２／日、２２５ｍｇ／ｍ２／日、２５０ｍｇ／ｍ２／日、２７５ｍｇ／ｍ２／日、または３００ｍｇ／ｍ２／日の投与量で投与される。いくつかの実施形態では、シクロホスファミドは、静脈内（すなわち、ｉ．ｖ．）投与される。いくつかの実施形態では、シクロホスファミド治療は、３５ｍｇ／ｋｇ／日で２～７日間投与される。いくつかの実施形態では、シクロホスファミド治療は、２５０ｍｇ／ｍ２／日で４～５日間ｉ．ｖ．投与される。いくつかの実施形態では、シクロホスファミド治療は、２５０ｍｇ／ｍ２／日で４日間ｉ．ｖ．投与される。
いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇は、患者にフルダラビンとシクロホスファミドを一緒に投与することによって行われる。いくつかの実施形態では、フルダラビンは、２５ｍｇ／ｍ２／日でｉ．ｖ．投与され、シクロホスファミドは、２５０ｍｇ／ｍ２／日で４日間にわたってｉ．ｖ投与される。
いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇は、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、続いてフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間投与することによって行われる。
いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇は、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、続いてフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で３日間投与することによって行われる。
いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇は、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、フルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間投与することによって行われ、シクロホスファミド及びフルダラビンは、両方とも最初の２日間に投与され、リンパ球枯渇は合計５日間で行われる。
いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇は、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、フルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で３日間投与することによって行われ、シクロホスファミド及びフルダラビンは、両方とも最初の２日間に投与され、リンパ球枯渇は合計３日間で行われる。
いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇は、シクロホスファミドを約５０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、フルダラビンを約２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間投与することによって行われ、シクロホスファミド及びフルダラビンは、両方とも最初の２日間に投与され、リンパ球枯渇は合計５日間で行われる。
いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇は、シクロホスファミドを約５０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、続いてフルダラビンを約２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で３日間投与することによって行われ、リンパ球枯渇は合計５日間で行われる。
いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇は、シクロホスファミドを約５０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、フルダラビンを約２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で３日間投与することによって行われ、シクロホスファミド及びフルダラビンは、両方とも最初の２日間に投与され、リンパ球枯渇は合計３日間で行われる。
いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇は、シクロホスファミドを約５０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、フルダラビンを約２０ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間投与することによって行われ、シクロホスファミド及びフルダラビンは、両方とも最初の２日間に投与され、リンパ球枯渇は合計５日間で行われる。
いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇は、シクロホスファミドを約５０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、続いてフルダラビンを約２０ｍｇ／ｍ２／日の用量で３日間投与することによって行われ、リンパ球枯渇は合計５日間で行われる。
いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇は、シクロホスファミドを約５０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、フルダラビンを約２０ｍｇ／ｍ２／日の用量で３日間投与することによって行われ、シクロホスファミド及びフルダラビンは、両方とも最初の２日間に投与され、リンパ球枯渇は合計３日間で行われる。
いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇は、シクロホスファミドを約４０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、フルダラビンを約２０ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間投与することによって行われ、シクロホスファミド及びフルダラビンは、両方とも最初の２日間に投与され、リンパ球枯渇は合計５日間で行われる。
いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇は、シクロホスファミドを約４０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、続いてフルダラビンを約２０ｍｇ／ｍ２／日の用量で３日間投与することによって行われ、リンパ球枯渇は合計５日間で行われる。
いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇は、シクロホスファミドを約４０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、フルダラビンを約２０ｍｇ／ｍ２／日の用量で３日間投与することによって行われ、シクロホスファミド及びフルダラビンは、両方とも最初の２日間に投与され、リンパ球枯渇は合計３日間で行われる。
いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇は、シクロホスファミドを約４０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、フルダラビンを約１５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間投与することによって行われ、シクロホスファミド及びフルダラビンは、両方とも最初の２日間に投与され、リンパ球枯渇は合計５日間で行われる。
いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇は、シクロホスファミドを約４０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与した後、フルダラビンを約１５ｍｇ／ｍ２／日の用量で３日間投与することによって行われ、リンパ球枯渇は合計５日間で行われる。
いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇は、シクロホスファミドを約４０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、フルダラビンを約１５ｍｇ／ｍ２／日の用量で３日間投与することによって行われ、シクロホスファミド及びフルダラビンは、両方とも最初の２日間に投与され、リンパ球枯渇は合計３日間で行われる。
いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇は、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で、及びフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与することによって行われ、その後フルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で３日間投与することによって行われる。
いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇は、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で、フルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間、続いてフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で１日間投与することによって行われる。
いくつかの実施形態では、シクロホスファミドは、メスナとともに投与される。いくつかの実施形態では、メスナは、１５ｍｇ／ｋｇで投与される。メスナが注入されるいくつかの実施形態では、連続的に注入される場合、メスナは、約２時間にわたってシクロホスファミドとともに注入することができ（－５日目及び／または－４日目）、次いで、各シクロホスファミド用量と同時に開始する２４時間にわたって残りの２２時間で３ｍｇ／ｋｇ／時間の速度で注入することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬを患者に投与した翌日から開始するＩＬ－２レジメンで患者を治療するステップをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬを患者に投与したのと同じ日に開始するＩＬ－２レジメンで患者を治療するステップをさらに含む。
いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇は、５日間のプレコンディショニング治療を含む。いくつかの実施形態では、日は、－５日から－１日、または０日から４日として示される。いくつかの実施形態では、レジメンは、－５日目及び－４日目（すなわち、０日目及び１日目）にシクロホスファミドを含む。いくつかの実施形態では、レジメンは、－５日目及び－４日目（すなわち、０日目及び１日目）に静脈内シクロホスファミドを含む。いくつかの実施形態では、レジメンは、－５日目及び－４日目（すなわち、０日目及び１日目）に６０ｍｇ／ｋｇの静脈内シクロホスファミドを含む。いくつかの実施形態では、シクロホスファミドは、メスナとともに投与される。いくつかの実施形態では、レジメンは、フルダラビンをさらに含む。いくつかの実施形態では、レジメンは、静脈内フルダラビンをさらに含む。いくつかの実施形態では、レジメンは、２５ｍｇ／ｍ２の静脈内フルダラビンをさらに含む。いくつかの実施形態では、レジメンは、－５日目～－１日目（すなわち、０～４日目）に２５ｍｇ／ｍ２の静脈内フルダラビンをさらに含む。いくつかの実施形態では、レジメンは、－５日目～－１日目（すなわち、０～４日目）に２５ｍｇ／ｍ２の静脈内フルダラビンをさらに含む。
いくつかの実施形態では、非骨髄破壊的リンパ球枯渇レジメンは、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で、フルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、続いてフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間投与するステップを含む。
いくつかの実施形態では、非骨髄破壊的リンパ球枯渇レジメンは、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で、フルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、続いてフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で３日間投与するステップを含む。
いくつかの実施形態では、非骨髄破壊的リンパ球枯渇レジメンは、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、続いてフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間投与するステップを含む。
いくつかの実施形態では、非骨髄破壊的リンパ球枯渇レジメンは、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、続いてフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で３日間投与するステップを含む。
いくつかの実施形態では、非骨髄破壊的リンパ球枯渇レジメンは、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で、フルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、続いてフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で１日間投与するステップを含む。
いくつかの実施形態では、非骨髄破壊的リンパ球枯渇レジメンは、以下の表に従って投与される。
Figure 2024511414000005
２．ＩＬ－２レジメン
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２レジメンは、高用量ＩＬ－２レジメンを含み、高用量ＩＬ－２レジメンは、治療用ＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ集団の治療有効分量を投与した翌日から静脈内投与されるアルデスロイキンまたはそのバイオシミラーもしくはバリアントを含み、アルデスロイキンまたはそのバイオシミラーもしくはバリアントは、最大１４用量で、寛解まで８時間毎に０．０３７ｍｇ／ｋｇまたは０．０４４ｍｇ／ｋｇＩＵ／ｋｇ（患者の体重）の用量で、１５分のボーラス静脈内注入を使用して投与される。９日間の休止後、このスケジュールは、さらに１４用量、合計最大２８用量にわたって繰り返され得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２は、１、２、３、４、５、または６用量で投与される。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２は、最大６用量の最大投与量で投与される。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２レジメンは、デクレッシェンドＩＬ－２レジメンを含む。デクレッシェンドＩＬ－２レジメンは、Ｏ′Ｄａｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９９９，１７，２７５２－６１、及びＥｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，２０００，８８，１７０３－９に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、デクレッシェンドＩＬ－２レジメンは、６時間にわたって静脈内投与される１８×１０６ＩＵ／ｍ２、続いて１２時間にわたって静脈内投与される１８×１０６ＩＵ／ｍ２、続いて２４時間にわたって静脈内投与される１８×１０６ＩＵ／ｍ２、続いて７２時間かけて静脈内投与される４．５×１０６ＩＵ／ｍ２で構成される。この治療サイクルは、２８日毎に最大４サイクル繰り返され得る。いくつかの実施形態では、デクレッシェンドＩＬ－２レジメンは、１日目の１８，０００，０００ＩＵ／ｍ２、２日目の９，０００，０００ＩＵ／ｍ２、３日目及び４日目の４，５００，０００ＩＵ／ｍ２を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２レジメンは、０．１０ｍｇ／日～５０ｍｇ／日の用量で、１、２、４、６、７、１４、または２１日毎にペグ化ＩＬ－２を投与することを含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２レジメンは、抗体骨格に生着されたＩＬ－２断片の投与を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２レジメンは、ＩＬ－２低親和性受容体に結合する抗体－サイトカイン生着タンパク質の投与を含む。いくつかの実施形態では、抗体サイトカイン生着タンパク質は、相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）と、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲに生着されたＩＬ－２分子またはその断片と、を含み、抗体サイトカイン生着タンパク質は、制御性Ｔ細胞よりもＴエフェクター細胞を優先的に拡張させる。いくつかの実施形態では、抗体サイトカイン生着タンパク質は、相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）と、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲに生着されたＩＬ－２分子またはその断片と、を含み、ＩＬ－２分子は変異タンパク質であり、抗体サイトカイン生着タンパク質は、制御性Ｔ細胞よりもＴエフェクター細胞を優先的に拡張させる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２レジメンは、米国特許出願公開第２０２０／０２７０３３４Ａ１号に記載されている抗体の投与を含み、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、抗体サイトカイン生着タンパク質は、相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及びＶＨまたはＶＬのＣＤＲに移植されたＩＬ－２分子またはその断片を含み、ＩＬ－２分子は変異タンパク質であり、抗体サイトカイン生着タンパク質は、制御性Ｔ細胞よりもＴエフェクター細胞を優先的に拡張させ、抗体は、米国特許出願公開第２０２０／０２７０３３４Ａ１号の配列番号６９を含むＩｇＧクラス軽鎖及び米国特許出願公開第２０２０／０２７０３３４Ａ１号の配列番号５３を含むＩｇＧクラス重鎖、ならびに米国特許出願公開第２０２０／０２７０３３４Ａ１号の配列番号３７を含むＩｇＧクラス軽鎖及び米国特許出願公開第２０２０／０２７０３３４Ａ１号の配列番号２１を含むＩｇＧクラス重鎖、ならびに米国特許出願公開第２０２０／０２７０３３４Ａ１号の配列番号６９を含むＩｇＧクラス軽鎖、及び米国特許出願公開第２０２０／０２７０３３４Ａ１号における配列番号２１を含むＩｇＧクラス重鎖、ならびに米国特許出願公開第２０２０／０２７０３３４Ａ１号における配列番号３７を含むＩｇＧクラス軽鎖及び米国特許出願公開第２０２０／０２７０３３４Ａ１号における配列番号５３を含むＩｇＧクラス重鎖からなる群から選択される、ＩｇＧクラス重鎖及びＩｇＧクラス軽鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２分子またはその断片は、ＶＨのＨＣＤＲ１に移植され、ＩＬ－２分子は、変異タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２分子またはその断片は、ＶＨのＨＣＤＲ２に移植され、ＩＬ－２分子は、変異タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２分子またはその断片は、ＶＨのＨＣＤＲ３に移植され、ＩＬ－２分子は、変異タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２分子またはその断片は、ＶＬのＬＣＤＲ１に移植され、ＩＬ－２分子は、変異タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２分子またはその断片は、ＶＬのＬＣＤＲ２に移植され、ＩＬ－２分子は、変異タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２分子またはその断片は、ＶＬのＬＣＤＲ３に移植され、ＩＬ－２分子は、変異タンパク質である。
ＩＬ－２分子の挿入は、ＣＤＲのＮ末端領域もしくはその近く、ＣＤＲの中間領域、またはＣＤＲのＣ末端領域もしくはその近くであり得る。いくつかの実施形態では、抗体サイトカイン移植タンパク質は、ＣＤＲに組み込まれたＩＬ－２分子を含み、ＩＬ２配列はＣＤＲ配列をフレームシフトしない。いくつかの実施形態では、抗体サイトカイン移植タンパク質は、ＣＤＲに組み込まれたＩＬ－２分子を含み、ＩＬ－２配列はＣＤＲ配列のすべてまたは一部を置き換える。ＩＬ－２分子による置き換えは、ＣＤＲのＮ末端領域、ＣＤＲの中間領域、またはＣＤＲのＣ末端領域もしくはその近くであり得る。ＩＬ－２分子による置き換えは、ＣＤＲ配列のわずか１個もしくは２個のアミノ酸、またはＣＤＲ配列全体であり得る。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２分子は、ペプチドリンカーなしで、ＣＤＲ配列とＩＬ－２配列との間に追加のアミノ酸なしで、ＣＤＲに直接的に移植される。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２分子は、ペプチドリンカーを用いて、ＣＤＲ配列とＩＬ－２配列との間に１つ以上の追加のアミノ酸を伴って、ＣＤＲに間接的に移植される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＩＬ－２分子は、ＩＬ－２変異タンパク質である。いくつかの事例では、ＩＬ－２変異タンパク質は、Ｒ６７Ａ置換を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２変異タンパク質は、米国特許出願公開第２０２０／０２７０３３４Ａ１号の配列番号４または配列番号６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２変異タンパク質は、米国特許出願公開第２０２０／０２７０３３４Ａ１号の表１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、抗体サイトカイン生着タンパク質は、米国特許出願公開第２０２０／０２７０３３４Ａ１号の配列番号７、配列番号１０、配列番号１３及び配列番号１６からなる群から選択されるＨＣＤＲ１を含む。いくつかの実施形態では、抗体サイトカイン生着タンパク質は、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３及び配列番号１６からなる群から選択されるＨＣＤＲ１、ならびに米国特許出願公開第２０２０／０２７０３３４Ａ１号の配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、及び配列番号１７からなる群から選択されるＨＣＤＲ２を含む。いくつかの実施形態では、抗体サイトカイン生着タンパク質は、米国特許出願公開第２０２０／０２７０３３４Ａ１号の配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、及び配列番号１６からなる群から選択されるＨＣＤＲ１、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、及び配列番号１７からなる群から選択されるＨＣＤＲ２、及び配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、及び配列番号１８からなる群から選択されるＨＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体サイトカイン生着タンパク質は、米国特許出願公開第２０２０／０２７０３３４Ａ１号の配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体サイトカイン生着タンパク質は、米国特許出願公開第２０２０／０２７０３３４Ａ１号の配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体サイトカイン生着タンパク質は、米国特許出願公開第２０２０／０２７０３３４Ａ１号のＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体サイトカイン生着タンパク質の抗体成分は、免疫グロブリン配列、フレームワーク配列、またはパリビズマブのＣＤＲ配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体サイトカイン生着タンパク質は、アルデスキューキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標））または同等の分子などであるがこれらに限定されない野生型ＩＬ－２分子よりも長い血清半減期を有する。

Figure 2024511414000006
Figure 2024511414000007
Figure 2024511414000008
Figure 2024511414000009
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３．追加の治療方法
他の実施形態では、本発明は、治療上有効な投与量の、上記の前の段落のうちのいずれかに記載の治療的ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ集団を対象に投与することを含む、がんを有する対象を治療するための方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、治療上有効な投与量の、上記の前の段落のうちのいずれかに記載のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ組成物を対象に投与することを含む、がんを有する対象を治療するための方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、それぞれ、治療上有効な投与量の、前の段落のうちのいずれかに記載のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬの治療的集団及びＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ組成物を投与する前に、非非骨髄破壊的リンパ球枯渇レジメンが対象に投与されるように修正された、上記の前の段落のうちのいずれかに記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、非骨髄破壊的リンパ球枯渇レジメンが、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与に続いて、２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間のフルダラビンを投与するステップを含むように修正された、上記の前の段落のうちのいずれかに記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、非骨髄破壊的リンパ球枯渇レジメンが、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量でのシクロホスファミド及び２５ｍｇ／ｍ２／日の用量でのフルダラビンを２日間投与し、次に、２５ｍｇ／ｍ２／日の用量でのフルダラビンを３日間投与するステップを含むように修正された、上記の前の段落のうちのいずれかに記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、非骨髄破壊的リンパ球枯渇レジメンが、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量でのシクロホスファミド及び２５ｍｇ／ｍ２／日の用量でのフルダラビンを２日間投与し、次に、２５ｍｇ／ｍ２／日の用量でのフルダラビンを１日投与するステップを含むように修正された、上記の前の段落のうちのいずれかに記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、非骨髄破壊的リンパ球枯渇レジメンが、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与に続いて、２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で３日間のフルダラビンを投与するステップを含むように修正された、上記の前の段落のうちのいずれかに記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、対象にＴＩＬ細胞を投与した翌日に開始する、高用量のＩＬ－２レジメンで対象を治療するステップをさらに含むように修正された、上記の前の段落のうちのいずれかに記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、高用量ＩＬ－２レジメンが、寛容まで８時間毎に１５分間のボーラス静脈内注入として投与される６００，０００または７２０，０００ＩＵ／ｋｇを含むように修正された、上記の前の段落のうちのいずれかに記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、がんが固形腫瘍であるように修正された、上記の前の段落のうちのいずれかに記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、がんが黒色腫であるように修正された、上記の前の段落のうちのいずれかに記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、がんが小児高頻度変異癌であるように修正された、上記の前の段落のうちのいずれかに記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、治療上有効な投与量の治療的ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏのＴＩＬ集団を対象に投与することを含む、がんを有する対象を治療するための方法で使用するための、上記の前の段落のうちのいずれかに記載のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏのＴＩＬの治療的なＴＩＬ集団を提供する。
他の実施形態では、本発明は、治療上有効な投与量のＴＩＬ組成物を対象に投与することを含む、がんを有する対象を治療するための方法で使用するための、上記の前の段落のうちのいずれかに記載のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ組成物を提供する。
他の実施形態では、本発明は、治療上有効な投与量の、上記の前の段落のいずれかに記載の治療的ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ集団または上記の前の段落のいずれかに記載のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ組成物を対象に投与する前に、非骨髄破壊的リンパ球枯渇レジメンが対象に投与されるように修正された、前の段落のいずれかに記載の治療的ＣＩＳＨｌｏもしくはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ集団または前の段落のいずれかに記載のＣＩＳＨｌｏもしくはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ組成物を提供する。
他の実施形態では、本発明は、非骨髄破壊的リンパ枯渇レジメンが、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与に続いて、２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間のフルダラビンを投与するステップを含むように修正された、上記の前の段落のうちのいずれかに記載の治療的ＣＩＳＨｌｏもしくはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ集団またはＣＩＳＨｌｏもしくはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、非骨髄破壊的リンパ球枯渇レジメンが、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で、及びフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、続いてフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で３日間投与するステップを含むように修正された、上記の前の段落のうちのいずれかに記載の治療的ＣＩＳＨｌｏもしくはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ集団またはＣＩＳＨｌｏもしくはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、非骨髄破壊的リンパ球枯渇レジメンが、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で、及びフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、続いてフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で１日間投与するステップを含むように修正された、上記の前の段落のうちのいずれかに記載の治療的ＣＩＳＨｌｏもしくはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ集団またはＣＩＳＨｌｏもしくはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、非骨髄破壊的リンパ枯渇レジメンが、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与に続いて、２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で３日間フルダラビンを投与するステップを含むように修正された、上記の前の段落のうちのいずれかに記載の治療的ＣＩＳＨｌｏもしくはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ集団またはＣＩＳＨｌｏもしくはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ組成物を提供する。
他の実施形態では、本発明は、ＴＩＬ細胞を患者に投与した翌日から開始する、高用量ＩＬ－２レジメンで患者を治療するステップをさらに含むように修正された、上記の前の段落のうちのいずれかに記載の治療的ＣＩＳＨｌｏもしくはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ集団またはＣＩＳＨｌｏもしくはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ組成物を提供する。
他の実施形態では、本発明は、高用量ＩＬ－２レジメンが、寛容までに毎日８時間、１５分間のボーラス静脈内注入として投与される６０００００または７２００００ＩＵ／ｋｇを含むように修正された、上記の前の段落のうちのいずれかに記載の治療的ＣＩＳＨｌｏもしくはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ集団またはＣＩＳＨｌｏもしくはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ組成物を提供する。
他の実施形態では、本発明は、がんが固形腫瘍であるように修正された、上記の前の段落のうちのいずれかに記載の治療的ＣＩＳＨｌｏもしくはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ集団またはＣＩＳＨｌｏもしくはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ組成物を提供する。
他の実施形態では、本発明は、がんが黒色腫であるように修正された、上記の前の段落のうちのいずれかに記載の治療的ＣＩＳＨｌｏもしくはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ集団またはＣＩＳＨｌｏもしくはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ組成物を提供する。
他の実施形態では、本発明は、がんが高頻度変異がんであるように修正された、上記の前の段落のうちのいずれかに記載の治療的ＣＩＳＨｌｏもしくはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ集団またはＣＩＳＨｌｏもしくはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ組成物を提供する。
他の実施形態では、本発明は、がんが小児高頻度変異がんであるように修正された、上記の前の段落のうちのいずれかに記載の治療的ＣＩＳＨｌｏもしくはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ集団またはＣＩＳＨｌｏもしくはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ組成物を提供する。
他の実施形態では、本発明は、治療上有効な投与量の治療的ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ集団を対象に投与することを含む、対象におけるがんを治療する方法における上記の前の段落のうちのいずれかに記載の治療的ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ集団の使用を提供する。
他の実施形態では、本発明は、治療上有効な投与量のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ組成物を対象に投与することを含む、対象におけるがんを治療する方法における上記の前の段落のうちのいずれかに記載のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ組成物の使用を提供する。
他の実施形態では、本発明は、非骨髄破壊的リンパ球枯渇レジメンを対象に投与することと、次いで、上記のいずれかに記載の治療上有効な投与量の治療的ＣＩＳＨｌｏもしくはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ集団または上記のいずれかに記載の治療上有効な投与量のＣＩＳＨｌｏもしくはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ組成物を対象に投与することと、を含む、対象におけるがんを治療する方法における、上記の前の段落いずれかに記載の治療的ＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ集団または上記の前の段落いずれかに記載のＣＩＳＨｌｏまたはＣＩＳＨｌｏ／ＰＤ－１ｌｏＴＩＬ組成物の使用を提供する。
本明細書に包含される実施形態は、これから以下の実施例を参照して説明される。これらの実施例は、例示のみを目的として提供されており、本明細書に包含される本開示は、決してこれらの実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変形を包含すると解釈されるべきである。
実施例１：ＣＩＳＨノックアウトを有するＴＩＬの調製
この実施例は、ＣＩＳＨノックアウトを有する腫瘍浸潤リンパ球（ＣＩＳＨ ＫＯ ＴＩＬ）の調製のための手順を説明する。この培地を、本出願及び実施例に記載の任意のＴＩＬの調製に使用することができる。
ＣＩＳＨ ＫＯ ＴＩＬ拡張のプロトコル
拡張前の設定：ｐｒｅ－ＲＥＰ培養物を、１１日間、ＩＬ－２を含むＣＭ１中のＧ－ＲＥＸ１０フラスコあたり６～８個の腫瘍断片から開始した。ｐｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬを、バイアルあたり３５ｅ６細胞でＣＳ１０凍結培地中で凍結保存し、使用まで－８０℃で保った。
拡張前ＴＩＬ解凍：ＴＩＬを凍結保存した例示的な場合において、凍結保存したＴＩＬを解凍し、２４ウェルプレート中のウェルあたり２ｅ６個の細胞で、ＩＬ－２（３０００ＩＵ／ｍＬ）を含有するＣＭ１中で２日間静置した。
Ｔ細胞活性化：３００ｎｇ／ｍｌの濃度のプレート結合抗ＣＤ３で、細胞をさらに２日間活性化した。
エレクトロポレーション：ＴＩＬを、ＣＩＳＨ ＴＡＬＥＮコードｍＲＮＡ、ＰＤ－１ＴＡＬＥＮコードｍＲＮＡ、ＣＩＳＨ ＴＡＬＥＮコードｍＲＮＡ＋ＰＤ－１ＴＡＬＥＮコードｍＲＮＡをエレクトロポレーションした、またはエレクトロポレーションしなかった。各エレクトロポレーションについて、１００万の活性化ＴＩＬを、Ｃｙｔｏｐｏｒａｔｉｏｎ緩衝液Ｔ４で２回洗浄した。各アームについて４μｇのＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡを含有する５０μｌのＣｙｔｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｔ４緩衝液に細胞を再懸濁した。細胞を１ｍｍギャップのエレクトロポレーションキュベットに移送し、ＢＴＸ ＡｇｉｌｅＰｕｌｓｅを使用してエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの直後に、細胞を１ｍｌのＣＭ１培地に再懸濁し、２４ウェルプレートウェルに播種した。細胞を３７°Ｃで１時間インキュベートし、続いて３０°Ｃで１５時間インキュベートした。
拡張：非エレクトロポレーション及びＣＩＳＨ ＫＯ ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡエレクトロポレーションＴＩＬ（１ｅ５細胞）を、ＯＫＴ３（３０ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、ＩＬ－２（６０００ＩＵ／ｍｌ、ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）及び照射されたＰＢＭＣ（３０ｅ６細胞）で１１日間培養することによって、急速拡張プロトコル（ＲＥＰ）を使用して拡張させた。
拡張後ＴＩＬ採取：細胞を採取し、以下のように処理した。
抗ＣＤ３で一晩再刺激してから、拡張後のＴＩＬを、ウェスタンブロット分析によりＣＩＳＨタンパク質について、及び／またはフローサイトメトリーによりＰＤ－１発現について評価した。ＮＥ＝非エレクトロポレーション。ＣＩＳＨタンパク質を過剰発現する２９３Ｔ細胞を陽性対照として使用した。相対的な倍率変化の計算にウェスタンブロット分析からの濃度測定データを使用した。ベースライン計算にＮＥを使用した。
Figure 2024511414000011
実験で使用されるＣＩＳＨ ＫＯ ＴＡＬＥＮコード配列及びＣＩＳＨ遺伝子におけるその対応する切断部位の説明は、以下の表７に提供される。

Figure 2024511414000012
Figure 2024511414000013
Figure 2024511414000014
Figure 2024511414000015
Figure 2024511414000016
Figure 2024511414000017
実験において使用されたＰＤ－１ ＫＯ ＴＡＬＥＮ及びＰＤ－１遺伝子におけるその対応する切断部位の説明を、以下の表８に提供する。

Figure 2024511414000018
Figure 2024511414000019
Figure 2024511414000020
Figure 2024511414000021
Figure 2024511414000022
Figure 2024511414000023
実験結果
それぞれ、シングルＣＩＳＨ ＫＯの効率は７５％、ダブルＣＩＳＨ ＫＯの効率は４０％であった（図２）。抗ＣＤ３で一晩再刺激してから、拡張後のＴＩＬを、ウェスタンブロット分析によってＣＩＳＨタンパク質について評価した。ＮＥ＝非エレクトロポレーション、＋Ｃｔｒｌ＝ＣＩＳＨタンパク質を過剰発現する２９３Ｔ細胞、ウェスタンブロット分析からの密度測定データを相対的な倍率変化の計算に使用し、ＮＥをベースライン計算に使用した。
ＰＤ－１ ＫＯ効率は、ダブルＣＩＳＨ／ＰＤ－１ ＫＯ ＴＩＬで５０～７５％の範囲であった（図３）。拡張後のＴＩＬを、フローサイトメトリーによってＰＤ－１発現について評価する前に、抗ＣＤ３で一晩再刺激した。ＫＯ効率の負値は、ＰＤ－１発現の増加を示す。
ＣＩＳＨ ＫＯ ＴＩＬの拡張倍率は、対照と比較して減少した（図４）。拡張後ＴＩＬを計数し、細胞生存率について評価した。拡張倍率を、拡張後のＴＩＬの総細胞数を拡張の０日目に播種された細胞数で割ることによって計算した。
Ｔ細胞系統及び記憶サブセットに関するＣＩＳＨ ＫＯ ＴＩＬの表現型は、非エレクトロポレーション対照と同等であった（図５）。拡張後ＴＩＬを、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、及びＣＣＲ７について染色した。細胞をＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）で取得し、ＦｌｏｗＪｏで分析した。
分化及び活性化／枯渇の観点から、ＣＩＳＨ ＫＯ ＴＩＬの表現型は、非エレクトロポレーション対照と同等であった（図６）。拡張後のＴＩＬを、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５６、ＤＮＡＭ、ＴＩＧＩＴ、及びＴＩＭ－３について染色した。細胞をＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）で取得し、ＦｌｏｗＪｏで分析した。
実施例２：ＣＩＳＨノックアウト効率
実験設計
９対のＣＩＳＨノックアウト及び非エレクトロポレーションＴＩＬから単離されたゲノムＤＮＡを、ＰＣＲを使用して、フォワードプライマー及びリバースプライマー（ＣＩＳＨ－Ｆ１及びＣＩＳＨ－ＲＩ）で増幅した。
ＰＣＲ産物を、ＮＧＳ配列決定によって分析した。
ＣＲＩＳＰｒｅｓｓｏ ２を使用してデータ分析を実行した。
プライマー、切断部位、及びＣＩＳＨ配列
ＣＩＳＨフォワードプライマー－ＣＴＧＣＡＣＴＧＣＴＧＡＴＡＣＣＣＧＡＡ（配列番号１７３）
ＣＩＳＨリバースプライマー－ＧＧＧＧＴＡＣＴＧＴＣＧＧＡＧＧＴＡＧＴ（配列番号１７４）
切断部位：ＴＧＣＧＣＣＴＡＧＴＧＡＣＣＣＡＧＣＡＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＧＣＣＡＣＴＧＣＴＧＴＡ（配列番号１６８）
ＣＩＳＨ標的部位配列：
Figure 2024511414000024
３つの下線付き領域は、ＣＩＳＨ配列上の特定の位置に対応する。

Figure 2024511414000025
上記の実施例は、当業者に対して、本発明の組成物、システム及び方法の実施形態の作製方法及び使用方法の完全な開示及び説明を提供するために提示されており、本発明者らが自身の発明とみなすものの範囲を限定することを意図しない。当業者に明らかな、本発明を実施するための上記のモードの修正は、添付の特許請求の範囲内にあることを意図している。本明細書で言及するすべての特許及び刊行物は、本発明が属する分野の当業者のレベルを示す。
すべての見出し及びセクションの指定は、明確化及び参照の目的のみのために使用されており、いかなる方法でも限定するものとしてみなされない。例えば、当業者は、本明細書に記載の本発明の趣旨及び範囲に従って異なる見出し及びセクションから様々な態様を適宜組み合わせることの有用性を理解する。
本明細書で引用されたすべての参考文献は、各個々の刊行物または特許もしくは特許出願がすべての目的のためにその全体が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度にすべての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
当業者に明らかであるように、本出願の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本出願の多くの修正及び変形が加えられてもよい。本明細書に記載の特定の実施形態及び実施例はほんの一例として提供されており、本出願は、特許請求の範囲が権利を与えられる等価物の全範囲に加えて、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定されるべきである。

Claims (76)

  1. ＣＩＳＨ及び任意選択でＰＤ－１の低減された発現を含む、遺伝子修飾腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を調製する方法であって、
    （ａ）ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化することができる１つ以上の第１の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）をコードする核酸（複数可）を、前記ＴＩＬに導入することであって、前記１つ以上の第１のＴＡＬＥヌクレアーゼが、配列番号１７５の核酸配列を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含む、前記導入すること、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断することによって選択的に不活性化することができる１つ以上の第２のＴＡＬＥヌクレアーゼを導入することと、
    （ｂ）前記ＴＩＬを拡張することと、を含む、前記方法。
  2. 前記１つ以上の第１のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードする核酸（複数可）を前記ＴＩＬ内に導入することが、エレクトロポレーションステップを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記１つ以上の第１のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードする前記核酸（複数可）がＲＮＡであり、前記ＲＮＡがエレクトロポレーションによって前記ＴＩＬに導入される、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記方法が、前記導入するステップの前に、前記ＴＩＬをＯＫＴ－３の存在下、細胞培養培地中で約１～３日間培養することによって、前記ＴＩＬを活性化するステップをさらに含む、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記方法が、前記導入するステップの後、及び前記拡張するステップの前に、ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で前記ＴＩＬを約１日間静置するステップをさらに含む、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 前記方法が、前記導入するステップの前に、前記ＴＩＬを凍結保存し、その後、解凍し、前記ＴＩＬを、ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で約１～３日間培養するステップをさらに含む、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
  7. 前記静置するステップにおける前記ＩＬ－２が、約３０００ＩＵ／ｍｌの濃度である、請求項５または６に記載の方法。
  8. 前記１つ以上の第１のＴＡＬＥヌクレアーゼが、それぞれ、第１の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼ及び第２の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼによって構成される、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
  9. 前記第１の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼが、第１のヌクレアーゼ触媒ドメインに融合した第１のＴＡＬＥ核酸結合ドメインで構成される第１の融合タンパク質であり、前記第２の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼが、第２のヌクレアーゼ触媒ドメインに融合した第２のＴＡＬＥ核酸結合ドメインで構成される第２の融合タンパク質である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記第１のＴＡＬＥ核酸結合ドメインが、第１のアミノ酸配列を有し、前記第２のＴＡＬＥ核酸結合ドメインが、第２のアミノ酸配列を有し、前記第１のアミノ酸配列が、前記第２のアミノ酸配列とは異なる、請求項９に記載の方法。
  11. 前記第１のヌクレアーゼ触媒ドメインが、第１のアミノ酸配列を有し、前記第２のヌクレアーゼ触媒ドメインが、第２のアミノ酸配列を有し、前記第１のアミノ酸配列が、前記第２のアミノ酸配列と同じである、請求項９または１０に記載の方法。
  12. 前記第１のヌクレアーゼ触媒ドメイン及び前記第２のヌクレアーゼ触媒ドメインが、両方とも、Ｆｏｋ－Ｉのアミノ酸配列を有する、請求項９～１１のいずれかに記載の方法。
  13. 前記第１の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼ及び前記第２の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼが、ヘテロ二量体ＤＮＡ切断複合体を形成して、前記ＣＩＳＨをコードする遺伝子内の前記標的部位でＤＮＡ切断を行うことができ、前記ＣＩＳＨをコードする遺伝子内の前記標的部位が、配列番号１７５の核酸配列を含む、請求項８～１２のいずれかに記載の方法。
  14. 前記第１の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼが、前記ＣＩＳＨをコードする遺伝子の前記標的部位内の第１の位置に位置する第１の半分の標的を認識し、前記第２の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼが、前記第１の位置と重複しない前記ＣＩＳＨをコードする遺伝子の前記標的部位内の第２の位置に位置する第２の半分の標的を認識する、請求項８～１３のいずれかに記載の方法。
  15. 前記ＴＡＬＥヌクレアーゼが、配列番号１６５及び配列番号１６７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９７．５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１４のいずれかに記載の方法。
  16. 前記ＴＡＬＥヌクレアーゼが、配列番号１６５及び配列番号１６７からなる群から選択される配列を含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記第１の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼが、配列番号１６５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９７．５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する前記アミノ酸配列を含み、前記第２の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼが、配列番号１６７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９７．５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する前記アミノ酸配列を含む、請求項８～１５のいずれかに記載の方法。
  18. 前記第１の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼが、配列番号１６５のアミノ酸配列を含み、前記第２の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼが、配列番号１６７のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記拡張されたＴＩＬが、治療上有効な投与量の前記ＴＩＬを、それを必要とする対象に投与するのに十分なＴＩＬを含む、請求項１～１８のいずれかに記載の方法。
  20. 前記拡張されたＴＩＬの前記治療上有効な投与量が、約１×１０９～約９×１０１０個のＴＩＬを含む、請求項１９に記載の方法。
  21. ＣＩＳＨ及び任意選択でＰＤ－１の、低減された発現を含む拡張された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団であって、前記拡張されたＴＩＬの集団が、請求項１～２０のいずれかに記載の方法によって得ることができる、前記集団。
  22. ＣＩＳＨをコードする遺伝子の標的部位でＤＮＡ切断を認識し、その結果をもたらす転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）であって、配列番号１６５及び配列番号１６７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９７．５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記ＴＡＬＥヌクレアーゼ。
  23. 前記ＴＡＬＥヌクレアーゼが、配列番号１６５及び配列番号１６７からなる群から選択される配列を含む、請求項２２に記載のＴＡＬＥヌクレアーゼ。
  24. 前記ＴＡＬＥヌクレアーゼが、第１の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼ及び第２の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼによって構成され、前記第１の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼが、配列番号１６５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９７．５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼが、配列番号１６７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９７．５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載のＴＡＬＥヌクレアーゼ。
  25. 前記第１の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼが、配列番号１６５のアミノ酸配列を含み、前記第２の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼが、配列番号１６７のアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載のＴＡＬＥヌクレアーゼ。
  26. 前記第１の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼが、第１のヌクレアーゼ触媒ドメインに融合された第１のＴＡＬＥ核酸結合ドメインによって構成される第１の融合タンパク質であり、前記第２の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼが、第２のヌクレアーゼ触媒ドメインに融合された第２のＴＡＬＥ核酸結合ドメインによって構成される第２の融合タンパク質である、請求項２４または２５に記載のＴＡＬＥヌクレアーゼ。
  27. 前記第１のＴＡＬＥ核酸結合ドメインが、第１のアミノ酸配列を有し、前記第２のＴＡＬＥ核酸結合ドメインが、第２のアミノ酸配列を有し、前記第１のアミノ酸配列が、前記第２のアミノ酸配列とは異なる、請求項２６に記載のＴＡＬＥヌクレアーゼ。
  28. 前記第１のヌクレアーゼ触媒ドメインが、第１のアミノ酸配列を有し、前記第２のヌクレアーゼ触媒ドメインが、第２のアミノ酸配列を有し、前記第１のアミノ酸配列が、前記第２のアミノ酸配列と同じである、請求項２６または２７に記載のＴＡＬＥヌクレアーゼ。
  29. 前記第１のヌクレアーゼ触媒ドメイン及び前記第２のヌクレアーゼ触媒ドメインの両方が、Ｆｏｋ－Ｉのアミノ酸配列を有する、請求項２６～２８のいずれかに記載のＴＡＬＥヌクレアーゼ。
  30. 前記第１の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼ及び前記第２の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼが、ヘテロ二量体ＤＮＡ切断複合体を形成して、前記ＣＩＳＨをコードする遺伝子の前記標的部位でＤＮＡ切断を行うことができ、前記標的部位が、配列番号１７５の核酸配列を含む、請求項２４～２９のいずれかに記載のＴＡＬＥヌクレアーゼ。
  31. 前記第１の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼが、前記ＣＩＳＨをコードする遺伝子の前記標的部位内の第１の位置に位置する第１の半分の標的を認識し、前記第２の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼが、前記第１の位置と重複しない前記ＣＩＳＨをコードする遺伝子の前記標的部位内の第２の位置に位置する第２の半分の標的を認識する、請求項２４～３０のいずれかに記載のＴＡＬＥヌクレアーゼ。
  32. 遺伝子修飾腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を、ＣＩＳＨ及び任意選択でＰＤ－１の発現の低減を含む治療的なＴＩＬ集団に拡張するための方法であって、前記方法が、
    （ａ）対象から取得された腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することによって、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を取得する、及び／または受け取ることと、
    （ｂ）前記第１のＴＩＬ集団を閉鎖系に添加することと、
    （ｃ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で、前記第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行うことであって、前記第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、前記第１の拡張が、約３～１４日間行われて第２のＴＩＬ集団を取得し、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、前記系を開放することなく起こる、前記第１の拡張を行うことと、
    （ｄ）ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化することができる１つ以上の第１の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）をコードする核酸（複数可）を、前記ＴＩＬに導入することであって、前記１つ以上の第１のＴＡＬＥヌクレアーゼが、前記ＣＩＳＨをコードする遺伝子中の標的部位を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含み、前記標的部位が、配列番号１７５の核酸配列を含み、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断することによって選択的に不活性化することができる１つ以上の第２のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードする核酸（複数可）を、前記ＴＩＬに導入する、前記導入することと、
    （ｅ）ステップ（ｄ）から得られた前記ＴＩＬを、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で培養することによって第２の拡張を実施して、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、前記第２の拡張が、約７～１４日間行われることにより前記第３のＴＩＬ集団を取得し、前記第３のＴＩＬ集団が、治療的なＴＩＬ集団であり、前記第２の拡張が、第２のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われる、前記第３のＴＩＬ集団を産生することと、
    （ｆ）ステップ（ｅ）から取得された前記治療的なＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行が、前記系を開放することなく起こる、前記採取することと、
    （ｇ）ステップ（ｆ）からの前記採取されたＴＩＬ集団を注入バッグに移送することであって、ステップ（ｆ）から（ｇ）への移送が、前記系を開放することなく起こる、前記移送することと、を含む、前記方法。
  33. 遺伝子修飾腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を、ＣＩＳＨ及び任意選択でＰＤ－１の発現の低減を含む治療的なＴＩＬ集団に拡張するための方法であって、前記方法が、
    （ａ）対象から取得された腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することによって、前記対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を取得することと、
    （ｂ）前記腫瘍断片を閉鎖系に添加することと、
    （ｃ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で前記第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行い、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、前記第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、前記第１の拡張が、約３～１１日間行われることにより前記第２のＴＩＬ集団を取得し、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、前記系を開放することなく起こる、前記第２のＴＩＬ集団を産生することと、
    （ｄ）ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化することができる１つ以上の第１の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）をコードする核酸（複数可）を、前記ＴＩＬに導入することであって、前記１つ以上の第１のＴＡＬＥヌクレアーゼが、前記ＣＩＳＨをコードする遺伝子中の標的部位を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含み、前記標的部位が、配列番号１７５の核酸配列を含み、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断することによって選択的に不活性化することができる１つ以上の第２のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードする核酸（複数可）を、前記ＴＩＬに導入する、前記導入することと、
    （ｅ）ステップ（ｄ）から得られたＴＩＬを、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で培養することによって第２の拡張を実施して、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、前記第２の拡張が、約７～１１日間行われて前記第３のＴＩＬ集団を取得し、前記第３のＴＩＬ集団が、治療的なＴＩＬ集団であり、前記第２の拡張が、第２のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われる、前記第３のＴＩＬ集団を産生することと、
    （ｆ）ステップ（ｅ）から取得された前記治療的なＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行が、前記系を開放することなく起こる、前記採取することと、
    （ｇ）ステップ（ｆ）からの採取された前記治療的なＴＩＬ集団を注入バッグに移送することであって、ステップ（ｆ）から（ｇ）への移送が、前記系を開放することなく起こる、前記移送することと、を含む、前記方法。
  34. 遺伝子修飾腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を、ＣＩＳＨ及び任意選択でＰＤ－１の発現の低減を含む治療的なＴＩＬ集団に拡張するための方法であって、前記方法が、
    （ａ）対象の黒色腫からの腫瘍及びＴＩＬ細胞との混合物を含有する試料を取得するために、外科的切除、針生検、コア生検、小生検、または他の手段から第１のＴＩＬ集団を取得及び／または受け取ることと、
    （ｂ）前記第１のＴＩＬ集団を閉鎖系に添加することと、
    （ｃ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で前記第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行い、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、前記第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、前記第１の拡張が、約３～１４日間行われることにより前記第２のＴＩＬ集団を取得し、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、前記系を開放することなく起こる、前記第２のＴＩＬ集団を産生することと、
    （ｄ）ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化することができる１つ以上の第１の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）をコードする核酸（複数可）を、前記ＴＩＬに導入することであって、前記１つ以上の第１のＴＡＬＥヌクレアーゼが、前記ＣＩＳＨをコードする遺伝子中の標的部位を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含み、前記標的部位が、配列番号１７５の核酸配列を含み、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断することによって選択的に不活性化することができる１つ以上の第２のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードする核酸を、前記ＴＩＬに導入する、前記導入することと、
    （ｅ）ステップ（ｄ）から得られた前記ＴＩＬを、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で培養することによって第２の拡張を実施して、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、前記第２の拡張が、約７～１４日間行われて前記第３のＴＩＬ集団を取得し、前記第３のＴＩＬ集団が、治療的なＴＩＬ集団であり、前記第２の拡張が、第２のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われる、前記第３のＴＩＬ集団を産生することと、
    （ｆ）ステップ（ｅ）から取得された前記治療的なＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行が、前記系を開放することなく起こる、前記採取することと、
    （ｇ）ステップ（ｆ）からの採取された前記治療的なＴＩＬ集団を注入バッグに移送することであって、ステップ（ｆ）から（ｇ）への移送が、前記系を開放することなく起こる、前記移送することと、を含む、前記方法。
  35. 遺伝子修飾腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を、ＣＩＳＨ及び任意選択でＰＤ－１の発現の低減を含む治療的なＴＩＬ集団内に拡張するための方法であって、前記方法が、
    （ａ）対象から腫瘍を切除することであって、前記腫瘍が、腫瘍及びＴＩＬ細胞との混合物を含有する試料を取得するための、任意選択で、外科的切除、針生検、コア生検、小生検、または他の手段からの、第１のＴＩＬ集団を含む、前記切除することと、
    （ｂ）前記腫瘍の断片を閉鎖系に添加することと、
    （ｃ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で前記第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行い、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、前記第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、前記第１の拡張が、約３～１１日間行われることにより前記第２のＴＩＬ集団を取得し、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、前記系を開放することなく起こる、前記第２のＴＩＬ集団を産生することと、
    （ｄ）ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化することができる１つ以上の第１の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）をコードする核酸（複数可）を、前記ＴＩＬに導入することであって、前記１つ以上の第１のＴＡＬＥヌクレアーゼが、前記ＣＩＳＨをコードする遺伝子中の標的部位を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含み、前記標的部位が、配列番号１７５の核酸配列を含む、前記導入すること、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断することによって選択的に不活性化することができる１つ以上の第２のＴＡＬＥヌクレアーゼを導入することと、
    （ｅ）ステップ（ｄ）から得られた前記ＴＩＬを、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で培養することによって第２の拡張を実施して、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、前記第２の拡張が、約７～１１日間行われて前記第３のＴＩＬ集団を取得し、前記第３のＴＩＬ集団が、治療的なＴＩＬ集団であり、前記第２の拡張が、第２のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われる、前記第３のＴＩＬ集団を産生することと、
    （ｆ）ステップ（ｅ）から取得された前記第３のＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行が、前記系を開放することなく起こる、前記採取することと、
    （ｇ）ステップ（ｆ）からの採取された前記第３のＴＩＬ集団を注入バッグに移送することであって、ステップ（ｆ）から（ｇ）への移送が、前記系を開放するとなく起こる、前記移送することと、を含む、前記方法。
  36. 遺伝子修飾腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を、ＣＩＳＨ及び任意選択でＰＤ－１の発現の低減を含む治療的なＴＩＬ集団内に拡張するための方法であって、前記方法が、
    （ａ）対象から取得された腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することによって、前記対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を取得することと、
    （ｂ）前記腫瘍断片を閉鎖系に添加することと、
    （ｃ）ＩＬ－２、及び任意選択によりＯＫＴ－３を含む細胞培養培地中で前記第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行い、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、前記第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、前記第１の拡張が、約３～１４日間行われて前記第２のＴＩＬ集団を取得し、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、前記系を開放することなく起こる、前記第２のＴＩＬ集団を産生することと、
    （ｄ）ＣＩＳＨをコードする遺伝子をＤＮＡ切断によって選択的に不活性化することができる１つ以上の第１の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）をコードする核酸（複数可）を、前記ＴＩＬに導入することであって、前記１つ以上の第１のＴＡＬＥヌクレアーゼが、前記ＣＩＳＨをコードする遺伝子中の標的部位を対象とするＴＡＬＥヌクレアーゼを含み、前記標的部位が、配列番号１７５の核酸配列を含む、前記導入することと、及び任意選択で、ＰＤ－１をコードする遺伝子をＤＮＡ切断することによって選択的に不活性化することができる１つ以上の第２のＴＡＬＥヌクレアーゼを導入することと、
    （ｅ）ステップ（ｄ）から得られたＴＩＬを、ＩＬ－２、任意選択によりＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で培養することによって第２の拡張を実施して、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、前記第２の拡張が、約４～６日間行われて、前記第３のＴＩＬ集団を取得し、前記第３のＴＩＬ集団が、治療的なＴＩＬ集団であり、前記第２の拡張が、第２のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われる、前記第３のＴＩＬ集団を産生することと、
    （ｅ）前記第３のＴＩＬ集団を、第１の複数の２～５のＴＩＬ亜集団に分割することであって、少なくとも１．０×１０９個のＴＩＬが各亜集団に存在し、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行が、前記系を開放することなく起こる、前記分割することと、
    （ｆ）前記各ＴＩＬ亜集団の細胞培養培地を追加のＩＬ－２、任意選択によりＯＫＴ－３で補充することによって、前記第１の複数のＴＩＬ亜集団の第３の拡張を行い、第２の複数のＴＩＬ亜集団を産生することであって、前記第３の拡張が、約５～７日間行われ、各亜集団の前記第３の拡張が、第３のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行が、前記系を開放することなく起こる、前記第２の複数のＴＩＬのサブ集団を産生することと、
    （ｇ）ステップ（ｆ）から取得された前記第２の複数のＴＩＬ亜集団を採取することと、
    （ｈ）ステップ（ｇ）からの採取された前記ＴＩＬ亜集団を１つ以上の注入バッグに移送することであって、ステップ（ｇ）から（ｈ）への移行である、前記移送することと、を含む、前記方法。
  37. 凍結保存プロセスを使用して、前記採取されたＴＩＬを凍結保存するステップをさらに含む、請求項３２～３６のいずれかに記載の方法。
  38. 前記１つ以上の第１のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードする前記核酸（複数可）が、ＲＮＡである、請求項３２～３７のいずれかに記載の方法。
  39. 前記１つ以上の第１のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードする前記核酸（複数可）を導入することが、エレクトロポレーションによって前記ＴＩＬに導入される、請求項３２～３８のいずれかに記載の方法。
  40. 前記方法が、前記導入するステップの前に、前記ＴＩＬをＯＫＴ－３の存在下で約１～３日間細胞培養培地中で培養することによって、前記ＴＩＬを活性化するステップをさらに含む、請求項３２～３９のいずれかに記載の方法。
  41. 前記ＯＫＴ－３が約３００ｎｇ／ｍｌの濃度である、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記方法が、前記導入するステップの後、及び前記第２の拡張するステップの前に、前記ＴＩＬを、ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で約１日間静置するステップをさらに含む、請求項３２～４１のいずれかに記載の方法。
  43. 前記静置するステップにおける前記ＩＬ－２が、約３０００ＩＵ／ｍｌの濃度である、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記方法が、前記ＴＩＬを凍結保存し、続いて、解凍し、前記ＴＩＬを、ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で約１～３日間培養することをさらに含む、請求項３２～４３のいずれかに記載の方法。
  45. 前記ステップ（ａ）～（ｇ）が、約１３日～約２９日間、任意選択により約１５日間、約１６日間、約１７日間、約１８日間、約１９日間、約２０日間、約２１日間、約２２日間、約２３日間、約２４日間、または約２５日間で行われる、請求項３２～４４のいずれかに記載の方法。
  46. 前記１つ以上の第１のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードする前記核酸（複数可）が、ＲＮＡであり、前記ＲＮＡが、エレクトロポレーションによって前記ＴＩＬに導入される、請求項３２～４５のいずれかに記載の方法。
  47. 前記１つ以上の第１のＴＡＬＥヌクレアーゼが、それぞれ、第１の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼ及び第２の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼによって構成される、請求項３２～４６のいずれかに記載の方法。
  48. 前記第１の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼが、第１のヌクレアーゼ触媒ドメインに融合した第１のＴＡＬＥ核酸結合ドメインで構成される第１の融合タンパク質であり、前記第２の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼが、第２のヌクレアーゼ触媒ドメインに融合した第２のＴＡＬＥ核酸結合ドメインで構成される第２の融合タンパク質である、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記第１のＴＡＬＥ核酸結合ドメインが、第１のアミノ酸配列を有し、前記第２のＴＡＬＥ核酸結合ドメインが、第２のアミノ酸配列を有し、前記第１のアミノ酸配列が、前記第２のアミノ酸配列とは異なる、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記第１のヌクレアーゼ触媒ドメインが、第１のアミノ酸配列を有し、前記第２のヌクレアーゼ触媒ドメインが、第２のアミノ酸配列を有し、前記第１のアミノ酸配列が、前記第２のアミノ酸配列と同じである、請求項４８または４９に記載の方法。
  51. 前記第１のヌクレアーゼ触媒ドメイン及び前記第２のヌクレアーゼ触媒ドメインが、両方とも、Ｆｏｋ－Ｉのアミノ酸配列を有する、請求項４８～５０のいずれかに記載の方法。
  52. 前記第１の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼ及び前記第２の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼが、ヘテロ二量体ＤＮＡ切断複合体を形成して、前記標的部位でＤＮＡ切断を行うことができる、請求項４７～５１のいずれかに記載の方法。
  53. 前記第１の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼが、前記標的部位内の第１の位置に位置する第１の半分の標的を認識し、前記第２の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼが、前記第１の位置と重複しない前記標的部位内の第２の位置に位置する第２の半分の標的を認識する、請求項４７～５２のいずれかに記載の方法。
  54. 前記ＴＡＬＥヌクレアーゼが、配列番号１６５及び配列番号１６７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９７．５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記ＴＡＬＥヌクレアーゼが、配列番号１６５及び配列番号１６７からなる群から選択される配列を含む、請求項５３または５４に記載の方法。
  56. 前記第１の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼが、配列番号１６５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９７．５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する前記アミノ酸配列を含み、前記第２の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼが、配列番号１６７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９７．５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する前記アミノ酸配列を含む、請求項５３または５４に記載の方法。
  57. 前記第１の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼが、配列番号１６５のアミノ酸配列を含み、前記第２の半分のＴＡＬＥヌクレアーゼが、配列番号１６７のアミノ酸配列を含む、請求項５６に記載の方法。
  58. 採取された前記ＴＩＬが、治療上有効な投与量の前記ＴＩＬを、それを必要とする対象に投与するのに十分なＴＩＬを含む、請求項３２～５７のいずれかに記載の方法。
  59. 前記ＴＩＬの前記治療上有効な投与量が、約１×１０９～約９×１０１０個のＴＩＬを含む、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記ＡＰＣが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む、請求項３２～５９のいずれかに記載の方法。
  61. 前記ＰＢＭＣが、約１：２５のＴＩＬ：ＰＢＭＣの比率で補充される、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記治療的なＴＩＬ集団が、前記対象に投与されたときに、増加した有効性、増加したインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）産生、増加したポリクローン性、増加した平均ＩＰ－１０、及び／または増加した平均ＭＣＰ－１を提供する、請求項３２～６１のいずれかに記載の方法。
  63. 前記ＩＬ－２が、前記第１の拡張において、前記細胞培養培地中に１０００ＩＵ／ｍＬ～６０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で存在する、請求項３２～３６のいずれかに記載の方法。
  64. 前記第２の拡張ステップにおいて、前記ＩＬ－２が、１０００ＩＵ／ｍＬ～６０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で存在し、前記ＯＫＴ－３抗体が、約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度で存在する、請求項３２～３６のいずれかに記載の方法。
  65. 前記第２及び／または第３の拡張ステップにおいて、前記ＩＬ－２が、１０００ＩＵ／ｍＬ～６０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で存在し、任意選択で、前記ＯＫＴ－３抗体が、約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度で存在する、請求項３６に記載の方法。
  66. 前記第１の拡張が、ガス透過性容器を使用して行われる、請求項３２～３６のいずれかに記載の方法。
  67. 前記第２の拡張が、ガス透過性容器を使用して行われる、請求項３２～３５のいずれか１項に記載の方法。
  68. 前記第２及び／または第３の拡張が、ガス透過性容器を使用して行われる、請求項３６に記載の方法。
  69. 前記第１の細胞培養培地が、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるサイトカインをさらに含む、請求項３２～３６のいずれか１項に記載の方法。
  70. 前記第２の細胞培養培地が、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるサイトカインをさらに含む、請求項３２～３５のいずれか１項に記載の方法。
  71. ステップ（ｄ）及び／または（ｆ）の前記細胞培養培地が、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるサイトカインをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
  72. 前記第２の拡張の前記細胞培養培地が、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるサイトカインをさらに含む、請求項３２～３５のいずれか１項に記載の方法。
  73. ステップ（ｃ）における前記第１の拡張及び／またはステップ（ｅ）における前記第２の拡張が、１１日間の期間内に個別に行われる、請求項３２～３５のいずれか１項に記載の方法。
  74. ＣＩＳＨ及び／またはＰＤ－１の低減された発現を含む遺伝子修飾腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む集団または組成物であって、請求項１～２０及び３２～７３のいずれかに記載の方法によって得ることができる、前記ＴＩＬを含む集団または組成物。
  75. がんの治療を必要とする対象においてがんを治療する方法であって、前記対象に、ＣＩＳＨ及び／またはＣＩＳＨ及びＰＤ－１の発現の低減を含む遺伝子修飾腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団を投与することを含み、前記遺伝子修飾ＴＩＬの治療的集団が、請求項１～２０及び３２～７３のいずれかに記載の方法によって得ることができる、前記方法。
  76. 前記がんが、黒色腫（転移性黒色腫を含む）、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされるがん、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、腎癌、及び腎細胞癌からなる群から選択される、請求項７５に記載のがんを治療する方法。
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