CN105829344B

CN105829344B - 犬化鼠抗犬pd-1抗体

Info

Publication number: CN105829344B
Application number: CN201480069679.8A
Authority: CN
Inventors: M.莫塞; 张远征; D.巴特斯-莫罗佐夫; J.埃斯基内; I.塔佩; L.G.普雷斯塔
Original assignee: Intervet International BV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 2013-12-20
Filing date: 2014-12-19
Publication date: 2021-12-07
Anticipated expiration: 2034-12-19
Also published as: AU2014368450A1; BR112016014293A2; JP2017500866A; RU2761663C2; CA2932519C; AU2014368449B2; CA2932567A1; DK3083694T3; JP6622703B2; CA3185195A1; JP2020031653A; RU2020129387A; JP2017500867A; AU2021200946A1; RU2016129274A; US20240084004A1; RU2019102939A; BR112016014284A2; AU2020210142A1; AU2023285870A1

Abstract

本发明提供了具有特定序列和对犬PD‑1的高结合亲和力的犬化鼠抗‑人PD‑1抗体。本发明也涉及这些抗体在治疗狗中的用途。

Description

犬化鼠抗犬PD-1抗体

相关申请的交叉引用

本申请要求享有于2013年12月20日提交的美国临时申请系列号61/918,847的权益，其内容通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本发明涉及针对人PD-1的犬化鼠抗体，其具有特定序列和对犬PD-1的高结合亲和力。本发明也涉及本发明的抗体在治疗狗癌症中的用途。

背景技术

主要在活化的T和B细胞上表达的免疫抑制性受体（程序性细胞死亡受体1，也被称作程序性死亡受体（PD-1））是与CD28和CTLA-4有关的免疫球蛋白超家族的一个成员。PD-1和类似的家族成员是含有细胞外Ig可变型（V-型）结构域（其结合它的配体）和胞质尾区（其结合信号传递分子）的I型跨膜糖蛋白。PD-1的胞质尾区含有两个基于酪氨酸的信号传递基序：ITIM（基于免疫受体酪氨酸的抑制基序）和ITSM（基于免疫受体酪氨酸的转换基序）。

PD-1当结合至程序性细胞死亡配体1（也被称作程序性死亡配体1（PD-L1））和/或程序性细胞死亡配体2（也被称作程序性死亡配体2（PD-L2））时减弱T-细胞应答。这些配体中的任一种与PD-1的结合会负调节抗原受体信号传递。阻断PD-L1与PD-1的结合会增强肿瘤特异性的CD8⁺ T-细胞免疫，同时辅助免疫系统对肿瘤细胞的清除。已经报道了鼠PD-1的三维结构、以及小鼠PD-1与人PD-L1的共晶结构[Zhang等人,Immunity 20: 337-347(2004); Lin等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105: 3011-3016 (2008)]。

PD-L1和PD-L2是含有在细胞外区域中的IgV-和IgC-样结构域以及不具有已知信号传递基序的短细胞质区域的I型跨膜配体。PD-L1和PD-L2二者组成性地表达，或者可以在多种细胞类型（包括非造血组织以及多种肿瘤类型）中诱导。PD-L1不仅在B、T、骨髓和树突细胞(DC)上表达，而且在周围细胞（诸如微血管内皮细胞和非淋巴样器官例如心脏或肺）上表达。相反，PD-L2仅存在于巨噬细胞和DC上。PD-1配体的表达模式提示，PD-1在维持外周耐受中起作用，并且还可以用于调节外周中的自体反应性T-和B-细胞应答。

在任何情况下，现在非常清楚的是，PD-1在至少某些人癌症中起关键作用，可能是通过介导免疫逃避。因此，PD-L1已经被证实在许多小鼠和人肿瘤上表达，且在大多数PD-L1阴性的肿瘤细胞系中可被IFNγ诱导[Iwai等人,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:12293-12297 (2002)；Strome等人, Cancer Res., 63: 6501-6505 (2003)]。此外，已经在许多原发性人肿瘤活组织检查中鉴别出PD-1在肿瘤浸润性淋巴细胞上的表达和/或PD-L1在肿瘤细胞上的表达。这样的肿瘤组织包括肺、肝、卵巢、子宫颈、皮肤、结肠、神经胶质瘤、膀胱、乳房、肾、食管、胃、口腔鳞状细胞、泌尿道上皮细胞和胰腺的癌症以及头和颈的肿瘤[Brown等人, J. Immunol. 170: 1257-1266 (2003); Dong等人,Nat. Med. 8: 793-800(2002); Wintterle等人,Cancer Res. 63: 7462-7467 (2003); Strome等人,Cancer Res., 63: 6501-6505 (2003); Thompson等人,Cancer Res. 66: 3381-5 (2006);Thompson等人,Clin. Cancer Res. 13: 1757-1761 (2007); Nomi等人,Clin.Cancer Res. 13: 2151-2157. (2007)]。更惊人的是，在肿瘤细胞上的PD-配体表达已经与跨多个肿瘤类型的人癌症患者的不良预后相关联[综述在Okazaki和Honjo, Int. Immunol. 19:813-824 (2007)]。

此外，Nomi等人[Clin. Cancer Res. 13: 2151-2157 (2007)]证实了通过施用PD-1或PD-L1指导的抗体在侵袭性胰腺癌的鼠模型中阻断PD-L1与PD-1的结合的治疗效果。这些抗体会有效地促进肿瘤反应性的CD8⁺ T细胞向肿瘤中的渗透，从而导致抗肿瘤效应物（包括IFNγ、颗粒蛋白酶B和穿孔蛋白）的上调。类似地，抗体用于阻断PD-L1和PD-1的结合的用途，会在小鼠鳞状细胞癌模型中显著地抑制肿瘤生长[Tsushima等人,Oral Oncol.42: 268-274 (2006)]。

在其它研究中，用PD-L1对鼠肥大细胞瘤系的转染导致当与肿瘤特异性的CTL克隆共培养时减少的肿瘤细胞裂解。当加入抗-PD-L1单克隆抗体时，裂解被恢复[Iwai等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 12293-12297 (2002)]。在体内，显示了阻断PD1/PD-L1相互作用会增加继承性T细胞转移疗法在小鼠肿瘤模型中的效力[Strome等人, Cancer Res. 63: 6501-6505 (2003)]。关于PD-1在癌症治疗中的作用的其它证据来自用PD-1敲除的小鼠执行的实验，其中表达PD-L1的骨髓瘤细胞仅在野生型动物中生长(导致肿瘤生长和有关的动物死亡)，但是不在PD-1缺陷型小鼠中生长[Iwai Y. 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 12293-12297 (2002)]。近年来，针对PD-1的抗体(包括针对人PD-1的人源化鼠单克隆抗体)已经至少在人类的癌症治疗中显示了初步成功[参见例 如，US 8,354,509 B2、US 8,008,449 B2和US 7,595,048 B2]。

抗-PD-1抗体还可以用在慢性病毒感染中。在急性病毒感染以后产生的记忆性CD8⁺T细胞是高度功能性的，并且构成保护性免疫的一个重要组分。相反，慢性感染经常特征在于病毒特异性的T-细胞应答的不同程度的功能缺损(耗竭)，并且该缺陷是宿主不能消除持久病原体的一个主要原因。尽管功能性的效应T细胞最初在感染的早期阶段产生，它们在慢性感染的进程中逐渐丧失功能。Barber等人[Nature 439: 682-687 (2006)]证实，用LCMV的实验室毒株感染的小鼠发展了慢性感染，导致血液和其它组织中的高病毒水平。这些小鼠最初形成了稳健的T细胞应答，但是最终在T细胞耗竭后屈服于感染。Barber等人发现，通过注射阻断PD-1和PD-L1之间的相互作用的抗体，可以反转慢性感染的小鼠中效应T细胞的数目和功能的下降。

本文中对任何参考文献的引用不应解释为承认：这样的参考文献可作为本申请的“背景技术”得到。

发明概述

本发明涉及犬化鼠抗-人PD-1抗体，其具有对犬PD-1的高结合亲和力，以及具有阻断犬PD-1与犬PD-L1的结合的能力。本发明也涉及这样的抗体在治疗疾病（诸如癌症和/或由感染引起的那些）中的用途。

因此，本发明提供了一种分离的、特异性地结合程序性死亡受体1 (PD-1)的、包含犬IgG重链和犬κ或λ轻链的犬化抗体或其抗原结合片段。在该类型的特定实施方案中，所述犬κ或λ轻链包含三个轻链互补决定区(CDR): CDR轻链1 (CDRL1)、CDR轻链2 (CDRL2)和CDR轻链3 (CDRL3)；且所述犬IgG重链包含三个重链CDR: CDR重链1 (CDRH1)、CDR重链2(CDRH2)和CDR重链3 (CDRH3)，它们得自哺乳动物PD-1抗体。本发明的犬化抗体及其片段的特定实施方案结合犬PD-1和/或阻断犬PD-1与犬程序性死亡配体1 (PD-L1)的结合。

在某些实施方案中，犬轻链是κ链。在该类型的特定实施方案中，CDRL1包含SEQ IDNO: 20的氨基酸序列。在有关的实施方案中，所述CDRL1包含SEQ ID NO: 20的保守修饰变体。在其它实施方案中，所述CDRL2包含含有SEQ ID NO: 22的氨基酸序列。在有关的实施方案中，所述CDRL2包含SEQ ID NO: 22的保守修饰变体。在还其它的实施方案中，所述CDRL3包含SEQ ID NO: 24的氨基酸序列。在有关的实施方案中，所述CDRL3包含SEQ ID NO: 24的保守修饰变体。在还其它的实施方案中，所述CDRH1包含SEQ ID NO: 14的氨基酸序列。在有关的实施方案中，所述CDRH1包含SEQ ID NO: 14的保守修饰变体。在还其它的实施方案中，所述CDRH2包含SEQ ID NO: 16的氨基酸序列。在有关的实施方案中，所述CDRH2包含SEQ IDNO: 16的保守修饰变体。在还其它的实施方案中，所述CDRH3包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列。在有关的实施方案中，所述CDRH3包含SEQ ID NO: 18的保守修饰变体。

在特定实施方案中，所述CDRL1包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列或SEQ ID NO:20的保守修饰变体，所述CDRL2包含含有SEQ ID NO: 22的氨基酸序列或SEQ ID NO: 22的保守修饰变体，且所述CDRL3包含SEQ ID NO: 24的氨基酸序列或SEQ ID NO: 24的保守修饰变体。

在其它特定实施方案中，所述CDRH1包含SEQ ID NO: 14的氨基酸序列或SEQ IDNO: 14的保守修饰变体，所述CDRH2包含含有SEQ ID NO: 16的氨基酸序列或SEQ ID NO:16的保守修饰变体，且所述CDRH3包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列或SEQ ID NO: 18的保守修饰变体。

在一个更特定的实施方案中，所述CDRL1包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列或SEQID NO: 20的保守修饰变体，所述CDRL2包含含有SEQ ID NO: 22的氨基酸序列或SEQ IDNO: 22的保守修饰变体，且所述CDRL3包含SEQ ID NO: 24的氨基酸序列或SEQ ID NO: 24的保守修饰变体，且所述CDRH1包含SEQ ID NO: 14的氨基酸序列或SEQ ID NO: 14的保守修饰变体，所述CDRH2包含含有SEQ ID NO: 16的氨基酸序列或SEQ ID NO: 16的保守修饰变体，且所述CDRH3包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列或SEQ ID NO: 18的保守修饰变体。

在一个甚至更特定的实施方案中，所述CDRL1包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列，所述CDRL2包含含有SEQ ID NO: 22的氨基酸序列，且所述CDRL3包含SEQ ID NO: 24的氨基酸序列，所述CDRH1包含SEQ ID NO: 14的氨基酸序列，所述CDRH2包含含有SEQ ID NO: 16的氨基酸序列，且所述CDRH3包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列。

对于本发明的实施方案，所述IgG重链包含SEQ ID NO: 26的氨基酸序列。在有关的实施方案中，所述IgG重链包含SEQ ID NO: 26的保守修饰变体。在其它实施方案中，所述IgG重链包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列。在有关的实施方案中，所述IgG重链包含SEQ IDNO: 28的保守修饰变体。在其它的实施方案中，所述IgG重链包含SEQ ID NO: 30的氨基酸序列。在有关的实施方案中，所述IgG重链包含SEQ ID NO: 30的保守修饰变体。

在某些实施方案中，所述κ轻链包含SEQ ID NO: 32的氨基酸序列。在具体实施方案中，所述κ轻链包含SEQ ID NO: 32的保守修饰变体。在具体实施方案中，所述κ轻链包含SEQ ID NO: 34的氨基酸序列。在有关的实施方案中，所述κ轻链包含SEQ ID NO: 34的保守修饰变体。

在一个更具体的实施方案中，一种分离的犬化抗体包含SEQ ID NO: 28和SEQ IDNO: 34的氨基酸序列。在有关的实施方案中，所述分离的犬化抗体包含SEQ ID NO: 28的保守修饰变体和SEQ ID NO: 34的保守修饰变体。在其它有关的实施方案中，所述分离的犬化抗体包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列和SEQ ID NO: 34的保守修饰变体。在其它有关的实施方案中，所述分离的犬化抗体包含SEQ ID NO: 28的保守修饰变体和SEQ ID NO: 34的氨基酸序列。

本发明还提供了分离的核酸，其编码本发明的犬化抗体的任一个轻链。类似地，本发明还提供了分离的核酸，其编码本发明的犬化抗体的任一个重链。本发明还提供了表达载体，其包含一个或多个本发明的分离的核酸。本发明还提供了宿主细胞，其包含一个或多个本发明的表达载体。

在具体实施方案中，所述抗体是重组抗体或其抗原结合片段。在有关的实施方案中，所述可变重链结构域和可变轻链结构域通过柔性接头连接以形成单链抗体。

在具体实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是Fab片段。

在其它实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是Fab' 片段。在其它实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是(Fab')₂片段。在其它实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是双体。在具体实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是结构域抗体。在具体实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是骆驼源化的单结构域抗体。

在具体实施方案中，所述犬化鼠抗-人PD-1抗体或抗原结合片段会增加正在治疗的犬受试者的免疫应答。

本发明还提供了分离的核酸，其编码如本文中公开的犬化鼠抗-人PD-1抗体或抗原结合片段。在有关的实施方案中，这样的抗体或抗原结合片段可以用于制备药物以治疗犬受试者中的癌症。可选地，或者联合地，本发明提供了本发明的任何抗体或抗体片段用于诊断应用的用途。在其它实施方案中，提供了一种试剂盒，其包含本文中公开的任何犬化抗体或抗原结合片段。

在其它实施方案中，提供了一种包含分离的核酸的表达载体，所述核酸编码本发明的任何犬化鼠抗-人PD-1抗体或抗原结合片段。本发明也涉及一种宿主细胞，其包含本文描述的任何表达载体。在具体实施方案中，本发明的这些核酸、表达载体或多肽可用在制备抗体的方法中。

本发明还包括药物组合物，其包含抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体或稀释剂。另外，本发明提供了增加免疫细胞的活性的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的这样的药物组合物。在某些实施方案中，所述方法用于治疗癌症。在其它实施方案中，所述方法用于治疗感染或传染性疾病。在其它实施方案中，本发明的犬化抗体或其抗原结合片段用作疫苗佐剂。

通过参考以下附图说明和详细描述会更好地理解本发明的这些和其它方面。

附图说明

图1显示了鼠抗-人PD-1单克隆抗体08A [mAb 08A；如在US 8,354,509 B2中关于人PD-1首次描述的]对His-标记的犬PD-1细胞外结构域的反应性。

图2显示了使用CELISA鼠抗-人PD-1单克隆抗体08A (参见上面)对在CHO细胞上表达的犬PD-1蛋白的反应性。发现鼠抗-人PD-1单克隆抗体08A和它的犬化变体以剂量依赖性的方式与犬PD-1反应。

图3描绘了鼠和犬化单克隆抗体的配体阻断。鼠抗-人PD-1单克隆抗体08A (参见上面)和它的犬化变体阻断了犬PD-L1与在CHO细胞表面上表达的PD-1的结合。

图4提供了缺乏ADCC功能的犬IgGB恒定重链(CH)的比对。描绘了犬野生型IgB[cIgGB wt]、犬IgGB(+)A-铰链[cIgGB(+) A-铰链]、犬IgGB(+) D-铰链[cIgGB(+) D-铰链]和犬IgGB (-)ADCC [cIgGB(-) ADCC]。(+) A-铰链是用IgG-A铰链替换+显示的赖氨酸和天冬酰胺氨基酸置换；(+) D-铰链是用IgG-D铰链替换+ 显示的赖氨酸和天冬酰胺氨基酸置换。(-)ADCC是赖氨酸和天冬酰胺氨基酸置换。

发明详述

缩写

贯穿本发明的详细描述和实例，将使用以下缩写：

ADCC 抗体依赖性细胞毒作用

CDC 依赖补体的细胞毒性

CDR 在免疫球蛋白可变区中的互补性决定区，使用Kabat编号系统定义

CHO 中国仓鼠卵巢

EC50 导致50%效力或结合的浓度

ELISA 酶联免疫吸附测定

FR 抗体框架区：不包括CDR区域的免疫球蛋白可变区。

HRP 辣根过氧化物酶

IFN 干扰素

IC50 导致50%抑制的浓度

IgG 免疫球蛋白G

Kabat 由Elvin A. Kabat [Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)]开辟的免疫球蛋白比对和编号系统

mAb 单克隆抗体(也表示为Mab或MAb)

MES 2-(N-吗啉代)乙磺酸

MOA 作用机理

NHS 正常人血清

PCR 聚合酶链式反应

PK 药代动力学

SEB 葡萄球菌属肠毒素B

TT 破伤风类毒素

V区域在不同抗体之间在序列上可变的IgG链区段。它延伸至轻链中的Kabat残基109和重链中的Kabat残基113。

VH 免疫球蛋白重链可变区

VK 免疫球蛋白κ轻链可变区。

定义

为了可以更容易地理解本发明，下面特别地定义了某些技术和科学术语。除非在本文件别处特别地定义，本文中使用的所有其它技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。

如本文（包括所附权利要求书）中使用的，词语的单数形式诸如“一个/种”和“所述”包括它们的对应复数形式，除非上下文另外清楚地指明。

“活化”在应用于细胞或受体时表示用配体活化或处理细胞或受体，除非上下文另外指出或明确地指出。“配体”包括天然的和合成的配体，例如，细胞因子、细胞因子变体、类似物、突变蛋白和从抗体衍生出的结合化合物。“配体”也包括小分子，例如，细胞因子的肽模拟物和抗体的肽模拟物。“活化”可以表示被内部机制以及被外部或环境因子调节的细胞活化。

分子的“活性”可以描述或表示分子与配体或与受体的结合，表示催化活性；表示刺激基因表达或细胞信号传递、分化或成熟的能力；表示抗原活性，表示其它分子的活性的调节等。分子的“活性”还可以表示调节或维持细胞-与-细胞相互作用(例如，粘附）的活性，或维持细胞的结构(例如，细胞膜或细胞骨架）的活性。“活性”也可以是指比活性，例如，[催化活性]/[mg蛋白]或[免疫学活性]/[mg蛋白]，在生物区室中的浓度，等。“活性”可以表示先天性或适应性免疫系统的组分的调节。

“施用”和“处理”当应用于动物(例如，犬实验受试者）、细胞、组织、器官或生物流体时表示外源药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物(例如，犬受试者、细胞、组织、器官或生物流体）的接触。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中流体与细胞发生接触。“施用”和“处理”也指用试剂、诊断剂、结合化合物或用另一种细胞体外和先体内后体外处理(例如，细胞）。术语”受试者”包括任何生物体，优选动物，更优选哺乳动物(例如，犬、猫或人)，且最优选犬。

“治疗”或“处理”是指给犬受试者或患者在内部或在外部施用治疗剂，诸如含有本发明的任何抗体或抗原结合片段的组合物，所述犬受试者或患者具有一种或多种疾病征状或疑似具有疾病，所述药剂对所述疾病征状或疾病具有治疗活性。通常地，所述药剂以有效地减轻和/或改善受治疗的受试者或群体中的一种或多种疾病征状的量施用，无论是通过诱导这样的征状的消退还是在任何临床上可测量的程度上抑制这样的征状的进展。有效地减轻任何具体疾病征状的治疗剂的量(也被称作“治疗有效量”)可以随因素诸如患者(例如，犬)的疾病状态、年龄和重量以及药物组合物在受试者中引起期望应答的能力而变化。疾病征状是否已经减轻或改善，可以通过兽医或其它熟练的健康护理提供者通常地使用的任何临床测量来评估，以评估该征状的严重程度或进展状态。尽管本发明的一个实施方案(例如，治疗方法或制成品)可能不会有效地减轻每个受试者中的靶疾病征状，但是它会减轻统计上显著数目的受试者中的靶疾病征状，如通过本领域已知的任何统计检验来确定的，诸如Student's t-检验、chi²-检验、根据Mann和Whitney的U-检验、Kruskal-Wallis检验(H-检验)、Jonckheere-Terpstra-检验和Wilcoxon-检验。

“治疗”当应用于人、兽医(例如，犬)或研究受试者时表示治疗性处理以及研究和诊断应用。“治疗”当应用于人、兽医(例如，犬)或研究受试者或细胞、组织或器官时包括本发明的抗体或抗原结合片段与犬或其它动物受试者、细胞、组织、生理学隔室或生理学流体的接触。

已经发现犬PD-1包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。在一个特定实施方案中，犬PD-1由包含SEQ ID NO: 1的核苷酸序列的核酸编码。犬PD-1序列可以差异在于具有，例如，在非保守区中的保守变异，但是犬PD-1将具有与包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的犬PD-1基本上相同的生物学功能。例如，PD-1的生物学功能是当结合至PD-L1和/或PD-L2时减弱T-细胞应答。也就是说，PD-1可以视作负调节剂。值得注意的是，PD-1的胞质尾区含有两个基于酪氨酸的信号传递基序：ITIM (基于免疫受体酪氨酸的抑制基序)和ITSM (基于免疫受体酪氨酸的转换基序)。另外，犬PD-1的生物学功能可能是具有例如在本发明的公开内容的抗体所特异性地结合的细胞外结构域中的表位。

已经发现犬PD-L1包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列。在一个特定实施方案中，犬PD-L1由包含的SEQ ID NO: 7核苷酸序列编码。犬PD-L1序列可以差异在于具有，例如，在非保守区中的保守变异，但是犬PD-L1将具有与包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的犬PD-L1基本上相同的生物学功能。例如，PD-L1的一个生物学功能是当结合至PD-1时减弱T-细胞应答。

一个特别的犬PD-1或PD-L1氨基酸序列通常分别与包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的犬PD-1或包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的犬PD-L1具有至少90%同一性。在某些情况下，犬PD-1或PD-L1可以分别与包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的犬PD-1或包含SEQ IDNO: 8的氨基酸序列的犬PD-L1具有至少95%或甚至至少96%、97%、98%或99%同一性。在某些实施方案中，犬PD-1或PD-L1氨基酸序列将分别与包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的犬PD-1或包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的犬PD-L1表现出不超过10个氨基酸差异。在某些实施方案中，所述犬PD-1或所述PD-L1氨基酸序列可以分别与包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的犬PD-1或包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的犬PD-L1表现出不超过5个或甚至不超过4、3、2或1个氨基酸差异。可以如下文中所述确定同一性百分比。

术语“免疫应答”表示例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由以上细胞产生的可溶性大分子或肝(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，所述作用导致对癌细胞、被病原体感染的细胞或组织、或侵入病原体的选择性损伤、破坏、或从哺乳动物身体(例如，犬身体)消除。

犬化的抗-人PD-1抗体

本发明提供了分离的结合犬PD-1的犬化鼠抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段以及这样的抗体或片段的用途。

本文中使用的犬化鼠抗-人PD-1抗体表示特异性地结合哺乳动物PD-1的犬化抗体。特异性地结合哺乳动物PD-1、且尤其是犬PD-1的抗体是这样的抗体：其表现出与其它抗原相比对哺乳动物PD-1的优先结合，但是该特异性不需要绝对结合特异性。在以下情况下认为犬化鼠抗-人PD-1抗体是对犬PD-1“特异性的”：如果它的结合是从犬得到的生物样品中犬PD-1的存在的确定因素，或如果它能够改变犬PD-1的活性而不会不适当地干扰犬样品中的其它犬蛋白的活性，例如不会产生不希望的结果诸如在诊断背景下的假阳性或在治疗背景下的副作用。犬化鼠抗-人PD-1抗体所需的特异性程度可能取决于抗体的预期用途，且至少由它就用于预期目的而言的适合性来限定。预见到的方法的抗体或从抗体的抗原结合位点衍生出的结合化合物与它的抗原或其变体或突变蛋白的结合亲和力是与任意其它犬抗原的亲和力的至少2倍，优选地至少10倍，更优选地至少20倍，且最优选地至少100倍。

在以下情况下，就说本文中使用的抗体特异性地结合包含给定序列的多肽(在该情况下，犬PD-1)：如果它结合包含犬PD-1的序列的多肽，但是不结合缺少犬PD-1的氨基酸序列的其它犬蛋白。例如，特异性地结合包含犬PD-1的多肽的抗体可以结合FLAG^®-标记的犬PD-1形式，但是不会结合其它FLAG^®-标记的犬蛋白。

如本文中使用的，除非另有说明，否则“抗体片段”或“抗原结合片段”表示抗体的抗原结合片段，即保留特异性地结合被全长抗体结合的抗原(例如，犬PD-1)的能力的抗体片段，例如保留一个或多个CDR区域的片段。抗原结合片段的例子包括、但不限于Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段；双体；直链抗体；单链抗体分子，例如，sc-Fv；纳米抗体（nanobodies）和由多个抗体片段形成的多特异性抗体。

通常地，当以摩尔基础表达该活性时，本发明的犬化抗体或其抗原结合片段保留它的犬PD-1结合活性的至少10%(当与对应的亲本抗体相比时)。优选地，本发明的抗体或抗原结合片段保留亲本抗体的犬PD-1结合亲和力的至少20%、50%、70%、80%、90%、95%或100%或更多。还预见到，本发明的抗体或抗原结合片段可以包括不会实质上改变它的生物学活性的保守或非保守氨基酸置换(被称作抗体的“保守变体”或“功能保守变体”)。

“分离的抗体”表示纯化状态，且在这样的背景下是指所述分子基本上不含有其它生物分子诸如核酸、蛋白、脂质、碳水化合物或其它物质诸如细胞碎片和生长培养基。通常，术语“分离的”无意表示这样的物质完全不存在或表示水、缓冲剂或盐的缺失，除非它们以实质上干扰如本文中所述的结合化合物的实验或治疗用途的量存在。

每个轻/重链对的可变区形成抗体的抗原结合位点。因而，一般而言，完整抗体具有两个结合位点。除了在双功能的或双特异性的抗体中以外，所述两个结合位点一般而言是相同的。

通常地，重链和轻链的可变结构域包含位于相对保守的框架区(FR)内的三个高变区，也称为互补性决定区(CDR)。所述CDR经常侧接框架区，能够结合至特定表位。一般而言，从N-端至C-端，轻链和重链可变结构域都包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。向每个结构域的氨基酸分配通常是根据以下文献的定义：Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, 等人.; National Institutes of Health,Bethesda, Md. ；第5版; NIH Publ. No. 91-3242 (1991); Kabat, Adv. Prot. Chem.32:1-75 (1978); Kabat, 等人,J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977); Chothia, 等 人,J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)或Chothia, 等人,Nature 342:878-883(1989)]。

本文中使用的术语“高变区”表示抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。所述高变区包含来自“互补性决定区”或“CDR”(即在轻链可变结构域中的CDRL1、CDRL2和CDRL3和在重链可变结构域中的CDRH1、CDRH2和CDRH3)的氨基酸残基[参见Kabat等人.Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版Public Health Service, NationalInstitutes of Health, Bethesda, Md. (1991)，其用序列限定了抗体的CDR区域；也参见Chothia和Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)，其用序列限定了抗体的CDR区域]。本文中使用的术语“框架”或“FR”残基表示除了高变区残基（在本文中被定义为CDR残基）以外的那些可变结构域残基。

本文中使用的术语“犬”包括所有家养狗、犬（Canis lupus familiaris）或家犬，除非另外指出。

本文中使用的术语“犬框架”表示除了高变区残基（在本文中被定义为CDR残基）以外的犬抗体重链和轻链的氨基酸序列。关于犬化抗体，在大多数实施方案中，在两条链中天然犬CDR的氨基酸序列被对应的外来CDR (例如，来自小鼠抗体的那些)替代。任选地，犬抗体的重链和/或轻链可以含有一些外来的非-CDR残基，例如，从而维持在犬抗体内的外来CDR的构象和/或改变Fc功能，如下面讨论的。

狗IgG存在四种已知的的IgG重链亚型，它们被称作IgG-A、IgG-B、IgG-C和IgG-D。两种已知的轻链亚型被称作λ和κ。

除了犬免疫细胞的结合和活化以外，针对PD-1的犬或犬化抗体最佳地具有两种属性：

1. 缺少效应子功能诸如抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)和依赖补体的细胞毒性(CDC)，和

2. 容易使用工业标准技术（诸如基于Protein A层析的技术）大规模纯化。

没有天然存在的犬IgG同种型满足两个标准。例如，IgG-B可以使用Protein A进行纯化，但是具有高水平的ADCC活性。另一方面，IgG-A微弱地结合Protein A，但是表现出不希望的ADCC活性。此外，IgG-C和IgG-D都不可以在Protein A柱上纯化，尽管IgG-D没有表现出ADCC活性。(IgG-C具有相当的ADCC活性)。本发明通过提供对PD-1特异性的突变体犬IgG-B抗体而克服了该困难；这样的抗体缺少效应子功能诸如ADCC，且可以使用工业标准Protein A层析容易地纯化。

本文中使用的术语“犬化抗体”表示包含来自鼠抗-人PD-1抗体的三个重链CDR和三个轻链CDR以及犬框架或修饰的犬框架的抗体。修饰的犬框架包含一个或多个在本文中举例说明的氨基酸变化，所述氨基酸变化进一步优化犬化抗体的有效性，例如，增加它与犬PD-1的结合和/或它的阻断犬PD-1与犬PD-L1的结合的能力。

“同源性”表示当将它们最佳地比对时两个多核苷酸序列之间或两个多肽序列之间的序列相似性。当在两个对比的序列中的位置被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子的每一个中的位置被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。同源性百分比是两个序列共有的同源位置的数目除以对比的位置的总数×100。例如，当将序列最佳地比对时，如果两个序列的10个位置中的6个是匹配的或同源的，那么所述两个序列是60%同源的。通常，当比对两个序列以给出最大同源性百分比时，做出所述对比。

“分离的核酸分子”是指基因组、mRNA、cDNA或合成起源或它们的某种组合的DNA或RNA，所述DNA或RNA与在自然界中在其中发现所述分离的多核苷酸的多核苷酸的全部或部分无关，或与在自然界中它没有与其连接的多核苷酸连接。为了本公开内容的目的，应当理解，包含特定核苷酸序列的“核酸分子”不包括完整的染色体。除了指定的序列以外，分离的“包含”指定的核酸序列的核酸分子还可以包括，多达10个或甚至多达20个或更多个其它蛋白或其部分或片段的编码序列，或可以包括可操作地连接的控制列举的核酸序列的编码区的表达的调节序列，和/或可以包括载体序列。

短语“控制序列”表示可操作地连接的编码序列在特定宿主生物体中的表达所必需的DNA序列。适合用于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞使用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。

当核酸与另一个核酸序列发生功能关联时，所述核酸是“可操作地连接的”。例如，前序列或分泌型前导序列的DNA与多肽的DNA可操作地连接，条件是其表达为参与所述多肽的分泌的前蛋白；启动子或增强子与编码序列可操作地连接，条件是其影响所述序列的转录；或核糖体结合位点与编码序列可操作地连接，条件是其被定位为促进翻译。通常，“可操作地连接的”是指，被连接的DNA序列是连续的，且在分泌型前导序列的情况下，是连续的且在阅读相中。然而，增强子不必须是连续的。连接通过在方便的限制性位点处的连接来实现。如果所述位点不存在，则合成的寡核苷酸适体或接头根据常规实践使用。还应当容易地理解，当在本文中提供核酸序列时，它可以包括终止密码子。但是，由于终止密码子是可互换的，特定终止密码子在序列中的包含不应当视作该序列的必要部分。

本文中使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，且所有这些名称都包括子代。因此，词语“转化子”和“转化的细胞”包括原代受试细胞和由其衍生出的培养物，而不考虑转移的次数。还应当理解，由于故意的或非故意的突变，并非所有后代都具有精确地相同的DNA含量。包括具有相同功能或生物活性的突变体后代，如在最初转化的细胞中所筛选的。在意指不同名称时，它从上下文是清楚的。

本文中使用的“种系序列”表示未重新排列的免疫球蛋白DNA序列的序列。可以使用未重新排列的免疫球蛋白序列的任意合适的来源。人种系序列可以例如在美国国立卫生研究院的国家关节炎和肌肉骨骼疾病和皮肤疾病研究所（National Institute ofArthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the United States NationalInstitutes of Health）的网站上从JOINSOLVER^®种系数据库得到。可以得到小鼠种系序列，例如，如在Giudicelli等人[Nucleic Acids Res. 33:D256-D261 (2005)]中所述。

示例性的犬化鼠抗-人PD-1抗体的性质

本发明提供了分离的犬化鼠抗-人PD-1抗体和所述抗体或其抗原结合片段在治疗疾病（例如，治疗犬的癌症）中的使用方法。结合犬PD-1的犬化鼠抗-人PD-1抗体的例子包括、但不限于包含犬IgG-A、IgG-B和IgG-D重链和/或犬κ轻链以及鼠抗-人PD-1 CDR的抗体。因此，本发明提供了分离的结合犬PD-1并阻断犬PD-1与犬PD-L1的结合的犬化鼠抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段。

结合犬PD-1的分离的抗体或其抗原结合片段可以包含如本文中所述的鼠抗-人抗体的1、2、3、4、5或6个互补性决定区(CDR)。1、2、3、4、5或6个CDR可以独立地选自在下面实施例中在表2中提供的那些的CDR序列。在某些实施方案中，1、2或3个CDR选自V_LCDR (氨基酸SEQ ID NO: 20、22和/或24)，和/或1、2或3个CDR选自V_H CDR (SEQ ID NO: 14、16和/或18)、和/或这些V_LCDR中的1、2或3个的保守修饰变体和/或这些V_HCDR中的1、2或3个的保守修饰变体。

在另一个实施方案中，结合犬PD-1的分离的抗体或其抗原结合片段包含含有鼠轻链CDR-1、CDR-2和/或CDR-3的犬抗体κ轻链和含有鼠重链CDR-1、CDR-2和/或CDR-3的犬抗体重链IgG。

在其它实施方案中，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，它们特异性地结合PD-1且具有犬抗体κ轻链和犬抗体重链IgG，同时仍然表现出期望的结合和功能性质，所述犬抗体κ轻链包含与SEQ ID NO: 20、22和/或24具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的CDR，所述犬抗体重链IgG包含与SEQ ID NO: 14、16和/或18具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的CDR。在另一个实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段包含犬框架，同时仍然表现出期望的结合和功能性质，所述犬框架包含IgG重链序列(包含SEQID NO: 26、28或30的氨基酸序列，具有和不具有信号序列)与κ轻链(包含SEQ ID NO: 32或34的氨基酸序列，具有和不具有信号序列)的组合，其具有多达0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个保守的或非保守的氨基酸置换。在该类型的一个具体实施方案中，保守氨基酸置换的数目是在0-5之间（对于IgG重链）和0-5之间（对于κ轻链）。

“保守修饰变体”或“保守置换”表示用具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚度等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得所述变化可以经常做出，而不改变蛋白的生物活性。本领域技术人员公知，一般而言，在多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换不会实质上改变生物活性[参见，例如，Watson等人, Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., 第224页(第4版; 1987)]。另外，在结构上或在功能上类似的氨基酸的置换不太可能破坏生物活性。本发明的抗体或抗原结合片段的不同实施方案包含具有本文中公开的序列（例如，SEQ ID NO: 26、28、30、32和/或34）的多肽链，或包含至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20个或更多个保守氨基酸置换的多肽链。示例性的保守置换阐述在表I中。

本发明也预见到本发明的抗体的功能保守变体。本文中使用的“功能保守变体”表示这样的抗体或片段：其中一个或多个氨基酸残基已经被改变，而没有改变期望的性质，诸如抗原亲和力和/或特异性。这样的变体包括、但不限于用具有类似性质的氨基酸替换一个氨基酸，诸如表I的保守氨基酸置换。

核酸

本发明还包括编码本文中公开的犬化鼠抗-人PD-1抗体和其抗原结合片段的免疫球蛋白链的核酸。例如，本发明包括在下面的表2和3和序列表表格中列出的核酸。

本发明还包括编码免疫球蛋白多肽的核酸，当通过BLAST算法（其中选择算法的参数以在各个参照序列的整个长度上给出各个序列之间的最大匹配）执行对比时，所述免疫球蛋白多肽的氨基酸序列与本文提供的抗体的氨基酸序列具有至少约70%同一性，优选地至少约80%同一性，更优选地至少约90%同一性和最优选地至少约95%同一性(例如，95%、96%、97%、98%、99%、100%)。本发明还提供了编码免疫球蛋白多肽的核酸，当用BLAST算法（其中选择算法的参数以在各个参照序列的整个长度上给出各个序列之间的最大匹配）执行对比时，所述免疫球蛋白多肽的氨基酸序列与任何参照氨基酸序列具有至少约70%相似性，优选地至少约80%相似性，更优选地至少约90%相似性和最优选地至少约95%相似性(例如，95%、96%、97%、98%、99%、100%)，也被本发明包括。

序列同一性表示，当最佳地比对两个序列时，两个多肽的氨基酸在相同位置相同的程度。序列相似性包括相同的残基和不相同的生化上有关的氨基酸。在上面讨论了具有类似性质且可以互换的生化上有关的氨基酸。

以下参考文献涉及经常用于序列分析的BLAST算法：BLAST ALGORITHMS:Altschul, S.F., 等人,J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Gish, W., 等人,Nature Genet. 3:266-272 (1993); Madden, T.L., 等人,Meth. Enzymol. 266:131-141(1996);Altschul, S.F., 等人,Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997); Zhang, J., 等人, Genome Res. 7:649-656 (1997); Wootton, J.C., 等人,Comput. Chem. 17:149-163(1993); Hancock, J.M. 等人,Comput. Appl. Biosci. 10:67-70 (1994); ALIGNMENTSCORING SYSTEMS: Dayhoff, M.O., 等人, “A model of evolutionary change inproteins.”in Atlas of Protein Sequence and Structure, 第5卷, 增刊3. M.O.Dayhoff (编), 第345-352页, (1978); Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Schwartz, R.M., 等人, “Matrices for detecting distant relationships.”in Atlasof Protein Sequence and Structure, 第5卷, 增刊3.”(1978), M.O. Dayhoff (编),第353-358页(1978), Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Altschul, S.F.,J. Mol. Biol. 219:555-565 (1991); States, D.J., 等人,Methods 3:66-70(1991);Henikoff, S., 等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919 (1992);Altschul, S.F., 等人,J. Mol. Evol. 36:290-300 (1993); ALIGNMENT STATISTICS:Karlin, S., 等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (1990); Karlin, S.,等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877 (1993); Dembo, A., 等人,Ann. Prob. 22:2022-2039 (1994)；和Altschul, S.F. “Evaluating the statisticalsignificance of multiple distinct local alignments.”in Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, 编), 第1-14页, Plenum,New York (1997)。

本发明还提供了包含本发明的分离的核酸的表达载体，其中所述核酸可操作地连接至控制序列，当用所述载体转染宿主细胞时，所述控制序列被宿主细胞识别。还提供了包含本发明的表达载体的宿主细胞和用于生产本文中公开的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：在培养基中培养携带编码抗体或抗原结合片段的表达载体的宿主细胞，和从宿主细胞或培养基分离所述抗原或其抗原结合片段。

表位结合和结合亲和力

本发明还提供了结合与以下抗体相同的在犬PD-1上的表位的抗体或其抗原结合片段：包含SEQ ID NO: 28和/或SEQ ID NO: 32的氨基酸序列的犬化鼠抗-人PD-1抗体，或包含SEQ ID NO: 28和/或SEQ ID NO: 34的氨基酸序列的犬化鼠抗-人PD-1抗体。犬化鼠抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段能够抑制犬PD-1与犬PD-L1的结合。

可以如下面在实施例中所述重组地生产所述犬化鼠抗-人PD-1抗体。可用作用于表达本文中公开的抗体或片段的宿主的哺乳动物细胞系是本领域众所周知的，且包括许多可从美国通常培养物保藏中心(ATCC)得到的永生化的细胞系。这些尤其包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、A549细胞、3T3细胞、HEK-293细胞和许多其它细胞系。哺乳动物宿主细胞包括人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞。通过确定哪些细胞系具有高表达水平，选择特别优选的细胞系。可以使用的其它细胞系是昆虫细胞系，诸如Sf9细胞、两栖动物细胞、细菌细胞、植物细胞和真菌细胞。当将编码重链或其抗原结合部分或片段、轻链和/或其抗原结合片段的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，如下生产抗体：将所述宿主细胞培养足以允许所述抗体在宿主细胞中的表达的时间段，或者更优选地，使所述抗体分泌进宿主细胞在其中生长的培养基中。

使用标准的蛋白纯化方法，可以从培养基回收抗体。此外，使用许多已知技术，可以增强本发明的抗体(或源自它的其它部分)从生产细胞系的表达。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)是一种用于增强在特定条件下的表达的常见方案。与欧洲专利号0216 846、0 256 055和0 323 997和欧洲专利申请号89303964.4关联地完整地或部分地讨论了GS系统。

一般而言，在特别的细胞系或转基因动物中生产的糖蛋白将具有在所述细胞系或转基因动物中生产的糖蛋白所特有的糖基化模式。因此，抗体的特别的糖基化模式将取决于用于生产所述抗体的特别的细胞系或转基因动物。但是，由本文提供的核酸分子编码的、或者包含本文提供的氨基酸序列的所有抗体构成本发明，独立于所述抗体可以具有的糖基化模式。类似地，在特别的实施方案中，具有仅包含未岩藻糖基化的N-聚糖的糖基化模式的抗体可能是有利的，因为这些抗体已经被证实通常地在体外和在体内表现出比它们的岩藻糖基化的相应物更有效的效力[参见例如，Shinkawa等人,J. Biol. Chem. 278: 3466-3473 (2003)；美国专利号6,946,292和7,214,775]。

本发明还包括本文中公开的犬化鼠抗-人PD-1抗体的抗体片段。所述抗体片段包括F(ab)₂片段，其可以通过例如胃蛋白酶对IgG的酶切割来生产。Fab片段可以通过例如用二硫苏糖醇或巯基乙胺还原F(ab)₂来生产。Fab片段是通过二硫键附加至V_H-C_H1链的V_L-C_L链。F(ab)₂片段是两个又通过两个二硫键附加的Fab片段。F(ab)₂分子的Fab部分包括二硫键位于其中间的Fc区部分。F_V片段是V_L或V_H区域。

在一个实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含重链恒定区，例如，犬恒定区，诸如IgG-A、IgG-B、IgG-C和IgG-D犬重链恒定区或其变体。在另一个实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含轻链恒定区，例如，犬轻链恒定区，诸如λ或κ犬轻链区域或其变体。作为例子，且非限制性地，所述犬重链恒定区可以来自IgG-D，且所述犬轻链恒定区可以来自κ。

抗体工程

本发明的犬化鼠抗-人PD-1抗体已经经过工程改造以包括对亲本(即，犬)单克隆抗体的可变结构域内的框架残基的修饰，例如以改善抗体的性质。

实验和诊断用途

本发明的犬化鼠抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段也可以用在犬PD-1蛋白的诊断测定中，例如，检测它在特定肿瘤细胞、组织或血清中的表达。这样的诊断方法可以用在不同的疾病诊断中，特别是犬中的某些癌症。

例如，这样的方法包括下述步骤：

(a)用犬化鼠抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段包被基质(例如，微孔滴定板孔的表面，例如，塑料板)；

(b)向所述基质施加要测试犬PD-1的存在的样品；

(c)洗涤所述板，使得所述样品中未结合的物质被除去；

(d)施加可检测地标记的抗体(例如，酶连接的抗体)，所述抗体也对PD-1抗原具有特异性；

(e)洗涤所述基质，使得未结合的、标记的抗体被除去；

(f)如果标记的抗体是酶连接的，施加被所述酶转化成荧光信号的化学物质；和

(g)检测所述标记的抗体的存在。

在另一个实施方案中，所述标记的抗体用过氧化物酶标记，所述过氧化物酶与ABTS [例如，2,2'-联氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)]或3,3’,5,5’-四甲基联苯胺反应以产生可检测的颜色变化。可选地，所述标记的抗体用可检测的放射性同位素(例如，³H)标记，所述放射性同位素可以在有闪烁剂存在下用闪烁计数器检测。本发明的犬化鼠抗-人PD-1抗体可以用在蛋白质印迹或免疫蛋白印迹操作中。

这样的操作形成本发明的组成部分，且包括例如：

(i)使要测试结合的犬PD-1或其片段的存在的膜或其它固体基质与本发明的犬化鼠抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段接触。这样的膜可以呈基于硝酸纤维素或乙烯树脂[例如，聚偏氟乙烯(PVDF)]的膜的形式，要在非变性PAGE (聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶或SDS-PAGE (十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶中测试犬PD-1的存在的蛋白已经转移至所述膜(例如，在凝胶中电泳分离以后)。在膜与犬化鼠抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段接触之前，任选地将所述膜用例如脱脂奶粉等封闭，从而结合所述膜上的非特异性的蛋白结合位点。

(ii)将所述膜洗涤一次或多次以除去未结合的犬化鼠抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段和其它未结合的物质；和

(iii)检测结合的犬化鼠抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段。

结合的抗体或抗原结合片段的检测可以是通过抗体或抗原结合片段与可检测地标记的第二抗体(抗-免疫球蛋白抗体)的结合，并然后检测所述第二抗体的存在。

本文中公开的犬化鼠抗-人PD-1抗体和其抗原结合片段也可以用于免疫组织化学。这样的方法形成本发明的组成部分，且包括，例如，(1)使要测试犬PD-1的存在的细胞与本发明的犬化鼠抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段接触；和(2)检测所述细胞的表面上或内部的抗体或片段。

如果抗体或抗原结合片段本身被可检测地标记，可以直接地检测它。可选地，所述抗体或抗原结合片段可以被可检测地标记的第二抗体结合，检测所述第二抗体。

本文中公开的某些犬化鼠抗-人PD-1抗体和其抗原结合片段也可以用于体内肿瘤成像。这样的方法可以包括：将放射性标记的犬化鼠抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段注射进要测试与犬PD-1表达有关的肿瘤的存在的犬的身体中，随后对要检测所述标记的抗体或抗原结合片段的存在的患者的身体进行核成像，例如，在包含高浓度的结合至肿瘤的抗体或抗原结合片段的部位。

成像技术包括SPECT成像(单光子发射计算机断层摄影术)或PET成像(正电子发射断层摄影术)。标记包括例如，碘-123 (¹²³I)和锝-99m (^99mTc)，例如，与SPECT成像结合，或¹¹C、¹³N、¹⁵O或¹⁸F，例如，与PET成像结合，或铟-111 [参见例如，Gordon等人,International Rev. Neurobiol. 67:385-440 (2005)]。

药物组合物和施用

为了制备药物或无菌组合物，将犬化鼠抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体或赋形剂混合[参见，例如，Remington'sPharmaceutical Sciences和U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA(1984)]。

通过与可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，可以制备治疗剂和诊断剂的制剂，所述制剂呈例如冻干粉剂、浆剂、水溶液或混悬液的形式[参见，例如，Hardman, 等人(2001)Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill,New York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, NY; Avis, 等人(编) (1993)Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY;Lieberman, 等人(编) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, MarcelDekker, NY; Lieberman, 等人(编) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner和Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY]。在一个实施方案中，将本发明的抗-PD-1抗体在乙酸钠溶液（pH 5-6）中稀释至适当浓度，并为了张度加入NaCl或蔗糖。可以加入另外的试剂（诸如聚山梨酯20或聚山梨酯80）以增强稳定性。

单独地或与另一种试剂联合地施用的抗体组合物的毒性和治疗效果可以通过标准药物操作在细胞培养物或实验动物中确定，例如，确定LD₅₀ (对群体的50%致命的剂量)和ED₅₀ (对群体中的50%治疗上有效的剂量)。有毒和治疗效果之间的剂量比是治疗指数(LD₅₀/ED₅₀)。在具体方面，表现出高治疗指数的抗体是期望的。从这些细胞培养测定和动物研究得到的数据可以用于阐明用在犬中的剂量的范围。这样的化合物的剂量优选地在包括ED50又几乎没有或没有毒性的循环浓度范围内。所述剂量可以在该范围内变化，取决于采用的剂型和施用途径。

施用模式可以变化。合适的施用途径包括口服、直肠、经粘膜、经肠、胃肠外；肌肉内、皮下、真皮内、骨髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、眼内、吸入、吹入法、局部、皮肤、透皮或动脉内。

在具体实施方案中，可以通过侵袭性途径（诸如通过注射）来施用犬化鼠抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段。在本发明的其它实施方案中，静脉内地、皮下地、肌肉内地、动脉内地、肿瘤内地或通过吸入、气雾剂递送，施用犬化鼠抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段或其药物组合物。通过非侵袭性途径(例如，口服地；例如，在丸剂、胶囊剂或片剂中)的施用也在本发明范围内。

可以用本领域已知的医疗装置施用组合物。例如，通过用皮下针（包括、例如，预装注射器或自动注射器）注射，可以施用本发明的药物组合物。还可以用无针皮下注射装置施用本文中公开的药物组合物；诸如在美国专利号6,620,135、6,096,002、5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556中公开的装置。

还可以通过输注来施用本文中公开的药物组合物。用于施用药物组合物的众所周知的植入物和模块形式的例子包括: 美国专利号4,487,603，其公开了一种用于以受控的速率分配药物的可植入的微量输液泵；美国专利号4,447,233，其公开了一种用于以精确的输注速率递送药物的药物输液泵；美国专利号4,447,224，其公开了一种用于连续药物递送的可变流可植入的输注设备；美国专利号4,439,196，其公开了一种具有多个腔隔室的渗透药物递送系统。许多其它这样的植入物、递送系统和模块是本领域技术人员众所周知的。

可选地，可以以局部方式而不是全身方式施用犬化鼠抗-人PD-1抗体，例如，通过将抗体直接注射进特征在于免疫病理学的关节炎关节或病原体诱导的病灶中，经常为贮库或持续释放制剂。此外，可以在靶向药物递送系统中施用犬化鼠抗-人PD-1抗体，例如，在用组织特异性抗体包被的脂质体中，所述组织特异性抗体靶向例如特征在于免疫病理学的关节炎关节或病原体诱导的病灶。所述脂质体将选择性地靶向患病组织和被患病组织摄入。

施用方案取决于几个因素，包括治疗性抗体的血清或组织周转率、征状的水平、治疗性抗体的免疫原性和靶细胞在生物基质中的可达性。优选地，施用方案递送足够的治疗性抗体以实现靶疾病状态的改善，同时使不希望的副作用最小化。因此，递送的生物试剂的量部分地取决于特定治疗性抗体和要治疗的病症的严重程度。可得到选择治疗性抗体的适当剂量的指南[参见，例如，Wawrzynczak Antibody Therapy, Bios Scientific Pub.Ltd, Oxfordshire, UK (1996); Kresina (编) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY (1991); Bach (编) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, NewYork, NY (1993); Baert, 等人.New Engl. J. Med. 348:601-608 (2003); Milgrom等人. New Engl. J. Med. 341:1966-1973 (1999); Slamon等人. New Engl. J. Med.344:783-792 (2001); Beniaminovitz等人.New Engl. J. Med. 342:613-619 (2000);Ghosh等人.New Engl. J. Med. 348:24-32 (2003); Lipsky等人.New Engl. J. Med.343:1594-1602 (2000)]。

适当剂量的确定由兽医做出，例如，使用本领域已知或疑似影响治疗的参数或因素。通常，所述剂量开始于稍微小于最适剂量的量，并且它在此后增加小增量，直到与任何负面副作用相比达到期望的或最适的效果。重要的诊断措施包括例如炎症的征状的诊断措施或产生的炎症性细胞因子的水平的诊断措施。

可以通过连续输注或通过例如每天1次、每周1-7次、每周1次、每2周1次、每月1次、每2月1次、每季度1次、每半年1次、每年1次等施用的剂量来提供本文中公开的抗体或其抗原结合片段。可以例如静脉内地、皮下地、局部地、口服地、鼻地、直肠地、肌肉内地、大脑内地、脊椎内地或通过吸入提供剂量。总每周剂量通常是至少0.05 μg/kg体重，更通常是至少0.2 μg/kg、0.5 μg/kg、1 μg/kg、10 μg/kg、100 μg/kg、0.25 mg/kg、1.0 mg/kg、2.0 mg/kg、5.0 mg/ml、10 mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg或更多[参见，例如，Yang, 等人.New Engl. J. Med. 349:427-434 (2003)；Herold, 等人.New Engl. J. Med. 346:1692-1698(2002)；Liu, 等人.J.Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456 (1999)；Portielji, 等 人.Cancer Immunol. Immunother. 52:133-144 (2003)]。还可以提供剂量以达到犬化鼠抗-人PD-1抗体在受试者的血清中的预定靶浓度，诸如0.1、0.3、1、3、10、30、100、300µg/ml或更多。在其它实施方案中，每周、每2周、“每4周”、每月、每2月或每季度以10、20、50、80、100、200、500、1000或2500 mg/受试者皮下地或静脉内地施用本发明的犬化鼠抗-人PD-1抗体。

本文中使用的“抑制”或“治疗”或“处理”包括与病症有关的征状的发展的延迟和/或这样的病症的症状的严重性的减少。该术语还包括改善既有的失控的或不希望的征状，阻止另外的征状，和改善或阻止这样的征状的基础原因。因而，该术语表示，已经给脊椎动物受试者赋予有益的结果，所述脊椎动物受试者具有病症、疾病或征状或具有发展这样的病症、疾病或征状的潜力。

本文中使用的术语“治疗有效量”、“治疗有效剂量”和“有效量”表示这样的本发明的犬化鼠抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段的量：当单独地或与另外的治疗剂组合地施用给细胞、组织或受试者时，所述量有效地造成疾病或病症的一种或多种征状或这样的疾病或病症的进展的可测量的改善。治疗有效剂量还表示，足以导致征状的至少部分改善的结合化合物的量，例如，有关的医学状况的治疗、治愈、预防或改善，或这样的状况的治疗、治愈、预防或改善的速率的增加。当应用于单独施用的单个活性成分时，治疗有效剂量表示单独的该成分。当应用于组合时，治疗有效剂量表示产生治疗效果的活性成分的组合量，无论是组合地、连续地还是同时地施用。有效量的治疗剂将导致诊断测量或参数改善至少10%；经常至少20%；优选地至少约30%；更优选地至少40%，和最优选地至少50%。在使用主观测量来评估疾病严重程度的情况下，有效量还可以导致主观测量的改善。

其它联合治疗

如前面描述的，犬化鼠抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段可以与一种或多种其它治疗剂(诸如化学治疗剂)一起共同施用。所述抗体可以连接至所述试剂(作为免疫复合物)，或可以与所述试剂分开施用。在后一种情况(分开施用)下，所述抗体可以在所述试剂之前、之后或并行地施用，或可以与其它已知的疗法一起共同施用。

试剂盒

还提供了包含一种或多种组分的试剂盒，所述组分包括、但不限于与一种或多种另外组分组合的如本文所讨论的特异性地结合PD-1的抗体或抗原结合片段(例如，本发明的犬化鼠抗-人PD-1抗体或其抗原结合片段)，所述另外组分包括、但不限于如本文中讨论的药学上可接受的载体和/或化学治疗剂。所述结合组合物和/或所述化学治疗剂可以配制为纯的组合物或在药物组合物中与药学上可接受的载体相组合。

在一个实施方案中，所述试剂盒包括在一个容器中(例如，在无菌的玻璃或塑料小瓶中)的本发明的结合组合物(包含SEQ ID NO: 28和SEQ ID NO: 32或34的氨基酸序列的犬化鼠抗-人PD-1抗体或其药物组合物)和在另一个容器中(例如，在无菌的玻璃或塑料小瓶中)的其药物组合物和/或化学治疗剂。

在另一个实施方案中，所述试剂盒包含本发明的组合，所述组合包括结合组合物组分(例如，包含SEQ ID NO: 28和SEQ ID NO: 32或34的氨基酸序列的犬化鼠抗-人PD-1抗体)以及药学上可接受的载体，任选地与一起配制的一种或多种治疗剂组分组合，任选地，在药物组合物中，在单个普通容器中。

如果试剂盒包括用于胃肠外施用给受试者的药物组合物，所述试剂盒可以包括用于执行这样的施用的装置。例如，所述试剂盒可以包括一个或多个皮下针头或如上面讨论的其它注射装置。所述试剂盒还可以包括包装说明书，其包括关于所述试剂盒内的药物组合物和剂型的信息。通常，这样的信息会帮助宠物主人和兽医有效地和安全地使用包封的药物组合物和剂型。例如，以下关于本发明的组合的信息可以提供在插页中：药代动力学、药效动力学、临床研究、效力参数、适应症和用法、禁忌证、警告、注意、不良反应、超量给药、适当剂量和施用、供应规格、适当贮存条件、参考文献、生产商/分销商信息和专利信息。

为了方便，可以将本文中公开的抗体或特异性结合剂与关于执行诊断或检测测定的说明书一起提供在试剂盒（即，预定量的试剂的包装组合）中。在用酶标记抗体的情况下，所述试剂盒将包括所述酶需要的底物和辅因子(例如，提供可检测的发色团或荧光团的底物前体)。另外，可能包括其它添加剂，诸如稳定剂、缓冲剂(例如，封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。各种试剂的相对量可以宽泛地变化，以提供实质上优化测定的灵敏度的试剂溶液的浓度。具体地，所述试剂可以提供为干粉，经常是冻干的，其包括在溶解后会提供具有适当浓度的试剂溶液的赋形剂。

实施例

实施例1

犬PD-1和PD-L1

犬PD-1的鉴别和克隆：

通过检索NCBI基因库数据库(登录号XM_543338.4, SEQ ID NO: 1)，鉴别编码全长犬PD-1 (cPD-1)的核酸。翻译的氨基酸序列SEQ ID NO: 2 (登录号XP-543338.3)对应于假定的犬PD-1蛋白，其如下进一步鉴别：检索基因库(NCBI)蛋白数据库，并将鉴别的氨基酸序列与鼠、猫和人PD-1氨基酸序列比对。合成了针对CHO细胞进行了密码子优化的、与全长犬PD-1基因对应的DNA序列，并将其克隆进命名为p96793的质粒中。预期的犬PD-1的DNA和蛋白序列与已知的PD-1 DNA和蛋白序列的对比导致编码犬PD-1的细胞外结构域(ECD)的DNA序列(SEQ ID NO: 3)和犬PD-1的ECD的氨基酸序列(SEQ ID NO: 4)的鉴别。

合成了编码犬PD-1的ECD（除了GT接头和8个组氨酸残基以外）的DNA序列，并将其克隆进命名为LPD2726的质粒中。化学合成了与犬PD-1 ECD +GT接头和人IgG1 Fc基因的Fc部分对应的核酸序列(SEQ ID NO: 5)，并将其克隆进命名为LPD2727的质粒中。犬PD-1 ECD和人IgG1 Fc的Fc部分包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列。

犬PD-L1的鉴别和克隆 ：

通过检索NCBI基因库数据库(登录号XM_541302.4; SEQ ID NO: 7)，鉴别编码全长犬PD-L1的核酸。如下鉴别与假定的犬PD-L1蛋白对应的翻译的氨基酸序列(登录号XP-541302.4; SEQ ID NO: 8)：检索基因库(NCBI)蛋白数据库，并将鉴别的序列与已知的PD-L1小鼠和人序列比对。

编码犬PD-L1的DNA与已知的PD-L1序列的对比会鉴别出与犬PD-L1的ECD结构域对应的DNA序列(SEQ ID NO: 9，且针对CHO细胞进行了密码子优化)。犬PD-L1的ECD的预期氨基酸序列是SEQ ID NO: 10。合成了编码PD-L1 ECD + GT接头和8个组氨酸残基的DNA，并将其克隆进命名为LPD2695的质粒中。

化学合成了编码犬PD-L1 ECD的氨基酸序列+ GT接头和人IgG1 Fc的Fc部分的DNA序列(SEQ ID NO: 11)，并将其克隆进命名为LPD2697的质粒中。犬PD-L1 ECD + GT接头和人IgG1的Fc部分包含SEQ ID NO: 12的氨基酸序列。表1含有上述表达质粒的描述。

PD-1和PD-L1蛋白的表达 ：

将编码PD-1ECD-HIS、PD-1ECD-Fc、PDL-1 ECD-HIS和PD-L1ECD-Fc蛋白的表达质粒转染进HEK 293细胞中，并使用Protein A（对于Fc融合蛋白）或镍(Ni²⁺)柱层析（对于HIS-标记的蛋白）从转染的细胞的上清液纯化蛋白。将纯化的蛋白用于如下详述的ELISA或结合测定。通过SDS-PAGE凝胶，分析表达的蛋白。

实施例2

结合犬PD-1的鼠抗-人单克隆抗体的鉴别

单克隆抗体对犬PD-1的反应性的证实

还发现以前已经针对人PD-1制备的小鼠单克隆抗体之一[hPD-1.08A，在US 8,354,509 B2中鉴别，特此通过引用整体并入]与犬PD-1强烈地反应。将纯化的hPD-1.08A如下通过ELISA测试与HIS-标记的犬PD-1的ECD结构域的反应性：将HIS-标记的犬PD-1 ECD蛋白在包被缓冲液(碳酸盐/碳酸氢盐pH 9.0)中稀释至10µg/mL，并以100µl/孔分配在96-孔平底ELISA平板(NUNC)中。将平板在4℃温育过夜。然后将平板用含有0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲盐水(PBST)洗涤3次。接着，将200µl封闭缓冲液(在PBST中的5%脱脂乳)加入每个孔，并将平板在37℃温育60分钟。

然后将平板用PBST洗涤3次。接着，将100µl在封闭缓冲液中稀释的测试单克隆抗体(mAb)加入适当列的第一个孔中。然后将测试mAb 2倍稀释至适当的平板位置。将平板在37℃温育60分钟以后，将平板用PBST洗涤3次。接着，将100µl/孔的辣根过氧化物酶缀合的山羊抗-小鼠IgG (KPL)的1:2,000稀释液加入平板，然后将平板在37℃温育60分钟。然后，将平板用PBST洗涤3次，并将100µl/孔的3,3’,5,5’四甲基联苯胺、(TMB)底物(得自KPL)加入平板。允许颜色反应在37℃发展5-20分钟，然后在650nm测量吸光度。

表达犬PD-1蛋白的CHO细胞

将全长犬PD-1基因克隆进质粒p96793中。在该质粒中，犬PD-1蛋白的表达由hCMV启动子驱动。将CHO DXB11细胞(dhfr-)维持在补充了10%胎牛血清的MEM-α(Gibco)中。使用Lipofectamine (Invitrogen)，通过脂质体介导的基因递送，在含有大约6 x10⁶个细胞的75 cm²烧瓶中，进行用质粒p96793对CHO细胞的转染。48小时以后，将细胞在补充了10%FBS和400µg/mL潮霉素B的、不含核苷的MEM-α培养基(选择性培养基)中传代。

对dhfr+、潮霉素抗性的细胞的集合执行有限稀释克隆。通过免疫荧光测定，评估克隆的犬PD-1表达。简而言之，将细胞单层固定在含有80%丙酮的96孔板中。然后将固定的且干燥的细胞单层与多克隆山羊抗-人PD-1抗体(R&D Systems)一起温育1小时。将平板用PBS洗涤，然后与荧光素-标记的兔抗-山羊IgG抗体(KPL)一起温育1小时。将平板用PBS洗涤。将表现出荧光的克隆扩增，并建立细胞储备物。

小鼠mAb对在CHO细胞上表达的犬PD-1蛋白的反应性

使用表达PD-1的CHO细胞，通过基于细胞的测定，确定小鼠抗-人PD-1 mAb与CHO细胞上的犬PD-1的反应性。简而言之，将表达犬PD-1的CHO细胞在50µl培养基(DMEM/HAM’sF12, 10%FBS；“CHO培养基”)中培养至80-100%汇合。接着，加入50µl含有不同浓度的纯化的mAb的培养基在37℃保持1小时。在用PBS-TWEEN洗涤3次以后，加入100µl在培养基中1:1000稀释的山羊抗-小鼠辣根过氧化物酶(HRP)在37℃保持1小时。用PBS-TWEEN洗涤另外3次以后，用过氧化物酶底物(TMB)使结合的mAb显影。在微量培养板读数器中测量由过氧化物酶活性引起的在450 nm的吸光度增加。通过加入50µL/孔的1 M磷酸，停止显色。

通过小鼠和犬化抗-PD-1 mAb实现的配体阻断

对于与犬PD-1反应的小鼠抗-人PD-1 mAb，使用基于表达犬PD-1的CHO细胞系的、基于细胞的ELISA (CELISA)测定。与生物素化的cPD-L1/Fc蛋白结合地使用该测定证实配体阻断。简而言之，将cPD-1 CHO细胞以4 x10⁴个细胞/孔接种在96-孔平板中，并将细胞在37℃温育18-24小时，直到它们是95-100%汇合的。抽吸细胞培养基，将平板用PBS + 0.05%吐温20和1x CHO培养基洗涤3次。从30µg/mL开始制备抗-cPD1 mAb在CHO培养基中的3倍系列稀释物，并将50µL/孔的每种抗体稀释物加入平板中。在摇动下在37℃、5%CO₂下温育30min。加入50µL/孔的cPD-L1-Fc -生物素(2 ug/ml在CHO培养基原液中)，并继续在摇动下在37℃、5%CO₂下温育45 min。将平板用PBS + 0.05%吐温20洗涤6次。加入100ul/孔的在CHO培养基中的1:2000抗生蛋白链菌素-辣根过氧化物酶(抗生蛋白链菌素-HRP)，并在37℃/5%CO₂下温育30-60 min。将平板用PBS + 0.05%吐温20洗涤5次。加入100µl/孔的TMB显色底物。通过加入50µl/孔的1M磷酸，停止显色。使用ELISA平板读数器在A450 - A620测量光密度(O.D.)。

与小鼠Hpd-.08A mAb对应的DNA序列的克隆和鉴别

如US 8,354,509所述，鉴别小鼠VH和VL链的DNA序列和编码它们的CDR的DNA序列[参见，US 8,354,509的表IV；直接在下面的表2中提供]。

实施例3

小鼠抗-人PD-1单克隆抗体的犬化

为了执行犬化过程，确定了编码犬IgG的重链和轻链的DNA序列。犬重链和轻链的DNA和蛋白序列是本领域已知的，且可以通过检索NCBI基因和蛋白数据库得到。狗IgG存在4种已知的IgG亚型，且它们被称作IgG-A、IgG-B、IgG-C和IgG-D。在犬抗体中存在两类轻链，被称作κ和λ。表3列出了本发明的经修饰的犬重(IgG-A、IgG-B、IgG-D)和轻(κ)抗体链的氨基酸和核酸序列，所述抗体链包含表2的鼠抗-人PD-1 CDR。

犬化的抗PD-1抗体的构建

不受任何特定方法约束，生产具有不同犬和小鼠序列含量的犬化抗-PD-1 mAb变体的方法包括以下一般方案：

i) 确定小鼠mab的VH和VL链的DNA序列

ii) 鉴别小鼠mab的H和L链CDR

iii) 鉴别犬IgG的合适H和L链

iv) 写下犬IgG H和L链的DNA序列

v) 用编码各个小鼠CDR的DNA序列替换编码内源性狗H和L链CDR的DNA序列。并且，任选地用来自对应的小鼠框架区的选定残基替换一些犬框架残基

vi) 合成来自步骤(v)的DNA，并将它克隆进合适的表达质粒中

vii) 将质粒转染进HEK 293细胞中

viii) 从HEK 293上清液纯化表达的抗体

ix) 测试纯化的抗体对犬PD-1的结合

上述步骤产生了一组具有不同犬和小鼠序列含量的变体抗体。本发明将包含SEQID NO: 28和SEQ ID NO: 32或34的犬化鼠抗-人PD-1抗体鉴别为具有与犬PD-1特别紧密的结合。

全长犬PD-1 DNA序列: 信号序列标有下划线且以粗体显示

核苷酸序列SEQ ID NO: 1没有信号序列；且

核苷酸序列SEQ ID NO: 35包括信号序列。

全长犬PD-1氨基酸序列: 信号序列标有下划线且以粗体显示

氨基酸序列SEQ ID NO: 2没有信号序列；且

氨基酸序列SEQ ID NO: 36包括信号序列。

犬PD-1细胞外结构域DNA序列: SEQ ID NO: 3 (为在CHO细胞中的表达经过密码子优化)

犬PD-1细胞外结构域: SEQ ID NO: 4：

犬PD-1细胞外结构域- 人IgG1 Fc DNA序列: SEQ ID NO: 5 (为在HEK-293细胞中的表达经过密码子优化)

犬PD-1细胞外结构域- 人IgG1 Fc融合蛋白: 信号序列标有下划线且以粗体显示: SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 53包括信号序列。

全长犬PD-L1 DNA序列: 信号序列标有下划线且以粗体显示

核苷酸序列SEQ ID NO: 7没有信号序列；且

核苷酸序列SEQ ID NO: 37包括信号序列。

全长犬PD-L1: 信号序列标有下划线且以粗体显示

氨基酸序列SEQ ID NO: 8没有信号序列；且

氨基酸序列SEQ ID NO: 38包括信号序列。

犬PD-L1细胞外结构域DNA序列: SEQ ID NO: 9 (为在CHO细胞中的表达经过密码子优化)

犬PD-L1细胞外结构域蛋白: SEQ ID NO: 10

犬PD-L1细胞外结构域- 人IgG1 Fc DNA序列: SEQ ID NO: 11 (为在HEK-293细胞中的表达经过密码子优化)

犬PD-L1细胞外结构域- 人IgG1 Fc融合蛋白: SEQ ID NO: 12

08A VH: CDR H1 DNA: SEQ ID NO: 13:

08A VH: CDR H1蛋白: SEQ ID NO: 14:

08A VH: CDR H2 DNA: SEQ ID NO: 15:

08A VH: CDR H2蛋白: SEQ ID NO: 16:

08A VH: CDR H3 DNA: SEQ ID NO: 17:

08A VH: CDR H3蛋白: SEQ ID NO: 18:

08A VL: CDR L1 DNA: SEQ ID NO: 19:

08A VL: CDR L1蛋白: SEQ ID NO: 20:

08A VL: CDR L2 DNA: SEQ ID NO: 21:

08A VL: CDR L2蛋白: SEQ ID NO: 22:

08A VL: CDR L3 DNA: SEQ ID NO: 23:

08A VL: CDR L3蛋白: SEQ ID NO: 24:

犬化鼠抗-人PD-1抗体08A

canVH-canIgGB-Fc (12G8信号序列标有下划线且以粗体显示): 重链

核苷酸序列SEQ ID NO: 27没有信号序列；且

核苷酸序列SEQ ID NO: 41包括信号序列。

氨基酸序列SEQ ID NO: 28没有信号序列；且

氨基酸序列SEQ ID NO: 42包括信号序列。

canVH-canIgGA-Fc (12G8信号序列标有下划线且以粗体显示): 重链

核苷酸序列SEQ ID NO: 25没有信号序列；且

核苷酸序列SEQ ID NO: 39包括信号序列。

氨基酸序列SEQ ID NO: 26没有信号序列；且

氨基酸序列SEQ ID NO: 40包括信号序列。

canVH-canIgGD-Fc (12G8信号序列标有下划线且以粗体显示): 重链

核苷酸序列SEQ ID NO: 29没有信号序列；且

核苷酸序列SEQ ID NO: 43包括信号序列。

氨基酸序列SEQ ID NO: 30没有信号序列；且

氨基酸序列SEQ ID NO: 44包括信号序列。

canVL-canκ(1022)xHGF信号序列标有下划线且以粗体显示: 轻链

核苷酸序列SEQ ID NO: 33没有信号序列；且

核苷酸序列SEQ ID NO: 47包括信号序列。

氨基酸序列SEQ ID NO: 34没有信号序列；且

氨基酸序列SEQ ID NO: 48包括信号序列。

canVL-canκ(1011)(xHGF信号序列标有下划线且以粗体显示:轻链

核苷酸序列SEQ ID NO: 31没有信号序列；且

核苷酸序列SEQ ID NO: 45包括信号序列。

氨基酸序列SEQ ID NO: 32没有信号序列；且

氨基酸序列SEQ ID NO: 46包括信号序列。

实施例4

对PD-1特异性的突变体犬IgG-B抗体

狗IgG存在4种已知的IgG重链亚型，它们被称作IgG-A、IgG-B、IgG-C和IgG-D。两种已知的轻链亚型被称作λ和κ。但是，除了犬免疫细胞的结合和活化以外，针对PD-1的犬或犬化抗体最佳地具有两种属性：

2. 使用工业标准技术（诸如基于Protein A层析的技术）容易地大规模纯化。

没有天然存在的犬IgG同种型满足两个标准。例如，IgG-B可以使用Protein A进行纯化，但是具有高水平的ADCC活性。IgG-C也具有相当的ADCC活性。另一方面，IgG-A微弱地结合Protein A，但是表现出不希望的ADCC活性。此外，IgG-C和IgG-D都不可以在Protein A柱上纯化，尽管IgG-D没有表现出ADCC活性。本发明通过提供对PD-1特异性的突变体犬IgG-B抗体而克服了该困难；这样的抗体缺少效应子功能诸如ADCC，且可以使用工业标准Protein A层析容易地纯化。确切的修饰显示在图4中。

描述的具有降低的效应子功能的IgG-B变体包括：第一种IgG-B变体，其中赖氨酸(D 277)和天冬酰胺(N 325)残基各自被突变成丙氨酸残基[cIgGB(-) ADCC]；第二种变体，其中IgG-B的铰链区被IgG-D的铰链区[cIgGB(+) D-铰链]替代；和第三种变体，其中IgG-B的铰链区被IgG-A的铰链区[cIgGB(+) A-铰链]替代。另外，第二种和第三种变体也包括用丙氨酸残基替代第一种变体的相同赖氨酸和天冬酰胺残基。在本发明中突变的赖氨酸和天冬酰胺残基的编号是基于Tang等人[Vet Immunol and Immunopathol, 80:259-270 (2001)]中关于犬IgG重链所述的编号方案。

犬IgGB wt

犬IgGB(+)A-铰链

犬IgGB(+)D-铰链

犬IgGB(-)ADCC

。

本文中引用的所有参考文献都通过引用并入如同每篇单独的出版物、数据库条目(例如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利被明确地且单独地指出通过引用并入。申请人根据37 C.F.R. §1.57(b)(1)意图用该通过引用并入的声明来表示每个和每篇单独的出版物、数据库条目(例如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利，它们中的每一个按照37 C.F.R. §1.57(b)(2)清楚地鉴别即使这样的引用不紧接于通过引用并入的专门声明。如果包含的话，在说明书中包含的通过引用并入的专门声明不以任何方式弱化该通过引用并入的一般声明。本文中对参考文献的引用无意承认：所述参考文献为有关的现有技术，其也不构成关于这些出版物或文件的内容或日期的任何承认。

本发明在范围上不受本文描述的具体实施方案限制。实际上，除了本文描述的那些内容以外，本领域技术人员从前述描述和附图会明白本发明的不同改变。这样的改变意图落入所附权利要求的范围内。

前述书面说明被认为足以使本领域技术人员能实践本发明。除了本文显示和描述的那些内容以外，本领域技术人员从前述描述会明白本发明的不同改变，并且所述改变落入所附的权利要求的范围内。

Claims

1.一种分离的犬化抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合程序性细胞死亡受体1(PD-1)，其中所述抗体包含SEQ ID NO: 28的犬IgG重链和SEQ ID NO: 34的犬κ轻链；其中所述犬κ轻链包含三个轻链互补决定区(CDR)：CDR轻链1 (CDRL1)、CDR轻链2 (CDRL2)和CDR轻链3 (CDRL3)；且所述犬IgG重链包含三个重链CDR：CDR重链1 (CDRH1)、CDR重链2(CDRH2)和CDR重链3 (CDRH3)；

其中所述CDRL1由SEQ ID NO: 20的氨基酸序列组成，所述CDRL2由SEQ ID NO: 22的氨基酸序列组成，所述CDRL3由SEQ ID NO: 24的氨基酸序列组成，所述CDRH1由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成；所述CDRH2由SEQ ID NO: 16的氨基酸序列组成；且所述CDRH3由SEQID NO: 18的氨基酸序列组成；

其中所述抗体和其抗原结合片段结合犬PD-1并阻断犬PD-1与犬程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的结合。

2.一对分离的核酸，其中一种核酸编码权利要求1的犬化抗体的轻链，且另一核酸编码权利要求1的犬化抗体的重链。

3.权利要求2的一对分离的核酸，其包含SEQ ID NO: 27和SEQ ID NO: 33的核苷酸序列。

4.一种表达载体，其包含权利要求2或3的一对分离的核酸。

5.一种宿主细胞，其包含一种或多种权利要求4的表达载体。

6.一种药物组合物，其包含权利要求1的抗体或抗原结合片段、权利要求2或3的一对核酸、权利要求4的表达载体、或它们的任意组合和药学上可接受的载体或稀释剂。

7.权利要求6的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于增加免疫细胞的活性的方法，所述方法包括：给有此需要的受试者施用治疗有效量的权利要求6的药物组合物。

8.权利要求7的用途，其中所述方法用于：

a. 治疗癌症；

b. 治疗感染或感染性疾病；或者

c. 作为疫苗佐剂。

9.一种生产特异性地结合PD-1的犬化抗体或其抗原结合片段的方法，其包括：

a. 在其中表达核酸的条件下在培养基中培养权利要求5的宿主细胞，由此生产包含轻链可变区的多肽、包含重链可变区的多肽、或包含轻链可变区的多肽和包含重链可变区的多肽；和

b. 从所述宿主细胞或培养基回收所述多肽。