MX2012009460A - Polipeptidos biparatopicos de union abeta. - Google Patents

Polipeptidos biparatopicos de union abeta.

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Abstract

La invención se refiere a polipéptidos biparatópicos de unión A-beta y, más específicamente, a polipéptidos biparatópicos de unión A-beta que comprenden al menos dos dominios de inmunoglobulina individuales variables que se unen con diferentes epitopes de A-beta. La invención también se refiere a secuencias específicas de estos polipéptidos, a métodos para su producción, y a métodos para su uso, incluyendo métodos de tratamiento de enfermedades tales como la enfermedad de Alzheimer.

Description

POLIPÉPTIDOS BIPARATÓPICOS DE UNIÓN ABETA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a nuevos polipéptidos de unión al péptido beta-amiloide (en lo sucesivo: "A-beta"), comprendiendo los polipéptidos dominios de inmunoglobulinas específicos. La invención también se refiere a ácidos nucleicos que codifican dichos polipéptidos; a métodos para preparar dichos polipéptidos; a células hospedadoras que expresan o capaces de expresar dichos polipéptidos; a composiciones que comprenden dichos polipéptidos; y a usos de dichos polipéptidos o dichas composiciones, en particular para fines profilácticos, terapéuticos y de diagnóstico.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Varias enfermedades neurales degenerativas se producen por el plegamiento o procesamiento inapropiado de proteínas o por priones, produciéndose en ambos casos deposiciones neurales invasivas conocidas como placas amiloides. Probablemente, la enfermedad neural degenerativa más conocida es la Enfermedad de Alzheimer (EA).
La incidencia de EA asegura una necesidad médica urgente y no satisfecha: entre 10 y 40% de todas las personas con edades comprendidas entre los 65 y los 85 años desarrollan EA. Además, este segmento de la población sigue creciendo exponencialmente. Por lo tanto, desde el punto de vista humano, así como desde el punto de vista social y económico, es imprescindible encontrar formas para diagnosticar y tratar de manera eficaz este trastorno devastador. En relación con el tratamiento, se necesitan fármacos no solo para ralentizar o detener la progresión de la enfermedad, sino también para restaurar las lesiones cerebrales que ya se han producido durante las fases iniciales de EA (antes del diagnóstico). En este momento no son eficaces ni el diagnóstico precoz ni el tratamiento terapéutico.
La EA se define como una demencia que coincide con la presencia en el cerebro de placas amiloides extracelulares, compuestas principalmente por péptidos amiloides, y por ovillos neurofibrilares intracelulares (NFT) compuestos principalmente por la proteína tau.
Un componente principal de las placas amiloides características de la EA es el péptido beta amiloide (A-beta), un péptido muy insoluble de 39-43 aminoácidos (aa) de longitud que tiene una fuerte predisposición a adoptar a estructuras de lámina beta, oligomerizar y formar agregados de proteína. El A-beta se produce a partir de la proteína precursora de A-beta (APP) por dos acontecimientos proteolíticos. Una actividad beta-secretasa escinde APP en el extremo N de A-beta ("sitio beta") entre los aminoácidos Met-671 y Asp-672 (usando la numeración de la isoforma de 770 aa de APP). La escisión en el sitio beta produce un fragmento de APP asociado a la membrana de 99 aa (C99). Un segundo sitio dentro del dominio transmembrana de C99 ("sitio gamma") después puede escindirse por una gamma-secretasa para liberar A-beta. Como alternativa, APP puede escindirse dentro de su región A-beta, predominantemente en el sitio de escisión por la alfa-secretasa de APP, para producir un fragmento de APP C-terminal de 83 aa (C83), que también puede escindirse adicionalmente por la gamma-secretasa para producir un péptido secretado soluble pequeño, p3. Esta ruta reduce la posible acumulación de A-beta.
El A-beta intra- y extracelular adopta una conformación de lámina beta y forma intermedios denominados ADDL (ligandos difusibles derivados de amiloide) y protofibrillas, y finalmente precipita en forma de fibrillas de amiloide que se unen formando placas amiloides. En estos procesos, se supone que el péptido A-beta (1-42) más hidrófobo (véase más adelante) sirve como agente de nucleación alrededor del cual crecen las placas de forma continuada.
Se han implicado varias mutaciones de sentido erróneo APP en formas de EA familiar de inicio prematuro. Todas estas están en uno de los sitios de escisión canónicos de APP o cerca de ellos. De esta manera, la doble mutación Swedish (K670N/M671L) está inmediatamente adyacente al sitio de escisión de la beta-secretasa y aumenta la eficacia de la actividad de la beta-secretasa, dando como resultado la producción de más A-beta total. Cualquiera de tres mutaciones en el resto 717 de APP, cerca del sitio de escisión de la gamma-secretasa, aumenta la proporción de una forma de 42 aa más amiloidogénica de A-beta, también denominada A-beta (1-42), con respecto a la forma de 40 aa más común, A-beta (1-40).
Se han descrito dos mutaciones adicionales de APP que están próximas pero no adyacentes al sitio alfa. Una mutación (A692G, resto 21 de A-beta) en una familia flamenca y una mutación (E693Q, resto 22 de A-beta) en un familia holandesa se han implicado en distintas formas de EA familiar. La mutación Flemish (flamenca), en particular, se presenta como un síndrome de hemorragias intracerebrales repetitivas o como una demencia de tipo EA. Los descubrimientos neuropatológicos incluyen placas seniles en la corteza y el hipocampo, y normalmente múltiples depósitos amiloides en las paredes de los microvasos cerebrales.
Hace varios años se ha demostrado que la aspartil proteasa asociada a la membrana, BACE (también denominada memapsina o Asp2) presenta propiedades esperadas de una beta-secretasa. Esta enzima escinde APP en su sitio beta y entre Tyr-10 y Glu-11 de la región de A-beta con eficacia comparable. Los fragmentos de A-beta escindidos en este último sitio se han observado en placas amiloides en casos de EA y en medios de células de riñon embrionario humano HEK293 transfectadas con APP. Varios grupos también observaron la presencia en la base de datos de una aspartil proteasa adicional, BACE2 (también denominada Asp1), un homólogo próximo de BACE (también denominada ahora BACE1). BACE2 escinde APP en su sitio beta y más eficazmente en sitios dentro de la región de A-beta de APP, después de Phe-19 y Phe-20 de A-beta. Estos sitios de A-beta internos están adyacentes a la mutación de APP Flemish en el resto 21 , y esta mutación aumenta notablemente la proporción del producto de escisión del sitio beta generado por BACE2. Las mutaciones del sitio beta conservativas de APP que aumentan (la mutación Swedish) o inhiben (M671V) la actividad de la beta-secretasa afectan a la actividad de BACE1 y BACE2 de forma similar. BACE2, al igual BACE1 , proteoliza APP de forma máxima a pH ácido.
Las mutaciones en el gen de APP o en el gen de la presenilina 1 (PS1) (que llevan la actividad "gamma-secretasa") producen EA familiar de inicio prematuro. Son ejemplos de mutaciones de APP las mutaciones 'Swedish' y 'London' (717) mencionadas anteriormente localizadas respectivamente cerca de los sitios de escisión de la beta- y gamma-secretasa. Estas mutaciones aumentan la formación de péptidos A-beta y especialmente de A-beta (1-42) y, por lo tanto, aumentan la formación de agregados y placas amiloides. Aunque se cree que las placas inicialmente son un desencadenante importante para el desarrollo de la EA, los estudios actuales subrayan el papel de las protofibrillas y ADDL como componentes tóxicos principales. Incluso es concebible que las placas sean un mecanismo por el que los péptidos neurotóxicos actualmente se están volviendo biológicamente inactivos.
Puede adquirirse más información sobre enfermedades neurodegenerativas y sobre el papel de A-beta en las mismas en Wisniewski & Konietzko (2008), Lancet Neurol. 7(9), 805-811 , Spires-Jones et al. (2009), Neurobiology of Disease, 213-220, y Lichlen & Mohajeri (2008), Journal of Neurochem. 104, 859-874.
La mayoría de los tratamientos actuales de la EA se dirigen a la deficiencia de acetilcolina usando inhibidores de acetilcolinesterasa tales como donepezil (Aricept®), galantamina (Reminyl®) y rivastigmina (Exelon®) que están registrados para el tratamiento de la EA de leve a moderada. El donepezil también está aprobado para la Demencia de tipo Alzheimer (DTA) en los Estados Unidos y en Canadá. El déficit de acetilcolina refleja la degeneración de neuronas colinérgicas del prosencéfalo basal y parece correlacionarse bien con las manifestaciones neuropsiquiátricas de la enfermedad. El tratamiento con inhibidores de acetilcolinesterasa tiene algunos efectos beneficiosos (una eficacia coherente y significativa pero modesta sobre medidas clínicas de cognición y función global), pero no puede curar o detener la progresión de la enfermedad, por lo que la etiología de la neurodegeneración se deja sin tratar.
La memantina (Axura®, Namenda®, Ebixa®; Merz Pharmaceuticals) es un antagonista del receptor NMDA que mostró un mejor resultado que el placebo en los dominios clínicos cognición, actividades de la vida diaria y respuesta clínica global en pacientes con EA con enfermedad de Alzheimer de moderada a severa. La memantina sigue siendo una terapia sintomática que está aprobada para la enfermedad de Alzheimer de moderada a severa únicamente. Ni cura ni detiene la progresión de la enfermedad. Se ha demostrado que una combinación de memantina e inhibidores de acetilcolinesterasa tiene una eficacia superior en la DTA de moderadamente severa a severa, pero no en el estadio de la enfermedad de leve a moderado. Algunas estrategias terapéuticas experimentales actuales se centran en A-beta como diana. Hay tres líneas de investigación principales: a) El desarrollo de moléculas pequeñas (con frecuencia peptidomiméticos) denominados disruptores de láminas beta, que están diseñadas para interferir con la estructura de lámina beta de los agregados de péptido amiloide. Se ha demostrado que un "disruptor de láminas beta" estable, cuando se administra a un modelo de ratón transgénico de EA, puede atravesar la barrera hematoencefálica y reducir el número de placas (Permanne et al. (2002), FASEB J. 16, 860-862). Aún no se ha demostrado si es este enfoque da como resultado una protección y/o restauración cognitiva. b) El desarrollo de moléculas pequeñas que inhiben el procesamiento proteolítico de APP en péptidos amiloides. Los inhibidores de la beta- o gamma-secretasa bloquearían eficazmente la formación de A-beta y, por lo tanto, protegerían al cerebro de los efectos neurotóxicos del amiloide. No se esperan efectos sobre la carga de A-beta cerebral ya existente, tal como las placas amiloides que se han acumulado durante años. c) Vacunación pasiva y activa contra A-beta. Esta línea de estrategia empezó con la observación por Schenk et al. (1999), Nature 400, 173-177, de que la vacunación de ratones EA transgénicos con A-beta (1-42) impedía la formación de placas amiloides. En un primer experimento, la vacunación mensual de ratones adultos jóvenes (6 semanas de edad) prevenía esencialmente la formación de placas y la reacción inflamatoria concomitante en el cerebro, es decir, la ausencia de placas amiloides, de astrocitosis y microgliosis. La vacunación empezando en una edad posterior, cuando las placas amiloides ya se habían establecido, dio como resultado una eliminación parcial. Posteriormente, se demostró que la vacunación con A-beta mejoraba los déficits conductuales y de memoria como se medía en los ensayos de memoria con laberinto de agua.
Dados los efectos secundarios de la vacunación con A-beta entero, se han diseñado péptidos más cortos alternativos y se han usado para vacunar ratones transgénicos. Los ensayos clínicos sugirieron que la inmunización activa con A-beta es terapéuticamente activa, como se demuestra por la inducción de la eliminación de placas, la atenuación de la patología relacionada con las placas, la reducción de los niveles de tau y la ralentización del deterioro cognitivo de los pacientes. Sin embargo, un número significativo de pacientes desarrollaron meningoencefalítis autoinmune, producida principalmente por la infiltración de linfocitos T autorreactivos en el cerebro en respuesta a una inmunización activa (Ferrer et al. (2004), Brain Pathol. 14, 11-20; Nicoll et al. (2003), Nat. Med. 9, 448-452; Masliah et al. (2005), Neurology 64, 1553-1562).
Como alternativa a las estrategias de inmunización activa, pueden administrarse anticuerpos dirigidos contra A-beta a un paciente. Se demostró que dicha estrategia de inmunización pasiva era satisfactoria para reducir la carga de A-beta cerebral en ratones EA transgénicos (DeMattos et al. (2001), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98, 8850-8855). Los mecanismos subyacentes siguen estando abiertos a la especulación ya que se pensó que era poco probable que los anticuerpos pudieran atravesar la barrera hematoencefálica y dirigirse a las placas presentes en el cerebro. Por lo tanto, los autores sugirieron que el anticuerpo creaba un 'sumidero de A-beta' en el plasma que sacaba el A-beta del cerebro. Posteriormente, usando gelsolina y gangliósido 1 , se demostró que cualquier ligando de unión a A-beta tiene la posibilidad de reducir la carga amiloide en ratones EA transgénicos sin atravesar la barrera hematoencefálica (Matsuoka et al. (2003) J. Neuroscience 23, 29-33). La inmunización pasiva a corto plazo (24 horas) parecía restaurar los déficit cognitivos de ratones EA transgénicos incluso sin afectar a la carga amiloide cerebral total (Dodart et al. (2002) Nature Neuroscience 5, 452-457). El resultado sugeriría que agregados más pequeños, aunque solubles, de A-beta se fijan como objetivo primero por algunos anticuerpos, y también que estas son las formas más tóxicas de A-beta. Por lo tanto, la eliminación de A-beta protofibrilar podría restaurar la memoria, al menos en ratones transgénicos para APP.
El anticuerpo monoclonal anti-A-beta humanizado bapineuzumab (un análogo del anticuerpo de ratón anti-A-beta conocido como "3D6") mientras tanto se ha introducido en ensayos clínicos. Sin embargo, los primeros datos presentados a partir de un ensayo de Fase II mostraron resultados mixtos: Se observaron efectos estadísticamente significativos sobre varios criterios de valoración de eficacia en no portadores de ApoE4 únicamente. Además, el bapineuzumab se toleraba bien y era seguro en los no portadores de ApoE4, mientras que en los portadores de ApoE4, se observaban acontecimientos adversos graves en los pacientes tratados con bapineuzumab con más frecuencia que en el brazo de placebo. Además, se han observado acontecimientos de edema vasogénico. También se ha descrito la inducción de microhemorragias cerebrales preclínicamente en ratones transgénicos para APP.
Se sospecha que los anticuerpos convencionales (que contienen una parte Fe) usados en las inmunizaciones pasivas anti-A-beta son responsables de la inducción de edema vasogénico o de microhemorragias observadas en modelos humanos y animales, que están asociadas con la fijación como objetivo de depósitos de A-beta vasculares cerebrales (angiopatía amiloide cerebral) que conduce a microhemorragias a través de ADCC y/o CDC (Wilcock, DM, Colton, CA, CNS Neurol. Disord. Drug Targets (2009) Vol. 8(1): 50-64).
Finalmente, se supone que la afinidad de unión de aproximadamente 2.5 nM de este anticuerpo, medida por Biacore, es demasiado baja para inducir un "efecto sumidero periférico" eficaz.
Otro anticuerpo anti-A-beta, solanezumab (anticuerpo humanizado m266; LY-2062430), también se ha introducido en ensayos clínicos. La reducción máxima de carga de placas que pudo conseguirse, según se publicó, fue de aproximadamente 60%. Además, la especificidad de este anticuerpo se limita a A-beta soluble, de forma que no puede esperarse la unión de agregados o placas.
Un tercer anticuerpo anti-A-beta, ponezumab (PF4360365), solo se une a moléculas de A-beta(x-40) y no a moléculas de A-beta(x-42), suponiéndose que estas últimas son las especies de A-beta (más) patógenas. Su afinidad es incluso menor que la afinidad de bapineuzumab, y el riesgo de microhemorragias cerebrales aún no puede descartarse debido a su capacidad unirse a placas de A-beta en vasos sanguíneos, junto con una actividad ADCC/CDC residual de su parte Fe.
En resumen, lo anterior demuestra que aunque la unión y la eliminación de A-beta por anticuerpos (clásicos) parece ser un modo de acción atractivo para el desarrollo de agentes terapéuticos para el tratamiento de, por ejemplo EA, otras características y efectos de dichas ¡nmunoglobulinas que aún no se han esclarecido completamente, tales como las implicaciones farmacológicas de su propiedad de unirse a ciertas formas de A-beta, hacen que sea mucho más difícil de lo que se habría asumido inicialmente encontrar y desarrollar anticuerpos terapéuticos seguros y eficaces.
También se han descrito en la técnica fragmentos de anticuerpo, tales como anticuerpos de dominio variable individual de inmunoglobulina o dominios VHH (como se define más adelante), que tienen especificidad por A-beta: documentos WO2004/44204; WO2006/40153; WO2007/35092; WO2008/122441; y WO2009/04494. Las características de unión de VHH sintetizados por los presentes inventores de acuerdo con las publicaciones WO anteriores no fueron satisfactorias, razón por la que se supone que no entraron en el desarrollo clínico.
El documento WO09/149185 describe las denominadas construcciones DVD, y, entre otras, construcciones DVD que tienen especificidad de unión a A-beta. Después de la combinación de dos dominios variables anti-A-beta diferentes en dichas construcciones DVD, se mantuvo la unión de los anticuerpos parentales, pero no se observó ningún aumento en afinidad por esta combinación. Además, las construcciones DVD descritas contienen una parte Fe que está presente en los anticuerpos "clásicos", de forma que no pueden evitarse los efectos secundarios producidos por las funciones efectoras de Fe, tales como la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (véase anteriormente).
El diagnóstico definitivo de EA aún requiere un examen patológico post-mortem del cerebro para demostrar la presencia de placas amiloides, ovillos neurofibrilares, pérdida sináptica y degeneración neuronal. Este es esencialmente el mismo procedimiento definido por Alois Alzheimer en 1906. En 1984, el National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke Alzheimer's Disease and Related Disorders Association (NINCDS-ADRDA) estableció criterios formales para el diagnóstico de EA (revisado en Petrella et al. (2003), Radiology 226, 315-336). Los pacientes que cumplían todos los criterios siguientes recibían un diagnóstico de EA probable: demencia demostrada por examen y ensayo (por ejemplo, Ensayo Mini-Mental, Escala de Demencia de Blessed, o ensayos similares), pérdida de memoria y al menos otra función cognitiva, consciencia normal, inicio entre 40 y 90 años de edad, y ausencia de signos de otras enfermedades que producen demencia (criterio de exclusión). Un deterioro cognitivo progresivo y gradual sin una causa identificable se diagnosticará como una posible EA. Una EA probable se define adicionalmente como una demencia leve en sus primeras fases), moderada (en fases intermedias) o severa (en fases tardías). Se usa un análisis de laboratorio para definir objetivamente o excluir causas alternativas de demencia. Los ensayos ELISA de A-beta (1-42) y fosfo-tau en líquido cefalorraquídeo (CSF), junto con la genotipificación para ApoE4 (un factor genético de predisposición) parecen ser sensibles y específicos. Sin embargo, los métodos no se pueden aplicar ampliamente debido a la punción invasiva del CSF, lo que impide que esto se convierta una exploración rutinaria. El ELISA para la proteína de cadena neural (AD7C-NTP) (desarrollada por Nymox) demostró mayores niveles en orina de pacientes con EA que en pacientes sin demencia EA o controles sanos. Sin embargo, los niveles medios fueron significativamente menores en los casos con EA prematura, lo sugiere que el ensayo no es fiable para el ensayo del inicio prematuro de EA.
Aún no hay un método bioquímico adecuado para el diagnóstico firme de las primeras fases de EA, sino que más bien simplemente ayudan a confirmar el diagnóstico clínico de los casos avanzados. Claramente, se necesitan técnicas más avanzadas para permitir un diagnóstico prematuro antes del inicio de los síntomas clínicos que indican una lesión cerebral irreversible.
Finalmente, no solo para fines de diagnóstico sino también, por ejemplo, en la investigación preclínica y el desarrollo, las moléculas de unión a A-beta son útiles como herramientas de investigación. Se usan ampliamente los anticuerpos ya mencionados anteriormente, es decir, el anticuerpo 3D6 y el anticuerpo m266. El anticuerpo 3D6 se une a A-beta con una afinidad relativamente baja y, por lo tanto, puede no ser adecuado para todos los fines. El anticuerpo m266 presenta reacción cruzada con versiones truncadas N-terminalmente de A-beta, tales como p3, lo que no permite distinguir entre especies de A-beta relevantes para la enfermedad, tales como A-beta(1-40) y A-beta(1-42), y otras moléculas tales como p3.
En vista de lo anterior, es un objeto de la invención proporcionar agentes farmacológicamente activos, así como composiciones que los comprenden, que puedan usarse en la prevención, tratamiento, alivio y/o diagnóstico de enfermedades, trastornos o afecciones asociadas con A-beta y/o mediadas por A-beta, tales como EA, y proporcionar métodos para la prevención, tratamiento, alivio y/o diagnóstico de dichas enfermedades, trastornos o afecciones, que impliquen el uso y/o administración de dichos agentes y composiciones. Dichos agentes también pueden ser útiles para realizar investigaciones en el campo de la EA en general y, específicamente, en el esclarecimiento de los mecanismos de la enfermedad EA y posibles mecanismos terapéuticos y/o profilácticos.
En particular, es un objeto de la invención proporcionar dichos agentes farmacológicamente activos, composiciones y/o métodos que proporcionen ciertas ventajas en comparación con los agentes, composiciones y/o métodos usados actualmente y/o conocidos en la técnica. Estas ventajas incluyen mejores propiedades terapéuticas y/o farmacológicas y/u otras propiedades ventajosas (tales como, por ejemplo, mayor facilidad de preparación y/o menores costes de los artículos), especialmente en comparación con los anticuerpos convencionales contra A-beta o fragmentos de los mismos como los descritos en la sección anterior. Otras ventajas serán evidentes tras la descripción adicional presentada más adelante.
Más en particular, es un objeto de la invención proporcionar nuevas moléculas de unión a A-beta y, específicamente, polipéptidos de unión a mamíferos y, especialmente a A-beta humano, donde dichas moléculas o polipéptidos son adecuados para los fines anteriores de diagnóstico, terapéutico e investigación.
LA INVENCIÓN De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporcionan polipéptidos que comprende un primer dominio variable individual de inmunoglobulina que se une específicamente a un primer epítopo de A-beta, y un segundo dominio variable individual de inmunoglobulina que se une específicamente a un segundo epítopo de A-beta, donde dicho primer y dicho segundo epítopos de A-beta no son epítopos idénticos, es decir, son epítopos diferentes, tales como, por ejemplo, el epítopo N-terminal (SEC ID N°: 3) por una parte y el epítopo central (SEC ID N°: 4) por otra parte.
Preferiblemente, dichos primer y segundo dominios variables individuales de inmunoglobulina consisten esencialmente en cuatro regiones flanqueantes (FR1 a FR4, respectivamente) y tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), donde dicho primer y dicho segundo dominios variables individuales de inmunoglobulina están unidos covalentemente por un péptido enlazador, donde dicho péptido enlazador comprende opcionalmente o consiste en un tercer dominio de inmunoglobulina, tal como, por ejemplo, un tercer dominio variable individual de inmunoglobulina.
Además, dicho primer y dicho segundo dominios variables individuales de inmunoglobulina preferiblemente son dominios de anticuerpo, más preferiblemente dominios VHH, e incluso más preferiblemente dominios VHH humanizados.
Los dominios variables individuales de inmunoglobulina comprendidos en dicho polipéptido de la invención típicamente tendrán la estructura FR (1)1 - CDR (1)1 - FR (1)2 - CDR (1)2 - FR (1)3 - CDR (1)3 - FR (1)4, y FR (2)1 - CDR (2)1 - FR (2)2 - CDR (2)2 - FR (2)3 - CDR (2)3 - FR (2)4, respectivamente. Preferiblemente, CDR (1 )3 se selecciona entre el grupo que consiste en: - las secuencias de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N°: 13 y SEC ID N°: 16; y - secuencias de aminoácidos que tienen hasta tres, preferiblemente hasta dos y más preferiblemente una diferencia de aminoácidos en comparación con dichas secuencias de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N°: 13 o la SEC ID N°: 16, respectivamente; y CDR(2)3 se selecciona entre el grupo que consiste en: - la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N°: 19; y - secuencias de aminoácidos que tienen hasta tres, preferiblemente hasta dos y más preferiblemente una diferencia de aminoácidos en comparación con dicha secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N°: 19.
Como alternativa, CDR(1)3 se selecciona entre el grupo que consiste en: - la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N°: 19; y - secuencias de aminoácidos que tienen hasta tres, preferiblemente hasta dos y más preferiblemente una diferencia de aminoácidos en comparación con dicha secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N°: 19; y CDR(2)3 se selecciona entre el grupo que consiste en: - las secuencias de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N°: 13 y SEC ID N°: 16; y - secuencias de aminoácidos que tienen hasta tres, preferiblemente hasta dos y más preferiblemente una diferencia de aminoácidos en comparación con dichas secuencias de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N°: 13 o la SEC ID N°: 16, respectivamente.
Los polipéptidos especialmente útiles de la invención incluirán las siguientes secuencias de CDR (numeración como se indica en el párrafo anterior): - CDR(1)1 : SEC ID N°: 11.
-CDR(1)2: SEC ID N°: 12. -CDR(1)3: SECIDN0: 13. -CDR(2)1: SEC ID N°: 17. -CDR(2)2: SECIDN0: 18. -CDR(2)3: SECID 0: 19. o: -CDR(1)1: SEC ID N°: 14. -CDR(1)2: SECIDN0: 15. -CDR(1)3: SECIDN0: 16. -CDR(2)1: SECIDN0: 17. -CDR(2)2: SEC ID N°: 18. -CDR(2)3: SEC ID N°: 19. o: -CDR(1)1: SECIDN0: 17. CDR(1)2: SEC ID N°: 18. CDR(1)3: SEC ID N°: 19. CDR(2)1: SEC ID N°: 11. CDR(2)2: SEC ID N°: 12. CDR(2)3: SEC ID N°: 13. f CDR(1)1: SEC ID N°: 17. CDR(1)2: SEC ID N°: 18. CDR(1)3: SEC ID N°: 19. CDR(2)1: SEC ID N°: 14. CDR(2)2: SECIDN0: 15. - CDR(2)3: SEC ID N°: 16.
De acuerdo con una realización específica de la invención, los polipéptidos de la invención comprenden, como un primer dominio variable individual de inmunoglobulina, el dominio VHH ABII035 (SEC ID N°: 44), y como segundo dominio variable individual de inmunoglobulina, el dominio VHH ABII059 (SEC ID N°: 45), o viceversa.
En una realización especialmente preferida, dicho polipéptido de la invención comprende además un resto de amplificación de la semivida, preferiblemente unido covalentemente a dicho polipéptido, tal como un resto de unión a albúmina (por ejemplo, un dominio de inmunoglobulina anti-albúmina), un resto de unión a transferrina (por ejemplo, un dominio de inmunoglobulina anti-transferrina), una molécula de polietilenglicol, una molécula de polietilenglicol recombinante, albúmina de suero humano, un fragmento de albúmina de suero humano y un péptido de unión a albúmina.
Son realizaciones muy especificas de la invención los polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la SEC ID N°: 26 a 31 (polipéptidos de fusión de Fe); SEC ID N°: 32 (polipéptido de fusión de HSA); SEC ID N°: 34 a 39 y 145 a 152 (polipéptidos de fusión del dominio variable individual de inmunoglobulina de unión a albúmina); y SEC ID N°: 40 a 43, 142 y 143 (polipéptidos PEGilados).
Los polipéptidos de la invención preferiblemente se unen, a través de uno de sus dominios variables individuales de inmunoglobulina, al epítopo de A-beta definido por la SEC ID N°: 3 (epítopo N-terminal), y a través de otro dominio variable individual de inmunoglobulina al epítopo de A-beta definido por la SEC ID N°: 4 (epítopo central). Incluso más preferiblemente, dichos polipéptidos de la invención forman contactos con al menos los aminoácidos 1 (aspartato), 3 (glutamato), 19 (fenilalanina), 20 (fenilalanina), y 23 (aspartato) del péptido A-beta humano (SEC ID N°: 1). Los valores de CI50 medidos en un ensayo de unión TR-FRET (usando ABII002 = SEC ID N°: 62 y ABII050 = SEC ID N°: 100 como competidores; véase el Ejemplo 9.3) preferiblemente están en el intervalo de 10"9 moles/litro o menos, y más preferiblemente en el intervalo de 5 x 10"10 moles/litro a 10"12 moles/litro.
De acuerdo con otro aspecto, la invención se refiere a polipéptidos que comprenden o consisten en un dominio variable individual de inmunoglobulina que consiste esencialmente en cuatro regiones flanqueantes (FR1 a FR4 respectivamente) y tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3 respectivamente), donde dichas secuencias de CDR se definen como se indica a continuación: - CDR1 : SEC ID N0: 11.
- CDR2: SEC ID N°: 12.
- CDR3: SEC ID N°: 13. o - CDR1 : SEC ID N°: 14.
- CDR2: SEC ID N0: 15.
- CDR3: SEC ID N°: 16. o - CDR1 : SEC ID N°: 17.
- CDR2: SEC ID N0: 18.
- CDR3: SEC ID N°: 19. y a polipéptidos que comprenden o consisten en un dominio VHH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N°: 47 a 111. Estos polipéptidos son bloques de construcción o intermedios útiles para la construcción de polipéptidos de unión a A-beta biparatópicos de acuerdo con el primer aspecto de la invención.
De acuerdo con aspectos adicionales, la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico, vectores de expresión, células hospedadoras y métodos de fabricación usados en la producción de un polipéptido de la invención. Las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de la invención pueden usarse, en forma aislada, para construir vectores de expresión respectivos, que después pueden introducirse por transfección en células hospedadoras usadas para la producción biofarmacéutica de los polipéptidos de la invención. Dicho método de fabricación típicamente comprende las etapas de cultivar la célula hospedadora en condiciones que permitan la expresión del polipéptido, recuperar el polipéptido y purificarlo de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.
Los polipéptidos de la presente invención son específicamente útiles en métodos de diagnóstico, prevención, tratamiento y/o alivio de las enfermedades, trastornos y afecciones indicadas con detalle más adelante y, especialmente, para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer (EA). De esta manera, de acuerdo con este aspecto, los polipéptidos de la invención se usarán en forma de una composición farmacéutica, es decir, como un medicamento para el tratamiento, alivio o prevención de una enfermedad, trastorno o afección, preferiblemente en un ser humano, seleccionándose dicha enfermedad trastorno o afección del grupo que consiste en enfermedades o trastornos neurodegenerativos, enfermedad de Alzheimer, demencia de tipo Alzheimer, angiopatía amiloide cerebral (CAA), trisomía 21 (Síndrome de Down), síndrome de Down en adultos, hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis de tipo Dutch (HCHWA-D), demencia con Cuerpos de Lewy, degeneración de lóbulo frontotemporal, glaucoma, esclerosis lateral amiotrófica, miositis con cuerpos de inclusión esporádicos, y trastorno de ansiedad en un ser humano de edad avanzada, o se usarán para el diagnóstico de dicha enfermedad, trastorno o afección.
Además de lo anterior, los polipéptidos de la presente invención son específicamente útiles para el tratamiento de la DME (degeneración macular relacionada con la edad) seca y el glaucoma. La forma "seca" de DME, también conocida como "atrofia geográfica central", se debe a la atrofia de la capa epitelial de pigmento retiniano por debajo de la retina neurosensorial, que produce una pérdida de visión por la pérdida de fotorreceptores (bastones y conos) en la parte central del ojo. Actualmente no se dispone de ningún tratamiento médico o quirúrgico para esta afección. Los tratamientos disponibles hasta ahora (por ejemplo, sugeridos por el Instituto Nacional del Ojo) incluyen el uso de suplementos de vitaminas con alta dosis de antioxidantes, luteína y zeaxantina, que pueden ralentizar la progresión de la degeneración macular seca. El glaucoma es una enfermedad en la que la presión de fluido dentro del ojo aumenta, produciendo una lesión irreversible en el nervio óptico y pérdida de visión. El A-beta se co-localiza con las células ganglionares retinianas apoptóticas en el glaucoma experimental e induce una apoptosis significativa de las células ganglionares de la retina de una manera dependiente de la dosis y dependiente del tiempo.
Para fines terapéuticos, los polipéptidos de la invención o composiciones farmacéuticas que comprenden dichos polipéptidos pueden administrarse a un ser humano que lo necesita, por ejemplo, por inyección parenteral (esp. intravenosa o subcutánea) o intravítrea (esp. para el tratamiento de DME seca o glaucoma).
Otros aspectos, realizaciones y aplicaciones de la invención serán evidentes tras la descripción adicional y las reivindicaciones adjuntas presentadas más adelante.
Inesperadamente, aunque ya se ha realizado una investigación intensiva de los anticuerpos monoclonales de unión a A-beta y aunque ya se dispone de anticuerpos muy específicos con alta afinidad por A-beta, los inventores tuvieron éxito al proporcionar un grupo de moléculas de unión a A-beta que tienen mejores características, por ejemplo, al tener valores de CI50 incluso mejores que, por ejemplo, los anticuerpos 3D6 y m266 (véase, por ejemplo, la Tabla XVI), los homólogos humanizados que se están ensayando actualmente para uso terapéutico en seres humanos.
Además, aunque pudo demostrarse que anticuerpos anti-A-beta conocidos en la técnica efectivamente pueden reducir la carga de placas amiloides en ratones transgénicos con una superproducción de A-beta (reducción de carga de placa máxima conseguida por la administración del anticuerpo monoclonal m266 o su homólogo humanizado, según se ha publicado, de aproximadamente 60%), por ejemplo, el anticuerpo m266 carece de unión a placas amiloides. De esta manera, puede esperarse que dicho anticuerpo convencional tenga menos potencial en situaciones en las que una unión directa de la molécula de anti-A-beta la A-beta presente en agregados amiloides producen un efecto beneficioso adicional. Por el contrario, los inventores pudieron generar moléculas de unión a A-beta que se unen a placas amiloides y que, por lo tanto, es de esperar que reduzcan o eliminen el amiloide vascular al promover la disociación física, sin aumentar el riesgo o inducir microhemorragias. Como el amiloide vascular está asociado con la gravedad de EA, esta ventaja de los polipéptidos de la invención puede resultar particularmente útil en el tratamiento de EA en una fase avanzada o severa, es decir, puede esperarse que sean particularmente útiles para el tratamiento de pacientes que tienen una alta carga de placas amiloides cerebrales, acumuladas durante muchos años.
De esta manera, en resumen, la mayor afinidad de los polipéptidos de unión a A-beta de la invención y sus capacidades únicas de unión a placas proporcionan una superioridad inesperada en comparación con los anticuerpos anti-A-beta convencionales descritos en la técnica.
Otro anticuerpo que se encuentra actualmente en ensayos clínicos, Ponezumab, tiene especificidad por A-beta(x-40) y no se une a A-beta(x-42), la especie patógena principal presente en EA y, por lo tanto, es de esperar que desplace el equilibrio A-beta(x-40):A-beta(x-42) hacia la especie tóxica A-beta(x-42). Por el contrario, los presentes inventores tuvieron éxito al proporcionar moléculas de unión a A-beta que, mediante la unión a al menos dos epítopos diferentes, pueden capturar el A-beta(x-40) y el A-beta(x-42) para neutralizar los efectos tóxicos de las dos especies.
En comparación con los anticuerpos convencionales en general, los polipéptidos de la invención pueden fabricarse de una forma mucho más fácil, rápida y barata, tienen mayor estabilidad y baja antigenicidad, y pueden ser adecuados para vías de administración más convenientes que la inyección o infusión, debido a su pequeño tamaño y estructura. Más específicamente, la producción de los polipéptidos de la invención por medio de fermentación en organismos hospedadores recombinantes convenientes tales como E. coli y levadura es eficaz en cuanto al coste, en comparación con la fabricación de anticuerpos convencionales que requieren instalaciones de cultivo de células de mamífero caras. Además, los niveles que pueden conseguirse de expresión son elevados y los rendimientos de los polipéptidos de la invención están en el intervalo de 1 a 10 g/l (E. coli) y hasta 10 g/l (levadura) y mayores. Los polipéptidos de la invención son más solubles, lo que significa que pueden almacenarse y/o administrarse en mayores concentraciones en comparación con los anticuerpos convencionales. Son estables a temperatura ambiente, lo que significa que pueden prepararse, almacenarse y/o transportarse sin el uso de un equipo de refrigeración y con ahorros en el coste de transporte, tiempo y ambiental. Los polipéptidos de la presente invención también presentan una estabilidad prolongada en condiciones extremas de pH, lo que significa que serían adecuados para la liberación por administración oral.
Además, los polipéptidos de la invención no necesitan comprender la parte Fe que está presente en los anticuerpos "clásicos", de forma que pueden evitarse los efectos secundarios producidos por las funciones efectoras de Fe, tales como la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Cuando se usan en inmunizaciones pasivas anti-A-beta, se sospecha que los anticuerpos convencionales (que tienen una parte Fe) son responsables de la inducción de las microhemorragias observadas en modelos humanos y animales, que están asociadas con la fijación como objetivo de los depósitos de A-beta vasculares cerebrales (angiopatía amiloide cerebral) que conduce a microhemorragias a través de ADCC y/o CDC (Wilcock, DM, Colton, CA, CNS Neurol. Disord. Drug Targets (2009) Vol. 8(1): 50-64).
De esta manera, en resumen, los polipéptidos de la invención combinan las características ventajosas de los anticuerpos convencionales, tales como un alta especificidad y una alta selectividad, con las ventajas indicadas anteriormente, y sorprendentemente tienen características mejoradas con respecto a la afinidad y especificidad en comparación con los anticuerpos de unión a A-beta convencionales.
Cuando se comparan con dominios VHH de unión a A-beta ya conocidos en la técnica, tales como los VHH descritos en los documentos WO2006/040153, WO2007/35092 y WO2004/44204, los polipéptidos de la invención muestran características de unión significativamente mejoradas, con respecto a la unión a A-beta monomérico así como con respecto a la unión a A-beta agregado (véanse, por ejemplo, los Ejemplos 3.2 y 6 presentados más adelante). Además, los polipéptidos de acuerdo con la invención se unen tanto a A-beta monomérico como a las placas amiloides, a diferencia de los dominios VHH descritos, por ejemplo, en el documento WO2008/122441 o en Habicht et al. (2007), Proc. Nati. Acad. Sci. USA; 104(49): 19232-19237, que solo se unen a placas amiloides agregadas.
Además, los dominios VHH de polipéptidos de unión a A-beta de la invención se unen de una forma igualmente potente a A-beta de humano y roedor, como se muestra, por ejemplo, en el Ejemplo 7 y en la Fig. 2. La unión del polipéptido biparatópico de la invención incluso aumenta la afinidad por el A-beta humano así como por el A-beta de roedor en un factor de al menos 103, en comparación con los dominios VHH individuales. De esta manera, los polipéptidos de la invención son herramientas de detección ideales entre especies para las formas de A-beta relevantes para la enfermedad tales como A-beta (1-40) y A-beta (1-42), permitiendo el uso de modelos animales de roedor esp. para la investigación preclínica y científica. Proporcionan superioridad con respecto al anticuerpo 3D6 que se une a A-beta con una afinidad significativamente menor y que solo presenta una reacción cruzada débil con A-beta de roedor. También hay superioridad en comparación con el anticuerpo m266 que reconoce el A-beta de roedor y humano igualmente bien, pero presenta reacción cruzada con versiones truncadas N-terminalmente de A-beta, tales como p3 de forma que este anticuerpo no es útil para ciertos ensayos o análisis que se basan en la detección específica de especies de A-beta relevantes para la enfermedad, tales como A-beta (1-40) y A-beta (1-42).
Finalmente, las construcciones de VHH anti-A-beta biparatópicas de acuerdo con la invención consiguieron afinidad en un factor de > 000 veces cuando se combinaron dos VHH que detectaban dos epítopos de A-beta diferentes, lo cual está en claro contraste con las construcciones descritas en el documento WO09/149185.
Por supuesto, los polipéptidos de la invención también son útiles para fines de diagnóstico, basándose en su afinidad (sensibilidad), especificidad (con respecto a epítopos así como a especies), y otras características como se ha indicado anteriormente, en comparación con otras moléculas de unión a A-beta conocidas en la técnica.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Fig. 1 muestra la reducción de A-beta(1-40) libre/no unido en plasma después de la administración i.p. de ABII320, ABII322, 3D6-lgG y m266- IgG, detectada 2 horas después de la inyección, en ratones transgénicos para APP (n=3). Se representa en la primera columna (recuadro sin relleno): vehículo (PBS), segunda columna: ABII320 (132 nmol/kg); tercera columna: ABII322 (132 nmol/kg); cuarta columna: IgG 3D6 (132 nmol/kg); quinta columna: IgG m266 (66.6 nmol/kg); las concentraciones para las IgG se calculan por sitio de unión (2 sitios de unión por molécula de IgG).
La Fig. 2 muestra la unión de una construcción de VHH anti-A-beta biparatópica, incluyendo dominios VHH ABII035 y ABII059, a A-beta humano y de roedor (ratón).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones Los aspectos anteriores y otros aspectos y realizaciones de la invención serán evidentes tras la descripción adicional de la presente memoria en la que: a) A menos que se indique o se definan de otra manera, todos los términos usados tienen su significado habitual en la técnica, que será evidente para el experto en la materia. Se hace referencia, por ejemplo, a manuales convencionales, tales como Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2a Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, New York, (1990), y Roitt et al., "Immunology" (2a Ed.), Gower Medical Publishing, London, New York (1989), así como a la técnica antecedente general citada en la presente memoria; además, a menos que se indique otra cosa, todos los métodos, etapas, técnicas y manipulaciones que no se describen específicamente con detalle pueden realizarse y se han realizado de una manera conocida per se cómo será evidente para el experto en la materia. De nuevo se hace referencia, por ejemplo, a manuales convencionales, a la técnica antecedente general mencionada anteriormente y a las referencias adicionales citadas en la presente memoria; b) A menos que se indique otra cosa, las expresiones "¡nmunoglobulina" y "secuencia de inmunoglobulina" - se usen en la presente memoria para hacer referencia a un anticuerpo de cadena pesada o un anticuerpo de cuatro cadenas convencional - se usan como términos generales para incluir el anticuerpo de tamaño completo, sus cadenas individuales, así como todas las partes, dominios o fragmentos de los mismos (incluyendo, pero sin limitación, dominios de unión a antígenos o fragmentos tales como dominios VHH o dominios VH/VL, respectivamente). Además, debe entenderse que el término "secuencia", como se usa en la presente memoria, (por ejemplo en términos como "secuencia de inmunoglobulina", "secuencia de anticuerpo", "secuencia de dominio variable (individual)", "secuencia de VHH" o "secuencia de proteína"), en general, incluye tanto la secuencia de aminoácidos relevante como las secuencias de ácidos nucleicos o secuencias de nucleótidos que las codifican, a menos que el contexto requiera una interpretación más limitada; c) El término "dominio" (de un polipéptido o proteína), como se usa en la presente memoria, se refiere a una estructura de proteína plegada que tiene la capacidad de conservar su estructura terciaria independientemente del resto de la proteína. En general, los dominios son responsables de las propiedades funcionales discretas de las proteínas, y en muchos casos pueden añadirse, retirarse o transferirse a otras proteínas sin pérdida de función del resto de la proteína y/o del dominio. d) La expresión "dominio de inmunoglobulina", como se usa en la presente memoria, se refiere a una región globular de una cadena de anticuerpo (tal como, por ejemplo, una cadena de un anticuerpo de cuatro cadenas convencional o de un anticuerpo de cadena pesada), o a un polipéptido que consiste esencialmente en dicha región globular. Los dominios de inmunoglobulina se caracterizan por que retienen el plegamiento de inmunoglobulina característico de las moléculas de anticuerpo, que consiste en un sándwich de dos capas de aproximadamente 7 cadenas beta antiparalela, dispuestas en 2 láminas beta, opcionalmente estabilizadas por un enlace disulfuro conservado. e) La expresión "dominio variable de inmunoglobulina", como se usa en la presente memoria, significa un dominio de inmunoglobulina que consiste esencialmente en cuatro "regiones flanqueantes" que se conocen en la técnica y más adelante como "región flanqueante 1" o "FR1"; como "región flanqueante 2" o "FR2"; como "región flanqueante 3" o "FR3"; y como "región flanqueante 4" o "FR4", respectivamente; estando dichas regiones flanqueantes interrumpidas por tres "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR", que se denominan en la técnica y más adelante en la presente memoria región de determinante de complementariedad 1" o "CDR1"; "región determinante de complementariedad 2" o "CDR2"; y "región determinante de complementariedad 3" o "CDR3", respectivamente. De esta manera, la estructura general o secuencia de un dominio variable de inmunoglobulina puede indicarse como se indica a continuación: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. Es el o los dominios variables de inmunoglobulina los que confieren especificidad a un anticuerpo para el antígeno al llevar el sitio de unión al antígeno. f) La expresión "dominio variable individual de inmunoglobulina", como se usa en la presente memoria, significa un dominio variable de inmunoglobulina que puede unirse específicamente a un epítopo del antígeno sin emparejarse con un dominio de inmunoglobulina variable adicional. Un ejemplo de dominios variables individuales de inmunoglobulina en el significado de la presente invención son "anticuerpos dominio", tales como los dominios variables individuales de inmunoglobulina VH y VL (dominios VH y dominios VL). Otro ejemplo de dominio variable individual de inmunoglobulina son los "dominios VHH" (o simplemente "VHH") de camélidos, como se define más adelante en la presente memoria.
En vista de la definición anterior, el dominio de unión a antígeno de un anticuerpo de 4-cadenas convencional (tal como una molécula de IgG, IgM, IgA, IgD o IgE; conocida en la técnica) o de un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv tal como un fragmento Fv unido por enlaces disulfuro o un fragmento scFv, o un diacuerpo (todos conocidos en la técnica) derivado de dicho anticuerpo de 4 cadenas convencional, normalmente no se consideraría un dominio variable individual de inmunoglobulina ya que, en estos casos, la unión al epítopo respectivo de un antígeno normalmente no se produciría por un (solo) dominio de inmunoglobulina, sino por un par de dominios de inmunoglobulina (en asociación) tales como dominios variables de cadena ligera y pesada, es decir, por un par VH-VL de dominios de inmunoglobulina, que conjuntamente se unen a un epítopo del antígeno respectivo. f1) "dominios de VHH ", también conocidos como VHH, dominios VHH, fragmentos de anticuerpo VHH y anticuerpos VHH, se han descrito originalmente como el dominio (variable) de inmunoglobulina de unión a antígeno de "anticuerpos de cadena pesada" (es decir, "anticuerpos que carecen de cadenas ligeras"; Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R.: "Naturally occurring antibodies devoid of light chains"; Nature 363, 446-448 (1993). La expresión "dominio VHH" se ha elegido para distinguir estos dominios variables de los dominios variables de cadena pesada que están presentes en anticuerpos de 4 cadenas convencionales (que se denominan en la presente memoria "dominios VH" O "dominios VH ") y de los dominios variables de cadena ligera que están presentes en anticuerpos de cuatro cadenas convencionales (que se denominan en la presente memoria "dominios VL" o "dominios VL"). Los dominios VHH pueden unirse específicamente a un epítopo sin un dominio de unión a antígeno adicional (a diferencia a los dominios VH o VL de un anticuerpo de 4 cadenas convencional, en cuyo caso el epítopo se reconoce por un dominio VL junto con un dominio VH). Los dominios VHH son unidades de reconocimiento de antígeno pequeñas, sólidas y eficaces formadas por un solo dominio de inmunoglobulina.
En el contexto de la presente invención, las expresiones dominio VHH, VHH, dominio VHH, fragmento de anticuerpo VHH, anticuerpo VHH así como "Nanobody®" y "dominio de Nanobody®" (siendo "Nanobody" una marca comercial de la compañía Ablynx N.V.; Ghent; Bélgica) se usan indistintamente y representan dominios variables individuales de inmunoglobulina (que tienen la estructura: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 y se unen específicamente a un epítopo sin necesitar la presencia de un segundo dominio variable de inmunoglobulina), y se distinguen de los dominios VH por los denominados "restos de sello", definidos, por ejemplo, en el documento WO2009/109635, Fig. 1.
Los restos aminoacídicos de un dominio VHH se enumeran de acuerdo con la numeración general para dominios VH proporcionada por Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, N° de Publicación 91), aplicada a los dominios VHH de Camélidos, como se muestra, por ejemplo en la Figura 2 de Riechmann y Muyldermans, J. Immunol. Methods 231 , 25-38 (1999). De acuerdo con esta numeración, - FR1 comprende los restos aminoacídicos en las posiciones 1-30, - CDR1 comprende los restos aminoacídicos en las posiciones 31-35, - FR2 comprende los restos aminoacídicos en las posiciones 36-49, - CDR2 comprende los restos aminoacídicos en las posiciones 50-65, - FR3 comprende los restos aminoacídicos en las posiciones 66-94, - CDR3 comprende los restos aminoacídicos en las posiciones 95-102, y - FR4 comprende los restos aminoacídicos en las posiciones 103-113.
Sin embargo, debe tenerse en cuenta que - como es bien conocido en la técnica para los dominios VH y para los dominios VHH - el número total de restos aminoacídicos en cada una de las CDR puede variar y puede no corresponder al número total de restos aminoacídicos indicados por la numeración de Kabat (es decir, una o más posiciones de acuerdo con la numeración de Kabat pueden no estar ocupadas en la secuencia real, o la secuencia real puede contener más restos aminoacídicos que el número permitido por la numeración de Kabat). Esto significa que, en general, la numeración de acuerdo con Kabat puede corresponder o no a la numeración real de los restos aminoacídicos en la secuencia real.
En la técnica se conocen métodos alternativos para numerar los restos aminoacídicos de dominios VH, pudiendo aplicarse también dichos métodos de una manera análoga a dominios VHH. Sin embargo, en la presente descripción, reivindicaciones y figuras, se seguirá la numeración de acuerdo con Kabat y aplicada a dominios VHH como se ha descrito anteriormente, a menos que se indique otra cosa.
El número total de restos aminoacídicos en un dominio VHH normalmente estará en el intervalo de 110 a 120, con frecuencia entre 112 y 115. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que también pueden ser adecuadas para los fines descritos en la presente memoria secuencias más pequeñas y más largas.
Otras características estructurales y propiedades funcionales de dominios VHH y polipéptidos que los contienen pueden resumirse como se indica a continuación: Los dominios VHH (que se han "diseñado" por la naturaleza para unirse funcionalmente a un antígeno sin la presencia, y sin ninguna interacción con un dominio variable de cadena ligera) pueden funcionar como una sola unidad estructural de unión a antígeno funcional, relativamente pequeña, dominio o polipéptido. Esto distingue los dominios VHH de los dominios VH y VL de los anticuerpos de 4 cadenas convencionales, que por sí mismos generalmente no son adecuados para la aplicación práctica como proteínas de unión a antígeno individuales o dominios variables individuales de inmunoglobulina, sino que necesitan combinarse de una forma u otra para proporcionar un sitio de unión a antígeno funcional (como, por ejemplo, en fragmentos de anticuerpo convencionales tales como fragmentos Fab; en scFv, que consisten en un dominio VH unido covalentemente a un dominio VL).
Debido a estas propiedades únicas, el uso de dominios VHH - solos o como parte de un polipéptido de mayor tamaño - ofrece varias ventajas significativas con respecto al uso de dominios VH y VL convencionales, scFv o fragmentos de anticuerpo convencionales (tales como fragmentos Fab o F(ab')2): - solo se necesita un único dominio para unirse un antígeno con alta afinidad y con alta selectividad, de forma que no hay necesidad de tener dos dominios separados, ni de asegurar que estos dos dominios están presentes en la conformación y configuración espacial correcta (es decir, por medio del uso de enlazadores diseñados especialmente, como ocurre con los scFv), - los dominios VHH pueden expresarse a partir de un solo gen y no necesitan plegamiento o modificaciones postraduccionales, - los dominios VHH pueden modificarse fácilmente por ingeniería genética en formatos multivalentes y multiespecíficos (como se analiza adicionalmente en la presente memoria), - los dominios VHH son muy solubles y no tienen tendencia a agregarse (como ocurre con los dominios de unión a antígeno derivados de ratón descritos por Ward et al., Nature 341 : 544- -546, (1989)), - los dominios VHH son muy estables al calor, pH, proteasas y otros agentes y condiciones desnaturalizantes y, por lo tanto, pueden prepararse, almacenarse y transportarse sin el uso de equipos de refrigeración, estando asociados con ahorros de coste, tiempo y ambientales, - los dominios VHH son fáciles y relativamente baratos de preparar, incluso en la escala necesaria para la producción. Por ejemplo, los dominios y polipéptidos de VHH que los contienen pueden producirse usando fermentación microbiana (por ejemplo, como se describe adicionalmente más adelante) y no requieren el uso de sistemas de expresión de mamífero, como ocurre, por ejemplo, con fragmentos de anticuerpo convencionales, - los dominios VHH son relativamente pequeños (aproximadamente 15 kDa, o 10 veces más pequeños que una IgG convencional) en comparación con anticuerpos de 4 cadenas convencionales y fragmentos de unión a antígeno de los mismos y, por lo tanto, - muestran una mayor penetración en tejidos y - pueden administrarse en dosis mayores que dichos anticuerpos de 4 cadenas convencionales y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, - los dominios VHH pueden mostrar las denominadas propiedades de unión a cavidad (entre otras cosas debidas a su bucle CDR3 extendido, en comparación con los dominios VH convencionales) y, por lo tanto, también pueden acceder a dianas y epítopos no accesibles a anticuerpos de 4 cadenas convencionales y fragmentos de unión a antígeno de los mismos.
Anteriormente se han descrito métodos para obtener dominios VHH que se unen a un antígeno o epítopo específico, por ejemplo, en los documentos WO2006/040153 y WO2006/122786. Como también se describe en la presente memoria con detalle, los dominios VHH procedentes de camélidos pueden "humanizarse" remplazando uno o más restos aminoacídicos en la secuencia de aminoácidos de la secuencia de VHH original por uno o más de los restos aminoacídicos que aparecen en la posición o posiciones correspondientes en un dominio VH de un anticuerpo de 4 cadenas convencional de un ser humano. Un dominio VHH humanizado puede contener una o más secuencias de región flanqueante completamente humana y, en una realización incluso más específica, puede contener secuencias de región flanqueante humana derivadas de DP-29, DP-47, DP-51, o partes de las mismas, opcionalmente combinadas con secuencias de JH, tales como JH5. f2) "Anticuerpos de dominio", también conocidos como "Dab", "Anticuerpos de dominio", y "dAb" (las expresiones "Anticuerpos de dominio" y 5 "dAb" usándose como marcas comerciales por el grupo de compañías GlaxoSmithKIine) se han descrito, por ejemplo en Ward, E.S., et al.: "Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli"; Nature 341 : 544-546 (1989); Holt, L.J. et al.: "Domain antibodies: proteins for therapy"; TRENDS in Biotechnology 21(11): 484-490, l o (2003); y el documento WO2003/002609.
Los anticuerpos de dominio corresponden esencialmente a los dominios VH o VL de mamíferos que no son camélidos, en particular anticuerpos de 4 cadenas humanos. Para unirse a un epítopo como un dominio de unión a antígeno individual, es decir, sin estar emparejado con un dominio VL o VH, 15 respectivamente, se necesita la selección específica con respecto a dichas propiedades de unión a antígeno, por ejemplo, usando bibliotecas de secuencias de dominios VH o VL individuales humanas.
Los anticuerpos de dominio tienen, al igual que VHH, un peso molecular de aproximadamente 13 a aproximadamente 16 kDa y, si proceden de 20 secuencias completamente humanas, no requieren la humanización, por ejemplo, para uso terapéutico en seres humanos. Como ocurre en los dominios VHH, se expresan bien también en sistemas de expresión procariotas, proporcionando una reducción significativa en el coste de fabricación general.
Los anticuerpos de dominio, así como los dominios VHH, pueden 5 someterse a maduración de afinidad introduciendo una o más alteraciones en la secuencia de aminoácidos de una o más CDR, dando como resultado dichas alteraciones una mejor afinidad del dominio variable individual de inmunoglobulina resultante por su antígeno respectivo, en comparación con su molécula parental respectiva. Las moléculas de dominio variable individual de inmunoglobulina de afinidad madurada de la invención pueden prepararse por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe por Marks et al., 1992, Biotechnology 10:779-783, o Barbas, et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91 : 38093813 Shier et al., 1995, Gene 169:147-155. Yelton et al., 1995, Immunol. 155: 1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol. 154(7):3310-9. Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol. 226(3): 889 896; KS Johnson and RE Hawkins, "Affinity maturation of antibodies using phage display", Oxford University Press 1996. f3) Además, será evidente para el experto en la materia que es posible "injertar" una o más de las CDR mencionadas anteriormente en otros "armazones", incluyendo, pero sin limitación, armazones humanos o armazones que no son de inmunoglobulina. En la técnica se conocen armazones y técnicas adecuadas para dicho injerto de CDR. g) Las expresiones "epítopo" y "determinante antígénico", que pueden usarse indistintamente, se refiere a la parte de una macromolécula, tal como un polipéptido, que se reconoce por moléculas de unión a antígeno, tales como anticuerpos convencionales o los polipéptidos de la invención, y más particularmente por el sitio de unión a antígeno de dichas moléculas. Los epítopos definen el sitio de unión mínimo para una inmunoglobulina y, por lo tanto, representan la diana de especificidad de una inmunoglobulina.
La parte de una molécula de unión a antígeno (tal como un anticuerpo convencional o un polipéptido de la invención) que reconoce el epítopo se denomina parátopo. h) La expresión molécula de unión (a antígeno) "biparatópica" o polipéptido "biparatópico", como se usa en la presente memoria, hará referencia a un polipéptido que comprende un primer dominio variable individual de inmunoglobulina y un segundo dominio variable individual de inmunoglobulina como se define en la presente memoria, donde estos dos dominios variables pueden unirse a dos epítopos diferentes de un antígeno, sin que dichos epítopos normalmente se unan al mismo tiempo por una inmunoglobulina monoespecífica, tal como, por ejemplo, un anticuerpo convencional o un dominio variable individual de inmunoglobulina. Los polipéptidos biparatópicos de acuerdo con la invención se componen de dominios variables que tienen diferentes especificidades de epítopo, y no contienen pares de dominios de variables mutuamente complementarios que se unen al mismo epítopo. Por lo tanto, no compiten entre sí por la unión a A-beta. i) Un polipéptido (tal como una inmunoglobulina, un anticuerpo, un dominio variable individual de inmunoglobulina, un polipéptido de la invención o generalmente una molécula de unión a antígeno o un fragmento de la misma) que puede "unirse a" o "unirse específicamente a", que "tiene afinidad por" y/o que "tiene especificidad por" un cierto epítopo, antígeno o proteína (o por al menos una parte, fragmento o epítopo del mismo) se dice que está "contra" o está "dirigido contra" dicho epítopo, antígeno o proteína o es una molécula de "unión" con respecto a dicho epítopo, antígeno o proteína. k) Generalmente, el término "especificidad" se refiere al número de tipos diferentes de antígenos o epítopos a los que se puede unir una molécula de unión a antígeno o proteína de unión a antígeno particular (tal como una inmunoglobulina, un anticuerpo, un dominio variable individual de inmunoglobulina o un polipéptido de la invención). La especificidad de una proteína de unión a antígeno puede determinarse basándose en su afinidad y/o avidez. La afinidad, representada por la constante de equilibrio para la disociación de un antígeno con una proteína de unión a antígeno (KD), es una medida de la fuerza de unión entre un epítopo y un sitio de unión a antígeno en la proteína de unión a antígeno: cuanto menor es el valor de la KD, más fuerte es la unión entre un epítopo y la molécula de unión a antígeno (como alternativa, la afinidad también puede expresarse como la constante de afinidad (KA), que es 1/KD). Como será evidente para el experto en la materia (por ejemplo, basándose en la descripción adicional de la presente memoria), la afinidad puede determinarse de una manera conocida per se dependiendo del antígeno específico de interés. La avidez es la medida de la fuerza de unión entre una molécula de unión a antígeno (tal como una inmunoglobulina, un anticuerpo, un dominio variable individual de inmunoglobulina o un polipéptido de la invención) y el antígeno pertinente. La avidez está relacionada tanto con la afinidad entre un epítopo y su sitio de unión a antígeno en la molécula de unión a antígeno como con el número de sitios de unión pertinente presentes en la molécula de unión a antígeno.
Típicamente, las proteínas de unión a antígeno (tales como los polipéptidos de la invención) se unirán con una constante de disociación (KD) de 10E-5 a 10E-1 moles/litro (M) o menos, y preferiblemente de 10E-7 a 10E-1 moles/litro (M) o menos, más preferiblemente de 10E-8 a 10E-14 moles/litro, e incluso más preferiblemente de 10E-11 a 10E-13 (medido, por ejemplo, en un ensayo Kinexa como se describe en el Ejemplo 9.7), y/o con una constante de asociación (KA) de al menos 10E7 ME-1 , preferiblemente al menos 10E8 ME-1 , más preferiblemente al menos 10E9 ME-1 , tal como al menos 10E11 ME-1. Generalmente se considera que cualquier valor de KD mayor de 10E-4 M indica unión no específica. Preferiblemente, un polipéptido de la invención se unirá al antígeno deseado con una KD menor de 500 nM, preferiblemente menor de 200 nM, más preferiblemente menor de 10 nM, tal como menor de 500 pM. La unión específica de una proteína de unión a antígeno a un antígeno o epítopo puede determinarse de cualquier manera adecuada conocida per se, incluyendo, por ejemplo, los ensayos descritos en la presente memoria, análisis de Scatchard y/o ensayos de unión competitiva, tales como radioinmunoensayos (RIA), inmunoensayos enzimáticos (EIA) y ensayos competitivos tipo sándwich y sus diferentes variantes conocidas per se en la técnica.
I) Los restos aminoacídicos se indicarán de acuerdo con el código de aminoácidos de una letra o tres letras convencional, como se conoce/ generalmente y está acordado en la técnica. Cuando se comparan dos secuencias de aminoácidos, la expresión "diferencia de aminoácidos" se refiere a inserciones, deleciones o sustituciones del número de restos aminoacídicos indicado en una posición de la secuencia de referencia, en comparación con una segunda secuencia. En caso de una o más sustituciones, dichas sustituciones preferiblemente serán sustituciones de aminoácidos conservativas, lo que significa que un resto aminoacídico se remplaza por otros restos aminoacídico de estructura química similar y que tiene una influencia pequeña o esencialmente nula sobre la función, actividad u otras propiedades biológicas del polipéptido.
Dichas sustituciones de aminoácidos conservativas son bien conocidas en la técnica, por ejemplo, por el documento WO 98/49185, en el que las sustituciones de aminoácidos conservativas preferiblemente son sustituciones en las que un aminoácido dentro de los siguientes grupos (i) - (v) se sustituye por otro resto aminoacídico dentro del mismo grupo: (i) restos alifáticos pequeños, no polares o ligeramente polares: Ala, Ser, Thr, Pro y Gly; (ii) restos polares cargados negativamente y sus amidas (sin carga): Asp, Asn, Glu y Gln; (iii) restos polares, cargados positivamente: His, Arg y Lys; (iv) restos alifáticos grandes no polares: Met, Leu, lie, Val y Cys; y (v) restos aromáticos: Phe, Tyr y Trp. Son sustituciones de aminoácidos conservativas particularmente preferidas las siguientes: Ala por Gly o por Ser, Arg por Lys, Asn por Gln o por His, Asp por Glu, Cys por Ser, Gln por Asn, Asp por Glu, Ala por Gly o por Ser, His por Asn o por Gln, lie por Leu o por Val, Leu por lie o por Val, Lys por Arg, por Gln o por Glu, Met por Leu, por Tyr o por lie, Phe por Met, por Leu o por Tyr, Ser por Thr, Thr por Ser, Trp por Tyr, Tyr por Trp o por Phe, Val por Me o por Leu. m) Una molécula de ácido nucleico o de polipéptido se considera "(en) (forma) esencialmente aislada" - por ejemplo, cuando se compara con su fuente biológica nativa y/o el medio de reacción o el medio de cultivo a partir del cual se ha obtenido - cuando se ha separado de al menos otro componente con el cual normalmente está asociada en dicha fuente o medio, tal como otro ácido nucleico, otra proteína/polipéptido, otro componente biológico o macromolécula o al menos un contaminante, impureza o componente minoritario. En particular, una molécula de ácido nucleico o polipéptido se considera "esencialmente aislada" cuando se ha purificado al menos 2 veces, en particular al menos 10 veces, más en particular al menos 100 veces y hasta 1000 veces o más. Una molécula de ácido nucleico o de polipéptido que está "en forma esencialmente aislada" preferiblemente es esencialmente homogénea, como se determina usando una técnica adecuada tal como una técnica cromatográfica adecuada, tal como electroforesis en gel de poliacrilamida; n) "Identidad de secuencia" entre, por ejemplo, dos secuencias de dominio variable individual de inmunoglobulina indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos entre esas dos secuencias. Puede calcularse o determinarse como se describe en el párrafo f) en las páginas 49 y 50 del documento WO08/020079. "Similitud de secuencia" indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos o que representan sustituciones de aminoácidos conservativas.
Especificidad de diana Los polipéptidos de la invención tienen especificidad por A-beta ya que comprenden dominios variables individuales de inmunoglobulina que se unen específicamente a una o más moléculas de A-beta y, de forma más precisa, a epítopos dentro de la molécula o moléculas de A-beta. A-beta puede adoptar y puede existir, por ejemplo, en el cuerpo humano en diferentes formas, tales como en forma monomérica, en forma oligomérica y en forma multimérica, en formas agregadas solubles e insolubles, en forma fibrilar, en forma protofibrilar, en forma de placas amiloides y depósitos que están presentes en el sistema nervioso central, músculo esquelético, plaquetas, sistema vascular, páncreas, riñon, bazo, corazón, hígado, testículos, aorta, pulmón, intestino, piel, glándula suprarrenal, glándula salivar y glándula tiroides (Roher et al. Alzheimer's & Dementia 5 (2009) pág. 18-29). Esta dentro del alcance de la invención que los polipéptidos de la invención se unan a cualquiera de las formas en las que puede existir A-beta y especialmente a las formas que son más relevantes desde el punto de vista biológico y/o terapéutico.
Los polipéptidos de la invención pueden unirse a moléculas de péptido A-beta de diferente longitud, tales como A-beta(1- 2) que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID IM°: 1 , A-beta(1-40) que consiste en los aminoácidos 1 a 40 de la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID N°: 1 , A-beta(1-39) (aminoácidos 1 a 39), A-beta(1-38) (aminoácidos 1 a 38), A-beta(1-37) (aminoácidos 1 a 37), y similares. La unión del polipéptido de la invención puede tener lugar en el extremo N, el extremo C o en cualquier parte entre ellos.
Además, la invención no se limita con respecto a la forma de especie de A-beta. Así pues, los polipéptidos de la invención preferiblemente pueden unirse a A-beta humano (SEC ID N°: 1), si se desea para fines terapéuticos. Sin embargo, también están dentro del alcance de la invención polipéptidos que se unen, por ejemplo, a otro animal de sangre caliente o, preferiblemente, a formas de mamífero de A-beta. Un polipéptido de la invención que se une a una forma de especie de A-beta puede presentar reacción cruzada con A-beta de una o más especies distintas. Por ejemplo, los polipéptidos de la invención que se unen a A-beta humano pueden o no mostrar reactividad cruzada con A-beta de una o más especies distintas de primates y/o con A-beta de una o más especies de animales que con frecuencia se usan en modelos animales para enfermedades (por ejemplo ratón - véase la SEC ID N°: 2, rata, conejo, cerdo o perro), y en particular en modelos animales de enfermedades y trastornos asociados con A-beta (tales como las especies y modelos animales mencionados en la presente memoria). Los polipéptidos de la invención que muestran dicha reactividad cruzada pueden tener ventajas desde el punto de vista de la investigación y/o el desarrollo de fármacos, ya que permite que los polipéptidos de la invención que se unen a A-beta humano se ensayen en modelos de enfermedad importantes tales como ratones o ratas.
Además, la invención no se limita o se define por un determinante antigénico específico, epítopo, parte, dominio, subunidad o confirmación (cuando es aplicable) de A-beta contra el cual se dirigen los polipéptidos de la invención. Algunos de los epítopos preferidos de A-beta contra los cuales pueden dirigirse los polipéptidos de la invención son los epítopos usados para inmunoterapia, y en particular para inmunoterapia pasiva de EA. Por ejemplo, como se menciona en Weksler M., Immunity and Ageing 1 , 2 (2004) y en la técnica antecedente mencionada en la presente memoria, se sabe que hay tres epítopos principales en A-beta, es decir, un epítopo N-terminal (aminoácidos 1-16 de A-beta: DAEFRHDSGYEVHHQK; SEC ID N°: 3), un epítopo central (aminoácidos 16-28: KLVFFAEDVGSNK; SEC ID N°: 4) y un epítopo C-terminal (aminoácidos 28-42; KGAIIGLMVGGWIA; SEC ID N°:5). Los polipéptidos de la invención pueden dirigirse contra cualquiera de estos epítopos. Se prefieren específicamente polipéptidos de la invención que comprenden al menos dos dominios variables individuales de inmunoglobulina, donde un dominio variable individual de inmunoglobulina se une al epítopo N-terminal y un segundo dominio variable individual de inmunoglobulina se une al epítopo central.
Polipéptidos de la invención En su sentido más amplio, la invención proporciona nuevos agentes farmacéuticamente activos para la prevención, tratamiento, alivio y/o diagnóstico de enfermedades, trastornos o afecciones asociadas con A-beta y, específicamente, EA. Los agentes de acuerdo con la invención pertenecen a una nueva clase de moléculas de unión a A-beta, particularmente polipéptidos biparatópicos que comprenden dos o más dominios variables individuales de inmunoglobulina que se unen al antígeno A-beta en diferentes epítopos. Más específicamente, dicho polipéptido de la invención consiste esencialmente o comprende (i) un primer dominio variable individual de inmunoglobulina que se une específicamente a un primer epítopo de A-beta y (ii) un segundo dominio variable individual de inmunoglobulina que se une específicamente a un segundo epítopo de A-beta, donde el primer epítopo de A-beta y el segundo epítopo de A-beta no son epítopos idénticos. En otras palabras, dicho polipéptido de la invención comprende o consiste esencialmente en dos o más dominios variables individuales de inmunoglobulina que se dirigen contra al menos dos epítopos diferentes presentes en A-beta, donde dichos dominios variables individuales de inmunoglobulina están unidos entre sí de tal forma que pueden unirse simultáneamente a A-beta. En este sentido, el polipéptido de la invención también puede considerarse una construcción de inmunoglobulina "multivalente" y, especialmente, como una "construcción de dominio variable individual de inmunoglobulina multivalente", ya que el polipéptido entero incluye al menos dos sitios de unión para A-beta.
Un polipéptido de la invención incluye (al menos) dos dominios variables individuales de inmunoglobulina anti-A-beta, donde (los) dos dominios variables individuales de inmunoglobulina se dirigen contra epítopos diferentes dentro de la molécula de A-beta. De esta manera, estos dos dominios variables individuales de inmunoglobulina tendrán una especificidad de epítopo diferente y, por lo tanto, diferentes secuencias de CDR. Por esta razón, los polipéptidos de la invención en la presente memoria también se denominan "polipéptidos biparatópicos" o "construcciones de anticuerpo de dominio biparatópico" (si los dominios variables individuales de inmunoglobulina consisten o consisten esencialmente en anticuerpos de dominio), o "construcciones de Nanobody biparatópicas" o "construcciones de dominio VHH biparatópicas" o "construcciones VHH biparatópicas" (si los dominios variables individuales de inmunoglobulina consiste o consisten esencialmente en Nanobodies o dominios VHH), respectivamente, ya que los dos dominios variables individuales de inmunoglobulina incluirán dos parátopos diferentes.
De acuerdo con una realización específica de la invención, en el caso en el que el polipéptido de la invención incluye más de dos dominios variables individuales de inmunoglobulina anti-A-beta, es decir, tres, cuatro o incluso más dominios variables individuales de inmunoglobulina anti-A-beta, al menos dos de los dominios variables individuales de inmunoglobulina anti-A-beta se dirigen contra diferentes epítopos dentro de la molécula de A-beta, pudiendo unirse cualquier dominio variable individual de inmunoglobulina adicional a cualquiera de estos epítopos diferentes y/o un epítopo adicional presente en la molécula de A-beta.
De acuerdo con otra realización específica de la invención, el polipéptido de la invención puede incluir, además de los dos dominios variables individuales de inmunoglobulina anti-A-beta descritos anteriormente, cualquier otro resto adicional, tal como un enlazador (como se describe con más detalle más adelante) y/o dominios de proteína adicionales tales como, por ejemplo, un dominio variable individual de inmunoglobulina adicional (como se describe con más detalle más adelante), siempre que su unión a A-beta no se impida por dicho resto adicional. El polipéptido de la invención puede contener adicionalmente modificaciones tales como restos glicosilo, cadenas laterales de aminoácidos modificadas y similares.
Como se ha indicado anteriormente, dos dominios variables individuales de inmunoglobulina dentro de un polipéptido de la invención se unirán a diferentes epítopos de A-beta. Esto puede conseguirse en una de las siguientes maneras: Los dos dominios variables individuales de inmunoglobulina se unirán a los dos epítopos dentro de la misma molécula de A-beta (unión intramolecular). Como alternativa, pueden unirse a epítopos localizados dentro de dos moléculas de A-beta distintas, es decir, un dominio variable individual de inmunoglobulina se unirá a un epítopo en una molécula de A-beta, mientras que el otro dominio variable individual de inmunoglobulina se unirá al otro epítopo en otra molécula de A-beta, presentando reacción cruzada de esta manera dos moléculas de A-beta (unión intermolecular).
De acuerdo con una realización preferida, el polipéptido de la invención se unirá a los dos epitopos dentro de la misma molécula de A-beta, de forma que no exista reacción cruzada, y los complejos de polipéptido de la invención - A-beta se formarán con una estequiometría de 1 :1. De esta manera, se prefiere la unión intramolecular (predominantemente) en comparación con la unión intermolecular (predominantemente), entendiéndose que sin embargo puede producirse una fracción minoritaria de unión intermolecular. Puede realizarse una distinción entre la unión intra- e intermolecular usando ensayos Biacore o de cromatografía de exclusión molecular (como se describe por Santora et al., Anal. Biochem., 299: 119-129) - véase el Ejemplo 8.2 mostrado más adelante en la presente memoria. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que también están dentro del alcance de esta invención polipéptidos que funcionan a través de la unió intermolecular de moléculas de A-beta separadas.
En otra realización preferida de la invención, el primer y el segundo dominios variables individuales de inmunoglobulina anti-A-beta comprendidos en un polipéptido de la invención consisten esencialmente en 4 regiones flanqueantes (FR1 a FR4 respectivamente) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3 respectivamente). Dentro del polipéptido de la invención, dichos primer y segundo dominios variables individuales de inmunoglobulina están unidos covalentemente, opcionalmente por una péptido enlazador como se describe más adelante, donde dicho enlazador permite estéricamente la unión óptima de al menos dos dominios variables individuales de inmunoglobulina a los respectivos epítopos de A-beta.
Será evidente para el experto en la materia que para usos farmacéuticos en seres humanos, los polipéptidos de la invención preferiblemente se dirigen contra A-beta humano, mientras que para fines veterinarios, los polipéptidos de la invención se dirigen preferiblemente contra A-beta de la especie a tratar.
También será evidente para el experto en la materia que cuando se usan como un agente terapéutico en seres humanos, los dominios variables individuales de inmunoglobulina comprendida en los polipéptidos de acuerdo con la invención preferiblemente son dominios variables individuales de inmunoglobulina humanizados.
De acuerdo con la invención, los dos o más dominios variables individuales de inmunoglobulina pueden ser, independientemente entre sí: Anticuerpos de dominio, es decir, dominios de anticuerpo VL o VH como se han descrito anteriormente y/o dominios VHH como se ha descrito anteriormente, y/o cualquier otro tipo de dominio variable individual de inmunoglobulina, siempre que estos dominios variables individuales de inmunoglobulina se unan al antígeno, es decir, A-beta, no mediante la formación de pares de dominios variables complementarios entre sí que se unen conjuntamente al mismo epítopo (como en el caso de, por ejemplo, un par de dominios VL-VH de un anticuerpo convencional), sino por la unión independiente a diferentes epítopos (es decir, como una molécula de unión a antígeno "biparatópica" como se ha definido anteriormente).
De acuerdo con una realización preferida de la invención, el primer y el segundo dominios variables individuales de inmunoglobulina esencialmente consiste en cualquier secuencia de anticuerpo de dominio o secuencia de dominio VHH como se ha descrito anteriormente. De acuerdo con una realización particularmente preferida, el primer y el segundo dominios variables individuales de inmunoglobulina esencialmente consisten en secuencias de dominio VHH. Por consiguiente, la invención en la presente memoria y, especialmente, en la parte experimental, se describirá con más detalle haciendo referencia a polipéptidos biparatópicos que comprenden dos secuencias de dominio VHH (VHH) anti-A-beta (opcíonalmente humanizadas) que se unen a dos epítopos diferentes de A-beta, es decir, construcciones de dominio VHH biparatópicas. Sin embargo, será evidente para un experto en la materia que la enseñanza de la presente memoria puede aplicarse de forma análoga a polipéptidos que incluyen otros dominios variables individuales de inmunoglobulina anti-A-beta, tales como anticuerpos de dominio.
Los polipéptidos de la invención no solo poseen las características ventajosas de los anticuerpos convencionales, tales como baja toxicidad y alta selectividad, sino que también presentan propiedades adicionales. Son más solubles, lo que significa que pueden almacenarse y/o administrarse en mayores concentraciones en comparación con los anticuerpos convencionales. Son estables a temperatura ambiente, lo que significa que pueden prepararse, almacenarse y/o transportarse sin el uso de un equipo de refrigeración, lo que lleva asociado ahorros de coste, de tiempo y ambientales. Los polipéptidos de la presente invención también presentan una estabilidad prolongada en condiciones extremas de pH, lo que significa que serían adecuados para la liberación por administración oral.
Además, los polipéptidos de la invención no necesitan comprender una parte Fe que está presente en los anticuerpos "clásicos", de forma que pueden evitarse los efectos secundarios producidos por funciones efectoras de Fe, tales como la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Cuando se usan en inmunizaciones pasivas anti-A-beta, se sospecha que los anticuerpos convencionales (que tienen un parte Fe) son responsables de la inducción de microhemorragias observadas en modelos humanos y animales, que están asociadas con la dirección a depósitos de A-beta vasculares cerebrales (angiopatia amiloide cerebral) que conduce a microhemorragias por medio de ADCC y/o CDC (Wilcock, DM, Colton, CA, CNS Neurol. Disord. Drug Targets (2009) Vol. 8(1): 50-64).
De acuerdo con otra realización de la invención, los al menos dos dominios variables individuales de inmunoglobulina presentes en un polipéptido de la invención pueden unirse entre sí directamente (en decir, sin el uso de un enlazador) o a través de un enlazador. El enlazador preferiblemente es un péptido enlazador y, de acuerdo con la invención, se seleccionará para permitir la unión de sus al menos dos dominios variables individuales de inmunoglobulina diferentes a cada uno de al menos dos epítopos diferentes de A-beta, dentro de la misma molécula de A-beta o dentro de dos moléculas diferentes.
Los enlazadores adecuados, entre otras cosas, dependerán de los epítopos y, específicamente, la distancia entre los epítopos en A-beta a los que se unen los dominios variables individuales de inmunoglobulina, y serán evidentes para el experto en la materia basándose en la descripción de la presente memoria opcionalmente después de algún grado limitado de experimentación rutinaria.
Además, cuando los dos o más dominios variables individuales de inmunoglobulina que se unen a A-beta son anticuerpos de dominio o dominios VHH, también pueden unirse entre sí a través de un tercer anticuerpo de dominio o dominio VHH (en el que los dos o más dominios variables individuales de inmunoglobulina pueden unirse directamente al tercer anticuerpo de dominio o dominio VHH o a través de enlazadores adecuados). Dicho tercer anticuerpo de dominio o dominio VHH puede ser, por ejemplo, un anticuerpo de dominio o dominio VHH que proporciona una mayor semivida, como se describe adicionalmente en la presente memoria. Por ejemplo, el último anticuerpo de dominio o dominio VHH puede ser un anticuerpo de dominio o dominio VHH que es capaz de unirse a una proteína de suero (humana) tal como albúmina de suero (humano) o transferrina (humana), como se describe adicionalmente en la presente memoria.
Como alternativa, los dos o más dominios variables individuales de inmunoglobulina que se unen a A-beta pueden unirse en serie (directamente o a través de un enlazador adecuado) y el tercer anticuerpo de dominio (individual) o dominio VHH (que puede proporcionar una mayor semivida, como se ha descrito anteriormente) puede conectarse directamente o a través de un enlazador a una de estas dos o más secuencias de inmunoglobulina mencionadas anteriormente. En la presente memoria se describen enlazadores adecuados en relación con polipéptidos específicos de la invención y pueden comprender - por ejemplo y sin limitación - una secuencia de aminoácidos, teniendo dicha secuencia de aminoácidos preferiblemente una longitud de 9 o más aminoácidos, más preferiblemente de al menos 17 aminoácidos, tal como de aproximadamente 20 a 40 aminoácidos. Sin embargo, el límite superior no es crítico sino que se elige por razones de conveniencia en relación, por ejemplo, con la producción biofarmacéutica de dichos polipéptidos.
La secuencia del enlazador puede ser una secuencia natural o una secuencia no natural. Si se usa para fines terapéuticos, el enlazador preferiblemente es no inmunogénico en el sujeto al que se administra el polipéptido anti-A-beta de la invención.
En los documentos WO 96/34103 y WO 94/04678 se describe otro grupo útil de secuencias enlazadoras que son enlazadores derivados de la región de bisagra de anticuerpos de cadena pesada.
Otros ejemplos son secuencias enlazadoras de polialanina tales como Ala-Ala-Ala.
Otros ejemplos preferidos de secuencias enlazadoras son enlazadores Gly/Ser de diferente longitud tales como enlazadores (glyxsery)z, incluyendo (gly4ser)3) (gly ser)4, (gly4ser), (gly3ser), gly3y (gly3ser2)3.
Si el polipéptido de la invención se modifica por la unión de un polímero, por ejemplo de un resto de polietilenglicol (PEG), la secuencia enlazadora preferiblemente incluye un resto aminoacídico, tal como una cisteína o una lisina, que permite dicha modificación, por ejemplo PEGilación, en la región enlazadora. Son ejemplos preferidos de dichos enlazadores: GGGGCGGGS ("GS9, C5", SEC ID N°: 6) GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ("GS25, C5, SEC ID N°: 7) GGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGG ("GS27, C14", SEC ID N°: 8), GGGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ("GS35, C15", SEC ID N°: 9), y GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ("GS35, C5", SEC ID N°: 10).
En las SEC ID N° 40 a 43, 142 y 143 se muestran algunos ejemplos no limitantes de polipéptidos PEGilados de la invención, incluyendo dichos enlazadores.
Además, el enlazador también puede ser un resto de poli (etilenglicol), como se muestra, por ejemplo, en el documento WO04/081026.
En otra realización, los al menos dos dominios variables individuales de inmunoglobulina del polipéptido de la invención están unidos entre sí a través de otro resto (opcionalmente a través de uno o dos enlazadores), tal como otro polipéptido que, en una realización preferida pero no limitante, puede ser un dominio variable individual de inmunoglobulina adicional como ya se ha descrito anteriormente. Dicho resto puede ser esencialmente inactivo o puede tener un efecto biológico tal como una mejora de las propiedades deseadas del polipéptido o puede conferir una o más propiedades deseadas adicionales al polipéptido. Por ejemplo, y sin limitación, el resto puede mejorar la semivida de la proteína o el polipéptido y/o puede reducir su inmunogenicidad o mejorar cualquier otra propiedad deseada.
Algunos ejemplos no limitantes de dichas construcciones son las construcciones de las SEC ID N°: 34 a 39.
De acuerdo con una realización preferida, los polipéptidos de la invención comprenden un primer dominio variable individual de inmunoglobulina que se une al epítopo como se define por la SEC ID N°: 3, y un segundo dominio variable individual de inmunoglobulina que se une al epítopo como se define por la SEC ID N°: 4, o un primer dominio variable individual de inmunoglobulina que se une al epítopo como se define por la SEC ID N°: 4, y un segundo dominio variable individual de inmunoglobulina que se une al epítopo como se define por la SEC ID N°: 3.
Incluso más preferiblemente, el contacto entre los dominios variables individuales de inmunoglobulina y la molécula de A-beta se realiza como se describe en los Ejemplos 8.2 y 8.3, es decir, el polipéptido de la invención contacta con al menos los aminoácidos 1 , 3, 13, 20 y 23 del péptido A-beta humano o de ratón.
Preferiblemente, los polipéptidos de la invención tienen valores de la constante de disociación (KD), medidos en los ensayos Kinexa descritos en el Ejemplo 9.7, en el intervalo de 10'6 moles/litro o menos, más preferiblemente 10"9 moles/litro o menos e incluso más preferiblemente en el intervalo de 10"11 a 10"13 moles/litro, o tienen un valor de CI50 medido en un ensayo de unión TR-FRET, como se expone en el Ejemplo 9.3, de 10"9 moles/litro o inferior, y preferiblemente en el intervalo de 5 x 10'10 moles/litro a 10"12 moles/litro.
De acuerdo con una realización incluso más preferida de la invención, las secuencias de CDR en el polipéptido de la invención son como se definen más adelante y también son tales que el polipéptido de la invención se une a A-beta con una constante de disociación (KD) como la establecida en el párrafo anterior o tienen valores de CI50 como los indicados anteriormente.
De acuerdo con una realización específica de la invención, el polipéptido de la invención comprende dos dominios variables individuales de inmunoglobulina de unión a A-beta que tienen la estructura (SEC ID N° proporcionadas en la Tabla I más adelante): Dominio variable individual de inmunoglobulina 1 : FR (1)1 - CDR (1 )1 - FR (1 )2 - CDR (1)2 - FR (1 )3 - CDR (1 )3 - FR (1 )4, Dominio variable individual de inmunoglobulina 2: FR (2)1 - CDR (2)1 - FR (2)2 - CDR (2)2 - FR (2)3 - CDR (2)3 - FR (2)4, donde: CDR (1)3 se selecciona del grupo que consiste en: - las secuencias de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N°: 13 y SEC ID N°: 16; y - secuencias de aminoácidos que tienen hasta tres, preferiblemente hasta dos y más preferiblemente una diferencia de aminoácidos en comparación con dichas secuencias de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N°: 13 o la SEC ID N°: 16, respectivamente; y CDR (2)3 se selecciona entre el grupo que consiste en: - la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N°: 19; y - secuencias de aminoácidos que tienen hasta tres, preferiblemente hasta dos y más preferiblemente una diferencia de aminoácidos en comparación con dicha secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N°: 19. y donde las otras secuencias de CDR y las secuencias de región flanqueante no se limitan específicamente, sino que se seleccionan por el experto en la materia de acuerdo con las necesidades específicas, tales como regiones flanqueantes humanizadas en caso de un polipéptido destinado para el uso en seres humanos para reducir la inmunogenicidad del polipéptido de la invención. El orden de los dominios variables individuales de inmunoglobulina 1 y 2 no se limita de forma particular, de forma que, dentro de un polipéptido de la invención, el dominio variable individual de inmunoglobulina 1 puede localizarse en el extremo N y el dominio variable individual de inmunoglobulina 2 puede localizarse en el extremo C, o viceversa.
Preferiblemente, CDR (1)3 se selecciona del grupo que consiste en las secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N°: 13 y SEC ID N°: 16 y CDR (2)3 es la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N°: 19.
Incluso más preferiblemente, el polipéptido de la invención comprende dos dominios variables individuales de inmunoglobulina de unión a A-beta que tienen la estructura (SEC ID N° proporcionadas en la Tabla I a continuación): Dominio variable individual de inmunoglobulina 1 : FR (1)1 - CDR (1)1 - FR (1)2 - CDR (1)2 - FR (1)3 - CDR (1)3 - FR (1) 4, Dominio variable individual de inmunoglobulina 2: FR (2)1 - CDR (2)1 - FR (2)2 - CDR (2)2 - FR (2)3 - CDR (2)3 - FR (2) 4, donde: CDR (1)1 es la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N°: 11 (que es igual que la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N°: 14); CDR (1)2 se selecciona del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N°: 2 y SEC ID N°: 5; CDR (1)3 se selecciona del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N°: 13 y SEC ID N°: 16; CDR (2)1 es la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N°: 17; CDR (2)2 es la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N°: 18; y CDR (2)3 es la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N°: 19; y donde las otras secuencias de región flanqueante no se limitan específicamente sino que se seleccionan por el experto en la materia de acuerdo con las necesidades específicas, tales como regiones flanqueantes humanizadas en caso de un polipéptido destinado para el uso en seres humanos para reducir la inmunogenicidad del polipéptido de la invención.
En el polipéptido de la invención como se ha descrito anteriormente, el orden particular de los dominios variables individuales de inmunoglobulina 1 y 2 como se ha indicado anteriormente dentro del polipéptido no es crítico, de forma que el dominio variable individual de inmunoglobulina 1 mencionado anteriormente puede localizarse en el extremo N del polipéptido, seguido del dominio variable individual de inmunoglobulina 2 mencionado anteriormente; como alternativa, el dominio variable individual de inmunoglobulina 2 mencionado anteriormente puede localizarse en el extremo N del polipéptido, seguido del dominio variable individual de inmunoglobulina 1 mencionado anteriormente. En ambos casos, pueden estar presentes secuencias y restos adicionales dentro del polipéptido de la invención, por ejemplo, en el extremo N, en el extremo C o localizados entre los dos dominios variables individuales de inmunoglobulina, como se indica con más detalle en la presente memoria.
Las secuencias de CDR anteriores y series de 6 secuencias de CDR como se presentan en los polipéptidos de la invención y se ha indicado anteriormente se resumen en las siguientes Tablas I y II, respectivamente: TABLA I y TABLA II: Combinaciones de CDR preferidas en polipéptidos de la invención que comprenden dos dominios variables individuales inmunoglobulina de unión a A-beta diferentes TABLA I: Secuencias de CDR TABLA II: Series preferidas de combinaciones de secuencias de CDR / CDR (secuencias definidas por su SEC ID N°: como se proporciona en la TABLA I anterior): En la técnica se conocen secuencias de región flanqueante (FR) de inmunoglobulina humana que también pueden usarse como secuencias de región flanqueante para los dominios variables individuales de inmunoglobulina como se han descrito anteriormente. También se conocen en la técnica métodos para humanizar regiones flanqueantes de dominios variables individuales de inmunoglobulina derivados de especies distintas de seres humanos.
En una realización preferida, los polipéptidos de la invención comprenden las siguientes secuencias de aminoácidos de región flanqueante 1 a 4 (FR1 a FR4; SEC ID N° indicados en la Tabla III mostrada a continuación): FR1 es o comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N°: 20 y SEC ID N°: 21 , FR2 es o comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N°: 22, FR3 es o comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N°: 23 y SEC ID N°: 24, y FR4 es o comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N°: 25, TABLA III Secuencias de aminoácidos de FR Son ejemplos específicos de dominios variables individuales de inmunoglobulina que tienen las secuencias de FR y CDR mostradas anteriormente: Dominio variable individual de inmunoglobulina 1 (el primer aminoácido, es decir, el glutamato, opcionalmente puede estar ausente): evqllesggglvqpggslrlscvhsgptfrtdtmgwfrqapgkgrefvaavtwnsgrinyadsvkgrftisrdnsknt aylqmnslrpedtavyycaahrfwggnrvedwrywgqgtlvtvss (ABII035; SEC ID N°: 44).
Dominio variable individual de inmunoglobulina 2 (el primer aminoácido, es decir, el glutamato, opcionalmente puede estar ausente): evqllesggglvqpggslrlscaasgrtfnnynmgwfrqapgkgrefvaavsrsgvstyyadsvkgrftisrdnsk ntvylqmnslrpedtavyycaaayrgtainvrrsysswgqgtlvtvss (ABII059; SEC ID N°: 45).
A continuación se proporcionan también ejemplos específicos de polipéptidos de la invención que incluyen, en una sola cadena polipeptídica, dos dominios variables individuales de inmunoglobulina como se ha mostrado anteriormente y, opcionalmente, un enlazador que conecta los dos dominios variables individuales de inmunoglobulina.
De acuerdo con una realización preferida, los polipéptidos de la invención incluyen, especialmente cuando se usan como un agente terapéutico, un resto que prolonga la semivida del polipéptido de la invención en suero u otros fluidos corporales de un paciente. El término "semivida" significa el tiempo que se necesita para que la concentración en suero del polipéptido (modificado) se reduzca en 50%, in vivo, por ejemplo debido a la degradación del polipéptido y/o la eliminación y/o secuestro por mecanismos naturales.
Más específicamente, dicho resto que prolonga la semivida puede estar unido covalentemente o fusionado a dicho polipéptido y puede ser, sin limitación, una parte Fe, un resto de albúmina, un fragmento de un resto de albúmina, un resto de unión a albúmina, tal como un dominio variable individual de inmunoglobulina anti-albúmina, un resto de unión a transferrina, tal como un dominio variable individual de inmunoglobulina anti-transferrina, una molécula de polioxialquileno, tal como una molécula de polietilenglicol, un péptido de unión a albúmina o derivados de hidroxietil almidón (HES).
De acuerdo con una realización, el polipéptido de la invención puede unirse a una o más partes de anticuerpos, fragmentos o dominios que confieren una o más funciones efectoras al polipéptido de la invención y/o puede conferir la capacidad de unirse a uno o más receptores de Fe. Por ejemplo, para este fin y sin limitación, las partes de anticuerpo pueden ser o pueden comprender dominios CH2 y/o CH3 de un anticuerpo, tales como de un anticuerpo de cadena pesada (como se ha descrito anteriormente en la presente memoria) y más preferiblemente de un anticuerpo de 4 cadenas humano convencional; específicamente, el polipéptido de la invención puede unirse a una región Fe, por ejemplo de IgG humana, de IgE humana o de otra Ig humana. Por ejemplo, el documento WO 94/04678 describe anticuerpos de cadena pesada que comprenden un dominio VHH de Camélido o un derivado humanizado del mismo, donde el dominio CH2 y/o CH3 de Camélido se han remplazado por dominios CH2 y/o CH3 humanos, para proporcionar una inmunoglobulina que consiste en 2 cadenas pesadas que comprenden, cada una, un dominio VHH -opcionalmente humanizado - y dominios CH2 y CH3 humanos (pero no dominio CH1 ), teniendo dicha inmunoglobulina la función efectora proporcionada por los dominios CH2 y CH3, pudiendo funcionar sin presencia de ninguna cadena ligera y teniendo una mayor semivida en comparación con los dominios VHH correspondientes sin dicha modificación.
Son ejemplos específicos de polipéptidos de la invención que incluyen una parte Fe (con o sin funciones efectoras) los polipéptidos indicados a continuación en la presente memoria: evqllesggglvqpggslrlscvhsgptfrtdtmgwfrqapgkgrefvaavtwnsgrinyadsv kgrftisrdnskntaylqmnslrpedtav^caahrfvvggnivedwrywgqgtlvtvssggggsgggsevqlles ggglvqpggslrlscaasgrtfnnynmgwfrqapgkgrefvaavsrsgvstyyadsvkgrftisrdnskntvylqm nslrpedtavyycaaayrgtainvrrsysswgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpep vtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcp apellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcv vdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvl tvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewe sngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk (SEC ID N°: 26) evqllesggglvqpggslrlscaasgrtfnnynmgwfrqapgkgrefvaavsrsgvstyyads vkgrftisrdnskntvylqmnslrpedtavyycaaayrgtainvrrsysswgqgtlvtvssgggsggggsggggsg ggQsgggQsgggevqUesggglvqpggsIrlscvhsgptfrtdtmgwfrqapgkgrefvaavtwnsgrinyads vkgrttisrdnskntaylqmnslrpedtavyycaahi^vggnrvedwrywgqgtlvtvssastkgpsvfplapss kstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntk vdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtc vvdvshedpevkfnwyvdgvevh naktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtkn qvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhyt qkslslspgk (SEC ID N°: 27) evqllesggglvqpggslrlscaasgrtfnnynmgwfrqapgkgrefvaavsrsgvstyyads vkgrftisrdnskntvylqmnslrpedtavyycaaayrgtainvrrsysswgqgtlvtvssggggsggggsggggc ggggsggggsggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscvhsgptfrtdtmgwfrqapgkgrefvaavtw nsgrinyadsvkgrftisrdnskntaylqmnslrpedtavyycaahrfvvggni^edwiTwgqgtlvtvssastkg psvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicn vnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtc vvdvshedpevkfn wyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytl ppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscs vmhealhnhytqkslslspgk (SEC ID N°: 28) evqllesggglvqpggslrlscvhsgptfrtdtmgwfrqapgkgrefvaavtwnsgrinyadsv kgiltisrdnskntaylqmnslrpedtavyycaahilvvggnn/edwiTwgqgtlvtvssggggsgggsevqlles ggglvqpggslrlscaasgrtfnnynmgwfrqapgkgre1vaavsrsgvstyyadsvkgii¾isrdnskntvylqm nslrpedtavyycaaayrgtainvrrsysswgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpep vtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcp apeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvs vltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiave wesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk (SEC ID N°: 29) evqllesggglvqpggslrlscaasgrtfnnynmgwfrqapgkgrefvaavsrsgvstyyads vkgrftisrdnskntvylqmnslrpedtavyycaaayrgtainvrrsysswgqgtlvtvssgggsggggsggggsg gggsggggsgggevqllesggglvqpggslrlscvhsgptfrtdtmgwfrqapgkgrefvaavtwnsgrinyads vkgrftisrdnskntaylqmnslrpedtavyycaahrfvvggnrvedwrywgqgtlvtvssastkgpsvfplapss kstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntk vdkrvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgve vhnaktkpreeqynstyrwsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemt knqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksnwqqgnvfscsvmheal^ hytqkslslspgk (SEC ID N°: 30) evqllesggglvqpggslrlscaasgrtfnnynmgwfrqapgkgrefvaavsrsgvstyyads vkgrftisrdnskntvylqmnslrpedtavyycaaayrgtainvrrsysswgqgtlvtvssggggsggggsggggc ggggsggggsggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscvhsgptfrtdtmgwfrqapgkgrefvaavtw nsgrinyadsvkgrftisrdnskntaylqmnslrpedtavyycaahrfvvggni^edwiTwgqgtlvtvssastkg psvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslss vtvpssslgtqtyicn vnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcv vdvshedpevkf nwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvy tlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfsc svmhealhnhytqkslslspgk (SEC ID N°: 31) De acuerdo con una realización adicional de la invención, los dos dominios variables individuales de inmunoglobulina pueden fusionarse a una molécula de albúmina de suero, tal como se describe, por ejemplo, en los documentos WO01 79271 y WO03/59934.
En la Tabla IV se proporciona un ejemplo de un polipéptido de unión a A-beta biparatópico de la invención que comprende un resto de albúmina de suero humano.
Tabla IV: Proteína de fusión a HSA DNSKNTAYLQMNSLRPEDTAVYYCAAHRFWGGNRVE DWRYWGQGTLVTVSSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKAL VLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAEN CD SLHTLFGD LCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERN ECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKK YLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAA CLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAW AVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLEC ADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEV ENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFL YEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECY AKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLV RYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMP CAE D YLS WLN Q LC VLH E KTP VS DRVTKCCTES LVN R R P CFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQ TALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDK ETCFAEEGKKLVAASQAALGL En otra realización preferida, el polipéptido de la invención comprende un resto que se une a un antígeno encontrado en la sangre, tal como albúmina de suero, inmunoglobulinas de suero, proteina de unión a tirosina, fibrinógeno o transferrina, confiriendo de esta manera una mayor semivida in vivo al polipéptido resultante de la invención. De acuerdo con una realización preferida específicamente, dicho resto es una inmunoglobulina de unión a albúmina y, de una forma especialmente preferida, un dominio variable individual de inmunoglobulina de unión a albúmina tal como un dominio VHH de unión a albúmina.
Si está destinado para el uso en seres humanos, dicho dominio variable individual de inmunoglobulina de unión a albúmina preferiblemente se unirá a albúmina de suero humano y preferiblemente será un dominio VHH de unión a albúmina humanizado.
En la técnica se conocen dominios variables individuales de inmunoglobulina que se unen a albúmina de suero humano y se describen con más detalle, por ejemplo, en el documento WO2006/122786. Un dominio VHH de unión a albúmina específicamente útil consiste o contiene la secuencia de aminoácidos: evqlvesggglvqpgnslrlscaasgftfssfgmswvrqapgkglewvssisgsgsdtlyads vkgrftisrdnakttlylqmnslrpedtavyyctiggslsrssqgtlvtvss (SEC ID N°: 33) En la Tabla V se muestran ejemplos específicos de polipéptidos de la invención que comprenden un dominio VHH de unión a albúmina: TABLA V: Polipéptidos biparatópicos de la invención, que comprend dominios VHH anti-A-beta y un dominio VHH anti-HSA En otra realización preferida, el polipéptido de la invención comprende un resto que se une a albúmina de suero, donde dicho resto es un péptido de unión a albúmina, como se describe, por ejemplo, en las publicaciones de patente internacionales WO2008/068280 y WO2009/12769Í.
De acuerdo con otra realización, una modificación que prolonga la semivida de un polipéptido de la invención (reduciendo también dicha modificación la inmunogenicidad del polipéptido) comprende la unión de un polímero farmacológicamente aceptable adecuado, tal como poli(etilenglicol) (PEG) de cadena lineal o ramificada o derivados del mismo (tales como metoxipoli(etilenglicol) o mPEG). Generalmente, puede usarse cualquier forma adecuada de PEGilación, tal como la PEGilación usada en la técnica para anticuerpos y fragmentos de anticuerpo (incluyendo, pero sin limitación, anticuerpos de dominio y scFv); se hace referencia, por ejemplo, a: Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002); Veronese y Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003); Harris y Chess, Nat. Rev. Drug. Discov. 2 (2003); documento WO 04/060965; y documento US6.875.841.
También están disponibles en el mercado diversos reactivos para la PEGilación de polipéptidos, por ejemplo, en Nektar Therapeutics, USA o NOF Corporation, Japón, tal como la Serie Sunbright® EA, Serie SH, Serie MA, Serie CA y Serie ME, tal como Sunbright® ME-100MA, Sunbright® ME-200MA y Sunbright® ME-400MA.
Preferiblemente se usa PEGilación dirigida, en particular a través de un resto de cisteína (véase, por ejemplo, Yang et al., Protein Engineering 16, 761-770 (2003)). Por ejemplo, para este fin, el PEG puede unirse a un resto de cisteína que existe de forma natural en un polipéptido de la invención, un polipéptido de la invención puede modificarse para introducir convenientemente uno o más restos de cisteína para la unión de PEG, o una secuencia de aminoácidos que comprende uno o más restos de cisteína para la unión de PEG puede fusionarse al extremo N y/o C y/o de una región enlazadora que une dos o más dominios funcionales de un polipéptido de la invención, todo ello usando técnicas de ingeniería de proteínas conocidas per se para el experto en la materia.
Preferiblemente, para los polipéptidos de la invención, se usa un PEG con un peso molecular mayor de 5 kDa, tal como mayor de 10 kDa y menor de 200 kDa, tal como menor de 100 kDa; por ejemplo en el intervalo de 20 kDa a 80 kDa.
Con respecto a la PEGilación, debe indicarse que, en general, la invención también incluye cualquier polipéptido de la invención que se ha PEGilado en una o más posiciones de aminoácidos, preferiblemente de tal forma que dicha PEGilación (1) aumenta la semivida in vivo; (2) reduce la inmunogenicidad; (3) proporciona una o más propiedades beneficiosas adicionales conocidas per se para la PEGilación; (4) no afecta esencialmente a la afinidad del polipéptido por A-beta (por ejemplo no reduce dicha afinidad en más de 50 %, y más preferiblemente no la reduce en más de 10%, como se determina por un ensayo adecuado, tal como los descritos en los Ejemplos presentados más adelante); y/o (4) no afecta a ninguna de las otras propiedades deseadas de los polipéptidos de la invención. Los grupos PEG adecuados y métodos para unirlos, de forma específica o no específica, serán evidentes para el experto en la materia.
De acuerdo con una realización preferida específicamente de la invención, un polipéptido PEGilado de la invención incluyen un resto de PEG lineal que tiene un peso molecular de 40 kDa o 60 kDa, donde el resto de PEG se une al polipéptido en una región enlazadora y, específicamente, a un resto de Cys en la posición 5 de un péptido enlazador-GS9 como se muestra en la SEC ID N°: 6, en la posición 14 de un péptido enlazador-GS27 como se muestra en la SEC ID N°: 8, o en la posición 15 de un péptido enlazador-GS35 como se muestra en la SEC ID N°: 9, o en la posición 5 de un péptido enlazador-35GS como se muestra en la SEC ID N°: 10.
En la Tabla VI mostrada a continuación se proporcionan ejemplos preferidos de polipéptidos de la invención, PEGilados preferiblemente con uno de los reactivos de PEG mencionados anteriormente, tales como "Sunbright® ME-400MA" como se muestra en la siguiente fórmula química: que tiene un peso molecular medio de 40 kDa: Tabla VI: Polipéptidos PEGilados de la invención; C* indica el resto de Cys que lleva el resto de PEG De acuerdo con una realización adicional, el polipéptido de la invención comprende además un resto que permite que el polipéptido atraviese la barrera hematoencefálica. En particular, dicho resto que permite que los polipéptidos resultantes de la invención atraviesen la barrera hematoencefálica pueden ser uno o más (tales como dos y preferiblemente uno) dominios variables individuales de inmunoglobulina, tales como los fragmentos de anticuerpo que se dirigen al cerebro (VHH) FC44 y FC5 descritos en el documento WO02/057445. Se muestran ejemplos de los mismos en la Tabla XIX mostrada a continuación.
De esta manera, los polipéptidos de la invención también pueden describirse por la siguiente fórmula general: A - ISVD1 - B - ISVD2 - C, donde ISVD1 e ISVD2 indican un dominio variable individual de inmunoglobulina de unión a A-beta como se ha descrito anteriormente en la presente memoria, que se une a diferentes epítopos de A-beta, tales como, por ejemplo, los dominios variables individuales de inmunoglobulina de acuerdo con las SEC ID N° 44 y 45, respectivamente; y A, B y C independientemente entre sí, indican: - ningún resto adicional (es decir, A es el extremo N de ISVD1 , B es un enlace peptídico que une ISVD1 e ISVD2 y C es el extremo C de ISVD2) - uno o más dominios seleccionados del grupo de dominios CH1, CH2 y CH3 de IgG, IgM, IgD, IgE humanas y similares, y preferiblemente C indica CH2-CH3; - albúmina o un fragmento de la misma y preferiblemente albúmina de suero humano o un fragmento de la misma; - un resto de unión a albúmina, y preferiblemente un dominio variable individual de inmunoglobulina de unión a albúmina o un péptido de unión a albúmina; - un péptido enlazador, que opcionalmente está PEGilado; y preferiblemente B indica un péptido enlazador que tiene de 3 a 45 aminoácidos, incluyendo al menos un resto de cisteína que está PEGilado, preferiblemente con un resto PEG40 o PEG60; - uno o más restos de unión a A-beta, preferiblemente un dominio variable de inmunoglobulina anti-A-beta adicional, idéntico o no idéntico a ISVD1 o ISVD2 - un polipéptido, preferiblemente un dominio variable individual de inmunoglobulina, que confiere al polipéptido propiedades de paso a través de la barrera hematoencefálica, tal como FC44 y FC5 descritos en el documento o donde ISVD1 , ISVD2, B y C tienen el significado indicado anteriormente y - A indica un resto de Met N-terminal, opcionalmente formilado, por ejemplo como resultado de la expresión en un organismo hospedador heterólogo; y/o una secuencia señal o líder que dirige la secreción del polipéptido de la invención desde una célula hospedadora tras la síntesis; y/o una pro-secuencia que se elimina opcionalmente después de la expresión del polipéptido en una célula hospedadora adecuada; o donde ISVD1 , ISVD2, A y B tienen el significado indicado anteriormente y - C indica un "marcador", tal como una secuencia de aminoácidos o resto que permite o facilita la purificación del polipéptido de la invención, por ejemplo usando técnicas de afinidad dirigidas contra dicha secuencia o resto; pudiendo eliminarse dicho marcador opcionalmente después de dicha etapa de purificación, por ejemplo, por escisión química o enzimática, para proporcionar la secuencia madura del polipéptido; para este fin, el marcador puede unirse opcionalmente a la secuencia del polipéptido a través de una secuencia enlazadora escindible o contener un motivo escindible. Algunos ejemplos preferidos pero no limitantes de dichos restos son múltiples restos de histidina, restos de glutatión y un marcador myc tal como AAAEQKLISEEDLNGAA (SEC ID N°: 46).
Uso terapéutico De acuerdo con un aspecto adicional importante, el polipéptido de la invención se usa para fines terapéuticos, tales como - para la prevención, tratamiento y/o alivio de un trastorno, enfermedad o afección como se indica más adelante, especialmente en un ser humano, tal como la Enfermedad de Alzheimer (EA), DME seca o glaucoma, - en un método de tratamiento de un paciente que necesita dicha terapia, comprendiendo dicho método la administración, al sujeto que lo necesita, de una cantidad farmacéuticamente activa de al menos un polipéptido de la invención o una composición farmacéutica (como se indica con detalle más adelante) que comprende dicho polipéptido de la invención, donde dicho sujeto que necesita dicha terapia puede ser un humano que padece cualquiera de los trastornos, enfermedades o afecciones indicadas más adelante, tales como EA, DME seca o glaucoma, - para la preparación de un medicamento para la prevención, tratamiento o alivio de trastornos, enfermedades o afecciones como se indica más adelante, tales como EA, DME seca o glaucoma en un ser humano, - como ingrediente activo en una composición farmacéutica o medicamento usado para los fines mencionados anteriormente.
El trastorno, enfermedad o afección (en lo sucesivo: enfermedad) como se ha mencionado anteriormente es una enfermedad que puede prevenirse y/o tratarse y/o aliviarse mediante la administración de un polipéptido de la invención al paciente o ser (humano) y, más específicamente, una enfermedad mediada por la disfunción de A-beta, tal como una disfunción de la producción, deposición o ausencia de eliminación de A-beta y/o una enfermedad mediada por la formación de placas amiloides, formación de oligómeros de A-beta y similares. Incluso más específicamente, la enfermedad es una enfermedad que puede prevenirse y/o tratarse y/o aliviarse mediante la modulación, reducción y/o inversión de la formación (indeseada) o acumulación de A-beta y/o de placas amiloides y/o de oligómeros de A-beta en un paciente, comprendiendo dichas enfermedades, por ejemplo, enfermedades neurodegenerativas, siendo la enfermedad neurodegenerativa relacionada con A-beta más prominente la EA.
De esta manera, los polipéptidos de la invención pueden usarse en un método para la prevención, tratamiento o alivio de enfermedades tales como: - Enfermedad de Alzheimer (EA; todos los tipos y estadios de la enfermedad incluyendo estadios preclínicos y prodromales); también conocida como "demencia de tipo Alzheimer", - la forma seca de degeneración macular relacionada con la edad (DME seca; atrofia geográfica central) - glaucoma, - angiopatía amiloide cerebral (CAA), - trisomía 21 (Síndrome de Down), incluyendo síndrome de Down en adultos, - hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis de tipo Dutch (HCHWA-D), - demencia con Cuerpos de Lewy, - degeneración de lóbulo frontotemporal, - glaucoma, - esclerosis lateral amiotrófica, - miositis con cuerpos de inclusión esporádicos, y - trastorno de ansiedad en seres humanos de edad avanzada (por ejemplo, de al menos 55 años), seleccionados del grupo que consiste en trastorno obsesivo-compulsivo, trastorno de pánico, ataque de pánico, agorafobia, trastorno de estrés post-traumático, fobia social, trastorno con comportamiento destructivo y síndrome de fatiga crónica (donde dicho ser humano de edad avanzada puede tener un diagnóstico o no de una afección relacionada con A-beta, seleccionada entre EA clínica o preclínica, angiopatía amiloide crónica y síndrome de Down), donde dicho método comprende administrar, a un sujeto que lo necesita, una cantidad farmacéuticamente activa de un polipéptido de la invención y/o de una composición farmacéutica que lo comprende.
En el contexto de la presente invención, la expresión "prevención, tratamiento y/o alivio" no solo comprende la prevención y/o tratamiento y/o alivio de la enfermedad, sino que también comprende, en general, la prevención del inicio de la enfermedad, la ralentización o inversión del progreso de la enfermedad, la prevención o ralentización del inicio de uno o más síntomas asociados con la enfermedad, la reducción y/o alivio de uno o más síntomas asociados con la enfermedad, la reducción de la gravedad y/o la duración de la enfermedad y/o de cualquier síntoma asociado con la misma y/o la prevención de un aumento adicional en la gravedad de la enfermedad y/o de cualquier síntoma asociado con la misma, la prevención, reducción o inversión de cualquier lesión fisiológica producida por la enfermedad, y en general cualquier acción farmacológica que sea beneficiosa para el paciente que está tratando.
Específicamente, en el caso de EA, los polipéptidos, composiciones y métodos de la invención pueden usarse para ayudar a prevenir o retrasar el inicio de EA en pacientes con factores de riesgo identificados para EA y/o depósito de A-beta demostrados, para tratar pacientes con deterioro cognitivo leve (MCI), que tienen riesgo de padecer EA, y para prevenir o retrasar el inicio de EA en los pacientes que por otra razón se esperaría que progresaran desde fases de enfermedad preclínicas o prodromales a demencia. Los factores de riesgo genéticos para EA incluyen mutaciones específicas en el gen APP (en particular en las posiciones 670 y 671 así como en la posición 717), en los genes de presenilina PS1 y PS2 y en ApoE4. Otros factores de riesgo incluyen una historia familiar de EA, hipercolesterolemia, aterosclerosis, diabetes y/o edad avanzada. La disposición de para EA puede diagnosticarse de forma prematura analizando las concentraciones de A-beta (1-42) y tau en el CSF. Las técnicas de formación de imágenes neurales (por ejemplo PET y MRI) pueden identificar pacientes con riesgo de convertirse en EA. En general, puede permitirse el uso de varios biomarcadores para diagnosticar EA en una fase muy temprana con una alta sensibilidad y especificidad.
En el caso de una predisposición al síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis de tipo Dutch y angiopatía beta-amiloide cerebral, los polipéptidos, composiciones y métodos de la invención también pueden ser útiles para prevenir sus posibles consecuencias, tales como hemorragias lobulares únicas y recurrentes.
El sujeto a tratar será un mamífero, y en más en particular un ser humano. Como será evidente para el experto en la materia, el sujeto a tratar en particular será una persona que padece, o con riesgo de padecer, las enfermedades, trastornos o afecciones mencionadas en la presente memoria.
También será evidente para el experto en la materia que los métodos de tratamiento anteriores de una enfermedad incluyen la preparación de un medicamento para el tratamiento de dicha enfermedad. Además, está claro que los polipéptidos de la invención pueden usarse como ingrediente activo en un medicamento o composición farmacéutica destinada al tratamiento de las enfermedades anteriores. De esta manera, la invención también se refiere al uso de un polipéptido de la invención en la preparación de una composición farmacéutica para la prevención, tratamiento y/o alivio de cualquiera de las enfermedades, trastornos o afecciones mencionadas anteriormente en la presente memoria. La invención además se refiere a un polipéptido de la invención para uso terapéutico o profiláctico y, específicamente, para la prevención, tratamiento y/o alivio de cualquiera de las enfermedades, trastornos o afecciones mencionadas anteriormente en la presente memoria. La invención además se refiere a una composición farmacéutica para la prevención, tratamiento y/o alivio de las enfermedades, trastornos o afecciones mencionadas anteriormente en la presente memoria, donde dicha composición comprende al menos un polipéptido de la invención.
Sin deseo de limitarse por una teoría específica, el efecto terapéutico o profiláctico anterior puede obtenerse por el siguiente mecanismo: Los polipéptidos de la invención se unen A-beta, con lo que se inhibe su interacción con una o más moléculas de A-beta distintas o la interacción de A-beta con un receptor o la interacción de A-beta con una biomolécula soluble o la interacción de A-beta con una biomolécula insoluble. El A-beta diana puede ser parte de una placa o suspensión o solución, o una o más de estas, donde las otras moléculas de A-beta también pueden formar parte de una placa, en suspensión o solución o una o más de estas. La eliminación de diferentes formas de A-beta, tales como la forma monomérica, formas oligo- y multiméricas, formas agregadas solubles e insolubles, formas fibrilares, formas proto-fibrilares y placas amiloides del cerebro, vasos sanguíneos u otras partes del cuerpo, puede deberse a la unión del polipéptido de la invención a A-beta. La reducción de los niveles de A-beta en un fluido corporal, y preferiblemente la reducción del nivel de A-beta soluble en la sangre por inhibición de la interacción entre una molécula de A-beta y otra molécula, tal como, por ejemplo, otra molécula de A-beta, aliviará los síntomas de enfermedades neurales degenerativas, ralentizará o detendrá la progresión de la enfermedad y/o restaurará la lesión cerebral, memoria y cognición.
De acuerdo con un aspecto adicional y más general, la invención se refiere a un método para inmunoterapia, y en particular para inmunoterapia pasiva, comprendiendo dicho método administrar, a un sujeto que padece, o con riesgo de padecer, las enfermedades mencionadas en la presente memoria, una cantidad farmacéuticamente activa de un polipéptido de la invención y/o de una composición farmacéutica que lo comprende.
De acuerdo con otro aspecto, la invención se refiere a un método (i) para la prevención, tratamiento y/o alivio del deterioro cognitivo, y/o (ii) para restaurar la función cognitiva y/o mejorar la función cognitiva, comprendiendo dicho método administrar, a un sujeto que lo necesita, una cantidad farmacéutica activa de un polipéptido de la invención y/o de una composición farmacéutica que lo comprende.
Los polipéptidos de la invención y/o las composiciones que los comprenden pueden administrarse a un paciente que lo necesita de cualquier manera adecuada, dependiendo de la formulación farmacéutica o composición específica a usar. De esta manera, los polipéptidos de la invención y/o las composiciones que los comprenden pueden administrarse, por ejemplo, por vía intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, oral, sublingual (por ejemplo en forma de un comprimido sublingual, pulverización o gota puesta debajo de la lengua y adsorbida a través de las membranas mucosas en la red capilar debajo de la lengua), (intra)nasal (por ejemplo en forma de una pulverización nasal y/o como un aerosol), tópicamente, por medio de un supositorio, por inhalación, por vía intravítrea (esp. para el tratamiento de DME seca o glaucoma), o cualquier otra manera adecuada en una cantidad o dosis eficaz.
Los polipéptidos de la invención y/o las composiciones que los comprenden se administran de acuerdo con un régimen de tratamiento que es adecuado para prevenir, tratar y/o aliviar la enfermedad, trastorno o afección a prevenir, tratar o aliviar. El médico generalmente podrá determinar un régimen de tratamiento adecuado, dependiendo de factores tales como la enfermedad, trastorno o afección a prevenir, tratar o aliviar, la gravedad de la enfermedad, la gravedad de sus síntomas, el polipéptido específico de la invención a usar, la vía de administración específica y la formulación farmacéutica o composición a usar, la edad, sexo, peso, dieta, estado general del paciente y factores similares bien conocidos para el médico. En general, el régimen de tratamiento comprenderá la administración de uno o más polipéptidos de la invención, o de una o más composiciones que los comprenden, en cantidades o dosis terapéutica y/o profilácticamente eficaces.
Generalmente, para la prevención, tratamiento y/o alivio de las enfermedades, trastornos y afecciones mencionadas en la presente memoria y dependiendo de la enfermedad, trastorno o afección específica a tratar, la potencia del polipéptido específico de la invención a usar, la vía específica de administración y la formulación farmacéutica o composición específica usada, los polipéptidos de la invención generalmente se administrarán en una cantidad comprendida entre 0.005 y 20.0 mg por kilogramo de peso corporal y dosis, preferiblemente entre 0.05 y 10.0 mg/kg/dosis, y más preferiblemente entre 0.5 and 10 mg/kg/dosis, de forma continua (por ejemplo, por infusión) o como dosis individuales (tales como, por ejemplo, dosis diarias, semanales o mensuales; véase más adelante), pero puede variar significativamente, especialmente dependiendo de los parámetros mencionados anteriormente.
Para aplicaciones profilácticas, también pueden administrarse composiciones que contienen los polipéptidos de la invención en dosificaciones similares o ligeramente menores. La dosificación también puede ajustarse por el médico individual en caso de cualquier complicación.
Dependiendo del polipéptido específico de la invención y sus propiedades farmacocinéticas específicas y otras propiedades, puede administrarse diariamente, un día sí y otro no, cada tres días, cada cuatro días, cada cinco días o cada seis días, semanalmente, mensualmente y similares. Un régimen de administración podría incluir el tratamiento semanal a largo plazo. Por "largo plazo" se entiende al menos dos semanas y preferiblemente meses o años de duración.
La eficacia de los polipéptidos de la invención y de composiciones que los comprenden, puede ensayarse usando cualquier ensayo in vitro adecuado, ensayo basado en células, ensayo in vivo y/o modelo animal conocido per se, o cualquier combinación de los mismos, dependiendo de la enfermedad específica implicada. Los ensayos y modelos animales adecuados serán evidentes para el experto en la materia, y por ejemplo incluyen los ensayos y modelos animales usados en los Ejemplos proporcionados a continuación. De esta manera, son ensayos adecuados, pero sin limitación, ensayos de unión ELISA que miden la unión de los polipéptidos anti-A-beta a péptidos A-beta monoméricos o agregados recubiertos o a A-beta biotinilado capturado, ensayos de SPR (Resonancia de Plasmón de Superficie) que mide la unión a péptidos A-beta monoméricos o agregados recubiertos o a A-beta biotinilado capturado (Malmqvist M.: Surface plasmon resonance for detection and measurement of antibody-antigen affinity and kinetics; Curr. Opin. Immunol. 5(2):282 (1993)), ensayos TR-FRET de competición (Transferencia Resonante de Energía de Fluorescencia de Resolución en el Tiempo) que miden la competición con una interacción de agente de unión específico a péptido A-beta(1 -40) /región N-terminal o con una interacción de agente de unión específico a A-beta(1 -40) / región central, ensayos de agregación de A-beta in vitro que miden la prevención o desagregación de la agregación, ensayos TAPIR (Inmunorreactividad de Placas Amiloides en Tejidos) que miden la unión de moléculas a placas amiloides usando análisis inmunohistoquímico en cerebros de pacientes con enfermedad de Alzheimer o animales transgénicos para APP, así como modelos mecánicos in vivo.
Preferiblemente, los polipéptidos de la invención tienen mejores características que anticuerpos convencionales conocidos en la técnica (tales como anticuerpos IgG anti-A-beta m266 y 3D6) o los Nanobodies® descritos en el documento WO2006/40153 en al menos uno de estos ensayos o modelos, y preferiblemente en uno o más de los modelos in vivo.
Para uso farmacéutico, los polipéptidos de la invención pueden formularse como una preparación farmacéutica que comprende (i) al menos un polipéptido de la invención y (ii) al menos un vehículo, diluyente, excipiente, adyuvante y/o estabilizante farmacéuticamente aceptable, y (iii) opcionalmente uno o más polipéptidos y/o compuestos farmacéuticamente activos adicionales.
Por "farmacéuticamente aceptable" se entiende que el material respectivo no muestra ningún efecto biológico o indeseable de otra manera cuando se administra a un individuo y no interacciona de una manera perjudicial con ninguno de los otros componentes de la composición farmacéutica (tales como, por ejemplo, el ingrediente farmacéuticamente activo) en el que está contenido. Pueden encontrarse ejemplos específicos en manuales convencionales tales como, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed., Mack Publishing Company, USA (1990). Por ejemplo, los polipéptidos de la invención pueden formularse y administrarse de cualquier manera conocida per se para anticuerpos y fragmentos de anticuerpos convencionales y otras proteínas farmacéuticamente activas. De esta manera, de acuerdo con una realización adicional, la invención se refiere a una composición farmacéutica o preparación que contiene al menos un polipéptido de la invención y al menos un vehículo, diluyente, excipiente, adyuvante y/o estabilizante farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente una o más sustancias farmacéuticamente activas adicionales.
Por medio de ejemplos no limitantes, dicha formulación puede estar en una forma adecuada para administración oral, para administración parenteral (tal como por inyección intravenosa, intramuscular, subcutánea, intratecal, intracavernosa o intraperitoneal o infusión intravenosa), para administración tópica, para administración sublingual, para administración por inhalación, por un parche cutáneo, por un implante, por un supositorio, para administración transdérmica, nasal, intravítrea, rectal o vaginal, y similares. Dichas formas de administración adecuadas, que pueden ser sólidas, semisólidas o líquidas, dependiendo de la manera de la administración - así como los métodos y vehículos para uso en su preparación, serán evidentes para el experto en la materia.
Las preparaciones farmacéuticas para administración parenteral, tales como inyección intravenosa, intramuscular, subcutánea o infusión intravenosa pueden ser, por ejemplo, soluciones, suspensiones, dispersiones, emulsiones o polvos estériles que comprenden el ingrediente activo y que son adecuados, opcionalmente después de una etapa adicional de disolución o dilución, para la infusión o inyección. Los vehículos o diluyentes adecuados para dichas preparaciones, por ejemplo, incluyen, sin limitación, agua estéril y tampones y soluciones acuosas farmacéuticamente aceptables tales como solución salina tamponada con fosfato fisiológica, solución de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank; agua; aceites; glicerol; etanol; glicoles tales como propilenglicol así como aceites minerales, aceites animales y aceites vegetales, por ejemplo aceite de cacahuete, aceite de soja así como mezclas adecuadas de los mismos.
Las soluciones del compuesto activo o sus sales también pueden contener un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos, tales como agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal (tiomersal) y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azúcares, tampones y cloruro sódico. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante la formación de liposomas, por el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de dispersiones o mediante el uso de tensioactivos. También pueden añadirse otros agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
En todos los casos, la forma de dosificación final debe ser estéril, fluida y estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento. Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con diversos de los demás ingredientes indicados anteriormente, cuando sea necesario, seguido de esterilización por filtro. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son secado al vacío y las técnicas de liofilización, que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional presente en las soluciones filtradas de forma estéril previamente.
Normalmente, se preferirán soluciones o suspensiones acuosas. En general, las formulaciones adecuadas para proteínas terapéuticas tales como los polipéptidos de la invención son soluciones de proteínas tamponadas, tales como soluciones que incluyen la proteína en una concentración adecuada (tal como de 0.001 a 400 mg/ml, preferiblemente de 0.005 a 200 mg/ml, más preferiblemente de 0.01 a 200 mg/ml, más preferiblemente de 1.0 - 100 mg/ml, tal como 1.0 mg/ml (administración i.v.) o 100 mg/ml (administración s.c.) y un tampón acuoso tal como: - solución salina tamponada con fosfato, pH 7.4, - otros tampones fosfato, pH 6.2 a 8.2, - tampones histidina, pH 5.5 a 7.0, - tampones succinato, pH 3.2 a 6.6, y - tampones citrato, pH 2.1 a 6.2, y, opcionalmente, sales (por ejemplo NaCI) y/o azúcares o polialcoholes (tales como trealosa, manitol o glicerol) para proporcionar isotonicidad en la solución.
Son soluciones de proteínas tamponadas preferidas soluciones que incluyen aproximadamente 0.05 mg/ml del polipéptido de la invención disuelto en tampón fosfato 25 mM, pH 6.5, ajustado a isotonicidad por la adición de trehalosa 220 mM. Además, pueden incluirse en dichas soluciones otros agentes tales como un detergente, por ejemplo, Tween-20 o Tween-80 al 0.02%. Las formulaciones para aplicación subcutánea pueden incluir significativamente mayores concentraciones del polipéptido de la invención, tales como hasta 100 mg/ml o incluso por encima de 100 mg/ml. Sin embargo, será evidente para el experto en la materia que los ingredientes y las cantidades de los mismos proporcionadas anteriormente solo representan una opción preferida. Serán inmediatamente evidentes para el experto en la materia alternativa y variaciones de las mismas, o pueden concebirse fácilmente a partir de la descripción anterior.
Los polipéptidos de la invención también pueden administrarse usando formulaciones de depósito, de liberación lenta o de liberación sostenida adecuadas, por ejemplo, adecuadas para inyección, usando dispositivos de liberación controlada para la implantación debajo de la piel y/o usando una bomba de dosificación u otros dispositivos conocidos per se para la administración de sustancias o principios farmacéuticamente activos. Además, los polipéptidos de la invención pueden formularse en forma de un gel, crema, pulverización, gota, parche o película que, si se pone en la piel, pasa a través de la piel.
Además, en comparación con anticuerpos o fragmentos de anticuerpo convencionales, un inconveniente importante del uso de los polipéptidos de la invención es que también pueden administrarse fácilmente a través de rutas distintas de la administración parenteral y pueden formularse fácilmente para dicha administración. Por ejemplo, como se describe en la solicitud internacional WO2004/041867, dichos polipéptidos pueden formularse para administración oral, intranasal, intrapulmonar y transdérmica.
De acuerdo con otra realización de la invención, se proporciona una combinación farmacéutica que comprende al menos un polipéptido anti-A-beta de la invención como se describe en la presente memoria y al menos otro agente terapéutico seleccionado entre el grupo que consiste en: inhibidores de colinesterasa tales como donepezil, rivastigmina, galantamina y tacrina; antagonista de NMDA tales memantina; agentes reductores de A-beta tales como agentes capaces de inhibir una o más enzimas implicadas en las formación de A-beta, tales como inhibidores de beta-secretasa, inhibidores de gamma-secretasa y moduladores de gamma-secretasa; agentes que previenen o reducen la acumulación de placas de A-beta; inhibidores de la agregación de A-beta; antagonistas de RAGE; y otros agentes para prevenir, tratar o aliviar enfermedades neurodegenerativas y/o reducir la función cognitiva. Son ejemplos específicos de dichos otros agentes terapéuticos: ELND-005, Caprospinol, NRM-8499, PBT-2, Posiphen, EHT-0202, CTS-21166, Semagacest, BMS-708163, BMS-299897, BMS-433796, ELND-006, ELN-475516, ELN-318463, ELN-475513, Begacestat, E-2012, CHF-5074, Dimebolin (Latrepiridin) y PF-4494700. Dicha combinación farmacéutica opcionalmente puede comprender además un diluyente, excipiente, adyuvante y/o estabilizante.
Cuando dos o más sustancias o principios se van a usar como parte de un régimen de tratamiento combinado, pueden administrarse a través de la misma vía de administración o a través de vías de administración diferentes, esencialmente al mismo tiempo o en momentos diferentes (por ejemplo, esencialmente de forma simultánea, consecutiva o de acuerdo con un régimen alternativo). Cuando las sustancias o principios se van administrar simultáneamente a través de la misma vía de administración, pueden administrarse como diferentes formulaciones o composiciones farmacéuticas o como parte de una formulación o composición farmacéutica combinada. Además, cuando dos o más sustancias o principios activos se van a usar como parte de un régimen de tratamiento combinado, cada una de las sustancias o principios pueden administrarse en la misma cantidad y de acuerdo con el mismo régimen que se usó cuando el compuesto o principio se usa por sí mismo, y dicho uso combinado puede conducir o no a un efecto sinérgico. Sin embargo, cuando el uso combinado de dos o más sustancias o principios activos conduce a un efecto sinérgico, también puede ser posible reducir la cantidad de uno, más o todas las sustancias o principios a administrar, consiguiéndose todavía la acción terapéutica deseada. Esto puede ser útil, por ejemplo, para evitar, limitar o reducir cualquier efecto secundario indeseado que esté asociado con el uso de una o más sustancias o principios cuando se usan en sus cantidades habituales, mientras que aún se obtiene el efecto farmacéutico o terapéutico deseado.
Otra realización adicional de la invención es un método para tratar las enfermedades y trastornos indicados anteriormente, que comprende administrar a un individuo, de forma simultánea, separada o secuencial, una cantidad eficaz de al menos un polipéptido anti-A-beta de la invención y al menos un agente seleccionado del grupo que consiste en: inhibidores de colinesterasa tales como donepezil, rivastigmina, galantamina y tacrina; antagonista de NMDA tales como memantina; agentes reductores de A-beta tales como agentes capaces de inhibir una o más enzimas implicadas en las formación de A-beta, tales como inhibidores de beta-secretasa, inhibidores de gamma-secretasa y moduladores de gamma-secretasa; agentes que previenen o reducen la acumulación de placas de A-beta; inhibidores de la agregación de A-beta; antagonistas de RAGE; y otros agentes para prevenir, tratar o aliviar enfermedades neurodegenerativas y/o reducir la función cognitiva, incluyendo los ejemplos específicos indicados anteriormente.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, el polipéptido de unión a A-beta de la invención se prepara para administrarse en combinación con otros fármacos usados para el tratamiento de las enfermedades y trastornos indicados anteriormente, seleccionándose dichos otros fármacos del grupo que consiste en: inhibidores de colinesterasa tales como donepezil, rivastigmina, galantamina y tacrina; antagonista de NMDA tales memantina; agentes reductores de A-beta tales como agentes capaces de inhibir una o más enzimas implicadas en las formación de A-beta, tales como inhibidores de beta-secretasa, inhibidores de gamma-secretasa y moduladores de gamma-secretasa; agentes que previenen o reducen la acumulación de placas de A-beta; inhibidores de la agregación de A-beta; antagonistas de RAGE; y otros agentes para prevenir, tratar o aliviar enfermedades neurodegenerativas y/o reducir la función cognitiva, incluyendo los ejemplos específicos indicados anteriormente.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, fármacos usados para el tratamiento de las enfermedades y trastornos indicados anteriormente, seleccionándose dichos fármacos del grupo que consiste en: inhibidores de colinesterasa tales como donepezil, rivastigmina, galantamina y tacrina; antagonista de NMDA tales memantina; agentes reductores de A-beta tales como agentes capaces de inhibir una o más enzimas implicadas en las formación de A-beta, tales como inhibidores de beta-secretasa, inhibidores de gamma-secretasa y moduladores de gamma-secretasa; agentes que previenen o reducen la acumulación de placas de A-beta; inhibidores de la agregación de A-beta; antagonistas de RAGE; y otros agentes para prevenir tratar o aliviar enfermedades neurodegenerativas y/o el deterioro en la función cognitiva (incluyendo los ejemplos específicos expuestos anteriormente) se preparan para administrarse en combinación con el polipéptido de unión a A-beta de la invención.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, el polipéptido de unión a A-beta de la invención se usa en combinación con un dispositivo útil para la administración del polipéptido, tal como una jeringa, pluma de inyección u otro dispositivo.
De acuerdo con otra realización de la invención, se proporciona un método para diagnosticar una enfermedad, trastorno o afección mediada por la disfunción de A-beta y/o la formación de placas amiloides, que comprende las etapas de: a) obtener una muestra a partir de un sujeto, b) poner en contacto, in vitro, la muestra con un polipéptido de la invención como se ha definido anteriormente y c) detectar la unión de dicho polipéptido o dicha muestra, y d) comparar la unión detectada en la etapa (c) con un patrón, donde una diferencia en la unión con respecto a dicha muestra es diagnóstico de una enfermedad, trastorno o afección caracterizado por la disfunción de A-beta y/o la formación de placas amiloides.
De acuerdo con otra realización de la invención, se proporciona un método para diagnosticar una enfermedad, trastorno o afección mediada por la disfunción de A-beta y/o la formación de placas amiloides, que comprende las etapas de: a) obtener una muestra a partir de un sujeto, b) poner en contacto la muestra con un polipéptido de la invención como se ha definido anteriormente, c) determinar la cantidad de A-beta en la muestra, y d) comparar la cantidad determinada en la etapa (c) con un patrón, donde una diferencia en la cantidad con respecto a dicha muestra es diagnóstico de una enfermedad, trastorno o afección caracterizada por la disfunción de A-beta y/o la formación de placas amiloides.
La muestra puede ser, por ejemplo, un fluido corporal del sujeto, tal como sangre o líquido cefalorraquídeo (CSF). La etapa de detectar la unión de un polipéptido de la invención a A-beta o la etapa de determinar la cantidad de A-beta en la muestra generalmente implicará medir la formación de un complejo entre el polipéptido y A-beta. De acuerdo con diferentes realizaciones de este método, la formación de complejos se producirá en solución o después de la inmovilización de un componente en un sustrato y se continuará por la detección de dichos complejos. Para este fin, puede ser útil modificar adicionalmente el polipéptido de la invención, tal como mediante la introducción de un grupo funcional que es una parte de un par de unión específico, tal como el par de unión biotina-(estrept) avidina. Dicho grupo funcional puede usarse para unir el polipéptido de la invención a otra proteína, polipéptido o compuesto químico que se une a la otra mitad del par de unión, es decir, por medio de la formación del par de unión. Por ejemplo, un polipéptido de la invención puede conjugarse con biotina y unirse a otra proteína, polipéptido, compuesto o vehículo conjugado con avidina o estreptavidina. Por ejemplo, dicho polipéptido conjugado de la invención puede usarse como indicador, por ejemplo en un sistema de diagnóstico donde un agente productor de señales detectables se conjuga con avidina o estreptavidina.
Los métodos de diagnóstico anteriores también pueden usarse para controlar la eficacia de un tratamiento terapéutico de un sujeto.
De acuerdo con otra realización de la invención, se proporciona un kit para diagnosticar una enfermedad, trastorno o afección mediada por la disfunción de A-beta, y especialmente la formación de placas amiloides y/o EA, para uso en un método como se ha definido anteriormente, comprendiendo dicho kit al menos un polipéptido de la invención y, opcionalmente, uno o más medios, medios de detección y/o agentes de formación de imágenes in vitro o in vivo y, opcionalmente, además, instrucciones de uso. Los agentes de formación de imágenes in vivo adecuados incluyen 99mTc, 111 Indio, 123lyodo y, para la formación de imágenes por resonancia magnética, compuestos paramagnéticos. La combinación de SPECT, PET o MRI con polipéptidos anti-A-beta marcados de la invención permitirá 'exploraciones de A-beta en el cerebro' y las evaluaciones de los riesgos individuales para cada paciente.
De acuerdo con otra realización de la invención, ciertos polipéptidos de unión a A-beta de la invención pueden usarse como herramienta de investigación para la detección específica de A-beta humano, así como A-beta de ratón, o A-beta de otra especie animal, y para ensayos y análisis que se basan en dicha detección. Esto puede ser particularmente útil para ensayos y análisis que hacen uso de modelos animales.
La invención también proporciona un kit que comprende al menos un polipéptido de unión a A-beta de la invención y, adicionalmente, uno o más componentes distintos seleccionados del grupo que consiste en otros fármacos usados para el tratamiento de las enfermedades y trastornos descritos anteriormente y dispositivos como se ha descrito anteriormente.
La invención proporciona además métodos para fabricar un polipéptido de unión a A-beta de la invención, comprendiendo dichos métodos generalmente las etapas de: - cultivar células hospedadoras que comprenden un ácido nucleico capaz de codificar un polipéptido de la invención (en lo sucesivo: "ácido nucleico de la invención") en condiciones que permiten la expresión del polipéptido de la invención; y, - recuperar o aislar el polipéptido expresado por las células hospedadoras del cultivo; y - opcionalmente purificar y/o modificar adicionalmente y/o formular el polipéptido de la invención.
Un ácido nucleico de la invención puede ser ADN genómico, ADNc o ADN sintético (tal como ADN con uso de codones que se ha adaptado específicamente para la expresión en la célula hospedadora u organismo hospedador deseado). De acuerdo con una realización de la invención, el ácido nucleico de la invención está en forma esencialmente aislada, como se ha definido anteriormente en la presente memoria.
El ácido nucleico de la invención también puede estar en forma de, estar presente y/o ser parte de un vector, tal como por ejemplo un plásmido, cósmido o YAC, que de nuevo puede estar en forma esencialmente aislada. El vector puede ser especialmente un vector de expresión, es decir un vector que puede proporcionar la expresión del polipéptido in vitro y/o in vivo (por ejemplo, en una célula hospedadora adecuada, organismo hospedador y/o sistema de expresión). Dicho vector de expresión generalmente comprende al menos un ácido nucleico de la invención y está unido operativamente a uno o más elementos reguladores adecuados, tales como uno o más promotores, potenciadores, terminadores y similares. Se describen ejemplos específicos de dichos elementos reguladores y otros elementos, tales como uno o más factores de integración, marcadores de selección, secuencias señal o líder, genes indicadores y similares, útiles o necesarios para expresar polipéptidos de la invención, en la pág. 131 a 133 del documento WO2006/040153.
Los ácidos nucleicos de la invención pueden prepararse u obtenerse de una manera conocida per se (por ejemplo por síntesis de ADN automática y/o tecnología de ADN recombinante), basándose en la información de las secuencias de aminoácidos para los polipéptidos de la invención proporcionados en la presente memoria, y/o pueden aislarse a partir de una fuente natural adecuada.
De acuerdo con otra realización, la invención se refiere a un hospedador o célula hospedadora que expresa o es capaz de expresar un polipéptido de la invención; y/o que contiene un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención. De acuerdo con una realización particularmente preferida, dichas células hospedadoras son células bacterianas, células de levadura, células fúngicas o células de mamífero.
Las células bacterianas adecuadas incluyen células de cepas de bacterias gram negativas tales como cepas de Escherichia coli, Proteus y Pseudomonas y cepas de bacterias gram positivas tales como cepas de Bacillus, Streptomyces, Staphylococcus y Lactococcus. Una célula fúngica adecuada incluye células de especies de Trichoderma, Neurospora y Aspergillus. Las células de levadura adecuada incluyen células de especies de Saccharomyces (por ejemplo Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces (por ejemplo Schizosaccharomyces pombé), Pichia (por ejemplo Pichia pastoris y Pichia methanolica) y Hansenula.
Las células de mamífero adecuadas incluyen, por ejemplo, células CHO, células BHK, células HeLa, células COS y similares. Sin embargo, también pueden usarse células de anfibio, células de insecto, células vegetales y cualquier otra célula usada en la técnica para la expresión de proteínas heterólogas.
Para la producción a escala industrial, los hospedadores heterólogos preferidos para la producción (industrial) de polipéptidos de dominio variable individual de inmunoglobulina y productos terapéuticos proteicos que los contienen incluyen cepas de E. coli, Pichia pastoris y S. cerevisiae que son adecuadas para la expresión a gran escala, producción y fermentación, y en particular para la expresión a gran escala (bio-) farmacéutica, producción y fermentación.
La elección del sistema de expresión específico dependerá en parte de la necesidad de ciertas modificaciones post-traduccionales, más específicamente glicosilación. La producción de un polipéptido de la invención para el que se desea o se necesita la glicosilación necesitaría el uso de hospedadores de expresión de mamífero que tienen la capacidad de glicosilar la proteína expresada. A este respecto, será evidente para el experto que el patrón de glicosilación obtenido (en el tipo, número y posición de restos unidos) dependerá de la célula o línea celular que se usa para la expresión.
Los polipéptidos de la invención producidos en una célula expuesta anteriormente pueden producirse intracelularmente (por ejemplo en el citosol, el periplasma o en cuerpos de inclusión) y después aislarse de las células hospedadoras y opcionalmente purificarse adicionalmente; o pueden producirse extracelularmente (secretarse en el medio en el que se cultivan las células hospedadoras) y después aislarse del medio de cultivo y opcionalmente purificarse adicionalmente.
En la técnica se conocen otros métodos y reactivos usados para la producción recombinante de polipéptidos, tales como vectores de expresión adecuados, métodos de transformación o transfección, marcadores de selección, métodos de inducción de expresión de proteínas, condiciones de cultivo y similares. De forma similar son bien conocidas para el experto en la materia las técnicas de aislamiento y purificación de proteínas útiles en un método de fabricación de un polipéptido de la invención.
La producción de los polipéptidos de la invención por medio de fermentación en organismos hospedadores recombinantes convenientes tales como E. coli y levadura es eficaz en cuanto al coste, en comparación con anticuerpos convencionales que también necesitan instalaciones caras de cultivo de células de mamífero. Además, los niveles que pueden conseguirse de expresión son elevados y los rendimientos de los polipéptidos de la invención están en el intervalo de 1 a 10 g/l (E. coli) y hasta 10 g/l (levadura) y mayores.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporcionan los dominios variables individuales de inmunoglobulina indicados en la Tabla VII presentada a continuación, que son útiles para acumular o construir polipéptidos de unión a A-beta de la invención. De esta manera, si cualquiera de los dominios variables individuales de inmunoglobulina indicados en la Tabla VII (opcionalmente después de haberse humanizado) se combina (preferiblemente en forma de una cadena polipeptídica continua) con uno o más dominios variables individuales de inmunoglobulina de unión a A-beta, donde dichos otros dominios variables individuales de inmunoglobulina se unen a un epítopo diferente de A-beta, se obtendrán como resultado moléculas de unión a A-beta biparatópicas de acuerdo con la invención, que tienen características de unión útiles, como se ex expone con detalle, por ejemplo, en los Ejemplos 9 a 11 presentados más adelante.
Tabla VII: Dominios variables individuales de inmunoglobulina de unión a A-beta EJEMPLOS Ejemplo 1: Inmunización de llamas con A-beta para la inducción de respuestas inmunes humorales Generación de péptido A-beta monomérico (BAM): Se prepara péptido A-beta monomérico (BAM) mediante tratamiento con ácido trífluoroacético (TFA; Sigma)/1 ,1 ,1 ,3,3,3-hexafluor-2-propanol (HFIP; Fluka). El péptido A-beta liofilizado se disuelve en su vial original en TFA al 100% a una concentración final de 1 mg/ml. La solución después se evapora en un speedvac a temperatura ambiente. Después de esta y de todas las etapas de evaporación posteriores, el sedimento restante se pone en hielo. El sedimento se re suspende en HFIP y se evapora de nuevo en un speedvac a temperatura ambiente seguido de otra solubilización de HFIP, después de lo cual la solución se divide en alícuotas de volúmenes apropiados. Las alícuotas se evaporan en un speedvac a temperatura ambiente y se los sedimentos se almacenan a -80°C. Inmediatamente antes del uso, la alícuota del péptido A-beta tratado con TFA/HFIP se disuelve en DMSO al 100% levantando y bajando la pipeta de forma repetida. La solución de péptido A-beta se centrifuga a 14000 rpm durante 10 minutos para retirar los posibles agregados y el sobrenadante se usa en los diferentes ensayos.
Inmunización de llamas: Se inmunizan llamas con péptidos A-beta agregados (BAA) y péptidos A-beta oligoméricos (BAO) mediante la inyección de los inmunógenos por vía intramuscular en el área del cuello aplicando dosis decrecientes a lo largo del tiempo. BAA consiste en una mezcla de péptidos A-beta (1-40) y A-beta (1-42) sintéticos que se prepara esencialmente como se describe por Schenk et al., 1999, Nature 400: 173-177. BAO se preparan esencialmente como se describe por Kayed et al. (2003), Science 300: 486-489. Las primeras dos inyecciones de antígeno consisten cada vez en 100 pg de antígeno por llama, mientras que para todas las administraciones siguientes, la dosis se reduce a 50 pg por llama. Las llamas 144 y 145 se vacunan con BAA recién preparado. En total, se inyectan nueve dosis de antígeno BAA como una emulsión usando Adyuvante Completo de Freund (primera inyección) o Stimune (todos los refuerzos siguientes con inmunogeno) en intervalos de 16 días como máximo. Las llamas 129, 130, 177 y 178 se vacunan con BAO. En total, se inyectan de seis a nueve dosis de antígeno BAO, como una emulsión usando adyuvante Completo de Freund (primera inyección) y Adyuvante Incompleto de Freund o Stimune (todos los refuerzos siguientes con antígeno) en intervalos de 18 días como máximo. Las llamas también se inmunizan con el fragmento del péptido A-beta 1-16 conjugado con albúmina de suero bovino (BSA; llamas 181 y 186) o el fragmento 1-30 del péptido A-beta conjugado con BSA (llamas 185 y 187) . Se administran cuatro inyecciones de antígeno en intervalos de 14 días, usando Adyuvante Completo de Freund o Adyuvante Incompleto de Freund con dosis de antígeno decrecientes desde 100 pg (primeras dos inyecciones) a 50 pg (dos inyecciones siguientes) por llama. Inmediatamente antes del inicio de cada esquema de inmunización se recoge una muestra de suero preinmune y a puntos de tiempo regulares durante el experimento de inmunización se recogen múltiples muestras de suero inmunes para evaluar la respuesta humoral específica del péptido A-beta de los distintos animales.
Para controlar los títulos en suero específicos de péptido A-beta mediante ELISA, se inmovilizan 2 pg/ml de A-beta(1-40), biotinilado en el extremo C (Anaspec), durante dos horas a temperatura ambiente en una placa Maxisorp (Nunc) de 96 pocilios recubierta con Neutravidina (0.2-0.5 pg por pocilio). Los pocilios se bloquean con una solución de caseína (al 1 % en PBS). Después de la adición de una seria de dilución de muestras de suero pre-inmune e inmune, se detectan inmunoglobulinas de llama unidas específicamente usando un conjugado de anticuerpo de cabra anti-llama con peroxidasa de rábano picante (Bethyl Lab. Inc.), lo que permite detectar la respuesta humoral mediada tanto por los anticuerpos convencionales como los anticuerpos únicamente con cadena pesada. En ciertos casos, se realiza un ELISA consecutivo para evaluar específicamente la respuesta mediada por anticuerpo de cadena pesada mediante detección con mAb de ratón que reconoce específicamente los anticuerpos lgG2 e lgG3 de llama solo de cadena pesada (Daley et al., 2005, Clin. Diagn. Lab. Imm. 12:380-386), seguido de un conjugado de anticuerpo de conejo anti-ratón-HRP (DAKO). Los ELISA se revelan usando TMB (Promega) como sustrato cromogénico y la absorbencia se mide a 450 nm. Para los cuatro formatos de inmunogeno (BAA, BAO, A-beta (1-16)-BSA y A-beta (1-30)-BSA) se detectan tanto las respuestas inmunes mediadas por anticuerpos convencionales como las respuestas inmunes mediadas por anticuerpo de cadena pesada específicas para A-beta (1-40) monomérico (biotinilado). Las muestras de suero que son positivas contra A-beta (1-40) monomérico también son positivas cuando se ensayan con BAA directamente aplicado como recubrimiento sobre una capa Maxisorp, lo que sugiere la presencia de al menos epítopos parcialmente comunes en el A-beta monomérico y preparaciones de BAA usadas.
Ejemplo 2: Aislamiento de dominios VHH de unión a A-beta (VHH) de llamas inmunizadas Clonación de los repertorios de fragmentos de anticuerpo solo de cadena pesada: Después de la inyección final de inmunogeno, se recogen tejidos inmunes como fuente de células B que producen los anticuerpos de cadena pesada a partir de las llamas inmunizadas. Típicamente, se recogen dos muestras de 150 mi 4 y 8 días después de la última inyección de antígeno y se recoge una biopsia de ganglio linfático, recogida 4 días después de la última inyección de antígeno por animal. A partir de las muestras de sangre, se preparan células mononucleares de sangre periférica (PBMC) usando Ficoll-Hypaque de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Amersham Biosciences). A partir de las PBMC y la biopsia de ganglios linfáticos, se extrae el ARN total, que se usa como material de partida para RT-PCR para amplificar los segmentos génicos que codifican VHH (descritos anteriormente en el documento WO2005/044858). Para cada llama inmunizada, se construye una biblioteca reuniendo el ARN total aislado de todos los tejidos inmunes recogidos de ese animal. En resumen, el repertorio de VHH amplificado por PCR se clona a través de sitios de restricción específicos en un vector diseñado para facilitar la presentación en fagos de la biblioteca de VHH. El vector procede de pUC1 19 y contenía el promotor de LacZ, una secuencia codificante de la proteína glll del fago M13, un gen de resistencia para ampicilina o carbenicilina, un sitio de clonación múltiple y una secuencia líder glll-pelB híbrida (pAX050). En fase con la secuencia codificante de VHH, el vector codifica un marcador c-myc C-terminal y un marcador (His)6. Los fagos se preparan de acuerdo con protocolos convencionales y se almacenan después de esterilización en filtro a 4°C para el uso adicional.
Selección de VHH específicos de A-beta mediante presentación en fagos: Los repertorios de VHH obtenidos de todas las llamas y clonados como bibliotecas de fagos se usan en diferentes estrategias de selección aplicando una multiplicidad de condiciones de selección. Las variables incluyen: i) el formato de péptido A-beta (A-beta (1-40) biotinilado en el extremo C o N, A-beta (1-16) biotinilado en el extremo C, A-beta (1-30) biotinilado en el extremo N y fusiones de glutatión-S-transferasa (GST) tales como A-beta (1-42)-GST, A-beta (1-10)-GST o GST-A-beta (1-42)), //) el estado de agregación del péptido A-beta (A-beta monomético, BAO o BAA), iii) el método de presentación de antígeno (fase sólida: aplicado directamente como un recubrimiento o a través de un marcador de biotina en placas recubiertas con Neutravidina; fase de solución: incubación en solución seguido de captura en placas recubiertas con Neutravidina), iv) la concentración de antígeno y v) diferentes métodos de elución (tripsina o TEA).
Las selecciones de realizan como se indica a continuación: se presentan preparaciones de antígeno para formatos de selección en fase sólida y en fase de solución como se ha descrito anteriormente a múltiples concentraciones. Después de 2 h de incubación con las bibliotecas de fago seguido de un lavado minucioso, los fagos unidos se eluyen con tripsina (1 mg/ml) o TEA durante 15 minutos. En caso de que se use tripsina para la elución del fago, la actividad de la proteasa se neutraliza inmediatamente aplicando inhibidor de proteasa ABSF 0.8 mM. Como control, se realizan selecciones sin antígeno en paralelo. Los resultados del fago que muestran enriquecimiento con respecto al nivel de fondo (control sin antígeno) se usan para infectar E.coli. Las células E. coli infectadas se usan para preparar fago para la siguiente vuelta de selección (rescate de fago) o se cultivan el placas de agar (LB + Amp + glucosa al 2%) para el análisis de clones de VHH individuales. Para explorar un resultado de selección con respecto a agentes de unión específicos, se repican colonias individuales a partir de las placas de agar y se cultivan en placas de 96 pocilios profundos de 1 mi. La expresión de VHH controlada por placZ se induce añadiendo IPTG (0.1-1 mM final) en ausencia de glucosa. Se preparan extractos periplásmicos (en un volumen de ~ 80 µ?) de acuerdo con métodos convencionales.
Exploración de extractos periplásmicos para la unión a A-beta: se capturan 2 pg/ml de A-beta (1-40), biotinilado en el extremo C (Anaspec), durante dos horas a temperatura ambiente en una placa; Maxisorp de 96 pocilios recubierta con Neutravidina (0.2-0.5 pg por pocilio) (Nunc). Los pocilios se bloquean con una solución de caseína (al 1% en PBS). Después de la adición de típicamente un dilución de 10 veces de los extractos periplásmicos, se detecta la unión a VHH usando un anticuerpo de ratón anti-myc y un conjugado de anticuerpo anti-ratón-HRP (DAKO). Los clones que proporcionan una señal ELISA de como mínimo dos veces el nivel de fondo se conservan para el análisis de la secuencia. Los VHH que puede unirse a A-beta (1-40) monomérico (biotinilado) pueden asignarse 16 linajes de células B diferentes. Los clones derivados del mismo linaje de células B comparten una secuencia de CDR3 muy similar y, por lo tanto, es probable que reconozcan el mismo epítopo. La Tabla VIII resume los parámetros de selección que conducen a la indentificación de un VHH representativo de cada uno de los 16 linajes de células B. En la Tabla IX, se muestran las secuencias de aminoácidos de los VHH indicada en la Tabla VIII.
Tabla VIII: Se usan parámetros de selección para la identificación de linajes de células B de VHH específicos de A-beta Tabla IX: Secuencias de aminoácidos VHH representativos resultantes: El número total de variantes (como mínimo diferencia de 1 aminoácido) encontrado para cada linaje de células B es 1 (ABII5D2), 195 (ABII42D4), 1 (ABII42G10), 1 (ABII60D2), 1 (ABII60H5), 23 (ABII1 E11), 3 (ABII14D4), 3 (ABII35C7), 6 (ABII35G2), 1 (ABII35D2), 7 (ABII42B10), 2 (ABII42F5), 3 (ABII42E10), 2 (ABII60A10), 2 (ABII60G11) y 15 (ABII61 F6).
Para identificar la variante de linaje de célula B con las mejores propiedades de unión, se usaron extractos periplásmicos de todas las variantes de VHH para determinar la velocidad de disociación (Biacore ?10?, GE Healthcare). Se prepara A-beta (1-40) monomérico (biotinilado en el extremo C; Anaspec), A-beta (1-16) monomérico (biotinilado en el extremo C; Bachem) y A-beta (12-28) monomérico (biotinilado en el extremo N; Bachem), como se describe en el Ejemplo 1 , irreversiblemente mediante estreptavidina en tres canales diferentes de la misma microplaca de detección de SA (GE Healthcare). Las superficies primero se lavan con 3 inyecciones de 1 minuto de tampón de lavado de superficie (NaCI 1 M en NaOH 50 mM) seguido de la inyección de A-beta biotinilado 50 nM hasta un nivel diana de 100 UR. Después de la captura, las superficies se bloquean por la inyección de un exceso (200 pg/ml) de d- biotina durante 180 s a 5 µ?/min. Una superficie de referencia se lava y se bloquea con d-biotina. Como tampón de proceso se usa tampón HBS-EP+ y los experimentos se realizan a 25°C. Para la exploración de la velocidad de disociación, se inyectan extractos periplásmicos de VHH a una dilución de 10 veces durante 2 min a 45 µ?/min y se dejan disociar durante 10 min. Se inyectan agentes de unión de referencia purificados (VHH a 100 nM, Fab 3D6 a 10 nM) como muestras de control positivo y se evalúan al menos al principio y al final de cada experimento. Entre las diferentes muestras de VHH, las superficies se regeneran con tampón de regeneración (NaOH 50 m ) durante 25 s a 45 µ?/min seguido de GuHCI 6 M 10 s a 45 µ?/min si la regeneración no es completa. Las velocidades de disociación se calculan a partir de los sensogramas obtenidos del canal con A-beta (1-40) biotinilado capturado. Las variantes de solo dos linajes de células B de VHH, ABII42D4 y ABII60G11 , mostraron un patrón de unión monofásico y permitieron el cálculo de velocidades de disociación a través de un modelo de interacción 1 :1 : 6.1 E-3 s"1 y 2.7E-2 s' respectivamente. Para todos los demás linajes de células B de VHH, se ajustan por separado dos secciones diferentes de la curva de disociación, produciendo una kdi (calculada a partir del marco de disociación entre 125 y 160 s) y una kd2 (400-700). Se proporciona una doble referencia a los datos restando las curvas en el canal de referencia y una inyección blanco con tampón de proceso. Los sensogramas se evalúan ajusfando un modelo de disociación 1 :1 usando el software Evaluación Biacore T100 v 1.1.1. Aunque se observa unión de los VHH ABII60D2 y ABII60H5 a A-beta en el ELISA de exploración, estos VHH muestran muy poca unión a la microplaca de deleción.
Para estudiar las características de unión de agentes de unión que no son VHH monovalentes, se usan fragmentos Fab de anticuerpos monoclonales m266 y 3D6. El anticuerpo monoclonal 3D6 se describe en Johnson-Wood et al., 1997, Proc. Nati. Acad. Sci. 94:1550-1555 y en Bard et al., 2000, Nature Medicine 6:916-919 y se une específicamente a los restos aminoacídicos 1 a 5 de A-beta (epítopo N-terminal). El anticuerpo monoclonal m266 se describe en Seubert et al., 1992, Nature 359:325-327 y se une específicamente a los restos aminoacídicos 16 a 24 de A-beta (epítopo central de A-beta). Los fragmentos Fab, que comprenden la cadena ligera variable (VL), la cadena pesada variable (VH), la cadena ligera constante (CL) y el dominio constante 1 de la cadena pesada (CH^ del anticuerpo respectivo (las secuencias se proporcionan más adelante) y, además, un marcador c-myc C-terminal y un marcador de hexa-histidina ((His)6 se clonan, se expresan y se purifican de acuerdo con técnicas convencionales, usando E.coli como el organismo hospedador y cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados (IMAC) y cromatografía de exclusión molecular (SEC) para la purificación. Los fragmentos de Fab purificados de m266 y 3D6 muestran, en el experimento de unión descrito anteriormente, velocidades de disociación de 4.0E-5 s"1 y A E-A s" 1, respectivamente.
Secuencias de VL y VH de fragmento Fab de 3D6: VL: YWMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYL VSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRIEAEDLGLYYCWQGTHFPRTFGGGTKL EIK (SEC ID °: 128) VH: EVKLVESGGGLVKPGASLKLSCAASGFTFSNYGMSvWRQNSDKRLEVWASIRS GGGRTYYSDNVKGRFTISRENAKNTLYLQMSSLKSEDTALYYCVRYDHYSGSS DYWGQGTTVTVSS (SEC ID N°: 129) Secuencias de VL y VH de fragmento Fab de m266: VL: DWMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLIYSDGNAYLHWFLQKPGQSPKLLIYK VSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTK LEIK (SEC ID N°: 130) VH: EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCAVSGFTFSRYSMSWVRQTPEKRLELVAQINS VGNSTYYPDTVKGRFTISRDNAEYTLSLQMSGLRSDDTATYYCASGDYWGQGT TLTVSS (SEC ID N°: 131) Ejemplo 3: Caracterización de VHH purificados Las variantes de VHH con las menores velocidades de disociación para cada linaje de células B se vuelven a clonar en un vector de expresión derivado de pUC1 19, que contiene el promotor de LacZ, un gen de resistencia para ampicilina o kanamicina, un sitio de clonación múltiple y una secuencia líder de glIl-pelB híbrida. En fase con la secuencia codificante de VHH, el vector codifica un marcador c-myc C-terminal y un marcador (His)6. Se producen VHH en E.coli TG1 y se purifican por cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados (IMAC) y cromatografía de exclusión molecular (SEC) dando como resultado un pureza de 95% como se evalúa por SDS-PAGE. 3.1 Unión de VHH a A-beta inmovilizado (ELISA): Para cuantificar la unión de los VHH al péptido A-beta monomérico (BAM), se aplican VHH como series de dilución en un ELISA usando la misma preparación que se ha descrito en el Ejemplo 2. Con la excepción de los VHH ABII60D2 y ABII60H5, los valores de CE50 pueden calcularse y se resumen en la Tabla X. Los VHH más potentes que interaccionan con el epítopo N-terminal de A-beta (aminoácidos 1 a 16) o el epítopo central de A-beta (aminoácidos 12 a 28), según se determina, son ABII42D4 (CE50 de 14.2 nM) y ABII60A10 (CE50 de 4.9 nM), respectivamente.
Los VHH que proporcionan señales detectables contra BAM se ensayan con respecto a la unión a agregados de péptido A-beta (BAA) en ELISA, aplicando una preparación similar a la descrita en el Ejemplo 2. El antígeno se prepara y se inmoviliza como se describe en Bohrmann et al., 1999, J Biol Chem 274: 15990-15995. En resumen, se deja que 100 µ? de A-beta (1-40) a 10 Mg/ml diluido en tampón TBS (Tris 50 mM, NaCI 150 mM pH 7.4 y azida Na al 0.05%) de una solución madre en DMSO de A-beta (1-40) sintético a 2 mg/ml (Bachem) se agreguen durante 60 h a 37°C. Todos los VHH que reconocen BAM también reconocen BAA y los valores de CE50 respectivos se resumen en la Tabla X. Tabla X: valores de CE50 para VHH purificados en ELISA de BAM BAA ND: no determinado; *: CI50 calculada a partir de curvas extrapoladas 3.2 Unión de VHH a A-beta en solución (TR-FRET): Se evalúa la interacción de VHH anti-A-beta VHH y péptido A-beta en solución usando un ensayo competitivo de transferencia resonante de energía de fluorescencia de resolución en el tiempo (TR-FRET). En dos preparaciones diferentes, se ensaya la competición con la interacción de péptido A-beta (1-40) - ABII42D4 (región N-terminal específica) o con la interacción A-beta (1-40) - ABII60A10 (específico para región central). Para el ensayo, A-beta (1-40) monomérico (biotinilado en el extremo C; Anaspec) marcado con quelato de estreptavidina-Europio y VHH ABII42D4 o ABII60A10 marcados con AlexaFluor647 se incuban durante 1 h con diferentes concentraciones de un competidor no marcado (VHH, IgG o Fab). Los compuestos marcados se usan a concentraciones de 0.2 nM (A-beta (1-40)), 50 nM (ABII42D4) y 10 nM (ABII60A10), respectivamente, y la señal de fluorescencia emitida tras la interacción de unión se detecta a 665 nm. Los valores de CI50 se determinan en los ensayos de TR-FRET de ABII42D4 y ABII60A10 dando como resultado la siguiente variación de potencia para los agentes de unión específicos para la región N-terminal ensayados: anticuerpo monoclonal 3D6 (2.5 nM) > fragmento Fab 3D6 (3.4 nM) > ABII42D4 (46.8 nM) > ABII5D2 = 42G10 (>1000 nM). El VHH específico de la región central más potente identificado por este ensayo fue ABII60A10, muestra un valor de CI50 de 1 1.1 nM mientras que los anticuerpos comparativos dieron valores de CI50 de 0.50 nM (anticuerpo monoclonal m266) y 0.52 nM (fragmento Fab de m266).
Por razones comparativas, se generan VHH anti-A-beta como los descritos previamente (los "VHH de referencia") y se purifican como se ha descrito anteriormente, usando la información de secuencia disponible de las publicaciones de patente internacional indicadas a continuación: VHH 2D2 y 2G6: documento WO2006/40153; VHH 3A, 1 B, 11G, 4D y 8B: documento WO2007/35092; y VHH 31-1 : documento WO2004/44204.
Sus secuencias de aminoácidos se muestran en la Tabla XI.
Tabla XI: Secuencias de aminoácidos de VHH de referencia En comparación con el VHH de referencia 2G6 (específico de la región N-terminal) y 2D2 (específico de la región central), los VHH 42D4 y 60A10 muestran CI50 mejoradas >21 veces y 36 veces, respectivamente (véase la Tabla X). 3.3 Determinación de la afinidad de la interacción péptido A-beta -VHH: Las afinidades de la interacción de péptido A-beta - VHH/Fab se determinan por resonancia de plasmón de superficie (Biacore) usando A-beta (1-40) biotinilado en el extremo C capturado en una microplaca de detección con estreptavidina como se ha descrito anteriormente (Ejemplo 2). Se inyectan VHH purificados o fragmentos Fab en 5 concentraciones diferentes (entre 2.5 300 nM para ABII42D4 y ABII60A10) durante 2 min y se dejan disociar durante 10 min. En el caso de ABII42D4 pero no en el caso de ABII60A10 las curvas de asociación y disociación pueden ajustarse usando un modelo de interacción 1 :1 (unión Langmuir) y puede determinarse un valor de KD preciso. Se descubre que las afinidades son de 16 nM para VHH ABII42D4, 5.1 nM para el fragmento Fab de 3D6 y 0.3 nM para el fragmento Fab de m266, respectivamente. 3.4 Localización de epítopo mediante resonancia de plasmón de superficie: La especificidad de unión de los VHH se determina mediante resonancia de plasmón de superficie (Biacore) usando A-beta (1 -16) biotinilado en el extremo C; Bachem) y A-beta(12-28) (biotinilado en el extremo N; Bachem) y los péptidos se capturan en una microplaca de detección con estreptavidina como se ha descrito anteriormente. Se descubre que cinco de los VHH indicados en la Tabla IX anterior interaccionan con la región N-terminal del péptido A-beta (ABII5D2, ABII42D4, ABII42G10, ABII60D2 y ABII60H5) y se descubre que 11 VHH interaccionan con la región central (ABII1 E1 1 , ABII14D4, ABII35C7, ABII35G2, ABII35D2, ABII42B10, ABII42F5, ABII42E10, ABII60A10, ABII60G11 y ABII61 F6; véase la Tabla X). 3.5 Ensayo de agregación de A-beta in vitro: Se ensaya VHH en un ensayo de agregación de A-beta in vitro para evaluar si la agregación puede inhibirse o reducirse. La agregación de A-beta in vitro se mide usando fluorescencia de Tioflavina T (ThT), que experimenta un desplazamiento típico al rojo tras la formación de fibrillas de A-beta (Levine, H. 1993. Protein Science (2): 404-410). Para el ensayo, se preparan soluciones madre de A-beta (1 -40) sintético (Bachem) en DMSO al 100% y ThT en glicina-NaOH 25 mM pH 8.5 y se almacena a -20°C. Antes del uso, la solución madre de A-beta (1 -40) se diluye a 56 µ? en tampón de agregación (fosfato sódico 50 mM, NaCI 100 mM, pH 5, NaN3 al 0.02%). Los fragmentos Fab y VHH se ensayan como series de dilución en D-PBS usando concentraciones comprendidas entre 56 y 7 µ?. Se mezclan volúmenes iguales (20 µ?) de la solución de A-beta (1-40) 56 µ? y la muestra de anticuerpo VHH o el control negativo apropiado (por triplicado) y las mezclas se incuban en tubos de microcentrífuga de baja adhesión durante 48 horas a 37°C en un medio oscuro. Después de la transferencia de 30 pl de las muestras incubadas en una placa de polipropileno de fondo plano de 96 pocilios negra (Greiner Bio-One), se añaden 250 µ? de ThT 2.5 µ? (solución madre diluida en glicina NaOH 25 mM) y se mide la señal de fluorescencia (Envision, PerkinElmer). La señal de fluorescencia máxima de A-beta (1-40) medida en ausencia de competidor se fija como la agregación de 100% (inhibición de 0%). La inhibición máxima a la mayor concentración de VHH ensayada (28 µ?) se calcula como una media de al menos dos experimentos independientes. Aunque se detecta una inhibición de fondo consistente de aproximadamente 25% para una VHH no relacionado (no específico de A-beta), los fragmentos Fab monovalentes de 3D6 y 266 muestran una inhibición dependiente de la dosis reproducible con una inhibición máxima de 79 y 85%, respectivamente. Del panel de VHH ensayado, 14D4, 35C7, 35G2, 35D2, 42B10, 42F5, 42E10 y 60A10 muestran una inhibición consistente de 78, 82, 76, 73, 77, 79, 75 y 80% de agregación de péptido, respectivamente (mayor que la inhibición de fondo de 25% inducida por el VHH de control no específico).
Ejemplo 4: Maduración de afinidad de VHH VHH ABII42D4 se somete a dos ciclos de maduración de afinidad. En un primer ciclo, se mutan restos de CDR individuales por los otros 19 aminoácidos. Se fijan como objetivo los siguientes restos: CDR1 : G26-G35; CDR2: V51-N58; y CDR3: H95-Y102 (numeración de acuerdo con Kabat). La mutagénesis se realiza en una estrategia basada en PCR usando oligonucleótidos degenerados que contienen un codón NNS en la posición mutada. Se reúnen productos de PCR para cada CDR y se insertan a través de un solo sitio de restricción en el molde del gen de ABII42D4. Se producen mutantes individuales como proteínas recombinantes usando un vector de expresión derivado de pUC119, que contiene el promotor de LacZ, un gen de resistencia para kanamicina, un sitio de clonación múltiple y una secuencia líder de ompA (pAXIOO). Las células E. coli TG1 se transforman con la biblioteca de vectores de expresión y se cultivan en placas de agar (LB + Amp + glucosa al 2%). Se recogen colonias individuales de las placas de agar y se cultivan en placas de 96 pocilios profundos de 1 mi. La expresión de VHH se induce añadiendo IPTG (1 mM). Se preparan extractor periplásmicos (en un volumen de - 80 µ?) de acuerdo con métodos convencionales y se exploran con respecto a la unión a A-beta (1-40) en ELISA y en un ensayo de velocidad de disociación Biacore como se ha descrito anteriormente (Ejemplo 2). Las mutaciones en seis posiciones (S30, T57, L97, T100b, S100c, G100e) dan como resultado velocidades de disociación ligeramente (~2 veces) mejoradas.
En un segundo ciclo, se crea una biblioteca combinatoria mediante la aleatorización simultánea de las seis posiciones susceptibles identificadas en el ciclo uno. Para esto, se sintetiza el gen ABII42D4 de longitud completa por PCR solapante usando oligonucleótidos degenerados (NNS) en las posiciones de aleatorización y se realiza una PCR de rescate. Los genes de ABII42D4 aleatorizados se insertan en un vector de presentación en fago (pAX50) que produce un tamaño de biblioteca funcional de 6x10E7. Se preparan fagos de acuerdo con protocolos convencionales. La biblioteca de fagos se somete a tres vueltas de selección en fase de solución contra A-beta (1-4) monomérico (biotinilado) usando perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina (Dynal) para la etapa de captura. La concentración se antígeno se reduce 10 veces en cada vuelta empezando con una concentración de antígeno de 50 nM en la vuelta uno. Los fagos unidos se eluyen con tripsina (1 mg/ml) durante 30 minutos y las producciones de fagos se infectan en E. coli TG1 para la preparación de extractos periplásmicos de clones de VHH individuales. La exploración para la unión A-beta (1-40) en ELISA y en un ensayo de velocidad de disociación Biacore (Ejemplo 2) identifica clones con velocidades de disociación mejoradas hasta 10 veces. Las mejores variantes de ABII42D4 se clonan en el vector de expresión pAX100 en fase con el marcador c-myc C terminal y un marcador (His)6. Se producen VHH en E.coli como proteínas marcadas con His6 y se purifican por cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados (IMAC) y cromatografía de exclusión molecular (SEC). Las afinidades de los VHH purificados se determinan por resonancia de Plasmón de superficie (Biacore) y los valores de CI50 se determinan en el ensayo de competición TR-FRET de ABII42D4 (Ejemplo 3.2).
En un intento de mejorar adicionalmente la afinidad de unión, la vanante ABIIPMP111 B5 se usa como molde y se introduce mutaciones divergentes encontradas en los clones ABIIPMP111E4 y ABIIPMP111 B4 una por una. Las variantes resultantes se producen en E. coli y se caracterizan como se ha descrito anteriormente. ABII111B5_M107R, ABII111B5_M107E y ABII111B5 E109Q se identifican como las mejores variantes, siendo tanto la CI50 como la KDl mayores de 10 veces mejores que el ABII42D4 original. La información de secuencia y los datos biológicos para las variantes mencionadas anteriormente se resumen en la Tabla VII anterior (primera línea: 42D4; líneas 2 a 9: clones útiles resultantes de los dos primeros ciclos de maduración de afinidad; líneas 10 a 18: clones útiles resultantes de mutaciones dirigidas adicionales).
Ejemplo 5: Humanización de VHH Las secuencias de aminoácidos del VHH anti-A-beta ABII111 B5_M107R (= ABII002; SEC ID N°: 62) y del VHH anti-A-beta ABII60A10 (= ABII050; SEC ID N°: 100) se somete a la tecnología blast frente a la base de datos de la secuencia de VH de línea germinal humana. La secuencia de VH3-23 de línea germinal humana (DP47; SEC ID N°: 140) en combinación con JH5 mostró la mayor identidad de secuencia con las dos secuencias de VHH.
Secuencia de DP-47A H3-23: EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISG SGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK (SEC ID N°: 140) Secuencia JH5: NWFDSWGQGTLVTVSS (SEC ID N°: 153) Se sustituyeron 17 y 10 restos aminoacídicos de ABII002 y ABII050, respectivamente, para la humanización creando varias variantes diferentes de cada VHH. Todas las variantes se ensamblaron a partir de oligonucleótidos usando el método de extensión solapante de PCR, se clonaron en un vector de expresión (pAX100) y se produjeron en E.coli. La información de secuencia y los datos de unión para las variantes obtenidas de ABII002, es decir ABII003 a ABII037, y para las variantes obtenidas de ABII0050, es decir ABII051 a ABII061 , se resumen en la Tabla VII anterior (líneas 19 a 53 y líneas 55 hasta la última línea 65, respectivamente). La Tabla XII indica además el grado de humanización de ABII002 a ABII036 yABII050 a ABII060.
Tabla XII Variantes humanizadas de ABII002 y ABII050 De acuerdo con los datos biológicos resumidos en las Tablas VII y XII anteriores, todas las variantes de VHH indicadas en la presente memoria pueden - al menos como intermedios - usarse para la construcción de los polipéptidos de la invención. Específicamente, para uso en seres humanos, se preferirán las variantes de VHH humanizadas ABII003 a ABII037 y ABII051 a ABII061. Son variantes particularmente útiles, que muestran un alto grado de humanización pero conservando sus propiedades de unión, ABII035 derivada del clon original 42D4 y ABII059 derivada del clon original 60A10. ABII035 se une al epítopo N-terminal de A-beta y comprende las secuencias de CDR SEC ID N°: 14 a 16. ABII059 se une al epítopo central y comprende las secuencias de CDR SEC ID N°: 17 a 19.
Ejemplo 6: Comparación de VHH humanizados con los VHH de referencia Se ensayan VHH de referencia anti-A-beta purificados (Ejemplo 3.2, Tabla XI) como se describe en el Ejemplo 3 en una microplaca de detección de SA recubierta con A-beta (1-40) monomérico biotinilado en el extremo C. Aunque ABII035 y ABII059 mostraron niveles de UR > 50 a concentraciones inyectadas de 11 y 3 nM, respectivamente, ninguno de los VHH 1B, 11G, 8B, 4D, 3A y VHH31-1 muestran unión (> 10 UR) a la microplaca de detección a una concentración de 1000 nM en las condiciones ensayadas. En el mismo experimento, los VHH de referencia 2G6 y 2D2 muestran niveles de UR > 50 a concentraciones inyectadas de 1000 y 100 nM, respectivamente, siendo por lo tanto mucho menos potentes que ABII035 y ABII059. No se detectó ninguna indicación de la degradación de superficie durante el experimento.
Posteriormente, la también se verifica que la unión de esta serie de VHH de referencia se une a A-beta monomérico en preparaciones de ELISA múltiples (detección descrita en el Ejemplo 3), usando distintas presentaciones de formatos de péptidos tales como A-beta(1-40) capturado (biotinilado en el extremo C o N), A-beta(1-40) y A-beta (1-42) inmovilizados directamente, GST-A-beta(1-42) o A-beta(1-42)-GST (captura a concentraciones de 1 pg/ml). Para los VHH de referencia 1 B, 11G, 8B, 4D, 3A no se detecta unión a A-beta monomérico. En el ELISA de BAA, únicamente el VHH de referencia 8B muestra unión a A-beta agregado a concentraciones de VHH por encima de 1000 nM. En comparación con los VHH 2D2 y 2G6, los VHH ABII035 y ABII059 muestran valores de CE50 > 50 veces mayores. Los resultados se resumen en la Tabla Xlla.
Tabla Xlla: Comparación de características de unión de VHH derivados de 42D4 y 60A10 con características de unión de VHH de referencia anti-A-beta ND: no determinado; *: CI50 calculada a partir de curvas extrapoladas Ejemplo 7: Unión de VHH de A-beta anti-humanos a A-beta de roedor (ELISA y Biacore) Se evalúa en un ELISA la unión de los VHH obtenidos anteriormente a A-beta de roedor. Se aplican como recubrimientos A-beta (1-40) de ratón (Bachem) o humano (Anaspec) a 2 g/ml en placas Maxisorp y se detecta la unión de VHH y, con fines comparativos, fragmentos Fab, mediante un anticuerpo anti-myc de ratón y un conjugado anti-ratón-HRP (DAKO). Se determinan los valores de CE50 para el fragmento Fab de 3D6, VHH ABII002 y VHH ABII035. Los resultados se indican en la Tabla XIII mostrada a continuación (media de dos experimentos independientes como mínimo).
Tabla XIII Valores de CE50 para la unión a A-beta humano y de ratón Aunque los fragmentos Fab de 3D6 se unen a A-beta de ratón significativamente menos que a A-beta humano (diferencia de 26 veces), ABII002 y ABII035 se unen igualmente bien a los dos (diferencia de 1.8 y 2.2 veces respectivamente), lo que indica que ABII002 y su derivado humanizado ABII035 reconocen un epítopo que es distinto del epítopo reconocido por 3D6.
La unión de los VHH a A-beta de ratón y humano se evalúa adicionalmente en Biacore con el péptido no biotinilado aplicado directamente como un recubrimiento sobre la microplaca. No se detecta ninguna diferencia en afinidad al péptido A-beta humano y de roedor para los VHH antes y después de la humanización.
Ejemplo 8: Generación y caracterización de construcciones de VHH anti-A-beta biparatópicas Se fusionan VHH ABII42D4 (que reconoce la región N terminal del péptido A-beta) y VHH ABII60A10 (que reconoce la región central) a través de enlazadores de glicina-serina flexibles (por ejemplo 9GS: GGGGSGGGG; SEC ID N°: 141) para crear construcciones de VHH bivalentes. Cuatro construcciones biparatópicas (que comprenden dos dominios VHH con diferente especificidad de epítopo) que difieren en la longitud y en la orientación del enlazador se exploran con más detalle: ABII42D4-25GS-ABII60A10, ABII60A10-25GS-ABII42D4, ABII42D4-35GS-ABII60A10 y ABII60A10-35GS-ABII42D4 y se comparan con dímeros de VHH respectivos (que comprenden dos dominios VHH idénticos, tales como la construcción ABII42D4-9GS-ABII42D4 bivalente). Los VHH biparatópicos y dimérico/bivalentes se producen en células E.coli TG1 y se purifican usando cromatografía de afinidad (IMAC o proteína A) y cromatografía de exclusión molecular (Superdex75 o Sephacryl S100), dando como resultado una pureza? 95% según se evalúa por SDS-PAGE. 8.1 Ensayos de unión TR-FRET: La unión de las construcciones de VHH biparatópicas a A-beta (1-40) se evalúa usando los ensayos TR-FRET de ABII42D4 y ABII60A10 (Ejemplo 3.2). Aunque la construcción ABII42D4-9GS-ABII42D4 bivalente muestra solo una CI50 ligeramente mejorada (mejorada 3,2 veces frente a ABII42D4 monovalente), se descubre que sorprendentemente los VHH biparatópicos se unen de una forma significativamente más fuerte al péptido A-beta que los bloques de construcción monovalentes y los fragmentos Fab 3D6 y m266 (Tabla XIV) así como la IgG 3D6 y m266 (anticuerpos monoclonales de longitud completa 3D6 y m266). No se encuentra diferencia en potencia entre las construcciones con diferentes longitudes y orientaciones de enlazador.
Tabla XIV Valores de CI50 para construcciones de VHH anti-A-beta biparatópicas y ejemplos comparativos en ensayos TR-FRET de ABII42D4 y ABII60A10 Ensayo TR-FRET de 42D4 8.2 Determinación del modo de unión: Para explorar el modo de unión de las construcciones biparatópicas, se evalúa si los dos bloques de construcción de VHH pueden unirse simultáneamente a la misma molécula de péptido. En un ELISA de tipo sándwich, se aplican como recubrimientos ABII60A10 sin marcador o ABII42D4 marcado con his en una placa Maxisorp y se incuban con el péptido A-beta (1-40). El complejo de VHH-péptido resultante después de incuba con el VHH marcado con c-myc que reconoce el epítopo del péptido A-beta N terminal o central. La detección a través de c-myc se realiza como se ha descrito anteriormente (Ejemplo 2). Se observa unión para las dos preparaciones, indicando que los dos VHH que reconocen el epítopo N terminal o central pueden unirse simultáneamente al péptido A-beta.
Determinación del modo de unión por el ensayo basado en SPR: Se inmoviliza A-beta (1-40) biotinilado en el extremo C sobre la microplaca de detección descrita anteriormente (Ejemplo 2). ABII60A10 se inyecta a una concentración de saturación de 500 nM y se observa unión a A-beta (1-40). Después de 120 segundos, se co-inyecta una concentración 200 nM de ABII42D4 y una concentración 500 nM de ABII60A10 dando como resultado una unión adicional. Una inyección de control de 60A10 500 nM solo no da como resultado ninguna unión adicional, lo que demuestra que la unión adicional observada se debe a la interacción de ABII42D4 - A-beta.
Determinación del modo de unión usando cromatografía de exclusión molecular: La cromatografía de exclusión molecular (SEC) separa moléculas de acuerdo con diferencias en tamaño según pasan a través de un medio de filtración en gel introducido en una columna. El modo de unión de construcciones de VHH biparatopicas a su diana puede identificarse analizando el complejo de proteína después de incubar una relación molar 1:2 de la construcción de VHH respectiva y la proteína diana. Por lo tanto, la mezcla se separará por SEC y el contenido de los picos resultante se analiza por electroforesis en gel de proteínas. Una proteína de fusión A-beta (1-28)-p38, que tiene un peso molecular calculado de 46 kDa, es desplaza como un monómero en la SEC. El VHH biparatópico fusionado a albúmina de suero humano (60A10-27GS-42D4-Alb) tiene un peso molecular calculado de 95 kDa. Para identificar si el VHH biparatópico se une a una (= unión intramolecular) o dos (= unión intermolecular) proteínas de fusión A-beta(1-28)-p38, se mezcla una relación molar 1 :2 del VHH y la proteína diana, se incuba durante noche a 4°C y se aplica a SEC usando un AKTAexplorer (GE Healthcare, USA) en combinación con una columna de exclusión molecular preparativa (HiLoad 26/60 Superdex 200 calidad prep, GE Healthcare, USA) para separar el complejo de proteína de las proteínas individuales. La filtración en gel produjo dos picos que se analizan adicionalmente por SDS-PAGE usando la estación de electroforesis automática Experion (Bio-Rad, USA) y la microplaca apropiada (Pro260 Chip, Bio-Rad, USA). El análisis en el Experion revela que el pico principal contiene el VHH y la proteína de fusión a A-beta (1-28)-p38 mientras que el pico más pequeño contiene solo la proteína de fusión A-beta (1-28)-p38. Las cantidades de VHH y proteína de fusión a A-beta (1-28)-p38 en el complejo se determinan usando el software de análisis de datos Experion. Los pesos moleculares de las proteínas medidos con el Experion son 53 kDa para la proteína de fusión A-beta-p38 y 101 kDa para la proteína 60A10-27GS-42D4-Alb. Las concentraciones medidas y, por lo tanto, la molaridad calculada es 0.87 µ? y 0.86 µ? para la proteína de fusión A-beta (1-28)-p38 y la proteína 60A10-27GS-42D4-Alb respectivamente. Por lo tanto, la relación entre A-beta (1-28)-p38 y 60A10-27GS-42D4-Alb en el complejo de proteína analizado es de aproximadamente 1 :1 , aunque se mezcla a una relación molar de 1 :2. A partir de este resultado puede concluirse que un VHH biparatópico se une a los dos epítopos de una molécula de péptido A-beta dentro de la misma molécula de A-beta y, por lo tanto, no actúa (o al menos no actúa principalmente) mediante entrecruzamiento de moléculas de A-beta a través de las construcciones de VHH bivalentes. 8.3 Estudios de cristalización: Para la cristalización, se incuban ABII035 y ABII059 (160 µ? de cada uno) con un exceso molar de 3 veces de péptido A-beta humano (restos 1-24) durante 16 horas y el complejo se purifica por cromatografía de exclusión molecular. El complejo se concentra por diafiltración a una concentración de 4 mg/ml. Los ensayos de cristalización se preparan como experimentos de difusión de vapor con gota sentada mezclando 200 ni de proteína con 200 ni de solución de depósito contra un volumen de depósito de 100 µ?. Los cristales aparecen después de varios días en una diversidad de condiciones diferentes, entre las que se usan las siguientes para determinar la estructura: tampón MMT 100 mM pH 5, PEG1500 al 25%. Los cristales se tratan con crio-protector (tampón MMT 85 mM pH 5, PEG1500 35%) y se congelan inmediatamente con nitrógeno líquido. Los datos se recogen en la línea experimental 6SA de la fuente de luz en el Paul-Scherrer Institute en Villigen, Suiza.
En la estructura cristalina, una molécula de ABII035, ABII059 y un péptido derivado del péptido A-beta humano (restos 1-24) forman un complejo ternario. Este complejo forma dimeros a través de una lámina beta antiparalela que se forma por dos moléculas de péptido A-beta. La unidad asimétrica del cristal está ocupada por dos de estas estructuras, que da un total de cuatro moléculas de cada péptido A-beta, ABII035 y ABII059. Los restos 1 a 9 de A-beta adoptan una conformación alfa-helicoidal, los restos 10 a 20 forman una cadena beta. Los restos 1 a 14 de A-beta están cerca de ABII035 y entre estos Asp1, Ala2, Glu3, Phe4, Asp7 e His14 contactan directamente con ABII035. Los restos 15 a 24 de A-beta están próximos a ABII059 y entre estos Gln15, Lys16, Val18, Phe19, Phe20, Glu22 y Asp23 contactan directamente con ABII059.
Además de lo anterior, por la estructura cristalina es evidente que ABII035 y ABII059 pueden unirse a la misma molécula de A-beta simultáneamente, lo que confirma los resultados obtenidos en el Ejemplo 8.2 anterior.
Además, el modo de interacción de ABII035 con el péptido derivado de A-beta como se demuestra por los datos de estructura cristalina anterior es coherente con la observación descrita en el Ejemplo 7 anterior: ABII035 muestra una buena reactividad cruzada de especie con respecto a los péptidos A-beta de roedor. Las únicas diferencias de secuencia entre A-beta de humano y roedor son R5G, Y10F y H13R. De acuerdo con los datos anteriores, ninguno de estos restos forma contactos con el VHH. Por lo tanto, se supone que el A-beta de roedor puede unirse a ABII035 en la misma conformación que el A-beta humano, lo que hace que sea particularmente útil como reactivo de herramienta (herramienta de investigación) para ensayos que implican modelos animales de roedores (que producen péptido A-beta de roedor), tales como ratones o ratas.
Ejemplo 9: Generación y caracterización de construcciones de VHH anti-A-beta biparatópicas humanizadas extendidas 9.1 Generación de construcciones ABI 1314 a ABII323: Para estudios de validación in vivo con construcciones de VHH biparatópicas humanizadas, se exploran diferentes estrategias de extensión de semivida (HLE): 1) fusión genética a un VHH de unión a albúmina (como se describe, por ejemplo, en el documento WO2004/041865), 2) PEGilación de un resto de Cys localizado en el enlazador entre VHH o en el extremo C de los VHH (documentos WO2008/142164) y 3) fusión genética a albúmina de suero humano o de ratón. Las diferentes estrategias de HLE se exploran con construcciones de VHH biparatópicas que comprenden ABII035 y los bloques de construcción/dominios VHH de ABII059. Las construcciones ABII314 a ABII323 se generan a través de montaje de genes usando series apropiadas de oligonucleótidos solapantes. En la Tabla XV se presentan ID de secuencias y secuencias de aminoácidos de ABII314 a ABII323.
En las construcciones ABII314, ABII315, ABII322 y ABII323, el bloque de construcción ABII059 se fusiona con ABII035 a través de un enlazador Gly-Ser de diferente longitud (como se indica en la Tabla XV), que contiene un resto de cisteína para la conjugación con PEG (en la posición indicada en la Tabla XV). Las construcciones ABII316 a ABII321 consisten en VHH unidos genéticamente a ABII035, ABII059 y ALB8 (VHH humanizado con albúmina humana con reactividad cruzada con albúmina de ratón), en diferentes orientaciones y separados por enlazadores 9- o 35-GS. Las construcciones mostradas en la Tabla XV presentada a continuación pueden incluir además opcionalmente un marcador de hexa-histidina y/o otros marcadores, por ejemplo, para facilitar la purificación de los polipéptidos resultantes.
Tabla XV Construcciones de VHH bi arató icas ABII314 a ABII323 9.2 Producción, purificación y PEG ilación de construcciones de VHH biparatópicas de semivida prolongada humanizadas: Se purifican construcciones de VHH biparatópicas marcadas con His6 ABII314, ABII315, ABII322 y ABII323 mediante cromatografía de afinidad (IMAC o proteína A), cromatografía de intercambio catiónico (SP Sepharose, Source 30S o POROS 50HS) y cromatografía de exclusión molecular (Superdex75 o Sephacryl S100). A niveles de pureza de la proteína de 90% como mínimo (determinado por SDS- PAGE y posterior tinción con Azul Brilliant de Coomassie), se realiza una PEGilación. Primero se reducen los enlaces S-S intermoleculares de los VHH añadiendo solución de DL-Ditiotreitol (DTT) a una concentración final de 10 mM seguido de una incubación de 2 a 3 h a temperatura ambiente o durante una noche a 4°C. Posteriormente se retira el agente reductor por cromatografía de exclusión molecular (Superdex 75/200) en tampón de proceso D-PBS, recogiendo el pico principal. Inmediatamente después de retirar el agente reductor, la construcción del polipéptido biparatópico se incuba con un exceso molar de 5 veces de PEG durante 1 h a temperatura ambiente o durante una noche a 4°C. El polipéptido PEGilado se separa de PEG libre y del polipéptido no PEGilado por cromatografía de intercambio catiónico (MacroCap SP). Se realiza una etapa de pulido final y de cambio de tampón a D-PBS mediante cromatografía de exclusión molecular preparativa en Superdex200 o Sephacryl S200. La calidad del polipéptido PEGilado purificado se verifica por SDS-PAGE seguido de tinción con CBB y PEG como se ha descrito anteriormente por Natarajan et al (1995) en Bioconjugate chemistry 16: 113-121. 9.3 Caracterización de construcciones de VHH anti-A-beta biparatópico humanizado de semivida prolongada por TR-FRET: Para comparar las propiedades de unión de las construcciones de VHH biparatópicas de semivida prolongada descritas anteriormente con los anticuerpos monoclonales (IgG) 3D6 y m266, se ensayan ABII315 a ABII320, ABII322 y ABII323 en ensayos TR-FRET competitivos de ABII002 y ABII050 (véanse los Ejemplos 8.1 y 3.2). En la Tabla XVI se resumen las CI50 medias derivadas de al menos dos experimentos independientes Tabla XVI.
Tabla XVI Valores de CI50 para VHH biparatópicos anti-A-beta de semivida prolongada en ausencia/presencia de albúmina.
NC: no se detectó competición MSA: albúmina de suero de ratón MSA_D3: dominio III de albúmina de suero de ratón En el ensayo competitivo TR-FRET de ABII002, todas las construcciones de VHH de semivida prolongada muestran una potencia muy mejorada entre 6.5 veces y 14.6 veces (para ABII315-PEG20) en comparación con la IgG 3D6 (CI50 de 1.9 nM). En comparación con IgG m266, todas las construcciones de VHH muestran valores de CI50 significativamente mejores en el ensayo competitivo TR-FRET de ABII050, teniendo el VHH ABII320 la menor CI50 de 0.21 nM, mejorada 2.5 veces con respecto a la lgG266.
En comparación con la potencia del VHH monovalente ABII035, la construcción de VHH adaptada con la máxima potencia (ABII315-PEG20) muestra una CI50 mejorada 27 veces en el ensayo competitivo TR-FRET ABII002. La construcción de VHH ABII320 muestra una potencia mejorada 61 veces con respecto a ABII059 monovalente en el ensayo competitivo TR-FRET de ABII050.
La mayor potencia de las construcciones biparatópicas con respecto a los bloques de construcción monoméricos ABII035 y ABII059 confirma los resultados obtenidos con las construcciones no humanizadas y no maduradas (Ejemplo 8.1) y confirma la hipótesis de la unión intramolecular de una construcción de VHH biparatópica a una molécula de péptido A-beta (véase el Ejemplo 8.2 anterior). Además, estos experimentos demuestran que las técnicas de prolongación de semivida aplicadas a las construcciones de VHH descritas anteriormente no interfieren con la unión de las construcciones al péptido A-beta.
Para evaluar si la unión de construcciones de VHH que contienen ALB8 al péptido A-beta se ve afectada por HSA (como está presente en la corriente sanguínea), se ensayan construcciones biparatópicas equivalentes a 5 ABII316-ABII320 pero que contienen los bloques de construcción de VHH no humanizado en ensayos TR-FRET competitivos tanto en presencia como ausencia de cantidades µ? de albúmina. En los dos formatos de ensayo, la pre- incubación con albúmina humana, de perro o bovina 6.5-10 µ?, (sin que las dos últimas variantes de albúmina muestren una interacción detectable con ALB8) no i o afectan a la potencia en los ensayos TR-FRET.
Para ensayar si ALB8 puede unirse aún a la albúmina en el contexto de las construcciones de VHH biparatópicas, se realiza un análisis cinético de las construcciones de VHH para la unión a una microplaca recubierta con HSA (Biacore). Se determinaron afinidades comparables para ALB8 1 5 monovalente y la construcción de fusión de ALB8 ensayada, indicando que no se realiza la unión a HSA del bloque de construcción de ALB8. 9.4 Inhibición de la formación de fibrillas de A-beta: En un experimento adicional, se evalúa una serie de dilución de la construcción de VHH biparatópica ABII320 con respecto a su capacidad de inhibir la formación de 20 fibrillas de A-beta in vitro como se describe en el Ejemplo 3.5 y se compara con la actividad de sus bloques de construcción monovalentes ABII035 y ABII059 y anticuerpos de control. La máxima inhibición a la mayor concentración de la construcción de VHH ensayada (26 µ?) se calcula como una media de dos experimentos independientes. Aunque se detecta una inhibición de fondo 5 consistente de aproximadamente 17% para un VHH no relacionado (no específico de A-beta), como control, los fragmentos Fab de 3D6 y m266 monovalentes muestran una inhibición dependiente de la dosis reproducible con una inhibición máxima de 82 %. Las IgG (intactas) 3D6 y m266 producen una inhibición de 75% y 83% respectivamente. Los VHH monovalentes ABII035 y ABII059 muestran una inhibición máxima de 54% y 80%, respectivamente, mientras que la construcción de VHH biparatópica de semivida prolongada ABII320 muestra una capacidad de inhibición máxima de 84% a 26 µ?. 9.5 Unión a APP-alfa soluble: APP-alfa soluble (sAPPalfa) se libera de su proteína precursora unida a la célula APP por una actividad alfa-secretasa. La secuencia de aminoácidos de sAPPalfa contiene los primeros dieciséis restos aminoacídicos del péptido A-beta, pero no contiene el epítopo de 3D6 correcto, ya que un resto aminoacídico N-terminal libre en el péptido A-beta es esencial para la interacción completa de 3D6. La localización de epítopos indica que el VHH específico de región N terminal ABII001 y sus derivados interaccionan con un epítopo distinto en comparación con el anticuerpo monoclonal 3D6. La unión de VHH a sAPPalfa en comparación con A-beta se ensaya usando una preparación de ensayo basándose en TR-FRET. Se mezcla sAPPalfa biotinilado (Sigma) a una concentración final de 0.82 nM con la misma concentración de perlas marcadas con estreptavidina-Europio y una concentración 4.4 nM de ABII320 marcado con AlexaFluor647. Los siguientes compuestos no marcados se ensayan con respecto a la competición: ABII320, sAPPalfa, IgG m266, IgG 3D6, ABII035 y A-beta (1-40). Se realizan dos experimentos independientes aplicando una serie de dilución de los compuestos competidores. Los valores de CI50 medios son 0.72 nM, 25.6 nM, 0.23 nM y 14 nM para ABII320 no marcado, ABII035, A-beta (1-40) y sAPPalfa, respectivamente. Como era de esperar, no se observa competición para la IgG m266 y la IgG 3D6. En esta preparación de ensayo, ABII320 interacciona 63 veces mejor con A-beta (1-40) que con sAPPalfa. En una situación paralela usando A-beta (1-40) biotinilado en lugar de sAPPalfa, biotinilado, ABII320 interacciona al menos 20000 veces mejor con A-beta (1-40) que con sAPPalfa (CI50 estimada basándose en datos extrapolados a mayores concentraciones), lo que indica que ABII320 prefiere la unión a A-beta (1-40) con respecto a sAPPalfa. 9.6 Localización de epítopos para construcciones de VHH biparatópicas: Se usan péptidos derivados de A-beta (1-42) presentados como micromatrices de péptidos (PepStar™) para determinar los epítopos de VHH. Las micromatrices de péptidos de PepStar™ (JPT Peptide Technologies, Alemania) son series de micromatrices de péptidos adaptadas para la exploración rápida de la interacción anticuerpo/péptido VHH presentada en portaobjetos. Los péptidos de la micromatriz representan una exploración 12/11 derivada de la estructura primaria de A-beta (1-42) inmovilizado a través de su extremo N. Además, se inmovilizan péptidos truncados el extremo N que representan los primeros 16 hasta los primero 7 aminoácidos de A-beta (1-42) a través de su extremo C. Tras la incubación con el VHH, el acontecimiento de unión puede detectarse leyendo la intensidad de fluorescencia del anticuerpo secundario marcado dirigido contra el VHH.
Después del bloqueo de la micromatriz con tampón de bloqueo (PBS, BSA al 1%, Tween20 al 0.1 %) durante una noche a 4°C, se incuba durante 2 h a 4°C con 200 µ? de la construcción de VHH biparatópica ABII320 en tampón de lavado (PBS, DTT 5 mM, Tritón X-100 0.05%, Glicerol 5%, BSA 1 %) a una concentración de 5 pg/ml. Para retirar el exceso de VHH, la micromatriz se incuba tres veces durante dos minutos en hielo con tampón de lavado. Posteriormente, la micromatriz se incuba durante una hora a 4°C con un Alexa Fluor 647 anti-VHH (Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co KG, Alemania) en tampón de lavado a una concentración de 0.5 pg/ml. El anti-VHH procede de suero de cabra después de la inmunización con el dímero de VHH G6-G6. El anticuerpo secundario no unido se retira por incubación de la micromatriz tres veces durante 2 minutos en hielo con tampón de lavado. Finalmente, el portaobjetos se seca en una centrífuga a 800 x g durante tres minutos y se explora con el ProScanArray de Perkin Elmer usando un láser de 633 nm. Los datos se analizan con el software ScanArray Express® de Perkin Elmer.
Como resultado, se obtienen manchas de péptido que tiene un diámetro de 420 pm que se analizan con respecto a la intensidad de fluorescencia, a partir de las cuales puede evaluarse la interacción del VHH con los péptidos de una manera semicuantitativa. De esta manera, la incubación de la construcción de VHH biparatópica ABII320 con las micromatrices de péptidos revela que ABII320 interacciona con los restos 1-11 y 15-24 del péptido A-beta. La exploración mediante alanina indicó que los restos Asp1 , Glu3, Phe19, Phe20 y Asp23 del péptido A-beta son esenciales para la unión del VHH biparatópico, lo cual es coherente con los datos obtenidos a partir del análisis de la estructura cristalina. Se obtienen los mismos resultados usando otras dos construcciones de VHH biparatópicas que incluyen los dominios VHH de ABII035 y ABII059. 9.7 Determinación de constantes de unión usando ensayo de exclusión cinética (KinExA): Se determinan las afinidades de tres construcciones de VHH biparatópicas para el péptido A-beta usando KinExA (Ensayo de Exclusión Cinética). KinExA es una tecnología con la capacidad de medir moléculas no modificadas en fase de solución (Darling, R.J. y Brault, P.-A.: Kinetic exclusión assay technology: Characterization of Molecular Interactions; Assay and Drug Development Technologies 2(6): 647 (2004)). El método KinExA mide la concentración de moléculas de VHH no complejadas en una mezcla de VHH, antígeno y complejo de VHH-antígeno. La concentración del VHH no complejado se mide exponiendo la mezcla en fase de solución a antígeno inmovilizado en fase sólida durante un periodo de tiempo muy breve. El "tiempo de contacto" entre la mezcla en fase de solución y el antígeno inmovilizado en fase sólida se mantiene suficientemente corto como para que la disociación del complejo de VHH-antígeno sea insignificante. Cuando se excluye cinéticamente la posibilidad de una disociación significativa del complejo de VHH-antígeno, solo el VHH no complejado ("libre") puede unirse a la fase sólida. La cantidad de VHH libre que se une a la fase sólida (medida por emisión de fluorescencia de un marcador secundario) es directamente proporcional a la concentración de VHH libre en la muestra en fase de solución.
El péptido A-beta (1-28) (Anaspec, USA) se usa como antígeno para la incubación con VHH biparatópicos. La proteína de fusión "His.Xa.Abetal-28.GS.p38" se usa para preparar la fase sólida para la unión de los VHH no complejados. La estructura de la proteína de fusión es la siguiente: Marcador His, sitio de escisión de factor Xa, péptido A-beta (1-28), enlazador GS, p38 alfa murina y tiene la siguiente secuencia: MHHHHHHIEGRDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGGSGGSQERPTFY RQELNKTIWEVPERYQNLSPVGSGAYGSVCAAFDTKTGHRVAVKKLSRPFQSII HAKRTYRELRLLKHMKHENVIGLLDVFTPARSLEEFNDVYLVTHLMGADLNNIVK CQKLTDDHVQFLIYQILRGLKYIHSADIIHRDLKPSNLAVNEDCELKILDFGLARHT DDEMTGWATRWYRAPEIMLNWMHYNQTVDIWSVGCI AELLTGRTLFPGTDHI DQLKLILRLVGTPGAELLKKISSESARNYIQSLAQMPKMNFANVFIGANPLAVDLL EKMLVLDSDKRITAAQALAHAYFAQYHDPDDEPVADPYDQSFESRDLLIDEWKS LTYDEVISFVPPPLDQEE ES (SEC ID N°: 144).
La proteína de fusión se expresa en E. coli, se purifica usando Ni-NTA (Qiagen, Alemania) y se alquila con yodoacetamida (Sigma, USA). Se recubren perlas de polimetilmetacrilato (Sapidyne Instruments Inc., USA) con la proteína de fusión en PBS con NaN3 al 0.02%, bloqueadas con BSA al 1% en el mismo tampón y se usan para todos los experimentos como fase sólida. Los experimentos KinExA se realizan con el software KinExA 3000 y KinExA Pro (Sapidyne Instruments Inc., USA) a temperatura ambiente (aprox. 21°C). Como tampón de proceso se usa PBS con NaN3 0.02%. Para todos los experimentos, el antígeno se diluye en serie en PBS con BSA al 0.1 % y aN3 al 0.02% que tiene una concentración constante de VHH. Las mezclas de antígeno y VHH se incuban durante 24 h a temperatura ambiente antes de la medición. El caudal de las muestras y el anticuerpo de mareaje para todos los experimentos es 0.25 ml/min.
El anticuerpo marcado con fluorescencia secundario para la medición de la construcción de VHH ABII320 (primera construcción de VHH) es el anticuerpo de cabra conjugado con Alexa 647 anti-G6G6 (anti-VHH) descrito en el punto 9.6 anterior. Este anticuerpo se usa a un volumen de 500 µ? y una concentración de 0.5 pg/ml en PBS con BSA al 0.1 % y NaN3 al 0.02%. El ABII320 se mide adicionalmente como se describe en presencia de albúmina humana recombinante (albcult™, novozymes, USA). La unión de la construcción de VHH ABII322 PEGilada (segunda construcción de VHH) a la fase sólida se determina usando 500 µ? de anti-PEG de conejo (Epitomics Inc., USA) a una concentración de 0.1 pg/ml en PBS con BSA 0.1 % y NaN3 0.02% en la línea 13 del instrumento en combinación con 250 pl de un anticuerpo de cabra anti-conejo conjugado con Alexa 647(Molecular Probes Inc., USA) a una concentración de 0.25 pg/ml en el mismo tampón. La unión de la proteína de fusión de la construcción de VHH biparatópica-HSA mostrada en la Tabla IV-anter¡or (SEC ID N°: 32; (tercera construcción de VHH) en la fase sólida se determina usando 500 µ? de un anticuerpo de cabra anti-HSA (Bethyl Laboratories, Inc., USA) a una concentración de 0.5 pg/ml en PBS con BSA 0.1 % y NaN3 0.02% en la línea 13 del instrumento en combinación con 500 µ? de un anticuerpo de cabra anti-conejo conjugado con Alexa 647(Molecular Probes Inc., USA) a una concentración de 0.5 pg/ml en el mismo tampón.
Los datos de titulación en equilibrio se ajustan a un modelo de unión 1 :1 usando el software KinExA Pro Versión 1.0.3 (Sapidyne Instruments Inc., USA). La primera construcción de VHH (VHH biparatópico ABII320) se mide a concentraciones de 3, 5 y 10 pM. El volumen de muestra es 5 mi de cada una. La KD medida es 1.1 ± 0.3 pM y 0.4 ± 0.1 pM en presencia de albúmina humana recombinante 1%. La segunda construcción de VHH (VHH PEGilado biparatópico ABII322) se mide a concentraciones de 3, 4, 5 y 6 pM. El volumen de muestra es mi cada una. La KD medida es 0.6 ± 0.2 pM. La tercera de construcción de VHH (proteína de fusión HSA-VHH) se mide a concentraciones de 2. 3 y 4 pM. El volumen de muestra es 5 mi cada una. La KD medida es 0.5 ± 0.3 pM. 9.8 Unión a piroglutamil-Abeta: Piroglutamil (pGlu) -A-beta es un componente principal de las placas neuríticas en la enfermedad de Alzheimer. Se forma por delación del glutamato N-terminal en la posición 3 catalizada por la glutaminil ciclasa (QC) dando como resultado una variante muy amiloidogénica de A-beta. La secuencia de aminoácidos de pGlu-A-beta contiene los restos aminoacídicos 3-42 del péptido A-beta. Los dos primeros aminoácidos N-terminales que son esenciales para la interacción completa con el anticuerpo 3D6 están ausentes. Las afinidades para la interacción pGlu-A-beta-ABII3207ABII322/m266/3D6 se determinan mediante resonancia de plasmón de superficie (Biacore) usando pGlu-A-beta (1-28) biotinilado en el extremo C capturado en una microplaca de detección con estreptavidina como se ha descrito anteriormente (Ejemplo 2). Se inyectan polipéptidos purificados ABII320 o ABII322 o anticuerpos m266 o 3D6 a 9 concentraciones diferentes (entre 0.195 y 50 nM para ABII320, 0.39-100 nM para ABII322 y 0.782-200 nM para 3D6 y m266) durante 3 min y se deja disociar durante 10 min. Las curvas de asociación y disociación pueden ajustarse usando un modelo de interacción 1 :1 y puede determinarse un valor de Kp preciso. Se observa que las afinidades son 2 nM para ABII320, 1 nM para ABII322, 224 pM para el anticuerpo m266 y no pudo observarse ninguna unión para el anticuerpo 3D6.
Ejemplo 10: Unión de VHH anti-A-beta a placas amiloides Se perfilan VHH en un ensayo de inmunorreactividad de placas amiloides en tejido (TAPIR) de acuerdo con su capacidad de unirse a placas amiloides en cortes de cerebro de ratón de Tg2576. El ensayo TAPIR muestra una evaluación cualitativa (núcleo denso y/o placas amiloides difusas) así como cuantitativa (dosis eficaz mínima MED) de los VHH. Para el ensayo, se preparan secciones de corona cortadas con criostato de ratones positivos para placas, se montan en portaobjetos Superfrost de 76x26 mm (Roth) y se almacenan a -20°C. Las criosecciones se descongelan durante 20 minutos y se fijan en paraformaldehído (PFA) al 3% durante 10 minutos en hielo. Las secciones después se incuban en peróxido de hidrógeno 0.3% durante 30 minutos, se bloquean con PBS que contiene albúmina de suero bovino (BSA) al 2.5% y suero de ratón al 2% durante 1 ,5 horas y se incuban con VHH marcado con myc o Fab a diferentes concentraciones (3.0 mg/ml a 4.11 ng/ml), disuelto en PBS que contiene BSA al 2.5%. Los cortes después se incuban durante 1.5 horas con anticuerpo monoclonal de ratón anti c-myc biotinilado a 10 mg/ml (9E10) (Sigma-Aldrich), disuelto en PBS que contiene BSA al 2.5% (con la excepción de los cortes incubados con ABII320 biotinilado). Las secciones se incuban durante 1.5 horas con solución de kit Vectastain ABC ELITE (Vector Laboratories) preparada de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se visualizan usando solución Vector VIP SK 4600 (Vector Laboratories), preparada de nuevo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secciones se deshidratan progresivamente por incubaciones durante 5 minutos en etanol al 60-, 80- y 100% e isopropanol 100% y se limpian durante 5 minutos en xileno. Las secciones después se montan con medio de montaje nuevo Entellan (Merck) y se cubren con cubreobjetos de 24x50 mm (Menzel-Glaeser). Los resultados se resumen en la siguiente tabla.
Además de ABII320 y fragmentos Fab de anticuerpo monoclonal m266 descrito anteriormente, se analizaron otras diversas construcciones de VHH biparatópicas (marcadas con myc) en el ensayo TAPIR anterior. La estructura de las construcciones de VHH ABII300 a ABII305 se muestra en la Tabla XVII proporcionada más adelante y, en todos los casos, incluye dominios VHH ABII002 (SEC ID N°: 62) y ABII050 (SEC ID N°: 100), en diferentes órdenes y combinados con un dominio VHH de unión a albúmina (ABII300 a ABII304) o un resto PEG40 (ABII305).
A partir de los resultados, puede verse que los VHH biparatópicos ABII300, ABII301 , ABII302, ABII303 y ABII304 así como ABII305-PEG40 revelan la misma afinidad por placas amiloides de tejidos auténticos (núcleo denso y tipo difuso de placas) en el ensayo TAPIR. El orden particular de los enlazadores o la conjugación con PEG40 no parece tener un efecto significativo sobre la afinidad de las placas.
Tabla XVII Estructura de construcciones de VHH biparatópicas ????30? a 305 y resultados obtenidos en el ensayo TAPIR Ejemplo 11: Farmacodinámica de construcciones de VHH a n ti -A-beta biparatópicas de semivida prolongada Para determinar las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de VHH, se inyectan muestras i.v. o i.p. en ratones transgénicos para APP. Se toman muestras de plasma extrayendo sangre de la V. safena. Se tomó una muestra antes de la dosis antes de la aplicación de VHH, IgG o vehículo y después de 4 y 24 horas.
Como la unión de los VHH y las IgG interfiere con la detección en el ELISA, los complejos A-beta:VHH o A-beta:lgG se desnaturalizan antes del ensayo para detectar la cantidad total de A-beta(1-40) en plasma. En resumen, las muestras se desnaturalizan con GuHCI 6 M (Sigma Aldrich) y se purifican sobre una columna de extracción en fase sólida. Se preparan placas de 96 pocilios HLB Oasis de 60 mg (Waters) en colectores de placas de extracción (Waters) conectados a vacío doméstico. Las columnas se activan con 1 mi de metanol (MeOH), seguido de 1 mi de H2O. Se cargan muestras extraídas con GuHCI y se lavan secuencialmente con volúmenes de 1 mi de MeOH al 5 y 30% y después se eluye A-beta con NH OH al 2% en MeOH al 90%. Se recogen muestras eluidas y se centrifugan al vacío (Eppendorf Vacufuge) a 1400 rpm, 60°C durante 90 min. Una vez que las muestras se han secado completamente, se reconstituyen en tampón de bloqueo y se almacenan a -20°C hasta el análisis. Los niveles totales en plasma de A-beta (1-40) se determinan por ELISA de tipo sándwich (4G8/anti-A-beta (1-40), mesoscale discoveries) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los niveles totales de A-beta (1 -40) previos a la dosis para ratones transgénicos para APP son aproximadamente 1.25 nM en plasma. En estos ratones inyectados con 15 nmol/kg de VHH biparatópicos o IgG (misma dosis, normalizada para los sitios de unión), el nivel de A-beta total en plasma alcanzó un máximo aproximadamente 4 horas después de la aplicación i.v. Los datos se expresan como "aumento en veces con respecto a antes de la dosis" donde las concentraciones en plasma de A-beta (1-40) determinadas a 4 y 24 horas después de la inyección se dividen por los niveles previos a la dosis. Los resultados se muestran en la Tabla XVIII.
Tabla XVIII Aumento en veces y AUD de A-beta (1-40) en plasma después de la inyección i.v. de VHH anti-A-beta en comparación con anticuerpos anti-A-beta 3D6 y m266 Aumento en veces de A-beta(1-40) en plasma con respecto a antes de la dosis ratones transgénicos para APP dosis exp. (nmol/kg) 4 h 24 h AUD ABII300 14/16 15 i.v. 37.78 21.00 632.5 ABII301 14/16 15 i.v. 26 13.34 402.9 ABII305 16 15 i.v. 33.86 15.81 877.5 ABII306 21 15 i.v. 45.05 32.83 862.5 ABII316 24-26 15 i.v. 21.88 9.26 649 ABII317 24-26 15 i.v. 35.91 18.95 1615 ABII318 24-26 15 i.v. 13.45 5.81 807.9 ABII319 24-26 15 i.v. 36.53 21.53 1313 ABII320 24-26 15 i.v. 42.36 17.57 969.9 ABII315-PEG40 24-26 15 i.v. 28.78 12.14 761 m266 lgG1 20 7.5 i.v. * 25.79 17.9 528.9 3D6 lgG2b 20 7.5 i.v. * 29.47 25.88 673.2 * 15 nmol/kg, cuando se calcula para los sitios de unión (2 por molécula de IgG) De esta manera, en comparación con las moléculas de IgG conocidas en la técnica, las construcciones de VHH biparatópicas tienen el potencial de mostrar niveles máximos hasta 50% mayores para A-beta en plasma total (4 h) y valores de AUD aumentados >2, que indican superioridad de las construcciones de VHH con respecto a las IgG en la captura de A-beta.
Para confirmar que el nivel de A-beta en plasma libre/no unido se reduce después de la administración de la construcción de VHH, se desarrolla un ELISA competitivo. En resumen, se captura A-beta (1-40) con un anticuerpo específico para A-beta (1-40) acoplado a una placa ECL-ELISA (mesoscale discoveries). Las moléculas de VHH o IgG que se usan para tratar los animales en inmunoterapia pasiva se marcan usando MSD Sulfo-Tag NHS-Ester (mesoscale discoveries) de acuerdo con el manual del fabricante y se usa como herramienta de detección en este formato ELISA de tipo sándwich. El A-beta (1-40) que se une al VHH o a IgG no puede detectarse en estas situaciones mientras que el A-beta (1-40) libre/no unido es detectable. Para comparar los datos de diferentes ensayos, todos los valores se normalizan a los datos de un grupo tratado con vehículo. Los ratones transgénicos para APP se tratan con VHH o IgG como se indica y el plasma se recoge y se analiza para el A-beta (1-40) libre/no unido. Ya a las 2 horas después de la inyección i.p. de 132 nmol/kg de VHH anti-A-beta (ABII320 y ABII322, respectivamente), los niveles de A-beta (1-40) libre/no unido se redujeron fuertemente y de una forma muy significativa desde los niveles básales (aprox. 2 nM) hasta por debajo del límite de detección a 2 pM. Una dosis equivalente de 3D6-lgG (10 mg/kg, 132 nmol/kg sitios de unión = 66 nmol/kg IgG) puede reducir A-beta (1-40) no unido en plasma sólo hasta un nivel de 52 pM (Fig.1). En esta comparación, las construcciones de VHH biparatópicas ABII320 y ABII322 muestran, a la misma dosis, una reducción inesperadamente mucho mayor en A-beta libre/no unido en plasma en comparación con IgG 3D6, indicando de nuevo superioridad en la captura de A-beta con respecto a IgG (3D6). Esto hace que estas construcciones de VHH sean particularmente útiles en términos de eficacia terapéutica de VHH. Específicamente, se espera una reducción más eficaz de A-beta en plasma para prevenir completamente la entrada de A-beta desde el plasma al cerebro, generando de esta manera una gradiente de concentración más escalonada entre las reservas de A-beta en el cerebro y en plasma, acelerándose de esta manera la salida de A-beta desde el cerebro al plasma.
Ejemplo 12: VHH que atraviesan la BBB Para mejorar adicionalmente las características de cruce de la barrera hematoencefálica (BBB) de las construcciones de VHH, se construyen VHH bioespecíficas que comprenden los VHH biparatópicos y los VHH que atraviesan BBB FC44 y FC5 (descritos con detalle en el documento WO2002/057445). Estos VHH mejoran el paso a través de la BBB por unión a una proteína diana expresada en la BBB, después de lo cual los VHH se someten a transcitosis a través de las células endoteliales y se liberan en el parénquima cerebral. Como tales, los VHH fusionados genéticamente a los VHH FC44 y FC5 es de esperar que experimenten un transporte activo al interior del cerebro, dando como resultado mayores niveles cerebrales y un mejor efecto terapéutico. Las construcciones ABII400-ABII407, que comprenden los VHH FC44 o FC5, se generan mediante montaje génico usando series apropiadas de oligonucleótidos solapantes. En la Tabla XIX proporcionada a continuación se presentan las SEC ID N° y las secuencias de aminoácidos. En resumen, se generan VHH que contienen los VHH FC5 o FC44 entre la construcción de VHH ABII035 y ABII059, o entre el VHH que se une a HSA y los bloques de construcción ABII035 o ABII059, o en extremo amino o carboxi de la molécula (véase la Tabla XIX). Los VHH se expresan en E.coli o en Pichia pastoris y se purifican como se describe en el Ejemplo 9.2. Los VHH purificados se evalúan en un ensayo de cruce de la BBB in vitro como se describe (documento WO2002/057445 y referencia adicionales en el mismo). Además, se administran in vivo VHH radiomarcados o no radiomarcados que comprenden los bloques de construcción FC5 y FC44 y se determinan los niveles cerebrales usando recuento de centelleo de líquidos o ELISA.
Tabla XIX Construcciones de VHH anti-A-beta biparatópicas, que comprenden además restos FC5 y FC44 Ejemplo 13: Proceso de fabricación industrial para polipéptidos biparatópicos PEGilados de la invención 13.1 Fermentación: Cualquiera de los polipéptidos ABII305, ABII306, ABII314, ABII315, ABII322 y ABII323 puede expresarse en el citoplasma de diferentes cepas de E. coli, tales como W3110, TG1, BL21 , BL21(DE3), HMS174, HMS174(DE3), MM294 bajo el control de un promotor inducible. Este promotor puede elegirse entre lacUV5, tac, T7, trp, T5 y araB. El medio de cultivo preferiblemente se define completamente de acuerdo con Wilms et al., 2001 (Wilms, B., Hauck, A., Reuss, M., Syldatk, C, Mattes, R., Siemann, M., y Altenbuchner, J.: High-Cell-Density Fermentation for Production of L-N-Carbamoylase Using an Expression System Based on the Escherichia coli rhaBAD Promoter. Biotechnology and Bioengineering, 73: 95-103 (2001)), DeLisa et al., 1999 (DeLisa, M. P., Li, J. C, Rao, G., Weigand, W. A., and Bentley, W. E.: Monitoring GFP-operon fusión protein expression during high cell density cultivation of Escherichia coli using an on-line optical sensor. Biotechnology and Bioengineering, 65: 54-64. (1999)) o equivalente. Sin embargo, puede ser beneficioso el suplemento del medio con aminoácidos tales como isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, trionina, tritófano y valina o componentes complejos de medio, tales como peptona de soja o extracto de levadura. El proceso para la fermentación se realiza en un modo semicontinuo. Condiciones: Temperatura 30 - 40°C, pH 6 - 7.5, el oxígeno disuelto se mantiene por encima de 20%. Después del consumo de la fuente de C inicial, el cultivo se alimenta con el medio de alimentación indicado anteriormente (o equivalente). Cuando se alcanza un peso celular seco en el fermentador de 40 a 90 g/l, el cultivo se induce con un inductor apropiado correspondiente al sistema promotor usado (por ejemplo IPTG, lactosa, arabinosa). La inducción puede realizarse como una inducción completa pulsátil o como una inducción parcial mediante el suministro del inductor respectivo al termentador durante un periodo de tiempo prolongado. La fase de producción debe durar al menos 4 horas. Las células se recuperan por centrifugación en decantadores centrífugos o decantadores centrífugos tubulares o centrífugas verticales y se desecha el sobrenadante del cultivo. 13.2 Purificación: La masa de células E. coli se resuspende en una cantidad de 6 a 8 veces mayor de tampón de lisis (tampón fosfato o Tris, pH 7-8.5). La lisis celular preferiblemente se realiza por homogeneización a alta presión seguido de retirada del desecho celular por centrifugación en un decantador centrífugo, decantador centrífugo tubular o centrífuga vertical. El sobrenadante que contiene la proteína diana opcionalmente se filtra usando un filtro de 0.22-10 µ?? y se separa por cromatografía de intercambio catiónico (por ejemplo, Toyopearl MegaCap® II SP-550EC, Toyopearl GigaCap S-650M, SP Sepharose BB, SP Sepharose FF o S HyperCel™) a pH 7-8.5. La elución se realiza por un gradiente lineal creciente de NaCI a pH 7-8.5. Las fracciones que contienen la proteína diana se reúnen y posteriormente se incuban con DTT 5-10 mM para prevenir la dimerización o la agregación mediada por restos de cisteína libres. Después de la adición adicional de sulfato amónico 0.8-1 M o NaCI 2-3 M, la solución se separa por cromatografía de interacción hidrófila (por ejemplo, Phenyl Sepharose HP, Phenyl Sepharose FF, Butyl Sepharose HP, Butyl Sephrose FF, Butyl Toyopearl 650 (S, M, C), Phenyl Toyopearl 650 (S, M,C)) a pH 7-8.5. La elución se realiza a pH 7-8.5 por un gradiente decreciente lineal de sulfato amónico o NaCI en presencia de DTT 5 mM. Se reúnen las fracciones que contienen la proteína diana con un nivel de pureza de 90% como mínimo y se desalifican por diafiltracion en presencia de DTT 5 mM seguido de concentración a aproximadamente 5 mg/ml. El replegamiento posterior se realiza diluyendo la solución de proteína 1 :5-1:20 con Tris 50 mM, NaCI 150 mM, Cystamin 4 mM, CHAPS 10 mM a pH 8.5 a una concentración final de proteina de 0.25-1 mg/ml. La solución de replegamiento se incuba con agitación durante 12-36 h a temperatura ambiente y después se separa por cromatografía de intercambio catiónico (por ejemplo, SP Sepharose FF, SP Sepharose HP, Toyopearl SP-650 (S, M, C)) a pH 7-8.5. La elución se realiza por un gradiente lineal creciente de NaCI a pH 7-8.5. Las fracciones que contienen proteína diana monomérica se reúnen y se activan para la PEGilación por la adición de agentes reductores tales como DTT, DTE o TCEP. La solución posteriormente se incuba a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de la diafiltración frente a tampón pH 6.5-7.5 o tampón HEPES 20 mM pH 6.5-7.5 o tampón Tris pH 8.0 y concentración a 5-10 mg/ml, se añade maleimida-polietilenglicol (PEG) de 40-kDa (relación entre proteína y PEG 1 :2-1 :10). La solución se incuba con agitación durante 3-18 h a temperatura ambiente y posteriormente se filtra usando un filtro de 0.22 pm. La proteína dinana PEGilada se separa del PEG libre y la proteína diana no PEGilada por cromatografía de intercambio catiónico (SP Sepharose HP, Toyopearl SP 650M, MacroCap™SP, Source™30S o Fractogel®EMD (M)) a pH 5-7. La elución se realiza mediante un gradiente de NaCI creciente lineal. Las fracciones que contienen diana mono-PEGilada se reúnen y formulan en fosfato Na 25 mM, trehalosa sin endotoxina 220 mM, pH 7.5 por diafiltración.
Ejemplo 14: Formulación farmacéutica y uso 14.1 Formulación farmacéutica: Cualquiera de las construcciones biparatópicas de polipéptidos humanizados de la invención, tales como ABII314 a Abll323, puede seleccionarse para la fabricación de una formulación farmacéutica para aplicación subcutánea que tiene una composición como la siguiente: Sustancia farmacéutica: 100 mg/ml (1 a 3 nmol/ml) Tampón fosfato: 25 mM Trehalosa: 220 mM Tween-20: 0.02 % La sustancia farmacéutica se formula en una solución que tiene la composición anterior, se esteriliza y se almacena a 2-8°C. 14.2 Uso farmacéutico: La solución preparada según el punto 14.1 anterior se aplica a un paciente que lo necesita, tal como un ser humano que padece EA, por inyección subcutánea en el abdomen en un volumen de 1 a 2 mi (dosificación de 100 a 200 mg) cada dos a cuatro semanas.

Claims (32)

REIVINDICACIONES
1. - Un polipéptido, caracterizado porque comprende un primer dominio variable individual de inmunoglobulina que se une específicamente a un primer epítopo de A-beta y un segundo variable individual de inmunoglobulina que se une específicamente a un segundo epítopo de A-beta, donde dicho primer y dicho segundo epítopos de A-beta no son epítopos idénticos.
2. - El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho primer y dicho segundo dominios variables individuales de inmunoglobulina consisten esencialmente, cada uno, en cuatro regiones flanqueantes (FR1 a FR4, respectivamente) y tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), donde dicho primer y dicho segundo dominios variables individuales de immunoglobulina se unen covalentemente por un péptido enlazador, donde dicho péptido enlazador comprende o consiste opcionalmente en un tercer dominio de immunoglobulina.
3. - El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado además porque dicho primer y dicho segundo dominios variables individuales de inmunoglobulina son dominios de anticuerpo, preferiblemente dominios VHH, y más preferiblemente dominios VHH humanizados.
4. - El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque dicho primer epítopo de A-beta es el epítopo definido por la SEC ID N°: 3 y dicho segundo epítopo de A-beta es el epítopo definido por la SEC ID N°: 4, o donde dicho primer epítopo de A-beta es el epítopo definido por la SEC ID N°: 4 y dicho segundo epítopo de A-beta es el epítopo definido por la SEC ID N°: 3.
5. - El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque dicho polipéptido forma contactos con al menos los aminoácidos 1 (aspartato), 3 (glutamato), 19 (fenilalanina), 20 (fenilalanina) y 23 (aspartato) del péptido A-beta humano (SEC ID N°: 1)
6. - El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el valor de CI50 medido en un ensayo de unión TR-FRET (usando ABII002 = SEC ID N°: 62 y ABII050 = SEC ID N°: 100 como competidores) está en el intervalo de 10"9 moles/litro o menos, y preferiblemente en el intervalo de 5 x 10"10 moles/litro a 10"12 moles/litro.
7. - El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, caracterizado además porque dicho polipéptido comprende dos dominios variables individuales de inmunoglobulina de unión a A-beta, teniendo dichos dominios variables individuales de inmunoglobulina la estructura FR(1)1 -CDR(1)1 - FR(1)2 - CDR(1)2 - FR(1 )3 - CDR(1)3 - FR(1)4, y FR(2)1 - CDR(2)1 -FR(2)2 - CDR(2)2 - FR(2)3 - CDR(2)3 - FR(2)4, respectivamente y donde CDR(1)3 se selecciona del grupo que consiste en: - las secuencias de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N°: 13 y SEC ID N°: 16; y - secuencias de aminoácidos que tienen hasta tres, preferiblemente hasta dos y más preferiblemente una diferencia de aminoácidos en comparación con dichas secuencias de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N°: 13 o la SEC ID N°: 16, respectivamente; y CDR(2)3 se selecciona entre el grupo que consiste en: - la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N°: 19, y - secuencias de aminoácidos que tienen hasta tres, preferiblemente hasta dos y más preferiblemente una diferencia de aminoácidos en comparación con dicha secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N°: 19, o donde CDR (1)3 se selecciona del grupo que consiste en: - la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N°: 19, y - secuencias de aminoácidos que tienen hasta tres, preferiblemente hasta dos y más preferiblemente una diferencia de aminoácidos en comparación con dicha secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N°: 19, y CDR (2)3 se selecciona entre el grupo que consiste en: -las secuencias de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N°: 13 y SEC ID N°: 16, y - secuencias de aminoácidos que tienen hasta tres, preferiblemente hasta dos y más preferiblemente una diferencia de aminoácidos en comparación con dichas secuencias de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID N°: 13 o la SEC ID N°: 16, respectivamente;
8.- El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, caracterizado además porque las secuencias de CDR de dicho primer dominio variable de inmunoglobulina (secuencias de CDR (1)) y las secuencias de CDR de dicho segundo dominio variable de inmunoglobulina (secuencias de CDR (2)) se definen como se indica a continuación: - CDR(1)1: SEC ID N°: 1 . - CDR(1)2: SEC ID N°: 12. - CDR(1)3: SEC ID N°: 13. - CDR(2)1: SEC ID N°: 17. - CDR(2)2: SEC ID N°: 18. - CDR(2)3: SEC ID N°: 19. o: - CDR(1)1 : SEC ID N°: 14. - CDR(1)2: SEC ID N°: 15. -CDR(1)3: SEC ID N°: 16. -CDR(2)1:SECIDN°: 17. -CDR(2)2: SEC ID N°: 18. -CDR(2)3: SEC ID N°: 19. o: -CDR(1)1:SEC ID N°: 17. -CDR(1)2: SEC ID N°: 18. -CDR(1)3: SEC ID N°: 19. -CDR(2)1: SECIDN0: 11. -CDR(2)2: SEC IDN°: 12. -CDR(2)3: SEC ID N°: 13. o: -CDR(1)1:SECIDN°: 17. -CDR(1)2: SEC ID N°: 18. -CDR(1)3:SECIDN°: 19. -CDR(2)1: SEC ID N°: 14. -CDR(2)2: SEC ID N°: 15. -CDR(2)3: SEC ID N°: 16.
9.- El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el polipéptido comprende un primer dominio variable individual de inmunoglobulina y un segundo dominio variable individual de inmunoglobulina, donde dicho primer dominio variable individual de inmunoglobulina es un dominio VHH ABII035 (SEC ID N°: 44) y ducho segundo dominio variable individual de inmunogolobulina es el dominio VHH ABII059 (SEC ID N°: 45) o donde dicho primer dominio variable individual de inmunoglobulina es el dominio VHH ABII059 (SEC ID N°: 45) y dicho segundo dominio variable individual de inmunoglobulina es el dominio VHH ABII035 (SEC ID N°: 44).
10. - El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado además porque el polipéptido incluye además un resto de prolongación de la semivida.
11. - El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado además porque dicho resto de prolongación de la semivida está unido covalentemente a dicho polipéptido y se selecciona del grupo que consiste en un resto de unión a albúmina, tal como un dominio de inmunoglobulina anti-albúmina, un resto de unión a transferrina, tal como un dominio de inmunoglobulina anti-transferrina, una molécula de polietilenglicol, una molécula de polietilenglicol recombinante, albúmina de suero humano, un fragmento de albúmina de suero humano y un péptido de unión a albúmina.
12. - El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 y 11, caracterizado además porque el polipéptido se selecciona entre el grupo que consiste en polipéptidos que tienen las SEC ID N°: 26 a 32, 34 a 43, 142, 143 y 145 a 152.
13. - Un polipéptido, caracterizado porque comprende o consiste en un dominio variable individual de inmunoglobulina que consiste esencialmente en cuatro regiones flanqueantes (FR1 a FR4, respectivamente) y tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), donde dichas secuencias de CDR se definen como se indica a continuación: - CDR1 : SEC ID N°: 11. - CDR2: SEC ID N°: 12. - CDR3: SEC ID N°: 13. O - CDR1 : SEC ID N°: 14. - CDR2: SEC ID N°: 15. - CDR3: SEC ID N°: 16. o - CDR1 : SEC ID N°: 17. - CDR2: SEC ID N°: 18. - CDR3: SEC ID N°: 19.
14. - Un polipéptido, caracterizado porque comprende o consiste en un dominio VHH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N°: 47 a 111.
15. - El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 13 o reivindicación 14 para uso en la construcción de un polipéptido de unión a A-beta biparatópico como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
16. - Una molécula de ácido nucleico, preferiblemente en forma aislada, caracterizada porque comprende una región que codifica un polipéptido como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
17. - Un vector de expresión, caracterizado porque comprende una molécula de ácido nucléico como la que se reclama en la reivindicación 16.
18. - Una célula hospedadora que lleva un vector de expresión como el que se reclama en la reivindicación 17, caracterizada porque dicha célula hospedadora es capaz de expresar un polipéptido como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, y donde dicha célula hospedadora es una célula procariota o eucariota.
19. - Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende (i) como ingrediente activo, uno o más polipéptidos como se reclaman en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente (iii) un diluyente, excipiente, adyuvante y/o estabilizante.
20. - Un método ex-vivo para obtener un polipéptido como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque comprende las etapas de: cultivar una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 18 en condiciones que permiten la expresión de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15; recuperar dicho polipéptido; y purificar dicho polipéptido.
21. - El uso de un polipéptido como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o una composición farmacéutica como la que se reclama en la reivindicación 19, para preparar un medicamento útil para el tratamiento, prevención o alivio de una enfermedad, trastorno o afección en un ser humano.
22. - El uso de un polipéptido como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o una composición farmacéutica como la que se reclama en la reivindicación 19, para preparar un medicamento útil para el tratamiento terapéutico, prevención o alivio de una enfermedad, trastorno o afección en un ser humano, donde dicha enfermedad, trastorno o afección se selecciona del grupo que consiste en enfermedades o trastornos neurodegenerativos, enfermedad de Alzheimer, demencia de tipo Alzheimer, DME seca, glaucoma, angiopatía amiloide cerebral, trisomía 21 (síndrome de Down), síndrome de Down en adulto, hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis de tipo Dutch (HCHWA-D), demencia con cuerpos de Lewy, degeneración del lóbulo frontotemporal, glaucoma, esclerosis lateral amiotrófica, miositis con cuerpos de inclusión esporádicos y trastorno de ansiedad en un ser humano de edad avanzada.
23. - Un polipéptido como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o una composición farmacéutica como la que se reclama en la reivindicación 19 adaptada para ser inyectable intravenosa o subcutáneamente.
24. - El uso de al menos un polipéptido como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o una composición farmacéutica como la que se reclama en la reivindicación 19, para preparar un medicamento útil para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad que está asociada con la deposición de A-beta en un sujeto.
25. - Un polipéptido como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o una composición farmacéutica como la que se reclama en la reivindicación 19, en combinación con un agente terapéutico seleccionado entre el grupo que consiste en ELND-005, Caprospinol, NRM-8499, PBT-2, Posiphen, EHT-0202, CTS-21 66, Semagacest, BMS-708163, BMS-299897, BMS-433796, ELND-006, ELN-475516, ELN-318463, ELN-475513, Begacestat, E-2012, CHF-5074, Dimebolin y PF-4494700.
26. - Un agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en ELND-005, Caprospinol, NRM-8499, PBT-2, Posiphen, EHT-0202, CTS-21166, Semagacest, BMS-708163, BMS-299897, BMS-433796, ELND-006, ELN-475516, ELN-318463, ELN-475513,Begacestat, E-2012, CHF-5074, Dimebolin y PF-4494700, preparado en combinación con un polipéptido como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o una composición farmacéutica como la que se reclama en la reivindicación 19 a un paciente que lo necesita.
27. - Una composición farmacéutica que comprende (i) uno o más polipéptidos como se reclaman en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, y (ii) uno o más agentes terapéuticos adicionales, preferiblemente seleccionados del grupo que consiste en ELND-005, Caprospinol, NRM-8499, PBT-2, Posiphen, EHT-0202, CTS-21166, Semagacest, BMS-708163, BMS-299897, BMS-433796, ELND-006, ELN-475516, ELN-318463, ELN-475513,Begacestat, E-2012, CHF-5074, Dimebolin y PF-4494700, y (¡ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable y opcionalmente (iv) un diluyente, excipiente, adyuvante y/o estabilizante.
28. - Un polipéptido como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para la reducción de los niveles de A-beta en un fluido corporal, y preferiblemente para la reducción del nivel de A-beta soluble en la sangre.
29. - Un polipéptido, caracterizado porque comprende un primer dominio variable individual de inmunoglobulina y un segundo dominio variable individual de inmunoglobulina, donde las secuencias de CDR de dicho primer dominio variable de inmunoglobulina (secuencias de CDR (1)) y las secuencias de CDR de dicho segundo dominio variable de inmunoglobulina (secuencias de CDR (2)) se definen como se indica a continuación: - CDR(1)1: SEC ID N°: 11. - CDR(1)2: SEC ID N°: 12. - CDR(1)3: SEC ID N°: 13. - CDR(2)1: SEC ID N°: 17. - CDR(2)2: SEC ID N°: 18. - CDR(2)3: SEC ID N°: 19. o: - CDR(1 1 : SEC ID N°: 14. - CDR(1 2: SEC ID N°: 15. - CDR(1 3: SEC ID N°: 16. - CDR(2 1 : SEC ID N°: 17. - CDR(2 2: SEC ID 0: 18. - CDR(2 3: SEC ID N°: 19. o: - CDR(1 1 : SEC ID N°: 17. - CDR(1 2: SEC ID N°: 18. - CDR(1 3: SEC ID N°: 19. - CDR(2 1 : SEC ID N°: 11. - CDR(2 2: SEC ID N°: 12. - CDR(2 3: SEC ID N°: 13. o: - CDR(1 )1 : SEC ID N°: 17. - CDR(1 )2: SEC ID N°: 18. - CDR(1 )3: SEC ID N°: 19. - CDR(2 )1 : SEC ID N°: 14. - CDR(2 )2: SEC ID °: 15. - CDR(2 )3: SEC ID N°: 16.
30.- Un polipéptido, caracterizado porque comprende un primer dominio variable individual de inmunoglobulina y un segundo dominio variable individual de inmunoglobulina, donde dicho primer dominio variable individual de inmunoglobulina es el dominio VHH ABII035 (SEC ID N°: 44) y dicho segundo dominio variable individual de inmunoglobulina es el dominio VHH ABII059 (SEC ID N°: 45), o donde dicho primer dominio variable individual de inmunoglobulina es el dominio VHH ABII059 (SEC ID N°: 45) y dicho segundo dominio variable individual de inmunoglobulina es el dominio VHH ABII035 (SEC ID N°: 44).
31.- El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 29 o la reivindicación 30, caracterizado además porque el polipéptido incluye además un resto que prolonga la semivida, seleccionándose preferiblemente dicho resto que prolonga la semivida del grupo que consiste en un resto de unión a albúmina, tal como un dominio de inmunoglobulina antialbúmina, un resto de unión a transferrina, tal como un dominio de inmunoglobulina anti-transferrina, una molécula de polietilenglicol, una molécula de polietilenglicol recombinante, albúmina de suero humano, un fragmento de albúmina de suero humano y un péptido de unión a albúmina.
32.- Un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en polipéptidos que tiene cualquiera de las SEC ID N°: 26 a 32, 34 a 43, 142, 143 y 145 a 152.
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