CN101213214A - 针对冯威勒布兰特因子的单一结构域vhh抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及针对冯威勒布兰特因子(von Willebrand Factor，vWF)的改进的纳米体TM，以及包括或者基本上由一种或多种所述纳米体组成的多肽。本发明还涉及编码所述纳米体和多肽的核酸；涉及制备所述纳米体和多肽的方法；涉及表达或者能够表达所述纳米体和多肽的宿主细胞；涉及包括所述纳米体、多肽、核酸或宿主细胞的组合物；并且涉及所述纳米体、所述多肽、所述核酸、所述宿主细胞或所述组合物的应用，特别是用于预防、治疗或诊断目的，诸如预防、治疗或诊断目的。

Description

针对冯威勒布兰特因子的单一结构域VHH抗体
本发明涉及针对针对冯威勒布兰特因子(von Willebrand Factor，vWF)的改进的纳米体TM(NanobodiesTM)，以及包括或者基本上由一种或多种所述纳米体组成的多肽。[注意：NanobodyTM，NanobodiesTM和NanocloneTM为AblynxN.V.的商标]
本发明还涉及编码所述纳米体和多肽的核酸；涉及制备所述纳米体和多肽的方法；涉及表达或者能够表达所述纳米体或多肽的宿主细胞；涉及包括所述纳米体、多肽、核酸或宿主细胞的组合物；并且涉及所述纳米体、所述多肽、所述核酸、所述宿主细胞或所述组合物的应用，特别是用于预防、治疗或诊断目的，诸如下文提及的预防、治疗或诊断目的。
本发明的其它方面、实施方案、优点和应用将通过下文的进一步描述而变得清楚。
申请人的WO 04/062551涉及针对冯威勒布兰特因子(vWF)的纳米体，并且涉及它的制备和应用，特别是用于预防和/或治疗与血小板-介导的聚集相关的疾病和紊乱。
按照WO 04/062551的抗-vWF纳米体可以被人源化，并且可以是单价或多价的，其中后者导致对vWF的增加的亲和力。按照WO 04/062551的抗-vWF纳米体还可以是多特异性的，并且特别可以是多特异性构建体的形式，其包括针对vWF的两个或多个纳米体和针对血清蛋白诸如人血清白蛋白的另外的纳米体，这在体内导致增加的半衰期。
WO 04/062551中所述的抗-vWF纳米体可以针对vWF的任意表位或构象(诸如A1结构域或A3结构域)，但是优选地针对A1结构域，并且特别是针对A1结构域的活化的构象。
WO 04/062551还描述抗-vWF纳米体、编码所述抗-vWF纳米体的核苷酸序列、以及涉及包括所述抗-vWF纳米体的药物组合物的制备。
WO 04/062551中所述的抗-vWF纳米体和组合物可以用于预防和治疗与血小板-介导的聚集相关的疾病和紊乱，诸如非-闭合性血栓的形成，闭合性血栓的形成，动脉血栓形成，急性冠状闭合，外周动脉闭合疾病，再狭窄以及由下列各项引起的紊乱：冠状旁路(bypass)移植，冠状动脉阀置换和冠状干预诸如血管成形术，支架术(stenting)或动脉粥样硬化斑切除术，血管成形术、动脉粥样硬化斑切除术或动脉支架之后的增生，血管系统中的闭合综合征或者缺乏患病动脉的开放性，血栓形成血小板减少性紫癜(TTP)，瞬时脑局部缺血性发作，不稳定或稳定的心绞痛，脑梗塞，HELLP综合征，颈动脉动脉内膜切除术，颈动脉狭窄，重要肢体局部缺血(critical limb ischaemia)，cardioembolism，外周血管病，再狭窄和心肌梗塞。
WO 04/062551中所述药物组合物可以适用于静脉内、皮下、口服、舌下、局部、鼻、阴道或直肠给药，或者适用于通过吸入给药；并且还可以包含血栓溶解剂，诸如葡萄球菌激酶、组织纤溶酶原激活物、链激酶、单链链激酶、尿激酶和酰基纤溶酶原链激酶复合物。WO 04/062551中所述的抗-vWF纳米体还可以用于诊断目的(任选地以成分试剂盒(kit-of-parts)形式)或者用于包被医学装置诸如支架(stents)。
本发明的一般目的是提供针对vWF的纳米体，特别是针对人vWF的纳米体。
具体地，本发明的一个目的是提供针对vWF的纳米体，特别是针对人vWF的纳米体，并且提供包括所述纳米体的蛋白或多肽，其适用于治疗和/或诊断应用，并且特别用于预防、治疗和/或诊断与vWF诸如上文提及的那些相关的和/或受之调控的一种或多种疾病和紊乱，和/或其可以用于制备预防和/或治疗与vWF如上文提及的那些相关的和/或受之调控的一种或多种疾病的药物组合物。
更具体地，本发明的一个目的是提供针对vWF的纳米体，并且提供包括所述纳米体的蛋白和多肽，其为WO 04/062551所述的针对vWF的纳米体和多肽的备选物，和/或与WO 04/062551所述的针对vWF的纳米体和多肽相比，其具有一种或多种改进的特性。
更具体地，本发明的一个目的是提供针对vWF的纳米体，并且提供包括所述纳米体的蛋白或多肽，与WO 04/062551所述的针对vWF的纳米体和多肽相比，其是改进的，具有一种或多种下述特性或特征：
-增加的对于vWF的亲和力，以单价形式，以多价形式(例如以二价形式)和/或多特异性形式(例如，WO 04/062551中或下文所述的多特异性形式的一种)；
-更好的适用性，适用于以多价形式(例如，以二价形式)格式化；
-更好的适用性，适用于以多特异性形式(例如，WO 04/062551或下文中所述的多特异性形式的一种)格式化；
-对于“人源化”取代(如本文定义)的提高的适用性或敏感性；和/或
-更低的免疫原性，以单价形式，以多价形式(例如以二价形式)和/或以单价形式的多特异性形式(例如，WO 04/062551中或下文所述的多特异性形式的一种)；
-增加的稳定性，以单价形式，以多价形式(例如以二价形式)和/或以单价形式的多特异性形式(例如，WO 04/062551中或下文所述的多特异性形式的一种)；
-增加的针对vWF的特异性，以单价形式，以多价形式(例如以二价形式)和/或以单价形式的多特异性形式(例如，WO 04/062551中或下文所述的多特异性形式的一种)；
-减小的或在需要的情形中增加的与来自不同物种的vWF的交叉反应性；
和/或
-一种或多种适于医药应用(包括预防应用和/或治疗应用)和/或诊断应用(包括但不限于成像目的的应用)的其它改进的特性，以单价形式，以多价形式(例如以二价形式)和/或以多特异性形式(例如，WO 04/062551中或下文所述的多特异性形式的一种)。
这些目的通过通过本文所述的针对vWF的纳米体和多肽而实现。本文所述的针对vWF的纳米体和多肽特别针对人vWF，但是包含在本发明的范围之内，本发明的一些抗-vWF纳米体和多肽可以表现出与来自其它脊椎动物的vWF的交叉-反应性，特别是来自其它温血动物，更特别是来自其它哺乳动物，并且特别是来自灵长类的其它物种，诸如下述实施例中所用的狒狒的vWF。然而，如同WO 04/062551中所述的抗-vWF纳米体一样，本发明在其最广泛意义上不特别限于或者限定于本发明的纳米体和多肽所针对的vWF的具体的表位、结构域或构象。然而，通常假定并且优选本发明的纳米体和多肽针对vWF的A1结构域，以其活化的或非-活化的构象。
因此，在第一方面，本发明涉及针对vWF的纳米体(如本文所定义)，其由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中：
i)CDR1包括或基本上由选自由下列各项组成的组的氨基酸序列组成：
NYGMG    [SEQ ID NO：15]
SYTLG    [SEQ ID NO：16]
NYNMG    [SEQ ID NO：13]
SSAMA    [SEQ ID NO：18]
YYNTG    [SEQ ID NO：19]
IGAMG    [SEQ ID NO：20]
IGTMG    [SEQ ID NO：21]
YNPMG    [SEQ ID NO：22]
或者选自由与上述氨基酸序列之一具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中：
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或选自由与上述氨基酸序列之一有2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
并且其中：
ii)CDR2包括或基本上由选自由下列各项组成的组的氨基酸序列组成：
SISWSGTYTAYSDNVKG    [SEQ ID NO：23]
GISWSGVSTDYAEFAKG    [SEQ ID NO：24]
TSISWSGSYTAYADNVKG   [SEQ ID NO：25]
SISWSGMSTYYTDSVKG    [SEQ ID NO：26]
TITSGGRTSYADSVKG     [SEQ ID NO：27]
AISWSGGLTYYADSVKG    [SEQ ID NO：28]
TITSGGSTNYADPVKG     [SEQ ID NO：29]
TITSGGSTNYADSVKG     [SEQ ID NO：30]
AISRTGGSTYYARSVEG    [SEQ ID NO：31]
AISRTGGSTYYPDSVEG    [SEQ ID NO：32]
或者选自由与上述氨基酸序列之一具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或选自由与上述氨基酸序列之一有3个，2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
并且其中：
iii)CDR3包括或基本上由选自由下列各项组成的组的氨基酸序列组成：
QSRYRSNYYDHDDKYAY    [SEQ ID NO：33]
LGRYRSNWRNIGQYDY     [SEQ ID NO：34]
QSRYSSNYYDHDDKYAY      [SEQ ID NO：35]
SNRYRTHTTQAMYNY        [SEQ ID NO：36]
VVDGKRAP               [SEQ ID NO：37]
NRRQKTVQMGERAYDY       [SEQ ID NO：38]
NLKQGSYGYRFNDY         [SEQ ID NO：39]
NLKQGDYGYRFNDY         [SEQ ID NO：40]
AGVRAEDGRVRTLPSEYNF    [SEQ ID NO：41]
AGVRAEDGRVRTLPSEYTF    [SEQ ID NO：42]
AGVRAEDGRVRSLPSEYTF    [SEQ ID NO：43]
或者选自由与上述氨基酸序列之一具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或选自由与上述氨基酸序列之一有3个，2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入。
在另一方面，本发明涉及针对vWF的纳米体(如本文所定义)，其由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中：
i)CDR1是选自由下列各项组成的组的氨基酸序列：
NYGMG    [SEQ ID NO：15]
SYTLG    [SEQ ID NO：16]
NYNMG    [SEQ ID NO：17]
SSAMA    [SEQ ID NO：18]
YYNTG    [SEQ ID NO：19]
IGAMG    [SEQ ID NO：20]
IGTMG    [SEQ ID NO：21]
YNPMG    [SEQ ID NO：22]
或者选自由与上述氨基酸序列之一具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或选自由与上述氨基酸序列之一有2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
并且其中：
ii)CDR2是选自由下列各项组成的组的氨基酸序列：
SISWSGTYTAYSDNVKG    [SEQ ID NO：23]
GISWSGVSTDYAEFAKG    [SEQ ID NO：24]
TSISWSGSYTAYADNVKG   [SEQ ID NO：25]
SISWSGMSTYYTDSVKG    [SEQ ID NO：26]
TITSGGRTSYADSVKG     [SEQ ID NO：27]
AISWSGGLTYYADSVKG    [SEQ ID NO：28]
TITSGGSTNYADPVKG     [SEQ ID NO：29]
TITSGGSTNYADSVKG     [SEQ ID NO：30]
AISRTGGSTYYARSVEG    [SEQ ID NO：31]
AISRTGGSTYYPDSVEG    [SEQ ID NO：32]
或者选自由与上述氨基酸序列之一具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或选自由与上述氨基酸序列之一有3个，2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
并且其中：
iii)CDR3是选自由下列各项组成的组的氨基酸序列：
QSRYRSNYYDHDDKYAY      [SEQ ID NO：33]
LGRYRSNWRNIGQYDY       [SEQ ID NO：34]
QSRYSSNYYDHDDKYAY      [SEQ ID NO：35]
SNRYRTHTTQAMYNY        [SEQ ID NO：36]
VVDGKRAP               [SEQ ID NO：37]
NRRQKTVQMGERAYDY       [SEQ ID NO：38]
NLKQGSYGYRFNDY         [SEQ ID NO：39]
NLKQGDYGYRFNDY         [SEQ ID NO：40]
AGVRAEDGRVRTLPSEYNF    [SEQ ID NO：41]
AGVRAEDGRVRTLPSEYTF    [SEQ ID NO：42]
AGVRAEDGRVRSLPSEYTF    [SEQ ID NO：43]
或者选自由与上述氨基酸序列之一具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或选自由与上述氨基酸序列之一有3个，2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入。
上述以及下文进一步所述的针对vWF的纳米体在本文中也叫作本发明的纳米体。
在本发明的纳米体中，特别优选包括一个或多个上文明确列出的CDR’s的纳米体；更特别优选包括两个或多个上文明确列出的CDR’s的纳米体；并且最特别优选包括三个上文明确列出的CDR’s的纳米体。
在另一方面，本发明涉及针对vWF的纳米体，其由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其选自由分别具有下述CDR1、CDR2和CDR3组合之一的纳米体组成的组：
-CDR1：NYGMG；CDR2：SISWSGTYTAYSDNVKG；
 CDR3：QSRYRSNYYDHDDKYAY
-CDR1：SYTLG；CDR2：GISWSGVSTDYAEFAKG；
 CDR3：LGRYRSNWRNIGQYDY
-CDR1：NYGMG；CDR2：TSISWSGSYTAYADNVKG；
 CDR3：QSRYSSNYYDHDDKYAY
-CDR1：NYNMG；CDR2：SISWSGMSTYYTDSVKG；
 CDR3：SNRYRTHTTQAMYNY
-CDR1：SSAMA；CDR2：TITSGGRTSYADSVKG；CDR3：VVDGKRAP
-CDR1：YYNTG；CDR2：AISWSGGLTYYADSVKG；
 CDR3：NRRQKTVQMGERAYDY
-CDR1：IGAMG；CDR2：TITSGGSTNYADPVKG；CDR3：NLKQGSYGYRFNDY
-CDR1：IGAMG；CDR2：TITSGGSTNYADSVKG；CDR3：NLKQGSYGYRFNDY
-CDR1：IGAMG；CDR2：TITSGGSTNYADSVKG；
 CDR3：NLKQGDYGYRFNDY
-CDR1：IGTMG；CDR2：TITSGGSTNYADSVKG；CDR3：NLKQGDYGYRFNDY
-CDR1：YNPMG；CDR2：AISRTGGSTYYARSVEG；
 CDR3：AGVRAEDGRVRTLPSEYNF
-CDR1：YNPMG；CDR2：AISRTGGSTYYPDSVEG；
 CDR3：AGVRAEDGRVRTLPSEYTF
-CDR1：YNPMG；CDR2：AISRTGGSTYYPDSVEG；
 CDR3：AGVRAEDGRVRSLPSEYTF
在包括上文提及的CDR’s组合的本发明的纳米体中，每一CDR可以被选自由与所提及的CDR’s具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组CDR替代；其中
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或选自由与上述氨基酸序列之一提及的CDR(s)有3个，2个或只有1个(如在前述段落中所示)“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入。
然而，在包括上文提及的CDR’s组合的本发明的纳米体中，特别优选包括一个或多个上文列出的CDR’s的纳米体；更特别优选包括两个或多个上文列出的CDR’s的纳米体；并且最特别优选包括三个上文列出的CDR’s的纳米体。
Figure A20068002401200241
Figure A20068002401200251
Figure A20068002401200261
因此，在本发明的纳米体中，至少一种存在的CDR1、CDR2和CDR3序列适当地分别选自由表I列出的CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组；或者分别选自由分别与表I列出的CDR1、CDR2和CDR3序列的至少一种有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的“序列相同性”(如本文所定义)的CDR1、CDR2和CDR3序列组成组；和/或分别选自由分别与表I列出的CDR1、CDR2和CDR3序列的至少一种有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组。在本内容中，“适当地选择”意指，当应用时，分别地，CDR1序列选自适当的CDR1序列(即，如本文所定义)，CDR2序列选自适当的CDR2序列(即，如本文所定义)，以及CDR3序列选自适当的CDR3序列(即，如本文所定义)。
特别地，在本发明的纳米体中，至少存在的CDR3序列适当地选自由表I所列出的CDR3序列组成的组，或者选自由与表I列出的至少一种CDR3序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的CDR3序列组成的组；和/或选自由与表I列出的至少一种CDR3序列有3个、2个或只有1个氨基酸差异的CDR3序列组成的组。
优选地，在本发明的纳米体中，存在的CDR1、CDR2和CDR3序列中的至少两种适当地分别选自由表I所列出的CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组，或者分别选自由分别与表I列出的CDR1、CDR2和CDR3序列中的至少一种具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组；和/或分别选自由分别与表I列出的CDR1、CDR2和CDR3序列中的至少一种有3个、2个或只有1个氨基酸差异的CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组。
特别地，在本发明的纳米体中，至少存在的CDR3序列适当地选自由表I列出的CDR3序列组成的组，或者选自分别与表I列出的至少一种CDR3序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的CDR3序列组；并且至少一种存在的CDR1和CDR2序列适当地分别选自由表I列出的CDR1和CDR2序列组成的组，或者分别选自分别与表I列出的至少一种CDR1和CDR2序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的CDR1和CDR2序列组；和/或分别选自由分别与表I列出的至少一种CDR1和CDR2序列有3个、2个或只有1个氨基酸差异的CDR1和CDR2序列组成的组。
最优选地，在本发明的纳米体中，所有三种存在的CDR1、CDR2和CDR3序列都适当地分别选自由表I列出的CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组，或者分别选自由分别与表I列出的至少一种CDR1、CDR2和CDR3序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的CDR1、CDR2和CDR3序列组；和/或分别选自由分别与表I列出的至少一种CDR1、CDR2和CDR3序列有3个、2个或只有1个氨基酸差异的CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组。
甚至更优选地，在本发明的纳米体中，至少一种存在的CDR1、CDR2和CDR3序列适当地分别选自由表I列出的CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组。优选地，在这一实施方案中，至少一种或者优选地其它两种存在的CDR序列都适当地选自分别与表I列出的至少一种相应的CDR序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的CDR序列；和/或选自由分别与表I列出的至少一种相应的序列有3个、2个或只有1个氨基酸差异的CDR序列组成的组。
特别地，在本发明的纳米体中，至少存在的CDR3序列适当地选自由表I列出的CDR3组成的组。优选地，在这一实施方案中，至少一种并且优选地存在的CDR1和CDR2序列二者都适当地分别选自分别与表I列出的CDR1和CDR2序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的CDR1和CDR2序列的组；和/或分别选自由分别与表I列出的至少一种CDR1和CDR2序列有3个、2个或只有1个氨基酸差异的CDR1和CDR2序列组成的组。
甚至更优选地，在本发明的纳米体中，存在的CDR1、CDR2和CDR3序列的至少两种适当地分别选自由表I列出的CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组。优选地，在这一实施方案中，其余存在的CDR序列适当地选自与表I列出的至少一种相应的CDR序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的CDR序列的组；和/或选自由与表I列出的至少一种相应序列有3个、2个或只有1个氨基酸差异的CDR序列组成的组。
特别地，在本发明的纳米体中，至少CDR3序列适当地选自有表I列出的CDR3序列组成的组，并且CDR1序列或CDR2序列适当地分别选自由表I列出的CDR1和CDR2序列组成的组。优选地，在这一实施方案中，其余存在的CDR序列适当地选自与表I列出的至少一种相应的CDR序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的CDR序列的组；和/或选自由与表I列出的相应CDR序列有3个、2个或只有1个氨基酸差异的CDR序列组成的组。
甚至更优选地，在本发明的纳米体中，所有三种存在CDR1、CDR2和CDR3序列都适当地分别选自由表I列出的CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组。
此外，通常优选在表I中所列出的CDR’s组合(即，在表I同一行所提及的那些)。因此，通常优选，本发明纳米体中的CDR是表I提及的CDR序列，或者适当地选自与表I列出的CDR序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的CDR序列的组；和/或选自由与表I列出的CDR序列有3个、2个或只有1个氨基酸差异的CDR序列组成的组，至少一种并且优选地其余CDR’s二者都适当地选自属于表I中同一组合(即，在表I同一行提及)的CDR序列，或适当地选自与属于同一组合的CDR序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的CDR序列的组，和/或选自由与属于同一组合的CDR序列有3个、2个或只有1个氨基酸差异的CDR序列组成的组。上一段落中显示的其它优选方案也适用于表I提及的CDR’s组合。
因此，通过非限制性实例的方式，例如，本发明的纳米体可以包括与表I提及的CDR1序列之一有大于80％的序列相同性的CDR1序列，与表I提及的(但是属于不同的组合)CDR2序列之一有3个、2个或1个氨基酸差异的CDR2序列，和CDR3序列。
例如，一些优选的本发明的纳米体可以包括：(1)与表I提及的CDR1序列之一有大于80％的序列相同性的CDR1序列；与表I提及的(但是属于不同的组合)CDR2序列之一有3个、2个或1个氨基酸差异的CDR2序列；和与表I提及的(但是属于不同的组合)CDR3序列之一有大于80％的序列相同性的CDR3序列；或者(2)与表I提及的CDR1序列之一有大于80％的序列相同性的CDR1序列；CDR2序列以及表I列出的CDR3序列之一；或者(3)CDR1序列；与表I列出的CDR2序列之一有大于80％序列相同性的CDR2序列；和与表I提及的同所述CDR2序列属于同一组合的CDR3序列有3个、2个或1个氨基酸差异的CDR3序列。
例如，一些特别优选的本发明的纳米体可以包括：(1)与表I提及的CDR1序列之一有大于80％的序列相同性的CDR1序列；与表I提及的属于同一组合的CDR2序列有3个、2个或1个氨基酸差异的CDR2序列；和与表I提及的属于同一组合的CDR3序列有大于80％的序列相同性的CDR3序列；(2)CDR1序列；表I列出的CDR2序列和表I列出的CDR3序列(其中所述CDR2序列和CDR3序列可以属于不同的组合)。
例如，一些甚至更优选的本发明的纳米体可以包括：(1)与表I提及的CDR1序列之一有大于80％的序列相同性的CDR1序列；表I列出的属于同一组合的CDR2序列；和表I提及的属于不同组合的CDR3序列；或(2)表I提及的CDR1序列；与表I提及的属于同一组合的CDR2序列有3个、2个或1个氨基酸差异的CDR2序列；和与表I列出的属于相同不同组合的CDR3序列有大于80％的序列相同性的CDR3序列。
例如，特别优选的本发明的纳米体包括表I提及的CDR1序列，与表I提及的属于同一组合的CDR2序列有大于80％的序列相同性的CDR2序列；和表I提及的属于同一组合的CDR3序列。
在本发明的纳米体中最优选的纳米体中，存在的CDR1、CDR2和CDR3序列适当地分别选自表I列出的CDR1、CDR2和CDR3序列的组合之一。
优选地，当CDR序列适当地选自与表I列出的CDR序列之一有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的CDR序列组时；和/或当CDR序列适当地选自与表I列出的CDR序列之一有3个、2个或只有1个氨基酸差异的CDR序列组成的组时：
i)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
ii)与表I列出的CDR序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入。
按照本发明非限制但是优选的实施方案，本发明纳米体中的CDR序列如上文定义，并且还是这样的，即，所述本发明的纳米体与vWF结合，具有10-5-10-12摩尔/升(M)或更小、并且优选地为10-7-10-12摩尔/升(M)或更小、并且更优选地10-8-10-12摩尔/升(M)的解离常数(KD)，和/或具有至少107M-1、优选地至少108M-1、更优选地至少109M-1诸如至少1012M-1的缔合常数(KA)；并且特别地具有低于500nM、优选地低于200nM、更优选地低于10nM诸如低于500pM的KD。本发明的纳米体针对vWF的KD和KA值可以以本质上已知的方式进行测定，例如使用本文所述的检测。更普遍地，本文所述的纳米体优选地具有本段所述的针对vWF的解离常数。
在另一方面中，本发明涉及具有下述氨基酸序列的纳米体，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO’s：60-73和SEQ ID NO’s：86-97组成的组，或者选自由与SEQ ID NO’s：60-73和SEQ ID NO’s：86-97的一种或多种氨基酸序列具有大于80％、优选地大于90％、更优选地大于95％诸如99％或更多“序列相同性”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，所述氨基酸序列最优选地具有下文在纳米体构架序列的综合描述下进一步限定的构架序列。
按照一个具体的但非限制性的实施方案，后者氨基酸序列已被“人源化”，如下文进一步所述。
最优选地，本发明的纳米体选自由SEQ ID NO’s：60-73和SEQ IDNO’s：86-97组成的组，其中特别优选SEQ ID NO’s：86-97的“人源化”纳米体。
按照本发明特别优选的纳米体是纳米体12B6(SEQ ID NO：62)及其同源物和变体，和其特定的人源化变体。例如，一些特别优选但非限制性的同源物和(人源化)变体是纳米体12A2(SEQ ID NO：71)；12F2(SEQ IDNO：72)；14H10(SEQ ID NO：73)及其人源化变体，诸如12B6H1(SEQ IDNO：86)；12B6H2(SEQ ID NO：87)；12B6H3(SEQ ID NO：88)；12B6H4(SEQ ID NO：89)；12A2H1(SEQ ID NO：90)；12A2H3(SEQ ID NO：91)；12A2H4(SEQ ID NO：92)；12A2H11(SEQ ID NO：93)和12A2H13(SEQ IDNO：94)。
本发明中特别优选纳米体12A2(SEQ ID NO：71)及其同源物和变体，并且特别是其人源化的变体。例如，一些特别优选但非限制性的同源物和(人源化)变体是纳米体12A2H1(SEQ ID NO：90)；12A2H3(SEQ ID NO：91)；12A2H4(SEQ ID NO：92)；12A2H11(SEQ ID NO：93)和12A2H13(SEQ ID NO：94)，其中特别优选纳米体12A2H1(SEQ ID NO：90)。
因此，本发明的一个优选的但非限制性方面涉及针对冯威勒布兰特因子(vWF)的纳米体，所述纳米体由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中：
a)CDR1包括或基本上由下列各项组成：
-氨基酸序列YNPMG；或
-与氨基酸序列YNPMG有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
并且
b)CDR2包括或基本上由下列各项组成：
-氨基酸序列AISRTGGSTYYPDSVEG；或
-与氨基酸序列AISRTGGSTYYPDSVEG有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列AISRTGGSTYYPDSVEG有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
并且
c)CDR3包括或基本上由下列各项组成：
-氨基酸序列AGVRAEDGRVRTLPSEYTF；或
-与氨基酸序列AGVRAEDGRVRTLPSEYTF有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列AGVRAEDGRVRTLPSEYTF只有1个氨基酸差异的氨基酸序列。
特别地，本发明涉及这样一种纳米体，其中：
-CDR1包括或基本上由氨基酸序列YNPMG组成；
或者其中：
-CDR2包括或基本上由氨基酸序列AISRTGGSTYYPDSVEG组成；
或者其中
-CDR3包括或基本上由氨基酸序列AGVRAEDGRVRTLPSEYTF组成。
例如，本发明涉及这样一种纳米体，其中：
-CDR1包括或基本上由氨基酸序列YNPMG组成；并且CDR3包括或基本上由氨基酸序列AGVRAEDGRVRTLPSEYTF组成；
或者其中：
-CDR1包括或基本上由氨基酸序列YNPMG组成；并且CDR2包括或基本上由氨基酸序列AISRTGGSTYYPDSVEG组成；
或者其中：
-CDR2包括或基本上由氨基酸序列AISRTGGSTYYPDSVEG组成；并且CDR3包括或基本上由氨基酸序列AGVRAEDGRVRTLPSEYTF组成。
在一个方面中，本发明涉及这样一种纳米体，其中CDR1包括或者基本上由氨基酸序列YNPMG组成；并且CDR3包括或基本上由氨基酸序列AGVRAEDGRVRTLPSEYTF组成。
本发明还涉及所述纳米体的人源化的变体。一些优选的但非限制性的人源化取代将在本文描述，或者通过比较本文公开的相应的非-人源化的和人源化的纳米体，其应该是熟练的技术人员所清楚的。一些特别有用的人源化取代是存在于12A2的人源化变体中的那些取代中的一种或多种(通过比较12A2H1(SEQ ID NO：90)的序列与12A2H3(SEQ ID NO：91)；12A2H4(SEQ ID NO：92)；12A2H11(SEQ ID NO：93)和12A2H13(SEQ IDNO：94)的相应的人源化序列，熟练的技术人员应该清楚)。
本发明的另一个优选的但非限制性的方面涉及一种针对冯威勒布兰特因子(vWF)的纳米体，所述纳米体由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中：
d)CDR1为：
-氨基酸序列YNPMG；或
-与氨基酸序列YNPMG有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
并且
e)CDR2为：
-氨基酸序列AISRTGGSTYYPDSVEG；或
-与氨基酸序列AISRTGGSTYYPDSVEG有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列AISRTGGSTYYPDSVEG有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
并且
f)CDR3为：
-氨基酸序列AGVRAEDGRVRTLPSEYTF；或
-与氨基酸序列AGVRAEDGRVRTLPSEYTF有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列AGVRAEDGRVRTLPSEYTF只有1个氨基酸差异的氨基酸序列。
特别地，本发明涉及这样一种纳米体，其中：
-CDR1是氨基酸序列YNPMG；
或者其中：
-CDR2是氨基酸序列AISRTGGSTYYPDSVEG；
或者其中
-CDR3是氨基酸序列AGVRAEDGRVRTLPSEYTF。
例如，本发明涉及这样的纳米体，其中：
-CDR1是氨基酸序列YNPMG；并且CDR3是氨基酸序列AGVRAEDGRVRTLPSEYTF；
或者其中：
-CDR1是氨基酸序列YNPMG；并且CDR2是氨基酸序列AISRTGGSTYYPDSVEG；
或者其中：
-CDR2是氨基酸序列AISRTGGSTYYPDSVEG；并且CDR3是氨基酸序列AGVRAEDGRVRTLPSEYTF。
在一个方面中，本发明涉及这样一种纳米体，其中CDR1是氨基酸序列YNPMG；并且CDR3是氨基酸序列AGVRAEDGRVRTLPSEYTF。
本发明还涉及所述纳米体的人源化变体。一些优选的但非限制性的人源化取代将在本文描述，或者通过比较本文公开的相应的非-人源化的和人源化的纳米体，其应该是熟练的技术人员所清楚的。一些特别有用的人源化取代是存在于12A2的人源化变体中的那些取代中的一种或多种(通过比较12A2H1(SEQ ID NO：90)的序列与12A2H3(SEQ ID NO：91)；12A2H4(SEQ ID NO：92)；12A2H11(SEQ ID NO：93)和12A2H13(SEQ IDNO：94)的相应的人源化序列，熟练的技术人员应该清楚)。
本文所述的纳米体可以是GLEW-类纳米体，“103P，R或S”-类纳米体或“KERE-类纳米体”(全部如本文所述)。特别地，本文所述的纳米体可以是KERE-类纳米体，尽管本发明并不限于此。
在另一方面中，本发明涉及与来自由SEQ ID NO’s 60-73和SEQ IDNO’s 86-97组成的组的至少一种纳米体有至少80％、或者至少90％、或者至少95％、或者至少99％序列相同性(如本文所定义)的纳米体。
特别地，本发明涉及与纳米体12B6(SEQ ID NO：62)；12A2(SEQ IDNO：71)；12F2(SEQ ID NO：72)；14H10(SEQ ID NO：73)；12B6H1(SEQ IDNO：86)；12B6H2(SEQ ID NO：87)；12B6H3(SEQ ID NO：88)；12B6H4(SEQ ID NO：89)；12A2H1(SEQ ID NO：90)；12A2H3(SEQ ID NO：91)；12A2H4(SEQ ID NO：92)；12A2H11(SEQ ID NO：93)和/或12A2H13(SEQID NO：94)中的至少一种有至少80％、或者至少90％、或者至少95％、或者至少99％序列相同性(如本文所定义)的纳米体。
更特别地，本发明涉及与纳米体12A2(SEQ ID NO：71)；12A2H1(SEQID NO：90)；12A2H3(SEQ ID NO：91)；12A2H4(SEQ ID NO：92)；12A2H11(SEQ ID NO：93)和/或12A2H13(SEQ ID NO：94)中的至少一种有至少80％、或者至少90％、或者至少95％、或者至少99％序列相同性(如本文所定义)的纳米体。
甚至更特别地，本发明涉及与纳米体12A2H1(SEQ ID NO：90)有至少80％、或者至少90％、或者至少95％、或者至少99％序列相同性(如本文所定义)的纳米体。
本发明还涉及所述纳米体的人源化变体。一些优选的但非限制性的人源化取代将在本文描述，或者通过比较本文公开的相应的非-人源化的和人源化的纳米体，其应该是熟练的技术人员所清楚的。一些特别有用的人源化取代是存在于12A2的人源化变体中的那些取代中的一种或多种(通过比较12A2H1(SEQ ID NO：90)的序列与12A2H3(SEQ ID NO：91)；12A2H4(SEQ ID NO：92)；12A2H11(SEQ ID NO：93)和12A2H13(SEQ IDNO：94)的相应的人源化序列，熟练的技术人员应该清楚)。
本发明还涉及选自由SEQ ID NO’s 60-73和SEQ ID NO’s 86-97的纳米体组成的组的纳米体。
特别地，本发明涉及选自由纳米体12B6(SEQ ID NO：62)；12A2(SEQID NO：71)；12F2(SEQ ID NO：72)；14H10(SEQ ID NO：73)；12B6H1(SEQID NO：86)；12B6H2(SEQ ID NO：87)；12B6H3(SEQ ID NO：88)；12B6H4(SEQ ID NO：89)；12A2H1(SEQ ID NO：90)；12A2H3(SEQ ID NO：91)；12A2H4(SEQ ID NO：92)；12A2H11(SEQ ID NO：93)和/或12A2H13(SEQID NO：94)组成的组的纳米体。
更特别地，本发明涉及选自由纳米体12A2(SEQ ID NO：71)；12A2H1(SEQ ID NO：90)；12A2H3(SEQ ID NO：91)；12A2H4(SEQ ID NO：92)；12A2H11(SEQ ID NO：93)和/或12A2H13(SEQ ID NO：94)组成的组的纳米体。一种特别有用的纳米体是纳米体12A2H1(SEQ ID NO：90)。
本文所述的纳米体优选地具有本文进一步所述的构架序列。一些特别优选的构架序列(分别为FR1，FR2，FR3和FR4)是纳米体12A2及其人源化变体的那些构架序列；以及与所述构架序列之一有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％序列相同性(如本文所定义)的构架序列；并且和/或选自由与所述构架序列之一具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组(其中任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代；和/或其中所述氨基酸序列优选地包含氨基酸取代，并且不多于3个氨基酸删除或不多于3个氨基酸插入)。具有所述构架序列的针对vWF的纳米体构成本发明的另一方面。
特别地，本发明涉及针对vWF的纳米体，其中FR1是SEQ ID NO：140；FR2是SEQ ID NO：192；FR3是SEQ ID 244；以及FR4是SEQ ID NO：296；或者与所述构架序列之一有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％序列相同性(如本文所定义)的构架序列；并且和/或来自由与所述构架序列之一具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组(其中任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代；和/或其中所述氨基酸序列优选地包含氨基酸取代，并且不多于3个氨基酸删除或不多于3个氨基酸插入)。
更特别地，本发明涉及一种针对vWF的纳米体，其中FR1是SEQ IDNO：140；FR2是SEQ ID NO：192；FR3是SEQ ID 244；以及FR4是SEQ IDNO：296。
在另一方面中，本发明涉及一种多肽，其包括或者基本上由本文所定义的至少一种针对vWF的纳米体组成。所述多肽在本文还叫作“本发明的多肽”，并且可以如下文进一步所述，和/或如WO 02/062551关于其中公开的纳米体的概括描述，并且例如，可以是多价多肽或多特异性多肽，也如下文进一步所述。
优选地，本发明的多肽是二价或三价(即，分别包含2个或3个本发明的纳米体，任选地分别通过一个或两个本文所定义的接头连接)或多特异性多肽，其包含一个或两个，并且优选地两个，本发明的纳米体和至少一个针对血清蛋白并且特别是针对人血清蛋白诸如针对人血清白蛋白的纳米体。
在一个优选的但是非限制性的实施方案中，存在于本发明的多肽中的本发明的纳米体选自由SEQ ID NO’s：60-73和SEQ ID NO’s：86-97组成的组，并且特别选自SEQ ID NO’s：86-97的“人源化”纳米体。存在于本发明的多肽中的针对人血清白蛋白的纳米体优选地如本文所定义，并且更优选地选自由SEQ ID NO’s：107-121组成的组，并且特别选自SEQ ID NO’s114-121的针对人血清白蛋白的“人源化”纳米体。
一些优选的但非限制性的本发明多肽的实例是SEQ ID NO’s：74-82的多肽和SEQ ID NO’s 98-106的多肽。本发明的其它多肽可以，例如，选自由与SEQ ID NO’s：74-82和/或SEQ ID NO’s 98-106中的一种或多种氨基酸序列有大于80％、优选地大于90％、更优选地大于95％诸如99％或更多的“序列相同性”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中包含在所述氨基酸序列中的所述纳米体优选地如本文所定义。
按照本发明的一个方面，本文所述的纳米体、蛋白和多肽基本上对ADAMTS-13分解ULvWF没有影响。特别地，当本文所述的纳米体、蛋白和多肽以本文中所述的剂量使用时，ADAMTS-13对ULvWF的分解(在体内当施用时和/或当使用适当的检测诸如本文所述的检测测定时)，基本上不减少或者抑制ADAMTS-13对ULvWF的分解，即，不多于50％，优选地不多于20％，甚至更优选地不多于10％，诸如低于5％或基本上一点也没有。因此，本发明的另一个方面涉及一种纳米体、蛋白或多肽，并且特别是本文所述的纳米体、蛋白或多肽，其基本上不减少或抑制ADAMTS-13对ULvWF的分解。
在另一方面中，本发明涉及编码本发明的纳米体和/或本发明的多肽的核酸。所述核酸在下文也叫作“本发明的核酸”，并且例如可以为遗传构建体的形式，如本文所定义。
在另一方面中，本发明涉及表达或者能够表达本发明的纳米体和/或本发明的多肽的宿主或宿主细胞；和/或包含编码本发明的纳米体和/或本发明的多肽的核酸的宿主或宿主细胞。所述宿主或宿主细胞还可以类似于WO 02/062551中所述的宿主和宿主细胞，但是其表达或者能够表达本发明的纳米体和/或本发明的多肽，和/或包含本文所述的核酸。
本发明还涉及包含或者包括本发明的纳米体、本发明的多肽；和/或本发明的核酸的产品或组合物。例如，所述产品或组合物可以是药物组合物(如下文所述)或用于诊断用途的产品或组合物(也如下文所述)。所述产品或组合物还可以类似于WO 02/062551中所述的产品和组合物，但是其包含或者包括本发明的纳米体、本发明的多肽或本发明的核酸。
本发明还涉及制备或者产生本文所述的纳米体、多肽、核酸、宿主细胞、产品和组合物的方法，所述方法在下文中进一步描述。此外，一般地，本文所述的纳米体、多肽、核酸、宿主细胞、产品和组合物还可以以同WO 02/062551中所述的方式类似的方式进行制备和应用。
本发明还涉及本文所述的上述纳米体、多肽、核酸、宿主细胞、产品和组合物的应用和用途，所述应用和用途包括，但不限于，下文所述的应用和用途和/或WO 02/062551中对于针对vWF的纳米体和/或对于包含其的多肽的其它用途和应用。
从下文的进一步描述中，本发明的其它方面、实施方案、优点和应用将清楚可见。
发明详述
本发明的上述和其它方面以及实施方案将通过下文的进一步描述而清楚，其中：
a)除非指明或另外定义，使用的所有术语具有它们在本领域中的通用意义，其对于熟练的技术人员是清楚可见的。例如，参考可以参见标准手册，诸如Sambrook等，″Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验手册)″(第2版)，卷1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版)(1989)；F.Ausubel等，eds.″Current protocols inmolecular biology(现代分子生物学方法)″，Green Publishing and WileyInterscience，纽约(1987)；Roitt等，“Immunology(免疫学)”(第6版)，Mosby/Elsevier，Edinburgh(2001)；和Janeway等，“Immunobiology(免疫生物学)”(第6版)，Garland Science Publishing/Churchill Livingstone，纽约(2005)，以及上文所引用的综合背景技术；
b)除非另外指明，术语“免疫球蛋白序列”--不管其在本文中用来指重链抗体或常规的4链抗体--用作一般术语，包括完整大小的抗体、其单独的链、以及其所有部分、结构域或片段(包括但不限于抗原-结合结构域或片段，分别诸如VHH结构域或VH/VL结构域)。另外，术语“序列”用于本文时(例如在类似“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“可变结构域序列”、“VHH序列”或“蛋白序列”的术语中)通常应该理解为包括相关的氨基酸序列以及编码所述氨基酸序列的核酸序列或核苷酸序列，除非上下文需要更狭义的解释；
c)除非另外指明，所有没有具体详细描述的方法、步骤、技术和操作可以以本质上已知的方式进行并且已经进行，这对于熟练的技术人员是清楚的。例如，参考仍旧参见标准手册，参见上文所引用的综合背景技术以及其中所引用的其它参考文献；
d)氨基酸残基按照标准的三字母或一字母的氨基酸密码显示，如在表1中所提及；
表1：一字母和三字母氨基酸密码
Figure A20068002401200411
e)出于比较两种或多种核苷酸序列的目的，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列之间的“序列相同性”百分数通过用【第一核苷酸序列中与第二核苷酸序列中相应位置的核苷酸相同的核苷酸数目】除以【第一核苷酸序列中的核苷酸总数】并且乘以【100％】而计算，其中第二核苷酸序列中核苷酸的每一删除、插入、取代或添加--与第一核苷酸序列相比--都视作在单一核苷酸(位置)的差异。
备选地，两种或多种核苷酸序列之间的序列相同性程度可以使用已知的用于序列比对的使用标准设置的计算机算法进行计算，诸如NCBIBlast v2.0。
例如，在WO 04/037999，EP 0 967 284，EP 1 085 089，WO 00/55318，WO 00/78972，WO 98/49185和GB 2 357 768-A中描述了用于确定序列相同性程度的一些其它的技术、计算机算法和设置。
通常，出于按照上文列出的计算方法来确定两种核苷酸序列之间的“序列相同性”的百分数的目的，将具有最大核苷酸数目的核苷酸序列视作“第一”核苷酸序列，并且将另一种核苷酸序列视作“第二”核苷酸序列；
f)出于比较两种或多种氨基酸序列的目的，第一氨基酸序列和第二氨基酸序列之间的“序列相同性”百分数通过用【第一氨基酸序列中与第二氨基酸序列中相应位置的氨基酸相同的氨基酸数目】除以【第一氨基酸序列中的氨基酸总数】并且乘以【100％】而计算，其中第二氨基酸序列中氨基酸的每一删除、插入、取代或添加--与第一氨基酸序列相比--都视作在单一氨基酸残基(位置)上的差异，即，视作下文所定义的“氨基酸差异”。
备选地，两种氨基酸序列之间的序列相同性程度可以使用已知的计算机算法进行计算，诸如上文提及的用于确定核苷酸序列的序列相同性程度的那些，其仍旧使用标准设置。
通常，出于按照上文列出的计算方法来确定两种氨基酸序列之间的“序列相同性”的百分数的目的，将具有最大氨基酸残基数目的氨基酸序列视作“第一”核苷酸序列，并且将另一种氨基酸序列视作“第二”氨基酸序列。
此外，在确定两种氨基酸序列之间的序列相同性程度时，熟练的技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，其通常可以描述为这样的氨基酸取代，即，其中氨基酸残基被具有相似化学结构的另一种氨基酸残基取代，并且其对所述多肽的功能、活性或其它生物学特性几乎没有或者基本上没有影响。这种保守氨基酸取代是本领域内公知的，例如，从WO04/037999，GB-A-2 357 768，WO 98/49185，WO 00/46383和WO 01/09300中可知；并且可以基于WO 04/037999以及WO 98/49185和其中所引用的其它参考文献的相关教导而选择所述取代的(优选)类型和/或结合。
这种保守取代优选地是这样的取代，即，其中下列组(a)-(e)内的一个氨基酸被同组内的另一氨基酸残基取代：(a)小的脂肪族、非极性或微极性的残基：Ala，Ser，Thr，Pro和Gly；(b)极性、带负电荷的残基及其(不带电荷的)酰胺：Asp，Asn，Glu和Gln；(c)极性、带正电荷的残基：His，Arg和Lys；(d)大的脂肪族、非极性残基：Met，Leu，Ile，Val和Cys；以及(e)芳族残基：Phe，Tyr和Trp。
特别优选的保守取代如下：Ala被取代成Gly或被取代成Ser；Arg被取代成Lys；Asn被取代成Gln或被取代成His；Asp被取代成Glu；Cys被取代成Ser；Gln被取代成Asn；Glu被取代成Asp；Gly被取代成Ala或被取代成Pro；His被取代成Asn或被取代成Gln；Ile被取代成Leu或被取代成Val；Leu被取代成Ile或被取代成Val；Lys被取代成Arg，被取代成Gln或被取代成Glu；Met被取代成Leu，被取代成Tyr或被取代成Ile；Phe被取代成Met，被取代成Leu或被取代成Tyr；Ser被取代成Thr；Thr被取代成Ser；Trp被取代成Tyr；Tyr被取代成Trp；和/或Phe被取代成Val，被取代成Ile或被取代成Leu。
用于本文所述的多肽的任何氨基酸取代还可以基于Schulz等，Principles of Protein Structure(蛋白质结构的原则)，Springer-Verlag，1978研究的不同物种的同源蛋白之间的氨基酸变异频率的分析，基于Chou和Fasman，Biochemistry(生物化学)13：211，1974和Adv.Enzymol.(高级酶学)，47：45-149，1978研究的结构形成潜力的分析，和基于Eisenberg等，Proc.Nad.Acad Sci.USA(美国国家科学院学报)81：140-144，1984；Kyte和Doolittle；J Molec.Biol.(分子生物学杂志)157：105-132，1981，以及Goldman等，Ann.Rev.Biophys.Chem(物理化学年刊综述).15：321-353，1986研究的蛋白中疏水模式的分析，所有这些完全结合于此作为参考。在下文描述和上文引用的综合背景技术中给出关于纳米体的一级、二级和三级结构的信息。此外，出于这一目的，例如，Desmyter等，Nature StructuralBiology(自然结构生物学)，卷3，9，803(1996)；Spinelli等，NaturalStructural Biology(自然结构生物学)(1996)；3，752-757；和Decanniere等，Structure(结构)，卷7，4，361(1999)给出美洲驼(llama)的VHH结构域的晶体结构；
g)如果在它们的全长有100％的序列相同性(如本文所定义)，那么认为氨基酸序列和核酸序列“完全相同”；
h)当比较两种氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”是指与第二序列相比，在第一序列位置上的单个氨基酸残基的插入、删除或取代；应该理解两种氨基酸序列可以包含1个、2个或多个这种氨基酸差异；
i)核酸序列或氨基酸序列视作“(以)基本上分离的(形式)”--例如，与其天然生物来源和/或从中获得其的反应介质或培养介质相比--此时其已经与其通常在所述来源或介质中与之缔合的至少一种其它成分(诸如另一种核酸，另一种蛋白/多肽，另一种生物成分或高分子或至少一种污染物、杂质或微量组分)分离。特别地，当它已被纯化至少2倍，特别是至少10倍，更特别地至少100倍，并且达到1000倍或更多时，认为核酸序列或氨基酸序列“基本上分离”。当使用适当技术确定时，诸如适当的层析技术，诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，“以基本上分离形式”的核酸序列或氨基酸序列优选地基本上是均一的；
j)当用于本文时，术语“结构域”通常是指抗体链的球状区域，并且特别是指重链抗体的球状区域，或者指基本上由所述球状区域组成的多肽。通常，例如，这样的结构域包括作为片层或通过二硫键而稳定的肽环(例如3或4个肽环)；
k)术语‘抗原决定簇’是指抗原上由抗原-结合分子(诸如本发明的纳米体或多肽)并且特别是所述分子的抗原-结合位点而识别的表位。术语“抗原决定簇”和“表位”在本文中还可以互换地使用；
l)对于特定的抗原决定簇、表位、抗原或蛋白(或对于至少其的一部分、片段或表位)可以结合、具有亲和性和/或具有特异性的氨基酸序列(诸如本发明的纳米体、抗体、多肽，或通常为抗原结合蛋白或多肽或其片段)认为是“针对(against)”或者“指向(directed against)”所述抗原决定簇、表位、抗原或蛋白；
m)术语“特异性”是指特定的抗原-结合分子或抗原-结合蛋白(诸如本发明的纳米体或多肽)分子可以结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的数目。一种抗原-结合蛋白的特异性可以依据亲和力和/或抗体亲抗原性(avidity)而确定。亲和力，表示为抗原与抗原-结合蛋白的解离平衡常数(KD)，是抗原决定簇和所述抗原-结合蛋白上抗原-结合位点之间的结合强度的测量：KD值越小，抗原决定簇和抗原-结合分子之间的结合强度越强(备选地，亲和力还可以表示为亲和常数(KA)，其为1/KD)。熟练的技术人员应该清楚(例如，基于本文的进一步公开)，亲和力可以以本质上已知的方式确定，其取决于目的特异性抗原。抗体亲抗原性是抗原-结合分子(诸如本发明的纳米体或多肽)和相关抗原之间的结合强度的测量。抗体亲抗原性与抗原决定簇及其在抗原-结合分子上的抗原结合位点以及在所述抗原-结合分子上存在的相关结合位点的数目相关。典型地，抗原-结合蛋白(诸如本发明的纳米体和/或多肽)将以10-5-10-12摩尔/升(M)或更小、并且优选地10-7-10-12摩尔/升(M)或更小并且更优选地10-8-10-12摩尔/升的解离常数(KD)而结合，和/或以至少107M-1、优选地至少108M-1、更优选地至少109M-1诸如至少1012M-1的缔合常数(KA)而结合。任何大于10-4M的KD值通常认为指示非特异性结合。优选地，本发明的纳米体或多肽将以小于500nM、优选地小于200nM、更优选地小于10nM诸如小于500pM的KD与理想的抗原结合。抗原-结合蛋白与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以以本质上已知的任何适当的方法确定，其包括，例如，斯卡查德分析(Scatchard analysis)和/或竞争结合检测，诸如放射性免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)和三明治竞争测定，以及本领域本质上已知的其不同的变化；
n)如下文进一步所述，可以认为--然而并不限于此--纳米体的氨基酸序列和结构由4个构架区或“FR’s”组成，其在本领域和下文中分别叫作“构架区1”或“FR1”；叫作“构架区2”或“FR2”；叫作“构架区3”或“FR3”；以及叫作“构架区4”或“FR4”；所述构架区被3个互补决定区或“CDR’s”中断，其在本领域分别叫作“互补决定区1”或“CDR1”；叫作“互补决定区2”或“CDR2”；以及叫作“互补决定区3”或“CDR3”；
o)也如下文进一步所述，纳米体中氨基酸残基总数可以在110-120区间，优选112-115，并且最优选113。然而，应该注意纳米体的部分、片段或类似物(如下文进一步所述)不特别局限于它们的长度和/或大小，只要这样的部分、片段或类似物满足下文列出的进一步要求，并且还优选地适于本文所述的目的；
p)纳米体的氨基酸残基按照Kabat等(“Sequence of proteins ofimmunological interest(免疫学目的的蛋白的序列)”，US Public HealthServices(美国公众健康服务中心)，NIH Bethesda，MD，Publication No.91)给出的关于VH结构域的通用编号方式进行编号，参考上文，这种编号方式在Riechmann和Muyldermans的文章中用于来自骆驼科的VHH结构域(例如，参见所述参考文献的图2)。按照这种编号方式，纳米体的FR1包括位置1-30的氨基酸残基，纳米体的CDR1包括位置31-36的氨基酸残基，纳米体的FR2包括位置36-49的氨基酸残基，纳米体的CDR2包括位置50-65的氨基酸残基，纳米体的FR3包括位置66-94的氨基酸残基，纳米体的CDR3包括位置95-102的氨基酸残基，以及，纳米体的FR4包括位置103-113的氨基酸残基。【在这一方面，应该注意--如在本领域内关于VH结构域和关于VHH结构域公知的--每一CDR’s中的氨基酸残基的总数可以不同，并且可以不与由Kabat编号方式指示的氨基酸残基的总数相对应(即，按照Kabat编号方式的一个或多个位置可能不占据在实际序列中，或者实际序列可能包含比由Kabat编号方式允许的数目更多的氨基酸残基)。这意味着，通常，按照Kabat的编号方式可能或可能不与实际序列中的氨基酸残基的实际编号方式相对应。然而，通常可以说，按照Kabat的编号方式并且不考虑CDR’s中的氨基酸残基编号，按照Kabat编号方式的位置1对应FR1的起点，并且反之亦然，按照Kabat编号方式的位置36对应FR2的起点，并且反之亦然，按照Kabat编号方式的位置66对应FR3的起点，并且反之亦然，以及按照Kabat编号方式的位置103对应FR4的起点，并且反之亦然。】
用于编号VH结构域的氨基酸残基的备选方法是由Chothia等(Nature(自然)342，877-883(1989))所述的方法，即所谓的“AbM定义”和所谓的“联系定义”，所述方法还可以以类似的方式用于来自骆驼科的VHH结构域以及用于纳米体。然而，在本说明书、权利要求和附图中，遵循由Riechmann和Muyldermans用于VHH结构域的按照Kabat的编号方式，除非另外指明；并且
q)给出附图、序列表和实验部分/实施例只是进一步举例说明本发明，并且不应该被以任何方式解释为或者认为限制本发明和/或附上的权利要求的范围，除非本文中另外明确指明。
关于重链抗体及其可变结构域的概括描述，尤其对下列参考文献进行参考，其作为概括背景技术提及：Vrije Universiteit Brussel的WO 94/04678，WO 95/04079和WO 96/34103；Unilever的WO 94/25591，WO 99/37681，WO 00/40968，WO 00/43507，WO 00/65057，WO 01/40310，WO 01/44301，EP 1134231和WO 02/48193；Vlaams Instituut voor Biotechnologie(VIB)的WO 97/49805，WO 01/21817，WO 03/035694，WO 03/054016和WO03/055527；Algonomics N.V.和本申请人的WO 03/050531；加拿大国家研究委员会的WO 01/90190；抗体研究所的WO 03/025020(＝EP 1 433 793)；以及本申请人的WO 04/041867，WO 04/041862，WO 04/041865，WO04/041863，WO 04/062551和本申请人发表的其它专利申请；
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如上文提及，本发明通常涉及针对vWF的纳米体，以及涉及包括或基本上由一种或多种所述纳米体组成的多肽，其可以用于下文以及在WO04/062551中所述的预防、治疗和/或诊断目的。
还如上文提及和下文进一步所述，本发明还涉及编码所述纳米体和多肽的核酸，涉及制备所述纳米体和多肽的方法，涉及表达或者能够表达所述纳米体或多肽的宿主细胞，涉及所述纳米体、多肽、核酸或宿主细胞的应用，并且涉及包括所述纳米体、多肽、核酸或宿主细胞的组合物。
通常，应该注意到，当用于本文时，术语纳米体在其最广泛意义上不限于具体的生物资源或具体的制备方法。例如，如将在下文中更详细地讨论那样，本发明的纳米体可以这样获得：(1)通过分离天然存在的重链抗体的VHH结构域；(2)通过表达编码天然存在的VHH结构域的核苷酸序列；(3)通过将天然存在的VHH结构域“人源化”(如下文所述)或者通过表达编码所述人源化VHH结构域的核酸；(4)通过将来自于任何动物物种特别是哺乳动物物种诸如来自于人类的天然存在的VH结构域“骆驼源化(camelization)”(如下文所述)，或者通过表达编码所述骆驼源化的VH结构域的核酸；(5)通过如Ward等(同前所述)所述将“结构域抗体”或“Dab”“骆驼源化”，或者通过表达编码所述骆驼源化的VH结构域的核酸；(6)应用合成或半合成技术制备蛋白、多肽或其它氨基酸序列；(7)通过应用核酸合成技术制备编码纳米体的核酸，然后表达这样获得的核酸；和/或(8)通过前述的任何结合。基于本文的公开，熟练的技术人员应该清楚实行前述的适当的方法和技术，以及例如包括下文更详细描述的方法和技术。
然而，按照一个具体的实施方案，本发明的纳米体不具有与天然存在的VH结构域的氨基酸序列，诸如来自于哺乳动物并且特别是来自于人类的天然存在的VH结构域的氨基酸序列完全相同(即，与之100％的序列相同性程度)的氨基酸序列。
本发明纳米体的一种特别优选的种类包括具有与天然存在的VHH结构域的氨基酸序列相对应但是已被“人源化”的氨基酸序列的纳米体，“人源化”即，用在来自于人类的常规4-链抗体的VH结构域中对应位置存在的一个或多个氨基酸残基替换所述天然存在的VHH序列的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基(例如，上文所示)。这可以以本质上已知的方式进行，这对于熟练的技术人员是清楚的，例如，基于下文的进一步描述以及本文引用的关于人源化的现有技术。此外，应该注意，本发明这样的人源化纳米体可以以本质上已知的任何适当方法获得(即，在上文(1)-(8)点下所示)，并且因此没有严格地限于使用包括天然存在的VHH结构域的多肽作为起始原料而获得的多肽。
本发明纳米体的另一种特别优选的种类包括具有与天然存在的VH结构域的氨基酸序列相对应但已被“骆驼源化”的氨基酸序列的纳米体，“骆驼源化”即，用在重链抗体的VHH结构域中对应位置存在的一个或多个氨基酸残基替换常规4-链抗体的天然存在的VH结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基。这可以以本质上已知的方式进行，这对于熟练的技术人员是清楚的，例如，基于下文的进一步描述。还可以参考WO94/04678。这样的骆驼源化可能优先发生在存在于VH-VL界面的氨基酸位置以及所谓的骆驼科(Camelidae)特征性残基(也参见例如WO 94/04678)，也如下文所提及。优选地，用作产生或设计所述骆驼源化纳米体的起始原料或起点的VH结构域或序列优选地是来自哺乳动物的VH序列，更优选地是人类的VH序列。然而，应该注意，这种骆驼源化的本发明纳米体可以以本质上已知的任何适当方式获得(即，在上文(1)-(8)点下所示)，并且因此没有严格地限于使用包括天然存在的VH结构域的多肽作为起始原料而获得的多肽。
例如，又如下文进一步所述，“人源化”和“骆驼源化”可以这样进行：通过提供分别编码所述天然存在的VHH结构域或VH结构域的核苷酸序列，并且然后以本质上已知的方式改变所述核苷酸序列中的一个或多个密码子，以致新核苷酸序列分别编码本发明的人源化的或骆驼源化的纳米体，并且然后以本质上已知的方式表达这样获得的核苷酸序列，以提供理想的本发明的纳米体。备选地，分别基于天然存在的VHH结构域或VH结构域的氨基酸序列，可以分别设计理想的本发明的人源化或骆驼源化的纳米体的氨基酸序列，然后应用本质上已知的肽合成技术从头开始合成。此外，分别基于天然存在的VHH结构域或VH结构域的氨基酸序列或核苷酸序列，可以分别设计编码所述理想的人源化或骆驼源化的本发明的纳米体的核苷酸序列，然后应用本质上已知的核酸合成技术从头开始合成，之后可以以本质上已知的方式表达这样获得的核苷酸序列，以提供理想的本发明的纳米体。
熟练的技术人员应该清楚从天然存在的VH结构域或优选的VHH结构域(的氨基酸序列)和/或从编码其的核苷酸序列和/或核酸序列起始而获得本发明的纳米体和/或编码其的核苷酸序列和/或核酸的其它适宜方法和技术，并且例如，可以包括将来自天然存在的VH结构域的一个或多个氨基酸序列和/或核苷酸序列(诸如一个或多个FR’s和/或CDR’s)与来自天然存在的VHH结构域的一个或多个氨基酸序列和/或核苷酸序列(诸如一个或多个FR’s或CDR’s)以适当方式组合，以提供本发明的纳米体(编码其的核苷酸序列或核酸)。
按照本发明方面的一个优选的但非限制性的方面，纳米体在其最广泛意义上通常可以定义为这样的多肽，其包括：
a)由被3个互补决定区/序列中断的4个构架区/序列组成的氨基酸序列，其中在按照Kabat编号方式的位置108的氨基酸残基是Q；
和/或：
b)由被3个互补决定区/序列中断的4个构架区/序列组成的氨基酸序列，其中按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基是E，并且其中按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是R；
和/或：
c)由被3个互补决定区/序列中断的4个构架区/序列组成的氨基酸序列，其中按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由P、R和S组成的组，并且特别选自由R和S组成的组。
因此，在第一优选的但非限制性的方面，本发明的纳米体可以具有结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补决定区1-3，并且其中
i)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基是Q；
和/或其中：
ii)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基是E，并且其中按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是R；
和/或其中：
iii)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由P、R和S组成的组，并且特别选自由R和S组成的组；
和/或其中：
iv)CDR 1是选自由下列氨基酸序列组成的组的氨基酸序列：
NYGMG    [SEQ ID NO：15]
SYTLG    [SEQ ID NO：16]
NYNMG    [SEQ ID NO：17]
SSAMA    [SEQ ID NO：18]
YYNTG    [SEQ ID NO：19]
IGAMG    [SEQ ID NO：20]
IGTMG    [SEQ ID NO：21]
YNPMG    [SEQ ID NO：22]
或者选自由与上述氨基酸序列之一有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或选自由与上述氨基酸序列之一有2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
并且其中：
v)CDR2是选自由下述氨基酸序列组成的组的氨基酸序列：
SISWSGTYTAYSDNVKG    [SEQ ID NO：23]
GISWSGVSTDYAEFAKG    [SEQ ID NO：24]
TSISWSGSYTAYADNVKG   [SEQ ID NO：25]
SISWSGMSTYYTDSVKG    [SEQ ID NO：26]
TITSGGRTSYADSVKG     [SEQ ID NO：27]
AISWSGGLTYYADSVKG    [SEQ ID NO：28]
TITSGGSTNYADPVKG     [SEQ ID NO：29]
TITSGGSTNYADSVKG     [SEQ ID NO：30]
AISRTGGSTYYARSVEG    [SEQ ID NO：31]
AISRTGGSTYYPDSVEG    [SEQ ID NO：32]
或者选自由与上述氨基酸序列之一具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或选自由与上述氨基酸序列之一有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
并且其中：
vi)CDR 3是选自由下列氨基酸序列组成的组的氨基酸序列：
QSRYRSNYYDHDDKYAY      [SEQ ID NO：33]
LGRYRSNWRNIGQYDY       [SEQ ID NO：34]
QSRYSSNYYDHDDKYAY      [SEQ ID NO：35]
SNRYRTHTTQAMYNY        [SEQ ID NO：36]
VVDGKRAP               [SEQ ID NO：37]
NRRQKTVQMGERAYDY       [SEQ ID NO：38]
NLKQGSYGYRFNDY         [SEQ ID NO：39]
NLKQGDYGYRFNDY         [SEQ ID NO：40]
AGVRAEDGRVRTLPSEYNF    [SEQ ID NO：41]
AGVRAEDGRVRTLPSEYTF    [SEQ ID NO：42]
AGVRAEDGRVRSLPSEYTF    [SEQ ID NO：43]
或者选自由与上述氨基酸序列之一具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或选自由与上述氨基酸序列之一有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入。
优选地，在本发明的纳米体中：
-当CDR1选自由下列各项组成的组时：(1)NYGMG；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；那么CDR2选自由下列各项组成的组：(1)SISWSGTYTAYSDNVKG；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；并且CDR3选自由下列各项组成的组：(1)QSRYRSNYYDHDDKYAY；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；
-当CDR1选自由下列各项组成的组时：(1)SYTLG；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；那么CDR2选自由下列各项组成的组：(1)GISWSGVSTDYAEFAKG；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；并且CDR3选自由下列各项组成的组：(1)LGRYRSNWRNIGQYDY；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；
-当CDR1选自由下列各项组成的组时：(1)NYGMG；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；那么CDR2选自由下列各项组成的组：(1)TSISWSGSYTAYADNVKG；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；并且CDR3选自由下列各项组成的组：(1)QSRYSSNYYDHDDKYAY；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；
-当CDR1选自由下列各项组成的组时：(1)NYNMG；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；那么CDR2选自由下列各项组成的组：(1)SISWSGMSTYYTDSVKG；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；并且CDR3选自由下列各项组成的组：(1)SNRYRTHTTQAMYNY；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；
-当CDR1选自由下列各项组成的组时：(1)SSAMA；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；那么CDR2选自由下列各项组成的组：(1)TITSGGRTSYADSVKG；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；并且CDR3选自由下列各项组成的组：(1)VVDGKRAP；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；
-当CDR1选自由下列各项组成的组时：(1)YYNTG；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；那么CDR2选自由下列各项组成的组：(1)AISWSGGLTYYADSVKG；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；并且CDR3选自由下列各项组成的组：(1)NRRQKTVQMGERAYDY；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；
-当CDR1选自由下列各项组成的组时：(1)IGAMG；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；那么CDR2选自由下列各项组成的组：(1)TITSGGSTNYADPVKG；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；并且CDR3选自由下列各项组成的组：(1)NLKQGSYGYRFNDY；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；
-当CDR1选自由下列各项组成的组时：(1)IGAMG；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；那么CDR2选自由下列各项组成的组：(1)TITSGGSTNYADSVKG；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；并且CDR3选自由下列各项组成的组：(1)NLKQGSYGYRFNDY；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；
-当CDR1选自由下列各项组成的组时：(1)IGAMG；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；那么CDR2选自由下列各项组成的组：(1)TITSGGSTNYADSVKG；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；并且CDR3选自由下列各项组成的组：(1)NLKQGDYGYRFNDY；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；
-当CDR1选自由下列各项组成的组时：(1)IGTMG；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；那么CDR2选自由下列各项组成的组：(1)TITSGGSTNYADSVKG；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；并且CDR3选自由下列各项组成的组：(1)NLKQGDYGYRFNDY；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；
-当CDR1选自由下列各项组成的组时：(1)YNPMG；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；那么CDR2选自由下列各项组成的组：(1)AISRTGGSTYYARSVEG；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；并且CDR3选自由下列各项组成的组：(1)AGVRAEDGRVRTLPSEYNF；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；
-当CDR1选自由下列各项组成的组时：(1)YNPMG；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；那么CDR2选自由下列各项组成的组：(1)AISRTGGSTYYPDSVEG；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；并且CDR3选自由下列各项组成的组：(1)AGVRAEDGRVRTLPSEYTF；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；
-当CDR1选自由下列各项组成的组时：(1)YNPMG；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；那么CDR2选自由下列各项组成的组：(1)AISRTGGSTYYPDSVEG；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；并且CDR3选自由下列各项组成的组：(1)AGVRAEDGRVRSLPSEYTF；(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列；和(3)与所述氨基酸序列有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列；其中
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入。
特别地，按照本发明针对vWF的纳米体可以具有结构：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补决定区1-3，并且其中
i)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基是Q；
和/或其中：
ii)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基是E，并且其中按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是R；
和/或其中：
iii)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由P、R和S组成的组，并且特别选自由R和S组成的组；
并且其中：
iv)CDR 1是选自由下列氨基酸序列组成的组的氨基酸序列：
NYGMG                [SEQ ID NO：15]
SYTLG                [SEQ ID NO：16]
NYNMG                [SEQ ID NO：17]
SSAMA                [SEQ ID NO：18]
YYNTG                [SEQ ID NO：19]
IGAMG                [SEQ ID NO：20]
IGTMG                [SEQ ID NO：21]
YNPMG                [SEQ ID NO：22]
并且其中：
v)CDR 2是选自由下列氨基酸序列组成的组的氨基酸序列：
SISWSGTYTAYSDNVKG    [SEQ ID NO：23]
GISWSGVSTDYAEFAKG    [SEQ ID NO：24]
TSISWSGSYTAYADNVKG   [SEQ ID NO：25]
SISWSGMSTYYTDSVKG    [SEQ ID NO：26]
TITSGGRTSYADSVKG     [SEQ ID NO：27]
AISWSGGLTYYADSVKG    [SEQ ID NO：28]
TITSGGSTNYADPVKG     [SEQ ID NO：29]
TITSGGSTNYADSVKG     [SEQ ID NO：30]
AISRTGGSTYYARSVEG    [SEQ ID NO：31]
AISRTGGSTYYPDSVEG    [SEQ ID NO：32]
并且其中：
vi)CDR 3是选自由下列氨基酸序列组成的组的氨基酸序列：
QSRYRSNYYDHDDKYAY      [SEQ ID NO：33]
LGRYRSNWRNIGQYDY       [SEQ ID NO：34]
QSRYSSNYYDHDDKYAY      [SEQ ID NO：35]
SNRYRTHTTQAMYNY        [SEQ ID NO：36]
VVDGKRAP               [SEQ ID NO：37]
NRRQKTVQMGERAYDY       [SEQ ID NO：38]
NLKQGSYGYRFNDY         [SEQ ID NO：39]
NLKQGDYGYRFNDY         [SEQ ID NO：40]
AGVRAEDGRVRTLPSEYNF    [SEQ ID NO：41]
AGVRAEDGRVRTLPSEYTF    [SEQ ID NO：42]
AGVRAEDGRVRSLPSEYTF    [SEQ ID NO：43]
优选地，在按照后一方面的本发明的纳米体中：
-当CDR1是：NYGMG时；那么CDR2是：SISWSGTYTAYSDNVKG；并且CDR3是：Q SRYRSNYYDHDDKYAY
-当CDR1是：SYTLG时；那么CDR2是：GISWSGVSTDYAEFAKG；并且CDR3是：LGRYRSNWRNIGQYDY
-当CDR1是：NYGMG时；那么CDR2是：TSISWSGSYTAYADNVKG；并且CDR3是：QSRYSSNYYDHDDKYAY
-当CDR1是：NYNMG时；那么CDR2是：SISWSGMSTYYTDSVKG；并且CDR3是：SNRYRTHTTQAMYNY
-当CDR1是：SSAMA时；那么CDR2是：TITSGGRTSYADSVKG；并且CDR3是：VVDGKRAP
-当CDR1是：YYNTG时；那么CDR2是：AISWSGGLTYYADSVKG；并且CDR3是：NRRQKTVQMGERAYDY
-当CDR1是：IGAMG时；那么CDR2是：TITSGGSTNYADPVKG；并且CDR3是：NLKQGSYGYRFNDY
-当CDR1是：IGAMG时；那么CDR2是：TITSGGSTNYADSVKG；并且CDR3是：NLKQGSYGYRFNDY
-当CDR1是：IGAMG时；那么CDR2是：TITSGGSTNYADSVKG；并且CDR3是：NLKQGDYGYRFNDY
-当CDR1是：IGTMG时；那么CDR2是：TITSGGSTNYADSVKG；并且CDR3是：NLKQGDYGYRFNDY
-当CDR1是：YNPMG时；那么CDR2是：AISRTGGSTYYARSVEG；并且CDR3是：AGVRAEDGRVRTLPSEYNF
-当CDR1是：YNPMG时；CDR2：AISRTGGSTYYPDSVEG；并且CDR3是：AGVRAEDGRVRTLPSEYTF
-当CDR1是：YNPMG时；那么CDR2是：AISRTGGSTYYPDSVEG；并且CDR3是：AGVRAEDGRVRSLPSEYTF
特别地，按照本发明方面中的一个优选的但非限制性的方面，纳米体一般可以定义为包括由被3个互补决定区/序列中断的4个构架区/序列组成的氨基酸序列的多肽，其中：
a-1)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由G，E，D，G，Q，R，S，L组成的组；并且优选地选自由G，E或Q组成的组；和
a-2)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基选自由L，R或C组成的组；并且优选地选自由L或R组成的组；和
a-3)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由W，R或S组成的组；并且优选地选自由W或R组成的组，以及最优选地为W；
a-4)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基是Q；
或者其中：
b-1)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由E和Q组成的组；和
b-2)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是R；和
b-3)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由W，R和S组成的组；并且优选地为W；
b-4)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基选自由Q和L组成的组；并且优选地为Q；
或者其中：
c-1)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由G，E，D，Q，R，S和L组成的组；并且优选地由G，E和Q组成的组；和
c-2)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基选自由L，R和C组成的组；并且优选地选自由L和R组成的组；和
c-3)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由P，R和S组成的组；并且特别选自由R和S组成的组；和
c-4)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基选自由Q和L组成的组；优选地为Q。
因此，在另一个优选的但非限制性方面，本发明的纳米体可以具有结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补决定区1-3，并且其中：
i)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由G，E，D，G，Q，R，S，L组成的组；并且优选地选自由G，E或Q组成的组；
并且其中：
ii)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基选自由L，R或C组成的组；并且优选地选自由L或R组成的组；
并且其中：
iii)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由W，R或S组成的组；并且优选地为W或R，并且最优选地为W；
并且其中
iv)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基是Q；
并且其中：
v)CDR1，CDR2和CDR3如本文定义，并且优选地如按照上述一种优选的定义而定义，并且更优选地如按照上述一种更优选的定义而定义。
在另一个优选的但非限制性方面中，本发明的纳米体可以具有结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补决定区1-3，并且其中：
i)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由E和Q组成的组；
并且其中：
ii)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是R；
并且其中：
iii)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由W，R和S组成的组；并且优选地为W；
并且其中：
iv)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基是Q；
并且其中：
vi)CDR1，CDR2和CDR3如本文定义，并且优选地如按照上述一种优选的定义而定义，并且更优选地如按照上述一种更优选的定义而定义。
在另一个优选的但非限制性方面中，本发明的纳米体可以具有结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补决定区1-3，并且其中：
i)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由G，E，D，Q，R，S和L组成的组；并且优选地选自由G，E和Q组成的组；
并且其中：
ii)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基选自由L，R和C组成的组；并且优选地选自由L和R组成的组；
并且其中：
iii)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由P，R和S组成的组；并且特别选自由R和S组成的组；
并且其中：
iv)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基选自由Q和L组成的组；优选地为Q；
并且其中：
v)CDR1，CDR2和CDR3如本文定义，并且优选地如按照上述一种优选的定义而定义，并且更优选地如按照上述一种更优选的定义而定义。
本发明纳米体的两种特别优选的但非限制性的组是按照上述a)；按照上述a-1)到a-4)；按照上述b)；按照上述b-1)到b-4)；按照上述c)；和/或按照上述c-1)到c-4)的那些，其中：
a)按照Kabat编号方式在位置44-47的氨基酸残基形成序列GLEW(或如本文定义的GLEW-样序列)，并且在位置108的氨基酸残基是Q；
或者其中：
b)按照Kabat编号方式在位置43-46的氨基酸残基形成序列KERE或KQRE(或KERE-样序列)，并且在位置108的氨基酸残基是Q或L，并且优选地为Q。
因此，在另一个优选的但非限制性方面，本发明的纳米体可以具有结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补决定区1-3，并且其中：
i)按照Kabat编号方式在位置44-47的氨基酸残基形成序列GLEW(或如本文定义的GLEW-样序列)，并且在位置108的氨基酸残基是Q；
并且其中：
ii)CDR1，CDR2和CDR3如本文定义，并且优选地如按照上述一种优选的定义而定义，并且更优选地如按照上述一种更优选的定义而定义。
在另一个优选的但非限制性方面中，本发明的纳米体可以具有结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补决定区1-3，并且其中：
i)按照Kabat编号方式在位置43-46的氨基酸残基形成序列KERE或KQRE(或KERE-样序列)，并且在位置108的氨基酸残基是Q或L，并且优选地为Q；
并且其中：
ii)CDR1，CDR2和CDR3如本文定义，并且优选地如按照上述一种优选的定义而定义，并且更优选地如按照上述一种更优选的定义而定义。
在其中按照Kabat编号方式在位置43-46的氨基酸残基形成序列KERE或KQRE的本发明的纳米体中，位置37的氨基酸残基最优选地为F。在其中按照Kabat编号方式在位置44-47的氨基酸残基形成序列GLEW的本发明的纳米体中，位置37的氨基酸残基选自由Y，H，I，V或F组成的组，并且最优选地为F。
因此，无论如何不限于此，基于存在于上述提及的位置的氨基酸残基，本发明的纳米体通常可以基于下列3组进行分类：
a)“GLEW-组”：按照Kabat编号方式在位置44-47具有氨基酸序列GLEW并且按照Kabat编号方式在位置108具有Q的纳米体。如本文进一步所述，在这一组内的纳米体通常在位置37具有V，并且可以在位置103具有W，P，R或S，并且优选地在位置103具有W。所述GLEW组还包括一些GLEW-样的序列，诸如下表2中提及的那些；
b)“KERE-组”：按照Kabat编号方式在位置43-46具有氨基酸序列KERE或KQRE并且按照Kabat编号方式在位置108具有Q或L的纳米体。如本文进一步所述，在这一组内的纳米体通常在位置37具有F，在位置47具有L或F；并且可以在位置103具有W，P，R或S，并且优选地在位置103具有W；
c)“103P，R，S-组”：在位置103具有P，R或S的纳米体。这些纳米体可以在按照Kabat编号方式的位置44-47具有氨基酸序列GLEW或者在按照Kabat编号方式的位置43-46具有氨基酸序列KERE或KQRE，后者最优选地与位置37的F和位置47的L或F结合(如关于KERE-组所定义)；并且可以在按照Kabat编号方式的位置108具有Q或L，并且优选地具有Q。
因此，在一个优选的但非限制性的方面，本发明的纳米体可以是属于GLEW-组(如本文所定义)的纳米体，并且其中CDR1，CDR2和CDR3如本文定义，并且优选地如按照上述一种优选的定义而定义，并且更优选地如按照上述一种更优选的定义而定义。
在另一个优选的但非限制性的方面，本发明的纳米体可以是属于KERE-组(如本文所定义)的纳米体，并且其中CDR1，CDR2和CDR3如本文定义，并且优选地如按照上述一种优选的定义而定义，并且更优选地如按照上述一种更优选的定义而定义。
因此，在另一个优选的但非限制性的方面，本发明的纳米体可以是属于103P，R，S-组(如本文所定义)的纳米体，并且其中CDR1，CDR2和CDR3如本文定义，并且优选地如按照上述一种优选的定义而定义，并且更优选地如按照上述一种更优选的定义而定义。
此外，更一般地，并且除了上文提及的108Q，43E/44R和103P，R，S残基之外，本发明的纳米体可以在常规VH结构域中形成(部分)VH/VL界面的一个或多个位置包含一个或多个氨基酸残基，所述氨基酸残基比在相对应的天然存在的VH或VHH结构域同一位置天然存在的氨基酸残基更加高度带电荷，并且特别是一个或多个带电荷的氨基酸残基(如表1中提及)。
这样的取代包括，但不限于下表2中提及的GLEW-样序列；以及国际公布WO 00/29004中所述关于所谓的“微体(microbodies)”的取代，例如在位置108的Q和在位置44-47的KLEW。
在本发明的纳米体中，在位置83的氨基酸残基选自由L，M，S，V和W组成的组；并且优选地为L。
此外，在本发明的纳米体中，位置83的氨基酸残基选自由R，K，N，E，I和Q组成的组；并且最优选地为K或E(对于与天然存在的VHH结构域相对应的纳米体)或R(对于“人源化”纳米体，如下文所述)。在位置84的氨基酸残基选自由P，A，R，S，D和V组成的组，并且最优选地是P(对于与天然存在的VHH结构域相对应的纳米体)或R(对于“人源化”纳米体，如下文所述)。
此外，在本发明的纳米体中，位置104的氨基酸残基选自由G和D组成的组；并且最优选地是G。
总而言之，在所述纳米体中如上文提及的在位置11，37，44，45，47，83，84，103，104和108的氨基酸残基在本文中还叫作“标志残基(hallmarkresidue)”。所述标志残基以及在最接近的相关的人VH结构域、VH3的相对应的位置的氨基酸残基总结在表2中。
在天然存在的VHH结构域中存在的这些标志残基的一些特别优选的组合在表3中提及。为了比较，叫作DP-47的人VH3的相对应氨基酸残基以斜体显示。
表2：纳米体中的标志残基
  位置   人VH3   标志残基
  11   L，V；主要为L   L，M，S，V，W；优选L
  37   V，I，F；一般为V   F(1)，Y，H，I或V，优选F(1)或Y
  44(8)   G   G(2)，E(3)，D，Q，R，S，L；优选G(2)，E(3)或Q；最优选G(2)或E(3)
  45(8)   L   L(2)，R(3)，C，I，L，P，Q，V；优选L(2)或R(3)
  47(8)   W，Y   W(2)，L(1)或F(1)，A，G，I，M，R，S
  或Y；优选W(2)，L(1)，F(1)或R
  83   R或K；一般为R   R，K(5)，N，E(5)，I，M或Q；优选K或R；最优选K
  84   A，T，D；主要为A   P(5)，A，L，R，S，D，V；优选P
  103   W   W(4)，P(6)，R(6)，S；优选W
  104   G   G或D；优选G
  108   L，M或T；主要为L   Q，L(7)或R；优选Q或L(7)
注释：
(1)：特别地，但是不排除，与在位置43-46的KERE或KQRE组合。
(2)：在位置44-47通常为GLEW。
(3)：在位置43-46通常为KERE或KQRE，例如，在位置43-47为KEREL，KEREF，KQREL，KQREF或KEREG。备选地，还可能是序列诸如TERE(例如TEREL)，KECE(例如KECEL或KECER)，RERE(例如REREG)，QERE(例如QEREG)，KGRE(例如KGREG)，KDRE(例如KDREV)。一些其它可能的但较不优选的序列包括例如DECKL和NVCEL。
(4)：具有在位置44-47的GLEW和在位置43-46的KERE或KQRE。
(5)：通常作为在天然存在的VHH结构域的位置83-84的KP或EP。
(6)：特别地，但是不排除，与在位置44-47的GLEW组合。
(7)：具有附加条件：当位置44-47为GLEW时，位置108总是Q。
(8)：所述GLEW组还在位置44-47包含GLEW-样序列，诸如例如GVEW，EPEW，GLER，DQEW，DLEW，GIEW，ELEW，GPEW，EWLP，GPER，GLER和ELEW。
Figure A20068002401200731
在所述纳米体中，除了所述标志残基外在任何其它位置的每一氨基酸残基可以是在天然存在的VHH结构域的相应位置(按照Kabat编号方式)天然存在的任何氨基酸残基。
对于熟练的技术人员这样的氨基酸残基应该是清楚的。表4-7提及一些非限制性的残基，其可以存在于天然存在的VHH结构域的FR1、FR2、FR3和FR4的任一位置(按照Kabat编号方式)。对于任一位置，在天然存在的VHH结构域的任一位置最经常存在的氨基酸残基(并且其在纳米体中对于所述位置是最优选的氨基酸残基)以粗体显示；并且对于任一位置的其它优选的氨基酸残基已加下划线(注意：在天然存在的VHH结构域的位置26-30发现的氨基酸残基的数目支持构成编号方式Chothia(同前所述)的基础的假说，即，在这些位置的残基已经形成部分CDR1。)
在表4-7中，还提及可以在人VH3结构域的任一位置存在的一些非限制性的残基。此外，对于每一位置，在天然存在的人VH3结构域的任一位置最经常存在的氨基酸残基以粗体显示；并且其它优选的氨基酸残基加下划线。
表4：FR1中的氨基酸残基的非限制性实例(关于脚注，参见表2的脚注)
Figure A20068002401200751
表4：FR1中的氨基酸残基的非限制性实例(续表)
Figure A20068002401200761
表5：FR2中的氨基酸残基的非限制性实例(关于脚注，参见表2的脚注)
Figure A20068002401200762
Figure A20068002401200771
表6：FR3中的氨基酸残基的非限制性实例(关于脚注，参见表2的脚注)
Figure A20068002401200772
Figure A20068002401200781
表6：FR3中的氨基酸残基的非限制性实例(续表)
Figure A20068002401200782
表7：FR4中的氨基酸残基的非限制性实例(关于脚注，参见表2的脚注)
Figure A20068002401200791
因此，在另一个优选的但非限制性的方面中，本发明的纳米体可以具有结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补决定区1-3，并且其中：
i)标志残基如上文所定义；
并且其中：
ii)CDR1，CDR2和CDR3如本文定义，并且优选地如按照上述一种优选的定义而定义，并且更优选地如按照上述一种更优选的定义而定义。
在另一个优选的但非限制性方面中，本发明的纳米体可以具有结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补决定区1-3，并且其中：
并且其中
i)FR1选自由下述氨基酸序列组成的组：
[1]QVQLQESGGGXVQAGGSLRLSCAASG[26]    [SEQ ID NO：1]
或者选自由与上述氨基酸序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)在除标志(hallmark)位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表4所限定的氨基酸取代；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；
和/或选自由与上述氨基酸序列中的一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表4所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；
并且其中：
ii)FR2选自由下述氨基酸序列组成的组：
[36]WXRQAPGKXXEXVA[49]    [SEQ ID NO：2]
或者选自由与上述氨基酸序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表5所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；
和/或选自由与上述氨基酸序列中的一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表5所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；
并且其中：
iii)FR3选自由下述氨基酸序列组成的组：
[66]RFTISRDNAKNTVYLQMNSLXXEDTAVYYCAA[94]    [SEQ ID NO：3]
或者选自由与上述氨基酸序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表6所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；
和/或选自由与上述氨基酸序列中的一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表6所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；
并且其中：
iv)FR4选自由下述氨基酸序列组成的组：
[103]XXQGTXVTVSS[113]    [SEQ ID NO：4]
或者选自由与上述氨基酸序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表6所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；
和/或选自由与上述氨基酸序列中的一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表6所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；
并且其中：
v)CDR1，CDR2和CDR3如本文定义，并且优选地如按照上述一种优选的定义而定义，并且更优选地如按照上述一种更优选的定义而定义；
其中所述标志残基用“X”表示，并且如上文所定义，并且其中括号内的数字是指按照Kabat编号方式的氨基酸位置。
在另一个优选的但非限制性的方面中，本发明的纳米体具有结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补决定区1-3，并且其中：
并且其中
i)FR1选自由下述氨基酸序列组成的组：
[1]QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG[26]    [SEQ ID NO：5]
或者选自由与上述氨基酸序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表4所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置上的标志残基如在上述序列中所示；
和/或选自由与上述氨基酸序列中的一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表4所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置上的标志残基如在上述序列中所示；
并且其中：
ii)FR2选自由下述氨基酸序列组成的组：
[36]WFRQAPGKERELVA[49]    [SEQ ID NO：6]
[36]WFRQAPGKEREFVA[49]    [SEQ ID NO：7]
[36]WFRQAPGKEREGA[49]     [SEQ ID NO：8]
[36]WFRQAPGKQRELVA[49]    [SEQ ID NO：9]
[36]WFRQAPGKQREFVA[49]    [SEQ ID NO：10]
[36]WYRQAPGKGLEWA [49]    [SEQ ID NO：11]
或者选自由与上述氨基酸序列之一有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表5所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置37，44，45和47上的标志残基如在上述每一种序列中所示；
和/或选自由与上述氨基酸序列中的一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表5所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置37，44，45和47上的标志残基如在上述每一种序列中所示；
并且其中：
iii)FR3选自由下述氨基酸序列组成的组：
[66]RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA[94]    [SEQ ID NO：12]
或者选自由与上述氨基酸序列有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表6所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置83和84的标志残基如在上述每一序列中所示；
和/或选自由与上述氨基酸序列中的一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表6所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置83和84的标志残基如在上述每一序列中所示；
并且其中：
iv)FR4选自由下述氨基酸序列组成的组：
[103]WGQGTQVTVSS[113]    [SEQ ID NO：13]
[103]WGQGTLVTVSS[113]    [SEQ ID NO：14]
或者选自由与上述氨基酸序列之一有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表6所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置103，104和108的标志残基如在上述每一序列中所示；和/或选自由与上述氨基酸序列中的一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表6所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置103，104和108的标志残基如在上述每一序列中所示；
并且其中：
v)CDR1，CDR2和CDR3如本文定义，并且优选地如按照上述一种优选的定义而定义，并且更优选地如按照上述一种更优选的定义而定义。
在另一个优选的但非限制性的方面，本发明的纳米体可以具有结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补决定区1-3，并且其中：
并且其中
i)FR1选自由下述氨基酸序列组成的组：
[1]QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG[26]    [SEQ ID NO：5]
和/或选自由与上述氨基酸序列中的一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表4所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置上的标志残基如在上述序列中所示；
并且其中：
ii)FR2选自由下述氨基酸序列组成的组：
[36]WFRQAPGKERELVA[49]    [SEQ ID NO：6]
[36]WFRQAPGKEREFVA[49]    [SEQ ID NO：7]
[36]WFRQAPGKEREGA[49]     [SEQ ID NO：8]
[36]WFRQAPGKQRELVA[49]    [SEQ ID NO：9]
[36]WFRQAPGKQREFVA[49]    [SEQ ID NO：10]
和/或选自由与上述氨基酸序列中的一种具有2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表5所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置37，44，45和47的标志残基如在上述每一序列中所示；
并且其中：
iii)FR3选自由下述氨基酸序列组成的组：
[66]RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA[94]    [SEQ ID NO：12]
和/或选自由与上述氨基酸序列中的一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表6所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置83和84的标志残基如在上述每一序列中所示；
并且其中：
iv)FR4选自由下述氨基酸序列组成的组：
[103]WGQGTQVTVSS[113]    [SEQ ID NO：13]
[103]WGQGTLVTVSS[113]    [SEQ ID NO：14]
和/或选自由与上述氨基酸序列中的一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表7所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置103，104和108的标志残基如在上述每一序列中所示；
并且其中：
v)CDR1，CDR2和CDR3如本文定义，并且优选地如按照上述一种优选的定义而定义，并且更优选地如按照上述一种更优选的定义而定义。
在另一个优选的但非限制性的方面，本发明的纳米体可以具有结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补决定区1-3，并且其中：
并且其中
i)FR1选自由下述氨基酸序列组成的组：
[1]QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG[26]    [SEQ ID NO：5]
和/或选自由与上述氨基酸序列中的一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表4所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置上的标志残基如在上述序列中所示；
并且其中：
ii)FR2选自由下述氨基酸序列组成的组：
[36]WYRQAPGKGLEWA[49]    [SEQ ID NO：11]
和/或选自由与上述氨基酸序列中的一种具有2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表5所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置37，44，45和47的标志残基如在上述每一序列中所示；
并且其中：
iii)FR3选自由下述氨基酸序列组成的组：
[66]RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA[94]    [SEQ ID NO：12]
和/或选自由与上述氨基酸序列中的一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表6所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置83和84的标志残基如在上述每一序列中所示；
并且其中：
iv)FR4选自由下述氨基酸序列组成的组：
[103]WGQGTQVTVSS[113]    [SEQ ID NO：13]
和/或选自由与上述氨基酸序列中的一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表7所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置103，104和108的标志残基如在上述每一序列中所示；
并且其中：
v)CDR1，CDR2和CDR3如本文定义，并且优选地如按照上述一种优选的定义而定义，并且更优选地如按照上述一种更优选的定义而定义。
在另一个优选的但非限制性的方面，本发明的纳米体可以具有结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补决定区1-3，并且其中：
并且其中
i)FR1选自由存在于SEQ ID NO’s 60-73和SEQ ID NO’s 86-97的纳米体中、并且特别是存在于SEQ ID NO’s 86-97的人源化纳米体中的FR1序列组成的组，
或者选自由与所述FR1序列的一种具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表4所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述FR1序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置上的标志残基如在所述FR1序列中所示；
和/或选自由与所述FR1序列中的一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表4所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与上述FR1序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置上的标志残基如在所述FR1序列中所示；
并且其中：
ii)FR2选自由存在于SEQ ID NO’s 60-73和SEQ ID NO’s 86-97的纳米体中、并且特别是存在于SEQ ID NO’s 86-97的人源化纳米体中的FR2序列组成的组，
或者选自由与所述FR2序列的一种具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表5所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与所述FR2序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置37，44，45和47上的标志残基如在所述FR2序列中所示；
和/或选自由与所述FR2序列中的一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表5所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与所述FR2序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置37，44，45和47上的标志残基如在所述FR2序列中所示；
并且其中：
iii)FR3选自由存在于SEQ ID NO’s 60-73和SEQ ID NO’s 86-97的纳米体中、并且特别是存在于SEQ ID NO’s 86-97的人源化纳米体中的FR3序列组成的组，
或者选自由与所述FR3序列的一种具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表6所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与所述FR3序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置83和84上的标志残基如在所述FR3序列中所示；
和/或选自由与所述FR3序列中的一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表6所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与所述FR3序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置83和84上的标志残基如在所述FR3序列中所示；
并且其中：
iv)FR4选自由存在于SEQ ID NO’s 60-73和SEQ ID NO’s 86-97的纳米体中、并且特别是存在于SEQ ID NO’s 86-97的人源化纳米体中的FR4序列组成的组，
或者选自由与所述FR4序列的一种具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表6所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与所述FR4序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置103，104和108上的标志残基如在所述FR3序列中所示；
和/或选自由与所述FR4序列中的一种具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表6所限定的氨基酸取代；
和/或
(2)与所述FR4序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入；并且
(3)在位置103，104和108上的标志残基如在所述FR4序列中所示；
并且其中：
v)CDR1，CDR2和CDR3如上文定义，并且优选地如按照上述一种优选的定义而定义，并且更优选地如按照上述一种更优选的定义而定义。
一些特别优选的本发明的纳米体可以选自由氨基酸序列SEQ IDNO’s 60-73和SEQ ID NO’s 86-97，并且特别是在SEQ ID NO’s 86-97的人源化纳米体中的氨基酸序列组成的组，或者选自由与氨基酸序列SEQ IDNO’s 60-73和SEQ ID NO’s 86-97(优选SEQ ID NO’s 86-97)中的一种具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)所述标志残基可以如在上述表2中所示；
(2)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表4-7所限定的氨基酸取代；和/或
(3)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入。
一些甚至更特别优选的本发明的纳米体可以选自由氨基酸序列SEQID NO’s 60-73和SEQ ID NO’s 86-97，并且特别是在SEQ ID NO’s 86-97的人源化纳米体中的氨基酸序列组成的组，或者选自由与氨基酸序列SEQID NO’s 60-73和SEQ ID NO’s 86-97(优选SEQ ID NO’s 86-97)中的一种具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)所述标志残基如在选自SEQ ID NO’s 60-73和SEQ ID NO’s86-97(并且优选地选自SEQ ID NO’s 86-97)的相关序列中所示；
(2)在除标志位置之外的任何位置的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)和/或如表4-7所限定的氨基酸取代；和/或
(3)与选自SEQ ID NO’s 60-73和SEQ ID NO’s 86-97(并且优选地选自SEQ ID NO’s 86-97)的相关序列相比，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并没有氨基酸删除或插入。
一些最优选的本发明的纳米体可以选自由氨基酸序列SEQ ID NO’s60-73和SEQ ID NO’s 86-97组成的组，并且特别选自SEQ ID NO’s 86-97的人源化纳米体。
从上文应该清楚，当用于本文时，术语本发明的纳米体在其最广泛意义上还包括在SEQ ID NO’s 60-73和SEQ ID NO’s 86-97中提及的纳米体的天然的或合成的突变体、变体、等位体、类似物和直向同源物(下文笼统叫作“类似物”)。
一般地，例如，所述类似物可以包括纳米体的同源序列、功能性片段或同源序列的功能性片段(如下文进一步所定义)。通常，在所述类似物中，在每一构架区的每一氨基酸残基(除标志残基之外)可以被任何氨基酸残基取代，条件是所述构架区的序列相同性的总程度保持如上文所限定。然而，优选地，在所述类似物中：
-上述构架序列中的一个或多个氨基酸残基被在天然存在的VHH结构域中的同一位置上天然存在的一个或多个氨基酸残基取代。这样的取代的一些实例在上述表4-7中提及；
和/或：
-上述构架序列中的一个或多个氨基酸残基被可以视为“保守”氨基酸取代的一个或多个氨基酸残基取代，如上文所述；
和/或：
-上述构架序列中的一个或多个氨基酸残基被在天然存在的人类VH结构域中的同一位置上天然存在的一个或多个氨基酸残基取代。这通常叫作一般在天然存在的VHH/纳米体以及特别在所述位置的“人源化”，并且将在下文中更详细地讨论；
并且：
-对于所述VH结构域和VHH结构域在上述表4-7中都只提及1个氨基酸残基的位置优选地不被取代。
此外，尽管一般较不优选，但是在所述类似物中，一个或多个氨基酸残基可以从所述构架区删除，和/或插入到构架区(任选地除了上文提及的一个或多个氨基酸取代)，条件是所述构架区的序列相同性的总程度保持如上文所限定。标志残基不应该删除。此外，最优选地，对于所述VH结构域和VHH结构域在上述表4-7中都只提及1个氨基酸残基的氨基酸残基位置优选地不被删除。
优选地，所述类似物应该是这样的，以致它们仍然可以结合vWF，对vWF具有亲和性和/或具有特异性，即，当应用适当的检测确定时，所述检测例如确定所述类似物与vWF的结合的检测，并且特别是下述实施例中所用的检测中的一种，具有的亲和性和/或特异性是SEQ ID No’s60-73和SEQ ID NO’s 86-97的纳米体中至少一种的亲和性和/或特异性的至少10％、优选地至少50％、更优选地至少70％、甚至更优选地至少80％、诸如至少90％、至少95％、至少99％或更多。
通常，例如，所述类似物可以这样获得：通过提供编码天然存在的VHH结构域的核酸，将要被人源化的一个或多个氨基酸残基的密码子改变成相对应的人氨基酸残基的密码子，在适当的宿主或表达系统中表达这样获得的核酸/核苷酸序列；并且任选地分离和/或纯化这样获得的类似物，以提供基本上分离形式(如上文所定义)的所述类似物。这通常可以应用本质上已知的方法和技术而进行，所述方法和技术应该是熟练的技术人员所清楚的，例如从手册和本文所引用的参考文献和/或从下文的进一步描述中可知。备选地，并且例如，编码类似物的核酸可以以本质上已知的方法合成(例如使用用于合成预先确定氨基酸序列的核酸序列的自动装置)，并且可以在适当的宿主或表达系统中表达，由此可以任选地分离和/或纯化这样获得的类似物，以提供基本上分离形式(如上文所定义)的所述类似物。另一种提供所述类似物的方法包括相关氨基酸序列的化学合成，其应用本质上已知的肽合成技术，诸如下文所提及的那些技术。
熟练的技术人员一般还应该清楚，纳米体(包括其类似物)还可以从人VH序列(即，氨基酸序列或相对应的核苷酸序列)起始制备，所述人VH序列诸如例如人VH3序列，诸如DP-47、DP-51或DP-29，通过改变所述人VH结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基，以提供具有下列各项的氨基酸序列：(a)在位置108具有Q；和/或(b)在位置44具有E和/或在位置45具有R，并且优选地在位置44具有E和在位置45具有R；和/或(c)在位置103具有P，R或S，如上文所述。此外，这通常可以应用前段中提到的各种方法和技术进行，其应用人VH结构域的氨基酸序列和/或核苷酸序列作为起点。
当用于本文时，术语纳米体以其最广泛的意义还包括如上文所定义的本发明的纳米体(包括类似物)的部分或片段，其也如在下文中进一步所述。
通常，所述纳米体和/或类似物的部分或片段具有这样的氨基酸序列，即，与相对应的全长纳米体或类似物的氨基酸序列相比，其中已经删除和/或去除N末端的一个或多个氨基酸残基，C末端的一个或多个氨基酸残基，一个或多个邻接的内部氨基酸残基，或者其任何组合。还可以将一个或多个这样的部分或片段组合以提供本发明的纳米体。
优选地，包含全长纳米体和/或类似物的一个或多个部分或片段的纳米体的氨基酸序列应该与相对应的全长纳米体的氨基酸序列有至少50％、优选地至少60％、更优选地至少70％、诸如至少80％、至少90％或至少95％的序列相同性程度。
此外，包含全长纳米体和/或类似物的一个或多个部分或片段的纳米体的氨基酸序列应该优选地是这样，以致其包括相对应的全长纳米体的氨基酸序列的至少10个邻接的氨基酸残基，优选地至少20个邻接的氨基酸残基，更优选地至少30个邻接的氨基酸残基，诸如至少40个邻接的氨基酸残基。
通常，本发明的纳米体的这样的部分或片段应该具有这样的氨基酸序列，即，与相对应本发明的全长纳米体的氨基酸序列相比，其中已经删除和/或去除N末端的一个或多个氨基酸残基，C末端的一个或多个氨基酸残基、一个或多个邻接的内部氨基酸残基，或其任何组合。还可以将一个或多个这样的部分或片段组合，以提供本发明的纳米体。
按照一个优选的实施方案，当用于本文时，片段包括至少一个存在于本发明的全长纳米体中的CDR’s，优选地至少两个存在于本发明的全长纳米体中的CDR’s，更优选地至少存在于本发明的全长纳米体中的CDR2和CDR3，诸如例如全部三个存在于本发明的全长纳米体中的CDR’s。
按照另一个特别优选但非限制性的实施方案，这样的部分或片段包括至少本发明的相对应的全长纳米体的FR3、CDR3和FR4，即，例如在国际申请WO 03/050531(Lasters等)中所述。
优选地，这样的部分或片段应该是这样的，以致它们仍然可以结合vWF，对vWF具有亲和性和/或具有特异性，即，例如确定所述类似物与vWF的结合的检测，并且特别是下述实施例中所用的检测中的一种，具有的亲和性和/或特异性是本发明的相对应的全长纳米体的亲和性和/或特异性的至少10％、优选地至少50％、更优选地至少70％、甚至更优选地至少80％、诸如至少90％、至少95％、至少99％或更多。
从上文的描述，应该清楚，本文所用的纳米体的氨基酸序列在至少一个构架区中的至少一个氨基酸位置不同于天然存在的VH结构域的氨基酸序列，诸如来自人类的抗体的天然存在的VH结构域的氨基酸序列。特别地，应该清楚，本文所用的纳米体的氨基酸序列在至少一个标志残基不同于天然存在的VH结构域的氨基酸序列，诸如来自骆驼科和/或人类的抗体的天然存在的VH结构域的氨基酸序列。
因此，按照一个具体的实施方案，本发明的纳米体具有在一个构架区的至少一个氨基酸位置不同于天然存在的VH结构域的氨基酸序列的氨基酸序列。按照本发明一个更具体的但非限制性的实施方案，本发明的纳米体具有在至少一个标志残基不同于天然存在的VH结构域的氨基酸序列的氨基酸序列。
从上文的描述，还应该清楚，一些本发明的纳米体的氨基酸序列，诸如本发明的人源化纳米体，应该在至少一个构架区的至少一个氨基酸位置(即，在标志残基位置或在另一位置)不同于天然存在的VHH结构域的氨基酸序列。因此，按照一个具体的但非限制性的实施方案，本发明的纳米体具有在一个构架区的至少一个氨基酸位置不同于天然存在的VHH结构域的氨基酸序列的氨基酸序列。按照本发明一个更具体的但非限制性的实施方案，本发明的纳米体具有在至少一个标志残基不同于天然存在的VHH结构域的氨基酸序列的氨基酸序列。
按照上文提及，本发明还涉及包含至少一个VHH结构域(即，如使用本发明的方法所确定)或至少一个基于其的纳米体的蛋白或多肽。
按照本发明的一个非限制性的实施方案，本发明的这样的多肽基本上由纳米体组成。“基本上由……组成”意指本发明的多肽的氨基酸序列与纳米体的氨基酸序列完全相同(如上文提及)或者与纳米体的氨基酸序列相对应，其中有限数目的氨基酸残基，诸如1-10个氨基酸残基，并且优选地1-6个氨基酸残基，诸如1、2、3、4、5或6个氨基酸残基，已经加入到所述纳米体的氨基酸序列的氨基末端、羧基末端、或者氨基末端和羧基末端两端。
所述氨基酸残基可以或不可以变化、改变或另外影响所述纳米体的(生物学)特性，并且可以或不可以给所述纳米体加入其它的官能性。例如，所述氨基酸残基可以：
a)形成“标记”，即允许或促进所述纳米体的纯化的氨基酸序列或残基，例如使用针对所述序列或残基的亲和技术进行纯化。然后，所述序列或残基可以被去除(例如，通过化学或酶促分裂)，以提供本发明的核苷酸序列(为了这一目的，所述序列或残基可以任选地通过可分裂的接头序列与本发明的氨基酸序列连接)。这种残基的一些优选的但非限制性的实例是多组氨酸残基和谷胱甘肽(glutatione)残基；
b)是N-端Met残基，例如，因此在异源宿主细胞或宿主生物体内表达；
c)是以本质上已知的方式可以提供有官能团和/或已经被官能化的一个或多个氨基酸残基。例如，如本领域已知，氨基酸残基诸如赖氨酸并且特别是半胱氨酸允许PEG基团附着，其可以掩盖蛋白上的表面位点，并且例如，因此而减少免疫原性，提高在血浆中的半衰期，并且抗蛋白水解分解而稳定；
d)增加本发明的纳米体或多肽在血清中的半衰期。可以附着和/或融合到治疗性蛋白上以增加它们的体内半衰期的氨基酸序列是技术人员公知的，并且包括人血清蛋白或其片段(诸如人血清白蛋白或其部分或片段)，或者甚至是抗体(特别是人抗体)的Fc片段。此外，如本文已经描述，用于增加半衰期的所述氨基酸序列可以是针对血清蛋白的氨基酸序列，诸如针对血清蛋白例如针对人血清白蛋白的纳米体。
关于聚乙二醇化，应该注意，通常本发明还包括已经在一个或多个氨基酸位置被聚乙二醇化的任何本发明的纳米体和/或本发明的多肽，优选地以这样的方式，即，所述聚乙二醇化(1)增加体内半衰期；(2)减少免疫原性；(3)提供关于聚乙二醇化本质上已知的一种或多种更有利的其它特性；(4)基本上不影响所述纳米体和/或多肽对vWF的亲和性(例如，当通过适当的检测测定时，诸如下述实施例中所述的那些检测，没有减小大于90％的所述亲和力，优选地没有减小大于50％的所述亲和力，并且更优选地没有减小大于10％的所述亲和力)；和/或(5)没有影响本发明的纳米体和/或多肽的任何其它理想的特性。熟练的技术人员应该清楚适宜的PEG-基团以及特异性地或非特异性地附着其的方法。例如，用于所述聚乙二醇化的适宜的试剂盒和试剂可以从Nektar(CA，USA)获得。
按照一个非限制性的实施方案，可以将一个或多个氨基酸残基加入、插入和/或取代在本发明的纳米体或多肽的氨基酸序列中，以提供用于PFG-基团附着的一个或多个特异的氨基酸残基。
本发明还包括已经在一个或多个氨基酸位置糖基化的任何本发明的纳米体和/或本发明的多肽，这通常取决于用于表达本发明的纳米体或多肽的宿主(如下文进一步所述)。
按照一个非限制性的实施方案，可以将一个或多个氨基酸残基添加到、插入和/或取代在本发明的纳米体或多肽的氨基酸序列中，以提供可以被所用的宿主生物体糖基化的一个或多个特异的氨基酸残基和/或位点。通过一个优选的但非限制性的实例，例如，在本发明的纳米体的CDR2内位置50上的N-残基可以被Q、D或S残基取代，以提供糖基化位点，例如，用于通过毕赤酵母(Pichia)糖基化。
按照另一个实施方案，本发明的多肽可以包括纳米体的氨基酸序列，在其氨基末端、在其羧基末端、或者在其氨基末端和其羧基末端两端融合至少一个其它氨基酸序列。
此外，所述其它氨基酸序列可以或不可以变化、改变或者另外影响所述纳米体的(生物学)特性，并且可以或者不可以为所述纳米体添加其它的官能性。
例如，按照一个优选的但非限制性的实施方案，所述其它氨基酸序列可以包括至少一个其它纳米体，以提供包括至少2个，诸如3个、4个或5个纳米体的本发明的多肽，其中所述纳米体可以任选地通过一个或多个接头序列(如本文所定义)连接。
包括两个或多个纳米体的本发明的多肽在本文还叫作“多价”多肽。例如，本发明的“二价”多肽包括2个纳米体，任选地通过一个接头序列连接，而本发明的“三价”多肽包括3个纳米体，任选地通过两个接头序列连接；等等。
在本发明的多价多肽中，所述两个或多个纳米体可以是相同的或不同的。例如，在本发明的多价多肽中的两个或多个纳米体：
-可以针对同一抗原，即，针对所述抗原的相同部分或表位或者针对所述抗原的两个或多个不同部分或表位；和/或：
-可以针对不同的抗原；
或其组合。
因此，例如，本发明的二价多肽：
-可以包括2个相同的纳米体；
-可以包括针对抗原的第一部分或表位的第一纳米体和针对所述抗原的同一部分和表位或者针对所述抗原的另一部分或表位的第二纳米体；
-或者可以包括针对第一抗原的第一纳米体和针对与所述第一抗原不同的第二抗原的第二纳米体；
然而，例如，本发明的三价多肽：
-可以包括针对同一抗原的相同的或不同的部分或表位的3个相同的或不同的纳米体；
-可以包括针对第一抗原的相同的或不同的部分或表位的2个相同的或不同的纳米体和针对与所述第一抗原不同的第二抗原的第三纳米体；或
-可以包括针对第一抗原的第一纳米体，针对与所述第一抗原不同的第二抗原的第二纳米体，和针对与所述第一和第二抗原不同的第三抗原的第三纳米体。
包含至少两个纳米体的本发明的多肽，其中至少一个纳米体针对第一抗原，并且至少一个纳米体针对不同于所述第一抗原的第二纳米体，还叫作“多特异性”纳米体。因此，“双特异性”纳米体是包括至少一个针对第一抗原的纳米体和至少一个针对第二抗原的其它纳米体的纳米体，而“三特异性”纳米体是这样的纳米体，即，其包括至少一个针对第一抗原的纳米体，至少一个针对第二抗原的其它纳米体，和至少一个针对第三抗原的其它纳米体；等等。
因此，在它们最简单的形式中，本发明的双特异性多肽是本发明的二价多肽(如本文所定义)，其包括针对第一抗原的第一纳米体，和针对第二抗原的第二纳米体，其中所述第一和第二纳米体可以任选地通过一个接头序列(如本文所定义)而连接；而最简单的形式的本发明的三特异性多肽是本发明的三价多肽(如本文所定义)，其包括针对第一抗原的第一纳米体，针对第二抗原的第二纳米体，和针对第三抗原的第三纳米体，其中所述第一、第二和第三纳米体可以任选地通过一个或多个，并且特别是一个或多个特别是两个接头序列连接。
然而，从上文所述应该清楚，本发明并不限于此，在这种意义上，本发明的多特异性多肽可以包括任何数目的针对两个或多个不同抗原的纳米体。
关于包含一个或多个VHH结构域的多价和多特异性多肽及其制备，参考还参见Conrath等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，卷276，10.7346-7350，以及EP 0 822 985。
用于多价和多特异性多肽的接头应该是熟练的技术人员所清楚的，并且例如包括gly-ser接头，例如(glyxsery)z类型，诸如例如(gly4ser)3或(gly3ser2)3，如在WO 99/42077中所述；铰链样区域，诸如天然存在的重链抗体的铰链区或类似的序列。对于其它适宜的接头，参考也参见上文引用的综合背景技术。一些特别优选的接头在SEQ ID NO’s 83-85中给出，其中特别优选SEQ ID NO’s 84和85的接头。
接头还可以为多价或多特异性多肽提供某种官能性。例如，包含一个或多个带电荷氨基酸残基(参见上表1)的接头可以提供提高的亲水特性，而形成或包含小的表位或标记的接头可以用于检测、鉴定和/或纯化目的。
还如本文进一步所述，与相对应的单价纳米体相比，本发明的多特异性多肽，其针对理想的抗原，并且针对至少一种血清蛋白，诸如下文提及的血清蛋白，并且特别针对人血清白蛋白，可以在血清中表现出增加的半衰期。
如上文提及，本文所述的方法特别适用于产生这样的本发明的多价的多特异性多肽。
在本发明的多肽中，所述至少一个纳米体还可以与常规VH结构域或者与VH结构域的天然的或合成的类似物连接，任选地通过接头序列连接。
在本发明的多肽中，所述至少一个纳米体还可以与VL结构域或者与VL结构域的天然的或合成的类似物连接，任选地通过接头序列连接，以提供这样的本发明的多肽，即，所述本发明的多肽以与常规scFv片段类似的形式但是包含纳米体而不是VH结构域。
在本发明的多肽中，所述至少一个纳米体还可以与一个或多个CH1、CH2和/或CH3结构域连接，任选地通过接头序列连接。例如，与适宜的CH1结构域连接的纳米体，例如--同适当的轻链一起--用来产生类似于常规Fab片段或F(ab’)2片段的抗体片段/结构，但是其中一个或者(F(ab’)2片段的情形中)一个或两个常规VH结构域已被纳米体取代。这种片段还可以是异种特异性或双特异性的，即，针对两种或更多种抗原。与适宜的CH2和CH3结构域连接的纳米体，例如来源于骆驼科，可以用来形成单特异性或双特异性的重链抗体。最后，与适宜的CH1、CH2和CH3结构域连接的纳米体，例如来源于人类，--与适宜的轻链一起--可以用来形成这样的抗体，即，其与常规4-链抗体类似，但是其中一个或两个常规VH结构域已被纳米体取代。
此外，除了所述一个或多个纳米体之外，本发明的多肽还可以包含官能团、部分或残基，例如治疗活性物质，诸如下文提及的那些，和/或标记或标志，诸如荧光标记、同位素等等，如下文进一步所述。
本发明的纳米体、本发明的多肽、以及编码其的核酸，可以以本质上已知的方式制备，熟练的技术人员应该从本文的进一步描述中而清楚。关于制备所述纳米体、多肽和核酸的一些优选的但非限制性的方法包括上文提及的和/或下文进一步所述的方法和技术。
熟练的技术人员应该清楚，用于制备本发明的纳米体和/或多肽的一种特别有用的方法通常包括步骤：
-在适宜的宿主细胞或宿主生物体(本文还叫作“本发明的宿主”)中或在另一种适宜的表达系统中，表达编码所述本发明的纳米体或多肽的核酸(本文还叫作“本发明的核酸”)，任选地接着进行：
-分离和/或纯化这样获得的本发明的纳米体或多肽。
特别地，这样的方法可以包括步骤：
-在某种条件下培养和/或维持本发明的宿主，所述条件是这样的，以致所述本发明的宿主表达和/或生产至少一种本发明的纳米体和/或多肽；
任选地接着进行：
-分离和/或纯化这样获得的本发明的纳米体或多肽。
本发明的核酸可以是单链或双链DNA或RNA的形式，并且优选地是双链DNA形式。例如，本发明的核苷酸序列可以是基因组DNA、cDNA或合成的DNA(诸如具有特别适用于在要用的宿主细胞或宿主生物体中表达的密码子应用的DNA)。
按照本发明的一个实施方案，本发明的核酸是基本上分离的形式，如上文所定义。
本发明的核酸还可以是这样的形式，存在于和/或是载体的部分，诸如例如质粒、黏端质粒或YAC，其也可以是基本上分离的形式。
本发明的核酸可以以本质上已知的方法制备或获得，其基于关于本文给出的本发明的多肽的氨基酸序列的信息，和/或可以从适当的天然来源分离。为了提供类似物，例如，编码天然存在的VHH结构域的核苷酸序列可以进行基因定点诱变，以提供编码所述类似物的本发明的核酸。并且，熟练的技术人员应该清楚，为了制备本发明的核酸，一些核苷酸序列，诸如至少一种编码纳米体的核苷酸序列，以及例如编码一种或多种接头的核酸，还可以以适当的方法连接在一起。
用于产生本发明的核酸的技术应该是熟练的技术人员所清楚的，并且例如可以包括但不限于，自动DNA合成；位点定向诱变；将两个或多个天然存在的和/和合成的序列(或者其两个或多个部分)结合，引入引起剪截表达产物表达的突变；引入一个或多个限制性位点(例如，以产生可以使用适宜的限制性酶容易地消化和/或连接的盒和/或区)，和/或通过PCR反应的方法引入突变，所述PCR反应使用一个或多个“错配”引物，使用例如天然存在的GPCR的序列作为模板。这些以及其它技术应该是熟练的技术人员所清楚的，并且参考也参见上文提及的标准手册，诸如Sambrook等和Ausubel等，以及下文的实施例。
本发明的核酸还可以是这样的形式，存在于和/或是遗传构建体的部分，这对于本领域的技术人员应该是清楚的。这样的遗传构建体通常包括至少一种本发明的核酸，其任选地与本质上已知的一个或多个遗传构建体元件连接，诸如例如一个或多个适宜的调控元件(诸如适当的启动子、增强子、终止子、等等)和下文提到的其它遗传构建体元件。包括至少一种本发明的核酸的所述遗传构建体在本文也叫作“本发明的遗传构建体”。
本发明的遗传构建体可以是DNA或RNA，并且优选地是双链DNA。本发明的遗传构建体还可以是适于转化要用的宿主细胞或宿主生物体的形式，适于结合到要用的宿主细胞的基因组DNA中的形式，或者适于在要用的宿主生物体中独立复制、维持和/或遗传的形式。例如，本发明的遗传构建体可以是载体形式，诸如例如质粒、黏端质粒、YAC、病毒载体或转座子。特别地，所述载体可以是表达载体，即，可以提供体外和/或体内表达的载体(例如，在适宜的宿主细胞、宿主生物体和/或表达系统中)。
在一个优选的但非限制性的实施方案中，本发明的遗传构建体包括
a)至少一种本发明的核酸；其可操作性地连接
b)一个或多个调控元件，诸如启动子和任选地适宜的终止子；
c)并且任选地还有
d)本质上已知的一个或多个遗传构建体的其它元件；
其中术语“调控元件”、“启动子”、“终止子”和“可操作性地连接”具有它们在本领域中的通用意思(如下文进一步所述)；并且其中存在于遗传构建体中的所述“其它元件”，例如，可以是3’-或5’-UTR序列、前导序列、选择标记、表达标记/报道子基因、和/或可以促进或增加转化或结合(效率)的元件。用于所述遗传构建体的这些和其它适宜的元件对于熟练的技术人员应该是清楚的，并且例如可能取决于所用的构建体、要用的宿主细胞或宿主生物体的类型；本发明的目的核苷酸序列在其中表达的方式(例如，通过组成型的、瞬时的或可诱导的表达)；和/或要用的转化技术。
优选地，在本发明的遗传构建体中，所述至少一种本发明的核酸和所述调控元件，以及任选地所述一个或多个其它元件，彼此“可操作性地连接”，这通常意指它们彼此是功能性关系。例如，如果所述启动子能够起始或者另外控制/调控编码序列的转录和/或表达，那么启动子被视为与编码序列“可操作性地连接”(其中所述编码序列应该理解为“受控于”所述启动子)。一般地，当两个核苷酸序列可操作性地连接时，它们应该在相同的方向，并且通常还在同一阅读框中。它们通常还应该基本上邻接，尽管这也可以不是必需的。
优选地，本发明的遗传构建体的调控以及其它元件是这样的，即，它们能够在要用的宿主细胞或宿主生物体内提供它们需要的生物学功能。
例如，在要用的宿主细胞或宿主生物体中，启动子、增强子或终止子应该是“可操作的”，这意味着(例如)所述启动子应该能够起始或者另外控制/调控与其可操作性地连接(如本文所定义)的核苷酸序列--例如，编码序列--的转录和/或表达。
一些特别优选的启动子包括但不限于，本质上已知用于在细菌细胞中表达的启动子，诸如下文提及的那些和/或在实施例中所用的那些。
选择标记应该是这样的，即，其允许--即，在适当的选择条件下--已经(成功地)转化本发明的核苷酸序列的宿主细胞和/或宿主生物体与没有(成功地)转化的宿主细胞和/或宿主生物体区分开来。所述标记的一些优选的但非限制性的实例是提供针对抗生素(诸如卡那霉素或氨苄青霉素)的抗性的基因，提供温度抗性的基因，或者在培养基中不存在某些因子、化合物和/或(食物)成分时允许所述宿主细胞或宿主生物体维持的基因，所述培养基是未转化的细胞或生物体生存所必需的。
前导序列应该是这样的，以致--在要用的宿主细胞或宿主生物体中--其允许理想的翻译后修饰和/或以致其将转录的mRNA导向细胞的理想部分或细胞器。前导序列还可以允许从所述细胞分泌表达产物。同样地，前导序列可以是在所述宿主细胞或宿主生物体中可操作的任何原-(pro-)、前-(pre-)或前原-(prepro-)序列。对于在细菌细胞中表达，前导序列可以不是必需的。
表达标记或报道子基因应该是这样的，即，--在宿主细胞或宿主生物体中--其允许检测所述遗传构建体(上存在的基因或核苷酸序列)的表达。表达标记任选地还可以允许表达产物的定位，例如，在细胞的特定部分或细胞器中和/或在多细胞生物体的特定细胞、组织、器官或部分中。所述报道子基因还可以表达为与本发明的氨基酸序列融合的蛋白。一些优选的但非限制性的实例包括荧光蛋白诸如GFP。
适宜的启动子、终止子和其它元件的一些优选的但非限制性的实例包括下述实施例中所用的那些。关于可以存在于/用于本发明的遗传构建体的启动子、选择标记、前导序列、表达标记和其它元件的一些(其它)非限制性的实例--诸如终止子、转录和/或翻译增强子和/或结合因子--参考参见上文提及的通用手册，诸如Sambrook等和Ausubel等，以及WO95/07463，WO 96/23810，WO 95/07463，WO 95/21191，WO 97/11094，WO97/42320，WO 98/06737，WO 98/21355，US-A-6,207,410，US-A-5,693,492和EP 1 085 089中给出的实例。其它实例对于熟练的技术人员应该是显而易见的。参考也参见上文引用的综合背景技术和下文引用的其它参考文献。
本发明的遗传构建体通常可以通过将本发明的核苷酸序列与上文所述的一个或多个其它元件适当地连接而提供，例如应用上文提及的通用手册诸如Sambrook等和Ausubel等中所述的技术。
通常，本发明的遗传构建体通过将本发明的核苷酸序列插入到本质上已知的适当的(表达)载体中而获得。适当的表达载体的一些优选的但非限制性的实例是下述实施例中所用的那些，以及下文提及的那些。
本发明的核酸和/或本发明的遗传构建体可以用于转化宿主细胞或宿主生物体，即，用于表达和/或生产本发明的纳米体或多肽。适宜的宿主或宿主细胞应该为熟练的技术人员所清楚，并且例如可以是任何适当的真菌的、原核的或真核的细胞或细胞系，或者任何适当的真菌的、原核的或真核的生物体，例如：
-细菌菌株，其包括但不限于革兰氏-阴性菌株，诸如大肠杆菌(Escherichia coli)菌株；变形菌属(Proteus)菌株，例如奇异变形菌(Proteus mirabilis)菌株；假单胞菌属(Pseudomonas)菌株，例如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株；以及革兰氏-阳性菌株诸如芽孢杆菌属(Bacillus)菌株，例如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)菌株或短芽孢杆菌(Bacillus brevis)菌株；链霉菌属(Streptomyces)菌株，例如浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)菌株；葡萄球菌属(Staphylococcus)菌株，例如肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)菌株；以及乳球菌属(Lactococcus)菌株，例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)菌株；
-真菌细胞，其包括但不限于来自下列各项物种的细胞：诸如木霉属(Trichoderma)，例如Trichoderma reesei的物种；脉孢菌(Neurospora)，例如Neurospora crassa；粪壳属(Sordaria)，例如Sordaria macrospora；曲霉属(Aspergillus)，例如黑曲霉(Aspergillusniger)或酱油曲霉(Aspergillus sojae)；或其它丝状真菌；
-酵母细胞，其包括但不限于来自下列各项物种的细胞：酵母属(Saccharomyces)，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；毕赤酵母属(Pichia)，例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或Pichia methanolica；汉逊酵母属(Hansenula)，例如多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，例如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)；Arxula，例如Arxula adeninivorans；Yarrowia，例如Yarrowialipolytica；
-两栖类细胞或细胞系，诸如爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)；
-来源于昆虫的细胞或细胞系，诸如衍生于鳞翅目(lepidoptera)的细胞/细胞系，包括但不限于贪夜蛾(Spodoptera)SF9和Sf21细胞，或者衍生于果蝇属(Drosophila)的细胞/细胞系，诸如Schneider和Kc细胞；
-植物或植物细胞，例如在烟草(tobacco)植物中；和/或
-哺乳动物细胞或细胞系，例如来源于人、来源于哺乳动物的细胞或细胞系，包括但不限于CHO-细胞、BHK-细胞(例如BHK-21细胞)，以及人细胞或细胞系，诸如HeLa，COS(例如COS-7)和PER.C6细胞；
以及本质上已知的用于表达和生产抗体及抗体片段(包括但不限于(单一)结构域抗体和ScFv片段)的所有其它宿主或宿主细胞，这对于熟练的技术人员应该是清楚的。参考还参见上文引用的综合背景技术，以及例如WO 94/29457；WO 96/34103；WO 99/42077；Frenken等，(1998)，同前所述；Riechmann和Muyldermans，(1999)，同前所述；van der Linden，(2000)，同前所述；Thomassen等，(2002)，同前所述；Joosten等，(2003)，同前所述；Joosten等，(2005)，同前所述；以及本文所应用的其它参考文献。
本发明的纳米体和多肽还可以被引入多细胞生物体的一个或多个细胞、组织或器官中并且在其中表达，例如用于预防和/或治疗目的(例如，作为基因治疗)。为了这一目的，可以将本发明的核苷酸序列以任何适当的方式引入到细胞或组织中，例如照此(例如使用脂质体)或者在它们插入到适当的基因治疗载体(例如，衍生于反转录病毒诸如腺病毒，或者细小病毒诸如腺伴随病毒)中之后。同样对于熟练的技术人员应该是清楚的，这样的基因治疗可以在体内进行和/或在患者体内原位进行，其通过给患者或患者的特定细胞或特定组织或器官施用本发明的核酸或者编码其的适当的基因治疗载体而进行；或者适宜的细胞(通常取自要治疗的患者的机体，诸如移植的淋巴细胞、骨髓吸出物或活组织切片)可以用本发明的核苷酸序列在体外进行治疗，然后适当地(重新)引入回到所述患者的机体内。所有这些可以使用熟练的技术人员公知的基因治疗载体、技术和递送系统进行，例如，Culver，K.W.″Gene Therapy(基因治疗)″，1994，p.xii，Mary Ann Liebert，Inc.Publishers，纽约，N.Y).Giordano，Nature F Medicine2(1996)，534-539；Schaper，Circ.Res(循环研究).79(1996)，911-919；Anderson，Science(科学)256(1992)，808-813；Verma，Nature(自然)389(1994)，239；Isner，Lancet 348(1996)，370-374；Muhlhauser，Circ.Res(循环研究).77(1995)，1077-1086；Onodera，Blood(血液学)91；(1998)，30-36；Verma，Gene Ther.(基因治疗)5(1998)，692-699；Nabel，Ann.N.Y.Acad.Sci.(纽约科学院年刊)：811(1997)，289-292；Verzeletti，Hum.Gene Ther.(人类基因治疗)9(1998)，2243-51；Wang，Nature Medicine 2(自然医药学2)(1996)，714-716；WO 94/29469；WO 97/00957，US 5,580,859；1US5,5895466；或Schaper，Current Opinion in Biotechnology(现代生物技术观点)7(1996)，635-640。例如，在本领域中已描述ScFv片段(Afanasieva等，Gene Ther.(基因治疗)，10，1850-1859(2003))和双抗体(Blanco等，J.Immunol(免疫学杂志)，171，1070-1077(2003))的原位表达。
对于纳米体在细胞中的表达，它们还可以作为所谓的或作为所谓的“胞内抗体”表达，例如在WO 94/02610，WO 95/22618和US-A-7004940；WO 03/014960中所述；在Cattaneo，A.和Biocca，S.(1997)IntracellularAntibodies：Development and Applications(细胞内抗体：发展和应用).Landes and Springer-Verlag；以及在Kontermann，Methods(方法)34，(2004)，163-170中所述。
对于生产，例如，本发明的纳米体和多肽还可以在转基因哺乳动物的乳中产生，例如在兔、母牛、山羊或绵羊的乳中(对于将转基因引入哺乳动物的通用技术参见例如US-A-6,741,957，US-A-6,304,489和US-A-6,849,992)，在植物中和植物的部分中产生，所述植物部分包括但不限于它们的叶、花、果、种子、根或turbers(例如在烟草、玉米、大豆或紫花苜蓿中)中，或者例如在蚕Bombix mori的蛹中。
此外，本发明的纳米体和多肽还可以在不含细胞的表达系统中表达和/或生产，并且这样的系统的适当的实例应该是熟练的技术人员所清楚的。一些优选的但非限制性的实例包括在麦芽系统中的表达；在兔网织红细胞裂解物中表达；或者在大肠杆菌(E.coli)Zubay系统中表达。
如上文提及，应用纳米体的一个优点在于，基于此的多肽可以通过在适宜的细菌系统中表达而制备，并且适宜的细菌表达系统、载体、宿主细胞、调控元件等对熟练的技术人员是清楚的，例如参考上文引用的参考文献。然而，应该注意，本发明在其最广泛意义上并不限于在细菌系统中表达。
优选地，在本发明中，应用(体内或体外)表达系统，诸如细菌表达系统，其以适于药用的形式提供本发明的多肽，并且所述表达系统也是熟练的技术人员所清楚的。也是熟练的技术人员所清楚的，适于药用的本发明的多肽可以使用肽合成技术制备。
对于工业规模的生产，用于纳米体或包含纳米体的蛋白治疗物的(工业)生产的优选的异源宿主包括大肠杆菌、巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母(S.cerevisiae)的菌株，其适用于大规模表达/生产/发酵，并且特别适用于大规模药物表达/生产/发酵。所述菌株的适当的实例是熟练的技术人员所清楚的。所述菌株以及生产/表达系统也可从公司诸如Biovitrum(Uppsala，瑞典)获得。
备选地，哺乳动物细胞系，特别是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，可以用于大规模表达/生产/发酵，并且特别用于大规模药物表达/生产/发酵。并且，所述表达/生产系统也可从上文提及的一些公司获得。
具体的表达系统的选择部分取决于特定的翻译后修饰的需要，更具体地是糖基化的需要。生产包含纳米体的重组蛋白，对于所述蛋白糖基化是理想的或者必需的，将使得应用具有将所表达的蛋白糖基化的能力的哺乳动物表达宿主成为必要。在这一方面，熟练的技术人员应该清楚，获得的糖基化模式(即，附着的残基的种类、数量和位置)将取决于表达所用的细胞或细胞系。优选地，使用人细胞或细胞系(即，形成基本上具有人糖基化模式的蛋白)，或者使用另一种哺乳动物细胞系，其可以提供基本上和/或功能上与人糖基化作用相同的糖基化模式或者至少模拟人糖基化作用。一般地，原核宿主诸如大肠杆菌不具有将蛋白糖基化的能力，并且应用更低等真核细胞诸如酵母通常导致与人糖基化作用不同的糖基化模式。不过，应该理解，所有前述宿主细胞和表达系统可以用于本发明，这取决于要获得的理想的纳米体或蛋白。
因此，按照本发明的一个非限制性实施方案，本发明的纳米体或多肽被糖基化。按照本发明的另一个非限制性实施方案，本发明的纳米体或多肽未被糖基化。
按照本发明的一个优选的但非限制性的实施方案，本发明的纳米体或多肽在细菌细胞中生产，特别是在适于大规模药物生产的细菌细胞，诸如上文提及的菌株的细胞中生产。
按照本发明另一个优选的但非限制性的实施方案，本发明的纳米体或多肽在酵母细胞中生产，特别是在适于大规模药物生产的酵母细胞，诸如上文提及的物种的细胞中生产。
按照本发明另一个优选的但非限制性的实施方案，本发明的纳米体或多肽在哺乳动物细胞中生产，特别是在人细胞或人细胞系的细胞中，并且更特别是在适于大规模药物生产的人细胞或人细胞系的细胞中，诸如上文提及的细胞系中生产。
当在宿主细胞中的表达用来生产本发明的纳米体和蛋白时，本发明的纳米体和蛋白可以在细胞内产生(例如，在细胞溶胶中，在外周胞质或在内含体中)，然后从宿主细胞分离，并且任选地进一步纯化；或者可以在细胞外产生(例如，在培养所述宿主细胞的培养基中)，然后从培养基分离，并且任选地进一步纯化。当使用真核宿主细胞时，由于这极大地促进进一步的分离以及获得的纳米体和蛋白的下游处理，所以通常优选细胞外生产。除了少数种类的蛋白诸如毒素和溶血素之外，细菌细胞诸如上文提及的大肠杆菌的菌株一般不向细胞外分泌蛋白，并且在大肠杆菌内的分泌生产是指蛋白穿过内膜移位到外周胞质空间。外周胞质生产相对于胞质生产提供一些优点。例如，在通过特异的信号肽酶将分泌信号序列分裂之后，所分泌的产物的N-端氨基酸序列可以与天然基因产物相同。此外，在外周胞质中比在细胞质中似乎存在少得多的蛋白酶活性。另外，由于在外周胞质中更少的污染蛋白，所以蛋白纯化更简单。另一个优点是，由于外周胞质提供比细胞质更加氧化性的环境，所以可以形成正确的二硫键。在大肠杆菌中过量表达的蛋白通常在不溶的聚集体，即所谓的内含体中发现。这些内含体可以位于细胞溶胶中或在外周胞质中；从这些内含体复苏生物活性蛋白需要变性/重折叠步骤。许多重组蛋白，包括治疗性蛋白，是从内含体复苏的。备选地，熟练的技术人员应该清楚，可以使用细菌的重组菌株。其已被遗传修饰，以分泌理想的蛋白，并且特别是本发明的纳米体或多肽。
因此，按照本发明的一个非限制性实施方案，本发明的纳米体或多肽是在细胞内产生并且从宿主细胞分离，并且特别是从细菌细胞或者从细菌细胞中的内含体中分离的纳米体或多肽。按照本发明的另一个非限制性的实施方案，本发明的纳米体或多肽是在细胞外产生并且从培养宿主细胞的培养基中分离的纳米体或多肽。
与这些宿主细胞一起使用的一些优选的但非限制性的启动子包括，
-用于在大肠杆菌中表达：lac启动子(及其衍生物，诸如lacUV5启动子)；阿拉伯糖启动子；噬菌体λ的左向-(PL)和右向(PR)启动子；trp操纵子的启动子；杂合lac/trp启动子(tac和trc)；T7-启动子(更具体地是T7-噬菌体基因10的启动子)以及其它T-噬菌体启动子；Tn10四环素抗性基因的启动子；上述启动子的工程变体，其包括一个或多个拷贝的外来调控操纵基因序列；
-用于在酿酒酵母中表达：组成型：ADH1(醇脱氢酶1)，ENO(烯醇化酶)，CYC1(异-1细胞色素c)，GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)；PGK1(磷酸甘油酸激酶)，PYK1(丙酮酸激酶)；调控型：GAL1，10，7(半乳糖代谢酶)，ADH2(醇脱氢酶2)，PHO5(酸性磷酸酶)，CUP1(铜金属硫蛋白)；异源型：CaMV(花椰菜花叶病毒35S启动子)；
-用于在毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达：AOX1启动子(醇氧化酶I)；
-用于在哺乳动物细胞中表达：人巨细胞病毒(hCMV)即时早期增强子/启动子；人巨细胞病毒(hCMV)即时早期启动子变体，其包含两个四环素操纵基因序列，以致所述启动子可以受Tet抑制基因调控；单纯疱疹病毒胸苷激酶(TK)启动子；劳斯肉瘤病毒长末端重复(RSV LTR)增强子/启动子；来自于人、黑猩猩、小鼠或大鼠的延伸因子1α(hEF-1α)启动子；SV40早期启动子；HIV-1长末端重复启动子；β-肌动蛋白启动子；
与这些宿主细胞一起使用的一些优选的但非限制性的载体包括：
-用于在哺乳动物细胞中表达的载体：pMAMneo(Clontech)，pcDNA3(Invitrogen)，pMC1neo(Stratagene)，pSG5(Stratagene)，EBO-pSV2-neo(ATCC 37593)，pBPV-1(8-2)(ATCC 37110)，pdBPV-MMTneo(342-12)(ATCC 37224)，pRSVgpt(ATCC37199)，pRSVneo(ATCC37198)，pSV2-dhfr(ATCC 37146)，pUCTag(ATCC 37460)和1ZD35(ATCC37565)，以及基于病毒的表达系统，诸如基于腺病毒的那些；
-用于在细菌细胞中表达的载体：pET载体(Novagen)和pQE载体(Qiagen)；
-用于在酵母或其它真菌细胞中表达的载体：pYES2(Invitrogen)和毕赤表达载体(Pichia expression vector)(Invitrogen)；
-用于在昆虫细胞中表达的载体：pBlueBacII(Invitrogen)和其它杆状病毒载体；
-用于在植物或植物细胞中表达的载体：例如基于花椰菜花叶病毒或烟草花叶病毒的载体，适宜的农杆菌(Agrobacterium)菌株，或基于Ti-质粒的载体。
与这些宿主细胞一起使用的一些优选的但非限制性的分泌序列包括：
-用于细菌细胞诸如大肠杆菌：PelB，Bla，OmpA，OmpC，OmpF，OmpT，StII，PhoA，PhoE，MalE，Lpp，LamB等；TAT信号肽，溶血素C-端分泌信号；
-用于酵母：α-交配因子前原-序列(α-mating factor prepro-sequence)，磷酸酶(pho1)，转化酶(Suc)，等；
-用于哺乳动物细胞：在靶点蛋白是真核起源的情形中固有的信号(indigenous signal)；鼠Igκ-链V-J2-C信号肽；等。
用于转化本发明的宿主或宿主细胞的适宜的技术对熟练的技术人员是清楚的，并且可能取决于要用的宿主细胞/宿主生物体和要用的遗传构建体。参考也参见上文提及的手册和专利申请。
转化后，可以进行检测并且选择已经成功转化本发明的核苷酸序列/遗传构建体的那些宿主细胞或宿主生物体的步骤。例如，这可以是基于存在于本发明的遗传构建体中的选择标记的选择步骤，或者是包括检测本发明的氨基酸序列的步骤，例如，使用特异的抗体进行。
转化的宿主细胞(其可以是稳定的细胞系的形式)或宿主生物体(其可以是稳定的突变系或株系的形式)形成本发明的另一方面。
优选地，这些宿主细胞或宿主生物体是这样的，以致它们表达或者(至少)能够表达(例如，在适宜的条件下)本发明的氨基酸序列(并且在宿主生物体的情形中：在它的至少一种细胞、部分、组织或器官中)。本发明还包括本发明的宿主细胞或宿主生物体的其它世代、后代和/或子代，例如，其可以通过细胞分裂或者通过有性或无性生殖获得。
为了生产/获得本发明的氨基酸序列的表达，所述转化的宿主细胞或转化的宿主生物体通常可以在本发明(理想的)氨基酸序列得到表达/生产的条件下保藏、维持和/或培养。适宜的条件对熟练的技术人员是清楚的，并且通常取决于所用的宿主细胞/宿主生物体，以及取决于控制本发明的(相关)核苷酸序列表达的调控元件。此外，参考参见在上文关于本发明的遗传构建体段落中提及的手册和专利申请。
一般地，适宜的条件可以包括使用适宜的培养基，存在适宜的食物来源和/或适宜的营养素，使用适当的温度，并且优选地存在适当的诱导因子或化合物(例如，在本发明的核苷酸序列在可诱导启动子的控制下的情形中)；所有这些可以由熟练的技术人员选择。此外，在这样的条件下，本发明的氨基酸序列可以以组成型方式、以瞬时方式、或者只在适当地诱导时表达。
熟练的技术人员还应该清楚，本发明的氨基酸序列可以(首先)以不成熟的形式(如上文提及)产生，其然后可以进行翻译后修饰，这取决于所用的宿主细胞/宿主生物体。并且，本发明的氨基酸序列可以被糖基化，这也取决于所用的宿主细胞/宿主生物体。
然后，本发明的氨基酸序列可以从宿主细胞/宿主生物体和/或从培养所述宿主细胞或宿主生物体的培养基中分离，这使用本质上已知的蛋白分离和/或纯化技术，诸如(制备)层析和/或电泳技术、差别沉淀技术、亲和技术(例如，使用与本发明的氨基酸序列融合的特异性的、可切割的氨基酸序列)和/或制备性免疫学技术(即，使用针对要被分离的氨基酸序列的抗体)。
通常，对于药物应用，本发明的多肽可以配制成药物制剂，其包括至少一种本发明的多肽和至少一种药用载体、稀释剂或赋形剂和/或佐剂，并且任选地一种或多种其它药物活性多肽和/或化合物。通过非限制性实例的方式，这样的制剂可以是适于下列各项的形式：口服给药，肠胃外给药(诸如通过静脉内、肌内或皮下注射或静脉内输注)，局部给药，通过吸入、皮肤贴片、移植物、栓剂给药，等等。所述适宜的给药形式--其可以是固体、半固体或液体，取决于给药的方式--以及制备其所用的方法和载体，对熟练的技术人员是清楚的，并且在下文中进一步描述。
因此，在另一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含至少一种本发明的纳米体，或至少一种本发明的多肽，以及至少一种适宜的载体(即，用于兽医应用的载体)，和任选地一种或多种其它活性物质。
本发明的一个实施方案是一种多肽构建体，其包含：
至少一种本发明的纳米体，即，针对vWF、vWF A1结构域、活化的vWF的A1结构域、vWF A3结构域中的任一种。
本发明的另一个实施方案是上文所述的一种多肽构建体，其中针对活化的vWF的A1结构域的本发明的纳米体特异性地识别在血栓形成位点的活化的vWF构象，但是不结合循环的非活化形式的vWF。
本发明的纳米体还针对vWF、vWF A1结构域、活化的vWF的A1结构域、vWFA3结构域的片段，诸如能够激发免疫应答的片段。靶点还是vWF、vWF A1结构域、活化的vWF的A1结构域、vWF A3结构域的片段，其能够结合针对‘亲本’全长靶点产生的本发明的纳米体。
当用于此处时，片段是指小于序列的100％(例如，99％，90％，80％，70％，60％，50％，40％，30％，20％，10％等)，但是包括5，6，7，8，9，10，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25个或更多个氨基酸。片段长度足够，以致目的相互作用保持1×10-6M或更好的亲和性。
当用于本文时，片段还指一个或多个氨基酸的任选的插入、删除和取代，其基本上不改变所述靶点结合针对野生型靶点产生的纳米体的能力。氨基酸插入、删除或取代的数目优选地达到1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69或70个氨基酸。
针对靶点的本发明的纳米体一般是指能够以好于10-6M的亲和力结合其靶点的本发明的纳米体。
本发明的另一个实施方案是上文所述的多肽构建体，其中至少一种本发明的纳米体是人源化序列。
本发明的另一个实施方案是上文所述的多肽构建体，其中至少一种本发明的纳米体是骆驼科VHH抗体。
本发明的另一个实施方案是上文所述的多肽构建体，其中所述本发明的纳米体是本发明的全长纳米体的同源序列、功能片段、或同源序列的功能片段。
本发明的另一个实施方案是上文所述的多肽构建体，其中所述多肽构建体是所述多肽构建体的同源序列、其功能片段、其功能片段的同源序列。
本发明的另一个实施方案是上文所述的多肽构建体，其还包含至少一种针对一种或多种血清蛋白特别是一种或多种人血清蛋白的本发明的纳米体。
本发明的另一个实施方案是上文所述的多肽构建体，其中所述至少一种(人)血清蛋白是(人)血清白蛋白、(人)血清免疫球蛋白、(人)甲状腺素-结合蛋白、(人)运铁蛋白、或(人)凝血因子I或其片段中的任一种。
按照本发明的一个具体的但非限制性的方面，除了所述一种或多种本发明的纳米体之外，本发明的多肽还包含至少一种针对人血清白蛋白的纳米体。尽管这些针对人血清白蛋白的纳米体可以如在W04/062551中或在本文引用的其它参考文献中综合所述，但是按照一个特别优选的但非限制性的实施方案，所述针对人血清白蛋白的纳米体由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中：
i)CDR1是选自由下列各项组成的组的氨基酸序列：
SFGMS        [SEQ ID NO：44]
LNLMG        [SEQ ID NO：45]
INLLG        [SEQ ID NO：46]
NYWMY；      [SEQ ID NO：47]
和/或选自由与上述氨基酸序列中的一种具有2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
并且其中：
ii)CDR2是选自由下列各项组成的组的氨基酸序列：
SISGSGSDTLYADSVKG    [SEQ ID NO：48]
TITVGDSTNYADSVKG     [SEQ ID NO：49]
TITVGDSTSYADSVKG     [SEQ ID NO：50]
SINGRGDDTRYADSVKG    [SEQ ID NO：51]
AISADSSTKNYADSVKG    [SEQ ID NO：52]
AISADSSDKRYADSVKG    [SEQ ID NO：53]
RISTGGGYSYYADSVKG    [SEQ ID NO：54]
或者选自由与上述氨基酸序列之一有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或选自由与上述氨基酸序列之一具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
并且其中：
iii)CDR3是选自由下列各项组成的组的氨基酸序列：
DREAQVDTLDFDY    [SEQ ID NO：55]
或者选自由与上述氨基酸序列之一有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或选自由与上述氨基酸序列之一具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
或者选自由下列各项组成的组：
GGSLSR      [SEQ ID NO：56]
RRTWHSEL    [SEQ ID NO：57]
GRSVSRS     [SEQ ID NO：58]
GRGSP       [SEQ ID NO：59]
和/或选自由与上述氨基酸序列之一具有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入。
在另一方面中，本发明涉及针对vWF的纳米体，其由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其选自由分别具有下述CDR1、CDR2和CDR3组合之一的纳米体组成的组：
-CDR1：SFGMS；CDR2：SISGSGSDTLYADSVKG；CDR3：GGSLSR；
-CDR1：LNLMG；CDR2：TITVGDSTNYADSVKG；CDR3：RRTWHSEL；
-CDR1：INLLG；CDR2：TITVGDSTSYADSVKG；CDR3：RRTWHSEL；
-CDR1：SFGMS；CDR2：SINGRGDDTRYADSVKG；CDR3：GRSVSRS；
-CDR1：SFGMS；CDR2：AISADSSDKRYADSVKG；CDR3：GRGSP；
-CDR1：SFGMS；CDR2：AISADSSDKRYADSVKG；CDR3：GRGSP；
-CDR1：NYWMY；CDR2：RISTGGGYSYYADSVKG；CDR3：
 DREAQVDTLDFDY.
在包括上文提及的CDR’s组合的本发明的纳米体中，每一CDR可以被选自由与所提及的CDR’s有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组的CDR所替代；其中
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或选自由与上述氨基酸序列之一所提及的CDR(s)具有3个、2个或只有1个(如前段所示)“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入。
然而，在包括上文提及的CDR’s组合的本发明的纳米体中，特别优选包括一个或多个上文列出的CDR’s的纳米体；更特别优选包括两个或多个上文列出的CDR’s的纳米体；并且最特别优选包括3个上文列出的CDR’s的纳米体。
在这些针对人血清白蛋白的纳米体中，构架区FR1-FR4优选地按照上文对于本发明的纳米体的定义。
特别优选的针对人血清白蛋白的纳米体选自由SEQ ID NO’s：107-121组成的组。这些对应本申请人于2005年5月18日提交的题目为“ImprovedNanobodiesTM against Tumor Necrosis Factor-alpha(针对肿瘤坏死因子-α的改进的纳米体TM)”的同时待审的美国临时申请中的SEQ ID NO’s：61-67，SEQ ID NO’s 87-89和SEQ ID NO’s 100-104的针对人血清白蛋白的纳米体。
更一般地，适于用于本发明的针对血清白蛋白的纳米体在本申请人于2006年5月17日国际提交的题目为“serum albumin binding proteins(血清白蛋白结合蛋白)”的国际申请中描述。
本发明的另一个实施方案是编码上述多肽构建体的核酸。
本发明的另一个实施方案是包含上述多肽构建体和至少一种血栓溶解剂的组合物，用于同时、分开或顺序地施用给受试者。
本发明的另一个实施方案是上述组合物，其中所述血栓溶解剂是葡萄球菌激酶、组织纤溶酶原激活物、链激酶、单链链激酶、尿激酶和酰基纤溶酶原链激酶复合物中的任一种。
本发明的另一个实施方案是上述多肽构建体、或上述核酸、或上述组合物，用于治疗、预防和/或减轻与血小板-介导的聚集或其功能障碍相关的紊乱。
本发明的另一个实施方案是上述多肽构建体、或上述核酸、或上述组合物在制备用于治疗、预防和/或减轻与血小板-介导的聚集或其功能障碍相关的紊乱的药物中的应用。
本发明的另一个实施方案是上述多肽构建体、核酸或组合物，或者上述多肽构建体、核酸或组合物的应用，其中所述紊乱由下列各项引起的任一种：瞬时脑局部缺血性发作、不稳定或稳定的绞痛、心绞痛、脑梗塞、心肌梗塞、外周动脉闭合疾病、再狭窄、冠状旁路(by-pass)移植、或冠状动脉阀置换和冠状干预诸如血管成形术，支架术(stenting)、颈动脉动脉内膜切除术或动脉粥样硬化斑切除术。
本发明的另一个实施方案是上述多肽构建体、核酸或组合物，或者上述多肽构建体、核酸或组合物的应用，其中所述紊乱是下列各项的任一种：非-闭合性血栓的形成，闭合性血栓的形成，动脉血栓形成，急性冠状闭合，再狭窄，PCTA或支架术之后的再狭窄，狭窄动脉中的血栓形成，血管成形术、动脉粥样硬化斑切除术或动脉支架术之后的增生，在脉管系统中或者缺少患病动脉的开放的闭合性综合征。
本发明的另一个实施方案是上述多肽构建体、核酸或组合物，或者上述多肽构建体、核酸或组合物的应用，其中所述紊乱是在高切应力的环境(high sheer environments)中的蚀斑或血栓形成。
本发明的另一个实施方案是上述多肽构建体、核酸或组合物，或者上述多肽构建体的应用，其中所述多肽构建体静脉内、皮下、口服、舌下、局部、鼻、阴道、直肠或通过吸入施用。
本发明的另一个实施方案是一种包含上述多肽构建体或编码所述多肽构建体的核酸、或上述组合物和药用赋性剂的组合物。
本发明的另一个实施方案是生产上述多肽的方法，其包括：
(a)在允许所述多肽表达的条件下，培养包含能够编码上述多肽的核酸的宿主细胞，和
(b)从所述培养物回收所产生的多肽。
本发明的另一个实施方案是上文所述方法，其中所述宿主细胞是细菌或酵母。
本发明的另一个实施方案是用于处理侵入性医学装置以防止侵入位点周围的血小板-介导的聚集的方法，所述方法包括将所述装置用上文所述的多肽构建体包被的步骤。
本发明的另一个实施方案是一种用于在侵入位点周围避开血小板-介导的聚集的侵入性医学装置，其中所述装置用上文所述的多肽构建体包被。
本发明的另一个实施方案是鉴定调节血小板-介导的聚集的试剂的方法，所述方法包括
(a)在允许所述多肽之间结合的条件下，存在和不存在候选调节剂时，将上文所述的多肽构建体与同其靶点相对应的多肽、或其片段相接触，和
(b)测定步骤(a)的多肽之间的结合，其中相对于不存在所述候选调节剂时的结合，在存在所述候选调节剂时的结合中的减少，鉴定了所述候选调节剂作为调节血小板-介导的聚集的候选调节剂。
本发明的另一个实施方案是用于按照上述方法筛选调节血小板-介导的聚集的试剂的试剂盒。
本发明的另一个实施方案是一种按照上述方法鉴定的调节血小板-介导的聚集的未知试剂。
本发明所另一个实施方案是诊断以血小板-介导的聚集功能障碍为特征的疾病或紊乱的方法，所述方法包括步骤：
(a)将样品与上述多肽构建体相接触，并且
(b)检测所述多肽构建体与所述样品的结合，并且
(c)将在步骤(b)中检测到的结合与标准值比较，其中相对于所述样品的结合的差异是以血小板-介导的聚集功能障碍为特征的疾病或紊乱的诊断症状。
本发明的另一个实施方案是用于按照上述方法筛选诊断以血小板-介导的聚集功能障碍为特征的疾病或紊乱的试剂盒。
本发明的另一个实施方案是上文所述的试剂盒，其包括上文所述的多肽构建体。
在本发明的多肽中，所述针对靶点的一个或多个本发明的纳米体可以是相同的序列。备选地，它们可以不全具有相同的序列。在本发明的范围内，本发明的多肽包含本发明的抗-靶点纳米体，其不全部共有相同的序列，但是其针对相同的靶点、或其片段、其一个或多个抗原。
本发明的另一方面，本发明的多肽包含两种或多种本发明的纳米体，其中任意两种本发明的纳米体针对不同的表位/靶点，即，针对vWF、vWFA1结构域、活化的vWF的A1结构域、vWF A3结构域中的任一种。
本发明的另一方面是一种本发明的双特异性的多肽，其包含一种针对vWF A1结构域、活化的vWF的A1结构域的本发明的纳米体，以及另一种针对vWF A3结构域的本发明的纳米体。所述本发明的双特异性的多肽抑制vWF和胶原蛋白之间的相互作用以及vWF和血小板之间的相互作用。
按照本发明的一个方面，本发明的多肽可以包含两种或多种已经结合的本发明的纳米体。所述本发明的纳米体可以在序列上相同，并且针对相同的靶点或抗原。取决于连接的VHHS的数目，多价VHH可以是二价的(2VHHs)、三价的(3VHHs)、四价的(4VHHs)或具有更高化合价的分子。
本发明还涉及这样的发现，即，本发明的多肽，其还包含每一种分别针对受试者的血清蛋白的一种或多种本发明的纳米体，与当不是所述构建体的部分的本发明的抗-靶点纳米体的半衰期相比较，令人吃惊的在所述受试者的循环中具有显著延长的半衰期。此外，发现所述构建体表现出同样有利的VHHs特性，诸如在小鼠中保持完整的高度稳定性、极端pH值抗性、高温稳定性和高靶点亲和性。
血清蛋白可以是在受试者的血清中发现的任何适宜的蛋白或其片段。在本发明的一个方面中，所述血清蛋白是血清白蛋白、血清免疫球蛋白、甲状腺素-结合蛋白、运铁蛋白、或凝血因子I。取决于目的用途，诸如对于有效治疗所需要的半衰期和/或靶点抗原的区分(compartimentalisation)，VHH-伙伴可以针对上述血清蛋白中的一种。
所述构建体能够在受试者的血清中循环几天，减少治疗的频率、对受试者的不便并且导致减少的治疗成本。此外，本发明的一个方面是本文公开的本发明的多肽的半衰期可以由在所述构建体中存在的本发明的抗-血清蛋白纳米体的数目控制。在一些情形中，例如在应用本发明的治疗性多肽的定时给药时，可控制的半衰期是理想的。
本发明的另一个实施方案是本文提及的本发明的多肽，其还包括血栓溶解剂。
所述血栓溶解剂可以通过共价的或非-共价的方式非-共价地或共价地附着到本发明的纳米体上。所述共价方式在下文描述。非-共价方式包括通过蛋白相互作用诸如生物素/链霉抗生物素蛋白(strepavidin)、或通过免疫缀合物。
备选地，所述血栓溶解剂可以关于本发明的多肽同时、分开或顺序地施用。
本发明的另一个方面是一种组合物，其包含至少一种本发明的多肽和至少一种血栓溶解剂，所述多肽和血栓溶解剂同时、分开或顺序地施用给受试者。
本发明的一个方面是治疗自体免疫疾病的方法，所述方法包括同时、分开或顺序地给个体施用有效量的至少一种本发明的多肽和至少一种血栓溶解剂。
本发明的另一个方面是包含同时、分开或顺序地施用给受试者的至少一种本发明的多肽和至少一种血栓溶解剂的试剂盒。本发明的一个方面是所述试剂盒可以按照本发明应用。本发明的一个方面是所述试剂盒可以用于治疗本文所引用的疾病。
同时施用意指将多肽和血栓溶解剂同时施用给受试者。例如，作为包含所述成分的混合物或组合物。实例包括但不限于，静脉内施用的溶液，片剂，液体，局部乳膏等，其中每种制剂包含目的成分。
分开施用意指将多肽和血栓溶解剂同时或基本上同时施用给受试者。所述成分作为分开的、未混合的制剂存在于试剂盒中。例如，多肽和血栓溶解剂可以作为个体片剂存在于试剂盒中。所述片剂可以通过同时吞咽两片片剂或者一片片剂直接跟着另一片而施用给受试者。
顺序施用意指将所述多肽和血栓溶解剂顺序地施用给受试者。多肽和血栓溶解剂作为分开的、未混合的制剂存在于试剂盒中。在给药之间存在时间间隔。例如，一种成分可以在另一种成分后达336，312，288，264，240，216，192，168，144，120，96，72，48，24，20，16，12，8，4，2，1或0.5小时施用。
在顺序施用中，在另一种成分施用之前和/或之后，一种成分可以施用一次，或者任何次数，并且以不同剂量。顺序施用可以与同时或顺序施用结合。
下文所述的本发明的多肽的医药用途，还适用于包含本发明的多肽和至少一种多肽血栓溶解剂的组合物，所述多肽和血栓溶解剂按照上文所公开同时、分开或顺序地施用给受试者。
按照本发明的血栓溶解剂可以包括，例如，葡萄球菌激酶、组织纤溶酶原激活物、链激酶、单链链激酶、尿激酶和酰基纤溶酶原链激酶复合物。
本发明的纳米体可以使用本领域内已知的方法或任何其它方法而连接形成本文公开的包含多于一种本发明纳米体的任何本发明的多肽。例如，它们可以通过将氨基酸残基与有机衍生剂反应而通过化学交联进行融合，诸如Blattler等，Biochemistry(生物化学)24，1517-1524；EP294703所述。备选地，本发明的纳米体可以在DNA水平上遗传融合，即形成编码完整的本发明的多肽的多聚核苷酸构建体，所述完整的多肽包含一个或多个本发明的抗-靶点纳米体和一个或多个本发明的抗-血清蛋白纳米体。用于生产本发明的二价或多价VHH多肽的方法在PCT专利申请WO96/34103中公开。一种连接多个本发明的纳米体的方法是通过遗传途径，直接地或通过肽接头而连接本发明的纳米体的编码序列。例如，本发明的第一纳米体的C-端可以连接到本发明的下一个纳米体的N-末端。这种连接模式可以延长，以连接本发明其它的纳米体，构建和产生三-、四-等功能性构建体。
本文公开的本发明的多肽可以由熟练的技术人员按照本领域已知的方法或任何其它方法制备。例如，可以使用本领域已知的方法获得VHHs，诸如通过免疫骆驼，并且从其获得杂交瘤，或者通过使用本领域已知的分子生物学技术克隆本发明的纳米体的文库，并且随后通过使用噬菌体展示进行选择。
纳米体具有由单一可变结构域组成的独特的结构。来源于骆驼科抗体的VHH分子是已知的最小的完整抗原-结合结构域之一(约15kDa，或比常规IgG小10倍)，并且因此非常适合递送到致密组织，并且适用于评估参与或者起始血小板介导的聚集过程的大分子之间的有限的空间。
除了纳米体的小的大小，并且因此适于穿透的优点之外，仍然令人吃惊地，这样的小分子可以抑制大的聚合物诸如vWF(达到60个单体)和胶原蛋白之间的相互作用，并且具有这样高的效率。已经描述只有大的多聚体形式的vWF才有止血活性(Furlan，M，.1996，Ann.Hematol.72：341-348)。多聚体vWF与胶原蛋白的结合以比单聚体vWF片段的结合高出～100-倍的亲和力而发生。
来自高切应力(shear)实验的结果表明更低的剂量可以施用给患者。因此，预计到更少的副作用(诸如免疫原性或出血问题)。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的多肽包含一个或多个针对相同靶点的本发明的纳米体，并且还包含一个或多个针对相同靶点但是针对相同结构域的不同表位的本发明的纳米体。
本发明的另一个实施方案是一种本发明的多肽，其中针对相同靶点的本发明的纳米体的数目是两个或更多个。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的多肽包含一个或多个针对相同靶点的一个结构域的本发明的纳米体，以及一个或多个针对相同靶点但是针对所述相同靶点的另一个结构域的本发明的纳米体。不同结构域的实例可以是vWF的A1和A3结构域。
本发明的一个非限制性方面，在本发明的异种特异性多肽中至少一个针对A1结构域的VHH识别vWF的活性构象。与单体VHH’s相比较，所述本发明的多肽可以具有优良的抗-血栓形成作用。在流动室(flow chamber)中进行灌流实验，以研究高切应力下的血小板聚集，从而研究本发明的这些多肽的效果。
本发明的天然存在的纳米体在美洲驼、单峰驼和骆驼中的发现揭示新的一类治疗分子，其将单克隆抗体的优点例如特异性、低毒性与小分子的优点例如组织穿透性和稳定性结合在一起。不幸地是，基于这些蛋白研发适宜的治疗产品具有骆驼科来源并且因此不是人源的缺点。非-人蛋白包含当注射到人患者中时可以产生免疫性的氨基酸残基。尽管研究已表明，当注射到小鼠中时，骆驼科-来源的VHH不产生免疫性，但是优选用人的残基取代骆驼科的残基。这些人源化的多肽在人中应该基本上不产生免疫性，但是保留野生型多肽的亲和性和活性。
优选人源化的结果，当施用到人患者中时免疫原性最小或不存在。按照本发明，将多肽人源化包括下述步骤：用在人共有序列中发现的它们的人类负体取代一个或多个骆驼科氨基酸，而所述多肽没有失去其典型性特征，即，人源化没有显著地影响得到的多肽的抗原结合能力。
WO 04/062551和本文的进一步叙述描述：抗体可变结构域(VHH)的氨基酸残基的一些优选的但非限制性的实例，所述氨基酸残基可以被修饰而不减小所述结构域对抗原的天然亲和力，并且同时减少其关于异源物种的免疫原性；在鉴定的残基具有有效用于施用给异源物种的修饰的VHHs的应用；以及这样修饰的VHH。更具体地，本发明还包括制备修饰的VHHs，其被修饰用于施用给人，包括获得的VHH本身，以及这样“人源化的”VHHs在治疗人类的疾病中的应用。
如在WO 04/062551中和在本文的进一步描述中提及，VHH多肽的人源化需要在单一多肽链引入并且诱变只是有限数目的氨基酸，而不显著损失结合和/或抑制活性。这与scFv、Fab、(Fab)2和IgG的人源化相反，其需要在两条链轻链和重链引入氨基酸变化，并且保留两条链的组装。
人源化技术可以通过下述方法进行，所述方法包括单独或组合地置换任意下列残基：FR1位置1，5，28和30，在FR2中位置37，44，45和47的标志氨基酸，FR3残基74，75，76，83，84，93和94，以及FR4中的位置103，104，108和111；编号按照Kabat编号方式。
本发明的纳米体与人种系VH DP-47具有高度同源性。进一步的人源化还可以包括在单一多肽链引入和诱变有限数目的氨基酸。这与scFv、Fab、(Fab)2和IgG的人源化相反，其需要在两条链轻链和重链引入氨基酸变化，并且保留两条链的组装。
所述多肽在FR2中包含人-样残基。人源化还可以包括诱变在FR1位置1和5的残基，所述诱变通过使用用于所有成分克隆的引物而引入，并且不在美洲驼序列中天然存在。这些残基的诱变没有导致结合和/或抑制活性的损失。FR1的人源化还需要诱变位置28和30。这些残基的诱变也没有导致结合和/或抑制活性的损失。
人源化还可以包括FR3中位置74，75，76，83，84，93，94的残基的诱变。这些残基的诱变没有导致结合和/或抑制活性的损失。
人源化还可以包括FR4中位置104，108和111的残基的诱变。Q108L诱变导致在大肠杆菌(Escherichia coli)中更低的生产水平。位置108在骆驼VHH中是暴露于溶剂的，而在人抗体中这一位置包埋在VH-VL界面(Spinelli，1996；Nieba，1997)。在分离的VHs中位置108暴露于溶剂。引入非极性疏水Leu代替极性不带电荷的Gln可以对分子的内在折叠/稳定性有显著的影响。
本发明的一个实施方案是将VHH人源化的方法，所述方法包括步骤：
(a)单独或组合地取代任何下述残基：
FR1位置1，5，28和30，
FR2中位置37，44，45和47的标志氨基酸，
FR3残基74，75，76，83，84，93和94，
和FR4中位置103，104，108和111；
编号按照Kabat编号方式。
所述人源化的序列的实例在下文及后附的序列表中给出。
由于一些原因，使用来源于诸如小鼠、绵羊、山羊、兔等的抗体及其人源化的衍生物作为需要调节血小板-介导的聚集的病况的治疗是成问题的。传统抗体在室温下不稳定，并且必须冷冻制备和保存，这需要必要的冷冻实验室设备、保存和转运，这构成时间和费用。在发展中国家冷冻有时并不可行。表达所述Fab分子的产量非常低，并且生产方法劳动量非常大。此外，由于对于表达完整和活性抗体必需的哺乳动物细胞系统在时间和设备上需要高水平的支持，并且产量很低，所以所述抗体的制备或小规模生产费用高。此外，传统抗体具有依赖于pH值的结合活性，并且因此对于用于常规生理pH值范围之外的环境不稳定，所述环境诸如例如在治疗胃出血、胃手术中。此外，传统抗体在低或高pH值不稳定，并且因此不适用于口服施用。然而，已经证明，骆驼科抗体抵抗苛刻条件，诸如极端pH值、变性试剂和高温(Ewert S等，Biochemistry 2002Mar19；41(11)：3628-36)，因此使得它们适于通过口服施用递送。此外，传统抗体具有依赖于温度的结合活性，并且因而不适合用于在生物活性-温度范围之外的温度(例如37±20℃)操作的检测或试剂盒。
本发明的纳米体和多肽不但具有常规抗体的有利特性，诸如低毒性和高选择性，而且它们还表现出其它特性。它们更加可溶，这意味着与常规抗体相比，它们可以以更高浓度保存和/或施用。它们在室温下稳定，这意味着它们可以无需使用冷冻设备而制备、保存和/或转运，实现成本、时间和环境节约。与常规抗体相比，其它有利特征包括在循环中的短的半衰期，所述半衰期可以按照本发明进行调节，例如，通过白蛋白-偶联，双特异性纳米体具有一种针对白蛋白的特异性和针对靶点的另一种特异性，Fc偶联，VHH偶联(二价VHHs)或通过聚乙二醇化。例如，对于需要在有限的时间期间抑制血小板-介导的聚集的手术程序，短的和可控制的半衰期是理想的。此外，当发生出血问题或其它并发症时，剂量可以立即降低。本发明的多肽还在超出常规生理范围的pH值和温度下保留结合活性，这意味着它们可以用于需要调节血小板-介导的聚集的极端的pH值和稳定的情形中，诸如胃手术、控制胃出血、在室温进行的检测中等。本发明的多肽还在极端pH值表现出延长的稳定性，这意味着它们适于通过口服施用递送。本发明的多肽可以在便利的重组宿主生物体诸如大肠杆菌和酵母菌中通过发酵而节约成本地生产；不同于还需要昂贵的哺乳动物细胞培养设备的常规抗体，获得的表达水平高。本发明的多肽的产率的实例是1-10mg/ml(大肠杆菌)并且达到1g/l(酵母菌)。本发明的多肽还表现出对于宽范围的不同的抗原类型的高结合亲和性，和结合不被常规抗体识别的表位的能力；例如，它们表现出具有透入腔的潜力的长的基于CDR的环结构，并且表现出酶功能抑制作用。此外，由于结合通常只通过CDR3环发生，所以考虑衍生于CDR3的肽可以治疗性应用(Desmyter等，J BiolChem(生物化学杂志)，2001，276：26285-90)。本发明的多肽作为与酶或毒素的融合蛋白还能够保留完全的结合能力。此外，可以预计，由于VHH不包含Fc，并且其不是二价的，所以当使用VHH时，将避免由Fc：Fc受体介导的血小板聚集的激活和/或F(ab′)(2)-介导的血小板交联而引起的不理想的血小板减少症，当使用完整的IgG或F(ab′)(2)进行体内治疗时已经观察到所述血小板减少症(参见Cauwenberghs N.等，Arteriosclerosis，Thrombosis and Vascular biology(动脉硬化，血栓和血管生物学)，2000，20：1347)。因此，本发明的多肽、其同源或功能性片段在与血小板-介导的聚集相关的病况治疗和诊断中提供相当大的成本和时间节约，并且需要所述多肽的患者将遇到与常规试剂相关的更少的问题。
血小板-介导的聚集是这样的过程，即，其中vWF-结合的胶原蛋白附着到血小板上和/或血小板受体上，最终导致血小板激活。血小板激活导致凝血因子I结合，并且最终导致血小板聚集。在本发明的范围内，提供调控这一过程的多肽，所述过程包括血小板-介导的聚集，诸如vWF-胶原蛋白结合、vWF-血小板受体附着、胶原蛋白-血小板受体附着、血小板激活、凝血因子I结合和/或血小板聚集。
按照本发明的一个方面，本发明的多肽可以是本发明的全长多肽的同源序列。按照本发明的另一个方面，本发明的多肽可以是本发明的全长多肽的功能片段。按照本发明的另一个方面，本发明的多肽可以是本发明的全长多肽的同源序列。按照本发明的另一个方面，本发明的多肽可以是本发明的全长多肽的同源序列的功能片段。按照本发明的一个方面，本发明的多肽可以包含本发明的多肽的序列。
按照本发明的一个方面，用于形成本发明的多肽的本发明的纳米体可以是本发明的完整的纳米体(例如VHH)或其同源序列。按照本发明的另一个方面，用于形成本发明的多肽的本发明的纳米体可以是本发明的完整的纳米体的功能性片段。按照本发明的另一个方面，用于形成本发明的多肽的本发明的纳米体可以是本发明的完整的纳米体的同源序列。按照本发明的另一个方面，用于形成本发明的多肽的本发明的纳米体可以是本发明的完整的纳米体的同源序列的功能片段。
按照本发明的另一个方面，本发明的多肽可以是亲本序列的同源序列。按照本发明的另一个方面，本发明的多肽可以是亲本序列的功能性片段。按照本发明的另一个方面，本发明的多肽可以是亲本序列的同源序列的功能片段。
当用于本文时，同源序列可以包括加入、删除或取代一个或多个氨基酸，所述氨基酸基本上不改变所述多肽的功能特征。氨基酸删除或取代的数目优选地达到1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69或70个氨基酸。
按照本发明的同源序列包括通过加入氨基酸形成人重链抗体或人单一结构域重链抗体而延长的多肽，其基本上不改变未修饰的多肽的功能性特征。
在同源序列指示序列相同性的情形中，它意指与亲本序列存在高序列相同性(大于70％，75％，80％，85％，90％，95％或98％的序列相同性)的序列，并且优选地特征在于亲本序列的相似特性，即，亲和性、使用已知方法计算的所述相同性。
备选地，同源序列还可以是允许在亲本序列的许多位置进行取代而获得的任何氨基酸序列，其按照下述规则：
Ser被Ser，Thr，Gly，和Asn取代；
Arg被Arg，His，Gln，Lys，和Glu中的一种取代；
Leu被Leu，Ile，Phe，Tyr，Met，和Val中的一种取代；
Pro被Pro，Gly，Ala，和Thr中的一种取代；
Thr被Thr，Pro，Ser，Ala，Gly，His，和Gln中的一种取代；
Ala被Ala，Gly，Thr，和Pro中的一种取代；
Val被Val，Met，Tyr，Phe，Ile，和Leu中的一种取代；
Gly被Gly，Ala，Thr，Pro，和Ser中的一种取代；
Ile被Ile，Met，Tyr，Phe，Val，和Leu中的一种取代；
Phe被Phe，Trp，Met，Tyr，Ile，Val，和Leu中的一种取代；
Tyr被Tyr，Trp，Met，Phe，Ile，Val，和Leu中的一种取代；
His被His，Glu，Lys，Gln，Thr，和Arg中的一种取代；
Gln被Gln，Glu，Lys，Asn，His，Thr，和Arg中的一种取代；
Asn被Asn，Glu，Asp，Gln，和Ser中的一种取代；
Lys被Lys，Glu，Gln，His，和Arg中的一种取代；
Asp被Asp，Glu，和Asn中的一种取代；
Glu被Glu，Asp，Lys，Asn，Gln，His，和Arg中的一种取代；
Met被Met，Phe，Ile，Val，Leu，和Tyr中的一种取代。
按照本发明的同源物可以是指，在严格杂交条件下，能够与编码多肽的核苷酸序列的反向-互补序列杂交的多于50，100，200，300，400，500，600，800或1000个核苷酸的核苷酸序列(诸如SAMBROOK等，MolecularCloning，Laboratory Manuel(分子克隆实验手册)，Cold Spring，HarborLaboratory press(冷泉港实验室出版)，纽约所述的那些)。
当用于本文时，功能性片段是指长度足够以致目的相互作用保持在1×10-6M或更好的亲和性的本发明的纳米体。
备选地，本发明的纳米体的功能性片段包含完整氨基酸序列的部分删除，并且仍然保持对于同靶点结合和相互作用必需的结合位点和蛋白结构域。
备选地，本发明的任一种纳米体的功能片段是这样一种多肽，即，其包含完整氨基酸序列的部分删除，并且其仍然保持对于抑制vWF与胶原蛋白结合所必需的结合位点和蛋白结构域。
备选地，本发明的任一种纳米体的功能片段是这样一种多肽，即，其包含完整氨基酸序列的部分删除，并且其仍然保持对于同vWF的A1结构域结合和相互作用所必需的结合位点和蛋白结构域。
备选地，本发明的任一种纳米体的功能片段是这样一种多肽，即，其包含完整氨基酸序列的部分删除，并且其仍然保持对于同胶原蛋白结合和相互作用所必需的结合位点和蛋白结构域。
备选地，功能片段包含多肽的完整氨基酸序列的部分删除，并且其仍然保持对于同其所针对产生的抗原的结合和相互作用所必需的结合位点和蛋白结构域。它包括，但不限于VHH结构域。
当用于本文时，当它是指多肽序列时，功能性片段是指小于序列的100％(例如，99％，90％，80％，70％，60％，50％等)，但是包括5个或更多个氨基酸。
当它是指编码多肽序列的核苷酸序列时，片段是指小于序列的100％(例如，99％，90％，80％，70％，60％，50％等)，但是包括15个或更多个核苷酸。
本发明的一个方面是按照本发明施用本发明的多肽可以避免对注射的需要。由于它们具有针对它们的靶点的极度特异性和低内在毒性，所以常规基于抗体的治疗具有作为药物的显著的潜力，然而，它们具有一个重要的缺点：它们相对不稳定，并且对蛋白酶分解敏感。这意味着，由于它们不抵抗在这些位点的低pH值，在这些位点以及在血液中的蛋白酶作用和/或由于它们大的大小，所以常规抗体药物不可以口服、舌下、局部、鼻、阴道、直肠或通过吸入施用。它们必须通过注射(静脉内、皮下等)施用，以克服这些问题中的一些。通过注射施用需要专业训练，以正确和安全地施用皮下注射器或针头。它还需要无菌设备，所述治疗多肽的液体制剂，所述多肽以无菌和稳定形式的小瓶包装，以及受试者进入针头的适宜位点。此外，在接受注射之前以及在接受注射时，受试者通常经历身体和心理压力。
本发明的一个方面通过提供本发明的多肽构建体而克服现有技术的这些问题。所述构建体足够小、抗性和稳定，以被口服、舌下、局部、鼻、阴道、直肠和通过吸入递送，而基本上不损失活性。本发明的多肽构建体避免对于注射的需要，不但节约成本/时间，而且其对于受试者还是更加便利和更加舒服的。
本发明的一个实施方案是本发明的多肽用于治疗、预防和/或减轻对控制血小板介导的聚集的物质的调控而敏感的紊乱的症状，所述物质能够通过胃环境而所述物质没有失活。
如本领域的技术人员已知，一旦拥有所述本发明的多肽，配制技术可以用来在正确的位置(在胃中，在结肠中)释放最大量的多肽。这种递送方法对于治疗、预防和/或减轻其靶点位于内脏系统的紊乱的症状很重要。
本发明的一个方面是一种治疗、预防和/或减轻对控制血小板介导的聚集的物质的调控而敏感的紊乱的症状的方法，所述物质能够通过胃环境而不失活，所述方法通过给受试者口服施用本发明的多肽而进行。
本发明的另一个实施方案是将本发明的纳米体或多肽用于制备治疗、预防和/或减轻对控制血小板介导的聚集的物质的调控而敏感的紊乱的症状的药物的应用，所述物质能够通过胃环境而不失活。
本发明的一个方面是一种将控制血小板介导的聚集的物质递送至内脏系统而所述物质不失活的方法，所述方法通过给受试者口服施用本发明的纳米体或多肽而进行。
本发明的一个方面是将控制血小板介导的聚集的物质递送至受试者的血流中而所述物质不失活的方法，所述方法通过给受试者口服施用本发明的纳米体或多肽而进行。
本发明的另一个实施方案是本发明的纳米体或多肽用于治疗、预防和/或减轻对递送至阴道和/或直肠道的控制血小板介导的聚集的物质的调控而敏感的紊乱的症状的应用。
在一个非限制性实例中，一种按照本发明的制剂包含本发明的纳米体或多肽，其以凝胶、乳膏、栓剂、薄膜形式，或者以海绵形式或作为随时间缓慢释放活性成分的阴道环(这样的制剂在EP 707473，EP 684814，US5629001中所述)。
本发明的一个方面是一种用于治疗、预防和/或减轻对对递送至阴道和/或直肠道的控制血小板介导的聚集的物质的调控而敏感的紊乱症状的方法，所述方法通过给受试者阴道和/或直肠施用本发明的纳米体或多肽而进行。
本发明的另一个实施方案是本发明的纳米体或多肽用于制备治疗、预防和/或减轻对对递送至阴道和/或直肠道的控制血小板介导的聚集的物质的调控而敏感的紊乱症状的药物的应用。
本发明的一个方面是一种将控制血小板介导的聚集的物质递送至阴道和/或直肠道而所述物质不失活的方法，所述方法通过将本发明的纳米体或多肽施用至受试者的阴道和/或直肠道而进行。
本发明的一个方面是一种将控制血小板介导的聚集的物质递送至受试者的血流而所述物质不失活的方法，所述方法通过将本发明的纳米体或多肽施用至受试者的阴道和/或直肠道而进行。
本发明的另一个实施方案是本发明的纳米体或多肽用于治疗、预防和/或减轻对递送至鼻、上呼吸道和/或肺的控制血小板介导的聚集的物质的调控而敏感的紊乱的症状。
在一个非限制性实例中，一种按照本发明的制剂包含以鼻喷雾(例如，气溶胶)或吸入器形式的本发明的纳米体或多肽。由于本发明的纳米体或多肽很小，所以它可以比治疗性IgG分子更加有效得多地到达其靶点。
本发明的一个方面是一种用于治疗、预防和/或减轻对递送至上呼吸道和肺的控制血小板介导的聚集的物质的调控而敏感的紊乱症状的方法，所述方法通过由嘴或鼻吸入给受试者施用本发明的纳米体或多肽而进行。
本发明的另一个实施方案是将本发明的纳米体或多肽用于制备治疗、预防和/或减轻对递送至鼻、上呼吸道和/或肺而所述多肽不失活的控制血小板介导的聚集的物质的调控而敏感的紊乱症状的药物的应用。
本发明的一个方面是一种用于将控制血小板介导的聚集的物质递送至鼻、上呼吸道和肺而不失活的方法，所述方法通过将本发明的纳米体或多肽施用至受试者的鼻、上呼吸道和/或肺而进行。
本发明的一个方面是一种用于将控制血小板介导的聚集的物质递送至受试者的血流中而不失活的方法，所述方法通过将本发明的纳米体或多肽施用至受试者的鼻、上呼吸道和/或肺而进行。
本发明的一个实施方案是本发明的纳米体或多肽用于治疗、预防和/或减轻对递送至肠黏膜的控制血小板介导的聚集的物质的调控而敏感的紊乱症状，其中所述紊乱增加肠黏膜的渗透性。由于它们小的大小，本发明的纳米体或多肽可以穿过肠黏膜，并且更有效地到达患有引起肠黏膜渗透性增加的紊乱的患者中的血流。
本发明的一个方面是一种用于治疗、预防和/或减轻对递送至肠黏膜的控制血小板介导的聚集的物质的调控而敏感的紊乱症状的方法，其中所述紊乱增加肠黏膜的渗透性，所述方法通过给受试者口服施用本发明的纳米体或多肽而进行。
这一过程甚至可以通过本发明的另一个方面--活性转运载体的应用--而进一步增强。在本发明的这一方面，将VHH融合到增强通过肠壁进入血流的转运的载体上。在一个非限制性实例中，这一“载体”是融合到治疗性VHH上的第二VHH。这种融合构建体使用本领域已知的方法制备。“载体”VHH特异性结合肠壁上的受体，所述受体诱导通过壁的活性转运。
本发明的另一个实施方案是本发明的纳米体或多肽用于制备治疗、预防和/或减轻对递送至肠黏膜的控制血小板介导的聚集的物质的调控而敏感的紊乱症状的药物的应用，其中所述紊乱增加肠黏膜的渗透性。
本发明的一方面是将控制血小板介导的聚集的物质递送至肠黏膜而没有失活的方法，其通过给受试者口服施用本发明纳米体或多肽而进行。
本发明的一个方面是将控制血小板介导的聚集的物质递送至受试者的血流而没有失活的方法，其通过给受试者口服施用本发明的纳米体或多肽而进行。
这一过程甚至可以通过本发明的另一个方面--活性转运载体的应用--而进一步增强。在本发明的这一方面，将本文所述的本发明的纳米体或多肽融合到增强通过肠壁进入血流的转运的载体上。在一个非限制性实例中，这一“载体”是融合到所述多肽上的VHH。这种融合构建体使用本领域已知的方法制备。“载体”VHH特异性结合肠壁上的受体，所述受体诱导通过壁的活性转运。
本发明的一个实施方案是本发明的纳米体或多肽用于治疗、预防和/或减轻对能够有效通过舌下组织的控制血小板介导的聚集的物质的调控而敏感的紊乱症状。将本发明的所述纳米体或多肽的制剂，例如，片剂、喷雾剂、滴剂，置于舌下，并且通过粘膜吸收到舌下的毛细管网中。
本发明的一个方面是一种用于治疗、预防和/或减轻对能够有效通过舌下组织的控制血小板介导的聚集的物质的调控而敏感的紊乱症状的方法，所述方法通过给受试者舌下施用本发明的纳米体或多肽而进行。
本发明的另一个实施方案是本发明的纳米体或多肽用于制备治疗、预防和/或减轻对能够通过舌下组织的控制血小板介导的聚集的物质的调控而敏感的紊乱症状的药物的应用。
本发明的一个方面是一种用于将控制血小板介导的聚集的物质递送至舌下组织而没有失活的方法，所述方法通过给受试者舌下施用本发明的纳米体或多肽而进行。
本发明的一个方面是一种将控制血小板介导的聚集的物质递送至受试者的血流而没有失活的方法，所述方法通过给受试者口服施用本发明的纳米体或多肽而进行。
本发明的一个实施方案是本发明的纳米体或多肽用于治疗、预防和/或减轻对能够有效透过皮肤的控制血小板介导的聚集的物质的调控而敏感的紊乱的症状。
将本发明的所述纳米体或多肽的制剂，例如，乳膏、薄膜、喷雾剂、滴剂、贴片，置于皮肤上，并且透过皮肤。
本发明的一个方面是一种用于治疗、预防和/或减轻对能够有效透过皮肤的控制血小板介导的聚集的物质的调控而敏感的紊乱症状的方法，所述方法通过给受试者局部施用本发明的纳米体或多肽而进行。
本发明的另一个实施方案是本发明的纳米体或多肽用于制备治疗、预防和/或减轻对能够有效透过皮肤的控制血小板介导的聚集的物质的调控而敏感的紊乱症状的药物的应用。
本发明的一个方面是一种用于将控制血小板介导的聚集的物质递送至皮肤而没有失活的方法，所述方法通过给受试者局部施用本发明的纳米体或多肽而进行。
本发明的一个方面是一种用于将控制血小板介导的聚集的物质递送至受试者的血流中而没有失活的方法，所述方法通过给受试者局部施用本发明的纳米体或多肽而进行。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的纳米体或多肽还包含本发明的载体纳米体(例如VHH)，其作用为活性转运载体用于将所述本发明的纳米体或多肽从肺内腔转运至血液中。
还包括载体的本发明的纳米体或多肽特异性地与黏膜表面(支气管上皮细胞)上存在的受体结合，导致所述多肽从肺内腔到血液的活性转运。所述本发明的载体纳米体可以融合到本发明的纳米体或多肽上。这种融合构建体使用本领域已知的方法制备，并且在本文描述。所述本发明的“载体”纳米体特异性地与黏膜表面上的受体结合，其诱导通过所述表面的活性转运。
本发明的另一个方面是确定在鼻施用时将哪一种本发明的纳米体(例如VHHs)活性转运至血流中的方法。类似地，首次用于实验的或免疫VHH噬菌体文库可以进行鼻施用，并且在施用后的不同时间点，可以分离血液或器官，以拯救已经被活性转运到血流的噬菌体。用于从肺内腔到血流的活性转运的受体的非限制性实例是Fc受体N(FcRn)。本发明的一个方面包括通过所述方法鉴定的VHH分子。然后所述VHH可以用作载体VHH，用于在鼻施用时，将治疗性VHH递送到血流中相对应的靶点。
本发明的一个实施方案是本发明的纳米体或多肽用于治疗、预防和/或减轻与血小板-介导的聚集或其功能障碍有关的紊乱的症状。所述紊乱包括，血栓形成血小板减少性紫癜(TTP)，瞬时脑局部缺血性发作，不稳定或稳定的心绞痛，脑梗塞，心肌梗塞、外周动脉闭合疾病、再狭窄。所述紊乱还包括由冠状旁路移植，冠状动脉阀置换和冠状干预诸如血管成形术、支架术或动脉粥样硬化斑切除术引起的那些。
其它紊乱是下列各项中的任一种：非-闭合性血栓的形成，闭合性血栓的形成，动脉血栓形成，急性心肌梗塞，再狭窄，PCTA或支架术后的再狭窄，狭窄动脉中的血栓形成，血管成形术、动脉粥样硬化斑切除术或动脉支架之后的增生，血管系统中的闭合综合征或者缺乏患病动脉的开放性。
本发明的一个方面是本发明的纳米体或多肽用于治疗、预防和/或减轻与血小板-介导的聚集或其功能障碍有关的紊乱或病况，其中所述本发明的纳米体或多肽静脉内、皮下、口服、舌下、局部、鼻、阴道、直肠或通过吸入进行施用。
本发明的另一个方面是本发明的纳米体或多肽用于制备治疗、预防和/或减轻与血小板-介导的聚集或其功能障碍有关的紊乱或病况的药物的应用，其中所述本发明的纳米体或多肽静脉内、皮下、口服、舌下、局部、鼻、阴道、直肠或通过吸入进行施用。
本发明的另一个方面是治疗、预防和/或减轻与血小板-介导的聚集或其功能障碍有关的紊乱或病况的方法，所述方法包括给受试者施用本发明的纳米体或多肽，其中所述本发明的异种特异性纳米体或多肽静脉内、皮下、口服、舌下、局部、鼻、阴道、直肠或通过吸入进行施用。
本发明的另一个方面是本发明的纳米体或多肽用于治疗、预防和/或减轻与血小板-介导的聚集或其功能障碍有关的紊乱或病况。
本发明的另一个方面是本发明的多肽制备用于治疗、预防和/或减轻与血小板-介导的聚集或其功能障碍有关的紊乱或病况的药物的应用。
可以应用本发明的纳米体或多肽，以筛选调节所述多肽与vWF的结合的试剂。当在单独测定结合或所述多肽的置换的检测中鉴定时，试剂必须进行功能性测试，以确定它们是否作用为血小板-介导的聚集的调节剂。适当的筛选方法的一些实例在WO 04/062551中讨论。当然，这些方法容易地用于筛选改变本文公开的本发明的纳米体或多肽与vWF之间的结合的候选调节剂。
按照本发明使用的细胞优选地选自由下列各项组成的组：细菌细胞，诸如例如大肠杆菌；酵母细胞，诸如例如酿酒酵母、毕赤酵母(P.pastoris)；昆虫细胞或哺乳动物细胞，例如上文提及的那些。
按照本发明使用的细胞可以是其中可以引入或者已经引入编码本发明的纳米体或多肽的核酸序列以致所述多肽在自然水平或高于自然水平进行表达的任何细胞，如本文所定义。优选地，在细胞中表达的本发明的多肽表现出正常的或接近正常的药理学，如本文所定义。
按照本发明的一个优选的实施方案，细胞选自由COS7-细胞，CHO细胞，LM(TK-)细胞，NIH-3T3细胞HEK-293细胞，K-562细胞或1321N1星细胞瘤细胞以及其它可转染的细胞系组成的组。
大体上，“治疗有效量”、“治疗有效剂量”和“有效量”意指获得理想的一项或多项结果(治疗或防止血小板聚集)所需要的量。本领域的普通技术人员应该意识到，效果，并且因此，“有效量”可以关于本发明中所用的抑制血小板-介导的聚集的不同的纳米体或多肽而不同。本领域的技术人员可以容易地评估所述纳米体或多肽的效果。
“药用”意指非生物性或另外不理想的物质，即，所述物质可以与所述纳米体或多肽一起施用给个体，而不引起任何不理想的生物作用或不以有害方式与其中所包含的药物组合物的任何其它成分相互作用。
本文公开的本发明用于治疗或预防受试者中血小板-介导的聚集的病况，并且包括施用药物有效量的抑制BTK并且抑制血小板-介导的聚集的纳米体或多肽或组合物。
本文公开的本发明用于治疗或预防受试者中血栓形成的第一步，并且包括施用药物有效量的按照本发明的纳米体或多肽或组合物。
本文公开的本发明用于在受试者中治疗或预防再狭窄，并且包括施用药物有效量的按照本发明的纳米体或多肽或组合物。
本发明的一个方面是本发明的纳米体或多肽用于治疗或预防受试者中血小板-介导的聚集的病况的应用，并且包括施用与另一种诸如例如阿司匹林组合的药物有效量的纳米体或多肽。
本发明的一个方面是本发明的纳米体或多肽用于治疗或预防受试者中血小板-介导的聚集的病况的应用，并且包括施用与另一种诸如例如血栓溶解剂组合的药物有效量的纳米体或多肽。
本发明的另一个方面是本发明的纳米体或多肽用于在个体中治疗或预防蚀斑或血栓的应用。所述蚀斑或血栓形成可以在高切应力(high sheer)的条件下形成。在血栓症和再闭合症(reocclusion)二者中，血小板在高切应力速率下的可逆的黏附或粘连之后接着是通过血小板上的胶原蛋白受体的牢固的黏附，导致血小板的活化；血小板通过vWF与暴露于受损的血管壁的胶原蛋白的粘连在高切应力条件下特别重要。本发明人已经发现，本发明的纳米体或多肽在高切应力条件下(high sheer conditions)出乎意料地表现良好。
本发明不限于施用包含单一的本发明的纳米体或多肽的制剂。在本发明的范围内，提供组合治疗，其中将包含多于一种本发明的纳米体或多肽的制剂施用给需要其的患者。
血小板-介导的聚集的病况包括，但不限于，不稳定的绞痛，稳定的绞痛，心绞痛，栓形成，深度无益的血栓症(deep vain thrombosis)，溶血性尿毒综合征，溶血性贫血症，急性肾衰竭，血栓溶解并发症，血栓形成血小板减少性紫癜，散发性血管内comgelopathy，血栓症，冠心病，血栓栓塞并发症，心肌梗塞，再狭窄，和在动脉纤维中的动脉血栓形成，慢性不稳定的绞痛，瞬时局部缺血性发作和中风，外周血管病，动脉血栓症，先兆子痫，栓塞症，在血管成形术、颈动脉动脉内膜切除术、血管移植物接合以及慢性暴露于心脏血管装置之后的再狭窄和/或血栓症。所述病况还可以在溶解血栓的治疗过程中或之后，在血管成形术之后，以及在冠状动脉旁路移植之后，由血栓栓塞和再闭合症导致。
在本领域内公知怎样使用本文所述的标准检测或使用其它相似的检测而确定对血小板-介导的聚集的抑制。优选地，所述方法将导致至少10％的血小板-介导的聚集的减少，包括，例如，15％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，或之间的任何量，更优选地90％。
类似地，所述方法将导致至少10％的细胞内钙运用的减少，包括，例如，15％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％。类似地，所述方法将导致至少10％的磷酸化的PLCg 2水平的减少，包括，例如，15％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％。
例如，所述减少可以通过在按时间记录血小板聚集仪(chronologyplatelet aggregometer)中比较光学阻抗(optical impedence)而测定。还可以使用任何其它已知的检测方法。例如，(1)当胶原蛋白刺激时，胶原蛋白-诱导的细胞内钙运用水平随时间增加，并且因此所述检测可以包括检测胶原蛋白-诱导的细胞内钙的水平，或者(2)当胶原蛋白刺激时，磷酸化的PLCg 2的水平随时间增加，并且因此所述检测可以包括检测磷酸化的PLCg 2的水平。
细胞可以体外接触，例如，通过将本发明的纳米体或多肽加入到培养基中(通过连续的输注，通过大丸剂递送，或通过将所述培养基改变为包含所述纳米体或多肽的培养基)，或者通过将所述纳米体或多肽体内加入到细胞外流体中(通过局部递送，系统递送，吸入，静脉内注射，大丸剂递送或连续输注)。与细胞或细胞群体“接触”的持续时间由所述纳米体或多肽在培养基中或在浸泡所述一种或多种细胞的细胞外流体中以生理有效水平或以假定的生理有效水平存在的时间而确定。优选地，接触的持续时间为1-96小时，并且更优选地，24小时，但是所述时间将基于所述纳米体或多肽的半衰期而不同，并且可以由本领域的技术人员使用常规实验而进行最优化。
用于本发明的纳米体或多肽可以配制成药物组合物，并且施用给哺乳动物宿主，诸如人患者或家畜，以适用于所选的施用途径的各种形式施用，施用途径即口服或肠胃外、通过鼻内、通过吸入、静脉内、肌内、局部或皮下途径。
本发明的纳米体或多肽还可以使用递送的基因治疗方法进行施用。参见，例如，美国专利No.5,399,346，其通过引用完全结合。应用递送的基因治疗方法，转染了用于本发明的纳米体或多肽的基因的初级细胞另外可以转染组织特异性启动子，以靶向特异的器官、组织、移植物、肿瘤或细胞。
因此，所述纳米体或多肽可以全身施用，例如，口服，与药用赋形剂诸如惰性稀释剂或可同化的食用载体组合。它们可以封装在硬或软壳白明胶胶囊中，可以压缩成片剂，或者可以直接与患者的日常饮食的食物结合。对于口服治疗性施用，所述纳米体或多肽可以与一种或多种赋形剂结合，并且以可吸收的片剂、口腔片剂、药片、胶囊、酏剂、混悬液、糖浆、糯米纸囊剂等形式使用。这种组合物和制剂应该包含至少0.1％的所述纳米体或多肽。当然，所述组合物和制剂的百分数可以改变，并且可以便利地在所给单位剂型的约2-约60重量％。所述纳米体或多肽在所述治疗用组合物中的量如此，以致将获得有效的剂量水平。
所述片剂、药片、丸剂、胶囊等还可以包含下述：粘合剂，诸如黄蓍胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或白明胶；赋形剂，诸如磷酸二钙；崩解剂，诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸等；润滑剂，诸如硬脂酸镁；并且可以加入甜味剂，诸如蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦，或者调味剂，诸如欧薄荷、冬青油、或樱桃调味剂。当单位剂型是胶囊时，除上述类型的物质之外，它还可以包含液体载体，诸如植物油或聚乙二醇。各种其它物质可以作为涂层存在，或者另外修饰所述固体单位剂型的物理形式。例如，片剂、丸剂、或胶囊可以用白明胶、蜡、紫胶或糖等包被。糖浆或酏剂可以包含所述纳米体或多肽，作为甜味剂的蔗糖或果糖，作为防腐剂的甲基和丙基对羟基苯甲酸酯类，染料和调味剂诸如樱桃或橙味调味剂。当然，在制备任何单位剂型中所用的任何物质都应该是药物可接受的，并且在所用的量上基本上无毒。另外，所述纳米体或多肽可以结合在持续释放的制剂和装置中。
所述纳米体或多肽还可以通过输注或注射进行静脉内或腹膜内施用。所述纳米体或多肽的溶液可以在水中制备，任选地与无毒表面活性剂混合。分散剂还可以在甘油、液体聚乙二醇、三醋精及其混合物中以及在油中制备。在普通的保存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物的生长。
适于注射或输注的药物剂型可以包括无菌的水溶液或分散液或者包含活性成分的无菌粉剂，其适合即时制备无菌注射或输注溶液或分散液，任选地包封在脂质体中。在所有情形中，在制备和保存条件下，最终剂型必须是无菌的、流动的和稳定的。液体载体或赋形剂可以是溶剂或液体分散介质，例如，其包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯及其适当的混合物。可以保持适当的流动性，例如，通过形成脂质体，在分散剂的情形中通过保持需要的颗粒大小或者通过使用表面活性剂。防止微生物作用可以通过各种抗细菌和抗真菌试剂获得，例如，对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情形中，优选地包括等渗剂，例如，糖、缓冲剂或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在所述组合物中使用延迟吸收剂例如单硬脂酸铝和白明胶而获得。
无菌注射溶液通过将需要量的纳米体或多肽结合在适当的溶剂中，当需要时，与上文列举的其它成分一起结合，然后进行过滤除菌。在用无菌粉剂制备无菌注射溶液的情形中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分加上在先前的无菌过滤溶液中存在的任何其它理想的成分的粉剂。
对于局部给药，所述纳米体或多肽可以以纯的形式应用，即，在它们是液体的情形中。然而，通常理想地将它们作为与皮肤病学可接受的载体结合的组合物或制剂施用到皮肤上，所述载体可以是固体或液体。
有用的固体载体包括细碎分裂的固体，诸如滑石、粘土、微晶纤维素、硅石、矾土等。有用的液体载体包括水、羟烷类或二醇类或水-醇/二醇掺合剂，其中所述纳米体或多肽可以以有效水平溶解或分散，任选地在无毒表面活性剂的帮助下。可以添加佐剂诸如香味剂和其它抗微生物剂，以将给定用途的特性最优化。得到的液体组合物可以从吸收衬垫施用，用于浸渍的绷带及其它敷料，或者使用泵型或气溶胶喷雾器喷到感染区域。
增稠剂诸如合成的聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐及酯、脂肪醇、改性纤维素或改性的矿物质还可以与液体载体一起使用，以形成易涂开的糊剂、凝胶、药膏、皂剂等，用于直接涂覆到使用者的皮肤。
可以用于将所述纳米体或多肽递送到皮肤的有用的皮肤病学组合物的实例是本领域已知的；例如，参见Jacquet等(U.S.Pat.No.4,608,392)，Geria(U.S.Pat.No.4,992,478)，Smith等(U.S.Pat.No.4,559,157)和Wortzman(U.S.Pat.No.4,820,508)。
所述纳米体或多肽的有用剂量可以通过比较它们的体外活性和在动物模型中的体内活性而确定。将在小鼠和其它动物中的有效剂量外推至人的方法是本领域已知的；例如，参见U.S.Pat.No.4,938,949。
通常，所述纳米体或多肽在液体组合物诸如洗液中的浓度约0.1-25wt-％，优选地约0.5-10wt-％。在半固体或固体组合物诸如凝胶或粉剂中的浓度约0.1-5wt-％，优选地约0.5-2.5wt-％。
需要用于治疗的所述纳米体或多肽的量随着施用途径、要治疗的病况的性质以及患者的年龄和病况而变化，并且最终取决于随从医生或临床医生的判断力。此外，所述纳米体或多肽的剂量变化取决于靶点细胞、肿瘤、组织、移植物或器官。
理想的剂量可以便利地以单一剂量或作为在适当的时间间隔施用的分割的剂量而存在，例如，作为每天2、3、4次或更多的亚剂量。所述亚剂量本身可以进一步分割，例如，分割成许多次不连续的宽松间隔的施用；诸如从吸入器多次吸入，或者通过使用多滴到眼睛中。
施用方案可以包括长期的、日常的治疗。“长期”意指至少2周，并且优选地几个星期、数月或数年的持续时间。在这一剂量范围的必要的修改可以由本领域的普通技术人员仅仅使用本文的教导所给的常规实验而确定。参见Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明顿的药物科学)(Martin，E.W.ed.4)，Mack Publishing Co.(马克出版公司)Easton，PA。在任何并发症情形中，剂量还可以由个别医生进行调整。
本发明提供一种作为血小板-介导的聚集的调节剂的试剂。
所述候选试剂可以是合成试剂、或试剂的混合物，或可以是天然产物(例如，植物提取物或培养物上层清液)。按照本发明的候选试剂包括可以合成的小分子、天然提取物、肽、蛋白、碳水化合物、脂质等。
可以从合成的或天然试剂的大文库筛选候选调节剂。目前应用许多方法来随机和定向地合成糖、肽和基于核酸的试剂。合成试剂文库可以从许多公司商购，包括Maybridge Chemical Co.(Maybridge化学公司)(Trevillet，康沃尔，英国)，Comgenex(普林斯顿，新泽西州)，Brandon Associates(Merrimack，新罕布什尔)，和Microsource(New Milford，康奈提格州)。一种稀有的化学文库可从Aldrich(密尔沃基，威斯康星州)获得。组合文库可获得并且可以制备。备选地，以细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然试剂的文库可从例如Pan Laboratories(Pan实验室)(Bothell，华盛顿州)或MycoSearch(NC)获得，或者通过本领域公知的方法容易地生产。另外，天然和合成产生的文库和试剂通过常规化学、物理和生化方法而容易地修饰。
有用的试剂可以在许多化学种类中找到。有用的试剂可以是有机试剂或小的有机试剂。小的有机试剂具有大于50而小于约2,500道尔顿的分子量，优选地小于约750，更优选地小于约350道尔顿。示例性种类包括杂环、肽、糖、类固醇等。所述试剂可以被修饰，以提高功效、稳定性、药物相容性等。试剂的结构识别可以用来鉴定、产生或筛选其它试剂。例如，在肽试剂得以鉴定的情形中，它们可以以各种方式进行修饰，以提高它们的稳定性，诸如使用非天然氨基酸，诸如D-氨基酸，特别是D-丙氨酸，通过官能化氨基或羧基端，例如，对于氨基、酰化或烷化，并且对于羧基，酯化或酰胺化(amidification)，等等。
对于初级筛选，按照本发明的候选试剂的有用浓度是从约10mM到约100μM或更大(即1mM，10mM，100mM，1M等)。初级筛选浓度将用作上限，与9个其它浓度一起，其中所述其它浓度通过以半-对数间隔减少所述初级筛选浓度而确定(例如，对于9个其它浓度)，用于二级筛选或用于产生浓度曲线。
按照本发明的高通量的筛选试剂盒包括用于进行检测调节血小板-介导的聚集的试剂的所有必要的装置和介质，其中所述调节通过在存在多肽时，多肽优选地在1μM-1mM的浓度范围，与本发明的靶点诸如例如vWF或其片段相互作用而进行。所述试剂盒包括下述。本发明的重组细胞，其包括并且表达编码vWF的核苷酸序列，或其片段，按照所述试剂盒，所述重组细胞在固体支持物上生长，诸如微量滴定平板，更优选地在96孔微量滴定平板上生长，这是按照本领域技术人员公知的方法，特别是在WO 00/02045中所述进行。备选地，vWF或其片段以纯的形式提供，例如，由本领域的技术人员固定在96孔微量滴定平板上。备选地，所述试剂盒中提供预先固定，例如，预先固定在96孔微量滴定平板上的vWF或其片段。在存在适当浓度的本发明的纳米体或多肽时，所述多肽的所述浓度优选地在1μM-1mM范围，将按照本发明的调节剂，浓度从约1μM到1mM或更多，加入到确定的孔中。试剂盒可以包含多于一种的多肽。
结合检测按照本文已经公开的方法进行，并且将结果与基线水平比较，所述基线水平例如，vWF或其片段与本发明的多肽的结合，但是不存在加入的调节剂。(例如)当与不存在调节剂的活性水平相比较时，选择在vWF-多肽结合中表现出至少2倍、优选地5倍、更优选地10倍和最优选地100倍或更大的增加或减少的孔用于进一步分析。
本发明提供用于筛选血小板-介导的聚集的调节剂的试剂盒，以及用于诊断以血小板-介导的聚集的失调为特征的疾病或紊乱的试剂盒。按照本发明应用的试剂盒可以包括分离的vWF，或其片段。备选地，或者另外，试剂盒可以包括被转化以表达vWF或其片段的细胞。在另一个实施方案中，按照本发明的试剂盒可以包括编码vWF或其片段的多聚核苷酸。在另一个实施方案中，按照本发明的试剂盒可以包括用于vWF或其片段扩增的特异引物。按照本发明应用的试剂盒可以包括本发明的纳米体或多肽。按照本发明的试剂盒可以包括被转化以表达所述多肽的细胞。试剂盒可以包含多于一种的多肽。在另一个实施方案中，按照本发明的试剂盒可以包括编码大分子，例如，vWF或其片段的多聚核苷酸。在另一个实施方案中，按照本发明的试剂盒可以包括用于大分子诸如例如vWF或其片段扩增的特异引物。因此所有按照本发明的试剂盒应该包括规定的项目或项目组合，以及包装物质。试剂盒还包括使用说明书。
本发明还提供用本发明的纳米体或多肽包被的侵入性医学装置，或从本发明的筛选方法获得的试剂用于需要其的装置。装置的非限制性实例包括外科手术管、闭合装置、修复装置。所述装置的应用包括在侵入位点周围需要调节血小板-介导的聚集的手术步骤。
本发明的一个实施方案是一种用于处理侵入医学装置以在侵入位点周围防止血小板-介导的聚集的方法，所述方法包括将所述装置用本发明的纳米体或多肽或者按照本发明的试剂包被的步骤。
本发明的另一个实施方案是侵入医学装置，其防止在侵入位点附近血小板介导的聚集，其中所述装置包被了本发明的纳米体或多肽或按照本发明的试剂。
在另一个方面中，本发明涉及用于预防和/或治疗至少一种聚集-介导的紊乱(如本文所述)的方法，所述方法包括给需要其的受试者施用药物活性量的本发明的纳米体、本发明的多肽、和/或包括其的药物组合物。
在本发明的上下文中，术语“预防和/或治疗”不但包括预防和/或治疗疾病，而且通常包括预防所述疾病的发作，减缓或逆转疾病进程，防止或减缓与所述疾病相关的一种或多种症状的发作，减少和/或减轻与所述疾病相关的一种或多种症状，减少所述疾病和/或与之相关的任何症状的严重性和/或持续时间，和/或防止所述疾病的严重性和/或与之相关的任何症状的进一步增加，防止、减少或逆转由所述疾病以及通常对治疗患者有益的任何药理作用而引起的任何生理损害。
待治疗的受试者可以是任何温血动物，但是特别是哺乳动物，并且更特别是人类。熟练的技术人员应该清楚，待治疗的受试者特别是患有或者有危险患有本文提及的疾病和紊乱的人。
本发明还涉及预防和/或治疗至少一种可以通过给患者施用本发明的纳米体或多肽而预防和/或治疗的疾病或紊乱的方法，所述方法包括，给需要所述方法的受试者施用药物活性量的本发明的纳米体、本发明的多肽、和/或包括其的药物组合物。
更特别地，本发明涉及预防和/或治疗选自由本文列出的疾病和紊乱组成的组的至少一种疾病或紊乱的方法，所述方法包括，给需要所述方法的受试者施用药物活性量的本发明的纳米体、本发明的多肽、和/或包括其的药物组合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及免疫治疗的方法，并且特别涉及被动免疫治疗的方法，所述方法包括给患有或者有危险患有本文提及的疾病和紊乱的受试者施用药物活性量的本发明的纳米体、本发明的多肽、和/或包括其的药物组合物。
在上述方法中，本发明的纳米体和/或本发明的多肽和/或包含其的组合物可以以任何适当的方式施用，这取决于要用的特定的药物制剂或组合物。因此，例如，本发明的纳米体和/或本发明的多肽和/或包含其的组合物可以口服、腹膜内(例如，静脉内、皮下、肌内、或者通过避开胃肠道的任何其它施用途径)、鼻内、透皮地、局部施用，通过栓剂、通过吸入方式施用，这也取决于要用的特定药物制剂或组合物。临床医生能够选择适当的施用途径和用于所述施用的适当的药物制剂或组合物，这取决于要预防或治疗的疾病或紊乱以及临床医生公知的其它因素。
如本文提及并且如技术人员所清楚，对于急性病况和并发症(即，可以与本文提及的一些聚集-介导的紊乱一起发生)，通常优选直接施用到血流中，诸如通过输注或注射或任何其它适当的方法。
本发明的纳米体和/或多肽和/或包含其的组合物按照治疗方案进行施用，所述治疗方案适于预防和/或治疗要被预防或治疗的疾病或紊乱。临床医生通常能够确定适宜的治疗方案，取决于下列因素，诸如要被预防或治疗的疾病或紊乱，要被治疗的疾病的严重性和/或其症状的严重性，要用的本发明的特定的纳米体或多肽，要用的特定的施用途径和药物制剂(farmaceutical formulation)或组合物，患者的年龄、性别、体重、饮食、综合病况，以及临床医生公知的类似因素。
一般地，所述治疗方案包括以一种或多种药物有效量或剂量施用一种或多种本发明的纳米体和/或多肽，或者包含其的一种或多种组合物。施用的具体量或剂量由临床医生确定，同样基于上文引用的因素。
通常，对于预防和/或治疗本文提及的疾病和紊乱，并且取决于要治疗的具体疾病或紊乱，要用的特定的本发明的纳米体和多肽的功效，具体的施用途径和使用的特定的药物制剂或组合物，本发明的纳米体和多肽一般以每天每kg体重1克-0.01微克的量施用，优选地每天每kg体重0.1克-0.1微克，诸如每天每kg体重约1，10，100或1000微克，作为单一的每日剂量连续施用(例如，通过输注)或者在一天内作为多次分割的剂量施用。临床医生通常能够确定适宜的日常剂量，这取决于本文提及的因素。还应该清楚，在具体的情形中，临床医生可以选择偏离这些量，例如，基于上文引用的因素以及它的专业判断。一般地，关于施用量的一些指导可从通过基本上相同的施用途径通常施用的相当的常规抗体或针对相同靶点的抗体片段的量而获得，但是要考虑亲和性/抗体亲抗原性、功效、生物分布、半衰期以及熟练的技术人员公知的类似因素之间的不同。
通常，在上述方法中，将使用单一的本发明的纳米体或多肽。然而，使用组合的两种或多种本发明的纳米体和/或多肽也在本发明范围之内。
本发明的纳米体和多肽还可以与一种或多种其它药物活性化合物或原理(principles)组合应用，即，作为组合治疗方案，其可以或者不可以引起增强效应。并且，基于上文所引用的因素及其专业判断，临床医生能够选择所述的其它化合物或原理，以及适宜的组合治疗方案。
特别地，本发明的纳米体和多肽可以与其它药物活性化合物或原理组合应用，所述其它药物活性化合物或原理是或者能够用于预防和/或治疗本文所引用的疾病和紊乱，结果可以或不可以获得增强效应。所述化合物和原理的实例，以及施用其的途径、方法和药物制剂或组合物是临床医生所清楚的，并且例如包括，但不限于，肝素，阿司匹林(例如，Aspegic
Figure A20068002401201491
)，Plavix和/或Reopro。
当两种或多种物质或原理用作组合治疗方案的一部分时，它们可以通过相同的施用途径或者通过不同的施用途径在基本上相同的时间或在不同时间(例如，基本上同时地、连续地、或者按照交互方案)施用。当所述物质或原理通过相同的施用途径同时施用时，它们可以作为不同的药物制剂或组合物或者组合药物制剂或组合物的一部分进行施用，这是熟练的技术人员所清楚的。
并且，当两种或多种活性物质或原理作为组合治疗方案的一部分使用时，每一物质或原理可以以相同的量施用，并且按照与当所述化合物或原理单独使用时相同的方案施用，并且所述组合应用可以或不可以引起增强效应。然而，当所述两种或多种活性物质或原理的组合应用引起增强效应时，还可能减少要施用的一种、多种或全部物质或原理的量，同时仍旧获得理想的治疗作用。例如，这可以用于避免、限制或减少当以它们的常规用量使用时与一种或多种所述物质或原理的应用相关的任何不需要的副作用，同时仍旧获得理想的药物或治疗效果。
按照本发明所用的治疗方案的效果可以以对于涉及的疾病或紊乱本质上已知的任何方式进行确定和/或遵循，这是临床医生所清楚的。在适当的并且基于病例/病例基础的情形中，临床医生还应该能够改变或改进特定的治疗方案，以便获得理想的治疗效果，避免、限制或减少副作用，和/或实现一方面获得理想的治疗效果与另一方面避免、限制或减少不理想的副作用之间的适当的平衡。
待治疗的受试者可以是任何温血动物，但是特别是哺乳动物，并且更特别是人类。熟练的技术人员应该清楚，待治疗的受试者特别是患有或者有危险患有本文提及的疾病和紊乱的人。
本发明还涉及本发明的纳米体和/或本发明的多肽在制备预防和/或治疗可以通过给患者施用本发明的纳米体或多肽而预防和/或治疗的至少一种疾病或紊乱(例如，本文提及的聚集紊乱)的药物组合物中的应用。
通常，将遵循所述治疗方案，直到获得理想的治疗效果和/或持续所述理想的治疗效果需要保持的那么久。并且，这可以由临床医生确定。
最后，熟练的技术人员还应该清楚，可能将上文提及的用于本发明的纳米体的一个或多个CDR’s“移植”到其它“支架”上，所述支架包括但不限于人支架或非-免疫球蛋白支架。用于这种CDR移植的适宜的支架和技术是熟练的技术人员所清楚的，并且是本领域公知的，参见，例如US-A-7,180,370，WO 01/27160，EP 0 605 522，EP 0 460 167，US-A-7,054,297，Nicaise等，Protein Science(蛋白质科学)(2004)，13：1882-1891；Ewert等，Methods(方法)，2004 Oct；34(2)：184-199；Kettleborough等，Protein Eng.(蛋白质工程)1991 Oct；4(7)：773-783；O’Brien和Jones，Methods Mol.Biol.(分子生物学方法)2003：207：81-100；和Skerra，J.Mol.Recognit.(分子识别杂志)2000：13：167-187，和Saerens等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)2005 Sep 23；352(3)：597-607，以及本文引用的其它参考文献；并且例如，还包括其它(单一)结构域抗体的构架区。例如，可以以相似的方式应用本质上已知的关于将小鼠或大鼠的CDR’s移植到人构架和支架上的技术，以提供包括一个或多个本发明的纳米体的CDR’s和一个或多个人构架区或序列的嵌合蛋白。
因此，在另一个实施方案中，本发明包括一种嵌合多肽，其包含至少一种选自由本文提及的用于本发明的纳米体的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列组成的组的CDR序列。优选地，这样的嵌合多肽包括至少一种选自由本文提及的用于本发明的纳米体的CDR3序列组成的组的CDR序列，并且任选地还包括至少一种选自由本文提及的用于本发明的纳米体的CDR1序列和CDR2序列组成的组的CDR序列。例如，这样的嵌合多肽可以包括一个选自由本文提及的用于本发明的纳米体的CDR3序列组成的组的CDR序列，一个选自由本文提及的用于本发明的纳米体的CDR1序列组成的组的CDR序列，和一个选自由本文提及的用于本发明的纳米体的CDR1序列和CDR2序列组成的组的CDR序列。对于这些嵌合多肽，本文提及的对于本发明的纳米体优选的CDR’s的组合通常也是优选的。
在所述嵌合多肽中，所述CDR’s可以与其它氨基酸序列连接和/或通过氨基酸序列彼此连接，其中所述氨基酸优选地是构架序列或作用为构架序列的氨基酸序列，或者一起形成用于递呈所述CDR’s的支架。参考也参见在前段中提及的现有技术。按照一个优选的实施方案，所述氨基酸序列是人构架序列，例如，VH3构架序列。然而，还可以使用非人的、合成的、半-合成的或非-免疫球蛋白构架序列。优选地，所用的构架序列如此，以致：(1)所述嵌合多肽能够结合xxxx，即，以相对应的本发明的纳米体的亲和力的至少1％、优选地至少5％、更优选地至少10％，诸如至少25％，并且达到50％或90％或更大的亲和力；(2)所述嵌合多肽适于药用；和(3)在用于其药用(即，指征、施用模式、剂量和治疗方案)的目的条件下(其可以基本上类似于本文所述的关于应用本发明的纳米体的条件)，所述嵌合多肽优选地基本上无免疫原性。
按照一个非限制性实施方案，所述嵌合多肽包括通过至少一个构架序列连接的至少两个CDR序列(如上文所提及)，其中优选地所述两个CDR序列中的至少一个是CDR3序列，另一CDR序列为CDR1或CDR2序列。按照一个优选的但非限制性的实施方案，所述嵌合多肽包括连接至少两个构架序列的至少两个CDR序列(如上文提及)，其中优选地所述三个CDR序列中的至少一个是CDR3序列，其余两个CDR序列是CDR1或CDR2序列，并且优选地是一个CDR1序列和一个CDR2序列。按照一个特别优选的但非限制性的实施方案，所述嵌合多肽具有结构FR1’-CDR1-FR2’-CDR2-FR3’-CDR3-FR4’，其中CDR1，CDR2和CDR3如本文关于本发明的纳米体的CDR’s的定义，而FR1’，FR2’，FR3’和FR4’是构架序列。特别地，FR1’，FR2’，FR3’和FR4’可以分别是人抗体(诸如VH3序列)的构架1，构架2，构架3和构架4序列，和/或所述构架序列的部分或片段。还可以使用具有结构FR1’-CDR1-FR2’-CDR2-FR3’-CDR3-FR4的嵌合多肽的部分或片段。优选地，这样的部分或片段如此，以致它们满足在前述段落中列出的标准。
现在将通过下述非限制性实例和附图的方法对本发明进一步描述，其中所述附图显示：
图1：在ELISA中纳米体结合vWF
图2：12A5同源纳米体序列比对
图3：12B6同源纳米体序列比对
图4：在BIACORE中12A5同源纳米体对vWF的结合
图5：在BIACORE中12B6同源纳米体对vWF的结合
图6：在不同浓度的12B6，12A2和12A5纳米体的血小板黏附
图7a：在升高温度加热后在ELISA中12B6纳米体对vWF的结合
图7b：在升高温度加热后在ELISA中12A2纳米体对vWF的结合
图7c：在升高温度加热后在ELISA中12A5纳米体对vWF的结合
图8a：在ELISA中来自不同物种的vWF与12B6纳米体的结合
图8b：在ELISA中来自不同物种的vWF与12A2纳米体的结合
图8c：在ELISA中来自不同物种的vWF与12A5纳米体的结合
图9：在BIACORE中二价12B6纳米体对vWF的结合
图10：在BIACORE中二价12A2纳米体对vWF的结合
图11：在BIACORE中二价12A5纳米体对vWF的结合
图12：在升高温度加热后在ELISA中二价12B6纳米体对vWF的结合
图13：在升高温度加热后在ELISA中二价12A2纳米体对vWF的结合
图14：在升高温度加热后在ELISA中二价12A5纳米体对vWF的结合
图15：人源化12B6纳米体序列的比对
图16：在ELISA中野生型vWF与人源化12B6纳米体的结合
图17：人源化12A2纳米体序列的比对
图18：在提高温度加热后在ELISA中人源化12A2纳米体对vWF的结合
图19：在ELISA中人源化12A2纳米体对vWF的结合
图20：人源化12A5纳米体序列的比对
图21：在ELISA中野生型vWF与人源化12A5纳米体的结合
图22：以二价形式选择的纳米体的比对
图23：在不同浓度的二价(人源化)纳米体的血小板黏附
图24：在狒狒中Folts模型的血液流动模式
图25：狒狒中Folts模型的实验设置
图26：狒狒对照组的Folts研究。显示以时间为函数的血流，表明CFRs(代表2次独立的实验)
图27：用Aspegic处理的狒狒组的Folts研究。显示以时间为函数的血流，表明CFRs(代表3次独立的实验)
图28：用肝素处理的狒狒组的研究。显示以时间为函数的血流，表明CFRs(代表3次独立的实验)
图29：用Plavix处理的狒狒组的Folts研究。显示以时间为函数的血流，表明CFRs(代表4次独立的实验)
图30：用Reopro处理的狒狒组的Folts研究。显示以时间为函数的血流，表明CFRs(代表3次独立的实验)
图31：用ALX-0081(SEQ ID NO：98)处理的狒狒组的Folts研究。显示以时间为函数的血流，表明CFRs(代表8次独立的实验)
图32：用Aspegic，肝素，Plavix和ALX-0081组合处理的狒狒ID 6的流速读数
图33：以Plavix，Reopro和ALX-0081的不同剂量为函数的相对失血平均值
图34：对于用Plavix处理的动物以增加的药物剂量为函数的CFRs平均长度和失血的平均相对量。
图35：对于用Reopro处理的动物以增加的药物剂量为函数的CFRs平均长度和失血的平均相对量
图36：对于用ALX-0081处理的动物以增加的药物剂量为函数的CFRs平均长度和失血的平均相对量
图37：对于用ALX-0081处理的每只狒狒以所有剂量为函数的利托菌素-诱导的聚集(％，■)和CFRs长度(s，◆)
图38：对于用ALX-0081处理的所有狒狒ALX-0081在血浆中的浓度相对CFRs长度
图39：ALX-0081在血浆中的浓度相对来自纱布的血液损失的相对量
图40：用ALX-0081和vWF处理的狒狒1的Folts研究。显示以时间为函数的血液流动，表明CFRs
图41：关于从刺激的内皮细胞分泌的ULvWF的黏附的血小板的串珠(strings)(箭头)
图42：当在存在ALX-0081时用ULvWF灌流血小板时没有串珠
图43：对照灌流实验：在用正常血浆灌流之前(A面，用红色箭头指示)和灌流过程中(B面)的ULvWF串珠。在B面，被ADAMTS-13分裂的ULvWF串珠用蓝色和红色箭头指示，分别关于移动的一串ULvWF串珠或关于很大程度上分裂的ULvWF串珠
图44：在ALX-0081存在下的灌流实验。在用正常血浆灌流之前的一个视野(A面)及之后同一视野(B面)的显微镜图像。在A面用红色箭头指示一串UlvWF串珠，由于UlvWF被ADAMTS-13分裂所以其在B面不存在。
图45：在不存在以及存在ALX-0081时，A1-A2-A3被存在于正常收集的血浆(NPP)中的ADAMTS-13分裂
并且其中表格，其形成本说明书的完整的部分，如下：
表8：抗-vWF纳米体的序列表
表9：抗-vWF纳米体的表达产率
表10：在抗-vWF纳米体灌流室中的血小板黏附
表11：12B6和12A5同源纳米体的序列表
表12：对于12A5同源纳米体估计的K-on，K-off和KD值
表13：对于12B6同源纳米体估计的K-on，K-off和KD值
表14：12B6，12A2和12A5纳米体的真正的KD值
表15：在12B6，12A2和12A5纳米体灌流室中的血小板黏附
表16：在升高温度加热后12B6，12A2和12A5纳米体的浓度
表17：二价纳米体的序列表
表18：接头序列的序列表
表19：二价12B6，12A2和12A5纳米体的表达产率
表20：在升高温度加热后12B6二价纳米体的浓度
表21：在升高温度加热后12A2二价纳米体的浓度
表22：在升高温度加热后12A5二价纳米体的浓度
表23：在12A2二价纳米体灌流室中的血小板黏附
表24：人源化12B6纳米体的序列表
表25：野生型和人源化12B6纳米体的表达产率
表26：在升高温度加热后野生型和人源化12B6纳米体的浓度
表27：野生型和人源化12B6纳米体的KD值
表28：人源化12A2纳米体的序列表
表29：野生型和人源化12A2纳米体的表达产率
表30：在升高温度加热后野生型和人源化12A2纳米体的浓度
表31：在灌流室中0.7和1.5μg/ml的野生型和人源化12A2纳米体的血小板黏附
表32：在灌流室中0.5、1和2μg/ml的野生型和人源化12A2纳米体的血小板黏附
表33：野生型和人源化12A2纳米体的KD值
表34：人源化12A5纳米体的序列表
表35：野生型和人源化12A5纳米体的表达产率
表36：在升高温度加热后野生型和人源化12A5纳米体的浓度
表37：野生型和人源化12A5纳米体的KD值
表38：人源化二价纳米体的序列表
表39：人源化二价纳米体的表达产率
表40：在升高温度加热后人源化二价纳米体的浓度
表41：野生型和二价纳米体的血小板黏附
表42：在Folts研究中使用不同检测化合物的狒狒
表43：对照动物的CFRs(s)长度(ND＝未处理)
表44：用AspegicTM处理的动物的CFRs(s)长度(ND＝未处理)
表45：用肝素TM处理的动物的CFRs(s)长度(ND＝未处理)
表46：用PlavixTM处理的动物的CFRs(s)长度(ND＝未处理)
表47：用ReoproTM处理的动物的CFRs(s)长度(ND＝未处理)
表48：用ALX-0081处理的动物的CFRs(s)长度(ND＝未处理)
表49：在Folts研究中使用不同检测化合物的狒狒
表50：在用于不同药物检测的Folts模型中CFRs的抑制。其中在所提及的不同条件观察到CFRs的抑制的实验次数显示为所述条件独立重复的总次数的函数。
表51：对于每只狒狒和每一剂量的Aspegic，肝素，Plavix和ALX-0081的CFRs长度(秒(seconds))。作用剂量用黄色显示。
表52：对于用PlavixTM处理的动物以最终剂量为函数的相对于第二对照纱布的失血(STD＝标准偏差)
表53：对于用ReoproTM处理的动物以最终剂量为函数的相对于第二对照纱布的失血(STD＝标准偏差)
表54：对于用ALX-0081处理的动物以最终剂量为函数的相对于第二对照纱布的失血(STD＝标准偏差)
表55：相对于第二次对照纱布的血液损失总量的平均值(＝第一次5种剂量的检测化合物的失血总量)
表56：对于用Aspegic、肝素、Plavix和ALX-0081处理的每只狒狒以药物剂量为函数的相对于第二对照纱布的纱布中的失血。其中观察到CFRs完全抑制的有效药物剂量用黄色显示。
表57：对于用Aspegic，肝素，Plavix和ALX-0081处理的每只狒狒以药物剂量为函数的％利托菌素-诱导的血小板聚集。
表58：在施用后10分钟获得的血液样品中的ALX-0081浓度[μg/ml]
表59：对于用ALX-0081和用vWF处理的狒狒的CFRs长度[秒]
表60：制备用于研究ADAMTS13分裂A1A2A3的不同的混合物的体积[μl]。
实施例
A.选择并且筛选对vWF特异并且抑制血小板黏附的纳米体
实施例1：抗原特异的单价纳米体
在表8中SEQ ID Nos：60-66代表的纳米体从用人vWF或用vWF的重组A1结构域免疫的美洲驼获得。所述纳米体结合vWF的A1结构域并且抑制血小板上vWF和gpIb之间的相互作用。
实施例2：纳米体的表达和纯化
制备质粒(QIAGEN，按照制造者的用法说明)，并且转化到WK6或TG1电-感受态细胞。单一菌落用来起始在含有2％葡萄糖和100μg/ml的氨苄青霉素的LB中过夜培养。将这一过夜培养物在2×300ml包含100μg/ml氨苄青霉素的TB培养基中稀释100-倍，并且在37℃培养至OD600nm＝0.5。加入1mM IPTG，并且将所述培养物在37℃培养3个多小时，或者在28℃过夜。
将培养物在4℃10000rpm离心20分钟。将沉淀物冷冻过夜或者在-20℃1小时。接着，将沉淀物在室温下解冻40分钟，重悬在20ml peri缓冲液(50mM NaH2PO4和300mM NaCl)中，并且在室温下摇动1小时。通过在4℃20000rpm离心20分钟而分离周质级分。纳米体在镍柱(TALON，Clonetech)上按照制造者所述进行纯化，并且计算表达产率如表9中所示。
实施例3：在ELISA中纳米体对vWF的结合
在EILSA中检测实施例1的纳米体对vWF的结合。因此，将微量滴定平板(Nunc，Maxisorb)用200-倍稀释的vWF(Red Cross)包被，并且在37℃预-温育15分钟。将所述平板在4℃包被过夜。然后，将平板用PBS-吐温洗涤，并且在室温下用PBS-1％酪蛋白封闭2小时。洗涤之后，样品以10μg/ml的浓度起始应用，并且在PBS中制备3-倍稀释液。在2个小时的温育时间后，洗涤平板，并且在室温下应用1000-倍稀释的小鼠单克隆抗-myc抗体1小时。洗涤平板，并且在室温下应用1000-倍稀释的多克隆抗-小鼠-HRP(DAKO)1小时。洗涤平板，并且应用ABTS/H2O2底物。检测OD 405nm。结果在图1中显示。
实施例4：在流动室中纳米体抑制血小板黏附
蛋白样品在灌流室中分析。将Thermanox盖玻片(Nunc)浸没在80％乙醇中过夜，用蒸馏水彻底润洗，并且空气-晾干。将人胎盘III型胶原蛋白III型(Sigma)溶解在0.05mol/l的醋酸中，并且使用修饰喷雾器以30μg/cm2的最终密度喷雾到盖玻片上。喷雾后，将盖玻片在RT下用在PBS中的1％人白蛋白溶液封闭至少1小时。使用具有裂口高度0.1mm和裂口宽度2mm的改进的小灌流室，在非-跳动流动条件下，使用单-通道灌流室进行灌流。血液通过静脉穿刺从健康的志愿者获得，并且与Penta/PPACK抗-缀合。将3个盖玻片插入到所述室中。将5毫升血液在37℃预-温育5分钟，加入或者不加入2微克/ml纳米体，并且然后使用输注泵在1600s-1壁切应力速率下通过所述室循环5分钟。在灌流运行后，将盖玻片从室中取出，用Hepes缓冲盐水(10mM Hepes，150mM NaCL，ph7.4)润洗，用在PBS中的0.5％戊二醛固定，在甲醇中脱水，并且用May-Grünwald和Giemsa(Riedel de)染色。使用光学显微镜和计算机-辅助的分析，以血小板表面覆盖度评估血小板沉积。结果在表10中显示。纳米体12B6和12A5在灌流室中在高切应力速率下清楚地抑制血小板对III型胶原蛋白的黏附。
实施例5：BIACORE中分析同源纳米体与vWF的结合
在灌流室中纳米体12B6和12A5抑制血小板黏附。从美洲驼获得包含氨基酸差异的同源序列，如表11中SEQ ID Nos 67-73所示。图2和图3显示12B6和12A5同源纳米体序列的比对。
vWF通过胺偶联共价结合到传感器芯片表面。芯片的CM5表面通过注射EDC/NHS(在水中的0,4M 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺和0,1M N-羟基琥珀酰亚胺的1∶1混合物)7分钟而活化。当活化时，注射vWF直到检测到6000应答单位的增加。过剩的活性基团用1M乙醇胺-HCl(pH8,5)灭活7分钟。在固定过程中流速保持稳定在5μl/min。洗脱缓冲液为具有0,15M NaCl，3mM EDTA和0,005％表面活性剂P20的0,01MHEPES(pH7,4)。
纳米体12B6和12A5以及它们的同源蛋白在BIACORE中以5μg/ml的纳米体浓度针对vWF进行分析，如图4和5所示。估计的kon，K-off和KD值在表12和13中显示。纳米体12A5和12B5具有最好的K-on和K-off速率。纳米体12A2和12B6具有最好的K-on速率，对于所有检测的纳米体K-off速率非常相似。
表14显示使用一定浓度范围的纳米体在BIACORE上关于vWF的真正KD值。从对于每一纳米体产生的一套曲线上，只有达到平衡的那些曲线用来通过稳定态亲和性推论KD值。
对于急性事件的处理，vWF的快速抑制非常重要，并且因此优选快速的K-on速率。K-on速率决定当注射到人或动物时纳米体多快与其靶点(vWF)结合。
实施例6：在灌流室中比较抑制性纳米体的功效
为了比较抑制血小板黏附的功效，将纳米体12A2，12B6和12A5在灌流室中以0.2，0.4和0.6μg/ml进行检测。对于所有纳米体使用相同的供体进行实验。结果在表15和图6中显示。纳米体在灌流室中表现出非常相似的抑制能力，在0.6μg/ml的纳米体浓度具有对血小板黏附的完全抑制。
实施例7：纳米体在升高的温度的稳定性
制备在PBS中浓度为200μg/ml的纳米体储液，并且分成几个管。将包含纳米体的每个管在不同温度温育1小时，然后在室温冷却2小时，并且置于4℃过夜。第二天，将样品在13000rpm离心30分钟，并且检测上层清液的OD280nm。上层清液的浓度通过分光光度法检测，并且表示为室温浓度的百分数。结果总结在表16中。
上层清液也在ELISA中检测与vWF的结合，如在上述实施例3中所述。图在图7a(12B6)，7b(12A2)和7c(12A5)中所示，纳米体在升高的温度下非常稳定。
实施例8：纳米体与来自其它物种的vWF的交叉-反应性
将微量滴定平板用1/1000的小鼠抗-myc在4℃包被过夜。将平板用PBS-吐温洗涤，并且在室温下用PBS-1％酪蛋白封闭2小时。洗涤之后，纳米体以在PBS中10μg/ml的浓度应用。在1个小时的温育时间后，洗涤平板，并且应用以5-倍稀释起始的血浆(犬、猪、人、狒狒和猕猴)，进一步在PBS中制备2-倍稀释液。将平板在室温温育1小时。洗涤平板，并且在室温下应用2000-倍稀释的多克隆抗-vWF-HRP(DAKO)1小时。洗涤平板，并且应用ABTS/H2O2底物。检测OD 405nm。
如在图8a(12B6)，8b(12A2)和8c(12A5)中所示，纳米体12A5，12A2和12B6与人、狒狒和猕猴vWF交叉-反应。纳米体12A2和12B6还与猪vWF交叉-反应。因此，这些纳米体可以在猪中检测功效和安全性。所述纳米体中没有一种与犬vWF交叉-反应。
B.构建对vWF特异的并且抑制血小板聚集的二价纳米体
实施例9：二价纳米体的氨基酸序列
表17SEQ ID Nos 74-82代表12B6，12A2和12A5构建的二价纳米体。所述纳米体通过表18 SEQ ID Nos 83-85代表的接头连接。
实施例10：二价纳米体的表达和纯化
表达按照上述实施例2中所述进行。表达产率总结在表19中。
实施例11：在BIACORE中分析二价纳米体
实施例9的二价纳米体在BIACORE中以1,3nM按照上述实施例5中所述进行分析，以相对单价纳米体比较对vWF的亲和力。当与单价纳米体比较时，二价纳米体12B6(图9)，12A2(图10)和12A5(图11)具有提高的对于vWF的亲和力。
实施例12：二价纳米体在升高的温度的稳定性
按照上述实施例7中所述检测二价纳米体的稳定性。测定上层清液浓度(μg/ml)，并且表示为在室温的浓度的百分数。结果总结在表20(二价12B6)，表21(二价12A2)和表22(二价12A5)中。
所述上层清液在ELISA中检测与vWF的结合，如在上述实施例3中所述。上层清液以1/100稀释起始应用，并且在PBS中制备1/5稀释液。结果在图12(12B6)，图13(12A2)和图14(12A5)中所示。
实施例13：在流动室中分析单价和二价12A2
纳米体12A2(单价和二价形式)在灌流室中检测，如在上述实施例4中所述。对于所有纳米体使用相同的供体进行实验。结果总结在表23中。二价纳米体比单价形式更有效地抑制血小板黏附。
C.对vWF特异并且抑制血小板黏附的纳米体的人源化
实施例14：12B6纳米体的人源化
表24SEQ ID Nos：86-89代表4种人源化的12B6纳米体。表II列出获得这些序列进行的氨基酸变化。图15显示12B6人源化序列的比对。
表II：非-限制性人源化取代
  Q1E   A14P   A17S   E44G   D46E   R76N   M77S   A82bS   K83R   P84A
  12B6H1   X   X   X   X   X   X   X
  12B6H2   X   X   X   X   X   X   X   X
  12B6H3   X   X   X   X   X   X   X   X
  12B6H4   X   X   X   X   X   X   X   X
表达按照实施例2中所述进行。表达产率总结在表25中。
人源化纳米体的稳定性按照实施例7中所述进行检测。表26总结表示为室温浓度的百分数的上层清液的OD280nm浓度(μg/ml)。
图16显示人源化12B6纳米体与vWF在ELISA中的结合，按照实施例3中所述进行。
人源化12B6纳米体对vWF的亲和性在BIACORE中确定。KD值总结在表27中。
实施例15：12A2纳米体的人源化
表28SEQ ID Nos：90-94代表5种人源化的12A2纳米体。表III和IV列出获得这些序列进行的氨基酸变化。图17显示12A2人源化序列的比对。
表III：非-限制性人源化取代：
 Q1E   K3Q   E5V   A14P   A17S   R27F   E44G   D46E
  12A2H1  X   X   X   X   X   X   X
  12A2H3  X   X   X   X   X   X   X
  12A2H4  X   X   X   X   X   X   X
  12A2H11  X   X   X   X   X   X   X   X
  12A2H13  X   X   X   X   X   X   X   X
表IV：
  R76N   M77S   N82bS   K83R   P84A   Q108L
  12A2H1   X   X   X
  12A2H3   X   X   X   X
  12A2H4   X   X   X   X
  12A2H11   X   X   X
  12A2H13   X   X   X   X   X   X
表达按照实施例2中所述进行。表达产率总结在表29中。
人源化纳米体的稳定性按照实施例7中所述进行检测。表30总结表示为室温浓度的百分数的上层清液的OD280nm浓度(μg/ml)。当升高温度加热时所有人源化的12A2纳米体都非常稳定。
图18和19的ELISA按照实施例3中所述进行。12A2H1和12A2H4在ELISA中与vWF结合非常好。
所述纳米体在流动室中以0.7μg/ml和1.5μg/ml的浓度进行检测。对于所有实验使用相同的供体。实验按照实施例4中所述进行。结果总结在表31和32中。
人源化12A2纳米体对vWF的亲和性在BIACORE中确定。KD值总结在表33中。
实施例16：12A5纳米体的人源化
表34SEQ ID Nos：95-97代表3种人源化的12A5纳米体。表V列出获得这些序列进行的氨基酸变化。图20显示12A5人源化序列的比对。
表V：非-限制件人源化取代：
  A1E   L23A   Q44G   G73N   P74A   K83R   P84A
  12A5H1   X   X   X   X   X
  12A5H2   X   X   X   X   X   X
  12A5H3   X   X   X   X   X   X   X
表达按照实施例2中所述进行。对于每一种人源化的12A5纳米体在TALON纯化后的表达产率总结在表35中。
人源化12A5纳米体的稳定性按照实施例7中所述进行检测。检测上层清液的OD280nm，并且表示为室温OD280的百分数。结果总结在表36中。当升高温度加热时所有人源化的12A5纳米体都与野生型相似地稳定。
ELISA按照实施例3中所述进行。图21举例说明ELISA中对vWF的结合活性。
人源化12A5纳米体对vWF的亲和性在BIACORE中确定。KD值总结在表37中。
实施例17：二价人源化的纳米体
选择具有3a接头的二价形式的3种人源化纳米体12A2H1、12A2H4和12B6H2。这3种纳米体的序列只与如图22所示的有一些氨基酸不同。表38 SEQ ID Nos 98-100列出所述二价纳米体的序列。表38SEQ ID Nos101-106列出分别由GS9和GS30接头连接的人源化二价纳米体的序列。
表达按照实施例2中所述进行。含有(His)6-标记的纳米体在镍柱(TALON，Clonetech)上按照制造者所述进行纯化。所述标记-序列是EQKLISEEDLNGAAHHHHHH。没有标记的纳米体在蛋白质A上纯化。计算表达产率并且总结在表39中。
所述人源化二价纳米体的稳定性如在实施例7中所述进行检测。检测上层清液的OD280，并且表示为室温下OD280的百分数。结果总结在表40中。
所述纳米体(人源化的以及野生型的)在流动室中以0.15μg/ml，0.3μg/ml和0.6μg/ml的浓度进行检测。对于所有实验使用相同的供体。实验按照实施例4中所述进行。图23显示在二价纳米体的不同浓度的血小板黏附。表41列出野生型和人源化二价纳米体的血小板黏附。
D.在狒狒FOLTS模型中(二价)纳米体对动脉血栓症的作用
实施例18：使用ALX-0081的狒狒FOLTS模型
在这一研究中，在狒狒中的Folts血栓症模型中评估ALX-0081的功效和安全性。
此外，将ALX-0081在狒狒中的Folts血栓症模型中的功效和安全性与目前用于临床的其它药物诸如Reopro、Plavix、Aspegic、肝素和肾上腺素进行比较。所有这些药物稀释在0.9％氯化钠中，并且作为静脉大丸剂注射而施用。这一研究也设计以确定对于这些化合物的每一种的有效剂量。
最后，检测目前在临床上用于经皮冠状干涉(PCI)装置的药物组合在狒狒Folts血栓症模型中的功效：Aspegic，肝素和Plavix。本发明人还评估当首先(on top)加入时ALX-0081是否可以提高这种组合的功效。
本发明人观察到安全性参数诸如流血的诱导、vWF和因子VIII水平、和血小板计数、PT以及aPTT。
研究流程
应用的研究流程是初始Folts模型和下文所述的一些改进(Folts JD，等，Circulation(循环).1976；54：365-370)。
使用健康的雄性或雌性狒狒(Papio ursinus)。动物重8-17kg，并且在使用之前至少2周没有疾病。狒狒只用于的标准食物喂养。狒狒在不同的时间点使用。狒狒的体重总结在表42中(ALX-0081的功效研究以及与个别药物的比较)和表50中(加之(on top of)这一组合的药物和ALX-0081组合的功效)。
将动物麻醉，并且使用加热台将体温保持在37℃。将一段股动脉与周围组织解离。将分流器(shunt)安放在股静脉和股动脉之间，以获得高切应力速率。在整个实验过程中连续记录平均和阶段性血液流动(phasicblood flow)。基线流动记录20分钟。然后通过使用镊子应用所述动脉的两次重叠闭合1秒钟而破坏股动脉的最接近的解剖位点。将钳子置于破坏的位点以产生外部的狭窄。
观察到由于血小板黏附和聚集的血液流动的逐渐减少。当流动减少到零时，通过打开钳子移走血小板-富集的血栓而恢复血液流动。这种在机械恢复之后减少血液流动的重复模式叫做循环流动减少(cyclic flowreductions，CFRs)。如果在这些狒狒中需要最终获得稳定的CFRs，那么重复额外的内皮损伤。需要被移走的血栓的次数决定CFRs的数目。图24举例说明在狒狒中Folts模型过程中的血液流动模式。
在可重复的CFRs的30-分钟控制期之后，施用赋形剂作为内部控制，并且追踪CFRs 30多分钟。在这一时期后，通过静脉内大丸剂注射(在连续输注ALX-0081后)而提供检测试剂(盐水(n＝2)，Reopro(n＝3)，Aspegic(n＝3)，Plavix(n＝4)，肝素(n＝3)或ALX-0081纳米体TM(n＝9))，并且在药物施用后继续监测达30分钟。使用逐步升高的检测物质的剂量将这一步骤重复几次。通过比较在药物施用之前和之后的CFRs长度而量化抗-血栓作用。当观察到CFRs的完全抑制时，应用新的损伤，以证实所述抑制是处理的作用而不是自然复原现象。在实验末期，注射肾上腺素(2.2μg/kg/min)，以区分CFRs的弱和强抑制。的确，以前已经证明，当在同一模型中使用阿司匹林(一种弱抗-血小板药物)时，存在肾上腺素时CFRs重新出现。所述实验的设置在图25中举例说明。
在每一剂量的检测化合物之后的CFRs长度总结在表43-48中。获得CFRs的完全抑制的剂量用阴影表示。
在Folts模型实验过程中血液流动的代表性读数在图26-31中显示。
所述结果证明，CFRs可以在对照动物中获得，持续至少3个小时，无需在其中的新的损伤。CFRs的平均长度是2-5分钟，并且注射盐水对CFRs的长度没有影响(图26，表43)。
Aspegic
将三只动物注射Aspegic(可注射的阿司匹林)，并且寻找CFRs的抑制。在临床上，恰好在开始经皮冠状干涉(PCI)方法之前，将250mg(±3-5mg/kg)的大丸剂注射施用给患者。在两只动物(狒狒3和5)中，在分别高达80和40mg/kg Aspegic的剂量不能获得CFRs抑制(图27，表44)。在狒狒4中，在所述控制期间很难建立CFRs的稳定的重复模式。在进行几次新的损伤之后(这在我们注射盐水时)，获得稳定的CFRs。在5mg/kgAspegic的剂量获得完全的CFRs抑制，但是在更高剂量并且当新的损伤时，CFRs恢复，尽管CFRs的平均长度比施用Aspegic之前长3-4倍。在输注肾上腺素之后，CFRs立即并且完全恢复(表44)。
肝素
将三只动物注射未级分的肝素，并且寻找CFRs的抑制。在临床上，给患者施用60-70IU/kg的大丸剂注射，并且每30分钟监测aPTT(活化的部分促凝血酶原激酶时间(activated partial thromboplastintime))。如果aPTT＜250秒，施用额外的肝素。在狒狒7和8中，即使不在高达240IU/kg的剂量，也没能获得CFRs抑制(图28，表45)。在狒狒6中，在15IU/kg的第一剂量和更高的剂量，获得CFRs的完全抑制，但是当我们进行新的损伤时，CFRs每次都恢复。在240IU/kg的最高剂量，甚至在新损伤后CFRs也被抑制，但是流动下降，并且当输注肾上腺素时，CFRs立即恢复。
Plavix
将4只狒狒用Plavix处理，并且用于Folts研究。我们通过将片剂重悬在甲醇中使用Plavix作为注射药物。因此，我们能够关于其它药物进行剂量增加的实验。在患者中，口服施用300-600mg Plavix，在Plavix的单一口服给药之后2小时，可以观察导血小板聚集的抑制。在狒狒中2.5mg/kg最终剂量时，可以表现出对CFRs长度的作用，但是这一抑制作用仅在注射后10分钟开始(图29，表46)。在狒狒12中，在这一2,5mg/kg的剂量获得CFRs的完全抑制。在其它三只狒狒中，在5mg/kg的最终剂量获得CFRs的完全抑制。当进行新的损伤时，CFRs保持被抑制，但是在输注肾上腺素之后恢复。当停止肾上腺素输注时，CFRs又保持5分钟，但是然后又获得完全抑制(图29)。
Reopro
在三只狒狒中在Folts模型中检测Reopro的功效。在临床上，患者接受250μg/kg的剂量，然后连续输注7,5μg/kg/小时。这也是我们在狒狒13、14和15中获得CFRs的完全抑制所需要的剂量(最终剂量170-420μg/kg)(图30，表47)。我们只给狒狒施用大丸剂注射。当进行新的损伤时，CFRs的完全抑制保持，并且输注肾上腺素不能逆转这种抑制(图30)。
ALX-0081
9只狒狒接受ALX-0081，并且用于Folts模型。在所有的狒狒中，在30μg/kg+45μg/kg/小时(最终剂量43μg/kg)的剂量获得CFRs的完全抑制。在2只狒狒中，在10μg/kg+15μg/kg/小时已经获得完全抑制(狒狒17和22)。在所有9只狒狒中在新损伤时并且在输注肾上腺素之后，抑制得到保持(图31，表48)。
Aspegic-肝素-Plavix-ALX-0081(Asp/Hep/Plav/ALX)组合
7只狒狒接受5mg/kg阿司匹林，60IU/kg肝素和增加剂量的Plavix的大丸剂注射。在不同时间点施用额外的肝素，以维持在一定的水平(相对于对照，aPTT应该至少是两倍)。在检测化合物的每次给药之后监测CFRs 30分钟。我们从1mg/kg Plavix的剂量起始，并且30分钟后加上1mg/kg。通过比较在药物施用之前和之后的CFRs的长度而量化抗血栓形成作用。当观察到完全的CFRs抑制时，进行新的损伤。注射肾上腺素，并且持续到实验结束。如果CFRs不恢复，那么进行新的损伤。2-3次CFRs之后，加入增加剂量的ALX-0081：(1)，3，10或30μg/kg。我们在每一剂量的ALX-0081后等待2次CFRs，并且增加剂量直到获得CFRs的完全抑制。在CFRs的完全抑制，开始1,5倍剂量的ALX-0081/kg/小时的连续输注30分钟，并且继续肾上腺素输注。在10-15分钟后进行新的损伤。我们用于这一研究的狒狒的说明在表49中所示。
对于每一种检测化合物来自这些研究的结果总结在表50中。当与阿司匹林，肝素或Plavix比较时，对于ALX-0081和Reopro，在Folts血栓症狒狒模型中观察到明显良好的抗血栓形成作用：当新损伤时并且在输注肾上腺素后，与Aspegic、肝素或Plavix处理的动物中的模型中相反，在ALX-0081和Reopro处理的狒狒中的Folts模型中，CFRs不恢复。对于CFRs完全抑制所需的ALX-0081剂量大约低于Reopro所需剂量的10倍。因此，得出结论ALX-0081比Reopro更有效。
在施用5mg/kg阿司匹林，60IU/kg肝素和增加剂量的Plavix的组合之后，在所有7只狒狒中，在这一最终剂量获得CFRs的完全抑制。对于完全抑制所需的Plavix剂量低于当单独施用Plavix时所需的剂量的2,5-倍。对于所有检测的狒狒，当进行新的损伤时，CFRs不恢复(图32)。然而，当注射肾上腺素时，在狒狒5、8、9和10中，CFRs自动恢复，并且当新损伤时，在狒狒4、6和7中，CFRs自动恢复。其余的肝素与肾上腺素同时注射。在2次CFRs后，施用增加剂量的ALX-0081，同时继续输注肾上腺素。ALX-0081的剂量从1或3-10增加到30μg/kg。但获得CFRs的完全抑制时，从有效剂量/kg/小时的1,5倍开始ALX-0081的连续输注。在所有7只狒狒中，在30μg/kg的剂量获得CFRs的完全抑制。这一ALX-0081的有效剂量与当单独施用ALX-0081时在Folts模型中的CFRs的完全抑制所需的剂量相同。
因此，我们得出结论，ALX-0081的功效不因同时输注Plavix、肝素和Aspegic而增加。这一观察完全符合我们的假设：ALX-0081抑制血小板与在损伤的动脉壁上暴露的胶原蛋白之间最开始的相互作用。另一方面，Plavix和Aspegic进一步抑制导致血栓发展的级联反应的下游。因此，由于ALX-0081已经妨碍血栓形成的第一步，所以Plavix和Aspirin不贡献更好的功效。此外，当在有效剂量的ALX-0081进行新损伤时，CFRs不恢复，这表明这种纳米体TM的有效的抗血栓形成作用。结果总结在表51中。
检测
检测下列参数：a)出血分析，b)vWF浓度，因子VIII水平，和血小板计数，PT以及aPTT，c)利托菌素-诱导的血小板聚集，d)ALX-0081浓度，和e)再狭窄动脉部分的分析，f)ALX-0081的免疫原性。
a)出血分析
为了分析出血，用解剖刀在腹股沟切口，这在记录基线流动后15分钟进行，此时在动脉中进行损伤。将纱布塞到伤口，并且恰好在检测化合物的每一新剂量前每30分钟更换。每次检测化合物给药后的失血量通过称重纱布而确定。失血相对于在第二对照纱布中的失血量(在盐水注射过程中)表示(表52-54)。
对于用Plavix和Reopro处理的所有狒狒，从有效剂量开始，失血很高(在最高剂量分别达到9-40倍)。对于用ALX-0081处理的动物，出血低于Plavix处理的动物，并且当与Reopro处理的动物相比时低得多。
为了确定Plavix、Reopro和ALX-0081作为抗血栓形成药物的安全性相对于功效水平，对于这些药物，将相对于第二对照纱布的失血平均值以药物剂量的函数表示为有效剂量的倍数(图33)。对于Plavix的有效剂量是5mg/kg，对于Reopro是250μg/kg，和对于ALX-0081是30μg/kg(表46-48)。但与Reopro和Plavix比较时，这些结果精确证明ALX-0081的优良的安全性：与Plavix和Reopro相比，可以施用ALX-0081而没有出血的主要增加的机会(window)要大得多。
来自纱布中平均失血的结果(如果可获得)与CFRs平均长度在图34-36中结合。
在Folts模型中对于ALX-0081观察到宽治疗机会：对于从43μg/kg到403μg/kg范围的累积的剂量，可以表现出强抗血栓形成作用，而没有任何主要的出血(图36)。然而，相反，在相同模型中，与ALX-0081相比，对于Reopro和Plavix的治疗机会要狭窄得多，其结合有效的抗血栓形成作用和高失血(图34-35)。
相对于第二对照纱布的失血总量(＝来自最初的检测化合物的5种剂量的纱布的失血总和)的平均值总结在表55中。在这一表格中，我们还将最终剂量表示为有效剂量的倍数(＝5种剂量的总和除以有效剂量)。如前面所提及，对于Plavix的有效剂量是5mg/kg，对于Reopro是250μg/kg，和对于ALX-0081是30μg/kg。
表55中显示的结果清楚地表明，在用Plavix处理的动物中失血总量显著增加，并且在用Reopro处理的动物中达到甚至更高的程度。在接受ALX-0081的动物中的失血比Plavix或Reopro处理的动物分别少2-倍和4倍。这又清楚地表明，尽管使用多于有效剂量10-倍的剂量，但是关于出血危险，ALX-0081比Plavix和Reopro更安全。
当与对照纱布相比时，Aspegic、肝素和Plavix的有效组合导致失血增加达到14倍。除了狒狒4和7之外，在Aspegic、肝素和Plavix组合之外接着加入ALX-0081没有导致增加的出血。在狒狒7中，在施用肾上腺素、额外的肝素和非有效剂量的ALX-0081后，出血更多地增加，但是在施用有效剂量的ALX-0081之后又降低。这些结果证明，当在目前用于临床设定的药物组合之外紧接着加入时，ALX-0081是安全的。
b)vWF浓度，因子VIII水平，血小板计数，PT和aPTT vWF
使用免疫吸附检测确定在Folts模型中施用不同剂量的药物之后而采集的血液样品的血小板富集的血浆(PRP)中的vWF水平，并且将其表示为人标准值(关于因子VIII和VWF的WHO第5次国际标准值)的百分数。
结果清楚地表明用于所述模型的不同的药物对vWF水平没有主要的影响。
因子VIII
使用aPTT检测确定在Folts模型中施用不同剂量的药物之后而采集的血液样品的PRP中的因子VIII水平。由于我们证明肝素延长aPTT时间，所以我们没有检测用肝素处理的狒狒的血浆样品。FVIII水平表示为在股动脉损伤后10分钟采集的第一对照样品的百分数。我们没有观察到所述处理对aPTT检测的任何影响。
血小板计数，PT和aPTT
在Folts模型实验过程中进行血小板计数检测。数据表明，当与其余动物相比时，狒狒15具有非常低的的血小板计数。对于所有种类的处理，除了Plavix处理，血小板计数与我们在对照动物中观察到的结果非常相似，并且随着时间相当稳定。
PT值表明，除了对用240IU/kg剂量的肝素处理的狒狒之外，在其中观察到PT的较小增加，检测的化合物对PT时间没有影响。
总结在Folts模型研究过程中观察到的aPTT值。这些结果表明，除了用肝素处理的狒狒之外，所检测的化合物对aPTT值没有影响。在这些动物中，aPTT值从30-60IU/kg剂量开始延长，这也在患者中观察到。肝素通过与抗凝血酶形成复合物并且催化激活的凝血因子诸如XIa、IXa、Xa和凝血酶(因子IIa)的抑制而作用为抗凝血剂。这些因子都参与内在的凝血级联反应，其中它的功能性在aPTT检测中测定。
c)检测从用ALX-0081处理的狒狒获得的血液中利托菌素-诱导的血小板 聚集
分析从用ALX-0081处理的狒狒获得的血液的血小板聚集的抑制。在Chronolog全血和光学聚集计(Model 560CA，Chronolog，USA)上进行血小板聚集。通过将全血在1200rpm离心5分钟而制备PRP(收集在0.38mol/L柠檬酸盐上)。小心去除含有PRP的上层级分。将下层级分在3000rpm进一步离心10分钟，以制备血小板含量少的血浆(platelet poor plasma，PPP)。计数PRP中的血小板，并且在PPP中稀释至每毫升200.000个血小板的最终浓度。加入3mg/ml利托菌素(DAKO)，并且检测聚集。
在Folts实验过程中在用ALX-0081处理的狒狒采集的血液样品中检测先体外后体内的血小板聚集。使用利托菌素作为调节剂，检测通过vWF的GPIb-IX-V依赖型血小板聚集。在每一时间点和每一剂量检测％聚集。对照样品在动脉损伤后10分钟采集。
对于用ALX-0081处理的每只狒狒，将来自RIPA检测的结果与CFRs的抑制比较(图37)。如在图37中所示，观察到RIPA和CFRs长度之间的反比关系。并且，这些结果表明，在RIPA检测中在比狒狒16、18、19和23中CFRs完全抑制更低的剂量获得完全抑制。对于狒狒20、21、22和24，使用RIPA的结果与对于Folts模型中功效的结果比较得很好。
d)ALX-0081的浓度
将微量滴定平板用1000-倍稀释的小鼠多克隆抗-myc在4℃包被过夜。将平板用PBS-吐温洗涤，并且在室温下用PBS-1％酪蛋白封闭2小时。在未包被的微量滴定平板上将样品稀释在25％的参照狒狒血浆中。通过将纳米体稀释在相同的参照狒狒血浆样品中而制备标准曲线。将样品应用在抗-myc包被的平板上，并且允许在RT结合2小时。将平板用PBS-吐温洗涤5次。在RT应用3000-倍稀释的兔抗-vWF-HRP(DAKO)1小时。为了检测OD405nm，将样品用PBS-吐温洗涤5次，并且加入ABTS/H2O2底物。
我们确定每次大丸剂注射后10分钟采集的血浆样品中的ALX-0081的浓度。大丸剂注射之后紧接着是连续输注。浓度(μg/ml)总结在表58中。
对于所有狒狒，在ALX-0081剂量增加之后，通过ELISA检测血浆样品中增加水平的ALX-0081。对于狒狒16，与30μg/kg后采集的样品相比，在10μg/kg剂量之后采集的血浆样品中检测到始终更高量的ALX-0081。所述样品中的ALX-0081水平还基本上高于给予相同的ALX-0081给药方法的所有其它狒狒注意到的ALX-0081水平。由于狒狒16在更高剂量之后的ALX-0081水平与预测相符，所以我们认为在血液取样过程中的未知的异常解释这一例外。
在不同狒狒中用于每一剂量的ALX-0081浓度可变。对于3μg/kg剂量，浓度在0,03和0,14μg/ml之间的范围，对于10μg/kg，在0,18和1,23μg/ml之间，对于30μg/kg，在0,51和1,14μg/ml之间，对于90μg/kg，在1,38和6,77μg/ml之间，并且对于270μg/kg，在4,03和35,14μg/ml之间。
在图38中，我们将血浆中的ALX-0081浓度相对CFRs长度绘图。
对于CFRs完全抑制所需的ALX-0081浓度在0,3和0,5μg/ml之间，这与在流动室中在高切应力速率下抑制血小板与胶原蛋白的黏附所需的浓度完全一致，此时ALX-0081集中在人血液中。我们用蓝色(图38，B面)指示抑制开始的ALX-0081浓度范围(排除狒狒16中的10μg/kg剂量)。
当我们将ALX-0081浓度相对来自纱布的失血相对量绘图时，在高于1μg/ml的剂量在出血中我们观察到大于2-倍的增加(图39)。当ALX-0081浓度为19μg/ml时，所述浓度是有效浓度的40-60倍，观察到10倍增加的失血。
e)再狭窄动脉部分的分析
在第二次动脉处理后4周，将动脉与周围组织解离。将动脉在包括放置分流器的位点的内皮损伤的上部和下部位点打结。将2厘米的部分移开，在下部(分流器位点)和上部部分(狭窄并且损伤的位点)切开，并且保存在10％甲醛中。然后通过无痛注射将狒狒处死。将动脉按照起源标记，并且分别切成2mm的环。将所述环置于适于组织学处理的标记的盒中。然后按照Bancroft所述的过夜处理时间表(Bancroft，John D.StevensAlan(1990).Theory and Practice of Histological Techniques(组织学技术理论和实践).第三版)将盒在自动VIP Tissue Tek处理器中放置过夜。
处理后，将动脉包埋在标记的石蜡块中，并且在冷冻盘上冷冻。将石蜡块在旋转切片机上连续切割，每一切片4微米。将切片放置在载玻片上，并且染色用于组织学评估。在每一动脉上进行用于弹性纤维染色的苏木精和伊红以及Verhoeff’s方法(Bancroft，John D.Stevens Alan(1990).Theoryand Practice of Histological Techniques(组织学技术理论和实践).第三版)。在染色后，将载玻片脱水，清洗，包封并且标记。对切片进行不知情分析(blind analysis)。
f)免疫原性分析
分别通过两种方法，一种ELISA方法和基于SPR的关于Biacore的方法，评估ALX-0081免疫球蛋白在3只狒狒血浆中的存在。将狒狒用增加剂量的ALX-0081(从10μg/kg开始)处理8周。在所述的第8周，当注射ALX-0081时没能观察到免疫原性应答。ALX-0081的半衰期在7和9小时范围内。
实施例20：使用vWF作为ALX-0081的解毒剂
不管ALX-0081在狒狒中的已证明的安全性和纳米体TM的快速清除，我们决定评估vWF作为ALX-0081的解毒剂的用途。这在狒狒的Folts模型中检测，在其中我们评估ALX-0081对动脉血栓形成的抑制作用是否可以通过注射vWF逆转。
实验方法按照前述实施例18所述的具有改进的初始Folts模型进行。
在这一研究中使用健康的雄性狒狒(Papio ursinus)。动物重9-12kg，并且在使用前至少2周没有患病。只用干的标准食物喂养狒狒。
3只狒狒用于这一研究，在施用盐水、ALX-0081和vWF之后在对照期间的CFRs长度总结在表59中。
对于每只狒狒和实验的以时间为函数的血液流动在图40中显示。
在所有3只狒狒中，在ALX-0081的30μg/kg+45μg/kg/小时剂量获得CFRs的完全抑制，甚至当进行新的损伤时，CFRs也不恢复。当注射第一剂量的vWF(250IU)时，流动逐渐下降，但是直到施用250IU额外剂量的vWF，CFRs才恢复。这一结果精确地表明，ALX-0081的活性可以通过施用vWF而逆转，并且因此，vWF可能是这种纳米体TM的一种良好的解毒剂。
因此，本发明的另一方面涉及vWF、其适当的片段、DDAVP(desmopressinor)或其适当的片段、或者包含前述任一种的药物组合物的应用，其用作与针对vWF的纳米体、蛋白质或多肽特别是本文所述的纳米体、蛋白质或多肽的应用相关的并发症或不理想的副作用的解毒剂。
实施例21：ALX-0081对血小板与内皮细胞-来源的UIvWF的黏附和对ADAMTS-13活性的作用
这一研究作为将ALX-0081用作TTP患者中的药物的观念的证据。在不存在和存在ALX-0081时，在分泌ULvWF的内皮细胞上进行在TTP血浆中再生的血小板(无ADAMTS13)的灌流。在独立的实验中，我们检测与vWF的A1结构域结合的ALX-0081是否妨碍ADAMTS-13活性。
ADAMTS-13结合并且分裂vWF的A2结构域。
内皮细胞通过Maruyama方法(Z.Zellforsch.Mikrosk.A4nat.60：69；1963)从人脐带静脉获得。在灌流实验之前，将内皮细胞用100μM组胺(Sigma-Aldrich，St Louis，MO)在室温下活化15分钟。
从在前10天拒绝摄取阿司匹林或其它非甾族抗炎性药物(NSAIDs)而摄取1/10体积的3.4％的柠檬酸钠的健康的志愿者采集血液。通过离心(在室温下200g 10分钟)从全血制备血小板-富集的血浆(PRP)。通过加入1/10体积的ACD(2.5％柠檬酸三钠，1.5％柠檬酸，和2％D-葡萄糖)而将PRP酸化，并且将血小板离心(500g，15分钟)。将血小板沉淀重悬在HEPES(N-2-羟基乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸)-Tyrode缓冲液(10mM HEPES，137mM NaCl，2.68mM KCl，0.42mM NaH2PO4，1.7mMMgCl2，5mM D-葡萄糖，pH 6.5)中。加入前列环素(PGI2，10ng/mL)，以在后续洗涤步骤中防止血小板活化。将血小板离心，并且重悬在小体积的HEPES-Tyrode缓冲液中。将这一血小板混悬液稀释在pH值7.4的HEPES缓冲液中或在TTP血浆中。
灌流在单-通道灌流室中进行，如前所述。实验之后是实时视频显微镜检。
在第二类型的实验中，按照表60所总结制备不同的反应混合物，然而，不加入A1A2A3构建体。A1A2A3构建体是由vWF的A1、A2和A3结构域组成的重组片段。将混合物在37℃预温育5分钟，然后加入A1A2A3片段，并且将所述混合物在37℃在水浴中温育过夜。第二天，对样品进行还原SDS-PAGE(12％，并且使用来自BioRad的精确+蛋白标准(Precision Plus Protein Standards)作为标记)，并且印迹在Immobilon-FL(Millipore)上。将所述印迹在室温下用封闭缓冲液(1∶1 Odyssey封闭缓冲液，在1xTBS中，pH＝7,4)封闭2小时，并且与兔多克隆抗-vWF(DAKO)一起温育。Alexa Fluor 680山羊抗-兔用于检测。在ODYSSEY上进行扫描，以检测降解产物。
对照实验：血小板与ULvWF的结合
通过用胶原酶消化脐静脉内部而从新鲜获得的人脐带分离内皮细胞。将所述细胞在组织培养基中生长成为均一的群体。培养的人内皮细胞生长成为紧密相对的、多边形的大细胞的单层，并且它们包含细胞质内含体(怀布尔-帕拉德体)。从人脐带分离的组胺-刺激的内皮细胞在它们的表面表达超大冯威勒布兰特因子(ULvWF)。用分离的血液血小板灌流这些刺激的细胞，导致血小板在UlvWF上的沉积(8)，所述分离的血液血小板悬浮在缓冲液中或者来自患有获得性(aquired)TTP的患者的血浆中。这些ULvWF-黏附的血小板作为所谓的“串珠”出现，当灌流实验用实时视频显微镜检监测时，这是可见的(图41)。
ALX-0081对产生血小板串珠的抑制
将血小板重悬在缓冲液中或TTP血浆中，并且用于本实验的ALX-0081的浓度为0,2，2和10μg/ml。从人脐带分离的组胺-刺激的内皮细胞用上文所述的这些血小板悬浮液灌流。
在所有检测条件下，向重悬在缓冲液或来自TTP患者的血浆中的血小板中加入ALX-0081导致串珠形成的完全抑制(图42)。在2.5dyn/cm2的切应力压力下进行灌流实验4分钟。在这4分钟过程中，检查至少20个显微镜视野的灌流，并且在存在纳米体TM时，在所有检测的条件下不能出现串珠(图42)。
ADAMTS-13分裂ULvWF
ADAMTS-13通过特异性分裂VWF A2结构域中的Y842/M843肽键而将大的和超大的VWF多聚物的大小减小到更小的形式。两种类型的检测用来评估ALX-0081对ADAMTS-13分裂ULvWF的影响：即，灌流检测以及观察重组vWF片段的分裂的检测。
在第一个实验中，通过在组胺-刺激的内皮细胞上用重悬在缓冲液中的洗涤的血小板灌流4分钟而产生串珠。随后，通过用缓冲液灌流4分钟而将未黏附的血小板洗掉。而后，再用缓冲液灌流4分钟，之后用含有ADAMTS-13的收集的正常血浆灌流4分钟。在合并的正常血浆灌流后观察到血小板串珠的分离(图43)在4分钟的灌流之后，大于95％的串珠被分裂。
在另一个实验中，通过在组胺-刺激的内皮细胞上用重悬在缓冲液中的洗涤的血小板灌流4分钟而产生串珠，并且通过用缓冲液如上述灌流4分钟而将未黏附的血小板洗掉。而后，用ALX-0081(在缓冲液中10μg/ml)灌流4分钟，然后用含有ALX-0081(10μg/ml＝与vWF相比，10-倍摩尔过量)和ADAMTS-13的合并的正常血浆灌流4分钟。我们可以清楚地证明血小板串珠的分离，并且在灌流4分钟后，95％的串珠分裂(图44)。
这些结果清楚地表明ALX-0081对ADAMTS-13分裂ULvWF串珠没有影响。
在第二种检测中，将含有vWF的A1-A2-A3结构域的重组片段与含有ADAMTS-13的正常合并血浆(NPP)混和，这导致所述片段的蛋白水解分裂，这通过蛋白质印迹分析观察到。检测不存在和存在10μg/mlALX-0081时的ADAMTS-13活性。如在图45中所示，ALX-0081对vWF片段的分裂没有影响(泳道6-7-8)。
为了证明所观察到的分裂关于ADAMTS-13特异，由于EDTA抑制ADAMTS-13的活性，所以在存在EDTA时进行对照实验。如预测，EDTA在NPP中的存在导致对所述片段的分裂的抑制(图45泳道4)。
这一实验还证明ALX-0081对ADAMTS-13活性没有影响。
表8：抗-vWF纳米体的序列表
  名称   SEQID NO   序列
  12A5   60   AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCLASGRIFSIGAMGMYRQAPGKQRELVATITSGGSTNYADPVKGRFTISRDGPKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCYANLKQGSYGYRFNDYWGQGTQVTVSS
  12B1   61   QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSNYGMGWFRQAPGKEREFVTSISWSGTYTAYSDNVKGRFTISRDNAKNTVYLQMDSLKPEDTAVYYCAAQSRYRSNYYDHDDKYAYWGQGTQVTVSS
  12B6   62   QVQLVESGGGLVQAGGALRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKERDVVAAISRTGGSTYYARSVEGRFTISRDNAKRMVYLQMNALKPEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYNFWGQGTQVTVSS
  12D11   63   AVQLVDSGGGLVQAGGSLRLSCTASERTTFSSYTLGWFRQAPGKEREFVGGISWSGVSTDYAEFAKGRFTISRDHAANTVYLEMNSLKPEDTAVYYCAALGRYRSNWRNIGQYDYWGQGTQVTVSS
  12E3   64   EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFNNYGMGWFRQAPGKEREFVTSISWSGSYTAYADNVKGRFTISRDNAKNTVYLQMDSLKPGDTAVYYCAAQSRYSSNYYDHDDKYAYWGQGTQVTVSS
  12C9   65   AVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGSIFSSSAMAWYRQASGKQRELVATITSGGRTSYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYDCNFVVDGKRAPWGQGTQVTVSS
  14F8   66   AVQLVESGGGLVQAGESLRLSCTSSGRAFSYYNTGWFRQAPGKEREFVAAISWSGGLTYYADSVKGRFTISRDNAKDMVYLQMASLKPEDTAVYYCAANRRQKTVQMGERAYDYWGQGTQVTVSS
表9：抗-vWF纳米体的表达产率
  纳米体   TALON后的产率(mg/l)
  12A5   13
  12B1   6
  12B6   16
  12D11   8
  12E3   4
  12C9   25
  14F8   48
表10：在抗-vWF纳米体灌流室中的血小板黏附
  纳米体   对照  2μg/ml的％血小板黏附
  12A5   60±7  10±3
  12B1   60±7  56±3
  12B6   60±7  19±5
  12D11   60±7  61±7
  12E3   60±7   54±1
  12C9   71±3   68±8
  14F8   71±3   51±10
表11：12B6和12A5同源纳米体的序列表
Figure A20068002401201801
表12：对于12A5同源纳米体估计的K-on，K-off和KD值
  纳米体   Koff(x10-3/s)   Kon(x1061/Ms)   KD(nM)
  12A5   2.51   0.629   3.98
  12B4   2.2   0.544   4.05
  12E8   2.93   0.171   17.1
  12A6   4.72   0.188   25.1
  12D8   5.84   0.139   41.9
表13：对于12B6同源纳米体估计的K-on，K-off和KD值
  纳米体   Koff(x10-3/s)   Kon(x1061/Ms)   KD(nM)
  12B6   5.97   2.55   2.33
  12A2   3.49   1.11   3.13
  12F2   4.04   6.41   6.3
  14H10   3.97   6.84   5.81
表14：12B6，12A2和12A5纳米体的真正的KD值
  纳米体   Koff(x10-3/s)   Kon(x1061/Ms)   KD(nM)
  12B6   10.03   2.28   4.5
  12A2   9.9   2.24   4.4
  12A5   3.3   1.22   2.7
表15：在12B6，12A2和12A5纳米体灌流室中的血小板黏附
Figure A20068002401201811
表16：在升高温度加热后12B6，12A2和12A5纳米体的浓度
  纳米体   RT   37℃   50℃   60℃   70℃   80℃   90℃
  12B6   100   97   100   104   94   91   68
  12A2   100   106   104   100   93   87   90
  12A5   100   108   107   98   83   75   66
表17：二价纳米体的序列表
Figure A20068002401201821
表18：接头序列的序列表
  名称   SEQ IDNO   序列
  3a   83   AAA
  GS9   84   GGGGSGGGS
  GS30   85   GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
表19：二价12B6，12A2和12A5纳米体的表达产率
  纳米体   TALON或其它纯化后的产率(mg/l)
  12B6   16
  12B6-3a-12B6   9
  12B6-GS9-12B6   16
  12B6-GS30-12B6   17
  12A2   18
  12A2-3a-12A2   45
  12A2-GS9-12A2   22
  12A2-GS30-12A2   11
  12A5   13
  12A5-3a-12A5   10
  12A5-GS9-12A5   11
  12A5-GS30-12A5   18
表20：在升高温度加热后12B6二价纳米体的浓度
  纳米体   RT   37℃   50℃   60℃   70℃   80℃   90℃
  12B6   100   97   100   104   94   91   68
  12B6-3a-12B6   100   103   96   87   9   8   6
  12B6-GS9-12B6   100   103   94   88   19   8   7
  12B6-GS30-12B6   100   100   100   98   46   14   11
表21：在升高温度加热后12A2二价纳米体的浓度
  纳米体   RT   37℃   50℃   60℃   70℃   80℃   90℃
  12A2   100   106   104   100   93   87   90
  12A2-3a-12A2   100   87   88   91   55   50   43
  12A2-GS9-12A2   100   102   113   138   91   13   15
  12A2-GS30-12A2   100   115   93   116   81   49   34
表22：在升高温度加热后12A5二价纳米体的浓度
  纳米体   RT   37℃   50℃   60℃   70℃   80℃   90℃
  12A5   100   108   107   98   83   75   66
  12A5-3a-12A5   100   101   114   29   6   4   6
  12A5-GS9-12A5   100   104   115   32   13   14   10
  12A5-GS30-12A5   100   104   87   7   6   35   21
表23：在12A2二价纳米体灌流室中的血小板黏附
Figure A20068002401201841
表24：人源化12B6纳米体的序列表
名称  SEQIDNO   序列
  12B6H1  86   EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKGRDVVAAISRTGGSTYYARSVEGRFTISRDNAKRMVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYNFWGQGTQVTVSS
  12B6H2  87   EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKGREVVAAISRTGGSTYYARSVEGRFTISRDNAKRMVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYNFWGQGTQVTVSS
  12B6H3  88   EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKGRDVVAAISRTGGSTYYARSVEGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYNFWGQGTQVTVSS
  12B6H4  89   EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKGRDVVAAISRTGGSTYYARSVEGRFTISRDNAKRSVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYNFWGQGTQVTVSS
表25：野生型和人源化12B6纳米体的表达产率
  纳米体   TALON或其它纯化后的产率(mg/l)
  12B6   16
  12B6H1   3
  12B6H2   9
  12B6H3   8
  12B6H4   3
表26：在升高温度加热后野生型和人源化12B6纳米体的浓度
  纳米体   RT   37℃   50℃   60℃   70℃   80℃   90℃
  12B6   100   97   100   104   94   91   68
  12B6H1   100   101   100   97   45   58   54
  12B6H2   100   97   96   96   83   46   53
  12B6H3   100   101   98   97   74   73   65
  12B6H4   100   101   100   93   41   66   54
表27：野生型和人源化12B6纳米体的KD值
  纳米体   KD(nM)
  12B6   4.4
  12B6H1   4.4
  12B6H2   3.5
  12B6H3   9
  12B6H4   7.3
表28：人源化12A2纳米体的序列表
名称  SEQIDNO 序列
  12A2H1  90   EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKGRELVAAISRTGGSTYYPDSVEGRFTISRDNAKRMVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYTFWGQGTQVTVSS
  12A2H3  91   EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKGRELVAAISRTGGSTYYPDSVEGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYTFWGQGTQVTVSS
  12A2H4  92   EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKGRELVAAISRTGGSTYYPDSVEGRFTISRDNAKRSVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYTFWGQGTQVTVSS
  12A2H11  93   EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYNPMGWFRQAPGKGRELVAAISRTGGSTYYPDSVEGRFTISRDNAKRMVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYTFWGQGTQVTVSS
  12A2H13  94   EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYNPMGWFRQAPGKGRELVAAISRTGGSTYYPDSVEGRFTISRDNAKNSVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYTFWGQGTLVTVSS
表29：野生型和人源化12A2纳米体的表达产率
  纳米体   TALON或其它纯化后的产率(mg/l)
  12A2   18
  12A2H1   11
  12A2H3   11
  12A2H4   11
  12A2H11   15
  12A2H13   11
表30：在升高温度加热后野生型和人源化12A2纳米体的浓度
  纳米体   RT   37℃   50℃   60℃   70℃   80℃   90℃
  12A2   100   106   104   100   93   87   90
  12A2H1   100   99   99   99   100   89   80
  12A2H3   100   102   101   102   102   90   89
  12A2H4   100   100   101   100   99   90   83
  12A2H11   100   111   113   107   103   85   67
  12A2H13   100   104   103   103   100   90   81
表31：在灌流室中0.7和1.5ug/ml的野生型和人源化12A2纳米体的血小板黏附
Figure A20068002401201871
表32：在灌流室中0.5、1和2μg/ml的野生型和人源化12A2纳米体的血小板黏附
Figure A20068002401201872
表33：野生型和人源化12A2纳米体的KD值
  纳米体   KD(nM)
  12A2   3,1
  12A2H3   14,6
  12A2H11   10,6
  12A2H13   38,8
表34：人源化12A5纳米体的序列表
名称 SEQIDNO 序列
  12A5H1 95   EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIFSIGAMGMYRQAPGKGRELVATITSGGSTNYADPVKGRFTISRDGPKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCYANLKQGSYGYRFNDYWGQGTQVTVSS
  12A5H2 96   EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIFSIGAMGMYRQAPGKGRELVATITSGGSTNYADPVKGRFTISRDGAKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCYANLKQGSYGYRFNDYWGQGTQVTVSS
  12A5H3 97   EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIFSIGAMGMYRQAPGKGRELVATITSGGSTNYADPVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCYANLKQGSYGYRFNDYWGQGTQVTVSS
表35：野生型和人源化12A5纳米体的表达产率
  纳米体   TALON后的产率(mg/l)
  12A5   13
  12A5H1   8
  12A5H2   9
  12A5H3   11
表36：在升高温度加热后野生型和人源化12A5纳米体的浓度
  纳米体   37℃   50℃   60℃   70℃   80℃   90℃
  12A5   108   107   98   83   75   66
  12A5H1   99   91   86   60   69   63
  12A5H2   99   108   90   58   67   60
  12A5H3   101   97   97   67   73   64
表37：野生型和人源化12A5纳米体的KD值
  纳米体   KD(nM)
  12A5   1,6
  12A5H1   1,8
  12A5H2   12,8
  12A5H3   ND
表38：人源化二价纳米体的序列表
名称   SEQIDNO 序列
  12A2H1-3a-12A2H1   98   EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKGRELVAAISRTGGSTYYPDSVEGRFTISRDNAKRMVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYTFWGQGTQVTVSSAAAEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKGRELVAAISRTGGSTYYPDSVEGRFTISRDNAKRMVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYTFWGQGTQVTVSS
  12A2H4-3a-12A2H4   99   EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKGRELVAAISRTGGSTYYPDSVEGRFTISRDNAKRSVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYTFWGQGTQVTVSSAAAEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKGRELVAAISRTGGSTYYPDSVEGRFTISRDNAKRSVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYTFWGQGTQVTVSS
  12B6H2-3a-12B6H2   100   EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKGREVVAAISRTGGSTYYARSVEGRFTISRDNAKRMVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYNFWGQGTQVTVSSAAAEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKGREVVAAISRTGGSTYYARSVEGRFTISRDNAKRMVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYNFWGQGTQVTVSS
  12A2H1-GS9-12A2H1   101   EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKGRELVAAISRTGGSTYYPDSVEGRFTISRDNAKRMVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYTFWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKGRELVAAISRTGGSTYYPDSVEGRFTISRDNAKRMVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYTFWGQGTQVTVSS
  12A2H4-GS9-12A2H4   102   EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKGRELVAAISRTGGSTYYPDSVEGRFTISRDNAKRSVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYTFWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKGRELVAAISRTGGSTYYPDSVEGRFTISRDNAKRSVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYTFWGQGTQVTVSS
  12B6H2-GS9-12B6H2   103   EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKGREVVAAISRTGGSTYYARSVEGRFTISRDNAKRMVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYNFWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKGREVVAAISRTGGSTYYARSVEGRFTISRDNAKRMVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYNFWGQGTQVTVSS
  12A2H1-GS30-12A2H1   104   EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKGRELVAAISRTGGSTYYPDSVEGRFTISRDNAKRMVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYTFWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG SGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKGRELVAAISRTGGSTYYPDSVEGRFTISRDNAKRMVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYTFWGQGTQVTVSS
  12A2H4-GS30-12A2H4   105   EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKGRELVAAISRTGGSTYYPDSVEGRFTISRDNAKRSVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYTFWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG SGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKGRELVAAISRTGGSTYYPDSVEGRFTISRDNAKRSVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYTFWGQGTQVTVSS
  12B6H2-GS30-12B6H2   106   EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKGREVVAAISRTGGSTYYARSVEGRFTISRDNAKRMVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYNFWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG SGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKGREVVAAISRTGGSTYYARSVEGRFTISRDNAKRMVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYNFWGQGTQVTVSS
表39：人源化二价纳米体的表达产率
  纳米体   标记   产率(mg/l)
  12A2H1-3a-12A2H1   有   5
  12A2H1-3a-12A2H1   无   6
  12A2H4-3a-12A2H4   有   10
  12A2H4-3a-12A2H4   无   7
  12B6H2-3a-12B6H2   有   10
  12B6H2-3a-12B6H2   无   2
表40：在升高温度加热后人源化二价纳米体的浓度
  纳米体   标记   37℃   50℃   60℃   70℃   80℃   90℃
  12A2H1-3a-12A2H1   有   98   96   93   63   8   9
  12A2H1-3a-12A2H1   无   100   99   100   77   14   15
  12A2H4-3a-12A2H4   有   100   99   95   9   6   9
  12A2H4-3a-12A2H4   无   98   98   98   18   17   26
  12B6H2-3a-12B6H2   有   100   91   85   7   6   7
  12B6H2-3a-12B6H2   无   100   99   99   28   13   18
表41：野生型和二价纳米体的血小板黏附
Figure A20068002401201911
表42：在Folts研究中使用不同检测化合物的狒狒
  狒狒ID   性别   重量[kg]   左腿   右腿
  1   雄性   9,8   对照
  2   雄性   10,0   对照
  13   雄性   12,4   Reopro
  14   雄性   9,5   Reopro
  15   雄性   10,8   Reopro
  16   雄性   ALX-0081
  17   雄性   15,6   ALX-0081
  18   雄性   17,2   ALX-0081
  20/22   雄性   12,7   ALX-0081   ALX-0081
  21   雌性   8,0   ALX-0081
  23   雄性   ALX-0081
  24   雄性   9,4   ALX-0081
  3/19   雄性   15,2   Aspegic   ALX-0081
  4   雌性   13,6   Aspegic
  5   雄性   17,4   Aspegic
  9   雄性   13,2   Plavix
  6/10   雄性   10,2   肝素   Plavix
  7/11   雄性   9,4   肝素   Plavix
  8/12   雄性   10,5   肝素   Plavix
表43：对照动物的CFRs(s)长度(ND＝未处理)
Figure A20068002401201921
Figure A20068002401201931
表44：用AspegicTM处理的动物的CFRs(s)长度(ND＝未处理)
表45：用肝素TM处理的动物的CFRs(s)长度(ND＝未处理)
表46：用PlavixTM处理的动物的CFRs(s)长度(ND＝未处理)
Figure A20068002401201941
表47：用ReoproTM处理的动物的CFRs(s)长度(ND＝未处理)
Figure A20068002401201942
表48：用ALX-0081处理的动物的CFRs(s)长度(ND＝未处理)
Figure A20068002401201951
表49：在Folts研究中使用不同检测化合物的狒狒
  狒狒ID   性别   重量[kg]   混合物
  1   雄性   9,8   Asp/Hep/Plav/ALX
  2   雌性   13,6   Asp/Hep/Plav/ALX
  3   雌性   7,8   Asp/Hep/Plav/ALX
  4   雄性   12,1   Asp/Hep/Plav/ALX
  5   雄性   11,4   Asp/Hep/Plav/ALX
  6   雄性   11,4   Asp/Hep/Plav/ALX
  7   雄性   14,0   Asp/Hep/Plav/ALX
表50：在用于不同药物检测的Folts模型中对CFRs的抑制。其中在所提及的不同条件观察到CFRs的抑制的实验次数显示为所述条件独立重复的总次数的函数。
  检测化合物   CFRs的抑制   新损伤后的CFRs抑制   施用肾上腺素后的CFRs抑制   有效剂量
  对照   0/2   ND   ND   -
  Aspegic   0/3   0/3   0/1   -
  肝素   1/3   1/3   0/2   -
  Plavix   4/4   4/4   0/4   5mg/kg
  Reopro   3/3   3/3   3/3   170-420μg/kg
  ALX-0081   9/9   9/9   9/9   13-43μg/kg+1,5x剂量/kg/小时
表51：对于每只狒狒和每一剂量的Aspegic，肝素，Plavix和ALX-0081的CFRs(秒)长度。有效剂量用黄色显示。
4 5 6 7 8 9 10
  对照 82 99 109 95 113 142 113
  盐水 113 119 108 114 131 168 92
  5mg/kg Aspegic+60IU/kg肝素+1mg/kg Plavix 153 135 272 742 146 219 223
  +1mg/kg Plavix ＞1800 ＞1800 ＞1800 ＞1800 ＞1800 ＞1800 ＞1800
  肾上腺素+非有效剂量的ALX-0081+肝素 250 72 87 95 106 105 105
  肾上腺素+有效剂量的ALX-0081 ＞1800 ＞1800 ＞1800 ＞1800 ＞1800 ＞1800 ＞1800
表52：对于用PlavixTM处理的动物以最终剂量为函数的相对于第二对照纱布的失血(STD＝标准偏差)
表53：对于用ReoproTM处理的动物以最终剂量为函数的相对于第二对照纱布的失血(STD＝标准偏差)
Figure A20068002401201971
表54：对于用ALX-0081处理的动物以最终剂量为函数的相对于第二对照纱布的失血(STD＝标准偏差)
Figure A20068002401201972
表55：相对于第二对照纱布的血液损失总量的平均值(＝第一次5种剂量的检测化合物的失血总量)
检测化合物   作为有效剂量倍数的总剂量   总失血量的平均值   失血的标准偏差
  Plavix   4   19,4   4,0
  Reopro   3,5   44   26
  ALX-0081   13   10,8   5,7
表56：对于用Aspegic、肝素、Plavix和ALX-0081处理的每只狒狒以药物剂量为函数的相对于第二对照纱布的纱布中的失血。其中观察到CFRs完全抑制的有效药物剂量用黄色显示。
  4   5   6   7   8   9   10   中值±STD
  5mg/kg Aspegic+60IU/kg肝素+1mg/kg Plavix   2,6   1   4,6   12,1   1,3   1,4   1,8   1,8±3,5
  +1mg/kg Plavix   3,7   13,9   4,8   13,1   1,4   4,3   5,6   4,8±6,7
  肾上腺素+非有效剂量的ALX-0081+肝素   9,4   2,7   2,7   67   0,3   4,8   9,2   4,8±13,7
  肾上腺素+有效剂量的ALX-0081   23,4   2,0   1   39,4   1,3   4,5   0,8   2,0±10,3
表57：对于用Aspegic，肝素，Plavix和ALX-0081处理的每只狒狒以药物剂量为函数的％利托菌素-诱导的血小板聚集
  4   5   6   7   8   9   10
  对照   75   78   79   70   46   70   46
  盐水   48   78   74   24   45   65   47
  5mg/kg Aspegic+60IU/kg肝素+1mg/kg Plavix   62   65   89   64   66   68   55
  +1mg/kg Plavix   42   63   66   83   59   76   60
  肾上腺素+有效剂量的ALX-0081   0   24   24   6   17   7   8
表58：在施用后10分钟获得的血液样品中的ALX-0081浓度[μg/ml]
Figure A20068002401201981
表59：对于用ALX-0081和用vWF处理的狒狒的CFRs长度[秒]
Figure A20068002401201991
表60：制备用于研究ADAMTS13分裂A1A2A3的不同的混合物的体积[μl]
  NPP   NPP+EDTA   NPP+ALX-0081   PBS
  Tris(100mM)   5   5   5   5
  BaCl2(10mM)   5   5   5   5
  Pefablock(100mM)   1.3   1.3   1.3   1.3
  血浆   3.3   3.3   3.3   3.3
  ALX 0081(2,48mg/ml)   -   -   4   -
  PBS   -   -   -   4
  EDTA(0,35M)pH＝8,3   -   2.6   -   -
  H2O   81.9   79.3   77.9   77.9
  A1A2A3(460g/ml)   3.5   3.5   3.5   3.5
序列表
<110>埃博灵克斯股份有限公司
<120>用于治疗凝集介导的疾病的改良的纳米体
<130>P05-003 PCT
<160>303
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>26
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)..(11)
<223>X＝标志残基(参见表2)
<400>1
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Xaa Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
            20                  25
<210>2
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>X＝标志残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..( 9)
<223>X＝标志残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>X＝标志残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(12)..(12)
<223>X＝标志残基
<400>
Trp Xaa Arg Gln Ala Pro Gly Lys Xaa Xaa Glu Xaa Val Ala
1               5                   10
<210>3
<211>32
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<222>(21)..(21)
<223>X＝标志残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(22)..(22)
<223>X＝标志残基
<400>3
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
1               5                   10                  15
Met Asn Ser Leu Xaa Xaa Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
            20                  25                  30
<210>4
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>X＝标志残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>X＝标志残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>X＝标志残基
<400>4
Xaa Xaa Gln Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>5
<211>26
<212>PRT
<213>人工的
<400>5
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
            20                  25
<210>6
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>6
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala
1               5                   10
<210>7
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>7
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala
1               5                   10
<210>8
<211>13
<212>PRT
<213>人工的
<400>8
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ala
1               5                   10
<210>9
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>9
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala
1               5                   10
<210>10
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>10
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Val Ala
1               5                   10
<210>11
<211>13
<212>PRT
<213>人工的
<400>261
Asn Leu Lys Gln Gly Asp Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr
1               5                   10
<210>262
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>262
Asn Leu Lys Gln Gly Asp Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr
1               5                   10
<210>263
<211>19
<212>PRT
<213>人工的
<400>263
Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Tyr Thr Phe
<210>264
<211>19
<212>PRT
<213>人工的
<400>264
 Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Ser Leu Pro Ser Glu
1               5                   10
<210>15
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>15
Asn Tyr Gly Met Gly
1               5
<210>16
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>16
 Ser Tyr Thr Leu Gly
 1               5
<210>17
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>17
 Asn Tyr Asn Met Gly
 1               5
<210>18
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>18
Ser Ser Ala Met Ala
1               5
<210>19
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>19
Tyr Tyr Asn Thr Gly
1               5
<210>20
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>20
Ile Gly Ala Met Gly
1               5
<210>21
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>21
Ile Gly Thr Met Gly
1               5
<210>22
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>22
Tyr Asn Pro Met Gly
1               5
<210>23
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>23
Ser Ile Ser Trp Ser Gly Thr Tyr Thr Ala Tyr Ser Asp Asn Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>24
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>24
Gly Ile Ser Trp Ser Gly Val Ser Thr Asp Tyr Ala Glu Phe Ala Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>25
<211>18
<212>PRT
<213>人工的
<400>25
Thr Ser Ile Ser Trp Ser Gly Ser Tyr Thr Ala Tyr Ala Asp Asn Val
1               5                   10                  15
Lys Gly
<210>26
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>26
Ser Ile Ser Trp Ser Gly Met Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>27
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<400>27
Thr Ile Thr Ser Gly Gly Arg Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1               5                   10                  15
<210>28
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>28
Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>29
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<400>29
Thr Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Val Lys Gly
1               5                   10                  15
<210>30
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<400>30
Thr Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1               5                   10                  15
<210>31
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>31
Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Arg Ser Val Glu
1               5                   10                  15
Gly
<210>32
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>32
Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Glu
1               5                   10                  15
Gly
<210>33
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>33
Gln Ser Arg Tyr Arg Ser Asn Tyr Tyr Asp His Asp Asp Lys Tyr Ala
1               5                   10                  15
Tyr
<210>34
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<400>34
Leu Gly Arg Tyr Arg Ser Asn Trp Arg Asn Ile Gly Gln Tyr Asp Tyr
1               5                   10                  15
<210>35
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>35
Gln Ser Arg Tyr Ser Ser Asn Tyr Tyr Asp His Asp Asp Lys Tyr Ala
1               5                   10                  15
Tyr
<210>36
<211>15
<212>PRT
<213>人工的
<400>36
Ser Asn Arg Tyr Arg Thr His Thr Thr Gln Ala Met Tyr Asn Tyr
1               5                   10                  15
<210>37
<211>8
<212>PRT
<213>人工的
<400>37
Val Val Asp Gly Lys Arg Ala Pro
1               5
<210>38
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<400>38
Asn Arg Arg Gln Lys Thr Val Gln Met Gly Glu Arg Ala Tyr Asp Tyr
1               5                   10                  15
<210>39
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>39
Asn Leu Lys Gln Gly Ser Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr
1               5                   10
<210>40
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>40
Asn Leu Lys Gln Gly Asp Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr
1               5                   10
<210>41
<211>19
<212>PRT
<213>人工的
<400>41
Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Tyr Asn Phe
<210>42
<211>19
<212>PRT
<213>人工的
<400>42
Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Tyr Thr Phe
<210>43
<211>19
<212>PRT
<213>人工的
<400>43
Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Ser Leu Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Tyr Thr Phe
<210>44
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>44
Ser Phe Gly Met Ser
1               5
<210>45
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>45
Leu Asn Leu Met Gly
1               5
<210>46
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>46
Ile Asn Leu Leu Gly
1               5
<210>47
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>47
Asn Tyr Trp Met Tyr
1               5
<210>48
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>48
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>49
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<400>49
Thr Ile Thr Val Gly AsP Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1               5                   10                  15
<210>50
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<400>50
Thr Ile Thr Val Gly Asp Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1               5                   10                  15
<210>51
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>51
Ser Ile Asn Gly Arg Gly Asp Asp Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>52
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>52
Ala Ile Ser Ala Asp Ser Ser Thr Lys Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>53
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>53
Ala Ile Ser Ala Asp Ser Ser Asp Lys Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>54
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>54
Arg Ile Ser Thr Gly Gly Gly Tyr Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>55
<211>13
<212>PRT
<213>人工的
<400>55
Asp Arg Glu Ala Gln Val Asp Thr Leu Asp Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>56
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<400>56
Gly Gly Ser Leu Ser Arg
1               5
<210>57
<211>8
<212>PRT
<213>人工的
<400>57
Arg Arg Thr Trp His Ser Glu Leu
1               5
<210>58
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
<400>58
Gly Arg Ser Val Ser Arg Ser
1               5
<210>59
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>59
Gly Arg Gly Ser Pro
1               5
<210>60
<211>122
<212>PRT
<213>人工的
<400>60
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Leu Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Ile G1y
            20                  25                  30
Ala Met Gly Met Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly Pro Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr
                85                  90                  95
Ala Asn Leu Lys Gln Gly Ser Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>61
<211>126
<212>PRT
<213>人工的
<400>61
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
        35                  40                  45
Thr Ser Ile Ser Trp Ser Gly Thr Tyr Thr Ala Tyr Ser Asp Asn Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Gln Ser Arg Tyr Arg Ser Asn Tyr Tyr Asp His Asp Asp Lys
            100                 105                 110
Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>62
<211>128
<212>PRT
<213>人工的
<400>62
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ala Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn
            20                  25                  30
Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Val Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Arg Ser Val
    50                  55                  60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ala Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro
            100                 105                 110
Ser Glu Tyr Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>63
<211>126
<212>PRT
<213>人工的
<400>63
Ala Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Glu Arg Thr Thr Phe Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Thr Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe
        35                  40                  45
Val Gly Gly Ile Ser Trp Ser Gly Val Ser Thr Asp Tyr Ala Glu Phe
    50                  55                  60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp His Ala Ala Asn Thr Val
65                  70                  75                  80
Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Ala Leu Gly Arg Tyr Arg Ser Asn Trp Arg Asn Ile Gly Gln
            100                 105                 110
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>64
<211>126
<212>PRT
<213>人工的
<400>64
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Asn Asn Tyr
            20                  25                  30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
        35                  40                  45
Thr Ser Ile Ser Trp Ser Gly Ser Tyr Thr Ala Tyr Ala Asp Asn Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Gln Ser Arg Tyr Ser Ser Asn Tyr Tyr Asp His Asp Asp Lys
            100                 105                 110
Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>65
<211>116
<212>PRT
<213>人工的
<400>65
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Arg Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Asp Cys Asn
                85                  90                  95
Phe Val Val Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
        115
<210>66
<211>125
<212>PRT
<213>人工的
<400>66
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ser Ser Gly Arg Ala Phe Ser Tyr Tyr
            20                  25                  30
Asn Thr Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Met Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Ala Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Asn Arg Arg Gln Lys Thr Val Gln Met Gly Glu Arg Ala Tyr
            100                 105                 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>67
<211>122
<212>PRT
<213>人工的
<400>67
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Leu Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Ile Gly
            20                  25                  30
Ala Met Gly Leu Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly Pro Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr
                85                  90                  95
Ala Asn Leu Lys Gln Gly Ser Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>68
<211>122
<212>PRT
<213>人工的
<400>68
Ala Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Leu Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Ile Gly
            20                  25                  30
Ala Met Gly Leu Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr
                85                  90                  95
Ala Asn Leu Lys Gln Gly Asp Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>69
<211>122
<212>PRT
<213>人工的
<400>69
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Leu Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Ile Gly
            20                  25                  30
Thr Met Gly Leu Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr
                85                  90                  95
Ala Asn Leu Lys Gln Gly Asp Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>70
<211>122
<212>PRT
<213>人工的
<400>70
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Leu Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Ile Gly
            20                  25                  30
Thr Met Gly Leu Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr
                85                  90                  95
Ala Asn Leu Lys Gln Gly Asp Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>71
<211>128
<212>PRT
<213>人工的
<400>71
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ala Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn
            20                  25                  30
Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Leu Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
    50                  55                  60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Ash Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro
            100                 105                 110
Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>72
<211>128
<212>PRT
<213>人工的
<400>72
Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ala Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn
            20                  25                  30
Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Arg Glu Arg Asp Val Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
    50                  55                  60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Ser Leu Pro
            100                 105                 110
Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>73
<211>128
<212>PRT
<213>人工的
<400>73
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ala Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn
            20                  25                  30
Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Val Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
    50                  55                  60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Met Asn Asn Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro
            100                 105                 110
Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>74
<211>259
<212>PRT
<213>人工的
<400>74
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ala Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn
            20                  25                  30
Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Leu Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
    50                  55                  60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro
            100                 105                 110
Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
Ala Ala Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
    130                 135                 140
Ala Gly Gly Ala Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe
145                 150                 155                 160
Ser Tyr Asn Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg
                165                 170                 175
Asp Leu Val Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro
            180                 185                 190
Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg
        195                 200                 205
Met Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val
    210                 215                 220
Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg
225                 230                 235                 240
Thr Leu Pro Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
                245                 250                 255
Val Ser Ser
<210>75
<211>265
<212>PRT
<213>人工的
<400>75
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ala Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn
            20                  25                  30
Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Leu Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
    50                  55                  60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro
            100                 105                 110
Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
    130                 135                 140
Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ala Leu Arg Leu Ser Cys Ala
145                 150                 155                 160
Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln
                165                 170                 175
Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Leu Val Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly
            180                 185                 190
Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser
        195                 200                 205
Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys
    210                 215                 220
Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala
225                 230                 235                 240
Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly
                245                 250                 255
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
            260                 265
<210>76
<211>286
<212>PRT
<213>人工的
<400>76
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ala Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn
            20                  25                  30
Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Leu Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
    50                  55                  60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro
            100                 105                 110
Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
    130                 135                 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
145                 150                 155                 160
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ala Leu
                165                 170                 175
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn Pro Met
            180                 185                 190
Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Leu Val Ala Ala
        195                 200                 205
Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Glu Gly
    210                 215                 220
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr Leu Gln
225                 230                 235                 240
Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Gly Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
                245                 250                 255
Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro Ser Glu
            260                 265                 270
Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        275                 280                 285
<210>77
<211>247
<212>PRT
<213>人工的
<400>77
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Leu Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Ile Gly
            20                  25                  30
Ala Met Gly Met Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly Pro Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr
                85                  90                  95
Ala Asn Leu Lys Gln Gly Ser Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Val Gln
        115                 120                 125
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
    130                 135                 140
Leu Ser Cys Leu Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Ile Gly Ala Met Gly
145                 150                 155                 160
Met Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile
                165                 170                 175
Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Val Lys Gly Arg Phe
            180                 185                 190
Thr Ile Ser Arg Asp Gly Pro Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn
        195                 200                 205
Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr Ala Asn Leu
    210                 215                 220
Lys Gln Gly Ser Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
225                 230                 235                 240
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
                245
<210>78
<211>253
<212>PRT
<213>人工的
<400>78
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Leu Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Ile Gly
            20                  25                  30
Ala Met Gly Met Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Thr Tle Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly Pro Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr
                85                  90                  95
Ala Asn Leu Lys Gln Gly Ser Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
        115                 120                 125
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
    130                 135                 140
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Leu Ala Ser Gly Arg Ile Phe
145                 150                 155                 160
Ser Ile Gly Ala Met Gly Met Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg
                165                 170                 175
Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp
            180                 185                 190
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly Pro Lys Asn Thr
        195                 200                 205
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
    210                 215                 220
Tyr Cys Tyr Ala Asn Leu Lys Gln Gly Ser Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn
225                 230                 235                 240
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
                245                 250
<210>79
<211>274
<212>PRT
<213>人工的
<400>79
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Leu Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Ile Gly
            20                  25                  30
Ala Met Gly Met Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly Pro Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr
                85                  90                  95
Ala Asn Leu Lys Gln Gly Ser Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
    130                 135                 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
145                 150                 155                 160
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Leu Ala
                165                 170                 175
Ser Gly Arg Ile Phe Ser Ile Gly Ala Met Gly Met Tyr Arg Gln Ala
            180                 185                 190
Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Ser
        195                 200                 205
Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
    210                 215                 220
Gly Pro Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu
225                 230                 235                 240
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr Ala Asn Leu Lys Gln Gly Ser Tyr
                245                 250                 255
Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
            260                 265                 270
Ser Ser
<210>80
<211>259
<212>PRT
<213>人工的
<400>80
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ala Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn
            20                  25                  30
Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Val Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Arg Ser Val
    50                  55                  60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ala Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro
            100                 105                 110
Ser Glu Tyr Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
Ala Ala Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
    130                 135                 140
Ala Gly Gly Ala Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe
145                 150                 155                 160
Ser Tyr Asn Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg
                165                 170                 175
Asp Val Val Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala
            180                 185                 190
Arg Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg
        195                 200                 205
Met Val Tyr Leu Gln Met Asn Ala Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val
    210                 215                 220
Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu AsP Gly Arg Val Arg
225                 230                 235                 240
Thr Leu Pro Ser Glu Tyr Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
                245                 250                 255
Val Ser Ser
<210>81
<211>265
<212>PRT
<213>人工的
<400>81
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ala Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn
            20                  25                  30
Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Val Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Arg Ser Val
    50                  55                  60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ala Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro
            100                 105                 110
Ser Glu Tyr Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
    130                 135                 140
Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ala Leu Arg Leu Ser Cys Ala
145                 150                 155                 160
Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln
                165                 170                 175
Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Val Val Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly
            180                 185                 190
Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Arg Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser
        195                 200                 205
Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr Leu Gln Met Asn Ala Leu Lys
    210                 215                 220
Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala
225                 230                 235                 240
Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro Ser Glu Tyr Asn Phe Trp Gly
                245                 250                 255
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
            260                 265
<210>82
<211>286
<212>PRT
<213>人工的
<400>82
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ala Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn
            20                  25                  30
Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Val Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Arg Ser Val
    50                  55                  60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ala Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro
            100                 105                 110
Ser Glu Tyr Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
    130                 135                 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
145                 150                 155                 160
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ala Leu
                165                 170                 175
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn Pro Met
            180                 185                 190
Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Val Val Ala Ala
        195                 200                 205
Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Arg Ser Val Glu Gly
    210                 215                 220
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr Leu Gln
225                 230                 235                 240
Met Asn Ala Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
                245                 250                 255
Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro Ser Glu
            260                 265                 270
Tyr Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        275                 280                 285
<210>83
<211>3
<212>PRT
<213>人工的
<400>83
Ala Ala Ala
1
<210>84
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<400>84
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1               5
<210>85
<211>30
<212>PRT
<213>人工的
<400>85
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1               5                   10                  15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
            20                  25                  30
<210>86
<211>128
<212>PRT
<213>人工的
<400>86
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Ash
            20                  25                  30
Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Asp Val Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Arg Ser Val
    50                  55                  60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro
            100                 105                 110
Ser Glu Tyr Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>87
<211>128
<212>PRT
<213>人工的
<400>87
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn
            20                  25                  30
Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Val Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Arg Ser Val
    50                  55                  60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro
            100                 105                 110
Ser Glu Tyr Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>88
<211>128
<212>PRT
<213>人工的
<400>88
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn
            20                  25                  30
Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Asp Val Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Arg Ser Val
    50                  55                  60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro
            100                 105                 110
Ser Glu Tyr Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>89
<211>128
<212>PRT
<213>人工的
<400>89
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn
            20                  25                  30
Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Asp Val Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Arg Ser Val
    50                  55                  60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Ser Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro
            100                 105                 110
Ser Glu Tyr Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>90
<211>128
<212>PRT
<213>人工的
<400>90
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn
            20                  25                  30
Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
    50                  55                  60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro
            100                 105                 110
Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>91
<211>128
<212>PRT
<213>人工的
<400>91
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn
            20                  25                  30
Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
    50                  55                  60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro
            100                 105                 110
Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>92
<211>128
<212>PRT
<213>人工的
<400>92
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn
            20                  25                  30
Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
    50                  55                  60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Ser Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro
            100                 105                 110
Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>93
<211>128
<212>PRT
<213>人工的
<400>93
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Asn
            20                  25                  30
Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
    50                  55                  60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro
            100                 105                 110
Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>94
<211>128
<212>PRT
<213>人工的
<400>94
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Asn
            20                  25                  30
Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
    50                  55                  60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro
            100                 105                 110
Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>95
<211>122
<212>PRT
<213>人工的
<400>95
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Ile Gly
            20                  25                  30
Ala Met Gly Met Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly Pro Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr
                85                  90                  95
Ala Asn Leu Lys Gln Gly Ser Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>96
<211>122
<212>PRT
<213>人工的
<400>96
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Ile Gly
            20                  25                  30
Ala Met Gly Met Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr
                85                  90                  95
Ala Asn Leu Lys Gln Gly Ser Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>97
<211>122
<212>PRT
<213>人工的
<400>97
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Ile Gly
            20                  25                  30
Ala Met Gly Met Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr
                85                  90                  95
Ala Asn Leu Lys Gln Gly Ser Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>98
<211>259
<212>PRT
<213>人工的
<400>98
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn
            20                  25                  30
Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
    50                  55                  60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro
            100                 105                 110
Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
Ala Ala Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
    130                 135                 140
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe
145                 150                 155                 160
Ser Tyr Asn Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg
                165                 170                 175
Glu Leu Val Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro
            180                 185                 190
Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg
        195                 200                 205
Met Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
    210                 215                 220
Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg
225                 230                 235                 240
Thr Leu Pro Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
                245                 250                 255
Val Ser Ser
<210>99
<211>259
<212>PRT
<213>人工的
<400>99
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn
            20                  25                  30
Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
    50                  55                  60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Ser Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro
            100                 105                 110
Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
Ala Ala Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
    130                 135                 140
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe
145                 150                 155                 160
Ser Tyr Asn Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg
                165                 170                 175
Glu Leu Val Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro
            180                 185                 190
Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg
        195                 200                 205
Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
    210                 215                 220
Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg
225                 230                 235                 240
Thr Leu Pro Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
                245                 250                 255
Val Ser Ser
<210>100
<211>259
<212>PRT
<213>人工的
<400>100
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn
            20                  25                  30
Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Val Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Arg Ser Val
    50                  55                  60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro
            100                 105                 110
Ser Glu Tyr Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
Ala Ala Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
    130                 135                 140
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe
145                 150                 155                 160
Ser Tyr Asn Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg
                165                 170                 175
Glu Val Val Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala
            180                 185                 190
Arg Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg
        195                 200                 205
Met Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
    210                 215                 220
Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg
225                 230                 235                 240
Thr Leu Pro Ser Glu Tyr Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
                245                 250                 255
Val Ser Ser
<210>101
<211>265
<212>PRT
<213>人工的
<400>101
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn
            20                  25                  30
Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
    50                  55                  60
Glu Gly Arg  Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro
            100                 105                 110
Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
    130                 135                 140
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
145                 150                 155                 160
Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln
                165                 170                 175
Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly
            180                 185                 190
Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser
        195                 200                 205
Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
    210                 215                 220
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala
225                 230                 235                 240
Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly
                245                 250                 255
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
            260                 265
<210>102
<211>265
<212>PRT
<213>人工的
<400>102
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn
            20                  25                  30
Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
    50                  55                  60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Ser Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro
            100                 105                 110
Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
    130                 135                 140
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
145                 150                 155                 160
Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln
                165                 170                 175
Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly
            180                 185                 190
Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser
        195                 200                 205
Arg Asp Asn Ala Lys Arg Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
    210                 215                 220
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala
225                 230                 235                 240
Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly
                245                 250                 255
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
            260                 265
<210>103
<211>265
<212>PRT
<213>人工的
<400>103
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn
            20                  25                  30
Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Val Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Arg Ser Val
    50                  55                  60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro
            100                 105                 110
Ser Glu Tyr Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
    130                 135                 140
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
145                 150                 155                 160
Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln
                165                 170                 175
Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Val Val Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly
            180                 185                 190
Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Arg Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser
        195                 200                 205
Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
    210                 215                 220
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala
225                 230                 235                 240
Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro Ser Glu Tyr Asn Phe Trp Gly
                245                 250                 255
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
            260                 265
<210>104
<211>286
<212>PRT
<213>人工的
<400>104
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn
            20                  25                  30
Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
    50                  55                  60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro
100                 105                 110
Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
                115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
            130                 135                 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
145                 150                 155                 160
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
                165                 170                 175
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn Pro Met
            180                 185                 190
Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val Ala Ala
        195                 200                 205
Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Glu Gly
    210                 215                 220
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr Leu Gln
225                 230                 235                 240
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
                245                 250                 255
Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro Ser Glu
            260                 265                 270
Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        275                 280                 285
<210>105
<211>286
<212>PRT
<213>人工的
<400>105
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn
            20                  25                  30
Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
    50                  55                  60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Ser Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro
            100                 105                 110
Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
    130                 135                 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
145                 150                 155                 160
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
                165                 170                 175
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn Pro Met
            180                 185                 190
Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val Ala Ala
        195                 200                 205
Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Glu Gly
    210                 215                 220
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Ser Val Tyr Leu Gln
225                 230                 235                 240
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
                245                 250                 255
Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro Ser Glu
            260                 265                 270
Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        275                 280                 285
<210>106
<211>286
<212>PRT
<213>人工的
<400>106
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn
            20                  25                  30
Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Val Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Arg Ser Val
    50                  55                  60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro
            100                 105                 110
Ser Glu Tyr Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
    130                 135                 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
145                 150                 155                 160
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
                165                 170                 175
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn Pro Met
            180                 185                 190
Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Val Val Ala Ala
        195                 200                 205
Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Arg Ser Val Glu Gly
    210                 215                 220
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr Leu Gln
225                 230                 235                 240
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
                245                 250                 255
Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro Ser Glu
            260                 265                 270
Tyr Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        275                 280                 285
<210>107
<211>117
<212>PRT
<213>人工的
<400>107
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Gly Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Glu Arg Ile Phe Asp Leu Asn
            20                  25                  30
Leu Met Gly Trp Tyr Arg Gln Gly Pro Gly Asn Glu Arg Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Thr Cys Ile Thr Val Gly Asp Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Met Asp Tyr Thr Lys Gln Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu His Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Lys Ile Arg Arg Thr Trp His Ser Glu Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>108
<211>116
<212>PRT
<213>人工的
<400>108
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Glu Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Glu Arg Ile Trp Asp Ile Asn
            20                  25                  30
Leu Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Gly Pro Gly Asn Glu Arg Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Thr Ile Thr Val Gly Asp Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Tyr Asp Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys Lys
                85                  90                  95
Ile Arg Arg Thr Trp His Ser Glu Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
        115
<210>109
<211>115
<212>PRT
<213>人工的
<400>109
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
            20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser
        115
<210>110
<211>116
<212>PRT
<213>人工的
<400>110
Ala Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Gly Ser Phe
            20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Tyr Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ser Ile Asn Gly Arg Gly Asp Asp Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Glu Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Ile Gly Arg Ser Val Ser Arg Ser Arg Thr Gln Gly Thr Gln Val
                100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
            115
<210>111
<211>114
<212>PRT
<213>人工的
<400>111
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
            20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Gln Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Ala Asp Ser Ser Thr Lys Asn Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Met Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Val Ile Gly Arg Gly Ser Pro Ser Ser Pro Gly Thr Gln Val Thr Val
            100                 105                 110
Ser Ser
<210>112
<211>114
<212>PRT
<213>人工的
<400>112
Gln Val Gln Leu Ala Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Phe
            20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Ala Asp Ser Ser Asp Lys Arg Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Met Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Val Ile Gly Arg Gly Ser Pro Ala Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
            100                 105                 110
Ser Ser
<210>113
<211>123
<212>PRT
<213>人工的
<400>113
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Trp Met Tyr Trp Val Arg Val Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Ile
        35                  40                  45
Ser Arg Asp Ile Ser Thr Gly Gly Gly Tyr Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser
    50                  55                  60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu
65                  70                  75                  80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Lys Asp Arg Glu Ala Gln Val Asp Thr Leu Asp Phe Asp Tyr
            100                 105                 110
Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>114
<211>115
<212>PRT
<213>人工的
<400>114
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
            20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser
        115
<210>115
<211>115
<212>PRT
<213>人工的
<400>115
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
            20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser
        115
<210>116
<211>115
<212>PRT
<213>人工的
<400>116
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
            20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser
        115
<210>117
<211>115
<212>PRT
<213>人工的
<400>117
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
            20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser
        115
<210>118
<211>115
<212>PRT
<213>人工的
<400>118
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
            20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser
        115
<210>119
<211>115
<212>PRT
<213>人工的
<400>119
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
            20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser
        115
<210>120
<211>115
<212>PRT
<213>人工的
<400>120
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
            20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu GLu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser
        115
<210>121
<211>115
<212>PRT
<213>人工的
<400>121
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
            20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser
        115
<210>122
<211>30
<212>PRT
<213>人工的
<400>122
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Leu Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser
            20                  25                  30
<210>123
<211>30
<212>PRT
<213>人工的
<400>123
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser
            20                  25                  30
<210>124
<211>30
<212>PRT
<213>人工的
<400>124
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ala Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser
            20                  25                  30
<210>125
<211>30
<212>PRT
<213>人工的
<400>125
Ala Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Glu Arg Thr Thr Phe
            20                  25                  30
<210>126
<211>30
<212>PRT
<213>人工的
<400>126
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Asn
            20                  25                  30
<210>127
<211>30
<212>PRT
<213>人工的
<400>127
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Ser Ile Phe Ser
            20                  25                  30
<210>128
<211>30
<212>PRT
<213>人工的
<400>128
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ser Ser Gly Arg Ala Phe Ser
            20                  25                  30
<210>129
<211>30
<212>PRT
<213>人工的
<400>129
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Leu Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser
            20                  25                  30
<210>130
<211>30
<212>PRT
<213>人工的
<400>130
Ala Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Leu Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser
            20                  25                  30
<210>131
<211>30
<212>PRT
<213>人工的
<400>131
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Leu Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser
            20                  25                  30
<210>132
<211>30
<212>PRT
<213>人工的
<400>132
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Leu Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser
            20                  25                  30
<210>133
<211>30
<212>PRT
<213>人工的
<400>133
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ala Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser
            20                  25                  30
<210>134
<211>30
<212>PRT
<213>人工的
<400>134
Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ala Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser
            20                  25                  30
<210>135
<211>30
<212>PRT
<213>人工的
<400>135
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ala Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser
            20                  25                  30
<210>136
<211>30
<212>PRT
<213>人工的
<400>136
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser
            20                  25                  30
<210>137
<211>30
<212>PRT
<213>人工的
<400>137
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser
            20                  25                  30
<210>138
<211>30
<212>PRT
<213>人工的
<400>138
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser
            20                  25                  30
<210>139
<211>30
<212>PRT
<213>人工的
<400>139
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser
            20                  25                  30
<210>140
<211>30
<212>PRT
<213>人工的
<400>140
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser
            20                  25                  30
<210>141
<211>30
<212>PRT
<213>人工的
<400>141
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser
            20                  25                  30
<210>142
<211>30
<212>PRT
<213>人工的
<400>142
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser
            20                  25                  30
<210>143
<211>30
<212>PRT
<213>人工的
<400>143
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
            20                  25                  30
<210>144
<211>30
<212>PRT
<213>人工的
<400>144
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
            20                  25                  30
<210>145
<211>30
<212>PRT
<213>人工的
<400>145
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser
            20                  25                  30
<210>146
<211>30
<212>PRT
<213>人工的
<400>146
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser
            20                  25                  30
<210>147
<211>30
<212>PRT
<213>人工的
<400>147
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser
            20                  25                  30
<210>148
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>148
Ile Gly Ala Met Gly
1               5
<210>149
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>149
Asn Tyr Gly Met Gly
1               5
<210>150
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>150
Tyr Asn Pro Met Gly
1               5
<210>151
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<400>151
Ser Ser Tyr Thr Leu Gly
1               5
<210>152
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>152
Asn Tyr Gly Met Gly
1               5
<210>153
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>153
Ser Ser Ala Met Ala
1               5
<210>154
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>154
Tyr Tyr Asn Thr Gly
1               5
<210>155
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>155
Ile Gly Ala Met Gly
1               5
<210>156
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>156
Ile Gly Ala Met Gly
1               5
<210>157
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>157
Ile Gly Thr Met Gly
1               5
<210>158
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>158
Ile Gly Thr Met Gly
1               5
<210>159
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>159
Tyr Asn Pro Met Gly
1               5
<210>160
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>160
Tyr Asn Pro Met Gly
1               5
<210>161
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>161
Tyr Asn Pro Met Gly
1               5
<210>162
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>162
Tyr Asn Pro Met Gly
1               5
<210>163
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>163
Tyr Asn Pro Met Gly
1               5
<210>164
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>164
Tyr Asn Pro Met Gly
1               5
<210>165
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>165
Tyr Asn Pro Met Gly
1               5
<210>166
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>166
Tyr Asn Pro Met Gly
1               5
<210>167
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>167
Tyr Asn Pro Met Gly
1               5
<210>168
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>168
Tyr Asn Pro Met Gly
1               5
<210>169
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>169
Tyr Asn Pro Met Gly
1               5
<210>170
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>170
Tyr Asn Pro Met Gly
1               5
<210>171
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>171
Ile Gly Ala Met Gly
1               5
<210>172
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>172
Ile Gly Ala Met Gly
1               5
<210>173
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>173
Ile Gly Ala Met Gly
1               5
<210>174
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>174
Met Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala
1               5                   10
<210>175
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>175
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Thr
1               5                   10
<210>176
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>176
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Val Val Ala
1               5                   10
<210>177
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>177
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Gly
1               5                   10
<210>178
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>178
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Thr
1               5                   10
<210>179
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>179
Trp Tyr Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala
1               5                   10
<210>180
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>180
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala
1               5                   10
<210>181
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>181
Leu Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala
1               5                   10
<210>182
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>182
Leu Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala
1               5                   10
<210>183
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>183
Leu Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala
1               5                   10
<210>184
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>184
Leu Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala
1               5                   10
<210>185
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>185
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Leu Val Ala
1               5                   10
<210>186
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>186
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Arg Glu Arg Asp Val Val Ala
1               5                   10
<210>187
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>187
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Val Val Ala
1               5                   10
<210>188
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>188
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Asp Val Val Ala
1               5                   10
<210>189
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>189
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Val Val Ala
1               5                   10
<210>190
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>190
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Asp Val Val Ala
1               5                   10
<210>191
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>191
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Asp Val Val Ala
1               5                   10
<210>192
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>192
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val Ala
1               5                   10
<210>193
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>193
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val Ala
1               5                   10
<210>194
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>194
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val Ala
1               5                   10
<210>195
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>195
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val Ala
1               5                   10
<210>196
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>196
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val Ala
1               5                   10
<210>197
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>197
Met Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val Ala
1               5                   10
<210>198
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>198
Met Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val Ala
1               5                   10
<210>199
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>199
Met Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val Ala
1               5                   10
<210>200
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<400>200
Thr Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Val Lys Gly
1               5                   10                  15
<210>201
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>201
Ser Ile Ser Trp Ser Gly Thr Tyr Thr Ala Tyr Ser Asp Asn Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>202
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>202
Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Arg Ser Val Glu
1               5                   10                  15
Gly
<210>203
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>203
Gly Ile Ser Trp Ser Gly Val Ser Thr Asp Tyr Ala Glu Phe Ala Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>204
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>204
Ser Ile Ser Trp Ser Gly Ser Tyr Thr Ala Tyr Ala Asp Asn Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>205
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<400>205
Thr Ile Thr Ser Gly Gly Arg Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1               5                   10                  15
<210>206
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>206
Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>207
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<400>207
Thr Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1               5                   10                  15
<210>208
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<400>208
Thr Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1               5                   10                  15
<210>209
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<400>209
Thr Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1               5                   10                  15
<210>210
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<400>210
Thr Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1               5                   10                  15
<210>211
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>211
Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Glu
1               5                   10                  15
Gly
<210>212
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>212
Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Glu
1               5                   10                  15
Gly
<210>213
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>213
Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Glu
1               5                   10                  15
Gly
<210>214
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>214
Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Arg Ser Val Glu
1               5                   10                  15
Gly
<210>215
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>215
Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Arg Ser Val Glu
1               5                   10                  15
Gly
<210>216
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>216
Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Arg Ser Val Glu
1               5                   10                  15
Gly
<210>217
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>217
Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Arg Ser Val Glu
1               5                   10                  15
Gly
<210>218
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>218
Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Glu
1               5                   10                  15
Gly
<210>219
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>219
Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Glu
1               5                   10                  15
Gly
<210>220
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>220
Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Glu
1               5                   10                  15
Gly
<210>221
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>221
Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Glu
1               5                   10                  15
Gly
<210>222
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>222
Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Glu
1               5                   10                  15
Gly
<210>223
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<400>223
Thr Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Val Lys Gly
1               5                   10                  15
<210>224
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<400>224
Thr Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Val Lys Gly
1               5                   10                  15
<210>225
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<400>225
Thr Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Val Lys Gly
1               5                   10                  15
<210>226
<211>32
<212>PRT
<213>人工的
<400>226
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly Pro Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
1               5                   10                  15
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr Ala
            20                  25                  30
<210>227
<211>32
<212>PRT
<213>人工的
<400>227
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
1               5                   10                  15
Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
            20                  25                  30
<210>228
<211>32
<212>PRT
<213>人工的
<400>228
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr Leu Gln
1               5                   10                  15
Met Asn Ala Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
            20                  25                  30
<210>229
<211>32
<212>PRT
<213>人工的
<400>229
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp His Ala Ala Asn Thr Val Tyr Leu Glu
1               5                   10                  15
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
            20                  25                  30
<210>230
<211>32
<212>PRT
<213>人工的
<400>230
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
1               5                   10                  15
Met Asp Ser Leu Lys Pro Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
            20                  25                  30
<210>231
<211>32
<212>PRT
<213>人工的
<400>231
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
1               5                   10                  15
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Asp Cys Asn Phe
            20                  25                  30
<210>232
<211>32
<212>PRT
<213>人工的
<400>232
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Met Val Tyr Leu Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
            20                  25                  30
<210>233
<211>32
<212>PRT
<213>人工的
<400>233
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly Pro Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
1               5                   10                  15
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr Ala
            20                  25                  30
<210>234
<211>32
<212>PRT
<213>人工的
<400>234
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
1               5                   10                  15
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr Ala
            20                  25                  30
<210>235
<211>32
<212>PRT
<213>人工的
<400>235
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
1               5                   10                  15
Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr Ala
            20                  25                  30
<210>236
<211>32
<212>PRT
<213>人工的
<400>236
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
1               5                   10                  15
Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr Ala
            20                  25                  30
<210>237
<211>32
<212>PRT
<213>人工的
<400>237
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr Leu Gln
1               5                   10                  15
Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
            20                  25                  30
<210>238
<211>32
<212>PRT
<213>人工的
<400>238
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr Leu Gln
1               5                   10                  15
Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
            20                  25                  30
<210>239
<211>32
<212>PRT
<213>人工的
<400>239
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr Leu Glu
1               5                   10                  15
Met Asn Asn Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
            20                  25                  30
<210>240
<211>32
<212>PRT
<213>人工的
<400>240
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr Leu Gln
1               5                   10                  15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
            20                  25                  30
<210>241
<211>32
<212>PRT
<213>人工的
<400>241
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr Leu Gln
1               5                   10                  15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
            20                  25                  30
<210>242
<211>32
<212>PRT
<213>人工的
<400>242
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Val Tyr Leu Gln
1               5                   10                  15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
            20                  25                  30
<210>243
<211>32
<212>PRT
<213>人工的
<400>243
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Ser Val Tyr Leu Gln
1               5                   10                  15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
            20                  25                  30
<210>244
<211>32
<212>PRT
<213>人工的
<400>244
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr Leu Gln
1               5                   10                  15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
            20                  25                  30
<210>245
<211>32
<212>PRT
<213>人工的
<400>245
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Val Tyr Leu Gln
1               5                   10                  15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
            20                  25                  30
<210>246
<211>32
<212>PRT
<213>人工的
<400>246
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Ser Val Tyr Leu Gln
1               5                   10                  15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
            20                  25                  30
<210>247
<211>32
<212>PRT
<213>人工的
<400>247
Arg Phe Thr Ile Ser Arg AsP Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr Leu Gln
1               5                   10                  15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
            20                  25                  30
<210>248
<211>32
<212>PRT
<213>人工的
<400>248
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Val Tyr Leu Gln
1               5                   10                  15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
            20                  25                  30
<210>249
<211>32
<212>PRT
<213>人工的
<400>249
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly Pro Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
1               5                   10                  15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr Ala
            20                  25                  30
<210>250
<211>32
<212>PRT
<213>人工的
<400>250
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
1               5                   10                  15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr Ala
            20                  25                  30
<210>251
<211>32
<212>PRT
<213>人工的
<400>251
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
1               5                   10                  15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr Ala
            20                  25                  30
<210>252
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>252
Asn Leu Lys Gln Gly Ser Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr
1               5                   10
<210>253
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>253
Gln Ser Arg Tyr Arg Ser Asn Tyr Tyr Asp His Asp Asp Lys Tyr Ala
1               5                   10                  15
Tyr
<210>254
<211>19
<212>PRT
<213>人工的
<400>254
Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Tyr Asn Phe
<210>255
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<400>255
Leu Gly Arg Tyr Arg Ser Asn Trp Arg Asn Ile Gly Gln Tyr Asp Tyr
1               5                   10                  15
<210>256
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>256
Gln Ser Arg Tyr Ser Ser Asn Tyr Tyr Asp His Asp Asp Lys Tyr Ala
1               5                   10                  15
Tyr
<210>257
<211>8
<212>PRT
<213>人工的
<400>257
Val Val Asp Gly Lys Arg Ala Pro
1               5
<210>258
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<400>258
Asn Arg Arg Gln Lys Thr Val Gln Met Gly Glu Arg Ala Tyr Asp Tyr
1               5                   10                  15
<210>259
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>259
Asn Leu Lys Gln Gly Ser Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr
1               5                   10
<210>260
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>260
Asn Leu Lys Gln Gly Asp Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr
1               5                   10
<210>261
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>261
Asn Leu Lys Gln Gly Asp Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr
1               5                   10
<210>262
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>262
Asn Leu Lys Gln Gly Asp Tyr Gly Tyr Arg  Phe Asn Asp Tyr
1               5                   10
<210>263
<211>19
<212>PRT
<213>人工的
<400>263
Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Tyr Thr Phe
<210>264
<211>19
<212>PRT
<213>人工的
<400>264
Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Ser Leu Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Tyr Thr Phe
<210>265
<211>19
<212>PRT
<213>人工的
<400>265
Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Tyr Thr Phe
<210>266
<211>19
<212>PRT
<213>人工的
<400>266
Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Tyr Asn Phe
<210>267
<211>19
<212>PRT
<213>人工的
<400>267
Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Tyr Asn Phe
<210>268
<211>19
<212>PRT
<213>人工的
<400>268
Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Tyr Asn Phe
<210>269
<211>19
<212>PRT
<213>人工的
<400>269
Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Tyr Asn Phe
<210>270
<211>19
<212>PRT
<213>人工的
<400>270
Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Tyr Thr Phe
<210>271
<211>19
<212>PRT
<213>人工的
<400>271
Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Tyr Thr Phe
<210>272
<211>19
<212>PRT
<213>人工的
<400>272
Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Tyr Thr Phe
<210>273
<211>19
<212>PRT
<213>人工的
<400>273
Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Tyr Thr Phe
<210>274
<211>19
<212>PRT
<213>人工的
<400>274
Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Tyr Thr Phe
<210>275
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>275
Asn Leu Lys Gln Gly Ser Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr
1               5                   10
<210>276
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>276
Asn Leu Lys Gln Gly Ser Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr
1               5                   10
<210>277
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>277
Asn Leu Lys Gln Gly Ser Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr
1               5                   10
<210>278
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<400>278
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>279
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<400>279
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>280
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<400>280
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>281
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<400>281
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>282
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<400>282
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>283
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<400>283
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>284
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<400>284
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>285
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<400>285
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>286
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<400>286
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>287
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<400>287
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>288
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<400>288
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>289
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<400>289
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>290
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<400>290
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>291
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<400>291
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>292
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<400>292
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>293
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<400>293
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>294
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<400>294
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>295
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<400>295
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>296
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<400>296
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>297
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<400>297
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>298
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<400>298
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>299
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<400>299
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>300
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<400>300
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>301
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<400>301
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>302
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<400>302
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>303
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<400>303
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10

Claims (78)

1.针对冯威勒布兰特因子(vWF)的纳米体，所述纳米体由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中：
i)CDR1包括选自由下列各项组成的组的氨基酸序列、基本上由选自由下列各项组成的组的氨基酸序列组成、或是选自由下列各项组成的组的氨基酸序列：
NYGMG                    [SEQ ID NO：15]
SYTLG                    [SEQ ID NO：16]
NYNMG                    [SEQ ID NO：17]
SSAMA                    [SEQ ID NO：18]
YYNTG                    [SEQ ID NO：19]
IGAMG                    [SEQ ID NO：20]
IGTMG                    [SEQ ID NO：21]
YNPMG                    [SEQ ID NO：22]
或者选自由与上述氨基酸序列之一具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或选自由与上述氨基酸序列之一有2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
并且其中：
ii)CDR2包括选自由下列各项组成的组的氨基酸序列、基本上由选自由下列各项组成的组的氨基酸序列组成、或是选自由下列各项组成的组的氨基酸序列：
SISWSGTYTAYSDNVKG                 [SEQ ID NO：23]
GISWSGVSTDYAEFAKG                 [SEQ ID NO：24]
TSISWSGSYTAYADNVKG                [SEQ ID NO：25]
SISWSGMSTYYTDSVKG                 [SEQ ID NO：26]
TITSGGRTSYADSVKG                  [SEQ ID NO：27]
AISWSGGLTYYADSVKG                 [SEQ ID NO：28]
TITSGGSTNYADPVKG                  [SEQ ID NO：29]
TITSGGSTNYADSVKG                  [SEQ ID NO：30]
AISRTGGSTYYARSVEG                 [SEQ ID NO：31]
AISRTGGSTYYPDSVEG                 [SEQ ID NO：32]
或者选自由与上述氨基酸序列之一具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或选自由与上述氨基酸序列之一有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
并且其中：
iii)CDR3包括选自由下列各项组成的组的氨基酸序列、基本上由选自由下列各项组成的组的氨基酸序列组成、或是选自由下列各项组成的组的氨基酸序列：
QSRYRSNYYDHDDKYAY                  [SEQ ID NO：33]
LGRYRSNWRNIGQYDY                   [SEQ ID NO：34]
QSRYSSNYYDHDDKYAY                  [SEQ ID NO：35]
SNRYRTHTTQAMYNY                    [SEQ ID NO：36]
VVDGKRAP                           [SEQ ID NO：37]
NRRQKTVQMGERAYDY                   [SEQ ID NO：38]
NLKQGSYGYRFNDY                     [SEQ ID NO：39]
NLKQGDYGYRFNDY                     [SEQ ID NO：40]
AGVRAEDGRVRTLPSEYNF                [SEQ ID NO：41]
AGVRAEDGRVRTLPSEYTF                [SEQ ID NO：42]
AGVRAEDGRVRSLPSEYTF                [SEQ ID NO：43]
或者选自由与上述氨基酸序列之一具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或选自由与上述氨基酸序列之一有3个、2个或只有1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
(1)任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代(如本文所定义)；和/或
(2)与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列优选地只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入。
2.按照权利要求1的纳米体的人源化变体。
3.针对冯威勒布兰特因子(vWF)的纳米体，所述纳米体由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中：
a)CDR1包括或基本上由下列各项组成：
-氨基酸序列YNPMG；或
-与氨基酸序列YNPMG有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
并且
b)CDR2包括或基本上由下列各项组成：
-氨基酸序列AISRTGGSTYYPDSVEG；或
-与氨基酸序列AISRTGGSTYYPDSVEG有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列AISRTGGSTYYPDSVEG有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
并且
c)CDR3包括或基本上由下列各项组成：
-氨基酸序列AGVRAEDGRVRTLPSEYTF；or
-与氨基酸序列AGVRAEDGRVRTLPSEYTF有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列AGVRAEDGRVRTLPSEYTF只有1个氨基酸差异的氨基酸序列。
4.按照权利要求3的纳米体，其中CDR1包括或基本上由氨基酸序列YNPMG组成。
5.按照权利要求3的纳米体，其中CDR2包括或基本上由氨基酸序列AISRTGGSTYYPDSVEG组成。
6.按照权利要求3的纳米体，其中CDR3包括或基本上由氨基酸序列AGVRAEDGRVRTLPSEYTF组成。
7.按照权利要求3的纳米体，其中：
-CDR1包括或基本上由氨基酸序列YNPMG组成；并且CDR3包括或基本上由氨基酸序列AGVRAEDGRVRTLPSEYTF组成；或
-CDR1包括或基本上由氨基酸序列YNPMG组成；并且CDR2包括或基本上由氨基酸序列AISRTGGSTYYPDSVEG组成；或
-CDR2包括或基本上由氨基酸序列AISRTGGSTYYPDSVEG组成；并且CDR3包括或基本上由氨基酸序列AGVRAEDGRVRTLPSEYTF组成。
8.按照权利要求3的纳米体，其中CDR1包括或基本上由氨基酸序列YNPMG组成；并且CDR3包括或基本上由氨基酸序列AGVRAEDGRVRTLPSEYTF组成。
9.按照权利要求3的纳米体，其中CDR1包括或基本上由氨基酸序列YNPMG组成；CDR2包括或基本上由氨基酸序列AISRTGGSTYYPDSVEG组成，并且CDR3包括或基本上由氨基酸序列AGVRAEDGRVRTLPSEYTF组成。
10.按照权利要求3-9中任一项的纳米体，其中
-任何氨基酸取代是保守氨基酸取代；和/或
-与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入。
11.针对冯威勒布兰特因子(vWF)的纳米体，所述纳米体由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中：
a)CDR1为：
-氨基酸序列YNPMG；或
-与氨基酸序列YNPMG有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
并且
b)CDR2为：
-氨基酸序列AISRTGGSTYYPDSVEG；或
-与氨基酸序列AISRTGGSTYYPDSVEG有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列AISRTGGSTYYPDSVEG有2个或只有1个氨基酸差异的氨基酸序列；
并且
c)CDR3为：
-氨基酸序列AGVRAEDGRVRTLPSEYTF；或
-与氨基酸序列AGVRAEDGRVRTLPSEYTF有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列；或
-与氨基酸序列AGVRAEDGRVRTLPSEYTF只有1个氨基酸差异的氨基酸序列。
12.按照权利要求11的纳米体，其中CDR1为氨基酸序列YNPMG。
13.按照权利要求11的纳米体，其中CDR2为氨基酸序列AISRTGGSTYYPDSVEG。
14.按照权利要求11的纳米体，其中CDR3为氨基酸序列AGVRAEDGRVRTLPSEYTF。
15.按照权利要求11的纳米体，其中：
-CDR1为氨基酸序列YNPMG；并且CDR3为氨基酸序列AGVRAEDGRVRTLPSEYTF；或
-CDR1为氨基酸序列YNPMG；并且CDR2包括氨基酸序列AISRTGGSTYYPDSVEG；或
-CDR2为氨基酸序列AISRTGGSTYYPDSVEG；并且CDR3包括氨基酸序列AGVRAEDGRVRTLPSEYTF。
16.按照权利要求11的纳米体，其中CDR1为氨基酸序列YNPMG；并且CDR3包括或基本上由氨基酸序列AGVRAEDGRVRTLPSEYTF组成。
17.按照权利要求11的纳米体，其中CDR1为氨基酸序列YNPMG；CDR2为氨基酸序列AISRTGGSTYYPDSVEG，并且CDR3为氨基酸序列AGVRAEDGRVRTLPSEYTF。
18.按照权利要求11-16中任一项的纳米体，其中
-任何氨基酸取代是保守氨基酸取代；和/或
-与上述氨基酸序列相比较，所述氨基酸序列只包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入。
19.按照权利要求3-18中任一项的纳米体，其为KERE-类纳米体。
20.权利要求3-19中任一项的纳米体的人源化变体。
21.纳米体，其与来自由SEQ ID NO’s 60-73和SEQ ID NO’s 86-97组成的组至少一种纳米体具有至少80％、或者至少90％、或者至少95％、或者至少99％的序列相同性(如本文所定义)。
22.纳米体，其与下述至少一种纳米体具有至少80％、或者至少90％、或者至少95％、或者至少99％的序列相同性：12B6(SEQ ID NO：62)；12A2(SEQ ID NO：71)；12F2(SEQ ID NO：72)；14H10(SEQ ID NO：73)；12B6H1(SEQ ID NO：86)；12B6H2(SEQ ID NO：87)；12B6H3(SEQ ID NO：88)；12B6H4(SEQ ID NO：89)；12A2H1(SEQ ID NO：90)；12A2H3(SEQ IDNO：91)；12A2H4(SEQ ID NO：92)；12A2H11(SEQ ID NO：93)和/或12A2H13(SEQ ID NO：94)。
23.纳米体，其与下述至少一种纳米体具有至少80％、或者至少90％、或者至少95％、或者至少99％的序列相同性(如本文所定义)：12A2(SEQ ID NO：71)；12A2H1(SEQ ID NO：90)；12A2H3(SEQ ID NO：91)；12A2H4(SEQ ID NO：92)；12A2H11(SEQ ID NO：93)和/或12A2H13(SEQ ID NO：94)。
24.纳米体，其与纳米体12A2H1(SEQ ID NO：90)具有至少80％、或者至少90％、或者至少95％、或者至少99％的序列相同性(如本文所定义)。
25.权利要求20-24中任一项的纳米体的人源化变体。
26.纳米体，其选自由SEQ ID NO’s 60-73和SEQ ID NO’s 86-97的纳米体组成的组。
27.纳米体，其选自由下述纳米体组成的组：12B6(SEQ ID NO：62)；12A2(SEQ ID NO：71)；12F2(SEQ ID NO：72)；14H10(SEQ ID NO：73)；12B6H1(SEQ ID NO：86)；12B6H2(SEQ ID NO：87)；12B6H3(SEQ ID NO：88)；12B6H4(SEQ ID NO：89)；12A2H1(SEQ ID NO：90)；12A2H3(SEQ IDNO：91)；12A2H4(SEQ ID NO：92)；12A2H11(SEQ ID NO：93)和/或12A2H13(SEQ ID NO：94)。
28.纳米体，其选自由下述纳米体组成的组：12A2(SEQ ID NO：71)；12A2H1(SEQ ID NO：90)；12A2H3(SEQ ID NO：91)；12A2H4(SEQ ID NO：92)；12A2H11(SEQ ID NO：93)和/或12A2H13(SEQ ID NO：94)。
29.纳米体12A2H1(SEQ ID NO：90)。
30.蛋白质或多肽，其包括或基本上由按照权利要求1-29中任一项的纳米体组成。
31.按照权利要求30的蛋白质或多肽，其包括或基本上由按照权利要求1-29中任一项的至少一种纳米体组成。
32.按照权利要求30-31中任一项的蛋白质或多肽，其包括按照权利要求1-29中任一项的至少两种纳米体。
33.按照权利要求30-31中任一项的蛋白质或多肽，其包括按照权利要求1-29中任一项的两种纳米体。
34.按照权利要求30-33中任一项的蛋白质或多肽，其中在所述蛋白质或多肽中存在的一种或多种纳米体是按照权利要求3-20中任一项的纳米体。
35.按照权利要求30-33中任一项的蛋白质或多肽，其中在所述蛋白质或多肽中存在的一种或多种纳米体是按照权利要求22-29中任一项的纳米体。
36.按照权利要求30-33中任一项的蛋白质或多肽，其中在所述蛋白质或多肽中存在的一种或多种纳米体是按照权利要求24的纳米体。
37.按照权利要求30-33中任一项的蛋白质或多肽，其中在所述蛋白质或多肽中存在的一种或多种纳米体选自由下述纳米体组成的组：12B6(SEQ ID NO：62)；12A2(SEQ ID NO：71)；12F2(SEQ ID NO：72)；14H10(SEQ ID NO：73)；12B6H1(SEQ ID NO：86)；12B6H2(SEQ ID NO：87)；12B6H3(SEQ ID NO：88)；12B6H4(SEQ ID NO：89)；12A2H1(SEQ IDNO：90)；12A2H3(SEQ ID NO：91)；12A2H4(SEQ ID NO：92)；12A2H11(SEQ ID NO：93)和/或12A2H13(SEQ ID NO：94)。
38.按照权利要求30-33中任一项的蛋白质或多肽，其中在所述蛋白质或多肽中存在的一种或多种纳米体选自由下述纳米体组成的组：12A2(SEQ ID NO：71)；12A2H1(SEQ ID NO：90)；12A2H3(SEQ ID NO：91)；12A2H4(SEQ ID NO：92)；12A2H11(SEQ ID NO：93)和/或12A2H13(SEQ ID NO：94)。
39.按照权利要求30-33中任一项的蛋白质或多肽，其中在所述蛋白质或多肽中存在的一种或多种纳米体是纳米体12A2H1(SEQ IDNO：90)。
40.按照权利要求31-39中任一项的蛋白质或多肽，其包括两种纳米体或至少两种纳米体，并且其中所述两种或至少两种纳米体直接彼此连接或者通过接头彼此连接。
41.按照权利要求40的蛋白质或多肽，其包括两种纳米体或至少两种纳米体，并且其中所述两种纳米体或至少两种纳米体通过接头彼此连接。
42.按照权利要求41的蛋白质或多肽，其中所述接头是氨基酸序列。
43.按照权利要求42的蛋白质或多肽，其中所述接头包括1-40个氨基酸残基，诸如2-30个氨基酸残基。
44.按照权利要求43的蛋白质或多肽，其中所述接头包括或者基本上由甘氨酸或丝氨酸残基组成。
45.按照权利要求44的蛋白质或多肽，其中所述接头包括接头GS9(SEQ ID NO：84)。
46.按照权利要求41的蛋白质或多肽，其中所述接头包括或基本上由丙氨酸残基组成。
47.按照权利要求42的蛋白质或多肽，其中所述接头包括1-10个氨基酸残基，诸如1，2，3，4或5个氨基酸残基。
48.蛋白质或多肽，其与来自由SEQ ID NOS：74-82或SEQ ID NOS98-106组成的组的至少一种多肽有至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少99％的序列相同性(如本文所定义)。
49.蛋白质或多肽，其与来自由SEQ ID NOS：74-76，SEQ ID NO’s80-82或SEQ ID NOS 98-106组成的组的至少一种多肽有至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少99％的序列相同性(如本文所定义)。
50.蛋白质或多肽，其与来自由SEQ ID NOS：74-76和SEQ ID NOS：98，99，101，102，104，105与106组成的组的至少一种多肽有至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少99％的序列相同性(如本文所定义)。
51.蛋白质或多肽，其与SEQ ID NO：90的多肽有至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少99％的序列相同性(如本文所定义)。
52.SEQ ID NO：90的多肽。
53.按照权利要求1-29中任一项的纳米体的片段。
54.按照权利要求3-20中任一项的纳米体的片段。
55.按照权利要求22-29中任一项的纳米体的片段。
56.按照权利要求24的纳米体的片段。
57.按照权利要求27-29中任一项的纳米体的片段。
58.按照权利要求53-57中任一项的片段，其与相对应的全长纳米体的氨基酸序列具有至少50％、优选地至少60％、更优选地至少70％、诸如至少80％、至少90％或至少95％的序列相同性程度。
59.蛋白质或多肽，其包括或基本上由按照权利要求53-58中任一项的片段组成。
60.按照权利要求59的蛋白质或多肽，其包括或基本上由按照权利要求53-58中任一项的至少一种片段组成。
61.按照权利要求59或60任一项的蛋白质或多肽，其包括按照权利要求53-58中任一项的至少两种片段。
62.按照权利要求59-61中任一项的蛋白质或多肽，其包括按照权利要求1-29的两种纳米体。
63.按照权利要求59-62中任一项的蛋白质或多肽，其包括两种或至少两种片段，并且其中所述两种或至少两种片段直接彼此连接或者通过接头彼此连接。
64.蛋白质或多肽，其包括或基本上由基本上不抑制ADAMTS-13对ULvWF的分裂的纳米体组成。
65.按照权利要求59的蛋白质或多肽，其包括或基本上由基本上不抑制ADAMTS-13对ULvWF的分裂的至少一种纳米体组成。
66.按照权利要求59或60任一项的蛋白质或多肽，其包括基本上不抑制ADAMTS-13对ULvWF的分裂的至少两种纳米体。
67.按照权利要求59-61中任一项的蛋白质或多肽，其包括基本上不抑制ADAMTS-13对ULvWF的分裂的两种纳米体。
68.按照权利要求64-68中任一项的蛋白质或多肽，其包括两种片段或至少两种片段，并且其中所述两种片段或至少两种片段直接彼此连接或者通过接头彼此连接。
69.核苷酸序列或核酸，其编码按照任一前述权利要求的纳米体、蛋白质、多肽或片段。
70.宿主细胞，其包含按照权利要求64的核苷酸序列或核酸，或者其表达或能够表达按照权利要求1-68中任一项的纳米体、蛋白质、多肽或片段。
71.制备按照权利要求1-68中任一项的纳米体、蛋白质、多肽或片段的方法，其包括在某种条件下培养或维持按照权利要求65的宿主细胞，所述条件使得所述宿主细胞生产或表达按照权利要求1-68中任一项的纳米体、蛋白质、多肽或片段；并且其任选地还包括分离按照权利要求1-68中任一项的纳米体、蛋白质、多肽或片段。
72.药物组合物，其包含按照权利要求1-68中任一项的至少一种纳米体、蛋白质、多肽或片段，并且任选地包含至少一种药用载体。
73.按照权利要求72的药物组合物，或按照权利要求1-73中任一项的纳米体、蛋白质、多肽或片段，用于预防或治疗与血小板-介导的聚集相关的疾病或紊乱。
74.按照权利要求73的药物组合物，或按照权利要求1-68中任一项的纳米体、蛋白质、多肽或片段，用于预防或治疗与血小板-介导的聚集相关的疾病或紊乱，所述疾病或紊乱选自下述：非-闭合性血栓，闭合性血栓的形成，动脉血栓形成，急性冠状闭合，外周动脉闭合疾病，再狭窄以及由下列各项引起的紊乱：冠状旁路移植，冠状动脉阀置换和冠状干预诸如血管成形术，支架术或动脉粥样硬化斑切除术，血管成形术、动脉粥样硬化斑切除术或动脉支架之后的增生，血管系统中的闭合综合征或者缺乏患病动脉的开放性，血栓形成血小板减少性紫癜(TTP)，瞬时脑局部缺血性发作，不稳定或稳定的心绞痛，脑梗塞，HELLP综合征，颈动脉动脉内膜切除术，颈动脉狭窄，重要肢体局部缺血，cardioembolism，外周血管病，再狭窄和心肌梗塞。
75.按照权利要求73的药物组合物，其还包含用于预防或治疗聚集介导的紊乱的一种或多种其它活性物质，诸如阿司匹林(Aspegic)、肝素、Plavix
Figure A2006800240120013C1
和/或Reopro
76.按照权利要求1-68中任一项的纳米体、蛋白质、多肽或片段在制备用于预防或治疗与血小板-介导的聚集相关的疾病或紊乱的药物中的应用。
77.按照权利要求1-68中任一项的纳米体、蛋白质、多肽或片段在制备用于预防或治疗与血小板-介导的聚集相关的疾病或紊乱的药物中的应用，所述疾病或紊乱选自下述：非-闭合性血栓，闭合性血栓的形成，动脉血栓形成，急性冠状闭合，外周动脉闭合疾病，再狭窄以及由下列各项引起的紊乱：冠状旁路移植，冠状动脉阀置换和冠状干预诸如血管成形术，支架术或动脉粥样硬化斑切除术，血管成形术、动脉粥样硬化斑切除术或动脉支架之后的增生，血管系统中的闭合综合征或者缺乏患病动脉的开放性，血栓形成血小板减少性紫癜(TTP)，瞬时脑局部缺血性发作，不稳定或稳定的心绞痛，脑梗塞，HELLP综合征，颈动脉动脉内膜切除术，颈动脉狭窄，重要肢体局部缺血，cardioembolism，外周血管病，再狭窄和心肌梗塞。
78.vWF，其适当的片段，DDAVP(desmopressinor)或其适当的片段、或者包含前述任一种的药物组合物的应用，其用作与针对vWF的纳米体、蛋白质或多肽特别是按照权利要求1-68中任一项的纳米体、蛋白质或多肽的应用相关的并发症或不理想的副作用的解毒剂。
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