NO345342B1

NO345342B1 - Enkeltdomene VHH antistoffer mot Van Willebrand faktor

Info

Publication number: NO345342B1
Application number: NO20190279A
Authority: NO
Inventors: Karen Silence
Original assignee: Ablynx Nv
Priority date: 2005-05-20
Filing date: 2019-02-27
Publication date: 2020-12-21
Also published as: HUS1900005I1; LTPA2019504I1; FR19C1005I1; AU2006249090A8; JP4986997B2; LUC00099I2; CN101213214B; PL3415535T3; WO2006122825A2; US20130136736A1; NL300966I1; EP2007814A2; EP3415535A1; US20100330084A1; NL300966I2; CA2608873A1; IL187168A0; RU2433139C2; AU2006249090B2; TR201815552T4

Description

Foreliggende oppfinnelse angår et protein eller polypeptid innbefattende to forbedrede Nanobodies™ mot von Willebrand Factor (vWF), som definert i kravene. [Note: Nanobody™, Nanobodies™ og Nanoclone™ er varemerker for Ablynx N.V.]

Foreliggende beskrivelse angår også nukleinsyrer som koder for slike Nanobodies og polypeptider; fremgangsmåter for fremstilling av slike Nanobodies og polypeptider; vertsceller som uttrykker eller i stand til å uttrykke slike Nanobodies eller polypeptider; sammensetninger omfattende slike Nanobodies, polypeptider, nukleinsyrer eller vertsceller; og anvendelser av slike Nanobodies, slike polypeptider, slike nukleinsyrer, slike vertsceller eller slike sammensetninger, spesielt for profylaktiske, terapeutiske eller diagnostiske formål, slik som de profylaktiske, terapeutiske eller diagnostiske formål nevnt nedenfor.

Andre aspekter, utførelsesformer, fordeler og anvendelser av foreliggende beskrivelse vil bli klar fra den videre beskrivelse nedenfor.

WO 04/062551 fra foreliggende søker angår Nanobodies mot Von Willebrand Factor (vWF) og fremstillingen og bruk derav, spesielt for forhindringen og/eller behandling av sykdommer og forstyrrelser vedrørende blodplate-mediert aggregering.

Anti-vWF Nanobodies ifølge WO 04/062551 kan være humanisert og kan være monovalent eller multivalent, hvor den siste fører til øket affinitet for vWF. Anti-vWF Nanobodies ifølge WO 04/062551 kan også være multispesifikke, og kan spesielt være i form av et multispesifikt konstrukt omfattende to eller flere Nanobodies mot vWF og et ytterligere Nanobody rettet mot et serumprotein slik som humant serumalbumin, som fører til en øket halveringstid in vivo.

Anti-vWF Nanobodies beskrevet i WO 04/062551 kan være rettet mot en hvilken som helst epitop eller konformasjon av vWF (slik som A1 domene eller A3 domene), men fortrinnsvis er rettet mot A1 domenet, og spesielt mot den aktiverte konformasjon av A1 domenet.

WO 04/062551 beskriver også fremstillingen av anti-vWF Nanobodies, nukleotidsekvenser som koder for anti-vWF Nanobodies, så vel som farmasøytiske sammensetninger omfattende anti-vWF Nanobodies.

Anti-vWF Nanobodies og sammensetninger beskrevet i WO 04/062551 kan bli benyttet for forhindringen og behandling av sykdommer og forstyrrelser relatert til blodplate-mediert aggregering, slik som dannelsen av en ikke-okklusiv trombus, dannelsen av en okklusiv trombus, arteriell trombus dannelse, akutt koronar okklusjon, perifer arteriell okklusive sykdom, restenose og forstyrrelser med opphav i koronar by-pass graft, koronar arterie ventilerstatning og koronar intervensjoner slik som angioplasti, stenting eller aterectomi, hyperplasi etter angioplasti, aterectomi eller arteriell stenting, okklusivt syndrom i et vaskulært system eller mangel på åpenhet i syke arterier, trombotisk trombocytopeniskpurpura (TTP), transient cerebralt iskemisk anfall, ustabil eller stabil angina pectoris, cerebralt infarkt, HELLP syndrom, carotid endarterectomi, carotid arteriestenosis, kritisk lem iskemi, cardioembolisme, perifer vaskulær sykdom, restenose og myokardialt infarkt.

De farmasøytiske sammensetninger beskrevet i WO 04/062551 kan være passende for intravenøs, subkutan, oral, sublingual, topikal, nasal, vaginal eller rektal administrasjon, eller for administrasjon ved inhalasjon; og kan også omfatte et trombolytisk middel, slik som staphylokinase, vevs plasminogen aktivator, streptokinase, enkeltkjede streptokinase, urokinase og acyl plasminogen streptokinase kompleks. Anti-vWF Nanobodies beskrevet i WO 04/062551 kan også bli benyttet for diagnostiske formål (eventuelt i form av et sett av deler) eller i belegg for medisinsk utstyr slik som stents.

Det er et generelt mål for foreliggende beskrivelse å fremskaffe Nanobodies mot vWF, spesielt mot human vWF.

Spesielt, er det et mål for foreliggende beskrivelse å fremskaffe Nanobodies mot vWF, spesielt mot human vWF, og å fremskaffe proteiner eller polypeptider omfattende det samme, som er passende for terapeutisk og/eller diagnostisk anvendelse, og spesielt for forhindringen, behandling og/eller diagnose av en eller flere sykdommer og forstyrrelser assosiert med og/eller mediert av vWF slik som de nevnt ovenfor, og/eller som kan bli benyttet i fremstillingen av en farmasøytisk sammensetning for forhindringen og/eller behandling av en eller flere sykdommer assosiert med og/eller mediert av vWF, slik som de nevnt ovenfor.

Mer spesielt, er det et mål for foreliggende beskrivelse å fremskaffe Nanobodies mot vWF, og å fremskaffe proteiner og polypeptider omfattende det samme, som er enten an alternativ til Nanobodies og polypeptider mot vWF beskrevet i WO 04/062551 og/eller som har en eller flere forbedrede egenskaper eller karakteristikker, sammenlignet med Nanobodies og polypeptider mot vWF beskrevet i WO 04/062551.

Mer spesielt, er det et mål for foreliggende beskrivelse å fremskaffe Nanobodies mot vWF, og å fremskaffe proteiner eller polypeptider omfattende det samme, som er forbedrede sammenlignet med Nanobodies og polypeptider mot vWF beskrevet i WO 04/062551 med hensyn til en eller flere av de følgende egenskaper eller karakteristikker:

- øket affinitet for vWF, enten i et monovalent format, i et multivalent format (for eksempel i et bivalent format) og/eller i et multispesifikt format (for eksempel et av de multispesifikke format beskrevet i WO 04/062551 eller nedenfor);

- bedre passende for formatting i et multivalent format (for eksempel i et bivalent format);

- bedre passende for formatting i et multispesifikt format (for eksempel et av de multispesifikke format beskrevet i WO 04/062551 eller nedenfor);

- forbedret egnethet eller mottakelighet for “humaniserende” substitusjoner (som definert heri); og/eller

- mindre immunogenisitet, enten i et monovalent format, i et multivalent format (for eksempel i et bivalent format) og/eller i et multispesifikt format (for eksempel et av de multispesifikke format beskrevet i WO 04/062551 eller nedenfor) i et monovalent format;

- øket stabilitet, enten i et monovalent format, i et multivalent format (for eksempel i et bivalent format) og/eller i et multispesifikt format (for eksempel et av de multispesifikke format beskrevet i WO 04/062551 eller nedenfor) i et monovalent format;

- øket spesifisitet mot vWF, enten i et monovalent format, i et multivalent format (for eksempel i et bivalent format) og/eller i et multispesifikt format (for eksempel et av de multispesifikke format beskrevet i WO 04/062551 eller nedenfor) i et monovalent format;

- redusert eller hvor ønsket, øket kryssreaktivitet med vWF fra forskjellige arter;

og/eller

- en eller flere andre forbedrede egenskaper som er ønskelige for farmasøytiske anvendelse (inkludert profylaktisk anvendelse og/eller terapeutiske anvendelse) og/eller for diagnostisk anvendelse (inkludert, men ikke begrenset til anvendelse for avbildingsformål), enten i et monovalent format, i et multivalent format (for eksempel in a bivalent format) og/eller in a multispesifikke format (for eksempel et av de multispesifikke formatene beskrevet i WO 04/062551 eller nedenfor).

-Disse målene blir nådd ved Nanobodies mot vWF og ved polypeptidene beskrevet heri. Nanobodies mot vWF og polypeptider beskrevet heri er spesielt rettet mot human vWF, men det er inkludert innen rammen ifølge foreliggende beskrivelse at noen av anti-vWF Nanobodies og polypeptider ifølge foreliggende beskrivelse kan vise kryssreaktivitet med vWF fra andre vertebrate dyr, spesielt fra andre varmblodige dyr, mer spesielt fra andre pattedyr, og spesielt fra andre arter primater, slik som bavianene benyttet i eksemplene nedenfor. Imidlertid, som med anti-vWF Nanobodies beskrevet i WO 04/062551, er foreliggende beskrivelse i sin videste forstand ikke spesielt begrenset til eller definert ved en spesifikk epitop , domene eller konformasjon av vWF mot hvilke Nanobodies og polypeptider ifølge foreliggende beskrivelse er rettet. Imidlertid, er det generelt antatt og foretrukket at Nanobodies og polypeptider ifølge foreliggende beskrivelse er rettet mot A1 domenet av vWF, enten i sin aktiverte eller ikkeaktiverte konformasjon.

Fra WO2004062551 er det kjent polypeptider innbefattende minst et enkeltdomene antistoff rettet mot vWF, vWF A1 domene, A1 domene til aktivert vWF, vWF A3 domene, gblp og/eller kollagen, homologer av nevnte polypeptider og/eller funksjonelle deler av nevnte polypeptider, for behandlinger av tilstander som krever en modulering av blodplatemediert aggregering.

Således, ifølge et første aspekt, angår foreliggende beskrivelse:

1. Et protein eller polypeptid som omfatter to VHHs, humanisert VHH domener eller kameliserte VH domener, hvor nevnte VHHs, humaniserte VHH domener eller kameliserte VH domener er rettet mot Von Willebrand Faktor (vWF), og hvor nevnte VHHs, humaniserte VHH domener eller kameliserte VH domener består av 4 rammeverkregioner (henholdsvis FR1 til FR4) og 3 komplementaritetsbestemmende regioner (CDR1 til CDR3 henholdsvis), i hvilke:

CDR1 omfatter eller består av aminosyresekvensen

i) YNPMG [SEQ ID NO: 22] og i hvilken:

ii) CDR2 omfatter eller består av en aminosyresekvens valgt blant gruppen bestående av:

AISRTGGSTYYARSVEG [SEQ ID NO: 31], og

AISRTGGSTYYPDSVEG [SEQ ID NO: 32]

og i hvilken:

iii) CDR3 omfatter, hovedsakelig består av eller er en aminosyresekvens valgt blant gruppen bestående av:

AGVRAEDGRVRTLPSEYNF [SEQ ID NO: 41] AGVRAEDGRVRTLPSEYTF [SEQ ID NO: 42], og AGVRAEDGRVRSLPSEYTF [SEQ ID NO: 43].

2. Proteinet eller polypeptidet i henhold til pkt.1 over, og i hvilke:

i) CDR1 består av aminosyresekvensen YNPMG [SEQ ID NO:22; og i hvilke:

ii) CDR2 består av aminosyresekvensen AISRTGGSTYYPDSVEG [SEQ ID NO: 32];

og i hvilke:

iii) CDR3 består av aminosyresekvensen

AGVRAEDGRVRTLPSEYTF [SEQ ID NO: 42].

3. Proteinet eller polypeptidet i henhold til punktene 1-2 over, hvor nevnte VHHs, humaniserte VHH domener eller kameliserte VH domener er KERE-klasse VHHs, humaniserte VHH domene eller kameliserte VH domener.

4. Proteinet eller polypeptidet i henhold til hvilke som helst av punktene 1-3 over, hvor nevnte VHHs, humaniserte VHH domene eller kameliserte VH domene er humaniserte varianter av nevnte VHHs, humaniserte VHH domene eller kameliserte VH domener.

5. Proteinet eller polypeptidet i henhold til hvilke som helst av punktene 1-4 over, hvor nevnte VHHs, humaniserte VHH domener eller kameliserte VH domener som er til stede i proteinet eller polypeptidet er valgt blant gruppen bestående av VHHs, humaniserte VHH domener eller kameliserte VH domener 12B6 (SEQ ID NO: 62); 12A2 (SEQ ID NO: 71); 12F2 (SEQ ID NO: 72); 14H10 (SEQ ID NO: 73); 12B6H1 (SEQ ID NO: 86); 12B6H2 (SEQ ID NO: 87); 12B6H3 (SEQ ID NO: 88); 12B6H4 (SEQ ID NO: 89); 12A2H1 (SEQ ID NO: 90); 12A2H3 (SEQ ID NO: 91); 12A2H4 (SEQ ID NO: 92); 12A2H11 (SEQ ID NO: 93) og 12A2H13 (SEQ ID NO: 94).

6. Proteinet eller polypeptidet i henhold til hvilke som helst av punktene 1-5 over, hvor VHHs, humaniserte VHH domener eller kameliserte VH domene som er til stedde i proteinet eller polypeptidet består av VHHs, humanisert VHH domene eller kameliserte VH domene 12A2H1 (SEQ ID NO: 90).

7. Proteinet eller polypeptidet i henhold til hvilke som helst av punktene 1-6 over,, hvor nevnte to VHHs, humaniserte VHH domener eller kameliserte VH domener er linket direkte til hverandre eller via en linker, fortrinnsvis er nevnte linker en aminosyresekvens, mer foretrukket omfatter nevnte linker mellom 1 og 40 aminosyrerester, slik som mellom 2 og 30 aminosyrerester, fortrinnsvis hvori linkeren omfatter eller hovedsakelig består av glycin- eller serinrester, eller i hvilke linkeren omfatter eller hovedsakelig består av alaninrester.

8. Proteinet eller polypeptidet valgt fra gruppen bestående av SEQ ID NOS: 74-76, SEQ ID NO’s 80-82 eller SEQ ID NOS 98-106, fortrinnsvis polypeptidet med SEQ ID NO: 98.

9. Proteinet eller polypeptidet bestående av SEQ ID NO: 98.

10. Nukleotidsekvens eller nukleinsyre, som koder for et protein eller et polypeptid ifølge et hvilket som helst av de foregående krav.

11. Vertscelle, omfattende en nukleotidsekvens eller nukleinsyre i henhold til punkt 10, eller som uttrykker eller er i stand til å uttrykke et protein eller et ifølge et hvilket som helst punktene 1-9.

12. Fremgangsmåte for fremstilling av et protein eller et polypeptid i henhold til hvilke som helst av punktene 1-9 over, som omfatter dyrking eller opprettholdelse av en vertscelle ifølge punkt 11 under betingelser slik at nevnte vertscelle produserer eller uttrykker et protein eller polypeptid; og som eventuelt ytterligere omfatter isolering av proteinet eller polypeptidet .

13. Farmasøytisk sammensetning, omfattende minst et protein eller polypeptid i henhold til hvilke som helst av punktene 1-9 over, og eventuelt minst en farmasøytisk akseptabel bærer.

14. Den farmasøytisk sammensetningen i henhold til punkt 13, eller et protein eller polypeptid i henhold til hvilke som helst av punktene 1-9, for anvendelse i en fremgangsmåte for forhindring eller behandling av en sykdom eller forstyrrelse relatert til blodplate-mediert aggregering, valgt blant ikke-okklusiv trombus, dannelsen av en okklusive trombus, arteriell trombus dannelse, akuttkoronar okklusjon, perifer arteriell okklusive sykdom, restenose og forstyrrelser med opphav i koronar bypass graft, koronar arterie ventilerstatning og koronar intervensjoner slik som angioplasti, stenting eller aterectomi, hyperplasi etter angioplasti, aterectomi eller arteriell stenting, okklusiv syndrom i et vaskulært system eller mangel på åpenhet i syke arterier, trombotisk trombocytopeniskpurpura (TTP), transient cerebralt iskemisk anfall, ustabil eller stabil angina pectoris, cerebralt infarkt, HELLP syndrom, carotid endarterectomi, carotid arterie stenose, kritisk lem ischaemi, cardioembolisme, perifer vaskulært sykdom, restenose og myocardialt infarkt, og eventuelt ytterligere inneholdende ett eller flere aktive stoffer for forhindring eller behandling av aggregeringsmedierte forstyrrelser, slik som asperin (Aspergic), heparin, Plavix ® og/eller Reopro®.

15. Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av et, protein eller polypeptid i henhold til hvilke som helst av punktene 1-9, i fremstillingen av et medikament for forhindringen eller behandling av en sykdom eller forstyrrelse relatert til blodplate-mediert aggregering, valgt blant ikkeokklusiv trombus, dannelsen av en okklusive trombus, arteriell trombus dannelse, akuttkoronar okklusjon, perifer arteriell okklusive sykdom, restenose og forstyrrelser med opphav i koronar by-pass graft, koronar arterie ventilerstatning og koronar intervensjoner slik som angioplasti, stenting eller aterectomi, hyperplasi etter angioplasti, aterectomi eller arteriell stenting, okklusivt syndrom i et vaskulært system eller mangel på åpenhet i syke arterier, trombotisk trombocytopenisk purpura (TTP), transient cerebralt iskemisk anfall, ustabil eller stabil angina pectoris, cerebralt infarkt, HELLP syndrom, carotid endarterectomi, carotid arterie stenosis, kritisk lem ischaemi, cardioembolisme, perifer vaskulær sykdom, restenose og myocardialt infarkt.

g

o

er

’

R D

C

va

g

o

r,

se

en

kv

se

rk

ve

e

m

ra

g

o

r

e ’

R D

C

v

r, a

’e

R D

C

va

e

n

ne

jo

as

in

b

m

ko

e

kn

r

tru ’e

re R

o F

e

I:F rt

e

L

L is

nE a

B m

A u T h

: tt<) >a rts (fo I L L E B A T

Således, i Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse, er minst en av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene som er tilstede passende valgt blant gruppen bestående av CDR1, CDR2 or CDR3 sekvensene, henholdsvis, opplistet i Tabell I; eller fra gruppen av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene, henholdsvis, som har minst 80%, foretrukket minst 90%, fortrinnsvis har minst 95%, enda mer foretrukket har minst 99% “sekvensidentitet” (som definert heri) med minst en av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene, henholdsvis, opplistet i Tabell I; og/eller fra gruppen bestående av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene, henholdsvis, som har 3, 2 eller kun 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med minst en av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene, henholdsvis, opplistet i Tabell I. I denne sammenheng, er det ved “passende valgt” ment at, som passende, at en CDR1 sekvens er valgt blant passenCDR1 sekvensene(dvs. som definert heri), en CDR2 sekvens er valgt blant passenCDR1 sekvensene(dvs. som definert heri), og en CDR3 sekvens er valgt blant passende CDR3 sekvens (dvs. som definert heri), henholdsvis.

Spesielt, i Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse, er minst CDR3 sekvensen present passende valgt blant gruppen bestående av CDR3 sekvensene opplistet i Tabell I eller fra gruppen av CDR3 sekvenser som har minst 80%, foretrukket minst 90%, fortrinnsvis har minst 95%, enda mer foretrukket har minst 99% sekvensidentitet med minst en av CDR3 sekvensene opplistet i Tabell I; og/eller fra gruppen bestående av CDR3 sekvensene som har 3, 2 eller kun 1 aminosyre forskjell(er) med minst en av CDR3 sekvenser opplistet i Tabell I.

Foretrukket, i Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse, er minst to av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene som er til stede passende valgt blant gruppen bestående av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene, henholdsvis, opplistet i Tabell I eller fra gruppen bestående av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene, henholdsvis, som har minst 80%, foretrukket minst 90%, fortrinnsvis har minst 95%, enda mer foretrukket har minst 99% sekvensidentitet med minst en av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene, henholdsvis, opplistet i Tabell I; og/eller fra gruppen bestående av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene, henholdsvis, som har 3, 2 eller kun 1 “aminosyre forskjell(er)” med minst en av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvenser, henholdsvis, opplistet i Tabell I.

Spesielt, i Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse, er minst CDR3 sekvensen present passende valgt blant gruppen bestående av CDR3 sekvensene opplistet i Tabell I eller fra gruppen av CDR3 sekvensene som har minst 80%, foretrukket minst 90%, fortrinnsvis har minst 95%, enda mer foretrukket har minst 99% sekvensidentitet med minst en av CDR3 sekvenser opplistet i Tabell I, henholdsvis; og minst en av CDR1 og CDR2 sekvensene som er til stede er passende valgt blant gruppen bestående av CDR1 og CDR2 sekvensene, henholdsvis, opplistet i Tabell I eller fra gruppen av CDR1 og CDR2 sekvenser, henholdsvis, som har minst 80%, foretrukket minst 90%, fortrinnsvis minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med minst en av CDR1 og CDR2 sekvensene, henholdsvis, opplistet i Tabell I; og/eller fra gruppen bestående av CDR1 og CDR2 sekvensene, henholdsvis, som har 3, 2 eller kun 1 aminosyre forskjell(er) med minst en av CDR1 og CDR2 sekvenser, henholdsvis, opplistet i Tabell I.

Mest foretrukket, i Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse, er alle tre CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene som er til stede er passende valgt blant gruppen bestående av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene, henholdsvis, opplistet i Tabell I eller fra gruppen av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene, henholdsvis, som har minst 80%, foretrukket minst 90%, fortrinnsvis er minst 95%, enda mer foretrukket har minst 99% sekvensidentitet med minst en av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvenser, henholdsvis, opplistet i Tabell I; og/eller fra gruppen bestående av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene, henholdsvis, som har 3, 2 eller kun 1 aminosyre forskjell(er) med minst en av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene, henholdsvis, opplistet i Tabell I.

Enda mer foretrukket er, i Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse, minst en av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene som er til stede er passende valgt blant gruppen bestående av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene, henholdsvis, opplistet i Tabell I. Foretrukket, i denne utførelsesformen, er minst en eller fortrinnsvis begge av de andre to CDR sekvensene som er til stede passende valgt blant CDR sekvenser som har minst 80%, foretrukket minst 90%, fortrinnsvis er minst 95%, enda mer foretrukket har minst 99% sekvensidentitet med minst en av korresponderende CDR sekvensene, henholdsvis, opplistet i Tabell I; og/eller fra gruppen bestående av CDR sekvensene som har 3, 2 eller kun 1 aminosyre forskjell(er) med minst en av korresponderende sekvenser, henholdsvis, opplistet i Tabell I.

Spesielt, i Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse, er minst CDR3 sekvensen present er passende valgt blant gruppen bestående av CDR3 opplistet i Tabell I. Foretrukket, i denne utførelsesformen, er minst en og foretrukket begge av CDR1 og CDR2 sekvensene som er til stede passende valgt blant gruppene av CDR1 og CDR2 sekvenser, henholdsvis, som har minst 80%, foretrukket minst 90%, fortrinnsvis har minst 95%, enda mer foretrukket har minst 99% sekvensidentitet med CDR1 og CDR2 sekvensene, henholdsvis, opplistet i opplistet i Tabell I; og/eller fra gruppen bestående av CDR1 og CDR2 sekvensene, henholdsvis, som har 3, 2 eller kun 1 aminosyre forskjell(er) med minst en av CDR1 og CDR2 sekvensene, henholdsvis, opplistet i Tabell I.

Enda mer foretrukket er, i Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse, minst to av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene som er til stede passende valgt blant gruppen bestående av de CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene, henholdsvis, opplistet i Tabell I. Foretrukket, i denne utførelsesformen, er den resterende CDR sekvensen som er til stede, passende valgt blant gruppen CDR sekvenser som har minst 80%, foretrukket minst 90%, fortrinnsvis har minst 95%, enda mer foretrukket har minst 99% sekvensidentitet med minst en av korresponderende CDR sekvenser opplistet i Tabell I; og/eller fra gruppen bestående av CDR sekvenser som har 3, 2 eller kun 1 aminosyre forskjell(er) med minst en av korresponderende sekvenser opplistet i Tabell I.

Spesielt, i Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse, er minst CDR3 sekvensen passende valgt blant gruppen bestående av CDR3 sekvensene opplistet i Tabell I, og enten CDR1 sekvensen eller CDR2 sekvensen er passende valgt blant gruppen bestående av CDR1 og CDR2 sekvenser, henholdsvis, opplistet i Tabell I. Foretrukket, i denne utførelsesformen, er de resterende CDR sekvensene som er til stede, passende valgt blant gruppen av CDR sekvenser som har minst 80%, foretrukket minst 90%, fortrinnsvis har minst 95%, enda mer foretrukket har minst 99% sekvensidentitet med minst en av korresponderende CDR sekvensene opplistet i Tabell I; og/eller fra gruppen bestående av CDR sekvenser som har 3, 2 eller kun 1 aminosyre forskjell(er) fra de korresponderende CDR sekvensene opplistet i Tabell I.

Enda mer foretrukket er, i Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse, alle tre CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene som er til stede, passende valgt blant gruppen bestående av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene, henholdsvis, opplistet i Tabell I.

Også generelt er kombinasjonene av CDR’er opplistet i Tabell I (dvs. de nevnt i den samme linje i Tabell I) foretrukket. Således, er det generelt foretrukket at, når et CDR i et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse er en CDR sekvens nevnt i Tabell I eller er passende valgt blant gruppen av CDR sekvenser som har minst 80%, foretrukket minst 90%, fortrinnsvis har minst 95%, enda mer foretrukket har minst 99% sekvensidentitet med en CDR sekvens opplistet i Tabell I; og/eller fra gruppen bestående av CDR sekvenser som har 3, 2 eller kun 1 aminosyre forskjell(er) fra CDR sekvens opplistet i Tabell I, som minst en og foretrukket begge av de andre CDR’er er passende valgt blant CDR sekvensene som hører til den samme kombinasjon i Tabell I (dvs. nevnt på den samme linjen i Tabell I) eller er passende valgt blant gruppen av CDR sekvenser som har minst 80%, foretrukket minst 90%, fortrinnsvis minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med CDR sekvensen(e) som hører til den samme kombinasjonen og/eller fra gruppen bestående av CDR sekvenser som har 3, 2 eller kun 1 aminosyre forskjell(er) fra CDR sekvensen(e) som hører til den samme kombinasjonen. De andre preferansene indikert i de ovenfornevnte avsnitt gjelder også kombinasjonene av CDR’er nevnt i Tabell I.

Således, ved hjelp av ikke-begrensende eksempler, kan et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse for eksempel omfatte en CDR1 sekvens som har mer enn 80 % sekvensidentitet med en av CDR1 sekvensene nevnt i Tabell I, en CDR2 sekvens som har 3, 2 eller 1 aminosyrers forskjell fra en av CDR2 sekvensene nevnt i Tabell I (men som hører til en annen kombinasjon), og en CDR3 sekvens.

Noen foretrukne Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse kan for eksempel omfatte: (1) en CDR1 sekvens som har mer enn 80 % sekvensidentitet med en av CDR1 sekvensene nevnt i Tabell I; en CDR2 sekvens som har 3, 2 eller 1 aminosyre forskjell fra en av CDR2 sekvensene nevnt i Tabell I (med som hører til en annen kombinasjon); og en CDR3 sekvens som har mer enn 80 % sekvensidentitet med en av CDR3 sekvensene nevnt i Tabell I (men som hører til en annen kombinasjon); eller (2) en CDR1 sekvens som har mer enn 80 % sekvensidentitet med en av CDR1 sekvensene nevnt i Tabell I; en CDR2 sekvens, og en av CDR3 sekvensene opplistet i Tabell I; eller (3) en CDR1 sekvens; en CDR2 sekvens som har mer enn 80% sekvensidentitet med en av CDR2 sekvensene opplistet i Tabell I; og en CDR3 sekvens som har 3, 2 eller 1 aminosyre en annen kombinasjon av CDR3 sekvens nevnt i Tabell I som hører den samme kombinasjonen som CDR2 sekvensen.

Noen spesielt foretrukne Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse kan for eksempel omfatte: (1) en CDR1 sekvens som har mer enn 80 % sekvensidentitet med en av CDR1 sekvensene nevnt i Tabell I; en CDR2 sekvens som har 3, 2 eller 1 aminosyre forskjell fra CDR2 sekvensen nevnt i Tabell I som hører til den samme kombinasjonen; og en CDR3 sekvens som har mer enn 80 % sekvensidentitet med CDR3 sekvensen nevnt i Tabell I som hører til den samme kombinasjonen; (2) en CDR1 sekvens; en CDR 2 opplistet i Tabell I og en CDR3 sekvens opplistet i Tabell I (i hvilke CDR2 sekvensen og CDR3 sekvensen kan høre til to forskjellige kombinasjoner).

Noen enda mer foretrukne Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse kan for eksempel omfatte: (1) en CDR1 sekvens som har mer enn 80 % sekvensidentitet med en av CDR1 sekvensene nevnt i Tabell I; CDR2 sekvensen opplistet i Tabell I som hører til den samme kombinasjonen; og en CDR3 sekvens nevnt i Tabell I som hører til en annen kombinasjon; eller (2) en CDR1 sekvens nevnt i Tabell I; en CDR2 sekvens som har 3, 2 eller 1 aminosyreforskjeller fra CDR2 sekvensen nevnt i Tabell I som hører til den samme kombinasjonen; og mer enn 80% sekvensidentitet med CDR3 sekvensen opplistet i Tabell I som hører til samme forskjellige kombinasjon.

Spesielt foretrukket kan Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse for eksempel omfatter en CDR1 sekvens nevnt i Tabell I, en CDR2 sekvens som har mer enn 80 % sekvensidentitet med CDR2 sekvensen nevnt i Tabell I som hører til den samme kombinasjonen; og CDR3 sekvensen nevnt i Tabell I som hører til den samme.

I de mest foretrukne Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse, er CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene som er til stede, passende valgt blant en av kombinasjonene av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene, henholdsvis, opplistet i Tabell I.

Foretrukket, når en CDR sekvens er passende valgt blant gruppen av CDR sekvenser som har minst 80%, foretrukket minst 90%, fortrinnsvis minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med en av CDR sekvensene opplistet i Tabell I; og/eller når en CDR sekvens er passende valgt blant gruppen bestående av CDR sekvenser som har 3, 2 eller kun 1 aminosyreforskjell(er) fra en av CDR sekvensene opplistet i Tabell I:

i) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon er fortrinnsvis en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri); og/eller ii) nevnte aminosyresekvens inneholder foretrukket kun aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller -innsettinger, sammenlignet med CDR sekvensen opplistet i Tabell I.

Ifølge en ikke-begrensende, men foretrukket utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse, er CDR sekvensene i Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse som definert ovenfor og er også slik som at Nanobodiet ifølge foreliggende beskrivelse binder til vWF med en dissosiasjonskonstant (KD) på 10<-5 >til 10<-12 >mol/liter (M) eller mindre, og foretrukket 10<-7 >mol 10<-12 >mol/liter (M) eller mindre og fortrinnsvis 10<-8 >til 10<-12 >mol/liter (M), og/eller med en assosiasjonskonstant (KA) på minst 10<7 >M<-1>, foretrukket minst 10<8 >M<-1>, fortrinnsvis minst 10<9 >M<-1>, slik som minst 10<12 >M<-1>; og spesielt med en KD mindre enn 500 nM, foretrukket mindre enn 200 nM, fortrinnsvis mindre enn 10 nM, slik som mindre enn 500 pM. KD og KA verdiene for Nanobodiet ifølge foreliggende beskrivelse mot vWF kan bli bestemt på en måte som er i og for seg kjent, for eksempel ved bruk av analysen beskrevet heri. Mer generelt, har Nanobodies beskrevet heri foretrukket en dissosiasjonskonstant med hensyn til vWF som er som beskrevet i dette avsnittet.

Ifølge et annet aspekt, angår foreliggende beskrivelse et Nanobody med en aminosyresekvens som er valgt blant gruppen bestående av SEQ ID NO’s: 60 til 73 og SEQ ID NO’s: 86 til 97 eller fra gruppen bestående av fra aminosyresekvenser som har mer enn 80%, foretrukket mer enn 90%, fortrinnsvis mer enn 95%, slik som 99% eller mer “sekvensidentitet” (som definert heri) med en eller flere av aminosyresekvensene i SEQ ID NO’s: 60 til 73 og SEQ ID NO’s: 86 til 97, vis aminosyresekvenser mest foretrukket har rammeverksekvenser som er som videre definert nedenfor under den generelle beskrivelse av rammeverksekvensene i Nanobodies.

Ifølge en spesifikk, men ikke-begrensende utførelsesform, har sistnevnte aminosyresekvenser blitt “humanisert”, som videre beskrevet nedenfor.

Mest foretrukket, blir Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse valgt blant gruppen bestående av SEQ ID NO’s: 60 til 73 og SEQ ID NO’s: 86 til 97, av hvilke de “humaniserte” Nanobodies i SEQ ID NO’s: 86 til 97 kan være spesielt foretrukket.

Nanobodies som er spesielt foretrukket ifølge foreliggende beskrivelse er Nanobody 12B6 (SEQ ID NO: 62) og homologer og varianter derav, og spesielt humanisert varianter derav. Noen spesielt foretrukket, men ikke-begrensende homologer og (humaniserte) varianter er for eksempel Nanobodies 12A2 (SEQ ID NO: 71); 12F2 (SEQ ID NO: 72); 14H10 (SEQ ID NO: 73) og humaniserte varianter derav, slik som 12B6H1 (SEQ ID NO: 86); 12B6H2 (SEQ ID NO: 87); 12B6H3 (SEQ ID NO: 88); 12B6H4 (SEQ ID NO: 89); 12A2H1 (SEQ ID NO: 90); 12A2H3 (SEQ ID NO: 91); 12A2H4 (SEQ ID NO: 92); 12A2H11 (SEQ ID NO: 93) og 12A2H13 (SEQ ID NO: 94).

Spesielt foretrukket i foreliggende beskrivelse er Nanobody 12A2 (SEQ ID NO: 71) og homologer og varianter derav, og spesielt humaniserte varianter derav. Noen spesielt foretrukne, men ikke-begrensende homologer og (humaniserte) varianter, er for eksempel Nanobodies 12A2H1 (SEQ ID NO: 90); 12A2H3 (SEQ ID NO: 91); 12A2H4 (SEQ ID NO: 92); 12A2H11 (SEQ ID NO: 93) og 12A2H13 (SEQ ID NO: 94), av hvilke Nanobody 12A2H1 (SEQ ID NO: 90) er spesielt foretrukket.

Således, angår ett foretrukket, men ikke-begrensende aspekt ifølge foreliggende beskrivelse et Nanobody mot Von Willebrand Factor (vWF), hvor nevnte Nanobody bestående av 4 rammeverkregioner (FR1 til FR4 henholdsvis) og 3 komplementaritetsbestemmende regioner (CDR1 til CDR3 henholdsvis), i hvilke:

a) CDR1 omfatter eller består av aminosyresekvensen YNPMG; og b) CDR2 omfatter eller består av aminosyresekvensen AISRTGGSTYYPDSVEG;

og

c) CDR3 omfatter eller består av:

- aminosyresekvensen AGVRAEDGRVRTLPSEYTF.

Spesielt, angår foreliggende beskrivelse slik som et Nanobody, i hvilket: - CDR1 omfatter eller består av aminosyresekvensen YNPMG;

og i hvilken:

- CDR2 omfatter eller består av aminosyresekvensen AISRTGGSTYYPDSVEG;

eller i hvilken

- CDR3 omfatter eller består av aminosyresekvensen AGVRAEDGRVRTLPSEYTF.

For eksempel, angår foreliggende beskrivelse slike Nanobodies, i hvilke: - CDR1 omfatter eller består av aminosyresekvensen YNPMG; og CDR3 omfatter eller består av aminosyresekvensen AGVRAEDGRVRTLPSEYTF; eller i hvilket:

- CDR1 omfatter eller hovedsakelig består av aminosyresekvensen YNPMG;

og CDR2 omfatter eller hovedsakelig består av aminosyresekvensen AISRTGGSTYYPDSVEG;

eller i hvilket:

- CDR2 omfatter eller består av aminosyresekvensen AISRTGGSTYYPDSVEG; og CDR3 omfatter eller består av aminosyresekvensen AGVRAEDGRVRTLPSEYTF

Ifølge ett aspekt, angår foreliggende beskrivelse slik som et Nanobody, i hvilket CDR1 omfatter eller består av aminosyresekvensen YNPMG; og CDR3 omfatter eller består av aminosyresekvensen AGVRAEDGRVRTLPSEYTF.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også humaniserte varianter av et slikt Nanobody. Noen foretrukne, men ikke-begrensende humaniserende substitusjoner vil bli beskrevet heri, eller vil være klare for fagmannen ved sammenligning av de korresponderende non-humaniserte og humaniserte Nanobodies beskrevet heri. Noen spesielt nyttige humaniserende substitusjoner er en eller flere av de som er til stede i de humaniserte varianter av 12A2 (som vil være klart for fagmannen fra en sammenligning av sekvenser i12A2H1 (SEQ ID NO: 90) med de korresponderende humaniserte sekvenser i 12A2H3 (SEQ ID NO: 91); 12A2H4 (SEQ ID NO: 92); 12A2H11 (SEQ ID NO: 93) og 12A2H13 (SEQ ID NO: 94).

Et annet foretrukket, men ikke-begrensende aspekt ifølge foreliggende beskrivelse angår et Nanobody mot Von Willebrand Factor (vWF), nevnte Nanobody bestående av 4 rammeverkregioner (FR1 til FR4 henholdsvis) og 3 komplementaritetsbestemmende regioner(CDR1 til CDR3 henholdsvis), i hvilket:

d) CDR1 er aminosyresekvensen YNPMG;

og

e) CDR2 er aminosyresekvensen AISRTGGSTYYPDSVEG;

og

f) CDR3 er aminosyresekvensen AGVRAEDGRVRTLPSEYTF.

Spesielt, angår foreliggende beskrivelse slik som et Nanobody, i hvilket: - CDR1 er aminosyresekvensen YNPMG;

eller i hvilket:

- CDR2 er aminosyresekvensen AISRTGGSTYYPDSVEG;

og i hvilket

- CDR3 er aminosyresekvensen AGVRAEDGRVRTLPSEYTF.

For eksempel, angår foreliggende beskrivelse slike Nanobodies, i hvilke: - CDR1 er aminosyresekvensen YNPMG; og CDR3 er aminosyresekvensen AGVRAEDGRVRTLPSEYTF;

eller i hvilket:

- CDR1 er aminosyresekvensen YNPMG; og CDR2 er aminosyresekvensen AISRTGGSTYYPDSVEG;

eller i hvilket:

- CDR2 er aminosyresekvensen AISRTGGSTYYPDSVEG; og CDR3 er aminosyresekvensen AGVRAEDGRVRTLPSEYTF

Ifølge ett aspekt, angår foreliggende beskrivelse slik som et Nanobody, i hvilket CDR1 er aminosyresekvensen YNPMG; og CDR3 er aminosyresekvensen AGVRAEDGRVRTLPSEYTF.

Foreliggende beskrivelse angår også humaniserte varianter av et slikt Nanobody. Noen foretrukne, men ikke-begrensende humaniserende substitusjoner vil bli beskrevet heri, eller vil være klare for fagmannen ved sammenligning av de korresponderende non-humaniserte og humaniserte Nanobodies beskrevet heri. Noen spesielt nyttige humaniserende substitusjoner er en eller flere av de som er til stede i de humanisert varianter av 12A2 (som vil være klart for fagmannen fra en sammenligning av sekvensene i 12A2H1 (SEQ ID NO: 90) med de korresponderende humaniserte sekvenser i12A2H3 (SEQ ID NO: 91); 12A2H4 (SEQ ID NO: 92); 12A2H11 (SEQ ID NO: 93) og 12A2H13 (SEQ ID NO: 94).

Nanobodies beskrevet heri kan være GLEW-klasse Nanobodies, “103 P, R eller S”-klasse Nanobodies eller “KERE-klasse Nanobodies” (alle som beskrevet heri). Spesielt, kan Nanobodies beskrevet heri være KERE-klasse Nanobodies, selv om foreliggende beskrivelse er ikke begrenset til det.

Ifølge et annet aspekt, foreliggende beskrivelse angår et Nanobody som har minst 80%, eller minst 90%, eller minst 95%, eller minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med minst en av Nanobodies fra gruppen bestående av SEQ ID NO’s 60-73 og SEQ ID NO’s 86-97.

Spesielt, angår foreliggende beskrivelse et Nanobody som har minst 80%, eller minst 90%, eller minst 95%, eller minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med minst ett av Nanobodies 12B6 (SEQ ID NO: 62); 12A2 (SEQ ID NO: 71); 12F2 (SEQ ID NO: 72); 14H10 (SEQ ID NO: 73); 12B6H1 (SEQ ID NO: 86); 12B6H2 (SEQ ID NO: 87); 12B6H3 (SEQ ID NO: 88); 12B6H4 (SEQ ID NO: 89); 12A2H1 (SEQ ID NO: 90); 12A2H3 (SEQ ID NO: 91); 12A2H4 (SEQ ID NO: 92); 12A2H11 (SEQ ID NO: 93) og/eller 12A2H13 (SEQ ID NO: 94).

Mer spesielt, foreliggende beskrivelse angår et Nanobody som har minst 80%, eller minst 90%, eller minst 95%, eller minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med minst ett av Nanobodies 12A2 (SEQ ID NO: 71); 12A2H1 (SEQ ID NO: 90); 12A2H3 (SEQ ID NO: 91); 12A2H4 (SEQ ID NO: 92);

12A2H11 (SEQ ID NO: 93) og/eller 12A2H13 (SEQ ID NO: 94).

Enda mer spesielt, angår foreliggende beskrivelse et Nanobody som har minst 80%, eller minst 90%, eller minst 95%, eller minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med Nanobodiet 12A2H1 (SEQ ID NO: 90).

Foreliggende beskrivelse angår også humaniserte varianter av slike Nanobodies. Noen foretrukne, men ikke-begrensende humaniserende substitusjoner vil bli beskrevet heri, eller vil være klart for fagmannen ved sammenligning av de korresponderende non-humaniserte og humaniserte Nanobodies beskrevet heri. Noen spesielt nyttige humaniserende substitusjoner er en eller flere av de som er til stede i de humanisert varianter av 12A2 (som vil være klart for fagmannen fra sammenligning av sekvensene i 12A2H1 (SEQ ID NO: 90) med de korresponderende humaniserte sekvenser av 12A2H3 (SEQ ID NO: 91); 12A2H4 (SEQ ID NO: 92); 12A2H11 (SEQ ID NO: 93) og 12A2H13 (SEQ ID NO: 94).

Foreliggende beskrivelse angår også et Nanobody som er valgt blant gruppen bestående av Nanobodies i SEQ ID NO’s 60-73 og SEQ ID NO’s 86-97.

Spesielt, angår foreliggende beskrivelse et Nanobody som er valgt blant gruppen bestående av Nanobodies 12B6 (SEQ ID NO: 62); 12A2 (SEQ ID NO: 71); 12F2 (SEQ ID NO: 72); 14H10 (SEQ ID NO: 73); 12B6H1 (SEQ ID NO: 86); 12B6H2 (SEQ ID NO: 87); 12B6H3 (SEQ ID NO: 88); 12B6H4 (SEQ ID NO: 89); 12A2H1 (SEQ ID NO: 90); 12A2H3 (SEQ ID NO: 91); 12A2H4 (SEQ ID NO: 92); 12A2H11 (SEQ ID NO: 93) og/eller 12A2H13 (SEQ ID NO: 94).

Mer spesielt, angår foreliggende beskrivelse et Nanobody som er valgt blant gruppen bestående av Nanobodies 12A2 (SEQ ID NO: 71); 12A2H1 (SEQ ID NO: 90); 12A2H3 (SEQ ID NO: 91); 12A2H4 (SEQ ID NO: 92); 12A2H11 (SEQ ID NO: 93) og/eller 12A2H13 (SEQ ID NO: 94). Et spesielt nyttig Nanobody er Nanobody 12A2H1 (SEQ ID NO:90).

Nanobodies beskrevet heri foretrukket har rammeverksekvenser som er som videre beskrevet heri. Noen spesielt foretrukne rammeverksekvenser (FR1, FR2, FR3 og FR4, henholdsvis) er de i Nanobody 12A2 og dets humaniserte varianter; og rammeverksekvenser som har minst 80%, foretrukket minst 90%, fortrinnsvis er minst 95%, enda mer foretrukket er minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med en av nevnte rammeverksekvenser; og og/eller fra gruppen bestående av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller kun 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med en av nevnte rammeverksekvenser (i hvilke en hvilken som helst aminosyresubstitusjon fortrinnsvis er en konservativ aminosyresubstitusjon; og/eller i hvilke nevnte aminosyresekvens foretrukket inneholder aminosyresubstitusjoner og ikke mer enn 3 aminosyre delesjoner eller ikke mer enn 3 aminosyre innsettinger). Nanobodies mot vWF med slik som rammeverksekvenser dannet et ytterligere aspekt ifølge foreliggende beskrivelse.

Spesielt, angår foreliggende beskrivelse et Nanobody mot vWF, i hvilke FR1 er SEQ ID NO: 140; FR2 er SEQ ID NO: 192; FR3 er SEQ ID 244; og FR4 er SEQ ID NO: 296; eller rammeverksekvenser som har minst 80%, foretrukket minst 90%, fortrinnsvis minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med en av nevnte rammeverksekvenser; og og/eller fra gruppen bestående av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller kun 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med en av nevnte rammeverksekvenser (i hvilke en hvilken som helst aminosyresubstitusjon fortrinnsvis er en konservativ aminosyresubstitusjon; og/eller i hvilke nevnte aminosyresekvens foretrukket inneholder aminosyresubstitusjoner og ikke mer enn 3 aminosyre delesjoner eller ikke mer enn 3 aminosyre innsetninger).

Mer spesielt, angår foreliggende beskrivelse et Nanobody mot vWF, i hvilket FR1 er SEQ ID NO: 140; FR2 er SEQ ID NO: 192; FR3 er SEQ ID 244; og FR4 er SEQ ID NO: 296.

Ifølge et annet aspekt, angår foreliggende beskrivelse et polypeptid som omfatter eller hovedsakelig består av minst ene nanobody mot vWF som definert heri. Slik som polypeptider som er referert til heri som “polypeptider ifølge foreliggende beskrivelse” og kan være som videre beskrevet nedenfor og/eller som generelt beskrevet i WO 02/062551 for Nanobodies beskrevet heri, og kan for eksempel være multivalente polypeptider eller multispesifikke polypeptider, igjen som videre beskrevet nedenfor.

Foretrukket, er et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse enten bivalent eller trivalent (dvs. omfattende to eller tre Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse, henholdsvis, eventuelt linket via en eller to linkere som definert heri, henholdsvis) eller et multispesifikt polypeptid, omfattende en eller to, og foretrukket to, Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse og minst ene nanobody rettet mot et serumprotein, og spesielt mot et humant serumprotein, slik som mot human serumalbumin.

I en foretrukket, men ikke-begrensende utførelsesform, er Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse som er til stede i polypeptidene ifølge foreliggende beskrivelse, valgt blant gruppen bestående av SEQ ID NO’s: 60 til 73 og SEQ ID NO’s: 86 til 97, og spesielt fra de “humanisert” Nanobodies i SEQ ID NO’s 86 til 97. Nanobodies mot human serumalbumin til stede i polypeptidene ifølge foreliggende beskrivelse fortrinnsvis er som definert heri, og er fortrinnsvis valgt blant gruppen bestående av SEQ ID NO’s: 107 til 121, og spesielt fra de “humaniserte” Nanobodies mot human serumalbumin i SEQ ID NO’s 114-121.

Noen foretrukne, men ikke-begrensende eksempler på polypeptider ifølge foreliggende beskrivelse er polypeptidene i SEQ ID NO’s: 74 til 82 og polypeptidene i SEQ ID NO’s 98-106. andre polypeptider ifølge foreliggende beskrivelse kan for eksempel være valgt blant gruppen bestående av aminosyresekvenser som har mer enn 80%, foretrukket mer enn 90%, fortrinnsvis er mer enn 95%, slik som 99% eller mer “sekvensidentitet” (som definert heri) med en eller flere av aminosyresekvensene i SEQ ID NO’s: 74 til 82 og/eller SEQ ID NO’s 98 til 106, i hvilke Nanobodies omfattet innen nevnte aminosyresekvenser fortrinnsvis er som definert heri.

Ifølge ett aspekt ifølge foreliggende beskrivelse, har Nanobodies, proteiner og polypeptider beskrevet heri hovedsakelig ingen påvirkning på spaltningen av ULvWF av ADAMTS-13. Spesielt, når Nanobodies, proteiner og polypeptider beskrevet heri blir benyttet i dosene beskrevet heri, reduserer eller hemmer spaltningen av ULvWF ved ADAMTS-13 (enten in vivo etter administrasjon og/eller som målt ved bruk av en passende assay, slik som assayet beskrevet heri), hovedsakelig ikke spaltningen av ULvWF ved ADAMTS-13, dvs. ikke med mer enn 50%, foretrukket ikke mer enn 20%, enda mer foretrukket ikke mer enn 10%, slik som mindre enn 5% eller hovedsakelig ikke i det hele tatt). Således, angår et ytterligere aspekt ifølge foreliggende beskrivelse et Nanobody, protein eller polypeptid, og spesielt et Nanobody, protein eller polypeptid som beskrevet heri, som hovedsakelig ikke reduserer eller hemmer spaltningen av ULvWF ved ADAMTS-13.

Ifølge et annet aspekt, angår foreliggende beskrivelse en nukleinsyre som koder for et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse og/eller et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse. En slik nukleinsyre vil også bli referert til nedenfor som en “nukleinsyre ifølge foreliggende beskrivelse” og kan for eksempel være i form av et genetisk konstrukt, som definert heri.

Ifølge et annet aspekt, angår foreliggende beskrivelse vert eller vertscelle som uttrykker eller er i stand til å uttrykke et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse og/eller et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse; og/eller som inneholder en nukleinsyre som koder for et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse og/eller et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse. En slik vert eller vertscelle kan også være analog til vertene og vertsceller beskrevet i WO 02/062551, men som uttrykker eller i stand til å uttrykke et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse og/eller et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse og/eller inneholdende en nukleinsyre som beskrevet heri.

Foreliggende beskrivelse angår videre et produkt eller sammensetning inneholdende eller omfattende et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse, et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse; og/eller en nukleinsyre ifølge foreliggende beskrivelse. Et slikt produkt eller sammensetning kan for eksempel være en farmasøytisk sammensetning (som beskrevet nedenfor) eller et produkt eller sammensetning for diagnostisk anvendelse (som også beskrevet nedenfor). Et slikt produkt eller sammensetning kan også være analog til produktene og sammensetningene beskrevet i WO 02/062551, men inneholdende eller omfattende et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse, et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse eller en nukleinsyre ifølge foreliggende beskrivelse.

Foreliggende beskrivelse angår videre fremgangsmåter for fremstilling av eller generering av Nanobodies, polypeptider, nukleinsyrer, vertsceller, produkter og sammensetninger som beskrevet heri, hvis fremgangsmåter er som videre beskrevet nedenfor. Også generelt, kan Nanobodies, polypeptider, nukleinsyrer, vertsceller, produkter og sammensetninger beskrevet heri også være preparert og benyttet på en måte analog til måten beskrevet i WO 02/062551.

Foreliggende beskrivelse angår videre anvendelser og bruk av de ovenfornevnte Nanobodies, polypeptider, nukleinsyrer, vertsceller, produkter og sammensetninger beskrevet heri, hvis anvendelser og bruk omfatter, men er ikke begrenset til, anvendelsene og brukene beskrevet nedenfor og/eller de videre bruk og anvendelser for Nanobodies mot vWF og/eller for polypeptider inneholdende det samme i WO 02/062551.

Andre aspekter, utførelsesformer, fordeler og anvendelser av foreliggende beskrivelse vil være klare fra den videre beskrivelse nedenfor.

Detaljert beskrivelse av foreliggende oppfinnelsen

De ovenfornevnte og andre aspekter og utførelsesformer ifølge foreliggende beskrivelse vil bli klare fra den videre beskrivelse nedenfor, i hvilken:

a) Hvis ikke indikert eller definert annerledes, har alle de anvendte termer sin vanlige betydning innen teknikken, som vil være klar for fagmannen. Det henvises for eksempel til standardbøker, slik som Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" ( 2nd.Ed.), Vols.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing og Wiley Interscience, New York (1987); Roitt et al., “Immunology” (6th. Ed.), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001); og Janeway et al., “Immunobiology” (6<th >Ed.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005), så vel som den generelle bakgrunn angitt ovenfor;

b) Hvis ikke indikert annerledes, blir termen “immunoglobulinsekvens” -enten det benyttet for å referere til tungkjede antistoff eller et konvensjonelt 4-kjedet antistoff – benyttet som en generell term for å inkludere både fullstørrelse antistoffet, de individuelle kjeder derav, så vel som alle parter, domener eller fragmenter derav (inkludert men ikke begrenset til antigen-bindende domener eller fragmenter slik som VHH domener eller VH/VL domener, henholdsvis). I tillegg, skal termen “sekvens” som benyttet heri (for eksempel i termer som “immunoglobulinsekvens”, “antistoffsekvens”, “variabelt domene sekvens”, “VHH sekvens” eller “proteinsekvens”), generelt bli forstått å omfatte både den relevante aminosyresekvens så vel som nukleinsyresekvenser eller nukleotidsekvenser som koder for det samme, hvis ikke sammenhengen krever en mer begrenset tolkning;

c) Hvis ikke indikert annerledes, kan alle fremgangsmåter, trinn, teknikker og manipulasjonersom ikke er spesifikt beskrevet i detalj bli utført og har blitt utført på en måte kjent per se, slik vil være klart for fagmannen. Det henvises for eksempel igjen til standardbøkene, den generelle bakgrunnsteknikken referert til ovenfor og to de videre referanser sitert deri;

d) Aminosyrerester bli angitt ifølge standard trebokstavs- eller enbokstavskodene som nevnt i Tabell 1;

Tabell 1: enbokstavs og trebokstavs aminosyrekoder

Merknader:

(1) Noen ganger ansett å være en polar ikke-ladet aminosyre.

(2) Noen ganger også ansett å være en upolar ikke-ladet aminosyre.

(3) Som vil være klart for fagmannen, det faktum at en aminosyrerest er referert til i denne Tabell som å være enten lade teller ikke-ladet ved pH 6,0 til 7,0 reflekterer ikke på noen måte den ladningen nevnte aminosyrerest kan ha ved en pH lavere enn 6,0 og/eller ved en pH høyere enn 7,0; aminosyrerestene nevnt i tabellen kan være enten ladede og/eller ikke-ladede ved en høyere eller lavere pH, som det vil være klart for fagmannen.

(4) Som kjent I teknikken, er ladningen til en His sterkt avhengig av selv små endringer I pH, men en His rest kan generelt bli ansett som hovedsakelig ikke-ladet ved pH på omkring 6,5.

e) For formålet å sammenligne to eller flere nukleotidsekvenser, kan prosentdelen av “sekvensidentitet” mellom en første nukleotidsekvens og en andre nukleotidsekvens bli utregnet ved dividering av [antallet nukleotider i den første nukleotidsekvensen som er identisk med nukleotidene i de korresponderende posisjoner i den andre nukleotidsekvensen] med [totalantallet nukleotider i den første nukleotidsekvensen] og multiplisering med [100%], i hvilke hver delesjon, innsetting, substitusjon eller addisjon av et nukleotid i den andre nukleotidsekvens - sammenlignet med den første nukleotidsekvens – blir ansett som en forskjell ved et enkel nukleotid (posisjon).

Alternativt, kan graden av sekvensidentitet mellom to eller flere nukleotidsekvenser bli utregnet ved bruk av en kjent komputeralgoritme sekvenstilpasning slik som NCBI Blast v2.0, ved bruk av standardinnstillinger.

Noen andre teknikker, komputeralgoritmer og innstillinger for bestemmende graden av sekvensidentitet er for eksempel beskrevet i WO 04/037999, EP 0967 284, EP 1085089, WO 00/55318, WO 00/78972, WO 98/49185 og GB 2357 768-A.

Vanligvis, for det formål ved bestemmende prosentdelen av “sekvensidentitet” mellom to nukleotidsekvenser ifølge

beregningsfremgangsmåten beskrevet ovenfor, vil nukleotidsekvensen med det største antallet nukleotider bli tatt som den “første” nukleotidsekvensen, og den andre nukleotidsekvensen vil bli tatt som den “andre” nukleotidsekvensen; f) For formålet å sammenligne to eller flere aminosyresekvenser, kan prosentandelen av “sekvensidentitet” mellom en første aminosyresekvens og en andre aminosyresekvens bli utregnet ved dividering av [antallet av aminosyrerester i den første aminosyresekvensen som er identisk med aminosyrerestene ved de korresponderende posisjoner i den andre aminosyresekvensen] på [totalantallet nukleotider i den første aminosyresekvensen] og multiplisering med [100%], i hvilke hver delesjon, innsetting, substitusjon eller addisjon av en aminosyrerest i den andre aminosyresekvensen - sammenlignet med den første aminosyresekvensen – er ansett som en forskjell ved en enkel aminosyrerest (posisjon), dvs. som en “aminosyre forskjell” som definert heri.

Alternativt, kan graden av sekvensidentitet mellom to aminosyresekvenser bli utregnet ved bruk av en kjent komputeralgoritme, slik som de nevnt ovenfor for bestemmende graden av sekvensidentitet for nukleotidsekvenser, igjen ved bruk av standardinnstillinger.

Vanligvis, for det formål av bestemmende prosentandelen av “sekvensidentitet” mellom to aminosyresekvenser ifølge utregningsfremgangsmåten beskrevet ovenfor, vil aminosyresekvensen med det største antallet aminosyrerester bli tatt som den “første” aminosyresekvensen, og den andre aminosyresekvensen vil bli tatt som den “andre” aminosyresekvensen.

Også, ved bestemmende graden av sekvensidentitet mellom to aminosyresekvenser, kan fagmannen ta i betraktning såkalte “konservative” aminosyresubstitusjoner, som generelt vil bli beskrevet som aminosyresubstitusjoner i hvilke en aminosyrerest er erstattet med en annen aminosyrerest med tilsvarende kjemisk struktur og som har liten eller hovedsakelig ingen påvirkning på funksjon, aktivitet eller andre biologiske egenskaper til polypeptidet. Slike konservative aminosyresubstitusjoner er velkjente i teknikken, for eksempel fra WO 04/037999, GB-A-2357768, WO 98/49185, WO 00/46383 og WO 01/09300; og (foretrukne) typer og/eller kombinasjonene av slik substitusjoner kan bli valgt på basis den pertinente læren fra WO 04/037999 så vel som WO 98/49185 og fra de videre referanser sitert deri.

Slike konservative substitusjoner er fortrinnsvis substitusjoner i hvilke en aminosyre innen de følgende gruppene (a) – (e) blir erstattet av en aminosyrerest innen den samme gruppen: (a) små alifatiske, ikke-polare eller svakt polare rester: Ala, Ser, Thr, Pro og Gly; (b) polar, negativt ladede rester og deres (ikke-ladede) amider: Asp, Asn, Glu og G1n; (c) polare, positivt ladede rester: His, Arg og Lys; (d) store alifatiske, ikke-polare rester: Met, Leu, Ile, Val og Cys; og (e) aromatiske rester: Phe, Tyr og Trp.

Spesielt foretrukne konservative substitusjoner er som følger: Ala til Gly eller til Ser; Arg til Lys; Asn til Gln eller til His; Asp til Glu; Cys til Ser; Gln til Asn; Glu til Asp; Gly til Ala eller til Pro; His til Asn eller til Gln; Ile til Leu eller til Val; Leu til Ile eller til Val; Lys til Arg, til Gln eller til Glu; Met til Leu, til Tyr eller til Ile; Phe til Met, til Leu eller til Tyr; Ser til Thr; Thr til Ser; Trp til Tyr; Tyr til Trp; og/eller Phe til Val, til Ile eller til Leu.

En hvilken som helst aminosyresubstitusjoner benyttet for polypeptidene beskrevet heri kan også være basert på analysen av frekvensen av aminosyrevariasjoner mellom homologe proteiner fra forskjellige arter utviklet av Schulz et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, 1978, på analyser av strukturdannende potensialer utviklet av Chou og Fasman, Biochemistry 13: 211, 1974 og Adv. Enzymol., 47: 45-149, 1978, og på analysen hydrofobisitetsmønstere i proteiner utviklet av Eisenberg et al., Proc. Nad. Acad Sci. USA 81: 140-144, 1984; Kyte & Doolittle; J Molec. Biol.157: 105-132, 1981, og Goldman et al., Ann. Rev. Biophys. Chem.15: 321-353, 1986. I dannelse av den primære, sekundære og tertiære strukturen til Nanobodies gitt i beskrivelsen nedenfor og i den generelle bakgrunnsteknikken sitert ovenfor. Også for dette formål er krystallstrukturen til et VHH domene fra en lama for eksempel gitt av Desmyter et al., Nature Structural Biology, Vol.3, 9, 803 (1996); Spinelli et al., Natural Structural Biology (1996); 3, 752-757; og Decanniere et al., Structure, Vol. 7, 4, 361 (1999);

g) aminosyresekvenser og nukleinsyresekvenser er nevnt å være “akkurat den samme” dersom de har 100% sekvensidentitet (som definert heri) over sin hele lengde;

h) ved sammenligning av to aminosyresekvenser, refererer termen “aminosyreforskjell” til en innsetting, delesjon eller substitusjon av en enkel aminosyrerest i en posisjon i den første sekvens, sammenlignet med den andre sekvens; det må forståes at to aminosyresekvenser kan inneholde en, to eller flere slike aminosyreforskjeller;

i) en nukleinsyresekvens eller aminosyresekvens er ansett å være “(i) hovedsakelig isolert (form)” - for eksempel, sammenlignet med sin native biologiske kilde og/eller reaksjonsmediet eller dyrkingsmediet fra hvilket den er oppnådd- når den er blitt separert fra minst en annen komponent med hvilken den vanligvis er assosiert i nevnte kilde eller medium, slik som en annen nukleinsyre, annet protein/polypeptid, en annen biologisk komponent eller makromolekyl eller minst en kontaminant, urenhet eller mindre komponent.

Spesielt, er en nukleinsyresekvens eller aminosyresekvens ansett som “hovedsakelig isolert” når den er renset minst to ganger, spesielt minst 10-ganger, mer spesielt minst 100-ganger, og opp til 1000-ganger eller mer. En nukleinsyresekvens eller aminosyresekvens som er “i hovedsakelig isolert form” er fortrinnsvis hovedsakelig homogen, som bestemt ved bruk av en passende teknikk, sli som en passende kromatografisk teknikk, slik som polyakrylamid-gelelektroforese;

j) Termen “domene” som benyttet heri, refererer generelt til en globulær region av en antistoffkjede, og spesielt en globulær region av et tungkjede antistoff, eller et polypeptid som hovedsakelig består av en globulær region. Vanligvis, vil et slikt domene omfatte peptidlooper (for eksempel 3 eller 4 peptidlooper) stabilisert , for eksempel, som en plate eller ved disulfid-bindinger.

k) Termen ‘antigenisk determinant’ refererer til epitopen på antigenet som blir gjenkjent av antigenbindende molekylet (slik som et Nanobody eller et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse) og mer spesielt av det antigenbindende setet til nevnte molekyl. Termene “antigenisk determinant” og “epitop ’ kan også bli benyttet om hverandre heri.

l) en aminosyresekvens (slik som et Nanobody, et antistoff, et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse, eller generelt et antigenbindende protein eller polypeptid eller et fragment derav) som kan binde til, som har affinitet for og/eller som har spesifisitet for en spesifikk antigenisk determinant, epitop , antigen eller protein (eller for minst en part, fragment eller epitop derav) er nevnt å være “mot” eller “rettet mot” nevnte antigenisk determinant, epitop , antigen eller protein.

m) Termen “spesifisitet” refererer til antallet av forskjellig typer av antigener eller antigeniske determinanter til hvilke et bestemt antigenbindende molekyl eller antigen-bindende protein (slik som et Nanobody eller et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse) molekyl kan binde. Spesifisiteten til et antigenbindende protein kan bli bestemt basert på affinitet og/eller aviditet. Affiniteten, representert ved likevektskonstanten for dissosiasjon av et antigen med et antigen-bindende protein (KD), er et mål for bindingsstyrken mellom en antigenisk determinant og et antigenbindende sete på det antigen-bindende proteinet: desto lavere verdi av KD, desto sterkere er bindingsstyrken mellom en antigenisk determinant og det antigenbindende molekylet (alternativt, affinitet kan også bli uttrykt som affinitetskonstanten (KA), som er 1/KD). Som det vil være klart for fagmannen (for eksempel på basis av den videre beskrivelsen heri), kan affinitet bli bestemt på en måte kjent per se, avhengig av det spesifikke antigent. Aviditet er målet for styrken av binding mellom et antigenbindende molekyl (slik som et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse) og det pertinente antigen. Aviditet er relatert til både affiniteten mellom en antigenisk determinant og dets antigen bindende sete på det antigenbindende molekyl og antallet av pertinente bindingssetes som er til stede på det antigenbindende molekylet. Typisk, vil antigen-bindende proteiner (slik som Nanobodies og/eller polypeptider ifølge foreliggende beskrivelse) binde med en dissosiasjonskonstant(KD) på 10<-5 >til 10<-12 >mol/liter (M) eller mindre, og foretrukket 10<-7 >til 10<-12 >mol/liter (M) eller mindre og fortrinnsvis er 10<-8 >til 10<-12 >mol/liter, og/eller med en assosiasjonskonstant(KA) på minst 10<7 >M<-1>, foretrukket minst 10<8 >M<-1>, fortrinnsvis minst 10<9 >M-1, slik som minst 10<12 >M<-1>. En hvilken som helst KD verdi større enn 10<-4 >M er generelt ansett å indikere ikke-spesifikk binding. Foretrukket, vil et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse binde til det ønskede antigen med en KD mindre enn 500 nM, foretrukket mindre enn 200 nM, fortrinnsvis er mindre enn 10 nM, slik som mindre enn 500 pM. Spesifikk binding av et antigen-bindende protein til et antigen eller antigenisk determinant kan bli bestemt på en hvilken som helst i og for seg, inkludert, for eksempel, Scatchard analyse og/eller kompetitiv binding assays, slik som radioimmunoassays (RIA), enzyme immunoassays (EIA) og sandwich kompetitive assays, og de forskjellig varianter derav kjent per se i teknikken.

n) som videre beskrevet nedenfor, kan aminosyresekvensen og strukturen til et Nanobody bli ansett - uten imidlertid å være begrenset til det – å være omfattet av fire rammeverkregioner eller “FR’s”, som er referert til i teknikken og nedenfor som “Rammeverkregion 1” eller “FR1”; som “Rammeverkregion 2” eller ”FR2”; som “Rammeverkregion 3” eller “FR3”; og som “Rammeverkregion 4” eller “FR4”, henholdsvis; hvis rammeverkregioner er avbrutt av tre komplementaritetsbestemmende regioner eller “CDR’er”, som er referert til i teknikken som “Komplementaritetsbestemmende Region 1” eller “CDR1”; as “Komplementaritetsbestemmende Region 2” eller ”CDR2”; og som “Komplementaritetsbestemmende Region 3” eller “CDR3”, henholdsvis;

o) som også videre beskrevet nedenfor, kan totalantallet aminosyrerester i et Nanobody være i området fra 110-120, fortrinnsvis 112-115, og mest foretrukket 113. Det må imidlertid bemerkes at deler, fragmenter eller analoger (som videre beskrevet nedenfor) av et Nanobody ikke er spesielt begrenset til deres lengde og/eller størrelse, så lenge som deler , fragmenter eller analoger møter de videre kravene beskrevet nedenfor og også er foretrukket passende for formålet beskrevet heri;

p) aminosyrerestene I et Nanobody er nummerert ifølge den generelle nummerering for VH domener gitt av Kabat et al. (“Sequences of proteins of immunological interest”, US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No.91), som benyttet for VHH domener fra Kamelider i artikkelen til Riechmann og Muyldermans, referert til ovenfor (se for eksempel Figur 2 i nevnte referanse). Ifølge denne nummereringen, omfatter FR1 til et Nanobody aminosyrerestene i posisjoner 1-30, CDR1 til et Nanobody omfatter aminosyrerestene i posisjoner 31-36, FR2 til et Nanobody omfatter aminosyrene i posisjoner 36-49, CDR2 til et Nanobody omfatter aminosyrerestene i posisjoner 50-65, FR3 til et Nanobody omfatter aminosyrerestene i posisjoner 66-94, CDR3 til et Nanobody omfatter aminosyrerestene i posisjoner 95-102, og FR4 til et Nanobody omfatter aminosyrerester i posisjoner 103-113. [I så henseende må det bemerkes at – som det er velkjent i teknikken for VH domener og for VHH domener – kan totalantallet av aminosyrerester i hver av CDR’ene variere og trenger ikke tilsvare totalantallet av aminosyrerester indikert ved Kabat (det vil si en eller flere posisjoner ifølge Kabat nummereringen trenger ikke å være opptatt i den aktuelle sekvensen, eller den aktuelle sekvensen kan inneholde flere aminosyrerester enn antallet tillatt av Kabat nummereringen). Dette betyr at, generelt, nummereringen ifølge Kabat kan, men trenger ikke tilsvare den aktuelle nummereringen av aminosyrerestene i den aktuelle sekvensen. Generelt, imidlertid, kan det bli nevnte at, ifølge nummereringen til Kabat og uten hensyn til antallet av aminosyrerester i CDR’ene, tilsvarer posisjon 1 ifølge Kabat nummereringen starten av FR1 og visa versa, posisjon 36 ifølge Kabat nummereringen tilsvarer starten av FR2 og visa versa, posisjon 66 ifølge Kabat nummereringen tilsvarer starten av FR3 og visa versa, og posisjon 103 ifølge Kabat nummereringen tilsvarer starten av FR4 og visa versa.].

Alternative fremgangsmåter for nummereringen av aminosyrerester i VH domener, hvis fremgangsmåter også kan bli benyttet på analog måte for VHH domener fra Kamelids og Nanobodies, er fremgangsmåtene beskrevet av Chothia et al. (Nature 342, 877-883 (1989)), den såkalte “AbM definisjonen” og en såkalte “kontaktdefinisjonen”. Imidlertid, i den foreliggende beskrivelse, krav og figurer, vil nummereringen ifølge Kabat som benyttet for VHH domener av Riechmann og Muyldermans bli fulgt , hvis ikke indikert annerledes; og

q) Figurene, Sekvenslistingen og den Eksperimentelle del/ Eksemplene er kun gitt for ytterligere å illustrere foreliggende beskrivelse og må ikke tolkes eller forståes som begrensende for rammen ifølge foreliggende beskrivelse og/eller til de vedlagte krav, hvis ikke annet er uttrykt eksplisitt annerledes heri.

For en generell beskrivelse av tungkjede antistoff og de variable domener derav, henvises det inter alia til de følgende referanser som er nevnt som bakgrunnsteknikk: WO 94/04678, WO 95/04079 og WO 96/34103 tilhørende Vrije Universiteit Brussel; WO 94/25591, WO 99/37681, WO 00/40968, WO 00/43507, WO 00/65057, WO 01/40310, WO 01/44301, EP 1134231 og WO 02/48193 tilhørende Unilever; WO 97/49805, WO 01/21817, WO 03/035694, WO 03/054016 og WO 03/055527 tilhørende Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB); WO 03/050531 tilhørende Algonomics N.V. og søkerne; WO 01/90190 tilhørende National Research Council of Canada; WO 03/025020 (= EP 1433 793) tilhørende Institute of Antibodies; så vel som WO 04/041867, WO 04/041862, WO 04/041865, WO 04/041863, WO 04/062551 tilhørende foreliggende søkere og de videre publiserte patentsøknadene til foreliggende søkere.;

Hamers-Casterman et al., Nature 1993 June 3; 363 (6428): 446-8; Davies og Riechmann, FEBS Lett.1994 Feb 21; 339(3): 285-90; Muyldermans et al., Protein Eng.1994 Sep; 7(9): 1129-3; Davies og Riechmann, Biotechnology (NY) 1995 May; 13(5): 475-9; Gharoudi et al., 9th Forum of Applied Biotechnology, Med. Fac. Landbouw Univ. Gent.1995; 60/4a part I: 2097-2100; Davies og Riechmann, Protein Eng.1996 Jun; 9(6): 531-7; Desmyter et al., Nat Struct Biol.

1996 Sep; 3(9): 803-11; Sheriff et al., Nat Struct Biol.1996 Sep; 3(9): 733-6; Spinelli et al., Nat Struct Biol.1996 Sep; 3(9): 752-7; Arbabi Ghahroudi et al., FEBS Lett.1997 Sep 15; 414(3): 521-6; Vu et al., Mol Immunol.1997 Nov-Dec; 34(16-17): 1121-31; Atarhouch et al., Journal of Kamel Practice og Research 1997; 4: 177-182; Nguyen et al., J. Mol. Biol.1998 Jan 23; 275(3): 413-8;

Lauwereys et al., EMBO J.1998 Jul 1; 17(13): 3512-20; Frenken et al., Res Immunol. 1998 Jul-Aug;149(6):589-99; Transue et al., Proteiner 1998 Sep 1; 32(4): 515-22; Muyldermans og Lauwereys, J. Mol. Recognit.1999 Mar-Apr; 12 (2): 131-40; van der Linden et al., Biochim. Biophys. Acta 1999 Apr 12; 1431(1): 37-46.; Decanniere et al., Structure Fold. Des.1999 Apr 15; 7(4): 361-70;

Ngyuen et al., Mol. Immunol.1999 Jun; 36(8): 515-24; Woolven et

al., Immunogenetics 1999 Oct; 50 (1-2): 98-101; Riechmann og Muyldermans, J. Immunol. Methods 1999 Dec 10; 231 (1-2): 25-38; Spinelli et al., Biochemistry 2000 Feb 15; 39(6): 1217-22; Frenken et al., J. Biotechnol. 2000 Feb 28; 78(1): 11-21; Nguyen et al., EMBO J.2000 Mar 1; 19(5): 921-30; van der Linden et al., J. Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 (1-2): 185-95;

Decanniere et al., J. Mol. Biol.2000 Jun 30; 300 (1): 83-91; van der Linden et al., J. Biotechnol.2000 Jul 14; 80(3): 261-70; Harmsen et al., Mol. Immunol.2000 Aug; 37(10): 579-90; Perez et al., Biochemistry 2001 Jan 9; 40(1): 74-83;

Conrath et al., J. Biol. Chem.2001 Mar 9; 276 (10): 7346-50; Muyldermans et al., Trends Biochem Sci.2001 Apr;26(4):230-5; Muyldermans S., J. Biotechnol.2001 Jun; 74 (4): 277-302; Desmyter et al., J. Biol. Chem.2001 Jul 13 ;276 (28): 26285-90; Spinelli et al., J. Mol. Biol.2001 Aug 3; 311 (1): 123-9; Conrath et al., Antimikrob Midler Chemother.2001 Oct; 45 (10): 2807-12; Decanniere et al., J. Mol. Biol.2001 Oct 26; 313(3): 473-8; Nguyen et al., Adv Immunol.2001; 79: 261-96; Muruganandam et al., FASEB J.2002 Feb; 16 (2): 240-2; Ewert et al., Biochemistry 2002 Mar 19; 41 (11): 3628-36; Dumoulin et al., Protein Sci.2002 Mar; 11 (3): 500-15; Cortez-Retamozo et al., Int. J. Cancer.2002 Mar 20; 98 (3): 456-62; Su et al., Mol. Biol. Evol.2002 Mar; 19 (3): 205-15; van der Vaart JM., Methods Mol Biol.2002; 178: 359-66; Vranken et al., Biochemistry 2002 Jul 9; 41 (27): 8570-9; Nguyen et al., Immunogenetics 2002 Apr; 54 (1): 39-47; Renisio et al., Proteiner 2002 Jun 1; 47 (4): 546-55; Desmyter et al., J. Biol. Chem.2002 Jun 28; 277 (26): 23645-50; Ledeboer et al., J. Dairy Sci.2002 Jun; 85 (6): 1376-82; De Genst et al., J. Biol. Chem.2002 Aug 16; 277 (33): 29897-907; Ferrat et al., Biochem. J.2002 Sep 1; 366 (Pt 2): 415-22; Thomassen et al., Enzyme og Mikrobial Technol.2002; 30: 273-8; Harmsen et al., Appl. Mikrobiol. Biotechnol.

2002 Dec; 60 (4): 449-54; Jobling et al., Nat Biotechnol.2003 Jan; 21 (1): 77-80; Conrath et al., Dev. Comp. Immunol.2003 Feb; 27 (2): 87-103; Pleschberger et al., Bioconjug. Chem.2003 Mar-Apr; 14 (2): 440-8; Lah et al., J. Biol. Chem. 2003 Apr 18; 278 (16): 14101-11; Nguyen et al., Immunology.2003 May; 109 (1): 93-101; Joosten et al., Mikrob. Cell Fact.2003 Jan 30; 2 (1): 1; Li et al., Proteiner 2003 Jul 1; 52 (1): 47-50; Loris et al., Biol Chem.2003 Jul 25; 278 (30): 28252-7; van Koningsbruggen et al., J. Immunol. Methods.2003 Aug; 279 (1-2): 149-61; Dumoulin et al., Nature.2003 Aug 14; 424 (6950): 783-8; Bond et al., J. Mol. Biol. 2003 Sep 19; 332 (3): 643-55; Yau et al., J. Immunol. Methods.2003 Oct 1; 281 (1-2): 161-75; Dekker et al., J. Virol.2003 Nov; 77 (22): 12132-9; Meddeb-Mouelhi et al., Toxicon.2003 Dec; 42 (7): 785-91; Verheesen et al., Biochim. Biophys. Acta 2003 Dec 5; 1624 (1-3): 21-8; Zhang et al., J Mol Biol.2004 Jan 2; 335 (1): 49-56; Stijlemans et al., J Biol Chem.2004 Jan 9; 279 (2): 1256-61; Cortez-Retamozo et al., Cancer Res.2004 Apr 15; 64 (8): 2853-7; Spinelli et al., FEBS Lett.2004 Apr 23; 564 (1-2): 35-40; Pleschberger et al., Bioconjug. Chem.

2004 May-Jun; 15 (3): 664-71; Nicaise et al., Protein Sci.2004 Jul; 13 (7): 1882-91; Omidfar et al., Tumour Biol.2004 Jul-Aug; 25 (4): 179-87; Omidfar et al., Tumour Biol.2004 Sep-Dec; 25(5-6): 296-305; Szynol et al., Antimikrob Midler Chemother. 2004 Sep;48(9):3390-5; Saerens et al., J. Biol. Chem.2004 Dec 10; 279 (50): 51965-72; De Genst et al., J. Biol. Chem.2004 Dec 17; 279 (51):

53593-601; Dolk et al., Appl. Environ. Mikrobiol.2005 Jan; 71(1): 442-50;

Joosten et al., Appl Mikrobiol Biotechnol.2005 Jan; 66(4): 384-92; Dumoulin et al., J. Mol. Biol.2005 Feb 25; 346 (3): 773-88; Yau et al., J Immunol Methods. 2005 Feb; 297 (1-2): 213-24; De Genst et al., J. Biol. Chem.2005 Apr 8; 280 (14): 14114-21; Huang et al., Eur. J. Hum. Genet.2005 Apr 13; Dolk et al., Proteiner. 2005 May 15; 59 (3): 555-64; Bond et al., J. Mol. Biol.2005 May 6;348(3):699-709; Zarebski et al., J. Mol. Biol.2005 Apr 21; [E-publikasjon i forkant av trykking].

Som nevnt ovenfor, angår foreliggende beskrivelse generelt Nanobodies rettet mot vWF, så vel som polypeptider omfattende eller hovedsakelig bestående av en eller flere av slike Nanobodies, som kan bli benyttet for profylaktisk, terapeutiske og/eller diagnostiske formål beskrevet nedenfor og i WO 04/062551.

Som også nevnt ovenfor og videre beskrevet nedenfor, angår foreliggende beskrivelse videre nukleinsyrer som koder for slike Nanobodies og polypeptider, fremgangsmåter for fremstilling av slike Nanobodies og polypeptider, vertsceller som uttrykker eller i stand til å uttrykke slike Nanobodies eller polypeptider, anvendelser av slike Nanobodies, polypeptider, nukleinsyrer eller vertsceller, og sammensetninger omfattende slike Nanobodies, polypeptider, nukleinsyrer eller vertsceller.

Generelt, må det bemerkes at termen Nanobody som benyttet heri i sin bredeste forstand ikke er begrenset til en spesifikk biologisk kilde eller til en spesifikk fremgangsmåte for fremstilling. For eksempel, som det vil bli diskutert i mer detaljernedenfor, kan Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse bli fremskaffet (1) ved isolering av VHH domene fra et naturlig forekommende tungkjede antistoff; (2) ved ekspresjon av en nukleotidsekvens som koder for et naturlig forekommende VHH domene; (3) ved “humanisering” (som beskrevet nedenfor) av et naturlig forekommende VHH domene eller ved ekspresjon av en nukleinsyre som koder for et slikt som humanisert VHH domene; (4) ved “kkamelisering” (som beskrevet nedenfor) av et naturlig forekommende VH domene fra hvilke som helst arter, spesielt arter av pattedyr, slik som fra et menneske, eller ved ekspresjon av en nukleinsyre som koder for slik som et kamelisert VH domene; (5) ved “kkamelisering” av et “domene antistoff” eller “Dab” som beskrevet av Ward et al (supra), eller ved ekspresjon av en nukleinsyre som koder for slik som et kamelisert VH domene; (6) ved bruk av syntetiske eller semi-syntetiske teknikker for fremstilling av proteiner, polypeptider eller andre aminosyresekvenser; (7) ved fremstilling av en nukleinsyre som koder for et Nanobody ved bruk av teknikker for nukleinsyresyntese, fulgt av ekspresjon av nukleinsyren således fremstilt; og/eller (8) ved en hvilken som helst kombinasjon av de foregående. Passende fremgangsmåter og teknikker for utøvelse av det foregående vil være klare for fagmannen basert på beskrivelsen heri og inkluderer for eksempel fremgangsmåter og teknikker beskrevet i større detalj nedenfor.

Imidlertid, ifølge en spesifikk utførelsesform, har Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse ikke en aminosyresekvens som er eksakt den samme som (dvs. som en grad av sekvensidentitet på 100% med) aminosyresekvensen til et naturlig forekommende VH domene, slik som aminosyresekvensen til et naturlig forekommende VH domene fra et pattedyr, og spesielt fra et menneske.

En spesielt foretrukket klasse av Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse omfatter Nanobodies med en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyresekvensen til et naturlig forekommende VHH domene, men som har blitt “humanisert” , dvs. ved erstatning av en eller flere aminosyrerester i aminosyresekvensen av nevnte naturlig forekommende VHH sekvens ved en eller flere av aminosyrerestene som opptrer i den korresponderende posisjonen(e) i et VH domene fra et konvensjonelt 4-kjedet antistoff fra et menneske (for eksempel indikert ovenfor). Dette kan bli utført på en måte som er kjent per se, som vil være klart for fagmannen, for eksempel på basis av den videre beskrivelse nedenfor og den kjent teknikk om humanisering referert til heri. Igjen må det bemerkes at slik som humaniserte Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse kan bli fremskaffet på en hvilken som helst måte kjent per se (dvs. som indikert under punkter (1) – (8) ovenfor) og er således ikke strengt begrenset til polypeptider som har blitt fremskaffet ved bruk av et polypeptid som omfatter et naturlig forekommende VHH domene som et startmateriale.

En annen spesielt foretrukket klasse av Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse omfatter Nanobodies med en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyresekvensen av et naturlig forekommende VH domene som har blitt “kamelisert”, dvs. ved erstatning av en eller flere aminosyrerester i aminosyresekvensen til et naturlig forekommende VH domene fra et konvensjonelt 4-kjedet antistoff ved en eller flere av aminosyrerestene som opptrer ved den korresponderende posisjon(er) i et VHH domene til et tungkjede antistoff. Dette kan bli utført på en måte som er kjent per se, som vil være klart for fagmannen, for eksempel på basis av den videre beskrivelse nedenfor. Det blir også referert til WO 94/04678. Slik kamelisering kan foretrukket opptre ved aminosyreposisjoner som er til stede ved VH-VL grenseflaten og ved de såkalte Kamelidae hallmark rester (se for eksempel også WO 94/04678), som også nevnt nedenfor. Foretrukket, er VH domene eller sekvensene som blir benyttet som et startmateriale eller startpunkt for generering eller designing av kamelisert Nanobody fortrinnsvis en VH sekvens fra et pattedyr, fortrinnsvis VH sekvensen fra et menneske. Imidlertid, må det bemerkes at slike kameliserte Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse kan bli fremskaffet på en hvilken som helst måte kjent per se (dvs. som indikert under punkter (1) – (8) ovenfor) og er således ikke strengt begrenset til polypeptider som har blitt fremskaffet ved bruk av et polypeptid som omfatter et naturlig forekommende VH domene som et startmateriale.

For eksempel, igjen som videre beskrevet nedenfor, kan både “humanisering” og “kkamelisering” bli utført ved å fremskaffe en nukleotidsekvens som koder for et slikt naturlig forekommende VHH domene eller VH domene, henholdsvis, også endring, på en måte som er kjent per se, en eller flere codons i nevnte nukleotidsekvens slik som at den nye nukleotidsekvensen koder for et humanisert eller kamelisert Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse, henholdsvis, og som så uttrykker nukleotidsekvensen som er således fremstilt på en måte som er kjent per se for å fremskaffe det ønskede Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse. Alternativt, basert på aminosyresekvensen til et naturlig forekommende VHH domene eller VH domene, henholdsvis, kan aminosyresekvensen til det ønskede humaniserte eller er kameliserte Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse, henholdsvis, bli designet og så syntetisert de novo ved bruk av teknikker for peptidsyntese som er kjent per se. Også, basert på aminosyresekvensen eller nukleotidsekvens til et naturlig forekommende VHH domene eller VH domene, henholdsvis, kan en nukleotidsekvens som koder for det ønskede humaniserte eller kameliserte Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse, henholdsvis, bli designet og så syntetisert de novo ved bruk av teknikker for nukleinsyre syntese som er kjent per se, etter hvilken nukleotidsekvens fremstilt slik kan bli uttrykt på en måte som er kjent per se for å fremskaffe det ønskede Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse.

Andre passende måter og teknikker for fremskaffelse av Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse og/eller nukleotidsekvenser og/eller nukleinsyrer som koder for det samme, med utgangspunkt i (aminosyresekvensen of) naturlig forekommende VH domener eller fortrinnsvis er VHH domener og/eller fra nukleotidsekvenser og/eller nukleinsyresekvenser som koder for det samme vil være klart for fagmannen, og kan for eksempel omfatte kombinering av en eller flere aminosyresekvenser og/eller nukleotidsekvenser fra naturlig forekommende VH domener (slik som en eller flere FR’s og/eller CDR’er) med en eller flere en eller flere aminosyresekvenser og/eller nukleotidsekvenser fra naturlig forekommende VHH domener (slik som en eller flere FR’er eller CDR’er), på en passende måte for å fremskaffe (e nukleotidsekvens eller nukleinsyre som koder for) et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse.

Ifølge et foretrukket, men ikke-begrensende aspekt av aspektet ifølge foreliggende beskrivelse, kan et Nanobody i sin videste forstand generelt bli definert som et polypeptid omfattende:

a) en aminosyresekvens som er omfattet av fire rammeverkregioner/sekvenser avbrutt av tre komplementaritets bestemmende regioner/sekvenser, i hvilke aminosyreresten i posisjon 108 ifølge Kabat nummereringen er;

og/eller:

b) en aminosyresekvens som er omfattet av fire rammeverkregioner/sekvenser avbrutt av tre komplementaritetsbestemmende regioner/sekvenser, i hvilke aminosyreresten i posisjon 44 ifølge Kabat nummereringen er E og i hvilke aminosyreresten i posisjon 45 ifølge Kabat nummereringen er enR; og/eller:

c) en aminosyresekvens som er omfattet av fire rammeverkregioner/sekvenser avbrutt av tre komplementaritetsbestemmende regioner/sekvenser, i hvilke aminosyreresten i posisjon 103 ifølge Kabat nummereringen er valgt blant gruppen bestående av P, R og S, og er spesielt valgt blant gruppen bestående av R og S.

Således, i et første foretrukket, men ikke-begrensende aspekt, kan et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse ha strukturen

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

i hvilke FR1 to FR4 refererer til rammeverkregioner 1 til 4, henholdsvis, og i hvilke CDR1 til CDR3 refererer til de komplementaritetsbestemmende regioner 1 til 3, henholdsvis, og i hvilke

i) aminosyreresten i posisjon 108 ifølge Kabat nummereringen er Q; og/eller i hvilke:

ii) aminosyreresten i posisjon 44 ifølge Kabat nummereringen er E og i hvilke aminosyreresten i posisjon 45 ifølge Kabat nummereringen er en R; og/eller i hvilke:

iii) aminosyreresten i posisjon 103 ifølge Kabat nummereringen er valgt blant gruppen bestående av P, R og S, og er spesielt valgt blant gruppen bestående av R og S;

og i hvilke:

iv) CDR 1 er en aminosyresekvens som er valgt blant gruppen bestående av de følgende aminosyresekvenser:

NYGMG [SEQ ID NO: 15]

SYTLG [SEQ ID NO: 16]

NYNMG [SEQ ID NO: 17]

SSAMA [SEQ ID NO: 18]

YYNTG [SEQ ID NO: 19]

IGAMG [SEQ ID NO: 20]

IGTMG [SEQ ID NO: 21]

YNPMG [SEQ ID NO: 22]

eller fra gruppen bestående av aminosyresekvenser som har minst 80%, foretrukket minst 90%, fortrinnsvis er minst 95%, enda mer foretrukket er minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med en av de ovenfornevnte aminosyresekvenser; i hvilke

(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon fortrinnsvis er en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri); og/eller (2) nevnte aminosyresekvens foretrukket inneholder kun aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller -innsettinger, sammenlignet med den ovenfornevnte

aminosyresekvensen(e);

og/eller fra gruppen bestående av aminosyresekvenser som har 2 eller kun 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med en av de ovenfornevnte aminosyresekvenser, i hvilke:

(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon fortrinnsvis er en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri); og/eller (2) nevnte aminosyresekvens foretrukket inneholder kun aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller -innsettinger, sammenlignet med den ovenfornevnte aminosyresekvensen(e);

og i hvilke:

v) CDR 2 er en aminosyresekvens som er valgt blant gruppen bestående av de følgende aminosyresekvenser:

SISWSGTYTAYSDNVKG [SEQ ID NO: 23]

GISWSGVSTDYAEFAKG [SEQ ID NO: 24]

TSISWSGSYTAYADNVKG [SEQ ID NO: 25]

SISWSGMSTYYTDSVKG [SEQ ID NO: 26]

TITSGGRTSYADSVKG [SEQ ID NO: 27]

AISWSGGLTYYADSVKG [SEQ ID NO: 28]

TITSGGSTNYADPVKG [SEQ ID NO: 29]

TITSGGSTNYADSVKG [SEQ ID NO: 30]

AISRTGGSTYYARSVEG [SEQ ID NO: 31]

AISRTGGSTYYPDSVEG [SEQ ID NO: 32]

aminosyresekvensen(e);

og/eller fra gruppen bestående av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller kun 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med en av de ovenfornevnte aminosyresekvenser, i hvilke:

og i hvilke:

vi) CDR 3 er en aminosyresekvens som er valgt blant gruppen bestående av de følgende aminosyresekvenser:

QSRYRSNYYDHDDKYAY [SEQ ID NO: 33]

LGRYRSNWRNIGQYDY [SEQ ID NO: 34]

QSRYSSNYYDHDDKYAY [SEQ ID NO: 35]

SNRYRTHTTQAMYNY [SEQ ID NO: 36]

VVDGKRAP [SEQ ID NO: 37]

NRRQKTVQMGERAYDY [SEQ ID NO: 38]

NLKQGSYGYRFNDY [SEQ ID NO: 39]

NLKQGDYGYRFNDY [SEQ ID NO: 40]

AGVRAEDGRVRTLPSEYNF [SEQ ID NO: 41]

AGVRAEDGRVRTLPSEYTF [SEQ ID NO: 42]

AGVRAEDGRVRSLPSEYTF [SEQ ID NO: 43]

(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon fortrinnsvis er en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri); og/eller (2) nevnte aminosyresekvens foretrukket inneholder kun

aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller -innsettinger, sammenlignet med den ovenfornevnte aminosyresekvensen(e);

(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon fortrinnsvis er en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri); og/eller (2) nevnte aminosyresekvens foretrukket inneholder kun aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller -innsettinger, sammenlignet med den ovenfornevnte aminosyresekvensen(e).

Foretrukket, i Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse:

- aminosyresekvenser som har 3, 2 eller kun 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) fra nevnte aminosyresekvens; i hvilke

Spesielt, kan et Nanobody mot vWF ifølge foreliggende beskrivelse ha strukturen:

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

i hvilken FR1 to FR4 refererer til rammeverkregioner 1 til 4, henholdsvis, og i hvilke CDR1 til CDR3 refererer til komplementaritetsbestemmende regioner 1 til 3, henholdsvis, og i hvilken

og i hvilke:

YNPMG [SEQ ID NO: 22]

og i hvilke:

AISRTGGSTYYARSVEG [SEQ ID NO: 31]

AISRTGGSTYYPDSVEG [SEQ ID NO: 32]

og i hvilke:

AGVRAEDGRVRTLPSEYNF [SEQ ID NO: 41]

AGVRAEDGRVRTLPSEYTF [SEQ ID NO: 42]

AGVRAEDGRVRSLPSEYTF [SEQ ID NO: 43]

Foretrukket, i Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse ifølge det siste aspekt:

- når CDR1 er: YNPMG; så er CDR2: AISRTGGSTYYARSVEG; og CDR3 :

AGVRAEDGRVRTLPSEYNF

- Når CDR1 er: YNPMG;CDR2:AISRTGGSTYYPDSVEG; og CDR3:

AGVRAEDGRVRTLPSEYTF

- når CDR1 er: YNPMG; så er CDR2 : AISRTGGSTYYPDSVEG; og CDR3 : AGVRAEDGRVRSLPSEYTF

Spesielt, ifølge et foretrukket, men ikke-begrensende aspekt av aspektet ifølge foreliggende beskrivelse, kan et Nanobody generelt bli definert som et polypeptid omfattende en aminosyresekvens som er omfattet av fire rammeverkregioner/sekvenser avbrutt av tre komplementaritetsbestemmende regioner/sekvenser, i hvilke;

a-1) aminosyreresten i posisjon 44 ifølge Kabat nummereringen er valgt blant gruppen bestående av G, E, D, G, Q, R, S, L; og fortrinnsvis er valgt blant gruppen bestående av G, E eller Q; og

a-2) aminosyreresten i posisjon 45 ifølge Kabat nummereringen er valgt blant gruppen bestående av L, R <eller >C; og fortrinnsvis er valgt blant gruppen bestående av L eller R; og

a-3) aminosyreresten i posisjon 103 ifølge Kabat nummereringen er valgt blant gruppen bestående av W, R eller S; og fortrinnsvis er W eller R, og er mest foretrukket W;

a-4) aminosyreresten i posisjon 108 ifølge Kabat nummereringen er Q; eller i hvilket:

b-1) aminosyreresten i posisjon 44 ifølge Kabat nummereringen er valgt blant gruppen bestående av E og Q; og

b-2) aminosyreresten i posisjon 45 ifølge Kabat nummereringen er R; og b-3) aminosyreresten i posisjon 103 ifølge Kabat nummereringen er valgt blant gruppen bestående av W, R og S; og fortrinnsvis er W;

b-4) aminosyreresten i posisjon 108 ifølge Kabat nummereringen er valgt blant gruppen bestående av Q og L; og fortrinnsvis er Q;

eller i hvilket:

c-1) aminosyreresten i posisjon 44 ifølge Kabat nummereringen er valgt blant gruppen bestående av G, E, D, Q, R, S og L; og fortrinnsvis er valgt blant gruppen bestående av G, E og Q; og

c-2) aminosyreresten i posisjon 45 ifølge Kabat nummereringen er valgt blant gruppen bestående av L, R <og >C; og fortrinnsvis er valgt blant gruppen bestående av L og R; og

c-3) aminosyreresten i posisjon 103 ifølge Kabat nummereringen er valgt blant gruppen bestående av P, R og S; og er spesielt valgt blant gruppen bestående av R og S; og

c-4) aminosyreresten i posisjon 108 ifølge Kabat nummereringen er valgt blant gruppen bestående av Q og L; fortrinnsvis er Q.

Således, ifølge et annet foretrukket, men ikke-begrensende aspekt, kan et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse ha strukturen

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

i hvilken FR1 til FR4 refererer til rammeverkregioner 1 til 4, henholdsvis, og i hvilke CDR1 til CDR3 refererer til de komplementaritetsbestemmende regioner 1 til 3, henholdsvis, og i hvilke:

i) aminosyreresten i posisjon 44 ifølge Kabat nummereringen er valgt blant gruppen bestående av G, E, D, G, Q, R, S, L; og fortrinnsvis er valgt blant gruppen bestående av G, E eller Q;

og i hvilke:

ii) aminosyreresten i posisjon 45 ifølge Kabat nummereringen er valgt blant gruppen bestående av L, R eller C; og fortrinnsvis er valgt blant gruppen bestående av L eller R;

og i hvilke:

iii) aminosyreresten i posisjon 103 ifølge Kabat nummereringen er valgt blant gruppen bestående av W, R eller S; og fortrinnsvis er W eller R, og er mest foretrukket W;

og i hvilke

iv) aminosyreresten i posisjon 108 ifølge Kabat nummereringen er Q;

og i hvilke:

v) CDR1, CDR2 og CDR3 er som definert heri, og fortrinnsvis er som definert ifølge en av foretrukne definisjoner ovenfor, og er fortrinnsvis er som definert ifølge et av de mer foretrukket definisjoner ovenfor.

Ifølge et annet foretrukket, men ikke-begrensende aspekt, kan et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse ha strukturen

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

i) aminosyreresten i posisjon 44 ifølge Kabat nummereringen er valgt blant gruppen bestående av E og Q;

og i hvilke:

ii) aminosyreresten i posisjon 45 ifølge Kabat nummereringen er R;

og i hvilke:

iii) aminosyreresten i posisjon 103 ifølge Kabat nummereringen er valgt blant gruppen bestående av W, R og S; og fortrinnsvis er W;

og i hvilke:

iv) aminosyreresten i posisjon 108 ifølge Kabat nummereringen er Q; og i hvilke:

vi) CDR1, CDR2 og CDR3 er som definert heri, og fortrinnsvis er som definert ifølge en av foretrukket definisjonene ovenfor, og er fortrinnsvis er som definert ifølge et av de mer foretrukne definisjonene ovenfor.

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

i hvilken FR1 til FR4 refererer til rammeverkregioner 1 to 4, henholdsvis, og i hvilke CDR1 til CDR3 refererer til de komplementaritetsbestemmende regioner 1 til 3, henholdsvis, og i hvilke:

i) aminosyreresten i posisjon 44 ifølge Kabat nummereringen er valgt blant gruppen bestående av G, E, D, Q, R, S og L; og fortrinnsvis er valgt blant gruppen bestående av G, E og Q;

og i hvilke:

ii) aminosyreresten i posisjon 45 ifølge Kabat nummereringen er valgt blant gruppen bestående av L, R og C; og fortrinnsvis er valgt blant gruppen bestående av L og R;

og i hvilke:

iii) aminosyreresten i posisjon 103 ifølge Kabat nummereringen er valgt blant gruppen bestående av P, R og S; og er spesielt valgt blant gruppen bestående av R og S;

og i hvilken:

iv) aminosyreresten i posisjon 108 ifølge Kabat nummereringen er valgt blant gruppen bestående av Q og L; fortrinnsvis er Q;

og i hvilke:

v) CDR1, CDR2 og CDR3 er som definert heri, og fortrinnsvis er som definert ifølge en av foretrukket definisjonene ovenfor, og er fortrinnsvis som definert ifølge et av de mer foretrukne definisjonene ovenfor.

To spesielt foretrukne, men ikke-begrensende grupper Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse er de ifølge a) ovenfor; ifølge a-1) til a-4) ovenfor; ifølge b) ovenfor; ifølge b-1) til b-4) ovenfor; ifølge c) ovenfor; og/eller ifølge c-1) til c-4) ovenfor, i hvilke;

a) aminosyrerestener i posisjoner 44-47 ifølge Kabat nummereringen danner sekvensen GLEW (eller en GLEW-liknende sekvens som definert heri) og aminosyreresten i posisjon 108 er Q;

eller i hvilket:

b) aminosyrerestener i posisjoner 43-46 ifølge Kabat nummereringen danner sekvensen KERE eller KQRE (eller en KERE-liknende sekvens) og aminosyreresten i posisjon 108 er Q eller L, og fortrinnsvis er Q.

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

i) aminosyrerestener i posisjoner 44-47 ifølge Kabat nummereringen danner sekvensen GLEW (eller en GLEW-liknende sekvens som definert heri) og aminosyreresten i posisjon 108 er Q;

og i hvilke:

ii) CDR1, CDR2 og CDR3 er som definert heri, og fortrinnsvis er som definert ifølge en av de foretrukne definisjonene ovenfor, og er fortrinnsvis er som definert ifølge en av de mer foretrukne definisjonene ovenfor. Ifølge et annet foretrukket, men ikke-begrensende aspekt, kan et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse ha strukturen

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

i hvilke FR1 til FR4 refererer til rammeverkregioner 1 til 4, henholdsvis, og i hvilke CDR1 til CDR3 refererer til de komplementaritetsbestemmende regioner 1 til 3, henholdsvis, og i hvilke:

i) aminosyrerestener i posisjoner 43-46 ifølge Kabat nummereringen danner sekvensen KERE eller KQRE (eller en KERE-liknende sekvens) og aminosyreresten i posisjon 108 er Q eller L, og fortrinnsvis er Q;

og i hvilke:

ii) CDR1, CDR2 og CDR3 er som definert heri, og fortrinnsvis er som definert ifølge en av de foretrukne definisjonene ovenfor, og er fortrinnsvis er som definert ifølge en av de mer foretrukne definisjonene ovenfor.

I Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse i hvilke aminosyrerestener i posisjoner 43-46 ifølge Kabat nummereringen danner sekvensen KERE eller KQRE, er aminosyreresten i posisjon 37 mest foretrukket F. I Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse i hvilke aminosyrerestener i posisjoner 44-47 ifølge Kabat nummereringen danner sekvensen GLEW, er aminosyreresten i posisjon 37 valgt blant gruppen bestående av Y, H, I, V eller F, og er mest foretrukket F.

Således, uten å være begrenset til dette på noen måte, på basis av aminosyrerestene som er til stede i posisjonene nevnt ovenfor, kan Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse generelt bli klassifisert å ̈ basis av de følgende tre grupper:

a) “GLEW-gruppen”: Nanobodies med aminosyresekvensen GLEW i posisjoner 44-47 ifølge Kabat nummereringen og Q i posisjon 108 ifølge Kabat nummereringen. Som videre beskrevet heri, har Nanobodies innen denne gruppen vanligvis en V i posisjon 37, og kan ha en W, P, R eller S i posisjon 103, og foretrukket ha en W i posisjon 103. GLEW gruppen omfatter også noen GLEW-liknende sekvenser slik som de nevnt i Tabell 2 nedenfor;

b) “KERE-gruppen”: Nanobodies med aminosyresekvensen KERE eller KQRE eller i posisjoner 43-46 ifølge Kabat nummereringen og Q eller L i posisjon 108 ifølge Kabat nummereringen. Som videre beskrevet heri, har Nanobodies innen denne gruppen vanligvis en F i posisjon 37, en L eller F i posisjon 47; og kan ha en W, P, R eller S i posisjon 103, og har foretrukket en W i posisjon 103;

c) “103 P, R, S-gruppen”: Nanobodies med en P R eller S i posisjon 103.

Disse Nanobodies kan ha enten aminosyresekvensen GLEW i posisjoner 44-47 av Kabat nummereringen eller aminosyresekvensen KERE eller KQRE i posisjoner 43-46 ifølge Kabat nummereringen, det siste mest foretrukket i kombinasjon med en F i posisjon 37 og en L eller en F i posisjon 47 (som definert for KERE-gruppen); og kan ha Q eller L i posisjon 108 ifølge Kabat nummereringen, og har foretrukket Q.

Således, ifølge et annet foretrukket, men ikke-begrensende aspekt, kan et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse være et Nanobody som hører til GLEW-gruppen (som definert heri), og i hvilke CDR1, CDR2 og CDR3 er som definert heri, og fortrinnsvis er som definert ifølge en av de foretrukne definisjonene ovenfor, og er fortrinnsvis er som definert ifølge en av de mer foretrukne definisjonene ovenfor.

Ifølge et annet foretrukket, men ikke-begrensende aspekt, kan et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse være et Nanobody som hører til KERE-gruppen (som definert heri), og i hvilke CDR1, CDR2 og CDR3 er som definert heri, og fortrinnsvis er som definert ifølge en av de foretrukne definisjonene ovenfor, og er fortrinnsvis er som definert ifølge en av de mer foretrukne definisjonene ovenfor.

Således, ifølge et annet foretrukket, men ikke-begrensende aspekt, kan et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse være et Nanobody som hører til 103 P, R, S-gruppen (som definert heri), og i hvilke CDR1, CDR2 og CDR3 er som definert heri, og fortrinnsvis er som definert ifølge en av foretrukket definisjonene ovenfor, og er fortrinnsvis som definert ifølge en av de mer foretrukne definisjonene ovenfor.

Også mer generelt og i tillegg til 108Q, 43E/44R og 103P,R,S restene nevnt ovenfor, kan Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse inneholde i en eller flere posisjoner som, i et konvensjonelt VH domene, ville danne (del av) VH/VL grenseflaten, inneholde en eller flere aminosyrerester som er mer sterkt ladet enn aminosyrerestener som naturlig opptrer ved den samme posisjonen(e) ide korresponderende naturlig forekommende VH eller VHH domenene, og spesielt en eller flere ladede aminosyrerester (som nevnt i Tabell 1).

Slike substitusjoner inkluderer, men er ikke begrenset til GLEW-liknende sekvenser nevnt i Tabell 2 nedenfor; så vel som substitusjonene som er beskrevet i den Internasjonal søknaden WO 00/29004 vedrørende såkalte “mikrobodies”, f.eks. en Q i posisjon 108 og KLEW i posisjoner 44-47.

I Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse, er aminosyreresten i posisjon 83 valgt blant gruppen bestående av L, M, S, V og W; og fortrinnsvis er L.

Også, i Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse, er aminosyreresten i posisjon 83 valgt blant gruppen bestående av R, K, N, E, I og Q; og er mest foretrukket enten K eller E (for Nanobodies korresponderende til naturlig forekommende VHH domener) eller R (for “humanisert” Nanobodies, som beskrevet nedenfor). Aminosyreresten i posisjon 84 er valgt blant gruppen bestående av P, A, R, S, D og V, og er mest foretrukket P (for Nanobodies korresponderende til naturlig forekommende VHH domener) eller R (for “humanisert” Nanobodies, som beskrevet nedenfor).

Videre, i Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse, er aminosyreresten i posisjon 104 valgt blant gruppen bestående av G og D; og er mest foretrukket G.

Kollektivt vil aminosyrerestene i posisjoner 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 og 108, som i Nanobodies er som nevnt ovenfor, også bli referert til heri som “Hallmark Rester”. Hallmark Restene og aminosyrerestene ved de korresponderende posisjoner til det nærmest relaterte humane VH domenet, VH3, er oppsummert i Tabell 2.

Noen spesielt foretrukket kombinasjonene av disse Hallmark Rester som opptrer i naturlig forekommende VHH domener er nevnt i Tabell 3. For sammenligning, har de korresponderende aminosyrerestene av det humane VH3 kalt DP-47 blitt indikert i kursiv.

Tabell 2: Hallmark rester i Nanobodies

Merknader:

(1): Spesielt, men ikke eksklusivt, i kombinasjon med KERE eller KQRE i posisjoner 43-46.

(2): Vanligvis som GLEW i posisjoner 44-47.

(3): Vanligvis som KERE eller KQRE i posisjoner 43-46, for eksempel som KEREL, KEREF, KQREL, KQREF eller KEREG i posisjoner 43-47. Alternativt, også sekvenser slik som TERE (for eksempel TEREL), KECE (for eksempel KECEL eller KECER), RERE (for eksempel REREG), QERE (for eksempel QEREG), KGRE (for eksempel KGREG), KDRE (for eksempel KDREV) er mulige. Noen andre mulige, men mindre foretrukne sekvenser inkluderer for eksempel DECKL og NVCEL.

(4): Med både GLEW i posisjoner 44-47 og KERE eller KQRE i posisjoner 43-46. (5): Ofte som KP eller EP i posisjoner 83-84 av naturlig forekommende VHH domener. (6): Spesielt, men ikke eksklusivt, i kombinasjon med GLEW i posisjoner 44-47. (7): Under den forutsetning at når posisjoner 44-47 er GLEW, er posisjon 108 alltid Q.

(8): GLEW gruppen inneholder også GLEW-liknende sekvenser i posisjoner 44-47, slik som for eksempel GVEW, EPEW, GLER, DQEW, DLEW, GIEW, ELEW, GPEW, EWLP, GPER, GLER og ELEW.

.

ies

do

b

no

a

N

e

nd

e

m

o

rek

fo

l<i>g

atur

.

in

r lsen

te e

res

skriv

rk e

a

til b

llm t

a

H de v s a e

is e

n , v ne ne jo ne as o in asj b in m b o m

k

e ko

n se

s

<u>k

di retr

va fo g en rin o e

N is

: n

3 a

m

ell

hu b

a or

T F

I Nanobodies, kan hver aminosyrerest ved en hvilken som helst av de andre posisjon enn Hallmark Restene være en hvilken som helst aminosyrerest som naturlig opptrer i den korresponderende posisjon (ifølge Kabat nummereringen) i et naturlig forekommende VHH domene.

Slike aminosyrerester vil være klare for fagmannen. Tabeller 4 - 7 nevner noen ikke-begrensende rester som kan være til stede i hver posisjon (ifølge Kabat nummereringen) av FR1, FR2, FR3 og FR4 i naturlig forekommende VHH domener. For hver posisjon, er aminosyrerestene som mest hyppig opptrer i hver posisjon i et naturlig forekommende VHH domene (og som er de mest foretrukne aminosyrerest for nevnte posisjon i et Nanobody) indikert som uthevet; og andre foretrukne aminosyrerester for hver posisjon har blitt understreket (note: antallet av aminosyrerester som blir funnet i posisjoner 26-30 i naturlig forekommende VHH domener støtter hypotesen som ligger til grunn for nummereringen Chothia (ovenfor) ved at restene i disse posisjoner allerede danner en del av CDR1.)

I Tabeller 4 - 7, har noen av de ikke-begrensende rester som kan bli være til stede i hver posisjon i et humant VH3 domene også blitt nevnt. Igjen, for hver posisjon er aminosyreresten som mest hyppig opptrer i hver posisjon i et naturlig forekommende humant VH3 domene indikert som uthevet; og andre foretrukne aminosyrerester har blitt understreket.

Tabell 4: Ikke-begrensende eksempler på aminosyrerester i FR1 (for fotnotene, se fotnotene til Tabell 2)

Tabell 4: Ikke-begrensende eksempler på aminosyrerester i FR1 (fortsatt)

Tabell 5: Ikke-begrensende eksempler på aminosyrerester i FR2 (for fotnotene se fotnotene til Tabell 2)

Tabell 6: Ikke-begrensende eksempler på aminosyrerester i FR3 (for fotnoter, se fotnotene til Tabell 2)

Tabell 6: Ikke-begrensende eksempler på aminosyrerester i FR3 (fortsatt)

Tabell 7: Ikke-begrensende eksempler på aminosyrerester i FR4 (for fotnotene se fotnotene til Tabell 2)

Således, ifølge et annet foretrukket, men ikke begrensende aspekt, kan et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse ha strukturen

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

i) Hallmark restene er som definert heri;

og i hvilken:

ii) CDR1, CDR2 og CDR3 er som definert heri, og fortrinnsvis er som definert ifølge en av foretrukket definisjonene ovenfor, og er fortrinnsvis er som definert ifølge en av de mer foretrukne definisjonene ovenfor. Ifølge et annet foretrukket, men ikke begrensende aspekt, kan et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse ha strukturen

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

i) FR1 er valgt blant gruppen bestående av aminosyresekvensen:

[1] QVQLQESGGGXVQAGGSLRLSCAASG [26] [SEQ ID NO: 1]

eller fra gruppen bestående av aminosyresekvenser som har minst 80%, foretrukket minst 90%, fortrinnsvis er minst 95%, enda mer foretrukket er minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med de ovenfornevnte aminosyresekvens; i hvilke

(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon i en hvilken som helst posisjon bortsett fra en Hallmark posisjon fortrinnsvis er enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 4; og/eller

(2) nevnte aminosyresekvens foretrukket inneholder kun aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller -innsettinger, sammenlignet med den ovenfornevnte aminosyresekvensen(e);

og i hvilken:

ii) FR2 er valgt blant gruppen bestående av aminosyresekvensen:

[36] WXRQAPGKXXEXVA [49] [SEQ ID NO: 2]

eller fra gruppen bestående av aminosyresekvenser som har minst 80%, foretrukket minst 90%, fortrinnsvis minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med de ovenfornevnte aminosyresekvens; i hvilke

(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon i en hvilken som helst posisjon bortsett fra en Hallmark posisjon fortrinnsvis er enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 5; og/eller

(2) nevnte aminosyresekvens foretrukket inneholder kun aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller -innsettinger, sammenlignet med den ovenfornevnte

aminosyresekvensen(e);

og i hvilken:

iii) FR3 er valgt blant gruppen bestående av aminosyresekvensen:

[66] RFTISRDNAKNTVYLQMNSLXXEDTAVYYCAA [94] [SEQ ID NO: 3]

(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon i en hvilken som helst posisjon bortsett fra en Hallmark posisjon fortrinnsvis er enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 6; og/eller

og i hvilken:

iv) FR4 er valgt blant gruppen bestående av aminosyresekvensen:

[103] XXQGTXVTVSS [113] [SEQ ID NO: 4]

og i hvilken:

v) CDR1, CDR2 og CDR3 er som definert heri, og fortrinnsvis er som definert ifølge en av foretrukket definisjonene ovenfor, og er fortrinnsvis som definert ifølge en av de mer foretrukne definisjonene ovenfor;

i hvilke Hallmark restene er indikert med “X” og er som definert ovenfor og i hvilke tallene mellom parenteser refererer til aminosyreposisjonene ifølge Kabat nummereringen.

Ifølge et annet foretrukket, men ikke begrensende aspekt, kan et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse ha strukturen

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

i) FR1 er valgt blant gruppen bestående av aminosyresekvensen:

[1] QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG [26] [SEQ ID NO: 5]

(2) nevnte aminosyresekvens foretrukket inneholder kun aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller -innsettinger, sammenlignet med den ovenfornevnte aminosyresekvensen(e); og

(3) Hallmark resten i posisjonen er som indikert i sekvensen ovenfor; og/eller fra gruppen bestående av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller kun 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med en av de ovenfornevnte aminosyresekvenser, i hvilke:

(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon i en hvilken som helst posisjon bortsett fra en Hallmark posisjon fortrinnsvis er enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 4; og/eller (2) nevnte aminosyresekvens foretrukket inneholder kun aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller -innsettinger, sammenlignet med den ovenfornevnte aminosyresekvensen(e); og

(3) Hallmark resten i posisjonen er som indikert i sekvensen ovenfor; og i hvilken:

ii) FR2 er valgt blant gruppen bestående av aminosyresekvensene:

[36] WFRQAPGKERELVA [49] [SEQ ID NO: 6]

[36] WFRQAPGKEREFVA [49] [SEQ ID NO: 7]

[36] WFRQAPGKEREGA [49] [SEQ ID NO: 8]

[36] WFRQAPGKQRELVA [49] [SEQ ID NO: 9]

[36] WFRQAPGKQREFVA [49] [SEQ ID NO: 10]

[36] WYRQAPGKGLEWA [49] [SEQ ID NO: 11]

eller fra gruppen bestående av aminosyresekvenser som har minst 80%, foretrukket minst 90%, fortrinnsvis minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med en av de ovenfornevnte aminosyresekvenser; i hvilke

(2) nevnte aminosyresekvens foretrukket inneholder kun aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller -innsettinger, sammenlignet med den ovenfornevnte aminosyresekvensen(e); and

(3) Hallmark restene i posisjoner 37, 44, 45 og 47 er som indikert i hver av sekvensene ovenfor;

og/eller fra gruppen bestående av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller kun 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) fra en av de ovenfornevnte aminosyresekvenser, i hvilke:

og i hvilken:

iii) FR3 er valgt blant gruppen bestående av aminosyresekvensen:

[66] RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA [94] [SEQ ID NO: 12]

(3) Hallmark restene i posisjoner 83 og 84 er som indikert i hver av sekvensene ovenfor;

og i hvilken:

iv) FR4 er valgt blant gruppen bestående av aminosyresekvensene:

[103] WGQGTQVTVSS [113] [SEQ ID NO: 13]

[103] WGQGTLVTVSS [113] [SEQ ID NO: 14]

eller fra gruppen bestående av aminosyresekvenser som har minst 80%, foretrukket minst 90%, fortrinnsvis minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med en av de ovenfornevnte aminosyresekvens; i hvilke

(3) Hallmark restene i posisjoner 103, 104 og 108 er som indikert i hver av sekvensene ovenfor;

og i hvilken:

v) CDR1, CDR2 og CDR3 er som definert heri, og fortrinnsvis er som definert ifølge en av foretrukket definisjonene ovenfor, og er fortrinnsvis som definert ifølge en av de mer foretrukne definisjonene ovenfor.

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

og i hvilken

i) FR1 er valgt blant gruppen bestående av aminosyresekvensen:

[1] QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG [26] [SEQ ID NO: 5]

(3) Hallmark resten i posisjon er som indikert i sekvensen ovenfor; og i hvilken:

ii) FR2 er valgt blant gruppen bestående av aminosyresekvensene:

[36] WFRQAPGKERELVA [49] [SEQ ID NO: 6]

[36] WFRQAPGKEREFVA [49] [SEQ ID NO: 7]

[36] WFRQAPGKEREGA [49] [SEQ ID NO: 8]

[36] WFRQAPGKQRELVA [49] [SEQ ID NO: 9]

[36] WFRQAPGKQREFVA [49] [SEQ ID NO: 10]

og/eller fra gruppen bestående av aminosyresekvenser som har 2 eller kun 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) fra en av de ovenfornevnte aminosyresekvenser, i hvilke:

(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon i en hvilken som helst posisjon bortsett fra en Hallmark posisjon fortrinnsvis er enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 5; og/eller (2) nevnte aminosyresekvens foretrukket inneholder kun aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller -innsettinger, sammenlignet med den ovenfornevnte aminosyresekvensen(e); og

og i hvilken:

iii) FR3 er valgt blant gruppen bestående av aminosyresekvensen:

[66] RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA [94] [SEQ ID NO: 12]

og i hvilken:

iv) FR4 er valgt blant gruppen bestående av aminosyresekvensene:

[103] WGQGTQVTVSS [113] [SEQ ID NO: 13]

[103] WGQGTLVTVSS [113] [SEQ ID NO: 14]

(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon i en hvilken som helst posisjon bortsett fra en Hallmark posisjon fortrinnsvis er enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 7; og/eller

og i hvilken:

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

i) FR1 er valgt blant gruppen bestående av aminosyresekvensen:

[1] QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG [26] [SEQ ID NO: 5]

ii) FR2 er valgt blant gruppen bestående av aminosyresekvensen:

[36] WYRQAPGKGLEWA [49] [SEQ ID NO: 11]

og i hvilken:

iii) FR3 er valgt blant gruppen bestående av aminosyresekvensen:

[66] RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA [94] [SEQ ID NO: 12]

(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon i en hvilken som helst posisjon bortsett fra en Hallmark posisjon fortrinnsvis er enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 6; og/eller (2) nevnte aminosyresekvens foretrukket inneholder kun aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller -innsettinger, sammenlignet med den ovenfornevnte aminosyresekvensen(e); og

og i hvilken:

iv) FR4 er valgt blant gruppen bestående av aminosyresekvensen:

[103] WGQGTQVTVSS [113] [SEQ ID NO: 13]

og i hvilken:

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

og i hvilken

i) FR1 er valgt blant gruppen bestående av de FR1 sekvensene som er til stede i Nanobodies av SEQ ID NO’s 60 til 73 og SEQ ID NO’s 86 til 97, og spesielt i de humanisert Nanobodies med SEQ ID NO’s 86 til 97, eller fra gruppen bestående av aminosyresekvenser som har minst 80%, foretrukket minst 90%, fortrinnsvis minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med en av nevnte FR1 sekvenser; i hvilke

(2) nevnte aminosyresekvens foretrukket inneholder kun aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller -innsettinger, sammenlignet med nevnte FR1 sekvens; og (3) Hallmark resten i posisjon er som indikert i nevnte FR1 sekvens; og/eller fra gruppen bestående av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller kun 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) fra en av nevnte FR1 sekvenser, i hvilke:

(2) nevnte aminosyresekvens foretrukket inneholder kun aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller -innsettinger, sammenlignet med nevnte FR1 sekvens; og (3) Hallmark resten i posisjon er som indikert i nevnte FR1 sekvens; og i hvilken:

ii) FR2 er valgt blant gruppen bestående av de FR2 sekvensene som er til stede i Nanobodies med SEQ ID NO’s 60 til 73 og SEQ ID NO’s 86 til 97, og spesielt in de humaniserte Nanobodies med SEQ ID NO’s 86 til 97, eller fra gruppen bestående av aminosyresekvenser som har minst 80%, foretrukket minst 90%, fortrinnsvis minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med en av nevnte FR2 sekvenser; i hvilke

(2) nevnte aminosyresekvens foretrukket inneholder kun aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller -innsettinger, sammenlignet med nevnte FR2 sekvens; og (3) Hallmark restene i posisjoner 37, 44, 45 og 47 er som indikert i nevnte FR2 sekvens;

og/eller fra gruppen bestående av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller kun 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med en av nevnte FR2 sekvenser, i hvilke:

(2) nevnte aminosyresekvens foretrukket inneholder kun aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller -innsettinger, sammenlignet med nevnte FR2 sekvens; and (3) Hallmark restene i posisjoner 37, 44, 45 og 47 er som indikert i nevnte FR2 sekvens;

og i hvilken:

iii) FR3 er valgt blant gruppen bestående av de FR3 sekvensene som er til stede i Nanobodies med SEQ ID NO’s 60 til 73 og SEQ ID NO’s 86 til 97, og spesielt i de humaniserte Nanobodies med SEQ ID NO’s 86-97, eller fra gruppen bestående av aminosyresekvenser som har minst 80%, foretrukket minst 90%, fortrinnsvis er minst 95%, enda mer foretrukket er minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med en av nevnte FR3 sekvenser; i hvilke

(2) nevnte aminosyresekvens foretrukket inneholder kun aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller -innsettinger, sammenlignet med nevnte FR3 sekvens; og (3) Hallmark restene i posisjoner 83 og 84 er som indikert i nevnte FR3 sekvens;

og/eller fra gruppen bestående av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller kun 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med en av nevnte FR3 sekvenser, i hvilke:

og i hvilken:

iv) FR4 er valgt blant gruppen bestående av de FR4 sekvensene som er til stede i Nanobodies med SEQ ID NO’s 60 til 73 og SEQ ID NO’s 86 til 97, og spesielt i de humaniserte Nanobodies med SEQ ID NO’s 86 til 97, eller fra gruppen bestående av aminosyresekvenser som har minst 80%, foretrukket minst 90%, fortrinnsvis minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med en av nevnte FR4 sekvenser; i hvilke

(2) nevnte aminosyresekvens foretrukket inneholder kun aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller -innsettinger, sammenlignet med nevnte FR4 sekvens; og (3) Hallmark restene i posisjoner 103, 104 og 108 er som indikert i nevnte FR3 sekvens;

og/eller fra gruppen bestående av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller kun 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med en av nevnte FR4 sekvenser, i hvilke:

(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon i en hvilken som helst posisjon bortsett fra en Hallmark posisjon fortrinnsvis er enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 6; og/eller (2) nevnte aminosyresekvens foretrukket inneholder kun aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller -innsettinger, sammenlignet med nevnte FR4 sekvens; og (3) Hallmark restene i posisjoner 103, 104 og 108 er som indikert i nevnte FR4 sekvens;

og i hvilken:

Noen spesielt foretrukne Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse kan bli valgt blant gruppen bestående av aminosyresekvensene i SEQ ID NO’s 60 til 73 og SEQ ID NO’s 86 til 97, og spesielt i de humanisert Nanobodies med SEQ ID NO’s 86 til 97 eller fra gruppen bestående av aminosyresekvenser som har minst 80%, foretrukket minst 90%, fortrinnsvis minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med en av aminosyresekvensene of SEQ ID NO’s 60 til 73 og SEQ ID NO’s 86 til 97 (og foretrukket med SEQ ID NO’s 86 til 97); i hvilke

(1) Hallmark restene kan være som indikert i Tabell 2 ovenfor;

(2) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon i en hvilken som helst posisjon bortsett fra en Hallmark posisjon fortrinnsvis er enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabeller 4-7; og/eller

(3) nevnte aminosyresekvens foretrukket inneholder kun aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller -innsettinger, sammenlignet med den ovenfornevnte aminosyresekvensen(e).

Noen enda mer spesielt foretrukne Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse kan bli valgt blant gruppen bestående av aminosyresekvensene med SEQ ID NO’s 60 til 73 og SEQ ID NO’s 86 til 97, og spesielt i de humaniserte Nanobodies med SEQ ID NO’s 86 til 97 eller fra gruppen bestående av aminosyresekvenser som har minst 80%, foretrukket minst 90%, fortrinnsvis minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med en av aminosyresekvensene med SEQ ID NO’s 60 til 73 og SEQ ID NO’s 86 til 97 (og foretrukket med SEQ ID NO’s 86 til 97); i hvilke (1) Hallmark restene er som indikert i den pertinente sekvens valgt blant SEQ ID NO’s 60 til 73 og SEQ ID NO’s 86 til 97 (og foretrukket fra SEQ ID NO’s 86 til 97);

(3) nevnte aminosyresekvens foretrukket inneholder kun aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller -innsettinger, sammenlignet med den pertinent sekvens valgt blant SEQ ID NO’s 60 til 73 og SEQ ID NO’s 86 til 97 (og foretrukket fra SEQ ID NO’s 86 til 97).

Noen av de mest foretrukne Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse kan be valgt blant gruppen bestående av aminosyresekvensene av SEQ ID NO’s 60 til 73 og SEQ ID NO’s 86 til 97 , og spesielt fra de humaniserte Nanobodies i SEQ ID NO’s 86 til 97.

Som det vil være klart fra det ovenfornevnte, omfatter termen Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse som benyttet heri i sin videste forstand, også naturlige eller syntetiske mutanter, varianter, alleler, analoger og ortologer (nedenfor samlet referert til som “analoger”) av Nanobodies nevnt i SEQ ID NO’s 60 til 73 og SEQ ID NO’s 86 til 97.

Generelt, kan slike analoger for eksempel omfatte homologe sekvenser, funksjonelle deler, eller en funksjonell del av en homolog sekvens (som videre definert nedenfor) av et Nanobody. Generelt, i slike analoger, kan hver aminosyrerest (bortsett fra Hallmark Resten) i hver av rammeverkregionene bli erstattet av en hvilken som helst andre aminosyrerester, forutsatt at den totale graden av sekvensidentitet av rammeverkregionene forblir som definert heri. Foretrukket, imidlertid, i slike analoger:

- Er en eller aminosyrerester i de ovenfornevnte rammeverksekvenser er erstattet av en eller flere aminosyrerester som naturlig opptrer ved den samme posisjon i et naturlig forekommende VHH domene. Noen eksempler på slike substitusjoner er nevnt i Tabeller 4-7 ovenfor; og/eller:

- Er en eller aminosyrerester i de ovenfornevnte rammeverksekvenser erstattet av en eller flere aminosyrerester som kan bli ansett som en “konservativ” aminosyresubstitusjon, som beskrevet ovenfor; og/eller:

- Er en eller aminosyrerester i de ovenfornevnte rammeverksekvenser erstattet av en eller flere aminosyrerester som naturlig opptrer ved den samme posisjon i et naturlig forekommende VH domene til et menneske. Dette er generelt referert til som “humanisering” av det naturlig forekommende VHH/Nanobody generelt og av nevnte posisjon spesielt, og vil bli diskutert i større detalj nedenfor;

og:

- posisjoner for hvilke kun en aminosyrerest er nevnt for både VH domenet og VHH domene i Tabeller 4 – 7 ovenfor fortrinnsvis ikke er erstattet. Også, selv om det generelt er mindre foretrukket, i slike analoger, kan en eller flere aminosyrerester bli deletert fra rammeverkregionene og/eller innsatt i rammeverkregionene (eventuelt i tillegg til en eller flere aminosyresubstitusjoner som nevnt ovenfor), forutsatt at den totale graden av sekvensidentitet til rammeverkregionene forblir som definert heri. Hallmark restene skal ikke være deletert. Også, mest foretrukket, aminosyrerester for hvilke kun en aminosyrerest er nevnt for både VH domenet og VHH domene i Tabeller 4 – 7 ovenfor er fortrinnsvis ikke deletert.

Foretrukket, skal slike analoger være slik at de fremdeles kan binde til, ha affinitet for og/eller ha spesifisitet for vWF, dvs. med en affinitet og/eller en spesifisitet som er minst 10%, foretrukket minst 50%, fortrinnsvis er minst 70%, enda mer foretrukket er minst 80%, slik som minst 90%, minst 95%, minst 99% eller mer, av affiniteten og/eller spesifisiteten til minst ett av Nanobodies med SEQ ID No’s 60 til 73 og SEQ ID NO’s 86 til 97, som bestemt ved bruk av en passende analyse, for eksempel en analyse for å bestemme bindingen av analogen til vWF, og spesielt en av analysene som benyttet i eksemplene nedenfor.

Generelt, kan slike analoger for eksempel bli fremskaffet ved fremskaffelse av en nukleinsyre som koder for et naturlig forekommende VHH domene, endringer av kodonene for den ene eller flere aminosyrerester som skal bli humanisert til kodonene for de korresponderende humane aminosyreresten(e), som uttrykker nukleinsyre-/nukleotidsekvensen således fremstilt i en passende vert eller ekspresjonssystem; og eventuelt isolering og/eller rensing av analogen således fremstilt for å fremskaffe nevnte analog i hovedsakelig isolert form (som definert ovenfor). Dette kan generelt bli utført ved bruk av fremgangsmåter og teknikker som er kjent per se, som vil være klart for fagmannen, for eksempel fra håndbøker og referanser sitert heri og/eller fra den videre beskrivelse nedenfor. Alternativt, og for eksempel, kan en nukleinsyre som koder for en analog bli syntetisert på en måte som er kjent per se (for eksempel ved bruk av et automatisert apparat syntetisering av nukleinsyresekvenser med en forhåndsbestemt aminosyresekvens) og kan bli uttrykt i en passende vert eller ekspresjonssystem, etter hvilket analogen således fremstilt kan eventuelt bli isolert og/eller renset for å fremskaffe nevnte analog i hovedsakelig isolert form (som definert ovenfor). En annen måte for å fremskaffe analogene involverer kjemisk syntese av den pertinente aminosyresekvens ved bruk av teknikker for peptidsyntese som er kjent per se, slik som de nevnt nedenfor.

Det vil også være generelt klart for fagmannen at Nanobodies (inkludert analoger derav) også kan bli fremstilt ved å starte fra humane VH sekvenser (dvs. aminosyresekvenser eller de korresponderende nukleotidsekvensene), slik som for eksempel humane VH3 sekvenser slik som DP-47, DP-51 eller DP-29, ved endring av en eller flere aminosyrerester i aminosyresekvensen av nevnte humane VH domene, for således å fremskaffe en aminosyresekvens som har (a) en Q i posisjon 108; og/eller (b) E i posisjon 44 og/eller R i posisjon 45, og foretrukket E i posisjon 44 og R i posisjon 45; og/eller (c) P, R eller S i posisjon 103, som beskrevet ovenfor. Igjen kan dette generelt bli utført ved bruk av de forskjellige fremgangsmåter og teknikker som er referert til i de tidligere avsnitt, ved bruk av en aminosyresekvens og/eller nukleotidsekvens for et humant VH domene som et startpunkt.

Termen Nanobodies som benyttet heri omfatter i sin videste forstand også deler eller fragmenter av Nanobodies (inkludert analoger) ifølge foreliggende beskrivelse som definert heri, som igjen kan være som videre beskrevet nedenfor.

Generelt, har deler eller fragmenter av Nanobodies og/eller analoger aminosyresekvenser i hvilke, sammenlignet med aminosyresekvensen til det korresponderende fullengde Nanobody eller analog, har en eller flere av aminosyrerestene ved den N-terminale enden, en eller flere aminosyrerester ved den C-terminale enden, en eller flere sammenhengende interne aminosyrerester, eller en hvilken som helst kombinasjon derav, blitt deletert og/eller fjernet. Det er også mulig å kombinere en eller flere av slike deler eller fragmenter for å fremskaffe et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse.

Foretrukket, skal aminosyresekvensen til et Nanobody som omfatter en eller flere deler eller fragmenter av et fullengde Nanobody og/eller analog ha en grad av sekvensidentitet på minst 50%, foretrukket minst 60%, fortrinnsvis er minst 70%, slik som minst 80%, minst 90% eller minst 95%, med aminosyresekvensen til det korresponderende fullengde Nanobody.

Også, aminosyresekvensen til et Nanobody som omfatter en eller flere deler eller fragmenter av et fullengde Nanobody og/eller analog er fortrinnsvis slike som omfatter minst 10 kontinuerlige aminosyrerester, foretrukket minst 20 kontinuerlige aminosyrerester, fortrinnsvis minst 30 kontinuerlige aminosyrerester, slik som minst 40 kontinuerlige aminosyrerester, med aminosyresekvensen til det korresponderende fullengde Nanobody.

Generelt, vil slike deler eller fragmenter av Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse ha aminosyresekvenser i hvilke, sammenlignet med aminosyresekvensen til det korresponderende fullengde Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse, har en eller flere av aminosyrerestene ved den N-terminale enden, en eller flere aminosyrerester ved den C-terminale enden, en eller flere kontinuerlige interne aminosyrerester, eller en hvilken som helst kombinasjon derav, har blitt deletert og/eller fjernet. Det er også mulig å kombinere en eller flere slike deler eller fragmenter for å fremskaffe et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse.

Ifølge en foretrukket utførelsesform, omfatter et fragment som benyttet heri minst ett av CDR’ene som er til stede i et fullstørrelse Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse, foretrukket minst to av CDR’ene som er til stede i et full-størrelse Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse, fortrinnsvis minst CDR2 og CDR3 som er til stede i et fullstørrelse Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse, slik som for eksempel alle tre CDR’er som er til stede i et fullstørrelse Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse.

Ifølge en spesielt foretrukket, men ikke-begrensende utførelsesform, omfatter en slik del eller fragment omfatter minst FR3, CDR3 og FR4 av det korresponderende fullengde Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse, dvs. som for eksempel beskrevet i den Internasjonal søknad WO 03/050531 (Lasters et al.).

Foretrukket, skal slike deler eller fragmenter være slik at de fremdeles kan binde til, ha affinitet for og/eller ha spesifisitet for vWF, dvs. med en affinitet og/eller en spesifisitet som er minst 10%, foretrukket minst 50%, fortrinnsvis minst 70%, enda mer foretrukket minst 80%, slik som minst 90%, minst 95%, minst 99% eller mer, av affiniteten og/eller spesifisiteten til det korresponderende fullstørrelse Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse, for eksempel ved en analyse for bestemmelse av binding av analogen til vWF, og spesielt en av analysene benyttet i eksemplene nedenfor.

Fra beskrivelsen ovenfor, vil det være klart at aminosyresekvensene til Nanobodies benyttet heri skiller seg ved minst en aminosyreposisjon i minst en av rammeverkregionene fra aminosyresekvensene til naturlig forekommende VH domener, slik som aminosyresekvensene til naturlig forekommende VH domener av antistoff fra et menneske. Spesielt, vil det være klart at aminosyresekvensene til Nanobodies benyttet heri skiller seg ved minst en av Hallmark Restene fra aminosyresekvensene til naturlig forekommende VH domener, slik som aminosyresekvensene til naturlig forekommende VH domener fra antistoff fra Kamelidaer og/eller mennesker.

Således, ifølge en spesifikk utførelsesform, har et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse en aminosyresekvens som skiller seg ved minst en aminosyreposisjon i en av rammeverkregionene fra aminosyresekvensen til et naturlig forekommende VH domene. Ifølge en mer spesifikk, men ikkebegrensende utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse, har et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse en aminosyresekvens som skiller seg ved minst en av Hallmark restene fra aminosyresekvensen til et naturlig forekommende VH domene.

Fra beskrivelsen ovenfor, vil det også være klart at aminosyresekvensene til noen av Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse, slik som de humaniserte Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse, vil være forskjellig ved minst en aminosyreposisjon i minst en av rammeverkregionene (dvs. enten ved posisjonen til en Hallmark rest eller ved en annen posisjon) fra aminosyresekvensene til naturlig forekommende VHH domener. Således, ifølge en spesifikk, men ikke-begrensende utførelsesform, har et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse en aminosyresekvens som skiller seg fra ved minst en aminosyreposisjon i en av rammeverkregioner fra aminosyresekvensen til et naturlig forekommende VHH domene. Ifølge en mer spesifikk, men ikkebegrensende utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse, har et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse en aminosyresekvens som skiller seg fra ved minst en av Hallmark restene fra aminosyresekvensen til et naturlig forekommende VHH domene.

Som nevnt ovenfor, angår foreliggende beskrivelse også proteiner eller polypeptider omfattende minst ett VHH domene (dvs. som identifisert ved bruk av fremgangsmåtene ifølge foreliggende beskrivelse) eller minst ene nanobody basert på dette.

Ifølge en ikke-begrensende utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse, består et slikt polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse hovedsakelig av et Nanobody. Ved “består hovedsakelig av” er det ment at aminosyresekvensen av polypeptidet ifølge foreliggende beskrivelse enten er nøyaktig den samme som aminosyresekvensen til et Nanobody (som nevnt ovenfor) eller tilsvarer aminosyresekvensen til et Nanobody i hvilket et begrenset antall aminosyrerester, slik som 1-10 aminosyrerester og foretrukket 1-6 aminosyrerester, slik som 1, 2, 3, 4, 5 eller 6 aminosyrerester, har blitt lagt til i den aminoterminale enden, til den karboksyterminale enden, eller både til den aminoterminale enden og til den karboksyterminale enden av aminosyresekvensen til Nanobodiet.

Nevnte aminosyrerester kan, men trenger ikke forandre, endre eller på annen måte påvirke på de (biologiske) egenskapene til Nanobodiet og kan, men trenger ikke legge til ytterligere funksjonalitet til Nanobodiet. For eksempel, kan nevnte aminosyrerester:

a) danne et “merke”, dvs. en aminosyresekvens eller rest som tillater eller letter rensingen av Nanobodiet, for eksempel ved bruk av affinitetsteknikker rettet mot nevnte sekvens eller rest. Deretter, kan nevnte sekvens eller rest bli fjernet (f.eks. ved kjemisk eller biologisk spalting) for å fremskaffe nukleotidsekvensen ifølge foreliggende beskrivelse (for dette formål kan sekvensen eller resten eventuelt være bundet til aminosyresekvensen ifølge foreliggende beskrivelse via en spaltbar linkersekvens). Noen foretrukne, men ikke-begrensende eksempler på slike rester er multiple histidinrester og glutationrester, b) kan være en N-terminal Met rest, for eksempel som resultat av ekspresjon i en heterolog vertscelle eller vertsorganisme.

c) kan være en eller flere aminosyrerester som kan bli utstyrt med ufunksjonelle grupper og/eller som har blitt funksjonalisert, på en måte som er kjent per se. For eksempel, som kjent i teknikken, tillater aminosyrerester slik som lysin og spesielt cystein festing av PEG grupper, som kan maskere overflatesete på et protein og således for eksempel redusere immunogenisitet, forbedre halveringstid i plasma og stabilisere mot proteolytisk spalting;

d) øke halveringstid i serum av et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse. Aminosyresekvenser som kan bli festet til og/eller sammensmeltet med terapeutiske proteiner for å øke deres halveringstid in vivo er velkjent for fagmannen og inkluderer humane serumproteiner eller fragmenter derav (slik som humant serum albumin eller en del eller fragment derav), eller også Fc deler av antistoff (spesielt av humant antistoff). Også, som allerede beskrevet heri, kan en slik aminosyresekvens for øking av halveringstiden være en aminosyresekvens rettet mot et serumprotein, slik som et Nanobody rettet mot et serumprotein, for eksempel mot humant serum albumin. Med hensyn til pegylering, må det noteres at generelt, omfatter foreliggende beskrivelse også et hvilket som helst Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse og/eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse som har blitt pegylert ved en eller flere aminosyreposisjoner, foretrukket på en slik måte at nevnte pegylering enten (1) øker halveringstiden in vivo; (2) reduserer immunogenisitet; (3) gir en eller flere ytterligere foretrukne egenskaper som er kjent per se for pegylering; (4) påvirker hovedsakelig ikke affiniteten til Nanobodiet og/eller polypeptidet for vWF (f.eks. reduserer ikke nevnte affinitet med mer enn 90%, foretrukket ikke med mer enn 50 %, og fortrinnsvis ikke med mer enn 10%, som bestemt ved en passende analyse, slik som de beskrevet i eksemplene nedenfor); og/eller (4) ikke påvirker noen av de andre ønskede egenskaper til Nanobodies og/eller polypeptider ifølge foreliggende beskrivelse. Passende PEG-grupper og fremgangsmåter for festing av dem, enten spesifikt eller ikke-spesifikt, vil være klart for fagmannen. Passende sett og midler for slik pegylering kan for eksempel bli fremskaffet fra Nektar (CA, USA).

Ifølge en ikke-begrensende utførelsesform, kan en eller flere aminosyrerester bli lagt til, satt inn i og/eller substituert i aminosyresekvensen til et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse, for å fremskaffe en eller flere spesifikke aminosyrerester for festing av en PEG-gruppe.

Foreliggende beskrivelse omfatter også et hvilket som helst Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse og/eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse som har blitt glycosylert ved en eller flere aminosyre posisjoner, vanligvis avhengig av verten benyttet for å uttrykke Nanobodiet eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse (som videre beskrevet nedenfor).

Ifølge en ikke-begrensende utførelsesform, kan en eller flere aminosyrerester bli lagt til, satt inn og/eller substituert i aminosyresekvensen til et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse, for å fremskaffe en eller flere spesifikk aminosyrerester og/eller et sete som kan bli glycosylert av den benyttede verts organismen. Ved hjelp av et foretrukket, men ikkebegrensende eksempel, kan N-resten i posisjon 50 innen CDR2 til et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse for eksempel bli erstattet av en Q, D eller S rest for å fremskaffe et glycosyleringssete, f.eks. for glycosylering av Pichia.

Ifølge en annen utførelsesform, kan et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse omfatte en aminosyresekvensen til et Nanobody, sin er tilkoblet ved dets aminoterminale ende, ved dens karboksyterminale ende, eller både dets aminoterminale ende og ved dets karboksyterminale ende med minst en ytterligere aminosyresekvens.

Igjen kan nevnte ytterligere aminosyresekvens(er), men trenger ikke endre, forandre eller på annen måte påvirke de (biologiske) egenskaper til Nanobodiet og kan, men trenger ikke legge til ytterligere funksjonalitet til Nanobodiet.

For eksempel, ifølge en foretrukket, men ikke-begrensende utførelsesform, kan nevnte ytterlige aminosyresekvens omfatte minst et ytterligere Nanobody, for å fremskaffe et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse som omfatter minst to, slik som tre, fire eller fem, Nanobodies, i hvilke nevnte Nanobodies eventuelt kan være bundet via en eller flere linkersekvenser (som definert heri).

Polypeptider ifølge foreliggende beskrivelse omfattende to eller flere Nanobodies vil også bli referert til heri som “multivalente” polypeptider. For eksempel omfatter et “bivalent” polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse to Nanobodies, eventuelt linket via en linkersekvens, mens et “trivalent” polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse omfatter tre Nanobodies, eventuelt linket via to linkersekvenser; etc.

I et multivalent polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse, kan de to eller flere Nanobodies være de samme eller være forskjellige. For eksempel, kan de to eller flere Nanobodies i et multivalent polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse:

- være rettet mot det samme antigen, dvs. mot det samme del eller epitop av nevnte antigen eller mot to eller flere forskjellig deler eller epitoper av nevnte antigen; og/eller:

- være rettet mot forskjellige antigener;

eller en kombinasjon derav.

Således, kan et bivalent polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse for eksempel:

- omfatte to identiske Nanobodies;

- omfatte en første Nanobody rettet mot en første del eller epitop av et antigen og et andre Nanobody rettet mot den samme del eller epitop av nevnte antigen eller mot en annen del eller epitop av nevnte antigen; - eller omfatte et første Nanobody rettet mot et første antigen og et andre Nanobody rettet mot et andre antigen forskjellig fra nevnte første antigen; mens et trivalent Polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse for eksempel:

- kan omfatte tre identiske eller forskjellige Nanobodies rettet mot det samme eller forskjellig deler eller epitoper av det samme antigen;

- kan omfatte to identiske eller forskjellig Nanobodies rettet mot de samme eller forskjellig deler eller epitoper på et første antigen og et tredje Nanobody rettet mot et andre antigen forskjellig fra nevnte første antigen; eller

- kan omfatte et første Nanobody rettet mot et første antigen, et andre Nanobody rettet mot et andre antigen forskjellig fra nevnte første antigen, og et tredje Nanobody rettet mot et tredje antigen forskjellig fra nevnte første og andre antigen,

Polypeptider ifølge foreliggende beskrivelse som inneholder minst to Nanobodies, i hvilke minst ene nanobody er rettet mot et første antigen og minst ene nanobody er rettet mot et andre Nanobody forskjellig fra det første antigen, vil også bli referert til som “multispesifikke” Nanobodies. Således, er et “bispesifikt” Nanobody et Nanobody som omfatter minst et Nanobody rettet mot et første antigen og minst ett ytterligere Nanobody rettet mot et andre antigen, mens et “trispesifikt” Nanobody er et Nanobody som omfatter minst ene nanobody rettet mot et første antigen, minst ett ytterligere Nanobody rettet mot et andre antigen, og minst ett ytterligere Nanobody rettet mot et tredje antigen; etc.

Følgelig, i sin enkleste form, er et bispesifikt polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse et bivalent polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse (som definert heri), omfattende et første Nanobody rettet mot et første antigen og et andre Nanobody rettet mot et andre antigen, i hvilke nevnte første og andre Nanobody eventuelt kan være linket via en linkersekvens (som definert heri); mens et trispesifikt polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse i sin enkleste form er et trivalent polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse (som definert heri), omfattende et første Nanobody rettet mot et første antigen, et andre Nanobody rettet mot et andre antigen og et tredje Nanobody rettet mot et tredje antigen, i hvilke nevnte første, andre og tredje Nanobody eventuelt kan være linket via en eller flere, og spesielt en og mer spesielt to, linkersekvenser.

Imidlertid, som det vil være klart fra beskrivelsen ovenfor, er foreliggende beskrivelse ikke begrenset til dette, i så måte at et multispesifikt polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse kan omfatte et hvilket som helst antall Nanobodies rettet mot to eller flere forskjellig antigener.

For multivalente og multispesifikke polypeptider inneholdende en eller flere VHH domener og deres fremstilling, blir det også referert til Conrath et al., J. Biol. Chem., Vol.276, 10.7346-7350, så vel som EP 0822 985.

Linkere for anvendelse i multivalente og multispesifikke polypeptider vil være klart for fagmannen, og inkluderer for eksempel gly-ser linkere, for eksempel av typen (glyxsery)z, slik som (for eksempel (gly4ser)3 eller (gly3ser2)3, som beskrevet i WO 99/42077, hengsle-like regioner slik som hengsleregioner av naturlig forekommende tungkjede antistoff eller tilsvarende sekvenser. For andre passende linkere, blir det også referert til den generelle bakgrunnsteknikken sitert til ovenfor. Noen spesielt foretrukne linkere er gitt i SEQ ID NO’s 83 til 85, i hvilke linkerne i SEQ ID NO’s 84 og 85 er spesielt foretrukket.

Linkere kan også fremskaffe noe funksjonalitet for det multivalente eller multispesifikke polypeptidet. For eksempel, kan linkere inneholdende en eller flere ladede aminosyrerester (se Tabell 1 ovenfor) fremskaffe forbedrede hydrofile egenskaper, mens linkere som danner eller inneholder små epitoper eller merker kan bli benyttet for formålet ved deteksjon, identifikasjon og/eller rensing.

Som også videre beskrevet heri, kan et multispesifikt polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse rettet mot et ønsket antigen og mot minst ett serumprotein, slik som serumproteinene nevnt nedenfor, og spesielt mot humant serumalbumin, vise øket halveringstid i serum, sammenlignet med det korresponderende monovalente Nanobody.

Som nevnt ovenfor, er fremgangsmåtene beskrevet heri spesielt passende for generering av slike multivalente multispesifikke polypeptider ifølge foreliggende beskrivelse.

I et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse, kan det minst ene Nanobody også være linket til et konvensjonelt VH domene eller til en naturlig eller syntetiske analog av et VH domene, eventuelt via en linkersekvens.

I et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse, kan det minst ene Nanobody også være linket til et VL domene eller til en naturlig eller syntetiske analog av et VL domene, eventuelt via en linkersekvens, for således å fremskaffe et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse som er i form av analog til et konvensjonelt scFv fragment, men inneholdende et Nanobody i steden for et VH domene.

I et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse, kan det minst ene nanobody også være linket til en eller flere av et CH1, CH2 og/eller CH3 domene, eventuelt via en linkersekvens. For eksempel, kan et Nanobody linket til et passende CH1 domene for eksempel bli benyttet – sammen med passende lette kjeder - for å generere antistoff fragmenter/strukturer som er analoge til konvensjonelle Fab fragmenter eller F(ab’)2 fragmenter, men i hvilke en eller (for et F(ab’)2 fragment) begge av de konvensjonelle VH domener har blitt erstattet av et Nanobody. Slike fragmenter kan også være heterospesifikke eller bispesifikke, dvs. rettet mot to eller flere antigener. Et Nanobody linket til passende CH2 og CH3 domener, for eksempel avledet fra Kamelids, kan bli benyttet for å danne et monospesifikt eller bispesifikt tungkjede antistoff. Til sist, kan et Nanobody linket til passende CH1, CH2 og CH3 domener, for eksempel avledet fra et menneske, bli benyttet – sammen med passende lette kjeder -for å danne et antistoff som er analogt til et konvensjonelt 4-kjedet antistoff, men i hvilket en eller begge av de konvensjonelle VH domener har blitt erstattet av et Nanobody.

Også, i tillegg til det ene eller flere Nanobodies, kan Polypeptider ifølge foreliggende beskrivelse også inneholde funksjonelle grupper, deler eller rester, for eksempel terapeutisk aktive stoffer, slik som de nevnt nedenfor, og/eller markører eller merker, slik som fluorescente markører, isotoper, etc., som videre beskrevet nedenfor.

Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse, polypeptidene ifølge foreliggende beskrivelse, og nukleinsyrer som koder for det samme, kan bli fremstilt på en måte som er kjent per se, og vil være klart for fagmannen fra den videre beskrivelse heri. Noen foretrukne, men ikke-begrensende fremgangsmåter for fremstilling av Nanobodies, polypeptider og nukleinsyrer inkluderer fremgangsmåtene og teknikkene nevnt ovenfor og/eller videre beskrevet nedenfor .

Som det vil være klart for fagmannen, omfatter en spesielt nyttig fremgangsmåte for fremstilling av et Nanobody og/eller et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse generelt trinnene:

- ekspresjonen, i en passende vertscelle eller vertsorganismer (også referert til heri som en “vert ifølge foreliggende beskrivelse”) eller ifølge et annet passende ekspresjonssystem av en nukleinsyre som koder for nevnte Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse (også referert til heri som en “nukleinsyre ifølge foreliggende beskrivelse”), eventuelt fulgt av: - isolering og/eller rensing av Nanobodiet eller polypeptidet ifølge foreliggende beskrivelse således fremstilt.

Spesielt, kan en slik fremgangsmåte omfatte trinnet:

- dyrking og/eller opprettholdelse av en vert ifølge foreliggende beskrivelse under betingelser som er slik at nevnte vert ifølge foreliggende beskrivelse uttrykker og/eller produserer minst ett nanobody og/eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse; eventuelt fulgt av:

- isolering og/eller rensing av Nanobodiet eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse således fremstilt.

En nukleinsyre ifølge foreliggende beskrivelse kan være form av enkelteller dobbeltstrenget DNA eller RNA, og fortrinnsvis er i form av dobbeltstrenget DNA. For eksempel, kan nukleotidsekvensene ifølge foreliggende beskrivelse være genomisk DNA, cDNA eller syntetisk DNA (slik som DNA med en codonbruk som har blitt spesifikt tilpasset for ekspresjon i den tiltenkte vertscelle eller vertsorganisme).

Ifølge en utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse, er nukleinsyren ifølge foreliggende beskrivelse i hovedsakelig isolert from, som definert ovenfor.

Nukleinsyren ifølge foreliggende beskrivelse kan også være i form av, være til stede i og/eller være en del av en vektor, slik som for eksempel et plasmid, cosmid eller YAC, som igjen kan være i hovedsakelig isolert form.

Nukleinsyrene ifølge foreliggende beskrivelse kan bli fremstilt eller oppnådd på en måte som er kjent per se, basert på aminosyresekvensene for polypeptidene ifølge foreliggende beskrivelse gitt heri, og/eller være isolert fra en passende naturlig kilde. For å fremskaffe analoger, kan nukleotidsekvenser som koder for naturlig forekommende VHH domener for eksempel li utsatt for sete-rettet mutagenese, for å fremskaffe en nukleinsyre ifølge foreliggende beskrivelse som koder for nevnte analog. Det vil også være klart for fagmannen, at for å fremstille en nukleinsyre ifølge foreliggende beskrivelse, kan flere nukleotidsekvenser, slik som minst en nukleotidsekvens som koder for et Nanobody og for eksempel nukleinsyrer som koder for en eller flere linkere bli linket sammen på en passende måte.

Teknikker for generering av nukleinsyrene ifølge foreliggende beskrivelse vil være klart for fagmannen og kan for eksempel omfatte, men er ikke begrenset til, automisert DNA syntese; sete-rettet mutagenese; kombinering av to eller flere naturlig forekommende og/eller syntetiske sekvenser (eller to eller flere deler derav), introduksjon av mutasjoner som fører til ekspresjonen av et trunkert ekspresjonsprodukt; introduksjon av en eller flere restriksjonsseter (f.eks. for å skape og/eller regioner som enkelt kan bli kuttet og/eller ligert ved bruk av passende restriksjonsenzymer), og/eller introduksjonen av mutasjoner ved hjelp av en PCR reaksjon ved bruk av en eller flere “mismatched” primere, ved bruk av for eksempel en sekvens av et naturlig forekommende GPCR som en templat. Disse og andre teknikker vil være klare for fagmannen, og referanse blir igjen gjort til standardverker, slik som Sambrook et al. og Ausubel et al., nevnt ovenfor, så vel som eksemplene nedenfor.

Nukleinsyren ifølge foreliggende beskrivelse kan også være i form av, være til stede i og/eller være del av et genetisk konstrukt, som også vil være klart for fagmannen. Slike genetiske konstrukter omfatter generelt minst en nukleinsyre ifølge foreliggende beskrivelse som eventuelt er linket til en eller flere elementer av genetiske konstrukter som er kjent per se, slik som for eksempel et eller flere passende regulatoriske elementer (slik som en passende promoter(er), enhancer(e), terminator(er), etc.) og de videre elementer av genetiske konstrukter referert til nedenfor. Slike genetiske konstrukter omfattende minst en nukleinsyre ifølge foreliggende beskrivelse vil også bli referert til heri som “genetiske konstrukter ifølge foreliggende beskrivelse”. De genetiske konstruktene ifølge foreliggende beskrivelse kan være DNA eller RNA, og er fortrinnsvis dobbeltstrenget DNA. De genetiske konstruktene ifølge foreliggende beskrivelse kan også være i en form passende for transformering av den tiltenkte vertscelle eller vertsorganisme, i en form passende for integrasjon inn i det genomiske DNA i den tiltenkte vertscellen eller i en form passende for uavhengig replikasjon, opprettholdelse og/eller rving i den tiltenkte vertsorganisme. For eksempel kan de, genetiske konstruktene ifølge foreliggende beskrivelse være i form av en vektor, slik som for eksempel et plasmid, cosmid, YAC, en viral vektor eller transposon.

Spesielt, kan vektor være en ekspresjonsvektor, dvs. en vektor som kan fremskaffe ekspresjon in vitro og/eller in vivo (f.eks. i en passende vertscelle, vertsorganisme og/eller ekspresjonssystem).

I en foretrukket men ikke-begrensende utførelsesform, omfatter et genetisk konstrukt ifølge foreliggende beskrivelse

a) minst en nukleinsyre ifølge foreliggende beskrivelse; operativt forbundet til

b) en eller flere regulatoriske elementer, slik som en promoter og eventuelt en passende terminator;

c) og eventuelt også

d) en eller flere ytterligere elementer av genetiske konstrukter kjent per se; i hvilke termene “regulatorisk element”, “promoter”, “terminator” og “operativt forbundet” har sin i teknikken vanlige betydning (som videre beskrevet nedenfor); og i hvilke nevnte “ytterligere elementer” som er til stede i de genetiske konstruktene for eksempel kan være 3’- eller 5’-UTR sekvenser, leadersekvenser, seleksjonsmarkører, ekspresjonsmarkører/reportergener, og/eller elementer som kan lette eller øke (effektiviteten av) transformering eller integrasjon. Disse og andre passende elementer for genetiske konstrukter vil være klare for fagmannen, og kan for eksempel avhenge av typen benyttet konstrukt, den tilsiktede vertscelle eller vertsorganisme; måten på hvilken nukleotidsekvensene ifølge foreliggende beskrivelse av interesse skal bli uttrykt (f.eks. via konstitutiv, transient eller induserbar ekspresjon); og/eller transformeringsteknikker som blir benyttet.

Foretrukket, i de genetiske konstruktene ifølge foreliggende beskrivelse, er nevnte minst ene nukleinsyre ifølge foreliggende beskrivelse og nevnte regulatoriske elementer, og eventuelt nevnte en eller flere ytterligere elementer, “operativt linket” til hverandre, ved hvilket generelt er ment at de er i et funksjonelt forhold til hverandre. For eksempel, en promoter er ansett som “operativt linket” til en kodende sekvens dersom nevnte promoter er i stand til å initiere eller på annen måte kontrollere/regulere transkripsjonen og/eller ekspresjonen av en kodende sekvens (i hvilke nevnte kodende sekvens skal bli å forstå som “under kontroll av” nevnte promotor). Generelt, når to nukleotidsekvenser er operativt linket, vil de ha samme orientering og vanligvis også i den samme leserammen. De vil også vanligvis være hovedsakelig kontinuerlige, selv om dette ikke er nødvendig.

Foretrukket, er de regulatoriske og ytterligere elementer av de genetiske konstrukter ifølge foreliggende beskrivelse slik at de er i stand til å fremskaffe sin tilsiktede funksjon i den tilsiktede vertscelle eller vertsorganisme.

For eksempel, skal en promoter, enhancer eller terminator være “operabel” i den tilsiktede vertscelle eller vertsorganisme, med hvilket det er ment at (for eksempel) nevnte promoter skal være i stand til å initiere eller annerledes kontrollere/regulere transkripsjonen og/eller ekspresjonen av en nukleotidsekvens - f.eks. en kodende sekvens – til hvilken den er operativt linket (som definert heri).

Noen spesielt foretrukne promoterer inkluderer, men er ikke begrenset til, promoterer som er kjent per se for ekspresjon i bakterielle celler, slik som de nevnt nedenfor og/eller de benyttet i eksemplene.

En seleksjonsmarkør skal være slik at den tillater - dvs. under passende seleksjonsbetingelser – at vertsceller og/eller vertsorganismer som har blitt (suksessfullt) transformert med nukleotidsekvensen ifølge foreliggende beskrivelse å bli skilt fra vertsceller/organismer som ikke har blitt (suksessfullt) transformert. Noen foretrukne, men ikke-begrensende eksempler på slike markører er gener som gir resistens mot antibiotika (slik som kanamycin eller ampicillin), gener som gir temperaturresistens, eller gener som tillater vertscellen eller vertsorganismen å bli opprettholdt i fravær av visse faktorer, forbindelser eller (mat) komponenter mediet som er essensielt for overlevelse av ikke-transformerte celler eller organismer.

En leadersekvens skal være slik at den i tiltenkte vertscelle eller vertsorganisme- tillater de ønskede post-transasjonelle modifikasjoner og/eller slik at den retter det transkriberte mRNA til en ønsket del eller organelle av en celle. En leadersekvens kan også tillate sekresjon av ekspresjonsproduktet fra nevnte celle. Som sådan, kan leadersekvensen være en hvilken som helst pro-, pre-, eller prepro-sekvens som er operabel i vertscelle eller vertsorganisme. Leadersekvenser trenger ikke å være nødvendig for ekspresjon i en bakteriell celle.

En ekspresjonsmarkør eller reportergen skal være slik at det i den i vertscelle eller vertsorganismen- tillater deteksjon av ekspresjon av (en geneller nukleotidsekvens som er til stede, på) det genetiske konstrukt. En ekspresjonsmarkør kan eventuelt også tillate lokalisering av det uttrykte produkt, f.eks. i en spesifikk del eller organelle av en celle og/eller i (en) spesifikk celle(er), vev, organ(er) eller del(er) av en multicellulær organisme. Slike reportergener kan også bli uttrykt som proteinfusjon med aminosyresekvensen ifølge foreliggende beskrivelse. Noen foretrukne, men ikke-begrensende eksempler inkluderer fluorescente proteiner slik som GFP.

Noen foretrukne, men ikke-begrensende eksempler på passende promoterer, terminatorer og ytterligere elementer inkluderer de benyttet i eksemplene nedenfor. For noen (ytterligere ) ikke-begrensende eksempler på promoterer, seleksjonsmarkører, leadersekvenser, ekspresjonsmarkører og ytterligere elementer som kan være til stede /bli benyttet i de genetiske konstruktene ifølge foreliggende beskrivelse - slik som terminatorer, transkripsjonelle og/eller transasjonelle enhancere og/eller integrasjonsfaktorer - blir det referert til de generelle bøkene slik som Sambrook et al. og Ausubel et al. nevnt ovenfor, så vel som eksemplene som er gitt i WO 95/07463, WO 96/23810, WO 95/07463, WO 95/21191, WO 97/11094, WO 97/42320, WO 98/06737, WO 98/21355, US-A-6,207,410, US-A- 5,693,492 og EP 1085089. andre eksempler som vil være klare for fagmannen. Det blir også referert til den generelle bakgrunnsteknikk som er angitt ovenfor og de videre referanse sitert nedenfor.

De genetiske konstruktene ifølge foreliggende beskrivelse kan generelt bli fremskaffet ved passende linking av nukleotidsekvensen(e) ifølge foreliggende beskrivelse til det ene eller flere ytterligere elementer beskrevet ovenfor, for eksempel ved bruk av teknikkene beskrevet i de generelle verkene slik som Sambrook et al. og Ausubel et al., nevnt ovenfor.

Ofte, vil de genetiske konstruktene ifølge foreliggende beskrivelse bli fremskaffet ved innsetting av en nukleotidsekvens ifølge foreliggende beskrivelse i en passende (ekspresjon) vektor kjent per se. Noen foretrukne, men ikke-begrensende eksempler på passende ekspresjonsvektorer er de benyttet i eksemplene nedenfor, så vel som de nevnt nedenfor.

Nukleinsyrene ifølge foreliggende beskrivelse og/eller de genetiske konstruktene ifølge foreliggende beskrivelse kan bli benyttet for å transformere en vertscelle eller vertsorganisme, dvs. for ekspresjon og/eller produksjon av Nanobodiet eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse. Passende verter eller vertsceller vil være klare for fagmannen, og kan for eksempel være en hvilken som helst passende fungal, prokaryot eller eukaryot celle eller cellelinje eller en hvilken som helst passende fungal, prokaryot eller eukaryot organisme, for eksempel:

- en bakteriell stamme, inkludert men ikke begrenset til gram-negative stammer slik som stammer av Escherichia coli; av Proteus, for eksempel av Proteus mirabilis; v Pseudomonas, for eksempel av Pseudomonas fluorescens; og gram-positive stammer slik som stammer av Bacillus, for eksempel av Bacillus subtilis eller av Bacillus brevis; av Streptomyces, for eksempel av Streptomyces lividans; av Staphylococcus, for eksempel av Staphylococcus carnosus; og av Lactococcus, for eksempel av Lactococcus lactis;

- en fungal celle, inkludert men ikke begrenset til celler fra arter v Trichoderma, for eksempel fra Trichoderma reesei; av Neurospora, for eksempel fra Neurospora crassa; av Sordaria, for eksempel fra Sordaria macrospora; fra Aspergillus, for eksempel fra Aspergillus niger eller fra Aspergillus sojae; eller fra andre filamentøse fungi;

- en gjærcelle, inkludert men ikke begrenset til celler fra arter av Saccharomyces, for eksempel av Saccharomyces cerevisiae; av Schizosaccharomyces, for eksempel av Schizosaccharomyces pombe; av Pichia, for eksempel av Pichia pastoris eller av Pichia metanolica; av Hansenula, for eksempel av Hansenula polymorpha; av Kluyveromyces, for eksempel av Kluyveromyces lactis; av Arxula, for eksempel av Arxula adeninivorans; of Yarrowia, for eksempel av Yarrowia lipolytica;

- en amfibisk celle eller cellelinje, slik som Xenopus oocytes;

- an insekt-avledet celle eller cellelinje, slik som celler/cellelinjer avledet fra lepidoptera, inkludert men ikke begrenset til Spodoptera SF9 og Sf21 celler eller celler/cellelinjer avledet fra Drosophila, slik som Schneider og Kc celler;

- en plante eller plantecelle, for eksempel i tobakksplanter; og/eller

- en pattedyr- celle eller cellelinje, for eksempel avledet en celle eller cellelinje avledet fra et menneske, fra pattedyr inkludert men ikke begrenset til CHO-celler, BHK-celler (for eksempel BHK-21 celler) og humane celler eller cellelinjer slik som HeLa, COS (for eksempel COS-7) og PER.C6 celler;

så vel som all andre verter eller vertsceller kjent per se for ekspresjon og produksjon av antistoff og antistoff fragmenter (inkludert men ikke begrenset til (enkelt) domene antistoff og ScFv fragmenter), som vil være klart for fagmannen. Det blir også referert til den generelle bakgrunnsteknikk sitert ovenfor, så vel som for eksempel WO 94/29457; WO 96/34103; WO 99/42077; Frenken et al., (1998), supra; Riechmann og Muyldermans, (1999), supra; van der Linden, (2000), supra; Thomassen et al., (2002), supra; Joosten et al., (2003), supra; Joosten et al., (2005), supra; og de videre referanser sitert heri.

Nanobodies og polypeptider ifølge foreliggende beskrivelse kan også bli introdusert og uttrykt i en eller flere celler, vev eller organer av en multicellulær organisme, for eksempel for profylaktisk og/eller terapeutiske formål (f.eks. som en genterapi). For dette formålet, kan nukleotidsekvensene ifølge foreliggende beskrivelse bli introdusert inn i cellene eller vevet på en hvilken som helst passende måte, for eksempel slik som ved (f.eks. ved bruk av liposomer) eller etter at de har bitt satt inn i en passende genterapivektor (for eksempel avledet fra retroviruser slik som adenovirus, eller parvoviruser slik som adeno-assosiert virus). Som det også vil være klart for fagmannen, kan slik genterapi bli utført in vivo og/eller in situ i kroppen til en pasient ved administrering av en nukleinsyre ifølge foreliggende beskrivelse eller en passende genterapivektor som koder for det samme til pasienten eller til spesifikke celler eller et spesifikt vev eller organ til pasienten; eller passende celler (ofte tatt fra kroppen til pasienten som skal behandles, slik som eksplanterte lymfocytter, benmarg aspirater eller vevsbiopsier) kan bli behandlet in vitro med en nukleotidsekvens ifølge foreliggende beskrivelse og så bli passende (re-)introdusert inn i pasientens kropp. Alt dette kan bli utført ved bruk av genterapivektorer, teknikker og leveringssystemer som er velkjente for fagmannen, se Culver, K. W., "Gene Therapy", 1994, p. xii, Mary Ann Liebert, Inc., Publishers, New York, N.Y).

Giordano, Nature F Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res.79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992),808-813; Verma, Nature 389 (1994),239; Isner, Lancet 348 (1996),370-374; Muhlhauser, Circ. Res.77 (1995),1077-1086; Onodera, Blood 91; (1998),30- 36; Verma, Gene Ther.5 (1998),692-699; Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci. : 811 (1997), 289-292; Verzeletti, Hum. Gene Ther.9 (1998), 2243-51; Wang, Nature Medicine 2 (1996),714-716; WO 94/29469; WO 97/00957, US 5,580,859; 1 US 5,5895466; eller Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640. For eksempel, in situ ekspresjon av ScFv fragmenter (Afanasieva et al., Gene Ther., 10, 1850-1859 (2003)) og av diabodies (Blanco et al., J. Immunol, 171, 1070-1077 (2003)) har blitt beskrevet i teknikken.

For ekspresjon av Nanobodies i en celle, kan de også bli uttrykt som såkalte eller som såkalte “intrabodies”, som for eksempel beskrevet i WO 94/02610, WO 95/22618 og US-A-7004940; WO 03/014960; i Cattaneo, A. & Biocca, S. (1997) Intracellular Antistoff: Development og Applications. Landes og Springer-Verlag; og i Kontermann, Methods 34, (2004), 163-170.

For produksjon, kan Nanobodies og polypeptider ifølge foreliggende beskrivelse for eksempel også bli produsert i melk av transgene pattedyr, for eksempel i melk fra kaniner, kuer, geiter eller får (se for eksempel US-A-6,741,957, US-A-6,304,489 og US-A-6,849,992 for general teknikker for introdusering av transgener inn i pattedyr), i planter eller deler av plants inkludert men ikke begrenset til deres blader, blomster, frukter, frø, røtter eller turbers (for eksempel i tobakk, mais, soyabønne eller alfalfa) eller i for eksempel puppen til silkeormen Bombix mori.

Videre, kan Nanobodies og polypeptider ifølge foreliggende beskrivelse også bli uttrykt og/eller produsert i cellefrie ekspresjonssystemer, og passende eksempler på slike systemer vil være klare for fagmannen. Noen foretrukne, men ikke-begrensende eksempler inkluderer ekspresjon hvetekimsystem; i kanin reticulocytt-lysater; eller i E. coli Zubay systemet.

Som nevnt ovenfor, er en av fordeler ved anvendelsen av Nanobodies at polypeptidene basert på disse kan bli fremstilt ved ekspresjon i et passende bakterielt system, og passende bakterielle ekspresjonssystemer, vektorer, vertsceller, regulatoriske elementer, etc., vil være klare for fagmannen, for eksempel fra referansene sitert ovenfor. Et må imidlertid bemerkes at foreliggende beskrivelse i sin videste forstand ikke er begrenset til ekspresjon i bakterielle systemer.

Foretrukket, blir i foreliggende beskrivelse, et (in vivo eller in vitro) ekspresjonssystem, slik som et bakterielt ekspresjonssystem, benyttet som gir polypeptidene ifølge foreliggende beskrivelse i en form som er passende for farmasøytiske anvendelse, og slike ekspresjon systems vil igjen være opplagte for fagmannen. Som det også vil være klart for fagmannen, kan polypeptider ifølge foreliggende beskrivelse passende for farmasøytiske anvendelse bli fremstilt ved bruk av teknikker for peptidsyntese.

For produksjon i industriell skala, inkluderer foretrukne heterologe verter for (industriell) produksjon av Nanobodies eller Nanobody-inneholdende protein terapeutiske stammer av E. coli, Pichia pastoris, S. cerevisiae som er passende for storskala ekspresjon/produksjon/fermentering, og spesielt for storskala farmasøytisk ekspresjon/produksjon/fermentering. Passende eksempler på slike stammer vil være klare for fagmannen. Slike stammer og produksjons-/ekspresjonsystemer er også gjort tilgjengelige av firmaer slik som Biovitrum (Uppsala, Sverige).

Alternativt, kan mammalske cellelinjer, spesielt Chinese hamster ovarie (CHO) celler, bli benyttet for storskala ekspresjon/produksjon/fermentering, og spesielt for storskala farmasøytisk ekspresjon/produksjon/fermentering. Igjen, er slike ekspresjon/produksjon systemer også gjort tilgjengelige ved noen av firmaene nevnt ovenfor.

Valget av det spesifikke ekspresjonssystemet vil avhenge delvis på kravene for visse post-transasjonelle modifikasjoner, mer spesifikt glycosylering. Produksjonen av et Nanobody-inneholdende rekombinant protein for hvilket glycosylering er ønskelig eller nødvendig, vil nødvendiggjøre anvendelsen av mammalske ekspresjonsverter som har evnen til å glycosylere det uttrykte proteinet. I så måte, vil det være klart for fagmannen at glycosyleringsmønsteret oppnådd (dvs. typen, antallet og posisjon til tilknyttede rester) avhengig av cellen eller cellelinjen som blir benyttet for ekspresjonen. Foretrukket, blir enten en human celle eller cellelinje benyttet (dvs. fører til et protein som hovedsakelig har et humant glycosyleringsmønster) eller det bli benyttet en annen mammalsk cellelinje som kan fremskaffe et glykosyleringsmønster som er hovedsakelig og/eller funksjonelt det samme som human glykosylering eller minst etterlikner human glykosylering. Generelt, har prokaryote verter slik som E. coli ikke evnen til å glycosylere proteiner, og anvendelse av lavere eukaryoter slik som gjær fører vanligvis til et glykosyleringsmønster som skiller seg fra human glykosylering. Likevel, må det forståes at alle de foregående vertsceller og ekspresjonsystemer kan bli benyttet i foreliggende beskrivelse, avhengig av det ønskede Nanobody eller protein som skal bli fremskaffet.

Således, ifølge en ikke-begrensende utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse, er Nanobodiet eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse glycosylert. Ifølge en annen ikke-begrensende utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse, er Nanobodiet eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse ikke-glycosylert.

Ifølge en foretrukket, men ikke-begrensende utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse, er Nanobodiet eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse produsert i en bakteriell celle, spesielt en bakteriell celle passende for storskala farmasøytisk produksjon, slik som celler av stammene nevnt ovenfor.

Ifølge en annen foretrukket, men ikke-begrensende utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse, er Nanobodiet eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse produsert i en gjærcelle, spesielt en gjærcelle passende for storskala farmasøytisk produksjon, slik som celler av artene nevnt ovenfor.

Ifølge enda en annen foretrukket, men ikke-begrensende utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse, er Nanobodiet eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse produsert i en mammalske celle, spesielt i en human celle eller i en celle av en human cellelinje, og mer spesielt i en human celle eller i en celle av en human cellelinje som er passende for storskala farmasøytisk produksjon, slik som cellelinjene nevnt ovenfor.

Når ekspresjon i en vertscelle blir benyttet for å produsere Nanobodies og proteinene ifølge foreliggende beskrivelse, kan Nanobodies og proteiner ifølge foreliggende beskrivelse bli produsert enten intracellullært (f.eks. i cytosol, i periplasma eller i inklusjonslegemer) og så isolert fra vertscellene og eventuelt ytterligere renset; eller kan bli fremstilt ekstracellulært (f.eks. i mediet hvilket vertscellene er dyrket) og så isolert fra kulturmedium og eventuelt ytterligere renset. Når eukaryote verter celler blir benyttet, er ekstracellulær produksjon vanligvis foretrukket siden dette betydelig letter den videre isolasjon og nedstrøms prosessering av Nanobodies og proteiner som er fremstilt.

Bakterielle celler slik som stammene av E. coli nevnt ovenfor skiller normalt ikke ut proteiner ekstracellulært, bortsett fra noen få klasser proteiner slik som toksiner og hemolysin, og sekretorisk produksjon i E. coli refererer til translokasjonen av proteiner over den indre membranen til det periplasmiske rom. Periplasmisk produksjon gir flere fordeler over cytosolisk produksjon. For eksempel, kan den N-terminale aminosyresekvens til det utskilte produktet være identisk med det naturlige genproduktet etter spalting av sekresjonssignalsekvensen ved en spesifikk signalpeptidase. Det synes også å være mye mindre proteaseaktivitet i periplasma enn i cytoplasma. I tillegg, er proteinrensing enklere på grunn av færre kontaminerende proteiner i periplasma. N annen fordel er at korrekte disulfidbindinger kan dannes på grunn av at periplasma gir et mer oksidativt miljø enn cytoplasma. Proteiner som er overuttrykt i E. coli er ofte funnet å være uoppløselige aggregater, såkalte inklusjonslegemer. Disse inklusjonslegemer kan være lokalisert i cytosol eller i periplasma; gjenvinningen av biologisk aktive proteiner fra disse inklusjonslegemer krever denaturering/refolding prosess. Mange rekombinante proteiner, inkludert terapeutiske proteiner, blir gjenvunnet fra inklusjonslegemer. Alternativt, som vil være klart for fagmannen, kan rekombinante stammer av bakterier som har blitt genetisk modifiserte for å utskille et ønsket protein, og spesielt et Nanobody eller et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse, bli benyttet.

Således, ifølge en ikke-begrensende utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse, er Nanobodiet eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse et Nanobody eller polypeptid som har blitt produsert intracellulært og som har blitt isolert fra vertscelle, og spesielt fra en bakteriell celle eller fra et inklusjonslegeme i en bakteriell celle. Ifølge en annen ikke-begrensende utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse, er Nanobodiet eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse et Nanobody eller polypeptid som har blitt produsert ekstracellulært, og som har blitt isolert fra mediet i hvilke vertscellen er dyrket.

Noen foretrukne, men ikke-begrensende promoterer for anvendelse med disse vertsceller inkluderer,

- for ekspresjon i E. coli: lac promoter (og derivater derav slik som lacUV5 promoter); arabinose promoter; venstre- (PL) og høyre- (PR) promoterer av fag lambda; promoter av trp operon; hybrid lac/trp promoterer (tac og trc); T7-promoter (mer spesifikt det til T7-fag gen 10) og andre T-fag promoterer; promoter av Tn10 tetracyclin resistensgenet; utviklede varianter av de ovenfornevnte promoterer som inkluderer en eller flere kopier av en ekstern regulatorisk operatorsekvens;

- for ekspresjon i S. cerevisiae: konstitutive: ADH1 (alkohol dehydrogenase 1), ENO (enolase), CYC1 (cytokrom c iso-1), GAPDH (glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase); PGK1 (fosfoglycerat kinase), PYK1 (pyruvate kinase); regulert: GAL1,10,7 (galactose metabolske enzymer), ADH2 (alkohol dehydrogenase 2), PHO5 (sur fosfatase), CUP1 (kopper metallotionein); heterologe: CaMV (blomkål mosaikk virus 35S promoter); - for ekspresjon i Pichia pastoris: AOX1 promoteren (alkohol oksidase I) - for ekspresjon i mammalske celler: humant cytomegalovirus (hCMV) umiddelbar tidlig enhancer/promoter; humant cytomegalovirus (hCMV) umiddelbar tidlig promoter variant som inneholder to tetracyclin operatorsekvenser slik at promoteren kan bli regulert av Tet repressoren; Herpes Simplex Virus tymidin kinase (TK) promoter; Rous Sarcoma Virus lang terminal repeat (RSV LTR) enhancer/promoter; forlengingsfaktor 1α (hEF-1α) promoter fra menneske, chimpanse, mus eller rotte; SV40 tidlig promoter; HIV-1 lang terminal repeat promoter; β-actin promoter;

Noen foretrukne, men ikke-begrensende vektorer for anvendelse med disse vertscellene inkluderer:

- vektorer for ekspresjon i mammalske celler: pMAMneo (Clontech), pcDNA3 (Invitrogen), pMC1neo (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1 (8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo (342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC37199), pRSVneo (ATCC37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) og 1ZD35 (ATCC 37565), så vel som viral-baserte ekspresjon systemer, slik som de basert på adenovirus;

- vektorer for ekspresjon i bakterieceller: pET vektorer (Novagen) og pQE vektorer (Qiagen);

- vektorer for ekspresjon i gjær eller andre fungale celler: pYES2 (Invitrogen) og Pichia ekspresjonsvektorer (Invitrogen);

- vektorer for ekspresjon i insektceller: pBlueBacII (Invitrogen) og andre baculovirus vektorer

- vektorer for ekspresjon i planter eller planteceller: for eksempel vektorer basert på blomkål mosaikk virus eller tobakk mosaikk virus, passende stammer av Agrobacterium, eller Ti-plasmid baserte vektorer.

Noen foretrukne, men ikke-begrensende sekretoriske sekvenser for anvendelse med disse vertsceller inkluderer:

- for anvendelse i bakterielle celler slik som E. coli: PelB, Bla, OmpA, OmpC, OmpF, OmpT, StII, PhoA, PhoE, MalE, Lpp, LamB, og liknende; TAT signal peptid, hemolysin C-terminal sekresjonssignal

- for anvendelse i gjær: α-mating faktor prepro-sekvens, fosfatase (pho1), invertase (Suc), etc.;

- for anvendelse i mammalske celler: medfødt signal hvor målproteinet er av eukaryot opprinnelse; murin Ig κ-kjedet V-J2-C signal peptid; etc.

Passende teknikker for transformering av en vert eller vertscelle ifølge foreliggende beskrivelse vil være klare for fagmannen og kan avhenge av den tiltenkte vertscelle/vertsorganisme og det genetiske konstrukt som blir anvendt. Det refereres igjen til håndbøker og patentsøknader nevnt ovenfor.

Etter transformering, kan for detektering og selektering av de vertsceller eller vertsorganismer som har blitt suksessfullt transformert med nukleotidsekvenen/det genetiske konstruktet ifølge foreliggende beskrivelse bli utført. Dette kan for eksempel være et seleksjonstrinn basert på en selekterbar markør som er til stede i det genetiske konstruktet ifølge foreliggende beskrivelse eller et trinn som omfatter deteksjonen av aminosyresekvensen ifølge foreliggende beskrivelse, f.eks. ved bruk av spesifikke antistoff.

Den transformerte vertscelle (som kan være i form eller en stabil cellelinje) eller vertsorganismer (som kan være i form av en stabil mutantlinje eller -stamme) danner ytterligere aspekter ifølge foreliggende beskrivelse.

Foretrukket, er disse vertsceller eller vertsorganismer slik at de uttrykker, eller er (minst) i stand til å uttrykke (f.eks. under passende betingelser), en aminosyresekvens ifølge foreliggende beskrivelse (og for en vertsorganisme: i minst en celle, del, vev eller organ derav). Foreliggende beskrivelse inkluderer også videre generasjoner, avkom og/eller etterkommer av vertscellen eller vertsorganismen ifølge foreliggende beskrivelse, som for eksempel kan bli fremskaffet ved celledeling eller ved kjønnet eller ukjønnet reproduksjon.

For å produsere/oppnå ekspresjon av aminosyresekvensene ifølge foreliggende beskrivelse, kan den transformerte vertscellen eller transformerte vertsorganismen bli holdt, opprettholdt og/eller dyrket under betingelser slik at den (ønskede) aminosyresekvensen ifølge foreliggende beskrivelse blir uttrykt/produsert. Passende betingelser vil være klare for fagmannen og vil vanligvis avhenge av vertscellen/vertsorganismen som blir benyttet, så vel som på de regulatoriske elementene som kontrollerer ekspresjonen av den (relevante) nukleotidsekvens ifølge foreliggende beskrivelse. Igjen, blir det referert til håndbøkene og patentsøknadene nevnt ovenfor i avsnittet om de genetiske konstruktene ifølge foreliggende beskrivelse.

Generelt, kan passende betingelser inkludere anvendelsen anvendelse av et passende medium, nærværet av en passende matkilde og/eller passende næringsstoffer, anvendelsen av en passende temperatur, og eventuelt nærværet av en passende induksjonsfaktor eller –forbindelse (f.eks. når nukleotidsekvensene ifølge foreliggende beskrivelse er under kontroll av en induserbar promoter); alle av hvilke kan bli valgt av fagmannen. Igjen, under slike betingelser, kan aminosyresekvensene ifølge foreliggende beskrivelse bli uttrykt på en konstitutiv måte, på en transient måte, eller kun når passende indusert.

Det vil også være klart for fagmannen at aminosyresekvensen ifølge foreliggende beskrivelse kan (først) bli generert i en umoden form (som nevnt ovenfor), som så kan bli utsatt for post-transasjonell modifikasjon, avhengig av benyttet vertscelle/vertsorganisme. Også, kan aminosyresekvensen ifølge foreliggende beskrivelse bli glycosylert, igjen avhengig av benyttet vertscelle/vertsorganisme.

Aminosyresekvensen ifølge foreliggende beskrivelse kan så bli isolert fra vertscellen/vertsorganismen og/eller fra mediet i hvilke nevnte vertscelle eller vertsorganisme ble dyrket, ved bruk av proteinisolasjon og/eller renseteknikker kjent per se, slik som (preparativ) kromatografi og/eller elektroforeseteknikker, forskjellige utfellingsteknikker, affinitetsteknikker (f.eks. ved bruk av en spesifikk, spaltbar aminosyresekvens fusert med aminosyresekvensen ifølge foreliggende beskrivelse) og/eller preparative immunologiske teknikker (dvs. ved bruk av antistoff mot aminosyresekvensen som skal bli isolert).

Generelt, for farmasøytiske anvendelse, kan polypeptidene ifølge foreliggende beskrivelse bli formulert som et farmasøytisk preparat omfattende minst ett polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse og minst en farmasøytisk akseptabel bærer, fortynner eller eksipient og/eller adjuvant, og eventuelt en eller flere ytterligere farmasøytisk aktive polypeptider og/eller forbindelser. Ved hjelp av ikke-begrensende eksempler, slik som en formulering kan være i form passende for oral administrasjon, for parenteral administrasjon (slik som ved intravenøs, intramuskulær eller subkutan injeksjon eller intravenøs infusjon), for topikal administrasjon, for administrasjon ved inhalasjon, ved et hudplaster, ved et implantat, ved en stikkpille, etc.. slike som passende administrasjonsformer – som kan være faste, semi-faste eller flytende, avhengig av administrasjonsmåten - så vel som fremgangsmåter og bærere for anvendelse i fremstillingen derav, vil være klare for fagmannen, og er ytterligere beskrevet nedenfor.

Således, i et ytterligere aspekt, angår foreliggende beskrivelse en farmasøytisk sammensetning som inneholder minst et nanobody ifølge foreliggende beskrivelse eller minst ett polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse og minst en passende bærer (dvs. en bærer passende for veterinærisk anvendelse), og eventuelt en eller flere ytterlige aktive stoffer.

En utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er et polypeptid konstrukt omfattende:

minst ett nanobody ifølge foreliggende beskrivelse, dvs. rettet mot en hvilken som helst av vWF, vWF A1 domene, A1 domene av aktivert vWF, vWF A3 domene.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er et polypeptid konstrukt som beskrevet ovenfor, hvori Nanobodiet ifølge foreliggende beskrivelse rettet mot A1 domene av aktivert vWF spesifikt gjenkjenner den aktiverte vWF konformasjonen ved setet for trombusdannelse men ikke binder til sirkulerende ikke-aktiverte former av vWF.

Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse kan også være rettet mot et fragment av vWF, vWF A1 domene, A1 domene av aktivert vWF, vWF A3 domene, slik som et fragment som er i stand til utvikling av en immunrespons. Et mål er også et fragment av vWF, vWF A1 domene, A1 domene av aktivert vWF, vWF A3 domene, som er i stand til binding til et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse rettet mot ”foreldere” fullengde målet.

Et fragment som benyttet heri refererer til mindre enn 100% av sekvensen (f.eks., 99%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% etc.), men omfattende 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 eller flere aminosyrer. Et fragment er av tilstrekkelig lengde slik at interaksjonene av interesse blir opprettholdt med affinitet på 1 x 10-6 M eller bedre.

Et fragment som benyttet heri refererer også til eventuelle innsettinger, delesjoner og substitusjoner av en eller flere aminosyrer som ikke betydelig endrer evnen til målet til å binde til et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse dyrket mot villtype målet. Antallet av aminosyreinnsettinger, -delesjoner eller -substitusjoner er fortrinnsvis opp til 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 eller 70 aminosyrer.

Et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse rettet mot et mål betyr generelt Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse om er i stand til binding til sitt mål med en affinitet på bedre enn 10<-6 >M.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er et polypeptidkonstrukt som beskrevet ovenfor hvori minst ett nanobody ifølge foreliggende beskrivelse er en humanisert sekvens.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er et polypeptidkonstrukt som beskrevet ovenfor hvor minst ett nanobody ifølge foreliggende beskrivelse er et Kamelidae VHH antistoff.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er et polypeptidkonstrukt som beskrevet ovenfor, hvor nevnte Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse er en homolog sekvens, en funksjonell del, eller en funksjonell del av en homolog sekvens av fullengde Nanobodyet ifølge foreliggende beskrivelse.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er et polypeptidkonstrukt som beskrevet ovenfor, hvor nevnte polypeptidkonstrukt er en homolog sekvens av nevnte polypeptidkonstrukt, en funksjonell del derav eller en homolog sekvens av en funksjonell del derav.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er et polypeptidkonstrukt som beskrevet ovenfor, videre omfattende minst ett nanobody ifølge foreliggende beskrivelse rettet mot et eller flere serumproteiner, spesielt et eller flere human serum proteiner.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er et polypeptidkonstrukt som beskrevet ovenfor hvor nevnte minst ett (humant) serumprotein er et hvilket som helst (humane) serumalbumin, (humane) serum immunoglobuliner, (humane) tyroxin-bindende protein, (human) transferrin, eller (humant) fibrinogen eller et fragment derav.

Ifølge et spesifikt, men ikke-begrensende aspekt ifølge foreliggende beskrivelse, inneholder polypeptidene ifølge foreliggende beskrivelse, ved siden av det ene eller flere Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse, minst ett nanobody mot humant serumalbumin. Selv om disse Nanobodies mot human serum albumin kan være som generelt beskrevet i W04/062551 eller i de videre referanser sitert deri, ifølge en spesielt foretrukket, men ikke-begrensende utførelsesform, består nevnte Nanobody mot humant serumalbumin av 4 rammeverkregioner (FR1 til FR4 henholdsvis) og 3 komplementaritetsbestemmende regioner (CDR1 til CDR3 henholdsvis), i hvilke:

i) CDR1 er en aminosyresekvens valgt blant gruppen bestående av:

SFGMS [SEQ ID NO: 44] LNLMG [SEQ ID NO: 45] INLLG [SEQ ID NO: 46] NYWMY; [SEQ ID NO: 47] og/eller fra gruppen bestående av aminosyresekvenser som har 2 eller kun 1 “aminosyreforskjell(er)” (som definert heri) med en av de ovenfornevnte aminosyresekvenser, i hvilke:

(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon fortrinnsvis er en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri); og/eller (2) nevnte aminosyresekvens foretrukket inneholder kun aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller -innsettinger, sammenlignet med de ovenfornevnte aminosyresekvenser;

og i hvilken:

ii) CDR2 er en aminosyresekvens valgt blant gruppen bestående av:

SISGSGSDTLYADSVKG [SEQ ID NO: 48] TITVGDSTNYADSVKG [SEQ ID NO: 49] TITVGDSTSYADSVKG [SEQ ID NO: 50] SINGRGDDTRYADSVKG [SEQ ID NO: 51] AISADSSTKNYADSVKG [SEQ ID NO: 52] AISADSSDKRYADSVKG [SEQ ID NO: 53] RISTGGGYSYYADSVKG [SEQ ID NO: 54] eller fra gruppen bestående av aminosyresekvenser som har minst 80%, foretrukket minst 90%, fortrinnsvis minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med en av de ovenfornevnte aminosyresekvenser; i hvilke

og i hvilken:

iii) CDR3 er en aminosyresekvens valgt blant gruppen bestående av:

DREAQVDTLDFDY [SEQ ID NO: 55] eller fra gruppen bestående av aminosyresekvenser som har minst 80%, foretrukket minst 90%, fortrinnsvis minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med en av de ovenfornevnte aminosyresekvenser; i hvilke

og/eller fra gruppen bestående av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller kun 1 “aminosyreforskjell(er)” (som definert heri) med en av de ovenfornevnte aminosyresekvenser, i hvilke:

(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon fortrinnsvis er en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri); og/eller (2) nevnte aminosyresekvens foretrukket inneholder kun aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller innsettinger, sammenlignet med de ovenfornevnte aminosyresekvenser;

eller fra gruppen bestående av:

GGSLSR [SEQ ID NO: 56] RRTWHSEL [SEQ ID NO: 57] GRSVSRS [SEQ ID NO: 58] GRGSP [SEQ ID NO: 59] og/eller fra gruppen bestående av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller kun 1 “aminosyreforskjell(er)” (som definert heri) med en av de ovenfornevnte aminosyresekvenser, i hvilke:

(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon fortrinnsvis er en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri); og/eller (2) nevnte aminosyresekvens foretrukket inneholder kun aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller -innsettinger, sammenlignet med de ovenfornevnte aminosyresekvenser.

Ifølge et annet aspekt, angår foreliggende beskrivelse et Nanobody mot vWF, som består av 4 rammeverkregioner (FR1 til FR4 henholdsvis) og 3 komplementaritetsbestemmende regioner (CDR1 til CDR3 henholdsvis), som er valgt blant gruppen bestående av Nanobodies med en av de følgende kombinasjonene av CDR1, CDR2 og CDR3, henholdsvis:

- CDR1: SFGMS; CDR2: SISGSGSDTLYADSVKG; CDR3: GGSLSR; - CDR1: LNLMG; CDR2: TITVGDSTNYADSVKG; CDR3: RRTWHSEL; - CDR1: INLLG; CDR2: TITVGDSTSYADSVKG; CDR3: RRTWHSEL; - CDR1: SFGMS; CDR2: SINGRGDDTRYADSVKG; CDR3: GRSVSRS; - CDR1: SFGMS; CDR2: AISADSSDKRYADSVKG; CDR3: GRGSP;

- CDR1: SFGMS; CDR2: AISADSSDKRYADSVKG; CDR3: GRGSP;

- CDR1: NYWMY; CDR2: RISTGGGYSYYADSVKG; CDR3:

DREAQVDTLDFDY.

I Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse som omfatter kombinasjonene av CDR’er nevnt ovenfor, kan hver CDR bli erstattet av CDR valgt blant gruppen bestående av aminosyresekvenser som har minst 80%, foretrukket minst 90%, fortrinnsvis minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med de nevnte CDR’er; i hvilke

og/eller valgt blant gruppen bestående av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller kun 1 (som indikert i det foregående avsnitt) “aminosyreforskjell(er)” (som definert heri) med de nevnte CDR(er) en av de ovenfornevnte aminosyresekvenser, i hvilke:

Imidlertid, av Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse som omfatter kombinasjonene av CDR’er nevnt ovenfor, er Nanobodies omfattende en eller flere av CDR’ene opplistet ovenfor spesielt foretrukket; Nanobodies omfattende to eller flere av CDR’ene opplistet ovenfor er mer spesielt foretrukket; og Nanobodies omfattende tre av CDR’ene opplistet ovenfor er mest spesielt foretrukket.

I disse Nanobodies mot human serumalbumin, er rammeverkregioner FR1 til FR4 fortrinnsvis er som definert ovenfor for Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse.

Spesielt foretrukket er Nanobodies mot human serum albumin valgt blant gruppen bestående av SEQ ID NO’s: 107-121. Disse tilsvarer Nanobodies mot humant serumalbumin med SEQ ID NO’s: 61 til 67, SEQ ID NO’s 87 til 89 og SEQ ID NO’s 100-104 fra søkerens parallelt løpende US provisional søknad med tittelen ”Improved Nanobodies™ against Tumor Necrosis Factor-alpha” med innleveringsdato 18. mai, 2005.

Mer generelt, er Nanobodies mot serumalbumin passende for anvendelse i foreliggende beskrivelse beskrevet i den Internasjonale søknad fra søkeren med tittelen “Serum albumin binding proteins” med en internasjonal innleveringsdag 17. mai, 2006.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er en nukleinsyre som koder for et polypeptidkonstrukt som beskrevet ovenfor.

En utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er en sammensetning omfattende et polypeptidkonstrukt som beskrevet ovenfor og minst ett thrombolytisk middel, for samtidig, separat eller sekvensiell administrasjon til et individ.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er en sammensetning som beskrevet ovenfor hvori nevnte trombolytiske middel er en hvilken som helst av stafylokinase, vevs plasminogenaktivator, streptokinase, enkeltkjede streptokinase, urokinase og acyl plasminogen streptokinase kompleks.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er et polypeptidkonstrukt som beskrevet ovenfor, eller en nukleinsyre som beskrevet ovenfor, eller en sammensetning som beskrevet ovenfor for anvendelse i behandlingen, forhindringen og/eller lettelsen av forstyrrelser vedrørende blodplate-mediert aggregering eller dysfunksjon derav.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er en anvendelse av et polypeptidkonstrukt som beskrevet ovenfor, eller en nukleinsyre som beskrevet ovenfor, eller en sammensetning som beskrevet ovenfor for fremstillingen av et medikament for behandling, forhindring og/eller lettelse av forstyrrelser vedrørende blodplate-mediert aggregering eller dysfunksjon derav.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er et polypeptidkonstrukt, nukleinsyre eller sammensetning som beskrevet ovenfor eller en anvendelse av et polypeptidkonstrukt, nukleinsyre eller sammensetning som beskrevet ovenfor hvori nevnte forstyrrelser er en hvilken som helst med opphav i transient cerebralt iskemisk anfall, ustabil eller stabil angina, angina pectoris, cerebralt infarkt, myokardialt infarkt, perifer arteriell okklusive sykdom, restenosis, koronart by-pass implantat, eller koronar arterie ventilerstatning og koronar intervensjoner slik som angioplasti, stenting, carotid endarterectomy eller aterectomi.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er et polypeptid konstrukt, nukleinsyre eller sammensetning som beskrevet ovenfor eller en anvendelse av et polypeptid konstrukt, nukleinsyre eller sammensetning som beskrevet ovenfor hvori nevnte forstyrrelser er en hvilken som helst av dannelsen av en ikke-okklusiv trombus, dannelsen av en okklusiv trombus, arteriell trombusdannelse, akutt koronar okklusjon, restenosis, restenosis etter PCTA eller stenting, trombusdannelse i stenoserte arterier, hyperplasi etter angioplasti, aterectomi eller arteriell stenting, okklusive syndrom i et vaskulært system eller mangel på åpenhet i de syke arteriene.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er et polypeptidkonstrukt, nukleinsyre eller sammensetning som beskrevet ovenfor eller en anvendelse av et polypeptid konstrukt, nukleinsyre eller sammensetning som beskrevet ovenfor hvori nevnte forstyrres er plakk eller trombusdannelse i høyskjæromgivelser.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er et polypeptid konstrukt, nukleinsyre eller sammensetning som beskrevet ovenfor eller en anvendelse av et polypeptidkonstrukt som beskrevet ovenfor hvori nevnte polypeptid konstrukt blir administrert intravenøst, subkutant, oralt, sublingualt, topikalt, nasalt, vaginalt, rektalt eller ved inhalasjon.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er en sammensetning omfattende et polypeptid konstrukt som beskrevet ovenfor eller en nukleinsyre som koder for nevnte polypeptidkonstrukt, eller en sammensetning som beskrevet ovenfor og en farmasøytisk akseptabel bærer.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er en fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid som beskrevet ovenfor, omfattende

(a) dyrking av vertsceller omfattende nukleinsyre som koder for et polypeptid som beskrevet ovenfor under betingelser som tillater ekspresjon av polypeptidet, og,

(b) gjenvinning av det produserte polypeptidet fra kulturen.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er en fremgangsmåte som beskrevet ovenfor, hvori nevnte vertsceller er bakterielle eller gjær.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er en fremgangsmåte for behandling av invasivt medisinsk utstyr for å forhindre blodplate-mediert aggregering omkring stedet for invasjon omfattende trinnet ved å belegge nevnte anordning med et polypeptidkonstrukt som beskrevet ovenfor.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er en invasiv medisinsk anordning for omgåelse av blodplate-mediert aggregering omkring invasjonsstedet, hvori nevnte anordning er belagt med et polypeptidkonstrukt som beskrevet ovenfor.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er en fremgangsmåte for identifisering av et middel som modulerer blodplate-mediert aggregering omfattende

(a) bringe i kontakt et polypeptidkonstrukt som beskrevet ovenfor med et polypeptid korresponderende til dets mål, eller et fragment derav, i nærvær av og fravær av en kandidatmodulator under betingelser som tillater binding mellom nevnte polypeptider, og

(b) baling av binding mellom polypeptidene fra trinn (a), hvori en reduksjon i binding i nærvær av nevnte kandidatmodulator, i forhold til bindingen i fravær av nevnte kandidatmodulator identifiserer nevnte kandidatmodulator som et middel som modulerer blodplate-mediert aggregering.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er et sett for screening for midler som modulerer blodplate-mediert aggregering ifølge fremgangsmåten som beskrevet ovenfor.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er et ukjent middel som modulerer blodplate-mediert aggregering identifisert ifølge fremgangsmåten som beskrevet ovenfor.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er en fremgangsmåte for diagnostisering av en sykdom eller forstyrrelse karakterisert ved dysfunksjon av blodplate-mediert aggregering omfattende trinnet:

(a) bringe i kontakt en prove med et polypeptidkonstrukt som beskrevet ovenfor, og

(b) detektering av binding av nevnte polypeptid konstrukt til nevnte prøve, og (c) sammenligning av bindingen detektert i trinn (b) med en standard, hvori en forskjell i binding relativt til nevnte prøve er diagnostisk for en sykdom eller forstyrrelse karakterisert ved dysfunksjon av blodplate-mediert aggregering.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er et sett for screening for diagnostisering av en sykdom eller forstyrrelse karakterisert ved dysfunksjon av blodplate-mediert aggregering ifølge fremgangsmåten som beskrevet ovenfor.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er et sett som beskrevet ovenfor omfattende et polypeptidkonstrukt som beskrevet ovenfor.

I polypeptidene ifølge foreliggende beskrivelse, kan det en eller flere Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse som er rettet mot et mål kan ha den samme sekvens. Alternativt kan de ikke i det hele tatt ha en samme sekvens. Det er innen rammen ifølge foreliggende beskrivelse at et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse omfatter anti-mål Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse som ikke alle deler den samme sekvens, men som er rettet mot det samme mål, eller fragment derav, et eller flere antigener derav.

Et annet aspekt ifølge foreliggende beskrivelse er at polypeptidet ifølge foreliggende beskrivelse omfatter to eller flere Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse, hvori hvilke som helst Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse er rettet mot forskjellige epitoper/mål, dvs. mot hvilke som helst av vWF, vWF A1 domene, A1 domene av aktiverte vWF, vWF A3 domene.

Et annet aspekt ifølge foreliggende beskrivelse er et bispesifikt polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse omfattende et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse rettet mot vWF A1 domene, A1 domene av aktivert vWF, og et annet Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse rettet mot vWF A3 domene. Nevnte bispesifikke polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse hemmer interaksjonen mellom vWF og kollagen, og interaksjonen mellom vWF og blodplater.

Ifølge et aspekt ifølge foreliggende beskrivelse kan et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse kan omfatte to eller flere Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse som har blitt forbundet. Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse kan være identiske i sekvens og rettet mot det samme mål eller antigen. Avhengig av antallet av linkede VHHs, kan et multivalent VHH være bivalent (2 VHHs), trivalent (3 VHHs), tetravalent (4 VHHs) eller ha et høyere valens molekyler.

Foreliggende beskrivelse angår også funnet at et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse ytterligere omfattende et eller flere Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse hver rettet mot et serumprotein til et individ, overraskende har signifikant forlenget halveringstid i sirkulasjonen til nevnte individ sammenlignet med halveringstiden til anti-mål Nanobodyet ifølge foreliggende beskrivelse når det ikke er en del av nevnte konstrukt. Videre, ble nevnte konstrukts funnet å utvise de samme fordelaktige egenskaper til VHHs slik som høyere stabilitet som blir intakt i mus, ekstrem pH resistens, høy temperaturstabilitet og høy målaffinitet.

Serumproteinet kan være et hvilket som helst passende protein funnet i serum til individet, eller fragment derav. Ifølge ett aspekt ifølge foreliggende beskrivelse, er serumproteinet serumalbumin, serum immunoglobuliner, tyroxinbindende protein, transferrin, eller fibrinogen. Avhengig av den tiltenkte anvendelse kan slik som den ønskede halveringstid for effektiv behandling og/eller kompartimentalisering av mål antigenet, kan VHH-partneren være rettet mot et av de ovenfornevnte serumproteiner.

Slike konstrukter er i stand til å sirkulere i individets serum i flere dager, for å redusere frekvensen av behandling, ubehaget for individet og resultere i en redusert kostnad for behandling. Videre, er det et aspekt ifølge foreliggende beskrivelse at halveringstiden til polypeptidet ifølge foreliggende beskrivelse beskrevet heri kan bli kontrollert av antallet av anti-serum protein Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse som er til stede i konstruktet. En kontrollerbar halveringstid er ønskelig i mange sammenhenger, for eksempel, i anvendelsen av tidsstyrte doser av et terapeutisk polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse som nevnt heri, videre omfattende et trombolytisk middel.

Nevnte trombolytiske middel kan være ikke-kovalent eller kovalent festet til et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse via kovalente eller ikke-kovalente midler. Slike kovalente midler er beskrevet nedenfor. Ikke-kovalente midler inkluderer via et protein interaksjon slik som biotin/strepavidin, eller via et immunokonjugat.

Alternativt, kan det trombolytiske middelet kan bli administrert samtidig, separat eller sekvensielt med hensyn på et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse.

Et annet aspekt ifølge foreliggende beskrivelse er en sammensetning omfattende minst ett polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse og minst ett trombolytisk middel, for samtidig, separat eller sekvensiell administrasjon til et individ.

Ett aspekt ifølge foreliggende beskrivelse er en fremgangsmåte for behandling autoimmun sykdom omfattende administrering til et individ av en effektiv mengde av minst ett polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse og minst ett trombolytisk middel, samtidig, separat eller sekvensielt.

Et annet aspekt ifølge foreliggende beskrivelse er et sett inneholdende minst ett polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse og minst ett trombolytisk middel for samtidig, separat eller sekvensiell administrasjon til et individ. Det er et aspekt ifølge foreliggende beskrivelse at settet kan bli benyttet ifølge foreliggende beskrivelse. Det er et aspekt ifølge foreliggende beskrivelse at settet kan bli benyttet for å behandle sykdommene som sitert heri.

Ved samtidig administrasjonsmidler blir polypeptid og trombolytisk middel administrert til et individ samtidig. For eksempel, som en blanding eller en sammensetning omfattende nevnte komponenter. Eksempler inkluderer, men er ikke begrenset til en oppløsning administrert intravenøst, en tablett, væske, topikal krem, etc., hvori hvert preparat omfatter komponentene av interesse.

Ved separate administrasjonsmidler blir polypeptid og trombolytisk middel administrert til et individ samtidig eller hovedsakelig samtidig.

Komponentene er til stede I settet som separate, ublandede preparater. For eksempel, kan polypeptid og trombolytisk middel være til stede i settet som individuelle tabletter. Tablettene kan bli administrert til individet ved svelging av begge tablettene samtidig, eller en tablett direkte etter den andre.

Ved sekvensielle administrasjonsmidler blir polypeptid og trombolytisk middel administrert til et individ sekvensielt. Polypeptidet og det trombolytiske middelet er til stede I settet som separate, ublandede preparater. Ser er et tidsintervall mellom dosene. For eksempel, kan en komponent bli administrert opp til 336, 312, 288, 264, 240, 216, 192, 168, 144, 120, 96, 72, 48, 24, 20, 16, 12, 8, 4, 2, 1, eller 0.5 time etter den andre komponenten.

I sekvensiell administrasjon, kan en komponent bli administrert en gang, eller et hvilket som helst antall ganger og i forskjellige doser før og/eller etter administrasjon av den andre komponenten. Sekvensiell administrasjon kan være kombinert med samtidig eller sekvensiell administrasjon.

De medisinske anvendelsene av polypeptidet ifølge foreliggende beskrivelse beskrevet nedenfor, gjelder også sammensetningen omfattende et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse og minst ett polypeptid trombolytisk middel, for samtidig, separat eller sekvensiell administrasjon til et individ som beskrevet her ovenfor.

Trombolytisk midler ifølge foreliggende beskrivelse kan inkludere, for eksempel, staphylokinase, vevsplasminogen aktivator, streptokinase, enkeltkjede streptokinase, urokinase og acyl plasminogen streptokinase kompleks.

Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse kan bli slått sammen for å danne et hvilket som helst polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse beskrevet heri omfattende mer enn ett Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse ved bruk av fremgangsmåter som er kjent i teknikken eller en hvilken som helst fremtidig fremgangsmåte. For eksempel, kan de bli fusert ved kjemisk tverrbinding ved reaksjon av aminosyrerester med et organisk derivatiseringsmiddel slik som beskrevet av Blattler et al, Biochemistry 24,1517-1524; EP294703. Alternativt, kan Nanobodiet ifølge foreliggende beskrivelse kan bli fusert genetisk ved DNA-nivå dvs. dannet et polynukleotid konstrukt for med sin koder for det fullstendige polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse omfattende en eller flere anti-mål Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse og en eller flere anti-serumprotein Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse. En fremgangsmåte for fremstilling av bivalent eller multivalent VHH polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse er beskrevet i PCT patentsøknaden WO 96/34103. En måte for å forbinde multiple Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse er via den genetiske rute ved linking av Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse kodende sekvenser enten direkte eller via en peptidlinker. For eksempel, kan den C-terminale enden av det første Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse bli linket til den N-terminale enden av det neste Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse. Denne linkingmodus kan bli forlenget for å linke ytterligere Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse for konstruksjon og produksjon av tri-, tetra-, etc. funksjonelle konstrukter.

Polypeptidet ifølge foreliggende beskrivelse beskrevet heri kan bli fremstilt av fagmannen ifølge fremgangsmåter som er kjent i teknikken eller en hvilken som helst fremtidig fremgangsmåte. For eksempel, kan VHHs bli oppnådd ved bruk av fremgangsmåter som er kjent i teknikken slik som ved immunisering av en kamel og fremskaffelse av hybridomas fra dette, eller ved kloning av et bibliotek av Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse ved bruk av molekylære biologiske teknikker i teknikken og påfølgende seleksjon ved bruk av fagdisplay.

Nanobodies har en unik struktur som består av et enkelt variabelt domene. VHH molekyler avledet fra Kamelidae antistoff er blant de minste intakte antigenbindende domener som er kjent (ca.15 kDa, eller 10 ganger mindre enn et konvensjonelt IgG) og er således vel tilpasset for levering til tette vev og for å få tilgang til det begrensede rommet mellom makromolekylene som deltar i eller starter prosessen ved blodplatemediert aggregering.

Trass den lille størrelsen til nanobodies, og således fordelene for penetrering, er det likevel overraskende at et slikt lite molekyl kan hemme interaksjonen mellom store polymerer slik som vWF (opp til 60 monomerer) og kollagen og med en slik høy effektivitet. Det har blitt beskrevet at kun de store multimere former av vWF er hemostatisk aktive (Furlan, M,.1996, Ann.

Hematol. 72:341-348). Binding av multimere vWF til kollagen opptrer med ~100-ganger høyere affinitet enn binding av monomere vWF fragmenter.

Resultatene fra høy-skjær eksperimentene indikere at en lavere dose kan bli administrert til pasienter. Derfor, er færre bieffekter forventet (slik som immunogenisitets eller blødningsproblemer).

Ifølge en annet utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse, omfatter et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse et eller flere Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse rettet mot det samme mål, og omfatter videre et eller flere Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse rettet mot det samme mål, men mot forskjellige epitoper i det samme domene.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse hvori antallet av Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse rettet mot det samme target er to eller flere.

Ifølge en annet utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse, omfatter et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse et eller flere Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse rettet mot ett domene av det samme mål, og et eller flere Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse rettet mot det samme mål, men mot et annet domene av det samme mål. Eksempler på forskjellig domener kan være A1 og A3 domenene av vWF

Det er et ikke-begrensende aspekt ifølge foreliggende beskrivelse at minst ett VHH rettet mot A1 domenet i et heterospesifikt polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse gjenkjenner den aktive konformasjonen av vWF.

Et slikt polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse kan ha overlegne antitrombotiske effekter sammenlignet med de monomere VHH’s.

Perfusjonseksperiment ble utført i et strømningskammer for å studere blodplateaggregering under høy skjær for å studere effektene av disse polypeptidene ifølge foreliggende beskrivelse.

Oppdagelsen av naturlig forekommende Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse i lama, dromedar og kamel avslørte en ny klasse av terapeutiske molekyler som kombinerer fordelene ved monoklonalt antistoff for eksempel spesifisitet, lav toksisitet med fordelene ved små molekyler for eksempel vevspenetrering og stabilitet. Uheldigvis, har utviklingen av passende terapeutiske produkter basert på disse proteinene ulempen ved å være kamelavledet, og således ikke human. Ikke-humane proteiner inneholder aminosyrerester som kan være immunogene når injisert i en human pasient. Selv om studier har vist at Kamelidae-avledede VHH ikke er immunogene når injisert i mus, er erstatning av Kamelidae-rester med humane rester foretrukket. Disse humaniserte polypeptidene skulle være hovedsakelig ikke-immunogene i mennesker, men opprettholder affiniteten og aktiviteten til villtype polypeptidet.

Resultatene or humanisering er fortrinnsvis at immunogenisitet etter administrasjon i humane pasienter er mindre eller ikke-eksisterende.

Humanising av et polypeptid, ifølge foreliggende beskrivelse, omfatter et trinn ved å erstatte en eller flere av Kamelidae aminosyrene med deres humane motparter som funnet i den humane konsensussekvensen, uten at polypeptidet mister sin typiske karakter, dvs. humanisering påvirker hovedsakelig ikke antigen bindingkapasiteten til det resulterende polypeptidet.

WO 04/062551 og den videre beskrivelse heri beskriver noen foretrukne, men ikke-begrensende eksempler på aminosyrerester av antistoff variabelt domenet (VHH) som kan bli modifisert uten å redusere den native affinitet til domenet for antigen og mens det reduserer dets immunogenisitet med hensyn til en heterolog art; anvendelsen av VHHs som har modifikasjoner ved de identifiserte rester som er nyttige for administrasjon til heterologe arter; og til det således modifiserte VHH. Mer spesifikt, omfatter foreliggende beskrivelse også fremstillingen av modifiserte VHHs, som er modifisert for administrasjon til mennesker, de resulterende VHH, og anvendelsen av slike "humaniserte" VHHs i behandling av sykdommer i mennesker.

Som nevnt i WO 04/062551 og i den videre beskrivelse heri, krever humanisering av VHH polypeptider introduksjonen og mutagenen av kun et begrenset antall aminosyrer i en enkel polypeptidkjede uten dramatisk tap av binding og/eller inhiberingsaktivitet. Dette er I contrast til humanisering av scFv, Fab, (Fab)2 og IgG, som krever introduksjonen av aminosyreendringer i to kjeder, den lette og tunge kjede og konserveringen av sammensetningen begge kjeder.

En humaniseringsteknikk kan bli utført ved en fremgangsmåte omfattende erstatningen av en hvilken som helst av de følgende rester enten alene eller i kombinasjon: FR1 posisjoner 1, 5, 28 og 30, hallmark aminosyren i posisjon 37, 44, 45 og 47 i FR2, FR3 rester 74, 75, 76, 83, 84, 93 og 94 og posisjoner 103, 104, 108 og 111 i FR4 ; nummereringen ifølge Kabat nummereringen.

Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse har en høy grad av homologi med human kimlinje VH DP-47. Videre kan humanisering også omfatte introduksjonen og mutagenesen av en begrenset mengde aminosyrer i en enkel polypeptidkjede. Dette er i kontrast til humanisering av scFv, Fab, (Fab)2 og IgG, Som krever introduksjonen av aminosyrenendringer i to kjeder, den lette og den tunge kjeden og konservering av sammensetningen av to kjeder.

Polypeptidene inneholder human-liknende rester i FR2. Humanisering kan også omfatte mutagenese av rester i FR1 i posisjon 1 og 5 som ble introdusert ved primeren benyttet for repertoarkloning og opptrer ikke naturlig i lamasekvensen. Mutagenese av de restene resulterte ikke I tap av binding og/eller inhiberingsaktiviteten. Humanisering av FR1 krever også mutagenese av posisjon 28 og 30. Mutagenese av de restene resulterer heller ikke i tap av binding og/eller inhiberingsaktivitet.

Humanisering kan også omfatte mutagenese av rester in FR3 i posisjon 74, 75, 76, 83, 84, 93, 94. Mutagenese av de rester resulterte ikke i tap av binding og/eller inhiberingsaktivitet.

Humanisering kan også involvere mutagenese av rester i FR4 i posisjon 104, 108 og 111. Mutagenese av Q108L resulterer i lavere produksjonsnivåer i Escherichia coli. Posisjon 108 er løsemiddeleksponert i kamelid VHH, mens i humant antistoff denne begravet i VH-VL grenseflaten (Spinelli, 1996; Nieba, 1997). I isolert VHs er posisjon 108 løsemiddeleksponert. Introduksjonen av en ikke-polar hydrofob Leu i stedet for polar uladet Gln kan gi en drastisk effekt på en intrinsiske foldbarhet/stabilitet til molekylet.

En utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er en fremgangsmåte for humanisering av et VHH omfattende trinnet:

(a) erstatning av en hvilken som helst av de følgende rester enten alene eller i kombinasjon:

FR1 posisjoner 1, 5, 28 og 30,

hallmark aminosyren i posisjon 37, 44, 45 og 47 i FR2,

FR3 rester 74, 75, 76, 83, 84, 93 og 94 ,

og posisjoner 103, 104, 108 og 111 i FR4 ;

nummereringen ifølge Kabat nummereringen.

Eksempler på slike humanisert sekvenser er gitt nedenfor og i den vedlagte sekvenslisting.

Anvendelse av antistoff avledet fra kilder slik som mus, sau, geit, kanin etc., og humaniserte derivater derav som en behandling for tilstander som krever en modulering av blodplate-assosiert aggregering, er problematisk av flere grunner. Tradisjonelt er antistoff ikke stabilt ved romtemperatur, og må bli avkjølt for preparering og lagring, krever nødvendig avkjølt laboratorieutstyr, lager og transport, noe som bidrar til tid og kostnad. Kjøling er noen ganger ikke tilgjengelig i utviklingsland. Utbyttene av ekspresjon av nevnte Fab molekyler er meget lav fremgangsmåtene for produksjon er meget arbeidsintensive. Videre, er fremstillingen eller småskalaproduksjonen av nevnte antistoff kostbar på grunn av det mammalske cellulære systemet som er nødvendig for ekspresjon av intakt og aktivt antistoff somkrever høye nivåer av støtte hva angår tid og utstyr og utbyttene er meget lave. Videre, har tradisjonelle antistoff en bindingsaktivitet som avhenger av pH, og er således upassende for anvendelse i miljøer utenfor det fysiologiske pH-området, slik som, for eksempel, ved behandling av mageblødning, gastrisk kirurgi. Videre, er tradisjonelle antistoff ustabile ved lav eller høy pH og passer således ikke for oral administrasjon. Imidlertid, hard et blitt vist at kamelid antistoff motstår tøffe betingelser, slik som ekstrem pH, denatureringsmidler og høye temperaturer (Ewert S et al, Biochemistry 2002 Mar 19;41(11):3628-36), noe som gjør dem passende for levering ved oral administrasjon. Videre, har tradisjonelle antistoff en bindingsaktivitet som avhenger av temperatur, og passer således ikke for anvendelse analyser eller sett utført ved temperaturer utenfor biologisk aktivetemperaturområder (f.eks.37 ± 20ºC).

Nanobodies og polypeptider ifølge foreliggende beskrivelse innehar ikke kun fordelaktige karakteristikker til konvensjonelt antistoff, slik som lav toksisitet og høy selektivitet, men de viser også ytterligere egenskaper. De er mer oppløselige, noe som betyr at de kan bli lagret og/eller administrert i høyere konsentrasjoner sammenlignet med konvensjonelt antistoff. De er stabile ved romtemperatur noe som betyr at de kan bli fremstilt, lagret og/eller transportert uten anvendelsen av kjøleutstyr, noe som gir en kostnads-, tids- og miljøinnsparing. Andre fordelaktige karakteristikker sammenlignet med konvensjonelt antistoff inkluderer kort halveringstid i sirkulasjonen som kan bli modulert ifølge foreliggende beskrivelse ved, for eksempel, albumin-kopling, et bispesifikt nanobody med en spesifisitet mot albumin og den andre mot målet, Fc kopling, VHH kopling (bivalent VHHs) eller ved pegylering. En kort og kontrollerbar halveringstid er ønskelig for kirurgiske prosedyrer, for eksempel, om krevere en inhibering av blodplate-mediert aggregering for en a begrenset tidsperiode. Også når blødningsproblemer opptrer, eller andre komplikasjoner, kan doseringen bli redusert umiddelbart. Polypeptidene ifølge foreliggende beskrivelse opprettholder også bindingsaktivitet ved en pH og temperatur på utsiden av de vanlige fysiologiske områdene, noe som betyr at de kan vøre nyttige i situasjoner med ekstrem pH og temperaturer som krever en modulering av blodplate-mediert aggregering, slik som ved gastrisk kirurgi, kontroll mageblødning, analyser utført ved romtemperatur etc. Polypeptidene ifølge foreliggende beskrivelse utviser også en forlenget stabilitet ved ekstremer av pH, noe som betyr at de vil passe for levering ved oral administrasjon.

Polypeptidene ifølge foreliggende beskrivelse kan bli kost-effektivt produsert ved fermentering i passende rekombinante vertsorganismer slik som Escherichia coli og gjær; til forskjell fra konvensjonelle antistoffer som også krever kostbare mammalske cellekulturfasiliteter, oppnåelige nivåer av ekspresjon er høy. Eksempler på utbytter av polypeptidene ifølge foreliggende beskrivelse er 1 til 10 mg/ml (E. coli) og opp til 1g/l (gjær). Polypeptidene ifølge foreliggende beskrivelse viser også høy bindingsaffinitet for et bredt område av forskjellige antigentyper, og evnen til å binde til epitoper som ikke blir gjenkjent av konvensjonelt antistoff; for eksempel fremviser de lange CDR-baserte sløyfestrukturer med potensiale til å penetrere inn i kaviteter og gi enzymfunksjonshemming. Videre, siden binding opptrer kun ved CDR3 sløyfen, er det antatt at peptider avledet fra CDR3 kan bli benyttet terapeutisk (Desmyter et al., J Biol Chem, 2001, 276: 26285-90). Polypeptidene ifølge foreliggende beskrivelse er også I stand til å opprettholde full bindingskapasitet som fusjonsprotein med et enzym eller toksin. Videre, kan det bli forventet at den uønskede trombocytopenia forårsaket av Fc:Fc reseptormediert aktivering av blodplateaggregering og/eller F(ab')(2)-mediert tverrbinding av blodplates som har blitt observert ved bruk av intakt IgG eller F(ab')(2) terapeutisk in vivo (se Cauwenberghs N. et al, Arteriosclerosis, Trombose og Vaskulært biology, 2000, 20: 1347), vil bli unngått ved anvendelse av VHH, siden VHH ikke inneholder noe Fc og det ikke er bivalent. Således fremskaffer polypeptidene ifølge foreliggende beskrivelse, homologer eller funksjonelle deler derav en betydelig innsparing i tid og kostnad i behandling og diagnose av betingelser relatert til blodplate-mediert aggregering, og pasienten med behov for nevnte polypeptider vil møte færre problemer assosiert med konvensjonelle midler.

Blodplate-mediert aggregering er prosessen hvori vWF-bundet collagen fester seg til blodplater og/eller blodplatereseptorer, for til sist å resultere i blodplateaktivering. Blodplateaktivering fører til fibrinogenbinding, og til sist til blodplateaggregering. Det er innen rammen ifølge foreliggende beskrivelse å fremskaffe polypeptider som modulerer prosessensom omfatter blodplatemediert aggregering slik som vWF-collagen binding, vWF-blodplate reseptoradhesjon, collagen-blodplate reseptoradhesjon, blodplate aktivering, fibrinogenbinding og/eller blodplateaggregering.

Ifølge et aspekt ifølge foreliggende beskrivelse kan et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse være en homolog sekvens av et fullengde polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse. Ifølge et annet aspekt ifølge foreliggende beskrivelse, kan et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse være en funksjonell del av et fullengde polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse. Ifølge et annet aspekt ifølge foreliggende beskrivelse, kan t polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse være en homolog sekvens av et fullengde polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse. Ifølge et annet aspekt ifølge foreliggende beskrivelse, kan et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse være en funksjonell del av en homolog sekvens av et fullengde polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse. Ifølge et aspekt ifølge foreliggende beskrivelse kan et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse omfatte en sekvens av et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse.

Ifølge et aspekt ifølge foreliggende beskrivelse kan et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse benyttet for å danne et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse, være et fullstendig Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse (f.eks. et VHH) eller en homolog sekvens derav. Ifølge et annet aspekt ifølge foreliggende beskrivelse, kan et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse benyttet for å danne polypeptidet ifølge foreliggende beskrivelse være en funksjonell del av et komplett Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse. Ifølge et annet aspekt ifølge foreliggende beskrivelse, kan et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse benyttet for å danne polypeptidet ifølge foreliggende beskrivelse være en homolog sekvens av et komplett Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse. Ifølge et annet aspekt ifølge foreliggende beskrivelse, kan et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse benyttet for å danne polypeptidet ifølge foreliggende beskrivelse være en funksjonell del av en homolog sekvens av et komplett Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse.

Ifølge et annet aspekt ifølge foreliggende beskrivelse kan et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse være en homolog sekvens av den parentale sekvensen. Ifølge et annet aspekt ifølge foreliggende beskrivelse, kan et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse være en funksjonell del av den parentale sekvensen. Ifølge et annet aspekt ifølge foreliggende beskrivelse, kan et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse være funksjonell del av en homolog sekvens av den parentale sekvensen.

Som benyttet heri, kan en homolog sekvens omfatte addisjon, delesjoner eller substitusjoner av en eller flere aminosyrer, som ikke betydelig endrer de funksjonelle karakteristikker til polypeptidet. Antallet av aminosyredelesjoner eller -substitusjoner er fortrinnsvis opp til 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 eller 70 aminosyrer.

En homolog sekvens ifølge foreliggende beskrivelse inkluderer polypeptider forlenget ved addisjon av aminosyrer for å danne humane tungkjede antistoff eller human enkelt domene tungkjede antistoff, som ikke betydelig endrer de funksjonelle karakteristikker til det umodifiserte polypeptidet.

Hvor homologe sekvens indikerer sekvensidentitet, er det ment en sekvens som representerer en høy sekvensidentitet (mer enn 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% eller 98% sekvensidentitet) med den parentale sekvensen, og fortrinnsvis er karakterisert ved liknende egenskaper til den parentale sekvensen, nemlig affinitet, hvor nevnte identitet er beregnet ved bruk av kjente fremgangsmåter.

Alternativt, kan en homolog sekvens også være en hvilken som helst aminosyresekvens som er resultat av tillatte substitusjoner ved et hvilket som helst antall posisjoner of den parentale sekvensen ifølge formelen nedenfor: Ser substituert med Ser, Thr, Gly, og Asn;

Arg substituert med en av Arg, His, Gln, Lys, og Glu;

Leu substituert med en av Leu, Ile, Phe, Tyr, Met, og Val;

Pro substituert med en av Pro, Gly, Ala, og Thr;

Thr substituert med en av Thr, Pro, Ser, Ala, Gly, His, og Gln;

Ala substituert med en av Ala, Gly, Thr, og Pro;

Val substituert med en av Val, Met, Tyr, Phe, Ile, og Leu;

Gly substituert med en av Gly, Ala, Thr, Pro, og Ser;

Ile substituert med en av Ile, Met, Tyr, Phe, Val, og Leu;

Phe substituert med en av Phe, Trp, Met, Tyr, Ile, Val, og Leu;

Tyr substituert med en av Tyr, Trp, Met, Phe, Ile, Val, og Leu;

His substituert med en av His, Glu, Lys, Gln, Thr, og Arg;

Gln substituert med en av Gln, Glu, Lys, Asn, His, Thr, og Arg;

Asn substituert med en av Asn, Glu, Asp, Gln, og Ser;

Lys substituert med en av Lys, Glu, Gln, His, og Arg;

Asp substituert med en av Asp, Glu, og Asn;

Glu substituert med en av Glu, Asp, Lys, Asn, Gln, His, og Arg;

Met substituert med en av Met, Phe, Ile, Val, Leu, og Tyr.

En homolog ifølge foreliggende beskrivelse kan referere til nukleotidsekvenser med mer enn 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 800 eller 1000 nukleotider som er i stand til å hybridisere til det reverse-komplement av nukleotidsekvens som koder for et polypeptid under stringente hybridiseringsbetingelser (slik som de beskrevet av SAMBROOK et al., Molecular Cloning, Laboratory Manuel, Cold Spring, Harbor Laboratory press, New York).

Som benyttet heri, refererer funksjonell del til et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse med tilstrekkelig lengde slik at interaksjonen av interesse blir oppretthold med affinitet på 1 x 10-6 M eller bedre.

Alternativt omfatter en funksjonell del av et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse en partiell delesjon av den komplette aminosyresekvensen og opprettholder fremdeles bindingssetet(ne) og proteindomenet(ne) som er nødvendige for binding av og interaksjon med målet.

Alternativt er en funksjonell del av et hvilket som helst Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse et polypeptid som omfatter en partiell delesjon av den komplette aminosyresekvens og som fremdeles opprettholder bindingssetet(ne) og proteindomenet(ene) som er nødvendig for inhibering av binding av vWF til kollagen.

Alternativt er en funksjonell del av et hvilket som helst Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse et polypeptid som omfatter en partiell delesjon av den komplette aminosyresekvens og som fremdeles opprettholder bindingsitet(ene) og proteindomenet(ene) som er nødvendige for binding av og interaksjon med A1 domenet til vWF.

Alternativt er en funksjonell del av et hvilket som helst Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse et polypeptid som omfatter en partiell delesjon av den komplette aminosyresekvens og som fremdeles opprettholder bindingssetet(ene) og proteindomenet(ene) som er nødvendige for binding av og interaksjon med kollagen.

Alternativt omfatter en funksjonell del en partiell delesjon av den komplette aminosyresekvens til et polypeptid og som opprettholder bindingssetet(ene) og proteindomenet(ene) som er nødvendige for bindingen av og interaksjonen med antigenet mot hvilket det er rettet. Det inkluderer, men is ikke begrenset til VHH domener.

Som benyttet heri, refererer en funksjonell del som refererer til en polypeptidsekvens til mindre enn 100% av sekvensen (f.eks., 99%, 90%, 80%, 70%, 60% 50% etc.), men omfattende 5 eller flere aminosyrer.

En del som den refererer til en nukleotidsekvens som koder for en polypeptidsekvens refererer til mindre enn 100% av sekvensen (f.eks., 99%, 90%, 80%, 70%, 60% 50% etc.), men omfattende 15 eller flere nukleotider.

Et aspekt ifølge foreliggende beskrivelse er at administrasjonen av et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse ifølge foreliggende beskrivelse kan unngå behovet for injeksjon. Konvensjonelle antistoff-baserte terapeutika har signifikant potensial som medikamenter da de har en utsøkt spesifisitet for sine mål og lav egentoksisitet, imidlertid, har de en viktig ulempe, de er relativt ustabile, og er sensitive for nedbrytning av proteaser. Dette betyr at konvensjonelle antistoffmedikamenter ikke kan bli administrert oralt, sublingualt, topikalt, nasalt, vaginalt, rektalt eller ved inhalasjon da de ikke er resistente overfor lav pH på disse stedene, virkningen av proteaser på disse stedene og i blodet og/eller på grunn av sin store størrelse. De må bli administrert ved injeksjon (intravenøst, subkutant, etc.) for å overvinne noen av disse problemene. Administrasjon ved injeksjon krever spesialtrening for å anvende en medisinsk sprøyte eller nål korrekt og sikkert. Videre krever det sterilt utstyr, en væskeformulering av det terapeutiske polypeptidet, glasspakking av nevnte polypeptid i en steril og stabil form og for individet, et passende sted til å stikke nålen. Videre erfarer individet vanligvis psykisk og fysisk stress før og ved mottak av en injeksjon.

Et aspekt ifølge foreliggende beskrivelse overvinner disse problemene ifølge kjent teknikk ved å fremskaffe polypeptidkonstruktene ifølge foreliggende beskrivelse. Nevnte konstrukter er tilstrekkelig små, resistente og stabile til å bli levert oralt, sublingualt, topikalt, nasalt, vaginalt, rektalt eller ved inhalasjon hovedsakelig uten tap av aktivitet. Polypeptidkonstruktene ifølge foreliggende beskrivelse unngår behovet for injeksjoner, er ikke bare kostnads og tidsbesparende, men er også mer behagelig og komfortabelt for individet.

En utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse for anvendelse ved behandling, forhindring og/eller letting av symptomene på forstyrrelser som er mottakelig for modulering ved et stoff som kontroller blodplatemediert aggregering om er i stand til å passere gjennom magemiljøet uten at stoffet blir inaktivert.

Som det er kjent av fagmannen i teknikken, kan straks man innehar nevnte polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse, kan formuleringsteknologien bli benyttet for å frigi en maksimal mengde av polypeptid på det rette stedet (i magesekken, i colon, etc.). Denne fremgangsmåte for tilførsel er viktig for behanlding, forhindring og/eller letting av symptomer på forstyrrelser hvis mål er lokalisert i fordøyelsessystemet.

Et aspekt ifølge foreliggende beskrivelse er en fremgangsmåte for behandling, forhindring og/eller letting av symptomene på en forstyrrelse som er mottakelig for modulering av et stoff som kontrollerer blodplatemediert aggregering som er i stand til å passere gjennom det gastriske miljø uten å bli inaktivert, ved oral administrering til et individ av et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er en anvendelse av et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse for fremstillingen av et medikament for behandling, forhindring og/eller letting av symptomene på forstyrrelser som er mottakelige for modulering av et stoff som kontrollerer blodplatemediert aggregering som er i stand til å passere gjennom det gastriske miljø uten å bli inaktivert.

Et aspekt ifølge foreliggende beskrivelse er en fremgangsmåte for levering av et stoff som kontrollerer blodplatemediert aggregering til tarmsystemet uten at nevnte stoff blir inaktivert, ved oral administrering til et individ av et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse.

Et aspekt ifølge foreliggende beskrivelse er en fremgangsmåte for levering av et stoff som kontrollerer blodplatemediert aggregering til blodstrømmen til et individ uten at stoffet blir inaktivert, ve oral administrering til et individ av et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse for anvendelse i behandling, forhindring og/eller letting av symptomene eller forstyrrelser mottakelig for modulering av et stoff som kontrollerer blodplatemediert aggregering levert til den vaginale og/eller rektale trakt.

I et ikke-begrensende eksempel, omfatter en formulering ifølge foreliggende beskrivelse et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse, i form av en gel, krem, stikkpille, film, eller i form av en svamp eller som en vaginal ring som sakte frigir den aktive ingrediens over tid (slike formuleringer er beskrevet i EP 707473, EP 684814, US 5629001).

Et aspekt ifølge foreliggende beskrivelse er en fremgangsmåte for behandling, forhindring og/eller letting av symptomene på forstyrrelser mottakelig for modulering av et stoff som kontrollerer blodplatemediert aggregering levert til den vaginale og/eller rektale trakt, ved vaginal og/eller rektal administrering til et individ av et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er en anvendelse av et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse for fremstillingen av et medikament for behandling, forhindring og/eller letting av symptomene på forstyrrelser mottakelig for modulering av et stoff som kontrollerer blodplatemediert aggregering levert til den vaginale og/eller rektale trakt.

Et aspekt ifølge foreliggende beskrivelse er en fremgangsmåte for levering av et stoff som kontrollerer blodplatemediert aggregering til den vaginale og/eller rektale trakt uten at nevnte stoff blir inaktivert, ved administrering til den vaginale og/eller rektale trakt til et individ, et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse.

Et aspekt ifølge foreliggende beskrivelse er en fremgangsmåte for levering av et stoff som kontrollerer blodplatemediert aggregering il blodstrømmen til et individ uten at nevnte stoff blir inaktivert, ved administrering til den vaginale og/eller rektale trakt til et individ, et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse, for anvendelse i behandling, forhindring og/eller letting av symptomene på forstyrrelser som er mottakelige for modulering av et stoff som kontrollerer blodplatemediert aggregering levert til nesen, den øvre respiratoriske trakt og/eller lunge.

I et ikke-begrensende eksempel, omfatter en formulering ifølge foreliggende beskrivelse, et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse i form av en nasal spray (f.eks. en aerosol) eller inhalator. Siden Nanobodiet eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse er lite, kan det nå sitt mål mye mer effektivt enn terapeutiske IgG molekyls.

Et aspekt ifølge foreliggende beskrivelse er en fremgangsmåte for behandling, forhindring og/eller letting av symptomene av forstyrrelser som er mottakelig for modulering av et stoff som kontrollerer blodplatemediert aggregering levert til den øvre respiratoriske trakt og lunge, ved administrering til et individ et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse, ved inhalasjon gjennom munnen eller nesen.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er en anvendelse av et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse for fremstillingen av et medikament for behandling, forhindring og/eller letting av symptomene på forstyrrelser som er mottakelig for modulering av et stoff som kontrollerer blodplatemediert aggregering levert til nesen, øvre respiratoriske trakt og/eller lunge, uten at nevnte polypeptid blir inaktivert.

Et aspekt ifølge foreliggende beskrivelse er en fremgangsmåte for levering av et stoff som kontrollerer blodplatemediert aggregering til nesen, øvre respiratoriske trakt og lunge uten inaktivering, ved administrering til nesen, øvre respiratoriske trakt og/eller lunge til et individ av et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse.

Et aspekt ifølge foreliggende beskrivelse er en fremgangsmåte for levering av et stoff som kontrollerer blodplatemediert aggregering til blodstrømmen til et individ uten inaktivering ved administrering til nese, øvre respiratoriske trakt og/eller lunge til et individ av et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse.

En utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse for anvendelse i behandling, forhindring og/eller letting av symptomene på forstyrrelser som er mottakelig for modulering av et stoff som kontrollerer blodplatemediert aggregering levert til den intestinale mucosa, hvori nevnte forstyrrelse øker permeabiliteten til den intestinale mucosa. På grunn av sin lille størrelse, kan et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse passere gjennom den intestinale mucosa og nå blodstrømmen mer effektivt i individer som lider av forstyrrelser som forårsaker en økning i permeabiliteten til den intestinale mucosa.

Et aspekt ifølge foreliggende beskrivelse er en fremgangsmåte for behandling, forhindring og/eller letting av symptomene på forstyrrelser som er mottakelig for modulering av et stoff som kontrollerer blodplatemediert aggregering levert til den intestinale mucosa, hvori nevnte forstyrrelse øker permeabiliteten til den intestinale mucosa, ved oral administrering til et individ av et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse.

Denne prosessen kan ytterligere bli fremmet ved et ytterligere aspekt ifølge foreliggende beskrivelse - anvendelsen av aktive transportbærere. Ifølge dette aspekt ifølge foreliggende beskrivelse, blir VHH sammenføyd med en bærer om fremmer overføringen gjennom den intestinale vegg inn i blodstrømmen. I et ikke-begrensende eksempel, er denne “bæreren” et andre VHH som er sammenføyd til det terapeutiske VHH. Slike fusjonskonstrukter blir fremstilt ved bruk av fremgangsmåter som er kjent i teknikken. “Bæreren” VHH binder spesifikt til en reseptor på den intestinale vegg som induserer en aktiv overføring gjennom veggen.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er en anvendelse av et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse for fremstillingen av et medikament for behandling, forhindring og/eller letting av symptomene på forstyrrelser som er mottakelig for modulering av et stoff som kontrollerer blodplatemediert aggregering levert til den intestinale mucosa, hvori nevnte forstyrrelse øker permeabiliteten til den intestinale mucosa.

Et aspekt ifølge foreliggende beskrivelse er en fremgangsmåte for levering av et stoff som kontrollerer blodplatemediert aggregering til den intestinale mucosa uten å bli inaktiverte, ved administrering oralt til et individ av et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse.

Et aspekt ifølge foreliggende beskrivelse er en fremgangsmåte for levering av et stoff som kontrollerer blodplatemediert aggregering til blodstrømmen til et individ uten å bli inaktivert, ved administrering oralt til et individ av et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse.

Denne prosessen kan bli ytterligere fremmet ved et ytterligere aspekt ifølge foreliggende beskrivelse - anvendelsen av aktive transportbærere. Ifølge dette aspekt ifølge foreliggende beskrivelse, blir et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse som beskrevet heri sammenføyd med en bærer som fremmer overføringen gjennom den intestinale vegg inn i blodstrømmen. I et ikke-begrensende eksempel, er denne “bæreren” et VHH som er sammenføyd med nevnte polypeptid. Slike fusjonskonstrukter blir fremstilt ved bruk av fremgangsmåter som er kjent i teknikken. “Bæreren” VHH binder spesifikt til en reseptor på den intestinale vegg som induserer en aktiv overføring gjennom veggen.

En utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse for anvendelse i behandling, forhindring og/eller letting av symptomene av forstyrrelser som er mottakelig for modulering av et stoff som kontrollerer blodplatemediert aggregering som er i stand til å passere gjennom vevet under tungen effektivt.. En formulering av nevnte Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse, for eksempel, en tablett, spray, dråpe blir plassert under tungen og adsorbert gjennom mucusmembraner inn i det kapillære nettverket under tungen.

Et aspekt ifølge foreliggende beskrivelse er en fremgangsmåte for behandling, forhindring og/eller letting av symptomene på forstyrrelser som er mottakelig for modulering av et stoff som kontrollerer blodplatemediert aggregering som er i stand til å passere gjennom vevet under tungen effektivt, ved sublingual administrering til et individ av et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er en anvendelse av et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse for fremstillingen av et medikament for behandling, forhindring og/eller letting av symptomene på forstyrrelser mottakelig for modulering av et stoff som kontrollerer blodplatemediert aggregering som er i stand til å passere gjennom vevet under tungen.

Et aspekt ifølge foreliggende beskrivelse er en fremgangsmåte for levering av et stoff som kontrollerer blodplatemediert aggregering til vevet under tungen uten å bli inaktivert, ved administrering sublingualt til et individ av et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse.

Et aspekt ifølge foreliggende beskrivelse er en fremgangsmåte for levering av et stoff som kontrollerer blodplatemediert aggregering til blodstrømmen til et individ uten å bli inaktivert, ved administrering oralt til et individ et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse.

En utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse for anvendelse i behandling, forhindring og/eller letting av symptomene av forstyrrelser som er mottakelig for modulering av et stoff som kontrollerer blodplatemediert aggregering som er i stand til å passere effektivt gjennom huden.

En formulering av nevnte Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse, for eksempel, en krem, film, spray, dråpe, plaster, blir plassert på huden og passerer gjennom.

Et aspekt ifølge foreliggende beskrivelse er en fremgangsmåte for behandling, forhindring og/eller letting av symptomene på forstyrrelser mottakelig for modulering av et stoff som kontrollerer blodplatemediert aggregering som er i stand til å passere effektivt gjennom huden, ved topikal administrering til et individ av et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er en anvendelse av et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse for fremstillingen av et medikament for behandling, forhindring og/eller letting av symptomene av forstyrrelser mottakelig for modulering av et stoff som kontrollerer blodplatemediert aggregering som er i stand til å passere effektivt gjennom huden.

Et aspekt ifølge foreliggende beskrivelse er en fremgangsmåte for levering av et stoff som kontrollerer blodplatemediert aggregering til huden uten å bli inaktivert, ved administrering topikalt til et individ av et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse.

Et aspekt ifølge foreliggende beskrivelse er en fremgangsmåte for levering av et stoff som kontrollerer blodplatemediert aggregering til blodstrømmen til et individ, ved administrering topikalt til et individ av et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse.

Ifølge et annet utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse, omfatter et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse ytterligere et bærer-Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse (f.eks. VHH) som virker som en aktiv transportbærer for transport av nevnte Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse via lungelumen til blodet.

Et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse ytterligere omfattende en bærer som binder spesifikt til en reseptor som er til stede på den mucosale overflate (bronkiale epitelceller) som resulterer i aktiv transport av polypeptidet fra lungelumen til blodet. Bærer-Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse kan bli sammenføyd med Nanobodiet eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse. Slike fusjonskonstrukter er fremstilt ved bruk av fremgangsmåter som er kjent i teknikken og er beskrevet heri. “Bærer”-Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse binder spesifikt til en reseptor på den mucosale overflaten som induserer en aktiv transport gjennom overflaten.

Et annet aspekt ifølge foreliggende beskrivelse er en fremgangsmåte for å bestemme hvilke Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse (f.eks. VHHs) som blir aktivt transportert inn i blodstrømmen etter nasal administrasjon.

Tilsvarende kan et nativt eller immun VHH fagbibliotek bli administrert nasalt, og etter forskjellig tidspunkter etter administrasjon, kan blod eller organer bli isolert for å gjenvinne fag som har blitt aktivt transportert til blodstrømmen. Et ikkebegrensende eksempel på en reseptor for aktiv transport fra lungelumen til blodstrømmen er Fc reseptoren N (FcRn). Ett aspekt ifølge foreliggende beskrivelse inkluderer VHH molekyler som er identifisert ved fremgangsmåten. Slike VHH kan så bli benyttet som en bærer VHH for leveringen av terapeutisk VHH til det korresponderende mål i blodstrømmen etter nasal administrasjon.

En utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse for anvendelse i behandling, forhindring og/eller letting av symptomene av forstyrrelser vedrørende blodplate-mediert aggregering eller dysfunksjon derav. Nevnte forstyrrelser inkluderer ,trombotisk trombocytopeniskpurpura (TTP), transient cerebral iskemisk anfall, ustabil eller stabil angina pectoris, cerebral infarkt, myocardial infarkt, perifer arteriell okklusive sykdom, restenosis. nevnte forstyrrelser inkluderer videre de med opphav i koronar by-pass graft, koronar arterie ventilerstatning og koronar intervensjoner slik som angioplasti, stenting, eller aterectomi.

Andre forstyrrelser er en hvilken som helst av dannelsen av en ikkeokklusiv trombus, dannelsen av en okklusiv trombus, arteriell trombusdannelse, akuttkoronar okklusjon, restenosis, restenosis etter PCTA eller stenting, trombusdannelse i stenoserte arterier, hyperplasi etter angioplasti, aterectomi eller arteriell stenting, okklusivt syndrom i et vaskulært system eller mangel på åpenhet i syke arterier.

Ett aspekt ifølge foreliggende beskrivelse er et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse for anvendelse t behandling, forhindring og/eller lettelse av forstyrrelser eller betingelser vedrørende blodplate-mediert aggregering eller dysfunksjon derav, hvori nevnte Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse blir administrert intravenøst, subkutant, oralt, sublingualt, topikalt, nasalt, vaginalt, rektalt eller ved inhalasjon.

Et annet aspekt ifølge foreliggende beskrivelse er anvendelsen av et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse for fremstillingen av et medikament for behandling, forhindring og/eller letting av forstyrrelser eller betingelser vedrørende blodplate-mediert aggregering eller dysfunksjon derav, hvori nevnte Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse blir administrert intravenøst, subkutant, oralt, sublingualt, topikalt, nasalt, vaginalt, rektalt eller ved inhalasjon.

Et annet aspekt ifølge foreliggende beskrivelse er en fremgangsmåte for behandling, forhindring og/eller letting av forstyrrelser eller betingelser vedrørende blodplate-mediert aggregering eller dysfunksjon derav, omfattende administrering til et individ av et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse, hvori nevnte heterospesifikk Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse blir administrert intravenøst, subkutant, oralt, sublingualt, topikalt, nasalt, vaginalt, rektalt eller ved inhalasjon.

Et annet aspekt ifølge foreliggende beskrivelse er et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse for anvendelse t behandling, forhindring og/eller letting av forstyrrelser eller betingelser vedrørende blodplate-mediert aggregering eller dysfunksjon derav.

Et annet aspekt ifølge foreliggende beskrivelse er en anvendelse av et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse for fremstillingen av et medikament for behandling, forhindring og/eller letting av forstyrrelser eller betingelser vedrørende blodplate-mediert aggregering eller dysfunksjon derav.

Man kan anvende et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse ifølge foreliggende beskrivelse for å screene for midler som modulerer bindingen av polypeptidet til et vWF. Når identifisert i en analyse malinger av binding eller erstatning av nevnte polypeptid displacement alene, må midler bli utsatt for funksjonell testing for å bestemme om de virker som modulatorer av blodplate-mediert aggregering. Noen eksempler på passende screening fremgangsmåter er diskutert i WO 04/062551. Naturligvis kan disse fremgangsmåter enkelt bli benyttet for screening for kandidatmodulatorer som endrer bindingen mellom Nanobodiet eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse beskrevet heri og vWF.

En celle som er nyttig ifølge foreliggende beskrivelse er fortrinnsvis er valgt fra gruppen bestående av bakterielle celler slik som, for eksempel, E. coli, gjærceller slik som, for eksempel, S. cerevisiae, P. pastoris, insektceller eller mammalske celler, f.eks. som nevnt ovenfor.

En celle som er nyttig ifølge foreliggende beskrivelse kan være en hvilken som helst celle inn i hvilken en nukleinsyresekvens som koder for et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse kan bli eller har blitt introdusert slik at polypeptidet blir uttrykt ved naturlige nivåer eller over naturlige nivåer, som definert heri. Foretrukket utviser et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse som er uttrykt i en celle normal eller nær normal farmakologi, som definert heri.

Ifølge en foretrukket utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse, er en celle valgt fra gruppen bestående av COS7-celler, en CHO celle, en LM (TK-) celle, en NIH-3T3 celle, HEK-293 celle, K-562 celle eller en 1321N1 astrocytomacelle, men andreandre transfekterbare cellelinjer.

Generelt, betyr “terapeutisk effektiv mengde”, “terapeutisk effektiv dose” og “effektiv mengde” betyr mengden som er nødvendig for å oppnå det ønskede resultat eller resulter (behandling eller forhindring av blodplateaggregering). Fagmannen innen teknikken vil forstå kraften og derfor en “effektiv mengde” kan variere for de forskjellige Nanobodies eller polypeptider som hemmer blodplate-mediert aggregering benyttet i foreliggende beskrivelse. Fagmannen innen teknikken kan enkelt finne raften til Nanobodiet eller polypeptid.

Ved “farmasøytisk akseptabel” blir det ment et materiale som ikke er biologisk eller ellers uønsket, dvs., materialet kan bli administrert til et individ sammen med Nanobodiet eller polypeptid uten å forårsake noen uønskede biologiske effekter eller interaksjon på en skadelig måte med noen av de andre komponentene av den farmasøytiske sammensetningen i hvilke den er inneholdt.

Foreliggende beskrivelse som beskrevet heri er nyttig for behandling eller forhindring av en tilstand av blodplate-mediert aggregering, i et individ og omfattende administrering av en farmasøytisk effektiv mengde av et Nanobody eller polypeptid eller sammensetning som hemmer BTK og som hemmer blodplate-mediert aggregering.

Foreliggende beskrivelse beskrevet heri er nyttig for behandling eller forhindring av det første trinn av trombusdannelse, i et individ og omfattende administrering av en farmasøytisk effektiv mengde av et Nanobody eller polypeptid eller sammensetning ifølge foreliggende beskrivelse.

Foreliggende beskrivelse beskrevet heri er nyttig for behandling eller forhindring av restenose, i et individ og omfattende administrering en farmasøytisk effektiv mengde av et Nanobody eller polypeptid eller sammensetning ifølge foreliggende beskrivelse.

Ett aspekt ifølge foreliggende beskrivelse er anvendelsen av Nanobodies eller polypeptider ifølge foreliggende beskrivelse for behandling eller forhindring en tilstand av blodplate-mediert aggregering, i et individ og omfattende administrering en farmasøytisk effektiv mengde av et Nanobody eller polypeptid i kombinasjon med et annet, slik som, for eksempel, aspirin.

Ett aspekt ifølge foreliggende beskrivelse er anvendelsen av Nanobodies eller polypeptider ifølge foreliggende beskrivelse for behandling eller forhindring en tilstand av blodplate-mediert aggregering, i et individ og omfattende administrering en farmasøytisk effektiv mengde av et Nanobody eller polypeptid i kombinasjon med et annet, slik som, for eksempel, et trombolytisk middel.

Et annet aspekt ifølge foreliggende beskrivelse er en anvendelse av et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse for behandling eller forhindring av plaque eller trombus i et individ. Nevnte plaque- eller trombusdannelse kan være betingelser under ved høyt skjær. I både trombose og reokklusjon, den reversible adhesjon eller festing av blodplatene ved høy skjærrate blir fulgt av sterk adhesjon via kollagenreseptoren på blodplatene som resulterer i blodplateaktivering; vedheften av blodplater ved vWF til kollagen som er eksponert i den skadede karveggen er spesielt viktig under betingelser med høyt skjær. Oppfinnerne har funnet at Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse ifølge foreliggende beskrivelse ga uventet gode resultater under høyskjærbetingelser.

Foreliggende beskrivelse er ikke begrenset til administrasjonen av formuleringer omfattende et enkelt Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse. Det er innen rammen ifølge foreliggende beskrivelse å fremskaffe kombinasjonsbehandlinger hvori en formulering blir administrert til en pasient med behov derav som omfatter mer enn ett Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse.

Betingelser for blodplate-mediert aggregering inkluderer, men er ikke begrenset til, ustabil angina, stabil angina, angina pectoris, embolusdannelse, dyp venøs trombose, hemolytisk uremisk syndrom, hemolytisk anemi, akuttrenal svikt, trombolytiske komplikasjoner, trombotiske trombocytopenisk purpura, simulert intravaskulært comgelopati , trombose, koronar hjertesykdom, tromboemboliske komplikasjoner, myokardialt infarkt, restenose, og atrial trombosedannelse i atriell fibrillering, kronisk ustabil angina, transient iskemisk anfall og slag, perifer vaskulært sykdom, arteriell trombose, pre-eclampsia, embolisme, restenosis og/eller trombose etter angioplasti, carotid endarterektomi, anastomose av vaskulære grafts, og kronisk eksponering av kardiovaskulære anordninger. Slike betingelser kan også være resultat av tromboembolisme og reokkulsjon under og etter trombolytisk terapi, etter angioplasti, og etter koronar arterie bypass.

Det er velkjent i teknikken hvordan å bestemme inhiberingen av blodplate-mediert aggregering ved bruk av standard testene beskrevet heri, eller ved bruk av andre tilsvarende tester. Foretrukket, vil fremgangsmåten resultere i minst en 10% reduksjon i blodplate-mediert aggregering, inkludert, for eksempel, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, eller en hvilken som helst mengde imellom, fortrinnsvis er omkring 90%.

Tilsvarende, vil fremgangsmåten resultere i minst en 10% reduksjon i intracellulær kalsium mobilisering inkludert, for eksempel, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%. Tilsvarende vil fremgangsmåten resultere i minst en 10% reduksjon i nivået av fosforylert PLCg 2 inkludert, for eksempel, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%.

Reduksjonen kan bli målt, for eksempel, ved sammenligning av den optiske impedansen i et kronologi blodplateaggregometer. En hvilken som helst annen kjent målefremgangsmåte kan også bli benyttet. For eksempel, (1) etter kollagenstimulering, the øker nivået av kollagen-indusert intracellulær kalsiummobilisering øker over time og slik at målingene kan inkludere målinger av nivået av kollagen-indusert intracellulær kalsium eller (2) etter kollagenstimulering, øker nivået av fosforylert PLCg 2 over tid og målingene kan således inkludere målinger av nivået av fosforylert PLCg 2.

Cellene kan bli kontaktet vitro, for eksempel, ved tilsetting av et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse til kulturmediet (ved kontinuerlig infusjon, ved boluslevering, eller endring av mediet til et medium som inneholder Nanobodiet eller polypeptid) eller ved tilsetting av Nanobodiet eller polypeptid til det ekstracellulære fluidet in vivo (ved lokal levering, systemisk levering, inhalering, intravenøs injeksjon, boluslevering, eller kontinuerlig infusjon). Varigheten av ‘‘kontakt’’ med en celle eller populasjon av celler blir bestemt på den tid Nanobodiet eller polypeptid er til stede ved fysiologisk effektive nivåer eller ved antatt fysiologisk effektive nivåer i mediet eller ekstracellulært fluidet i hvilket cellen eller cellene bader. Foretrukket, er varigheten for kontakt 1-96 timer, og fortrinnsvis er, 24 timer, denne tiden vil variere basert på halveringstiden til Nanobodiet eller polypeptidet og kan bli optimalisert av fagmannen i teknikken ved bruk av rutineeksperimentering.

Nanobodiet eller polypeptidet som er nyttig i foreliggende beskrivelse kan bli formulert som farmasøytiske sammensetninger og administrert til en mammalske vert, slik som en human pasient eller et husdyr i forskjellige former tilpasset for administrasjonsveien, dvs., oralt eller parenteralt, intra-nasalt ved inhalasjon, intravenøs, intramuskulær, topikal eller subkutane ruter.

Nanobodiet eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse kan også bli administrert ved bruk av genterapifremgangsmåter for levering. Se, f.eks., U.S. Patent nr.5,399,346. Ved bruk av en genterapifremgangsmåte for levering, kan primærceller transfektert med genet for Nanobodiet eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse i tillegg bli transfektert med vevsspesifikke promoterer for spesifikke organer, vev, grafts, tumorer, eller celler.

Således, kan foreliggende Nanobody eller polypeptid bli systemisk administrert, f.eks., oralt, i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer slik som en inert fortynner eller en tillatelig spiselig bærer. De kan være innelukket i gelatinkapsler med hardt eller mykt skall, kan bli presset til tabletter, eller kan bli innlemmet direkte i mat i pasientens diett. For oral terapeutiske administrasjon, Nanobodiet eller polypeptid kan bli kombinert med en eller flere eksipienter og bli benyttet i form av spiselige tabletter, buccale tabletter, trocheer, kapsler, eliksirer, suspensjoner, siruper, kjeks, og liknende. Slike sammensetninger og preparater skal inneholde minst 0.1% av Nanobodiet eller polypeptidet. Prosentandelen av sammensetningene og preparatene kan, naturligvis, bli variert og kan passende være mellom omkring 2 til omkring 60% av vekten av en vekten av en gitt enhetsdoseringsform. Mengden av Nanobodiet eller polypeptid i en slik terapeutisk nyttig sammensetning er slik at et effektivt doseringsnivå vil bli fremskaffet.

Tablettene, trocheenes, pillene, kapslene, og liknende kan også inneholde: bindemidler slik som gum tragacanth, acacia, maisstivelse eller gelatin; eksipienter slik som dikalsium fosfat; et disintegreringsmiddel slik som maisstivelse, potetstivelse, alginsyre og liknende; et smøremiddel slik som magnesiumstearat; og et søtningsmiddel slik som sukrose, fruktose, laktose eller aspartam eller et smaksmiddel slik som peppermynte, olje av vintergrønn, eller kirsebærsmak kan bli tilsatt. Når enhetsdoseringsformen er en kapsel, kan den inneholde, i tillegg til materialer av den ovenfornevnte typer, en væskeformig bærer, slik som en matolje eller en polyetylenglykol. Forskjellige andre materialer kan være til stede som belegg eller for på annen måte modifisere den fysikalske form av den faste enhetsdoseringsformen. For eksempel kan tabletter, piller, eller kapsler bli belagt med gelatin, voks, shellac eller sukker og liknende. En sirup eller eliksir kan inneholde Nanobodiet eller polypeptidet, sukrose eller fruktose som et søtningsmiddel, metyl- og propylparabener som konserveringsmidler, et fargestoff og smaksstoff slik som kirsebær- eller appelsinsmak. Naturligvis, skal et hvilket som helst materiale benyttet i fremstilling av en hvilken som helst enhetsdoseringsform være farmasøytisk akseptabel og hovedsakelig ikke-toksisk i de benyttede mengder. I tillegg, kan Nanobodiet eller polypeptid være inkorporert i vedvarende frigivingsprepareater og -anordninger.

Nanobodiet eller polypeptid kan også bli administrert intravenøst eller intraperitonealt ved infusjon eller injeksjon. Oppløsninger av Nanobodiet eller polypeptidet kan være fremstilt i vann, eventuelt blandet med en ikke-toksisk surfaktant. Dispersjoner kan også være fremstilt i glyserol, flytende polyetylenglykoler, triacetin, og blandinger derav og i oljer. Under vanlige betingelser for lagring og anvendelse, inneholder disse preparatene et konserveringsmiddel for å forhindre vekst av mikroorganismer.

De farmasøytiske doseringsformer passende for injeksjon eller infusjon kan inkludere sterile vandige oppløsninger eller dispersjoner eller sterile pulvere omfattende de aktive ingredienser som er tilpasset for ekstemporert preparering av sterile injiserbare eller infuserbare oppløsninger eller dispersjoner, eventuelt innkapslet i liposomer. I alle tilfeller å den resulterende doseringsform være steril, flytende og stabil under betingelsene for fremstilling og lagring.

Væskebæreren eller vehikkelen kan være et løsemiddel eller et flytende dispersjonsmedium omfattende, for eksempel, vann, etanol, en polyol (for eksempel, glycerol, propylenglykol, flytende polyetylenglykoler, og liknende), matoljer, ikke-toksiske glycerylestere, og passende blandinger derav. Den passende fluiditet kan bli oppretthold, for eksempel, ved dannelsen av liposomer, ved opprettholdelsen av den nødvendige partikkelstørrelsen for dispersjoner eller ved anvendelsen av surfaktanter. Forhindringen av virkningen av mikroorganismer kan bli frembrakt ved forskjellige antibakterielle og antifungale midler, for eksempel, parabener, klorobutanol, fenol, sorbinsyre, timerosal, og liknende. I mange tilfeller, vil det være foretrukket å inkludere isotone midler, for eksempel, sukkere, buffere eller natriumklorid. Forlenget absorpsjon av de injiserbare sammensetningene kan bli fremskaffet ved anvendelse i sammensetningene av midler som forsinker absorpsjon, for eksempel, aluminium monostearat og gelatin.

Sterile injiserbare oppløsninger blir fremstilt ved inkorporering av Nanobodiet eller polypeptidet i den påkrevede mengde i det passende løsemiddelet med forskjellige av de andre ingrediensene angitt ovenfor, etter behov, fulgt av filtersterilisering. For sterile pulvere for fremstillingen av sterile injiserbare oppløsninger, er foretrukne fremgangsmåter for fremstilling, vakuumtørking og frysetørkingsteknikker, som gir et pulver av de aktive ingredienser pluss eventuelt andre ønskede ingredienser som er til stede i tidligere steril-filtrerte oppløsninger.

For topikal administrasjon, kan foreliggende Nanobody eller polypeptid bli anvendt i ren form, dvs., når de er væsker. Imidlertid, vil det generelt være ønskelig å administrere dem på huden som sammensetninger eller formuleringer, i kombinasjon med en dermatologisk akseptabel bærer, som kan være et faststoff eller en væske.

Nyttige faste bærere inkluderer findelte faststoff slik som talk, leire, mikrokrystallinsk cellulose, silika, alumina og liknende. Nyttige væskebærere inkluderer vann, hydroksyalkyler eller glykoler eller vann-alkohol/glykol blandinger, i hvilke foreliggende Nanobody eller polypeptid kan være oppløst eller dispergert ved effektive nivåer, eventuelt med hjelp av ikke-toksiske surfaktanter. Adjuvanter slik som duft og ytterligere antimikrobielle midler kan bli tilsatt for å optimalisere egenskapene for gitt anvendelse. De resulterende væskesammensetningene kan bli påført fra absorbent puter, benyttet for å impregnere bandasjer og andre sårforbindinger, eller sprøytet på påvirkede områder ved bruk av pumpe-type eller aerosolsprayere.

Fortykningsmidler slik som syntetiske polymer, fettsyrer, fettsyresalter og -estere, fettalkoholer, modifiserte celluloser eller modifiserte mineralmaterialer kan også bli benyttet med væskebærerne for å danne påsmørbare pastaer, geler, kremer, såper, og liknende, for påføring direkte på brukerens hud.

Eksempler på nyttige dermatologiske sammensetninger som kan bli benyttet å levere Nanobodiet eller polypeptid til huden er kjent i teknikken; for eksempel, se Jacquet et al. (U.S. Pat. Nn.4,608,392), Geria (U.S. Pat. Nn. 4,992,478), Smith et al. (U.S. Pat. Nn.4,559,157) og Wortzman (U.S. Pat. Nn.

4,820,508).

Nyttige doseringer av Nanobodiet eller polypeptidet kan bli bestemt ved sammenligning av deres in vitro aktivitet, og in vivo aktivitet i dyremodeller. Fremgangsmåter for ekstrapolering av effektive doseringer i mus, og andre dyr, til menesker er kjent i teknikken, se for eksempel, U.S. Pat. Nr.4,938,949.

Generelt, vil konsentrasjonen av Nanobodiet eller polypeptid i en væskesammensetning, slik som en hudkrem, være omkring 0.1-25 vekt%, foretrukket fra omkring 0.5-10 vekt%. Konsentrasjonen i en halvfast eller fast sammensetning slik som en gel eller et pulver vil være omkring 0.1-5 vekt%, foretrukket omkring 0.5-2.5 vekt%.

Mengden av Nanobodiet eller polypeptid som er nødvendig for anvendelse i behandling vil variere med administrasjonsveien, nature til tilstanden som blir behandlet og alder og tilstand til pasienten og vil til sist være ansvaret til den behandlende lege eller kliniker. Doseringen av Nanobodiet eller polypeptidet varierer avhengig av målcellen, tumoren, vevet, graftet, eller organet.

Det ønskede dose kan hensiktsmessig være til stede som en enkeltdose eller som delte doser administrert med passende intervaller, for eksempel, som to, tre eller flere sub-doser per dag. Sub-dosen selv kan være ytterligere oppdelt, f.eks., i et antall løst oppdelte administrasjoner; slik som multiple inhaleringer fra en insufflator eller ved påføring av et flertall dråper i øyet.

Et administrasjonsregime kan inkludere langtids, daglige behandlinger. Ved “langtids” er det ment minst to uker, foretrukket flere ukers, eller års varighet. Nødvendige modifikasjoner i dette doseringsområdet kan bli bestemt av fagmannen i teknikken ved bruk av kun rutineeksperimentering ut fra læren heri. See Remington’s Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed.4), Mack Publishing Co., Easton, PA. Doseringen kan bli justert av den enkelte legen fall noen komplikasjoner.

Foreliggende beskrivelse fremskaffer også et middel som er en modulator av blodplate-mediert aggregering.

Kandidatmiddelet kan være et syntetisk middel, eller en blanding av midler, eller kan bli være et naturlig produkt (f.eks. et planteekstrakt eller kultursupernatant). Et kandidatmiddel ifølge foreliggende beskrivelse inkluderer et lite molekyl som kan bli syntetisert, et naturlig ekstrakt, peptider, proteiner, karbohydrater, lipider etc.

Kandidat modulatormidler fra store biblioteker av syntetiske eller naturlige midler kan bli screenet. Tallrike midler bli i dag benyttet for tilfeldig og rettet syntese av sakkarider, peptider, og nukleinsyrebaserte midler. Syntetiske middelbiblioteker er kommersielt tilgjengelige fra et antall firmaer inkludert Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK), Comgenex (Princeton, NJ), Brandon Associates (Merrimack, NH), og Mikrosource (New Milford, CT). Et sjeldent kjemisk bibliotek er tilgjengelig fra Aldrich (Milwaukee, WI).

Kombinatoriske biblioteker er tilgjengelige og kan bli fremstilt. Alternativt, er biblioteker av naturlige midler i form av bakterielle, fungale, plante og animalske ekstrakter tilgjengelige fra f.eks., Pan Laboratories (Bothell, WA) eller MycoSearch (NC), eller blir enkelt produsert ved fremgangsmåter som er kjent i teknikken. I tillegg, blir naturlig og syntetisk produserte biblioteker og midler enkelt modifisert ved konvensjonelle kjemiske, fysiske og biokjemiske midler.

Nyttige midler kan bli funnet innen tallrike kjemiske klasser. Nyttige midler kan være organiske midler, eller små organiske midler. Små organiske midler har en molekylvekt på mer enn 50, men mindre enn omkring 2,500 dalton, foretrukket mindre enn omkring 750, fortrinnsvis mindre enn omkring 350 dalton. Eksempler på klasser inkluderer heterocycler, peptider, sakkarider, steroider, og liknende. Midlene kan bli modifisert for å øke effektivitet, stabilitet, farmasøytisk kompatibilitet, og liknende. Strukturell identifikasjon av et middel kan bli benyttet for å identifisere, generere, eller screene for ytterligere midler. For eksempel, hvor peptidmidler er identifisert, kan de bli modifisert på forskjellige måter for å fremme deres stabilitet, slik som ved bruk av en unaturlig aminosyre, slik som en D-aminosyre, spesielt D-alanin, ved funksjonalisering av amino- eller karboksylterminalen, f.eks. for aminogruppen, acylering eller alkylering, og for karboksylgruppen, esterifisering eller amidifisering, eller liknende.

For primær screening, er nyttig konsentrasjon av et kandidatmiddel ifølge foreliggende beskrivelse fra omkring 10 mM til omkring 100 µM eller mer (dvs.1 mM, 10 mM, 100 mM, 1 M etc.). Den primære sceeningkonsentrasjonen vil bli benyttet som en øvre grense, sammen med ni ytterligere konsentrasjoner, hvori de ytterligere konsentrasjonene blir bestemt ved redusering av den primære screeningkonsentrasjonen ved halv-log intervaller (f.eks. for 9 flere konsentrasjoner) for sekundære screener eller for generering av konsentrasjonskurver.

Et høygjennomløps screeningsett ifølge foreliggende beskrivelse omfatter alle de nødvendige midler og medier for utøvelse av deteksjonen av et middel som modulerer blodplate-mediert aggregering ved vekselvirkning med et måt ifølge foreliggende beskrivelse, slik som for eksempel vWF, eller fragment derav i nærvær av et polypeptid, foretrukket ved en konsentrasjon i området 1µM to 1 mM. Settet omfatter det følgende . Rekombinante celler ifølge foreliggende beskrivelse, omfattende og som uttrykker nukleotidsekvensen som koder for vWF, eller fragment derav, som bli r dyrket ifølge settet på en fast støtte, slik som en mikrotiterplate, fortrukket er en 96 brønners mikrotiterplate, ifølge fremgangsmåter som er velkjent for fagmannen i teknikken spesielt som beskrevet i WO 00/02045. Alternativt blir vWF, eller fragment derav levert i en renset form for å bli immobilisert på, for eksempel, en 96 brønners mikrotiterplate av en fagmann i teknikken. Alternativt blir vWF, eller fragment derav levert I settet pre-immobilisert på, for eksempel, en 96 brønners mikrotiterplate. Modulatormidler ifølge foreliggende beskrivelse, ved konsentrasjonene fra omkring 1 µM til1 mM eller mer, blir tilsatt til angitte brønner i nærvær av en passende konsentrasjon av Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse, hvor nevnte konsentrasjon av nevnte polypeptid foretrukket er i området 1 µM til 1 mM. Sett kan inneholde mer enn ett polypeptid.

Bindingsanalyser blir utført ifølge fremgangsmåtene som allerede er beskrevet heri og resultatene blir sammenlignet med baselinjenivåer av, for eksempel vWF, eller fragment derav som binder til et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse, men i fravær av tilsatt modulatormiddel. Brønner som viser minst 2 ganger, foretrukket 5 ganger, fortrinnsvis 10 ganger og mest foretrukket 100 ganger eller mer økning eller reduksjon i vWF-polypeptid binding (for eksempel) sammenlignet med nivået av aktivitet i fravær av modulator, blir valgt for videre analyse.

Foreliggende beskrivelse fremskaffer sett som er nyttige for screening for modulatorer for blodplate-mediert aggregering, så vel som settsom er nyttige for diagnose av sykdommer eller forstyrrelser som er karakterisert ved dysregulering av blodplate-mediert aggregering. Nyttige sett ifølge foreliggende beskrivelse kan inkludere et isolert vWF, eller fragment derav. Alternativt, eller i tillegg, kan settet omfatte celler som er transformert til å uttrykke vWF, eller fragment derav. Ifølge en ytterligere utførelsesform, kan et sett ifølge foreliggende beskrivelse omfatte et polynukleotid som koder for vWF, eller fragment derav . Ifølge enda en utførelsesform, kan et sett ifølge foreliggende beskrivelse omfatte de spesifikke primere som er nyttige for amplifisering av vWF, eller fragment derav. Sett som er nyttige ifølge foreliggende beskrivelse kan omfatte et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse. Et sett ifølge foreliggende beskrivelse kan omfatte celler som er transformert til å uttrykke nevnte polypeptid. Sett kan inneholde mer enn ett polypeptid. Ifølge en ytterligere utførelsesform, kan et sett ifølge foreliggende beskrivelse omfatte et polynukleotid som koder for et makromolekyl, for eksempel, vWF, eller fragment derav. Ifølge enda en utførelsesform, kan et sett ifølge foreliggende beskrivelse omfatte de spesifikke primere som er nyttige for amplifisering av et makromolekyl slik som, for eksempel, vWF, eller fragment derav. Alle sett ifølge foreliggende beskrivelse vil omfatte de angitte bestanddeler eller kombinasjonene av bestanddeler og pakkematerialer for disse. Vil også inkludere instruksjoner for anvendelse.

Foreliggende beskrivelse fremskaffer også invasivt medisinsk utstyr belagt med et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse eller et middel som er resultat av en screeningfremgangsmåte ifølge foreliggende beskrivelse for anvendelse i anordninger som krever det samme. Ikkebegrensende eksempler på anordninger inkluderer kirurgiske slanger, okklusjonsanordninger, prosteske anordninger. Anvendelser av nevnte anordninger inkluderer kirurgiske prosedyrer som krever en modulering av blodplate-mediert aggregering omkring invasjonsstedet.

En utførelsesform av foreliggende er en fremgangsmåte for behandling invasivt medisinsk utstyr for å forhindre blodplate-mediert aggregering omkring invasjonsstedet omfattende trinnet ved belegning av nevnte anordning med et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse eller middel ifølge foreliggende beskrivelse.

En annen utførelsesform av foreliggende er et invasivt medisinsk utstyr som omgår blodplate-mediert aggregering omkring invasjonsstedet, hvori nevnte anordning er belagt med et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse eller middel ifølge foreliggende beskrivelse.

Ifølge et annet aspekt, angår foreliggende beskrivelse en fremgangsmåte for forhindring og/eller behandling av minst ett aggregering-mediert forstyrrelse (som beskrevet heri), hvor nevnte fremgangsmåte omfatter administrering, til et individ med behov derav, av en farmasøytisk aktiv mengde av et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse, av et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse, og/eller av en farmasøytisk sammensetning omfattende det samme.

I forbindelse med foreliggende beskrivelse, omfatter termen “forhindring og/eller behandling” ikke kun forhindring og/eller behandling av sykdommen, men også generelt forhindring av start av sykdommen, forsinkelse eller reversering av forløpet for sykdommen, forhindring eller forsinkelse av et eller flere symptomer assosiert med sykdommen, reduksjon og/eller letting av en eller flere symptomer som er assosiert med sykdommen, reduksjon av alvoret og/eller varigheten av sykdommen og/eller av ett eller flere symptomer assosiert med denne og/eller forhindring av en ytterligere forverring av alvoret av sykdommen og/eller av et hvilket som helst symptom assosiert med dette, forhindring, redusering eller reversering av en hvilken som helst fysiologisk skade forårsaket av sykdommen, og generelt en hvilken som helst farmakologisk virkning som er fordelaktig for pasienten som bli behandlet.

Individet som skal behandles kan være et hvilket som helst varmblodige dyr, men er spesielt et pattedyr, og mer spesielt et menneske. Som det vil være klart for fagmannen, vil individet som skal behandles spesielt være en person om lider av, eller med risiko for sykdommer og forstyrrelser som er nevnt heri.

Foreliggende beskrivelse angår også en fremgangsmåte for forhindringen og/eller behandling av minst ett sykdom eller forstyrrelse som kan bli forhindret og/eller behandlet ved administrering av et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse til en pasient, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter administrering, til et individ med behov derav, av en farmasøytisk aktiv mengde av et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse, av et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse, og/eller av en farmasøytisk sammensetning omfattende det samme.

Mer spesielt, angår foreliggende beskrivelse en fremgangsmåte for forhindringen og/eller behandling av minst en sykdom eller forstyrrelse valgt blant gruppen bestående av de sykdommer og forstyrrelser som er listet heri, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter administrering, til et individ med behov derav, av en farmasøytisk aktiv mengde av et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse, av et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse, og/eller av en farmasøytisk sammensetning omfattende det samme.

Ifølge en annen utførelsesform, angår foreliggende beskrivelse en fremgangsmåte for immunoterapi, og spesielt for passiv immunoterapi, hvilken fremgangsmåte omfatter administrering, til et individ som lider av eller har risiko for sykdommene og forstyrrelsene som er nevnt heri, av en farmasøytisk aktiv mengde av et Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse, av et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse, og/eller av en farmasøytisk sammensetning omfattende det samme.

I de ovenfornevnte fremgangsmåter, kan Nanobodies og/eller polypeptider ifølge foreliggende beskrivelse og/eller sammensetningene omfattende de samme bli administrert på en hvilken som helst måte, avhengig av den spesifikke farmasøytiske formuleringen eller sammensetningen som blir benyttet. Således, kan Nanobodies og/eller polypeptider ifølge foreliggende beskrivelse og/eller sammensetningene omfattende det samme for eksempel bli administrert oralt, intraperitonealt (f.eks. intravenøst, subkutant, intramuskulært, eller via en hvilken som hest annen administrasjonsvei som omgår den gastrointestinale trakt), intranasalt, transdermalt, topikalt, ved hjelp av et stikkpille, ved inhalasjon, igjen avhengig av den spesifikke farmasøytiske formulering eller sammensetning som skal benyttes. Klinikeren vil være i stand til å velge en passende administrasjonsvei og en passende farmasøytiske formulering eller sammensetning som skal bli benyttet i lik administrasjon, avhengig av sykdommen eller forstyrrelse som skal bli forhindret eller behandlet og andre faktorer som er velkjent for klinikeren.

Som nevnt heri og som vil være klart for fagmannen, for akutt tilstander og komplikasjoner (dvs. som kan opptre med visse aggregering-mediert forstyrrelser som er nevnt heri), vil vanligvis administrasjon direkte inn i blodstrømmen slik som ved infusjon eller injeksjon eller hvilke som helst andre passende midler bli foretrukket.

Nanobodies og/eller polypeptider ifølge foreliggende beskrivelse og/eller sammensetningene omfattende det samme blir administrert ifølge et regime for behandling som er passende for forhindring og/eller behandling sykdommen eller forstyrrelsen som skal forhindres eller behandles. Klinikeren vil være I stand til å bestemme et passende behandlingsregime, avhengig av faktorer slik som sykdommen eller forstyrrelsen som skal forhindres eller behandles, alvoret av sykdommen som skal bli behandlet og/eller alvoret av symptomene derav, det spesifikke Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse som skal bli anvendt, den spesifikke administrasjonsvei og farmasøytisk formulering eller sammensetning som skal bli benyttet, alder, kjønn, vekt, diett, almenntilstand hos pasienten, og tilsvarende faktorer som er velkjent for klinikeren.

Generelt, vil behandlingsregimener omfatte administrasjonen av en eller flere Nanobodies og/eller polypeptider ifølge foreliggende beskrivelse, eller av en eller flere sammensetninger omfattende det samme, i en eller flere farmasøytisk effektiv mengder eller doser. Den spesifikke mengde(n) eller dosen som skal bli administrert kan bli bestemt av klinikeren igjen basert på faktorene ovenfor.

Generelt, for forhindringen og/eller behandling av de sykdommer og forstyrrelser som er nevnt heri og avhengig av den spesifikke sykdom eller forstyrrelse som skal bli behandlet, kraften av det spesifikke Nanobody og polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse som skal bli benyttet, den spesifikke administrasjonsvei og den spesifikke farmasøytiske formulering eller sammensetning som blir benyttet, vil Nanobodies og polypeptider ifølge foreliggende beskrivelse generelt bli administrert i en mengde mellom 1 gram og 0.01 mikrogram per kg kroppsvekt per dag, foretrukket mellom 0.1 gram og 0.1 mikrogram per kg kroppsvekt per dag, slik som omkring 1, 10, 100 eller 1000 mikrogram per kg kroppsvekt per dag, enten kontinuerlig (f.eks. ved infusjon), som en enkel daglig dose eller som flere oppdelte doser i løpet av dagen. Klinikeren vil generelt være i stand til å bestemme en passende daglig dose, avhengig av faktorene som er nevnt heri. Det må også være klart at i spesifikke tilfeller kan klinikeren velge å avvike fra disse mengdene, for eksempel på basis av faktorene sitert ovenfor og på sin ekspertbedømmelse. Generelt, kan noe veiledning vedrørende mengder som skal bli administrert bli fremskaffet fra mengdene som vanligvis blir administrert for sammenlignbare konvensjonelle antistoff eller antistoff fragmenter mot det samme mål administrert via hovedsakelig den samme ruten, under hensyntagen til forskjeller til affinitet/aviditet, effektivitet, biodistribusjon, halveringstid og tilsvarende faktorer som er kjent for fagmannen.

Vanligvis, i de ovenfornevnte fremgangsmåte, vil et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse bli benyttet. Det er imidlertid innen rammen ifølge foreliggende beskrivelse å anvende to eller flere Nanobodies og/eller polypeptider ifølge foreliggende beskrivelse i kombinasjon.

Nanobodies og polypeptider ifølge foreliggende beskrivelse kan også bli benyttet i kombinasjon med en eller flere ytterligere farmasøytisk aktive forbindelser eller prinsipper, dvs. som et kombinert behandlingsregime, som kan, men trenger ikke å føre til en synergistisk effekt. Igjen vil klinikeren være i stand til å velge slike ytterligere forbindelser eller prinsipper, så vel som a passende kombinerte behandlingsregimer, basert på faktorene sitert ovenfor og hans ekspertkunnskap.

Spesielt, kan Nanobodies og polypeptider ifølge foreliggende beskrivelse bli benyttet i kombinasjon med andre farmasøytisk aktive forbindelser eller prinsipper som blir eller kan bli benyttet for forhindringen og/eller behandling av de sykdommer og forstyrrelser som er sitert heri, som et resultat av hvilket en synergistisk effekt kan eller trenger ikke å bli oppnådd. Eksempler på slike forbindelser og prinsipper, så vel som ruter, fremgangsmåter og farmasøytiske formuleringer eller sammensetninger for administrering av dem vil være klart for klinikeren, og kan for eksempel inkludere, men er ikke begrenset til heparin, aspirin (f.eks. Aspegic®), Plavix og/eller Reopro.

Når to eller flere stoffer eller prinsipper blir benyttet som del av et kombinert behandlingsregime, kan de bli administrert via de samme administrasjonsvei eller via forskjellige administrasjonsveier, hovedsakelig samtidig eller ved forskjellige tider (f.eks. hovedsakelig samtidig, etter hverandre, eller ifølge et alternerende regime). Når stoffene eller prinsippene blir administrert for å være samtidig via den samme administrasjonsvei, kan de bli administrert som forskjellige farmasøytiske formuleringer eller sammensetninger eller del av en kombinert farmasøytisk formulering eller sammensetning, som det vil være klart for fagmannen.

Også, når to eller flere aktive stoffer eller prinsipper blir benyttet som deler av et kombinert behandlingsregime, kan hvert av stoffene eller prinsippene bli administrert den samme mengde og ifølge det samme regime som benyttet når forbindelsen eller prinsippet blir benyttet alene, og slik kombinert anvendelse kan, men trenger ikke føre til synergistisk effekt.

Imidlertid, når den kombinerte anvendelsen av de to eller flere aktive stoffene eller prinsippene fører til en synergistisk effekt, kan det også være mulig å redusere mengden av et, flere eller alle stoffene eller prinsippene som skal bli administrert, mens det likevel blir oppnådd den ønskede terapeutiske virkning. Dette kan for eksempel være nyttig for unngåelse, begrensning eller redusering av eventuelle uønskede bi-effekter som er assosiert med anvendelsen av en eller flere av stoffene eller prinsippene når de blir benyttet i sine vanlige mengder, mens den ønskede farmasøytiske eller terapeutiske effekt blir opprettholdt.

Effektiviteten til behandlingsregimene benyttet ifølge foreliggende beskrivelse kan bli bestemt og/eller fulgt på en hvilken som helst kjent fremgangsmåte per se for sykdommen eller forstyrrelsen involvert, som det vil være klart for klinikeren. Klinikeren vil også være i stand til, hvor passende eller på en sak til sak basis, å endre eller modifisere et bestemt behandlingsregime, for å oppnå den ønskede terapeutiske effekt, for å unngå, begrense eller redusere uønskede bi-effekter, og/eller for å oppnå en passende balanse mellom oppnåelse av den ønskede terapeutiske effekt på den ene siden og unngå, begrense eller redusere uønskede bieffekter på den andre siden.

Individet som skal behandles kan være et hvilket som helst varmblodig animal, men er spesielt et pattedyr, og mer spesielt et menneske. Som det vil være klart for fagmannen, vil individet som skal behandles spesielt være en person som lider av, eller har risiko for å få, sykdommene og forstyrrelsene som er nevnt heri.

Foreliggende beskrivelse angår også anvendelsen av et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse i fremstillingen av en farmasøytisk sammensetning for forhindringen og/eller behandling av minst en sykdom eller forstyrrelse (f.eks. en aggregeringsforstyrrelse som nevnt heri) som kan bli forhindret og/eller behandlet ved administrering av et Nanobody eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse til en pasient.

Generelt, vil behandlingsregimet bli fulgt inntil den ønskede terapeutiske effekt blir oppnådd og/eller så lenge den ønskede terapeutiske effekt skal bli opprettholdt. Igjen kan dette bli bestemt av klinikeren.

Til sist vil det også bli klart for fagmannen at det kan være mulig å “pode” (”graft”) en eller flere av CDR’ene nevnt ovenfor for Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse på andre ”skjeletter” inkludert men ikke begrenset til humane skjeletter eller ikke-immunoglobulin skjeletter. Passende skjeletter og teknikker for slik CDR grafting vil være klart for fagmannen og er velkjent i teknikken, se for eksempel US-A-7,180,370, WO 01/27160, EP 0605522, EP 0 460 167, US-A-7,054,297, Nicaise et al., Protein Science (2004), 13:1882-1891; Ewert et al., Methods, 2004 Oct; 34(2):184-199; Kettleborough et al., Protein Eng. 1991 Oct; 4(7): 773-783; O’Brien og Jones, Methods Mol. Biol.2003: 207: 81-100; og Skerra, J. Mol. Recognit.2000: 13: 167-187, og Saerens et al., J. Mol. Biol.2005 Sep 23;352(3):597-607, og de videre referanser sitert deri; og inkluderer også for eksempel rammeverkregionene av andre (enkelt) domene antistoff. For eksempel, kan teknikker kjent per se for grafting av mus eller rotte CDR’er på humane rammeverk og skjeletter bli benyttet på en analog måte for å fremskaffe kimære proteiner omfattende en eller flere av CDR’ene av Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse og en eller humane rammeverkregioner eller sekvenser.

Således, ifølge et annet utførelsesform, omfatter foreliggende beskrivelse et kimært polypeptid omfattende minst en CDR sekvens valgt blant gruppen bestående av CDR1 sekvenser, CDR2 sekvenser og CDR3 sekvenser som er nevnt heri for Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse. Foretrukket, omfatter slike kimære polypeptider minst en CDR sekvens valgt blant gruppen bestående av CDR3 sekvensene som er nevnt heri for Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse, og eventuelt også minst en CDR sekvens valgt blant gruppen bestående av CDR1 sekvensene og CDR2 sekvenser som er nevnt heri for Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse. For eksempel, kan et slikt kimært polypeptid omfatte en CDR sekvens valgt blant gruppen bestående av CDR3 sekvensene som er nevnt heri for Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse, en CDR sekvens valgt blant gruppen bestående av CDR1 sekvensene som er nevnt heri for Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse og en CDR sekvens valgt blant gruppen bestående av CDR1 sekvensene og CDR2 sekvenser som er nevnt heri for Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse. Kombinasjonene av CDR’er som er nevnt heri å være foretrukket for Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse vil vanligvis også være foretrukket for disse kimære polypeptidene.

I nevnte kimære polypeptider, kan CDR’ene bli linket til ytterligere aminosyresekvenser og/eller kan bli linket til hverandre via aminosyresekvenser, i hvilke nevnte aminosyresekvenser fortrinnsvis er rammeverksekvenser eller er aminosyresekvenser som virker som rammeverksekvenser, eller sammen danner et skjelett for presentering av CDR’ene. Referanse blir igjen gjort til den kjente teknikkensom er nevnt i det siste avsnittet. Ifølge en foretrukket utførelsesform, er aminosyresekvensene humane rammeverksekvenser, for eksempel VH3 rammeverksekvenser.

Imidlertid, kan ikke-humane, syntetiske, semi-syntetiske eller ikkeimmunoglobulin rammeverksekvenser også bli benyttet. Foretrukket, er rammeverksekvensene benyttet slik at (1) det kimære polypeptidet er i stand til binding xxxx, dvs. med en affinitet som er minst 1%, foretrukket minst 5%, fortrinnsvis minst 10%, slik som minst 25% og opp til 50% eller 90% eller mer av affiniteten til det korresponderende Nanobody ifølge foreliggende beskrivelse; (2) det kimære polypeptidet er passende for farmasøytiske anvendelse; og (3) det kimære polypeptidet er fortrinnsvis hovedsakelig ikkeimmunogent under de tilsiktede betingelsene for farmasøytiske anvendelse (dvs. indikasjon, administrasjonsmodus, dose- og behandlingsregime) derav (som kan være hovedsakelig analog med betingelsene beskrevet heri for anvendelsen av Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse).

Ifølge en ikke-begrensende utførelsesform, omfatter det kimære polypeptidet minst to CDR sekvenser (som nevnt ovenfor) linket via minst en rammeverksekvens, i hvilke foretrukket minst en av to CDR sekvenser er en CDR3 sekvens, hvor den andre CDR sekvensen er en CDR1 eller CDR2 sekvens. Ifølge en foretrukket, men ikke-begrensende utførelsesform, omfatter det kimære polypeptidet minst to CDR sekvenser (som nevnt ovenfor) linket til minst to rammeverksekvenser, i hvilke foretrukket minst en av tre CDR sekvenser er en CDR3 sekvens, hvor de andre to CDR sekvenser er CDR1 eller CDR2 sekvenser, og foretrukket er en CDR1 sekvens og en CDR2 sekvens. Ifølge en spesifikt foretrukket, men ikke-begrensende utførelsesform, har de kimære polypeptidene strukturen FR1’ - CDR1 - FR2’ - CDR2 - FR3’ -CDR3 - FR4’, i hvilke CDR1, CDR2 og CDR3 er som definert heri for CDR’ene til Nanobodies ifølge foreliggende beskrivelse, og FR1’, FR2’, FR3’ og FR4’ er rammeverksekvenser. FR1’, FR2’, FR3’ og FR4’ kan spesielt være Rammeverk 1, Rammeverk 2, Rammeverk 3 og Rammeverk 4 sekvenser, henholdsvis, av et humant antistoff (slik som VH3 sekvenser) og/eller deler eller fragmenter av slike Rammeverksekvenser. Det er også mulig å anvende deler eller fragmenter av et kimært polypeptid med strukturen FR1’ - CDR1 - FR2’ - CDR2 - FR3’ - CDR3 - FR4. Foretrukket, er slike deler eller fragmenter slik at de møter kriteriene som er angitt i det foregående avsnitt.

Foreliggende beskrivelse vil nå bli videre beskrevet ved hjelp av de følgende ikke-begrensende eksempler og figurer, i hvilke figurene viser: Figur 1: Binding av nanobodies til vWF i ELISA

Figur 2: Innretning av 12A5 homologe nanobodysekvenser

Figur 3: Innretning av 12B6 homologe nanobodysekvenser

Figur 4: Binding av 12A5 homologe nanobodies til vWF i BIACORE Figur 5: Binding av 12B6 homologe nanobodies til vWF i BIACORE Figur 6: Blodplateadhesjon ved forskjellige konsentrasjoner av 12B6, 12A2 og 12A5 nanobodies

Figur 7a: Binding i ELISA til vWF for 12B6 nanobody etter oppvarming ved økende temperaturer

Figur 7b: Binding i ELISA til vWF for 12A2 nanobody etter oppvarming ved økende temperaturer

Figur 7c: Binding i ELISA til vWF for 12A5 nanobody etter oppvarming ved økende temperaturer

Figur 8a: Binding av vWF fra forskjellige arter til 12B6 nanobody i ELISA Figur 8b: Binding av vWF fra forskjellige arter til 12A2 nanobody i ELISA Figur 8c: Binding av vWF fra forskjellige arter til 12A5 nanobody i ELISA Figur 9: Binding av bivalent 12B6 nanobodies til vWF i BIACORE

Figur 10: Binding av bivalent 12A2 nanobodies til vWF i BIACORE

Figur 11: Binding av bivalent 12A5 nanobodies til vWF i BIACORE

Figur 12: Binding i ELISA til vWF av bivalente 12B6 nanobodies etter oppvarming ved økende temperaturer

Figur 13: Binding i ELISA til vWF av bivalente 12A2 nanobodies etter oppvarming ved økende temperaturer

Figur 14: Binding i ELISA til vWF av bivalente 12A5 nanobodies etter oppvarming ved økende temperaturer

Figur 15: Innretning av humaniserte 12B6 nanobodysekvenser

Figur 16: Binding i ELISA til vWF av villtype og humanisert 12B6 nanobody Figur 17: Innretning av humaniserte 12A2 nanobodysekvenser

Figur 18: Binding i ELISA til vWF av humaniserte 12A2 nanobodies, etter oppvarming ved økende temperaturer

Figur 19: Binding i ELISA til vWF av humaniserte 12A2 nanobodies Figur 20: Innretning av humaniserte 12A5 nanobody sekvenser

Figur 21: Binding i ELISA til vWF v villtype og humanisert 12A5 nanobody Figur 22: Innretning av nanobodies selektert for bivalent form

Figur 23: Blodplateadhesjon ved forskjellige konsentrasjonene av bivalente (humaniserte) nanobodies

Figur 24: Blodstrømmønster for Folts modell i bavianer

Figur 25: Eksperimentelt oppsett for Folts modell i bavianer

Figur 26: Folts studie of bavian kontroll gruppe. Det er vist blodstrømningen som funksjon av tid, som indikere CFR’ene (representativt eller 2 uavhengig eksperimenter)

Figur 27: Folts studie av baviangruppebehandlet med Aspegic. Blodstrømmen som funksjon av tid er vist, noe som indikerer at CFRs (representative for 3 uavhengige eksperimenter)

Figur 28: studie av baviangruppe behandlet med Heparin. Blodstrømmen som funksjon av tid er vist, noe som indikerte CFR’er (representative for 3 uavhengig eksperimenter)

Figur 29: Folts studie på baviangruppe behandlet med Plavix. Blodstrømmen som funksjon på tiden er vist, indikerer CFR’er (representative for 4 uavhengige eksperimenter)

Figur 30: Folts studie på baviangruppe behandlet med Reopro. Blodstrømmen som funksjon av tiden er vist, indikerer CFR’er (representative for 3 uavhengige eksperimenter)

Figur 31: Folts studie av baviangruppe behandlet med ALX-0081 (SEQ ID NO:98). Blodstrømmen som funksjon av tiden er vist, indikerer CFR’er (representative for 8 uavhengige eksperimenter)

Figur 32: Strømningsavlesning ut fra bavian ID 6 behandlet med en kombinasjon av Aspegic, Heparin, Plavix og ALX-0081

Figur 33: gjennomsnitt av relative blodtap som funksjon av forskjellige doser Plavix, Reopro og ALX-0081

Figur 34: gjennomsnittlig lengde av CFR’er og gjennomsnittlig relativ mengde av blodtap for dyr behandlet med Plavix som funksjon av økende medikamentdose.

Figur 35: gjennomsnittlig lengde av CFR’er og gjennomsnittlig relativ mengde av blodtap for dyr behandlet med Reopro som funksjon av økende medikamentdose

Figur 36: Gjennomsnittlig lengde av CFR’er og gjennomsnittlig relativ mengde av blodtap for dyr behandlet med ALX-0081 som funksjon av økende medikamentdose

Figur 37: ristocetin-indusert aggregering (%, ■) og lengde av CFR’er (s, ♦) for hver bavian behandlet med ALX-0081 som funksjon av alle doser

Figur 38: Konsentrasjon av ALX-0081 i plasma versus lengden av CFR’er for alle bavianer behandlet med ALX-0081

Figur 39: Konsentrasjon av ALX-0081 i plasma versus relativ mengde blodtap fra gasbindene

Figur 40: Folts studie av bavian 1 behandlet med ALX-0081 og vWF.

Blodstrømmen som funksjon av tide r vist, noe som indikerer CFR’er Figur 41: strenger (piler) av vedheftende blodplater på ULvWF utskilt fra stimulerte endoteliale celler

Figur 42: Fravær av strenger når blodplates blir perfusert over ULvWF i nærvær av ALX-0081

Figur 43: Kontroll perfusjonseksperiment: ULvWF strenger før (panel A, indikert med rode piler) og under (panel B) perfusjon med normalt plasma. I panel B,, ULvWF blir strenger som blir spaltet av ADAMTS-13 indikert med blå og røde piler for en del av en ULvWF streng som beveger seg bort eller henholdsvis for hovedsakelig spaltede ULvWF strenger

Figur 44: Perfusjonseksperiment I nærvær av ALX-0081. Mikroskopbilde av et felt før (panel A) og av det samme felt etter (panel B) perfusjon med normalt plasma. En UlvWF streng er indikert I panel A med en rød pil som er fraværende I panel B på grunn av spalting v ULvWF med ADAMTS-13.

Figur 45: spalting av A1-A2-A3 ved ADAMTS-13 som er til stede i normalt oppsamlet plasma (NPP) i fravær og nærvær av ALX-0081

og i hvilke tabellene, som danner en integrert del av foreliggende beskrivelse, er som følger:

Tabell 8: Sekvenslisting av anti-vWF nanobodies

Tabell 9: Ekspresjonsutbytter av anti-vWF nanobodies

Tabell 10: Blodplateadhesjon i perfusjonskammere av anti-vWF nanobodies Tabell 11: Sekvenslisting av 12B6 og 12A5 homologe nanobodies

Tabell 12: Estimerte K-on, K-off og KD verdier for 12A5 homologe nanobodies Tabell 13: Estimerte K-on, K-off og KD verdier for 12B6 homologe nanobodies Tabell 14: Faktisk KD verdi av 12B6, 12A2 og 12A5 nanobodies

Tabell 15: Blodplateadhesjon i perfusjonskammer av 12B6, 12A2 og 12A5 nanobodies

Tabell 16: Konsentrasjon av 12B6, 12A2 og 12A5 nanobodies etter oppvarming ved økende temperaturer

Tabell 17: Sekvenslisting av bivalente nanobodies

Tabell 18: Sekvenslisting av linkersekvenser

Tabell 19: Ekspresjonsutbytter av bivalente 12B6, 12A2 og 12A5 nanobodies Tabell 20: Konsentrasjon av 12B6 bivalente nanobodies etter oppvarming ved økende temperaturer

Tabell 21: Konsentrasjon av 12A2 bivalente nanobodies etter oppvarming ved økende temperaturer

Tabell 22: Konsentrasjon av 12A5 bivalente nanobodies etter oppvarming ved økende temperaturer

Tabell 23: Blodplateadhesjon i perfusjonskammer av 12A2 bivalent nanobodies Tabell 24: Sekvenslisting av humaniserte 12B6 nanobodies

Tabell 25: Ekspresjonutbytter av villtype og humaniserte 12B6 nanobodies Tabell 26: Konsentrasjon av villtype og humaniserte 12B6 nanobodies etter oppvarming ved økende temperaturer

Tabell 27: KD verdier for villtype og humaniserte 12B6 nanobodies

Tabell 28: Sekvenslisting av humaniserte 12A2 nanobodies

Tabell 29: Ekspresjonutbytter av villtype og humaniserte 12A2 nanobodies Tabell 30: Konsentrasjon av villtype og humaniserte 12A2 nanobodies etter oppvarming ved økende temperaturer

Tabell 31: Blodplateadhesjon av villtype og humaniserte 12A2 nanobodies i perfusjonskammer ved 0.7 og 1.5 ug/ml

Tabell 32: Blodplate adhesjon av villtype og humaniserte 12A2 nanobodies i perfusjonskammer ved 0.5, 1 og 2 ug/ml

Tabell 33: KD verdier for villtype og humaniserte 12A2 nanobodies Tabell 34: Sekvenslisting av humaniserte 12A5 nanobodies

Tabell 35: Ekspresjonsutbytter av villtype og humaniserte 12A5 nanobodies Tabell 36: Konsentrasjon av villtype og humaniserte 12A5 nanobodies etter oppvarming ved økende temperaturer

Tabell 37: KD verdier for villtype og humaniserte 12A5 nanobodies Tabell 38: Sekvenslisting av humaniserte bivalente nanobodies

Tabell 39: Ekspresjonutbytter av humaniserte bivalente nanobodies Tabell 40: Konsentrasjon av humaniserte bivalent nanobody etter oppvarming ved økende temperaturer

Tabell 41: Blodplateadhesjon av villtype og humaniserte bivalente nanobodies Tabell 42: bavianer benyttet med de forskjellige testforbindelsene i Folts studie Tabell 43: Lengde av CFR’er (s) for kontroll dyr (ND= ikke utført)

Tabell 44: Lengde av CFR’er (s) for dyr behandlet med Aspegic™ (ND= ikke utført)

Tabell 45: Lengde av CFR’er (s) for dyr behandlet med Heparin™ (ND= ikke utført)

Tabell 46: Lengde av CFR’er (s) for dyr behandlet med Plavix™ (ND= ikke utført)

Tabell 47: Lengde av CFR’er (s) for dyr behandlet med Reopro™ (ND= ikke utført)

Tabell 48: Lengde av CFR’er (s) for dyr behandlet med ALX-0081 (ND= ikke utført)

Tabell 49: bavianer med de forskjellig testforbindelsene i Folts studien Tabell 50: Inhibering av CFRs i Folts modellen for de forskjellig testede medikamentene. Antallet av eksperimentene i hvilke en inhibering av CFRs ble observer under de nevnte forskjellige betingelser er vist som funksjon av totalantallet uavhengige repetisjoner av den tilstanden.

Tabell 51: Lengde av CFRs (sekunder) for hver bavian og hver dose av Aspegic, Heparin, Plavix og ALX-0081. Den effektive dose er indikert i gult Tabell 52: Blodtap relativt til det andre kontroll gauze for dyr behandlet med Plavix™ som funksjon av endelig dose (STD= standardavvik)

Tabell 53: Blodtap relativt til den andre kontroll gauze for dyr behandlet med Reopro™ som funksjon av endelig dose (STD= standardavvik)

Tabell 54: Blodtap relativt til den andre kontroll gauze for dyr behandlet med ALX-0081som funksjon av endelig dose (STD= standardavvik)

Tabell 55: den gjennomsnittlige totale mengde blodtap (= sum av blodtap fra de første fem doser av testforbindelse) i forhold til den andre kontroll gauze Tabell 56: Blodtap i gauzes relativt til den andre kontroll gauze for hver bavian behandlet med Aspegic, Heparin, Plavix og ALX-0081 som funksjon av medikamentdose. Den effektive medikamentdose i hvilken en fullstendig inhibering av CFRs ble observert, er angitt i gult

Tabell 57: % ristocetin-indusert blodplate aggregering for hver bavian behandlet med Aspegic, Heparin, Plavix og ALX-0081 som funksjon av medikamentdose Tabell 58: konsentrasjon av ALX-0081 [μg/ml] i blodprøver tatt 10 minutter etter administrasjon

Tabell 59: Lengde av CFRs [sekunder] for bavianer behandlet med ALX-0081 og med vWF

Tabell 60: Volumer [µl] for å fremstille de forskjellige blandinger for studie av spalting av A1A2A3 ved ADAMTS13.

EKSEMPLER

A. Seleksjon og screening av nanobodies som er spesifikke for vWF og inhibering av blodplateadhesjon

Eksempel 1: Antigenspesifikke monovalente nanobodies

Nanobodies representert i Tabell 8 SEQ ID Nos: 60 til 66 er fremskaffet fra lamaer immunisert med human vWF eller med rekombinant A1 domene av vWF. Nanobodies binder til A1 domenet av vWF og hemmer interaksjonen mellom vWF og gpIb på blodplatene.

Eksempel 2: Ekspresjon og rensing av nanobodies

Plasmid ble preparert (QIAGEN, ifølge produsentens instruksjoner) og ble transformert inn i WK6 eller TG1 elektro-kompetente celler. En enkeltkoloni ble benyttet for å starte en overnattkultur I LB inneholdende 2% glukose og 100 μg/ml ampicillin. Denne overnattkulturen ble fortynnet 100 ganger i 2x300 ml TB medium inneholdende 100 μg/ml ampicillin, og inkubert ved 37 ̊C inntil OD600nm= 0.5.1 mM IPTG ble tilsatt og kulturen ble inkubert i ytterligere 3 timer ved 37 ̊C eller over natten ved 28 ̊C.

Kulturer ble sentrifugert i 20 minutter ved 10000 rpm ved 4 ̊C. Pelletenn ble frosset over natten eller ved 1 time ved -20 ̊C. Deretter ble pelleten tint ved romtemperatur i 40 minutter, resuspendert i 20 ml peribuffer (50 mM NaH2PO4 og 300 mM NaCl) og ristet ved romtemperatur i 1 time. Periplasmiske fraksjoner ble isolert ved sentrifugering i 20 minutter at 4 ̊C ved 20000 rpm. Nanobodies ble renset på en Nickel kolonne (TALON, Clonetech) som beskrevet av produsenten og ekspresjonsutbytter ble utregnet som angitt i Tabell 9.

Eksempel 3: Binding av nanobodies til vWF i ELISA

Nanobodies fra Eksempel 1 ble testet for binding til vWF i ELISA. For dette ble en mikrotiterplate (Nunc, Maxisorb) belagt med vWF (Red Cross) ved en 200-ganger fortynning og forvarmet I 15 minutter ved 37°C. Platen ble belagt over natten ved 4°C. Platen ble så vasket med PBS-Tween og blokkert i to timer ved romtemperatur med PBS-1% kasein. Etter vasking ble prøvene påsatt med start ved en konsentrasjon på 10 µg/ml og 3-ganger fortynninger ble gjort med PBS. Etter en to timers inkuberingsperiode ble platen vasket og mus monoklonale anti-myc antistoff ved en 1000-ganger fortynning ble satt på i 1 time ved romtemperatur. Platene ble vasket og polyklonal anti-mouse-HRP (DAKO) ble benyttet ved en 1000-ganger fortynning i en time ved romtemperatur. Platene ble vasket og ABTS/H2O2 substrat ble benyttet ved. OD 405 nm ble målt. Resultatene er vist i Figur 1.

Eksempel 4: Inhibering av blodplateadhesjon v nanobodies i et strømningskammer

Proteinprøvene ble analysert i et perfusjonskammer. Thermanox dekkglass (Nunc) var neddykket i 80 % etanol over natten, ble grundig vasket med destillert vann og lufttørket. Human placental kollagen type III (Sigma) ble oppløst i 0.05 mol/l eddiksyre og sprayet på dekkglasset ved en endelig densitet på 30µg/cm<2 >ed en retusjerings airbrush. Etter spraying ble dekkglasset blokkert med 1% human albuminoppløsning i PBS i minst 1 time ved RT.

Perfusjoner ble utført med et single-pass perfusjonskammer under ikke-pulsatile stømningsbetingelser ved bruk av et modifisert lite perfusjonskammer med en spaltehøyde på.1 mm og spaltevidde på 2 mm. Blod ble fremskaffet ved venipunktur fra sunne frivillige og anti-koagulert med Penta/PPACK. Triplikate dekkglass ble satt inn i kammeret. Fem milliliter av blod ble forvarmet ved 37°C i 5 minutter med eller uten tilsetning av 2 mikrogram/ml nanobody og så sirkulert gjennom kammeret I 5 minutter ved en vegg skjærrate på 1600 s<-1 >ved bruk av en infusjonspumpe. Etter en perfusjonskjøring ble dekkglasset tatt fra kammeret, renset i Hepesbufret saltvann (10 mM Hepes, 150 mM NaCL, ph 7.4), fiksert i 0.5% glutaraldehyd i PBS, dehydrert i metanol og farget med May-Grünwald og Giemsa (Riedel de Haën). Blodplateavsetning ble evaluert som blodplateoverflatedekning ved bruk av lysmikroskopi og komputer-assistert analyse. Resultater er vist i Tabell 10. Nanobodies 12B6 og 12A5 emner klart blodplateadhesjon til kollagen type III i perfusjonskammeret ved høy skjærrate.

Eksempel 5: Analyse i BIACORE for binding til vWF for homologer nanobodies

Nanobodies 12B6 og 12A5 hemmer blodplateadhesjon i perfusjonskammeret. Homologe sekvenser ble fremskaffet fra lama omfattende aminosyreforskjellene vist i Tabell 11 SEQ ID Nos 67 til 73. Figur 2 og 3 representerer alignment av 12A5 og 12B6 homologe nanobodysekvenser.

vWF var kovalent bundet til sensorchip overflaten via aminkopling. CM5 overflaten til chippen var aktivert ved injeksjon av EDC/NHS (1:1 blanding av 0,4 M 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-carbodiimid og 0,1 M Nhydroksysuccinimid i vann) i 7 minutter. Etter aktivering ble vWF injisert inntil en økning på 6000 responsenheter ble detektert. Overskuddet av reaktive grupper ble deaktivert med 1 M Etanolamin-HCl (pH 8,5) i 7 minutter. Strømningsraten ble holdt konstant under immobiliseringsprosedyren ved 5 ul/min.

Elueringsbuffer var 0,01 M HEPES (pH 7,4) med 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA og 0,005 % Surfaktant P20.

Nanobodies 12B6 og 12A5 og deres homologe proteiner ble analysert i BIACORE på vWF ved en konsentrasjon av Nanobodiet på 5 μg/ml som vist i Figur 4 og 5. Estimerte kon, K-off og KD verdier er vist i Tabell 12 og 13.

Nanobodies 12A5 og 12B5 har de beste K-on og K-off rater. Nanobodies 12A2 og 12B6 har de beste K-on rater, K-off ratene er også meget sammenlignbare for alle de testede nanobodies.

Tabell 14 viser den reelle KD Verdi for vWF på BIACORE ved bruk av et område av konsentrasjoner av nanobodies. Fra settene av kurver som var generert for hvert nanobody, ble kun de kurver hvor likevekt ble oppnådd, benyttet for å avlede KD verdien via steady state affinitet.

For behandling av akutte tilfeller, er den hurtige inhibering av vWF meget viktig, og således er en hurtig K-on rate foretrukket. K-on raten bestemmer hvor hurtig et Nanobody binder til sitt mål (vWF) når det blir injisert i et menneske eller dyr.

Eksempel 6: Sammenligning av inhibering av nanobodies for kraft i perfusjonskammeret

For å sammenligne kraften for inhibering av blodplateadhesjon, ble Nanobodies 12A2, 12B6 og 12A5 testet i perfusjonskammeret ved 0.2, 0.4 og 0.6 μg/ml. Eksperimentet ble utført ved bruk av den samme donor for alle nanobodies. Resultater er vist i Tabell 15 og Figur 6. Nanobodies viser en meget sammenlignbar kapasitet i perfusjonskammeret, med full inhibering av blodplateadhesjon ved en konsentrasjon på 0.6 μg/ml nanobody.

Eksempel 7: Stabilitet av nanobodies ved forhøyede temperaturer

En stamløsning av nanobodies ved en konsentrasjon av 200 μg/ml i PBS ble fremstilt og delt opp i flere rør. Hvert rør inneholdende nanobody ble inkubert ved forskjellige temperaturer i en time, så avkjølt ved romtemperatur i 2 timer og plassert ved 4°C over natten. Den neste dagen ble prøvene sentrifugert I 30 minutter ved 13000 rpm, og supernatanten ble testet ved OD280 nm. Konsentrasjonen av supernatanter ble malt spektrofotometrisk og uttrykt som prosentdel av konsentrasjon ved romtemperatur. Resultatene er oppsummert i Tabell 16.

Supernatantene ble også testet i ELISA for binding til vWF som beskrevet ovenfor i Eksempel 3. Som vist i Figur 7a (12B6), 7b (12A2) og 7c (12A5), er Nanobodies meget stabile ved forhøyede temperaturer.

Eksempel 8: Kryssreaktivitet av Nanobodies med vWF fra andre arter En mikrotiterplate ble belagt med mus anti-myc ved 1/1000 over natten ved 4°C. Platen ble vasket med PBS-Tween og blokkert i to timer ved romtemperatur med PBS-1% kasein. Etter vasking ble Nanobodies benyttet ved en konsentrasjon av 10 μg/ml i PBS. Etter en times inkuberingsperiode ble platene vasket og plasma (hund, svin, menneske, bavian og cynomolog ape) ble benyttet ved start ved en fem-ganger fortynning og utførelse av ytterligere to ganger fortynninger i PBS. Platene ble inkubert i en time ved romtemperatur. Platene ble vasket og polyklonalt anti-vWF-HRP (DAKO) ble benyttet ved en 2000-ganger fortynning i en time ved romtemperatur. Platene ble vasket og ABTS/H2O2 substrat ble benyttet. OD 405 nm ble målt.

Som vist i Figur 8a er (12B6), 8b (12A2) og 8c (12A5), nanobodies 12A5, 12A2 og 12B6 kryss -reaktive med menneske, bavian og cynomolog ape vWF. Nanobodies 12A2 og 12B6 er også kryssreaktive med svine vWF. Disse nanobodies kan derfor bli testet for effektivitet og sikkerhet i svin. Ingen av Nanobodies er kryssreaktive med hunde vWF.

B. Konstruksjon av bivalente nanobodies som er spesifikke for vWF og inhibering av blodplateadhesjon

Eksempel 9: Aminosyresekvenser av de bivalente nanobodies

Tabell 17 SEQ ID Nos 74 til 82 representerer bivalente nanobodies som er konstruert for 12B6, 12A2 og 12A5. Nanobodies ble linket med linkerne representert i Tabell 18 SEQ ID Nos 83 til 85.

Eksempel 10: Ekspresjon og rensing av de bivalente nanobodies Ekspresjoner ble utført som beskrevet ovenfor i Eksempel 2.

Ekspresjonsutbytter er oppsummert i Tabell 19.

Eksempel 11: Analyse av de bivalente nanobodies i BIACORE

De bivalente nanobodies av Eksempel 9 ble analysert i BIACORE ved 1,3 nM som beskrevet ovenfor i Eksempel 5 for å sammenligne affinitetene for vWF versus det monovalente nanobody. De bivalente nanobodies 12B6 (Figur 9), 12A2 (Figur 10) og 12A5 (Figur 11) har en forbedrede affinitet for vWF sammenlignet med det monovalente nanobody.

Eksempel 12: Stabilitet til de bivalente nanobodies ved forhøyede temperaturer

Stabilitet til de bivalente nanobodies ble målt som beskrevet ovenfor i Eksempel 7. Konsentrasjonen ( μg/ml) til supernatantene ble målt og uttrykt som prosentdel av konsentrasjon ved romtemperatur. Resultatene er oppsummert i Tabell 20 (bivalent 12B6), Tabell 21 (bivalent 12A2) og Tabell 22 (bivalent 12A5).

Supernatantene ble testet i ELISA for binding til vWF som beskrevet ovenfor i Eksempel 3. Supernatantene ble benyttet med start ved en 1/100 fortynning og 1/5 fortynninger ble gjort i PBS. Resultater er vist I Figur 12 (12B6), Figur 13 (12A2) og Figur 14 (12A5).

Eksempel 13: Analyse av monovalent og bivalent 12A2 i strømningskammeret

Nanobody 12A2 (monovalente og bivalente former) ble testet i perfusjonskammeret som beskrevet ovenfor i Eksempel 4. Eksperimentet ble utført ved bruk av det samme donor for alle nanobodies. Resultatene er oppsummert i Tabell 23. De bivalente nanobodies hemmer blodplateadhesjon mer effektivt enn den monovalente form.

C. Humanisering av nanobodies som er spesifikke for vWF og inhibering av blodplateadhesjon

Eksempel 14: Humanisering av 12B6 nanobody

Tabell 24 SEQ ID Nos: 86 til 89 representerer fire humaniserte 12B6 nanobodies. Tabell II lister opp aminosyreendringer som ble utført for å oppnå disse sekvenser. Figur 15 representerer alignment av de humaniserte sekvenser for 12B6.

Tabell II: ikke-begrensende humaniserende substitusjoner

Ekspresjoner ble utført som beskrevet i Eksempel 2. Ekspresjonsutbytter er oppsummert i Tabell 25.

Stabiliteten til de humaniserte nanobodies ble målt som beskrevet i Eksempel 7. Tabell 26 oppsummerer OD280 nm konsentrasjonene ( μg/ml) i supernatantene uttrykt som prosentdel av konsentrasjon ved romtemperatur.

Figur 16 viser bindingen av humaniserte 12B6 nanobodies til vWF i ELISA utført som beskrevet i Eksempel 3.

Affiniteten til humaniserte 12B6 nanobodies for vWF ble bestemt i BIACORE. KD verdier er oppsummert i Tabell 27.

Eksempel 15: Humanisering av 12A2 nanobody

Tabell 28 SEQ ID Nos: 90 til 94 representer fem humaniserte 12A2 nanobodies. Tabeller III og IV lister de følgende aminosyreendringene som ble utført for å oppnå disse sekvensene. Figur 17 representer alignment av de humaniserte sekvenser for 12A2.

Tabell III: ikke-begrensende humaniserende substitusjoner:

Tabell IV:

Ekspresjoner ble utført som beskrevet i Eksempel 2. Ekspresjonsutbytter er oppsummert i Tabell 29.

Stabilitet av de humaniserte nanobodies ble målt som beskrevet i Eksempel 7. Tabell 30 oppsummerer OD280 nm konsentrasjonene ( μg/ml) til supernatantene uttrykt som en prosentdel av konsentrasjon ved romtemperatur. Alle humaniserte 12A2 nanobodies er meget stabile etter oppvarming ved økende temperaturer.

ELISA ifølge Figur 18 og 19 ble utført som beskrevet i Eksempel 3.

12A2H1 og 12A2H4 binder meget bra til vWF i ELISA.

Nanobodies ble testet I strømningskammeret ved en konsentrasjon på 0.7 μg/ml og 1.5 μg/ml. Den samme donor ble benyttet for alle eksperimentene. Eksperimentet ble utført som beskrevet i Eksempel 4. Resulter er oppsummert i Tabell 31 og 32.

Affiniteten til humaniserte 12A2 nanobodies for vWF ble bestemt i BIACORE. KD verdier er oppsummert i Tabell 33.

Eksempel 16 (Referanse): Humanisering av 12A5 nanobody

Tabell 34 SEQ ID Nos: 95 til 97 representer tre humaniserte 12A5 nanobodies. Tabell V lister opp aminosyreendringer som ble utført for å oppnå disse sekvensene. Figur 20 representer alignment av de humaniserte sekvenser for 12A5.

Tabell V: ikke-begrensende humaniserende substitusjoner:

Ekspresjoner ble utført som beskrevet ovenfor i Eksempel 2.

Ekspresjonsutbytter etter TALON rensing er oppsummert i Tabell 35 for hvert humaniserte 12A5 nanobody.

Stabilitet til de humaniserte 12A5 nanobodies ble målt som beskrevet ovenfor i Eksempel 7. OD280 til supernatantene ble målt og uttrykt som prosentdel av OD280 ved romtemperatur. Resultatene er oppsummert i Tabell 36. Alle humaniserte 12A5 nanobodies er sammenlignbart stabile ved oppvarming ved økende temperaturer overfor villtypen.

ELISA ble utført som beskrevet i Eksempel 3. Figur 21 illustrerer bindingsaktiviteten for vWF i ELISA.

Affiniteten til humaniserte 12A5 nanobodies for vWF ble bestemt i BIACORE. KD verdier er oppsummert i Tabell 37.

Eksempel 17: Bivalente humaniserte nanobodies

Tre humaniserte nanobodies 12A2H1, 12A2H4 og 12B6H2 ble valgt for bivalent form med 3a linker. Sekvensene av disse 3 nanobodies skiller seg fra hverandre kun ved noen få aminosyrer som vist i Figur 22. Tabell 38 SEQ ID Nos 98 til 100 lister sekvensene til de bivalente nanobodies. Tabell 38 SEQ ID Nos 101 – til 106 lister sekvensene til humaniserte bivalente nanobodies linket med GS9 og GS30 linker, henholdsvis.

Ekspresjoner ble utført som beskrevet i Eksempel 2. Nanobodies inneholdende et (His)6-merke ble renset på en Nickel-kolonne (TALON, Clonetech) som beskrevet av produsenten. Tag-sekvensen er EQKLISEEDLNGAAHHHHHH. Nanobodies merker ble renset på protein A.

Ekspresjonsutbytter ble utregnet og er oppsummert i Tabell 39.

Stabilitet til de humaniserte bivalent nanobodies ble målt som beskrevet i Eksempel 7. OD280 av supernatantene ble målt og uttrykt som prosentdel av OD280 ved romtemperatur. Resultatene er oppsummert i Tabell 40.

Nanobodies (humaniserte, men også villtype) ble testet i strømningskammeret ved konsentrasjoner på 0.15 μg/ml, 0.3 μg/ml og 0.6 μg/ml. Den samme donor ble benyttet for alle eksperimentene. Eksperimentet ble utført som beskrevet i Eksempel 4. Figur 23 viser blodplateadhesjon ved forskjellige konsentrasjoner av bivalente nanobodies. Tabell 41 lister blodplateadhesjon av villtype og humaniserte bivalente nanobodies.

D. Effekt av (bivalent) nanobody på arteriell trombose i en bavian FOLTS modell

Eksempel 18: Bavian FOLTS modell med ALX-0081

I denne studien ble effektiviteten to sikkerheten til ALX-0081 evaluert i en Folts trombosemodell i bavianer.

Effektiviteten til ALX-0081 in en Folts trombosemodell i bavianer ble også sammenlignet med andre medikamenter som i dag blir benyttet i klinikken, slik som Reopro, Plavix, Aspegic, Heparin og Adrenalin. Alle disse ble fortynnet I 0.9% natrium klorid og administrert som intravenøse bolusinjeksjoner. Denne studien var utformet for å bestemme den effektive dose for hver av disse forbindelsene.

Til sist ble effektiviteten I en Folts trombosemodell i bavianer til en kombinasjon av medikamenter som i dag blir benyttet i klinikken i en perkutan koronar intervensjon (PCI) oppsetting testet: Aspegic, Heparin, og Plavix. Vi evaluerte videre om ALX-0081 kan forbedre effektiviteten til denne kombinasjonen når den blir lagt til på toppen.

Vi så på sikkerhetsparametere slik som induksjon av blødning, vWF og faktor VIII nivåer, og blodplatetelling, PT, og aPTT.

Studieprotokoll

Studieprotokollen som ble benyttet er den opprinnelige Folts modellen og noen modifikasjoner beskrevet nedenfor (Folts JD, et al, Circulation.

1976;54:365-370).

Sunne hann- eller hunn-bavianer (Papio ursinus) ble benyttet. Dyrene var 8-17 kg tunge og var sykdom–fri i minst 2 uker før bruk. Bavianene ble foret med kun tort standardfor. Bavianene ble benyttet ved forskjellige tidspunkter. Vekten til bavianene er oppsummert i tabell 42 (effektivitetsstudie ALX-0081 og sammenligning med individuelle medikamenter) og tabell 50 (effektivitet av kombinasjon av medikamenter og ALX-0081 på toppen av denne kombinasjonen).

Dyr ble bedøvet og kroppstemperaturen ble holdt ved 37°C med en varmetabell. Et segment av en femoral arterie ble dissekert fri for omkringliggende vev. En shunt ble plassert mellom dem femorale venen og femorale arterie for å oppnå høye skjærrater. Den gjennomsnittlige og faktiske blodstrømmen ble registrert kontinuerlig gjennom eksperimentet.

Basislinjestrømmen ble registrert i 20 minutter. Det proksimale disseksjonsstedet for den femorale arterie ble så skadet ved å påføre to overlappende okklusjoner av arterien i ett sekund ved bruk av en pinsett. En klemme ble plassert over skadestedet for å skape en ekstern stenose.

En gradvis reduksjon i blodstrømmen på grunn av blodplateadhesjon og -aggregering ble observert. Når strømmen var redusert til null, ble blodstrømmen gjenopptatt ved åpning av klemmen for å slippe fri den blodplaterike trombus. Dette repetitive mønsteret ar reduksjon av blodstrøm fult av mekanisk gjenoppretting er referert til som sykliske strømningsreduksjoner(CFRs).

Ytterligere endotelial skade ble repetert hvis behov for til sist å oppnå stabil CFRs i disse bavianene. Antallet ganger som trombus matte bli frigitt for bestemmer antallet av CFRs. Figur 24 illustrerer blodstrømningsmønster under Folts modell i bavianer.

Etter en 30-minutters kontrollperiode av reproduserbare CFRs, ble bæreren administrert som en intern kontroll og CFRs ble fult opp i ytterligere 30 minutter. Etter denne perioden, ble testmidler (saltvann (n=2), Reopro (n=3), Aspegic (n=3), Plavix (n=4), Heparin (n=3) eller ALX-0081 Nanobody™ (n=9)) gitt via n intravenøs bolusinjeksjon (fulgt av en kontinuerlig infusjon for ALX-0081) og registreringen ble fortsatt opp til 30 minutter etter medikamentadministrasjon. Denne prosedyren ble gjentatt flere ganger med økende doser v teststoffet. Den anti-trombotiske effekt ble kvantifisert ved sammenligning av lengden av CFRs før og etter medikamentadministrasjon. Når full hemming av CFRs ble observert, ble en ny skade benyttet for å bekrefte at hemmingen var en effekt av behandlingen, men ikke et naturlig helingsfenomen. Ved slutten av eksperimentene, ble Adrenalin (2.2 μg/kg/min) injisert for å skille mellom en svak og en sterk hemming av CFRs. Faktisk har det blitt demonstrert tidligere at CFRs gjenopptrer i nærvær av Adrenalin når aspirin (et svakt anti-blodplatemedikament) blir benyttet i den samme modell. Oppsettet av eksperimentet er illustrert i Figur 25.

Lengden av CFRene, etter hver dose av testforbindelse er oppsummert i tabeller 43-48. Doser ved hvilken full inhibering av CFRs blir oppnådd er skyggelagt.

En representative avlesning av blodstrømmen under Folts modelleksperimentene er vist i figurene 26-31.

Resultatene demonstrerer at CFRs kan bli fremskaffet i kontrolldyrene minst 3 ganger, uten behov for en ny skade mellom. Den gjennomsnittlige lengde av CFRs er 2-5 minutter og der er ingen effekt på lengden av CFRs ved injeksjon av saltvann (figur 26, tabell 43).

Aspegic

Tre dyr ble injisert med Aspegic (injiserbar Aspirin) og observert for inhibering av CFRs. I klinikken blir en bolusinjeksjon av 250 mg (± 3-5 mg/kg) administrert til pasienten, rett før starten av en perkutan koronar intervensjons (PCI) prosedyre. I to dyr (bavian 3 og 5) kunne ingen inhibering av CFRs bli fremskaffet ed doser så høye som 80 og 40 mg/kg Aspegic henholdsvis (figur 27, tabell 44). I bavian 4, er det meget vanskelig å skille mellom et stabilt repetitivt mønster av CFRs i kontrollfasen. Etter flere nye skader var gjort (dette er ved tiden vi injiserte saltvann), ble stabil CFRs oppnådd. Full inhibering av CFRs ble oppnådd ved dose på 5 mg/kg Aspegic, men ved høyere doser og etter ny skade, returnerte CFRs, selv om den gjennomsnittlige lengde av CFRs var 3-4 ganger lengre før enn etter administrasjon av Aspegic. Etter infusjon av Adrenalin, kom CFRs tilbake umiddelbart og fullstendig (tabell 44).

Heparin

Tre dyr ble injisert med ikke-fraksjonert Heparin og undersøkt for inhibering av CFRs. I klinikken ble en bolusinjeksjon av 60-70 IU/kg administrert til pasienten, og aPTT (aktiverte partiell tromboplastin tid) ble overvåket hvert 30. minutter. Ekstra Heparin ble administrert dersom aPTT er <250 sekunder. I bavianer 7 og 8, kunne ingen inhibering av CFRs bli fremskaffet selv ikke ved doser så høye som 240 IU/kg (figur 28, tabell 45). I bavian 6, ble full inhibering av CFRs oppnådd ved den første dose av 15 IU/kg og ved høyere doser, men når det ble lage en ny skade returnerte CFRs hver gang. Ved den høyeste dose av 240 IU/kg, ble CFRs hemmet selv etter en ny skade, men strømningen ble redusert og etter infusjon av Adrenalin, returnerte CFRs umiddelbart.

Plavix

Fire bavianer ble behandlet med Plavix og benyttet for Folts studie. Vi benyttet Plavix som injiserbart medikament ved re-suspendering av tabletter i metanol. Derfor var vi I stand til å utføre et doseeskalingseksperiment som for de andre medikamenter. I pasienter, ble 300-600 mg Plavix administrert oralt, inhibering av blodplate aggregering kan bli sett 2 timer etter enkle orale doser av Plavix. Allerede ved 2.5 mg/kg endelig dose i bavianene, kunne en effekt på lengden av CFRs bli demonstrert, men denne inhibitoriske effekten startet kun 10 minutter etter injeksjon (figur 29, tabell 46). I bavian 12, ble full inhibering av CFRs oppnådd ved denne dose på 2,5 mg/kg. I de andre tre bavianene ble full inhibering av CFRs oppnådd ved 5 mg/kg endelig dose. CFRs forble hemmet når en ny skade ble gjort, men returnerte etter infusjon av Adrenalin. Når Adrenalin infusjon ble stoppet, forble CFRs i ytterligere 5 minutter, men så ble igjen full hemming oppnådd (figur 29).

Reopro

Reopro ble testet for effektivitet I Folts modellen i tre bavianer. I klinikken mottok pasientene en dose på 250 μg/kg fulgt av en kontinuerlig infusjon på 7,5 μg/kg/time. Dette er også dosen vi hadde behov for i bavianer 13, 14 og 15 for å oppnå full inhibering av CFRs (endelig dose av 170-420 μg/kg (figur 30, tabell 47). Vi administrerte til bavianene kun en bolusinjeksjon. Når en ny skade ble gitt, ble full inhibering av CFRs oppretthold og infusjon av Adrenalin kunne ikke reversere denne hemmingen (figur 30).

ALX-0081

Ni bavianer mottok ALX-0081 og ble benyttet i Folts modellen. I alle bavianer ble full inhibering av CFRs oppnådd ved dose på 30 μg/kg 45 μg/kg/time (endelig dose på 43 μg/kg). I 2 bavianer, ble full inhibering allerede oppnådd ved 10 μg/kg 15 μg/kg/time (bavianer 17 og 22). Inhibering ble oppretthold etter ny skade o getter infusjon av Adrenalin i alle ni bavianer (figur 31, tabell 48).

Aspegic-Heparin-Plavix-ALX-0081 (Asp/Hep/Plav/ALX) kombinasjoner Syv bavianer mottok en bolusinjeksjon på 5 mg/kg Aspirin, 60 IU/kg Heparin og økende doser av Plavix. Ekstra Heparin ble administrert ved forskjellig tidspunkter for å opprettholde et visst nivå (aPTT skal være minst det dobbelte av kontroll). CFRs ble registrert I 30 minutter etter hver dose av testforbindelser. Vi startet ved en dose på 1 mg/kg Plavix og la til 1 mg/kg etter 30 minutter. Den anti-trombotiske effekt ble kvantifisert ved sammenligning av lengden av CFRs før og etter medikamentadministrasjon. Når full inhibering av CFRs ble observert, ble en ny skade tilført. Adrenalin ble injisert og fortsatt inntil slutten av eksperimentet. Dersom CFRs ikke kom tilbake, ble en ny skade tilført. Etter 2-3 CFRs ble økende doser av ALX-0081 tilsatt: (1), 3, 10 eller 30 μg/kg. Vi ventet etter hver dose av ALX-0081 for 2 CFRs og øket dosen inntil full inhibering av CFRs ble oppnådd. Ved full inhibering av CFRs, ble kontinuerlig infusjon startet av 1,5 ganger dose ALX-0081/kg/time i 30 minutter og adrenalininfusjon ble fortsatt. En ny skade ble påført etter 10-15 minutter. Spesifikasjonene til bavianene som ble benyttet i denne studien er angitt i tabell 49.

Resultatene fra disse studiene for hver testforbindelse er individuelt oppsummert i tabell 50. En klart overlegen anti-trombotisk effekt i Folts trombose bavian modellen ble observert for ALX-0081 og Reopro når de ble sammenlignet med Aspirin, Heparin eller Plavix: etter ny skade og etter infusjon av Adrenalin, returnerte ikke CFRs i Folts modellen i de ALX-0081 og Reopro behandlede bavianer i motsetning til modellen for Aspegic, Heparin eller Plavix behandlede dyr. Dosen av ALX-0081 sin var nødvendig for full inhibering av CFRs er omkring 10-ganger lavere enn dosen som er nødvendig for Reopro. Derfor blir det konkludert at ALX-0081 er mer potent enn Reopro.

Etter administrasjon av en kombinasjon av 5 mg/kg Aspirin, 60 IU/kg Heparin og økende doser av Plavix, ble det for alle syv bavianer oppnådd full inhibering av CFRs ved denne endelige dosen. Dosen av Plavix som var nødvendig for full inhibering er 2,5-ganger lavere enn dosen som er nødvendig når Plavix blir administrert alene. For alle testede bavianer, returnerte ikke CFRs når en ny skade ble påført (figur 32). Imidlertid, etter injeksjon av Adrenalin, returnerte CFRs spontant i bavianer 5, 8, 9 og 10 og etter en ny skade i bavianer 4, 6 og 7. Ekstra Heparin ble injisert samtidig som adrenalin. Etter 2 CFRs, ble økende doser av ALX-0081 administrert under fortsatt infusjon av Adrenalin. Dosen av ALX-0081 ble øket fra 1 over 3-10 til 30 μg/kg. Når full inhibering av CFRs ble oppnådd, ble en kontinuerlig infusjon av ALX-0081 startet ved 1,5 ganger den effektive dose/kg/tid. I alle syv bavianer, ble full inhibering av CFRs oppnådd ved 30 μg/kg dose. Denne effektive dose av ALX-0081 er den samme som er nødvendig for fullstendig inhibering av CFRs i Folts modellen når ALX-0081 blir administrert alene.

Derfor kan vi konkludere med at effektiviteten av ALX-0081 ikke blir øket ved samtidig infusjon av Plavix, Heparin og Aspegic. Denne observasjonen er fullstendig på linje med vår hypotese: ALX-0081 hemmer den første interaksjonen mellom blodplater og det eksponerte collagen i den skadede arterielle vegg. Plavix og Aspegic på den andre siden hemmer lengre nedstrøms i kaskaden som fører til utvikling av en trombus. Derfor bidrar Plavix og Aspirin ikke til bedre effektivitet siden ALX-0081 vekselvirker allerede med det første trinn i trombusdannelse. Videre, når en ny skade blir påført ved den effektive dose av ALX-0081, kom ikke CFRs igjen, noe som demonstrerer en potent antitrombotisk effekt av dette Nanobody<TM>. Resultatene er oppsummert i tabell 51.

Målinger

De følgende parametere ble målt: a) blødningsanalyse, b) vWF konsentrasjon, Faktor VIII nivåer, og blodplatetellinger, PT og aPTT c) ristocetin-indusert blodplateaggregering d) ALX-0081 konsentrasjon, og e) analyse av arterielle seksjoner for restenose, f) immunogenisitet av ALX-0081

a) Blødningsanalyse

For å analysere blødning ble et snitt gjort med en skalpell i lysken. Dette ble gjort 15 minutter etter registrering av basislinjestrømning, når skaden ble påført. Gas ble satt inn I sårene og erstattet hvert 30 minutter rett før hver nye dose av testforbindelse. Mengden av blodtap etter hver dose av testforbindelse ble bestemt ved å veie gasbindene. Blodtap er uttrykt relativt til mengden av blodtap i det andre kontroll gasbind (under saltvannsinjeksjonen) (tabeller 52-54).

For alle bavianer behandlet med Plavix og Reopro, er blodtap høyt (opp til 9-40 ganger, henholdsvis, ved den høyeste dose), med utgangspunkt fra den effektive dose. For dyr behandlet med ALX-0081 er blødning lavere enn i de Plavix behandlede dyrene, og mye lavere når sammenlignet med Reopro behandlede dyr.

For å bestemme sikkerhet versus effektivitetsnivåer av Plavix, Reopro og ALX-0081 som antitrombotiske medikamenter, er gjennomsnittlig blodtap relativt til det andre kontroll-gasbind vist for disse medikamentene som funksjon av medikamentdose som multippel av den effektive dose (figur 33). Den effektive dose for Plavix er 5 mg/kg, for Reopro 250 μg/kg og for ALX-008130 μg/kg (tabell 46-48). Disse resultatene viser den overlegne sikkerheten for ALX-0081 sammenlignet med Reopro og Plavix: vinduet ved hvilket ALX-0081 kan bli administrert uten en stor økning i blødning er mye videre sammenlignet med Plavix og Reopro.

Resultatene fra de gjennomsnittlige blodtap i gasbind (hvis tilgjengelig) ble kombinert med de gjennomsnittlige lengder av CFRs i figurene 34-36.

Et bredt terapeutisk vinduble observert for ALX-0081 i Folts modellen: en sterk antitrombotisk effekt kan bli demonstrert uten noen kraftig blødning for kumulative doser i området fra 43 µg/kg opp til 403 µg/kg (figur 36). I motsetning var, imidlertid, det terapeutiske vinduet for Reopro og Plavix i den samme modell meget smalere sammenlignet med ALX-0081, som kombinerer en effektiv antitrombotisk effekt med et høyt blodtap (figur 34-35).

Den gjennomsnittlig totale mengde av blodtap (= sum av blodtap fra gasbindene for de første fem doser av testforbindelse) i forhold til det andre kontrollgasbind er oppsummert i tabell 55. I denne tabellen indikerer vi også den endelig dose som multippel av den effektive dose (= sum av de fem doser delt på den effektive dose). Som nevnt tidligere, er den effektive dose for Plavix 5 mg/kg, for Reopro 250 μg/kg og for ALX-008130 μg/kg.

Resultatene vist i tabell 55 viser klart at totalt blodtap blir øket signifikant i dyrene behandlet med Plavix og til en enda høyere grad for dyrene behandlet med Reopro. Blodtap i dyr som mottar ALX-0081 er 2-ganger og 4 ganger mindre enn i Plavix eller Reopro behandlede dyr, henholdsvis. Dette demonstrerer igjen at ALX-0081 er sikrere enn Plavix og Reopro hva angår blødningsrisiko, selv om doser på mer enn 10-ganger den effektive dose ble benyttet.

Den effektive kombinasjon av Aspegic, Heparin og Plavix resulterer i en økning av blodtap på opptil 14 ganger sammenlignet med kontrollgasbindet (tabell 56). Addisjon av ALX-0081 på toppen av kombinasjonen av Aspegic, Heparin og Plavix resulterer ikke i øket blødning bortsett fra for bavianer 4 og 7. I bavian 7, ble blødning kraftig øket etter administrasjon av adrenalin, ekstra heparin og ikke-effektive doser av ALX-0081, men ble redusert igjen etter administrasjon av den effektive dose av ALX-0081. Disse resultatene demonstrerte at ALX-0081 er sikker når den bli lagt på toppen av kombinasjonen av medikamenter som i dag blir benyttet i en klinisk setting.

b) vWF konsentrasjon, Factor VIII nivå, blodplatetelling, PT og aPTT

vWF

vWF nivåene i blodplaterikt plasma (PRP) av blodprøver som var tatt etter administrasjon av de forskjellige dosene av medikamentene i Folts modellen ble bestemt ved bruk av en immunosorbent analyse og uttrykt som en prosentdel av den humane standard (WHO 5<th >International Standard for faktor VIII og VWF)

Disse resultatene demonstrerer klart at de forskjellige medikamentene benyttet i modellen har ingen større effekt på vWF nivået.

Faktor VIII

Faktor VIII nivåene av PRP i blodprøver tatt etter administrasjon av de forskjellige dosene av medikament i Folts modellen ble bestemt ved bruk av aPTT testen. Vi testet ikke plasmaprøvene av bavianene behandlet med Heparin, som vi demonstrerte at Heparin forlenger aPTT tiden. FVIII nivåene ble uttrykt som prosentdel av den første kontrollprøven, tatt 10 minutter etter skade av den femorale arterien. Vi så ingen effekt på behandlingene på aPTT testen.

Blodplatetelling, PT og aPTT

Blodplatetellings målingene ble utført under Folts modell eksperimentene. Dataene viser at bavian 15 hadde en meget lav blodplatetelling sammenlignet med de andre dyrene. Blodplatetellingene for alle typer behandlinger, bortsett fra Plavix behandlingen, er meget sammenlignbare med de vi ser i kontrolldyrene og er relativt konstante over tid.

PT verdiene demonstrerer ingen effekt av testforbindelsene på PT tiden, bortsett fra på bavianer behandlet med 240 IU/kg dose Heparin hvor en mindre økning i PT ble observert.

aPTT verdiene observert under Folts modellstudiene er oppsummert. Disse resultatene indikere at testforbindelsene ikke har noen effekt på aPTT verdiene, bortsett fra for bavianene behandlet med Heparin. I disse dyrene, er aPTT verdiene forlenget fra 30-60 IU/kg dosen, som det også er observert i pasienter. Heparin virker som et antikoagulerende middel ved dannelse av et kompleks med antitrombin og katalysering av inhiberingen av aktiverte blodkoaguleringsfaktorer slik som XIa, IXa, Xa og trombin (faktor IIa). Disse faktorene er alle involvert i den intrinsiske koaguleringskaskaden og dens funksjonalitet blir målt i aPTT testen.

c) Målinger av ristocetin-indusert blodplate aggregering i blod tatt fra bavianer behandlet med ALX-0081

Blod tatt fra bavianer behandlet med ALX-0081 ble analysert for inhibering av blodplateaggregering. Blodplateaggregeringer ble utført på et Chronolog helblod og optisk Aggregometer (Model 560CA, Chronolog, USA). PRP ble preparert (samlet på 0.38 mol/L citrat), ved sentrifugering av helblod ved 1200 rpm i 5 minutter. Den øvre inneholdende PRP ble forsiktig fjernet. Den nedre fraksjon ble videre sentrifugert ved 3000 rpm i 10 minutter for å preparere blodplatefattig plasma (PPP). Blodplater ble talt i PRP og fortynnet i PPP til en endelig konsentrasjon på 200.000 blodplater per mikroliter.3 mg/ml ristocetin (DAKO) ble tilsatt og aggregering ble målt.

Ex vivo blodplateaggregering ble målt i blodprøvene som ble tatt under Folts eksperimentet i bavianene behandlet med ALX-0081. GPIb-IX-V avhengig blodplateaggregering ved vWF ble målt ved bruk av ristocetin som en modulator. % aggregering ble malt ved hvert tidspunkt og ved hver dose.

Kontrollprøven ble tatt ved 10 minutter etter arteriell skade.

Resultater fra RIPA testen ble sammenlignet med inhibering av CFRs for hver bavian behandlet med ALX-0081 (figur 37). Som vist i figur 37, blir en invers relasjon mellom RIPA og lengden av CFRs observert. Videre, viser disse resultatene at full inhibering i RIPA testen blir oppnådd ved lavere doser enn full inhibering av CFRs i bavianer 16, 18, 19 og 23. For bavianer 20, 21, 22 og 24 sammenlignes resultatene med RIPA meget godt med resultatene for effektivitet i Folts modellen.

d) Konsentrasjon av ALX-0081

Mikrotiterplater ble belagt med mus polyklonal anti-myc over natten ved 4°C ved en 1000-ganger fortynning. Platene ble vasket med PBS-Tween og blokkert i 2 timer ved RT med PBS-1% kasein. Prøver blir fortynnet på en ikkebelagt mikrotiterplate i 25% referanse bavianplasma. Standardkurven ble fremstilt ved fortynning av Nanobodiet i den samme referanse bavianplasmaprøven. Prøver ble att på de anti-myc belagte plater og tillatt å binde i 2 timer ved RT. Platene ble vasket 5 ganger med PBS-Tween. Kanin anti-vWF-HRP (DAKO) ble satt på ved en 3000-ganger fortynning i en time ved RT. For målinger av OD405 nm, ble prøver vasket 5 ganger med PBS-Tween og ABTS/H2O2 substrat ble tilsatt.

Vi bestemte konsentrasjonen av ALX-0081 i plasmaprøver tatt ved 10 minutter etter hver bolusinjeksjon. Bolusinjeksjonen ble umiddelbart fulgt av en kontinuerlig infusjon. Konsentrasjonene (µg/ml) er oppsummert i tabell 58.

For alle bavianer ble et økende nivå av ALX-0081 i plasmaprøvene målt ved ELISA etter dose-eskalering av ALX-0081. For bavian 16, ble konsistent høyere mengder av ALX-0081 funnet i plasmaprøven tatt etter 10 μg/kg dosen sammenlignet med prøven tatt etter 30 μg/kg. ALX-0081 nivået I prøven er også betydelig høyere enn det som ble notert for alle andre bavianer gitt den samme dosingsplan for ALX-0081. Da nivåene av ALX-0081 for bavian 16 etter de høyere dosene er i samsvar med forventningene, antar vi at en ukjent abnormalitet under blodprøvetakingen står for dette resultatet.

Konsentrasjonen av ALX-0081 for hver dose i de forskjellige bavianer er variabel. For 3 μg/kg dosen, ligger konsentrasjonsområdet mellom 0,03 og 0,14 μg/ml for 10 μg/kg mellom 0,18 og 1,23 μg/ml, for 30 μg/kg mellom 0,51 og 1,14 μg/ml, for 90 μg/kg mellom 1,38 og 6,77 μg/ml og for 270 μg/kg mellom 4,03 og 35,14 μg/ml.

I figur 38, plotter vi konsentrasjonen av ALX-0081 i plasma versus lengden av CFRs.

Konsentrasjon av ALX-0081 som kreves for full inhibering av CFRs er mellom 0,3 og 0,5 μg/ml, som er i fullt samsvar med konsentrasjon som kreves for å hemme blodplateadhesjon til collagen i strømningskammer ved høy skjærrate, når ALX-0081 blir tilsatt til humant blod. I blått (figur 38, panel B) indikerer vi konsentrasjonsområdet av ALX-0081 hvor inhibering starter (utelater 10 μg/kg dosen i bavian 16).

Ved plotting av konsentrasjon av ALX-0081 versus den relative mengde av blodtap fra gasbindene, observerer vi en mer enn to ganger økning i blødning ved doser over 1 μg/ml (figur 39). En 10-ganger økning i blodtap ble observert når ALX-0081 konsentrasjon er 19 μg/ml, som er 40-60-ganger den effektive konsentrasjonen.

e) Analyse av arterielle seksjoner for restenose

Fire uker etter behandling av de den andre arterien, ble arterier dissekert fri for omkringliggende vev. Arterien ble bundet ved det øvre og nedre stedet for den endoteliale skaden inkludert stedet hvor shunten var plassert. En seksjon på 2 centimeter ble fjernet, kuttet i en nedre (shunt sete) og øvre del (stenosert og skadet sete) og lagret i 10% formaldehyd. Bavianene ble så avlivet ved eutanaseinjeksjon. Arteriene ble markert etter opprinnelse og skåret i ringer hver på 2 mm. Ringene ble plassert i merkede kassetter passende for histologisk prosessering. Kassettene ble så plassert over natten i en automatisert VIP Tissue Tek prosessor ifølge overnatt prosesseringsplanen som beskrevet i Bancroft (Bancroft, John D., Stevens Alan (1990). Theory og Practice of Histological Techniques. Third Edition).

Etter prosessering, ble arteriene innesluttet i merkede parafinvoksblokker og avkjølt på en fryseplate. Voksblokkene ble skåret i serier av seksjoner hver på 4 mikron på en roterende mikrotom. Seksjoner ble plukket opp på glassplater of farget for histologisk evaluering. Haematoxylin og Eosin så vel som Verhoeff’s fremgangsmåte for farging av elastiske fibre ble utført på hver av arteriene (Bancroft, John D., Stevens Alan (1990). Theory og Practice of Histological Teknikker. Third Edition). Etter farging ble platen dehydrert, klaret, montert og markert. Blindanalyse av seksjonene ble utført.

f) Immunogenisitetsanalyse

Nærværet av ALX-0081 immunoglobuliner i plasma fra tre bavianer ble evaluert ved to fremgangsmåter, henholdsvis en ELISA fremgangsmåte og en SPR-basert fremgangsmåte på Biacore. Bavianene ble behandlet I 8 uker med økende doser av ALX-0081 (med start fra 10 µg/kg). Under nevnte 8 uker kunne ingen immunogen respons bli observer etter injeksjon av ALX-0081. Halveringstiden for ALX-0081 varierte mellom 7 og 9 timer.

Eksempel 20: Anvendelse av vWF som en antidot for ALX-0081

Trass i den beviste sikkerheten for ALX-0081 i bavianer, og den hurtige klareringen av Nanobody™, bestemte vi å evaluere anvendelsen av vWF som en antidot for ALX-0081. Dette ble testet i en Folts modell i bavianer hvor vi evaluerte om den inhibitoriske effekten til ALX-0081 på arteriell trombusdannelse kan bli reversert ved injeksjon av vWF.

Den eksperimentelle prosedyren fulgte den originale Folts modellen med modifikasjonene som beskrevet i det tidligere eksempel 18.

Sunne hankjønns bavianer (Papio ursinus) ble benyttet i denne studien. Dyrene hadde en vekt på 9-12 kg og var sykdoms-fri i minst 2 uker før bruk. Bavianene ble kun foret med standard tørrfor.

Tre bavianer ble benyttet i denne studien, lengden av CFRs under kontrollfasen, etter administrasjon av saltvann, ALX-0081 og vWF er oppsummert i tabell 59.

Blodstrømmen som funksjon av tiden for hver bavian og eksperiment er vist i figur 40.

I alle tre bavianer, ble full inhibering av CFRs oppnådd ved 30 μg/kg 45 μg/kg/time dose av ALX-0081, selv når ny skade ble påført, returnerte ikke CFRs. Etter injeksjon av den første dosen av vWF (250 IU), avtok strømmen gradvis, men CFRs returnerte ikke før en ekstra dose på 250 IU av vWF ble administrert. Dette resultatet demonstrerte at aktiviteten til ALX-0081 kan bli reversert ved administrasjon av vWF, og at vWF derfor vil være en god antidot for dette Nanobody™.

Således, ifølge et annet aspekt angår foreliggende beskrivelse anvendelsen av vWF, av et passende fragment derav, av DDAVP (desmopressinor) eller et passende fragment derav, eller av en farmasøytisk sammensetning omfattende en hvilken som helst av de foregående, som en antidot for komplikasjoner eller uønskede bieffekter som er assosiert med anvendelsen av et Nanobody, protein eller polypeptid mot vWF, spesielt et Nanobody, protein eller polypeptid som beskrevet heri.

Eksempel 21: Effekter av ALX-0081 på blodplateadhesjon til endotelial celle-avledet UlvWF og på aktiviteten til ADAMTS-13

Denne studien tjener som bevis på konseptet for anvendelsen av ALX-0081 som et medikament for TTP pasienter. Perfusjoner av blodplates rekonstituert i TTP plasma (intet ADAMTS13) ble utført på endotelialceller som skiller ut ULvWF, i fravær og nærvær av ALX-0081. I et separat eksperiment t3estet vi om ALX-0081, som binder til A1 domenet av vWF, forstyrrer ADAMTS-13 aktivitet. ADAMTS-13 binder til og spalter A2 domenet av vWF.

Endotelialceller ble anskaffet fra humane navlestrengsvener ved fremgangsmåten ifølge Maruyama (Z.Zellforsch. Mikrosk. A4nat.60:69; 1963). Endotelialceller ble aktiverte med 100 µM histamin (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) i 15 minutter ved romtemperatur før perfusjonseksperimentene.

Blod ble trukket fra friske frivillige som hadde avstått fra inntak av aspirin eller andre ikke-steroidale anti-inflammatoriske medikamenter (NSAIDs) i de foregående 10 dagene, av en tiendels volum 3,4% natriumcitrat. Blodplate-rikt plasma (PRP) ble preparert fra helblod ved sentrifugering (10 minutter ved 200g ved romtemperatur). PRP ble surgjort ved tilsetting av en tiendels volum av ACD (2.5% trinatriumcitrat, 1.5% sitronsyre, og 2% D-glukose), og blodplatene ble spunnet ned (500g, 15 minutter). Blodplatepelleten ble resuspendert i HEPES (N-2-hydroksyetylpiperazin-N'-2-etanesulfonsyre)-Tyrode buffer (10 mM HEPES, 137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, 0.42 mM NaH2PO4, 1.7 mM MgCl2, 5 mM D-glukose, pH 6.5). Prostacyclin (PGI2, 10 ng/mL) ble tilsatt for å forhindre blodplateacktivering under de påfølgende vasketrinn. Blodplater ble spunnet ned og suspendert i et lite volum HEPES-Tyrode buffer. Denne blodplatesuspensjonen ble fortynnet i HEPES buffer at pH 7.4, eller i TTP plasma.

Perfusjoner ble utført i et enkeltpasserings perfusjonskammer som beskrevet tidligere. Eksperimentet ble fulgt av sanntids videomikroskopi.

I en annen type eksperiment, ble forskjellige reaksjonsblandinger preparert som oppsummert I tabell 60, imidlertid, uten tilsetning av A1A2A3 konstruktet. A1A2A3 konstruktet er et rekombinant fragment bestående av A1, A2 og A3 domene av vWF. Blandinger ble pre-inkubert i 5 minutter ved 37 ̊C etter hvilket A1A2A3 fragmentet ble tilsatt og blandingen ble inkubert i et vannbad over natten ved 37 ̊C. Den neste dag ble reduserende SDS-PAGE kjørt på prøvene (12%, og ved bruk av som markør Precision Plus Protein Standarder fra BioRad) og blottet på Immobilon-FL (Millipore). Blottet ble blokkert i 2 timer ved romtemperatur med blokkeringsbuffer (1:1 Odyssey blokkeringsbuffer i 1xTBS pH=7,4) og inkubert med kanin polyklonal anti-vWF (DAKO). Alexa Fluor 680 geit anti-kanin ble benyttet for deteksjon. Skanning ble utført på ODYSSEY for å detektere degradringsprodukter.

Kontrolleksperiment: binding av blodplater til ULvWF

Endotheliale celler ble isolert fra friskt oppnådde human navlestreng ved collagenaseaktivitet av det indre av navlestrengen. Cellene ble dyrket i vevskultur som en homogen populasjon. Dyrkede humane endoteliale celler vokser som monolag av nært mot hverandre liggende , polygonale store celler og de inneholder cytoplasmiske inklusjoner (Weibel-Palade legemer). Histaminstimulerte endotelialceller isolert fra human navlestreng utrykker ultrastor von Willebrand faktor (ULvWF) på overflaten. Perfusjon av disse stimulerte cellene med blodplates fra isolert blod, som ble suspendert i enten buffer eller plasma fra en pasient med ervervet TTP, resulterer i avsetting av blodplater på ULvWF (8). Disse ULvWF-vedheftede blodplater fremkommer som såkalte ‘strenger’, som er synlige når perfusjonseksperimentet blir overvåket ved sanntids videomikroskopi (figur 41).

Inhibering av ALX-0081 for genereringen av blodplatestrenger Blodplater ble resuspendert i buffer eller i TTP plasma og konsentrasjonene av ALX-0081 benyttet i dette eksperimentet var 0,2, 2 og 10 µg/ml. Histamin-stimulerte endotelialceller isolert fra human navlestreng blir perfusert med disse blodplatesuspensjonene som beskrevet ovenfor.

Addisjon av ALX-0081 til blodplater resuspendert i buffer eller i plasma fra en TTP pasient resulter i en fullstendig hemming av strengdannelse under alle testede betingelser (figur 42). Perfusjonseksperimentene ble utført ved et skjærstress på 2.5 dyn/cm2 i 4 minutter. Under disse 4 minutter perfusjon ble minst 20 mikroskopifelt undersøkt, o I nærvær av Nanobodiet<TM>, kunne ingen strenger bli vist i noen av de testede betingelsene (figur 42).

Spalting av ULvWF ved ADAMTS-13

ADAMTS-13 reduserer størrelse av store og ultrastore VWF multimerer til mindre former ved spesifikk spalting av Y842/M843 peptidbindingen i VWF A2 domenet. To typer av analyser ble benyttet for å evaluere effekten av ALX-0081 på spaltingen av ULvWF ved ADAMTS-13: dvs. en perfusjonsanalyse og en analyse som observerer spaltingen av et rekombinant vWF fragment.

I et første eksperiment, ble strenger generert ved en 4 minutters perfusjon av vaskede blodplater resuspendert i buffer over histamin-stimulerte endothelialceller. Deretter ble ikke-vedheftende blodplater vasket bort ved en 4 minutters perfusjon av buffer. Etter dette ble buffer perfusert i ytterligere 4 minutter, fulgt av en 4 minutters perfusjon av oppsamlet normalt plasma inneholdende ADAMTS-13. Løsgjøring av blodplatestrenger ble observer etter perfusjon av oppsamlet normalt plasma (figur 43). Mer enn 95% av strengene ble spaltet etter den 4 minutters perfusjonen.

I et neste eksperiment, ble strengene generert ved en 4 minutters perfusjon av vaskede blodplater som var resuspendert i buffer over histaminstimulerte endothelialceller og de ikke-vedheftede blodplatene ble vasket bort ved en 4 minutters perfusjon av buffer som ovenfor. Etter dette ble ALX-0081 (10 µg/ml i buffer) perfusert i 4 minutter, fulgt av en 4 minutters perfusjon av oppsamlet normalt plasma inneholdende ALX-0081 (10 µg/ml= 10-ganger molart overskudd over vWF) og ADAMTS-13. Vi kunne klart demonstrere løsgjøring av blodplatestrengene og 95% av strengene ble spaltet etter den 4 minutters perfusjonen (figur 44)

Disse resultatene viser klart at ALX-0081 ikke har en effekt på spalting av ULvWF strenger ved ADAMTS-13.

I en annen analyse, ble et rekombinant fragment inneholdende A1-A2-A3 domenet av vWF blandet med normalt oppsamlet plasma (NPP) inneholdende ADAMTS-13, for å resultere i proteolytisk spalting av fragmentet som ble observert ved en Western Blot analyse. ADAMTS-13 aktivitet ble testet i fravær og nærvær av 10 μg/ml ALX-0081. Som indikert i figur 45 har ALX-0081 ingen effekt på spaltingen av vWF fragmentet (spor 6-7-8).

For å demonstrere at den observerte spaltingen er spesifikk for ADAMTS-13, ble et kontrolleksperiment i nærvær av EDTA utført da EDTA hemmer aktiviteten til ADAMTS-13. Som forventet resulterer nærværet av EDTA i NPP i inhibering av spalting av fragmentet (figur spor 4).

Dette eksperimentet beviser igjen at ALX-0081 ikke har påvirkning på ADAMTS-13 aktiviteten.

Tabell 8: Sekvenslisting av anti-vWF nanobodies

Tabell 9: Ekspresjonsutbytter av anti-vWF nanobodies

Tabell 10: Blodplateadhesjon i perfusjonskammer av anti-vWF nanobodies

Tabell 11: Sekvenslisting av 12B6 og 12A5 homologe nanobodies

Tabell 12: Estimerte K-on, K-off og KD verdier for 12A5 homologe nanobodies

Tabell 13: Estimerte K-on, K-off og KD verdier for 12B6 homologe nanobodies

Tabell 14: Reell KD verdi av 12B6, 12A2 og 12A5 nanobodies

Tabell 17: Sekvenslisting av bivalente nanobodies

Tabell 18: Sekvenslisting av linkersekvenser

Tabell 19: Ekspresjonsutbytter av bivalente 12B6, 12A2 og 12A5 nanobodies

Tabell 20: Konsentrasjon av 12B6 bivalent nanobodies etter oppvarming ved økende temperaturer

Tabell 21: Konsentrasjon av 12A2 bivalent nanobodies etter oppvarming ved økende temperaturer

Tabell 22: Konsentrasjon av 12A5 bivalent nanobodies etter oppvarming ved økende temperaturer

Tabell 23: Blodplateadhesjon i perfusjonskammere av 12A2 bivalente nanobodies

Tabell 24: Sekvenslisting av humaniserte 12B6 nanobodies

Tabell 25: Ekspresjonsutbytter av villtype og humaniserte 12B6 nanobodies

Tabell 26: Konsentrasjon av villtype og humaniserte 12B6 nanobodies etter oppvarming ved økende temperaturer

Tabell 27: KD verdier for villtype og humaniserte 12B6 nanobodies

Tabell 28: Sekvenslisting av humaniserte 12A2 nanobodies

Tabell 29: Ekspresjonsutbytter av villtype og humaniserte 12A2 nanobodies

Tabell 30: Konsentrasjon av villtype og humaniserte 12A2 nanobodies etter oppvarming ved økende temperaturer

Tabell 31: Blodplate adhesjon av villtype og humaniserte 12A2 nanobodies i perfusjonskammer ved 0.7 og 1.5 ug/ml

Tabell 32: Blodplateadhesjon av villtype og humaniserte 12A2 nanobodies i perfusjonkammer ved 0.5, 1 og 2 ug/ml

Tabell 33: KD verdier for vill type og humaniserte 12A2 nanobodies

Tabell 34: Sekvenslisting av humaniserte 12A5 nanobodies

Tabell 35: Ekspresjonsutbytter av villtype og humaniserte 12A5 nanobodies

Tabell 36: Konsentrasjon av villtype og humaniserte 12A5 nanobodies etter oppvarming ved økende temperaturer

Tabell 37: KD verdier for villtype og humaniserte 12A5 nanobodies

Tabell 38: Sekvenslisting av humaniserte bivalente nanobodies

Tabell 39: Ekspresjonutbytter av humaniserte bivalente nanobodies

Tabell 40: Konsentrasjon av humanisert bivalent nanobody etter oppvarming ved økende temperaturer

Tabell 41: Blodplateadhesjon av villtype og humaniserte bivalente nanobodies

Tabell 42: bavianer benyttet med forskjellig testforbindelser i Folts studien

Tabell 43: Lengde av CFRs (s) for kontroll dyr (ND= ikke utført)

Tabell 44: Lengde av CFRs (s) for dyr behandlet med Aspegic™ (ND= ikke utført)

Tabell 45: Lengde av CFRs (s) for dyr behandlet med Heparin™ (ND= ikke utført)

Tabell 46: Lengde av CFRs (s) for dyr behandlet med Plavix™ (ND= ikke utført)

Tabell 47: Lengde av CFRs (s) for dyr behandlet med Reopro™ (ND= ikke utført)

Tabell 48: Lengde av CFRs (s) for dyr behandlet med ALX-0081 (ND= ikke utført)

Tabell 49: bavianer benyttet med forskjellige testforbindelser i Folts studien

Tabell 50: Inhibering av CFRs i Folts modellen for de forskjellige testede medikamentene. Antallet av eksperimentene i hvilke en inhibering av CFRs ble observer under de nevnte forskjellige betingelsene er vist som en funksjon av det totale antallet uavhengige gjentakelser av tilstanden.

Tabell 51 : Lengde av CFRs (sekunder) for hver bavian og hver dose av Aspegic, Heparin, Plavix og ALX-0081. Den effektive dose er indikert I gult

Tabell 52: Blodtap relativt til den andre kontrollgasbind for dyr behandlet med

Tabell 53: Blodtap relativt til den andre kontrollgasbind for dyr behandlet med Reopro™ som funksjon av endelig dose (STD= standardavvik)

Tabell 54: Blodtap relativt til den andre kontroll gasbind for dyr behandlet med ALX-0081 som funksjon av endelig dose (STD= standardavvik)

Tabell 55: Den gjennomsnittlige totale mengde blodtap (= sum av blodtap fra de første fem doser av testforbindelse) i forhold til den andre kontroll gas

Tabell 56: Blodtap i gasbind relativt til den andre kontroll gasbind for hver bavian behandlet med Aspegic, Heparin, Plavix og ALX-0081 som funksjon av medikamentdose. Den effektiv medikamentdose ved hvilken en fullstendig inhibering av CFRs ble observert, er indikert gult

Tabell 57: % ristocetin-indusert blodplate aggregering for hver bavian behandlet med Aspegic, Heparin, Plavix og ALX-0081 som funksjon av medikamentdose

Tabell 58: konsentrasjon av ALX-0081 [μg/ml] i blodprøver oppnådd ved 10

minutter etter administrasjon

Tabell 60: Volumer [µl] for å fremstille de forskjellige blandinger for studie av spalting av A1A2A3 ved ADAMTS13

Claims

Patentkrav

1.

Et protein eller polypeptid som omfatter to VHHs, humanisert VHH domener eller kameliserte VH domener, hvor nevnte VHHs, humaniserte VHH domener eller kameliserte VH domener er rettet mot Von Willebrand Faktor (vWF), og hvor nevnte VHHs, humaniserte VHH domener eller kameliserte VH domener består av 4 rammeverkregioner (henholdsvis FR1 til FR4) og 3 komplementaritetsbestemmende regioner (CDR1 til CDR3 henholdsvis), i hvilke:

CDR1 omfatter eller består av aminosyresekvensen

ii) YNPMG [SEQ ID NO: 22] og i hvilken:

AISRTGGSTYYARSVEG [SEQ ID NO: 31], og

AISRTGGSTYYPDSVEG [SEQ ID NO: 32] og i hvilken:

AGVRAEDGRVRTLPSEYNF [SEQ ID NO: 41] AGVRAEDGRVRTLPSEYTF [SEQ ID NO: 42], og

AGVRAEDGRVRSLPSEYTF [SEQ ID NO: 43].

2.

Proteinet eller polypeptidet ifølge krav 1, og i hvilke:

a. CDR1 består av aminosyresekvensen YNPMG [SEQ ID NO:22; og i hvilke:

b. CDR2 består av aminosyresekvensen

AISRTGGSTYYPDSVEG [SEQ ID NO: 32];

og i hvilke:

c. CDR3 består av aminosyresekvensen

AGVRAEDGRVRTLPSEYTF [SEQ ID NO: 42].

3.

Proteinet eller polypeptidet ifølge et hvilket som helst av kravene 1-2, hvor nevnte VHHs, humaniserte VHH domener eller kameliserte VH domener er KERE-klasse VHHs, humaniserte VHH domene eller kameliserte VH domener.

4.

Proteinet eller polypeptidet ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3, hvor nevnte VHHs, humaniserte VHH domene eller kameliserte VH domene er humaniserte varianter av nevnte VHHs, humaniserte VHH domene eller kameliserte VH domener.

5.

Proteinet eller polypeptidet ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4, hvor nevnte VHHs, humaniserte VHH domener eller kameliserte VH domener som er til stede i proteinet eller polypeptidet er valgt blant gruppen bestående av VHHs, humaniserte VHH domener eller kameliserte VH domener 12B6 (SEQ ID NO: 62); 12A2 (SEQ ID NO: 71); 12F2 (SEQ ID NO: 72); 14H10 (SEQ ID NO: 73); 12B6H1 (SEQ ID NO: 86); 12B6H2 (SEQ ID NO: 87); 12B6H3 (SEQ ID NO: 88); 12B6H4 (SEQ ID NO: 89); 12A2H1 (SEQ ID NO: 90); 12A2H3 (SEQ ID NO: 91); 12A2H4 (SEQ ID NO: 92); 12A2H11 (SEQ ID NO: 93) og 12A2H13 (SEQ ID NO: 94).

6.

Proteinet eller polypeptidet ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5, hvor VHHs, humaniserte VHH domener eller kameliserte VH domene som er til stedde i proteinet eller polypeptidet består av VHHs, humanisert VHH domene eller kameliserte VH domene 12A2H1 (SEQ ID NO: 90).

7.

Proteinet eller polypeptidet ifølge et hvilket som helst av kravene 1-6, hvor nevnte to VHHs, humaniserte VHH domener eller kameliserte VH domener er linket direkte til hverandre eller via en linker, fortrinnsvis er nevnte linker en aminosyresekvens, mer foretrukket omfatter nevnte linker mellom 1 og 40 aminosyrerester, slik som mellom 2 og 30 aminosyrerester, fortrinnsvis hvori linkeren omfatter eller hovedsakelig består av glycin- eller serinrester, eller i hvilke linkeren omfatter eller hovedsakelig består av alaninrester.

8.

Proteinet eller polypeptidet valgt fra gruppen bestående av SEQ ID NOS: 74-76, SEQ ID NO’s 80-82 eller SEQ ID NOS 98-106, fortrinnsvis polypeptidet med SEQ ID NO: 98.

9.

Proteinet eller polypeptidet bestående av SEQ ID NO: 98.

10.

Nukleotidsekvens eller nukleinsyre, som koder for et protein eller et polypeptid ifølge et hvilket som helst av de foregående krav.

11.

Vertscelle, omfattende en nukleotidsekvens eller nukleinsyre ifølge krav 10, eller som uttrykker eller er i stand til å uttrykke et protein eller et ifølge et hvilket som helst krav 1-9.

12.

Fremgangsmåte for fremstilling av et protein eller et polypeptid ifølge et hvilket som helst krav 1-9, som omfatter dyrking eller opprettholdelse av en vertscelle ifølge krav 11 under betingelser slik at nevnte vertscelle produserer eller uttrykker et protein eller polypeptid ifølge et hvilket som helst krav 1-9; og som eventuelt ytterligere omfatter isolering av proteinet eller polypeptidet ifølge et hvilket som helst krav 1-9.

13.

Farmasøytisk sammensetning, omfattende minst et protein eller polypeptid ifølge et hvilket som helst krav 1-9, og eventuelt minst en farmasøytisk akseptabel bærer.

14.

Den farmasøytisk sammensetningen ifølge krav 13, eller et protein eller polypeptid ifølge et hvilket som helst krav 1-9, for anvendelse i en fremgangsmåte for forhindring eller behandling av en sykdom eller forstyrrelse relatert til blodplate-mediert aggregering, valgt blant ikke-okklusiv trombus, dannelsen av en okklusive trombus, arteriell trombus dannelse, akuttkoronar okklusjon, perifer arteriell okklusive sykdom, restenosis og forstyrrelser med opphav i koronar by-pass graft, koronar arterie ventilerstatning og koronar intervensjoner slik som angioplasti, stenting eller aterectomi, hyperplasi etter angioplasti, aterectomi eller arteriell stenting, okklusiv syndrom i et vaskulært system eller mangel på åpenhet i syke arterier, trombotisk trombocytopenisk purpura (TTP), transient cerebralt iskemisk anfall, ustabil eller stabil angina pectoris, cerebralt infarkt, HELLP syndrom, carotid endarterectomi, carotid arterie stenose, kritisk lem ischaemi, cardioembolisme, perifer vaskulært sykdom, restenose og myocardialt infarkt, og eventuelt ytterligere inneholdende ett eller flere aktive stoffer for forhindring eller behandling av aggregeringsmedierte forstyrrelser, slik som asperin (Aspergic), heparin, Plavix ® og/eller Reopro®.

15.

Anvendelse av et, protein eller polypeptid ifølge et hvilket som helst krav 1-9, i fremstillingen av et medikament for forhindringen eller behandling av a sykdom eller forstyrrelse relatert til blodplate-mediert aggregering, valgt blant ikkeokklusiv trombus, dannelsen av en okklusive trombus, arteriell trombus dannelse, akuttkoronar okklusjon, perifer arteriell okklusive sykdom, restenose og forstyrrelser med opphav i koronar by-pass graft, koronar arterie ventilerstatning og koronar intervensjoner slik som angioplasti, stenting eller aterectomi, hyperplasi etter angioplasti, aterectomi eller arteriell stenting, okklusivt syndrom i et vaskulært system eller mangel på åpenhet i syke arterier, trombotisk trombocytopenisk purpura (TTP), transient cerebralt iskemisk anfall, ustabil eller stabil angina pectoris, cerebralt infarkt, HELLP syndrom, carotid endarterectomi, carotid arterie stenosis, kritisk lem ischaemi, cardioembolisme, perifer vaskulær sykdom, restenose og myocardialt infarkt.