TW202229338A - 包含靶向ｉｌ－１３和ｏｘ４０ｌ的免疫球蛋白單可變結構域的多肽 - Google Patents

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Abstract

本文提供了一種用於治療患有發炎性疾病的受試者的新型藥物。具體地，本文提供了包含至少三個免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）的多肽，其特徵在於至少一個ISV與OX40L結合並且至少兩個ISVD與IL-13結合。本文還提供了核酸、載體和組成物。

Description

包含靶向IL-13和OX40L的免疫球蛋白單可變結構域的多肽
本文涉及靶向介白素-13（IL-13）和OX40L的多肽。本文還涉及編碼所述多肽的核酸分子和包含所述核酸的載體，以及包含所述多肽、核酸或載體的組成物。本文還涉及用於治療患有自體免疫性和/或發炎性疾病和/或纖維化疾病的受試者的方法中的這些產物。此外，本文涉及一種產生這些產物的方法。
雖然對於宿主防禦是必需的，但不受限制的免疫反應可能導致一系列自體免疫性和/或發炎性疾病，例如像氣喘和異位性皮膚炎。由免疫系統的先天性和後天性途徑介導的一連串免疫反應（例如抗原識別、抗原處理、抗原呈獻、細胞因子產生、抗體產生、目標細胞殺傷）驅動一系列免疫疾病的啟動和傳播。自體免疫性和發炎性疾病通常是慢性的，並且甚至可能危及生命。變應性和特應性疾病（如氣喘和異位性皮膚炎）主要由第2型免疫反應驅動，並且特徵在於顯著的第2型免疫特徵，如高IgE產生和嗜酸性粒細胞增多症。
目前，患有中度至重度氣喘的患者對目前可用的護理標準沒有良好反應。
特別是在具有低嗜酸性粒細胞表型的氣喘患者中，目前的標準療法包括使用生物製劑的治療，所述生物製劑如抗IL4Rα單株抗體度匹魯單抗（Dupilumab）（以Sanofi Biotechnology的注冊商標名稱Dupixent®銷售）、單株抗IL5抗體美泊利單抗（以GSK Group的注冊商標名稱Nucala®銷售）或瑞利珠單抗（以Teva Pharmaceutical Industries Ltd的注冊商標名稱Cinqair®銷售）、或抗IgE單株抗體奧馬珠單抗（以Novartis AG的注冊商標名稱Xolair®銷售）。
雖然用如上文所述的傳統單株抗體治療患者已經在阻斷第2型途徑和顯著減輕氣喘症狀和/或治療氣喘方面顯示出有效性，但仍有一部分患者未完全和最佳地對這些治療產生反應。
對於異位性皮膚炎，許多拮抗性抗體顯示出早期臨床功效。
KY1005（由Kymab開發）是一種完全人類單株抗體，所述完全人類單株抗體與OX40L結合並阻止其活化OX40，從而可以解決患有發炎性和/或自體免疫性疾病的患者中的潛在免疫系統失衡。
ISB 830（先前為GBR 830，由Glenmark Pharmaceuticals開發）是一種針對OX40的人源化單株抗體。OX40抑制可以在T細胞介導的疾病（包括異位性皮膚炎）中具有治療作用。
KHK 4083是一種用於治療異位性皮膚炎和潰瘍性結腸炎的免疫調節性抗OX40單株抗體（由Kyowa Kirin開發）。某些國家正在進行皮下和靜脈內調配物的早期臨床開發。
曲羅蘆單抗（Tralokinumab）是一種由Leo Pharma開發、用於治療異位性皮膚炎（AD）和斑禿(alopecia areata)的IL-13中和人類IgG4單株抗體。曲羅蘆單抗與IL-13螺旋A和D結合，從而阻止IL-13與IL-13Rα1和IL-13Rα2相互作用。曲羅蘆單抗正在歐洲和美國接受針對用於治療異位性皮膚炎的監管審查。多個國家正在進行用於異位性皮膚炎的臨床開發且在美國正在進行用於斑禿的臨床開發。
雖然一些上述針對OX40、OX40L或IL-13的拮抗性抗體在異位性皮膚炎中顯示出早期臨床功效，但用於治療這種第2型發炎性疾病的改善藥劑仍有未滿足的醫療需求。
本發明人開發了用於治療自體免疫性疾病和/或發炎性疾病例如特別是氣喘和異位性皮膚炎和/或纖維化疾病的新型且改善的藥劑。這些藥劑靶向包括IL-13和OX40L的兩種或多種疾病因子，所述因子介導與自體免疫性或發炎性或纖維化疾病相關的生物學機制。
介白素-13（IL-13）是由第2型輔助T（Th2）細胞、CD4細胞、自然殺傷T細胞、肥大細胞、嗜鹼性粒細胞、嗜酸性粒細胞和nuocyte分泌的細胞因子。IL-13是IgE合成、杯狀細胞增生、粘液分泌過多、氣道高反應性和纖維化的中央調節劑。它是變應性發炎和包括氣喘的不同疾病的關鍵介導物。IL-13的訊息傳遞是通過與IL-4共用的多個次單元受體介導的。該受體是由IL-4受體α（IL-4Rα）和IL-13受體α1（IL-13Rα1）組成的異二聚體受體複合物。IL-13對IL-13Rα1的高親和力導致它們形成鍵，這進一步增加了與IL-4Rα形成異二聚體以及產生第2型IL-4受體的可能性。來自人和小鼠研究的資料顯示IL-13在包括氣喘和異位性皮膚炎的第2型免疫疾病中的重要作用。
OX40L（也稱為CD252或TNFSF4）是TNF超家族的成員，並且是OX40受體（也稱為CD134或TNFRSF4）的可誘導共刺激配體。它主要在包括樹突細胞、巨噬細胞和B細胞的活化的抗原呈獻細胞（APC）上表現。另一方面，OX40主要在活化的T細胞和自然殺傷T細胞上表現。OX40L主要表現為膜結合分子，但也可以以裂解的可溶形式檢測到。OX40L/OX40已被認為是許多疾病中的免疫共刺激調節劑，其特徵在於策劃免疫反應的活化的T細胞。其觸發通過OX40的訊息傳遞，從而導致一系列活動，包括發炎性細胞因子的產生和釋放、效應T細胞（例如TH1、TH2、TH17）和細胞毒性T細胞的擴增和積累。來自人和小鼠研究的資料表明OX40/OX40L軸在包括氣喘和異位性皮膚炎的多種第2型免疫疾病中具有重要作用。已經顯示OX40L或OX40的阻斷可減輕氣喘小鼠模型中的疾病，並且患有異位性皮膚炎的患者的皮膚樣品可能顯示出含有升高的OX40表現T細胞。
不希望受任何特定理論的束縛，上述生物學機制在第2型發炎性反應的啟動和傳播中起著核心作用，並且是引起疾病如異位性皮膚炎和氣喘的一系列免疫病理學途徑的基礎。
到目前為止，還沒有主動針對IL-13和OX40L二者的臨床開發計畫。
發明人現在驚人地發現，OX40L和IL-13與單一藥劑的雙重靶向具有在次群體中的低第2型和高第2型氣喘以及異位性皮膚炎中賦予充分功效的潛力，在所述次群體中針對相同適應症的單一單特異性藥劑療法可能不足夠有效。
本文描述了靶向多種疾病因子可以例如通過兩種獨立的生物製劑（例如與不同治療目標結合的抗體）的共投予或組合使用來實現。然而，從實踐和商業角度兩者來看，共投予或組合使用獨立的生物製劑可能具有挑戰性。例如，兩次注射獨立的產品使治療方案對於患者更加不便且更痛苦，這可能對順服性造成負面影響。對於兩種單獨產品的單次注射，可能難以或無法提供這樣的調配物，其允許兩種產品在所需濃度下的可接受的粘度以及合適的穩定性和不干擾。另外，共投予和共配製需要產生兩種獨立的藥物，這可能會增加總成本。
因此，還需要改善的抗自體免疫性和/或抗發炎性和/或抗纖維化疾病藥劑，其可以方便地投予至患者。
能夠結合兩種不同抗原的雙特異性抗體已被建議作為解決與獨立之生物製劑（如抗體）的共投予或組合使用相關的上述限制的一種策略。
有多種形式的雙特異性抗體構建體已被提出。例如，雙特異性抗體形式可以涉及兩種抗體或其片段的化學綴合（Brennan, M等人, Science, 1985. 229(4708): 第81-83頁；Glennie, M. J.等人, J Immunol, 1987. 139(7): 第2367-2375頁）。
然而，此類雙特異性抗體形式的缺點可能包括高濃度下的高粘度，從而使得例如皮下投予具有挑戰性。此外，每個結合單元都需要以特異性且高親和力與不同目標相互作用，這對多肽穩定性和產生效率具有意義。例如，雙特異性抗體形式的產生可能潛在地導致與輕鏈錯配或重鏈錯配相關的CMC（化學製造和控制）問題。
因此，需要改善的雙特異性或多特異性抗體構建體，其以對於兩個或更多個目標足夠的親和力與OX40L和IL-13二者結合以調節自體免疫反應和/或發炎性反應。同時，希望能夠高效地例如在微生物宿主中產生此類構建體，並且可以方便地將此類構建體投予至患者。理想地，此類構建體在待治療的受試者中還應具有足夠長的半衰期，使得可以限制連續治療的次數，從而在時間上充分間隔開。此外，希望限制此類構建體對在待治療的受試者中預先存在的抗體（即在用抗體構建體第一次治療之前存在於受試者中的抗體）的反應性。
本發明人發現，與單特異性抗OX40L和/或單特異性抗IL-13多肽相比，同時特異性靶向OX40L和IL-13的雙特異性或多特異性多肽（在本文的上下文中也稱為免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）構建體）具有調節第2型發炎性反應的增加的效率。可以高效地產生（例如在微生物宿主中）並方便地投予所述多肽或ISVD構建體。此外，可以證實此類多肽或ISVD構建體對在待治療的受試者中預先存在的抗體（即，在第一次用所述抗體構建體治療之前存在於受試者中的抗體）具有有限的反應性。在一些實施例中，此類多肽或ISVD構建體在待治療的受試者中展現出足夠長的半衰期，使得可以限制連續治療的次數並且因此可以在時間上充分間隔開。
本文的多肽（在本文的上下文中也稱為免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）構建體）包含至少三個免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或由其組成，其中至少一個ISVD與OX40L特異性結合，並且至少兩個ISVD與IL-13特異性結合。根據一些實施例，與OX40L結合的所述至少一個ISVD與人類OX40L特異性地結合，並且與IL-13結合的所述至少兩個ISVD與人類IL-13特異性地結合。
根據一些實施例，本文的多肽還包含一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元，其視情況地經由一或多個肽連接子所連接，其中與沒有所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元的相應多肽相比，所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元為所述多肽提供增加的半衰期。例如，所述結合單元可以是與血清蛋白，例如與人血清蛋白如人類血清白蛋白結合的ISVD。
本文還提供了能夠表現本文的多肽的核酸分子、包含所述核酸的核酸或載體，以及包含所述多肽、所述核酸或所述載體的組成物。在一些實施例中，所述組成物是醫藥組成物。
本文還提供了包含編碼根據本文的多肽的核酸或載體的宿主或宿主細胞。
本文進一步提供了一種用於產生根據本文的多肽的方法，所述方法至少包括以下步驟： a.  在合適的宿主細胞或宿主生物體或另一個合適的表現系統中表現核酸序列；視情況地接著進行： b.  分離和/或純化根據本文的多肽。
此外，本文提供了所述多肽、包含所述多肽的組成物、或包含含有編碼所述多肽的核苷酸序列的核酸或載體的組成物，所述多肽或組成物用作藥物。在一些實施例中，所述多肽或組成物用於治療自體免疫性和/或發炎性疾病，如第2型發炎性疾病。在一些實施例中，所述第2型發炎性疾病選自異位性皮膚炎和氣喘。在一些實施例中，所述多肽或組成物用於治療纖維化疾病。
另外，本文提供了一種治療自體免疫性和/或發炎性疾病如第2型發炎性疾病的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者投予醫藥活性量的根據本文的多肽或組成物。在一些實施例中，所述第2型發炎性疾病是異位性皮膚炎和/或氣喘。另外，提供了一種治療纖維化疾病的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者投予醫藥活性量的根據本文的多肽或組成物。在一些實施例中，所述方法還包括投予一或多種另外的治療劑。
本文還提供了本文的多肽或組成物在製備用於治療自體免疫性和/或發炎性疾病如第2型發炎性疾病的醫藥組成物中的用途。在一些實施例中，所述第2型發炎性疾病是異位性皮膚炎和/或氣喘。還提供了本文的多肽或組成物在製備用於治療纖維化疾病的醫藥組成物中的用途。
特言之，本文提供了以下實施例：
實施例1. 一種多肽、包含所述多肽的組成物、或包含含有編碼所述多肽的核苷酸序列的核酸的組成物，所述多肽或組成物用作藥物，其中所述多肽包含至少三個免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或由其組成，其中每個所述ISVD一或多個包含三個互補決定區（分別為CDR1至CDR3），視情況地經由一或多個肽連接子所連接；並且其中： a)  第一ISVD包含 i.    具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 6具有2或1個胺基酸差異的CDR1； ii.   具有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 10具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 iii.  具有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 14具有2或1個胺基酸差異的CDR3； b) 第二ISVD包含 iv.   具有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 7具有2或1個胺基酸差異的CDR1； v.    具有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 11具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 vi.  具有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 15具有2或1個胺基酸差異的CDR3；和 c)  第三ISVD包含 vii. 具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 9具有2或1個胺基酸差異的CDR1； viii. 具有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 13具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 ix.  具有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 17具有2或1個胺基酸差異的CDR3， 其中所述ISVD的順序是從N端開始。
實施例2. 根據實施例1所述的用於所述用途的組成物，所述組成物是醫藥組成物，所述醫藥組成物還包含至少一種醫藥上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑和/或佐劑，並且視情況地包含一或多種其他醫藥活性多肽和/或化合物。
實施例3. 根據實施例1或2所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中： a)  所述第一ISVD包含具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的CDR3； b) 所述第二ISVD包含具有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR3；並且 c)  所述第三ISVD包含具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列的CDR3。
實施例4. 根據實施例1至3中任一項所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中： a)  所述第一ISVD的胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 2大於90%的序列同一性； b) 所述第二ISVD的胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 3大於90%的序列同一性；並且 c)  所述第三ISVD的胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 5大於90%同一性的序列同一性。
實施例5. 根據實施例1至4中任一項所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中： a)  所述第一ISVD具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列； b) 所述第二ISVD具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列；並且 c)  所述第三ISVD具有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列。
實施例6. 根據實施例1至5中任一項所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中所述多肽還包含任選地經由一或多個肽連接子連接的一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元，其中與沒有所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元的相應多肽相比，所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元為所述多肽提供增加的半衰期。
實施例7. 根據實施例6所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中為所述多肽提供增加的半衰期的所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元選自聚乙二醇分子、血清蛋白或其片段、可與血清蛋白結合的結合單元、Fc部分以及可與血清蛋白結合的小蛋白或肽。
實施例8. 根據實施例6至7中任一項所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中為所述多肽提供增加的半衰期的所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元選自可與血清白蛋白（如人類血清白蛋白）或血清免疫球蛋白（如IgG）結合的結合單元。
實施例9. 根據實施例8所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中為所述多肽提供增加的半衰期的所述結合單元是可與人類血清白蛋白結合的ISVD。
實施例10.     根據實施例9所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中與人類血清白蛋白結合的所述ISVD包含 i.   具有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 8具有2或1個胺基酸差異的CDR1； ii.  具有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 12具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 iii. 具有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 16具有2或1個胺基酸差異的CDR3。
實施例11.     根據實施例9至10中任一項所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中與人類血清白蛋白結合的所述ISVD包含具有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR3。
實施例12.     根據實施例9至11中任一項所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中與人類血清白蛋白結合的所述ISVD的胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 4大於90%的序列同一性。
實施例13.     根據實施例9至12中任一項所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中與人類血清白蛋白結合的所述ISVD具有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列。
實施例14.     根據實施例1至13中任一項所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中所述多肽的胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 1大於90%的序列同一性。
實施例15.     根據實施例1至14中任一項所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中所述多肽包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列或由其組成。
實施例16.     根據實施例1至15中任一項所述的用於所述用途的多肽或組成物，所述多肽或組成物用於治療發炎性疾病，如第2型發炎性疾病。
實施例17.     根據實施例16所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中所述第2型發炎性疾病選自氣喘和異位性皮膚炎。
實施例18.     一種多肽，所述多肽包含至少三個免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或由其組成，其中每個所述ISVD一或多個包含三個互補決定區（分別為CDR1至CDR3），視情況地經由一或多個肽連接子連接的；並且其中： a)  第一ISVD與OX40L結合並且包含 i.    具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 6具有2或1個胺基酸差異的CDR1； ii.   具有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 10具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 iii.  具有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 14具有2或1個胺基酸差異的CDR3； b) 第二ISVD與IL-13結合並且包含 iv.   具有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 7具有2或1個胺基酸差異的CDR1； v.    具有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 11具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 vi.  具有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 15具有2或1個胺基酸差異的CDR3；和 c)  第三ISVD與IL-13結合並且包含 vii. 具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 9具有2或1個胺基酸差異的CDR1； viii. 具有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 13具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 ix.  具有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 17具有2或1個胺基酸差異的CDR3， 其中所述ISVD的順序是從N端開始。
實施例19.     根據實施例18所述的多肽，其中： a)  所述第一ISVD包含具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的CDR3； b) 所述第二ISVD包含具有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR3；並且 c)  所述第三ISVD包含具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列的CDR3。
實施例20.     根據實施例18或19中任一項所述的多肽，其中： a)  所述第一ISVD的胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 2大於90%的序列同一性； b) 所述第二ISVD的胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 3大於90%的序列同一性；並且 c)  所述第三ISVD的胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 5大於90%同一性的序列同一性。
實施例21.     根據實施例18至20中任一項所述的多肽，其中： a)  所述第一ISVD具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列； b) 所述第二ISVD具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列；並且 c)  所述第三ISVD具有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列。
實施例22.     根據實施例18至21中任一項所述的多肽，其中所述多肽還包含任選地經由一或多個肽連接子連接的一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元，其中與沒有所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元的相應多肽相比，所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元為所述多肽提供增加的半衰期。
實施例23.     根據實施例22所述的多肽，其中為所述多肽提供增加的半衰期的所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元選自聚乙二醇分子、血清蛋白或其片段、可與血清蛋白結合的結合單元、Fc部分以及可與血清蛋白結合的小蛋白或肽。
實施例24.     根據實施例22至23中任一項所述的多肽，其中為所述多肽提供增加的半衰期的所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元選自可與血清白蛋白（如人類血清白蛋白）或血清免疫球蛋白（如IgG）結合的結合單元。
實施例25.     根據實施例24所述的多肽，其中為所述多肽提供增加的半衰期的所述結合單元是可與人類血清白蛋白結合的ISVD。
實施例26.     根據實施例25所述的多肽，其中與人類血清白蛋白結合的所述ISVD包含 i.   具有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 8具有2或1個胺基酸差異的CDR1； ii.  具有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 12具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 iii. 具有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 16具有2或1個胺基酸差異的CDR3。
實施例27.     根據實施例25至26中任一項所述的多肽，其中與人類血清白蛋白結合的所述ISVD包含具有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR3。
實施例28.     根據實施例25至27中任一項所述的多肽，其中與人類血清白蛋白結合的所述ISVD的胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 4大於90%的序列同一性。
實施例29.     根據實施例25至28中任一項所述的多肽，其中與人類血清白蛋白結合的所述ISVD具有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列。
實施例30.     根據實施例18至29中任一項所述的多肽，其中所述多肽的胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 1大於90%的序列同一性。
實施例31.     根據實施例18至29中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列或由其組成。
實施例32.     一種核酸，所述核酸包含編碼根據實施例18至31中任一項所述的多肽的核苷酸序列。
實施例33.     一種宿主或宿主細胞，所述宿主或宿主細胞包含根據實施例32所述的核酸。
實施例34.     一種用於產生根據實施例18至31中任一項所述的多肽的方法，所述方法至少包括以下步驟： a)  在合適的宿主細胞或宿主生物體或另一合適的表現系統中表現根據實施例32所述的核酸；視情況地接著進行： b) 分離和/或純化根據實施例18至31中任一項所述的多肽。
實施例35.     一種組成物，所述組成物包含至少一種根據實施例18至31中任一項所述的多肽或根據實施例32所述的核酸。
實施例36.     根據實施例35所述的組成物，所述組成物是醫藥組成物，所述醫藥組成物還包含至少一種醫藥上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑和/或佐劑，並且視情況地包含一或多種其他醫藥活性多肽和/或化合物。
實施例37.     一種治療發炎性疾病如第2型發炎性疾病的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者投予醫藥活性量的根據實施例18至31中任一項所述的多肽或根據實施例35至36中任一項所述的組成物。
實施例38.     根據實施例37所述的方法，其中所述第2型發炎性疾病選自氣喘和異位性皮膚炎。
實施例39.     根據實施例18至31中任一項所述的多肽或根據實施例35至36中任一項所述的組成物在製備用於治療發炎性疾病如第2型發炎性疾病的醫藥組成物中的用途。
實施例40.     根據實施例39所述的多肽或組成物的用途，其中所述第2型發炎性疾病選自氣喘和異位性皮膚炎。
實施例41.     一種多肽，所述多肽包含至少三個免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或由其組成，其中每個所述ISVD一或多個包含三個互補決定區（分別為CDR1至CDR3），視情況地經由一或多個肽連接子連接的；並且其中： a)  第一ISVD包含 i.    具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 6具有2或1個胺基酸差異的CDR1； ii.   具有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 10具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 iii.  具有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 14具有2或1個胺基酸差異的CDR3； b) 第二ISVD包含 iv.   具有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 7具有2或1個胺基酸差異的CDR1； v.    具有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 11具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 vi.  具有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 15具有2或1個胺基酸差異的CDR3；和 c)  第三ISVD包含 vii. 具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 9具有2或1個胺基酸差異的CDR1； viii. 具有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 13具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 ix.  具有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 17具有2或1個胺基酸差異的CDR3， 其中所述ISVD的順序是從N端開始。
本文提供了一種用於治療自體免疫性和/或發炎性疾病（如異位性皮膚炎和氣喘）和/或纖維化疾病的新型藥物。
本發明人發現，與單特異性抗OX-40L或抗IL-13多肽相比，同時靶向OX40L和IL-13的多肽在體外和/或體內導致調節第2型發炎性反應的增加的效率。可以高效地產生所述多肽（例如在微生物宿主中）。此外，可以證實此類多肽對在待治療的受試者中預先存在的抗體（即，在第一次用所述抗體構建體治療之前存在於受試者中的抗體）具有有限的反應性。在一些實施例中，此類多肽可以方便地投予並且在待治療的受試者中展現出足夠長的半衰期以使得保持有限的連續治療次數並且因此這些治療可以方便地在時間上間隔開。
所述多肽是至少雙特異性的，但也可以是例如三特異性、四特異性或五特異性的。此外，所述多肽是至少四價的，但也可以是例如五價的或六價的等。
術語「雙特異性」、「三特異性」、「四特異性」或「五特異性」均落在術語「多特異性」範圍內，並且分別是指與兩種、三種、四種或五種不同的目標分子結合。術語「二價」、「三價」、「四價」、「五價」或「六價」均落在術語「多價」範圍內，並且分別表示存在兩個、三個、四個或五個結合單元（如ISVD）。例如，所述多肽可以是三特異性四價的，如包含四個ISVD或由其組成的多肽，其中一個ISVD與人類OX40L結合，兩個ISVD與人類IL-13結合並且一個ISVD與人類血清白蛋白結合（如ISVD構建體F027100187）。這種多肽可以同時是雙互補位的，例如在兩個ISVD結合人類OX40L或人類IL-13上的兩個不同表位的情況下。術語「雙互補位（biparatopic）」是指與同一目標分子的兩個不同部分（例如表位）結合。
如本文所用，術語「第一ISVD」、「第二ISVD」、「第三ISVD」等僅表示ISVD彼此的相對位置，其中編號從本文的多肽的N端開始。因此，「第一ISVD」比「第二ISVD」更靠近N端，而「第二ISVD」比「第三ISVD」更靠近N端，等等。因此，當從C端考慮時，ISVD排列是相反的。由於編號不是絕對的，並且僅指示所述至少三個ISVD的相對位置，因此不排除多肽中可能存在其他結合單元/構建塊，如與OX40L或IL-13結合的另外的ISVD，或者與另一個目標結合的ISVD。此外，不排除可以在其間放置其他結合單元/構建塊（諸如ISVD）的可能性。例如，如下文進一步所述（具體參見第5.3節「（體內）半衰期延長」），所述多肽還可以包含與人類血清白蛋白結合的另一個ISVD，其甚至可以位於例如「第二ISVD」與「第三ISVD」之間。
鑒於上述，本文提供了一種包含至少三個ISVD或由其組成的多肽，其中至少一個ISVD與OX40L特異性結合並且至少兩個ISVD與IL-13特異性結合。
所述多肽的組分如ISVD可以通過一或多個合適的連接子（如肽連接子）彼此連接。
使用連接子連接兩個或更多個(多)肽是業內熟知的。示例性肽連接子在表A-5中示出。一類常用肽連接子被稱為「Gly-Ser」或「GS」連接子。這些是基本上由甘胺酸（G）和絲胺酸（S）殘基組成的連接子，並且通常包含肽基序的一或多個重複，所述肽基序如GGGGS（SEQ ID NO: 65）基序（例如，具有式（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser）n，其中n可以是1、2、3、4、5、6、7或更大）。此類GS連接子的一些經常使用的例子是9GS連接子（GGGGSGGGS，SEQ ID NO: 68）、15GS連接子（n=3）和35GS連接子（n=7）。參考例如，Chen等人, Adv. Drug Deliv. Rev. 2013 Oct 15；65(10): 1357–1369；以及Klein等人, Protein Eng. Des. Sel. (2014) 27 (10): 325-330。
在本文的多肽中，在一些實施例中，可以選擇使用9GS連接子將多肽的組分彼此連接。
在一個實施例中，與OX40L特異性結合的ISVD位於所述多肽的N端處。發明人令人驚訝地發現，這種構型可以增加所述多肽的產物產量。
同樣在一個實施例中，一個與IL-13特異性結合的ISVD位於所述多肽的C端處。
因此，在一些實施例中，所述多肽按照從所述多肽的N端開始的順序包含以下項或由其組成：與OX40L特異性結合的第一ISVD、與IL-13特異性結合的第一ISVD、為所述多肽提供增加的半衰期的視情況存在的結合單元、以及與IL-13特異性結合的第二ISVD。在一個實施例中，為所述多肽提供增加的半衰期的結合單元是ISVD。
前提是在一些實施例中，所述多肽按照從所述多肽的N端開始的順序包含以下項或由其組成：與OX40L特異性結合的ISVD、連接子、與IL-13特異性結合的第一ISVD、連接子、與人類血清白蛋白結合的ISVD、連接子、以及與IL-13特異性結合的第二ISVD。在一些實施例中，所述連接子是9GS連接子。
所述多肽的此類構型可以提供增加的產物產量、良好的CMC特徵以及關於免疫反應調節的優化的功能性和更強效力。
在一些實施例中，本文的多肽展現出與人類血清中預先存在的抗體的降低的結合。為此，在一個實施例中，所述多肽在至少一個ISVD或每個ISVD中具有胺基酸位置11處的擷胺酸（V）以及胺基酸位置89（根據Kabat編號）處的白胺酸（L）。在另一個實施例中，所述多肽在C端ISVD的C端具有1至5個胺基酸（天然存在的、非天然存在的或其混合物）的延伸，如單個丙胺酸（A）延伸。ISVD的C端可以是VTVSS（SEQ ID NO: 81）。在另一個實施例中，所述多肽在至少一個ISVD或每個ISVD中具有位置110（根據Kabat編號）處的離胺酸（K）或麩醯胺酸（Q）。在另一個實施例中，所述ISVD在至少一個ISVD或每個ISVD中具有位置112（根據Kabat編號）處的離胺酸（K）或麩醯胺酸（Q）。在一些實施例中，所述ISVD的C端是VKVSS（SEQ ID NO: 82）、VQVSS（SEQ ID NO: 83）、VTVKS（SEQ ID NO: 84）、VTVQS（SEQ ID NO: 85）、VKVKS（SEQ ID NO: 86）、VKVQS（SEQ ID NO: 87）、VQVKS（SEQ ID NO: 88）或VQVQS（SEQ ID NO: 89），使得在添加單個丙胺酸後，所述多肽的C端例如具有序列VTVSSA（SEQ ID NO: 90）、VKVSSA（SEQ ID NO: 91）、VQVSSA（SEQ ID NO: 92）、VTVKSA（SEQ ID NO: 93）、VTVQSA（SEQ ID NO: 94）、VKVKSA（SEQ ID NO: 95）、VKVQSA（SEQ ID NO: 96）、VQVKSA（SEQ ID NO: 97）或VQVQSA（SEQ ID NO: 98）。在一個實施例中，所述序列是VKVSSA（SEQ ID NO: 91）。在另一個實施例中，所述多肽在每個ISVD中具有胺基酸位置11處的擷胺酸（V）和胺基酸位置89處的白胺酸（L）（根據Kabat編號），視情況地在至少一個ISVD中的胺基酸位置110（根據Kabat編號）處的離胺酸（K）或麩醯胺酸（Q），並且在C端ISVD的C端具有1至5個胺基酸（天然存在的、非天然存在的或其混合物）的延伸，如單個丙胺酸（A）延伸（使得所述多肽的C端例如具有序列VTVSSA（SEQ ID NO: 90）、VKVSSA（SEQ ID NO: 91）或VQVSSA（SEQ ID NO: 92））。關於在這方面的進一步資訊，參見例如通過引用以其整體併入於此的WO 2012/175741和WO 2015/173325。
在另一個實施例中，本文的多肽包含具有與SEQ ID NO: 1大於90%，如大於95%或大於99%的序列同一性的胺基酸序列或由其組成，其中四個ISVD的CDR分別如以下章節「5.1免疫球蛋白單可變結構域」和「5.3（體內）半衰期延長」中示出的項目A至D（或A'至D'，如果使用Kabat定義）所定義，其中特別地： •           與OX40L特異性結合的ISVD具有含有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的CDR3； •           與IL-13特異性結合的第一ISVD具有含有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR3； •           與IL-13特異性結合的第二ISVD具有含有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列的CDR3；並且 •           與人類血清白蛋白結合的ISVD具有含有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR3， 或者可替代地如果使用Kabat定義： •           與OX40L特異性結合的ISVD具有含有SEQ ID NO: 31的胺基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO: 35的胺基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的CDR3； •           與IL-13特異性結合的第一ISVD具有含有SEQ ID NO: 32的胺基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO: 36的胺基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR3； •           與IL-13特異性結合的第二ISVD具有含有SEQ ID NO: 34的胺基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO: 38的胺基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列的CDR3；並且 •           與人類血清白蛋白結合的ISVD具有含有SEQ ID NO: 33的胺基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO: 37的胺基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR3。
在一些實施例中，所述多肽包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列或由其組成。在一個實施例中，所述多肽由SEQ ID NO: 1的胺基酸序列組成。
在一些實施例中，與由SEQ ID NO: 1的胺基酸組成的多肽相比，本文的多肽對人O40L和人類IL-13具有至少一半結合親和力、至少相同的結合親和力、或甚至更高的結合親和力，其中使用相同的方法（如SPR）測量結合親和力。 5.1 免疫球蛋白單可變結構域
術語「免疫球蛋白單可變結構域」（ISVD）可與「單可變結構域」互換使用，定義了其中抗原結合位點存在於單個免疫球蛋白結構域上並由其形成的免疫球蛋白分子。這使免疫球蛋白單可變結構域與「常規」免疫球蛋白（例如單株抗體）或其片段（如Fab、Fab'、F（ab'） 2、scFv、二scFv）區分開來，其中兩個免疫球蛋白結構域、特別是兩個可變結構域相互作用形成抗原結合位點。通常，在常規的免疫球蛋白中，重鏈可變結構域（V H）和輕鏈可變結構域（V L）相互作用形成抗原結合位點。在這種情況下，V H和V L兩者的互補決定區（CDR）將有助於抗原結合位點，即總共6個CDR將參與抗原結合位點形成。
鑒於以上定義，常規4鏈抗體（如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子；業內已知）的抗原結合結構域或衍生自這種常規4鏈抗體的Fab片段、F（ab'） 2片段、Fv片段（如二硫鍵連接的Fv或scFv片段）或雙抗體（全部都在業內已知）的抗原結合結構域通常不會被視為免疫球蛋白單可變結構域，因為在這些情況下，與抗原的相應表位結合通常不是通過一個單個免疫球蛋白結構域發生，而是通過一對締合的免疫球蛋白結構域，如輕鏈和重鏈可變結構域，即通過共同結合到相應抗原的表位的免疫球蛋白結構域的V H-V L對發生。
相反地，免疫球蛋白單可變結構域能夠在不與另外的免疫球蛋白可變結構域配對的情況下與抗原的表位特異性地結合。免疫球蛋白單可變結構域的結合位元點由單個V H、單個V HH或單個V L結構域形成。
因此，所述單可變結構域可以是輕鏈可變結構域序列（例如，V L序列）或其合適的片段；或者重鏈可變結構域序列（例如，V H序列或V HH序列）或其合適的片段；只要它能夠形成單個抗原結合單元（即，基本上由單可變結構域組成的功能性抗原結合單元，使得單個抗原結合結構域不需要與另一個可變結構域相互作用以形成功能性抗原結合單元）。
免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）可以是例如重鏈ISVD，如V H、V HH，包括駝源化V H或人源化V HH。根據一些實施例，免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）是V HH，包括駝源化V H或人源化V HH。重鏈ISVD可以源自常規的四鏈抗體或重鏈抗體。
例如，免疫球蛋白單可變結構域可以是單個結構域抗體（或適合用作單個結構域抗體的胺基酸序列）、「dAb」或dAb（或適合用作dAb的胺基酸序列）或Nanobody®（如本文所定義，並且包括但不限於V HH）；其他單可變結構域，或其任一種的任何合適的片段。
特別地，免疫球蛋白單可變結構域可以是Nanobody®（如V HH，包括人源化V HH或駝源化V H）或其合適的片段。Nanobody®、Nanobodies®和Nanoclone®是Ablynx N.V.的注冊商標。
「V HH結構域」（也被稱為V HH、V HH抗體片段和V HH抗體）最初被描述為「重鏈抗體」的（即「沒有輕鏈的抗體」的；Hamers-Casterman等人 Nature 363: 446-448, 1993）抗原結合免疫球蛋白可變結構域。選擇術語「V HH結構域」以便將這些可變結構域與存在於常規4鏈抗體中的重鏈可變結構域（在本文中稱為「V H結構域」）和存在於常規4鏈抗體中的輕鏈可變結構域（在本文中稱為「V L結構域」）區分開來。對於V HH的進一步描述，參考了Muyldermans的綜述文章（Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001），以及作為一般背景技術提及的以下專利申請：布魯塞爾自由大學（Vrije Universiteit Brussel）的WO 94/04678、WO 95/04079和WO 96/34103；Unilever的WO 94/25591、WO 99/37681、WO 00/40968、WO 00/43507、WO 00/65057、WO 01/40310、WO 01/44301、EP 1134231和WO 02/48193；比利時弗蘭德生物技術研究院（Vlaams Instituut voor Biotechnologie，VIB）的WO 97/49805、WO 01/21817、WO 03/035694、WO 03/054016和WO 03/055527；Algonomics N.V.和Ablynx N.V.的WO 03/050531；加拿大國家研究院（National Research Council of Canada）的WO 01/90190；抗體研究所（Institute of Antibodies）的WO 03/025020（= EP 1433793）；以及Ablynx N.V.的WO 04/041867、WO 04/041862、WO 04/041865、WO 04/041863、WO 04/062551、WO 05/044858、WO 06/40153、WO 06/079372、WO 06/122786、WO 06/122787和WO 06/122825，將其每一個通過引用以其整體併入於此。
通常，免疫球蛋白的產生涉及對實驗動物進行免疫，融合免疫球蛋白產生細胞以產生雜交瘤，並針對所需特異性進行篩選。可替代地，可以通過篩選幼稚的或合成的文庫，例如通過噬菌體展示來生成免疫球蛋白。
免疫球蛋白序列（如Nanobodies®）的產生已在各種出版物中進行了廣泛的描述，其中WO 94/04678、Hamers-Casterman等人 1993和Muyldermans等人 2001（Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001）可以作為例子，其每一個都通過引用以其整體併入於此。在這些方法中，用目標抗原對駱駝科動物進行免疫，以便誘導針對所述目標抗原的免疫反應。對從所述免疫獲得的Nanobodies庫進一步篩選結合目標抗原的Nanobodies。
在這些情況下，抗體的產生需要純化的抗原用於免疫和/或篩選。可以從天然來源或在重組產生過程中純化抗原。
免疫球蛋白序列的免疫和/或篩選可以使用此類抗原的肽片段進行。
可以使用不同來源的免疫球蛋白序列，包括小鼠、大鼠、兔、驢、人和駱駝免疫球蛋白序列。本文還包括完全人類、人源化或嵌合序列。例如，本文包括駱駝免疫球蛋白序列和人源化駱駝免疫球蛋白序列或駝源化結構域抗體，例如由Ward等人（參見例如WO 94/04678和Riechmann, Febs Lett., 339:285-290, 1994和Prot. Eng., 9:531-537, 1996，其每一個通過引用以其整體併入於此）描述的駝源化dAb。此外，本文還使用融合免疫球蛋白序列，例如形成多價和/或多特異性構建體（對於含有一或多個V HH結構域的多價和多特異性多肽及其製劑，還參考Conrath等人, J. Biol. Chem., 第276卷, 10. 7346-7350, 2001以及例如WO 96/34103和WO 99/23221，其每一個通過引用以其整體併入於此），以及可從本文的免疫球蛋白序列衍生的包含標籤或其他功能部分（例如毒素、標記、放射性化學物質等）的免疫球蛋白序列。
「人源化V HH」包含對應於天然存在的V HH結構域的胺基酸序列但已經被「人源化」的胺基酸序列，即通過用在來自人類的常規4鏈抗體（例如，如上所指出）的V H結構域的一或多個相應位置出現的一或多個胺基酸殘基替代所述天然存在的V HH序列的胺基酸序列中（並且特別是在架構序列中）的一或多個胺基酸殘基來進行。這可以以本身已知的方式進行，所述方式例如基於本文的進一步描述和在文獻（例如WO 2008/020079）中對於熟習此項技術者來說是清楚的。同樣，應注意，此類人源化V HH可以以任何本身已知的合適方式來獲得，並且因此並不嚴格限於已經使用包含天然存在的V HH結構域作為起始材料的多肽獲得的多肽。
「駝源化V H」包含對應於天然存在的V H結構域的胺基酸序列但已經被「駝源化」的胺基酸序列，即通過用在重鏈抗體的V HH結構域的一或多個相應位置出現的一或多個胺基酸殘基替代來自常規4鏈抗體的天然存在的V H結構域的胺基酸序列中的一或多個胺基酸殘基來進行。這可以以本身已知的方式進行，所述方式例如基於本文的進一步描述和文獻（例如WO 2008/020079）對於熟習此項技術者來說是清楚的。如本文所定義，此類「駝源化」取代可以插入形成和/或存在於V H-V L介面的胺基酸位置處和/或所謂的駱駝科標誌殘基處（參見例如WO 94/04678以及Davies和Riechmann, 1994和1996, 同上）。在一些實施例中，用作產生或設計駝源化V H的起始材料或起點的V H序列是來自哺乳動物的V H序列或人類的V H序列，如V H3序列。然而，應注意，可以以任何本身已知的合適方式獲得這種駝源化V H，並且因此並不嚴格限於使用包含天然存在的V H結構域作為起始材料的多肽獲得的多肽。
應注意，一或多個免疫球蛋白序列可以彼此連接和/或與其他胺基酸序列連接（例如經由二硫橋）以提供也可能有用的肽構建體（例如Fab'片段、F(ab’)2片段、scFv構建體、「雙抗體」和其他多特異性構建體）。例如參考了Holliger和Hudson, Nat Biotechnol. 2005年9月;23(9):1126-36的綜述。通常，當將多肽旨在用於投予至受試者（例如用於預防、治療和/或診斷目的）時，其可以包含所述受試者中非天然存在的免疫球蛋白序列。
免疫球蛋白單可變結構域序列的結構的非限制性例子可以被認為由四個架構區（「FR」）構成，其在業內和本文中分別被稱為「架構區1」（「FR1」）；「架構區2」（「FR2」）；「架構區3」（「FR3」）；和「架構區4」（「FR4」）；所述架構區被三個互補決定區（「CDR」）中斷，所述三個互補決定區在業內和本文中分別被稱為「互補決定區1」（「CDR1」）；「互補決定區2」（「CDR2」）；和「互補決定區3」（「CDR3」）。
如WO 08/020079（通過引用併入本文）的第58和59頁的q) 段進一步描述的，免疫球蛋白單可變結構域的胺基酸殘基可以根據Kabat等人（“Sequence of proteins of immunological interest”, US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91）給出的V H結構域的一般編號進行編號，如在Riechmann和Muyldermans, 2000的文章（J. Immunol. Methods 240 (1-2): 185-195；參見例如該出版物的圖2）中應用於來自駱駝科動物的V HH結構域。應注意，如業內熟知的，對於V H結構域和V HH結構域——每個CDR中胺基酸殘基的總數可以變化，並且可以不對應由Kabat編號指示的胺基酸殘基的總數（即，根據Kabat編號的一或多個位置可能不會在實際序列中被佔用，或者實際序列可以含有比Kabat編號允許的數目更多的胺基酸殘基）。這意味著，通常，根據Kabat的編號可以對應於或可以不對應於實際序列中胺基酸殘基的實際編號。V H結構域和V HH結構域中的胺基酸殘基的總數通常將在110至120的範圍內，通常在112至115之間。然而，應注意，較小和較長的序列也可能適用於本文所述的目的。
在本申請中，除非另有說明，否則根據如Kontermann和Dübel（編輯 2010, Antibody Engineering, 第2卷, Springer Verlag Heidelberg Berlin, Martin, 第3章, 第33-51頁）中所述的AbM編號來確定CDR。根據此方法，FR1包含位置1-25處的胺基酸殘基，CDR1包含位置26-35處的胺基酸殘基，FR2包含位置36-49處的胺基酸，CDR2包含位置50-58處的胺基酸殘基，FR3包含位置59-94處的胺基酸殘基，CDR3包含位置95-102處的胺基酸殘基，並且FR4包含位置103-113處的胺基酸殘基。
CDR區的確定也可以根據不同的方法進行。在根據Kabat的CDR測定中，免疫球蛋白單可變結構域的FR1包含位置1-30處的胺基酸殘基，免疫球蛋白單可變結構域的CDR1包含位置31-35處的胺基酸殘基，免疫球蛋白單可變結構域的FR2包含位置36-49處的胺基酸，免疫球蛋白單可變結構域的CDR2包含位置50-65處的胺基酸殘基，免疫球蛋白單可變結構域的FR3包含位置66-94處的胺基酸殘基，免疫球蛋白單可變結構域的CDR3包含位置95-102處的胺基酸殘基，並且免疫球蛋白單可變結構域的FR4包含位置103-113處的胺基酸殘基。
在這種免疫球蛋白序列中，架構序列可以是任何合適的架構序列，並且合適的架構序列的例子對於熟習此項技術者將是清楚的，例如基於標準手冊以及本文中提及的進一步公開和現有技術。
架構序列可以是免疫球蛋白架構序列或者（例如通過人源化或駝源化）衍生自免疫球蛋白架構序列的架構序列的合適組合。例如，架構序列可以是衍生自輕鏈可變結構域（例如V L序列）和/或重鏈可變結構域（例如V H序列或V HH序列）的架構序列。在一個實施例中，架構序列是衍生自V HH序列的架構序列，其中所述架構序列可以任選地被部分或完全人源化；或者是已經駝源化的常規V H序列（如本文所定義）。
特別地，如本文公開的ISVD序列中存在的架構序列可以含有一或多個標誌殘基（如本文定義），使得ISVD序列是Nanobody®（如V HH，包括人源化V HH或駱駝化V H）。此類架構序列（合適組合）的一些非限制性例子將從本文的進一步公開中變得清楚。
同樣，如本文針對免疫球蛋白序列的一般描述，也可以使用任何前述的合適片段（或片段的組合），如含有一或多個CDR序列的片段，其適當地側接一或多個架構序列和/或經由一或多個架構序列連接（例如，以與這些CDR和架構序列相同的順序可以出現在衍生所述片段的全長免疫球蛋白序列中）。
然而，應注意，本文關於ISVD序列的起源（或用於表現所述ISVD序列的核苷酸序列的起源），以及關於產生或獲得（或者已經產生或獲得）所述ISVD序列或核苷酸序列的方式不受限制。因此，ISVD序列可以是天然存在的序列（來自任何合適的物種）或者合成的或半合成的序列。在特定但非限制性的方面，ISVD序列是天然存在的序列（來自任何合適的物種）或者合成的或半合成的序列，包括但不限於「人源化」（如本文所定義）免疫球蛋白序列（諸如部分或完全人源化的小鼠或兔免疫球蛋白序列，並且特別是部分或完全人源化的V HH序列）、「駝源化」（如本文所定義）免疫球蛋白序列，以及通過諸如以下的技術獲得的免疫球蛋白序列：親和力成熟（例如，從合成的、隨機的或天然存在的免疫球蛋白序列開始）、CDR移植、鑲面、組合衍生自不同免疫球蛋白序列的片段、使用重疊引物的PCR組裝，以及熟習此項技術者熟知的工程化免疫球蛋白序列的類似技術；或任何前述的任何適當組合。
類似地，核苷酸序列可以是天然存在的核苷酸序列或者合成的或半合成的序列，並且可以是例如通過PCR從合適的天然存在的範本分離的序列（例如從細胞分離的DNA或RNA）、已經從文庫（並且特別是，表現文庫）分離的核苷酸序列、已經通過將突變引入天然存在的核苷酸序列製備的核苷酸序列（使用本身已知的任何合適的技術，如錯配PCR）、已經通過使用重疊引物的PCR製備的核苷酸序列，或者已經使用本身已知的DNA合成技術製備的核苷酸序列。
如上所述，ISVD可以是Nanobody®或其合適的片段。對於Nanobodies®（Nanobody®和Nanobodies®是Ablynx N.V.（Sanofi Company）的注冊商標）的一般描述，參考以下進一步描述以及本文引用的現有技術。然而，在這方面，應注意，此描述和現有技術主要描述了所謂的「V H3類」的Nanobodies®（即與如DP-47、DP-51或DP-29的V H3類的人種系序列具有高度序列同源性的Nanobodies®）。然而，應注意，本文在其最廣泛的意義上通常可以使用任何類型的Nanobody®，並且例如還使用屬於所謂的「V H4類」的Nanobodies®（即與如DP-78的V H4類的人種系序列具有高度序列同源性的Nanobodies®），關於例子描述於通過引用以其整體併入本文的WO 2007/118670中。
通常，Nanobodies®（特別是V HH序列，包括（部分）人源化V HH序列和駝源化V H序列）的特徵可以是在一或多個架構序列（同樣如本文進一步所述）中存在一或多個「標誌殘基」（如本文所述）。因此，通常可以將Nanobody®定義為具有（一般）結構的免疫球蛋白序列： FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 其中FR1至FR4分別是指架構區1至4，並且其中CDR1至CDR3分別是指互補決定區1至3，並且其中一或多個標誌殘基如本文進一步定義。
特別地，Nanobody®可以是具有（一般）結構的免疫球蛋白序列： FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 其中FR1至FR4分別是指架構區1至4，並且其中CDR1至CDR3分別是指互補決定區1至3，並且其中架構序列如本文進一步定義。
更特別地，Nanobody®可以是具有（一般）結構的免疫球蛋白序列 FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 其中FR1至FR4分別是指架構區1至4，並且其中CDR1至CDR3分別是指互補決定區1至3，並且其中： 根據Kabat編號的位置11、37、44、45、47、83、84、103、104和108處的一或多個胺基酸殘基選自下表A-0中提及的標誌（hallmark）殘基。 表 A-0 ： Nanobodies® 中的標誌殘基
位置 人類 V H3 標誌殘基
11 L，V；主要是L L, S, V, M, W, F, T, Q, E, A, R, G, K, Y, N, P, I
37 V、I、F；通常是V F ( 1), Y, V, L, A, H, S, I, W, C, N, G, D, T, P
44 (8) G E ( 3), Q (3), G (2), D, A, K, R, L, P, S, V, H, T, N, W, M, I
45 (8) L L ( 2), R (3), P, H, F, G, Q, S, E, T, Y, C, I, D, V
47 (8) W, Y F ( 1), L (1)or W (2) G, I, S, A, V, M, R, Y, E, P, T, C, H, K, Q, N, D
83 R或K；通常是R R, K ( 5), T, E (5), Q, N, S, I, V, G, M, L, A, D, Y, H
84 A、T、D；主要是A P ( 5), S, H, L, A, V, I, T, F, D, R, Y, N, Q, G, E
103 W W ( 4), R (6), G, S, K, A, M, Y, L, F, T, N, V, Q, P (6), E, C
104 G G, A, S, T, D, P, N, E, C, L
108 L、M或T；主要是L Q, L ( 7), R, P, E, K, S, T, M, A, H
注意：(1)   特別地但非排他地，與位置43-46處的KERE或KQRE組合。 (2)   通常為位置44-47處的GLEW。 (3)   通常為位置43-46處的KERE或KQRE，例如為位置43-47的KEREL、KEREF、KQREL、KQREF、KEREG、KQREW或KQREG。可替代地，諸如以下的序列也是可能的：TERE（例如TEREL）、TQRE（例如TQREL）、KECE（例如KECEL或KECER）、KQCE（例如KQCEL）、RERE（例如REREG）、RQRE（例如RQREL、RQREF或RQREW）、QERE（例如QEREG）、QQRE,（例如QQREW、QQREL或QQREF）、KGRE（例如KGREG）、KDRE（例如KDREV）。一些其他可能的序列包括例如DECKL和NVCEL。 (4)   具有位置44-47的兩個GLEW以及位置43-46處的KERE或KQRE。 (5)   通常為天然存在的V HH結構域的位置83-84處的KP或EP。 (6)   特別地但非排他地，與位置44-47處的GLEW組合。 (7)   前提是當位置44-47為GLEW時，還含有103處的W的（非人源化）V HH序列中的位置108總是Q。 (8)   GLEW基團還含有位置44-47處的GLEW樣序列，例如像GVEW、EPEW、GLER、DQEW、DLEW、GIEW、ELEW、GPEW、EWLP、GPER、GLER和ELEW。
在一些實施例中，位置11處的標誌殘基是L。在一些實施例中，位置37處的標誌殘基是F (1)或Y。在一些實施例中，位置44處的標誌殘基是G (2)或Q (3)。在一些實施例中，位置45處的標誌殘基是L (2)或R (3)。在一些實施例中，位置47處的標誌殘基是F (1)、L (1)或W (2)。在一些實施例中，位置83處的標誌殘基是K。在一些實施例中，位置84處的標誌殘基是P。在一些實施例中，位置103處的標誌殘基是W。在一些實施例中，位置104處的標誌殘基是G。在一些實施例中，位置108處的標誌殘基是Q或L。
本文尤其使用可與OX40L或IL-13特異性結合的ISVD。在本文的上下文中，「與某種目標分子結合」具有業內如在抗體及其相應抗原的情境中所理解的常見含義。
本文的多肽可以包含與OX40L結合的一或多個ISVD以及與IL-13結合的兩個或更多個ISVD。例如，所述多肽可以包含一個與OX40L結合的ISVD和兩個與IL-13結合的ISVD。
在一些實施例中，至少一個ISVD可以在功能上阻斷其目標分子。例如，靶向部分可以阻斷OX40L與OX40（受體）之間的相互作用，並且在一些實施例中可以抑制OX40L誘導的IL2從T細胞的釋放，或者可以阻斷IL-13與IL-13Rα1（介白素13受體，α1）和/或IL-13/IL-13Rα1複合物與IL-4Rα（α介白素-4受體）之間的相互作用。因此，在一個實施例中，本文的多肽包含與OX40L特異性結合並抑制其與OX40相互作用的至少一個ISVD，以及與IL-13特異性結合並在功能上阻斷其與IL-13Rα1相互作用和/或IL-13/IL-13Rα1複合物與IL-4Rα之間的相互作用的兩個ISVD。
本文中使用的ISVD形成本文的多肽的一部分，所述多肽包含至少三個ISVD或由其組成，使得所述多肽可以與OX40L和IL-13特異性地結合。
因此，如在本文的多肽中使用的所述至少三個ISVD的目標分子是OX40L和IL-13。例子是哺乳動物OX40L和IL-13。雖然可以使用人類OX40L（Uniprot登錄號P23510）和人類IL-13（Uniprot登錄號P35225），但來自其他物種的形式也適用於本文，例如來自小鼠、大鼠、兔、貓、狗、山羊、綿羊、馬、豬、非人靈長類動物（如食蟹猴（本文也稱為「 cyno」）或駱駝科動物（如美洲駝或羊駝）的OX40L和IL-13。
可用於本文的與OX40L或IL-13特異性結合的ISVD的具體例子如以下項目A至C中所述：
A.    與人類OX40L特異性結合並包含以下項的ISVD i.   具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 6具有2或1個胺基酸差異的CDR1； ii.  具有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 10具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 iii. 具有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 14具有2或1個胺基酸差異的CDR3，
在一些實施例中，CDR1具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列，並且CDR3具有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列。
與人類OX40L特異性結合的這種ISVD的非限制性例子具有如表A-2中對於構建體15B07AM所示的一或多個或全部架構區（以及如前述項目A中定義的CDR），如具有構建體15B07AM的完整胺基酸序列的ISVD（SEQ ID NO: 2，參見表A-1和A-2）。
此外，在一個實施例中，與人類OX40L特異性結合的ISVD的胺基酸序列可以具有與SEQ ID NO: 2大於90%，如大於95%或大於99%的序列同一性，其中CDR視情況地如前述項目A中所定義。在一些實施例中，與OX40L特異性結合的ISVD具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列。
當與OX40L特異性結合的這種ISVD在至少一個CDR中具有相對於相應參考CDR序列的2或1個胺基酸差異（上述項目A）時，在一些實施例中，與構建體15B07AM相比，所述ISVD對人類OX40L具有至少一半結合親和力、至少相同的結合親和力、或甚至更高的結合親和力，其中使用相同的方法（如SPR）測量結合親和力。
B.     與人類IL-13特異性結合並包含以下項的ISVD i.   具有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 7具有2或1個胺基酸差異的CDR1； ii.  具有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 11具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 iii. 具有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 15具有2或1個胺基酸差異的CDR3，
在一些實施例中，CDR1具有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列，並且CDR3具有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列。
與人類IL-13特異性結合的這種ISVD的非限制性例子具有如表A-2中對於構建體4B02/1所示的一或多個或全部架構區（以及如前述項目B中定義的CDR），如具有構建體4B02/1的完整胺基酸序列的ISVD（SEQ ID NO: 3，參見表A-1和A-2）。
此外，在一個實施例中，與人類IL-13特異性結合的ISVD的胺基酸序列可以具有與SEQ ID NO: 3大於90%，如大於95%或大於99%的序列同一性，其中CDR視情況地如前述項目B中所定義。在一些實施例中，與IL-13結合的ISVD具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列。
當與IL-13結合的這種ISVD在至少一個CDR中具有相對於相應參考CDR序列的2或1個胺基酸差異（上述項目B）時，在一些實施例中，與構建體4B02/1相比，所述ISVD對人類IL-13具有至少一半結合親和力、至少相同的結合親和力、或甚至更高的結合親和力，其中使用相同的方法（如SPR）測量結合親和力。
C.     與人類IL-13特異性結合並包含以下項的ISVD i.   具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 9具有2或1個胺基酸差異的CDR1； ii.  具有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 13具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 iii. 具有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 17具有2或1個胺基酸差異的CDR3，
在一些實施例中，CDR1具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列，並且CDR3具有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列。
與人類IL-13特異性結合的這種ISVD的非限制性例子具有如表A-2中對於構建體4B06/1所示的一或多個或全部架構區（以及如前述項目C中定義的CDR），如具有構建體4B06/1的完整胺基酸序列的ISVD（SEQ ID NO: 5，參見表A-1和A-2）。
此外，在一個實施例中，與人類IL-13特異性結合的ISVD的胺基酸序列可以具有與SEQ ID NO: 5大於90%，如大於95%或大於99%的序列同一性，其中CDR視情況地如前述項目C中所定義。在一些實施例中，與IL-13結合的ISVD具有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列。
當與IL-13特異性結合的這種ISVD在至少一個CDR中具有相對於相應參考CDR序列的2或1個胺基酸差異（上述項目C）時，與構建體4B06/1相比，所述ISVD對人類IL-13具有至少一半結合親和力、至少相同的結合親和力、或甚至更高的結合親和力，其中使用相同的方法（如SPR）測量結合親和力。
在一些實施例中，如上述專案A至C所定義的每一個ISVD被包含在本文的多肽中。在一些實施例中，與由SEQ ID NO: 1的胺基酸組成的多肽相比，包含如上述專案A至C所定義的每一個ISVD的本文的這種多肽對人類OX40L和人類IL-13具有至少一半結合親和力、至少相同的結合親和力、或甚至更高的結合親和力，其中使用相同的方法（如SPR）測量結合親和力。
上述專案A至C中提及的SEQ ID NO是基於根據AbM定義的CDR定義（參見表A-2）。注意，根據Kabat定義（參見表A-2.1）定義相同CDR的SEQ ID NO同樣可以用於上述項目A至C。
因此，可如上所述使用AbM定義在本文中使用的與OX40L或IL-13特異性結合的特定ISVD也可以如以下項目A’至C’中所述使用Kabat定義進行描述：
A'.    與人類OX40L特異性結合並包含以下項的ISVD i.   具有SEQ ID NO: 31的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 31具有2或1個胺基酸差異的CDR1； ii.  具有SEQ ID NO: 35的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 35具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 iii. 具有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 14具有2或1個胺基酸差異的CDR3，
在一些實施例中，CDR1具有SEQ ID NO: 31的胺基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO: 35的胺基酸序列，並且CDR3具有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列。
與人類OX40L特異性結合的這種ISVD的非限制性例子具有如表A-2.1中對於構建體15B07AM所示的一或多個或全部架構區（以及如前述項目A'中定義的CDR），如具有構建體15B07AM的完整胺基酸序列的ISVD（SEQ ID NO: 2，參見表A-1和A-2.1）。
B'.    與人類IL-13特異性結合並包含以下項的ISVD i.   具有SEQ ID NO: 32的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 32具有2或1個胺基酸差異的CDR1； ii.  具有SEQ ID NO: 36的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 36具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 iii. 具有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 15具有2或1個胺基酸差異的CDR3，
在一些實施例中，CDR1具有SEQ ID NO: 32的胺基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO: 36的胺基酸序列，並且CDR3具有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列。
與人類IL-13特異性結合的這種ISVD的非限制性例子具有如表A-2.1中對於構建體4B02/1所示的一或多個或全部架構區（以及如前述項目B'中定義的CDR），如具有構建體4B02/1的完整胺基酸序列的ISVD（SEQ ID NO: 3，參見表A-1和A-2.1）。
C'.    與人類IL-13特異性結合並包含以下項的ISVD i.   具有SEQ ID NO: 34的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 34具有2或1個胺基酸差異的CDR1； ii.  具有SEQ ID NO: 38的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 38具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 iii. 具有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 17具有2或1個胺基酸差異的CDR3，
在一些實施例中，CDR1具有SEQ ID NO: 34的胺基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO: 38的胺基酸序列，並且CDR3具有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列。
與人類IL-13特異性結合的這種ISVD的非限制性例子具有如表A-2.1中對於構建體4B06/1所示的一或多個或全部架構區（以及如前述項目C'中定義的CDR），如具有構建體4B06/1的完整胺基酸序列的ISVD（SEQ ID NO: 5，參見表A-1和A-2.1）。
第一胺基酸序列與第二胺基酸序列之間的「序列同一性」的百分比可以通過將[第一胺基酸序列中與第二胺基酸序列中相應位置處的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基的數量]除以[第一胺基酸序列中胺基酸殘基的總數]並乘以[100%]來計算，其中第二胺基酸序列中胺基酸殘基的每個缺失、插入、取代或添加（與第一胺基酸序列相比）被認為是單個胺基酸殘基（即單個位置處）的差異。
通常，出於根據上文概述的計算方法確定兩個胺基酸序列之間「序列同一性」的百分比的目的，將具有最大胺基酸殘基數量的胺基酸序列作為「第一」胺基酸序列，並將另一個胺基酸序列作為「第二」胺基酸序列。
如本文所用的「胺基酸差異 」是指單個胺基酸殘基相對於參考序列的缺失、插入或取代。在一些實施例中，所述胺基酸差異是取代。
在一些實施例中，所述胺基酸取代是保守取代。在一些實施例中，此類保守取代是其中以下 (a) – (e) 組中的一個胺基酸被同一組中的另一個胺基酸殘基取代的取代：(a) 小的脂族、非極性或微極性殘基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；(b) 極性、帶負電荷的殘基及其（不帶電荷的）醯胺：Asp、Asn、Glu和Gln；(c) 極性、帶正電荷的殘基：His、Arg和Lys；(d) 大的脂族、非極性殘基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；以及 (e) 芳族殘基：Phe、Tyr和Trp。
在一些實施例中，所述保守取代如下：Ala變成Gly或變成Ser；Arg變成Lys；Asn變成Gln或變成His；Asp變成Glu；Cys變成Ser；Gln變成Asn；Glu變成Asp；Gly變成Ala或變成Pro；His變成Asn或變成Gln；Ile變成Leu或變成Val；Leu變成Ile或變成Val；Lys變成Arg,變成Gln或變成Glu；Met變成Leu,變成Tyr或變成Ile；Phe變成Met,變成Leu或變成Tyr；Ser變成Thr；Thr變成Ser；Trp變成Tyr；Tyr變成Trp；和/或Phe變成Val、變成Ile或變成Leu。 5.2 特異性
術語「特異性」、「特異性地結合」或「特異性結合」是指特定結合單元（諸如ISVD）可以以足夠高的親和力結合的來自相同生物體的不同目標分子（諸如抗原）的數量（參見下文）。「特異性」、「特異性地結合」或「特異性結合」在本文中與「選擇性」、「選擇性地結合」或「選擇性結合」互換使用。根據一些實施例，結合單元（如ISVD）與其指定的目標特異性地結合。
可以基於親和力確定結合單元的特異性/選擇性。親和力表示分子相互作用的強度或穩定性。親和力通常通過KD或解離常數給出，單位為莫耳/公升（或M）。親和力也可以表示為締合常數KA，其等於1/KD並且具有（莫耳/公升） -1（或M -1）的單位。
親和力是一個部位與目標分子上結合位點之間的結合強度的量度：KD值越小，目標分子與靶向部位之間的結合強度越強。
通常，本文中使用的結合單元（如ISVD）將以10 -5至10 -12莫耳/公升或更低，如10 -7至10 -12莫耳/公升或更低，更特別地如10 -8至10 -12莫耳/公升的解離常數（KD）（即以10 5至10 12公升/莫耳或更高，如10 7至10 12公升/莫耳或更高，並且更特別地如10 8至10 12公升/莫耳的締合常數（KA））與其目標（在室溫下）結合。
大於10 -4莫耳/公升的任何KD值（或小於10 4公升/莫耳的任何KA值）通常被認為指示非特異性結合。
被認為具有特異性的生物學相互作用（諸如免疫球蛋白序列與抗原的結合）的KD通常在10 -5莫耳/公升（10000 nM或10µM）至10 -12莫耳/公升（0.001 nM或1 pM）或更低的範圍內。
因此，特異性/選擇性結合可能意味著，使用相同的測量方法（例如SPR），結合單元（或包含其的多肽）以10 -5至10 -12莫耳/公升或更低的KD值與OX40L和/或IL-13結合，並以大於10 -4莫耳/公升的KD值與相關細胞因子結合。OX40L相關目標的例子是人TRAIL、CD30L、CD40L和RANKL。IL-13相關目標的例子是人類IL-4。因此，在一個實施例中，多肽中包含的至少一個ISVD以10 -5至10 -12莫耳/公升或更低的KD值與OX40L結合而以大於10 -4莫耳/公升的KD值與相同物種的TRAIL、CD30L、CD40L和RANKL結合，並且多肽中包含的至少兩個ISVD以10 -5至10 -12莫耳/公升或更低的KD值與IL-13結合而以大於10 -4莫耳/公升的KD值與相同物種的IL-4結合。
因此，在一些實施例中，與由SEQ ID NO: 1的胺基酸組成的多肽相比，本文的多肽對人類OX40L和人類IL-13具有至少一半結合親和力、至少相同的結合親和力、或甚至更高的結合親和力，其中使用相同的方法（如SPR）測量結合親和力。
特異性結合來自某個物種的某種目標並不排除結合單元也可以特異性地結合來自不同物種的類似目標。例如，與人類OX40L的特異性結合不排除結合單元或包含所述結合單元的多肽也可以與來自食蟹猴的OX40L特異性地結合。同樣，例如，與人類IL-13的特異性結合不排除結合單元或包含所述結合單元的多肽也可以與來自食蟹猴（「cyno」）的IL-13特異性地結合。
結合單元與其指定目標的特異性結合可以以本身已知的任何合適方式來確定，所述方式包括但不限於Scatchard分析和/或競爭性結合分析法，諸如放射免疫分析法（RIA）、酵素免疫分析法（EIA）和三明治競爭分析法，以及它們在業內本身已知的不同變體；以及本文提及的其他技術。
如熟習此項技術者將清楚的，解離常數可以是實際的或表觀的解離常數。用於確定解離常數的方法對熟習此項技術者將是清楚的，並且例如包括以下提及的技術。在此方面，還將清楚的是，可能不可以測量大於10 -4莫耳/公升或10 -3莫耳/公升（例如，10 − 2莫耳/公升）的解離常數。視情況地，熟習此項技術者還將清楚的是，可以基於（實際或表觀）締合常數（KA），借助關係式[KD = 1/KA]來計算（實際或表觀）解離常數。
可以經由本身已知的不同技術（如熟知的表面電漿共振（SPR）生物感測器技術）來測量兩個分子之間的分子相互作用的親和力（參見例如Ober等人 2001, Intern. Immunology 13: 1551-1559）。如本文所用，術語「表面電漿共振」是指一種光學現象，其允許通過檢測生物感測器矩陣內蛋白質濃度的改變來分析即時生物特異性相互作用，其中一個分子固定在生物感測器晶片上，並且另一個分子在流動條件下經過固定的分子，從而得到k 締 合、k 解離測量值，並且因此得到K D（或K A）值。例如，這可以使用熟知的BIAcore®系統（BIAcore International AB，一家GE Healthcare公司，烏普薩拉，瑞典和皮斯卡塔韋，新澤西州）進行。對於進一步描述，參見Jonsson等人 (1993, Ann. Biol. Clin. 51: 19-26)、Jonsson等人 (1991 Biotechniques 11: 620-627)、Johnsson等人 (1995, J. Mol. Recognit. 8: 125-131) 以及Johnsson等人 (1991, Anal. Biochem. 198: 268-277)。
另一種熟知的確定生物分子相互作用的親和力的生物感測器技術是生物層干涉法（bio-layer interferometry，BLI）（參見例如Abdiche等人 2008, Anal. Biochem. 377: 209-217）。如本文所用，術語「生物層干涉法」或「BLI」是指無標籤光學技術，其分析從兩個表面反射的光的干涉圖案：內部參考層（參考光束）和生物感測器尖端上的固定蛋白質的層（信號光束）。結合到生物感測器尖端的分子數量的變化會導致干涉圖案的偏移，報告為波長偏移（nm），其幅度是結合到生物感測器尖端表面的分子數量的直接量度。由於可以即時測量相互作用，因此可以確定締合和解離速率和親和力。例如，BLI可以使用熟知的Octet®系統（ForteBio，Pall Life Sciences的分公司，門洛派克，美國）來進行。
或者，可以使用KinExA®平臺（Sapidyne Instruments Inc, 美國博伊西）在動力學排除測定（KinExA）中測量親和力（參見例如，Drake等人 2004, Anal. Biochem., 328: 35-43）。如本文所用，術語「KinExA」是指測量未修飾分子的真實平衡結合親和力和動力學的基於溶液的方法。使抗體/抗原複合物的平衡溶液通過具有用抗原（或抗體）預包被的珠的柱，從而允許游離的抗體（或抗原）與被包被的分子結合。用結合抗體（或抗原）的螢光標記的蛋白完成了對如此捕獲的抗體（或抗原）的檢測。
GYROLAB®免疫測定系統為自動化生物分析和快速樣品周轉提供了平臺（Fraley等人 2013, Bioanalysis 5: 1765-74）。 5.3 （體內）半衰期延長
所述多肽可以進一步包含一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元，其視情況地經由一或多個肽連接子連接，其中與沒有所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元的相應多肽相比，所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元提供具有增加的（體內）半衰期的多肽。體內半衰期延長意指，例如，所述多肽在投予後在哺乳動物（諸如人受試者）中具有增加的半衰期。半衰期可以表示為例如t1/2β。
基團、殘基、部分或結合單元的類型通常不受限制，並且可以例如選自聚乙二醇分子、血清蛋白或其片段、可以結合血清蛋白的結合單元、Fc部分，以及可以結合血清蛋白的小蛋白或肽。
更具體地，提供具有增加的半衰期的多肽的所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元可以選自可以結合血清白蛋白（如人類血清白蛋白）或血清免疫球蛋白（諸如IgG）的結合單元。在一些實施例中，所述結合單元可以與人類血清白蛋白結合。在一些實施例中，所述結合單元是ISVD。
例如，WO 04/041865（通過引用以其整體併入）描述了與血清白蛋白（並且特別是針對人類血清白蛋白）結合的Nanobodies®，其可以與其他蛋白質（如與所需目標結合的一或多個其他Nanobodies®）連接，以增加所述蛋白質的半衰期。
國際申請WO 06/122787（通過引用以其整體併入）描述了針對（人類）血清白蛋白的多種Nanobodies®。這些Nanobodies®包括稱為Alb-1（通過引用以其整體併入的WO 06/122787中的SEQ ID NO: 52）及其人源化變體如Alb-8（通過引用以其整體併入的WO 06/122787中的SEQ ID NO: 62）的Nanobody®。同樣，這些可以用於延長治療性蛋白質和多肽以及其他治療性實體或部分的半衰期。
此外，WO 2012/175400（通過引用以其整體併入）描述了Alb-1的進一步改善形式，稱為Alb-23。
在一個實施例中，所述多肽包含選自Alb-1、Alb-3、Alb-4、Alb-5、Alb-6、Alb-7、Alb-8、Alb-9、Alb-10和Alb-23的血清白蛋白結合部分。在一些實施例中，所述多肽包含如WO 2012/175400的第7-9頁所示的Alb-8或Alb-23或其變體，以及WO 2012/175741、WO 2015/173325、WO 2017/080850、WO 2017/085172、WO 2018/104444、WO 2018/134235、WO 2018/134234中描述的白蛋白結合物，其每一個通過引用以其整體併入本文。表A-4中還顯示了血清白蛋白結合物的一些非限制性例子。在一些實施例中，本文的多肽包含如專案D中所述的其他組分：
D． 與人類血清白蛋白結合並包含以下項的ISVD i.   具有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 8具有2或1個胺基酸差異的CDR1； ii.  具有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 12具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 iii. 具有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 16具有2或1個胺基酸差異的CDR3；
在一些實施例中，CDR1具有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列，並且CDR3具有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列。
與人類血清白蛋白結合的這種ISVD的非限制性例子具有如表A-2中對於構建體ALB23002所示的一或多個或全部架構區（以及如前述項目D中定義的CDR），如具有構建體ALB23002的完整胺基酸序列的ISVD（SEQ ID NO: 4，參見表A-1和A-2）。
也可以使用Kabat定義將項目D描述為：
D'.    與人類血清白蛋白結合並包含以下項的ISVD i.   具有SEQ ID NO: 33的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 33具有2或1個胺基酸差異的CDR1； ii.  具有SEQ ID NO: 37的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 37具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 iii. 具有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 16具有2或1個胺基酸差異的CDR3；
在一些實施例中，CDR1具有SEQ ID NO: 33的胺基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO: 37的胺基酸序列，並且CDR3具有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列。
與人類血清白蛋白結合的這種ISVD的非限制性例子具有如表A-2.1中對於構建體ALB23002所示的一或多個或全部架構區（以及如前述項目D’中定義的CDR），如具有構建體ALB23002的完整胺基酸序列的ISVD（SEQ ID NO: 4，參見表A-1和A-2.1）。
此外，在一個實施例中，與人類血清白蛋白結合的ISVD的胺基酸序列可以具有與SEQ ID NO: 4大於90%，如大於95%或大於99%的序列同一性，其中CDR視情況地如前述項目D中所定義。在一些實施例中，與人類血清白蛋白結合的ISVD具有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列。
當與人類血清白蛋白結合的這種ISVD在至少一個CDR中具有相對於相應參考CDR序列的2或1個胺基酸差異（上述項目D）時，與構建體ALB23002相比，所述ISVD對人類血清白蛋白具有至少一半結合親和力、至少相同的結合親和力、或甚至更高的結合親和力，其中使用相同的方法（如SPR）測量結合親和力。
當與人類血清白蛋白結合的這種ISVD具有C端位置時，其展現出C端丙胺酸（A）或甘胺酸（G）延伸並且可以選自SEQ ID NO: 52、53、55、57、58、59、60、61、62和63（參見下表A-4）。在一個實施例中，與人類血清白蛋白結合的ISVD具有不同於C端位置的另一位置（即不是本文的多肽的C端ISVD）並且選自SEQ ID NO: 4、50、51、54和56（參見下表A-4）。 5.4 核酸分子
本文還提供了一種編碼本文的多肽的核酸分子。
「核酸分子」（可與「核酸」互換使用）是經由磷酸酯骨架彼此連接以形成核苷酸序列的核苷酸單體的鏈。核酸可以用於轉化/轉染宿主細胞或宿主生物體，例如用於多肽的表現和/或產生。用於產生目的的合適的宿主或宿主細胞對熟習此項技術者將是清楚的，並且可以例如是任何合適的真菌、原核或真核細胞或細胞系或任何合適的真菌、原核或真核生物體。包含編碼本文的多肽的核酸的宿主或宿主細胞也包括在本文中。
核酸可以是例如DNA、RNA或其雜合體，並且還可以包含（例如化學地）修飾的核苷酸，如PNA。其可以是單鏈或雙鏈DNA。例如，本文的核苷酸序列可以是基因組DNA、cDNA。
本文的核酸可以以本身已知的方式製備或獲得，和/或可以從合適的天然來源中分離。編碼天然存在的(多)肽的核苷酸序列可以例如進行定點誘變，以便提供編碼具有序列變異的多肽的核酸分子。同樣，如熟習此項技術者將清楚的，為了製備核酸，也可以以合適的方式將數個核苷酸序列，諸如至少一個編碼靶向部分的核苷酸序列和例如編碼一或多個連接子的核酸連接在一起。
用於產生核酸的技術對熟習此項技術者將是清楚的，並且可以例如包括但不限於自動化DNA合成；定點誘變；組合兩個或更多個天然存在的和/或合成的序列（或其兩個或更多個部分），引入導致截短的表現產物表現的突變；引入一或多個限制性位點（例如，以產生可能易於使用合適的限制性酶消化和/或連接的盒和/或區域），和/或借助使用一或多個「錯配」引物的PCR反應引入突變。 5.5 載體
本文還提供了一種包含編碼本文的多肽的核酸分子的載體。如本文所用的載體是適用於將遺傳物質攜帶到細胞中的媒劑。載體包括裸核酸（如質體或mRNA）或嵌入到更大結構（如脂質體或病毒載體）中的核酸。
載體通常包含至少一種核酸，其任選地與一或多個調節元件（例如像一或多個合適的啟動子、增強子、終止子等）連接。所述載體是表現載體，即適用於在合適的條件下（例如當所述載體被引入（例如人類）細胞中時）表現編碼的多肽或構建體的載體。對於基於DNA的載體，其通常包括用於轉錄（例如啟動子和polyA信號）和轉譯（例如Kozak序列）的元件的存在。
在一些實施例中，在所述載體中，所述至少一種核酸和所述調節元件彼此「可操作地連接」，這通常意指它們彼此之間具有功能關係。例如，如果啟動子能夠啟動或以其他方式控制/調節編碼序列的轉錄和/或表現，則所述啟動子被認為與編碼序列「可操作地連接」（其中，所述編碼序列應理解為「在所述啟動子的控制下」）。通常，當兩個核苷酸序列可操作地連接時，它們將取向相同，並且通常也處於同一閱讀框中。它們通常也基本上是連續的，儘管這也可能不是必需的。
在一些實施例中，所述載體的任何調節元件使得它們能夠在預期的宿主細胞或宿主生物體中提供其預期的生物學功能。
例如，啟動子、增強子或終止子在預期的宿主細胞或宿主生物體中應是「可操作的」，這意味著例如所述啟動子應能夠啟動或以其他方式控制/調節與其可操作地連接的核苷酸序列（例如編碼序列）的轉錄和/或表現。 5.6 組成物
本文還提供了一種組成物，所述組成物包含至少一種本文的多肽、至少一種編碼本文的多肽的核酸分子或至少一種包含這種核酸分子的載體。所述組成物可以是醫藥組成物。所述組成物還可以包含至少一種醫藥上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑和/或佐劑，並且視情況地包含一或多種其他醫藥活性多肽和/或化合物。 5.7 宿主生物體
本文還涉及宿主細胞或宿主生物體，所述宿主細胞或宿主生物體包含本文的多肽、編碼本文多肽的核酸，和/或包含編碼本文多肽的核酸分子的載體。
合適的宿主細胞或宿主生物體對熟習此項技術者是清楚的，並且是例如任何合適的真菌、原核或真核細胞或細胞系或任何合適的真菌、原核或真核生物體。具體例子包括HEK293細胞、CHO細胞、大腸桿菌（ Escherichia coli）或巴斯德畢赤酵母（ Pichia pastoris）。在一些實施例中，所述宿主是巴斯德畢赤酵母。 5.8 多肽的方法和用途
本文還提供了一種用於產生本文的多肽的方法。所述方法可以包括用編碼所述多肽的核酸轉化/轉染宿主細胞或宿主生物體，在宿主中表現所述多肽，任選地隨後進行一或多個分離和/或純化步驟。具體地，所述方法可以包括： a)  在合適的表現系統（例如，合適的宿主細胞或宿主生物體或另一個表現系統）中表現編碼所述多肽的核酸序列；視情況地接著進行： b) 分離和/或純化所述多肽。
用於產生目的的合適的宿主或宿主生物體對熟習此項技術者將是清楚的，並且可以例如是任何合適的真菌、原核或真核細胞或細胞系或任何合適的真菌、原核或真核生物體。具體例子包括HEK293細胞、CHO細胞、大腸桿菌或巴斯德畢赤酵母。在一些實施例中，所述宿主是巴斯德畢赤酵母。
本文的多肽、如所述的核酸分子或載體、或包含本文的多肽、核酸分子或載體的組成物——如所述多肽或包含所述多肽的組成物——可用作藥物。
因此，本文提供了本文的多肽、如所述的核酸分子或載體、或包含本文的多肽、核酸分子或載體的組成物，其用作藥物。
還提供了本文的多肽、如所述的核酸分子或載體、或包含本文的多肽、核酸分子或載體的組成物，其用於（預防性或治療性）治療自體免疫性和/或發炎性疾病和/或纖維化疾病。
還提供了一種治療自體免疫性和/或發炎性和/或纖維化疾病的（預防性和/或治療性）方法，其中所述方法包括向有需要的受試者投予醫藥活性量的本文的多肽、如所述的核酸分子或載體、或包含本文的多肽、核酸分子或載體的組成物。
還提供了本文的多肽、如所述的核酸分子或載體、或包含本文的多肽、核酸分子或載體的組成物在製備醫藥組成物（如用於治療自體免疫性疾病或發炎性疾病或纖維化疾病的醫藥組成物）中的用途。
如在本文的上下文中提及的「受試者」可以是任何動物，如哺乳動物。在哺乳動物之間，可以區分人與非人類哺乳動物。非人類動物可以是例如陪伴動物（例如狗、貓）、家畜（例如牛、馬、綿羊、山羊或豬動物），或通常用於研究目的和/或用於產生抗體的動物（例如小鼠、大鼠、兔、貓、狗、山羊、綿羊、馬、豬、非人類靈長類動物（諸如食蟹猴）或駱駝科動物（諸如駱馬或羊駝）。
在預防和/或治療目的的上下文中，所述受試者可以是任何動物，並且更具體地是任何哺乳動物，如人類受試者。
包括多肽、核酸分子和載體、或組成物的物質可以通過任何合適的投予途徑投予至受試者，例如通過腸內（諸如口服或直腸）或腸胃外（如表皮、舌下、頰、鼻、關節內、皮內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、經皮或經粘膜）投予。可以使用腸胃外投予，如肌內、皮下或皮內投予。在一些實施例中，使用皮下投予。
可以將有效量的多肽、如所述的核酸分子或載體，或者包含所述多肽、核酸分子或載體的組成物投予於受試者，以便提供預期的治療結果。
可以投予一或多個劑量。如果投予多於一個劑量，則可以以合適的間隔投予所述劑量，以便最大化所述多肽、組成物、核酸分子或載體的作用。 表 A-1 ：在四價多肽 F027100187 內鑒定的不同單價 V HH 構建塊的胺基酸序列（ 「 ID 」 是指如本文所用的 SEQ ID NO ）
名稱 ID 胺基酸序列
15B07AM (構建塊1） 2 DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASRSIGRYDRMGWYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNFNKYQISRDTWGQGTLVTVSS
4B02/1 (構建塊2) 3 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYRMGWFRQAPGKEREFVAALSGDGYSTYTANSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAKLQYVSGWSYDYPYWGQGTLVTVSS
ALB23002 (構建塊3) 4 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
4B06/1 (構建塊4) 5 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYAMKWVRQAPGKGLEWVSSITTGGGSTDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCANVPFGYYSEHFSGLSFDYRGQGTLVTVSSA  
表 A-2 ：根據 AbM 編號的 CDR 和架構的序列（ 「 ID 」 是指給出的 SEQ ID NO ）
ID V HH ID FR1 ID CDR1 ID FR2 ID CDR2 ID FR3 ID CDR3 ID FR4
2 15B07AM 18 DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAAS 6 RSIGRYDRMG 20 WYRHRPGEPRELVA 10 TITGGSSIN 24 YGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNF 14 NKYQISRDT 28 WGQGTLVTVSS
3 4B02/1 19 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAAS 7 GRTFSSYRMG 21 WFRQAPGKEREFVA 11 ALSGDGYSTY 25 TANSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAA 15 KLQYVSGWSYDYPY 28 WGQGTLVTVSS
4 ALB23002 19 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAAS 8 GFTFRSFGMS 22 WVRQAPGKGPEWVS 12 SISGSGSDTL 26 YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTI 16 GGSLSR 29 SSQGTLVTVSS
5 4B06/1 19 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAAS 9 GFTFNNYAMK 23 WVRQAPGKGLEWVS 13 SITTGGGSTD 27 YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCAN 17 VPFGYYSEHFSGLSFDY 30 RGQGTLVTVSSA
表 A-2.1 ：根據 Kabat 編號的 CDR 和架構的序列（ 「 ID 」 是指給出的 SEQ ID NO ）
ID V HH ID FR1 ID CDR1 ID FR2 ID CDR2 ID FR3 ID CDR3 ID FR4
2 15B07AM 39 DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAAS 31 RSIGRYDRMG 43 WYRHRPGEPRELVA 35 TITGGSSINYGDSVKG 46 RFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNF 14 NKYQISRDT 28 WGQGTLVTVSS
3 4B02/1 40 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTFS 32 SYRMG 44 WFRQAPGKEREFVA 36 ALSGDGYSTYTANSVKG 47 RFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAA 15 KLQYVSGWSYDYPY 28 WGQGTLVTVSS
4 ALB23002 41 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFR 33 SFGMS 45 WVRQAPGKGPEWVS 37 SISGSGSDTLYADSVKG 48 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTI 16 GGSLSR 29 SSQGTLVTVSS
5 4B06/1 42 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFN 34 NYAMK 45 WVRQAPGKGLEWVS 38 SITTGGGSTDYADSVKG 49 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCAN 17 VPFGYYSEHFSGLSFDY 30 RGQGTLVTVSSA
表 A-3 ：選擇的多價多肽的胺基酸序列（「 ID 」是指給出的 SEQ ID NO ）
名稱 ID 胺基酸序列
F027100187 1 DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASRSIGRYDRMGWYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNFNKYQISRDTWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYRMGWFRQAPGKEREFVAALSGDGYSTYTANSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAKLQYVSGWSYDYPYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGS EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYAMKWVRQAPGKGLEWVSSITTGGGSTDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCANVPFGYYSEHFSGLSFDYRGQGTLVTVSSA
F027100186 99 DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASRSIGRYDRMGWYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNFNKYQISRDTWGQGTLVTVSSGGGGSGGGS EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYRMGWFRQAPGKEREFVAALSGDGYSTYTANSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAKLQYVSGWSYDYPYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGS EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASRSIGRYDRMGWYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNFNKYQISRDTWGQGTLVTVSSGGGGSGGGS EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYAMKWVRQAPGKGLEWVSSITTGGGSTDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCANVPFGYYSEHFSGLSFDYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGS EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA
F027100188 100 DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTFSSIYAKGWFRQAPGKEREFVAAISRSGRSTSYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAVGGATTVTASEWDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGS EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTFSSIYAKGWFRQAPGKEREFVAAISRSGRSTSYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAVGGATTVTASEWDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGS EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYRMGWFRQAPGKEREFVAALSGDGYSTYTANSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAKLQYVSGWSYDYPYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGS EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGS EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYAMKWVRQAPGKGLEWVSSITTGGGSTDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCANVPFGYYSEHFSGLSFDYRGQGTLVTVSSA
表 A-4 ：結合血清白蛋白的 ISVD 序列（ 「 ID 」 是指如本文所用的 SEQ ID NO ）
名稱 ID 胺基酸序列
Alb8 50 EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
Alb23 51 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
Alb129 52 EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTATYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA
Alb132 53 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTATYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA
Alb11 54 EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
Alb11 (S112K)-A 55 EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVKVSSA
Alb82 56 EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
Alb82-A 57 EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA
Alb82-AA 58 EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSAA
Alb82-AAA 59 EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSAAA
Alb82-G 60 EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSG
Alb82-GG 61 EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGG
Alb82-GGG 62 EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGG
Alb23002 4 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
Alb223 63 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA
表 A-5 ：連接子序列（ 「 ID 」 是指如本文所用的 SEQ ID NO ）
名稱 ID 胺基酸序列
3A連接子 64 AAA
5GS連接子 65 GGGGS
7GS連接子 66 SGGSGGS
8GS連接子 67 GGGGSGGS
9GS連接子 68 GGGGSGGGS
10GS連接子 69 GGGGSGGGGS
15GS連接子 70 GGGGSGGGGSGGGGS
18GS連接子 71 GGGGSGGGGSGGGGSGGS
20GS連接子 72 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
25GS連接子 73 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
30GS連接子 74 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
35GS連接子 75 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
40GS連接子 76 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
G1鉸鏈 77 EPKSCDKTHTCPPCP
9GS-G1鉸鏈 78 GGGGSGGGSEPKSCDKTHTCPPCP
美洲駝上部長鉸鏈區 79 EPKTPKPQPAAA
G3鉸鏈 80 ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP
6 實例 6.1 實例 1 ：多特異性 ISVD 構建體產生
鑒定了通過資料驅動的雙特異性工程化和格式化活動（formatting campaign）產生的含有ISVD的多肽F027100187（SEQ ID NO: 1），其中包含抗OX40L構建塊（OX40L01E07、OX40L01B11和OX40L15B07，在WO 2011073180中分別描述為SEQ ID NO: 181、180和179）、抗IL-13構建塊（F0107003D12、F0107009F07、F0107009G09、F0107004B02、F0107004B06和F0107007C10）和抗HSA V HH構建塊ALB23002（在WO 2017085172中描述為SEQ ID NO: 10）。應用了構建塊的不同位置/取向/化合價和不同的連接子長度（9GS與20GS與35GS）並證明其對於不同參數（效力、交叉反應性、表現等）至關重要。本實例中的效力指分別如實例6和7中所測定的體外IL-13誘導的嗜酸性粒細胞趨化因子釋放測定的抑制和體外OX40L誘導的T細胞共刺激的抑制。
在畢赤酵母中轉化了包含123個構建體的組以用於小規模生產。通過逐步添加甲醇來誘導ISVD構建體表現。將具有分泌的ISVD構建體的澄清培養基用作起始材料，用於經由蛋白A親和層析法純化，隨後進行脫鹽。純化的樣品用於功能表徵和表現評價。
取決於化合價、連接子長度、使用的ISVD構建塊以及ISVD構建塊的相對位置，一些構建體顯示出受損的效力和表現水準。一般而言，五價ISVD構建體顯示出低表現水準，但一些具有位於C端的二價抗OX40L構建塊OX40L01E07（以下稱為「1E07」）的ISVD除外。然而，位於C端的1E07對於OX40L顯示出不足的效力。通過使用單價OX40L臂降低化合價改善了表現水準，但再次導致對OX40L的效力不足。因此，發現特定的組成（化合價、構建塊的取向和連接子長度的使用）對於效力和充分的表現水準很重要。
為了產生有效的單價OX40L靶臂以併入四價多特異性ISVD構建體中，使OX40L構建塊OX40L015B07（以下稱為「15B07」）和OX40L001B11（以下稱為「1B11」）經受親和力成熟化。
對於每個（V HH）構建塊，為每個CDR構建了所有CDR位置的合併單個位點飽和文庫。每個單個位元點飽和文庫都使用根據22c-trick方法設計的引物來構建（Kille等人 ACS Synth. Biol., 2013, 2 (2), 第83-92頁）。對固定的人和食蟹猴OX40L進行基於表面電漿共振光譜（SPR）的解離率篩選，以鑒定導致改善的結合的各個突變。
在第二步中，構建了包含在第一步中鑒定的有益突變的組合文庫。再次對人和食蟹猴OX40L進行解離率篩選以鑒定具有進一步改善的結合的V HH變體。然後將這些變體純化以用於經由SPR的生物物理學表徵親和力測定和在PBMC活性測定中的功能表徵（如實例7中所述），從而選擇最終的親和力成熟變體。表1列出了ISVD OX40L015B07和OX40L001B11的親和力成熟變體的特徵。 表 1 ：分別與親本形式 OX40L015B07 （ 15B07 ）和 OX40L001B11 （ 01B11 ）相比，最終親和力成熟變體 15B07AM 和 01B11AM 的特性的總結。
ISVD ID 相比於親本的變化 KD (M) huOX40L/ cyOX40L 相比於親本，親和力改善的倍數 IC50 (nM) PBMC 測定 人類 OX40L IC50 (nM) PBMC 測定 食蟹猴 OX40L 人 - 食蟹猴 OX40L 差距
F027300042 (15B07) NA 4.52E-09 / 9.92E-09 NA 150 ~368 ~2.45
F027301552 (15B07AM) L31Y-T99I-V98Q 8.53E-11 / 1.08E-10 53 / 92 1.78 7.58 4.3
F02730041 (1B11) NA 6.20E-10 / 4.30E-10 NA 39.7 244 6.1
F027301969 (1B11AM) S59Y-Q100fI – L100hG 2.00E-10 / 1.90E-10 3.1 / 2.7 14.5 35.6 2.5
通過使用單價OX40L構建塊15B07和1B11的親和力成熟形式，可以獲得有效且良好表現的四價多特異性ISVD構建體。
與非親和力成熟的對應物（15B07）相比，四價多特異性ISVD構建體中親和力成熟的單價15B07構建塊（15B07AM）的存在在OX40L驅動的PBMC活性測定（如實例7中所述）中提供了20倍更好的效力（表3）。
此外，四價多特異性ISVD構建體中15B07AM構建塊的N端位置至關重要。表4中構建體F-027100172和F-027100179的比較顯示出在15B07AM構建塊位於N端位置相比於C端位置的情況下10倍更好的效力。
與僅遭受低表現產量的五價構建體相比，F-027100187（SEQ ID NO: 1）四價多特異性ISVD中N端15B07AM構建塊的存在對CMC特性（即表現和溶解度）有益。如表2所示，三種多特異性ISVD構建體F027100186（SEQ ID NO: 99）（五價）、F027100187（SEQ ID NO: 1）（四價）和F027100188（SEQ ID NO: 100）（五價）展現出很大不同的初始CMC（化學製造和控制）譜。在5L發酵後，ISVD構建體F027100187（SEQ ID NO: 1）達到4 g/l的滴度，這是五價ISVD構建體F027100186（SEQ ID NO: 99）和F027100188（SEQ ID NO: 100）的多於2倍；並且還展現出優越的溶解度。
為了在兩種IL13構建塊之間留出足夠的空間以獲得對IL-13的最佳效力，並且為了避免在F027100187四價多特異性ISVD構建體中存在長35GS連接子，兩個IL13構建塊均經由9GS-ALB-9GS的單元（9GS-ALB-9GS entity）來連接。
最後，基於對IL-13和OX40L的總體良好效力以及優越的表現水準和CMC特徵選擇了ISVD構建體F027100187。 表 2 ：五價 ISVD F027100186 （ SEQ ID NO: 99 ） 和 F027100188 （ SEQ ID NO: 100 ） 以及四價 ISVD F027100187 （ SEQ ID NO: 1 ） 的表現產量和溶解度。 ALB = ALB23002 ， BB= 構建塊 。
ISVD ID BB1 連接子 1 BB2 連接子 2 BB3 連接子 3 BB4 連接子 4 BB5 表現產量 5 ml 培養物 (µg/ml) 表現產量 5 L 發酵槽 (g/L) 溶解度 (mg/ml)
F027100186 15B07 9GS 4B02/1 9GS 15B07 9GS 4B06/01 9GS ALB 92 1.5 nt
F027100187 15B07AM 9GS 4B02/1 9GS ALB 9GS 4B06/01 194 4.0 150
F027100188 1E07 9GS 1E07 9GS 4B02/1 9GS ALB 9GS 4B06/01 109 1.7 ＜25
表 3 ：在 PBMC 測定中 ISVD 構建體介導的對人類 OX40L 所誘發之 IL-2 釋放的中和的 IC50 值
ISVD ID BB1 連接子 1 BB2 連接子 2 BB3 連接子 3 BB4 PBMC 活性測定 IC50 (M)
F027100057 15B07 9GS ALB 9GS 3D12 35GS 9G09 59.9E-09
F027100060 15B07 9GS ALB 9GS 4B02/1 35GS 3D12 47.7E-09
F027100172 15B07AM 9GS 3D12 9GS ALB 9GS 9G09 2.5E-09
表 4 ：在 PBMC 測定中 ISVD 構建體介導的對人類 OX40L 所誘發之 IL-2 釋放的中和的 IC50 值
ISVD ID BB1 連接子 1 BB2 連接子 2 BB3 連接子 3 BB4 PBMC 活性測定 IC50 (M)
F027100172 15B07AM 9GS 3D12 9GS ALB 9GS 9G09 2.5E-09
F027100179 3D12 9GS ALB 9GS 9G09 9GS 15B07 26.3E-09
6.2 實例 2 ：多特異性 ISVD 構建體對 OX40L 、 IL-13 和血清白蛋白的結合親和力
以平衡解離常數（K D）表示的F027100187對人類、食蟹猴（cyno）和恆河猴IL-13、對人類和食蟹猴OX40L以及人類、食蟹猴和小鼠血清白蛋白的親和力通過在Gyrolab xP Workstation（Gyros）上的溶液中親和力測量來定量。
在K D控制的測量下，將OX40L（範圍為1.3 µM - 0.008 pM）、IL-13（範圍為0.1 µM - 0.25 fM）或血清白蛋白（範圍為100 µM - 3.2 pM）的系列稀釋液以及固定量的ISVD構建體F027100187（在OX40L的情況下為10 pM、在IL-13的情況下為5 pM、在HSA和食蟹猴SA的情況下為100 pM以及在小鼠SA的情況下為30 nM）混合以允許相互作用並培育24或48小時（在OX40L和IL-13的情況下）或2小時（在血清白蛋白的情況下）以達到平衡。
在受體控制的測量下，將OX40L（範圍為1.3 µM - 0.031 pM）、IL-13（範圍為0.1 µM - 0.25 fM）或血清白蛋白（範圍為100 µM - 3.2 pM）的系列稀釋液以及固定量的ISVD構建體F027100187（在OX40L的情況下為5 nM、在IL-13的情況下為250 pM、在HSA和食蟹猴SA的情況下為30 nM）混合以允許相互作用並培育24或48小時（在OX40L和IL-13的情況下）或2小時（在血清白蛋白的情況下）以達到平衡。
生物素化的人類OX40L/IL-13/血清白蛋白被捕獲在Gyrolab Bioaffy 1000 CD的微結構中，其含有小珠管柱，並用作分子探針以從平衡溶液中捕獲游離F027100187。使OX40L/IL13/血清白蛋白和F027100187的混合物（含有游離OX40L/IL-13/血清白蛋白、游離F027100187以及OX40L/IL13/血清白蛋白 - F027100187複合物）流過所述小珠，並捕獲小百分比的游離F027100187，這與游離ISVD構建體濃度成比例。然後注射螢光標記的抗ISVD抗體ABH0086-Alexa647以標記任何捕獲的F027100187，並在沖洗掉過量的螢光探針後，測定螢光的變化。使用Gyrolab Analysis軟體完成稀釋系列的擬合，其中分析K D控制和受體控制的曲線以確定K D值。
結果（表5）證明多特異性ISVD構建體以高親和力結合人類/食蟹猴OX40L和人類/食蟹猴/恆河猴IL-13。 表 5 ： F027100187 對人、恆河猴和食蟹猴 IL-13 ；人類和食蟹猴 OX40L ；以及人類、食蟹猴和小鼠血清白蛋白的結合親和力（食蟹猴和恆河猴 OX40L 的序列相同，並且食蟹猴和恆河猴白蛋白的序列相同）
人類 食蟹猴 恆河猴
抗原 K D(pM) 95% CI (pM) K D(pM) 95% CI (pM) K D(pM) 95% CI (pM) 培育時間 (h)
O40XL 125 108 - 141 196 174 - 218     24
109 98 - 120 275 225 - 326     48
77.8 64.7 - 91.0 128 101 - 156     24
IL-13 7.8 6.4 - 9.1 6.7 5.8 - 7.5 29.3 9.0 – 49.5 48
5.3 3.4 - 7.1 11.7 9.5 – 13.9 14.1 6.3 – 49.5 48
7.6 3.8 - 11.5 8.2 7.0 – 9.3 23.2 6.8 - 39.6 48
    5.9 4.7 – 7.1     48
  人類 食蟹猴 小鼠  
抗原 K D(nM) 95% CI (nM) K D(nM) 95% CI (nM) K D(nM) 95% CI (nM) 培育時間 (h)
SA 8.3 7.7 – 9.0 10.2 9.7 – 10.7 109 101 - 117 2
6.6 5.5 – 7.6 10.6 9.0 – 12.3     2
7.8 6.7 – 8.9 9.6 8.3 – 10.9     2
6.3 實例 3 ：多特異性 ISVD 構建體與膜結合 OX40L 的結合
使用對表現人類或食蟹猴OX40L的CHO-KI細胞的流式細胞術來證明F027100187與人和食蟹猴膜結合OX40L的結合。簡而言之，將細胞用PBS中的4%多聚甲醛和0.1%戊二醛固定，以1 × 10 4個細胞/孔的密度接種，並與ISVD F027100187或參考化合物抗hOX40L mAb（命名為比較物3）的從100 nM至0.5 pM的稀釋系列一起在室溫下培育48小時。比較物3是針對人類OX40L的標準傳統單株抗體，其在本文所述的實例1至12中用作參考。將細胞洗滌3次，隨後與抗V HHmAb（ABH00119）一起在4ºC下培育30 min，再次洗滌並與山羊抗小鼠PE或FITC標記的抗體一起在4ºC下培育30 min。將樣品洗滌並重懸於FACS緩衝液（補充有5 nM TOPRO3的含10% FBS和0.05%疊氮化鈉的D-PBS）中。然後在iQuescreener上分析細胞懸浮液。使用GraphPad Prism計算EC50值。表6顯示了F0271000187和抗hOX40L參考mAb比較物3的結合親和力。 表 6 ：與參考化合物抗 hOX40L mAb 比較物 3 相比， F027100187 在 48 h 培育後對膜表現的人和食蟹猴 OX40L 的結合親和力。
  人類 OX40L 食蟹猴 OX40L
分析物 EC50 (M) EC50 (M)
F027100187 2.354E-11 3.632E-11
比較物3 9.934E-11 9.587E-11
6.4 實例 4 ：多特異性 ISVD 構建體與 OX40L 和 IL-13 選擇性地結合
經由SPR（Proteon XPR36）評估與OX40L和IL-13相關人類細胞因子的不結合。作為IL-13相關細胞因子，評估了IL-4。作為OX40L相關目標，評估了人類TRAIL、CD30L、CD40L和RANKL。
為此，使用胺偶聯將細胞因子以25 µg/mL固定在ProteOn GLC感測器晶片上持續600 s，其中注射EDC/NHS 80秒用於啟動，並注射1 M乙醇胺HCl 150秒用於失活（ProteOn Amine Coupling Kit，目錄號176-2410）。啟動和失活期間的流速設置為30 µl/min，並且配體注射期間的流速設置為25 µl/min。對於所有細胞因子，10 mM乙酸鹽固定緩衝液的pH值為6.0，但對於RANKL除外，其中所述pH為5.0。
接下來，將1 µM F027100187注射2分鐘，並以45 µL/min的流速解離600 s。使用PBS（pH 7.4） + 0.005% Tween 20作為運行緩衝液。作為陽性對照，注射了100 nM α-hIL-4、α-hTRAIL、α-hCD30L、α-hCD40L Ab和α-hRANKL V HH（Nanobody®，Nb）。F027100187和陽性對照與固定目標之間的相互作用通過檢測由於結合後晶片質量變化而發生的折射率增加來測量。
所有陽性對照均與各自的目標結合。未檢測到ISVD構建體F027100187與人類IL-4、TRAIL、CD30L、CD40L和RANKL的結合。 6.5 實例 5 ：多特異性 ISVD 與 IL-13 、 OX40L 和 HSA 的同時結合
使用流式細胞術，確定了ISVD構建體F0271000187是否可以同時與重組可溶性hIL-13和細胞膜結合hOX40L結合。為此，將表現人類OX40L的CHO-KI細胞以5 × 10 4個細胞/孔的密度接種，並與100 nM ISVD構建體F027100187一起在4ºC下培育90分鐘。隨後將混合物與生物素化IL-13的從500 nM開始降至7.6 pM的稀釋系列一起在4ºC下在存在30 µM HSA的情況下培育30 min。將細胞洗滌3次，隨後與PE標記的抗鏈黴親和素一起在4ºC下培育30 min，再次洗滌。將樣品洗滌並重懸於FACS緩衝液（補充有5 nM TOPRO3的含10% FBS和0.05%疊氮化鈉的D-PBS）中。然後在iQuescreener上分析細胞懸浮液。劑量反應曲線（圖1）證明，ISVD構建體F027100187可以在存在HAS的情況下同時結合膜結合hOX40L和可溶性hIL-13，而陰性對照V HHIRR0096不能如此結合。 6.6 實例 6 ：多特異性 ISVD 對 IL-13 誘導的嗜酸性粒細胞趨化因子釋放的體外抑制
使用研究通過A549人類肺癌細胞的嗜酸性粒細胞趨化因子釋放的基於細胞的測定來研究來自不同目的物種（人類、恆河猴和食蟹猴）的可溶性IL-13的功能活性和F027100187對其的抑制。
為此，將A549懸浮細胞在補充有10% FCS的Ham's F12K中培養，並以400.000個細胞/孔接種到96孔板中。培育24小時後，添加F027100187或參考化合物（抗hIL-13參考mAb比較物1和比較物2）的稀釋系列。比較物1和2二者均是針對人類IL-13的標準傳統單株抗體，其在本文所述的實例1至12中用作參考。培育20 min後，添加IL-13（人類IL13（Sino Biological，目錄號10369-HNAC）、食蟹猴IL13（Sino Biological，目錄號11057-CNAH）或恆河猴IL13（R&D Systems，目錄號2674-RM-025）至終濃度為160 pM。在存在30 µM HSA的情況下進一步培育24小時後，添加終濃度為50 µg/ml的肝素，以增強嗜酸性粒細胞趨化因子表現。在另外培育4小時後，通過使用人類CCL26/嗜酸性粒細胞趨化因子-3 DuoSet ELISA（R&D systems，DY346）對細胞上清液中分泌的嗜酸性粒細胞趨化因子-3進行定量。
F027100187以濃度依賴性方式抑制人類、食蟹猴和恆河猴IL-13誘導的嗜酸性粒細胞趨化因子-3釋放，其中IC50為259 pM（對於人類IL-13）、1940 pM（對於食蟹猴IL-13）和858 pM（對於恆河猴IL-13）（表7，圖2）。 表 7 ：在嗜酸性粒細胞趨化因子釋放測定中 F027100187 相比於參考化合物抗 hIL-13 參考 mAb 比較物 1 和比較物 2 介 導的對人、食蟹猴和恆河猴 IL-13 的中和的 IC 50 值。
F027100187 抗 hIL-13 參考 mAb 比較物 1 抗 hIL-13 參考 mAb 比較物 2
抗原 人類 IL-13 食蟹猴 IL-13 恆河猴IL-13 人類 IL-13 食蟹猴 IL-13 恆河猴IL-13 人類 IL-13 食蟹猴 IL-13 恆河猴IL-13
嗜 酸性粒細胞趨化因子釋放測定 (IC50 ， pM) 259 1940 858 48 250 107 686 10400 4680
6.7 實例 7 ：多特異性 ISVD 構建體對 OX40L 誘導的 T 細胞共刺激的體外抑制
使用研究OX40L誘導的T細胞共刺激的基於細胞的測定（PBMC活性測定）來研究人類和食蟹猴OX40L的功能活性和ISVD構建體F027100187對其的抑制。所述測定是通過以下方法來進行：在存在次最佳濃度的PHA-L（以誘導OX40表現）的情況下，將血沉棕黃層（buffy coat）衍生的PBMC（密度為1 × 10 5個細胞/孔）與過表現OX40L的CHO-KI細胞（密度為1 x 10 4個細胞/孔）在透明96孔板中共培養。將ISVD構建體F027100187或參考化合物抗hOX40L mAb（稱為比較物3）的稀釋系列添加至共培養物中，並在37ºC下在加濕培養箱中在存在30 µM HSA的情況下培育22小時。通過使用ELISA評價這些細胞上清液中的IL-2水準來進行讀數。
ISVD構建體F027100187以濃度依賴性方式抑制人類和食蟹猴OX40L誘導的T細胞啟動，其中IC50為1.9 nM（對於人類OX40L）和14 nM（對於食蟹猴OX40L），這與參考化合物抗hOX40L mAb比較物3是可比較的（表8，圖3）。 表 8 ：在 PBMC 活性測定中 ISVD 構建體 F0271000187 相比於參考化合物抗 hOX40L mAb 比較物 3 介 導的對人類和食蟹猴 OX40L 的中和的 IC50 值。
F027100187 比較物 3
抗原 人類OX40L 食蟹猴OX40L 人類OX40L 食蟹猴OX40L
PBMC活性測定IC50 (M) 1.9E-09 1.4E-08 9.9E-10 1.4E-08
6.8 實例 8 ：多特異性 ISVD 構建體與預先存在的抗體的結合
使用ProteOn XPR36（Bio-Rad Laboratories, Inc.）確定存在於來自健康志願者的96個血清樣品中的預先存在的抗體與ISVD構建體F027100187的結合。將PBS/Tween（磷酸鹽緩衝鹽水，pH 7.4，0.005% Tween20）用作運行緩衝液，並且在25ºC下進行實驗。
經由ALB23002構建塊與固定在晶片上的HSA的結合，在晶片上捕獲ISVD構建體。為了固定HSA，用EDC/NHS（流速30 μl/min）啟動ProteOn GLC感測器晶片的配體泳道，並將HSA以100 µl/ml注射至pH 4.5的ProteOn醋酸鹽緩衝液中，以實現大約2600 RU的固定水準。在固定後，用乙醇胺HCI（流速30 μl/min）使表面失活。
隨後，將ISVD構建體以45 μl/min在HSA表面上注射2分鐘，以實現大約800 RU的ISVD捕獲水準。將含有預先存在的抗體的樣品以14,000 rpm離心2分鐘，並將上清液在PBS-Tween20（0.005%）中以1:10稀釋，然後以45 μl/min注射2分鐘，隨後進行後續400秒的解離步驟。在每個迴圈後（即在新的ISVD捕獲和血液樣品注射步驟之前），通過將HCI（100 mM）以45 μl/min注射2分鐘使HSA表面再生。在通過減去1) ISVD-HSA解離和2) 與參考配體泳道的非特異性結合進行雙重參考後，獲得顯示預先存在的抗體結合的傳感圖。通過將報告點設置在125秒（締合結束後5秒）來確定預先存在的抗體的結合水準。相對於參考ISVD構建體在125秒時的結合水準，計算預先存在的抗體結合的減少百分比。
與對照的未優化五價ISVD F027301186相比，針對通過在每個構建塊中引入突變L11V和V89L以及C端丙胺酸減少預先存在的抗體結合進行優化的四價ISVD構建體F027100187顯示出與預先存在的抗體的結合顯著減少（圖4）。 6.9 實例 9 ：多特異性 ISVD 構建體 F027100187 對 OX40L 和 IL-13 的抑制降低了三重培養體系中的 IL-5 和 CCL26 水準：
為了測試OX40L阻斷對T細胞活化的生理作用，將對屋塵蟎有反應的健康獻血者的PBMC與MRC5（成纖維細胞）和A549（上皮）細胞共培養。混合這些細胞提供另外的啟動，從而通過誘導IL-5和IL-13的產生來驅動第2型免疫反應。IL-13觸發局部上皮細胞產生CCL26，導致第2型免疫反應介導的發炎性疾病等等。另外，在目的組織（皮膚和肺）中發現了這些細胞類型的重現（recapitulate）。在混合細胞後7天，通過測量上清液中的細胞因子來監測T細胞反應。 方法：
將在500 μl具有血清替代CTS的AIM V CTS培養基（測定培養基）中的7.5 x 10 4個MRC5和7.5 x 10 4個A549細胞添加至24孔板的每個孔中，並培育過夜。然後，將100 μl的ISVD構建體F02710018、抗OX40L參考mAb比較物3或抗hIL-13參考mAb比較物1添加至測定培養基中持續15 min。然後，將1.2 x 10 6個解凍並靜置的變應性PBMC添加至200 µl測定培養基中，接著添加200 µl來自耗盡培養物的低內毒素塵蟎過敏原蛋白（Der P）。將培養物培育7天，然後通過Luminex分析培養上清液中的IL-5和CCL26，測定進行二重複。顯示了4位獻血者的總結。 結果：
F027100187和基準抗體以及抗hOX40L mAb比較物3和參考抗hIL-13 mAb比較物1的抑制反應的總體結果顯示在表9和表10以及圖5和圖6中。
結論，這些結果表明ISVD F027100187在包含與組織結構細胞共培養的人PBMC的複雜測定體系中阻斷兩種細胞因子/趨化因子（IL-5和CCL26）的能力方面與抗hOX40L參考mAb（即比較物3）等效，並且幾乎與抗hIL-13參考mAb（即比較物1）等效，從而突出了其對於治療第2型發炎性疾病（如氣喘和異位性皮膚炎）以及廣泛範圍的免疫疾病適應症的治療潛力。 表 9 ： IL-5 平均 IC50 結果。
化合物 IL-5 IC50 (nM)
F027100187 1
比較物3 2.3
比較物1 NA
表 10 ： CCL26 平均 IC50 結果。
化合物 CCL26 IC50 (pM)
F027100187 40.7
比較物1 7.56
比較物3 NA
6.10 實例 10 ：用於評價 F027100187 在體內介導的目標佔用率和藥效動力學的 NSG 人源化 小鼠模型
F027100187同時靶向人類OX40L和IL-13，並且不會與鼠直向同源物有交叉反應。因此，為了評價F027100187的生物活性，使用異種移植的人源化模型系統。從美國緬因州巴爾港的傑克遜實驗室獲得雌性NSG（NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ）。這些小鼠表現人類造血細胞因子：幹細胞因子（SCF）、粒細胞/巨噬細胞刺激因子（GM-CSF）和介白素-3（IL-3），其全部都由人巨細胞病毒啟動子/增強子序列驅動。三重轉基因小鼠組成型地產生上述細胞因子，從而提供細胞增殖和存活信號，支援CD33+骨髓譜系和某些種類型的淋巴細胞的穩定移植。
簡而言之，移植所遵循的方案如下：
在研究的第0天，通過靜脈（IV）途徑向小鼠移植在200 µl Dulbecco磷酸鹽緩衝鹽水（DPBS）中的5 x 10 6個屋塵蟎敏感性外周血單核細胞（PBMC）。在研究的第1、2、3、6、7、8、9和10天，用40 µl屋塵蟎（HDM）提取物（Greer lab，目錄號XPB70-X29）中的25 µg對小鼠進行鼻內攻毒。用HDM攻毒的小鼠在第1、3、6、8、10和13天接受媒劑或F27100187（11.1、3.72、1.11或0.37 mg/kg）的皮下劑量。在第20天，通過異氟烷麻醉對小鼠進行麻醉。在異氟烷麻醉下，通過眼眶後出血收集血液。血液收集後且仍處於異氟醚麻醉下，通過頸椎脫臼處死小鼠。收穫一部分肺並將其置於培養基中以用於人細胞表型分析（流式細胞術）。來自第20天血漿樣品的人細胞因子和趨化因子的血漿水準通過Lumenix評價（目錄號HSTCMAG28SPMX13，Milliplex）來測定。來自第20天血漿樣品的人類IgE的血漿水準通過ELISA（目錄號BMS2097，Invitrogen）來測定。
如圖7和圖8所示的這些實驗的結果表明F027100187能夠顯著抑制NSG小鼠的人類T和B細胞擴增。圖9和圖10表明F027100187能夠顯著抑制關鍵類型細胞因子（IL-2、IL-4、IL-5和IL-10）和IgE的產生。總的來說，這些結果證明了F027100187的體內功效。
在NSG-PBMC小鼠模型中，第2型變應性疾病的幾個關鍵標記物增加。如圖7至圖10所示的這些實驗的總體結果表明，F27100187能夠顯著抑制第2型變應性疾病的關鍵標記物，從而表明了F27100187對人類第2型標記物的體內藥效動力學作用。 6.11 實例 11 ：用於評價 F027100187 在體內介導的目標佔用率和藥效動力學的 NSG-SGM3 人源化 小鼠模型
F027100187同時靶向人類OX40L和IL-13，並且不會與鼠直向同源物交叉反應。因此，為了評價F027100187的生物活性，使用異種移植的人源化模型系統。從美國緬因州巴爾港的傑克遜實驗室獲得移植了人CD34+細胞的雌性NSG-SGM3（NOD/SCID-IL2Rγ-/-，NOD.Cg-PrkdcscidIl2rγtm1Wjl/SzJ）。這些小鼠表現人造血細胞因子：幹細胞因子（SCF）、粒細胞/巨噬細胞刺激因子（GM-CSF）和介白素-3（IL-3），其全部都由人類巨細胞病毒啟動子/增強子序列驅動。三重轉基因小鼠組成型地產生上述細胞因子，從而提供細胞增殖和存活信號，支援CD33+骨髓譜系和某些種類型的淋巴細胞的穩定移植。動物是在移植後80至100天。簡而言之，移植所遵循的方案如下：
傑克遜實驗室提供了來自通過流式細胞術進行的移植檢查的資料。來自移植檢查的資訊用於將小鼠分組。小鼠在第0天和第2天接受媒劑或ISVD構建體F27100187的皮下劑量。在研究的第1、2和3天，用20 µl 人IL-33（目錄號200-33-500UG，Pepro Tech）中的7.5 µg對小鼠進行鼻內攻毒。在第4天，在異氟烷麻醉下，通過眼眶後出血收集血液。血液收集後且仍處於異氟醚麻醉下，通過頸椎脫臼處死小鼠。收穫一部分肺並將其置於培養基中以用於人類細胞表型分析（流式細胞術）。人類細胞因子和趨化因子的血漿水準通過Lumenix評價（目錄號HSTCMAG28SPMX13，Milliplex）來測定。來自第20天血漿樣品的人類IL-13的血漿水準通過ELISA（目錄號88-7439-88，Invitrogen）來測定。
如圖11所示的這些實驗的總體結果表明，F027100187能夠顯著抑制人源化NSG-SGM3小鼠的血漿中可檢測的人類IL-13水準，從而表明了對於人類IL-13的目標佔用率。此外，F027100187能夠顯著抑制關鍵第2型細胞因子IL-5、TARC和小鼠嗜酸性粒細胞趨化因子。因此，這些結果表明F027100187適用於治療異位性皮膚炎和/或氣喘。 實例 12 年輕成年恆河猴的變應性氣喘模型
來自加利福尼亞國家靈長類動物研究中心（California National Primate Research Center，CNPRC）的30隻2至4歲雄性恆河猴是基於以下進行選擇的：行為抑制測試、乙醯甲膽鹼反應性的肺功能測試（PFT）、150%的有效濃度（EC150）（＜ 3 mg/ml乙醯甲膽鹼）和200%的有效濃度（EC200）（＜ 8 mg/ml乙醯甲膽鹼）值。對參與本研究的所有動物進行了體格檢查、全血細胞計數（CBC）和血清化學檢測組套。
本研究選擇的所有動物都經歷了屋塵蟎（HDM）致敏。動物每兩週一次接受單次皮下注射在1 mg明礬中約60 ug HDM提取物（屋塵蟎，D. Pteronyssinus，Greer B58A52）（每次注射1 ml總體積，Thermo 77161），持續28週。
從研究的第12週開始，每兩週一次通過霧化器投予霧化的HDM（8.5 ug Der P 1/ml，由凍乾的屋塵蟎製備，Greer）。將研究動物用氯胺酮和右美托咪定鎮靜，然後以半直立的姿勢放置在兒童安全座椅上。隨後給鎮靜的動物戴上同時覆蓋鼻子和嘴巴的面罩。放置一個口腔堵塞物以確保最大的氣溶膠通道進入氣管和肺。投予一定劑量的阿托品以儘量減少通常由氯胺酮鎮靜引起的唾液的產生，因為過多的唾液可導致由於氣道阻塞而使程式提前終止。在不阻塞氣道的情況下仔細調整面罩貼合度和頭部位置，以防止氣溶膠洩漏。將HDM氣溶膠通過面罩投予約5-15分鐘。在整個程式中持續監測心率和氧飽和度。在所述程式後，用等劑量的阿替美唑反轉鎮靜作用。
在第0週收集血液樣品，然後從第18週開始每週收集一次。在第20週和第29週，在測試品投予後收集血清血液樣品以供藥動學分析。在每只研究動物的剃光後背上進行HDM皮內注射和皮膚活檢。在每個部位皮內注射100 ul鹽水或HDM（100 ul鹽水中1:1000 W/V），每個時間點8個部位。在第19、25和29週進行HDM皮膚反應性和皮膚生物檢體採樣。根據獸醫的判斷，使用4 mm鑽孔機從肩胛間區域進行活檢，並用皮膠或縫合線封閉所述部位。動物在每次活檢後接受酮洛芬（2-5mg/kg，IM，SID x 活檢後 1-2 天）。
支氣管肺泡灌洗（BAL）：在鎮靜下，將動物置於仰臥位。使用喉鏡將喉部視覺化，並用利多卡因麻醉喉部。將支氣管鏡置於亞段支氣管內。手動滴注和吸出2 mg/kg的磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）。其重複兩次。
群組分配：根據PFT標準（在前面章節中定義），以滾動方式將6隻動物的組納入三個群組之一。在第18週期間從BAL程式獲得的嗜酸性粒細胞頻率/數量用於將動物分配到治療組或對照（媒劑）組。
測試品投予：動物從第20週開始通過皮下投予接受媒劑或測試品。測試品由F027100187組成，每週投予一次。媒劑也是每週投予一次。
屍檢：動物將在第30週或第31週結束時在最後的PFT和BAL程式後立即進行屍檢。將通過過量的戊巴比妥鈉進行安樂死。將收集血液並將其準備用於血清、血漿和PBMC。將肺整體取出並將來自每個肺葉的切片準備用於RNA、流式細胞術和組織學。
IL-5的血漿水準由Simoa（目錄號102860，Quanterix）來測定。IgE的血清水準通過ELISA（目錄號KA2450，Abnova）來測定。
如圖13所示的這些實驗的結果表明F027100187能夠顯著抑制肺的發炎（嗜酸性粒細胞密度（組織學）、Bal IL-5和嗜酸性粒細胞百分比）。圖14表明F027100187能夠顯著抑制皮膚的發炎（組織學）。圖15表明F027100187能夠顯著抑制全身IgE的產生。總的來說，這些結果證明了F027100187的體內功效。這些結果進一步支持F27100187適用於治療氣喘。 7 工業實用性
所述多肽、編碼其的核酸分子、包含本文所述的核酸和組成物的載體可以用於例如治療患有發炎性疾病的受試者。
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儘管已經結合本發明的具體實施例對本發明進行了描述，但應當理解能夠對本發明進行進一步的修改，並且本申請旨在涵蓋總體上遵循本發明的原理，並且包括屬於本發明所屬領域內的已知或慣常實踐的且可以應用於上文所述的和如下在所附申請專利範圍之內的實質特徵的與本文的此類偏離的對本發明進行的任何變動、使用或改編。
無
圖 1 ：可溶性IL-13和膜結合hOX40L與ISV構建體F027100187的同時結合，如通過對表現人類OX40L的CHO-Ki細胞的流式細胞術所示。IRR00096是陰性對照V HH。
圖 2 ：ISVD F027100187和參考抗hIL-13 mAb（命名為比較物1和比較物2）在嗜酸性粒細胞趨化因子釋放測定中對人、食蟹猴和恆河猴IL-13的抑制。比較物1和比較物2都是針對人類IL-13的標準傳統單株抗體。資料點是全域平均值（n=2），誤差棒表示+/- SD。
圖 3 ：如在PBMC活性測定中確定的ISVD構建體F027100187和參考化合物抗hOX40L mAb（命名為比較物3）對膜結合OX40L的抑制。比較物3是針對人類OX40L的標準傳統單株抗體。資料點是全域平均值（n = 2），誤差棒表示+/- SD。
圖 4 ：顯示出96個人類血清樣品中存在的預先存在的抗體與ISVD構建體F027100187相比於對照ISVD構建體F027301186的結合的箱形圖（具有中位數和四分位差）。
圖 5 和圖 6 ：在三重培養測定中ISVD構建體F027100187以及參考抗體抗hIL-13 mAb（命名為比較物1）和抗hOX40L mAb（命名為比較物3）對過敏原屋塵蟎（Der P）誘導的由人PBMC產生IL-5和CCL26的抑制譜。將與MRC5成纖維細胞和A549上皮細胞共培養的正常供體PBMC用3 mg/mL塵蟎過敏原蛋白（Der P）刺激，並與11.1 nM的ISVD、抗hIL-13參考mAb（命名為比較物1）或抗hOX40L參考mAb比較物3一起在37 oC細胞培養箱中在24孔板中培育6天。新收集的上清液中的IL-5和CCL26濃度通過Human Magnetic Luminex Assay來測量。相對於未接受ISVD多肽或抗體的未刺激（min）和刺激（max）對照樣品計算抑制百分比。所有計算均使用GraphPad Prism 8.0進行。資料表示為來自根據上述設置的3個獨立實驗的合併的所有供體的平均值 ± 平均值標準誤差（SEM）。圖5：在第7天，三重培養測定中的IL-5抑制。來自4位PBMC供體的結果。圖6：在第7天，三重培養測定中的CCL26抑制。來自4位PBMC供體的結果。
圖 7 ：F27100187顯著降低了NSG小鼠的肺中的人類經活化、效應和中樞記憶T細胞的細胞性。 A)當與媒劑治療的小鼠相比時，使用11.1 mg/kg、3.72 mg/kg、1.11 mg/kg或0.37 mg/kg的任一種劑量下的F27100187均未顯著降低活化細胞（CD4+ CD45RA-細胞）。 B)當與媒劑治療的小鼠（132,035個細胞）相比時，使用11.1 mg/kg F27100187劑量（16,609個細胞）、3.72 mg/kg F27100187劑量（17,779個細胞）、1.11 mg/kg F27100187劑量（14,808個細胞）和0.37 mg/kg F27100187劑量（23,568個細胞）降低了啟動細胞（CD4+ HLA-DR+ CD38+細胞）。 C)當與媒劑治療的小鼠（685,726個細胞）相比時，使用11.1 mg/kg F27100187劑量（151,974個細胞）、3.72 mg/kg F27100187劑量（164,639個細胞）、1.11 mg/kg F27100187劑量（156,677個細胞）和0.37 mg/kg F27100187劑量（176,243個細胞）降低了效應記憶細胞。 D)當與媒劑治療的小鼠（681,508個細胞）相比時，使用11.1 mg/kg F27100187劑量（106,497個細胞）、3.72 mg/kg F27100187劑量（97,465個細胞）、1.11 mg/kg F27100187劑量（95,135個細胞）和0.37 mg/kg F27100187劑量（135,098個細胞）降低了中樞記憶細胞。
圖 8 ：F27100187顯著降低了NSG小鼠的肺中的人類經活化（CD19+）、記憶B細胞和漿母細胞的細胞性。 A)當與媒劑治療的小鼠（60,393個細胞）相比時，使用11.1 mg/kg F27100187劑量（11,581個細胞）、3.72 mg/kg F27100187劑量（8,236個細胞）、1.11 mg/kg F27100187劑量（9,948個細胞）和0.37 mg/kg F27100187劑量（10,248個細胞）降低了活化細胞（CD19+）。 B)當與媒劑治療的小鼠（6,467個細胞）相比時，使用11.1 mg/kg F27100187劑量（1,636個細胞）、3.72 mg/kg F27100187劑量（914個細胞）、1.11 mg/kg F27100187劑量（1,243個細胞）和0.37 mg/kg F27100187劑量（11,268 3個細胞）降低了記憶B細胞。 C)當與媒劑治療的小鼠（26,148個細胞）相比時，使用11.1 mg/kg F27100187劑量（3,270個細胞）、3.72 mg/kg F27100187劑量（2,216個細胞）、1.11 mg/kg F27100187劑量（3,314個細胞）和0.37 mg/kg F27100187劑量（2,559個細胞）降低了漿母細胞。
圖 9 ：F27100187在所有劑量下均顯著降低了NSG小鼠的血漿中的人類第2型關鍵細胞因子IL-2、IL-4、IL-5和IL-10的可檢測水準。當與媒劑治療的小鼠（2.203 pg/ml）相比時，使用11.1 mg/kg F27100187劑量（0.7115 pg/ml）、3.72 mg/kg F27100187劑量（0.689 pg/ml）、1.11 mg/kg F27100187劑量（0.8593 pg/ml）和0.37 mg/kg F27100187劑量（1.659 pg/ml）降低了人類IL-2。當與媒劑治療的小鼠（44.42 pg/ml）相比時，使用11.1 mg/kg F27100187劑量（1.074 pg/ml）、3.72 mg/kg F27100187劑量（7.859 pg/ml）、1.11 mg/kg F27100187劑量（3.920 pg/ml）和0.37 mg/kg F27100187劑量（7.415 pg/ml）降低了人類IL-4。當與媒劑治療的小鼠（14.74 pg/ml）相比時，使用11.1 mg/kg F27100187劑量（0 pg/ml）、3.72 mg/kg F27100187劑量（1.388 pg/ml）、1.11 mg/ kg F27100187劑量（0.6192 pg/ml）和0.37 mg/kg F27100187劑量（0.6517 pg/ml）降低了人類IL-5。當與媒劑治療的小鼠（58.74 pg/ml）相比時，使用11.1 mg/kg F27100187劑量（9.324 pg/ml）、3.72 mg/kg F27100187劑量（10.51 pg/ml）、1.11 mg/kg F27100187劑量（12.94 pg/ml）和0.37 mg/kg F27100187劑量（13.47 pg/ml）降低人類IL-10。
圖 10 ：F27100187在所有劑量下均顯著降低了NSG小鼠的血漿中的人類IgE的可檢測水準。當與媒劑治療的小鼠（383.2 pg/ml）相比時，使用11.1 mg/kg F27100187劑量（0 pg/ml）、3.72 mg/kg F27100187劑量（42.95 pg/ml）、1.11 mg/ kg F27100187劑量（11.55 pg/ml）和0.37 mg/kg F27100187劑量（11.91 pg/ml）降低了人類IgE。
圖 11 ：F27100187顯著降低了NSG-SGM3小鼠的血漿中的人類IL-13、IL-5、TARC和小鼠嗜酸性粒細胞趨化因子的可檢測水準。當與媒劑治療的小鼠（981.7 pg /ml）相比時，使用3.72 mg/kg F27100187劑量（28.94 pg/ml）和1.11 mg/kg F27100187劑量（25.89 pg/ml）降低了人類IL-13。當與媒劑治療的小鼠（1121 pg /ml）相比時，使用3.72 mg/kg F27100187劑量（1.158 pg/ml）和1.11 mg/kg F27100187劑量（1.079 pg/ml）降低了人類IL-5。當與媒劑治療的小鼠（623.9 pg /ml）相比時，使用3.72 mg/kg F27100187劑量（259.7 pg/ml）和1.11 mg/kg F27100187劑量（368.5 pg/ml）降低了人類TARC。當與媒劑治療的小鼠（1107 pg /ml）相比時，使用3.72 mg/kg F27100187劑量（803.2 pg/ml）和1.11 mg/kg F27100187劑量（984.4 pg/ml）降低了小鼠嗜酸性粒細胞趨化因子。
圖 12 ：ISVD構建體F027100187的示意圖，其從N端到C端顯示出經由9GS連接子連接的單價構建塊/ISVD 15B07AM、4B02/1、ALB23002和4B06/1。
圖 13.F27100187顯著降低了在HDM攻毒後的肺嗜酸性粒細胞、BAL IL-5和嗜酸性粒細胞百分比。 A)當與媒劑治療的小鼠（2.37分）相比時，使用5.2 mg/kg F27100187劑量（0.529分）和1.0 mg/kg F27100187劑量（0.585分）降低了肺嗜酸性粒細胞。 B)當與媒劑治療的小鼠（1.798 pg/ml）相比時，使用5.2 mg/kg F27100187劑量（0.4178 pg/ml）和1.0 mg/kg F27100187劑量（0.6825 pg/ml）降低了BAL IL-5。 C)當與媒劑治療的小鼠（14.27%）相比時，使用5.2 mg/kg F27100187劑量（2.897%）和1.0 mg/kg F27100187劑量（2.836%）降低了BAL嗜酸性粒細胞百分比。
圖 14.F27100187顯著減輕了HDM攻毒後的皮膚發炎。當與媒劑治療的小鼠（3.25分）相比時，使用5.2 mg/kg F27100187劑量（2.018分）和1.0 mg/kg F27100187劑量（2.475分）減輕了皮膚發炎。
圖 15.F27100187顯著降低了血清中的IgE水準。當與媒劑治療的小鼠（548.7 pg/ml）相比時，使用5.2 mg/kg F27100187劑量（-1291 pg/ml）和1.0 mg/kg F27100187劑量（-180.2 pg/ml）降低了血清IgE水準。
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無。

Claims (25)

  1. 一種多肽、包含所述多肽的組成物、或包含含有編碼所述多肽的核苷酸序列的核酸的組成物，其中所述多肽包含至少三個免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或由其組成，其中每個所述ISVD一或多個包含三個互補決定區（分別為CDR1至CDR3），視情況地經由一或多個肽連接子所連接；並且其中： a)   第一ISVD與OX40L結合並且包含 i.      具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 6具有2或1個胺基酸差異的CDR1； ii.     具有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 10具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 iii.    具有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 14具有2或1個胺基酸差異的CDR3； b)  第二ISVD與IL-13結合並且包含 iv.    具有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 7具有2或1個胺基酸差異的CDR1； v.     具有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 11具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 vi.    具有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 15具有2或1個胺基酸差異的CDR3；和 c)   第三ISVD與IL-13結合並且包含 vii.   具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 9具有2或1個胺基酸差異的CDR1； viii.  具有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 13具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 ix.    具有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 17具有2或1個胺基酸差異的CDR3。
  2. 如請求項1所述的組成物，所述組成物是醫藥組成物，所述醫藥組成物還包含至少一種醫藥上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑和/或佐劑，並且視情況地包含一或多種其他醫藥活性多肽和/或化合物。
  3. 如請求項1或2所述的多肽或組成物，其中： a)   所述第一ISVD包含具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的CDR3； b)  所述第二ISVD包含具有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR3；並且 c)   所述第三ISVD包含具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列的CDR3。
  4. 如請求項1至3中任一項所述的多肽或組成物，其中： a)   所述第一ISVD的胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 2大於90%的序列同一性； b)  所述第二ISVD的胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 3大於90%的序列同一性；並且 c)   所述第三ISVD的胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 5大於90%同一性的序列同一性。
  5. 如請求項1至4中任一項所述的多肽或組成物，其中： a)   所述第一ISVD具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列； b)  所述第二ISVD具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列；並且 c)   所述第三ISVD具有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列。
  6. 如請求項1至5中任一項所述的多肽或組成物，其中所述多肽還包含任選地經由一或多個肽連接子連接的一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元，其中與沒有所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元的相應多肽相比，所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元為所述多肽提供增加的半衰期。
  7. 如請求項6所述的多肽或組成物，其中為所述多肽提供增加的半衰期的所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元選自聚乙二醇分子、血清蛋白或其片段、可與血清蛋白結合的結合單元、Fc部分以及可與血清蛋白結合的小蛋白或肽。
  8. 如請求項6或7所述的多肽或組成物，其中為所述多肽提供增加的半衰期的所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元選自可與血清白蛋白（如人類血清白蛋白）或血清免疫球蛋白（如IgG）結合的結合單元。
  9. 如請求項8所述的多肽或組成物，其中為所述多肽提供增加的半衰期的所述結合單元是可與人類血清白蛋白結合的ISVD。
  10. 如請求項9所述的多肽或組成物，其中與人類血清白蛋白結合的所述ISVD包含 i.    具有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 8具有2或1個胺基酸差異的CDR1； ii.   具有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 12具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 iii.  具有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 16具有2或1個胺基酸差異的CDR3。
  11. 如請求項9或10所述的多肽或組成物，其中與人類血清白蛋白結合的所述ISVD包含具有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR3。
  12. 如請求項9至11中任一項所述的多肽或組成物，其中與人類血清白蛋白結合的所述ISVD的胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 4大於90%的序列同一性。
  13. 如請求項9至12中任一項所述的多肽或組成物，其中與人類血清白蛋白結合的所述ISVD具有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列。
  14. 如請求項1至13中任一項所述的多肽或組成物，其中所述多肽的胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 1大於90%的序列同一性。
  15. 如請求項1至14中任一項所述的多肽或組成物，其中所述多肽的胺基酸序列具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列。
  16. 如請求項1至15中任一項所述的多肽或組成物，所述多肽或組成物用作藥物。
  17. 如請求項1至15中任一項所述的多肽或組成物，所述多肽或組成物用於治療發炎性疾病，如第2型發炎性疾病。
  18. 如請求項17所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中所述第2型發炎性疾病選自氣喘和/或異位性皮膚炎。
  19. 一種核酸，所述核酸包含編碼如請求項1至18中任一項所述的多肽的核苷酸序列。
  20. 一種宿主或宿主細胞，所述宿主或宿主細胞包含如請求項19所述的核酸。
  21. 一種用於產生如請求項1至18中任一項所述的多肽的方法，所述方法至少包括以下步驟： a)   表現如請求項19所述的核酸；視情況地接著進行： b)  分離和/或純化所述多肽。
  22. 一種組成物，所述組成物包含至少一種如請求項1至18中任一項所述的多肽。
  23. 一種組成物，所述組成物包含如請求項19所述的核酸。
  24. 一種如請求項1至18中任一項所述的多肽或如請求項22中任一項所述的組成物用於製備治療自體免疫性疾病和/或發炎性疾病如第2型發炎性疾病的醫藥組成物中的用途。
  25. 如請求項24所述的多肽或組成物的用途，其中所述第2型發炎性疾病選自氣喘和異位性皮膚炎。
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