CN107739407B - 抗c-MEt的单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了与人c‑Met这种肝细胞生长因子受体结合的分离的单克隆抗体和相关的基于抗体的组合物和分子。还公开了包含该抗体的药物组合物和使用该抗体的治疗与诊断方法。

Description

抗c-MEt的单克隆抗体
本申请是2011年3月10日提交的题为“抗c-MEt的单克隆抗体” 的国家申请号为201180027522.5(PCT/EP2010/053646)的发明专利 申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及针对人c-Met这种肝细胞生长因子受体的单克隆抗 体，并涉及这类抗体的用途，特别是其在癌症治疗中的用途。
背景技术
c-Met是一种跨膜受体酪氨酸激酶蛋白质。最初的单链前体经翻 译后切割产生c-Met异二聚体的成熟形式，所述异二聚体由二硫键连 接的胞外α-链(50kDa)和较长的跨膜β-链(145kDa)组成(Birchmeier 等，2003，Nat Rev Mol Cell Biol 4：915)。c-Met的胞外部分由3种结 构域类型组成。N端SEMA结构域由完整的α-亚基和部分β-亚基构成， 并包括脑信号蛋白的同源物。SEMA结构域后面是富含半胱氨酸的结 构域，再后面是4个免疫球蛋白-(Ig)样结构域。胞质部分含有对下游 信号转导是必不可少的近膜激酶结构域和羧基端尾。c-Met的唯一已 知的高亲和力配体肝细胞生长因子(HGF)在正常条件下主要由成纤维细胞表达(Li和Tseng 1995，J Cell Physiol 163：61)，并由肿瘤细胞表达 (Ferracini等，1995，Oncogene 10：739)。HGF(亦称为分散因子：SF)以 前体合成，该前体经蛋白水解转化成有活性的α/β异二聚体。根据受 体结合片段的晶体结构，认为HGF作为二聚体与c-Met结合(Chirgadze 等，1999，Nat Struct Biol 6：72)。HGF-α链以高亲和力与c-Met中的Ig 样结构域结合，而HGF-β链以低亲和力与c-Met SEMA结构域结合 (Basilico等，2008，J BiolChem 283：21267)。后一互相作用在活性HGF 异二聚体结合时，负责c-Met二聚化和受体酪氨酸激酶活化。受体自 身磷酸化产生用于效应子募集的独特停靠位点，Gab1(生长因子受体 结合蛋白2[Grb2]相关结合物1)与之结合对于以下主要c-Met下游信 号转导途径是必需的(Comoglio等，2008，Nat Rev Drug Discov 7：504)：
●Ras-ERK1/2途径：增殖。
●Ras-Rac途径：侵袭、移动、上皮至间充质转换。
●PI3K-Akt途径：存活。
c-Met在胚胎发生期间和在成年期的许多器官的上皮和内皮细胞 表面上表达，包括肝、胰腺、前列腺、肾、肌肉和骨髓。c-Met活化 在由包括增殖、移动、血管生成和防止细胞凋亡在内的一系列过程组 成的所谓“侵袭性生长”程序中起重要作用(Boccaccio和Comoglio 2006， Nat Rev Cancer 6：637)。这些c-Met调节的过程发生在胚胎发育、肝脏和心脏损伤修复期间的正常生理条件下和肿瘤发生期间的病理情况 下(Eder等，2009，Clin Cancer Res 15：2207)。
不良的c-Met信号转导几乎发生在实体瘤的所有类型以及各种肉 瘤、造血系统恶性肿瘤和黑素瘤中，所述实体瘤例如膀胱癌、乳腺癌、 子宫颈癌、结肠直肠癌、胃癌、头颈癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺 癌、前列腺癌、肾癌和甲状腺癌(Birchmeier等，2003，Nat RevMol Cell Biol 4：915；Comoglio等，2008，Nat Rev Drug Discov 7：504；Peruzzi和Bottaro 2006，Clin Cancer Res 12：3657)。c-Met的致肿瘤性的主要机制 通常以下列3种不同的方式实现：
●自分泌HGF/c-Met环，
●c-Met或HGF过量表达，
●c-Met受体编码序列中激活激酶的突变。
最值得注意的是，在遗传性乳头状肾癌患者中鉴定出激活性 c-Met突变(Schmidt等，1997，Nat Genet 16：68)。c-Met的组成型活化促 成增殖、侵袭、存活或血管生成性癌表型之一或组合。已表明肿瘤细 胞中内源性表达的c-Met的基因沉默导致增殖和肿瘤生长缺乏及已建 立的转移消退，以及新转移的产生减少(Corso等，2008，Oncogene 27：684)。
由于从开始直到向转移进展，c-Met促成癌症发展的多个阶段， 因此c-Met及其配体HGF成为定向癌症疗法的主要候选药物 (Comoglio等，2008，Nat Rev Drug Discov 7：504；Knudsen和Vande Woude 2008，Curr Opin Genet Dev 18：87)。正对若干策略进行探索以达 到该目的：
●诱铒受体：HGF或c-Met或分子类似物的亚区可通过阻断配体 结合或受体二聚化而作为化学计量竞争剂(stochiometric competitor)起 拮抗性作用。HGF的这类拮抗亚区的一个实例是NK4(Kringle Pharma)。
●小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)：在临床评价的不同阶段中，3 种c-Met特异性TKI为ARQ197(ArQule)、JNJ 38877605(Johnson& Johnson)和PF-04217903(Pfizer)。
●抗HGF单克隆抗体，例如AMG102、rilotumumab(Amgen)、 HuL2G7(Takeda)和AV-299(Schering)。
●抗c-Met单克隆抗体描述于WO2005016382、WO2006015371、 WO2007090807、WO2007126799WO2009007427、WO2009142738和 van der Horst等(van der Horst等，2009，Neoplasoa 11：355)。MetMAb (Genentech)是与c-Met的胞外结构域结合从而防止HGF结合和随后的 受体活化的人源化一价(单臂)OA-5D5抗体(Jin等，2008，Cancer Res 68：4360)。在小鼠异种移植模型中，发现用MetMAb治疗抑制HGF驱 动的原位成胶质细胞瘤和皮下胰腺肿瘤的肿瘤生长(Jin等，2008， Cancer Res 68：4360；Martens等，2006，Clin Cancer Res12：6144)。 h224G11(Pierre Fabre)(Corvaia和Boute 2009，摘要835AACR第100 周年年会(AACR 100th Annual Meeting))是人源化二价抗c-Met IgG1 抗体。在小鼠中观察到该抗体的抗肿瘤作用(Goetsch等，2009，摘要 2792，AACR第100周年年会)。CE-355621(Pfizer)是一种人IgG2，在 肿瘤异种移植模型中，通过与c-Met的胞外结构域结合阻断配体结合 并抑制HGF依赖性长生(Tseng等，2008，J Nucl Med 49：129)。
综上所述，对几个抗c-Met产品正在进行研究，但迄今为止，尚 无抗c-Met产品获准用于治疗应用。仍然需要用于治疗严重c-Met相 关疾病(例如癌症)的有效安全的产品。
发明概述
本发明的一个目的是提供用于医药用途的新的高特异性和有效 的单克隆抗c-Met抗体。本发明的抗体具有不同于本领域所述抗体的 c-Met结合性质。在优选的实施方案中，本发明的抗体对人c-Met具 有高亲和力，是拮抗性的，并且具有用于人患者的有利的药代动力学 特征。
附图简述
图1：HuMab重链可变区序列的比对。根据这些序列，可为一些 CDR序列确定共有序列。表4给出这些共有序列。
图2：HuMab轻链可变区序列的比对。根据这些序列，可为一些 CDR序列确定共有序列。表4给出这些共有序列。
图3：抗c-Met抗体的一价和二价形式与表达c-Met的A431细胞 的结合曲线。所示数据为一次代表性实验的MFI。由于IgG1-024和 Uni-068不具有与A431细胞的饱和结合，因此不可能计算精确的EC50值。
图4：抗体与猕猴(Rhesus monkey)上皮细胞中表达的c-Met的结 合。所示数据为一次实验的MFI。
图5：抗c-Met抗体诱导的对HGF与c-Met受体胞外结构域的结 合的抑制。所示数据为一次代表性实验。
图6：针对与cMetSEMA_567His8的结合用TR-FRET测定的各 种抗c-Met抗体的HGF结合抑制曲线。所示数据为3次独立实验的平 均MFI±标准差。
图7：与未处理细胞(0％)相比，在抗c-Met抗体处理后活的KP4 细胞的抑制百分比。所示数据为2次独立实验的活细胞的抑制百分比 ±标准差。在一次实验中IgG1-1016-022仅为阳性。
图8：SCID小鼠KP4异种移植模型中抗c-Met抗体抑制肿瘤生 长的功效。小鼠在第9天用400μg抗体治疗，接着一周一次用200μg 的维持剂量治疗。给出了每个治疗组的肿瘤大小中位值。
图9：SCID小鼠KP4异种移植模型中抗c-Met抗体抑制肿瘤生 长的功效。小鼠在第9天用400μg抗体治疗，接着一周一次用200μg 的维持剂量治疗。治疗随时间对肿瘤发生率的作用。给出了无肿瘤小 鼠的百分比(肿瘤大小＜500mm3)。与对照抗体相比，用拮抗性抗体治 疗的小鼠中，肿瘤形成延迟。
图10：SCID小鼠MKN45异种移植模型中抗c-Met抗体抑制肿 瘤生长的功效。小鼠在第7天用40mg/kg抗体治疗，在第14、21和 28天用20mg/kg抗体治疗。给出了每个治疗组直到50％小鼠达到700 mm3终点的肿瘤大小中位值。
图11：SCID小鼠MKN45异种移植模型中抗c-Met抗体抑制肿 瘤生长的功效。小鼠在第7天用40mg/kg抗体治疗，在第14、21和 28天用20mg/kg抗体治疗。Kaplan Meier图中给出肿瘤大小小于700 mm3的小鼠百分比。与同种型对照抗体相比，用抗c-Met抗体治疗的 小鼠中，肿瘤形成延迟。
图12：测定抗体柔性对激动活性的作用的KP4存活力测定法。 与相同抗体的IgA1和IgG1形式不同，IgA2m(1)形式不诱导增殖。5D5 抗c-Met抗体的变体(参见US6468529和实施例2)用于该实验。
图13：(069)的柔性突变体的非还原SDS-PAGE分析。未观察到 多聚体或降解产物异常，但在C220S、ΔC220和IgG1-铰链IgG3突变 体中可见呈50kD条带的轻链配对((LC)2)。
图14：测量c-Met抗体的铰链突变体的c-Met结合的抗原结合 ELISA。如ELISA所示，所有突变体以不相上下的亲和力与c-Met结 合。
图15：c-Met磷酸化作为抗c-Met抗体的激动活性的读出。图15 表示A549裂解物的蛋白质印迹结果；用抗磷酸化c-met的抗体、抗 总的c-Met的抗体或抗β-肌动蛋白的抗体染色的膜。
图16：用NCI-H441细胞的增殖测定法。在抗体或对照存在下温 育7天后测定细胞质量，并根据非处理样品(设定为100％)的百分比作 图。
图17：KP4存活力测定法。测定抗c-Met的抗体对KP4细胞的 总体存活力的作用。通过引入降低抗体柔性的突变，保持和/或改进 IgG1-1016-069降低KP4的存活力的能力。
图18：采用ELISA在A549裂解物中以总c-Met水平测量的减量 调节。抗体(069)的所有变体保持减量调节能力。
图19：比较高和低岩藻糖形式的抗体IgG1-1016-069的ADCC测 定法。
图20：FACS结合测定法中缺乏c-Met抗体与全血中细胞的结合。 显示了B细胞、单核细胞和粒细胞的结果。
发明详述
定义
术语“c-Met”当用于本文时是指肝细胞生长因子受体(Genbank登 记号NM000245)，包括由细胞天然表达的或在用c-Met基因转染的细 胞中表达的人c-Met的任何变体、同种型和种间同源物。
术语“免疫球蛋白”是指一类结构上相关的糖蛋白，由两对多肽链 组成，一对低分子量轻(L)链和一对重(H)链，所有4条链通过二硫键 相互连接。免疫球蛋白的结构已得到充分表征。参见例如Fundamental Immunology第7章(Paul，W.主编，第2版，Raven Press，N.Y.(1989))。 简单地说，各条重链通常由重链可变区(本文简称为VH或VH)和重链 恒定区组成。重链恒定区通常由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。 各条轻链通常由轻链可变区(本文简称为VL或VL)和轻链恒定区组成。 轻链恒定区通常由1个结构域CL组成。VH和VL区还可进一步再分为 超变区(即在结构上界线清晰的环的序列和/或形式上可以是超变化的 超变区)，亦称互补决定区(CDR)，散布在称为构架区(FR)的更保守的 区中。各VH和VL通常由3个CDR和4个FR组成，按下列顺序自氨 基端至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(另 参见Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196，901-917(1987))。通常，该区 中氨基酸残基的编号按照以下文献所述方法进行：Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版.Public Health Service， National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991)(表述例如如Kabat 中的或按照Kabat的可变结构域残基编号在本文是指该用于重链结构 域或轻链结构域的编号系统)。采用该编号系统，肽的实际线性氨基酸 序列可含有相当于可变结构域FR或CDR的缩短或插入的较少或额外 的氨基酸。例如重链可变结构域在VH CDR2的残基52后可包括单个 氨基酸插入(按照Kabat的残基52a)、在重链FR残基82后可包括插 入的残基(例如按照Kabat的残基82a、82b和82c等)。可通过将给定 抗体的序列同源区与具有“标准”Kabat编号的序列进行比对，来确定 所述抗体的残基的Kabat编号。
在本发明的情况下，术语“抗体”(Ab)是指免疫球蛋白分子、免疫 球蛋白分子的片段或其任一种的衍生物，其具有在典型生理条件下与 抗原特异性结合的能力，具有相当时间的半寿期，例如至少约30分 钟、至少约45分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约4小时、 至少约8小时、至少约12小时、约24小时以上、约48小时以上、 约3、4、5、6、7天或更多天等，或者任何其它相关的功能上明确的 时期(例如足以诱导、促进、提高和/或调节与同抗原结合的抗体有关 的生理反应的时间，和/或足以供抗体募集效应子活性的时间)。免疫球蛋白分子的重链和轻链可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。 抗体(Ab)的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括 免疫系统的各种细胞(例如效应子细胞)和补体系统的组分例如补体活 化经典途径的第一组分C1q。抗c-Met抗体还可以是双特异性抗体、 双链抗体(diabody)或类似分子(关于双链抗体的描述参见例如PNAS USA 90(14)，6444-8(1993))。实际上，本发明提供的双特异性抗体、 双链抗体等可结合除c-Met的一部分以外的任何合适的靶标。如上所 述，除非另有说明或与文中显然抵触，否则本文的术语抗体包括保持 与抗原特异性结合的能力的抗体片段。已经表明，可由全长抗体的片段执行抗体的抗原结合功能。包括在术语“抗体”内的结合片段的实例 包括(i)Fab’或Fab片段，一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的一 价片段，或描述于WO2007059782(Genmab)中的一价抗体；(ii)F(ab′)2片段，包含通过铰链区上的二硫桥连接的2个Fab片段的二价片段；(iii)基本上由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)基本上由抗体单臂 的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等，Nature 341， 544-546(1989))，其基本上由VH结构域组成，亦称结构域抗体(Holt 等，Trends Biotechnol.2003年11月；21(11)：484-90)；(vi)骆驼抗体或 纳米抗体(camelid或nanobodies)(Revets等；Expert Opin Biol Ther. 2005年1月；5(1)：111-24)和(vii)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽 然Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但可采用重组 方法，通过能够使它们成为单条蛋白质链的合成接头将其连接，其中 VL和VH区对形成一价分子(称为单链抗体或单链Fv(scFv)，参见例如 Bird等，Science 242，423-426(1988)和Huston等，PNAS USA 85， 5879-5883(1988))。这类单链抗体包括在术语抗体内，除非另有说明 或与文中显然抵触。虽然这类片段一般包括在抗体的含义内，但它们 总体上且各自独立地是本发明的特色，具有不同的生物学性质和用 途。本文还进一步论述了在本发明的情况下的这些和其它有用的抗体 片段。还应了解的是，除非另有说明，否则术语抗体还包括通过任何 已知技术例如酶促切割、肽合成和重组技术提供的多克隆抗体、单克 隆抗体(mAb)、抗体样多肽例如嵌合抗体和人源化抗体及保持与抗原特异性结合的能力的抗体片段(抗原结合片段)。如此产生的抗体可具 有任何同种型。
本文所用“同种型”是指由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白类 别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM)。
在本发明的情况下，术语“一价抗体”意指能够结合单个抗原分 子、因此不能够抗原交联的抗体分子。
“缺乏效应子功能的抗体”或“效应子功能缺陷型抗体”是指激活一 种或多种效应子机制(例如补体活化或Fc受体结合)的能力显著降低或 无激活能力的抗体。因此，效应子功能缺陷型抗体介导依赖抗体的细 胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或依赖补体的细胞毒性(CDC)的能力显 著降低或无介导能力。这类抗体的实例是IgG4。
“抗c-Met抗体”是与抗原c-Met特异性结合的上述抗体。
本文所用术语“人抗体”欲包括具有来源于人种系免疫球蛋白序 列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包括不是由人种系免 疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机诱变或位点专一 诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，本文所用术语“人 抗体”无意包括其中来源于另一哺乳动物物种(例如小鼠)种系的CDR 序列被移植入人构架序列中的抗体。
如果抗体获自使用人免疫球蛋白序列的系统，例如通过免疫携带 人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或通过筛选人免疫球蛋白基因文库， 且其中所选择的人抗体与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列 有至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至 少98％或例如至少99％氨基酸序列同一性，则本文所用人抗体“来源 于”特定种系序列。通常，除重链CDR3外，来源于特定的人种系序 列的人抗体与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列的差异将不 超过20个氨基酸，例如不超过10个氨基酸，例如不超过9、8、7、6 或5个、例如不超过4、3、2或1个氨基酸。
在一个优选的实施方案中，分离出本发明的抗体。本文所用“分 离抗体”欲指基本不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如与 c-Met特异性结合的分离抗体基本不含特异性结合非c-Met的抗原的 抗体)。然而，与人c-Met的表位、同种型或变体特异性结合的分离抗 体可与例如来自其它物种的其它相关抗原(例如c-Met种间同源物)具 有交叉反应性。此外，分离抗体可基本不含其它细胞物质和/或化学物 质。在本发明的一个实施方案中，两个或更多个具有不同抗原结合特 异性的“分离的”单克隆抗体以明确的组成结合在一起。
当在本文中在两种或更多种抗体的情况下使用时，术语“与...... 竞争”或“与......交叉竞争”表明两种或更多种抗体竞争结合c-Met，例 如在本文实施例中描述的测定法中竞争c-Met结合。对于某些抗体对， 当将一种抗体包覆在板上，另一抗体用来竞争时，才观察到实施例测 定法中的竞争，反之则不然。术语“与......竞争”当用于本文时还欲包 括这类组合抗体(combinations antibody)。
术语“表位”意指能够与抗体特异性结合的蛋白质决定簇。表位通 常由表面集合的分子(例如氨基酸或糖侧链)组成，通常具有特定的三 维结构特征以及特定的电荷特性。分辨得出构象和非构象表位，因为 在变性溶剂存在时，与前者的结合而非与后者的结合丧失。表位可包 含直接参与结合的氨基酸残基(亦称为表位的免疫显性组分)和不直接 参与结合的其它氨基酸残基，例如被特异性抗原结合肽有效封闭的氨 基酸残基(换句话说，氨基酸残基位于特异性抗原结合肽的覆盖区 (footprint)内)。
本文所用术语“单克隆抗体”是指具有单一分子组成的抗体分子 的制备物。单克隆抗体组合物对特定表位具有单一的结合特异性和亲 和力。因此，术语“人单克隆抗体”是指具有来源于人种系免疫球蛋白 序列的可变区和恒定区的具有单一结合特异性的抗体。人单克隆抗体 可由杂交瘤产生，所述杂交瘤包括与永生化细胞融合的、获自具有包 含人重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因或转染色体非人动 物(例如转基因小鼠)的B细胞。
在抗体与预定抗原结合的情况下，本文所用术语“结合”通常是这 样的结合，即在使用抗原作为配体，抗体作为分析物，通过例如表面 等离振子共振(SPR)技术在BIAcore3000仪器中测定时，其亲和力相 当于约10-7M或更低、例如约10-8M或更低、例如约10-9M或更低、 约10-10M或更低或约10-11M或甚至更低的KD，且与所述预定抗原结 合的亲和力相当于以下KD，其是所述抗体与并非预定抗原的非特异性 抗原(例如BSA、酪蛋白)或密切相关的抗原结合的亲和力的KD的至多1/10、例如至多1/100、例如至多1/1,000、例如至多1/10,000、例如至 多1/100,000。亲和力较低时的量取决于抗体的KD，使得如果抗体的 KD非常低(即抗体是高特异性的)，则对抗原的亲和力小于对非特异性 抗原的亲和力时的量可为至少10,000倍。
本文所用术语“kd”(sec-1)是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率 常数。所述值亦称为koff值。
本文所用术语“ka”(M-1x sec-1)是指特定抗体-抗原相互作用的缔 合速率常数。
本文所用术语“KD”(M)是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡 常数。
本文所用术语“KA”(M-1)是指特定抗体-抗原相互作用的缔合平衡 常，通过ka除以kd求得。
本文所用术语“抑制生长”(例如涉及细胞，例如肿瘤细胞)欲包括 与不与抗c-Met抗体接触的相同细胞的生长相比，当与抗c-Met抗体 接触时任何可测量的细胞生长的降低，例如抑制细胞培养物的生长达 至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％ 或100％。可通过各种机制，例如效应子细胞吞噬作用、ADCC、CDC 和/或细胞凋亡，来产生这类细胞生长的降低。
本发明还提供包含实施例抗体的VL区、VH区或一个或多个CDR 的功能变体的抗体。在抗c-Met抗体情形中使用的VL、VH或CDR的 功能变体仍允许抗体保持至少相当比例(至少约50％、60％、70％、80％、 90％、95％或更高)的亲本抗体的亲和力/亲合力和/或特异性/选择性， 在某些情况下，这类抗c-Met抗体可以比亲本抗体大的亲和力、选择 性和/或特异性缔合。
这类功能变体通常保持与亲本抗体显著的序列同一性。2个序列 间的同一性百分比是序列所共同的相同位置数的函数(即％同源性＝相 同位置数/位置总数x 100)，其要考虑空位数和各空位的长度，所述空 位需要被引入以用于2个序列的最佳比对。可通过例如应用整合至ALIGN程序(2.0版)的算法(E.Meyers和W.Miller，Comput.Appl. Biosci 4，11-17(1988))，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的空位长度罚分和4的空位罚分，来确定2个核苷酸或氨 基酸序列之间的同一性百分比。另外，可应用Needleman和Wunsch， J.Mol.Biol.48，444-453(1970)算法，确定2个氨基酸序列之间的同 一性百分比。
CDR变体的序列可不同于亲本抗体序列CDR的序列，虽然大部 分为保守取代；例如变体中至少10个，例如至少9、8、7、6、5、4、 3、2或1个取代是保守氨基酸残基置换。
在本发明的情况下，保守取代可定义为下表中所反映的氨基酸类 别内的取代：
保守取代的氨基酸残基类别
Figure BDA0001367921440000121
本文所用术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)欲指已将表 达载体导入其中的细胞，例如编码本发明抗体的表达载体。重组宿主 细胞包括例如转染瘤，例如CHO细胞、HEK293细胞、NS/0细胞和 淋巴细胞。
术语“转基因非人动物”是指具有包含一个或多个人重链和/或轻 链转基因或转染色体(整合或未整合至动物天然基因组DNA)且能够表 达完全人抗体的基因组的非人动物。例如，转基因小鼠可具有人轻链 转基因和人重链转基因或人重链转染色体，使得当用c-Met抗原和/ 或表达c-Met的细胞免疫时，小鼠产生人抗c-Met抗体。可将人重链 转基因整合至小鼠染色体DNA中，如转基因小鼠的情况，例如HuMAb 小鼠，例如HCo7或HCo12小鼠，或者可将人重链转基因保持在染色 体外，如WO02/43478中描述的转染色体KM小鼠的情况。具有较大 人Ab基因库的类似小鼠包括HCo7和HCo20(参见例如 WO2009097006)。这类转基因和转染色体小鼠(本文统称为“转基因小 鼠”)能够通过进行V-D-J重组和同种型转换，产生多个抗指定抗原的 人单克隆抗体同种型(例如IgG、IgA、IgM、IgD和/或IgE)。还可通 过引入编码抗特定抗原的抗体的基因，例如通过将所述基因与在动物 乳中表达的基因有效连接，使用转基因非人动物产生这类特定抗体。
“治疗”是指给予有效量的本发明的治疗活性化合物，其目的在于 减轻、改善、抑制或根除(治愈)症状或疾病状态。
“有效量”是指以所必需的剂量和持续时间对达到所需治疗结果有 效的量。抗c-Met抗体的治疗有效量可随例如个体的疾病状态、年龄、 性别和体重等因素和抗c-Met抗体在个体中诱导所需反应的能力而变 化。治疗有效量也是其中抗体或抗体部分的治疗有益作用超过任何有 毒或有害作用的量。
“抗独特型”抗体是识别一般与抗体的抗原结合部位相关的独特 决定簇的抗体。
本发明的其它方面和实施方案
如上所述，第一方面，本发明涉及结合人c-Met的单克隆抗体。
本发明的单克隆抗体可通过例如最早由Kohler等人(Nature 256， 495(1975))描述的杂交瘤方法产生，或者可通过重组DNA方法产生。 还可采用描述于例如Clackson等，Nature 352，624-628(1991)和Marks 等，J.Mol.Biol.222，581-597(1991)的技术，从噬菌体抗体文库中分 离单克隆抗体。单克隆抗体可获自任何合适来源。因此，例如单克隆 抗体可获自杂交瘤，所述杂交瘤自获自用目标抗原(例如以在表面上表 达抗原的细胞或编码目标抗原的核酸的形式)免疫的小鼠的鼠脾B细 胞制备。单克隆抗体还可获自来源于经免疫的人或非人哺乳动物(例如 大鼠、狗、灵长类动物等)的抗体表达细胞的杂交瘤。
在一个实施方案中，本发明的抗体是人抗体。可使用携带人免疫 系统而非小鼠系统的组成部分的转基因或转染色体小鼠产生针对 c-Met的人单克隆抗体。这类转基因和转染色体小鼠包括在本文分别 称为HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，本文统称为“转基因小鼠”。
HuMAb小鼠含有人免疫球蛋白基因小基因座(miniloci)，其编码 非重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列连同使内源μ和κ链 基因座失活的靶定突变(Lonberg，N.等，Nature 368，856-859(1994))。 因此，小鼠具有降低的小鼠IgM或κ表达，且在响应免疫时，所引入 的人重链和轻链转基因进行类别转换和体细胞突变以产生高亲和力 人IgG，κ单克隆抗体(Lonberg，N.等(1994)，同上；有关综述见Lonberg， N.Handbook ofExperimental Pharmacology 113，49-101(1994)； Lonberg，N.和Huszar，D.，Intern.Rev.Immunol.第13卷65-93(1995) 及Harding，F.和Lonberg，N.Ann.N.Y.Acad.Sci764536-546(1995))。 HuMAb小鼠的制备详细描述于Taylor，L.等，Nucleic AcidsResearch 20， 6287-6295(1992)；Chen，J.等，International Immunology 5，647-656(1993)；Tuaillon等，J.Immunol.152，2912-2920(1994)；Taylor，L.等， InternationalImmunology 6，579-591(1994)；Fishwild，D.等，Nature Biotechnology 14，845-851(1996)。另参见US 5,545,806、US 5,569,825、 US 5,625,126、US 5,633,425、US 5,789,650、US 5,877,397、US 5,661,016、US 5,814,318、US 5,874,299、US 5,770,429、US 5,545,807、 WO 98/24884、WO 94/25585、WO 93/1227、WO 92/22645、WO 92/03918和WO 01/09187。
HCo7小鼠在其内源轻链(κ)基因具有JKD破坏(参见Chen等， EMBO J.12，821-830(1993))，在其内源重链基因中具有CMD破坏(参 见WO 01/14424的实施例1)，具有KCo5人κ轻链转基因(参见Fishwild 等，Nature Biotechnology 14，845-851(1996))并具有HCo7人重链转基 因(参见US 5,770,429)。
HCo12小鼠在其内源轻链(κ)基因中具有JKD破坏(参见Chen等，EMBO J.12，821-830(1993))，在其内源重链基因中具有CMD破坏(参 见WO 01/14424的实施例1)，具有KCo5人κ轻链转基因(参见Fishwild 等，Nature Biotechnology 14，845-851(1996))并具有HCo12人重链转 基因(参见WO 01/14424的实施例2)。
在KM小鼠品系中，内源小鼠κ轻链基因被纯合破坏(参见Chen 等，EMBO J.12，811-820(1993))，内源小鼠重链基因被纯合破坏(参见 WO 0I/09187的实施例1)。该小鼠品系携带人κ轻链转基因KCo5(参 见Fishwild等，Nature Biotechnology 14，845-851(1996))。该小鼠品系 还携带由染色体14片段hCF(SC20)组成的人重链转染色体(参见 WO 02/43478)。
可按照众所周知的技术，使用得自这些转基因小鼠的脾细胞产生 分泌人单克隆抗体的杂交瘤。
此外，可采用本领域众所周知的技术，通过展示型技术，包括而 不限于噬菌体展示、反转录病毒展示、核糖体展示和其它技术，来鉴 定本发明的人抗体或得自其它物种的本发明抗体，并可对所得分子进 行另外的成熟，例如亲和力成熟，因为这类技术是本领域众所周知的 (参见例如Hoogenboom等，J.Mol.Biol.227，381(1991)(噬菌体展示)；Vaughan等，Nature Biotech 14，309(1996)(噬菌体展示)；Hanes和 Plucthau，PNAS USA94，4937-4942(1997)(核糖体展示)；Parmley和 Smith，Gene 73，305-318(1988)(噬菌体展示)；Scott TIBS 17，241-245 (1992)；Cwirla等，PNAS USA 87，6378-6382(1990)；Russel等，Nucl. Acids Research 21，1081-1085(1993)；Hogenboom等，Immunol. Reviews 130，43-68(1992)；Chiswell和McCafferty TIBTECH 10，80-84 (1992)和US 5,733,743)。如果利用展示技术产生不是人的抗体，则可 将这类抗体人源化。
在一个实施方案中，本发明的抗体是同种型IgG1、IgG2、IgG3、 IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM。
在本发明抗体的第一个主要实施方案中，抗体与固定化抗体竞争 结合可溶性cMetECDHis，其中所述固定化抗体含有包含SEQ ID NO：33的序列的VH区和包含SEQ ID NO：37的序列的VL区(024)， 优选其中在按实施例17中所述测定时，所述抗体与所述固定化抗体 的竞争超过50％，例如超过75％。
在又一个实施方案中，抗体不与选自以下的抗体竞争结合可溶性 cMetECDHis：
a)含有包含SEQ ID NO：1的序列的VH区和包含SEQ ID NO：5 的序列的VL区的固定化抗体(005)
b)含有包含SEQ ID NO：17的序列的VH区和包含SEQ ID NO：21 的序列的VL区的固定化抗体(008)
c)包含的抗体5D5的VH区和VL区的固定化抗体，和
d)含有包含SEQ ID NO：49的序列的VH区和包含SEQ ID NO：53 的序列的VL区的固定化抗体(045)，
优选其中在按实施例17中所述测定时，所述抗体与所述固定化抗体 的竞争小于25％，例如小于20％。
在又一个实施方案中，抗体与选自以下的抗体结合相同的表位：
a)含有包含SEQ ID NO：33的序列的VH区和包含SEQ ID NO：37 的序列的VL区的抗体(024)
b)含有包含SEQ ID NO：65的序列的VH区和包含SEQ ID NO：69 的序列的VL区的抗体(061)
c)含有包含SEQ ID NO：73的序列的VH区和包含SEQ ID NO：77 的序列的VL区的抗体(062)
d)含有包含SEQ ID NO：81的序列的VH区和包含SEQ ID NO：85 的序列的VL区的抗体(064)
e)含有包含SEQ ID NO：89的序列的VH区和包含SEQ ID NO：93 的序列的VL区的抗体(068)
f)含有包含SEQ ID NO：97的序列的VH区和包含SEQ ID NO：101的序列的VL区的抗体(069)
g)含有包含SEQ ID NO：113的序列的VH区和包含SEQ ID NO：117的序列的VL区的抗体(098)
h)含有包含SEQ ID NO：121的序列的VH区和包含SEQ ID NO：125的序列的VL区的抗体(101)，和
i)含有包含SEQ ID NO：129的序列的VH区和包含SEQ ID NO：133的序列的VL区的抗体(181)。
在又一个实施方案中，抗体包含具有下列所示序列的VH CDR3 区
a)SEQ ID NO：36(024)
b)SEQ ID NO：193，例如SEQ ID NO：68、76、84或92所示的 VH CDR3区(061、062、064、068)
c)SEQ ID NO：196，例如如SEQ ID NO：100或132所示的VH CDR3区(069、181)
d)SEQ ID NO：116(098)，或
e)SEQ ID NO：201，例如如SEQ ID NO：124所示的VH CDR3区 (101)。
在又一个实施方案中，抗体含有：
a)包含SEQ ID NO：34、185和36的CDR1、2和3序列的VH 区和包含SEQ ID NO：38、39和206的CDR1、2和3序列的VL区， 例如含有包含SEQ ID NO：34、35和36的CDR1、2和3序列的VH 区和包含SEQ ID NO：38、39和40的CDR1、2和3序列的VL区的 抗体，(024)
b)包含SEQ ID NO：191、192和193的CDR1、2和3序列的VH 区和包含SEQ ID NO：78、79和208的CDR1、2和3序列的VL区， 例如含有以下的抗体：
a.包含SEQ ID NO：66、67和68的CDR1、2和3序列的VH 区和包含SEQ ID NO：70、71和72的CDR1、2和3序列的VL区(061)
b.包含SEQ ID NO：74、75和76的CDR1、2和3序列的VH 区和包含SEQ ID NO：78、79和80的CDR1、2和3序列的VL区， (062)
c.包含SEQ ID NO：82、83和84的CDR1、2和3序列的VH 区和包含SEQ ID NO：86、87和88的CDR1、2和3序列的VL区， (064)，或
d.包含SEQ ID NO：90、91和92的CDR1、2和3序列的VH 区和包含SEQ ID NO：94、95和96的CDR1、2和3序列的VL区， (068)
c)包含SEQ ID NO：194、195和196的CDR1、2和3序列的VH 区和包含SEQ ID NO：209、210和104的CDR1、2和3序列的VL区， 例如含有以下的抗体：
a.包含SEQ ID NO：98、99和100的CDR1、2和3序列的VH 区和包含SEQ ID NO：102、103和104的CDR1、2和3序列的VL区， (069)，或
b.包含SEQ ID NO：130、131和132的CDR1、2和3序列的 VH区和包含SEQ ID NO：134、135和136的CDR1、2和3序列的VL 区，(181)
d)包含SEQ ID NO：197、198和116的CDR1、2和3序列的VH 区和包含SEQ ID NO：118、119和211的CDR1、2和3序列的VL区， 例如含有包含SEQ ID NO：114、115和116的CDR1、2和3序列的 VH区和包含SEQ ID NO：118、119和120的CDR1、2和3序列的VL 区的抗体(098)，或
e)包含SEQ ID NO：199、200和201的CDR1、2和3序列的VH 区和包含SEQ ID NO：126、212和128的CDR1、2和3序列的VL 区，例如含有包含SEQ ID NO：122、123和124的CDR1、2和3序列 的VH区和包含SEQ ID NO：126、127和128的CDR1、2和3序列的 VL区的抗体(101)。
在又一个实施方案中，抗体含有：
a)包含SEQ ID NO：33的序列的VH区和优选包含SEQ ID NO：37 的序列的VL区(024)
b)包含SEQ ID NO：61的序列的VH区和优选包含SEQ ID NO：69 的序列的VL区(061)
c)包含SEQ ID NO：73的序列的VH区和优选包含SEQ ID NO：77 的序列的VL区(062)
d)包含SEQ ID NO：81的序列的VH区和优选包含SEQ ID NO：85 的序列的VL区(064)
e)包含SEQ ID NO：89的序列的VH区和优选包含SEQ ID NO：93 的序列的VL区(068)
f)包含SEQ ID NO：97的序列的VH区和优选包含SEQ ID NO：101的序列的VL区(069)
g)包含SEQ ID NO：113的序列的VH区和优选包含SEQ ID NO：117的序列的VL区(098)
h)包含SEQ ID NO：121的序列的VH区和优选包含SEQ ID NO：125的序列的VL区(101)
i)包含SEQ ID NO：129的序列的VH区和优选包含SEQ ID NO：133的序列的VL区(181)
j)包含SEQ ID NO：159的序列的VH区和优选包含SEQ ID NO：160的序列的VL区(078)
k)包含SEQ ID NO：161的序列的VH区和优选包含SEQ ID NO：162的序列的VL区(084)
1)包含SEQ ID NO：163的序列的VH区和优选包含SEQ ID NO：164的序列的VL区(063)
m)包含SEQ ID NO：165的序列的VH区和优选包含SEQ ID NO：166的序列的VL区(087)
n)包含SEQ ID NO：137的序列的VH区和优选包含SEQ ID NO：138的序列的VL区(066)
o)包含SEQ ID NO：139的序列的VH区和优选包含SEQ ID NO：140的序列的VL区(065)
p)包含SEQ ID NO：141的序列的VH区和优选包含SEQ ID NO：142的序列的VL区(082)
q)包含SEQ ID NO：143的序列的VH区和优选包含SEQ ID NO：144的序列的VL区(089)，或
r)任何所述抗体的变体，其中所述变体在所述序列中优选具有 至多1、2或3个氨基酸修饰、更优选氨基酸取代，例如保守氨基酸 取代。
在一个实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO：100的CDR3序列 的VH区和包含SEQID NO：104的CDR3序列的VL区，(069)。
在一个实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO：98、99和100的 CDR1、2和3序列的VH区和包含SEQ ID NO：102、103和104的 CDR1、2和3序列的VL区，(069)。
在一个实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO：97的序列的VH 区和包含SEQ IDNO：101的序列的VL区(069)。
在本发明抗体的另一个主要实施方案中：
-抗体与固定化抗体竞争结合可溶性cMetECDHis，其中所述固 定化抗体含有包含SEQ ID NO：9的序列的VH区和包含SEQ ID NO：13 的序列的VL区(006)，优选其中在按实施例17中所述测定时，所述 抗体与所述固定化抗体的竞争超过50％，例如超过75％，
和
-抗体不与固定化抗体竞争结合可溶性cMetECDHis，所述固定 化抗体含有包含SEQ ID NO：49的序列的VH区和包含SEQ ID NO：53 的序列的VL区(045)，优选其中在按实施例17中所述测定时，所述 抗体与所述固定化抗体的竞争小于50％、例如小于25％、例如小于 20％，
和
-抗体与c-Met的SEMA结构域结合，优选其中所述抗体能够抑 制HGF与SEMA结构域结合，其IC50小于10μg/mL，例如小于2 μg/mL，如实施例9所述。
在又一个实施方案中，抗体不与固定化抗体竞争结合可溶性 cMetECDHis，所述固定化抗体含有包含SEQ ID NO：33的序列的VH 区和包含SEQ ID NO：37的序列的VL区(024)，优选其中在按实施例 17中所述测定时，所述抗体与所述固定化抗体的竞争小于25％、例如小于20％。
在又一个实施方案中，抗体与选自以下的抗体结合相同的表位：
a)含有包含SEQ ID NO：1的序列的VH区和包含SEQ ID NO：5 的序列的VL区的抗体(005)
b)含有包含SEQ ID NO：9的序列的VH区和包含SEQ ID NO：13 的序列的VL区的抗体(006)
c)含有包含SEQ ID NO：25的序列的VH区和包含SEQ ID NO：29 的序列的VL区的抗体(022)，和
d)含有包含SEQ ID NO：57的序列的VH区和包含SEQ ID NO：61 的序列的VL区的抗体(058)。
在又一个实施方案中，抗体包含具有下列所示序列的VH CDR3 区：
a)SEQ ID NO：181，例如SEQ ID NO：4或12中所示的VH CDR3 区(005、006)
b)SEQ ID NO：28(022)，或
c)SEQ ID NO：60(058)。
在又一个实施方案中，抗体含有：
a)包含SEQ ID NO：179、180和181的CDR1、2和3序列的VH 区和包含SEQ ID NO：6、7和202的CDR1、2和3序列的VL区，例 如含有以下的抗体：
a.包含SEQ ID NO：2、3和4的CDR1、2和3序列的VH区和 包含SEQ ID NO：6、7和8的CDR1、2和3序列的VL区，(005)，或
b.包含SEQ ID NO：10、11和12的CDR1、2和3序列的VH 区和包含SEQ ID NO：14、15和16的CDR1、2和3序列的VL区， (006)
b)包含SEQ ID NO：26、184和28的CDR1、2和3序列的VH 区和包含SEQ ID NO：30、31和205的CDR1、2和3序列的VL区， 例如含有包含SEQ ID NO：26、27和28的CDR1、2和3序列的VH 区和包含SEQ ID NO：30、31和32的CDR1、2和3序列的VL区的 抗体(022)，或
c)包含SEQ ID NO：189、190和60的CDR1、2和3序列的VH 区和包含SEQ ID NO：62、63和207的CDR1、2和3序列的VL区， 例如含有包含SEQ ID NO：58、59和60的CDR1、2和3序列的VH 区和包含SEQ ID NO：62，63和64的CDR1、2和3序列的VL区的 抗体(058)。
在甚至又一个实施方案中，抗体包含：
a)包含SEQ ID NO：1的序列的VH区和优选包含SEQ ID NO：5 的序列的VL区(005)
b)包含SEQ ID NO：9的序列的VH区和优选包含SEQ ID NO：13 的序列的VL区(006)
c)包含SEQ ID NO：25的序列的VH区和优选包含SEQ ID NO：29 的序列的VL区(022)
d)包含SEQ ID NO：57的序列的VH区和优选包含SEQ ID NO：61 的序列的VL区(058)
e)包含SEQ ID NO：145的序列的VH区和优选包含SEQ ID NO：146的序列的VL区(031)
f)包含SEQ ID NO：147的序列的VH区和优选包含SEQ ID NO：148的序列的VL区(007)
g)包含SEQ ID NO：149的序列的VH区和优选包含SEQ ID NO：150的序列的VL区(011)
h)包含SEQ ID NO：151的序列的VH区和优选包含SEQ ID NO：152的序列的VL区(017)
i)包含SEQ ID NO：153的序列的VH区和优选包含SEQ ID NO：154的序列的VL区(025)，或
j)所述抗体中的任一种的变体，其中所述变体在所述序列中优选 具有至多1、2或3个氨基酸修饰、更优选氨基酸取代，例如保守氨 基酸取代。
在本发明抗体的另一个主要实施方案中：
-抗体与固定化抗体竞争结合可溶性cMetECDHis，其中所述固 定化抗体含有包含SEQ ID NO：49的序列的VH区和包含SEQ ID NO：53的序列的VL区(045)，优选其中在按实施例17中所述测定时， 所述抗体与所述固定化抗体的竞争超过50％，例如超过75％，
和
-抗体不与固定化抗体竞争结合可溶性cMetECDHis，其中所述 固定化抗体含有包含SEQ ID NO：9的序列的VH区和包含SEQ ID NO：13的序列的VL区(006)，优选其中在按实施例17中所述测定时， 所述抗体与所述固定化抗体的竞争小于25％，例如小于20％。
在又一个实施方案中，抗体不与选自以下的抗体竞争结合可溶性 cMetECDHis：
a)含有包含SEQ ID NO：17的序列的VH区和包含SEQ ID NO：21 的序列的VL区的固定化抗体(008)，和
b)含有包含SEQ ID NO：33的序列的VH区和包含SEQ ID NO：37 的序列的VL区的固定化抗体(024)，
优选其中在按实施例17中所述测定时，所述抗体与所述固定化抗体 的竞争小于25％，例如小于20％。
在又一个实施方案中，抗体与含有包含SEQ ID NO：49的序列的 VH区和包含SEQID NO：53的序列的VL区的抗体(045)结合相同的表 位。
在又一个实施方案中，抗体含有具有如SEQ ID NO：188所示序列 的VH CDR3区，例如如SEQ ID NO：52所示的VH CDR3区(045)。
在又一个实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO：186、187和188 的CDR1、2和3序列的VH区和包含SEQ ID NO：54、55和56的CDR1、 2和3序列的VL区，例如含有包含SEQ ID NO：50、51和52的CDR1、 2和3序列的VH区和包含SEQ ID NO：54、55和56的CDR1、2和3 序列的VL区的抗体(045)。
在又一个实施方案中，抗体包含：
a)包含SEQ ID NO：49的序列的VH区和优选包含SEQ ID NO：53 的序列的VL区(045)
b)包含SEQ ID NO：155的序列的VH区和优选包含SEQ ID NO：156的序列的VL区(040)
c)包含SEQ ID NO：157的序列的VH区和优选包含SEQ ID NO：158的序列的VL区(039)，或
d)所述抗体中的任一种的变体，其中所述变体在所述序列中优 选具有至多1、2或3个氨基酸修饰、更优选氨基酸取代，例如保守 氨基酸取代。
在又一个实施方案中，抗体与c-Met的SEMA结构域结合，优选 其中所述抗体能够抑制HGF与SEMA结构域结合，其IC50小于10 μg/mL，例如小于2μg/mL，如实施例9所述。
在本发明抗体的另一个主要实施方案中，抗体与含有包含SEQ ID NO：17的序列的VH区和包含SEQ ID NO：21的序列的VL区的抗体 (008)结合相同的表位，或者与含有包含SEQ ID NO：41的序列的VH 区和包含SEQ ID NO：45的序列的VL区的抗体(035)结合相同的表位， 或者与含有包含SEQ ID NO：105的序列的VH区和包含SEQ ID NO：109的序列的VL区的抗体(096)结合相同的表位。
在又一个实施方案中，抗体包含具有SEQ ID NO：183所示序列的VH CDR3区，例如SEQ ID NO：20、44或108所示VH CDR3区(008、 035、096)。
在又一个实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO：18、182和183 的CDR1、2和3序列的VH区和包含SEQ ID NO：22、203和204的 CDR1、2和3序列的VL区，例如含有以下的抗体：
a)包含SEQ ID NO：18、19和20的CDR1、2和3序列的VH区 和包含SEQ ID NO：22、23和24的CDR1、2和3序列的VL区， (008)，或
b)包含SEQ ID NO：42、43和44的CDR1、2和3序列的VH区 和包含SEQ ID NO：46、47和48的CDR1、2和3序列的VL区， (035)，或
c)包含SEQ ID NO：106、107和108的CDR1、2和3序列的VH 区和包含SEQ ID NO：110、111和112的CDR1、2和3序列的VL区 (096)。
在又一个实施方案中，抗体含有：
a)包含SEQ ID NO：17的序列的VH区和优选包含SEQ ID NO：21 的序列的VL区(008)
b)包含SEQ ID NO：41的序列的VH区和优选包含SEQ ID NO：45 的序列的VL区(035)
c)包含SEQ ID NO：105的序列的VH区和优选包含SEQ ID NO：109的序列的VL区(096)
或
d)所述抗体中的任一种的变体，其中所述变体在所述序列中优 选具有至多1、2或3个氨基酸修饰、更优选氨基酸取代，例如保守 氨基酸取代。
在又一个实施方案中，抗体与A431细胞结合，优选按照实施例 13测定时，其EC50为10nM或更低，例如EC50为2nM或更低。
在甚至又一个实施方案中，抗体与c-Met结合，优选按照实施例14测定时，其亲和力常数(KD)为20nM或更低，例如亲和力为5nM 或更低。
在甚至又一个实施方案中，抗体与猕猴c-Met结合，优选其中按 照实施例15测定时，所述抗体与猕猴c-Met结合的信号是阴性对照抗 体的至少5倍。
在甚至又一个实施方案中，抗体抑制HGF与c-Met的胞外结构 域结合，优选其中按照实施例16测定时，所述抗体抑制结合超过40％、 例如超过50％、例如超过60％、例如超过70％、例如超过80％、例如 超过90％。
在甚至再一个实施方案中，抗体能够抑制KP4细胞的存活力，优 选其中优选按照实施例19所述，所述抗体能够抑制超过10％、例如 超过25％、例如超过40％的存活力。
抗体形式
本发明提供拮抗性和非拮抗性抗c-Met抗体。虽然一些抗体不论 是一价还是二价对靶细胞都起拮抗作用，但对于其它抗体，功能作用 取决于化合价(valency)。如本文实施例19所示，例如抗体024、062、 064、068、069、098、101、181(其均在同一个交叉阻断组中，参见 实施例17)不论形式，在KP4存活力测定法中均具有拮抗性质。另一 方面，抗体022和058，在该测定法中在呈一价形式时表现出拮抗性， 但在呈二价形式时表现出激动性(或至少非拮抗性)。因此，根据对特 定用途的所需功能性质，可从本发明提供的抗体组中选出特定抗体和 /或可对其形式作改动以改变化合价。
此外，本发明的抗体可以是任何同种型。同种型的选择通常将受 所需效应子功能(例如ADCC诱导)指导。示例性的同种型为IgG1、 IgG2、IgG3和IgG4。可以使用人轻链恒定区κ或λ的任一个。如有 需要，本发明的抗c-Met抗体的类别可通过已知方法转换。例如，最 初是IgM的本发明抗体可类别转换成本发明的IgG抗体。此外，可采 用类别转换技术将一种IgG亚类转换为另一种，例如自IgG1转换为IgG2。因此，可通过同种型转换成例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、 IgA、IgE或IgM抗体而改变本发明抗体的效应子功能用于各种治疗应用。在一个实施方案中，本发明的抗体是IgG1抗体，例如IgG1，κ。
由拮抗性抗体诱导的c-Met的减量调节代表治疗性c-Met抗体的 作用机制。因此，在本发明的一个方面，需要具有降低的激动性质但 保持诱导c-Met减量调节的能力的抗体。
已经发现，通过降低抗体的构象柔性，使二价IgG1抗体潜在的 残余激动活性降到最低。
因此，在又一个实施方案中，本发明的抗体已经修饰(例如通过 铰链区突变)使之较少柔性。
最大的构象变化是铰链柔性的结果，铰链柔性允许各种Fab-Fc 角度(OllmannSaphire，E.，R.L.Stanfield，M.D.M.Crispin，P.W.H.I. Parren，P.M.Rudd，R.A.Dwek，D.R.Burton和I.A.Wilson.2002. Contrasting IgG structures reveal extremeasymmetry and flexibility(对比 IgG结构显示极不对称性和柔性).J.Mol.Biol.319：9-18)。降低免疫球 蛋白中Fab臂柔性的一种方法是通过遗传修饰防止轻链和重链之间形 成二硫键。在天然IgG1抗体中，轻链通过二硫键与重链共价连接， 所述二硫键连接轻链的C端半胱氨酸与重链Fc铰链中220位(C220 EU编号)上的半胱氨酸。通过使氨基酸C220突变成丝氨酸或任何其 它天然氨基酸、通过除去C220、通过除去完整铰链或通过用IgG3铰 链置换IgG1铰链，形成这样的分子，其中轻链通过其C端半胱氨酸 连接，这类似于人同种型IgA2m(1)中存在的情形。如实施例中所示， 这就导致Fab相对于Fc的柔性降低，因此交联能力降低。
降低IgG1分子的柔性的另一种策略是用IgG2铰链或IgG2样铰 链置换IgG1铰链。(Dangl等.EMBO J.1988；7：1989-94)。该铰链区具 有与IgG1的性质截然不同的2种性质，其被认为赋予分子较少的柔 性。首先，与IgG1铰链相比，IgG2铰链短3个氨基酸。其次，IgG2铰链含有额外的半胱氨酸，因此可形成3个而非2个重链间二硫桥。 或者，可引入类似于IgG2铰链的IgG1铰链的变体。该突变体(TH7Δ6-9) (WO2010063746)含有突变T223C和2个缺失(K222和T225)，以产生 具有额外半胱氨酸的较短铰链。
在又一个实施方案中，本发明的抗体是IgG1亚型的，其中通过 以下方面修饰铰链区：
(i)缺失序列EPKSCDKTHTCPPCP的铰链区并将其用序列： ERKCCVECPPCP的IgG2铰链区取代(IgG1铰链-IgG2)；
(ii)缺失第220位使得修饰铰链区具有EPKSDKTHTCPPCP的序 列(IgG1 ΔC220)；
(iii)220位上的半胱氨酸用任何其它天然氨基酸(X)取代使得修饰 铰链区具有EPKSXDKTHTCPPCP的序列(IgG1 C220X)；
(iv)缺失序列EPKSCDKTHTCPPCP的铰链区(UniBody IgG1)；
(v)缺失序列EPKSCDKTHTCPPCP的铰链区并将其用序列 ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPE PKSCDTPPPCPRCP的IgG3铰链区取代(IgG1铰链-IgG3)；或
(vi)223位上的苏氨酸用半胱氨酸取代，并缺失222上的赖氨酸 和225位上的苏氨酸，使得修饰铰链区具有EPKSCDCHCPPCP的序 列(IgG1 TH7Δ6-9)。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体是IgG1亚型的，其 中通过缺失第220位来修饰铰链区，使得修饰铰链区具有 EPKSDKTHTCPPCP的序列(IgG1 ΔC220)，或通过将220位上的半胱 氨酸用任何其它天然氨基酸(X)取代来修饰铰链区，使得修饰铰链区具 有EPKSXDKTHTCPPCP的序列(IgG1 C220X)；
在又一个实施方案中，本发明的抗体是IgG1亚型的，其中通过 将220位上的半胱氨酸用丝氨酸取代来修饰铰链区，使得修饰铰链区 具有EPKSSDKTHTCPPCP的序列(IgG1C220S)。
在又一个实施方案中，本发明的抗体是IgG2亚型的。
在又一个实施方案中，通过例如按US2009317869所述或按van Berkel等(2010)Biotechnol.Bioeng.105：350所述，在抗体产生期间向 培养基中加入化合物，或者例如按Yamane-Ohnuki等(2004)Biotechnol. Bioeng 87：614所述，使用FUT8敲除细胞，对本发明的抗体进行糖改 造以减少岩藻糖，因此提高ADCC。可采用
Figure BDA0001367921440000291
等(1999)NatureBiotech 17：176所述方法，备选地使ADCC最优化。
在一个实施方案中，抗体含有IgG1亚型的包含SEQ ID NO：100 的CDR3序列的VH区和包含SEQ ID NO：104的CDR3序列的VL区 (069)，其中通过将220位上的半胱氨酸用丝氨酸取代来修饰铰链区， 使得修饰铰链区具有EPKSSDKTHTCPPCP的序列(IgGl C220S)。
在一个实施方案中，抗体含有IgG1亚型的包含SEQ ID NO：98、 99和100的CDR1、2和3序列的VH区和包含SEQ ID NO：102、103 和104的CDR1、2和3序列的VL区(069)，其中通过将220位上的 半胱氨酸用丝氨酸取代来修饰铰链区，使得修饰铰链区具有EPKSSDKTHTCPPCP的序列(IgG1 C220S)。
在一个实施方案中，抗体含有IgG1亚型的包含SEQ ID NO：97 的序列的VH区和包含SEQ ID NO：101的序列的VL区(069)，其中通 过220位上的半胱氨酸用丝氨酸取代来修饰铰链区，使得修饰铰链区 具有EPKSSDKTHTCPPCP的序列(IgG1 C220S)。
多个出版物已证实核心岩藻糖基化降低与体外ADCC活性提高 之间的相关性(Shields RL.2002 JBC；277：26733-26740；Shinkawa T. 2003 JBC；278(5)：3466-3473；
Figure BDA0001367921440000292
P.Nat Biotechnol.1999年2 月；17(2)：176-80)。
在又一个实施方案中，本发明的抗体被修饰，以降低核心岩藻糖 基化低于10％，例如低于5％，如通过高效阴离子交换层析法-脉冲安 培检测联用(HPAEC-PAD)所测定。这可通过现有技术众所周知的方法 实现，例如kifunensine处理或在FUT8阴性细胞中产生。
在又一个实施方案中，本发明的抗体经工程改造以提高补体活 化，例如如Natsume等(2009)Cancer Sci.100：2411中所述。
在一个实施方案中，本发明的抗体是全长抗体，优选IgG1抗体， 特别是IgG1，κ抗体。在另一个实施方案中，本发明的抗体是抗体片段 或单链抗体。
例如，可采用常规技术，通过断裂成片段来获得抗体片段，并以 与本文对于完整抗体所述方式的相同方式，针对效用对片段进行筛 选。例如，可通过用胃蛋白酶处理抗体来产生F(ab′)2片段。可处理所 得F(ab′)2片段以还原二硫桥产生Fab′片段。可通过用木瓜蛋白酶处理 IgG抗体来获得Fab片段；可用胃蛋白酶消化IgG抗体来获得Fab′片 段。还可通过硫醚键或二硫键结合下述Fab′来产生F(ab′)片段。Fab′ 片段是通过切割F(ab′)2铰链区的二硫键而获得的抗体片段。可用还原 剂(例如二硫苏糖醇)处理F(ab′)2片段来获得Fab′片段。还可通过在重 组细胞中表达编码这类片段的核酸来产生抗体片段(参见例如Evans等，J.Immunol.Meth.184，123-38(1995))。例如，编码部分F(ab′)2片 段的嵌合基因可包括编码H链的CH1结构域和铰链区的DNA序列， 后面接翻译终止密码子以产生这类截短的抗体片段分子。
如上所述，在一个实施方案中，本发明的抗c-Met抗体是二价抗 体。
在另一个实施方案中，本发明的抗c-Met抗体是一价抗体。
在一个实施方案中，本发明的抗体是例如US20080063641 (Genentech)中所描述的Fab片段或单臂抗体，或例如WO2007048037 (Amgen)中所描述的其它一价抗体。
在一个优选的实施方案中，一价抗体具有 WO2007059782(Genmab)(通过引用结合到本文中)中描述的具有缺失 铰链区的结构。因此，在一个实施方案中，抗体是一价抗体，其中所 述抗c-Met抗体通过以下方法构建，所述方法包括：
i)提供编码所述一价抗体的轻链的核酸构建体，所述构建体包含 编码选定的抗原特异性抗c-Met抗体的VL区的核苷酸序列和编码Ig的 恒定CL区的核苷酸序列，其中所述编码选定的抗原特异性抗体的VL 区的核苷酸序列和所述编码Ig的CL区的核苷酸序列有效地连接在一 起，其中，在IgG1亚型的情况下，编码CL区的核苷酸序列经修饰，使 得CL区不含能够在多克隆人IgG存在时或当给予动物或人类时，与包 含CL区的相同氨基酸序列的其它肽形成二硫键或共价键的任何氨基 酸；
ii)提供编码所述一价抗体的重链的核酸构建体，所述构建体包 含编码选定的抗原特异性抗体的VH区的核苷酸序列和编码人Ig的恒 定CH区的核苷酸序列，其中编码CH区的核苷酸序列经修饰，使得相 当于铰链区的区和按Ig亚型所需要的CH区的其它区(例如CH3区)不包 含这样的任何氨基酸残基，所述氨基酸残基当多克隆人IgG存在时或 当给予动物人类时，参与与包含人Ig的CH区的相同氨基酸序列的其它 肽形成二硫键或共价或稳定的非共价重链间键，其中所述编码选定的 抗原特异性抗体的VH区的核苷酸序列和所述编码所述Ig的CH区的核 苷酸序列有效地连接在一起；
iii)提供用于产生所述一价抗体的细胞表达系统；
iv)通过在(iii)的细胞表达系统的细胞中共表达(i)和(ii)的核酸构 建体来产生所述一价抗体。
同样地，在一个实施方案中，抗c-Met抗体是一价抗体，其包含
(i)本文所述的本发明抗体的可变区或所述区的抗原结合部分， 和
(ii)免疫球蛋白的CH区或其包含CH2和CH3区的片段，其中所 述CH区或其片段经修饰，使得相当于铰链区的区和CH区的其它区(例 如CH3区)(如果免疫球蛋白不是IgG4亚型的话)不包含这样的任何氨 基酸残基，所述氨基酸残基能够在多克隆人IgG存在时与相同的CM区形成二硫键或与相同CH区形成其它共价或稳定的非共价重链间键。
在有关此点的又一个实施方案中，一价抗c-Met抗体的重链经修 饰，使得整个铰链缺失。
在另外又一个实施方案中，所述一价抗体是IgG4亚型的，但CH3 区经修饰，使得产生一个或多个下列氨基酸取代：
CH3突变的编号
Figure BDA0001367921440000321
*KABAT表明按照Kabat的氨基酸编号(Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版.Public Health Service，National Institutes ofHealth， Bethesda，MD.(1991)。EU索引表示按照Kabat等人概述的EU索引的氨基酸编号(Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。
在另外又一个实施方案中，所述一价抗体的序列经修饰，使得它 不包含N-联糖基化的任何接受位点。
本发明的抗c-Met抗体还包括单链抗体。单链抗体是其中重链和 轻链Fv区连接的肽。在一个实施方案中，本发明提供单链Fv(scFv)， 其中单一肽链中本发明的抗c-Met抗体Fv中的重链和轻链与柔性肽接 头(通常约10、12、15个或更多个氨基酸残基)连接。产生这类抗体的 方法描述于例如US 4,946,778；Pluckthun in The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore主编， Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994)；Bird等，Science 242， 423-426(1988)；Huston等，PNAS USA 85，5879-5883(1988)和 McCafferty等，Nature 348，552-554(1990)。如果仅使用单个VH和VL，则单链抗体可为一价，如果使用两个VH和VL则可为二价，或如果使用 超过两个的VH和VL则为多价。
在一个实施方案中，本发明的抗c-Met抗体是效应子功能缺陷型 抗体。在一个实施方案中，效应子功能缺陷型抗c-Met抗体是稳定化 IgG4抗体，其经修饰以防止Fab臂交换(van der Neut Kolfschoten等 (2007)Science 317(5844)：1554-7)。合适的稳定化IgG4抗体的实例是 这样的抗体，其中人IgG4重链恒定区中的409位上的精氨酸(其按 Kabat等的EU索引表示)，被赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或亮氨酸、 优选赖氨酸取代(参见WO2006033386(Kirin))和/或其中铰链区经修饰 以包含Cys-Pro-Pro-Cys序列。
在又一个实施方案中。稳定化IgG4抗c-Met抗体是包含重链和 轻链的IgG4抗体，其中所述重链包含在相当于409位处具有选自Lys、 Ala、Thr、Met和Leu的残基和/或在相当于405位处具有选自Ala、 Val、Gly、Ile和Leu的残基的人IgG4恒定区，且其中所述抗体任选包含一个或多个其它的取代、缺失和/或插入，但在铰链区中不包含 Cys-Pro-Pro-Cys序列。优选所述抗体在相当于409位上包含Lys或 Ala残基，或抗体的CH3区被人IgG1、人IgG2或人IgG3的CH3区 置换。另参见WO2008145142(Genmab)。
在甚至又一个实施方案中。稳定化IgG4抗c-Met抗体是包含重 链和轻链的IgG4抗体，其中所述重链包含在相当于409位处具有选 自Lys、Ala、Thr、Met和Leu的残基和/或在相当于405位处具有选 自Ala、Val、Gly、I1e和Leu的残基的人IgG4恒定区，其中所述抗 体任选包含一个或多个其它的取代、缺失和/或插入，且其中所述抗体 在铰链区包含Cys-Pro-Pro-Cys序列。优选所述抗体在相当于409位上 包含Lys或Ala残基，或抗体的CH3区被人IgG1、人IgG2或人IgG3 的CH3区置换。
在又一个实施方案中，效应子功能缺陷型抗c-Met抗体是非IgG4 型(例如IgG1、IgG2或IgG3)的抗体，其经突变使得介导效应子功能(例 如ADCC)的能力降低或甚至消除。这类突变描述于例如Dall′Acqua WF等，J Immunol.177(2)：1129-1138(2006)和HezarehM，J Virol. 75(24)：12161-12168(2001)。
缀合物
在又一个实施方案中，本发明提供与治疗部分(例如细胞毒素、 化学治疗药、免疫抑制药或放射性同位素)缀合的抗c-Met抗体。这类 缀合物在本文称为“免疫缀合物(immunoconjugate)”。包括一种或多种 细胞毒素的免疫缀合物称为“免疫毒素”。
细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害(例如杀死细胞)的任何作 用剂。用于形成本发明的免疫缀合物的合适治疗剂包括泰素、细胞松 弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、 tenoposide、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二 羟炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、光神霉素、放 线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、 普萘洛尔和嘌罗霉素、抗代谢药(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟 嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉滨(fludarabin)、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪 (decarbazine)、羟基脲、天冬酰胺酶、吉西他滨、克拉屈滨)、烷化剂(例 如氮芥、噻替派(thioepa)、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)、 洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、达 卡巴嗪(DTIC)、丙卡巴肼、丝裂霉素C、顺铂和其它铂衍生物，例如 卡铂)、抗生素(例如放线菌素D(旧称放线菌素)、博来霉素、柔红霉 素(旧称道诺霉素)、多柔比星、伊达比星、光神霉素、丝裂霉素、米 托蒽醌、普卡霉素、安曲霉素(AMC))、白喉毒素和相关分子(例如白 喉A链和其活性片段和杂交分子)、蓖麻毒蛋白毒素(例如蓖麻毒蛋白 A或去糖基化蓖麻毒蛋白A链毒素)、霍乱毒素、志贺样毒素(SLT-I、 SLT-II、SLT-IIV)、LT毒素、C3毒素、志贺毒素、百日咳毒素、破 伤风毒素、大豆Bowman-Birk蛋白酶抑制剂、假单胞菌属(Pseudomonas) 外毒素、alorin、肥皂草蛋白、塑莲根毒蛋白II、gelanin、相思豆毒蛋 白A链、塑莲根毒蛋白II A链、α-帚曲霉素、油桐(Aleurites fordii)蛋 白、香石竹毒蛋白、美洲商陆(Phytolacca americana)蛋白(PAPI、PAPII 和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆 毒蛋白、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制剂、多花白树毒蛋白、 mitogellin、局限曲菌素、酚霉素和伊诺霉素毒素。其它合适的缀合分 子包括核糖核酸酶(RNase)、脱氧核糖核酸酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、白喉毒素和假单胞菌属内毒素。参见例如Pastan 等，Cell 47，641(1986)和Goldenberg，Calif.A Cancer Journal for Clinicians 44，43(1994)。可与本文其它部分所述的本发明的抗c-Met 抗体组合给予的治疗剂，还可以是可用于与本发明抗体缀合的治疗部 分的候选物。
在另一个实施方案中，本发明的抗c-Met抗体包含缀合的核酸或 核酸缔合的分子。在本发明的一个这个方面中，缀合的核酸是细胞毒 性核糖核酸酶、反义核酸、抑制性RNA分子(例如siRNA分子)或免 疫刺激核酸(例如含免疫刺激CpG基序的DNA分子)。在另一个实施 方案中，本发明的抗c-Met抗体与适体或核酶缀合。
在一个实施方案中，提供包含一个或多个放射性标记的氨基酸的 抗c-Met抗体。放射性标记的抗c-Met抗体可用于诊断和治疗目的两 者(与放射性标记的分子的缀合是另一个可能的特征)。用于多肽的标 记的非限制性实例包括3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc和125I、 131I和186Re。
抗c-Met抗体还可通过与聚合物共价缀合而经化学修饰，以例如 延长其循环半寿期。例如US 4,766,106、US 4,179,337、US 4,495,285 和US 4,609,546中说明了将其与肽连接的示例性的聚合物和方法。其 它聚合物包括聚氧乙烯化多元醇和聚乙二醇(PEG)(例如分子量介于 约1,000和约40,000之间、例如介于约2,000和约20,000之间的PEG)。
可采用将抗c-Met抗体与缀合的分子(例如上述分子)缀合的本领 域已知的任何方法，包括以下文献所述方法：Hunter等，Nature 144，945(1962)，David等，Biochemistry13，1014(1974)，Pain等，J.Immunol. Meth.40，219(1981)和Nygren，J.Histochem.和Cytochem.30，407 (1982)。可通过将其它部分化学缀合至抗c-Met抗体或其片段的N端 侧或C端侧(例如抗c-Met抗体H或L链)来产生这类抗体(参见例如 Antibody EngineeringHandbook，Osamu Kanemitsu主编，Chijin Shokan 出版(1994))。适当时，还可通过在内部残基或糖上缀合来产生这类缀 合的抗体衍生物。可将作用剂与本发明的抗c-Met抗体直接或间接偶 联。第二作用剂的间接偶联的一个实例是通过间隔物部分偶联。在一 个实施方案中，将本发明的抗c-Met抗体与螯合剂接头(例如tiuxetan) 连接，所述螯合剂接头允许抗体与放射性同位素缀合。
双特异性抗体
在又一方面，本发明涉及包含得自本文上述的本发明的抗c-Met 抗体的第一抗原结合部位和具有不同结合特异性(例如对于人效应子 细胞、人Fc受体、T细胞受体、B细胞受体的结合特异性或对于c-Met 的非重叠表位的结合特异性)的第二抗原结合部位的双特异性分子，即 其中例如当按照实施例17所述测定时，第一和第二抗原结合部位不 竞争结合c-Met的双特异性抗体。
本发明的示例性双特异性抗体分子包括(i)2种抗体，其中一种对 c-Met具有特异性，另一种对缀合在一起的第二靶标有特异性，(ii)具 有对c-Met有特异性的一条链或臂和对第二分子有特异性的第二链或 臂的单一抗体，和(iii)对c-Met和第二分子具有特异性的单链抗体。在 一个实施方案中，第二分子为癌症抗原/肿瘤相关抗原，例如癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、RAGE(肾抗原)、甲胎蛋白、CAMEL (黑素瘤上的CTL识别的抗原)、CT抗原(例如MAGE-B5、-B6、-C2、-C3 和D；Mage-12；CT10；NY-ESO-1、SSX-2、GAGE、BAGE、MAGE 和SAGE)、黏蛋白抗原(例如MUCl、黏蛋白-CA125等)、神经节苷脂 抗原、酪氨酸酶、gp75、C-myc、Mart1、MelanA、MUM-1、MUM-2、 MUM-3、HLA-B7、Ep-CAM或癌症相关整联蛋白，例如α5β3整联蛋 白。在另一个实施方案中，第二分子是血管生成因子或其它癌症相关生长因子，例如血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长 因子、血管生成素或任何这些的受体，特别是与癌症进程有关的受体 (例如HER1-HER4受体之一)。在一个实施方案中，本发明的双特异 性抗体是双链抗体。
核酸序列\载体和宿主细胞
在又一方面，本发明涉及编码本发明抗体的重链和轻链的核酸序 列，例如DNA序列。
在一个实施方案中，核酸序列编码选自以下的氨基酸序列： SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、 53、57、61、65、69、73、77、81、85、89、93、97、101、105、109、113、117、121、125、129、133、137、138、139、140、 141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、 152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、 163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、 174、175、176、177和178。
在另一个具体实施方案中、核酸序列编码选自以下的VH氨基酸 序列：SEQ ID NO：1、9、17、25、33、41、49、57、65、73、81、 89、97、105、113、121、129、137、139、141、143、145、147、 149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、 171、173、175和177。
在另一个具体实施方案中，核酸序列编码选自以下的VL氨基酸 序列：SEQ ID NO：5、13、21、29、37、45、53、61、69、77、85、 93、101、109、117、125、133、138、140、142、144、146、148、 150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、 172、174、176和178。
在更进一步的方面，本发明涉及编码本发明的抗体的表达载体或 表达载体套组。抗体的重链和轻链可通过相同载体或通过不同的载体 编码。
这类表达载体可用于本发明抗体的重组产生。
在一个实施方案中，本发明的表达载体包含编码选自以下的一个 或多个氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、 25、29、33、37、41、45、49、53、57、61、65、69、73、77、81、 85、89、93、97、101、105、109、113、117、121、125、129、133、 137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、 149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、 161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、 173、174、175、176、177和178。
在另一个具体实施方案中，本发明的表达载体包含编码一个或多 个选自以下的VH氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO：1、9、17、 25、33、41、49、57、65、73、81、89、97、105、113、121、129、 137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、 161、163、165、167、169、171、173、175和177。
在另一个具体实施方案中，本发明的表达载体包含编码一个或多 个选自以下VL氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO：5、13、21、 29、37、45、53、61、69、77、85、93、101、109、117、125、133、 138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、 162、164、166、168、170、172、174、176和178。
在又一个实施方案中，表达载体还包含编码抗体(例如人抗体)的 轻链、重链或轻链和重链两者的恒定区的核苷酸序列。
在本发明的情况下，表达载体可以是任何合适的载体，包括染色 体、非染色体和合成核酸载体(包含合适的表达调控元件套组的核酸序 列)。这类载体的实例包括SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、 杆状病毒、酵母质粒、来源于质粒和噬菌体DNA的组合的载体和病 毒核酸(RNA或DNA)载体。在一个实施方案中，抗c-Met抗体编码核 酸包含裸DNA或RNA载体中，包括例如线性表达元件(参见例如Sykes和Johnston，Nat Biotech 17，355-59(1997))、密实的核酸载体(参 见例如US 6,077,835和/或WO 00/70087)、质粒载体例如pBR322、pUC 19/18或pUC 118/119、“侏儒”最小化(“midge”minimally-sized)核酸载 体(参见例如Schakowski等，Mol Ther 3，793-800(2001))或作为沉淀 的核酸载体构建体，例如CaPO4沉淀的构建体(参见例如WO 00/46147；Benvenisty和Reshef，PNAS USA 83，9551-55(1986)；Wigler 等，Cell 14，725(1978)和Coraro和Pearson，Somatic Cell Genetics7， 603(1981))。这类核酸载体及其使用是本领域众所周知的(参见例如 US 5,589,466和US 5,973,972)。
在一个实施方案中，载体适于在细菌细胞中表达抗c-Met抗体。 这类载体的实例包括例如BlueScript(Stratagene)、pIN载体(Van Heeke 和Schuster，J Biol Chem 264，5503-5509(1989)、pET载体(Novagen， Madison WI)等)等表达载体。
表达载体还可为或备选为适于在酵母系统中表达的载体。可以使 用适于在酵母系统中表达的任何载体。合适的载体包括例如包含组成 型或诱导型启动子例如α因子、醇氧化酶和PGH的载体(有关综述见： F.Ausubel等主编，Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing and Wiley InterScience New York(1987)；以及Grant等，Methods in Enzymol 153.，516-544(1987))。
表达载体还可为或备选为适于在哺乳动物细胞中表达的载体，例 如包含谷氨酰胺合成酶作为选择标记的载体，例如以下文献描述的载 体(Bebbington(1992)Biotechnology(NY)10：169-175)。
核酸和/或载体还可包含编码分泌/定位序列的核酸序列，所述分 泌/定位序列可将多肽(例如新生多肽链)靶向周质间隙或靶入细胞培养 基中。这类序列是本领域已知的，包括分泌前导肽或信号肽。
在本发明的表达载体中，抗c-Met抗体编码核酸可包含任何合适 的启动子、增强子和其它表达促进元件或与这些元件缔合。这类元件 的实例包括强表达启动子(例如人CMV IE启动子/增强子以及RSV、SV40、SL3-3、MMTV和HIV LTR启动子)、有效的聚(A)终止序列、 用于大肠杆菌(E.coli)中的质粒产品的复制起点、作为选择标记的抗生 素抗性基因和/或合适的克隆位点(例如多接头)。核酸还可包含与组成 型启动子(例如CMV IE)相对的诱导型启动子。
在一个实施方案中，抗c-Met-抗体编码表达载体可通过病毒载体 定位于和/或递送至宿主细胞或宿主动物中。
在更进一步的方面，本发明涉及重组真核或原核宿主细胞例如转 染瘤，其产生本文定义的本发明抗体。宿主细胞的实例包括酵母、细 菌和哺乳动物细胞，例如CHO或HEK细胞。例如，在一个实施方案 中，本发明提供包含稳定整合至细胞基因组的核酸的细胞，所述细胞 基因组包含编码用于表达本发明的抗c-Met抗体的序列。在另一个实 施方案中，本发明提供包含未整合核酸(例如质粒、黏粒、噬菌粒或线 性表达元件)的细胞，所述未整合核酸包含编码用于表达本发明抗 c-Met抗体的序列。
在又一方面，本发明涉及产生本文定义的本发明抗体的杂交瘤。 在更进一步的方面，本发明涉及包含编码人重链和人轻链的核酸的转 基因非人动物或植物，其中所述动物或植物产生本发明的抗体。
在又一方面，本发明涉及用于产生本发明的抗c-Met抗体的方法， 所述方法包括以下步骤：
a)培养如本文文所述的本发明杂交瘤或宿主细胞，和
b)从培养基中纯化出本发明的抗体。
组合物
在又一个主要方面，本发明涉及药物组合物，其包含：
-本文定义的抗c-Met抗体，和
-药学上可接受的载体。
本发明的药物组合物可含有一种本发明的抗体或本发明不同抗 体的组合。
可按照常规技术配制药物组合物，所述常规技术例如公开于下述 文献中的常规技术：Remington：The Science and Practice of Pharmacy， 第19版，Gennaro主编，MackPublishing Co.，Easton，PA，1995。本发明 的药物组合物可包含例如稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、洗涤剂(例如 非离子型洗涤剂，例如吐温-20(Tween-20)或吐温-80)、稳定剂(例如不 含糖或蛋白质的氨基酸)、防腐剂、组织固定剂、增溶剂和/或适于纳 入药物组合物中的其它物质。
药学上可接受的载体包括与本发明的化合物在生理上相容的任 何和所有合适的溶剂、分散介质、包衣材料、抗细菌剂和抗真菌剂、 等渗剂、抗氧化剂和吸收延缓剂等。可用于本发明药物组合物的合适 的水性和非水性载体的实例包括水、盐水、磷酸缓冲盐溶液、乙醇、 葡萄糖、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、 植物油、羧甲基纤维素胶体溶液、西黄蓍胶和注射用有机酯例如油酸 乙酯和/或各种缓冲剂。药学上可接受的载体包括无菌水性溶液剂或分 散剂和用于临时配制无菌注射用溶液剂或分散剂的无菌粉剂。可通过 例如使用包衣材料(例如卵磷脂)、在分散剂的情况下通过保持所需粒径和通过使用表面活性剂，来保持适当的流动性。
本发明的药物组合物还可包含药学上可接受的抗氧化剂，例如(1) 水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫 酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁 羟茴醚、丁基化羟基甲苯、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和 (3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒 石酸、磷酸等。
本发明的药物组合物还可在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元 醇，例如甘露醇、山梨糖醇、甘油或氯化钠。
本发明的药物组合物还可含有适于所选给药途径的可提高药物 组合物的保存期限或有效性的一种或多种辅助剂，例如防腐剂、润湿 剂、乳化剂、分散剂、防腐剂或缓冲剂。可将本发明的化合物与可防 止化合物快速释放的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物、透 皮贴剂和微囊化递送系统。这类载体可包括明胶、单硬脂酸甘油酯、 二硬脂酸甘油酯、生物可降解的生物相容性聚合物例如乙烯乙酸乙 酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和单独的或与蜡一起的聚乳酸， 或者本领域众所周知的其它物质。用于制备这类制剂的方法一般为本 领域技术人员所知。
可根据需要通过将所需量的活性化合物与例如上文列举的一种 成分或成分的组合一起掺入适当溶剂中，接着除菌微量过滤，来制备 无菌注射用溶液剂。一般而言，通过将活性化合物掺入含有碱性分散 介质和所需要的其它成分(例如上文列举的成分)的无菌溶媒中来制备 分散剂。在用于制备无菌注射用溶液剂的无菌粉剂的情况下，制备方 法的实例是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加来自其前 述除菌过滤溶液的任何其它所需成分的粉剂。
药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以便获得对于 特定患者、组合物和给药方式有效实现所需治疗反应而又对患者无毒 的活性成分的量。所选的剂量水平将取决于多个药代动力学因素，包 括所用的本发明具体组合物或其酰胺的活性、给药途径、给药时间、 所用具体化合物的排泄率、治疗持续时间、与所用具体组合物联用的 其它药物、化合物和/或物质、待治疗患者的年龄、性别、体重、状况、 一般健康状况和既往病史等医学领域众所周知的因素。
可通过任何合适的途径和方式给予药物组合物。在一个实施方案 中，胃肠外给予本发明的药物组合物。本文所用“胃肠外给予”意指非 肠内和局部给药的给予方式，通常通过注射给予，包括表皮、静脉内、 肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏内、真皮内、腹膜内、腱内、 经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、颅内、 胸内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
在一个实施方案中，通过静脉内或皮下注射或输注而给予药物组 合物。
用途
在又一个主要方面，本发明涉及用作药物的本发明的抗c-Met抗 体。
本发明的抗c-Met抗体可用于多种目的。具体地说，本发明的抗 体可用于治疗各种形式的癌症，包括转移癌和难治性癌。这类癌症可 以是依赖HGF的或不依赖HGF的癌症。
在一个实施方案中，本发明的抗c-Met抗体用于治疗选自以下的 癌症形式：膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、胆管癌、结肠直肠癌、子宫 内膜癌、食管癌、胃癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌(例如非小细胞肺 癌(NSCLC))、鼻咽癌、卵巢癌、胰腺癌、胆囊癌、前列腺癌和甲状腺 癌。
在另一个实施方案中，本发明的抗c-Met抗体用于治疗选自以下 的癌症形式：骨肉瘤、横纹肌肉瘤和滑膜肉瘤。
在另一个实施方案中，本发明的抗c-Met抗体用于治疗选自以下 的癌症形式：卡波西肉瘤(Kaposi′s sarcoma)、平滑肌肉瘤、恶性纤维 组织细胞瘤和纤维肉瘤。
在另一个实施方案中，本发明的抗c-Met抗体用于治疗造血系统 恶性肿瘤，例如选自以下的恶性肿瘤：急性髓细胞白血病、成人型T 细胞性白血病、慢性髓细胞样白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
在又一个实施方案中，本发明的抗c-Met抗体用于治疗选自以下 的肿瘤：成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤和肾母细胞瘤 (Wilm’s tumor)。
在又一个实施方案中，本发明的抗c-Met抗体用于治疗MiT肿瘤， 包括透明细胞肉瘤(CCS)、软组织腺泡状肉瘤(ASPS)和易位相关性肾 细胞癌。
在另一个实施方案中，本发明的激动性抗c-Met抗体用于例如在 冠心病患者中的细胞因子产生的调节和内皮祖细胞动员的诱导(Yang 等(2009)Clin Exp PharmacolPhysiol.36：790)。
在另一个实施方案中，本发明的激动性抗c-Met抗体用来抑制或 改善慢性肾衰竭(Mizuno等(2008)Front Biosci.13：7072)。
同样地，本发明涉及用于抑制表达c-Met的肿瘤细胞的生长和/ 或增殖的方法，所述方法包括将有效量的本发明抗体给予有需要的个 体。
在一个实施方案中，所述肿瘤细胞涉及选自以下的癌症形式：膀 胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、胆管癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食管 癌、胃癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、卵巢癌、胰腺癌、 胆囊癌、前列腺癌、甲状腺癌、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤、卡 波西肉瘤、平滑肌肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、纤维肉瘤、急性髓细 胞白血病、成人型T细胞性白血病、慢性髓细胞样白血病、淋巴瘤、 多发性骨髓瘤、成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤和肾母 细胞瘤。
此外，本发明涉及与人c-Met结合的单克隆抗体在制备用于癌症 治疗的药物中的用途，所述癌症例如上述具体癌症适应症之一。
在一个实施方案中，用抗c-Met抗体治疗的患者的选择以所述患 者相关肿瘤细胞上c-Met和/或HGF的(过量)表达水平为基础。
在本发明的治疗方法的又一个实施方案中，通过测定相关肿瘤细 胞上的c-Met表达水平，监测治疗期间(例如预定时间点)的治疗功效。
调整上述治疗方法和用途中的剂量方案以提供最佳的所需反应 (例如治疗反应)。例如，可给予单次推注，可随时间给予若干分剂量， 或可按治疗情况危急程度所示，按比例减少或增加剂量。可以剂量单 位形式配制胃肠外组合物以易于给药和剂量一致性。
抗c-Met抗体的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病 况，并可由本领域的技术人员确定。本发明化合物的治疗有效量的示 例性非限制性范围为约0.1-100mg/kg、例如约0.1-50mg/kg、例如约 0.1-20mg/kg、例如约0.1-10mg/kg、例如约0.5mg/kg、约例如0.3 mg/kg、约1mg/kg、约3mg/kg、约5mg/kg或约8mg/kg。
掌握本领域普通技能的医生或兽医可容易地确定并开予所需的 有效量的药物组合物。例如，医生或兽医可以低于达到所需治疗效果 所需的水平开始给予用于药物组合物中的抗c-Met抗体的剂量，逐渐 增加剂量直到达到所需效果。一般而言，本发明组合物的合适日用量 是有效产生治疗效果的最低剂量的化合物的量。给药可以是例如胃肠 外，例如静脉内、肌内或皮下。在一个实施方案中，可以10-500mg/m2、 例如200-400mg/m2一周一次的剂量通过输注给予抗c-Met抗体。这 类给药可重复例如1-8次，例如3-5次。可在2-24小时、例如2-12小 时的时间内通过连续输注给药。在一个实施方案中，可在一段长时间 (例如超过24小时)内通过缓慢的连续输注，给予抗c-Met抗体以降低 毒副作用。
在一个实施方案中，可以250mg-2000mg、例如300mg、500mg、 700mg、1000mg、1500mg或2000mg的一周一次剂量给予抗c-Met 抗体多达8次，例如4-6次。必要时，例如6个月或12个月后，可重 复该方案一次或多次。可通过经由例如获取生物样品并使用靶向本发明抗c-Met抗体的抗原结合区的抗独特型抗体，测量给药后血液中本 发明化合物的量，来确定或调整剂量。
在一个实施方案中，可通过维持疗法给予抗c-Met抗体，例如一 周一次持续6个月或更长的时间。
还可预防性给予抗c-Met抗体以降低发生癌症的风险、延迟癌症 进程中事件出现的开始时间和/或当癌症缓解时降低复发的风险。
还可以联合疗法，即以与待治疗疾病或病况相关的其它治疗剂的 组合，给予抗c-Met抗体。因此，在一个实施方案中，含抗体的药物 用于与一种或多种其它治疗剂例如细胞毒性剂、化疗剂或抗血管生成 药组合。
这类联合给药可以是同时的、单独的或序贯的。对于同时给药， 适当时，治疗剂可作为一种组合物或作为单独的组合物给予。因此， 本发明还提供用于治疗涉及上述表达c-Met的细胞的病症的方法，所 述方法包括给予与下述一种或多种其它治疗剂组合的本发明的抗c-Met抗体。
在一个实施方案中，本发明提供用于治疗受试者的涉及表达 c-Met的细胞的病症的方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明的 抗c-Met抗体和至少一种其它的治疗剂给予有需要的受试者。
在一个实施方案中，本发明提供用于治疗或预防癌症的方法，所 述方法包括将治疗有效量的本发明的抗c-Met抗体和至少一种其它的 治疗剂给予有需要的受试者。
在一个实施方案中，这类其它的治疗剂可选自抗代谢药，例如甲 氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉滨、5-氟尿嘧 啶、达卡巴嗪、羟基脲、天冬酰胺酶、吉西他滨或克拉屈滨。
在另一个实施方案中，这类其它的治疗剂可选自烷化剂，例如氮 芥、噻替派、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)、洛莫司汀(CCNU)、 环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、达卡巴嗪(DTIC)、丙 卡巴肼、丝裂霉素C、顺铂和其它铂衍生物，例如卡铂。
在另一个实施方案中，这类其它的治疗剂可选自抗有丝分裂剂， 例如紫杉烷类(例如多西他赛和紫杉醇)和长春花属生物碱，例如长春 地辛、长春新碱、长春碱和长春瑞滨。
在另一个实施方案中，这类其它的治疗剂可选自拓扑异构酶抑制 剂(例如托泊替康或伊立替康)或细胞抑制药，例如依托泊苷和替尼泊 苷。
在另一个实施方案中，这类其它的治疗剂可选自生长因子抑制 剂，例如ErbB1的抑制剂(EGFR)(例如抗EGFR抗体，例如扎芦木单 抗、西妥昔单抗、帕尼单抗或尼妥珠单抗或其它EGFR抑制剂，例如 吉非替尼或埃罗替尼)、ErbB2的抑制剂(Her2/neu)(例如抗HER2抗体， 例如曲妥珠单抗，曲妥珠单抗-DM1或培妥珠单抗)或EGFR和HER2 两者的抑制剂，例如拉帕替尼)。
在另一个实施方案中，这类其它的治疗剂可选自酪氨酸激酶抑制 剂，例如伊马替尼(Glivec、Gleevec STI571)或拉帕替尼、PTK787/ZK222584。
在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗受试者的涉及表达 c-Met的细胞的病症的方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明的 抗c-Met抗体和至少一种血管生成、新血管形成和/或其它血管生成的 抑制剂给予有需要的受试者。
这类血管生成抑制剂的实例为尿激酶抑制剂、基质金属蛋白酶抑 制剂(例如马立马司他、新伐司他、BAY 12-9566、AG 3340、 BMS-275291和类似抑制剂)、内皮细胞迁移和增殖抑制剂(例如 TNP-470、角鲨胺、2-甲氧基雌二醇、康普瑞汀、内皮生长抑素、血 管生长抑素、青霉胺、SCH66336(Schering-Plough Corp，Madison，NJ)、 R115777(JanssenPharmaceutica，Inc，Titusville，NJ)和类似抑制剂)、血 管生成生长因子拮抗剂(例如ZD6474、SU6668、抗血管生成剂和/或 或其受体的抗体(例如VEGF(例如贝伐单抗)、bFGF和血管生成素-1)、 沙利度胺、沙利度胺类似物(例如CC-5013)、Sugen 5416、SU5402、 抗血管生成核酶(例如angiozyme)、干扰素α(例如干扰素α2a)、苏拉 明和类似拮抗剂)、VEGF-R激酶抑制剂和其它抗血管生成酪氨酸激酶 抑制剂(例如SU011248)、内皮特异性整联蛋白/存活信号转导抑制剂 (例如αVβ3人源化抗单抗和类似抑制剂)、铜拮抗剂/螯合剂(例如四硫钼酸盐、卡托普利和类似作用剂)、羧基酰氨基-三唑(CAI)、ABT-627、 CM101、白介素-12(IL-12)、IM862、PNU145156E以及抑制血管生成 的核苷酸分子(例如反义-VEGF-cDNA、编码血管生长抑素的cDNA、 编码p53的cDNA和编码缺陷型VEGF受体-2的cDNA)。
血管生成、新血管形成和/或其它血管生成的这类抑制剂的其它实 例为抗血管生成肝素衍生物(例如肝素酶III(heperinase III))、替莫唑 胺、NK4、巨噬细胞迁移抑制因子、环加氧酶-2抑制剂、缺氧诱导因 子1抑制剂、抗血管生成大豆异黄酮、奥替普拉、烟曲霉素及其类似 物、促生长素抑制素类似物、戊聚糖多硫酸酯、替可加兰钠、达肝素、 肿瘤抑制蛋白、血小板反应蛋白、NM-3、康普瑞汀(combrestatin)、血 管能抑素(canstatin)、阿瓦斯丁(avastatin)、抗其它靶标的抗体，例如抗 α-v/β-3整联蛋白和抗kininostatin抗体。
在一个实施方案中，用于与治疗上述病症的抗c-Met抗体联周的 治疗剂可为抗癌免疫原，例如癌症抗原/肿瘤相关抗原(例如上皮细胞 黏着分子(EpCAM/TACSTD1)、黏蛋白1(MUC1)、癌胚抗原(CEA)、 肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)、gp100、Melan-A、MART-1、KDR、RCAS1、MDA7、癌症相关病毒疫苗(例如人乳头瘤病毒疫苗)或肿瘤 来源的热激蛋白。
在一个实施方案中，用于与治疗上述病症的抗c-Met抗体联用的 治疗剂可为抗癌细胞因子、趋化因子或其组合。合适细胞因子和生长 因子的实例包括IFNγ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、 IL-15、IL-18、IL-23、IL-24、IL-27、IL-28a、IL-28b、IL-29、KGF、 IFNα(例如INFα2b)、IFNβ、GM-CSF、CD40L、Flt3配体、干细胞因 子、安西司亭和TNFα。合适的趋化因子可包括Glu-Leu-Arg(ELR)- 阴性趋化因子，例如来自人CXC和C-C趋化因子家族的IP-10、 MCP-3、MIG和SDF-1α。合适的细胞因子包括细胞因子衍生物、细 胞因子变体、细胞因子片段和细胞因子融合蛋白。
在一个实施方案中，用于与治疗上述病症的抗c-Met抗体联用的 治疗剂可为细胞周期控制/细胞凋亡调节因子(或“调节剂”)。细胞周期 控制/细胞凋亡调节因子可包括靶向和调节细胞周期控制/细胞凋亡调 节因子的分子，例如(i)cdc-25(例如NSC 663284)，(ii)过量刺激细胞 周期的细胞周期蛋白依赖性激酶(例如黄酮吡多(L868275、HMR1275)、7-羟基星形孢菌素(UCN-01、KW-2401)和洛斯可维汀(R-洛斯可维汀、 CYC202))，和(iii)端粒酶调节剂(例如描述于例如US 6,440,735和US 6,713,055中的BIBR1532、SOT-095、GRN163和组合物)。干扰细胞 凋亡途径的分子的非限制性实例包括TNF相关细胞凋亡诱导配体 (TRAIL)/细胞凋亡-2配体(Apo-2L)、激活TRAIL受体的抗体、IFN和 反义Bcl-2。
在一个实施方案中，用于与治疗上述病症的抗c-Met抗体联用的 治疗剂可为激素调节剂，例如可用于抗雄激素和抗雌激素疗法的调节 剂。这类激素调节剂的实例为他莫昔芬、艾多昔芬、氟维司群、屈洛 昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、己烯雌酚、炔雌醇/乙炔雌二醇、抗雄激 素物质(例如氟他胺(flutaminde)/eulexin)、孕酮(例如己酸羟孕酮、甲孕 酮/普维拉、醋酸甲地孕酮/梅格施)、肾上腺皮质类固醇(例如氢化可的 松、泼尼松)、促黄体素释放素(及其类似物和其它LHRH激动剂例如 布舍瑞林和戈舍瑞林)、芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑/瑞宁得、氨鲁米 特/cytraden、依西美坦)或激素抑制剂(例如奥曲肽/善得定)。
在一个实施方案中，用于与治疗上述病症的抗c-Met抗体联用的 治疗剂可为抗无反应性剂(anti-anergic agent)，例如作为阻断CTLA-4 的活性的分子的化合物，例如伊匹木单抗。
在一个实施方案中，用于与治疗上述病症的抗c-Met抗体联用的 治疗剂可为抗癌核酸或抗癌抑制性RNA分子。
可作为用于与治疗上述病症的抗c-Met抗体联用的治疗剂有关的 其它抗癌药的实例为分化诱导剂、视黄酸类似物(例如全反式视黄酸、 13-顺式视黄酸和类似物质)、维生素D类似物(例如西奥骨化醇和类似 物质)；ErbB3、ErbB4、IGF-IR、胰岛素受体、PDGFRa、PDGFRβ、 Flk2、Flt4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、TRKA、TRKC、RON (例如抗RON抗体)、Sea、Tie、Tie2、Eph、Ret、Ros、Alk、LTK、 PTK7和类似物质的抑制剂。
可作为用于与治疗上述病症的抗c-Met抗体联用的治疗剂有关的 其它抗癌药的实例为雌莫司汀和表柔比星。
可作为用于与治疗上述病症的抗c-Met抗体联用的治疗剂有关的 其它抗癌药的实例为HSP90抑制剂像17-烯丙基氨基格尔德霉素、针 对肿瘤抗原例如PSA、CA125、KSA、整联蛋白例如整联蛋白β1的 抗体，或VCAM的抑制剂。
可作为用于与治疗上述病症的抗c-Met抗体联用的治疗剂有关的 其它抗癌药的实例为钙调神经磷酸酶抑制剂(例如伐司朴达、PSC 833 和其它MDR-1或p-糖蛋白抑制剂)、TOR-抑制剂(例如西罗莫司、依 维莫司和雷帕霉素(rapamcyin))及“淋巴细胞归巢”机制的抑制剂(例如 FTY720)和对细胞信号转导具有作用的作用剂，例如黏着分子抑制剂 (例如抗LFA)。
在一个实施方案中，本发明的抗c-Met抗体与一种或多种其它治 疗性抗体联用，所述其它治疗性抗体例如奥法木单抗、扎木单抗、 daratumumab、雷珠单抗、Zenapax、Simulect、Remicade、Humira、 Tysabri、Xolair、依法珠单抗和/或利妥昔单抗。
可与本发明的抗体联用的其它治疗性抗体为与c-Met的其它区结 合的抗c-Met抗体，例如以下文献描述的抗体：WO2005016382、 WO2006015371、WO2007090807、WO2007126799或WO2009007427 (均通过引用结合到本文中)。
在另一个实施方案中，本文所述两种或更多种不同的本发明抗体 联用于疾病治疗。特别有益的组合包括两种或更多种非竞争性抗体。 这类联合疗法可导致每细胞结合的抗体分子数目增加，这可通过例如 补体介导的裂解的活化来提高功效。
除上述以外，本发明的联合疗法的其它实施方案包括如下方案：
●对于非小细胞肺癌的治疗，抗c-Met抗体与EGFR抑制剂(例如 抗EGFR抗体，例如扎芦木单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗或尼妥珠单 抗)或其它EGFR抑制剂(例如吉非替尼或埃罗替尼)组合，或与ErbB2 (Her2/neu)的抑制剂(例如抗HER2抗体，例如曲妥珠单抗、曲妥珠单 抗-DM1或培妥珠单抗)组合或与EGFR和HER2两者的抑制剂(例如拉 帕替尼)组合或与HER3抑制剂组合。
●对于神经胶质瘤的治疗，抗c-Met抗体与替莫唑胺或血管生成 抑制剂(例如贝伐单抗)组合。
●对于结肠直肠癌的治疗，抗c-Met抗体与选自以下的一种或多 种化合物组合：吉西他滨、贝伐单抗、FOLFOX、FOLFIRI、XELOX、IFL、奥沙利铂、伊立替康、5-FU/LV、卡培他滨、UFT、EGFR靶向 药，例如西妥昔单抗、帕尼单抗、扎芦木单抗；VEGF抑制剂或酪氨 酸激酶抑制剂(例如舒尼替尼)。
●对于前列腺癌的治疗，抗c-Met抗体与选自以下的一种或多种 化合物组合：激素/抗激素疗法；例如抗雄激素、促黄体激素释放激素 (LHRH)激动剂和化疗药物，例如紫杉烷类、米托蒽醌、雌莫司汀、5FU、 长春碱、伊沙匹隆。
放射治疗-手术
在一个实施方案中，本发明提供用于治疗受试者的涉及表达 c-Met的细胞的病症的方法，所述方法包括将治疗有效量的抗c-Met 抗体例如本发明的抗c-Met抗体和放射治疗给予有需要的受试者。
在一个实施方案中，本发明提供用于治疗或预防癌症的方法，所 述方法包括将治疗有效量的抗c-Met抗体例如本发明的抗c-Met抗体 和放射治疗给予有需要的受试者。
在一个实施方案中，本发明提供抗c-Met抗体例如本发明的抗 c-Met抗体用于制备待与放射治疗组合给予的用于治疗癌症的药物组 合物的用途。
放射治疗可包括放射或为患者提供放射性药品的伴随给予。放射 来源可为待治疗患者的外部或内部(放射治疗可呈例如外部射线放射 治疗(external beam radiationtherapy，EBRT)或近程治疗(BT)的形式)。 可用于实施这类方法的放射性元素包括例如镭、铯-137、铱-192、镅 -241、金-198、钴-57、铜-67、锝-99、碘-123、碘-131和铟-111。
在又一个实施方案中，本发明提供用于治疗或预防癌症的方法， 所述方法包括将治疗有效量的抗c-Met抗体例如本发明的抗c-Met抗 体结合手术给予有需要的受试者。
诊断应用
本发明的抗c-Met抗体还可用于诊断目的。因此，在又一方面， 本发明涉及包含本文定义的抗c-Met抗体的诊断组合物。
在一个实施方案中，可通过检测c-Met的水平或在其膜表面上含 有c-Met的细胞的水平，而在体内或体外使用本发明的抗c-Met抗体 诊断其中表达c-Met的活化细胞在发病机制中起积极作用的疾病。这 可通过例如使待测样品任选连同对照样品与抗c-Met抗体在允许在抗 体和c-Met之间形成复合物的条件下接触而实现。
因此，在又一方面，本发明涉及用于检测样品中c-Met抗原或表 达c-Met的细胞的存在情况的方法，所述方法包括：
-使样品与本发明的抗c-Met抗体在允许在抗体和c-Met之间形 成复合物的条件下接触；和
-分析是否形成复合物。
在一个实施方案中，在体外进行所述方法。
更具体地讲，本发明提供用于鉴定和诊断侵袭细胞和组织及被本 发明的抗c-Met抗体靶定的其它细胞和用于监测治疗性治疗的进程、 治疗后的状态、发生癌症的风险、癌症进程等的方法。
用于抗c-Met抗体的合适标记和/或用于这类技术的第二抗体是 本领域众所周知的。
在又一方面，本发明涉及用于检测样品中c-Met抗原或表达c-Met 的细胞的存在情况的试剂盒，所述试剂盒包括：
-本发明的抗c-Met抗体或本发明的双特异性分子；和
-试剂盒使用说明书。
在一个实施方案中，本发明提供用于诊断癌症的试剂盒，其包括 装有抗c-Met抗体和用于检测抗c-Met抗体和c-Met的结合的一种或 多种试剂的容器。试剂可包括例如荧光标签、酶标签或其它检测标签。 试剂还可包括用于酶促反应的第二或第三抗体或试剂，其中酶促反应 产生可观测的产物。
抗独特型抗体
在又一方面，本发明涉及与如本文所述的本发明抗c-Met抗体结 合的抗独特型抗体。
抗独特型(Id)抗体是识别一般与抗体的抗原结合部位相关的独特 决定簇的抗体。可通过用待针对其制备抗Id的mAb免疫与抗c-Met mAb来源相同的物种和遗传类型的动物，来制备Id抗体。经免疫的 动物通常可通过产生抗这些独特型决定簇的抗体(抗Id抗体)，识别免 疫抗体的独特型决定簇并对免疫抗体的独特型决定簇起反应。
抗Id抗体还可用作“免疫原”以在甚至另一种动物中诱导免疫应 答，产生所谓的抗抗Id抗体。抗抗Id在表位上可与起始mAb的相同， 这就诱导了抗Id。因此，通过使用抗mAb的独特型决定簇的抗体， 有可能鉴定表达相同特异性的抗体的其它克隆。
通过下列实施例对本发明作进一步说明，所述实施例不应解释为 是进一步限制性的。
实施例
实施例1：c-Met的表达构建体
在HEK或CHO细胞中，产生了用于表达c-Met、胞外结构域(ECD) (aa1-932和C端His6标签)或c-Met的SEMA结构域(aa 1-567和C端 His9标签)的密码子最优化构建体。由这些构建体编码的蛋白质与 c-Met的Genbank登记号NM 000245相同。构建体含有用于克隆的合 适限制位点和最佳Kozak序列(Kozak等(1999)Gene 234：187-208)。 在哺乳动物表达载体pEE13.4(Lonza Biologics)中克隆了构建体 (Bebbington(1992)Biotechnology(NY)10：169-175)，得到 pEE13.4cMet、pEE13.4cMetECDHis和pEE13.4cMetSEMA-567His8。 实施例2：5D5v1、5D5和G11-HZ的表达构建体
在HEK细胞中产生了表达IgG1抗体5D5v1、5D5和G11-HZ的 重链(HC)和轻链(LC)的密码子最优化构建体。对于5D5vl重链和轻 链，由这些构建体编码的蛋白质与美国专利6468529(序列编号3和 4)描述的那些相同，对于5D5重链和轻链，与WO2006/015371 A2(图13)中描述的那些相同，对于224G11重链和轻链，与WO 2009/007427 A2(序列从多个图中摘录)中描述的那些相同。224G11在本文亦称G11-HZ。
实施例3：HEK-293F细胞中的瞬时表达
FreestyleTM 293-F(一种适于悬浮生长和化学成分确定的Freestyle 培养基的HEK-293亚克隆(HEK-293F))细胞获自Invitrogen，按照生产 商的说明书使用293fectin(Invitrogen)，用合适的质粒DNA转染。通 过下述FACS分析，检测了c-Met的表达。在抗体表达的情况下，使 合适的重链和轻链表达载体共表达。
实施例4：CHO细胞中的瞬时表达
使用Freestyle MAX转染试剂(Invitrogen)，在FreestyleTM CHO-S (Invitrogen)细胞系中，使pEE13.4cMet瞬时转染。通过下述FACS分 析，检测了c-Met的表达。
实施例5：一价抗体(
Figure BDA0001367921440000541
分子)的克隆和表达
对于一价抗体在哺乳动物细胞中的表达，在哺乳动物表达载体 pcDNA3.3(Invitrogen)中合成失去铰链区(Ch)(氨基酸E99-P110)且在 CH3区含有2个突变F405T和Y407E的IgG4的HC恒定区作为密码 子最优化构建体，并命名为pUniTE。通过将人κ轻链区的密码子最 优化恒定区插入pcDNA3.3来构建单独的载体，并命名为pKappa。
将相关的VH和VL区分别插入pUniTE和pKappa，产生用于表 达特定抗体的重链和轻链的载体。HEK-293F(Invitrogen)细胞中特定 抗体的重链和轻链载体的共转染，导致具有所需特异性的一价抗体的 瞬时产生。采用A蛋白亲和柱层析法进行了纯化(参见实施例11)。
实施例6：加His标签的c-Met的纯化
使cMetECDHis和cMetSEMAHis在HEK-293F细胞中表达。 cMetECDHis和cMetSEMAHis中的His-标签使得能够用固定金属亲和 层析法纯化。在该方法中，固定在层析树脂的螯合剂荷有Co2+阳离子。 将含有cMetECDHis和cMetSEMAHis的上清液以成批方式(即溶液)与 树脂一起孵育。加His标签的蛋白质与树脂珠粒牢固结合，而存在于培 养物上清液中的其它蛋白质结合不牢。在孵育后，将珠粒从上清液中 回收，并塞进柱中。将柱洗涤，以除去弱结合的蛋白质。牢固结合的 cMetECDHis和cMetSEMAHis蛋白然后用含有咪唑的缓冲液洗脱，所 述咪唑与His竞争结合Co2+。通过在脱盐柱上进行缓冲液交换，从蛋白 质中除去洗脱液。
实施例7：转基因小鼠的免疫方法
从下列免疫中获得了抗体005、006、007、008、011、012、016、 017、022、024、025、028、031、035、039、040、045、093、095、 096、101和104：1只HCo20小鼠(1只雌性，品系GG2713)、1只 HCo17小鼠(雌性，品系GG2714)和2只HCo12-Balb/C小鼠(2只雌性， 品系GG2811)(Medarex，San José，CA，USA；有关参考文献参见上 文HuMab小鼠的段落、WO2009097006和US2005191293)每隔两周交 替地用5x106个NCI-H441肿瘤细胞腹膜内(IP)和20μg与半抗原镇眼 帽贝血蓝蛋白(KLH)偶联的cMetECDHis蛋白皮下(SC)免疫。
抗体058、061、062、063、064、065、066、068、069、078、082、 084、087、089、098和181从下列免疫中获得：2只HCo20小鼠(1 只雄性和1只雌性，品系GG2713)和1只HCo12-Balb/C小鼠(1只雄 性，品系GG2811)(Medarex，San José，CA，USA；有关参考文献参 见上文HuMab小鼠的段落)每隔两周交替用5x106个用cMetECD瞬时 转柒的CHO-K1SV细胞腹膜内(IP)和20μg与半抗原镇眼帽贝血蓝蛋 白(KLH)偶联的cMetECDHis蛋白皮下(SC)免疫。
每只小鼠最多进行8次免疫，4次IP，4次在尾底部的SC免疫。 用细胞的第一次免疫在完全弗氏佐剂(CFA；Difco Laboratories， Detroit，MI，USA)中进行。对于所有其它免疫，IP注射PBS中的细 胞，使用不完全弗氏佐剂(IFA；Difco Laboratories，Detroit，MI，USA)， SC注射KLH偶联的cMetECD。将小鼠融合，所述小鼠具有在实施例 8中描述的抗原特异性筛选FMAT测定法中检测到的200(1/200的血 清稀释度)或更高的至少两次相继c-Met特异性抗体效价。
实施例8：同质抗原特异性筛选测定法
采用荧光微体积测定技术(Fluorometric Micro volume Assay Technology，FMAT；Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)，通 过同质抗原特异性筛选测定法(4个象限)，测定经免疫的小鼠血清或 HuMab(人单克隆抗体)杂交瘤或转染瘤培养物上清液中抗c-Met抗体 的存在情况。为此，采用3次基于细胞的测定法和1次基于珠粒的测 定法的组合。在基于细胞的测定法中，测定了与TH1016-cMet(瞬时 表达c-Met受体的胞外结构域的HEK-293F细胞；如上所述产生)和 HT29(其在细胞表面上表达c-Met)以及HEK293野生型细胞(不表达 c-Met的阴性对照)的结合。对于基于珠粒的测定法，测定了与 SB1016-cMet(获自如上所述的瞬时转染的HEK-293F细胞、生物素化 并与链霉抗生物素蛋白涂覆的珠粒偶联的cMetECDHis)的结合。将样 品加到细胞/珠粒中以供与c-Met结合。随后，使用荧光缀合物(山羊 抗人IgG-Cy5；Jackson ImmunoResearch)，检测HuMab的结合。嵌合 的c-Met特异性抗体5D5v1(在HEK-293F细胞中产生)周作阳性对照， HuMab-小鼠合并血清和HuMab-KLH用作阴性对照。采用Applied Biosystems 8200细胞检测系统(8200CDS)筛选样品，‘计数x荧光’用 作读出。当计数高于50，且计数x荧光是阴性对照HuMab-KLH的至 少3倍时，规定样品为阳性。
实施例9：HuMab杂交瘤产生
将具有充分的抗原特异性效价发生(如上定义)的HuMab小鼠处 死，收集脾脏及腹主动脉和腔静脉两侧的淋巴结。基本上按照生产商 的说明书，使用CEEF 50电融合系统(Cyto Pulse Sciences，Glen Burnie， MD，USA)，通过电融合进行脾细胞和淋巴结细胞与小鼠骨髓瘤细胞 系的融合。用如上所述的抗原特异性结合测定法对融合板进行筛选， 来自该测定法中的阳性物在如下所述的ERK-磷酸化
Figure BDA0001367921440000561
Figure BDA0001367921440000562
测定法和亲和力分级Octet测定法(affinity ranking Octet assay) 中进行了测定。根据标准方案(例如参见Coligan J.E.，Bierer，B.E， Margulies，D.H.，Shevach，E.M.和Strober，W.主编.Current Protocols in Immunology，John Wiley&Sons，Inc.，2006)，对抗体031、035、087和 089进行了扩繁和培养。
平行地，采用ClonePix系统(Genetix，Hampshire，UK)，克隆了 抗体005、006、007、008、011、012、016、017、022、024、025、 028、035、039、040、045、058、061、062、063、064、065、066、 068、069、078、082、084、093、095、096、098、101、104和181。 将特定的初级孔(primarywell)杂交瘤接种在由40％CloneMedia (Genetix，Hampshire，UK)和60％HyQ 2x完全培养基(Hyclone， Waltham，USA)制成的半固体培养基中，从各初级孔中挑出约100个 亚克隆。在前述抗原特异性结合测定法中对亚克隆进行再测定，采用 Octet测量IgG水平，以选择每初级孔中最佳特异性和最多产的克隆 用于进一步扩繁。根据标准方案(例如参见ColiganJ.E.，Bierer，B.E.， Margulies，D.H.，Shevach，E.M.和Strober，W.主编.CurrentProtocols in Immunology，John Wiley&Sons，Inc.，2006)，进行所得HuMab杂交瘤 的进一步的扩繁和培养。
实施例10：纯化抗体的质谱分析
在Sciclone ALH 3000工作站(Caliper Lifesciences，Hopkinton， USA)中，使用含有G蛋白树脂的PhyTip柱(PhyNexus Inc.，San Jose， USA)，纯化了得自6孔或Hyperflask阶段的0.8ml小等分样的含有抗 体的杂交瘤上清液。按照生产商说明书使用PhyTip柱，但缓冲剂替换 为：结合缓冲液PBS(B.Braun，Medical B.V.，Oss，Netherlands)和洗 脱缓冲液0.1M甘氨酸-HCl pH 2.7(Fluka Riedel-de
Figure BDA0001367921440000571
Buchs， Germany)。在纯化后，样品用2M Tris-HCl pH 9.0(Sigma-Aldrich， Zwijndrecht，Netherlands)中和。或者，在某些情况下，较大体积的培 养物上清液使用A蛋白亲和柱层析法纯化。
在纯化后，将样品置于384孔板(Waters，100ul正方形孔板，零 件号186002631)。使样品在37℃去糖基化过夜，其中将N-糖苷酶F. DTT(15mg/mL)加入(1μl/孔)，并在37℃下温育1小时。在具有BEH300 C18，1.7μm，2.1x 50mm柱的Acquity UPLCTM(Waters， Milford，USA)上，使样品(5或6ul)在60℃下脱盐。两者都具有0.1％ 甲酸(Fluka，目录号56302，Buchs，Germany)的MQ水和LC-MS级 乙腈(Biosolve，目录号01204101，Valkenswaard，Netherlands)分别用 作洗脱液(Eluens)A和B。在以阳离子模式操作的micrOTOFTM质谱仪(Bruker，Bremen，Germany)上，在线记录飞行时间电喷雾电离质谱。 在分析前，900-3000m/z标度用ES调谐混合物(tuning mix)(Agilent Technologies，Santa Clara，USA)校准。应用检索介于5和80kDa之 间的分子量的最大熵(Maximal Entropy)算法，用DataAnalysisTM软件 3.4版(Bruker)对质谱去卷积。
去卷积后，比较所得的所有样品的重链和轻链质量以找出完全一 致的抗体。在比较重链时，要考虑可能存在的C端赖氨酸变体。这便 产生了独特抗体的清单，其中独特定义为重链和轻链的唯一组合。假 使发现完全一致的抗体，则使用其它试验的结果以决定哪一个抗体是 继续实验的最佳材料。
实施例11：抗c-Met抗体可变结构域的序列分析和在表达载体中的克 隆
自5x106个杂交瘤细胞制备抗c-Met HuMab的总RNA，并按照生 产商的说明书，使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)，自 100ng总RNA制备5’-RACE-互补DNA(cDNA)。VH(重链可变区) 和VL(轻链可变区)编码区通过PCR扩增，并采用不依赖于连接的克 隆策略(Aslanidis等.1990Nucleic Acids Res.18：6069-6074)，符合读框 地克隆至恒定区载体pG1f(在哺乳动物表达载体pEE6.4(Lonza Biologics，Slough，UK(Bebbington等(1992)Biotechnology 10：169-175) 中含有密码子最优化的完全合成的人IgG1的重链恒定区(同种异型f)) 和pKappa(在哺乳动物表达载体pEE12.4(Lonza Biologics，Slough， UK(Bebbington等(1992)Biotechnology 10：169-175)中含有密码子最优 化的完全合成的人κ轻链的恒定区(同种异型Km3))。对于各种HuMab，对12个VL克隆和8个VH克隆进行测序，计算其理论质量， 并与可获得的抗体质谱分析数据进行比较。在序列表和本文的下表1 中给出序列。按照Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.Public Health Service，National Institutes of Health， Bethesda，MD.(1991)定义CDR序列。表2和表3给出抗体序列信息 和最同源种系序列概观。
表1：HuMab的重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)和CDR序列
Figure BDA0001367921440000591
Figure BDA0001367921440000601
Figure BDA0001367921440000611
Figure BDA0001367921440000621
Figure BDA0001367921440000631
Figure BDA0001367921440000641
Figure BDA0001367921440000651
Figure BDA0001367921440000661
Figure BDA0001367921440000671
Figure BDA0001367921440000681
Figure BDA0001367921440000691
Figure BDA0001367921440000701
表2：小鼠来源和重链序列同源性
抗体： 小鼠编号： 小鼠品系： 种系VH：
TH1016-005 339732 HCo12B，C1 IgHV1-69-4
TH1016-006 339732 HCo12B，C1 IgHV1-69-4
TH1016-008 339732 HCo12B，C1 IgHV5-51-1
TH1016-022 339733 HCo12B，C1 IgHV3-30-3*1
TH1016-024 339733 HCo12B，C1 IgHV3-23-1
TH1016-035-D09 339732 HCo12B，C1 IgHV5-51-1
TH1016-045 339282 HCo17，C1 IgHV3-23-1
TH1016-058 343191 HCo12B，C2 IgHV3-11-3
TH1016-061 348072 HCo20，C2 IgHV4-30-2*1
TH1016-062 348072 HCo20，C2 IgHV4-30-2*1
TH1016-064 348072 HCo20，C2 IgHV4-30-2*1
TH1016-068 348072 HCo20，C2 IgHV4-30-2*1
TH1016-069 348072 HCo20，C2 IgHV1-18-1
TH1016-096 339732 HCo12B，C1 IgHV5-51-1
TH1016-098 347330 HCo20，C2 IgHV1-18-1
TH1016-101 340659 HCo20，C1 IgHV1-18-1
TH1016-181 348072 HCo20，C2 IgHV1-18-1
表3：小鼠来源和轻链序列同源性
Figure BDA0001367921440000702
Figure BDA0001367921440000711
图1和图2给出HuMab序列的比对。根据这些序列，可为一些CDR 序列确定共有序列。表4中给出这些共有序列。
表4：共有序列
Figure BDA0001367921440000712
Figure BDA0001367921440000721
Figure BDA0001367921440000731
实施例12：抗体的纯化
将培养物上清液经0.2μm死端滤器过滤，并上样到5ml MabSelect SuRe柱(GEHealth Care)上，用0.1M柠檬酸钠-NaOH(pH 3) 洗脱。洗脱物立即用2M Tris-HCl(pH 9)中和，并针对12.6mM NaH2PO4、140mM NaCl，pH 7.4(B.Braun)透析过夜。或者，纯化后， 将洗脱物上样到HiPrep脱盐柱上，抗体经交换至12.6mM NaH2PO4、 140mM NaCl，pH 7.4(B.Braun)缓冲液中。在透析或缓冲液交换后， 使样品经0.2μm死端滤器除菌过滤。通过SDS-PAGE测定纯度，通 过浊度测定法和280nm下的吸光度测量浓度。将纯化抗体保存在4℃ 下。如实施例10中的描述，进行质谱分析以鉴定由杂交瘤表达的抗 体重链和轻链的分子质量。
实施例13：通过FACS分析测量的抗c-Met克隆与表达膜结合的c-Met 的肿瘤细胞的结合
采用流式细胞术(FACS Canto II，BD Biosciences)，测试抗c-Met 抗体及其一价形式(本文亦称“UniBody分子”，参见实施例5)与表达膜 结合的c-Met的A431细胞(购自ATCC，CRL-1555)的结合。Qifi分析 (Dako，Glostrup，Denmark)显示，A431细胞平均表达30,000个拷贝 的c-Met蛋白/细胞。使用藻红蛋白缀合的山羊-抗人IgG抗体(Jackson)， 检测抗c-Met抗体和UniBody分子的结合。IgG1-5D5用作阳性对照抗 体，HuMab-KLH用作同种型对照抗体。应用GraphPad Prism V4.03 软件(GraphPad Software，San Diego，CA，USA)，通过非线性回归(具 有可变斜率的s形剂量反应)，求出EC50值。
图3表示所有所测抗c-Met抗体和UniBody分子以剂量依赖方式 与A431细胞上表达的c-Met结合。对于IgG，结合的ECs0值在0.28-1.92 nM之间变化，对于UniBody分子则在0.52-13.89nM之间变化。有趣 的是，抗体IgG1-024表明与A431细胞的高不饱和结合水平，这在测 定与HT-29细胞(购自ATCC，HTB-38TM)的结合时未观察到(数据未显 示)。对于抗体022、024、062、064、069、098、101和181，在相同 克隆的IgG1和UniBody分子间未观察到EC50值减少或观察到低于2 倍减少的EC50值。另外，在IgG1和UniBody分子之间最大结合水平 未改变。另一方面，对于抗体005、006、008、035、045和058，当 将IgG1与其UniBody对应物比较时，观察到EC50值超过2倍的降低 以及最大结合水平降低。这非常可能是由于这些抗体较低的解离速率 (Kd)所致(参见实施例14)。
实施例14：亲和力分级Octet测定法
在Octet系统(Fortebio，Menlo Park，USA)中，通过生物层干涉 测量(Bio-LayerInterferometry，BLI)技术对抗体与cMetECDHis的结合 进行分析。按照生产商推荐的方法，使用抗人IgG涂覆的生物传感器 (Fc特异性)来俘获抗c-Met抗体。通过带负载的生物传感器置于含有 10μg/mL在10倍稀释的动力学缓冲液(Fortebio)中稀释的 cMetECDHis的孔中，而将来源于HEK293细胞的cMetECDHis加载 到固定的抗c-Met抗体之上。在约10分钟时间内，实时测量由 cMetECDHis结合引起的生物传感器表面上光反射的差异(Δλ，nm)， 并将其用来通过Octet软件(V4.0，Fortebio)计算缔合常数(ka[1/M x s])。 接下来，将带负载的生物传感器置于只含有动力学缓冲液(10倍稀释 于PBS)的孔中以测定解离常数(kd[l/s])。使用模型1∶1(langmuir)，进 行动力学分析，测定亲和力(KD[M])。作为阳性对照，使用0.2μg/mL 在HEK293细胞中产生的5D5IgG1。
表5显示所有与cMetECDHis结合的抗c-Met抗体具有0.6-13.9 nM范围内的纳摩尔亲和力。
表5：与cMetECDHis结合的抗体的动力学常数(ka、kd和KD)
Figure BDA0001367921440000751
Figure BDA0001367921440000761
除5D5以外，各样品测量一次
实施例15：通过FACS分析测量的抗c-Met抗体与猕猴上皮细胞上表 达的膜结合的c-Met的结合
为了测定与猕猴c-Met的交叉反应性，采用流式细胞计(FACS Canto II，BDBiosciences)，测定了抗c-Met抗体与c-Met阳性猕猴上 皮细胞(4MBr-5，购自ATCC)的结合。藻红蛋白缀合的山羊-抗人IgG 抗体(Jackson)用作第二缀合物。HuMab-KLH用作同种型对照抗体。
图4表明，所有所测抗c-Met抗体与猕猴c-Met有交叉反应。在 两个所测量的浓度(0.5μg/mL和10μg/mL)下，抗c-Met抗体能够与猕 猴c-Met特异性结合。对于所有抗体，信号是同种型对照抗体 HuMab-KLH的至少5倍。有趣的是，与其它c-Met特异性抗体相比，P1016-035表明高得多的顶部荧光水平(MFI约为200.000)。在表达人 c-Met受体的细胞系中未观察到这种差异。
实施例16：用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定的HGF与c-Met胞外 结构域的结合的阻断
进行了ELISA，以分析抗c-Met抗体是否可阻断肝细胞生长因子 (HGF)与c-Met受体的结合。为此，将涂覆的c-Met的胞外结构域与未 标记的抗c-Met抗体和荧光标记的HGF一起温育。非阻断抗体不与标 记的HGF竞争结合c-Met，导致最大荧光信号。阻断抗体与标记的 HGF竞争结合c-Met，导致荧光信号减弱。
HGF(ProSpec Tany，Rehovot，Israel)通过与铕3+(PerkinElmer， Turku，Finland)缀合来进行荧光标记。ELISA孔用0.5μg/mL在PBS 中稀释的重组人c-Met胞外结构域(R&Dsystems，Minneapolis，USA) 在4℃下包被过夜。接下来，ELISA孔用PBST(补充0.05％吐温-20 [Sigma-Aldrich，Zwijndrecht，Netherlands])的PBS)洗涤，并用补充2％ (v/v)鸡血清(Gibco，Paisley，Scotland)的PBST在室温(RT)下封闭1小 时。在用PBST洗涤后，ELISA孔用50μL系列稀释的抗c-Met抗体 (0.128-10,000ng/mL，5倍稀释)和50μL 0.44μg/mL铕3+缀合的 HGF/PBST的混合物在室温下避光温育1小时，接下来，用PBST洗 去未结合的铕3+缀合的HGF，结合的铕3+缀合的HGF用Delfia增强 溶液(Enhancement Solution)(PerkinElmer)在室温下避光温育30分钟 以增强荧光信号。应用下列设置，采用EnVision 2101Multilabel读数 器(PerkinElmer)测量615nm下的平均荧光强度：Lance/Delfia双反射 镜，发射光滤光片615，激发光滤光片340nm，延迟时间400μs，窗 口400μs，100闪光，2000μs/周期和双向按行读出。为了测定IC50值， 应用GraphPad Prism V4.03软件(GraphPad Software，SanDiego，CA， USA)，用非线性回归(具有可变斜率的s形剂量反应，对于所有数据 集，最高值受分摊值约束)分析结合曲线。
图5表示针对与重组人c-Met胞外结构域的结合的抗c-Met抗体 的HGF结合抑制曲线的代表性实例。5D5用作阳性对照抗体。所示 实验中所有抗c-Met抗体能够与铕3+缀合的HGF竞争结合重组c-Met。 IC50值在0.0011-0.0794μg/mL之间变化。在未加入铕3+缀合的HGF的情况下，检测到大致约600相对荧光单位(RFU)，表明实现最大抑 制时的信号。如果铕3+缀合的HGF的结合未被抑制，则检测到约66,000 RFU。抗体005、006、058、101和阳性对照抗体5D5能够抑制84.5-92.1％ 的HGF与c-Met受体结合。所有其它抗体都能够抑制至少55％的HGF 与c-Met结合。由于HGF可在SEMA结构域和Ig区两者上与c-Met 受体结合，因此一些抗体可只抑制这些相互作用之一。为了确定哪种 互相作用受抑制，进行了时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)测定 法的基于cMetSEMAHis的抑制。
实施例17：用夹心-ELISA测量的抗c-Met抗体对与可溶性 cMetECDHis的结合的竞争
首先，确定受测抗c-Met抗体的最佳涂覆浓度和最佳cMetECDHis 浓度。为此，ELISA孔用系列稀释于PBS(8μg/mL，2倍稀释)的抗c-Met HuMab在4℃下包被过夜。接下来，ELISA孔用PBST(补充0.05％吐 温-20[Sigma-Aldrich，Zwijndrecht，Netherlands]的PBS)洗涤，在室温 (RT)下用PBSTC(补充2％[v/v]鸡血清[Gibco，Paisley，Scotland]的 PBST)封闭1小时。随后，ELISA孔用PBST洗涤，与系列稀释于PBSTC (1μg/mL，2倍稀释)的生物素化cMetECDHis一起在室温下温育1小 时。用PBST洗去未结合的生物素化cMetECDHis，将结合的生物素 化cMetECDHis与0.1μg/mL稀释于PBST的链霉抗生物素蛋白-聚 HR(Sanquin，Amsterdam，Netherlands)一起在室温下温育1小时。 洗涤后，通过与2，2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS：将 1小片ABTS稀释于50mL ABTS缓冲液[Roche Diagnostics，Almere， Netherlands])在室温下避光温育15分钟可视化反应。通过加入等体积 的草酸(Sigma-Aldrich，Zwijndrecht，Netherlands)终止显色。在微量滴 定板读数器(BiotekInstruments，Winooski，USA)上测量405nm下的 荧光。确定了导致各抗体的亚最佳(约80％)结合的条件，并将其用于 下列交叉阻断实验。
在以上述亚最佳剂量下用抗c-Met抗体包被ELISA孔。在封闭 ELISA孔后，将它们在过量的抗c-Met抗体存在下，与预定浓度的生 物素化cMetECDHis一起温育。如上所述使反应显色。残余结合表示 为相对于在缺乏竞争剂抗体下观察到的结合的百分比。
表6：当作为竞争剂加入时，所有抗c-Met抗体能够与其固定化 对应物竞争结合。022、058和5D5当作为竞争剂抗体加入时，与抗 体005和006竞争。然而，逆向反应显示抗体005和006仅部分竞争。 这些差异可通过抗体005和006对生物素化cMetECDHis的较低亲和力来解释。抗体5D5当作为竞争剂抗体加入时，同样显示与抗体008 和045的部分竞争，而在逆向反应中观察到无竞争或最低竞争。另外， 抗体024、062、064、068和181当作为竞争剂抗体加入时，显示与 抗体101部分竞争，而逆向反应表明完全抑制cMetECDHis结合。高 于100％的值可通过亲合力作用和含有两个非竞争抗体的抗体 -cMetECDHis复合物的形成来解释。
抗体024、062、064、068、069、098、101和181相互竞争结合 cMetECDHis。抗体005、006、022和058被认为属于一个交叉阻断组， 即特征在于与005、006、022、058和5D5完全竞争的一个组。然而， 抗体5D5是还能够竞争结合抗体045的唯一抗体。竞争结合 cMetECDHis的抗体的另一个组由008、035和G11-HZ构成。
表6：抗c-Met抗体对结合生物素化cMetECDHis的竞争
竞争抗体
Figure BDA0001367921440000801
Figure BDA0001367921440000802
Figure BDA0001367921440000803
Figure BDA0001367921440000804
竞争抗体
Figure BDA0001367921440000811
所示数据为3次独立实验的结合的抑制百分比±标准差。对于抗 体035、5D5和G11-HZ，交叉阻断ELISA只进行了两次。另外，许 多竞争反应(*)导致高于5.0的最佳密度值，其高出ELISA读数器的检 出限。这些结果从导致产生一式两份测量结果的分析中弃去。
实施例18：通过时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)测定的与 cMetSEMA-567His8的HGF结合的阻断
HGF可在SEMA结构域和IgG-区两者上结合c-Met受体。然而， 发现仅与SEMA结构域结合的HGF对受体活化是至关重要的。为此， 采用TR-FRET技术，对抗c-Met抗体与c-Met受体的SEMA结构域 的相互作用进行了研究。为了进行这种基于均相邻近的测定法，使肝 细胞生长因子(HGF，ProSpec Tany，Rehovot，Israel)与荧光受体染料 AlexaFluor-647(Invitrogen，Breda，Netherlands)缀合。 cMetSEMA-567His8用针对组氨酸标签的荧光供体分子(抗6xhis铕3+， PerkinElmer，Turku，Finland)标记。AlexaFluor-647缀合的HGF与铕3+-标记的cMetSEMA-567His8的结合使得能够将供体分子(激发340 nm)能量转移到受体分子(发射665nm)。在EnVision 2101Multilabel 读数器(PerkinElmer)上测量665nm下的平均荧光强度。通过665nm 下TR-FRET信号的降低，测量未标记的抗c-Met抗体与AlexaFluor-647 缀合的HGF的竞争，因为在未结合状态下，供体和受体荧光团之间 的距离太大以致不能发生能量转移。
所有稀释均在补充2.67％稳定剂溶液(PerkinElmer)和0.03％(v/v) 吐温-20(Riedel de Haen，Seelze，Germany)的0.5x Lance检测缓冲液 (PerkinElmer)中进行。将25μL cMetSEMA-567His8加入25μL AlexaFluor-647缀合的HGF中，将25μL抗6xhis铕3+和25μL未标 记的抗c-Met抗体加到96孔opti-white板(PerkinElmer)中。得到2.93 μg/mLcMetSEMA-567His8、0.96μg/mL AlexaFluor-647缀合的HGF 和0.4μg/mL抗6×his铕3+的终浓度。测定了0.49-8000ng/mL范围内 的4倍系列稀释的未标记的抗c-Met抗体。在4℃下避光温育过夜后， 应用下列设置，使用EnVision 2101Multilabel读数器测量665nm下 的平均荧光强度：Lance/Delfia双反射镜，发射光滤光片615-665nm， 激发光滤光片320nm，延迟时间60μs，窗口100μs，100闪光，2000 μs/周期和双向按行读出。为了测定IC50值，应用GraphPad Prism V4.03 软件(GraphPad Software，San Diego，CA，USA)，用非线性回归(具有 可变斜率的s形剂量反应)，分析结合曲线。
图6显示针对与cMetSEMA_567His8的结合用TR-FRET测定的 各种抗c-Met抗体的HGF结合抑制曲线。除抗体008、035和096以 外，所有抗体均能够与AlexaFluor-647缀合的HGF竞争结合 cMetSEMA-567His8。抗体022能够抑制约80％HGF结合，而抗体005、 006、024、045、058、061、062、064、068、069、098、101、181和 阳性对照抗体5D5能够抑制＞90％的cMetSEMA-567His8的HGF结 合。测定了IC50值，其范围为0.082-0.623μg/mL范围。
表7：针对与cMetSEMA-567His8的结合用TR-FRET测定的抗c-Met 抗体的IC50值(μg/mL)和配体抑制百分比
Figure BDA0001367921440000831
所示数据为3个独立实验的平均MFI。
实施例19：KP4存活力测定法
针对其抑制KP4细胞(Riken BioResource Center Cell Bank， RCB1005)存活力的能力，对c-Met抗体进行测定。将以自分泌方式表 达高水平的c-Met和HGF两者的KP4细胞接种在96孔组织培养板 (Greiner bio-one，Frickenhausen，Germany)(10,000个细胞/孔)内的无 血清培养基(1份HAM’s F12K[Cambrex，East Rutherford，New Jersey] 和1份DMEM[Cambrex])中。在无血清培养基中制备66.7nM抗c-Met 抗体稀释液，并加到细胞中。3天孵育后，按照生产商说明书，用 Alamarblue (BioSource International，San Francisco，US)定量测定活细 胞的量。采用具有标准Alamarblue设置的EnVision 2101Multilabel读数器(PerkinElmer，Turku，Finland)，监测荧光。将抗体处理的细胞的 Alamarblue信号作图为与未处理细胞相比的信号百分比。
图7表示与未处理的细胞(0％)相比，在抗c-Met抗体处理后活的 KP4细胞的抑制百分比。用方框标出的克隆是如实施例17所述彼此 交叉竞争的抗体。有趣的是，属于相同交叉阻断组的抗体024、062、 064、068、069、098、101和181，均能够作为IgG1和作为UniBody分子两者抑制KP4存活力(18-46％)。另外，抗体008、061和096的 IgG1分子能够抑制KP4存活力。相比之下，抗体045在作为IgG1和 UniBody分子时都不抑制KP4存活力。对于Uni-1016-045-TE，这可 能是由于其对膜结合的c-Met的低表观亲和力(如通过FACS分析(实 施例13)所测量)所致。克隆005、006、022和058的IgG1抗体不显 著抑制KP4存活力，而Uni-1016-022-TE、Uni-1016-058-TE和 IgG1-1016-058-wtFab的确分别抑制57％、38％和44％的KP4存活力。 Uni-1016-005和Uni-1016-006还与克隆022和058交叉竞争，但却不 显著抑制KP4存活力。这可能是由于其低表观亲和力(如通过FACS 分析(实施例13)所测的)引起的。有趣的是，IgG4-1016-058也表明对 KP4存活力的某种抑制。这在用IgG4-5D5时未观察到。
总的来说，数据表明对于某些交叉阻断组，需要一价结合来抑制 KP4存活力，而对于其它交叉阻断组，一价和二价结合抗体两者均可 抑制KP4存活力。
实施例20：SCID小鼠KP4异种移植肿瘤模型
进行了在SCID小鼠中的KP4异种移植肿瘤模型以测定抗c-Met HuMab体内抑制肿瘤生长的功效。7-11周龄雌性SCID-小鼠，品系 C.B-17/IcrPrkdc-scid/CRL购自CharlesRiver Laboratories Nederland (Maastricht，Netherlands)，饲养在滤盖(filter-top)笼中的无菌条件下， 任意供食供水。放置微晶片(PLEXX BV，Elst，Netherlands)用于小鼠识别。所有实验都经Utrecht University动物伦理委员会批准。
在第0天，将200μl PBS中的10x106个KP4细胞皮下接种到右 胁。每周至少两次检查小鼠的临床疾病体征。一周至少一次测定肿瘤 大小。从第16天开始，由测径器(PLEXX)测量值计算体积(mm3)为0.52 x(长)x(宽)2。在第9天，测量平均肿瘤大小，把小鼠分为8组，每组各7只小鼠。腹膜内注射抗c-Met抗体(008、058、069和098)。抗 体G11-HZ用作阳性对照抗体，而5D5和同种型-对照抗体用作阴性对 照抗体。小鼠接受400μg/小鼠的负荷剂量，接着一周一次200μg/小 鼠的维持剂量持续7周时间。
另外，在给予第1次、第3次和第5次维持剂量前和处死小鼠时， 收集血浆样品，在BNII浊度计(Dade Behring，Atterbury，UK)上使用 胶乳珠粒证实人IgG的存在。
图8和图9表示KP4细胞的肿瘤生长受HuMab 008、069、098 和阳性对照G11-HZ抑制。将该抑制与同种型-对照抗体的治疗作比 较。KP4细胞的肿瘤生长延迟，但不被对照抗体G11-HZ完全抑制。 与克隆008和G11-HZ相比，克隆069和098显示更有效的抑制。抗 体5D5和058不抑制肿瘤生长。这与实施例19所述体外数据一致。 总之，这些数据表明，对于某些交叉阻断组，二价结合抗体可抑制 KP4肿瘤生长。
实施例21：MKN45异种移植肿瘤模型
使用裸小鼠人胃腺癌MKN45异种移植肿瘤模型以测定抗c-Met HuMab体内抑制肿瘤生长的功效。
将人MKN45胃腺癌细胞在37℃和5％CO2下培养在含有100单 位/mL青霉素G钠、100μg/mL硫酸链霉素、25μg/mL庆大霉素、20％ 胎牛血清和2mM谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中。使用7-8周龄雌 性裸小鼠(nu/nu，Harlan)(开始研究时体重范围为17.0-26.4g)。动物任 意提供水和食物。把小鼠关养在符合实验动物护理与使用指南(Guide for Care andUse of Laboratory Animal)建议的条件下。动物护理与使用 规程经由AAALAC认可。在第0天，将200μl 50％基质胶/PBS中的 1x10e7个MKN45细胞皮下接种在各小鼠的胁腹。在第7天，把平均 肿瘤体积80-120mm3的动物分成5组(n＝10)，并开始治疗。将抗c-Met 抗体(008、058、069)注射至尾静脉(iv)。抗体G11-HZ用作阳性对照 抗体，同种型对照抗体用作阴性对照抗体。所有小鼠在第7天接受40 mg/kg抗体，在第14、21和28天接受20mg/kg抗体。
使用测径器一周两次测量肿瘤，直到终点肿瘤体积为700mm3或 直到研究结束(第62天)。图10和图11表示与用同种型对照抗体的治 疗相比，MKN45细胞的肿瘤生长被抗体008、058、069和对照抗体 G11-HZ显著延迟。
实施例22：通过降低构象柔性降低IgG1 c-Met抗体的残余激动活性
c-Met的天然配体HGF是诱导两个c-Met分子二聚化的功能二聚 体。c-Met的胞内结构域随后的胞内磷酸化导致参与细胞增殖、侵袭 和存活的若干信号转导途径活化。针对c-Met产生的大多数二价抗体 显示同HGF对细胞命运相当的作用，尤其当抗体的结合表位接近或 位于c-Met的SEMA结构域时。
为了将二价IgG1抗体潜在的残余激动活性降到最低，采用了降 低构象柔性的策略。在IgG1中，对于Fab臂相对于Fc结构域运动有 大的自由度。最大的构象变化是铰链的柔性的结果，铰链的柔性允许 各种Fab-Fc角度(Ollmann Saphire，E.，R.L.Stanfield，M.D.M.Crispin， P.W.H.I.Parren，P.M.Rudd，R.A.Dwek，D.R.Burton和I.A.Wilson.2002.Contrasting IgG structures reveal extreme asymmetry and flexibility (对比IgG结构显示极不对称性和柔性).J.Mol.Biol.319：9-18)。降低 免疫球蛋白中Fab臂柔性的一种方法是通过遗传修饰防止在轻链和重 链间形成二硫键。在天然IgG1抗体中，轻链通过二硫键与重链共价 连接，所述二硫键将轻链的C端半胱氨酸与重链Fc铰链220位(C220EU编号)上的半胱氨酸连接。通过使氨基酸C220突变成丝氨酸或任 何其它天然氨基酸、通过除去C220、通过除去完整铰链或通过用IgG3 铰链置换IgG1铰链，形成这样的分子，其中轻链通过其C端半胱氨 酸连接，这类似于人同种型IgA2m(1)中存在的情形。这就导致Fab相对于Fc的柔性降低，因此交联能力降低，如KP4存活力测定法中用 激动剂性c-Met抗体(5D5)的IgA2m(1)和IgG1形式的比较研究所示(图 12)。
降低IgG1分子的柔性的另一种策略是用IgG2铰链或IgG2样铰 链置换IgG1铰链。(Dangl等.EMBO J.1988；7：1989-94)。该铰链区 具有与IgG1的性质截然不同的两种性质，其被认为赋予分子较少的 柔性。首先，与IgG1铰链相比，IgG2铰链短3个氨基酸。其次，IgG2铰链含有额外的半胱氨酸，因此可形成3个而非2个重链间二硫桥。 或者，可引入类似于IgG2铰链的IgG1铰链的变体。该突变体(TH7Δ6-9) (WO2010063746)含有突变T223C和2个缺失(K222和T225)，以产生 具有额外半胱氨酸的较短铰链。
实施例23：柔性降低的IgG1分子(刚化IgG1分子)的产生
克隆和表达
采用标准分子生物学技术，设计并克隆突变体IgG1抗体。所有 产生的铰链区突变的序列的概况见下表8。
表8：突变体IgG1抗体铰链的氨基酸序列。缺失用′-′标记，突变用下 划线表示。
Figure BDA0001367921440000871
对于所得刚化IgG1抗体在哺乳动物细胞中的表达，合成了在铰 链区含有突变(参见上表8)的IgG1的HC恒定区作为哺乳动物表达载 体pcDNA3.3(Invitrogen)中的密码子最优化的构建体。通过将人κ轻 链区的密码子最优化恒定区插入pcDNA3.3来构建独立的载体。将克 隆069和对照抗体5D5的VH和VL区分别插入HC恒定质粒和κ轻 链质粒，产生用于特定抗体的(突变的)重链和轻链表达的载体。 HEK-293F(Invitrogen)细胞中特定抗体的重链和轻链载体的共转染导 致突变体抗体的瞬时产生。使用A蛋白亲和柱层析法进行了抗体纯化 (参见实施例11)。
生物化学表征
瞬时表达
如通过MS(＞99％纯度)和SDS-PAGE所测定，所有突变体以充足 水平表达，未显示多聚体的异常形成。
SDS-PAGE结果见图13。在C220突变体(C220S和ΔC220)和铰 链缺失的IgG1变体(铰链缺失的IgG1变体亦称为UniBody-IgG1或 Uni-IgG1)中观察到轻链配对，在非还原SDS-PAGE分析中显现为大 约50kD的蛋白质条带。具有IgG3铰链的变体也显示轻链配对，而具有IgG2铰链的变体和IgG1 TH7Δ6-9突变体显示正常的轻链-重链 配对。
实施例24：突变体的c-Met结合性质
在ELISA中测定了突变体的c-Met结合性质。ELISA板孔用PBS中 的rhHGF R/Fc嵌合体(R&D Systems；目录358MT/CF)(1μg/mL)在4℃ 下包被过夜。接下来，各孔用PBST(补充0.05％吐温-20[Sigma-Aldrich， Zwijndrecht，Netherlands]的PBS)洗涤，在室温(RT)下用PBSTC(补充 2％[v/v]鸡血清[Gibco，Paisley，Scotland]的PBST)封闭1小时。随后， 各孔用PBST洗涤，与在PBSTC中系列稀释的抗cMet抗体和变体(10 μg/mL，4倍稀释)一起在室温下温育1小时。用PBST洗去未结合的抗体， 通过与稀释于PBST中的山羊-抗人IgG F(ab′)2-HR(Jackson目录号 109-035-097)一起在室温下温育1小时，检测与包被物(coat)结合的抗 体。洗涤后，通过与2，2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS： 将1小片ABTS稀释于50mL ABTS缓冲液[Roche Diagnostics，Almere， Netherlands])一起在室温下避光温育15分钟来显现反应。通过加入等 体积的草酸(Sigma-Aldrich，Zwijndrecht，Netherlands)终止显色。在微 量滴定板读数器(Biotek Instruments，Winooski，USA)上测量405nm下 的荧光。所有结合的突变体对c-Met具有相当的表观亲和力(EC50)(图 14)。表10显示本实验中得到的突变体的EC50值。
表9：通过ELISA测定的EC50值
Figure BDA0001367921440000891
实施例25：刚化IgG1 c-Met抗体的激动作用降低
受体磷酸化
为了测定刚化抗体的激动性质，进行了抗体对cMet磷酸化的作 用。在两个相邻cMet受体通过天然配体HGF或大多数二价抗体二聚 化时，c-Met的胞内结构域中的3个酪氨酸残基(1230、1234和1235 位)交叉磷酸化，其接下来是胞内结构域中若干其它氨基酸随后的磷酸 化和多个信号转导级联的活化。因此可通过对这些位置上的磷酸化受 体有特异性的抗体，来监测cMet的二聚化和活化，因此其用作抗c-Met 抗体潜在激动作用(agonism)的读出。
使A549细胞(获自ATCC的CCL-185)生长在含血清DMEM培养 基中直到达到70％汇合。在胰蛋白酶消化和洗涤细胞后，将其以 1*10e6个细胞/孔接种在6孔培养板的含血清培养基中。在隔夜温育 后，将细胞用HGF(R&D systems；目录294-HG)(50ng/mL)或抗体组 (30μg/mL)处理，并在37℃下温育15分钟。细胞然后用冰冷的PBS 洗涤两次，用补充蛋白酶抑制剂混合物(Roche；目录11836170001)的 裂解缓冲液(Cell Signaling；目录9803)裂解，将样品保存在-80℃下。 通过使用磷酸c-Met特异性抗体经蛋白质印迹测量磷酸化来测定受体 活化。细胞裂解物中的蛋白质在4-12％SDS-PAGE凝胶上分离后，转 移到硝酸纤维素膜上，随后用对磷酸化c-Met(Y1234/1235)有特异性 的抗体(Cell Signaling，目录3129)染色。为了控制凝胶上样，使用抗 总c-Met和β-肌动蛋白的抗体。蛋白质印迹的结果见图15。
组织培养基对照和用抗体5D5的一价形式UniBody处理的细胞 未显示受体的磷酸化。相比之下，用阳性对照HGF或激动剂抗体 IgG1-1016-058处理的细胞的蛋白质印迹分析在预期高度显示明显条 带。抗体IgG1-1016-069显示低但可检出的受体磷酸化，这就表明发 生了一些受体交联。然而，经设计以降低抗体分子柔性的变体显示最 小受体活化，其水平下至相当于用一价对照Uni-5D5-TE处理的细胞 中检测的水平。(图15)。
体外c-Met抗体对NCI-H441增殖的作用
使用表达高水平hc-Met，但不产生其配体HGF的肺腺癌细胞系 NCI-H441(ATCC，HTB-174TM)，来测定cMet抗体的潜在增殖激动活 性。将NCI-H441细胞接种至96孔组织培养板(Greiner bio-one， Frickenhausen，Germany)(5，000细胞/孔)的无血清RPMI(Lonza)中。 在无血清RPMI中制备抗c-Met抗体稀释液(66.7nM)，并加到细胞中。 在37℃/5％CO2下温育7天后，按照生产商说明书，用Alamarblue (BioSource International，SanFrancisco，US)定量测定活细胞的量。使 用具有标准A1amarblue设置的EnVision 2101Multilabel读数器 (PerkinElmer，Turku，Finland)监测荧光。
从图17中显而易见，NCI-H441细胞的增殖受激动性对照mAb IgG1-058和IgG1-5D5强诱导。与用同种型对照处理的细胞相比，抗 体IgG1-1016-069也显示某种激动作用。可通过引入C220突变体 C220S和-del完全消除IgG1-1016-069的激动活性，以及通过具有IgG2和TH7Δ6-9铰链或IgG2骨架的变体，部分消除IgG1-1016-069的激 动活性。用同种型对照和5D5的一价形式(Uni-5D5-TE)处理的对照样 品不诱导细胞的生长。
KP4存活力测定法
对于抗c-Met抗体突变体，在KP4存活力测定法中，还测定了抑 制依赖HGF的细胞的能力(实验方法参见实施例19)。结果见图17。 基于IgG1-1016-069的突变体的功效完全保持或略好于C220突变体。 引人注目的是，激动性抗体5D5中突变的C220导致KP4存活力明显 降低。因HGF通过KP4的高表达(自分泌HGF环)所致，未观察到呈 IgG1形式的058和5D5抗体的激动作用。
减量调节
由拮抗性抗体诱导的c-Met的减量调节代表了治疗性c-Met抗体 的作用机制。因此，在一个实施方案中，需要具有激动性质降低、但 保持诱导c-Met减量调节的能力的抗体。为了测定抗体的减量调节潜 力，将A549细胞(CCL-185，获自ATCC)接种到6孔组织培养板 (500,000个细胞/孔)的含血清细胞培养基中，并在37℃下培养过夜。 次日早晨，以10μg/mL的终浓度加入抗c-Met抗体，将板在37℃下 再温育2天。用PBS洗涤后，通过与250μL裂解缓冲液(Cell Signaling， Danvers，USA)一起在室温下温育30分钟来裂解细胞。按照生产商的 方案，使用二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白质测定试剂(Pierce) 定量测定蛋白质总水平。使用c-Met特异性夹心ELISA定量测定细胞 裂解物中的c-Met蛋白水平。为此，ELISA板的各孔用稀释于PBS的 针对c-Met的胞外结构域的山羊-抗人c-Met抗体(R&D systems)(1 μg/mL)一起在4℃下包被过夜。接下来，各孔用PBST(补充0.05％吐 温-20[Sigma-Aldrich，Zwijndrecht，Netherlands]的PBS)洗涤，用PBSTC (补充2％[v/v]鸡血清[Gibco，Paisley，Scotland]的PBST)在室温下封 闭1小时。加入未稀释的细胞裂解物(100μL)，在室温下温育1小时。 在用PBST洗涤后，将孔与1∶1000稀释于PBSC中的针对人-c-Met的 胞内酪氨酸-1234残基的小鼠抗体(Cell Signaling)一起在室温下温育1 小时。孔再用PBST洗涤，并与1∶5000稀释于PBSC中的山羊-抗小鼠 Fc-HRP抗体(Jackson)一起在室温下温育1小时。在用PBST洗涤后， 通过与2，2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS：将1小片 ABTS稀释于50mL ABTS缓冲液[Roche Diagnostics，Almere，Netherlands])一起在室温下避光温育30分钟显性反应。通过加入等体 积的草酸(Sigma-Aldrich，Zwijndrecht，Netherlands)终止显色。在微量 滴定板读数器(BiotekInstruments，Winooski，USA)上测量405nm下 的荧光。由图18显而易见，抗体069的所有突变体均能够诱导减量 调节。
实施例26：依赖抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)
收获MKN45细胞(购自RIKEN BioResource Center，Tsukuba， Japan，RCB1001)(5x106个细胞)，洗涤(在PBS中两次，1500rpm，5 分钟)，收集在1mL RPMI 1640培养基中，该培养基补充了向其中加 入200μCi 51Cr(铬-51；Amersham Biosciences Europe GmbH，Roosendaal，Netherlands)的10％加强型小牛血清(cosmic calf serum， CCS)(HyClone，Logan，UT，USA)。将混合物在振荡水浴中于37℃ 温育1.5小时。洗涤细胞后(在PBS中两次，1500rpm，5分钟)，将细 胞重新悬浮于补充10％CCS的RPMI 1640培养基中，通过锥虫蓝排除法计数，并稀释至1x105个细胞/mL的浓度。
同时，按照生产商的说明书(淋巴细胞分离介质；Lonza，Verviers， France)，使用标准菲可(Ficoll)密度离心，从新鲜血沉棕黄层(Sanquin， Amsterdam，Netherlands)中分离出外周血单核细胞(PBMC)。将细胞重 新悬浮于补充10％CCS的RPMI 1640培养基中后，将细胞通过锥虫 蓝排除法进行计数，并浓缩至1x107个细胞/mL。
对于各ADCC实验，在96孔微量滴定板中的总体积为100μL补 充10％CCS的RPMI培养基中，将50μL 51Cr-标记的MKN45细胞 (5，000个细胞)与15μg/mL cMet抗体一起预温育。在室温下15分钟后， 加入50μL PBMC(500,000个细胞)，得到效应子与靶细胞的比率为100∶1。通过将50μL 51Cr-标记的MKN45细胞(5,000个细胞)与100μL 5％Triton-X100一起温育，测定最大量的细胞裂解。在无抗体或效应 子细胞的情况下，通过温育150μL培养基中的5,000个51Cr-标记的 MKN45细胞，来测定自发裂解的量。在无抗体的情况下，通过将5,000 个MKN45细胞与500,000个PBMC一起温育，来测定不依赖于抗体 的细胞裂解的水平。随后，将细胞在37℃、5％CO2下温育4小时。 将细胞离心(1200rpm，3分钟)，将75μL上清液转移到微量管(micronic tube)中，之后使用γ计数器，对释放的51Cr进行计数。如下利用所测 计数/分钟(cpm)来计算抗体介导的裂解的百分比：
(cpm样品-cpm不依赖于Ab的裂解)/(cpm最大裂解-cpm自发裂解) x 100％
多种出版物已证实核心岩藻糖基化降低与体外ADCC活性提高 之间的相关性(Shie1ds RL.2002JBC；277：26733-26740，Shinkawa T. 2003JBC；278(5)：3466-3473)。图19表明抗体069不通过ADCC诱导 MKN45细胞裂解。然而当因mAb在HEK-细胞中产生期间kifunensine 的存在所致核心岩藻糖基化减少时，抗体069能够诱导超过30％ MKN45细胞的裂解。此外，在低于0.01ug/mL的抗体浓度下已经观 察到裂解。所述值是得自用MKN45细胞的一个代表性体外ADCC实 验的平均最大51Cr稀放百分比±标准差。在kifunensine存在时，在HEK 293细胞中产生069低岩藻糖，产生约99.5％非核心岩藻糖基化(即缺 乏岩藻糖)。在没有k而nensin的情况下，在HEK 293细胞中产生069 高岩藻糖，产生约2.11％非核心岩藻糖基化，如用高效阴离子交换层 析法-脉冲安培检测联用(HPAEC-PAD)所测定的(数据未显示)。
实施例27：c-Met抗体与人外周血细胞结合的缺乏
为了呈现克隆069与存在于外周血的3种类型的细胞(B-细胞、 单核细胞和粒细胞)的结合，进行了FACS结合测定法。使用荧光标记 的克隆069能够在不使用第二检测抗体的情况下直接测量FACS。使 用抗目标细胞上的特定标记的市售荧光抗体，在该测定法中鉴定了血 液中的细胞群。
将来自健康志愿者(University Medical Center Utrecht)的外周血在FACS缓冲液(PBS+0.4％BSA+0.02％NaN3)中稀释10倍，与Alexa488缀合的c-Met抗体和FITC缀合的抗CD19、抗CD16和抗CD14抗体 (终浓度10μg/mL)和藻红蛋白(PE)标记的抗CD19、抗CD16和抗CD14 抗体(BD Biosciences，San Jose CA)一起在100μl的最终体积中温育以 鉴定细胞群(分别为B细胞、粒细胞和单核细胞)。在4℃下30分钟后， 将样品离心(300g，3分钟)，除去上清液，通过与200μl Ery裂解溶液 (155mM NH4Cl、10mM KHCO3、0.1Mm EDTA[pH 7.4])一起温育(10 分钟，4℃)来裂解红细胞，并将样品在FACS缓冲液中洗涤两次。将 样品重新悬浮于100μL FACS缓冲液中，使用FACS Canto II(BD Biosciences)进行分析。
图20是代表性的FACS图，其表明Alexa488缀合的-069不与B 细胞群(淋巴细胞闸门(gate)内的CD19-PE+细胞)结合。Alexa488缀合的 利妥昔单抗的结合用作阳性对照。类似地分析了与其它细胞群的结 合，3个供体之一的代表性结果也绘制在图20中。抗体069-Alexa488不与B细胞、单核细胞或粒细胞结合，而阳性对照抗体的确显示特异 性结合。
CPCH1762043D 序 列 表
<110> 根马布股份公司
<120> 抗c-Met的单克隆抗体
<130> P/59.WO
<160> 212
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Phe Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ser Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Met Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Val Gly Tyr Asp Trp Pro Asp Thr Phe Asp Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Ile Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人
<400> 2
Ser Tyr Gly Phe Gly
1 5
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> 人
<400> 3
Arg Ile Ser Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Met Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人
<400> 4
Asp Val Gly Tyr Asp Trp Pro Asp Thr Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 5
<211> 107
<212> PRT
<213> 人
<400> 5
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人
<400> 6
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人
<400> 7
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人
<400> 8
Gln Gln Tyr Asn Ser Phe Pro Pro Thr
1 5
<210> 9
<211> 121
<212> PRT
<213> 人
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Ile Leu Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Met Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Val Gly Tyr Asp Ser Ala Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> 人
<400> 10
Ser Phe Gly Ile Gly
1 5
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> 人
<400> 11
Arg Ile Phe Pro Ile Leu Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Met Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 人
<400> 12
Asp Val Gly Tyr Asp Ser Ala Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> 人
<400> 13
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人
<400> 14
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人
<400> 15
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人
<400> 16
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro Thr
1 5
<210> 17
<211> 118
<212> PRT
<213> 人
<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Glu Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Glu Ile Thr Gly Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> 人
<400> 18
Ser Tyr Trp Ile Gly
1 5
<210> 19
<211> 17
<212> PRT
<213> 人
<400> 19
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Glu Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人
<400> 20
Gln Glu Ile Thr Gly Glu Phe Asp Tyr
1 5
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人
<400> 21
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 人
<400> 22
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人
<400> 23
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人
<400> 24
Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Arg Thr
1 5
<210> 25
<211> 123
<212> PRT
<213> 人
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Leu Leu Trp Phe Gly Glu Leu Trp Gly Tyr Phe Asp Leu
100 105 110
Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 26
<211> 5
<212> PRT
<213> 人
<400> 26
Ser Tyr Ala Met His
1 5
<210> 27
<211> 17
<212> PRT
<213> 人
<400> 27
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 28
<211> 14
<212> PRT
<213> 人
<400> 28
Glu Leu Leu Trp Phe Gly Glu Leu Trp Gly Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 29
<211> 107
<212> PRT
<213> 人
<400> 29
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Glu Ala Ser Ser Phe Thr Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 人
<400> 30
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人
<400> 31
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人
<400> 32
Gln Glu Ala Ser Ser Phe Thr Trp Thr
1 5
<210> 33
<211> 122
<212> PRT
<213> 人
<400> 33
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Val Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Ala Asn Ser Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Lys Asp Leu Asp Arg Gly Trp Met Gly Tyr Phe Gly Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 34
<211> 5
<212> PRT
<213> 人
<400> 34
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 35
<211> 18
<212> PRT
<213> 人
<400> 35
Ala Ile Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 36
<211> 12
<212> PRT
<213> 人
<400> 36
Asp Leu Asp Arg Gly Trp Met Gly Tyr Phe Gly Tyr
1 5 10
<210> 37
<211> 106
<212> PRT
<213> 人
<400> 37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 38
<211> 11
<212> PRT
<213> 人
<400> 38
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 人
<400> 39
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 40
<211> 8
<212> PRT
<213> 人
<400> 40
Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Thr
1 5
<210> 41
<211> 118
<212> PRT
<213> 人
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Glu Ile Thr Gly Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 42
<211> 5
<212> PRT
<213> 人
<400> 42
Ser Tyr Trp Ile Gly
1 5
<210> 43
<211> 17
<212> PRT
<213> 人
<400> 43
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 人
<400> 44
Gln Glu Ile Thr Gly Glu Phe Asp Tyr
1 5
<210> 45
<211> 108
<212> PRT
<213> 人
<400> 45
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Met
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 46
<211> 11
<212> PRT
<213> 人
<400> 46
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 人
<400> 47
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> 人
<400> 48
Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Met Tyr Thr
1 5 10
<210> 49
<211> 117
<212> PRT
<213> 人
<400> 49
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Gly Trp Gly Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 50
<211> 5
<212> PRT
<213> 人
<400> 50
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 51
<211> 17
<212> PRT
<213> 人
<400> 51
Val Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 52
<211> 8
<212> PRT
<213> 人
<400> 52
Asp Arg Gly Trp Gly Ser Asp Tyr
1 5
<210> 53
<211> 107
<212> PRT
<213> 人
<400> 53
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> 人
<400> 54
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 人
<400> 55
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> 人
<400> 56
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Phe Thr
1 5
<210> 57
<211> 125
<212> PRT
<213> 人
<400> 57
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asp Asp Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Leu Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Asn Gln
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 58
<211> 5
<212> PRT
<213> 人
<400> 58
Asp Tyr Tyr Met Tyr
1 5
<210> 59
<211> 17
<212> PRT
<213> 人
<400> 59
Thr Ile Ser Asp Asp Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 60
<211> 16
<212> PRT
<213> 人
<400> 60
Glu Gly Leu Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Asn Gln Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 61
<211> 108
<212> PRT
<213> 人
<400> 61
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Leu Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Thr Ser Tyr Pro Gln
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 62
<211> 11
<212> PRT
<213> 人
<400> 62
Arg Ala Ser Gln Gly Leu Ser Ser Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 63
<211> 7
<212> PRT
<213> 人
<400> 63
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210> 64
<211> 10
<212> PRT
<213> 人
<400> 64
Gln Gln Phe Thr Ser Tyr Pro Gln Ile Thr
1 5 10
<210> 65
<211> 118
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 其它特征
<222> (52)..(52)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 65
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ser Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Gly His Ser Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Xaa Ile Tyr His Ser Gly Asn Thr Tyr Asp Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ala Val Asp Arg Ser Lys Asn Gln Leu
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Phe Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ser Ser Tyr Asp Phe Leu Thr Asp Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> 人
<400> 66
Ser Gly Gly His Ser Trp Ser
1 5
<210> 67
<211> 16
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 其它特征
<222> (1)..(1)
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<400> 67
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<213> 人
<400> 68
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人
<400> 69
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Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
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<213> 人
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Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
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<212> PRT
<213> 人
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<213> 人
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<221> 其它特征
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Ser Gly Gly His Ser Trp Ser
1 5
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 其它特征
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 75
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<213> 人
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 其它特征
<222> (52)..(52)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 81
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<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 其它特征
<222> (1)..(1)
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<400> 83
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 其它特征
<222> (52)..(52)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 89
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<220>
<221> 其它特征
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 91
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<212> PRT
<213> 人
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人
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<212> PRT
<213> 人
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Gly
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<213> 人
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<212> PRT
<213> 人
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<213> 人
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<212> PRT
<213> 人
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<212> PRT
<213> 人
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<213> 人
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<213> 人
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Asn Phe Gly Ile Ser
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<210> 115
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<213> 人
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<213> 人
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<213> 人
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<213> 人
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<213> 人
<400> 119
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
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<213> 人
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<213> 人
<400> 121
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<213> 人
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人
<400> 123
Trp Ile Ser Ala Asp Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
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Asp
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人
<400> 124
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<211> 108
<212> PRT
<213> 人
<400> 125
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<213> 人
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人
<400> 127
Gly Val Phe Ser Arg Ala Thr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人
<400> 128
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Thr
1 5
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<211> 119
<212> PRT
<213> 人
<400> 129
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Ser Tyr Gly Ile Ser
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<213> 人
<400> 131
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<213> 人
<400> 132
Asp Leu Arg Gly Thr Ala Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 133
<211> 107
<212> PRT
<213> 人
<400> 133
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Gly Phe Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 167
<211> 118
<212> PRT
<213> 人
<400> 167
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Glu Val Thr Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 168
<211> 107
<212> PRT
<213> 人
<400> 168
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 169
<211> 118
<212> PRT
<213> 人
<400> 169
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Glu Val Thr Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 170
<211> 107
<212> PRT
<213> 人
<400> 170
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人
<400> 171
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Glu Ile Thr Gly Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 172
<211> 107
<212> PRT
<213> 人
<400> 172
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人
<400> 173
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asn Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gln Glu Ile Thr Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 174
<211> 107
<212> PRT
<213> 人
<400> 174
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人
<400> 175
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
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Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
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Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 176
<211> 107
<212> PRT
<213> 人
<400> 176
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 177
<211> 118
<212> PRT
<213> 人
<400> 177
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
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Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
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Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
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100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 178
<211> 107
<212> PRT
<213> 人
<400> 178
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Val Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
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<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
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<220>
<221> 变体
<222> (3)..(3)
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<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
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<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
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Ser Xaa Xaa Xaa Xaa
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<213> 人
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
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<220>
<221> 变体
<222> (3)..(3)
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<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
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<220>
<221> 变体
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<220>
<221> 变体
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Gly
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<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
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<220>
<221> 变体
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<220>
<221> 变体
<222> (9)..(9)
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<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
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<400> 182
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Xaa Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
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<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 变体
<222> (3)..(3)
<223> X1=V或I
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> X2=E或D
<400> 183
Gln Glu Xaa Thr Gly Xaa Phe Asp Tyr
1 5
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<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(1)
<223> X1=V或F
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
<223> X2=N或S
<220>
<221> 变体
<222> (10)..(10)
<223> X3=D或Y
<220>
<221> 变体
<222> (11)..(11)
<223> X4=Y或F
<400> 184
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1 5 10 15
Gly
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<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
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<220>
<221> 变体
<222> (13)..(13)
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<400> 185
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1 5 10 15
Lys Gly
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(1)
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<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
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<400> 186
Xaa Tyr Ala Met Xaa
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(1)
<223> X1=A或V
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
<223> X2=S或I
<220>
<221> 变体
<222> (15)..(15)
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<400> 187
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1 5 10 15
Gly
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
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<400> 188
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1 5
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<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
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<400> 189
Asp Tyr Tyr Met Xaa
1 5
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<213> 人
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(1)
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<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
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<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
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<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
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<220>
<221> 变体
<222> (10)..(10)
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<220>
<221> 变体
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1 5 10 15
Gly
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<213> 人
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
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<400> 191
Ser Gly Gly Xaa Ser Trp Ser
1 5
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(1)
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<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
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<220>
<221> 变体
<222> (7)..(7)
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<220>
<221> 变体
<222> (10)..(10)
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<400> 192
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1 5 10 15
<210> 193
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<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> X1=F或I
<400> 193
Ser Ser Tyr Asp Xaa Leu Thr Asp
1 5
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<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(1)
<223> X1=S或N
<400> 194
Xaa Tyr Gly Ile Ser
1 5
<210> 195
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<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> X1=A或T
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
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<400> 195
Trp Ile Ser Xaa Tyr Asn Gly Xaa Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 196
<211> 10
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> X1=A或N
<400> 196
Asp Leu Arg Gly Thr Xaa Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 197
<211> 5
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(1)
<223> X1=N或S
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> X2=F或Y
<400> 197
Xaa Xaa Gly Ile Ser
1 5
<210> 198
<211> 17
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> X1=F或Y
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
<223> X2=H或N
<220>
<221> 变体
<222> (10)..(10)
<223> X3=D或N
<220>
<221> 变体
<222> (12)..(12)
<223> X4=S或A
<220>
<221> 变体
<222> (15)..(15)
<223> X5=V或L
<400> 198
Trp Ile Ser Ala Xaa Asn Gly Xaa Thr Xaa Tyr Xaa Gln Lys Xaa Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 199
<211> 5
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(1)
<223> X1=R或S
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> X2=H或Y
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> X3=T或S
<400> 199
Xaa Xaa Gly Ile Xaa
1 5
<210> 200
<211> 17
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> X1=D或Y
<220>
<221> 变体
<222> (15)..(15)
<223> X2=F或L
<220>
<221> 变体
<222> (17)..(17)
<223> X3=D或G
<400> 200
Trp Ile Ser Ala Xaa Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Xaa Gln
1 5 10 15
Xaa
<210> 201
<211> 14
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> X1=F或L
<220>
<221> 变体
<222> (10)..(10)
<223> X2=P或无aa
<400> 201
Val Xaa Arg Tyr Phe Asp Trp Leu Leu Xaa Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 202
<211> 9
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> X1=Y或F
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
<223> X2=P或W
<400> 202
Gln Gln Tyr Asn Ser Xaa Pro Xaa Thr
1 5
<210> 203
<211> 7
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(1)
<223> X1=D、V或A
<400> 203
Xaa Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210> 204
<211> 10
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 变体
<222> (9)..(9)
<223> X1=R、I、L、W或MY
<400> 204
Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Xaa Thr
1 5 10
<210> 205
<211> 9
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> X1=Q或E
<220>
<221> 变体
<222> (3)..(3)
<223> X2=A或T
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> X3=N或S
<220>
<221> 变体
<222> (7)..(7)
<223> X4=P或T
<400> 205
Gln Xaa Xaa Xaa Ser Phe Xaa Trp Thr
1 5
<210> 206
<211> 9
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
<223> X1=I或无aa
<400> 206
Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Xaa Thr
1 5
<210> 207
<211> 10
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> X1=T或N
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
<223> X2=Q或无aa
<400> 207
Gln Gln Phe Xaa Ser Tyr Pro Xaa Ile Thr
1 5 10
<210> 208
<211> 9
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> X1=G或S
<400> 208
Gln Gln Ala Asn Xaa Phe Pro Ile Thr
1 5
<210> 209
<211> 11
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
<223> X1=S或N
<400> 209
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Xaa Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 210
<211> 7
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> X1=Q或L
<400> 210
Ala Ala Ser Ser Leu Xaa Ser
1 5
<210> 211
<211> 9
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(1)
<223> X1=H或Q
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> X2=K或N
<400> 211
Xaa Gln Tyr Xaa Ser Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 212
<211> 7
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> X1=V或A
<220>
<221> 变体
<222> (3)..(3)
<223> X2=F或S
<400> 212
Gly Xaa Xaa Ser Arg Ala Thr
1 5

Claims (26)

1.一种结合人c-Met的单克隆抗体，其中所述抗体含有：
a) 包含如SEQ ID NO:2所示的CDR1序列、如SEQ ID NO:3所示的CDR2序列和如SEQ IDNO:4所示的CDR3序列的VH区和包含如SEQ ID NO:6所示的CDR1序列、如SEQ ID NO:7所示的CDR2序列和如SEQ ID NO:8所示的CDR3序列的VL区，
b) 包含如SEQ ID NO:10所示的CDR1序列、如SEQ ID NO:11所示的CDR2序列和如SEQID NO:12所示的CDR3序列的VH区和包含如SEQ ID NO:14所示的CDR1序列、如SEQ ID NO:15所示的CDR2序列和如SEQ ID NO:16所示的CDR3序列的VL区，
c) 包含如SEQ ID NO:26所示的CDR1序列、如SEQ ID NO:27所示的CDR2序列和如SEQID NO:28所示的CDR3序列的VH区和包含如SEQ ID NO:30所示的CDR1序列、如SEQ ID NO:31所示的CDR2序列和如SEQ ID NO:32所示的CDR3序列的VL区，或
d) 包含如SEQ ID NO:58所示的CDR1序列、如SEQ ID NO:59所示的CDR2序列和如SEQID NO:60所示的CDR3序列的VH区和包含如SEQ ID NO:62所示的CDR1序列、如SEQ ID NO:63所示的CDR2序列和如SEQ ID NO:64所示的CDR3序列的VL区。
2.权利要求1的抗体，其含有：
a) 包含SEQ ID NO:1的序列的VH区和包含SEQ ID NO:5的序列的VL区，
b) 包含SEQ ID NO:9的序列的VH区和包含SEQ ID NO:13的序列的VL区，
c) 包含SEQ ID NO:25的序列的VH区和包含SEQ ID NO:29的序列的VL区，或
d) 包含SEQ ID NO:57的序列的VH区和包含SEQ ID NO:61的序列的VL区。
3.权利要求1的抗体，其含有包含如SEQ ID NO:58所示的CDR1序列、如SEQ ID NO:59所示的CDR2序列和如SEQ ID NO:60所示的CDR3序列的VH区和包含如SEQ ID NO:62所示的CDR1序列、如SEQ ID NO:63所示的CDR2序列和如SEQ ID NO:64所示的CDR3序列的VL区。
4.权利要求1的抗体，其含有包含SEQ ID NO:57的序列的VH区和包含SEQ ID NO:61的序列的VL区。
5.权利要求1-4中任一项的抗体，其中所述抗体与c-Met的SEMA结构域结合。
6.权利要求5的抗体，其中所述抗体能够抑制HGF与SEMA结构域结合，其IC50小于2 μg/mL。
7.权利要求1-4中任一项的抗体，其中所述抗体抑制HGF与c-Met的胞外结构域结合超过80%。
8.权利要求1-4中任一项的抗体，其中所述抗体是全长抗体。
9.权利要求8的抗体，其中所述全长抗体是IgG1抗体。
10.权利要求1-4中任一项的抗体，其中所述抗体与另一部分缀合，其中所述另一部分是细胞毒素、化学治疗药、免疫抑制药或放射性同位素。
11.权利要求1-4中任一项的抗体，其中所述抗体是效应子功能缺陷型抗体。
12.权利要求1-4中任一项的抗体，其中所述抗体是一价抗体。
13.权利要求12的抗体，其中所述一价抗体包含：
(i) 权利要求1-4中任一项的抗体的可变区或所述区的抗原结合部分，和
(ii) 免疫球蛋白的CH区或其包含CH2和CH3区的片段，其中所述CH区或其片段经修饰使得相当于铰链区的区和如果免疫球蛋白不是IgG4亚型时的CH区的其它区或CH3区不包含这样的任何氨基酸残基，所述氨基酸残基在多克隆人IgG存在时能够与相同CH区形成二硫键或与相同的CH区形成其它共价或稳定的非共价重链间键。
14.权利要求13的抗体，其中步骤(ii)中提及的免疫球蛋白是IgG4亚型的。
15.权利要求1-4中任一项的抗体，其中所述抗体是IgG2亚型的。
16.权利要求1-4中任一项的抗体，其中所述抗体是IgG4亚型的。
17.权利要求1-4和13-14中任一项的抗体，其中所述抗体是双特异性抗体，其包含权利要求1-4中任一项限定的c-Met结合部位和具有不同结合特异性的第二抗原结合部位。
18.一组核苷酸，其编码：
a) SEQ ID NO: 1和5的序列的组合；
b) SEQ ID NO: 9和13的序列的组合；
c) SEQ ID NO: 25和29的序列的组合；或
d) SEQ ID NO: 57和61的序列的组合。
19.一种表达载体，其包含权利要求18的核苷酸序列，其中所述载体还编码有效连接的抗体的轻链恒定区、重链恒定区或轻链和重链恒定区两者。
20.一种重组真核或原核宿主细胞，其产生权利要求1-17中任一项限定的抗体。
21.一种药物组合物，其包含权利要求1-17中任一项限定的抗体和药学上可接受的载体。
22.权利要求1-17中任一项的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症为依赖于HGF的癌症。
23.一种用于产生权利要求1-17中任一项的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
a) 培养权利要求20的宿主细胞，和
b) 从培养基中纯化出所述抗体。
24.权利要求1-17中任一项的抗体在制备用于检测样品中c-Met的存在情况的试剂盒中的用途，其中所述用途包括：
- 在允许在抗体和c-Met之间形成复合物的条件下使样品与权利要求1-17任一项的抗体接触；和
- 分析是否形成了复合物。
25.一种用于检测样品中c-Met的存在情况的试剂盒，所述试剂盒包含：
- 权利要求1-17中任一项的抗体；和
- 试剂盒使用说明书。
26.一种抗权利要求1-17中任一项的抗体的抗独特型抗体。
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