CN117677397A - 上皮细胞粘附分子(epcam)抑制剂及肝脏生长因子受体(hgfr)抑制剂的结合癌症治疗 - Google Patents
上皮细胞粘附分子(epcam)抑制剂及肝脏生长因子受体(hgfr)抑制剂的结合癌症治疗 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种使用上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)抑制剂及肝脏生长因子受体(hepatocyte growth factor receptor,HGFR)抑制剂的结合癌症治疗。具体而言,该EpCAM抑制剂为针对EpCAM的胞外结构域(extracellular domain,EpEX)的抗体。结合治疗可有效诱导癌细胞凋亡、抑制癌细胞迁移/侵袭、减小肿瘤大小,及/或延长癌症患者的寿命。
Description
相关申请案
本申请主张根据美国专利法第119条(35 U.S.C.§119)于2021年6月25日提出申请之美国临时申请第63/215,016号的权益,其全部内容透过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及使用上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)抑制剂及肝脏生长因子受体(hepatocyte growth factor receptor,HGFR)抑制剂的结合癌症治疗。具体而言,该EpCAM抑制剂为针对EpCAM的胞外结构域(extracellulardomain,EpEX)的抗体。结合治疗可有效诱导癌细胞凋亡、抑制癌细胞迁移/侵袭、减小肿瘤大小,及/或延长癌症患者的寿命。
背景技术
EpCAM为一种第I型跨膜蛋白,具有314个胺基酸且观察到的分子量为39-42kDa。它包含一个胞外结构域(EpEX,具有265个胺基酸)、一个单一跨膜结构域,以及一个短胞内结构域(intracellular domain,EpICD,具有26个胺基酸)。作为一个众所周知的肿瘤相关抗原,EpCAM在各种癌中富集,且还已知其参与正常上皮中的同型细胞与细胞间的黏附(Dolle等人,2015年)。虽然EpCAM在绝大多数健康的上皮鳞状细胞中不存在或仅有微弱的表现,但其在鳞状细胞癌中具有强烈的表现(Balzar等人,1999年)。此外,EpCAM在鳞状细胞癌中的表现与细胞增殖的增加以及分化的减少有关(Litvinov等人,1996年)。我们团队先前开发了一种抗EpCAM的中和抗体EpAb2.6,其具有作为大肠直肠癌(colorectal carcinoma,CRC)治疗的强大潜力(Chen等人,2020年;Liang等人,2018年;Liao等人,2015年)。尽管其有望成为CRC的治疗标靶,但EpCAM促进肿瘤发生及转移的机制仍不完全清楚。
HGFR(c-MET)为一种高亲和力受体酪胺酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK),由肝脏生长因子(hepatocyte growth factor,HGF,亦称为分散因子)活化并由MET基因所编码(Lai等人,2009;Peschard&Park,2007年)。HGFR的酪胺酸激酶结构域在位置1234以及1235上含有两个酪胺酸残基,这两个位点的磷酸化对于HGFR受体的活化相当重要(Koch等人,2020年;Ponzetto等人,1994年)。许多报告已经证明HGFR在肿瘤发生、细胞生长、存活以及转移中扮演重要的角色(Cao等人,2019年;Li等人,2018年;Mazzone与Comoglio,2006年)。在正常组织中,HGFR在上皮细胞中表现,在上皮细胞中HGFR被源自周围的或循环中的间质细胞的HGF活化(Birchmeier等人,2003年)。在HGF活化HGFR后,启动形态生成程序以促进细胞迁移及侵袭。基于HGFR的已知功能,HGFR被认为是一种原致癌基因,通常参与胚胎发育、成体组织稳态以及再生。值得注意的是,HGFR的早期研究显示其与生长因子受体以及RTK家族具有同源性(Dean等人,1985年)。后来证明HGFR为HGF的同源RTK,与称为分散因子的HGFR配体相同(Koch等人,2020年;Naldini等人,1991年)。
上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)与癌症进展及转移有关(Iwatsuki等人,2010年)。EMT过程涉及一系列复杂的可逆事件,这些事件可导致丧失上皮细胞黏附以及诱导细胞的间质表型。经历EMT的癌细胞还透过诱导间质特性以及丧失上皮细胞黏附而表现出增强的细胞活动性及侵袭性。EMT的指标包括间质标记物(如,波形蛋白、Snail蛋白及Slug蛋白)的表现增加,以及上皮标记物(如,E-钙黏蛋白)的表现减少(Singh&Settleman,2010年)。许多报导显示,HGFR讯息传导促进EMT程序,进而增强癌细胞的侵袭及转移潜力(Gumustekin等人,2012年;Jiao等人,2016年)。
EpEX含有两个类表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)结构域,可作为局部肿瘤微环境中的可溶性生长因子。先前的一份报告显示,EGF受体(EGF receptor,EGFR)的活化可触发EpCAM的调节膜内蛋白水解(regulated intramembrane proteolysis,RIP)以诱导EMT(Hsu等人,2016年)。值得注意的是,EGFR为一种与多种癌症高度相关的RTK,因为EGFR在多种肿瘤中过度表现(Normanno等人,2006年)。与EGFR的作用类似,过度的HGFR活化促进癌细胞的生长、存活以及迁移(Kim等人,2014年;Simiczyjew等人,2018年),透过许多下游效应子(如,AKT、胞外讯息相关激酶(extracellular signal-related kinase,ERK)、磷酸肌醇3-激酶、RAS,以及SRC)进行作用(Comoglio等人,2008年;Ortiz-Zapater等人,2017年)。有趣的是,HGFR的表现与基底型乳腺癌中的EGFR的表现呈正相关(Mueller等人,2010年),且HGFR与EGF家族受体通常在癌细胞中共表现(Shattuck等人,2008年)。此外,据报导,在以EGFR配体刺激表皮癌细胞时会发生EGFR依赖性磷酸化以及HGFR的活化(Jo等人,2000年)。在几种类型的肿瘤中也观察到在具有升高的EGFR讯息传导的细胞中HGFR的这种交叉活化(Tang等人,2008年)。然而,重要的是,这种交叉活化效应背后的机制以前尚未确定。
发明内容
本文公开一种上皮细胞黏附分子(EpCAM)抑制剂以及一种HGFR抑制剂之结合使用,供治疗癌症。具体而言,该EpCAM抑制剂为针对EpCAM胞外结构域(EpEX)的抗体。结合治疗可有效诱导癌细胞凋亡、抑制癌细胞迁移/侵袭、减小肿瘤大小,及/或延长癌症患者的寿命。
在一方面,本发明提供一种治疗癌症的方法,包括向有需要的个体施用
(i)有效量的第一抑制剂,其抑制上皮细胞黏附分子(EpCAM)讯息传导的活化;以及
(ii)有效量的第二抑制剂,其抑制肝脏生长因子受体(HGFR)讯息传导的活化。
于某些具体实施例中,该第一抑制剂减少EpEX的产生(或释放)、阻断EpEX与HGFR的结合,及/或抑制EpEX诱导的HGFR磷酸化。
于某些具体实施例中,该第二抑制剂阻断HGF与HGFR的结合。
于某些具体实施例中,该第一抑制剂为针对EpEX的抗体或其抗原结合片段。
于某些具体实施例中,本文所述之抗EpEX抗体特异性结合类表皮生长因子(EGF)结构域I及II。于某些实施例中,本文所述之抗-EpEX抗体对位于该类EGF结构域I的CVCENYKLAVN序列(第27至37个胺基酸)(SEQ ID NO:20)以及位于该类EGF结构域II的KPEGALQNNDGLYDPDCD序列(第83至100个胺基酸)(SEQ ID NO:19)内的抗原决定位(epitope)具有特异性结合亲和力。
于某些具体实施例中,该抗体或抗原结合片段包含
(a)重链可变区(VH),其包含:包含SEQ ID NO:2的胺基酸序列的重链互补决定区1(heavy chain complementary determining region 1,HC CDR1)、包含SEQ ID NO:4的胺基酸序列的重链互补决定区2(HC CDR2),以及包含SEQ ID NO:6的胺基酸序列的重链互补决定区3(HC CDR3);以及
(b)轻链可变区(VL),其包含:包含SEQ ID NO:9的胺基酸序列的轻链互补决定区1(light chain complementary determining region 1,LC CDR1),包含SEQ ID NO:11的胺基酸序列的轻链互补决定区2(LC CDR2),以及包含SEQ ID NO:13的胺基酸序列的轻链互补决定区3(LC CDR3)。
于某些具体实施例中,该VH包含SEQ ID NO:15的胺基酸序列,及/或该VL包含SEQID NO:16的胺基酸序列。
于某些具体实施例中,该第一抑制剂有效抑制TACE及PS2讯息传导的磷酸化。
于某些具体实施例中,该第二抑制剂系选自由福瑞替尼(foretinib)、克唑替尼(crizotinib)以及卡博替尼(cabozantinib)所组成之群组。
于某些具体实施例中,本发明的方法有效诱导癌细胞凋亡。
于某些具体实施例中,本发明的方法有效抑制癌细胞的迁移/侵袭及/或减小肿瘤大小。
于某些具体实施例中,本发明的方法有效延长个体的寿命。
于某些具体实施例中,该癌症选自由下列所组成之群组:肺癌、脑癌、乳癌、子宫颈癌、大肠癌、胃癌、头颈癌、肾癌、血癌、肝癌、卵巢癌、胰脏癌、前列腺癌、皮肤癌,以及睾丸癌。
在另一方面,本发明提供一种套组或医药组合物,包含
(i)有效量的第一抑制剂,其抑制上皮细胞黏附分子(EpCAM)讯息传导的活化;以及
(ii)有效量的第二抑制剂,其抑制肝脏生长因子受体(HGFR)讯息传导的活化。
本发明还提供一种(i)抑制上皮细胞黏附分子(EpCAM)讯息传导活化的第一抑制剂以及(ii)抑制肝脏生长因子受体(HGFR)讯息传导活化的第二抑制剂之组合用于制造治疗癌症的药物或套组之用途。
本发明之一个或多个实施例的细节在以下描述中阐述。从以下几个实施例的详细描述以及从所附申请专利范围中,本发明之其他特征或优点将变得显而易见。
附图说明
当结合附图阅读时,将更好理解以上概述以及本发明之以下详细描述。为了说明本发明,在附图中显示目前较佳具体实施例。然而,应当理解的是,本发明不限于所示之精确设置及手段。
于图式中:
图1A至1J:EpEX与HGFR相互作用并诱导HGFR磷酸化。(图1A)在HCT116以及HT29细胞中与HGFR结合的内源性EpCAM的免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)。(图1B)以HGFRECD-c-Myc以及EpCAM-V5转染的HEK293T细胞。以对照IgG、抗V5抗体或抗c-Myc抗体进行IP,然后进行西方墨点法分析。(图1C)藉由使用Dynabeads蛋白G的IP以及使用抗6X His标签抗体的西方墨点法检测EpEX-Fc以及HGFR-His重组蛋白(2.5μg/ml)的相互作用。(图1D)以不同剂量的EpEX-His处理饥饿的HCT116及HT29细胞15分钟,以50nM EpEX-His处理饥饿的HCT116及HT29细胞一段指定的时间。藉由西方墨点法检查HGFR的磷酸化。(图1E)使野生型(WT)或EpCAM敲除(knockout,KO)的HCT116及H29细胞饥饿16小时,然后以EpEX-His(50nM)处理15分钟。使用ELISA套组(ab126451)分析磷酸化HGFR的含量。(图1F)以HGFRECD-c-Myc以及全长或类EGF结构域缺失突变体EpCAM-V5转染HEK293T细胞。藉由使用抗V5或抗c-Myc抗体的IP以及使用抗V5或抗c-Myc抗体的西方墨点法探测蛋白质相互作用。(图1G)以c-Myc或HGFRECD-c-Myc以及全长或类EGF结构域缺失突变体EpEX-His转染HEK293T细胞。藉由使用抗c-Myc抗体的IP以及使用抗c-Myc与抗His抗体的西方墨点法探测蛋白质相互作用。(图1H)将HGFR-His重组蛋白(2μg/ml)添加至类EGF结构域缺失突变体-Fc包覆的(1μg/ml)ELISA盘中,并透过TMB比色过氧化物酶分析法检测。使HCT116细胞饥饿并以野生型或EGF结构域缺失突变体EpEX处理,并以(图1I)西方墨点法以及(图1J)ELISA套组(ab126451)分析磷酸化的HGFR。所有数据均表示为平均值±平均值标准误差(standard error of the mean,SEM)。*,p<0.05。
图2A至2K:EpEX透过HGFR讯息传导促进肿瘤进展。(图2A)野生型或EpCAM敲除(KO)HCT116及HT29细胞以HGF(0.5nM)处理15分钟。藉由西方墨点法检查HGFR、AKT,以及ERK的磷酸化。(图2B)野生型或KO的HCT116及HT29细胞以含有2% FBS的HGF(0.5nM)处理一段指定的时间。透过WST-1分析检查细胞生长。(图2C)饥饿的HCT116细胞以HGFR抑制剂SU11274(SU,10μM)处理1小时,然后以50nM EpEX-His处理15分钟。以西方墨点法检查磷酸化的HGFR、EGFR、AKT,以及ERK的含量。以50nM EpEX以及SU(10μM)处理HCT116及HT29细胞。(图2D)在处理一段指定时间后透过WST-1分析检查细胞生长。(图2E)HCT116细胞以shLuc或HGFR shRNA处理,然后以50nM EpEX-His处理15分钟。藉由西方墨点法检测HGFR敲低的HCT116细胞中磷酸化HGFR、EGFR、ERK,以及AKT的含量。(图2F)藉由西方墨点法检查磷酸化的ADAM17以及早老素2的含量。(图2G)藉由使用西方墨点法测定活性β-连环蛋白的核转位。(图2H)以shLuc或HGFR shRNA处理HCT116细胞,然后以50nM EpEX-His处理一段指定的时间。透过WST-1分析检查细胞生长。(图2I)以shLuc及shHGFR处理后的HCT116细胞以50nM的EpEX-His及2% FBS处理7天。藉由结晶紫染色检查细胞群落的形成。下图所示为核β-连环蛋白的量化结果。(图2J)以HGF(0.5nM)处理HCT116细胞一段指定的时间,并藉由免疫沉淀及西方墨点法检查培养基中的EpEX蛋白含量。(图2K)以HGF(0.5nM)处理HCT116细胞15分钟。藉由西方墨点法分析细胞裂解物中的磷酸化HGFR、早老素2,以及ADAM17蛋白含量,并藉由免疫沉淀与西方墨点法检查培养基中的EpEX蛋白含量。所有数据均表示为平均值±SEM。*,p<0.05;**,p<0.01。
图3A至3H:EpEX诱导ERK及FAK-AKT讯息传导途径的活化。在以EpEX-His处理后的野生型(WT)或EpCAM敲除(KO)的HCT116细胞。(图3A)藉由西方墨点法测定磷酸化HGFR、AKT、FAK、GSK3β、ERK、ADAM17,以及早老素2的含量。(图3B)藉由结晶紫染色检查细胞群落的形成。(图3C)以TAPI(ADAM17抑制剂)或DAPT(γ-分泌酶抑制剂)处理HCT116细胞24小时,以西方墨点法分析HGFR、AKT,以及ERK的磷酸化,以及藉由免疫沉淀及西方墨点法检查培养基中的EpEX蛋白含量。(图3D)使HCT116及HT29细胞饥饿16小时,然后以EpEX-His(50nM)及HGF(0.5nM)处理15分钟。透过西方墨点法检测磷酸化HGFR、AKT,以及ERK的含量。(图3E)使HCT116细胞饥饿16小时,然后以50nM EpEX-His处理15分钟。在EpEX处理前1小时施用HGFR抑制剂SU11274(SU,10μM)、AKT抑制剂LY294002(LY,25μM)、ERK抑制剂U0126(U0,20μM),或FAK抑制剂PF-562271(PF,10μM)。以西方墨点法检查AKT、ERK以及FAK的磷酸化。(图3F)使HCT116细胞饥饿16小时,然后以50nM EpEX以及SU(10μM)、LY(25μM)、U0(20μM)或PF(10μM)处理。处理7天后以结晶紫染色检查细胞群落形成。显示相对细胞群落密度。(图3G)于指定的时间以伤口愈合分析检查迁移能力。(图3H)于处理24小时后,藉由一Transwell评估迁移细胞的数量。所有数据均表示为平均值±SEM。*,p<0.05。
图4A至4L:EpEX透过降低GSK3β活性以稳定β-连环蛋白与Snail蛋白来诱导EMT及侵袭。(图4A)以EpEX处理后,藉由西方墨点法在野生型(WT)或EpCAM敲除(KO)HCT116细胞中检测EMT标记物以及调节剂的蛋白质表现。(图4B)藉由使用基质胶的Transwell小室分析法检查细胞侵袭。(图4C)使野生型或KO的HCT116以及HT29细胞饥饿16小时,然后以0.5nM的HGF及2% FBS处理24小时。藉由西方墨点法检查EMT相关蛋白表现(E-钙黏蛋白、波形蛋白,以及Snail蛋白)。(图4D)以HGF(0.5nM)处理野生型或KO的HCT116及HT29细胞24小时。藉由使用基质胶的Transwell小室分析法来检查HCT116及HT29细胞的侵袭。(图4E)使HCT116及HT29细胞饥饿16小时,然后以0.5nM的HGF以及2%FBS处理24小时。透过西方墨点法检查EMT相关蛋白表现(E-钙黏蛋白、波形蛋白,以及Snail蛋白)。(图4F)使HCT116及HT29细胞饥饿16小时,然后以0.5nM的HGF以及2% FBS处理24小时。藉由使用基质胶的Transwell分析法评估细胞侵袭。(图4G)以shLuc及shHGFR处理后的HCT116细胞再以50nM EpEX-His处理。以shLuc及shHGFR处理后的HCT116细胞再以50nM的EpEX-His以及2% FBS处理24小时。藉由西方墨点法检查EMT相关蛋白表现(E-钙黏蛋白、波形蛋白,以及Snail蛋白)。(图4H)藉由使用基质胶的Transwell小室分析法检查细胞侵袭。(图4I)以SU(10μM)处理饥饿的HCT116细胞1小时,然后以EpEX-His(50nM)处理24小时。藉由西方墨点法检测磷酸化的GSK3β、活性-β-连环蛋白,以及Snail蛋白。(图4J)使HCT116细胞饥饿16小时,然后以50nM EpEX-His处理24小时。在以EpEX处理前1小时施用AKT抑制剂LY294002(25μM)、ERK抑制剂U0126(20μM),或PF-562271(10μM)。藉由西方墨点法检查磷酸化GSK3β以及Snail蛋白的蛋白质表现。(图4K)使HCT116细胞饥饿16小时,然后以50nM EpEX以及SU(10μM)、LY(25μM)、U0(20μM),或PF(10μM)处理。藉由使用基质胶的Transwell小室分析法检查细胞侵袭。(图4L)在使用或不使用2μMGSK3β抑制剂(BIO)处理24小时后,藉由西方墨点法分析EpEX-His(50nM)处理的HCT116细胞中的蛋白质表现。右图所示为标准化蛋白质表现的量化结果。所有数据均表示为平均值±SEM。*,p<0.05;**,p<0.01。
图5A至5I:EpEX透过抑制泛素化调节的蛋白酶体降解来促进Snail蛋白的稳定性。(图5A)以qRT-PCR在野生型(WT)或EpCAM敲除(KO)的HCT116及HT29细胞中检测EMT标记物及调节剂的基因表现。(图5B)在野生型或KO的HCT116细胞中Snail蛋白的稳定性。在指定的时间间隔以100μg/ml的环己酰胺(cyclohexamide,CHX)处理细胞并进行西方墨点法。(图5C)使用或不使用10mM MG132(蛋白酶体抑制剂)处理野生型或KO的HCT116细胞6小时后,藉由西方墨点法在该些细胞中分析Snail蛋白的表现。(图5D)在收集细胞之前,以10μMMG132处理野生型或KO的HCT116细胞6小时。使用抗Snail蛋白抗体以及阳性对照对裂解物进行免疫沉淀。使用指定的抗体进行西方墨点法以检测泛素化的Snail蛋白。(图5E)以EpEX(50nM)处理24小时后,在HCT116细胞中Snail蛋白的稳定性。以指定的时间间隔使用环己酰胺(CHX;100μg/ml)处理细胞,然后进行西方墨点法。(图5F)在以EpEX(50nM)处理24小时后,藉由qRT-PCR在HCT116细胞中检测到编码SNAIL的基因的表现。(图5G)在以EpEX(50nM)处理24小时后,使用或不使用10μM MG132(蛋白酶体抑制剂)处理HCT116细胞6小时后,透过西方墨点法分析细胞内Snail蛋白的表现。(图5H)Snail蛋白的磷酸化基序中突变体位置的示意图。(图5I)以Snail-野生型、2SA、4SA,以及6SA转染HCT116细胞24小时,然后使用或不使用EpEX(50nM)进一步处理24小时。藉由西方墨点法检测Snail的表现。所有数据均表示为平均值±SEM。*,p<0.05;**,p<0.01。
图6A至6J:EpAb2-6抑制EpCAM以及HGFR的讯息传导,并透过活化GSK3β促进活性β-连环蛋白以及Snail蛋白的降解。(图6A)HCT116细胞以10μg/ml的对照IgG(正常小鼠IgG,NMIgG)或小鼠EpAb2-6(EpAb2-6)处理16小时,然后以EpEX-His(50nM)处理15分钟。藉由西方墨点法检测磷酸化HGFR、AKT、FAK、GSK3β、ERK、ADAM17,以及早老素2的含量。(图6B)以10μg/ml对照IgG或小鼠EpAb2-6处理HCT116细胞16小时,然后使用或不使用HGF(0.5nM)处理15分钟。藉由西方墨点法检查磷酸化HGFR、AKT,以及ERK的含量。以小鼠EpAb2-6(10μg/ml)及HGF(0.5nM)处理HCT116细胞。(图6C)于指定时间藉由伤口愈合分析法检查细胞迁移。(图6D)24小时后,藉由使用基质胶的Transwell分析法评估细胞侵袭。(图6E)以NMIgG或EpAb2-6处理HCT116细胞6小时,然后以抗EpCAM(IP:EpCAM)或抗HGFR(IP:HGFR)抗体进行免疫沉淀,然后进行西方墨点法。(图6F)将与1μg IgG或EpAb2-6共同处理的EpEX-His(2μg/ml)添加至HGFR-Fc(1μg/ml)包覆的ELISA盘中,并透过TMB比色过氧化物酶分析法检测。(图6G)藉由西方墨点法在以NMIgG或EpAb2-6处理24小时的HCT116细胞中检测EMT相关蛋白的含量。(图6H)在以EpAb2-6以及2μM GSK3β抑制剂(BIO)处理HCT116细胞24小时后,藉由西方墨点法在HCT116细胞中分析蛋白质表现。下图所示为标准化蛋白质表现的量化结果。(图6I)在收集细胞及接着进行西方墨点法之前,以10μM MG132以及EpAb2-6处理HCT116细胞6小时。(图6J)以NMIgG或EpAb2-6处理的HCT116细胞中Snail蛋白的稳定性。以指定的时间间隔使用100μg/ml环己酰胺(CHX)处理细胞并进行西方墨点法。下图所示为指定群组中Snail蛋白半衰期的量化结果。所有数据均表示为平均值±SEM。*,p<0.05;**,p<0.01。
图7A至7G:EpAb2-6与EpEX结合并透过F(ab’)2诱导细胞凋亡,并抑制受调节的膜内蛋白水解(RIP)活化及HGFR讯息传导。(图7A)使用ELISA(OD450)检查IgG EpAb2-6(小鼠)以及F(ab’)2与过夜包覆的EpEX-His(1μg/ml)的结合亲和力。(图7B)以100μg/ml的EpAb2-6的对照IgG、Fc或F(ab’)2处理HCT116细胞24小时。藉由萤光素膜联蛋白V-FITC/PI双标记对凋亡及坏死的细胞进行定量。(图7C)以10μg/ml对照IgG、MT201、人源化EpAb2-6(hEpAb2-6)或小鼠杂交瘤EbAb2-6(mEpAb2-6)处理HCT116及HT29细胞24小时。透过萤光素膜联蛋白V-FITC/PI双标记对凋亡及坏死的细胞进行定量。(图7D)以10μg/ml对照IgG、MT201、hEpAb2-6,或mEpAb2-6处理HCT116细胞16小时,然后以EpEX-His(50nM)处理15分钟。藉由西方墨点法检查磷酸化HGFR、AKT,以及ERK以及(图7E)RIP蛋白ADAM17与早老素2的含量。抗EpCAM抗体以及克唑替尼协同诱导大肠癌细胞凋亡。(图7F)以10μg/ml NMIgG或EpAb2-6以及4μMHGFR抑制剂克唑替尼处理HCT116以及HT29细胞24小时。藉由萤光素膜联蛋白V-FITC/PI双标记对凋亡及坏死的细胞进行定量。(图7G)以10μg/ml NMIgG或EpAb2-6以及10μM HGFR抑制剂克唑替尼处理HCT116以及HT29细胞。24小时后,藉由使用基质胶的Transwell分析法评估细胞侵袭。所有数据均表示为平均值±SEM。*,p<0.05。
图8A至8G:EpAb2-6与EpCAM的类EGF结构域I及II结合。以全长或类EGF结构域缺失突变体EpCAM-V5转染HEK293T细胞。藉由(图8A)西方墨点法、(图8B)流式细胞仪分析,以及(图8C)免疫萤光来评估抗体结合。(图8D)EpCAM突变体是以EGF-I(Y32A)以及EGF-II(L94A、Y95A或D96A)结构域中的胺基酸取代进行构筑的。EpCAM野生型及突变蛋白在HEK293T细胞中表现。藉由(图8E)免疫萤光、(图8F)流式细胞仪分析,以及(图8G)细胞ELISA来评估MT201、EpAb2-6,以及EpAb23-1与EpCAM野生型及突变体的结合。所有数据均表示为平均值±SEM。*,p<0.05;**,p<0.01。
图9A至9K:EpAb2-6与克唑替尼协同抑制肿瘤进展及转移。(图9A)以转移性动物模型评估EpAb2-6及/或克唑替尼作用的实验时间表。(图9B)以静脉注射5x106个HCT116细胞至NOD/SCID小鼠体内,然后以对照IgG、EpAb2-6及/或克唑替尼处理小鼠(n=5)。转移性动物模型中肺组织的存活曲线、中位存活天数,以及代表性H&E染色。(图9C)在原位动物模型中评估EpAb2-6及/或克唑替尼的实验时间表。(图9D)NOD/SCID小鼠接受HCT116-Luc细胞原位植入,然后在肿瘤接种后3天开始以对照IgG(正常小鼠IgG,NMIgG)、克唑替尼、EpAb2-6或克唑替尼结合EpAb2-6处理小鼠(n=5)。藉由使用IVIS200影像系统检查生物发光来监测肿瘤生长。(图9E)藉由生物发光定量监测的HCT116-Luc肿瘤细胞。(图9F)HCT116原位动物模型中每个处理组在以指定的方式处理后的体重。(图9G)HCT116原位动物模型中每个治疗组的存活曲线及中位存活天数。(图9H)NOD/SCID小鼠原位植入HT29-Luc细胞,然后在肿瘤接种后3天开始以对照IgG、克唑替尼、EpAb2-6或克唑替尼结合EpAb2-6处理小鼠(n=5)。藉由使用IVIS200影像系统检查生物发光来监测肿瘤生长。(图9I)透过生物发光定量监测的HT29-Luc肿瘤细胞。(图9J)HT29原位动物模型中每个处理组在以指定的方式处理后的小鼠体重。(图9K)HT29原位动物模型中每个处理组的存活曲线以及中位存活天数。所有数据均表示为平均值±SEM。*,p<0.05;**,p<0.01。
图10A至10B:人类EpCAM的序列特征及结构域。(图10A)全长人类EpCAM含有314个胺基酸残基(SEQ ID NO:17)。(图10B)鉴定EpCAM的结构域,其中EpEX结构域包括涵盖VGAQNTVIC(第51至59个胺基酸,SEQ ID NO:18)的EGF结构域I(第27-59个胺基酸),以及涵盖带有LYD基序(第94-96个胺基酸)的KPEGALQNNDGLYDPDCDE(第83至100个胺基酸,SEQ IDNO:19)的EGF结构域II(第66-135个胺基酸)。
图11:EpAb2-6的胺基酸序列,其中VH(SEQ ID NO:15)包含SEQ ID NO:2的HCCDR1、SEQ ID NO:4的HC CDR2,以及SEQ ID NO:6的HC CDR3;以及VL(SEQ ID NO:16)包含SEQ ID NO:9的LC CDR1、SEQ ID NO:11的LC CDR2,以及SEQ ID NO:13的HC CDR3。
具体实施方式
以下描述目的仅在说明本发明之各种具体实施例。因此,本文讨论之特定具体实施例或修改不应被解释为对本发明范围的限制。对本领域技术人员而言显而易见的是,在不背离本发明之范围的情况下可进行各种改变或产生等效物。
为了使本发明能清晰易懂地被理解,首先定义某些术语。在整个详细描述中阐述附加定义。除非另有定义,否则本文使用之所有技术及科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用,单数形式“一”、“一个”以及“该”包括复数指示物,除非上下文另有明确规定。因此,例如,提及“一组成分”,其包括本领域技术人员已知的多个这样的组成分及其等同物。
术语“包含(comprise)”或“包含(comprising)”通常以包括(include)/包括(including)的含义使用,其表示允许存在一种或多种特征、成分或组成分。术语“包含(comprise)”或“包含(comprising)”含括术语“组成(consists)”或“由...组成(consisting of)”。
如本文所用,术语“多胜肽”系指由透过胜肽键连接的胺基酸残基所组成的聚合物。术语“蛋白质”通常系指相对较大的多胜肽。术语“胜肽”通常系指相对较短的多胜肽(例如,含有最多100、90、70、50、30、20或10个胺基酸残基)。
如本文所用,术语“大约”或“约”系指本领域普通技术人员将理解的可接受偏差的程度,其可根据其使用的上下文而在一定程度上变化。具体而言,“大约”或“约”可表示具有在引用值周围±10%或±5%或±3%范围内的数值。
如本文所用,术语“基本相同”系指具有80%或更多、较佳85%或更多、更佳90%或更多、甚至更佳95%或更多同源性的两个序列。
如本文所用,术语“抗体(antibody)”(可与复数形式(antibodies)互换使用)系指具有特异性结合特定目标抗原分子的能力的免疫球蛋白分子。如本文所用,术语“抗体”不仅包括完整的(亦即,全长)抗体分子,还包括其保留抗原结合能力的抗原结合片段,例如Fab、Fab’、F(ab’)2,以及Fv。此类片段在本领域中也是众所周知的且经常在体外及体内使用。术语“抗体”还包括嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、双抗体、线性抗体、单链抗体、多特异性抗体(例如,双特异性抗体),以及包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型,包括抗体的胺基酸序列变体、抗体的糖基化变体,以及共价修饰的抗体。
完整或完全的抗体包含两条重链和两条轻链。每条重链包含一可变区(VH)以及一第一、第二以及第三恒定区(CH-1、CH-2,及CH-3);每条轻链包含一可变区(VL)以及一恒定区(CL)。抗体呈现“Y”字形,Y的主干由透过双硫键结合在一起的两条重链的第二及第三恒定区所组成。Y的每个手臂包括与一单个轻链的可变区以及恒定区结合的一单个重链的可变区及第一恒定区。轻链的可变区及重链的可变区负责与抗原结合。两条链中的可变区通常负责与抗原结合,每个可变区都包含三个高度可变区,称为互补决定区(complementaritydetermining regions,CDRs);亦即,重(H)链的CDRs包括HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3,以及轻(L)链的CDRs包括LC CDR1、LC CDR2,以及LC CDR3。该三个CDRs由框架区(FR1、FR2、FR3,以及FR4)围绕,这些框架区比CDRs更高度保守并形成支架以支持该些高度可变区。重链及轻链的恒定区不负责与抗原结合,但涉及各种效应子功能。根据抗体重链恒定结构域的胺基酸序列,免疫球蛋白可分为不同的类别。免疫球蛋白有五种主要类别:IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ以及μ。
如本文所用,术语“抗原结合片段”或“抗原结合结构域”系指负责抗原结合的完整抗体分子的一部分或区域。抗原结合片段能够结合与亲本抗体结合的相同抗原。抗原结合片段的实例包括,但不限于:(i)Fab片段,可为由VH-CH1链以及VL-CL链所组成之单价片段;(ii)F(ab’)2片段,可为在该铰链区透过双硫键连接的两个Fab片段所组成之二价片段;(iii)Fv片段,由一抗体分子的VH及VL结构域所组成,该二结构域透过非共价相互作用结合在一起;(iv)单链Fv(single chain Fv,scFv),可为由VH结构域以及VL结构域透过胜肽连接子所组成之单一多胜肽链;以及(v)(scFv)2,其可包含透过胜肽连接子连接的两个VH结构域以及两个VL结构域,这两个VL结构域透过双硫键与该两个VH结构域相连。
如本文所用,术语“嵌合抗体”系指含有来自不同来源,例如不同物种的多胜肽的抗体。于某些具体实施例中,在嵌合抗体中,轻链与重链的可变区可模拟源自一种哺乳动物(例如,非人类哺乳动物,例如小鼠、兔以及大鼠)的抗体的可变区,而该恒定区可与衍生自另一种哺乳动物(如,人类)的抗体中的序列同源。
如本文所用,术语“人源化抗体”系指包含源自人类抗体的框架区以及来自非人类(通常为小鼠或大鼠)的免疫球蛋白的一个或多个CDRs的抗体。
如本文所用,术语“人类抗体”系指其中轻链及重链序列的基本上整个序列,包括互补决定区(CDRs),来自人类基因的抗体。于某些情况下,人类抗体可包括一个或多个非由人类种系免疫球蛋白序列所编码的胺基酸残基,例如,透过一个或多个CDRs或一个或多个FRs中的突变,以,例如,降低可能的免疫原性、增加亲和力,以及消除可能导致不想要的折迭的半胱胺酸等。
如本文所用,术语“特异性结合”或“特异性地结合”系指两个分子之间的非随机结合反应,例如,抗体与其目标抗原的抗原决定位的结合。“特异性结合”目标抗原或抗原决定位的抗体为本领域熟知的术语,而且测定这种特异性结合的方法也是本领域所熟知。如抗体以比它与其他物质结合更大的亲和力/结合性、更容易,及/或更长的持续时间结合一目标抗原,则它与该目标抗原“特异性结合”。换言之,透过阅读该定义还可理解的是,例如,特异性结合一第一目标抗原的抗体可以或可以不特异性或优先结合一第二目标抗原。因此,“特异性结合”或“优先结合”不一定需要(尽管它可以包括)独占性结合。通常,结合的亲和力可以一解离常数(dissociation constant,KD)来定义。通常,当用于抗体时,特异性结合可指以小于约10-7M,例如,约10-8M或更小的KD值,例如,约10-9M或更小、约10-10M或更小、约10-11M或更小、约10-12M或更小,或甚至更小的KD值,并且以对应于KD值的亲和力与该特定目标结合,该KD值比其结合一非特异性抗原(例如,BSA或酪蛋白)的亲和力低至少10倍,例如低至少100倍,例如低至少1,000倍或至少低10,000倍。
如本文所用,术语“核酸”或“多核苷酸”可指由核苷酸单元所组成之聚合物。多核苷酸包括天然存在的核酸,例如去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,“DNA”)以及核糖核酸(ribonucleic acid,“RNA”)以及核酸类似物,包括那些具有非天然存在的核苷酸的核酸类似物。例如,可使用一自动化DNA合成仪合成多核苷酸。应当理解的是,当一核苷酸序列由一DNA序列(亦即,A、T、G、C)表示时,这也包括其中以“U”取代“T”的RNA序列(亦即,A、U、G、C)。术语“cDNA”系指与单链或双链形式的mRNA互补或相同的DNA。
如本文所用,术语“互补”系指两个多核苷酸的相互作用表面的拓扑相容性或配对在一起。当第一多核苷酸的核苷酸序列与第二多核苷酸的多核苷酸结合配偶体的核苷酸序列相同时,该第一多核苷酸与该第二多核苷酸互补。因此,序列5’-ATATC-3’的多核苷酸与序列为5’-GATAT-3’的多核苷酸互补。
如本文所用,术语“编码”系指多核苷酸(例如,一基因、一cDNA,或一mRNA)中特定核苷酸序列的天然特性,可作为在生物过程中合成其他聚合物及大分子的模板,具有给定的RNA转录子序列(亦即,rRNA、tRNA,以及mRNA)或给定的胺基酸序列以及由此产生的生物学特性。因此,若由该基因产生的mRNA的转录及转译在一细胞或其他生物系统中产生一蛋白质,则该基因编码该蛋白质。技术人员应当理解的是,由于遗传密码的简并性,许多不同的多核苷酸及核酸可编码相同的多胜肽。还应理解的是,技术人员可使用常规技术进行不影响由此处描述之多核苷酸编码的多胜肽序列的核苷酸进行取代,以反映要表现多胜肽的任何特定宿主生物中使用的密码子。因此,除非另有说明,否则“编码胺基酸序列的核苷酸序列”涵盖彼此为简并形式且编码相同胺基酸序列的所有核苷酸序列。
如本文所用,术语“重组核酸”系指具有非天然连接在一起的序列的多核苷酸或核酸。重组核酸可以载体的形式存在。“载体”可包含给定的目标核苷酸序列以及调控序列。载体可用于表现该给定的核苷酸序列(表现载体)或维持该给定的核苷酸序列以复制、操纵或在不同位置之间(例如,不同生物之间)转移。可将载体引入合适的宿主细胞以用于上述目的。“重组细胞”系指已将重组核酸引入其中的宿主细胞。“转化细胞”系指已透过重组DNA技术引入编码目标蛋白质的DNA分子的细胞。
载体可为不同的类型,包括质体、黏质体、游离基因组、F型黏接质体、人工染色体、噬菌体、病毒载体等。通常,在载体中,给定的核苷酸序列可操纵地连接至调节序列,使得当该载体被引入宿主细胞时,该给定的核苷酸序列可在该调节序列的控制下在该宿主细胞中表现。该调节序列可包括,例如,但不限于,启动子序列(例如,巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)启动子、猿病毒40(simian virus 40,SV40)早期启动子、T7启动子,以及醇氧化酶基因(AOX1)启动子)、起始密码子、复制起始点、增强子、分泌讯息序列(例如,α-交配因子讯息)、终止密码子,以及其他控制序列(例如,夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)序列以及终止序列)。较佳地,载体可进一步包含用于随后的筛选/选择程序的标记序列(例如,抗生素抗性标记序列)。基于蛋白质生产之目的,在载体中,该给定的目标核苷酸序列可连接到除了上述调节序列之外的另一核苷酸序列,进而产生融合的多胜肽并有利于随后的纯化程序。该融合多胜肽包括用于纯化目的之标签,例如,组胺酸标签(His-tag)。
如本文所用,术语“治疗”系指将一种或多种活性剂施用于患有疾病、该疾病之症状或病症,或该疾病之进展的个体,目的在于治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、增进,或影响该疾病、该疾病之症状或病症、由该疾病引起之残疾,或该疾病之进展或易感性。
本发明至少部分基于使用上皮细胞黏附分子(EpCAM)抑制剂以及HGFR抑制剂的结合癌症疗法之开发。
EpEX为一种EpCAM的胞外结构域,包含两个类表皮生长因子(EGF)结构域,可作为局部肿瘤微环境中的可溶性生长因子。EGF受体(EGFR)的活化可触发调节的EpCAM膜内蛋白水解(RIP)以诱导上皮间质转化(EMT)(Hsu等人,2016年)。EGFR为一种与多种癌症高度相关的RTK,因为它在多种肿瘤中过度表现(Normanno等人,2006年)。过度的HGFR活化透过许多下游效应子(例如,AKT、细胞外讯息相关激酶(ERK)、磷酸肌醇3-激酶、RAS,以及SRC)(Comoglio等人,2008年;Ortiz-Zapater等人,2017年)促进癌细胞的生长、存活及迁移(Normanno等人,2006年)。HGFR表现与基底型乳腺癌中的EGFR表现呈正相关(Comoglio等人,2008年;Ortiz-Zapater等人,2017年),且HGFR以及EGF家族受体通常在癌细胞中共表现(Comoglio等人,2008年;Ortiz-Zapater等人,2017年)。此外,EGFR依赖性磷酸化以及HGFR活化发生在以EGFR配体刺激表皮癌细胞时(Comoglio等人,2008年;Ortiz-Zapater等人,2017年)。在几种肿瘤类型中也观察到在具有升高的EGFR讯息传导的细胞中的HGFR的这种交叉活化(Tang等人,2008年)。
在本发明中,意外地发现EpEX与HGFR结合并活化其下游讯息传导以促进细胞增殖、迁移以及侵袭。还发现EpCAM中和抗体EpAb2-6减弱HGFR的磷酸化并抑制癌细胞转移。因此,本研究的结果提供同时以EpCAM及HGFR讯息传导为标靶以对抗癌症转移的机制原理。
如本文所用,“组合疗法”系指组合两种或更多种治疗剂或方法的治疗。“组合”系指同时或按顺序将两种或多种治疗剂或方法给予同一个体。较佳地,结合治疗提供协同效应。
如本文所用,术语“协同效应”可指并包括导致两种或更多种活性剂组合的协同效应,其中该两种或更多种活性剂的组合活性超过每种活性剂单独的活性之总和。术语“协同效应”还可指当一起使用两种或更多种活性剂时所提供的组合活性,其中每种活性剂使用的剂量较低,即可达到相当于或高于单一活性剂使用时所达到的活性。
因此,本发明提供一种用于治疗癌症之结合治疗,包括向有需要的个体施用组合物,该组合物包括(i)有效量的抑制EpCAM讯息传导活化的第一抑制剂(一pCAM抑制剂);以及(ii)有效量的抑制HGFR讯息传导活化的第二抑制剂(HGFR抑制剂)。
于某些具体实施例中,本文使用之抗EpEX抗体特异性结合EpCAM的类EGF结构域I(EpCAM的第27-59个胺基酸)以及EpCAM的类EGF结构域II(EpCAM的第66-135个胺基酸)。具体而言,如本文所用之抗-EpEX抗体对位于该类EGF结构域I的CVCENYKLAVN(第27-37个胺基酸)(SEQ ID NO:20)以及位于该类EGF结构域II的KPEGALQNNDGLYDPDCD(第83-100个胺基酸)(SEQ ID NO:19)序列内的抗原决定位具有特异性结合亲和力。更具体而言,本文使用之抗EpEX抗体识别EpCAM中结构域I内的NYK基序(第31-33个胺基酸)以及结构域II内的LYD基序(第94-96个胺基酸)。相较之下,许多其他抗体(例如,MT201、M97、323/A3以及依决洛单抗(edrecolomab))仅针对已充分描述之EpCAM的EGF结构域I为标靶。以下描述根据本发明之抗EpEX抗体与其他抗体的不同特征。
如本文所用之特定抗EpEX抗体为EpAb2-6,如以下之实施例中所示。EpAb2-6的重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)的胺基酸序列,以及其互补决定区(HC CDR1、HC CDR2,以及HC CDR3)(LC CDR1、LC CDR2,以及LC CDR3)如下表1所示。本发明之抗EpEX抗体包括EpAb2-6及其功能变体。
表1
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于某些具体实施例中,本发明之抗EpEX抗体为EpAb2-6的功能变体,其特征在于包含(a)VH,包含SEQ ID NO:2的HC CDR1、SEQ ID NO:4的HC CDR2,以及SEQ ID NO:6的HCCDR3;以及(b)VL,包含SEQ ID NO:9的LC CDR1、SEQ ID NO:11的LC CDR2,以及SEQ ID NO:13的HC CDR3,或其抗原结合片段。
于某些具体实施例中,本发明之抗EpEX抗体,具有(a)VH,包含SEQ ID NO:2的HCCDR1、SEQ ID NO:4的HC CDR2,以及SEQ ID NO:6的HC CDR3;以及(b)VL,包含SEQ ID NO:9的LC CDR1、SEQ ID NO:11的LC CDR2,以及SEQ ID NO:13的HC CDR3,可包含VH,该VH包含SEQID NO:15或与SEQ ID NO:15基本相同的胺基酸序列,以及VL,该VL包含SEQ ID NO:16或与SEQ ID NO:16基本相同的胺基酸序列。具体而言,本发明之抗EpEX抗体包括VH,该VH包含具有与SEQ ID NO:15至少80%(例如82%、84%、85%、86%、88%、90%、92%、94%、95%、96%、98%,或99%)同一性的胺基酸序列,以及VL,该VL包含具有与SEQ ID NO:16至少80%(例如82%、84%、85%、86%、88%、90%、92%、94%、95%、96%、98%,或99%)同一性的胺基酸序列。本发明之抗-EpEX抗体还包括由编码如本文所述之相关VH或VL胺基酸序列的多核苷酸序列所编码之任何重组(工程化)衍生的抗体。
术语“基本相同”可表示相较于参考抗体,变体的相关胺基酸序列(例如,在FRs、CDRs、VH或VL中)几乎没又差异,使得该变体相对于该参考抗体具有基本相似的结合活性(例如,亲和力、特异性或两者)以及生物活性。这种变体可能包括较小的胺基酸变化。可理解的是,多胜肽可能具有一有限数量的变化或修饰,这些变化或修饰可在与其活性或功能无关的多胜肽的某个部分内进行,但仍会产生具有可接受程度的等效或相似的生物学活性或功能的变体。于某些实施例中,该胺基酸残基变化为保守性胺基酸取代,系指化学结构相似的胺基酸残基与另一胺基酸残基对该多胜肽的功能、活性或其他生物学特性的影响较小或基本上没有影响。通常,相较于CDR区,FR区可进行相对更多的取代,只要它们不会对抗体的结合功能及生物活性产生不利的影响(例如,相较于该原始抗体,结合亲和力降低50%以上)。于某些具体实施例中,该参考抗体与该变体之间的序列同一性可为约80%、82%、84%、85%、86%、88%、90%、92%、94%、95%、96%、98%,或99%,或更高。可根据本领域普通技术人员已知的改变多胜肽序列的方法制备变体,例如,在汇编此类方法的参考文献中发现的那些,例如,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,J.Sambrook,J.Sambrook等人编辑,第二版,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约,1989年。例如,胺基酸的保守置换包括在以下群组内的胺基酸之间进行的置换:(i)A、G;(ii)S、T;(iii)Q、N;(iv)E、D;(v)M、I、L、V;(vi)F、Y、W;以及(vii)K、R、H。
本文所述之抗体可为动物抗体(例如,小鼠来源的抗体)、嵌合抗体(例如,小鼠-人类嵌合抗体)、人源化抗体,或人类抗体。本文所述之抗体还可包括它们的抗原结合片段,例如,Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段、单链Fv(scFv),以及(scFv)2。可透过本领域已知的方法制备抗体或其抗原结合片段。
如本文所用之抗-EpEX抗体的更多细节如美国专利第9,187,558号中所述,出于本文所引用之目的或主题,每个专利的相关公开内容透过引用并入本文。
本领域的许多常规方法可用于获得抗体或其抗原结合片段。
于某些具体实施例中,本文提供之抗体可透过常规融合瘤技术制备。通常,目标抗原,例如,可选择地与载体蛋白(例如,钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH))偶联的肿瘤抗原,及/或与佐剂(例如,完全弗氏佐剂)混合,可用于免疫宿主动物以产生与该抗原结合的抗体。收集分泌单株抗体的淋巴细胞并与骨髓瘤细胞融合以产生融合瘤。然后筛选以这种方式形成的融合瘤细胞株以鉴定并选择那些分泌所需单株抗体的融合瘤细胞株。
于某些具体实施例中,本文提供之抗体可透过重组技术制备。于相关态样,还提供编码所公开之胺基酸序列的分离的核酸,以及包含此类核酸的载体以及以该核酸转化或转染的宿主细胞。
例如,可将包含编码此类抗体的重链及轻链可变区的核苷酸序列的核酸选殖至表现载体(例如,细菌载体,如大肠杆菌载体、酵母载体、病毒载体,或哺乳动物载体),透过常规技术,且任何载体可被引入合适的细胞(例如,细菌细胞、酵母细胞、植物细胞,或哺乳动物细胞)中以表现该抗体。编码本文所述之抗体的重链及轻链可变区的核苷酸序列的实例如表1所示。哺乳动物宿主细胞株的实例为人类胚胎肾细胞株(293细胞)、小仓鼠肾细胞(BHK细胞)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、非洲绿猴肾细胞(VERO细胞),以及人类肝细胞(Hep G2细胞)。用于表现本文所述之抗体的重组载体通常包含一编码该抗体胺基酸序列的核酸,该核酸可操纵地连接至一组成型或诱导型的启动子。典型的载体含有用于调节编码该抗体的核酸表现的转录及转译终止子、起始序列,以及启动子。载体任选地包含用于原核及真核系统的选择标记物。于某些实施例中,编码重链及轻链的序列都包含在相同的表现载体中。于其他实施例中,抗体的每条重链及轻链被选殖至个别的载体中并单独产生,然后可在合适的条件下培养以进行抗体组装。
用于表现本文所述之抗体的重组载体通常包含编码该抗体胺基酸序列的核酸,该核酸可操纵地连接至组成型或诱导型启动子。该重组抗体可在原核或真核表现系统中产生,例如细菌、酵母、昆虫,以及哺乳动物细胞。典型的载体含有用于调节编码该抗体的核酸表现的转录及转译终止子、起始序列,以及启动子。载体任选地包含用于原核及真核系统的选择标记物。可以进一步分离或纯化所产生的抗体蛋白以获得基本上均质的制剂,用于进一步的分析及应用。例如,合适的纯化程序可包括在免疫亲和或离子交换管柱上分级分离、乙醇沉淀、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)、高效液相色层分析(high-performance liquid chromatography,HPLC)、硫酸铵沉淀,以及凝胶过滤。
当需要全长抗体时,本文所述之任何编码VH及VL链的序列可连接至编码免疫球蛋白的Fc区的序列,且所得之编码全长抗体重链及轻链的基因可在合适的宿主细胞(例如,植物细胞、哺乳动物细胞、酵母细胞,或昆虫细胞)中表现及组装。
可透过常规方法制备抗原结合片段。例如,可透过全长抗体分子的胃蛋白酶消化产生F(ab’)2片段,以及可透过还原F(ab’)2片段的二硫键来产生Fab片段。或者,这些片段也可透过重组技术制备,藉由在合适的宿主细胞中表现重链及轻链片段并将其组装,以在体内或体外形成所需的抗原结合片段。单链抗体可透过重组技术,藉由连接编码重链可变区的核苷酸序列以及编码轻链可变区的核苷酸序列来制备。较佳地,在两个可变区之间掺入弹性连接子。
可进一步修饰抗体以在该抗体的N-及/或C-端缀合一或多个附加元件,例如,另一种蛋白质及/或药物或载体。较佳地,与附加元件缀合的抗体保留所需的结合特异性以及治疗效果,同时提供由该附加元件产生的附加特性,例如,有助于溶解度、储存或其他处理特性、细胞渗透性、半衰期、减少超敏反应,控制递送,及/或分布。其他具体实施例包括标记的缀合,例如,用于分析、检测、追踪等的染料或萤光团。于某些具体实施例中,抗体可缀合至附加元件,例如,胜肽、染料、萤光团、碳水化合物、抗癌剂、脂质等。此外,抗体可透过Fc区直接附着在脂质体表面,例如形成免疫脂质体。
于某些具体实施例中,该第二抑制剂(HGFR抑制剂)阻断HGF与HGFR的结合。
于某些具体实施例中,该第二抑制剂(HGFR抑制剂)为HGFR的一种小分子酪胺酸激酶受体抑制化合物。表2所示为一些小分子HGFR抑制化合物之实例。
表2
可用于本发明之HGFR抑制化合物的其他实例包括,但不限于,AMEP(Bioalliance公司)、EMD-1204831(Merck KgaA/EMD Serono公司)、INCB-028060(Incyte/Novartis公司)、ARQ197(ArQule公司)、AMG102(Amgen公司),以及RG-3638(Roche/Genentech公司)。例如,于PCT专利申请公开第WO2012042421A1号中所描述之细节,其透过引用整体并入本文。
如本文所用,术语“小分子HGFR抑制化合物”或“小分子HGFR抑制剂”可包括抑制或结合HGFR的小分子化合物。除非另有说明,本文对小分子HGFR抑制剂的所有引用均包括对其药学上可接受之盐类、溶剂化物、水合物,以及复合物的引用,以及对其药学上可接受之盐类的溶剂化物、水合物,以及复合物(包括其多晶型物、立体异构体,以及同位素标记的形式)的引用。
如本文所用,术语“药学上可接受之盐类”包括酸加成盐类。“药学上可接受之酸加成盐类”系指保留游离碱的生物有效性及性质的那些盐类,其由无机酸形成,例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等,以及由有机酸形成,例如醋酸、丙酸、丙酮酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、三氟乙酸等。术语“药学上可接受之盐类”还包括碱盐。合适的碱盐由形成无毒盐的碱所形成。实例包括铝、精胺酸、苄乙二胺、钙、胆碱、二乙胺、二醇胺、甘胺酸、离胺酸、镁、葡甲胺、乙醇胺、钾、钠、氨丁三醇,以及锌盐。
本文所用之术语“有效量”系指在一治疗个体或细胞中赋予所需生物效应的活性成分的量。有效量可根据各种原因而改变,例如施用途径及频率、接受该药物的个体之体重及种类,以及施用目的。本领域技术人员可根据本文之公开内容、确定的方法,及其自己的经验来确定每种情况下的剂量。
透过本文所述之治疗方法治疗的个体可为哺乳动物,更佳为人类。哺乳动物包括,但不限于,农场动物、运动动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠,以及大鼠。
如本文所用,“药学上可接受之载体”系指该载体与该组合物中的活性成分相容,且较佳可稳定该活性成分并对接受的个体而言是安全的。该载体可为该活性成分的稀释剂、载剂、赋形剂,或基质。通常,包含活性成分的组合物,例如,EpCAM抑制剂、HGFR抑制剂,或其组合可配制为溶液形式,例如水溶液(如,盐溶液)或其可以粉末形式提供。适当的赋形剂还包括乳糖、蔗糖、葡萄糖、山梨糖、甘露糖、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙,海藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素,聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆,以及甲基纤维素。该组合物还可包含接近生理条件所需的药学上可接受之辅助物质,例如,pH调节剂以及缓冲剂,例如,乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。该组合物的形式可为片剂、丸剂、粉剂、锭剂、小包、口含锭、酏剂、混悬剂、洗剂、溶液、糖浆、软及硬明胶胶囊、栓剂、无菌注射液,以及包装粉末。本发明之组合物可透过任何生理上可接受之途径递送,例如口服、肠胃外(例如,肌肉内、静脉内、皮下,以及腹膜内)、透皮、栓剂,以及鼻内方法。于某些具体实施例中,本发明之组合物以一液体可注射制剂形式施用,其可以即用剂型或可重构的稳定粉末形式来提供。
于某些具体实施例中,本发明中使用的两种活性成分EpCAM抑制剂以及HGFR抑制剂可配制成混合物或独立地配制成套组形式,用于同时、分开或依序施用于个体。每种成分可与合适的药学上可接受之载体一起配制,以用于适当的给药途径。于某些具体实施例中,EpCAM抑制剂以及HGFR抑制剂可在合适的包装单元中提供,其中EpCAM抑制剂或包含EpCAM抑制剂的组合物以及HGFR抑制剂或包含HGFR抑制剂的组合物存在于不同的包装单元中。
根据本发明,相较于单独使用EpCAM抑制剂或HGFR抑制剂,EpCAM抑制剂与HGFR抑制剂的结合使用对于癌症治疗提供协同效应,特别是在抑制癌细胞的迁移/侵袭、减小肿瘤大小、减少或抑制肿瘤进展、转移,及/或延长癌症患者的生存期。特别是,如实施例(例如,实施例2.8)所示,在转移性及原位动物模型中,对照IgG以及HGFR抑制剂(克唑替尼)组中的所有动物都表现出显著的肿瘤以及较差的存活率,而以EpCAM中和抗体(EpAb2-6)作为EpCAM抑制剂的处理组则表现出较慢的肿瘤进展以及较高的中位生存期;令人惊讶的是,使用EpCAM中和抗体(EpAb2-6)作为EpCAM抑制剂以及HGFR抑制剂(克唑替尼)的结合治疗在减少肿瘤进展方面提供了显著的协同作用。
于某些具体实施例中,EpCAM抑制剂以及HGFR抑制剂同时、分别,或依序施用以提供协同抗癌或抗转移作用,特别是该癌症对协同组合敏感。
于某些具体实施例中,该癌症选自由肺癌、脑癌、乳癌、子宫颈癌、大肠癌、胃癌、头颈癌、肾癌、血癌、肝癌、卵巢癌、胰脏癌、前列腺癌、皮肤癌,以及睾丸癌所组成之群组。
本发明透过以下实施例进一步说明,提供这些实施例之目的是为了说明而非限制。本领域技术人员应当理解,根据本发明之内容,在不脱离本发明之精神及范围的情况下,可对所公开的具体实施方式进行许多改变且仍然获得相似或类似的结果。
实施例
已知EpCAM讯息传导可促进大肠癌的进展及转移。虽然转移是癌症治疗失败的主要原因之一,但EpCAM讯息传导在转移过程中的参与程度尚不清楚。于此,我们证明了EpCAM(EpEX)的可溶性胞外结构域与HGFR结合,且在大肠癌细胞中诱导下游讯息传导。我们还显示,在HGF处理后EpEX的产生升高,且EpEX以及HGF协同调节HGFR讯息传导。此外,EpEX透过活化ERK以及FAK-AKT讯息传导途径以增强大肠癌细胞的转移潜能,并透过降低GSK3β活性进一步稳定活化的β-连环蛋白以及Snail蛋白。最后,我们显示,抗EpCAM中和抗体(EpAb2-6)以及HGFR抑制剂(克唑替尼)的结合治疗可显著抑制肿瘤进展并延长大肠癌转移性以及原位动物模型的生存期。我们的研究结果阐明,EpCAM讯息传导促进大肠癌转移的分子机制,进一步表明EpAb2-6与克唑替尼的组合可能是大肠癌治疗的有效策略。
1.材料与方法
1.1化学品与抗体
抗α-微管蛋白以及GAPDH抗体来自Sigma-Aldrich公司。抗人类EpCAM抗体、抗总ERK以及Thr202/Tyr204-磷酸化ERK抗体、抗总AKT抗体、抗Ser473-磷酸化AKT抗体、抗总HGFR抗体、抗Tyr1234/1235-磷酸化HGFR抗体、抗非磷酸化(活化)β-连环蛋白(Ser45)抗体、抗β-连环蛋白抗体、抗E-黏附蛋白抗体、抗波形蛋白抗体、抗Snail抗体、抗Slug抗体,以及抗Twist抗体来自Cell Signaling Technology公司。LY294002(AKT抑制剂)亦来自CellSignaling Technology公司。福瑞替尼(HGFR抑制剂)、SU11274(HGFR抑制剂)、U0126(MEK抑制剂)、PF-562271(FAK抑制剂),以及BIO(GSK3β抑制剂)购自Selleck Chemicals公司。克唑替尼(HGFR抑制剂)购自Med Chem Express公司。抗总GSK3β抗体、抗磷酸化GSK3β(磷酸化S9)抗体、抗磷酸化ADAM17(磷酸化T735)抗体、抗总ADAM17抗体、抗磷酸化早老素2/AD5(磷酸化S327)抗体、抗总早老素2/AD5抗体、抗V5-tag抗体、抗6x His-tag抗体,以及抗c-Myc-tag抗体,以及Met(pY1234/pY1235)+总Met ELISA套组(ab126451)购自Abcam公司。人类HGFR(c-MET)以及HGF重组蛋白则购自Sino Biological公司。
1.2细胞株与培养
使用以下人类细胞株:HEK293T、大肠癌细胞株HCT116(ATCC:CCL-247),以及HT29。细胞在添加10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS;Gibco公司)以及100μg/ml青霉素/链霉素(P/S;Gibco公司)的Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(Dulbecco modified Eagle’smedia,DMEM)中,于37℃、5% CO2加湿培养箱中培养。
1.3哺乳动物慢病毒shRNA
针对敲低实验,pLKO载体中的人类EpCAM shRNA系从台湾地区研究院的RNAi核心设施所获得。慢病毒系根据标准程序稍作修改所生产。简言之,将293T细胞以70%的密度接种在100毫米培养皿中,并转染包装载体(亦即,pCMV-ΔR8.91,含有gag、pol以及rev基因)、包膜载体(亦即,pMD2.G;VSV-G表现质体),以及一个别shRNA载体。使用poly-jet转染试剂(SignaGen Laboratories公司)将shRNA质体转染至293T细胞中。经过隔夜培养后,将培养基更换为含BSA的培养基。以含有聚凝胺(8μg/ml)的病毒上清液感染HCT116细胞24小时。重复感染过程,然后将细胞在嘌呤霉素(2μg/ml)中培养7天,以选择具有稳定shRNA表现的细胞。
1.4EpCAM基因敲除
针对EpCAM敲除,自Genescript公司购买CRISPR/cas9 gRNA构筑物。为了产生慢病毒,293T细胞转染CRISPR/cas9 gRNA质体、EpCAM gRNA(目标序列:GTGCACCAACTGAAGTACAC,SEQ ID NO:21)、包装质体(pCMV-ΔR8.91)以及包膜表现质体(pMD.G)。以含有慢病毒的培养基培养HCT116或HT29细胞,并以2μg/ml嘌呤霉素筛选。从筛选到的群体中分离出单细胞株,并以西方墨点法检测EpCAM的表现。
1.5EpEX-His重组蛋白的生产及纯化
使用Expi293表现系统表现并纯化重组蛋白。细胞在Expi293表现培养基中生长,透过添加增强剂诱导蛋白表现。离心收获上清液。于4℃下以8000g离心20分钟后,将上清液与镍螯合亲和树脂(Ni-NTA,Qiagen公司)于4℃下作用2小时。以含有50mM Tris-HCl(pH8.0)、500mM NaCl,以及20mM咪唑的清洗缓冲液清洗树脂,并以含有50mM Tris-HCl(pH8.0)、500mM NaCl,以及250mM咪唑的流洗缓冲液流洗蛋白质。
1.6EpCAM类EGF结构域缺失突变体之构筑
在EpCAM的胞外结构域中,EpCAM在第27-59个胺基酸(类EGF结构域I)以及第66-135个胺基酸(类EGF结构域II)处包含两个类EGF结构域,以及一个不含半胱胺酸的基序(Schnell等人,2013年)。EpCAM类EGF结构域缺失突变体系使用标准QuikChangeTM缺失突变系统所产生,该系统具有第一正向诱变缺失引子(5'-GCAGCTCAGGAAGAATCAAAGCTGGCTGCC-3',SEQ ID NO:22)、第一反向诱变缺失引子(5'-GGCAGCCAGCTTTGATTCTTCCTGAGCTGC-3',SEQ ID NO:23)、第二正向引子(5'-AAGCTGGCTGCCAAATCTGAGCGAGTGAGA-3',SEQ ID NO:24),以及第二反向引子(5'-TCTCACTCGCTCAGATTTGGCAGCCAGCTT-3',SEQ ID NO:25)。使用KAPA HiFi热启动DNA聚合酶(Kapa Biosystems公司)进行PCR扩增,并以限制酶DpnI(Thermo Scientific公司)处理产物以消化甲基化的亲本DNA。
1.7免疫沉淀分析
以蛋白酶抑制剂(Roche公司)在裂解缓冲液(50mM Tris-HCl,pH 7.4、150mMNaCl,以及1% NP-40)中裂解细胞。针对免疫沉淀,将细胞裂解物及抗体于4℃下作用6小时。然后,加入20μL Dynabeads蛋白G,该混合物于4℃下培养2小时以下拉抗体结合蛋白。以PBS清洗免疫沉淀样品3次,在样品缓冲液中变性,并以西方墨点法分析。
1.8单株抗体的产生及IgG的纯化
如前所述(Liao等人,2015年)进行EpAb2-6以及对照IgG的生成。实验方法经台湾地区研究院动物实验伦理委员会(AS IACUC:11-04-166)核准。
1.9蛋白质萃取以及西方墨点法
以RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.4、1% NP-40、0.5%去氧胆酸钠、0.1%SDS、150mM NaCl、2mM EDTA、50mM NaF)制备全细胞萃取物。细胞裂解物的蛋白质浓度由Bradford分析法确定。裂解物在10%聚丙烯酰胺凝胶上分离,然后转移至PVDF膜上。以含有3% BSA的PBST阻隔该膜1小时。然后将膜与初级抗体一起作用至隔天。施用适当的辣根过氧化物酶相关的二级抗体(Millipore公司),并将膜于室温(RT)下作用1小时。随后以化学发光试剂(Millipore公司)使蛋白质条带可视化,并以BioSpectrum 600影像系统(UVP公司)进行检测。使用Gel-Pro分析仪3.1(Media Cybernetics公司)以条带强度进行蛋白质含量的量化。
1.10细胞活性分析
透过使用WST-1(4-[3-(4-碘苯)-2-(4-硝基苯基)-2H-5-四唑啉]-1,3-苯二磺酸盐)分析法测量粒线体去氢酶活性以测定细胞活性。将细胞以104个细胞/孔的密度接种在96孔盘中并培养24小时。将含有指定浓度的EGF、EpEX或聚醣-EpEX的新培养基添加至细胞中。处理期结束时,每孔加入10μl WST-1增殖试剂(5μg/ml),于37℃下培养1小时。培养后,使用分光光度微量盘分析仪于波长450nm处检测每个孔的吸光度。
1.11细胞群落形成分析
将细胞接种于24孔盘中(1x 104个细胞/孔)并培养7天。然后以4%的甲醛固定细胞并以结晶紫溶液染色。捕获该24孔盘的影像后,将含有0.5% SDS的溶液添加到每个孔中,并将该24孔盘于室温下作用2小时。然后藉由使用微量盘分析仪测量溶液于波长570nm处的吸光度以确定细胞的相对密度。本实验进行三重复。
1.12Transwell迁移及侵袭分析
以含或不含10%基质胶的8-μm孔径的Transwell迁移室(Millicell公司)测定细胞迁移及侵袭。将细胞(1x 105个)添加至含有500μl无血清DMEM的上室中。然后,将含有10% FBS的700μl DMEM作为化学引诱剂添加至下室中。于37℃下在标准细胞培养箱中进行16小时的迁移及侵袭。然后,以棉签从膜的上表面去除细胞,迁移到下表面的细胞则以包含0.05%(w/v)结晶紫的4%多聚甲醛(溶于1x PBS内)染色15分钟并以水清洗。将膜干燥15-20分钟,然后针对每个实验条件的样品以高功率检查膜上的至少四个随机区域以进行细胞计数。
1.13细胞凋亡分析
接种细胞并以10μg/ml单株抗体或抑制剂处理6小时;以适当稀释度的无关小鼠骨髓瘤免疫球蛋白(Invitrogen公司,型号02-6200)作为IgG2a同种型对照。使用Annexin V-FITC以及PI检测凋亡细胞,并使用流式细胞仪(BD Immunocytometry Systems)进行分析。使用Annexin V-FITC细胞凋亡检测套组II(BD Pharmingen公司)测量早期细胞凋亡。以碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色检测晚期凋亡细胞核。
1.14 RNA萃取、cDNA合成、定量反转录聚合酶连锁反应(quantitative reversetranscription polymerase chain reaction,qRT-PCR)
如制造商说明书所述进行总RNA萃取、第一链cDNA合成,以及基于SYBR-green的即时PCR。为了萃取总RNA,使用TRIzol试剂(Invitrogen公司)裂解细胞,并使用氯仿从TRIzol中去除蛋白质及苯酚。离心后,收集顶部无色层并与异丙醇混合以沉淀RNA。然后以70%乙醇清洗该RNA沉淀物,于室温下风干,并将该RNA溶解于不含RNase的水中。针对第一链cDNA的合成,使用5μg总RNA与oligo(dT)引子以及SuperScriptIII反转录酶(Invitrogen公司)于50℃下进行反转录60分钟。使用LightCycler 480SYBR Green I Master Mix(Roche公司)以及LightCycler480 System(Roche公司)藉由定量PCR(quantitative PCR,qPCR)评估目标基因含量。测量GAPDH mRNA的表现作为内源性管家基因对照以标准化所有q-PCR反应。qPCR反应为95℃5分钟,然后进行40个循环,95℃变性10秒,60℃黏合10秒,72℃延伸30秒。最终结果由三个独立实验计算得出。用于检测目标基因的mRNA表现的引子序列列于补充材料表3中。
表3
1.15大肠癌转移动物模型
透过尾静脉将PBS中的大肠癌HCT116或HT29细胞(5x 106个细胞/小鼠)注射至4-6周龄的雌性NOD/SCID小鼠中。然后将小鼠按体重随机分配到不同的处理组。3天后,以尾静脉注射施用抗体,每周两次,连续四周。每日透过口服管饲法施用克唑替尼,每周5天(处理4周)。针对治疗研究,荷瘤小鼠接受同种型对照IgG1(15mg/kg)、克唑替尼(20mg/kg)、EpAb2-6(15mg/kg),或克唑替尼(20mg/kg)结合EpAb2-6(15mg/kg)的处理。测量小鼠存活率。动物护理依照台湾地区研究院的指导方针进行。该实验程序经台湾地区研究院动物实验伦理委员会核准(AS IACUC:20-05-1468)。
1.16原位植入与治疗研究
如先前报导所述建立原位肿瘤模型(Chen等人,2020年)。简言之,NSCID小鼠用于原位植入先前感染Lenti-luc病毒(含有萤光素酶基因的慢病毒)的HCT116细胞。透过腹腔注射麻醉小鼠。以250mg/kg的剂量注射麻醉剂Avertin、2,2,2-三溴乙醇(Sigma-Aldrich公司)。透过生物发光影像监测肿瘤发展。针对治疗研究,荷瘤小鼠接受同种型对照IgG1(15mg/kg)、克唑替尼(20mg/kg)、EpAb2-6(15mg/kg),或克唑替尼(20mg/kg)结合EpAb2-6(15mg/kg)处理。藉由定量生物发光来监测肿瘤进展。并且监测小鼠存活率。动物护理依照台湾地区研究院的指导方针进行。该实验程序经台湾地区研究院动物实验伦理委员会核准(AS IACUC:20-05-1468)。
1.17统计分析
针对指定的实验次数,所有数据均表示为平均值±SEM。以未配对学生氏t检验分析实验与对照培养物中的表现百分比。p值小于0.05被认为具有统计学意义。
2.结果
2.1EpEX透过与HGFR相互作用诱导HGFR磷酸化
在我们先前的研究中,我们以Human Phospho-RTK Array Kit(R&D Systems公司)进行分析,发现EpEX在HCT116细胞中诱导EGFR与HGFR磷酸化(Liang等人,2018年)。为了测试内源性EpCAM是否直接与HCT116以及HT29大肠癌细胞株中的HGFR相互作用,我们使用交联剂DTSSP来稳定推定的EpCAM-HGFR复合物。正如我们所预测,藉由免疫沉淀(IP)以及西方墨点法证实EpCAM与HGFR的相互作用(图1A)。为了进一步研究膜结合的EpCAM是否可与HGFR的胞外结构域(HGFRECD)结合,我们使用过表现EpCAM-V5以及HGFRECD-c-Myc-tag的HEK293T细胞进行共免疫沉淀(co-IP)实验。结果证实外源性EpCAM与HGFR之间的相互作用(图1B)。接下来,我们进行IP实验以探测重组EpEX-Fc与HGFRECD-His重组蛋白之间的直接相互作用。(图1C)。为了研究EpEX对大肠癌细胞中HGFR磷酸化的影响,我们分析了HCT116以及HT29细胞中磷酸化HGFR的含量。西方墨点法以及ELISA结果显示,EpCAM与EpEX均诱导两种细胞类型中的HGFR磷酸化。事实上,只有EpEX可以在没有EpCAM的情况下诱导HGFR磷酸化(图1D及图1E)。
EpEX由两个类EGF的结构域所组成(Schnell等人,2013年),因此我们试图确定哪个结构域与HGFR相互作用。为此,我们构建了各种类EGF结构域缺失突变体(EpCAMΔEGFI+II、EpCAMΔEGFI,以及EpCAMΔEGFII)质体。令人惊讶的是,仅含有一个类EGF结构域缺失的突变体(EpCAMΔEGFI以及EpCAMΔEGFII)可与HGFR相互作用,而两个结构域缺失的突变体(EpCAMΔEGFI+II)则未显示出这种结果(图1F)。当评估HGFRECD与可溶性EpEX野生型或突变蛋白的结合时,观察到类似的结果(图1G)。总体而言,这些发现表示膜结合的EpCAM以及分泌的EpEX皆可透过EpCAM/EpEX的EGF结构域I或II结合HGFR。
接下来,我们进行ELISA以探测EpEX-Fc以及HGFR-His蛋白的类EGF结构域缺失突变体的几种变体之间的潜在相互作用。结果证实,当HGFR与EpEXΔEGFI+II突变蛋白的结合完全消除时,EpEX透过其两个结构域与HGFR结合(图1H)。与先前研究的野生型EpEX(图1D以及E)表现出的磷酸化结果相似,我们观察到EpEXΔEGFI以及EpEXΔEGFII都可诱导HGFR磷酸化,但EpEXΔEGFI+II蛋白则不能(图1I及图1J)。基于这些结果,我们得出结论,EpEX可与HGFR结合并诱导随后的磷酸化。
2.2EpEX透过HGFR讯息传导促进肿瘤进展
EpCAM诱导HGFR磷酸化的能力表示该途径可能部分负责大肠癌细胞的致瘤性。为了研究EpCAM以及HGFR活化是否协同调节癌症进展及转移,我们检测了在有或没有HGF处理的EpCAM敲除细胞中磷酸化ERK以及AKT的含量。西方墨点法结果显示,在EpCAM敲除的HCT116以及HT29细胞中,HGFR、AKT以及ERK的磷酸化不受HGF处理的影响(图2A)。此外,细胞生长试验的结果显示,EpCAM敲除细胞的生长速度比野生型HCT116及HT29细胞慢,但EpCAM敲除的HCT116及HT29细胞的生长轨迹可以HGF处理来恢复(图2B)。
为了确定EpEX是否可透过HGFR讯息传导诱导癌症进展及侵袭,我们分析了以EpEX-His以及HGFR的酪胺酸激酶抑制剂SU11274组合处理后,大肠癌细胞中EGFR、ERK以及AKT的磷酸化。我们发现SU11274可减弱HCT116及HT29细胞中EpEX调节的ERK及AKT的磷酸化(图2C)。为了进一步了解这种抑制对细胞生长的影响,我们发现,单独以EpEX处理会刺激HCT116以及HT29细胞的生长,而SU11274消除了大肠癌细胞中由EpEX诱导的细胞活性及增殖的增加(图2D)。
此外,HGFR敲低降低了HGFR、EGFR、AKT以及ERK的磷酸化程度。有趣的是,HGFR敲低也降低了EGFR的磷酸化程度(图2E)。此外,HGFR敲低减少了EpEX诱导的RIP(磷酸化的ADAM17以及早老素2)(图2F)以及活化β-连环蛋白的核转译(图2G)。此外,HCT116细胞中HGFR的敲低显著降低了EpEX诱导的细胞生长及细胞群落的形成(图2H及图2I)。事实上,我们发现透过IP分析显示,以HGF处理HCT116细胞后EpEX的产生增加(图2J)。我们还注意到,HGF的处理增加了HCT116细胞中ADAM17、早老素2以及EpEX的磷酸化(图2K)。
2.3EpEX活化ERK及FAK-AKT的讯息传导
已知EpCAM透过其下游效应子影响癌细胞的生长、存活以及转移。在其讯息传导过程中,EpCAM的蛋白水解产生EpEX,这可能进一步刺激RIP以及EpICD的释放,随后转导EpCAM讯息传导(Lin等人,2012年)。此外,先前的研究显示,对HCT116细胞进行EpEX处理可透过磷酸化TACE与早老素2(γ-分泌酶的催化亚基)来增加RIP(Liang等人,2018年)。因此,我们以EpEX处理EpCAM敲除的HCT116细胞,导致HGFR下游讯息传导的部分恢复,例如AKT、FAK以及ERK的磷酸化以及RIP蛋白(ADAM17与早老素2)的磷酸化(图3A)。先前的研究显示,GSK3β拮抗剂透过AKT刺激EMT(An等人,2020年)。根据此一机制,我们发现EpEX可挽救GSK3β(S9,非活化GSK3β)的抑制性磷酸化,同时降低EpCAM敲除细胞中GSK3β(Y216,活化GSK3β)的活化磷酸化(图3A)。我们还发现EpEX增加了EpCAM敲除的HCT116细胞中的细胞群落形成(图3B),并阻断内源性EpEX而非EpICD的脱落,导致HGFR、AKT以及ERK的磷酸化程度降低,表示内源性EpEX对HGFR讯息传导活化相当重要(图3C)。
我们接下来测试EpEX是否可增强HGF诱导的HGFR讯息传导。相较于单独以EpEX或HGF处理,HCT116以及HT29细胞与可溶性EpEX结合HGF的作用上调了HGFR的磷酸化以及随后的下游包括AKT以及ERK的磷酸化(图3D)。由于EpEX可触发HGFR活化,我们进一步研究EpEX对HGFR讯息传导介质的影响。于此情况下,AKT以及ERK讯息传导是两个最重要的癌症相关讯息传导途径(Chang等人,2013年;Sun等人,2015年),因为它们在EMT、细胞周期、存活,以及癌症进展的调节中发挥多种生理作用。因此,我们测试了HGFR抑制剂(SU11274)、AKT抑制剂(LY294002)、ERK抑制剂(U0126),以及FAK抑制剂(PF-562271)是否会影响HCT116细胞中由EpEX诱导的讯息传导。我们注意到,EpEX增加了AKT、ERK以及FAK的磷酸化程度(图3E)、细胞群落形成潜力(图3F)、伤口愈合(图3G)以及迁移(图3H)的能力。总之,这些结果表示,EpEX透过诱导大肠癌细胞中的HGFR活化来增加ERK以及FAK-AKT讯息传递途径。
2.4EpEX透过下调GSK3β活性来诱导活化β-连环蛋白以及Snail蛋白的表现以促进EMT及侵袭
我们发现,EpCAM敲除抑制了间质标记物波形蛋白的表现,以及EMT调节因子Snail的蛋白含量,同时增强了HCT116细胞中E-黏附蛋白的表现;此外,这种EMT指标在EpEX处理后恢复(图4A)。EpEX还在EpCAM敲除的HCT116细胞中诱导细胞侵袭(图4B)。
为了研究EpCAM以及HGFR活化是否协同调节癌细胞侵袭,我们检视有或没有以HGF处理的EpCAM敲除细胞。我们发现,相较于野生型细胞,EpCAM敲除的HCT116及HT29细胞中,EMT相关蛋白的表现以及细胞侵袭特性显著降低。在EpCAM敲除细胞中,HGF诱导的EMT及侵袭活性也降低了(图4C及图4D)。相较于单独以EpEX或HGF处理,HCT116以及HT29细胞与EpEX结合HGF的作用上调了EMT的程度以及细胞侵袭(图4E及图4F)。此外,透过HGFR的敲低可防止EpEX诱导的EMT相关蛋白表现以及细胞侵袭(图4G及图4H)。这些结果表示,EpEX可增强HGFR活化并诱导大肠癌细胞的EMT及转移。
先前的报导显示,GSK3β拮抗剂透过AKT讯息传导刺激EMT,进而透过其磷酸化及泛素调节的蛋白水解影响Snail蛋白的转换(An等人,2020年)。根据此一机制,我们发现,EpEX可诱导GSK3β(S9,非活化GSK3β)的抑制性磷酸化,同时降低该蛋白质的活化磷酸化(Y216,活化GSK3β);这些变化与HCT116细胞中Snail蛋白的表现增加一致。然而,SU11274可减弱EpEX调节的GSK3β活性并消除HCT116细胞中EpEX诱导的活性β-连环蛋白以及Snail蛋白的表现(图4I)。我们还发现,HGFR下游介质的抑制剂(亦即,LY294002、U0126,以及PF-562271)可减弱EpEX调节的GSK3β活性以及Snail蛋白的表现(图4J)。LY294002、U0126以及PF-562271也抑制EpEX诱导的侵袭(图4K)。值得注意的是,在以GSK3β抑制剂BIO处理后,对照及EpEX处理的细胞中活性β-连环蛋白以及Snail蛋白的表现均上调(图4L)。这些结果表示,EpEX透过下调GSK3β活性诱导活β-连环蛋白以及Snail蛋白的表现来促进EMT及侵袭。
2.5EpEX透过抑制泛素化调节的蛋白酶体降解来促进Snail蛋白的稳定性
我们透过以表现Cas9的慢病毒以及以EpCAM为目标的sgRNA转染大肠癌细胞,来分析EpCAM对EMT相关基因表现的影响。结果显示,EpCAM的敲除增加了E-黏附蛋白的基因表现,降低了VIM的基因表现。然而,EpCAM的敲除不影响SNAIL基因的表现程度(图5A)。事实上,我们注意到,环己酰胺处理加上EpCAM的敲除缩短了Snail蛋白的半衰期(图5B)。另一方面,以MG132(26S蛋白酶体抑制剂)处理则增加Snail稳态蛋白质的含量,表示蛋白质含量在很大程度上受蛋白酶体降解的控制(图5C)。相较于对照细胞,EpCAM的敲除还导致泛素化Snail蛋白的含量增加(图5D)。此外,以环己酰胺处理进一步证实EpEX延长了Snail蛋白的半衰期(图5E)。EpEX不影响Snail基因的表现及程度(图5F),而MG132在有或没有EpEX处理的情况下则增加HCT116细胞中的Snail稳态蛋白的含量(图5G)。
于此方面,Snail蛋白的富含丝胺酸区域的两个共通基序(基序1:S97、S101;基序2:S108、S112、S116、S120)对其转录后调控及泛素化调节的蛋白酶体降解相当重要(Zhou等人,2004年)。以野生型(Snail-WT)以及三种突变体(Snail-2SA、Snail-4SA,以及Snail-6SA)Snail构筑体转染HCT116细胞(图5H)。虽然以EpEX处理转染细胞显著增加了Snail-WT以及Snail-2SA的表现,但对Snail-4SA以及Snail-6SA突变体的表现没有观察到这种影响(图5I)。这些数据显示,EpEX透过Snail蛋白在癌细胞中的富含丝胺酸的共通基序2上调节Snail的蛋白质稳定性。综上所述,这些实验的结果显示,EpEX透过促进大肠癌细胞中Snail蛋白的稳定性,在EMT的调节中具有重要的作用。
2.6EpAb2-6透过活化GSK3β来抑制EpCAM以及HGFR的讯息传导并促进活化β-连环蛋白以及Snail蛋白的降解
于此之前,我们开发了一种中和抗体EpAb2-6,其以EpEX为标靶并诱导癌细胞凋亡(Liang等人,2018年;Liao等人,2015年)。因此,我们使用EpAb2-6阻断大肠癌细胞中EpEX的功能,并分析HCT116细胞中HGFR、AKT、FAK、GSK3β、ERK、ADAM17及早老素2的磷酸化程度。相较于以对照IgG处理,以EpAb2-6处理细胞导致HGFR、AKT、ERK以及FAK的磷酸化程度降低(图6A)。HGF的处理增加了HCT116细胞中HGFR、AKT以及ERK的磷酸化程度。同时,这些磷酸化蛋白的含量在以EpAb2-6处理的细胞中显著降低。此外,EpAb2-6的处理也显著降低了HCT116细胞的侵袭及迁移活性(图6B)。当HCT116细胞在以EpAb2-6处理后再以HGF处理时,EpAb2-6对侵袭及迁移的影响被部分减弱(图6C及6D)。
有趣的是,EpAb2-6降低了EpCAM与HGFR之间的关联,这透过HCT116细胞中内源蛋白的IP而被检测到(图6E)。为了评估重组EpEX是否直接与HGFR结合,我们进行ELISA以探测纯化的EpEX-His以及HGFR-Fc蛋白之间的相互作用。ELISA分析进一步证实EpEX与HGFR的结合活性,我们还发现,抗EpCAM单株抗体EpAb2-6可抑制EpEX与HGFR的结合(图6F)。
在这些实验之后,我们接下来分析以对照IgG或EpAb2-6处理的HCT116细胞中的EMT蛋白表现程度。结果显示,EpAb2-6增加了E-钙黏蛋白的含量,同时降低了Snail及活性β-连环蛋白的含量(图6G)。此外,EpAb2-6降低了S9处GSK3β的抑制性磷酸化(非活化GSK3β),同时增加了Y216处蛋白质的活化磷酸化(活化GSK3β)。预计这些变化会增加GSK3β的活性,并且与观察到的活化β-连环蛋白以及Snail蛋白的减少一致。相应地,在以GSK3β抑制剂BIO处理后,活化β-连环蛋白以及Snail蛋白的含量增加(图6H)。以EpAb2-6处理则降低了活化β-连环蛋白以及Snail稳态蛋白的含量,而以蛋白酶体抑制剂(MG132)处理增则加了活化β-连环蛋白以及Snail稳态蛋白的含量(图6I)。此外,EpAb2-6缩短了Snail蛋白的半衰期,如环己酰胺处理试验所示(图6J)。这些结果显示,EpAb2-6透过下调HGFR讯息传导来抑制转移过程,并透过增加GSK3β的活性允许活化β-连环蛋白以及Snail蛋白的降解。
我们进一步测试EpAb2-6的二价抗体片段F(ab’)2与EpEX的结合是否可诱导细胞凋亡。结果显示,EpAb2-6的F(ab’)2确实可与EpEX结合(图7A)并诱导大肠癌细胞凋亡(图7B)。我们还使用细胞凋亡分析来评估人源化EpAb2-6(hEpAb2-6)以及人类抗EpCAM抗体阿德木单抗(adecatumumab)(MT201)是否具有相似的活性。EpAb2-6以及hEpAb2-6在诱导细胞凋亡方面表现出相似的功能属性,而MT201在HCT116或HT29癌细胞中没有表现出这种效果(图7C)。我们还发现,EpAb2-6以及hEpAb2-6都抑制HGFR、AKT以及ERK的磷酸化,但MT201则不能(图7D)。在以EpAb2-6或hEpAb2-6处理后,磷酸化的ADAM17及早老素2的含量也降低了,而MT201抗体没有这种效果(图7E)。我们的数据显示,EpEX以及HGFR协同刺激下游HGFR的讯息传导以促进肿瘤进展及细胞侵袭,因此我们希望透过同时阻断EpCAM以及HGFR的讯息传导来进一步测试抗肿瘤效果。此外,我们发现,HGFR抑制剂克唑替尼可增强EpAb2-6对HCT116以及HT29癌细胞的凋亡作用(图7F)。在细胞侵袭试验中,相较于对照IgG,克唑替尼增强了EpAb2-6对HCT116以及HT29细胞侵袭的抑制作用(图7G)。
2.7EpAb2-6与EpCAM的类EGF结构域I及II结合
先前的一项研究确认EpAb2-6抗体的结合抗原决定位为EpCAM中的LYD基序,该基序对应于第94-96个胺基酸残基;特别是,残基95(Y95)在EpAb2-6结合中具有主要的作用(Liao等人,2015年)。于本文中,我们发现EpEX透过类EGF结构域I及II与HGFR结合(图1F及图1G),且EpAb2-6可抑制EpEX与HGFR的结合(图6E及图6F)。因此,我们想确定该抗体是否在EpEX的两个类EGF结构域与EpCAM结合(图8A、图8B、图8C)。为了确认EpAb2-6识别EpCAM中的LYD基序,我们构筑了编码EpCAM的第一类EGF重复序列(第27-59个胺基酸;EGF-I结构域)的cDNA序列以及第二类EGF重复序列(第66-135个胺基酸;EGF-II/TY结构域)的cDNA序列。然后使用基于PCR的定点诱变将突变引入每个结构域(图8D)。透过免疫萤光(图8E)、流式细胞仪分析(图8F)以及细胞ELISA分析(图8G)评估EpAb2-6抗体对这些EpCAM突变体的反应。EpCAM位置Y32(EGF-I结构域)或Y95(EGF-II结构域)的胺基酸突变导致EpAb2-6的结合显著降低,但不影响MT201的结合。因此,我们得出结论,EpAb2-6与EpEX的EGF-I以及EGF-II结构域结合,分别以胺基酸残基Y32以及Y95为标靶。
2.8EpAb2-6提高克唑替尼治疗大肠癌动物模型的疗效
在动物模型中,移植后72小时开始进行处理(图9A)。首先,我们检视克唑替尼与EpAb2-6对大肠癌细胞HCT116转移的影响。在注射细胞后3天,对NOD/SCID小鼠静脉注射HCT116细胞,然后以克唑替尼以及EpAb2-6或等量的对照IgG共同处理。相较于对照IgG,植入HCT116细胞并接受EpAb2-6及克唑替尼结合处理的小鼠的中位生存时间以及总生存时间都增加(图9B),这支持了EpAb2-6可提高克唑替尼体内抗转移作用的观点。
接下来,我们在大肠癌原位小鼠模型中测试了结合EpAb2-6及克唑替尼以作为治疗策略的效果。如图9C所示,透过体内监测稳定表现萤火虫萤光素酶的HT29-Luc以及HCT116-Luc细胞来评估肿瘤生长。在开始处理前(肿瘤细胞植入后3天),在所有的小鼠中都可观察到肿瘤生长。处理后,相较于对照IgG或单独使用克唑替尼的组别,接受EpAb2-6或EpAb2-6与克唑替尼结合处理的小鼠的生物发光强度显著降低;在移植HCT116(图9D及图9E)或HT29(图9H及图9I)细胞的原位模型中观察到类似的效果。此外,在移植HCT116(图9F)或HT29(图9J)细胞原位模型中,处理组之间的体重没有显著差异。相较于对照IgG组,接受EpAb2-6及克唑替尼组合的移植HCT116(图9G)或HT29(图9K)细胞的小鼠的中位生存时间以及总生存时间显著增加。总体而言,我们使用转移性及原位动物模型的实验结果显示,对照IgG及克唑替尼组中的所有动物都出现了明显的肿瘤且存活率很差。同时,相较于对照IgG或单独以克唑替尼处理的组别,以EpAb2-6处理的组别的肿瘤进展要慢得多,且显示出更高的中位生存期。重要的是,肿瘤进展的减弱在结合处理组中最为明显。
3.讨论
EpCAM表现与许多癌症的肿瘤发生及转移相关,因此我们试图阐明本研究中的潜在机制。于此,我们进一步显示EpEX诱导的肿瘤进展及转移是由HGFR讯息传导所调节的。
许多研究已将高HGFR表现或活化与癌症患者的不良结果连结(Birchmeier等人,2003年)。HGFR的高表现预示着甲状腺癌及非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的预后不良,HGFR为大肠癌中肿瘤侵袭及淋巴结转移的预测因子(Al-Saad等人,2017年;Takeuchi等人,2003年)。先前的报导还显示,在胃癌及CRC模型中,阻断HGFR讯息传导可减少肿瘤细胞在体外及体内的生长与扩散(Smolen等人,2006年;Toiyama等人,2012年;Zou等人,2007年)。
HGF为一种可调节上皮细胞增殖的细胞激素,主要由间质细胞表现及分泌(Lassus等人,2006年;Taher等人,2002年)。HGF讯息传导的主要协调者为HGFR,由该讯息传导途径诱导的复杂程序促进增殖、存活、基质降解及迁移。HGFR及HGF共同构成了伤口闭合及血管生成所必需的重要上皮及间质相互作用的基础(Comoglio&Trusolino,2002年)。我们的结果显示,EpCAM的敲除减弱了大肠癌细胞中HGFR的磷酸化,相较于野生型细胞,EpCAM敲除的HCT116细胞的细胞生长及迁移能力显著降低。当在EpCAM敲除的HCT16细胞中恢复以HGF处理时,EpCAM诱导的对细胞增殖及迁移的效果被部分逆转。EpCAM调节HGFR磷酸化的能力显示该途径很可能在大肠癌细胞中发挥重要作用。
酪胺酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors,TKIs)为一种小分子药物,可透过阻止ATP到达激酶结构域的ATP结合口袋来以活化的RTK作为标靶,无论配体是否存在(Pasquini&Giaccone,2018年)。通常,抗药性的产生是由于获得可消除TKI作用的RTK突变,或透过扩增另一种可刺激类似讯息传导的RTK,例如HGFR(Sacher等人,2014年)。我们团队先前使用人类磷酸化-RTK分析套组来筛选EpEX-Fc以及Fc处理的HCT116大肠癌细胞中RTK的磷酸化。结果显示,EpEX处理可刺激HGFR(MET)-酪胺酸磷酸化(Liang等人,2018年)。在这项研究中,我们发现HCT116大肠癌细胞与可溶性EpEX-His蛋白一起作用可诱导HGFR磷酸化。有趣的是,HGFR酪胺酸激酶抑制剂(SU11274)可减弱EpEX调节的ERK以及AKT磷酸化。此外,我们证实HGFR的消耗可减弱EpEX诱导的细胞生长及侵袭,这与HGFR抑制剂的作用一致。
许多研究显示,EMT与癌症进展及转移有关(Iwatsuki等人,2010年)。EMT过程涉及一系列复杂的可逆事件,这些事件可导致丧失上皮细胞黏附以及诱导出细胞间质表型。EMT为肿瘤提供获得间质特征所需的类似干细胞的可塑性特征,使肿瘤细胞能够扩散并变得更具侵袭性(Sacchetti等人,2021年;Thiery及Sleeman,2006年)。随着丧失上皮细胞黏附以及诱导间质特性,经历EMT的癌细胞也表现出增强的细胞运动及侵袭。EMT的指标包括间质标记物(如,波形蛋白、Snail蛋白,以及Slug蛋白)的表现增加,以及上皮标记物(如,E-钙黏蛋白)的表现降低,这会破坏细胞与细胞之间的连接(Meng等人,2012年)。此外,经历过EMT的细胞也会对细胞凋亡产生抗性。许多报告显示,不同癌症类型的EMT可促进对各种治疗药物的抗药性(Singh&Settleman,2010年)。基于治疗目的,可透过以有助于活化肿瘤细胞中EMT程序的肿瘤微环境成分为标靶来阻断EMT(Shibue&Weinberg,2017年)。例如,HGF透过HGFR讯息传导诱导EMT程序,进而透过允许细胞在没有锚定的情况下在血流中存活,以增强癌细胞的侵袭及转移潜力。先前的报导显示,FAK-PI3K/AKT以及MAPK讯息传导途径促进大肠癌以及胶质母细胞瘤的迁移及转移(Golubovskaya,2014年;Song等人,2016年)。我们的数据则显示,这些分子的抑制剂(亦即,SU11274、LY294002、U0126,以及PF-562271)可减弱EpEX诱导的HCT116细胞的迁移及侵袭。
透过EpEX讯息传导抑制GSK3β可稳定β-连环蛋白以及Snail蛋白,进而协调诱导EMT相关的细胞迁移及侵袭。值得注意的是,EMT与非磷酸化(活化)β-连环蛋白的高度表现以及β-连环蛋白易位进入细胞核相关,但单独的β-连环蛋白过度表现并不一定促进EMT相关过程(Kim等人,2000年;Zhou等人,2004年)。此外,Snail为一种锌指转录因子,可透过抑制E-黏附蛋白的表现来触发EMT。许多致癌讯息,如PI3K/AKT、MAPK以及Wnt,已被证明可抑制GSK3β,进而导致Snail蛋白及随后的EMT的稳定(Zhou等人,2004年)。我们的数据显示,EpEX透过降低GSK3β的活性来稳定活化β-连环蛋白以及Snail蛋白以诱导EMT及侵袭。此外,我们研发之抗EpCAM抗体透过增加GSK3β活性来抑制EMT及侵袭,进而导致活化β-连环蛋白以及Snail蛋白的降解。
HGFR讯息转导为抗癌治疗的重要标靶,而且在开发该途径的拮抗剂方面已经挹注了许多努力。许多HGFR酪胺酸激酶结构域的小分子抑制剂目前正在临床试验中进行评估。已知HGFR的过度表现会促进许多癌细胞的抗药性,导致治疗效果不佳并缩短患者的寿命(Yang等人,2021年;Zhao等人,2020年)。例如,有些强有力的临床前及临床证据显示,HGFR讯息传导途径为多发性骨髓瘤患者多种药物抗药性的关键驱动因素(Moschetta等人,2013年)。大多数HGFR抑制剂直接以其RTK活性作为标靶,而非以HGF配体为标靶,因为HGFR活化的主要机制并不依赖配体的HGFR过度表现(Koch等人,2020;Liang等人,2020年)。目前有两种非选择性HGFR TKIs获得核准:用于ALK以及ROS1阳性NSCLC的克唑替尼(2011年首次核准)以及用于甲状腺癌及肾癌的卡博替尼(2016年首次核准)(Kobayashi等人,2016年;Shaw等人,2014年)。HGFR抑制的相关性正在接受严密的评估,有几项关于克唑替尼的临床试验正在进行。其中一项克唑替尼试验结果显示,对于治疗带有HGFR外显子14跳跃突变的NSCLC有一定的希望(Paik等人,2015年)。MErCuRIC1第I期试验正在评估将克唑替尼与一种MEK抑制剂的组合用于一组带有扩增HGFR及野生型或突变RAS(NCT02510001)的CRC患者上(VanSchaeybroeck等人,2015年)。先前的一份报告显示,克唑替尼可阻断HGF/STAT3/SOX13/HGFR反馈回路以抑制SOX13调节的CRC迁移、侵袭,以及转移(Du等人,2020年)。
我们团队创造出一种EpEX中和抗体EpAb2-6,其可用来阻断EpEX的功能。已知以EpAb2-6处理会破坏EpEX/EGFR/ADAM17轴中的讯息传导,该轴包含一个正向反馈回路以促进EpCAM裂解并随后增加EpEX以及EpICD的产生(Liang等人,2018年;Liao等人,2015年)。值得注意的是,在EpAb2-6处理后观察到磷酸化HGFR含量的降低。此外,EpAb2-6可减弱HCT116细胞的侵袭及迁移能力,但以HGF处理后则恢复部分能力。先前的报导已经证明EpAb2-6可诱导细胞凋亡,我们证实在克唑替尼治疗后,HCT116细胞对人源化EpAb2-6抗体以及EpAb2-6诱导的细胞凋亡敏感。我们使用的来自原位大肠癌动物模型的结果还显示,在EpAb2-6及克唑替尼结合治疗后,肿瘤生长受到显著抑制。
在NSCLC的潜在治疗中,克唑替尼以及其他以HGFR为标靶的治疗具有一些最有益的结果。这一事实强调了深入了解可用于阻断HGFR活化的机制的重要性。我们发现EpCAM或EpEX可诱导HGFR-ERK-AKT讯息传导轴。根据这些发现,EpCAM可能是与克唑替尼结合治疗的绝佳标靶。事实上,在我们的实验中,EpAb2-6降低了磷酸化HGFR的含量并提高了克唑替尼在动物模型中的治疗效果。因此,我们的研究结果揭示了EpCAM在调节HGFR讯息传导中的新作用,并提出以EpCAM/HGFR为标靶的结合治疗的新策略。
于本研究中,我们发现EpCAM/EpEX透过在大肠肠癌细胞中诱导HGFR活化、GSK3β-Snail蛋白以及β-连环蛋白的讯息传导,透过ERK以及FAK-AKT诱导肿瘤进展及转移。我们进一步证明EpCAM讯息传导的抑制或消耗会导致HGFR活化及其下游讯息传导的减少。以抗EpCAM单株抗体EpAb2-6治疗可减少大肠癌的进展及转移,重要的是,它提高了小鼠在原位肿瘤及转移模型中的存活率。因此,我们的数据显示,以EpCAM为标靶的治疗性抗体与HGFR抑制剂的结合使用可能对大肠癌治疗具有巨大潜力。从这些发现中获得的见解可能有助于开发可抑制转移并改善患者预后的新型抗癌疗法。
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二正向引子
<400> 24
aagctggctg ccaaatctga gcgagtgaga 30
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二反向引子
<400> 25
tctcactcgc tcagatttgg cagccagctt 30
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EPCAM引子F
<400> 26
ctccacgtgc tggtgtgt 18
<210> 27
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EPCAM引子R
<400> 27
tgttttagtt caatgatgat ccagta 26
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E-钙黏蛋白引子F
<400> 28
ggaactatga aaagtgggct tg 22
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E-钙黏蛋白引子R
<400> 29
aaattgccag gctcaatgac 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VIM引子F
<400> 30
gtttccccta aaccgctagg 20
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VIM引子R
<400> 31
agcgagagtg gcagagga 18
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNAIL引子F
<400> 32
cttcggctcc aggagagtc 19
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNAIL引子R
<400> 33
ttcccactgt cctcatctga c 21
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH引子F
<400> 34
cttcaccacc atggaggagg c 21
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH引子R
<400> 35
ggcatggact gtggtcatga g 21
Claims (21)
1.一种治疗癌症的方法,包括向有需要的个体施用
(i)有效量的第一抑制剂,其抑制上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesionmolecule,EpCAM)讯息传导的活化;以及
(ii)有效量的第二抑制剂,其抑制肝脏生长因子受体(hepatocyte growth factorreceptor,HGFR)讯息传导的活化。
2.根据权利要求1的方法,其中该第一抑制剂减少上皮细胞黏附分子(EpCAM)的胞外结构域(EpEX)的产生(或释放)、阻断EpEX与肝脏生长因子受体(HGFR)的结合,及/或抑制EpEX诱导的HGFR磷酸化。
3.根据权利要求1或2的方法,其中该第二抑制剂阻断肝脏生长因子(hepatocytegrowth factor,HGF)与肝脏生长因子受体(HGFR)的结合。
4.根据权利要求1至3中任一项的方法,其中该第一抑制剂系针对EpEX的抗体或其抗原结合片段。
5.根据权利要求4的方法,其中该抗体特异性结合类表皮生长因子(epidermal growthfactor,EGF)结构域I及II。
6.根据权利要求4的方法,其中该抗体对位于该类EGF结构域I的CVCENYKLAVN序列(第27至37个胺基酸)(SEQ ID NO:20)以及位于该类EGF结构域II的KPEGALQNNDGLYDPDCD序列(第83至100个胺基酸)(SEQ ID NO:19)内的抗原决定位具有特异性结合亲和力。
7.根据权利要求4至6中任一项的方法,其中该抗体或抗原结合片段包含
(a)重链可变区(VH),其包含:包含SEQ ID NO:2的胺基酸序列的重链互补决定区1(heavy chain complementary determining region 1,HC CDR1)、包含SEQ ID NO:4的胺基酸序列的重链互补决定区2(HC CDR2),以及包含SEQ ID NO:6的胺基酸序列的重链互补决定区3(HC CDR3);以及
(b)轻链可变区(VL),其包含:包含SEQ ID NO:9的胺基酸序列的轻链互补决定区1(light chain complementary determining region 1,LC CDR1),包含SEQ ID NO:11的胺基酸序列的轻链互补决定区2(LC CDR2),以及包含SEQ ID NO:13的胺基酸序列的轻链互补决定区3(LC CDR3)。
8.根据权利要求1至7中任一项的方法,其中该第一抑制剂有效抑制TACE以及PS2讯息传导的磷酸化。
9.根据权利要求1至8中任一项的方法,其中该第二抑制剂系选自由福瑞替尼(foretinib)、克唑替尼(crizotinib)以及卡博替尼(cabozantinib)所组成之群组。
10.根据权利要求1至9中任一项的方法,其中该方法有效诱导癌细胞凋亡。
11.根据权利要求1至10中任一项的方法,其中该方法有效抑制癌细胞的迁移/侵袭及/或减小肿瘤大小。
12.根据权利要求1至11中任一项的方法,其中该方法有效延长该个体的寿命。
13.根据权利要求1至12中任一项的方法,其中该癌症选自由下列所组成之群组:肺癌、脑癌、乳癌、子宫颈癌、大肠癌、胃癌、头颈癌、肾癌、血癌、肝癌、卵巢癌、胰脏癌、前列腺癌、皮肤癌,以及睾丸癌。
14.一种套组或医药组合物,包括:
(i)第一抑制剂,其抑制上皮细胞黏附分子(EpCAM)讯息传导的活化;以及
(ii)第二抑制剂,其抑制肝脏生长因子受体(HGFR)讯息传导的活化。
15.根据权利要求14之套组或医药组合物,其中该第一抑制剂如权利要求1、2、4至8中任一项所定义,及/或该第二抑制剂如权利要求3或9所定义。
16.一种(i)抑制上皮细胞黏附分子(EpCAM)讯息传导活化的第一抑制剂以及(ii)抑制肝脏生长因子受体(HGFR)讯息传导活化的第二抑制剂之组合用于制造治疗癌症的药物或套组之用途。
17.根据权利要求16之用途,该第一抑制剂如权利要求1、2、4至6中任一项所定义,及/或该第二抑制剂如权利要求3或7所定义。
18.根据权利要求16或17之用途,其中该药物或套组有效诱导癌细胞凋亡。
19.根据权利要求16至18中任一项之用途,其中该药物或套组有效抑制癌细胞的迁移/侵袭及/或减小肿瘤大小。
20.根据权利要求16至19中任一项之用途,其中该药物或套组有效延长该个体的寿命。
21.根据权利要求16至20中任一项之用途,其中该癌症选自由下列所组成之群组:肺癌、脑癌、乳癌、子宫颈癌、大肠癌、胃癌、头颈癌、肾癌、血癌、肝癌、卵巢癌、胰脏癌、前列腺癌、皮肤癌,以及睾丸癌。
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