KR20240026985A - 상피 세포 부착 분자(epcam) 억제제 및 간세포 성장 인자 수용체(hgfr) 억제제와의 조합된 암 요법 - Google Patents

상피 세포 부착 분자(epcam) 억제제 및 간세포 성장 인자 수용체(hgfr) 억제제와의 조합된 암 요법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 상피 세포 부착 분자(EpCAM) 억제제 및 간세포 성장 인자 수용체(HGFR) 억제제를 사용한 암의 조합 요법에 관한 것이다. 구체적으로, EpCAM 억제제는 EpCAM의 세포외 도메인(EpEX)에 대한 항체이다. 조합 요법은 암 세포의 아폽토시스를 유도하고, 암 세포의 이동/침윤을 억제하고, 종양 크기를 감소시키고, 및/또는 암 환자의 생존을 연장하는데 효과적이다.

Description

상피 세포 부착 분자(EPCAM) 억제제 및 간세포 성장 인자 수용체(HGFR) 억제제와의 조합된 암 요법
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C. §119 하에 2021년 6월 25일에 출원된 미국 가출원 번호 63/215,016호의 이익을 청구하며, 이러한 문헌의 전체 내용은 본원에 참조로서 포함된다.
기술분야
본 발명은 상피 세포 부착 분자(EpCAM) 억제제 및 간세포 성장 인자 수용체(HGFR) 억제제를 사용한 암의 조합 요법에 관한 것이다. 구체적으로, EpCAM 억제제는 EpCAM의 세포외 도메인(EpEX)에 대한 항체이다. 조합 요법은 암 세포의 아폽토시스를 유도하고/하거나, 암 세포의 이동/침윤을 이동하고/하거나, 종양 크기를 감소시키고/시키거나, 암 환자의 생존을 연장하는데 효과적이다.
EpCAM은 314개의 아미노산 및 39 내지 42 kDa의 관찰된 분자량을 갖는 타입 I 막횡단 단백질이다. 이는 세포외 도메인(EpEX, 265개 아미노산), 단일 막횡단 도메인, 및 짧은 세포내 도메인(EpICD, 26개 아미노산)을 함유한다. 잘 알려진 종양-관련 항원으로서, EpCAM은 다양한 암종에서 풍부하고, 또한 정상 상피에서 동형 세포-세포 부착에 관여하는 것으로 알려져 있다(Dolle et al, 2012). EpCAM은 대다수의 건강한 상피 편평 세포에서 부재하거나 약하게 발현되지만, 편평 세포 암종에서는 강하게 발현된다(Balzar et al, 1999). 또한, 편평상피 암종에서 EpCAM의 발현은 증가된 세포 증식 및 감소된 분화와 상관관계가 있다(Litvinov et al, 1996). 본 발명자의 그룹은 이전에 결장직장 암종(CRC) 치료로서 사용하기에 강한 잠재력을 갖는 EpCAM, EpAb2.6에 대한 중화 항체를 개발하였다(Chen et al, 2020; Liang et al, 2018; Liao et al, 2015). CRC에서 치료 표적으로서의 이의 약속에도 불구하고, EpCAM이 종양형성 및 전이에 기여하는 메카니즘은 여전히 완전히 알려져 있지 않다.
HGFR(c-MET)은 간세포 성장 인자(HGF, 스캐터 인자로도 알려져 있음)에 의해 활성화되고 MET 유전자에 의해 인코딩되는 고친화성 수용체 티로신 키나제(RTK)이다(Lai et al, 2009; Peschard & Park, 2007). HGFR의 티로신 키나제 도메인은 위치 1234 및 1235에 2개의 티로신 잔기를 함유하고, 이들 2개 부위의 인산화는 HGFR 수용체의 활성화에 필수적이다(Koch et al, 2020; Ponzetto & Comoglio, 2006). 많은 보고서에서는 종양형성, 세포 성장, 생존 및 전이에서 HGFR에 대한 중요한 역할이 입증되었다(Cao et al, 2019; Li et al, 2018; Mazzone & Comoglio, 2006). 정상 조직에서, HGFR은 상피 세포에서 발현되며, 여기서 이는 주변 중간엽 세포로부터 또는 순환계에서 유래된 HGF에 의해 활성화된다(Birchmeier et al, 2003). HGF에 의한 HGFR 활성화 시에, 세포 이동 및 침윤을 촉진하기 위해 형태형성 프로그램이 개시된다. 이의 공지된 기능에 기초하여, HGFR은 배아 발달, 성체 조직 항상성 및 재생에 정상적으로 참여하는 원종양유전자인 것으로 간주된다. 특히, HGFR에 대한 초기 연구는 이것이 성장 인자 수용체 및 RTK 패밀리 둘 모두와 상동성을 갖는 것으로 나타났다(Dean et al, 1985). HGFR은 스캐터 인자로 불리는 HGFR 리간드와 동일한 HGF에 대한 동족 RTK인 것이 나중에 입증되었다(Koch et al., 2020; Naldini et al, 1991).
상피-중간엽 전이(EMT)는 암 진행 및 전이와 관련이 있다(Iwatsuki et al, 2010). EMT의 과정은 상피 세포 부착의 손실 및 세포에서 중간엽 표현형의 유도를 초래할 수 있는 복잡한 일련의 가역적 사건을 포함한다. EMT를 겪는 암 세포는 또한 중간엽 특성 및 상피 세포 부착 손실의 유도를 통해 향상된 세포 이동성 및 침윤을 나타낸다. EMT의 지표는 E-카드헤린과 같은 상피 마커의 발현 감소와 함께 비멘틴(Vimentin), Snail 및 Slug와 같은 중간엽 마커의 발현 증가를 포함한다(Singh & Settleman, 2010). 많은 보고서에서는 HGFR 신호전달은 EMT 프로그램을 촉진하여 암 세포의 침윤성 및 전이성 잠재력을 향상시킨다는 것을 나타내었다(Gumustekin et al, 2012; Jiao et al, 2016).
EpEX는 2개의 표피 성장 인자(EGF)-유사 도메인을 함유하고, 이는 국소 종양 미세환경에서 가용성 성장 인자로서 작용할 수 있다. 이전 보고서에서는 EGF 수용체(EGFR)의 활성화가 EMT를 유도하기 위해 EpCAM의 조절된 막내 단백질분해(RIP)를 유발할 수 있음을 보여주었다(Hsu et al, 2016). 특히, EGFR은 다양한 종양에서 과발현되기 때문에 많은 유형의 암과 매우 관련이 있는 RTK이다(Normanno et al, 2006). EGFR의 효과와 유사하게, 과도한 HGFR 활성화는 AKT, 세포외 신호-관련 키나제(ERK), 포스포이노시티드 3-키나제, RAS, 및 SRC와 같은 다수의 다운스트림 이펙터를 통해 작용하는, 암 세포의 성장, 생존 및 이동(Kim et al, 2014; Simiczyjew et al, 2018)을 증진시킨다(Comoglio et al, 2008; Ortiz-Zapater et al, 2017). 흥미롭게도, HGFR 발현은 기저형 유방암에서 EGFR 발현과 양의 상관관계가 있으며(Mueller et al, 2010), HGFR 및 EGF 패밀리 수용체는 종종 암 세포에서 공동-발현된다(Shattuck et al, 2008). 또한, EGFR-의존적 인산화 및 HGFR의 활성화는 EGFR 리간드로 표피 암종 세포의 자극시 발생하는 것으로 보고되었다(Jo et al, 2000). 상승된 EGFR 신호전달을 갖는 세포에서 HGFR의 이러한 교차-활성화는 또한 여러 유형의 종양에서 관찰되었다(Tang et al, 2008). 그러나, 중요하게는, 이러한 교차-활성화 효과의 근간이 되는 메커니즘은 이전에 확인되지 않았다.
암을 치료하기 위한 상피 세포 부착 분자(EpCAM) 억제제 및 HEGR 억제제의 조합 사용이 본원에 개시된다. 구체적으로, EpCAM 억제제는 EpCAM의 세포외 도메인(EpEX)에 대한 항체이다. 조합 요법은 암 세포의 아폽토시스를 유도하고/하거나, 암의 이동/침윤을 억제하고/하거나, 종양 크기를 감소시키고/시키거나, 암 환자의 생존을 연장하는데 효과적이다.
일 양태에서, 본 발명은 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게
(i) 유효량의, EpCAM 신호전달의 활성화를 억제하는 제1 억제제; 및
(ii) 유효량의, HGFR 신호전달의 활성화를 억제하는 제2 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 제1 억제제는 EpEX의 생산(또는 방출)을 감소시키고/시키거나 HGFR에 대한 EpEX의 결합을 차단하고/하거나 EpEX-유도된 HGFR 인산화를 억제한다.
일부 구현예에서, 제2 억제제는 HGFR에 대한 HGF의 결합을 차단한다.
일부 구현예에서, 제1 억제제는 EpEX에 대한 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항-EpEX 항체는 표피 성장 인자(EGF)-유사 도메인 I 및 II에 특이적으로 결합한다. 특정 예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항-EpEX 항체는 EGF-유사 도메인 I에 위치한 CVCENYKLAVN(aa 27 내지 37)(서열번호 20) 및 EGF-유사 도메인 II에 위치한 KPEGALQNNDGLYDPDCD(aa 83 내지 100)(서열번호 19)의 서열 내의 에피토프에 대한 특정 결합 친화력을 갖는다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은
(a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(HC CDR1), 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(HC CDR2), 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(HC CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및
(b) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(LC CDR1), 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(LC CDR2), 및 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보적 결정 영역 3(LC CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)
을 포함한다.
일부 구현예에서, VH는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하고/하거나 VL은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 억제제는 TACE의 인산화 및 PS2 신호전달을 억제하는데 효과적이다.
일부 구현예에서, 제2 억제제는 포레티닙, 크리조티닙, 및 카보잔티닙으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 암 세포의 아폽토시스를 유도하는데 효과적이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 암 세포의 이동/침윤을 억제하고/하거나 종양 크기를 감소시키는데 효과적이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 대상체의 생존을 연장하는데 효과적이다.
일부 구현예에서, 암은 폐암, 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 위암, 두경부암, 신장암, 백혈병, 간암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 피부암 및 고환암으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은
(i) 유효량의 EpCAM 신호전달의 활성화를 억제하는 제1 억제제; 및
(ii) 유효량의, HGFR 신호전달의 활성화를 억제하는 제2 억제제를
포함하는 약학적 조성물의 키트를 제공한다.
또한, 본 발명에서, 암을 치료하기 위한 의약 또는 키트를 제조하기 위한 (i) EpCAM 신호전달의 활성화를 억제하는 제1 억제제 및 (ii) HGFR 신호전달의 활성화를 억제하는 제2 억제제의 조합물의 용도가 제공된다.
본 발명의 하나 이상의 구현예의 세부사항은 하기 설명에 기재되어 있다. 본 발명의 다른 특징 또는 이점은 여러 구현예의 하기 상세한 설명, 및 또한 첨부된 청구범위로부터 명백할 것이다.
전술한 요약 뿐만 아니라 본 발명의 하기 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 본 발명을 예시할 목적으로, 현재 바람직한 구현예가 도면에 도시되어 있다. 그러나, 본 발명은 도시된 정확한 배열 및 수단으로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
도면에서,
도 1a 내지 1j. EpEX는 HGFR과 상호작용하고 HGFR 인산화를 유도한다. (도 1a) HCT116 및 HT29 세포에서 HGFR에 결합된 내인성 EpCAM의 면역침전(IP). (도 1b) HEK293T 세포를 HGFRECD-c-Myc 및 EpCAM-V5로 트랜스펙션시켰다. IP는 대조군 IgG, 항-V5 항체 또는 항-c-Myc 항체에 이어 웨스턴 블롯팅으로 수행되었다. (도 1c) EpEX-Fc 및 HGFR-His 재조합 단백질(2.5 ㎍/ml) 상호작용을 Dynabeads 단백질 G를 사용한 IP 및 항-6X His 태그 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅에 의해 조사하였다. (도 1d) 굶주린 HCT116 및 HT29 세포를 상이한 용량의 EpEX-His로 15분 동안 처리하고, 굶주린 HCT116 및 HT29 세포를 지시된 시간 동안 50 nM EpEX-His로 처리하였다. HGFR의 인산화를 웨스턴 블롯팅에 의해 조사하였다. (도 1e) 야생형(WT) 또는 EpCAM 녹아웃(KO) HCT116 및 H29 세포를 16시간 동안 굶주린 다음, EpEX-His(50 nM)로 15분 동안 처리하였다. 인산화된 HGFR의 수준을 ELISA 키트(ab126451)로 검정하였다. (도 1f) HEK293T 세포를 HGFRECD-c-Myc 및 전장 또는 EGF 유사-도메인 결실 돌연변이체 EpCAM-V5로 트랜스펙션시켰다. 단백질 상호작용을 항-V5 또는 항-c-Myc 항체를 이용한 IP 및 항-V5 또는 항-cMyc 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 조사하였다. (도 1g) HEK293T 세포를 c-Myc 또는 HGFRECD-c-Myc 및 전장 또는 EGF 유사-도메인 결실 돌연변이체 EpEX-His로 트랜스펙션시켰다. 항-c-Myc 항체를 이용한 IP 및 항-cMyc 및 항-His 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 단백질 상호작용을 조사하였다. (도 1h) HGFR-His 재조합 단백질(2 ㎍/ml)을 EGF 유사-도메인 결실 돌연변이체-Fc-코팅된(1 ㎍/ml) ELISA 플레이트에 첨가하고, TMB 비색 퍼옥시다제 검정에 의해 검출하였다. HCT116 세포를 굶주리고 야생형 또는 EGF-도메인 결실 돌연변이체 EpEX로 처리하고, 인산화된 HGFR을 (도 1i) 웨스턴 블롯팅 및 (도 1j) ELISA 키트(ab126451)에 의해 분석하였다. 모든 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. *, p < 0.05.
도 2a 내지 2k. EpEX는 HGFR 신호전달을 통해 종양 진행을 촉진한다. (도 2a) 15분 동안 HGF(0.5 nM)로 처리된 WT 또는 EpCAM 녹아웃(KO) HCT116 및 HT29 세포. HGFR, AKT, 및 ERK의 인산화를 웨스턴 블롯팅에 의해 조사하였다. (도 2b) WT 또는 KO HCT116 및 HT29 세포를 지시된 시간 동안 2% FBS를 갖는 HGF(0.5 nM)로 처리하였다. 세포 성장을 WST-1 검정에 의해 조사하였다. (도 2c) 굶주린 HCT116 세포를 HGFR 억제제 SU11274(SU, 10 μM)로 1h 동안 처리한 다음, 50 nM의 EpEX-His로 15분 동안 처리하였다. 인산화된 HGFR, EGFR, AKT, 및 ERK의 수준을 웨스턴 블롯팅에 의해 조사하였다. HCT116 및 HT29 세포를 50 nM EpEX 및 SU(10 μM)로 처리하였다. (도 2d) 지시된 시간 동안 처리 후 WST-1 검정에 의해 세포 성장을 조사하였다. (도 2e) HCT116 세포를 shLuc 또는 HGFR shRNA로 처리한 다음, 50 nM의 EpEX-His로 15분 동안 처리하였다. 인산화된 HGFR, EGFR, ERK, 및 AKT의 수준을 HGFR 녹다운 HCT116 세포에서 웨스턴 블롯팅에 의해 조사하였다. (도 2f) 인산화된 ADAM17 및 프레세닐린 2의 수준을 웨스턴 블롯팅에 의해 조사하였다. (도 2g) 활성 β-카테닌 핵 전위를 웨스턴 블롯팅을 사용하여 검정하였다. (도 2h) HCT116 세포를 shLuc 또는 HGFR shRNA로 처리한 다음, 지시된 시간 동안 50 nM의 EpEX-His로 처리하였다. 세포 성장을 WST-1 검정에 의해 조사하였다. (도 2i) shLuc 및 shHGFR 처리 후 HCT116 세포를 7일 동안 2% FBS와 함께 50 nM의 EpEX-His로 처리하였다. 콜로니 형성을 크리스탈 바이올렛 염색으로 조사하였다. 하단 패널에서 핵 β-카테닌의 정량. (도 2j) HCT116 세포를 지시된 시간 동안 HGF(0.5 nM)로 처리하고, 배양 배지에서 EpEX 단백질 수준을 면역침전 및 웨스턴 블롯팅에 의해 조사하였다. (도 2k) HCT116 세포를 HGF(0.5 nM)로 15분 동안 처리하였다. 세포 용해물에서 인산화된 HGFR, 프레세닐린 2 및 ADAM17 단백질 수준을 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하고, 배양 배지에서 EpEX 단백질 수준을 면역침전 및 웨스턴 블롯팅에 의해 조사하였다. 모든 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. *, p < 0.05; **, p < 0.01.
도 3a 내지 3h. EpEX는 ERK 및 FAK-AKT 신호전달 경로의 활성화를 유도한다. EpEX-His 처리 후 야생형(WT) 또는 EpCAM 녹아웃(KO) HCT116 세포. (도 3a) 인산화된 HGFR, AKT, FAK, GSK3β, ERK, ADAM17, 및 프레세닐린 2의 수준을 웨스턴 블롯팅에 의해 검정하였다. (도 3b) 콜로니 형성을 크리스탈 바이올렛 염색에 의해 조사하였다. (도 3c) HCT116 세포를 TAPI(ADAM17 억제제) 또는 DAPT(γ-세크레타제 억제제)로 24시간 동안 처리하고, HGFR, AKT, 및 ERK의 인산화를 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하고, 배양 배지에서 EpEX 단백질 수준을 에 의해 조사하였다. 면역침전 및 웨스턴 블롯팅. (도 3d) HCT116 및 HT29 세포를 16h 동안 굶주린 다음, EpEX-His(50 nM) 및 HGF(0.5 nM)로 15분 동안 처리하였다. 인산화된 HGFR, AKT, 및 ERK의 수준을 웨스턴 블롯팅에 의해 조사하였다. (도 3e) HCT116 세포를 16h 동안 굶주린 다음, 50 nM EpEX-His로 15분 동안 처리하였다. HGFR 억제제 SU11274(SU, 10 μM), AKT 억제제 LY294002(LY, 25 μM), ERK 억제제 U0126(U0, 20 μM), 또는 FAK 억제제 PF-562271(PF, 10 μM)을 EpEX 처리 1시간 전에 적용하였다. AKT, ERK, 및 FAK의 인산화를 웨스턴 블롯팅에 의해 조사하였다. (도 3f) HCT116 세포를 16시간 동안 굶주린 다음, 50 nM EpEX, 및 SU(10 μM), LY(25 μM), U0(20 μM) 또는 PF(10 μM)로 처리하였다. 7일 동안 처리한 후 크리스탈 바이올렛 염색에 의해 콜로니 형성을 조사하였다. 상대 콜로니 밀도가 제시된다. 이동 능력은 (도 3g) 지시된 시간에 상처 치유 검정에 의해 시험되었다. (도 3h) 이동 세포의 수를 24h 동안 처리한 후 Transwell에 의해 평가하였다. 모든 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. *, p < 0.05.
도 4a 내지 4l. EpEX는 GSK3β 활성을 감소시켜 β-카테닌 및 Snail를 안정화시킴으로써 EMT 및 침윤을 유도한다. (도 4a) EMT 마커 및 조절인자의 단백질 발현은 EpEX 처리 후 야생형(WT) 또는 EpCAM 녹아웃(KO) HCT116 세포에서 웨스턴 블롯팅에 의해 검출되었다. (도 4b) 세포 침윤을 마트리겔을 이용한 Transwell 챔버 검정에 의해 조사하였다. (도 4c) WT 또는 KO HCT116 및 HT29 세포를 16h 동안 굶주린 다음, 2% FBS와 함께 0.5 nM의 HGF로 24h 동안 처리하였다. EMT-관련 단백질 발현(E-카드헤린, 비멘틴, 및 Snail)을 웨스턴 블롯팅에 의해 조사하였다. (도 4d) WT 또는 KO HCT116 및 HT29 세포를 24h 동안 HGF(0.5 nM)로 처리하였다. HCT116 및 HT29 세포에 의한 침윤을 마트리겔을 이용한 Transwell 챔버 검정에 의해 조사하였다. (도 4e) HCT116 및 HT29 세포를 16h 동안 굶주린 다음, 24h 동안 2% FBS와 함께 0.5 nM의 HGF로 처리하였다. EMT-관련 단백질 발현(E-카드헤린, 비멘틴, 및 Snail)을 웨스턴 블롯팅에 의해 조사하였다. (도 4f) HCT116 및 HT29 세포를 16h 동안 굶주린 다음, 24h 동안 2% FBS와 함께 0.5 nM의 HGF로 처리하였다. 세포 침윤을 마트리겔을 이용한 Transwell 검정에 의해 평가하였다. (도 4g) shLuc 및 shHGFR 처리 후 HCT116 세포를 50 nM의 EpEX-His로 처리하였다. shLuc 및 shHGFR 처리 후 HCT116 세포를 24h 동안 2% FBS와 함께 50 nM의 EpEX-His로 처리하였다. EMT-관련 단백질 발현(E-카드헤린, 비멘틴, 및 Snail)을 웨스턴 블롯팅에 의해 조사하였다. (도 4H) 세포 침윤을 마트리겔을 이용한 Transwell 챔버 검정에 의해 조사하였다. (도 4i) 굶주린 HCT116 세포를 SU(10 μM)로 1시간 동안 처리한 후, EpEX-His(50 nM)로 24시간 동안 처리하였다. 인산화된 GSK3β, 활성-β-카테닌, 및 Snail를 웨스턴 블롯팅에 의해 검출하였다. (도 4j) HCT116 세포를 16h 동안 굶주린 다음, 50 nM EpEX-His로 24분 동안 처리하였다. AKT 억제제 LY294002(25 μM), ERK 억제제 U0126(20 μM), 또는 PF-562271(10 μM)을 EpEX 처리 1시간 전에 적용하였다. 인산화된 GSK3β 및 Snail의 단백질 발현을 웨스턴 블롯팅에 의해 조사하였다. (도 4K) HCT116 세포를 16시간 동안 굶주린 다음, 50 nM EpEX, 및 SU(10 μM), LY(25 μM), U0(20 μM) 또는 PF(10 μM)로 처리하였다. 세포 침윤을 마트리겔을 이용한 Transwell 챔버 검정에 의해 조사하였다. (도 4L) 단백질 발현을 2 μM GSK3β 억제제(BIO)의 존재 또는 부재 하에 24h 동안 처리한 후 EpEX-His(50 nM) 처리된 HCT116 세포에서 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. 우측 패널에서 표준화된 단백질 발현의 정량화. 모든 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. *, p < 0.05; **, p < 0.01.
도 5a 내지 5i. EpEX는 유비퀴틴화-매개된 프로테아솜 분해의 억제를 통해 Snail 단백질 안정성을 촉진한다. (도 5a) EMT 마커 및 조절인자의 유전자 발현은 HCT116 및 HT29 세포의 야생형(WT) 또는 EpCAM 녹아웃(KO)에서 qRT-PCR에 의해 검출되었다. (도 5b) HCT116 세포의 WT 또는 KO에서 Snail 단백질의 안정성. 세포를 지시된 간격으로 사이클로헥사미드(CHX) 100 ㎍/ml로 처리하고 웨스턴 블롯팅하였다. (도 5c) 10 mM MG132(프로테아좀 억제제)의 존재 또는 부재 하에 6시간 동안 처리한 후 웨스턴 블롯팅함으로써 WT 또는 KO HCT116 세포에서 Snail의 단백질 발현을 분석하였다. (도 5d) WT 또는 KO HCT116 세포를 세포 수집 전에 6h 동안 10 μM MG132로 처리하였다. 용해물을 항-Snail 항체 및 투입물을 사용하여 면역침전시켰다. 유비퀴틴화된 Snail 단백질을 검출하기 위해 지시된 항체로 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. (도 5e) 24h 동안 EpEX(50 nM) 처리 후 HCT116 세포에서 Snail 단백질의 안정성. 세포를 지시된 간격 동안 사이클로헥사미드(CHX; 100 ㎍/ml)로 처리한 다음 웨스턴 블롯팅에 적용하였다. (도 5f) SNAIL을 인코딩하는 유전자의 발현은 24h 동안 EpEX(50 nM) 처리 후 HCT116 세포에서 qRT-PCR에 의해 검출되었다. (도 5g) HCT116에서 Snail의 단백질 발현을 24h 동안 EpEX(50 nM) 처리 및 6h 동안 10 μM MG132(프로테아좀 억제제)의 존재 또는 부재 하에 처리한 후 웨스턴 블롯팅에 의해 세포를 분석하였다. (도 5h) Snail 인산화 모티프 내의 돌연변이체의 위치의 개략도. (도 5i) HCT116 세포를 24h 동안 Snail-WT, 2SA, 4SA, 및 6SA로 트랜스펙션시킨 다음, 24h 동안 EpEX(50 nM)의 존재 또는 부재 하에 추가 처리하였다. Snail의 발현은 웨스턴 블롯팅에 의해 검출되었다. 모든 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. *, p < 0.05; **, p < 0.01.
도 6a 내지 6j. EpAb2-6은 EpCAM 및 HGFR 신호전달을 억제하고 GSK3β 활성화를 통해 활성 β-카테닌 및 Snail 단백질 분해를 촉진한다. (도 6a) HCT116 세포를 10 ㎍/ml 대조군 IgG(정상 마우스 IgG, NMIgG) 또는 마우스 EpAb2-6(EpAb2-6)로 16시간 동안 처리한 후, 15분 동안 EpEX-His(50 nM)로 처리하였다. 인산화된 HGFR, AKT, FAK, GSK3β, ERK, ADAM17, 및 프레세닐린 2의 수준을 웨스턴 블롯팅에 의해 조사하였다. (도 6b) HCT116 세포를 16시간 동안 10 ㎍/ml 대조군 IgG 또는 마우스 EpAb2-6으로 처리한 다음, 15분 동안 HGF(0.5 nM) 없이 또는 HGF로 처리하였다. 인산화된 HGFR, AKT, 및 ERK의 수준을 웨스턴 블롯팅에 의해 조사하였다. HCT116 세포를 마우스 EpAb2-6(10 ㎍/ml) 및 HGF(0.5 nM)로 처리하였다. (도 6c) 지시된 시간에 상처 치유 검정에 의해 세포 이동을 조사하였다. (도 6d) 24시간 후에 마트리겔을 이용한 Transwell 검정에 의해 세포 침윤을 평가하였다. (도 6e) HCT116 세포를 NMIgG 또는 EpAb2-6으로 6시간 동안 처리한 다음, 항-EpCAM(IP: EpCAM) 또는 항-HGFR(IP: HGFR) 항체로 면역침전시킨 후, 웨스턴 블롯팅하였다. (도 6f) 1 ㎍ IgG 또는 EpAb2-6으로 공동-처리된 EpEX-His(2 ㎍/ml)를 HGFR-Fc-코팅된(1 ㎍/ml) ELISA 플레이트에 첨가하고, TMB 비색 퍼옥시다제 검정에 의해 검출하였다. (도 6g) EMT 관련 단백질 수준은 24h 동안 NMIgG 또는 EpAb2-6으로 처리된 HCT116 세포에서 웨스턴 블롯팅에 의해 검출되었다. (도 6h) 단백질 발현을 24h 동안 EpAb2-6 및 2 μM GSK3β 억제제(BIO)로 처리한 후 HCT116 세포에서 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. 하단 패널에서 표준화된 단백질 발현의 정량화. (도 6i) HCT116 세포를 세포 수집 및 후속 웨스턴 블롯팅 전에 6h 동안 10 μM MG132 및 EpAb2-6으로 처리하였다. (도 6j) NMIgG 또는 EpAb2-6으로 처리된 HCT116 세포에서 Snail 단백질의 안정성. 세포를 지시된 간격으로 사이클로헥사미드(CHX) 100 ㎍/ml로 처리하고 웨스턴 블롯팅하였다. 하단 그래프는 표시된 그룹에서 Snail 반감기의 정량화를 보여준다. 모든 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. *, p < 0.05; **, p < 0.01.
도 7a 내지 7g. EpAb2-6은 EpEX에 결합하고 F(ab') 2 에 의한 아폽토시스를 유도하고 조절된 막내 단백질분해(RIP) 활성화 및 HGFR 신호전달을 억제한다. (도 7a) 밤새 코팅된 EpEX-His(1 ㎍/ml)에 대한 IgG EpAb2-6(마우스) 및 F(ab')2의 결합 친화성을 ELISA(OD450)를 사용하여 확인하였다. (도 7b) HCT116 세포를 EpAb2-6의 100 ㎍/ml 대조군 IgG, Fc, 또는 F(ab')2로 24시간 동안 처리하였다. 아폽토시스 및 괴사 세포를 플루오레세인 아넥신 V-FITC/PI 이중 표지에 의해 정량화하였다. (도 7c) HCT116 및 HT29 세포를 10 ㎍/ml 대조군 IgG, MT201, 인간화된 EpAb2-6(hEpAb2-6) 또는 마우스 하이브리도마 EbAb2-6(mEpAb2-6)으로 24시간 동안 처리하였다. 아폽토시스 및 괴사 세포를 플루오레세인 아넥신 V-FITC/PI 이중 표지에 의해 정량화하였다. (도 7d) HCT116 세포를 10 ㎍/ml 대조군 IgG, MT201, hEpAb2-6 또는 mEpAb2-6으로 16시간 동안 처리한 후, 15분 동안 EpEX-His(50 nM)로 처리하였다. 인산화된 HGFR, AKT, 및 ERK의 수준 및 (도 7e) RIP 단백질 ADAM17 및 프레세닐린 2의 수준을 웨스턴 블롯팅에 의해 조사하였다. 항-EpCAM 항체 및 크리조티닙은 결장암 세포에서 아폽토시스를 공동으로 유도한다. (도 7f) HCT116 및 HT29 세포를 10 ㎍/ml NMIgG 또는 EpAb2-6 및 4 μM HGFR 억제제 크리조티닙으로 24시간 동안 처리하였다. 아폽토시스 및 괴사 세포를 플루오레세인 아넥신 V-FITC/PI 이중 표지에 의해 정량화하였다. (도 7g) HCT116 및 HT29 세포를 10 ㎍/ml NMIgG 또는 EpAb2-6 및 10 μM HGFR 억제제 크리조티닙으로 처리하였다. 24시간 후에 마트리겔을 이용한 Transwell 검정에 의해 세포 침윤을 평가하였다. 모든 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. *, p < 0.05.
도 8a 내지 8g. EpAb2-6은 EpCAM의 EGF-유사 도메인 I 및 II 둘 모두에 결합한다. HEK293T 세포를 전장 또는 EGF 유사-도메인 결실 돌연변이체 EpCAM-V5로 트랜스펙션시켰다. 항체 결합은 (도 8a) 웨스턴 블롯팅, (도 8b) 유세포 분석, 및 (도 8c) 면역형광에 의해 평가되었다. (도 8d) EpCAM 돌연변이체를 EGF-I(Y32A) 및 EGF-II(L94A, Y95A, 또는 D96A) 도메인에서 아미노산 치환으로 작제하였다. EpCAM 야생형 및 돌연변이체 단백질은 HEK293T 세포에서 발현되었다. EpCAM 야생형 및 돌연변이체에 대한 MT201, EpAb2-6 및 EpAb23-1의 결합은 (도 8e) 면역형광, (도 8f) 유세포 분석, 및 (도 8g) 세포 ELISA에 의해 평가되었다. 모든 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. *, p < 0.05; **, p < 0.01.
도 9a 내지 9k. EpAb2-6 및 크리조티닙은 종양 진행 및 전이를 공동으로 억제한다. (도 9a) 전이성 동물 모델에서 EpAb2-6 및/또는 크리조티닙 효과를 평가하기 위한 실험의 타임라인. (도 9b) NOD/SCID 마우스에 5 × 106개의 HCT116 세포를 정맥내 주사한 후, 대조군 IgG, EpAb2-6 및/또는 크리조티닙으로 처리하였다(n = 5). 전이성 동물 모델에서 폐 조직의 생존 곡선, 중간 생존 일수 및 대표적인 H&E 염색. (도 9c) 동소 동물 모델에서 EpAb2-6 및/또는 크리조티닙을 평가하기 위한 실험의 타임라인. (도 9d) NOD/SCID 마우스는 HCT116-Luc 세포의 동소 이식을 받은 후, 종양 접종 3일 후에 시작하여 대조군 IgG(정상 마우스 IgG, NMIgG), 크리조티닙, EpAb2-6, 또는 EpAb2-6과 조합된 크리조티닙으로 처리되었다(n = 5). IVIS 200 이미징 시스템으로 생물발광을 조사함으로써 종양 성장을 모니터링하였다. (도 9e) 생물발광 정량화에 의해 모니터링된 HCT116-Luc 종양 세포. (도 9f) 지시된 처리 후 HCT116 동소 동물 모델에서 각 처리 그룹의 체중. (도 9g) HCT116 동소 동소 동물 모델에서 각 치료 그룹의 생존 곡선 및 중앙 생존 일수. (도 9h) NOD/SCID 마우스에 HT29-Luc 세포를 동소 이식한 다음, 종양 접종 3일 후에 시작하여 대조군 IgG, 크리조티닙, EpAb2-6, 또는 EpAb2-6과 조합된 크리조티닙으로 처리하였다(n = 5). IVIS 200 이미징 시스템으로 생물발광을 조사함으로써 종양 성장을 모니터링하였다. (도 9i) 생물발광 정량화에 의해 모니터링된 HT29-Luc 종양 세포. (도 9j) 지시된 처리 후 HT29 동소 동물 모델에서 각 처리 그룹의 마우스 체중. (도 9k) HT29 동위원소 동물 모델에서 각 처리 그룹의 생존 곡선 및 중앙 생존 일수. 모든 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. *, p < 0.05; **, p < 0.01.
도 10a 내지 10b. 인간 EpCAM의 서열 특징 및 도메인. (도 10a) 314개의 아미노산 잔기를 함유하는 인간 EpCAM의 전장(서열번호 17). (도 10b) EpEX 도메인이 VGAQNTVIC(aa 51 내지 59, 서열번호 18)를 덮는 EGF I 도메인(aa 27-59) 및 LYD 모티프(aa 94-96)를 갖는 KPEGALQNNDGLYDPDCDE(aa 83-100, 서열번호 19)를 덮는 EGF II 도메인(aa 66-135)을 포함하는 EpCAM의 도메인의 확인.
도 11. EpAb2-6의 아미노산 서열로서, 여기서, VH(서열번호 15)는 서열번호 2의 HC CDR1, 서열번호 4의 HC CDR2, 및 서열번호 6의 HC CDR3을 포함하고; VL(서열번호 16)은 서열번호 9의 LC CDR1, 서열번호 11의 LC CDR2, 및 서열번호 13의 HC CDR3을 포함한다.
하기 설명은 단지 본 발명의 다양한 구현예를 예시하기 위한 것이다. 이와 같이, 본원에 논의된 특정 구현예 또는 변형은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 다양한 변경 또는 균등물이 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명의 명확하고 용이한 이해를 제공하기 위해, 특정 용어가 먼저 정의된다. 추가 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 제시된다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "성분"에 대한 언급은 당업자에게 공지된 복수의 이러한 성분 및 이의 등가물을 포함한다.
용어 "포함하다" 또는 "포함하는"은 일반적으로 하나 이상의 특징, 성분 또는 성분의 존재를 허용하는 것을 의미하는 포함하는/포함하는 의미로 사용된다. 용어 "포함하다(comprise)" 또는 "포함하는(comprising)"은 용어 "~로 구성된(consist)" 또는 "~로 구성된(consisting of)"을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리펩타이드"는 펩타이드 결합을 통해 연결된 아미노산 잔기로 구성된 폴리머를 지칭한다. 용어 "단백질"은 통상적으로 비교적 큰 폴리펩타이드를 지칭한다. 용어 "펩타이드"는 통상적으로 비교적 짧은 폴리펩타이드(예를 들어, 최대 100, 90, 70, 50, 30, 20 또는 10개의 아미노산 잔기를 함유함)를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "대략" 또는 "약"은 당업자에 의해 이해될 허용 가능한 편차의 정도를 지칭하며, 이는 사용되는 맥락에 따라 어느 정도 달라질 수 있다. 구체적으로, "대략" 또는 "약"은 인용된 값 주위에 ± 10% 또는 ±5% 또는 ±3%의 범위를 갖는 수치 값을 의미할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "실질적으로 동일한"은 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 2개의 서열을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"(복수 형태로 상호교환적으로 사용되는 항체)는 특정 표적 항원 분자에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 면역글로불린 분자를 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 온전한(즉, 전장) 항체 분자 뿐만 아니라 항원 결합 능력, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv를 보유하는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 이러한 단편은 또한 당 분야에 잘 알려져 있으며, 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 정기적으로 사용된다. 용어 "항체"는 또한 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 디아바디, 선형 항체, 단일 사슬 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체) 및 항체의 아미노산 서열 변이체, 항체의 글리코실화 변이체, 및 공유적으로 변형된 항체를 포함하는 요구되는 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성을 포함한다.
온전한 또는 완전한 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함한다. 각각의 중쇄는 가변 영역(VH) 및 제1, 제2 및 제3 불변 영역(CH1, CH2 및 CH3)을 함유하고; 각각의 경쇄는 가변 영역(VL) 및 불변 영역(CL)을 함유한다. 항체는 디설파이드 결합을 통해 함께 결합된 2개의 중쇄의 제2 및 제3 불변 영역으로 구성된 Y의 스템을 갖는 "Y" 형상을 갖는다. Y의 각각의 아암은 단일 경쇄의 가변 및 불변 영역에 결합된 단일 중쇄의 가변 영역 및 제1 불변 영역을 포함한다. 경쇄의 가변 영역 및 중쇄의 가변 영역은 항원 결합을 담당한다. 둘 모두의 사슬에서 가변 영역은 일반적으로 항원 결합을 담당하며, 각각은 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 3개의 고도 가변 영역을 함유하고; 즉, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3을 포함하는 중쇄(H) CDR 및 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3을 포함하는 경쇄(L) CDR을 포함한다. 3개의 CDR은 프레임워크 영역(FR1, FR2, FR3, 및 FR4)에 의해 프랭킹되며, 이는 CDR보다 더 고도로 보존되고 초가변 영역을 지지하기 위해 스캐폴드를 형성한다. 중쇄 및 경쇄의 불변 영역은 항원 결합을 담당하지 않지만 다양한 이펙터 기능에 관여한다. 이의 중쇄의 불변 도메인의 항체 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 부류로 배정될 수 있다. 면역글로불린에는 5개의 주요 부류가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 입실론, 감마, 및 뮤로 지칭된다.
본원에서 사용되는 용어 "항원-결합 단편" 또는 "항원-결합 도메인"은 항원 결합을 담당하는 온전한 항체 분자의 일부 또는 영역을 지칭한다. 항원-결합 단편은 모 항체가 결합하는 동일한 항원에 결합할 수 있다. 항원-결합 단편의 예는 (i) VH-CH1 사슬 및 VL-CL 사슬로 구성된 1가 단편일 수 있는 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편으로 구성된 2가 단편일 수 있는 F(ab')2 단편; (iii) 비공유 상호작용에 의해 함께 회합된 항체 분자의 VH 및 VL 도메인으로 구성된 Fv 단편; (iv) 펩타이드 링커를 통해 VH 도메인 및 VL 도메인으로 구성된 단일 폴리펩타이드 사슬일 수 있는 단일 사슬 Fv(scFv); 및 (v) 펩타이드 링커에 의해 연결된 2개의 VH 도메인 및 디설파이드 브릿지를 통해 2개의 VH 도메인과 회합된 2개의 VL 도메인을 함유할 수 있는 (scFv)2를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "키메라 항체"는 상이한 공급원, 예를 들어, 상이한 종으로부터의 폴리펩타이드를 함유하는 항체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 키메라 항체에서, 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 가변 영역은 한 종의 포유동물(예를 들어, 마우스, 토끼 및 래트와 같은 비-인간 포유동물)로부터 유래된 항체의 가변 영역을 모방할 수 있는 반면, 영역은 인간과 같은 다른 포유동물로부터 유래된 항체의 서열과 상동일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "인간화 항체"는 인간 항체로부터 유래된 프레임워크 영역 및 비-인간(대개 마우스 또는 래트) 면역글로불린으로부터의 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 상보적 결정 영역(CDR)을 포함하는 경쇄 및 중쇄 서열의 본질적으로 전체 서열이 인간 유전자로부터 유래된 항체를 지칭한다. 일부 상황에서, 인간 항체는, 예를 들어, 가능한 면역원성을 감소시키고, 친화성을 증가시키고, 바람직하지 않은 폴딩을 유발할 수 있는 시스테인을 제거하는 것 등을 위해 CDR 중 하나 이상에서 또는 FR 중 하나 이상에서 예를 들어 돌연변이에 의해 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "특이적 결합하다" 또는 "특이적 결합하는"은 이의 표적 항원의 에피토프에 대한 항체의 결합과 같은 2개의 분자 사이의 비-무작위 결합 반응을 지칭한다. 표적 항원 또는 에피토프에 "특이적으로 결합하는" 항체는 당 분야에서 잘 이해되는 용어이고, 이러한 특이적 결합을 결정하는 방법은 또한 당 분야에 잘 알려져 있다. 항체는 다른 물질에 결합하는 것보다 더 큰 친화성/결합력, 더 용이하게 및/또는 더 긴 지속기간으로 결합하는 경우 표적 항원에 "특이적으로 결합한다". 다시 말해서, 또한, 이 정의를 읽음으로써, 예를 들어, 제1 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 제2 표적 항원에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하거나 결합하지 않을 수 있음이 이해된다. 이와 같이, "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"은 배타적 결합을 반드시 필요로 하지는 않는다(비록 포함될 수 있지만). 일반적으로, 결합의 친화성은 해리 상수(KD)의 관점에서 정의될 수 있다. 통상적으로, 항체와 관련하여 사용될 때 특이적으로 결합하는 것은 약 10-7 M 미만, 예를 들어, 예를 들어, 약 10-7 M 이하, 예컨대, 약 10-8 M 이하, 10-9 M 이하, 약 10-10 M 이하, 약 10-11 M 이하, 약 10-12 M 이하, 또는 심지어 그 미만의 KD 값으로 이의 표적에 특이적으로 결합(인식)하고 비특이적 항원(예를 들어, BSA 또는 카세인)에 대한 결합에 대한 친화성보다 적어도 10배 더 낮고, 예를 들어, 적어도 100배 더 낮고, 예를 들어, 적어도 1,000배 더 낮거나 또는 적어도 10,000배 더 낮은 KD에 상응하는 친화성을 갖는 특이적 표적에 결합하는 항체를 지칭할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드 단위로 구성된 폴리머를 지칭할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 데옥시리보핵산("DNA") 및 리보핵산("RNA")과 같은 자연 발생 핵산 뿐만 아니라 비-자연 발생 뉴클레오타이드를 갖는 것들을 포함하는 핵산 유사체를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어, 자동화된 DNA 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열이 DNA 서열(즉, A, T, G, C)로 표시되는 경우, 이는 또한 "U"가 "T"를 대체한다. 용어 "cDNA"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 mRNA에 상보적이거나 동일한 DNA를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "상보적인"은 2개의 폴리뉴클레오타이드의 상호작용 표면의 위상적 상용성 또는 함께 매칭을 지칭한다. 제1 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이 제2 폴리뉴클레오타이드의 폴리뉴클레오타이드 결합 파트너의 뉴클레오타이드 서열과 동일한 경우, 제1 폴리뉴클레오타이드는 제2 폴리뉴클레오타이드에 상보적이다. 따라서, 서열이 5'-ATATC-3'인 폴리뉴클레오타이드는 서열이 5'-GATAT-3'인 폴리뉴클레오타이드에 상보적이다."
본원에서 사용되는 용어 "인코딩"은 RNA 전사체의 주어진 서열(즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 아미노산의 주어진 서열 및 이로부터 생성된 생물학적 특성을 갖는 생물학적 과정에 다른 폴리머 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 역할을 하는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 유전자, cDNA, 또는 mRNA)에서 뉴클레오타이드의 특정 서열의 천연 특성을 지칭한다. 따라서, 유전자에 의해 생산된 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생산하는 경우, 유전자는 단백질을 인코딩한다. 당업자는 유전자 코드의 축퇴의 결과로서 다수의 상이한 폴리뉴클레오타이드 및 핵산이 동일한 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있음을 이해한다. 또한, 당업자는 통상적인 기술을 사용하여, 폴리펩타이드가 발현될 임의의 특정 숙주 유기체의 코돈 용법을 반영하기 위해 거기에 기재된 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 폴리펩타이드 서열에 영향을 미치지 않는 뉴클레오타이드 치환을 할 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열"은 서로의 축퇴 버전이고 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 모든 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "재조합 핵산"은 자연적으로 함께 연결되지 않은 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산을 지칭한다. 재조합 핵산은 벡터의 형태로 존재할 수 있다. "벡터"는 주어진 관심 뉴클레오타이드 서열 및 조절 서열을 함유할 수 있다. 벡터는 주어진 뉴클레오타이드 서열(발현 벡터)을 발현시키거나 이를 복제, 조작 또는 상이한 위치 사이(예를 들어, 상이한 유기체 사이)로 전달하기 위해 주어진 뉴클레오타이드 서열을 유지하는 데 사용될 수 있다. 벡터는 상기 기재된 목적을 위해 적합한 숙주 세포에 도입될 수 있다. "재조합 세포"는 재조합 핵산이 도입된 숙주 세포를 지칭한다. "형질전환된 세포"는 관심 단백질을 인코딩하는 DNA 분자가 재조합 DNA 기술에 의해 도입된 세포를 의미한다.
벡터는 플라스미드, 코스미드, 에피솜, 포스미드, 인공 염색체, 파지, 바이러스 벡터 등을 포함하는 다양한 유형일 수 있다. 통상적으로, 벡터에서, 주어진 뉴클레오타이드 서열은, 벡터가 숙주 세포에 도입될 때, 주어진 뉴클레오타이드 서열이 조절 서열의 제어 하에 숙주 세포에서 발현될 수 있도록, 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다. 조절 서열은, 예를 들어, 비제한적으로, 프로모터 서열(예를 들어, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, T7 프로모터, 및 알코올 옥시다제 유전자(AOX1) 프로모터), 시작 코돈, 복제 기점, 인핸서, 분비 신호 서열(예를 들어, α-교배 인자 신호), 정지 코돈, 및 다른 제어 서열(예를 들어, Shine-Dalgarno 서열 및 종결 서열)을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 벡터는 후속 스크리닝/선택 절차를 위한 마커 서열(예를 들어, 항생제 내성 마커 서열)을 추가로 함유할 수 있다. 단백질 생산을 위해, 벡터에서, 주어진 관심 뉴클레오타이드 서열은 융합된 폴리펩타이드가 생산되고 후속 정제 절차에 유리하도록 상기 언급된 조절 서열 이외의 또 다른 뉴클레오타이드 서열에 연결될 수 있다. 상기 융합된 폴리펩타이드는 정제를 위한 태그, 예를 들어, His-태그를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "치료"는 장애, 장애의 증상 또는 상태, 장애에 의해 유발된 불능(disability), 또는 장애의 진행 또는 소인을 치료, 치유, 경감, 완화, 변경, 치료, 개량, 개선 또는 영향을 미치는 목적으로, 장애, 장애의 증상 또는 상태, 또는 장애의 진행을 앓는 대상체에게 하나 이상의 활성제의 적용 또는 투여를 지칭한다.
본 개시내용은 적어도 부분적으로 상피 세포 부착 분자(EpCAM) 억제제 및 HGFR 억제제를 사용한 조합된 암 요법의 개발에 기초한다.
EpCAM의 세포외 도메인인 EpEX는 2개의 표피 성장 인자(EGF)-유사 도메인을 함유하고, 이는 국소 종양 미세환경에서 가용성 성장 인자로서 작용할 수 있다. EGF 수용체(EGFR)의 활성화는 EpCAM의 조절된 막내 단백질분해(RIP)를 유발하여 상피-중간엽 전이(EMT)를 유도할 수 있다(Hsu et al., 2016). EGFR은 다양한 종양에서 과발현되기 때문에 많은 유형의 암과 매우 관련이 있는 RTK이다(Normanno et al, 2006). 과도한 HGFR 활성화는 AKT, 세포외 신호-관련 키나제(ERK), 포스포이노시티드 3-키나제, RAS, 및 SRC와 같은 다수의 다운스트림 이펙터를 통해 암 세포(Normanno et al, 2006)의 성장, 생존 및 이동을 촉진한다(Comoglio et al, 2008; Ortiz-Zapater et al, 2017). HGFR 발현은 기저형 유방암에서 EGFR 발현과 양의 상관관계가 있으며(Comoglio et al, 2008; Ortiz-Zapater et al, 2017), HGFR 및 EGF 패밀리 수용체는 종종 암 세포에서 공동-발현된다(Comoglio et al, 2008; Ortiz-Zapater et al, 2017). 또한, EGFR-의존적 인산화 및 HGFR의 활성화는 EGFR 리간드로 표피 암종 세포의 자극시 발생한다(Comoglio et al, 2008; Ortiz-Zapater et al, 2017). 상승된 EGFR 신호전달을 갖는 세포에서 HGFR의 이러한 교차-활성화는 또한 여러 종양 유형에서 관찰된다(Tang et al, 2008).
본 발명에서, 놀랍게도 EpEX가 HGFR에 결합하고 이의 다운스트림 신호전달을 활성화시켜 세포 증식, 이동 및 침윤을 촉진시키는 것으로 밝혀졌다. 또한, EpCAM 중화 항체, EpAb2-6은 HGFR의 인산화를 약화시키고 암 세포 전이를 억제하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이 연구의 결과는 암 전이와 싸우기 위해 EpCAM 및 HGFR 신호전달의 동시 표적화에 대한 기계론적 근거를 제공한다.
본원에서 사용되는 "조합 요법"은 2개 이상의 치료제 또는 접근법을 조합하는 치료를 지칭한다. "조합"은 2개 이상의 치료제 또는 접근법이 동일한 대상체에게 동시에 또는 순차적으로 제공되는 것을 의미한다. 바람직하게는, 조합 요법은 상승적인 효과를 제공한다.
본원에서 사용되는 용어 "상승적 효과"는 2개 이상의 활성제의 조합된 활성이 각각의 활성제 단독의 활성의 합을 초과하는 2개 이상의 활성제의 조합을 초래하는 협력 작용을 의미하고 이를 포함할 수 있다. 용어 "상승적 효과"는 또한 2개 이상의 활성제가 함께 사용될 때 조합된 활성을 제공하여, 단일 제제가 사용될 때 각각의 더 낮은 용량이 비교 또는 증진된 활성을 달성하는 데 사용될 수 있음을 지칭할 수 있다.
따라서, 본 발명은 (i) 유효량의, EpCAM 신호전달의 활성화를 억제하는 제1 억제제(EpCAM 억제제); 및 (ii) 유효량의 HGFR 신호전달의 활성화를 억제하는 제2 억제제(HGFR 억제제)를 포함하는 조합물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하기 위한 조합 요법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본원에서 사용되는 항-EpEX 항체는 EpCAM의 EGF-유사 도메인 I(EpCAM의 aa 27-59) 및 EpCAM의 EGF-유사 도메인 II(EpCAM의 aa 66-135)에 특이적으로 결합한다. 구체적으로, 본원에서 사용되는 항-EpEX 항체는 EGF-유사 도메인 I에 위치한 CVCENYKLAVN(aa 27 내지 37)(서열번호 20)의 서열 내의 에피토프, 및 EGF-유사 도메인 II에 위치한 KPEGALQNNDGLYDPDCD(aa 83 내지 100)(서열번호 19)에 대해 특이적 결합 친화성을 갖는다. 더욱 구체적으로, 본원에서 사용되는 항-EpEX 항체는 EpCAM에서 도메인 I 내의 NYK 모티프(aa 31-33) 및 도메인 II 내의 LYD 모티프(aa 94-96)를 인식한다. 대조적으로, 다수의 다른 항체(예를 들어, MT201, M97, 323/A3 및 에드레콜로맙)는 EpCAM의 잘 기술된 EGF I 도메인만을 표적화한다. 다른 항체와 본 발명에 따른 항-EpEX 항체의 구별되는 특징은 하기에 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 하나의 특정 항 EpEX 항체는 하기 실시예에 제시된 바와 같은 EpAb2-6이다. EpAb2의 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)의 아미노산 서열, 및 이들의 상보적인 결정 영역(HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3)(LC CDR1, LC CDR2 및 LC CDR3)은 하기 표 1에 제시된 바와 같다. 본 발명의 항-EpEX 항체는 EpAb2-6 및 이의 기능적 변이체를 포함한다.
표 1
일부 구현예에서, 본 발명의 항-EpEX 항체는 (a) 서열번호 2의 HC CDR1, 서열번호 4의 HC CDR2, 및 서열번호 6의 HC CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 서열번호 9의 LC CDR1, 서열번호 11의 LC CDR2, 및 서열번호 13의 HC CDR3을 포함하는 VL, 또는 이의 항원-결합 단편을 포함함을 특징으로 하는 EpAb2-6의 기능적 변이체이다.
일부 구현예에서, (a) 서열번호 2의 HC CDR1, 서열번호 4의 HC CDR2, 및 서열번호 6의 HC CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 서열번호 9의 LC CDR1, 서열번호 11의 LC CDR2, 및 서열번호 13의 HC CDR3을 포함하는 VL을 갖는 본 발명의 항-EpEX 항체는 서열번호 15 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 16 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 구체적으로, 본 발명의 항-EpEX 항체는 서열번호 15와 적어도 80%(예를 들어, 82%, 84%, 85%, 86%, 88%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 98%, 또는 99%)의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 16과 적어도 80%(예를 들어, 82%, 84%, 85%, 86%, 88%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 98%, 또는 99%)의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 본 발명의 항-EpEX 항체는 또한 본원에 기재된 바와 같은 관련 VH 또는 VL 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 임의의 재조합적으로 (조작된)-유래된 항체를 포함한다.
용어 "실질적으로 동일한"은 변이체의 관련 아미노산 서열(예를 들어, FR, CDR, VH, 또는 VL에서)이 참조 항체와 비교하여 실질적으로 상이하여 변이체가 실질적으로 유사한 결합 활성(예를 들어, 친화성, 특이성, 또는 둘 모두) 및 기준 항체에 대한 생물활성을 갖는다. 이러한 변이체는 사소한 아미노산 변화를 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는 이의 활성 또는 기능과 무관하게 폴리펩타이드의 특정 부분 내에서 만들어질 수 있는 제한된 수의 변화 또는 변형을 가질 수 있고, 여전히 동등하거나 유사한 생물학적 활성 또는 기능의 허용 가능한 수준을 갖는 변이체를 생성할 수 있음이 이해될 수 있다. 일부 예에서, 아미노산 잔기 변화는 보존적 아미노산 치환이며, 이는 또 다른 아미노산 잔기에 대한 유사한 화학 구조 및 더 적은 효과를 갖거나 실질적으로 효과가 없는 폴리펩타이드 기능, 활성 또는 다른 생물학적 효과의 아미노산 잔기를 지칭한다. 통상적으로, CDR 영역과 대조적으로, 항체의 결합 기능 및 생물활성에 악영향을 미치지 않는 한(예컨대, 결합 친화성을 원래 항체와 비교하여 50% 초과만큼 감소시키는 한), FR 영역에서 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 서열 동일성은 참조 항체와 변이체 사이에 약 80%, 82%, 84%, 85%, 86%, 88%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 98%, 또는 99%, 또는 그 초과일 수 있다. 변이체는 당업자에게 공지된 폴리펩타이드 서열을 변경하기 위한 방법, 예를 들어, 이러한 방법을 편집하는 참고문헌에서 발견되는 방법(예를 들어, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)을 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 아미노산의 보존적 치환은 하기 그룹 내의 아미노산 사이에서 이루어진 치환을 포함한다: (i) A, G; (ii) S, T; (iii) Q, N; (iv) E, D; (v) M, I, L, V; (vi) F, Y, W; 및 (vii) K, R, H.
본원에 기재된 항체는 동물 항체(예를 들어, 마우스-유래 항체), 키메라 항체(예를 들어, 마우스-인간 키메라 항체), 인간화 항체, 또는 인간 항체일 수 있다. 본원에 기재된 항체는 또한 이들의 항원-결합 단편, 예를 들어, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 단일 사슬 Fv(scFv) 및 (scFv)2를 포함할 수 있다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 당 분야에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다.
본원에서 사용되는 항-EpEX 항체의 보다 상세한 내용은 미국 특허 제9,187,558호에 기재된 바와 같으며, 이들 각각의 관련 개시는 본원에서 언급된 목적 또는 주제를 위해 본원에 참조로서 포함된다.
당 분야에서 통상적인 수많은 방법이 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 수득하는 데 이용 가능하다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 통상적인 하이브리도마 기술에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 표적 항원, 예를 들어, 담체 단백질, 예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)에 선택적으로 커플링되고/거나 애주번트, 예를 들어, 완전 프로인트 애주번트와 혼합된 종양 항원은 그러한 항원에 대한 항체 결합을 생성하기 위해 숙주 동물을 면역화하는 데 사용될 수 있다. 모노클로날 항체를 분비하는 림프구는 수확되고 골수종 세포와 융합되어 하이브리도마를 생산한다. 이어서, 이러한 방식으로 형성된 하이브리도마 클론은 스크리닝되어 요망되는 모노클로날 항체를 분비하는 것들을 확인하고 선택한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 재조합 기술을 통해 제조될 수 있다. 관련 양태에서, 개시된 아미노산 서열을 인코딩하는 분리된 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 핵산으로 형질전환되거나 트랜스펙션된 숙주 세포가 또한 제공된다.
예를 들어, 이러한 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산은 일반적인 기술을 통해 발현 벡터(예를 들어, 박테리아 벡터, 예컨대, E. 콜라이 벡터, 효모 벡터, 바이러스 벡터, 또는 포유동물 벡터)에 클로닝될 수 있으며, 임의의 벡터들은 항체 발현을 위해 적합한 세포(예를 들어, 박테리아 세포, 효모 세포, 식물 세포 또는 포유동물 세포)에 도입될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 예는 표 1에 제시된 바와 같다. 포유동물 숙주 세포주의 예는 인간 배아 신장주(293 세포), 아기 햄스터 신장 세포(BHK 세포), 중국 햄스터 난소 세포(CHO 세포), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO 세포), 및 인간 간 세포(Hep G2 세포)이다. 본원에 기재된 항체를 발현시키기 위한 재조합 벡터는 통상적으로 구성적이거나 유도성인 프로모터에 작동 가능하게 연결된 항체 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 함유한다. 통상적인 벡터는 항체를 인코딩하는 핵산의 발현의 조절에 유용한 전사 및 번역 종결자, 개시 서열, 및 프로모터를 함유한다. 벡터는 선택적으로 원핵 및 진핵 시스템 둘 모두에 대한 선택 마커를 함유한다. 일부 예에서, 중쇄 및 경쇄 코딩 서열 둘 모두는 동일한 발현 벡터에 포함된다. 다른 예에서, 항체의 각각의 중쇄 및 경쇄는 개별 벡터로 클로닝되고 별도로 생산되며, 이후 항체 어셈블리를 위해 적합한 조건 하에 인큐베이션될 수 있다.
본원에 기재된 항체를 발현시키기 위한 재조합 벡터는 통상적으로 구성적이거나 유도성인 프로모터에 작동 가능하게 연결된 항체 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 함유한다. 재조합 항체는 박테리아, 효모, 곤충 및 포유동물 세포와 같은 원핵 또는 진핵 발현 시스템에서 생산될 수 있다. 통상적인 벡터는 항체를 인코딩하는 핵산의 발현의 조절에 유용한 전사 및 번역 종결자, 개시 서열, 및 프로모터를 함유한다. 벡터는 선택적으로 원핵 및 진핵 시스템 둘 모두에 대한 선택 마커를 함유한다. 생산된 항체 단백질은 추가로 단리되거나 정제되어 추가 검정 및 적용을 위해 실질적으로 균질한 제조물을 수득할 수 있다. 적합한 정제 절차는, 예를 들어, 면역친화성 또는 이온-교환 컬럼에서의 분획화, 에탄올 침전, 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE), 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 암모늄 설페이트 침전, 및 겔 여과를 포함할 수 있다.
전장 항체가 요망되는 경우, 본원에 기재된 임의의 VH 및 VL 사슬의 코딩 서열은 면역글로불린의 Fc 영역의 코딩 서열에 연결될 수 있고, 전장 항체 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 생성된 유전자는 적합한 숙주 세포, 예를 들어, 식물 세포, 포유동물 세포, 효모 세포, 또는 곤충 세포에서 발현되고 어셈블링될 수 있다.
항원-결합 단편은 일상적인 방법을 통해 제조될 수 있다. 예를 들어, F(ab')2 단편은 전장 항체 분자의 F(ab')2 단편의 디설파이드 브릿지를 환원시킴으로써 제조될 수 있는 Fab 단편의 펩신 분해에 의해 생성될 수 있다. 대안적으로, 이러한 단편은 또한 적합한 숙주 세포에서 중쇄 및 경쇄 단편을 발현시킴으로써 재조합 기술을 통해 제조될 수 있고, 이들을 어셈블링하여 생체내 또는 시험관내에서 요망되는 항원-결합 단편을 형성할 수 있다. 단일-사슬 항체는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 연결함으로써 재조합 기술을 통해 제조될 수 있다. 바람직하게는, 가요성 링커는 2개의 가변 영역 사이에 도입된다.
하나의 항체는 항체의 N- 및/또는 C-말단에서 하나 이상의 추가 요소, 예컨대, 또 다른 단백질 및/또는 약물 또는 담체를 컨쥬게이션시키기 위해 추가로 변형될 수 있다. 바람직하게는, 추가 요소와 컨쥬게이션된 항체는 요망되는 결합 특이성 및 치료 효과를 유지하면서, 예를 들어, 용해도, 저장 또는 다른 취급 특성, 세포 투과성, 반감기, 과민증은 전달 및/또는 분포를 조절한다. 다른 구현예는 검정, 검출, 추적 등을 위한 표지, 예를 들어, 염료 또는 형광단의 컨쥬게이션을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 펩타이드, 염료, 형광단, 탄수화물, 항암제, 지질 등과 같은 추가 요소에 컨쥬게이션될 수 있다. 또한, 항체는 예를 들어, 면역리포솜을 형성하기 위해 Fc 영역을 통해 직접적으로 리포솜의 표면에 부착될 수 있다.
일부 구체예에서, 제2 억제제(HGFR 억제제)는 HGFR에 대한 HGF의 결합을 차단한다.
일부 구체예에서, 제2 억제제(HGFR 억제제)는 HGFR의 소분자 티로신 키나제 수용체 억제 화합물이다. 표 2는 소분자 HGFR 억제 화합물의 일부 예를 보여준다.
표 2
본 발명에 유용한 HGFR 억제 화합물의 추가 예는 AMEP(Bioalliance), EMD-1204831(Merck KgaA/EMD Serono), INCB-028060(Incyte/Novartis), ARQ197(ArQule), AMG102(Amgen) 및 RG-3638(Roche/Genentech)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 세부사항은, 예를 들어, WO2012042421A1호에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "소분자 HGFR 억제 화합물" 또는 "소분자 HGFR 억제제"는 HGFR을 억제하거나 이에 결합하는 소분자 화합물을 포함할 수 있다. 달리 지시되지 않는 한, 소분자 HGFR 억제제에 대한 본원의 모든 언급은 이의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물 및 복합체, 및 이의 다형체, 입체이성질체, 및 동위원소 표지된 버전을 포함하는 이의 약학적으로 허용되는 염의 용매화물, 수화물 및 복합체에 대한 언급을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는 염"은 산 부가염을 포함한다. "약학적으로 허용되는 산 부가염"은 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등과 같은 무기산, 및 아세트산, 프로피온산, 피루브산, 말레산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 살리실산, 트리플루오로아세트산 등과 같은 유기산으로 형성되는 유리 염기의 생물학적 효과 및 특성을 유지하는 염을 지칭한다. 용어 "약학적으로 허용되는 염"은 또한 염기 염을 포함한다. 적합한 염기 염은 무독성 염을 형성하는 염기로부터 형성된다. 예는 알루미늄, 아르기닌, 벤자틴, 칼슘, 콜린, 디에틸아민, 디올아민, 글리신, 리신, 마그네슘, 메글루민, 올라민, 칼륨, 소듐, 트로메타민 및 아연 염을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "유효량"은 치료된 대상체 또는 세포에서 요망되는 생물학적 효과를 부여하기 위한 활성 성분의 양을 지칭한다. 유효량은 투여 경로 및 빈도, 상기 의약을 투여받는 개인의 체중 및 종, 및 투여 목적과 같은 다양한 이유에 따라 달라질 수 있다. 당업자는 본원의 개시, 확립된 방법, 및 그들 자신의 경험에 기초하여 각각의 경우에 투여량을 결정할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 치료 방법에 의해 치료될 대상체는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간일 수 있다. 포유동물은 농장 동물, 스포츠 동물, 애완동물, 영장류, 말, 개, 고양이, 마우스 및 래트를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 "약학적으로 허용되는 담체"는 담체가 조성물 중 활성 성분과 상용성이고, 바람직하게는 상기 활성 성분을 안정화시킬 수 있고 수용하는 개인에게 안전함을 의미한다. 상기 담체는 활성 성분에 대한 희석제, 비히클, 부형제, 또는 매트릭스일 수 있다. 통상적으로, 활성 성분, 예를 들어, EpCAM 억제제, HGFR 억제제 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물은 수용액, 예를 들어, 염수 용액과 같은 용액의 형태로 제형화될 수 있거나, 이는 분말 형태로 제공될 수 있다. 적절한 부형제는 또한 락토스, 수크로스, 덱스트로스, 소르보스, 만노스, 전분, 아라비아 검, 칼슘 포스페이트, 알기네이트, 트래거켄스 검, 젤라틴, 칼슘 실리케이트, 미세결정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스, 멸균수, 시럽, 및 메틸셀룰로스를 포함한다. 조성물은 생리학적 조건을 근사화하는데 필요한 약학적으로 허용되는 보조 물질, 예를 들어, pH 조절제 및 완충제, 예컨대, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 소듐 락테이트 등을 추가로 함유할 수 있다. 조성물의 형태는 정제, 알약, 분말, 로젠지, 패킷, 트로키, 엘릭서, 현탁액, 로션, 용액, 시럽, 연질 및 경질 젤라틴 캡슐, 좌제, 멸균된 주사액, 및 패키징된 분말일 수 있다. 본 발명의 조성물은 임의의 생리학적으로 허용되는 경로, 예컨대, 경구, 비경구(예컨대, 근육내, 정맥내, 피하, 및 복강내), 경피, 좌제, 및 비강내 방법을 통해 전달될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 즉시 사용 가능한 투여 형태 또는 재구성 가능한 안정한 분말로서 제공될 수 있는 액체 주사 가능한 제형으로 투여된다.
일부 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 2개의 활성 성분인 EpCAM 억제제 및 HGFR 억제제는 대상체에 대한 동시, 개별 또는 순차적 투여를 위해 혼합물로서 또는 독립적으로 키트 형태로 제형화될 수 있다. 각각의 성분은 적절한 투여 경로를 위해 적합한 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, EpCAM 억제제 및 HGFR 억제제는 EpCAM 억제제 또는 이를 포함하는 조성물 및 HGFR 억제제 또는 이를 포함하는 조성물이 별개의 패키징 단위 내에 존재하는 적합한 패키징 단위로 제공될 수 있다.
본 발명에 따르면, EpCAM 억제제 및 HGFR 억제제의 조합 사용은 EpCAM 억제제 또는 HGFR 억제제 단독과 비교하여 암 치료, 특히 암 세포의 이동/침윤 억제, 종양 크기 감소, 종양 진행, 전이 감소 또는 억제, 및/또는 암 환자의 생존 연장에 있어서 상승적인 효과를 제공한다. 특히, 실시예(예를 들어, 실시예 2.8)에 제시된 바와 같이, 전이성 및 동소성 동물 모델에서, 대조군 IgG 및 HGFR 억제제(크리조티닙) 그룹의 모든 동물은 유의한 종양 및 불량한 생존을 나타내는 반면, EpCAM 억제제로서의 EpCAM 중화 항체(EpAb2-6)에 의해 치료된 그룹은 더 느린 종양 진행 및 더 높은 중앙 생존을 나타내고, 놀랍게도 EpCAM 억제제로서 EpCAM 중화 항체(EpAb2-6) 및 HGFR 억제제(크리조티닙)를 사용한 조합 치료는 종양 진행을 감소시키는데 상승적인 현저한 효과를 제공한다.
일부 구현예에서, EpCAM 억제제 및 HGFR 억제제는 상승적인 항암 또는 항-전이 효과를 제공하기 위해 동시에, 별도로 또는 순차적으로 투여되고, 특히 암은 상승적인 조합에 민감하다.
일부 구현예에서, 암은 폐암, 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 위암, 두경부암, 신장암, 백혈병, 간암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 피부암 및 고환암으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 제한이 아니라 입증의 목적으로 제공된다. 당업자는 본 개시에 비추어, 개시된 특정 구현예에서 많은 변경이 이루어질 수 있고 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 여전히 유사하거나 유사한 결과를 얻을 수 있음을 이해해야 한다.
실시예
EpCAM 신호전달은 결장암 진행 및 전이를 촉진하는 것으로 알려져 있다. 전이는 암 치료 실패의 주요 원인 중 하나이지만, 전이 과정에서 EpCAM 신호전달의 관여는 불분명하다. 여기에서, 본 발명자들은 EpCAM(EpEX)의 가용성 세포외 도메인이 HGFR에 결합하고 결장암 세포에서 다운스트림 신호전달을 유도한다는 것을 입증한다. 본 발명자들은 또한 EpEX 생산이 HGF 처리시 상승하고 EpEX 및 HGF가 HGFR 신호전달을 협력적으로 조절한다는 것을 보여준다. 또한, EpEX는 ERK 및 FAK-AKT 신호전달 경로를 활성화시킴으로써 결장암 세포의 전이 가능성을 향상시키고, GSK3β 활성을 감소시킴으로써 활성 β-카테닌 및 Snail 단백질을 추가로 안정화시킨다. 마지막으로, 본 발명자들은 항-EpCAM 중화 항체(EpAb2-6) 및 HGFR 억제제(크리조티닙)의 조합 치료가 결장암의 전이성 및 동소성 동물 모델에서 종양 진행을 유의하게 억제하고 생존을 연장시킨다는 것을 보여준다. 본 발명의 발견은 결장암 전이의 EpCAM 신호전달 촉진의 기초가 되는 분자 메커니즘을 조명하며, 추가로 EpAb2-6 및 크리조티닙의 조합이 결장암 치료를 위한 효과적인 전략일 수 있음을 시사한다.
1. 재료 및 방법
1.1 화학물질 및 항체
항-α-튜불린 및 GAPDH 항체는 Sigma-Aldrich로부터 입수하였다. 인간 EpCAM, 총 ERK 및 Thr202/Tyr204-인산화된 ERK, 총 AKT, Ser473-인산화된 AKT, 총 HGFR, Tyr1234/1235-인산화된 HGFR, 비-포스포(활성) β-카테닌(Ser45), β-카테닌, E-카드헤린, 비멘틴, Snail, Slug, 및 Twist에 대한 항체는 Cell Signaling Technology로부터의 것이었다. LY294002(AKT 억제제)는 또한 Cell Signaling Technology로부터의 것이었다. 포레티닙(Foretinib)(HGFR 억제제), SU11274(HGFR 억제제), U0126(MEK 억제제), PF-562271(FAK 억제제), 및 BIO(GSK3 베타 억제제)를 Selleck Chemicals로부터 입수하였다. 크리조티닙(HGFR 억제제)은 Med Chem Express로부터 입수하였다. 총 GSK3 베타, 인산화된 GSK3 베타(포스포 S9), 인산화된 ADAM17(포스포 T735), 총 ADAM17, 인산화된 프레세닐린 2/AD5(포스포 S327), 총 프레세닐린 2/AD5, V5-태그, 6x His-태그, 및 c-Myc-태그 뿐만 아니라 Met(pY1234/pY1235) + 총 Met ELISA 키트(ab126451)에 대한 항체를 Abcam으로부터 입수하였다. 인간 HGFR(c-MET) 및 HGF 재조합 단백질은 Sino Biological로부터 입수하였다.
1.2 세포주 및 배양
하기 인간 세포주가 사용되었다: HEK293T, 결장직장암 세포주 HCT116(ATCC: CCL-247), 및 HT29. 세포를 5% CO2를 갖는 가습 인큐베이터에서 37℃에서 10% 우태아 혈청(FBS; Gibco) 및 100 ㎍/ml 페니실린/스트렙토마이신(P/S; Gibco)이 보충된 둘베코 변형된 이글 배지(DMEM)에서 배양하였다.
1.3 포유동물 렌티바이러스 shRNA
녹다운 실험을 위해, pLKO 벡터에서 인간 EpCAM shRNA를 Academia Sinica의 RNAi 코어 시설로부터 수득하였다. 렌티바이러스는 약간의 변형으로 표준 프로토콜에 따라 생산되었다. 요약하면, 293T 세포를 100-mm 디쉬에 70%의 밀도로 시딩하고 패키징 벡터(즉, pCMV-ΔR8.91, gag, pol 및 rev 유전자를 함유함), 엔벨로프 벡터(즉, pMD2.G ; VSV-G 발현 플라스미드), 및 개별 shRNA 벡터로 트랜스펙션하였다. shRNA 플라스미드를 폴리-젯 트랜스펙션 시약(SignaGen Laboratories)을 사용하여 293T 세포로 트랜스펙션시켰다. 밤새 인큐베이션 후, 배지를 BSA-함유 배지로 교체하였다. HCT116 세포를 폴리브렌(8 ㎍/ml)을 함유하는 바이러스 상청액으로 24시간 동안 감염시켰다. 감염 절차를 반복한 후, 세포를 퓨로마이신(2 ㎍/ml)에서 7일 동안 인큐베이션하여 안정한 shRNA 발현을 갖는 세포를 선택하였다.
1.4 EpCAM 유전자 녹아웃
EpCAM 녹아웃을 위해, CRISPR/cas9 gRNA 작제물을 Genescript로부터 구입하였다. 렌티바이러스를 생산하기 위해, 293T 세포를 CRISPR/cas9 gRNA 플라스미드, EpCAM gRNA(표적 서열: GTGCACCAACTGAAGTACAC, 서열번호 21), 패키징 플라스미드(pCMV-ΔR8.91) 및 엔벨로프 발현 플라스미드(pMD. G)로 일시적으로 트랜스펙션시켰다. HCT116 또는 HT29 세포를 렌티바이러스-함유 배지와 함께 배양하고 2 ㎍/ml 퓨로마이신으로 선택하였다. 단일 세포 클론을 선택된 풀로부터 분리하고, EpCAM의 발현을 웨스턴 블롯팅으로 조사하였다.
1.5 EpEX-His 재조합 단백질의 생산 및 정제
재조합 단백질을 Expi293 발현 시스템을 사용하여 발현시키고 정제하였다. 세포를 Expi293 발현 배지에서 성장시키고, 인핸서 시약의 첨가에 의해 단백질 발현을 유도하였다. 원심분리에 의해 상청액을 수확하였다. 8000g에서 4℃에서 20분 동안 원심분리한 후, 상청액을 4℃에서 2h 동안 니켈-킬레이트화된 친화성 수지(Ni-NTA, Qiagen)와 함께 인큐베이션하였다. 수지를 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 500 mM NaCl, 및 20 mM 이미다졸을 함유하는 세척 완충제로 세척하고, 단백질을 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 500 mM NaCl, 및 250 mM 이미다졸을 함유하는 용리 완충제로 용리시켰다.
1.6 EpCAM EGF-유사 도메인 결실 돌연변이체의 작제
이의 세포외 도메인에서, EpCAM은 아미노산 27-59(제1 EGF-유사 도메인) 및 66-135(제2 EGF-유사 도메인)에 2개의 EGF-유사 도메인, 및 시스테인-비함유 모티프를 함유한다(Schnell et al, 2013). EpCAM EGF-유사 도메인 결실 돌연변이체는 제1 정방향 돌연변이원성 결실 프라이머(5'-GCAGCTCAGGAAGAATCAAAGCTGGCTGCC-3', 서열번호 22), 제1 역방향 돌연변이원성 결실 프라이머(5'-GGCAGCCAGCTTTGATTCTTCCTGAGCTGC-3', 서열번호 23), 제2 정방향 프라이머(5'-AAGCTGGCTGCCAAATCTGAGCGAGTGAGA-3', 서열번호 24) 및 제2 역방향 프라이머(5'-TCTCACTCGCTCAGATTTGGCAGCCAGCTT-3', 서열번호 25)를 갖는 표준 QuikChange™ 결실 돌연변이 시스템을 사용하여 생성되었다. KAPA HiFi Hot Start DNA 폴리머라제(Kapa Biosystems)를 사용하여 PCR 증폭을 수행하고, 생성물을 제한 효소 DpnI(Thermo Scientific)로 처리하여 메틸화된 모 DNA를 소화시켰다.
1.7 면역침전 검정
세포를 프로테아제 억제제(Roche)와 함께 용해 완충제(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 및 1% NP-40)에서 용해시켰다. 면역침전을 위해, 세포 용해물을 4℃에서 6h 동안 항체와 함께 인큐베이션하였다. 이후, 20 ㎕ Dynabeads 단백질 G를 첨가하고, 혼합물을 4℃에서 2h 동안 인큐베이션하여 항체-결합된 단백질을 풀-다운시켰다. 면역침전 샘플을 PBS로 3회 세척하고, 샘플 완충제에서 변성시키고, 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다.
1.8 모노클로날 항체의 생산 및 IgG의 정제
EpAb2-6 및 대조군 IgG의 생산은 전술한 바와 같이 수행되었다(Liao et al, 2015). 실험 프로토콜은 Academia Sinica의 동물 실험 윤리 위원회(AS IACUC: 11-04-166)에 의해 승인되었다.
1.9 단백질 추출 및 면역블롯팅
전체 세포 추출물을 RIPA 완충제(50 mM Tris-HCl pH7.4, 1% NP-40, 0.5% 소듐 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF)로 제조하였다. 세포 용해물의 단백질 농도를 브래드포드 검정에 의해 결정하였다. 용해물을 10% 폴리아크릴아미드 겔에서 분리한 다음 PVDF 막으로 옮겼다. 막을 PBST 중 3% BSA로 1시간 동안 차단하였다. 이후, 막을 일차 항체와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 적절한 양고추냉이 퍼옥시다제-관련 이차 항체(Millipore)를 적용하고 막을 실온(RT)에서 1h 동안 인큐베이션하였다. 단백질 밴드를 이후 화학발광 시약(Millipore)으로 시각화하고 BioSpectrum 600 이미징 시스템(UVP)에서 검출하였다. 단백질 수준d을 Gel-Pro 분석기 3.1(Media Cybernetics)을 사용하여 밴드 강도로부터 정량화하였다.
1.10 세포 생존력 검정
세포 생존력은 WST-1(4-[3-(4-로도페닐)-2-(4-니트로페닐)-2H-5-테트라졸리오]-1,3-벤젠 디설포네이트) 검정으로 미토콘드리아 데하이드로게나제 활성을 측정함으로써 검정되었다. 세포를 104개 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩하고 24h 동안 배양하였다. 지시된 농도의 EGF, EpEX, 또는 데글리칸-EpEX를 갖는 새로운 배양 배지를 세포에 첨가하였다. 처리 기간의 말미에, 10 ㎕의 WST-1 증식 시약(5 ㎍/ml)을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 1h 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 분광광도계 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 각 웰의 흡광도를 검출하였다.
1.11 콜로니 형성 검정
세포를 24-웰 플레이트(1 x 104개 세포/웰)에 시딩하고 7일 동안 배양하였다. 이후, 세포를 4%의 포름알데히드로 고정시키고 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색하였다. 플레이트의 이미지를 캡처한 후, 0.5% SDS를 갖는 용액을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 2h 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 570 nm에서 용액의 흡광도를 측정함으로써 세포의 상대 밀도를 결정하였다. 실험을 3회 수행하였다.
1.12 Transwell 이동 및 침윤 분석
세포 이동 및 침윤을 10% 마트리겔 없이 또는 10% 마트리겔과 함께 8-㎛ 기공 크기 Transwell 이동 챔버(Millicell)로 검정하였다. 세포(1 × 105)를 500 ㎕의 무혈청 DMEM에서 상부 챔버에 첨가하였다. 이후, 10% FBS를 함유하는 700 ㎕의 DMEM을 화학유인물질로서 하부 챔버에 첨가하였다. 이동 및 침윤을 표준 세포 배양 인큐베이터에서 37℃에서 16시간 동안 진행시켰다. 이후, 면봉으로 막의 상부 표면으로부터 세포를 제거하고, 하부 표면으로 이동한 세포를 4% 파라포름알데히드(1x PBS 중) 중 0.05%(w/v) 크리스탈 바이올렛으로 15분 동안 염색하고, 물로 세척하였다. 고배율로 조사된 막 상의 적어도 4개의 무작위 필드를 각 실험 조건에 대해 계수하기 전에 막을 15 내지 20분 동안 건조시켰다.
1.13 아폽토시스 검정
세포를 시딩하고 10 ㎍/ml mAb 또는 억제제로 6시간 동안 처리하였다; 적절한 희석액으로 사용된 관련 없는 마우스 골수종 면역글로불린은 IgG2a(Invitrogen #02-6200) 이소타입 대조군으로 제공되었다. 아폽토시스 세포는 Annexin V-FITC 및 PI를 사용하여 검출되었고, 유세포 분석기(BD Immunocytometry Systems)를 사용하여 분석되었다. 조기 아폽토시스는 Annexin V-FITC 아폽토시스 검출 키트 II(BD Pharmingen)로 측정되었다. 프로피디움 아이오다이드(PI) 염색으로 후기 아폽토시스 핵을 검출하였다.
1.14 RNA 추출, cDNA 합성, 정량적 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(qRT-PCR)
총 RNA 추출, 제1 가닥 cDNA 합성, 및 SYBR-그린 기반 실시간 PCR을 제조자의 설명서에 기재된 바와 같이 수행하였다. 총 RNA를 추출하기 위해, TRIzol 시약(Invitrogen)을 사용하여 세포를 용해시키고, 클로로포름을 사용하여 TRIzol로부터 단백질 및 페놀을 제거하였다. 원심분리 후, 상부 무색 층을 수집하고 이소프로판올과 혼합하여 RNA 펠렛을 침전시켰다. 이어서, RNA 펠렛을 70% 에탄올로 세척하고, 실온에서 공기-건조시키고, RNase 유리수에 용해시켰다. 제1 가닥 cDNA 합성을 위해, 5 ㎍의 총 RNA를 50℃에서 60분 동안 올리고(dT) 프라이머 및 SuperScriptIII 역전사효소(Invitrogen)를 사용한 역전사에 사용하였다. 표적 유전자 수준을 LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix(Roche) 및 LightCycler480 System(Roche)을 사용하여 정량적 PCR(qPCR)에 의해 평가하였다. 모든 q-PCR 반응을 표준화하기 위해 GAPDH mRNA 발현을 내인성 하우스키핑 대조군으로서 측정하였다. qPCR 반응은 95℃에서 5분 동안 수행된 후, 95℃에서 10초 동안 변성, 60℃에서 10초 동안 어닐링 및 72℃에서 30초 동안 연장의 40 사이클이었다. 최종 결과는 3개의 독립적인 실험으로부터 계산되었다. 관심 유전자의 mRNA 발현을 검출하기 위해 사용된 프라이머 서열은 보충 자료 표 3에 열거되어 있다.
표 3
1.15 결장암 전이성 동물 모델
PBS 중 결장암 HCT116 또는 HT29(5 × 106개 세포/마우스)를 꼬리 정맥을 통해 4 내지 6주령 암컷 NOD/SCID 마우스에 주사하였다. 이어서, 마우스를 체중에 따라 상이한 처리 그룹에 무작위로 할당하였다. 3일 후, 연속 4주 동안 주 2회 꼬리 정맥 주사를 통해 항체를 투여하였다. 크리조티닙을 주당 5일 동안 경구 위관 영양법에 의해 매일 투여하였다(4주 동안 치료). 치료 연구를 위해, 종양-보유 마우스를 아이소형 대조군 IgG1(15 mg/kg), 크리조티닙(20 mg/kg), EpAb2-6(15 mg/kg), 또는 EpAb2-6(15 mg/kg)과 조합된 크리조티닙(20 mg/kg)으로 처리하였다. 마우스 생존율을 측정하였다. Academia Sinica(Taiwan)의 지침에 따라 동물 관리를 수행하였다. 프로토콜은 Academia Sinica의 동물 실험 윤리 위원회(AS IACUC: 20-05-1468)에 의해 승인되었다.
1.16 동소 이식 및 치료 연구
동소 종양 모델은 이전에 보고된 바와 같이 생성되었다(Chen et al, 2020). 간략하게, NSCID 마우스를 렌티-luc 바이러스(루시페라제 유전자를 함유하는 렌티바이러스)로 이전에 감염된 HCT116 세포의 동소 이식에 사용하였다. 마우스를 250 mg/kg의 용량으로 아베르틴, 2,2,2-트리브로모-에탄올(Sigma-Aldrich)의 i.p. 주사에 의해 마취시켰다. 종양 발달을 생물발광 이미징에 의해 모니터링하였다. 치료 연구를 위해, 종양-보유 마우스를 아이소형 대조군 IgG1(15 mg/kg), 크리조티닙(20 mg/kg), EpAb2-6(15 mg/kg), 또는 EpAb2-6(15 mg/kg)과 조합된 크리조티닙(20 mg/kg)으로 처리하였다. 종양 진행을 생물발광의 정량화에 의해 모니터링하였다. 마우스 생존을 또한 모니터링하였다. Academia Sinica의 지침에 따라 동물 관리를 수행하였다. 프로토콜은 Academia Sinica의 동물 실험 윤리 위원회(AS IACUC: 20-05-1468)에 의해 승인되었다.
1.17 통계 분석
모든 데이터는 표시된 실험 횟수에 대한 평균 ± SEM으로 제시된다. 짝을 이루지 않은 스튜던트 t-검정을 사용하여 실험 대 대조군 배양물에서 발현 백분율을 분석하였다. 0.05 미만의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
2. 결과
2.1 EpEX는 HGFR과의 상호작용을 통해 HGFR 인산화를 유도한다
본 발명자들의 이전 연구에서, 본 발명자들은 인간 포스포-RTK 어레이 키트(R&D Systems) 검정을 수행하였고, EpEX가 HCT116 세포에서 EGFR 및 HGFR 인산화 둘 모두를 유도한다는 것을 발견하였다(Liang et al, 2018). 내인성 EpCAM이 HCT116 및 HT29 결장암 세포주에서 HGFR과 직접 상호작용하는지 여부를 시험하기 위해, 본 발명자들은 가교제인 DTSSP를 사용하여 추정되는 EpCAM-HGFR 복합체를 안정화시켰다. 본 발명자들이 예측한 바와 같이, EpCAM과 HGFR의 상호작용은 면역침전(IP) 및 웨스턴 블롯팅에 의해 확인되었다(도 1a). 막-결합된 EpCAM이 HGFR의 세포외 도메인(HGFRECD)에 결합할 수 있는지 여부를 추가로 연구하기 위해, 본 발명자들은 EpCAM-V5 및 HGFRECD-c-Myc-태그 둘 모두를 과발현하는 HEK293T 세포를 사용하여 co-IP 실험을 수행하였다. 결과는 외인성 EpCAM과 HGFR 사이의 상호작용을 확인하였다(도 1b). 다음으로, 본 발명자들은 재조합 EpEX-Fc와 HGFRECD-His 재조합 단백질 사이의 직접적인 상호작용을 조사하기 위해 IP를 수행하였다(도 1c). 결장암 세포에서 HGFR의 인산화에 대한 EpEX의 효과를 조사하기 위해, 본 발명자들은 HCT116 및 HT29 세포에서 인산화된 HGFR의 수준을 분석하였다. 웨스턴 블롯팅 및 ELISA 결과는 EpCAM 및 EpEX 둘 모두가 둘 모두의 세포 유형에서 HGFR의 인산화를 유도함을 나타내었다. 사실, EpEX만이 EpCAM의 부재 하에서 HGFR 인산화를 유도할 수 있었다(도 1d 및 도 1e).
EpEX는 2개의 EGF-유사 도메인으로 구성되므로(Schnell et al, 2013), 본 발명자들은 어느 도메인이 HGFR과 상호작용하는지를 결정하고자 하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 다양한 EGF-유사 도메인 결실 돌연변이체(EpCAMΔEGFI+II, EpCAMΔEGFI 및 EpCAMΔEGFII) 플라스미드를 작제하였다. 놀랍게도, 단지 하나의 EGF-유사 도메인 결실을 보유하는 돌연변이체(EpCAMΔEGFI 및 EpCAMΔEFGII)는 HGFR과 상호작용할 수 있는 반면, 둘 모두의 도메인-결실된 돌연변이체(EpCAMΔEGFI+II)는 이러한 종류의 결과를 나타내지 않았다(도 1f). 가용성 EpEX 야생형 또는 돌연변이체 단백질과의 HGFRECD 결합을 평가할 때 유사한 결과가 관찰되었다(도 1g). 전반적으로, 이러한 발견은 막-결합된 EpCAM 및 분비된 EpEX가 둘 모두 EpCAM/EpEX의 EGF 도메인 I 또는 II를 통해 HGFR에 결합할 수 있음을 나타낸다.
다음으로, 본 발명자들은 EpEX-Fc 및 HGFR-His 단백질의 EGF-유사-도메인-결실 돌연변이체의 여러 변이체 사이의 잠재적인 상호작용을 조사하기 위해 ELISA를 수행하였다. 결과는 EpEXΔEGFI+II 돌연변이체 단백질에 대한 HGFR 결합이 완전히 폐지될 때 이의 둘 모두의 도메인을 통해 HGFR에 대한 EpEX 결합을 확인하였다(도 1h). 야생형 EpEX에 의해 나타난 이전의 인산화 결과와 유사하다(도 1d 및 1e), 본 발명자들은 EpEXΔEGFI 및 EpEXΔEFII 둘 모두가 HGFR 인산화를 유도할 수 있지만, EpEXΔEGFI+II 단백질은 유도할 수 없음을 관찰하였다(도 1i 및 도 1j). 이러한 결과에 기초하여, 본 발명자들은 EpEX가 HGFR에 결합하여 결과적인 인산화를 유도할 수 있다고 결론지었다.
2.2 EpEX는 HGFR 신호전달을 통해 종양 진행을 촉진한다
HGFR 인산화를 유도하는 EpCAM의 능력은 이 경로가 결장암 세포에서 종양원성에 부분적으로 책임이 있을 수 있는 특정 가능성을 시사하였다. EpCAM 및 HGFR 활성화가 암 진행 및 전이를 협력적으로 조절하는지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 HGF 처리의 유무에 관계없이 EpCAM 녹아웃 세포에서 인산화된 ERK 및 AKT의 수준을 조사하였다. 웨스턴 블롯팅은 HGFR, AKT 및 ERK의 인산화가 EpCAM 녹아웃 HCT116 및 HT29 세포에서 HGF로의 처리에 의해 영향을 받지 않음을 보여주었다(도 2a). 추가로, 세포 성장 검정의 결과는 EpCAM 녹아웃 세포가 야생형 HCT116 및 HT29 세포보다 느리게 성장했지만, 세포 성장의 궤적은 EpCAM 녹아웃 HCT116 및 HT29 세포를 HGF로 처리함으로써 회복될 수 있음을 보여주었다(도 2b).
EpEX가 HGFR 신호전달을 통해 암 진행 및 침윤을 유도할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 본 발명자들은 EpEX-His 및 HGFR의 티로신 키나제 억제제인 SU11274의 조합물로 처리한 후 결장암 세포에서 EGFR, ERK 및 AKT의 인산화를 분석하였다. 본 발명자들은 SU11274가 HCT116 및 HT29 세포에서 EpEX-매개된 ERK 및 AKT 인산화를 약화시킬 수 있음을 발견하였다(도 2c). 세포 성장에 대한 이러한 억제의 효과를 추가로 이해하면, 본 발명자들은 EpEX 처리 단독이 HCT116 및 HT29 세포의 성장을 자극한 반면, SU11274는 결장암 세포에서 세포 생존 및 증식의 EpEX-유도된 증가를 폐지하였음을 발견하였다(도 2d).
또한, HGFR 녹다운은 HGFR, EGFR, AKT, 및 ERK에서 인산화 수준을 감소시켰다. 흥미롭게도, HGFR 녹다운은 또한 EGFR 인산화의 수준을 감소시켰다(도 2e). 또한, HGFR 녹다운은 EpEX-유도된 RIP(포스포릴화된 ADAM17 및 프레세닐린 2)(도 2f) 및 활성 β-카테닌의 핵 번역(도 2g)을 감소시켰다. 또한, EpEX-유도된 세포 성장 및 콜로니 형성 둘 모두는 HCT116 세포에서 HGFR 녹다운에 의해 유의하게 감소되었다(도 2h 및 도 2i). 실제로, 본 발명자들은 IP 검정을 사용하여 HCT116 세포의 HGF 처리 후 EpEX 생산이 상승한다는 것을 발견하였다(도 2j). 본 발명자들은 또한 HGF 처리가 HCT116 세포에서 ADAM17, 프레세닐린 2 및 EpEX 생산의 인산화를 증가시켰다는 것을 발견하였다(도 2k).
2.3 EpEX는 ERK 및 FAK-AKT 신호전달을 활성화시킨다
EpCAM은 다운스트림 이펙터를 통해 암 세포의 성장, 생존 및 전이에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 신호전달의 과정에서, EpCAM의 단백질분해는 EpEX를 생산하며, 이는 RIP 및 후속적으로 EpCAM 신호전달을 형질도입하는 EpICD의 방출을 추가로 자극할 수 있다(Lin et al, 2012). 또한, HCT116 세포에 대한 EpEX 처리는 TACE 및 γ-세크레타제의 촉매 서브유닛인 프레세닐린 2의 인산화를 통해 RIP를 증가시킬 수 있는 것으로 이전에 나타났다(Liang et al, 2018). 따라서, 본 발명자들은 EpCAM 녹아웃 HCT116 세포를 EpEX로 처리하여 AKT, FAK, 및 ERK의 인산화 뿐만 아니라 RIP 단백질(ADAM17 및 프레세닐린 2)의 인산화와 같은 HGFR 다운스트림 신호전달의 부분적 회복을 초래하였다(도 3a). 이전 작업은 GSK3β 길항제가 AKT를 통해 EMT를 자극한다는 것을 보여주었다(An et al, 2020). 이 메카니즘의 라인에서, 본 발명자들은 EpEX가 GSK3β(S9, 불활성 GSK3β)의 억제적 인산화를 구제할 수 있는 한편, EpCAM 녹아웃 세포에서 GSK3β(Y216, 활성 GSK3β)의 활성화 인산화를 동시에 감소시킬 수 있음을 발견하였다(도 3a). 본 발명자들은 또한 EpEX가 EpCAM 녹아웃 HCT116 세포에서 콜로니 형성을 증가시켰으며(도 3b), EpICD가 아닌 내인성 EpEX의 쉐딩을 차단하는 것은 감소된 HGFR, AKT 및 ERK 인산화를 야기하여 내인성 EpEX가 HGFR 신호전달 활성화에 결정적임을 시사한다(도 3c)는 것을 발견하였다.
다음으로 EpEX가 HGF 유도된 HGFR 신호전달을 향상시킬 수 있는지 여부를 시험하였다. EpEX 또는 HGF 처리 단독과 비교하여 HGFR 및 AKT 및 ERK를 포함하는 후속 다운스트림의 HGF 상향조절된 인산화와 함께 가용성 EpEX와 함께 HCT116 및 HT29 세포의 인큐베이션(도 3d). EpEX는 HGFR 활성화를 유발할 수 있으므로, 본 발명자들은 HGFR 신호전달의 매개체에 대한 EpEX의 효과를 추가로 조사하였다. 이러한 맥락에서, AKT 및 ERK 신호전달은 EMT, 세포 주기, 생존, 및 암 진행의 조절에서 다양한 생리학적 역할을 하기 때문에, 가장 중요한 암-관련 신호전달 경로 중 2개이다(Chang et al, 2013; Sun et al, 2015). 따라서, 본 발명자들은 HGFR 억제제(SU11274), AKT 억제제(LY294002), ERK 억제제(U0126) 및 FAK 억제제(PF-562271)가 HCT116 세포에서 EpEX-유도 신호전달에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 시험하였다. 본 발명자들은 EpEX가 AKT, ERK 및 FAK 인산화 수준(도 3e), 콜로니 형성 가능성(도 3f), 상처 치유(도 3g) 및 이동(도 3h) 능력을 증가시켰다는 것을 확인하였다. 함께, 이러한 결과는 EpEX가 결장암 세포에서 HGFR 활성화를 유도함으로써 ERK 및 FAK-AKT 신호전달 경로를 증가시킨다는 것을 나타낸다.
2.4 EpEX는 GSK3β 활성을 하향조절함으로써 활성 β-카테닌 및 Snail 발현을 유도함으로써 EMT 및 침윤을 촉진한다
본 발명자들은 EpCAM 녹아웃이 중간엽 마커 비멘틴의 발현 뿐만 아니라 EMT 조절자 Snail의 단백질 수준을 억제하는 한편, HCT116 세포에서 E-카드헤린 발현을 향상시키는 것을 발견하였다; 또한, 이러한 EMT 지표는 EpEX 처리 후 회복되었다(도 4a). EpEX는 또한 EpCAM 녹아웃 HCT116 세포에서 세포 침윤을 유도하였다(도 4b).
EpCAM 및 HGFR 활성화가 협력적으로 암 세포 침윤을 조절하는지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 HGF 처리의 유무에 관계없이 EpCAM 녹아웃 세포를 조사하였다. 본 발명자들은 EpCAM 녹아웃 HCT116 및 HT29 세포에서 EMT-관련 단백질의 발현 뿐만 아니라 세포 침윤 특성이 야생형 세포와 비교하여 유의하게 감소되었음을 발견하였다. HGF-유도된 EMT 및 침윤 활성은 또한 EpCAM 녹아웃 세포에서 감소하였다(도 4c 및 도 4d). HGF와 조합한 EpEX와 함께 HCT116 및 HT29 세포의 인큐베이션은 EpEX 또는 HGF 단독 처리와 비교하여 EMT 및 세포 침윤의 수준을 상향조절하였다(도 4e 및 도 4f). 또한, EpEX-유도된 EMT-관련 단백질 발현 및 세포 침윤은 HGFR 녹다운에 의해 방지되었다(도 4g 및 도 4h). 이러한 결과는 EpEX가 HGFR 활성화를 향상시키고 결장암 세포에서 EMT 및 전이를 유도할 수 있음을 시사한다.
이전 보고서는 GSK3β 길항제가 AKT 신호전달에 의해 EMT를 자극하여 이의 인산화 및 유비퀴틴-매개 단백질분해를 통해 Snail 단백질 회전율에 영향을 미치는 것으로 나타났다(An et al, 2020). 이러한 메커니즘의 라인에서, 본 발명자들은 EpEX가 GSK3β의 억제적 인산화(S9, 불활성 GSK3β)를 유도할 수 있는 한편, 단백질의 활성화 인산화(Y216, 활성 GSK3β)를 동시에 감소시킬 수 있음을 발견하였다; 이러한 변화는 HCT116 세포에서 증가된 Snail 단백질 발현과 일치하였다. 그러나, SU11274는 HCT116 세포에서 EpEX-매개된 GSK3β 활성을 약화시키고 EpEX-유도된 활성 β-카테닌 및 Snail 단백질 발현을 없앨 수 있었다(도 4i). 본 발명자들은 또한 HGFR 다운스트림 매개체(즉, LY294002, U0126 및 PF-562271)의 억제제가 EpEX-매개된 GSK3β 활성 및 Snail 단백질 발현을 약화시킬 수 있음을 발견하였다(도 4j). EpEX-유도된 침윤은 또한 LY294002, U0126 및 PF-562271에 의해 억제되었다(도 4k). 참고로, 활성 β-카테닌 및 Snail 단백질 발현은 GSK3β 억제제, BIO로 처리한 후 대조군 및 EpEX-처리된 세포 둘 모두에서 상향조절되었다(도 4l). 이러한 결과는 EpEX가 GSK3β 활성의 하향-조절을 통해 활성 β-카테닌 및 Snail 단백질 발현을 유도함으로써 EMT 및 침윤을 촉진한다는 것을 시사한다.
2.5 EpEX는 유비퀴틴화-매개된 프로테아솜 분해의 억제를 통해 Snail 단백질 안정성을 촉진한다
본 발명자들은 결장암 세포를 Cas9를 발현하는 렌티바이러스 및 EpCAM을 표적화하는 sgRNA로 트랜스펙션시킴으로써 EMT-관련 유전자 발현에 대한 EpCAM의 효과를 분석하였다. 결과는 EpCAM 녹아웃이 E-카드헤린의 유전자 발현을 증가시키고 VIM의 유전자 발현을 감소시켰음을 보여주었다. 그러나, EpCAM 녹아웃은 SNAIL 유전자 발현 수준에 영향을 미치지 않았다(도 5a). 실제로, 본 발명자들은 사이클로헥사미드 처리가 EpCAM의 녹아웃과 함께 Snail 단백질의 반감기를 단축시켰다는 것을 확인하였다(도 5b). 반면에, MG132(26S 프로테아솜의 억제제)로의 처리는 Snail 정상-상태 단백질 수준을 증가시켰는데, 이는 단백질 수준이 프로테아솜 분해에 의해 크게 조절됨을 나타낸다(도 5c). EpCAM 녹아웃은 또한 대조군 세포와 비교하여 증가된 수준의 유비퀴틸화된 Snail를 야기하였다(도 5d). 또한, 사이클로헥사미드 처리는 EpEX가 Snail 단백질 반감기를 연장시키는 것을 추가로 확인시켜 주었다(도 5e). EpEX는 Snail 유전자 발현의 수준에 영향을 미치지 않았으며(도 5f), MG132는 EpEX 처리의 유무에 관계없이 HCT116 세포에서 Snail 정상-상태 단백질 수준을 증가시켰다(도 5g).
이와 관련하여, Snail의 세린-풍부 영역에서 2개의 공통 모티프(모티프 1: S97, S101; motif 2: S108, S112, S116, S120)는 이의 전사 후 조절 및 유비퀴틴화-매개된 프로테아좀 분해에 중요하다(Zhou et al, 2004). HCT116 세포를 야생형(Snail-WT) 및 3개의 돌연변이체(Snail-2SA, -4SA, 및 -6SA) Snail 작제물로 트랜스펙션시켰다(도 5h). EpEX로 트랜스펙션된 세포의 처리는 Snail-WT 및 -2SA의 발현을 유의하게 증가시켰지만, Snail-4SA 및 -6SA 돌연변이체의 발현에는 그러한 효과가 나타나지 않았다(도 5i). 이러한 데이터는 EpEX가 암 세포에서 Snail의 세린-풍부 공통 모티프 2를 통해 Snail의 단백질 안정성을 조절한다는 것을 시사한다. 종합하면, 이러한 실험의 결과는 EpEX가 결장암 세포에서 Snail 단백질 안정성을 촉진함으로써 EMT의 조절에 중요한 역할을 한다는 것을 보여주었다.
2.6 EpAb2-6은 EpCAM 및 HGFR 신호전달을 억제하고 GSK3β의 활성화를 통해 활성 β-카테닌 및 Snail 단백질 분해를 촉진한다
이전에, 본 발명자들은 EpEX를 표적화하고 암 세포 아폽토시스를 유도하는 중화 항체 EpAb2-6을 개발하였다(Liang et al., 2018; Liao et al, 2015). 따라서, 본 발명자들은 결장암 세포에서 EpEX의 기능을 차단하기 위해 EpAb2-6을 사용하고 HCT116 세포에서 HGFR, AKT, FAK, GSK3β, ERK, ADAM17, 및 프레세닐린 2의 인산화 수준을 분석하였다. EpAb2-6 처리는 대조군 IgG 처리와 비교하여 HGFR, AKT, ERK, 및 FAK의 감소된 인산화를 초래하였다(도 6a). HGF 처리는 HCT116 세포에서 HGFR, AKT, 및 ERK의 인산화 수준을 증가시켰다. 한편, 이러한 인산화된 단백질의 수준은 EpAb2-6으로 처리된 세포에서 유의하게 감소하였다. 더욱이, HCT116 세포의 침윤 및 이동 활성은 또한 EpAb2-6 처리에 의해 유의하게 감소되었다(도 6b). EpAb2-6 후 HCT116 세포를 HGF로 처리한 경우, 침윤 및 이동에 대한 EpAb2-6의 효과는 부분적으로 둔화되었다(도 6c 및 6d).
흥미롭게도, EpAb2-6은 HCT116 세포에서 내인성 단백질의 IP에 의해 검출된 바와 같이 EpCAM과 HGFR 사이의 연관성을 감소시켰다(도 6e). 재조합 EpEX가 HGFR에 직접 결합하는지 여부를 평가하기 위해, 본 발명자들은 정제된 EpEX-His와 HGFR-Fc 단백질 사이의 상호작용을 조사하기 위해 ELISA를 수행하였다. HGFR에 대한 EpEX의 결합 활성은 ELISA에 의해 추가로 확인되었고, 본 발명자들은 또한 항-EpCAM 모노클로날 항체 EpAb2-6이 HGFR에 대한 EpEX 결합을 억제할 수 있음을 보여주었다(도 6f).
이러한 실험에 이어, 본 발명자들은 다음으로 대조군 IgG 또는 EpAb2-6으로 처리된 HCT116 세포에서 EMT 단백질 발현의 수준을 분석하였다. 결과는 EpAb2-6이 E-카드헤린의 수준을 증가시킨 반면, Snail 및 활성 β-카테닌을 감소시켰음을 보여주었다(도 6g). 또한, EpAb2-6은 S9에서 GSK3β의 억제적 인산화(비활성 GSK3β)를 감소시켰고, 동시에 Y216에서 단백질의 활성화 인산화를 증가시켰다(활성 GSK3β). 이러한 변화는 GSK3β 활성을 증가시킬 것으로 예상되며, 활성 β-카테닌 및 Snail 단백질에서 관찰된 감소와 일치하였다. 상응하게, 활성 β-카테닌 및 Snail 단백질은 GSK3β 억제제, BIO로 처리한 후 증가하였다(도 6h). 활성 β-카테닌 및 Snail 정상-상태 단백질 수준은 EpAb2-6으로의 처리에 의해 감소한 반면, 프로테아좀 억제제(MG132)로의 치료는 활성 β-카테닌 및 Snail 정상-상태 단백질 수준을 증가시켰다(도 6i). 또한, EpAb2-6은 사이클로헥사미드 처리 검정에 도시된 바와 같이 Snail 단백질 반감기를 단축시켰다(도 6j). 이러한 결과는 EpAb2-6이 HGFR 신호전달을 하향조절함으로써 전이성 과정을 억제하고 증가된 GSK3β 활성을 통해 활성 β-카테닌 및 Snail 단백질 분해를 가능하게 함을 시사한다.
본 발명자들은 EpAb2-6의 2가 항체 단편 F(ab')2가 EpEX에 결합하여 아폽토시스를 유도할 수 있는지 여부를 추가로 시험하였다. 결과는 EpAb2-6의 F(ab')2가 실제로 EpEX에 결합할 수 있고(도 7a) 결장암 세포에서 아폽토시스를 유도함(도 7b)을 보여주었다. 본 발명자들은 또한 인간화된 EpAb2-6(hEpAb2-6) 및 인간 항-EpCAM 항체, 아데카투무맙(MT201)이 유사한 활성을 공유하는지 여부를 평가하기 위해 아폽토시스 검정을 사용하였다. EpAb2-6 및 hEpAb2-6은 아폽토시스를 유도하는 것과 관련하여 유사한 기능적 속성을 나타낸 반면, MT201은 HCT116 또는 HT29 암 세포에서 이러한 효과를 나타내지 않았다(도 7c). 본 발명자들은 또한 EpAb2-6 및 hEpAb2-6 둘 모두가 HGFR, AKT, 및 ERK의 인산화를 억제했지만, MT201은 그렇지 않았다는 것을 발견하였다(도 7d). 인산화된 ADAM17 및 프레세닐린 2의 수준은 또한 EpAb2-6 또는 hEpAb2-6 처리 후에 감소한 반면, MT201 항체는 이러한 효과를 나타내지 않았다(도 7e). 본 발명자들의 데이터는 EpEX 및 HGFR이 종양 진행 및 세포 침윤을 촉진하기 위해 다운스트림 HGFR 신호전달을 공동으로 자극하여, EpCAM 및 HGFR 신호전달 둘 모두를 동시에 차단함으로써 항-종양 효과를 추가로 시험하고자 하였다. 또한, 본 발명자들은 HGFR 억제제 크리조티닙이 HCT116 및 HT29 암 세포에 대한 EpAb2-6의 아폽토시스 효과를 향상시킬 수 있음을 발견하였다(도 7f). 세포 침윤 검정에서, 크리조티닙은 대조군 IgG와 비교하여 HCT116 및 HT29 세포에서 침윤에 대한 EpAb2-6의 억제 효과를 향상시켰다(도 7g).
2.7 EpAb2-6은 EpCAM의 EGF-유사 도메인 I 및 II에 결합한다
이전 연구는 EpAb2-6 항체의 결합 에피토프를 EpCAM에서 LYD 모티프로서 확인하였고, 이는 아미노산 잔기 94-96에 상응하며; 특히, 잔기 95(Y95)는 EpAb2-6 결합에서 주요 역할을 한다. 여기서, 본 발명자들은 EpEX가 EGF-유사 도메인 I 및 II를 통해 HGFR에 결합하며(도 1f 및 도 1g), EpAb2-6은 HGFR에 대한 EpEX 결합을 억제할 수 있음(도 6e 및 도 6f)을 발견하였다. 따라서, 본 발명자들은 항체가 EpEX의 둘 모두의 EGF-유사 도메인에서 EpCAM에 결합하는지 여부를 결정하기를 원하였다(도 8a, 도 8b, 도 8c). EpAb2-6이 EpCAM에서 LYD 모티프를 인지하는지 확인하기 위해, 본 발명자들은 EpCAM의 제1(aa 27-59; EGF-I 도메인) 및 제2(aa 66-135; EGF-II/TY 도메인) EGF-유사 반복부를 인코딩하는 cDNA 서열을 작제하였다. 이후, PCR-기반 부위-지정 돌연변이유발을 사용하여 돌연변이를 각 도메인에 도입하였다(도 8d). 이러한 EpCAM 돌연변이체에 대한 EpAb2-6 항체의 반응성을 면역형광법(도 8e), 유세포 분석(도 8f), 및 세포 ELISA(도 8g)에 의해 평가하였다. EpCAM 위치 Y32(EGF-1 도메인) 또는 Y95(EGF-II 도메인)에서의 아미노산 돌연변이는 EpAb2-6 결합의 현저한 감소를 야기했지만 MT201 결합에는 영향을 미치지 않았다. 따라서, 본 발명자들은 EpAb2-6이 각각 아미노산 잔기 Y32 및 Y95를 표적화하는 EpEX의 EGF-1 및 EGF-II 도메인에 결합한다고 결론지었다.
2.8 EpAb2-6은 결장암 동물 모델에서 크리조티닙 요법의 효능을 개선한다
동물 모델에서, 치료는 이식 72시간 후에 개시되었다(도 9a). 먼저, 본 발명자들은 결장암 세포 HCT116 전이에 대한 크리조티닙 및 EpAb2-6의 효과를 조사하였다. NOD/SCID 마우스에 HCT116 세포를 정맥내 주사한 다음, 세포 주입 3일 후에 크리조티닙 및 EpAb2-6, 또는 등가 부피의 대조군 IgG로 공동-처리하였다. EpAb2-6 및 크리조티닙의 조합물을 수용한 HCT116 세포가 이식된 마우스의 중앙값 및 전체 생존 시간은 대조군 IgG 그룹과 비교하여 증가하였는데(도 9b), 이는 EpAb2-6이 생체내에서 크리조티닙의 항-전이 작용을 개선할 수 있다는 사상을 뒷받침한다.
다음으로, 본 발명자들은 결장암의 동위원소 마우스 모델에서 치료 전략으로서 EpAb2-6 및 크리조티닙의 조합 효과를 시험하였다. 도 9c에 예시된 바와 같이, 종양 성장은 반딧불이 루시페라제를 안정적으로 발현하는 HT29-Luc 및 HCT116-Luc 세포의 생체내 모니터링에 의해 평가되었다. 치료적 치료를 시작하기 전(종양 세포 이식 3일 후), 모든 마우스에서 종양 성장이 관찰될 수 있었다. 치료 후, EpAb2-6 또는 EpAb2-6 및 크리조티닙의 조합물을 수용한 마우스에서 생물발광 강도는 대조군 IgG 또는 크리조티닙 단독 그룹과 비교하여 유의하게 감소하였고; HCT116(도 9d 및 도 9e) 또는 HT29(도 9d 및 도 9e) 도 9h 및 도 9i) 세포를 이식한 동소 모델에서 유사한 효과가 관찰되었다. 또한, 체중은 HCT116(도 9f) 또는 HT29(도 9J) 세포를 이식한 동소 모델에서 치료 그룹 간에 유의하게 다르지 않았다. EpAb2-6과 크리조티닙의 조합물을 수용한 HCT116(도 9g) 또는 HT29(도 9k) 세포가 이식된 마우스의 중앙값 및 전체 생존 시간은 대조군 IgG 그룹과 비교하여 유의미하게 증가되었다. 전반적으로, 전이성 및 동소성 동물 모델을 사용한 본 발명자들의 실험 결과는 대조군 IgG 및 크리조티닙 그룹의 모든 동물이 유의한 종양을 발달시켰고 불량한 생존을 가졌다는 것을 보여주었다. 한편, EpAb2-6-처리된 그룹은 대조군 IgG- 또는 크리조티닙-처리된 그룹보다 훨씬 더 느린 종양 진행을 가졌고 더 높은 중앙 생존을 나타내었다. 중요하게는, 종양 진행의 약화는 조합 치료 그룹에서 가장 두드러졌다.
3. 토론
EpCAM 발현은 많은 암에서 종양형성 및 전이와 상관관계가 있으므로, 본 연구에서 기본 메커니즘을 설명하고자 하였다. 여기서, 본 발명자들은 EpEX-유도된 종양 진행 및 전이가 HGFR 신호전달에 의해 매개된다는 것을 추가로 보여준다.
많은 연구에서 암 환자에서 높은 HGFR 발현 또는 활성화와 좋지 않은 결과 사이의 연관성이 확인되었다(Birchmeier et al., 2003). HGFR의 높은 발현은 갑상선 암종 및 비-소세포 폐암(NSCLC)에서 불량한 예후를 나타내고, 이는 결장암에서 종양 침윤 및 림프절 전이의 예측인자이다(Al-Saad et al, 2017; Takeuchi et al, 2003). 이전 보고서는 또한 위암 및 CRC의 모델에서, HGFR 신호전달의 차단이 종양 세포 성장을 감소시키고 시험관내 및 생체내에서 퍼질 수 있음을 보여주었다(Smolen et al, 2006; Toiyama et al, 2012; Zou et al, 2007).
HGF는 상피 세포의 증식을 조절할 수 있는 사이토카인이며, 주로 중간엽 세포에 의해 발현되고 분비된다(Lassus et al, 2006; Taher et al, 2002). HGF 신호전달의 주요 조정자는 HGFR이고, 이 신호전달 경로에 의해 유도된 복잡한 프로그램은 증식, 생존, 매트릭스 분해 및 이동을 촉진한다. HGFR 및 HGF는 함께 상처 봉합 및 혈관형성에 필요한 중요한 상피 및 중간엽 상호작용의 기초를 형성한다(Comoglio & Trusolino, 2002). 본 발명의 결과는 EpCAM 녹아웃이 결장암 세포에서 HGFR의 인산화를 약화시키고, EpCAM 녹아웃 HCT116 세포에서 세포 성장 및 이동 능력이 야생형 세포에 비해 유의하게 감소되었음을 보여준다. EpCAM 녹아웃 HCT16 세포에서 HGF 처리가 회복되었을 때, 세포 증식 및 이동에 대한 EpCAM-유도 효과는 부분적으로 역전되었다. HGFR 인산화를 조절하는 EpCAM의 능력은 이 경로가 결장암 세포에서 중요한 역할을 할 수 있다는 강한 가능성을 시사한다.
티로신 키나제 억제제(TKI)는 ATP가 키나제 도메인의 ATP-결합 포켓에 도달하는 것을 방지함으로써 리간드 존재와 상관없이 활성화된 RTK를 표적화할 수 있는 소분자 약물이다(Pasquini & Giaccone, 2018). 전형적으로, 약물 내성은 TKI의 효과를 폐지할 수 있는 RTK에서의 돌연변이의 획득으로 인해, 또는 HGFR과 같은 유사한 신호전달을 자극할 수 있는 또 다른 RTK의 증폭에 의해 발생한다(Sachet et al, 2014). 이전에 우리 그룹은 인간 포스포-RTK 어레이 키트를 사용하여 EpEX-Fc- 및 Fc-처리된 HCT116 결장암 세포에서 RTK의 인산화에 대해 스크리닝하였다. 결과는 HGFR(MET)-티로신 인산화가 EpEX 처리에 의해 자극되었음을 나타내었다(Liang et al, 2018). 이 연구에서, 본 발명자들은 가용성 EpEX-His 단백질과 함께 HCT116 결장암 세포의 인큐베이션이 HGFR 인산화를 유도한다는 것을 발견하였다. 흥미롭게도, HGFR 티로신 키나제 억제제(SU11274)는 EpEX-매개 ERK 및 AKT 인산화를 약화시킬 수 있다. 또한, 본 발명자들은 HGFR의 고갈이 HGFR 억제제의 효과와 일치하여 EpEX-유도된 세포 성장 및 침윤을 약화시킬 수 있음을 확인하였다.
많은 연구에서 EMT가 암 진행 및 전이와 관련이 있는 것으로 나타났다(Iwatsuski et al, 2010). EMT의 과정은 상피 세포 부착의 손실 및 세포에서 중간엽 표현형의 유도를 초래할 수 있는 복잡한 일련의 가역적 사건을 포함한다. EMT는 종양에 중간엽 특징을 획득하는데 필요한 가소성 특성과 같은 줄기 세포를 제공하여, 종양 세포가 전파되고 보다 침윤적이 된다(Sacchetti et al, 2021; Thiery & Sleeman, 2006). 상피 세포 부착 손실 및 중간엽 특성의 유도와 함께, EMT를 겪는 암 세포는 또한 향상된 세포 운동성 및 침윤을 나타낸다. EMT의 지표는 세포-세포 접합을 방해하는 E-카드헤린과 같은 상피 마커의 발현 감소와 함께 비멘틴, Snail 및 Slug와 같은 중간엽 마커의 발현 증가를 포함한다(Meng et al, 2012). 또한, EMT를 겪은 세포는 또한 아폽토시스에 내성이 된다. 많은 보고서에 따르면 상이한 암 유형에서 EMT는 다양한 유형의 치료 약물에 대한 내성을 촉진할 수 있다(Singh & Settleman, 2010). 치료 목적으로 EMT를 차단하는 것은 종양 세포에서 EMT 프로그램의 활성화에 기여하는 종양 미세환경의 성분을 표적화함으로써 달성될 수 있다(Shibue & Weinberg, 2017). 예를 들어, HGF는 HGFR 신호전달을 통해 EMT 프로그램을 유도함으로써, 세포가 고정 없이 혈류에서 생존하게 함으로써 암 세포의 침윤성 및 전이성 잠재력을 향상시킨다. 이전 보고서는 결장암 및 교모세포종에서 이동 및 전이를 촉진하는 FAK-PI3K/AKT 및 MAPK 신호전달 경로를 나타내었다(Golubovskaya, 2014; Song et al, 2016). 본 발명자들의 데이터는 이러한 분자의 억제제(즉, SU11274, LY294002, U0126 및 PF-562271)가 HCT116 세포에서 EpEX-유도된 이동 및 침윤을 약화시킬 수 있음을 나타냈다.
EpEX 신호전달에 의한 GSK3β의 억제는 β-카테닌 및 Snail 둘 모두를 안정화시킬 수 있으며, 이는 EMT-관련 세포 이동 및 침윤을 공동으로 유도한다. 참고로, EMT는 비-인산화된(활성) β-카테닌의 높은 발현 및 β-카테닌의 핵으로의 전위와 상관관계가 있지만, β-카테닌 단독의 과발현이 반드시 EMT-관련 과정을 촉진시키는 것은 아니다. 또한, Snail는 E-카드헤린 발현을 억제함으로써 EMT를 유발하는 아연-핑거 전사 인자이다. PI3K/AKT, MAPK 및 Wnt와 같은 많은 발암성 신호는 GSK3β를 억제하여 Snail 및 후속 EMT의 안정화를 유발하는 것으로 나타났다. 본 발명잘들의 데이터는 EpEX가 감소된 GSK3β 활성을 통해 활성 β-카테닌 및 Snail를 안정화시킴으로써 EMT 및 침윤을 유도한다는 것을 보여주었다. 또한, 본 발명자들의 항-EpCAM 항체는 GSK3β 활성을 증가시켜 EMT 및 침윤을 억제하여, 이는 활성 β-카테닌 및 Snail의 분해를 초래한다.
HGFR 신호전달은 항암 요법의 중요한 표적이며, 이 경로의 길항제를 개발하기 위한 상당한 노력이 있어 왔다. HGFR 티로신-키나제 도메인의 많은 소분자 억제제가 현재 임상 시험에서 평가되고 있다. HGFR 과발현은 많은 암 세포에서 약물 내성을 촉진시켜, 치료 효능이 좋지 않고 환자 생존 시간을 단축시키는 것으로 알려져 있다(Yang et al, 2021; Zhao et al, 2020). 예를 들어, HGFR 신호전달 경로가 다발성 골수종 환자에서 다약물 내성의 주요 구동자임을 보여주는 강력한 전임상 및 임상 증거가 있다(Moschetta et al, 2013). HGFR 활성화의 주요 메커니즘은 리간드-비의존적 HGFR 과발현이기 때문에 대부분의 HGFR 억제제는 HGF 리간드보다 이의 RTK 활성을 직접 표적화한다(Koch et al, 2020; Liang et al, 2020). 현재 2개의 비선택적 HGFR TKI가 승인되었다: ALK- 및 ROS1-양성 NSCLC에 대한 크리조티닙(2011년에 처음 승인됨), 및 갑상선암 및 신장암에 대한 카보잔티닙(2016년에 처음 승인됨)(Kobayashi et al, 2016; Shaw et al, 2014). HGFR 억제의 관련성은 크리조티닙에 대한 여러 진행 중인 임상 시험과 함께 집중적으로 평가되고 있다. 한 크리조티닙 시험 결과는 HGFR 엑손 14-스키핑 돌연변이를 보유하는 NSCLC의 치료에 대한 일부 가능성을 시사하였다(Paik et al, 2015). I상 MErCuRIC1 시험은 증폭된 HGFR 및 야생형 또는 돌연변이된 RAS를 보유하는 CRC 환자의 코호트에서 크리조티닙과 MEK 억제제의 조합을 평가하고 있다(NCT02510001)(Van Schaey broeck et al, 2015). 하나의 이전 보고서는 크리조티닙이 HGF/STAT3/SOX13/HGFR 피드백 루프를 차단하여 SOX13-매개 CRC 이동, 침윤 및 전이를 억제할 수 있음을 나타냈다(Du et al, 2020).
본 발명자들의 그룹은 EpEX의 기능을 차단하는데 사용될 수 있는 EpEX 중화 항체 EpAb2-6을 생산하였다. EpAb2-6 치료는 EpCAM 절단을 촉진하고 후속하여 EpEX 및 EpICD 생산을 증가시키는 양성 피드백 루프를 포함하는 EpEX/EGFR/ADAM17 축에서 신호전달을 방해하는 것으로 알려져 있다(Liang et al, 2018; Liang et al, 2015). 참고로, 인산화된 HGFR의 감소된 수준이 EpAb2-6 처리 후에 관찰되었다. 또한, EpAb2-6은 HCT116 세포의 침윤 및 이동 능력을 약화시킬 수 있었지만, HGF 처리 후 능력은 부분적으로 회복되었다. 이전 보고서는 EpAb2-6이 아폽토시스를 유도할 수 있음을 입증하였고, 본 발명자들은 크리조티닙 처리 후, HCT116 세포가 인간화-EpAb2-6- 및 EpAb2-6-유도된 아폽토시스에 감작되었음을 확인하였다. 동소성 결장암 동물 모델로부터의 본 발명자들의 결과는 또한 EpAb2-6 및 크리조티닙의 조합 치료 후 종양 성장이 유의하게 억제되었음을 나타내었다.
NSCLC에 대한 잠재적인 치료 중에서, 크리조티닙 및 다른 HGFR-표적화 요법은 가장 유리한 결과 중 일부를 갖는다. 이러한 사실은 HGFR 활성화를 차단하는데 사용될 수 있는 메커니즘을 깊이 이해하는 것의 중요성을 강조한다. 본 발명자들은 EpCAM 또는 EpEX가 HGFR-ERK-AKT 신호전달 축을 유도할 수 있음을 발견하였다. 이러한 발견에 따르면, EpCAM은 크리조티닙과의 조합 요법에 대한 우수한 표적이 될 수 있다. 실제로, 본 발명의 실험에서, EpAb2-6은 인산화된 HGFR의 수준을 감소시키고 동물 모델에서 크리조티닙의 치료 효능을 개선시켰다. 따라서, 본 발명자들의 발견은 HGFR 신호전달의 조절에서 EpCAM의 신규한 작용을 나타내고 EpCAM/HGFR-표적화된 조합 요법의 새로운 전략을 제안한다.
이 연구에서, 본 발명자들은 EpCAM/EpEX가 결장암 세포에서 HGFR 활성화, GSK3β-Snail 및 β-카테닌 신호전달을 유도함으로써 ERK 및 FAK-AKT를 통해 종양 진행 및 전이를 유도한다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 EpCAM 신호전달의 억제 또는 고갈이 HGFR 활성화 및 이의 다운스트림 신호전달의 감소를 초래한다는 것을 추가로 입증한다. 항-EpCAM mAb EpAb2-6으로의 치료는 결장암 진행 및 전이를 감소시켰고, 중요하게는, 이는 동소 종양 및 전이 모델에서 마우스의 생존을 개선시켰다. 따라서, 본 발명자들의 데이터는 HGFR 억제제와 조합하여 EpCAM을 표적화하는 치료용 항체가 결장암 요법에 대해 큰 잠재력을 보유할 수 있음을 시사한다. 이러한 발견으로부터 얻은 통찰력은 전이를 억제하고 환자 결과를 개선할 수 있는 신규한 항암 치료제의 개발에 유용할 수 있다.
참고문헌
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Glu Leu Lys His Lys Ala Arg Glu Lys Pro Tyr Asp Ser Lys 145 150 155 160 Ser Leu Arg Thr Ala Leu Gln Lys Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Gln Leu 165 170 175 Asp Pro Lys Phe Ile Thr Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn Val Ile Thr 180 185 190 Ile Asp Leu Val Gln Asn Ser Ser Gln Lys Thr Gln Asn Asp Val Asp 195 200 205 Ile Ala Asp Val Ala Tyr Tyr Phe Glu Lys Asp Val Lys Gly Glu Ser 210 215 220 Leu Phe His Ser Lys Lys Met Asp Leu Thr Val Asn Gly Glu Gln Leu 225 230 235 240 Asp Leu Asp Pro Gly Gln Thr Leu Ile Tyr Tyr Val Asp Glu Lys Ala 245 250 255 Pro Glu Phe Ser Met Gln Gly Leu Lys Ala Gly Val Ile Ala Val Ile 260 265 270 Val Val Val Val Ile Ala Val Val Ala Gly Ile Val Val Leu Val Ile 275 280 285 Ser Arg Lys Lys Arg Met Ala Lys Tyr Glu Lys Ala Glu Ile Lys Glu 290 295 300 Met Gly Glu Met His Arg Glu Leu Asn Ala 305 310 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Val Gly Ala Gln Asn Thr Val Ile Cys 1 5 <210> 19 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Lys Pro Glu Gly Ala Leu Gln Asn Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp 1 5 10 15 Cys Asp Glu <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Cys Val Cys Glu Asn Tyr Lys Leu Ala Val Asn 1 5 10 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EpCAM gRNA <400> 21 gtgcaccaac tgaagtacac 20 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1st forward mutagenic deletion primer <400> 22 gcagctcagg aagaatcaaa gctggctgcc 30 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1st reverse mutagenic deletion primer <400> 23 ggcagccagc tttgattctt cctgagctgc 30 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2nd forward primer <400> 24 aagctggctg ccaaatctga gcgagtgaga 30 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2nd reverse primer <400> 25 tctcactcgc tcagatttgg cagccagctt 30 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPCAM primer F <400> 26 ctccacgtgc tggtgtgt 18 <210> 27 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPCAM primer R <400> 27 tgttttagtt caatgatgat ccagta 26 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E-cadherin primer F <400> 28 ggaactatga aaagtgggct tg 22 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E-cadherin primer R <400> 29 aaattgccag gctcaatgac 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM primer F <400> 30 gtttccccta aaccgctagg 20 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM primer R <400> 31 agcgagagtg gcagagga 18 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNAIL primer F <400> 32 cttcggctcc aggagagtc 19 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNAIL primer R <400> 33 ttcccactgt cctcatctga c 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH primner F <400> 34 cttcaccacc atggaggagg c 21 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH primer R <400> 35 ggcatggact gtggtcatga g 21

Claims (21)

  1. 암을 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게
    (i) 유효량의, 상피 세포 부착 분자(EpCAM) 신호전달의 활성화를 억제하는 제1 억제제; 및
    (ii) 유효량의, HGFR 신호전달의 활성화를 억제하는 제2 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 제1 억제제가 EpCAM의 세포외 도메인(EpEX)의 생산(또는 방출)을 감소시키고, HGFR에 대한 EpEX의 결합을 차단하고, 및/또는 EpEX-유도된 HGFR 인산화를 억제하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제2 억제제가 HGFR에 대한 HGF의 결합을 차단하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 억제제가 EpEX에 대한 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 항체가 표피 성장 인자(EGF)-유사 도메인 I 및 II에 특이적으로 결합하는, 방법.
  6. 제4항에 있어서, 항체가 EGF-유사 도메인 I에 위치한 CVCENYKLAVN(aa 27 내지 37)(서열번호 20) 및 EGF-유사 도메인 II에 위치한 KPEGALQNNDGLYDPDCD(aa 83 내지 100)(서열번호 19)의 서열 내의 에피토프에 대한 특이적 결합 친화력을 갖는, 방법.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편이
    (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(HC CDR1), 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(HC CDR2), 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(HC CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및
    (b) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(LC CDR1), 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(LC CDR2), 및 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보적 결정 영역 3(LC CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 억제제가 TACE 및 PS2 신호전달의 인산화를 억제하는데 효과적인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 억제제가 포레티닙, 크리조티닙 및 카보잔티닙으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 암 세포의 아폽토시스를 유도하는데 효과적인, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 암 세포의 이동/침윤을 억제하고/거나 종양 크기를 감소시키는데 효과적인, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 대상체의 생존을 연장하는데 효과적인, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 폐암, 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 위암, 두경부암, 신장암, 백혈병, 간암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 피부암 및 고환암으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
  14. 키트 또는 약학적 조성물로서,
    (i) EpCAM 신호전달의 활성화를 억제하는 제1 억제제; 및
    (ii) HGFR 신호전달의 활성화를 억제하는 제2 억제제를 포함하는, 키트 또는 약학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 제1 억제제가 제1항, 제2항, 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같고/거나 제2 억제제가 제3항 또는 제9항에 정의된 바와 같은, 키트 또는 약학적 조성물.
  16. 암을 치료하기 위한 의약 또는 키트를 제조하기 위한 (i) EpCAM 신호전달의 활성화를 억제하는 제1 억제제 및 (ii) HGFR 신호전달의 활성화를 억제하는 제2 억제제의 조합물의 용도.
  17. 제16항에 있어서, 제1 억제제가 제1항, 제2항, 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같고/거나, 제2 억제제가 제3항 또는 제7항에 정의된 바와 같은, 용도.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 의약 또는 키트가 암 세포의 아폽토시스를 유도하는데 효과적인, 용도.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 의약 또는 키트가 암 세포의 이동/침윤을 억제하고/거나 종양 크기를 감소시키는데 효과적인, 용도.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 의약 또는 키트가 대상체의 생존을 연장하는데 효과적인, 용도.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 폐암, 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 위암, 두경부암, 신장암, 백혈병, 간암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 피부암 및 고환암으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 용도.
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