KR20130137583A - Ｓ100ａ4 항체들 및 이들의 치료 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 S100A4에 대한 항체들, 이들 항체들의 제조방법, 이들 항체들을 포함하는 약학 조성물들, 및 이들의 치료 및 진단적 이용에 관한 것이다.

Description

Ｓ100Ａ4 항체들 및 이들의 치료 용도{S100A4 ANTIBODIES AND THERAPEUTIC USES THEREOF}
본 발명은 분자 면역학 및 인간 질병의 치료에 관한 것이다. 구체적으로, 이는 인간 S100A4에 대한 항체들, 이들 항체들을 포함하는 약학 조성물들, 및 이들의 치료 및 진단 용도에 관한 것이다.
암은 인간의 악성질병들 중 가장 흔한 유형의 것으로, 암의 치사성(fatality)은 최초 종양 세포들이 먼 위치로 유포된(disseminate) 이후의 전이 형성으로 인한 결과이다.
종양 진행, 혈관칼슘-결합 단백질들의 S100 족의 구성원인, 전이-유도 S100A4 단백질의, 혈관신생(angiogenesis) 및 전이성 유포에서의 일시적인(casual) 관련은 몇몇 시도들에 의해 증명되어 왔다.
S100A4는, 직접적인 세포-세포 접촉 또는 오토크라인/파라크라인(autocrine/paracrine) 시토카인 및 성장 인자 신호화(signalling)에 의해 주로 매개되는, 종양 세포들과 그들의 기질(섬유아세포들, 내피, 평활근, 염증성 및 신경 세포들 포함))간에 일어나는 종양-기질(tumor-stroma) 교차상호작용(cross-talk)에 중추적인 역할을 한다. 예로서, 표피 성장 인자, 종양 성장 인자-β1 및 섬유아세포 성장 인자-2는 S100A4의 발현들을 자극할 수 있고 (Strutz 등, Kidney Int. 2002;61(5):1714~1728); 종양 또는 기질 세포들 중 어느 하나에 의해 종양 환경 내로 방출된 S100A4는 종양 세포들 내에서 전이-촉진 캐스캐이드반응들(pro-metastatic cascades)을 촉발시키며 (Grum-Schwensen 등, Cancer Res. 2005;65(9):3772~3780); 종양 세포들 또는 종양-관련 섬유아세포들은 정상의 섬유아세포들과 대조적으로, 높은 수준의 S100A4를 발현하고 (Ambartsumian 등, Oncogene. 1996;13(8):1621~1630); 기타 숙주-유래된 종양 기질 세포들, 예컨대 림프구들 및 마크로파지는 활성화시 S100A4의 발현을 증가시킨다 (Grigorian 등, Electrophoresis. 1994;15(3~4):463~468).
S100A4는 혈관신생자극(proangiogenic) 인자로서 작용하여, 세포외 기질의 자극 및 리모델링 (열화(degrading) 효소들의 생성)을 통한 종양 혈관신생 및 내피 세포들의 운동성에 영향을 미친다 (Schmidt-Hansen 등, J. Biol. Chem. 2004;279(23):24498~24504).
S100A4 유전자 자체는 본래 전이성이 높은 마우스 유선 선암종(mammary adenocarcinoma)에서 구분되어 발현되는 유전자로서 분리되었다 (Ebralidze 등, Genes Dev. 1989; 3(7):1086~1093). S100A4 유전자의 비-전이성 종양 세포주들 내로의 도입 및 전이성인 세포주들에서의 그의 억제가 그러한 세포들의 종양형성성 및 전이성 인과관계를 변경시킴이 증명되었으며, 그에 따라 이의 종양 진행 및 전이 형성에서의 관련이 입증되었다 (Lloyd 등, Oncogene. 1998; 17(4):465~473).
임상에서, S100A4의 높은 수준의 발현과 암환자들에서의 좋지 않은 예후간에 양의 상관관계가 있다는 것이 특히 하기의 경우들에서 증명되었다: 유방 암종 (Rudland PS 등, Cancer Res 2000. 60(6): 1595~1603), 전립선 암종 (Saleem M 등, PNAS 2006. 103(40): 14825~30), 폐 암종 (Tsuna M 등, Anticancer Res 2009. 29(7): 2547~54), 결장 암종 (Cho Y 등, World J Gastroent 2005. 11(31): 4852~6), 췌장 암종 (Rosty C 등, Am J Pathol 2002. 160(1): 45~50), 신장 암종 (Bandiera A 등, World J Surg 2009. 33(7): 1414~20), 위 암종 (Yonemura Y 등, Clin Cancer Res 2000. 6(11): 4234~42), 난소 암종 (Maelandsmo GM 등, Tumor Biol 2009. 30(1):15-25), 유두 갑상선 암종 (Min HS 등, Mod Pathol 2008. 21(6): 748~55), 흑색종 (Andersen K 등, Mod Pathol 2004. 17(8): 990~997), 간세포 암종 (Cui J 등, J Can Res Clin Oncol 2004. 130(10): 615~22), 방광 암종 (Agerbaek M 등, Eur Urol 2006. 50(4): 777~785), 지방육종 침습성 암종 (Pazzaglia L 등, Anticancer Res 2004. 24(2B): 967~972), 신경아세포종(neuroblastoma) (Bjornland K 등, J Pediatr Surg 2001. 36(7): 1040~44), 식도 편평상피세포 암종 (Ninomiya I 등, Int J Oncol 2001. 18(4): 715~20), 골육종(osteosarcoma) (Mathisen B 등, Clin Exp Metastasis 2003. 20(8): 701~11), 담낭 암종 (Nakamura T 등, Int J Oncol 2002. 20(5): 937~41), 구강 편평상피세포 암종 (Moriyama-Kita M 등, Oral Oncol 2004. 40(5): 496~500), 자궁내막 암종 (Xie R 등, Lab Invest 2009. 89(8): 937~947), 및 수모세포종(medulloblastoma) (Hernan R 등, Cancer Res 2003. 63(1): 140~148).
각종 비-악성 병리 상태들에서의 S100A4의 관련성도, 다수의 연구군들에 의하여 증명되어 왔으며, 특히 자가면역성 염증 및 심혈관, 신경 및 폐 기관들에서의 장애들과 같은 병리 상태에서 증명되어 왔다 (Grigorian M 등, Current Molecular Medicine 2008. 8(6):492~6). 따라서, S100A4는 임상적 적용을 위한 후보 타겟이다. 그러나, S100A4의 생물학적 기능의 복잡성 및 그의 작용의 전체 메커니즘은 알려지지 않았으므로, 이 단백질의 세포내 또는 세포외 작용들 중 어느 하나를 차단하는 억제제들은 아직까지 없다.
항체에 기초한 치료는 다수의 질병들에서 효과적인 치료의 필수적인 부분으로서 알려져 왔다. 지난 10년간, 모노클로날(monoclonal) 항체들은 악성 및 비악성 질병들의 치료에서 주요한 치료제가 되어왔다.
오늘날까지, S100A4에 대하여 발생된 모노클로날 및 폴리클로날(polyclonal) 항체들은 다른 여러 회사들 및 연구진들에 의하여 제공되어 왔다 (특히, Zhang 등, Calcium Binding Proteins 2006. 1:4, 219~223; Germany, antibodies-online GmbH의 ABIN167355 및 ABIN171123; Denmark, DakoCytomation의 A5114). 과학 문헌들 및 특허에서 알려주는 내용들은 이들 항체들의 치료 적용들에 대하여 추측을 하고는 있으나, 본 발명자들의 최선의 지식에서, 현 기술수준에서의 항체들이 암 및 비-악성 질병들의 치료 문제를 실질적으로 해결한 자료에 대한 증거는 아직 없다.
WO2000064475 (Research Corporation Technologies, Inc.)는, (i) mts-1 단백질에 대항하는 항체들 (항체들이 독소에 컨쥬게이트될 수 있음)을 이용하여 mts-1을 억제 또는 (ii) 안티센스 mts-1 뉴클레오티드 서열을 암호화하는 핵산을 제공함에 의한, 악성 암의 진단 방법을 개시한다.
따라서, 현 기술수준에서 S100A4 단백질을 타겟팅하는, 암 치료, 특히 혈관신생 및 전이의 치료를 위한 새로운 치료 방법들을 제공하는 것이 요구된다.
추가적으로, 진단 수준에서, S100A4는 정상적인 세포의 종양 세포로의 분화 과정에서의 좋은 마커로 고려될 수 있으며, 따라서 이는 암종들의 세포학적 실험에서 좋은 바이오마커(biomarker)이다. 그러나, 암 조직에서 S100A4의 발현의 검출은 환자의 생검을 필요로한다는 단점을 갖는다. 따라서, 현 기술수준에서, 대상에서 S100A4의 수준을 검출하므로써, 더욱 간단하고 덜 침습성인 암의 임상적 진단 방법을 제공하는 것이 요구되고 있다.
발명의 요약
제 1 측면에서, 본 발명은 항-혈관신생 활성을 갖는 특이적 항-S100A4 항체 또는 상기 항체의 항-혈관신생 활성을 실질적으로 보존하고 있는 상기 항체의 단편에 관한 것으로, 상기 항체는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된다:
(i) 서열 ELPSFLGKRT (서열번호: 3)을 포함하는 S100A4의 에피토프를 인식하는 항체,
(ii) 서열 EGFPDKQPRKK (서열번호: 24)를 포함하는 S100A4의 에피토프를 인식하는 항체, 및
(iii) 하이브리도마 ECACC 11051804에 의해 생성되는 항체.
또다른 측면에서, 본 발명은 기탁 번호(accession number) ECACC 10022401, ECACC 11051801, ECACC 11051802, ECACC 11051803 및 ECACC 11051804로 기탁된 세포주로 이루어지는 군으로부터 선택된 하이브리도마 세포에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의, 본 발명에 따른 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은, 전이 및 원하지 않는 혈관신생으로부터 선택되는 질병에 대한 예방 및/또는 치료 용도를 위한 본 발명에 따른 항체 또는 단편에 관한 것이다.
추가적인 측면에서, 본 발명은, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 단편 및 하기 군으로부터 선택되는 제 2의 성분을 포함하는 접합물(conjugate)에 관한 것이며:
(a) 항혈관신생제(antiangiogenic agent)
(b) 항전이제(antimetastatic agent)
(c) 세포독성제
(d) 소염제
또한, 전이, 원하지 않는 혈관신생관련 질병 및 염증관련 질병으로부터 선택되는 질병의 예방 및/또는 치료에서의 그의 용도에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 기탁번호 ECACC 10022401, ECACC 11051801, ECACC 11051802, ECACC 11051803 및 ECACC 11051804로 기탁된 세포주들로부터 선택된 하이브리도마 세포주를, 상기 항체의 생산이 가능한 조건에서 배양하는 것을 포함하는 본 발명에 따른 모노클로날 항체를 수득하는 방법에 관한 것이다.
추가의 측면들에서, 본 발명은 특이적 항-S100A4 항체 및 항대사물질을 포함하는 조성물 및 그의 암 또는 전이의 예방 및/또는 치료에서의 이용에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은, 항원에의 결합능을 갖는 S100A4 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체의, 염증 관련 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 의약 제조에의 용도에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 다음 단계들을 포함하는, 대상에서 암 또는 염증 관련 질병의 시험관 내 진단방법에 관한 것이다:
(a) ECACC 10022401, ECACC 11051801, ECACC 11051802, ECACC 11051803 및 ECACC 11051804으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하이브리도마에 의해 생산되는 모노클로날 항체 또는 상기 항체의 기능적 변형체를 사용하므로써, 상기 대상의 생체액 중에서 S100A4 단백질 또는 그의 변형체 수준을 검출하는 단계,
(b) 상기 수준을 기준 값과 비교하여, 기준 값에 대하여 S100A4 단백질 또는 그의 변형체의 증가된 수준이 암 또는 염증 관련 질병을 앓고 있는 대상에서 나타나는 것인 단계.
또다른 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 샘플에서의 S100A4 검출 방법에 관한 것이다:
(i) S100A4를 포함하는 것으로 의심되는 샘플을, 본 발명에서 정의된 것과 같은 특이적 항-S100A4 항체 또는 그의 단편과 접촉시키는 단계; 및
(ii) S100A4와 항체 또는 그의 단편 간의 면역 복합체들의 형성을 검출하는 단계로, 상기 S100A4와 상기 항체 간의 면역 복합체들의 검출은 샘플 중 S100A4의 존재를 나타낸다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편을 포함하는 생체액에서 암 또는 염증 관련 질병의 진단을 위한 키트에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 암을 진단받은 대상을 대한 맞춤형 치료를 설계하기 위한 시험관 내 방법에 관한 것으로, 이는 ECACC 10022401, ECACC 11051801, ECACC 11051802, ECACC 11051803 및 ECACC 11051804로 이루어지는 군으로부터 선택된 하이브리도마에 의해 생산된 모노클로날 항체 또는 상기 항체의 기능적 변형체를 이용하므로써 상기 대상의 생체액 중 S100A4 단백질 또는 그의 변형체의 수준을, 동일한 모노클로날 항체를 이용한 치료 전 후에 검출하며, 여기에서 치료 전 S100A4 단백질 또는 그의 변형체의 수준에 비하여 치료 후 S100A4 단백질 또는 그의 변형체의 수준의 증가는 환자가 원래 받은 치료에 대한 대안이 필요하다는 것을 나타내는 것이다.
본 발명의 한 목적은 인간 또는 쥐과의 S100A4에는 특이적으로 결합하지만 다른 S100 과의 단백질들에는 결합하지 않는 항체들을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 인간 또는 쥐과의 S100A4에는 나노그램들, 및 피코그램들의 검출 한계에서 민감하게 결합하는 항체들을 제공하는 것이다.
본 발명의 한 중요한 목적은, 악성 및 비악성 질병들에 대해 증명된 활성을 갖는 S100A4에 대한 치료 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 한 중요한 목적은, 체내에서 그의 기능 작용 전에 대사되거나 분해되지 않으면서, 악성 및 비악성 질병들에 대해 생체 내에서의 증명된 활성을 갖는 S100A4에 대한 치료 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 한 중요한 목적은 최소의 독성 또는 독성 없이, 악성 및 비악성 질병들에 대해 증명된 활성을 갖는 S100A4에 대한 치료 항체들을 제공하는 것이다.
본 발명의 한 목적은 종양 성장을 저해할 수 있는 S100A4에 대한 항체들을 제공하는 것이다.
본 발명의 한 목적은 종양 발생(development)을 저해할 수 있는 S100A4에 대한 항체들을 제공하는 것이다.
본 발명의 한 목적은 혈관신생 및 종양 혈관신생을 저해할 수 있는 S100A4에 대한 항체들을 제공하는 것이다.
본 발명의 한 목적은 내피 세포 이동(cell migration)을 저해할 수 있는 S100A4에 대한 항체들을 제공하는 것이다.
본 발명의 한 목적은 암 줄기세포들을 저해할 수 있는 S100A4에 대한 항체들을 제공하는 것이다.
본 발명의 한 목적은 염증 과정을 저해할 수 있는 S100A4에 대한 항체들을 제공하는 것이다.
도 1. 웨스턴-블롯 분석에 의해 결정된 S100A4 단백질 발현. (A) 상이한 기원들의 종양 세포주들 및 마우스 배아 섬유아세포 세포주 NIH3T3로부터의 총 추출물들 중에서의 S100A4 발현 수준. (B) 종양 유도된 HCT116, MiaPACA-2 및 BxPC3 이종이식(xenograft) 모델들로부터의 총 추출물 중 S100A4 발현 수준. (C) 종양 세포주 MDA-MB-231 및 이 세포주로부터 유래된 암 줄기세포들로부터의 총 추출물 중 S100A4 발현 수준.
도 2. S100A4 발현의 면역조직학적 분석. 2개의 췌장 선암종 세포주들 Panc1 및 BxPC3로부터 유래된 종양들에서, 조직학에 사용된 S100A4에 대한 가장 많이 인용된 토끼 폴리클로날 항체(Dako)와 5C3간의, S100A4 발현 및 분포의 비교 면역조직학적 분석. 사진들 (A-D)는 40배 배율로 찍은 것이다. 사진들 (E-H)는 120배 배율로 찍은 것이다. (A) 마우스 모노클로날 항체 5C3으로 염색된, BxPC3 세포주 이종이식 모델로부터 유도된 샘플에서 종양의 중심에서보다 침습성 전면에서 S100A4의 보다 강한 발현을 나타내는 경우. (B) Dako로부터의 토끼 폴리클로날 항체로 염색된, BxPC3 세포주 이종이식 모델로부터 유래된 샘플에서 종양의 중심에서보다 침습성 전면에서 S100A4의 보다 강한 발현이 나타나는 경우. (C) BxPC3 세포주 이종이식 모델로부터 유래된 종양에서 음성 대조구로서 사용된 비-관련(non-related) 마우스 모노클로날 항체 항-폴리히스티딘으로 염색. (D) BxPC3 세포주 이종이식 모델로부터 유도된 종양 샘플에서 일차 항체 없이 음성 대조구 염색. (E) 마우스 모노클로날 항체 5C3로 염색된, Panc-1 세포주 이종이식 모델로부터 유래된 종양의 세포질 및 핵에서의 S100A4의 강한 발현. (F) Dako로부터의 토끼 폴리클로날 항체로 염색된 Panc-1 세포주 이종이식 모델로부터 유래된 종양의 세포질 및 및 핵에서의 S100A4의 강한 발현. (G) Panc-1 세포주 이종이식 모델로부터 유래된 종양에서 음성 대조구로서 사용된 비-관련 마우스 모노클로날 항체 항-폴리히스티딘으로 염색. (H) Panc-1 세포주 이종이식 모델로부터 유래된 종양 샘플에서 일차 항체 없이 음성 대조구 염색.
도 3. 5C3은 S100A4에 의해 유도된 MMP9 단백분해활성을 중화한다. HUVECs 컨디셔닝된 매질 중 MMPs의 단백분해 활성. HUVECs는 24시간 동안 상이한 자극들로 처리되었다. 상등액들을 원심분리하여 파편들을 제거하고, 젤라틴 자이모그래피(gelatin zymography)로 분석하였다. 보다 명확한 밴드는 MMP9 및 MMP2 활성을 나타낸다. (A) S100A4는 투여량-의존 방식으로 MMP9의 활성 형태들의 분비를 증가시킨다. (B) 모노클로날 항체 5C3은 재조합 S100A4 단백질에 의해 유도된 MMP9의 활성 형태들의 생산을 중화하였다.
도 4. HUVEC의 이동(migration)에서 S100A4에 대한 모노클로날 항체들의 저해 효과. 이동의 유도 전에, 항체들을 37℃에서 2시간 동안 S100A4 단백질과 함께 인큐베이션하였다. HUVEC's를 24시간 동안 S100A4 (1μM), VEGF (3ng/ml), VEGF과 S100A4의 조합물 또는 이들 단백질들과 항체들의 조합물 (5C3, 1E2, 8B6, 6B9, 5A3, 5H4)로 처리하였다. (A) 세포들을 5C3 (0.25, 0.5, 1, 2 및 4μM) 및 5H4 (4μM)로 24시간 동안 처리하였다. 각 데이터 지점은, 100% 이동을 나타내는 양성 대조구 (왼쪽 막대)에 대하여 정규화된다. 양성 대조구는 EBM과 보충물들 (EGM) 및 FCS (완전 배지)와 함께 인큐베이션된 세포들에 대응한다. (B) 세포들을 24시간 동안 5C3, 1E2, 8B6, 6B9, 5A3 (2μM)로 처리하였다. 각 데이터 지점은, 100% 이동을 나타내는 VEGF와 S100A4에 의해 유도된 이동에 대하여 정규화된다. 막대들은 평균±표준편차를 나타낸다. ** p < 0.005 ("만-휘트니(Mann-Whitney) U 검정").
도 5. 인간 췌장 (MiaPACA-2) 종양들에서의 5C3 항체의 항체-종양 활성. 암컷 무흉선(athymic), 누드(nude) 마우스들을, 보충물 없이 0.1ml 배양 배지 중에서 5×106 MiaPACA-2 세포들을 이용하여, 0일 째에 마우스들의 오른쪽 옆구리 상단에 피하주사 접종하였다. MiaPACA-2 세포들에서 종양들이 65~160mm3에 도달되면, 처리를 개시하였다. 처리군들은 동물 10마리로 하였다. PBS (음성 대조구) 또는 5C3 (25mg/kg)를 복강내로 1주에 3회 제공하였다(1010100). 최종 제조 버퍼를 비히클 대조구로서 제공하였다. 종양 크기를 1주일에 3회 측정하고, 종양 부피를 하기 식에 따라 계산하였다: 종양 크기 = 너비2.길이/2. 실험 종료시 (MiaPACA-2 세포들에 대하여 30일), 종양들을 갖고 있는 마우스들을 희생시키고, 종양들을 제거하고 칭량하였다. (A, B) MiaPACA-2 실험들에 대한 결과. 관련 종양 부피 및 종양 중량의 그래프들은 평균±표준편차 ns p > 0.05, * p < 0.05, *** p < 0.001 ("만-휘트니 U검정")를 나타낸다.
도 6. 누드 마우스들에서 모노클로날 항체 5C3을 이용한 투여 스케쥴.
도 7. 종양 미세혈관(microvasculature)의 정량화. MiaPACA-2 종양들로부터의 미세혈관 (쥐과 CD31 모노클로날 항체)의 면역조직화학적 분석들. 혈관구조 수준들을 실험 종료(30일)시 측정하여, PBS 대조구 및 모노클로날 항체 5C3로 처리된 동물들을 비교하였다. (A) mm2당 혈관 프로파일들 (v.p.)의 수단으로서 발현된 규정된 종양 부피(MVD)에서 혈관 밀도. (B) 종양에서의 혈관 면적의 정량화 (Aa).
정량화는 120배 배율에서 종양들의 크기에 따라 슬라이스 당 8 내지 39 사진들간의 분석으로 정량화하였다. NIH ImageJ imaging 소프트웨어를 이용하여 영상들을 분석하였다. 그래프들은 평균±표준편차, * p<0.05 ("만-휘트니 검정")를 나타낸다.
도 8. 모노클로날 항체 5C3은 생체 내 독성 효과를 나타내지 않는다. 암컷인 무흉선 누드 마우스들을, 보충물 없이 0.1ml 배양 배지 중에서 5×106 MiaPACA-2 세포들 또는 1×106 HCT116 세포들을, 0일 째에 마우스들의 오른쪽 옆구리 상단에 피하주사 접종하였다. MiaPACA-2의 경우 종양이 65~160mm3 또는 HCT116의 경우 종양이 155~370 mm3 에 도달하면, 처리를 개시하였다. 처리군들은 MiaPACA-2 또는 HCT116 세포들에 대하여 각각 동물 10 마리 또는 동물 7마리였다. PBS (음성 대조구) 또는 5C3 (25mg/kg)을 1주 당 3회 복강내로 제공하였다(1010100). 최종 제조 버퍼를 비히클 대조구로서 제공하였다. 체중을 시험에 따라 1주 당 3회 측정하였다. 체중 그래프는 평균±표준편차를 나타낸다.
도 9. S100A4의 혈장 수준의 결정. 종양이 없는 동물들에서 S100A4 수준(Basal-02)에 비교하여 무흉선 마우스들 (MiaPACA-2, HCT116, MDAMB-231, Colo205)에서의 몇몇 이종이식 모델들에서의 S100A4 단백질 혈장 수준을 샌드위치 ELISA 방법에 의하여 결정하였다. MiaPACA-2+5C3 및 HCT116+5C3 조건들은, 5C3 모노클로날 항체에 결합되지 않은, 혈장 내 S100A4의 수준을 나타낸다. 혈장 수준을 실험 종료시 측정하였다. 혈장 수준의 그래프는 평균±표준편차를 나타낸다.
도 10. 모노클로날 항체 5C3와 조합된 젬시타빈(Gemcitabine)의 세포 생육성에서의 시너지 효과. 헥소스아미니다제(hexosaminidase) 활성에 의하여, 젬시타빈 단독 또는 모노클로날 항체 5C3와 조합된 세포 생육성에 대한 효과를 측정하였다. 젬시타빈의 세포독성 투여량-반응 효과는 모노클로날 항체 5C3의 조합으로 상승적으로 개선된다. MiaPACA-2 세포들을 5C3과 함께, 또는 5C3 없이 상이한 투여량으로, 40nM 또는 100nM의 일정 농도로, 72시간 동안 화학치료 약물과 함께 인큐베이션하였다. 생육성을 100%의 생육성을 나타내는, 화합물들(젬시타빈 또는 5C3)이 없는 세포들인, 양성 대조구에 대하여 정규화하하였다.
도 11. THP-1 단핵세포들에서 S100A4에 의해 유도된 IL-8 방출에 대한 모노클로날 항체 5C3의 저해 효과. (A) 24시간 인큐베이션 후, THP-1 단핵구들에 의해 분비된 IL-8에 대한 S100A4의 투여량 반응 및 이의 LPS에 의해 유도된 분비(양성 대조구)에 대한 비교. (B) 3μM에서 24시간 동안 S100A4로 처리된 THP-1 단핵구들에서의 IL-8 방출에 대한, 5C3의 효과. 세포들은 항상 항-마우스 IgG(Fc 특이적)로 처리하여 Fc 수용체-유도된 IL-8 방출을 회피하였다. 상등액들로부터의 IL-8을 ELISA에 의하여 분석하였다. 값들은 평균±표준편차를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 발명자들은 예기치 않게, S100A4 단백질에 대한 모노클로날 항체들이 이종이식 종양 모델 모두에서 시험관내 운동성 분석에서 내피 세포들의 S100A4-유도된 이동을 중화할 수 있고(실시예 9 참조), S100A4에 의해 유도된 혈관신생능을 중화할 수 있음(실시예 11 참조)을 발견하였다. 이들 결과들은, 항-S100A4 항체가 원하지 않는 혈관신생 및 전이 관련 질병들, 예컨대 암의 예방 및/또는 치료에 유용하다는 것을 나타낸다.
본 발명은, 특이적으로 S100A4와 상호작용하고, S100A4 혈관신생 작용을 차단하고 5C3, 1E2, 6B9, 5A3 및 8B6로서 명명된, 인간 및 쥐 S100A4 단백질에 대한 모노클로날 항체들을 제공한다. 본 발명자들은 이들 항체들이 종양 성장, 종양 혈관 신생을 억제하고, 나아가 생체 내에서 독성 부작용이 없거나, 독성을 최소로 갖기 때문에, 중요한 약물학적 활성들을 갖는다는 것을 놀랍게도 발견하였다. 흥미롭게도, 본 발명자들에 의해 수행된 작업은 S100A4에 의해 유도된 내피 세포 이동에서 상기 항체들의 작용의 신규 차단 메커니즘을 밝혔다.
본 발명의 발명자들은 생체액 내에서 S100A4의 수준들이 암의 조기 검출을 위한 진단 마커로서 적당함을 추가적으로 증명하였다. 따라서, 본 발명은 상기 항체들을 갖는 생체액 내 S100A4의 수준을 검출하므로써, 시험관 내 방법 및 환자에서의 암 진단용 키트에도 관한 것이다.
본 발명의 항-혈관신생 항체들
첫번째 측면에서, 본 발명은 항-혈관신생 활성을 갖는 특이적 항-S100A4 항체 및 상기 항체의 항-혈관신생 활성을 실질적으로 보존하는 단편에 관한 것으로, 상기 항체는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된다:
(i) 서열 ELPSFLGKRT (서열번호: 3)을 포함하는 S100A4의 에피토프를 인식하는 항체,
(ii) 서열 EGFPDKQPRKK (서열번호: 24)를 포함하는 S100A4의 에피토프를 인식하는 항체 및
(iii) 하이브리도마 ECACC 11051804에 의해 생산되는 항체.
본 발명의 제 1 측면에서 여기 사용된 것과 같은, "항체"라는 용어는 결정된 항원에 결합능을 갖고, 면역글로불린 분자의 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 적어도 하나의 폴리펩티드들 포함하는 단량체성 및 다량체성 단백질에 관한 것이다. 상기 항체라는 용어는 예로서, 폴리클로날 항체들, 모노클로날 항체들과 같은 알려진 임의의 유형의 항체 및 유전공학적으로 처리된 항체들, 예컨대 키메라성 항체들, 인간화 항체들, 영장류화(primatized) 항체들, 인간 항체들 및 2특이적 항체들을 포함한다. "항체"라는 용어의 보다 광범위한 정의는 "정의" 섹션에 나타내었다.
"폴리클로날 항체들" 및 "모노클로날 항체들"이라는 용어들은 "정의" 섹션에 나타내었다. 특정 구체예에서, 상기 항체는 모노클로날 항체이다.
"키메라성(chimeric) 항체들"은 한 종의 항체의 가변 영역들(대개 그 모노클로날 항체가 생성된 포유동물) 및 또다른 종의 불변 영역들(그 키메라성 항체가 사용될 종)로 구축된 항체들로서 이해된다. 상기 구축물의 목적은 원래의 모노클로날 항체를 갖지만, 치료될 대상에서 덜 면역원성이고 더 잘 감내되고(tolerated), 개선된 혈청 반감기를 갖고 면역학적 이펙터(effector) 메커니즘에 의해 인식될 수 있는 항체, 즉 보체인, 세포독성 세포들의 Fc 수용체 또는 종 특이성을 나타내는 기타 특이적 면역글로불린 수용체들 Fc 수용체를 수득하고자 하는 것이다. 바람직한 구체예에서, 키메라성 항체들은 쥐 가변 영역들 및 인간 불변영역들에 의해 형성된다.
"인간화 항체"는 부모 항체의 항원 결합능을 보존하고 있으나, 인간에서는 덜 면역원성인, 전형적으로 쥐과 항체인, 인간이 아닌 생물로부터의 항체로서 이해된다. 이는 상이한 과정들을 통하여 달성될 수 있으며, 상기 과정은 다음 단계들을 포함한다: (a) 완전한 비인간 가변 도메인들을 인간 불변영역들 내로 그래프팅(grafting)하여 키메라 항체들을 생성하는 단계; (b) 인간 프레임워크 및 불변영역들에서 비인간 상보성 결정 영역들(CDR)만을, 중요(critical) 프레임워크 잔기들만을 유지 또는 유지하지 않으면서 그래프팅하는 단계; 및 (c) 이들을, 표면 잔기들을 대체하므로써, 인간 가변 도메인에 유사한 부분으로 "가리면서", 완전한 비인간 가변성 도메인들을 이식하는 단계.
"영장류화된 항체"는, 원숭이 항체(또는 다른 영장동물)의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인들을 포함하도록 유전적으로 조작된 재조합 항체, 구체적으로 필리핀원숭이(cynomolgus monkey)의 항체, 및 인간 불변 도메인의 서열들, 바람직하게는 인간 감마 1 내지 4 면역글로불린의 불변 영역(또는 PE 변형물)을 포함하는 항체로서 이해된다. 상기 항체들의 제조는 Newman 등, Biotechnology, 10: 1458~1460 (1992); 특허 문서 US 5,658,570 및 US 6,113,898에 설명되어 있다. 이들 항체들은 인간 항체들과 고도로, 즉 85%~98%의 상동성을 나타내며, 이들은 인간 이펙터 기능들을 가지며, 면역원성이 더욱 낮으며, 인간 항원들에 대해 높은 친화성을 나타낼 수 있다는 것이 기재되어 있다. 재조합 항체들의 생성을 위한 또다른 매우 유효한 방법이 Newman, Biotechnology, 10: 1455~1460 (1992)에 설명되어 있다.
"인간 항체"는, 임의의 알려진 표준 방법들에 의하여 생산되는 인간 경쇄 및 중쇄들 및 불변 영역들을 완전히 포함하는 항체로서 이해된다. 하기 "정의" 섹션에서 더욱 광범위하게 정의된다.
"2특이적 항체들" 또는 "2관능성 항체들"은 하기 "정의" 섹션에서 정의된다.
본 발명은 상기 항체의 항-혈관신생 활성을 실질적으로 보존하고 있는 상이한 유형들의 상기 언급된 항체들의 단편의 이용도 포함한다. "항체 단편"이라는 용어는 Fab, F(ab')2, Fab'과 같은 항체 단편들, 단일쇄 Fv 단편들 (scFv), 디아바디들(diabodies) 및 나노바디들(nanobodies)를 포함한다.
항체들의 파파인 분해는 "Fab" 단편들로서 언급되는 단일 항원 결합 자리를 각각 갖는 2 개의 동일한 항원 결합 단편들 및 쉽게 결정화되는 능력이 이름에 반영된 잔류 "Fc" 단편을 생성한다. 펩신 처리는, 2개의 항원 결합 자리를 갖고 항원에 대하여 여전히 가교될 수 있는 F(ab')2 단편을 생산한다.
"Fv"는 완전한 항원 결합 및 항원 인식 자리를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 강한 비공유결합성으로 연합된 가변성 경쇄 및 중쇄 2량체의 가변 도메인으로 이루어진다. 이러한 구조에서, 각 가변 도메인의 상기 3개의 과가변성(hypervariable) 영역들은 상호작용하여 VH-VL 2량체의 표면 상에서의 항원 결합 자리를 규정한다. 전체로서, 6개의 과가변성 영역들은 항원-항체 특이성을 항체에 부여한다. 그러나, 완전한 결합 자리보다 친화성을 덜 갖지만, 단일한 가변성 도메인만이 (또는 Fv 절반, 항원에 대해 특이적인 단지 3개의 과가변성 영역들을 포함한다) 항원 이식능 및 항원 결합능을 갖는다.
상기 Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 첫번째 불변 도메인 (CH1)도 포함한다. Fab' 단편들은, 중쇄의 도메인 Fab 단편들과, 항체 힌지(hinge) 영역의 하나 이상의 시스테인들을 포함하여, 중쇄의 도메인 CH1의 카르복시 말단에서의 몇몇 잔기들의 첨가 면에서 상이하다.
상기 "단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편들은 항체의 VH 및 VL 도메인들을 포함하며, 여기에서 이들 도메인들은 단일 폴리펩티드 사슬 중에 존재한다. 바람직하게는, 상기 Fv 폴리펩티드는 추가적으로 VH와 VL 도메인들 간의 링커 폴리펩티드를 포함하며, 이는 scFv가 항원 결합에 바람직한 구조를 형성하는 것을 가능하게 한다. scFv의 리뷰와 관련하여, Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, N.Y., pp. 269-315 (1994) 참조.
"디아바디들(diabodies)"이라는 용어는 2개의 항원 결합 자리들을 갖는 작은 항체 단편들을 의미하며, 이들 단편들은 동일한 폴리펩티드 사슬 내에서 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다 (VH-VL). 동일한 사슬 중에서 2 개의 도메인들 간의 짝짓기(pairing)가 가능하기에는 너무 짧은 링커를 이용하므로써, 도메인들이 또다른 사슬의 상보성 도메인들과 짝지어 2개의 항원 자리들을 생성하도록 강제한다. 디아바디들은 예로서, 문서 EP 404,097; WO 93/11161; 및 Hollinger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)에 보다 구체적으로 설명되어 있다.
"나노바디들"은 면역글로불린들의 중쇄의 항원 결합 영역 (VH 단편)에 의해 단독으로 형성되는 소형 크기의 독립체들(entities) (15kDa)을 나타낸다. 상기 나노바디들은 낙타과(Camelidae)의 동물들, 예컨대 낙타, 라마(llama) 및 단봉 낙타, 주로 라마; 및 상어과 동물들의 면역화 후 주로 생성되며, 이들은 천연적으로 경쇄가 없고 중쇄 가변 도메인에 의해 항원을 인식하는 항체들을 갖는 특이성을 갖는다. 그럼에도 불구하고, 이들 소스들로부터 유래된 나노바디들은 이들의 치료 적용을 위한 인간화 과정을 필요로 한다. 나노바디들을 수득하기 위한 또다른 잠재적인 공급원은, 가변 영역의 VH 및 VL 도메인들을 분리함에 의한, 상이한 인간 샘플들로부터 유래된 항체들로부터이다. 나노바디들은, 전체 항체들과 관련된 생산 비용 감소, 안정성 및 면역원성 감소와 같은 장점들을 제공한다.
다른 항체 단편들은 "정의" 섹션에서 열거된다.
본 발명에 따른 항체들은 항-혈관신생 활성을 갖는다.
본 "항혈관신생 활성"을 갖는 발현은 상기 항체들이 S100A4-유도된 혈관신생을 저해하는 능력을 의미한다. 상기 항혈관신생 활성은, 상기 항체 또는 그의 단편이 본 출원의 실시예 9에 예로서 나타낸 것과 같은 S100A4-유도된 이동 HUVEC 세포들의 이동을 차단하는 능력을 시험관 내 결정하거나 또는 본 발명의 실시예 11에 설명되는 것과 같이 S100A4를 과잉발현하는 종양 세포들의 이식으로부터 유래되는 암종들에서 종양 혈관의 형성을 차단하는 생체 내 시험으로 결정하므로써 결정될 수 있다. 본 발명에 따라, 항-S100A4 항체는 S100A4 단백질의 혈관신생 활성의 적어도 100% 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 적어도 40%, 적어도 30%, 적어도 20% 또는 적어도 10%를 차단하는 경우 항혈관신생성인 것으로 간주된다.
본 발명의 제 1 측면에 포함되는 항체 단편들은, 그들이 유래된 전체 항체 S100A4 항원에의 결합능을 보존하며, 이들은 S100A4 단백질의 혈관신생 활성을 저해하는 기능도 보유한다.
여기 사용된 것과 같은, "항-S100A4 단백질의 항-혈관신생 활성을 보존한다"라는 표현은, 완전한 항체보다 항-혈관신생 활성을 실질적으로 나타내는 항체 단편의 능력을 나타낸다. 상기 항혈관신생 활성은, 상기 항체 또는 그의 단편이 예로서 본 출원의 실시예 9에 나타낸 것과 같이 S100A4-유도된 이동 HUVEC 세포들의 이동을 차단할 수 있는 능력을 시험관 내 실험으로 결정하므로써 또는 항체가 본 발명의 실시예 11에서 설명된 것과 같이 S100A4를 과잉발현하는 종양 세포들의 이식으로부터 유래된 암종들에서 종양 혈관 형성을 차단하는 능력을 생체 내 실험으로 결정하므로서 결정될 수 있다. 종양 혈관 형성의 차단은 항체로 처리되지 않은 동물들과 비교하여 미세혈관들의 수에서의 감소로서 측정될 수 있거나 또는 항체로 처리되지 않은 동물들과 비교하여 미세혈관들의 밀도에서의 감소로서 측정될 수 있다. 항체 단편은, 항체 활성의 적어도 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% 또는 50%를 나타내는 경우, 그 항체의 항-혈관신생 활성을 보존하는 것이다.
본 발명에 유용한 항체들은 S100A4 단백질에 특이적이어야만 한다. 상기 "특이적"이라는 용어는 S100A4 단백질에 특이적으로 결합하지만 S100 과의 다른 단백질들에는 결합하지 않는 항체들의 능력을 의미한다.
원하는 특이성을 갖는 항체들을 확인하기 위하여, 면역화학적 분석, 예컨대 면역형광, 유세포 분석(flow cytometry), 웨스턴 블롯 및 ELISA 분석, 방사선면역측정, 면역조직화학적 분석, 면역침강 또는 당 기술분야에 알려진 기타 면역화학적 분석들이 사용될 수 있다. 경쟁적 결합 또는 면역방사계수측정(immunoradiometric) 분석법에 대한 다수의 프로토콜들이 당 기술분야에 알려져 있다. 상기 면역분석법은 S100A4 단백질의 항체 및 면역원간의 복합체 형성을 측정하는 것을 전형적으로 포함한다.
본 발명의 제 1 측면에 따른 상기 항체 또는 그의 단편은 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택된다:
(i) 서열 ELPSFLGKRT (서열번호: 3)을 포함하는 S100A4의 에피토프를 인식하는 항체,
(ii) 서열 EGFPDKQPRKK (서열번호: 24)를 포함하는 S100A4의 에피토프를 인식하는 항체 및
(iii) 하이브리도마 ECACC 11051804에 의해 생산되는 항체.
상기 "S100A4의 에피토프를 인식하는 항체"라는 표현은, 상기 항체가 이 서열을 포함하지 않는 다른 에피토프들에 실질적인 결합을 나타내지 않으면서 이 에피토프에는 특이적인 결합을 나타낼 수 있음을 나타낸다. 항체가 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는지의 여부를 결정하기 위한 적당한 방법들은 본 발명의 실시예 14에 나타내었으며, 여기에서 타겟 단백질의 완전한 서열을 나타내는 펩티드들은 상기 항체 또는 그의 단편에 대하여 시험된다. 항체가 상기 에피토프의 서열을 포함하지 않는 펩티드에 대해서보다 상기 에피토프의 서열을 포함하는 펩티드에 대하여 실질적으로 더욱 높은 친화성으로 결합하는 경우, 그 에피토프에 특이적으로 결합하는 것으로 간주된다. 본 명세서에서 사용된 "실질적으로 더욱 높은 친화성"이라는 표현은, 의도된 측정 기기 또는 방법을 이용하여 검출한 경우 다른 아미노산 서열의 수준에 대해 구분가능한 특정 아미노산 서열에 대한 친화성 수준을 의미한다. 바람직하게는, 항체 및 상기 에피토프를 포함하는 펩티드간의 결합 친화성은, 항체와 상기 에피토프 서열을 포함하지 않는 펩티드간의 결합 친화성보다 적어도 10배 이상, 적어도 100배 이상, 적어도 1000배 이상, 적어도 10000배 이상, 적어도 100000배 이상, 적어도 1000000배 이상으로 높다. 실질적으로 높은 친화성을 갖는 결합의 결합상수 (association constant)(Ka)는 예로서, 적어도 107M-1, 바람직하게는 적어도 108M-1, 및 보다 바람직하게는 적어도 109M-1 이하이다.
"S100A4"라는 표현은 하기 "정의" 섹션에서 정의된다. 상기 표현은 단백질의 기능성이 유지되는 한, 생리학적으로 관련된 번역 후 모든 화학적 변경 형태들, 예로서 글리코실화, 포스포릴화 또는 아세틸화 등도 포함한다. 상기 표현은 이에 제한되지는 않지만, 사육 및 농장 동물들(소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 또는 설치류), 영장류 및 인간들을 포함하는 임의의 포유동물 종들의 S100A4를 포괄한다. 바람직하게는, S100A4는 인간이다.
본 발명의 제 1의 측면은 S100A4의 기능적으로 균등한 변형물들의 이용을 고려한다. 본 명세서에 사용된 것과 같은, "S100A4의 기능적으로 균등한 변형물"은 S100A4와 관련하여 본 발명에서 설명된 혈관신생 기능을, 시험관 내 및 생체 내 모두에서, S100A4와 공유하며, 아미노산 서열에서의 최소 동일성(identity)을 갖는, 임의의 분자로서 이해된다. S100A4의 변형체들은 천연 및 인공 모두일 수 있다.
"천연 변형물"이라는 표현은 다른 종들에서 자연적으로 존재하는 상기 언급된 인간 S100A4의 모든 변형물들, 즉 S100A4 오솔로그들(orthologs)을 의미한다. 상기 천연 변형물들은 이에 제한되지는 않지만, 기탁번호 DAA31755.1 (2010.5.21판)을 갖는 예측된(predicted) 서열에 대응하는 소의 S100A4; 기탁번호 NP_036750.1 (2011.4.10 판)을 갖는 예측된 서열에 대응하는 쥐들의 S100A4; 기탁번호 NP_035441.1 (2011.5.29 판)을 갖는 예측된 서열에 대응하는 마우스들의 S100A4; 기탁번호 NP_001003161.1 (2011.2.19 판)을 갖는 예측된 서열에 대응하는 개들의 S100A4을 포함한다. 본 발명의 제 1 측면에서의 사용에 적당한 S100A4의 천연 변형물들은 하나 이상의 아미노산들의 삽입, 치환 또는 결실에 의하여 상기 서열들로부터 유래될 수도 있으며, 천연 대립유전자들, 대안적인 과정으로부터 초래하는 변형물들 및 자연에 존재하는 분비 및 절단(truncated) 형태들을 포함한다.
본 발명에서 사용될 수 있는 S100A4는, 천연유래 S100A4와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 경우, 천연 서열일 수 있다. 이러한 천연 서열의 폴리펩티드들은 자연으로부터 분리될 수 있거나 또는 재조합 및/또는 합성 수단에 의해 생산될 수 있다. 따라서, 본 발명의 S100A4는, S100A4를 암호화하는(encoding) 폴리뉴클레오티드 또는 이의 기능적으로 균등한 변형물의 이종성(heterologous) 생물, 예컨대 세균, 효모 또는 벌레 또는 포유동물 세포에서의 발현에 의해 수득된 재조합 단백질일 수 있다. 상기 재조합 단백질은 이후의 정제를 용이하게 하는 히스티딘들의 아미노-말단 테일(tail)을 갖는 융합 단백질로서 수득될 수 있다. 상기 단백질들의 발현 및 정제는 당업자에게 알려진 방법들 및 당 기술수준에서 설명되는 바에 따라 수행될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 상기 S100A4는 인간 기원으로, 바람직하게는 서열번호: 21의 서열이다. 또다른 바람직한 구체예에서, S100A4는, 서열번호: 25의 서열로, 3개의 추가적인 아미노산들의 아미노-말단 테일을 갖는 인간 S100A4의 서열을 포함하는 융합 단백질의 발현으로부터 유래한다.
서열번호: 25
1 GSHMACPLEK ALDVMVSTFH KYSGKEGDKF KLNKSELKEL LTRELPSFLG KRTDEAAFQK
61 LMSNLDSNRD NEVDFQEYCV FLSCIAMMCN EFFEGFPDKQ PRKK
다르게는, 상기 S100A4는 재조합 및/또는 합성 수단들에 의하여 수득할 수 있는 S100A4의 기능적으로 균등한 인공 변형물일 수 있다.
상기 "변형물"이라는 용어에 대해서는 하기 "정의" 섹션에서 더욱 상세한 정보를 찾을 수 있다.
본 발명의 제 1 측면에서 고려되는 S100A4의 변형물들은 제한없이, 하기와 같은 S100A4의 적어도 하나의 기능들을 나타낸다:
- MMP9 기질 메탈로프로테이나아제(metalloproteinase) 작용의 활성화능, 이는 본 발명의 실시예 8에 설명된 방법에 의하여 결정될 수 있음.
- 내피 세포 이동의 유도능, 이는 본 발명의 실시예 9에 설명된 방법에 의하여 결정될 수 있음.
- 누드 마우스에서 종양 발달 유도능, 이는 본 발명의 실시예 10에 설명된 방법에 의하여 결정될 수 있음.
- 혈관신생능 또는 종양 미세혈관 형성능, 이는 본 출원의 실시예 11에 설명된 방법에 의하여 결정될 수 있음.
- IL8의 분비에 의해 매개되는 단핵구들에서 염증성 반응의 유도능, 본 출원의 실시예 16에 설명된 방법에 의하여 결정될 수 있음.
추가적으로, 본 발명의 제 1 측면에서 고려되는 S100A4의 기능적으로 균등한 변형물들은, 상기 언급된 S100A4의 상이한 천연 변형물들과 적어도 60%, 65%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% 유사성 또는 동일성을 나타내는 폴리펩티드들을 포함한다. 2개의 폴리펩티드들 간의 동일성 정도는, 당업자에게 널리 알려진 컴퓨터 및 방법들에서 실시되는 알고리즘(algorithm)들을 이용하여 결정된다. 2 아미노산 서열들 간의 동일성은 바람직하게는 BLASTP 알고리즘을 이용하여 결정된다 (BLAST Manual, Altschul, S. 등, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., 등, J., 1990, Mol. Biol. 215:403-410). 동일성 정도를 계산하기 위한 방법은 하기 "정의" 섹션에서 나타내었다.
상기 "항체의 항-혈관신생 활성을 실질적으로 보존한다"는 표현은 본 발명의 제 1 측면의 항체가 항-혈관신생 활성을 완전하게 소실할 수 없음을 의미한다.
일반적으로, 본 발명의 항체의 아미노산 서열에서의 변경들도 고려된다. 예로서, 상기 항체의 결합 친화성 및/또는 기타 생물학적 성질들을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열들의 변형물들은 상기 항체를 암호화하는 핵산에 적당한 뉴클레오티드 변화들을 도입하거나, 또는 펩티드 합성에 의하여 제조된다. 상기 변경들은 예로서, 항체의 아미노산 서열들에서 잔기들의 제거 및/또는 삽입들 및/또는 치환들을 포함한다. 제거, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 수행하여 최종 구축물을 달성하며, 단 상기 최종 구축물은 상기 단백질의 원하는 특징들, 즉 S100A4 결합 특이성 및 안타고니스트(antagonist) 항-혈관신생 활성을 갖는다. 아미노산들에서의 변화들은, 글리코실화 자리들의 수 또는 위치를 변경시키는 것과 같이, 항체의 번역 후 과정들을 변경시킬 수도 있다.
아미노산 서열에서의 일부 삽입들은, 하나의 잔기에서 백 이상의 잔기들을 포함하는 폴리펩티드에 이르기까지 길이 면에서 변화하는 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단 융합물들 및 하나 또는 수 개의 아미노산 잔기들의 서열 내에서의 삽입물들을 포함한다. 말단 삽입물들의 일부 예들은 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체, 또는 세포독성 폴리펩티드에 융합된 항체를 포함한다. 상기 항체 분자의 삽입에 의한 다른 변형물들은 효소의 항체의 N- 또는 C-말단을 갖는 융합물 또는 항체의 혈청을 증가시키는 폴리펩티드를 포함한다.
또다른 유형의 변형물은 아미노산 치환에 의한 변형물이다. 이들 변형물들은 상이한 잔기로 치환된 항체의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 갖는다. 항체 치환에 의한 돌연변이유발(mutagenesis)에 대한 주요 관심을 끄는 자리들은 과가변성 영역들을 포함하지만, FR에서의 변경들도 고려된다.
본 발명의 문맥에서, "항원"이라는 표현은 S100A4를 의미한다.
본 발명의 제 1 측면의 특이적 항-S100A4 항체는 항원 S100A4의 에피토프를 인식한다. 본 발명자들은 본 발명의 항-혈관신생 항체들이 S100A4의 서열 ELPSFLGKRT (서열번호: 3) 또는 서열 EGFPDKQPRKK (서열번호: 24)에 의해 규정되 영역 내에 포함된 에피토프들을 인식한다는 것을 발견하였다. 따라서, 바람직한 구체예에서, 상기 항체는 서열 ELPSFLGKRT (서열번호: 3)를 포함하는 S100A4의 에피토프를 인식한다. 또다른 바람직한 구체예에서, 상기 항체는 서열 EGFPDKQPRKK (서열번호: 24)을 포함하는 S100A4의 에피토프를 인식한다.
"에피토프를 인식한다"라는 표현은, 항체가 하기 "정의" 섹션에서 정의되는 것과 같은 에피토프에 결합할 수 있음을 의미한다. 상기 에피토프는 전체 서열 ELPSFLGKRT (서열번호: 3) 또는 EGFPDKQPRKK (서열번호: 24) 또는 상기 서열들의 일부 아미노산들에 의해 형성될 수 있다.
본 발명의 제 1 측면의 특이적 항-S100A4 항체는 상기 정의되고 하기 "정의" 섹션에서 정의되는 것과 같은 모노크로날 항체일 수도 있다. 따라서, 바람직한 구체예에서, 본 발명의 제 1 측면의 특이적 항-S100A4 항체 또는 그의 단편은 모노클로날 항체이다.
본 발명은 상이한 하이브리도마 세포주들에 의해 생산되는 모노클로날 항체들을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 특허청구범위 제 2항에 따른 특이적 항-S100A4 항체 또는 그의 단편은 ECACC 10022401, ECACC 11051801, ECACC 11051802, ECACC 11051803 및 ECACC 11051804 또는 이의 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하이브리도마에 의해 생산된다.
본 발명의 문맥에서, "하이브리드 세포" 또는 "하이브리도마"는 단일의 독특한 줄기 세포 및 골수종 세포의 자손인 B-세포 클론 융합 생성물로서 이해된다. 특이적으로, 본 발명의 제 1측면의 모노클로날 항체들은 본 명세서의 실험 부분에서, 본 발명자들에 의해 생성되고 각각 5C3-1B8-1F4, 6B9-1E8-2A8, 5A3-4A6-5B6, 1E2-2H4-2G8 및 8B6-2F6-1H9-1H10로서 확인되는 하이브리도마들로부터 수득된, 5C3, 6B9, 5A3, 1E2 및 8B6로서 언급된 항-S100A4 모노클로날 항체들에 대응한다. 상기 하이브리도마들은, 본 특허출원 신청 전, Porton Down, Salisbury, SP4 OJG, 영국 소재의 미생물 기탁의 국제적 승인(International Recognition of the Deposit of Microorganisms)에 대한 1977.4.28자 부다페스트 조약(Budapest Treaty)에 따르는 목적에 대해 법적으로 승인된 기관인 European Collection of Cell Cultures (ECACC)에 기탁되었다.
기탁자들은 Francesc Mitjans 및 Marc Masa from Leitat Technological Center (주소: Baldiri Reixach 15-21 Helix Building, Barcelona, 08028, Spain)이다.
상기 European Collection of Cell Cultures (ECACC)는 하이브리도마들 5C3-1B8-1F4, 6B9-1E8-2A8, 5A3-4A6-5B6, 1E2-2H4-2G8 및 8B6-2F6-1H9-1H10 각각에, 개별적인 기탁 번호 ECACC 10022401, ECACC 11051801, ECACC 11051802, ECACC 11051803 및 ECACC 11051804를 부여하였다. 본 발명의 항-S100A4 모노클로날 항체들을 수득가능하게 하는 상기 하이브라도마주들의 배양 조건은 본 발명의 모노클로날 항체들의 수득 방법이라는 맥락에서 설명된다.
본 명세서에서, 하이브리도마들 5C3-1B8-1F4, 6B9-1E8-2A8, 5A3-4A6-5B6, 1E2-2H4-2G8 및 8B6-2F6-1H9-1H10 및 상기 하이브리도마들에 의해 생산되는 항체들은 이들의 약어 5C3, 6B9, 5A3, 1E2 및 8B6로 각각 표시된다.
본 발명은 또한, S100A4에 대한 결합능 및 항-혈관신생능을 유지하는 본 발명의 제 1 측면의 상기 특이적인 항-S100A4 모노클로날 항체들의 단편들도 고려한다. 결합능은, 본 발명의 실시예 5, 6 및 7에 설명된 것과 같은, ELISA 또는 웨스턴 블롯과 같이 당업자에 의해 알려진 방법들을 통하여 확인될 수 있다. 항-혈관신생능을 유지하는 능력은, 본 발명의 실시예 9에 설명된 것과 같이, 당업자에 의해 알려진 방법들을 통하여 확인될 수 있다.
상기 "단편"이라 함은, S100A4에 대한 결합능을 유지하는 상기 언급된 모노클로날 항체의 아미노산 서열의 하나 또는 몇몇 부분들에 대응하는 항체 서열의 단편을 의미하며, 따라서 상기 폴리펩티드는 6 CDR 영역들의 서열을 포함하여야만 하며, 이는 본 발명의 제 1 측면의 맥락에서 정의된 항체들, 예컨대 제한없이 유전공학 처리된 항체들 예컨대 키메라 항체들, 인간화 항체 및 2특이적 항체들을 수득하는데 사용될 수 있다. 상기 "단편"은 Fab, F(ab')2, Fab', 단일쇄 Fv 단편들 (scFv), 디아바디들 또는 나노바디들과 같은 항체 단편들을 수득하는데 사용될 수도 있다. 추가적으로, 단편들은 혈관신생을 차단하는 능력을 유지한다.
상기 Fab 및 F(ab')2 단편들은 본 발명의 제 1측면의 온전한 모노클로날 항체들의 효소 또는 화학적 절개를 통하여 수득될 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체의 파파인 분해는 각각 하나의 항원 결합 자리를 갖는, "Fab" 단편으로서 언급되는 2개의 동일한 항원 결합 단편들을 생산한다. 다음으로, "F(ab')2" 단편은 2개의 항원 결합 자리들을 갖고, 펩신 처리에 의해 수득된다.
추가적으로, 상기 "단편"은 유전공학 기술에 의하여, Fab 단편들, 단일쇄 Fv 단편들(scFv) 또는 디아바디들과 같은 또다른 유형의 항체 단편들의 수득을 가능하게 한다.
바람직한 구체예에서, 특이적 항-S100A4 항체 또는 그의 단편은 하이브리도마 ECACC 10022401에 의해 생산된다.
본 발명은 서열번호: 1을 포함하는 분리된(isolated) 아미노산 서열을 제공한다. 이 아미노산 서열은 S100A4에 대항하는 모노클로날 항체의 가변영역의 경쇄의 FRs 및 CDRs을 포함한다. 특히, 가변영역의 경쇄의 서열들 및 FRs 및 CDRs 각각은 다음과 같다:
Figure pct00001
본 발명은 서열번호: 2를 포함하는 분리된 아미노산 서열을 제공한다. 이 아미노산 서열은 인간 또는 쥐과의 S100A4에 대항하는 모노클로날 항체의 가변영역의 중쇄의 FRs 및 CDRs을 포괄한다. 구체적으로, 가변영역의 중쇄 서열 및 FRs 및 CDRs 각각은 다음과 같다:
Figure pct00002
상기 서열들은 하이브리도마 ECACC 10022401에 의해 생산된 항체에 대응된다. 따라서, 바람직한 구체예에서, 상기 항체 또는 그의 단편은, 항-혈관신생 활성을 실질적으로 유지하며, 서열번호: 1의 서열을 포함하는 적어도 하나의 VL 영역 및 서열번호: 2의 서열 또는 기능적으로 균등한 그의 변형체를 포함하는 적어도 하나의 VH 영역을 포함한다.
상기 "VL 영역"이라는 표현은, 항체의 경쇄의 가변영역을 의미하는 한편; "상기 "VH 영역"이라는 표현은, 항체의 중쇄의 가변영역을 의미한다.
상기 "항-혈관신생 활성을 실질적으로 유지하는 기능적으로 균등한 그의 변형물"이라는 표현은, 시험관 내 및 생체 내 모두에서, 본 발명의 항체와 항-혈관신생 기능을 공유하고, 최소의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 임의의 분자를 의미한다. 본 발명의 항체들의 기능적으로 균등한 변형물들은 하나 이상의 아미노산들의 삽입, 치환 또는 결실을 통하여 상기 서열들로부터 유래될 수 있으며, 재조합 및/또는 합성 수단에 의하여 수득될 수 있다.
본 발명의 항체들의 기능적으로 균등한 변형물들은 S100A4 항원에 그들의 결합능 및 S100A4 단백질의 혈관신생 기능 저해능을 보존하여야만 한다. 상기 기능은 당업자에게 알려진 방법들을 통하여 확인될 수 있으며, 예로서 본 발명의 실시예 9에 설명된 것과 같은 VEGF 및 S100A4를 이용한 내피 이동 분석을 통하여 확인될 수 있다.
본 발명의 항체들의 기능적으로 균등한 변형물들은, 앞서 언급된 폴리펩티드 서열들과 적어도 60%, 65%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% 동일성을 나타내는 폴리펩티드; 바람직하게는 적어도 90% 동일성을 나타내는 폴리펩티드이다. 2개의 폴리펩티드들간의 동일성 정도는, 당업자에게 널리 알려진 컴퓨터 상에서 실행되는 알고리즘들 및 방법들을 이용하여 결정된다. 두 아미노산 서열들 간의 동일성은 바람직하게는 BLASTP 알고리즘 (BLAST Manual, Altschul, S. 등, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., 등, J., 1990, Mol. Biol. 215:403-410)을 이용하여 결정된다. 동일성 정도는, 하기 "정의" 섹션에서 설명되는 방법에 따라 계산된다.
본 발명은 서열번호: 3을 포함하는 분리된 아미노산 서열을 제공한다. 이러한 아미노산은 인간 또는 쥐과의 S100A4의 에피토프 또는 항원 결정인자에 대응한다.
서열번호: 3 ELPSFLGKRT
본 발명의 한 구체예에서, 서열번호: 3을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편이 제공된다.
본 발명의 한 구체예에서, 서열번호:3을 포함하는 폴리펩티드로 포유동물을 면역화하므로써 생산되는 인간 또는 쥐과의 S100A4 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편이 제공된다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 항체 또는 그의 단편은 인간 항체 또는 그의 단편; 인간화 항체 또는 그의 단편; 폴리클로날 항체 또는 그의 단편; 모노클로날 항체 또는 그의 단편; Fab 항체; 및 키메라 항체 또는 그의 단편으로부터 선택된다.
본 발명의 한 구체예에서, 서열번호: 1을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 모노클로날 항체가 제공된다.
본 발명의 한 구체예에서, 서열번호: 2를 포함하는 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 모노클로날 항체가 제공된다.
본 발명의 한 구체예에서, 프레임워크 영역들(FRs) 및 상보성 결정 영역 (CDRs)을 포함하는 모노클로날 항체가 제공되며, 상기 모노클로날 항체는 서열번호: 1을 포함하는 경쇄 및 서열번호: 2를 포함하는 중쇄를 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 모노클로날 항체는 인간 항체; 인간화 항체; 및 키메라 항체 또는 그의 단편으로부터 선택된다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 모노클로날 항체는:
a) 인간 또는 쥐과의 S100A4 단백질과만 반응하거나; 또는
b) 인간 또는 쥐과의 S100A4 단백질의 작용 메커니즘을 차단하거나; 또는
c) 인간 또는 쥐과의 S100A4 단백질의 시험관 내 또는 생체 내 기능적 활성을 차단하거나; 또는
d) 인간 또는 쥐과의 S100A4 단백질에 의해 또는 내피 세포에서 VEGF와 조합된 인간 또는 쥐과의 S100A4 단백질에 의해 유도되는 친이동성(promigratory) 효과를 차단하거나; 또는
e) 종양 성장을 차단하거나; 또는
f) 종양 발생을 차단하거나; 또는
g) 종양 혈관신생을 차단하거나; 또는
h) 세포적 유포 및 전이 수립을 차단하거나; 또는
i) 염증성 과정들을 차단하거나; 또는
j) 암 줄기 세포들을 차단하거나; 또는
k) 상기 a) 내지 j)의 임의의 조합이다.
본 발명의 한 구체예에서, 서열번호: 1 및 서열번호: 2를 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 단편이 제공되며, 여기에서 상기 항체 또는 단편은 1가 또는 2가이다. 본 발명은 나아가, 본 명세서에서 제시된 임의의 하나의 구체예들에 따른 모노클로날 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포주를 제공한다.
본 발명은, 또한 European Collection of Cell Cultures (ECACC)에 기탁번호 10022401 하에 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 수득가능한 모노클로날 항체를 제공한다.
본 발명의 한 구체예에서, 모노클로날 항체의 가변영역의 경쇄의 FRs 및 CDRs를 코딩하는 서열번호: 4를 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
서열번호: 4
1 GATGTTTTGA TGACCCAAAC TCCACTCTCC CTGCCTGTCA GTCTTGGAGA TCAAGCCTCC
61 ATCTCTTGCA GATCTAGTCA GAGTATTGTA CATAGTAATG GAAACACCTA TTTAGAATGG
121 TACCTGCAGA AAACAGGCCA GTCTCCAGAG CTCCTGATCT ACAAAGTTTC CAACCGACTC
181 TCTGGGGTCC CAGACAGGTT CAGTGGCAGT GGATCAGGGA CAGATTTCAC ACTCAAGATC
241 AGCAGAGTGG AGGCTGAGGA TCTGGGAGTT TATTACTGCT TTCAAGGTTC ACATGTTCCA
301 TTCACGTTCG GCTCGGGGAC AAAGTTGGAA ATAAAA
본 발명의 한 구체예에서, 모노클로날 항체의 가변영역의 중쇄의 FRs 및 CDRs를 코딩하는 서열번호: 5를 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
서열번호: 5
1 GAGGCTCAGC TGCAGCAGTC TGGGGCAGAG CTTGTGAAGC CAGGGGCCTC TGTCAAGTTG
61 TCCTGCACAG CCTCTGGCTT CAACATTCAA GAGACCTATA TGCACTGGGT GAAGCAGAGG
121 CCTGAACAGG GCCTGGAGTG GATTGGAAGG ATTGATCCTG CGAATGGTAA TACCAAAGAT
181 GACCCGAAGT TCCAGGGCAA GGCCTCTATA ACAGTAGACA CATCCTCCAA CACAGCCTAC
241 CTGCAGCTCA GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC ACTGCCGTCT ATTACTGTGC TTCAAGTTAT
301 GCTATGGACT ACTGGGGTCA AGGAACCTCA GTCACCGTCT CCTCA
본 발명의 한 구체예에서, 인간 S100A4 단백질의 에피토프 영역을 코딩하는 서열번호: 6을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
서열번호: 6 GAGCTGCCCAGCTTCTTGGGGAAAAGGACA
또다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 특이적 항-S100A4 항체 또는 그의 단편은 하이브리도마 ECACC 11051801에 의해 생산된다.
또다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 특이적 항-S100A4 항체 또는 그의 단편은 하이브리도마 ECACC 11051802에 의해 생산된다.
또다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 특이적 항-S100A4 항체 또는 그의 단편은 하이브리도마 ECACC 11051803에 의해 생산된다.
또다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 특이적 항-S100A4 항체 또는 그의 단편은 하이브리도마 ECACC 11051804에 의해 생산되는 항체이다.
본 발명의 제 1 측면의 모노클로날 항체들은 인간 내피 세포들의 이동 능을 정지시킬 수 있음을 증명하였다. 따라서, 특정 구체예에서, 본 발명은 인간 내피 세포들의 이동능을 정지시킬 수 있는 상기 항체의 항-혈관신생 활성을 실질적으로 보존하는, 항-혈관신생 활성을 갖는 특이적 항-S100A4 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
상기 "인간 내피 세포들의 이동능을 정지"시킨다는 표현은 적어도 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%; 바람직하게는 적어도 20%; 더욱 바람직하게는 적어도 30%; 더욱 바람직하게는 적어도 45%로 상기 세포의 이동능을 저해하는 것으로 이해된다. 상기 이동능의 저해 또는 이동의 저해는 본 발명의 실시예 9에 설명된 분석들에 의해 평가될 수 있다.
상기 "인간 내피 세포들의 이동능"이라는 표현은 신생혈관(neovasculature) 형성에서의 주요 단계인, 상기 세포들이 이동하는 능력을 의미한다. 인간 내피 세포들은 포유동물 생물의 모든 혈관 내층에 대어져 있는(lining) 세포들이다. 상기 정의에 포함되는 인간 내피 세포들은, 이에 제한되지는 않지만, 인간 태정맥 내피세포들 (HUVECs)이다. 바람직한 구체예에서, 상기 인간 내피 세포들은 HUVECs 세포들이다.
하이브리도마 세포주들 및 본 발명의 모노클로날 항체들의 수득방법
또다른 측면에서, 본 발명은, 상기 항체의 생산을 가능하게 하는 조건 하에서, 기탁번호 ECACC 10022401, ECACC 11051801, ECACC 11051802, ECACC 11051803 및 ECACC 11051804로 기탁된 이들 세포주들로부터 선택된 하이브리도마 세포주를 배양하는 것을 포함하는 본 발명의 제 1 측면에 따른 모노클로날 항체의 수득방법에 관한 것이다.
본 발명의 제 1 측면의 모노클로날 항체들의 수득방법은 당 기술 수준에서 알려진 기존 방법들에 따라 수행될 수 있다. 기본적으로, 상기 방법은 하이브리도마 세포들이 항체들을 생산하고 그들을 매질 내로 분비하는데 적당한 배양 매질 중에서 하이브리도마 세포주를 배양하고, 이어서 생산된 모노클로날 항체들을 포함하는 배양 매질의 상등액을 모으는 것으로 이루어진다. 상기 항체들은 기존의 방법들, 예컨대 친화성 크로마토그래피, 단백질 A 세파로오스(sepharose), 히드록시 아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동 또는 투석에 의하여 임의로 정제될 수 있다.
"모노클로날 항체"라는 용어는 이전에 이미 정의되었다
하이브리도마 세포주를 "배양"한다는 표현은 배양 바이알들(vials) 중 적당한 매질 존재 하에서, 하이브리도마 세포들을 적당한 시간 동안, 상기 세포들의 증식 및 본 발명의 모노클로날 항체들의 생산이 일어나기에 적당한 조건 하에 인큐베이션하는 것으로서 이해된다. 상기 배양은 상이한 조성들을 갖는 배양 매질의 이용을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 첫번째 단계에서, 세포들은 그들의 증식을 선호하는 혈청을 함유한 매질 중에서 배양되고, 상기 세포들을 수집 및 그들을 세척한 후, 무혈청 매질 중에서 이들을 배양하여 항체들을 수득한다. 이 방법에 따른 항체들을 수득하는데 적당한 배양 매질은, 제한없이, 세포 증식에 유리한 L-글루타민 및 우태아혈청으로 보충된 DMEM/F12 및 항체 수집 매질로서 L-글루타민으로 보충되었으나 우태아혈청은 결여한 DMEM/F12 매질("무단백 매질")에 기초한 혼합물이다. 항체들을 생산하기 위한 매질은 합성 세포 배양 매질들의 임의의 매질 또는 혼합물로 이루어질 수도 있으며, 그의 조성 및 이후의 보충은 단백질을 포함하지 않거나("무단백 매질") 또는 상기 단백질들이 매우 낮은 비율로 존재하며("무혈청 매질" 또는 "저단백 매질"), 이들은 면역글로불린들의 군에 속하지 않는다. 상기 매질은 세포 성장 및 유지의 허용 뿐만 아니라 우태아혈청 부재 하에서 성장하도록 미리 순응된 하이브리도마 세포주에 의한 항체들의 분비도 가능하게 하여야만 한다. 바람직한 구체예에서, 상기 세포들의 배양에 적당한 매질은 DMEM/F12 및 L-글루타민을 포함하는 매질이다. 상기 배양이 수행되는 조건은 바람직하게는 습한 환경으로, 37℃ 온도에서 표준 공기 분위기 또는 5% CO2 풍부화된 공기를 이용한다.
따라서, 본 발명의 또다른 측면은 기탁번호 ECACC 10022401, ECACC 11051801, ECACC 11051802, ECACC 11051803 및 ECACC 11051804로 기탁된 세포주로 이루어지는 군으로부터 선택된 하이브리도마 세포주에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 세포주는 기탁번호 ECACC 10022401의 세포주이다. 또다른 구체예에서, 하이브리도마 세포주는 기탁번호 ECACC 11051801, ECACC 11051802, ECACC 11051803 및 ECACC 11051804로 기탁된 세포주로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
"하이브리도마 세포주"라는 표현은, 본 발명의 제 1 측면에서 앞서 정의된 것과 같은 하이브리드 세포들 또는 하이브리도마들에 의해 형성된 세포주를 의미한다. 상기 하이브리도마 세포주는 본 발명의 실시예 4에서 설명된 것과 같은 표준 방법론에 의하여 수득된다. 간략하게는, 마우스들을 인간 재조합 S100A4 단백질으로 면역화하였고, 세포들을 PEG-1500과 같은 융합 유도자 존재 하에서 골수종 세포들과 융합된 면역화된 마우스의 비장으로부터 추출하였다. 상기 하이브리도마들을 HAT 매질 중에서 선택하고, 선택된 각 클론을 희석을 제한하므로써 부클론화하였다(subclone). 확장(expansion)에 적당한 클론들을 DMEM/F12 매질에 적합화하고 동결시켰으며, 이들은 하이브리도마 세포주들 ECACC 10022401, ECACC 11051801, ECACC 11051802, ECACC 11051803 및 ECACC 11051804를 구성한다.
본 발명의 바람직한 구체예들에서, 이 방법에 의해 제조된 상기 모노클로날 항체는 본 발명의 맥락에서 설명되는 하이브리도마 세포주들에 의해 생산되는 임의의 것일 수 있다.
본 발명은 여기 제시된 임의의 하나의 구체예들에 따른 모노클로날 항체의 제조 방법을 더욱 제공하며, 상기 방법은 다음 단계들을 포함한다:
(i) 정제된 인간 또는 쥐과의 S100A4 단백질로, 또는 항원에 대한 면역반응을 유도하는데 효과적인 약제와 조합된 정제된 인간 또는 쥐과의 S100A4 단백질로 마우스를 면역화하는 단계;
(ii) 하나 이상의 하이브리도마 세포들을 생산하는 단계,
(iii) 하나 이상의 세포들을 선택하는 단계로, 그의 상등액은:
a) 인간 또는 쥐과의 S100A4 단백질과만 반응하거나; 또는
b) 인간 또는 쥐과의 S100A4 단백질의 작용 메커니즘을 차단하거나;
c) 인간 또는 쥐과의 S100A4 단백질의 시험관 내 또는 생체 내 기능 활성을 차단하거나; 또는
d) 인간 또는 쥐과의 S100A4 단백질에 의해 또는 내피 세포들 중 VEGF와 조합된 인간 또는 쥐과의 S100A4 단백질에 의해 유도되는 친이동성 효과를 차단하거나; 또는
e) 종양 성장을 차단하거나; 또는
f) 종양 발생을 차단하거나; 또는
g) 종양 혈관신생을 차단하거나; 또는
h) 세포적 유포 및 전이 수립을 차단하거나; 또는
i) 염증성 과정들을 차단하거나; 또는
j) 암 줄기 세포들을 차단하거나; 또는
k) 상기 a) 내지 j)의 임의의 조합.
(iv) 상기 단계 iii)의 선택된 세포들 중 하나로부터 특이적 세포주를 생산하는 단계; 및
(v) 상기 세포주로부터 모노클로날 항체를 분리하는 단계.
본 발명의 특이적 항-S100A4 항체들을 포함하는 약학 조성물들
또다른 측면에서, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 본 발명의 제 1 측면에 따른 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 제 1 측면에 따른 항체는 ECACC 10022401, ECACC 11051801, ECACC11051802, ECACC 11051803 및 ECACC 11051804 또는 그의 단편의 군으로부터 선택되는 하이브리도마에 의해 생산되며; 바람직하게는 ECACC 10022401에 의해 생산된다.
본 발명에서 사용된 것과 같이, "약학 조성물"이라는 표현은, S100A4 단백질의 과잉발현이 있는 하나의 세포, 세포들의 군, 기관, 조직 또는 동물에, 예정된 투여량의 하나 이상의 치료적으로 유용한 약제들을 투여하기에 적합화된 제제를 의미한다.
"약학적으로 유효한 양"은 치료효과를 제공할 수 있는, 일반적으로 사용되는 방법으로써 당업자에 의해 결정될 수 있는 양으로서 이해된다.
본 발명의 조성물들은 본 발명의 제 1 측면에 따른 하나 이상의 항체들 또는 상기 항체의 항-혈관신생 활성을 실질적으로 보존하는 그의 하나 이상의 단편들을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물들은 S100A4 단백질의 과잉발현이 일어나는 병상들, 예컨대 암 또는 염증 관련 질병들의 예방 및/또는 치료를 위한 하나 또는 몇몇 추가적인 화합물들도 포함할 수 있다. 세포독성제들, 항혈관신생제들, 항전이제들 또는 소염제들과 같은 상기 추가적인 화합물들은 모노클로날 항체들에 관계없이 독립체들로서 약학조성물의 일부를 형성할 수 있거나 또는 상기 항체들과의 접합물들을 형성할 수 있다.
약학 조성물들은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제들을 이용하여 통상적인 방법들에 의하여 제조된다.
"약학적으로 허용가능한 부형제"라는 표현은 활성 성분을 포함하기 위하여 사용되는 치료적으로 비활성인 성분으로, 이는 약물학적/독성학적 관점에서 환자에게 허용가능하고, 조성, 제형, 안정성, 환자에의 용인 및 생체이용성과 관련하여 물리적/화학적 관점에서 그를 제조하는 약물화학자에게 허용되는 것으로 이해된다.
약학적으로 허용가능한 부형제들의 수 및 성질은 원하는 투여량 형태에 따라 달라진다. 상기 약학적으로 허용가능한 부형제들은 당업자에게 알려져 있다 (Fauli y Trillo C. (1993) "Tratado de Farmacia Galenica", Luzn 5, S.A. Ediciones, Madrid). 상기 조성물들은 당 기술분야에서 알려진 통상의 방법들에 의하여 제조될 수 있다("Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20째 판, (2003) Genaro A.R., ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, US).
본 발명의 약학 조성물들은 임의의 유형의 적당한 경로, 예컨대 경구 경로, 국소 경로, 흡입 또는 비경구 경로에 의해 투여되어 원하는 투약 형태의 제형에 요구되는 약학적으로 허용가능한 부형제들이 포함될 것이다. 약학 조성물의 바람직한 투여 경로는 정맥 내(endovenous) 경로이다.
"경구 경로"는 약학 조성물이 연하(deglutition) 후에 생물 내로 통합되는 것으로서 이해된다. 특정 구체예에서, 본 발명의 약학 조성물은 고체이든 액체이든, 경구 경로에 의한 투여에 적합한 제형일 수 있다. 경구 경로에 의한 투여에 적당한 투약 형태들은 정제, 캡슐, 시럽 또는 용액일 수 있으며, 당 기술분야에서 알려진 임의의 통상의 부형제를 포함할 수 있으며, 예컨대 결합제들, 예로서 시럽, 아라비아검(acacia), 젤라틴, 소르비톨 또는 폴리비닐피롤리돈; 충전제들 예로서 락토오스, 당, 옥수수 전분, 인산칼슘, 소르비톨 또는 글리신; 압축을 위한 활제들, 예로서 마그네슘 스테아레이트; 붕괴제, 예로서 전분, 폴리비닐피롤리돈, 전분의 나트륨 글리콜레이트 또는 미정질 셀룰로오스; 또는 약학적으로 허용가능한 습윤제들, 예컨대 나트륨 라우릴 술페이트. 고체의 구형 조성물들은, 혼합, 충전 또는 압축이라는 통상적인 과정들에 의하여 제조될 수 있다. 반복적인 혼합 조작들은, 많은 양의 충전제들을 이용하는 조성물들에서 활성 약제를 완전히 분포시키는데 사용될 수 있다. 상기 조작들은 당 기술분야에서 통상의 것이다. 정제들은 예로서, 습식 또는 건식 과립화, 및 일반적인 약학적 실시에서 알려진 과정들에 따라 이들을 임의로 코팅, 특히 장용 코팅하므로써 제조될 수 있다.
한편, "국소 경로"는 비전신 경로에 의한 투여로서 이해되며, 본 발명의 약학 조성물을 외부적으로 표피 상, 구강(oral cavity) 내 적용 및 상기 조성물의 귀, 눈 및 코 내로의 적하를 포함하며, 여기에서 혈류로 현저히 도입되지는 않는다. "전신 경로"는 경구 경로, 정맥 경로, 복강 경로 및 근육내 경로에 의한 투여로서 이해된다. 치료 또는 예방 효과에 필요한 항체의 양은 선택된 항체, 치료될 질병의 성질 및 심각성 및 환자에 따라 자연히 변화될 것이다.
"흡입"은 비강내 경로 및 구강 흡입에 의한 투여로서 이해된다. 상기 투여에 적당한 투약 형태들은, 예컨대 에어로졸 또는 계량 투여 흡입기(meter dosed inhaler)와 같은 것들로, 통상의 기술들에 의하여 제조될 수 있다
본 명세서에서 사용된 것과 같은 "비경구"라는 표현은 정맥 경로, 복강 경로, 근육내 경로 또는 피하 경로에 의한 투여를 포함한다. 비경구 투여의 피하, 근육내 및 정맥 투여 형태들이 일반적으로 바람직하다.
한 구체예에서, 본 발명의 약학 조성물들은 예컨대 적당한 투여량 단위의 멸균 용액, 현탁액 또는 동결건조 제품들과 같은 비경구 투여에 대하여 적합화될 수 있다. 그의 주사 이용에 적당한 약학 조성물들은 멸균 수용액들(이들이 물에 용해가능한 경우), 또는 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액들의 즉흥적인 제조를 위한분산액들 및 멸균 분말들을 포함한다. 정맥 경로에 의한 투여의 경우, 일부 적당한 담체들은 포스페이트로 버퍼화된 식염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우들에서, 조성물은 멸균이어야만 하며, 주사 용이성의 관점에서 유체어야만 한다. 제조 및 저장 조건 하에서 안정하여야 하며, 세균 및 곰팡이와 같은 미생물들의 오염 작용으로부터 보호되어야만 한다. 상기 담체는 용매 또는 분산액일 수 있으며, 예로서, 물, 에탄올, 약학적으로 허용가능한 폴리올, 예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액상 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 적당한 혼합물들을 포함한다. 적당한 유동성은, 예로서 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기를 유지함에 의해, 그리고 계면활성제 이용에 의해 유지될 수 있다. 미생물들의 작용의 예방은 각종 항균제 및 항진균제들, 예로서 파라벤류, 클로로부탄, 페놀, 아스코르빈산, 티오머살(thiomersal) 등에 의하여 달성될 수 있다. 대부분의 경우에서, 조성물은 등장성제(isotonic agents), 예로서 당; 다가알코올들 예컨대 만니톨, 소르비톨; 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물들의 연장된 흡수는, 흡수를 지연시키는 약제, 예로서 알루미늄 및 젤라틴 모노스테아레이트의 포함에 의해 유발될 수 있다.
주사가능한 멸균 용액들은 적당한 용매 중에 그 활성 화합물을 필요한 양으로, 필요에 따라 상기 언급된 성분들의 하나 또는 조합물과 함께 혼입시키고, 이어서 멸균막을 통한 여과에 의한 멸균에 의하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액들은 기본 분산 매질을 포함하는 멸균 비히클 중에 활성 화합물 및 앞서 열거된 것들로부터 요구되는 나머지 성분들을 포함시키므로써 제조된다. 주사가능한 멸균 용액들의 제조를 위한 멸균 분말들의 경우, 바람직한 제조 공정들은 진공 건조 및 동결건조이며, 이들은 분말이 미리 여과된 그의 멸균 용액으로부터 활성 성분과 임의의 원하는 추가적인 성분들을 갖도록 한다. 항체들은 일반적으로 동결건조 형태 또는 용액 형태로 저장될 것이다. 치료 항체 조성물들은 일반적으로 멸균 접근 개구를 갖는 포장 내에 수용되며, 예로서 피하주사용 바늘에 의해 천공될 수 있는 마개와 같이 제형을 회수할 수 있는 어댑터(adaptor)를 갖는 정맥주사 용액 백(bag) 또는 바이알이 있다.
약학 조성물은 펄스(pulse) 주입, 예로서 항체의 투여량을 감소시키면서 적당하게 투여될 수 있다. 바람직하게는, 상기 투여량은, 투여가 급성인지 만성인지의 여부에 일부 의존하여, 주사, 보다 바람직하게는 정맥주사 또는 피하 주사에 의하여 투여된다.
한 구체예에서, 본 발명의 제 1 측면의 항체를 포함하는 약학 조성물은 신체로부터 신속히 제거되는 것으로부터 보호하는 담체들을 이용하여 제조되며, 예컨대 임플랜트 및 마이크로캡슐화된 투여 시스템을 포함하는 방출 제어 제형이 있다. 에틸렌 비닐아세테이트, 폴리무수물들, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르들 및 폴리락트산과 같은 생분해성 생체적합성 중합체들이 사용될 수 있다. 상기 제형들의 제조방법들은 당업자들에게는 명백할 것이다. 물질들은 Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc에서 상업적으로도 수득가능하다.
서방성 조성물들은, 적당한 제형들 중에 현탁된 항체 결정들의 제제를 포함하며, 이들은 결정들을 현탁액 중에 유지할 수 있다. 이들 제제들은, 피하 또는 복강내 경로에 의하여 주사되는 경우, 서방성 효과를 생성할 수 있다. 다른 조성물들은 리포솜들들 중에 트랩된 항체들도 포함한다. 이러한 항체들을 포함하는 리포좀들은 Epstein 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1985) 82:3688-3692; Hwang 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1980) 77:4030-4034; EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949과 같은 알려진 방법들에 의하여 제조된다.
본 발명의 조성물들은 임의의 유형의 포유동물, 바람직하게는 인간 내로 투여되기 적합하다.
본 발명은, 본 명세서에서 제공된 구체예들 중 임의의 것에 따른 모노클로날 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 한 구체예에서, 약학 조성물은 화학치료제를 더욱 포함한다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 약학 조성물은 소염제를 더 포함한다.
특이적 항-S100A4 항체들 및 항대사물질들을 포함하는 약학 조성물들
본 발명자들은 특이적 항체들 항-S100A4와 항대사물질 약물의 조합이 암 치료에 있어서 세포독성제로서의 상승작용적 효과를 갖는다는 것을 놀랍게도 발견하였다(본 발명의 실시예 15 참조)
본 발명의 한 측면은 특이적 항-S100A4 항체 및 항대사물질을 포함하는 약학 조성물이다.
본 발명에서 사용된 것과 같은 "약학 조성물"이라는 표현은, 하나 또는 몇몇 유용한 치료제들의 예정된 투여량을 하나의 세포, 일군의 세포들, 기관, 조직 또는 암을 겪고있는 동물에 투여하기에 적합화된 제형에 관한 것이다.
본 발명의 이러한 측면에서 "특이적 항-S100A4 항체"라는 표현은, S100A4 단백질을 특이적으로 인식하는 임의의 항체를 의미하며, 이는 당 기술분야에서 앞서 개시된 항체들을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 "항대사물질"은, 넓은 의미에서, 이들의 생물체에 중요한 대사산물들(비타민, 보조효소, 아미노산 및 당류)과 구조적 또는 기능적 유사성으로 인하여, 정상의 대사작용을 방해하는 성분들 및 전자 전달 시스템을 저해하여 에너지-풍부 중간체들의 생산을 방지하는 성분들에 관한 것이다.
본 발명에서의 사용에 적당한 항대사물질들은 이에 제한되지는 않지만, 폴린산 항대사물질들 (아미놉테린(aminopterin), 데놉테린(denopterin), 메토트렉세이트, 에다트렉세이트, 트리메트렉세이트, 놀라트렉시드(nolatrexed), 로메트렉솔(lometrexol), 페메트렉시드(pemetrexed), 랄티트렉시드(raltitrexed), 피리트렉심(piritrexim), 프테롭테린(pteropterin), 류코보린(leucovorin), 10-프로파길-5,8-디데아자폴레이트 (PDDF, CB3717)), 퓨린 유사체들 (클라드리빈, 클로파라빈, 플루다라빈, 머캡토퓨린, 펜토스타틴, 티오구아닌) 및 피리미딘 유사체들 (카페시타빈(capecitabine), 시타라빈 또는 아라-C(ara-C), 데시타빈(decitabine), 플루오로우라실(fluorouracil), 5-플루오로우라실, 독시플루리딘(doxifluridine), 플록수리딘(floxuridine) 및 젬시타빈). 바람직한 구체예에서, 상기 항대사물질은 5-플루오로우라실 및 젬시타빈으로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 젬시타빈이다. 대상이 결장암을 앓고 있는 경우, 제 1선의 화학치료 처리는 항대사물질들, 바람직하게는 5-플루오로우라실이다. 대상이 췌장암, 방광암 또는 담낭암을 앓고 있는 경우, 제 1선의 화학치료 처리는 항대사물질들, 바람직하게는 젬시타빈이다.
바람직한 구체예에서, 상기 항체는 항-혈관신생 활성을 갖는 특이적 항-S100A4 항체 또는 상기 항체의 항-혈관신생 활성을 실질적으로 보존하고 있는 단편으로, 여기에서 상기 항체는 하기 군으로부터 선택된다:
(i) 서열 ELPSFLGKRT (서열번호: 3)을 포함하는 S100A4의 에피토프를 인식하는 항체,
(ii) 서열 EGFPDKQPRKK (서열번호: 24)를 포함하는 S100A4의 에피토프를 인식하는 항체 및
(iii) 하이브리도마 ECACC 11051804에 의해 생성되는 항체.
바람직한 구체예에서, 본 측면에 따른 항체는 모노클로날 항체, 바람직하게는 ECACC 10022401, ECACC 11051801, ECACC11051802, ECACC 11051803 및 ECACC 11051804의 군으로부터 선택된, 보다 바람직하게는 ECACC 10022401인, 하이브리도마에 의해 생산된 모노클로날 항체 또는 그의 단편이다.
본 발명자들은 항-S100A4 항체와 항대사물질의 조합이 종양 세포들의 생육력을 감소시킬 수 있음을 증명하였다.
따라서, 바람직한 구체예에서, 상기 조성물은 종양 세포들의 생육성을 감소시킬 수 있다.
"종양 세포들의 생육성을 감소"라는 표현은, 세포들이 생존, 성장 및 증식능이 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%; 바람직하게는 적어도 60%; 더욱 바람직하게는 적어도 65%; 가장 바람직하게는 적어도 70% 감소하는 것으로서 이해된다. 상기 생육성의 감소는 본 발명의 실시예 15에서 설명된 분석을 통하여 평가될 수 있다.
"종양 세포"는, 정상 범위를 벗어나 성장 및 분열하여 주변 조직을 공격하고 때때로 전이를 일으키는 암성 또는 암종성 세포로서도 알려진 악성 세포로서 이해된다. 본 발명의 항체들로 처리될 수 있는 종양 세포들은 S100A4 단백질을 과잉발현하는 세포들이다. 상기 세포들은 알려지고 수립된 세포주들로부터의 종양 세포들 및 암 환자의 기관에 존재하는 종양 세포들을 포함한다. S100A4를 과잉발현하는 종양주들의 몇몇 예시적인 비-제한적 예들은 Colo 205 결장 선암종 종양주, MiaPACA-2 인간 췌장 선암종 종양주, Panc1 인간 췌장 암종 세포주, HCT116 결장 선암종 세포주, MDA-MB-231 유선 선암종 세포주의 배양물로부터 유래된 암 줄기세포들이 있다. 암환자에 존재하며 S100A4를 과잉발현하는 종양 세포들의 예시적이며 비제한적인 예들은, 특히 하기로부터의 종양 세포들이다: 유방 암종 (Rudland PS 등, Cancer Res 2000. 60(6): 1595-1603), 전립선 암종 (Saleem M 등, PNAS 2006. 103(40): 14825-30), 폐 암종 (Tsuna M 등, Anticancer Res 2009. 29(7): 2547-54), 결장 암종 (Cho Y 등, World J Gastroent 2005. 11(31): 4852-6), 췌장 암종 (Rosty C 등, Am J Pathol 2002. 160(1): 45-50), 신장 암종 (Bandiera A 등, World J Surg 2009. 33(7): 1414-20), 위 암종 (Yonemura Y 등, Clin Cancer Res 2000. 6(11): 4234-42), 난소 암종 (Maelandsmo GM 등, Tumor Biol 2009. 30(1):15-25), 유두 갑상선 암종 (Min HS 등, Mod Pathol 2008. 21(6): 748-55), 흑색종 (Andersen K 등, Mod Pathol 2004. 17(8): 990-997), 간세포 암종 (Cui J 등, J Can Res Clin Oncol 2004. 130(10): 615-22), 방광 암종 (Agerbaek M 등, Eur Urol 2006. 50(4): 777-785), 지방육종 침습성 암종 (Pazzaglia L 등, Anticancer Res 2004. 24(2B): 967-972), 신경아세포종 (Bjornland K 등, J Pediatr Surg 2001. 36(7): 1040-44), 식도 편평상피세포 암종 (Ninomiya I 등, Int J Oncol 2001. 18(4): 715-20), 골육종 (Mathisen B 등, Clin Exp Metastasis 2003. 20(8): 701-11), 담낭 암종 (Nakamura T 등, Int J Oncol 2002. 20(5): 937-41), 구강 편평상피세포 암종 (Moriyama-Kita M 등, Oral Oncol 2004. 40(5): 496-500), 자궁내막 암종 (Xie R 등, Lab Invest 2009. 89(8): 937-947), 및 수모세포종 (Hernan R 등, Cancer Res 2003. 63(1): 140-148).
S100A4 단백질을 발현하는 종양 세포들은, 본 발명에서 설명된 바에 따라, ELISA 또는 웨스턴 블롯과 같은 기존 방법들에 의하여 확인될 수 있다.
한 구체예에서, 그 생육성이 본 발명의 상기 측면의 항체들에 의하여 감소된 종양 세포들은 췌장암 또는 결장암, 바람직하게는 췌장암으로부터의 종양 세포들이다.
또다른 측면에서, 본 발명은, 암 또는 전이의 예방 및/또는 치료에의 용도를 위한 특이적 항-S100A4 항체 및 대사물질을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 암 또는 전이의 예방 및/또는 치료용 의약 제조를 위한 특이적 항-S100A4 항체 및 대사물질을 포함하는 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 대상에서 암 또는 전이의 예방 또는 치료방법에 관한 것으로, 상기 대상에 특이적 항-S100A4 항체 및 대사산물을 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
"예방", "치료", "암" 및 "전이"라는 표현은 본 발명의 항체들의 치료적 이용의 맥락에서 정의될 것이다.
이전의 측면들의 모든 특정 구체예들은 상기 측면들에 적용가능하다.
본 발명의 항체들의 치료적 이용
혈관신생 및 암
본 발명은, 본 명세서에서 제시된 구체예들 중 어느 하나에 따른 항체 또는 그의 단편 또는 모노클로날 항체를, 의약으로서의 용도를 위하여 제공한다.
본 발명은, 본 명세서에서 제시된 구체예들 중 어느 하나에 따른 항체 또는 그의 단편 또는 모노클로날 항체를, 종양 치료를 위한 의약으로서의 용도를 위하여 제공한다.
본 발명은, 본 명세서에서 제시된 구체예들 중 어느 하나에 따른 항체 또는 그의 단편 또는 모노클로날 항체를, 종양 치료를 위한 의약 제조를 위하여 제공한다.
또한 본 발명은, 본 명세서에서 제시된 구체예들 중 어느 하나에 따른 항체 또는 그의 단편 또는 모노클로날 항체의 약학적으로 유효한 양을, 상기 치료를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하는 종양 치료방법을 제공한다.
S100A4 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항-S100A4 항체들은, 상기 단백질이 과잉발현되는 질병들에서의 적용을 갖는다.
특히, 상기 S100A4 단백질은, 상기 설명된 것과 같이, 광범위한 종류의 암에서 발현된다.
그 결과, S100A4 단백질 리간드들, 보다 특이적으로, 이 단백질에 대해 특이적인 항체들은, 상기 질병 치료를 위해 사용되어질 후보 약물들이다.
따라서, 본 발명의 한 측면은, 본 발명의 제 1측면에 따른 항체 및 그의 단편의, 전이 및 원하지 않는 혈관신생 관련 질병들으로부터 선택되는 질병의 예방 및/또는 치료에 유용하다.
또다른 측면에서, 본 발명은 전이로부터 선택된 질병 및 원하지 않는 혈관신생 관련 질병으로부터 선택된 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 의약 제조를 위한, 본 발명의 제 1 측면에 따른 항체 또는 단편의 용도에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 대상에서 전이로부터 선택되는 질병 및 원하지 않는 혈관신생 관련 질병의 치료 또는 예방 방법에 관한 것으로, 이는 본 발명의 제 1 측면에 따른 항체 또는 단편을 상기 대상에 투여하는 것을 포함한다.
상기 "항체" 및 "단편"이라는 용어는 본 발명의 제 1 측면의 맥락에서 앞서 정의되었다.
"예방(prevention)"은 본 발명의 제 1 측면에 따른 항체 또는 단편, 또는 그를 포함하는 의약을, 질병의 초기 또는 조기 단계에서 또는 그의 개시를 방지하기 위하여 투여하는 것으로서 이해된다.
"치료(treatment)"라는 표현은, 임상적 징후가 나타나기 전 또는 나타난 후에 그 질병의 진전을 제어하기 위하여, 본 발명의 제 1측면에 따른 항체 또는 그의 단편 또는 그를 포함하는 의약의 투여를 지칭하는데 사용된다. 질병의 진전의 제어는, 이에 제한되지는 않지만, 증상의 감소, 질병 기간의 감소, 병리학적 상태들의 안정화(특이적으로 추가적인 손상을 회피), 질병의 진전의 지연, 병리학적 상태의 (일부 및 완전한) 개선 및 소실(remission)을 포함하는 유리하거나 바람직한 임상적 결과들로서 이해된다. 질병의 진전의 제어는 그 치료가 적용되지 않은 경우 예측되는 생존에 비교한, 생존의 연장도 포함한다.
"의약"은 본 발명의 제 1측면에 따른 항체 또는 그의 단편을 포함하는 약학 조성물로서 이해된다.
"전이"라는 용어는 본질적으로 림프성 또는 혈류에 의한, 암 유발 세포들의 원거리(distance) 증식, 및 상기 전이의 목적지들에서 새로운 종양들의 성장으로서 이해된다.
본 발명의 맥락에서, "혈관신생"은 기존 혈관들로부터 새로운 혈관들의 형성으로 이루어지는 생리학적 과정을 의미하는 것으로 이해된다. 혈관신생은 신혈관신생으로서도 알려져 있다.
"원하지 않는 혈관신생 관련 질병들"이라는 표현은, 병원성 혈관신생이 일어나는 모든 질병들, 즉, 암 여부를 떠나, 과정이 해롭거나 바람직하지 않는 모든 경우들에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 범주는, 상처 회복과 같은 필요에 따른 상황에서의 혈관신생의 처리는 제외한다. 본 발명에 따른 화합물들로 치료될 수 있는 원하지 않는 혈관신생 관련 질병들은, 이에 제한되지는 않지만, 염증성 질병들, 특히 만성 염증성 질병들, 예컨대 류마티즘성 관절염, 건선, 유육종증(sarcoidosis) 등; 자가면역 질병들; 바이러스성 질병들; 유전성 질병들; 알러지성 질병들; 세균성 질병들; 안과학적 질병들, 예컨대 당뇨 망막병증(diabetic retinopathy), 미숙아 망막병증(premature retinopathy), 증식성 심방 망막병증(proliferative atrial retinopathy), 망막정맥 폐쇄, 황반변성, 노인성 원반형(senile discoid) 황반변성, 신생혈관성 눈 녹내장(neovascular ocular glaucoma), 맥락막(choroidal) 혈관신생 질병들, 망막성 혈관신생 질병들, 홍조(rubeosis) (각 혈관신생화(angle neovascularization)), 각막 이식 거부반응, 수정체후 섬유증식증(retrolental fibroplasia), 유행성 각결막염, 비타민 A 결핍, 콘택트 렌즈 피로(exhaustion), 어토피컬(atopical) 각막염, 위각막 가장자리 각막염(superior limbic keratitis), 검열반 건성안(pterygium dry eye), 쇼그렌 증후군(Shogrens syndrome), 주사성 좌창(acne rosacea), 플릭텐성 각결막염(phlyctenulosis), 매독(syphilis), 마이코박테리아 감염, 지방변성증, 부식성 물질들로인한 화상, 세균성 궤양, 곰팡이성 궤양, 원생동물 감염, 카포시(Kaposi) 육종, 무렌 각막궤양(Mooren's ulcer), 테리엔 변연 변성(Terrien marginal degeneration), 가장자리 각질용해증(marginal keratolysis), 공막염(scleritis), 만성 망막 박리 등; 죽상동맥경화증(atherosclerosis); 자궁내막증(endometriosis); 비만; 심부전증; 진전(advanced) 신부전증; 내독소혈증(endotoxemia); 독성 쇼크 증후군; 뇌막염; 실리콘-유도된 섬유형성증; 석면-유도된 섬유형성증; 졸중(apoplexia); 치주염; 치은염; 대구성 빈혈(macrocytic anaemia); 불응성 빈혈(refractory anaemia); 5q 결실 증후군; 혈관신생이 HIV에 의한 감염, 간염, 출혈성 모세혈관 확장증(hemorrhagic telangiectasia) 또는 랑뒤-오슬러-웨버 질병(Rendu-Osler-Weber's disease)으로서 변경된 병태들을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 상기 원하지 않는 혈관신생 관련 질병은 암, 류마티즘성 관절염, 건선, 유육종증, 당뇨 망막병증, 미숙아 망막병증, 망막정맥 폐쇄, 노인성 원반형 황반변성, 죽상동맥경화증, 자궁내막증 및 비만으로부터 선택되는 질병으로, 바람직하게는 암이다.
특정 구체예에서, 상기 원하지 않는 혈관신생 관련 질병들은 염증성 질병들이다. "염증성 질병"은 염증성 증상들을 이끌어내는 과도한 또는 변경된 염증성 반응이 있는 임의의 질병으로 이해되어야 한다.
본 발명의 화합물들에 의해 치료될 수 있는 상기 염증성 질병들은 이에 제한되지는 않지만, 아디손병(Addison's disease), 여드름, 원형탈모증, 아밀로이드증, 강직성 척추염, 궤양형성, 아프타 구내염(aphthous stomatitis), 관절염, 동맥경화증, 골관절염, 류마티즘성 관절염, 기관지 천식, 베체트병(Bechet's disease), 베크 유육종증(Boeck's disease), 장 염증성 질병, 크론병(Crohn's disease), 맥락막염, 궤양성 대장염, 셀리악병(celiac's disease), 한냉글로불린혈증(cryoglobulinemia), 황반변성, 피부염, 포진상 피부염, 피부근염(dermatomyositis), 인슐린 의존성 당뇨병, 소아당뇨, 염증성 탈수초성 질병, 듀피트렌 구축(Dupuytren contracture), 뇌척수염, 알러지성 뇌척수염, 엔도프탈미아(endophthalmia), 알러지성 장염, 자가면역 장증후군, 나병결절홍반(erythema nodosum leprosum), 강직성 척추염, 특발성(idiopathic) 안면마비, 만성 피로 증후군, 류마티스성 열, 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 치은염, 사구체신염, 굿패스쳐 증후군(Goodpasture syndrome), 그래이브즈 증후군(Graves syndrome), 하시모토병(Hashimoto's disease), 만성 간염, 조직구증식증(histiocytosis), 국한성 회장염(regional ileitis), 홍채염(iritis), 파종 홍반성 낭창(disseminated lupus erythematous), 전신 홍반성 낭창, 피부 홍반성 낭창, 림프육아종(lymphogranuloma), 전염성 단핵증(infectious mononucleosis), 중증 근무력증(miastenia gravis), 횡단성 척추염(transverse myelitis), 일차특발성 점액수종(primary idiopathic myxedema), 신장증(nephrosis), 비만, 교감성 안염(sympathetic ophthalmia), 육아종성 고환염(granulomatous orchitis), 췌장염, 지방층염(panniculitis), 심상성천포창(pemphigus vulgaris), 치주염, 결절성 다발성 동맥염, 만성 다발성관절염, 다발성근염(polymyositis), 급성 다발성신경근염, 건선, 만성폐쇄성 폐질병, 자반(purpura), 괴저성 농피증(gangrenous pioderma), 리히터증후군(Reiter's syndrome), 당뇨 망막병증, 주사(rosacea), 유육종증, 실조형 경화증(ataxic sclerosis), 진행성 전신성 경화증, 공막염, 강피증(sclerodermia), 다발성 경화증, 파종 경화증, 급성 전방성 포도막염, 백반증(vitiligo), 위플병(Whipple's disease), AIDS 연관 질병들, 중증 복합면역결핍증 및 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr's virus) 예컨대 쇼그렌 증후군, 골관절성결핵(osteoarticular tuberculosis) 및 기생병(parasitic diseases) 예컨대 레슈마니아증(leishmaniasis)을 포함한다. 바람직한 염증성 질병들은 류마티즘성 관절염, 건선, 유육종증, 당뇨 망막병증, 황반변성, 동맥경화증 및 비만이다.
또다른 바람직한 구체예에서, 상기 질병은 암이다.
"암" 또는 "종양"이라는 용어는 포유동물에서 조절되지 않는 세포 성장에 의해 특징되는 생리학적 조건에 관한 것이다. 본 발명의 제 1 측면의 S100A4 단백질에 특이적으로 결합하는 항체들 또는 그의 단편들은 임의의 암 또는 종양, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 유방, 심장, 폐, 소장, 결장, 비장, 신장, 방광, 머리, 목, 난소, 전립선, 뇌, 췌장, 피부, 뼈, 골수, 혈액, 갑상선, 자궁, 고환 및 간 종양들의 치료에 유용하다. 특히, 상기 항체들로 치료될 수 있는 종양들은, 이에 제한되지는 않지만, 선종(adenoma), 혈관육종(angiosarcoma), 성상세포종(astrocytoma), 내피암종, 배아세포종(germinoma), 교모세포종(glioblastoma), 신경교종(glioma), 혈관내피종(hemangioendothelioma), 혈관육종(hemangiosarcoma), 혈종(hematoma), 간모세포종(hepatoblastoma), 백혈병, 림프종, 수모세포종, 흑색종, 신경아세포종, 골육종, 망막모세포종(retinoblastoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 육종 및 기형종(teratoma)을 포함한다. 특히, 상기 종양/암은 하기 군으로부터 선택된다: 말단 흑자성 흑색종(acral lentiginous melanoma), 광선각화증성(actinic keratosis) 선암종, 선모낭포암(adenoid cystic carcinoma), 선종들, 선육종(adenosarcoma), 선편평상피세포 암종, 성상세포성 종양들(astrocytic tumors), 바르톨린 선(Bartholin agland) 암종, 기저핵 암종, 기관지 선암종, 모세혈관 카르시노이드(capillary carcinoid), 암종, 암육종(carcinosarcoma), 담관암(cholangiocarcinoma), 낭선종(cystadenoma), 내배엽동 종양(endodermal sinus tumor), 자궁내막증식증, 자궁내막 기질 육종, 자궁내막유사성(endometrioid) 선암종, 상의세포(ependymal) 육종, 스윙 육종(Swing's sarcoma), 국소 결절성 과증식증(focal nodular hyperplasia), 생식계열(germ-line) 종양들, 교모세포종, 글루카곤생성종양(glucagonoma), 혈관아종(hemagioblastoma), 혈관내피종, 혈관종(hemangioma), 간 선종, 간 선종증(adenomatosis), 간세포 암종, 인슐린종(insulinoma), 상피내 종양(intraepithelial neoplasia), 상피내 편평상피세포 종양형성, 침습성 편평상피세포 암종, 대세포(large-cell) 암종, 평활근육종(leiomyosarcoma), 흑색종, 악성 흑색종, 악성 중피세포(mesothelial) 종양, 수모세포종, 수질상피종(medulloepithelioma), 점액표피양(mucoepidermoid) 암종, 신경아세포종, 신경상피(neuroepithelial) 선암종, 결절성 흑색종, 골육종, 유두상 장액성(papillary serous) 선암종, 뇌하수체 종양들, 형질세포종(plasmacytoma), 가육종(pseudosarcoma), 폐 아세포종, 신장세포 암종, 망막모세포종, 횡문근육종, 육종, 장액성 암종, 소세포(small-cell) 암종, 연조직 암종, 소마토트로핀 분비 종양, 편평상피세포 암종, 편평상피세포 세포암종, 미분화 암종, 포도막(uveal) 흑색종, 사마귀형(verrucous) 암종, 비포마(vipoma), 윌름 종양(Wilm's tumor). 본 발명의 한 구체예에서, 종양은 하기 구성된 군으로부터 선택된다 : 유방암종, 전립선 암종, 폐 암종, 결장 암종, 췌장 암종, 신장 암종, 위 암종, 난소 암종, 유두 갑상선 암종, 흑색종, 간세포 암종, 방광 암종, 지방육종 침습성 암종, 신경아세포종, 식도 편평상피세포 암종, 골육종, 담낭 암종, 구강 편평상피세포 암종, 자궁내막 암종 및 수모세포종. 또다른 구체예에서, 상기 종양은 결장 암종, 췌장 암종 및 임의의 다른 S100A4 매개 종양들로부터 선택된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 항체들을 이용하여 예방 또는 치료되는 종양/암은 췌장암 및 결장암, 바람직하게는 췌장암으로부터 선택된다.
"췌장암"이라는 표현은 선암종 및 그의 일부 변형물들을 포함하는 췌장의 임의의 악성 신생물로서 이해된다.
"결장직장암"이라는 표현은 결장, 직장 또는 충수에서의 신생물형성에 의해 특징되는 암으로서 이해된다. 결장암은, 항문에 걸린 항문암과 임상적으로 구분된다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 의약은 단독 치료제로서 본 발명의 제 1측면에 따른 하나 이상의 항체들을 포함한다. 그러나, 본 발명의 의약은 암 치료를 위한 하나 또는 몇몇의 추가적인 화합물들도 포함한다. 따라서, 본 발명의 또다른 구체예에서, 의약은 본 발명에 따른 항체 및 상기 질병의 치료에 유용한 하나 이상의 치료제들의 병용 투여를 위하여 제조된다.
상기 질병의 치료에 유용한 "치료제"라는 용어는 암 치료에 사용되기 적당한 약제를 의미한다.
암 치료의 경우, 본 발명의 항체는 추가적인 치료 활성 화합물, 예컨대 세포독성제, 항혈관신생제 또는 항전이제와 조합되어 사용될 수 있다.
암 치료를 위한 본 발명의 항체들과 조합되어 사용될 수 있는 세포독성제들은, 이에 제한되지는 않지만, 독소루비신 및 다우노루비신과 같은 안트라사이클린 항생제들, 탁솔(Taxol) 및 도세탁셀(docetaxel)과 같은 탁산류(taxanes), 빈크리스틴 및 빈블라스틴과 같은 빈카 알칼로이드류, 5-플루오로우라실 (5-FU), 류코보린(leucovorin), 이리노테칸(irinotecan), 이다루비신(idarubicin), 미토마이신 C (mitomycin C), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 랄티트렉시드(raltitrexed), 타목시펜, 시스플라틴, 카르보플라틴, 메토트렉세이트, 악티노마이신 D, 마이토잔트론(mitoxantrone), 블레녹산(blenoxane) 또는 미트라마이신(mithramycin)을 포함한다. 암 치료를 위하여 본 발명의 항체와 조합하여 사용될 수 있는 항혈관신생제들은 이에 제한되지는 않지만, 하기 군으로부터 선택되는 항혈관신생제를 포함한다: 파클리탁셀, 2-메톡시에스트라디올, 프리노마스타트(prinomastat), 바티마스타트(batimastat), BAY 12-9566, 카르복시아미도트리아졸(carboxyamidotriazole), CC-1088, 덱스트로메토르판 아세트산(dextromethorphan acetic acid), 디메틸잔테논(dimethylxanthenone) 아세트산, 엔도스타틴(endostatin), IM-862, 마리스타트(marimastat), 페니실라민(penicillamine), PTK787/ZK 222584, RPI.4610, 스쿠알라민 락테이트(squalamine lactate), SU5416, 탈리도미드(thalidomide), 콤브레타스타틴(combretastatin), 타목시펜, COL-3, 네오바스타트(neovastat), BMS-275291, SU6668, 항-VEGF 항체들, Medi-522 (비탁신(Vitaxin) II), CAI, 인터류킨 12, IM862, 아밀로리드(amiloride), 안지오스타틴(angiostatin), Kl-3 안지오스타틴, Kl-5 안지오스타틴, 캅토프릴(Captopril), DL-알파-디플루오로메틸오르니틴, DL-알파-디플루오로메틸오르니틴 HCl, 엔도스타틴, 푸마길린(fumagillin), 허비마이신(herbimycin) A, 4-히드록시페닐레틴아미드, 주글론(juglone), 라미닌(laminin), 라미닌 헥사펩티드, 라미닌 펜타펩티드, 라벤두스틴(lavendustin) A, 메드록시프로게스테론(medroxyprogesterone), 미노시클린(minocycline), 플라센타 태반 리보뉴클레아제 저해제, 수마린(suramin), 트롬보스폰딘(thrombospondin), 혈관신생자극 인자들에 대항하는 항체(예로서, 아바스틴(Avastin), 에르비툭스(Erbitux), 벡티빅스(Vectibix), 허셉틴(Herceptin)); 혈관신생자극 성장 인자들의 저분자량 티로신 키나아제 저해제들(예로서, 타르세바(Tarceva), 넥사바르(Nexavar), 수텐트(Sutent), 이레사(Iressa)); mTOR 저해제들 (예로서, 토리셀(Torisel)); 인터페론 알파, 베타 및 감마, IL-12, 기질 메탈로프로테나아제 저해제들 (예로서, COL3, 마리마스타트(marimastat), 바티마스타트(batimastat)); ZD6474, SUl1248, 바이탁신(vitaxin); PDGFR 저해제들 (예로서, 글리벡(Gleevec)); NM3 및 2-ME2; 시렌지티드(cilengitide)와 같은 시클로펩티드들. 암 치료를 위해 본 발명의 항체들과 조합하여 사용될 수 있는 항전이제들은, 이에 제한되지는 않지만, 다음을 포함한다: 알킬화제와 같은 항전이제로서 작용하는 임의의 약제; 5-플루오로우라실, 페메트렉시드(pemetrexed) (MTA), 랄티트렉시드 (TDX)와 같은 항대사물질들; 시스플라틴 또는 옥살리플라틴과 같은 백금 세포독성제들; 토포아이소머라아제(topoisomerase) 저해제들; 항미세소관제들(antimicrotubule agents); 안트라사이클린류; 식물성 알칼로이드들; GTP아제 저해제들; 혈관신생 저해제들; 기질 메탈로프로테나아제 저해제들; 세포 사이클 조절 키나아제의 저해제들, 예컨대 사이클린-의존성 키나아제들 및 사이클린 저해제들; Wnt 신호화 저해제들; E2F 전사인자의 저해제들; 히스톤 탈아세틸화제 저해제들; AKT 키나아제 또는 ATP아제 저해제들.
"조합된(병용) 투여"는 본 발명에 따른 항체가 암치료에 유용한 치료제와 동일시간에 또는 임의의 순서로 순차적으로, 함께 또는 구별하여, 동시에 투여될 수 있는 것으로서 이해된다. 예로서, 본 발명의 항체의 투여가 첫번째로 수행될 수 있으며, 이어서 상기 병리의 처리에 유용한 하나 이상의 치료제들이 투여될 수 있다; 또는 본 발명의 항체의 투여는 마지막으로 수행될 수 있으며, 그 전에 상기 병리의 처리에 유용한 하나 이상의 치료제들의 투여가 선행될 수 있다; 또는 본 발명의 항체의 투여는 상기 병리의 처리에 유용한 하나 이상의 치료제들의 투여와 동시에 수행될 수 있다.
당업자는 본 발명의 맥락에서, 본 발명에 따른 항체와 암치료에 유용한 추가적인 치료제의 조합 투여를 위한 의약이 단일 투여 형태 또는 별개의 투약 형태들로서 제조될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
바람직한 구체예에서, 항-혈관신생 활성을 갖는 특이적 항-S100A4 항체는 모노클로날 항체, 바람직하게는 ECACC 10022401, ECACC 11051801, ECACC 11051802, ECACC 11051803 및 ECACC 11051804의 군으로부터 선택되는 하이브리도마에 의해 생산되는 항체; 보다 바람직하게는 하이브리도마 ECACC 10022401에 의해 생산되는 항체이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 의학에서의 용도를 위한, ECACC 10022401, ECACC 11051801, ECACC 11051802, ECACC 11051803 및 ECACC 11051804의 군으로부터 선택되는 하이브리도마에 의해 생산되는 특이적 항-S100A4 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 임의의 S100A4 매개 질병들의 치료를 위한 의약으로서의 용도를 위한, 본 명세서에서 제시된 구체예들 중 어느 하나에 따른 항체 또는 그의 단편 또는 모노클로날 항체를 제공한다.
본 발명은 또한, S100A4 매개 질병들의 치료를 위한 의약 제조를 위한, 본 명세서에서 제시된 구체예들 중 어느 하나에 따른 항체 또는 그의 단편 또는 모노클로날 항체를 제공한다.
본 발명은 S100A4 매개 질병들의 치료방법을 제공하며, 이는 본 명세서에서 제시된 구체예들 중 어느 하나에 따른 항체 또는 그의 단편 또는 모노클로날 항체의 약학적으로 유효한 양을 상기 치료를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함한다.
염증
본 발명자들은 특이적 항-S100A4 항체들이 염증 관련 질병들의 예방 및/또는 치료에 유용하다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 한 측면은, 염증 관련 질병의 예방 및/또는 치료용 의약 제조를 위한 항원에 결합능을 갖는 S100A4 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편의 이용에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 염증 관련 질병의 예방 및/또는 치료에서의 이용을 위한 항원 결합능을 갖는, S100A4 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 대상에서 염증 관련 질병의 치료 또는 예방 방법에 관한 것으로, 이는 항원 결합능을 갖는 S100A4 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 대상에 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 이 측면의 맥락에서, "S100A4 단백질에 특이적으로 결합하는 항체"라는 표현은 S100 과의 다른 단백질들은 인식하지 않지만 S100A4 단백질은 특이적으로 인식하는 항체를 의미한다. 상기 발현은 선행기술에서 미리 개시된 항체들을 포함한다.
상기 "단편"이라는 용어는 항원 결합능을 갖는 항체의 단편을 의미한다. 이는 상기 단편이 항-혈관신생 활성을 가질 필요는 없다.
"염증 관련 질병"이라는 표현은, 암 여부에 관계없이, 즉 상기 과정이 유해하거나 바람직하지 않은 경우, 병리학적 염증이 일어나는 모든 질병들에 관한 것이다. 염증 관련 질병들은, 염증성 증상들을 일으키는 과도하거나 또는 변경된 염증 반응들이 존재하는 염증성 질병들을 포함한다. 본 발명의 항체들에 의해 치료될 수 있는 상기 염증성 질병들은 이에 제한되지는 않지만, 다음을 포함한다: 아디손병, 여드름, 원형탈모증, 아밀로이드증, 강직성 척추염, 궤양형성, 아프타 구내염, 관절염, 동맥경화증, 골관절염, 류마티즘성 관절염, 기관지 천식, 베체트병, 베크 유육종증, 장 염증성 질병, 크론병, 맥락막염, 궤양성 대장염, 셀리악병, 한냉글로불린혈증, 황반변성, 피부염, 포진상 피부염, 피부근염, 인슐린 의존성 당뇨병, 소아당뇨, 염증성 탈수초성 질병, 듀피트렌 구축, 뇌척수염, 알러지성 뇌척수염, 엔도프탈미아, 알러지성 장염, 자가면역 장증후군, 나병결절홍반, 강직성 척추염, 특발성 안면마비, 만성 피로 증후군, 류마티스성 열, 낭포성 섬유증, 치은염, 사구체신염, 굿패스쳐 증후군, 그래이브즈 증후군, 하시모토병, 만성 간염, 조직구증식증, 국한성 회장염, 홍채염, 파종 홍반성 낭창, 전신 홍반성 낭창, 피부 홍반성 낭창, 림프육아종, 전염성 단핵증, 중증 근무력증, 횡단성 척추염, 일차특발성 점액수종, 신장증, 비만, 교감성 안염, 육아종성 고환염, 췌장염, 지방층염, 심상성천포창, 치주염, 결절성 다발성 동맥염, 만성 다발성관절염, 다발성근염, 급성 다발성신경근염, 건선, 만성폐쇄성 폐질병, 자반, 괴저성 농피증, 리히터 증후군, 당뇨 망막병증, 주사, 유육종증, 실조형 경화증, 진행성 전신성 경화증, 공막염, 강피증, 다발성 경화증, 파종 경화증, 급성 전방성 포도막염, 백반증, 위플병, AIDS관련 질병들, 중증복합면역결핍증 및 엡스타인 바 바이러스, 예컨대 쇼그렌 증후군, 골관절성결핵 및 기생병 예컨대 레슈마니아증. 바람직한 염증성 질병들은 류마티즘성 관절염, 동맥경화증, 건선, 염증성 장 질병 및 이식-대-숙주 질병이다.
"의약", "예방" 및 "치료"라는 용어는 본 발명의 항체들의 치료적 이용의 맥락에서 정의된다.
바람직한 구체예에서, 상기 S100A4 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편은 항-혈관신생 활성을 갖는 항-S100A4 항체 또는 상기 항체의 항-혈관신생 활성을 실질적으로 보존하고 있는 그의 단편으로, 여기에서 항체는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된다:
(i) 서열 ELPSFLGKRT (서열번호: 3)을 포함하는 S100A4의 에피토프를 인식하는 항체,
(ii) 서열 EGFPDKQPRKK (서열번호: 24)를 포함하는 S100A4의 에피토프를 인식하는 항체 및
(iii) 하이브리도마 ECACC 11051804에 의해 생성되는 항체.
보다 바람직한 구체예에서, 상기 항체는 ECACC 10022401, ECACC 11051801, ECACC 11051802, ECACC 11051803 및 ECACC 11051804의 군으로부터 선택되는 하이브리도마에 의해 생산되고; 보다 바람직하게는 상기 하이브리도마는 ECACC 10022401이다.
본 발명의 항체들의 접합물들 및 그의 이용
본 발명의 제 1 측면의 항체들이 S100A4 단백질에 결합할 수 있고, 이 단백질이 암에서 과잉발현된다는 가정 하에, 본 발명의 제 1 측면에 따른 상기 항-혈관신생 활성을 갖는 특이적 항-S100A4 항체 또는 그의 단편은 S100A4의 발현 자리에 대해 치료 활성을 갖는 화합물들을 운반하는데 적합한 약제들을 구성한다.
상기 S100A4 단백질은, 각종 암들에서 상기 설명된 것과 같이 발현된다. 상기 단백질은 류마티즘성 관절염과 같은 염증 관련 질병들에서도 발현된다.
따라서, 또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제 1 측면에 따른 항체 또는 그의 단편 및 하기 군으로부터 선택되는 제 2 성분을 포함하는 접합물에 관한 것이다:
a) 항혈관신생제,
b) 항전이제,
c) 세포독성제
d) 소염제.
바람직한 구체예에서, 상기 제 2 성분은: a) 항혈관신생제, b) 항전이제, 및 c) 세포독성제의 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 맥락에서 "접합물"은 적어도 하나의 제 2의 성분에 결합, 연결 또는 연합된 본 발명의 제 1 측면에 따른 항체에 의해 형성된 조합물(assembly)로서 이해된다.
본 발명의 제 1측면에 따른 항체들 또는 단편은 상기 제 1 측면의 맥락에서 설명된다.
"제 2 성분"은 본 발명의 모노클로날 항체에 의하여 그의 작용 자리로 향하는 치료 활성을 갖는 분자로서 이해된다.
상기 S100A4 단백질은 종양 세포들에서 과잉발현된다. 따라서, 본 발명의 항체들은 항종양 약물들을 발현 자리들로 향하게 하는데 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 것과 같은, "세포독성제"라는 용어는 세포 사멸을 촉진시킬 수 있고, 세포들, 특히 신속하게 증식하는 세포들, 더욱 특히 종양 세포들의 성장 감소, 성장 저지 또는 파괴 능을 갖는 약제에 관한 것이다. 세포 사멸은, 예컨대 아폽토시스(apoptosis)와 같은 임의의 메커니즘에 의해 유발될 수 있으며, 이는 이러한 원인에 제한되지는 않지만, 대사 저해, 세포골격의 조직화 방해 또는 DNA의 화학 변경에 의하여 유발될 수 있다. 상기 세포독성제라는 용어는, 작은 유기 분자들, 펩티드들, 올리고뉴클레오티드들 등을 포함하는 임의의 화학치료제; 독소들; 효소들; 시토카인들; 방사성동위원소들 또는 방사성치료제들을 포함한다.
"화학치료제"들은 이에 제한되지는 않지만, 독소루비신 및 다우노루비신과 같은 안트라사이클린 항생제들, 탁솔 및 도세탁셀과 같은 탁산류, 빈크리스틴 및 빈블라스틴과 같은 빈카 알칼로이드류, 5-플루오로우라실 (5-FU), 류코보린, 이리노테칸, 이다루비신, 미토마이신 C, 옥살리플라틴, 랄티트렉시드, 타목시펜, 시스플라틴, 카르보플라틴, 메토트렉세이트, 악티노마이신 D, 마이토잔트론, 블레녹산 또는 미트라마이신과 같은 화학 화합물들, 젬시타빈과 같은 항대사물질들로서 이해된다.
"독소"는, 본 발명의 항체와 접합하여 면역독소를 형성하는 독성제로서 이해된다. 결정된 독소들과 항체들과의 접합은 상기 독소들의 독성을 감소시켜, 이들의 치료제로서의 이용을 가능하게 하는데, 이는 그렇지 않은 경우 지나치게 독성일 수 있기 때문이다. 독소와 항체간의 결합은 화학적으로 수행되며, 그의 생물학적 활성은 보존된다. 이들의 분리는 일반적으로 항체에 의해 인식되는 타겟 세포들의 리소자임들에서, 상기 언급된 화학 결합이 리소자임들에 의해 제공된 둘러싸인(enclosed) 산성 세포 환경 내에서만 깨어지도록 하는 방식으로 일어난다. 본 발명의 맥락에서 유용한 독소들은 식물 독소, 세균성 독소, 곰팡이 또는 동물 기원의 독소들 및 그의 단편들, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 리신(ricin) A-사슬, 사포닌, 디프테리아 A-사슬, 디프테리아 독소의 활성 비결합 단편들, 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 외독소(exotoxin) A-사슬, 아브린(abrin) A-사슬, 모데신(modecin) A-사슬, α-사르신(α-sarcin), 레우라이츠 포르디(Leurites fordii) A-단백질들, 디안틴(dianthin) 단백질들, 파이톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) (PAPI, PAPII 및 PAP-S) 단백질들, 모모르디카 카란티아(Momordica charantia) 저해제, 쿠르신(curcine), 크로틴(crotin), 사포나리아 오피시날리스(Saponaria officinalis) 저해제, 젤로닌(gelonin), 마이토젤린(mitogelin), 레스트릭토신(restrictocin), 페노마이신(phenomycin), 에노마이신(enomycin) 및 트리코테신(trichothecenes)이다.
"효소들"은, 본 발명의 맥락에서 독소 또는 약물 활성화 효소들로서 이해되며, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 에토포시드(etoposide) 및 독소루비신을 활성화시키는 알칼리성 포스파타아제; 질소 머스타드(nitrogen mustards)를 활성화시키는 카르복시펩티다아제 G2; 독소루비신, 파클리탁셀 및 미토마이신을 활성화시키는 베타-락타마아제가 있다.
"시토카인들"은 면역 반응의 조절 목적을 위하여 면역체계의 세포들을 합성하는 상이한 크기들 및 분자량들의 펩티드들로서 이해되며, 이들은 호르몬, 성장인자들, 괴사 인자들, 등일 수 있다. 이들은 천연 기원 또는 재조합 세포 배양물들 및 천연 서열 시토카인들의 생물학적으로 활성인 균등물들일 수 있다. 이들의 항체와의 접합은 면역시토카인들을 유발한다. 본 발명에 유용한 시토카인들은, 이에 제한되지는 않지만, TNF 인자 알파, INF-감마, GM-GSF 인자 또는 IL-2이다.
"방사성동위원소들"은 방사성 활성인 동위원소들로서 이해되며, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 131I, 90Y, 177Lu, 188Re, 67Cu, 211At, 213Bi, 125I, 111In이다.
"항혈관신생제"는 새로운 혈관들의 형성, 즉 혈관신생을 저해 또는 감소시키는 화학적 또는 생물학적 성분으로서 이해된다. 본 발명의 제 1 측면의 항체들과 컨쥬게이트될 수 있는 항혈관신생제들의 예들은, 이에 제한되지는 않지만, 다음 군으로부터 선택되는 항혈관신생제들을 포함한다: 파클리탁셀, 2-메톡시에스타라디올, 프리노마스타트, 바티마스타트, BAY 12-9566, 카르복시아미도트리아졸, CC-1088, 덱스트로메토르판 아세트산, 디메틸잔테논 아세트산, 엔도스타틴, IM-862, 마리스타트, 페니실라민, PTK787/ZK 222584, RPI.4610, 스쿠알라민 락테이트, SU5416, 탈리도미드, 콤브레타스타틴, 타목시펜, COL-3, 네오바스타트, BMS-275291, SU6668, 항-VEGF 항체들, Medi-522 (비탁신 II), CAI, 인터류킨 12, IM862, 아밀로리드, 안지오스타틴, Kl-3 안지오스타틴, Kl-5 안지오스타틴, 캅토프릴, DL-알파-디플루오로메틸오르니틴, DL-알파-디플루오로메틸오르니틴 HCl, 엔도스타틴, 푸마길린, 허비마이신 A, 4-히드록시페닐레틴아미드, 주글론, 라미닌, 라미닌 헥사펩티드, 라미닌 펜타펩티드, 라벤두스틴 A, 메드록시프로게스테론, 미노시클린, 플라센타 태반 리보뉴클레아제 저해제, 수마린, 트롬보스폰딘, 혈관신생자극 인자들에 대항하는 항체(예로서, 아바스틴, 에르비툭스, 벡티빅스, 허셉틴); 혈관신생자극 성장 인자들의 저분자량 티로신 키나아제 저해제들(예로서, 타르세바, 넥사바르, 수텐트, 이레사); mTOR 저해제들 (예로서, 토리셀); 인터페론 알파, 베타 및 감마, IL-12, 기질 메탈로프로테나아제 저해제들 (예로서, COL3, 마리마스타트, 바티마스타트); ZD6474, SUl1248, 바이탁신; PDGFR 저해제들 (예로서, 글리벡); NM3 및 2-ME2; 시렌지티드와 같은 시클로펩티드들.
"항전이제"는 전이, 즉 암 유발 세포들의 근본적으로 림프 또는 혈류에 의한, 원거리 증식 및 상기 전이의 목적지에서 새로운 종양들의 성장을 저해 또는 감소시키는, 화학적 또는 생물학적 성분으로서 이해된다.
본 발명의 제 1 측면의 항체들과 컨쥬게이트될 수 있는 항전이제들은, 이에 제한되지는 않지만, 다음을 포함한다: 항전이제로서 작용할 수 있는, 알킬화제들과 같은 임의의 세포독성제; 5-플루오로우라실, 페메트렉시드 (MTA), 랄티트렉시드 (TDX)와 같은 항대사물질들; 시스플라틴 또는 옥살리플라틴과 같은 백금 세포독성제들; 토포아이소머라아제 저해제들; 항미세소관제들; 안트라사이클린류; 식물성 알칼로이드들; GTP아제 저해제들; 혈관신생 저해제들; 기질 메탈로프로테나아제 저해제들; 세포 사이클 조절 키나아제의 저해제들, 예컨대 사이클린-의존성 키나아제들 및 사이클린 저해제들; Wnt 신호화 저해제들; E2F 전사인자의 저해제들; 히스톤 탈아세틸화제 저해제들; AKT 키나아제 또는 ATP아제 저해제들.
상기 항체 및 다른 약제와의 접합물들은 다양한 커플링제들 또는 2관능성 단백질 링커들을 이용하여 창출될 수 있다. 링커는 세포 내에서 약제 방출을 가능하게 하는 "탈착성(detachable) 링커"일 수 있으며, 예컨대 산-불안정성(acid-labile) 링커, 펩티다아제-민감성 링커, 디메틸 링커 또는 디술파이드 함유 링커이다.
S100A4 단백질은 염증 관련 질병들에서도 발현된다. 따라서, 본 발명의 항체들은 소염제들을 발현 자리들로 향하게 하는데 사용될 수 있다.
"소염제"라는 용어는 프로스타글란딘 합성을 저해 또는 차단하는 임의의 소염제를 의미한다. 이에 제한되지는 않지만, 유용한 소염제들로는 5-아미노살리실산 및 그를 포함하는 약제들(술파살라진(sulfasalazine), 메살라민(mesalamine), 메살라진(mesalazine), 올살라진(olsalazine)); 아세틸살리실산; 코르티코스테로이들, 예컨대 하이드로코르티손, 코르티손, 트리암시놀론; 부데소나이드; 프레드니손; 데플라자코트, 메토트렉세이트; 인플릭시맙; 아달리무맙(adalimumab)이 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 접합물인 특이적 항-S100A4 항체는 모노클로날 항체, 바람직하게는 ECACC 10022401, ECACC 11051801, ECACC 11051802, ECACC 11051803 및 ECACC 11051804로부터 선택되는 하이브리도마 또는 그의 단편에 의해 생산되는 모노클로날 항체 또는 그의 단편; 보다 바람직하게는 하이브리도마 ECACC 10022401에 의해 생산되는 모노클로날 항체 또는 그의 단편이다.
따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 의약에서의 용도를 위한 본 발명의 제 1 측면에 따른 항체 또는 그의 단편을 포함하는 접합물에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 전이로부터 선택되는 질병, 원하지 않는 혈관신생 관련 질병 및 염증 관련 질병; 바람직하게는 전이로부터 선택되는 질병 및 원하지 않는 혈관신생 관련 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 의약 제조를 위한, 본 발명의 제 1 측면에 따른 항-혈관신생 활성을 갖는 특이적 항-S100A4 항체 또는 그의 단편을 포함하는 접합물의 이용에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 전이로부터 선택되는 질병, 원하지 않는 혈관신생 관련 질병 및 염증 관련 질병; 바람직하게는 전이로부터 선택되는 질병 및 원하지 않는 혈관신생 관련 질병의 예방 및/또는 치료에서의 용도를 위한, 본 발명의 제 1 측면에 따른 항-혈관신생 활성을 갖는 특이적 항-S100A4 항체 또는 그의 단편을 포함하는 접합물에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 전이로부터 선택되는 질병, 원하지 않는 혈관신생 관련 질병 및 염증 관련 질병을 앓고 있는 대상에서의 치료 또는 예방 방법에 관한 것으로, 이는 본 발명의 제 1 측면에 따른 항-혈관신생 활성을 갖는 특이적 항-S100A4 항체 또는 그의 단편을 포함하는 접합물을 상기 대상에 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 질병은 전이 및 원하지 않는 혈관신생 관련 질병으로부터 선택된다.
바람직한 구체예에서, 특이적 항-S100A4 항체는 모노클로날 항체, 바람직하게는 ECACC 10022401, ECACC 11051801, ECACC 11051802, ECACC 11051803 및 ECACC 11051804의 군으로부터 선택되는 하이브리도마 또는 그의 단편에 의해 생산되는 모노클로날 항체 또는 그의 단편; 더욱 바람직하게는 하이브리도마 ECACC 10022401에 의해 생산되는 모노클로날 항체 또는 그의 단편이다.
이들 발명의 측면들의 맥락에서 "의약(medicament)"은, 본 발명의 제 1 측면의 항체 또는 그의 단편과, 암치료, 특히 전이로부터 선택되는 질병 및 원하지 않는 혈관신생 관련 질병의 치료에 유용한 화합물 또는 염증 관련 질병의 치료에 유용한 화합물과의 접합물을 포함하는 약학 조성물로서 이해된다.
"예방", "치료", "전이", "원하지 않는 혈관신생 관련 질병" 및 "염증 관련 질병"이라는 용어는 본 발명의 치료적 용도의 맥락에서 앞서 정의되었다.
본 발명의 진단 방법
S100A4 단백질은 종양 세포들에 의한 세포외 매질 내로 분비되기 때문에, 이의 존재는 각종 생체액들 중에서 검출될 수 있어, 암 진단에 사용될 수 있다. 상기 단백질은, 류마티즘성 관절염과 같은 염증 관련 질병을 앓고 있는 환자들의 혈장 및 관절 활액에서도 발견된다.
따라서, 한 측면에서 본 발명은 다음을 포함하는, 대상에서 시험관 내 암 또는 염증 관련 질병의 진단 방법에 관한 것이다:
(a) ECACC 10022401, ECACC 11051801, ECACC 11051802, ECACC 11051803 및 ECACC 11051804로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하이브리도마에 의해 생산된 모노클로날 항체 또는 상기 항체의 기능적 변형물을 이용하므로써, 상기 대상의 생체액 중에서 S100A4 단백질 또는 그의 변형체의 수준을 검출하고;
(b) 상기 수준을 참조 값과 비교하며,
여기에서, 참조값에 비하여 S100A4 단백질 또는 그의 변형체의 증가된 수준은 암 또는 염증 관련 질병을 앓고 있는 대상을 나타낸다.
본 발명의 맥락에서, "암 진단을 위한 시험관 내 방법"은 대상에서, 환자로부터 분리된 생체액 중에 가용성인 S100A4 단백질의 존재를 검출하므로써 악성 종양의 존재를 나타내는 것을 가능하게 하는 방법으로서 이해된다. 환자들의 적당한 선택 및 최적 투여량의 결정을 가능하게 하기 위하여, S100A4 선택 약물들의 투여 전에 종양에 의해 생산된 S100A4의 발현을 증명하는데도 유용하다.
본 발명의 맥락에서, "염증 관련 질병을 진단하기 위한 시험관 내 방법"은, 환자로부터 분리된 생체액 중에 가용성인 S100A4 단백질의 존재를 검출하므로써, 대상에서 염증성 질병의 존재를 나타내는 것을 가능하게 하는 방법으로서 이해된다.
본 발명에서 "대상"은, 포유동물로서 분류되는 임의의 동물로서 이해되며, 이에 제한되지는 않지만 사육 및 농장 동물들, 영장류 및 인간들, 예로서 인간, 비-인간 영장류들, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 또는 설치류들을 포함한다. 바람직하게는, 상기 대상은 임의의 인종 또는 연령의 여성 또는 남성 인간이다. 본 발명의 맥락에서, 상기 대상은 암 또는 염증 관련 질병을 잠재적으로 앓고 있는 대상 또는 암 또는 염증 관련 질병을 앞서 진단받은 대상이다.
본 발명의 방법의 제 1 단계는 본 발명의 모노클로날 항체들을 이용하여 연구대상의 생체액 중 S100A4 단백질 또는 그의 변형체의 수준을 결정하는 것을 포함한다.
본 발명의 맥락에서 "생체액"이라는 용어는, 생리학적 또는 병리학적 여부에 관계없이, 대상의 신체에서 생산된 임의의 생물학적 분비물 또는 유체를 의미한다. 이러한 생체액은, 이에 제한되지는 않지만, 혈액, 혈장, 혈청, 기관지폐포 세척액(bronchoalveolar washing fluid), 소변, 코 분비물, 귀 분비물, 요도 분비물, 뇌척수액, 흉막액, 활액, 복막액, 복수액(ascites), 심막액(pericardial liquid), 양수, 위액, 림프액, 간질액(interstitial fluid), 타액, 담(sputum), 액체 퇴적물(liquid deposition), 눈물, 점액, 땀, 젖, 정액, 질분비물, 궤양, 물집, 종기 및 기타 표면 발진들로부터의 액체를 포함한다. 상기 샘플들은, 당업자에 의해 당 기술 수준에서 알려진 과정들, 예컨대 혈액 추출, 기관지경법(bronchofibroscopy) 동안이 주입(instilling) 및 흡출(aspirating), 대조천자(cisternal puncture), 심실천자 또는 요추 천자(lumbar puncture), 흉막 천자 또는 흉강천자(thoracocentesis), 관절 또는 활액 경피 천자, 복부 천자, 양수천자, 객담, 복강 경피 천자, 심막 경피 천자, 등에 의하여, 또는 단순 채집을 이용하여 수득될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 상기 생체액은 혈액, 혈장 및 혈청으로부터 선택되고, 바람직하게는 혈청, 보다 바람직하게는 혈장이다. 상기 혈액 샘플은 동맥 또는 정맥, 대개 팔꿈치 안쪽의 정맥 또는 손등의 정맥을 천자하므로써 전형적으로 추출되며, 상기 혈액 샘플은 기밀(air-tight) 바이알 또는 주사기 중에 수집된다. 발 뒤꿈치 또는 손가락의 끝마디뼈(distal phalanxes) 상에서의 모세혈관 천자는 미세방법(micromethod)을 이용한 분석을 위해 수행될 수 있다. 혈청은, 전혈 샘플로부터, 상기 샘플이 응고되도록 10분 동안 정치시키고 이어서 혈청(상등액)으로부터 세포들(침전물)을 분리하기 위한 목적으로 이를 1,500rpm에서 10분 동안 원심분리하므로써 항응고제 부재하에 수득될 수 있다. 그 후, 혈장 샘플을 수득하기 위하여 전혈을 항응고제와 접촉시키고, 3,000rpm에서 20분 동안 원심분리시킨다. 상기 원심분리의 침전물은 형성된 성분들에 대응하며, 상등액은 혈장에 대응한다.
수득된 혈청 또는 혈장은 본 발명의 방법에 의한 샘플 분석을 위한 저장 튜브로 이동될 수 있다.
또다른 구체예에서, 상기 생체액은 관절 윤활액이다.
S100A4 단백질의 발현 수준은 기존 방법들에 의하여 검출 및 정량화될 수 있다.
상기 방법은, 이에 제한되지는 않지만, RAGE와 같은 그의 리간드들 중 하나에 대한 이의 친화성을 측정함에 의한 S100A4의 검출 및 이후 S100A4-리간드 복합체의 정량화; 또는 ECACC 10022401, ECACC 11051801, ECACC 11051802, ECACC 11051803 및 ECACC 11051804로 이루어지는 군으로부터 선택된 하이브리도마에 의해 생산된 S100A4 단백질(또는 항원성 결정인자들을 포함하는 그의 단편) 또는 상기 항체의 기능적 변형체에 대한 특이적인 결합능을 갖는 모노클로날 항체들을 이용함에 의한 방법을 포함한다. 그 후, 결과의 항원-항체 복합체들을 정량한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명에서 사용된 항체는 하이브리도마 ECACC 10022401에 의해 생산된 항체이다.
본 발명은 상기 항체들의 기능적 변형체들의 이용도 고려한다. 본 발명의 모노클로날 항체들의 "기능적 변형체"는, 시험관 내 및 생체 내에 모두에서, 상기 모노클로날 항체들과 연관된 본 발명에 기재된 하나 이상의 기능들을 상기 모노클로날 항체들과 공유하고, 아미노산 서열에서의 최소 동일성을 갖는 임의의 분자로서 이해된다. 본 발명의 모노클로날 항체들의 기능적 변형체들은 하나 이상의 아미노산들의 삽입, 치환 또는 결실에 의하여 상기 서열들로부터 유도될 수 있고, 재조합 및/또는 합성 수단에 의해 수득될 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체들의 기능적 변형체들은 S100A4 항원에의 그들의 결합능 및 또한 혈관신생과 같은 S100A4 단백질의 하나 이상의 특징적인 기능들에 대한 저해능도 보존하고 있어야만 한다. 상기 기능들은 본 발명의 실시예들에서 설명된 방법들을 통해 결정될 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체들의 기능적 변형체들은, 상기 항체들의 폴리펩티드 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99%의 유사성 또는 동일성을 나타내는 폴리펩티드들을 포함한다. 두 폴리펩티드들 간의 동일성 정도는 컴퓨터에서 실행되는 알고리즘들 및 당업자에 널리 알려진 방법들을 이용하여 결정된다. 두 아미노산 서열들 간의 동일성은 바람직하게는 BLASTP 알고리즘을 이용하여 결정된다 (BLAST Manual, Altschul, S. 등, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., 등, J., 1990, Mol. Biol. 215:403~410).
추가적으로, 본 발명의 방법에서 사용되는 항체들은 검출제로 표지될(label) 수 있거나 또는 표지되지 않을 수 있다. 특정 구체예에서, 사용된 항체는 검출제에 컨쥬게이트된다.
본 발명의 맥락에서, "검출제(detectable agent)" 및 "라벨링(labelling)"이라는 표현은 동의어이며, 이들은 효소, 방사성 또는 형광 방법들로써 그의 검출을 가능하게 하는 성질의 약제를 의미한다. 검출 화합물은 효소, 방사성 라벨된 화합물 또는 방사성 동위원소, 형광색소(fluorochrome), 화학발광 시약, 효소성 기질 또는 보조인자(cofactor), 효소성 저해제, 입자, 염료 등일 수 있다.
방사동위원소 또는 방사성핵종들로도 명명되는 방사성 동위원소를 통해 방사성 라벨된 화합물들은, 이에 제한되지는 않지만, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I를 포함한다. 형광 표지들은 이에 제한되지는 않지만, 로다민, 인-란타나이드들 또는 FITC를 포함할 수 있다. 효소성 라벨들은, 이에 제한되지는 않지만, 호스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase), β-갈락토시다아제, 루시퍼라아제 또는 알칼리성 포스파타아제를 포함할 수 있다. 바람직한 라벨링은, 이에 제한되지는 않지만, 플루오레세인(fluorescein), 알칼리성 포스파타아제와 같은 포스파타아제, 비오틴, 아비딘, 호스래디쉬 퍼옥시다아제와 같은 퍼옥시다아제 및 비오틴 관련 화합물들 또는 아비딘 관련 화합물들(예로서, 스트렙트아비딘 또는 ImmunoPure® NeutrAvidin, Pierce, Rockford, IL로부터 입수가능)을 포함한다.
본 발명에서 사용될 수 있는 다양한 광범위한 공지된 분석들이 있으며, 이들 분석들은 일차적인 비-라벨된 항체들 및 이차적인 표지된 항체들을 이용하고; 상이러한 기술들은 웨스턴 블롯 또는 웨스턴 전달, ELISA (효소 결합 면역흡수분석: Enzyme Linked Immunosorbent Assay), RIA (방사성면역분석: radioimmunoassay), 경쟁적 EIA (경쟁적 효소 면역분석: competitive enzyme immunoassay), DAS-ELISA (이중 항체 샌드위치 ELISA: double antibody sandwich ELISA), 또는 단백질 마이크로어레이(microarrays) 또는 특이적 항체들을 포함하는 바이오칩(biochips)의 이용에 기초한 기술들 또는 반응성 스트립들(strips)과 같은 형태의 콜로이드성 침전에 기초한 분석들을 포함한다. S100A4 단백질을 검출하는 다른 방법들은 친화성 크로마토그래피, 리간드 결합 분석들 등과 같은 기술들을 포함한다.
특정 구체예에서, S100A4의 수준의 정량화는 웨스턴 블롯 또는 ELISA에 의하여 수행된다.
보다 특정의 구체예에서, S100A4 단백질 또는 그의 변형체들의 수준은 웨스턴 블롯에 의해 결정된다. 웨스턴 블롯은, S100A4에 특이적인 항체와의 인큐베이션 및 전개 시스템(예로서, 화학발광)에 의하여, 변성 조건 하에서 겔 중 전기영동을 통해 미리 용해된 단백질들의 검출, 및 막, 일반적으로 니트로셀룰로오스 막 상에서의 고정화를 기초로 한다.
또다른 바람직한 구체예에서, 진단은 ELISA에 의하여 수행된다. 상기 기술은 기질 상에 고정화된 항-S100A4 항체를 통한 샘플 중 S100A4 단백질의 검출 및 이후 제 2 항체에 의한 S100A4-항체 복합체의 검출을 기초로 한다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 "단백질"은 공유결합 또는 비공유결합들에 의해 결합된 아미노산의 분자 사슬을 의미한다. 상기 용어는 생리학적으로 관련된 모든 번역후 화학 변경 형태들을 포함한다. 본 발명의 범주 내에 속하는 번역 후 변경들은, 예로서 신호 펩티드 분할(cleavage), 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화, 이소프레닐화, 단백분해, 미리스틸화(myristoylation), 단백질 접힘 및 단백분해 과정 등을 포함한다. 추가적으로, 단백질들은 번역후 변경들에 의해 또는 번역 동안 비천연 아미노산들을 도입함에 의해 형성된 비천연 아미노산들을 포함할 수 있다.
"S100A4"라는 용어는 본 발명의 제 1 발명의 측면의 맥락에서 정의되었다. 본 발명의 진단 방법의 경우, 검출된 S100A4는, 분석될 생체액이 추출된 대상이 속하는 종에 대응하는 것이다.
상기 언급된 것과 같이, 상기 단백질의 변형체들은 본 발명의 방법에서 S100A4 단백질의 수준을 측정하는데도 사용될 수 있다.
따라서, S100A4 단백질의 변형체들은 다음과 같을 수 있다: (i) 하나 이상의 아미노산 잔기들이 보존성 또는 비보존성 아미노산 잔기로 치환된 것들 (바람직하게는 보존성 아미노산) 및 상기 치환된 아미노산 잔기는 유전암호에 의해 암호화되거나 또는 되지 않을 수 있다, (ii) 하나 이상의 변경된 아미노산 잔기들, 예로서 치환기들의 커플링에 의해 결합된 잔기들이 있는 것들, (iii) 단백질이 S100A4의 대안적인 스플라이싱(splicing) 변형체인 것들 및/또는 (iv) 단백질의 단편들. 단편들은 원래 서열의 단백분해 과정을 통해 생성된다 (다수의 자리에서의 단백 분해 포함). 상기 변형체들은 본 발명의 범주 내에 속한다.
본 발명에 따른 변형체들은 원래의 아미노산 서열에 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 96% 유사하거나 동일한 아미노산 서열들을 포함한다. 알려진 것과 같이, 상기 2개의 단백질들간의 유사성은 단백질의 아미노산 서열을 제 2의 단백질 서열과 비교하므로써 결정된다. 2 단백질들간의 동일성 정도는 컴퓨터 알고리즘들 및 당업자에 의해 널리 알려진 방법들, 바람직하게는 BLASTP 알고리즘을 이용하는 방법들을 이용하여 결정된다 [BLASTManual, Altschul, S., 등, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., 등, J. Mol. Biol. 215: 403~410 (1990)].
구체적인 구체예에서, 변형체는 포유동물, 바람직하게는 인간 변형체, 보다 바람직하게는 원래 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 96%의 유사성 또는 동일성을 갖는 변형체이다.
당업자는 본 발명의 방법이 S100A4 단백질의 발현의 절대 수준 및 상대 수준 모두를 이용하여 실시될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명에서, "S100A4 단백질의 수준"이라는 표현은 상기 단백질의 절대 수준 및 상대 수준 모두를 의미하는데 사용된다.
"절대 수준"이라는 표현은 샘플 중에서 관심 대상의 단백질의 총 량을 의미한다. 상기 값은 단위 부피 당 단위 질량들로 표시되는(즉, ng/ml 샘플) 단백질 농도, 단위 부피 당 단백질 분자 수(예로서, pmol 단백질/ml 샘플), 총 단백질 단위질량 당 S100A4 단백질 단위 질량 (pg S100A4/mg 총 단백질) 또는 총 단백질의 단위 질량 당 S100A4 분자들의 수(예로서, pmol S100A4/총 단백질 mg)로서 제공될 수 있다.
"상대 수준"이라는 표현은 연구 대상의 S100A4 단백질의 발현과 참조 단백질의 발현간의 관계를 의미하며, 즉 상기 참조 단백질에 대해 표준화된 형태의 S100A의 농도가 규정된다.
상이한 샘플들간의 단백질 값들을 표준화하기 위하여, 분석될 샘플들에서의 S100A4 단백질 수준을 대조구 단백질의 발현과 비교하는 것이 가능하다. 본 발명에서 "대조구 단백질"은 비종양 세포들에 대하여 종양 세포들에서 그 발현 수준이 변화되지 않거나 단지 제한된 양으로만 변화하는 단백질로서 이해된다. 바람직하게는, 대조구 단백질은 구조적으로 발현되는 유전자들에 의해 암호화된 단백질로, 이들 유전자들은 항상 활성이거나 또는 일정하게 전사되어, 이들 단백질들이 구조적으로 발현되고 필수적인 세포 기능들을 실시하도록 한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 바람직한 대조구 단백질들은 이에 제한되지는 않지만, β-2-마이크로글로불린 (B2M), 유비퀴틴, 18-S 리보솜성 단백질, 사이클로필린(cyclophilin), GAPDH, PSMB4, 튜불린(tubulin) 및 액틴을 포함한다.
당업자는 S100A4 단백질의 아미노산 서열에서의 돌연변이들이 그의 발현의 검출에 영향을 미치지 않으며, 따라서 아미노산 서열의 돌연변이들에 의해 생성되는 이 단백질의 변형체들이 본 발명의 범주 내에 속한다는 것을 이해한다.
샘플 중 S100A4의 발현 수준이 일단 결정되면, 단계 (a)에서 수득된 S100A4d의 수준을 참조값과 비교하는 것으로 이루어지는 본 발명의 단계 (b)를 실행한다.
"참조값"은 바람직하게는, 암에 의해 영향받지 않은 정상의 개인들로부터 분석될 생체액의 혼합물에 의해 형성된 샘플 수집물로부터 유래된다. 상기 참조값은 당 기술분야에서 잘 알려진 기술들, 예로서 건강한 대상으로부터 취한 생체액 중 측정된 S100A4 단백질의 수준의 평균을 결정함에 의하여 결정될 수 있다. 상기 참조값은 분석될 동일한 대상으로부터 취해진 구성적으로 발현된 단백질로부터 수득될 수도 있다.
일단 참조값이 수립되면, 단계 (a)에서 수득된 S100A4의 수준들의 값은 이 참조값과 비교될 수 있고, 따라서 참조값에 대하여 그 대상의 S100A4 단백질의 수준에서의 변경들을 검출가능하다. 보다 특이적으로, 본 발명의 방법에서, 참조값에 비하여 S100A4의 수준의 증가는 대상이 암 또는 염증 관련 질병을 앓고 있다는 것을 나타낸다.
본 발명의 맥락에서, 참조값에 대하여 "증가된 수준"은, 참조값에 비하여 참조값의 적어도 1.1배, 1.5배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배 또는 그 이상을 넘는 S100A4의 수준의 변화량으로서 이해된다.
따라서, 일단 상기 비교가 수행되면, 대상이 암 또는 염증 관련 질병을 앓는 경우, 본 발명의 방법은 진단을 가능하게 한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 암, 특히 췌장암 및 결장암의 진단에 적당하다.
또다른 특정 구체예에서, 본 방법은 염증 관련 질병, 바람직하게는 류마티즘성 관절염의 진단에 적당하다.
"암" 및 "염증 관련 질병"이라는 표현은 앞서 정의되었다.
S100A4의 검출방법
본 발명의 제 1 측면에서 정의된 것과 같은 항체들은 생체액과 상이한 다른 유형의 생물학적 샘플들 중 S100A4를 검출하는데도 유용하다. 상기 검출 과정들은, 그 세포들이 S100A4 단백질을 발현하는 세포들인, 암 또는 염증 관련 질병들의 진단 및/또는 예후에 유리하게 적용된다.
이들 항체들은 면역형광, 유세포 분석, 친화성 크로마토그래피 또는 면역침강과 같은 표준 기술들에 의하여 S100A4 단백질을 발현하는 세포들 및 조직들을 확인하는데 사용될 수 있다. 예로서, 본 발명의 모노클로날 항체는 S100A4 단백질을 발현하는 종양 세포의 확인을 촉진할 수 있으며, 대상에서 암 진단을 가능한다.
따라서, 또다른 측면에서, 본 발명은 다음 단계들을 포함하는, 대상에서 암 또는 염증 관련 질병의 시험관 내 진단방법에 관한 것이다:
(i) ECACC 10022401, ECACC 11051801, ECACC 11051802, ECACC 11051803 및 ECACC 11051804의 군으로부터 선택된 하이브리도마에 의해 생산된 특이적 항-S100A4 모노클로날 항체 또는 상기 항체의 기능적 변형체에 의하여, 상기 대상의 세포 또는 조직에서 S100A4 단백질 또는 그의 변형체의 수준을 검출하는 단계
(ii) 상기 수준을 참조 값과 비교하는 단계,
여기에서, 참조값에 대하여 S100A4 단백질 또는 그의 변형체의 증가된 수준은 암 또는 염증 관련 질병을 앓는 대상을 나타낸다.
"시험관 내 방법"이라는 표현은, 샘플을 취한 대상으로부터 분리된 그 생물학적 샘플 중에서 상기 방법을 실시한다는 것을 의미한다. 상기 생물학적 샘플은 혈액 세포, 상피 세포, 생식세포 등과 같은 세포 또는 조직의 생검 샘플일 수 있다.
"S100A4 단백질의 수준", "변형체", "참조값" 및 "증가된 수준"이라는 표현은 본 발명의 진단 방법의 맥락에서 이미 정의되었다.
검출은 라벨링 기에 대한 항체의 커플링(즉, 물리적 결합)을 통하여 촉진될 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 다음 단계들을 포함하는, 샘플 중 S100A4의 검출 방법에 관한 것이다:
(i) S100A4를 포함하는 것으로 의심되는 샘플을, 본 발명의 제 1 측면에서 정의된 것과 같은 특이적 항-S100A4 항체 또는 그의 단편과 접촉시키는 단계; 및
(ii) S100A4와 항체 또는 그의 단편 사이의 면역 복합체들의 형성을 검출하는 단계,
상기 S100A4와 상기 항체 사이의 면역 복합체들의 검출은 샘플 중 S100A4의 존재를 나타낸다.
S100A4 검출 방법의 바람직한 구체예에서, 특이적 항-S100A4 항체는 ECACC 10022401, ECACC 11051801, ECACC 11051802, ECACC 11051803 및 ECACC 11051804의 군으로부터 선택되는 하이브리도마에 의해 생산되는 모노클로날 항체 또는 상기 항체의 기능적 변형체이다.
본 발명의 모노클로날 항체들이 S100A4 단백질을 인식한다는 가정 하에, 이들은 샘플로부터 상기 단백질을 정제하는데 사용될 수 있다.
바람직하게는, S100A4의 정제에서의 용도를 위하여, 본 발명의 제 1측면의 모노클로날 항체들은 이들을 지지체 또는 기질과 연합하므로써 사용된다. 원칙적으로, 임의의 유형의 지지체는 본 발명의 방법들에서 사용될 수 있으나, 폴리머 유형의 지지체들, 예컨대 세파덱스(Sephadex), 덱스트란, 수가용성인 폴리아미노산, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리글루탐산 (PGA), 폴리락트산(PLA), 폴리락트-코-글리콜산(PLGA), 폴리((D,L-락티드-코-글리콜리드) (PLA/PLGA), 폴리(히드록시알킬메타크릴아미드), 폴리글리세롤, 폴리아미도아민 (PAMAM) 및 폴리에틸렌이민 (PEI)이 바람직하다.
전형적으로, 본 발명의 제 1측면의 모노클로날 항체들을 이용한 S100A4의 정제는 다음 단계들을 포함하는 과정을 통하여 실시된다:
(i) S100A4 단백질이 그로부터 정제되어질 샘플을, 항체와 S100A4 단백질간의 결합이 일어나기 적당한 조건 하에서 지지체 상에 고정된, ECACC 10022401, ECACC 11051801, ECACC 11051802, 11051803 및 ECACC 11051804의 군으로부터 선택되는 하이브리도마에 의해 생산된 항체 또는 그의 단편과 접촉시키는 단계;
(ii) 단계 (i)에서 형성된 복합체들을 세척하여, 지지체-항체 접합물에 비특이적으로 결합된 샘플로부터 모든 화합물들을 제거하는 단계; 및
(iii) 상기 화합물에 결합된 상기 S100A4 단백질을 용리하는 단계.
본 발명의 S100A4 단백질의 정제방법은, 예로서 친화성 크로마토그래피 컬럼들을 포함하는, 친화성에 의한 임의의 알려진 단백질 정제 방법을 이용하여 실시될 수 있으며, 상기 컬럼의 정지상은 고체 지지체에 컨쥬게이트된 본 발명의 제 1 측면에 따른 모노클로날 항체들에 의해 형성된다.
본 발명의 키트들 및 그들의 용도
또다른 측면에서, 본 발명은 생체액 중 암 또는 염증 관련 질병을 진단하기 위한 키트에 관한 것으로, 본 발명의 제 1 측면에 따른 적어도 하나의 항체 또는 단편을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 항체는 ECACC 10022401, ECACC 11051801, ECACC 11051802, 11051803 및 ECACC 11051804의 군으로부터 선택되는 하이브리도마에 의해 생산되는 항체 또는 그의 단편이다. 특정 구체예에서, 상기 질병은 암, 바람직하게는 췌장암 또는 결장암이다. 또다른 바람직한 구체예에서, 상기 질병은 염증 관련 질병, 바람직하게는 류마티즘성 관절염이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 대상의 생체액에서 암 또는 염증 관련 질병을 진단하기 위해 앞서 정의된 것과 같은 키트의 용도에 관한 것이다.
특정 구체예에서, 상기 질병은 암, 바람직하게는 췌장암 또는 결장암이다. 또다른 바람직한 구체예에서, 상기 질병은 염증 관련 질병, 바람직하게는 류마티즘성 관절염이다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 "키트(kit)"라는 용어는, S100A4의 수준을 검출하는데 적당한 시약들의 세트와 하나 이상의 유형의 요소들 또는 성분들의 조합물을 의미한다 (예로서, 다른 유형들의 생화학 시약들, 용기들, 그의 상업적 판매에 적당한 포장, 시약들이 결합되는 기질들, 전자 하드웨어 성분들, 등).
본 발명에서, "S100A4의 수준을 검출하는데 적당한 시약들"은 ECACC 10022401, ECACC 11051801, ECACC 11051802, ECACC 11051803 및 ECACC 11051804의 군으로부터 선택되는 하이브리도마에 의해 생산된 특이적 항-S100A4 모노클로날 항체 또는 그의 단편 및 선택적으로 하나 이상의 구조적 단백질을 검출하기 위한 시약들로서 이해된다.
당업자에 의해 이해될 것이나, 본 발명의 키트의 항체들은 생체액의 분석에 적당한 것으로 알려진 단백질 수준 결정을 위한 모든 기술들에서 사용될 수 있으며, 예컨대 웨스턴 블롯 또는 웨스턴 전달, ELISA, RIA, 경쟁적 EIA, DAS-ELISA, 바이오칩의 이용에 기초한 기술들, 단백질 마이크로어레이, 반응성 스트립들 중 콜로이드성 침전 등이 있다.
항체들은, 항체들의 지지체에 대한 고정을 용이하게 하기 위하여 임의로 처리된, 막, 플라스틱 또는 유리와 같은 고체 지지체에 고정될 수 있다. 상기 고체 지지체는, S100A 단백질을 특이적으로 인식하고, 상기 단백질의 발현 수준을 검출하는데 사용될 수 있는 항체들의 세트를 적어도 포함한다.
본 발명의 키트들은 구조 유전자에 의해 암호화된 단백질을 검출하기 위한 시약들을 추가적으로 포함한다. 상기 추가적인 시약들의 이용성은 생체마커들의 발현에서의 차이들이, 샘플에서 총 단백질 양의 상이한 양으로 인해, 발현의 상대 수준에서 실제 차이들보다 더욱 나는 것을 배재하여, 상이한 샘플들(예로서, 분석될 샘플 및 대조구 샘플)에서 수행된 측정들을 표준화하는 것을 가능하게 한다. 본 발명에서 구조 유전자들은 항상 활성이거나 또는 일정하게 전사되는 유전자로, 구조적으로 발현된 단백질들을 암호화하고 필수적인 세포 기능들을 실시한다. 구조적으로 발현되고 본 발명에서 사용되는 단백질들은 제한 없이, β-2-마이크로글로불린 (B2M), 유비퀴틴, 18-S 리보솜성 단백질, 시클로필린, GAPDH, PSMB4, 튜불린 및 액틴을 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 구체예들 모두는 본 발명의 키트들 및 그들의 용도에 적용가능하다.
맞춤(customizing) 치료 방법
본 발명자들은, 본 발명의 모노클로날 항체를 이용한 암을 앓고 있는 대상의 치료가 치료 전 더 높았던 순환성 S100A4 단백질 전체를 차단한다는 것을 발견하였다.
따라서, 또다른 측면에서, 본 발명은, 다음 단계들을 포함하는 암으로 진단받은 대상에 대해 맞춤화된 치료를 설계하는 시험관 내 방법에 관한 것이다:
(i) 상기 대상의 생체액 중 S100A4 단백질 또는 그의 변형체의 수준을 결정하는 단계, 및
(ii) 상기 S100A4 단백질의 수준을 참조값과 비교하는 단계로,
상기 참조 수준에 대하여 S100A4 단백질 또는 그의 변형체의 증가된 수준은, 환자가 항-혈관신생 활성을 갖는 특이적 항-S100A4 항체 또는 상기 항체의 항-혈관신생 활성을 실질적으로 보존하고 있는 그의 단편으로 치료되어야 함을 나타내고, 여기에서 상기 항체는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된다:
(a) 서열 ELPSFLGKRT (서열번호: 3)을 포함하는 S100A4의 에피토프를 인식하는 항체,
(b) 서열 EGFPDKQPRKK (서열번호: 24)를 포함하는 S100A4의 에피토프를 인식하는 항체 및
(c) 하이브리도마 ECACC 11051804에 의해 생산되는 항체.
"맞춤화된 치료를 설계한다"는 표현은, 상기 방법에 의해 수득된 결과들이, 상기 대상이 본 발명의 모노클로날 항체들을 이용한 치료에 후보자인지의 여부를 결정하는데 유용함을 의미한다.
"대상"이라는 표현은, 암을 진단받은 인간 및 인간이 아닌 동물들을 의미한다. 인간이 아닌 동물들은 모든 척추동물들, 예로서 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 영장류 및 비-인간 영장류들, 양, 개, 토끼, 쥐, 마우스, 소, 닭, 양서류들, 및 파충류들을 포함한다.
"암", "S100A4 단백질", "상기 단백질의 변형체", "생체액", "모노클로날 항체", "하이브리도마", "항체의 기능적 변형체"는 앞서 정의되었다.
본 발명의 측면의 맥락에서, 상기 대상은 적어도 본 발명의 모노클로날 항체로 처리되기 위하여 선택되며, S100A4의 수준을 감독하기 위하여 동일한 항체가 사용된다. S100A4 단백질의 수준이 참조 수준보다 높은 경우, 상기 대상은 투여된 본 발명의 모노클로날 항체를 이용한 치료에 대한 후보자가 된다.
S100A4 단백질의 발현 수준은, 환자로부터의 샘플 중에서 상기 단백질을 검출 및 정량하는 것을 가능하게 하는 임의의 통상적인 방법에 의하여 정량화될 수 있다. 이 분석에서 사용된 항체들은 표지되거나 혹은 되지 않을 수 있다. 사용될 수 있는 마커들의 예시적인 예들은 방사성 동위원소, 효소, 형광단들(fluorophores), 화학발광 시약, 효소성 기질 또는 보조인자, 효소성 저해제, 입자, 염료 등을 포함한다.
본 발명에 사용될 수 있는, 비-라벨된 항체들 (일차 항체) 및 라벨된 항체들(이차 항체)을 이용하는, 알려진 다양한 분석들이 있으며; 이들 기술들은 웨스턴 블롯, ELISA (효소 결합 면역흡수분석), RIA (방사성면역분석), 경쟁적 EIA (경쟁적 효소 면역분석), DAS-ELISA (이중 항체 샌드위치 ELISA), 면역세포화학 및 면역조직화학적 기술들, 단백질 바이오칩들 또는 특이적 항체들을 포함하는 마이크로어레이들의 사용에 기초한 기술들 또는 딥스틱들(dipsticks)과 같은 형태들에서 콜로이드성 침전에 기초한 분석들을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 단계 (i)에서 S100A4 단백질의 수준의 결정은 ECACC 10022401, ECACC 11051801, ECACC 11051802, ECACC 11051803 및 ECACC 11051804로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하이브리도마에 의해 생산된 모노클로날 항체 또는 상기 항체의 기능적 변형체를 이용하므로써 실시된다.
특정 구체예에서, S100A4 단백질의 수준은 웨스턴 블롯, 면역조직화학 또는 ELISA로써 정량화된다.
본 발명의 다른 측면들
본 발명은, 본 명세서에서 제시된 구체예들 중 어느 하나에 따른 항체 또는 그의 단편 또는 모노클로날 항체의, 대상에서 종양 또는 임의의 다른 S100A4 매개 질병들의 확인, 위치, 평가, 진단, 예후 또는 감독을 위한 마커로서의 이용을 제공한다.
본 발명은, 여기 제시된 구체예들 중 어느 하나에 따른 항체 또는 그의 단편 또는 모노클로날 항체를 포함하는 생성물 및 항암제를, 종양 치료에서 동시, 분리 또는 순차적인 이용을 위한 병용 제제로서 더욱 제공한다.
본 발명은, 여기 제시된 구체예들 중 어느 하나에 따른 항체 또는 그의 단편 또는 모노클로날 항체를 포함하는 생성물 및 치료제를, S100A4 매개 질병들의 치료에서 동시, 분리 또는 순차적인 이용을 위한 병용 제제로서 더욱 제공한다.
종양 치료를 위한 의약으로서의 용도를 위한 인간 또는 쥐과의 S100A4 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편.
정의
"S100A4", "S100A4 단백질", "S100 칼슘-결합 단백질 A4", "칼슘 단백질", "칼바스쿨린(calvasculin)", "메타스타신(metastasin)", "쥐과 태반 상동체(murine placental homolog)", "MTS1", "CAPL", "p9Ka", "18A2", "pEL98", "42A", "FSP1", "섬유아세포-특이적 단백질-1", "악성 형질전환 억제 1", "백혈병 다중약물 내성 연관 단백질", "OTTHUMP00000015469", "OTTHUMP00000032895"이라는 표현은 상호변경가능하게 사용되며, 인간 또는 쥐과의 S100A4의 변형체들, 아이소폼들(isoforms), 종 상동체들, 및 인간 또는 쥐과의 S100A4와 적어도 하나의 공통된 에피토프를 갖는 유사체들도 포함한다.
인간 S100A4에 대한 완전한 cDNA 서열은 Genbank 기탁번호 M80563(1994. 10. 31)를 갖는다.
쥐과의 S100A4 완전한 cDNA 서열은 Genbank 기탁번호 D00208 (1997.12.5)를 갖는다.
인간 S100A4에 대한 완전한 단백질 서열은 UniProt 기탁번호 P26447 (1992.8.1)를 갖는다:
서열번호: 21
MACPLEKALDVMVSTFHKYSGKEGDKFKLNKSELKELLTRELPSFLGKRTDEAAFQKLMSNLDSNRDNEVDFQEYCVFLSCIAMMCNEFFEGFPDKQPRKK
쥐과의 S100A4에 대한 완전한 단백질 서열은 UniProt 기탁번호 P07091 (1988. 4. 1)을 갖는다.
"항체"라는 용어는, 가장 광범위한 의미에서 본 명세서에서 사용되며, 이들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 모노클로날 항체들 (전장의 모노클로날 항체들 포함), 폴리클로날 항체들, 다중특이적 항체들 (예로서, 2특이적 항체들), 및 항체 단편들을 망라한다.
온전한 "항체"는 이황화물 결합들에 의해 내부결합된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 이종성다중결합성(heteromultimeric) 당단백질들을 포함한다. 전형적으로, 각 경쇄는 하나의 공유결합 2황화물 결합에 의하여 중쇄에 연결되는 한편, 상이한 면역글로불린 아이소타입(isotype)의 중쇄들간의 2황화물 결합들의 수는 다양하게 변화된다. 각 중쇄 및 경쇄는 사슬내부(intrachain) 2황화물 브릿지들(bridges)도 갖는다. 각 중쇄는 한 말단에서 중쇄 가변 영역 (본 명세서에서 HCVR 또는 VH로 약어표기됨)에 이어 중쇄 불변 영역을 갖는다. 상기 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3, 3개의 도메인들로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 명세서에서 LCVR 또는 VL로 약어표기됨) 및 경쇄 불변 영역을 그의 다른 말단에 갖는다. 상기 경쇄 불변 영역은, 하나의 도메인 CL로 구성된다. 상기 VH 및 VL 영역들은, 상보성 결정 영역 (CDR)로 명명되는, 과변이(hypervariability)의 영역들, 프레임워크 영역들(framework regions: FR)로 명명되는, 산재된 보다 보존적인 영역들로 더욱 세분될 수 있다. 각 VH 및 VL은 3개의 CDRs 및 4개의 FRs로 구성되며, 이는 다음 순서로 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 불변 영역들은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관련되지는 않지만, 항체 의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)에서의 참여, Fc 수용체에의 결합을 통한 대식작용, 신생아기 Fc 수용체 (FcRn)를 통한 반감기/소거율(clearance rate) 및 보체 캐스캐이드의 C1q 성분을 통한 보체 의존성 세포독성과 같은 각종 이펙터 작용들을 나타낸다.
"단편"이라는 용어는, 항체를 의미하는 경우에는, 인간 또는 쥐과의 S100A4에 결합하는 능력을 보유하는, 일부 중쇄 또는 경쇄 가변 서열을 포함하는 항체의 항원 결합 단편들을 의미한다. 단편들의 예들은, 이에 제한되지는 않지만, (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어지는 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 2황화물 브릿지 결합에 의하여 연결된 2개의 Fab 단편들을 포함하는 2가 단편인, F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인들로 이루어지는 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 팔(arm)의 VL 및 VH 도메인들로 이루어지는 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 이루어지는 dAb 단편 (Ward 등, (1989) Nature 341:544~546); 및 (vi) 독립된 상보성 결정 영역 (CDR). 단편들은 재조합 기술, 온전한 항체들의 효소적 또는 화학적 분할, 예로서 파파인 분해(예로서, WO94/29348 참조)에 의해 제조될 수 있다.
나아가, Fv 단편의 2 도메인들 VL 및 VH는 별개의 유전자들에 의해 암호화되지만, 이들은 재조합 방법들을 이용하여, 그들이 단일한 단백질 사슬로서 제조되는 것을 가능하게 하는 합성 링커에 의하여 결합될 수 있으며, 상기 단일 단백질사슬에서 VL 및 VH 영역들은 짝을 이루어 1가 분자들을 형성한다 (단일 사슬 Fv (scFv)로서도 알려짐; See, e.g., Bird 등. (1988) Science 242:423~426; 및 Huston 등, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879~5883). 이러한 단일 사슬 항체는 참고로 "항체"라는 용어에 포함된다.
"모노클로날 항체"라는 용어는 균질한 분자 조성의 항체 분자들의 제제, 즉 개체군을 포함하는 개별적인 항체들이, 소량으로 존재할 수 있는 자연적으로 일어나는 가능한 돌연변이들을 제외하고, 동일한 것을 의미한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프 또는 항원 결합 자리에 대하여 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다. 모노클로날 항체들은 단일 고유 부모 세포 및 종양 혈장 세포의 B-세포 클론 자손의 융합물의 잡종 세포 생성물에 의하여 생산된다. 나아가, 전형적으로 상이한 결정인자들(에피토프들)에 대항하는 상이한 항체들을 포함하는 폴리클로날 항체 제제들과 대조적으로, 각 모노클로날 항체는 항원에 대한 단일한 결정인자에 직접 대항한다.
"디클로날(diclonal) 항체"라는 표현은 쥐과의 또는 인간 S100A4에 대한 적어도 2개의 항체들의 제제를 의미한다. 전형적으로, 상이한 항체들은 상이한 에피토프들에 결합한다.
"올리고클로날(oligoclonal) 항체"라는 표현은 쥐과 또는 인간 S100A4에 대한 3개 내지 100개의 상이한 항체들의 제제를 의미한다. 전형적으로, 이러한 제제 중의 항체들은 일정 범위의 상이한 에피토프들에 결합한다.
"폴리클로날 항체"라는 표현은 상이한 B-세포주들로부터 유래된 쥐과 또는 인간 S100A4에 대한 1 이상(2 이상)의 상이한 항체들, 즉 특이적 항원 (S100A4)에 대하여 분비되는 면역글로불린들의 혼합물의 제제를 의미한다. 이러한 제제는 일정 범위의 상이한 에피토프에 결합하는 항체들을 포함한다.
"2특이적 항체"라는 표현은 2개의 상이한 결합 특이성을 갖는 항체를 의미하며, 예로서 미국특허 5,922,845 및 5,837,243; Zeilder (1999) J. Immunol. 163:1246~1252; Somasundaram (1999) Hum. Antibodies 9:47~54; Keler (1997) Cancer Res. 57:4008~4014 참조. 예로서, 2특이적 항체는 세포 표면 항원에 대한 하나의 결합자리 및 이펙터 세포의 표면 상에서 Fc 수용체에 대한 제 2 결합자리를 가질 수 있다. 예시적인 2특이적 항체들은 B-세포 표면 마커의 2개의 상이한 에피토프들에 결합할 수 있다. 상기 항체들 중 다른 것들은 제 1 B-세포 마커에 결합할 수 있으며, 추가적으로 제 2 B-세포 표면 마커에 결합할 수 있다. 다르게는, 항 B-세포 마커의 결합 팔은 백혈구 중의 촉발(triggering) 분자, 예컨대 T-세포 수용체 분자 (예로서, CD2 또는 CD3), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체 (FcyR), 예컨대 FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) 및 FcyRIII (CD 16)에 결합하는 팔과 결합하여, 세포 방어 기작이 B-세포에 집중되도록 할 수 있다. 2특이적 항체들은 B-세포에 대항하여 세포독성제들의 위치를 정하는데 사용될 수도 있다. 이들 항체들은 림프구의 마커에 대한 결합팔 및 세포독성제에 결합하는 팔을 갖는다 (예로서, 사포린(saporin), 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신 A-사슬, 메토트렉세이트 또는 방사성 햅텐 동위원소). 2특이적 항체들은 전체 항체들로서 또는 항체 단편들로서 제조될 수 있다 (예로서, F(ab)2 2특이적 항체들).
2특이적 항체들은 디아바디드를 더 포함한다. 디아바디들은 2가, 2특이적 항체들로, 여기에서 VH 및 VL 도메인들은 단일 폴리펩티드 사슬 상에서 발현되지만, 동일한 사슬 상의 2개의 도메인들간의 결합쌍을 형성(pairing)하기에는 너무 짧은 링커를 이용하므로써, 도메인들이 또다른 사슬의 상보적 도메인들과 결합쌍을 형성하도록 하여 2개의 항원 결합 자리들을 생성한다(예로서, Holliger, P., 등. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444~6448; Poljak, RJ., 등. (1994) Structure 2:1121~1123).
"다중특이적 항체"라는 표현은, 그 항체가 적어도 3개의 결합 자리들 또는 특이성들을 갖는다는 것을 의미한다.
"에피토프"라는 용어는, 항체에 대한 특이적 결합을 가능하게 하는 단백질 결정인자, 또는 항체가 그의 Ag에 결합하는 장소, 또는 나아가 T-세포 수용체가 결합하는 MHC 분자 중에 존재하는 펩티드를 의미한다. 에피토프들은 아미노산들 또는 당 곁사슬들과 같은 분자들의 화학적으로 활성인 표면 그룹화물(groupings)로 이루어지며, 일반적으로 특이적인 3차원 구조적 특징들 및 특이적 전하 특징들을 갖는다. 입체구조적(conformational) 및 비-입체구조적 에피토프들은, 입체구조에 대한 결합은 변성 용매의 존재 하에서 소실되지만 비-입체구조적 에피토프들은 그렇지 않다는 점에서 구분된다.
"분리된"이라는 표현은 그의 천연 환경으로부터 확인되고 분리되거나 또는 제거되는 것을 의미한다. 예로서, 생물체에 자연적으로 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 분리된 것이 아니지만, 그의 천연 상태의 공존 물질들로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 "분리된" 것이며, 이에 제한되지는 않지만, 그 세포가 그 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 분리되어 나온 세포들과 동일한 종들 또는 유형이라 하더라도, 그러한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 세포 내로 다시 도입되는 경우도 포함한다
"항원에 대항하여 면역 반응을 유도하는데 효과적인 약제"라는 표현은, 면역 반응들의 자극제로서 작용하여, 그 자신에서 임의의 특이적 항원 효과를 갖지 않으면서 백신에 대한 반응을 증가시키는 작용을 하는 본 발명의 모노클로날 항체와 상이한 물질을 의미한다. 이러한 약제는 당 분야에서 보조제(adjuvant)로도 알려져 있다. 예로서, 지질 A, 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis) 또는 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 유도된 단백질들, 프로인트(Freund's) 불완전 보조제 및 완전 보조제 (Difco Laboratories, Detroit, Mich.); 머크 보조제 65(Merck Adjuvant 65) (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.); 알루미늄염들, 예컨대 수산화알루미늄 겔(알륨) 또는 인산알루미늄; 칼슘, 철 또는 아연의 염들; 아실화 티로신 아실화 당류의 불용성 현탁액; 양이온적으로 또는 음이온적으로 유도체화된 다당류; 폴리포스파겐 생분해성 중심체들(microspheres); 모노포스포릴 지질 A 및 퀼(quil) A를 포함한다. 시토카인들, 예컨대 GM CSF 또는 인터류킨-2, 인터류킨-7, 또는 인터류킨-12도 보조제들로서 사용될 수 있다.
"특이적으로 결합한다"는 표현은, 항체들 및 그의 항원 결합 단편들을 의미하는 경우, 상기 항체가 쥐과의 또는 인간 S100A4에 결합하며, 다른 쥐과의 또는 인간 단백질들에 결합하지 않거나 무의미한 정도로 결합한다는 것을 나타낸다. 그러나, 상기 표현은 본 발명의 항체들이 S100A4의 다른 형태들과 교차반응성일 수도 있다는 사실을 배제하는 것은 아니다. "특이적으로 결합한다"는 표현은, 단백질들 및 다른 생물학적 약제들(biologics)의 이종성 개체군 중 단백질의 존재를 결정하는 결합 반응을 의미한다. 전형적으로, 상기 항체는 적어도 약 1×106 M-1 또는 107 M-1, 또는 약 108 M-1 내지 109 M-1, 또는 약 1010 M-1 내지 1011 M-1 또는 그 이상의 결합 상수(Ka)로 결합하며, 예정된 항원 또는 밀접하게 관련된 항원 외에, 비특이적 항원(예로서, BSA, 카제인)에의 결합에 대한 그의 친화성보다 적어도 2배 더 큰 친화성으로 예정된 항원에 결합한다. "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"라는 표현은 본 명세서에서 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"라는 표현과 상호변경가능하게 사용된다.
"특이적으로 결합한다" 또는 "특이적 결합"이라는 표현은, 펩티드를 지칭하는 경우, 타겟 분자에 대하여 배타적으로 또는 현저하게, 중간 또는 높은 결합 친화성을 갖는 펩티드 분자를 의미한다. 상기 "특이적으로 결합한다"는 표현은 단백질 또는 다른 생물학적 약제들의 이종성 개체군의 존재 하에서 타겟 단백질의 존재를 결정하는 결합 반응을 의미한다. 따라서, 지정된 분석 조건 하에서, 상기 특정된 결합 부분들은 특정 타겟 단백질에 우선적으로 결합하고, 시험 샘플에 존재하는 다른 성분들에 현저한 양으로 결합하지 않는다. 그러한 조건 하에서 타겟 단백질에 대한 특이적 결합은 특정 타겟 항원에 대한 그의 특이성에 대하여 선택된 결합 부분을 필요로 할 수 있다. 특정 단백질과 특이적으로 반응하는 리간드들을 선택하기 위하여 다양한 분석 형태들이 사용될 수 있다. 예로서, 인간 또는 쥐과의 S100A4와 특이적으로 반응하는 펩티드들을 확인하기 위하여 고체상 ELISA 면역분석, 면역침강, 바이아코어(Biacore) 및 웨스턴 블롯이 사용된다. 전형적으로, 특이적 또는 선택적 반응은 적어도 2배의 백그라운드 신호 또는 노이즈일 것이며, 보다 전형적으로는 10배 이상의 백그라운드일 것이다.
본 발명의 항체 및 그의 항원 결합 단편과 관련하여 본 명세서 전체에 걸쳐 사용된 "차단한다(blocks)"라는 표현은 인간 또는 쥐과의 S100A4의 생물학적 활성이 본 발명의 항체들 및 항원 결합 단편들의 존재시, 이들의 부재시 인간 또는 쥐과의 S100A4의 활성에 비하여 감소된다는 것을 의미한다. 차단은 이에 제한되지는 않지만, 하나 이상의 리간드 결합을 중화, 수용체의 리간드 활성화를 방지, 인간 또는 쥐과의 S100A4를 하향조절(down regulateing)하거나 또는 이펙터 기능성에의 영향을 미치는 것에 기인할 수 있다. 봉쇄(blockade) 수준은 몇가지 방법들, 예로서 하기 실시예에서, 단백분해활성, 세포 이동, 종양 발생, 종양 혈관신생 및 종양 유포(전이)에서 설명되는 바와 같은 분석들의 이용에 의하여 측정될 수 있다.
항체 또는 그의 항원 결합 단편이 차단할 수 있다면, 이는 쥐과 또는 인간 S100A4 결합 단백질 및 그의 수용체간의 상호작용의 저해를 나타내는 것이다.
"인간 또는 쥐과의 S100A4 단백질의 작용 메커니즘"이라는 표현은 S100A4 단백질의 세포내 및 세포외 기능 각각을 의미한다. S100A4 단백질의 세포내 기능은 이러한 세포 운동성, 침입, 세포 분할 및 생존과 같은 중요한 세포 기능들을 방해하고(Kriajevska MV 등, J Biol Chem 1994. 269(31):19679~82 and Grigorian M 등, J Biol Chem 2001. 276(25):22699~708); 몇몇 세포내 타겟 단백질들, 예컨대 비-근육 미오신 II (Kriajevska MV 등, J Biol Chem 1994. 269(31):19679~82 and Ford HL 등, Oncogene 1995. 10(8):1597~1605); 및 립프린β1(Liprinβ1) (Kriajevska M 등, J Biol Chem 2002. 277(7):5229~35)의 중쇄에의 결합 및 그들의 조절; 종양 억제제 단백질 p53와의 상호작용 및 그의 전사촉진(transactivation) 기능을 제어하고 그에 의하여 세포-특이적 방식으로 차별적으로 p53-타겟 유전자 발현을 조정한다 (Grigorian M 등, J Biol Chem 2001. 276(25):22699-708). S100A4 단백질의 세포외 기능들은, 종양 세포 운동성, 생존 및 아폽토시스의 세포특이적 조정자(modulator); 혈관신생 인자로서의 작용(Ambartsumian N 등, Oncogene 2001. 20(34):4685~95; Pedersen MV 등, J Neurosci Res 2004. 77(6):777~86; Belot N 등, Biochim Biophys Acta 2002. 1600(1~2):74~83 및 Pedersen KB 등, BMC Cancer 2004. 19;452); 전이-촉진제; 종양의 혈관망 증진제; 신생혈관화의 자극제; 내피 세포 운동성의 증가; 종양 세포 세포골격의 리모델링(remodeling); 세포 운동성 및 접착 촉진; 단백분해적으로 활성인 MMPs의 유도를 통한 세포외 기질의 분해 촉진 기능들을 포함한다. 세포외 S100A4 기능들은, 수용체 RAGE에 결합하고, 신호 형질도입 또는 내면화(internalization)에 이어 세포내 타겟 단백질들(p53, 비근육성 미오신 및 기타)과의 상호작용을 통한 일련의 캐스캐이드 반응들을 촉발시킴에 의한, 종양 내피 세포들을 타겟하는 기능들도 포함한다. 그 결과, 종양 세포들은 더욱 전진된 전이성 표현형 활성을 획득한다. 추가적인 세포외 S100A4 기능들은 내피 세포들의 타겟팅, 그에 의한 그들의 운동성의 자극, 종양 혈관신생의 증진, 및 따라서 전이성 유포에 대한 경로를 제공하는 것을 포함한다 (Schmidt-Hansen B 등, J Biol Chem 2004. 279(23):24498~504).
IgG 항체에 대한 "높은 친화성"이라는 표현은, 적어도 약 107M-1, 적어도 약 108M-1, 적어도 약 109M-1, 적어도 약 1010M-1, 적어도 약 1011M-1 또는 적어도 약 1012M-1 또는 그 이상, 예로서 1013M-1 또는 1014M-1 또는 그 이상의 평형 결합 상수(Ka)를 의미한다. 그러나, "높은 친화성" 결합은 다른 항체 아이소타입들에 따라 변화할 수 있다.
여기 사용된 것과 같은, "Ka"라는 표현은, 특히 항체-항원 상호작용의 평형 결합 상수를 의미하고자 하는 것이다. 이 상수는 1/M의 단위를 갖는다.
여기 사용된 것과 같은, "Kd"라는 표현은, 특정 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 의미하고자 하는 것이다. 이 상수는 M의 단위를 갖는다.
여기 사용된 것과 같은, "ka"라는 표현은, 특정 항체-항원 상호작용의 동적 결합 상수를 의미하고자 하는 것이다. 이 상수는 1/Ms의 단위를 갖는다.
여기 사용된 것과 같은, "kd"라는 표현은, 특정 항체-항원 상호작용의 동적 평형 해리 상수를 의미하고자 하는 것이다. 이 상수는 1/s의 단위를 갖는다.
"특정 항체-항원 상호작용"이라는 표현은 평형 및 동적 상수들이 측정되는 실험되는 조건을 의미한다.
"아이소타입"이라는 표현은, 중쇄 불변영역 유전자들에 의하여 암호화되는 항체 부류(예로서, IgM 또는 IgG1)를 의미한다.
"핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"라는 표현은 DNA 분자 및 RNA 분자들을 포함하고자 하는 것이다. 핵산은 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있다.
인간 또는 쥐과의 S100A4에 결합하는 항체들 또는 그의 항체 단편들(예로서, VR, VL, CDR3)을 암호화하는 핵산들과 관련하여 "분리된 핵산" 또는 "분리된 폴리뉴클레오티드"라는 표현은, 핵산으로서 여기에서 항체 또는 항체 부분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열들이, 인간 또는 쥐과의 S100A4 외의 항원들에 결합하는 항체들 또는 항체 부분들을 암호화하는, 인간 게놈 DNA 중 핵산에 천연적으로 측면근접(flank)할 수 있는 다른 뉴클레오티드 서열들을 갖지 않는 핵산을 의미하고자 하는 것이다.
항체들 및 그의 단편들과 관련하여 사용된 것과 같은 "안정성"이라는 표현은, 직접 결합 ELISA에 의해 결정되는 경우, 항체 또는 항원 결합 단편의 활성이 -20℃, 4℃, 또는 37℃에서 혈청 중 인큐베이션한지 12일 후 EC50 출발값들에 필적하는 것을 의미한다.
"인간 항체"라는 표현은, 인간 생식계열 면역글로불린 서열들로부터 유래된 가변영역 및 불변영역(존재하는 경우)을 갖는 항체들을 포함한다. 본 발명의 인간 서열 항체들은 인간 생식계열 면역글로불린 서열들 (예로서, 시험관 내에서 랜덤 또는 위치-특이적 돌연변이유발원성에 의해 유도된 돌연변이 또는 생체 내에서 체세포 돌연변이에 의해 유도된 돌연변이들)에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기들을 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명에서 사용된 것과 같은 "인간 항체"라는 표현은, 마우스와 같은 또다른 포유동물 종들의 생식계열로부터 유도된 CDR 서열들이 인간 프레임워크 서열들 상으로 이식된 항체들(즉, 인간화 항체들)을 포함하고자 하는 것은 아니다.
"키메라성 항체"라는 표현은 억셉터(aceptor) 항체로부터 유래된 경쇄 및 중쇄 불변 영역들과 연합된 공여자 항체로부터 유래된 천연적으로 존재하는 가변 도메인 (경쇄 및 중쇄들)을 포함하는 공학적으로 처리된 유형의 항체를 의미한다.
"인간화 항체"라는 표현은 CDR들이 비-인간 공여자 면역글로불린으로부터 유래된 것이고, 상기 분자의 나머지 면역글로불린-유래 부분들은 하나 (또는 그 이상)의 인간 면역글로불린(들)로부터 유도된 것인, 공학적으로 처리된 유형의 항체를 의미한다. 추가적으로, 프레임워크 지지체 잔기들은 결합 친화성을 보존하도록 변경될 수 있다 (예로서, Queen 등, Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029~10032 (1989), Hodgson 등, Bio/Technology, 9:421 (1991) 참조). 적당한 인간 억셉터 항체는, 공여자 항체의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열들에 대한 상동성에 의하여, 통상적인 데이타베이스, 예로서 KABAT® 데이타베이스, 로스 알라모스(Los Alamos) 데이타베이스, 및 스위스 단백질(Swiss Protein) 데이타베이스로부터 선택된 하나일 수 있다. 공여자 항체 프레임워크 영역들에 대한 상동성 (아미노산 기준)에 의해 특징되는 인간 항체는 공여자 CDRs의 삽입을 위하여 중쇄 불변 영역 및/또는 중쇄 가변 프레임워크 영역을 제공하는데 적당할 수 있다. 경쇄 불변 또는 가변 프레임워크 영역들을 공여할 수 있는 적당한 억셉터 항체는 유사한 방식으로 선택될 수 있다. 상기 억셉터 항체 중쇄 및 경쇄들은 동일한 억셉터 항체로부터 기원할 것을 필요로 하지는 않음에 유의하여야 한다. 선행기술은 이러한 인간화 항체들을 생산하는 몇몇 방식들을 설명한다 - 예로서 EP-A-0239400 및 EP-A-054951.
"공여자 항체"라는 표현은 그의 가변 도메인들, CDRs, 또는 그의 다른 기능성 단편들 또는 그의 유사체들의 아미노산 서열들이 제 1 면역글로불린 파트너(partner)에 제공하여, 변경된 면역글로불린 암호화 영역 및 공여자 항체의 항원 특이성 및 중화 작용 특징을 갖는 결과의 발현된 변경된 항체를 제공하는 항체를 의미한다.
"억셉터 항체"라는 표현은 공여자 항체에 대하여 이종성인 항체 (모노클로날 및/또는 재조합)을 의미하며, 이는 그의 중쇄 및/또는 경쇄 프레임워크 영역들 및/또는 그의 중쇄 및/또는 경쇄 불변영역들을 암호화하는 아미노산 서열들 모두 (또는 임의의 부분, 바람직하게는 전부)를 제 1 면역글로불린 파트너에게 제공하는 항체를 의미한다. 인간 항체는 억셉터 항체이다.
"CDRs"라는 두문자어는, 항체의 상보성 결정 영역 아미노산 서열들을 의미하며, 이는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄들의 과가변성 도메인들이다. 예로서, Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987) 참조. 면역글로불린의 가변성 부분에는 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDRs (또는 CDR 영역들)이 존재한다. 따라서, 본 명세서에서 사용된 것과 같은 "CDRs"은 모든 3개의 중쇄 CDRs, 또는 모든 3개의 경쇄 CDRs(또는 적절한 경우, 모든 중쇄 및 모든 경쇄 CDRs 모두)을 의미한다. 항체의 구조 및 단백질 접힘구조는, 다른 잔기들이 항원 결합 영역의 고려되는 부분일 수 있으며 당업자에 의하여 그렇게 이해될 수 있는 것임을 의미할 수 있다. 예로서, Chothia 등, (1989), Conformations of immunoglobulin hypervariable domains; Nature 342, p877~883 참조. CDRs은 항체의 항원 또는 에피토프로의 결합에 대다수의 접촉 잔기들을 제공한다. 본 발명에서 관심 대상의 CDRs은 공여자 항체 가변 중쇄 및 경쇄 서열들로부터 유래되며, 천연적으로 존재하는 CDRs의 유사체들을 포함하며, 상기 유사체들도 그들이 유래된 공여자 항체와 동일한 항원 결합 특이성 및/또는 중화능을 공유 또는 보유한다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 항체 서열들 중 아미노산 잔기들은 Kabat 방식에 따라 번호매김된다. 유사하게, "CDR", "CDRL1", "CDRL2", "CDRL3", "CDRH1", "CDRH2", "CDRH3"이라는 용어들은 Kabat 번호매김 체계를 따르며, 이는 Kabat 등; Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987에 설명된 바와 같다. 예로서, Chothia 등, (1989)에 설명된 것과 같은 CDR 서열들의 대안적인 정의들은 당업자에게 명백할 것이다.
"유도된"이라는 용어는 그 공급원이 그 물질의 물리적 기원이라는 의미 뿐 아니라, 구조적으로 그 물질에 동일(일차 아미노산 서열 면에서)하지만 그 기준 공급원으로부터 기원하지는 않는 물질도 규정하고자 하는 것이라는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 예로서 "그로부터 CDRH3가 유도된 공여자 항체에서 발견되는 잔기들"은 공여자 항체로부터 정제된 것일 필요는 없다.
"VH" 및 "VL"이라는 표현은 항체의 중쇄 가변성 도메인 및 경쇄 가변성 도메인 각각을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 "이펙터 기능"이라는 용어는, 하나 이상의 항체 의존성 세포 매개된 세포독성 활성 (ADCC) 및 상보성 의존 세포독성 활성 (CDC) 매개된 반응들, Fc-매개된 대식작용 및 FcRn 수용체를 통한 항체 재순환을 의미하고자 하는 것이다. 항체 및 각종 Fc 수용체들 (FcR)의 불변 영역간의 상호작용은 항체의 이펙터 기능들을 매개하는 것으로 여겨진다. 현저한 생물학적 효과들은 이펙터 기능의 결과, 특히 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC), 보체의 고정화 (보체 의존성 세포독성 또는 CDC), 대식작용 (항체-의존성 세포-매개된 대식작용 또는 ADCP) 및 항체의 반감기/소거일 수 있다. 일반적으로, 이펙터 기능을 매개하는 능력은 항체의 항원에의 결합을 필요로 하며, 모든 항체들이 모든 이펙터 기능을 매개하지는 않을 것이다. 이펙터 기능은 다수의 방식으로 측정될 수 있으며, 이는 예로서 FcyR111의 자연살생세포들에의 결합을 통하여 또는 ADCC 이펙터 기능에 대한 측정을 위해 FcyRI의 단핵구들/마크로파지들에의 결합 통한 방법들을 포함한다.
항체들의 중쇄 불변 영역에 대한 각종 변경들이 원하는 이펙터 성질에 따라 실시될 수 있다. 다음 a) 및 b) 기능들을 본질적으로 결여한 인간 불변 영역들은 IgG4 불변영역 및 IgG2 불변영역을 포함한다: a) 전통적인 경로에 의한 보체 활성화; 및 b) 항체-의존성 세포 세포독성을 매개. 특이적 돌연변이들을 포함하는 IgG1 불변영역들은 Fc 수용체들에 대한 결합을 감소시키고, 따라서 ADCC 및 CDC에 대한 결합도 감소시키는 것이 개별적으로 설명되어 왔다 (Duncan 등, Nature 1988, 332; 563~564; Lund 등, J. Immunol. 1991, 147; 2657~2662; Chappel 등, PNAS 1991,88; 9036~9040; Burton and Woof, Adv. Immunol. 1992,51 ;1~84; Morgan 등, Immunology 1995,86; 319~324; Hezareh 등, J. Virol. 2001, 75 (24); 12161~12168). 잔기 Asn297 상에서, 특이적 돌연변이들 또는 변경된 글리코실화를 포함하는 인간 IgG1 불변영역들은 Fc 수용체들에 대한 결합을 개선시키는 것으로 설명되어 왔다. 이들은, 일부 경우들에서 ADCC 및 CDC를 개선시키는 것으로도 나타났다 (Lazar 등, PNAS 2006, 103; 4005~4010; Shields 등, J Bioi Chem 2001, 276; 6591~6604; Nechansky 등, Mollmmunol, 2007, 44; 1815~1817).
IgG 항체들의 경우, ADCC 및 ADCP를 포함하는 이펙터 기능성들은, 그 중쇄 불변영역과 면역 세포들의 표면 상에 존재하는 Fcγ과 수용체들과의 상호작용에 의하여 매개된다. 인간들에서, 이들은 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)을 포함한다. 항원에 결합된 항체간의 상호작용 및 Fc/Fcγ 복합체의 형성은 다양한 세포독성, 면역 세포 활성화, 대식작용 및 염증성 시토카인들의 방출을 포함하는 효과범위를 유도한다. 불변영역에서 특이적 치환들은 (S239D/I332E 포함) 특정 Fc 수용체들에 대한 중쇄 불변 영역의 친화성을 증가시켜, 그에 따라 항체의 이펙터 기능성을 개선시키는 것으로 알려져 있다 (Lazar 등, PNAS 2006).
"상동성" 또는 "서열 상동성"이라는 용어는, 그들의 공통된 조상으로 인한, 서열들 간의 유사성 정도를 의미한다. 당업자에게 알려진, 상동성을 계산하기 위한, 다양한 서열 데이타베이스 유사성 조사 도구들이 존재하며, 예컨대 FASTA, BLAST가 있다.
"동일성(identity)" 또는 "서열 동일성"이라는 표현은, 폴리뉴클레오티드들 및 폴리펩티드들"의 경우, 경우에 따라 다르지만, 하기 (1) 및 (2)에서 제공된 알고리즘을 이용하여 계산된 비교를 의미한다:
(1) 폴리뉴클레오티드들에 대한 동일성은, 소정의 서열 중 뉴클레오티드의 총 수를 100으로 나눈 % 동일성을 규정하는 정수를 곱하고, 그 결과물을 상기 서열 중 뉴클레오티드들의 상기 총 수로부터 차감하므로써 계산되거나, 또는:
nn ≤ xn - (xnㆍy),
식 중, nn은 뉴클레오티드 변경물들의 수이고, xn은 소정의 서열에서 뉴클레오티드들의 총 수이고, y는 95%인 경우 0.95, 97%인 경우 0.97 또는 100%인 경우 1.00,이고, ㆍ는 곱셈 연산자 기호이며, xn 및 y의 임의의 비-정수 결과수치는 그를 xn에서 빼기 전에 버림하여 가장 가까운 정수로 한다. 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 변경물들은 비-센스(nonsense), 미스센스(missense) 또는 구조이동 돌연변이(frameshift mutations)를 창출할 수 있으며, 이에 따라, 그러한 변경들을 따른 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드를 변경할 수 있다.
(2) 폴리펩티드에 대한 동일성은 아미노산의 총 수를, 100으로 나눈 퍼센트 동일성을 규정하는 정수와 곱한 후, 그 결과수치를 상기 아미노산 총 수로부터 빼는 것에 의하여 계산되거나, 또는:
na ≤ xa - (xaㆍy),
식 중, na는 아미노 변경물들의 수이고, xa는 소정의 서열에서 아미노산들의 총 수이고, y는 95%인 경우 0.95, 97%인 경우 0.97 또는 100%인 경우 1.00,이고, ㆍ는 곱셈 연산자에 대한 기호이며, 식 중, xa 및 y의 임의의 비-정수 결과수치는 이를 xa로부터 차감시키기 전에 가장 가까운 정수로 버림한다.
"변형체(들)"이라는 표현은, 참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 각각과 상이하지만 본질적인 성질들은 보유하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 폴리뉴클레오티드의 전형적인 변형체는 또다른 참조 폴리뉴클레오티드와 뉴클레오티드 서열이 상이하다. 변형체 메이어(mayor)의 뉴클레오티드 서열에서의 변화들은 참조 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변경시키지 않을 수 있다. 뉴클레오티드 변화들은, 하기 설명되는 것과 같이, 참조 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드에서의 아미노산 치환들, 추가들, 결실들, 융합 단백질들 및 절단물들(truncations)을 결과로서 제공할 수 있다. 폴리펩티드의 전형적인 변형체는 또다른 참조 폴리펩티드와 아미노산 서열 면에서 상이하다. 일반적으로, 차이점들은, 참조 폴리펩티드 및 변형체의 서열들이 전체적으로 밀접하게 유사하고, 많은 영역들에서 동일하도록 제한된다. 변형체 및 참조 폴리펩티드는 임의의 조합중 하나 이상의 치환, 첨가, 결실에 의하여 아미노산 서열면에서 상이할 수 있다. 치환되거나 또는 삽입된 아미노산 잔기 메이어(mayor)는 유전자 암호에 의해 암호화되는 것이 아닐 수 있다. 특정 아미노산 치환들은 "보존성"인 것으로 간주된다는 것이 당 분야에서 잘 인지되어 있다. 아미노산은 공통의 측쇄 성질에 기초한 군으로 나누어지며, 본 발명의 항원 또는 그의 항원 결합 단편의 결합 친화성을 모두 또는 실질적으로 모두 유지하는 군들 내에서의 치환들은 보존성 치환들로서 여겨지며, 이는 하기 표에 나타내었다.
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본 발명의 일부 측면들에서, 일부, 예로서 5~10, 1~5, 1~3, 1~2개의 아미노산 잔기들 또는 1개의 아미노산 잔기는 임의의 조합으로 치환, 결실되거나 부가된 변형체들이 포함될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 변형체는 대립유전형질 변형체와 같은 자연적으로 존재하는 것일 수 있거나, 또는 자연적으로 존재하는 것으로 알려지지 않은 변형체일 수 있다. 폴리뉴클레오티드들 및 폴리펩티드들의 자연적으로 존재하지 않는 변형체들은, 돌연변이원성 기술들, 직접 합성 및 당업자들에게 알려진 다른 재조합 방법들에 의하여 제조될 수 있다.
키메라성 및 인간화 항체들의 생산
인간 질병들 또는 장애들의 치료에서 온전한 비-인간 항체들의 이용은 이제는 잘 확립된 면역원성 문제들에 대한 잠재성이 따르며, 이는 환자의 면역 시스템이 비-인간 온전한 항체를 자신의 것이 아닌 것으로서 인식할 수 있어 중화 반응을 개시할 수 있다는 것이다. 이는 비-인간 항체의 인간 환자로의 다중 투여시 특히 명백하다. 이들 문제들을 극복하기 위하여 수년간에 걸쳐 각종 기술들이 개발되어 왔으며, 이들은 일반적으로 온전한 항체에서 비-인간 아미노산 서열들의 조성을 감소시키는 한편, 면역화된 동물, 예로서 마우스, 쥐 또는 토끼로부터 비-인간 항체들을 수득하는데 있어 상대적 용이성을 유지하는 것을 포함한다. 광범위하게는 2가지 방법들이 이를 달성하는데 사용되어 왔다. 첫번째 방법은 키메라성 항체들로, 이는 일반적으로 인간 불변영역에 융합된 비-인간 (예로서, 마우스와 같은 설치류) 가변 도메인을 포함한다. 항체의 항원-결합 자리는 가변 도메인들 내에 위치되기 때문에, 키메라성 항체는 항원에 대한 그의 결합 친화성을 유지하지만 인간 불변영역의 이펙터 기능들을 획득하고, 따라서 앞서 설명된 것과 같이 이펙터 기능들을 수행할 수 있다. 키메라성 항체들은 재조합 DNA 방법들을 이용하여 전형적으로 생산된다. 항체들을 암호화하는 DNA(예로서, cDNA)는 전통적인 절차들, 예로서 본 발명의 항체의 H 및 L 사슬들을 암호화하는 유전자들에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브들을 이용하므로써 암호화 및 서열화된다. 하이브리도마 세포들은 그러한 DNA의 전형적인 공급원으로서 제공된다. 일단 분리되면, DNA는 발현 벡터들 내에 배치되며, 이는 형질감염되지 않으면 항체 합성을 수득하기 위한 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주세포들, 예컨대 E.Coli, COS 세포들, CHO 세포들 또는 골수종 세포들 내로 형질감염된다. 상기 DNA는 인간 L 및 H 사슬들에 대한 코딩 서열로 대응 비-인간 (예로서, 쥐과) H 및 L 불변영역들을 치환하므로써 변경되며, 예로서 Morrison; PNAS 81, 6851 (1984) 참조.
두번째 방법은 인간화 항체들의 생성을 포함하며, 여기에서 항체의 상기 비-인간 내용물은 가변 도메인을 인간화하므로써 감소된다. 인간화를 위한 2가지 기술들이 대중적으로 받아들여졌다. 첫번째는 CDR 그래프팅에 의한 인간화이다. CDRs는 항체의 N-말단 가까이에 고리들(loops)을 구축하며, 여기에서 이들은 프레임워크 영역들에 의해 제공되는 골격(scaffold)에 놓여지는(mounted) 표면을 형성한다. 항체의 항원-결합 특이성은 주로 토포그래피(topography) 및 그의 CDR 표면의 화학 특이성들에 의해 규정된다. 이들 특징들은 이에따라 개별적인 CDRs의 입체구조에 의해, CDRs의 상대 배치에 의해, 그리고 CDRs를 포함하는 잔기들의 측쇄들의 성질 및 배치에 의하여 결정된다. 비-인간 (예로서, 쥐과) 항체들 ("공여자 항체들")의 CDRs만을 인간 프레임워크 ("억셉터 프레임워크") 및 불변영역들 상으로 그래프팅하므로써 면역원성에서의 큰 감소가 달성될 수 있다 (Jones 등 (1986) Nature 321,522~525 및 Verhoeyen M 등 (1988) Science 239, 1534~1536, 참조). 그러나, CDR 그래프팅 자체는 항원 결합 성능들의 완전한 보유를 결과로서 일으키지 않을 수 있으며, 현저한 항원 결합 친화성이 회복되는 경우, 공여자 항체의 일부 프레임워크 잔기들 (때때로 "역 돌연변이")이 인간화 분자에서 보존될 필요가 있다는 것이 종종 발견된다 (Queen C 등 (1989) PNAS 86, 10029~10033, Co, M 등 (1991) Nature 351, 501~502 참조). 이러한 경우, 인간 프레임워크 (FR)을 제공하기 위하여, 비-인간 공여자 항체에 대한 가장 큰 서열 상동성을 나타내는 인간 가변 도메인들은 데이터베이스로부터 선택된다. 인간 FRs의 선택은 인간 컨센선스(consensus) 또는 개별적인 인간 항체들 중 하나로부터 이루어질 수 있다. 필요한 경우, 공여자 항체로부터의 주요 잔기들은 인간 억셉터 프레임워크 내로 치환되어 CDR 입체구조들을 보존한다. 항체의 컴퓨터 모델링은 이러한 구조적으로 중요한 잔기들을 확인하는 것을 보조하는데 사용될 수 있으며, 이는 WO99/48523 참조.
대안적으로, 인간화는 "베니어링(veneering)" 공정에 의하여 달성될 수 있다. 독특한 인간 및 쥐과 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 도메인들의 통계적 분석은, 노출된 잔기들의 정확한 패턴들은 인간 및 쥐과 항체들에서 상이하고, 가장 개별적인 표면 위치들은 적은 수의 상이한 잔기들을 강하게 선호한다는 것을 밝혔다(Padlan E.A. 등; (1991) Mol.Immunol.28, 489~498 및 Pedersen J.T. 등(1994) J.Mol.Biol. 235; 959~973 참조).
따라서, 인간 항체들에서 일반적으로 발견되는 것과는 상이한 그의 프레임워크 영역들에서 노출된 잔기들을 대체(replacing)하므로써 비-인간 Fv의 면역원성을 감소시키는 것이 가능하다. 단백질 면역원성은 표면 접근성과 상관될 수 있기 때문에, 표면 잔기들의 대체는 그 마우스 가변 도메인이 인간 면역 시스템에 대하여 "비가시성"으로 만들기에 충분할 수 있다 (Mark G.E. 등 (1994) in Handbook of Experimental Pharmacology vol.113: The pharmacology of monoclonal antibodies, Springer-Verlag, pp105~134 참조). 이러한 인간화 절차는 "베니어링"으로서 언급되는데, 이는 항체의 표면만이 변경되어, 지지 잔기들은 방해받지 않은 채로 남기 때문이다.
인간 항체들의 생산
본 발명의 모노클로날 항체들 (mAbs)은 기존의 모노 클로날 항체 방법 예로서, Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)의 표준 체세포 혼성화 기술을 포함하는 각종 기술들에 의하여 생산될 수 있다. 모노클로날 항체를 생산하기 위한 임의의 기술이 사용될 수 있으며, 예로서 B 림프구들의 바이러스 또는 종양형성성 형질전환이 있다. 하이브리도마들을 제조하기 위한 하나의 동물계로 쥐과의 계통이 있다. 마우스에서의 하이브리도마 생산은 매우 잘 수립된 절차이다. 융합을 위해 면역화된 비장세포들의 분리를 위한 면역화 프로토콜들 및 기술들은 당 분야에 알려져 있다. 융합 파트너들 (예로서, 쥐과의 골수종 세포들) 및 융합 절차들도 알려져 있다(예로서, Harlow and Lane (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York 참조).
쥐과 또는 인간 S100A4에 대한 인간 모노클로날 항체들은 마우스 계보다는 인간 면역계를 갖는 유전자변형(transgenic) 마우스들을 이용하여 생성될 수 있다. 마우스 면역글로불린 유전자좌는 인간 면역글로불린 유전자 절편들로 대체된 몇몇 유전자변형 마우스들이 이제 입수가능하다 (Tomizuka K, (2000) PNAS 97,722~727; Fishwild D.M (1996) Nature Biotechnol. 14,845~851, Mendez MJ, 1997, Nature Genetics, 15,146~156 참조). 항원 도전의 경우, 그러한 마우스들은 관심대상의 항체들이 선택될 수 있는 인간 항체들의 레퍼터리를 생산할 수 있다. 특히, 인간 림프구들이 방사선조사된 마우스들 내로 이식되는 트리메라™(Trimera™) 시스템 (Eren R 등, (1998) Immunology 93:154~161 참조), 인간 (또는 기타 종들) 림프구들이 시험관 내 거대하게 모인(pooled) 항체 생성 절차에 이어 디컨벌레이트된(deconvulated), 제한 희석 및 선택 절차를 효과적으로 처리하는 선별된 림프구 항체 시스템 (Selected Lymphocyte Antibody System: SLAM Babcook 등, PNAS (1996) 93:7843~7848) 및 Xenomouse II™ (Abgenix Inc)가 있다. 선택적인 방법이 Morphodoma™ 기술을 이용하는 Morphotek Inc로부터 이용가능하다.
인간 또는 쥐과의 S100A4를 위한 완전한 인간 모노클로날 항체들을 생성하기 위한 구체적인 절차들은 하기 실시예에 설명된다. 각종 항원들의 누적 경험은, 완전 프로인트 보조제에서 항원으로 최초로 복막내적으로 (IP) 면역화되고, 이어서 불완전 프로인트 보조제에서 항원으로 매주 IP 면역화(총 6까지)되는 경우, 유전자변형 마우스들이 반응한다는 것을 나타내었다. 그러나, 프로인트 보조제 외의 보조제들도 효과적인 것으로 나타난다. 추가적으로, 보조제 부재 하에 전체 세포들은 매우 면역원성인 것으로 발견된다. 면역반응은 역안와(retroorbital) 출혈에 의해 수득되는 혈장 샘플들을 이용한 면역화 프로토콜 과정 동안에 걸쳐 모니터링될 수 있다. 혈장은 ELISA에 의해 스크리닝될 수 있으며, 충분한 역가의 항-S100A4 인간 면역글로불린을 갖는 마우스들이 융합에 사용될 수 있다. 마우스들은, 살생 및 비장 제거 전 3일에 항원으로 정맥주사로 부스트될 수 있다. 각 면역화를 위한 2~3 융합들이 수행될 필요가 있음이 예측된다. 6마리 내지 24마리 마우스들이 각 항원에 대해 전형적으로 면역화된다.
인간 항-S100A4 항원들을 정제하기 위하여, 선택된 하이브리도마들은 모노클로날 항체 정제를 위해 2리터 스피너-플라스크들(spinner-flasks) 중에서 성장될 수 있다. 단백질 A-세파로오스(Pharmacia, Piscataway, NJ)를 이용하여 친화성 크로마토그래피 전에 상등액들은 여과 및 농축될 수 있다. 용리된 IgG는 정제를 보장하기 위하여 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 확인될 수 있다. 버퍼 용액은 PBS 내로 교환될 수 있으며, 농도는 1.43의 흡광계수를 이용하여 OD280에 의하여 결정될 수 있다. 모노클로날 항체들은 분취하여 -80℃에서 저장할 수 있다.
선택된 인간 항-S100A4 모노클로날 항체들이 독특한 에피토프에 결합하는지의 여부를 결정하기 위하여, 각 항체는 상업적으로 입수가능한 시약들을 이용하여 비오티닐화될 수 있다(Pierce, Rockford, IL). 비라벨된 모노클로날 항체들을 이용한 경쟁 연구들 및 비오티닐화 모노클로날 항체들은 인간 또는 쥐과의 S100A4 코팅된-ELISA 플레이트들을 이용하여 수행될 수 있다. 비오티닐화 MAb 결합은 스트렙트-아비딘-알칼라인 포스파타아제 프로브를 이용하여 검출될 수 있다.
정제된 항체들의 아이소타입을 결정하기 위하여, 아이소타입 ELISAs를 수행할 수 있다. 마이크로적정 플레이트들의 웰들은 1㎍/ml의 항-인간 IgG로 4℃에서 하룻밤 동안 코팅될 수 있다. 1% BSA로 차단한 후, 플레이트들을 1㎍/ml 이하의 모노클로날 항체들 또는 정제된 아이소타입 대조구들과 1시간 내지 2시간 동안 실온에서 반응시킨다. 웰들을 그 후 인간 IgG1 또는 인간 IgM-특이적 알칼리성 포스파타아제-컨쥬게이트된 프로브들과 반응시킬 수 있다. 플레이트들을 전개시키고 상기 설명된 바와 같이 분석하였다.
인간 또는 쥐과의 S100A4를 발현하는 생세포들에 대한 모노클로날 항체들의 결합을 증명하기 위하여, 유세포 분석을 사용할 수 있다. 간략하게는, (표준 성장 조건 하에서 성장한) 인간 또는 쥐과의 S100A4를 발현하는 세포주들을, 0.1% BSA 및 10% 우태아혈청을 포함하는 PBS 중 각종 농도의 모노클로날 항체들과 혼합하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 세포들을 플루오레세인-라벨된 항-인간 IgG 항체와, 일차 항체 염색에서와 동일한 조건 하에서 반응시킨다. 샘플들은 단일 세포들 상에서 게이트(gate)를 위하여 광 및 측면 산란 성질들을 이용하여 FACScan 기기에 의하여 분석될 수 있다. 플루오레세인 현미경을 이용한 선택적인 분석이 추가적으로 또는 유세포 분석방법 대신 사용될 수 있다. 세포들은 상기 설명된 것과 똑같이 염색될 수 있으며, 플루오레세인 현미경 관찰에 의해 검사된다. 이러한 방법은 개별적인 세포들의 시각화를 가능하게 하지만, 항원 밀도에 따라 감소된 감도를 가질 수 있다.
항-S100A4 인간 IgGs는 인간 또는 쥐과의 S100A4 항원과의 반응성에 대하여 웨스턴 블롯팅에 의하여 더욱 시험될 수 있다. 간략하게는, 인간 또는 쥐과의 S100A4를 발현하는 세포들로부터의 세포 추출물들을 제조하여 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 투입될 수 있다. 전기영동 후, 분리된 항원들은 니트로셀룰로오스 막들로 이동되며, 10% 우태아혈청으로 차단하고, 시험될 모노클로날 항체들을 이용하여 탐침된다. 인간 IgG 결합은 항-인간 IgG 알카리성 포스파타아제를 이용하여 검출될 수 있으며, BCIP/NBT 기질 정제들을 이용하여 될 수 있다 (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO).
파지 디스플레이 기술은 인간 항체들 (및 그의 단편들)을 생산하는데 사용될 수 있으며, McCafferty; Nature, 348, 552~553 (1990) 및 Griffiths AD 등(1994) EMBO 13:3245~3260 참조. 이 기술에 따르면 항체 가변 도메인 유전자들은, M13 또는 fd와 같은 섬유상 박테리오파아지의 단백질 유전자의 주요 코트(coat) 또는 작은 코트 내로 인 프레임 (in frame) 클로닝되고, 파지 입자의 표면 상에서 기능성 항원 결합 단편으로서 디스플레이된다 (일반적으로 헬퍼 파지의 보조를 받아). 항체의 기능적 성질들의 선택은 그러한 성질들을 나타내는 항체를 암호화하는 유전자의 선택하는 결과를 일으킨다. 파지 디스플레이 기술은 상기 설명된 질병 또는 장애를 앓고 있는 개인들로부터 또는 대안적으로 비면역화된 인간 공여자들로부터 취한 인간 B 세포들로부터 만들어진 라이브러리들로부터 항원 특이적 항체들을 선발하는데 사용될 수 있다 (Marks; J.Mol.Bio. 222, 581~597, 1991 참조). 불변 도메인을 포함하는 온전한 인간 항체가 바람직한 경우, 파지 디스플레이된 유도된 단편을, 원하는 불변 영역들을 포함하고 안정한 발현 세포주들을 수립하는 포유동물 발현 벡터들 내로 재클로닝하는 것이 필요하다.
친화성 돌연변이 기술 (Marks; Bio/technol 10, 779~783 (1992))은 결합 친화성을 개선시키는데 사용될 수 있으며, 여기에서 일차 인간 항체의 친화성은 H 및L 사슬 가변 도메인들을 천연적으로 존재하는 변형체들로 순차적으로 대체하고 개선된 결합 친화성에 기초하여 선택하므로써 개선되다. "에피토프 임프린팅"과 같은 이 기술의 변형들도 이용가능하다: WO93/06213 참조. Waterhouse; Nucl.Acids Res 21, 2265~2266 (1993) 참조.
약학 조성물들
본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 조제된 하나 또는 조합된 모노클로날 항체들 또는 그의 단편들을 포함하는 약학 조성물들을 제공한다. 일부 조성물들은 본 발명의 다수의 (예로서, 2 이상) 분리된 항체들 또는 단편들의 조합을 포함한다. 일부 조성물들에서, 조성물의 항체들 또는 그의 단편들 각각은 인간 또는 쥐과의 S100A4의 구분되는 미리-선발된 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체이다.
선택된 투여 경로에 관계없이, 적당한 수화된 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 화합물들 또는 본 발명의 약학 조성물들은 당업자에게 알려진 통상의 방법들에 의하여 약학적으로 허용가능한 투약 형태들로 제형화된다.
항체로 투여하는 경우, 투여량은 숙주 체중의 약 0.0001mg/kg 내지 100mg/kg, 및 더욱 일반적으로 0.01mg/kg 내지 5mg/kg의 범위이다. 예로서, 투여량은 1mg/kg 체중 또는 10mg/kg 체중 또는 1~10mg/kg의 범위 내이다. 면역원들을 암호화하는 핵산들에 대한 투약량은 환자 당 약 10ng 내지 1g, 100ng 내지 100mg, 1㎍ 내지 10mg, 또는 30~300 ㎍ DNA의 범위이다. 감염성 바이러스성 벡터들에 대한 투약량은 1회 투여 당 10~100 또는 그 이상의 비리온(virions)에서 변화가능하다.
치료 적용을 위하여, 약학 조성물들은 확립된 질병으로 고통받고 있는 환자에게 그 질병의 더이상의 전개를 정지 또는 저해시키거나 또는 그 질병, 그의 증상들 또는 생화학적 마커들을 역전 또는 제거시키기에 충분한 양으로 투여된다. 예방 적용을 위하여, 약학 조성물들은 질병에 걸리기 쉽거나 질병의 위험이 있는 환자에게, 그 질병의 전개, 그의 증상 및 생물학적 마커들을 지연, 저해 또는 방지하기에 충분한 양으로 투여된다. 이를 달성하기에 적당한 양은 "치료적으로-유효한" 또는 "예방적으로-유효한" 투여량으로서 정의된다. 투약량은 치료될 질병, 대상의 크기, 대상의 증상의 심각성, 및 특정 조성물 또는 선택된 투여 경로에 따라 달라진다. 특히, 종양 치료에서, "치료적으로 유효한 투약량"은 종양 성장을 미처리된 대상들에 비하여 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 80% 까지 저해할 수 있다. 화합물의 암 저해능은 인간 종양들에서의 효능을 예측가능한 동물 모델계통에서 평가될 수 있다. 대안적으로, 조성물의 이러한 성질을, 화합물의 저해능을 시험관 내 통상적인 분석들에 의해 검사하므로써 평가할 수 있다. 치료적으로 유효한 양의 치료 화합물은 종양 크기를 감소시키거나 그렇지 않으면 대상에서 증상을 완화시킬 수 있다.
본 발명의 조성물은 당 분야에서 알려진 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 투여 경로 및 방법은 원하는 결과들에 따라 변화된다. 치료 조성물의 경우, 본 발명의 제형들은 경구, 비강, 국소 (볼 및 설하(sublingual) 포함), 직장, 질 및 비경구 투여에 적당한 것들을 포함한다. 제형들은 약학 분야에 알려진 임의의 방법들에 의하여 제조될 수 있으며, 바람직하게는 미국 식품의약국(U.S. Food and Drug Administration)의 양호 제조실시(Good Manufacturing Practice: GMP)에 완전히 따르는 방식으로 제조될 수 있다.
"비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여된"이라는 표현은 장(enteral) 및 국소 투여 외의 투여 방식을 의미하며, 일반적으로 주사에 의하며, 이에 제한되지는 않지만, 정맥주사, 근육내, 동맥내, 척추강내(intrathecal), 관절낭내(intracapsular), 안와내(intraorbital), 심장내(intracardiac), 피부내, 복강내, 경기관(transtracheal), 피하(subcutaneous), 피하세포(subcuticular), 관절내(intraarticular), 피막하(subcapsular), 지주막하(subarachnoid), 척수내(intraspinal), 경막외 및 복장내(intrastemal) 주사 및 주입을 포함한다.
약학적으로 허용가능한 담체들은, 생리학적으로 상용가능한, 용매, 분산 매질, 코팅, 항세균제 및 항진균제, 등장 및 흡수 지연제, 등을 포함한다. 담체는 정맥, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여에 적합할 수 있다(예로서, 주사 또는 주입). 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉 항체 또는 그의 단편, 2특이적 및 다중특이적 분자는, 산 작용 및 화합물을 비활성화할 수 있는 기타 자연 조건들로부터 화합물을 보호하기 위한 물질로 코팅될 수 있다.
활성 화합물들은, 방출 조절제와 같이 화합물의 빠른 방출을 막는 담체들과 함께 제조될 수 있으며, 이는 임플랜트, 경피 패치 및 미세캡슐화 전달 시스템을 포함한다. 생분해성, 생체적합성 중합체들, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 다가무수물들, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르들 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제형들의 제조를 위한 많은 방법들이 예로서, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978에 기재되어 있다.
본 발명의 화합물을 소정의 투여 경로에 의하여 투여하기 위하여, 화합물을 그의 비활성화를 방지하기 위한 물질과 함께 코팅하거나, 또는 함께 투여하는 것이 필요할 수 있다. 예로서, 화합물은 적절한 담체, 예로서 리포좀 또는 희석제 중에서 대상에 투여될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 희석제들은 염수 및 수성 버퍼 용액들을 포함한다. 리포좀들은 수중유중수(water-in-oil-in-water) CFG 에멀션들 및 통상의 리포좀들을 포함한다 (Strejan 등, (1984) J. Neuroimmunol. 7:27). 활성 화합물이 상기 설명된 바와 같이 적당하게 보호된 경우, 화합물은 비활성 희석제 또는 융합가능한(assimilable) 가식성 담체와 함께 경구투여될 수 있다.
전형적으로 약학적으로 허용가능한 담체들은 멸균 수용액들 또는 분산액들 및 멸균 주사용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말들을 포함한다. 약학적으로 활성인 성분들에 대한 이러한 매질 및 약제의 이용은 당 분야에 알려져 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 약제가 활성 화합물과 비상용성인 경우를 제외하고, 본 발명의 약학 조성물들에서의 이들의 이용은 고려된다. 보충 활성 화합물들이 조성물들에 혼입될 수도 있다.
치료 조성물들은 전형적으로 멸균, 실질적으로 등장성이고 제조 및 저장 조건 하에서 안정하여야만 한다. 이들은 양호한 주사성이 존재하는 정도로 유체여야만 하며, 세균 및 곰팡이와 같은 미생물들의 오염 작용에 저항하여 보존되어야만 한다. 조성물은 용액, 미세에멀션, 리포좀 또는 높은 약물 농도에 적당한 기타 배열된 구조로서 제형화될 수 있다. 담체는, 예로서 물, 등장성 버퍼화된 염수, 에탄올, 폴리올 (예로서, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜, 등) 및 이의 적당한 혼합물들을 포함하는 용매 또는 분산매질, 올리브오일과 같은 식물성 오일, 및 에틸 올레이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르들일 수 있다. 적절한 유동성은, 예로서 레시틴과 같은 코팅의 이용, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 이용에 의하여 유지될 수 있다. 많은 경우들에서, 조성물 중, 등장제들, 예로서 당류, 만니톨, 소르비톨과 같은 다가알코올들, 또는 염화 나트륨을 포함하는 것이 바람직하다. 주사가능한 조성물들의 연장된 흡수는, 흡수를 지연시키는 약제, 예로서 모노스테아레이트염들 및 젤라틴을 조성물 중에 포함시키므로써 야기될 수 있다.
멸균 주사성 용액들은, 상기 열거된 성분들의 하나 또는 조합과 함께 적절한 용매 중에서 활성 화합물을 혼입시키므로써 제조될 수 있으며, 필요에 따라, 이후 멸균 미세여과된다. 일반적으로, 분산액들은 활성 화합물을, 상기 열거된 기본 분산 매질 및 필요한 다른 성분들을 포함하는 멸균 비히클 내로 혼입시키므로써 제조된다. 멸균 주사성 용액들의 제조를 위한 멸균 분말들의 경우 바람직한 제조방법은 진공건조 및 동결건조(냉동건조)로, 이는 이전에 멸균여과된 용액으로부터 활성성분에 더하여 임의의 추가적인 바람직한 성분의 분말을 생성한다.
이들 조성물들은 보존제들, 습윤제들, 항산화제들, 유화제들 및 분산제들과 같은 부형제들도 포함할 수 있다. 미생물들의 존재의 방지는 상기와 같은, 멸균 절차들 및 각종 항균제들 및 항진균제들, 예로서 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르빈산 등에 의하여 보장될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 항산화제들의 실시예들은 다음을 포함한다: (1) 수용성 항산화제들, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 염산염, 나트륨 비술페이트(sodium bisulfate), 나트륨 메타비술파이트(sodium metabisulfite), 아황산나트륨, 등; (2) 유용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤, 등; 및 (3) 금속 킬레이트제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등.
치료 조성물들은 당 분야에서 알려진 의약 기기들을 이용하여 투여될 수도 있다. 예로서, 바람직한 구체예에서, 본 발명의 치료 조성물은 무바늘(needeless) 피하주사장치, 제어된 속도로 의약 분배를 위한 임플랜트성 미세-주입 펌프 등을 이용하여 투여될 수 있다.
본 발명의 화합물들이 의약으로서 인간 및 동물들에게 투여되는 경우, 이들은 단독으로, 또는 약학적으로 허용가능한 담체와 조합하여 예로서 0.01% 내지 99.5% (또는 0.1 내지 90%)의 활성 성분을 포함하는 약학 조성물로서 제공될 수 있다.
본 발명의 방법들 및 용도
인간 또는 쥐과의 S100A4에 대한 모노클로날 항체들 및 그의 단편들 및 그의 유도체들 또는 접합물들은 시험관 및 생체 내에서 진단 및 치료 용도들을 갖는다. 예로서, 이들 분자들은, 예로서 시험관 내 또는 생체 외에서 배양물 중 세포들, 조직, 기관들에 또는 예로서, 생체 내에서 대상에 각종 장애들을 치료, 예방, 감독 또는 진단하기 위하여 투여될 수 있다.
"대상"이라는 용어는 인간 및 비-인간 동물들을 포함한다. 비-인간 동물들은 모든 척추동물들, 예로서 포유동물들 및 비-포유동물들, 예컨대 영장류 및 비-인간 영장류들, 양, 개, 토끼, 쥐, 마우스들, 소, 닭, 양서류들 및 파충류들을 포함한다. 나타낸 경우를 제외하고, "환자" 또는 "대상"은 서로교환가능하게 사용된다.
방법들은 임의의 종류의 암을 치료하는데 사용될 수 있으며, 이는 이에 제한되지는 않지만 유방암, 전립선암, 림프종, 피부암, 췌장암, 결장암, 흑색종, 악성 흑색종, 난소암, 뇌암, 일차 뇌암종, 머리-목 암, 신경교종, 교모세포종, 간암, 방광암, 비소세포(non-small cell) 폐암, 머리 또는 목 암종, 유방암종, 난소 암종, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 윌름즈(Wilms) 종양, 자궁경부 암종, 고환암종, 방광 암종, 췌장 암종, 위암종, 결장암종, 전립선 암종, 요생식기(genitourinary) 암종, 갑상선 암종, 식도 암종, 골수종, 다발성 골수종, 부신(adrenal) 암종, 신장 세포 암종, 자궁내막 암종, 부신 피질 암종, 악성 췌장 인슐린종, 악성 유 암종(carcinoid carcinoma), 융모막암종(choriocarcinoma), 균상 식육종(mycosis fungoides), 악성 고칼슘혈증, 경부 이상증식(cervical hyperplasia), 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 과립구성 백혈병, 급성 과립구성 백혈병, 털모양 세포(hairy cell) 백혈병, 신경아세포종, 횡문근육종, 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 진성 적혈구증가증(polycythemia vera), 본태성 혈소판 증가증(essential thrombocytosis), 호지킨병(Hodgkin's disease), 비호지킨성 림프종, 연조직 육종, 골육종(osteogenic sarcoma), 1차 매크로글로불린혈증(macroglobulinemia) 및 망막모세포종을 포함한다. 일부 구체예들에서, 치료될 암세포들은 전이성이다. 다른 구체예들에서, 치료된 암세포들은 항암제 또는 항혈관신생제들에 저항성이다.
구체적으로, 본 발명의 항체들 및 그의 단편들은 종양들을 처리하는데 사용될 수 있으며, 여기에서 종양은 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된다: 유방암종, 전립선 암종, 폐 암종, 결장 암종, 췌장 암종, 신장 암종, 위 암종, 난소 암종, 유두 갑상선 암종, 흑색종, 간세포 암종, 방광 암종, 지방육종 침습성 암종, 신경아세포종, 식도 편평상피세포 암종, 골육종, 담낭 암종, 구강 편평상피세포 암종, 자궁내막 암종, 수모세포종, 및 임의의 다른 S100A4 발현 종양.
구체적으로, 본 발명의 항체들 및 그의 단편들은 신장장애, 류마티즘성 관절염, 폐 긴장항진증, 건선 및 기타 S100A4 매개된 질병들을 치료하는데 사용될 수 있다.
신장장애의 전개 또는 매개에 있어서 S100A4의 역할의 증거는 특히 다음 문서들에서 제공되었다: Inoue, T., Okada, H., Takenaka, T., Watanabe, Y. & Suzuki, H. 2009 (A case report suggesting the occurrence of epithelial-mesenchymal transition in obstructive nephropathy. Clin. Exp. Nephrol 13, 385~388); Yamaguchi, Y. 등, 2009 (Epithelial-mesenchymal transition as a potential explanation for podocyte depletion in diabetic nephropathy. Am. J. Kidney Dis 54, 653~664); Le Hir, M., Hegyi, I., Cueni-Loffing, D., Loffing, J. & Kaissling, B. 2005 (Characterization of renal interstitial fibroblast-specific protein 1/S100A4-positive cells in healthy and inflamed rodent kidneys. Histochem. Cell Biol 123, 335~346).
류마티즘성 관절염의 전개 또는 매개에 있어서 S100A4의 역할의 증거는 특히 다음 문서들에서 제공되었다: Bo, G. 등, 2009 (Analyses of differential proteome of human synovial fibroblasts obtained from arthritis. Clin. Rheumatol 28, 191~199); Oslejskova, L. 등, 2009 (Metastasis-inducing S100A4 protein is associated with the disease activity of rheumatoid arthritis. Rheumatology (Oxford) 48, 1590~1594); Masuda, K. 등, 2002 (Molecular profile of synovial fibroblasts in rheumatoid arthritis depends on the stage of proliferation. arthritis Res 4, R8).
폐 긴장항진증의 전개 또는 매개에 있어서 S100A4의 역할의 증거는 특히 다음 문서들에서 제공되었다: Peng, T. 등, 2009 (Plasma levels of S100A4 in portopulmonary hypertension. Biomarkers 14, 156~160); Hodge, S. 등, 2009 (Posttransplant bronchiolitis obliterans syndrome is associated with bronchial epithelial to mesenchymal transition. Am. J. Transplant 9, 727~733); Spiekerkoetter, E. 등, 2008 (Reactivation of gammaHV68 induces neointimal lesions in pulmonary arteries of S100A4/Mts1-overexpressing mice in association with degradation of elastin. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol 294, L276~289); Brisset, A.C. 등, 2007 (Intimal smooth muscle cells of porcine and human coronary artery express S100A4, a marker of the rhomboid phenotype in vitro. Circ. Res 100, 1055~1062); Lawrie, A. 등, 2005 (Interdependent serotonin transporter and receptor pathways regulate S100A4/Mts1, a gene associated with pulmonary vascular disease. Circ. Res 97, 227~235); Merklinger, S.L. 등, 2005 (Increased fibulin-5 and elastin in S100A4/Mts1 mice with pulmonary hypertension. Circ. Res 97, 596~604); Greenway, S. 등, 2004 (S100A4/Mts1 produces murine pulmonary artery changes resembling plexogenic arteriopathy and is increased in human plexogenic arteriopathy. Am. J. Pathol 164, 253~262).
건선의 전개 또는 매개에 있어서 S100A4의 역할의 증거는 특히 다음 문서들에서 제공되었다: Zibert, JR, Skov, L. Thyssen JP, Jacobsen GK, Grigorian M. 2010 (Significance of the S100A4 protein in psoriasis. J Invest Dermatology. 130(1): 150~60); Eckert RL, Broome AM, Ruse M, Robinson N, Ryan D, Lee K. 2004 (J Invest Dermatol. 123(1): 23~33).
"치료(treating)"라는 표현은, 질병의 증상, 합병증, 또는 생화학적 표시의 개시를 예방 또는 지연시키기기 위하여 본 발명의 화합물들 또는 약제들을 투여하여, 증상을 완화시키거나, 질병, 질환 또는 장애의 더이상의 전개를 정지 또는 저해하는 것을 포함한다. 치료는 예방적(질병의 개시를 방지 또는 지연, 또는 임상적 또는 그의 준임상적(subclinical) 증상의 발현을 방지하기 위함) 또는 질병이 나타난 후 증상의 치료적 억제 또는 완화일 수 있다.
부품 키트(Kits-of-parts)
본 발명은 나아가, 종양 치료에서 동시, 분리 또는 순차적인 이용을 위한 조합된 제제로서, 본 명세서에서 제시된 임의의 하나의 구체예들에 따른 항체 또는 그의 단편 또는 모노클로날 항체, 및 항암제를 포함하는 생산품에 관한 것이다.
S100A4에 대한 항체들이 또다른 약제와 함께 투여되는 경우, 상기 두 성분은 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체들 및 그의 단편들은 병용 치료, 즉 다른 약제들과 조합되어 투여될 수 있다. 예로서, 암치료에서 병용 치료법은 적어도 하나의 항암제 또는 다른 통상의 치료법, 예컨대 방사선 치료와 더불어 본 발명의 항체 조성물을 포함할 수 있다.
이러한 항암제 또는 기타 통상의 치료는 이에 제한되지는 않지만, 아폽토시스 조절제들, 화학치료 항신생물제, 면역치료제들, 항미생물제들, 항바이러스제들, 항진균제들, 소염제들 및 외과적 중재 및 방사선치료를 포함한다.
다수의 적당한 항암제들은, 상기 언급된 임의의 질병들, 병 또는 장애들을 치료, 예방 또는 완화시키기 위하여 예컨대 하기와 조합 또는 공동투여하는 것이 고려된다: 아폽토시스를 유도하는 약제들; 폴리뉴클레오티드들 (예로서, 항-센스, 리보자임, siRNA); 폴리펩티드들 (예로서, 효소들 및 항체들); 생물학적 유사체들(mimetics) (예로서, 고시폴(gossypol) 또는 BH3 유사체들); S100A4와 결합(예로서, 올리고머화 또는 착화)하는 약제들; 알칼로이드들; 알킬화제들; 항종양 항생제들; 항대사물질들; 호르몬들; 백금 화합물들; 모노클로날 또는 폴리클로날 항체들 (예로서, 항암약물들, 독소들, 디펜신들(defensins)과 컨쥬게이트된 항체들), 독소들; 방사성 핵종들; 생물학적 반응 개질제들 (예로서, 인터페론들 (예로서, IFN-.알파.) 및 인터류킨들 (예로서, IL-2)); 입양 면역요법제들(adoptive immunotherapy agents); 조혈 성장 인자들; 종양 세포 분화를 유도하는 약제들 (예로서, 모든-트랜스-레티논산); 유전자 치료 시약들 (예로서, 안티센스 요법 시약 및 뉴클레오티드들); 종양 백신들; 혈관신생 저해제들; 프로테아좀(proteasome) 저해제들; NF-KB 조절제들; 항-CDK 화합물들; HDAC 저해제들; 등.
아폽토시스 조절제들은, 이에 제한되지는 않지만, 방사선 (예로서, X-선들,감마선들, UV); 종양 괴사 인자 (TNF)-관련 인자들 (예로서, TNF 부류 수용체 단백질들, TNF 부류 리간드들, TRAIL, TRAILR1 또는 TRAILR2에 대한 항체들); 키나아제 저해제들 (예로서, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 키나아제 저해제, 혈관(vascular) 성장 인자 수용체 (VGFR) 키나아제 저해제, 섬유아세포 성장 인자 수용체 (FGFR) 키나아제 저해제, 혈소판 유래 성장 인자 수용체 (PDGFR) 키나아제 저해제, 및 Bcr-Abl 키나아제 저해제들 (예컨대 이마티닙 메실레이트); 안티센스 분자들; 항체들 (예로서, 트라스투주맵(trastuzumab), 리툭시맵(rituximab), 이브리투모맵 티욱세탄 (ibritumomab tiuxetan) 및 베바시주맵 (bevacizumab); 항-에스트로겐들 (예로서, 랄록시펜(raloxifene) 및 타목시펜); 항-안드로겐들 (예로서, 플루타미드(flutamide), 비칼루타미드(bicalutamide), 피나스테라이드(finasteride), 아미노글루테타미드(aminoglutethamide), 케토코나졸(ketoconazole) 및 코르티코스테로이드들); 시클로옥시게나아제 2(cyclooxygenase 2: COX-2) 저해제들 (예로서, 셀레콕십(celecoxib), 멜록시캄(meloxicam), NS-398 및 비-스테로이드성 소염 약물들 (NSAIDs)); 소염성 약물들 (예로서, 부타졸리딘(butazolidin), 덱사메타손(dexamethasone), 히드록시클로로킨(hydroxychloroquine), 옥시펜부타존(oxyphenbutazone), 페닐부타존(phenylbutazone), 프레드니솔론(prednisolone), 프레드니손(prednisone)); 및 암 화학치료 약물들 (예로서, 이리노테칸(irinotecan), 플루다라빈(fludarabine), 다카르바진(dacarbazine), 미토잔트론, 젬투주맵 오조가마이신(gemtuzumab ozogamicin), 에토포시드 포스페이트(etoposide phosphate), 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥살리플라틴(oxaliplatin), 플루오로우라실, 독소루비신, 젬시타빈, 보르테조밉(bortezomib), 제피티닙(gefitinib), 베바시주맵 또는 파클리탁셀); 세포 신호화 분자들; 세라마이드들 및 시토카인들; 스타우로스포린(staurosporine) 등.
항신생물제 또는 또는 항-과증식제들은 알킬화제들, 항대사물질들, 및 천연 생산물들 (예로서, 허브 및 기타 식물 및 동물 유래된 화합물들)을 포함한다.
알킬화제들은, 이에 제한되지는 않지만 다음을 포함한다: 1) 질소 머스터드 (예로서, 메클로레타민, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 멜팔란 (L-사르콜리신) 및 클로람부실); 2) 에틸렌이민들 및 메틸멜라민들 (예로서, 헥사메틸멜라민 및 티오테파); 3) 알킬 술포네이트들 (예로서, 부술판); 4) 니트로소우레아들 (예로서, 카르무스틴; 로무스틴; 세무스틴; 및 스트렙토조신); 및 5) 트리아젠 (예로서, 다카르바진; 디메틸 트리아제노이미드-아졸카르복사미드).
항대사물질들은 이에 제한되지는 않지만, 다음을 포함한다: 1) 폴린산 유사체들(예로서, 메토트렉세이트 (암폽테린)); 2) 피리미딘 유사체들 (예로서, 플루오로우라실, 플록수리딘 및 시타라빈 (시토신 아라비노사이드); 및 3) 퓨린 유사체들 (예로서, 머캡토퓨린, 티오구아닌 및 펜토스타틴).
화학치료제들은 이에 제한되지는 않지만, 다음을 포함한다: 1) 빈카 알칼로이드들 (예로서, 빈블라스틴 (VLB), 빈크리스틴); 2) 에피포도필로톡신 (epipodophyllotoxins) (예로서, 에토포시드 및 테니포시드); 3) 항생제들 (예로서, 닥티노마이신(dactinomycin) (악티노마이신 D), 다우노루비신 (다우노마이신; 루비도마이신), 독소루비신, 블레오마이신, 플리카마이신 (미트라마이신), 및 미토마이신 (미토마이신 C)); 4) 효소들 (예로서, L-아스파라기나아제); 5) 생물학적 반응 변경제들 (예로서, 인터페론-알파); 6) 백금 배위 착화합물들 (예로서, 시스플라틴 (cis-DDP) 및 카르보플라틴); 7) 안트라센디온류 (anthracenediones) (예로서, 미토잔트론); 8) 치환 우레아들 (예로서, 히드록시우레아); 9) 메틸히드라진 유도체들 (예로서, 프로카르바진 (N-메틸히드라진; MIH)); 10) 아드레노코르티칼 억제제들 (예로서, 미토탄(mitotane) (o,p'-DDD) 및 아미노글루테트이미드); 11) 아드레노코르티코스테로이드들 (adrenocorticosteroids) (예로서, 프레드니손); 12) 프로게스틴류 (예로서, 히드록시프로게스테론 카프로에이트, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 및 메제스테롤(megestrol) 아세테이트; 13) 에스트로겐들 (예로서, 디에틸스틸베스트롤 및 에티닐 에스트라디올); 14) 항에스트로겐들 (예로서, 타목시펜); 15) 안드로겐류 (예로서, 테스토스테론 프로피오네이트 및 플루옥시메스테론); 16) 항안드로겐류 (예로서, 플루타미드); 및 17) 고나도트로핀-방출 호르몬 유사체들 (예로서, 류플로리드(leuprolide)).
다른 통상의 항암제들은 이에 제한되지는 않지만, 다음을 포함한다: 아드리아마이신, 5-플루오로우라실, 에토포시드, 캄프토테신, 악티노마이신 D, 미토마이신 C, 시스플라틴, 도세탁셀, 젬시타빈, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 보르테조밉, 제피티닙, 베바시주맵, 탈메틸화제, her-2의 저해제들, IGF-IR의 저해제들, 혈관 내피 성장인자 (VEGF), VEGFR의 저해제들, mTOR 저해제들, 마이토틱(mitotic) 저해제들, Smad 저해제들 및 탁산류. 이들 약제들은 단독으로, 조합된 치료 조성물로, 키트로, 또는 면역치료제들 등과의 조합으로 제조 및 사용될 수 있다.
방사선 투여량이 허용되지 않는 부정적인 부작용 없이 환자에 의해 감내되는 한, 임의의 유형의 방사선이 환자에게 적용될 수 있다. 적당한 유형의 방사선치료는, 예로서 이온화(전자기) 방사선치료 (예로서, X-선들 또는 감마선들) 또는 입자 빔 방사선치료 (예로서, 고선형 에너지 방사선)을 포함한다.
본 발명은 또한 하기에 대한 것이다:
[1]. 서열번호: 1, 서열번호: 2 및 서열번호: 3으로부터 선택되는 서열을 포함하는 분리된 아미노산 서열.
[2]. 서열번호: 3을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편.
[3]. 서열번호: 3을 포함하는 폴리펩티드로 포유동물을 면역화하므로써 생산되는 인간 또는 쥐과의 S100A4 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편.
[4]. 상기 [2] 또는 [3]의 상기 항체 또는 그의 단편으로서, 상기 항체 또는 그의 단편은 인간 항체 또는 그의 단편; 인간화 항체 또는 그의 단편; 폴리클로날 항체 또는 그의 단편; 모노클로날 항체 또는 그의 단편; Fab 항체; 및 키메라 항체 또는 그의 단편으로부터 선택된다.
[5]. 모노클로날 항체로서, 상기 모노클로날 항체는 서열번호: 1을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 포함하거나, 또는 상기 모노클로날 항체는 서열번호: 2를 포함하는 중쇄 폴리펩티드를 포함한다.
[6]. 프레임워크 영역들 (FRs) 및 상보성 결정 영역들 (CDRs)을 포함하는 모노클로날 항체로서, 상기 모노클로날 항체는 서열번호: 1을 포함하는 경쇄 및 서열번호: 2를 포함하는 중쇄를 포함한다.
[7]. 상기 [5] 또는 [6]의 모노클로날 항체로서, 상기 모노클로날 항체는 인간 항체; 인간화 항체; 및 키메라 항체 또는 그의 단편으로부터 선택된다.
[8]. 상기 [5], [6] 또는 [7]에 따른 모노클로날 항체로서, 상기 모노클로날 항체는:
a) 인간 또는 쥐과의 S100A4 단백질과만 반응하거나; 또는
b) 인간 또는 쥐과의 S100A4 단백질의 작용 메커니즘을 차단하거나; 또는
c) 인간 또는 쥐과의 S100A4 단백질의 시험관 내 또는 생체 내 기능적 활성을 차단하거나; 또는
d) 인간 또는 쥐과의 S100A4 단백질에 의해 또는 내피 세포에서 혈관 내피 성장 인자(VEGF)와 조합된 인간 또는 쥐과의 S100A4 단백질에 의해 유도되는 친이동성 효과를 차단하거나; 또는
e) 종양 성장을 차단하거나; 또는
f) 종양 발생을 차단하거나; 또는
g) 종양 혈관신생을 차단하거나; 또는
h) 세포적 유포 및 전이 수립을 차단하거나; 또는
i) 암 줄기 세포들을 차단하거나; 또는
j) 상기 a) 내지 i)의 임의의 조합이다.
[9]. 서열번호: 1 및 서열번호: 2를 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 단편으로서, 상기 항체 또는 그의 단편은 1가 또는 2가이다.
[10]. [5], [6], [7], [8] 또는 [9]에 따른 모노클로날 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포주.
[11]. European Collection of Cell Cultures (ECACC)에 기탁번호 10022401로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 수득가능한 모노클로날 항체.
[12]. 분리된 폴리뉴클레오티드로서, 상기 분리된 폴리뉴클레오티드는 모노클로날 항체의 가변영역의 경쇄의 FRs 및 CDRs를 코딩하는 서열번호: 4를 포함하거나, 또는 상기 분리된 폴리뉴클레오티드는 모노클로날 항체의 가변영역의 중쇄의 FRs 및 CDRs를 코딩하는 서열번호: 5를 포함한다.
[13]. 인간 S100A4 단백질의 에피토프 영역을 코딩하는 서열번호: 6을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
[14]. 상기 [5], [6], [7], [8], [9] 또는 [11]에 따른 모노클로날 항체의 제조방법으로서, 상기 방법은 다음 단계들을 포함한다:
(i) 정제된 인간 또는 쥐과의 S100A4 단백질로, 또는 항원에 대한 면역반응을 유도하는데 효과적인 약제와 조합된 정제된 인간 또는 쥐과의 S100A4 단백질로 마우스를 면역화하는 단계;
(ii) 하나 이상의 하이브리도마 세포들을 생산하는 단계,
(iii) 하나 이상의 세포들을 선택하는 단계로, 그의 상등액은:
` a) 인간 또는 쥐과의 S100A4 단백질과만 반응하거나; 또는
b) 인간 또는 쥐과의 S100A4 단백질의 작용 메커니즘을 차단하거나;
c) 인간 또는 쥐과의 S100A4 단백질의 시험관 내 또는 생체 내 기능 활성을 차단하거나; 또는
d) 인간 또는 쥐과의 S100A4 단백질에 의해 또는 내피 세포들 중 VEGF와 조합된 인간 또는 쥐과의 S100A4 단백질에 의해 유도되는 친이동성 효과를 차단하거나; 또는
e) 종양 성장을 차단하거나; 또는
f) 종양 발생을 차단하거나; 또는
g) 종양 혈관신생을 차단하거나; 또는
h) 세포적 유포 및 전이 수립을 차단하거나; 또는
i) 암 줄기 세포들을 차단하거나; 또는
j) 상기 a) 내지 i)의 임의의 조합이다.
(iv) 상기 단계 iii)의 선택된 세포들 중 하나로부터 특이적 세포주를 생산하는 단계; 및
(v) 상기 세포주로부터 모노클로날 항체를 분리하는 단계.
[15]. 상기 [5], [6], [7], [8], [9] 또는 [11]에 따른 모노클로날 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
[16]. 화학치료제를 더 포함하는, 상기 [15]에 따른 약학 조성물.
[17]. 의약으로서의 용도를 위한, 상기 [2], [3] 또는 [4]에 따른 상기 항체 또는 그의 단편, 또는 상기 [5], [6], [7], [8], [9] 또는 [11]에 따른 모노클로날 항체.
[18]. 종양 치료용 의약으로서의 용도를 위한, 상기 [2], [3] 또는 [4]에 따른 상기 항체 또는 그의 단편 또는 상기 [5], [6], [7], [8], [9] 또는 [11]에 따른 모노클로날 항체.
[19]. 종양 치료용 의약 제조를 위한, 상기 [2], [3] 또는 [4]에 따른 항체 또는 그의 단편, 또는 상기 [5], [6], [7], [8], [9] 또는 [11]에 따른 모노클로날 항체의 이용.
[20]. 치료를 필요로 하는 대상에, 약학적으로 유효한 양의 상기 [5], [6], [7], [8], [9] 또는 [11]에 따른 모노클로날 항체를 투여하는 것을 포함하는 종양 치료방법.
[21]. 상기 [18]에 따른 상기 항체 또는 그의 단편 또는 모노클로날 항체, 상기 [19]에 따른 이용, 또는 상기 [20]에 따른 종양 치료방법에 있어서, 상기 종양은 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된다: 유방 암종, 전립선 암종, 폐 암종, 결장 암종, 췌장 암종, 신장 암종, 위 암종, 난소 암종, 유두 갑상선 암종, 흑색종, 간세포 암종, 방광 암종, 지방육종 침습성 암종, 신경아세포종, 식도 편평상피세포 암종, 골육종, 담낭 암종, 구강 편평상피세포 암종, 자궁내막 암종, 수모세포종, 및 임의의 기타 S100A4 매개된 종양들.
[22]. 상기 [2], [3] 또는 [4]에 따른 항체 또는 단편, 또는 상기 [5], [6], [7], [8], [9] 또는 [11]에 따른 모노클로날 항체의, 대상에서의 종양 또는 임의의 다른 S100A4 매개 질병들의 확인, 위치, 평가, 진단, 예후 또는 감독을 위한 마커로서의 이용.
[23]. 종양 치료에서의 동시, 개별 또는 순차적 이용을 위한 병용 제제로서 상기 [2], [3] 또는 [4]에 따른 항체 또는 그의 단편, 또는 상기 [5], [6], [7], [8], [9] 또는 [11]에 따른 모노클로날 항체, 및 항암제를 포함하는 생산품.
[24]. 종양 치료용 의약으로서의 용도를 위한 인간 또는 쥐과의 S100A4 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편.
본 발명은, 하기 실시예들에 의해 설명되며, 이들은 단지 본 발명의 예시를 위한 것이지 본 발명을 제한하는 것으로서 해석되어서는 안된다.
실시예들
재조합 인간 S100A4 단백질 및 모노클로날 항체의 제조
실시예 1: 종양 세포주들들 및 배양물들의 기원 및 제조
인간 태정맥 내피 세포들 (HUVECs, Lonza)을, hEGF, 하이드로코르티손, 소 뇌추출물 및 젠타마이신(EGM, Lonza) 및 10% FCS (Invitrogen)로 보충된, 내피세포 기초 매질 EMB(Lonza)중의 소가죽(Sigma)로부터의 1% B 유형 젤라틴 상에서 배양하였다. HUVECs를 6~9 계대(passages) 사이에 사용하였으며, 모든 실험들은 동일 배치의 세포들을 이용하여, 80~85%의 컨플루언스(confluence)에서 실시된다.
결장 선암종 HCT-116 (ATCC, 번호:CCL-247) 및 췌장 선암종 MiaPACA-2 (ECACC, 번호.:85062806) 세포주들을 10% FCS (Invitrogen)와 2mM L-글루타민으로 보충된 DMEM 고-글루코오스 (PAA)로 배양하였다.
골수종 세포들을 10% FCS (PAA; Australian origin)와 2mM GlutaMAX™I (Invitrogen)으로 보충된 RPMI 1640 (PAA)에서 배양하였다.
모든 세포들을 습윤된 5% CO2-분위기 중 37℃에서 배양하였으며, EZ-PCR 마이코플라즈마 시험 키트 (Biological Industries)에 의하여 평가된 바에 따르면 일관되게 마이코플라스마가 없었다.
실시예 2: 동물들의 기원 및 제조
항체 생산을 위한 마우스들 (암컷 BALB/cAnNHsd); 6주령) 및 종양 모델들을 위한 마우스들 ("누드 마우스들" 암컷 무흉선 (Hsd: 무흉선 Nude-Foxn1nu; 6~7주령)을 Harlan Laboratories Models, S.L. (Barcelona, Spain)로부터 수득하였다. 누드 마우스들을 마이크로-분리기 케이지들(cages) 중 멸균실에 유지시켰으며, 소정의 멸균된 음식과 물을 임의로 첨가하였다. 모든 조작들은 층류 후드 중에서 수행되었다.
실시예 3: 재조합 인간 S100A4 단백질의 획득
전장 인간 S100A4를 암호화하는 단편을, 인간 결장 선암종으로부터 유도된, 세포주 HCT-116의 mRNA로부터의 RT-PCR에 의하여 수득하였다. PCR에 사용된 특정 프라이머들은 다음과 같았다:
서열번호: 22
5'-ACTCACATATGGCGTGCCCTCTGGAGAAGGCCCTGGATGTG-3'
서열번호: 23
5'-ACTCATGAGCTCATCATTTCTTCCTGGGCTGCTTATCTGGGAA-3'
S100A4 cDNA는 세균성 발현 벡터 pET28a(+) (Novagen)의 NdeI 자리 내로 클로닝되었고, 양성 클론들은 DNA 서열분석에 의해 선택 및 확인되었다. 이 구축물은 대장균 TunerTM (DE3) 컴피턴트(competent) 세포들 (Novagen) 내로 형질전환되고, 상기 단백질은 6시간 동안 1mM 이소프로필-D-티오갈락토-피라노시드 (IPTG; Sigma)를 이용하여 유도되었다. 그 후, 세균들을 수확하고 버퍼 A 중에서 초음파처리에 의해 분리하였다 (100 ㎍/mL 리소짐(lisozim), 0.5M NaCl, 10mM Na2HPO4.2H2O, 10mM NaH2PO4.2H2O 및 10mM 이미다졸 pH 7.5). 분해물을 원심분리 및 HiTrapTM 킬레이트화 친화도 컬럼 (Amersham)을 통하여 여과하여 청징화하였다. 단백질을 버퍼 B (0.5M NaCl, 10mM Na2HPO4.2H2O, 10mM NaH2PO4.2H2O 및 300mM 이미다졸 pH 7.5)를 이용하여 용리하였다. 일부 실험들에서, 트롬빈 프로테아제를 이용하여 히스티딘 태그(tag)를 분할하였다 (Novagen, 인식 서열은 Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser이며, 분할 자리는 Arg과 Gly 사이). 따라서, 최종 전장 재조합 S100A4 단백질은 N-말단에서 추가적인 Gly-Ser-His를 갖는다. 효소분해 후, 다중-히스티딘 서열 태그를 이용하여 남아있는 다중-his 사슬을 HiTrapTM 킬레이트화 친화도 컬럼(Amersham)에 의해 제거하고, 재조합 S100A4 단백질을 함유하는 상등액의 순도를 SDS-12% (w/v) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의하여 확인하였다.
실시예 4: S100A4에 대한 모노클로날 항체들의 수득
표준 기술들을 이용하여 모노클로날 항체 (MAb) 융합, ELISA 스크리닝 및 부클로닝을 수행하였다. 배양물들의 유지, 확장 및 규모 확대는 습윤된 분위기(94% 공기 및 6% CO2) 중 37℃에서 수행하였다.
각 모노클로날 항체의 경우, 5마리 동물들을 다음 프로토콜에 따라 태환 재조합 S100A4을 이용하여 면역화하였다. PBS (137mM NaCl, 2.8mM KCl, 8.1mM Na2HPO4, 1.5mM KH2PO4; pH 7.2) 중에서 희석된 S100A4 단백질 50마이크로그램을, 초기 피하(s.c.) 면역화를 위하여 완전 프로인트 보조제 (Sigma)를 갖는, 그리고 19일 및 35일에 순차적인 주사(s.c.)를 위하여 불완전 프로인트 보조제 (Sigma)를 갖는 에멀션으로서 사용하였다. 세번째 주사한지 10일 후, 혈청을 수득 및 시험하였다. 51일에, PBS 중 희석된 S100A4 단백질 25㎍의 최종 부스트는 가장 높은 역가의 혈청을 갖는 마우스에 정맥주사로 제공되었다.
최종 주사한지 4일 후 융합을 수행하였다. 수득된 Mabs는 골수종 세포들과 선택된 마우스로부터의 비장 세포들을 PEG-1500 (Roche Diagnostics)을 융합 유도체로서 사용하여 각각 1/10의 비율로 하나의 융합으로부터 유래되었다. 그 후, 세포들을 혼성물들의 선택을 위하여 HAT (Invitrogen)을 포함하는 매질 중 96 마이크로웰 플레이트들 중에 플레이팅되었다(plated).
하이브리도마 상등액들을, ELISA에 의하여 재조합 인간 S100A4과의 반응성에 대하여 스크리닝하였다. S100A4 단백질 (PBS중 3㎍/mL) 50㎕를 MaxiSorp 96 마이크로웰 플레이트들 (NUNC) 상에서 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. PBS로 세척하고 차단한 후(PBS 중 1% 탈지유(skimmed milk); 1시간; 37℃), 50㎕의 하이브리도마 상등액들을 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 실온에서, 칼슘-마그네슘이 없는 PBS-HT (274mM NaCl, 2.8mM KCl, 8.1mM Na2HPO4, 1.5mM KH2PO4, 0.1% Tween-20; pH 7.2)를 이용하여 5회 세척 후, 결합된 면역글로불린들을, 기질로서 테트라메틸벤지딘 3,3 5,5 (TBM, Sigma)를 이용하여 HRP-컨쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG/IgM (Jackson ImmunoResearch)로 검출하였다.
클로닝을 위하여 플레이트 백그라운드보다 3배 더 큰 광학 밀도를 갖는 웰들을 선택하였다. 모노클로날 항체 5C3 (내부 코드(internal code) 5C3-1B8-1F4; ECACC 10022401), 1E2 (내부 코드 1E2-2H4-2G8; ECACC 11051803), 6B9 (내부 코드 6B9-1E8-2A8; ECACC 11051801), 8B6 (내부 코드 8B6-2F6-1H9-1H10; ECACC 11051804) 및 5A3 (internal code 5A3-4A6-5B6; ECACC 11051802)에 대응하는 클론들을 시험관 내 및 생체 내 분석을 위해 선택하고, 제한 희석에 의하여 부클론화하였다. 웰 당 0.1 및 0.01 세포로 성장한 부클론들만이 확장에 적당한 것으로 간주되어, DMEM/F12 매질 (PAA)에 적합화 및 동결되었다.
대규모 정제를 위하여, 175cm2 배양 플라스크 중에서 10% 우태아 혈청 (PAA, 호주산) 및 2mM의 L-글루타민 (GlutaMAX™I, Invitrogen)을 포함하는 DMEM/F12에서 하이브리도마 세포들을 배양하였다. 세포 농도가 0.8x106세포/mL (85% 넘게 생육)에 도달했을 때, 배양 배지를 제거하고 세포들을 혈청 없는 DMEM/F12 배지를 이용하여 2회 세척하였다. 그 후, 80% DMEM/F12, 20% CD하이브리도마 (Invitrogen) 및 2mM의 L-글루타민을 포함하는 50ml의 매질을 각 플라스크에 첨가하고 96시간 동안 인큐베이션하였다. 종료시, 무혈청 배지를 수집하고, 원심분리하고 정제때까지 동결시켰다.
하이브리도마로부터의 무혈청 상등액 6리터를 수득하였다. 여과 후, 정제 5ml HiTrap 단백질 G HP 친화도 컬럼 (Amersham)을 이용하여 정제하였다. 용리된 항체를 농축하고, 저-결합 Ultracel® 막(30000 NMWL, Millipore)을 갖는 Amicon® Ultra-15 원심분리 여과 장치를 이용하여, PBS 중에서 정용여과하였다(diafiltrated). 최종 조절된(conditioned) 항체들을 280nm에서 정량화하였다.
실시예 5: 모노클로날 항체들 5C3, 1E2, 6B9, 8B6, 5A3의 교차-반응성 특징화: 모노클로날 항체들은 S100A4와만 반응한다
모노클로날 항체들 5C3, 1E2, 6B9, 8B6 및 5A3를, 하기 S100 과의 다른 원들에 대한 교차-반응성에 대하여 스크리닝하였다: 재조합 인간 S100A1, S100A2, S100A6 (Abnova), 재조합 인간 S100A7, S100P (Leitat Biomed Division에서, MDA-MD-468 유방 선암종 세포주로부터 및 HeLa 자궁경부(cervix) 선암종 세포주로부터 각각 클로닝됨), 및 재조합 쥐과 S100A4 (Leitat Biomed Division에서, NIH/3T3 마우스 배아 섬유아세포 선암종 세포주로부터 클로닝됨). S100A4에 대항하는 모노클로날 항체들에 대한 면역글로불린 아이소타입을 마우스 면역글로불린 서브타이핑(subtyping) 키트(Sigma)를 이용하여 결정하였다.
정제된 인간 S100A4, 인간 S100A1, 인간 S100A2, 인간 S100A6, 인간 S100A7, 인간 S100P, 및 쥐과의 S100A4 상에서의 ELISA에 의한 항체 스크리닝은, 모노클로날 항체 5C3, 1E2, 8B6 및 5A3이 인간 및 쥐과 S100A4와, 동일한 강도로 반응한 한편, 6B9는 인간 S100A4 만을 인식하였음을 나타내었다 (표 1).
ELISA에 의해 분석된 5C3, 1E2, 6B9, 8B6, 5A3 특이성
ELISA에서 mAb의 반응 패턴
항체 면역원 아이소타입 인간 S100A4 마우스 S100A4 인간 S100A1 인간 S100A2 인간 S100A6 인간 S100A7 인간 S100P
5C3 인간 S100A4 IgG1 ++++ ++++ - - - - -
1E2 인간 S100A4 IgG2a ++++ ++++ na na na - -
6B9 인간 S100A4 IgG1 ++++ - na na na - -
8B6 인간 S100A4 IgG1 ++++ ++++ na na na - -
5A3 인간 S100A4 IgG1 ++++ ++++ na na na - -
++++ 양성 반응, - 반응 없음, na 분석되지 않음
실시예 6: 웨스턴 블롯체 의한 5C3의 면역-특징화
세포 및 종양 샘플들을 PBS로 2회 헹구고, 빙냉 세포 용해 버퍼(150mM NaCl, 1% IGEPAL CA630, 5mM EDTA, 100㎍/mL PMSF, 1mM Na3VO4, 1mM NaF 및 50mM Tris pH 7.4)로 즉시 용균시켰다. 용균물들을 원심분리하여 청징화하고(cleared), 브래드포드(Bradford) 시약 (Bio-Rad)를 이용하여 단백질 농도를 정량하였다. 총 추출물들 (50mg)을 환원 조건 하에서 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔 (PAGE) 전기영동 중에서 분해하고, BioTraceTM PVDF 막들 (PALL corporation)로 이동시켰다. 막들을 TBS 및 0.1% Tween-20 중에서 5% 탈지건조유를 이용하여 1시간 동안 차단시키고, 관련 일차 항체와 함께 하룻밤 동안, 그 후 차단 버퍼 중에서 1시간 동안 2차 항체와 함께 인큐베이션시킨 후, 각 인큐베이션 후 TBS 및 0.1% Tween-20 중에서 10분 동안 3회 세척하였다. 신호들을 ECLTM 웨스턴 블로팅 검출 시약들 (Amersham)을 이용하여 전개시키고, HyperfilmTM ECL (Amersham)에 노출시켰다.
항체들의 농도는 하기와 같았다: 2차 항체들로서, 모노클로날 마우스 항-인간 S100A4 5C3 (Leitat Biomed Division) 1㎍/mL; 다클론성 토끼 항-튜불린(anti-tubulin) (ICN Biomedicals) 1:5000 희석액; 염소 항-마우스 (Jackson ImmunoResearch) 0.04㎍/ml 및 염소 항-토끼 (Sigma) 1:25000 희석액.
도 1a~1b는 몇몇 종양 세포주들, 마우스 배아 섬유아세포 세포주 NIH3T3 및 HCT116, MiaPACA-2 및 BxPC3 세포주 이종이식 모델들로부터 유래된 종양 샘플들에서 S100A4 단백질의 발현 패턴을 나타낸다. 인간 췌장 선암종 세포주들 MiaPACA-2 및 Panc1은, 또다른 인간 췌장 선암종 세포주인 BxPC3보다 더욱 높은 발현 수준을 나타내었다. 도 1b에서 알 수 있는 바와 같이, BxPC3로부터 유래된 종양들은 배양물 중 BxPC3이 갖는 것보다 더 높은 수준의 S100A4 발현을 나타내었다. S100A4 수준의 이러한 증가는 악성 침습성 종양들(이는 면역조직학 섹션에서도 관찰됨)의 생성에 있어 단백질의 직접적인 역할을 나타내는 것일 수 있다. 이들 증가된 수준들은 종양 세포들 자신 또는 종양 기질 세포들 중 어느 하나에 의하여 생성될 수 있다. 유선 선암종 세포주들 MDA-MB-231 및 468은 무의미한 S100A4 단백질 수준을 나타내었으나, 도 1c에서, MDA-MB-231의 배양물로부터 유래된 암 줄기 세포들이 S100A4 발현의 상승된 수준을 나타내었음을 관찰할 수 있다. 결장 선암종 세포주 Colo 205 및 또다른 결장 선암종 세포주, HCT116으로부터 유래된 종양들은 높은 수준의 단백질 발현을 나타내었다. 도 1a는, 5C3이 인간 S100A4와 반응할 뿐만 아니라, 쥐과의 S100A4 (NIH-3T3 마우스 섬유아세포)와도 반응한다는 것을 나타내었다(NIH-3T3 마우스 섬유아세포).
5C3로 수득된 동일한 결과들은 다른 mAbs의 경우에도 확장될 수 있을 것이지만, 변성된 S100A4 단백질과 반응하지 않은 8B6 (데이터 미도시)은 예외이다.
실시예 7: 면역조직화학에 의한 5C3의 면역-특징화
종양 블럭들로부터 4개의 마이크로미터 두께의 섹션들을 탈파라핀화하고, 등급 알코올 중에서 재수화하고 가공하였다. 간략하게는, 항원 회복(retrieval)을 10mM 나트륨 시트레이트, pH 6.0 중에서 0.05% Tween-20과 함께 15분 동안 마이크로파 오븐에서 수행하였다. 내생의 퍼옥시다아제 활성을 증류수 중 3% H2O2 용액으로 차단하고, 슬라이드들을 5% 정상의 염소 혈청 중에서 30분 동안 인큐베이션하여 비특이적 염색을 방지하였다. 그 후, 이들을 적절하게 희석된 1차 항체들과 4℃에서 하루밤 동안 인큐베이션하였다. 다음 항체들을 사용하였다: 마우스 모노클로날 항체 5C3 (1㎍/mL), Dako (희석 1:200)로부터의 토끼 폴리클로날 항-S100A4 항체 및 R&D 시스템들 (5㎍/mL)로부터의 마우스 모노클로날 항-폴리히스티딘 항체. 그 후, 상기 절단물들을 2㎍/mL의 적절하게 비오티닐화된 염소 항-마우스 IgG (H+L) (Vector Laboratories) 및 2㎍/mL의 비오티닐화된 염소 항-토끼 IgG (H+L) (Vector Laboratories)와 함께, 60분 동안 인큐베이션하고, 실온에서 30분 동안 ABC 복합체(Dako)와 인큐베이션하였다. NovaRed (Dako)를 발색체(chromogen)으로서 사용하였다. 음성 대조구로서, 일차 항체를 비-관련된 모노클로날 항체 (항-폴리히스티딘)로 치환하였다.
5C3 모노클로날 항체를 이용한 면역조직화학적 분석 (도 2)은, Panc 1 또는 BxPC3 췌장 선암종 이종이식 모델들 중 어느 하나로부터 유래된 종양의 중심부에서보다 침습성 전방에서의 S100A4 발현 수준이 더욱 높았음을 보여주었다. 또한, 고배율 (×120)에서의 분석들은, 세포질에서 뿐만 아니라 종양 세포들의 핵들에서의 단백질의 존재를 나타내었다. 면역조직화학적 분석을 위하여 S100A4 대하여 가장 많이 인용된 항체를 사용하였을 때 (Dako로부터의 토끼 폴리클로날 항체), 본 발명자들은 동일한 분포 패턴을 관찰하였다.
이들 결과들을 모두 함께 고려시, 본 발명자들은 시험된 모노클로날 항체들이 진단 분석에서의 도구로서 사용될 수 있음을 확인하였다
실시예 8: 5C3은 S100A4에 의해 유도된 MMP9 기질 금속프로테나아제 활성을 변조한다.
정량적 단백질 기질 자이모그래피 방법은 세포외 기질의 파괴, 성장 인자들의 가동(mobilisation), 표면 분자들의 가공의 지표로서 입증되며, 기질 및 종양 세포들의 이동 및 침습성 과정과 상관된다. 암환자들에서, 이러한 표준 실험 기술은 질병의 임상적 정도의 척도를 반영하는 것으로 나타난다. 환자의 혈청 중 MMP 활성 분석은 암의 하위군들 구분을 위한 진단 값을 가질 수 있으며 보다 높은 전이 가능성을 갖는 것들을 결정할 수 있을 것이다.
HUVECs는, 24-웰 배양 플레이트들에서 EBM과 보충물들 (EGM) 및 10% FCS 중에서 성장하였다. 자극 전, 혈청 또는 기타 보충물들 부재 하에 EBM 중에서 세포들을 4시간 동안 유지하였다. 그 후, EBM 중 S100A4 (0.3-1-3 mM)를 상기 배양물에 첨가하여, 이들의 기질 금속프로테나아제들(MMPs)의 활성형 분비 증가능을 분석하였다. S100A4 자극을 차단하는 5C3의 저해 효과를 시험하기 위하여, 1~2μM의 항체들을, 배양물에 첨가하기 전에, S100A4 (1μM)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 37℃에서 24시간 후, 파편들을 제거하기 위하여 상등액을 원심분리하였다. 그 후, 환원제 없이 10mL의 램리(Laemmli) 샘플 버퍼(80mM Tris-HCl pH 6.8, 4% SDS, 10% 글리세롤, 0.01% 브로모페놀 블루)를 10μl의 맑은 상등액들 각각에 첨가하였으며, 이는 비등 없이, 돼지 피부로부터의 A 형 젤라틴(Sigma)와 공중합된 8% SDS-폴리아크릴아미드 겔에 1mg/ml의 최종 농도로 부하되었다. 전기영동 후, H2O 중 2.5% Triton X-100를 이용하여 겔을 15분 동안 3회 세척하여 SDS를 제거하였다. 50mM Tris-HCl pH 7.5, 10mM CaCl2 및 0.02% NaN3 존재하에 37℃에서 겔을 48시간 인큐베이션하므로써 활성화가 나타났다. 1:3:6 부피비의 아세트산, 메탄올 및 물 중 0.1% 나프톨 아미도 블랙 (Sigma)을 이용하여, 실온에서 1시간 동안 염색을 수행하였다. 그 후, 어두운 배경 위에 명확한 밴드들이 나타날 때까지, 겔들을 탈염(destaining) 용액으로 세척하였다. NIH ImageJ 영상화 소프트웨어를 이용하여 밴드들을 정량하였다.
본 발명자들은 내피 이동의 유도에서 S100A4의 작용 메커니즘 일부를 결정하고자, HUVECs로부터의 컨디셔닝된 매질 중에서 MMPs의 생산 및 활성화를 분석하였다. S100A4 (0.3-1-3μM)로 처리된 세포들로부터의 컨디셔닝된 매질은 비처리된 세포들로부터의 것들에 비하여 MMP9단백질의 실질적으로 더욱 활성형들을 포함하였다. 이 활성은 투여량-의존성이었다 (도 3A). 이들 차이들은 처리 24시간에 검출되었다. 매질 중 MMP9의 활성은, 항-S100A4 항체 5C3이 S100A4 단백질과 함께 첨가되었을 때 완전히 감소되었다 (도 3B). S100A4는 이러한 세포 모델에서 MMP2 활성에서의 변화를 유도하지 않았다.
본 발명자들은, S100A4로 처리된 HUVECs의 컨디셔닝된 매질 중에서 검출된 증진된 단백분해 활성이, VEGF와 S100A4가 배양물에 첨가되는 경우 이동의 자극과 상관되는 것으로 추측할 수 있었다. 이는 적어도 부분적으로 MMP9의 작용에 대해 의존적이다.
실시예 9: S100A4 및 VEGF는 HUVECs 이동에 대한 상승작용적 효과를 나타내고, 모노클로날 항체들 5C3, 1E2, 6B9, 8B6 및 5A3는 이러한 활성을 차단한다.
내피 세포들(EC)은 임의의 포유동물의 모든 혈관들 내부에 덧대어져 있다. EC는 병적 상황 또는 생리적 상황에 기원할 수 있는 특정 자극들 하에서 새로운 혈관 형성을 개시하는 역할을 하는 세포들이다. EC 이동은 이러한 신생혈관 형성에서의 주요 단계인 것으로서 현재 인정되고 있다. 따라서, EC 이동 연구들은 항-신생혈관 약물의 치료 활성 프로파일을 완전히 나타낸다.
8μm기공들을 갖는 광-불투명 PET 막 필터 삽입물들이 있는 24-웰 세포 배양 플레이트들(Becton Dickinson로부터의 Transwell HTS FluoroBlokTM Multiwell Insert Systems)을 사용하여 이동 활성을 시험하였다. 상기 Transwell 막들의 상부 및 하부 표면들을 15㎍/mL의 I형 Collagen (Upstate)으로, 37℃에서 2시간 동안 코팅하였다. 혈청 또는 다른 보충물들 부재 하에 100μl의 EMB 중에 현탁된 내피 세포들(5×104 HUVEC)을, 상기 콜라겐 코팅 후, 각 Transwell 챔버의 상부 면 상에 접종하고, 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, S100A4 (1μM)를, 단독 또는 EBM 중 VEGF(3ng/mL)와의 조합으로, 24-웰 플레이트들의 하부 구역에 첨가하여 이들의 화학주성 능(chemotactic capacity)을 시험하였다. 항-S100A4 (5C3, 1E2, 6B9, 8B6, 5A3) 모노클로날 항체들의 저해능을 시험하기 위하여 (Leitat Biomed Division), 몇몇 농도의 (도 4 참조) 항체들을, 이동을 개시하기 위하여 상기 트랜스웰(transwell)의 하부 챔버에 첨가하기 전에, S100A4 및 VEGF과 함께 또는 단독의 VEGF과 함께 2시간 동안 인큐베이션하였다. 5H4 (Leitat Biomed Division)로 명명되는 다른 모노클로날 항체 항-S100A4를 이용하여 활성을 비교하였다. 37℃에서 24시간 후, 트랜스웰의 하부측으로 이동한 세포들을 5μM Calcein-AM (Calbiochem)과 함께 37℃에서 25~30분 동안 인큐베이션하였다. 이동된 세포들을 ×10배 확대로 광현미경 하에서 계수하였다. 군들 간의 비교는 양쪽 비모수적 (two-tailed nonparametric) 만-휘트니 U검정을 이용하여 수행되었다. P 값에 대한 차이가 0.05 미만이면 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
이 실험은 S100A4와 다른 혈관신생 인자 (VEGF)의 조합이 HUVECs의 이동 활성을 상승작용적으로 증가시켰음을 최초로 증명하였다. S100A4를 1μM의 투여량으로 시험하였으며, 대조구 -EBM에 비하여 현저한 활성을 나타내지는 않았다. 3ng/mL의 단독 VEGF와 HUVECs의 인큐베이션은 EMB에 비하여, 각각 2.4-배로 전이를 증가시켰다. VEGF (3ng/mL)이 S100A4 (1μM)와 조합되는 경우, 상승작용적 효과가 관찰되었다(도 4). 특히, 재조합 S100A4 (1μM)가 VEGF (3ng/mL)와 함께 첨가되는 경우, 전이는 VEGF 단독의 효과에 비하여 235% 증가하였다.
본 발명자들은 S100A4의 친전이성(promigratory) 활성을 저해하기 위하여, 모노클로날 항체들 항-S100A4 (5C3, 1E2, 6B9, 8B6, 5A3)도 사용하였다. 도 4A에 나타낸 바와 같이, 250nM의 5C3은, VEGF (3 ng/mL)과 S100A4 (1μM) 의 조합의 HUVECs 이동에 대한 상승작용적 효과를 완전히 없앴다. 5C3으로 인한 이동의 저해는 투여량-의존적이었다. 항체는 VEFG 단독에 의해 유도된 이동에 영향을 미치지 않았다. 대조적으로, 5H4 로 명명되는 다른 모노클로날 항체 항-S100A4는 중화 효과를 나타내지 않았다. 도 4B는, 5C3과 비교하여 모두 2μM에서 작용하는 S100A4에 대한 다른 모노클로날 항체들의 저해 활성을 나타내었다. 생화학적 데이터와 함께 이들 모두를 고려하여, 이들 결과들은 5C3, 1E2, 6B9, 8B6 및 5A3이 S100A4에 특이적으로 결합하고, HUVECs 전이에 대하여 S100A4에 의해 유도된 시험관 내 중화 활성을 나타낸다는 것을 증명하였다.
실시예 10: 5C3은 누드 마우스들에서 MiaPACA-2 및 HCT116 종양 전개를 차단한다
종양 이종이식편들은, 화학치료 결과들이 암 화학치료에 대한 잠재적인 임상적 관련성을 갖는 경우에서 반응들을 평가하는데 흔히 사용된다. 따라서 종양 이종이식편들은 이종이식편 데이터를 임상 데이터와 상관시키는데 좋은 모델들이다. 상이한 유형의 이종이식된 종양들을 이용한 약물 시험은 면역-결핍 동물들에서 수득된 이종이식편들의 반응이 임상적 실시에서의 반응에 필적한다는 것을 나타내었다. 추가적으로, 특정 종양 유형의 이종이식편들은 질병에 대항하는 알려진 임상 활성을 갖는 약제들을 확인할 수 있다.
지수적(exponential) 성장기의 MiaPACA-2 인간 췌장 선암종 세포주 및 HCT116 인간 결장 선암종 세포주는 트립신-EDTA (0.05%/0.02%) (Invitrogen)를 이용하여 수확, 세척되고 트립판 블루(trypan blue) 염료 배제에 의하여 생육성에 대하여 시험되었다. 생육성은 95% 초과였다. 일차 종양 성장을 위하여, 세포들 (0.1mL DMEM 고글루코오즈 중 MiaPACA-2 또는 HCT116 각각에 대한 5x106 또는 1x106 세포들)은 누드 마우스들의 옆구리 내로 피하주사되었다. MiaPACA-2의 경우 65~160mm3 사이의 종양 부피들 및 HCT116의 경우 155~370mm3 사이의 부피들을 이용하여, 평균 종양 크기가 군들 간에 균일하도록(MiaPACA-2의 경우 약 100mm3 또는 HCT116의 경우 220mm3 ), 마우스들을 10마리 마우스들 각각 (MiaPACA-2) 또는 7마리 마우스들 각각 (HCT116)의 2개 군으로 나누었다. 종양 성장은 캘리퍼스(calipers)를 이용하여 종양 직경들을 측정하였으며, 종양 부피는 편장 타원면(prolate ellipsoid)에 대해 근사된 하기 공식을 이용하여 계산하였다:
부피= (Dxd 2 )/2
식 중, D은 종양의 가장 긴 축을 나타내고, d 는 가장 짧은 축을 나타낸다. 마우스들은 비히클 (PBS) 또는 항체 중 어느 하나로, 복강 내 (i.p.), 주 3회 25mg/Kg/100μL 멸균 PBS로 처리되었으며, 규정된 종양 부피(100mm3 및 220mm3)에서 처리를 시작하였다. 실험 종료시, 동물들을 살생시키고, 종양들을 외과수술로 제거하고, 칭량하였으며, 종양의 반은 이후의 CD31 면역염색 분석을 위해 OCT 화합물 중에 임베딩시키고, 나머지 반은 이후의 분석을 위하여 포름알데히드 중에 고정시켰다. MiaPACA-2 또는 HCT116 종양들을 포함하는 동물들로부터의 혈액 샘플들을, EDTA-코팅된 물질을 사용하여, 실험 종료시 수집하였다(모든 동물들). 직후에, 혈장 샘플들을 실온에서 5000rpm으로 10분 동안 원심분리시키고, 분석때까지 -20℃에서 저장하였다.
군들 간의 비교는 양쪽 비모수적 만-휘트니 U검정을 이용하여 수행되었다. P 값에 대한 차이가 0.05 미만이면 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
본 발명자들은 무흉선 누드 마우스들에서 MiaPACA-2 (도 5) 또는 HCT116 종양들의 피하 발생에 대한 5C3의 효과를 연구하였다. MiaPACA-2/HCT116 세포주들 또는 누드 마우스들에서의 MiaPACA-2/HCT116로부터 발생된 종양들 중 하나는 S100A4 단백질 발현의 높은 수준 및 상기 단백질의 배양 배지 내 및 혈액내 각각으로의 분비를 나타내었다 (데이터 미도시). 췌장 및 결장 종양들에서 S100A4의 역할 및 상기 단백질이 이들 세포주에 의해 분비된다는 증거로 인하여, 본 발명자들은 본 발명의 모노클로날 항체 5C3의 생체 내 활성을 시험하기 위하여 이 모델을 시도해보기로 결정하였다.
이종이식편들을 이식하고 배양하였으며, 종양을 갖는 동물들을 임의로 지정하고 상기 설명된 것과 같이 치료하였다. MiaPACA-2의 경우 세포 이식 후 17일에 치료를 개시하였으며 (각 군의 평균 종양 부피가 100mm3보다 높았음) (0일), 치료한지 30일 후 종양들을 수집하였다. HCT116의 경우 세포 이식 후 23일에 치료를 개시하였다(각 군의 평균 종양 부피가 220mm3보다 높았음) (0일). 5C3을 복강내 경로에 의하여 제공하여 (25mg/kg), 도 6에 나타낸 주 투여 스케쥴로 3회 투여하였다(MiaPACA-2에 대한 예).
도 5A는 MiaPACA-2 종양을 갖는 마우스들에 대하여, 시간에 따른 5C3의 항종양 활성의 비교 분석을 나타낸다. 대조구(비히클)는 초기 부피 (치료 전)에 대하여 592%의 평균 상대 종양 부피를 갖는 최대 종양 성장을 나타내었다. 5C3-주사된 마우스들에서의 종양 부피 변화들은 초기 부피에 비하여 274%의 최대 평균 상대 종양 부피를 나타내었다(30일). 이들 데이터와 관련하여, 본 발명자들은 5C3을 이용한 치료가 실험 종료시 대조구에 비하여 종양 중량에서의 통계적으로 유의한 감소를 유도하였음을 관찰하였다(도 5B). 추가적으로, 이들 차이들은 계산된 종양 부피 및 종양 중량의 T/C 비율에 반영된다: 각각 46% 및 38%.
HCT116 종양을 갖는 마우스들의 경우 시간에 따른 5C3의 항종양 활성. 대조구(비히클)는 초기 부피 (치료 전)에 대하여 557%의 평균 상대 종양 부피를 갖는 최대 종양 성장을 나타내었다. 5C3-주사된 마우스들에서의 종양 부피 변화들은 초기 부피에 비하여 511%의 최대 평균 상대 종양 부피를 나타내었다(21일). 이들 데이터와 관련하여, 본 발명자들은 5C3을 이용한 치료가 실험 종료시(21일) 대조구에 비하여, 종양 부피 평가에서 관찰된 것 보다 더 높은, 종양 중량에서의 감소를 유도하였음을 관찰하였다(데이터 미도시). 추가적으로, 이들 차이들은 계산된 종양 부피 및 종양 중량의 T/C 비율(처리군 대 대조구)에 반영된다: 각각 91% 및 74%.
따라서, 본 발명자들은, MiaPACA-2 인간 췌장 종양에 대한 비처리군 (비히클)에 비하여, S100A4에 대한 모노클로날 항체를 이용한 치료가 종양 성장에서 통계적으로 현저히 두드러지는 지연 및 종양 중량에 영향을 미치는 HCT116 인간 결장 종양에서의 내부종양 (intratumoral) 괴사에서의 증가를 유도하였다는 것을 최초로 증명하였다.
실시예 11: 5C3은 종양 신생혈관 형성을 차단한다.
실험적 증거는, 특정 크기가 넘는 종양 성장은, 전이도 허용할 수 있는 혈관 신생을 필요로 한다는 것을 제안한다. 종양 혈관신생이 암종에서의 전이에 어떻게 상관되는지를 연구하기 위하여, 조사자들은 미세혈관들(모세혈관들 및 소정맥들)을 계수하고 초기 침습성 암종들내의 미세혈관들의 밀도를 등급화하였다. 미세혈관들의 수 및 밀도 등급은 원위 전이들에도 상관되었다. 종양 혈관신생의 평가는 따라서, 공격적 치료에 대하여 초기 유방암종을 갖는 환자들을 선발하는데 유익한 것으로 입증될 수 있다.
MiaPACA-2 이종이식편 종양 모델로부터의 종양들은 임베딩 및 동결된 OCT (Tissue-Tek®Sakura)였다. 각 종양의 중심부에 대응하는 하나의 동결절단물(cryosection) (5㎛)을 분석하였다. 절단물들을 아세톤/클로로포름 (1:1) 중, -20℃에서 5분 동안 고정시키고, 실온에서 하룻밤 동안 건조시키고, PBS로 세척하고, 암실에서 PBS 중 H2O2 (0.03%)로 4℃에서 10분 동안 처리하였다. 그 후, 절단물들을 PBS로 세척하고, PBS-BSA (2%)와 토끼 혈청(5%) (Vector) 를 이용하여 4℃에서 20분동안 차단하고, 아비딘-비오틴 차단 용액 (Dako)으로 각각 4℃에서 10분 동안 차단하였다. 샘플들을 실온에서 1시간 동안 일차 항체와 함께 인큐베이션하였다; 차단 버퍼 중에서 희석된 CD31 (희석 1:200, BD PharMingen) 에 대한 모노클로날 쥐 항-마우스 항체. 인큐베이션 절단면들을, 이차 항체 (희석 1:500, Vector)로서 폴리클로날 비오티닐화 항-쥐 항체와 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 후, ABC 시약 (Pierce)과 함께 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 최종적으로, 절단물들을 NovaRed (Vector)와 함께 20분 동안 4℃에서 인큐베이션하고, 헤마톡실린 해리스 (Sigma)로 10초 동안 염색하고, DPX 비수성 탑재(mounting) 매질(Sigma)을 이용하여 탑재하였다
혈관신생 정량은 2개의 기준을 이용하여 측정하였다:
Figure pct00004
Figure pct00005
종양의 크기에 따라 슬라이스 하나 당 8 및 39개의 사진들을 찍어 NIH ImageJ imaging 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
군들 간의 비교는 양쪽 비모수적 만-휘트니 U검정을 이용하여 수행되었다. P 값에 대한 차이가 0.05 미만이면 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
본 발명자들은 5C3이 생체 내 종양 혈관신생에 실질적으로 영향을 미치는지의 여부를 조사하였다. 종양 혈관신생의 평가는 CD31 면역염색 및 2 개의 분석 근사값들에 근거하여 수행되었다: 미세혈관 밀도(MicroVessel Density: M.V.D.) 및 혈관의 분획 면적(A.A.).
표 2는, 동물 하나하나마다 수득된, 각 피하 MiaPACA-2 종양에 대해 분석된 사진들의 수와 관련하여, 혈관의 총 면적, 혈관 번호, 종양 총 면적 및 MVD 및 %A.A. 정량화의 모든 데이터를 나타낸다.
Figure pct00006
Figure pct00007
모노클로날 항체 5C3로 처리된 동물들로부터의 종양들은, 대조구(비히클)로부터의 동물들에 비하여, 미세혈관 밀도에서 약 40%의 감소 및 혈관에 의해 점유된 절단면적의 30%의 감소를 나타내었다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 내부종양 미세혈관들에서의 이러한 차이들은 통계적으로 유의하였다.
본 실험 데이터는, 종양 발생을 차단하는 5C3의 효과가, 부분적으로는 종양 혈관신생의 가장 강한 감소로 인한 것일 수 있다는 것을 밝혔다.
실시예 12: 5C3 치료는 체중 감소 또는 불리한 부작용들을 유도하지 않는다.
비히클 대조구와 5C3-처리군의 투여일에서의 체중 프로파일을 실험에 따른 투여 전에 모니터링하였다. 어떤 군에서도 체중 손실은 관찰되지 않았으며, 치료들은 방해받지 않았다.
도 8은 실험에 따른 동물들의 체중 프로파일을 나타낸다. 5C3은 주 당 3회의 투여량 스케쥴로 실험 종료시까지 25mg/kg에서 잘 감내되었다.
동물들의 거시적 분석들은 기관들에서의 이상들을 증명하지 못하였다. 본 발명자들은 실험에 따라 어떤 동물에서도 불리한 부작용들을 관찰하지 못했다 (운동 실조증(motor incoordination), 마비, 사지 기능장애(ataxia), 경련(convulsions), 설사, 악액질(cachexia), 홍반, 저체온증, 사망).
실시예 13: 이종이식편 종양 모델에서 S100A4의 혈장 정량화
암환자에서의 치료 향상을 위한 중요한 과정인, 종양 및 전이의 초기 검출이 요구되고 있다. 혈액에 기초한 정량화 방법들로서 비-침습성인 간단한 시험들을 이용한 분자 바이오마커들의 검출은, 종양의 존재를 검출하고 암치료를 모니터링하는데 가장 임상적으로 요구되는 것들 중 하나이다.
S100A4의 혈장 수준은 샌드위치 ELISA 방법에 의하여 정량화되었다. 간략하게는, 96개 마이크로리터 플레이트들 (Maxisorb, NUNC)을, PBS (100㎕/웰) 중에 희석된 10㎍/ml의 모노클로날 항체 5C3으로, 4℃에서 24시간 코팅하였다. 상기 코팅을 제거 후, 플레이트들을 PBS로 2회 세척하고, 차단 버퍼 (1%의 탈지유 함유 PBS) 중에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
희석 버퍼(PBS-4% BSA) 중 1:4로 희석된 혈장 샘플들을 웰들에 적용하고 (100㎕/웰), 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트들을 세척 버퍼 (PBS-0.1% Tween-20)로 8회 세척하고, 적절히 희석된 토끼 폴리클로날 항-S100A4 이차 항체 (Dako) 상기 웰들에 적용하고 (100㎕/웰), 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
플레이트들을 세척 버퍼로 8회 세척하고, 적절히 희석된 컨쥬게이트된 염소 항-토끼-IgG-퍼옥시다아제 (Sigma)를 각 웰에 첨가하고 (100㎕/웰), 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 버퍼로 8회 세척 후, 100㎕의 테트라메틸벤지딘 기질 (Sigma)을 첨가하여 ELISA를 나타내었으며, 1M HCl로 정지시키기 전에 RT에서 30분 인큐베이션하였다. 흡광도는 450nm에 두었다.
기준 혈장 샘플들(종양 없는 동물들)에 대한 표준 곡선을, 희석 버퍼 중 쥐과의 재조합 S100A4의 순차적인 희석에 의하여 수득하였다. 최종 혈장 샘플들 (실험 종료시 종양을 갖는 동물들)에 대한 표준 곡선을, 희석 버퍼 중 인간 재조합 S100A4의 순차적인 희석에 의하여 수득하였다.
도 9는 몇몇 MiaPACA-2, Colo205, MDA-MB-231 및 HCT116 세포주들의 피하 종양(약 600~1000mm3의 평균 종양 부피)을 갖고 있는 동물들에서 S100A4의 혈장 수준의 정량화를 나타낸다. 실험 데이터는 종양들이 없는 동물들에서 S100A4 단백질의 기본 발현 (Basal-02)과 동물들에 종양이 존재하는 경우 실험 종료시에서의 발현간의 일정한 차이를 증명하였다.
도 9는 모노클로날 항체 5C3 (MiaPACA-2 및 HCT116 이종이식 종양 모델)로 처리된 동물들에서의 S100A4 단백질 수준도 나타내며, 이는 대응 치료(실시예 10 참조)가 혈장에서 총 순환성 S100A4 단백질을 차단한다는 것을 나타낸다.
실시예 14: 모노클로날 항체들 5C3, 1E2, 6B9. 8B6 및 5A3의 에피토프 결정
항체 인식의 에피토프 영역의 결정은 ELISA에 의해 평가되었다. 간략하게는, 인간 S100A4 단백질의 전장 서열을 9개의 중복(overlapping) 펩티드들로 분획화하였다. 96 마이크로역가 플레이트들 (Maxisorb, NUNC)을 PBS (100㎕/웰) 중에서 희석된 각 펩티드들을 24시간 동안 4℃에서 3㎍/ml로 코팅하였다. 희석 버퍼 (BSA의 PBS-1%) 중에서 5㎍/ml로 희석된 항체들 항-S100A4들을 웰들에 적용하고 (100㎕/웰), 37℃에서 90분 인큐베이션하였다. 플레이트들을 세척 버퍼 (Tween-20의 PBS-0.1%)로 8회 세척하고, 적절한 희석으로, 컨쥬게이트된 염소 항-마우스-IgG-퍼옥시다아제 (Jackson Immunoresearch)를 각 웰(100㎕/웰) 에 첨가하고 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 세척 버퍼로 8회 세척한 후, ELISA는, 100㎕의 테트라메틸벤디딘 기질(Sigma)을 첨가하고 1M의HCl로 정지되기 전, 실온에서 15분 동안 인큐베이션되어 나타내었다. 흡광도는 450nm에 두었다.
표 3은 기능성 5C3, 1E2, 6B9, 8B6 및 5A3 모노클로날 항체들에 의해 인식되는 인간 S100A4의 영역을 나타낸다. 8B6 항체는 9개의 설계된 선형 펩티드들 중 어느것도 인식하지 않았음에 주목하여, 이는 단백질의 입체구조적 영역을 인식한다는 가능성을 본 발명자들에게 제공하였다. 5H4로 명명되는, 인간 S100A4에 대항하는 또다른 모노클로날 항체는 이동 분석에서 음성 대조구로서 사용되었으며, 상이한 영역을 인식한다 (VMVSTFHKYSGKEGDKFKLN) (서열번호: 26).
모노클로날 항체들에 의해 인식된 S100A4의 서열들
모노클로날 항체 S100A4 서열 기탁번호
5C3 ELPSFLGKRT (서열번호: 3) 10022401
1E2 EGFPDKQPRKK (서열번호: 24) 11051803
6B9 EGFPDKQPRKK (서열번호: 24) 11051801
5A3 EGFPDKQPRKK (서열번호: 24) 11051802
8B6 ------ 11051804
실시예 15: 젬시타빈과 5C3의 세포독성 효과
암은 다단계 및 다수인자 과정이며, 따라서 상이한 분자 타겟들 또는 종양 구획들에 대한 치료 전략들이 현재 이 질병과 싸우기 위한 최선의 선택이다. 젬시타빈을 이용한 기존의 화학치료는, 진전된 췌장암에 대한 표준적인 제 1선의 치료로, 광범위하게 이용되지만, 화학내성의 획득 및 다수의 부작용들로 인하여 온건한 정도의 이익만을 제공한다. 따라서, 몇몇 종양 구획들을 감작할 수 있고, 표준 화학치료와 조합하여 종양 세포들을 죽이는데 보다 효과적인 독성이 덜한 타겟화된 약제의 동정이 필요하다. 췌장암 치료에 대한 항종양 효과의 개선 및 새로운 시약의 동정을 위하여, 본 발명자들은 젬시타빈과 조합된 모노클로날 항체 5C3의, 인간 MiaPACA-2 췌장암 세포주에서의 세포 증식 및 생육성에 대한 효과를 조사하였다.
젬시타빈 및 모노클로날 항체 5C3의 세포독성 효과는 헥소스아미니다제 활성에 의해 측정하였다. 간략하게는, MiaPACA-2 세포들을, 50㎕의 DMEM 배지 중 96-웰 세포 배양 플레이트들 (5x103 세포들/웰) 상에 플레이트하였다. 24시간 후, 몇몇 농도의 젬시타빈 단독 또는 5C3과의 조합물 (40nM, 100nM)의 50㎕의 배지를 각 웰에 첨가하고, 72시간 동안 배양하였다. 배양 매질을 제거한 후, 세포들을 PBC로 1회 세척하였다. 60마이크로리터의 기질 용액 (p-니트로페놀-N-아세틸-베타-D-글루코사미드 7.5mM , 나트륨 시트레이트 0.1M, 0.25% Triton X-100, pH 5.0)을 각 웰에 첨가하고, 플레이트들을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하고; 이 인큐베이션 시간 이후, 밝은 황색이 나타나면, 90㎕의 전개 용액(글리신 50mM, EDTA 5mM, pH 10.4)을 첨가하여 플레이트들을 전개시키고, 450nm에서의 흡광도를 다중-웰 스캐닝 분광광도계를 이용하여 측정하였다. 데이터 분석은, 100%의 생육성으로서 간주되는 음성 대조구(미처리된 세포들)을 이용하여 결과들을 정규화하여 수행하였다.
곡선들은, S자형(sigmoidal) 투여량-반응 (가변 경사) 식을 이용하여 조절하였으며, EC50 값은 하기 식으로부터 수득하였다:
Y= 바닥 + (최상단-바닥)/(1+10^((LogEC50-X)*언덕경사))
식 중, X는 로그 농도이고, Y는 반응이다. Y는 바닥(Bottom)에서 시작하며, S자 형태로 최상단(Top)으로 간다.
젬시타빈과 5C3간의 상호작용 수준을 평가하기 위하여 (상승작용적, 추가적 또는 길항제(antagonist) 작용), 초우-탈라레이(Chou-Talalay)에 의해 제안된 방법의 변형을 이용하였다. 간략하게는, 젬시타빈과 5C3을 합한 효과는 조합 지수 (CI)에 의하여 정량하였다:
CI= (D)1/(Dm)1
식 중, (Dm)1= EC50 약물 1 농도이고, (D)1= EC50 (약물 1 + 약물 2)
CI 지수를 이용한 값들(시너지, 부가, 길항)의 결정
<0.1 매우 강한 상승작용효과 0.90-1.10 거의 추가적
0.1-0.3 강한 상승작용효과 1.20-1.45 약한 길항성
0.3-0.7 상승작용 1.45-3.3 길항성
0.7-0.85 중간정도의 상승작용 3.3-10 강항 길항성
0.85-0.9 약한 상승작용 >10 매우 강한 길항성
도 10은 MiaPACA-2 세포주에서 젬시타빈 단독 및 젬시타빈과 2종류 농도의 모노클로날 항체 5C3의 조합물을 이용한 처리들에 의해 유도된 세포 생육성에서의 효과를 나타낸다. 젬시타빈에 대한 EC50은 8.356nM이었다. 5C3과의 조합은, 40nM과 100nM의 mAb에 대하여 각각 5.161nM 및 4.586 nM의 EC50을 나타내었다.
CI 지수의 결정은 젬시타빈과 각각 40nM 및 100 nM의 5C3의 조합에 대하여 0.61 및 0.54의 값을 나타내었으며, 이는 2개의 화합물들의 상승작용적 효과를 증명하였다.
이 실험은, S100A4에 대항하는 모노클로날 항체와 화학치료약물 젬시타빈의 조합이 상기 약물 단독의 효과를 상승작용적으로 향상시킬 수 있다는 것을 최초로 증명하였다. 이러한 이유로, 모노클로날 항체들 항-S100A4는 암환자 치료를 위한 화학치료 약물과의 조합에서의 사용을 위한 신규한 후보물질인 것으로서 입증될 수 있다.
실시예 16: S100A4는 THP1 단핵구들에서 IL8의 분비를 유도하고, 모노클로날 항체 5C3는 이러한 효과를 차단한다.
만성 염증성 질병들은 단핵성 세포들, 예컨대 단핵구들 및 림프구들의 활성화에 의하여 특징화되는 많은 군의 장애들을 포함한다. 만성 염증 및 자가면역 질병들에서의 현저한 특징들(hallmarks) 중 하나는 단핵구/마크로파지 세포들의 강한 활성화 및 축적이다. 활성화된 단핵구들 및 마크로파지들은 대부분의 만성 염증성 장애들에서 시토카인들의 가장 중요한 공급원이다. 이러한 모든 사실들을 고려하여, S100A4 봉쇄가 단핵구들 활성이 중추적인 역할을 하는 만성 염증성 질병들의 치료에 유용할 수 있을 지의 여부를 관찰하였다.
5C3의 단핵구 활성화에 대한 효과를 평가하기 위하여, 인간 단핵구성 세포주, THP-1을 S100A4에 노출시키고, 분비된 IL-8 수준들의 정도를 단핵구 활성화의 표지로서 사용하였다.
인간 단핵구성 백혈병 세포주 THP-1의 세포들(ATCC)을, 10% FCS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 RPMI 1640 배양배지 중에서, 습윤된 인큐베이터 중 37℃, 5% CO2에서 배양시켰다. 세포들을 5.0 x 105세포들/웰로 플레이트하였다. S100A4 및 5C3 항체를, 단핵구들 첨가 전에 1시간 동안 함게 인큐베이션하였다. Fc 수용체 반응을 방지하기 위하여, 항-마우스 IgG (Fc 특이적)를 모든 경우들에 항상 첨가하였다. 세포 배양물 상등액들을 24시간 후 모아서, -20℃에 저장하였다. IL-8의 수준을 샌드위치 ELISA에 의하여 분석하였다.
S100A4는 투여량 반응 방식으로 인간 단핵구들을 활성화하여 시토카인 방출을 유도하였다 (도 11A). 이 반응은 모노클로날 항체 5C3 (도 11B)에 의하여 차단될 수 있다. 이 반응은 모노클로날 항체 5C3에 의해 차단될 수 있다 (도 11B). S100A4 부재 하에 5C3 및 항-마우스 모두는 IL-8 수준에 영향을 미치지 않는다(데이터 미도시).
이러한 사실들은, 5C3이 모든 만성 염증성 질병들, 예컨대 단핵구 활성이 이들의 병태생리에서 중추적인 역할을 하는, 류마티즘성 관절염, 건선성 관절염, 건선, 염증성 장질환, 동맥경화증, 다발성 경화증, 등의 치료에 유용할 수 있음을 제안한다.
생물학적 물질의 기탁
5C3-1B8-1F4 항-S100A4 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는, 부타페스트 조약에서 규정된 조건 하에, European Collection of Cell Cultures (ECACC) (Porton Down, Salisbury, SP4 OJG, 영국)에 기탁되었다. 이는 2010.2.24일 기탁되었으며, 상기 기탁물에 부여된 번호는 10022401 이었다.
6B9-1E8-2A8 항-S100A4 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는, 부타페스트 조약에서 규정된 조건 하에, European Collection of Cell Cultures (ECACC) (Porton Down, Salisbury, SP4 OJG, 영국)에 기탁되었다. 이는 2011.5.18일 기탁되었으며, 상기 기탁물에 부여된 번호는 ECACC 11051801 이었다.
5A3-4A6-5B6 항-S100A4 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는, 부타페스트 조약에서 규정된 조건 하에, European Collection of Cell Cultures (ECACC) (Porton Down, Salisbury, SP4 OJG, 영국)에 기탁되었다. 이는 2011.5.18일 기탁되었으며, 상기 기탁물에 부여된 번호는 ECACC 11051802 이었다.
1E2-2H4-2G8 항-S100A4 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는, 부타페스트 조약에서 규정된 조건 하에, European Collection of Cell Cultures (ECACC) (Porton Down, Salisbury, SP4 OJG, 영국)에 기탁되었다. 이는 2011.5.18일 기탁되었으며, 상기 기탁물에 부여된 번호는 ECACC 11051803 이었다.
8B6-2F6-1H9-1H10 항-S100A4 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는, 부타페스트 조약에서 규정된 조건 하에, European Collection of Cell Cultures (ECACC) (Porton Down, Salisbury, SP4 OJG, 영국)에 기탁되었다. 이는 2011.5.18일 기탁되었으며, 상기 기탁물에 부여된 번호는 ECACC 11051804 이었다.
SEQUENCE LISTING <110> ACONDICIONAMIENTO TARRASENSE <120> S100A4 ANTIBODIES AND THERAPEUTIC USES THEREOF <130> P7045PC00 <150> EP10382170.8 <151> 2010-06-14 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL region of the 5C3 monoclonal antibody <400> 1 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Thr Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Glu Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 2 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH region of the 5C3 monoclonal antibody <400> 2 Glu Ala Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Gln Glu Thr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Asp Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Ser Ile Thr Val Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Glu Leu Pro Ser Phe Leu Gly Lys Arg Thr 1 5 10 <210> 4 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding for the FRs and CDRs of the light chain of the variable region of 5C3 monoclonal antibody <400> 4 gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagtattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120 tacctgcaga aaacaggcca gtctccagag ctcctgatct acaaagtttc caaccgactc 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttcca 300 ttcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaa 336 <210> 5 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding for the FRs and CDRs of the heavy chain of the variable region of a 5C3 monoclonal antibody <400> 5 gaggctcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaagc caggggcctc tgtcaagttg 60 tcctgcacag cctctggctt caacattcaa gagacctata tgcactgggt gaagcagagg 120 cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cgaatggtaa taccaaagat 180 gacccgaagt tccagggcaa ggcctctata acagtagaca catcctccaa cacagcctac 240 ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc ttcaagttat 300 gctatggact actggggtca aggaacctca gtcaccgtct cctca 345 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 gagctgccca gcttcttggg gaaaaggaca 30 <210> 7 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FRL1 region of the 5C3 monoclonal antibody <400> 7 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 region of 5C3 monoclonal antibody <400> 8 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FRL2 region of 5C3 monoclonal antibody <400> 9 Trp Tyr Leu Gln Lys Thr Gly Gln Ser Pro Glu Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 region of the 5C3 monoclonal antibody <400> 10 Lys Val Ser Asn Arg Leu Ser 1 5 <210> 11 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FRL3 region of the 5C3 monoclonal antibody <400> 11 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 region of the 5C3 monoclonal antibody <400> 12 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr 1 5 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FRL4 region of the 5C3 monoclonal antibody <400> 13 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 14 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FRH1 region of the 5C3 monoclonal antibody <400> 14 Glu Ala Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Gln 20 25 30 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 region of the 5C3 monoclonal antibody <400> 15 Glu Thr Tyr Met His 1 5 <210> 16 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FRH2 region of the 5C3 monoclonal antibody <400> 16 Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 1 5 10 <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 region of the 5C3 monoclonal antibody <400> 17 Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Asp Asp Pro Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 18 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FRH3 region of the 5C3 monoclonal antibody <400> 18 Lys Ala Ser Ile Thr Val Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser 20 25 30 <210> 19 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 region of the 5C3 monoclonal antibody <400> 19 Ser Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FRH4 region of the 5C3 monoclonal antibody <400> 20 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 21 <211> 101 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Met Ala Cys Pro Leu Glu Lys Ala Leu Asp Val Met Val Ser Thr Phe 1 5 10 15 His Lys Tyr Ser Gly Lys Glu Gly Asp Lys Phe Lys Leu Asn Lys Ser 20 25 30 Glu Leu Lys Glu Leu Leu Thr Arg Glu Leu Pro Ser Phe Leu Gly Lys 35 40 45 Arg Thr Asp Glu Ala Ala Phe Gln Lys Leu Met Ser Asn Leu Asp Ser 50 55 60 Asn Arg Asp Asn Glu Val Asp Phe Gln Glu Tyr Cys Val Phe Leu Ser 65 70 75 80 Cys Ile Ala Met Met Cys Asn Glu Phe Phe Glu Gly Phe Pro Asp Lys 85 90 95 Gln Pro Arg Lys Lys 100 <210> 22 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 22 actcacatat ggcgtgccct ctggagaagg ccctggatgt g 41 <210> 23 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 23 Ala Cys Thr Cys Ala Thr Gly Ala Gly Cys Thr Cys Ala Thr Cys Ala 1 5 10 15 Thr Thr Thr Cys Thr Thr Cys Cys Thr Gly Gly Gly Cys Thr Gly Cys 20 25 30 Thr Thr Ala Thr Cys Thr Gly Gly Gly Ala Ala 35 40 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Glu Gly Phe Pro Asp Lys Gln Pro Arg Lys Lys 1 5 10 <210> 25 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein comprising the sequence of human S100A4 with an amino-terminus tail <400> 25 Gly Ser His Met Ala Cys Pro Leu Glu Lys Ala Leu Asp Val Met Val 1 5 10 15 Ser Thr Phe His Lys Tyr Ser Gly Lys Glu Gly Asp Lys Phe Lys Leu 20 25 30 Asn Lys Ser Glu Leu Lys Glu Leu Leu Thr Arg Glu Leu Pro Ser Phe 35 40 45 Leu Gly Lys Arg Thr Asp Glu Ala Ala Phe Gln Lys Leu Met Ser Asn 50 55 60 Leu Asp Ser Asn Arg Asp Asn Glu Val Asp Phe Gln Glu Tyr Cys Val 65 70 75 80 Phe Leu Ser Cys Ile Ala Met Met Cys Asn Glu Phe Phe Glu Gly Phe 85 90 95 Pro Asp Lys Gln Pro Arg Lys Lys 100 <210> 26 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Val Met Val Ser Thr Phe His Lys Tyr Ser Gly Lys Glu Gly Asp Lys 1 5 10 15 Phe Lys Leu Asn 20

Claims (32)

  1. 항-혈관신생 활성을 갖는 특이적 항-S100A4 항체 또는 상기 항체의 항-혈관신생 활성을 실질적으로 보존하고 있는 그의 단편:
    여기에서 상기 항체는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 함:
    (i) 서열 ELPSFLGKRT (서열번호: 3)을 포함하는 S100A4의 에피토프를 인식하는 항체,
    (ii) 서열 EGFPDKQPRKK (서열번호: 24)를 포함하는 S100A4의 에피토프를 인식하는 항체 및
    (iii) 하이브리도마 ECACC 11051804에 의해 생산되는 항체.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 단편.
  3. 제 2항에 있어서, ECACC 10022401, ECACC 11051801, ECACC 11051802, ECACC 11051803 및 ECACC 11051804로 이루어지는 군으로부터 선택된 하이브리도마에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 단편.
  4. 제 3항에 있어서, 하이브리도마 ECACC 10022401에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 단편.
  5. 제 4항에 있어서, 서열번호: 1의 서열 또는 기능적으로 균등한 그의 변형체를 포함하는 적어도 하나의 VL 영역 및 서열번호: 2의 서열 또는 기능적으로 균등한 그의 변형체를 포함하는 적어도 하나의 VH 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 단편.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 내피 세포들의 이동능을 정지시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 단편.
  7. 기탁번호 ECACC 10022401, ECACC 11051801, ECACC 11051802, ECACC 11051803 및 ECACC 11051804로 기탁된 세포주로 이루어지는 군으로부터 선택된 하이브리도마 세포주.
  8. 약학적으로 유효한 양의 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 항체 또는 단편 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  9. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 전이, 원하지 않는 혈관신생 관련 질병 및 염증 관련 질병으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질병의 예방 및/또는 치료에서의 용도를 갖는 항체 또는 그의 단편.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 질병은 암인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 단편.
  11. 제 10항에 있어서, 췌장암 및 결장암으로부터 선택되는 암인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 단편.
  12. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 단편 및 하기 군으로부터 선택되는 제 2 성분을 포함하는 접합물:
    (a) 항혈관신생제
    (b) 항전이제
    (c) 세포독성제
    (d) 소염제
  13. 제 12항에 있어서, 전이, 원하지 않는 혈관신생 및 염증관련 질병으로부터 선택되는 질병의 예방 및/또는 치료에서의 용도를 갖는 접합물.
  14. 기탁번호 ECACC 10022401, ECACC 11051801, ECACC 11051802, ECACC 11051803 및 ECACC 11051804 로 기탁된 세포주들로부터 선택된 하이브리도마 세포주를, 상기 항체의 생산이 가능한 조건에서 배양하는 것을 포함하는 제 2항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체의 수득방법.
  15. 특이적 항-S100A4 항체 및 항대사물질을 포함하는 조성물.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 항대사물질은 젬시타빈인 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제 15항 또는 제 16항에 있어서, 상기 특이적 항-S100A4 항체는 항-혈관신생 활성을 갖는 항-S100A4 항체 또는 상기 항체의 항-혈관신생 활성을 실질적으로 보존하고 있는 그의 단편이며, 상기 항체는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물:
    (i) 서열 ELPSFLGKRT (서열번호: 3)을 포함하는 S100A4의 에피토프를 인식하는 항체,
    (ii) 서열 EGFPDKQPRKK (서열번호: 24)를 포함하는 S100A4의 에피토프를 인식하는 항체 및
    (iii) 하이브리도마 ECACC 11051804에 의해 생성되는 항체.
  18. 제 15항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 특이적 항-S100A4 항체는 ECACC 10022401, ECACC 11051801, ECACC 11051802, ECACC 11051803 및 ECACC 11051804로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하이브리도마에 의해 생산되는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 특이적 항-S100A4 항체는 하이브리도마 ECACC 10022401에 의해 생산되는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  20. 제 15항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 이는 종양 세포들의 생육력을 감소시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  21. 제 15항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 암 또는 전이의 예방 및/또는 치료용인 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. 항원에의 결합능을 갖는, S100A4 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체의, 염증 관련 질병의 예방 및/또는 치료용 의약 제조에의 용도.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 S100A4 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체는 항-혈관신생 활성을 갖는 항-S100A4 항체 또는 상기 항체의 항-혈관신생 활성을 실질적으로 보존하고 있는 상기 항체의 단편으로, 상기 항체는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도:
    (i) 서열 ELPSFLGKRT (서열번호: 3)을 포함하는 S100A4의 에피토프를 인식하는 항체,
    (ii) 서열 EGFPDKQPRKK (서열번호: 24)를 포함하는 S100A4의 에피토프를 인식하는 항체 및
    (iii) 하이브리도마 ECACC 11051804에 의해 생성되는 항체.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 S100A4 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 ECACC 10022401, ECACC 11051801, ECACC 11051802, ECACC 11051803 및 ECACC 11051804의 군으로부터 선택된 하이브리도마에 의하여 생산된 항체인 것을 특징으로 하는 용도.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 S100A4 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 하이브리도마 ECACC 10022401에 의해 생산된 항체인 것을 특징으로 하는 용도.
  26. (a) ECACC 10022401, ECACC 11051801, ECACC 11051802, ECACC 11051803 및 ECACC 11051804로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하이브리도마에 의해 생산되는 모노클로날 항체 또는 상기 항체의 기능적 변형체를 사용하므로써, 상기 대상의 생체액 중에서 S100A4 단백질 또는 그의 변형체 수준을 검출하는 단계,
    (b) 상기 수준을 기준 값과 비교하는 단계
    를 포함하는, 대상에서 암 또는 염증 관련 질병의 시험관 내 진단방법으로서, 기준 값에 대하여 S100A4 단백질 또는 그의 변형체의 증가된 수준이 암 또는 염증 관련 질병을 앓고 있는 대상임을 나타내는 것을 특징으로 하는 진단방법.
  27. 제 26항에 있어서, 상기 질병은 암인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 26항 또는 제 27항에 있어서, 상기 생체액은 혈액, 혈장 및 혈청으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. (i) S100A4를 포함하는 것으로 의심되는 샘플을, 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 정의된 것과 같은 특이적 항-S100A4 항체 또는 그의 단편과 접촉시키는 단계; 및
    (ii) S100A4와 항체 또는 그의 단편 사이의 면역 복합체들의 형성을 검출하는 단계를 포함하는 샘플에서 S100A4의 검출 방법으로서,
    상기 S100A4와 상기 항체 사이의 면역 복합체들의 검출은 샘플 중 S100A4의 존재를 나타내는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  30. 제 1항 내지 제 6항에 따른 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편을 포함하는 생체액에서 암 또는 염증 관련 질병의 진단을 위한 키트.
  31. (i) 상기 대상의 생체액 중 S100A4 단백질 또는 그의 변형체의 수준을 결정하는 단계, 및
    (ii) S100A4 단백질의 수준을 기준 값과 비교하는 단계,
    를 포함하는 암을 진단받은 대상을 대한 맞춤형 치료를 설계하기 위한 시험관 내 방법으로서,
    기준 수준과 비교하여 S100A4 단백질 또는 그의 변형체의 증가된 수준은, 환자가 항-혈관신생 활성을 갖는 특이적 항-S100A4 항체 또는 상기 항체의 항-혈관신생 활성을 실질적으로 보존하고 있는 그의 단편으로 처리되어야 함을 나타내며, 여기에서 상기 항체는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법:
    (i) 서열 ELPSFLGKRT (서열번호: 3)을 포함하는 S100A4의 에피토프를 인식하는 항체,
    (ii) 서열 EGFPDKQPRKK (서열번호: 24)를 포함하는 S100A4의 에피토프를 인식하는 항체 및
    (iii) 하이브리도마 ECACC 11051804에 의해 생성되는 항체.
  32. 제 31항에 있어서, 상기 단계 (i)에서 수준의 결정은 ECACC 10022401, ECACC 11051801, ECACC 11051802, ECACC 11051803 및 ECACC 11051804로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하이브리도마에 의해 생산된 모노클로날 항체 또는 상기 항체의 기능적 변형체를 이용하므로써 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
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