JP6081911B2

JP6081911B2 - Ｓ１００ａ４抗体およびその治療上の使用

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Publication number: JP6081911B2
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Inventors: ルイスヘルナンデスミゲスホセ; アダンプラナハウメ; マリアマルティネスエスコーラジュゼップ; マサアルヴァレスマーク; メッセゲールペイポーチラモン; ミットジャンズプラットフランセスク; ダケルプラザシェイラ; コルマンサーノアントニオ; マリアエルヴァスヴィジェガスロサ; カルヴィスカルペカルメ; パディージャガルシアラウラ; タチアナロケナヴァロロードレス; バルベラフェランドラウラ; リヴァスカニャスマヌエル; アンヘルゴメスカサフスルイス
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Description

本発明の分野を記載する。本発明は、分子免疫学およびヒト疾患の処置に関する。特に、本発明は、ヒトS100A4に対する抗体群、これらの抗体群を含む製薬上の組成物、その治療上および診断上の使用に関するものである。

本発明の背景を記載する。ガンはヒト悪性腫瘍の最も頻度の高いタイプであり、そしてガンの死亡は、主に遠隔部位への原発腫瘍細胞の伝播およびその後の転移の形成に起因する。

腫瘍の進行、血管新生（血管形成）、および転移性播種の転移誘導S100A4タンパク質、カルシウム結合タンパク質のS100ファミリーのメンバーの原因に関する密接な関連（causal implication）はいくつかのアプローチによって実証されている。

S100A4は、腫瘍細胞および主に直接細胞間接触または自己分泌/傍分泌サイトカイン増殖因子のシグナル伝達によって媒介されるそれらの間質（線維芽細胞、内皮細胞、平滑筋、炎症、および神経細胞を含む）の間で発生する腫瘍間質のクロストークにおいて極めて重要な役割を果たしている。たとえば、上皮成長因子、腫瘍増殖因子-β1、および線維芽細胞増殖因子-2は、S100A4の発現を刺激することができ〔Strutz（シュトラツ）ら、Kidney Int.（キドニー・インターナショナル）、2002年；61(5)：1714-1728〕；腫瘍または間質細胞のどちらによっても腫瘍環境へ放出されるS100A4は、腫瘍細胞におけるプロ（前）転移カスケードのきっかけとなり〔Grum-Schwensen（グルム-シュベンセン）ら、Cancer Res.（キャンサー・リサーチ）、2005年；65(9)：3772-3780〕；正常線維芽細胞とは対照的に、腫瘍細胞または腫瘍関連線維芽細胞は、S100A4の高レベルを発現し〔Ambartsumian（アンバルツミアン）ら、Oncogene（オンコジーン）、1996年；13(8)：1621-1630〕；リンパ球およびマクロファージのような他の宿主由来の腫瘍間質細胞は、活性化の際にS100A4の発現を増加させる〔Grigorian（グリゴリヤン）ら、Electrophoresis（エレクトロホレシス）、1994年；15(3-4)：463-468〕。

S100A4はまた、細胞外マトリックス（分解酵素の生産）および血管新生促進因子として内皮細胞の運動性の刺激およびリモデリング（組織修復）を介して腫瘍の血管新生に影響を与える〔Schmidt-Hansen（シュミットハンセン）ら、J. Biol. Chem. （ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー）、2004年；279(23)：24498-24504〕。

S100A4遺伝子自体は、もともと高度に転移性のマウスの乳腺腺ガンにおいて異なって発現された遺伝子として分離された〔Ebralidze（エブラリゼ）ら、Genes Dev.（ジーンズ・アンド・デベロップメント）、1989年；3(7)：1086-1093〕。また、S100A4遺伝子の非転移性腫瘍細胞系への導入ならびに転移性のものにおけるその遺伝子の抑制は、このような細胞の発ガン性および転移性の結末を修飾し、そのために、腫瘍の進行および転移形成におけるその関与が証明されたことを明らかにした〔Lloyd（ロイド）ら、Oncogene、1998年；17(4)：465-473〕。

臨床では、ガン患者（ガン受動体）におけるS100A4の高レベルの発現および不良な予後の間に正の相関が実証されており、中でも下記について参照。胸部（乳）ガン〔Rudland（ラドランド）PSら、Cancer Res、2000年、60(6)：1595-1603〕、前立腺ガン〔Saleem（サレーム）Mら、PNAS（プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ）、2006年、103(40)：14825-30〕、肺ガン〔Tsuna（ツナ）Mら、Anticancer Res（アンチキャンサー・リサーチ）、2009年29(7)：2547-54〕、結腸直腸ガン〔Cho（チョー）Yら、World J Gastroent（ワールド・ジャーナル・オブ・ガストロエンテロロジー）、2005年、11(31)：4852-6〕、膵臓ガン〔Rosty（ロスティー）Cら、Am J Pathol（ザ・アメリカン・ジャーナル・オブ・パソロジー）、2002年、160(1)：45-50〕、腎ガン〔Bandiera（バンディエラ）Aら、World J Surg（ワールド・ジャーナル・オブ・サージェリー）2009年、33(7)：1414-20〕、胃ガン〔Yonemura（ヨネムラ）Yら、Clin Cancer Res（クリニカル・キャンサー・リサーチ）、2000年、6(11)：4234-42〕、卵巣ガン〔Maelandsmo（マエランドスモ）GMら、Tumor Biol（テューマー・バイオロジー）、2009年、30(1)：15-25〕、甲状腺乳頭ガン〔Min（ミン）HSら、Mod Pathol（モダン・パソロジー）、2008年、21(6): 748-55〕、メラノーマ〔Andersen（アンデルセン）Kら、Mod Pathol、2004年、17(8)：990-997〕、肝細胞ガン〔Cui（キュイ）Jら、J Can Res Clin Oncol（ジャーナル・オブ・キャンサー・リサーチ・アンド・クリニカル・オンコロジー）2004年、130(10)：615-22〕、膀胱ガン〔Agerbaek（アジェルベーク）Mら、Eur Urol（ヨーロピアン・ユロロジー）、2006年50(4)：777から785〕、脂肪肉腫浸潤ガン〔Pazzaglia（パッザリア）Lら、Anticancer Res、2004年、24(2B)：967-972〕、神経芽細胞腫〔Bjornland（ビエルランド）Kら、J Pediatr Surg（ジャーナル・オブ・ペディアトリック・サージェリー）、2001年、36(7)：1040-44〕、食道扁平上皮ガン〔Ninomiya（ニノミヤ）ら、Int J Oncol（インターナショナル・ジャーナル・オブ・オンコロジー）、2001年、18(4)：715-20〕、骨肉腫〔Mathisen（マティセン）Bら、Clin Exp Metastasis（クリニカル・アンド・エクスペリメンタル・メタスタシス）、2003年、20(8)：701-11〕、胆嚢癌〔Nakamura（ナカムラ）ら、Int J Oncol（インターナショナル・ジャーナル・オブ・オンコロジー）、2002年、20(5)：937-41〕、口腔扁平上皮癌〔Moriyama-Kita（モリヤマ-キタ）Mら、Oral Oncol（オーラル・オンコロジー）、2004年、40(5)：496-500〕、子宮内膜癌〔Xie（シェ）Rら、Lab Invest（ラボラトリー・インベスティゲーション）、2009年、89(8)：937 -947〕、および髄芽（細胞）腫〔Hernan（エルナン）Rら、Cancer Res、2003年、63(1)：140-148〕。

様々な非悪性の病的状態におけるS100A4の密接な関連はまた、心血管系、神経系、および肺系統（肺システム）において自己免疫的炎症および障害のような病的状態において、特に、多数の研究グループによって実証されている〔Grigorian（グリゴリヤン）Mら、Current Molecular Medicine（カレント・モレキュラー・メディシン）、2008年、8（6）：492-6〕。したがって、S100A4は臨床応用のための候補のターゲットである。しかし、S100A4の生物学的機能の複雑性およびその作用の知られていない全体の機構のために、まだ、このタンパク質の細胞内または細胞外の機能のいずれかをもブロックするインヒビターは存在していない。

抗体ベースの治療は、多くの病気のために、効果的な処置の欠くことができない部分として登場した。過去10年間で、モノクローナル抗体は、悪性および非悪性疾患の処置において主要な治療上の薬剤となった。

現在までに、S100A4に対して生じたモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体は、異なる会社および研究グループによって提供されている〔中でも、Zhang（チャン）ら、Calcium Binding Proteins（カルシウム・ビンディング・プロテインズ）、2006年、1：4、219-223；antibodies-online GmbH（アンティボディズ-オンライン社）、ドイツ国からのABIN167355およびABIN171123； DakoCytomation（ダコーサイトメーション）、デンマーク王国からのA5114〕。科学文献および特許の教示は、発明者の最大の知識に対して、これらの抗体の治療への応用を推測するが、最先端の抗体が実際にガンおよび非悪性の疾患の処置の問題を解決したことについて記録上の証拠はまだ存在しない。

国際公開第2000064475号〔Research Corporation Technologies, Inc.（リサーチ・コーポレーション・テクノロジー社）〕は、悪性ガンの診断のための方法を、(i)mts-1タンパク質に対して向けられた抗体（抗体は毒素にコンジュゲートすることができる）によりmts-1タンパク質を抑制することによって、または(ii)アンチセンスmts-1ヌクレオチド配列をコード化する核酸を提供することによって明らかにする。

したがって、最先端の技術において、ガンの処置のために、新しい治療上のアプローチ、特に、血管形成および転移の処置のために、S100A4タンパク質を標的とすることを提供する必要性がある。

加えて、診断上のレベルで、S100A4は腫瘍細胞に向けた正常な細胞の分化過程（分化プロセス）において良好なマーカーと考えることができ、そして従って、それは腫瘍の細胞学的検査の良好なバイオマーカーである。しかし、ガン組織でのS100A4の発現の検出は、患者の生検が必要であるという欠点を示す。したがって、最先端の技術で、対象体においてS100A4のレベルを検出することによってより一層単純で、かつ、より一層低侵襲的な方法を、ガンの臨床診断のために提供する必要性がある。

第1の態様において、本発明は抗血管形成活性を有する特異的な抗S100A4抗体または前記抗体の抗血管形成活性を実質保存するそのフラグメントに関し、抗体は次の、
（i）シークエンスELPSFLGKRT（配列番号3）を含むS100A4のエピトープを認識する抗体、
（ii）シークエンスEGFPDKQPRKK（配列番号24）を含むS100A4のエピトープを認識する抗体および
（iii）ハイブリドーマECACC11051804によって生成される抗体
からなる群から選ばれるものである。

別の見地において、本発明は、受入番号ECACC10022401、ECACC11051801、ECACC11051802、ECACC11051803およびECACC11051804として寄託された細胞系からなる群から選ばれるハイブリドーマ細胞系に関する。

別の見地において、本発明は、本発明に従う薬学的に有効な量の少なくとも1の抗体またはそのフラグメントおよび少なくとも1の薬学的に許容可能な担体を含む、製薬上組成物に関する。

また別の見地において、本発明は、転移および望ましくない血管形成に関連する疾患から選ばれる疾患の防止および/または処置における使用のための本発明に従う抗体またはそのフラグメントに関する。

追加の見地において、本発明は、本発明に従う抗体またはそのフラグメントおよび次の、
（a）抗血管形成剤
（b）抗転移剤
（c）細胞毒性剤
（d）抗炎症剤
からなる群から選ばれる第2成分を含むコンジュゲート、ならびに転移、望ましくない血管形成に関連する疾患および炎症と関係する疾患から選ばれる疾患の防止および/または処置でのその使用に関する。

別の見地において、本発明は、前記抗体の生産を許す条件において受託番号ECACC10022401、ECACC11051801、ECACC11051802、ECACC11051803およびECACC11051804として寄託されたハイブリドーマ細胞系から選ばれる細胞系を培養することを含む、本発明に従うモノクローナル抗体を得るための方法に関する。

追加の見地において、本発明は、特異的な抗S100A4抗体および代謝拮抗物質を含む組成物、ならびにガンまたは転移の防止および/または処置におけるその使用に関する。

別の見地において、S100A4タンパク質と特異的に結合する抗体、またはその抗原との結合のための能力を有するそのフラグメントの、炎症と関係する疾患の防止および/または処置のための薬の調製のための使用に関する。

また別の見地において、本発明は、対象体においてガンまたは炎症と関係する疾患を判断するための生体外の方法に関しており、それは、次の、
（a）S100A4タンパク質の、またはその変形物のレベルを、ECACC10022401、ECACC11051801、ECACC11051802、ECACC11051803およびECACC11051804からなる群から選ばれるハイブリドーマによって生産されるモノクローナル抗体または前記抗体の機能的な変形物の使用を用いて前記対象体の生物流体において検出すること
（b）前記レベルを基準値と比較すること
を含み、
基準値に関するS100A4タンパク質の、またはその変形物の増加したレベルは、ガンまたは炎症と関係する疾患を患う対象体を示す。

また別の見地において、本発明は、試料においてS100A4を検出するための方法に関しており、それは、次の、
（i）S100A4を含む疑いがある試料を、本発明に規定されるような、特異的な抗S100A4抗体またはそのフラグメントと接触させること、および
（ii）S100A4と抗体またはそのフラグメントとの間の免疫複合体の形成を検出することを含み、
S100A4および抗体の間の免疫複合体の検出は試料におけるS100A4の存在を示す。

別の見地において、本発明は、本発明に従う少なくとも1の抗体またはそのフラグメントを含む、生物流体においてガンまたは炎症と関係する疾患を診断するためのキットに関する。

別の見地において、ガンと診断される対象体のためにカスタマイズされた治療を設計するための生体外の方法に関しており、それは、前記対象体の生物流体におけるS100A4タンパク質の、またはその変形物のレベルを、ECACC10022401、ECACC11051801、ECACC11051802、ECACC11051803およびECACC11051804からなる群から選ばれるハイブリドーマによって生産されるモノクローナル抗体または前記抗体の機能的な変形物を、同じモノクローナル抗体による治療の前後に用いて検出することを含み、そこでは、S100A4タンパク質の、またはその変形物のレベルに関して治療後のS100A4タンパク質の、またはその変形物のレベルの上昇は、受動体が元々に施された療法に対する代替療法を必要とすることを示す。

本発明の目的は、ヒトまたはネズミのS100A4に対し特異的に結合するが、他のS100ファミリーのタンパク質に対してはそうでない抗体を提供することである。

本発明の目的は、ヒトまたはネズミのS100A4に対し、ナノグラム、さらにピコグラムの検出限界において、高感度に結合する抗体を提供することである。

重要なことに、本発明の目的は、悪性および非悪性疾患に対する立証された活性を有するS100A4に対する治療上の抗体を提供することである。

本発明の目的は、重要なことには、悪性および非悪性疾患に対する生体内での立証された活性を有し、それ機能が体内で発効される前に代謝または分解されることのないS100A4に対する治療上の抗体を提供することである。

重要なことには、本発明の目的は、悪性および非悪性の疾患に対して立証された活性を有し、その一方で毒性作用を最小でしか、またはまったく生じない、S100A4に対する治療上の抗体を提供することである。

本発明の目的は、腫瘍の増殖を抑制することができるS100A4に対する抗体を提供することである。

本発明の目的は、腫瘍発生を抑制することができるS100A4に対する抗体を提供することである。

本発明の目的は、血管形成および腫瘍血管形成を抑制することができるS100A4に対する抗体を提供することである。

本発明の目的は、内皮細胞移動を抑制することができるS100A4に対する抗体を提供することである。

本発明の目的は、ガン幹細胞を抑制することができるS100A4に対する抗体を提供することである。

本発明の目的は、炎症過程を抑制することができるS100A4に対する抗体を提供することである。以下には、図面の説明を記す。

ウエスタンブロット分析で定めるS100A4タンパク質発現である。(A)異なる起源の腫瘍細胞系およびマウス胚線維芽細胞系NIH3T3からの全抽出物でのS100A4発現のレベル。(B)腫瘍由来HCT116、MiaPACA-2およびBxPC3異種移植モデルからの全抽出物でのS100A4発現のレベル。(C)腫瘍細胞系MDA-MB-231およびこの細胞系に由来するガン幹細胞からの全抽出物でのS100A4発現のレベル。 S100A4発現の免疫組織化学的分析。5C3および組織学のために用いるS100A4に対して最も引用されるラビット（ウサギ）ポリクローナル抗体〔Dako（ダコー社）〕の間で、2つの膵臓腺癌細胞系Panc1およびBxPC3に由来する腫瘍においての、S100A4発現および分布の比較免疫組織化学的分析。イメージ（画像）（A-D）は拡大×40で撮影した。画像（E-H）は拡大×120で撮影した。(A)BxPC3細胞系異種移植モデルに由来し、マウスモノクローナル抗体5C3により染色した試料（サンプル）において、浸潤フロントでのS100A4の発現が腫瘍の中央のものより強いことを示すケース。(B)BxPC3細胞系異種移植モデルに由来し、Dakoからのラビットポリクローナル抗体で染色した試料で、浸潤フロントでのS100A4が腫瘍の中央の発現より強いことを示すケース。(C)BxPC3細胞系異種移植モデルに由来した腫瘍での陰性コントロールとして用いる非関連マウスモノクローナル抗体抗ポリヒスチジンによる染色。(D)BxPC3細胞系異種移植モデルに由来した腫瘍試料での一次抗体を用いない陰性コントロール染色。(E)Panc-1細胞系異種移植モデルから由来し、マウスモノクローナル抗体5C3で染色した腫瘍の細胞質および核でのS100A4の強い発現。(F)Panc-1細胞系異種移植モデルから由来し、Dakoからのラビットポリクローナル抗体で染色された腫瘍の細胞質および核でのS100A4の強い発現。(G)Panc-1細胞系異種移植モデルに由来した腫瘍での陰性コントロールとして用いる非関連マウスモノクローナル抗体抗ポリヒスチジンによる染色。(H)Panc-1細胞系異種移植モデルに由来した腫瘍試料での一次抗体を用いない陰性コントロール染色。 5C3はS100A4によって誘発されるMMP9タンパク質分解活性を中和する。HUVECs（ヒト臍帯静脈内皮細胞）馴化培地でのMMPタンパク質分解活性。HUVECsは24時間異なる刺激で処置した。上清はデブリ（残骸）を除去するために遠心分離し、そしてゼラチン酵素電気泳動（ゼラチンザイモグラフィ）によって分析した。より一層明りょうなバンドはMMP9およびMMP2活性を表す。(A)S100A4は用量依存的様式においてMMP9の活性型の分泌を増やす。(B)モノクローナル抗体5C3は組換え型S100A4タンパク質によって誘発されるMMP9の活性型の生産を中和した。 HUVEC’sの移動（遊走）におけるS100A4に対するいくつかのモノクローナル抗体の抑制効果。移動の誘導前に、抗体は37℃で2時間、S100A4タンパク質とともにインキュベートした。HUVEC’sは、S100A4（1μM）、VEGF（3ng/ml）、VEGFプラスS100A4の組合せまたは抗体を用いたこれらのタンパク質の組合せ（5C3、1E2、8B6、6B9、5A3、5H4）で24時間処理した。（A）細胞は5C3（0.25、0.5、1、2、および4μM）および5H4（4μM）で24時間処理した。各データポイントは、移動の100％を表す陽性コントロール（左側バー）に対して正規化する。陽性コントロールは、EBMプラスサプリメント（EGM）およびFCS（完全培地）によりインキュベートした細胞に対応する。（B）細胞を5C3、1E2、8B6、6B9、5A3（2μM）で24時間処理した。各データポイントは、移動の100％を表すVEGFプラスS100A4によって誘発される移動に対して正規化する。バーは平均±S-dを示す。**p<0.005〔“Mann-Whitney U test（マンホイットニーU検定）”〕。ヒトすい臓（MiaPACA-2）腫瘍での5C3抗体の抗腫瘍活性。雌性の、無胸腺性のヌードマウスを用い、0日目のマウスの右上脇腹部に、栄養補助剤（サプリメント）なしの0.1mlの培養基中での5×10⁶のMiaPACA-2細胞を皮下に接種した。腫瘍がMiaPACA-2細胞について65-160mm³に達したとき、処置を始めた。処置群は、10匹の動物がいた。PBS（陰性コントロール）または5C3（25mg/kg）は週に3回腹腔内に与えた（1010100）。最終的な調剤バッファ（Final formulation buffer）を媒体（ビヒクル）コントロールとして与えた。腫瘍サイズは1週につき3回測定し、そして腫瘍容量は方程式：腫瘍サイズ= 幅².長さ/2によって算出した。実験終了後（MiaPACA-2細胞について30日目）、腫瘍を有するマウスを犠牲にし、そして腫瘍を取り出して、秤量した。（A、B）MiaPACA-2実験についての結果である。相対的な腫瘍容量および腫瘍重量のグラフを、平均±s-d ns p>0.05、*p<0.05、***p<0.001を表す（“マンホイットニーＵ検定”）。ヌードマウスにおけるモノクローナル抗体での投薬スケジュールである。腫瘍微小血管系の定量化。MiaPACA-2腫瘍からの微小血管系（ネズミCD31モノクローナル抗体）の免疫組織学的分析（analisis）。脈管構造のレベルはPBSコントロール群およびモノクローナル抗体5C3で（whit）処理した動物を比較した実験終了後（30日）に測定した。(A)規定腫瘍域（MVD）の脈管密度はmm²あたりの脈管プロファイル（v.p.）の平均として表される。(B)腫瘍における血管面積の定量化である（Aa）。定量化は、×120の拡大で腫瘍のサイズに応じてスライスあたり8および39の映像の間で分析された。画像はNIH ImageJ（イメージJ）画像化ソフトウェアを使用して分析された。グラフは、平均±s-d、*p<0.05（“マンホイットニーの検定”）を示す。モノクローナル抗体5C3は生体内で毒性作用を示さない。雌の、無胸腺のヌードマウスは、0日目のマウスの右上脇腹部に、栄養補助剤なしの0.1mlの培養基中での5×10⁶のMiaPACA-2細胞または1×10⁶のHCT116細胞を皮下に接種した。腫瘍がMiaPACA-2細胞について65-160mm³に、またはHCT116細胞について155-370mm³に達したとき、処置を開始した。処置群には、MiaPACA-2細胞またはHCT116細胞についてそれぞれ10匹または7匹の動物がいた。PBS（陰性コントロール）または5C3（25mg/kg）は週に3回腹腔内に与えた（1010100）。最終的な調剤バッファを媒体コントロールとして与えた。体重は実験を通して1週につき3回測定した。体重のグラフは平均±s-dを表す（“マンホイットニーＵ検定”）。 S100A4の血しょうレベル（濃度）の決定である。無胸腺のマウス（MiaPACA-2、HCT116、MDAMB-231、Colo205）におけるいくつかの異種移植モデルでのS100A4タンパク質の血しょうレベルは、腫瘍のない動物（ベーサル02）のS100A4レベルと比較してサンドイッチELISA法によって決定した。MiaPACA-2+5C3およびHCT116+5C3状況は、血しょうでの、5C3モノクローナル抗体に結合していないS100A4のレベルを表す。血しょうレベルは実験の終点で測定した。血しょうレベルのグラフは平均±s-dを示す。モノクローナル抗体5C3と組み合わされたゲムシタビンの細胞生存率での相乗効果である。ゲムシタビン単独またはモノクローナル抗体5C3と組み合わされるもものヘキソサミニダーゼ活性で測定される細胞生存率への影響である。ゲムシタビンの細胞障害性用量反応効果は、モノクローナル抗体5C3の組合せで、相乗作用的に改善される。MiaPACA-2細胞を、72h、40nMまたは100nMの一定の濃度で、5C3を伴うかまたは伴わずに、異なる用量において化学療法薬と共にインキュベーションした。生存率は、陽性コントロール、化合物（ゲムシタビンまたは5C3）を伴わない細胞、100%の生存率を表す細胞に対して、正規化された。モノクローナル抗体5C3のTHP-1単球におけるS100A4によって誘導されるIL-8放出に対する抑制効果である。(A)24時間のインキュベーションの後THP-1単球によって分泌され、そしてLPS（陽性コントロール）によって誘発される分泌と比較したIL-8でのS100A4の用量反応である。(B)5C3の効果で、24時間3μMでのS100A4で処理されたTHP-1単球のIL-8放出に対するものである。細胞を、Fc受容体によって誘発されたIL-8放出を避けるために、常に抗マウスIgG（Fc特異的）で処理した。上清からのIL-8をELISAによって分析した。値は平均±sdを表す。

以降に、本発明の説明を記す。本発明の著者らは、予想外にも、S100A4タンパク質に対して向けられるモノクローナル抗体が、試験管内での運動性分析において内皮細胞のS100A4によって誘発された移動を中和（無効に）すること（例9参照）、ならびに異種移植腫瘍モデルでも双方ともS100A4によって誘導される血管形成能力を中和すること（例11参照）ができるということを発見した。これらの結果は、抗S100A4抗体が、望ましくない血管形成および転移、たとえばガン（癌）のようなものに関連する疾患の防止および/または処置に役立つことを示す。

本発明は、ヒトおよびネズミS100A4タンパク質、5C3、1E2、6B9、5A3および8B6と表され、S100A4血管形成活性と特異的に相互作用し、およびブロックするものに対して向けられるモノクローナル抗体を提供する。本発明者は、驚くべきことに、これらの抗体には、それらが、腫瘍発生、腫瘍血管形成をブロックし、そしてさらに生体内でまったくないか、または最小の毒性副作用しかもたないため、価値ある薬理活性が有されることを見出した。面白いことに、本発明者によって実行された作業は、S100A4によって誘発される内皮細胞移動（遊走、マイグレーション）において、前記抗体の作用の新しいブロッキングメカニズムを明らかにした。

本発明の著者らは、生物流体におけるS100A4のレベルがガンの早期検出のための診断用マーカー（標識）として適切なことをさらに証明した。したがって、本発明も、試験管内（インビトロ）の方法に、そして前記抗体により生物流体におけるS100A4のレベルを検出することによる受動体（患者）のガンの診断のためのキットに関する。
本発明の抗血管形成性抗体

第1の見地（態様）において、本発明は抗血管形成活性を有する特異的な抗S100A4抗体または前記抗体の抗血管形成活性を実質保存するそのフラグメント（断片）であって、抗体は次の、
（i）シークエンスELPSFLGKRT（配列番号3）を含むS100A4のエピトープを認識する抗体、
（ii）シークエンスEGFPDKQPRKK（配列番号24）を含むS100A4のエピトープを認識する抗体および
（iii）ハイブリドーマECACC11051804によって生成される抗体
からなる群から選ばれるものである。

本発明の第1の態様において、ここに使われるように、「抗体」という語は定められた抗原と結合する能力を有し、そして免疫グロブリン分子の軽鎖または重鎖の可変領域の全部または一部を含む少なくとも1つのポリペプチドが包含される、単量体または多量体タンパク質に関する。用語の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化（primatized）抗体、ヒト抗体および二重特異性抗体のようなポリクローナル抗体、モノクローナル抗体および遺伝子工学による抗体のような任意の種類の既知の抗体でも含む。「抗体」という語のより一層広範囲な定義は、「定義」セクションにおいて見出すことができる。
用語「ポリクローナル抗体」および「モノクローナル抗体」は「定義」セクションにおいて定められる。特定の具体化（実施形態）において、抗体はモノクローナル抗体である。

「キメラ抗体」は、種（通常モノクローナル抗体が発生する哺乳類）の抗体の可変部および別の種の定常部（キメラ抗体が使われるであろう種）によって構築される抗体として理解される。前記構築物の目的は、元のモノクローナル抗体を伴う抗体を得ることであるが、しかし、それは、処置される対象体において、より一層少なくしか免疫原性でなく、そしてより一層良好に許容され、改善された血清半減期を有し、そして免疫学的エフェクター機構、すなわち、補体、細胞障害性細胞のFc受容体または種特異性を示す他の特異的免疫グロブリン受容体によって認識されることができる。好ましい実施形態において、キメラ抗体はネズミ可変部およびヒト定常部によって形成される。

「ヒト化抗体」は非ヒト生物からの抗体、典型的にネズミ抗体として理解され、そしてそれは元の抗体の抗原結合特性を保存するが、しかし、それは人間でのものより少ない免疫原性でしかない。このことは異なるプロセスによって達成することができ、それには、(a)キメラ抗体を生み出すために、ヒト定常部に完全な非ヒト可変ドメインをグラフト（移植）させること；(b)ヒトフレームワークおよび定常部において、重要なフレームワーク残分を保持することを伴うか、または伴わずに、非ヒト相補性決定領域（CDR）だけをグレーティングする（おろす）こと；および（c）完全な非ヒト可変ドメインを移植することであるが、表面の残分を取り替えることによってヒト可変部に類似したセクションで「それらを隠す（コンシーリングする）こと」を含む。

「霊長類化抗体」は、サルの抗体（または別の霊長類のもの）、特にカニクイザルの抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインを含み、そしてヒト定常ドメイン、好ましくはヒトガンマ1または4の免疫グロブリン〔またはPE変異体（バリアント）〕の定常ドメインのシークエンスを含むように遺伝的に操作された組換え抗体として理解される。前記抗体の調製は、Newman（ニューマン）ら、Biotechnology（バイオテクノロジー）、10：1458-1460年（1992年）において、および特許文献である米国特許第5,658,570号明細書および米国特許第6,113,898号明細書において記載されている。これらの抗体はヒト抗体と高い程度の、すなわち、85-98％の相同性を示し、それらはヒトのエフェクター（作動体）機能を有し、それらはより一層低い免疫原性を有し、そしてヒト抗原に対して高い親和性を示すことができると説明された。組換え抗体を生成するための別の非常に有効な手段はNewman、Biotechnology、10：1455-1460（1992年）によって記載されている。

「ヒト抗体」は一体的にヒト軽鎖および重鎖だけでなく、定常領域を含む、いずれかの既知の標準的な方法を使って製造される抗体として理解される。より一層広範な定義は「定義」のセクションに見出される。

用語「二重特異性抗体」または「二機能性抗体」を「定義」のセクションで規定する。

本発明はまた、実質的に抗体の抗血管形成活性を保持する前述の抗体の異なる種類の断片の使用を含む。用語「抗体フラグメント（抗体断片）」は、Fab、F（ab'）2、Fab'、一本鎖Fvフラグメント（scFv）、ダイアボディ（二特異性抗体）およびナノボディなどのような抗体フラグメントを含む。

抗体のパパイン消化は、「Fab」断片と称される2つの同一の抗原結合断片で、それぞれは単一の抗原結合部位を有するもの、および残部の「Fc」断片を生成し、その名称は容易に結晶化するその能力を反映する。ペプシン処理は、2つの抗原結合部位を有し、そしてまだ依然として抗原に架橋することが可能であるF（ab '）2断片を産生する。

「Fv」は、完全な抗原結合部位および抗原認識部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、強い非共有結合性会合（noncovalent association）において可変軽鎖および重鎖二量体（ダイマー）の可変ドメインから構成される。この構成では、各可変ドメインの3つの超可変領域はVH-VL二量体の表面上の抗原結合部位を規定するために相互作用する。全体としては、6つの超可変領域は、抗体に抗原抗体特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な唯一の3つの超可変領域を含む2分の1の Fv）は、完全な結合部位よりも低い親和性を有するものの、抗原認識および結合容量をもつ。

Fab断片はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第1定常ドメイン（CH1）を含む。Fab'断片は抗体ヒンジ領域の1またはそれよりも多く（1以上）のシステインを含み、重鎖のドメインCH1のカルボキシ末端にわずか数個の残基が付加することにおいてFab断片とは異なる。

「単鎖Fv」または「scFv」抗体断片は抗体のVHおよびVLドメインを含み、そこではこれらのドメインは単一のポリペプチド鎖中に存在する。好ましくは、Fvポリペプチドはさらに、scFvが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするVHおよびVLドメインの間のリンカーポリペプチドを含む。scFvの総説に関するものでは、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies（プラックトゥーン・イン・ザ・ファルマコロジー・オブ・モノクローナル・アンティボディズ）、vol. 113（第113巻）、Rosenburg（ローゼンバーグ）およびMoore（ムーア）編、Springer-Verlag（シュプリンガー・フェアラーク）、N.Y.（ニューヨーク）、第269-315頁（1994年）を参照。

用語「ダイアボディ（二特異性抗体）」は2つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片に言及し、それらの断片は、同じポリペプチド鎖（VH-VL）において軽鎖可変ドメイン（VL）に接続された重鎖可変ドメイン（VH）を含む。同じ鎖においての2つのドメインの間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使うことによって、ドメインは別の鎖の相補的ドメインと強制的に対形成され、そして2つの抗原結合部位を作成する。ダイアボディは、たとえば、文献欧州特許出願公開EP 404097号明細書、国際公開WO93/11161号、およびHollinger（ホリンガー）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイデッド・ステイツ・オブ・アメリカ）、90：6444-6448（1993年）でさらに詳細に記載されている。

「ナノボディ」という語は、免疫グロブリンの重鎖（VH断片）の抗原結合領域によってだけで作成される小さなサイズの実体（15kDa）を示す。前記ナノボディは、ラクダ科（Camelidae）のファミリー（科）、たとえば、ラクダ、ラマおよびヒトコブラクダ、主にラマ；およびシャーク（サメ）科のような動物を免疫化した後に主として生産され、それらは、自然に軽鎖が不足し、そして重鎖変数ドメインによって抗原を認識する抗体をもつ特殊性を有する。それでも、これらの供給源に由来するナノボディは、それらの治療上の適用のためのヒト化プロセスを必要とする。ナノボディを得るための別の潜在的供給源は、可変領域のVHおよびVLドメインを分離すことによって異なるヒト試料に由来する抗体からのものである。ナノボディは、全体としての抗体に関して生産コスト削減、安定性および免疫原性の減少のような利点を提示する。

他の抗体断片を「定義」セクションに挙げる。

本発明に係る抗体は抗血管形成活性をもつ。ここに使用する「抗血管形成活性を有する」の表現は、S100A4誘導血管形成を抑制する抗体の能力に言及する。抗血管形成活性は、抗体またはその断片が、例として、本出願（hte present application）の例9に示すように、S100A4誘発移動HUVEC細胞の移動をブロックする能力を、試験管内（インビトロ）で定めることにより、または抗体が、本発明の例11に記載のS100A4を過剰発現する腫瘍細胞の移植から由来した上皮性悪性腫瘍（ガン腫）において腫瘍血管の形成をブロックする能力を、生体内（インビボ）で定めることによって決定することができる。本発明によれば、抗S100A4抗体は、それが少なくとも100％、少なくとも90％、少なくとも80％、少なくとも70％、少なくとも60％、少なくとも50％、少なくとも（at leat）40％、少なくとも30％、少なくとも20％または少なくとも10％のS100A4タンパク質の血管形成活性をブロックする場合、抗血管形成性であると考えられる。

本発明の第1の態様において含まれる抗体フラグメント（断片）は、全長抗体がS100A4抗原に結合するための能力を保存し、そこからそれらが派生し、そしてそれらはまた、S100A4タンパク質の抗血管形成活性を抑制する機能を保つ。

「特異的な抗S100A4タンパク質の抗血管形成活性を保つ」という用語は、ここで用いるように、完全な抗体よりも実質的に抗血管形成活性（activivity）を示すために、抗体断片の能力に言及する。抗血管形成活性は、抗体またはその断片が、例として、本出願（hte present application）の例9について示すように、S100A4誘発移動HUVEC細胞の移動をブロックする能力を、インビトロで定めることにより、または抗体が本発明の例11に記載のS100A4を過剰発現する腫瘍細胞の移植から由来した上皮性悪性腫瘍（ガン腫）において腫瘍血管の形成をブロックする能力を、インビボで定めることによって決定することができる。腫瘍脈管形成の抑制は、抗体で処理されていない動物と比較して、微小血管の数における減少として、または抗体で処理されていない動物と比較して、微小血管の密度における減少として測定することができる。抗体断片は、抗体の抗血管形成活性を、それが抗体の活性の少なくとも100％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％または50％を示す場合に保たれる。

本発明において有用な抗体はS100A4タンパク質に特異的でなければならない。用語「特異的」は、S100A4タンパク質に特異的に結合し、そしてS100ファミリーの他のタンパク質にはそうでない抗体の能力をいう。

所望の特異性を有する抗体を識別するために、免疫蛍光、フローサイトメトリー、ウエスタンブロットおよびELISAアッセイ、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学的アッセイ、免疫沈降またはその技術分野で既知の他の免疫化学的アッセイなどのような免疫化学的アッセイを用いることができる。競合的結合または免疫放射線アッセイのための多数のプロトコルはこの技術の状態において既知である。前記イムノアッセイは、一般的に抗体およびS100A4タンパク質の免疫原の間の複合体の形成を測定することを含む。

本発明の第1の態様に従う抗体またはその断片は、以下の、
（i）シークエンスELPSFLGKRT（配列番号3）を含むS100A4のエピトープを認識する抗体、
（ii）シークエンスEGFPDKQPRKK（配列番号24）を含むS100A4のエピトープを認識する抗体および
（iii）ハイブリドーマECACC11051804によって生成される抗体
からなる群から選ばれる。

「S100A4のエピトープを認識する抗体」の表現は、このシーケンスを含まない他のエピトープに対する実質的結合を示すことのない（thje）エピトープに対し特異的な結合を示すことが可能な抗体を示す。本発明の例14において、抗体が特異的にエピトープと結合することが可能かどうか決定するための適切な手段が示され、そこでは、標的タンパク質の完全なシーケンスを表すペプチドが、その抗体または断片に対してテストされる。抗体は、前記エピトープのシーケンスを含まないペプチドに対するよりも著しく高い親和性（アフィニティ）を有するエピトープのシーケンスを含むペプチドにそれが結合する場合、所定のエピトープと特異的に結合すると考えられる。「著しくより一層高い親和性」という語は、ここで用いるように、以下のこと、意図された測定装置または方法により検出されるとき、他のアミノ酸配列のレベルから区別される特定のアミノ酸配列のための親和性レベルに言及する。好適には（Preferrably）、抗体と、エピトープを含むペプチドとの間の結合の親和性は、少なくとも1のオーダー（次数）の規模、少なくとも2のオーダーの規模、少なくとも3のオーダーの規模、少なくとも4のオーダーの規模、少なくとも5のオーダーの規模、少なくとも6のオーダーの規模で、抗体と、エピトープを含まないペプチドとの間の結合の親和性よりも高い。著しく高い親和性による結合の会合定数（Ka）は、たとえば、少なくとも10⁷M^-1、望ましくは少なくとも10⁸M^-1、およびより一層望ましくは少なくとも10⁹M^-1またはそれよりも低い。

「S100A4」という語は、「定義」セクションにおいて規定される。用語はまた、すべての生理学的に関連した翻訳後化学修飾の形態、たとえば、グリコシル化、リン酸化またはアセチル化、その他を含み、ただし、タンパク質の機能が維持される場合に限られる。前記用語には、任意の哺乳類種のS100A4が包含され、制限されないが、家畜および農場動物（ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたは齧歯動物）、霊長類およびヒトを含む。望ましくは、S100A4はヒト型である。

本発明の第1の態様は、S100A4の機能的に等価な変形物（変異体）の使用を考える。ここに使われるように、「S100A4の機能的に等価な変形物」は、試験管内で、そして生体内での双方で、少なくとも、S100A4と関係する本発明において記述される血管形成機能をS100A4と共有し、そしてアミノ酸配列において最小の同一性（アイデンティティ）を有する任意の分子として理解される。S100A4の変形物は、自然および人工的であることができる。

表現「自然な変形物」は、他の種、即ち、S100A4オルソログにおいて自然に生じる上述のヒトS100A4のすべてのそれらの変形物について言及する。前記自然な変形物には、制限されないが、カウ（ウシ）のS100A4で、受入番号DAA31755.1（2010年5月21日のバージョン）を有する予測されたシーケンスに対応するもの；ラットのS100A4で、受入番号NP_036750.1（2011年4月10日のバージョン）を有する予測されたシーケンスに対応するもの；マウスのS100A4で、受入番号NP_035441.1（2011年5月29日のバージョン）を有する予測されたシーケンスに対応するもの；イヌのS100A4で、受入番号NP_001003161.1（2011年2月19日のバージョン）を有する予測されたシーケンスに対応するものが含まれる。本発明の第1の態様において使用に適するS100A4の自然な変形物は、1以上のアミノ酸の挿入、置換または欠失によって前記シーケンスに由来することもでき、および自然な対立遺伝子、そして他の処理から得られる変形物、および自然に生じる分泌された形態および切断型を含むこともできる。

したがって、本発明において有用なS100A4は、それが天然に由来するS100A4と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む自然な配列であることができる。自然な配列のそのようなポリペプチドは、自然から分離することができ、またはそれらは組換えおよび/または合成手段によって生産することができる。このようにして、本発明にかかるS100A4は、非相同（異種）生物、たとえば、バクテリア（細菌）、イースト（酵母）または昆虫または哺乳類の細胞のようなものにおけるS100A4またはその機能的に等価な変形物をコード化するポリヌクレオチドの発現によって得られる組換え型タンパク質であることができる。前記組換え型タンパク質は、以降の精製を容易にするヒスチジンのアミノ末端テイル（尾部）による融合タンパク質として得ることができる。この技術に熟達する者によって知られ、そして最高水準の技術で記述される方法に従い、前記タンパク質の発現および精製を実行することができる。

好適実施形態において、S100A4はヒト起源、望ましくはシーケンス配列番号21のものである。もう一つの好適実施形態において、S100A4は、3つの追加のアミノ酸のアミノ末端テイルを有するヒトS100A4のシーケンスを含む融合タンパク質の発現からもたらされ、それのシーケンスは配列番号25である。
配列番号25
1 GSHMACPLEK ALDVMVSTFH KYSGKEGDKF KLNKSELKEL LTRELPSFLG KRTDEAAFQK
61 LMSNLDSNRD NEVDFQEYCV FLSCIAMMCN EFFEGFPDKQ PRKK

あるいはまた、S100A4は、組換えおよび/または合成手段によって得ることができるS100A4の人工の機能的に等価な変形物であることができる。

「変形物」という語に関するより一層詳細な情報は「定義」セクション上で見出すことができる。

本発明の第1の態様において考えられるS100A4の変形物は、たとえば、制限を伴わずに、次の：
- MMP9基質（マトリクス）メタロプロテイナーゼ活性を活性化するための能力で、本発明の例8において記述する方法を使って決定することができるもの。
- 内皮細胞移動を誘発するための能力で、本発明の例9において記述する方法を使って決定することができるもの。
- ヌードマウスにおいて腫瘍発生を誘発するための能力で、本出願の例10において記述する方法を使って決定することができるもの。
- 血管形成能力または腫瘍微小血管系形成のための能力で、本出願の例11において記述する方法を使って決定することができるもの。
- IL8の分泌によって媒介された単球での炎症反応を誘発するための能力で、本出願の例16において記述する方法を使って決定することができるもの
のようなものの、S100A4の機能の少なくとも1つを示す

加えてさらに、本発明の第1の態様において考えられるS100A4の機能的に等価な変形物は、上述のS100A4の異なる天然の変形物と少なくとも60％、65％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、90％、95％、97％、99％の類似性または同一性（アイデンティティ）を示すポリペプチドが含まれる。2つのポリペプチドの間のアイデンティティの程度は、コンピュータにおいて実装されるアルゴリズムおよびこの技術において熟練した者に広く知られる方法を用いて決定される。2つのアミノ酸配列の間のアイデンティティは、望ましくはBLASTPアルゴリズムを使用し決定される〔BLASTPマニュアル、Altschul（アルチュール）、S.ら、NCBI NLM NIH Bethesda（ベセズダ）、メリーランド州、20894、Altschul, S.ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J., 1990, Mol. Biol.）1990年、215：403-410〕。アイデンティティの程度を算出する方法は、「定義」セクション上で示した。

「表現で前記抗体の抗血管形成活性を実質保つ」は、本発明の第1の態様の抗体が完全に抗血管形成活性を失われないことを意味する。

大抵は、本発明の抗体のアミノ酸配列における修飾もまた考えられる。たとえば、抗体の結合親和性および/または他の生物学的特性を改善することは望ましいことがある。抗体のアミノ酸配列の変形物は、抗体をコード化する核酸において適切なヌクレオチド変化を導入することで、またはペプチド合成によって調製される。前記修飾には、たとえば、抗体のアミノ酸配列内の残基の除去および/または挿入および/または置換が包含される。除去、挿入および置換の任意の組合せは、最終的構築物が所望の特性、すなわち、前記タンパク質のS100A4の結合特異性およびアンタゴニスト抗血管形成活性を有することを条件に、最終的構築物を達成するために実行される。アミノ酸での変化はまた、グリコシル化の部位の数または位置を変化させることのような、抗体の翻訳後プロセスを変えることができる。

アミノ酸配列での若干の挿入では、長さで1残基から百以上の残基を含有するポリペプチドまで変動するアミノ末端および/またはカルボキシ末端融合物、ならびに1つまたは複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入のいくつかの例には、N末端メチオニン残基を有する抗体、または細胞毒性（細胞傷害性）ポリペプチドに融合した抗体が含まれる。抗体分子の挿入による他の変形物には、酵素の抗体のN末端またはC末端による融合、または抗体の血中半減期を増加させるポリペプチドが含まれる。

他のタイプの変形物はアミノ酸置換による変形物である。これらの変形物は異なる残基により置換された抗体の少なくとも1のアミノ酸残基を有する。抗体置換による変異誘発のための主要な興味ある部位は、超可変領域を含むが、FRにおける改変もまた考えられる。

本発明との関連において、用語「抗原」はS100A4を指す。

本発明の第1の態様の特異的な抗S100A4抗体は、抗原S100A4のエピトープを認識する。本発明者らは、本発明の抗血管形成抗体がS100A4のシーケンスELPSFLGKRT（配列番号3）によってか、またはシーケンスEGFPDKQPRKK（配列番号24）によって規定される領域において含まれるエピトープを認識することを見出した。このようにして、好適な実施形態では、抗体は、シーケンスELPSFLGKRT（配列番号3）を含むS100A4のエピトープを認識する。別の好適例において、抗体は、シーケンスEGFPDKQPRKK（配列番号24）を含むS100A4のエピトープを認識する。

表現「エピトープを認識する」は「定義」セクションで定義されるように抗体がエピトープに対し結合できることを意味する。エピトープは、全体のシーケンスELPSFLGKRT（配列番号3）またはEGFPDKQPRKK（配列番号24）または前記シーケンスの若干のアミノ酸によって形成することができる。

前に、および「定義」のセクションで規定するように、本発明の第1の態様の特異的な抗S100A4抗体はモノクローナル抗体であってもよい。したがって、好適実施形態では、本発明の第1の態様の特異的抗S100A4抗体またはその断片はモノクローナル抗体のものである。

本発明は、異なるハイブリドーマ細胞系（細胞株）によって生産されるモノクローナル抗体を提供する。好適例において、クレーム2に従う特異的な抗S100A4抗体またはその断片はグループECACC 10022401、ECACC 11051801、ECACC 11051802、ECACC 11051803およびECACC 11051804から選ばれるハイブリドーマによって生産され、またはその断片である。

本発明の関連において、「ハイブリッド細胞（雑種細胞）」または「ハイブリドーマ」は、単一のユニーク（独特な）幹細胞のB細胞クローン子孫の、および骨髄腫細胞の融合の生成物として理解される。具体的には、本発明の第1の態様のモノクローナル抗体は、本発明者によって生産され、およびそれぞれ5C3-1B8-1F4、6B9-1E8-2A8、5A3-4A6-5B6、1E2-2H4-2G8および8B6-2F6-1H9-1H10として識別されたハイブリドーマから得られた5C3、6B9、5A3、1E2および8B6のように、本書類の実験部分において言及する抗S100A4モノクローナル抗体に対応する。前記ハイブリドーマは、1977年4月28日の、微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約に従い、その目的のために法的に認められた機関としてヨーロピアン・コレクション・オブ・セル・カルチャー（ECACC）、Porton Down（ポートンダウン）、Salisbury（ソールズベリー）、SP4 OJG、イギリスにおいて本特許出願をする前に寄託した。

寄託者は、Baldiri Reixach（バルディリ・レイシャク）15-21のHelix Building（ヘリックス・ビル）、Barcelona（バルセロナ）、08028、スペインのアドレスを有するLeitat Technological Center（レイタット・テクノロジー・センター）からのFrancesc Mitjans（フランセスク・ミットジャンズ）およびMarc Masa（マーク・マサ）であった。

ヨーロピアン・コレクション・オブ・セル・カルチャー（ECACC）は、ハイブリドーマ5C3-1B8-1F4、6B9-1E8-2A8、5A3-4A6-5B6、1E2-2H4-2G8および8B6-2F6-1H9-1H10に、それぞれ受託番号ECACC 10022401、ECACC 11051801、ECACC 11051802、ECACC 11051803およびECACC 11051804を割り当てた。本発明の抗S100A4モノクローナル抗体を取得できるようにする前記ハイブリドーマ系の培養条件は、本発明のモノクローナル抗体を得るための方法との関連で説明される。

本文書では、ハイブリドーマ5C3-1B8-1F4、6B9-1E8-2A8、5A3-4A6-5B6、1E2-2H4-2G8および8B6-2F6-1H9-1H10および前記ハイブリドーマによって生産された抗体は、それぞれ略称5C3、6B9、5A3、1E2および8B6によって示される。

本発明はまた、S100A4に結合するための能力およびまた抗血管形成能力を維持する本発明の第1の態様の特異的抗S100A4モノクローナル抗体の断片を企図する。結合のための能力は、本発明の例5、6および7に記載のように、たとえば、ELISAまたはウエスタンブロットのような、この技術において熟練した者（当業者）によって知られる方法を使って確認することができる。抗血管形成キャパシティを維持するための能力は、本発明の例9に記載されているもののような当業者に既知の方法を使って確認することができる。

前記「断片」は、S100A4に結合するための能力を維持する言及したモノクローナル抗体のアミノ酸配列の1またはいくつかの部分に対応する抗体配列の断片を称し、そしてそのためポリペプチドは、6つのCDR領域の配列が含まれている必要があり、それは、たとえば、制限されないが、キメラ抗体、ヒト化抗体または二重特異性抗体などの、遺伝子組換え抗体のような本発明の第1の態様との関連で規定される抗体を得るために用いることができる。前記「断片」はまた、Fab、F(ab')2、Fab'、単鎖Fv断片（scFv）のような抗体断片、ダイアボディまたはナノボディを得るために用いることができる。加えて、断片は、血管形成をブロックする能力を維持する。

FabおよびF(ab')2断片は、本発明の第1の態様のインタクト（無傷）のモノクローナル抗体の酵素的または化学的切断によって得ることができる。

本発明にかかるモノクローナル抗体のパパイン消化は「Fab」断片と称される2つの同一の抗原結合断片を生産し、各々は単一の抗原結合部位を有する。次には、2つの抗原結合部位をもつ「F(ab')2」断片はペプシン処理によって得られる。

さらに、「断片」は、Fab'断片、単鎖Fv断片（scFv）またはダイアボディのような別のタイプの抗体断片を、遺伝子工学的技術によって得ることを可能にする。

好適実施形態において、特異的な抗S100A4抗体またはその断片はハイブリドーマECACC 10022401によって生産される。

本発明は、配列番号1を含む分離されたアミノ酸配列を提供する。このアミノ酸配列はS100A4に対して向けられたモノクローナル抗体の可変領域の軽鎖のFRsおよびCDRsを包含する。特に、可変領域の軽鎖ならびにそれぞれのFRsおよびCDRsの配列は次のとおりである。

本発明は、配列番号2を含む分離したアミノ酸配列を提供する。このアミノ酸配列には、ヒトまたはネズミS100A4に対して向けられたモノクローナル抗体の可変領域の重鎖のFRsおよびCDRsが包含される。特に、可変領域の重鎖ならびにそれぞれのFRsおよびCDRsのシーケンスは次のとおりである。

前記配列はハイブリドーマECACC 10022401によって生産された抗体に対応する。したがって、好適実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号1を含む少なくともあるVL領域および配列番号2を含む少なくともあるVH領域または実質抗血管形成活性を維持するその機能的に等価な変形物を包含する。

用語「VL領域」は抗体の軽鎖の可変領域に言及し、その一方で用語「VH領域」は抗体の重鎖の可変領域を指す。

表現「実質抗血管形成活性を維持するその機能的に等価な変形物」は、本発明での抗体と、インビトロおよびインビボの双方で抗血管形成機能を共有する任意の分子に言及し、そしてアミノ酸配列と最小の同一性を有する。本発明での抗体の機能的に等価な変形物は、1以上のアミノ酸の挿入、置換または欠失を使って前記配列から導くことができ、そして組換えおよび/または合成手段によって得ることができる。

本発明での抗体の機能的に等価な変形物は、S100A4抗原に結合するためのそれらの能力、およびさらに、S100A4タンパク質の血管形成機能を抑制するための能力を保存していなければならず、前記機能は、本出願の例9に記載のように、たとえば、VEGFおよびS100A4での内皮細胞移動アッセイを使うような当業者に既知の方法を使って確認することができる。

本発明の抗体の機能的に等価な変形物には、前に述べたポリペプチド配列と少なくとも60％、65％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、90％、95％、97％、99％の同一性を示すポリペプチドが包含され、好ましくは少なくとも90％の同一性を有する。2つのポリペプチド間の同一性の程度は、当業者によって広く知られるコンピュータに実装されたアルゴリズムおよび方法を用いて決定される。2つのアミノ酸配列間の同一性は、好ましくは、BLASTPアルゴリズムを用いて定められる（BLAST Manual、Altschul, S.ら、NCBI、NLM NIH Bethesda、Md.、20894、Altschul, S.ら、1990、J. Mol. Biol. 215：403-410）。同一性の程度は「定義」のセクションにおいて記載した方法に従って算出される。

本発明は、配列番号3を含む分離されたアミノ酸配列を提供する。このアミノ酸は、ヒトまたはネズミS100A4のエピトープまたは抗原決定基に対応する。

配列番号3 ELPSFLGKRT

本発明の1実施形態では、配列番号3を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその断片を提供する。

本発明の1実施形態では、配列番号3を含むポリペプチドにより哺乳動物を免疫化することによって生産されたヒトまたはマウスS100A4ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその断片が提供される。

本発明の1実施形態では、抗体またはその断片は、ヒト抗体またはその断片、ヒト化抗体またはその断片、ポリクローナル抗体またはその断片、モノクローナル抗体またはその断片、Fab抗体、およびキメラ抗体またはその断片から選択される。

本発明の1実施形態では、配列番号1を含む軽鎖ポリペプチドが含まれるモノクローナル抗体が提供される。

本発明の1実施形態では、配列番号2を含む重鎖ポリペプチドが含まれるモノクローナル抗体が提供される。

本発明の1実施形態では、フレームワーク領域（FRs）および相補性決定領域（CDRs）を含むモノクローナル抗体が提供され、そこではモノクローナル抗体には、配列番号1を含む軽鎖および配列番号2を含む重鎖が含まれる。

本発明の1実施形態では、モノクローナル抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、およびキメラ抗体またはその断片から選択される。

本発明の1実施形態では、モノクローナル抗体は、
a）ヒトまたはネズミS100A4タンパク質とのみ反応し、または
b）ヒトまたはネズミS100A4タンパク質の作用のメカニズムをブロックし、または
c）ヒトまたはネズミS100A4タンパク質のインビトロでの、またはインビボでの機能的活性をブロックし、または
d）ヒトまたはネズミS100A4タンパク質によってか、または内皮細胞においてVEGFと組み合わせるヒトまたはネズミS100A4タンパク質によって誘導されるプロマイグラトリー（プロ移動性、promigratory）効果をブロックし、または
e）腫瘍の増殖をブロックし、または
f）腫瘍の発生をブロックし、または
g）腫瘍の血管形成をブロックし、または
h）細胞性散在（cellular dissemination）および転移の確立（metastatic establishment）をブロックし、または
i）炎症プロセスをブロックし、または
j）ガン幹細胞をブロックし、または
k）上記a）からj）の任意の組合せ
である。

本発明の1実施形態では、配列番号1および配列番号2を含むモノクローナル抗体またはその断片が提供され、そこでは、前記抗体またはその断片は一価または二価である。本発明はさらに、本明細書で提示の実施形態のいずれか1つに従うモノクローナル抗体を生産することが可能なハイブリドーマ細胞株を提供する。

本発明はさらに、ヨーロピアン・コレクション・オブ・セル・カルチャー（ECACC）受入番号10022401で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって得られるモノクローナル抗体を提供する。

本発明の1実施形態では、モノクローナル抗体の可変領域の軽鎖のFRsおよびCDRsについてコード化する配列番号4を含む分離されたポリヌクレオチドを提供する。

配列番号4
1 GATGTTTTGA TGACCCAAAC TCCACTCTCC CTGCCTGTCA GTCTTGGAGA TCAAGCCTCC
61 ATCTCTTGCA GATCTAGTCA GAGTATTGTA CATAGTAATG GAAACACCTA TTTAGAATGG
121 TACCTGCAGA AAACAGGCCA GTCTCCAGAG CTCCTGATCT ACAAAGTTTC CAACCGACTC
181 TCTGGGGTCC CAGACAGGTT CAGTGGCAGT GGATCAGGGA CAGATTTCAC ACTCAAGATC
241 AGCAGAGTGG AGGCTGAGGA TCTGGGAGTT TATTACTGCT TTCAAGGTTC ACATGTTCCA
301 TTCACGTTCG GCTCGGGGAC AAAGTTGGAA ATAAAA

本発明の1実施形態では、モノクローナル抗体の可変領域の重鎖のFRsおよびCDRsについてコード化する配列番号5を含む分離されたポリヌクレオチドを提供する。

配列番号5
1 GAGGCTCAGC TGCAGCAGTC TGGGGCAGAG CTTGTGAAGC CAGGGGCCTC TGTCAAGTTG
61 TCCTGCACAG CCTCTGGCTT CAACATTCAA GAGACCTATA TGCACTGGGT GAAGCAGAGG
121 CCTGAACAGG GCCTGGAGTG GATTGGAAGG ATTGATCCTG CGAATGGTAA TACCAAAGAT
181 GACCCGAAGT TCCAGGGCAA GGCCTCTATA ACAGTAGACA CATCCTCCAA CACAGCCTAC
241 CTGCAGCTCA GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC ACTGCCGTCT ATTACTGTGC TTCAAGTTAT
301 GCTATGGACT ACTGGGGTCA AGGAACCTCA GTCACCGTCT CCTCA

本発明の1実施形態では、ヒトS100A4タンパク質のエピトープ領域についてコード化する配列番号6を含む分離されたポリヌクレオチドを提供する。

配列番号6 GAGCTGCCCAGCTTCTTGGGGAAAAGGACA

別の好適実施形態において、本発明での特異的抗S100A4抗体またはその断片はハイブリドーマECACC 11051801によって生産される。

別の好適実施形態において、本発明での特異的抗S100A4抗体またはその断片はハイブリドーマECACC 11051802によって生産される。

別の好適実施形態において、本発明での特異的抗S100A4抗体またはその断片はハイブリドーマECACC 11051803によって生産される。

別の好適実施形態において、本発明での特異的抗S100A4抗体またはその断片はハイブリドーマECACC 11051804によって生産される抗体である。

本発明の第1の態様のモノクローナル抗体は、ヒト内皮細胞の移動能力を停止することが可能であることが実証された。そのため、特定の実施形態において、本発明は、抗血管形成活性を有する特異的な抗S100A4抗体、またはヒト内皮細胞の移動能力を停止させることができる前記抗体の抗血管形成活性を実質保つ、その断片に関する。

「ヒト内皮細胞の移動能力を停止する」では、少なくとも20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70 ％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％、好ましくは少なくとも20％、より一層好ましくは少なくとも30％、さらにより一層好ましくは少なくとも45％によって前記細胞の移動能力を抑制するものとして理解される。移動能力の前記抑制または移動停止は、本発明の例9に記載のアッセイを使って評価することができる。

表現「ヒト内皮細胞の移動能力」は新血管形成においてキーとなるステップである前記細胞の移動性の能力に言及する。ヒト内皮細胞は、哺乳動物の生物すべての血管を裏打ちする細胞である。前記定義に含まれるヒト内皮細胞は、制限されないがヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVECs）である。好適実施形態では、ヒト内皮細胞はHUVECs細胞である。

本発明でのモノクローナル抗体を得るためのハイブリドーマ細胞株および方法

別の態様において、本発明は、本発明の第1の態様に従うモノクローナル抗体を得るための方法に関し、それには、受入番号ECACC 10022401、ECACC 11051801、ECACC 11051802、ECACC 11051803 およびECACC 11051804として寄託されたそれらの細胞株から選択したハイブリドーマ細胞株を、前記抗体の生産を許容する条件下に培養することを含む。

本発明の第1の態様のモノクローナル抗体を得るための方法は、この技術の分野で既知の慣習的な方法に従って行うことができる。基本的に、この方法は、抗体を生産させて、およびそれらを分泌させ、そしてその後に生産されたモノクローナル抗体を含む培養基上清を収集するために、ハイブリドーマ細胞に適した培養基において、ハイブリドーマ細胞株を培養することからなる。前記抗体は、随意に、アフィニティークロマトグラフィー、プロテインAセファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動または透析のような慣習的な手段によって精製することができる。

用語「モノクローナル抗体」は既に前述の態様において規定されるものである。

ハイブリドーマ細胞株を「培養すること」は、必要な時間、培養バイアルにおいて、適した培地の存在下で、前記細胞の増殖および本発明にかかるモノクローナル抗体の生産を起こすために適した条件下で、ハイブリドーマ細胞をインキュベートすることとして理解される。前記培養には、異なる組成の培養基の使用を含むことができる。好ましくは、第1ステップにおいて、細胞は、その増殖を支持するために血清を含む培地において培養し、そして細胞を収集し、それらを洗浄した後、それらは抗体を得るために、無血清培地で培養される。この方法に従って抗体を得るのに適した培地は、制限されないが、細胞増殖を支持するためL-グルタミンおよびFetal Calf Serum（ウシ胎仔血清）を補ったDMEM/F12培地およびL-グルタミンを補ったが、ウシ胎仔血清を欠く抗体収集媒体としてのDMEM/F12（「タンパク質フリー培地」）に基づく混合物である。抗体を産生するための媒体はまた、任意の培地または合成細胞培養媒体の混合物からなることができ、この組成およびその後の補給はタンパク質を含まず（「タンパク質フリー培地」）、または前記タンパク質が非常に低い割合であり（「血清フリー培地」または「低タンパク質培地」）、およびそれらは免疫グロブリンのグループに属しない。前記培地は、細胞の増殖および維持だけでなく、以前にウシ胎仔血清の不存在下で増殖するように適合されたハイブリドーマ細胞株による抗体の分泌を許容しなければならない。好適例において、前記細胞の培養に適した培地はDMEM/F12およびL-グルタミンを含む培地である。前記培養が実行される条件は好ましくは、湿気の多い環境で、標準的な空気雰囲気または5％のCO2富化空気と共に37℃の温度である。

したがって、別の態様において、本発明は、受入（受託）番号ECACC 10022401、ECACC 11051801、ECACC 11051802、ECACC 11051803およびECACC 11051804として寄託した細胞株からなる群から選ばれたハイブリドーマ細胞株に関する。好ましくは、細胞株は受入番号ECACC 10022401を有する。別の実施形態では、ハイブリドーマ細胞株は、受入番号ECACC 11051801、ECACC 11051802、ECACC 11051803およびECACC 11051804として寄託された細胞株からなる群から選択される。

表現「ハイブリドーマ細胞系（株）」は、本発明の第1の態様において先に規定したようなハイブリッド細胞またはハイブリドーマによって形成された細胞株を指す。前記ハイブリドーマ細胞株は、本発明の例4に記載のような標準的な方法によって得られた。簡単に説明すると、マウスを、ヒト組換えS100A4タンパク質で免疫化し、そして細胞を免疫化したマウスの脾臓から抽出し、それを、たとえば、PEG-1500のような融合誘導因子の存在下で骨髄腫細胞と融合させた。ハイブリドーマをHAT培地中で選び、選択した各クローンを限界希釈法によってサブクローニングした。拡張するのに適したクローンを、DMEM/F12培地に適合し、そして凍結し、ハイブリドーマ細胞株ECACC 10022401、ECACC 11051801、ECACC 11051802、ECACC 11051803およびECACC 11051804が構成される。

本発明の好適実施形態では、この方法を使って調製したモノクローナル抗体は、本発明との関連で記載されたハイブリドーマ細胞株によって生産されたもののいずれかであることができる。

本発明はさらに、ここに提示する実施形態のいずれか1つに従うモノクローナル抗体の製造のための方法を提供し、前記方法には、次の、
（i）精製したヒトまたはネズミS100A4タンパク質で、抗原に対する免疫応答を誘導するのに有効な薬剤と組み合わせた精製ヒトまたはネズミS100A4タンパク質で、マウスを免疫化すること、
（ii）1以上のハイブリドーマ細胞を産生する、
（iii）1以上の細胞を選び、その上清は、
a）ヒトまたはネズミS100A4タンパク質とだけ反応し、または
b）ヒトまたはネズミS100A4タンパク質の作用メカニズムをブロックし、または
c）インビトロでの、またはインビボで、ヒトまたはネズミS100A4タンパク質の機能的活性をブロックし、または
d）ヒトまたはネズミS100A4タンパク質によって、または内皮細胞におけるVEGFと組み合わせるヒトまたはネズミS100A4タンパク質によって誘導されるプロマイグラトリー効果をブロックし、または
e）腫瘍の増殖をブロックし、または
f）腫瘍の発生をブロックし、または
g）腫瘍の血管形成をブロックし、または
h）細胞性散在および転移の確立をブロックし、または
i）炎症プロセスをブロックし、または
j）ガン幹細胞をブロックし、または
k）上記a）からj）の任意の組み合わせであること。
（iv）ステップiii）の選定した細胞のいずれか1つから特定の細胞株を生産すること、および
（v）前記細胞株からモノクローナル抗体を分離すること
が含まれる。

本発明での特異的な抗S100A4抗体を含む製薬上組成物

別の態様において、本発明は、本発明の第1の態様に従う少なくとも1の抗体またはその断片の薬学的有効量および少なくとも1の薬学的に許容可能な賦形剤を含む製薬上組成物に関する。

好適実施形態において、本発明の第1の態様に従う抗体は、そのグループECACC 10022401、ECACC 11051801、ECACC11051802、ECACC 11051803およびECACC 11051804から選択されたハイブリドーマによって産生され、またはその断片、好ましくは、ECACC 10022401である。

本発明においてそれが用いられるように、表現「製薬上組成物」は、細胞、細胞のグループ、器官、組織または動物で、それではS100A4タンパク質の過剰発現があるものに対して、1つまたはいくつかの治療上有用な薬剤の予め定めた用量を投与するために適合された調剤物に関する。

「薬学的に有効な量」は、治療効果を提供することが可能な量として理解され、そしてそれは普通に用いられる手段により当業者によって決定することができる。

本発明の組成物は、本発明の第1の態様に従う1つ以上の抗体または前記抗体の抗血管形成活性を実質保つ1つ以上のその断片を含むことができる。

本発明の組成物はまた、病変の防止および/または処置のための1またはいくつかの追加の化合物を含むことができ、それにはガンまたは炎症と関係する疾患のようなS100A4タンパク質の過剰発現がある。前記追加の化合物は、細胞毒性剤、抗血管形成剤、抗転移剤または抗炎症剤のように、モノクローナル抗体の独立実体として製薬上組成物の一部を形成することができ、または前記抗体とのコンジュゲートも形成される。

製薬上組成物は、1以上の薬学的に許容可能な賦形剤と共に慣習的な手段によって調製される。

「薬学的に許容可能な賦形剤」は、活性成分を組み込むために使用されると言われる治療上不活性な物質であり、そしてそれは、薬理学的/毒性学的観点から受動体にとって、および物理的/化学的観点からそれを製造する薬剤師にとって、組成、調剤、安定性、受動体の容認および生物学的利用能に関して許容可能なものと理解される。

薬学的に許容可能な賦形剤の数および性質は所望の剤形に依存する。薬学的に許容可能な賦形剤は当業者によって知られる〔Fauli y Trillo（ファウリ・ワイ・トリロ）C.（1993）「Tratado de Farmacia Galenica（トラタド・デ・ファルマシア・ガレニカ）」、Luzan（ルザン）5、S.A. Ediciones（エディシオネス）、Madrid（マドリッド）〕。前記組成物は、この技術の分野において知られる慣習的方法を使って調製することができる〔「Remington（レミントン）：The Science and Practice of Pharmacy（ザ・サイエンス・アンド・プラクティス・オブ・ファルマシー）」、20th edition（第20版）（2003年）Genaro（ゲネロ）A.R.編、Lippincott Williams & Wilkins（リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス）、Philadelphia（フィラデルフィア）、US〕。

望ましい剤形の調剤物のために必要な薬学的に許容可能な賦形剤が含まれるように、本発明の製薬上組成物は、経口経路、局所経路によって、吸入または非経口経路によってなどのような、適切な経路の任意のタイプによって投与することができる。製薬上組成物の好ましい投与経路は静脈内経路（endovenous route）である。

「経口経路」は、嚥下後に有機体（生物体）に組み込まれる製薬上組成物として理解される。特定の実施形態において、本発明の製薬上組成物は、経口経路、固形または液体であるかどうかによって、その投与に適した剤形であってよい。経口経路によるそれらの投与に適した剤形は、錠剤、カプセル剤、シロップ剤または液剤とすることができ、およびこの技術分野で既知の任意の慣習的な賦形剤、たとえば、結合剤で、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、ポリビニルピロリドンなどのようなもの；充填剤で、たとえば、乳糖、糖、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビトールまたはグリシン；圧縮用潤滑剤で、たとえば、ステアリン酸マグネシウム；崩壊剤で、たとえば、デンプン、ポリビニルピロリドン、デンプンのグリコール酸ナトリウムまたは微結晶性セルロース；またはラウリル硫酸ナトリウムなどのような薬学的に許容可能な湿潤剤のようなものを含むことができる。
固体の経口組成物は、混合、充填または圧縮する慣習的なプロセスを使って調製することができる。反復的なミキシング操作を、充填剤を大量に使用するそれらの組成物中の活性剤を完全に分配するために用いることができる。前記操作は、この技術分野において慣習的なものである。錠剤は、たとえば、湿式または乾式の造粒、および随意に普通の薬務において知られるプロセスに従ってそれらを必要に応じてコーティング、特に腸溶性コーティングすることによって調製することができる。

一方では、「局所的経路」は非全身経路によって投与するものとして理解され、そして表皮上に外部から、口腔での本発明の製薬上組成物の適用、および前記組成物の耳、眼および鼻への滴下が含まれ、そしてそれにはそれが著しく血流に入ることはない。「全身経路」は、経口経路、静脈内経路、腹腔内経路および筋肉内経路による投与として理解される。
治療上または予防上の効果のために必要な抗体の量は、選定された抗体、その性質および扱われようとしている病気、患者の重症度に応じて必然的に異なる。

「吸入」は、鼻腔内経路によっての、および経口吸入によっての投与として理解される。エアロゾルまたはメートルドーズド吸入器（meter dosed inhaler）内の調剤物のような前記投与に適した剤形は、慣習的な技術を使って調製することができる。

ここで用いるように、用語「非経口」には、静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路または皮下経路による投与が含まれる。
非経口投与の皮下、筋肉内および静脈内の剤形が大抵は好ましい。

1実施形態において、本発明の製薬上組成物は、適切な投薬単位形態において、滅菌溶液、懸濁物または凍結乾燥製剤として、それらの非経口投与のために適合させることができる。
その注射用途に適した製薬上組成物には、滅菌水溶液（それらが水に溶解性である場合）、または滅菌注射用溶液または分散物の即時調製のための分散物および滅菌粉体が含まれる。
静脈内経路によるその投与のために、若干の適切な担体（キャリヤー）には、リン酸塩（PBS）で緩衝化された塩類溶液が含まれる。全ての場合において、組成物は殺菌されていなければならず、そして注入するのに簡単な能力が存在するそのポイントに対して流動性でなければならない。それは、調製および保存条件で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、溶媒または分散媒であることができ、それにはたとえば、水、エタノールや、グリセロール（グリセリン）、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールおよびそれらの適切な混合物のような薬学的に許容可能なポリオールが含まれる。適切な流動性は、たとえば、レシチンなどのようなコーティングを用いることによって、分散物の場合において必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤を用いることによって、維持することができる。微生物の作用の予防は、たとえば、種々の抗菌剤および抗真菌剤を用いて、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チオメルサールなどを使って達成することができる。ほとんどの場合、それは等張剤を含むことが好ましく、たとえば、組成物において、糖類や、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコールや、または塩化ナトリウムが含まれる。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤、たとえば、アルミニウムおよびゼラチンモノステアレートを含めることによって引き起こされることがある。

注射用滅菌溶液は、前述の成分の1または組合せで、適切な溶媒中に必要量の活性化合物を配合し、必要に応じて、滅菌膜を通してろ過することにより滅菌することによって調製することができる。概して、分散物は、塩基性分散媒および以前に記載したものの中から必要な原料の残りの部分を含む滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むことによって調製される。注射用滅菌溶液を調製するための滅菌粉体の場合、好ましい調製方法はその予めろ過した滅菌溶液から活性成分プラス任意の追加の成分を有する粉体を生じさせる真空（減圧）乾燥および凍結乾燥である。抗体は通常、凍結乾燥形態において、または溶液中で保存される。治療用抗体の組成物は概して、滅菌した点検用窓を有するパッケージング（包装）、たとえば、皮下注射針によって穿孔することができるストッパーのような調剤物を回収することができるアダプタを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルに収容される。

製薬上組成物は、パルスインフュージョン（パルス注入）によって、たとえば、適切に抗体の用量を減少させることを伴って投与することができる。用量は、好適には、注射を使って、投与が急性かまたは慢性かに部分的に依存して、より一層好適には静脈内または皮下注射により投与される。

1実施形態において、本発明の第1の態様の抗体を含む製薬上組成物は、インプラントおよびマイクロカプセル投与システムを含む放出制御調剤物のような、前記抗体を体からの迅速な排除から保護する担体を用いて調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などのような生分解性生体適合性ポリマーを用いることができる。前記調剤物を調製するためのプロセスは、当業者に対して明らかである。物質類はまた、商業的にもアルザ・コーポレーション（Alza Corporation）およびノバ・ファーマシューティカル社（Nova Pharmaceuticals, Inc.）で得ることができる

徐放性組成物はまた、懸濁物において結晶を維持することができる適した調剤物中に懸濁させた抗体結晶の調製物を含む。これらの調製物は、それらが皮下または腹腔内経路によって注射されるとき、徐放効果を生じることができる。他の組成物はまたリポソームの中に捕捉された抗体を含む。このような抗体を含むリポソームは、好適には、Epstein（エプスタイン）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、（1985年）82：3688-3692；ウォン（Hwang）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、（1980年）77：4030-4034；欧州特許EP 52322号、EP 36,676号、EP 88,046号、EP 143,949号などのような既知の方法を使って調製される。

本発明の組成物は、任意のタイプの哺乳動物、好適にはヒトへの投与に適する。

本発明はさらに、ここに提示する具体化（実施形態）のいずれか1つに記載のモノクローナル抗体および薬学的に許容可能な担体を含む製薬上組成物（医薬組成物ということがある）を提供する。

本発明の１実施形態において、医薬組成物にはさらに化学療法剤が含まれる。

本発明の別の実施形態において、医薬組成物にはさらに抗炎症剤が含まれる。

特異的抗S100A4抗体および代謝拮抗物質を含む製薬上組成物

本発明者らは、驚くべきことに、特定の抗S100A4抗体と代謝拮抗物質との組合せがガンの処置における細胞毒性として相乗効果を有することを見出した（本発明の例15参照）。

したがって、本発明のある態様は、特異的な抗S100A4抗体および代謝拮抗物質を含む医薬組成物である。

本発明で用いるように、表現「製薬上組成物（医薬組成物）」は、細胞、細胞群、器官、組織またはガンを患っている動物に対し1またはいくつかの治療上有用な薬剤の所定の用量を投与するために適合された調剤物に関する。

用語「特異的な抗S100A4抗体」は、本発明のこの態様との関連で、以前に、先行技術に開示された抗体を含む、S100A4タンパク質を特異的に認識する任意の抗体に言及する。

「代謝拮抗物質」は、ここで用いるように、ブロッドセンス（bro`d sense）において生物のために重要である代謝物（たとえば、ビタミン、補酵素、アミノ酸および糖質類のようなもの）とのそれらの構造的または機能的な類似性のため、高エネルギー中間体の生成を防ぐために、電子伝達系を抑制する正常な代謝および物質を妨げる物質に関する。

本発明での使用に適した代謝拮抗物質は、制限されないが、葉酸代謝拮抗物質〔アミノプテリン、デノプテリン、メトトレキサート、エダトレキサート、トリメトレキサート、ノラトレキセド、ロメトレキソール、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、ピリトレキシム、プテロプテリン（pteropterin）、ロイコボリン、10-プロパルギル-5,8-ジデアザフォレート（dideazafolate）（PDDF、CB3717）〕、プリンアナログ（クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリン、ペントスタチン、チオグアニン）およびピリミジン類似体〔カペシタビン、シタラビンまたはアラ-C（ara-C）で、デシタビン、フルオロウラシル、5 -フルオロウラシル、ドキシフルリジン、フロクスウリジンおよびゲムシタビン〕が含まれる。好適例において、代謝拮抗物質は、5-フルオロウラシル、ゲムシタビン、より一層好適にはゲムシタビンから選ばれる。対象体が結腸ガンを患うとき、最も重要な（第一線の）化学療法の処置は、代謝拮抗物質、好適には5-フルオロウラシルである。対象体が、膵臓ガン、膀胱ガンまたは胆嚢ガンを患うとき、最も重要な化学療法の処置は、代謝拮抗物質、好適にはゲムシタビンである。

好適な実施形態において、抗体は、抗血管形成活性を有する特異的な抗S100A4抗体またはほぼ前記抗体の抗血管形成活性を保つその断片であり、抗体は次のものからなる群から選ばれる。
（i）S100A4のエピトープを認識するシーケンスELPSFLGKRT（配列番号3）を含む抗体、
（ii）S100A4のエピトープを認識するシーケンスEGFPDKQPRKK（配列番号24）を含む抗体および
（iii）ハイブリドーマECACC 11051804によって生成される抗体。

好適な実施形態において、この態様に係る抗体は、モノクローナル抗体であり、好適には、グループECACC 10022401、ECACC 11051801、ECACC11051802、ECACC 11051803およびECACC 11051804から選ばれた、より一層好適には、ECACC 10022401のハイブリドーマによって生産されるモノクローナル抗体またはその断片である。

本発明者らは、抗S100A4抗体および代謝拮抗物質の組合せが、腫瘍細胞の生存能力を減らすことが可能であることを実証した。
したがって、好適な実施形態では、組成物は腫瘍細胞の生存能力を減らすことができる。

「腫瘍細胞の生存能力を減らすこと」は、細胞が生き残り、増殖し、および増加する能力の少なくとも30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80 ％、85％、90％、95％、99％、100％、好適には少なくとも60％、さらにより一層好適には少なくとも65％、最も好適には少なくとも70％による減少として理解される。生存能力の前記減少は本発明の例15に記載のアッセイを使って評価することができる。

「腫瘍細胞」は、悪性細胞として理解され、また増殖し、周囲の組織に浸潤し、時には転移を引き起こし、正常範囲を超えて分割するガン性または発ガン性細胞として知られている。本発明の抗体を用いて処置することができる腫瘍細胞は、S100A4タンパク質を過剰発現する細胞である。前記細胞は、既知の、確立された細胞株およびガンを患う受動体の生物体内に存在する腫瘍細胞からの腫瘍細胞が含まれる。S100A4を過剰発現する腫瘍系のいくつかの実例の非制限的な例は、Colo205結腸腺ガンの腫瘍系、MiaPACA-2ヒト膵臓腺ガン細胞株、Panc1ヒト膵臓ガン細胞株、HCT116結腸腺ガン細胞株、MDA-MB-231乳腺腺ガン細胞株の培養から由来するガン幹細胞である。腫瘍細胞の実例の非制限的な例は、ガンを患う受動体に存在し、そしてS100A4を過剰発現するが、中でも、乳ガン〔Rudland PSら、Cancer Res.、2000年、60(6)：1595-1603〕、前立腺ガン〔Saleem Mら、PNAS、2006年、103(40)：14825-30〕、肺ガン〔Tsuna Mら、Anticancer Res、2009年29(7)：2547-54〕、結腸直腸ガン〔Cho Yら、World J Gastroent、2005年、11(31)：4852-6〕、膵臓ガン〔Rosty Cら、Am J Pathol、2002年、160(1)：45-50〕、腎ガン〔Bandiera Aら、World J Surg 2009年、33(7)：1414-20〕、胃ガン〔Yonemura Yら、Clin Cancer Res、2000年、6(11)：4234-42〕、卵巣ガン〔Maelandsmo GMら、Tumor Biol、2009年、30(1)：15-25〕、甲状腺乳頭ガン〔Min HSら、Mod Pathol、2008年、21(6): 748-55〕、メラノーマ〔Andersen Kら、Mod Pathol、2004年、17(8)：990-997〕、肝細胞ガン〔Cui Jら、J Can Res Clin Oncol 2004年、130(10)：615-22〕、膀胱ガン〔Agerbaek Mら、Eur Urol、2006年50(4)：777から785〕、脂肪肉腫浸潤ガン〔Pazzaglia Lら、Anticancer Res、2004年、24(2B)：967-972〕、神経芽細胞腫〔Bjornland Kら、J Pediatr Surg、2001年、36(7)：1040-44〕、食道扁平上皮ガン〔Ninomiyaら、Int J Oncol、2001年、18(4)：715-20〕、骨肉腫〔Mathisen Bら、Clin Exp Metastasis、2003年、20(8)：701-11〕、胆嚢癌〔Nakamuraら、Int J Oncol、2002年、20(5)：937-41〕、口腔扁平上皮癌〔Moriyama-Kita Mら、Oral Oncol、2004年、40(5)：496-500〕、子宮内膜癌〔Xie Rら、Lab Invest、2009年、89(8)：937-947〕、および髄芽（細胞）腫〔Hernan Rら、Cancer Res、2003年、63(1)：140-148〕である。

S100A4タンパク質を発現する腫瘍細胞は、本発明に記載の方法に従って、たとえばELISAまたはウエスタンブロット法などのような慣習的な方法を使って識別することができる。

1実施形態では、腫瘍細胞は、本発明の前記態様の抗体を使ってその生存能力が減らされ、膵臓ガンから、または結腸ガンから、好適には、膵臓ガンからの腫瘍細胞である。

別の態様において、本発明は特異的な抗S100A4抗体および代謝物を含むガンまたは転移の防止および/または処置のための薬の調製用の製薬上組成物に関する。

別の態様において、本発明は特異的な抗S100A4抗体および代謝物を含むガンまたは転移の防止および/または処置のための薬の調製用の製薬上組成物の使用に関する。

別の態様において、本発明は、対象体におけるガンまたは転移の処置または防止の方法に関し、特異的な抗S100A4抗体および代謝物を含む製薬上組成物の前記対象体への投与を含む。

用語「防止」、「処置」、「ガン」および「転移」は、本発明の抗体の治療上使用との関連で規定される。

前の態様のすべての特定の実施形態は前記態様にも適用可能である。

本発明の抗体の治療上の使用

血管形成およびガン

さらに、本発明は、薬として使用するための、ここに提示する実施形態のいずれか1つに従う抗体またはその断片またはモノクローナル抗体を提供する。

また、本発明は、腫瘍を処置するための薬として使用するために、ここで提示する実施形態のいずれか1つに従う抗体またはその断片またはモノクローナル抗体を提供する。

また、本発明は、腫瘍の処置のための薬の製造のために、ここで提示する実施形態のいずれか1つに従う抗体またはその断片またはモノクローナル抗体の使用を提供する。

また、本発明は、前記処置を必要とする対象体、ここで提示する実施形態のいずれか1つに従う抗体またはその断片またはモノクローナル抗体の薬学的有効量を投与することを含む、腫瘍を処置するための方法を提供する。

S100A4タンパク質に特異的に結合することが可能な抗S100A4抗体は、前記タンパク質が過剰発現するそれらの疾患での適用（アプリケーション）を有する。

具体的には、S100A4タンパク質は多種多様なガンで上述したように発現される。

結果として、S100A4タンパク質リガンド、およびより一層具体的には、このタンパク質に対して特異的な抗体は、前記疾患の処置のために治療において使用する候補薬物である。

したがって、1態様では、本発明は、転移および望ましくない血管形成に関連する疾患から選ばれる疾患の防止および/または処置における使用のための、本発明の第1の態様に従う抗体またはその断片にも関する。

別の態様において、本発明は、転移および望ましくない血管形成に関連する疾患から選択される疾患の防止および/または処置のための薬の調製のための、本発明の第1の態様に従う抗体またはその断片の使用に関する。

別の態様において、本発明は、対象体における転移および望ましくない血管形成に関連する疾患から選択される疾患の処置または防止の方法に関し、それは本発明の第1の態様に従う抗体またはその断片の前記対象体への投与を含む。

用語「抗体」および「断片（フラグメント）」は本発明の第1の態様との関連で前に規定する。

「防止（予防）」は、本発明の第1の態様に従う抗体またはその断片、または疾患の初期または早期に、またはさらにその発症を防ぐためにそれを含む薬の投与として理解される。

用語「処置（治療）」は、本発明の第1の態様に従う抗体またはその断片、または臨床症状が出現する前または後に、それが疾患の進行を調節（コントロール）するために含まれる薬を投与することを指定するために用いる。病気の進行の調節は、制限されないが、症状の軽減、罹病期間の短縮、病態の安定化（具体的には、追加的な障害を回避すること）、疾患の進行を遅らせること、病態および寛解を改善すること（部分的および完全の双方）が含まれる有益な、または望ましい臨床結果として理解される。疾患の進行の調節はまた、処置が適用されなかった場合、期待生存率と比較して生存期間の延長を伴う。

「薬（メディカメント）」は、本発明の第1の態様に従う抗体またはその断片を含む製薬上の組成物として理解される。

用語「転移」は、基本的には、リンパまたは血流、ガンを起こす（発ガン性）細胞のもの、および前記転移の目的部位における新しい腫瘍の増殖によって、離れた伝搬として理解される。

本発明との関連において、「血管形成」は、既存の血管からの新しい血管の形成からなる生理的過程を意味すると理解される。血管形成はまた、新血管形成として知られている。

表現「望ましくない血管形成に関連する疾患」は、病原性血管形成が発生する、すなわち、前記プロセスがガンによるものか否かに関わらず、有害であるか、または望ましくないものであるとき、すべてのこれらの疾患に関連する。それゆえ、本発明の範囲には、創傷治癒などのように必要になった状況での血管形成の処置が除かれる。本発明に従って化合物により処置することができる望ましくない血管形成に関連する疾患には、制限を受けることなく、炎症性疾患、特に慢性炎症性疾患で、関節リウマチ、乾癬、サルコイドーシスなどなどのようなもの、自己免疫疾患、ウイルス性疾患、遺伝的疾患、アレルギー性疾患、細菌性疾患、眼科疾患で、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、増殖性心房性網膜症（proliferative atrial retinopathy）、網膜静脈閉塞（retinal vein oclusion、retinal vein occlusion）、黄斑変性（症）、老人性円板状黄斑変性（症）、血管形成眼緑内障（neovascular ocular glaucoma）、脈絡膜血管新生疾患、網膜血管新生疾患、ルベオーシス〔角血管新生（angle neovascularization）〕、角膜移植拒絶反応、水晶体後線維増殖（症）、表皮角結膜炎、ビタミンA欠乏症、コンタクトレンズ疲弊（contact lens exhaustion）、アトピー性角膜炎（atopical keratitis）、上方辺縁系角膜炎（superior limbic keratitis）、翼状片ドライアイ（pterygium dry eye）、Sjogrens（シェーグレン）症候群、酒さ性挫創ざそう（acne rosacea）、フリクテヌロシス（phlyctenulosis）、梅毒、マイコバクテリア（micobacterial）感染（症）、脂質変性、腐食性物質による火傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、原虫感染（症）、カポジ肉腫、モーレン潰瘍（Mooren's ulcer）、テリエンマージナル変性（Terrien marginal degeneration）、マージナル（辺縁）表皮剥奪（角質溶解）、強（鞏）膜炎、慢性網膜剥離などなどのようなもの、アテローム性動脈硬化（症）、子宮内膜症、肥満、心不全、進行した腎不全、内毒素血症、毒素性ショック症候群、髄膜炎
、ケイ素誘導線維症、アスベスト誘導線維症、卒中、歯周炎、歯肉炎、大球性貧血、不応性貧血、5q欠失症候群（5q deletion syndrome）、血管形成が、HIV、肝炎、出血性毛細血管拡張症またはランデュ-オスラー-ウェーバー病（Rendu-Osler-Weber’s disease）による感染のように変更される状態である。

好適な実施形態では、望ましくない血管形成に関連する疾患は、ガン、関節リウマチ、乾癬、サルコイドーシス、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、網膜静脈閉塞（oclusion）、老人性円板状黄斑変性、アテローム性動脈硬化症、子宮内膜症および肥満、好適にはガンから選ばれる疾患である。

特定の実施形態では、望ましくない血管形成に関連する疾患は炎症性疾患である。「炎症性疾患」は、炎症症状につながる過度のまたは異常な炎症反応がある場合での任意の疾患であると理解される。本発明の化合物によって処置することができる前記炎症性疾患には、制限を伴わず、アジソン病、尋常性ざそう、円形脱毛（症）、アミロイド症（類でんぷん症）、強直性脊椎炎、潰瘍形成、アフタ性口内炎、関節炎、動脈硬化（症）、変形性関節症、関節リウマチ、気管支喘息、ベーチェット病（Bechet’s disease、Behcet's disease）、ベック病、腸の炎症性疾患、クローン病、脈絡膜炎、潰瘍性大腸炎、セリアック病（celiac’s disease）、クリオグロブリン血（症）、黄斑変性（症）、皮膚炎、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、インスリン依存性糖尿病、若年性糖尿病、炎症性脱髄性疾患、デュピュイトラン拘縮、脳脊髄炎、アレルギー性脳脊髄炎、眼内炎（endophthalmia）、アレルギー性腸炎、自己免疫性腸疾患症候群、らい性（癩性）結節性紅斑（erythema nodosum leprosum、結節性紅斑ライ病）、強直性脊椎炎、特発性顔面神経麻痺、慢性疲労症候群、リウマチ熱、嚢胞性線維症、歯肉炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス症候群、橋本病、慢性肝炎、組織球（増殖）症、限局性回腸炎、虹彩炎、播種性紅斑性狼瘡（erythematous、erythematosus）、全身性紅斑性狼瘡（erythematous）、皮膚エリテマトーデス（cutaneous lupus erythematous）、リンパ肉芽腫、伝染性単核球症、重症（性）筋無力症（miastenia gravis、myasthenia gravis）、横断性脊髄炎、一次特発性粘液水腫、ネフローゼ、肥満、交感性眼炎、肉芽腫性睾丸炎、膵炎、脂肪織炎、尋常性天疱瘡、歯周炎、結節性多発性動脈炎、慢性多発性関節炎、多発（性）筋炎、急性多発性神経根炎、乾癬、慢性閉塞性肺疾患、紫斑病、壊疽性膿皮症（pioderma、pyoderma）、ライター症候群、糖尿病性網膜症、酒さ、サルコイドーシス（類肉腫症）、失調性硬化症、進行性全身性硬化症、強膜炎、硬（鞏）皮症（sclerodermia、scleroderma）、多発（性）硬化（症）（multiple sclerosis）、散在性硬化症（disseminated sclerosis）、急性前部ブドウ膜炎、白斑、ウィップル病、AIDS（エイズ）、重症複合免疫不全およびシェーグレン症候群、骨関節結核のようなエプスタイン・バー・ウイルスに関連する疾患およびリーシュマニア症などのような寄生虫疾患が含まれる。好適な炎症性疾患については、関節リウマチ、乾癬、サルコイドーシス、糖尿病性網膜症、黄斑変性、動脈硬化（症）および肥満である。

別の好適な実施形態において、疾患はガンである。

用語「ガン」および「腫瘍」は、無秩序な細胞増殖によって特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態に関する。本発明の第1の態様のS100A4タンパク質に特異的に結合する抗体またはその断片は、任意のガン（癌）または腫瘍の処置のために有用であり、たとえば、制限を伴わないが、胸部（乳房）、心臓、肺、小腸、大腸（結腸）、脾臓、腎臓、膀胱、頭部、頸部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣および肝臓の腫瘍のようなものである。特に、前記抗体で処置することができる腫瘍には、制限されないが、腺腫（アデノーマ）、血管肉腫、星状細胞腫、上皮癌、胚細胞腫、神経膠芽腫、神経膠腫、血管内皮腫、ヘムアンジオサルコーマ（血管肉腫）、血腫、肝芽腫、白血病、リンパ腫、髄芽腫、黒色腫、神経芽（細胞）腫、骨肉腫、網膜芽腫、横紋筋肉腫、肉腫および奇形腫が含まれる。特に、腫瘍/癌は、末端黒子型（末端性黒子性）黒色腫、光線（性）角化症（日光角化症）腺癌、腺様嚢胞癌、腺腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、アストロサイト腫瘍（星細胞腫）、バルトリン腺癌（Bartholin gland carcinoma、Bartholin’s gland carcinoma）、基底細胞癌、気管支腺癌（bronchial gland carcinoma）、毛管類癌腫（capillary carcinoid）、癌腫、癌肉腫、胆管癌、嚢胞腺腫、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮内膜間質肉腫、類内膜腺癌、上衣肉腫（ependymal sarcoma）、スイングの肉腫（Swing’s sarcoma）、限局性結節性過形成、生殖細胞腫瘍（germ-line tumors）、（神経）膠芽（細胞）腫、グルカゴノーマ（グルカゴン産生腫瘍）、血管芽細胞腫（hemagioblastoma、hemangioblastoma）、血管内皮腫、血管腫、肝細胞腺腫、肝腺種症（hepatic adenomatosis）、肝細胞癌、インスリノーマ、上皮内腫瘍（上皮内新生物）、上皮内扁平上皮新生物（interepithelial squamous cell neoplasia、intraepithelial squamous cell neoplasia）、浸潤性扁平上皮癌、大細胞癌、平滑筋肉腫、黒色腫、悪性黒色腫、悪性中皮腫、髄芽（細胞）腫、髄様上皮
腫、粘表皮癌（粘液性類表皮癌）、神経芽（細胞）腫、神経上皮腺癌（neuroepithelial adenocarcinoma）、結節型黒色腫（結節性メラノーマ）、骨肉腫、乳頭状漿液性腺癌（papillary serous adenocarcinoma）、下垂体（部）腫瘍、形質細胞腫、偽肉腫、肺芽腫、腎細胞癌、網膜芽（細胞）腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液性癌（serous carcinoma）、小細胞癌、軟部組織癌（soft tissue carcinoma）、ソマトスタチン産生腫瘍、扁平上皮癌、有棘細胞癌（扁平上皮癌、squamous cell carcinoma）、未分化癌、ぶどう膜（脈絡膜悪性）黒色腫、疣（いぼ）状癌、ビポーマ（VIP産生腫瘍）、ウィルムス腫（瘍）の群から選択される。本発明の1実施形態では、腫瘍は、以下の乳癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌（大腸癌）、膵臓癌、腎癌、胃癌、卵巣癌、甲状腺乳頭癌、黒色腫、肝細胞癌、膀胱癌、脂肪肉腫浸潤癌（liposarcoma invasive carcinoma）、神経芽（細胞）腫、食道扁平上皮癌（esophageal squamous carcinoma）、骨肉腫、胆嚢癌、口腔扁平上皮癌（oral squamous carcinoma）、子宮内膜癌、髄芽（細胞）腫からなる群から選択される。別の実施形態では、腫瘍は結腸直腸癌（大腸癌）、膵臓癌、および任意の他のS100A4媒介腫瘍から選択される。

本発明の好ましい実施形態では、前記抗体により防止または治療すべき腫瘍/癌は、膵臓癌および結腸直腸癌（大腸癌）から選択され、好ましくは、膵臓癌である。

用語「膵臓癌」は、腺癌およびその若干の変形物を含め、膵臓の任意の悪性新生物として理解される。

用語「結腸直腸癌（大腸癌）」は、結腸、直腸または虫垂において腫瘍によって特徴付けられる癌として理解される。大腸がんは、肛門に影響を与える肛門癌とは臨床的には区別される。

本発明の一実施形態では、薬剤は唯一の治療上の薬剤として本発明の第一の態様に従う1またはそれよりも多く（1または複数）の抗体を含む。しかしながら、本発明の薬はまた、癌の処置（治療）のために1またはいくつかの追加の化合物を含むことができる。したがって、本発明の別の実施形態では、薬は、本発明に従う抗体および前記疾患の処置において有用な1または複数の治療上の薬剤の併用投与のために調製される。

用語「前記疾患の処置において有用な治療上の薬剤」は、癌の処置（治療）において用いるために適した薬剤に言及する。

癌の処置のために、本発明の抗体は、追加の治療上活性な化合物、たとえば、細胞毒性（細胞傷害性）薬剤、抗血管形成薬剤または抗転移薬剤などのようなものとの組合せで用いることができる。

癌の治療のために、本発明の抗体と組み合わせて使用することができる細胞傷害性薬剤としては、制限されないが、たとえば、ドキソルビシンおよびダウノルビシンなどのようなアントラサイクリン系抗生物質、Taxol^TM〔タキソール（商品名）〕およびドセタキセルなどのようなタキサン、たとえば、ビンクリスチンおよびビンブラスチンなどのようなビンカアルカロイド、5-フルオロウラシル（5-FU）、ロイコボリン、イリノテカン、イダルビシン、マイトマイシンC、オキサリプラチン、ラルチトレキセド、タモキシフェン、シスプラチン、カルボプラチン、メトトレキサート、アクチノマイシンD、ミトキサントロン、ブレノキサン（blenoxane）またはミトラマイシンが含まれる。癌の治療のために、本発明の抗体と組み合わせて用いることができる抗血管形成剤（抗アンギオゲニン）には、制限されないが、パクリタキセル、2-メトキシエストラジオール、プリノマスタット、バチマスタット、BAY 12-9566、カルボキシアミドトリアゾール（carboxyamidotriazole）、CC-1088、デキストロメトルファン酢酸、ジメチルキサンテノン（dimethylxanthenone）酢酸、エンドスタチン、IM-862、マリマスタット、ペニシラミン、PTK787/ZK 222584、RPI.4610、スクアラミンラクタート、SU5416、サリドマイド、コンブレタスタチン、タモキシフェン、COL-3、ネオバスタット（neovastat）、BMS-275291、SU6668、抗VEGF抗体、Medi-522〔Vitaxin（ビタキシン）II〕、CAI、インターロイキン12、IM862、アミロライド、アンギ（アンジ）オスタチン、Kl-3アンギオスタチン、Kl-5アンギオスタチン、カプトプリル、DL-アルファ-ジフルオロメチルオルニチン、DL-アルファ-ジフルオロメチルオルニチンHCl、エンドスタチン、フマギリン、ハービマイシンA、4-ヒドロキシフェニルレチンアミド、ユグロン（ジュグロン）、ラミニン、ラミニンヘキサペプチド、ラミニンペンタペプチド、ラベンダスチンA、メドロキシプロゲステロン、ミノサイクリン、胎盤（プラセンタ）リボヌクレアーゼインヒビター（抑制剤）、スラミン、トロンボスポンジン、血管新生促進因子に対する抗体（たとえば、アバスチン、アービタックス、ベクチビックス、ハーセプチン）；血管新生促進性増殖因子の低分子量チロシンキナーゼインヒビター（たとえば、タルセバ、ネクサバール、スーテント、イレッサ）；mTORインヒビター〔たとえば、Torisel（トーリセル）〕；インターフェロンアルファ、ベータおよびガンマ、IL-12、マトリックスメタロプロテイナーゼインヒビター（たとえば、COL3、マリマスタット、バチマスタット）；ZD6474、SUl1248、ビタキシン（vitaxin）；PDGFRインヒビター（たとえば、グリベック）；NM3および2-ME2；シレンギチド（シレンジタイド）（cilengitide）のようなシクロペプチドの群から選ばれる抗血管形成薬剤が含まれる。癌の治療用に、本発明の抗体と組み合わせて用いることができる抗転移薬剤には、制限されないが、抗転移剤として作用することが可能な任意の薬剤が含まれ、たとえば、アルキル化剤のようなもの；たとえば、5-フルオロウラシル、ペメトレキセド（MTA）、ラルチトレキセド（TDX）などのような代謝拮抗物質；たとえば、シスプラチンまたはオキサリプラチンなどのような白金細胞毒性薬（platinum cytotoxic agents）；トポイソメラーゼインヒビター、抗微小管剤（微小管阻害剤）、アントラサイクリン、植物性アルカロイド、GTPアーゼインヒビター；血管形成インヒビター；マトリックスメタロプロテイナーゼインヒビター；細胞周期調節キナーゼのインヒビターで、たとえば、サイクリン依存性キナーゼおよびサイクリンインヒビターなどのようなもの；Wntシグナル伝達インヒビター；E2F転写因子のインヒビター；ヒストンデアセチラーゼ（ヒストン脱アセチル化酵素）インヒビター；AKTキナーゼまたはATPアーゼインヒビターである。

「併用投与」は、本発明に従う抗体が、任意の順序において、一緒に、または別々に、同時に、癌の治療に有用な治療剤と同時に、または連続して投与することが可能であるものとして理解される。たとえば、本発明の抗体の投与は、まず行って、次いで前記病変の治療に有用な1以上の治療薬の投与が続くことができ、または本発明の抗体の投与は、最後に行って、前記病変の治療に有用な1以上の治療薬の投与を先行させることができ、または本発明の抗体の投与は、前記病変の治療に有用な1以上の治療薬の投与と同時に行うことができる。

当業者は、本発明との関連で、本発明に係る抗体および癌の治療に有用な追加の治療剤の併用投与のための薬を、単一の剤形としてまたは別々の剤形において調製することができることを理解するであろう。

好ましい態様において、抗血管形成活性を有する特異的な抗S100A4抗体は、モノクローナル抗体であり、好ましくは、グループECACC 10022401、ECACC 11051801、ECACC 11051802、ECACC 11051803およびECACC 11051804から選択されたハイブリドーマによって産生された抗体、より一層好ましくはハイブリドーマECACC 10022401によって産生される。

別の態様において、本発明は、グループECACC 10022401、ECACC 11051801、ECACC 11051802、ECACC 11051803およびECACC 11051804から選択ハイブリドーマによって産生される特異的な抗S100A4抗体またはその断片またはそれらの断片の、医薬におけるその使用についてに関連する。

また、本発明は、ここで提示する実施形態のいずれかに従う抗体またはその断片またはモノクローナル抗体を、S100A4媒介疾患の治療用の薬として使用するために提供する。

本発明はまた、ここで提示する実施形態のいずれかに従う抗体またはその断片またはモノクローナル抗体の使用を、S100A4媒介疾患の治療用の薬の製造のために提供する。

また、本発明は、S100A4媒介疾患を治療するための方法を提供し、それはここで提示する実施形態のいずれかに従う抗体またはその断片またはモノクローナル抗体の薬学的有効量を、前記治療を必要とする対象体に投与することを含む。

炎症

本発明者らは、特定の抗S100A4抗体が炎症と関係する疾患の防止および/または治療に有用であることを見出した。したがって、本発明の一態様は、S100A4タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原に結合する能力を有するその断片の、炎症と関係する疾患の防止および/または治療用の薬の製造のために使用することに関する。

別の態様において、本発明は、S100A4タンパク質に特異的に結合する抗体または抗原に結合する能力を有するその断片の、炎症と関係する疾患の防止および/または治療おける使用に関する。

別の態様において、本発明は、炎症と関係する疾患の対象体における治療または防止（予防）の方法に関し、それには、S100A4タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原への結合のための能力を有するその断片の前記対象体への投与を含む。

表現「S100A4タンパク質に特異的に結合する抗体」は、本発明のこの態様との関連で、S100A4タンパク質を特異的に認識し、そしてS100ファミリーの他のタンパク質は認識しない任意の抗体に言及する。前記表現には、先行技術において予め開示される抗体が含まれる。

用語「フラグメント（断片）」は、抗原に結合するための能力を有する抗体の断片を指す。前記断片は抗血管形成活性を有することは必要ではない。

表現「炎症と関係する疾患」は、病因となる炎症が起こるところのこれらすべての疾患、すなわち、前記プロセスが有害または望ましくないものであるとき、癌か否かに関わらずに関連する。炎症と関係する疾患には、炎症症状につながる過度のまたは変容した炎症反応がある炎症性疾患が含まれる。本発明の抗体によって治療することができる前記炎症性疾患には、制限を伴わず、アジソン病、尋常性ざそう（ざ瘡）、円形脱毛（症）、アミロイド症（類でんぷん症）、強直性脊椎炎、潰瘍（形成）、アフタ性口内炎、関節炎、動脈硬化（症）、変形性関節症、関節リウマチ、気管支喘息（ぜんそく）、ベーチェット病（Bechet’s disease、Behcet's disease）、ベック病、腸の炎症性疾患、クローン病、脈絡膜炎、潰瘍性大腸炎、セリアック病（celiac’s disease）、クリオグロブリン血（症）、黄斑変性（症）、皮膚炎、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、インスリン依存（性）糖尿病、若年性（若年型）糖尿病、炎症性脱髄（性）疾患、デュピュイトラン拘縮、脳脊髄炎、アレルギー性脳脊髄炎、眼内炎（endophthalmia）、アレルギー性腸炎、自己免疫性腸疾患症候群（autoimmune enteropathy syndrome）、らい性（癩性）結節性紅斑（erythema nodosum leprosum、結節性紅斑ライ病）、強直性脊椎炎、特発性顔面神経麻痺、慢性疲労症候群、リウマチ熱、嚢胞性線維症、歯肉炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス症候群、橋本病、慢性肝炎、組織球（増殖）症、限局性回腸炎、虹彩炎、播種性紅斑性狼瘡（erythematous、erythematosus）、全身性紅斑性狼瘡（erythematous）、皮膚エリテマトーデス（cutaneous lupus erythematous）、リンパ肉芽腫、伝染性単核球症、重症（性）筋無力症（miastenia gravis、myasthenia gravis）、横断性脊髄炎、一次特発性粘液水腫、ネフローゼ、肥満、交感性眼炎、肉芽腫性睾丸炎、膵炎、脂肪織炎、尋常性天疱瘡、歯周炎、結節性多発性動脈炎、慢性多発性関節炎、多発（性）筋炎、急性多発性神経根炎、乾癬、慢性閉塞性肺疾患、紫斑病、壊疽性膿皮症（pioderma、pyoderma）、ライター症候群、糖尿病性網膜症、酒さ、サルコイドーシス（類肉腫症）、失調性硬化症、進行性全身性硬化症、強膜炎、硬（鞏）皮症（sclerodermia、scleroderma）、多発（性）硬化（症）（multiple sclerosis）、散在性硬化症（disseminated sclerosis）、急性前部ブドウ膜炎、白斑、ウィップル病、AIDS（エイズ）、重症複合免疫不全およびシェーグレン症候群、骨関節結核のようなエプスタイン・バー・ウイルスと関係する疾患およびリーシュマニア症などのような寄生虫疾患が含まれる。好適な炎症性疾患については、関節リウマチ、動脈硬化（症）、乾癬、炎症性腸疾患および移植片対宿主病である。

用語「薬」、「防止」および「処置（治療）」は、本発明の抗体の治療上の使用との関連で規定される。

好ましい実施形態では、S100A4タンパク質に特異的に結合する抗体またはその断片は、抗血管形成活性を有する抗S100A4抗体または抗血管形成活性を実質保持するその断片であって抗体は次の、
（i）シーケンスELPSFLGKRT（配列番号3）を含むS100A4のエピトープを認識する抗体、
（ii）シーケンスEGFPDKQPRKK（配列番号24）を含むS100A4のエピトープを認識する抗体および
（iii）ハイブリドーマECACC 11051804によって生成される抗体
からなる群から選択される。

より好ましい実施形態において、抗体は、グループECACC 10022401、ECACC 11051801、ECACC 11051802、ECACC 11051803およびECACC 11051804から選択されるハイブリドーマによって産生され、より好ましくは、ハイブリドーマはECACC 10022401である。

本発明の抗体のコンジュゲート（接合体）およびそれらの使用

本発明の第一の態様の抗体はS100A4タンパク質に結合する能力があり、そしてこのタンパク質は癌で過剰発現されていることを考えると、本発明の第一の態様に従う抗血管形成活性を有する特異的な抗S100A4抗体またはその断片は、S100A4の発現部位に向かう治療上の活性を有する化合物を運ぶのに適した薬剤を構成する。

S100A4タンパク質は、多種多様の癌において、上記に詳述するように発現される。前記タンパク質はまた、関節リウマチなどのような炎症と関係する疾患において発現する。

したがって、別の態様において、本発明は、本発明の第一の態様に従う抗体またはその断片、および次の群から選択される第二の成分を含む複合体に関する。すなわち、
a）抗血管形成薬（血管新生阻害剤）、
b）抗転移剤、
c）細胞毒性剤（細胞傷害性薬剤）
d）抗炎症剤
である。

好ましい実施形態において、第二成分は、a）血管新生阻害剤、b）抗転移剤、およびc）細胞傷害性薬剤の群から選択される。

本発明との関連で「コンジュゲート（接合体）」は、本発明の第一の態様に従う抗体によって形成された組立体が、少なくとも一つの第二成分に結合され、連結（リンク）され、または関連すると理解される。

本発明の第一の態様によれば、抗体またはその断片は、前記第一の態様との関連で記載される。

「第二成分」は、本発明のモノクローナル抗体によってその作用部位に指向する治療上の活性を有する分子として理解される。

S100A4タンパク質は腫瘍細胞において過剰発現する。したがって、本発明の抗体は発現部位に対して抗腫瘍薬物を方向付けるために使用することができる。

本発明で使用されるように、用語「細胞傷害性薬剤」は、細胞死を促進することができ、およびその増殖を減少させ、増殖の停止または細胞を破壊するための能力を有する薬剤に関し、特に、急速に増殖する細胞およびさらにより一層具体的には、腫瘍細胞である。細胞死は、たとえば、アポトーシスなどのような何らかのメカニズムによって発生する可能性があり、それが、この原因に限定されるものではないが、代謝阻害、細胞骨格の組織やDNAの化学修飾との干渉によることがある。用語としての細胞傷害性薬剤には、有機小分子、ペプチド、オリゴヌクレオチドなどを含む任意の化学療法薬剤、毒素、酵素、サイトカイン、放射性同位元素または放射線療法用の薬剤が含まれる。

「化学療法薬剤」は、たとえば、制限するものではないが、アントラサイクリン系抗生物質であってドキソルビシンおよびダウノルビシンのようなもの、タキサンでタキソールおよびドセタキセルのようなもの、ビンカアルカロイドでビンクリスチンおよびビンブラスチンのようなもの、5-フルオロウラシル（5-FU）、ロイコボリン、イリノテカン、イダルビシン、マイトマイシンC、オキサリプラチン、ラルチトレキセド、タモキシフェン、シスプラチン、カルボプラチン、メトトレキサート、アクチノマイシンD、ミトキサントロン、ブレノキサン（blenoxane）またはミトラマイシン、代謝拮抗物質でゲムシタビンのようなものなどの化学的化合物として理解される。

「毒素」は、本発明の抗体とコンジュゲートし（接合、複合体化し）、免疫毒素（抗毒素）を形成するする毒性薬剤として理解される。決定された毒素の抗体を用いてのコンジュゲートは、そうでなければ、それらはあまりにも毒性があることになるため、治療薬としてのそれらの使用を有効にし、前者の毒性を軽減する。毒素と抗体の間の結合は、化学的に実行され、その生物学的活性が保存される。それらの分離は、大抵は、記述した化学結合がリソソームにより提供される封入された酸性の細胞環境において単に壊れるように、その抗体によって認識される標的細胞のリソソームにおいて起こる。本発明との関連で有用な毒素は、植物毒素、細菌毒素、真菌または動物起源の毒素およびその断片であり、たとえば、これらに限定されないが、リシンA鎖、サポニン、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の活性な非結合断片、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa、緑膿菌）外毒素A鎖、アブリンA鎖、モデシン（modecin）A鎖、α-サルシン（sarcin）、レウリテス・ホルディ（Leurites fordii、Aleurites fordii、シナアブラギリ）Aタンパク質、ジアンチン（dianthin）タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ（Phytolaca americana、Phytolacca americana、アメリカヤマゴボウ）（PAPI、PAPIIおよびPAP-S）タンパク質、モモルジカ・カランチア（Momordica charantia、ニガウリ、ゴーヤー）インヒビター、クルシン（curcine）、コルチン（crotin）、サポナリア・オフィシナリス（Saponaria officinalis、サボンソウ）インヒビター、ゲロニン、（ミトゲリン（mitogelin）、レストリクトシン（restrictocin）、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）およびトリコテシン（トリコテセン）のようなものである。

「酵素」は、毒素または薬物活性化酵素、たとえば、制限されないが、エトポシドおよびドキソルビシンを活性化するアルカリホスファターゼ、ナイトロジェンマスタードを活性化するカルボキシペプチダーゼG2、ドキソルビシン、パクリタキセルおよびマイトマイシンを活性化するベータ-ラクタマーゼとして本発明での関連において理解される。

「サイトカイン」は、免疫応答を調整するために、免疫系の細胞を総合（合成）する異なるサイズおよび分子量のペプチドとして理解され、そしてそれらはホルモン、増殖（成長）因子、壊死因子などでありうる。それらは、自然起源のものであり得、または組換え細胞培養物および自然な配列サイトカインの生物学的に活性な等価物からでもよい。抗体とのコンジュゲートは免疫サイトカインを生じさせる。本発明において有用なサイトカインは、制限されないが、TNF因子α、IFN-γ、GM-GSF因子またはIL-2である。

「放射性同位体」は、放射能のある同位元素、たとえば、制限されないが、¹³¹I、⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁸Re、⁶⁷Cu、²¹¹At、²¹³Bi、¹²⁵I、¹¹¹Inのようなものとして理解される。

「抗血管形成剤」は、新しい血管の形成、すなわち、血管新生を抑制または減少させる化学的または生物学的物質として理解される。本発明の第一の態様の抗体とコンジュゲートさせることができる抗血管形成剤の例としては、制限されないが、パクリタキセル、2-メトキシエストラジオール、プリノマスタット、バチマスタット、BAY 12-9566、カルボキシアミドトリアゾール（carboxyamidotriazole）、CC-1088、デキストロメトルファン酢酸、ジメチルキサンテノン（dimethylxanthenone）酢酸、エンドスタチン、IM-862、マリマスタット、ペニシラミン、PTK787/ZK 222584、RPI.4610、スクアラミンラクタート、SU5416、サリドマイド、コンブレタスタチン、タモキシフェン、COL-3、ネオバスタット（neovastat）、BMS-275291、SU6668、抗VEGF抗体、Medi-522〔Vitaxin（ビタキシン）II〕、CAI、インターロイキン12、IM862、アミロライド、アンギ（アンジ）オスタチン、Kl-3アンギオスタチン、Kl-5アンギオスタチン、カプトプリル、DL-アルファ-ジフルオロメチルオルニチン、DL-アルファ-ジフルオロメチルオルニチンHCl、エンドスタチン、フマギリン、ハービマイシンA、4-ヒドロキシフェニルレチンアミド、ユグロン、ラミニン、ラミニンヘキサペプチド、ラミニンペンタペプチド、ラベンダスチンA、メドロキシプロゲステロン、ミノサイクリン、胎盤リボヌクレアーゼインヒビター、スラミン、トロンボスポンジン、血管新生促進因子に対する抗体（たとえば、アバスチン、アービタックス、ベクチビックス、ハーセプチン）；血管新生促進性増殖因子の低分子量チロシンキナーゼインヒビター（たとえば、タルセバ、ネクサバール、スーテント、イレッサ）；mTORインヒビター〔たとえば、Torisel（トーリセル）〕；インターフェロンアルファ、ベータおよびガンマ、IL-12、マトリックスメタロプロテイナーゼインヒビター（たとえば、COL3、マリマスタット、バチマスタット）；ZD6474、SUl1248、ビタキシン（vitaxin）；PDGFRインヒビター（たとえば、グリベック）；NM3および2-ME2；シレンギチド（シレンジタイド）（cilen
gitide）のようなシクロペプチドの群から選ばれる抗血管形成薬剤が含まれる。

「抗転移剤」は、転移、すなわち、基本的に、発癌性細胞の、リンパ液または血流による離れた伝搬、デスティネーションサイトで新しい腫瘍の増殖、および前記転移の目的部位での新しい腫瘍の増殖を抑制または減らす化学的または生物学的物質として理解される。

本発明の第一の態様の抗体とコンジュゲートすることができる抗転移剤には、制限されないが、抗転移剤として作用することが可能な任意の細胞傷害性薬剤が含まれ、たとえば、アルキル化剤のようなもの；たとえば、5-フルオロウラシル、ペルメトレキセド（permetrexed、pemetrexed、ペメトレキセド）（MTA）、ラルチトレキセド（TDX）などのような代謝拮抗物質；たとえば、シスプラチンまたはオキサリプラチンなどのような白金細胞毒性薬；トポイソメラーゼインヒビター、抗微小管剤、アントラサイクリン、植物性アルカロイド、GTPアーゼインヒビター；血管形成インヒビター；マトリックスメタロプロテイナーゼインヒビター；細胞周期調節キナーゼのインヒビターで、たとえば、サイクリン依存性キナーゼおよびサイクリンインヒビターなどのようなもの；Wntシグナル伝達インヒビター；E2F転写因子のインヒビター；ヒストンデアセチラーゼインヒビター；AKTキナーゼまたはATPアーゼインヒビターである。

抗体および他の薬剤のコンジュゲートは、さまざまなカップリング剤または二官能性タンパク質リンカーを使って作成することができる。リンカーは、細胞内の薬剤、たとえば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィドを含むリンカーなどのようなものの放出を可能にする「取り外し可能なリンカー」であることができる。

S100A4タンパク質はまた、炎症と関係する疾患において発現される。したがって、本発明の抗体は発現部位に抗炎症薬を向けるのに用いることができる。

用語「抗炎症薬」は、プロスタグランジン合成を抑制またはブロック（遮断）する任意の抗炎症性薬物を意味する。有用な抗炎症剤には、制限されないが、5-アミノサリチル酸およびそれを含む医薬（スルファサラジン、メサラミン、メサラジン、オルサラジン）、アセチルサリチル酸、コルチコステロイドで、ヒドロコルチゾン、コルチゾン、トリアムシノロン、ブデソニド、プレドニゾン、デフラザコート、メトトレキサートなどのようなもの、インフリキシマブ、アダリムマブである。

好ましい実施形態において、本発明のコンジュゲートの特異的な抗S100A4抗体は、モノクローナル抗体であり、好ましくは、グループECACC 10022401、ECACC 11051801、ECACC 11051802、ECACC 11051803およびECACC 11051804から選択されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体またはその断片であり、またはより一層好ましくは、ハイブリドーマECACC 10022401によって生成される。

このようにして、別の態様において、本発明は、医薬における使用のための本発明の第1の態様に従う抗体またはその断片を含むコンジュゲートに関する。

別の局面において、本発明は、次の、転移、望ましくない血管形成に関連する疾患および炎症と関係する疾患、好適には、転移および望ましくない血管形成に関連する疾患から選択される疾患の防止および/または処置のための薬の調製用の本発明の第1の態様に従う抗血管形成活性を有する特異的な抗S100A4抗体またはその断片を含むコンジュゲートの使用に関する。

別の態様において、本発明は、転移、望ましくない血管形成に関連する疾患および炎症と関係する疾患、好適には、転移および望ましくない血管形成に関連する疾患から選択される疾患の防止および/または処置において使用するための本発明の第1の態様に従う抗血管形成活性を有する特異的な抗S100A4抗体またはその断片を含むコンジュゲートに関する。

別の態様において、本発明は、転移、望ましくない血管形成および炎症と関係する疾患から選択される疾患に罹患している対象体における治療または予防の方法であって、それには、前記対象体に、本発明の第1の態様に従い抗血管形成活性を有する抗S100A4抗体またはその断片が含まれるコンジュゲートを投与することが含まれる。好ましい実施形態において、疾患は、転移および望ましくない血管形成に関連する疾患から選択される。

好ましい実施形態では、特異的な抗S100A4抗体は、モノクローナル抗体であり、好ましくは、グループECACC 10022401、ECACC 11051801、ECACC 11051802、ECACC 11051803およびECACC 11051804から選択されたハイブリドーマまたはその断片により産生されるモノクローナル抗体またはその断片であり、より好ましくは、ハイブリドーマECACC 10022401によって生産される。

これらの発明の態様との関連で、「薬（メディカメント）」は、本発明の第1の態様の抗体またはその断片と、癌の処置において、具体的には、転移および望ましくない血管形成に関連する疾患から選択される疾患の処置において有用な化合物との、または炎症と関係する疾患の処置に有用な化合物とのコンジュゲートを含む医薬組成物として理解される。

用語「防止（予防）」、「処置（治療）」、「転移」、「望ましくない血管形成に関連する疾患」および「炎症と関係する疾患」は、本発明の治療上の使用との関連で以前に規定される。

本発明の判断方法

S100A4タンパク質が腫瘍細胞によって細胞外媒体中に分泌されるので、その存在は様々な生物流体中に検出することができ、それが癌を判断するために使用されうる。前記タンパク質は、血漿において、および関節リウマチなどのような炎症と関係する疾患を患う受動体の関節液流体においても見出される。

したがって、ある態様において本発明は、対象体における癌または炎症と関係する疾患を判断するための生体外（インビトロ）の方法に関し、それには、次の、
（a）前記対象体の生物流体におけるそのS100A4タンパク質またはその変形物のレベルを、ECACC 10022401、ECACC 11051801、ECACC 11051802、ECACC 11051803およびECACC 11051804からなる群から選択されたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体、または前記抗体の機能的変形物の使用によって検出すること
（b）前記レベルを基準値と比較すること
が含まれ、
基準値に対して、そのS100A4タンパク質または変形物の増加したレベルは癌または炎症と関係する疾患を患う対象体を示すの指標である。

本発明との関連で、「癌を判断するための生体外（インビトロ）方法」は、受動体から分離した生物流体において溶解するS100A4タンパク質の存在を検出することにより、対象体体における悪性腫瘍の存在を示すことができる方法として理解される。また、受動体の適切な選定および最適な用量の決定を可能にすることは、S100A4選択薬を投与する前に腫瘍によって生産されるS100A4の発現を立証すのに有用である。

本発明との関連で、「炎症と関係する疾患を判断するためのインビトロ方法」は、対象体における炎症性疾患の存在を、受動体から分離された生物流体において可溶性なS100A4タンパク質の存在を検出することによって示すことが可能な方法として理解される。

本発明における「対象体」は、哺乳類として分類される任意の動物として理解され、そしてそれには、制限されないが、家畜および農場の動物、霊長類およびヒト、たとえば、人間、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたはげっ歯類が含まれる。好ましくは、対象体はあらゆる人種または齢にある雌性または雄性の人間である。本発明との関連で、対象体は、潜在的に癌または炎症と関係する疾患を患う対象体、または以前に癌または炎症と関係する疾患と判断された対象体である。

本発明の方法の第1のステップは、本発明のモノクローナル抗体を用いて、研究対象の生物流体におけるS100A4タンパク質のか、またはその変形物のレベルを決定することを含む。

本発明との関連において「生物流体」という用語は、生理的であろうと病理学的であろうと、対象体の体内で生産される任意の生物学的分泌物または流体に言及する。このような生物流体には、制限されないが、血液、血漿、血清、気管支肺胞洗浄液（気管支洗浄液、bronchoalveolar）、尿、鼻汁、耳分泌物（ear secretion）、尿道分泌物、脳脊髄液、胸水、滑液、腹膜の流体（peritoneal fluid）、腹水症の流体（ascites fluid）、心膜の流体（pericardial liquid）、羊水、胃液、リンパ液、間質液、唾液、痰、液相成長（液相堆積）、涙、粘液、汗、乳汁、精液、膣分泌物、潰瘍、水疱、膿瘍などの表面の発疹から来る流体が含まれる。前記試料（サンプル）は、たとえば、血液抽出、植え付け（instilling）および気管支ファイバースコープ検査（bronchofibroscopy、bronchofiberscopy）の間の液体吸引、脳槽内、心室または腰椎穿刺、胸膜穿刺（pleural puncture）または胸腔穿刺（thoracocentesis）、関節（ジョイント）または滑膜経皮的穿刺（joint or synovial percutaneous）、腹腔穿刺、羊水穿刺、喀痰、腹膜経皮的穿刺（peritoneal percutaneous puncture）、心膜経皮的穿刺（pericardial percutaneous puncture）等によって、または単純な収集によって、当業者が当技術分野において既知のプロセスを使用して慣習的な方法により得ることができる。

好ましい実施形態では、生体流体は、血液、血漿、血清、好ましくは血清、より好ましくは血漿から選択される。血液試料は、典型的には、動脈または静脈、通常は、肘の内側の部分から、あるいは手の裏からの静脈を穿刺することにより抽出され、血液試料は気密バイアルまたはシリンジにおいて収集される。通常、かかと上または指の末節骨上での毛細管穿刺が、測微法による分析のために実行すうことができる。血清は、試料をそれが凝固するように10分間静置し、そしてその後、細胞を（沈殿物）を血清（上清）から分離することを目的として10分間1,500 rpmでそれを遠心分離することによって、完全な血液試料から、そして抗凝固剤の非存在下で得ることができる。次には、血漿試料を得るために、完全な血液は抗凝血剤と接触させ、20分間、3000rpmで遠心分離する。前記遠心分離の沈殿物は形成された要素に対応し、そして上清は血漿に相当する。

得られた血清または血漿は、本発明の方法によって試料分析のための保存管（蓄積管）に移すことができる。

別の好ましい実施形態において、生物流体は関節滑液である。
S100A4タンパク質の発現のレベルは、慣習的な方法によって検出し、そして定量することができる。前記方法には、制限されないが、RAGEのようなそのリガンドの一つに対するその親和性を測定することによるS100A4の検出、およびその後のS100A4-リガンド複合体の定量化、またはECACC 10022401、ECACC 11051801、ECACC 11051802、ECACC 11051803およびECACC 11051804からなる群から選択されたハイブリドーマによって産生されるS100A4タンパク質（または抗原決定基を含むその断片）に特異的に結合する能力を有するモノクローナル抗体または前記抗体の機能的変形物を用いることによる。次に、（te）結果として得られる抗原-抗体複合体を定量する。本発明の好ましい実施形態において、使用される抗体は、ハイブリドーマECACC 10022401によって産生される抗体である。

また、本発明は、前記抗体の機能的変形物の使用を想定する。本発明のモノクローナル抗体の「機能的変形物」は、前記モノクローナル抗体と、前記モノクローナル抗体と関係する本発明において記載する機能の1以上を、インビトロおよびインビボの双方で共有し、そしてアミノ酸配列において最小限の同一性を有する任意の分子として理解される。本発明のモノクローナル抗体の機能的変形物は、1以上のアミノ酸の挿入、置換または欠失によって、前記配列から誘導することができ、そして組換えおよび/または合成によって得ることができる。

本発明のモノクローナル抗体の機能的変形物はS100A4抗原に結合し、およびまた、血管形成などのようなS100A4タンパク質の1以上の特徴的機能を抑制するためのそれらの能力を保存する必要がある。前記機能は、本発明の例において記載する方法によって決定することができる。

本発明のモノクローナル抗体の機能的変形物には、前記抗体のポリペプチド配列と少なくとも60％、65％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、90％、95％、97％、99％を含む類似性または同一性を示すポリペプチドが含まれる。2つのポリペプチド間の同一性の程度は、コンピュータに実装されたアルゴリズムおよび当業者によって広く知られる方法を用いて決定される。二つのアミノ酸配列間の同一性は、好ましくは、BLASTPアルゴリズムを用いて定められる〔BLASTマニュアル、Altschul, S.ら、NCBI、NLM NIHベセスダ、メリーランド州20894、Altschul, S.ら、(J.,)1990年、J. Mol. Biol. 215:403-410〕。

加えて、本発明の方法で使用される抗体は、検出可能な薬剤で標識されてよく、そうでなくてもよい。特定の実施形態において、使用される抗体は、検出可能な薬剤にコンジュゲート（結合）する。

本発明との関連で、用語「検出可能な薬剤」および「ラベリング（標識化）」は同義的であり、そしてそれらは、酵素、放射性または蛍光法を使ってその検出を可能にする性質が薬剤に言及される。検出可能な化合物は、酵素、放射性標識化合物または放射性同位元素、蛍光色素、化学発光試薬、酵素基質または補因子、酵素的インヒビター、粒子、染料等であってよい。

また、放射性同位元素によって放射能で標識された化合物は、放射性同位元素または放射性核種と呼ばれ、制限されないが、³H、¹⁴C、¹⁵N、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹Iが含まれる。蛍光標識には、制限されないが、ローダミン、リン-ランタニドまたはFITCが含まれうる。酵素標識には、制限されないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたはアルカリホスファターゼが含まれる。好ましい標識には、制限されないが、フルオレセイン、ホスファターゼで、アルカリホスファターゼのようなもの、ビオチン、アビジン、ペルオキシダーゼで、西洋ワサビペルオキシダーゼのようなもの、およびビオチンに関連する化合物またはアビジンに関連する化合物（たとえば、ストレプトアビジンまたはイムノピュア〔ImmunoPure^(R)〕（商標）ニュートラアビジン（NeutrAvidin）、Pierce（ピアース社）、ロックフォード、イリノイ州から入手可能）が含まれる。
本発明で使用することができるよく知られている多種多様のアッセイがあり、これらのアッセイは、一次非標識抗体および二次標識抗体を使用し、このような技術には、ウエスタンブロットまたはウエスタントランスファー（転送）、ELISA（酵素結合免疫測定法）、RIA（ラジオイムノアッセイ）、競合的EIA（競合酵素免疫測定法）、DAS-ELISA法（二重抗体サンドイッチELISA）、または反応性ストリップなどのような形態でのコロイド沈殿に基づく特異的抗体またはアッセイが含まれるタンパク質マイクロアレイまたはバイオチップの使用に基づく技術が含まれる。S100A4タンパク質を検出するためのその他の方法としては、アフィニティークロマトグラフィー、リガンド結合アッセイなどのような技術が含まれる。

特定の実施形態において、S100A4のレベルの定量は、ウエスタンブロット法またはELISA法を用いて行われる。

まだそれ以上の特定の実施形態において、S100A4タンパク質またはその変形物のレベルは、ウエスタンブロット法によって決定される。ウエスタンブロット法は、変性条件下にゲルでの電気泳動および膜、一般的にニトロセルロース上で固定することによって、S100A4に特異的な抗体および発色システム（たとえば、化学発光）を用いるインキュベーションを使って、予め分離したタンパク質を検出することに基づく。

別の好ましい実施形態では、判断はELISA法を用いて行われる。前記技術は、基材上に固定された抗S100A4抗体を使っての試料におけるS100A4タンパク質の検出および二次抗体を使ってのS100A4-抗体複合体のその後の検出に基づく。

用語「タンパク質」は、ここで用いられるように、共有結合または非共有結合によって結合したアミノ酸の分子鎖を指す。この用語は、さらに、すべての生理学的に適切な翻訳後の化学修飾形態を含む。本発明の範囲内に含まれる翻訳後修飾としては、たとえば、シグナルペプチド切断、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、イソプレニル、タンパク質分解、ミリストイル化、タンパク質の折りたたみおよびタンパク質分解過程などが含まれる。さらに、タンパク質には、翻訳後修飾によって、または、翻訳中に非天然アミノ酸を導入することにより形成された非天然アミノ酸を含めることができる。

用語「S100A4」は、本発明の第一の発明の態様との関連で規定されている。本発明の判断方法については、検出されたS100A4は、分析される生体流体試料を抽出された対象者に属する種に対応していることである。

前述したように、前記タンパク質の変形物は、本発明の方法において、S100A4タンパク質のレベルを測定するために用いることができる。

したがって、S100A4タンパク質の変形物は、（i）アミノ酸残基の1以上が保存または非保存のアミノ酸残基（好ましくは、保存アミノ酸）であり、およびそのような置換されたアミノ酸残基は遺伝暗号によってコード化することができるか、またはそうでなくてよいもの、（ii）1以上の修飾されたアミノ酸残基、例は、置換基の結合によって修飾されている残基が存在するもの、（iii）タンパク質がS100A4の選択的スプライシング変形物であるものおよび/または（iv）タンパク質の断片であってよい。断片には、元の配列のタンパク質分解プロセス（複数の部位でのタンパク質分解を含む）を経由して生成されたタンパク質を含むことができる。前記変形物は本発明の範囲内に入る。

本発明に従う変形物には、元のアミノ酸配列と、少なくとも60％、70％、80％、90％、95％または96％で類似または同一であるアミノ酸配列が含まれる。知られているように、2つのタンパク質間の「類似性」は、第2のタンパク質の配列を有するタンパク質のアミノ酸配列を比較することによって決定される。2つのタンパク質の間の同一性の程度は、コンピュータのアルゴリズムと当業者によって広く知られている方法を用い、好ましくは、BLASTPアルゴリズムを用いて決定される〔BLASTManual、Altschul, Sら、NCBI NLM NIH Bethesda、Md. 20894、Altschul, S.ら、J. Mol. Biol. 215：403-410（1990）〕。

特定の実施形態において、変形物は、哺乳類からの変形物、好ましくは、ヒトからの変形物、より好ましくは、元のアミノ酸配列と、少なくとも60％、70％、80％、90％、95％または96％での類似性または同一性を有する。

当業者は、本発明の方法が、S100A4タンパク質の発現の絶対レベルと相対レベルの両方を使用して実践できることを理解するであろう。そのように、本発明では、表現「S100A4タンパク質のレベル」は、前記タンパク質の絶対的なレベルと相対的なレベルの両方を参照するために使用される。

表現「絶対レベル」は、試料中の目的のタンパク質の総量を指す。前記値は、容積の単位当たりの質量において（例は、試料のng/mlにおいて）、容積の単位当たりのタンパク質分子の数において〔例は、ピコモル（pmol）のタンパク質/試料のmlにおいて〕、合計タンパク質の質量の単位当たりのS100A4タンパク質の質量の単位において（pgの100A4合計タンパク質のmg）または合計タンパク質の質量の単位当たりのS100A4分子の数において（例は、pmolのS100A4/合計タンパク質のmgにおいて）発現されるタンパク質の濃度として与えることができる。

表現「相対的なレベル」は、研究の目的のS100A4タンパク質の、および参照タンパク質の発現のレベルの間の関係に言及し、すなわち、前記比較タンパク質に関して正規化された形式におけるS100A4タンパク質の濃度が規定される。

異なる試料間のタンパク質の値を正規化するために、コントロールタンパク質の発現を用いて分析する試料においてS100A4タンパク質のレベルを比較することができる。本発明において、「コントロールタンパク質」は、タンパク質として、非腫瘍細胞に関して、腫瘍細胞での、変化しないか、または限られた量でしか変化しない発現レベルとして理解される。好ましくは、コノトロールタンパク質は、構成的（恒常的）に発現している遺伝子によってコード化されるタンパク質であり、これらのタンパク質が構成的に発現され、そして本質的な細胞機能を遂行するよう、常に活性で、または絶えず転写されるそれらの遺伝子である。本発明で用いることができる好適なコントロールタンパク質は、制限されないが、β-2-ミクログロブリン（B2M）、ユビキチン、18-Sリボソームタンパク質、シクロフィリン、GAPDH、PSMB4、チューブリンおよびアクチンが含まれる。

当業者は、S100A4タンパク質のアミノ酸配列での変異が、その発現の検出に影響を与えず、それゆえに、アミノ酸配列の変異によって生成されたこのタンパク質の変形物が本発明の範囲内に入ることを理解する。

試料におけるS100A4の発現のレベルが決定されると、工程（a）で得られたS100A4のレベルを基準値と比較することからなる本発明の工程（b）が行われる。

「基準値」は、癌によって影響を受けない正常な個体からの分析すべき生物流体の混合物によって好適に形成される試料収集物（サンプルコレクション）に由来する。前記基準値は、当技術分野においてよく知られた技術によって決定することができ、たとえば、健全な対象体から採取した生物流体中で測定されるS100A4タンパク質のレベルの平均値が決定される。基準値はまた、分析される同じ対象体から採取された構成的に発現されたタンパク質から得ることができる。

基準値が確立されると、ステップ（a）で得られたS100A4のレベルの値は、この基準値と比較することができ、そして従って、基準値に関して対象体のS100A4タンパク質のレベルにおける改変を検出することができる。より具体的には、本発明の方法においては、基準値に関してS100A4のレベルの増加は、癌または炎症と関係する疾患を患う対象体の指標である。

本発明との関連で、基準値に関して「増加したレベル」は、基準値と比較して、少なくとも1.1倍、1.5倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、またはさらにより一層高い倍率の基準値を上回るS100A4のレベルの改変として理解される。

したがって、一度前記比較が実行されていると、本発明の方法は、対象体が、癌または炎症と関係する疾患を患うかどうか判断することを可能にする。特定の実施形態において、本方法は、癌、特に（particulary）膵臓癌、結腸直腸癌を判断するのに適している。

別の特定の実施形態において、本方法は、炎症と関係する疾患、好ましくは、関節リウマチを判断するのに適する。

用語「癌」、「炎症と関係する疾患」は、以前に規定された。

S100A4を検出するための方法

抗体はまた、本発明の第一の態様に規定するように、生物流体とは異なる別の種類の生物学的試料におけるS100A4を検出するのに有用でありうる。前記検出プロセスは、癌または炎症と関係する疾患の判断および/または予後に有利に適用され、それらの細胞は、S100A4タンパク質を発現する細胞である。

これらの抗体は、免疫蛍光、フローサイトメトリー、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降などのような標準的な技術を使って、S100A4タンパク質を発現する細胞および組織を識別するために使用することができる。たとえば、本発明のモノクローナル抗体は、S100A4タンパク質を発現する腫瘍細胞の識別を容易にすることができ、そして対象体における癌を判断することが可能になる。

したがって、別の態様において、本発明は、対象体において、癌または炎症と関係する疾患を判断するためのインビトロ方法に関し、それには、
（i）前記対象体の細胞または組織におけるS100A4タンパク質またはそれらの変形物のレベルを、ECACC 10022401、ECACC 11051801、ECACC 11051802、ECACC 11051803およびECACC 11051804の群から選択されたハイブリドーマによって産生される特異的な抗S100A4モノクローナル抗体または前記抗体の機能的変形物を使って検出すること、
（ii）前記レベルを基準値と比較すること
が含まれ、
基準値に関して、S100A4タンパク質の、またはその変形物の増加したレベルは、癌または炎症と関係する疾患を患う対象体を示す。

用語「インビトロ方法」は、前記方法が、対象体から採取され分離された生物学的試料において遂行されることを意味する。前記生物学的試料は、血液細胞、上皮細胞、生殖細胞などのような細胞または、さらに組織の生検標本でありうる。

用語「S100A4タンパク質のレベル」、「変形物」、「基準値」および「増加したレベル」は、既に本発明の判断方法のとの関連で規定した。

検出は、標識基への抗体のカップリング（結合）（すなわち、物理的結合）によって促進することができる。

別の態様において、本発明は、試料においてS100A4を検出するための方法に関し、それには、
（i）S100A4を含むことが疑われる試料を、特異的な抗S100A4抗体または本発明の第一の態様において規定されたようなその断片と接触させること、
（ii）S100A4および抗体またはその断片との間の免疫複合体の形成を検出すること
が含まれ、
S100A4および抗体の間の免疫複合体の検出は、前記試料におけるS100A4の存在を示す。

S100A4を検出するための方法の好ましい実施形態では、特異的な抗S100A4抗体は、ECACC 10022401、ECACC 11051801、ECACC 11051802、ECACC 11051803およびECACC 11051804の群から選択されたハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体または前記抗体の機能的変形物である。

本発明のモノクローナル抗体がS100A4タンパク質を認識することを考えると、それらは試料から前記タンパク質を精製するために使用することができる。

好ましくは、S100A4の精製において使用するために、本発明の第1の態様のモノクローナル抗体は、支持体または基材と共にそれらを関連付けて使用される。原則、支持体の任意のタイプを本発明の方法で使用することができるが、セファデックス（Sephadex）、デキストラン、水に可溶なポリアミノ酸、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリグルタミン酸（PGA）、ポリ乳酸（PLA）、ポリ乳酸-コ-グリコール酸（PLGA）、ポリ（D,L-乳酸-コ-グリコリド）（PLA / PLGA）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリグリセリン、ポリアミドアミン（PAMAM）およびポリエチレンイミン（PEI）のような高分子タイプの支持体の使用が好ましい。

典型的には、本発明の第1の態様のモノクローナル抗体を用いたS100A4の精製は、以下の工程を含むプロセスによって行われる。すなわち、
（i）S100A4タンパク質が精製されるべき試料を、ECACC 10022401、ECACC 11051801、ECACC 11051802、11051803およびECACC 11051804の群から選択されたハイブリドーマによって産生された抗体またはその断片で、抗体およびS100A4タンパク質の間の結合が起こるのに適した条件において支持体上に固定化したものと接触させること、
（ii）ステップ（工程）（i）において形成された複合体を、非特異的に支持体-抗体複合体に結合する試料からのすべてのそれらの化合物を除去するために洗浄すること、および
（iii）化合物に結合するS100A4タンパク質を溶出すること
である。

本発明のS100A4タンパク質を精製するための方法は、親和性によって、たとえば、固定相が固形支持体にコンジュゲートする本発明の第1の態様に従うモノクローナル抗体によって形成されるアフィニティークロマトグラフィーカラムを含めて、任意の公知のタンパク質精製法を用いて行うことができる。

本発明のキットおよびその使用

別の態様において、本発明は、生体流体において癌または炎症と関係する疾患を判断するためのキットに関し、それには、本発明の第1の態様に従う少なくとも1の抗体またはその断片を含む。好ましい実施形態において、抗体は、ECACC 10022401、ECACC 11051801、ECACC 11051802、11051803およびECACC 11051804の群から選択されたハイブリドーマにより産生される抗体またはその断片である。特定の実施形態では、疾患は、癌、好適には膵臓癌、(o)結腸直腸癌である。別の好適な実施形態では、疾患は、炎症性疾患、好ましくは関節リウマチに関連する疾患である。

別の態様において、本発明は、以前に規定したように、対象体の生物流体において癌または炎症と関係する疾患の判断のためにキットの使用に関する。特定の実施形態において、疾患は、癌、好ましくは膵臓癌、(ｏ)結腸直腸癌である。別の好ましい実施形態においては、疾患は、炎症と関係する疾患、好ましくは関節リウマチである。

用語「キット」は、本文書で使用されるように、要素または構成要素の1以上のタイプ（たとえば、他のタイプの生化学試薬、容器、その商業的販売に適した包装、試薬のセットの組み合わせを指す、その、試薬が結合している基材、電子ハードウェア部品等）と一緒にS100A4のレベルを検出するのに適した試薬のセットの組合せを指す。

本発明において、「S100A4のレベルを検出するのに適する試薬」は、ECACC 10022401、ECACC 11051801、ECACC 11051802、ECACC 11051803およびECACC 11051804の群から選択するハイブリドーマによって産生される特異的な抗S100A4モノクローナル抗体またはその断片および、随意に1以上の構成タンパク質を検出するための試薬として理解される。

当業者によって理解されるように、本発明のキットでの抗体は、生物流体の分析のために適することが知られるタンパク質のレベルを決定するためのすべての技術、たとえば、ウエスタンブロット法またはウエスタントランスファー、ELISA、RIA、競合的EIA、DAS-ELISA、バイオチップの使用に基づく技術、タンパク質マイクロアレイ、反応性ストリップでのコロイド沈殿のアッセイなどのようなもので用いることができる。

抗体は、固形支持体で、たとえば、膜、プラスチックまたはガラスなどのようなもので固定され、随意に支持体に対する前記抗体の固定を容易にするために処理することができる。前記固形支持体は、少なくとも、特異的にS100A4タンパク質を認識し、および前記タンパク質の発現のレベルを検出するために用いることができる抗体のセットを含む。

加えて、本発明のキットは、構成遺伝子によってコード化されたタンパク質を検出するための試薬を含む。前記追加の試薬の可用性は、バイオマーカーの発現での違いが、試料における合計タンパク質量の異なる量が発現の相対的レベルでの本当の違いよりも大きいためであること除外するために、異なる試料（たとえば、分析される試料およびコントロール試料）において実行する測定の正規化を可能にする。本発明における構成遺伝子は常に活性であるか、または絶えず転写され、そして構成的に発現され、および必須の細胞機能を遂行するタンパク質をコードする遺伝子である。構成的に発現され、および本発明において使用することができるタンパク質は、制限されないが、β-2-ミクログロブリン（B2M）、ユビキチン、18-Sリボソームタンパク質、シクロフィリン、GAPDH、PSMB4、チューブリンおよびアクチンが含まれる。

本発明の方法のすべての特定の実施形態は、本発明のキットへ、およびそれらの使用にも適用可能である。

治療をカスタマイズするための方法

本発明者らは、癌を患う対象体の、本発明に従うモノクローナル抗体による処置は、処置前に高値であった巡回（circulant）S100A4タンパク質の全体をブロックすることを見出した。

したがって、別の態様では、本発明は、癌と診断された対象体のためにカスタマイズされた治療を設計するためのインビトロ方法に関し、それには、
（i）前記対象体の生物流体におけるS100A4タンパク質の、またはその変形物のレベルを定めること、および
（ii）S100A4タンパク質のレベルを基準値と比較すること
が含まれ、
S100A4タンパク質の、またはその変形物のレベルが基準レベルに関して増加することは、受動体が抗血管形成活性を有する特異的な抗S100A4抗体または前記抗体の抗血管形成活性を実質保つその断片で処置されるべきことを示し、そこで抗体は、次の、
（a）S100A4のエピトープを認識するシーケンスELPSFLGKRT（配列番号3）を含む抗体
（b）S100A4のエピトープを認識するシーケンスEGFPDKQPRKK（配列番号24）を含む抗体、および
（c）ハイブリドーマECACC11051804によって生産される抗体
からなる群から選ばれる。

用語「カスタマイズされた治療法を設計すること」によって、前記方法により得られた結果は、対象体が本発明のモノクローナル抗体を用いた処置のための候補である場合を決定するのに有用であることを意味する。

用語「対象体」は、癌と診断されたヒトおよび非ヒト動物を意味する。非ヒト動物には、霊長類および非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウサギ、ラット、マウス、カウ（ウシ）、チキン（ニワトリ）、両生類、および爬虫類のような、すべての脊椎動物、例は、哺乳動物および非哺乳動物が含まれる。

用語「ガン（癌）」、「S100A4タンパク質」、「前記タンパク質の変形物（変異体）」、「生物流体」、「モノクローナル抗体」、「ハイブリドーマ」、「抗体の機能的変形物」は、以前に規定した。

本態様との関連で、対象体は、少なくとも本発明のモノクローナル抗体で治療するために選択され、そして同じ抗体をS100A4のレベルを監視するために使用される。S100A4タンパク質のレベルが基準レベルよりも高いとき、対象体は、管理（投与）された本発明のモノクローナル抗体での治療の候補である。

S100A4タンパク質の発現レベルを、患者からの試料における前記タンパク質を検出および定量することができる任意の慣習的な方法を使って定量化することができる。これらのアッセイで使用される抗体は標識されても、またはされなくてもよい。使用できるマーカーの例示的例としては、放射性同位元素、酵素、蛍光団、化学発光試薬、酵素基質や補因子、酵素阻害剤、粒子、染料等が含まれる。本発明に用いることができる既知の多種多様なアッセイがあり、それらは、非標識抗体（一次抗体）および標識抗体（二次抗体）を用いられ、これらの技術には、ウエスタンブロット法、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、RIA（ラジオイムノアッセイ）、競合的EIA（競合酵素免疫測定法）、DAS-ELISA（ダブル抗体サンドイッチELISA）、免疫細胞化学的および免疫組織化学的技術、特異的抗体を含むタンパク質バイオチップまたはマイクロアレイの使用に基づく技術またはディップスティックのような形式でのコロイド沈殿に基づくアッセイが含まれる。

好ましい実施形態では、工程（i）におけるS100A4タンパク質のレベルの決定は、ECACC 10022401、ECACC 11051801、ECACC 11051802、ECACC 11051803とECACC 11051804から成る群から選択されたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体または前記抗体の機能的な変異体を用いることによって実施される。
特定の実施形態において、S100A4タンパク質のレベルは、ウエスタンブロット、免疫組織化学またはELISAによって定量化される。

本発明の他の態様

本発明はさらに、識別、位置選定、評価、診断、予知、または対象体における腫瘍またはその他のS100A4媒介性疾患のモニタリングのためのマーカーとして、本明細書で提示の実施形態のいずれか1に従う抗体またはその断片またはモノクローナル抗体の使用を提供する。

さらに本発明は、腫瘍の治療における同時、個別または逐次使用するための組合せ調製物として、ここに提示する実施形態のいずれか1に従う抗体またはその断片またはモノクローナル抗体、および抗がん剤を含有する生産物を提供する。

本発明はさらに、S100A4媒介性疾患の治療における同時、個別または逐次使用するための組合せ調剤物として、ここに提示する実施形態のいずれか1に従う抗体またはその断片またはモノクローナル抗体、および治療剤を含有する生産物を提供する。

抗体またはその断片は、腫瘍の治療のための薬として使用するためにヒトまたはマウスS100A4ポリペプチドに特異的に結合する。

定義
用語「S100A4」、「S100A4タンパク質」、「S100カルシウム結合タンパク質A4」、「カルシウムタンパク質」、「カルレチクリン（calvasculin）」、「メタスタシン（metastasin）」、「ネズミ胎盤ホモログ」、「MTS1」、「CAPL」、「p9Ka」、「18A2」、「pEL98」、「42A」、「FSP1」、「線維芽細胞特異的タンパク質-1」、「悪性形質転換サプレッション1（transformation suppression）」、「白血病多剤耐性関連タンパク質」、「OTTHUMP00000015469」、「OTTHUMP00000032895」は、交換可能に用い、そして同様に、変異体、アイソフォーム、ヒトまたはマウスS100A4の種ホモログ、およびヒトまたはネズミS100A4と少なくとも1の共通エピトープを有する類似体が含まれる。

ヒトS100A4についての完全なcDNA配列はジェンバンク（Genbank）受入（アクセッション）番号M80563（1994年10月31日）を有する。

ネズミS100A4についての完全なcDNA配列はジェンバンク受入番号D00208（1997年12月5日）を有する。

ヒトS100A4についての完全なタンパク質配列はユニプロト（UniProt）受入番号P26447（1992年8月1日）を有する。すなわち、
配列番号21
MACPLEKALDVMVSTFHKYSGKEGDKFKLNKSELKELLTRELPSFLGKRTDEAAF
QKLMSNLDSNRDNEVDFQEYCVFLSCIAMMCNEFFEGFPDKQPRKK

ネズミS100A4についての完全なタンパク質配列はUniProt受入番号P07091（1988年4月1日）を有する。

用語「抗体」はここでは最も広い意味で使用され、そしてモノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例は、二重特異性抗体）、およびそれらが所望の生物活性を示す限りの抗体断片をカバーする。

無傷の「抗体」には、ジスルフィド結合によって相互接続した少なくとも2つの重（H）鎖および2つの軽（L）鎖を含むヘテロ多量の糖タンパク質が含まれる。通常、各軽鎖は、1つの共有ジスルフィド結合により重鎖にリンクされ、その一方異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間のジスルフィド結合の数は異なる。各重鎖および軽鎖はまた、鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一端に重鎖可変領域（ここではHCVRまたはVHと略す）を有し、重鎖定常領域に続く。重鎖定常領域は3つのドメイン、CH1、CH2およびCH3を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（LCVRまたはVLと略す）およびそのもう一方の端で軽鎖定常領域を有する。軽鎖定常領域は1つのドメイン、CLを含む。VHおよびVL領域はさらに、超可変性で、相補性決定領域（CDR）と呼ばれる領域に細分され、より保存されたフレームワーク領域（FR）と呼ばれる領域で散在することができる。各VH及びVLは3つのCDRと、4つのFRで構成され、以下の順序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4でアミノ末端からカルボキシル末端に配置される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。定常領域は直接抗原に対する抗体の結合に関与しないが、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ADCC）、Fcγ受容体への結合を介する食作用、新生仔Fc受容体（FcRn）を介する半減期/クリアランス率および補体カスケードのC1qのコンポーネントを介する補体依存性細胞傷害への関与などのような様々なエフェクター機能を発揮する。

用語「フラグメント（断片）」は、抗体を参照して、部分的な重鎖または軽鎖の可変配列を含む抗体の抗原結合断片を意味し、ヒトまたはマウスS100A4を結合する能力を保持する。断片の例には、制限されず、（i）Fab断片、VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価断片、（ii）F（ab'）2断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む二価断片、（iii）VHおよびCH1ドメインからなるFd断片、（iv）抗体の単一アームのVLおよびVHドメインからなるFv断片、（v）dAb断片〔ワード（Ward）ら、（1989年）Nature（ネイチャー）、341：544-546〕で、VHドメインからなるもの、および（vi）単離された相補性決定領域（CDR）が含まれる。断片は、組換え技術またはインタクトな抗体の酵素的または化学的な切断、例は、パパイン消化により調製することができる（たとえば、WO94/29348を参照）。

さらに、Fv断片、VLおよびVHの2つのドメインが別々の遺伝子によってコードされるが、それらは組換え技術を用いて、それらが単一のタンパク質鎖として作られるのを可能にする合成リンカーによって結合することができ、そこではVLおよびVH領域が一価分子〔一本鎖Fv（scFv）として知られる、例は、Bird（バード）ら、（1988年）Science（サイエンス）、242：423-426；およびHuston（ヒューストン）ら、（1988年）Proc. Natl. Acad. Sci USA、85：5879-5883参照〕を形成するために対になる。このような一本鎖抗体は、「抗体」という用語への参照によって含まれる。

用語「モノクローナル抗体」とは、均質分子組成の抗体分子、すなわち、母集団を構成する個々の抗体の調製物は、少量で存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除き、同一であることを意味する。モノクローナル抗体組成は、特定のエピトープまたは抗原結合部位に対して単一の結合特異性および親和性を示す。モノクローナル抗体は、単一の独特な親細胞および腫瘍形質細胞のB細胞クローン子孫の融合のハイブリッドセル生成物によって生産される。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。

用語「ジクローナル（diclonal）抗体」は、ネズミまたはヒトS100A4に対する少なくとも2つの抗体の調製物を意味する。典型的には、異なる抗体は異なるエピトープに結合する。

用語「オリゴクローナル抗体」は、ネズミまたはヒトS100A4に対する3から100の異なる抗体の調製物を意味する。典型的には、そのような調製物における抗体はさまざまな異なるエピトープに結合する。

用語「ポリクローナル抗体」は、異なるB細胞株由来のマウスまたはヒトS100A4に対する1よりも多く（2以上）の異なる抗体、すなわち、免疫グロブリンの混合物である、特定の抗原（S100A4）に対して分泌される抗体の調製物を指す。このような調製物には、さまざまな異なるエピトープに結合する抗体が含まれる。

用語「二重特異性抗体」は、2つの異なる結合特異性を有するその抗体を指し、例は、米国特許第5922845および5837243号；Zeilder（ジールダー）（1999年）J. Immunol.（ザ・ジャーナル・オブ・イムノロジー）、163：1246-1252；Somasundaram（ソーマスントラム）（1999年）Hum. Antibodies（ヒューマン・アンティボディーズ）、9：47-54；Keler（ケレル）（1997年）Cancer Res．57：4008-4014を参照。たとえば、二重特異性抗体は、細胞表面抗原のための1つの結合部位、およびエフェクター細胞の表面上のFc受容体のための第2の結合部位を有することができる。模範的な二重特異性抗体は、B細胞表面マーカーの2つの異なるエピトープに結合することができる。他の前記抗体は第1のB細胞マーカーに結合し、さらに第2のB細胞表面マーカーに結合することができる。あるいはまた、抗B細胞マーカーの結合アームは、白血球におけるトリガー分子で、T細胞レセプター分子（例えばCD2またはCD3）などのようなものに結合するアーム、またはIgGのためのFc受容体（FcyR）、FcyRI（CD64）、FcyRII（CD32）とFcyRIII CD（16）などのようなものと、細胞の防御のメカニズムがB細胞において集中するように組み合わせることができる。また、二重特異性抗体はB細胞に対する細胞傷害性薬物を突き止めるために使用することができる。これらの抗体は、リンパ球のマーカーおよび細胞傷害性薬物（たとえば、サポリン、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンA鎖、メトトレキセートまたは放射性ハプテン同位体）に結合するアームに対する結合アームを有する。二重特異性抗体は、抗体全体として、または抗体断片〔たとえば、F（ab）2二重特異性抗体〕として調製することができる。

二重特異性抗体は、さらにダイアボディが含まれる。ダイアボディは、二価の、二重特異性抗体であり、そこではVHおよびVLドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現されるが、同一鎖上の2つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用し、それによって、ドメインが強制的に別の鎖の相補ドメインとペアにされ、そして2つの抗原結合部位が造られる〔例は、Holliger（ホリガー）, P.ら、（1993年）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90：6444-6448；Poljak（ポラク）, RJら、（1994年）、Structure（ストラクチャー）、2：1121-1123参照〕。

用語「多特異性抗体」は、少なくとも3つの結合部位または特異性を有するその抗体を指す。

用語「エピトープ」は、抗体に特異的に結合し得るタンパク質決定基、または抗体がそのAgに結合するところ、または拡張することで、T細胞受容体が結合するMHC分子において提示されるペプチドに言及する。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面グループ分けからなり、そして通常、特異的な三次元構造特性、ならびに特定の電荷特性を有する。コンフォメーションおよび非立体配座エピトープは、前者への後者ではない結合は、変性溶媒の存在下で失われていることで区別される。

用語「分離（単離）された」は、その自然環境から識別され、分離され、または除去されることを意味する。たとえば、生体内に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離された」ものではないが、その天然状態の共存物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離された」ものであり、制限されないが、細胞がポリヌクレオチドまたはポリペプチドを分離されたものと同じ種またはタイプのものであっても、そのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドを細胞に再び導入されるときが含まれる。

語句「抗原に対する免疫応答を誘導するのに有効な薬剤」は、免疫応答の刺激剤として作用し、それによって、任意の特定の抗原効果をそれ自体伴わす、ワクチンに対する応答が増加する、本発明のモノクローナル抗体とは異なる物質を指す。この薬剤は、アジュバントとして当該技術分野で知られている。例には、リピッドA、Bordetella pertussis（ボルデテラ・バータシス、百日咳菌）またはMycobacterium tuberculosis（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、結核菌）由来タンパク質、フロイント不完全アジュバントおよび完全アジュバント〔Difco Laboratories（ディフコ・ラボラトリー社、Detroit（デトロイト）、Mich.（ミシガン州）；Merck Adjuvant（メルクアジュバント）65〔Merck and Company, Inc.（メルク・アンド・カンパニー社）、Rahway（ラーウェイ）、N.J.（ニュージャージー州）〕；水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウムなどのようなアルミニウム塩；カルシウム、鉄、亜鉛の塩；アシル化チロシンアシル化糖の不溶性懸濁物；カチオンまたはアニオン誘導体化された多糖類；ポリホスファゼン生分解性マイクロスフェア；モノホスホリルリピドAおよびクイル（quil）Aが含まれる。サイトカインで、たとえば、GM CSFまたはインターロイキン-2、-7、または-12などのようなものはまた、アジュバントとして使用され得る。

語句「特異的に結合する」は、抗体およびその抗原結合断片を指すとき、その抗体が、ネズミまたはヒトS100A4を、他のネズミまたはヒトのタンパク質にまったくまたはわずかしか結合しないで結合することを意味する。しかしながら、この用語は、本発明の抗体がまた、S100A4の他の形態と交差反応かもしれないという事実を排除するものではない。結合反応に対する語句「特異的に結合する」は、タンパク質および他の生物製剤の不均一集団におけるタンパク質の存在に決定的である。典型的には、抗体は、少なくとも約1×10⁶M^-1または10⁷M^-1、または約10⁸M^-1乃至10⁹M^-1、または約10¹⁰M^-1乃至10¹¹M^-1またはそれよりも多くの結合定数（Ka）で結合し、そして所定の抗原または密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例は、BSA、カゼイン）に結合するためのその親和性よりも少なくとも2倍大きい親和性で所定の抗原に特異的に結合する。語句「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」は、ここで「抗原に特異的に結合する抗体」と交換可能に使用される。

語句「特異的に（複数に）結合する」または「（複数に）特異的に結合する」は、ペプチドを参照するとき、標的分子に対し、排他的にまたは主に、中間または高い結合親和性を有するペプチド分子を指す。語句「に対して特異的に結合する」は、タンパク質および他の生物製剤の異種集団の存在下における標的タンパク質の存在を決定する結合反応に言及する。したがって、指定されたアッセイ条件下で、特異的結合部は、特定の標的タンパク質に優先的に結合し、試験試料中に存在する他の成分に有意な量で結合しない。このような条件下での標的タンパク質への特異的結合は、特定の標的抗原に対するその特異性のために選択される結合部を必要とすることがある。アッセイの様々な形式（フォーマット）は、特定のタンパク質と特異的に反応するリガンドを選択するために使用され得る。たとえば、固相ELISAイムノアッセイ、免疫沈降法、ビアコア（Biacore）、およびウエスタンブロット法を用いて、ヒト（HUMAN）またはネズミS100A4と特異的に反応するペプチドを同定する。典型的に、特異的または選択的反応は、バックグラウンドの少なくとも2倍の信号またはノイズであり、典型的にはバックグラウンドの10倍より高い。

用語「ブロック」は、本発明の抗体および抗原結合断片との関係で、本明細書を通じて用いるように、ヒトまたはネズミS100A4の生物学的活性が本発明の抗体および抗原結合断片の存在下で、そのような抗体およびその抗原結合断片の不存在下でヒトまたはネズミS100A4の活性と比較して減少することを意味する。ブロッキングは、制限されないが、リガンド結合を中和すること、受容体を活性化するリガンドを防止すること、ヒトまたはネズミS100A4のダウンレギュレーション（下方調整）またはエフェクター機能に影響を与えることの1以上によるかもしれない。阻止（blockade）のレベルは、いくつかの方法で、たとえば、以下の例の、タンパク質分解活性は、細胞遊走、腫瘍発生、腫瘍血管形成および腫瘍播種（転移）で定められたアッセイを使用することによって測定することができる。

抗体またはその抗原結合断片はブロック可能である場合、そのときにこれは、ネズミまたはヒトS100A4結合タンパク質およびその受容体の間の相互作用の抑制を示す。

語句「ヒトまたはネズミS100A4タンパク質の作用のメカニズム」は、S100A4タンパク質の細胞内および細胞外の機能のそれぞれを指す。S100A4タンパク質の細胞内機能には、細胞運動、浸潤、細胞分裂、および生存のような重要な細胞機能に干渉すること〔Kriajevska（クリアジェスカ）MVら、J Biol Chem、1994年269（31）：19679-82およびGrigorian（グリゴリヤン）Mら、J Biol Chem、2001年276（25）：22699-708〕；いくつかの細胞内標的タンパク質への結合およびそれらの機能の調節で、（such us）非筋肉ミオシンIIの重鎖へのようなもの〔Kriajevska MVら、J Biol Chem、1994年、269（31）：19679-82およびFord（フォード）HLら、Oncogene（オンコジーン）1995年10（8）：1597-1605〕；およびリプリン（Liprin）β1〔Kriajevska Mら、J Biol Chem、2002年277（7）：5229-35〕；腫瘍抑制タンパク質p53と相互作用し、およびそのトランス活性化（transactivational）機能を調節し、それによって細胞特異的な方法でのp53標的遺伝子の発現が別個に調節されること〔Grigorian Mら、J Biol Chem、2001年276（25）：22699-708〕のようなものが含まれる。S100A4タンパク質の細胞外機能には、腫瘍細胞の運動性、生存、およびアポトーシスの細胞特異的なモジュレーター；血管形成因子として作用すること〔Ambartsumian Nら、Oncogene、2001年20（34）：4685-95；Pedersen MVら、J Neurosci Res（ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス・リサーチ）、2004年77（6）：777-86；Belot（ベロット）Nら、Biochim Biophys Acta（バイオキミカ・バイオフィジカ・アクタ）、2002年1600（1-2）：74-83、Pedersen（ペダーセン）KBら、BMC Cancer（キャンサー）2004年19；452〕；転移プロモーター；腫瘍の血管網の増強；新血管形成の刺激、血管内皮細胞の運動性の増加；腫瘍細胞細胞骨格のリモデリング、細胞の運動性および接着性の促進；タンパク質分解活性MMPsの誘導を介する細胞外マトリックスの分解の促進のものが含まれる。細胞外S100A4機能はまた、受容体RAGEへの結合、および細胞内の標的タンパク質（p53、非筋肉ミオシンなど）との相互作用に続くシグナル伝達または内在化のいずれかを介した事象のカスケードの誘発により、腫瘍血管内皮細胞を標的とするものが含まれる。結果として、腫瘍細胞はより進行した転移性表現型の活性を取得する。追加の細胞外S100A4機能には、血管内皮細胞を標的し、それによってそれらの運動性が刺激され、腫瘍の血管形成が増強され、そして従って転移性播種のための経路を提供することが含まれる〔Schmidt-HansenらJ. Biol. Chem. 2004年279（23）：24498-504〕。

用語「高親和性」は、IgG抗体について、少なくとも約10⁷M^-1、少なくとも約10⁸M^-1、少なくとも約10⁹M^-1、少なくとも約10¹⁰M^-1、少なくとも約10¹¹M^-1、または少なくとも約10¹²M^-1またはそれよりも多く、例は、10¹³M^-1または10¹⁴M^-1またはそれよりも多くまでの会合平衡定数（K_a）に言及する。しかし、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプについて異なることがある。

用語「K_a」は、ここで用いるように、特定の抗体-抗原相互作用の会合平衡定数に言及することを意図する。この定数は1/Mの単位を有する。

用語「K_d」は、ここで用いるように、特定の抗体-抗原相互作用の解離平衡定数に言及することを意図する。この定数はMの単位を有する。

用語「k_a」は、ここで用いるように、特定の抗体-抗原相互作用の会合速度定数（kinetic association constant）に言及することを意図する。この定数は1/Msの単位を有する。

用語「k_d」は、ここで用いるように、特定の抗体-抗原相互作用の解離速度定数に言及することを意図する。この定数は1/sの単位を有する。

語句「特定の抗体-抗原相互作用」は、平衡および速度定数が測定される際の実験条件を指す。

用語「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例は、IgMまたはIgG1）を指す。

用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、DNA分子およびRNA分子を含むことを意図する。核酸は一本鎖または二本鎖であり得る。

用語「分離（単離）された核酸」または「分離（単離）されたポリヌクレオチド」は、ヒトまたはネズミS100A4に結合する抗体またはそれらの抗体断片（例は、VR、VL、CDR3）をコード化する核酸を参照し、抗体または抗体部分をコード化するヌクレオチド配列が、ヒトまたはマウスS100A4以外の抗原に結合する抗体または抗体部分をコードする他の塩基配列を含まない核酸に言及するために意図され、他の配列はヒトゲノムDNAにおいて核酸の側面に自然に位置してよい。

用語「安定性」は、抗体またはその断片に関して用いるように、抗体または抗原結合断片の活性が、12日間、血清中でのインキュベーション後に直接結合ELISAによって決定するときに、-20℃、4℃、または37℃でEC₅₀の開始値に匹敵することに言及する。

用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域（存在する場合）を有する抗体が含まれる。本発明のヒト配列抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列（例は、インビトロのランダムまたは部位特異的変異誘発によって、またはインビボの体細胞変異によって導入された変異）によってコード化されないアミノ酸残基を含むことができる。しかしながら、用語「ヒト抗体」は、ここで用いられるように、マウスのような別の哺乳動物種の生殖細胞に由来するCDR配列が、ヒトフレームワーク配列上にグラフトされる抗体（すなわち、ヒト化抗体）を含むことを意図していない。

用語「キメラ抗体」は、アクセプター抗体由来の軽鎖および重鎖の定常領域に関連して、ドナー抗体由来の天然由来の可変ドメイン（軽鎖および重鎖）が含まれる操作された抗体の種類を指す。

用語「ヒト化抗体」は、操作された抗体の種類を指し、非ヒトのドナー免疫グロブリン由来のそのCDRsを有し、分子の残りの免疫グロブリン由来の部分は、1（またはそれよりも多く）のヒト免疫グロブリン（群）から誘導される。追加的に、フレームワークのサポート残基は結合親和性を保つために変えられうる〔たとえば、Queen（クイーン）ら（et aI）、Proc. Natl Acad Sci USA、86：10029-10032（1989年）、Hodgson（ホジソン）ら、Bio/Technology、9： 421（1991年）〕。適切なヒトアクセプター抗体は、ドナー抗体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列への相同性によって、慣習的なデータベース、例は、KABAT（R）（商標）データベース、ロスアラモスデータベース、およびスイスタンパク質データベースから選択されたものであってもよい。ドナー抗体のフレームワーク領域（アミノ酸ベース）との相同性によって特徴付けられたヒト抗体は、重鎖定常領域および/またはドナーCDRsの挿入のための重鎖可変フレームワーク領域を提供するために適しうる。軽鎖の定常または可変フレームワーク領域を供与することが可能な適切なアクセプター抗体は、同様の方法で選択することができる。アクセプター抗体の重鎖および軽鎖は、同じアクセプター抗体に由来する必要はないことに留意すべきである。先行技術では、そのようなヒト化抗体を産生するいくつかの方法を説明し、たとえば、EP-A-0239400およびEP-A-054951を参照。

用語「ドナー抗体」は、改変免疫グロブリンコーディング領域および結果として得られるドナー抗体の抗原特異性および中和活性特性を有する発現された改変抗体を提供するように、第一の免疫グロブリンパートナーのその可変ドメイン、CDRs、または他の機能的断片またはその類似体のアミノ酸配列に与えられる抗体（モノクローナル抗体、および/または組換え体）に言及する。

用語「アクセプター抗体」は、ドナー抗体に対して異種の抗体（モノクローナルおよび/または組換え体）に言及し、それは、その重鎖および/または軽鎖フレームワーク領域および/または第一の免疫グロブリンパートナーへの重鎖および/または軽鎖の定常領域をコードするアミノ酸配列のすべて（または任意の部分、好ましくはすべて）を与えられる。ヒト抗体はアクセプター抗体である。

頭字語「CDRs」は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変ドメインである抗体の相補性決定領域のアミノ酸配列を指す。例は、Kabat（カバト）ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest（免疫学的に興味あるタンパク質の配列）、第四版（4th Ed.）、U.S. Department of Health and Human Services（米国保健社会福祉省）、National Institutes of Health（国立衛生研究所）(1987年)を参照。免疫グロブリンの可変部分において3つの重鎖および3つの軽鎖CDRs（またはCDR領域）がある。したがって、ここで用いるように、「CDRs」は、すべての3つの重鎖CDRs、またはすべての3つの軽鎖CDRs（または適切な場合は、両方のすべての重鎖およびすべての軽鎖CDRs）を指す。抗体のタンパク質の構造および折り畳み（フォールディング）は、他の残基が抗原結合領域の一部と考えられ、そして当業者によってそうであることが理解されるであろうことを意味しうる。たとえば、Chothia（ホティア）ら、（1989年）Conformations of immunoglobulin hypervariable domains（免疫グロブリン超可変ドメインのコンフォメーション）；Nature、342、p877-883を参照。CDRsは、抗原またはエピトープに対する抗体結合用の接触残基の大部分を提供する。本発明における関心のCDRsは、ドナー抗体可変重鎖および軽鎖配列に由来し、および自然に生じるCDRsの類似体が含まれ、それはまた類似体またはドナー抗体と同じ抗原結合特異性および/または中和能力を共有し、または保持し、それからそれらが誘導された。

本明細書を通して、抗体配列中のアミノ酸残基は、Kabatスキームに従って番号が付けられる。同様に、用語「CDR」、「CDRL1」、「CDRL2」、「CDRL3」、「CDRH1」、「CDRH2」、「CDRH3」は、Kabatら、Sequences of proteins of Immunological Interest NIH、1987年に記載のKabatの番号付けシステムに従う。たとえば、Chothiaら（1989年）に定めるもののようなCDR配列の代わりの定義が存在することは、当業者には明らかであろう。

用語「由来する」は、それが材料の物理的な起源であるという意味で、供給源を定義するだけでなく、材料に対し構造的には同一である（一次アミノ酸構造に関して）材料であるが、基準供給源からもたらされない材料をも定義することを意図していることは当業者には明らかであろう。したがって、たとえば、「CDRH3が導かれるドナー抗体に見出される残基」は、必ずしもドナー抗体から精製されている必要はない。

用語「VH」および「VL」は、抗体のそれぞれの重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインに言及する。

ここで用いるように「エフェクター機能」は、抗体依存性細胞媒介細胞傷害活性（ADCC）および補体依存性細胞傷害活性（CDC）媒介応答、Fc媒介食作用およびFcRn受容体を介した抗体リサイクリングの1以上を指すことを意図される。抗体の定常領域および様々なFc受容体（FcR）の間の相互作用は、抗体のエフェクター機能を媒介すると考えられている。重要な生物学的効果は、エフェクター機能の結果、特に、抗体依存性細胞傷害（ADCC）、補体の固定（補体依存性細胞傷害活性またはCDC）、食作用（抗体依存性細胞媒介食作用またはADCP）および抗体の半減期/クリアランスであることができる。通常、エフェクター機能を媒介する能力は、抗原に対する抗体の結合を必要とし、およびすべての抗体があらゆるエフェクター機能を媒介することはない。エフェクター機能は、多数の方法で、たとえば、ナチュラルキラー細胞へのFcyR1l1の結合を介すること、またはADCCエフェクター機能について測定するために単球/マクロファージへのFcyRIを介することを含むものにおいて測定することができる。

抗体の重鎖定常領域に対する様々な修飾は、所望のエフェクター特性に応じて行うことができる。本質的に、a）古典経路による補体の活性化の機能、およびb）抗体依存性細胞傷害性を媒介することが欠けるヒト定常領域には、IgG4定常領域およびIgG2定常領域が含まれる。特定の変異を含むIgG1定常領域は、別途にFc受容体への結合を減少させることが記載されており、そして従って、ADCCおよびCDCを減少する〔Duncan（ダンカン）ら、Nature、1988、332；563-564；Lund（ランド）ら、J. Immunol.、1991年、147；2657-2662；Chappel（チャペル）ら、PNAS、1991年、88；9036-9040；Burton（バートン）およびWoof（ウーフ）、Adv. Immunol（アドヴァンシーズ・イン・イムノロジー）、1992年、51；1-84；Morgan（モルガン）ら、Immunology、1995年、86；319-324；Hezareh（ヘザレ）ら（etal）、J. Virol.（ジャーナル・オブ・ヴァイロロジー）、2001年、75（24）；12161-12168〕。特定の変異または残基Asn297上の改変されたグリコシル化を含むヒトIgG1定常領域はまた、Fc受容体への結合を強化するために記載されている。これらはまた、いくつかのケースで、ADCCおよびCDCを増強することが示されている〔Lazar（ラザール）ら、PNAS、2006年、103；4005-4010；Shields（シールズ）ら、J Bioi Chem、2001年、276；6591-6604；Nechansky（ネチャンスキー）ら、Mollmmunol（モレキュラー・イムノロジー）、2007年、44；1815-1817〕。

IgG抗体について、ADCCおよびADCPを含むエフェクターの機能性は、免疫細胞の表面上に存在するFcγ受容体のファミリーとの重鎖定常領域の相互作用によって媒介される。ヒトでは、これらには、FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）およびFcγRIII（CD16）が含まれる。抗原に結合した抗体およびFc/Fcγ複合体の形成の間の相互作用は、細胞傷害性、免疫細胞活性化、食作用および炎症性サイトカインの放出を含む一連の効果を誘導する。定常領域における特定の置換（S239D/I332Eを含む）は、一定のFc受容体のための重鎖定常領域の親和性を高めることが知られており、このようにして、抗体のエフェクター機能が高められる〔Lazarら、PNAS 2006年）。

用語「相同性」または「配列相同性」は、配列間の類似性の程度を指し、それらの共通の祖先に起因する。相同性を算出するために、FASTA、BLASTのような、当業者によって知られる様々な配列データベースの類似性検索ツールが存在する。

用語「同一」または「配列同一性」は、場合によっては、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドについて、以下の（1）および（2）に提供されたアルゴリズムを用いて計算した比較を意味する。すなわち、
（1）ポリヌクレオチドについての同一性は、所定の配列におけるヌクレオチドの合計数に、100で割ったパーセント同一性を規定する整数を乗じ、そして次いで前記配列においてヌクレオチドの前記合計数からその生成物（積）を差し引くことによって算出され、または：
nn≦xn-(xn^●y）、
式中、nnはヌクレオチド変化（nucleotide alterations）の数であり、xnは所定の配列におけるヌクレオチドの合計数であり、yは95％についての0.95、97％についての0.97または100％についての1.00であり、および^●は、乗算演算子の符号であり、およびそこでは、xnおよびyの任意の非整数の積はxnからそれを差し引く前に、最も近い整数に切り捨てる。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変化は、このコード配列においてナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト変異をつくり、そしてこれにより、このような変異後にポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを変えることができる。
（2）ポリペプチドについての同一性は、アミノ酸の合計数に、100で割ったパーセント同一性を規定する整数を乗じ、そして次いでアミノ酸の前記合計数からその生成物（積）を差し引くことによって算出され、または：
na≦na-(xa^●y)、
式中、naはアミノ酸変化の数であり、xaは配列におけるアミノ酸の合計数であり、yは95％について0.95、97％について0.97、100％について1.00であり、および^●は乗算演算子の符号であり、およびそこではxaおよびyの任意の非整数の積はxaからそれを引く前に、最も近い整数に切り捨てられる。

用語「変形物（変異体）変種（群）」は、基準ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの、それぞれと相違するが、本質的な特性を保持するポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。ポリヌクレオチドの典型的な変種は、別の、基準のポリヌクレオチドとヌクレオチド配列が異なる。変種のヌクレオチド配列における変化は、基準ポリヌクレオチドによってコード化されるポリペプチドのアミノ酸配列を変えてよく、または（mayor）そうでなくてよい。後述するように、ヌクレオチドの変化は、アミノ酸の置換、付加、欠失、融合タンパク質および基準配列によりコード化されるポリペプチドにおける切り詰めをもたらすことができる。ポリペプチドの典型的な変異体は、別の、基準ポリペプチドとアミノ酸配列で異なる。大抵、差異は、基準ポリペプチドおよび変種の配列が、全体的に極めて類似し、多くの領域において同一であるように制限される。変異体および基準ポリペプチドは、任意の組合せにおいて1以上の置換、付加、欠失によりアミノ酸配列が異なることができる。置換され、または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝コードによってコード化されてよく、またはそうでなくてよい。一定のアミノ酸置換が「保存的」であるとみなされることは、当該技術分野においてよく認識されている。アミノ酸は、本発明の抗体の、またはその抗原結合断片の結合親和性のすべてまたは実質すべてを維持する基内の共通の側鎖特性および置換に基づく基に分けられ、保存的置換とみなされ、以下の表を参照する。すなわち、

本発明のいくつかの態様では、いくつかの、たとえば、5-10、1-5、1-3、1-2のアミノ酸残基、または1のアミノ酸残基が、置換、欠失、または任意の組合せで追加された変異体が含まれる。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は自然に対立遺伝子変異体などのように発生し、またはそれが天然に存在することが知られていない変異体であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの非天然変異体は、変異誘発技術によって、直接合成によって、および当業者に知られている他の組換え方法によって作ることができる。

キメラおよびヒト化抗体の生産

ヒトの疾患または障害の治療における無傷の非ヒト抗体の使用は、今では十分に確立された免疫原性の問題が発生する可能性を運び、すなわち、患者の免疫系では、非ヒトの無傷の抗体を非自己として認識し、そして中和応答を高める。これは、ヒト患者への非ヒト抗体の反復投与時に特に顕著である。様々な技術が、これらの問題を克服し、一般的に、免疫した動物、例は、マウス、ラットまたはラビットから非ヒト抗体を得るための相対的な容易さを維持しながら、無傷の抗体での非ヒトアミノ酸配列の組成を低減すること関与し、長年にわたって開発された。大きく二つのアプローチがこれを達成するために使用される。第一は、一般的にヒト定常領域に融合した非ヒト（例は、マウスなどのようなげっ歯類）の可変ドメインを含むキメラ抗体である。抗体の抗原結合部位は可変ドメイン内に局在化されるので、キメラ抗体は、抗原に対する結合親和性を保持するが、ヒト定常領域のエフェクター機能を獲得し、したがって、上記に説明したようにエフェクター機能を実行することができる。キメラ抗体は、典型的には、組換えDNA法を用いて生産される。抗体をコード化するDNA（例は、cDNA）は、慣習的な手順を使用して（例は、本発明の抗体のH及びL鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）、分離され、配列決定されてる。ハイブリドーマ細胞は、このようなDNAの典型的な供給源として働く。一旦単離されると、DNAは発現ベクター中に配置され、それは次いで大腸菌、COS細胞、CHO細胞または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトされ、それらは他の方法では抗体の合成物を得るために免疫グロブリンタンパク質を産生しない。DNAは対応する非ヒト（例は、ネズミ）のHとLの定常領域のためのヒトLおよびH鎖のコード配列を置換することによって修飾することができ、例は、Morrison（モリソン）；PNAS、81、6851（1984年）を参照。

第二のアプローチは、抗体の非ヒト内容物が可変ドメインをヒト化することによって低減されるヒト化抗体の生成を含む。ヒト化のための2つの手法が人気を集めている。第1には、CDR移植によってヒト化することである。CDRsは、それらが、フレームワーク領域によって提供される足場に取り付けられた表面を形成する抗体のN-末端に近いループを構築する。抗体の抗原結合特異性は、主にトポグラフィーによって、およびそのCDR表面の化学的特性によって規定される。これらの特色は、順に、個々のCDRsのコンフォメーションによって、CDRsの相対的な配置によって、およびCDRsを含む残基の側鎖の性質および配置によって決定される。免疫原性の大幅な減少はヒトフレームワーク（「アクセプターフレームワーク」）および定常領域上に、非ヒト（例は、ネズミ）抗体（「ドナー」抗体）のCDRのみを移植することによって達成することができる〔Jones（ジョーンズ）ら（1986年）Nature、321、522-525およびVerhoeyen（ベルホーエン）Mら、（1988年）Science、239、1534-1536を参照〕。しかし、CDR移植はそれ自体、抗原結合特性の完全保持をもたらさないかもしれず、そしてそれはしばしば、重要な抗原結合親和性が回復される場合、ドナー抗体の若干のフレームワーク残基が、（時には、「バック変異」と称され）、ヒト分子内に保持する必要があることを見出される〔Queen（クイーン）Cら（1989年）PNAS 86、10029-10033、Co（コ）, Mら（1991年）Nature、351、501-502参照〕。このケースでは、非ヒトドナー抗体に最大の配列相同性を示すヒト可変ドメインは、ヒトフレームワーク（FR）を提供するために、データベースから選択される。ヒトFRの選定は、ヒトコンセンサスまたは個々のヒト抗体から作製することができる。必要に応じて、ドナー抗体からのキーとなる残基は、CDRのコンフォメーション（立体配座）を維持するためにヒトアクセプターフレームワークに置換される。そのような構造的に重要な残基を特定するために多分使用される抗体のコンピュータモデリングはWO99/48523を参照。

あるいはまた、ヒト化は、「ベニーリング（veneering）」のプロセスによってたぶん達成される。ユニークなヒトおよびネズミ免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変ドメインの統計分析は、露出残基の正確なパターンがヒトおよびネズミ抗体で異なっていることを明らかにし、そしてほとんどの個々の表面の位置は、少数の異なる残基について大いに好まれる〔Padlan（パドラン）EAら、（1991年）Mol. Immunol.、28、489-498およびPedersen（ペダーセン）JTら、（1994年）J.Mol.Biol 235；959-973〕。

したがって、通常ヒト抗体で見出されるものと異なるそのフレームワーク領域において露出残基を置換することにより、非ヒトFvの免疫原性を低減することができる。タンパク質の抗原性は表面アクセシビリティ（可触性）と相関しえるので、表面残基の置換は、マウス可変ドメインを、ヒトの免疫系に対し、「見えない」ようにするために十分であるかもしれない〔また、Mark（マーク）, G.E.ら（1994年）in Handbook of Experimental Pharmacology実（イン・ハンドブック・オブ・エクスペリメンタル・ファーマコロジー）vol.113（第113巻）：The pharmacology of monoclonal Antibodies（モノクローナル抗体の薬理学）、Springer-Verlag（シュプリンガー・フェアラーク）、pp105-134〕。ヒト化のこの手法は、抗体の表面のみが変えられるので、「ベニーリング」と称され、支持残基は邪魔されずに残る。

ヒト抗体の生産

本発明のモノクローナル抗体（mAbs）は、慣習的なモノクローナル抗体法、例は、Kohler（ケーラー）およびMilstein（ミルスタイン）、Nature、256：495（1975年）の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む、様々な技術によって生産することができる。モノクローナル抗体を産生するための任意の技術は、例は、Bリンパ球のウイルスまたは発癌性形質転換を採用することができる。ハイブリドーマを調製するための一つの動物系はネズミ系である。マウスにおけるハイブリドーマの生産は非常によく確立された手順である。融合のために免疫された脾細胞を分離するための免疫化のプロトコルおよび技術は、当技術分野で知られている。融合パートナー（例は、ネズミ骨髄腫細胞を参照）および融合手順も知られている〔例は、Harlow（ハーロー）およびLane（レーン）（1988）、Antibodies, A Laboratory Manual（抗体、実験室マニュアル）、Cold Spring Harbor Laboratory Press（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）、Cold Spring Harbor New York（コールド・スプリング・ハーバー・ニューヨーク）参照〕。

ネズミまたはヒトS100A4に対するヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫系よりはむしろ、マウス系を有するトランスジェニックマウスを用いて生成することができる。トランスジェニックマウスのいくつかの系統が利用可能であり、そこでは、それらのマウス免疫グロブリン遺伝子座はヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントに置き換えられる〔Tomizuka（トミヅカ）K、（2000年）PNAS、97、722-727、Fishwild（フィシュワイルド）D.M（1996年）、Nature Biotechnol.（ネイチャー・バイオテクノロジー）14、845-851、Mendez（メンデス）MJ、1997年、Nature Genetics（ネイチャー・ジェネティックス）、15、146-156参照〕。抗原チャレンジ（投与）時には、そのようなマウスは、ヒト抗体のレパートリーを産生することができ、そこから目的とする抗体を選択することができる。特に注目すべきなのは、Trimera（トリメラ）^ＴＭ（商品名）システムであり〔Eren（エレン）Rら、（1998年）、Immunology、93：154-161参照〕、そこではヒトのリンパ球を放射線照射したマウス、Selected Lymphocyte Antibody System（選定したリンパ球抗体システム）に移植し〔SLAM、Babcook（バブクック）ら、PNAS（1996年）93：7843-7848参照〕、そしてヒト（または他の種）のリンパ球が、絡まりを解かれ（deconvulated、deconvolute）、限界希釈法および選択手順およびXenomouse（ゼノマウス）II^TM〔Abgenix Inc（アブジェニックス社）〕が続く大規模なプールされたインビトロの抗体生成手順が効果的に達成される。別のアプローチはMorphotek（モルフォテック社）からMorphodoma（モルフォドーマ）^TMテクノロジーを用いて入手可能である。

ヒトまたはネズミのS100A4に対する全長（完全）ヒトモノクローナル抗体を生成するための詳細な手順は、以下の例に記載する。種々の抗原を伴う累積的経験は、トランスジェニックマウスが、完全フロイントアジュバントにおいて抗原により腹腔内（IP）で初期に免疫化されたときに応答し、次いで不完全フロイントアジュバントにおいて抗原により隔週でIP免疫化が続く（計6まで）ことを示した。しかし、フロイント以外のアジュバントも有効であることが見出される。また、アジュバントの不存在下で、全細胞が高い免疫原性であることが見出される。免疫応答は、後眼窩出血（retroorbital bleeds）により得られる血しょう検体を用いた免疫化プロトコルの過程にわたり監視することができる。血しょうは、ELISAによってスクリーニングすることができ、抗S100A4ヒト免疫グロブリンの十分な力価を有するマウスを融合に使用することができる。マウスは犠牲にし、そして脾臓の除去する前3日で、抗原を静脈内にブースト（追加免疫）することができる。各免疫化のための2-3の融合が実行される必要があるかもしれないと予想される。6および24匹の間のマウスは典型的に、各抗原に対して免疫化される。

ヒト抗S100A4抗体を精製するために、選択したハイブリドーマをモノクローナル抗体精製用の2リットルのスピナーフラスコ中で増殖させることができる。上清をプロテインA-セファロース〔Pharmacia（ファルマシア社）、Piscataway（ピスカタウェイ）、NJ〕を用いたアフィニティークロマトグラフィーの前に、ろ過し、濃縮することができる。溶出したIgGは、純度を確保するため、ゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーで確認することができる。緩衝液をPBSに交換することができ、そして濃度を1.43の吸光係数を用いるOD280によって決定することができる。モノクローナル抗体は小分けし、そして-80℃で保存することができる。

選択されたヒト抗S100A4モノクローナル抗体が固有のエピトープに結合するかどうかを判断するため、各抗体を、市販の試薬〔Pierce（ピアス社）、Rockford（ロックフォード）、IL〕を用いてビオチン化することができる。未標識モノクローナル抗体およびビオチン化モノクローナル抗体を用いた競合研究は、ヒトまたはマウスS100A4-コーティングしたELISAプレートを用いて行うことができる。ビオチン化mAb結合は、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼプローブで検出することができる。

精製抗体のアイソタイプを決定するために、アイソタイプELISAを行うことができる。マイクロタイタープレートのウェルを、4℃で一晩、抗ヒトIgGの1μg/mlでコーティングすることができる。1％BSAでブロッキングした後、プレートを1〜2時間、周囲温度で、モノクローナル抗体または精製アイソタイプコントロールの1μg/mlまたはそれよりも少ないものと反応させる。ウェルをヒトIgG1またはヒトIgM特異的アルカリホスファターゼ結合（コンジュゲート）プローブのいずれかと反応させることができる。プレートを展開させ、そして上記のように分析する。

ヒトまたはマウスのS100A4を発現する生きた細胞へのモノクローナル抗体の結合を実証するために、フローサイトメトリーを使用することができる。簡単には、ヒトまたはマウスS100A4を発現する細胞株（標準増殖条件下で培養した）を、0.1％BSAおよび10％ウシ胎仔血清を含むPBS中でモノクローナル抗体の様々な濃度を混合し、1時間37℃でインキュベートする。洗浄した後、細胞を、一次抗体染色と同じ条件下でフルオレセイン標識抗ヒトIgG抗体と反応させる。試料は、単一細胞にゲート制御する（gate on）光および側方散乱特性を用いたFACScan装置によって分析することができる。蛍光顕微鏡を用いる代替アッセイは（加えて、またはその代わりに）フローサイトメトリーアッセイを使用することができる。細胞は、上記のように正確に染色し、そして蛍光顕微鏡によって検査することができる。この方法は、個々の細胞の可視化を可能にするが、抗原の密度（濃度）に応じて感度を減少させている可能性がある。

抗S100A4ヒトIgGはさらにウエスタンブロッティングによってヒトまたはマウスS100A4抗原との反応性について試験することができる。簡単には、ヒトまたはマウスS100A4を発現する細胞からの細胞抽出物を調製し、そしてドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に供することができる。電気泳動後、分離した抗原を、ニトロセルロース膜に移し、10％ウシ胎仔血清でブロックし、テストするモノクローナル抗体でプローブされる。ヒトIgG結合は、抗ヒトIgGアルカリホスファターゼを用いて検出し、BCIP/NBT基質タブレット〔Sigma Chem.（シグマケム社）、St. Louis（セントルイス）、MO〕で発色させることができる。

ファージディスプレイ技術は、ヒト抗体（およびその断片）を生成するために使用することができ、McCafferty（マッカファティ）；Nature、348、552-553（1990年）およびGriffiths（グリフィス）ADら（1994年）EMBO 13：3245-3260を参照される。この技術によれば、抗体可変ドメイン遺伝子は、M13またはfdなどのような糸状バクテリオファージのタンパク質遺伝子のメジャーまたはマイナーコートのどちらかにフレームでクローニングされ、そしてそのファージ粒子の表面上でその機能的抗原結合断片として表示される（通常、ヘルパーファージの助けを借りる）。抗体の機能特性に基づいた選択は、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択をもたらす。ファージディスプレイ技術は、上記記載の疾患または障害に罹患した個体から、あるいは、免疫化されていないヒトのドナーから採取したヒトB細胞から作製したライブラリーからの抗原特異的な抗体を選択するために使用することができる〔Marks（マークス）； J.Mol.Bio.、222、581-597、1991年を参照〕。無傷のヒト抗体は定常ドメインを含むのが望まれているところでは、ファージディスプレイされた導かれた断片を、所望の定常領域を含み、そして安定な発現細胞系（株）を確立する哺乳動物発現ベクター中に再クローンすることが必要である。

親和性成熟の技術〔Marks；Bio/technol、10、779-783（1992年）〕を用いて、結合親和性を向上させることができ、そこでは初代ヒト抗体の親和性が、順次、H鎖およびL鎖可変ドメインを自然に生じる変異体で交換すること、および改良された結合親和性に基づいて選択することによって改善される。「エピトープインプリンティング」のようなこの技術の変形物も利用できる：WO93/06213参照。また、Waterhouse（ウォーターハウス）；Nucl.Acids Res、21、2265-2266（1993年）が参照される。

製薬上組成物

本発明は、モノクローナル抗体またはその断片の1または組合せを、その薬学的に許容可能な担体と一緒に調剤されて含む製薬上組成物（医薬組成物）を提供する。いくつかの組成物には、本発明の複数（例は、2以上の）の分離された抗体またはその断片の組合せが含まれる。若干の組成物では、その組成の抗体またはその断片の各々は、ヒトまたはマウスS100A4の別個の、あらかじめ選択されたエピトープに結合するモノクローナル抗体である。

選択した投与経路にかかわらず、本発明の化合物は、適切な水和形態で、または本発明の医薬組成物に使用することができ、当業者に知られる慣習的な方法によって薬学的に許容可能な剤形に調剤される。

抗体を伴う投与について、投薬量は、ホストの体重の、約0.0001から100mg/kgまで、より一層通常は0.01乃至5mg/kgの範囲である。たとえば、投薬量は1mg/kg体重または10mg/kg体重または1-10mg/kgの範囲内とすることができる。免疫原をコードする核酸のための用量は、受動体（患者）あたり、約10ngから1グラムまで、100ng乃至100mg、1μg乃至10mg、または30-300μgのDNAの範囲である。感染性ウイルスベクターの用量は、用量当たり10-100、またはそれよりも多いビリオンまで変動する。

治療上の適用については、医薬組成物は、確立された疾患を患う患者に、疾患、その症状または生化学的マーカーを抑え、またはさらに進展するのを抑制し、または逆転させ、または排除するのに十分な量で投与される。予防的な適用のために、医薬組成物は、疾患を受け易いか、またはそのリスクのある患者に、疾患、その症状または生化学的マーカーの発達を遅延、抑制または防ぐのに十分な量で投与される。これを達成するのに十分な量は、「治療上で」または「予防上で有効な用量」として規定される。投薬量は、治療される疾患、対象体の大きさ、対象体の症状の重症度、および選択された特定の組成物または投与の経路に依存する。具体的には、腫瘍の治療において、「治療上有効な投薬量」は、未処理の対象体に比較して腫瘍増殖を、少なくとも約20％、または少なくとも約40％、または少なくとも約60％、または少なくとも約80％抑制することができる。癌を抑制する化合物の能力は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系で評価することができる。あるいはまた、組成物のこの特性は、インビトロで、慣習的なアッセイによって抑制する化合物の能力を調べることで評価することができる。治療上の化合物の治療上有効な量は、腫瘍の大きさを減少させ、またはそうでなければ、対象体における症状を改善することができる。

本発明の組成物は、当技術分野で既知の様々な方法によって投与することができる。投与の経路およびモードは所望の結果に応じて変化する。治療用組成物のためには、本発明の調剤物には、経口、経鼻、局所（頬および舌下を含む）、直腸、膣、および非経口の投与に適したものが含まれる。調剤物は、好ましくは、米国食品医薬品局（FDA）の適正製造基準（GMP）規制に十分に準拠し、薬学の分野で既知の任意の方法により調製することができる。

語句「非経口投与」および「非経口的に投与される」は、経腸および局所投与以外の投与のモードを意味し、通常は注射によるもので、そしてそれには、制限されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下の、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内的（intrastemal）注射および注入が含まれる。

薬学的に許容可能な担体には、溶媒、分散媒、コーティング（被膜）、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれ、それらは生理的に互換性がある。担体（キャリヤ）は、静脈内、筋肉内、皮下、経口、脊髄または表皮の投与（例は、注射または注入による）のために適していてよい。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、抗体またはその断片、二重特異性および多重特異性分子は、化合物を不活性化しうる酸および他の自然条件の作用から化合物を保護する物質で被覆することができる。

活性化合物は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化したデリバリーシステム（送達系）を含め、放出制御（徐放性）製剤のような、急速な放出に対して化合物を保護する担体を用いて調製することができる。生物分解性、生体適合性ポリマー、たとえば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などのようなものを使用することができる。このような製剤を調製するための多くの方法は、たとえば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems（持続的かつ放出制御された薬物送達システム）、J.R. Robinson（ロビンソン）編、Marcel Dekker, Inc.（マーセル・デッカー社）、ニューヨーク、1978年によって記載されている。

投与の一定の経路により本発明の化合物を投与するために、化合物をその不活性化を防止する材料でコートするか、または化合物を同時投与することが必要な場合がある。たとえば、化合物は、適当な担体、例えば、リポソーム、または希釈剤において対象体に投与することができる。薬学的に許容可能な希釈剤には、生理食塩水および緩衝水溶液が含まれる。リポソームには、水中油中水（water-in-oil-in-water）CGFエマルジョン（乳剤）ならびに慣習的なリポソームが含まれる〔Strejan（ストリージャン）ら（1984年）J. Neuroimmunol.、7：27〕。上記のように、活性化合物は好適に保護されるとき、化合物は、例えば、経口的に不活性希釈剤または同化（吸収可能な）食用担体と共に投与することができる。

典型的な薬学的に許容可能な担体には、滅菌注射用溶液または分散物の即時調製のための滅菌水溶液または分散物、および滅菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質のためのそのような媒質および薬剤の使用は、当技術分野で知られている。ただし、任意の慣習的な媒体または薬剤が活性化合物と不適合である限り、本発明の医薬組成物におけるその使用が意図される。補助的な活性化合物も組成物に組み入れることができる。

治療用組成物は典型的には、滅菌の、実質的に等張であり、および製造および貯蔵の条件下で安定でなければならない。それらは容易に注入可能性が存在する程度に流動性であるべきで、そしてそのような細菌および真菌などのような微生物の汚染作用に対して保護されるべきである。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬物濃度に適した他の秩序構造として調剤化することができる。担体は、たとえば、水、等張性緩衝化塩類溶液（生理食塩水）、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコール、等）、およびそれらの適切な混合物、植物油で、オリーブ油のようなもの、および注射可能な有機エステルで、オレイン酸エチルなどのようなものを含めた、溶媒または分散媒体であることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのようなもののコーティングの使用により、分散物の場合には必要な粒子サイズ（粒径、粒度）の維持により、および界面活性剤の使用により、維持することができる。多くの場合、それには、等張剤、例えば、そのような組成物では、糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムを含有することが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、組成物において、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを含むことによってもたらされうる。

滅菌注射可能な溶液は、1または上記に列挙した成分の組み合わせを有する適切な溶媒中に必要量の活性化合物を配合することにより調製し、必要に応じて、その後滅菌精密ろ過を続けることができる。大抵は、分散物は、上記に列挙したものから基本的分散媒および必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに活性化合物を組み入れることによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分に、その予め濾過滅菌した溶液からの任意の追加の所望成分を加えた粉末を生じる真空（減圧）乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）である。

これらの組成物はまた、保存料（防腐剤）、湿潤剤、抗酸化剤、乳化剤、および分散剤などのような賦形剤を含むことができる。微生物の存在の防止は、滅菌手順で、前掲のものによって、および様々な抗菌剤および抗真菌剤の含有によって、それらの両方を確保することができ、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などが挙げられる。薬学的に許容可能な抗酸化剤としては、例えば、（1）水溶性抗酸化物質で、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどのようなもの；（2）油溶性抗酸化剤で、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソールのようにソール（BHA）、ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ-トコフェロール、等のようなもの、および（3）金属キレート剤で、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが含まれる。

治療用組成物はまた、当技術分野で知られている医療装置（医療用デバイス）と一緒に投与することができる。例えば、好ましい実施形態では、本発明の治療上組成物は、ニードルレス皮下注射装置、制御された速度で薬物を分配するための移植可能な微量注入ポンプなどを用いて投与することができる。

本発明の化合物が、ヒトおよび動物に、医薬品として投与される場合、それらは単独または例えば、薬学的に許容可能な担体との組み合わせで、活性成分の0.01から99.5％（または0.1乃至90％）を含有する医薬組成物として与えることができる。

本発明の方法および使用

本発明の、ヒトまたはマウスS100A4に対するモノクローナル抗体およびその断片およびその誘導体またはコンジュゲートは、インビトロおよびインビボの診断および治療上の有用性（ユーティリティ）がある。例えば、これらの分子は、培養における細胞、組織、器官に、例は、インビトロまたはエキソビボで、または対象体において、例は、インイボで、治療、予防、監視、または種々の障害を診断するために投与することができる。

「対象体」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物が含まれる。非ヒト動物には、すべての脊椎動物、例は、哺乳動物および非哺乳動物で、霊長類および非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ラビット（ウサギ）、ラット、マウス、カウ（ウシ）、チキン（ニワトリ）、両生類、および爬虫類のようなものが含まれる。顕著な場合を除き、「受動体（患者）」または「対象体」という用語は、同じ意味で使用される。

方法は、制限されないが、以下のものを含む癌の任意の種類を治療するために使用することができ、それは、乳癌、前立腺癌、リンパ腫、皮膚癌、膵臓癌、結腸癌、メラノーマ、悪性黒色腫、卵巣癌、脳癌、原発性脳腫瘍、頭頸部癌、神経膠腫、神経膠芽腫、肝臓癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、頭頸部癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、小細胞肺癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、精巣癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌、大腸癌、前立腺癌、泌尿生殖器癌、甲状腺癌、食道癌、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫、副腎癌、腎細胞癌、子宮内膜癌、副腎皮質癌、悪性膵インスリノーマ、悪性カルチノイド癌、絨毛癌、菌状息肉症、悪性高カルシウム血症、子宮頸部過形成、白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性顆粒球性白血病、ヘアリー細胞白血病、神経芽腫、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、真性多血症、本態性血小板血症、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、軟部組織肉腫、骨肉腫、原発性マクログロブリン血症、および網膜芽細胞腫である。いくつかの実施形態では、治療を受けるがん細胞は転移性である。他の実施形態では、治療を受ける癌細胞は抗癌剤または抗血管新生剤に耐性である。

特に、本発明の抗体およびその断片は、腫瘍の治療のために使用することができ、その腫瘍は、乳癌、前立腺癌、肺癌、大腸癌、膵臓癌、腎癌、胃癌、卵巣癌、甲状腺乳頭癌、黒色腫、肝細胞癌、膀胱癌、脂肪肉腫浸潤癌、神経芽腫、食道扁平上皮癌、骨肉腫、胆嚢癌、口腔扁平上皮癌、子宮内膜癌、髄芽腫、および任意の他のS100A4発現性腫瘍からなる群から選択される。

特に、本発明の抗体および断片は、腎症、関節リウマチ（reumathoid arthritis、rheumatic arthritis）、肺高血圧症、乾癬、および任意の他のS100A4媒介性疾患を治療するために使用することができる。

進行性または媒介（developing or mediating）腎症におけるS100A4の役割の証拠は、Inoue（イノウエ）, T.、Okada（オカダ）, H.、Takenaka（タケナカ）, T.、Watanabe（ワタナベ）, Y.およびSuzuki（スズキ）, H、2009年〔閉塞性腎症における上皮間葉転換発生を示唆する症例報告、Clin. Exp. Nephrol（クリニカル・アンド・エクスペリメンタル・ネフロロジー）、13、385から388〕；Yamaguchi（ヤマグチ）, Y.ら、2009年〔Epithelial-mesenchymal transition as a potential explanation for podocyte depletion in diabetic nephropathy（糖尿病性腎症における足細胞枯渇の可能性の説明としての上皮間葉転換）、Am. J. Kidney Dis（アメリカン・ジャーナル・オブ・キドニー・デジーズ）、54、653-664〕；Le Hir（ル・ヒル）, M.、Hegyi（ヘジー）, I.、Cueni-Loffing（クエニ-ロフィン）, D.、Loffing, J.およびKaissling（キスリング）, B.、2005年〔Characterization of renal interstitial fibroblast-specific protein 1/S100A4-positive cells in healthy and inflamed rodent kidneys.（健康な、および炎症を起こしたげっ歯類の腎臓における腎間質線維芽細胞特異的タンパク質1/S100A4-陽性細胞のキャラクタリゼーション）Histochem. Cell Biol（ヒストケミストリー・アンド・セル・バイオロジー）123、335-346〕；などによって提供されている。

進行性または媒介関節リウマチにおけるS100A4の役割の証拠は、Bo（ボー）, G.ら2009年〔Analyses of differential proteome of human synovial fibroblasts obtained from arthritis.（関節炎から得られたヒト滑膜線維芽細胞のディファレンシャルプロテオームの解析）、Clin. Rheumatol（クリニカル・リューマトロジー）28、191-199；Oslejskova（オスレコバ）, L.ら、2009年〔Metastasis-inducing S100A4 protein is associated with the disease activity of rheumatoid arthritis.（転移誘導S100A4タンパク質は関節リウマチの疾患活性に関連する）、Rheumatology (Oxford)〔リウマトロジー（オックスフォード）〕、48、1590-1594〕；Masuda（マスダ）, K.ら、2002年〔Molecular profile of synovial fibroblasts in rheumatoid arthritis depends on the stage of proliferation.（関節リウマチにおける滑膜線維芽細胞の分子プロファイルは病期によって異なる。）、Arthritis Res（アースライティス・リサーチ）、4、R8〕などによって提供される。

進行性または媒介肺高血圧症におけるS100A4の役割の証拠は、Peng（パン）, T.ら、2009年〔Plasma levels of S100A4 in portopulmonary hypertension.（門脈肺高血圧症におけるS100A4の血しょうレベル。）、Biomarkers（バイオマーカーズ）、14、156-160〕；Hodge（ホッジ）, S.ら、2009年〔Posttransplant bronchiolitis obliterans syndrome is associated with bronchial epithelial to mesenchymal transition. （移植後の閉塞性細気管支炎症候群は間葉移行に対し気管支上皮と関係する。）、Am. J. Transplant （アメリカン・ジャーナル・オブ・トランスプランテーション）、9、727-733〕；Spiekerkoetter（スピーカーコッター）, E.ら、2008年〔Reactivation of gammaHV68 induces neointimal lesions in pulmonary arteries of S100A4/Mts1-overexpressing mice in association with degradation of elastin.（ガンマHV68の再活性化は、エラスチンの分解に関連してS100A4/Mts1-過剰発現マウスの肺動脈に新生内膜病変を誘導する。）、Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol（アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー・ラング・セルラー・アンド・モレキュラー・フィジオロジー）、294、L276-289〕；Brisset（ブリスセット）, A,C.ら、2007年〔Intimal smooth muscle cells of porcine and human coronary artery express S100A4, a marker of the rhomboid phenotype in vitro.（ブタおよびヒト冠動脈の内膜平滑筋細胞は、インビトロでS100A4、菱形表現型のマーカーを発現する。）、Circ. Res（サーキュレーション・リサーチ）、100、1055-1062〕；Lawrie（ローリー）, A.ら、2005年〔Interdependent serotonin transporter and receptor pathways regulate S100A4/Mts1, a gene associated with pulmonary vascular disease.（相互依存のセロトニントランスポーターおよび受容体経路はS100A4/Mts1、肺血管疾患に関連する遺伝子を調節する。）、Circ. Res、97、227-235〕；Merklinger（メルクリンガー）, S.L.ら、2005年〔Increased fibulin-5 and elastin in S100A4/Mts1 mice with pulmonary hypertension.（肺高血圧症を有するS100A4/Mts1マウスにおける増加したフィブリン-5およびエラスチン。）、Circ. Res、97、596-604〕；Greenway（グリーンウェイ）, S.ら、2004年〔S100A4/Mts1 produces murine pulmonary artery changes resembling plexogenic arteriopathy and is increased in human plexogenic arteriopathy.（S100A4/Mts1は叢生成の動脈症に似たネズミの肺動脈の変化を生成し、ヒトの叢生成の動脈症で増加する。）、Am. J. Pathol（ザ・アメリカン・ジャーナル・オブ・パソロジー）、164、253-262〕；などによって提供される。

進行性または媒介乾癬におけるS100A4の役割の証拠は、Zibert（ジーベル）, JR、Skov（スコフ）, L.、Thyssen（ティッセン）JP、Jacobsen（ヤコブセン）GK、Grigorian（グリゴリヤン）M.、2010年〔Significance of the S100A4 protein in psoriasis.（乾癬におけるS100A4タンパク質の意義。） J Invest Dermatology（ザ・ジャーナル・インヴェスティゲーティブ・ダーマトロジー）、130（1）：150-60〕、エッカート RL、Broome（ブルーム）, AM、Ruse（ルセ）, M、Robinson（ロビンソン）, N、D・Ryan（ライアン）, D.、Lee（リー）K.、2004年〔J Invest Dermatol、123（1）：23-33〕などによって提供される。

用語「処置（治療）」は、疾患の症状、合併症、または生化学的指標の発現を防止するか、または遅らせるために、本発明の化合物または薬剤を投与することを含み、症状が軽減され、または疾患、状況または障害のさらなる発達が抑止または抑制される。治療は、疾患の発現後の症状の予防上（疾患の発症を防止または遅らせ、またはその臨床的または無症状の兆候の発現を防止するため）または治療上の抑制または緩和をすることができる。

キット・オブ・パーツ（キットのパーツ）

本発明はさらに、ここで提示する実施形態のいずれか1つに従う抗体またはその断片を含む製品またはモノクローナル抗体に関するものであり、腫瘍の治療中に同時、個別または逐次使用するための組合せ製剤などのような抗がん剤である。

S100A4に対する抗体が別の薬剤と一緒に投与されるとき、両者は、同時、別々に、または連続して投与することができる。したがって、本発明のそれらの抗体および断片はまた、他の薬剤と組み合わせて、すなわち、併用療法で投与することができる。たとえば、癌の治療において、併用療法は、少なくとも1の抗腫瘍剤または他の慣習的な治療法で、放射線治療のようなものとともに、本発明の抗体組成物を含むことができる。

この抗腫瘍剤または他の慣習的な治療には、制限されないが、アポトーシス調節剤、化学療法上の抗腫瘍薬、免疫療法薬、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗炎症剤、ならびに外科的介入、および放射線療法が含まれる。

適切な抗がん剤の数は、前述の疾患、疾病（maladies）、または障害のいずれかを治療、予防、または改善するための組み合わせまたは同時投与のために意図され、たとえば：アポトーシスを誘導する薬剤；ポリヌクレオチド（例えば、アンチセンス、リボザイム、siRNA）、ポリペプチド（例えば、酵素および抗体）；生物模倣物（例えば、ゴシポールまたはBH3模倣物）；S100A4と結合する薬剤（例えば、オリゴマー化または複合体）；アルカロイド；アルキル化剤；抗腫瘍性抗生物質；代謝拮抗剤；ホルモン剤；白金化合物；モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体（例えば、抗がん剤、毒素、ディフェンシンとの抗体コンジュゲート）、毒素；放射性核種；生物学的応答調節剤（例えば、インターフェロン（例えば、IFN-α）およびインターロイキン（例えば、IL-2））；養子免疫療法剤；造血成長因子；腫瘍細胞の分化を誘導する薬剤（例えば、オールトランスレチノイン酸）；遺伝子治療試薬（例えば、アンチセンス治療試薬およびヌクレオチド）；腫瘍ワクチン；血管新生阻害剤；プロテアソームインヒビター（阻害剤）：NF-κBモジュレーター；抗CDK化合物；HDACインヒビターなどのようなものである。

アポトーシス調節剤には、制限されないが、放射線（例えば、X線、ガンマ線、紫外線）；腫瘍壊死因子（TNF）関連因子（例えば、TNFファミリー受容体タンパク質、TNFファミリーリガンド、TRAIL、TRAILR1またはTRAILR2への抗体）；キナーゼ阻害剤〔例えば、上皮成長因子受容体（EGFR）キナーゼ阻害剤、血管成長因子受容体（VGFR）キナーゼ阻害剤、線維芽細胞増殖因子受容体（FGFR）キナーゼ阻害剤、血小板由来増殖因子受容体（PDGFR）キナーゼ阻害剤、およびBcr-Ablキナーゼ阻害剤（例えば、メシル酸イマチニブなどのようなもの）；アンチセンス分子；抗体（例えば、トラスツズマブ、リツキシマブ、イブリツモマブチウキセタン、およびベバシズマブ）；抗エストロゲン（例えば、ラロキシフェンおよびタモキシフェン）；抗アンドロゲン（例えば、フルタミド、ビカルタミド、フィナステリド、アミノグルテチミド（aminoglutethamide）、ケトコナゾール、副腎皮質ホルモン剤）；シクロオキシゲナーゼ-2（COX-2）阻害剤（例えば、セレコキシブ、メロキシカム、NS-398、および非ステロイド性抗炎症薬（NSAID））；抗炎症薬（例えば、ブタゾリジン（butazolidin）、デキサメタゾン、ヒドロキシクロロキン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン）；および癌化学療法薬（例えば、イリノテカン、フルダラビン、ダカルバジン、ミトキサントロン、ゲムツズマブオゾガマイシン、リン酸エトポシド、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、フルオロウラシル、ドキソルビシン、ゲムシタビン、ボルテゾミブ、ゲフィチニブ、ベバシズマブ、またはパクリタキセル）；細胞シグナル伝達分子；セラミドおよびサイトカイン；スタウロスポリン、などが含まれる。

抗悪性腫瘍薬または抗過剰増殖剤には、アルキル化剤、代謝拮抗剤、および天然物（例えば、ハーブおよび他の植物および動物由来の化合物）が含まれる。

アルキル化剤には、制限されないが、以下のものが含まれる。すなわち、1）ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン（L-sarcolysin、L-サルコリシン）、およびクロラムブシル）；2）エチレンイミンおよびメチルメラミン（例えば、ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ）；3）アルキルスルホン酸塩（例えば、ブスルファン）；4）ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン；ロムスチン；セムスチン；およびストレプトゾシン）；および5）トリアゼン（例えば、ダカルバジン；ジメチルトリアゼノイミド-アゾレカルボキサミド（dimethyltriazenoimid-azolecarboxamide））である。

代謝拮抗剤には、制限されないが、以下のものが含まれる。すなわち、1）葉酸類似体（例えば、メトトレキサート（アメトプテリン））；2）ピリミジン類似体（例えば、フルオロウラシル、フロクスウリジン、およびシタラビン（シトシンアラビノシド））；および3）プリンアナログ（例えば、メルカプトプリン、チオグアニン、およびペントスタチン）である。

化学療法剤には、制限されないが、以下のものが含まれる。すなわち、1）ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン（VLB）、ビンクリスチン）；2）エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシドおよびテニポシド）；3）抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンD）、ダウノルビシン（ダウノマイシン；ルビドマイシン（rubidomycin））、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、およびマイトマイシン（マイトマイシンC））、4）酵素（例えば、L-アスパラギナーゼ）、5）生物学的応答モディファイアー（調節剤）（例えば、インターフェロン-α）、6）白金配位錯体（例えば、シスプラチン（シス-DDP）およびカルボプラチン）；7）アントラセンジオン（例えば、ミトキサントロン）；8）置換尿素（例えば、ヒドロキシウレア）；9）メチルヒドラジン誘導体（例えば、プロカルバジン（N-メチルヒドラジン、MIH））；10）副腎皮質抑制薬（サプレサント）（例えば、ミトタン（O、p'-ジDDD）およびアミノグルテチミド）；11）副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニゾン）；12）プロゲスチン（例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、および酢酸メゲストロール）；13）エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール）；14）抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）；15）アンドロゲン（例えば、プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロン）；16）抗アンドロゲン（例えば、フルタミド）：および17）ゴナドトロピン放出ホルモン類似体（例えば、ロイプロリド）である。

その他の慣習的な抗がん剤には、制限されないが、アドリアマイシン、5-フルオロウラシル、エトポシド、カンプトテシン、アクチノマイシンD、マイトマイシンC、シスプラチン、ドセタキセル、ゲムシタビン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ボルテゾミブ、ゲフィチニブ、ベバシズマブ、脱メチル化剤、her-2の阻害剤、IGF-IRの阻害剤、血管内皮増殖因子（VEGF）、VEGFRの阻害剤、mTOR阻害剤、有糸分裂阻害剤、スマッド（Smad）阻害剤およびタキサンが含まれる。これらの薬剤は、組み合わせた治療用組成物、キットにおいて、または免疫療法剤との組合せにおいて、用意し、そして単独で用いることができる。

任意の種類の放射線は、放射線の線量が許容できない負の副作用がなく、患者によって許容されている限り、患者に投与することができる。放射線治療の適当な種類としては、例えば、電離（電磁）放射線（例えば、X線またはガンマ線）または粒子ビーム放射線療法（例えば、高線形エネルギー放射）が含まれる。

本発明はまた、以下のものに向けられる。すなわち、
[1]．配列番号1、配列番号2、および配列番号3から選択される配列を含む分離されたアミノ酸配列。
[2]．配列番号3を含むポリペプチド：に特異的に結合する抗体またはその断片。
[3]．配列番号3を含むポリペプチドで哺乳動物を免疫することによって産生された、ヒトまたはマウスS100A4ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその断片。
[4]．[2]または[3]のいずれかの抗体またはその断片で、ヒト抗体またはその断片；ヒト化抗体またはその断片；ポリクローナル抗体またはその断片；モノクローナル抗体またはその断片；Fab抗体；およびキメラ抗体またはその断片から選択された抗体またはその断片。
[5]．モノクローナル抗体で、前記モノクローナル抗体は、配列番号1を含む軽鎖ポリペプチドを含み、または前記モノクローナル抗体は配列番号2を含む重鎖ポリペプチドを含む。
[6]．フレームワーク領域（FR）および相補性決定領域（CDR）を含むモノクローナル抗体で、モノクローナル抗体は、配列番号1を含む軽鎖および配列番号2を含む重鎖を含む。
[7]．[5]または[6]のモノクローナル抗体で、モノクローナル抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、およびキメラ抗体またはその断片から選択される。
[8]．[5]、[6]または[7]のモノクローナル抗体で、前記モノクローナル抗体は以下のもの、
a）ヒトまたはマウスS100A4タンパク質のみと反応する；または
b）ヒトまたはマウスS100A4タンパク質の作用のメカニズムをブロックする；または
c）ヒトまたはマウスS100A4タンパク質のインビトロでのまたはインビボでの機能的活性をブロックする；または
d）ヒトまたはマウスS100A4タンパク質によって、または内皮細胞における血管内皮増殖因子（VEGF）と結合したヒトまたはマウスS100A4タンパク質により誘導されたプロマイグラトリー効果をブロックする、または
e）腫瘍の増殖をブロックする；または
f）腫瘍の発生をブロックする；または
g）腫瘍の血管形成をブロックする；または
h）細胞播種および転移確立をブロックする；または
i）癌幹細胞をブロックする；または
j）上記a）〜i）の任意の組み合わせ
のものである。
[9]．配列番号1および配列番号2を含むモノクローナル抗体またはその断片で、前記抗体またはその断片は一価または二価である。
[10]．[5]、[6]、[7]、[8]または[9]に従うモノクローナル抗体を産生することが可能なハイブリドーマ細胞株。
[11]．European Collection of Cell Cultures（ヨーロピアン・コレクション・オブ・セル・カルチャーズ）（ECACC）にて受入番号10022401の下で寄託したハイブリドーマ細胞株によって得られるモノクローナル抗体。
[12]．分離されたポリヌクレオチドで、前記分離されたポリヌクレオチドは、モノクローナル抗体の可変領域の軽鎖のFRsおよびCDRsをコードする配列番号4を含む、または分離されたポリヌクレオチドは、モノクローナル抗体の可変領域の重鎖のFRsおよびCDRsをコードする配列番号5を含むもの。
[13]．ヒトS100A4タンパク質のエピトープ領域をコードする配列番号6を含む分離されたポリヌクレオチド。
[14]．[5]、[6]、[7]、[8]、[9]または[11]に従うモノクローナル抗体の製造方法であって、前記方法には、次の、
（i）精製したヒトまたはマウスS100A4タンパク質で、または抗原に対する免疫応答を誘導するのに有効な薬剤と組み合わせた精製ヒトまたはマウスS100A4タンパク質でマウスを免疫化すること；
（ii）1以上の複数のハイブリドーマ細胞を産生すること；
（iii）1以上の細胞を選択することで、その上清は、以下の、
a）ヒトまたはマウスS100A4タンパク質とだけ反応し；または
b）ヒトまたはマウスS100A4タンパク質の作用メカニズムをブロックし、または
c）インビトロまたはインビボでのヒトまたはマウスS100A4タンパク質の機能的活性をブロックし；または
d）ヒトまたはマウスS100A4タンパク質によって、または内皮細胞におけるVEGFと組み合わせるヒトまたはマウスS100A4タンパク質により誘導されたプロマイグラトリー効果をブロックし；または
e）腫瘍の成長をブロックし；または
f）腫瘍の発生をブロックし；または
g）腫瘍の血管形成をブロックし；または
h）細胞播種および転移確立をブロックし；または
i）癌幹細胞をブロックし；または
j）上記a）〜i）の任意の組み合わせ）
のものである。
（iv）ステップiii）の選択した細胞のいずれか1つから特定の細胞株を産生すること；および
（v）前記細胞株からモノクローナル抗体を分離すること
が含まれる。
[15]．[5]、[6]、[7]、[8]、[9]または[11]に従うモノクローナル抗体、および薬学的に受容可能な担体を含む医薬組成物。
[16]．さらに化学療法剤を含む、[15]に従う医薬組成物。
[17]．薬としての使用のための、[2]、[3]または[4]に従う抗体またはその断片、または[5]、[6]、[7]、[8]、[9]または[11]に従うモノクローナル抗体。
[18]．腫瘍の治療用の薬としての使用のための、[2]、[3]または[4]に従う抗体またはその断片、または[5]、[6]、[7]、[8]、[9]または[11]に従うモノクローナル抗体。
[19]．腫瘍の治療用の薬の製造のための、[2]、[3]または[4]に従う抗体またはその断片、または[5]、[6]、[7]、[8]、[9]または[11]に従うモノクローナル抗体の使用。
[20]．腫瘍を治療するための方法であり、それには、前記治療を必要とする対象体に、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]または[11]に従うモノクローナル抗体の薬学的に有効な量を投与することが含まれる。
[21]．[18]に従う抗体またはその断片またはモノクローナル抗体、[19]に従う使用、または[20]に従う腫瘍を治療するための方法で、腫瘍は、以下の、すなわち、乳癌、前立腺癌、肺癌、大腸癌、膵臓癌、腎癌、胃癌、卵巣癌、甲状腺乳頭癌、黒色腫、肝細胞癌、膀胱癌、脂肪肉腫浸潤癌、神経芽腫、食道扁平上皮癌、骨肉腫、胆嚢癌、口腔扁平上皮癌、子宮内膜癌、髄芽腫、および任意の他のS100A4媒介腫瘍からなる群から選択される。
[22]．対象体における腫瘍または他のS100A4媒介性疾患の識別（同定）、位置特定（location）、評価、判断、予測（予後）、または監視のためのマーカーとしての、[2]、[3]または[4]に従う抗体またはその断片、または[5]、[6]、[7]、[8]、[9]または[11] に従うモノクローナル抗体の使用。
[23]．腫瘍の治療における同時、個別または逐次使用するための組合せ調剤物としての、[2]、[3]または[4]に従う抗体またはその断片、または[5]、[6]、[7]、[8]、[9]または[11]に従うモノクローナル抗体、および抗がん剤を含有する生成物。
[24]．腫瘍の治療のための薬剤として使用するための、ヒトまたはマウスS100A4ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその断片。

本発明を、以下に、次の例によって説明するが、それらは単なる例示であり、そして本発明を制限するものではないと解釈されるべきである。

組換えヒトS100A4タンパク質およびモノクローナル抗体の調製

例1：腫瘍細胞株および培養物の起源および調製

ヒト臍帯静脈内皮細胞〔HUVECs、Lonza（ロンザ社）〕を、内皮細胞基本培地EBM（Lonza）で、hEGF、ヒドロコルチゾン、ボバイン（ウシ）脳抽出物（エキス）およびゲンタマイシン（gentamicine）（EGM、Lonza）、および10％FCS〔Invitrogen（インビトロゲン社）〕を補充したものにおいて、ウシの皮膚からの1％のB型ゼラチン〔Sigma（シグマ社）〕上で培養した。HUVECsを継代数6-9の間で用い、およびすべての実験を細胞の同じバッチによって80〜85％のコンフルエントで行った。

結腸腺癌HCT-116（ATCC番号：CCL-247）および膵臓腺癌MiaPACA-2（ECACC、番号：85062806）細胞株を10％FCS（Invitrogen）を補充し2mMのL-グルタミンをプラスした高グルコース（PAA）をDMEM中で培養した。

10％FCS（PAA；オーストラリア起源）を補充し、2mMのグルタマックス（GlutaMAX）-I（Invitrogen）をプラスした、RPMI 1640（PAA）で骨髄腫細胞を培養した。

すべての細胞を、加湿した5％CO2-大気中37℃で培養し、EZ-PCRマイコプラズマテストキット〔Biological Industries（バイオインダストリー社）〕による評価として一貫してマイコプラズマは存在しなかった。

例2：動物の起源および準備

マウスを、抗体産生のため（雌BALB/cAnNHsd）；6週齢）および腫瘍モデルのため（「ヌードマウス」：雌無胸腺（Hsd：無胸腺ヌード-Foxn1nu、6〜7週齢）はHarlan Laboratories Models（ハーランラボラトリーズモデル）、S.L.〔Barcelona（バルセロナ）、Spain（スペイン）〕からであった。ヌードマウスは、マイクロアイソレータケージ内の無菌室で維持し、そして滅菌食餌および水を随意に摂取させた。すべての操作は、層流フード中で行った。

例3：組換えヒトS100A4タンパク質の獲得

全長ヒトS100A4をコードする断片はヒト結腸腺癌由来の細胞株HCT-116のmRNAからRT-PCRにより得られた。PCRで使用した特異的プライマーは次のとおりだった。すなわち、

配列番号22
5'-ACTCACATATGGCGTGCCCTCTGGAGAAGGCCCTGGATGTG-3 '
および
配列番号23
5'-ACTCATGAGCTCATCATTTCTTCCTGGGCTGCTTATCTGGGAA-3 '

S100A4のcDNAを、細菌発現ベクターpET28a（+）〔Novagen（ノバゲン社）〕のNdeI部位にクローニングし、陽性クローンを選択し、およびDNA配列決定によって確認した。この構築物（コンストラクト）をエシェリキア・コリ（E. coli、大腸菌）Tuner（チューナー）^TM（DE3）コンピテント細胞（Novagen）に形質転換し、そしてタンパク質を1mMイソプロピル-D-チオガラクトピラノ-シド（IPTG；Sigma）で6時間誘導した。その後、細菌を集収し、そして緩衝剤A〔100μg/mLのリゾチーム（lisozim）、0.5M NaCl、10mMのNa₂HPO₄.2H₂O、10mMのNaH₂PO₄.2H₂Oおよび10mMイミダゾールpH7.5）中で超音波処理することによって溶解させた。溶解物（ライセート）を遠心分離により清澄にし、そしてHiTrap^TMキレートアフィニティーカラム〔Amersham（アマシャム社）〕に通してろ過した。タンパク質は、緩衝剤B（0.5M NaCl、10mMのNa₂HPO₄.2H₂O、10mMのNaH₂PO₄.2H₂Oおよび300mMイミダゾールpH7.5）で溶出した。若干の実験において、ヒスチジンタグをトロンビンプロテアーゼ（Novagen社、認識配列はLeu-Val-Pro-Arg-Gly-Serで、ArgおよびGlyの間の切断部位である）を使用して切断した。したがって、最終的な完全長組換えS100A4タンパク質はN末端に追加のGly-Ser-Hisを有する。残りのポリhis鎖を消化した後、ポリヒスチジン配列タグを使用するHiTrap^TMChelating affinity column（キレートアフィニティーカラム）（Amersham社）により除去し、および組換えS100A4タンパク質を含む上清の純度を、SDS-12％（w/v）ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確認した。

例4：S100A4に対するモノクローナル抗体の獲得

モノクローナル抗体（MAb）融合、ELISAスクリーニングおよびサブクローニングは、標準的な技術を用いて行った。培養物の保守、拡張およびスケールアップは37℃での加湿雰囲気（94％空気および6％CO2）で行った。

各モノクローナル抗体について、5匹の動物を、次のプロトコルに従ってヒト組み換えS100A4で免疫化した。PBS（137mMのNaCl、2.8のKCl、8.1 mMのNa₂HPO₄、1.5mMのKH₂PO₄、pH7.2）で希釈したS100A4タンパク質の五十マイクログラムを、初期皮下（s.c.）免疫化用の完全フロイントアジュバント（Sigma）との、および19、35日でのその後の注射（s.c.）用の不完全フロイントアジュバント（Sigma）とのエマルジョンとして使用した。3回目の注射の10日後、血清を得、そして試験した。51日目にPBSで希釈したS100A4タンパク質25μgの最終ブーストを、最高力価血清を有するマウスに静脈内投与した。

融合は4日間の最後の注射の後に行った。得られたmAbは、融合誘導因子としてのPEG-1500〔Roche Diagnostics（ロシュ・ダイアグノスティックス社）〕を使用してそれぞれ比率1/10で選択したマウスからの脾臓細胞とミエローマ細胞の1つの融合体に由来した。その後、細胞をハイブリッドの選択のために、HAT（Invitrogen）を含む培地において96マイクロウェルプレートに播種した。

ハイブリドーマ上清をELISA法による組換えヒトS100A4との反応性についてスクリーニングした。S100A4タンパク質の50μl（PBS中3μg/ mL）は一晩4℃でMaxiSorp（マキシソープ）96マイクロウェルプレート（NUNC）上に塗布した。PBSで洗浄し、そしてブロッキング（PBS中1％スキムミルク、1h、37℃）した後、ハイブリドーマ上清の50μlを、各ウェルに添加し、そして37℃で2時間インキュベートした。カルシウム-マグネシウムを含まないPBS-HT（274 mMのNaCl、2.8 mMのKCl、8.1 mMのNa₂HPO₄、1.5mMのKH₂PO₄、0.1％Tween-20、pH7.2）により、室温で5回洗浄した後、結合した免疫グロブリンを、HRP結合ヤギ抗マウスIgG / IgM抗体〔Jackson ImmunoReserch（ジャクソンイムノリサーチ社）〕により、基質としてテトラメチルベンジジン3,3 5,5（TBM、Sigma）を用いて検出した。

三回のプレートのバックグラウンドより高い光学濃度を有するウェルを、クローニングのために選んだ。モノクローナル抗体5C3（内部コード5C3-1B8-1F4；ECACC 10022401）、1E2（内部コード1E2-2H4-2G8；ECACC 11051803）、6B9（内部コード6B9-1E8-2A8；ECACC 11051801）、8B6（内部コード8B6-2F6-1H9-1H10；ECACC 11051804）および5A3（内部コード5A3-4A6-5B6；ECACC 11051802）に対応するクローンを、インビトロおよびインビボでの解析のために選択し、そして限界希釈法によりサブクローニングした。ウェルあたり0.1および0.01細胞で増殖したそれらのサブクローンだけが展開のために適していると考えられ、そしてDMEM/F12培地（PAA）に適応させ、および凍結させた。

大規模な精製のために、ハイブリドーマ細胞を、175cm²培養フラスコ中、10％ウシ胎児血清（PAA、オーストラリア起源）および2mM のL-グルタミン（GlutaMAX^TM-I、Invitrogen）を含むDMEM/F12で培養した。細胞濃度が0.8×10⁶細胞/mL（生存率85％以上）に達したとき培地を除去し、そして細胞を血清なしのDMEM/F12培地で2回洗浄した。次いでその後、80％DMEM/F12、20％CD Hybridoma（CDハイブリドーマ）（Invitrogen）および2mMのL-グルタミンを含む培地の50mlを各フラスコに添加し、96時間インキュベートした。終了時に、無血清培地を収集し、遠心分離して、精製まで凍結した。

ハイブリドーマから無血清上清の6リットルを取得した。ろ過後、精製を5mlのHiTrap（ハイトラップ）プロテインG HPアフィニティーカラム（Amersham）を用いて作製した。溶出した抗体を、濃縮し、低結合Ultracel（ウルトラセル）^(R)（商標）メンブレン〔30000 NMWL、Millipore（ミリポア社）〕を有したAmicon（アミコン）^(R)Ultra（ウルトラ）-15遠心式フィルター装置を含むPBS中でダイアフィルトレーションした（diafiltrated）。最終的条件（ファイナルコンディションド）抗体を280nmで定量した。

例5：モノクローナル抗体5C3、1E2、6B9、8B6、5A3の交差反応性の特徴付け：モノクローナル抗体はS100A4とだけ反応する

モノクローナル抗体5C3、1E2、6B9、8B6および5A3を、以下のS100ファミリーの他のメンバーに対する交差反応性に関してスクリーニングした。すなわち、組換えヒトS100A1、S100A2、S100A6〔Abnova（アブノバ社）〕、組換えヒトS100A7、S100P〔MDA- MD-468乳腺癌細胞株から、およびHeLa（ヒーラ）子宮頸部腺癌細胞株から、それぞれLeitat Biomed Division（レイタット・バイオメド・ディビジョン）でクローニングされたもの〕、および組換えネズミS100A4（Leitat Biomed DivisionでNIH/3T3マウス胚線維芽細胞腺癌細胞株からクローニングされたもの）である。S100A4に対するモノクローナル抗体についての免疫グロブリンアイソタイプは、マウス免疫グロブリンサブタイピングキット（Sigma）を用いて決定した。

精製したヒトS100A4、ヒトS100A1、ヒトS100A2、ヒトS100A6、ヒトS100A7、ヒトS100P、およびネズミS100A4上のELISAによる抗体のスクリーニングはモノクローナル抗体5C3、1E2、8B6および5A3が、ヒトおよびネズミのS100A4と反応し、そして同じ強度であるが、一方で6B9はヒトS100A4だけを認識したことを明らかにした（テーブル1）。

++++ 陽性反応、 - 無反応、na 分析してない

例6：ウエスタンブロットによる5C3の免疫特性評価

細胞および腫瘍試料をPBSで2回洗浄し、そして直ちに氷冷Cell Lysis Buffer（細胞溶解バッファ）（150mMのNaCl、1％IGEPAL CA630、5mMのEDTA、100μg/ mLのPMSF、1mMのNa₃VO₄、1mMのNaFおよび50 mMのトリスpH7.4）で溶解した。溶解物を遠心分離により清澄化し、そしてタンパク質濃度をBradford（ブラッドフォード）試薬〔Bio-Rad（バイオラッド社）〕を用いて定量した。総抽出物（50mg）を還元条件下で12％のSDS-ポリアクリルアミドゲル（PAGE）電気泳動で分解し、そしてBioTrace（バイオトレース）TM PVDF膜〔PALL corporation（ポール・コーポレーション）〕に移した。膜を、0.1％のTween-20（トゥイーン20）をプラスしたTBSにおいて5％乾燥スキムミルクで1時間ブロックし、関連する一次抗体と一晩、次いで1時間二次抗体とブロッキング緩衝剤中でインキュベートし、各インキュベーション後0.1％のTween-20をプラスしたTBSにおいて10分間3回洗浄した。信号を、ECL^TMウエスタンブロッティングDetection Reagents（検出試薬）（Amersham）を使って展開させ、そしてHyperfilm（ハイパーフィルム）^TMECL（Amersham）にさらした。

抗体の濃度は次のようであった。すなわち、二次抗体として、1μg/mlでのモノクローナルマウス抗ヒトS100A4 5C3（Leitat Biomed Division）；1:5000希釈でのポリクローナルウサギ抗チューブリン〔ICN Biomedicals（ICNバイオメディカルズ社）〕；0.04μg/mLでのヤギ抗マウス〔Jackson ImmunoResearch（ジャクソン・イムノリサーチ社）〕および1:25000希釈でのヤギ抗ウサギ（Sigma）。

図1a-1bは、いくつかの腫瘍細胞株において、マウス胚性線維芽細胞株NIH3T3およびHCT116、MiaPACA-2およびBxPC3細胞株移植モデル由来の腫瘍試料において、S100A4タンパク質の発現パターンを示す。ヒト膵臓腺癌細胞株MiaPACA-2およびPanc1は、BxPC3で、別のヒト膵臓腺癌細胞株より高い発現のレベルを示した。本発明者らが図1bで見ることができるように、BxPC3由来の腫瘍は、培養物中で独自のBxPC3より高いレベルのS100A4の発現を示した。S100A4のレベルのこの増加は、悪性浸潤性腫瘍の生成においてタンパク質の直接的な役割を示している可能性がある（また、免疫組織学的切片で観察される）。これらの増加したレベルは、腫瘍細胞自身によって、または腫瘍間質細胞のいずれかによって生産することができる。乳腺腺癌細胞株MDA-MB-231および468は、S100A4タンパク質の無意味なレベルを示したが、本発明者らにより、図1cにおいて、MDA-MB-231の培養物由来の癌幹細胞はS100A4の発現の上昇したレベルを示したことが見られる。結腸腺癌細胞株Colo 205およびHCT116由来腫瘍、別の結腸腺癌細胞株は、タンパク質の高レベルの発現を示した。図1aは、5C3がヒトのS100A4とだけでなく、ネズミS100A4（NIH-3T3マウス線維芽細胞）と反応することを示した。

5C3を用いて得られた同じ結果は、変性したS100A4タンパク質とは反応しなかった8B6を除いて、他のmAbsのためにも拡張可能でありうる（データは示さず）。

例7：免疫組織化学による5C3の免疫特性評価

腫瘍ブロックからの4マイクロメートル厚の切片を脱パラフィン化し、グレードアルコールで再水和処理した。簡単には、抗原回復を0.05％Tween-20を含む10mMのクエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）において15分間電子レンジで実施した。内因性ペルオキシダーゼ活性を、蒸留水での3％H₂O₂溶液でブロッキングした後、スライドを、非特異的染色を防ぐために、30分間、5％正常ヤギ血清中でインキュベートした。その後、それらを、適切に希釈した一次抗体と4℃で一晩インキュベートした。以下の抗体を使用した。すなわち、マウスモノクローナル抗体5C3（1μg/mL）を、Dako（ダコ社）からのウサギポリクローナル抗S100A4抗体〔希釈（dil）1:200〕およびR＆Dシステム（5μg/mL）からのマウスモノクローナル抗ポリヒスチジン抗体である。その後、切片を適切にビオチン化したヤギ抗マウスIgG（H + L）〔Vector Laboratories（ベクター・ラボラトリーズ社）〕と2μg/mlで、およびビオチン化ヤギ抗ウサギIgG（H + L）（Vector Laboratories社）と2μg/mlで、60分間および、室温において30分間ABC複合体（Dako）でインキュベートした。NovaRed（ノバレッド）（Dako）を色素原として用いた。陰性コントロールとして、非関連モノクローナル抗体（抗ポリヒスチジン）を、一次抗体の代わりに用いた。

5C3モノクローナル抗体を用いた免疫組織化学的分析（図2）は、Panc 1またはBxPC3膵臓腺癌（adenocarcimona）異種移植モデルのいずれかに由来する腫瘍の中心部に比べて侵襲的なフロントにおいてS100A4発現の高いレベルを示した。また、高倍率（X120）での分析は、腫瘍細胞の細胞質内だけでなく、核内にもタンパク質の存在を示した。本発明者らが免疫組織化学分析のためのS100A4に対する最も多く挙げられた抗体（Dakoからのウサギポリクローナル抗体）を使用した場合、本発明者は同じ分布パターンを観察した。

すべてのこれらの結果をまとめると、本発明者らは、テストしたモノクローナル抗体が、診断解析のツールとして使用できることを認める。

例8：5C3はS100A4によって誘導されたMMP9のマトリックスメタロプロテイナーゼ活性を調節する。

定量的なタンパク質基質の酵素電気泳動法は、表面分子の処理は、細胞外マトリックス、成長因子の流動の破壊の指標として検証され、そして間質細胞および腫瘍細胞の遊走および浸潤プロセスと相関する。癌の患者では、この標準的な実験技術は、疾患の臨床上の程度の尺度を反映するようである。患者血清中のMMPの活性の解析は、癌のサブグループ識別のための診断上の値を有し、より一層高い転移の可能性を定めることができる。

HUVECsを、24ウェル培養プレートにおいて、補給剤（EGM）および10％FCSをプラスしたEBM中で増殖させた。刺激前に、細胞を、血清または他の補給剤が存在しない場合に、EBMで4時間維持した。その後、S100A4（0.3-1-3 mm）を、EBMにおいて、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMPs）の活性型の分泌を増加させる能力を分析するために培養物に添加した。S100A4刺激をブロックする5C3の抑制効果を試験するために、抗体の1-2μMを、培養物の両方を追加する前に、S100A4（1μM）と1時間インキュベートした。37℃で24時間後、上清を、デブリ（破片）を除去するために遠心分離した。その後、還元剤を使わないLaemmli（レムリ）サンプルバッファー（80mMのトリス-HCl、pH 6.8、4％SDS、10％グリセロール、0.01％ブロモフェノールブルー）の10μLを、透明な上清の各10ミリリットルを添加し、それはブタ皮膚（Sigma）からのタイプAゼラチンと1 mg/mLの終濃度で共重合させた8％SDS-ポリアクリルアミドゲルにおいて煮沸することなく負荷した。電気泳動後、SDSを、H₂Oにおいて2.5％のTriton（トライトン）X-100で15分間ゲルを3回洗浄することにより除去した。活性化は、50mMトリス-HCl、pH 7.5、10mMのCaCl₂、および0.02％NaN₃（アジ化ナトリウム）の存在下に、37℃でのゲルの48時間のインキュベーションを通じて明らかになった。染色は、酢酸、メタノールおよび水の容量で1：3：6の割合にて0.1％ナフトールアミドブラック（Sigma）を用いて室温で1時間行った。その後、ゲルを、クリアバンドが暗い背景の上で観察されるまで溶液を脱色することで洗浄した。バンドを、NIH ImageJのイメージングソフトウェアを用いて定量した。

本発明者らは、内皮細胞遊走の誘導におけるS100A4の作用の機序の一部を決定することを試み、HUVECsからの馴化培地におけるMMPsの生産および活性が分析された。S100A4（0.3-1-3μM）で処理した細胞からの馴化培地は、MMP9タンパク質の実質的に活性な形態が、非処理細胞からのものより多く含まれていた。この活性は用量依存性であった（図3A）。これらの違いを治療の24時間で検出した。培地におけるMMP9の活性は、抗S100A4抗体5C3がS100A4タンパク質と一緒に添加されたときに完全に減少した（図3B）。S100A4はこの細胞モデルにおけるMMP2活性における変化を誘発しなかった。

本発明者らは、S100A4で処理されたHUVECsの馴化培地で検出された高められたタンパク質分解活性がVEGFプラスS100A4を培養物に添加するとき、遊走の刺激と相関していると推測することができる。これは、少なくとも部分的にMMP9の活性に依存しなければならない。

例9：S100A4およびVEGFはHUVECsの遊走での相乗効果を発揮し、およびモノクローナル抗体5C3、1E2、6B9、8B6および5A3はこの活性をブロックする。

内皮細胞（EC）は任意の哺乳動物の生物のすべての血管を裏打ちしている。ECは、病理学的または生理学的状況によって起こることがある特定の刺激下に新しい血管の形成を開始するための原因細胞である。EC遊走は、現在このような新生血管形成における重要なステップであると認められている。したがって、EC遊走の研究は、抗血管形成薬物の治療上の活性プロファイルを十分に示すものである。

8μm細孔の光不透過のPETメンブレンフィルターインサート付き二十四ウェル細胞培養プレート〔Becton Dickinson（ベクトン・ディックソン社）からTranswell（トランスウェル）HTS FluoroBlokTM Multiwell Insert Systems（HTSフルオロブロックTM・マルチウェルインサートシステムズ）〕を、遊走活性をテストするために使用した。Transwell膜の上面および下面を、I型コラーゲン〔Upstate（アップステート）〕の15μg/mLと37℃で2時間コーティングした。血清または他の補給剤の不存在下にEBMの100μlで懸濁した内皮細胞（5×10⁴のHUVECのもの）を、各トランスウェルチャンバーの上側に、コラーゲンコーティングした後播種し、37℃で4時間インキュベートした。その後、S100A4（1μM）を、単独で、またはEBMにおけるVEGF（3 ng/mL）との組み合わせで、それらの走化性能力をテストするために、24ウェルプレートの下部コンパートメントに添加した。抗S100A4（5C3、1E2、6B9、8B6、5A3）モノクローナル抗体（Leitat Biomed Division）の抑制作用をテストするため、抗体のいくつかの濃度を（図4を参照）、遊走を開始するためにトランスウェルの下側チャンバーに双方を添加する前に、S100A4およびVEGFまたはVEGFの単独と2時間インキュベートした。5H4（Leitat Biomed Division）と呼ばれる他のモノクローナル抗体抗S100A4を、活性を比較するために使用した。37℃で24時間後、トランスウェルの下側に移動した細胞を、5μMのカルセイン-AM〔Calbiochem（カルビオケム）〕と共に37℃で25-30分間インキュベートした。遊走した細胞はX10の倍率を用い光学顕微鏡下で計数した。群間の比較は、両側検定ノンパラメトリックマン・ホイットニーのU検定を用いて行った。P値が0.05未満であった違いは統計的に有意とみなした。

この実験は、S100A4および他の血管形成因子（VEGF）の組み合わせが相乗的にHUVECの遊走活性を増加させることを初めて実証した。S100A4を、1μMの用量で試験し、コントロール-EBMに比べて有意な活性が示された。VEGF単独の3 ng/mLとのHUVECsのインキュベーションは、EBMに比べ、それぞれ2.4倍で遊走を増加させた。VEGFは（3ng/mL）をS100A4（1μM）と併用した場合に、相乗効果が観察された（図4）。具体的には、組換えS100A4（1 mm）を、VEGF（3ng/mL）と一緒に添加したとき、遊走がVEGF単独での効果に比べ235％増加した。

本発明者らはまた、S100A4のプロマイグラトリー活性を抑制するために、モノクローナル抗体抗S100A4（5C3、1E2、6B9、8B6、5A3）を使用した。図4Aに示すように、5C3の250nMを、HUVECsの遊走に対するVEGF（3ng/mL）プラスS100A4（1μM）の組み合わせの相乗効果を消滅させた。5Cによる遊走の抑制は用量依存性であった。抗体はVEGF単独によって誘発される遊走に影響を及ぼさなかった。対照的に、他のモノクローナル抗体抗S100A4は、5H4と称されるが、中和作用を示さなかった。図4Bは、すべて、2μMではたらく5C3と比較してS100A4に対する他のモノクローナル抗体の抑制活性を示す。生化学的なデータを用いてまとめると、これらの結果により、5C3、1E2、6B9、8B6および5A3がS100A4と特異的に結合し、そしてHUVECの遊走においてS100A4によって誘発されるインビトロでの中和活性を示すことが実証される。

例10：5C3はヌードマウスにおけるMiaPACA-2およびHCT116腫瘍発達をブロックする。

腫瘍異種移植を、応答を評価するために普通に使用し、そこでは化学療法の結果は癌化学療法のための潜在的な臨床的意義をもつ。腫瘍異種移植は、このように、臨床データと異種データを相関させるために良好なモデルである。異種移植された腫瘍の異なるタイプによる薬物検査は、免疫不全動物で得られた異種移植片の応答が実際の臨床でのそれに匹敵することが示された。また、特定の腫瘍タイプの異種移植片は、薬剤のその疾患に対する既知の臨床上の活性を識別することが可能である。

指数関数的な増殖でのMiaPACA-2ヒト膵臓腺癌細胞株およびHCT116ヒト大腸腺癌（adenocarciona）細胞株を、トリプシン-EDTA（0.05％/0.02％）（Invitrogen）を用いて収集し、洗浄し、そしてトリパンブルー色素排除法により生存率を調べた。生存率は95％よりも高かった。原発腫瘍増殖について、細胞（MiaPACA-2またはHCT116のための5×10⁶または1×10⁶細胞のいずれかの、それぞれ0.1mLのDMEMの高グルコース）をヌードマウス皮下の脇腹に注射した。MiaPACA-2についての65-160mm³間の腫瘍の容量およびHCT116についての155-370mm³間の容量を用い、マウスを、平均腫瘍サイズがグループ間で同等であるように（およそMiaPACA-2についての100mm³またはHCT116についての220mm³）、10匹ずつ（MiaPACA-2）または7匹ずつ（HCT116）の2つのグループのどちらかに分割した。次いで腫瘍増殖を、キャリパーで腫瘍径を測定することで続けさせ、腫瘍容量を扁長楕円についての次の近似式を用いて計算した。すなわち、
容量=（Dxd²）/2
式中、Dは腫瘍の最長軸およびdは最短のものである。マウスを、ビヒクル（PBS）で、または抗体でのいずれかで、i.p.（腹腔内）、滅菌PBSの25mg/Kg/100μLで週三回処理し、その処置は定義された腫瘍容積（100立方ミリメートルと220立方ミリメートル）で開始する。最後に実験動物を死なせ、腫瘍を外科的に摘出して秤量し、半分の腫瘍をその後のCD31の免疫染色の分析のためのOCTコンパウンドに包埋し、他の半分の腫瘍をその後の分析のためにホルムアルデヒドにおいて固定した。MiaPACA-2またはHCT116腫瘍を有する動物からの血液試料を、EDTA-コーティングした材料を用いて、実験の終了時に収集した（すべての動物）。直後に、血しょう試料を、室温で、5000rpmにて10分間遠心分離し、そして分析するまで-20℃で保存した。

群間の比較は、両側検定ノンパラメトリックマン・ホイットニーのU検定を用いて行った。P値が0.05未満であった違いは統計的に有意とみなした。

本発明者らは、無胸腺ヌードマウスでのMiaPACA-2の皮下発達（図5）またはHCT116腫瘍における5C3の効果を調査した。MiaPACA-2/HCT116細胞株またはヌードマウスにおけるMiaPACA-2/HCT116から発達した腫瘍のいずれかはそれぞれ、培養培地中に、および血液中にS100A4タンパク質の発現およびタンパク質の分泌の高いレベルを示す（データは示していない）。膵臓や大腸腫瘍におけるS100A4の役割およびタンパク質がこれらの細胞株により分泌されたという証拠のために、本発明者らは本発明者らのモノクローナル抗体5C3のインビボ活性をテストするために、このモデルを試すことに決めた。

異種移植片を移植し、そして増殖させ、腫瘍を帯びる動物は、ランダムに割り当て、上述のように扱った。治療はMiaPACA-2（100立方ミリメートルより高い各群の平均腫瘍体積）についての細胞移植（0日）後の17日で開始し、そして腫瘍を治療後30日目に採取した。治療は、HCT116（220立方ミリメートルより高い各群の平均腫瘍体積）についての細胞移植（0日）後の23日で開始した。5C3は、腹腔内投与（25mg/kg）によって与え、図6（MiaPACA-2についての例）に示すように、週投与スケジュールでの3回投与した。

図5Aは、MiaPACA-2腫瘍所有マウスについての時間に沿った5C3の抗腫瘍活性の比較分析を示す。コントロール（対照）群（ビヒクル）は、初期容量（処置前）に関し592％の平均相対腫瘍容量を伴う最大の腫瘍の増殖を示した。5C3注入マウスでの腫瘍容量の変化は、初期体積に対して274％の最大相対腫瘍容量（30日）を示した。これらのデータとの関連で、本発明者らは、5C3での処置がまた、実験終了（30日目）での対照群と比較して腫瘍重量の統計学的に有意な減少を誘発することが観察された（図5B）。また、これらの違いは、腫瘍容量のT/C比に反映され、および腫瘍重量は、それぞれ46％、および38％に算出された。

5C3の抗腫瘍活性はHCT116腫瘍所有マウスについての時間に沿う。対照群（ビヒクル）は、初期量（治療前）に関し557パーセントの平均相対腫瘍体積で最大の腫瘍の増殖を示した。5C3注入マウスでの腫瘍容量変化は、初期量に関し511パーセント（21日目）の最大平均相対腫瘍体積を示した。これらのデータとの関連で、本発明者らは、5C3での処置が、実験（21日目）の終わりに、対照群と比較して腫瘍重量の減少を誘導すること（データは示さず）を観察し、腫瘍体積の評価で観察よりも高い。また、これらの違いは、腫瘍重量のT/C比（処理対対照群）に反映され、そして腫瘍体積はそれぞれ、91％、および74％と計算された。

したがって、本発明者らはS100A4に対するモノクローナル抗体による治療がMiaPACA-2ヒト膵腫瘍についての非治療群（ビヒクル）およびで腫瘍の重量に影響を与えるHCT116ヒト大腸腫瘍での腫瘍壊死における増加と比較して腫瘍増殖の統計的に有意な著しい遅延を誘発したことを初めて実証する。

例11：5C3は腫瘍微小血管系の形成をブロックする。

実験的証拠は、一定の大きさを超えての腫瘍の増殖が血管新生を必要とし、それが転移することを許すことがあることを示唆する。腫瘍血管形成がどのように癌での転移と相関しているかを調べるために、研究者らは、微小血管（毛細血管および細静脈）をカウントし、初期浸潤癌内の微小血管の密度を等級付けた。微小血管数および密度グレードも遠隔転移と相関した。したがって、腫瘍血管形成の評価は、積極的な治療のために早期乳癌を有する患者の選定に価値があることを証明することができる。

MiaPACA-2異種移植腫瘍モデルからの腫瘍は、OCT〔Tissue-Tek（ティッシュテック）^(R)、Sakura（さくら）〕を埋め込まれ、および凍結した。各腫瘍の中央部に対応する一つの低温切開片（5μm）を分析した。切片は5分間-20℃でアセトン/クロロホルム（1:1）で固定し、室温で一晩乾燥させ、PBSで洗浄し、そしてPBS中でH₂O₂（0.03％）により、暗室において4℃で10分間処理した。その後、切片をPBSで洗浄し、ウサギ血清（5％）（Vector）を加えたPBS-BSA（2％）を用い4℃で20分間、アビジン-ビオチンブロッキング溶液（Dako）と共に、4℃で各々のものを10分間ブロックした。試料は、一次抗体；ブロッキング緩衝液で希釈したCD31に対するモノクローナルラット抗マウス抗体〔dil、1:200、BD PharMingen（BDファルミンゲン）〕と室温で1時間インキュベートした。インキュベーション切片は、室温で30分間二次抗体としてポリクローナルビオチン化抗ラット抗体（dil、1:500、Vector）と共にインキュベートし、そして室温で30分間、ABC試薬（Pierce）と共にインキュベートした。最後に、切片を、4℃で20分間NovaRed（Vector）と共にインキュベートし、10秒間ヘマトキシリンHarris（ハリス）（Sigma）で染色し、そしてDPX非水性封入剤（mounting medium）（Sigma）を使用してマウントした。

血管形成の定量は次の2つの基準を用いて測定した。

スライスごとに8および39の映像を、腫瘍のサイズに応じ、撮影し、およびNIH ImageJ（イメージJ）イメージングソフトウェアを使用して分析した。
群間の比較は、両側検定ノンパラメトリックマン・ホイットニーのU検定を用いて行った。P値が0.05未満であった違いは統計的に有意とみなした。

本発明者らは、5C3が生体内で腫瘍血管形成に実際に影響を与えるかどうかを検討した。腫瘍血管形成の評価は、CD31の免疫染色および2分析近似：微小血管密度（Micro Vessel Density、M.V.D.）および血管の分割領域（fractional area）（AA）に基づいて行った。

テーブル2は、各皮下のMiaPACA-2腫瘍ための分析画像の数、血管の総面積、血管の数、腫瘍の総面積、およびM.V.D.および％A.A.の定量化に関連して、動物ごとに、すべての取得したデータを示す。

G1（ビヒクル対照群）、G2（5C3治療群）。
M.V.D. （微小血管密度）および％A.A.（血管の分割領域）の定量化。
モノクローナル抗体5C3で処置した動物からの腫瘍は、微小血管密度においておよそ40％、および対照群（ビヒクル）からの動物と比較して血管が占有する断面積の30％の減少を示した。図7に示すように、腫瘍内微小血管におけるこれらの差は統計的に有意であった。

本発明者らの実験データは、腫瘍の発達をブロックする5C3の効果は、部分的に腫瘍血管新生の最大の減少に起因していることを明らかにした。

例12：5C3処置は体重減少または有害な副作用を誘発しない。

5C3処置およびビヒクル対照群の投与日での体重プロファイルは実験に沿って投与する前にモニターした。体重減少は、どのグループでも観察されず、そして処置は中断されなかった。

図8は実験に沿った動物の体重のプロファイルを示す。5C3は実験の終わりまでに週三回の投与スケジュールでの25 mg/kgで良好な耐容性を示した。

動物の巨視的な分析は器官における異常を証明しなかった。本発明者らは、実験に沿った任意の動物に有害な副作用（運動失調、麻痺、運動失調、痙攣、下痢、悪液質、紅斑、低体温症、死亡率）は観察されなかった。

例13：異種移植腫瘍モデルにおけるS100A4の血しょうの定量化

腫瘍および転移の早期検出、癌患者での処置を改善するための重要なプロセスのための必要性がある。血液ベースの定量法のような非侵襲的な簡単なテストを用いた分子バイオマーカーの検出は、腫瘍の存在を検出するための最も臨床的なニーズの一つであり、そしてモニター癌治療である。

S100A4の血しょうレベルをサンドイッチELISA法により定量した。簡単に言えば、96ウェルマイクロタイタープレート〔Maxisorb（マクシソーブ）、NUNC〕を、PBSで希釈したモノクローナル抗体5C3の10μg/mlで（100μl/ウェル）、4℃にて24時間コーティングした。コーティングを除去した後、プレートをPBSで2回洗浄し、ブロッキングバッファー（スキムミルク1％含有PBS）で37℃にて1時間インキュベートした。

希釈緩衝液（PBS-4％BSA）で1:4に希釈した血しょう試料を、ウェルに適用し（100μl/ウェル）、そして37℃で2時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（Tween-20のPBS-0.1％）で8回洗浄し、および適切な希釈でウサギポリクローナル抗S100A4二次抗体（Dako）をウェルに適用し（100μl/ウェル）、および1時間37℃でインキュベートした。

プレートを洗浄緩衝液で8回洗浄し、そして適切な希釈でコンジュゲートした結合ヤギ抗ウサギIgG-ペルオキシダーゼ（Sigma）を各ウェルに添加し（100μl/ウェル）、そして37℃で1時間インキュベートした。ワッシャーバッファーで8回洗浄した後、ELISAを、テトラメチルベンジジン基質（Sigma）の100μlを加えることで明らかにし、HClの1Mで停止する前に、RT（室温）で30分間インキュベートした。吸光度は450nmによった。

基底血しょう試料（basal plasma samples）（腫瘍を伴わない動物）についての標準曲線は、希釈緩衝液でのネズミ組換えS100A4の段階希釈により取得した。最終的血しょう試料（実験終了時に腫瘍を有する動物）の標準曲線は、希釈緩衝液中でのヒト組換えS100A4の段階希釈により取得した。

図9は、いくつかのMiaPACA-2、Colo205、MDA-MB-231およびHCT116細胞株の皮下腫瘍（腫瘍体積の約立方ミリメートル600から1000の間の平均）を運ぶ動物におけるS100A4の血しょう中濃度の定量化を示す。実験データは、動物が腫瘍を提示するとき、腫瘍を有しない動物におけるS100A4タンパク質の基底発現（基底-02）および実験終了時の発現の間に一貫した違いを示した。

図9は、対応する処置（例10を参照）が血しょう中の循環S100A4タンパク質の全体をブロックすることを示すモノクローナル抗体5C3（MiaPACA-2およびHCT116異種移植腫瘍モデル）で処置した動物におけるS100A4タンパク質のレベルを示す。

実施例14：モノクローナル抗体5C3、1E2、6B9、8B6および5A3のエピトープ決定。

抗体認識のエピトープ領域の決定はELISAによって評価した。簡単に言えばヒトS100A4タンパク質の全長配列は9つのオーバーラップペプチドに分画した。96ウェルマイクロタイタープレート（Maxisorb、NUNC）を、PBS（100μl/ウェル）24時間4℃において希釈した各ペプチドの3μg/mlでコーティングした。希釈緩衝液（BSAのPBS-1％）において5μg/mlで希釈した抗体の抗S100A4を、ウェルに適用し（100μl/ウェル）、37℃で90分間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（Tween-20のPBS-0.1％）で8回洗浄し、そして適切な希釈で結合したヤギ抗マウスIgG-ペルオキシダーゼ（Jackson Immunoresearch）を各ウェルに添加し（100μl/ウェル）、そして30分間37°Cでインキュベートした。ワッシャーバッファーで8回洗浄した後、ELISAはテトラメチルベンジジン基質（Sigma）の100μlの添加を明らかにし、そしてHClの1Mで停止する前に、室温で15分インキュベートした。吸光度は450nmによった。

テーブル3は、機能的5C3、1E2、6B9、8B6および5A3のモノクローナル抗体によって認識されたヒトS100A4の領域を示す。8B6抗体が、9つの設計された線状ペプチド（lineal peptide）のいずれをも認識せず、本発明者らにそれがタンパク質のコンフォメーションの領域を認識する可能性を与えることに注目される。ヒトのS100A4に対する別のモノクローナル抗体は、5H4と呼ばれ、遊走アッセイにおいて陰性コントロールとして用いられ、異なる領域（VMVSTFHKYSGKEGDKFKLN）（配列番号26）を認識する。

例15：ゲムシタビンおよび5C3の細胞傷害性効果

癌は多段階かつ多元的なプロセスであり、そのため、異なる標的分子または腫瘍のコンパートメントに向けた治療戦略は目下、この病気と闘うために最高の選択肢（オプション）である。ゲムシタビンとしての慣習的な化学療法、進行性膵臓癌についての標準的な第一戦（ファーストライン）の治療は、広範囲に使用されるが、化学療法抵抗性および複数の副作用の獲得のためにのみ適度な利益を提供する。したがって、いくつかの腫瘍コンパートメントを感作することができ、および標準的な化学療法との組合せで腫瘍細胞を殺すことがより効果的になる毒性の低い標的薬を識別する必要がある。抗腫瘍効果を改善し、および膵臓癌治療のための新しい試薬を識別するために、本発明者らはヒトMiaPACA-2膵臓癌細胞株における細胞増殖および生存率に対するゲムシタビンとの併用でのモノクローナル抗体5C3の効果を検討した。

ゲムシタビンおよびモノクローナル抗体5C3の細胞傷害性効果をヘキソサミニダーゼ活性により測定した。簡単に言えば、MiaPACA-2細胞をDMEM培地の50μlでの96ウェル細胞培養プレート（5x10³細胞/ウェル）上にプレート培養した。二十四時間（Twenty-for hours）後、ゲムシタビン単独のいくつかの濃度または5C3との組合せでの培地の50μl（40nM、100nM）を、各ウェルに添加し、そして72時間培養した。培養培地を除去した後に、細胞をPBSで1回洗浄した。基質溶液の六十マイクロリットル（p-ニトロ-N-アセチル-β-D-グルコサミド7.5 mM、クエン酸ナトリウム0.1M、0.25％Triton X-100、pH5.0）を、各ウェルに添加し、そしてプレートを37℃で2時間インキュベートし、このインキュベーション時間の後に、明るい黄色を表示させ、そしてプレートを現像液（グリシン50mM、EDTA5mM、pH 10.4）の90μlを添加することによって発色させ、450nmの吸光度は、マルチウェルスキャンニング分光光度計を用いて測定した。データ分析は、生存率100％と考えられた陰性対照（未処理細胞）との結果を正規化して行った。

曲線はシグモイド用量反応（可変勾配）の式を用いて調整し、EC50値は以下の式から得られた：
Y=ボトム+（トップ-ボトム）/（1 +10^（（LogEC50-X）*ヒルスロープ））
式中、Xは濃度の対数であり、およびYは応答である。Yはボトム（底部）から始まり、シグモイド形状を有するトップ（頂上）に向かう。

ゲムシタビンおよび5C3の間の相互作用のレベル（相乗効果、相加効果またはアンタゴニスト作用）を評価するために、Chou-Talalay（チョウ-タラレイ）よって提案された方法の変形を用いた。簡単に説明すると、ゲムシタビンプラス5C3の効果は組合せ指数（CI）により定量化される。すなわち、
CI=（D）1/（Dm）1
式中、（Dm）1=EC50薬物1濃度および（D）1=EC50（薬物1+薬物2）

図10は、ゲムシタビン単独およびゲムシタビンとの組合せおよびMiaPACA-2細胞株におけるモノクローナル抗体5C3の二つの濃度を用いる処置によって誘導される細胞生存率の効果を示す。ゲムシタビンについてのEC50は8.356 nMであった。5C3との組合せは、5.161nMおよび4.586nMのEC50を、それぞれ40nMおよび100nMのmAbについて示す。

CI指数の決定は、2つの化合物の相乗効果を実証する5C3の40nMおよび100nMでのゲムシタビンの組合せについて0.61および0.54の値を示した。

この実験は、化学療法薬ゲムシタビンとのS100A4に対するモノクローナル抗体の組合せが、薬の単独での効果を相乗的に向上させることができることを初めて実証した。このような理由から、抗S100A4モノクローナル抗体は、癌患者の治療のための化学療法薬と組み合わせて使用するための新たな候補であることを証明することができる。

例16：S100A4はTHP1単球においてIL8の分泌を誘導し、およびモノクローナル抗体5C3はこの効果をブロックする。

慢性炎症性疾患は、単球およびリンパ球などのような単核細胞の活性化によって特徴付けられる障害の大規模なグループを含む。慢性炎症性および自己免疫疾患における顕著な特徴の1つは、単球/マクロファージ細胞の強烈な活性化および蓄積である。活性化した単球およびマクロファージは、慢性炎症性疾患のほとんどのサイトカインの中で最も重要な情報源である。すべてのこれらの事実を考慮すると、S100A4の阻害は単球の活性化が極めて重要な役割を果たす慢性炎症性疾患を治療するために有用でありうるかどうかが調べられた。

単球活性化での5C3の効果を評価するために、THP-1、ヒト単球性細胞株を、S100A4に曝露し、そして分泌されたIL-8レベルのレベルを単球活性化の指標として用いた。

ヒト単球性白血病細胞株THP-1の細胞（ATCC）を、加湿インキュベーター中、5％CO2において37℃、10％FCSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したRPMI 1640培地にて増殖させた。細胞は、5.0×10⁵細胞/ウェルでプレート培養（播種）した。 S100A4および5C3抗体を、単球の添加前に1時間一緒にインキュベートした。抗マウスIgG（Fc特異的なもの）を、常にFc受容体応答を防止するために、すべての例で添加した。細胞培養上清を24時間後に集収し、そして-20℃で保存した。IL-8のレベルをサンドイッチELISAにより分析した。

S100A4は、サイトカイン放出を誘導する用量反応マナーにおいてヒト単球を活性化した（図11A）。この応答は、モノクローナル抗体5C3によってブロックされることがある（図11B）。S100A4の非存在下での5C3および抗マウスIgGの双方は、IL-8レベルには影響を与えない（データは示さない）。

これらの事実は、5C3が関節リウマチ、乾癬性関節炎、乾癬、炎症性腸疾患、動脈硬化症、多発性硬化症などのような、単球活性化がそれらの病態に重要な役割を果たすなどの、すべての慢性炎症性疾患の治療に有用でありうることを示唆する。

生物材料の寄託

5C3-1B8-1F4の抗S100A4モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、ブダペスト条約に定められた条件下でEuropean Collection of Cell Cultures（ヨーロピアン・コレクション・オブ・セル・カルチャーズ（ECACC）〔Porton Down（ポートンダウン）、Salisbury（ソールズベリー）、SP4 OJG、United Kingdom（イギリス）〕に寄託した。それは、2010年2月24日に寄託し、および前記寄託に対して割り当てられた番号は10022401であった。

6B9-1E8-2A8の抗S100A4モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、ブダペスト条約に定められた条件下でEuropean Collection of Cell Cultures（ECACC）（Porton Down、Salisbury、SP4 OJG、United Kingdom）に寄託した。それは、2011年5月18日に寄託し、および前記寄託に対して割り当てられた番号はECACC 11051801であった。

5A3-4A6-5B6の抗S100A4モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、ブダペスト条約に定められた条件下でEuropean Collection of Cell Cultures（ECACC）（Porton Down、Salisbury、SP4 OJG、United Kingdom）に寄託した。それは、2011年5月18日に寄託し、および前記寄託に対して割り当てられた番号はECACC ECACC 11051802であった。

1E2-2H4-2G8の抗S100A4モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、ブダペスト条約に定められた条件下でEuropean Collection of Cell Cultures（ECACC）（Porton Down、Salisbury、SP4 OJG、United Kingdom）に寄託した。それは、2011年5月18日に寄託し、および前記寄託に対して割り当てられた番号はECACC 11051803であった。

8B6-2F6-1H9-1H10の抗S100A4モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、ブダペスト条約に定められた条件下でEuropean Collection of Cell Cultures（ECACC）（Porton Down、Salisbury、SP4 OJG、United Kingdom）に寄託した。それは、2011年5月18日に寄託し、および前記寄託に対して割り当てられた番号はECACC 11051804であった。

Claims

抗血管形成活性を有する特異的な抗S100A4モノクローナル抗体または前記抗体の少なくとも50%の抗血管形成活性を示すそのフラグメントであって抗体はグループECACC10022401、ECACC11051801、ECACC11051802、ECACC11051803およびECACC11051804から選ばれるハイブリドーマによって生産されるものである、抗体またはそのフラグメント。
ハイブリドーマECACC10022401によって生産される、請求項1に記載のモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
配列番号1によって代表される配列が含まれる少なくともあるVL領域および配列番号2によって代表される配列が含まれる少なくともあるVH領域を含む、請求項2に記載の抗体またはそのフラグメント。
ヒト内皮細胞の移動能力を停止させることが可能である、請求項1乃至3のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント。
受託番号ECACC10022401、ECACC11051801、ECACC11051802、ECACC11051803およびECACC11051804として寄託された細胞系からなる群から選ばれるハイブリドーマ細胞系。
請求項1乃至4のいずれかに記載の薬学的に有効な量の少なくとも1の抗体またはそのフラグメントおよび少なくとも1の薬学的に許容可能な担体を含む、製剤用組成物。
請求項1乃至4のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントを含む、転移、望ましくない血管形成に関連する疾患および炎症と関係する疾患からなる群から選ばれる疾患の防止および/または処置における使用のための、製薬上の組成物。
疾患はガンである、請求項7に記載の製薬上の組成物。
ガンは膵ガンおよび結腸直腸ガンから選ばれる、請求項8に記載の製薬上の組成物。
請求項1乃至4のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント、および次の、
（a）抗血管形成剤
（b）抗転移剤
（c）細胞毒性剤
（d）抗炎症剤
の群から選ばれる第2成分
を含む、コンジュゲート。
請求項10に記載のコンジュゲートを含む、転移、望ましくない血管形成に関連する疾患および炎症と関係する疾患から選ばれる疾患の防止および/または処置での使用のための、製薬上の組成物。
前記抗体の生産を許す条件において受託番号ECACC10022401、ECACC11051801、ECACC11051802、ECACC11051803およびECACC11051804として寄託されたハイブリドーマ細胞系から選ばれる細胞系を培養することを含む、請求項1に記載のモノクローナル抗体を得るための方法。
請求項1乃至4のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント、
および代謝拮抗物質
を含む、組成物。
代謝拮抗物質はゲムシタビンである、請求項13に記載の組成物。
抗体はハイブリドーマECACC10022401によって生産されるモノクローナル抗体である、請求項13または14に記載の組成物。
腫瘍細胞の生存能力を減らすことが可能である、請求項13乃至15のいずれかに記載の組成物。
請求項1乃至4のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントを含む、ガンまたは転移の防止および/または処置のための、薬であり、代謝拮抗物質と組み合わせられる、薬。
S100A4タンパク質に特異的に結合する抗体はハイブリドーマECACC10022401によって生産される抗体である、請求項7乃至9のいずれかに記載の製薬上の組成物。
対象体においてガンまたは炎症と関係する疾患を判断するための生体外の方法であって、次の、
（a）S100A4タンパク質の、またはS100A4アミノ酸配列との少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するその変形物のレベルを、請求項1乃至4のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントの使用によって前記対象体の生物流体において検出すること
（b）前記レベルを基準値と比較すること
を含み、
基準値に関するS100A4タンパク質、またはS100A4アミノ酸配列との少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するその変形物の増加したレベルは、ガンまたは炎症と関係する疾患を患う対象体を示す、方法。
疾患はガンである、請求項19に記載の方法。
生物流体は血液、血しょうおよび血清から選ばれる、請求項19または20に記載の方法。
試料においてS100A4を検出するための方法であって、次の、
（i）S100A4を含む疑いがある試料を、請求項1乃至4のいずれかに記載の特異的な抗S100A4抗体またはそのフラグメントと接触させること、および
（ii）S100A4と抗体またはそのフラグメントとの間の免疫複合体の形成を検出すること
を含み、
S100A4および抗体の間の免疫複合体の検出は試料におけるS100A4の存在を示す、方法。
請求項1乃至4に記載の少なくとも1の抗体またはそのフラグメントを含む、生物流体においてガンまたは炎症と関係する疾患を診断するためのキット。
ガンと診断される対象体のためにカスタマイズされた治療を設計するための生体外の方法であって、次の、
（i）前記対象体の生物流体におけるS100A4タンパク質の、またはS100A4アミノ酸配列との少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するその変形物のレベルを定めること、および
（ii）S100A4タンパク質のレベルを基準レベルと比較すること
を含み、
S100A4タンパク質の、またはS100A4アミノ酸配列との少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するその変形物のレベルの基準レベルに関する増加は、対象体が請求項1乃至4のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントで処置されるべきことを示す、方法。
ステップ（i）においてレベルの決定は請求項1乃至4のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントの使用によって行われる、請求項24に記載の方法。