TW202317189A - 上皮細胞粘附分子(epcam)抑制劑及肝臟生長因子受體(hgfr)抑制劑的結合癌症治療 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及一種使用上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)抑制劑及肝臟生長因子受體(hepatocyte growth factor receptor,HGFR)抑制劑的結合癌症治療。具體而言,該EpCAM抑制劑為針對EpCAM的胞外結構域(extracellular domain,EpEX)的抗體。結合治療可有效誘導癌細胞凋亡、抑制癌細胞遷移/侵襲、減小腫瘤大小,及/或延長癌症患者的壽命。
Description
相關申請。本申請主張根據美國專利法第119條(35 U.S.C. §119)於2021年6月25日提出申請之美國臨時申請第63/215,016號的權益,其全部內容透過引用併入本文。
本發明涉及使用上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)抑制劑及肝臟生長因子受體(hepatocyte growth factor receptor,HGFR)抑制劑的結合癌症治療。具體而言,該EpCAM抑制劑為針對EpCAM的胞外結構域(extracellular domain,EpEX)的抗體。結合治療可有效誘導癌細胞凋亡、抑制癌細胞遷移/侵襲、減小腫瘤大小,及/或延長癌症患者的壽命。
EpCAM為一種第I型跨膜蛋白,具有314個胺基酸且觀察到的分子量為39-42 kDa。它包含一個胞外結構域(EpEX,具有265個胺基酸)、一個單一跨膜結構域,以及一個短胞內結構域(intracellular domain,EpICD,具有26個胺基酸)。作為一個眾所周知的腫瘤相關抗原,EpCAM在各種癌中富集,且還已知其參與正常上皮中的同型細胞與細胞間的黏附(Dolle等人,2015年)。雖然EpCAM在絕大多數健康的上皮鱗狀細胞中不存在或僅有微弱的表現,但其在鱗狀細胞癌中具有強烈的表現(Balzar等人,1999年)。此外,EpCAM在鱗狀細胞癌中的表現與細胞增殖的增加以及分化的減少有關(Litvinov等人,1996年)。我們團隊先前開發了一種抗EpCAM的中和抗體EpAb2.6,其具有作為大腸直腸癌(colorectal carcinoma,CRC)治療的強大潛力(Chen等人,2020年;Liang等人,2018年;Liao等人,2015年)。儘管其有望成為CRC的治療標靶,但EpCAM促進腫瘤發生及轉移的機制仍不完全清楚。
HGFR(c-MET)為一種高親和力受體酪胺酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK),由肝臟生長因子(hepatocyte growth factor,HGF,亦稱為分散因子)活化並由
MET基因所編碼(Lai等人,2009;Peschard & Park,2007年)。HGFR的酪胺酸激酶結構域在位置1234以及1235上含有兩個酪胺酸殘基,這兩個位點的磷酸化對於HGFR受體的活化相當重要(Koch等人,2020年;Ponzetto等人,1994年)。許多報告已經證明HGFR在腫瘤發生、細胞生長、存活以及轉移中扮演重要的角色(Cao等人,2019年;Li等人,2018年;Mazzone與Comoglio,2006年)。在正常組織中,HGFR在上皮細胞中表現,在上皮細胞中HGFR被源自周圍的或循環中的間質細胞的HGF活化(Birchmeier等人,2003年)。在HGF活化HGFR後,啟動形態生成程序以促進細胞遷移及侵襲。基於HGFR的已知功能,HGFR被認為是一種原致癌基因,通常參與胚胎發育、成體組織穩態以及再生。值得注意的是,HGFR的早期研究顯示其與生長因子受體以及RTK家族具有同源性(Dean等人,1985年)。後來證明HGFR為HGF的同源RTK,與稱為分散因子的HGFR配體相同(Koch等人,2020年;Naldini等人,1991年)。
上皮間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)與癌症進展及轉移有關(Iwatsuki等人,2010年)。EMT過程涉及一系列複雜的可逆事件,這些事件可導致喪失上皮細胞黏附以及誘導細胞的間質表型。經歷EMT的癌細胞還透過誘導間質特性以及喪失上皮細胞黏附而表現出增強的細胞活動性及侵襲性。EMT的指標包括間質標記物(如,波形蛋白、Snail蛋白及Slug蛋白)的表現增加,以及上皮標記物(如,E-鈣黏蛋白)的表現減少(Singh & Settleman,2010年)。許多報導顯示,HGFR訊息傳導促進EMT程序,進而增強癌細胞的侵襲及轉移潛力(Gumustekin等人,2012年;Jiao等人,2016年)。
EpEX含有兩個類表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)結構域,可作為局部腫瘤微環境中的可溶性生長因子。先前的一份報告顯示,EGF受體(EGF receptor,EGFR)的活化可觸發EpCAM的調節膜內蛋白水解(regulated intramembrane proteolysis,RIP)以誘導EMT(Hsu等人,2016年)。值得注意的是,EGFR為一種與多種癌症高度相關的RTK,因為EGFR在多種腫瘤中過度表現(Normanno等人,2006年)。與EGFR的作用類似,過度的HGFR活化促進癌細胞的生長、存活以及遷移(Kim等人,2014年;Simiczyjew等人,2018年),透過許多下游效應子(如,AKT、胞外訊息相關激酶(extracellular signal-related kinase,ERK)、磷酸肌醇3-激酶、RAS,以及SRC)進行作用(Comoglio等人,2008年;Ortiz-Zapater等人,2017年)。有趣的是,HGFR的表現與基底型乳腺癌中的EGFR的表現呈正相關(Mueller等人,2010年),且HGFR與EGF家族受體通常在癌細胞中共表現(Shattuck等人,2008年)。此外,據報導,在以EGFR配體刺激表皮癌細胞時會發生EGFR依賴性磷酸化以及HGFR的活化(Jo等人,2000年)。在幾種類型的腫瘤中也觀察到在具有升高的EGFR訊息傳導的細胞中HGFR的這種交叉活化(Tang等人,2008年)。然而,重要的是,這種交叉活化效應背後的機制以前尚未確定。
本文公開一種上皮細胞黏附分子(EpCAM)抑制劑以及一種HGFR抑制劑之結合使用,供治療癌症。具體而言,該EpCAM抑制劑為針對EpCAM胞外結構域(EpEX)的抗體。結合治療可有效誘導癌細胞凋亡、抑制癌細胞遷移/侵襲、減小腫瘤大小,及/或延長癌症患者的壽命。
在一方面,本發明提供一種治療癌症之方法,包括向有需要的個體施用
(i)有效量的第一抑制劑,其抑制上皮細胞黏附分子(EpCAM)訊息傳導的活化;以及
(ii)有效量的第二抑制劑,其抑制肝臟生長因子受體(HGFR)訊息傳導的活化。
於某些具體實施例中,該第一抑制劑減少EpEX的產生(或釋放)、阻斷EpEX與HGFR的結合,及/或抑制EpEX誘導的HGFR磷酸化。
於某些具體實施例中,該第二抑制劑阻斷HGF與HGFR的結合。
於某些具體實施例中,該第一抑制劑為針對EpEX的抗體或其抗原結合片段。
於某些具體實施例中,本文所述之抗EpEX抗體特異性結合類表皮生長因子(EGF)結構域I及II。於某些實施例中,本文所述之抗-EpEX抗體對位於該類EGF結構域I的CVCENYKLAVN序列(第27至37個胺基酸)(SEQ ID NO: 20)以及位於該類EGF結構域II的KPEGALQNNDGLYDPDCD序列(第83至100個胺基酸)(SEQ ID NO: 19)內的抗原決定位(epitope)具有特異性結合親和力。
於某些具體實施例中,該抗體或抗原結合片段包含
(a)重鏈可變區(VH),其包含:包含SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的重鏈互補決定區1(heavy chain complementary determining region 1,HC CDR1)、包含SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的重鏈互補決定區2(HC CDR2),以及包含SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的重鏈互補決定區3(HC CDR3);以及
(b)輕鏈可變區(VL),其包含:包含SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的輕鏈互補決定區1(light chain complementary determining region 1,LC CDR1),包含SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的輕鏈互補決定區2(LC CDR2),以及包含SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的輕鏈互補決定區3(LC CDR3)。
於某些具體實施例中,該VH包含SEQ ID NO: 15的胺基酸序列,及/或該VL包含SEQ ID NO: 16的胺基酸序列。
於某些具體實施例中,該第一抑制劑有效抑制TACE及PS2訊息傳導的磷酸化。
於某些具體實施例中,該第二抑制劑係選自由福瑞替尼(foretinib)、克唑替尼(crizotinib)以及卡博替尼(cabozantinib)所組成之群組。
於某些具體實施例中,本發明之方法有效誘導癌細胞凋亡。
於某些具體實施例中,本發明之方法有效抑制癌細胞的遷移/侵襲及/或減小腫瘤大小。
於某些具體實施例中,本發明之方法有效延長個體的壽命。
於某些具體實施例中,該癌症選自由下列所組成之群組:肺癌、腦癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、胃癌、頭頸癌、腎癌、血癌、肝癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、皮膚癌,以及睾丸癌。
在另一方面,本發明提供一種套組或醫藥組合物,包含
(i)有效量的第一抑制劑,其抑制上皮細胞黏附分子(EpCAM)訊息傳導的活化;以及
(ii)有效量的第二抑制劑,其抑制肝臟生長因子受體(HGFR)訊息傳導的活化。
本發明還提供一種(i)抑制上皮細胞黏附分子(EpCAM)訊息傳導活化的第一抑制劑以及(ii)抑制肝臟生長因子受體(HGFR)訊息傳導活化的第二抑制劑之組合用於製造治療癌症的藥物或套組之用途。
本發明之一個或多個實施例的細節在以下描述中闡述。從以下幾個實施例的詳細描述以及從所附申請專利範圍中,本發明之其他特徵或優點將變得顯而易見。
以下描述目的僅在說明本發明之各種具體實施例。因此,本文討論之特定具體實施例或修改不應被解釋為對本發明範圍的限制。對本領域技術人員而言顯而易見的是,在不背離本發明之範圍的情況下可進行各種改變或產生等效物。
為了使本發明能清晰易懂地被理解,首先定義某些術語。在整個詳細描述中闡述附加定義。除非另有定義,否則本文使用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域的技術人員通常理解的相同含義。
如本文所用,單數形式「一」、「一個」以及「該」包括複數指示物,除非上下文另有明確規定。因此,例如,提及「一組成分」,其包括本領域技術人員已知的多個這樣的組成分及其等同物。
術語「包含(comprise)」或「包含(comprising)」通常以包括(include)/包括(including)的含義使用,其表示允許存在一種或多種特徵、成分或組成分。術語「包含(comprise)」或「包含(comprising)」含括術語「組成(consists)」或「由...組成(consisting of)」。
如本文所用,術語「多胜肽」係指由透過胜肽鍵連接的胺基酸殘基所組成的聚合物。術語「蛋白質」通常係指相對較大的多胜肽。術語「胜肽」通常係指相對較短的多胜肽(例如,含有最多100、90、70、50、30、20或10個胺基酸殘基)。
如本文所用,術語「大約」或「約」係指本領域普通技術人員將理解的可接受偏差的程度,其可根據其使用的上下文而在一定程度上變化。具體而言,「大約」或「約」可表示具有在引用值周圍±10%或±5%或±3%範圍內的數值。
如本文所用,術語「基本相同」係指具有80%或更多、較佳85%或更多、更佳90%或更多、甚至更佳95%或更多同源性的兩個序列。
如本文所用,術語「抗體(antibody)」(可與複數形式(antibodies)互換使用)係指具有特異性結合特定目標抗原分子的能力的免疫球蛋白分子。如本文所用,術語「抗體」不僅包括完整的(亦即,全長)抗體分子,還包括其保留抗原結合能力的抗原結合片段,例如Fab、Fab’、F(ab’)
2,以及Fv。此類片段在本領域中也是眾所周知的且經常在體外及體內使用。術語「抗體」還包括嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體、多特異性抗體(例如,雙特異性抗體),以及包含所需特異性的抗原識別位點的免疫球蛋白分子的任何其他修飾構型,包括抗體的胺基酸序列變體、抗體的糖基化變體,以及共價修飾的抗體。
完整或完全的抗體包含兩條重鏈和兩條輕鏈。每條重鏈包含一可變區(V
H)以及一第一、第二以及第三恆定區(C
H-1、C
H-2,及C
H-3);每條輕鏈包含一可變區(V
L)以及一恆定區(C
L)。抗體呈現「Y」字形,Y的主幹由透過雙硫鍵結合在一起的兩條重鏈的第二及第三恆定區所組成。Y的每個手臂包括與一單個輕鏈的可變區以及恆定區結合的一單個重鏈的可變區及第一恆定區。輕鏈的可變區及重鏈的可變區負責與抗原結合。兩條鏈中的可變區通常負責與抗原結合,每個可變區都包含三個高度可變區,稱為互補決定區(complementarity determining regions,CDRs);亦即,重(H)鏈的CDRs包括HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3,以及輕(L)鏈的CDRs包括LC CDR1、LC CDR2,以及LC CDR3。該三個CDRs由框架區(FR1、FR2、FR3,以及FR4)圍繞,這些框架區比CDRs更高度保守並形成支架以支持該些高度可變區。重鏈及輕鏈的恆定區不負責與抗原結合,但涉及各種效應子功能。根據抗體重鏈恆定結構域的胺基酸序列,免疫球蛋白可分為不同的類別。免疫球蛋白有五種主要類別:IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM。對應於不同類別免疫球蛋白的重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、γ以及μ。
如本文所用,術語「抗原結合片段」或「抗原結合結構域」係指負責抗原結合的完整抗體分子的一部分或區域。抗原結合片段能夠結合與親本抗體結合的相同抗原。抗原結合片段的實例包括,但不限於:(i)Fab片段,可為由V
H- C
H1鏈以及V
L- C
L鏈所組成之單價片段;(ii)F(ab’)
2片段,可為在該鉸鏈區透過雙硫鍵連接的兩個Fab片段所組成之二價片段;(iii)Fv片段,由一抗體分子的V
H及V
L結構域所組成,該二結構域透過非共價相互作用結合在一起;(iv)單鏈Fv(single chain Fv,scFv),可為由V
H結構域以及V
L結構域透過胜肽連接子所組成之單一多胜肽鏈;以及(v)(scFv)
2,其可包含透過胜肽連接子連接的兩個V
H結構域以及兩個V
L結構域,這兩個V
L結構域透過雙硫鍵與該兩個V
H結構域相連。
如本文所用,術語「嵌合抗體」係指含有來自不同來源,例如不同物種的多胜肽的抗體。於某些具體實施例中,在嵌合抗體中,輕鏈與重鏈的可變區可模擬源自一種哺乳動物(例如,非人類哺乳動物,例如小鼠、兔以及大鼠)的抗體的可變區,而該恆定區可與衍生自另一種哺乳動物(如,人類)的抗體中的序列同源。
如本文所用,術語「人源化抗體」係指包含源自人類抗體的框架區以及來自非人類(通常為小鼠或大鼠)的免疫球蛋白的一個或多個CDRs的抗體。
如本文所用,術語「人類抗體」係指其中輕鏈及重鏈序列的基本上整個序列,包括互補決定區(CDRs),來自人類基因的抗體。於某些情況下,人類抗體可包括一個或多個非由人類種系免疫球蛋白序列所編碼的胺基酸殘基,例如,透過一個或多個CDRs或一個或多個FRs中的突變,以,例如,降低可能的免疫原性、增加親和力,以及消除可能導致不想要的折疊的半胱胺酸等。
如本文所用,術語「特異性結合」或「特異性地結合」係指兩個分子之間的非隨機結合反應,例如,抗體與其目標抗原的抗原決定位的結合。「特異性結合」目標抗原或抗原決定位的抗體為本領域熟知的術語,而且測定這種特異性結合的方法也是本領域所熟知。如抗體以比它與其他物質結合更大的親和力/結合性、更容易,及/或更長的持續時間結合一目標抗原,則它與該目標抗原「特異性結合」。換言之,透過閱讀該定義還可理解的是,例如,特異性結合一第一目標抗原的抗體可以或可以不特異性或優先結合一第二目標抗原。因此,「特異性結合」或「優先結合」不一定需要(儘管它可以包括)獨占性結合。通常,結合的親和力可以一解離常數(dissociation constant,K
D)來定義。通常,當用於抗體時,特異性結合可指以小於約10
-7M,例如,約10
-8M或更小的KD值,例如,約10
-9M或更小、約10
-10M或更小、約10
-11M或更小、約10
-12M或更小,或甚至更小的KD值,並且以對應於K
D值的親和力與該特定目標結合,該K
D值比其結合一非特異性抗原(例如,BSA或酪蛋白)的親和力低至少10倍,例如低至少100倍,例如低至少1,000倍或至少低10,000倍。
如本文所用,術語「核酸」或「多核苷酸」可指由核苷酸單元所組成之聚合物。多核苷酸包括天然存在的核酸,例如去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,「DNA」)以及核糖核酸(ribonucleic acid,「RNA」)以及核酸類似物,包括那些具有非天然存在的核苷酸的核酸類似物。例如,可使用一自動化DNA合成儀合成多核苷酸。應當理解的是,當一核苷酸序列由一DNA序列(亦即,A、T、G、C)表示時,這也包括其中以「U」取代「T」的RNA序列(亦即,A、U、G、C)。術語「cDNA」係指與單鏈或雙鏈形式的mRNA互補或相同的DNA。
如本文所用,術語「互補」係指兩個多核苷酸的相互作用表面的拓撲相容性或配對在一起。當第一多核苷酸的核苷酸序列與第二多核苷酸的多核苷酸結合配偶體的核苷酸序列相同時,該第一多核苷酸與該第二多核苷酸互補。因此,序列5’-ATATC-3’的多核苷酸與序列為5’-GATAT-3’的多核苷酸互補。
如本文所用,術語「編碼」係指多核苷酸(例如,一基因、一cDNA,或一mRNA)中特定核苷酸序列的天然特性,可作為在生物過程中合成其他聚合物及大分子的模板,具有給定的RNA轉錄子序列(亦即,rRNA、tRNA,以及mRNA)或給定的胺基酸序列以及由此產生的生物學特性。因此,若由該基因產生的mRNA的轉錄及轉譯在一細胞或其他生物系統中產生一蛋白質,則該基因編碼該蛋白質。技術人員應當理解的是,由於遺傳密碼的簡併性,許多不同的多核苷酸及核酸可編碼相同的多胜肽。還應理解的是,技術人員可使用常規技術進行不影響由此處描述之多核苷酸編碼的多胜肽序列的核苷酸進行取代,以反映要表現多胜肽的任何特定宿主生物中使用的密碼子。因此,除非另有說明,否則「編碼胺基酸序列的核苷酸序列」涵蓋彼此為簡併形式且編碼相同胺基酸序列的所有核苷酸序列。
如本文所用,術語「重組核酸」係指具有非天然連接在一起的序列的多核苷酸或核酸。重組核酸可以載體的形式存在。「載體」可包含給定的目標核苷酸序列以及調控序列。載體可用於表現該給定的核苷酸序列(表現載體)或維持該給定的核苷酸序列以複製、操縱或在不同位置之間(例如,不同生物之間)轉移。可將載體引入合適的宿主細胞以用於上述目的。「重組細胞」係指已將重組核酸引入其中的宿主細胞。「轉化細胞」係指已透過重組DNA技術引入編碼目標蛋白質的DNA分子的細胞。
載體可為不同的類型,包括質體、黏質體、游離基因組、F型黏接質體、人工染色體、噬菌體、病毒載體等。通常,在載體中,給定的核苷酸序列可操縱地連接至調節序列,使得當該載體被引入宿主細胞時,該給定的核苷酸序列可在該調節序列的控制下在該宿主細胞中表現。該調節序列可包括,例如,但不限於,啟動子序列(例如,巨細胞病毒(cytomegalovirus,CMV)啟動子、猿病毒40(simian virus 40,SV40)早期啟動子、T7啟動子,以及醇氧化酶基因(
AOX1)啟動子)、起始密碼子、複製起始點、增強子、分泌訊息序列(例如,α-交配因子訊息)、終止密碼子,以及其他控制序列(例如,夏因-達爾加諾(Shine-Dalgarno)序列以及終止序列)。較佳地,載體可進一步包含用於隨後的篩選/選擇程序的標記序列(例如,抗生素抗性標記序列)。基於蛋白質生產之目的,在載體中,該給定的目標核苷酸序列可連接到除了上述調節序列之外的另一核苷酸序列,進而產生融合的多胜肽並有利於隨後的純化程序。該融合多胜肽包括用於純化目的之標籤,例如,組胺酸標籤(His-tag)。
如本文所用,術語「治療」係指將一種或多種活性劑施用於患有疾病、該疾病之症狀或病症,或該疾病之進展的個體,目的在於治療、治癒、減輕、緩解、改變、補救、改善、增進,或影響該疾病、該疾病之症狀或病症、由該疾病引起之殘疾,或該疾病之進展或易感性。
本發明至少部分基於使用上皮細胞黏附分子(EpCAM)抑制劑以及HGFR抑制劑的結合癌症療法之開發。
EpEX為一種EpCAM的胞外結構域,包含兩個類表皮生長因子(EGF)結構域,可作為局部腫瘤微環境中的可溶性生長因子。EGF受體(EGFR)的活化可觸發調節的EpCAM膜內蛋白水解(RIP)以誘導上皮間質轉化(EMT)(Hsu等人,2016年)。EGFR為一種與多種癌症高度相關的RTK,因為它在多種腫瘤中過度表現(Normanno等人,2006年)。過度的HGFR活化透過許多下游效應子(例如,AKT、細胞外訊息相關激酶(ERK)、磷酸肌醇3-激酶、RAS,以及SRC)(Comoglio等人,2008年;Ortiz-Zapater等人,2017年)促進癌細胞的生長、存活及遷移(Normanno等人,2006年)。HGFR表現與基底型乳腺癌中的EGFR表現呈正相關(Comoglio等人,2008年;Ortiz-Zapater等人,2017年),且HGFR以及EGF家族受體通常在癌細胞中共表現(Comoglio等人,2008年;Ortiz-Zapater等人,2017年)。此外,EGFR依賴性磷酸化以及HGFR活化發生在以EGFR配體刺激表皮癌細胞時(Comoglio等人,2008年;Ortiz-Zapater等人,2017年)。在幾種腫瘤類型中也觀察到在具有升高的EGFR訊息傳導的細胞中的HGFR的這種交叉活化(Tang等人,2008年)。
在本發明中,意外地發現EpEX與HGFR結合並活化其下游訊息傳導以促進細胞增殖、遷移以及侵襲。還發現EpCAM中和抗體EpAb2-6減弱HGFR的磷酸化並抑制癌細胞轉移。因此,本研究的結果提供同時以EpCAM及HGFR訊息傳導為標靶以對抗癌症轉移的機制原理。
如本文所用,「組合療法」係指組合兩種或更多種治療劑或方法的治療。「組合」係指同時或按順序將兩種或多種治療劑或方法給予同一個體。較佳地,結合治療提供協同效應。
如本文所用,術語「協同效應」可指並包括導致兩種或更多種活性劑組合的協同效應,其中該兩種或更多種活性劑的組合活性超過每種活性劑單獨的活性之總和。術語「協同效應」還可指當一起使用兩種或更多種活性劑時所提供的組合活性,其中每種活性劑使用的劑量較低,即可達到相當於或高於單一活性劑使用時所達到的活性。
因此,本發明提供一種用於治療癌症之結合治療,包括向有需要的個體施用組合物,該組合物包括(i)有效量的抑制EpCAM訊息傳導活化的第一抑制劑(一pCAM抑制劑);以及(ii)有效量的抑制HGFR訊息傳導活化的第二抑制劑(HGFR抑制劑)。
於某些具體實施例中,本文使用之抗EpEX抗體特異性結合EpCAM的類EGF結構域I(EpCAM的第27-59個胺基酸)以及EpCAM的類EGF結構域II(EpCAM的第66-135個胺基酸)。具體而言,如本文所用之抗-EpEX抗體對位於該類EGF結構域I的CVCENYKLAVN(第27-37個胺基酸)(SEQ ID NO: 20)以及位於該類EGF結構域II的KPEGALQNNDGLYDPDCD(第83-100個胺基酸)(SEQ ID NO: 19)序列內的抗原決定位具有特異性結合親和力。更具體而言,本文使用之抗EpEX抗體識別EpCAM中結構域I內的NYK基序(第31-33個胺基酸)以及結構域II內的LYD基序(第94-96個胺基酸)。相較之下,許多其他抗體(例如,MT201、M97、323/A3以及依決洛單抗(edrecolomab))僅針對已充分描述之EpCAM的EGF結構域I為標靶。以下描述根據本發明之抗EpEX抗體與其他抗體的不同特徵。
根據本發明之抗EpEX抗體 | 與結構域I及結構域II結合,有效誘導癌細胞凋亡 |
其他抗體(例如,MT201、M97、323/A3以及依決洛單抗) | 僅與結構域I結合,不能誘導癌細胞凋亡 |
如本文所用之特定抗EpEX抗體為EpAb2-6,如以下之實施例中所示。EpAb2-6的重鏈可變區(V
H)及輕鏈可變區(V
L)的胺基酸序列,以及其互補決定區(HC CDR1、HC CDR2,以及HC CDR3)(LC CDR1、LC CDR2,以及LC CDR3)如下表1所示。本發明之抗EpEX抗體包括EpAb2-6及其功能變體。
表1
V H 結構域 | ||||||
FW1 | CDR1 | FW2 | CDR2 | |||
V KL QESGPELKKPGETVKISCKAS (SEQ ID NO: 1) | GYTFTDYSMH ( SEQ ID NO: 2 ) | WVKQAPGKGLKWMGW (SEQ ID NO: 3) | INTETGEP ( SEQ ID NO: 4 ) | |||
FW3 | CDR3 | FW4 | ||||
T YADDFKGRFAFSLETSA ST AYLQINNLKNEDTATYFCAR (SEQ ID NO: 5) | TAVY ( SEQ ID NO: 6 ) | WGQGT TVTVSS (SEQ ID NO: 7) | ||||
V L 結構域 | ||||||
FW1 | CDR1 | FW2 | CDR2 | |||
DIQ MTQSPSSLSASLGERVSLTC (SEQ ID NO: 8) | RASQEISVSLS ( SEQ ID NO: 9 ) | WLQQ EPDGTIKRLIY (SEQ ID NO: 10) | ATSTLDS ( SEQ ID NO: 11 ) | |||
FW3 | CDR3 | FW4 | ||||
GVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDF VDYYC(SEQ ID NO: 12) | LQYASYPWT ( SEQ ID NO: 13 ) | FGGGTKLEIKRADAAPTVS (SEQ ID NO: 14) | ||||
重鏈與輕鏈的全長胺基酸序列 | ||||||
重鏈 | VKLQESGPELKKPGETVKISCKAS GYTFTDYSMHWVKQAPGKGLKWMGW INTETGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCAR TAVYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO: 15) | |||||
輕鏈 | DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTC RASQEISVSLSWLQQEPDGTIKRLIY ATSTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVDYYC LQYASYPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVS(SEQ ID NO: 16) | |||||
於某些具體實施例中,本發明之抗EpEX抗體為EpAb2-6的功能變體,其特徵在於包含(a)VH,包含SEQ ID NO: 2的HC CDR1、SEQ ID NO: 4的HC CDR2,以及SEQ ID NO: 6的HC CDR3;以及(b)VL,包含SEQ ID NO: 9的LC CDR1、SEQ ID NO: 11的LC CDR2,以及SEQ ID NO: 13的HC CDR3,或其抗原結合片段。
於某些具體實施例中,本發明之抗EpEX抗體,具有(a)VH,包含SEQ ID NO: 2的HC CDR1、SEQ ID NO: 4的HC CDR2,以及SEQ ID NO: 6的HC CDR3;以及(b)V
L ,包含SEQ ID NO: 9的LC CDR1、SEQ ID NO: 11的LC CDR2,以及SEQ ID NO: 13的HC CDR3,可包含V
H,該V
H包含SEQ ID NO: 15或與SEQ ID NO: 15基本相同的胺基酸序列,以及V
L,該V
L包含SEQ ID NO: 16或與SEQ ID NO: 16基本相同的胺基酸序列。具體而言,本發明之抗EpEX抗體包括V
H,該V
H包含具有與SEQ ID NO:15至少80%(例如82%、84%、85%、86%、88%、90%、92%、94%、95%、96%、98%,或99%)同一性的胺基酸序列,以及V
L,該V
L包含具有與SEQ ID NO:16至少80%(例如82%、84%、85%、86%、88%、90%、92%、94%、95%、96%、98%,或99%)同一性的胺基酸序列。本發明之抗-EpEX抗體還包括由編碼如本文所述之相關V
H或V
L胺基酸序列的多核苷酸序列所編碼之任何重組(工程化)衍生的抗體。
術語「基本相同」可表示相較於參考抗體,變體的相關胺基酸序列(例如,在FRs、CDRs、V
H或V
L中)幾乎沒又差異,使得該變體相對於該參考抗體具有基本相似的結合活性(例如,親和力、特異性或兩者)以及生物活性。這種變體可能包括較小的胺基酸變化。可理解的是,多胜肽可能具有一有限數量的變化或修飾,這些變化或修飾可在與其活性或功能無關的多胜肽的某個部分內進行,但仍會產生具有可接受程度的等效或相似的生物學活性或功能的變體。於某些實施例中,該胺基酸殘基變化為保守性胺基酸取代,係指化學結構相似的胺基酸殘基與另一胺基酸殘基對該多胜肽的功能、活性或其他生物學特性的影響較小或基本上沒有影響。通常,相較於CDR區,FR區可進行相對更多的取代,只要它們不會對抗體的結合功能及生物活性產生不利的影響(例如,相較於該原始抗體,結合親和力降低50%以上)。於某些具體實施例中,該參考抗體與該變體之間的序列同一性可為約80%、82%、84%、85%、86%、88%、90%、92%、94%、95%、96%、98%,或99%,或更高。可根據本領域普通技術人員已知的改變多胜肽序列的方法製備變體,例如,在彙編此類方法的參考文獻中發現的那些,例如,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,J. Sambrook,J. Sambrook等人編輯,第二版,冷泉港實驗室出版社,冷泉港,紐約,1989年。例如,胺基酸的保守置換包括在以下群組內的胺基酸之間進行的置換:(i)A、G;(ii)S、T;(iii)Q、N;(iv)E、D;(v)M、I、L、V;(vi)F、Y、W;以及(vii)K、R、H。
本文所述之抗體可為動物抗體(例如,小鼠來源的抗體)、嵌合抗體(例如,小鼠-人類嵌合抗體)、人源化抗體,或人類抗體。本文所述之抗體還可包括它們的抗原結合片段,例如,Fab片段、F(ab’)
2片段、Fv片段、單鏈Fv(scFv),以及(scFv)
2。可透過本領域已知的方法製備抗體或其抗原結合片段。
如本文所用之抗-EpEX抗體的更多細節如美國專利第9,187,558號中所述,出於本文所引用之目的或主題,每個專利的相關公開內容透過引用併入本文。
本領域的許多常規方法可用於獲得抗體或其抗原結合片段。
於某些具體實施例中,本文提供之抗體可透過常規融合瘤技術製備。通常,目標抗原,例如,可選擇地與載體蛋白(例如,鑰孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH))偶聯的腫瘤抗原,及/或與佐劑(例如,完全弗氏佐劑)混合,可用於免疫宿主動物以產生與該抗原結合的抗體。收集分泌單株抗體的淋巴細胞並與骨髓瘤細胞融合以產生融合瘤。然後篩選以這種方式形成的融合瘤細胞株以鑑定並選擇那些分泌所需單株抗體的融合瘤細胞株。
於某些具體實施例中,本文提供之抗體可透過重組技術製備。於相關態樣,還提供編碼所公開之胺基酸序列的分離的核酸,以及包含此類核酸的載體以及以該核酸轉化或轉染的宿主細胞。
例如,可將包含編碼此類抗體的重鏈及輕鏈可變區的核苷酸序列的核酸選殖至表現載體(例如,細菌載體,如大腸桿菌載體、酵母載體、病毒載體,或哺乳動物載體),透過常規技術,且任何載體可被引入合適的細胞(例如,細菌細胞、酵母細胞、植物細胞,或哺乳動物細胞)中以表現該抗體。編碼本文所述之抗體的重鏈及輕鏈可變區的核苷酸序列的實例如表1所示。哺乳動物宿主細胞株的實例為人類胚胎腎細胞株(293細胞)、小倉鼠腎細胞(BHK細胞)、中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)、非洲綠猴腎細胞(VERO細胞),以及人類肝細胞(Hep G2細胞)。用於表現本文所述之抗體的重組載體通常包含一編碼該抗體胺基酸序列的核酸,該核酸可操縱地連接至一組成型或誘導型的啟動子。典型的載體含有用於調節編碼該抗體的核酸表現的轉錄及轉譯終止子、起始序列,以及啟動子。載體任選地包含用於原核及真核系統的選擇標記物。於某些實施例中,編碼重鏈及輕鏈的序列都包含在相同的表現載體中。於其他實施例中,抗體的每條重鏈及輕鏈被選殖至個別的載體中並單獨產生,然後可在合適的條件下培養以進行抗體組裝。
用於表現本文所述之抗體的重組載體通常包含編碼該抗體胺基酸序列的核酸,該核酸可操縱地連接至組成型或誘導型啟動子。該重組抗體可在原核或真核表現系統中產生,例如細菌、酵母、昆蟲,以及哺乳動物細胞。典型的載體含有用於調節編碼該抗體的核酸表現的轉錄及轉譯終止子、起始序列,以及啟動子。載體任選地包含用於原核及真核系統的選擇標記物。可以進一步分離或純化所產生的抗體蛋白以獲得基本上均質的製劑,用於進一步的分析及應用。例如,合適的純化程序可包括在免疫親和或離子交換管柱上分級分離、乙醇沉澱、十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)、高效液相色層分析(high-performance liquid chromatography,HPLC)、硫酸銨沉澱,以及凝膠過濾。
當需要全長抗體時,本文所述之任何編碼V
H及V
L鏈的序列可連接至編碼免疫球蛋白的Fc區的序列,且所得之編碼全長抗體重鏈及輕鏈的基因可在合適的宿主細胞(例如,植物細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞,或昆蟲細胞)中表現及組裝。
可透過常規方法製備抗原結合片段。例如,可透過全長抗體分子的胃蛋白酶消化產生F(ab’)
2片段,以及可透過還原F(ab’)
2片段的二硫鍵來產生Fab片段。或者,這些片段也可透過重組技術製備,藉由在合適的宿主細胞中表現重鏈及輕鏈片段並將其組裝,以在體內或體外形成所需的抗原結合片段。單鏈抗體可透過重組技術,藉由連接編碼重鏈可變區的核苷酸序列以及編碼輕鏈可變區的核苷酸序列來製備。較佳地,在兩個可變區之間摻入彈性連接子。
可進一步修飾抗體以在該抗體的N-及/或C-端綴合一或多個附加元件,例如,另一種蛋白質及/或藥物或載體。較佳地,與附加元件綴合的抗體保留所需的結合特異性以及治療效果,同時提供由該附加元件產生的附加特性,例如,有助於溶解度、儲存或其他處理特性、細胞滲透性、半衰期、減少超敏反應,控制遞送,及/或分佈。其他具體實施例包括標記的綴合,例如,用於分析、檢測、追蹤等的染料或螢光團。於某些具體實施例中,抗體可綴合至附加元件,例如,胜肽、染料、螢光團、碳水化合物、抗癌劑、脂質等。此外,抗體可透過Fc區直接附著在脂質體表面,例如形成免疫脂質體。
於某些具體實施例中,該第二抑制劑(HGFR抑制劑)阻斷HGF與HGFR的結合。
於某些具體實施例中,該第二抑制劑(HGFR抑制劑)為HGFR的一種小分子酪胺酸激酶受體抑制化合物。表2所示為一些小分子HGFR抑制化合物之實例。
表2
克唑替尼 3-[(1R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基吡唑-4-基)吡啶-2-胺 | |
福瑞替尼 N 1-[3-氟-4-({6-甲氧基-7-[3-(嗎啉-4-基)丙氧基]喹啉-4-基}氧基)苯基]- N' 1-(4-氟苯基)環丙烷-1,1-二甲醯胺 | |
卡博替尼 1- N-[4-(6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧苯基]-1- N'-(4-氟苯基)環丙烷-1,1-二甲醯胺 | |
PF-04217903 2-(4-(3-(喹啉-6-基甲基)-3H-[1,2,3]三唑並[4,5-b]吡嗪-5-基)-1 H-吡唑-1-基)乙醇 | |
SU11274 (3Z)-N-(3-氯苯基)-3-({3,5-二甲基-4-[(4-甲基哌嗪-1-基)羰基]-1H-吡咯-2-基}亞甲基)-N-甲基-2-氧代-2,3-二氫-1H-吲哚-5-磺醯胺 |
可用於本發明之HGFR抑制化合物的其他實例包括,但不限於,AMEP(Bioalliance公司)、EMD-1204831(Merck KgaA/EMD Serono公司)、INCB-028060(Incyte/Novartis公司)、ARQ197(ArQule公司)、AMG102(Amgen公司),以及RG-3638(Roche/Genentech公司)。例如,於PCT專利申請公開第WO2012042421A1號中所描述之細節,其透過引用整體併入本文。
如本文所用,術語「小分子HGFR抑制化合物」或「小分子HGFR抑制劑」可包括抑制或結合HGFR的小分子化合物。除非另有說明,本文對小分子HGFR抑制劑的所有引用均包括對其藥學上可接受之鹽類、溶劑化物、水合物,以及複合物的引用,以及對其藥學上可接受之鹽類的溶劑化物、水合物,以及複合物(包括其多晶型物、立體異構體,以及同位素標記的形式)的引用。
如本文所用,術語「藥學上可接受之鹽類」包括酸加成鹽類。「藥學上可接受之酸加成鹽類」係指保留游離鹼的生物有效性及性質的那些鹽類,其由無機酸形成,例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等,以及由有機酸形成,例如醋酸、丙酸、丙酮酸、馬來酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸、三氟乙酸等。術語「藥學上可接受之鹽類」還包括鹼鹽。合適的鹼鹽由形成無毒鹽的鹼所形成。實例包括鋁、精胺酸、苄乙二胺、鈣、膽鹼、二乙胺、二醇胺、甘胺酸、離胺酸、鎂、葡甲胺、乙醇胺、鉀、鈉、氨丁三醇,以及鋅鹽。
本文所用之術語「有效量」係指在一治療個體或細胞中賦予所需生物效應的活性成分的量。有效量可根據各種原因而改變,例如施用途徑及頻率、接受該藥物的個體之體重及種類,以及施用目的。本領域技術人員可根據本文之公開內容、確定的方法,及其自己的經驗來確定每種情況下的劑量。
透過本文所述之治療方法治療的個體可為哺乳動物,更佳為人類。哺乳動物包括,但不限於,農場動物、運動動物、寵物、靈長類動物、馬、狗、貓、小鼠,以及大鼠。
如本文所用,「藥學上可接受之載體」係指該載體與該組合物中的活性成分相容,且較佳可穩定該活性成分並對接受的個體而言是安全的。該載體可為該活性成分的稀釋劑、載劑、賦形劑,或基質。通常,包含活性成分的組合物,例如,EpCAM抑制劑、HGFR抑制劑,或其組合可配製為溶液形式,例如水溶液(如,鹽溶液)或其可以粉末形式提供。適當的賦形劑還包括乳糖、蔗糖、葡萄糖、山梨糖、甘露糖、澱粉、阿拉伯膠、磷酸鈣,海藻酸鹽、黃蓍膠、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素,聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、無菌水、糖漿,以及甲基纖維素。該組合物還可包含接近生理條件所需的藥學上可接受之輔助物質,例如,pH調節劑以及緩衝劑,例如,乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等。該組合物的形式可為片劑、丸劑、粉劑、錠劑、小包、口含錠、酏劑、混懸劑、洗劑、溶液、糖漿、軟及硬明膠膠囊、栓劑、無菌注射液,以及包裝粉末。本發明之組合物可透過任何生理上可接受之途徑遞送,例如口服、腸胃外(例如,肌肉內、靜脈內、皮下,以及腹膜內)、透皮、栓劑,以及鼻內方法。於某些具體實施例中,本發明之組合物以一液體可注射製劑形式施用,其可以即用劑型或可重構的穩定粉末形式來提供。
於某些具體實施例中,本發明中使用的兩種活性成分EpCAM抑制劑以及HGFR抑制劑可配製成混合物或獨立地配製成套組形式,用於同時、分開或依序施用於個體。每種成分可與合適的藥學上可接受之載體一起配製,以用於適當的給藥途徑。於某些具體實施例中,EpCAM抑制劑以及HGFR抑制劑可在合適的包裝單元中提供,其中EpCAM抑制劑或包含EpCAM抑制劑的組合物以及HGFR抑制劑或包含HGFR抑制劑的組合物存在於不同的包裝單元中。
根據本發明,相較於單獨使用EpCAM抑制劑或HGFR抑制劑,EpCAM抑制劑與HGFR抑制劑的結合使用對於癌症治療提供協同效應,特別是在抑制癌細胞的遷移/侵襲、減小腫瘤大小、減少或抑制腫瘤進展、轉移,及/或延長癌症患者的生存期。特別是,如實施例(例如,實施例2.8)所示,在轉移性及原位動物模型中,對照IgG以及HGFR抑制劑(克唑替尼)組中的所有動物都表現出顯著的腫瘤以及較差的存活率,而以EpCAM中和抗體(EpAb2-6)作為EpCAM抑制劑的處理組則表現出較慢的腫瘤進展以及較高的中位生存期;令人驚訝的是,使用EpCAM中和抗體(EpAb2-6)作為EpCAM抑制劑以及HGFR抑制劑(克唑替尼)的結合治療在減少腫瘤進展方面提供了顯著的協同作用。
於某些具體實施例中,EpCAM抑制劑以及HGFR抑制劑同時、分別,或依序施用以提供協同抗癌或抗轉移作用,特別是該癌症對協同組合敏感。
於某些具體實施例中,該癌症選自由肺癌、腦癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、胃癌、頭頸癌、腎癌、血癌、肝癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、皮膚癌,以及睾丸癌所組成之群組。
本發明透過以下實施例進一步說明,提供這些實施例之目的是為了說明而非限制。本領域技術人員應當理解,根據本發明之內容,在不脫離本發明之精神及範圍的情況下,可對所公開的具體實施方式進行許多改變且仍然獲得相似或類似的結果。
實施例
已知EpCAM訊息傳導可促進大腸癌的進展及轉移。雖然轉移是癌症治療失敗的主要原因之一,但EpCAM訊息傳導在轉移過程中的參與程度尚不清楚。於此,我們證明了EpCAM(EpEX)的可溶性胞外結構域與HGFR結合,且在大腸癌細胞中誘導下游訊息傳導。我們還顯示,在HGF處理後EpEX的產生升高,且EpEX以及HGF協同調節HGFR訊息傳導。此外,EpEX透過活化ERK以及FAK-AKT訊息傳導途徑以增強大腸癌細胞的轉移潛能,並透過降低GSK3β活性進一步穩定活化的β-連環蛋白以及Snail蛋白。最後,我們顯示,抗EpCAM中和抗體(EpAb2-6)以及HGFR抑制劑(克唑替尼)的結合治療可顯著抑制腫瘤進展並延長大腸癌轉移性以及原位動物模型的生存期。我們的研究結果闡明,EpCAM訊息傳導促進大腸癌轉移的分子機制,進一步表明EpAb2-6與克唑替尼的組合可能是大腸癌治療的有效策略。
1.
材料與方法
1.1
化學品與抗體
抗α-微管蛋白以及GAPDH抗體來自Sigma-Aldrich公司。抗人類 EpCAM抗體、抗總ERK以及Thr202/Tyr204-磷酸化ERK抗體、抗總AKT抗體、抗Ser473-磷酸化AKT抗體、抗總HGFR抗體、抗Tyr1234/1235-磷酸化HGFR抗體、抗非磷酸化(活化)β-連環蛋白(Ser45)抗體、抗β-連環蛋白抗體、抗E-黏附蛋白抗體、抗波形蛋白抗體、抗Snail抗體、抗Slug抗體,以及抗Twist抗體來自Cell Signaling Technology公司。LY294002(AKT抑制劑)亦來自Cell Signaling Technology公司。福瑞替尼(HGFR抑制劑)、SU11274(HGFR抑制劑)、U0126(MEK抑制劑)、PF-562271(FAK抑制劑),以及BIO(GSK3β抑制劑)購自Selleck Chemicals公司。克唑替尼(HGFR抑制劑)購自Med Chem Express公司。抗總GSK3β抗體、抗磷酸化GSK3β(磷酸化S9)抗體、抗磷酸化ADAM17(磷酸化T735)抗體、抗總ADAM17抗體、抗磷酸化早老素2/AD5(磷酸化S327)抗體、抗總早老素2/AD5抗體、抗V5-tag抗體、抗6x His-tag抗體,以及抗c-Myc-tag抗體,以及Met(pY1234/pY1235)+ 總Met ELISA套組(ab126451)購自Abcam公司。人類HGFR(c-MET)以及HGF重組蛋白則購自Sino Biological公司。
1.2
細胞株與培養
使用以下人類細胞株:HEK293T、大腸癌細胞株HCT116(ATCC: CCL-247),以及HT29。細胞在添加10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS;Gibco公司)以及100 µg/ml青黴素/鏈黴素(P/S;Gibco公司)的Dulbecco氏改良Eagle氏培養基(Dulbecco modified Eagle’s media,DMEM)中,於37℃、5% CO
2加濕培養箱中培養。
1.3
哺乳動物慢病毒
shRNA
針對敲低實驗,pLKO載體中的人類EpCAM shRNA係從中央研究院的RNAi核心設施所獲得。慢病毒係根據標準程序稍作修改所生產。簡言之,將293T細胞以70%的密度接種在100毫米培養皿中,並轉染包裝載體(亦即, pCMV-ΔR8.91,含有gag、pol以及rev基因)、包膜載體(亦即,pMD2.G;VSV-G表現質體),以及一個別shRNA載體。使用poly-jet轉染試劑(SignaGen Laboratories公司)將shRNA質體轉染至293T細胞中。經過隔夜培養後,將培養基更換為含BSA的培養基。以含有聚凝胺(8 µg/ml)的病毒上清液感染HCT116細胞24小時。重複感染過程,然後將細胞在嘌呤黴素(2 µg/ml)中培養7天,以選擇具有穩定shRNA表現的細胞。
1.4 EpCAM
基因敲除
針對EpCAM敲除,自Genescript公司購買CRISPR/cas9 gRNA構築物。為了產生慢病毒,293T細胞轉染CRISPR/cas9 gRNA質體、EpCAM gRNA(目標序列:GTGCACCAACTGAAGTACAC,SEQ ID NO: 21)、包裝質體(pCMV-ΔR8.91)以及包膜表現質體(pMD. G)。以含有慢病毒的培養基培養HCT116或HT29細胞,並以2 µg/ml嘌呤黴素篩選。從篩選到的群體中分離出單細胞株,並以西方墨點法檢測EpCAM的表現。
1.5 EpEX-His
重組蛋白的生產及純化
使用Expi293表現系統表現並純化重組蛋白。細胞在Expi293表現培養基中生長,透過添加增強劑誘導蛋白表現。離心收穫上清液。於4℃下以8000
g離心20分鐘後,將上清液與鎳螯合親和樹脂(Ni-NTA,Qiagen公司)於4℃下作用2小時。以含有50 mM Tris-HCl(pH 8.0)、500 mM NaCl,以及20 mM咪唑的清洗緩衝液清洗樹脂,並以含有50 mM Tris-HCl(pH 8.0)、500 mM NaCl,以及250 mM咪唑的流洗緩衝液流洗蛋白質。
1.6 EpCAM
類
EGF
結構域缺失突變體之構築
在EpCAM的胞外結構域中,EpCAM在第27-59個胺基酸(類EGF結構域I)以及第66-135個胺基酸(類EGF結構域II)處包含兩個類EGF結構域,以及一個不含半胱胺酸的基序(Schnell等人,2013年)。EpCAM類EGF結構域缺失突變體係使用標準QuikChange
TM缺失突變系統所產生,該系統具有第一正向誘變缺失引子(5'-GCAGCTCAGGAAGAATCAAAGCTGGCTGCC-3',SEQ ID NO: 22)、第一反向誘變缺失引子(5'-GGCAGCCAGCTTTGATTCTTCCTGAGCTGC-3',SEQ ID NO: 23)、第二正向引子(5'-AAGCTGGCTGCCAAATCTGAGCGAGTGAGA-3',SEQ ID NO: 24),以及第二反向引子(5'-TCTCACTCGCTCAGATTTGGCAGCCAGCTT-3',SEQ ID NO: 25)。使用KAPA HiFi熱啟動DNA聚合酶(Kapa Biosystems公司)進行PCR擴增,並以限制酶DpnI(Thermo Scientific公司)處理產物以消化甲基化的親本DNA。
1.7
免疫沉澱分析
以蛋白酶抑制劑(Roche公司)在裂解緩衝液(50 mM Tris-HCl,pH 7.4、150 mM NaCl,以及1% NP-40)中裂解細胞。針對免疫沉澱,將細胞裂解物及抗體於4℃下作用6小時。然後,加入20 µL Dynabeads蛋白G,該混合物於4℃下培養2小時以下拉抗體結合蛋白。以PBS清洗免疫沉澱樣品3次,在樣品緩衝液中變性,並以西方墨點法分析。
1.8
單株抗體的產生及
IgG
的純化
如前所述(Liao等人,2015年)進行EpAb2-6以及對照IgG的生成。實驗方法經中央研究院動物實驗倫理委員會(AS IACUC: 11-04-166)核准。
1.9
蛋白質萃取以及西方墨點法
以RIPA緩衝液(50 mM Tris-HCl pH7.4、1% NP-40、0.5%去氧膽酸鈉、0.1% SDS、150 mM NaCl、2 mM EDTA、50 mM NaF)製備全細胞萃取物。細胞裂解物的蛋白質濃度由Bradford分析法確定。裂解物在10%聚丙烯醯胺凝膠上分離,然後轉移至PVDF膜上。以含有3% BSA的PBST阻隔該膜1小時。然後將膜與初級抗體一起作用至隔天。施用適當的辣根過氧化物酶相關的二級抗體(Millipore公司),並將膜於室溫(RT)下作用1小時。隨後以化學發光試劑(Millipore公司)使蛋白質條帶可視化,並以BioSpectrum 600影像系統(UVP公司)進行檢測。使用Gel-Pro分析儀3.1(Media Cybernetics公司)以條帶強度進行蛋白質含量的量化。
1.10
細胞活性分析
透過使用WST-1(4-[3-(4-碘苯)-2-(4-硝基苯基)-2H-5-四唑啉]-1, 3-苯二磺酸鹽)分析法測量粒線體去氫酶活性以測定細胞活性。將細胞以10
4個細胞/孔的密度接種在96孔盤中並培養24小時。將含有指定濃度的EGF、EpEX或聚醣-EpEX的新培養基添加至細胞中。處理期結束時,每孔加入10 µl WST-1增殖試劑(5 µg/ml),於37℃下培養1小時。培養後,使用分光光度微量盤分析儀於波長450 nm處檢測每個孔的吸光度。
1.11
細胞群落形成分析
將細胞接種於24孔盤中(1 x 10
4個細胞/孔)並培養7天。然後以4%的甲醛固定細胞並以結晶紫溶液染色。捕獲該24孔盤的影像後,將含有0.5% SDS的溶液添加到每個孔中,並將該24孔盤於室溫下作用2小時。然後藉由使用微量盤分析儀測量溶液於波長570 nm處的吸光度以確定細胞的相對密度。本實驗進行三重複。
1.12 Transwell
遷移及侵襲分析
以含或不含10%基質膠的8-µm孔徑的Transwell遷移室(Millicell公司)測定細胞遷移及侵襲。將細胞(1 x 10
5個)添加至含有500 µl無血清DMEM的上室中。然後,將含有10% FBS的700 µl DMEM作為化學引誘劑添加至下室中。於37℃下在標準細胞培養箱中進行16小時的遷移及侵襲。然後,以棉籤從膜的上表面去除細胞,遷移到下表面的細胞則以包含0.05%(w/v)結晶紫的4%多聚甲醛(溶於1x PBS內)染色15分鐘並以水清洗。將膜乾燥15-20分鐘,然後針對每個實驗條件的樣品以高功率檢查膜上的至少四個隨機區域以進行細胞計數。
1.13
細胞凋亡分析
接種細胞並以10 µg/ml單株抗體或抑制劑處理6小時;以適當稀釋度的無關小鼠骨髓瘤免疫球蛋白(Invitrogen公司,型號02-6200)作為IgG2a同種型對照。使用Annexin V-FITC以及PI檢測凋亡細胞,並使用流式細胞儀(BD Immunocytometry Systems)進行分析。使用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測套組II(BD Pharmingen公司)測量早期細胞凋亡。以碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色檢測晚期凋亡細胞核。
1.14 RNA
萃取、
cDNA
合成、定量反轉錄聚合酶連鎖反應(
quantitative reverse transcription polymerase chain reaction
,
qRT-PCR
)
如製造商說明書所述進行總RNA萃取、第一鏈cDNA合成,以及基於SYBR-green的即時PCR。為了萃取總RNA,使用TRIzol試劑(Invitrogen公司)裂解細胞,並使用氯仿從TRIzol中去除蛋白質及苯酚。離心後,收集頂部無色層並與異丙醇混合以沉澱RNA。然後以70%乙醇清洗該RNA沉澱物,於室溫下風乾,並將該RNA溶解於不含RNase的水中。針對第一鏈cDNA的合成,使用5 µg總RNA與oligo(dT)引子以及SuperScriptIII反轉錄酶(Invitrogen公司)於50℃下進行反轉錄60分鐘。使用LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix(Roche公司)以及LightCycler480 System(Roche公司)藉由定量PCR(quantitative PCR,qPCR)評估目標基因含量。測量GAPDH mRNA的表現作為內源性管家基因對照以標準化所有q-PCR反應。qPCR反應為95℃ 5分鐘,然後進行40個循環,95℃變性10秒,60℃黏合10秒,72℃延伸30秒。最終結果由三個獨立實驗計算得出。用於檢測目標基因的mRNA表現的引子序列列於補充材料表3中。
表3
基因 | 正向、反向引子 |
EPCAM | 正向:5'- CTCCACGTGCTGGTGTGT R -3'(SEQ ID NO: 26) 反向:5'- TGTTTTAGTTCAATGATGATCCAGTA-3'(SEQ ID NO: 27) |
E-黏附蛋白 | 正向:5'- GGAACTATGAAAAGTGGGCTTG-3'(SEQ ID NO: 28) 反向:5'- AAATTGCCAGGCTCAATGAC-3'(SEQ ID NO: 29) |
VIM | 正向:5'-GTTTCCCCTAAACCGCTAGG-3'(SEQ ID NO: 30) 反向:5'-AGCGAGAGTGGCAGAGGA-3'(SEQ ID NO: 31) |
SNAIL | 正向:5'-CTTCGGCTCCAGGAGAGTC-3'(SEQ ID NO: 32) 反向:5'-TTCCCACTGTCCTCATCTGAC-3'(SEQ ID NO: 33) |
GAPDH | 正向:5'-CTTCACCACCATGGAGGAGGC-3'(SEQ ID NO: 34) 反向:5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'(SEQ ID NO: 35) |
1.15
大腸癌轉移動物模型
透過尾靜脈將PBS中的大腸癌HCT116或HT29細胞(5 x 10
6個細胞/小鼠)注射至4-6週齡的雌性NOD/SCID小鼠中。然後將小鼠按體重隨機分配到不同的處理組。3天後,以尾靜脈注射施用抗體,每週兩次,連續四週。每日透過口服管飼法施用克唑替尼,每週5天(處理4週)。針對治療研究,荷瘤小鼠接受同種型對照IgG1(15 mg/kg)、克唑替尼(20 mg/kg)、EpAb2-6(15 mg/kg),或克唑替尼(20 mg/kg)結合EpAb2-6(15 mg/kg)的處理。測量小鼠存活率。動物護理依照中央研究院(臺灣)的指導方針進行。該實驗程序經中央研究院動物實驗倫理委員會核准(AS IACUC:20-05-1468)。
1.16
原位植入與治療研究
如先前報導所述建立原位腫瘤模型(Chen等人,2020年)。簡言之,NSCID小鼠用於原位植入先前感染Lenti-luc病毒(含有螢光素酶基因的慢病毒)的HCT116細胞。透過腹腔注射麻醉小鼠。以250 mg/kg的劑量注射麻醉劑Avertin、2,2,2-三溴乙醇(Sigma-Aldrich公司)。透過生物發光影像監測腫瘤發展。針對治療研究,荷瘤小鼠接受同種型對照IgG1(15 mg/kg)、克唑替尼(20 mg/kg)、EpAb2-6(15 mg/kg),或克唑替尼(20 mg/kg)結合EpAb2-6(15 mg/kg)處理。藉由定量生物發光來監測腫瘤進展。並且監測小鼠存活率。動物護理依照中央研究院的指導方針進行。該實驗程序經中央研究院動物實驗倫理委員會核准(AS IACUC:20-05-1468)。
1.17
統計分析
針對指定的實驗次數,所有數據均表示為平均值 ± SEM。以未配對學生氏t檢驗分析實驗與對照培養物中的表現百分比。
p值小於0.05被認為具有統計學意義。
2.
結果
2.1 EpEX
透過與
HGFR
相互作用誘導
HGFR
磷酸化
在我們先前的研究中,我們以Human Phospho-RTK Array Kit(R&D Systems公司)進行分析,發現EpEX在HCT116細胞中誘導EGFR與HGFR磷酸化(Liang等人,2018年)。為了測試內源性EpCAM是否直接與HCT116以及HT29大腸癌細胞株中的HGFR相互作用,我們使用交聯劑DTSSP來穩定推定的EpCAM-HGFR複合物。正如我們所預測,藉由免疫沉澱(IP)以及西方墨點法證實EpCAM與HGFR的相互作用(圖1A)。為了進一步研究膜結合的EpCAM是否可與HGFR的胞外結構域(HGFR
ECD)結合,我們使用過表現EpCAM-V5以及HGFR
ECD-c-Myc-tag的HEK293T細胞進行共免疫沉澱(co-IP)實驗。結果證實外源性EpCAM與HGFR之間的相互作用(圖1B)。接下來,我們進行IP實驗以探測重組EpEX-Fc與HGFR
ECD-His重組蛋白之間的直接相互作用。(圖1C)。為了研究EpEX對大腸癌細胞中HGFR磷酸化的影響,我們分析了HCT116以及HT29細胞中磷酸化HGFR的含量。西方墨點法以及ELISA結果顯示,EpCAM與EpEX均誘導兩種細胞類型中的HGFR磷酸化。事實上,只有EpEX可以在沒有EpCAM的情況下誘導HGFR磷酸化(圖1D及圖1E)。
EpEX由兩個類EGF的結構域所組成(Schnell等人,2013年),因此我們試圖確定哪個結構域與HGFR相互作用。為此,我們構建了各種類EGF結構域缺失突變體(EpCAM
ΔEGFI+II、EpCAM
ΔEGFI,以及EpCAM
ΔEGFII)質體。令人驚訝的是,僅含有一個類EGF結構域缺失的突變體(EpCAM
ΔEGFI以及EpCAM
ΔEGFII)可與HGFR相互作用,而兩個結構域缺失的突變體(EpCAM
ΔEGFI+II)則未顯示出這種結果(圖1F)。當評估HGFR
ECD與可溶性EpEX野生型或突變蛋白的結合時,觀察到類似的結果(圖1G)。總體而言,這些發現表示膜結合的EpCAM以及分泌的EpEX皆可透過EpCAM/EpEX的EGF結構域I或II結合HGFR。
接下來,我們進行ELISA以探測EpEX-Fc以及HGFR-His蛋白的類EGF結構域缺失突變體的幾種變體之間的潛在相互作用。結果證實,當HGFR與EpEX
ΔEGFI+II突變蛋白的結合完全消除時,EpEX透過其兩個結構域與HGFR結合(圖1H)。與先前研究的野生型EpEX(圖1D以及E)表現出的磷酸化結果相似,我們觀察到EpEX
ΔEGFI以及EpEX
ΔEGFII都可誘導HGFR磷酸化,但EpEX
ΔEGFI+II蛋白則不能(圖1I及圖1J)。基於這些結果,我們得出結論,EpEX可與HGFR結合並誘導隨後的磷酸化。
2.2 EpEX
透過
HGFR
訊息傳導促進腫瘤進展
EpCAM誘導HGFR磷酸化的能力表示該途徑可能部分負責大腸癌細胞的致瘤性。為了研究EpCAM以及HGFR活化是否協同調節癌症進展及轉移,我們檢測了在有或沒有HGF處理的EpCAM敲除細胞中磷酸化ERK以及AKT的含量。西方墨點法結果顯示,在EpCAM敲除的HCT116以及HT29細胞中,HGFR、AKT以及ERK的磷酸化不受HGF處理的影響(圖2A)。此外,細胞生長試驗的結果顯示,EpCAM敲除細胞的生長速度比野生型HCT116及HT29細胞慢,但EpCAM敲除的HCT116及HT29細胞的生長軌跡可以HGF處理來恢復(圖2B)。
為了確定EpEX是否可透過HGFR訊息傳導誘導癌症進展及侵襲,我們分析了以EpEX-His以及HGFR的酪胺酸激酶抑制劑SU11274組合處理後,大腸癌細胞中EGFR、ERK以及AKT的磷酸化。我們發現SU11274可減弱HCT116及HT29細胞中EpEX調節的ERK及AKT的磷酸化(圖2C)。為了進一步了解這種抑制對細胞生長的影響,我們發現,單獨以EpEX處理會刺激HCT116以及HT29細胞的生長,而SU11274消除了大腸癌細胞中由EpEX誘導的細胞活性及增殖的增加(圖2D)。
此外,HGFR敲低降低了HGFR、EGFR、AKT以及ERK的磷酸化程度。有趣的是,HGFR敲低也降低了EGFR的磷酸化程度(圖2E)。此外,HGFR敲低減少了EpEX誘導的RIP(磷酸化的ADAM17以及早老素2)(圖2F)以及活化β-連環蛋白的核轉譯(圖2G)。此外,HCT116細胞中HGFR的敲低顯著降低了EpEX誘導的細胞生長及細胞群落的形成(圖2H及圖2I)。事實上,我們發現透過IP分析顯示,以HGF處理HCT116細胞後EpEX的產生增加(圖2J)。我們還注意到,HGF的處理增加了HCT116細胞中ADAM17、早老素2以及EpEX的磷酸化(圖2K)。
2.3 EpEX
活化
ERK
及
FAK-AKT
的訊息傳導
已知EpCAM透過其下游效應子影響癌細胞的生長、存活以及轉移。在其訊息傳導過程中,EpCAM的蛋白水解產生EpEX,這可能進一步刺激RIP以及EpICD的釋放,隨後轉導EpCAM訊息傳導(Lin等人,2012年)。此外,先前的研究顯示,對HCT116細胞進行EpEX處理可透過磷酸化TACE與早老素2(γ-分泌酶的催化亞基)來增加RIP(Liang等人,2018年)。因此,我們以EpEX處理EpCAM敲除的HCT116細胞,導致HGFR下游訊息傳導的部分恢復,例如AKT、FAK以及ERK的磷酸化以及RIP蛋白(ADAM17與早老素2)的磷酸化(圖3A)。先前的研究顯示,GSK3β拮抗劑透過AKT刺激EMT(An等人,2020年)。根據此一機制,我們發現EpEX可挽救GSK3β(S9,非活化GSK3β)的抑制性磷酸化,同時降低EpCAM敲除細胞中GSK3β(Y216,活化GSK3β)的活化磷酸化(圖3A)。我們還發現EpEX增加了EpCAM敲除的HCT116細胞中的細胞群落形成(圖3B),並阻斷內源性EpEX而非EpICD的脫落,導致HGFR、AKT以及ERK的磷酸化程度降低,表示內源性EpEX對HGFR訊息傳導活化相當重要(圖3C)。
我們接下來測試EpEX是否可增強HGF誘導的HGFR訊息傳導。相較於單獨以EpEX或HGF處理,HCT116以及HT29細胞與可溶性EpEX結合HGF的作用上調了HGFR的磷酸化以及隨後的下游包括AKT以及ERK的磷酸化(圖3D)。由於EpEX可觸發HGFR活化,我們進一步研究EpEX對HGFR訊息傳導介質的影響。於此情況下,AKT以及ERK訊息傳導是兩個最重要的癌症相關訊息傳導途徑(Chang等人,2013年;Sun等人,2015年),因為它們在EMT、細胞週期、存活,以及癌症進展的調節中發揮多種生理作用。因此,我們測試了HGFR抑制劑(SU11274)、AKT抑制劑(LY294002)、ERK抑制劑(U0126),以及FAK抑制劑(PF-562271)是否會影響HCT116細胞中由EpEX誘導的訊息傳導。我們注意到,EpEX增加了AKT、ERK以及FAK的磷酸化程度(圖3E)、細胞群落形成潛力(圖3F)、傷口癒合(圖3G)以及遷移(圖3H)的能力。總之,這些結果表示,EpEX透過誘導大腸癌細胞中的HGFR活化來增加ERK以及FAK-AKT訊息傳遞途徑。
2.4 EpEX
透過下調
GSK3β
活性來誘導活化
β-
連環蛋白以及
Snail
蛋白的表現以促進
EMT
及侵襲
我們發現,EpCAM敲除抑制了間質標記物波形蛋白的表現,以及EMT調節因子Snail的蛋白含量,同時增強了HCT116細胞中E-黏附蛋白的表現;此外,這種EMT指標在EpEX處理後恢復(圖4A)。EpEX還在EpCAM敲除的HCT116細胞中誘導細胞侵襲(圖4B)。
為了研究EpCAM以及HGFR活化是否協同調節癌細胞侵襲,我們檢視有或沒有以HGF處理的EpCAM敲除細胞。我們發現,相較於野生型細胞,EpCAM敲除的HCT116及HT29細胞中,EMT相關蛋白的表現以及細胞侵襲特性顯著降低。在EpCAM敲除細胞中,HGF誘導的EMT及侵襲活性也降低了(圖4C及圖4D)。相較於單獨以EpEX或HGF處理,HCT116以及HT29細胞與EpEX結合HGF的作用上調了EMT的程度以及細胞侵襲(圖4E及圖4F)。此外,透過HGFR的敲低可防止EpEX誘導的EMT相關蛋白表現以及細胞侵襲(圖4G及圖4H)。這些結果表示,EpEX可增強HGFR活化並誘導大腸癌細胞的EMT及轉移。
先前的報導顯示,GSK3β拮抗劑透過AKT訊息傳導刺激EMT,進而透過其磷酸化及泛素調節的蛋白水解影響Snail蛋白的轉換(An等人,2020年)。根據此一機制,我們發現,EpEX可誘導GSK3β(S9,非活化GSK3β)的抑制性磷酸化,同時降低該蛋白質的活化磷酸化(Y216,活化GSK3β);這些變化與HCT116細胞中Snail蛋白的表現增加一致。然而,SU11274可減弱EpEX調節的GSK3β活性並消除HCT116細胞中EpEX誘導的活性β-連環蛋白以及Snail蛋白的表現(圖4I)。我們還發現,HGFR下游介質的抑制劑(亦即,LY294002、U0126,以及PF-562271)可減弱EpEX調節的GSK3β活性以及Snail蛋白的表現(圖4J)。LY294002、U0126以及PF-562271也抑制EpEX誘導的侵襲(圖4K)。值得注意的是,在以GSK3β抑制劑BIO處理後,對照及EpEX處理的細胞中活性β-連環蛋白以及Snail蛋白的表現均上調(圖4L)。這些結果表示,EpEX透過下調GSK3β活性誘導活β-連環蛋白以及Snail蛋白的表現來促進EMT及侵襲。
2.5 EpEX
透過抑制泛素化調節的蛋白酶體降解來促進
Snail
蛋白的穩定性
我們透過以表現Cas9的慢病毒以及以EpCAM為目標的sgRNA轉染大腸癌細胞,來分析EpCAM對EMT相關基因表現的影響。結果顯示,EpCAM的敲除增加了E-黏附蛋白的基因表現,降低了VIM的基因表現。然而,EpCAM的敲除不影響SNAIL基因的表現程度(圖5A)。事實上,我們注意到,環己醯胺處理加上EpCAM的敲除縮短了Snail蛋白的半衰期(圖5B)。另一方面,以MG132(26S蛋白酶體抑制劑)處理則增加Snail穩態蛋白質的含量,表示蛋白質含量在很大程度上受蛋白酶體降解的控制(圖5C)。相較於對照細胞,EpCAM的敲除還導致泛素化Snail蛋白的含量增加(圖5D)。此外,以環己醯胺處理進一步證實EpEX延長了Snail蛋白的半衰期(圖5E)。EpEX不影響Snail基因的表現及程度(圖5F),而MG132在有或沒有EpEX處理的情況下則增加HCT116細胞中的Snail穩態蛋白的含量(圖5G)。
於此方面,Snail蛋白的富含絲胺酸區域的兩個共通基序(基序1:S97、S101;基序2:S108、S112、S116、S120)對其轉錄後調控及泛素化調節的蛋白酶體降解相當重要(Zhou等人,2004年)。以野生型(Snail-WT)以及三種突變體(Snail-2SA、Snail-4SA,以及Snail-6SA)Snail構築體轉染HCT116細胞(圖5H)。雖然以EpEX處理轉染細胞顯著增加了Snail-WT以及Snail-2SA的表現,但對Snail-4SA以及Snail-6SA突變體的表現沒有觀察到這種影響(圖5I)。這些數據顯示,EpEX透過Snail蛋白在癌細胞中的富含絲胺酸的共通基序2上調節Snail的蛋白質穩定性。綜上所述,這些實驗的結果顯示,EpEX透過促進大腸癌細胞中Snail蛋白的穩定性,在EMT的調節中具有重要的作用。
2.6 EpAb2-6 透過活化 GSK3β 來抑制 EpCAM 以及 HGFR 的訊息傳導並促進活化β
- 連環蛋白以及 Snail 蛋白的降解
於此之前,我們開發了一種中和抗體EpAb2-6,其以EpEX為標靶並誘導癌細胞凋亡(Liang等人,2018年;Liao等人,2015年)。因此,我們使用EpAb2-6阻斷大腸癌細胞中EpEX的功能,並分析HCT116細胞中HGFR、AKT、FAK、GSK3β、ERK、ADAM17及早老素2的磷酸化程度。相較於以對照IgG處理,以EpAb2-6處理細胞導致HGFR、AKT、ERK以及FAK的磷酸化程度降低(圖6A)。HGF的處理增加了HCT116細胞中HGFR、AKT以及ERK的磷酸化程度。同時,這些磷酸化蛋白的含量在以EpAb2-6處理的細胞中顯著降低。此外,EpAb2-6的處理也顯著降低了HCT116細胞的侵襲及遷移活性(圖6B)。當HCT116細胞在以EpAb2-6處理後再以HGF處理時,EpAb2-6對侵襲及遷移的影響被部分減弱(圖6C及6D)。
有趣的是,EpAb2-6降低了EpCAM與HGFR之間的關聯,這透過HCT116細胞中內源蛋白的IP而被檢測到(圖6E)。為了評估重組EpEX是否直接與HGFR結合,我們進行ELISA以探測純化的EpEX-His以及HGFR-Fc蛋白之間的相互作用。ELISA分析進一步證實EpEX與HGFR的結合活性,我們還發現,抗EpCAM單株抗體EpAb2-6可抑制EpEX與HGFR的結合(圖6F)。
在這些實驗之後,我們接下來分析以對照IgG或EpAb2-6處理的HCT116細胞中的EMT蛋白表現程度。結果顯示,EpAb2-6增加了E-鈣黏蛋白的含量,同時降低了Snail及活性β-連環蛋白的含量(圖6G)。此外,EpAb2-6降低了S9處GSK3β的抑制性磷酸化(非活化GSK3β),同時增加了Y216處蛋白質的活化磷酸化(活化GSK3β)。預計這些變化會增加GSK3β的活性,並且與觀察到的活化β-連環蛋白以及Snail蛋白的減少一致。相應地,在以GSK3β抑制劑BIO處理後,活化β-連環蛋白以及Snail蛋白的含量增加(圖6H)。以EpAb2-6處理則降低了活化β-連環蛋白以及Snail穩態蛋白的含量,而以蛋白酶體抑制劑(MG132)處理增則加了活化β-連環蛋白以及Snail穩態蛋白的含量(圖6I)。此外,EpAb2-6縮短了Snail蛋白的半衰期,如環己醯胺處理試驗所示(圖6J)。這些結果顯示,EpAb2-6透過下調HGFR訊息傳導來抑制轉移過程,並透過增加GSK3β的活性允許活化β-連環蛋白以及Snail蛋白的降解。
我們進一步測試EpAb2-6的二價抗體片段F(ab’)
2與EpEX的結合是否可誘導細胞凋亡。結果顯示,EpAb2-6的F(ab’)
2確實可與EpEX結合(圖7A)並誘導大腸癌細胞凋亡(圖7B)。我們還使用細胞凋亡分析來評估人源化EpAb2-6(hEpAb2-6)以及人類抗EpCAM抗體阿德木單抗(adecatumumab)(MT201)是否具有相似的活性。EpAb2-6以及hEpAb2-6在誘導細胞凋亡方面表現出相似的功能屬性,而MT201在HCT116或HT29癌細胞中沒有表現出這種效果(圖7C)。我們還發現,EpAb2-6以及hEpAb2-6都抑制HGFR、AKT以及ERK的磷酸化,但MT201則不能(圖7D)。在以EpAb2-6或hEpAb2-6處理後,磷酸化的ADAM17及早老素2的含量也降低了,而MT201抗體沒有這種效果(圖7E)。我們的數據顯示,EpEX以及HGFR協同刺激下游HGFR的訊息傳導以促進腫瘤進展及細胞侵襲,因此我們希望透過同時阻斷EpCAM以及HGFR的訊息傳導來進一步測試抗腫瘤效果。此外,我們發現,HGFR抑制劑克唑替尼可增強EpAb2-6對HCT116以及HT29癌細胞的凋亡作用(圖7F)。在細胞侵襲試驗中,相較於對照IgG,克唑替尼增強了EpAb2-6對HCT116以及HT29細胞侵襲的抑制作用(圖7G)。
2.7 EpAb2-6
與
EpCAM
的類
EGF
結構域
I
及
II
結合
先前的一項研究確認EpAb2-6抗體的結合抗原決定位為EpCAM中的LYD基序,該基序對應於第94-96個胺基酸殘基;特別是,殘基95(Y95)在EpAb2-6結合中具有主要的作用(Liao等人,2015年)。於本文中,我們發現EpEX透過類EGF結構域I及II與HGFR結合(圖1F及圖1G),且EpAb2-6可抑制EpEX與HGFR的結合(圖6E及圖6F)。因此,我們想確定該抗體是否在EpEX的兩個類EGF結構域與EpCAM結合(圖8A、圖8B、圖8C)。為了確認EpAb2-6識別EpCAM中的LYD基序,我們構築了編碼EpCAM的第一類EGF重複序列(第27-59個胺基酸;EGF-I結構域)的cDNA序列以及第二類EGF重複序列(第66-135個胺基酸;EGF-II/TY結構域)的cDNA序列。然後使用基於PCR的定點誘變將突變引入每個結構域(圖8D)。透過免疫螢光(圖8E)、流式細胞儀分析(圖8F)以及細胞ELISA分析(圖8G)評估EpAb2-6抗體對這些EpCAM突變體的反應。EpCAM位置Y32(EGF-I結構域)或Y95(EGF-II結構域)的胺基酸突變導致EpAb2-6的結合顯著降低,但不影響MT201的結合。因此,我們得出結論,EpAb2-6與EpEX的EGF-I以及EGF-II結構域結合,分別以胺基酸殘基Y32以及Y95為標靶。
2.8 EpAb2-6
提高克唑替尼治療大腸癌動物模型的療效
在動物模型中,移植後72小時開始進行處理(圖9A)。首先,我們檢視克唑替尼與EpAb2-6對大腸癌細胞HCT116轉移的影響。在注射細胞後3天,對NOD/SCID小鼠靜脈注射HCT116細胞,然後以克唑替尼以及EpAb2-6或等量的對照IgG共同處理。相較於對照IgG,植入HCT116細胞並接受EpAb2-6及克唑替尼結合處理的小鼠的中位生存時間以及總生存時間都增加(圖9B),這支持了EpAb2-6可提高克唑替尼體內抗轉移作用的觀點。
接下來,我們在大腸癌原位小鼠模型中測試了結合EpAb2-6及克唑替尼以作為治療策略的效果。如圖9C所示,透過體內監測穩定表現螢火蟲螢光素酶的HT29-Luc以及HCT116-Luc細胞來評估腫瘤生長。在開始處理前(腫瘤細胞植入後3天),在所有的小鼠中都可觀察到腫瘤生長。處理後,相較於對照IgG或單獨使用克唑替尼的組別,接受EpAb2-6或EpAb2-6與克唑替尼結合處理的小鼠的生物發光強度顯著降低;在移植HCT116(圖9D及圖9E)或HT29(圖9H及圖9I)細胞的原位模型中觀察到類似的效果。此外,在移植HCT116(圖9F)或HT29(圖9J)細胞原位模型中,處理組之間的體重沒有顯著差異。相較於對照IgG組,接受EpAb2-6及克唑替尼組合的移植HCT116(圖9G)或HT29(圖9K)細胞的小鼠的中位生存時間以及總生存時間顯著增加。總體而言,我們使用轉移性及原位動物模型的實驗結果顯示,對照IgG及克唑替尼組中的所有動物都出現了明顯的腫瘤且存活率很差。同時,相較於對照IgG或單獨以克唑替尼處理的組別,以EpAb2-6處理的組別的腫瘤進展要慢得多,且顯示出更高的中位生存期。重要的是,腫瘤進展的減弱在結合處理組中最為明顯。
3.
討論
EpCAM表現與許多癌症的腫瘤發生及轉移相關,因此我們試圖闡明本研究中的潛在機制。於此,我們進一步顯示EpEX誘導的腫瘤進展及轉移是由HGFR訊息傳導所調節的。
許多研究已將高HGFR表現或活化與癌症患者的不良結果連結(Birchmeier等人,2003年)。HGFR的高表現預示著甲狀腺癌及非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的預後不良,HGFR為大腸癌中腫瘤侵襲及淋巴結轉移的預測因子(Al-Saad等人,2017年;Takeuchi等人,2003年)。先前的報導還顯示,在胃癌及CRC模型中,阻斷HGFR訊息傳導可減少腫瘤細胞在體外及體內的生長與擴散(Smolen等人,2006年;Toiyama等人,2012年;Zou等人,2007年)。
HGF為一種可調節上皮細胞增殖的細胞激素,主要由間質細胞表現及分泌(Lassus等人,2006年;Taher等人,2002年)。HGF訊息傳導的主要協調者為HGFR,由該訊息傳導途徑誘導的複雜程序促進增殖、存活、基質降解及遷移。HGFR及HGF共同構成了傷口閉合及血管生成所必需的重要上皮及間質相互作用的基礎(Comoglio & Trusolino,2002年)。我們的結果顯示,EpCAM的敲除減弱了大腸癌細胞中HGFR的磷酸化,相較於野生型細胞,EpCAM敲除的HCT116細胞的細胞生長及遷移能力顯著降低。當在EpCAM敲除的HCT16細胞中恢復以HGF處理時,EpCAM誘導的對細胞增殖及遷移的效果被部分逆轉。EpCAM調節HGFR磷酸化的能力顯示該途徑很可能在大腸癌細胞中發揮重要作用。
酪胺酸激酶抑制劑(Tyrosine kinase inhibitors,TKIs)為一種小分子藥物,可透過阻止ATP到達激酶結構域的ATP結合口袋來以活化的RTK作為標靶,無論配體是否存在(Pasquini & Giaccone,2018年)。通常,抗藥性的產生是由於獲得可消除TKI作用的RTK突變,或透過擴增另一種可刺激類似訊息傳導的RTK,例如HGFR(Sacher等人,2014年)。我們團隊先前使用人類磷酸化-RTK分析套組來篩選EpEX-Fc以及Fc處理的HCT116大腸癌細胞中RTK的磷酸化。結果顯示,EpEX處理可刺激HGFR(MET)-酪胺酸磷酸化(Liang等人,2018年)。在這項研究中,我們發現HCT116大腸癌細胞與可溶性EpEX-His蛋白一起作用可誘導HGFR磷酸化。有趣的是,HGFR酪胺酸激酶抑制劑(SU11274)可減弱EpEX調節的ERK以及AKT磷酸化。此外,我們證實HGFR的消耗可減弱EpEX誘導的細胞生長及侵襲,這與HGFR抑制劑的作用一致。
許多研究顯示,EMT與癌症進展及轉移有關(Iwatsuki等人,2010年)。EMT過程涉及一系列複雜的可逆事件,這些事件可導致喪失上皮細胞黏附以及誘導出細胞間質表型。EMT為腫瘤提供獲得間質特徵所需的類似幹細胞的可塑性特徵,使腫瘤細胞能夠擴散並變得更具侵襲性(Sacchetti等人,2021 年;Thiery及Sleeman,2006年)。隨著喪失上皮細胞黏附以及誘導間質特性,經歷EMT的癌細胞也表現出增強的細胞運動及侵襲。EMT的指標包括間質標記物(如,波形蛋白、Snail蛋白,以及Slug蛋白)的表現增加,以及上皮標記物(如,E-鈣黏蛋白)的表現降低,這會破壞細胞與細胞之間的連接(Meng等人,2012年)。此外,經歷過EMT的細胞也會對細胞凋亡產生抗性。許多報告顯示,不同癌症類型的EMT可促進對各種治療藥物的抗藥性(Singh & Settleman,2010年)。基於治療目的,可透過以有助於活化腫瘤細胞中EMT程序的腫瘤微環境成分為標靶來阻斷EMT(Shibue & Weinberg,2017年)。例如,HGF透過HGFR訊息傳導誘導EMT程序,進而透過允許細胞在沒有錨定的情況下在血流中存活,以增強癌細胞的侵襲及轉移潛力。先前的報導顯示,FAK-PI3K/AKT以及MAPK訊息傳導途徑促進大腸癌以及膠質母細胞瘤的遷移及轉移(Golubovskaya,2014年;Song等人,2016年)。我們的數據則顯示,這些分子的抑制劑(亦即,SU11274、LY294002、U0126,以及PF-562271)可減弱EpEX誘導的HCT116細胞的遷移及侵襲。
透過EpEX訊息傳導抑制GSK3β可穩定β-連環蛋白以及Snail蛋白,進而協調誘導EMT相關的細胞遷移及侵襲。值得注意的是,EMT與非磷酸化(活化)β-連環蛋白的高度表現以及β-連環蛋白易位進入細胞核相關,但單獨的β-連環蛋白過度表現並不一定促進EMT相關過程(Kim等人,2000年;Zhou等人,2004年)。此外,Snail為一種鋅指轉錄因子,可透過抑制E-黏附蛋白的表現來觸發EMT。許多致癌訊息,如PI3K/AKT、MAPK以及Wnt,已被證明可抑制GSK3β,進而導致Snail蛋白及隨後的EMT的穩定(Zhou等人,2004年)。我們的數據顯示,EpEX透過降低GSK3β的活性來穩定活化β-連環蛋白以及Snail蛋白以誘導EMT及侵襲。此外,我們研發之抗EpCAM抗體透過增加GSK3β活性來抑制EMT及侵襲,進而導致活化β-連環蛋白以及Snail蛋白的降解。
HGFR訊息轉導為抗癌治療的重要標靶,而且在開發該途徑的拮抗劑方面已經挹注了許多努力。許多HGFR酪胺酸激酶結構域的小分子抑制劑目前正在臨床試驗中進行評估。已知HGFR的過度表現會促進許多癌細胞的抗藥性,導致治療效果不佳並縮短患者的壽命(Yang等人,2021年;Zhao等人,2020年)。例如,有些強有力的臨床前及臨床證據顯示,HGFR訊息傳導途徑為多發性骨髓瘤患者多種藥物抗藥性的關鍵驅動因素(Moschetta等人,2013年)。大多數HGFR抑制劑直接以其RTK活性作為標靶,而非以HGF配體為標靶,因為HGFR活化的主要機制並不依賴配體的HGFR過度表現(Koch等人,2020;Liang等人,2020年)。目前有兩種非選擇性HGFR TKIs獲得核准:用於ALK以及ROS1陽性 NSCLC的克唑替尼(2011年首次核准)以及用於甲狀腺癌及腎癌的卡博替尼(2016年首次核准)(Kobayashi等人,2016年;Shaw等人,2014年)。HGFR抑制的相關性正在接受嚴密的評估,有幾項關於克唑替尼的臨床試驗正在進行。其中一項克唑替尼試驗結果顯示,對於治療帶有HGFR外顯子14跳躍突變的NSCLC有一定的希望(Paik等人,2015年)。MErCuRIC1第I期試驗正在評估將克唑替尼與一種MEK抑制劑的組合用於一組帶有擴增HGFR及野生型或突變RAS(NCT02510001)的CRC患者上(Van Schaeybroeck等人,2015年)。先前的一份報告顯示,克唑替尼可阻斷HGF/STAT3/SOX13/HGFR反饋迴路以抑制SOX13調節的CRC遷移、侵襲,以及轉移(Du等人,2020年)。
我們團隊創造出一種EpEX中和抗體EpAb2-6,其可用來阻斷EpEX的功能。已知以EpAb2-6處理會破壞EpEX/EGFR/ADAM17軸中的訊息傳導,該軸包含一個正向反饋迴路以促進EpCAM裂解並隨後增加EpEX以及EpICD的產生(Liang等人,2018年;Liao等人,2015年)。值得注意的是,在EpAb2-6處理後觀察到磷酸化HGFR含量的降低。此外,EpAb2-6可減弱HCT116細胞的侵襲及遷移能力,但以HGF處理後則恢復部分能力。先前的報導已經證明EpAb2-6可誘導細胞凋亡,我們證實在克唑替尼治療後,HCT116細胞對人源化EpAb2-6抗體以及EpAb2-6誘導的細胞凋亡敏感。我們使用的來自原位大腸癌動物模型的結果還顯示,在EpAb2-6及克唑替尼結合治療後,腫瘤生長受到顯著抑制。
在NSCLC的潛在治療中,克唑替尼以及其他以HGFR為標靶的治療具有一些最有益的結果。這一事實強調了深入了解可用於阻斷HGFR活化的機制的重要性。我們發現EpCAM或EpEX可誘導HGFR-ERK-AKT訊息傳導軸。根據這些發現,EpCAM可能是與克唑替尼結合治療的絕佳標靶。事實上,在我們的實驗中,EpAb2-6降低了磷酸化HGFR的含量並提高了克唑替尼在動物模型中的治療效果。因此,我們的研究結果揭示了EpCAM在調節HGFR訊息傳導中的新作用,並提出以EpCAM/HGFR為標靶的結合治療的新策略。
於本研究中,我們發現EpCAM/EpEX透過在大腸腸癌細胞中誘導HGFR活化、GSK3β-Snail蛋白以及β-連環蛋白的訊息傳導,透過ERK以及FAK-AKT誘導腫瘤進展及轉移。我們進一步證明EpCAM訊息傳導的抑制或消耗會導致HGFR活化及其下游訊息傳導的減少。以抗EpCAM單株抗體EpAb2-6治療可減少大腸癌的進展及轉移,重要的是,它提高了小鼠在原位腫瘤及轉移模型中的存活率。因此,我們的數據顯示,以EpCAM為標靶的治療性抗體與HGFR抑制劑的結合使用可能對大腸癌治療具有巨大潛力。從這些發現中獲得的見解可能有助於開發可抑制轉移並改善患者預後的新型抗癌療法。
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當結合附圖閱讀時,將更好理解以上概述以及本發明之以下詳細描述。為了說明本發明,在附圖中顯示目前較佳具體實施例。然而,應當理解的是,本發明不限於所示之精確設置及手段。
於圖式中:
圖 1A 至 1J : EpEX 與 HGFR 相互作用並誘導 HGFR 磷酸化。(圖1A)在HCT116以及HT29細胞中與HGFR結合的內源性EpCAM的免疫沉澱(Immunoprecipitation,IP)。(圖1B)以HGFR
ECD-c-Myc以及EpCAM-V5轉染的HEK293T細胞。以對照IgG、抗V5抗體或抗c-Myc抗體進行IP,然後進行西方墨點法分析。(圖1C)藉由使用Dynabeads蛋白G的IP以及使用抗6X His標籤抗體的西方墨點法檢測EpEX-Fc以及HGFR-His重組蛋白(2.5 µg/ml)的相互作用。(圖1D)以不同劑量的EpEX-His處理飢餓的HCT116及HT29細胞15分鐘,以50 nM EpEX-His處理飢餓的HCT116及HT29細胞一段指定的時間。藉由西方墨點法檢查HGFR的磷酸化。(圖1E)使野生型(WT)或EpCAM敲除(knockout,KO)的HCT116及H29細胞飢餓16小時,然後以EpEX-His(50 nM)處理15分鐘。使用ELISA套組(ab126451)分析磷酸化HGFR的含量。(圖1F)以HGFR
ECD-c-Myc以及全長或類EGF結構域缺失突變體EpCAM-V5轉染HEK293T細胞。藉由使用抗V5或抗c-Myc抗體的IP以及使用抗V5或抗c-Myc抗體的西方墨點法探測蛋白質相互作用。(圖1G)以c-Myc或HGFR
ECD-c-Myc以及全長或類EGF結構域缺失突變體EpEX-His轉染HEK293T細胞。藉由使用抗c-Myc抗體的IP以及使用抗c-Myc與抗His抗體的西方墨點法探測蛋白質相互作用。(圖1H)將HGFR-His重組蛋白(2 µg/ml)添加至類EGF結構域缺失突變體-Fc包覆的(1 µg/ml)ELISA盤中,並透過TMB比色過氧化物酶分析法檢測。使HCT116細胞飢餓並以野生型或EGF結構域缺失突變體EpEX處理,並以(圖1I)西方墨點法以及(圖1J)ELISA套組(ab126451)分析磷酸化的HGFR。所有數據均表示為平均值 ± 平均值標準誤差(standard error of the mean,SEM)。*,
p< 0.05。
圖 2A 至 2K : EpEX 透過 HGFR 訊息傳導促進腫瘤進展。(圖2A)野生型或EpCAM敲除(KO)HCT116及HT29細胞以HGF(0.5 nM)處理15分鐘。藉由西方墨點法檢查HGFR、AKT,以及ERK的磷酸化。(圖2B)野生型或KO的HCT116及HT29細胞以含有2% FBS的HGF(0.5 nM)處理一段指定的時間。透過WST-1分析檢查細胞生長。(圖2C)飢餓的HCT116細胞以HGFR抑制劑SU11274(SU,10 µM)處理1小時,然後以50 nM EpEX-His處理15分鐘。以西方墨點法檢查磷酸化的HGFR、EGFR、AKT,以及ERK的含量。以50 nM EpEX以及SU(10 µM)處理HCT116及HT29細胞。(圖2D)在處理一段指定時間後透過WST-1分析檢查細胞生長。(圖2E)HCT116細胞以shLuc或HGFR shRNA處理,然後以50 nM EpEX-His處理15分鐘。藉由西方墨點法檢測HGFR敲低的HCT116細胞中磷酸化HGFR、EGFR、ERK,以及AKT的含量。(圖2F)藉由西方墨點法檢查磷酸化的ADAM17以及早老素2的含量。(圖2G)藉由使用西方墨點法測定活性β-連環蛋白的核轉位。(圖2H)以shLuc或HGFR shRNA處理HCT116細胞,然後以50 nM EpEX-His處理一段指定的時間。透過WST-1分析檢查細胞生長。(圖2I)以shLuc及shHGFR處理後的HCT116細胞以50 nM的EpEX-His及2% FBS處理7天。藉由結晶紫染色檢查細胞群落的形成。下圖所示為核β-連環蛋白的量化結果。(圖2J)以HGF(0.5 nM)處理HCT116細胞一段指定的時間,並藉由免疫沉澱及西方墨點法檢查培養基中的EpEX蛋白含量。(圖2K)以HGF(0.5 nM)處理HCT116細胞15分鐘。藉由西方墨點法分析細胞裂解物中的磷酸化HGFR、早老素2,以及ADAM17蛋白含量,並藉由免疫沉澱與西方墨點法檢查培養基中的EpEX蛋白含量。所有數據均表示為平均值 ± SEM。*,
p< 0.05;**,
p< 0.01。
圖 3A 至 3H : EpEX 誘導 ERK 及 FAK-AKT 訊息傳導途徑的活化。在以EpEX-His處理後的野生型(WT)或EpCAM敲除(KO)的HCT116細胞。(圖3A)藉由西方墨點法測定磷酸化HGFR、AKT、FAK、GSK3β、ERK、ADAM17,以及早老素2的含量。(圖3B)藉由結晶紫染色檢查細胞群落的形成。(圖3C)以TAPI(ADAM17抑制劑)或DAPT(γ-分泌酶抑制劑)處理HCT116細胞24小時,以西方墨點法分析HGFR、AKT,以及ERK的磷酸化,以及藉由免疫沉澱及西方墨點法檢查培養基中的EpEX蛋白含量。(圖3D)使HCT116及HT29細胞飢餓16小時,然後以EpEX-His(50 nM)及HGF(0.5 nM)處理15分鐘。透過西方墨點法檢測磷酸化HGFR、AKT,以及ERK的含量。(圖3E)使HCT116細胞飢餓16小時,然後以50 nM EpEX-His處理15分鐘。在EpEX處理前1小時施用HGFR抑制劑SU11274(SU,10 µM)、AKT抑制劑LY294002(LY,25 µM)、ERK抑制劑U0126(U0,20 µM),或FAK抑制劑PF-562271(PF,10 µM)。以西方墨點法檢查AKT、ERK以及FAK的磷酸化。(圖3F)使HCT116細胞飢餓16小時,然後以50 nM EpEX以及SU(10 µM)、LY(25 µM)、U0(20 µM)或PF(10 µM)處理。處理7天後以結晶紫染色檢查細胞群落形成。顯示相對細胞群落密度。(圖3G)於指定的時間以傷口癒合分析檢查遷移能力。(圖3H)於處理24小時後,藉由一Transwell評估遷移細胞的數量。所有數據均表示為平均值 ± SEM。*,
p< 0.05。
圖 4A 至 4L : EpEX 透過降低 GSK3β 活性以穩定β - 連環蛋白與 Snail 蛋白來誘導 EMT 及侵襲。(圖4A)以EpEX處理後,藉由西方墨點法在野生型(WT)或EpCAM敲除(KO)HCT116細胞中檢測EMT標記物以及調節劑的蛋白質表現。(圖4B)藉由使用基質膠的Transwell小室分析法檢查細胞侵襲。(圖4C)使野生型或KO的HCT116以及HT29細胞飢餓16小時,然後以0.5 nM的HGF及2% FBS處理24小時。藉由西方墨點法檢查EMT相關蛋白表現(E-鈣黏蛋白、波形蛋白,以及Snail蛋白)。(圖4D)以HGF(0.5 nM)處理野生型或KO的HCT116及HT29細胞24小時。藉由使用基質膠的Transwell小室分析法來檢查HCT116及HT29細胞的侵襲。(圖4E)使HCT116及HT29細胞飢餓16小時,然後以0.5 nM的HGF以及2%FBS處理24小時。透過西方墨點法檢查EMT相關蛋白表現(E-鈣黏蛋白、波形蛋白,以及Snail蛋白)。(圖4F)使HCT116及HT29細胞飢餓16小時,然後以0.5 nM的HGF以及2% FBS處理24小時。藉由使用基質膠的Transwell分析法評估細胞侵襲。(圖4G)以shLuc及shHGFR處理後的HCT116細胞再以50 nM EpEX-His處理。以shLuc及shHGFR處理後的HCT116細胞再以50 nM的EpEX-His以及2% FBS處理24小時。藉由西方墨點法檢查EMT相關蛋白表現(E-鈣黏蛋白、波形蛋白,以及Snail蛋白)。(圖4H)藉由使用基質膠的Transwell小室分析法檢查細胞侵襲。(圖4I)以SU(10 µM)處理飢餓的HCT116細胞1小時,然後以EpEX-His(50 nM)處理24小時。藉由西方墨點法檢測磷酸化的GSK3β、活性-β-連環蛋白,以及Snail蛋白。(圖4J)使HCT116細胞飢餓16小時,然後以50 nM EpEX-His處理24小時。在以EpEX處理前1小時施用AKT抑制劑LY294002(25 µM)、ERK抑制劑U0126(20 µM),或PF-562271(10 µM)。藉由西方墨點法檢查磷酸化GSK3β以及Snail蛋白的蛋白質表現。(圖4K)使HCT116細胞飢餓16小時,然後以50 nM EpEX以及SU(10 µM)、LY(25 µM)、U0(20 µM),或 PF(10 µM)處理。藉由使用基質膠的Transwell小室分析法檢查細胞侵襲。(圖4L)在使用或不使用2 µM GSK3β抑制劑(BIO)處理24小時後,藉由西方墨點法分析EpEX-His(50nM)處理的HCT116細胞中的蛋白質表現。右圖所示為標準化蛋白質表現的量化結果。所有數據均表示為平均值 ±S EM。*,
p< 0.05;**,
p< 0.01。
圖 5A 至 5I : EpEX 透過抑制泛素化調節的蛋白酶體降解來促進 Snail 蛋白的穩定性。(圖5A)以qRT-PCR在野生型(WT)或EpCAM敲除(KO)的HCT116及HT29細胞中檢測EMT標記物及調節劑的基因表現。(圖5B)在野生型或KO的HCT116細胞中Snail蛋白的穩定性。在指定的時間間隔以100 µg/ml的環己醯胺(cyclohexamide,CHX)處理細胞並進行西方墨點法。(圖5C)使用或不使用10 mM MG132(蛋白酶體抑制劑)處理野生型或KO的HCT116細胞6小時後,藉由西方墨點法在該些細胞中分析Snail蛋白的表現。(圖5D)在收集細胞之前,以10 µM MG132處理野生型或KO的HCT116細胞6小時。使用抗Snail蛋白抗體以及陽性對照對裂解物進行免疫沉澱。使用指定的抗體進行西方墨點法以檢測泛素化的Snail蛋白。(圖5E)以EpEX(50 nM)處理24小時後,在HCT116細胞中Snail蛋白的穩定性。以指定的時間間隔使用環己醯胺(CHX;100 µg/ml)處理細胞,然後進行西方墨點法。(圖5F)在以EpEX(50 nM)處理24小時後,藉由qRT-PCR在HCT116細胞中檢測到編碼SNAIL的基因的表現。(圖5G)在以EpEX(50 nM)處理24小時後,使用或不使用10 µM MG132(蛋白酶體抑制劑)處理HCT116細胞6小時後,透過西方墨點法分析細胞內Snail蛋白的表現。(圖5H)Snail蛋白的磷酸化基序中突變體位置的示意圖。(圖5I)以Snail-野生型、2SA、4SA,以及6SA轉染HCT116細胞24小時,然後使用或不使用EpEX(50 nM)進一步處理24小時。藉由西方墨點法檢測Snail的表現。所有數據均表示為平均值 ± SEM。*,
p< 0.05;**,
p< 0.01。
圖 6A 至 6J : EpAb2-6 抑制 EpCAM 以及 HGFR 的訊息傳導,並透過活化 GSK3β 促進活性 β- 連環蛋白以及 Snail 蛋白的降解。(圖6A)HCT116細胞以10 µg/ml的對照IgG(正常小鼠IgG,NMIgG)或小鼠EpAb2-6(EpAb2-6)處理16小時,然後以EpEX-His(50 nM)處理15分鐘。藉由西方墨點法檢測磷酸化HGFR、AKT、FAK、GSK3β、ERK、ADAM17,以及早老素2的含量。(圖6B)以10 µg/ml對照IgG或小鼠EpAb2-6處理HCT116細胞16小時,然後使用或不使用HGF(0.5 nM)處理15分鐘。藉由西方墨點法檢查磷酸化HGFR、AKT,以及ERK的含量。以小鼠EpAb2-6(10 µg/ml)及HGF(0.5 nM)處理HCT116細胞。(圖6C)於指定時間藉由傷口癒合分析法檢查細胞遷移。(圖6D)24小時後,藉由使用基質膠的Transwell分析法評估細胞侵襲。(圖6E)以NMIgG或EpAb2-6處理HCT116細胞6小時,然後以抗EpCAM(IP:EpCAM)或抗HGFR(IP:HGFR)抗體進行免疫沉澱,然後進行西方墨點法。(圖6F)將與1 µg IgG或EpAb2-6共同處理的EpEX-His(2 µg/ml)添加至HGFR-Fc(1 µg/ml)包覆的ELISA盤中,並透過TMB比色過氧化物酶分析法檢測。(圖6G)藉由西方墨點法在以NMIgG或EpAb2-6處理24小時的HCT116細胞中檢測EMT相關蛋白的含量。(圖6H)在以EpAb2-6以及2 µM GSK3β抑制劑(BIO)處理HCT116細胞24小時後,藉由西方墨點法在HCT116細胞中分析蛋白質表現。下圖所示為標準化蛋白質表現的量化結果。(圖6I)在收集細胞及接著進行西方墨點法之前,以10 µM MG132以及EpAb2-6處理HCT116細胞6小時。(圖6J)以NMIgG或EpAb2-6處理的HCT116細胞中Snail蛋白的穩定性。以指定的時間間隔使用100 µg/ml環己醯胺(CHX)處理細胞並進行西方墨點法。下圖所示為指定群組中Snail蛋白半衰期的量化結果。所有數據均表示為平均值 ± SEM。*,
p< 0.05;**,
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圖 7A 至 7G : EpAb2-6 與 EpEX 結合並透過 F(ab’)
2 誘導細胞凋亡,並抑制受調節的膜內蛋白水解( RIP )活化及 HGFR 訊息傳導。(圖7A)使用ELISA(OD450)檢查IgG EpAb2-6(小鼠)以及F(ab’)
2與過夜包覆的EpEX-His(1 µg/ml)的結合親和力。(圖7B)以100 µg/ml的EpAb2-6的對照IgG、Fc或F(ab’)
2處理HCT116細胞24小時。藉由螢光素膜聯蛋白V-FITC/PI雙標記對凋亡及壞死的細胞進行定量。(圖7C)以10 µg/ml對照IgG、MT201、人源化EpAb2-6(hEpAb2-6)或小鼠雜交瘤EbAb2-6(mEpAb2-6)處理HCT116及HT29細胞24小時。透過螢光素膜聯蛋白V-FITC/PI雙標記對凋亡及壞死的細胞進行定量。(圖7D)以10 µg/ml對照IgG、MT201、hEpAb2-6,或mEpAb2-6處理HCT116細胞16小時,然後以EpEX-His(50 nM)處理15分鐘。藉由西方墨點法檢查磷酸化HGFR、AKT,以及ERK以及(圖7E)RIP蛋白ADAM17與早老素2的含量。抗EpCAM抗體以及克唑替尼協同誘導大腸癌細胞凋亡。(圖7F)以10 µg/ml NMIgG或EpAb2-6以及4 µM HGFR抑制劑克唑替尼處理HCT116以及HT29細胞24小時。藉由螢光素膜聯蛋白V-FITC/PI雙標記對凋亡及壞死的細胞進行定量。(圖7G)以10 µg/ml NMIgG或EpAb2-6以及10 µM HGFR抑制劑克唑替尼處理HCT116以及HT29細胞。24小時後,藉由使用基質膠的Transwell分析法評估細胞侵襲。所有數據均表示為平均值 ± SEM。*,
p< 0.05。
圖 8A 至 8G : EpAb2-6 與 EpCAM 的類 EGF 結構域 I 及 II 結合。以全長或類EGF結構域缺失突變體EpCAM-V5轉染HEK293T細胞。藉由(圖8A)西方墨點法、(圖8B)流式細胞儀分析,以及(圖8C)免疫螢光來評估抗體結合。(圖8D)EpCAM突變體是以EGF-I(Y32A)以及EGF-II(L94A、Y95A或D96A)結構域中的胺基酸取代進行構築的。EpCAM野生型及突變蛋白在HEK293T細胞中表現。藉由(圖8E)免疫螢光、(圖8F)流式細胞儀分析,以及(圖8G)細胞ELISA來評估MT201、EpAb2-6,以及EpAb23-1與EpCAM野生型及突變體的結合。所有數據均表示為平均值 ± SEM。*,
p< 0.05;**,
p< 0.01。
圖 9A 至 9K : EpAb2-6 與克唑替尼協同抑制腫瘤進展及轉移。(圖9A)以轉移性動物模型評估EpAb2-6及/或克唑替尼作用的實驗時間表。(圖9B)以靜脈注射5 x 10
6個HCT116細胞至NOD/SCID小鼠體內,然後以對照IgG、EpAb2-6及/或克唑替尼處理小鼠(n = 5)。轉移性動物模型中肺組織的存活曲線、中位存活天數,以及代表性H&E染色。(圖9C)在原位動物模型中評估EpAb2-6及/或克唑替尼的實驗時間表。(圖9D)NOD/SCID小鼠接受HCT116-Luc細胞原位植入,然後在腫瘤接種後3天開始以對照IgG(正常小鼠IgG,NMIgG)、克唑替尼、EpAb2-6或克唑替尼結合EpAb2-6處理小鼠(n = 5)。藉由使用IVIS 200影像系統檢查生物發光來監測腫瘤生長。(圖9E)藉由生物發光定量監測的HCT116-Luc腫瘤細胞。(圖9F)HCT116原位動物模型中每個處理組在以指定的方式處理後的體重。(圖9G)HCT116原位動物模型中每個治療組的存活曲線及中位存活天數。(圖9H)NOD/SCID小鼠原位植入HT29-Luc細胞,然後在腫瘤接種後3天開始以對照IgG、克唑替尼、EpAb2-6或克唑替尼結合EpAb2-6處理小鼠(n = 5)。藉由使用IVIS 200影像系統檢查生物發光來監測腫瘤生長。(圖9I)透過生物發光定量監測的HT29-Luc腫瘤細胞。(圖9J)HT29原位動物模型中每個處理組在以指定的方式處理後的小鼠體重。(圖9K)HT29原位動物模型中每個處理組的存活曲線以及中位存活天數。所有數據均表示為平均值 ± SEM。*,
p< 0.05;**,
p< 0.01。
圖 10A 至 10B :人類 EpCAM 的序列特徵及結構域。(圖10A)全長人類EpCAM含有314個胺基酸殘基(SEQ ID NO: 17)。(圖10B)鑑定EpCAM的結構域,其中EpEX結構域包括涵蓋VGAQNTVIC(第51至59個胺基酸,SEQ ID NO: 18)的EGF結構域I(第27-59個胺基酸),以及涵蓋帶有LYD基序(第94-96個胺基酸)的KPEGALQNNDGLYDPDCDE(第83至100個胺基酸,SEQ ID NO: 19)的EGF結構域II(第66-135個胺基酸)。
圖 11 : EpAb2-6 的胺基酸序列,其中VH(SEQ ID NO: 15)包含SEQ ID NO: 2的HC CDR1、 SEQ ID NO: 4的HC CDR2,以及SEQ ID NO: 6的HC CDR3;以及V
L(SEQ ID NO: 16)包含SEQ ID NO: 9的LC CDR1、SEQ ID NO: 11的LC CDR2,以及SEQ ID NO: 13的HC CDR3。
無
序列表 <![CDATA[<110> 中央研究院]]> <![CDATA[<120> 上皮細胞粘附分子(EPCAM)抑制劑及肝臟生長因子受體(HGFR)抑制劑的結合癌症治療]]> <![CDATA[<140> 111123775]]> <![CDATA[<141> 2022-06-24]]> <![CDATA[<150> 63/215,016]]> <![CDATA[<151> 2021-06-25]]> <![CDATA[<160> 35 ]]> <![CDATA[<170> PatentIn version 3.5]]> <![CDATA[<210> 1]]> <![CDATA[<211> 24]]> <![CDATA[<212> PRT]]> <![CDATA[<213> 人類]]> <![CDATA[<400> 1]]> Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr 1 5 10 15 Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser 20 <![CDATA[<210> 2]]> <![CDATA[<211> 10]]> <![CDATA[<212> PRT]]> <![CDATA[<213> 人類]]> <![CDATA[<400> 2]]> Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Met His 1 5 10 <![CDATA[<210> 3]]> <![CDATA[<211> 15]]> <![CDATA[<212> PRT]]> <![CDATA[<213> 人類]]> <![CDATA[<400> 3]]> Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp 1 5 10 15 <![CDATA[<210> 4]]> <![CDATA[<211> 8]]> <![CDATA[<212> PRT]]> <![CDATA[<213> 人類]]> <![CDATA[<400> 4]]> Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro 1 5 <![CDATA[<210> 5]]> <![CDATA[<211> 40]]> <![CDATA[<212> 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<![CDATA[<213> 人工序列]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> VIM引子F]]> <![CDATA[<400> 30]]> gtttccccta aaccgctagg 20 <![CDATA[<210> 31]]> <![CDATA[<211> 18]]> <![CDATA[<212> DNA]]> <![CDATA[<213> 人工序列]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> VIM引子R]]> <![CDATA[<400> 31]]> agcgagagtg gcagagga 18 <![CDATA[<210> 32]]> <![CDATA[<211> 19]]> <![CDATA[<212> DNA]]> <![CDATA[<213> 人工序列]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> SNAIL引子F]]> <![CDATA[<400> 32]]> cttcggctcc aggagagtc 19 <![CDATA[<210> 33]]> <![CDATA[<211> 21]]> <![CDATA[<212> DNA]]> <![CDATA[<213> 人工序列]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> SNAIL引子R]]> <![CDATA[<400> 33]]> ttcccactgt cctcatctga c 21 <![CDATA[<210> 34]]> <![CDATA[<211> 21]]> <![CDATA[<212> DNA]]> <![CDATA[<213> 人工序列]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> GAPDH引子F]]> <![CDATA[<400> 34]]> cttcaccacc atggaggagg c 21 <![CDATA[<210> 35]]> <![CDATA[<211> 21]]> <![CDATA[<212> DNA]]> <![CDATA[<213> 人工序列]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> GAPDH引子R]]> <![CDATA[<400> 35]]> ggcatggact gtggtcatga g 21
圖9
Claims (21)
- 一種治療癌症之方法,包括向有需要的個體施用 (i)有效量的第一抑制劑,其抑制上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)訊息傳導的活化;以及 (ii)有效量的第二抑制劑,其抑制肝臟生長因子受體(hepatocyte growth factor receptor,HGFR)訊息傳導的活化。
- 根據請求項1之方法,其中該第一抑制劑減少上皮細胞黏附分子(EpCAM)的胞外結構域(EpEX)的產生(或釋放)、阻斷EpEX與肝臟生長因子受體(HGFR)的結合,及/或抑制EpEX誘導的HGFR磷酸化。
- 根據請求項1或2之方法,其中該第二抑制劑阻斷肝臟生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)與肝臟生長因子受體(HGFR)的結合。
- 根據請求項1至3中任一項之方法,其中該第一抑制劑係針對EpEX的抗體或其抗原結合片段。
- 根據請求項4之方法,其中該抗體特異性結合類表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)結構域I及II。
- 根據請求項4之方法,其中該抗體對位於該類EGF結構域I的CVCENYKLAVN序列(第27至37個胺基酸)(SEQ ID NO: 20)以及位於該類EGF結構域II的KPEGALQNNDGLYDPDCD序列(第83至100個胺基酸)(SEQ ID NO: 19)內的抗原決定位具有特異性結合親和力。
- 根據請求項4至6中任一項之方法,其中該抗體或抗原結合片段包含 (a)重鏈可變區(VH),其包含:包含SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的重鏈互補決定區1(heavy chain complementary determining region 1,HC CDR1)、包含SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的重鏈互補決定區2(HC CDR2),以及包含SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的重鏈互補決定區3(HC CDR3);以及 (b)輕鏈可變區(VL),其包含:包含SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的輕鏈互補決定區1(light chain complementary determining region 1,LC CDR1),包含SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的輕鏈互補決定區2(LC CDR2),以及包含SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的輕鏈互補決定區3(LC CDR3)。
- 根據請求項1至7中任一項之方法,其中該第一抑制劑有效抑制TACE以及PS2訊息傳導的磷酸化。
- 根據請求項1至8中任一項之方法,其中該第二抑制劑係選自由福瑞替尼(foretinib)、克唑替尼(crizotinib)以及卡博替尼(cabozantinib)所組成之群組。
- 根據請求項1至9中任一項之方法,其中該方法有效誘導癌細胞凋亡。
- 根據請求項1至10中任一項之方法,其中該方法有效抑制癌細胞的遷移/侵襲及/或減小腫瘤大小。
- 根據請求項1至11中任一項之方法,其中該方法有效延長該個體的壽命。
- 根據請求項1至12中任一項之方法,其中該癌症選自由下列所組成之群組:肺癌、腦癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、胃癌、頭頸癌、腎癌、血癌、肝癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、皮膚癌,以及睾丸癌。
- 一種套組或醫藥組合物,包括: (i)第一抑制劑,其抑制上皮細胞黏附分子(EpCAM)訊息傳導的活化;以及 (ii)第二抑制劑,其抑制肝臟生長因子受體(HGFR)訊息傳導的活化。
- 根據請求項14之套組或醫藥組合物,其中該第一抑制劑如請求項1、2、4至8中任一項所定義,及/或該第二抑制劑如請求項3或9所定義。
- 一種(i)抑制上皮細胞黏附分子(EpCAM)訊息傳導活化的第一抑制劑以及(ii)抑制肝臟生長因子受體(HGFR)訊息傳導活化的第二抑制劑之組合用於製造治療癌症的藥物或套組之用途。
- 根據請求項16之用途,該第一抑制劑如請求項1、2、4至6中任一項所定義,及/或該第二抑制劑如請求項3或7所定義。
- 根據請求項16或17之用途,其中該藥物或套組有效誘導癌細胞凋亡。
- 根據請求項16至18中任一項之用途,其中該藥物或套組有效抑制癌細胞的遷移/侵襲及/或減小腫瘤大小。
- 根據請求項16至19中任一項之用途,其中該藥物或套組有效延長該個體的壽命。
- 根據請求項16至20中任一項之用途,其中該癌症選自由下列所組成之群組:肺癌、腦癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、胃癌、頭頸癌、腎癌、血癌、肝癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、皮膚癌,以及睾丸癌。
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