JP2020198874A - C−metに対するモノクローナル抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、肝細胞増殖因子受容体であるヒトc-Metに対するモノクローナル抗体、およびこのような抗体の使用、特に、癌の治療におけるこのような抗体の使用に関する。
c-Metは、膜貫通受容体型チロシンキナーゼタンパク質である。主に単鎖の前駆体は翻訳後、切断されて、成熟型c-Metヘテロ二量体を生じる。成熟型c-Metヘテロ二量体は細胞外α鎖(50kDa)およびさらに長い膜貫通β鎖(145kDa)からなり、これらはジスルフィド結合している(Birchmeier et al. 2003. Nat Rev Mol Cell Biol 4:915(非特許文献1))。c-Metの細胞外部分は3つのドメインタイプからなる。N末端SEMAドメインは、αサブユニット全体およびβサブユニットの一部によって形成され、セマフォリンタンパク質と相同性を有する。SEMAドメインの後ろにはシステインリッチドメインが続き、さらに4つの免疫グロブリン(Ig)様ドメインが続く。細胞質部分は、膜近傍キナーゼドメインおよび下流シグナル伝達に不可欠なカルボキシ末端テールを含む。c-Metの唯一知られている高親和性リガンドである肝細胞増殖因子(HGF)は、主に、正常条件下では線維芽細胞(Li and Tseng 1995. J Cell Physiol 163:61(非特許文献2))および腫瘍細胞(Ferracini et al. 1995. Oncogene 10:739(非特許文献3))によって発現される。HGF(細胞分散因子(scatter factor):SFとも呼ばれる)は前駆体として合成され、タンパク分解によって活性α/βヘテロ二量体に変換される。受容体-結合断片の結晶構造に基づいて、HGFは二量体としてc-Metに結合すると考えられている(Chirgadze et al. 1999. Nat Struct Biol 6:72(非特許文献4))。HGF-α鎖は高い親和性でc-Metの中にあるIg様ドメインと結合するのに対して、HGF-β鎖は低い親和性でc-Met SEMAドメインと結合する(Basilico et al. 2008. J Biol Chem 283:21267(非特許文献5))。後者の相互作用は、活性HGFヘテロ二量体が結合した時のc-Met二量体化および受容体型チロシンキナーゼ活性化を担っている。受容体が自己リン酸化すると、エフェクターが動員するための独特のドッキング部位が生じる。これらのうちGab1(増殖因子受容体結合タンパク質2[Grb2]関連バインダー1)の結合は、主要なc-Met下流シグナル伝達経路:
・Ras-ERK1/2経路:増殖
・Ras-Rac経路:浸潤、運動性、上皮から間葉系への移行
・PI3K-Akt経路:生存
に不可欠である(Comoglio et al. 2008. Nat Rev Drug Discov 7:504(非特許文献6))。c-Metは、胚形成の間および成人期に、肝臓、膵臓、前立腺、腎臓、筋肉、および骨髄を含む多くの臓器の上皮細胞および内皮細胞の表面において発現する。c-Met活性化は、増殖、運動、血管形成、およびアポトーシスからの保護を含む一連のプロセスからなる、いわゆる「浸潤性増殖」プログラムにおいて不可欠な役割を果たしている(Boccaccio and Comoglio 2006. Nat Rev Cancer 6:637(非特許文献7))。これらのc-Metによって調節されるプロセスは正常な生理学的条件下では胚発生、肝臓損傷修復および心臓損傷修復の間に、病理学的には腫瘍形成の間に起こる(Eder et al. 2009. Clin Cancer Res 15:2207(非特許文献8))。
・オートクラインHGF/c-Metループ、
・c-MetまたはHGFの過剰発現、
・c-Met受容体コード配列内のキナーゼ活性化変異
で成し遂げられる。
・低分子チロシンキナーゼ阻害剤(TKI):臨床評価の異なる段階にある3種類のc-Met特異的TKIが、ARQ197(ArQule)、JNJ38877605(Johnson & Johnson)、およびPF-04217903(Pfizer)である。
・抗HGFモノクローナル抗体、例えばAMG102、リロツムマブ(rilotumumab)(Amgen)、HuL2G7(Takeda)、およびAV-299(Schering)。
・抗c-Metモノクローナル抗体がWO2005016382(特許文献1)、WO2006015371(特許文献2)、WO2007090807(特許文献3)、WO2007126799(特許文献4)、WO2009007427(特許文献5)、WO2009142738(特許文献6)、およびvan der Horst et al.(van der Horst et al. 2009. Neoplasoa 11:355(非特許文献13))に記載されている。MetMAb(Genentech)は、c-Met細胞外ドメインに結合し、それによって、HGF結合およびその後の受容体活性化を阻止するヒト化一価(1アーム(one-armed))OA-5D5抗体である(Jin et al. 2008. Cancer Res 68:4360(非特許文献14))。マウス異種移植モデルにおいて、MetMAbを用いた治療は、HGFによって誘導される同所性グリア芽細胞腫および皮下膵臓腫瘍の腫瘍成長を阻害することが見出された(Jin et al. 2008. Cancer Res 68:4360(非特許文献14); Martens et al. 2006. Clin Cancer Res 12:6144(非特許文献15))。h224G11(Pierre Fabre)(Corvaia and Boute 2009. Abstract 835 AACR 100th Annual Meeting(非特許文献16))はヒト化二価抗c-Met IgG1抗体である。この抗体の抗腫瘍作用がマウスにおいて観察されている(Goetsch et al. 2009. Abstract 2792 AACR 100th Annual Meeting(非特許文献17))。CE-355621(Pfizer)は、c-Met細胞外ドメインに結合することによってリガンド結合をブロックし、腫瘍異種移植モデルにおいてHGF依存性増殖を阻害するヒトIgG2である(Tseng et al. 2008. J Nucl Med 49:129(非特許文献18))。
[本発明1001]
ヒトc-Metに結合するモノクローナル抗体。
[本発明1002]
可溶性cMetECDHisとの結合において、SEQ ID NO:33の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:37の配列を含むVL領域を含む固定化抗体(024)と競合する抗体であって、好ましくは、実施例17に記載のように求められた時に、該固定化抗体と50%を超えて、例えば75%を超えて競合する、本発明1001の抗体。
[本発明1003]
可溶性cMetECDHisとの結合において、以下:
a)SEQ ID NO:1の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:5の配列を含むVL領域を含む固定化抗体(005)、
b)SEQ ID NO:17の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:21の配列を含むVL領域を含む固定化抗体(008)、
c)抗体5D5のVH領域およびVL領域を含む固定化抗体、ならびに
d)SEQ ID NO:49の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:53の配列を含むVL領域を含む固定化抗体(045)
からなる群より選択される抗体と競合しない抗体であって、好ましくは、実施例17に記載のように求められた時に、該固定化抗体と25%未満、例えば20%未満競合する、本発明1002の抗体。
[本発明1004]
a)SEQ ID NO:33の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:37の配列を含むVL領域を含む抗体(024)、
b)SEQ ID NO:65の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:69の配列を含むVL領域を含む抗体(061)、
c)SEQ ID NO:73の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:77の配列を含むVL領域を含む抗体(062)、
d)SEQ ID NO:81の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:85の配列を含むVL領域を含む抗体(064)、
e)SEQ ID NO:89の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:93の配列を含むVL領域を含む抗体(068)、
f)SEQ ID NO:97の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:101の配列を含むVL領域を含む抗体(069)、
g)SEQ ID NO:113の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:117の配列を含むVL領域を含む抗体(098)、
h)SEQ ID NO:121の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:125の配列を含むVL領域を含む抗体(101)、ならびに
i)SEQ ID NO:129の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:133の配列を含むVL領域を含む抗体(181)
からなる群より選択される抗体と同じエピトープに結合する、本発明1002の抗体。
[本発明1005]
a)SEQ ID NO:36に示した配列を有するVH CDR3領域(024)、
b)SEQ ID NO:193に示した配列を有するVH CDR3領域、例えばSEQ ID NO:68、76、84、もしくは92に示したVH CDR3領域(061、062、064、068)、
c)SEQ ID NO:196に示した配列を有するVH CDR3領域、例えばSEQ ID NO:100もしくは132に示したVH CDR3領域(069、181)、
d)SEQ ID NO:116に示した配列を有するVH CDR3領域(098)、または
e)SEQ ID NO:201に示した配列を有するVH CDR3領域、例えばSEQ ID NO:124に示したVH CDR3領域(101)
を含む、本発明1002または1004の抗体。
[本発明1006]
a)SEQ ID NO:33、185、および36のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:37、39、および206のCDR1、2、および3配列を含むVL領域、例えばSEQ ID NO:34、35、および36のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:38、39、および40のCDR1、2、および3配列を含むVL領域(024)、
b)SEQ ID NO:191、192、および193のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:78、79、および208のCDR1、2、および3配列を含むVL領域、例えば
a. SEQ ID NO:66、67、および68のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:70、71、および72のCDR1、2、および3配列を含むVL領域(061)、
b. SEQ ID NO:74、75、および76のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:78、79、および80のCDR1、2、および3配列を含むVL領域(062)、
c. SEQ ID NO:82、83、および84のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:86、87、および88のCDR1、2、および3配列を含むVL領域(064)、もしくは
d. SEQ ID NO:90、91、および92のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:94、95、および96のCDR1、2、および3配列を含むVL領域(068)、
c)SEQ ID NO:194、195、および196のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:209、210、および104のCDR1、2、および3配列を含むVL領域、例えば
a. SEQ ID NO:98、99、および100のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:102、103、および104のCDR1、2、および3配列を含むVL領域(069)、もしくは
b. SEQ ID NO:130、131、および132のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:134、135、および136のCDR1、2、および3配列を含むVL領域(181)、
d)SEQ ID NO:197、198、および116のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:118、119、および211のCDR1、2、および3配列を含むVL領域、例えばSEQ ID NO:114、115、および116のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:118、119、および120のCDR1、2、および3配列を含むVL領域(098)、または
e)SEQ ID NO:199、200、および201のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:126、212、および128のCDR1、2、および3配列を含むVL領域、例えばSEQ ID NO:122、123、および124のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:126、127、および128のCDR1、2、および3配列を含むVL領域(101)
を含む、本発明1002または1004の抗体。
[本発明1007]
a)SEQ ID NO:33の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:37の配列を含むVL領域(024)、
b)SEQ ID NO:65の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:69の配列を含むVL領域(061)、
c)SEQ ID NO:73の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:77の配列を含むVL領域(062)、
d)SEQ ID NO:81の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:85の配列を含むVL領域(064)、
e)SEQ ID NO:89の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:93の配列を含むVL領域(068)、
f)SEQ ID NO:97の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:101の配列を含むVL領域(069)、
g)SEQ ID NO:113の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:117の配列を含むVL領域(098)、
h)SEQ ID NO:121の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:125の配列を含むVL領域(101)、
i)SEQ ID NO:129の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:133の配列を含むVL領域(181)、
j)SEQ ID NO:159の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:160の配列を含むVL領域(078)、
k)SEQ ID NO:161の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:162の配列を含むVL領域(084)、
l)SEQ ID NO:163の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:164の配列を含むVL領域(063)、
m)SEQ ID NO:165の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:166の配列を含むVL領域(087)、
n)SEQ ID NO:137の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:138の配列を含むVL領域(066)、
o)SEQ ID NO:139の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:140の配列を含むVL領域(065)、
p)SEQ ID NO:141の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:142の配列を含むVL領域(082)、
q)SEQ ID NO:143の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:144の配列を含むVL領域(089)、または
r)該配列内に、好ましくは最大で1個、2個、もしくは3個のアミノ酸修飾、より好ましくはアミノ酸置換、例えば保存的アミノ酸置換を有する、該抗体のいずれかの変種
を含む、本発明1002の抗体。
[本発明1008]
可溶性cMetECDHisとの結合において、SEQ ID NO:9の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:13の配列を含むVL領域を含む固定化抗体(006)と競合し、好ましくは、実施例17に記載のように求められた時に、該固定化抗体と50%を超えて、例えば75%を超えて競合し、かつ
可溶性cMetECDHisとの結合において、SEQ ID NO:49の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:53の配列を含むVL領域を含む固定化抗体(045)と競合せず、好ましくは、実施例17に記載のように求められた時に、該固定化抗体と、50%未満、例えば25%未満、例えば20%未満、競合し、かつ
c-MetのSEMAドメインに結合し、好ましくは実施例9に記載のように、HGFとSEMAドメインとの結合を、10μg/mL未満、例えば2μg/mL未満のIC50で阻害することができる、
本発明1001の抗体。
[本発明1009]
可溶性cMetECDHisとの結合において、SEQ ID NO:33の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:37の配列を含むVL領域を含む固定化抗体(024)と競合しない抗体であって、好ましくは、実施例17に記載のように求められた時に、該固定化抗体と25%未満、例えば20%未満、競合する、本発明1008の抗体。
[本発明1010]
a)SEQ ID NO:1の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:5の配列を含むVL領域を含む抗体(005)、
b)SEQ ID NO:9の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:13の配列を含むVL領域を含む抗体(006)、
c)SEQ ID NO:25の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:29の配列を含むVL領域を含む抗体(022)、ならびに
d)SEQ ID NO:57の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:61の配列を含むVL領域を含む抗体(058)
からなる群より選択される抗体と同じエピトープに結合する、本発明1008の抗体。
[本発明1011]
a)SEQ ID NO:181に示した配列を有するVH CDR3領域、例えばSEQ ID NO:4もしくは12に示したVH CDR3領域(005、006)、
b)SEQ ID NO:28に示した配列を有するVH CDR3領域(022)、または
c)SEQ ID NO:60に示した配列を有するVH CDR3領域(058)
を含む、本発明1008または1010の抗体。
[本発明1012]
a)SEQ ID NO:179、180、および181のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:6、7、および202のCDR1、2、および3配列を含むVL領域、例えば
a. SEQ ID NO:2、3、および4のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:6、7、および8のCDR1、2、および3配列を含むVL領域(005)、もしくは
b. SEQ ID NO:10、11、および12のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:14、15、および16のCDR1、2、および3配列を含むVL領域(006)、
b)SEQ ID NO:26、184、および28のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:30、31、および205のCDR1、2、および3配列を含むVL領域、例えばSEQ ID NO:26、27、および28のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:30、31、および32のCDR1、2、および3配列を含むVL領域(022)、または
c)SEQ ID NO:189、190、および60のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:62、63、および207のCDR1、2、および3配列を含むVL領域、例えばSEQ ID NO:58、59、および60のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:62、63、および64のCDR1、2、および3配列を含むVL領域(058)
を含む、本発明1008または1010の抗体。
[本発明1013]
a)SEQ ID NO:1の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:5の配列を含むVL領域(005)、
b)SEQ ID NO:9の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:13の配列を含むVL領域(006)、
c)SEQ ID NO:25の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:29の配列を含むVL領域(022)、
d)SEQ ID NO:57の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:61の配列を含むVL領域(058)、
e)SEQ ID NO:145の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:146の配列を含むVL領域(031)、
f)SEQ ID NO:147の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:148の配列を含むVL領域(007)、
g)SEQ ID NO:149の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:150の配列を含むVL領域(011)、
h)SEQ ID NO:151の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:152の配列を含むVL領域(017)、
i)SEQ ID NO:153の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:154の配列を含むVL領域(025)、または
j)該配列内に、好ましくは最大で1個、2個、もしくは3個のアミノ酸修飾、より好ましくはアミノ酸置換、例えば保存的アミノ酸置換を有する、該抗体のいずれかの変種
を含む、本発明1008または1010の抗体。
[本発明1014]
可溶性cMetECDHisとの結合において、SEQ ID NO:49の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:53の配列を含むVL領域を含む固定化抗体(045)と競合し、好ましくは、実施例17に記載のように求められた時に、該固定化抗体と50%を超えて、例えば75%を超えて競合し、かつ
可溶性cMetECDHisとの結合において、SEQ ID NO:9の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:13の配列を含むVL領域を含む固定化抗体(006)と競合せず、好ましくは、実施例17に記載のように求められた時に、該固定化抗体と25%未満、例えば20%未満、競合する、
本発明1001の抗体。
[本発明1015]
可溶性cMetECDHisとの結合において、以下:
a)SEQ ID NO:17の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:21の配列を含むVL領域を含む固定化抗体(008)、ならびに
b)SEQ ID NO:33の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:37の配列を含むVL領域を含む固定化抗体(024)
からなる群より選択される抗体と競合せず、
好ましくは、実施例17に記載のように求められた時に、該固定化抗体と25%未満、例えば20%未満、競合する、
本発明1014の抗体。
[本発明1016]
SEQ ID NO:49の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:53の配列を含むVL領域を含む抗体(045)と同じエピトープに結合する、本発明1014の抗体。
[本発明1017]
SEQ ID NO:188に示した配列を有するVH CDR3領域、例えばSEQ ID NO:52に示したVH CDR3領域を含む(045)、本発明1014または1016の抗体。
[本発明1018]
SEQ ID NO:186、187、および188のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:54、55、および56のCDR1、2、および3配列を含むVL領域、例えばSEQ ID NO:50、51、および52のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:54、55、および56のCDR1、2、および3配列を含むVL領域を含む(045)、本発明1014または1016の抗体。
[本発明1019]
a)SEQ ID NO:49の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:53の配列を含むVL領域(045)、
b)SEQ ID NO:155の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:156の配列を含むVL領域(040)、
c)SEQ ID NO:157の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:158の配列を含むVL領域(039)、または
d)該配列内に、好ましくは最大で1個、2個、もしくは3個のアミノ酸修飾、より好ましくはアミノ酸置換、例えば保存的アミノ酸置換を有する、該抗体のいずれかの変種
を含む、本発明1014または1016の抗体。
[本発明1020]
SEQ ID NO:17の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:21の配列を含むVL領域を含む抗体(008)と同じエピトープに結合する、またはSEQ ID NO:41の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:45の配列を含むVL領域を含む抗体(035)と同じエピトープに結合する、またはSEQ ID NO:105の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:109の配列を含むVL領域を含む抗体(096)と同じエピトープに結合する、本発明1001の抗体。
[本発明1021]
SEQ ID NO:183に示した配列を有するVH CDR3領域、例えばSEQ ID NO:20、44、または108に示したVH CDR3領域を含む(008、035、096)、本発明1020の抗体。
[本発明1022]
SEQ ID NO:18、182、および183のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:22、203、および204のCDR1、2、および3配列を含むVL領域、例えば
a)SEQ ID NO:18、19、および20のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:22、23、および24のCDR1、2、および3配列を含むVL領域(008)、または
b)SEQ ID NO:42、43、および44のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、2、および3配列を含むVL領域(035)、または
c)SEQ ID NO:106、107、および108のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:110、111、および112のCDR1、2、および3配列を含むVL領域(096)
を含む、本発明1020の抗体。
[本発明1023]
a)SEQ ID NO:17の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:21の配列を含むVL領域(008)、
b)SEQ ID NO:41の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:45の配列を含むVL領域(035)、
c)SEQ ID NO:105の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:109の配列を含むVL領域(096)、または
d)該配列内に、好ましくは最大で1個、2個、もしくは3個のアミノ酸修飾、より好ましくはアミノ酸置換、例えば保存的アミノ酸置換を有する、該抗体のいずれかの変種
を含む、本発明1020または1022の抗体。
[本発明1024]
c-MetのSEMAドメインに結合する抗体であって、好ましくは、実施例9に記載のように、HGFとSEMAドメインとの結合を、10μg/mL未満、例えば2μg/mL未満のIC50で阻害することができる、前記本発明1001〜1019のいずれかの抗体。
[本発明1025]
好ましくは実施例13に従い求められた時に、10nM以下のEC50、例えば2nM以下のEC50でA431細胞に結合する、前記本発明のいずれかの抗体。
[本発明1026]
二価抗体である、本発明1025の抗体。
[本発明1027]
好ましくは実施例14に従い求められた時に、20nM以下の親和性定数(KD)、例えば5nM以下の親和性でc-Metに結合する、前記本発明のいずれかの抗体。
[本発明1028]
アカゲザルc-Metに結合する抗体であって、好ましくは、実施例15に従い求められた時に、アカゲザルc-Metに結合した抗体のシグナルが負の対照抗体のシグナルの少なくとも5倍である、前記本発明のいずれかの抗体。
[本発明1029]
HGFとc-Met細胞外ドメインとの結合を阻害する抗体であって、好ましくは、実施例16に従い求められた時に、40%を超えて、例えば50%を超えて、例えば60%を超えて、例えば70%を超えて、例えば80%を超えて、例えば90%を超えて、結合を阻害する、前記本発明のいずれかの抗体。
[本発明1030]
KP4細胞の生存を阻害することができる抗体であって、好ましくは実施例19に記載のように、好ましくは、10%を超えて、例えば25%を超えて、例えば40%を超えて、生存を阻害することができる、前記本発明のいずれかの抗体。
[本発明1031]
完全長抗体、好ましくはIgG1抗体、特にIgG1,κ抗体である、前記本発明のいずれかの抗体。
[本発明1032]
別の部分、例えば細胞傷害性部分、放射性同位体、または薬物と結合体化されている、前記本発明のいずれかの抗体。
[本発明1033]
エフェクター機能欠損性の抗体、例えば安定化されたヒトIgG4抗体、例えばヒトIgG4の重鎖定常領域にある位置409のアルギニンが、リジン、スレオニン、メチオニン、もしくはロイシン、好ましくはリジンで置換されているおよび/またはヒンジ領域がCys-Pro-Pro-Cys配列を含む抗体
である、前記本発明のいずれかの抗体。
[本発明1034]
一価抗体である、前記本発明のいずれかの抗体。
[本発明1035]
一価抗体が、
(i)本発明1001〜1023のいずれかの抗体の可変領域または該領域の抗原結合部分、および
(ii)ヒンジ領域に対応する領域、および免疫グロブリンがIgG4サブタイプでない場合はCH領域の他の領域、例えばCH3領域が、ポリクローナルヒトIgGの存在下で、同一のCH領域とのジスルフィド結合または同一のCH領域との他の共有結合もしくは安定した非共有結合による重鎖間結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基を含まないように修飾されている、免疫グロブリンのCH領域、またはCH2領域およびCH3領域を含むその断片
を含む、本発明1034の抗体。
[本発明1036]
工程(ii)において言及されている免疫グロブリンがIgG4サブタイプである、本発明1035の抗体。
[本発明1037]
ヒンジ全体が欠失されるように重鎖が修飾されている、本発明1035または1036の抗体。
[本発明1038]
例えばヒンジ領域変異によって、可動性が低下するように修飾されている、前記本発明のいずれかの抗体。
[本発明1039]
IgG1サブタイプである抗体であって、ヒンジ領域が、
(i)配列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:213)のヒンジ領域を欠失させ、これを配列:ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO:214)のIgG2ヒンジ領域で置換する(IgG1ヒンジ-IgG2);
(ii)修飾されたヒンジ領域の配列がEPKSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:215)となるように位置220を欠失させる(IgG1 ΔC220);
(iii)修飾されたヒンジ領域の配列がEPKSXDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:216)となるように、位置220のシステインを他の任意の天然アミノ酸(X)で置換する(IgG1 C220X);
(iv)配列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:213)のヒンジ領域を欠失させる(ユニボディ IgG1);
(v)配列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:213)のヒンジ領域を欠失させ、これを配列
(SEQ ID NO:217)
のIgG3ヒンジ領域で置換する(IgG1ヒンジ-IgG3);または
(vi)修飾されたヒンジ領域の配列がEPKSCDCHCPPCP(SEQ ID NO:218)となるように、位置223のスレオニンをシステインで置換し、位置222のリジンおよび位置225のスレオニンを欠失させる(IgG1 TH7Δ6-9)
ことによって修飾されている、本発明1038の抗体。
[本発明1040]
修飾されたヒンジ領域の配列がEPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:219)(IgG1 C220S)となるように、位置220のシステインをセリンで置換することによってヒンジ領域が修飾されている、本発明1039の抗体。
[本発明1041]
IgG2サブタイプである、本発明1038の抗体。
[本発明1042]
陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー-パルスドアンペロメトリ検出(HPAEC-PAD)によって確かめられた時に、コアフコシル化が10%未満、例えば5%未満に低減されるように修飾されている、前記本発明のいずれかの抗体。
[本発明1043]
前記本発明のいずれか一項記載において定義されたc-Met結合部位と、異なる結合特異性、例えばヒトエフェクター細胞、ヒトFc受容体、B細胞受容体、またはc-Metの非重複エピトープに対する結合特異性を有する第2の抗原結合部位とを含む二重特異性抗体である、前記本発明のいずれかの抗体。
[本発明1044]
SEQ ID NO:1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61、65、69、73、77、81、85、89、93、97、101、105、109、113、117、121、125、129、133、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、および178からなる群より選択されるアミノ酸配列の1つまたは複数をコードする、ヌクレオチド配列。
[本発明1045]
本発明1044のヌクレオチド配列を含み、抗体の機能的に連結された軽鎖定常領域、重鎖定常領域、または軽鎖および重鎖の両方をさらにコードする、発現ベクター。
[本発明1046]
本発明1001〜1043のいずれか一項において定義された抗体を産生する、組換え真核宿主細胞または組換え原核宿主細胞。
[本発明1047]
本発明1001〜1043のいずれか一項において定義された抗体および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
[本発明1048]
医薬として使用するための、本発明1001〜1043のいずれかの抗体。
[本発明1049]
癌、例えばHGF依存性癌またはHGF非依存性癌の治療において使用するための、本発明1001〜1043のいずれかの抗体。
[本発明1050]
膀胱癌、乳癌、子宮頚癌、胆管癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭頚部癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、鼻咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌、胆嚢癌、前立腺癌、甲状腺癌、骨肉腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、悪性線維性組織球腫、線維肉腫、急性骨髄性白血病、成人T細胞性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、グリア芽細胞腫、星状細胞腫、黒色腫、中皮腫、ウィルムス腫瘍、ならびに明細胞肉腫(CCS)、胞状軟部肉腫(ASPS)、および転座関連腎細胞癌を含むMiT腫瘍からなる群より選択される癌の治療において使用するための、本発明1001〜1043のいずれかの抗体。
[本発明1051]
1種類または複数種のさらなる治療剤、例えば化学療法剤と組み合わせて癌を治療するためのものである、本発明1049または1050の抗体。
[本発明1052]
任意で、本発明1049および1050のさらなる特徴を含む、癌を治療するための医薬を製造するための、本発明1001〜1043のいずれかの抗体の使用。
[本発明1053]
c-Metを発現する腫瘍細胞の成長および/または増殖を阻害するための方法であって、それを必要とする個体に、本発明1001〜1043のいずれかの抗体を投与する工程を含む、方法。
[本発明1054]
a)本発明1046の宿主細胞を培養する工程、および
b)培地から抗体を精製する工程
を含む、本発明1001〜1043のいずれかの抗体を産生するための方法。
[本発明1055]
抗体とc-Metの複合体の形成を可能にする条件下で、試料を本発明1001〜1043のいずれかの抗体と接触させる工程;および
複合体が形成されたかどうか分析する工程
を含む、試料中のc-Metの存在を検出するための方法。
[本発明1056]
本発明1001〜1043のいずれかの抗体;および
キットを使用するための説明書
を含む、試料中のc-Metの存在を検出するためのキット。
[本発明1057]
本発明1001〜1043のいずれかの抗体に対する、抗イディオタイプ抗体。
定義
「c-Met」という用語は、本明細書において用いられる時には、肝細胞増殖因子受容体(GenBankアクセッションNM000245)を指し、細胞によって天然に発現されたヒトc-Met、またはc-Met遺伝子でトランスフェクトされた細胞上に発現されたヒトc-Metの任意の変種、アイソフォーム、および種ホモログを含む。
前記のように、第1の局面において、本発明は、ヒトc-Metに結合するモノクローナル抗体に関する。
a)SEQ ID NO:1の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:5の配列を含むVL領域を含む固定化抗体(005)、
b)SEQ ID NO:17の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:21の配列を含むVL領域を含む固定化抗体(008)、
c)抗体5D5のVH領域およびVL領域を含む固定化抗体、ならびに
d)SEQ ID NO:49の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:53の配列を含むVL領域を含む固定化抗体(045)
からなる群より選択される抗体と競合しない。好ましくは前記抗体は、実施例17に記載のように求められた時に、前記固定化抗体と25%未満、例えば20%未満、競合する。
a)SEQ ID NO:33の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:37の配列を含むVL領域を含む抗体(024)、
b)SEQ ID NO:65の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:69の配列を含むVL領域を含む抗体(061)、
c)SEQ ID NO:73の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:77の配列を含むVL領域を含む抗体(062)、
d)SEQ ID NO:81の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:85の配列を含むVL領域を含む抗体(064)、
e)SEQ ID NO:89の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:93の配列を含むVL領域を含む抗体(068)、
f)SEQ ID NO:97の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:101の配列を含むVL領域を含む抗体(069)、
g)SEQ ID NO:113の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:117の配列を含むVL領域を含む抗体(098)、
h)SEQ ID NO:121の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:125の配列を含むVL領域を含む抗体(101)、ならびに
i)SEQ ID NO:129の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:133の配列を含むVL領域を含む抗体(181)
からなる群より選択される抗体と同じエピトープに結合する。
a)SEQ ID NO:36に示した配列を有するVH CDR3領域(024)、
b)SEQ ID NO:193に示した配列を有するVH CDR3領域、例えば、SEQ ID NO:68、76、84、もしくは92に示したVH CDR3領域(061、062、064、068)、
c)SEQ ID NO:196に示した配列を有するVH CDR3領域、例えば、SEQ ID NO:100もしくは132に示したVH CDR3領域(069、181)、
d)SEQ ID NO:116に示したVH CDR3領域(098)、または
e)SEQ ID NO:201に示したVH CDR3領域、例えば、SEQ ID NO:124に示したVH CDR3領域(101)。
a)SEQ ID NO:34、185、および36のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:38、39、および206のCDR1、2、および3配列を含むVL領域、例えば、SEQ ID NO:34、35、および36のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:38、39、および40のCDR1、2、および3配列を含むVL領域、(024)、
b)SEQ ID NO:191、192、および193のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:78、79、および208のCDR1、2、および3配列を含むVL領域、例えば、
a. SEQ ID NO:66、67、および68のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:70、71、および72のCDR1、2、および3配列を含むVL領域(061)、
b. SEQ ID NO:74、75、および76のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:78、79、および80のCDR1、2、および3配列を含むVL領域、(062)、
c. SEQ ID NO:82、83、および84のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:86、87、および88のCDR1、2、および3配列を含むVL領域、(064)、もしくは
d. SEQ ID NO:90、91、および92のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:94、95、および96のCDR1、2、および3配列を含むVL領域、(068)、
c)SEQ ID NO:194、195、および196のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:209、210、および104のCDR1、2、および3配列を含むVL領域、例えば、
a.SEQ ID NO:98、99、および100のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:102、103、および104のCDR1、2、および3配列を含むVL領域、(069)、もしくは
b.SEQ ID NO:130、131、および132のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:134、135、および136のCDR1、2、および3配列を含むVL領域、(181)、
d)SEQ ID NO:197、198、および116のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:118、119、および211のCDR1、2、および3配列を含むVL領域、例えば、SEQ ID NO:114、115、および116のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:118、119、および120のCDR1、2、および3配列を含むVL領域(098)、または
e)SEQ ID NO:199、200、および201のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:126、212、および128のCDR1、2、および3配列を含むVL領域、例えば、SEQ ID NO:122、123、および124のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:126、127、および128のCDR1、2、および3配列を含むVL領域(101)。
a)SEQ ID NO:33の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:37の配列を含むVL領域(024)、
b)SEQ ID NO:61の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:69の配列を含むVL領域(061)、
c)SEQ ID NO:73の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:77の配列を含むVL領域(062)、
d)SEQ ID NO:81の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:85の配列を含むVL領域(064)、
e)SEQ ID NO:89の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:93の配列を含むVL領域(068)、
f)SEQ ID NO:97の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:101の配列を含むVL領域(069)、
g)SEQ ID NO:113の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:117の配列を含むVL領域(098)、
h)SEQ ID NO:121の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:125の配列を含むVL領域(101)、
i)SEQ ID NO:129の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:133の配列を含むVL領域(181)、
j)SEQ ID NO:159の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:160の配列を含むVL領域(078)、
k)SEQ ID NO:161の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:162の配列を含むVL領域(084)、
l)SEQ ID NO:163の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:164の配列を含むVL領域(063)、
m)SEQ ID NO:165の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:166の配列を含むVL領域(087)、
n)SEQ ID NO:137の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:138の配列を含むVL領域(066)、
o)SEQ ID NO:139の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:140の配列を含むVL領域(065)、
p)SEQ ID NO:141の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:142の配列を含むVL領域(082)、
q)SEQ ID NO:143の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:144の配列を含むVL領域(089)、または
r)前記配列内に、好ましくは最大で1個、2個、もしくは3個のアミノ酸修飾、より好ましくはアミノ酸置換、例えば保存的アミノ酸置換を有する、前記抗体のいずれかの変種。
前記抗体は、可溶性cMetECDHisとの結合において、SEQ ID NO:9の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:13の配列を含むVL領域を含む固定化抗体(006)と競合し、好ましくは、実施例17に記載のように求められた時に、前記固定化抗体と50%を超えて、例えば75%を超えて競合し、かつ
前記抗体は、可溶性cMetECDHisとの結合において、SEQ ID NO:49の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:53の配列を含むVL領域を含む固定化抗体(045)と競合せず、好ましくは、実施例17に記載のように求められた時に、前記固定化抗体と50%未満、例えば25%未満、例えば20%未満、競合し、かつ
前記抗体はc-MetのSEMAドメインに結合し、好ましくは実施例9に記載のように、HGFとSEMAドメインとの結合を、10μg/mL未満、例えば2μg/mL未満のIC50で阻害することができる。
a)SEQ ID NO:1の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:5の配列を含むVL領域を含む抗体(005)、
b)SEQ ID NO:9の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:13の配列を含むVL領域を含む抗体(006)、
c)SEQ ID NO:25の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:29の配列を含むVL領域を含む抗体(022)、ならびに
d)SEQ ID NO:57の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:61の配列を含むVL領域を含む抗体(058)
からなる群より選択される抗体と同じエピトープに結合する。
a)SEQ ID NO:181に示した配列を有するVH CDR3領域、例えば、SEQ ID NO:4もしくは12に示したVH CDR3領域(005、006)、
b)SEQ ID NO:28に示した配列を有するVH CDR3領域(022)、または
c)SEQ ID NO:60に示した配列を有するVH CDR3領域(058)。
a)SEQ ID NO:179、180、および181のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:6、7、および202のCDR1、2、および3配列を含むVL領域、例えば、
a. SEQ ID NO:2、3、および4のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:6、7、および8のCDR1、2、および3配列を含むVL領域、(005)、もしくは
b. SEQ ID NO:10、11、および12のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:14、15、および16のCDR1、2、および3配列を含むVL領域、(006)、
b)SEQ ID NO:26、184、および28のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:30、31、および205のCDR1、2、および3配列を含むVL領域、例えば、SEQ ID NO:26、27、および28のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:30、31、および32のCDR1、2、および3配列を含むVL領域(022)、または
c)SEQ ID NO:189、190、および60のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:62、63、および207のCDR1、2、および3配列を含むVL領域、例えば、SEQ ID NO:58、59、および60のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:62、63、および64のCDR1、2、および3配列を含むVL領域(058)。
a)SEQ ID NO:1の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:5の配列を含むVL領域(005)、
b)SEQ ID NO:9の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:13の配列を含むVL領域(006)、
c)SEQ ID NO:25の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:29の配列を含むVL領域(022)、
d)SEQ ID NO:57の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:61の配列を含むVL領域(058)、
e)SEQ ID NO:145の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:146の配列を含むVL領域(031)、
f)SEQ ID NO:147の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:148の配列を含むVL領域(007)、
g)SEQ ID NO:149の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:150の配列を含むVL領域(011)、
h)SEQ ID NO:151の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:152の配列を含むVL領域(017)、
i)SEQ ID NO:153の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:154の配列を含むVL領域(025)、または
j)前記配列内に、好ましくは最大で1個、2個、もしくは3個のアミノ酸修飾、より好ましくはアミノ酸置換、例えば保存的アミノ酸置換を有する、前記抗体のいずれかの変種。
前記抗体は、可溶性cMetECDHisとの結合において、SEQ ID NO:49の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:53の配列を含むVL領域を含む固定化抗体(045)と競合し、好ましくは、実施例17に記載のように求められた時に、前記固定化抗体と50%を超えて、例えば75%を超えて競合し、かつ
前記抗体は、可溶性cMetECDHisとの結合において、SEQ ID NO:9の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:13の配列を含むVL領域を含む固定化抗体(006)と競合せず、好ましくは、実施例17に記載のように求められた時に、前記固定化抗体と25%未満、例えば20%未満、競合する。
a)SEQ ID NO:17の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:21の配列を含むVL領域を含む固定化抗体(008)、ならびに
b)SEQ ID NO:33の配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:37の配列を含むVL領域を含む固定化抗体(024)
からなる群より選択される抗体と競合せず、好ましくは、実施例17に記載のように求められた時に、前記固定化抗体と25%未満、例えば20%未満、競合する。
a)SEQ ID NO:49の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:53の配列を含むVL領域(045)、
b)SEQ ID NO:155の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:156の配列を含むVL領域(040)、
c)SEQ ID NO:157の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:158の配列を含むVL領域(039)、または
d)前記配列内に、好ましくは最大で1個、2個、もしくは3個のアミノ酸修飾、より好ましくはアミノ酸置換、例えば保存的アミノ酸置換を有する、前記抗体のいずれかの変種。
SEQ ID NO:18、182、および183のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:22、203、および204のCDR1、2、および3配列を含むVL領域、例えば、
a)SEQ ID NO:18、19、および20のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:22、23、および24のCDR1、2、および3配列を含むVL領域(008)、または
b)SEQ ID NO:42、43、および44のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、2、および3配列を含むVL領域(035)、または
c)SEQ ID NO:106、107、および108のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:110、111、および112のCDR1、2、および3配列を含むVL領域(096)。
a)SEQ ID NO:17の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:21の配列を含むVL領域(008)、
b)SEQ ID NO:41の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:45の配列を含むVL領域(035)、
c)SEQ ID NO:105の配列を含むVH領域、および、好ましくはSEQ ID NO:109の配列を含むVL領域(096)、または
d)前記配列内に、好ましくは最大で1個、2個、もしくは3個のアミノ酸修飾、より好ましくはアミノ酸置換、例えば保存的アミノ酸置換を有する、前記抗体のいずれかの変種。
本発明は、拮抗性抗c-Met抗体および非拮抗性抗c-Met抗体を提供する。一部の抗体は一価または二価であるかに関係なく標的細胞に拮抗作用するが、他の抗体の場合、機能作用は結合価に左右される。本明細書において実施例19に示したように、例えば、抗体024、062、064、068、069、098、101、181(これらは全て同じクロスブロッキング(cross-blocking)グループにある。実施例17を参照されたい)は形式に関係なくKP4生存アッセイにおいて拮抗性を有する。他方で、抗体022および058は、このアッセイでは一価形式では拮抗的に振る舞うが、二価形式ではアゴニストとして(または少なくとも非拮抗的に)振る舞う。従って、特定の用途の望ましい機能特性に応じて、本発明において提供される抗体セットから特定の抗体を選択することができる、および/または給合価を変えるように、これらの形式を適応することができる。
(i)配列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:213)のヒンジ領域を欠失させ、これを、配列:ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO:214)のIgG2ヒンジ領域で置換する(IgG1ヒンジ-IgG2);
(ii)修飾されたヒンジ領域の配列がEPKSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:215)になるように、位置220を欠失させる(IgG1 ΔC220);
(iii)修飾されたヒンジ領域の配列がEPKSXDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:216)になるように、位置220にあるシステインを他の任意の天然アミノ酸(X)で置換する(IgG1 C220X);
(iv)配列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:213)のヒンジ領域を欠失させる(ユニボディ(UniBody)IgG1);
(v)配列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:213)のヒンジ領域を欠失させ、これを、配列
(SEQ ID NO:217)のIgG3ヒンジ領域で置換する(IgG1ヒンジ-IgG3);または
(vi)修飾されたヒンジ領域の配列がEPKSCDCHCPPCP(SEQ ID NO:218)になるように、位置223にあるスレオニンをシステインで置換し、位置222にあるリジンおよび位置225にあるスレオニンを欠失させる(IgG1 TH7Δ6-9)
ことによって修飾されている。
i)前記一価抗体の軽鎖をコードする核酸構築物を準備する工程であって、前記構築物が、選択された抗原特異的抗c-Met抗体のVL領域をコードするヌクレオチド配列とIgの定常CL領域をコードするヌクレオチド配列とを含み、前記選択された抗原特異的抗体のVL領域をコードするヌクレオチド配列および前記IgのCL領域をコードするヌクレオチド配列が一緒に機能的に連結され、IgG1サブタイプの場合、ポリクローナルヒトIgGの存在下で、または動物もしくはヒトに投与された時に、CL領域の同一のアミノ酸配列を含む他のペプチドとジスルフィド結合または共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸もCL領域が含有しないように、CL領域をコードするヌクレオチド配列が修飾されている、工程;
ii)前記一価抗体の重鎖をコードする核酸構築物を準備する工程であって、前記構築物が、選択された抗原特異的抗体のVH領域をコードするヌクレオチド配列とヒトIgの定常CH領域をコードするヌクレオチド配列とを含み、ヒンジ領域に対応する領域、およびIgサブタイプにより必要とされる場合にはCH領域の他の領域、例えばCH3領域が、ポリクローナルヒトIgGの存在下で、または動物もしくはヒトに投与された時に、ヒトIgのCH領域の同一のアミノ酸配列を含む他のペプチドとのジスルフィド結合、または共有結合もしくは安定した非共有結合による重鎖間結合の形成に関与するいかなるアミノ酸残基も含まないように、CH領域をコードするヌクレオチド配列が修飾されており、前記選択された抗原特異的抗体のVH領域をコードするヌクレオチド配列および前記IgのCH領域をコードするヌクレオチド配列が一緒に機能的に連結されている、工程;
iii)前記一価抗体を産生するための細胞発現系を準備する工程;
iv)(iii)の細胞発現系の細胞において、(i)および(ii)の核酸構築物を同時発現させることによって、前記一価抗体を産生する工程。
(i)本明細書に記載の本発明の抗体の可変領域または前記領域の抗原結合部分、ならびに
(ii)ヒンジ領域に対応する領域、および免疫グロブリンがIgG4サブタイプでない場合はCH領域の他の領域、例えばCH3領域が、ポリクローナルヒトIgGの存在下で同一のCH領域とのジスルフィド結合または同一のCH領域との他の共有結合もしくは安定した非共有結合による重鎖間結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基も含まないように修飾されている、免疫グロブリンのCH領域、またはCH2領域およびCH3領域を含むその断片。
*KABATは、Kabat(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)に準拠するアミノ酸ナンバリングを示す。EUインデックスは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))に概説されたEUインデックスに準拠するアミノ酸ナンバリングを示す。
さらなる態様において、本発明は、治療部分、例えば細胞毒、化学療法薬、免疫抑制剤、または放射性同位体と結合体化された抗c-Met抗体を提供する。このような結合体は本明細書において「免疫結合体」と呼ばれる。1種類または複数種の細胞毒を含む免疫結合体は「免疫毒素」と呼ばれる。
さらなる局面において、本発明は、本明細書において前述で説明された本発明の抗c-Met抗体に由来する第1の抗原結合部位、および異なる結合特異性、例えばヒトエフェクター細胞、ヒトFc受容体、T細胞受容体、B細胞受容体に対する結合特異性、またはc-Metの非重複エピトープに対する結合特異性を有する第2の抗原結合部位を含む二重特異性分子、すなわち、例えば実施例17に記載のように試験された時に、第1および第2の抗原結合部位がc-Metとの結合において競合しない二重特異性抗体に関する。
さらなる局面において、本発明は、本発明の抗体の重鎖および軽鎖をコードする、核酸配列、例えばDNA配列に関する。
a)本明細書において前述された本発明のハイブリドーマまたは宿主細胞を培養する工程、および
b)培地から本発明の抗体を精製する工程
を含む方法に関する。
さらなる主な局面において、本発明は、
本明細書において定義された抗c-Met抗体、および
薬学的に許容される担体
を含む、薬学的組成物に関する。
さらなる主な局面において、本発明は、医薬として使用するための本発明の抗c-Met抗体に関する。
・非小細胞肺癌を治療するためには、抗c-Met抗体と、EGFR阻害剤、例えば抗EGFR抗体、例えばザルツムマブ、セツキシマブ、パニツムマブもしくはニモツズマブ(nimotuzumab)または他のEGFR阻害剤、例えばゲフィチニブもしくはエルロチニブ)、あるいはErbB2(Her2/neu)阻害剤(例えば、抗HER2抗体、例えばトラスツズマブ、トラスツズマブ-DMl、もしくはペルツズマブ)、またはEGFRおよびHER2両方の阻害剤、例えばラパチニブ、あるいはHER3阻害剤との併用。
・神経膠腫を治療するためには、抗c-Met抗体と、テモゾロミドまたは血管形成阻害剤、例えばベバシズマブとの併用。
・結腸直腸癌を治療するためには、抗c-Met抗体と、ゲムシタビン、ベバシズマブ、FOLFOX、FOLFIRI、XELOX、IFL、オキサリプラチン、イリノテカン、5-FU/LV、カペシタビン、UFT、EGFR標的剤、例えばセツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ;VEGF阻害剤、またはチロシンキナーゼ阻害剤、例えばスニチニブより選択される1種類または複数種の化合物との併用。
・前立腺癌を治療するためには、抗c-Met抗体と、ホルモン/抗ホルモン療法;例えば、抗アンドロゲン、黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)アゴニスト、および化学療法剤、例えばタキサン、ミトキサントロン、エストラムスチン、5FU、ビンブラスチン、イクサベピロンより選択される1種類または複数種の化合物との併用。
1つの態様において、本発明は、対象において、c-Metを発現する細胞に関与する障害を治療するための方法を提供するものであり、この方法は、それを必要とする対象への、治療的有効量の抗c-Met抗体、例えば本発明の抗c-Met抗体および放射線療法の投与を含む。
本発明の抗c-Met抗体は診断目的でも使用することができる。従って、さらなる局面において、本発明は、本明細書において定義された抗c-Met抗体を含む診断用組成物に関する。
-試料と本発明の抗c-Met抗体とを、抗体とc-Metとの複合体が形成する条件下で接触させる工程;および
-複合体が形成したかどうか分析する工程
を含む方法に関する。
-本発明の抗c-Met抗体または本発明の二重特異性分子;および
-キットを使用するための説明書
を含む、試料中のc-Met抗原またはc-Metを発現する細胞の存在を検出するためのキットに関する。
さらなる局面において、本発明は、本明細書に記載のように本発明の抗c-Met抗体に結合する抗イディオタイプ抗体に関する。
HEK細胞またはCHO細胞において、c-Met、c-Metの細胞外ドメイン(ECD)(aa 1-932およびC末端His6タグ)、またはSEMAドメイン(aa 1-567およびC末端His9タグ)を発現させるためのコドン最適化構築物を作製した。これらの構築物によってコードされるタンパク質は、c-MetのGenBankアクセッションNM000245と同一である。これらの構築物は適切なクローニング用制限部位および最適なKozak配列(Kozak et al.(1999)Gene 234:187-208)を含有する。これらの構築物を哺乳動物発現ベクターpEE13.4(Lonza Biologics)(Bebbington(1992)Biotechnology(NY)10:169-175)にクローニングして、pEE13.4cMet、pEE13.4cMetECDHis、およびpEE13.4cMetSEMA-567His8を得た。
HEK細胞において、IgG1抗体である5D5v1、5D5、およびG11-HZの重鎖(HC)および軽鎖(LC)を発現させるためのコドン最適化構築物を作製した。これらの構築物によってコードされるタンパク質は、5D5v1重鎖および軽鎖については米国特許第6468529号(配列番号3および4)に記載のタンパク質、5D5重鎖および軽鎖についてはWO2006/015371A2(図13)に記載のタンパク質、ならびに224G11重鎖および軽鎖についてはWO2009/007427A2(複数の図から配列を抽出した)に記載のタンパク質と同一である。224G11を本明細書ではG11-HZとも呼ぶ。
Freestyle(商標)293-F(懸濁増殖および化学的に明らかにされているFreestyle培地に適応したHEK-293サブクローン、(HEK-293F))細胞をInvitrogenから入手し、293fectin(Invitrogen)を用いて製造業者の説明書に従って適切なプラスミドDNAでトランスフェクトした。下記のように、c-Met発現をFACS分析によって試験した。抗体発現の場合には、適切な重鎖発現ベクターおよび軽鎖発現ベクターを同時発現させた。
Freestyle(商標)CHO-S(Invitrogen)細胞株において、Freestyle MAXトランスフェクション試薬(Invitrogen)を用いて、pEE13.4cMetを一過的にトランスフェクトした。下記のように、c-Met発現をFACS分析によって試験した。
哺乳動物細胞において一価抗体を発現させるために、ヒンジ領域(Ch)(アミノ酸E99-P110)が無く、CH3領域に2つの変異F405TおよびY407Eを含有するIgG4 HC定常領域を哺乳動物発現ベクターpcDNA3.3(Invitrogen)の中でコドン最適化構築物として合成して、pUniTEと名付けた。ヒトκ軽鎖領域のコドン最適化定常領域をpcDNA3.3に挿入することによって別のベクターを構築し、pKappaと名付けた。
cMetECDHisおよびcMetSEMAHisをHEK-293F細胞において発現させた。cMetECDHisおよびcMetSEMAHisの中にあるHisタグは、固定化金属アフィニティクロマトグラフィーを用いた精製を可能にする。このプロセスでは、クロマトグラフィー樹脂上に固定化されたキレート剤にCo2+カチオンが充填されている。バッチモードで(すなわち、溶液中で)、cMetECDHisおよびcMetSEMAHisを含有する上清を樹脂とインキュベートした。Hisタグ化タンパク質は樹脂ビーズに強く結合するのに対して、培養上清中に存在する他のタンパク質は強く結合しない。インキュベーション後、ビーズを上清から取り出し、カラムに詰めた。弱く結合しているタンパク質を除去するためにカラムを洗浄する。次いで、強く結合しているcMetECDHisタンパク質およびcMetSEMAHisタンパク質を、HisとCo2+との結合において競合するイミダゾールを含有する緩衝液で溶出する。脱塩カラムにおける緩衝液交換によって溶出剤をタンパク質から除去する。
抗体005、006、007、008、011、012、016、017、022、024、025、028、031、035、039、040、045、093、095、096、101、および104は以下の免疫から得られた。1匹のHCo20マウス(1匹の雌、GG2713系統)、1匹のHCo17マウス(雌、GG2714系統)、および2匹のHCol2-Balb/Cマウス(2匹の雌、GG2811系統)(Medarex, San Jose, CA, USA;参照のために、前記のHuMabマウスに関する章、WO2009097006、およびUS2005191293を参照されたい)を、5x106個のNCI-H441腫瘍細胞、腹腔内(IP)および20μgのハプテンキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)結合cMetECDHisタンパク質、皮下(SC)を2週間ごとに交互に用いて免疫した。
免疫マウスの血清中またはHuMab(ヒトモノクローナル抗体)ハイブリドーマもしくはトランスフェクトーマの培養上清中にある抗c-Met抗体の存在を、均質抗原特異的スクリーニングアッセイ(4クワドラント(four quadrant))によってFluorometric Micro volume Assay Technology(FMAT; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を用いて確かめた。このために、3種類の細胞ベースのアッセイおよび1種類のビーズベースのアッセイの組み合わせを使用した。細胞ベースのアッセイにおいては、TH1016-cMet(c-Met受容体の細胞外ドメインを一過的に発現するHEK-293F細胞;前記のように作製された)およびHT29(細胞表面にc-Metを発現する)ならびにHEK293野生型細胞(c-Metを発現しない負の対照)との結合を確かめた。ビーズベースのアッセイの場合、SB1016-cMet(前記のように、一過的にトランスフェクトされたHEK-293F細胞から得られ、ビオチン化され、ストレプトアビジンコーティングビーズと結合されたcMetECDHis)との結合を確かめた。c-Metと結合させるために、試料を細胞/ビーズに添加した。その後に、蛍光結合体(ヤギ抗ヒトIgG-Cy5; Jackson ImmunoResearch)を用いて、HuMabの結合を検出した。キメラc-Met特異的抗体5D5v1(HEK-293F細胞において作製された)を正の対照として使用し、HuMab-マウスプール血清およびHuMab-KLHを負の対照として使用した。試料を、Applied Biosystems 8200 Cellular Detection System(8200 CDS)を用いてスキャンし、「カウントx蛍光」を読み取り値として使用した。カウントが50を超える時に試料は陽性と示され、カウントx蛍光は、負の対照であるHuMab-KLHの少なくとも3倍であった。
十分な抗原特異的力価(前記で定義した)が発生したHuMabマウスを屠殺し、脾臓ならびに腹大動脈および大静脈に隣接するリンパ節を収集した。脾細胞およびリンパ節細胞とマウスミエローマ細胞株を、CEEF 50 Electrofusion System(Cyto Pulse Sciences, Glen Burnie, MD, USA)を用いて、本質的に製造業者の説明書に従って融合した。融合プレートを、前記のように抗原特異的結合アッセイを用いてスクリーニングし、このアッセイからの陽性を、下記のようにERK-リン酸化Alphascreen(登録商標)SureFire(登録商標)アッセイおよび親和性ランキング(affinity ranking)Octetアッセイにおいて試験した。標準的なプロトコールに基づいて(例えば、Coligan J.E., Bierer, B.E., Margulies, D.H., Shevach, E.M. and Strober, W., eds. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., 2006に記載のプロトコールに基づいて)、抗体031、035、087、および089を増殖および培養した。
6ウェルまたはHyperflask段階からの抗体含有ハイブリドーマ上清の小さな0.8mlアリコートを、Sciclone ALH 3000ワークステーション(Caliper Lifesciences, Hopkinton, USA)においてプロテインG樹脂(PhyNexus Inc., San Jose, USA)を含有するPhyTipカラムを用いて精製した。PhyTipカラムを製造業者の説明書に従って使用したが、緩衝液を、Binding Buffer PBS(B. Braun, Medical B.V., Oss, Netherlands)およびElution Buffer 0.1Mグリシン-HCl pH2.7(Fluka Riedel-de Haen, Buchs, Germany)と交換した。精製後、試料を2M Tris-HCl pH9.0(Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Netherlands)によって中和した。または、場合によっては、さらに多量の培養上清を、プロテインAアフィニティカラムクロマトグラフィーを用いて精製した。
抗c-Met HuMabの全RNAを5x106個のハイブリドーマ細胞から調製し、SMART RACE cDNA Amplificationキット(Clontech)を用いて製造業者の説明書に従って、100ngの全RNAから5'-RACE-Complementary DNA(cDNA)を調製した。VH(重鎖の可変領域)コード領域およびVL(軽鎖の可変領域)コード領域をPCR増幅し、連結非依存クローニング戦略(ligation independent cloning strategy)(Aslanidis et al.1990 Nucleic Acids Res. 18:6069-6074)を用いて、哺乳動物発現ベクターpEE6.4(Lonza Biologics, Slough, UK(Bebbington et al.(1992)Biotechnology 10:169-175))の中にある定常領域ベクターpGlf(コドン最適化された完全合成のヒトIgG1(アロタイプf)重鎖定常領域を含有する)、および哺乳動物発現ベクターpEE12.4(Lonza Biologics, Slough, UK(Bebbington et al.(1992)Biotechnology 10:169-175)の中にあるpKappa(コドン最適化された完全合成のヒトκ軽鎖(アロタイプKm3)定常領域を含有する)にインフレームでクローニングした。それぞれのHuMabについて、12個のVLクローンおよび8個のVHクローンを配列決定し、それらの理論質量を計算し、入手可能な抗体質量分析データと比較した。配列を配列表および本明細書にある以下の表1に示した。CDR配列は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, M D.(1991)に準拠して定義した。表2および表3は、抗体配列情報および最も相同性のある生殖系列配列の概要を示す。
培養上清を0.2μmデッドエンドフィルターで濾過し、5mlのMabSelect SuReカラム(GE Health Care)にロードし、0.1Mクエン酸ナトリウム-NaOH, pH3を用いて溶出した。すぐに、溶出液を2M Tris-HCl, pH9で中和し、12.6mM NaH2PO4、140mM NaCl, pH7.4(B.Braun)に対して一晩、透析した。または、精製後、溶出液をHiPrep Desaltingカラムにロードし、抗体を12.6mM NaH2PO4、140mM NaCl, pH7.4(B.Braun)緩衝液に交換した。透析後または緩衝液交換後、試料を0.2μmデッドエンドフィルターで滅菌濾過した。純度をSDS-PAGEによって求め、濃度を比濁分析および280nmでの吸光度によって測定した。精製抗体を4℃で保管した。実施例10に記載のように、ハイブリドーマによって発現された抗体重鎖および軽鎖の分子量を特定するために、質量分析を行った。
抗c-Met抗体およびその一価型(本明細書では「ユニボディ分子」とも呼ぶ。実施例5を参照されたい)と膜結合型c-Metを発現するA431細胞(ATCC, CRL-1555で購入した)との結合を、フローサイトメトリー(FACS Canto II, BD Biosciences)を用いて試験した。Qifi分析(Dako, Glostrup, Denmark)から、A431細胞は、細胞1個あたり平均30,000コピーのc-Metタンパク質を発現することが明らかになった。抗c-Met抗体およびユニボディ分子との結合を、フィコエリトリン結合ヤギ抗ヒトIgG抗体(Jackson)を用いて検出した。IgG1-5D5を正の対照抗体として使用し、HuMab-KLHをアイソタイプ対照抗体として使用した。GraphPad Prism V4.03ソフトウェア(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)を用いて、非線形回帰(傾きが変化するS字形用量反応)によってEC50値を求めた。
抗体とcMetECDHisとの結合を、Octet System(Fortebio, Menlo Park, USA)においてBio-Layer Interferometry(BLI)技術によって分析した。抗ヒトIgGでコーティングされたバイオセンサー(Fc特異的)を用いて、製造業者によって推奨された手順に従って抗c-Met抗体を捕捉した。ロードされたバイオセンサーを、10倍に希釈したキネティクス(kinetics)緩衝液(Fortebio)で希釈した10μg/mL cMetECDHisを含有するウェルに入れることによって、固定化された抗c-Met抗体の上にHEK293細胞由来cMetECDHisをロードした。cMetECDHis結合によるバイオセンサー表面の光反射の差(Δλ, nm)を約10分間リアルタイム測定し、会合定数(ka [1/Mxs])を計算するためにOctetソフトウェア(V4.0, Fortebio)によって使用した。次に、解離定数(kd [1/s])を求めるために、ロードされたバイオセンサーを、(PBSで10倍希釈した)キネティクス緩衝液のみを含有するウェルに入れた。モデル1:1(ラングミュア)を用いて、親和性(KD [M])を求めるためにキネティクス分析を行った。正の対照として、HEK293細胞において産生された0.2μg/mLの5D5 IgG1を使用した。
アカゲザルc-Metとの交差反応性を確かめるために、抗c-Met抗体とc-Met陽性アカゲザル上皮細胞(ATCCで購入した4MBr-5)との結合を、フローサイトメトリー(FACS Canto II, BD Biosciences)を用いて試験した。フィコエリトリン結合ヤギ抗ヒトIgG抗体(Jackson)を二次結合体として使用した。HuMab-KLHをアイソタイプ対照抗体として使用した。
肝細胞増殖因子(HGF)とc-Met受容体との結合を抗c-Met抗体がブロックできるかどうか分析するために、ELISAを行った。従って、コーティングされたc-Met細胞外ドメインを非標識抗c-Met抗体および蛍光標識HGFとインキュベートした。非阻止抗体はc-Met結合において標識HGFと競合せず、その結果、最大蛍光シグナルが発生する。阻止抗体はc-Met結合において標識HGFと競合し、その結果、蛍光シグナルが減少する。
最初に、試験される抗c-Met抗体の最適コーティング濃度およびcMetECDHisの最適濃度を求めた。従って、ELISAウェルを、PBSで連続希釈した抗c-Met HuMab(2倍希釈して8μg/mL)と4℃で一晩コーティングした。次に、ELISAウェルをPBST(0.05%Tween-20[Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands]を添加したPBS)で洗浄し、PBSTC(2%[v/v]ニワトリ血清[Gibco, Paisley, Scotland]を添加したPBST)によって室温(RT)で1時間ブロックした。その後に、ELISAウェルをPBSTで洗浄し、PBSTCで連続希釈したビオチン化cMetECDHis(2倍希釈して1μg/mL)とRTで1時間インキュベートした。結合しなかったビオチン化cMetECDHisをPBSTで洗い流し、結合したビオチン化cMetECDHisを、PBSTで希釈した0.1μg/mLストレプトアビジン-ポリ-HRP(Sanquin, Amsterdam, The Netherlands)とRTで1時間インキュベートした。洗浄後、2,2'-アジノ-bis(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸(ABTS:1個のABTS錠剤を50mL ABTS緩衝液[Roche Diagnostics, Almere, The Netherlands]で希釈した)とRTで15分間、光から保護しながらインキュベートすることによって、反応を視覚化した。等量のシュウ酸(Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands)を添加することによって、発色を停止した。マイクロタイタープレートリーダー(Biotek Instruments, Winooski, USA)において405nmでの蛍光を測定した。各抗体の最適以下(約80%)の結合を生じる条件を確かめ、以下のクロスブロック(cross-block)実験のために使用した。
HGFは、c-Met受容体のSEMAドメインおよびIgG領域の両方に結合することができる。しかしながら、SEMAドメインに結合したHGFのみが受容体活性化に重要であると見出された。従って、TR-FRET技術を用いて、抗c-Met抗体とc-Met受容体SEMAドメインとの相互作用を研究した。この均質な、至近距離に基づくアッセイを行うために、肝細胞増殖因子(HGF, ProSpec Tany, Rehovot, Israel)を蛍光アクセプター色素;AlexaFluor-647(Invitrogen, Breda, The Netherlands)と結合体化させた。cMetSEMA-567His8を、ヒスチジンタグに対する蛍光ドナー分子(抗6xhisユーロピウム3+, PerkinElmer, Turku, Finland)で標識した。AlexaFluor-647結合HGFとユーロピウム3+標識cMetSEMA-567His8が結合すると、ドナー分子(励起340nm)からアクセプター分子(発光665nm)へのエネルギー転移が可能になる。665nmでの平均蛍光強度をEnVision 2101 Multilabelリーダー(PerkinElmer)において測定した。665nmでのTR-FRETシグナルの減少によって、非標識抗c-Met抗体とAlexaFluor-647結合HGFとの競合を測定した。なぜなら、非結合状態ではドナーとアクセプターフルオロフォアとの距離は離れすぎて、エネルギー転移が起こらないからである。
示されたデータは、3回の独立した実験の平均MFIである。
c-Met抗体がKP4細胞(理研バイオリソースセンター細胞バンク, RCB1005)の生存を阻害する能力を試験した。自己分泌により高レベルのc-MetおよびHGFを発現するKP4細胞を、無血清培地(1部のHAM's F12K[Cambrex, East Rutherford, New Jersey]および1部のDMEM[Cambrex])が入っている96ウェル組織培養プレート(Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany)(10,000個の細胞/ウェル)に播種した。66.7nM抗c-Met抗体希釈液を無血清培地に溶解して調製し、細胞に添加した。3日間インキュベートした後に、Alamarblue(BioSource International, San Francisco, US)を用いて製造業者の説明書に従って、生細胞の量を定量した。EnVision 2101 Multilabelリーダー(PerkinElmer, Turku, Finland)と標準的なAlamarblue環境を用いて、蛍光をモニタリングした。抗体処理細胞のAlamarblueシグナルを、非処理細胞と比較してパーセントシグナルとしてプロットした。
抗c-Met HuMabがインビボでの腫瘍成長を阻害する効力を確かめるために、SCIDマウスにおけるKP4異種移植腫瘍モデルを行った。7〜11週齢の雌SCIDマウス、C.B-17/IcrPrkdc-scid/CRL系統をCharles River Laboratories Nederland(Maastricht, the Netherlands)から購入し、フィルタートップケージに入れて無菌条件下に保ち、飼料および水を自由に与えた。マウス識別のためにマイクロチップ(PLEXX BV, Elst, The Netherlands)を付けた。全ての実験はユトレヒト大学動物倫理委員会によって認可された。
ヌードマウスにおけるヒト胃腺癌MKN45異種移植腫瘍モデルを用いて、抗c-Met HuMabがインビボで腫瘍成長を阻害する効力を確かめた。
c-Metの天然リガンドであるHGFは、2つのc-Met分子の二量体化を誘導する機能的二量体である。その後に、c-Met細胞内ドメインが細胞内リン酸化すると、細胞の増殖、浸潤、および生存に関与するいくつかのシグナル伝達経路が活性化される。c-Metに対して作製された大部分の二価抗体は、特に、抗体の結合エピトープがc-MetのSEMAドメインの近く、またはc-MetのSEMAドメインの中にある時に細胞運命に対してHGFと同等の作用を示す。
クローニングおよび発現
変異体IgG1抗体を設計し、標準的な分子生物学的技法を用いてクローニングした。作製された全てのヒンジ領域変異の配列の概要を以下の表8に示した。
一過的発現
全ての変異体を十分なレベルで発現させた。これらの変異体は、MS(>99%純度)およびSDS-PAGEによって確かめられた時に異常な多量体形成を示さなかった。
変異体のc-Met結合特性をELISAにおいて試験した。ELISAプレートウェルを、PBSに溶解したrhHGFR/Fcキメラ(R&D Systems; Cat.358MT/CF)(1μg/mL)によって4℃で一晩コーティングした。次に、ウェルをPBST(0.05%Tween-20[Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands]を添加したPBS)で洗浄し、PBSTC(2%[v/v]ニワトリ血清[Gibco, Paisley, Scotland]を添加したPBST)によって室温(RT)で1時間ブロックした。その後に、ウェルをPBSTで洗浄し、PBSTCで連続希釈した抗cMet抗体および変種(4倍希釈で10μg/mL)とRTで1時間インキュベートした。結合しなかった抗体をPBSTで洗い流し、コーティングに結合している抗体を、PBSTで希釈したヤギ抗ヒトIgG F(ab')2-HRP(Jacksonカタログ番号109-035-097)とRTで1時間インキュベートすることによって検出した。洗浄後、2,2'-アジノ-bis(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)(ABTS:1個のABTS錠剤を50mL ABTS緩衝液[Roche Diagnostics, Almere, The Netherlands]で希釈した)とRTで15分間、光から保護しながらインキュベートすることによって、反応を視覚化した。等量のシュウ酸(Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands)を添加することによって発色を止めた。マイクロタイタープレートリーダー(Biotek Instruments, Winooski, USA)において405nmでの蛍光を測定した。全ての変異体が、c-Metに匹敵する見かけの親和性(EC50)で結合した(図14)。表10は、この実験において得られた変異体のEC50値を示す。
受容体リン酸化
硬化した抗体のアゴニスト特性を確かめるために、cMetリン酸化に対する抗体の作用を行った。天然リガンドHGFまたは大部分の二価抗体によって、2つの隣接するcMet受容体が二量体化すると、c-Metの細胞内ドメインにある3つのチロシン残基(位置1230、1234、および1235)が交差リン酸化(cross phosphorylate)され、その後に、細胞内ドメインにある他のいくつかのアミノ酸がリン酸化し、多数のシグナル伝達カスケードが活性化される。従って、cMetの二量体化および活性化は、リン酸化受容体のこれらの位置に特異的な抗体を用いてモニタリングし、従って、抗c-Met抗体の潜在的なアゴニズムの読み取り値として使用することができる。
cMet抗体の潜在的な増殖性アゴニスト活性を、高レベルのc-Metを発現するが、そのリガンドHGFを産生しない肺腺癌細胞株NCI-H441(ATCC, HTB-174(商標))を用いて試験した。NCI-H441細胞を、血清を含まないRPMI(Lonza)が入っている96ウェル組織培養プレート(Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany)(5,000個の細胞/ウェル)に播種した。抗c-Met抗体希釈液(66.7nM)を、血清を含まないRPMIに溶解して調製し、細胞に添加した。37℃/5%CO2で7日間インキュベートした後に、Alamarblue(BioSource International, San Francisco, US)を用いて製造業者の説明書に従って、生細胞の量を定量した。EnVision 2101 Multilabelリーダー(PerkinElmer, Turku, Finland)と標準的なAlamarblue環境を用いて、蛍光をモニタリングした。
抗c-Met抗体変異体がHGF依存性細胞を阻害する能力もKP4生存アッセイにおいて確かめた(実験手順については実施例19を参照されたい)。結果を図17に示した。IgG1-1016-069ベースの変異体の効力は完全に保持されているか、またはC220変異体においてわずかに良かった。特に、アゴニスト性抗体5D5のC220を変異させると、KP4生存は著しく低下した。IgG1形式の058抗体および5D5抗体のアゴニスト作用は、KP4によるHGF高発現(オートクラインHGFループ)のために観察されなかった。
拮抗性抗体によって誘導されるc-Metの発現低下は治療用c-Met抗体の作用機構である。従って、1つの態様において、アゴニスト特性が低下しているが、c-Metの発現低下を誘導する能力を保持している抗体が望ましい。抗体の発現低下能を確かめるために、A549細胞(ATCCから入手したCCL-185)を、血清含有細胞培地が入っている6ウェル組織培養プレート(500,000個の細胞/ウェル)に播種し、37℃で一晩、培養した。翌朝、最終濃度10μg/mLの抗c-Met抗体を添加し、プレートを37℃でさらに2日間インキュベートした。PBSで洗浄した後に、250μL溶解緩衝液(Cell signaling, Danvers, USA)と室温で30分間インキュベートすることによって細胞を溶解した。総タンパク質量は、ビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイ試薬(Pierce)を用いて製造業者のプロトコールに従って定量した。細胞溶解産物中のc-Metタンパク質量は、c-Met特異的サンドイッチELISAを用いて定量した。このために、ELISAプレートウェルを、PBSで希釈したc-Met細胞外ドメインに対するヤギ抗ヒトc-Met抗体(R&D systems)(1μg/mL)を用いて4℃で一晩コーティングした。次に、ウェルをPBST(0.05%Tween-20[Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands]を添加したPBS)で洗浄し、PBSTC(2%[v/v]ニワトリ血清[Gibco, Paisley, Scotland]を添加したPBST)を用いてRTで1時間ブロックした。未希釈の細胞溶解産物を添加し(100μL)、RTで1時間インキュベートした。PBSTによって洗浄した後に、ウェルを、PBSCで1:1000に希釈した、ヒト-c-Met細胞内チロシン-1234残基に対するマウス抗体(Cell signaling)とRTで1時間インキュベートした。ウェルをPBSTで再洗浄し、PBSCで1:5000に希釈したヤギ抗マウスFc-HRP抗体(Jackson)とRTで1時間インキュベートした。PBSTで洗浄した後に、2,2'-アジノ-bis(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)(ABTS:1個のABTS錠剤を50mL ABTS緩衝液[Roche Diagnostics, Almere, The Netherlands]で希釈した)とRTで30分間、光から保護しながらインキュベートすることによって、反応を視覚化した。等量のシュウ酸(Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands)を添加することによって発色を止めた。マイクロタイタープレートリーダー(Biotek Instruments, Winooski, USA)において405nmでの蛍光を測定した。図18に見られるように、抗体069の全ての変異体は発現低下を誘導することができた。
MKN45細胞(理研バイオリソースセンター, Tsukuba, Japan, RCB1001から購入した)を回収し(5x106細胞)、洗浄し(PBS、1500rpm、5分で2回)、10%cosmic calf serum(CCS)(HyClone, Logan, UT, USA)を添加したRPMI1640培地1mLに入れて収集し、これに200μCiの51Cr(クロム-51; Amersham Biosciences Europe GmbH, Roosendaal, The Netherlands)を添加した。混合物を、振盪している水浴に入れて37℃で1.5時間インキュベートした。細胞を洗浄した後に(PBS、1500rpm、5分で2回)、細胞を、10%CCSを添加したRPMI1640培地に再懸濁し、トリパンブルー排除によってカウントし、1x105細胞/mLの濃度まで希釈した。
(cpm試料-cpm Ab非依存性溶解)/(cpm最大溶解-cpm自然溶解)x100%
のように抗体性溶解のパーセントを計算した。
クローン069と、末梢血に存在する3種類の細胞(B細胞、単球、および顆粒球)との結合を扱うために、FACS結合アッセイを行った。蛍光標識されたクローン069を用いると、二次検出抗体を用いることなくFACSによって直接測定することができた。関心対象の細胞上にある特異的マーカーに対する市販の蛍光標識抗体を用いたアッセイにおいて、血中の細胞集団が特定された。
Claims (15)
- a)配列番号18、19、および20のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびに配列番号22、23、および24のCDR1、2、および3配列を含むVL領域(008)、または
b)配列番号42、43、および44のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびに配列番号46、47、および48のCDR1、2、および3配列を含むVL領域(035)、または
c)配列番号106、107、および108のCDR1、2、および3配列を含むVH領域、ならびに配列番号110、111、および112のCDR1、2、および3配列を含むVL領域(096)
を含む、ヒトc-Metに結合するモノクローナル抗体。 - a)配列番号17の配列を含むVH領域、および配列番号21の配列を含むVL領域(008)、
b)配列番号41の配列を含むVH領域、および配列番号45の配列を含むVL領域(035)、または
c)配列番号105の配列を含むVH領域、および配列番号109の配列を含むVL領域(096)
を含む、請求項1記載の抗体。 - 以下の特徴のうち1つまたは複数を含む、請求項1〜2のいずれか一項記載の抗体:
a)20nM以下の親和性定数(KD)でc-Metに結合する、
b)アカゲザルc-Metに結合し、アカゲザルc-Metに結合した抗体のシグナルが負の対照抗体のシグナルの少なくとも5倍である、
c)KP4細胞の生存を、10%を超えて、もしくは25%を超えて、もしくは40%を超えて、阻害することができる、
d)完全長抗体である、
e)完全長IgG1抗体である、
f)別の部分と結合体化されている、
g)細胞傷害性部分と結合体化されている、
h)エフェクター機能欠損性の抗体である、
i)安定化されたヒトIgG4抗体であって、ヒトIgG4の重鎖定常領域にある位置409のアルギニンが、リジン、スレオニン、メチオニン、もしくはロイシンで置換されているおよび/もしくはヒンジ領域がCys-Pro-Pro-Cys配列を含む抗体である、かつ/または
j)一価抗体である。 - 二価抗体である、請求項1〜3のいずれか一項記載の抗体。
- IgG2サブタイプである、請求項1〜4のいずれか一項記載の抗体。
- IgG4サブタイプである、請求項1〜4のいずれか一項記載の抗体。
- 請求項1〜2のいずれか一項において定義されたc-Met結合部位と、異なる結合特異性を有する第2の抗原結合部位とを含む二重特異性抗体である、請求項1〜6のいずれか一項記載の抗体。
- a)配列番号17および21の配列の組み合わせ、
b)配列番号41および45の配列の組み合わせ、または
c)配列番号105および109の配列の組み合わせ
をコードする、ヌクレオチドのセット。 - 請求項8記載のヌクレオチド配列を含み、抗体の機能的に連結された軽鎖定常領域、重鎖定常領域、または軽鎖および重鎖の両方をさらにコードする、発現ベクター。
- 請求項1〜7のいずれか一項において定義された抗体を産生する、組換え真核宿主細胞または組換え原核宿主細胞。
- 請求項1〜7のいずれか一項において定義された抗体および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
- 癌を治療するための医薬を製造するための、請求項1〜7のいずれか一項記載の抗体の使用。
- a)請求項10記載の宿主細胞を培養する工程、および
b)培地から抗体を精製する工程
を含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の抗体を産生するための方法。 - 抗体とc-Metの複合体の形成を可能にする条件下で、試料を請求項1〜7のいずれか一項記載の抗体と接触させる工程;および
複合体が形成されたかどうか分析する工程
を含む、試料中のc-Metの存在を検出するための方法。 - 請求項1〜6のいずれか一項記載の抗体に対する、抗イディオタイプ抗体。
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