MX2012009987A - Anticuerpos monoclonales anti-c-met. - Google Patents

Anticuerpos monoclonales anti-c-met.

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Abstract

Se describen anticuerpos monoclonales que se unen a c-Met humano, el receptor del factor de crecimiento de hepatocito, y composiciones y moléculas relacionadas con base en el anticuerpo. También se describen las composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos y métodos terapéuticos y de diagnóstico para utilizar los anticuerpos.

Description

ANTICUERPOS MONOCLONALES ANTI-C-MET Campo de la Invención La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales dirigidos hacia c-Met humano, el receptor del factor de crecimiento de hepatocito, y los usos de tales anticuerpos, en particular su uso en el tratamiento de cáncer .
Antecedentes de la Invención c-Met es una proteína de tirosina cinasa del receptor que se disemina en la membrana. El precursor de cadena individual principalmente se separa post-traducción para producir la forma madura del heterodímero c-Met que consiste de una cadena extracelular (50 kDa) y una cadena ß de transmembrana más larga (145 kDa) , que están enlazadas a disulfuro (Birchmeier y otros 2003. Nat Rev Mol Cell Biol 4:915). La parte extracelular de c-Met está compuesta de tres tipos de dominio. El domino SEMA N-terminal se forma por la subunidad a entera y parte de la subunidad ß, y abarca la homología a las proteínas de semaforina. El domino SEMA es seguido por un dominio rico en cisteína y además por cuatro dominios de tipo inmunoglobulina (Ig). La parte citoplásmica contiene un dominio de cinasa de yuxtamembrana y una cola carboxi- terminal que es esencial para la señalización en corriente abajo. El único ligando de alta afinidad conocido Ref. 233886 para c-Met, el factor de crecimiento de hepatocito (HGF, por sus siglas en inglés) , principalmente se expresa a través de fibroblastos bajo condiciones normales (Li y Tseng 1995. J Cell Physiol 163:61) y por células de tumor (Ferracini y otros 1995. Oncogene 10:739) . HGF (también denominado factor de dispersión: SF) se sintetiza como un precursor que se convierte proteolíticamente en un heterodímero OÍ/ß activo. Con base en la estructura de cristal del fragmento de unión al receptor, HGF se cree que se une a c-Met como un dímero (Chirgadze y otros 1999. Nat Struct Biol 6:72). La cadena HGF-a se une con alta afinidad al domino de tipo Ig en c-Met, mientras la cadena HGF-ß se une con baja afinidad al domino SEMA c-Met (Basilico y otros 2008. J Biol Chem 283:21267). La interacción anterior es responsable de la dimerización c-Met y de la activación del receptor de tirosina cinasa después de la unión al heterodímero HGF. La autofosforilación del receptor da como resultado un único sitio de acoplamiento para el reclutamiento de efectores, de los cuales la unión de Gabl (aglutinante 1 asociado con la proteína 2 de unión al receptor del factor de crecimiento [Grb2] ) es esencial para las trayectorias de señalización en corriente abajo de c-Met principales (Comoglio y otros 2008. Nat Rev Drug Discov 7 :504) : • Trayectoria Ras-ERKl/2: proliferación. · Trayectoria Ras-Rae : invasión, motilidad, transición de epitelial a mesenquinal .
• Trayectoria PI3K-Akt: supervivencia. c-Met se expresó en la superficie de células epiteliales y endoteliales de muchos órganos durante la embriogénesis y en la edad madura, incluyendo el hígado, el páncreas, la próstata, el riñon, los músculos y la médula espinal. La activación de c-Met juega un papel esencial en el denominado programa "de crecimiento invasivo" que consiste de una serie de procesos, que incluyen proliferación, motilidad, angiogénesis y protección de apoptosis (Boccaccio y Comoglio 2006. Nat Rev Cáncer 6:637). Estos procesos regulados por c-Met ocurren bajo condiciones fisiológicas normales durante el desarrollo embrionario, la reparación de daño hepático y cardiaco, y patológicamente durante la oncogénesis (Eder y otros 2009. Clin Cáncer Res 15:2207).
La señalización inapropiada de c-Met ocurre virtualmente en todos los tipos de tumores sólidos, tales como de vejiga, pecho, cervical, colorectal, gástrico, de cabeza y cuello, de hígado, de pulmón, ovárico, pancreático, de próstata, renal y de tiroides, así como en varios sarcomas, malignidades hematopoyéticas , y melanoma (Birchmeier y otros 2003. Nat Rev Mol Cell Biol 4:915; Comoglio y otros 2008. Nat Rev Drug Discov 7:504; Peruzzi y Bottaro 2006. Clin Cáncer Res 12:3657). Los mecanismos subyacentes para la tumorigenicidad de c-Met típicamente se obtienen en tres diferentes formas: • ciclos HGF/c-Met autocrinos, • sobre-expresión de c-Met o HGF, • mutaciones de activación de cinasa en la secuencia de codificación del receptor c-Met.
Más notablemente, la activación de las mutaciones c-Met se han identificado en pacientes con cáncer renal papilar hereditario (Schmidt y otros 1997. Nat Genet 16:68). La activación constitutiva de c-Met contribuye a uno o una combinación de fenotipos cancerígenos proliferativos , invasivos, de supervivencia o angiogénicos . La silenciación génica de c-Met endógenamente expresado en células tumorales ha demostrado que da como resultado la falta de proliferación y crecimiento del tumor y la regresión de la metástasis establecida, así como la generación disminuida de nuevas metástasis (Corso y otros 2008. Oncogene 27:684).
Como c-Met contribuye a múltiples etapas del desarrollo cancerígeno, desde el inicio a través del avance a la metástasis, c-Met y su ligando HGF se han convertido en candidatos líderes para terapias cancerígenas activadas (Comoglio y otros 2008. Nat Rev Drug Discov 7:504; Knudsen y Vande Woude 2008. Curr Opin Genet Dev 18:87). Se han explorado varias estrategias para obtener este objetivo: • Receptores señuelo: subregiones de HGF o c-Met o análogos moleculares que actúan antagónicamente como competidores estequiométricos bloqueando la unión de ligando o la dimerización del receptor. Un ejemplo de tal subregión antagónica de HGF es NK4 (Kringle Pharma) .
• Inhibidores de tirosina cinasa de molécula pequeña (TKI, por sus siglas en inglés): Tres TKI específicos de c-Met en diferentes etapas de la evaluación clínica son ARQ197 (ArQule) , JNJ 38877605 (Johnson & Johnson) y PF-04217903 (Pfizer) .
• Anticuerpos monoclonales anti-HGF, tales como AMG102, rilotumumab (Amgen) , HuL2G7 (Takeda) , y AV-299 (Schering) .
• Los anticuerpos monoclonales anti-c-Met han sido descritos en WO2005016382 , O2006015371 , O2007090807 , O2007126799, W02009007427 , WO2009142738 y van der Horst y otros (van der Horst y otros 2009. Neoplasoa 11:355). MetMAb (Genentech) es un anticuerpo OA-5D5 monovalente humanizado (de un brazo) que se une al dominio extracelular de c-Met, por lo tanto evitando la unión de HGF y la posterior activación del receptor (Jin y otros 2008. Cáncer Res 68:4360) . En modelos de xenoinjerto de ratón, el tratamiento con MetMAb se encontró que inhibe el crecimiento del tumor del glioblastoma ortotópico conducido por HGF y tumores pancreáticos subcutáneos (Jin y otros 2008. Cáncer Res 68:4360; Martens y otros 2006. Clin Cáncer Res 12:6144). h224Gll (Pierre Fabre) (Corvaia y Boute 2009. Resumen 835 AACR lOOava. Annual Meeting) es un anticuerpo IgGl anti-c-Met bivalente humanizado. Los efectos antitumorales de este anticuerpo se han observado en ratones (Goetsch y otros 2009. Resumen 2792 AACR lOOava. Annual Meeting) . CE-355621 (Pfizer) es un IgG2 humano que bloquea la unión del ligando mediante la unión al domino extracelular de c-Met e inhibe el crecimiento dependiente de HGF en modelos de xenoinjerto de tumor (Tseng y otros 2008. J Nucí Med 49:129) .
En conclusión, varios productos anti-c-Met se han investigado, pero hasta ahora ningún producto anti-c-Met ha sido aprobado para uso terapéutico. Aún existe la necesidad de productos efectivos y seguros para tratar enfermedades serias relacionadas con c-Met, tales como cáncer.
Breve Descripción de la Invención Es un objeto de la presente invención proporcionar anticuerpos anti-c-Met monoclonales altamente específicos y efectivos para uso médico. Los anticuerpos de la invención exhiben la unión a c-Met característica que difiere de los anticuerpos descritos en la técnica. En modalidades preferidas, los anticuerpos de la invención tienen una alta afinidad hacia c-Met humano, son antagónicos y tienen un perfil farmacocinético favorable para utilizarse en pacientes humanos .
Breve Descripción de las Figuras Figura 1: Alineación de secuencias de la región variable de cadena pesada HuMab. Sobre las bases de esta secuencia, las secuencias de consenso pueden definirse para algunas de las secuencias CDR. Estas secuencias de consenso se dan en la Tabla 4.
Figura 2 : Alineación de secuencias de la región variable de cadena ligera HuMab. Sobre las bases de esta secuencia, las secuencias de consenso pueden definirse para algunas de las secuencias CDR. Estas secuencias de consenso se dan en la Tabla 4.
Figura 3 : Curvas de unión de las formas monovalente y bivalente de anticuerpos anti-c-Met a células A431 que expresan c-Met. Los datos mostrados son MFI de un experimento representativo. Debido a que IgGl-024 y Uni-068 no muestran una unión saturada a células A431 no fue posible calcular un valor EC50 preciso.
Figura 4: Unión de los anticuerpos a c-Met expresado en células epiteliales de mono Rhesus . Los datos mostrados son MFI de un experimento.
Figura 5: Inhibición inducida por anticuerpo anti-c-Met de la unión de HGF al dominio extracelular del receptor c-Met. El dato mostrado es un experimento representativo .
Figura 6 : Curvas de inhibición de la unión HGF de varios anticuerpos anti-c-Met para la unión a cMetSEMA_567His8 ensayado con TR-FRET. Los datos mostrados son FI media ± desviación estándar de tres experimentos diferentes .
Figura 7: Porcentaje de inhibición de células KP4 viables después del tratamiento con el anticuerpo anti-c-Met comparado con células sin tratar (0%) . Los datos mostrados son los porcentajes de inhibición de células viables de dos experimentos independientes + la desviación estándar. IgGl-1016-022 solamente fue positivo en un experimento.
Figura 8: Eficacia de los anticuerpos anti-c-Met para inhibir el crecimiento . tumoral en un modelo de xenoinjerto KP4 en ratones SCID. Los ratones se trataron con 400 pg de anticuerpo en el día 9 seguido semanalmente con una dosis de mantenimiento de 200 ]ig . Los tamaños de tumor medios por grupo de tratamiento se muestran.
Figura 9: Eficacia de los anticuerpos anti-c-Met para inhibir el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto KP4 en ratones SCID. Los ratones se trataron con 400 ig de anticuerpo en el día 9 seguido semanalmente con una dosis de mantenimiento de 200 ig . Efecto del tratamiento en la incidencia del tumor con el tiempo. Se muestra el porcentaje de ratones libres de tumor (tamaños de tumor de <500 mm3) . La formación del tumor se retrasó en ratones tratados con anticuerpos antagónicos comparados con los anticuerpos de control.
Figura 10: Eficacia de los anticuerpos anti-c-Met para inhibir el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto MK 45 en ratones SCID. Los ratones se trataron con 40 mg/kg de anticuerpo en el día 7 y 20 mg/kg del anticuerpo en los días 14, 21 y 28. Los tamaños de tumor medios hasta el 50% de los ratones alcanzaron un punto de final 700 mm3, por grupo del tratamiento como se muestra.
Figura 11: Eficacia de los anticuerpos anti-c-Met para inhibir el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto MKN45 en ratones SCID. Los ratones se trataron con 40 mg/kg de anticuerpo en el día 7 y 20 mg/kg de anticuerpo en los días 14, 21 y 28. El porcentaje de ratones con tamaños del tumor menores de 700 mm3 se muestra en una gráfica de Kaplan Meier. La formación del tumor se retrasó en los ratones tratados con los anticuerpos anti-c-Met comparados con el anticuerpo del control de isotipo.
Figura 12: Ensayo de viabilidad KP4 para determinar el efecto de una flexibilidad de un anticuerpo en actividad agonista. El formato IgA2m(l) no indujo la proliferación, en contraste con los formatos IgAl y IgGl del mismo anticuerpo. Las variantes del anticuerpo anti-c-Met 5D5 (ver US6468529 y Ejemplo 2) se utilizaron en este experimento.
Figura 13 : Análisis SDS-PAGE no reducido de los mutantes de flexibilidad de (069) . No se observaron multímeros aberrantes o productos de degradación a pesar de que el par de cadenas ligeras fue visible en una banda de 50 kD ((LC)2) en los mutantes C220S, AC220 y IgGl-de bisagra IgG3.
Figura 14 : ELISA de unión a antígeno para medir la unión de c-Met a mutantes de bisagra de anticuerpos c-Met. Todos los mutantes se unieron con una afinidad comparable a c-Met como se muestra en ELISA.
Figura 15: Fosforilación c-Met como la lectura de la actividad agonística de anticuerpos anti-c-Met. La Figura 15 muestra los resultados de Western blot de lisados A549; las membranas se tiñeron con anticuerpos anti-c-Met fosforilado, c-Met total o ß-actina.
Figura 16: Ensayo de proliferación con células NCI-H441. La masa celular se determinó después de 7 días en incubación en la presencia del anticuerpo o controles y se graficaron como porcentaje de muestras no tratadas (fijado como 100%) .
Figura 17: Ensayo de viabilidad KP4. El efecto de los anticuerpos anti-c-Met en la viabilidad global de células KP4 se ensayó. La habilidad de IgGl-1016-069 para reducir la viabilidad de KP4 se retuvo y/o mejoró mediante la introducción de mutaciones que disminuyen la flexibilidad de los anticuerpos.
Figura 18: Regulación descendente según medida como niveles C-Met totales en lisados A549 utilizando ELISA. Todas las variantes del anticuerpo (069) retuvieron la capacidad de modulación descendente.
Figura 19 : Ensayo ADCC para comparar las versiones de fucosa altas y bajas del anticuerpo IgGl-1016-069.
Figura 20: Falta de unión de los anticuerpos c-Met a células en sangre entera en el ensayo de unión FACS . Los resultados se muestran para las células B; monocitos y granulocitos .
Descripción Detallada de la Invención Definiciones El término "c-Met", cuando se utiliza en la presente, se refiere al receptor del factor de crecimiento de hepatocito (No. de acceso Genbank NM 000245) e incluye cualquier variante, isoforma y especies homologas al c-Met humano que naturalmente se expresa por las células o se expresan en células transfectadas con el gen c-Met.
El término "inmunoglobulina" se refiere a una clase de glicoproteínas estructuralmente relacionada que consisten de dos pares de cadenas de polipéptido, un par de cadenas de peso molecular bajo ligeras (L) y un par de cadenas pesadas (H) , las cuatro conectadas por enlaces de disulfuro. La estructura de las inmunoglobulinas ha estado bien caracterizada. Ver, por ejemplo Fundamental Immunology Cap. 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y. (1989)) . En resumen, cada cadena pesada típicamente está comprendida de una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente como VH o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada típicamente está comprendida de tres dominios, CH1, CH2 , y CH3. Cada cadena ligera típicamente está comprendida de una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente como VL o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera típicamente está comprendida de un dominio, CL. Las regiones VH y VL además pueden subdividirse en regiones de hipervariabilidad (o regiones hipervariables que pueden ser hipervaribles en secuencia y/o forma de los ciclos estructuralmente definidos) , también denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus sigas en inglés), intercaladas con regiones que son más conservadas, denominadas regiones de cadena principal (FR, por sus siglas en inglés) . Cada VH y VL típicamente está compuesto de tres CDR y cuatro FR, configurados del termino amino al término carboxi en el siguiente orden: FR1 , CDR1, FR2 , CDR2 , FR3 , CDR3, FR4 (ver también Chothia y Lesk J. Mol. Biol . 196 , 901-917 (1987) ) . Típicamente, la numeración de los residuos de aminoácido en esta región se lleva a cabo a través del método descrito en Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD . (1991) (frases tales como residuo de dominio variable se enumeran como en Kabat o de acuerdo con Kabat en la presente para referirse a este sistema de numeración para dominios variables de cadena pesada o dominios variables de cadena ligera) . Al utilizar este sistema de numeración, la secuencia de aminoácido lineal actual de un péptido puede contener menos o adicionales aminoácidos correspondientes al acortamiento de, o la inserción en, una FR o CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir un inserto de un solo aminoácido (residuo 52a de acuerdo con Kabat) después del residuo 52 de VH CDR2 y los residuos insertados (por ejemplo los residuos 82a, 82b, y 82c, etc., de acuerdo con Kabat) después del residuo 82 FR de cadena pesada. La numeración de Kabat de los residuos puede determinarse para un anticuerpo dado mediante la alineación de las regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat "estándar" .
El término "anticuerpo" (Ab, por sus siglas en inglés) en el contexto de la presente invención se refiere a una molécula de inmunoglobulin , un fragmento de una molécula de inmunoglobulina, o un derivado de cualquiera de éstos, que tienen la habilidad de específicamente unirse a un antígeno bajo condiciones fisiológicas típicas con una medida de periodos de tiempo significativos, tales como al menos aproximadamente 30 minutos, al menos aproximadamente 45 minutos, al menos aproximadamente una hora, al menos aproximadamente dos horas, al menos aproximadamente cuatro horas, al menos aproximadamente 8 horas, al menos aproximadamente 12 horas, aproximadamente 24 horas o más, aproximadamente 48 horas o más, aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7 o más días, etc., o cualquier otro periodo funcionalmente definido relevante (tal como el tiempo suficiente para inducir, promover, potenciar y/o modular una respuesta fisiológica asociada con la unión del anticuerpo al antígeno y/o el tiempo suficiente para que el anticuerpo reclute una actividad efectora) . Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de la molécula de inmunoglobulina contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos (Ab) pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores hospederos, incluyendo varias células del sistema inmunitario (tales como células efectoras) y los componentes del sistema complementario tales como Clq, el primer componente en la trayectoria clásica de la activación del complemento. Un anticuerpo anti-c-Met también puede ser un anticuerpo biespecífico , diacuerpo o molécula similar (ver por ejemplo PNAS USA 90 (14) , 6444-8 (1993) para una descripción de los diacuerpos) . Ciertamente, los anticuerpos biespecífieos , los diacuerpos y similares, provistos por la presente invención pueden unirse a cualquier objetivo adecuado además de una porción de c-Met. Como se indicó anteriormente, el término anticuerpo en la presente, a menos que se afirme lo contrario o se contradiga claramente por el contexto, incluye fragmentos del anticuerpo que retiene la habilidad de específicamente unirse al antígeno. Se ha demostrado que la función de unión al antígeno de un anticuerpo puede llevarse a cabo a través de fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término "anticuerpo" incluyen (i) un fragmento Fab' o Fab, un fragmento monovalente que consisten de los dominios VL, VH, CL y CH1, o un anticuerpo monovalente como se describe en WO2007059782 (Genmab) ; (ii) fragmentos F(ab')2, fragmentos bivalentes que comprenden dos fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfuro en la región de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste esencialmente de los dominios VH y CH1 ; (iv) un fragmento Fv que consiste esencialmente de los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward y otros, Nature 341 , 544-546 (1989)), que consiste esencialmente de un dominio VH y también se denomina anticuerpo de dominio (Holt y otros; Trends Biotechnol. 2003 Nov; 21(11) :484-90) ; (vi) camélido o nanocuerpos (Revets y otros; Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan; 5(1) : 111-24) y (vii) una región determinante de complementariedad aislada (CDR) . Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, se codifican por genes separados, pueden unirse, utilizando métodos recombinantes , a través de un enlazador sintético que les permite hacerse como una cadena de proteína individual en donde el par de regiones VL y VH forman moléculas monovalentes (conocidos como anticuerpos de cadena individual o Fv de cadena individual (scFv) , ver por ejemplo Bird y otros, Science 242 , 423-426 (1988) y Huston y otros, PNAS USA 85_, 5879-5883 (1988) ) . Tales anticuerpos de cadena individual están abarcados dentro del término anticuerpo a menos que se observe lo contrario o claramente se indique por el contexto. Aunque tales fragmentos generalmente se incluyen dentro del significado del anticuerpo, colectivamente y cada uno independientemente son características únicas de la presente invención, que exhiben diferentes propiedades biológicas y utilidad. Estos y otros fragmentos de anticuerpo útiles en el contexto de la presente invención se explican con mayor detalle en la presente. También se debe entender que el término anticuerpo, a menos que se especifique lo contrario, también incluye anticuerpos policlonales , anticuerpos monoclonales (mAb, por sus siglas en inglés) , polipéptidos de tipo anticuerpo, tales como anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados, y fragmentos de anticuerpo que retienen la habilidad de específicamente unirse al antígeno (fragmentos de unión a antígeno) provistos a través de cualquier técnica conocida, tal como la separación enzimática, la síntesis de péptido, y técnicas recombinantes . Un anticuerpo como se genera puede poseer cualquier isotipo.
Como se utiliza en la presente, "isotipo" se refiere a la clase de inmunoglobulina (por ejemplo IgGl , IgG2, IgG3, IgG4 , IgD, IgA, IgE, o IgM) que se codifica a través de los genes de la región constante de cadena pesada.
El término "anticuerpo monovalente" significa en el contexto de la presente invención que una molécula de anticuerpo es capaz de unirse a una sola molécula del antígeno, y de esta forma no es capaz de entrelazarse con el antígeno .
Un "anticuerpo deficiente en la función efectora" o un "anticuerpo deficiente de la función efectora" se refieren a un anticuerpo que tiene una habilidad significativamente reducida o ninguna habilidad para activar uno o más de los mecanismos efectores, tales como la activación del complemento o la unión del receptor Fe. De esta forma, los anticuerpos deficientes de la función efectora tienen una habilidad significativamente reducida o ninguna habilidad para mediar la citotoxicidad mediada por la célula dependiente del anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC, por sus siglas en inglés) . Un ejemplo de tal anticuerpo es IgG4.
Un "anticuerpo anti-c-Met" es un anticuerpo como se describe anteriormente, que se une específicamente al antígeno c-Met.
El término "anticuerpo humano", como se utiliza en la presente, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácido no codificados por las secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica del sitio in vitro o a través de la mutación somática in vivo) . Sin embargo, el término "anticuerpo humano", como se utiliza en la presente, no pretende incluir anticuerpos en donde las secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otras especies de mamífero, tales como de ratón, han sido injertadas sobre las secuencias de cadena principal humana.
Como se utiliza en la presente, un anticuerpo humano se "deriva de" una secuencia de la línea germinal particular si el anticuerpo se obtiene de un sistema utilizando secuencias de inmunoglobulina humana, por ejemplo, mediante la inmunización de un ratón transgénico que lleva genes de inmunoglobulina humanos o a través de la clasificación de una colección génica de inmunoglobulina humana, y en donde el anticuerpo humano seleccionado es al menos 90%, tal como al menos 95%, por ejemplo al menos 96%, tal como al menos 97%, por ejemplo al menos 98%, o tal como al menos 99% idéntico en la secuencia de aminoácido a la secuencia de aminoácido codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal. Típicamente, fuera de la CDR3 de cadena pesada, el anticuerpo humano derivado de una secuencia de la línea germinal humana particular desplegará no más de 20 diferencias de aminoácido, por ejemplo no más de 10 diferencias de aminoácido, por ejemplo no más de 10 diferentes aminoácidos, tal como no más de 9 , 8, 7, 6 ó 5, por ejemplo no más de 4 , 3, 2, ó 1 diferencias de aminoácido de la secuencia de aminoácido codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea terminal.
En una modalidad preferida, el anticuerpo de la invención se aisla. Un "anticuerpo aislado" como se utiliza en la presente, pretende referirse a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que específicamente se une a c-Met está sustancialmente libre de anticuerpos que específicamente se unen a antígenos diferentes de c-Met) . Un anticuerpo aislado que específicamente se une a un epítopo, isoforma o variante de c-Met humano, puede, sin embargo, tener una reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, por ejemplo, de otras especies (tales como homólogos de la especie c-Met) . Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o químico. En una modalidad de la presente invención, dos o más anticuerpos monoclonales "aislados" tienen diferentes especificidades de unión a antígeno que se combinan en una composición bien definida.
Cuando se utiliza la presente en el contexto de dos o más anticuerpos, el término "compite con" o "compite de manera cruzada con" indica que los dos o más anticuerpos compiten por la unión a c-Met, por ejemplo, compiten por la unión a c-Met en el ensayo descrito en los ejemplos de la presente. Para algunos pares de anticuerpos, la competencia del ensayo de los ejemplos es solamente observada cuando un anticuerpo se cubre sobre la placa y el otro se utiliza para competir, y no viceversa. El término "compite con" como se utiliza en la presente también pretende cubrir tales combinaciones de anticuerpos.
El término "epítopo" significa una determinante proteica capaz de la unión específica a un anticuerpo. Los epítopos usualmente consisten de agrupaciones de moléculas de superficie tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y usualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como cargas específicas características. Los epítopos conformacionales o no con ormacionales se distinguen en que la unión del primero pero no del último se pierde en la presencia de solventes de desnaturalización. El epítopo puede comprender residuos de aminoácido directamente involucrados en la unión (también denominado componente inmunodominante del epítopo) y otros residuos de aminoácido, que no están directamente involucrados en la unión, tales como residuos de aminoácido que efectivamente se bloquean por el péptido que se une al antígeno específicamente (en otras palabras el residuo de aminoácido está dentro de la marca del péptido de unión a antígeno específicamente) .
El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en la presente se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de la composición molecular individual. Una composición de anticuerpo monoclonal despliega una especificidad de unión y afinidad individual para un epítopo particular. Por consiguiente, el término "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos que despliegan una sola especificidad de unión que tiene regiones variables y constantes derivadas de las secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos monoclonales humanos pueden generarse a través de un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal no humano transgénico o transcromosómico, tal como un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgen de cadena pesada humana y un transgen de cadena ligera, fusionado a una célula inmortalizada .
Como se utiliza en la presente, el término "unión" en el contexto de la unión de un anticuerpo a un antígeno predeterminado típicamente es una unión con una afinidad correspondiente a un KD de aproximadamente 10"7 M o menor, tal como aproximadamente 10" M o menor, tal como aproximadamente 10"9 M o menor, aproximadamente 10"10 M o menor, o aproximadamente 10"11 M o aún menor cuando se determina a través de por ejemplo tecnología de resonancia de plasmón de superficie (SPR, por sus siglas en inglés) en un instrumento BIAcore 3000 utilizando el antígeno como el ligando y el anticuerpo como el analito, y la unión al antígeno predeterminado con una afinidad correspondiente a un KD que es al menos 10 veces menor, tal como al menos 100 veces menor, por ejemplo al menos 1,000 veces menor, tal como al menos 10,000 veces menor, por ejemplo al menos 100,000 veces menor que su afinidad para la unión a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína) diferente del antígeno predeterminado o un antígeno cercanamente relacionado. La cantidad con la cual la afinidad es menor depende de KD del anticuerpo, de tal forma que cuando el KD del anticuerpo es muy baja (es decir, el anticuerpos es altamente específico), entonces la cantidad con la cual la afinidad para el antígeno es menor que la afinidad para un antígeno no específico puede ser de al menos 10,000 veces.
El término "kd" (sec"1) , como se utiliza en la presente, se refiere a la constante del grado de disociación de una interacción de anticuerpo-antígeno particular. Tal valor también es referido como el valor kde3activado · El término "ka" (?G1 x sec"1) , como se utiliza en la presente, se refiere a la constante del grado de asociación de una interacción de anticuerpo-antígeno particular.
El término "KD" (M) , como se utiliza en la presente, se refiere a la constante de equilibrio de disociación de una interacción de anticuerpo-antígeno particular .
El término "KA" (M"1) , como se utiliza en la presente, se refiere a la constante de equilibrio de asociación de una interacción de anticuerpo-antígeno particular y se obtiene dividiendo el ka por el kd.
Como se utiliza en la presente, el término "inhibe el crecimiento" (por ejemplo refiriéndose a células, tales como células tumorales) , pretende incluir cualquier disminución miscible en el crecimiento celular cuando se pone en contacto con un anticuerpo anti-c-Met según comparado con el crecimiento de las mismas células no en contacto con un anticuerpo anti-c-Met, por ejemplo, la inhibición del crecimiento de un cultivo celular en al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99%, ó 100%. Tal disminución en el crecimiento celular puede ocurrir a través de una variedad de mecanismos, por ejemplo, fagocitosis de célula efectora, ADCC, CDC, y/o apoptosis.
La presente invención también proporciona anticuerpos que comprenden variantes funcionales de la región VL, la región VH, o una o más CDR de los anticuerpos de los ejemplos. Una variante funcional de una VL, VH, o CDR utilizada en el contexto de un anticuerpo anti-c-Met aún permite que el anticuerpo retenga por lo menos una porción sustancial (al menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más) de la afinidad/avidez y/o la especificidad/selectividad del anticuerpo progenitor y en algunos casos tal anticuerpo anti-c-Met puede estar asociado con una mayor afinidad, selectividad y/o especificidad que el anticuerpo progenitor.
Tales variantes funcionales típicamente retienen una significante identidad de secuencia con el anticuerpo progenitor. El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % homología = # de posiciones idénticas/total del # de posiciones x 100), tomando en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que es necesario introducirse para la alineación óptima de dos secuencias. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótido o aminoácido puede, por ejemplo, determinarse utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller, Comput . Appl . Biosci 4, 11-17 (1988) que ha sido incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de residuo de peso PAM120, una penalidad de longitud de hueco de 12 y una penalidad de hueco de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácido puede determinarse utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. _48, 444-453 (1970).
La secuencia de las variantes CDR puede diferir de la secuencia de la CDR de la secuencia del anticuerpo progenitor a través de la mayor parte de las sustituciones conservadoras; por ejemplo al menos 10, tal como al menos 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó l de las sustituciones en la variante son reemplazos del residuo de aminoácido conservadoras.
En el contexto de la presente invención, las sustituciones conservadoras pueden definirse a través de sustituciones dentro de la clase de aminoácidos reflejada en la siguiente tabla: Clases de residuos de aminoácido para sustituciones conservadoras El término "célula hospedera recombinante" (o simplemente "célula hospedera"), como se utiliza en la presente, pretende referirse a una célula en la cual un vector de expresión ha sido introducido, por ejemplo, un vector de expresión que codifica un anticuerpo de la invención. Las células hospederas recombinantes incluyen, por ejemplo, transíectomas , tales como células CHO, células HEK293, células NS/0, y células linfocíticas .
El término "animal no humano transgénico" se refiere a un animal no humano que tiene genoma que comprende uno o más transgenes de cadena pesada y/o ligera humanas o transcromosomas (ya sea integrados o no integrados en el ADN genómico natural del animal) , y que son capaces de expresar anticuerpos completamente humanos. Por ejemplo, un ratón transgénico puede tener un transgen de cadena ligera humana y cualquiera de un transgen de cadena pesada humana o un transcromosoma de cadena pesada humana, tal como el ratón produce anticuerpos anti-C-Met humano cuando se inmuniza con el antígeno c-Met y/o células que expresan c-Met. El transgen de la cadena pesada humana puede integrarse en el ADN del cromosoma del ratón, como es el caso para los ratones transgénicos , por ejemplo para ratones HuMAb, tales como ratones HCo7 o HCol2, o el transgen de la cadena pesada humana puede mantenerse extracromosómicamente , como es el caso para ratones KM transcromosómicos como se describe en O02/43478. Los ratones similares, que tienen un mayor repertorio génico Ab humano, incluyen HCo7 y HCo20 (ver, por ejemplo, WO2009097006) . Tales ratones transgénicos y transcromosómicos (colectivamente referidos en la presente como "ratones transgénicos") son capaces de producir múltiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos para un antígeno dado (tal como IgG, IgA, IgM, IgD y/o IgE) experimentando la recombinación V-D-J y el intercambio de isotipo. El animal no humano, transgénico también puede utilizarse para la producción de anticuerpos contra un antígeno específico mediante la introducción de genes que codifican tal anticuerpo específico, por ejemplo operativamente enlazando los genes a un gen que se expresa en la leche del animal .
"Tratamiento" se refiere a la administración de una cantidad efectiva de un compuesto terapéuticamente activo de la presente invención con el propósito de facilitar, mitigar, detener, o erradicar (curar) los síntomas o estados de enfermedad .
Una "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosis y durante periodos de tiempo necesarios, para obtener un resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-c-Met puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la habilidad del anticuerpos anti-c-Met para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es una en donde cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo o de la porción del anticuerpo se supera por los efectos terapéuticamente benéficos .
Un anticuerpo "antiidiotípico" es un anticuerpo que reconoce determinantes únicas generalmente asociadas con el sitio de unión antígeno de un anticuerpo Aspectos adicionales y modalidades de la invención Como se describe anteriormente, en un primer aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal que está unido a c-Met humano.
Los anticuerpos monoclonales de la presente invención pueden, por ejemplo, producirse a través del método de hibridoma primero descrito por Kohler y otros, Nature 256, 495 (1975), o pueden producirse a través de métodos de ADN recombinantes . Los anticuerpos monoclonales también pueden aislarse de colecciones de anticuerpo de fago utilizando las técnicas descritas en, por ejemplo, Clackson y otros, Nature 352, 624-628 (1991) and Marks y otros, J. Mol. Biol . 222, 581-597 (1991) . Los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse de cualquier fuente adecuada. De esta forma, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse de hibridomas preparados de células B esplénicas de murino obtenidas de ratones inmunizados con un antígeno de interés, por ejemplo en la forma de células que expresan el antígeno en la superficie, o un ácido nucleico que purifica un antígeno de interés. Los anticuerpos monoclonales también pueden obtenerse de hibridomas derivados de células que expresan el anticuerpo de mamíferos humanos o no humanos humanizados tales como ratas, perros, primates, etc.
En una modalidad, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo humano. Los anticuerpos monoclonales humanos dirigidos anti-c-Met pueden generarse utilizando ratones transgénicos o transcromosómicos que llevan partes del sistema inmunitario humano en lugar del sistema de ratón. Tales ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones referidos en la presente como ratones HuMAb y ratones KM, respectivamente, y son colectivamente referidos en la presente como "ratones transgénicos" .
El ratón HuMAb contiene un mini -sitio génico de inmunoglobulina humana que codifica secuencias de inmunoglobulina de la cadena pesada humana sin organizar (µ y ?) y ligera ?, junto con mutaciones activadas que inactivan el sitio de la cadena µ y ? endógeno (Lonberg, N. y otros, Nature 368 , 856-859 (1994)). Por consiguiente, los ratones exhiben una expresión reducida del IgM de ratón o ? y en respuesta a la inmunización, los transgenes de cadena pesada y ligera humanos son introducidos, experimentan un intercambio de clase y la mutación somática para generar anticuerpos monoclonales IgG, ? humanos de alta afinidad (Lonberg, N. y otros (1994), supra; revisado en Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49-101 (1994), Lonberg, N. y Huszar, D., Intern. Rev. Immunol . Vol . 13 65-93 (1995) y Harding, F. y Lonberg, N. Ann. N.Y. Acad. Sci 764 536-546 (1995) ) . La preparación de ratones HuMAb se describe con detalle en Taylor, L. y otros, Nucleic Acids Research 20, 6287-6295 (1992), Chen, J. y otros, International Immunology 5, 647-656 (1993), Tuaillon y otros, J. Immunol. 152, 2912-2920 (1994), Taylor, L. y otros, International Immunology 6, 579-591 (1994), Fishwild, D. y otros, Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Ver también, US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,789,650, US 5,877,397, US 5,661,016, US 5,814,318, US 5,874,299, US 5,770.,429, US 5,545,807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 y WO 01/09187.
Los ratones HCo7 tienen una alteración JKD en los genes de la cadena ligera endógena (kappa) (como se describe en Chen y otros, EMBO J. 12, 821-830 (1993)), y una alteración CMD en sus genes de la cadena pesada endógena (como se describe en el Ejemplo 1 de WO 01/14424), un transgen de cadena ligera kappa humana KCo5 (como se describe en Fishwild y otros, Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996) ) , y un transgen de la cadena pesada humana HCo7 (como se describe en US 5,770,429).
Los ratones HCol2 tienen una alteración JKD en sus genes de la cadena ligera endógena (kappa) (como se describe en Chen y otros, EMBO J. 12, 821-830 (1993)), una alteración CMD en sus genes de la cadena pesada endógena (como se describe en el Ejemplo 1 de WO 01/14424) , un transgen de la cadena ligera kappa humana KCo5 (como se describe en Fishwild y otros, Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)), y un transgen de la cadena pesada humana HCol2 (como se describe en el Ejemplo 2 de WO 01/14424) .
En la cepa de ratón KM, el gen de la cadena ligera kappa de ratón endógeno ha sido homocigotamente alterado como se describe en Chen y otros, EMBO J. 12, 811-820 (1993), y el gen de la cadena pesada de ratón endógeno ha sido homocigotamente alterado como se describe en el Ejemplo 1 de WO 01/09187. Esta cepa de ratón lleva un transgen de cadena ligera kappa humano, KCo5 , como se describe en Fishwild y otros, Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996) . Esta cepa de ratón también lleva un transcromosoma de cadena pesada humano compuesto del fragmento hCF del cromosoma 14 (SC20) como se describe en WO 02/43478.
Los esplenocitos de estos ratones transgénicos pueden utilizarse para generar hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales humanos de acuerdo con técnicas bien conocidas .
Además, los anticuerpos humanos de la presente invención o los anticuerpos de la presente invención de otras especies pueden identificarse a través de tecnología de tipo desligue, incluyendo, sin limitación, despliegue de fago, despliegue retroviral, despliegue de ribosoma, y otras técnicas, utilizando técnicas bien conocidas en la técnica y las moléculas resultantes pueden someterse a maduración adicional, tal como maduración por afinidad, como tales técnicas son bien conocidas en la técnica (ver por ejemplo Hoogenboom y otros, J. Mol. Biol . 227, 381 (1991) (despliegue de fago), Vaughan y otros, Nature Biotech 14, 309 (1996) (despliegue de fago), Hanes y Plucthau, PNAS USA 94, 4937-4942 (1997) (despliegue ribosómico) , Parmley y Smith, Gene 73, 305-318 (1988) (despliegue de fago), Scott TIBS 17, 241-245 (1992), Cwirla y otros, PNAS USA 87, 6378-6382 (1990), Russel y otros. Nucí. Acids Research 21, 1081-1085 (1993), Hogenboom y otros, Immunol . Reviews 130, 43-68 (1992) , Chiswell y McCafferty TIBTECH 10, 80-84 (1992) , y US 5,733,743) . Si se utilizan las tecnologías de despliegue para producir anticuerpos que no son humanos, tales anticuerpos pueden humanizarse.
En una modalidad, el anticuerpo de la invención es del isotipo IgGl, IgG2 , IgG3, IgG4 , IgD, IgA, IgE, o IgM.
En una primera modalidad principal del anticuerpo de la invención, el anticuerpo compite por la unión a cMetECDHis soluble con un anticuerpo inmovilizado, en donde tal anticuerpo inmovilizado comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 33 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 37 (024) , preferiblemente en donde el anticuerpo compite por más del 50%, tal como más del 75% con tal anticuerpo inmovilizado, cuando se determina como se describe en el Ejemplo 17.
En una modalidad más, el anticuerpo no compite por la unión a cMetECDHis soluble con un anticuerpo seleccionado del grupo que consisten de: a) un anticuerpo inmovilizado que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 1 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 5 (005) b) un anticuerpo inmovilizado que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 17 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 21 (008) c) un anticuerpo inmovilizado que comprende la región VH y la región VL del anticuerpo 5D5, y d) un anticuerpo inmovilizado que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 49 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 53 (045) , preferiblemente en donde el anticuerpo compite por menos del 25%, tal como al menos el 20% con tal anticuerpo inmovilizado, cuando se determina como se describe en el Ejemplo 17.
En una modalidad más, el anticuerpo se une al mismo epítopo como un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de: a) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 33 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 37 (024) b) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 65 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 69 (061) c) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 73 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 77 (062) d) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 81 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 85 (064) e) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 89 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 93 (068) f) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 97 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 101 (069) g) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 113 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 117 (098) h) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO : 121 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 125 (101), y i) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 129 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 133 (181) .
En una modalidad más, el anticuerpo comprende una región CDR3 VH que tiene la secuencia como se establece en a) SEC ID NO: 36 (024) b) SEC ID NO: 193, tal como una región CDR3 VH como se establece en SEC ID NO: 68, 76, 84 ó 92 (061, 062, 064, 068) c) SEC ID NO: 196, tal como una región CDR3 VH como se establece en SEC ID NO: 100 ó 132 (069, 181) d) SEC ID NO: 116 (098) , o e) SEC ID NO: 201, tal como una región CDR3 VH como se establece en SEC ID NO: 124 (101) .
En una modalidad más, el anticuerpo comprende: a) una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 34, 185 y 36 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 38, 39 y 206, tal como un anticuerpo que comprende una región VH que comprende las secuencias CDR1 , 2 y 3 de SEC ID NO: 34, 35 y 36 y una región VL que comprende las secuencias CDR1 , 2 y 3 de SEC ID NO: 38, 39 y 40, (024) b) una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 191, 192 y 193 y una región VL que comprende las secuencias CDR1 , 2 y 3 de SEC ID NO: 78, 79 y 208, tal como un anticuerpo que comprende a. una región VH que comprende las secuencias CDRl, 2 y 3 de SEC ID NO: 66, 67 y 68 y una región VL que comprende las secuencias CDRl, 2 y 3 de SEC ID NO: 70, 71 y 72 (061) b. una región VH que comprende las secuencias CDRl, 2 y 3 de SEC ID NO: 74, 75 y 76 y una región VL que comprende las secuencias CDRl, 2 y 3 de SEC ID NO: 78, 79 y 80, (062) c. una región VH que comprende las secuencias CDRl, 2 y 3 de SEC ID NO: 82, 83 y 84 y una región VL que comprende las secuencias CDRl, 2 y 3 de SEC ID NO: 86, 87 y 88, (064) , o d. una región VH que comprende las secuencias CDRl, 2 y 3 de SEC ID NO: 90, 91 and 92 y una región VL que comprende las secuencias CDRl, 2 y 3 de SEC ID NO: 94, 95 y 96, (068) c) una región VH que comprende las secuencias CDRl, 2 y 3 de SEC ID NO: 194, 195 y 196 y una región VL que comprende las secuencias CDRl, 2 y 3 de SEC ID NO: 209, 210 y 104, tal como un anticuerpo que comprende a. una región VH que comprende las secuencias CDRl, 2 y 3 de SEC ID NO: 98, 99 y 100 y una región VL que comprende las secuencias CDRl, 2 y 3 de SEC ID NO: 102, 103 y 104, (069), o b. una región VH que comprende las secuencias CDRl, 2 y 3 de SEC ID NO: 130, 131 y 132 y una región VL que comprende las secuencias CDRl, 2 y 3 de SEC ID NO: 134, 135 y 136, (181) d) una región VH que comprende las secuencias CDRl, 2 y 3 de SEC ID NO: 197, 198 y 116 y una región VL que comprende las secuencias CDRl, 2 y 3 de SEC ID NO: 118, 119 y 211, tal como un anticuerpo que comprende una región VH que comprende las secuencias CDRl, 2 y 3 de SEC ID NO: 114, 115 y 116 y una región VL que comprende las secuencias CDRl, 2 y 3 de SEC ID NO: 118, 119 y 120 (098) , o e) una región VH que comprende las secuencias CDRl, 2 y 3 de SEC ID NO: 199, 200 y 201 y una región VL que comprende las secuencias CDRl, 2 y 3 de SEC ID NO: 126, 212 y 128, tal como un anticuerpo que comprende una región VH que comprende las secuencias CDRl, 2 y 3 de SEC ID NO: 122, 123 y 124 y una región VL que comprende las secuencias CDRl, 2 y 3 de SEC ID NO: 126, 127 y 128 (101) .
En una modalidad más, el anticuerpo comprende: a) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 33 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 37 (024) b) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO : 61 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 69 (061) c) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 73 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 77 (062) d) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 81 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 85 (064) e) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 89 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 93 (068) f) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 97 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 101 (069) g) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 113 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 117 (098) h) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 121 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 125 (101) i) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 129 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 133 (181) j ) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 159 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 160 (078) k) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 161 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 162 ( 084 ) 1) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 163 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 164 ( 063 ) m) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 165 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 166 ( 087 ) n) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 137 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 138 ( 066 ) o) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 139 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 140 ( 065 ) p) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 141 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 142 ( 082 ) q) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 143 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 144 ( 089 ) , o r) una variante de cualquiera de tales anticuerpos, en donde tal variante preferiblemente tiene a lo sumo 1, 2 ó 3 modificaciones de aminoácido, más preferiblemente sustituciones de aminoácido, tales como sustituciones de aminoácido conservadoras en tales secuencias.
En una modalidad, el anticuerpo comprende una región VH que comprende la secuencia CDR3 de SEC ID NO: 100 y una región VL que comprende la secuencia CDR3 de SEC ID NO: 104, (069) .
En una modalidad, el anticuerpo comprende una región VH que comprende las secuencias CDR1 , 2 y 3 de SEC ID NO: 98, 99 y 100 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 102, 103 y 104, (069) .
En una modalidad, el anticuerpo comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 97 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 101 (069) .
En otra modalidad principal del anticuerpo de la invención : - el anticuerpo compite por la unión a cMetECDHis soluble con un anticuerpo inmovilizado, en donde tal anticuerpo inmovilizado comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 9 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 13 (006) , preferiblemente en donde el anticuerpo compite por más del 50%, tal como más del 75% con tal anticuerpo inmovilizado, cuando se determina como se describe en el Ejemplo 17, y el anticuerpo no compite con la unión a cMetECDHis soluble con un anticuerpo inmovilizado que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 49 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 53 (045) , preferiblemente en donde el anticuerpo compite en menos del 50%, por ejemplo menos del 25%, tal como al menos el 20% con tal anticuerpo inmovilizado, cuando se determina como se describe en el Ejemplo 17 y - el anticuerpo se une al dominio SEMA de c-Met, preferiblemente en donde el anticuerpo es capaz de inhibir la unión de HGF al dominio SEMA con un IC50 de menos de 10 µ9/p?1, tal como al menos el 2 ug/ml como se describe en el Ejemplo 9.
En una modalidad más, el anticuerpo no compite por la unión a cMetECDHis soluble con un anticuerpo inmovilizado que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 33 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 37 (024) , preferiblemente en donde el anticuerpo compite por menos del 25%, tal como al menos el 20% con tal anticuerpo inmovilizado, cuando se determina como se describe en el Ejemplo 17.
En una modalidad más, el anticuerpo se une al mismo epítopo como un anticuerpo seleccionado del grupo que consisten de: a) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 1 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO : 5 (005) b) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 9 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 13 (006) c) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 25 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 29 (022) , y d) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 57 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 61 (058) .
En una modalidad más, el anticuerpo comprende una región CDR3 VH que tiene la secuencia como se establece en a) SEC ID NO: 181, tal como una región CDR3 VH como se establece en SEC ID NO: 4 ó 12 (005, 006) b) SEC ID NO: 28 (022) , ó c) SEC ID NO: 60 (058) .
En una modalidad más, el anticuerpo comprende: a) una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 179, 180 y 181 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 6, 7 y 202, tal como un anticuerpo que comprende a. una región VH que comprende las secuencias CDRl, 2 y 3 de SEC ID NO : 2, 3 y 4 y una región VL que comprende las secuencias CDRl, 2 y 3 de SEC ID NO: 6, 7 y 8, (005), o b. una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 10, 11 y 12 y una región VL que comprende las secuencias CDR1 , 2 y 3 de SEC ID NO: 14, 15 y 16, ( 006 ) b) una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 26, 184 y 28 y una región VL que comprende las secuencias CDR1 , 2 y 3 de SEC ID NO: 30, 31 y 205, tal como un anticuerpo que comprende una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 26, 27 y 28 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 30, 31 y 32 ( 022 ) , o c) una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 189, 190 y 60 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 62, 63 y 207, tal como un anticuerpo que comprende una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 58, 59 y 60 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 62, 63 y 64 ( 058 ) En aún una modalidad más, el anticuerpo comprende: a) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 1 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 5 ( 005 ) b) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 9 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 13 ( 006 ) c) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 25 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 29 (022) d) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 57 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 61 (058) e) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 145 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 146 (031) f) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 147 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 148 (007) g) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 149 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 150 (011) h) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 151 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 152 (017) i) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 153 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 154 (025), o j ) una variante de cualquiera de tales anticuerpos, en donde tal variante preferiblemente tiene a lo sumo 1, 2 ó 3 modificaciones de aminoácido, más preferiblemente sustituciones de aminoácido, tales como sustituciones de aminoácido conservadoras en tales secuencias .
En otra modalidad principal del anticuerpo de la invención : - el anticuerpo compite por la unión a cMetECDHis soluble con un anticuerpo inmovilizado, en donde tal anticuerpo inmovilizado comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 49 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 53 (045) , preferiblemente en donde el anticuerpo compite por más del 50%, tal como más del 75% con tal anticuerpo inmovilizado, cuando se determina como se describe en el Ejemplo 17, y el anticuerpo no compite con la unión a cMetECDHis soluble con un anticuerpo inmovilizado, en donde tal anticuerpo inmovilizado comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 9 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 13 (006) , preferiblemente en donde el anticuerpo compite por menos del 25%, tal como al menos el 20% con tal anticuerpo inmovilizado, cuando se determina como se describe en el Ejemplo 17.
En una modalidad más, el anticuerpo no compite por la unión a cMetECDHis soluble con un anticuerpo seleccionado del grupo que consisten de: a) un anticuerpo inmovilizado que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 17 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 21 (008) , y b) un anticuerpo inmovilizado que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 33 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 37 (024) , preferiblemente en donde el anticuerpo compite por menos del 25%, tal como al menos el 20% con tal anticuerpo inmovilizado, cuando se determina como se describe en el Ejemplo 17.
En una modalidad más, el anticuerpo se une al mismo epítopo como un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 49 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 53 (045) .
En una modalidad más, el anticuerpo comprende una región CDR3 VH que tiene la secuencia como se establece en SEC ID NO: 188, tal como una región CDR3 VH como se establece en SEC ID NO: 52 (045) .
En una modalidad más, el anticuerpo comprende una región VH que comprende las secuencias CDRl, 2 y 3 de SEC ID NO: 186, 187 y 188 y una región VL que comprende las secuencias CDRl, 2 y 3 de SEC ID NO: 54, 55 y 56, tal como un anticuerpo que comprende una región VH que comprende las secuencias CDRl, 2 y 3 de SEC ID NO: 50, 51 y 52 y una región VL que comprende las secuencias CDRl, 2 y 3 de SEC ID NO: 54, 55 y 56 ( 045 ) .
En una modalidad más, el anticuerpo comprende: a) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO : 49 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 53 ( 045 ) b) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 155 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 156 ( 040 ) c) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 157 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 158 ( 039 ) , o d) una variante de cualquiera de tales anticuerpos, en donde tal variante preferiblemente tiene a lo sumo 1, 2 ó 3 modificaciones de aminoácido, más preferiblemente sustituciones de aminoácido, tales como sustituciones de aminoácido conservadoras en tales secuencias .
En una modalidad más, el anticuerpo se une al dominio SEMA de c-Met, preferiblemente en donde el anticuerpo es capaz de inhibir la unión de HGF al dominio SEMA con un IC50 de menos de 10 µg/ml, tal como al menos el 2 µg/ml como se describe en el Ejemplo 9.
En otra modalidad principal del anticuerpo de la invención, el anticuerpo se une al mismo epítopo como un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 17 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 21 ( 008 ) o unión al mismo epítopo como un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 41 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 45 ( 03 5 ) o unión al mismo epítopo como un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 105 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 109 ( 096 ) .
En una modalidad más, el anticuerpo comprende una región CDR3 VH que tiene la secuencia como se establece en SEC ID NO: 183, tal como una región CDR3 VH como se establece en SEC ID NO: 20, 44 ó 108 ( 008 , 03 5 , 096 ) .
En una modalidad más, el anticuerpo comprende una región VH que comprende las secuencias CDR1 , 2 y 3 de SEC ID NO: 18, 182 y 183 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 22, 203 y 204, tal como un anticuerpo que comprende a) una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO : 18, 19 y 20 y una región VL que comprende las secuencias CDR1 , 2 y 3 de SEC ID NO: 22, 23 y 24, ( 0 08 ) , o b) una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 42, 43 y 44 y una región VL que comprende las secuencias CDR1 , 2 y 3 de SEC ID NO: 46, 47 y 48, ( 035 ) , o c) una región VH que comprende las -secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 106, 107 y 108 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 110, 111 y 112 (096) .
En una modalidad más, el anticuerpo comprende: a) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 17 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 21 (008) b) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO : 41 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 45 (035) c) una región VH . que comprende la secuencia de SEC ID NO: 105 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 109 (096) o d) una variante de cualquiera de tales anticuerpos, en donde tal variante preferiblemente tiene a lo sumo 1 2 ó 3 modificaciones de aminoácido, más preferiblemente sustituciones de aminoácido, tales como sustituciones de aminoácido conservadoras en tales secuencias .
En una modalidad más, el anticuerpo se une a las células A431 con un EC50 de 10 nM o menor, tal como un EC50 de 2 nM o menor, preferiblemente como se determina de acuerdo al Ejemplo 13.
En aún una modalidad más, el anticuerpo se une a c-Met con una afinidad constante (KD) de 20 nM o menor, tal como una afinidad de 5 nM o menor, preferiblemente como se determina de acuerdo al Ejemplo 14.
En aún una modalidad más, el anticuerpo se une to Rhesus c-Met, preferiblemente en donde la señal de la unión del anticuerpo a c-Met Rhesus es al menos 5 veces que al del anticuerpo de control, como se determina de acuerdo con el Ejemplo 15.
En aún una modalidad más, el anticuerpo inhibe la unión de HGF al dominio extracelular de c-Met, preferiblemente en donde el anticuerpo inhibe la unión en más de 40%, tal como más del 50%, por ejemplo más de 60%, por ejemplo más de 70%, por ejemplo más de 80%, por ejemplo más de 90%, como se determina de acuerdo con el Ejemplo 16.
En aún una modalidad más, el anticuerpo es capaz de inhibir la viabilidad de las células KP4 , preferiblemente en donde el anticuerpo es capaz de inhibir la viabilidad de más de 10%, tal como más del 25%, por ejemplo más de 40%, preferiblemente como se describe en el Ejemplo 19.
Formatos de Anticuerpo La presente invención proporciona anticuerpos anti-c-Met antagónicos y no antagónicos. A pesar de que algunos anticuerpos actúan antagónicamente en células objetivo independientemente de si son monovalentes o bivalentes, para otros anticuerpos, el efecto funcional depende de la valencia. Como se muestra en el Ejemplo 19 en la presente, los anticuerpos 024, 062, 064, 068, 069, 098, 101, 181, por ejemplo, (que todos están en el mismo grupo de bloqueo cruzado ver Ejemplo 17) tienen propiedades antagónicas en un ensayo de viabilidad KP4 independientemente del formato. Los anticuerpos 022 y 058, por el otro lado, se comportan antagónicamente en este ensayo en un formato monovalente, pero agonísticamente (o por lo menos no antagónicamente) en un formato bivalente. De esta forma, dependiendo de las propiedades funcionales deseadas para uso particular, los anticuerpos particulares pueden seleccionarse del grupo de anticuerpos provistos en la presente invención y/o su formato puede adaptarse al cambio de la valencia.
Además, el anticuerpo de la invención el anticuerpo de la invención puede ser de cualquier isotipo. La selección del isotipo típicamente estará guiada por las funciones efectoras deseadas, tal como la inducción ADCC . Los isotipos ilustrativos son IgGl, IgG2 , IgG3 , e IgG4. Cualquiera de las regiones constantes de cadena ligera humana, kappa o lambda, pueden utilizarse. Si se desea, la clase del anticuerpo anti-c-Met de la presente invención puede cambiarse a través de métodos conocidos. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención que fue originalmente IgM puede cambiar clase a un anticuerpo igG de la presente invención. Además, las técnicas de cambio de clase pueden utilizarse para convertir una subclase IgG en otra, por ejemplo de IgGl a IgG2. De esta forma, la función efectora de los anticuerpos de la presente invención puede cambiarse a través del cambio de isotipo a, por ejemplo, un anticuerpo IgGl, IgG2 , IgG3 , IgG4 , IgD, IgA, IgE , o IgM para varios usos terapéuticos. En una modalidad un anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo IgGl, por ejemplo un IgGl, K.
La modulación descendente inducida por C-Met a través de anticuerpos antagónicos representa un mecanismo de acción de anticuerpos C-Met terapéuticos. Por consiguiente en un aspecto de la invención los anticuerpos con propiedades agonistas reducidas, pero con la habilidad retenida para inducir la modulación descendente de c-Met son deseables.
Se ha descubierto que a través de la reducción de la flexibilidad conformacional de los anticuerpos la actividad agonista residual potencial de los anticuerpos IgGl divalentes se minimizan.
Por consiguiente, en una modalidad más, el anticuerpo de la invención ha sido modificado para hacerlo menos flexible, tal como a través de mutaciones de región de bisagra .
Los cambios más grandes conformacionales son el resultado de la flexibilidad de la bisagra, que permite un amplio intervalo de ángulos Fab-Fc (Ollmann Saphire, E . , R.L.
Stanfield, M.D.M. Crispin, P.W.H.I. Parren, P.M. Rudd, R.A. Dwek, D.R. Burton e I.A. Wilson. 2002. En contraste la estructuras IgG revelan una extrema asimetría y flexibilidad. J. Mol. Biol . 319: 9-18) . Una forma de reducir la flexibilidad del brazo Fab en las inmunoglobulinas es evitar la formación de enlaces de disulfuro entre la cadena ligera y pesada por medio de modificación genética. En un anticuerpo IgGl natural la cadena ligera se conecta covalentemente con la cadena pesada a través de un enlace de disulfuro, conectando la cisteína C-terminal de la cadena ligera a la cisterna en la posición 220 (numeración EU C220) en la bisagra del Fe de la cadena pesada. Mediante cualquier mutación del aminoácido C220 a serina o cualquier otro aminoácido natural, eliminando C220, mediante la remoción de la bisagra completa, o reemplazando la bisagra IgGl con una bisagra IgG3 , se forma una molécula en la cual las cadenas ligeras se conectan a través de cisternas C-terminal, análogos a la situación encontrada en el isotipo humano IgA2m(l) . Esto da como resultado la flexibilidad reducida de los Fabs con relación al Fe y consecuentemente la capacidad de entrelazamiento reducida, como se muestra en los Ejemplos.
Otra estrategia para reducir la flexibilidad de una molécula IgGl es reemplazar la bisagra IgGl con la bisagra IgG2 , o la bisagra de tipo IgG2. (Dangl y otros EMBO J. 1988; 7:1989-94). Esta región de bisagra tiene dos propiedades diferentes de las de IgGl, que se considera que convierten a la moléculas en menos flexibles. En primer lugar, comparado con la bisagra IgGl la bisagra IgG2 es más corta en 3 aminoácidos. En segundo lugar, la bisagra IgG2 contiene una cisteína adicional, de esta forma 3 en lugar de 2 enlaces de disulfuro de inter-cadena pesada se formarán. Alternativamente, una variante de la bisagra IgGl que se asemeja a la bisagra IgG2 puede introducirse. Este mutante (??7?6-9) (WO2010063746) contiene la mutación T223C y dos eliminaciones (K222 y T225) con el fin de crear una bisagra más corta con una cisteína adicional.
En una modalidad más, el anticuerpo de la invención es del subtipo IgGl, en donde la región de bisagra ha sido modificada por: (i) la eliminación de la región de bisagra de la secuencia EPKSCDKTHTCPPCP y sustituyéndola con la región de bisagra IgG2 de la secuencia: ERKCCVECPPCP (IgGl Bisagra-IgG2) ; (ii) eliminando la posición 220 de tal forma que la región de bisagra modificada tiene la secuencia de EPKSDKTHTCPPCP (IgGl AC220) ; (iii) sustituir la cisteína en la posición 220 con cualquier otro aminoácido natural (X) de tal forma que la región de bisagra modificada tiene la secuencia de EPKSXDKTHTCPPCP (IgGl C220X); (iv) eliminar la región de bisagra de la secuencia EPKSCDKTHTCPPCP (UniCuerpo IgGl) ; (v) la eliminación de la región de bisagra de la secuencia EPKSCDKTHTCPPCP y sustituirla con la región de bisagra IgG3 de la secuencia ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRC P (IgGl Bisagra- IgG3) ; o (vi) sustituir treonina en la posición 223 con cisteína, y eliminar la lisina en la posición 222 y la treonina en la posición 225, de tal forma que la región de bisagra modificada tiene la secuencia de EPKSCDCHCPPCP (IgGl ??7?6-9) .
En una modalidad de la invención, el anticuerpo de la invención es del subtipo IgGl, en donde la región de bisagra ha sido modificada eliminando la posición 220 de tal forma que la región de bisagra modificada tiene la secuencia de EPKSDKTHTCPPCP (IgGl AC220) o mediante la sustitución de cisteína en la posición 220 con cualquier otro aminoácido natural (X) de tal forma que la región de bisagra modificada tiene la secuencia de EPKSXDKTHTCPPCP (IgGl C220X) ; En una modalidad más, el anticuerpo de la invención es del subtipo IgGl, en donde la región de bisagra ha sido modificada mediante la sustitución de cisteína en la posición 220 con serina de tal forma que la región de bisagra modificada tiene la secuencia de EPKSSDKTHTCPPCP (IgGl C220S) .
En una modalidad más, el anticuerpo de la invención es del subtipo IgG2.
En una modalidad más, el anticuerpo de la invención está glico-modif icado para reducir la fucosa y de esta forma mejorar la ADCC, por ejemplo mediante la adición de compuestos al medio de cultivo durante la producción del anticuerpo como se describe en US2009317869 o como se describe en van Berkel y otros (2010) Biotechnol . Bioeng. 105:350 o mediante el uso de células aniquiladoras FUT8, por ejemplo como se describe en Yamane-Ohnuki y otros (2004) Biotechnol. Bioeng 87:614. ADCC puede alternativamente optimizarse utilizando el método descrito por Umaña y otros (1999) Nature Biotech 17:176.
En una modalidad, el anticuerpo comprende una región VH que comprende la secuencia CDR3 de SEC ID NO: 100 y una región VL que comprende la secuencia CDR3 de SEC ID NO: 104 (069) del subtipo IgGl, en donde la región de bisagra ha sido modificada mediante la sustitución de cisteína en la posición 220 con serina de tal forma que la región de bisagra modificada tiene la secuencia de EPKSSDKTHTCPPCP (IgGl C220S) .
En una modalidad, el anticuerpo comprende una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 98, 99 y 100 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 102, 103 y 104 (069) del subtipo IgGl, en donde la región de bisagra ha sido modificada mediante la sustitución de cisteína en la posición 220 con serina de tal forma que la región de bisagra modificada tiene la secuencia de EPKSSDKTHTCPPCP (IgGl C220S) .
En una modalidad, el anticuerpo comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 97 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID 'NO: 101 (069) del subtipo IgGl, en donde la región de bisagra ha sido modificada mediante la sustitución de cisteína en la posición 220 con serina de tal forma que la región de bisagra modificada tiene la secuencia de EPKSSDKTHTCPPCP (IgGl C220S) .
Varias publicaciones han demostrado la correlación entre la núcleo-fucolización reducida y la actividad ADCC mejorada in vitro (Shields RL . 2002 JBC; 277:26733-26740, Shinkawa T. 2003 JBC; 278 (5) : 3466-3473 , Umaña P. Nat Biotechnol. 1999 Feb; 17 (2) : 176-80) .
En una modalidad más, el anticuerpo de la invención ha sido modificado para reducir la núcleo-fucolización por debajo de 10%, tal como por debajo de 5% según determinado con cromatografía de intercambio de anión de alto rendimiento acoplada con detección amperométrica pulsada (HPAEC-PAD) . Esto puede lograrse a través de métodos bien conocidos en la técnica anterior, por ejemplo el tratamiento de kifunensina o la producción de células negativas FUT8.
En una modalidad más, el anticuerpo de la invención ha sido modificado para mejorar la activación del complemento, por ejemplo como se describe en Natsume y otros (2009) Cáncer Sci . 100:2411.
En una modalidad, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo de longitud completa, preferiblemente un anticuerpo IgGl, en particular un anticuerpo IgGl, K. En otra modalidad, el anticuerpo de la invención es un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo de cadena individual.
Los fragmentos de anticuerpos pueden, por ejemplo, obtenerse a través de fragmentación utilizando técnicas convencionales, y los fragmentos clasificados por utilidad en la misma forma como se describe en la presente para anticuerpos completos. Por ejemplo, los fragmentos F(ab')2 pueden generarse mediante el tratamiento del anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab' )2 resultante puede tratarse para reducir los enlaces de disulfuro para producir fragmentos Fab 1. Los fragmentos Fab pueden obtenerse mediante el tratamiento de un anticuerpo IgG con papaína; los fragmentos Fab1 pueden obtenerse con digestión de pepsina del anticuerpo IgG. Un fragmento F(ab') también puede producirse a través de la unión de Fab1 descrito más adelante a través de un enlace tioéter o un enlace de disulfuro. Un fragmento Fab' es un fragmento de anticuerpo obtenido a través recorte de un enlace de disulfuro de la región de bisagra del F(ab')2. Un fragmento Fab 1 puede obtenerse mediante el tratamiento de un fragmento F(ab' )2 con un agente de reducción, tal como ditiotreitol . El fragmento del anticuerpo también puede generarse a través de la expresión de ácidos nucleicos que codifican tales fragmentos en células recombinantes (ver por ejemplo Evans y otros, J. Immunol . Meth. 184 , 123-38 (1995)). Por ejemplo, un gen quimérico que codifica una porción de un fragmento F(ab' >2 podría incluir secuencias de AND que codifican el dominio CH1 y la región de bisagra de la cadena H, seguido por un codón de detención de traducción para producir tal molécula del fragmento del anticuerpo truncado.
Como se explicó anteriormente, en una modalidad, el anticuerpo anti-c-Met de la invención es un anticuerpo bivalente.
En otra modalidad, el anticuerpo anti-c-Met de la invención es un anticuerpo monovalente.
En una modalidad, el anticuerpo de la invención es un fragmento Fab o un anticuerpo de un brazo, tal como se describe en US20080063641 (Genentech) u otro anticuerpo monovalente, por ejemplo tal como se describe en WO2007048037 (Amgen) .
En una modalidad preferida, un anticuerpo monovalente tiene una estructura como se describe en WO2007059782 (Genmab) (incorporada en la presente por referencia) que tiene una eliminación de la región de bisagra. Por consiguiente, en una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo monovalente, en donde tal anticuerpo anti-c-Met está construido a través de un método que comprende : i) proporcionar un constructo de ácido nucleico que codifica la cadena ligera del anticuerpo monovalente, el constructo comprende una secuencia de nucleótido que codifica la región VL de un anticuerpo anti-c-Met específico del antígeno seleccionado y una secuencia de nucleótido que codifica la región CL constante de un Ig, en donde la secuencia de nucleótido que codifica la región VL de un anticuerpo específico del antígeno seleccionado y la secuencia de nucleótido que codifica la región CL de un Ig están operablemente enlazados, y en donde, en el caso de un subtipo IgGl, la secuencia de nucleótido que codifica la región CL ha sido modificada de tal forma que la región CL no contiene ningún aminoácido capaz de formar enlaces de disulfuro o enlaces covalentes con otros péptidos que comprenden una secuencia de aminoácido idéntica de la región CL en la presencia de IgG humano policlonal o cuando se administra a un animal o un ser humano; ii) proporcionar un constructo de ácido nucleico que codifica la cadena pesada de tal anticuerpo monovalente, el constructo comprende una secuencia de nucleótido que codifica la región VH de un anticuerpo específico del antígeno seleccionado y una secuencia de nucleótido que codifica una región CH constante de un Ig humano, en donde la secuencia de nucleótido que codifica la región CH ha sido modificada de tal forma que la región correspondiente a la región de bisagra y, como se requiere por el subtipo Ig, otras regiones de la región CH, tal como la región CH3 , no comprende ningún residuo de aminoácido que participa en la formación de los enlaces de disulfuro o los enlaces de inter-cadena pesada covalentes o estables no covalentes con otros péptidos que comprenden una secuencia de aminoácido idéntica de la región CH del Ig humano en la presencia del IgG humano policlonal o cuando se administra a un animal o ser humano, en donde la secuencia de nucleótido que codifica la región VH del anticuerpo específico del antígeno seleccionado y la secuencia de nucleótido que codifica la región CH de tal Ig están operablemente enlazadas; iii) proporcionar un sistema de expresión celular para producir el anticuerpo monovalente; iv) producir el anticuerpo monovalente a través de la co-expresión de los constructos de ácido nucleico de (i) y (ii) en células del sistema de expresión celular de (iii) .
Similarmente , en una modalidad, el anticuerpo anti-c-Met es un anticuerpo monovalente, que comprende (i) una región variable de un anticuerpo de la invención como se describe en la presente o una parte de unión de antígeno de tal región, y (ii) una región CH de una inmuno-globulina o uno de sus fragmentos que comprenden las regiones CH2 y CH3 , en donde la región CH o uno de sus fragmentos ha sido modificado de tal forma que la región correspondiente a la región de bisagra y, si la inmunoglobulina no es del subtipo IgG4 , otras regiones de la región CH, tal como la región CH3 , no comprenden ningún residuo de aminoácido, que sea capaz de formar enlaces de disulfuro con una región CH idéntica u otros enlaces inter-cadena pesada covalentes o no covalentes estables con una región CH idéntica en la presencia de IgG humano policlonal .
En una modalidad más de la misma, la cadena pesada del anticuerpo anti-c-Met monovalente ha sido modificada de tal forma que la bisagra completa ha sido eliminada.
En otra modalidad más, tal anticuerpo monovalente es del subtipo IgG4 , pero la región CH3 ha sido modificada de tal forma que se han hecho una o más de las sustituciones de aminoácidos siguientes: Numeración de las Mutaciones CH3 KABAT* Indice G4* EU Mutaciones E378 E357 E357A O E357T o E357V O E357I S387 S364 S364R o S364 T389 T366 T366A o T366R o T366K o T366N L368A o L368V o L368E o L368G O L368S o L391 L368 L368T D427 D399 D399A O D399T o D399S F405A o F405L o F405T O F405D O F405R O F436 F405 F405Q O F405K o F405Y KABAT* Indice G4* EU Mutaciones Y438 Y407 Y407A o Y407E o Y407Q o Y407K o Y407F F436 y Y438 F405 y Y407 (F405T y Y407E) o (F405D y Y407E) (D399S y Y407Q) o (D399S y Y407K) o (D399S D427 y Y438 D399 y Y407 y Y407E) *KABAT indica la numeración de aminoácido de acuerdo con Kabat (Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest , 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) . El Indice EU indica la numeración de aminoácido de acuerdo con el índice EU como se describe en Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest , 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD . (1991) ) .
En otra modalidad más, la secuencia del anticuerpo monovalente ha sido modificada de tal forma que no comprende ningún sitio aceptor para la glicosilación N-enlazada.
Loa anticuerpo anti-c-Met de la invención también incluyen anticuerpos de cadena individual. Los anticuerpos de cadena individual son péptidos en donde las regiones Fv de cadena pesada y ligera se conectan. En una modalidad, la presente invención proporciona una cadena Fv individual (scFv) en donde las cadenas pesada y ligera en el Fv de un anticuerpo anti-c-Met de la presente invención están unidos con un enlazador de péptido flexible (típicamente de aproximadamente 10, 12, 15 o más residuos de aminoácido) en una sola cadena de péptido. Los métodos para producir tales anticuerpos se describen en por ejemplo US 4,946,778, Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol . 113, Rosenburg y Moore eds . Springer-Verlag, New York, pp . 269-315 (1994), Bird y otros, Science 242 , 423-426 (1988), Huston y otros, PNAS USA 85, 5879-5883 (1988) y McCafferty y otros, Nature 348, 552-554 (1990) . El anticuerpo de cadena individual puede ser monovalente, si solamente se utiliza un solo VH y VL, bivalente, si se utilizan dos VH y VL, o polivalente, si se utilizan más de dos VH y VL.
En una modalidad, el anticuerpo anti-c-Met de la invención es un anticuerpo deficiente de la función efectora. En una modalidad, el anticuerpo anti-c-Met deficiente de la función efectora es un anticuerpo IgG4 estabilizado, que ha sido modificado para evitar el intercambio del brazo Fab (van der Neut Kolfschoten y otros (2007) Science 317 ( 5844 ) : 1554 -7) . Los ejemplos de anticuerpos IgG4 estabilizados adecuados son anticuerpos, en donde la arginina en la posición 409 en una región constante de cadena pesada del IgG4 humano, que se indica en el índice EU como en Kabat y otros, se sustituyen con lisina, treonina, metionina o leucina, preferiblemente lisina (descrito en WO2006033386 (Kirina) ) y/o en donde la región de bisagra ha sido modificada para comprender una secuencia Cys-Pro-Pro-Cys .
En una modalidad más, el anticuerpo anti-c-Met IgG4 estabilizado es un anticuerpo IgG4 que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena pesada comprende una región constante IgG4 humana que tiene un residuo seleccionado del grupo que consisten de: Lys, Ala, Thr, Met y Leu en la posición correspondiente a 409 y/o un residuo seleccionado del grupo que consiste de: Ala, Val, Gly, lie y Leu en la posición correspondiente a 405, y en donde el anticuerpo opcionalmente comprende una o más sustituciones, eliminaciones y/o inserciones adicionales, pero no comprende una secuencia Cys-Pro-Pro-Cys en la región de bisagra. Preferiblemente, tal anticuerpo comprende un residuo Lys o Ala en la posición correspondiente a 409 o la región CH3 del anticuerpo ha sido reemplazada por a región CH3 del IgGl humano, del IgG2 humano o del IgG3 humano. Ver también WO2008145142 (Genmab) En aún una modalidad más, el anticuerpo anti-C-Met IgG4 estabilizado es un anticuerpo IgG4 que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena pesada comprende una región constante IgG4 humana que tiene un residuo seleccionado del grupo que consisten de: Lys, Ala, Thr, Met y Leu en la posición correspondiente a 409 y/o un residuo seleccionado del grupo que consisten de: Ala, Val, Gly, lie y Leu en la posición correspondiente a 405, y en donde el anticuerpo opcionalmente comprende una o más sustituciones, eliminaciones y/o inserciones adicionales y en donde el anticuerpo comprende una secuencia Cys-Pro-Pro-Cys en la región de bisagra. Preferiblemente, el anticuerpo comprende un residuo Lys o Al seleccionado en la posición correspondiente a 409 o la región CH3 del anticuerpo ha sido reemplazada por la región CH3 del IgGl humano, del IgG2 humano o del IgG3 humano.
En una modalidad más, el anticuerpo anti-c-Met deficiente de la función efectora es un anticuerpo no de tipo IgG4 , por ejemplo IgGl, IgG2 o IgG3 que ha sido mutado de tal forma que la habilidad para mediar las funciones efectoras, tales como ADCC, ha sido reducida o aún eliminada. Tales mutaciones han sido descritas, por ejemplo en Dall'Acqua WF y otros, J Immunol. 177 (2) : 1129-1138 (2006) y Hezareh M, J Virol.; 75 (24 ): 12161- 12168 (2001).
Conjugados En una modalidad más, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-c-Met conjugado con una fracción terapéutica, tal como citotoxina, un fármaco quimioterapéutico, un inmunosupresor, o un radioisótopo.
Tales conjugados son referidos en la presente como "inmunoconjugados" . Los inmunoconjugados que incluyen una o más citotoxinas son referidos como "inmunotoxinas" .
Una citotoxina o un agente citotóxico incluye cualquier agente que es perjudicial para (por ejemplo, aniquila) las células. Los agentes terapéuticos adecuados para formar inmunoconjugados de la presente invención incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidro-testosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaina, lidocaína, propranolol, y puromicina, antimetabolitos (tales como metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracilo, decarbazina, hidroxiurea, asparaginasa, gemcitabina, cladribina) , agentes de alquilación (tales como mecloretamina, tioepa, clorambucilo, melfalano, carmustina (BS U) , lomustina (CC U) , ciclofosfamida, busulfano, dibromomanitol , estreptozotocina, dacarbazina (DTIC) , procarbazina, mitomicina C, cisplatina y otros derivados de platino, tales como carboplatina) , antibióticos (tales como dactinomicina (anteriormente actinomicina) , bleomicina, daunorubicina (anteriormente daunomicina) , doxorubicina, idarubicina, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, plicamicina, antramicina (AMC) ) , La toxina de difteria y moléculas relacionadas (tales como la cadena A de difteria y sus fragmentos activos y moléculas híbridas) , la toxina de ricina (tal como ricina A o una toxina de cadena de ricina A desglicosilada) , la toxina del cólera, una toxina de tipo Shiga (SLT-I, SLT-II, SLT-IIV) , toxina LT, toxina C3 , toxina Shiga, toxina de tosferina, toxina de tétanos, inhibidor de proteasa Bowman-Birk de frijol de soja, exotoxina de Pseudomonas, alorina, saporina, modecina, gelanina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, proteínas fordii Aleurites, proteínas diantina, proteínas americanas de Fitolaca (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de momordica, curcina, crotina, inhibidor de saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, y toxinas de enomicina. Otras moléculas conjugadas adecuadas incluyen ribonucleasa (RNase) , DNase I, enterotoxina-A de estafilococo, proteína antivírica de hierba carmín, toxina de difteria, y endotoxina de Pseudomonas. Ver, por ejemplo, Pastan y otros, Cell 47, 641 (1986) y Goldenberg, Calif. A Cáncer Journal for Clinicians 44, 43 (1994) . Los agentes terapéuticos, que pueden administrarse en combinación con un anticuerpo anti-c-Met de la presente invención como se describe en cualquier lugar en la presente, también pueden ser candidatos para fracciones terapéuticas útiles para la conjugación a un anticuerpo de la presente invención.
En otra modalidad, un anticuerpo anti-c-Met de la invención comprende un ácido nucleico conjugado o una molécula asociada con el ácido nucleico. En una de tales facetas de la presente invención, el ácido nucleico conjugado es ribonucleasa citotóxica, un ácido nucleico antisentido, una molécula de ADN inhibidora (molécula de ARNsi) , o un ácido nucleico inmunoestimulador (por ejemplo, una molécula de ADN que contiene un motivo CpG inmunoestimulador) . En otra modalidad, un anticuerpo anti-C-Met de la invención se conjuga con un aptámero o una ribozima.
En una modalidad, los anticuerpos anti-c-Met que comprenden aminoácidos radiomarcados son provistos. Un anticuerpo anti-c-Met radiomarcado puede utilizarse tanto para propósito de diagnóstico como terapéutico (la conjugación con moléculas radiomarcadas es otra característica posible) . Los ejemplos no limitantes de etiquetas para polipéptidos incluyen 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, y 1251, 1311, y 186Re.
Los anticuerpos anti-c-Met también pueden químicamente modificarse a través de la conjugación covalente a un polímero para por ejemplo aumentar su vida media en circulación. Los polímeros ilustrativos, y los métodos para acoplarlos a los péptidos, se ilustran en, por ejemplo US 4,766,106, US 4,179,337, US 4,495,285 y US 4,609,546. Los polímeros adicionales incluyen polioles polioxietilados y polietilenglicol (PEG) (por ejemplo, un PEG con un peso molecular de entre aproximadamente 1,000 y aproximadamente 40,000, tal como entre aproximadamente 2,000 y aproximadamente 20,000).
Cualquier método conocido en la técnica para conjugar el anticuerpo anti-c-Met a la molécula (s) conjugada, tales como las descritas anteriormente, puede utilizarse, incluyendo los métodos descritos por Hunter y otros, Mature 144 , 945 (1962), David y otros, Biochemistry 13, 1014 (1974), Pain y otros, J. Immunol . Meth. 4_0, 219 (1981) y Nygren, J. Histochem. y Cytochem. 3_0' 407 (1982) . Tales anticuerpos pueden producirse a través de la conjugación química de otra fracción de lado N-terminal o el lado C-terminal del anticuerpo anti-c-Met o uno de sus fragmentos (por ejemplo, una cadena H o L del anticuerpo anti-c-Met) (ver, por ejemplo, Antibody Engineering Handbook, editada por Osamu Kanemitsu, publicada por Chijin Shokan (1994)). Tales derivados de anticuerpos conjugados también pueden generarse mediante la conjugación en residuos o azúcares internos, cuando es apropiado. Los agentes pueden acoplarse ya sea directa o indirectamente a un anticuerpo anti-c-Met de la presente invención. Un ejemplo de acoplamiento indirecto de un segundo agente es el acoplamiento a través de un residuo separador. En una modalidad, el anticuerpo anti-c-Met de la presente invención se acopla a un enlazador quelatador, por ejemplo tiuxetano, que permite que el anticuerpo se conjugue con un radioisótopo.
Anticuerpos biespecífieos En un aspecto más, la invención se refiere a una molécula biespecífica que comprende un sitio de unión al primer antígeno de un anticuerpos anti-c-Met de la invención como se describe en la presente anteriormente y un segundo sitio de unión a antígeno con una especificidad de unión diferente, tal como la especificidad, de unión para célula efectora humana, un receptor Fe humano, un receptor de célula T, un receptor de célula B o una especificidad de unión para un epítopo no de traslape de c-Met, es decir, un anticuerpo biespecífico en donde el primero y el segundo sitios de unión de antígeno no compiten por la unión a c-Met, por ejemplo cuando se ensaya como se describe en el Ejemplo 17.
Las moléculas de anticuerpo biespecíficas ilustrativas de la invención comprenden (i) dos anticuerpos uno con una especificidad a c-Met y otro con un segundo objetivo que se conjugan juntos, (ii) un solo anticuerpo que tiene una cadena o brazo específico para c-Met y una segunda cadena o brazo específico para una segunda molécula, y (iii) un anticuerpo de cadena individual que tiene una especificidad para c-Met y una segunda molécula. En una modalidad, la segunda molécula es un antígeno cancerígeno/antígeno asociado con tumor tal como un antígeno carcinoembrionario (CEA, por sus siglas en inglés) , un antígeno específico de próstata (PSA, por sus siglas en inglés) , RAGE (antígeno renal) , a-fetoproteína, CAMEL (antígeno reconocido por CTL en el melanoma) , antígenos CT (tales como MAGE-B5, -B6, -C2, -C3, y D; Mage-12; CT10; NY-ESO-1, SSX-2, GAGE , BAGE, MAGE, y SAGE) , antígenos de mucina (por ejemplo, MUC1, mucina-CA125 , etc.), antígenos gangliosida, tirosinasa, gp75, C-myc, Marti, MelanA, MUM-1( MUM-2, MUM-3, HLA-B7, Ep-CAM o una integrina asociada con cáncer, tal como la integrina ,a5ß3. En otra modalidad, la segunda molécula es un factor angiogénico u otro factor de crecimiento asociado con el cáncer, tal como un factor de crecimiento endotelial vascular, un factor de crecimiento de fibroblasto, un factor de crecimiento epidérmico, una angiogenina, o un receptor de cualquiera de estos, particularmente receptores asociados con el avance de cáncer (por ejemplo, uno de los receptores HER1-HER4) . En una modalidad, un anticuerpo biespecífico de la presente invención es un diacuerpo.
Secuencias de acido nucleico, vectores y células hospederas En un aspecto más, la invención se refiere a secuencias de ácido nucleico, tales como secuencias de ADN, que codifican cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo de la invención.
En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácido seleccionado del grupo que consisten de: SEC ID NO : 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177 y 178.
En otra modalidad particular, la secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácido VH seleccionada del grupo que consisten de: SEC ID NO: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 97, 105, 113, 121, 129, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175 y 177.
En otra modalidad particular, la secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácido VL seleccionada del grupo que consiste de: SEC ID NO: 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85, 93, 101, 109, 117, 125, 133, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176 y 178.
En un aspecto más, la invención se refiere a un vector de expresión, o a un grupo de vectores de expresión, que codifican un anticuerpo de la invención. La cadena pesada y ligera del anticuerpo puede codificarse a través del mismo vector o a través de un vector diferente.
Tales vectores de expresión pueden utilizarse para solución recombinante de anticuerpos de la invención.
En una modalidad, el vector de expresión de la invención comprende una secuencia de nucleótido que codifica una o más de las secuencias de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de: SEC ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177 y 178.
En otra modalidad particular, el vector de expresión de la invención comprende una secuencia de nucleótido que codifica una o más de las secuencias de aminoácido VH seleccionada del grupo que consisten de: SEC ID NO: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 97, 105, 113, 121, 129, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175 y 177.
En otra modalidad particular, el vector de expresión de la invención comprende una secuencia de nucleótido que codifica una o más de las secuencias de aminoácido VL seleccionadas del grupo que consisten de: SEC ID NO: 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85, 93, 101, 109, 117, 125, 133, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, .166, 168, 170, 172, 174, 176 y 178.
En una modalidad más, el vector de expresión además comprende una secuencia de nucleótido que codifica la región constante de una cadena ligera, una cadena pesada o ambas cadenas ligera y pesada de un anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo humano.
Un vector de expresión en el contexto de la presente invención puede ser cualquier vector adecuado, incluyendo vectores de ácido nucleico, cromosómicos , no cromosómicos y sintéticos (una secuencia de ácido nucleico que comprende un grupo adecuado de elementos de control de expresión) . Los ejemplos de tales vectores incluyen derivados de SV40, plásmidos bacterianos, ADN de fago, baculovirus, plásmidos de levadura, vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fago, y vectores de ácido nucleico virales (A N o ADN) . En una modalidad, el ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-c-Met está comprendido de un vector de ADN o ARN desnudo, incluyendo, por ejemplo, un elemento de expresión lineal (como se describe por ejemplo en Sykes y Johnston, Nat Biotech 17, 355-59 (1997)), un vector de ácido nucleico compactado (como se describe por ejemplo en US 6,077, 835 y/o WO 00/70087), un vector de plásmido tal como pBR322, pUC 19/18, ó pUC 118/119, un vector de ácido nucleico mínimamente dimensionado "mosquito pequeño" (como se describe en por ejemplo Schakowski y otros, Mol Ther 3_, 793-800 (2001) ) , o un constructo del vector de ácido nucleico precipitado, tal como el constructor precipitado CaP04 (como se describe en por ejemplo WO 00/46147, Benvenisty y Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986), Wigler y otros, Cell 14, 725 (1978) , y Coraro y Pearson, Somatic Cell Genetics 1_, 603 (1981)) . Tales vectores de ácido nucleico y su uso son bien conocidos en la técnica (ver por ejemplo US 5,589,466 y US 5, 973, 972) .
En una modalidad, el vector es adecuado para la expresión del anticuerpo anti-c-Met en una célula bacteriana. Los ejemplos de tales vectores incluyen vectores de expresión tales como BlueScript (Stratagene) , vectores pIN (Van Heeke & Schuster, J Biol Chem 264 , 5503-5509 (1989) , vectores pET (Novagen, Madison WI) y similares) .
Un vector de expresión también puede ser o alternativamente ser un vector adecuado para la expresión en un sistema de levadura. Cualquier vector adecuado para la expresión en un sistema de levadura puede utilizarse. Los vectores adecuados incluyen, por ejemplo, vectores que comprenden promotores constitutivos o inducibles tales como el factor alfa, alcohol oxidasa y PGH (revisado en: F. Ausubel y otros, ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987) , y Grant y otros, Methods in Enzymol 153 , 516-544 (1987)).
Un vector de expresión también puede ser o alternativamente ser un vector adecuado para la expresión en células de mamífero, por ejemplo un vector que comprende glutamina sintetasa como un marcador selecciónatele , tales como los vectores descritos en (Bebbington (1992) Biotechnology (NY) 10:169-175).
Un ácido nucleico y/o vector también puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de secreción/localización que puede activar un polipéptido, tal como una cadena de polipéptido naciente, en el espacio periplásmico o dentro del medio del cultivo celular. Tales secuencias son conocidas en la técnica e incluyen péptidos líder o de señal de secreción.
En un vector de expresión de la invención, los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo anti-c-Met pueden comprender o estar asociados con cualquier promotor, potenciador y otros elementos que facilitan la expresión adecuados. Los ejemplos de tales elementos incluyen promotores de expresión fuerte (por ejemplo el promotor/potenciador CMV IE humano así como los promotores RSV, SV40, SL3-3, MMTV, y hlV LTR) , secuencias de terminación poli (A) efectivos, un origen de replicación para el producto de plásmido en E. coli, un gen resistente a antibióticos como marcador seleccionable , y/o un sito de clonación conveniente (por ejemplo, un poli-enlazador) . Los ácidos nucleicos también pueden comprender un promotor inducible según opuesto al promotor constitutivo tal como CMV IE .
En una modalidad, el vector de expresión que codifica el anticuerpo anti-c-Met puede colocarse en y/o suministrarse a la célula hospedera o al animal hospedero a través de un vector viral.
En un aspecto más, la invención se refiere a una célula hospedera eucariota o procariota recombinante, tal como una transfectoma , que produce un anticuerpo de la invención como se define en la presente. Los ejemplos células hospederas incluyen células de levadura, bacterianas y de mamífero, tales como células CHO o HEK. Por ejemplo, en una modalidad, la presente invención provee una célula que comprende un ácido nucleico establemente integrado en el genoma celular que comprende una secuencia de codificación para la expresión de un anticuerpo anti-c-Met de la presente invención. En otra modalidad, la presente invención proporciona una célula que comprende un ácido nucleico no integrado, tal como un plásmido, cósmico, fagémido, o elementos de expresión lineal, que comprende una secuencia de codificación para la expresión de un anticuerpo anti-c-Met de la invención.
En un aspecto más, la invención se refiere a un hibridoma que produce un anticuerpo de la invención como se define en la presente. En un aspecto más, la invención se refiere a un animal no humano o planta transgénico que comprende ácidos nucleicos que codifican una cadena pesada humana y una cadena ligera humana, en donde el animal o la planta producen un anticuerpo de la invención.
En un aspecto más, la invención se refiere a un método para producir un anticuerpo anti-c-Met de la invención, el método comprende los pasos de a) cultivar un hibridoma o una célula hospedera de la invención como se describe en la presente anteriormente, y b) purificar el anticuerpo de la invención del medio celular.
Composiciones En un aspecto principal adicional, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende: - un anticuerpo anti-c-Met como se define en la presente, y - un portador farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica de la presente invención puede contener un anticuerpo de la presente invención o una combinación de diferentes anticuerpos de la presente invención.
Las composiciones farmacéuticas pueden formularse de acuerdo con técnicas convencionales tales como las descritas en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a. Edición, Gennaro, Ed. , Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. Una composición farmacéutica de la presente invención puede, por ejemplo, incluir diluyentes, rellenos, sales, reguladores de pH, detergentes (por ejemplo, un detergente no iónico, tal como Tween-20 o Tween-80) , estabilizantes (por ejemplo, azúcares o aminoácidos libres de proteína), conservantes, fijativos de tejidos, solubilizantes y/u otros materiales adecuados para la inclusión en una composición farmacéutica .
Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen cualquiera y todos los solventes adecuados, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos , agentes de isotonicidad, agentes antioxidantes y retardadores la absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles con un compuesto de la presente invención. Los ejemplos de portadoras acuosos y no acuosos adecuados que pueden utilizarse en las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen agua, salina, salina regulada en su pH con fosfato, etanol, dextrosa, polioles (tales como glicerol, propilenglicol , polietilenglicol , y similares), y sus mezclas, aceites vegetales, soluciones coloidales de carboximetil celulosa, goma de tragacanto y esteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo, y/o varios reguladores de pH. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de las soluciones inyectables estériles o dispersión. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, a través del uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, a través del mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones, y a través del uso de agentes tensioactivos .
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden comprender antioxidantes farmacéuticamente aceptables por ejemplo (1) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, lecitina, propil galato, alfa-tocoferol y similares; y (3) agentes quelatadores metálicos, tales como ácido cítrico, ácido etilenodiamina tetraacético (EDTA) , sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, y similares .
Las composiciones armacéuticas de la presente invención también pueden comprender agentes de isotonicidad, tales como azúcares, polialcoholes , tales como manitol, sorbitol, glicerol o cloruro de sodio en las composiciones.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden contener uno o más adyuvantes apropiados para la ruta de administración seleccionada tales como conservantes, agentes de humectación, agentes emulsionantes, agentes de dispersión, conservantes o reguladores de pH, que pueden mejorar la vida en almacenamiento o la efectividad de la composición farmacéutica. Los compuestos de la presente invención pueden prepararse con portadores que protegerán el compuesto contra la rápida liberación, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos , y sistemas de suministro microencapsulados . Tales portadores pueden incluir gelatina, monoestearato de glicerilo, diestearato de glicerilo, biodegradables , polímeros biocompatibles tales como vinil acetato de etileno, polianhídridos , ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico solos o con una cera, u otros materiales bien conocidos en la técnica. Los métodos para la preparación de tales formulaciones son bien conocidos por el experto en la técnica.
Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes, por ejemplo, como se enumera anteriormente, según sea requerido, seguido por microfiltración por esterilización. Generalmente las dispersiones se preparan mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y otros ingredientes requeridos, por ejemplo, de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los ejemplos de métodos de preparación son secado al vacío y secado en frío ( liofilización) que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una de sus soluciones estériles filtradas previamente.
Los niveles de dosificación actuales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas puede variar para sí obtener una cantidad del ingrediente activo que es efectiva para obtener la respuesta terapéutica deseada para un paciente particular, con posición, y modos de administración, sin ser tóxico para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente invención utilizadas, o una de sus amidas, la ruta de administración, el tiempo de administración, el grado de excreción del compuesto particular que se está utilizando, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en la combinación con composiciones particulares utilizadas, la edad, sexo, peso, afección, salud general e historial médico anterior del paciente que se está tratando, y factores similares bien conocidos en las artes médicas.
La composición farmacéutica puede administrarse a través de cualquier ruta y modo adecuado. En una modalidad, una composición farmacéutica de la presente invención se administra parenteralmente . "Administrado parenteralmente" como se utiliza en la presente significa los modos de administración diferentes de la administración enteral y tópica, usualmente por inyección, e incluyen inyección e infusión epidérmica, intravenosa, intramuscular, intraarterial , intratecal, intracapsular, intraorbital , intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal , intratendón, transtraqueal , subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal , intracraneal, intratoráxica , epidural e intraesternal .
En una modalidad la composición farmacéutica se administra por inyección o infusión intravenosa o subcutánea.
Usos En un aspecto principal adicional, la invención se refiere a un anticuerpo anti-c- et de la invención para utilizarse como un medicamento.
Los anticuerpos anti-c-Met de la invención pueden utilizarse para un número de propósitos. En particular, los anticuerpos de la invención pueden utilizarse para el tratamiento de varias formas de cáncer, incluyendo un cáncer metastático y cáncer refractario. Tal cáncer puede ser dependiente de HGF o independiente de HGF.
En una modalidad, los anticuerpos anti-c-Met de la invención se utilizan para el tratamiento de una forma de cáncer seleccionado del grupo que consiste de: cáncer de vejiga, cáncer de pecho, cáncer cervical, colangiocarcinoma, cáncer colorectal, cáncer del endometrio, cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer de cabeza y cuello, cáncer renal, cáncer hepático, cáncer de pulmón (tal como cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC, por sus siglas en inglés) ) , cáncer nasofaríngeo, cáncer ovárico, cáncer pancreático, cáncer de la vesícula biliar, cáncer de próstata y cáncer tiroides .
En otra modalidad, los anticuerpos anti-c-Met de la invención se utilizan para el tratamiento de una forma de cáncer seleccionado del grupo que consisten de: osteosarcoma, rabdomiosarcoma y sarcoma sinovial.
En otra modalidad, los anticuerpos anti-c-Met de la invención se utilizan para el tratamiento de una forma de cáncer seleccionado del grupo que consisten de: sarcoma de Kaposi, leiomiosarcoma, histiocitoma fibroso maligno y fibrosarcoma .
En otra modalidad, los anticuerpos anti-c-Met de la invención se utilizan para el tratamiento de malignidades hematopoyéticas , tales como una malignidad seleccionada del grupo que consisten de: leucemia mielagenosa aguda, leucemia de célula T en adultos, leucemia mieloide crónica, linfoma y mieloma múltiple.
En una modalidad más, los anticuerpos anti-c-Met de la invención se utilizan para el tratamiento de un neoplasma seleccionado del grupo . que consisten de: glioblastoma , astrocitoma, melanoma, mesotelioma y tumor de Wilm.
En una modalidad más, los anticuerpos anti-c-Met de la invención se utilizan para el tratamiento de tumores MiT, que incluyen sarcoma de célula transparente (CCS, por sus siglas en inglés), sarcoma de la parte suave alveolar (ASPS, por sus siglas en inglés) y carcinoma de célula renal asociado con translocación.
En otra modalidad, los anticuerpos anti-c-Met agonistas de la invención se utilizan para regulación de la producción de citosina y la inducción de la movilización de la célula progenitora endotelial, por ejemplo en pacientes con enfermedad cardiaca coronaria (Yang y otros (2009) Clin Exp Pharmacol Physiol . 36:790).
En otra modalidad, los anticuerpos anti-c-Met agonistas de la invención se utilizan para inhibir o mejorar la falla renal crónica (Mizuno y otros (2008) Front Biosci . 13 :7072) .
Similarmente, la invención se refiere a un método para inhibir el crecimiento y/o proliferación de una célula tumoral que expresa c-Met, que comprende la administración, a un individuo en la necesidad del mismo, de una cantidad efectiva de un anticuerpo de la invención.
En una modalidad, tal célula tumoral está involucrada en una forma de cáncer seleccionado del grupo que consisten de: cáncer de vejiga, cáncer de pecho, cáncer cervical, colangiocarcinoma, cáncer colorectal, cáncer del endometrio, cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer de cabeza y cuello, cáncer renal, cáncer hepático, cáncer de pulmón, cáncer nasofaríngeo, cáncer ovárico, cáncer pancreático, cáncer de la vesícula biliar, cáncer de próstata, cáncer tiroides, osteosarcoma , rabdomiosarcoma, sarcoma sinovial, sarcoma de Kaposi, leiomiosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, fibrosarcoma, leucemia mielagenosa aguda, leucemia de célula T en adultos, leucemia mieloide crónica, linfoma, mieloma múltiple, glioblastoma, astrocitoma, melanoma, mesotelioma y tumor de Wilm.
También, la invención se refiere al uso de un anticuerpo monoclonal que se une al c-Met humano para la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer, tal como una de las indicaciones cancerígenas específicas mencionada anteriormente.
En una modalidad, la selección de los pacientes ha ser tratados con un anticuerpo anti -c-Met se basa en el nivel de (sobre) expresión de c-Met y/o HGF en las células tumorales relevantes de tales pacientes.
En una modalidad más de los métodos del tratamiento de la presente invención, la eficacia del tratamiento que se está monitoreando durante la terapia, por ejemplo, en puntos predefinidos en el tiempo, mediante la determinación de los niveles de expresión c-Met en las células relevantes tumorales .
Los regímenes de dosificación en los métodos de tratamiento anteriores y los usos se ajustan para proporcionar una respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica) . Por ejemplo, un solo bolo puede administrarse, varias dosis divididas pueden administrarse con el tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según se indica por las exigencias de la situación terapéutica. Las composiciones parenterales pueden formularse en formas de dosificación unitaria para facilitar la administración y uniformar la dosis.
Las dosis eficientes y los regímenes de dosificación para los anticuerpos anti-c-Met dependen de la enfermedad o afección a ser tratada y pueden determinarse por el experto en la técnica. Un intervalo no limitante, ilustrativo para una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la presente invención es de aproximadamente 0.1-100 mg/kg, tal como aproximadamente 0.1-50 mg/kg, por ejemplo de aproximadamente 0.1-20 mg/kg, tal como aproximadamente 0.1-10 mg/kg, por ejemplo aproximadamente 0.5, aproximadamente tal como 0.3, aproximadamente 1 , aproximadamente 3 , aproximadamente 5 , o aproximadamente 8 mg/kg .
Un médico o veterinario que tienen experiencia en la técnica pueden fácilmente determinar y prescribir la cantidad efectiva de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo el médico veterinario podría empezar con dosis del anticuerpo anti-c-Met utilizado en la composición farmacéutica a niveles menores que los requeridos con el fin de obtener un efecto terapéutico deseado y gradualmente aumentar la dosis hasta que se logre el efecto deseado. En general, una dosis diaria adecuada de una composición de la presente invención será la cantidad del compuesto que es la menor dosis efectiva para producir un efecto terapéutico. La administración puede ser, por ejemplo, parenteral, tal como intravenosa, intramuscular o subcutánea. En una modalidad, los anticuerpos anti-c-Met pueden administrarse a través de infusión en una dosis semanal de aproximadamente 10 a 500 mg/m2, tal como de 200 a 400 mg/m2. Tal administración puede repetirse, por ejemplo, de 1 a 8 veces, tal como de 3 a 5 veces. La administración puede llevarse a cabo a través de infusión continua durante un periodo de 2 a 24 horas, tal como de 2 a 12 horas. En una modalidad, los anticuerpos anti-c-Met pueden suministrarse a través de una infusión continua lenta durante un largo periodo, tal como más de 24 horas, con el fin de reducir los efectos secundarios tóxicos.
En una modalidad los anticuerpos anti-c-Met pueden administrarse en una dosis semanal de 250 mg a 2000 mg, tal como por ejemplo 300 mg, 500 mg, 700 mg, 1000 mg, 1500 mg o 2000 mg, durante hasta 8 veces, tal como de 4 a 6 veces. Tal régimen puede repetirse una o más veces según sea necesario, por ejemplo después de 6 meses o 12 meses. La dosis puede determinarse o ajustarse midiendo la cantidad del compuesto de la presente invención en la sangre después de la administración a través de por ejemplo, tomando una muestra biológica y utilizando anticuerpos antiidiotípicos que activan la región de unión al antígeno de los anticuerpos anti-c-Met de la presente invención.
En una modalidad, los anticuerpos anti-c-Met pueden administrarse a través de terapia de mantenimiento, tal como, por ejemplo, una vez por semana durante un periodo de 6 meses o más .
Un anticuerpos anti-c-Met también puede administrase profilácticamente con el fin de reducir el riesgo de desarrollar cáncer, retrasar el inicio de la aparición de un evento en un avance cancerígeno, y/reducir el riesgo de la recurrencia cuando un cáncer está en remisión.
Los anticuerpos anti-c-Met también pueden administrarse en terapia de combinación, es decir, combinados con otros agentes terapéuticos relevantes para la enfermedad o afección a ser tratada. Por consiguiente, en una modalidad, el medicamento que contiene el anticuerpo es para la combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos, tales como un agente citotóxico, quimioterapéutico, o antiangiogénico .
Tal administración combinada puede ser simultánea, separada o secuencial. Para la administración simultánea los agentes pueden administrarse como una composición o composiciones separadas, según sea apropiado. La presente invención de esta forma también proporciona métodos para tratar un trastorno que involucra células que expresan c-Met como se describe anteriormente, cuyos métodos comprenden la administración de un anticuerpo anti -c-Met de la presente invención combinado con uno o más agentes terapéuticos adicionales como se describe más adelante En una modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar un trastorno que involucra células que expresan c-Met en un sujeto, cuyo método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-c-Met de la presente invención y por lo menos un agente terapéutico adicional a un sujeto en la necesidad de esto.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar o prevenir cáncer, el método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-c-Met de la presente invención y por lo menos un agente terapéutico adicional a un sujeto en la necesidad de esto.
En una modalidad, tal agente terapéutico adicional puede seleccionarse de un antimetabolito , tal como metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5 -fluorouracilo, decarbazina, hidroxiurea, asparaginasa , gemcitabina o cladribina.
En otra modalidad, tal agente terapéutico adicional puede seleccionarse de un agente alquilación, tal como mecloretamina , tioepa, clorambucilo, melfalano, carmustina (BSNU) , lomustina (CCNU) , ciclofosfamida, busulfano, dibromomanitol , estreptozotocina, dacarbazina (DTIC) , procarbazina, mitomicina C, cisplatina y otros derivados de platino, tales como carboplatina .
En otra modalidad, tal agente terapéutico adicional puede seleccionarse de un agente antimitótico, tales como taxanos, por ejemplo docetaxel, y paclitaxel, y alcaloides vinca, por ejemplo vindesina, vincristina, vinblastina, y vinorelbina .
En otra modalidad, tal agente terapéutico adicional puede seleccionarse de un inhibidor de topoisomerasa, tal como topotecano o irinotecano, o un fármaco citostático, tal como etoposida y teniposida.
En otra modalidad, tal agente terapéutico adicional puede seleccionarse de un inhibidor del factor de crecimiento, tal como un inhibidor de ErbBl (EGF ) (tal como un anticuerpos anti-EGFR, por ejemplo zalutumumab, cetuximab, panitumumab o nimotuzumab u otros inhibidores EGFR (tales como gefitinib o erlotinib) , un inhibidor de ErbB2 (Her2/neu) (tal como un anticuerpo anti-HER2, por ejemplo trastuzumab, trastuzumab-DMl o pertuzumab) o un inhibidor de ambos EGFR y HER2 , tal como lapatinib) .
En otra modalidad, tal agente terapéutico adicional puede seleccionarse de un inhibidor de tirosina cinasa, tal como imatinib (Glivec, Gleevec STI571) o lapatinib, PTK787/ZK222584.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar un trastorno que involucra células que expresan c-Met en un sujeto, cuyo método comprende una administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti -c-Met of la presente invención y por lo menos un inhibidor de la angiogénesis , neovascularización y/u otra vascularización a un sujeto en la necesidad de esto.
Los ejemplos de tales inhibidores angiogénesis son inhibidores de urocinasa, inhibidores de metaloproteasa de matriz (tales como marimastat, neovastat, BAY 12-9566, AG 3340, BMS-275291 y agentes similares), inhibidores de la migración y la proliferación de la célula endotelial (tales como TNP-470, esqualamina, 2 -metoxeestradiol , combretastatinas , endostatina, angiostatina , penicilamina, SCH66336 (Schering-Plough Corp, Madison, NJ) , R115777 (Janssen Pharmaceutica, Inc, Titusville, NJ) y agentes similares) , antagonistas de los factores de crecimiento angiogénicos (tales como ZD6474, SU6668, anticuerpos contra agentes angiogénicos y/o sus receptores (tal como VEGF (por ejemplo bevacizumab) , bFGF, y angiopoyetina-1) , talidomida, análogos de talidomida (tales como CC-5013) , Sugen 5416, SU5402, ribozima antiangiogénica (tal como angiozima) , interferón a (tal como interferón a2a) , suramina y agentes similares) , inhibidores de cinasa VEGF-R y otros inhibidores de tirosina cinasa antiangiogénicos (tales como SU011248), inhibidores de la integrina específica endotelial/señalización de supervivencia (tal como vitamina y agentes similares) , antagonistas/quelatadores de cobre (tales como tetratiomolibdato , captopril y agentes similares) , carboxiamido-triazol (CAI) , ABT-627, CM101, interleucina- 12 (IL-12) , IM862, PNU145156E así como moléculas de nucleótido que inhiben la angiogénesis (tal como VEGF-ADNc-antisentido, ADNc que codifica angiostatina, ADNc que codifica p53 y ADNc que codifica el receptor 2 de VEGF deficiente) .
Otros ejemplos de tales inhibidores de angiogénesis, neovascularización y/u otra vascularización son derivados de heparina antiangiogénicos (por ejemplo, heperinasa III), temozolomida , NK4 , factor inhibidor de la migración de macrófago, inhibidores de ciclooxigenasa-2 , inhibidores del factor 1 inducible por hipoxia, isoflavonas de soja antiangiogénica , oltipraz, fumagilina y sus análogos, análogos de somatostatina, polisulfato de pentosan, tecogalan sódico, dalteparina, tumstatina, trombospondina, NM-3, combrestatina , canstatina, avastatina, anticuerpos contra otros objetivos, tales como anti-alfa-v/beta-3 integrina y anticuerpos anti -quininostatina .
En una modalidad, un agente terapéutico para utilizarse en combinación con un anticuerpo anti-c-Met para tratar los trastornos como se describe anteriormente puede ser un inmunógeno anticancerígeno, tal como un antígeno cancerígeno/antígeno asociado con tumor (por ejemplo, molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM/TACSTDl ) , mucina 1 (MUC1) , antígeno carcinoembrionario (CEA) , glicoproteína 72 asociada con tumor (TAG-72) , gplOO, Melan-A, MART-1, KDR, RCAS1, MDA7 , vacunas virales asociadas con el cáncer (por ejemplo, vacunas del virus de papiloma humano), o proteínas de choque por calor derivadas de tumor.
En una modalidad, un agente terapéutico para utilizarse en combinación con un anticuerpo anti-c-Met para tratar los trastornos como se describe anteriormente puede ser una citosina anticancerígena, quimiocina, o sus combinaciones. Los ejemplos de citosinas y factores de crecimiento adecuados incluyen IFNy, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNa (por ejemplo, INFa2b) , IF , GM-CSF, CD40L, un ligando Flt3, un factor de célula madre, ancestima, y TNFa. Las quimiocinas adecuadas pueden incluir Glu-Leu-Arg (ELR) -quimiocinas negativas tales como IP-10, MCP-3, MIG, y SDF-?a de CXC humano y familias de quimiocina C-C. Las citosinas adecuadas incluyen derivados de citosina, variantes de citosina, fragmentos de citosina, y proteínas de fusión de citosina.
En una modalidad, un agente terapéutico para utilizarse en combinación con un anticuerpo anti-c-Met para tratar los trastornos como se describe anteriormente puede ser un regulador del control/apoptosis del ciclo celular (o "agente de regulación")- Un regulador de control/apoptosis del ciclo celular puede incluir moléculas que activan y modulan los reguladores de control/apoptosis del ciclo celular tales como (i) cdc-25 (tal como NSC 663284) , (ii) cinasas dependientes de ciclina que sobre-estimulan el ciclo celular (tal como flavopiridol (L868275, HMR1275) , 7-hidroxi-estaurosporina (UCN-01, KW-2401) , y roscovitina (R-roscovitina, CYC202)), y (iii) moduladores de telomerasa (tales como BIBR1532, SOT-095, GR 163 y las composiciones descritas en por ejemplo US 6,440,735 y US 6,713,055). Los ejemplos no limitantes de moléculas que interfieren con las trayectorias apoptóticas incluyen un ligando que induce a la apoptosis relacionada con TNF (TRAIL) /ligando de apoptosis-2 (Apo-2L) , anticuerpos que activan los receptores TRAIL, IFN, y Bcl-2 antisentido.
En una modalidad, un agente terapéutico para utilizarse en combinación con un anticuerpo anti-c-Met para tratar los trastorno como se describe anteriormente puede ser un agente regulador hormonal, tales como los agentes útiles para la terapia anti -andrógeno y antiestrogeno. Los ejemplos de tales agentes reguladores hormonal son tamoxifeno, idoxifeno, fulvestrant, droloxifeno, toremifeno, raloxifeno, dietilestilbestrol , etinil estradiol/estinilo, un anti-andrógeno (tal como flutaminda/eulexina) , una progestina (tal como hidroprogesterona caproato, medroxiprogesterona/provera , megestrol acepato/megace) , un adrenocorticoesteroide (tal como hidrocortisona, prednisona) , una hormona de liberación de la hormona lutenizante (y sus análogos y otros agonistas LHRH tales como buserelina y goserelina) , un inhibidor de aromatasa (tal como anastrazol/arimidex, aminoglutetimida/citraden, exemestano) o un inhibidor de hormona (tal como octreotida/sandostatina) .
En una modalidad, un agente terapéutico para utilizarse en combinación con un anticuerpo anti-c-Met para tratar los trastornos como se describe anteriormente puede ser un agente antianérgico, tales como los compuestos que son moléculas que bloquean la actividad de CTLA-4, por ejemplo ipilimumab .
En una modalidad, un agente terapéutico para utilizarse en combinación con un anticuerpo anti-c-Met para tratar los trastornos como se describe anteriormente puede ser un ácido nucleico anticancerígeno o una molécula de ARN inhibidora anticancerígena.
Los ejemplos de otros agentes anticancerígenos, que pueden ser relevantes como agentes terapéuticos para utilizarse en combinación con un anticuerpo anti-c-Met para tratar los trastornos como se describe anteriormente son agentes de inducción de la diferenciación, análogos de ácido retinoico (por ejemplo todos trans ácido retinoico, 13-cis ácido retinoico y agentes similares) , análogos de vitamina D (tales como seocalcitol y agentes similares) , inhibidores de ErbB3, ErbB4, IGF- IR, receptor de insulina, PDGFRa , PDGFRbeta, Flk2 , Flt4, FGFR1, FGFR2 , FGFR3 , FGFR4 , TRKA, TRKC, RON (tales como el anticuerpo anti-RON) , Sea, Tie, Tie2, Eph, Ret, Ros, Alk, LTK, PTK7 y agentes similares.
Los ejemplos de otros agentes anticancerígenos, que pueden ser relevantes como agentes terapéuticos para utilizarse en combinación con un anticuerpo anti-c-Met para tratar los trastornos como se describe anteriormente son estramustina y epirubicina.
Los ejemplos de otros agentes anticancerígenos, que pueden ser relevantes como agentes terapéuticos para utilizarse en combinación con un anticuerpo anti-c-Met para tratar los trastornos como se describe anteriormente son un inhibidor HSP90 de tipo 17-allil amino geld-anamicina, anticuerpos dirigidos contra un antígeno de tumor tales como PSA, CA125, KSA, integrinasa, por ejemplo integrina ß?, o inhibidores de VCAM.
Los ejemplos de otros agentes anticancerígenos, que pueden ser relevantes como agentes terapéuticos para utilizarse en combinación con un anticuerpo anti-c-Met para tratar los trastornos como se describe anteriormente son inhibidores de calcinerio (tales como valspodar, PSC 833 y otros inhibidores MDR-1 o p-glicoproteina) , inhibidores TOR (tal como sirolimus, everolimus y rápameina) , e inhibidores de mecanismos "centrados en linfocitos" (tales como FTY720) , y agentes con efectos en la señalización celular tales como inhibidores de la molécula de adhesión (por ejemplo anti-LFA) .
En una modalidad, el anticuerpo anti-c-Met de la invención es para utilizarse en combinación con uno o más de otros anticuerpos terapéuticos, tales como ofatumumab, zanolimumab, daratumumab, ranibizumab, Zenapax, Simulect, Remicade, Humira, Tisabri, Xolair, raptiva y/o rituximab.
Otros anticuerpos terapéuticos que pueden utilizarse en combinación con el anticuerpo de la presente invención son anticuerpos anti-c-Met que se unen a otras regiones de c-Met, tales como los anticuerpos descritos en WO2005016382 , WO2006015371 , WO2007090807 , WO2007126799 o WO2009007427 (todas incorporadas en la presente por referencia) .
En otra modalidad, dos o más diferentes anticuerpos de la invención como se describe en la presente se utilizan en combinación para el tratamiento de la enfermedad. Las combinaciones particularmente interesantes incluyen dos o más anticuerpos no de competencia. Tal terapia de combinación pueden conducir a la unión de un número aumentado de moléculas de anticuerpo por célula, que pueden dar una eficacia aumentada, por ejemplo, a través de la activación de la lisis mediada por el complemento.
Además de lo anterior, otras modalidades de terapia de combinación de la invención incluyen lo siguiente: • Para el tratamiento de cáncer de pulmón de célula no pequeña, un anticuerpo anti-c-Met en combinación con inhibidores EGFR, tal como el anticuerpo anti-EGFR, por ejemplo zalutumumab, cetuximab, panitumumab o nimotuzumab u otros inhibidores EGFR, tales como gefitinib o erlotinib) , o en combinación con un inhibidor de ErbB2 (Her2/neu) (tal como un anticuerpo anti-HER2, por ejemplo trastuzumab, trastuzumab-DMl o pertuzumab) o en combinación con un inhibidor de ambos EGFR y HER2 , tal como lapatinib, o en combinación con inhibidor HER3.
• Para el tratamiento de glioma, un anticuerpo anti-c-Met en combinación con temozolomida o un inhibidor de la angiogénesis , tal como bevacizumab .
• Para el tratamiento de cáncer colorectal un anticuerpo anti-c-Met en combinación con uno o más compuestos seleccionados de: gemcitabina, bevacizumab, FOLFOX, FOLFIRI, XELOX, IFL, oxaliplatina , irinotecan, 5-FU/LV, Capecitabina , UFT , agentes que activan el EGFR, tales como cetuximab, panitumumab, zalutumumab ; inhibidores de VEGF, o inhibidores de tirosina cinasa tales como sunitinib.
• Para el tratamiento de cáncer de próstata un anticuerpo anti-c-Met en combinación con uno o más compuestos seleccionados de: terapias hormonales/antihormonales; tales como anti -andrógenos , agonistas de la hormona de liberación de la hormona lutenizante (LHRH, por sus siglas en inglés) , y quimioterapéuticos tales como taxanos, mitoxantrona , estraraustina , 5FU, vinblastina, ixabepilona.
Radioterapia-cirugía En una modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar un trastorno que involucra células que expresan c-Met en un sujeto, cuyo método comprende la administración una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-c-Met, tal como un anticuerpo anti-c-Met de la presente invención, y radio terapia a un sujeto en la necesidad del mismo.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar o prevenir cáncer, cuyo método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-c-Met, tal como el anticuerpo anti-c- et de la presente invención, y radioterapia a un sujeto en la necesidad del mismo.
En una modalidad, la presente invención proporciona el uso de un anticuerpo anti-c-Met, tal como un anticuerpo anti-c-Met de la presente invención, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar cáncer a ser administrado en combinación con radioterapia.
La radioterapia puede comprender radiación o se puede proporcionar administración asociada de radiofarmacéuticos a un paciente. La fuente de radiación puede ser ya sea externa o interna al paciente que se está tratando (el tratamiento de radiación puede, por ejemplo, estar en la forma de terapia por radiación de rayo externo (EBRT, por sus siglas en inglés) o braquiterapia (BT) ) . Los elementos radioactivos que pueden utilizarse en la práctica de tales métodos incluyen, por ejemplo, radio, cesio-137, iridio-192, americio-241 , oro-198, cobalto-57, cobre-67, tectenio-99, yodo-123, yodo-131, e indio-111.
En una modalidad más, la presente invención proporciona un método para tratar o prevenir cáncer, cuyo método comprende la administración a un sujeto en la necesidad del mismo de una cantidad terapéuticamente efectiva de anticuerpo anti-c-Met, tal como un anticuerpo anti-c-Met de la presente invención, en combinación con cirugía.
Usos diagnósticos Los anticuerpos anti-c-Met de la invención también pueden utilizarse para propósitos de diagnóstico. De esta forma, en un aspecto más, la invención se refiere a una composición de diagnóstico que comprende un anticuerpo anti-c-Met como se define en la presente.
En una modalidad, los anticuerpos anti-c-Met de la presente invención pueden utilizarse in vivo o in vitro para diagnosticar enfermedades en donde las células activadas expresan c-Met que juega un papel activo en la patogénesis, mediante la detección de los niveles de c-Met, o niveles de células que contienen c-Met, o su superficie de membrana. Esto puede lograrse, por ejemplo, poniendo en contacto una muestra a ser ensayada, opcionalmente junto con una muestra de control, con el anticuerpo anti-c-Met bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo y c-Met .
De esta forma, en un aspecto más, la invención se refiere a un método para detectar la presencia del antígeno c-Met, o una célula que expresa c-Met, en una muestra que comprende : - poner en contacto la muestra con un anticuerpo anti-c-Met de la invención bajo condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo y c-Met; y - analizar si se ha formado un complejo.
En una modalidad, el método se lleva a cabo in vi tro.
Más específicamente, la presente invención proporciona métodos para la identificación de, y el diagnóstico de células y tejidos invasivos, y otras células activadas a través de los anticuerpos anti-c-Met de la presente invención, y para monitorear el avance de los tratamientos terapéuticos, el estado después del tratamiento, el riesgo de desarrollar cáncer, el avance del cáncer, y similar .
Las etiquetas adecuadas para el anticuerpo anti-c-Met y/o anticuerpos secundarios utilizados en tales técnicas son bien conocidas en la técnica.
En un aspecto más, la invención se refiere a un kit para detectar la presencia del antígeno c-Met, o una célula que expresa c-Met, en una muestra que comprende: - un anticuerpo anti-c-Met de la invención o una molécula biespecífica de la invención; y - instrucciones para utilizar el kit.
En una modalidad, la presente invención proporciona un kit para el diagnóstico de cáncer que comprende un envase que comprende un anticuerpo anti-c-Met, y uno o más reactivos para detectar la unión del anticuerpo anti-c-Met a c-Met. Los reactivos pueden incluir, por ejemplo, etiquetas fluorescentes, etiquetas enzimáticas, u otras etiquetas detectables. Los reactivos también pueden incluir anticuerpos secundarios y terciarios o reactivos para reacciones enzimáticas, en donde las reacciones enzimáticas producen un producto que puede visualizarse.
Anticuerpos antiidiotípicos En un aspecto más, la invención se refiere a un anticuerpo antiidiotípico que se une a un anticuerpo anti-c-Met de la invención como se describe en la presente.
Un anticuerpo antiidiotípico (Id) es un anticuerpo que reconoce las determinantes únicas generalmente asociadas con el sitio de unión al antigeno de un anticuerpo. Un anticuerpo Id puede prepararse mediante la inmunización de un animal de la misma especie y el tipo genético que la fuente de un mAb anti-c-Met con el mAb del cual está preparando un anti-Id. En animal inmunizado típicamente puede reconocer y responder a las determinantes idiotípicas del anticuerpo de inmunización mediante la producción de un anticuerpo para estas determinantes idiotípicas (el anticuerpo anti-Id) . un anticuerpo anti-Id también puede utilizarse como un "inmunógeno" para inducir una respuesta inmunitaria en aún otro animal, produciendo el denominado anticuerpo anti-Id. Un anticuerpo anti-Id puede epitópicamente ser idéntico al mAb original, que induce el anti-Id. De esta forma, mediante el uso de anticuerpos para las determinantes idiotípicas de un mAb, es posible identificar otros clones que expresan anticuerpos de especificidad idéntica La presente invención además se ilustra por los siguientes ejemplos que no deberán construirse como además limitantes.
EJEMPLOS Ejemplo 1: Expresión de constructos para c-Met Se generaron los constructos con codón optimizado para la expresión de c-Met, el dominio extracelular (ECD, por sus siglas en inglés) (aa 1-932 y una etiqueta His6 C-terminal o el dominio SEMA de c-Met (aa 1-567 y una etiqueta His 9 C-terminal His9), en células HEK o CHO. Las proteínas codificadas por estos constructos son idénticas Acceso Genbank NM 000245 para c-Met. Los constructos contuvieron sitios de restricción adecuados para la clonación y una secuencia Kozak óptima (Kozak y otros (1999) Gene 234: 187-208) . Los constructos se clonaron en el vector de expresión de mamífero pEE13.4 (Lonza Biologics) (Bebbington (1992) Biotechnology (NY) 10:169-175), obteniendo pEE13.4cMet, pEE13.4cMetECDHis y pEE13.4cMetSEMA-567His8.
Ejemplo 2: Expresión de constructos para 5D5vl, 5D5 y Gll-HZ Se generaron Los constructos con codón optimizado para la expresión de la cadena pesada (HC, por sus siglas en inglés) y la cadena ligera (LC, por sus siglas en inglés) los anticuerpos IgGl 5D5vl, 5D5 y Gll-HZ en células HEK. Las proteínas codificadas por estos constructos son idénticas a las descritas en la patente de E.U.A. 6468529 (números de secuencia 3 y 4) para las cadena pesada y cadena ligera 5D5vl, WO 2006/015371 A2 (fig. 13) para la cadena pesada y cadena ligera 5D5y WO 2009/007427 A2 (la secuencia se extrajo de múltiples figuras) para la cadena pesada y ligera 224G11. 224G11 también se denomina en la presente Gll-HZ.
Ejemplo 3: Expresión temporal en células HEK-293F Las células Freestyle™ 293-F (un subclon HEK-293 adaptado a medio Freestyle de crecimiento de suspensión y químicamente definido, (HEK-293F) ) se obtuvieron de Invitrogen y transfectaron con el ADN de plásmido apropiado, utilizando 293fectina (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La expresión de c- et se ensayó por medio de análisis FACS como se describe más adelante. En el caso de la expresión del anticuerpo, los vectores de expresión apropiados de cadena pesada y cadena ligera se coexpresaron .
Ejemplo 4: Expresión temporal en células CHO pEE13.4cMet se transfectó temporalmente en la línea celular Freestyle™ CHO-S (Invitrogen) utilizando el reactivo de transfección Freestyle MAX (Invitrogen) . La expresión de se ensayó por medio de análisis FACS como se describe más adelante.
Ejemplo 4: Clonación y expresión de anticuerpos monovalentes (moléculas UniBody®) Para la expresión de anticuerpos monovalentes en células de mamífero la región constante HC de IgG4 , sin la región de bisagra (Ch) (aminoácidos E99-P110) y conteniendo las 2 mutaciones F405T y Y407E en la región CH3 , se sintetizó como un constructo con codón optimizado en el vector de expresión de mamífero pcDNA3.3 (Invitrogen) y se denominó pUniTE . Se construyó un vector separado mediante la inserción de la región constante con codón optimizado de la región de cadena ligera kappa en pcDNA3.3 y se denominó pKappa.
Las regiones VH y VL relevantes se insertaron respectivamente en pUniTE y pKappa dando como resultado vectores para la expresión de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos específicos. La co- transíección de los vectores de cadena pesada y ligera de un anticuerpo específico en células HEK-293F (Invitrogen), dio como resultado la producción temporal de anticuerpos monovalentes con especificidades relacionadas. La purificación se realizó utilizando cromatografía de columna de afinidad de Proteína A (como se describe en el Ejemplo 11) .
Ejemplo 5: Purificación de c-Met etiquetado con His Se expresaron cMetECDHis y cMetSEMAHis en células HEK-293F. La etiqueta His en cMetECDHis y cMetSEMAHis permite la purificación con cromatografía de afinidad de metal inmovilizada. En este proceso, se cargó un quelatador sobre la resina cromatográfica con cationes Co2+ . c etECDHis y cMetSEMAHis conteniendo los sobrenadantes se incubaron con la resina en modo por lotes (es decir, solución) . La proteína marcada con His se une fuertemente a las perlas de resina, mientras otras proteínas presentes en el sobrenadante de cultivo no se unen fuertemente. Después de la incubación las perlas se recuperaron del sobrenadante y se empacaron en un a columna. La columna se lavó con el fin de remover las proteínas débilmente unidas. Las proteínas cMetECDHis y cMetSEMAHis fuertemente unidas después se eluyeron con un regulador de pH conteniendo imidazol, que compite con la unión de His a Co2+ . El eluyente se removió de la proteína por intercambio de regulador de pH en una columna desalada.
Ejemplo 6: Procedimiento de inmunización de ratones transgénicos .
Los anticuerpos 005, 006, 007, 008, 011, 012, 016, 017, 022, 024, 025, 028, 031, 035, 039, 040, 045, 093, 095, 096, 101 y 104 se derivaron de las siguientes inmunizaciones: un ratón HCo20 (1 hembra, cepa GG2713), un ratón HCol7 (hembra, cepa GG2714) y dos ratones HCol2-Balb/C (2 hembras, cepa GG2811) (Medarex, San José, CA, USA; para referencias ver párrafo en ratón HuMab anterior, WO2009097006 y US2005191293 ) se inmunizaron cada quince días alternando con 5xl06 células de tumor NCI-H441 intraperitoneal (IP) y 20 \ig de proteína cMetECDHis acoplada al hapteno de Hemocianina de Lapa Californiana (KLH, por sus siglas en inglés) subcutánea (se) .
Los anticuerpos 058, 061, 062, 063, 064, 065, 066, 068, 069, 078, 082, 084, 087, 089, 098 y 181 se derivaron de las siguientes inmunizaciones: dos ratones HCo20 (1 macho y 1 hembra, cepa GG2713) y un ratón HCol2-Balb/C (1 macho, cepa GG2811) (Medarex, San José, CA, USA; para referencias ver párrafo en ratón HuMab anterior) se inmunizaron cada 15 días alternando con 5xl06 células CHO-K1SV temporalmente transfectadas con cMetECD intraperitoneal (IP) y 20 µg de proteína cMetECDHis acoplada al hapteno Hemocianina de Lapa Californiana (KLH) subcutánea (SC) .
Se llevaron a cabo un máximo de ocho inmunizaciones por ratón, cuatro inmunizaciones IP y cuatro SC en la base de la cola. La primera inmunización con células se hizo en adyuvante de Freund completo (CFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, USA). Para todas las otras inmunizaciones, las células se inyectaron IP en PB y cMetECD acoplado a KLH se inyectó SC utilizando adyuvante de Freund incompleto (IFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) . Los ratones con al menos dos concentraciones de anticuerpo específico de c-Met de 200 (diluciones séricas de 1/200) o mayores, detectados en el ensayo FMAT de clasificación específico del antígeno como se describe en el Ejemplo 8, se fusionaron.
Ejemplo 7: Ensayo de Clasificación específico de antígeno homogéneo La presencia de los anticuerpos anti-c-Met en suero de ratones inmunizados o hibridoma HuMab (anticuerpo monoclonal humano) o sobrenadante de cultivo de transfectoma se determinó por ensayos de clasificación específicos de antígeno homogéneo (cuatro cuadrantes) utilizando la Tecnología del Ensayo de Micro-Volumen Fluorométrico (FMAT; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) . Para esto, se utilizó una combinación de 3 ensayos con base en células y un ensayo a base de perlas. En los ensayos a base de células, se determinó la unión a TH1016-cMet (células HEK-293F temporalmente expresando el dominio extracelular del receptor c-Met; producido como se describe anteriormente) y HT29 (que expresa c-Met en la superficie celular) así como células HEK293 de tipo silvestre (control negativo que no expresa c-Met) . Para el ensayo a base de perlas, se determinó la unión a SB1016-cMet (cMetECDHis obtenidas de células HEK-293F temporalmente transfectadas como se describe anteriormente, biotiniladas y acopladas a perlas cubiertas con estreptavidina) . Las muestras se agregaron a las células/perlas para permitir la unión a c-Met. Posteriormente, la unión de HuMab se detectó utilizando un conjugado fluorescente (IgG-Cyy anti-humano de cabra: Jackson ImmunoResearch) . El anticuerpo específico c-Met quimérico 5D5vl (producido en células HEK-293F) se utilizó como un control positivo, y el suero combinado de ratón HuMab se utilizaron como controles negativos. Las muestras se escanearon utilizando un Sistema de Detección Celular Applied Biosystems 8200 (8200 CDS) y los 'conteos x fluorescencia' se utilizaron como la lectura. Las muestras se declararon como positivas cuando los conteos fueron mayores de 50 y los conteos x fluorescencia fueron al menos tres ves más altos que el control negativo HuMab-KLH.
Ejemplo 8: Generación del hibridoma HuMab Se sacrificaron los ratones HuMab con suficiente desarrollo de concentración específica del antígeno (definido como anteriormente) y se recolectaron el bazo y los nodos linfoides que flanquean la aorta abdominal y la vena cava. La fusión de las células de los esplenocitos y los nodos linfoides a una línea celular de mieloma de ratón se hizo por electrofusión utilizando un Sistema de Electrofusión CEEF 50 (Cyto Pulse Sciences, Glen Burnie, MD, USA), esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las placas de fusión se clasificaron con el ensayo de unión específico de antígeno como se describe anteriormente y los positivos de este ensayo se ensayaron en un ensayo ERK- fosforilación Alphascreen"5 SureFire* y el ensayo de Octeto de calificación de afinidad como se describe más adelante. Los anticuerpos 031, 035, 087 y 089 se expandieron y cultivaron con base en protocolos estándar (por ejemplo, como se describe en Coligan J.E., Bierer, B.E., Margulies, D.H., Shevach, E.M. y Strober, W. , eds . Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc . , 2006) .
En paralelo los anticuerpos 005, 006, 007, 008, 011, 012, 016, 017, 022, 024, 025, 028, 035, 039, 040, 045, 058, 061, 062, 063, 064, 065, 066, 068, 069, 078, 082, 084, 093, 095, 096, 098, 101, 104 y 181 se clonaron utilizando el sistema ClonePix (Genetix, Hampshire, UK) . Los hibridomas de cavidad primarios específicos se sembraron en medio semisólido hecho de 40% de CloneMedia (Genetix, Hampshire, UK) y 60% de HyQ 2x de medio completo (Hyclone, Waltham, USA) y aproximadamente 100 sub-clones de cada cavidad primaria se seleccionaron. Los sub-clones se re-ensayaron en el ensayo de unión específico de antígeno como se describe previamente y se midieron los niveles IgG utilizando Octeto con el fin de seleccionar el clon más específico y productos por cavidad primaria para expansión adicional. Además la expansión y el cultivo de los hibridomas HuMab resultantes se hicieron con base de acuerdo con protocolos estándar (por ejemplo, como se describe en Coligan J.E., Bierer, B.E., Margulies, D.H., Shevach, E.M. y Strober, . , eds. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., 2006) .
Ejemplo 9: Espectrometría de Masas de anticuerpos purificados Se purificaron pequeñas alícuotas de 0.8 mi del anticuerpo que contiene el sobrenadante del hibridoma de 6 cavidades o en la etapa Hyperflask utilizando columna PhyTip conteniendo resina de Proteína G (PhyNexus Inc., San José, USA) en una estación de trabajo Sciclone ALH 3000 (Caliper Lifesciences , Hopkinton, USA) . Las columnas PhyTip se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante, pero los reguladores de pH se reemplazaron por: PBS de Regulador de pH de unión (B. Braun, Medical B.V., Oss, Países Bajos) y 0.1M de Glicina-HCl de Regulador de pH de elución, pH 2.7 (Fluka Riedel-de Haén, Buchs, Alemania) . Después de la purificación, la muestras se neutralizaron con 2M de Tris-HCl pH 9.0 (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Países Bajos) . Alternativamente, en algunos casos se purificaron mayores volúmenes de sobrenadante de cultivo utilizando cromatografía de columna de afinidad de Proteína A.
Después de la purificación, las muestras se colocaron en una placa de 384 cavidades (Waters, placas de cavidades cuadradas de 100 ul, parte # 186002631) . Las muestras se desglicosilaron durante la noche a 37 °C con N-glicosidasa F. Se agregó DTT (15 mg/ml) (1 µ? / cavidad) y se incubó durante 1 h a 37°C. Las muestras (5 o 6 ul) se desalaron en un Acquity UPLC™ (Waters, Milford, USA) con una columna BEH300 C18, 1.7µp?, 2. lx 50 mm a 60°C. Se utilizó agua MQ y acetonitrilo de grado LC-MS (Biosolve, no. cat 01204101, Valkenswaard, Países Bajos) con ambos de 0.1% ácido fórmico (Fluka, no. de cat . 56302, Buchs , Alemania), como Eluyentes A y B, respectivamente. El espectro de masas de ionización por electro-aspersión del tiempo de vuelo se registró en línea en un espectrómetro de masas micrOTOF™ (Bruker, Bremen, Alemania) operando en modo de ión positivo. Antes del análisis, se calibró una escala de 900-3000 m/z con mezcla de sintonización ES (Agilent Technologies, Santa Clara, USA). El espectro de masas se desplegó con el software DataAnalysis™ v. 3.4 (Bruker) utilizando el algoritmo de Entropía Máximo buscando pesos moleculares entre 5 y 80 kDa.
Después del despliegue las masas de las cadenas pesada y ligera para todas las muestras se compararon con el fin de encontraron anticuerpos duplicados. En la comparación de las cadenas pesadas, la posible presencia de variantes de lisina C-terminal se tomó en cuenta. Esto dio como resultado una lista de anticuerpos únicos, en donde único se define como una combinación única de cadenas pesada y ligera. En el caso de encontrar anticuerpos duplicados, los resultados de otras pruebas se utilizaron para decidir que anticuerpo fue el mejor material con el cual continuar los experimentos.
Ejemplo 10: Análisis de secuencia de los dominios variables del anticuerpo anti-c-Met y la clonación en vectores de expresión El ARN total de HuMabs anti-c-Met se preparó de 5xl06 células de hibridoma y ADN Complementario de 5' -RACE (ADNc) de 100 ng de ARN total, utilizando el kit de Amplificación de ADNc SMART RACE (Clontech) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las regiones de codificación VH (región variable de cadena pesada) y VL (región variable de cadena ligera) se amplificaron por PCR y se clonaron en marco en los vectores de región constante pGlf (Conteniendo la región constante, con codón optimizado, completamente sintética de la cadena pesada de IgGl humano (alotipo f) en el vector de expresión de mamífero pEE6.4 (Lonza Biologics, Slough, UK (Bebbington y otros (1992) Biotechnology 10:169-175)) y pKappa (Conteniendo la región constante, con codón optimizado, completamente sintética de la cadena ligera kappa humana (alotipo Km3 ) en el vector de expresión de mamífero pEE12.4 (Lonza Biologics, Slough, UK (Bebbington y otros (1992) Biotechnology 10:169-175)) utilizando una estrategia de clonación independiente de la ligación (Aslanidis y otros 1990 Nucleic Acids Res. 18:6069-6074) . Para cada HuMab, se secuenciaron 12 clones VL y 8 clones VH y se calcularon sus masas teóricas y se compararon con los datos de la espectrometría de masas del anticuerpo disponibles. Las secuencias se dan en el Listado de Secuencias y en la Tabla 1 siguiente. Las secuencias CDR se definieron de acuerdo con Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a. Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD . (1991) .
La Tabla 2 y la Tabla 3 dan una visión general de 'la información de secuencia del anticuerpo y las secuencias de la línea germinal más homologas.
Tabla 1: Región variable de cadena pesada (VH) , región variable de cadena ligera (VL) y secuencias CDR de HuMabs SEC ID No : 144 VL 089 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISNWL AWFQHKPGKAPKLLIYAASSLLSGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPITFG QGTRLEIK SEC ID No: 145 VH 031 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYG FG VRQAPGQGLE MGRISPILGITNYAQMFQG RVTI ADKSTSTAYMELSSLRSEDT VYYCARD VGYDWPDTFDIWGQGTMVIVSS SEC ID No: 146 VL 031 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISS L AWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGGG SGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSFPPTFG QGTKVEIK SEC ID No: 147 VH 007 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYG IGWVRQAPGQGLEWMGRIFPILGTANYAQMFQG RVTITADKSTSTAYIELTSLRSEDTAVYYCARD VGYDSADAFDI GQGTMVTVSS SEC ID No: 148 VL 007 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWL A YQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPPTFG QGTKVEIK SEC ID No: 149 VH 011 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYG IGWVRQAPGQGLEWMGRVFPILGTANYAQMFQG RVTITADKSTSTAYMELTSLRSEDTAVYYCARD VGYDSADAFDI GQGTMVTVSS SEC ID No: 150 VL 011 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWL AWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPPTFG QGTKVEIK SEC ID No: 151 VH 017 QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYA MHWVRQAPGKGLEWVAFISYDGSNKYFADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARE LLWFGELWGYFDL GRGTLVTVSS SEC ID No: 152 VL 017 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWL AWYQHKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSG SGTDFTL ISSLQPEDFA YYCQEA SFTWTFG QGTKVEIK SEC ID No: 153 VH 025 QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYA MHWVRQAPGKGLEWVAFISYDGSSKDYADSVKG RFTIFRDNSKNTLYLQMSSLRAADTAVYYCARE LL FGELWGYFDLWGRGTLVTVSS SEC ID No: 154 VL 025 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISS L AWYQHKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTNSFTWTFG QGTKVEIK SEC ID No: 155 VH 040 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYA MTWVRQAPGKGLEWVSVISGSGGITYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARD RGWGSDYWGQGTLVTVSS SEC ID No: 156 VL 040 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYL AWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSG SGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPFTFG PGTKVDIK SEC ID No: 157 VH 039 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYA MSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGITYYADSEKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKD RGWGSDCWGQGTLVTVSS SEC ID No: 158 VL 039 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYL AWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSG SGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPFTFG PGTKVDIK SEC ID No : 159 VH 078 QLQLQESGSGLVKPSQTLSLTCAVSGGSISSGG HSWSWIRQPPGKGLEWIGCLYHSGNTYYNPSLK SRVTISVDRSK QFSLKLSSVTAADTAVYYCAR SSYDILTDWGQGILVTVSS SEC ID No : 160 VL 078 DIQ TQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWL A YQHKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPITFG QGTRLEIK SEC ID No: 161 VH 084 QLQLQESGSGLV PSQTLSLTCGVSGGSISSGG HS SWIRQPPGKGLEWIGCLYHSGNTYYNPSLK SRVTISVDRS NQFSLKLSS TAADTAVYYCAR SSYDILTDWGQGTLV VSS SEC ID No: 162 VL 084 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWL AWYQHKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPITFG QGTRLEIK SEC ID No: 163 VH 063 QLQLQESGSGLVKPSQTLSLTCAVSGGSISSGG HSWSWIRQPPGKGLEWIGCIYHSGNTYDNPSLK SRVTIAVDRSKNQLSLKLSFV AADTAVYYCAR SSYDILTDWGQGTLVTVSS SEC ID No: 164 VL 063 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWL A YQHKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANGFPITFG QGTRLEIK SEC ID No: 165 VH 087 QLQLQESGSGLVKPSQTLSLTCAVSGGSISSGG HSWSWIRQPPGKGLE IGCIYHSGNTYDNPSLK SRVTISVDRSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR SSYDILTDWGQGTLVTVSS SEC ID No: 166 VL 087 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWL AWYQHKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANGFPITFG QGTRLEIK SEC ID No : 167 VH 016 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYIFTSYW IGWVRQMPGKGLEW GIIYPGDSDTRYSPSFQG QVTISADKSISTAYLQWSSLKASD AMYYCARQ EVTGDFDYWGQGTLVTVSS SEC ID No: 168 VL 016 AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSAL AWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFG GGTKVEIK SEC ID No: 169 VH 028 EVQLVQSGGEVK PGESLKISCKGSGYSFTSYW IGWVRQMPGKGLEW GIIYPGDSDTRYSPSFQG QVTISADKSISTAYLQ SSLKASDTAMYYCARQ EVTGDFDYWGQGTLVTVSS SEC ID No: 170 VL 028 AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSAL AWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFG GGTKVEIK SEC ID No: 171 VH 012 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYW IG VRQMPGKGLEW GIIYPGDSDTRYSPSFQG QVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTA YYCARQ EITGEFDYWGQGTLVTVSS SEC ID No : 172 VL 012 AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSAL A YQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPRTFG QGTKVEIK SEC ID No: 173 VH 095 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYW IGWVRQMPGKGLEW GIIYPGDSNTRYSPSFQG QVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARQ EITGDFDYWGQGTLVTVSS SEC ID No: 174 VL 095 AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSAL AWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFG GGTKVEIK SEC ID No : 175 VH 093 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYW IGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQG QVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARQ EITGDFDYWGQGTLVTVSS Tabla 2 : Homologías de secuencias de cadena origen y pesada de ratón Tabla 3: Homologías de secuencias de cadena gen y ligera de ratón Las Figuras 1 y 2 dan una alineación de las secuencias HuMabs . Sobre las bases de estas secuencias, se puede definir la secuencia de consenso para algunas secuencias CDR. Etas secuencias de consenso se dan en la Tabla 4.
Tabla 4 : Secuencias de consenso Ejemplo 11: Purificación de anticuerpos El sobrenadante de cultivo se filtró sobre un filtro sin salida de 0.2 µt? y se cargó en columnas de 5 mi MabSelect SuRe (GE Health Care) y eluyó con 0.1 M de citrato de sodio -NaOH, pH 3. El eluato se neutralizó inmediatamente con 2M Tris-HCl, pH 9 y dializó durante la noche con 12.6 mM de NaH2P0 , 140 mM de NaCl, pH 7.4 (B.Braun). Alternativamente, después de la purificación el eluato se cargó en una columna de Desalación HiPrep y el anticuerpo se cambió a regulador de pH con 12.6 mM de NaH2P04, 140 mM de NaCl, pH 7.4 (B.Braun). Después de la diálisis las muestras con cambio de regulador de pH se filtraron estérilmente sobre filtros sin salida de 0.2 µp?. La pureza se determinó por SDS-PAGE y la concentración se midió por nefelometría y la absorbencia a 280nm. Los anticuerpos purificados se almacenaron a 4°C. La espectrometría de masas se realizó para identificar la masa molecular de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo expresadas por los hibridomas como se describe en el Ejemplo 10.
Ejemplo 12: Unión de los clones anti-c-Met a células de tumor que expresan c-Met unido a membrana por medio de análisis FACS La unión de los anticuerpos anti-c-Met y sus formas monovalentes (también denominadas "moléculas UniBody" en la presente, ver Ejemplo 5) a células A431 que expresan c-Met unido a membrana (comprado en ATCC, CRL-1555) se ensayaron utilizando citometría de flujo (FACS Canto II, BD Biosciences) . El análisis Qifi (Dako, Glostrup, Dinamarca) reveló que las células A431 expresan un promedio de 30,000 copias de proteína c-Met por célula. La unión de los anticuerpos anti-c-Met y las moléculas UniBody se detectó utilizando un anticuerpo IgG cabra-anti-humano conjugado con Ficoeritrina (Jackson) . Se utilizó IgGl-5D5 como anticuerpo de control positivo, y se utilizó HuMab-KLH como anticuerpo de control de isotipo. Los valores EC50 se determinaron por medio de regresión no lineal (dosis-respuesta sigmoidea con declive variable) utilizando el software GraphPad . Prism V .03 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) .
La Figura 3 muestra todos los anticuerpos anti-c-Met ensayados y las moléculas UniBody unidas a c-Met expresadas en células A431 en una forma dependiente de la dosis. Los valores EC50 para la unión variaron de entre 0.28-1.92 nM para IgG y 0.52-13.89 nM para moléculas UniBody. De manera interesante, el anticuerpo IgGl-024 demostró altos niveles de unión insaturados a las células A431, lo cual no se observó cuando se ensayó la unión a células HT-29 (compradas en ATCC, HTB-38™) (datos no mostrados) . Para los anticuerpos 022, 024, 062, 064, 069, 098, 101 y 181, no se observaron disminuciones o disminuciones menores de dos veces en los valores EC50 entre las moléculas IgGly y UniBody de clones idénticos. Tampoco cambiaron los niveles de unión máximos entre las moléculas de IgGl y UniBody. Para los anticuerpos 005, 006, 008, 035, 045 y 058, por el otro lado, se observó una disminución de más de dos veces en el valor EC50 así como una disminución en el nivel de unión máximo cuando se compara el IgGl con su contraparte UniBody. Esto más probablemente se debe a la menor adherencia celular (Kd) de estos anticuerpos (ver Ejemplo 14) .
Ejemplo 13: Ensayo Octeto de claisificacíon de afinidad La unión del anticuerpo a cMetECDHis se analizó por medio de la tecnología Bio-Layer Int erferometry (BLI) en el Sistema Octeto (Fortebio, Menlo Park, USA) . Los biosensores recubiertos con IgG anti-humano (específico de Fe) se utilizaron para capturar anticuerpos anti-c-Met de acuerdo con el procedimiento recomendado por el fabricante. Los cMetECDHis derivados de células HEK293 se cargaron en la parte superior de anticuerpos anti-c-Met inmovilizados colocando el biosensor cargado en una cavidad conteniendo 10 µg/ml de cMetECDHis diluido 10 veces en regulador de pH de cinéticos diluido (Fortebio) . La diferencia en la reflexión de luz (??, nm) de la superficie del biosensor debido a la unión de cMetECDHis se midió en tiempo real durante aproximadamente 10 minutos y se utilizó mediante el software Octeto (V4.0, Fortebio) para calcular la constante de asociación (Ja [l/M x s] ) . Después, el biosensor cargado se colocó en una cavidad conteniendo solamente regulador de pH de cinéticos (10 veces diluido en PBS) para determinar la constante de disociación (kd [l/s] ) . El análisis de los cinéticos se llevó a cabo para determinar la afinidad (?? [M] ) utilizando el modelo 1:1 (langmuir) . Como un control positivo, se utilizaron 0.2 ]ig/ml de 5D5 IgGl producido en células HEK293.
La Tabla 5 muestra todos los anticuerpos anti-c-Met unidos a cMetECDHis con afinidades nanomolares en el intervalo de 0.6-13.9 nM .
Tabla 5: Constantes cinéticas (ka, kd y KD) de anticuerpos para la unión a c etECDHis Excepto para 5D5 , cada muestra se midió una vez.
Ejemplo 14: Unión de anticuerpos anti-c-Met para c-Met unido a membrana expresado en células epiteliales de mono Rhesus medida por medio de análisis FACS Para determinar la reactividad cruzada con c-Met de mono Rhesus, la unión de los anticuerpos anti-c-Met a células epiteliales de mono c-Met positivas (4MBr-5 compradas en ATCC) se ensayaron utilizando citometría de flujo (FACS Canto II, BD Biosciences) . Se utilizó un anticuerpo IgG anti -humano de cabra conjugado con ficoeritirina (Jackson) como un conjugado secundario. HuMab-KLH se utilizó como un anticuerpo de control de isotipo.
La Figura 4 demuestra que todos los anticuerpos anti-c-Met ensayados reaccionan de forma cruzada con c-Met de Rhesus. En las dos concentraciones ensayadas (0.5 ug/ml y 10 µg/ml) los anticuerpos anti-c-Met fueron capaces de unirse específicamente al c-Met de mono Rhesus. Para todos los anticuerpos, la señal fue al menos 5 veces mayor que para el anticuerpo de control de isotipo HuMab-KLH. De manera interesante, P1016-035 demostró niveles de fluorescencia superior más altos (MFI de -200,000) comparado con otros anticuerpos específicos c-Met. Esta diferencia no se observó en líneas de células que expresan c-Met del receptor humano.
Ejemplo 15: Bloque de la unión HGF al dominio extracelular de c-Met determinado con el Ensayo Inmunoabsorbente Enlazado a Enzima (ELISA, por sus siglas en inglés) Se llevó a cabo un ELISA para analizar si los anticuerpos anti-c-Met podrían bloquear el factor de crecimiento de hepatocito (HGF, por sus siglas en inglés) al receptor c-Met. Por consiguiente, el dominio extracelular recubierto de c-Met se incubó con un anticuerpo anti-c-Met sin marcar y HGF fluorescentemente marcado. Los anticuerpos no de bloqueo no compiten con el HGF marcado para la unión a c-Met, dando como resultado una señal de fluorescencia máxima. Los anticuerpos de bloque compiten con HGF marcado para la unión a c-Met, dando como resultado una señal fluorescente disminuida.
HGF (ProSpec Tany, Rehovot, Israel) se marcó fluorescentemente por conjugación con Europio3"1" (PerkinElmer, Turku, Finlandia) . Las cavidades de ELISA se cubrieron durante la noche a 4°C con 0.5 µg/ml del dominio extracelular c-Met humano recombinante (sistemas R&D, Minneapolis, USA) diluido en PBS . Después, las cavidades de ELISA se lavaron con PBST (PBS suplementado con 0.05% de T een-20 [Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Países Bajos]) y bloquearon por una hora a temperatura ambiente (temperatura ambiente) con PBST suplementado con 2% de (v/v) suero de pollo (Gibco, Paisley, Escocia) . Después de lavar con PBST, las cavidades de ELISA se incubaron por una hora a temperatura ambiente protegidas de la luz con una mezcla de 50 µ? anticuerpo anti-c-Met serialmente diluido (0.128-10,000 ng/ml en diluciones quíntuples) y 50 µ? de 0.44 µg/ml de HGF conjugado con Europio3"1"- en PBST. Después, el HGF conjugado con Europio3"1" sin unir se lavó con PBST y el HGF conjugado con Europio3"1" se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad con Solución de Potenciación Delfia (PerkinElmer) para aumentar la señal fluorescente. La intensidad fluorescente media a 615 nm se midió utilizando el lector EnVision 2101 Multilabel (PerkinElmer) aplicando la siguiente configuración: espejo doble Lance/Delfia , filtro de emisión 615, filtro de excitación 340 nm, tiempo de retraso 400 µe, ventana 400 µe, 100 flashes, 2000 ys por ciclo y lectura línea por línea bidireccional . Para determinar los valores IC50, las curvas de unión se analizaron con regresión no lineal (dosis-respuesta sigmoidea con declive variable, valores superiores limitados a un valor compartido para todos los grupos de datos) utilizando el software GraphPad Prism V4.03 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
La Figura 5 describe ejemplos representativos de las curvas de inhibición de unión HGF de anticuerpos anti-c-Met para la unión al dominio extracelular de c-Met humano recombinante. Se utilizó 5D5 como anticuerpo de control positivo. Todos los anticuerpos anti -c-Met en el experimento mostraron que son capaces de competir con HGF conjugado con Europio3"1" para la unión a c-Met recombinante. Los valores IC50 variaron entre 0.0011-0.0794 yg/ml . Sin la adición de HGF conjugado con Europio3+, se detectaron aproximadamente -600 unidades fluorescentes (RFU, por sus siglas en inglés) , lo que indica la señal cuando se logra la máxima inhibición.
Cuando no se inhibió la unión de HGF conjugado con Europio3"1", se detectaron aproximadamente -66,000 RFU. Los a anticuerpos 005, 006, 058, 101 y el anticuerpo de control positivo 5D5 fue capaz de inhibir 84.5-92.1% de la unión de HGF al receptor c-Met. Todos los otros anticuerpos fueron capaces de inhibir al menos 55% de la unión de HGF a c-Met. Ya que HGF puede unirse al receptor c-Met en ambos, el dominio SEMA y la región Ig, algunos anticuerpos pueden inhibir solamente una de estas interacciones. Para determinar que interacción se inhibió, se llevó a cabo un ensayo de inhibición con base en cMetSEMAHis de transferencia de energía de resonancia fluorescente resuelta con el tiempo (TR-FRET, por sus siglas en inglés) .
Ejemplo 16: Competencia de anticuerpos anti-c-Met para la unión a cMetECDHis soluble medido con emparedado-ELISA En primer lugar, se determinaron las concentraciones de recubrimiento óptimas de los anticuerpos anti-c-Met ensayados y la concentración de cMetECDHis óptima. Por consiguiente, las cavidades de ELISA se cubrieron durante la noche a 4°C con HuMab anti-c-Met serialmente diluidos en PBS (8 µg/ml en diluciones dobles) . Después, las cavidades de ELISA se lavaron con PBST (PBS suplementado con 0.05% de Tween-20 [Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Países Bajos]) y bloquearon por una hora a temperatura ambiente (temperatura ambiente) con PBSTC (PBST suplementado 2% [v/v] de suero de pollo [Gibco, Paisley, Escocia]). Posteriormente, las cavidades de ELISA se lavaron con PBST e incubaron por una hora a temperatura ambiente con cMetECDHis biotinilado serialmente diluido en PBSTC (1 µ9/??1 en diluciones dobles) . Los cMetECDHis biotinilados sin unir se lavaron con PBST, y los cMetECDHis biotinilados unidos se incubaron por una hora a temperatura ambiente con 0.1 pg/ml de Estreptavidina-poli-HRP (Sanquin, Amsterdam, Países Bajos) diluido en PBST. Después del lavado, la reacción se visualizó a través de incubación durante 15 minutos con ácido 2 , 2 ' -azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico (ABTS : diluir una tableta ABTS en 50 mi de regulador de pH ABTS [Roche Diagnostics, Almere, Países Bajos]) a temperatura ambiente, protegidas de la luz. La colorización se detuvo por la adición de un volumen igual de ácido oxálico (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Países Bajos). La fluorescencia a 405 nm se midió en un lector de placas de microtitulación (Biotek Instruments, inooski, USA). Las condiciones que resultaron en la unión sub-óptima (aprox. 80%) de cada anticuerpo se determinaron y utilizaron para los siguientes experimentos de bloqueo cruzado.
Las cavidades de ELISA se cubrieron con anticuerpo anti-c-Met a una dosis sub-óptima como se describe anteriormente. Después del bloque de las cavidades de ELISA, se incubaron con la concentración predeterminada de cMetECDHis biotinilado en la presencia de un exceso de anticuerpo anti-c- et . La reacción se desarrolló como se describe anteriormente. La unión residual se expresó como un porcentaje relativo a la unión observada en la ausencia del anticuerpo competidor.
Tabla 6: Cuando se agregan, como competidores, todos los anticuerpos anti-c-Met fueron capaces de competir por la unión con sus contrapartes inmovilizadas. 022, 058 y 5D5 , cuando se agregan como anticuerpos competidores, compiten con los anticuerpos 005 y 006. Sin embargo, la reacción inversa reveló solamente una competencia parcial de los anticuerpos 005 y 006. Estas diferencias pueden explicarse por las inferiores afinidades de los anticuerpos 005 y 006 cMetECDHis biotinilados . El anticuerpo 5D5, cuando se agregó como anticuerpo competidor, también demostró competencia parcial con los anticuerpos 008 y 045, mientras no se observó ninguna o una mínima competencia en la reacción inversa. Además, los anticuerpos 024, 062, 064, 068 y 181, cuando se agregan como anticuerpos competidores, demostraron una competencia parcial con el anticuerpo 101, mientras que la reacción inversa demostró la completa inhibición de la unión de cMetECDHis. Los valores más altos del 100% pueden explicarse mediante los efectos de avidez y la formación de complejos anticuerpo-cMetECDHis que contienen dos anticuerpos no de competencia.
Los anticuerpos 024, 062, 064, 068, 069, 098, 101 y 181 compiten entre sí para la unión a cMetECDHis. Los anticuerpos 005, 006, 022 y 058 se considera que pertenecen a un grupo de bloqueo cruzado, un grupo que se caracteriza por la completa competencia con 005, 006, 022, 058 y 5D5. Sin embargo, el anticuerpo 5D5 fue el único anticuerpo que también fue capaz de competir para la unión con el anticuerpo 045. Otro grupo de anticuerpos que compite para la unión a cMetECDHis se formó por 008, 035 y Gll-HZ.
Tabla 6: Competencia de anticuerpos anti-c-Met para la unión a cMetECDHis biotinilados Anticuerpos de competencia ¡75 - > 100% de competencia| \25 - 74% de competencia! de competencia Anticuerpo de competencia Los datos mostrados son porcentajes de inhibición de la unión + desviación estándar de 3 experimentos independientes. Para los anticuerpos 035, 5D5 y Gll-HZ el ELISA de bloqueo cruzado se realizó solamente dos veces. Además, un número de reacciones de competencia (*) resultó en valores de Densidad Optima mayores de 5.0, que están por arriba del límite de detección del lector de ELISA. Estos resultados se descartaron de los análisis, dando como resultado mediciones por duplicado.
Ejemplo 17: Bloqueo de la unión de HGF a c etSEMA-567His8 determinado por medio de transferencia de energía de resonancia fluorescente resuelta con el tiempo (TR-FRET) GF puede unir el receptor c-Met a ambos, el dominio SEMA y la región IgG. Sin embargo, solamente la unión de HGF al dominio SEMA se encontró como crucial para la activación del receptor. Por consiguiente, la interacción de los anticuerpos anti-c-Met con el dominio SEMA del receptor c-Met se estudió utilizando la tecnología TR-FRET. Con el fin de realizar este ensayo con base en la proximidad homogénea, se conjugó el factor de crecimiento de hepatocito (HGF, ProSpec Tany, Rehovot, Israel) con un colorante aceptor fluorescente; AlexaFluor-647 (Invitrogen, Breda, Países Bajos) . cMetSEMA-567His8 se marcó con una molécula donante fluorescente dirigida contra la etiqueta de histidina (Anti-6xhis Europio3"1", PerkinElmer, Turku, Finlandia) . La unión del HGF conjugado a AlexaFluor-647 para cMetSEMA-567His8 marcado con Europio3"1" permite una transferencia de energía de la molécula donante (excitación 340 nm) a la molécula aceptora (emisión 665 nm) . La intensidad fluorescente media a 665 nm se midió en el lector Multi -etiqueta EnVision 2101 (PerkinElmer) . La competencia de los anticuerpos anti-c-Met sin marcar con HGF conjugado con AlexaFluor-647 se midió por una disminución en la señal TR-FRET a 665 nm, porque en el estado no unido, la distancia entre los fluoróforos donante y aceptor es demasiado grande para que ocurra la transferencia de energía.
Todas las diluciones se hicieron en 0.5x de regulador de pH de detección Lance (PerkinElmer) con 2.67% de solución Estabilizante (PerkinElmer) y 0.03% (v/v) de Tween-20 (Riedel de Haen, Seelze, Alemania) . Se agregaron 25 µ? de cMetSEMA-567His8 a 25 µ? de HGF conjugado con AlexaFluor647 , 25 µ? de anti-6xhis Europio3+ y 25 µ? del anticuerpo anti-c-Met sin marcar en una placa opti-blanca de 96 cavidades (PerkinElmer) . A una concentración final de 2.93 ug/ml de cMetSEMA- 567His8 , se obtuvieron 0.96 ug/ml de HGF conjugado con AlexaFluor- 647 y 0.4 ug/ml de anti-6xhis Europio3+. Se ensayó una dilución serial por cuadriplicado del anticuerpo anti-c-Met sin marcar en el intervalo de 0.49-8000 ng/ml. Después de la incubación durante la noche a 4°C en la oscuridad, se midió la intensidad fluorescente media a 665 nm utilizando el lector Multi-etiqueta EnVision 2101 aplicando la siguiente configuración: espejo doble Lance/Delf ia, filtro de emisión 615-665 nm, filtro de excitación 320 nm, tiempo de retraso 60 µß, ventana 100 \is , 100 flashes, 2000 µe por ciclo y lectura línea por línea bidireccional . Para determinar los valores IC50, las curvas de unión se analizaron con regresión no lineal (dosis-respuesta sigmoidea con declive variable) utilizando el software GraphPad Prism V4.03 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) .
La Figura 6 muestra las curvas de inhibición de unión de HGF a varios anticuerpos anti-c- et para la unión a cMetSEMA_567His8 ensayado con TR-FRET. Excepto por los anticuerpos 008, 035 y 096, todos los anticuerpos fueron capaces de competir con HGF conjugado con AlexaFluor-647 para la unión a cMetSEMA- 567His8. El anticuerpo 022 fue capaz de inhibir -80% de la unión a HGF, a pesar de que los anticuerpos 005, 006, 024, 045, 058, 061, 062, 064, 068, 069, 098, 101, 181 y el anticuerpo de control positivo 5D5 fueron capaces de inhibir >90% de la unión de HGF a cMetSEMA-567His8. Se determinaron los valores IC50 en el intervalo de 0.082-0.623 g/ml.
Tabla 7: Valores IC50 (p.g/m.1) y porcentaje de inhibición de ligando de anticuerpos anti-c-Met para la unión a cMetSE A-567His8 determinados con TR-FRET Los datos mostrados son MFI medio de tres experimentos independientes Ejemplo 18: Ensayo de viabilidad KP4 Los anticuerpos C-Met se ensayaron para su habilidad para inhibir la viabilidad de células KP4 (Riken BioResource Center Cell Bank, RCB1005) . Las células KP4 , que expresan altos niveles de ambos, c-Met y HGF_ en una forma autocrina, se sembraron en placas de cultivo tisular de 96y cavidades (Greiner bio-one, Frickenhausen, Alemania) (10,000 células/cavidad) en medio sin suero (1 parte de F12 K de HAM [Cambrex, East Rutherford, New Jersey] y 1 parte de DMEM [Cambrex] ) . Se preparó una dilución de 667 n del anticuerpo anti-c-Met en medio sin suero y se agregó a las células. Después de 3 días en incubación, la cantidad de células viables se cuantificó con Alamarblue (BioSource International, San Francisco, US) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La fluorescencia se monitoreó utilizando el lector Multi-etiqueta EnVision 2101 (PerkinElmer, Turku, Finlandia) con configuraciones de Alamarblue estándares. La señal Alamarblue de las células tratadas con el anticuerpo se graficaron como un porcentaje de señal comparado con las células tratadas.
La Figura 7 describe el porcentaje de inhibición de células KP4 después del tratamiento del anticuerpo anti-c-Met comparado con células sin tratar (0%) . Los clones en cajas son anticuerpos que compiten de forma cruzada entre sí como se describe en el Ejemplo 17. De manera interesante, los anticuerpos 024, 062, 064, 068, 069, 098, 101 y 181, que pertenecen al mismo grupo de bloqueo cruzado, todos fueron capaces de inhibir la viabilidad de KP4 (18-46%), tanto como molécula IgGl como UniBody. También las moléculas IgGl de los anticuerpos 008, 061 y 096 fueron capaces de inhibir la viabilidad de KP4. En contraste, los anticuerpo 045 no inhibieron la viabilidad de KP4 como molécula IgGl ni como UniBody. Para Uni- 1016 - 045-TE esto puede deberse a su baja afinidad evidente para c-Met unido a membrana, según medido por análisis FACS (Ejemplo 13) . Los anticuerpos IgGl de los clones 005, 006, 022 y 058 no inhibieron la significativa viabilidad de KP4 , mientras Uni-1016-022-TE, Uni - 1016 - 058-TE y IgGl-1016-058-wtFab inhibieron 57, 38 y 44% de la viabilidad de KP4 , respectivamente. Uni-1016-005 y Uni-1016-006 también compiten de forma cruzada con los clones 022 y 058 pero no inhiben la viabilidad de KP4 de forma significativa. Esto puede deberse a sus bajas afinidades evidentes según medidas por análisis FACS (Ejemplo 13) . De manera interesante también IgG4-1016-058 demostró algo de inhibición de la viabilidad de KP4. Esto no se observó con IgG4-5D5) .
En general los datos indican que para algunos grupos de bloqueo cruzado, es requerida la unión monovalente para inhibir la viabilidad de KP4 , mientras para otros grupos de bloqueo cruzado ambas moléculas de unión monovalente y bivalente pueden inhibir la viabilidad de KP4.
Ejemplo 19: Modelo de xenoinjerto de tumor KP4 en ratones SCID Se llevó cabo un modelo de xenoinjerto de tumor KP4 en ratones SCID para determinar la eficacia de los HuMabs anti-c-Met para inhibir el crecimiento tumoral in vivo. Siete de los onece ratones SCID hembra, cepa C . B- 17/ IcrPrkdc-scid/CRL, se compraron de Charles River Laboratories Nederland (Maastricht, Países Bajos) y se mantuvieron bajo condiciones estériles en jaulas con filtro en la parte superior con alimentos y agua provistos ad libitum. Se colocaron microchips (PLEXX BV, Elst, Países Bajos) para la identificación de los ratones. Todos los experimentos se aprobaron por el comité de éticas animales de la Universidad de Utrecht .
En el día 0, se inocularon subcutáneamente lOxlO6 células KP4 en 200 µ? PBS en el costado derecho. Los ratones se examinaron al menos dos veces por semanas para signos clínicos de enfermedad. El tamaño de tumor se determinó al menos una vez por semana. Los volúmenes (mm3 ) se calcularon de mediciones con un calibrador (PLEXX) como 0.52 x (longitud) x (ancho) 2, empezando en el día 16. En el día 9, se midieron los tamaños de tumor promedio y los ratones se dividieron en 8 grupos de 7 ratones cada uno. Los anticuerpos anti-c-Met (008, 058, 069 y 098) se inyectaron intraperitonealmente . El anticuerpo Gll-HZ se utilizó como un anticuerpo de control positivo, mientras que los anticuerpos 5D5 y de control de isotipo se utilizaron como anticuerpos de control negativo. Los ratones recibieron una dosis de carga de 400 µg/ratón seguido por dosis de mantenimiento semanal de 200 ug/ratón, durante 7 semanas.
Adicionalmente , las muestras de plasma, recolectadas antes de las administraciones la., 2a., 3a. y 5a., de dosis de mantenimiento, y cunado los ratones se sacrificaron, se verificó la presencia de IgG humano utilizando perlas de látex en el nefelómetro BNII (Dade Behring, Atterbury, UK) .
Las Figuras 8 y 9 que muestran que el crecimiento del tumor de células KP4 se inhibió por los HuMab 008, 069, 098 y Gll-HZ de control positivo. La inhibición se comparó con el tratamiento con anticuerpo de control de isotipo. El crecimiento tumoral de células KP4 se retrasó, pero no se inhibió completamente por el anticuerpo de control Gll-HZ. Los clones 069 y 098 mostraron una inhibición más potente comparados con los clones 008 y Gll-HZ. Los anticuerpos 5D5 y 058 no inhibieron el crecimiento tumoral. Esto fue consistente con los datos in vitro como se describe en el Ejemplo 19. Tomados juntos, estos datos indican que para algunos grupos de bloqueo cruzado los anticuerpos de unión bivalente pueden inhibir el crecimiento tumoral KP4.
Ejemplo 20: Modelo de xenoinjerto de tumor MKN45 Se utilizó un modelo de xenoinjerto de tumor MKN45 de adenocarcinoma gástrico en ratones desnudos para determinar la eficacia de los HuMab anti-c-Met para inhibir el crecimiento tumoral in vivo.
Se cultivaron células de adenocarcinoma gástrico MKN45 humanas a 37°C y 5% de C02 en medio RPMI-1640 conteniendo 100 unidades/ml de penicilina G sódica, 100 ug/ml de sulfato de estreptomicina, 25 g/ml de gentamicina, 20% de suero de bovino fetal, y 2 mM de glutamina. Se utilizaron Siete de ocho ratones desnudos hembra de 8 semanas de edad (nu/nu, Harían) (pesos corporales en el intervalo de 17.0 a 26.4 g el inicio del estudio) . Los ratones se alojaron bajo condiciones que cumplen con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. El programa de uso y cuidado de animales fue acreditado por la AAALAC. En el día 0, se inocularon subcutáneamente lxlOe7 células MKN45 en 200 µ? 50% de matrigel en PBS en el costado de cada ratón. En el día 7, los animales se clasificaron en cinco grupos (n=10) con un volumen tumoral promedio de 80 a 120 mm3 y se inició el tratamiento. Los anticuerpos anti-c-Met (008, 058, 069) se inyectaron en la vena de la cola (iv) . El anticuerpo Gll-HZ se utilizó como un anticuerpo de control positivo y se utilizó un anticuerpo de control de isotipo como un anticuerpo de control negativo. Todos los ratones recibieron 40 mg/kg de anticuerpo en el día 7 y 20 mg/kg del anticuerpo en los días 14, 21, y 28.
Los tumores se midieron dos veces semanalmente utilizando calibradores hasta un punto final de volumen tumoral de 700 mm3 o hasta el final de estudio (día 62) . Las Figuras 10 y 11 muestran que el crecimiento tumoral de las células MKN45 se retrasó significativamente por los anticuerpos 008, 058, 069 y el anticuerpo de control Gll-HZ comparado con el tratamiento con el anticuerpo de control de isotipo.
Ejemplo 21: Disminución de la actividad agonística residual de los anticuerpos IgGl c-Met mediante la reducción de la flexibilidad conformacional .
El ligando natura de c-Met, HGF, es un dímero funcional que induce la dimerización de dos moléculas c-Met. La posterior fosforilación intracelular del dominio intracelular de c-Met da como resultado la activación de varias trayectorias de señalización que están involucradas en la proliferación, invasión y supervivencia de las células. La mayor parte de los anticuerpos bivalentes producidos anti-c-Met mostraron efectos comparables como HGF el destino de la célula, especialmente cuando la unión de los epítopos del anticuerpo se localiza cerca o en el dominio SEMA de c-Met.
Para minimizar la actividad agonística residual potencial de los anticuerpos IgGl bivalentes, se utilizó una estrategia para reducir la flexibilidad conformacional . En un IgGl existe un gran grado de libertad para que los brazos Fab se muevan con relación al dominio Fe. Los cambios en la conformación más grandes son el resultado de la flexibilidad de la bisagra, que permite un amplio intervalo de ángulos Fab-Fc (Ollmann Saphire, E., R.L. Stanfield, M.D.M. Crispin, P.W.H.I. Parren, P.M. Rudd, R.A. Dwek, D.R. Burton y I.A. Wilson. 2002. Contrasting IgG structures reveal extreme asymmetry y flexibility. J. Mol. Biol . 319: 9-18). Una forma de reducir la flexibilidad del brazo Fab en inmunoglobulinas es prevenir la formación de enlaces de disulfuro entre la cadena ligera y pesada por medio de modificación genética. En un anticuerpo IgGl natural la cadena ligera se conecta covalentemente a la cadena pesada mediante un enlace de disulfuro, que conecta la cisteína C-terminal de la cadena ligera a la cisteína en la posición 220 (C220 numeración EU) en la bisagra del Fe de la cadena pesada. Al ya sea mutar el aminoácido C220 a serina o cualquier otro aminoácido natural, removiendo 220, removiendo la bisagra completa, o reemplazando la bisagra IgGl con una bisagra IgG3 , se forma la molécula en donde las cadenas ligeras se conectan a través de sus cisteínas C-terminal, análogo a la situación encontrada en el isotipo humano IgA2m(l). Esto resulta en una flexibilidad reducida de los Fabs con relación al Fe y en consecuencia una capacidad de entrelazamiento reducida, como se muestra en los estudios comparativos con los formatos IgA2m(l) y IgGl de un anticuerpo c-Met agonístico (5D5) en un ensayo de viabilidad KP4 (Figura 12) .
Otra estrategia para reducir la flexibilidad de una molécula IgGl es reemplazar la bisagra IgGl con la bisagra IgG2 o la bisagra de tipo IgG2. (Dangl y otros EMBO J. 1988;7:1989-94). Esta región de bisagra tiene dos propiedades diferentes de la de IgGl, que se considera que convierten a la molécula en menos flexible. En primer lugar, comparada con la bisagra IgGl la bisagra IgG2 es de 3 aminoácidos más corta. En segundo lugar, la bisagra IgG2 contiene una cisteína adicional, de esta forma se formarán tres en lugar de dos puentes de disulfuro inter-cadena pesada. Alternativamente, una variante de la bisagra IgGl que se asemeja a la bisagra IgG2 puede introducirse. Este mutante (??7?6-9) (WO2010063746) contiene la mutación T223C y dos eliminaciones (K222 y T225) con el fin de crear una bisagra más corta con una cisteína adicional Ejemplo 22: Generación de moléculas IgGl con flexibilidad reducida (moléculas IgGl endurecidas) Clonación y expresión Los anticuerpos IgGl mutantes se diseñaron y clonaron utilizando técnicas biológicas estándar. Una visión general de las secuencias de todas las mutaciones de región de bisagra generadas se muestra en la Tabla 8 siguiente.
Tabla 8: Secuencia de aminoácido de la bisagra de anticuerpos IgGl mutantes. Las eliminaciones se marcan con '- ', y las mutaciones se resaltan en gris.
IgGl TS EPKSCDKTHTCPPCP IgGl Bisagra- IgG2 ERKCCVE CPPCP IgGl AC220 EPKS-DKTHTCPPCP IgGl C220S EPKSSD THTCPPCP IgGl ??7?6-9 EPKSCD-CH-CPPCP Bisagra IgGl eliminada (Uni-IgGl) IgGl Bisagra- IgG3 LKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEP SCDTPPPCPTCPEPKSCDTPPPCPRCP Para la expresión de los anticuerpos IgGl endurecidos resultantes en las células de mamífero, la región constante HC de IgGl, que contiene las mutaciones en la región de bisagra (ver Tabla 8 anterior) , se sintetizó como un constructo con codón optimizado en el vector de expresión de mamífero pcDNA3.3 (Invitrogen) . Se construyó un vector separado insertando la región constante con codón optimizado de la región de cadena ligera kappa humana en pcDNA3.3. VH y las regiones VL del clon 069 y el anticuerpo de control 5D5 en el plásmido constante He y el plásmido de cadena ligera Kappa respectivamente resultando en vectores para la expresión de las cadenas pesada y ligera (mutada) de los anticuerpos específicos. La co-transfección de los vectores de cadena pesada y ligera de un anticuerpo específico en células HEK-293F (Invitrogen), dio como resultado la, producción temporal de anticuerpos mutantes . La purificación de los anticuerpos se llevó a cabo utilizando cromatografía de columna de afinidad de Proteína A (como se describe en el Ej emplo 11) .
Caracterización bioquímica Expresión temporal Todos los mutantes se expresaron a niveles suficientes y no mostraron la formación aberrante de multímeros como se determina por MS (>99% pureza) y SDS-PAGE.
Los resultados de SDS-PAGE se muestran en la Figura 13. En los mutantes C220 (C220S y ?0220) y las variantes IgGl con bisagra eliminada (las variantes IgGl con bisagra eliminada también se denominan UniBody-IgGl o Uni-IgGl) , se observaron pares de cadenas ligeras, visibles como una banda de proteína de alrededor de 50 kD en análisis SDS-PAGE no reducido. La variante con una bisagra IgG2 también mostró un par de cadenas ligeras, aunque la variante con la bisagra IgG2 y el mutante IgGl ??7?6-9 mostraron pares de cadenas ligera-pesada normales.
Ejemplo 23: Propiedades de unión de c-Met de los mutantes Las propiedades de unión de c-Met de los mutantes se ensayaron en un ELISA. Las cavidades de la placa ELISA se cubrieron durante la noche de 4°C con rhHGF R/Quimera Fe (R&D Systems; Cat .358MT/CF) en PBS (1 g/ml) . Enseguida, las cavidades se lavaron con PBST (PBS suplementado con 0.05% de Tween-20 [Sigma-Aldrich, Zwijndrecht , Países Bajos] ) y bloquearon por una hora a temperatura ambiente (temperatura ambiente) con PBSTC (PBST suplementado con 2% [v/v] de suero de pollo [Gibco, Paisley, Escocia] ) . Posteriormente, todas las cavidades se lavaron con PBST e incubaron por una hora a temperatura ambiente con los anticuerpos anti-cMet y variantes serialmente diluidas en PBSTC (10 g/ml diluciones por cuadriplicado) . El anticuerpo no unido se lavó con PBST, y el anticuerpo unido a la cubierta se detectó por incubación por una hora a temperatura ambiente con F(ab')2-HRP IgG anti-humano de cabra diluido en PBST (Jackson cat. no. 109-035-097) . Después de lavado, la reacción se visualizó por medio de 15 minutos en incubación con ácido 2 , 2 ' -azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS: diluir una tableta ABTS en 50 mi de regulador de pH ABTS [Roche Diagnostics, Almere, Países Bajos]) a temperatura ambiente protegido de la luz. La colorización se detuvo mediante la adición de un volumen igual de ácido oxálico (Sigma-Aldrich, Z ijndrecht, Países Bajos) . La fluorescencia a 405 nm se midió en un lector de placas de microtitulación (Biotek Instruments, Winooski , USA) . Todos los mutantes unidos tuvieron una afinidad evidente comparable (EC50) a c-Met (Figura 14) . La Tabla 10 muestra los valores EC50 de los mutantes obtenidos en este experimento .
Tabla 9: Valores EC50 según determinados por ELISA Ejemplo 24: Efecto agonístico reducido de anticuerpos c-Met IgGl endurecidos Fosforilación del receptor Para determinar las propiedades agonísticas de los anticuerpos endurecidos, se realizó el efecto de los anticuerpos en la fosforilación de cMet . Después de la dimerización de dos receptores cMet adyacentes ya sea mediante HGF de ligando natural o anticuerpos más bivalentes, tres residuos de tirosina (posición 1230, 1234 y 1235) en el dominio intracelular de c-Met se fosforilaron de forma cruzada, lo que es seguido por la posterior fosforilación de varios otros aminoácidos en el dominio intracelular y la activación de un número de cascadas se señalización. La dimerización y activación de cMet por consiguiente puede monitorearse utilizando anticuerpos específicos para el receptor fosforilado en estas posiciones, y de esta forma utilizarse como una lectura para el agonismo potencial de los anticuerpos anti-c-Met.
Las células A549, CCL-185 obtenidas de ATCC, se cultivaron en medio DMEM conteniendo suero hasta que se obtuvo una confluencia de 70%. Después de la tripsinización y el lavado de las células se plaquearon en un placa de cultivo de 6 cavidades a l*10e6 células/cavidad en medio de cultivo con suero. Después de incubación durante la noche las células se trataron con cualquier sistema HGF (sistemas R&D; cat . 294-HG) (50 ng/ml) o el panel de anticuerpos (30 ug/ml) y se incubaron por 15 minutos a 37°C. Las células después se lavaron dos veces con PBS helado y lisaron un regulador de pH de lisis (Señalización de célula; cat. 9803) suplementado con un coctel inhibidor de proteasa (Roche; cat. 11836170001) y las muestras se almacenaron a -80°C. La activación del receptor se determinó midiendo la fosforilación por medio de Western blot utilizando anticuerpos fosfo c-Met. Las proteínas en el lisado celular se separaron en 4-14% de gel SDS-PAGE y transfirieron a la membrana de nitrocelulosa que posteriormente se tiñó con el anticuerpo específico para c-Met fosforilado (Y1234/1235) (Señalización celular, cat : 3129) . Para controlar la carga de gel, se utilizaron anticuerpos anti-c-Met totales y beta-actina. Los resultados de los Western blots se muestran en la Figura 15.
Los controles del medio de cultivo tisular y las células tratadas con el formato Unibody monovalente del anticuerpo 5D5 no mostraron la fosforilación del receptor. En contraste, el análisis Western de las células tratadas con el HGF de control positivo o anticuerpo agonista IgGl-1016-058 mostraron una banda clara de la altura esperada. El anticuerpo IgGl - 1016 - 069 mostró una baja, pero detectable fosforilación del receptor indicando que toma lugar algún entrelazamiento cruzado del receptor. Sin embargo, las variantes que se diseñaron para reducir la flexibilidad de la molécula del anticuerpo mostraron una activación del receptor mínima, de forma descendente a un nivel comparable con los niveles detectados en células tratadas con el control monovalente Uni-5D5-TE. (Figura 15} .
Efecto de los anticuerpos c-Met en la proliferación de NCI-H441 prolif ration in vitro La actividad agonística proliferativa potencial de los anticuerpos cMet se ensayó utilizando la línea de células de adenocarcinoma de pulmón NCI-H441 (ATCC, HTB-174™) , que expresa altos niveles de c-Met, pero no produce su ligando HGF . Las células NCI-H441 se sembraron en una placa de cultivo tisular de 96 cavidades (Greiner bio-one, Frickenhausen, Alemania) (5,000 células/cavidad) en RPMI (Lonza) sin suero. Las diluciones del anticuerpo anti-c-Met (66.7 nM) se prepararon en RPMI sin suero y se agregaron a las células. Después de 7 días de incubación a 37°C/5% de C02, la cantidad de células viables se cuantificó con Alamarblue (BioSource International, San Francisco, US) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La fluorescencia se monitoreó utilizando el lector Multietiqueta EnVision 2101 ( PerkinElmer , Turku, Finlandia) con configuraciones Alamarblue estándar.
Como se ve en la Figura 17 la proliferación de las células NCI-H441 fue fuertemente inducida por los mAb de control agonísticos IgGl-058 y IgGl-5D5. El anticuerpo IgGl-1016-069 también mostró algún efecto agonístico comparado con las células tratadas con el control de isotipo. La actividad agonística de IgGl-1016-069 podría completamente removerse introduciendo los mutantes C220, C220S y -del, y parcialmente por las variantes con la bisagra IgG2 y ??7?6-9 o la cadena principal gG2. Las muestras de control tratadas con el control de isotipo y la versión monovalente de 5D5 (Uni-5D5^ TE) no indujeron el crecimiento de las células.
Ensayo de viabilidad KP4 La habilidad para inhibir las células dependientes de HGF también se determinó para los mutantes del anticuerpo anti-c-Met en un ensayo de viabilidad KP4 (ver el Ejemplo 19 para los procedimientos experimentales) . Los resultados se muestran en la Figura 17. La eficacia de los mutantes con base en IgGl-1016-069 se retuvo completamente o fue ligeramente mejor en los mutantes C220. Notablemente, la mutación de C220 en el anticuerpo 5D5 agonístico dio como resultado una marcada reducción de la viabilidad de KP4. No se observó ningún efecto agonístico en los anticuerpos 058 y 5D5 en el formato IgGl debido a la alta expresión de HGF por KP4 (ciclo HGF autocrino) .
Modulación descendente La modulación descendente de c-Met inducida por anticuerpos agonísticos representa un mecanismo de acción de anticuerpos c-Met terapéuticos. Por consiguiente, en una modalidad, los anticuerpos con propiedades agonísticas reducidas, pero con la habilidad para inducir la regulación descendente retenida de c-Met, son deseables. Para determinar la modulación descendente potencial de los anticuerpos, se sembraron células A549 (CCL-185 obtenidas de ATCC) en placas de cultivo celular de 6 cavidades (500,000 células/cavidad) en medio de cultivo celular con suero y se cultivaron durante la noche a 37 °C. La siguiente mañana, se agregaron los anticuerpos anti-c-Met a una concentración final de 10 µ9 p?1 y la placa se incubó otros dos días a 37°C. Después de lavar con PBS, las células se lisaron por incubación durante 30 min a temperatura ambiente con 250 µ? de regulador de pH de lisis (Cell signaling, Danvers, USA) . Los niveles de la proteína totales se cuantificaron utilizando el reactivo del ensayo de proteína con ácido bicinchonínico (BCA, por sus siglas en inglés) siguiendo el protocolo del fabricante. Los niveles de la proteína c-Met en los lisados celulares se cuantificaron utilizando un emparedado ELISA específico de c-Met. En este punto, las cavidades de las placas ELISA se cubrieron durante la noche a 4°C con anticuerpo c-Met anti-humano de cabra dirigido contra el dominio extracelular de c-Met (sistemas R&D) , se diluyeron en PBS (1 ug/ml) . Después, las cavidades se lavaron con PBST (PBS suplementado con 0.05% de Tween-20 [Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Países Bajos]) y bloquearon por una hora a temperatura ambiente con PBSTC (PBST suplementado 2% [v/v] de suero de pollo [Gibco, Paisley, Escocia] ) . Los lisados celulares sin diluir se agregaron (100 µ?) e incubaron una hora a temperatura ambiente. Después de lavar con PBST, las cavidades se incubaron una hora a temperatura ambiente con un anticuerpo de ratón dirigido contra el residuo de Tirosina-1234 intracelular de c-Met humano (Señalización celular), diluido 1:1000 en PBSC. Las cavidades se lavaron de nuevo con PBST e incubaron una hora a temperatura ambiente con un anticuerpo Fc-HRP anti -ratón de cabra (Jackson) diluido 1:5000 en PBSC. Después del lavado con PBST, la reacción se visualizó a través de una incubación de 30 minutos con 2 , 2 ' -azino-bis (ácido 3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS: diluir una tableta ABTS en 50 mi de regulador de pH ABTS [Roche Diagnostics, Almere, Países Bajos]) a temperatura ambiente protegida de la luz. La colorización se detuvo por la adición de un volumen igual de ácido oxálico (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Países Bajos) . La fluorescencia a 405 nm se midió en un lector de placas de microtitulación (Biotek Instruments, Winooski, USA) . Como se ve en la Figura 18 todos los mutantes del anticuerpo 069 fueron capaces de inducir la regulación descendente.
Ejemplo 25: Citotoxicidad mediada por la célula dependiente del anticuerpo (ADCC) Las células MK 45 (compradas de RIKEN BioResource Center, Tsukuba, Japón, RCB1001) se cosecharon (5xl06 células) , lavaron (dos veces en PBS, 1500 rpm, 5 min) y recolectaron en 1 mi de medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino cósmico (CCS, por sus siglas en inglés) (HyClone, Logan, UT, USA) , al cual se agregaron 200 Ci de 51Cr (Chromiura-51 ; Amersham Biosciences Europe GmbH, Roosendaal, Países Bajos) . La mezcla se incubó en un baño de agua con agitación durante 1.5 horas a 37°C. Después del lavado de las células (dos veces en PBS, 1500 rpm, 5 min) , las células se volvieron a suspender en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de CCS, se contaron por medio de exclusión de azul de tripano y diluyeron a una concentración de lxlO5 células/ml.
Mientras tanto, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) se aislaron de capas leucocitarias frescas (Sanquin, Amsterdam, Países Bajos) utilizando centrifugación de densidad Ficoll estándar de acuerdo con las instrucciones del fabricante (medio de separación de linfocito; Lonza, Verviers, Francia) . Después de la resuspensión de las células en el medio RPMI 1640 suplementado con 10% de CCS, las células se contaron por medio de exclusión de azul de tripano y se concentraron a lxlO7 células/ml.
Para cada experimento ADCC, se pre-incubaron 50 µ? de células KN45 marcadas con 51Cr (5.000 células) con 15 µg/ml del anticuerpo pcMet en un volumen total de 100 µ? de medio RPMI suplementado con 10% de CCS en una placa de microtitulación de 96 cavidades. Después de 15 minutos a temperatura ambiente, se agregaron 50 µ? de PBMC (500,000 células) , dando como resultado un efector para activar la proporción de células objetivo de 100:1. La cantidad máxima de lisis celular se determinó por medio de incubación de 50 µ? células MKN45 marcadas con 51Cr (5,000 células) con 100 µ? 5% de Triton-X100. La cantidad de lisis espontánea se determinó por incubación de 5,000 células KN45 marcadas con 51Cr en 150 µ? de medio, sin anticuerpo o células efectoras . El nivel de lisis celular dependiente del anticuerpo se determinó por incubación de 5,000 células MKN45 con 500,000 PBMC sin anticuerpo. Posteriormente, las células se incubaron 4 horas a 37°C, 5% de C02. Las células se centrifugaron (1200 rpm, 3 min) y se transfirieron 75 µ? de sobrenadante a tubos micrónicos, después de lo cual el 51Cr liberado se contó utilizando un contador gamma. Los conteos medidos por minuto (cpm) se utilizaron para calcular el porcentaje de lisis mediada por el anticuerpo como sigue: (cpm de muestra - cpm de lisis independiente de Ab-) / (cpm max. de lisis - cpm de lisis espontánea) x 100% Varias publicaciones han demostrado la correlación entre la fucosilación central reducida y la actividad ADCC potenciada in vitro (Shields RL. 2002 JBC; 277:26733-26740, Shinkawa T. 2003 JBC; 278 (5) : 3466-3473) . La Figura 19 demuestra que el anticuerpo 069 no induce la lisis de las células MKN45 a través de ADCC. Sin embargo, cuando se reduje la fucosilación central debido a la presencia de kifunensina durante la producción del mAb en células HEK, el anticuerpo 069 fue capaz de inducir sobre 30% de lisis de células MK 45. Además, la lisis ya se observó a concentraciones de anticuerpo por debajo de 0.01 ug/ml . Los valores descritos son los porcentajes máximos medios de liberación de 51Cr ± la desviación estándar de un experimento ADCC in vítro representativo con células MKN45. 069 bajo en fucosa se produjo en células HEK 293 en la presencia de kifunensina, dando como resultado una fucosilación no central de -99.5% (i.e., ausencia de fucosa) . 069 alto en fucosa se produjo en células HEK 293 sin kifunensina, dando como resultado -2.11% de fucosilación no central, como se determina con cromatografía de intercambio de anión de alto rendimiento acoplada a detección amperométrica pulsada (HPAEC-PAD) (datos no mostrados) .
Ejemplo 26: Falta de unión de anticuerpos c- et a células de sangre periférica humana Con el fin de dirigir la unión del clon 069 a tres tipos de células (células B, monocitos y granulocitos) presentes en sangre periférica, se realizó un ensayo de unión FACS . El clon 069 fluorescentemente marcado se utilizó para permitir la medición directa en FACS sin el uso de los anticuerpos de detección secundarios. Las poblaciones de células en la sangre se identificaron en el ensayo utilizando anticuerpo fluorescentemente comerciales en el ensayo contra marcadores específicos en las células de interés.
La sangre periférica de voluntarios saludables (University Medical Center Utrecht) se diluyó diez veces en regulador de pH FACS (PBS + 0.4% de BSA + 0.02% de NaN3) y se incubó con anticuerpos c-Met conjugados con Alexa488 y los anticuerpos anti-CD19, -CD16 y -CD14 conjugados con FITC (concentración final 10 µg/ml) y anticuerpos anti-CD19, CD16 y -CD14 marcados con ficoeritrina (PE) (BD Biosciences, San José CA) para identificar las poblaciones de células (células B resp., granulocitos y monocitos) en un volumen final de 100 µ? . Después de 30 minutos a 4°C, las muestras se centrifugaron (300 g, 3 min) , el sobrenadante se removió, los eritrocitos se lisaron por incubación (10 min, 4°C) con 200 µ? de solución de lisis Ery (155 mM de NH4C1, 10 mM de KHC03, 0.1 Mm de EDTA [pH 7.4]), y las muestras se lavaron dos veces con regulador de pH FACS. Las muestras se volvieron a suspender en ???µ? de regulador de pH FACS y analizaron utilizando un FACS Canto II (BD Biosciences) .
La Figura 20 es una gráfica FACS representativa que demuestra que 069 conjugado con Alexa488 no une la población de células B (células CD19-PE+ dentro de la compuerta de linfocitos) . La unión de rituximab conjugado con Alexa488 se utilizó como un control positivo. La unión de las otras poblaciones de células se analizó similarmente y los resultados representativos para 1 de 3 donantes también se gráfico en la Figura 21. El anticuerpo 069-Alexa488 no se une a las células B, monocitos o granulocitos , a pesar de que los anticuerpos de control positivo demuestran unión específica.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (57)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Un anticuerpo monoclonal caracterizado porque se une a c-Met humano.
2. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque compite por la unión a cMetECDHis soluble con un anticuerpo inmovilizado, en donde el anticuerpo inmovilizado comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 33 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 37 (024) , preferiblemente en donde el anticuerpo compite por más del 50%, tal como más del 75% con tal anticuerpo inmovilizado, cuando se determina como se describe en el Ejemplo 17.
3. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque no compite por la unión a cMetECDHis soluble con un anticuerpo seleccionado del grupo que consisten de: a) un anticuerpo inmovilizado que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO : 1 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO : 5 (005) b) un anticuerpo inmovilizado que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 17 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 21 (008) c) un anticuerpo inmovilizado que comprende la región VH y la región VL del anticuerpo 5D5, y d) un anticuerpo inmovilizado que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 49 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 53 (045) , preferiblemente en donde el anticuerpo compite por menos del 25%, tal como al menos el 20% con tal anticuerpo inmovilizado, cuando se determina como se describe en el Ejemplo 17.
4. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque se une al mismo epítopo como un anticuerpo seleccionado del grupo que consisten de: a) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 33 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 37 (024) b) un anticuerpo que comprende una región VH que . comprende la secuencia de SEC ID NO: 65 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 69 (061) c) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 73 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 77 (062) d) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 81 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 85 (064) e) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 89 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 93 (068) f) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 97 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 101 (069) g) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 113 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 117 (098) h) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 121 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 125 (101), y i) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 129 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 133 (181) .
5. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2 ó 4, caracterizado porque comprende una región CDR3 VH que tiene la secuencia como se establece en a) SEC ID NO: 36 (024) b) SEC ID NO: 193, tal como una región CDR3 VH como se establece en SEC ID NO: 68, 76, 84 ó 92 (061, 062, 064, 068) c) SEC ID NO: 196, tal como una región CDR3 VH como se establece en SEC ID NO: 100 ó 132 (069, 181) d) SEC ID NO: 116 (098) , o e) SEC ID NO: 201, tal como una región CDR3 VH como se establece en SEC ID NO: 124 (101) .
6. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2 ó 4, caracterizado porque comprende: a) una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 33, 185 y 36 y una región VL que comprende las secuencias CDR1 , 2 y 3 de SEC ID NO: 37, 39 y 206, tal como un anticuerpo que comprende una región VH que comprende las secuencias CDR1 , 2 y 3 de SEC ID NO: 34, 35 y 36 y una región VL que comprende las secuencias CDR1 , 2 y 3 de SEC ID NO: 38, 39 y 40, (024) b) una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 191, 192 y 193 y una región VL que comprende las secuencias CDR1 , 2 y 3 de SEC ID NO: 78, 79 y 208, tal como un anticuerpo que comprende a. una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 66, 67 y 68 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 70, 71 y 72, (061) b. una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 74, 75 y 76 y una región VL que comprende las secuencias CDR1 , 2 y 3 de SEC ID NO: 78, 79 y 80, (062) c. una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 82, 83 y 84 y una región VL que comprende las secuencias CDR1 , 2 y 3 de SEC ID NO: 86, 87 y 88, (064) , o d. una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 90, 91 and 92 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 94, 95 y 96, (068) c) una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 194, 195 y 196 y una región VL que comprende las secuencias CDR1 , 2 y 3 de SEC ID NO: 209, 210 y 104, tal como un anticuerpo que comprende a. una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 98, 99 y 100 y una región VL que comprende las secuencias CDR1 , 2 y 3 de SEC ID NO: 102, 103 y 104, (069) , o b. una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 130, 131 y 132 y una región VL que comprende las secuencias CDR1 , 2 y 3 de SEC ID NO: 134, 135 y 136, (181) d) una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 197, 198 and 116 y una región VL que comprende las secuencias CDR1 , 2 y 3 de SEC ID NO: 118, 119 y 211, tal como un anticuerpo que comprende una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 114, 115 y 116 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 118, 119 y 120 (098) , o e) una región VH que comprende las secuencias CDRl, 2 y 3 de SEC ID NO: 199, 200 y 201 y una región VL que comprende las secuencias CDRl, 2 y 3 de SEC ID NO: 126, 212 y 128, tal como un anticuerpo que comprende una región VH que comprende las secuencias CDRl, 2 y 3 de SEC ID NO: 122, 123 y 124 y una región VL que comprende las secuencias CDRl, 2 y 3 de SEC ID NO: 126, 127 y 128 (101) .
7. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende: a) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 33 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 37 (024) b) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 65 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 69 (061) c) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 73 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 77 (062) d) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 81 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 85 (064) e) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO : 89 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 93 (068) f) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 97 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 101 (069) g) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 113 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 117 (098) h) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 121 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 125 (101) i) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 129 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 133 (181) ) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 159 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 160 (078) k) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 161 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 162 (084) 1) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 163 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 164 (063) m) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 165 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 166 (087) n) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 137 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 138 (066) o) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 139 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 140 (065) p) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 141 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 142 (082) q) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 143 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 144 (089), o r) una variante de cualquiera de tales anticuerpos, en donde porque la variante preferiblemente tiene a lo sumo 1, 2 ó 3 modificaciones de aminoácido, más preferiblemente sustituciones de aminoácido, tales como sustituciones de aminoácido conservadoras en tales secuencias .
8. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque: - el anticuerpo compite por la unión a cMetECDHis soluble con un anticuerpo inmovilizado, en donde el anticuerpo inmovilizado comprende la secuencia de SEC ID NO: 9 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 13 (006), preferiblemente en donde el anticuerpo compite por más del 50%, tal como más del 75% con tal anticuerpo inmovilizado, cuando se determina como se describe en el Ejemplo 17, y el anticuerpo no compite con la unión a cMetECDHis soluble con un anticuerpo inmovilizado que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 49 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 53 (045), preferiblemente en donde el anticuerpo compite por menos del 50%, por ejemplo menos del 25%, tal como al menos el 20% con tal anticuerpo inmovilizado, cuando se determina como se describe en el Ejemplo 17 y - el anticuerpo se une al dominio SEMA de c-Met, preferiblemente en donde el anticuerpo es capaz de inhibir la unión de HGF al dominio SEMA con un IC50 de menos de 10 pg/ml, tal como al menos el 2 g/ml como se describe en el Ejemplo 9.
9. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque no compite por la unión a cMetECDHis soluble con un anticuerpo inmovilizado que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 33 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 37 (024) , preferiblemente en donde el anticuerpo compite por menos del 25%, tal como al menos el 20% con tal anticuerpo inmovilizado, cuando se determina como se describe en el Ejemplo 17.
10. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque se une al mismo epitopo como un anticuerpo seleccionado del grupo que consisten de: a) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 1 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 5 ( 005 ) b) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 9 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 13 ( 006 ) c) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 25 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 29 ( 022 ) , y d) un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 57 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 61 ( 058 ) .
11. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 8 ó 10, caracterizado porque comprende una región CDR3 VH que tiene la secuencia como se establece en a) SEC ID NO: 181, tal como una región CDR3 VH como se establece en SEC ID NO: 4 ó 12 ( 005 , 006 ) b) SEC ID NO: 28 ( 022 ) , o c) SEC ID NO: 60 (058) .
12. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 8 ó 10, caracterizado porque comprende: a) una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 179, 180 y 181 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 6, 7 y 202, tal como un anticuerpo que comprende a . una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 2, 3 y 4 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 6, 7 y 8, (005), o b. una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 10, 11 y 12 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 14, 15 y 16, (006) b) una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 26, 184 y 28 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 30, 31 y 205, tal como un anticuerpo que comprende una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 26, 27 y 28 y una región VL que comprende las secuencias CDR1 , 2 y 3 de SEC ID NO: 30, 31 y 32 (022), o c) una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 189, 190 y 60 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 62, 63 y 207, tal como un anticuerpo que comprende una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 58, 59 y 60 y una región VL que comprende las secuencias CDR1 , 2 y 3 de SEC ID NO: 62, 63 y 64 (058) .
13. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 8 ó 10, caracterizado porque comprende: a) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 1 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO:' 5 (005) b) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO : 9 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 13 (006) c) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 25 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 29 (022) d) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 57 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 61 (058) e) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 145 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO : 146 (031) f) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 147 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 148 (007) g) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 149 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 150 (011) h) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 151 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 152 (017) i) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 153 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 154 (025), o j ) una variante de cualquiera de tales anticuerpos, en donde tal variante preferiblemente tiene a lo sumo 1, 2 ó 3 modificaciones de aminoácido, más preferiblemente sustituciones de aminoácido, tales como sustituciones de aminoácido conservadoras en tales secuencias .
14. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque: - el anticuerpo compite por la unión a cMetECDHis soluble con un anticuerpo inmovilizado, en donde el anticuerpo inmovilizado comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 49 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 53 (045), preferiblemente en donde el anticuerpo compite por más del 50%, tal como más del 75% con tal anticuerpo inmovilizado, cuando se determina como se describe en el Ejemplo 17, y el anticuerpo no compite con la unión a cMetECDHis soluble con un anticuerpo inmovilizado, en donde el anticuerpo inmovilizado comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 9 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 13 (006) , preferiblemente en donde el anticuerpo compite por menos del 25%, tal como al menos el 20% con tal anticuerpo inmovilizado, cuando se determina como se describe en el Ejemplo 17
15. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque no compite por la unión a cMetECDHis soluble con un anticuerpo seleccionado del grupo que consisten de: a) un anticuerpo inmovilizado que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 17 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 21 (008) , y b) un anticuerpo inmovilizado que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 33 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 37 (024), preferiblemente en donde el anticuerpo compite por menos del 25%, tal como al menos el 20% con tal anticuerpo inmovilizado, cuando se determina como se describe en el Ejemplo 17.
16. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque se une al mismo epítopo como un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 49 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 53 ( 045 ) .
17. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 14 ó 16, caracterizado porque comprende una región CDR3 VH que tiene la secuencia como se establece en SEC ID NO: 188, tal como una región CDR3 VH como se establece en SEC ID NO: 52 ( 045 ) .
18. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 14 ó 16, caracterizado porque el anticuerpo comprende una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 186, 187 y 188 y una región VL que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 54, 55 y 56, tal como un anticuerpo que comprende una región VH que comprende las secuencias CDR1 , 2 y 3 de SEC ID NO: 50, 51 y 52 y una región VL que comprende las secuencias CDR1 , 2 y 3 de SEC ID NO: 54, 55 y 56 ( 045 ) .
19. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 14 ó 16, caracterizado porque comprende: a) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 49 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 53 ( 045 ) b) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 155 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 156 ( 040 ) c) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 157 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 158 ( 039 ) , o d) una variante de cualquiera de tales anticuerpos, en donde la variante preferiblemente tiene a lo sumo 1, 2 ó 3 modificaciones de aminoácido, más preferiblemente sustituciones de aminoácido, tales como sustituciones de aminoácido conservadoras en tales secuencias .
20. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se une al mismo epítopo como un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 17 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 21 ( 008 ) o unión al mismo epítopo como un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 41 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 45 ( 035 ) o unión al mismo epítopo como un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 105 y una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 109 ( 096 ) .
21. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque comprende una región CDR3 VH que tiene la secuencia como se establece en SEC ID NO: 183, tal como una región CDR.3 VH como se establece en SEC ID NO: 20, 44 ó 108 ( 008 , 035 , 096 ) .
22. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el anticuerpo comprende una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 18, 182 y 183 y una región VL que comprende las secuencias CDR1 , 2 y 3 de SEC ID NO: 22, 203 y 204, tal como un anticuerpo que comprende a) una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 18, 19 y 20 y una región VL que comprende las secuencias CDR1 , 2 y 3 de SEC ID NO: 22, 23 y 24 , ( 008 ) , o b ) una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 42, 43 y 44 y una región VL que comprende las secuencias CDR1 , 2 y 3 de SEC ID NO: 46, 47 y 48, ( 03 5 ) , ó c) una región VH que comprende las secuencias CDR1, 2 y 3 de SEC ID NO: 106, 107 y 108 y una región VL que comprende las secuencias CDR1 , 2 y 3 de SEC ID NO: 110, 111 y 112 ( 09 6 ) .
23. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 20 ó 22, caracterizado porque comprende: a) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 17 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 21 ( 008 ) b ) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO : 41 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 45 ( 035 ) c) una región VH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 105 y, preferiblemente, una región VL que comprende la secuencia de SEC ID NO: 109 (096), o d) una variante de cualquiera de tales anticuerpos, en donde la variante preferiblemente tiene a lo sumo 1, 2 ó 3 modificaciones de aminoácido, más preferiblemente sustituciones de aminoácido, tales como sustituciones de aminoácido conservadoras en tales secuencias.
24. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 19, caracterizado porque se une al dominio SEMA de c-Met, preferiblemente en donde el anticuerpo es capaz de inhibir la unión de HGF al dominio SEMA con un IC50 de menos de 10 yg/ml, tal como al menos el 2 g/ml como se describe en el Ejemplo 9.
25. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo se une a células A431 con un EC50 de 10 nM o menor, tal como un EC50 de 2 nM o menor, preferiblemente como se determina de acuerdo al Ejemplo 13.
26. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque es un anticuerpo bivalente .
27. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se une a c-Met con una constante de afinidad (KD) of 20 nM o menor, tal como una afinidad de 5 nM o menor, preferiblemente como se determina de acuerdo al Ejemplo 14.
28. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se une a c-Met del mono Rhesus, preferiblemente en donde la señal la unión del anticuerpo a c-Met de mono Rhesus es al menos 5 veces la del anticuerpo de control negativo, como se determina de acuerdo con el Ejemplo 15.
29. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque inhibe la unión de HGF al dominio extracelular de c-Met, preferiblemente en donde el anticuerpo inhibe la unión en más de 40%, tal como más del 50%, por ejemplo más de 60%, por ejemplo más de 70%, por ejemplo más de 80%, por ejemplo más de 90%, como se determina de acuerdo con el Ejemplo 16.
30. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque es capaz de inhibir la viabilidad de células KP4 , preferiblemente en donde el anticuerpo es capaz de inhibir la viabilidad en más de 10%, tal como más del 25%, por ejemplo más de 40%, preferiblemente como se describe en el Ejemplo 19.
31. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque es un anticuerpo de longitud completa, preferiblemente un anticuerpo IgGl, en particular un anticuerpo IgGl , .
32. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se conjuga con otra fracción, tal como una fracción citotóxica, una radioisótopo o un fármaco.
33. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque es un anticuerpo deficiente de la función efectora, por ejemplo un anticuerpo IgG4 humano estabilizado, tal como un anticuerpo en donde la arginina en la posición 409 en la región constante de cadena pesada de IgG4 humano está sustituido por lisina, treonina, metionina, o leucina, preferiblemente lisina y/o en donde la región de bisagra comprende una secuencia Cys-Pro-Pro-Cys .
34. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque es un anticuerpo monovalente.
35. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el anticuerpo monovalente comprende: (i) una región variable de un anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1 a 23 o una parte de unión de antígeno de tal región, y (ü) una región CH de una inmunoglobulina o uno de sus fragmentos que comprenden las regiones CH2 y CH3 , en donde la región CH o uno de sus fragmentos ha sido modificado de tal forma que la región correspondiente a la región de bisagra y, si la inmunoglobulina no es del subtipo IgG4 , otras regiones de la región CH, tal como la región CH3 , no comprenden ningún residuo de aminoácido, que sea capaz de formar enlaces de disulfuro con una región CH idéntica u otros enlaces inter-cadena pesada covalentes o no covalentes estables con una región CH idéntica en la presencia de IgG humano policlonal.
36. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la inmunoglobulina referida en el paso (ii) es del subtipo IgG4.
37. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 35 ó 36, caracterizado porque la cadena pesada ha sido modificada de tal forma que se ha eliminado la bisagra completa.
38. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque ha sido modificado para hacerlo menos flexible, tal como por medio de mutaciones de la región de bisagra.
39. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque es del subtipo IgGl, and en donde la región de bisagra ha sido modificada: (i) la eliminación de la región de bisagra de la secuencia EPKSCDKTHTCPPCP y sustituyéndola con la región de bisagra IgG2 de la secuencia: ERKCCVECPPCP (IgGl Bisagra-IgG2 ) ; (ii) eliminando la posición 220 de tal forma que la región de bisagra modificada tiene la secuencia de EPKSDKTHTCPPCP (IgGl AC220) ; (iii) sustituir la cisteína en la posición 220 con cualquier otro aminoácido natural (X) de tal forma que la región de bisagra modificada tiene la secuencia de EPKSXDKTHTCPPCP (IgGl C220X) ; (iv) eliminar la región de bisagra de la secuencia EPKSCDKTHTCPPCP (UniCuerpo IgGl) ; (v) la eliminación de la región de bisagra de la secuencia EPKSCDKTHTCPPCP y sustituirla con la región de bisagra IgG3 de la secuencia ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP (IgGl Bisagra-IgG3) ; o (vi) sustituir treonina en la posición 223 con cisteína, y eliminar la lisina en la posición 222 y la treonina en la posición 225, de tal forma que la región de bisagra modificada tiene la secuencia de EPKSCDCHCPPCP (IgGl ??7?6-9) .
40. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la región de bisagra ha sido modificada mediante la sustitución de cisteína en la posición 220 con serina de tal forma que la región de bisagra modificada tiene la secuencia de EPKSSDKTHTCPPCP (IgGl C220S) .
41. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque es del subtipo IgG2.
42. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque ha sido modificado para reducir la nucleo-fucolización por debajo de 10%, tal como por debajo de 5%, según determinado por cromatografía de intercambio de anión de alto rendimiento acoplada con detección amperometrica pulsada (HPAEC-PAD) .
43. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque es un anticuerpo biespecífico, que comprende un sitio de unión c-Met, como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y un segundo sitio de unión a antígeno que tiene una especificidad de unión diferente, tal como una especificidad para una célula efectora humana, un receptor Fe humano, un receptor de célula B o un epítopo no de traslape de c-Met .
44. Una secuencia de nucleótido caracterizada porque una o más de las secuencias de aminoácido seleccionado del grupo que consisten de SEC ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177 y 178.
45. Un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótido de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque además codifica una región constante de cadena ligera operativamente enlazada, una región constante de una cadena pesada o ambas cadenas ligera y pesada de un anticuerpo .
46. Una célula hospedera eucariota o procariota caracterizada porque produce un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 43.
47. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 43 y un portador farmacéuticamente aceptable
48. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 43, para usarse como medicamento.
49. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 43, para usarse en el tratamiento de cáncer, tal como un cáncer dependiente de HGF o un cáncer independiente de HGF.
50. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 43, para usarse en el tratamiento de cáncer, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consisten de: cáncer de vejiga, cáncer de pecho, cáncer cervical, colangiocarcinoma, cáncer colorectal, cáncer del endometrio, cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer de cabeza y cuello, cáncer renal, cáncer hepático, cáncer de pulmón, cáncer nasofaríngeo, cáncer ovárico, cáncer pancreático, cáncer de la vesícula biliar, cáncer de próstata, cáncer tiroides, osteosarcoma, rabdomiosarcoma, sarcoma sinovial, sarcoma de Kaposi, leiomiosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, fibrosarcoma, leucemia mielagenosa aguda, leucemia de célula T en adultos, leucemia mieloide crónica, linfoma, mieloma múltiple, glioblastoma, astrocitoma, melanoma, mesotelioma, tumor de Wilm, y tumores MiT, que incluyen sarcoma de célula transparente (CCS) , sarcoma de la parte suave alveolar (ASPS) y carcinoma de célula renal asociado con translocación.
51. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 49 ó 50, caracterizado porque es para el tratamiento de cáncer en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales, tal como un agente quimioterapéutico .
52. El uso de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 43, para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de cáncer, opcionalmente comprendiendo las características adicionales de conformidad con la reivindicación 49 y 50.
53. Un método para inhibir el crecimiento y/o proliferación de una célula tumoral que expresa c-Met, caracterizado porque comprende la administración, a un individuo en la necesidad del mismo, de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 43.
54. Un método para producir un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 43, caracterizado porque comprende los pasos de: a) cultivar una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 46, y b) purificar el anticuerpo del medio de cultivo.
55. Un método para detectar la presencia de c-Met en una muestra, caracterizado porque comprende: - poner en contacto la muestra con un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 43 bajo condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo y and c-Met; y - analizar si se ha formado un complejo.
56. Un kit para detectar la presencia de c-Met en una muestra caracterizado porque comprende: - un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 43; e - instrucciones para utilizar el kit.
57. Un anticuerpo antiidiotipico caracterizado porque esta frente a un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 43.
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