JPH05504476A - ヒト胃癌検出用診断プローブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 ヒト胃癌検出用診断プローブ ある種の癌を検出し、病気の予後を追跡する診断法として有効と報告されている 癌遺伝子あるいはプロト癌遺伝子（ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ）プローブは 数多く知られている。しかしながら、ヒト胃癌の診断に特異的なプローブは、従 来知られてもいないし、これに関する文献もない。

したがって、本発明の目的は、ヒト胃癌を検出する特異的プローブを与えること である。このユニークなプローブは、思いがけない発見から生まれた。即ち、あ る種の、ヒト癌細胞系（ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ）において、ｍｅｔプロト癌遺伝子 が活性化されるという所見である。ｍｅｔ遺伝子（ｍｅｔ癌遺伝子、ｍｅｔプロ ト癌遺伝子）の特徴は、Ｐａｒｋ　ｅｔ　ａｔ、１９８６、Ｃｅ１ｌ、４５：８ ９５−９０４；Ｐａｒｋｅｔ　ａｌ、１９８７．ＰＮＡＳ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ ｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃ ｅｓ）、８４：６３７９−６３８３およびＧｏｎｚａｔｔ　１−Ｈａｃｅｓｅｔ 　ａｌ、１９８Ｂ、ＰＮＡＳ、８５：２１−２５に記載されている。

材料と方法 ｍｅｔ遺伝子の活性化をテストするのに用いられる様々の方法を以下に述べる。

サザーン・プロ・ ＨＯ３系統、および、いくつかの胃癌細胞系から得たゲノムＤＮＡを、ＥｃｏＲ Ｉで切断し、１％アガロース・ゲルで分画し、ニトロセルロースに移した。プロ ットを２時間加熱・乾燥した。次に、プロットを、４２°Ｃで、４時間、ハイブ リダイゼーション前処理したゆハイブリダイゼーション前処理、ハイブリダイゼ ーションは、５０％ホルムアミド、５×デンハルト（Ｄｅｎｈａ　ｒ　ｔ　ｓ） 、２００μｇ／ｍｌ鮭精子ＤＮＡ、５ｘ　５ＳＰＥ、０．１％ＳＤＳの中で行な った。

プロットを、２Ｘ　ＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中で、室温で、２０分洗浄し、次に 、６８°Ｃで、０．２ＸＳＳＣ，Ｏ５１％ＳＤＳで３回洗浄した。

ノーザンー二ニズー只−ノー上五 全ＲＮＡを、１．１％ホルムアルデヒド・アガロース・ゲルで分画し、ニトロセ ルロースに移した。このニトロセルロースを２時間加熱・乾燥し、次に、５×Ｓ ＣＣで２０分洗浄した。このプロットを、４２°Ｃで、４時間ハイブリダイゼー ション前処理した。ハイブリダイゼーション前処理、ハイブリダイゼーションは 、５０％ホルムアミド、０．１％ＳＤＳ、６Ｘ　５ＳＰＥ、１×デンハルト、２ ００μｇ　／　ｍ　ｌ超音波処理蛙精子ＤＮＡの中で行なった。プロットを、２ Ｘ　ＳＣＣ，０，１％ＳＤＳ中で、室温（約２２〜２４°Ｃ）で、２０分、２回 洗浄し、次に、５５°Ｃで、０．２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳで３回洗浄した。

細胞を、メチオニン、システィンを含まず、１０％牛血清を添加したＤＭＥＭ中 で、予め１５分インキュベートし、次に、２．５ｍＣ１／ｍｌ　”Ｓ−メチオニ ンとシスティンを添加した、上記の培養液中で、３０分標識した。細胞を溶解し 、ｍｅｔを、キナーゼ領域に対向するモノクローナル抗体で、免疫沈澱させた。

免疫沈澱物を、３−１７％勾配ゲルで分画した。蛋白を、フルオログラフィーに よって検出した。

３２ｐ±１ユ１ム 細胞を、リン酸を含まないＤＭＥＭで１５分間予めインキュベートし、次に、０ ．　５ｍＣ１７ｍ　１　”ｐ−正リン酸塩を添加した上記培養液中で２時間標識 した。

ｄ　−にたい　るモノク曙＝［口り生 ｍｅｔ癌遺伝子産物にたいして特異性を持つモノクローナル抗体を産生ずるハイ ブリドーマを、１９８９年１２月１４日に、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙ ｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）。

（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、）に寄託した。寄託番号ばＨＢ　１０３０９であ る。この寄託物は、特許の有効期間中に生存を保てなくなると交換され、預入れ の日付から３０年間、または、寄託標本請求の最後の日付から５年間、のどちら か長い方の期間、保持される。これは、特許の発行が、法の条例の定めるところ により無制限に公衆に公開されると同時に有効になる。

特許商標庁長官は、請求があれば、寄託物を呈示できるようにしておかなければ ならない。

結　果 第１図は、サザーン・プロットで定量した、胃癌細胞系中の遺伝子コピーの数を 示す。ｍｅｔ　ｃＤＮＡの大部分を表すフラグメントを用いて、あらかじめＥｃ ｏＲＩで切断したゲノムＤＮＡをプローブした。交雑ハンドがいくつか検出され た。ＭＫＮ−４５およびＯｋａ　ｊ　ｉｍａ細胞系では、ｍｅｔ遺伝子の著明な 増幅が認められた。このプローブによっては再配置（ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎ ｔ）は検出されなかった。この結果をさらに確かめるために、ＲＮＡレヘルを、 ノーザン・プロントで調べた。いくつかの細胞系から得た全ＲＮＡを、ｍｅｔ細 胞外領域（ｍｅｔ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｄｏｍａｉｎ）を含むフラグ メントでプローブした。全ての細胞系において、９ｋｂｍｅｔ　ＲＮＡが検出さ れた。第２図に示すように、ｍｅｔＲＮＡは、ＭＫＮ−４５およびＯｋａ　ｊ　 ｉｍａ細胞系において過剰な発現を見た。

次に、これら細胞系の内のい（つかについて、ｍｅｔ蛋白の発現と、半減期を、 パルス追跡で調べた。細胞を、３５３で３０分標識し、次に、非放射性培養液（ ｃｏｌｄ　ｍｅｄｉａ）で、１／２．２または４時間追跡した。第３図に示すよ うに、高濃度のｍｅｔ蛋白が、ＭＫＮ−４５系から検出された。蛋白は、正常に 処理されているようであった。ＭＫＮ−７４，ＫＡＴＯＩＩＩ系は、正常な蛋白 濃度を示した。Ｏｋａ　ｊｉｍａ系は、３０分の標識後に、最大量の蛋白を呈し た。これは、高速の合成のあることを示す。この系のｍｅ　ｔｉ白は、１４０形 に処理されるのであるが、４時間の追跡後、１４０はほぼ完全に消失した。これ は、半減期がきわめて短いことを示す。

次に、蛋白が、チロシンで、リン酸化できるかどうかを調べた。細胞を、３Ｚｐ 正リン酸塩で、２時間標識し、蛋白を、フォスフォチロシンに対向する抗体で沈 澱させた。第４図に示すように、ＭＫＮ−４５およびＯｋａ　ｊ　ｉｍａ系の両 方とも、ｐ１４０形上にフォスフォチロシンの存在することを示す。その他の細 胞系のＰ１４０には、過度に、長く露出をしたが、フォスフォチロシンは検出さ れなかった。

第１表は、第１図〜第４図に示したデータをまとめたものである。調べた７細胞 系の内、２種（ＭＫＮ−４５およびＯｋａ　ｊ　ｉｍａ）が、増幅と、ｐ１４０ 上のチロシンのリン酸化を示した。Ｏｋａ　ｊ　ｉｍａ系は、Ｐ１４０に対する 半減期がきわめて短いことで独特である。これらの細胞系を、血清非含有培養液 での成長能力について調べてみると、Ｏｋａ　ｊ　ｉｍａ系だけが、生育できる ことが判明した。注目すべきことは、ｍｅｔは、分化の進んでいない腺癌におい てのみ増幅されることである０分類の分かっている、その他の系として良く分化 した、２種の腺癌と、指輪型癌が試験された。

結果は、ｍｅｔ遺伝子は、分化の遅れた胃癌細胞系においてのみ、増幅され、過 度の発現を見ることを示した。ある細胞系に見られた、急速な物質交代から、癌 の発生には、自己分泌ループが関係するかもしれないことが示唆された。ｍｅｔ 増幅は、分化の遅れた腺癌にのみ観察されたのであるから、ｍｅｔプローブは、 ある腫瘍の達した臨床段階を特徴づけるのにきわめて有用であることは明らかで ある。ｍｅｔ遺伝子産物にたいしモノクローナル抗体を反応させることによって 、ｍｅｔ遺伝子産物を単離、精製することができるだけでなく、標準的な免疫法 、例えば、生体内免疫蛍光法、その他の標準法を用いて、生物標本中に、ｍｅｔ 遺伝子崖物の存在を検出することができる。したがって、ｍｅｔ遺伝子産物の診 断キットは、ｍｅｔ遺伝子産物に対する抗体を容れる容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ ）を含むこととなる。

もちろん、ヌクレオチドやアミノ酸の配列が与えられれば、ｍｅｔ遺伝子あるい はｍｅｔ遺伝子魔物を検出するための、核酸またはポリペプチド・プローブは、 当業者に良く知られた従来技術により容易に作製することができる。この目的の ために有効な核酸プローブは、Ｐａｒｋ　ｅＬ　ａｌ、（前述）、あるいはまた Ｇｏｎｚａｔｔｉ−Ｈａｃｅｓ　ｅｔ　ａｌ、（前述）に記載されている。

特に定義しない限り、ここに用いる技術的、科学的用語はすべて、本発明の所属 する分野の通常の技術を持つ人が普通に理解するものと同一の意味を持つ。ここ に記載したものと同様の、または、等価の方法や材料は、いずれのものでも、本 発明の実行、試験に用いることができるけれども、好ましい方法、材料について 記載した。特に断わらない限り、ここに使用ないし想定する技術は、本技術に通 常の修練を持つものにとっては、よく知られた標準法である。材料、方法、実施 例は、ただ例示のためであって、限定的なものではない。

ここに述べる実施例、具体例は、ただ、例示のためであること、様々な修飾ない し変形は、その例示に照らして見れば、本技術に習熟した人々には自ずから明ら かであり、そのような修飾、変化も、本出願の主旨と技術的範囲、添付の請求の 範囲の中に含まれることが了解されるであろう。

ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ、　４ 要　約　書 ヒト胃癌検出用診断プローブが記載されてｐｓる。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成４年６月２９日 囚

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．標本中のｍｅｔ遺伝子の発現を癌状態を示すものとして検出するべく、適当 なプローブにより、ヒト胃癌標本中に、ｍｅｔ遺伝子の過度の発現を調べること から成るヒト胃癌の臨床段階の検出法。
2. ２．上記ｍｅｔ遺伝子に特異的に結合するＤＮＡフラグメント。
3. ３．上記ｍｅｔ遺伝子による遺伝子産物に特異的に結合する抗体。
4. ４．請求項３の抗体を容れる容器を含む、生物標本中のｍｅｔ遺伝子産物の存在 を検出するための診断キット。
5. ５．陽性免疫反応を上記標本中にｍｅｔ遺伝子産物の存在を示すものとして検出 するべく、ｍｅｔ遺伝子産物の存在を調べるべき生物標本を、請求項３の抗体と 反応させることから成る生物標本中にｍｅｔ遺伝子の存在を検出する方法。
6. ６．請求項３の抗体を利用して、ｍｅｔ遺伝子産物を吸着させ、次に、該吸着ｍ ｅｔ遺伝子産物を純粋な形で回収することから成る精製ｍｅｔ遺伝子産物を単離 する方法。