CN102653783B - 一种hvem基因在制备肝癌诊断和预后预测的产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种HVEM基因在制备诊断肝癌的产品中的应用。本发明还提供一种HVEM基因在制备预测肝癌预后的产品中的应用和一种HVEM基因在制备治疗肝癌的药物中的应用。本发明优点在于：首次发现了HVEM在实体瘤组织的异常表达，本发明的HVEM基因，可作为诊断肝癌和预测肝癌预后的特异标志基因，使肝癌诊断和预后预测更加准确、快速，且为防治肝癌提供了新的治疗靶点和有效新药。

Description

一种HVEM基因在制备肝癌诊断和预后预测的产品中的应用

技术领域

本发明涉及一种HVEM基因的应用，具体地说，是HVEM基因在制备肝癌诊断和预后预测的产品中的应用。

背景技术

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一，目前已居我国肿瘤致死率的第二位，并有逐步增高的趋势，严重危害我国人民的健康。肝癌的治疗目前仍是以手术为主的综合治疗，但中晚期患者常失去手术机会。肝癌的恶性程度高，发展迅速，容易复发，致使目前总体疗效仍不理想，每年死亡人数与新增病例数几乎相等。驾驭免疫系统来攻克肝癌的想法很早以前就有人提出，但是到目前为止都没有取得预期效果。目前的研究认为，肿瘤细胞能通过变异和进化躲避机体的免疫监视，甚至抑制肿瘤特异的免疫应答，最终进入免疫逃逸阶段。在该阶段，肿瘤通过癌细胞本身和肿瘤间质，直接和间接地利用多种机制形成一个免疫抑制的肿瘤微环境，如同一个完善的免疫屏障，使得机体的抗肿瘤免疫无功而返。T淋巴细胞在活化时需要来自抗原受体即T细胞受体第一信号和由一系列表达于细胞表面的共刺激分子传递的第二信号。这些共刺激能调节淋巴细胞活化的程度、性质和持续时间。

疱疹病毒侵入介体（herpes virus entry mediator，HVEM）是肿瘤坏死因子受体超家族中的一员，同时也是属于共刺激分子。HVEM主要表达于初始T细胞、NK细胞、B细胞和单核细胞，也可表达于一些非免疫细胞如肝细胞、肠上皮细胞和平滑肌细胞等。人们发现HVEM能同淋巴毒素α(LTα)和LTα同源分子配体—LIGHT相互作用。由于LIGHT同时具有诱导肿瘤细胞凋亡和共刺激T细胞活化的功能，它有希望为肿瘤的治疗带来新的方法。有研究表明，位于基质细胞、树突状细胞、T淋巴细胞和肿瘤细胞株表面的HVEM与LIGHT结合后，导致肿瘤局部免疫效应细胞显著增加，产生强烈的抗肿瘤免疫，最终清除原发和转移的肿瘤。

近年来肝癌的免疫治疗研究也在不断进行，如细胞因子、自体淋巴细胞活化回输、基于树突状细胞的免疫治疗和甲胎蛋白来源的多肽疫苗等。但是，这些试验的结果都不太理想。对于疗效欠佳的原因，除了免疫治疗措施本身在质和量上存在缺陷之外，肿瘤细胞利用各种免疫逃逸机制来摆脱机体免疫监视也为原因之一。基于此，要想成功实现肿瘤免疫治疗，探索肿瘤的免疫逃逸机制是极其关键的。由于HVEM担当着T细胞活化的开关分子作用，对T细胞的免疫反应起着共刺激信号，所以HVEM的异常表达，可能在T细胞介导的免疫增强中具有重要作用。绝大多数对HVEM免疫调节的研究，针对的是表达于免疫细胞表面的HVEM分子。

中国专利文献CN：101896198A公开了一种治疗血液恶性肿瘤和自身免疫疾病的HVEM配体，该发明涉及治疗血液恶性肿瘤，尤其是慢性淋巴细胞型白血病，以及治疗自身免疫性疾病的HVEM配体。中国专利文献CN：1891714A公开了一种单纯疱疹病毒进入介体HVEM的新配体（p30），p30可用于调节免疫应答并可用于抑制疱疹病毒感染，也提供应用该发明p30治疗淋巴细胞疾病患者或患有或怀疑患有疱疹病毒感染的患者的方法。但是关于HVEM在实体肿瘤中的研究及其临床意义，以及HVEM在抗肿瘤中的作用机制目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种HVEM基因在制备诊断肝癌的产品中的应用。

所述的诊断肝癌的产品包括：用RT-PCR、实时定量PCR或免疫检测诊断肝癌的产品。

所述的用RT-PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增HVEM基因的引物。

所述的用实时定量PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增HVEM基因的引物。

所述的用免疫检测诊断肝癌的产品包括与HVEM蛋白特异性结合的抗体。

本发明的再一的目的是，提供一种HVEM基因在制备预测肝癌预后的产品中的应用。

本发明的第三个的目的是，提供一种HVEM基因在制备治疗肝癌的药物中的应用。

本发明优点在于：

首次发现了HVEM在实体瘤组织的异常表达，本发明的HVEM基因，可作为诊断肝癌和预测肝癌预后的特异标志基因，使肝癌诊断和预后预测更加准确、快速，且为防治肝癌提供了新的治疗靶点和有效新药。

附图说明

附图1是Real-time PCR结果图。

附图2是实时定量PCR结果图。

附图3是Western-blot结果图。

附图4是HVEM在肝癌组织显著低表达。

附图5是HVEM在癌旁肝组织显著高表达。

附图6是肝癌组织中HVEM表达较低者与较高者的无瘤生存率和总体生存率比较。

附图7是各细胞株HVEM的表达情况。

附图8是合成用于转染HVEM的质粒。

附图9是成功转染SMMC-7721。

附图10是上调HVEM后的SMMC-7721增殖减低。

附图11是划痕实验示转HVEM组的肝癌细胞迁移能力明显下降。

附图12是Transwell分析细胞侵袭能力。

附图13是上调HVEM后的SMMC-7721成瘤的HE染色。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例 1 HVEM 在肝癌和癌旁的表达情况

1.材料与方法

1.1实验材料

1.1.1组织标本

免疫组织化学用组织来源：103例肝癌（HCC）及相对应的癌旁组织石蜡切片来自东方肝胆外科医院病理科2004年1月-2004年6月行肝癌根治性切除术标本。

Realtime-PCR、Western-blot用组织来源：2009年1月-2009年6月东方肝胆外科医院行肝癌根治性切除术的新鲜组织标本。

1.1.2主要试剂

⑴ 免疫组织化学用试剂：

一抗（所用浓度1：200），HVEM（N-19,SC-7766），Stanta公司；抗体稀释液（长岛公司）；二抗（所用浓度1：200），HRP 标记的兔抗羊 IgG，ICL公司；用0.01M PH7.4 PBS稀释；BSA（鼎国生物）；1%BSA （0.01M PBS PH7.4 10ml+ BSA 100mg）；

抗原修复液：

原液A液 （0.1M） 21.01克 C6H8O7.H2O (枸橼酸）+ 1000ML双蒸水

B液 （0.1M) 29.14克 C6H5Na3O7.2H2O(枸橼酸钠）+1000ml双蒸水

配液 0.01M枸橼酸缓冲液 PH =6.0+0.1~6.0-0.1 ，A液 9ml，B液 41ml

450 ml双蒸水，共500ml；DAB显色试剂盒：DAKO公司，按说明书操作；另外过程中浸洗所用PBS均为 0.01M PH7.4 溶液。

⑵ Realtime-PCR试剂

5×RT缓冲液，2.5 mM dNTP混合液，引物：见表1。

表1 HVEM和actin mRNA RT-PCR检测引物

基因名称	序列	合成
			actin -F	5’- ACAGAGCCTCGCCTTTGCCG -3’	上海捷瑞
actin -R	5’- TGGGCCTCGTCGCCCACATA -3’	上海捷瑞
			HVEM-F	5’- GACTGGGGGCCTCCTCCCTG -3’	上海捷瑞
HVEM-R	5’- CCGCAGGCCTCCTTCACACG -3’	上海捷瑞

⑶ Western Blot 试剂

30%丙烯酰胺溶液，8%分离胶（10ml），5%积层胶（4ml），1 mol/L二硫苏糖醇（DTT）储存液，5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液储存液，转移缓冲液，10×Tris缓冲液(TBS)，丽春红S染液，抗体（一抗加5%小牛血清5ml和50ul叠氮钠，终浓度为1-2ul/ml，二抗加5%脱脂奶粉5ml），封闭液（脱脂奶粉2g加入1×TBST 40ml 中）。

1.2 实验方法

1.2.1实时定量PCR检测

（1）肝癌细胞总RNA提取

取50mg肝癌组织，加入1ml Trizol冰上匀浆，将裂解物移入1.5ml Eppendorf管，室温静置5min，加入氯仿0.2ml，用力颠倒Eppendorf管数次，静置5min，12000×g离心10min，将上层水相移入另一个Eppendorf管，加入0.5ml异丙醇，振荡混匀，静置5min，12000×g离心5min，管底可见RNA白色沉淀物，弃液体，加入75%乙醇1ml，振荡1min，7500×g离心5min，弃乙醇，室温静置5~10min，待乙醇挥发至RNA沉淀物刚好干燥，加入30ul DEPC双蒸水，溶解RNA后，测OD260值，-80℃保存（OD260=1时，RNA浓度为40μg/ml）。

（2）逆转录反应（RT）

RNA 2μg、Oligo d(T)18 0.5μg、DEPC双蒸水12ul，70℃ 10min，迅速置冰上，7500×g离心1min，将溶液集中到管底，加：5×RT反应缓冲液5ul、10mM dNTP 1.25ul、M-MLV RT 200U、rRNasin® Ribonuclease Inhibitor 25U、DEPC双蒸水，加至终容积25ul，37℃温育60min，70℃变性15min，获得RT产物（cDNA），-20℃保存或进行PCR反应。

（3）realtime PCR反应

cDNA 1ul

SYBR Premix Ex TaqTMII( 2×) 10ul

上游引物 1ul

下游引物 1ul

双蒸水 加至终体积20ul

PCR条件：94℃预变性5秒，以94℃5秒，60℃30秒为一个循环，进行40个循环。

（4）PCR及琼脂糖凝胶电泳

RT反应产物 1ul

2×PCR反应混合液 10ul

引物1 1ul

引物2 1ul

双蒸水 加至终体积20ul

PCR条件：94℃5秒，60℃30秒，40个循环，取PCR产物10ul，加6×琼脂糖凝胶加样缓冲液2ul上样，1%琼脂糖凝胶电泳（EB染色），电泳缓冲液采用0.5×TAE缓冲液，SX-100紫外成像仪成像，记录结果。

1.2.2 Western Blot

铺好5%积层胶和8%的分离胶，按照SDS-PAGE要求对蛋白进行分离，80伏，跑到溴酚蓝离底边约为1cm处，转移前，将PVDF薄膜和滤纸切成分离胶大小，PVDF薄膜甲醇中浸泡5-10分钟，膜、滤纸以及分离胶在转移液中浸泡15-30分钟。将分离的蛋白质转移到PVDF薄膜上，电压30伏，过夜，清水洗涤一次，用丽春红染色以观察转移情况，充分洗去丽春红，将PVDF薄膜细条置于5%的脱脂奶中，封闭2小时，室温，或4度过夜。TBST洗涤15分钟，三次，将PVDF薄膜与一抗反应，室温，2小时，TBST洗涤15分钟，三次，与二抗反应，室温，2小时，TBST洗涤15分钟，三次，在PVDF膜上加入ECL显色溶液,全膜润湿1分钟，暗室压片，曝光 (根据条带及背景强弱调整压片时间)。

1.2.3 免疫组织化学染色

⑴ 实验过程

石蜡切片脱蜡至水；3%H2O2 甲醇液室温孵育 20 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性；蒸馏水冲洗，ddH2O 浸泡5分钟x3；抗原修复（高压）：0.01M枸橼酸盐缓冲液，大火加热至沸腾（没过玻片），放玻片架高压，加热至喷气时，开始计时2min，关火自然冷却；ddH2O 5 分钟 x2；0.01MPBS洗 5min；1% BSA封闭，37℃孵育30分钟，倾去血清，勿洗。滴加一抗工作液（1：200），4℃过夜；4℃取出复温15min；0.01M PBS冲洗，5分钟x4次。滴加二抗工作液（1：200），37℃孵育30分钟；0.01M PBS冲洗，5分钟x4次；DA显色3-10min，镜观（视情况，反应出现明显砖红色即终止)；终止反应甩去DAB，ddH2O洗5分钟x4次；苏木素复染5-10min，dH2O洗，盐酸酒精分化；自来水充分冲洗，反蓝2-5min；脱水，透明，封片。

⑵ 免疫组化染色评价及统计学分析

免疫组化染色分析，使用上海求为生物科技有限公司MIQAS医学图象定量分析系统、医学图象定量分析软件，JVC TK―C1481BEC 彩色摄象机， OLYMPUS BH2 生物显微镜，NIKON 4500数码相机。操作时每张片子随机选取3个200倍视野进行观察，分析每个视野的阳性区域面积和光密度值。免疫组化染色强度指数=阳性区域面积×光密度值/总面积。由两位病理学医师在不知临床病理资料的情况下对免疫组化的结果进行复阅。

2. 实验结果

2.1 Real-time PCR结果提示HVEM在肝癌、癌旁和远隔处的肝组织的表达存在差异

Real-time PCR结果提示HVEM在肝癌组织表达较低，癌旁和远隔处的正常肝组织的表达较高。请参照附图1，附图1是Real-time PCR结果图，C-肝癌；N-正常肝；P-癌旁。HVEM在癌旁和远隔的正常肝细胞中有较高表达，而在肝癌中显著低表达。经统计分析，HVEM在肝癌组织中的表达显著低于与癌旁和远隔肝组织中的表达。前者与后二者差异有统计学意义（P<0.05）。而癌旁和远隔正常肝组织中的表达差异不显著。请参照附图2，附图2是实时定量PCR结果图，实时定量PCR显示HVEM在肝癌(C)与癌旁(P)和远隔正常肝细胞(N)中的表达差异均有统计学意义（P<0.05）。

2.2 Western-blot结果提示HVEM在肝癌、癌旁和远隔处的正常肝组织的表达存在差异

Western-blot结果提示结果提示HVEM在肝癌组织表达较低，癌旁和远隔处的正常肝组织的表达较高。请参照附图3，附图3是Western-blot结果图。Western-blot显示：HVEM在癌旁和远隔的正常肝细胞中有较高表达，而在肝癌中显著低表达。C-肝癌；N-正常肝；P-癌旁。

2.3 免疫组化结果：HVEM在肝癌和癌旁组织的表达差异

免疫组化结果显示所检测的HVEM分子在癌旁组织的肝细胞中存在强弱不等的表达，肝细胞胞浆有表达，胞浆表达包括胞质和细胞器（以下同）；肝癌组织的肿瘤细胞中也存在一定程度表达，与癌旁组织相比呈现显著的低表达。请参照附图4和附图5，附图4是HVEM在肝癌组织显著低表达，200×。附图5是HVEM在癌旁肝组织显著高表达，200×。

在103例肝癌根治性切除术后的病人，HVEM在肝癌组织和癌旁组织中的表达强度，对其统计学结果分析显示：HVEM在肝癌中的表达强度显著低于癌旁组织的表达强度 （P<0.01）。

2.4 HVEM在肝癌组织的表达与病人的临床预后相关

全组103例病人的临床病理特点，经统计分析发现HVEM高表达与低表达和病人的肿瘤大小和TNM分期这两个临床病理特征有关。

作生存分析发现：肝癌组织中HVEM表达较低者与肝癌组织中HVEM表达较高者相比，中位至复发时间（TTR）分别为6.7月 vs 23月，二者差异有统计学意义（p<0.001）；中位生存时间分别为11.4 vs 34.1 月，二者差异有统计学意义（p<0.001）；其1，3，5年无瘤生存率（图6.A.）和总体生存率（图6.B.）均有显著差异，肝癌组织中HVEM表达越低者，预后越差。请参照附图6，附图6是肝癌组织中HVEM表达较低者与较高者的无瘤生存率和总体生存率比较。A. 肝癌组织中HVEM表达较低者与肝癌组织中HVEM表达较高者相比，其1，3，5年无瘤生存率显著较低(P<0.001); B. 肝癌组织中HVEM表达较低者与肝癌组织中HVEM表达较高者相比，其1，3，5年总体生存率显著较低(P<0.001)。

对于无瘤生存率，单因素分析显示：高HVEM表达、肿瘤大小≤5cm、无微血管侵犯和较低的TNM分期与较高的无瘤生存率有关，见表2。Cox比例风险模型提示肝癌中的HVEM表达高低对于无瘤生存率为独立预后因子；肝癌组织中HVEM表达较高者与表达较低者对于复发的相对危险度HR=0.086，p=0.002，见表3。

对于总生存率，单因素分析显示：高HVEM表达、肿瘤大小≤5cm、肿瘤单发、无微血管侵犯、无肝硬化和较低的TNM分期与较高的总体生存率有关，见表2。Cox比例风险模型提示肝癌中的HVEM表达高低对于总体生存率为独立预后因子；肝癌组织中HVEM表达较高者与表达较低者对于死亡的相对危险度HR=0.05，p=0.001，见表3。

表2 单因素分析病人的临床病理特征与DFS和OS的关系

表3 多因素分析病人的临床病理特征与无瘤生存率和总生存率的关系

实施例 2 HVEM 对肝癌细胞生长和转移的作用

1. 材料和方法

1.1材料

细胞系：人肝癌细胞系SMMC-7721、HepG2、Hep3B及干细胞株Chang和HL-7702由本实验室保存。

细胞培养试剂：新生小牛血清（NCS）、胎牛血清（FBS）、DMEM培养基和胰蛋白酶均购自Gibco公司。

三气培养箱：低氧培养用N2-O2-CO2培养箱（MCO-18M）为日本SANYO公司产品。

高纯氮（N2）：N2（≥99.999％）购自上海成功气体工业有限公司。

试剂盒：质粒小量抽提试剂盒QIAprepR Miniprep Kit购自Qiagen公司； Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；转染试剂FuGENER HD Transfection Reagent购自Roche公司。

细菌培养试剂：胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉为晶美生物工程公司产品。

其它生化试剂：3-MA、PI和LY294002均购自Sigma公司，DAPI染色液购自碧云天。

细胞培养有关溶液：1×PBS缓冲液，DMEM细胞培养液，0.25%胰蛋白酶溶液，MTT溶液。

1.2方法

1.2.1细胞低氧培养

细胞置N2-O2-CO2培养箱，调节气体浓度为94% N₂，5% CO₂和1% O₂，37℃培养。

1.2.2 Realtime PCR筛选低HVEM表达的细胞株

Realtime PCR方法同实施例1。

1.2.3化学发光法检测HVEM启动子活性

（1）质粒构建

从NCBI 中查找到人HVEM基因全长mRNA序列（NCBI Reference Sequence: NM_003820.2 ）；采用GeneTool-Lite-Install软件将SDS序列进行分析，并据此设计引物，引物序列为：

HVEM-F CCGCTCGAGCATGGAGCCTCCTGGAGACTGG

HVEM-R GGAATTCTCAGTGGTTTGGGCTCCTCC；

以人cDNA做模板用引物做RT-PCR，得到PCR产物；用Xho 1和EcoR 1酶切PCR产物及PIRES2-EGFP，连接转化到感受态细胞

（2）感受态细菌的制备

取5μl DH5α甘油菌于5ml液体LB培养基，225rpm 37℃振荡培养过夜，制备过夜菌；按1：100将过夜菌接种到液体LB培养基中，225rpm 37℃振荡培养2-3小时，OD值约为0.4时停止培养；1.5ml Ependorf管收集菌液，4000 rpm，10分钟沉淀细菌，弃上清，重复三次；加入冰预冷的100mM CaCl2溶液，200μl/管，重悬沉淀，冰浴30分钟；4000 rpm，10分钟沉淀细菌，弃上清，加入冰预冷的100mM CaCl2溶液，100μl/管；冰浴2小时，4℃保存备用，（不用者加30％无菌甘油-80℃保存）。

（3）质粒转化

40-100ng待转化质粒与感受态菌混匀，冰浴30分钟；42℃水浴热休克1.5分钟；加入0.5ml不含抗生素液体LB培养基，225rpm 37℃振荡培养0.5-1小时；取200μl涂布于含100μg/ml kan的LB固体培养基；待液体全部吸收后，37℃倒置培养过夜。

（4）质粒的抽提

挑取数个转化的单菌落，每个菌落分别接种于5ml含100μg/ml kan的液体LB培养基，225rpm 37℃振荡培养过夜；收集细菌，10000rpm，30秒；按质粒抽提试剂盒提取质粒；分光光度仪检测质粒浓度；酶切及测序鉴定阳性结果。

（5）质粒转染SMMC-7721细胞（参照LIPOFECTAMIN2000 24孔板转染步骤）

转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在次日细胞密度达90％，细胞铺板在0.5ml含血清不含抗生素的培养基中；对于每孔细胞，以0.5μl无血清培养基稀释0.4μg质粒DNA，0.5μl无血清培养基稀释1μl LIPOFECTAMIN2000,两者在5分钟内混合；室温保温20分钟；将细胞培养板中培养基替换为0.5ml有血清培养基，加入上述复合物；在37℃，5％CO2中保温4-5小时后更换为完全生长培养基；药物处理36小时后，检测报告基因活性。

（6）检测荧光素酶报告基因活性（参照Promega荧光素酶双检测系统），计算荧光素酶活性和海参荧光素酶活性的比值。

1.2.4 MTT比色实验

肝癌细胞接种至96孔板，按细胞数103～104/孔，37℃培养24h；药物处理72h；每孔（200μL培养液）加MTT溶液(5mg/ml)20μL，37℃孵育4 h，终止培养，小心吸弃上清（尽量避免吸出紫色颗粒）；加150μlDMSO/孔，振荡溶解10min，至显微镜下见不到紫色颗粒；选择570 nm波长，酶标仪上检测各孔吸光度值（OD₅₇₀）；按如下计算公式计算细胞死亡率，作为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

1.2.5划痕实验

细胞长满单层后, 分别用单纯SMMC-7721、转染空质粒的SMMC-7721和转染HVEM基因的SMMC-7721做划痕试验, 用200μL枪头在中间划一横线, 之后0、24 h分别观察照相。

1.2.6 Transwell实验检测细胞的运动迁移能力

300ul无血清DMEM冲洗小室2次；加1：6稀释的Martrigel胶（美国BD公司）20ul，摇匀使其铺满上室底部，放入培养箱20-30分钟使其凝固，做成人工基底膜；上室加入1*10⁵个细胞，总体积200ul；下室加入300ul含血清培养液，37℃培养20h进行观察；吸干下室培养液，加入4%多聚甲醛，固定30分钟；吸出多聚甲醛后自来水冲洗3次；下室加入Gimsa染液染色5分钟；小心用棉签擦掉上室膜上细胞，计数基底膜下室面细胞数；200倍光镜下随机选择8个视野进行计数，取其平均值作为穿过人工基底膜的细胞数量。

1.2.7裸鼠成瘤实验

（1）细胞接种：

BALB／C-nu／nu裸鼠(由中科院上海实验动物中心提供)，4周龄，雌雄兼用，随机分成3组，每组5只，共15只裸鼠。在裸鼠室(SPF级动物实验室，由第二军医大学实验动物中心提供)饲养一周适应新环境后，将稳定筛选后的转染HVEM、转染空载体质粒和未转染的SMMC-7721细胞用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化，PBS沈1次，计数，调整细胞浓度为5*10⁶细胞/ml浓度，取0.2ml/只接种存BALB/C-nu/nu裸鼠左侧颈背部皮下组织中，继续放进裸鼠室内的超净生物层流架(SST-CT-I型，上海佘山净化设备厂)中无菌饲养。

（2）成瘤观察及样本处理：

瘤细胞种植后，每三天记录一次肿瘤生长情况，当瘤细胞接种后8周，最大肿瘤已长至1.5cm直径时，用颈椎脱臼术处死裸鼠，将各裸鼠照相，并测量各移植瘤的大小及重量，计算各组裸鼠的成瘤率，并进行大体解剖各主要脏器和区域淋巴结等，对各组标本经10％中性福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋，HE染色进行形态学观察。

1.2.8 统计学检验

所有实验数据均以Means±SD 表示，并用SPSS 17.0软件作Student-T-test分析，以P<0.05为统计学上有显著差异。

2. 结果

2.1筛选出低表达的肝癌细胞株

通过real-time PCR从多数肝癌细胞株成功地筛选出低表达的肝癌细胞株SMMC-7721。请参照附图7，附图7是各细胞株HVEM的表达情况。Realtime PCR显示HVEM在肝癌细胞株SMMC-7721中的表达极低。

2.2成功构建质粒，可进一步用于转染肝癌细胞株，上调HVEM的表达

提取肝癌组织的RNA做逆转录，得到cDNA，设计引物：

HVEM-F CCGCTCGAGCATGGAGCCTCCTGGAGACTGG

HVEM-R GGAATTCTCAGTGGTTTGGGCTCCTCC

用引物做RT-PCR，得到PCR产物，用Xho 1和EcoR 1酶切PCR产物。克隆、测序，得到阳性克隆，将重组体命名为pIRES2-EGFP-HVEM。请参照附图8和附图9，附图8是合成用于转染HVEM的质粒，附图9是成功转染SMMC-7721。A.转染成功后，实时定量PCR测定的SMMC-7721的HVEM表达情况；B.荧光显微镜下观察是否转染成功，绿色荧光表示转染成功。

2.3 HVEM对肝癌细胞生长的影响

MTT检测结果显示上调HVEM后的SMMC-7721，其增殖减低。其OD值分别为：转染HVEM的SMMC-7721组：0.98±0.104；转染空质粒的SMMC-7721组：1.65±0.107；SMMC-7721组：1.7±0.12；P<0.05。请参照附图10，附图10是上调HVEM后的SMMC-7721增殖减低。

2.4 HVEM对肝癌细胞迁移能力的影响

细胞划痕实验检测细胞迁移能力，与对照组及空载体组相比，转染HVEM组的肝癌细胞迁移能力明显下降，请参照附图11，附图11是划痕实验示转HVEM组的肝癌细胞迁移能力明显下降。Transwell实验检测细胞侵袭能力，与对照组及空载体组相比，转染HVEM组的肝癌细胞侵袭能力明显下降，请参照附图12，附图12是Transwell分析细胞侵袭能力，与对照组及空载体组相比，转HVEM组的肝癌细胞侵袭能力明显下降。

2.5 HVEM对肝癌细胞裸鼠成瘤能力的影响

转染HVEM的SMMC-7721形成肿瘤的重量明显小于转染空质粒的SMMC-7721和未转染的SMMC-7721。各组移植瘤重量分别为：转染HVEM的SMMC-7721组：0.43±0.05克；转染空质粒的SMMC-7721组：0.85±0.06克；SMMC-7721组：0.88±0.08克，P<0.05。各组成瘤率分别为：转染HVEM的SMMC-7721组：20%；转染空质粒的SMMC-7721组：70%；SMMC-7721组：80%，P<0.05。经HE染色在显微镜下观察移植瘤组织切片发现SMMC-7721细胞移植瘤肝癌细胞的形态没有发生改变，提示移植是成功的，请参照附图13，附图13是上调HVEM后的SMMC-7721成瘤的HE染色。

以上结果显示，HVEM在肝癌中具有抑制肿瘤细胞生长、浸润、转移的功能。提示我们考虑可以通过上调肿瘤细胞内的HVEM的表达来抑制肿瘤增殖、迁移等途径来抑制肿瘤的生长。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种检测HVEM基因的引物在制备诊断肝癌的产品中的应用，其特征在于，所述肝癌中HVEM基因显著低表达，在癌旁和远隔的正常肝细胞中HVEM基因有较高表达。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的诊断肝癌的产品包括：用RT-PCR、实时定量PCR或免疫检测诊断肝癌的产品。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的用RT-PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增HVEM基因的引物。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的用实时定量PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增HVEM基因的引物。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的用免疫检测诊断肝癌的产品包括与HVEM蛋白特异性结合的抗体。

6.一种检测HVEM基因的引物在制备预测肝癌预后的产品中的应用，其特征在于，所述肝癌中HVEM基因显著低表达，在癌旁和远隔的正常肝细胞中HVEM基因有较高表达，肝癌组织中HVEM表达越低者，预后越差。

7.一种HVEM基因在制备治疗肝癌的药物中的应用，其特征在于，所述肝癌中HVEM基因显著低表达，在癌旁和远隔的正常肝细胞中HVEM基因有较高表达。

Images