CN107841485B - 一种心肌环的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于动物细胞培养技术领域，涉及一种心肌环的培养方法。步骤如下：心脏样品的预处理，制备心室肌样品组织小块；心室肌样品组织小块的消化和终止；收集终止消化后的上清液进行培养，制备初期心肌环细胞液；对初期心肌环细胞液进行细胞换液后，观察心肌环的动态生长。本发明体外分离培养心肌细胞时，发现了心肌环样结构，并初步命名为“心肌环”，对心肌环细胞组分、形成机制及其分化潜能进行详尽研究非常必要；阐明此结构对进一步研究心肌干细胞功能及其分子调节机制、丰富种子细胞来源、研发心肌再生的新途径等具有重要意义，为心脏干细胞的自我更新和分化调控提供理论依据，为临床治疗缺血性心脏病提供新的思路。

Description

一种心肌环的培养方法
技术领域
本发明属于动物细胞培养技术领域，涉及一种心肌环的培养方法。
背景技术
传统观念认为，心脏是终末分化器官，不能进行内源性修复。近年来，从心脏中分离出的c-kit+和sca-1+细胞，增殖迅速，能分化为心肌、平滑肌和内皮细胞，称为心脏干细胞。这些干细胞能够参与维持心肌稳态和病理修复。依据其表达细胞标志物等多种因素，分为纯化的心脏干细胞和混合心脏干细胞。纯化的心脏干细胞有c-kit+细胞、sca-1+细胞、CD117+细胞、Isl+细胞、侧群细胞即SP细胞等。混合心脏干细胞包括心肌球（cardiosphere,CSP）和心肌球源性干细胞（cardiosphere derived cells, CDCs）。心肌球是将心内膜活检获取的心脏组织块，培养14-28 d，通过酶消化法获取向外生长的细胞，并将这些细胞悬浮培养获得球样成簇的混合细胞团。心肌球可分为两层：中心是可增殖的原始细胞层，表达c-kit等干细胞标记，外层是间质细胞和分化细胞层，表达CD105、CD90及心肌细胞特异性蛋白cTnT、缝隙连接蛋白Cx43等。体外培养的CSP和CDCs均具有较强的向心肌细胞分化和血管再生的能力，并能产生多种血管生成因子和抗凋亡因子；体内实验表明，小鼠、大鼠和猪的心肌梗死模型中，CSP和CDCs移植均能发挥良好的治疗作用，包括降低梗死区域面积和心室重塑，增加有功能的心肌细胞和毛细血管密度，促进局部室壁运动，提高心室功能等。Cho等将CDCs再次经过体外成球培养形成次级心肌球，注入到小鼠心肌梗死模型后，发现次级心肌球较心肌球更能明显提高迁移能力，促进新生血管生成，改善心功能、缩小梗死面积，其机制还有待进一步阐明。
1978年，Schofield 提出造血干细胞龛(Hematopoietic stem cell niche)，用以描述造血干细胞(Hematopoietic stem cells，HSCs)所处的微环境。早期的组织学与解剖学的研究已经发现HSCs的微环境是由骨髓基质细胞(成纤维细胞、成骨细胞、成脂肪细胞、内皮细胞、巨噬细胞等)和细胞外基质(I、Ⅲ、Ⅳ型胶原、蛋白聚糖、氨基聚糖、纤维结合蛋白、层粘连蛋白等)共同构成。近期研究表明造血干细胞龛可调控信号的协调整合，防止干细胞更新与分化的过度，维系着组织正常功能。分化过度、削弱自我更新，可致干细胞枯竭；而干细胞自我更新过度，则阻碍级别分化，扩增过快，甚至向肿瘤转化。自2003年发现心脏干细胞后，众多学者也开始关注心脏干细胞龛（cardiac stem cell niche），心脏干细胞在龛内成簇分布，可以表达c-kit，心肌转录因子Nkx2.5，α-横纹肌肌动蛋白（α-sarcomericactin，α-SCA），龛内还有平滑肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞分布，但对其在心肌中的分布、龛中细胞组分及增龄和疾病时变化、调控心脏干细胞稳定和分化的分子机制，目前还不清楚。
发明内容
本发明发现了体外培养的心脏干细胞自发形成的一种新的微环境，为解决心脏干细胞体外调控机制的技术难题，公开了一种心肌环的培养方法。
为解决上述技术难题，本发明采用以下技术方案：
一种心肌环的培养方法，步骤如下：
（1）心脏样品的预处理，制备心室肌样品组织小块；
（2）心室肌样品组织小块的消化和终止；
（3）收集终止消化后的上清液进行培养，制备初期心肌环细胞液；
（4）对初期心肌环细胞液进行细胞换液后，观察心肌环的动态生长。
所述步骤（1）的具体操作为：无菌条件下取出心脏样品，于PBS溶液中漂洗3-4次后，从漂洗后的心脏样品上取心室肌样品组织并剪成0.5-1.5mm3小块。
所述步骤（2）的具体操作为：分批次将心室肌样品组织小块置于无菌离心管中，加入0.25%胰酶和0.1%Ⅰ型胶原酶，吹打40-50次后置于37℃恒温水浴箱中消化5-10min，取细胞悬液加入与细胞悬液等量的完全培养基终止消化，重复至样品组织消化完全。
所述步骤（3）的具体操作为：收集各批次终止消化后的上清液，1000rpm离心10min，弃上清，加完全培养基悬浮细胞沉淀并接种于培养瓶中，将培养瓶置于37℃、5%CO2的培养箱中培养1.5h，形成细胞悬液，将悬液平均接种到培养板内，于37℃、5%CO2的培养箱中培养48小时，得初期心肌环细胞液。
所述步骤（4）的具体操作为：将步骤（4）中的初期心肌环细胞液进行细胞换液处理后，在活细胞工作站内培养，每隔2-3天更换完全培养基，至心肌环成形。
所述心脏样品取自5-10只出生1-3天的SD大鼠。
所述PBS溶液于4℃预冷，完全培养基于37℃预热。
所述0.25%胰酶和0.1%Ⅰ型胶原酶的加入体积比为1:1。
本发明的有益效果在于：本发明体外分离培养心肌细胞时，除观察到心肌球、干细胞龛之外，发现了心肌环样结构，并初步命名为“心肌环”cardio-annulation，并对心肌环细胞组分、形成机制及其分化潜能进行详尽研究；推测心肌环可能是心肌干细胞在体外存在的另一种新的结构，阐明此结构对进一步研究心肌干细胞功能及其分子调节机制、丰富种子细胞来源、研发心肌再生的新途径等具有重要意义，也可为心脏干细胞的自我更新和分化调控提供理论依据，为临床治疗缺血性心脏病提供新的思路。
附图说明
图1为心肌环的形态示意图，Bar=200μm，其中A为培养8d心肌环的肉眼观察图，B：培养4d的闭合圆环形的心肌环；C：培养10d的闭合心形心肌环；D：被环壁分割为两大小不等的心肌环。
图2为心肌环壁及环内细胞形态示意图，Bar=50μm，其中A为环壁细胞的三个区，*表示环内，1、2、3分别表示环壁的内中外区，细胞形态、排列结构明显不同；B为伸入环内的环壁两侧多为小圆亮的干细胞；C为环内的telocytes；D为图C方框部分的放大图，▲示telocytes的胞体，↑示telocytes的突起。
图3为心肌环细胞种类的免疫荧光鉴定图。
具体实施方式
一、材料和方法
1. 实验动物
出生1-3d SD大鼠共80只，雌雄不限，体重平均7.3±0.62g，由新乡医学院实验动物中心提供。
心肌环细胞的分离培养和鉴定
出生1-3d SD大鼠8只浸泡于75%酒精5s，超净工作台内无菌条件下开胸取心脏，放入4℃无菌PBS液中，漂洗3-4次，洗去残存血液，去除与心相连大血管、心耳等组织，用眼科剪将心室肌组织剪成约1mm3小块。置于50mL无菌离心管中，加入0.25%胰酶（Sigma公司）和0.1% Ⅰ型胶原酶（Sigma公司）各2mL，吸管机械吹打1min后放入37℃恒温水浴箱中消化7min，取出吹打40-50次，待组织块沉淀，吸取细胞悬液，加入与细胞悬液等量的完全培养基终止消化，该完全培养基含12%胎牛血清的低糖DMEM（美国Hyclone公司）。余组织块按上述方法重复7-8次至组织块基本消化完毕。收集各次终止消化后的上清液，1000rpm离心10min，弃上清，加完全培养基悬浮细胞沉淀并接种于培养瓶中。放于37℃、5%CO2培养箱中培养1.5h，待心肌成纤维细胞贴壁后，小心吸取上清液，平均接种到12孔板内，放入培养箱培养。48h后首次细胞换液，以后每天在倒置显微镜和活细胞工作站下观察细胞及心肌环生长情况，每2-3天更换完全培养基。应用免疫荧光显色鉴定心肌环细胞类型。
活细胞工作站实时动态监测心肌环变化
体外培养的原代混合细胞接种于激光共聚焦仪专用小培养皿中，放于活细胞工作站培养小室观察并截图照相，每10min拍照一张，同一视野连续实时监测6d；对已经形成的心肌环放于视野下实时观察3d，每10min拍照一张。
间接法双重免疫荧光标记
原代培养的心肌环进行免疫荧光双标显色：4％多聚甲醛溶液室温固定30min，PBS浸洗3次；0.3%的Triton透膜10min，PBS浸洗3次（每次3min）；正常山羊血清封闭，室温孵育20min，吸弃山羊血清；滴加1：500的小鼠抗大鼠肌钙蛋白-T（cTnT）单克隆抗体（Abcam公司）和兔抗大鼠波形蛋白（vimentin）单克隆抗体（Santa公司），放于湿盒中4℃孵育过夜。次日，吸弃一抗，PBS浸洗3次、每次3min，滴加1：400的FITC标记山羊抗小鼠和Cy3标记山羊抗兔二抗（上海市碧云天生物技术有限公司）；4℃孵育过夜，吸弃二抗，PBS浸洗3次、每次3min；10µg/mLDAPI复染细胞核10min，PBS洗3次，荧光显微镜下观察摄像。阴性对照为PBS代替免疫荧光一抗。并按上述免疫荧光双标方法检测心肌环cTnT和Cx43，cTnT和nanog，c-kit和nanog，c-kit和sca-1表达。
二、结果
1. 原代培养心肌环的形态学观察
原代培养的心肌环混合细胞，3-6d可观察到心肌环形成，6-12d心肌环增殖扩大，其直径约800μm-3500μm不等，较大的可肉眼观察到环壁形态如图1A所示；心肌环形态多样，有圆环、椭圆环、心形环，有环壁结构伸入环内将大环分成大小不等的两个或多个环，环壁及环外细胞密集、数量大、种类多，环内细胞稀疏、数量少、种类局限如图1B、C、D所示。心肌环分为开放环和闭合环，环壁细胞排列不同，依据细胞组分和排列方式，可明显地分为三个区域：内侧区细胞小而数目较多，排列致密；中间区细胞逐渐增大，数量变少，排列较疏松；外侧区细胞大而数目较少，排列疏松如图2A所示。环内有大量的小且圆的干细胞和胞体较小、突起呈网络状分布的telocytes，可见telocytes长长的突起联通对侧环壁，还有少量的成纤维细胞如图2B、C、D所示。有些心肌环还可出现有节律的收缩，频率约为30-90次/分。
心肌环细胞成分的免疫荧光鉴定
原代培养6d的心肌环免疫荧光双标，从DAPI标记的细胞核荧光强度的强弱可见环壁内侧区细胞核多而密集，大量细胞聚集层叠生长，从环壁内侧区到环壁外侧区细胞核逐渐减少稀疏，层叠生长现象减少；环内细胞核成簇或稀疏散在分布，无层叠生长如图3A、E、I、M、Q所示；cTnT标记的心肌细胞集中分布在环壁内侧区顶层如图3B所示或散在分布于整个环壁，胞体较大如图3F、J所示；成纤维细胞在环壁及环内均高表达，尤以环壁内侧区底层高表达如图3C所示；Cx43作为哺乳动物心脏中最主要的连接蛋白广泛分布于心肌环壁及环内如图3G所示；nanog+、c-kit+和sca-1+心脏干细胞集中在环壁及环内高表达如图3K、N、O、R、S所示，且存在共表达现象如图3L、P、T所示，而心肌环结构以外的细胞几乎不表达这些干细胞标记物。

Claims (1)

1.一种心肌环的培养方法，其特征在于步骤如下：
（1）心脏样品的预处理，制备心室肌样品组织小块；
（2）心室肌样品组织小块的消化和终止；
（3）收集终止消化后的上清液进行培养，制备初期心肌环细胞液；
（4）对初期心肌环细胞液进行细胞换液后，观察心肌环的动态生长；
所述步骤（1）的具体操作为：无菌条件下取出心脏样品，于PBS溶液中漂洗3-4次后，从漂洗后的心脏样品上取心室肌样品组织并剪成0.5-1.5mm3小块；
所述步骤（2）的具体操作为：分批次将心室肌样品组织小块置于无菌离心管中，加入0.25%胰酶和0.1%Ⅰ型胶原酶，吹打1min后放入37℃恒温水浴箱中消化5-10min，取出吹打40-50次，取细胞悬液加入与细胞悬液等量的完全培养基终止消化，重复至样品组织消化完全；所述完全培养基为含12%胎牛血清的低糖DMEM；
所述步骤（3）的具体操作为：收集各批次终止消化后的上清液，1000rpm离心10min，弃上清，加完全培养基悬浮细胞沉淀并接种于培养瓶中，将培养瓶置于37℃、5%CO2的培养箱中培养1.5h，待心肌成纤维细胞贴壁后，吸取上清液，平均接种到培养板，于37℃、5%CO2的培养箱中培养48小时，得初期心肌环细胞液；
所述步骤（4）的具体操作为：将步骤（3 ）中的初期心肌环细胞液进行细胞换液处理后，在活细胞工作站内培养，每隔2-3天更换完全培养基，至心肌环成形；
所述心脏样品取自5-10只出生1-3天的SD大鼠；
所述PBS溶液于4℃预冷，完全培养基于37℃预热；
所述0.25%胰酶和0.1%Ⅰ型胶原酶的加入体积比为1:1。
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体外培养状态下心肌细胞有丝分裂的证据;李辞霞 等;《解剖学报》;20150228;第46卷(第1期);第64页左栏第2-3段 *

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