CN114015648A

CN114015648A - 一种高性能的脂肪间充质干细胞溶液及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN114015648A
Application number: CN202111230337.8A
Authority: CN
Inventors: 朱依谆
Original assignee: Chengdu Baimeisen Biotechnology Co ltd
Current assignee: Chengdu Baimeisen Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-10-20
Filing date: 2021-10-20
Publication date: 2022-02-08
Anticipated expiration: 2041-10-20
Also published as: CN114015648B

Abstract

本发明公开了一种高性能的脂肪间充质干细胞溶液及其制备方法和用途；通过免洗脱细胞制剂复苏法制得细胞悬液，并结合质量分数10％的葡萄糖对细胞悬液进行稀释，制得高性能的细胞溶液，制备的细胞溶液中的细胞活力、凋亡水平等均得到了极大程度的改善，进而可将细胞溶液运用于治疗关节炎药剂中，提高关节软骨修复程度以及关节炎的疗效，还可以用于全身静脉输注，兼顾细胞制剂全身应用的适应症，为提高临床级间充质干细胞产品的疗效提供了解决方法。

Description

一种高性能的脂肪间充质干细胞溶液及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，特别是一种高性能的脂肪间充质干细胞溶液及其制备方法和用途。

背景技术

间充质干细胞(MSC)具有多向分化潜能，在组织工程、细胞替代治疗、再生医学、基因治疗等领域得到了日益广泛的应用。现有技术中，间充质干细胞的长期保存主要为冻存的方式，而临床使用的MSC均需要在复苏后注射或输注入人体，故需要使用临床级别的溶质对细胞悬液进行稀释。

现有技术中，间充质干细胞的复苏方法主要包括两个，(1)常规复苏法：37℃孵温完全培养基，从液氮罐中取出细胞冻存管，放入40℃水浴锅中，轻轻晃动管身，注意管帽始终高于液面；待冻存液融化，酒精消毒后转入超净台，打开盖子，轻轻吹打冻存管内细胞，转移入15mL离心管，按冻存液10倍体积加入完全培养基，300g离心5min，吸弃上清，加入新鲜培养基，临床使用则加入生理盐水等临床常用溶质；(2)免洗脱冻存液复苏法：从液氮罐中取出细胞冻存管，放入40℃水浴锅中，轻轻晃动管身，注意管帽始终高于液面；待冻存液融化，酒精消毒后转入超净台，打开盖子，轻轻吹打冻存管内细胞，转移入新鲜培养基，临床使用则加入生理盐水等临床常用溶质。

目前静脉输注常用的细胞复苏的稀释溶质为复方电解质液，用该溶质稀释后的复苏细胞的活力及增殖能力都下降，注射入关节腔后细胞功效会受到影响，因此一般不用于关节腔的注射；而现有技术中，关节腔注射常用的细胞复苏的稀释溶质为玻璃酸钠，因玻璃酸钠使用局限，其仅能用于局部注射，不利于按照药品管理制度下的适应症扩展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高性能的脂肪间充质干细胞溶液及其制备方法和用途；通过免洗脱细胞制剂复苏法，并采用质量分数为10％葡萄糖作为细胞复苏的稀释溶质，其制备的复苏细胞的活性、增殖活性以及凋亡水平均得到了极大程度的改善，能够直接注射入关节腔，提高关节软骨修复程度以及关节炎的疗效，还可以用于全身静脉输注，兼顾细胞制剂全身应用的适应症，为提高临床级间充质干细胞产品的疗效提供了解决方法。

本发明的第一个目的是通过以下技术方案来实现的：

一种高性能的脂肪间充质干细胞溶液，由细胞悬液和10％的葡萄糖溶液等体积混合而成，所述细胞悬液由冻存的脂肪间充质干细胞复苏制得，所述冻存的脂肪间充质干细胞的额细胞密度为0.8×10⁷/mL～1.2×10⁷/mL。

优选的，所述的冻存的脂肪间充质干细胞的细胞密度为1.0×10⁷/mL。

本发明提供的第二个目的为：提供一种高性能的脂肪间充质干细胞溶液的制备方法，包括如下步骤：

S1从液氮罐中取出冻存有脂肪间充质干细胞的细胞冻存管；

S2将所述细胞冻存管水浴融化；

S3对所述细胞冻存管进行消毒；

S4打开细胞冻存管的盖子，轻轻吹打细胞冻存管内的细胞，制得细胞悬液；

其特征在于：所述步骤S1中，冻存的脂肪间充质干细胞的细胞密度为0.8×10⁷/mL～1.2×10⁷ /mL；所述步骤S2中的水浴融化过程中，水浴锅设定温度为42℃，且水浴锅锅盖保持打开状态，轻轻顺时针晃动管身；所述步骤S4后，将细胞悬液与质量分数为10％的葡萄糖溶液等体积混合，制得细胞溶液。

本发明提供的第三个目的为：提供一种高性能的脂肪间充质干细胞溶液的用途，用于制备治疗关节炎的注射液。

本发明的有益效果是：

1、现有技术中常采用37～40℃水浴融化冻存液，因其温度较低，融化速度较慢，易导致水分渗入到细胞内，导致再次形成胞内结晶损伤细胞；而本发明采用42℃水浴融化冻存液，水溶融化过程中锅盖保持打开状态，能够使水浴温度保持略低于42℃，相较37～40℃，温度较高，能够极大程度减短复苏时间，保证细胞外结晶快速融化，减少细胞损伤，进一步提高复苏细胞的活性、增殖活性以及细胞性能等。

2.通过本发明中的免洗脱冻存液复苏法获得的细胞悬液具有极强的均一性和稳定性，其能很好的保持细胞的活性、增殖活性、分泌活性、细胞性能等；同时本发明中采用的溶质为质量分数为10％的葡萄糖，该浓度的葡萄糖是文献所查及的治疗OA的有效浓度的最低浓度，可以兼顾疗效的同时，最大限度减少对糖尿病患者的影响。并且，10％葡萄糖注射液已有临床级的产品，其不仅可以直接用于关节腔、局部注射，还可以静脉输注，不影响细胞的使用范围，是解决临床级细胞冻存后使用的“最佳伴侣”。

附图说明

图1：豚鼠的行为学测试图；

图2：豚鼠修复图；

图3：对比例3中复苏的活细胞比例图；

图4：实施例1中复苏的活细胞比例图；

图5：细胞因子水平测定图。

具体实施方式

下面结合实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下。

一、实施例与对比例

实施例1

从液氮罐中取出1管细胞密度为1.0×10⁷/mL的细胞冻存管，放入42℃水浴锅中(水浴锅设定温度为42℃，并保持锅盖为打开状态)，轻轻顺时针晃动管身，使管帽始终高于液面；待冻存管中的细胞融化后，对冻存管进行酒精消毒，其后转入超净台，打开冻存管盖子，并轻轻吹打3次冻存管内细胞，制得细胞悬液，将细胞悬液与质量分数为10％的葡萄糖溶液(即稀释溶质)等体积混合，制得细胞溶液。

对比例1

将质量分数为10％的葡萄糖溶液换为质量分数为0.9％的生理盐水，其余步骤同实施例1。

对比例2

将质量分数为10％的葡萄糖溶液换为复方电解质液，其余步骤同实施例1。

对比例3

将42℃改为40℃，其余步骤同实施例1。

二、脂肪间充质干细胞的增殖活性、活性、凋亡率的实验方法

1.CCK8检测(细胞增殖活性)

(1)细胞种板：取三只5ml离心管，分别加入实施例1和对比例1-2中的细胞悬液和稀释溶质，制得细胞混合液，分别使用相应的稀释溶质调节三只离心管中细胞混合液的细胞密度，使细胞密度均为1×10⁵/mL，将三只离心管中的细胞混合液分别以100μL/孔接种于96孔板中(边缘孔用无菌PBS填充)，每组4次重复，37℃、5％CO₂恒温培养；

(2)CCK8反应：培养4h、12h、24h、48h后，每孔加入10μL CCK8溶液，37℃、5％CO₂恒温继续培养1h；

(3)测吸光度值：使用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光值。

2.细胞活性检测

(1)细胞种板：取三只5ml离心管，分别加入实施例1和对比例1-2中的细胞悬液和稀释溶质，制得细胞混合液，分别使用相应的稀释溶质调节三只离心管中细胞混合液的细胞密度，使细胞密度均为1×10⁴/mL，将三只离心管中的细胞混合液分别以1mL/孔接种于24孔板中，每组3次重复，37℃、5％CO₂恒温培养；

(2)结晶紫染色：4h、12h、24h后，终止培养。弃去上清液，加入4％多聚甲醛，固定20min后，去除固定液，PBS洗涤1次，吸除上清液，0.1％结晶紫染色15，PBS洗去多余结晶紫，倒置显微镜下计数。

3.流式凋亡(细胞凋亡率测定)

(1)细胞种板：取三只5ml离心管，分别加入加入实施例1和对比例1-2中的细胞悬液和稀释溶质，制得细胞混合液，分别使用相应的稀释溶质调节三只离心管中细胞混合液的细胞密度，使细胞密度均为1×10⁵/mL，将三只离心管中的细胞混合液分别以2mL/孔接种于6 孔板中，每组3次重复，37℃、5％CO₂恒温培养；

(2)收集细胞：4h、12h、24h后，根据分组，吸取上层清液于对应编号的离心管中备用，PBS洗涤细胞1次，吸弃上清。用不含EDTA胰酶消化，待细胞质回缩，细胞之间不再连接成片，加入已收集的细胞上清液终止消化并收集于对应离心管中，250g离心5min，吸弃上清液，加入适量PBS洗涤并将悬液转移至1.5mL尖底EP管中，250g离心5min，吸弃上清，获得细胞沉淀；

(3)染色上机：用500μL的Binding Buffer重悬细胞后，加入5μL Annexin V-APC轻轻吹匀，再加入5μL的PI混匀；室温避光反应15min，上机检测分析。

上述实验1～3中的细胞计数方法为：取细胞计数板和盖玻片，用75％酒精擦净，将盖玻片置于计数板上；用移液枪吸取混合均匀的细胞悬液，滴入计数室内，静置约1min后计数；统计四个大格的细胞数，将细胞计数板放于显微镜的低倍镜下观察，数出四角每个大方格中的细胞数；压边线细胞计上不计下，计左不计右，计算细胞密度：细胞密度(个/mL)＝(四大格中细胞总数/4)×10⁴。

4.比较对比例3和实施例1中复苏的活细胞比例

取对比例3中的细胞溶液，并调节其细胞密度为2.32×105/mL，取实施例1中的细胞溶液，并调节其细胞密度为2.58×10⁵/mL，进行活细胞数测定实验。

实验结果

1.CCK-8结果(细胞增殖活性)

利用SPSS17.0软件，单因素方差分析OD值，不同介质对细胞的影响，结果见表1。

表1不同介质对细胞的影响

注：与实施例1相比，^*P<0.05；

4h：与实施例1相比，对比例2、对比例1细胞增殖活性更低，差异具有显著性(P＜0.05)

12h：与实施例1相比，对比例2、对比例1细胞增殖活性更低，差异具有显著性(P＜0.05)；

24h：与实施例1相比，对比例2、对比例1细胞增殖活性更低，差异具有显著性(P＜0.05)；

48h：与实施例1相比，对比例2、对比例1略低，但是差异不具备统计学意义(P>0.05)。

2.细胞活性检测结果

通过SPSS17.0软件，单因素方差分析各组细胞活性，不同组别细胞细胞贴壁数见表2。

表2不同组别细胞贴壁数

注：与实施例1相比，^*P<0.05；

4h：与实施例1相比，对比例2、对比例1有显著性差异(P＜0.05)，实施例1具有更高的细胞活性；

12h：与实施例1相比，对比例2有显著性差异(P＜0.05)，实施例1具有更高的细胞活性，对比例1细胞活性略低于实施例1，但差异无统计学意义(P>0.05)；

24h：与实施例1相比，对比例2、对比例1有显著性差异(P＜0.05)，实施例1具有更高的细胞活性。

3.流式凋亡(细胞凋亡率测定)结果

通过SPSS17.0软件，单因素方差分析各组细胞凋亡率，不同组别细胞凋亡结果见表3、表4、表5。

表3 4h不同组别细胞凋亡结果

表4 12h不同组别细胞凋亡结果

表5 24不同组别细胞凋亡结果

注：与实施例1相比，^*P<0.05；

4h：与实施例1相比，对比例2、对比例1Q1-LR期和Q1-UR期有显著性差异(P＜0.05)；

12h：与实施例1相比，对比例2、对比例1Q1-LR期和Q1-UR期有显著性差异(P＜0.05)；

24h：与实施例1相比，对比例2、对比例1Q1-LR期和Q1-UR期有显著性差异(P＜0.05)。

通过表1～5可知：

1)10％葡萄糖作为复苏后的细胞溶质，具有更好的细胞活性、细胞增殖活性，细胞可以更好的贴壁和复制，行使细胞功能；

2)细胞凋亡率测定结果示：10％葡萄糖作为复苏后的细胞溶质组的细胞凋亡表现为早期凋亡(Q1-LR期)，而0.9％NS组和复方电解质组的表现为晚期凋亡(Q1-UR期)，并且总凋亡率也最低。细胞凋亡是一个动态过程，此间涉及一系列复杂的生化反应，多个基因的表达调控、信号转导，多种酶参与的级联反应和多种信号通路。细胞感受到相应的凋亡信号刺激，胞内一系列控制开关的开启或关闭，多种酶的活化，引发一系列级联反应。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡早期，PS由脂膜内侧翻向外侧。正常线粒体膜电位是维持线粒体进行氧化磷酸化、产生ATP的前提，是维持线粒体功能所必需，线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。细胞凋亡中,尤其凋亡晚期，染色体DNA会发生断裂。因此，早期凋亡的细胞仍然存有一定的功能，晚期凋亡的细胞则无功能。10％葡萄糖作为复苏后的细胞溶质组的细胞功能保存更为完整，有利于对关节炎的治疗。

4.对比例3和实施例1中复苏的活细胞比例比较结果

细胞计数仪测试数据见图3(对比例3)和图4(实施例1)。通过图3和图4对比可知，实施例1中的活细胞比例大于对比例3，即体现出了本发明中的温度优势，本发明中的温度相较现有技术较高，能够极大程度减短复苏时间，保证细胞外结晶快速融化，减少细胞损伤，进一步提高复苏细胞的活性、增殖活性以及细胞性能等，从而使其在治疗关节炎时能够具有更好的疗效。

三、细胞溶液在治疗关节炎方面的相关实验。

1.关节腔注射实验

(1)豚鼠分组，每组3只，左腿膝关节造模，采用MTT手术造模，手术后3周注射治疗：

组1：注射对比例1中的细胞溶液；

组2：注射对比例2中的细胞溶液；

组3：注射实施1中细胞溶液；

比较三组模型左右后爪重点分布变化，采用双足疼痛测试仪(Stoelting Co；WoodDale,IL, USA)测定动物后腿重量分布。将豚鼠放在一个有角度的有机玻璃室中，每个后爪放在一个单独的力板上，每个后肢施加的力(以克为单位)在5秒内确定。每个数据点是3个读数的平均值，数据统一表述为受伤/非受伤重量百分比，即受伤侧的敏感性用<100％表示，结果如图1 所示。

(2)注射后3周，对动物实施安乐死。每组的膝关节标本均由三名独立(盲)的检查者进行解剖和宏观检查，采用国际软骨修复学会(ICRS)分级系统，结果如图2和表6所示。

2.实验结果

(1)行为学测试结果(如图1所示)

比较三组左右后爪重点分布变化，采用双足疼痛测试仪(Stoelting Co；WoodDale,IL,USA) 测定动物后腿重量分布。将豚鼠放在一个有角度的有机玻璃室中，每个后爪放在一个单独的力板上，每个后肢施加的力(以克为单位)在5秒内确定。每个数据点是3个读数的平均值，数据统一表述为受伤/非受伤重量百分比，即受伤侧的敏感性用<100％表示。

图1中：N组注射的为对比例1中的稀释细胞悬液；

F组注射的为对比例2中的稀释细胞悬液

G组注射的为实施例1中的稀释细胞悬液；

由图1可知：经实施例1中的细胞溶液注射后的豚鼠的左右双爪重量分布更均匀，更好的缓解了造模侧关节腔的疼痛，关节修复更佳，治疗骨关节炎的疗效更好。

(2)大体解剖(如图2所示)及评分结果(表6)

表6评分表

通过表6可知，实施例1中的三组实验的修复评估均为接近正常，因此实施例1中的细胞溶液治疗骨关节炎更加有效且稳定。

3、细胞因子水平测定(如图5)

采用滑液中细胞因子IL-1β、TGF-β、TNF-α评价各组豚鼠的炎症反应。如图5(注：图5 表示各组滑液中细胞因子变化，*表示P<0.05)所示，显示接受10％葡萄糖作为溶质的脂肪间充质干细胞注射的豚鼠与生理盐水及复方电解质液组相比，滑液中与炎症严重程度相关的细胞因子IL-1β、TNF-α的水平降低，而与软骨修复相关的细胞因子TGF-β的表达水平增加，说明10％葡萄糖作为溶质的脂肪间充质干细胞治疗骨关节炎的效果更好。

本实验采用人脂肪间充质干细胞，保护范围应不限于人脂肪间充质干细胞，应包含所有间充质干细胞。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种高性能的脂肪间充质干细胞溶液，其特征在于，由细胞悬液和10％的葡萄糖溶液等体积混合而成，所述细胞悬液由冻存的脂肪间充质干细胞复苏制得，所述冻存的脂肪间充质干细胞的额细胞密度为0.8×10⁷/mL～1.2×10⁷/mL。

2.根据权利要求1所述的一种高性能的脂肪间充质干细胞溶液，其特征在于，所述的冻存的脂肪间充质干细胞的细胞密度为1.0×10⁷/mL。

3.一种高性能的脂肪间充质干细胞溶液的制备方法，包括如下步骤：

S1从液氮罐中取出冻存有脂肪间充质干细胞的细胞冻存管；

S2将所述细胞冻存管水浴融化；

S3对所述细胞冻存管进行消毒；

其特征在于：所述步骤S1中，冻存的脂肪间充质干细胞的细胞密度为0.8×10⁷/mL～1.2×10⁷/mL；所述步骤S2中的水浴融化过程中，水浴锅设定温度为42℃，且水浴锅锅盖保持打开状态；所述步骤S4后，将细胞悬液与质量分数为10％的葡萄糖溶液等体积混合，制得细胞溶液。

4.根据权利要求1所述的一种高性能的脂肪间充质干细胞溶液的用途，其特征在于，用于制备治疗关节炎的注射液。