CN110755452A - 干细胞治疗骨关节炎的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及干细胞治疗骨关节炎的用途。具体的，本发明一方面涉及用于治疗骨关节炎和软骨缺损的细胞治疗组合物，该组合物中包括：胎盘间充质干细胞、透明质酸或其药用盐、氯化钠、和水，该细胞治疗组合物是按照包括如下步骤的方法制备得到的：将透明质酸或其药用盐和氯化钠加入水中溶解，任选地对该溶液进行除菌，获得制剂的基质；将预先制得的间充质干细胞混悬于该基质中，分装，即得；本发明还涉及所述细胞治疗组合物的制备方法，以及它们的医学用途。本发明方法呈现如说明书所述优异技术效果，例如，本发明所得组合物在细胞复苏时呈现优良的细胞复苏性能，细胞经历复苏过程的活力以及复苏后细胞的存活稳定性方面，显著高于现有技术方案。

Description

干细胞治疗骨关节炎的用途
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，其涉及用于治疗和/或预防急性和/或慢性骨关节病方法，该方法中使用的药物组合物，以及该组合物用于治疗骨关节炎的用途。特别是涉及使用干细胞治疗骨关节炎的方法和组合物。
背景技术
骨关节炎是最常见的关节炎形式，其特征在于关节软骨、软骨下骨的缓慢退行性过程，并伴有边缘骨赘形成和低程度的炎症。据信，慢性形式的骨关节炎影响到15％的人口。其中，四分之一为严重残疾。大多数骨关节炎病例的原因不明，并被称为“原发性骨关节炎”。当骨关节炎的原因已知时，其被称为“继发性骨关节炎”。继发性骨关节炎由其它疾病或情形引起。可导致继发性骨关节炎的情形包括关节结构的反复性损伤或手术、出生时关节异常(先天性异常)、痛风、糖尿病和其它激素紊乱。其它形式的关节炎包括系统性疾病，例如类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)。
骨关节炎主要涉及髋部、膝部、脊柱和指/趾间关节。骨关节炎的最常见症状是受影响关节在反复使用后产生疼痛。关节疼痛通常在日间的晚些时候更加严重。受影响关节可发生肿胀、发热以及发出咯吱声。关节在长期不活动后也会发生疼痛和僵硬。在严重的骨关节炎中，软骨垫的完全丧失导致骨间发生摩擦，造成静止时的疼痛或在有限运动时的疼痛。
骨关节炎的特征在于在数年间软骨发生缓慢的降解。在正常软骨中，在基质的合成与降解之间存在微妙的平衡；但是在骨关节炎中，软骨的降解超过了合成。合成与降解之间的平衡受年龄影响，并由滑膜和软骨细胞产生的几种因子(包括细胞因子、生长因子、聚集蛋白聚糖酶(aggrecanase)和基质金属蛋白酶)所调控。除了水以外，胞外基质还含有蛋白聚糖，其由连接到透明质酸或其药用盐所形成之骨架上的糖胺聚糖形成，并包封(entrap)于胶原框架或纤丝基质(fibrillary matrix)中。关节软骨中的一种重要蛋白聚糖是聚集蛋白聚糖(aggrecan)，其与透明质酸或其药用盐结合并有助于赋予软骨以可压缩性和弹性。聚集蛋白聚糖被聚集蛋白聚糖酶所切割，这导致其降解以及随后的软骨侵蚀。软骨基质中聚集蛋白聚糖的损失是骨关节炎(OA)中观察到的最初病理生理变化之一。
透明质酸或其药用盐为作为润滑剂和减震器的滑液提供粘弹性。在滑液中，透明质酸或其药用盐覆盖关节软骨的表面并与胶原纤丝(collagen fibril)和硫酸蛋白聚糖共用软骨中的深部空间。它保护软骨并阻止蛋白聚糖从软骨基质流失到滑液中，维持正常的软骨基质。在患骨关节炎的膝关节滑液中，透明质酸或其药用盐、糖胺聚糖和硫酸角质素的浓度比正常膝关节滑液中要低。此外，使用兔滑膜细胞的实验显示，促炎细胞因子IL-1β和TNF-α刺激透明质酸或其药用盐合成酶的表达，其可导致透明质酸或其药用盐在炎性条件下发生片段化。外源透明质酸或其药用盐可有利于产生新合成的透明质酸或其药用盐。透明质酸或其药用盐及衍生物已被用作骨关节炎治疗中的治疗性辅助物，用以提高关节连接表面的润滑度进而减少关节疼痛。几个体外培养研究也表明，透明质酸或其药用盐通过抑制由纤连蛋白片段介导之软骨溶解而具有有益的作用。透明质酸或其药用盐还显示具有抗炎作用，以及对前列腺素合成以及蛋白聚糖释放和降解的抑制作用。
透明质酸或其药用盐(一种糖胺聚糖)被广泛地用于治疗膝部骨关节炎。英国的两项一般性调查显示，约有15％患有骨关节炎的患者接受过透明质酸或其药用盐制备物的关节内治疗。由于它具有粘弹性，因此可以取代滑液。此外，它还可以减轻对疼痛的感知。还报道了有益的分子作用和细胞作用。透明质酸或其药用盐常常通过关节内注射来施用，然而有关其临床相关性的证据却存在矛盾。现有技术中最近出版了系统性综述和统合分析(meta-analysis)，其作者得出的结论是，关节内的透明质酸或其药用盐充其量具有很小的作用，而具有临床意义的作用是指疼痛的视觉模拟评分提高至少15mm。这些数据成为对骨关节炎患者关节内施用透明质酸或其药用盐的基础。有时，在注射一年后才能观察到效用，并且在一些实验中必须每周进行3～5次注射。
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是一组源于基质的异质细胞群，可以从人体大多数组织获取。大量实验研究显示，间充质干细胞具有表皮细胞分化潜能，可促进受创皮肤的愈合。骨髓源性间充质干细胞由于存在病毒污染的隐患，且随着供者年龄增长，其细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势，不适合批量制备。而来源于人脐带、胎盘或羊膜的间充质干细胞，成功避开了胚胎干细胞来源缺乏、异体排斥、道德伦理等诸多限制，成为了骨髓源间充质干细胞的很好的替代物；它们具有自我更新、组织修复、免疫调节能力，可以向中胚层谱系分化，例如分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞等，此外还能够向及其它胚层谱系细胞分化，例如向表皮细胞、血管内皮细胞分化；而且细胞在体外易于扩增，扩增后分化能力、增殖能力保持稳定，适合大规模制备。
已知有将间充质干细胞或透明质酸或其药用盐用于治疗骨关节炎的文献报道。然而在将二者组合并且成功地应用于临床时，却需要面临诸多技术性问题。因此，提供一种包含间充质干细胞和透明质酸或其药用盐并且可用于治疗骨关节炎的方法和组合物，仍然是本领域技术人员迫切期待的。
发明内容
本发明的另一目在于提供一种使用干细胞治疗骨关节炎的方法和组合物，特别是该细胞治疗组合物可以用于关节腔注射治疗骨关节炎和软骨缺损。已经出人意料地发现本发明组合物具有优异的性能。
本发明是通过如下方案实现的。
在本发明的第一方面，提供了一种用于治疗骨关节炎和软骨缺损的细胞治疗组合物，该组合物中包括：间充质干细胞(可简称为MSC，其来源例如可以是脐带或胎盘)、透明质酸或其药用盐、氯化钠、和水。
根据本发明的细胞治疗组合物，其中所述透明质酸或其药用盐的质量体积百分数为3％～5％。
根据本发明的细胞治疗组合物，其中所述透明质酸或其药用盐的质量体积百分数为3～4％。
根据本发明的细胞治疗组合物，其中所述透明质酸或其药用盐的质量体积百分数为3％。
根据本发明的细胞治疗组合物，其中所述间充质干细胞的密度为2×107个/mL～5×107个/mL。
根据本发明的细胞治疗组合物，其中所述间充质干细胞的密度为3×107个/mL。
根据本发明的细胞治疗组合物，其中所述氯化钠的质量体积百分数为0.8％～1.0％。
根据本发明的细胞治疗组合物，其中所述氯化钠的质量体积百分数为0.9％。
根据本发明的细胞治疗组合物，其中还包含氯化镁。
根据本发明的细胞治疗组合物，其中所述氯化镁的质量体积百分数为0.05％～0.1％。
根据本发明的细胞治疗组合物，其中所述氯化镁的质量体积百分数为0.08％。
根据本发明的细胞治疗组合物，其中还包含乙二胺四乙酸钙钠。
根据本发明的细胞治疗组合物，其中所述乙二胺四乙酸钙钠的质量体积百分数为0.02％～0.05％。
根据本发明的细胞治疗组合物，其中所述乙二胺四乙酸钙钠的质量体积百分数为0.03％。
根据本发明的细胞治疗组合物，其中透明质酸或其药用盐的质量体积百分数为3％、间充质干细胞的密度为3×107个/mL、氯化钠的质量体积百分数为0.9％。
根据本发明的细胞治疗组合物，其中透明质酸或其药用盐的质量体积百分数为4％、间充质干细胞的密度为5×107个/mL、氯化钠的质量体积百分数为0.9％。
根据本发明的细胞治疗组合物，其中透明质酸或其药用盐的质量体积百分数为5％、间充质干细胞的密度为5×107个/mL、氯化钠的质量体积百分数为0.9％。
根据本发明的细胞治疗组合物，其特征在于：
(1)其中包含：胎盘间充质干细胞4×107个/mL、透明质酸钠4％、氯化钠0.9％、氯化镁0.08％、乙二胺四乙酸钙钠0.03％、麦芽糖醇0.4％、和注射用水；或者，
(2)其中包含：胎盘间充质干细胞2×107个/mL、透明质酸钠5％、氯化钠0.8％、氯化镁0.1％、乙二胺四乙酸钙钠0.02％、麦芽糖醇0.3％、和注射用水；或者，
(3)其中包含：胎盘间充质干细胞5×107个/mL、透明质酸钠3％、氯化钠1.0％、氯化镁0.05％、乙二胺四乙酸钙钠0.05％、麦芽糖醇0.5％、和注射用水；或者，
(4)其中包含：胎盘间充质干细胞3×107个/mL、透明质酸4％、氯化钠0.9％、氯化镁0.08％、乙二胺四乙酸钙钠0.04％、麦芽糖醇0.2％、和注射用水；或者，
(5)其中包含：脐带间充质干细胞4×107个/mL、透明质酸钠4％、氯化钠0.9％、氯化镁0.08％、乙二胺四乙酸钙钠0.03％、麦芽糖醇0.4％、和注射用水；或者，
(6)其中包含：脐带间充质干细胞2×107个/mL、透明质酸钠5％、氯化钠0.8％、氯化镁0.1％、乙二胺四乙酸钙钠0.02％、麦芽糖醇0.3％、和注射用水；或者，
(7)其中包含：脐带间充质干细胞5×107个/mL、透明质酸钠3％、氯化钠1.0％、氯化镁0.05％、乙二胺四乙酸钙钠0.05％、麦芽糖醇0.5％、和注射用水；或者，
(8)其中包含：脐带间充质干细胞4×107个/mL、透明质酸4％、氯化钠0.9％、氯化镁0.08％、乙二胺四乙酸钙钠0.04％、麦芽糖醇0.2％、和注射用水。
本发明的细胞治疗组合物中，干细胞密度过大则存活率会因营养不足而大幅降低，而干细胞密度过小也不利于存活率的保持，且过小的干细胞密度会导致用所需制剂量的增大。本发明通过实验证实，干细胞密度为2×107个/mL～5×107个/mL时，干细胞存活率最高。
本发明组合物为水混悬液，其中包含氯化钠，其浓度基本上与生理盐水相当。生理盐水是指生理学实验或临床上常用的渗透压与动物或人体血浆的渗透压相等的氯化钠溶液。因此，本发明细胞治疗组合物中的间充质干细胞基本上是分散于生理盐水即质量体积百分数为0.9％的氯化钠溶液中，其与人体组织的渗透压一致，以此生理盐水作为溶剂，不会对间充质干细胞产生损伤。
透明质酸或其药用盐又称玻尿酸、玻璃酸，是一种高分子的聚合物。是由单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的高级多糖。透明质酸或其药用盐是构成人体细胞间质、眼玻璃体、关节滑液等结缔组织的主要成分，在体内发挥保水、维持细胞外空间、调节渗透压、润滑、促进细胞修复的重要生理功能。按照分子量的大小，透明质酸或其药用盐可分为：大分子量透明质酸或其药用盐、中分子量透明质酸或其药用盐、小分子量透明质酸或其药用盐三类。其中：大分子量透明质酸或其药用盐的分子量为1800000～2200000，主要用于防止脱水，组织细胞再生，紧致肌肤；中分子量透明质酸或其药用盐的分子量为1000000～1800000，主要用于紧致肌肤,长久保湿；小分子量透明质酸或其药用盐的分子量为400000～1000000，主要用于快速与细胞发生水合作用，保持细胞的水分。在间充质干细胞制剂中添加透明质酸或其药用盐可以为脂肪干细胞提供合适的基质环境，维持间充质干细胞的存活率，且利于间充质干细胞在治疗关节疾病的过程中，分化为软骨组织。
本发明使用的乙二胺四乙酸钙钠，其分子式为C10H12N2O8CaNa2.2H2O，是一种白色结晶颗粒或白色至灰白色粉末，其1％水溶液的pH值＝6.0-7.0。乙二胺四乙酸钙钠无臭，微带咸味，稍吸湿，空气中稳定，易溶于水，几乎不溶于乙醇，乙二胺四乙酸钙钠通常作为螯合剂、防腐剂、抗氧化剂，具有对游离金属结合而使产品质量稳定的作用，通常用于消除因痕量重金属引起的对酶催化反应的抑制。根据本发明的细胞治疗组合物，其中所述透明质酸或其药用盐的分子量为400000～1000000。
根据本发明的细胞治疗组合物，其中所述间充质干细胞为原代～第十代的间充质干细胞。
根据本发明的细胞治疗组合物，其中所述的间充质干细胞可以来自已知的各种途径，例如其可以是来自于骨髓、脐带或胎盘。
根据本发明的细胞治疗组合物，其中所述的间充质干细胞的获取方法是众所周知的，例如CN102586184A(2012100446386)中所记载的方法从胎盘中获取间充质干细胞的方法。
根据本发明的细胞治疗组合物，其中所述的间充质干细胞的获取方法是众所周知的，例如CN102660497A(2012101599162)中所记载的方法从脐带中获取间充质干细胞的方法。
根据本发明的细胞治疗组合物，其中所述的间充质干细胞的获取方法包括如下步骤(胎盘来源)：
(a)用PBS缓冲液充分冲洗胎盘小叶，以去除胎盘中残留的血液；
(b)将胎盘小叶剪成块状，加入含有组织消化酶的PBS缓冲液，再在37℃孵育消化；
(c)将组织块用铜网过滤，必要时研磨以促使过滤；
(d)将收集的过滤液离心，分离单个核细胞，再用MSC培养基悬浮所获得的细胞，然后在37℃、5％的CO2培养箱中培养；
(e)待散在细胞形成克隆后，挑取各克隆细胞，用MSC培养基分别培养，待细胞融合后，用胰酶消化传代，即得胎盘间充质干细胞。必要时进行传代和/或在液氮中冻存以备用。
根据本发明的细胞治疗组合物，其中所述的间充质干细胞的获取方法包括如下步骤(脐带来源)：
(1)脐带组织贴壁处理：取细胞培养平皿，将组织块平铺于平皿中，每个平皿中的组织块数量维持在5-20块，使组织块风干2-50分钟直至组织贴在平皿上；
(2)脐带组织培养：沿平皿边缘慢慢加入间充质干细胞培养基至组织淹没即可；将平皿放进CO2浓度为5％的37℃培养箱进行培养，培养至第3-7天时将平皿从培养箱取出，补加适量间充质干细胞培养基；在第9-11天时将平皿中的培养基移出，加入适量新鲜的间充质干细胞培养基，继续培养；在第11-13天时清除所有脐带组织块并继续培养；此后每1-3天进行一次全换液；
(3)细胞传代：当平皿内的贴壁细胞融合率达到50-70％时，使用消化酶TrypLEExpress使贴壁细胞脱离平皿底部；离心，去除上清液，加入间充质干细胞培养基重新悬浮细胞，再接种于T25细胞培养瓶进行传代并进行扩增培养；此后每1-3天换液一次，直至融合率达到70-90％后，即得脐带间充质干细胞。必要时进行传代和/或在液氮中冻存以备用。必要时对所得间充质干细胞的以下项目中的一项或多项进行检测：细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型。
根据本发明的细胞治疗组合物，其是按照包括如下步骤的方法制备得到的：
将透明质酸或其药用盐和氯化钠(以及任选的氯化镁和/或任选的乙二胺四乙酸钙钠)加入水中溶解，任选地对该溶液进行除菌，获得制剂的基质；
将预先制得的间充质干细胞混悬于该基质中，分装，即得。
根据本发明的细胞治疗组合物，其制备过程是在无菌条件下进行的。
根据本发明的细胞治疗组合物，其制备过程中，在与间充质干细胞混和前所述基质的温度低于25℃。
根据本发明的细胞治疗组合物，其制备过程中，在温度低于25℃条件下将所述基质与间充质干细胞混和。
本发明提供的间充质干细胞的细胞治疗组合物的制备方法简单温和，不会损伤干细胞的活性，从而提高间充质干细胞制剂中干细胞的存活率。
根据本发明的细胞治疗组合物，其中所述分装是将配制得到的细胞治疗组合物分装到预充注射器中，尤其是分装到一次性使用的预充注射器中。
根据本发明的细胞治疗组合物，其中所述预充式注射器的针筒材质为高分子聚合物(例如聚丙烯)、活塞材质为橡胶，本发明具体实例中如未特别说明，所用预充式注射器的针筒材质为高分子聚合物(例如聚丙烯)、活塞材质为橡胶。
预充式注射器首次出现于第二次世界大战期间，目的是为了满足战地医院对现场无菌医疗的需要。预充式注射器再度被强力推向市场是在上世纪50年代初，当时BectonDickinson公司为Jonas Salks博士的脊髓灰质炎疫苗项目提供玻璃预充式注射器。此后，预充式注射器继续得到应用，大多是在胰岛素和人生长素给药领域。不过，预充式注射器真正盛行起来是在过去5年中，它几乎成为注射剂供应商必需提供的一种产品。而多数创新性的液体药品，如果适合的话，将装在预充式注射器中上市。预充式注射器之所以走俏主要由于产品本身具有的优势，尤其是使用简便。医药市场正在发生变化，生物技术疗法以及仅能通过注射途径给药的候选药物数量增多，它们涉及的治疗领域非常广泛，如多发性硬化、不孕、骨质疏松、肝炎、类风湿性关节炎、癌症、贫血及血友病等。一些生物技术药物需要患者本人频繁注射给药，他们从预充式注射器的便利中受益最深，因为预充式注射器省却了一些操作步骤，让使用更快捷、更简便。患者的需要是推动预充式注射器发展的真正动力。从小瓶中量出药品装入注射器中是一件费时的工作，缺乏充分训练的人很容易出错。此外，一些疾病如类风湿性关节炎患者常常难以，甚至不能拿稳小瓶并量出准确剂量。制药厂家已经将一些药品由冻干剂型改为液体剂型，以便于装入预充式注射器中，例如Berlex的治疗多发性硬化药物Betaseron、诺和诺德的人生长素Norditropin以及基因泰克的人生长素Nutropin都已由冻干剂型改为液体剂型，装在预充式注射器中出售。注射器元件生产商加快步伐以满足对即用性元件不断增长的需求。法国Stelmi公司的即用型柱塞以及BectonDickinson公司的Hypak SCF预充式注射器使得灌装现场无需进行清洗、除热原以及消毒操作。即用性元件经过清洗、环氧乙烷或γ射线消毒、验证后可以直接使用。预充式注射器的另一优势是可以显著减少产品过度充填量。使用预充式注射器，可以节省10％、15％，有时甚至是20％的原料药。有些将小瓶改为预充式注射器的厂家还降低了原料药产量，因为新剂型不再需要那么多原料药。Becton Dickinson公司的一项研究显示，与小瓶相比，预充式注射器中的剂量可以高出23％，因为在从小瓶向注射器转移过程中药品损失更少。
根据本发明的第二方面，提供了一种制备细胞治疗组合物的方法，该细胞治疗组合物可用于治疗骨关节炎和软骨缺损的细胞治疗组合物，该组合物中包括：间充质干细胞(其来源例如可以是脐带或胎盘)、透明质酸或其药用盐、氯化钠、和水。
根据本发明的方法，其中所述细胞治疗组合物中还包含氯化镁和/或乙二胺四乙酸钙钠。
根据本发明的方法，其包括以下步骤：
将透明质酸或其药用盐和氯化钠(以及任选的氯化镁和/或任选的乙二胺四乙酸钙钠)加入水中溶解，任选地对该溶液进行除菌，获得制剂的基质；
将预先制得的间充质干细胞混悬于该基质中，分装，即得。
根据本发明的方法，所述细胞治疗组合物中，所述透明质酸或其药用盐的质量体积百分数为3％～5％。
根据本发明的方法，所述细胞治疗组合物中，所述透明质酸或其药用盐的质量体积百分数为3～4％。
根据本发明的方法，所述细胞治疗组合物中，所述透明质酸或其药用盐的质量体积百分数为3％。
根据本发明的方法，所述细胞治疗组合物中，所述间充质干细胞的密度为2×107个/mL～5×107个/mL。
根据本发明的方法，所述细胞治疗组合物中，所述间充质干细胞的密度为3×107个/mL。
根据本发明的方法，所述细胞治疗组合物中，所述氯化钠的质量体积百分数为0.8％～1.0％。
根据本发明的方法，所述细胞治疗组合物中，所述氯化钠的质量体积百分数为0.9％。
根据本发明的方法，所述细胞治疗组合物中，还包含氯化镁。
根据本发明的方法，所述细胞治疗组合物中，所述氯化镁的质量体积百分数为0.05％～0.1％。
根据本发明的方法，所述细胞治疗组合物中，所述氯化镁的质量体积百分数为0.08％。
根据本发明的方法，所述细胞治疗组合物中，还包含乙二胺四乙酸钙钠。
根据本发明的方法，所述细胞治疗组合物中，所述乙二胺四乙酸钙钠的质量体积百分数为0.02％～0.05％。
根据本发明的方法，所述细胞治疗组合物中，所述乙二胺四乙酸钙钠的质量体积百分数为0.03％。
根据本发明的方法，所述细胞治疗组合物中，透明质酸或其药用盐的质量体积百分数为3％、间充质干细胞的密度为3×107个/mL、氯化钠的质量体积百分数为0.9％。
根据本发明的方法，所述细胞治疗组合物中，透明质酸或其药用盐的质量体积百分数为4％、间充质干细胞的密度为5×107个/mL、氯化钠的质量体积百分数为0.9％。
根据本发明的方法，所述细胞治疗组合物中，透明质酸或其药用盐的质量体积百分数为5％、间充质干细胞的密度为5×107个/mL、氯化钠的质量体积百分数为0.9％。
根据本发明的方法，其特征在于，其所制得的细胞治疗组合物中，
(1)包含：胎盘间充质干细胞4×107个/mL、透明质酸钠4％、氯化钠0.9％、氯化镁0.08％、乙二胺四乙酸钙钠0.03％、麦芽糖醇0.4％、和注射用水；或者，
(2)包含：胎盘间充质干细胞2×107个/mL、透明质酸钠5％、氯化钠0.8％、氯化镁0.1％、乙二胺四乙酸钙钠0.02％、麦芽糖醇0.3％、和注射用水；或者，
(3)包含：胎盘间充质干细胞5×107个/mL、透明质酸钠3％、氯化钠1.0％、氯化镁0.05％、乙二胺四乙酸钙钠0.05％、麦芽糖醇0.5％、和注射用水；或者，
(4)包含：胎盘间充质干细胞3×107个/mL、透明质酸4％、氯化钠0.9％、氯化镁0.08％、乙二胺四乙酸钙钠0.04％、麦芽糖醇0.2％、和注射用水；或者，
(5)包含：脐带间充质干细胞4×107个/mL、透明质酸钠4％、氯化钠0.9％、氯化镁0.08％、乙二胺四乙酸钙钠0.03％、麦芽糖醇0.4％、和注射用水；或者，
(6)包含：脐带间充质干细胞2×107个/mL、透明质酸钠5％、氯化钠0.8％、氯化镁0.1％、乙二胺四乙酸钙钠0.02％、麦芽糖醇0.3％、和注射用水；或者，
(7)包含：脐带间充质干细胞5×107个/mL、透明质酸钠3％、氯化钠1.0％、氯化镁0.05％、乙二胺四乙酸钙钠0.05％、麦芽糖醇0.5％、和注射用水；或者，
(8)包含：脐带间充质干细胞4×107个/mL、透明质酸4％、氯化钠0.9％、氯化镁0.08％、乙二胺四乙酸钙钠0.04％、麦芽糖醇0.2％、和注射用水。
根据本发明的方法，所述细胞治疗组合物中，所述透明质酸或其药用盐的分子量为400000～1000000。
根据本发明的方法，所述细胞治疗组合物中，所述间充质干细胞为原代～第十代的间充质干细胞。
根据本发明的方法，所述细胞治疗组合物中，所述的间充质干细胞可以来自已知的各种途径，例如其可以是来自于骨髓、脐带或胎盘。
根据本发明的方法，所述细胞治疗组合物中，所述的间充质干细胞的获取方法是众所周知的，例如CN102586184A(2012100446386)中所记载的方法从胎盘中获取间充质干细胞的方法。
根据本发明的方法，所述细胞治疗组合物中，所述的间充质干细胞的获取方法是众所周知的，例如CN102660497A(2012101599162)中所记载的方法从脐带中获取间充质干细胞的方法。
根据本发明的方法，所述细胞治疗组合物中，所述的间充质干细胞的获取方法包括如下步骤(胎盘来源)：
(a)用PBS缓冲液充分冲洗胎盘小叶，以去除胎盘中残留的血液；
(b)将胎盘小叶剪成块状，加入含有组织消化酶的PBS缓冲液，再在37℃孵育消化；
(c)将组织块用铜网过滤，必要时研磨以促使过滤；
(d)将收集的过滤液离心，分离单个核细胞，再用MSC培养基悬浮所获得的细胞，然后在37℃、5％的CO2培养箱中培养；
(e)待散在细胞形成克隆后，挑取各克隆细胞，用MSC培养基分别培养，待细胞融合后，用胰酶消化传代，即得胎盘间充质干细胞。必要时进行传代和/或在液氮中冻存以备用。
根据本发明的方法，所述细胞治疗组合物中，所述的间充质干细胞的获取方法包括如下步骤(脐带来源)：
(1)脐带组织贴壁处理：取细胞培养平皿，将组织块平铺于平皿中，每个平皿中的组织块数量维持在5-20块，使组织块风干2-50分钟直至组织贴在平皿上；
(2)脐带组织培养：沿平皿边缘慢慢加入间充质干细胞培养基至组织淹没即可；将平皿放进CO2浓度为5％的37℃培养箱进行培养，培养至第3-7天时将平皿从培养箱取出，补加适量间充质干细胞培养基；在第9-11天时将平皿中的培养基移出，加入适量新鲜的间充质干细胞培养基，继续培养；在第11-13天时清除所有脐带组织块并继续培养；此后每1-3天进行一次全换液；
(3)细胞传代：当平皿内的贴壁细胞融合率达到50-70％时，使用消化酶TrypLEExpress使贴壁细胞脱离平皿底部；离心，去除上清液，加入间充质干细胞培养基重新悬浮细胞，再接种于T25细胞培养瓶进行传代并进行扩增培养；此后每1-3天换液一次，直至融合率达到70-90％后，即得脐带间充质干细胞。必要时进行传代和/或在液氮中冻存以备用。
必要时对所得间充质干细胞的以下项目中的一项或多项进行检测：细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型。
根据本发明的方法，其制备过程是在无菌条件下进行的。
根据本发明的方法，其制备过程中，在与间充质干细胞混和前所述基质的温度低于25℃。
根据本发明的方法，其制备过程中，在温度低于25℃条件下将所述基质与间充质干细胞混和。
本发明提供的间充质干细胞的细胞治疗组合物的制备方法简单温和，不会损伤干细胞的活性，从而提高间充质干细胞制剂中干细胞的存活率。
根据本发明的任一方面，其中所述透明质酸药用盐是透明质酸钠。
根据本发明的任一方面，其中所述细胞治疗组合物中，还包括麦芽糖醇。在本发明的任一方面的一个实施方案中，所述麦芽糖醇在细胞治疗组合物中的质量体积百分数为0.2％～0.5％。在本发明的任一方面的一个实施方案中，所述麦芽糖醇在细胞治疗组合物中的质量体积百分数为0.3％～0.5％。在本发明的任一方面的一个实施方案中，所述麦芽糖醇是与氯化钠一起添加到组合物中的。本发明细胞治疗组合物通常在配制完成后，可以预充到一次性注射器中，然后冷冻保存，以保持细胞存活；然后在需要使用时，使细胞治疗组合物融化并回复到室温。然而，本发明人发现，使用现有方法获得的细胞治疗组合物在经冷冻-融化后，组合物的粘度比之于冷冻之前显著地增加，并造成不能顺利地注射的问题。本发明人已经出人意料地发现，当向细胞治疗组合物中添加少量的麦芽糖醇时，可以克服这种粘度变化的问题，这种优异的技术效果是完全出人意料的。例如，测定本发明细胞治疗组合物在-80℃冰箱中冻存前的粘度(M0)；然后使该细胞治疗组合物在-80℃冰箱中冻存30天之后，再常温融化，测定此冻存30天后的粘度(M1)，以方程式(M1÷M0)×100％计算冻存后的相对粘度，结果显示，本发明实施例1-8的全部组合物的相对粘度均在186～203％范围内，照现有技术方法得到的组合物(CN 105106238 A之实施例3、CN 104771414 A之实施例3、CN 102670654 A之实施例1)的相对粘度均在182～217％范围内，而本发明实施例9的全部组合物的相对粘度均在96～113％范围内。添加了透明质酸或其药用盐的组合物通常具有较高的粘度，在注射时由于粘度较高而需要缓缓注射，显然，本发明实施例1-8的全部组合物以及现有技术的组合物它们在经历细胞治疗组合物通常需要经历的冻存过程后，粘度显示增加，不利于其临床上的使用；并且还发现这些组合物随着冻存时间延长粘度还有继续增加的趋势，但本发明实施例9的全部组合物却未见这种趋势，表明麦芽糖醇能够赋予组合物优良的粘度稳定性。另外，经测定，本发明实施例11～18的全部组合物的相对粘度均在95～110％范围内，例如实施例11组合物的相对粘度为99.7％，表明氯化镁和乙二胺四乙酸钙钠的添加不会影响麦芽糖醇在组合物中功能的发挥。
根据本发明的任一方面，其中所述细胞治疗组合物中，还包含规定量的氯化镁和/或任选的乙二胺四乙酸钙钠，已经出人意料地发现，组合添加氯化镁和/乙二胺四乙酸钙钠所得组合物在细胞冻存后复苏时呈现优良的细胞复苏性能，细胞经历冻存复苏过程的活力以及复苏后细胞的存活稳定性方面，显著高于其它未添加氯化镁和乙二胺四乙酸钙钠技术方案。
本发明提供的间充质干细胞的细胞治疗组合物优选的是可注射用的组合物，其在常温下呈注射液状态，所述注射溶液适于经关节内施用(经皮注射)给哺乳动物对象(优选人类患者)的关节内。例如，本发明提供的间充质干细胞的细胞治疗组合物也适于局部施用(经皮注射至哺乳动物对象、优选人类患者的发炎关节内或附近区域)，其中局部施用注射涉及表皮、肌肉或任何深部器官。
本发明提供的间充质干细胞的细胞治疗组合物对哺乳动物对象(特别是人类患者)经关节内施用所述药物组合物能够改善骨关节病相关的症状，例如缓解了骨关节疼痛、改善了关节活动性和/或功能、减少了关节中的炎性积液、缩短了第一组分开始发挥治疗活性的时间、延长了第一组分的作用持续时间以及降低了可能由上述疾病或病症引起的关节退化或其进程。
本发明还涉及用于治疗和/或预防选自上述疾病或症状之病症特别是骨关节炎的方法，该方法包括以下步骤：向哺乳动物对象(优选人类患者)施用足够量的本发明的间充质干细胞的细胞治疗组合物，其通过关节内施用(特别是在哺乳动物对象(优选人类患者)的膝部、髋部和脊柱中)来实现。
在本发明中，透明质酸或其药有盐用作本发明提供的间充质干细胞的细胞治疗组合物中的载体。不同形式的商业上可得的透明质酸，例如非动物稳定化透明质酸和乙酰透明质酸，可以用于本发明的目的。在一个范例性的实施方案中，可以使用由Q-med，Seminariegatan，Uppsala生产的
Figure BDA0002285776240000111
和非动物稳定化透明质酸。在注射剂中透明质酸处于凝胶形式。透明质酸凝胶，例如
Figure BDA0002285776240000113
和凝胶颗粒，在注射位点被缓慢地重新吸收。随着凝胶通过水解作用分解，水替代它的位置。凝胶变得越不浓缩，则其能结合的水越多。当全部吸收时，凝胶不被注意地从身体里消失。应用不同的透明质酸浓度和凝胶粒度，在注射位点的凝胶的吸收速率可以是不同的，因此，注射组合物中生长因子的释放速率可以是不同的。因此在这个方面，透明质酸凝胶充当延时释放载体或者在瞬时注射组合物中生长因子的递送介质，其随着时间逐渐释放生长因子到接受注射的真皮或者皮下组织中。
在本发明上述制备方法的步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。
本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。下面对本发明作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
本发明提供的间充质干细胞的细胞治疗组合物具备优异的性质。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。以下实施例进一步说明本发明，而不是限制本发明。在下文中，如未特别说明，透明质酸/盐的分子量为500000。在下文中，如未特别说明，间充质干细胞为第五代的间充质干细胞。
实施例1、胎盘MSC的组合物
终产物的配料比例：
间充质干细胞，4×107个/mL；
透明质酸钠，4％；
氯化钠，0.9％；
注射用水，余量。
制法：
参照CN102586184A(2012100446386)中所记载的方法从胎盘中获取间充质干细胞。
称取透明质酸钠和氯化钠，加适量注射用水溶解，121℃高压灭菌15分钟，冷却备用；使间充质干细胞悬液与透明质酸钠和氯化钠的水溶液混合，补加水至全量，混合均匀后，分装到预充注射器中，即得。可以放到-80℃冰箱中冻存以备临床应用。
实施例2、胎盘MSC的组合物
终产物的配料比例：
间充质干细胞，2×107个/mL；
透明质酸钠(分子量为400000)，5％；
氯化钠，0.8％；
注射用水，余量。
制法：
参照CN102586184A(2012100446386)中所记载的方法从胎盘中获取间充质干细胞。
称取透明质酸钠和氯化钠，加适量注射用水溶解，121℃高压灭菌15分钟，冷却备用；使间充质干细胞悬液与透明质酸钠和氯化钠的水溶液混合，补加水至全量，混合均匀后，分装到预充注射器中，即得。可以放到-80℃冰箱中冻存以备临床应用。
实施例3、胎盘MSC的组合物
终产物的配料比例：
间充质干细胞，5×107个/mL；
透明质酸钠(分子量为1000000)，3％；
氯化钠，1.0％；
注射用水，余量。
制法：
参照CN102586184A(2012100446386)中所记载的方法从胎盘中获取间充质干细胞。
称取透明质酸钠和氯化钠，加适量注射用水溶解，121℃高压灭菌15分钟，冷却备用；使间充质干细胞悬液与透明质酸钠和氯化钠的水溶液混合，补加水至全量，混合均匀后，分装到预充注射器中，即得。可以放到-80℃冰箱中冻存以备临床应用。
实施例4、胎盘MSC的组合物
终产物的配料比例：
间充质干细胞(第三代)，3×107个/mL；
透明质酸，4％；
氯化钠，0.9％；
注射用水，余量。
制法：
参照CN102586184A(2012100446386)中所记载的方法从胎盘中获取间充质干细胞。
称取透明质酸和氯化钠，加适量注射用水溶解，121℃高压灭菌15分钟，冷却备用；使间充质干细胞悬液与透明质酸钠和氯化钠的水溶液混合，补加水至全量，混合均匀后，分装到预充注射器中，即得。可以放到-80℃冰箱中冻存以备临床应用。
实施例5、脐带MSC的组合物
终产物的配料比例：
间充质干细胞(第七代)，4×107个/mL；
透明质酸钠，4％；
氯化钠，0.9％；
注射用水，余量。
制法：
参照CN102660497A(2012101599162)中所记载的方法从脐带中获取间充质干细胞。
称取透明质酸钠和氯化钠，加适量注射用水溶解，121℃高压灭菌15分钟，冷却备用；使间充质干细胞悬液与透明质酸钠和氯化钠的水溶液混合，补加水至全量，混合均匀后，分装到预充注射器中，即得。可以放到-80℃冰箱中冻存以备临床应用。
实施例6、脐带MSC的组合物
终产物的配料比例：
间充质干细胞(第十代)，2×107个/mL；
透明质酸钠，5％；
氯化钠，0.8％；
注射用水，余量。
制法：
参照CN102660497A(2012101599162)中所记载的方法从脐带中获取间充质干细胞。
称取透明质酸钠和氯化钠，加适量注射用水溶解，121℃高压灭菌15分钟，冷却备用；使间充质干细胞悬液与透明质酸钠和氯化钠的水溶液混合，补加水至全量，混合均匀后，分装到预充注射器中，即得。可以放到-80℃冰箱中冻存以备临床应用。
实施例7、脐带MSC的组合物
终产物的配料比例：
间充质干细胞(原代)，5×107个/mL；
透明质酸钠，3％；
氯化钠，1.0％；
注射用水，余量。
制法：
参照CN102660497A(2012101599162)中所记载的方法从脐带中获取间充质干细胞。
称取透明质酸钠和氯化钠，加适量注射用水溶解，121℃高压灭菌15分钟，冷却备用；使间充质干细胞悬液与透明质酸钠和氯化钠的水溶液混合，补加水至全量，混合均匀后，分装到预充注射器中，即得。可以放到-80℃冰箱中冻存以备临床应用。
实施例8、脐带MSC的组合物
终产物的配料比例：
间充质干细胞，4×107个/mL；
透明质酸，4％；
氯化钠，0.9％；
注射用水，余量。
制法：
参照CN102660497A(2012101599162)中所记载的方法从脐带中获取间充质干细胞。
称取透明质酸和氯化钠，加适量注射用水溶解，121℃高压灭菌15分钟，冷却备用；使间充质干细胞悬液与透明质酸钠和氯化钠的水溶液混合，补加水至全量，混合均匀后，分装到预充注射器中，即得。可以放到-80℃冰箱中冻存以备临床应用。
实施例9：MSC的组合物
分别照实施例1-8的配料和方法，不同的仅是在添加氯化钠的同时还添加有麦芽糖醇，使麦芽糖醇在最终组合物中的质量体积百分数为0.2％～0.5％(照实施例1、5的为0.4％，照实施例2、6的为0.3％，照实施例3、7的为0.5％，照实施例4、8的为0.2％)，得到8个组合物。
实施例11、胎盘MSC的组合物
终产物的配料比例：
间充质干细胞，4×107个/mL；
透明质酸钠，4％；
氯化钠，0.9％；
氯化镁，0.08％；
乙二胺四乙酸钙钠，0.03％；
麦芽糖醇，0.4％；
注射用水，余量。
制法：
参照CN102586184A(2012100446386)中所记载的方法从胎盘中获取间充质干细胞。
称取透明质酸钠和氯化钠、氯化镁、乙二胺四乙酸钙钠、麦芽糖醇，加适量注射用水溶解，121℃高压灭菌15分钟，冷却备用；使间充质干细胞悬液与透明质酸钠和氯化钠、氯化镁、乙二胺四乙酸钙钠、麦芽糖醇的水溶液混合，补加水至全量，混合均匀后，分装到预充注射器中，即得。可以放到-80℃冰箱中冻存以备临床应用。
实施例12、胎盘MSC的组合物
终产物的配料比例：
间充质干细胞，2×107个/mL；
透明质酸钠(分子量为400000)，5％；
氯化钠，0.8％；
氯化镁，0.1％；
乙二胺四乙酸钙钠，0.02％；
麦芽糖醇，0.3％；
注射用水，余量。
制法：
参照CN102586184A(2012100446386)中所记载的方法从胎盘中获取间充质干细胞。
称取透明质酸钠和氯化钠、氯化镁、乙二胺四乙酸钙钠、麦芽糖醇，加适量注射用水溶解，121℃高压灭菌15分钟，冷却备用；使间充质干细胞悬液与透明质酸钠和氯化钠、氯化镁、乙二胺四乙酸钙钠、麦芽糖醇的水溶液混合，补加水至全量，混合均匀后，分装到预充注射器中，即得。可以放到-80℃冰箱中冻存以备临床应用。
实施例13、胎盘MSC的组合物
终产物的配料比例：
间充质干细胞，5×107个/mL；
透明质酸钠(分子量为1000000)，3％；
氯化钠，1.0％；
氯化镁，0.05％；
乙二胺四乙酸钙钠，0.05％；
麦芽糖醇，0.5％；
注射用水，余量。
制法：
参照CN102586184A(2012100446386)中所记载的方法从胎盘中获取间充质干细胞。
称取透明质酸钠和氯化钠、氯化镁、乙二胺四乙酸钙钠、麦芽糖醇，加适量注射用水溶解，121℃高压灭菌15分钟，冷却备用；使间充质干细胞悬液与透明质酸钠和氯化钠、氯化镁、乙二胺四乙酸钙钠、麦芽糖醇的水溶液混合，补加水至全量，混合均匀后，分装到预充注射器中，即得。可以放到-80℃冰箱中冻存以备临床应用。
实施例14、胎盘MSC的组合物
终产物的配料比例：
间充质干细胞(第三代)，3×107个/mL；
透明质酸，4％；
氯化钠，0.9％；
氯化镁，0.08％；
乙二胺四乙酸钙钠，0.04％；
麦芽糖醇，0.2％；
注射用水，余量。
制法：
参照CN102586184A(2012100446386)中所记载的方法从胎盘中获取间充质干细胞。
称取透明质酸和氯化钠、氯化镁、乙二胺四乙酸钙钠、麦芽糖醇，加适量注射用水溶解，121℃高压灭菌15分钟，冷却备用；使间充质干细胞悬液与透明质酸钠和氯化钠、氯化镁、乙二胺四乙酸钙钠、麦芽糖醇的水溶液混合，补加水至全量，混合均匀后，分装到预充注射器中，即得。可以放到-80℃冰箱中冻存以备临床应用。
实施例15、脐带MSC的组合物
终产物的配料比例：
间充质干细胞(第七代)，4×107个/mL；
透明质酸钠，4％；
氯化钠，0.9％；
氯化镁，0.08％；
乙二胺四乙酸钙钠，0.03％；
麦芽糖醇，0.4％；
注射用水，余量。
制法：
参照CN102660497A(2012101599162)中所记载的方法从脐带中获取间充质干细胞。
称取透明质酸钠和氯化钠、氯化镁、乙二胺四乙酸钙钠、麦芽糖醇，加适量注射用水溶解，121℃高压灭菌15分钟，冷却备用；使间充质干细胞悬液与透明质酸钠和氯化钠、氯化镁、乙二胺四乙酸钙钠、麦芽糖醇的水溶液混合，补加水至全量，混合均匀后，分装到预充注射器中，即得。可以放到-80℃冰箱中冻存以备临床应用。
实施例16、脐带MSC的组合物
终产物的配料比例：
间充质干细胞(第十代)，2×107个/mL；
透明质酸钠，5％；
氯化钠，0.8％；
氯化镁，0.1％；
乙二胺四乙酸钙钠，0.02％；
麦芽糖醇，0.3％；
注射用水，余量。
制法：
参照CN102660497A(2012101599162)中所记载的方法从脐带中获取间充质干细胞。
称取透明质酸钠和氯化钠、氯化镁、乙二胺四乙酸钙钠、麦芽糖醇，加适量注射用水溶解，121℃高压灭菌15分钟，冷却备用；使间充质干细胞悬液与透明质酸钠和氯化钠、氯化镁、乙二胺四乙酸钙钠、麦芽糖醇的水溶液混合，补加水至全量，混合均匀后，分装到预充注射器中，即得。可以放到-80℃冰箱中冻存以备临床应用。
实施例17、脐带MSC的组合物
终产物的配料比例：
间充质干细胞(原代)，5×107个/mL；
透明质酸钠，3％；
氯化钠，1.0％；
氯化镁，0.05％；
乙二胺四乙酸钙钠，0.05％；
麦芽糖醇，0.5％；
注射用水，余量。
制法：
参照CN102660497A(2012101599162)中所记载的方法从脐带中获取间充质干细胞。
称取透明质酸钠和氯化钠、氯化镁、乙二胺四乙酸钙钠、麦芽糖醇，加适量注射用水溶解，121℃高压灭菌15分钟，冷却备用；使间充质干细胞悬液与透明质酸钠和氯化钠、氯化镁、乙二胺四乙酸钙钠、麦芽糖醇的水溶液混合，补加水至全量，混合均匀后，分装到预充注射器中，即得。可以放到-80℃冰箱中冻存以备临床应用。
实施例18、脐带MSC的组合物
终产物的配料比例：
间充质干细胞，4×107个/mL；
透明质酸，4％；
氯化钠，0.9％；
氯化镁，0.08％；
乙二胺四乙酸钙钠，0.04％；
麦芽糖醇，0.2％；
注射用水，余量。
制法：
参照CN102660497A(2012101599162)中所记载的方法从脐带中获取间充质干细胞。
称取透明质酸和氯化钠、氯化镁、乙二胺四乙酸钙钠、麦芽糖醇，加适量注射用水溶解，121℃高压灭菌15分钟，冷却备用；使间充质干细胞悬液与透明质酸钠和氯化钠、氯化镁、乙二胺四乙酸钙钠、麦芽糖醇的水溶液混合，补加水至全量，混合均匀后，分装到预充注射器中，即得。可以放到-80℃冰箱中冻存以备临床应用。
实施例20：测定细胞活率
针对本发明实施例1-9以及实施例11～18配制得到的全部细胞治疗组合物，采用公知的台盼蓝拒染法计数活细胞，测定并计算其细胞活率(即活细胞的比例)，其计算式如下：
细胞活率＝(细胞总数-死细胞数)/细胞总数x 100％
结果：
上述实施例1-9以及实施例11～18的全部组合物，它们在冻存之前，经测定，细胞活率在98～100％范围内(例如实施例1和实施例11组合物分别为98.4％和99.7％)；冻存之前室温放置6小时细胞活率在93～97％范围内(例如实施例1和实施例5组合物分别为95.1％和93.8％，实施例11和实施例15组合物分别为96.3％和94.7％)；冻存之前室温放置24小时细胞活率在82～88％范围内(例如实施例1和实施例5组合物分别为84.3％和86.1％，实施例11和实施例15组合物分别为86.3％和84.7％)，显示细胞具有优异的存活率。
上述实施例1-9的全部组合物，它们在-80℃冰箱中冻存10天之后，常温融化复苏后细胞活率在86-91％范围内(例如实施例1和实施例5组合物分别为88.7％和87.1％)；复苏后常温放置6小时细胞活率在78-81％范围内(例如实施例1和实施例5组合物分别为79.2％和78.5％)，显示细胞具有优异的存活率。
上述实施例11-18的全部组合物，它们在-80℃冰箱中冻存10天之后，常温融化复苏后细胞活率在95～97％范围内(例如实施例11和实施例15组合物分别为96.3％和95.6％)；复苏后常温放置6小时细胞活率在91～93％范围内(例如实施例11和实施例15组合物分别为92.4％和91.2％)，显示细胞具有比之于实施例1～9具有更优异的存活率。
上述-80℃冻存10天，对于药品来说明显是偏短的，难以满足药品贮藏、运输的常规要求。例如，细胞可以在经典的冻存液中在-196℃冻存相当长的时间，但是在将其配制成注射用的液体组合物时，细胞环境发生巨大变化，长期冻存是不可取的，而采取临用预配的方法灌装于预充式注射器中后在-80℃冻存3个月通常能够满足临床关于贮藏、运输的要求。因此，参照本文测定方法，使实施例1～9以及实施例11～18全部组合物在-80℃冻存3个月，然后测定这些组合物常温融化复苏后细胞活率和复苏后常温放置6小时细胞活率，结果：
上述实施例1-9的全部组合物，它们在-80℃冰箱中冻存3个月之后，常温融化复苏后细胞活率在66-74％范围内(例如实施例1和实施例5组合物分别为71.4％和68.8％)，经测定，6小时细胞活率在44-53％范围内(例如实施例1和实施例5组合物分别为51.5％和48.3％)；
上述实施例11-18的全部组合物，它们在-80℃冰箱中冻存3个月之后，常温融化复苏后细胞活率在90-94％范围内(例如实施例11和实施例15组合物分别为93.7％和92.3％)，经测定，6小时细胞活率在87-90％范围内(例如实施例11和实施例15组合物分别为89.5％和88.3％)，显示细胞具有比之于实施例1～9具有更优异的存活率。
实施例21：分别参照实施例11～18的配方和制法，不同的仅是不添加氯化镁，得到8种液体组合物。实施例22：分别参照实施例11～18的配方和制法，不同的仅是不添加乙二胺四乙酸钙钠，得到8种液体组合物。
上述实施例21-22的全部组合物，它们在-80℃冰箱中冻存3个月之后，常温融化复苏后细胞活率在68-73％范围内(例如实施例21分别参照实施例11和实施例15所得组合物分别为71.4％和69.3％)，经测定，复苏后常温放置6小时细胞活率在48-55％范围内(例如实施例21分别参照实施例11和实施例15所得组合物分别为53.5％和49.7％)。这一结果表明，本发明出人意料的发现是：组合物中不添加氯化镁或者不添加乙二胺四乙酸钙钠，不能获得优良的复苏后细胞活率(反映细胞经历复苏过程的活力)以及复苏后6小时细胞活率(反映复苏后细胞的存活稳定性)。
上述实施例1-9以及实施例11-18的全部细胞组合物，通过利用流式细胞仪对细胞表面标记物进行检测，根据美国“The International Society for Cellular Therapy(ISCT)”在2006年发布的有关检定间充质干细胞的准则，该细胞在标记物检测中应符合以下要求：标记物CD73、CD90、CD105表达阳性；标记物CD11b、CD34、CD45、CD19、HLA-DR表达阴性。经测定上述实施例1-9以及实施例11-18的全部细胞组合物，各标记物检测结果均符合标准要求。

Claims (10)

1.用于治疗骨关节炎和软骨缺损的细胞治疗组合物，该组合物中包括：胎盘间充质干细胞、透明质酸或其药用盐、氯化钠、和水。
2.根据权利要求1的细胞治疗组合物，其特征在于：
所述透明质酸或其药用盐的质量体积百分数为3％～5％、3～4％或3％；
所述间充质干细胞的密度为2×107个/mL～5×107个/mL或3×107个/mL；
所述氯化钠的质量体积百分数为0.8％～1.0％或0.9％；
其中还包含氯化镁，例如其质量体积百分数为0.05％～0.1％或0.08％；和/或
还包含乙二胺四乙酸钙钠，例如其质量体积百分数为0.02％～0.05％或0.03％。
3.根据权利要求1的细胞治疗组合物，其特征在于：
其中透明质酸或其药用盐的质量体积百分数为3％、间充质干细胞的密度为3×107个/mL、氯化钠的质量体积百分数为0.9％；
其中透明质酸或其药用盐的质量体积百分数为4％、间充质干细胞的密度为5×107个/mL、氯化钠的质量体积百分数为0.9％；和/或
其中透明质酸或其药用盐的质量体积百分数为5％、间充质干细胞的密度为5×107个/mL、氯化钠的质量体积百分数为0.9％。
4.根据权利要求1的细胞治疗组合物，其特征在于：
(1)其中包含：胎盘间充质干细胞4×107个/mL、透明质酸钠4％、氯化钠0.9％、氯化镁0.08％、乙二胺四乙酸钙钠0.03％、麦芽糖醇0.4％、和注射用水；或者，
(2)其中包含：胎盘间充质干细胞2×107个/mL、透明质酸钠5％、氯化钠0.8％、氯化镁0.1％、乙二胺四乙酸钙钠0.02％、麦芽糖醇0.3％、和注射用水；或者，
(3)其中包含：胎盘间充质干细胞5×107个/mL、透明质酸钠3％、氯化钠1.0％、氯化镁0.05％、乙二胺四乙酸钙钠0.05％、麦芽糖醇0.5％、和注射用水；或者，
(4)其中包含：胎盘间充质干细胞3×107个/mL、透明质酸4％、氯化钠0.9％、氯化镁0.08％、乙二胺四乙酸钙钠0.04％、麦芽糖醇0.2％、和注射用水。
5.根据权利要求1的细胞治疗组合物，其中所述透明质酸或其药用盐的分子量为400000～1000000。
6.根据权利要求1的细胞治疗组合物，其中所述间充质干细胞为原代～第十代的间充质干细胞。
7.根据权利要求1的细胞治疗组合物，其中所述的(胎盘来源)间充质干细胞的获取方法包括如下步骤：
(a)用PBS缓冲液充分冲洗胎盘小叶，以去除胎盘中残留的血液；
(b)将胎盘小叶剪成块状，加入含有组织消化酶的PBS缓冲液，再在37℃孵育消化；
(c)将组织块用铜网过滤，必要时研磨以促使过滤；
(d)将收集的过滤液离心，分离单个核细胞，再用MSC培养基悬浮所获得的细胞，然后在37℃、5％的CO2培养箱中培养；
(e)待散在细胞形成克隆后，挑取各克隆细胞，用MSC培养基分别培养，待细胞融合后，用胰酶消化传代，即得胎盘间充质干细胞。
8.根据权利要求1的细胞治疗组合物，其是按照包括如下步骤的方法制备得到的：
将透明质酸或其药用盐和氯化钠(以及任选的氯化镁和/或任选的乙二胺四乙酸钙钠)加入水中溶解，任选地对该溶液进行除菌，获得制剂的基质；
将预先制得的间充质干细胞混悬于该基质中，分装，即得；
进一步的，
其制备过程是在无菌条件下进行的；
其制备过程中，在与间充质干细胞混和前所述基质的温度低于25℃；
其制备过程中，在温度低于25℃条件下将所述基质与间充质干细胞混和；
所述分装是将配制得到的细胞治疗组合物分装到预充注射器中，尤其是分装到一次性使用的预充注射器中；和/或
所述预充式注射器的针筒材质为高分子聚合物(例如聚丙烯)、活塞材质为橡胶。
9.制备权利要求1-8任一项所述细胞治疗组合物的方法，包括以下步骤：
将透明质酸或其药用盐和氯化钠(以及任选的氯化镁和/或任选的乙二胺四乙酸钙钠)加入水中溶解，任选地对该溶液进行除菌，获得制剂的基质；
将预先制得的间充质干细胞混悬于该基质中，分装，即得。
10.根据权利要求9的方法，其特征在于：
其制备过程是在无菌条件下进行的；
其制备过程中，在与间充质干细胞混和前所述基质的温度低于25℃；
其制备过程中，在温度低于25℃条件下将所述基质与间充质干细胞混和；
所述分装是将配制得到的细胞治疗组合物分装到预充注射器中，尤其是分装到一次性使用的预充注射器中；和/或
所述预充式注射器的针筒材质为高分子聚合物(例如聚丙烯)、活塞材质为橡胶。
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