CN111575394A - 一种猪胸膜肺炎放线杆菌的lamp检测试剂盒 - Google Patents

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    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Abstract

本发明公开了一种猪胸膜肺炎放线杆菌的LAMP检测试剂盒，具有一检测引物组和一内标引物组；该检测引物组包括一检测外引物对、一检测内引物对和一检测环引物对，该内标引物组包括一内标外引物对、一内标内引物对和一内标环引物对。本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、成本低、不需要昂贵仪器、适合现场检测等有益效果，更重要是该方法提高检测的准确性，及时发现检测中的假阴性结果，可有效防止因假阴性检测结果引起各种事故。

Description

一种猪胸膜肺炎放线杆菌的LAMP检测试剂盒
技术领域
本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及一种猪胸膜肺炎放线杆菌的LAMP检测试剂盒。
背景技术
胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，App)可导致猪传染性胸膜肺炎，其病理特征是纤维素性胸膜炎和出血性、坏死性脑炎。该病是国际上公认的危害现代养猪业的五大疾病之一，给各国养猪业造成了巨大的经济损失。此病发病率和致死率极高，但在大多数病例中呈隐性感染。据报道临床表现健康的猪，其上呼吸道仍有病原体寄生，这是造成猪胸膜肺炎放线杆菌传播的主要原因，也是造成增重率下降，饲料转化率下降，上市时间延长的主要原因。尽早诊断亚临床感染病猪是控制该病的关键，但亚临床感染猪的诊断十分困难。
猪胸膜肺炎放线杆菌现在已发现15个血清型，其中有的不具致病性，有的则会导致严重疾病。1、5、9、11和12型通常具有很强毒力，而3、6型较为温和。这种细菌寄生于扁桃体和上呼吸道。病原经飞沫或气雾在短距离内传播，在体外环境只能存活几天。APP对猪致病有几个毒力因素，包括荚膜多糖、脂多糖、外膜蛋白、转铁结合蛋白、蛋白酶、渗透因子及溶血素等，在所有致病因子中最重要的是溶血素(Hemolysin，RTX)。APP外毒素(Actinobacillus pleuropeumoniae-RTX-toxin，Apx)对许多细胞，包括巨嗜细胞具有细胞毒性作用。在APP的15个血清型中共发现了3种不同的Apx溶血素，即Apx I、Apx II、ApxIII。前二者具有溶血活性和细胞毒性作用，而ApxIII仅具有细胞毒性作用。1997年Anderso和Machnnes发现了一个新型Apx毒素，由ApxVII基因编码，它与Apx I、ApxII、ApxIII毒素基因不同，在所有血清型App中均能检测到。ApxVII基因具有保守性；以App所有15个血清型菌种做模板，用PCR，方法都能扩增出这条片段，而从其它亲缘关系相近的细菌中无法扩增这一片段，证明这一片段有很高的种特异性。基于ApxVII的特性，在不分型的情况下，可建立快速特异的诊断方法，检测出猪胸膜肺炎放线杆菌。所以有学者将胸膜肺炎分子生物学基因诊断的重点放在ApxVII上。
近年来包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、原位杂交、常规PCR、巢式PCR和实时荧光定量PCR等多种分子生物学检测方法已被开发用于App的诊断检测。其中各种基于PCR的检测方法具有较高的敏感性和较好的特异性，在实验室检测中应用最为广泛；但是这些方法需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求，限制了它们在养殖猪场的实际应用。因此，建立一种可鉴别假阴性检测结果的快速、高通量且对仪器要求不高的猪胸膜肺炎放线杆菌检测试剂盒及检测方法成为目前急需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种猪胸膜肺炎放线杆菌的LAMP检测试剂盒。
本发明的技术方案如下：
一种猪胸膜肺炎放线杆菌的LAMP检测试剂盒，具有一检测引物组和一内标引物组；
该检测引物组包括一检测外引物对、一检测内引物对和一检测环引物对，该检测外引物对由如SEQ ID NO.01所示的正向检测外引物和如SEQ ID NO.02所示的反向检测外引物组成，该检测内引物对由如SEQ ID NO.03所示的正向检测内引物和如SEQ ID NO.04所示的反向检测内引物组成，该检测环引物对由如SEQ ID NO.05所示的正向检测环引物和如SEQ ID NO.06所示的反向检测环引物组成；
该内标引物组包括一内标外引物对、一内标内引物对和一内标环引物对，该内标外引物对由如SEQ ID NO.07所示的正向内标外引物和如SEQ ID NO.08所示的反向内标外引物组成，该内标内引物对由如SEQ ID NO.09所示的正向内标内引物和如SEQ ID NO.010所示的反向内标内引物组成，该内标环引物对由如SEQ ID NO.11所示的正向内标环引物和如SEQ ID NO.12所示的反向内标环引物组成。
在本发明的一个优选实施方案中，所述检测外引物对、检测内引物对和检测环引物对的摩尔比为1-2∶4-6∶2-4。
在本发明的一个优选实施方案中，所述内标外引物对、内标内引物对和内标环引物对的摩尔比为1-2∶4-6∶2-4。
在本发明的一个优选实施方案中，还包括DNA聚合酶、LAMP反应液、内标、阳性对照和阴性对照。
进一步优选的，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
进一步优选的，所述LAMP反应液中含有浓度为6mM的dNTPs溶液、10×ThermoPol反应缓冲液和浓度为140mM的MgSO4水溶液。
更进一步优选的，所述dNTPs溶液、10×Thermo Pol反应缓冲液和MgSO4水溶液的体积比为8∶4∶3。
进一步优选的，所述阳性对照为含有猪胸膜肺炎放线杆菌apxIVA基因片段的T载体克隆。
进一步优选的，所述阴性对照为超纯水。
进一步优选的，所述内标为含有猪胸膜肺炎放线杆菌omlA基因片段的T载体克隆。
本发明的有益效果是：
1、本发明快速高效：整个扩增只用30-60min即可完成，扩增产量可达109-1010个拷贝。
2、本发明操作简便：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要一部恒定温度仪就能反应和检测，条件比较温和。
3、本发明特异性稿：本发明根据猪胸膜肺炎放线杆菌apxIVA基因设计了检测引物组，应用这特定的检测引物组，扩增靶序列的6个区域，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行。
4、本发明灵敏度高：最低检测极限可达到1fg/μL。
5、本发明鉴定简便：可通过观察扩增曲线判断扩增与否，无需电泳等其他任何分析步骤，适合现场检测。
6、本发明的准确性高：本发明的检测试剂盒内含内标，可根据检测内标引物组是否有扩增来判断是否有假阴性检测结果，有效预防因抑制等原因造成的检测结果为假阴性的情况发生，为目前无法判断检测结果是假阴性结果的情况提供一种新的LAMP检测方法，提高检测的准确性。
7、本发明的内标与实际样品的检测不在同一管中进行检测，该内标与样品检测管中的扩增靶标不同，内标的核酸浓度在该内标的检测线附近，可识别轻微的反应抑制；正常情况下因内标检测管在加入样品提取液的同时加入有低浓度的内标，所以内标检测管检测检测结果为阳性，如内标管检测结果为阴性，提示样品提取液中含有抑制因子或其他原因，导致内标检测管不能进行扩增反应，同样样品检测管也可能因抑制因子或其他原因导致不能进行正常扩增检测，造成样品检测管检测结果为假阴性，因此该方法可根据内标管的检测结果辅助判断样品检测结果可能为假阴性结果。
附图说明
图1为本发明实施例3的实验结果图之一，其显示猪胸膜肺炎放线杆菌内标的最低检出限为1fg/μL。
图2为本发明实施例3的实验结果图之二，其为猪胸膜肺炎放线杆菌内标的最低检出限为1fg/μL的复核。
图3为本发明实施例3的实验结果图之三，其中猪胸膜肺炎放线杆菌apxIVA基因最低检出限102copies/μL。
图4为本发明实施例4中的特异性实验结果图，其中，对猪链球菌(SS)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、副猪嗜血杆菌(HPS)、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪多杀性巴氏杆菌、健康猪血清临床样本的DNA均无非特异性扩增。
图5为本发明实施例5的无抑制因子的实际样品检测结果图。
图6为本发明实施例5的有抑制因子的实际样品检测结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1猪胸膜肺炎放线杆菌LAMP检测试剂盒的建立
猪胸膜肺炎放线杆菌的LAMP-PCR检测试剂盒，包括检测引物组、内标引物组、LAMP反应液、Bst DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和内标。
(1)检测引物组：以猪胸膜肺炎放线杆菌apxIVA基因为靶基因，进行LAMP引物的设计，所述检测引物组包括一检测外引物对、一检测内引物对和一检测环引物对，该检测外引物对由如SEQ ID NO.01所示的正向检测外引物和如SEQ ID NO.02所示的反向检测外引物组成，该检测内引物对由如SEQ ID NO.03所示的正向检测内引物和如SEQ ID NO.04所示的反向检测内引物组成，该检测环引物对由如SEQ ID NO.05所示的正向检测环引物和如SEQID NO.06所示的反向检测环引物组成，核苷酸序列分别如下所示：
apxIVA-F3：5’-ggtaatgatacggttaatggc-3’(SEQ ID NO.01)；
apxIVA-B3：5’-cttcaagcgacacaagagata-3’(SEQ ID NO.02)；
apxIVA-FIP：5’-acgatatcctgtccgtgtcctggtaatggcgatgacacc-3’(SEQ IDNO.03)；
apxIVA-BIP：5’-tggtgagcactcaggtggactctcctccgtgcttct-3’(SEQ ID NO.04)；
apxIVA-LF：5’-gccacctcttagaatatcattacct-3’(SEQ ID NO.05)；
apxIVA-LB：5’-agatggttgagtcgatggc-3’(SEQ ID NO.06)；
(2)内标引物组：以猪胸膜肺炎放线杆菌omlA基因为内标，进行LAMP引物的设计，所述内标引物组包括一内标外引物对、一内标内引物对和一内标环引物对，该内标外引物对由如SEQ ID NO.07所示的正向内标外引物和如SEQ ID NO.08所示的反向内标外引物组成，该内标内引物对由如SEQ ID NO.09所示的正向内标内引物和如SEQ ID NO.10所示的反向内标内引物组成，该内标环引物对由如SEQ ID NO.11所示的正向内标环引物和如SEQ IDNO.12所示的反向内标环引物组成，核苷酸序列分别如下所示：
omlA-F3：5’-caggtaagagaaggtgaacg-3’(SEQ ID NO.07)：
omlA-B3：5’-ttaccatcagcacttcctg-3’(SEQ ID NO.08)；
omlA-FIP：5’-gatccttgtacgtctgccactaagtgttatctatggacgaatcaaca-3’(SEQ IDNO.09)；
omlA-BIP：5’-cacggtgattattggaagctaggtttgagatagtaccatccttatcaac-3’(SEQID NO.10)；
omlA-LoopF：5’-agccatatagcatcttacctctat-3’(SEQ ID NO.11)；
omlA-LoopB：5’-aagatatggttacaggcgttgta-3’(SEQ ID NO.12)。
(3)LAMP反应液：6mM dNTPs、10×ThermoPol反应缓冲液、140mM MgSO4水溶液、三者的体积比是8∶4∶3。
(4)阳性对照为含有猪胸膜肺炎放线杆菌apxIVA基因部分片段的T载体克隆，其制备方法为：以分离鉴定的猪胸膜肺炎放线杆菌为模板，利用检测外引物对(apxIVA外引物，SEQ ID NO.01和SEQ ID NO.02)进行扩增，所得apxIVA基因扩增片段序列如SEQ ID NO.13所示，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中，即为阳性对照。
(5)内标为含有omlA基因部分片段的T载体克隆，以分离鉴定的猪胸膜肺炎放线杆菌为模板，利用内标外引物对(omlA外引物，SEQ ID NO.07和SEQ ID NO.08)进行扩增，所得omlA基因扩增片段序列如SEQ ID NO.14所示，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中，即为内标。
(6)阴性对照为超纯水。
实施例2猪胸膜肺炎放线杆菌的LAMP检测方法
利用实施例1的猪胸膜肺炎放线杆菌的LAMP检测试剂盒对样品进行检测，步骤如下：
(1)提取待检样品DNA。
(2)利用权利要求1的LAMP引物组合物对待检样品DNA进行LAMP恒温扩增：
LAMP恒温扩增的25μL反应体系含有：apxIVA-F3 0.2μM，apxIVA-B3 0.2μM，apxIVA-FIP 1.2μM，apxIVA-BIP 1.2μM，apxIVA-LF 0.6μM，apxIVA-LB 0.6μM，omlA-F3 0.2μM，omlA-B30.2μM，omlA-FIP 1.1μM，omlA-BIP 1.1μM，omlA-LoopF 0.6μM，omlA-LoopB 0.6μM，LAMP反应液12.5μL，DNA聚合酶8U，10×SYBR Green I 0.5μL，待检样品2μL，内标2μL，用超纯水补齐到25μL；
LAMP恒温扩增的程序为：63-65℃反应30-60min，并在80℃持续2min。
(3)结果判断：将反应管中置于恒温荧光检测仪或荧光PCR仪中，实时读取荧光信号，根据apxIVA基因检测结果和内标omlA检测结果进行判断：
apxIVA基因检测结果为阳性且内标检测结果全为阳性时，检测结果为阳性；
apxIVA基因检测结果为阴性且内标检测结果全为阳性时，检测结果为阴性；
apxIVA基因检测结果为阳性且内标检测结果全为阴性时，检测结果为阳性；
apxIVA基因检测结果为阴性且内标检测结果全为阴性时，检测结果可能为假阴性，建议重新提取DNA进行检测。
实施例3灵敏度实验
将构建的质粒进行灵敏度实验，将1pg/μL质粒以10倍梯度稀释为100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、0.1fg/μL等梯度作为质控标准，用实施例2的方法进行检测，通过灵敏度实验确定内标的最低检出限1fg/μL(如图1所示)，并对最低检出限予以复核(图2)，将内标浓度定为最低检出限的浓度。
将猪胸膜肺炎放线杆菌进行培养，将培养后的菌进行10倍梯度稀释，提取DNA，同时将稀释的菌液进行平板培养计数，将平板培养计数结果与本试剂盒的最低灵敏度进行对比，本试剂盒的最低检出度为1.2×102CFU/mL，检测结果见图3。
实施例4特异性实验
用实施例2的方法分别对猪链球菌(SS)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、副猪嗜血杆菌(HPS)、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪多杀性巴氏杆菌、健康猪血清临床样本进行检测，如图4所示，结果显示阳性对照及内标基因扩增正常，猪链球菌(SS)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、副猪嗜血杆菌(HPS)、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪多杀性巴氏杆菌、健康猪血清临床样本的DNA均无扩增。
实施例5实际样品检测
取不含抑制因子的样品及不含抑制因子的样品同时进行实验，并增加灵敏度实验予以辅助判断结果，检测方法及结果如下：
1、待检样品DNA的提取：
1)取猪胸膜肺炎放线杆菌及含有EDTA抑制因子的猪胸膜肺炎放线杆菌菌液1-2ml，12000rpm离心5min，弃上清；
2)加入500μL 0.8％NaCl水溶液或医用生理盐水，12000rpm离心5min，尽量弃净上清液；
3)沉淀中加入100μL DNA提取液，剧烈涡旋混匀，100℃加热10min，加热后迅速冷却(置于-20℃冰箱)10min；
4)12000rpm离心2min，将上清转移至新的离心管中备用(2μL上清用于核酸扩增)。
2、恒温基因扩增检测反应体系及条件：25μL反应体系含有：apxIVA-F3 0.2μM，apxIVA-B3 0.2μM，apxIVA-FIP 1.2μM，apxIVA-BIP 1.2μM，apxIVA-LF 0.6μM，apxIVA-LB0.6μM，，LAMP反应液12.5μL，，DNA聚合酶8U，10×SYBR Green I0.5μL，待检2μL g，用超纯水补齐到25μL；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63-65℃反应30-45min，并在80℃持续2min；
(3)恒温基因扩增内标反应体系及条件：25μL反应体系含有：omlA-F3 0.2μM，omlA-B3 0.2μM，omlA-FIP 1.1μM，omlA-BIP 1.1μM，omlA-LoopF 0.6μM，omlA-LoopB 0.6μM，LAMP反应液12.5μL，DNA聚合酶8U，10×SYBR Green I 0.5μL，待检样品2μL，内标基因2μL，用超纯水补齐到25μL；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63-65℃反应30-45min，并在80℃持续2min；
(4)结果判断：将上述反应管中置于恒温荧光检测仪或荧光PCR仪(如ABI 7500)中，根据仪器实时读取的荧光信号来判断扩增结果。根据apxIVA基因检测结果和内标基因omlA检测结果进行判断。
检测结果见图5(为不含抑制因子的样品检测结果图)及图6(含抑制因子的样品检测结果及灵敏度对照图)，内标基因及样品检测结果为阳性，检测结果正常，且试剂盒各浓度梯度均能检出，出峰时间正常，但含抑制因子的内标基因及样品检测结果均为阴性，提示检测结果可能为假阴性检测结果，样品中可能含有抑制因子或其他原因引起检测结果异常，需重新实验并排查原因，做进一步的确认。通过上述实验证明该方法可有效的鉴别检测结果是否为假阴性。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110> 厦门银祥集团有限公司
<120> 一种猪胸膜肺炎放线杆菌的LAMP检测试剂盒
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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agccatatag catcttacct ctat 24
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<212> DNA
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<400> 12
aagatatggt tacaggcgtt gta 23

Claims (10)

1.一种猪胸膜肺炎放线杆菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于：具有一检测引物组和一内标引物组；
该检测引物组包括一检测外引物对、一检测内引物对和一检测环引物对，该检测外引物对由如SEQ ID NO.01所示的正向检测外引物和如SEQ ID NO.02所示的反向检测外引物组成，该检测内引物对由如SEQ ID NO.03所示的正向检测内引物和如SEQ ID NO.04所示的反向检测内引物组成，该检测环引物对由如SEQ ID NO.05所示的正向检测环引物和如SEQID NO.06所示的反向检测环引物组成；
该内标引物组包括一内标外引物对、一内标内引物对和一内标环引物对，该内标外引物对由如SEQ ID NO.07所示的正向内标外引物和如SEQ ID NO.08所示的反向内标外引物组成，该内标内引物对由如SEQ ID NO.09所示的正向内标内引物和如SEQ ID NO.010所示的反向内标内引物组成，该内标环引物对由如SEQ ID NO.11所示的正向内标环引物和如SEQ ID NO.12所示的反向内标环引物组成。
2.如权利要求1所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述检测外引物对、检测内引物对和检测环引物对的摩尔比为1-2∶4-6∶2-4。
3.如权利要求1所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述内标外引物对、内标内引物对和内标环引物对的摩尔比为1-2∶4-6∶2-4。
4.如权利要求1至3中任一权利要求所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于：还包括DNA聚合酶、LAMP反应液、内标、阳性对照和阴性对照。
5.如权利要求4所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
6.如权利要求4所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述LAMP反应液中含有浓度为6mM的dNTPs溶液、10×Thermo Pol反应缓冲液和浓度为140mM的MgSO4水溶液。
7.如权利要求6所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述dNTPs溶液、10×ThermoPol反应缓冲液和MgSO4水溶液的体积比为8∶4∶3。
8.如权利要求4所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为含有猪胸膜肺炎放线杆菌apxIVA基因片段的T载体克隆。
9.如权利要求4所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述阴性对照为超纯水。
10.如权利要求4所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述内标为含有猪胸膜肺炎放线杆菌omlA基因片段的T载体克隆。
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