JP2024519082A

JP2024519082A - 肝細胞がんのｄｎａメチル化バイオマーカー

Info

Publication number: JP2024519082A
Application number: JP2023571830A
Authority: JP
Inventors: リール，ホセペレイラ; ヴァズ，ジョアナカルドソ; ゴンサルベス，エマニュエルホセヴィエイラ; レイス，マリアアナゴンサルベス
Original assignee: オフィオミクス－インベスティガカオイーデセンボルヴィメントエンバイオテクノロジアエスエー
Priority date: 2021-05-21
Filing date: 2022-05-23
Publication date: 2024-05-08
Also published as: US20240229158A1; CN117355616A; WO2022243566A1; EP4341441A1

Abstract

本発明は、患者から得られる探索的な組織生検又は血漿試料から抽出されたＤＮＡにおいてがんを検出するための頑健な方法を提供し、前記方法は、複数のＣｐＧ部位を含むゲノムの複数の定義されたメチル化差異領域におけるＤＮＡメチル化レベルを測定することを含む。
【選択図】なし

Description

本発明は、複数の遺伝子座におけるＤＮＡメチル化シグネチャーを決定することによる患者試料中の低濃度のがん由来ＤＮＡを検出するための有利な方法に関する。

本発明は、２０２１年５月２１日に出願された欧州特許出願（ＥＰ）第２１１７５４２５号の優先権の利益を主張するものであり、これは参照により本明細書に完全に組み込まれる。

現在の肝細胞がん（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＨＣＣ）診断ガイドラインでは、組織生検などの侵襲的方法の利用の後に、組織学的画像診断及び／又は造影画像診断を行うことが必要である。このように多大な時間を必要とする方法のために、ＨＣＣは進行した段階で検出されることが多く、４０％の症例が多結節性又は転移性であり、７２％の症例が治療の選択肢を失っている状態である（Ｌｌｏｖｅｔら，２０２１Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｉｓ．Ｐｒｉｍｅｒｓ７：６）。したがって、スクリーニングプログラム及びサーベイランスプログラムは、ＨＣＣを早期に検出及び診断し、余命を延ばすことができる治療オプションのためのより長い時間的余裕を患者に提供するために不可欠である。

血漿及び尿などの体液から採取した液体生検（ｌｉｑｕｉｄｂｉｏｐｓｙ：ＬＢ）には、肝細胞がんの循環分子バイオマーカーが含まれており、早期診断アッセイのための非侵襲的かつ安価な代替法としての可能性がある。このような試料中のα－フェト蛋白（ａｌｐｈａ－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ：ＡＦＰ）が高いレベルであれば、ほぼ完全な特異度で肝細胞がんを同定できるが、感度（再現率）は４５％未満と低いことが多く、一方、ＡＦＰが低い閾値（２０ｎｇ／ｍｌ）であれば、特異度と感度とのバランスがとれており、どちらも７９％前後の範囲である。注目すべきは、慢性肝疾患、特にＨＣＶ関連肝硬変患者では、バイオマーカーとしてのＡＦＰの適合率が著しく低下し、確実な診断には不十分であることである（Ｂｉａｌｅｃｋｉら，２００５ＨＰＢ７：２６）。ＬＢはまた、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｕｒＤＮＡ：ｃｔＤＮＡ）を含む全身の細胞に由来する無細胞（セルフリー）ＤＮＡ（ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅＤＮＡ：ｃｆＤＮＡ）物質を含有する。変異及びメチル化など、ｃｔＤＮＡの遺伝子マーカーの測定は、診断及び治療のツールとして使用可能である。

複数の研究で、ＨＣＣのＤＮＡメチル化バイオマーカーが同定されているが（Ｌｉｕら，２０２０Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．３１，７４５；Ｂｏｎｄｅｒら，２０１４ＢＭＣＧｅｎｏｍｉｃｓ１５，８６０；Ｗａｎｇら，２０１９Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ７０，５１；Ｃｈａｎｇら，２０１８ＧｅｎｏｍｅＭｅｄ．１０，４２；Ｓｈｕｉら，２０２０Ｆｒｏｎｔ．Ｇｅｎｅｔ．１１，９０６）、組織試料のみに限定され、単一ＣｐＧ部位の小セットの同定に焦点を当て、及び／又は健常肝組織試料との比較であったため、肝硬変などの慢性肝疾患とＨＣＣとを区別することができず、さらにプローブの不具合又は患者試料中の変異の存在に対して診断の結果を不可能にする脆弱性があった。

Ｌｌｏｖｅｔら，２０２１Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｉｓ．Ｐｒｉｍｅｒｓ７：６Ｂｉａｌｅｃｋｉら，２００５ＨＰＢ７：２６Ｌｉｕら，２０２０Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．３１，７４５Ｂｏｎｄｅｒら，２０１４ＢＭＣＧｅｎｏｍｉｃｓ１５，８６０Ｗａｎｇら，２０１９Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ７０，５１Ｃｈａｎｇら，２０１８ＧｅｎｏｍｅＭｅｄ．１０，４２Ｓｈｕｉら，２０２０Ｆｒｏｎｔ．Ｇｅｎｅｔ．１１，９０６

上記の技術状態に基づき、本発明の目的は、患者試料中の低濃度の腫瘍由来ＤＮＡを正確に検出する手段及び方法、特に血漿などの無細胞試料中の肝細胞がん由来ＤＮＡの存在を検出する手段及び方法を提供することである。

この目的は、本明細書の独立請求項の主題によって達成され、本明細書の従属請求項、実施例、図及び一般的な説明に記載されたさらに有利な実施形態によって達成される。

図１は、集められたＤＮＡメチル化データセットの概要を示す。ａ）様々な種類にわたる試料の数、つまり、ＨＣＣ腫瘍、健常肝臓、及び肝硬変及びその他の肝臓病の試料。ｂ）訓練及び試験データセットを構成する研究ごとの試料の数。ｃ）ｂ）と同様に検証データセットを構成する研究ごとの試料の数。図２は、上位ＤＮＡメチル化ＨＣＣバイオマーカーの数の最適化を示す。貪欲な（グリーディ）逐次ＤＭＲ選択は、ＬｉｎｅａｒＳＶＣモデルに逐次加えるための最適なＤＭＲを選択する。各ＤＭＲ数について、３０個のバランスのとれた訓練セットを作成し、ベンチマークを行った。モデルをバランスのとれた訓練セットで訓練し、訓練データセット、試験データセット、及び検証データセットの予測に使用した。選択対象の特徴の数の範囲は１～３８であり、３８はＬｉｎｅａｒＳＶＣモデルの特徴の数の中央値を示す。誤差は９５信頼区間を表す。図３はＨＣＣバイオマーカーのＤＭＲベンチマーク解析を示す。ａ）組織試料及びｂ）ｃｆＤＮＡ試料に対する複数のＨＣＣバイオマーカーセットにより得られた一つ抜き（リーブワンアウト）（ｌｅａｖｅ－ｏｎｅ－ｏｕｔ）再現率及び適合率の比較。ｃ）訓練及び試験試料を用いて訓練し、独立した検証セットで予測した複数のＨＣＣバイオマーカー特徴セットの適合率及び再現率。図３はＨＣＣバイオマーカーのＤＭＲベンチマーク解析を示す。ａ）組織試料及びｂ）ｃｆＤＮＡ試料に対する複数のＨＣＣバイオマーカーセットにより得られた一つ抜き（リーブワンアウト）（ｌｅａｖｅ－ｏｎｅ－ｏｕｔ）再現率及び適合率の比較。ｃ）訓練及び試験試料を用いて訓練し、独立した検証セットで予測した複数のＨＣＣバイオマーカー特徴セットの適合率及び再現率。ｄ）訓練及び試験試料サブセットにおけるＨＣＣ及び非ＨＣＣ（健常、肝硬変、慢性肝疾患）試料の平均βメチル化値を示すヒートマップ。ｄ）訓練及び試験試料サブセットにおけるＨＣＣ及び非ＨＣＣ（健常、肝硬変、慢性肝疾患）試料の平均βメチル化値を示すヒートマップ。図４は、ＨＣＣのＤＮＡメチル化リスクスコアの特徴のランキングを示す。ａ）バランスのとれたデータセットの１，０００通りの並べ替えにおけるＤＭＲ係数：ｂ）左：上位１～３８個のＤＭＲの適合率と再現率とは、訓練及び試験データセットで訓練することにより試験し、検証データセットを用いて試験した。右：上位３８個及び上位２０個のＤＭＲシグネチャーから得られたリッジ分類器ＤＭＲ係数。黒い実線は線形回帰と９５％信頼区間とを表す。破線は対角線を表す。ｃ）１，０００通りの並べ替え解析で得られる平均係数から推定される線形リスクスコアを用いて計算される検証試料の適合率－再現率曲線。図５は、ＨＣＣバイオマーカー及び重みを同定及び推定することに使用されなかった訓練及び試験データセット内の試料のみを対象としたＤＭＲシグネチャーリスクスコアａ）の適合率（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）－再現率（ｒｅｃａｌｌ）曲線のランキングを示す。曲線に沿った最大のＦ１スコアは、「ｘ」、及び所与の再現率及び適合率におけるＤＭＲシグネチャーのリスクスコア閾値で表される。ランダムな適合率は破線の水平線で示す。ｂ）ＨＣＣバイオマーカーの発見に使用されなかったＤＭＲシグネチャーリスクスコアの訓練及び試験試料を代表的な上位性能のＤＭＲに対してプロットした。縦線は、ａ）において最大のＦ１スコアで見出されたＤＭＲシグネチャーリスクスコア閾値を示し、関連する再現率及び適合率が報告される。ｃ）他の種類のがん患者（「がん」と表示）の試料を含む訓練及び試験データセットの全ｃｆＤＮＡ試料の適合率－再現率曲線。ｄ）ｂ）と同様にＤＭＲシグネチャーリスクスコアの閾値（垂直の破線）は、ｃ）の適合率－再現率曲線に沿ったＦ１スコアの最大点から推定され、再現率及び適合率が報告される。ｅ）検証セットの試料について推定されるＤＭＲシグネチャーリスクスコアは、予測性の高い２つのＨＣＣのＤＭＲ及びそのメチル化プロファイルに対してプロットされる。ＤＭＲシグネチャーリスクスコアの閾値は、訓練及び試験データセットを用いて定義した。適合率及び再現率は、検証データセットで推定されたものである。図６は、ベンチマーク及び性能特性の指標のＤＭＲシグネチャーリスクスコアを示す。ａ）ＤＭＲシグネチャーのリスクスコアのバイオマーカーのＤＭＲ値とその重みとの特定に使用されなかった訓練及び試験データセット内のすべての試料に対して計算されたＤＭＲシグネチャーリスクスコア。ＤＭＲシグネチャーリスクスコアを、３つの上位予測ＨＣＣＤＮＡメチル化バイオマーカーに対してプロットした。ＨＣＣ分類閾値は縦の破線で表され、適合率及び再現率が報告される。ｂ）ａ）と同様に、ｃｆＤＮＡ試料のみが利用され、他のがんを有する患者からのｃｆＤＮＡ試料（青色でマークされ、「がん」と表示）も陽性イベントとみなされる。健常な対照由来のｃｆＤＮＡ試料は緑色（「健常」）でマークされ、再現率と適合率が報告される。図７は、各ＤＭＲ内の１、２、３個のＣｐＧ部位のみをランダムにアンダーサンプリングし、上位８、１０、２０、３８個のＤＭＲについてこれらのＣｐＧ部位のみを用いてそれらの平均メチル化度を推定することにより、ＤＭＲシグネチャーリスクスコアモデルの平均（ｍｅａｎ）及び標準誤差（Ｓｔｄ）のａ）再現率及びｂ）適合率がどのように変化するかを示している。図７は、各ＤＭＲ内の１、２、３個のＣｐＧ部位のみをランダムにアンダーサンプリングし、上位８、１０、２０、３８個のＤＭＲについてこれらのＣｐＧ部位のみを用いてそれらの平均メチル化度を推定することにより、ＤＭＲシグネチャーリスクスコアモデルの平均（ｍｅａｎ）及び標準誤差（Ｓｔｄ）のａ）再現率及びｂ）適合率がどのように変化するかを示している。

発明の概要
本発明は、がん細胞ＤＮＡが非常に低濃度で存在する場合であっても（例えば特定の臓器にがんを有する疑いのある患者、特に肝細胞がんを有する疑いのある患者から得られた血漿試料中に存在する無細胞（セルフリー）腫瘍ＤＮＡなど）、患者試料中のがん細胞に特異的なＤＮＡメチル化シグナルを検出する方法に関する。

本方法は、ゲノムの複数のメチル化差異領域（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｍｅｔｈｙｌａｔｅｄｒｅｇｉｏｎ：ＤＭＲ）におけるメチル化レベルを測定して、区別可能ながん特異的メチル化シグネチャーを共有する１つ又は複数の冗長なＣｐＧ部位のメチル化状態を反映する各ＤＭＲの値を取得することを含む。本方法はさらに、患者に、がんを有する確率が高いか、又は低いかを割り当てるために、複数のＤＭＲメチル化値の統計的有意性を評価することを含む。

本発明による方法は、有利なことに、複数の冗長なメチル化測定値からの予測情報を取り入れるため、例えば患者ＤＮＡ中の一塩基多型の存在による単一のＣｐＧ測定値の取得の失敗、又は１つ又は複数のアッセイプローブの技術的失敗など、方法の１つ又は複数の個々の構成が失敗した事象において、患者はなお、正常に決定された他の測定値に基づいて、がんを有する確率を正確に割り当てられることが可能である。

これらのＤＭＲは、ＤＭＲ内の単一のＣｐＧ部位のＤＮＡメチル化がＤＭＲ内の２つ以上又はすべてのＣｐＧ部位の平均と同等のがん予測値を提供するように定められている。ｅｘｖｉｖｏ（生体外）試料のＤＮＡメチル化シグネチャーに基づいて患者にがんを有する確率を正確に割り当てる方法を形成するために、表１に規定される２～３８個、特に８～３８個、より特に１０～２０個のＤＭＲの予測値と予測リスクスコアとを柔軟に組み合わせることによって、診断方法の感度を高める第２の冗長性の層が導入される。

本発明の特定の実施形態は、ＤＭＲメチル化レベルをがん予測分類アルゴリズムに入力してリスクスコアを取得し、次いで患者にがんを有する確率を割り当てること、及び任意にこのリスクスコアを閾値と比較することに関する。

本発明の特定の実施形態は、患者が肝細胞がんであるか否かを決定するために血漿試料又は肝生検試料を分析する上記本発明による方法の使用に関する。

用語と定義
本明細書を解釈するために、以下の定義が適用され、適宜、単数形で使用される用語は複数形も含み、その逆もまた同様である。以下に定める定義が、参照により本明細書に組み込まれる文書と矛盾する場合は、ここに定める定義が優先されるものとする。

本明細書で使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び他の同様の形態、並びにそれらの文法的に同等な用語は、意味において同等であること、及びこれらの単語のいずれか１つに続く１つ又は複数の項目が、係る１つ又は複数の項目を網羅的に列挙するものではない、又は列挙した１つ又は複数の項目のみに限定するものではないことにおいてオープンエンドとすることを意図している。例えば、成分Ａ、Ｂ及びＣを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」品目は、成分Ａ、Ｂ及びＣからなる（すなわち、成分Ａ、Ｂ及びＣのみを含有する）こともできるし、又は成分Ａ、Ｂ及びＣのみならず、１つ又は複数の他の成分を含むこともできる。このように、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及びその類似の形態、並びにその文法的同等な用語は、「本質的にそれからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ）」又は「それからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」の実施形態の開示を含むことが意図及び理解される。

値の範囲が提供されている場合、文脈上明らかにそうでないと指示されない限り、その範囲の上限と下限の間の、下限の単位の１０分の１までの各介在値、及びその記載の範囲内の他の記載の値若しくは介在値は、記載の範囲の具体的に除外される制限を受けて本開示内に包含されると理解される。記載の範囲に限界値の一方又は両方が含まれる場合、それらの含まれる限界値の一方又は両方を除いた範囲もまた開示に含まれる。

本明細書において、値又はパラメーター「約（ａｂｏｕｔ）」という言及は、その値又はパラメーターそれ自体に向けられた変化を含む（かつ記述する）。例えば、「約（ａｂｏｕｔ）Ｘ」と言及する記述には、「Ｘ」という記述も含まれる。

添付の特許請求の範囲を含め、本明細書で使用されるとおり、単数形「ａ」、「ｏｒ（又は）」、「ｔｈｅ」は、文脈上明らかにそうでない場合を除き、複数の参照語を含む。

他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術及び生化学）により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学的方法、遺伝学的方法、及び生化学的方法（一般に、ＳａｍｂｒｏｏｋらＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第４編（２０１２）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．及びＡｕｓｕｂｅｌら，ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（２００２）第５編，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照）及び化学的方法には、標準的な技術が使用される。

配列
本明細書に開示される配列と類似又は相同（例えば、少なくとも約７０％の配列同一性）の配列もまた本発明の一部である。いくつかの実施形態において、アミノ酸レベルでの配列同一性は、約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９％超過であり得る。核酸レベルでは、配列同一性は、約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９％超過であり得る。あるいは、核酸セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下（例えば、非常に高いストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件下）で、その鎖の相補体にハイブリダイズする場合には、実質的な同一性が存在する。核酸は、全細胞中に、細胞溶解物中に、又は部分的に精製された形態若しくは実質的に純粋な形態で存在し得る。

本明細書において、「配列同一性」及び「配列同一性のパーセンテージ」という用語は、アライメントされる２つの配列を位置ごとに比較することによって決定される配列比較の結果を表す１つの定量的パラメーターを指す。比較用の配列のアライメントの方法は、当技術分野でよく知られている。比較用の配列アライメントは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎのローカルホモロジーアルゴリズム，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのグローバルアライメントアルゴリズム、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの類似性検索法、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４（１９８８）、又はこれらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装によって実行され、ＣＬＵＳＴＡＬ、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡを含むが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、例えば、アメリカ国立生物工学情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公的に入手可能である。

核酸配列の比較のそのような例の１つは、以下のデフォルトの設定を使用するＢＬＡＳＴＮアルゴリズムが挙げられる：Ｅｘｐｅｃｔｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：１０；Ｗｏｒｄｓｉｚｅ：２８；Ｍａｘｍａｔｃｈｅｓｉｎａｑｕｅｒｙｒａｎｇｅ：０；Ｍａｔｃｈ／ＭｉｓｍａｔｃｈＳｃｏｒｅｓ：１．－２；Ｇａｐｃｏｓｔｓ：Ｌｉｎｅａｒ。特に断らない限り、本明細書で提供される配列同一性の値は、それぞれタンパク質及び核酸の比較のための上記で特定されたデフォルトパラメータを使用して、ＢＬＡＳＴのプログラム群を用いて得られた値を指す（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０））。パーセンテージを指定しない同一配列への言及は、１００％同一配列（すなわち同じ配列）の意味を含む。

本明細書の分脈における「ヌクレオチド」という用語は、核酸又は核酸アナログの構築ブロックに関し、そのオリゴマーは、塩基対形成に基づいてＲＮＡオリゴマー又はＤＮＡオリゴマーと選択的ハイブリッドを形成することができる。この文脈における「ヌクレオチド」という用語には、古典的なリボヌクレオチド構築ブロックであるアデノシン、グアノシン、ウリジン（及びリボシルチミン）、シチジン、古典的なデオキシリボヌクレオチドであるデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシウリジン、デオキシシチジンが含まれる。さらに、ホスホチオエート、２’Ｏ－メチルホスホチオエート、ペプチド核酸（ＰＮＡ；Ｎ－（２－アミノエチル）－グリシン単位をペプチド結合でつなぎ、グリシンのα炭素に核酸塩基を結合したもの）又はロック核酸（ＬＮＡ；２’Ｏ，４’Ｃメチレン架橋ＲＮＡ構成ブロック）などの核酸のアナログが含まれる。本明細書で「ハイブリダイズ配列」に言及する場合、そのようなハイブリダイズ配列は上記のヌクレオチドのいずれか、又はそれらの混合物から構成され得る。

本明細書の文脈における「プローブ」という用語は、分子プローブに関し、特に、単一の標的ＣｐＧジヌクレオチドを含む特定の領域に選択的にハイブリダイズすることができる「核酸プローブ」に関する。このようなハイブリダイズ核酸配列は、標的配列と連続して逆相補的であり得、又はギャップ、ミスマッチ、又は追加の一致していないヌクレオチドを含み得る。ハイブリッドを形成することができる配列の最小の長さは、その組成に依存し（Ｃ又はＧのヌクレオチドはＡ又はＴ／Ｕのヌクレオチドよりも結合エネルギーに寄与する）かつ骨格化学的性質に依存する。

本明細書の文脈において、「ハイブリダイズ配列」という用語は、ＲＮＡ（リボヌクレオチド）、ＤＮＡ（デオキシリボヌクレオチド）、ホスホチオエートデオキシリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ホスホチオエートリボヌクレオチド、ＬＮＡ及び／又はＰＮＡヌクレオチドアナログを含む、又は本質的にそれからなるポリヌクレオチド配列を包含する。特定の実施形態において、本発明によるハイブリダイズ配列は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個のヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ハイブリダイズ配列は、表１に記載されたＣｐＧ部位周辺の逆相補配列と少なくとも８０％同一であり、より好ましくは８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である。特定の実施形態において、ハイブリダイズ配列は、デオキシヌクレオチド、ホスホチオエートデオキシヌクレオチド、ＬＮＡ及び／又はＰＮＡヌクレオチド、又はそれらの混合物を含む。

「ＣｐＧ部位」、「ＣｐＧ遺伝子座」、又は「ＣｐＧ残基」という用語は、ＣｐＧ部位命名法では「ｃｇ」と略されることもあり、本明細書の分脈では、上記のとおりメチル化又は非メチル化のいずれかがなされ得るＣｐＧＤＮＡジヌクレオチドに関する。ＣｐＧジヌクレオチドとは、シトシンヌクレオチドがグアニンヌクレオチドとホスホジエステル結合で（５’から３’方向に）結合しているゲノム位置のことである。ヒトでは、ＤＮＡメチル化はシトシン残基のピリミジン環の５’位で起こる。表１に示すＣｐＧ部位は、がん、特に肝細胞がんに罹患する患者の血漿などの液体の無細胞試料又は肝組織試料の両方において、健常対照の試料、又は非がん疾患の患者の試料と比較して、メチル化差異が正確に検出され得るＣｐＧ部位を指す。

本明細書の文脈における「ＤＮＡメチル化レベル」、「ＤＮＡメチル化」、又は「メチル化レベル」という用語は、特定の遺伝子座、あるいはメチル化差異領域内の１つ又は複数のＣｐＧ部位のいずれかにおける、メチル化ＣｐＧジヌクレオチドモチーフの存在又は非存在に言及する（下記参照）。実施例で示したデータに関して、ＣｐＧ部位のＤＮＡメチル化は、βメチル化の値を用いて表され、この値は、メチル化マイクロアレイにおいて、ゲノム中の特定の標的ＣｐＧ部位で、ビスルファイト修飾されたメチル化されていない対立遺伝子、又はメチル化された対立遺伝子のいずれかに結合するプローブによって生成された蛍光シグナル強度から得られる測定値を正規化した値である。本明細書で使用される「βメチル化」は、メチル化モチーフ及び非メチル化モチーフの存在に関連する生の測定値を、特定の標的ＣｐＧジヌクレオチド部位の低メチル化を示す０から、その部位の高メチル化を示す１までの限られた範囲内で標準化する。これは試料中に存在する標的ＣｐＧを含むＤＮＡの総量に対して相対的に表され、測定モードに固有の固定値でオフセットされ、製造者によって推奨されるものである。

「メチル化差異領域（メチル化が異なる領域）（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｍｅｔｈｙｌａｔｅｄｒｅｇｉｏｎ）」又は「ＤＭＲ」という用語は、２つの群でメチル化状態に差がある（異なる）ゲノム領域を指し、本明細書では「ＣｐＧクラスター」と呼ぶこともある。本明細書では、メチル化シグネチャーが異なるがん試料及び非がん試料によって本発明によって特に注目される３８個のＤＭＲを、ヒトリファレンスゲノム３８におけるそれらの位置とともに表１に示す。ＤＭＲ１～３８は少なくとも３つのＣｐＧ部位を含み、かつ連続する２つのＣｐＧ部位が５００塩基対超過離れていない。ＤＭＲのメチル化とは、前記ＣｐＧ部位の１つで測定されたメチル化レベルを指すか、又は前記ＣｐＧ部位の２つ以上のメチル化レベルの平均値、又は中央値を指す。

本明細書の分脈における「がん」とは、腫瘍細胞が制御不能に増殖する悪性腫瘍性疾患を指し、かつ原発性腫瘍と転移性疾患との両方を包含する。重要なことは、腫瘍細胞は、健常対照又は他の炎症性疾患と比較して異常なＤＮＡメチル化により特徴づけられることが多い。がんに特異的な異なるＤＮＡメチル化は、多量の腫瘍ＤＮＡを含有する腫瘍生検試料だけでなく、尿、血漿、血清、又は血液などの非常に低濃度の無細胞（セルフリー）ＤＮＡを含有する試料でも、十分に感度の高い診断アッセイによって検出することができる。本発明による「がん」という用語は、肺がん、肝臓がん、又は結腸がんなどの固形腫瘍、並びにリンパ腫又は白血病などの血球由来のがんを包含する。本発明によるがんという用語は、原発性がん、並びにがん疾患の再発の両方を包含する。

本明細書の分脈における「患者」という用語は、がんを有することが疑われる対象、又は以前にがんと診断され、かつ疾患再発に対してモニタリングを受けている患者を包含する。

本発明による「肝臓がん」という用語は、肝細胞に由来するがんを指し、例えば肝細胞に由来する肝細胞がん（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＨＣＣ）及び肝内胆管がんを指す。ＨＣＣ患者には、Ｃ型肝炎感染又は肝硬変など、肝臓に影響を及ぼす併存疾患も罹患する患者も包含する。

特定の本発明の文脈における「慢性肝疾患」という用語は、Ａ型肝炎又はＣ型肝炎などのウイルス感染、α－１アンチトリプシン欠損症患者、肥満に関連する炎症、及び肝硬変を含むがこれらに限定されない、肝臓の炎症によって特徴づけられる非がん性疾患を指す。実施例に従って予測性ＤＭＲを同定するためにがん試料との比較に使用される対照試料は、がん細胞を含む試料と肝機能に影響を与える非がん性炎症によって特徴づけられる試料とを区別するメチル化シグネチャーを同定するためにこのような慢性肝疾患試料を使用する。本発明による「慢性肝疾患」と診断された患者から得られた試料は、本発明による予測アルゴリズムを訓練するために使用される。

「肝硬変」という用語は、肝細胞死、炎症、及び線維化を特徴とする慢性肝疾患を指す。「肝硬変」はＨＣＣの前駆症状であることが多い。肝硬変は、遺伝子変異、ウイルス感染、毒素への暴露、又はアルコール摂取などが原因で発症し得る。

発明の詳細な説明
本発明の第１の態様は、患者ががんを有するかどうかを判定する方法であり、以下の工程を含む：
患者から得られた生体外（ｅｘ－ｖｉｖｏ）試料中の複数のメチル化差異領域（ＤＭＲ）について、ＤＮＡメチル化レベルのレベルを決定する測定工程。本発明による複数のＤＭＲは、表１に規定されるＤＭＲのいずれか２つ、又はそれ以上を含むか、又は本質的にそれからなり、各ＤＭＲは、がん試料と非がん試料とでのメチル化の差異によって特徴づけられる３つ以上のＣｐＧ部位を含む。

いくつかの実施形態において、本発明によって上記で規定される任意のＤＭＲのＤＮＡメチル化レベルは、表１によってそのＤＭＲ内に列挙されるＣｐＧ部位のうちの１つについて決定されたＤＮＡメチル化レベルであり得る。例えば、ＤＭＲ１のメチル化レベルは、ｃｇ１４４８５５７４４、ｃｇ２０５４７７７７、又はｃｇ１６００９３１１のうちの１つで測定されたメチル化レベルであり得る。

他の実施形態は、ＤＭＲのメチル化レベルを提供するために、任意のＤＭＲ内に含まれる２つ以上のＣｐＧ部位のメチル化レベルの平均を使用することに関する。例えば、ＤＭＲ１のメチル化レベルは、
－ｃｇ１４４８５５７４４、及びｃｇ２０５４７７７７、
－ｃｇ１４４８５５７４４、及びｃｇ１６００９３１１、
－ｃｇ２０５４７７７７、及びｃｇ１６００９３１１、又は
－ｃｇ１４４８５５７４４、ｃｇ２０５４７７７７、及びｃｇ１６００９３１１
で決定されたそれぞれのＤＮＡメチル化レベルの平均であり得る。

ＤＮＡメチル化レベルが各ＤＭＲ内で測定されるＣｐＧ部位の数は、実施例の図７に示されるとおり、それぞれが同等のがん予測情報を提供するため、本発明では特に限定されない。

本方法の次の工程は評価工程であり、ここでは測定工程で決定された複数のＤＭＲメチル化レベルの組み合わせられた統計的有意性が評価される。複数のＤＭＲメチル化レベルの統計的有意性を評価することには、例えば、がん細胞由来のＤＮＡを含有すること、又は含有しないことが前もって決定された対照試料、又は前記対照試料のメチル化レベルを代表する閾値とメチル化値を比較すること、各ＤＭＲが前記対照又は閾値と比較して低メチル化を特徴とするか、又は高メチル化を特徴とするかを評価すること、又は各ＤＭＲについて得られた複数のＤＮＡメチル化値を、試料の全体的なＤＭＲメチル化シグネチャーを反映する単一の数値を提供するアルゴリズムに組み合わせることを含み得る。

次に、割り当て工程では、評価工程で得られた複数のＤＭＲメチル化レベルが組み合わされた統計的有意性に基づいて、がんを有する確率が高いか、又はがんを有する確率が低いかのいずれかを患者に割り当てる。

任意のさらなる工程では、がんを有する確率が高いと割り当てられた患者を、適切な抗悪性腫瘍療法又は特定のがん特異的治療レジメン、例えば本明細書に記載されているとおりの１つ又は複数の化学療法剤又はチェックポイント阻害剤などで治療することができる。あるいは、がんを有する確率が低いと割り当てられた患者は、最初の低い確率の割り当てから２、４、６、８、１０、１２ヶ月以上にて、治療を必要としないか、あるいはがんの追加検査が必要となるであろう。

メチル化レベルが取得されるＤＭＲの数は、本発明の様々な実施形態に応じて、及びメチル化レベルが取得される方法、あるいは診断アッセイに望まれる精度又は感度に応じて変化し得る。

いくつかの実施形態は、さらに、リスクスコアに２つのＤＭＲのＤＮＡメチル化レベルを組み込むことでさえ８０％超過の感度を達成することが実証され、９０％超過の適合率で患者試料をがんあり又はなしに分類する（表７）ように、表１に特定されるＤＭＲの２～３８個の間でＤＭＲメチル化レベルを決定する方法に関する。

他の実施形態は、リスクスコアにおいて８つのＤＭＲのＤＮＡメチル化レベルを使用することにより、９０％を超える感度率で患者のＨＣＣの存在に従って患者試料を分類するように、ＤＭＲメチル化レベルを表１に規定されるＤＭＲの８～３８について決定する方法に関する。

特定の実施形態は、患者試料中のＨＣＣ由来ＤＮＡの有無に従って患者を分類するリスクスコアを得るための予測加算線形アルゴリズムにおいて使用される際に実施例の表２で９５％を超える感度を達成することが実証される表１に列挙される約２０個のＤＭＲについてＤＭＲメチル化レベルを決定する方法に関する。

本発明による方法は、患者試料中のがん細胞の存在を検出するために使用することができる。いくつかの実施形態は、肺がん、結腸がん、乳がん、又は肝臓がんを示すＤＮＡメチル化シグネチャーを同定するための本発明による診断方法の使用に関する。

本発明の特定の実施形態は、患者が肝細胞がんを有するか、又は有しないかを決定するために、患者試料から抽出されるＤＮＡ中のＤＮＡメチル化シグネチャーを検出するための上記で規定される方法の使用に関する。

本発明による方法は高感度と頑健との両方であるため、この方法は多くの異なる種類のｅｘｖｉｖｏ患者試料に広く適用できると期待される。

特定の実施形態は、がんの存在が疑われる組織の探索生検から抽出されるＤＮＡの使用に関する。

他の実施形態は、血液などの液体組織試料、あるいはさらに血漿又は血清などの無細胞試料から抽出されるＤＮＡの使用に関する。

特定の実施形態は、固形臓器に由来するがん、例えばＨＣＣが疑われる患者から得られた血漿から抽出されるＤＮＡの使用に関する。

本発明のいくつかの実施形態は、ＤＭＲ２、ＤＭＲ４、ＤＭＲ５、ＤＭＲ９、ＤＭＲ１０、ＤＭＲ１４、ＤＭＲ１５、ＤＭＲ１６、ＤＭＲ１８、ＤＭＲ２３、ＤＭＲ２４、ＤＭＲ２８、ＤＭＲ２９、ＤＭＲ３５、及び／又はＤＭＲ３７について決定されるメチル化レベルがその領域が高メチル化されていることを示す場合、及び／又はＤＭＲ１、ＤＭＲ３、ＤＭＲ６、ＤＭＲ７、ＤＭＲ８、ＤＭＲ１１、ＤＭＲ１２、ＤＭＲ１３、ＤＭＲ１７、ＤＭＲ１９、ＤＭＲ２０、ＤＭＲ２１、ＤＭＲ２２、ＤＭＲ２５、ＤＭＲ２６、ＤＭＲ２７、ＤＭＲ３０、ＤＭＲ３１、ＤＭＲ３２、ＤＭＲ３３、ＤＭＲ３４、ＤＭＲ３６、及び／又はＤＭＲ３８について決定されるメチル化レベルがその領域が低メチル化されていることを示す場合、患者にがんを有する確率が高いことを割り当てることに関する。

本発明のこの実施形態による高メチル化又は低メチル化は、評価工程において、がん細胞を含まないことが前もって決定された複数の対照試料において決定されるように前記ＤＭＲのメチル化レベルの平均値、又は中央値、特に前記平均値から２標準偏差以内、より特に１標準偏差以内に関して確認することができる。

評価工程の他の実施形態では、複数のＤＮＡメチル化レベルは、予測分類アルゴリズムに供され、このアルゴリズムは、リスクスコアを得るために、試料ががん細胞由来のＤＮＡを含有する確率に従って試料を分類する。

特定の実施形態は、本発明による分類アルゴリズムとしての加算線形スコアの使用に関する。

特定の実施形態は、
－重み付けされた複数のＤＭＲメチル化値を得るために、複数のＤＭＲメチル化レベルの各々と、任意の１つのＤＭＲについて観察される相対的予測力に応じて計算される加重値とを乗算すること、及び
－リスクスコアを得るために、この複数の重み付けされたＤＭＲメチル化値の合計を計算すること、
による加算線形スコアに測定工程で得られた複数のＤＮＡメチル化レベルを供することに関する。

任意の１つのＤＭＲの相対的予測力は、実施例で使用される複数のＨＣＣ及び非ＨＣＣの患者試料の試験コホート及び検証コホートの間で観察されるＤＮＡメチル化の量とばらつきとの関数である。ＨＣＣの上位３８、２０、１０、８、５、３、及び２個の予測ＤＭＲを実施例の表１～７に示す。

測定工程のいくつかの実施形態は、上位の予測領域ＤＭＲ１を含む複数のＤＭＲにおけるメチル化レベルの決定に関する。

測定工程の他の実施形態は、上位２つの予測領域ＤＭＲ１及びＤＭＲ４を含む、又はそれらからなる複数のＤＭＲにおけるメチル化レベルの決定に関する。

測定工程の他の実施形態は、上位３つの予測領域ＤＭＲ１、ＤＭＲ４、及びＤＭＲ２８を含む、又はそれらからなる複数のＤＭＲにおけるメチル化レベルの決定に関する。

測定工程の他の実施形態は、上位５つの予測領域ＤＭＲ１、ＤＭＲ４、ＤＭＲ２８、ＤＭＲ３５、及びＤＭＲ３６を含む、又はそれらからなる複数のＤＭＲにおけるメチル化レベルの決定に関する。

測定工程の特定の実施形態は、上位８つの予測領域ＤＭＲ１、ＤＭＲ４、ＤＭＲ６、ＤＭＲ７、ＤＭＲ３１、ＤＭＲ３５、ＤＭＲ２８及びＤＭＲ２３を含む、又はそれらからなる複数のＤＭＲにおけるメチル化レベルを決定することに関する。

測定工程の特定の実施形態は、上位１０個の予測領域ＤＭＲ１、ＤＭＲ４、ＤＭＲ２７、ＤＭＲ６、ＤＭＲ２、ＤＭＲ１６、ＤＭＲ３１、ＤＭＲ３５、ＤＭＲ２８、及びＤＭＲ２３を含む、又はそれらからなる複数のＤＭＲにおけるメチル化レベルの決定に関する。

実施例で示されるマルチコホートメタ解析は、がん由来細胞を含有した、又は含有しなかった２つの試料群における２～３８個のＤＭＲの高又は低ＤＮＡメチル化の大きさ及びばらつきから得られる情報を組み込む予測リスクスコアを実証する。組み込まれたＤＭＲ値の数に応じた閾値と比較される場合、前記予測リスクスコアは、患者試料が肝組織試料であろうと、又は血清試料であろうと、がん細胞由来、特にＨＣＣ細胞由来のＤＮＡメチル化シグネチャーが患者試料中に存在するか否かを頑健に同定することができる。

上記に規定された割り当て工程のいくつかの実施形態は、上記に規定されたリスクスコアと、がん試料と非がん試料とを正確に識別する閾値とを比較するプロセスに関する。いくつかの実施形態において、複数のＤＭＲメチル化値を上記に規定されるとおりの予測アルゴリズムに入力することによって得られるリスクスコアが、閾値と等しいか、又は閾値以上であることは、患者ががんを有する確率が高いことを示す。逆に、リスクスコアが閾値未満であれば、患者ががんを有する確率が低いことを示す。

本発明の特定の実施形態は、分類モデルを訓練することによって得られる評価工程における予測アルゴリズムの使用に関する。新しい値を分類できるアルゴリズムを開発するために、分類モデルは訓練値の入力を使用する。本発明による適切な分類モデルには、ロジスティック分類モデル、又はエラスティックネット分類モデル、特にリッジ回帰分類モデルが含まれるが、これらに限定されるものではない。実施例で調査したコホートで実証されるデータは、正則化パラメーターを１としたリッジ回帰分類モデルを用いて、加算線形スコアの一部としてＤＭＲメチル化値に適用する適切な係数又は個々の加重値が得られることを実証する。

がんを有する、又は有していないと以前に決定された患者から得られた複数の試料を用いて分類モデルを訓練することに関する特定の実施形態では、本発明のこの実施形態による訓練試料のコホートは、ほぼ等しい割合の以下の試料：
－がん由来のＤＮＡを含有すると以前に決定された血漿試料などの無細胞試料、
－がん由来のＤＮＡを含有すると以前に決定された組織生検、
－健常対象及び／又は例えば慢性肝疾患又は敗血症などの他の疾患を有する患者の血漿試料などの無細胞試料、及び
－健常対象及び／又は例えば慢性肝疾患又は敗血症などの他の疾患の患者の組織生検対照試料、
を含む。

本発明による予測アルゴリズムで使用する係数及び閾値の統計的に信頼できる値を得るために、上記の４つのサブセットのそれぞれは、ほぼバランスのとれた数で存在する場合にその全体を分類モデルを訓練するために使用することができ、あるいは大きな集団をバランスのとれたデータセットの反復的なランダムなアンダーサンプリングに供することができる。

特定の実施形態は、個々の加重値（係数）を乗じた各選択されたＤＭＲの合計に基づいてリスクスコアを生成するモデルアルゴリズムを得るためのロジスティック回帰、特にリッジ回帰分析の使用に関する。本発明による個々の加重値は、がんを含有する試料と健常対照試料とを区別する各ＤＭＲの能力を反映する。リスクスコアは、がん由来のＤＮＡを含む試料を正確に分離する閾値と比較することができる。個々の加重値の値は、本発明によれば特に限定されず、予測アルゴリズムに使用するために選択されるＤＭＲ測定値、予測アルゴリズムを開発するために使用される分類モデルの種類、及び所望の精度のレベルに依存する。このような加重値の例を表１～表７に示す。

本発明による閾値は、例えば、最も高いＦスコア（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ－Ｄｉｃｅ係数、又はＤｉｃｅ類似度係数）を有する値又はリスクスコアを見つけることにより、最も高い正解率（ａｃｃｕｒａｃｙ）でがん由来試料をがんに由来しない試料から判別するリスクスコア値を見つけることによって同定され得る。言い換えれば、がんの状態が既知の患者コホートについて得られたリスクスコアに適用される閾値は、最高の適合率（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）と再現値（ｒｅｃａｌｌｖａｌｕｅ）とを達成し、ここで完全な適合率と再現値とは値１で示される。本発明の特定の実施形態は、ＨＣＣ患者の分類が少なくとも９０％、特に９３％超過、より特に９５％超過の再現率（ｒｅｃａｌｌ）、及び少なくとも９５％の適合率を達成する閾値に関する。本発明によるＤＭＲの特定のサブセットから得られる、又はそれに適用されるメチル化値を利用する加算予測スコアでの使用に適切なこのような閾値を表１から表７に示す。

加算線形リスクスコア計算における２０～３８個のＤＭＲについて決定されたメチル化レベルの使用に関連する、本発明による測定工程の特定の実施形態では、割り当て工程で使用される閾値の絶対値は、０．７０～１．７０であり、特に１．００～１．５０、より特に閾値の絶対値は約１．２３である。

本発明による割り当て工程の特定の実施形態は、がんを有する低い確率に関し、この確率はがんを有する確率が約６％と定義され、及び／又はがんを有する高い確率に関し、この確率はがんを有する確率が特に約９４％と定義される。

本発明の特定の実施形態は、がんの存在が疑われる組織の探索生検、及び／又は患者から採取される血液、血漿若しくは血清の試料から選択される患者試料の使用に関し、ここでＤＮＡはまず試料から抽出され、その後に脱アミノ化ＤＮＡを生成するために脱アミノ化剤で処理される。

特定の実施形態は、患者試料から抽出されるＤＮＡに存在するジヌクレオチドＣｐＧ部位のメチル化形態又は非メチル化形態のいずれかを選択的に修飾する化学試薬の使用に関する。得られた修飾ＣｐＧは直接検出することができ、又は修飾部位を識別するさらなる試薬に曝露することができる。ＣｐＧ部位の選択的修飾は、例えばヒドラジンイオン又は重亜硫酸イオンで処理することで達成できる。ヒドラジン処理したＤＮＡは、ＣｐＧメチル化を同定するために、ピペリジンによる切断に対して標的され得る。

特定の実施形態は、メチル化アッセイにおける重亜硫酸塩処理ＤＮＡの使用に関し、特に患者試料から得られたＤＮＡを重亜硫酸ナトリウムで処理することに関する。このプロセスは、シチジン残基をウラシルに変換し、５－メチルシトシンは修飾せずにそのまま残す。処理されたＤＮＡはさらに、メチル化遺伝子座又は非メチル化遺伝子座のそれぞれを区別するために、特定の部位に存在するシトシン又はウラシルのいずれかにハイブリダイズするように設計された核酸プローブと接触させることができる。プローブ結合は、配列決定（シーケンシング）、定量的ポリメラーゼ連鎖反応、又は例えば実施例で分析される患者試料集団のＤＮＡメチル化レベルを測定するために使用されるイルミナ社製などのメチル化チップアレイなどの定量的手法によって評価することができる。ＣｐＧ部位のＤＮＡメチル化レベルを得るためのＤＮＡ配列決定法の使用に関する実施形態では、メチル化シトシンはシトシンの存在によって示され、一方、メチル化されていない残基はチミン残基として読み取られる。

ＣｐＧ部位のメチル化は、次世代シーケンシング、定量的ポリメラーゼ連鎖反応、又はメチル化アレイを含むがこれらに限定されない、当技術分野で知られているＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態に感度のある方法によって測定することができる。

特定の実施形態は、メチル化アレイを用いて得られたβメチル化値の使用に関する。

いくつかの実施形態では、測定工程は、患者試料から調製した脱アミノ化ＤＮＡを、特定のＣｐＧ部位に特異的な核酸プローブと接触させることを含む。

特定の実施形態は、患者試料から調製した脱アミノ化ＤＮＡを、蛍光標識を有する核酸プローブと接触させることに関する。例えば、メチル化アレイの核酸プローブ又はＴａｑＭａｎプローブが挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、特定のＣｐＧ部位の１つに特異的な核酸プローブが、このＣｐＧにおけるＤＮＡメチル化レベルを決定するためにシーケンシング反応で使用される。特定の実施形態では、２つのプローブを用いて、メチル化配列と非メチル化配列とに特異的にハイブリダイズさせ、それによってメチル化配列と非メチル化配列とを検出及び定量する。このような実施形態では、例えば非メチル化シトシンをウラシルに変換可能な酵素、又は同様にＣをＵに変換する重亜硫酸塩変換などによって達成される変換反応によって生じた配列に特異的なあるプローブを採用することができる。変換の影響を受けないメチル化部位に特異的にハイブリダイズするように別のプローブを採用する。この２つのプローブは、同じ反応ミックス中で異なる蛍光チャネルに対して検出可能な異なる蛍光色素によって標識することが可能である。

ナノポア検出では、特定のプライマーを用いて、変換された配列又は変換されていない配列をそれぞれ増幅し、次いでそれを直接配列決定する。

本発明の先の実施形態又は態様のいずれか１つによる方法の特定の実施形態は、肝細胞がん（ＨＣＣ）ＤＮＡメチル化シグネチャーが患者試料中に存在するか否かを決定するために、患者試料から抽出されたＤＮＡ中の表１に規定されるＤＭＲのうちの８～２０個のＤＮＡメチル化レベルを測定することを含む方法に関し、ここで前記ＤＭＲのうちの１つはＤＭＲ１である。

本発明はさらに、ヒト組織試料、又は血漿及び血清を含む無細胞試料中の肝細胞がんＤＮＡの状態の検出のためのキットの製造における使用のための、上記で規定されたＤＭＲ１～ＤＭＲ３８の３個以上、特に８～１０個以上、より特に２０個以上の各々における規定されるＣｐＧ部位の１つ又は複数にメチル化依存的様式で結合する１つ又は複数の核酸プローブの使用を包含する。

特定の実施形態において、本キットは、肝臓がんの早期発見を可能にするために、肝硬変と診断された患者から得られる液体の血液試料の定期的なスクリーニング（特に年１回、より特に年２回の間隔）に提供される。

特定の実施形態において、本発明による方法は、以前に肝硬変と診断された患者から得られた試料に適用される。いくつかの特定の実施形態では、試料はＣ型肝炎と診断された患者から得られる。

特定の実施形態において、本発明による方法は、患者が肝臓がんの一種、特にＨＣＣの発症に近づいているか、あるいはすでに進行している可能性を判定するために、肝硬変と以前に診断された患者から得られた試料に適用される。より特定の実施形態では、患者が肝臓がん、特にＨＣＣに進行しているかどうかを判定するために、肝硬変と診断された患者に対して、例えば６ヵ月間隔で、定期的なスクリーニング戦略として本方法を適用する。特定の実施形態では、がんを有する確率が高いと割り当てられた患者には、ＭＲＩ又は肝生検手順など、より侵襲的又は費用の高いスクリーニングプロトコルが推奨される。

本発明のさらなる態様は、肝硬変と以前に診断された患者を含め、上記のとおりの方法によってがんを有する確率が高いと割り当てられている患者の治療における使用のための医薬組成物に関し、この組成物は抗悪性腫瘍治療剤を含む。上記の診断方法により、がんが比較的進行している肝硬変患者（しかし、これに限らない）などの患者が同定される場合、特にここでがんを有する確率が高いことを割り当てられた後に画像診断及び腫瘍病理組織学的分析が実施される場合、肝臓以外の臓器などへの転移、門脈浸潤、又はパフォーマンスステータス（ＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＳｔａｔｕｓ）分類１又は２が割り当てられており、化学療法剤が提供される。特定の実施形態において、化学療法剤は、レンバチニブ、レゴラフェニブ、カボザンチニブ、ラムシルマブ、又はソラフェニブから選択される。特定の実施形態では、化学療法剤はソラフェニブである。別の実施形態において、薬剤は、ＣＴＬＡ－４（ＵｎｉｐｒｏｔＰ１６４１０）、ＰＤ－１（ＵｎｉｐｒｏｔＱ１５１１６）、ＰＤ－Ｌ１（ＵｎｉｐｒｏｔＱ９ＮＺＱ７）、Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６；ＵｎｉｐｒｏｔＱ５ＺＰＲ３）、ＶＩＳＴＡ（ＵｎｉｐｒｏｔＱ９Ｈ７Ｍ９）、ＴＩＧＩＴ（ＵｎｉｐｒｏｔＱ４９５Ａ１）、ＴＩＭ－３（ＨＡＶＣＲ２、ＵｎｉｐｒｏｔＱ８ＴＤＱ０）、ＣＤ１５８（キラー細胞免疫グロブリン様受容体ファミリー）、ＴＧＦ－β（Ｐ０１１３７）の群に含まれるチェックポイント調節分子に対して反応性の抗体の群から選択されるチェックポイント阻害剤である。特定の実施形態において、薬剤は、イピリムマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ－ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ；ＣＡＳ番号４７７２０２－００－９）、ニボルマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ－ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ；ＣＡＳ番号９４６４１４－９４－４）、ペムブロリズマブ（ＭｅｒｃｋＩｎｃ．；ＣＡＳ番号１３７４８５３－９１－４）、ピジリズマブ（ＣＡＳ番号１０３６７３０－４２－３）、アテゾリズマブ（ＲｏｃｈｅＡＧ；ＣＡＳ番号１３８０７２３－４４－３）、アベルマブ（ＭｅｒｃｋＫＧａＡ；ＣＡＳ番号１５３７０３２－８２－８）、デュルバルマブ（ＡｓｔｒａＺｅｎａｃａ；ＣＡＳ番号１４２８９３５－６０－７）、及びセミピリマブ（ＳａｎｏｆｉＡｖｅｎｔｉｓ；ＣＡＳ番号１８０１３４２－６０－８）から構成される群から選択される。

本発明のさらなる態様は、画像分析及び／又は病理組織学的腫瘍分析の結果と組み合わせて、バルセロナ－クリニック肝臓がん病期分類システム（ＫｈｏｒｓａｎｄｉＳ．Ｅ．，ＨＢＰＳｕｒｇｅｒｙ２０１２，２０１２：１５４０５６，その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）によって提供される推奨の臨床適用に従って、本明細書で概説した方法によりがんを有する確率が高いと割り当てられている肝硬変患者を治療する方法に関する。

本発明は、肝硬変と以前に診断されている患者を治療する方法を包含し、ここでこの患者は、上記の態様及び実施形態のいずれか１つに規定される方法によってがんを有する可能性が高いと分類されている。患者がウイルス性肝硬変又はアルコール性肝硬変ではなく、がんを有する可能性が高いと分類される場合、その後患者は、当技術分野で知られている肝臓がん治療の臨床的ベストプラクティスに従って、すなわち、早期から徐々に以下の後期介入を適用する順番に従って治療される：
－切除手術、
－肝移植手術、
－高周波又はマイクロ波アブレーション、
－経動脈的化学塞栓療法、
－レンバチニブ、レゴラフェニブ、カボザンチニブ、ラムシルマブ、ニボルマブ、又はペムブロリズマブ又はソラフェニブ、特にソラフェニブから選択される化学療法剤、及び／又は
－本明細書に開示されるチェックポイント阻害剤による免疫療法、特にイピリムマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ－ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ；ＣＡＳ番号４７７２０２－００－９）、ニボルマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ－ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ；ＣＡＳ番号９４６４１４－９４－４）、ペムブロリズマブ（ＭｅｒｃｋＩｎｃ．ＣＡＳ番号１３７４８５３－９１－４）、ピジリズマブ（ＣＡＳ番号１０３６７３０－４２－３）、アテゾリズマブ（ＲｏｃｈｅＡＧ；ＣＡＳ番号１３８０７２３－４４－３）、アベルマブ（ＭｅｒｃｋＫＧａＡ；ＣＡＳ番号１５３７０３２－８２－８）、デュルバルマブ（ＡｓｔｒａＺｅｎａｃａ；ＣＡＳ番号１４２８９３５－６０－７）、及びセミプリマブ（ＳａｎｏｆｉＡｖｅｎｔｉｓ；ＣＡＳ番号１８０１３４２－６０－８）から構成される群から選択されるチェックポイント阻害剤による免疫療法。

記載された方法は、本明細書で議論されるように、第１に患者ががんを有する確率が高いかどうかを決定し、次にそのように分類された患者のみを治療することによって、肝硬変からＨＣＣ若しくは胆管がんなどの肝臓がんに進行する可能性が最も高い患者のみに抗腫瘍療法を提供する能力を提供する。

肝硬変と以前に診断された患者を治療する方法は、以下を含む：
ｅｘ－ｖｉｖｏの患者試料、特に肝生検及び／又は血液、血漿若しくは血清試料において、以下を含むか又はそれからなるリストから選択される２～３８個、特に８～３８個、より特に８～２０個のメチル化差異領域（ＤＭＲ）のメチル化レベルを決定することであって：
－ＣｐＧ部位（ｃｇ）１４４８５５７４４、ｃｇ２０５４７７７７、及び／又はｃｇ１６００９３１１を含むＤＭＲ１；
－ｃｇ２５３６６４０４、ｃｇ０８８６４２４０、ｃｇ０３４２２３５０、ｃｇ０９６５５２５３、及び／又はｃｇ１０７９１２７８を含むＤＭＲ２；
－ｃｇ０７００３６４３、ｃｇ１０９０４８６７、ｃｇ１６９９６２８１、ｃｇ１９５６０９７１、及び／又はｃｇ０９１８６８１８を含むＤＭＲ３；
－ｃｃｇ１７５７１５５９、ｃｇ０９６６６５７３、ｃｇ１１７０２８６６、ｃｇ１７６６０８３３、及び／又はｃｇ０５５５１００３を含むＤＭＲ４；
－ｃｇ１４０２１５２３、ｃｇ０７０４００２４、及び／又はｃｇ２７０８８０３８を含むＤＭＲ５；
－ｃｇ０６７５３９８５、ｃｇ０２４５７３４６、及び／又はｃｇ２７１４６８２４を含むＤＭＲ６；
－ｃｇ１６９８７６３８、ｃｇ２２３９９９８４、ｃｇ０９１１３４７４、及び／又はｃｇ０４２０６２１９を含むＤＭＲ７；
－ｃｇ２４９３２４５７、ｃｇ１４４３０１４１、ｃｇ２１５７７８３６、及び／又はｃｇ０９４７３８２６を含むＤＭＲ８；
－ｃｇ２６５５０９３６、ｃｇ２５１４０５３１、ｃｇ１１８８２６０７、ｃｇ２３４８２８９８、及び／又はｃｇ０８８５１７８２を含むＤＭＲ９；
－ｃｇ２７５２８７４８、ｃｇ２７１０８６２９、及び／又はｃｇ０２４７５６００を含むＤＭＲ１０；
－ｃｇ２０５１１７９７、ｃｇ１３８４７９８７、及び／又はｃｇ１３８０３７６５を含むＤＭＲ１１；
－ｃｇ０９７５４８４５、ｃｇ２５０２９７９７、ｃｇ２２６４６３１１、及び／又はｃｇ０６６３５３２８を含むＤＭＲ１２；
－ｃｇ２４２２４３０４、ｃｇ００５１２７２６、ｃｇ２５９３６１７７、ｃｇ１６１７９９６９、ｃｇ０７７２６９５３、ｃｇ２４５６９４４７、及び／又はｃｇ１０１５１６８５を含むＤＭＲ１３；
－ｃｇ１０７５９９７２、ｃｇ０２８６０５９９、及び／又はｃｇ０８６２５８２２を含むＤＭＲ１４；
－ｃｇ２４２０２４４８、ｃｇ０３９２０７６４、及び／又はｃｇ０９８４５２９３を含むＤＭＲ１５；
－ｃｇ０９８１６０９６、ｃｇ２２１５１９８５、及び／又はｃｇ０８９０１０５７を含むＤＭＲ１６；
－ｃｇ２３５５１７２０、ｃｇ２４０９５５９２、及び／又はｃｇ０３２６０２４０を含むＤＭＲ１７；
－ｃｇ０５４６９５７４、ｃｇ１２４３２５２６、ｃｇ０４１７２６４０、及び／又はｃｇ０６８６２９４９を含むＤＭＲ１８；
－ｃｇ２６１３４６６５、ｃｇ０２０４３６００、ｃｇ０３７９３８０４、ｃｇ２５０３３９９３、ｃｇ０７５３７２０６、ｃｇ０３１４４２３２、及び／又はｃｇ０５７８７２０９を含むＤＭＲ１９；
－ｃｇ０９３４３０９２、ｃｇ０３３６８０９９、ｃｇ２５３９０１６５、ｃｇ２０８１７１３１、ｃｇ０１３２３３８１、ｃｇ０３７４４７６３、ｃｇ１４０１３６９５、ｃｇ０５７７４６９９、ｃｇ０３２０７６６６、ｃｇ１２０１５７３７、ｃｇ１４０５８３２９、ｃｇ１９６４３０５３、ｃｇ０７０４９５９２、ｃｇ０２１０６６８２、ｃｇ２７１５１３０３、ｃｇ２１６４１４５８、ｃｇ１４８８２２６５、ｃｇ０５５７９０３７、ｃｇ１３６９４９２７、ｃｇ１７４３２８５７、ｃｇ２３４５４７９７、ｃｇ０８０７０３２７、ｃｇ２５５０６４３２、ｃｇ００９６９４０５、ｃｇ０１７４８８９２、ｃｇ２６０２３９１２、及び／又はｃｇ１６９９７６４２を含むＤＭＲ２０；
－ｃｇ２１５９１７４２、ｃｇ０３９１８３０４、ｃｇ２５３７１６３４、ｃｇ１８１１５０４０、ｃｇ１３２１７２６０、ｃｇ２０６４９０１７、及び／又はｃｇ１７４８９９３９を含むＤＭＲ２１；
－ｃｇ２６４６５３９１、ｃｇ０８６６８７９０、ｃｇ０１２６８８２４、ｃｇ２１７９０６２６、ｃｇ０５６６１２８２、ｃｇ１２５０６９３０、ｃｇ０３１４２５８６、ｃｇ１１２９４５１３、ｃｇ２７０４９７６６、及び／又はｃｇ０３２３４１８６を含むＤＭＲ２２；
－ｃｇ０５１０５２０７、ｃｇ０４０２４８６５、及び／又はｃｇ０１８８７３８８を含むＤＭＲ２３；
－ｃｇ０７００３６４３、ｃｇ１０９０４８６７、ｃｇ１６９９６２８１、ｃｇ１９５６０９７１、及び／又はｃｇ０９１８６８１８を含むＤＭＲ２４；
－ｃｇ０８９９２３０５、ｃｇ００３９３５８５、ｃｇ１２８６１９４５、ｃｇ０６４８１１６８、ｃｇ１１６３０５５４、ｃｇ２５９０４１８３、及び／又はｃｇ２０６９７０９４を含むＤＭＲ２５；
－ｃｇ０５６７０００４、ｃｇ０６９９９８５６、ｃｇ２６７６８０７５、ｃｇ１６６９２７３５、及び／又はｃｇ０２６１３８０９を含むＤＭＲ２６；
－ｃｇ１５６９９０８５、ｃｇ０４０７１２７０、及びｃｇ０６８８３１２６を含むＤＭＲ２７；
－ｃｇ１８５１２２３２、ｃｇ２７１１０９３８、ｃｇ１３８０６２６７、ｃｇ２５８７７５１２、ｃｇ１５９０９７２５、ｃｇ０５０３３４３９、ｃｇ０３１３４８０９、ｃｇ１８４３１４８６、及び／又はｃｇ０１９９８８５６を含むＤＭＲ２８；
－ｃｇ２６８８２２２４、ｃｇ０４８８６９３４、及び／又はｃｇ１７０５７０９８を含むＤＭＲ２９；
－ｃｇ０７４８１３２０、ｃｇ１４９３１８５４、及び／又はｃｇ２４５２０５３８を含むＤＭＲ３０；
－ｃｇ１９８８５７６１、ｃｇ１７８４７５２０、ｃｇ２３４９５７４８、ｃｇ０７２９５９６４、ｃｇ１０３１２５７２、ｃｇ２２７７６５７８、ｃｇ１４６４８９１６、ｃｇ０５９５８７４０、ｃｇ１８９０９２９５、ｃｇ１８３２８８９４、及び／又はｃｇ１５６３０４５９を含むＤＭＲ３１；
－ｃｇ１０２３７９９０、ｃｇ１６８００８５１、ｃｇ１８４１１５５０、ｃｇ０８３５８３９２、ｃｇ１８７９８９９５、ｃｇ０８１０６１４８、ｃｇ０７８２６２７５、ｃｇ２４５１６１４７、及び／又はｃｇ０９７１０７４０を含むＤＭＲ３２；
－ｃｇ１１０４４０９９、ｃｇ１２１２０３６７、ｃｇ００５８３００１、ｃｇ２６８３１００１、ｃｇ０４６０００５５、及び／又はｃｇ１７３９８５１５を含むＤＭＲ３３；
－ｃｇ００６０３３４０、ｃｇ２６６００７５３、ｃｇ１７２７９６５２、及び／又はｃｇ１２７１７９６３を含むＤＭＲ３４；
－ｃｇ０２５３２０３０、ｃｇ２２１３６０１３、ｃｇ０８３１３０４０、ｃｇ０２３７５５８５、ｃｇ１１７１５９４３、ｃｇ１７６６４２３３、ｃｇ０１３０９３９５、ｃｇ１８９２７１８５、ｃｇ０５５４７３９１、ｃｇ１２２０８０００、及び／又はｃｇ１５７３７１２３を含むＤＭＲ３５；
－ｃｇ１５７１２３１０、ｃｇ０１６３５５５５、ｃｇ０１７４４８２２、ｃｇ０６９８４９０３、及び／又はｃｇ０１３９４８４７を含むＤＭＲ３６；
－ｃｇ１９８４６１６８、ｃｇ００７７９５６５、ｃｇ１５２０３９０５、及び／又はｃｇ２３６４０２３１を含むＤＭＲ３７；
－ｃｇ２４４２８３７２、ｃｇ２４７３７４０８、ｃｇ２３９００２２８、ｃｇ０１１４４７６８、及び／又はｃｇ２２４０５７７４を含むＤＭＲ３８、
ここで、前記ＤＭＲのメチル化レベルは、複数のＤＭＲメチル化レベルを提供する前記ＤＭＲ内に含まれるＣｐＧ部位の１つ、又は２つ以上の平均のメチル化レベルであり；かつ
ここでＤＭＲ２、ＤＭＲ４、ＤＭＲ５、ＤＭＲ９、ＤＭＲ１０、ＤＭＲ１４、ＤＭＲ１５、ＤＭＲ１６、ＤＭＲ１８、ＤＭＲ２３、ＤＭＲ２４、ＤＭＲ２８、ＤＭＲ２９、ＤＭＲ３５、及び／又はＤＭＲ３７に対して決定されるメチル化レベルは、そのＤＭＲの高メチル化を示し、及び／又は
ここでＤＭＲ１、ＤＭＲ３、ＤＭＲ６、ＤＭＲ７、ＤＭＲ８、ＤＭＲ１１、ＤＭＲ１２、ＤＭＲ１３、ＤＭＲ１７、ＤＭＲ１９、ＤＭＲ２０、ＤＭＲ２１、ＤＭＲ２２、ＤＭＲ２５、ＤＭＲ２６、ＤＭＲ２７、ＤＭＲ３０、ＤＭＲ３１、ＤＭＲ３２、ＤＭＲ３３、ＤＭＲ３４、ＤＭＲ３６、及び／又はＤＭＲ３８に対して決定されるメチル化レベルは、そのＤＭＲの低メチル化を示すこと；
患者が肝細胞がん（ＨＣＣ）を有することを示し、その後に以下のリストから選択される治療を患者に施すこと（投与すること）：
－外科的切除、又は肝移植手術；
－高周波アブレーション又はマイクロ波アブレーション；
－有効量の化学療法剤、特にレンバチニブ、レゴラフェニブ、カボザンチニブ、ラムシルマブ、ニボルマブ、又はペムブロリズマブ若しくはソラフェニブ、より特にソラフェニブから選択される有効量の化学療法剤。

本発明はさらに、ＨＣＣ検出用キットの製造における使用のための定量的ＰＣＲ及び／又はシーケンシング装置に加えて、プライマー、及び適切なオリゴヌクレオチドプローブの使用を包含する。

本方法は、特に評価及び割り当て工程がコンピュータによって実行される、コンピュータ実装方法によって実施することができる。

さらに、本方法は、コンピュータ上で実行される際に、コンピュータに少なくとも評価工程及び／又は割り当て工程を実行させるコンピュータプログラムコードを含むコンピュータプログラムによって実施することができる。特に、測定工程の結果は、ユーザー入力によって、及び／又は測定工程中に得られたメチル化レベルに関する情報を含むコンピュータ読み取り可能なファイルを提供することによって、コンピュータ及び／又はコンピュータプログラムに提供され得る。測定工程からの結果は、さらなる処理のために、コンピュータのメモリ又は非一過性の記憶媒体に保存することができる。

別の態様において、本発明は、対象ががんを有するリスク又は可能性を決定するためのシステムを提供する。特定の実施形態では、前記がんは、肺がん、結腸がん、乳がん、肝臓がんである。より特定の実施形態では、本システムは、肝疾患患者がＨＣＣを発症しているか、又は再発のリスクが高いかどうかを決定する。一実施形態において、本システムは、本明細書において同定されるとおり、メチル化差異領域（ＤＭＲ）におけるメチル化、すなわち高メチル化又は低メチル化のレベルを検出する（探査する、又は明らかにする）ように設計及び構成された（明らかにすることができる）、複数のプローブを含む。特定の一実施形態では、前記複数のプローブは、ＤＭＲごとに２つのプローブのセットを含み、一方はメチル化された配列に特異的にハイブリダイズすることができ、もう一方は変換によってメチル化されていない配列から生成された配列に特異的にハイブリダイズすることができる。このシステムは、各プローブの信号レベルを読み出すために設計及び構成された装置、並びにコンピュータ（電子計算装置）及びコンピュータプログラムを含み、前記コンピュータプログラムは、コンピュータ上で実行される際に、コンピュータに上記で概説した本発明の態様のいずれか１つによる方法の工程を実行させるコンピュータプログラムコードを含む。例えば、ＤＭＲ内の冗長なＣｐＧのプローブについて平均メチル化値を計算し、又は複数のＤＭＲのメチル化レベルに加重値を適用して、それらを特許の分類アルゴリズムに組み込むことが挙げられる。

別の実施形態において、このシステムは、本明細書において同定されるとおり、メチル化差異領域（ＤＭＲ）における高メチル化又はその非存在を検出することができるメチル化アレイを含む。

例えば異なるＤＭＲのサブセット、各ＤＭＲ内のＣｐＧ部位の異なる選択、又はがんの種類など、単一の分離可能な特徴の代替形態が、本明細書において「実施形態」として示される場合、そのような代替形態は、本明細書に開示される本発明の個別の実施形態を形成するために自由に組み合わされ得ることを理解されたい。したがって、ＤＭＲの別の実施形態のいずれかを、がんの種類の別の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、これらの組み合わせは、本明細書に記載されている任意の診断方法と組み合わせることができる。

本発明は、以下の実施例及び図によってさらに説明され、そこからさらなる実施形態及び利点を引き出すことができる。これらの実施例は、本発明を説明するためのものであり、その範囲を限定するものではない。

表１はこの３８個の予測可能なメチル化差異領域（ＤＭＲ）を示し、平均は反復リッジ回帰分析を用いて同定された加重値（係数）であり、試験及び訓練データセット内の試料を分類するために、ＤＭＲシグネチャーリスクスコア閾値、及び性能の再現率及び適合率を３８個のＤＭＲすべてからのデータを用いて計算した。また、バイオインフォマティクスのＤＭＲ同定に使用されたクラスターアノテーション、ヒトリファレンスゲノム３８（ｈｇ３８）上のＤＭＲのゲノム位置、各ＤＭＲ内で評価されたマイクロアレイプローブによって測定されたＣｐＧ部位、及び訓練及び試験データセットの非ＨＣＣ試料と比較したＨＣＣ試料における各ＤＭＲの相対的平均メチル化も示した。

表２は、表１のとおりの線形回帰分類器リッジ回帰分析を使用して２０個のＤＭＲの選択について同定された平均（ｍｅａｎ）加重値（係数）、標準偏差（ＳｔＤ）、並びに再現率（ｒｅｃａｌｌ）及び適合率（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）に対して計算されたＤＭＲシグネチャーリスクスコアの閾値及び性能を示す。

実施例１：
ＨＣＣバイオマーカーの発見のためのＤＮＡメチル化データセット
組織及び血漿ｃｆＤＮＡの試料からＨＣＣを検出するためのＤＮＡメチル化バイオマーカーの包括的なセットを定義するために、高スループットのイルミナベースのＩｎｆｉｎｉｕｍ４５０Ｋ及びＥＰＩＣアッセイを用いて、ゲノムワイドのＤＮＡメチル化変化を特徴づけるＨＣＣ関連性研究を特定した。上記で定義された基準に合致する８５９試料の訓練及び試験セットを：ＨＣＣ患者由来のＨＣＣ組織及びｃｆＤＮＡ試料；複数の病因による肝硬変組織、及び肝硬変患者からのｃｆＤＮＡ；健常肝組織；及びその他の非ＨＣＣ疾患組織（例えば肝肥満及びα１アンチトリプシン欠損症など）及び非ＨＣＣ患者からのｃｆＤＮＡ（例えば敗血症及びその他のがん種など）をカバーする６つの異なる研究から集めた。

合計４５２，５６７個のメチル化部位（ＣｐＧ部位）に対して利用可能であるＤＮＡメチル化レベルが測定され、メチル化レベルはβメチル化値を用いて表され、０（低メチル化）～１（高メチル化）の範囲である。すべてのデータセットを、生のＩＤＡＴファイルからインポートされるシグナル強度を含む単一のマトリックスにマージし、機能正規化パイプラインを用いて処理した（Ｆｏｒｔｉｎ，Ｊ．Ｐら，２０１４，ＧｅｎｏｍｅＢｉｏｌ．１５：５０３）。メチル化チャネルと非メチル化チャネルとの間の比率を計算し、１００のオフセット（イルミナのメチル化アレイの推奨標準オフセット）で、小数点第５位に丸めたβメチル化値（β）［ＥＱ１］としてエクスポートした：

下流の分析では、いくつかのフィルタリング工程を行った：（ｉ）マイナーアレル頻度（ｍｉｎｏｒａｌｌｅｌｅｆｒｅｑｕｅｎｃｙ：ＭＡＦ）が０．０１より低いＣｐＧ部位又は一塩基延長に一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ）を含むプローブを下流の解析から除外した；（ｉｉ）ｍａｘｐｒｏｂｅｓＲパッケージ（ｖ０．０．２）を用いて、イルミナのメチル化アレイの交差反応性プローブを除去した；（ｉｉｉ）欠損値のあるＣｐＧ部位を放棄した；（ｉｖ）ｈｇ３８リファレンスビルドにマッピングされた更新されたプローブアノテーション、及び利用可能なアライメントがないプローブは考慮しなかった；及び（ｖ）性別に対するマッピングに依存しないＣｐＧ部位のバイオマーカーに焦点を当てるため、性染色体Ｘ及びＹを下流の分析から除外した。最終的にフィルタリングされたＤＮＡメチル化マトリックスは、全試料にわたっていずれの欠損値のない合計３９０，４４５個のＣｐＧ部位をカバーした。

さらに、６９２個の組織試料を含む検証データセットは、元のデータ又は出版物は利用できなかったが、処理済みのβメチル化値は入手できた７つの独立したデータセットから集めた。この検証データセットには、本試験で使用したアプローチの独立した検証として、異なる実験及び分析パイプラインによる複数の試験が含まれる。全体として、集められた１，５００超過の全ゲノムＤＮＡのメチル化アレイは、肝硬変などの疾患背景に臨床的に関連するＨＣＣのＤＮＡメチル化バイオマーカーを発見及び検証するための不均一かつ包括的なリソースを表す。

高品質かつ有益なＤＮＡメチル化領域の教師なし選択
ＨＣＣ患者試料は、低メチル化プロファイルと高メチル化プロファイルとを有する複数のクラスター化したＣｐＧ部位の区別可能なパターンを示した。ＣｐＧクラスターは、ＢｕｍｐＨｕｎｔｅｒＲパッケージ（ｖ１．３０．０）のｃｌｕｓｔｅｒＭａｋｅｒ関数を用いて、連続する２つの部位が多くとも５００塩基対（ｂｐ）離れているような、少なくとも３つのＣｐＧ部位にまたがるものと定義した。ＣｐＧクラスターを、上記のように定義されたフィルターされたＣｐＧ部位と重複し、少なくとも３つのＣｐＧ部位が測定されたＣｐＧクラスターのみを考慮した。最終的なＣｐＧクラスターのマトリックス（行列）を、各クラスター領域内でフィルタリングされたすべてのＣｐＧ部位の平均を取ることによって定義し、３９，８６８個のＣｐＧクラスターにまたがるＤＮＡメチル化のマトリックスを生成した。これは、潜在的な交絡因子の作用の影響を軽減し、ＨＣＣの頑健で一般化可能なバイオマーカーを明らかにするために、個々のＣｐＧ部位ではなくゲノム領域に焦点を当てるためである。

ＨＣＣを予測するメチル化領域の発見
組織及びｃｆＤＮＡにおいてＨＣＣを肝硬変試料のバックグラウンドから区別するために、ＨＣＣを予測するメチル化領域を見つけるために、線形サポートベクターマシン分類法（ｌｉｎｅａｒｓｕｐｐｏｒｔｖｅｃｔｏｒｍａｃｈｉｎｅｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ：ＬｉｎｅａｒＳＶＣ）を、一度に１個の試料を予測試験用に残し、他の８５８個の試料を訓練セットとして使用するリーブワンアウト交差検証（ｅａｖｅ－ｏｎｅ－ｏｕｔｃｒｏｓｓ－ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）戦略を用いて訓練した。

バランスのとれたデータセットを用いることにより、メチル化差異領域及び予測領域を２段階のアプローチで同定した。第１に、潜在的な共創因子、すなわち性別、年齢、全体的なメチル化、及び腫瘍の純度などの影響を除去することによって、メチル化差異領域（ＤＭＲ）を同定する。次に、ＨＣＣ（ＨＣＣ－Ｔ及びＨＣＣ－ＣＦ）試料と肝硬変（Ｃ－Ｔ及びＣ－ＣＦ）試料との間のメチル化差異解析を行い、それらの潜在的な影響を考慮するために、線形モデリング順序で共変量として前述の変数を組み込んだ。有意に差異的にメチル化されたＣｐＧクラスター（尤度比検定ＦＤＲ＜１％）のみをモデルトレーニングに選択した。

ＤＭＲは、比率検定及び分散分析のＦＤＲが１％未満のＣｐＧクラスターとして定義される。したがって、リーブワンアウト手順全体での中央値は１，３５５個のＤＭＲである。ＨＣＣと肝硬変、並びにｃｆＤＮＡと組織試料を同じ割合で含む合計８８試料をモデルトレーニングに使用した。より少ないｃｆＤＮＡ試料セットに関連する情報を最大限に保持するため、ｃｆＤＮＡ試料を分析する際に、この試料を訓練に使用せず、したがって各クラスの試料総数は２１個に減少し、それ故代わりに合計８４個の均等に分布した試料が使用される。

ＨＣＣメチル化シグネチャーの評価、比較、及びアセンブリ
予測的メチル化シグネチャーのための最適なＤＭＲの数を見つけるために、特徴セットにＤＭＲを加えることを順次試験し、得られたＬｉｎｅａｒＳＶＣモデルの適合性及び再現性を評価した。ＨＣＣ試料で同定されたＤＭＲは、モデルで考慮されるＤＭＲの数を減らすために、ペナルティパラメータ（Ｃ）を１．５に設定したＬ１正則化を用いて線形サポートベクターマシン（ＬｉｎｅａｒＳＶＣ）を訓練することにより、ＨＣＣを予測する能力を評価した。そして、訓練済みのモデルにおいて重みがゼロでないＤＭＲを、ＨＣＣ試料を分類する最も予測的なＤＭＲと定義する。８５９回のリーブワンアウト法の繰り返しで１モデルあたり３８個のＨＣＣ予測ＤＭＲの中央値が同定され、ここで全トレーニング済みモデルの少なくとも５％（ｎ＝４３）で、１５０個の固有なＤＭＲが見出された。再現率及び適合率は１０個のＤＭＲまで急激に増加し、それ以降は試験データセット及び検証データセットは、小さいながらも一貫した性能の向上を示している。最適モデルにおける各ＤＭＲの頻度はその絶対平均効果量と正の相関があるという事実と共に、リーブワンアウト交差検証手順における最も頻度の高い上位３８個のＤＭＲである（図２）。

得られたＤＮＡメチル化シグネチャーを、出版物４件（ＶｉｌｌａｎｕｅｖａＡ．ら，２０１５．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ６１：１９４５；ＨｌａｄｙＲ．Ａ．ら，２０１９．Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ９：７２３９；ＣｈｅｎｇＪ．ら，２０１８．ＧｅｎｏｍｅＭｅｄ．１０：４２；ＡｒａｎＤ．ら，２０１５．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．６：８９７１）、及び特許７件（韓国特許（ＫＲ）第１０２１０３８８５号（Ｂ１）；米国公開特許（ＵＳ）第２０１９３００９６５号（Ａ１）；ＵＳ第２０１８０２１６１９５号（Ａ１）；ＵＳ第２０２０２６３２５６号（Ａ１）；日本公開特許（ＪＰ）第２０１８５０８２２８号（Ａ１）；ＪＰ第２０１８５０８２２８号（Ａ２）；ＵＳ第２０２００２９９７７６号（Ａ１））による１３セットのＣｐＧ部位を含む文献から集められた他の類似アプローチと比較した。潜在的な方法論的な偏りを回避するために、以前に使用されていたサポートベクターマシンモデルとは対照的に、ロジスティック分類モデルと線形分類モデルを使用するアンサンブルモデル（ｅｎｓｅｍｂｌｅｍｏｄｅｌ）を使用した。このアプローチでは、リーブワンアウト交差検証で試験するために抜かれた試料のＨＣＣの状態を繰り返し予測する。すべてのモデルの性能は、複数の標準的な性能指標、すなわち、再現率、適合率、正解率、Ｍａｔｈｅｗの相関係数（Ｍａｔｈｅｗ’ｓｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ：ＭＣＣ）、及びバランスのとれた正解率を用いて推定された。組織試料の全体的な適合率と再現率のスコアは０．８超過であり（図３ａ）、ｃｆＤＮＡ試料のサブセットを予測する場合、すべてのモデルの性能が低下したが、適合率は影響が少なかった（図３ａ及び３ｂ）。次に、検証組織試料データセットを独立したベンチマークとして使用し、全体的な特徴セットは平均９６％の適合率及び８６％の再現率を提供することが観察された（図３ｃ）。本試験のシグネチャーは、適合率（９８％）を維持したまま、最も高い再現率（９５％）を得た（図３ｃ）。

このアプローチは、高メチル化領域及び低メチル化領域のシグネチャーが、肝硬変試料、健常試料、及びその他のＨＣＣ試料を区別することが成功できたことを確認することができ、他のＤＮＡメチル化シグネチャーに対して正のベンチマークを示し、特に組織試料とｃｆＤＮＡ試料との両方で、低い偽陰性率、すなわち高い再現率を示した。

肝細胞がんのメチル化診断指標
次に、ＨＣＣの早期検出のための診断指標として使用するＤＮＡメチル化シグネチャー全体からの情報を包含することができる単一指標を定義するために、合計２１４個（そのうちＨＣＣにおける有意な高メチル化と低メチル化とが示されたのは１１８個と７４個とである（図３ｄ、表１））のＣｐＧ部位を含む上位３８個のＤＭＲを使用した。

上記と同様に１，０００個のバランスのとれた訓練データセットをランダムに生成し、線形回帰分類器を訓練することにより、このシグネチャーにおける各ＤＭＲの重要度（ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ）及びばらつきを推定した（図４ａ）。次に、各モデルによって学習される符号付き平均係数で重み付けされた、各々の３８個のＤＭＲのメチル化シグネチャーの合計から構成される加算線形スコア（ＤＭＲシグネチャーリスクスコア）を作成した。言い換えれば、すべての訓練済みモデルで平均係数の絶対値が高いＤＭＲは、スコアでより優位になる。簡単に説明すると、この線形リスクスコアは、リーブワンアウト交差検証にてバランスのとれた試料セットで訓練された線形サポートベクターマシン（ＬｉｎｅａｒＳＶＣ）において、非ゼロの重みで再帰的に存在する上位３８個のＤＭＲの統合されたスコアである。各ＤＭＲの重要度（重み）を、αパラメーターを１に設定したリッジ分類器を訓練するために使用されるバランスのとれたデータセットの１，０００通りの並べ替えを使用して推定し、ゼロ以外として保持しながらモデルの特徴係数（個々の加重値）の正則化を確保した。そして、各ＤＭＲの平均及び標準偏差を、１，０００回の反復すべてで計算する。次いで平均係数を、線形ＤＭＲシグネチャーリスクスコアにおいて、より大きい絶対スコアを持つ特徴がより優位となる加重加算スコアで使用する。この特徴セット及び重みに基づいて、各試料のスコアを計算する。試料のリスクスコア及びＨＣＣ状態を用いて、再現率及び適合率の曲線を作成した。最適な閾値、並びに適合率及び再現率を、曲線に沿って可能な最良のＦ１指標に基づいて推定する。

上位３８個のＤＭＲを重要度の高い順に並べ（絶対平均係数、表１）、上位１～３８個のＤＭＲの適合率及び再現率を、訓練及び試験データセットで訓練し、検証データセットを用いて試験することによって、試験した。ここでもまた、適合率は比較的安定した状態であったが、再現率はＤＭＲが８～１０個までは急峻に増加し、１０～２２個は試験データセットと検証データセットでは小さいながらも一貫した性能の向上を示し、２２～３８個では、評価された指標が徐々に安定することから、わずかな改善を推測することができる（図４ｂ）。正則化パラメーターαを１に設定したリッジ分類器をフィッティングすることにより、選択されたＤＭＲのサブセットに従って係数を推定する。これをそれぞれの上位２、３、５、８、１０、２０、３８個のシグネチャーについて独立して行った結果、ＨＣＣ分類のための調整された係数及び閾値を得た（表１、２、図４ｂ）。選択されたＤＭＲのサブセットは、再現値及び適合値によって示されるとおり、ＨＣＣ患者を健常対照又は肝硬変対照から正確に分類することができた。モデルを、組織生検のＨＣＣ試料及び肝硬変試料のランダムなアンダーサンプリングと、同数のＨＣＣ及び肝硬変の液体生検（リキッドバイオプシー）試料を共に用いて訓練し、各クラスが同様に表現されることを確保した。ランダムなアンダーサンプリングは、上位２０個及び上位３８個の各シグネチャーについて１，０００回実行される。

ＤＭＲシグネチャーリスクスコアを、試験及び訓練及び検証のデータセットの全試料について計算し、試料をＨＣＣへの割り当ての可能性に従ってランク付けした。他のＣｐＧ部位シグネチャーについても線形リスクスコアを推定し、独立した検証データセットでは、ＤＭＲシグネチャーに基づくスコアが性能に優れ、ＨＣＣの非常に正確な予測を提供することが観察された（図４ｃ）。さらに、ＤＭＲシグネチャー及びスコアの訓練から除外された訓練及び試験データセットの試料では、ＤＭＲシグネチャーリスクスコアは、ＨＣＣ試料と非ＨＣＣ試料とを明確に分け、再現率（感度）は８６％、適合率は８３％であった（図５ａ、ｂ）。

ｃｆＤＮＡ試料は、腫瘍生検試料と比較して腫瘍由来のＤＮＡの割合が低いため、メチル化シグナルに関するバックグラウンドはノイズが多いが、組織生検と比較して血漿又は血液などの液体試料の取得が容易であるため早期診断アプローチに関連性がある。ＨＣＣ及び肝硬変のｃｆＤＮＡ試料に加え、健常対照、敗血症、並びに肺、乳房、大腸など他の組織のがんを有する患者のｃｆＤＮＡ試料もまた評価した。ここでもＨＣＣ指標は、シグネチャー及びスコアの訓練に使用されたｃｆＤＮＡのＨＣＣ試料と肝硬変試料とを明確に分離した。

主にＨＣＣのがん試料を用いて訓練したＤＭＲシグネチャーのリスクスコアはまた、敗血症対照又は健常対照と比較して、他のがん患者のｃｆＤＮＡ試料も完全に同定することができた（再現率８８％、適合率７８％）（図５ｃ及びｄ）。このことは、ＨＣＣのバイオマーカーが、複数のがんにわたりメチル化差異を検出することを示唆している。包括的に、上位３８個のＤＭＲから導出されたリスクスコアは、ＨＣＣ試料の分類に成功し、乳がん、肺がん、及び結腸直腸がんを含む他の悪性腫瘍由来の７個（１１個中）のｃｆＤＮＡ試料を同定した。

線形リスクスコアは、不均一なバックグラウンドを有する多くの異なるデータセットにおいて（図５ｅ）、そして最も重要なことは組織生検と液体生検との両方において（図６）、頑健な予測力を有するＨＣＣの診断のための価値ある指標である。各ＤＭＲで同定される複数のＣｐＧ部位の冗長性は、上位８、１０、２０、又は３８個のＤＭＲのメチル化レベルに寄与する１、２、又は３個のいずれかのＣｐＧ部位のランダムなアンダーサンプリングを実行することによって確認した。再現率は、ＤＭＲごとに考慮されるＣｐＧ部位の数とは無関係に、使用される上位のＤＭＲの数と共に増加することを観察した（図７）。

もたらされるＤＭＲシグネチャーリスクスコアは、類似のメチル化プロファイルを持つ複数の連続したＣｐＧ部位を包含するメチル化差異領域（ＤＭＲ）からの情報を組み込み、液体生検の頑健なバイオマーカーを提供し、出版物及び特許によるＨＣＣの複数のＤＮＡメチル化シグネチャーと比較して良好である。

Claims

患者ががんを有するか否かを決定する方法、特に肺がん、結腸がん、乳がん、又は肝臓がん、より特に肝細胞がんを有するか否かを決定する方法であって、前記方法は以下の工程：
ａ．測定工程において、患者のｅｘ－ｖｉｖｏ試料、特にがんの存在が疑われる組織の探索生検、及び／又は患者から採取した血液、血漿、若しくは血清の試料において、２～３８個、特に８～３８個、より特に８～２０個のメチル化差異領域（ＤＭＲ）のメチル化レベルを決定する工程であって、
ここで、前記ＤＭＲは：
－ＣｐＧ部位（ｃｇ）１４４８５５７４４、ｃｇ２０５４７７７７、及び／又はｃｇ１６００９３１１を含むＤＭＲ１；
－ｃｇ２５３６６４０４、ｃｇ０８８６４２４０、ｃｇ０３４２２３５０、ｃｇ０９６５５２５３、及び／又はｃｇ１０７９１２７８を含むＤＭＲ２；
－ｃｇ０７００３６４３、ｃｇ１０９０４８６７、ｃｇ１６９９６２８１、ｃｇ１９５６０９７１、及び／又はｃｇ０９１８６８１８を含むＤＭＲ３；
－ｃｇ１７５７１５５９、ｃｇ０９６６６５７３、ｃｇ１１７０２８６６、ｃｇ１７６６０８３３、及び／又はｃｇ０５５５１００３を含むＤＭＲ４；
－ｃｇ１４０２１５２３、ｃｇ０７０４００２４、及び／又はｃｇ２７０８８０３８を含むＤＭＲ５；
－ｃｇ０６７５３９８５、ｃｇ０２４５７３４６、及び／又はｃｇ２７１４６８２４を含むＤＭＲ６；
－ｃｇ１６９８７６３８、ｃｇ２２３９９９８４、ｃｇ０９１１３４７４、及び／又はｃｇ０４２０６２１９を含むＤＭＲ７；
－ｃｇ２４９３２４５７、ｃｇ１４４３０１４１、ｃｇ２１５７７８３６、及び／又はｃｇ０９４７３８２６を含むＤＭＲ８；
－ｃｇ２６５５０９３６、ｃｇ２５１４０５３１、ｃｇ１１８８２６０７、ｃｇ２３４８２８９８、及び／又はｃｇ０８８５１７８２を含むＤＭＲ９；
－ｃｇ２７５２８７４８、ｃｇ２７１０８６２９、及び／又はｃｇ０２４７５６００を含むＤＭＲ１０；
－ｃｇ２０５１１７９７、ｃｇ１３８４７９８７、及び／又はｃｇ１３８０３７６５を含むＤＭＲ１１；
－ｃｇ０９７５４８４５、ｃｇ２５０２９７９７、ｃｇ２２６４６３１１、及び／又はｃｇ０６６３５３２８を含むＤＭＲ１２；
－ｃｇ２４２２４３０４、ｃｇ００５１２７２６、ｃｇ２５９３６１７７、ｃｇ１６１７９９６９、ｃｇ０７７２６９５３、ｃｇ２４５６９４４７、及び／又はｃｇ１０１５１６８５を含むＤＭＲ１３；
－ｃｇ１０７５９９７２、ｃｇ０２８６０５９９、及び／又はｃｇ０８６２５８２２を含むＤＭＲ１４；
－ｃｇ２４２０２４４８、ｃｇ０３９２０７６４、及び／又はｃｇ０９８４５２９３を含むＤＭＲ１５；
－ｃｇ０９８１６０９６、ｃｇ２２１５１９８５、及び／又はｃｇ０８９０１０５７を含むＤＭＲ１６；
－ｃｇ２３５５１７２０、ｃｇ２４０９５５９２、及び／又はｃｇ０３２６０２４０を含むＤＭＲ１７；
－ｃｇ０５４６９５７４、ｃｇ１２４３２５２６、ｃｇ０４１７２６４０、及び／又はｃｇ０６８６２９４９を含むＤＭＲ１８；
－ｃｇ２６１３４６６５、ｃｇ０２０４３６００、ｃｇ０３７９３８０４、ｃｇ２５０３３９９３、ｃｇ０７５３７２０６、ｃｇ０３１４４２３２、及び／又はｃｇ０５７８７２０９を含むＤＭＲ１９；
－ｃｇ０９３４３０９２、ｃｇ０３３６８０９９、ｃｇ２５３９０１６５、ｃｇ２０８１７１３１、ｃｇ０１３２３３８１、ｃｇ０３７４４７６３、ｃｇ１４０１３６９５、ｃｇ０５７７４６９９、ｃｇ０３２０７６６６、ｃｇ１２０１５７３７、ｃｇ１４０５８３２９、ｃｇ１９６４３０５３、ｃｇ０７０４９５９２、ｃｇ０２１０６６８２、ｃｇ２７１５１３０３、ｃｇ２１６４１４５８、ｃｇ１４８８２２６５、ｃｇ０５５７９０３７、ｃｇ１３６９４９２７、ｃｇ１７４３２８５７、ｃｇ２３４５４７９７、ｃｇ０８０７０３２７、ｃｇ２５５０６４３２、ｃｇ００９６９４０５、ｃｇ０１７４８８９２、ｃｇ２６０２３９１２、及び／又はｃｇ１６９９７６４２を含むＤＭＲ２０；
－ｃｇ２１５９１７４２、ｃｇ０３９１８３０４、ｃｇ２５３７１６３４、ｃｇ１８１１５０４０、ｃｇ１３２１７２６０、ｃｇ２０６４９０１７、及び／又はｃｇ１７４８９９３９を含むＤＭＲ２１；
－ｃｇ２６４６５３９１、ｃｇ０８６６８７９０、ｃｇ０１２６８８２４、ｃｇ２１７９０６２６、ｃｇ０５６６１２８２、ｃｇ１２５０６９３０、ｃｇ０３１４２５８６、ｃｇ１１２９４５１３、ｃｇ２７０４９７６６、及び／又はｃｇ０３２３４１８６を含むＤＭＲ２２；
－ｃｇ０５１０５２０７、ｃｇ０４０２４８６５、及び／又はｃｇ０１８８７３８８を含むＤＭＲ２３；
－ｃｇ０７００３６４３、ｃｇ１０９０４８６７、ｃｇ１６９９６２８１、ｃｇ１９５６０９７１、及び／又はｃｇ０９１８６８１８を含むＤＭＲ２４；
－ｃｇ０８９９２３０５、ｃｇ００３９３５８５、ｃｇ１２８６１９４５、ｃｇ０６４８１１６８、ｃｇ１１６３０５５４、ｃｇ２５９０４１８３、及び／又はｃｇ２０６９７０９４を含むＤＭＲ２５；
－ｃｇ０５６７０００４、ｃｇ０６９９９８５６、ｃｇ２６７６８０７５、ｃｇ１６６９２７３５、及び／又はｃｇ０２６１３８０９を含むＤＭＲ２６；
－ｃｇ１５６９９０８５、ｃｇ０４０７１２７０、及びｃｇ０６８８３１２６を含むＤＭＲ２７；
－ｃｇ１８５１２２３２、ｃｇ２７１１０９３８、ｃｇ１３８０６２６７、ｃｇ２５８７７５１２、ｃｇ１５９０９７２５、ｃｇ０５０３３４３９、ｃｇ０３１３４８０９、ｃｇ１８４３１４８６、及び／又はｃｇ０１９９８８５６を含むＤＭＲ２８；
－ｃｇ２６８８２２２４、ｃｇ０４８８６９３４、及び／又はｃｇ１７０５７０９８を含むＤＭＲ２９；
－ｃｇ０７４８１３２０、ｃｇ１４９３１８５４、及び／又はｃｇ２４５２０５３８を含むＤＭＲ３０；
－ｃｇ１９８８５７６１、ｃｇ１７８４７５２０、ｃｇ２３４９５７４８、ｃｇ０７２９５９６４、ｃｇ１０３１２５７２、ｃｇ２２７７６５７８、ｃｇ１４６４８９１６、ｃｇ０５９５８７４０、ｃｇ１８９０９２９５、ｃｇ１８３２８８９４、及び／又はｃｇ１５６３０４５９を含むＤＭＲ３１；
－ｃｇ１０２３７９９０、ｃｇ１６８００８５１、ｃｇ１８４１１５５０、ｃｇ０８３５８３９２、ｃｇ１８７９８９９５、ｃｇ０８１０６１４８、ｃｇ０７８２６２７５、ｃｇ２４５１６１４７、及び／又はｃｇ０９７１０７４０を含むＤＭＲ３２；
－ｃｇ１１０４４０９９、ｃｇ１２１２０３６７、ｃｇ００５８３００１、ｃｇ２６８３１００１、ｃｇ０４６０００５５、及び／又はｃｇ１７３９８５１５を含むＤＭＲ３３；
－ｃｇ００６０３３４０、ｃｇ２６６００７５３、ｃｇ１７２７９６５２、及び／又はｃｇ１２７１７９６３を含むＤＭＲ３４；
－ｃｇ０２５３２０３０、ｃｇ２２１３６０１３、ｃｇ０８３１３０４０、ｃｇ０２３７５５８５、ｃｇ１１７１５９４３、ｃｇ１７６６４２３３、ｃｇ０１３０９３９５、ｃｇ１８９２７１８５、ｃｇ０５５４７３９１、ｃｇ１２２０８０００、及び／又はｃｇ１５７３７１２３を含むＤＭＲ３５；
－ｃｇ１５７１２３１０、ｃｇ０１６３５５５５、ｃｇ０１７４４８２２、ｃｇ０６９８４９０３、及び／又はｃｇ０１３９４８４７を含むＤＭＲ３６；
－ｃｇ１９８４６１６８、ｃｇ００７７９５６５、ｃｇ１５２０３９０５、及び／又はｃｇ２３６４０２３１を含むＤＭＲ３７；
－ｃｇ２４４２８３７２、ｃｇ２４７３７４０８、ｃｇ２３９００２２８、ｃｇ０１１４４７６８、及び／又はｃｇ２２４０５７７４を含むＤＭＲ３８、
を含む、又はそれからなるリストから選択され、かつ
前記ＤＭＲのメチル化レベルは、複数のＤＭＲのメチル化レベルを提供する前記ＤＭＲ内に含まれるＣｐＧ部位の１つ、又は２つ以上の平均のメチル化レベルである、前記工程；
ｂ．評価工程において、前記測定工程ａで決定された複数のＤＭＲメチル化レベルの組み合わされた統計的有意性を確立する工程、
ｃ．割り当て工程において、前記複数のＤＭＲメチル化レベルの組み合わされた統計的有意性に基づいて、がんを有する確率が高いこと、又はがんを有する確率が低いことを患者に割り当てる工程、
を含む、前記方法。
患者ががんを有する確率が高いことを割り当てられ、ここで
－ＤＭＲ２、ＤＭＲ４、ＤＭＲ５、ＤＭＲ９、ＤＭＲ１０、ＤＭＲ１４、ＤＭＲ１５、ＤＭＲ１６、ＤＭＲ１８、ＤＭＲ２３、ＤＭＲ２４、ＤＭＲ２８、ＤＭＲ２９、ＤＭＲ３５、及び／又はＤＭＲ３７に対して決定されるメチル化レベルは、そのＤＭＲの高メチル化を示し；
及び／又は
－ＤＭＲ１、ＤＭＲ３、ＤＭＲ６、ＤＭＲ７、ＤＭＲ８、ＤＭＲ１１、ＤＭＲ１２、ＤＭＲ１３、ＤＭＲ１７、ＤＭＲ１９、ＤＭＲ２０、ＤＭＲ２１、ＤＭＲ２２、ＤＭＲ２５、ＤＭＲ２６、ＤＭＲ２７、ＤＭＲ３０、ＤＭＲ３１、ＤＭＲ３２、ＤＭＲ３３、ＤＭＲ３４、ＤＭＲ３６、及び／又はＤＭＲ３８に対して決定されるメチル化レベルは、そのＤＭＲの低メチル化を示し；かつ
－高メチル化は、がん細胞を含まないことが以前に決定された複数の対照試料で決定されるように前記ＤＭＲのメチル化レベルの平均を上回るメチル化レベルとして特徴づけられ、かつ低メチル化は、前記ＤＭＲのメチル化レベルの平均を下回るメチル化レベルとして特徴づけられる、
請求項１に記載の方法。
前記評価工程では、リスクスコアを得るために、前記複数のＤＮＡメチル化レベルを、試料ががん細胞由来のＤＮＡを含有する確率によって試料を分類する予測アルゴリズムに供し、
特に、前記アルゴリズムは加算線形スコアであり、
より特に、前記複数のＤＮＡメチル化レベルを、
－複数の重み付けされたＤＭＲメチル化値を得るために、前記複数のＤＭＲメチル化レベルの各々に各ＤＭＲの相対的予測力に応じて個々の加重値を乗算すること、及び
－リスクスコアを得るために、前記複数の重み付けされたＤＭＲメチル化値の合計を計算すること、
による加算線形スコアに供する、
請求項１又は２に記載の方法。
前記割り当て工程において、前記リスクスコアが閾値と比較され、ここで
－閾値以上のリスクスコアは、患者ががんを有する確率が高いことを示し、
－閾値未満のリスクスコアは、患者ががんを有する確率が低いことを示し、
－特に測定工程において、２０～３８個のＤＭＲのメチル化レベルが決定され、かつ割り当て工程において、前記閾値の絶対値は０．７０～１．７０であり、特に１．００～１．５０であり、より特に前記閾値の絶対値は約１．２３である、
請求項３に記載の方法。
測定工程において、ＤＭＲメチル化レベルが決定される前記複数のＤＭＲは、ＤＭＲ１を含み、
－特にＤＭＲ１及びＤＭＲ４を含み、
－より特にＤＭＲ１、ＤＭＲ４、及びＤＭＲ２８を含み、
－さらにより特にＤＭＲ１、ＤＭＲ４、ＤＭＲ２８、ＤＭＲ３５、及びＤＭＲ３６を含み、
－なおより特にＤＭＲ１、ＤＭＲ４、ＤＭＲ６、ＤＭＲ７、ＤＭＲ３１、ＤＭＲ３５、ＤＭＲ２８、及びＤＭＲ２３を含み、
－なおより特にＤＭＲ１、ＤＭＲ４、ＤＭＲ２７、ＤＭＲ６、ＤＭＲ２、ＤＭＲ１６、ＤＭＲ３１、ＤＭＲ３５、ＤＭＲ２８、及びＤＭＲ２３を含む、
請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
前記予測アルゴリズムは、分類モデルを訓練することによって得られ、特にロジスティック分類モデル、又はエラスティックネット分類モデル、より特にリッジ回帰分類モデルを訓練することによって得られ、かつ
前記分類モデルは、同数の：
ｉ．複数のがん患者の組織試料、特にＨＣＣ患者の試料と、
ｉｉ．複数の対照試料、特に慢性肝疾患の患者試料と健常対照試料との組み合わせと
を含む既知のがん状態の複数の患者試料から得られた複数のメチル化値を使用して訓練され、
ｉｉｉ．ここで、前記複数のがん患者の組織試料と前記複数の対照試料とはそれぞれ、同数の組織生検試料及び無細胞液体生検試料のそれぞれを含む、請求項４又は５に記載の方法。
前記割り当て工程において、
－がんを有する確率が低いとは、がんを有する確率が約６％として定義され、及び／又は
－がんを有する確率が高いとは、がんを有する確率が特に約９４％として定義される、
請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
がんの存在が疑われる組織の探索生検、及び／又は患者から採取された血液、血漿、若しくは血清の試料から選択される患者試料を得ること、及び
－前記試料からＤＮＡを抽出すること、及び
－前記抽出されたＤＮＡを脱アミノ化剤で処理して脱アミノ化ＤＮＡを生成すること、
を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
所定のＣｐＧ部位のメチル化値は、次世代シーケンシング、定量ポリメラーゼ連鎖反応、又はメチル化アレイから選択される方法を用いて決定され、特に前記メチル化値は、メチル化アレイを用いて得られるβメチル化値である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
前記患者試料は血漿試料である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
前記患者試料はがんを有することが疑われる組織の探索生検試料である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
前記がんは肝細胞がん（ＨＣＣ）である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
肝硬変と以前に診断された患者の治療における使用のための医薬組成物であって、前記組成物は：
－レンバチニブ、レゴラフェニブ、カボザンチニブ、ラムシルマブ、又はソラフェニブから選択され、特にソラフェニブである、抗悪性腫瘍薬；及び／又は
－チェックポイント阻害剤、特にイピリムマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、及びセミピリムマブ、より特にニボルマブ、又はペムブロリズマブからなる群から選択されるチェックポイント阻害剤；
を含み、
ここで前記患者は、請求項１～１２のいずれか一項に記載される方法によって、がんを有する確率が高いと割り当てられている、前記医薬組成物。
患者ががんを有するか否かを決定するためのシステム、特に肺がん、結腸がん、乳がん、又は肝臓がん、より特に肝細胞がんを有するか否かを決定するためのシステムであって：
－請求項１又は５に記載のＤＭＲのメチル化レベルを明らかにするように設計及び構成されたプローブのセット；
－プローブのシグナルを読み取るように設計及び構成された装置；及び
－コンピュータプログラムが、コンピュータ上で実行される際にコンピュータに、請求項１～１２のいずれか一項による方法の工程を実行させるコンピュータプログラムコードを含む、コンピュータ及びコンピュータプログラム、
を含む、前記システム。