CN114432445A - Itpripl1的调节剂在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了ITPRIPL1的调节剂在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物中的用途，所述的调节剂用于提高或降低机体的ITPRIPL1基因或蛋白的表达或功能。本发明还公开了一种药物组合物，其包含所述的用途中采用的调节剂。本发明还公开了一种分离的ITPRIPL1重组蛋白，以及一种识别并结合ITPRIPL1的抗体。本发明基于新的科学发现，即ITPRIPL1蛋白结合CD3ε与NRP2受体调节不同免疫细胞的功能，进而参与免疫反应的调节和肿瘤的免疫逃逸过程，证实ITPRIPL1的调节剂可用于制备药物或药物组合物，在抑制肿瘤、自身免疫性疾病、移植排斥反应、过敏和感染等疾病方面具有应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及ITPRIPL1的调节剂在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物中的用途。
背景技术
ITPRIPL1编码蛋白为Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor-interactingprotein-like 1(肌醇1,4,5-三磷酸受体相互作用蛋白样1)，既往未见到关于ITPRIPL1功能的报道。根据UniProtKB数据库的注释，人类的ITPRIPL1包括555个氨基酸，分为胞外区(1-103氨基酸)、跨膜区(104-124氨基酸)、胞内区(125-555氨基酸)。
T细胞是适应性免疫反应的关键效应细胞，在消除病原体和自身免疫性疾病中具有许多重要作用。T细胞有几个亚群，每个亚群具有不同的功能。在T细胞表面上发现的TCR(T细胞受体)是由α和β多肽链组成的异二聚体，构成大约95％的TCR群体，或者是γ和δ多肽链(Pitcher和van Oers，2003年)。每种多肽均包含恒定(C)和可变(V)区域。恒定区锚定在细胞膜中，而可变区在细胞外延伸并负责结合抗原。TCR的细胞质短尾缺乏转导信号的能力。细胞内信号传导由CD3蛋白复合物启动，该复合物包含细胞内免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。
CD3(分化簇3)T细胞共受体是一种蛋白质复合物，由四个不同的链组成。在哺乳动物中，复合物包含一条CD3γ(γ)链，一条CD3δ(δ)链和两条CD3ε(ε)链。这些链与TCR和ζ链(zeta链)相关，在T淋巴细胞中产生激活信号。TCR，ζ链和CD3分子一起构成TCR复合物。CD3γ，CD3δ和CD3ε链是包含单个细胞外免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白。TCR不能结合游离的表位/抗原，相反，TCR会结合酶切的与主要组织相容性复合物(MHC)相关的较大多肽的片段，这与人的人类白细胞抗原(HLA)系统同义。这种相互作用发生在被称为免疫突触的空间中。I类MHC分子在人体所有有核细胞上表达，并向细胞毒性T细胞呈递抗原，这些细胞毒性T细胞上的CD8稳定MHC/TCR相互作用。细胞毒性T细胞的活化随后导致靶细胞的破坏。在巨噬细胞，B细胞和树突状细胞上发现II类MHC。这些免疫细胞将抗原呈递给辅助性T细胞，并带有稳定MHC/TCR相互作用的CD4。MHC II类和TCR之间的相互作用最终导致抗体介导的免疫反应。其他共刺激分子，例如CD45，CD28和CD2有助于免疫突触中的T细胞活化并启动TCR信号体的形成，TCR信号体是负责细胞内信号传导的大分子蛋白质复合物。
结合人CD3ε的几种抗体曾被报道，例如抗体OKT3(参见例如Kung，P.等人，Science206(1979)347-349；Salmeron，A.等人，J Immunol 147(1991)3047-3052)，抗体UCHT1(参见例如Callard，RE等，Clin Exp Immunol 43(1981)497-505)或抗体SP34(参见例如Pessano，S。等，EMBO J 4(1985)337-344)。目前已知的抗体中SP34是人食蟹猕猴交叉反应性的(Conrad M.L.等人，Cytometry A 71(2007)925-933)。既往已知直接结合CD3ε胞外区的蛋白质都是抗体类分子，并未见到过天然的非抗体类蛋白(例如跨膜蛋白、分泌型蛋白等典型配体)结合CD3ε胞外区的报道。
神经纤毛蛋白-2即NRP-2(neuropilin-2)是一种可调节免疫细胞功能的受体(AmJ Physiol Lung Cell Mol Physiol.2018)，被报道调控抗原递呈细胞的功能，并促进肿瘤的免疫逃逸(Sohini Roy等，Cancer Res.2018)；NRP2可影响免疫细胞的迁移、吞噬功能，以及免疫细胞间的接触(S Schellenburg等，Mol Immunol.2017)。NRP2和Plexin形成的共受体对淋巴管内皮细胞的迁移具有反趋化作用(Liu X等，Cell Rep.2016)。NRP2还可调控细胞的NFKB信号通路，见(Rizzolio,S.等.Cancer Research.2017)等报道。既往已经被发现的NRP2配体包括Semaphorin家族成员，但其它类型的配体未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种调节免疫反应和抑制肿瘤的方法，以及ITPRIPL1的调节剂在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物中的用途。
为了达到上述目的，本发明提供了ITPRIPL1的调节剂在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物中的用途，所述的调节剂用于提高或降低机体的ITPRIPL1基因或蛋白的表达或功能。
优选地，所述的调节剂包含以下任意一种：
(1)使细胞内ITPRIPL1基因被敲除或突变的基因编辑系统；
(2)降低ITPRIPL1基因表达水平的RNA分子；
(3)用于导入细胞内的核酸分子，所述核酸分子编码ITPRIPL1并提高ITPRIPL1的表达量；
(4)分离的ITPRIPL1重组蛋白；
(5)识别并结合ITPRIPL1的抗体。
优选地，所述的基因编辑系统为CRISPR/Cas9基因编辑系统；用于所述CRISPR/Cas9基因编辑系统的靶序列选自SEQ ID NO:11-13所示的任意一条序列，用于编码sgRNA的寡聚DNA序列选自SEQ ID NO:14-19；所述的核酸分子包含：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示的序列；所述的ITPRIPL1重组蛋白包含：ITPRIPL1蛋白胞外区中能够结合CD3ε或NRP2蛋白的功能片段；所述的识别并结合ITPRIPL1的抗体为多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体、抗原结合结构域、双特异性抗体、多特异性抗体，或嵌合抗原受体中的抗原结合部。
优选地，所述的功能片段的序列选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4中任意一条，或为其衍生序列，衍生方法包括：将一个以上的氨基酸进行替换、删除或插入但并未改变序列的功能。
优选地，所述的ITPRIPL1重组蛋白与抗体恒定区形成融合蛋白(如SEQ ID NOs:5-7所示)或与凝血因子形成融合蛋白；或者，对所述的ITPRIPL1重组蛋白进行修饰，修饰的方式包括：聚乙二醇修饰、糖基化修饰、多聚唾液酸修饰、脂肪酸修饰、KLH修饰、生物素修饰。
优选地，通过药物传递系统将所述的核酸分子导入细胞内，所述的药物传递系统包括：重组表达载体、病毒、脂质体或纳米材料。
优选地，所述的调节免疫反应包括：在自身免疫反应、抑制移植排斥免疫反应、过敏反应、抗感染免疫反应、抗肿瘤免疫反应的过程中，抗原递呈细胞和T淋巴细胞的功能的调节。
优选地，所述的免疫反应包括：I型糖尿病、免疫性不孕不育、器官移植后排斥反应、过敏反应、全身炎症或细胞因子风暴、感染。
优选地，所述的肿瘤为实体瘤或血液系统肿瘤；所述的实体瘤包括：胶质瘤、肺癌、头颈部癌、胃癌、结直肠癌、甲状腺癌、食管癌、尿路上皮癌、睾丸癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌，黑色素瘤、胰腺癌或肝癌；所述的血液系统肿瘤包括：白血病或淋巴瘤。
本发明还提供了一种药物组合物，其包含上述的用途中采用的调节剂，以及药学上可接受的载体。
本发明还提供了一种分离的ITPRIPL1重组蛋白，所述的重组蛋白为ITPRIPL1蛋白胞外区中能够结合CD3ε或NRP2蛋白的功能片段。
本发明还提供了一种识别并结合ITPRIPL1的抗体，所述的抗体识别并结合ITPRIPL1蛋白的胞外区。
本发明还提供了一种用于鉴定上述的抗体的方法，通过检测受试抗体的以下一种或多种性质：特异性结合ITPRIPL1蛋白的能力；对ITPRIPL1与CD3ε结合的影响；对ITPRIPL1与NRP2结合的影响；对免疫细胞或肿瘤细胞功能的影响。
本发明还提供了分离的ITPRIPL1重组蛋白的应用，其用于检测自身抗ITPRIPL1抗体的存在，其中检测的主要步骤包括将所述的ITPRIPL1重组蛋白与受试者的血液样本直接接触，以及洗涤去除非特异性结合。
本发明还提供了上述的抗体用于检测ITPRIPL1在样本中的含量的应用，识别并结合ITPRIPL1的抗体用于判断细胞、组织、器官或个体内ITPRIPL1的表达，或用于判断是否适合施用本发明的通过靶向ITPRIPL1调节免疫反应和抑制肿瘤的方法。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一种调节免疫反应和抑制肿瘤的方法，通过调控ITPRIPL1基因的表达或功能实现上述目的。本发明基于新的科学发现，即ITPRIPL1蛋白结合CD3ε与NRP2受体调节不同免疫细胞的功能，进而参与免疫反应的调节和肿瘤的免疫逃逸过程。本发明证实ITPRIPL1的调节剂可用于制备药物或药物组合物，在抑制肿瘤、自身免疫性疾病、移植排斥反应、过敏和感染等疾病方面具有应用前景。
附图说明
图1为实施例1的质粒构建结果。
图2为实施例1的免疫共沉淀实验结果。
图3为实施例1的外源表达的ITPRIPL1与CD3E在细胞内共定位的结果图。
图4为实施例2的表达ITPRIPL1胞外区受体结合结构域的表达载体构建结果。
图5为实施例2的免疫共沉淀实验结果。
图6示出实施例2的免疫荧光及共定位分析ITPRIPL1胞外区和CD3胞外区具有反式结合的实验结果。
图7为实施例3的ITPRIPL1-RBD重组蛋白(IT1-RBD蛋白)凝胶电泳后考马斯亮蓝染色结果。
图8为实施例4的ELISA实验结果。
图9和图10为实施例5中流式细胞术证明ITPRIPL1的胞外区纯化蛋白片段结合高表达CD3的Jurkat细胞的结果图，其中，图9的(a)为不划入死亡细胞的阈值设定，图9的(b)反映Jurkat细胞与不同浓度的ITPRIPL1胞外区纯化蛋白片段的结合情况。图10则为图9的(b)中各条件下具体染色及蛋白结合情况。
图11和图12为实施例5中流式细胞术证明ITPRIPL1蛋白以更高的效率结合过表达CD3的细胞的结果图，其中，图11的(a)为不划入死亡细胞的阈值设定，图11的(b)反映CD3ε表达情况不同的细胞与不同浓度ITPRIPL1重组蛋白的结合情况。图12则为图11的(b)中各条件下具体染色及蛋白结合情况。
图13和图14为实施例5中流式细胞术证明CD3以更高效率结合过表达ITPRIPL1的细胞的结果图，其中，图13的(a)为不划入死亡细胞的阈值设定，图13的(b)反映ITPRIPL1表达情况不同的细胞与CD3ε蛋白的结合情况。图14则分别为图13的(b)中各条件下具体染色及蛋白结合情况。
图15为实施例5中50微克每毫升ConA激活的条件下，随ITPRIPL1蛋白浓度变化的NFKB信号变化的结果图。
图16为实施例5中50微克每毫升ConA激活的条件下，随微球包被ITPRIPL1蛋白浓度变化的NFKB信号变化的结果图。
图17为免疫印迹法中GAPDH内参调齐后的不同类型的肿瘤细胞的ITPRIPL1的表达情况。
图18示出ITPRIPL1在正常组织、肿瘤组织中的mRNA表达水平。
图19为实施例6中酶联免疫吸附剂测定证明多克隆抗体能与表达ITPRIPL1的细胞结合的结果图。
图20为实施例6中酶联免疫吸附剂测定证明多克隆抗体能阻断ITPRIPL1与CD3E结合的结果图。
图21和图22为实施例6中流式细胞术证明多克隆抗体能阻断ITPRIPL1与过表达CD3ε的细胞的结合的结果图，其中，图21的(a)为不划入死亡细胞的阈值设定。图21的(b)反映多克隆抗体浓度变化时ITPRIPL1与CD3ε结合情况变化。图22则为图21的(b)中各条件下具体染色及蛋白结合情况。
图23为实施例7中萤光素报告实验证明过表达ITPRIPL1的HCT116细胞能更多地降低Jurkat-dual细胞NFKB增殖信号的结果图。
图24为实施例7中萤光素报告实验证明CD3E蛋白可以阻断ITPRIPL1蛋白对Jurkat-dual细胞NFKB增殖信号的抑制的结果图。
图25和图26为实施例8中流式细胞术证明ITPRIPL1-RBD重组蛋白可降低人外周血单核细胞(PBMC)对肾脏来源的H3K293细胞的杀伤的结果图，其中，图25的(a)和(b)表示依据CD45来划分293E细胞。图25的(c)为不同ITPRIPL1蛋白浓度条件下依据各组凋亡数据所计算出的PBMC相对杀伤活性。图26为图25的(c)中各条件下具体凋亡染色情况。
图27和图28为实施例9中流式细胞术证明ITPRIPL1过表达能降低PBMC对于肿瘤细胞的杀伤而敲除ITPRIPL1能促进PBMC对于肿瘤细胞的杀伤的结果图，其中，图27的(a)和(b)表示依据CD45来划分HCT116细胞。图27的(c)为不同多克隆抗体浓度条件下依据各组凋亡数据所计算出的PBMC相对杀伤活性。图28为图27的(c)中各条件下具体凋亡染色情况。
图29和图30为实施例10中流式细胞术证明ITPRIPL1多克隆抗体能促进PBMC对于肿瘤细胞的杀伤的结果图。图29的(a)和(b)表示依据CD45来划分HCT116细胞。图29的(c)为不同多克隆抗体浓度条件下依据各组凋亡数据所计算出的PBMC相对杀伤活性。图30为图29的(c)中各条件下具体凋亡染色情况。
图31为实施例11的免疫共沉淀实验结果。
图32为实施例12的酶联免疫吸附实验结果图。
图33和图34为实施例12的流式细胞术证明NRP2以更高效率结合过表达ITPRIPL1的细胞的实验结果。其中，图33的(a)为不划入死亡细胞的阈值设定。图33的(b)反映ITPRIPL1表达情况不同的细胞与NRP2蛋白的结合情况，图34则分别为图33的(b)中各条件下具体染色及蛋白结合情况。
图35为实施例13的萤光素报告实验结果。
图36为实施例14的萤光素报告实验结果。
图37和图38为实施例14中的流式细胞术证明纯化得到的IT1-RBD1-Fc重组蛋白可降低人外周血单核细胞(PBMC)对肾脏来源的H3K293细胞的杀伤的结果图，其中，图37的(a)表示依据CD45来划分293E细胞。图37的(b)为不同ITPRIPL1表达与不同蛋白条件下依据各组凋亡数据所计算出的PBMC相对杀伤活性，图38为图37的(b)中各条件下具体凋亡染色情况。
图39为实施例14的免疫印迹法实验结果。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
本发明首次揭示，ITPRIPL1的胞外区结合CD3ε胞外区和NRP2胞外区，并公开了ITPRIPL1结合CD3ε和NRP2后分别对T细胞和抗原递呈细胞产生的调节作用。基于新的科学发现，本发明公开了一种通过靶向ITPRIPL1调节免疫反应和抑制肿瘤的方法，并揭示ITPRIPL1的调节剂在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物中的用途。具体地，本发明提供了对ITPRIPL1基因编辑的方法，以及将遗传物质导入细胞以调节ITPRIPL1表达的方法。本发明进一步公开了ITPRIPL1的受体结合域(RBD)并提供了制备ITPRIPL1-RBD分离蛋白的方案，演示了用ITPRIPL1-RBD结合CD3ε和NRP2从而调节免疫细胞功能的方法。再进一步地，本发明示例了制备ITPRIPL1抗体的方法，并证明上述抗体可以增强免疫细胞的抗肿瘤作用。本发明公开的通过靶向ITPRIPL1以调节免疫反应和抑制肿瘤的方法，显示了ITPRIPL1在治疗肿瘤、自身免疫疾病、移植排斥反应、过敏反应、感染等疾病中的靶点价值。
既往未见报到关于ITPRIPL1基因功能的报道，本发明公开了ITPRIPL1作为CD3ε新鉴定的配体(实施例1)，阐明ITPRIPL1胞外区受体结合域(RBD)为第25-103氨基酸(实施例2)，在此基础上制备了具有调节CD3ε和T细胞功能的分离重组蛋白(实施例3)。本发明还公开了上述分离蛋白的制备、用途和施用方法。
进一步地，本发明公开了分离的ITPRIPL1-RBD蛋白结合CD3ε的能力(实施例4)，分别利用酶联免疫吸附试验(ELISA)、流式细胞术等实验方法证明了ITPRIPL1-RBD分离蛋白能够结合CD3ε胞外区。
由于ITPRIPL1-RBD(序列见SEQ ID NO:1)是结合CD3ε的关键区域，通过重组表达的方式可制备分离的ITPRIPL1-RBD蛋白，可用于结合细胞表面的CD3ε蛋白，并向T细胞内传递抑制性信号(实施例5)，因此该分离的ITPRIPL1-RBD蛋白可用于调节T细胞的功能。虽然本发明提供了序列为SEQ ID NO:1的分离蛋白在结合CD3ε、调节T细胞和和制备中和抗体方面的作用，通过本领域技术人员容易实施的、非创造性的衍生(如截短、插入、突变或融合等)方法而得到的其他具有类似功能的蛋白序列，亦在本发明主张的权利范围内。
本发明公开了分离的ITPRIPL1-RBD作为免疫原制备中和性抗体的应用(实施例6)。在ITPRIPL1作为CD3ε的配体未被揭示的情况下，本领域的技术人员无法有目的地制备用于阻断ITPRIPL1和CD3结合的抗体。本发明揭示了CD3ε和ITPRIPL1这对受体配体的存在，定义了ITPRIPL1结合CD3的关键结构，并提供了ITPRIPL1-RBD分离蛋白的制备方法，这使得制备用于阻断ITPRIPL1和CD3结合的抗体成为本领域人员通过常规技术(例如杂交瘤、噬菌体展示等技术)容易实现的目标。因此，以ITPRIPL1胞外区片段作为免疫原制备得到的阻断性抗体，亦在本申请专利的权利要求范围内。
本发明还揭示，通过调节ITPRIPL1-RBD和CD3胞外区的结合来调节T细胞来源的细胞株的增殖信号通路激活(实施例7)。
本发明揭示，ITPRIPL1-RBD重组蛋白可降低人外周血单核细胞(PBMC)对肾脏来源的H3K293细胞的杀伤(实施例8)，据此提出靶向ITPRIPL1在抑制自身免疫方面的应用，以及在制备治疗自身免疫、移植排斥反应、过敏、感染等疾病的药物组合物的应用价值。
本发明揭示，降低肿瘤细胞表达的ITPRIPL1可显著增加人外周血单核细胞对肿瘤细胞的杀伤(实施例9)，支持ITPRIPL1在肿瘤的免疫逃逸中扮演的角色，据此提出了ITPRIPL1作为肿瘤免疫治疗靶点的重要价值。
本发明还揭示，以ITPRIPL1-RBD蛋白作为免疫原制备的抗体，有效地促进了免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤(实施例10)。这验证了ITPRIPL1作为肿瘤免疫治疗靶点的重要价值，并建立了以抗体阻断ITPRIPL1和CD3结合的方法。所述抗体代表一类具有全新功能的抗体，即具有识别ITPRIPL1并阻断其与CD3ε的结合，从而调节T细胞功能的抗体。
进一步地，本发明比较了不同长度的ITPRIPL1胞外区片段，证明ITPRIPL1-RBD2序列具有与CD3ε结合的能力但稍有降低，而ITPRIPL1-RBD3结合CD3的能力显著降低，因此揭示了ITPRIPL1胞外区的长度和CD3ε结合能力的正向相关性，表征了具备功能的ITPRIPL1胞外区序列的基本特性(实施例11)。
本发明揭示了ITPRIPL1-RBD蛋白具有结合NRP2的能力(实施例12)。且分离的ITPRIPL1-RBD蛋白具有向表达NRP2蛋白的分化THP1巨噬细胞传递抑制信号的能力(实施例13)。同时，纯化得到的IT1-RBD-Fc蛋白具有抑制T细胞信号与杀伤的功能(实施例14)。
本发明采用的序列列表如下：
表1
实施例1：ITPRIPL1作为CD3ε新鉴定的配体
1.构建表达质粒
基于已公开序列(NCBI参考序列NM_001008949.3)通过合成全长人类ITPRIPL1的cDNA，以pcDNA3.1为载体，其中C末端融合至Flag标签，从而产生含有Flag标签的ITPRIPL1质粒。质粒构建结果如图1所示。图1的(a)是载体克隆结构示意图，图1的(b)是基因表达载体质粒被EcoRI/XhoI酶切后DNA凝胶电泳图，所得片段大小符合预期，图1的(c)为载体测序验证结果的部分截取。
2.免疫共沉淀及免疫印迹法分析结果表明ITPRIPL1与CD3结合。
将含有Flag标签的ITPRIPL1(或空载)，以及HA标签的CD3ε的pcDNA3.1质粒共转染至HCT116细胞(ATCC，VA，美国)中，置于六孔板(康宁，NY，美国)培养48-72小时至蛋白充分表达后，用1：100免疫沉淀裂解液(赛默飞，MA，美国)与蛋白酶、磷酸酶、PMSF三联(康臣，上海，中国)混合裂解液裂解并刮取细胞，一部分细胞样本经离心、上样缓冲液(碧云天，上海，中国)混合及100摄氏度金属浴变性后制得输入量蛋白样本；剩余细胞样本用Flag标签特异性鼠抗体(CST，MA，美国)进行免疫沉淀，经PBS清洗、上样缓冲液(碧云天，上海，中国)混合及100摄氏度金属浴变性后制得免疫沉淀蛋白样品。再按照说明书于胶板(伯乐，CA，美国)中配置12.5％PAGE凝胶(雅酶，上海，中国)，将配置好的胶置于电泳槽(伯乐，CA，美国)中，接好电源(伯乐，CA，美国)以80伏恒压的条件让条带跑完浓缩胶，以120伏恒压的条件跑完分离胶。待条带跑至分离胶底部时，运用湿法转膜，转膜槽(伯乐，CA，美国)350毫安恒流90分钟转膜。待转膜完成后，以ITPRIPL1-Flag和CD3ε-HA蛋白的质量大小进行剪膜处理。用快速封闭液(雅酶，上海，中国)封闭十分钟，用Flag标签特异性兔抗体(Abcam，MA，美国)和HA标签特异性兔抗体(CST，MA，美国)分别孵育ITPRIPL1-Flag与CD3ε-HA相应条带，4℃过夜。次日经TBST清洗后，用溶于TBS的5％脱脂牛奶(生工，上海，中国)稀释的特异性抗兔二抗(康臣，上海，中国)室温孵育一小时，经TBST清洗后，置于混合发光液(圣尔，上海，中国)中一分钟，于凝胶成像仪(伯乐，CA，美国)下曝光。
如图2示出了免疫共沉淀实验结果。图2的(a)和(b)分别显示用于免疫共沉淀的输入蛋白中ITPRIPL1和CD3ε的含量即输入量，图2的(c)显示直接沉淀的ITPRIPL1，图2的(d)显示间接被沉淀的、与ITPRIPL1结合的CD3ε。免疫共沉淀实验结果表明ITPRIPL1与CD3结合。
3.免疫荧光及共定位分析表明ITPRIPL1与CD3具有显著共定位。
将含有Flag标签的ITPRIPL1(或空载)和HA标签的CD3ε的pcDNA3.1质粒共转染至HCT116细胞(ATCC，VA，美国)中，置于八孔载玻片(赛默飞，MA，美国)培养30小时至蛋白充分表达后弃去培养液，PBS清洗后4％多聚甲醛固定二十分钟，PBS再次清洗后透膜封闭液封闭一小时，然后加入透膜封闭液稀释的Flag标签特异性鼠抗体(CST，MA，美国)与HA标签特异性兔抗体(CST，MA，美国)4℃孵育过夜。PBS清洗过夜后的八孔载玻片，加入PBS稀释的AlexaFluor 488荧光特异性抗鼠抗体(Invitrogen，CA，美国)与Alexa Fluor 594荧光特异性抗兔抗体(Invitrogen，CA，美国)室温孵育二十分钟，PBS清洗后DAPI封片，待封片剂干燥后置于荧光显微镜下观察。
图3示出了外源表达的ITPRIPL1与CD3ε在细胞内的显著共定位。图3的(a)是ITPRIPL1的定位模式；(b)是CD3ε蛋白的定位模式；(c)是两种颜色的蛋白定位模式相叠加，其中白色的直线路径上ITPRIPL1和CD3ε的荧光强度在图3的(d)显示。由以上结果可以观察到两种蛋白的定位具有显著的相关性，支持两种蛋白的相互结合。
实施例2：ITPRIPL1胞外区受体结合域(RBD)为第25-103氨基酸
1.构建表达质粒
基于已公开序列(NCBI参考序列NM_001008949.3)，分别选中其中胞外区(25-103氨基酸)、胞外区和跨膜区(25-124氨基酸)、跨膜区和胞内区(104-555氨基酸)为三段不同的目标序列，合成全长人类ITPRIPL1，以pcDNA3.1为载体，其中胞外区、胞外区和跨膜区C末端融合至Flag标签与绿色荧光蛋白(GFP)，跨膜区和胞内区N末端融合至Flag标签与绿色荧光蛋白(GFP)，从而产生含有Flag标签与绿色荧光蛋白(GFP)的ITPRIPL1胞外区、胞外区和跨膜区、跨膜区和胞内区质粒。其中，ITPRIPL1(25-103)即CD3结合结构域的表达载体构建结果如图4所示。图4的(a)是载体质粒构建图谱，将编码ITPRIPL1(25-103)氨基酸片段的cDNA在所及末端链接编码Flag标签的cDNA，插入pEGFP-C1(上海捷瑞公司)，该载体表达产物带有GFP荧光标记，但其主要功能产物是ITPRIPL1(25-103)即CD3结合片段。图4的(b)是基因表达载体质粒被EcoRI/XhoI酶切后DNA凝胶电泳图，所得片段大小符合预期，图4的(c)为测序结果峰图的截图。
2.免疫共沉淀实验结果表明ITPRIPL1的胞外区(而非胞内区或跨膜区)与CD3ε结合。
将含有Flag标签的ITPRIPL1胞外区、胞外区和跨膜区、胞内区和跨膜区与HA标签的CD3ε的pcDNA3.1质粒分别共转染至HCT116细胞(ATCC，VA，美国)中，置于六孔板(康宁，NY，美国)培养48-72小时至蛋白充分表达后，用1：100免疫沉淀裂解液(赛默飞，MA，美国)与蛋白酶、磷酸酶、PMSF三联(康臣，上海，中国)混合裂解液裂解并刮取细胞，一部分细胞样本经离心、上样缓冲液(碧云天，上海，中国)混合及100摄氏度金属浴变性后制得输入量蛋白样本；剩余细胞样本用Flag标签特异性鼠抗体(CST，MA，美国)进行免疫沉淀，经PBS清洗、上样缓冲液(碧云天，上海，中国)混合及100摄氏度金属浴变性后制得免疫沉淀蛋白样品。再按照说明书于胶板(伯乐，CA，美国)中配置12.5％PAGE凝胶(雅酶，上海，中国)，将配置好的胶置于电泳槽(伯乐，CA，美国)中，接好电源(伯乐，CA，美国)以80伏恒压的条件让条带跑完浓缩胶，以120伏恒压的条件跑完分离胶。待条带跑至分离胶底部时，运用湿法转膜，转膜槽(伯乐，CA，美国)350毫安恒流90分钟转膜。待转膜完成后，以ITPRIPL1胞外区、胞外区和跨膜区、胞内区和跨膜区-Flag与CD3ε-HA蛋白的质量大小进行剪膜处理。用快速封闭液(雅酶，上海，中国)封闭十分钟，用Flag标签特异性兔抗体(Abcam，MA，美国)和HA标签特异性兔抗体(CST，MA，美国)分别孵育ITPRIPL1-Flag与CD3ε-HA相应条带，4℃过夜。次日经TBST清洗后，用5％溶于TBS的脱脂奶粉(生工，上海，中国)稀释的特异性抗兔二抗(康臣，上海，中国)室温孵育一小时，经TBST清洗后，置于混合发光液(圣尔，上海，中国)中一分钟，于凝胶成像仪(伯乐，CA，美国)下曝光。
图5为免疫共沉淀实验结果。如图5所示，图5的(a)显示了Flag抗体检测到的输入量蛋白中ITPRIPL1的含量，而图5的(b)显示了输入蛋白量中CD3ε的含量。图5的(c)显示了直接沉淀的ITPRIPL1不同的突变体，而图5的(d)显示了相应被间接沉淀(因与ITPRIPL1突变体结合)的CD3ε。上述结果表明，ITPRIPL1的胞外区(而不是胞内区或跨膜区)存在的情况下，CD3ε和ITPRIPL1保持结合状态。因此ITPRIPL1的胞外区结合了CD3ε，符合CD3ε的配体ITPRIPL1其胞外区受体结合域(RBD)为第25-103氨基酸的结论。
3.免疫荧光及共定位分析表明ITPRIPL1胞外区和CD3胞外区具有反式结合。
将HA标签的CD3ε转染HCT116细胞；另外单独将Flag标签的ITPRIPL1(胞外区与跨膜区)-绿色荧光蛋白的pcDNA3.1质粒转染另一批HCT116；最后将两次分别转染的细胞共同培养，以免疫荧光双染色法确定两种蛋白的定位模式。具体步骤如下：将含有HA标签的CD3ε的pcDNA3.1质粒转染一批HCT116细胞(ATCC，VA，美国)；另外单独将含有Flag标签的ITPRIPL1(胞外区与跨膜区)-绿色荧光蛋白的pcDNA3.1质粒转染另一批HCT116细胞(ATCC，VA，美国)；转染20小时后用胰酶将细胞各自消化，混合并充分重悬混匀，铺板至八孔载玻片(赛默飞，MA，美国)，继续培养10小时。弃去培养液，PBS清洗后4％多聚甲醛固定二十分钟，PBS再次清洗后透膜封闭液封闭一小时，然后加入透膜封闭液稀释的HA标签特异性兔抗体(CST，MA，美国)4℃孵育过夜。PBS清洗过夜后的八孔载玻片，加入PBS稀释的Alexa Fluor594荧光特异性抗兔抗体(Invitrogen，CA，美国)室温孵育二十分钟，PBS清洗后DAPI封片，待封片剂干燥后置于荧光显微镜下观察。以免疫荧光双染色法确定两种蛋白的定位模式。
如图6所示，图6的(a)显示ITPRIPL1和CD3ε染色重叠的图像，图6的(b)和(c)分别显示了ITPRIPL1受体结合区域(ITPRIPL1-RBD)以及CD3ε的染色结果。图6的(d)是通过ImageJ软件包的共定位分析模块进行分析，得到的两种蛋白共定位的区域。其中白色的直线路径上ITPRIPL1和CD3ε的荧光强度在图6的(e)显示。可见在两个细胞交界处，ITP-RBD(绿色荧光)和CD3ε(红色荧光)的信号都有明显的集中和强化，这支持两种蛋白的胞外区在细胞表面反式结合。
实施例3：具有调节CD3ε和T细胞功能的ITPRIPL1-RBD分离重组蛋白的制备
基于已公开序列(NCBI参考序列NP_001008949.1)通过Cusabio(武汉，中国)合成人类ITPRIPL1胞外区(25-103氨基酸)重组蛋白，通过酵母表达并提纯蛋白，其中C末端融合至6x-His与Myc标签，从而产生含有6x-His与Myc标签的ITPRIPL1-RBD重组蛋白。
如图7所示，为ITPRIPL1-RBD重组蛋白凝胶电泳后考马斯亮蓝染色结果，提示其分子量和纯度符合预期。
实施例4：刀豆蛋白A(ConA)与分离的ITPRIPL1-RBD蛋白分别具有结合CD3ε的能力
酶联免疫吸附剂测定(ELISA)证实刀豆蛋白A(ConA)与分离的ITPRIPL1胞外区片段分别与CD3ε胞外区存在浓度依赖的直接结合。使用ELISA专用板(costar，ME，美国)。首先用0.5/1/2/4微克每毫升的ConA或0.03125/0.0625/0.125/0.25/0.5/1/2微克每毫升的ITPRIPL1-RBD重组蛋白各溶于100微升ELISA包被液(Solarbio，北京，中国)包板，阴性对照采用不含蛋白的100微升包被液包板。四度包被过夜。PBST清洗后用100微升5％溶于PBS的BSA(VWR，PA，美国)进行封闭，温箱37度封闭90分钟。PBST清洗后，再以用1微克每毫升CD3ε胞外区蛋白质片段(义翘神州，北京，中国)进行孵育结合，该CD3ε(Met1-Asp126)蛋白带有hFc标签，温箱37度结合60分钟。PBST清洗后，用PBS稀释的特异性抗人Fc段抗体(Abcam，MA，美国)进行孵育结合，温箱37度结合30分钟。PBST清洗后，配置显色液(生工，上海，中国)，每孔100微升，置于温箱反应5-30分钟，再予以50微升终止液(生工，上海，中国)，置于酶标仪(赛默飞，MA，美国)下450nm显色读数。
图8为ELISA实验结果。实验表明，刀豆蛋白A(ConA)和分离的ITPRIPL1的胞外区纯化蛋白(IT1-RBD)分别与CD3胞外区纯化蛋白存在浓度依赖的直接结合，且IT1-RBD的结合强度大于ConA。上述结果证明刀豆蛋白A(ConA)与分离的ITPRIPL1的胞外区纯化蛋白(IT1-RBD)分别与CD3ε胞外区纯化蛋白直接结合，且IT1-RBD的结合强度大于ConA。
实施例5：分离的ITPRIPL1-RBD蛋白可用于结合细胞表面的CD3ε蛋白，并向T细胞内传递抑制性信号
1.构建HCT116-ITPRIPL1与HCT116-CD3ε稳转株细胞
将构建的全长ITPRIPL1-Flag质粒与CD3ε-HA质粒以及空载pcDNA3.1质粒分别转染至HCT116细胞(ATCC，VA，美国)，置于培养箱中培养24-48小时后，加入1000微克每毫升的遗传霉素(Geneticin，G418)(Gibco，CA，美国)进行筛选，10-14天后至空载pcDNA3.1质粒转染组细胞全部死亡后，即得HCT116-ITPRIPL1与HCT116-CD3ε稳转株细胞。
2.流式细胞术证明ITPRIPL1的胞外区纯化蛋白片段结合高表达CD3的Jurkat细胞。
将培养的Jurkat细胞(ATCC，VA，美国)计数，调整细胞数为2x105每毫升，分别加入200微升至6支1.5ml EP管(Axygen，CA,美国)中。向其中4支EP管中分别加入0.1微克、0.2微克、0.4微克、0.8微克ITPRIPL1-RBD-6x-His重组蛋白(IT1-6x-His蛋白)使其浓度为0.5微克每毫升、1微克每毫升、2微克每毫升、4微克每毫升。将所有EP管置于细胞培养箱中，静置30分钟，而后取出EP管，400rcf离心5分钟后弃去上清。用500微升细胞染色缓冲液(Invitrogen，CA，美国)重悬洗涤细胞，400rcf离心5分钟后再次弃去上清并重复洗涤。用细胞染色缓冲液按1:500稀释6x-His-FITC抗体(Abcam，MA，美国)，除阴性对照外，每支EP管中加入200微升抗体稀释液，室温下摇床上40rpm孵育30分钟。而后取出EP管，400rcf离心5分钟后弃去上清。用1000微升细胞染色缓冲液重悬洗涤细胞，400rcf离心5分钟后再次弃去上清并重复洗涤。洗涤完成后，各EP管加入300微升细胞染色缓冲液重悬，转移至流式管(Falcon，NY，美国)中，进行上机分析(美天旎，科隆，德国)。
图9的(a)为不划入死亡细胞的阈值设定。图9的(b)反映Jurkat细胞与不同浓度的ITPRIPL1胞外区纯化蛋白片段的结合情况。图10则为图9的(b)中各条件下具体染色及蛋白结合情况。上述结果表明ITPRIPL1胞外区纯化蛋白片段可与高表达CD3的Jurkat细胞结合。
3.流式细胞术证明ITPRIPL1蛋白以更高的效率结合过表达CD3的细胞。
将培养的HCT116野生型细胞(ATCC，VA，美国)与HCT116-CD3ε稳转株细胞消化后计数，分别调整细胞数为2x105每毫升，加入200微升分别至5支与3支1.5ml EP管(Axygen，CA,美国)。向HCT116野生细胞中3支EP管和HCT116-CD3ε稳转株细胞的3支EP管中各自分别加入0.2微克、0.4微克、0.8微克ITPRIPL1-RBD-6x-His重组蛋白使其浓度为1微克每毫升、2微克每毫升、4微克每毫升。将所有EP管置于细胞培养箱中，静置30分钟，而后取出EP管，400rcf离心5分钟后弃去上清。用500微升细胞染色缓冲液(Invitrogen，CA，美国)重悬洗涤细胞，400rcf离心5分钟后再次弃去上清并重复洗涤。用细胞染色缓冲液按1:500稀释6x-His-FITC抗体(Abcam，MA，美国)，除阴性对照外，每支EP管中加入200微升抗体稀释液，室温下摇床上40rpm孵育30分钟。而后取出EP管，400rcf离心5分钟后弃去上清。用1000微升细胞染色缓冲液重悬洗涤细胞，400rcf离心5分钟后再次弃去上清并重复洗涤。洗涤完成后，各EP管加入300微升细胞染色缓冲液重悬，转移至流式管(Falcon，NY，美国)中，进行上机分析(美天旎，科隆，德国)。
图11的(a)为不划入死亡细胞的阈值设定。图11的(b)反映CD3ε表达情况不同的细胞与不同浓度ITPRIPL1重组蛋白的结合情况。图12则为图11的(b)中各条件下具体染色及蛋白结合情况。上述结果表明ITPRIPL1胞外区纯化蛋白片段可与过表达CD3的HCT116细胞结合而不与不表达CD3的HCT116细胞结合。
4.流式细胞术证明CD3以更高效率结合过表达ITPRIPL1的细胞。
将培养的HCT116野生型细胞(ATCC，VA，美国)与HCT116-ITPRIPL1稳转株细胞消化后计数，分别调整细胞数为2x105每毫升，加入200微升分别至3支与1支1.5ml EP管(Axygen，CA,美国)。向HCT116野生细胞中1支EP管和HCT116-ITPRIPL1稳转株细胞的EP管中加入0.4微克CD3E-人Fc蛋白(义翘神州，北京，中国)使其浓度为2微克每毫升。将所有EP管置于细胞培养箱中，静置30分钟，而后取出EP管，400rcf离心5分钟后弃去上清。用500微升细胞染色缓冲液(Invitrogen，CA，美国)重悬洗涤细胞，400rcf离心5分钟后再次弃去上清并重复洗涤。用细胞染色缓冲液按1:1000稀释抗人IgG Alexa Fluor 647抗体(Invitrogen，CA，美国)，除阴性对照外，每支EP管中加入200微升抗体稀释液，室温下摇床上40rpm孵育30分钟。而后取出EP管，400rcf离心5分钟后弃去上清。用1000微升细胞染色缓冲液重悬洗涤细胞，400rcf离心5分钟后再次弃去上清并重复洗涤。洗涤完成后，各EP管加入300微升细胞染色缓冲液重悬，转移至流式管(Falcon，NY，美国)中，进行上机分析(美天旎，科隆，德国)。
图13的(a)为不划入死亡细胞的阈值设定。图13的(b)反映ITPRIPL1表达情况不同的细胞与CD3ε蛋白的结合情况。图14则分别为图13的(b)中各条件下具体染色及蛋白结合情况。上述结果表明CD3ε能与表达ITPRIPL1的HCT116结合，并能更强地结合过表达ITPRIPL1的HCT116细胞。
5.萤光素报告实验证明ITPRIPL1的胞外区纯化蛋白片段抑制ConA激活的Jurkat-dual细胞NFKB增殖信号。
将培养的Jurkat-dual细胞(Invivogen，CA，美国)计数，1000rpm x5分钟离心后用不含抗生素的IMDM培养基(Gibco，CA，美国)重悬调整细胞数为2x106每毫升，透明96孔板(赛默飞，MA，美国)中每孔加入200微升细胞。各孔分别加入0.2微克、0.4微克、0.8微克ITPRIPL1-6x-His重组蛋白使其浓度为1微克每毫升、2微克每毫升、4微克每毫升。置于细胞培养箱中反应两小时后，各孔加入10微克每毫升刀豆蛋白A(ConA)(阿拉丁，上海，中国)，置于细胞培养箱中反应18-24小时。反应完成后，取不透明96孔板(costar，ME，美国)，各孔加入50微升Quanti-luc试剂(Invivogen，CA，美国)与20微升反应混合液，加入混匀后用多功能酶标仪(赛默飞，MA，美国)立即检测信号。
如图15所示，在10微克每毫升ConA激活的条件下，随ITPRIPL1蛋白浓度变化的NFKB信号变化。上述结果表明ITPRIPL1-RBD的纯化重组蛋白能抑制ConA激活的Jurkat-dual细胞的NFKB增殖信号，并呈浓度依赖性。
6.萤光素报告实验证明固定在微球表面的ITPRIPL1的胞外区纯化蛋白片段抑制ConA激活的Jurkat-dual细胞NFKB增殖信号。
将蛋白G磁性微球(赛默飞，MA，美国)与His抗体(Abcam，MA，美国)置于4支EP管(Axygen，CA,美国)中，放入DNA混合仪(新芝，宁波，中国)最低速室温旋转1小时。向其中3支EP管加入0.2微克、0.4微克、0.8微克ITPRIPL1-6x-His重组蛋白，再次最低速室温旋转1小时。培养的Jurkat-dual细胞(Invivogen，CA，美国)计数，1000rpm x5分钟离心后用不含抗生素的IMDM培养基(Gibco，CA，美国)重悬调整细胞数为2x106每毫升，透明96孔板(赛默飞，MA，美国)中每孔加入200微升细胞。各孔分别加入各EP管内容物使包被蛋白浓度为1微克每毫升、2微克每毫升、4微克每毫升。置于细胞培养箱中反应两小时后，各孔加入50微克每毫升刀豆蛋白A(ConA)(阿拉丁，上海，中国)，置于细胞培养箱中反应18-24小时。反应完成后，取不透明96孔板(costar，ME，美国)，各孔加入50微升Quanti-luc试剂(Invivogen，CA，美国)与20微升反应混合液，加入混匀后用多功能酶标仪(赛默飞，MA，美国)立即检测信号。
如图16所示，在50微克每毫升ConA激活的条件下，随微球包被ITPRIPL1蛋白浓度变化的NFKB信号变化。上述结果表明固定于微球表面的ITPRIPL1-RBD纯化重组蛋白能抑制ConA激活的Jurkat-dual细胞的NFKB增殖信号，并呈浓度依赖性。
7.检测ITPRIPL1在不同类型的肿瘤细胞中表达的水平
由于ITPRIPL1的胞外区具有抑制免疫细胞(例如T细胞)的功能，因此肿瘤细胞可能表达ITPRIPL1以逃避免疫系统的监视和杀伤。如果多种肿瘤细胞异常表达ITPRIPL1，则提示ITPRIPL1可能对于肿瘤的发生和发展(包括免疫逃逸)起到促进作用。本发明揭示ITPRIPL1在来自不同类型肿瘤的细胞系中，ITPRIPL1存在异常的表达。具体实验步骤为：将培养的各细胞系计数，取2x106个细胞至15ml离心管，800rpm x4分钟离心后弃去上清，PBS重悬清洗，800rpm x4分钟离心，重复PBS重悬清洗。离心完成后弃去上清，按1:100配置RIPA裂解液与蛋白酶、磷酸酶、PMSF三联，每管细胞加入120微升混合裂解液，并转移至EP管中。各EP管于液氮-冰上进行三冻三融，最后一次融化后12000rpm 4摄氏度条件下离心15分钟。离心完成后取上清，离心后上清:5x上样缓冲液按4:1配置成各细胞样品，置于100摄氏度金属浴中10分钟变性。变性完成后，通过凝胶电泳和免疫印迹分析，以GAPDH作为内参，确定各肿瘤细胞系中ITPRIPL1的内源性表达。
图17为免疫印迹法中GAPDH内参调齐后的ITPRIPL1的表达情况。如图17所示，免疫印迹实验检测肿瘤细胞系表达ITPRIPL1蛋白的水平，其中包括LoVo结直肠癌、Raji淋巴瘤、RL淋巴瘤、MDA-MB-231乳腺癌、HCT116结直肠癌、A549肺癌、HL60、Jurkat淋巴瘤、H1299肺癌、A375黑色素瘤细胞中都存在较高水平的表达。发明人虽然并没有检测所有类型的肿瘤细胞中ITPRIPL1的表达，但是从已经检测过的肿瘤细胞中表达ITPRIPL1的比例来看(10/11，超过90％)，ITPRIPL1在恶性肿瘤中可能存在多种类型的、相当广泛的表达。
相应地，Protein Atlas数据库基于高通量mRNA表达谱分析提取的结果提示，ITPRIPL1可能在多种肿瘤中都存在表达显著升高的病例。过去没有见到过关于ITPRIPL1功能的任何报道。因此在本发明的内容公开之前，本领域的技术人员无法预知ITPRIPL1在肿瘤发生发展和免疫逃逸中扮演的任何功能。本发明公开了ITPRIPL1肿瘤细胞蛋白质水平的异常表达升高、ITPRIPL1胞外区结合CD3ε并造成T细胞抑制等实验数据，这首次揭示了ITPRIPL1在肿瘤免疫治疗靶标的重要价值。
如图18所示，根据Protein Atlas网站收集的mRNA表达谱数据，ITPRIPL1在正常组织或细胞中可能主要表达在睾丸、T细胞中。值得说明的是，mRNA的表达并不能直接代表蛋白质水平的表达，而且通常意义上，表达谱数据的再分析还需要低通量的生物学实验进行验证(例如蛋白凝胶电泳免疫印迹分析)才能得到可靠结论。
实施例6：分离的ITPRIPL1-RBD作为免疫原制备中和性抗体的应用
1.ITPRIPL1-RBD作为免疫原制备小鼠多克隆抗体和多克隆抗体
将人类ITPRIPL1-RBD重组蛋白作为免疫原，经过上述实施例中验证了该样本的纯度和生物学活性后，对C57BL/6小鼠进行免疫，进行多次免疫以增强效果：(1)初次免疫，抗原50μg/只，加福氏完全佐剂皮下多点注射，间隔3周；(2)第二次免疫，剂量途径同上，加福氏不完全佐剂，间隔3周；(3)第三次免疫，剂量同上，不加佐剂，腹腔注射间隔3周；(4)加强免疫，剂量50μg，腹腔注射。最后一次注射3天后采血测其效价。检测免疫效果达到要求后，再进行多次累积方式取血、分离多克隆抗体，并进行多克隆抗体纯化，具体实验步骤包括：(1)准备蛋白G sepharose CL-4B亲和柱。准备10mL蛋白G sepharose CL-4B填料，在真空瓶中将等体积的填料和TBS缓冲溶液混合，搅拌。抽真空15分钟以除去填料中的气泡。将蛋白Gsepharose CL-4B填料缓慢加入玻璃柱中，利用泵控制填充速度为1mL/分-2mL/分，避免柱干，利用10倍于床体积并经过预冷的TBS缓冲溶液平衡柱子。(2)制备多克隆抗体。将多克隆抗体放入冰水或4℃冰箱中缓慢解冻以避免蛋白质的聚集。在蛋白质解冻过程中出现的聚集可通过37℃预热而溶解。加入固体叠氮化钠至浓度为0.05％，4℃，15,000×g离心5分钟，移出澄清的多克隆抗体再经过滤器过滤除去多余的脂。(3)亲和层析。将抗体用TBS缓冲溶液以1：5的比例进行稀释，再用过滤器进行过滤。以每分钟0.5mL的速度将多克隆抗体上到柱上，为保证多克隆抗体与填料的结合，需连续上柱2次并保留上样流出液。用TBS缓冲溶液清洗柱子至Aλ280nm<0.008后加Ph 2.7洗脱缓冲溶液，以0.5mL/min的速度洗脱至所有蛋白均流下来。用已经加入100μL中和缓冲溶液的1.5mL EP管分管收集洗脱液，混匀后用pH试纸检查洗脱液的pH，如果pH低于7可利用中和缓冲液调至约pH7.4以防止抗体的变性。在柱中加入10mL，pH1.9洗脱缓冲溶液，按上述方法收集洗脱液至Aλ280nm<0.008。利用分光光度计测定各管中蛋白质的含量。
2.酶联免疫吸附剂测定(ELISA)证明ITPRIPL1-RBD作为免疫原的多克隆抗体能与表达ITPRIPL1的细胞结合
使用ELISA专用板(costar，ME，美国)。首先将不表达ITPRIPL1的B16细胞(ATCC，VA，美国)、中等程度表达ITPRIPL1的LoVo细胞(ATCC，VA，美国)与HCT116-ITPRIPL1的稳转株细胞胰酶消化并计数，调整细胞数量为2x106每毫升，每孔100微升细胞铺板，4℃包被过夜。PBST清洗后用100微升5％溶于PBS的脱脂奶粉(生工，上海，中国)进行封闭，温箱37度封闭90分钟。PBST清洗后，再将总IgG浓度为10毫克每毫升的多克隆抗体以1:1000/1:500/1:250/1:125进行梯度稀释，与铺板细胞孵育结合，温箱37度结合60分钟。PBST清洗后，用PBS稀释的特异性抗鼠Fc段抗体(康臣，上海，中国)进行孵育结合，温箱37度结合30分钟。PBST清洗后，配置显色液(生工，上海，中国)，每孔100微升，置于温箱反应5-30分钟，再予以50微升终止液(生工，上海，中国)，置于酶标仪(赛默飞，MA，美国)下450nm显色读数。
图19的(a)为B16细胞与不同浓度多克隆抗体的结合率变化。图19的(b)为LoVo细胞与不同浓度多克隆抗体的结合率变化。图19的(c)为HCT116-ITPRIPL1稳转株细胞与不同浓度多克隆抗体的结合率变化。该实验表明，随多克隆抗体中IgG浓度增加，B16细胞与多克隆抗体结合率无明显变化趋势，LoVo细胞与多克隆抗体的结合率呈一定程度的浓度依赖的增长，HCT116-ITPRIPL1稳转株细胞与多克隆抗体的结合率呈明显的浓度依赖的增长。上述结果证明多克隆抗体能与表达ITPRIPL1的细胞结合。
3.酶联免疫吸附剂测定(ELISA)证明多克隆抗体能阻断ITPRIPL1与CD3ε结合。
使用ELISA专用板(costar，ME，美国)。首先用0.1微克CD3ε蛋白片段(义翘神州，北京，中国)溶于100微升ELISA包被液(Solarbio，北京，中国)包板，该CD3ε(Met 1-Asp117)蛋白带有hFc标签，阴性对照采用不含蛋白的100微升包被液包板。4℃包被过夜。PBST清洗后用100微升5％溶于PBS的脱脂奶粉(生工，上海，中国)进行封闭，温箱37度封闭90分钟。PBST清洗后，再以2微克每毫升的ITPRIPL1-RBD-6x-His蛋白分别与1:1000/1:500/1:250/1:125的总IgG浓度为10毫克每毫升的多克隆抗体混合后进行共孵育结合，温箱37度结合60分钟。PBST清洗后，用PBS稀释的特异性抗6x-His标签辣根过氧化物酶抗体(Abcam，MA，美国)进行孵育结合，温箱37度结合30分钟。PBST清洗后，配置显色液(生工，上海，中国)，每孔100微升，置于温箱反应5-30分钟，再予以50微升终止液(生工，上海，中国)，置于酶标仪(赛默飞，MA，美国)下450nm显色读数。
如图20所示，该实验表明，随多克隆抗体中IgG浓度增加，CD3ε与ITPRIPL1-RBD蛋白的结合率逐渐降低。上述结果证明多克隆抗体可以阻断ITPRIPL1与CD3ε之间的结合。
4.流式细胞术证明多克隆抗体能阻断ITPRIPL1与过表达CD3ε的细胞的结合。
将HCT116-CD3ε稳转株细胞消化后计数，分别调整细胞数为2x105每毫升，加入200微升分别至8支1.5ml EP管(Axygen，CA,美国)。向EP管中各加入0.8微克IT1-RBD蛋白使其浓度为4微克每毫升。向其中五支EP管分别加入1:1000/1:500/1:250/1:125/1:67.5稀释的总IgG浓度为10毫克每毫升的多克隆抗体，静置细胞培养箱中30分钟。而后取出EP管，400rcf离心5分钟后弃去上清。用500微升细胞染色缓冲液(Invitrogen，CA，美国)重悬洗涤细胞，400rcf离心5分钟后再次弃去上清并重复洗涤。用细胞染色缓冲液按1:500稀释6x-His FITC抗体(Abcam，MA，美国)，除阴性对照外，每支EP管中加入200微升抗体稀释液，室温下摇床上40rpm孵育30分钟。取出EP管，400rcf离心5分钟后弃去上清。用1000微升细胞染色缓冲液重悬洗涤细胞，400rcf离心5分钟后再次弃去上清并重复洗涤。洗涤完成后，各EP管加入300微升细胞染色缓冲液重悬，转移至流式管(Falcon，NY，美国)中，进行上机分析(美天旎，科隆，德国)。
图21的(a)为不划入死亡细胞的阈值设定。图21的(b)反映多克隆抗体浓度变化时ITPRIPL1与CD3ε结合情况变化。图22则为图21的(b)中各条件下具体染色及蛋白结合情况。上述结果表明多克隆抗体能阻断ITPRIPL1与过表达CD3ε的细胞的结合。
实施例7：通过调节ITPRIPL1-RBD和CD3胞外区的结合来调节T细胞来源的细胞株的增殖信号通路激活
由于既往研究表明，CD3ε的结合可能造成T细胞增殖和功能的改变，而由于T细胞是原代细胞不利于进行干预和检测，进行此类研究最广泛采用的模型是Jurkat细胞即来源于T细胞的细胞株，而NF-KB的信号转导是广泛采用的体现Jurkat或T细胞激活程度的检测指标。因此，我们构建了Jurkat-NFKB报告细胞株(将NF-KB启动子下游的萤火虫荧光酶通过慢病毒转导入Jurkat细胞，经检测可以用刀豆蛋白A激活)，用于检测ITPRIPL1在肿瘤细胞表达的情况下，对共培养的T细胞功能状态的影响。
首先，萤光素报告实验证明过表达ITPRIPL1的HCT116细胞能更多地降低Jurkat-dual细胞NFKB增殖信号，如图23所示。将培养的Jurkat-dual细胞计数，1000rpm x5分钟离心后用不含抗生素的IMDM培养基重悬调整细胞数为2x106每毫升，透明96孔板中每孔加入200微升细胞。将HCT116细胞与HCT116-ITPRIPL1稳转株细胞胰酶消化并计数，调整细胞数为2x106每毫升，各加入20微升与相应的Jurkat-dual细胞混合。置于细胞培养箱中共培养18-24小时。反应完成后，取不透明96孔板，各孔加入50微升Quanti-luc试剂与20微升反应混合液，加入混匀后用多功能酶标仪立即检测信号。上图反映表达ITPRIPL1的HCT116细胞能抑制Jurkat-dual细胞的NFKB增殖信号，而过表达ITPRIPL1的HCT116细胞能进一步降低NFKB增殖信号。上述结果表明过表达ITPRIPL1的HCT116细胞能更多地降低Jurkat-dual细胞的NFKB增殖信号。
进一步地，萤光素报告实验证明CD3ε蛋白可以阻断ITPRIPL1蛋白对Jurkat-dual细胞NFKB增殖信号的抑制，如图24所示。培养的Jurkat-dual细胞计数，1000rpm x5分钟离心后用不含抗生素的IMDM培养基重悬调整细胞数为2x106每毫升，透明96孔板中每孔加入200微升细胞。各孔分别加入2微克每毫升的ITPRIPL1蛋白与0微克每毫升、1微克每毫升、2微克每毫升、4微克每毫升的CD3ε蛋白混合物。置于细胞培养箱中反应两小时后，各孔加入50微克每毫升刀豆蛋白A(ConA)，置于细胞培养箱中反应18-24小时。反应完成后，取不透明96孔板，各孔加入50微升Quanti-luc试剂与20微升反应混合液，加入混匀后用多功能酶标仪立即检测信号。上图反映在50微克每毫升ConA激活的条件下，加入2微克每毫升ITPRIPL1蛋白与不同浓度的CD3ε蛋白的条件下Jurkat-dual细胞的NFKB信号变化。上述结果表明ITPRIPL1蛋白对ConA激活的Jurkat-dual细胞的NFKB增殖信号的抑制能被CD3ε蛋白阻断，并呈浓度依赖性，从而说明ITPRIPL1的抑制作用通过CD3ε产生。
实施例8：ITPRIPL1-RBD重组蛋白可降低人外周血单核细胞(PBMC)对肾脏来源的H3K293细胞的杀伤
使用流式细胞术证明ITPRIPL1-RBD重组蛋白可降低人外周血单核细胞(PBMC)对肾脏来源的H3K293细胞的杀伤。将CD3与CD28抗体(Invitrogen，CA，美国)与PBMC(ATCC，VA，美国)混合稀释使得其终浓度为1微克每毫升以激活T细胞，培养过夜。次日将PBMC与293E(ATCC，VA，美国)细胞计数，分别调整细胞数为1x106每毫升，对照组加入100微升293E细胞与100微升培养液，实验组两种细胞各加入100微升至96孔板(赛默飞，MA，美国)中，实验组中再有4组各自加入1、2、4、8微克每毫升的ITPRIPL1-RBD重组蛋白，置于培养箱中孵育6小时。取出96孔板，将各孔细胞置于EP管(Axygen，CA,美国)中，400rcf离心5分钟后弃去上清。用500微升细胞染色缓冲液(Invitrogen，CA，美国)重悬洗涤细胞，重复离心与洗涤。用细胞染色缓冲液按1:20稀释CD45-APC抗体(Invitrogen，CA，美国)，各EP管加入200微升混合液重悬，室温慢摇孵育30分钟。400rcf离心5分钟后弃去上清，用1毫升binding buffer(美仑，上海，中国)重悬清洗细胞；重复离心与洗涤。设置不加PBMC不染组、不加PBMC双染组、加入PBMC不染组、加入PBMC单染Annexin V-FITC组、加入PBMC单染PI组、加入PBMC双染组与各加入ITPRIPL1蛋白的双染组，依据条件分别加入100微升binding buffer，5微升Annexin V-FITC(美仑，上海，中国)与10微升PI(美仑，上海，中国)，室温慢摇孵育15分钟，再各自加入400微升binding buffer，转移至流式管(Falcon，NY，美国)中上机(美天旎，科隆，德国)。
图25的(a)和(b)表示依据CD45来划分293E细胞。图25的(c)为不同ITPRIPL1蛋白浓度条件下依据各组凋亡数据所计算出的PBMC相对杀伤活性。图26为图25的(c)中各条件下具体凋亡染色情况。上述结果表明ITPRIPL1-RBD重组蛋白可降低人外周血单核细胞(PBMC)对肾脏来源的H3K293细胞的杀伤。
实施例9：通过基因编辑敲除肿瘤细胞表达的ITPRIPL1可显著增加人外周血单核细胞对肿瘤细胞的杀伤
1.构建CRISPR/Cas9基因编辑系统，即含有嘌呤霉素抗性的特定切割ITPRIPL1的sgRNA的慢病毒。
实验总体流程：首先合成gRNA序列的单链DNA oligo，然后退火配对产生双链DNAoligo，再通过其两端所含酶切位点将其直接连入酶切后的CRISPR/Cas9载体上；将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，对长出的单克隆菌落送测序公司进行测序鉴定，比对正确的克隆即为构建成功的CRISPR/Cas9载体。针对目的基因靶基因序列，利用公用网站中提供的gRNA序列设计原则，设计多个靶位点序列，如SEQ ID NOs:11-13所示。根据基因序列分别设计并合成3对gRNA寡聚单链DNA，oligo序列如SEQ ID NOs:14-19所示，其中SEQ ID NO:14,15为靶序列SEQ ID NO:11对应的gRNA寡聚单链DNA序列；SEQ ID NO:16,17为靶序列SEQID NO:12对应的gRNA寡聚单链DNA序列；SEQ ID NO:18,19为靶序列SEQ ID NO:13对应的gRNA寡聚单链DNA序列。将寡聚单链DNA退火成双链，将双链的gRNA oligo分别插入到CRISPR/Cas9载体中，构建CRISPR/Cas9重组质粒，并转化至感受态细胞Stbl3。载体的构建包括以下具体步骤：
1)gRNA的退火：用无菌的TE buffer稀释引物使终浓度为100μMol。分别吸取10μl的上下游引物混合并吹打均匀放入PCR管内进行退火，结束后置于冰上放置几分钟可直接连接或于-20℃冷冻保存。
2)CRISPR/Cas9载体的酶切及回收：酶切体系如下：CRISPR/Cas9 vector 5μg；10*Buffer5μl；BsmBI4μl；ddH2O补足50μl。于37℃酶切约30min。在此期间，可配置0.8％的琼脂糖凝胶，待酶切结束后进行核酸电泳。电泳结束后切下包含目的片段的胶条。用天平称量总重量并减去空管的重量算出凝胶的重量，按100mg约为100μl来计算凝胶的体积，并加入3倍胶体积的QG buffer置于50℃水浴内将凝胶彻底融化，期间适当摇晃EP管，加快凝胶的溶解。等凝胶彻底融化后，加入与凝胶等体积的异丙醇并混合均匀。将上述液体全部转移到滤柱内，13000rpm离心30s。弃掉管内液体，向柱子内加入750μl的PE buffer，离心1min。弃掉管内液体，再次空离1min。换一个新的1.5ml的EP管，向柱子内加入50μl的EB buffer，离心1min，离心管中即为回收的载体。
3)CRISPR/Cas9载体与引物的连接。连接体系如下：回收载体3μl(50ng)；Oligo引物1μl(0.5μM)；T4 DNA ligase buffer1.5μl；T4 DNA连接酶1μl；ddH2O补足15μl。于25℃水浴中孵育30min。
4)转化：将感受态细胞置于冰上待其自然解冻后，把连接产物全部加入感受态细胞中，于冰上放置20min，后于42℃水浴中热击90S。然后迅速置于冰上放置2-3min。加入1000μl不含抗生素的LB培养基于37℃，150rpm振荡培养45min。3000rpm离心2min，弃掉约850μl的上清液，将管底的菌液吹打散开，加入到含有相应抗性的培养皿中，用灭菌的涂布器涂匀，倒置于37℃恒温培养箱内过夜培养。
5)重组质粒的制备：挑取若干个单菌落，进行小量摇菌培养。
6)测序鉴定阳性克隆，经过比对，重组克隆中插入片段序列与设计的oligo序列完全一致，因此载体构建成功。
2.利用CRISPR/Cas9基因编辑系统进行基因编辑并构建HCT116-ITPRIPL1敲除细胞系。
将HCT116细胞(ATCC，VA，美国)以合适的密度(第二日生长至密度约30-40％左右)铺置于24孔板(康宁，NY，美国)中，次日消化计数，先以GFP对照慢病毒(吉满，上海，中国)数量梯度以感染细胞，48小时后换液，72小时后镜下观察GFP荧光以确定最佳病毒细胞感染比，以探索MOI值。确定MOI值后，重新铺板，以含有杀稻瘟菌素抗性的Cas9系统慢病毒(吉满，上海，中国)以MOI值感染HCT116细胞，48小时后换液，72小时后加入浓度梯度的杀稻瘟菌素(Invivogen，CA，美国)以筛选10-14天，最终筛选所得的细胞系即含有Cas9系统的HCT116细胞。再将含有Cas9系统的HCT116细胞于24孔板中铺板计数，以含有嘌呤霉素抗性的特定切割ITPRIPL1的sgRNA的慢病毒以MOI值进行感染，48小时后换液，72小时后进入浓度梯度的嘌呤霉素(Invivogen，CA，美国)进行筛选10-14天，即得HCT116-ITPRIPL1敲除细胞系。
3.流式细胞术证明敲降肿瘤细胞表达的ITPRIPL1可显著增加人外周血单核细胞对肿瘤细胞的杀伤。
将CD3与CD28抗体(Invitrogen，CA，美国)与PBMC(ATCC，VA，美国)混合稀释使得其终浓度为1微克每毫升以激活T细胞，培养过夜。次日将PBMC与HCT116野生型(ATCC，VA，美国)/ITPRIPL1过表达/ITPRIPL1敲除细胞计数，分别调整细胞数为1x106每毫升，对照组加入100微升肿瘤细胞与100微升培养液，实验组肿瘤细胞与PBMC各加入100微升至96孔板(赛默飞，MA，美国)中，置于培养箱中孵育6小时。取出96孔板，PBS(美仑，大连，中国)润洗后用不含EDTA的胰酶(碧云天，上海，中国)将细胞消化，置于EP管(Axygen，CA,美国)中，400rcf离心5分钟后弃去上清。用500微升细胞染色缓冲液(Invitrogen，CA，美国)重悬洗涤细胞，重复离心与洗涤。用细胞染色缓冲液按1:20稀释CD45-APC抗体(Invitrogen，CA，美国)，各EP管加入200微升混合液重悬，室温慢摇孵育30分钟。400rcf离心5分钟后弃去上清，用1毫升binding buffer(美仑，大连，中国)重悬清洗细胞；重复离心与洗涤。设置不加PBMC不染组、不加PBMC双染组、加入PBMC不染组、加入PBMC单染Annexin V-FITC组、加入PBMC单染PI组、加入PBMC双染组与各加入IT1蛋白的双染组，依据条件分别加入100微升bindingbuffer，5微升Annexin V-FITC(美仑，大连，中国)与10微升PI(美仑，大连，中国)，室温慢摇孵育15分钟，再各自加入400微升binding buffer，转移至流式管(Falcon，NY，美国)中上机(美天旎，科隆，德国)。
图27的(a)和(b)表示依据CD45来划分肿瘤细胞。图27的(c)为不同ITPRIPL1表达条件下依据各组凋亡数据所计算出的PBMC相对杀伤活性。图28为图27的(c)中各条件下具体凋亡染色情况。上述结果表明ITPRIPL1过表达能降低PBMC对于肿瘤细胞的杀伤而敲除ITPRIPL1能促进PBMC对于肿瘤细胞的杀伤。
实施例10：以ITPRIPL1-RBD蛋白作为免疫原制备的抗体能有效促进免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤
将CD3与CD28抗体(Invitrogen，CA，美国)与PBMC(ATCC，VA，美国)混合稀释使得其终浓度为1微克每毫升以激活T细胞，培养过夜。次日将PBMC与HCT116细胞(ATCC，VA，美国)计数，分别调整细胞数为1x106每毫升，对照组加入100微升HCT116细胞与100微升培养液，实验组两种细胞各加入100微升至96孔板(赛默飞，MA，美国)中，实验组中再有4组各自加入1：500/250/125/62.5的ITPRIPL1多克隆抗体，置于培养箱中孵育6小时。取出96孔板，PBS(美仑，上海，中国)润洗后用不含EDTA的胰酶(碧云天，上海，中国)将细胞消化，置于EP管(Axygen，CA,美国)中，400rcf离心5分钟后弃去上清。用500微升细胞染色缓冲液(Invitrogen，CA，美国)重悬洗涤细胞，重复离心与洗涤。用细胞染色缓冲液按1:20稀释CD45-APC抗体(Invitrogen，CA，美国)，各EP管加入200微升混合液重悬，室温慢摇孵育30分钟。400rcf离心5分钟后弃去上清，用1毫升binding buffer(美仑，上海，中国)重悬清洗细胞；重复离心与洗涤。设置不加PBMC不染组、不加PBMC双染组、加入PBMC不染组、加入PBMC单染Annexin V-FITC组、加入PBMC单染PI组、加入PBMC双染组与各加入ITPRIPL1蛋白的双染组，依据条件分别加入100微升binding buffer，5微升Annexin V-FITC(美仑，上海，中国)与10微升PI(美仑，上海，中国)，室温慢摇孵育15分钟，再各自加入400微升bindingbuffer，转移至流式管(Falcon，NY，美国)中上机(美天旎，科隆，德国)。
图29的(a)和(b)表示依据CD45来划分HCT116细胞。图29的(c)为不同多克隆抗体浓度条件下依据各组凋亡数据所计算出的PBMC相对杀伤活性。图30为图29的(c)中各条件下具体凋亡染色情况。上述结果表明ITPRIPL1多克隆抗体能促进PBMC对于肿瘤细胞的杀伤。
实施例11：ITPRIPL1-RBD2序列突变体与CD3E结合能力有一定程度的降低，ITPRIPL1-RBD3与CD3ε结合能力显著下降
1.构建HCT116-RBD2与RBD3序列突变体
基于已公开序列(NCBI参考序列NM_001008949.3)，分别选中胞外区(25-103氨基酸)中的DRMDLDTLARSRQLEKRMSEEMRLLEMEFEERKRAAEQRQKAENFWTGDTSSDQ(ITPRIPL1-RBD2，即SEQ ID NO:2)、
MDLDTLARSRQLEKRMSEEMRLLEMEFEERKRAAEQRQKAEN(ITPRIPL1-RBD3，即SEQ ID NO:3)为两段不同的目标序列，合成特定ITPRIPL1序列突变体，以pcDNA3.1为载体，其中胞外区、胞外区和跨膜区C末端融合至Flag标签与绿色荧光蛋白(GFP)，从而产生含有Flag标签与绿色荧光蛋白(GFP)的ITPRIPL1胞外区、ITPRIPL1-RBD2、ITPRIPL1-RBD3质粒。
2.免疫共沉淀实验分析ITPRIPL1-RBD2为与CD3E结合的最短序列。
将含有Flag标签的ITPRIPL1胞外区、ITPRIPL1-RBD2、ITPRIPL1-RBD3与HA标签的CD3E的pcDNA3.1质粒分别共转染至HCT116细胞(ATCC，VA，美国)中，置于六孔板(康宁，NY，美国)培养48-72小时至蛋白充分表达后，用1：100免疫沉淀裂解液(赛默飞，MA，美国)与蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、PMSF三联(康臣，上海，中国)混合裂解液裂解并刮取细胞，一部分细胞样本经离心、上样缓冲液(碧云天，上海，中国)混合及100摄氏度金属浴变性后制得输入量蛋白样本；剩余细胞样本用HA标签特异性鼠抗体(Biolegend，CA，美国)或Flag标签特异性鼠抗体(CST，MA，美国)进行免疫沉淀，经PBS清洗、上样缓冲液(碧云天，上海，中国)混合及100摄氏度金属浴变性后制得免疫沉淀蛋白样品。再按照说明书于胶板(伯乐，CA，美国)中配置12.5％PAGE凝胶(雅酶，上海，中国)，将配置好的胶置于电泳槽(伯乐，CA，美国)中，接好电源(伯乐，CA，美国)以80伏恒压的条件让条带跑完浓缩胶，以120伏恒压的条件跑完分离胶。待条带跑至分离胶底部时，运用湿法转膜，转膜槽(伯乐，CA，美国)350毫安恒流90分钟转膜。待转膜完成后，以ITPRIPL1胞外区、ITPRIPL1-RBD2、ITPRIPL1-RBD3与CD3E-HA蛋白的质量大小进行剪膜处理。用快速封闭液(雅酶，上海，中国)封闭十分钟，用Flag标签特异性兔抗体(Abcam，MA，美国)和HA标签特异性兔抗体(CST，MA，美国)分别孵育ITPRIPL1胞外区、ITPRIPL1-RBD2、ITPRIPL1-RBD3与CD3E-HA相应条带，四度过夜。次日经TBST清洗后，用5％溶于TBS的脱脂奶粉(生工，上海，中国)稀释的特异性抗兔二抗(康臣，上海，中国)室温孵育一小时，经TBST清洗后，置于混合发光液(圣尔，上海，中国)中一分钟，于凝胶成像仪(伯乐，CA，美国)下曝光。
图31的(a)显示了输入量蛋白中不同ITPRIPL1序列突变体与CD3ε的含量，图31的(b)显示了间接沉淀(因与CD3ε结合)的ITPRIPL1不同序列的突变体，与直接沉淀的CD3ε。图31的(c)显示了输入量蛋白中不同ITPRIPL1序列突变体与CD3ε的含量，图31的(d)显示了间接沉淀(因与ITPRIPL1不同序列的突变体结合)的CD3E，与直接沉淀的ITPRIPL1不同序列的突变体。上述结果表明，在ITPRIPL1的胞外区和RBD2序列突变体存在的情况下，CD3E和ITPRIPL1保持结合状态；而RBD3序列则不能检测到明显的结合。由上可得ITPRIPL1胞外区的长度或完整程度与CD3E结合的能力存在正向相关性。
实施例12：分离的ITPRIPL1-RBD蛋白具有结合NRP2的能力
1.酶联免疫吸附剂测定(ELISA)证实分离的ITPRIPL1(IT1)胞外区片段与NRP2胞外区存在浓度依赖的直接结合。
使用ELISA专用板(costar，ME，美国)。首先用0.03125/0.0625/0.125/0.25/0.5/1/2微克每毫升的ITPRIPL1-RBD重组蛋白各溶于100微升ELISA包被液(Solarbio，北京，中国)包板，阴性对照采用不含蛋白的100微升包被液包板。四度包被过夜。PBST清洗后用100微升5％溶于PBS的BSA(VWR，PA，美国)进行封闭，温箱37度封闭90分钟。PBST清洗后，再以用1微克每毫升的NRP2胞外区蛋白质片段(义翘神州，北京，中国)进行孵育结合，该NRP2蛋白带有hFc标签(N2-Fc)，温箱37度结合60分钟。PBST清洗后，用PBS稀释的特异性抗人Fc段抗体(Abcam，MA，美国)进行孵育结合，温箱37度结合30分钟。PBST清洗后，用显色液(生工，上海，中国)进行显色，每孔100微升，置于温箱反应5-30分钟，再予以50微升终止液(生工，上海，中国)，置于酶标仪(赛默飞，MA，美国)下450nm显色读数。
如图32所示，该实验表明，分离的ITPRIPL1胞外区片段与NRP2胞外区存在浓度依赖的直接结合。上述结果证明分离的ITPRIPL1的胞外区纯化蛋白(IT1-RBD)与NRP2胞外区纯化蛋白直接结合，且呈浓度依赖性。
2.流式细胞术证明NRP2以更高效率结合过表达ITPRIPL1的细胞。
经检测，HEK293细胞内源表达一定水平的ITPRIPL1，稳转表达后表达水平进一步升高。将培养的293E野生型细胞(ATCC，VA，美国)与293E-ITPRIPL1稳转株细胞消化后计数，分别调整细胞数为2x106每毫升，加入200微升分别至96孔板(costar，ME，美国)各孔中。向各实验组孔中分别加入0/0.5/1/2/4微克每毫升的NRP2蛋白(义翘神州，北京，中国)。将96孔板置于细胞培养箱中，静置30分钟，而后取出，转移至EP管(Axygen，CA，美国)中400rcf离心5分钟后弃去上清。用500微升细胞染色缓冲液(Invitrogen，CA，美国)重悬洗涤细胞，400rcf离心5分钟后再次弃去上清并重复洗涤。用细胞染色缓冲液按1:1000稀释抗人IgGAlexa Fluor 647抗体(Invitrogen，CA，美国)，除阴性对照外，每支EP管中加入200微升抗体稀释液，室温下摇床上40rpm孵育30分钟。而后取出EP管，400rcf离心5分钟后弃去上清。用1000微升细胞染色缓冲液重悬洗涤细胞，400rcf离心5分钟后再次弃去上清并重复洗涤。洗涤完成后，各EP管加入300微升细胞染色缓冲液重悬，转移至流式管(Falcon，NY，美国)中，进行上机分析(美天旎，科隆，德国)。
图33的(a)为不划入死亡细胞的阈值设定。图33的(b)反映ITPRIPL1表达情况不同的细胞与NRP2蛋白的结合情况。图34则分别为图33的(b)中各条件下具体染色及蛋白结合情况。上述结果表明NRP2能与有一定ITPRIPL1表达量的293E结合，并能更强地结合过表达ITPRIPL1的293E细胞。
实施例13：分离的ITPRIPL1-RBD蛋白具有向表达NRP2蛋白的分化THP1巨噬细胞传递抑制信号的能力
萤光素报告实验证明游离的分离的ITPRIPL1的胞外区纯化蛋白(IT1-RBD)能抑制不激活条件下的PMA诱导分化完成的THP1-dual细胞IFN增殖信号。
将培养的THP1-dual细胞(Invivogen，CA，美国)计数，1000rpmx5分钟离心后用不含抗生素的RPMI-1640培养基(Gibco，CA，美国)重悬调整细胞数为2x106每毫升，透明96孔板(赛默飞，MA，美国)中每孔加入200微升细胞与20纳克每毫升的PMA试剂(Invivogen，CA，美国)诱导，培养箱培养3小时后PBS清洗并更换培养基。72小时后再次更换培养基并分别加入0/1/2/4/8微克每毫升的游离的分离的ITPRIPL1的胞外区纯化蛋白，置于细胞培养箱中培养18-24小时。反应完成后，取不透明96孔板，各孔加入50微升Quanti-luc试剂(Invivogen，CA，美国)与10微升细胞混合液，加入混匀后用多功能酶标仪立即检测信号。
如图35所示，上述结果表明游离的分离的ITPRIPL1的胞外区纯化蛋白(IT1-RBD)能抑制不激活条件下的PMA诱导分化完成的THP1-dual细胞IFN增殖信号。由上可得分离的ITPRIPL1-RBD蛋白具有向表达NRP2蛋白的分化THP1巨噬细胞传递抑制信号的能力。
实施例14：纯化得到的IT1-RBD-Fc蛋白具有抑制T细胞信号与杀伤的功能
1.分离纯化IT1-RBD-Fc蛋白。
基于已公开序列(NCBI参考序列NM_001008949.3)，选中胞外区(HPLMVSDRMDLDTLARSRQLEKRMSEEMRLLEMEFEERKRAAEQRQKAENFWTGDTSSDQLVLGKKDMGWPFQADGQEG)作为IT1-RBD1，其中的DRMDLDTLARSRQLEKRMSEEMRLLEMEFEERKRAAEQRQKAENFWTGDTSSDQ作为IT1-RBD2、MDLDTLARSRQLEKRMSEEMRLLEMEFEERKRAAEQRQKAEN作为IT1-RBD3，其后串联不含CH1区的Fc序列(PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK)，以pcDNA3.1为载体，构建相应质粒。获取质粒后，通过PEI试剂(李记，上海，中国)转染至293E细胞(ATCC，VA，美国)，120小时后，用RIPA裂解液(碧云天，上海，中国)与蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、PMSF三联(康臣，上海，中国)冰上裂解细胞10分钟，12000rpm离心15分钟后吸取上清，用1：100的蛋白A磁珠(天地人和，常州，中国)室温130rpm摇动2小时，将混合液吸入预先用平衡液(20mM磷酸氢二钠，0.15M氯化钠，pH7.0)平衡的过滤柱(密理博，MA，美国)，平衡液清洗两次后，用洗脱液(0.1M甘氨酸，pH3.0)：中和液(1M Tris-HCl，pH8.5)＝16:1进行洗脱，洗脱所得即为纯化的IT1-RBD-Fc蛋白。用Nanodrop分光光度计测定蛋白浓度，置于-20℃保存。
2.萤光素报告实验证明纯化得到的IT1-RBD1-Fc蛋白能抑制ConA激活与不激活条件下的Jurkat-dual细胞NFKB增殖信号。
培养的Jurkat-dual细胞(Invivogen，CA，美国)计数，1000rpmx5分钟离心后用不含抗生素的IMDM培养基(Gibco，CA，美国)重悬调整细胞数为2x106每毫升，透明96孔板中每孔加入200微升细胞。各孔分别加入0/4微克每毫升提纯的IT1-RBD1/RBD2/RBD3的Fc蛋白。置于细胞培养箱中反应两小时后，各孔加入50微克每毫升刀豆蛋白A(ConA)(阿拉丁，上海，中国)作为激活组或等体积去内毒素水作为不激活组，置于细胞培养箱中反应18-24小时。反应完成后，取不透明96孔板(costar，ME，美国)，各孔加入50微升Quanti-luc试剂(Invivogen，CA，美国)与20微升反应混合液，加入混匀后用多功能酶标仪立即检测信号。
如图36所示，在50微克每毫升ConA激活与不激活的条件下，加入4微克每毫升不同IT1-RBD段的Fc蛋白条件下Jurkat-dual细胞的NFKB信号变化。上述结果表明纯化得到的IT1-RBD1-Fc蛋白能抑制ConA激活与不激活条件下的Jurkat-dual细胞NFKB增殖信号，且随着序列逐渐缩短，抑制效果逐渐减弱。
3.流式细胞术证明纯化得到的IT1-RBD1-Fc重组蛋白可降低人外周血单核细胞(PBMC)对肾脏来源的H3K293细胞的杀伤。
将CD3与CD28抗体(Invitrogen，CA，美国)与PBMC(ATCC，VA，美国)混合稀释使得其终浓度为1微克每毫升以激活T细胞，培养过夜。次日将PBMC与293E野生型(ATCC，VA，美国)/ITPRIPL1过表达细胞计数，分别调整细胞数为1x106每毫升，对照组加入100微升293E野生型/ITPRIPL1过表达细胞与100微升培养液，实验组将PBMC与另一种细胞各加入100微升至96孔板(costar，ME，美国)中，实验组中再有3组野生型293E细胞分别加入2微克每毫升的IT1-RBD1/RBD2/RBD3-Fc蛋白，置于培养箱中孵育6小时。取出96孔板，吸收细胞，置于EP管(Axygen，CA,美国)中，400rcf离心5分钟后弃去上清。用500微升细胞染色缓冲液(Invitrogen，CA，美国)重悬洗涤细胞，重复离心与洗涤。用细胞染色缓冲液按1:20稀释CD45-APC抗体(Invitrogen，CA，美国)，各EP管加入200微升混合液重悬，室温慢摇孵育30分钟。400rcf离心5分钟后弃去上清，用1毫升binding buffer(碧云天，上海，中国)重悬清洗细胞；重复离心与洗涤。设置不加PBMC不染组、不加PBMC双染组、加入PBMC不染组、加入PBMC单染Annexin V-FITC组、加入PBMC单染PI组、加入PBMC双染组与各加入IT1蛋白的双染组，依据条件分别加入100微升binding buffer，5微升Annexin V-FITC(碧云天，上海，中国)与10微升PI(碧云天，上海，中国)，室温慢摇孵育15分钟，再各自加入400微升bindingbuffer，转移至流式管(Falcon，NY，美国)中上机(美天旎，科隆，德国)。
图37的(a)表示依据CD45来划分293E细胞。图37的(b)为不同ITPRIPL1表达与不同蛋白条件下依据各组凋亡数据所计算出的PBMC相对杀伤活性。图38为图37的(b)中各条件下具体凋亡染色情况。上述结果表明纯化得到的IT1-RBD1-Fc重组蛋白可降低人外周血单核细胞(PBMC)对肾脏来源的H3K293细胞的杀伤，且随着序列逐渐缩短，降低效果逐渐减弱。
4.免疫印迹法实验表明ITPRIPL1-RBD重组蛋白与纯化得到的IT1-RBD1-Fc重组蛋白具有抑制CD3E下游的ZAP70与Akt通路的功能。
将培养的Jurkat细胞(ATCC，VA，美国)计数，取4x106个细胞至15ml离心管(康宁，NY，美国)，800rpmx4分钟离心后弃去上清，用不含血清的RPMI1640培养基(美仑，大连，中国)重悬，置于培养箱中饥饿培养3小时，800rpmx4分钟离心，4毫升完全培养基(美仑，大连，中国)重悬，各取1毫升于12孔板(康宁，NY，美国)各孔中，各孔分别加入：不处理；4微克每毫升IT1-RBD蛋白；4微克每毫升RBD1-Fc蛋白；4微克每毫升RBD2-Fc蛋白。充分混匀后置于培养箱中培养10min后取出，将细胞转移至1.5mlEP管(Axygen，CA,美国)中，800rpmx4分钟离心，PBS重悬清洗并离心，重复清洗。离心完成后弃去上清，按1:100配置RIPA裂解液(碧云天，上海，中国)与蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、PMSF三联(康臣，上海，中国)，每管细胞加入80微升混合裂解液。各EP管于液氮-冰上进行三冻三融，最后一次融化后12000rpm 4摄氏度条件下离心15分钟。离心完成后取上清，离心后上清:5x上样缓冲液(碧云天，上海，中国)按4:1配置成各细胞样品，置于100摄氏度金属浴中10分钟变性以制得蛋白样品。再按照说明书于胶板(伯乐，CA，美国)中配置10％PAGE凝胶(雅酶，上海，中国)，将配置好的胶置于电泳槽(伯乐，CA，美国)中，接好电源(伯乐，CA，美国)以80伏恒压的条件让条带跑完浓缩胶，以120伏恒压的条件跑完分离胶。待条带跑至分离胶底部时，运用湿法转膜，转膜槽(伯乐，CA，美国)350毫安恒流90分钟转膜。待转膜完成后，以Akt、ZAP70与GAPDH蛋白的质量大小进行剪膜处理。用快速封闭液(雅酶，上海，中国)封闭十分钟，用pAkt特异性兔抗体(CST，MA，美国)、Akt特异性兔抗体(CST，MA，美国)、pZAP70特异性兔抗体(CST，MA，美国)、GAPDH抗体(康臣，上海，中国)分别孵育相应条带，四度过夜。次日经TBST清洗后，用5％溶于TBS的脱脂奶粉(生工，上海，中国)稀释的特异性抗兔二抗(康臣，上海，中国)室温孵育一小时，经TBST清洗后，置于混合发光液(圣尔，上海，中国)中一分钟，于凝胶成像仪(伯乐，CA，美国)下曝光。
图39的(a)和(b)分别为免疫印迹法中GAPDH内参调齐后的磷酸化Akt与磷酸化ZAP70的表达情况，其中Akt磷酸化与ZAP70磷酸化经ITPRIPL1-RBD重组蛋白与纯化得到的IT1-RBD-Fc蛋白处理后均有一定程度的降低，而IT1-RBD1-Fc重组蛋白的磷酸化降低较IT1-RBD2-Fc蛋白更为明显。实验结果表明ITPRIPL1-RBD重组蛋白与纯化得到的IT1-RBD1-Fc蛋白具有降低CD3E下游的Akt与ZAP70磷酸化的作用，从而说明其具有抑制相应T细胞通路的功能。
综上所述，本发明公开了一种新鉴定的结合CD3ε胞外区的天然膜蛋白ITPRIPL1，并揭示了ITPRIPL1结合CD3ε后产生的、控制T细胞活化的信号转导改变。这提示，过去曾被发现的结合CD3ε的抗体可能在一定程度上模拟或影响了ITPRIPL1所具有的天然配体功能。CD3ε和ITPRIPL1这对免疫检查点受体配体的发现，为深入理解机体免疫稳态的维持和肿瘤细胞的免疫逃逸机制带来新的视角。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
序列表
<110> 复旦大学
<120> ITPRIPL1 的调节剂在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物中的用途
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 79
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
His Pro Leu Met Val Ser Asp Arg Met Asp Leu Asp Thr Leu Ala Arg
1 5 10 15
Ser Arg Gln Leu Glu Lys Arg Met Ser Glu Glu Met Arg Leu Leu Glu
20 25 30
Met Glu Phe Glu Glu Arg Lys Arg Ala Ala Glu Gln Arg Gln Lys Ala
35 40 45
Glu Asn Phe Trp Thr Gly Asp Thr Ser Ser Asp Gln Leu Val Leu Gly
50 55 60
Lys Lys Asp Met Gly Trp Pro Phe Gln Ala Asp Gly Gln Glu Gly
65 70 75
<210> 2
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Arg Met Asp Leu Asp Thr Leu Ala Arg Ser Arg Gln Leu Glu Lys
1 5 10 15
Arg Met Ser Glu Glu Met Arg Leu Leu Glu Met Glu Phe Glu Glu Arg
20 25 30
Lys Arg Ala Ala Glu Gln Arg Gln Lys Ala Glu Asn Phe Trp Thr Gly
35 40 45
Asp Thr Ser Ser Asp Gln
50
<210> 3
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Asp Leu Asp Thr Leu Ala Arg Ser Arg Gln Leu Glu Lys Arg Met
1 5 10 15
Ser Glu Glu Met Arg Leu Leu Glu Met Glu Phe Glu Glu Arg Lys Arg
20 25 30
Ala Ala Glu Gln Arg Gln Lys Ala Glu Asn
35 40
<210> 4
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Asn Val Asp Ala Glu Ala Ser Met Ala Val Ile Ser Leu Leu Phe
1 5 10 15
Leu Ala Val Met Tyr Val Val His His Pro Leu Met Val Ser Asp Arg
20 25 30
Met Asp Leu Asp Thr Leu Ala Arg Ser Arg Gln Leu Glu Lys Arg Met
35 40 45
Ser Glu Glu Met Arg Leu Leu Glu Met Glu Phe Glu Glu Arg Lys Arg
50 55 60
Ala Ala Glu Gln Arg Gln Lys Ala Glu Asn Phe Trp Thr Gly Asp Thr
65 70 75 80
Ser Ser Asp Gln Leu Val Leu Gly Lys Lys Asp Met Gly Trp Pro Phe
85 90 95
Gln Ala Asp Gly Gln Glu Gly
100
<210> 5
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
His Pro Leu Met Val Ser Asp Arg Met Asp Leu Asp Thr Leu Ala Arg
1 5 10 15
Ser Arg Gln Leu Glu Lys Arg Met Ser Glu Glu Met Arg Leu Leu Glu
20 25 30
Met Glu Phe Glu Glu Arg Lys Arg Ala Ala Glu Gln Arg Gln Lys Ala
35 40 45
Glu Asn Phe Trp Thr Gly Asp Thr Ser Ser Asp Gln Leu Val Leu Gly
50 55 60
Lys Lys Asp Met Gly Trp Pro Phe Gln Ala Asp Gly Gln Glu Gly Pro
65 70 75 80
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
85 90 95
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
100 105 110
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
115 120 125
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
130 135 140
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
145 150 155 160
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
165 170 175
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
180 185 190
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
195 200 205
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
210 215 220
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
225 230 235 240
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
245 250 255
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
260 265 270
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
275 280 285
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
290 295 300
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
305 310
<210> 6
<211> 285
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Asp Arg Met Asp Leu Asp Thr Leu Ala Arg Ser Arg Gln Leu Glu Lys
1 5 10 15
Arg Met Ser Glu Glu Met Arg Leu Leu Glu Met Glu Phe Glu Glu Arg
20 25 30
Lys Arg Ala Ala Glu Gln Arg Gln Lys Ala Glu Asn Phe Trp Thr Gly
35 40 45
Asp Thr Ser Ser Asp Gln Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
50 55 60
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
65 70 75 80
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
85 90 95
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
100 105 110
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
115 120 125
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
130 135 140
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
145 150 155 160
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
165 170 175
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
180 185 190
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
195 200 205
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
210 215 220
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
225 230 235 240
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
245 250 255
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
260 265 270
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
275 280 285
<210> 7
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Asp Leu Asp Thr Leu Ala Arg Ser Arg Gln Leu Glu Lys Arg Met
1 5 10 15
Ser Glu Glu Met Arg Leu Leu Glu Met Glu Phe Glu Glu Arg Lys Arg
20 25 30
Ala Ala Glu Gln Arg Gln Lys Ala Glu Asn Pro Lys Ser Cys Asp Lys
35 40 45
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
50 55 60
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
65 70 75 80
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
85 90 95
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
100 105 110
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
115 120 125
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
130 135 140
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
145 150 155 160
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
165 170 175
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
180 185 190
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
195 200 205
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
210 215 220
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
225 230 235 240
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
245 250 255
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
260 265 270
Lys
<210> 8
<211> 1710
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaattcgcca ccatgaatgt tgatgcagag gcctccatgg ctgtgataag cctgctgttc 60
ttggcagtga tgtatgttgt tcaccaccct ctgatggtca gtgatcggat ggacctggac 120
acattagcca ggagtcggca gctggagaag cgaatgagtg aggagatgcg cctgctagag 180
atggagtttg aagagagaaa gcgagccgct gagcagaggc agaaggcaga gaacttctgg 240
acaggagaca catccagtga ccagttagtg ctggggaaga aagacatggg gtggccgttc 300
caggccgatg gccaggaagg gcctctgggc tggatgctgg gaaacctgtg gaacactggc 360
ctcttttgcc tttttctcgt ctttgagctc ctgcgacaga acatgcagca tgaaccggcc 420
tttgattcca gcagtgagga ggaggaggag gaagtccgtg ttgtccctgt cacctcttac 480
aactggctta ctgacttccc ctcccaggag gccctggact ccttttacaa acactatgtc 540
caaaatgcca tccgtgacct gccctgcacc tgtgagtttg tggagagttt tgtggatgat 600
ctcattgagg cctgtcgggt gctcagccgc caagaggctc acccacaatt ggaagactgc 660
ctgggcatcg gggctgcctt tgagaaatgg ggaaccctcc atgagaccca gaaatttgat 720
atcctggtgc ccattgtccc cccacagggc accatgtttg tcctggagat gagggaccca 780
gccctgggcc gccgctgtgg ctgtgtgctg gtggagtcag aatgtgtgtg caagcgtgag 840
aaactcctag gggacgtgct gtgcctggtg caccaccaca gggacccctc ggcagtcttg 900
gggaagtgta gtagctccat caaggcagct ctctgcaccg gcttccacct agacgtgtgc 960
aagactgtgc agtggttccg gaacatgatg ggcaatgcct gggcccttgt ggcccacaag 1020
tatgacttta aactcagtct cccaccgtct accacctcct gcaagctccg gctggactat 1080
cgctcaggcc gctttctctc aatccacttg gtcctggggg tgcaacgaga agacaccttg 1140
gtctacctgg tgagtcaggc tcctgaccag gagcagctca ccagtgtgga ctggcctgag 1200
tcctttgtgg cctgtgagca cctgttcctg aagctggtgg ggcgctttgc ccccgagaac 1260
acctgtcacc tcaagtgcct ccagatcatt ttaagtctcc ggcagcatca gagcttaccc 1320
catggagcat cccgccccat cctcacttct taccatttta aaacagctct catgcacctc 1380
ttgctacggc tgcccctcac ggactgggcc cacaacatgc tctctcagcg gctccaggac 1440
attctctggt tcttgggccg tggcctccag caaaggtccc tccatcattt cctcattggt 1500
aacaattttc tgcccctgac catcccaatc cctaagacat ttaggaatgc tgagccggtc 1560
aatctcttcc aacacctggt gctcaacccc aaggcacatt cacaggcagt ggaagagttc 1620
caaaaccttc tgacccaggt gaaaactctg cctcatgccc cactggctgc agcacctgat 1680
tacaaggatg acgacgataa gtgactcgag 1710
<210> 9
<211> 237
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cacccactga tggtgagcga ccgcatggac ctcgacacac tcgcccggtc acgacagcta 60
gaaaagcgga tgtctgagga gatgagactg ctggagatgg agttcgagga gcgcaagcgc 120
gccgccgagc agaggcagaa ggccgagaac ttctggaccg gcgacacatc ctctgaccag 180
ctcgtgctcg gcaagaagga catgggctgg cctttccagg ccgacggcca ggagggc 237
<210> 10
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaccgcatgg acctcgacac actcgcccgg tcacgacagc tagaaaagcg gatgtctgag 60
gagatgagac tgctggagat ggagttcgag gagcgcaagc gcgccgccga gcagaggcag 120
aaggccgaga acttctggac cggcgacaca tcctctgacc ag 162
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccccagcact aactggtcac 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agacatgggg tggccgttcc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcctggccat cggcctggaa 20
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caccgcccca gcactaactg gtcac 25
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aaacgtgacc agttagtgct ggggc 25
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
caccgagaca tggggtggcc gttcc 25
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaacggaacg gccaccccat gtctc 25
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
caccgtcctg gccatcggcc tggaa 25
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aaacttccag gccgatggcc aggac 25
Claims (12)
1.ITPRIPL1的调节剂在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物中的用途，其特征在于，所述的调节剂用于提高或降低机体的ITPRIPL1基因或蛋白的表达或功能。
2.根据权利要求1所述的ITPRIPL1的调节剂在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物中的用途，其特征在于，所述的调节剂包含以下任意一种：
(1)使细胞内ITPRIPL1基因被敲除或突变的基因编辑系统；
(2)降低ITPRIPL1基因表达水平的RNA分子；
(3)用于导入细胞内的核酸分子，所述核酸分子编码ITPRIPL1并提高ITPRIPL1的表达量；
(4)分离的ITPRIPL1重组蛋白；
(5)识别并结合ITPRIPL1的抗体。
3.根据权利要求2所述的ITPRIPL1的调节剂在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物中的用途，其特征在于：
所述的基因编辑系统为CRISPR/Cas9基因编辑系统；用于所述CRISPR/Cas9基因编辑系统的靶序列选自SEQ ID NO:11-13所示的任意一条序列，用于编码sgRNA的寡聚DNA序列选自SEQ ID NO:14-19；
所述的核酸分子包含：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示的序列；
所述的ITPRIPL1重组蛋白包含：ITPRIPL1蛋白胞外区中能够结合CD3ε或NRP2蛋白的功能片段；
所述的识别并结合ITPRIPL1的抗体为多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体、抗原结合结构域、双特异性抗体、多特异性抗体，或嵌合抗原受体中的抗原结合部。
4.根据权利要求3所述的ITPRIPL1的调节剂在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物中的用途，其特征在于，所述的功能片段的序列选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4中任意一条，或为其衍生序列，衍生方法包括：将一个以上的氨基酸进行替换、删除或插入但并未改变序列的功能。
5.根据权利要求3或4所述的ITPRIPL1的调节剂在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物中的用途，其特征在于，所述的ITPRIPL1重组蛋白与抗体恒定区形成融合蛋白或与凝血因子形成融合蛋白；或者，对所述的ITPRIPL1重组蛋白进行修饰，修饰的方式包括：聚乙二醇修饰、糖基化修饰、多聚唾液酸修饰、脂肪酸修饰、KLH修饰、生物素修饰。
6.根据权利要求3所述的ITPRIPL1的调节剂在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物中的用途，其特征在于，通过药物传递系统将所述的核酸分子导入细胞内，所述的药物传递系统包括：重组表达载体、病毒、脂质体或纳米材料。
7.根据权利要求1所述的ITPRIPL1的调节剂在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物中的用途，其特征在于，所述的调节免疫反应包括：在自身免疫反应、抑制移植排斥免疫反应、过敏反应、抗感染免疫反应、抗肿瘤免疫反应的过程中，抗原递呈细胞和T淋巴细胞的功能的调节。
8.根据权利要求7所述的ITPRIPL1的调节剂在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物中的用途，其特征在于，所述的免疫反应包括：I型糖尿病、免疫性不孕不育、器官移植后排斥反应、过敏反应、全身炎症或细胞因子风暴、感染。
9.根据权利要求1的ITPRIPL1的调节剂在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物中的用途，其特征在于，所述的肿瘤为实体瘤或血液系统肿瘤；所述的实体瘤包括：胶质瘤、肺癌、头颈部癌、胃癌、结直肠癌、甲状腺癌、食管癌、尿路上皮癌、睾丸癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌，黑色素瘤、胰腺癌或肝癌；所述的血液系统肿瘤包括：白血病或淋巴瘤。
10.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1至9中任意一项所述的用途中采用的调节剂，以及药学上可接受的载体。
11.一种分离的ITPRIPL1重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白为ITPRIPL1蛋白胞外区中能够结合CD3ε或NRP2蛋白的功能片段。
12.一种识别并结合ITPRIPL1的抗体，其特征在于，所述的抗体识别并结合ITPRIPL1蛋白的胞外区。
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