JP6530436B2 - Ｔ細胞活性化の阻害剤 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その全内容を参照によって本明細書に組み入れる、以下の２０１１年６月３０日に出願した米国仮特許出願第６１／５０３，２８２号の利益を主張するものである。

自己免疫疾患または臓器移植のモデルにおいて新たに単離された、エキソビボで増殖したまたはインビトロで誘導したＴｒｅｇを使用した細胞療法により、Ｔｒｅｇの養子免疫伝達がＴｒｅｇ対エフェクターＴ細胞の平衡を元に戻すことができ、それによりこれらの疾患に関連する自己免疫を制御することが実証されている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。しかしながら、治療戦略としての養子免疫伝達の使用は臨床へ移行するためのいくつかの課題を提示している。ヒト対象の末梢血から単離され得る自己Ｔｒｅｇの数は限られており、Ｔｒｅｇの広範囲のエキソビボでの増殖はそれらの機能性および／または純度を変化させる場合がある。単離されたＴｒｅｇはポリクローナルであるので、それらは非標的エフェクターＴ細胞に汎免疫（ｐａｎ−ｉｍｍｕｎｅ）抑制機能を与えることができる。重要なことに、養子移植したＴｒｅｇは、Ｆｏｘｐ３発現およびＴｈ１７細胞への再分化（非特許文献５）または病原性記憶Ｔ細胞（非特許文献６）を損失する場合があり、これにより自己免疫もしくは炎症を悪化する危険性を増加させるので、Ｔｒｅｇの柔軟性は重要な課題をもたらす（非特許文献７；非特許文献８）。

元の位置において抗原特異的様式でＴｒｅｇの生成を誘導する治療は養子Ｔｒｅｇ細胞療法より利点を有する。細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４（ＣＴＬＡ−４；ＣＤ１５２）はＴ細胞応答の十分に確立された負の調節因子であり、Ｔ細胞恒常性および自己寛容の維持に重要である。ＣＴＬＡ−４は同時刺激分子ＣＤ２８と同種であり、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上で発現される、同じリガンドであるＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＣＤ８６（Ｂ７．２）を共有する。しかしながら、エフェクターＴ細胞上のＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４に対するＡＰＣ上のＣＤ８０／ＣＤ８６の異なる結合は、ＣＤ２８がＴ細胞活性化を誘発し、ＣＴＬＡ−４がＴ細胞阻害を引き起こすという反対の結果を導く。

ＣＤ２８はＴ細胞上で構成的に発現され、ＣＴＬＡ−４の発現のみが、Ｔ細胞活性化後、最大で２〜３日後に誘導されるので（非特許文献９）、広範なＴ細胞活性化はＣＴＬＡ−４会合の前に起こっている。それ故、ＣＴＬＡ−４の主な役割は、Ｔ細胞活性化を阻害するというよりむしろ過剰なＴ細胞応答に対する保護として作用することである。しかしながら、ＣＴＬＡ−４のリガンドによるＣＴＬＡ−４の早期会合およびその後のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に対するＣＴＬＡ−４の架橋はＴＣＲシグナル伝達を時期尚早に減衰させる場合があり、Ｔ細胞阻害および低応答性、またはアネルギーを引き起こす。この概念は以下を含む様々な方法を使用して実験的に検証されている：（ｉ）ビーズ上での同時固定化により、または二次抗体を介してアゴニスト抗ＣＴＬＡ−４抗体を使用してＴ細胞活性化抗体（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８）を架橋すること（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）；（ｉｉ）ＡＰＣ上でＣＴＬＡ−４に対する表面結合アゴニストｓｃＦｖを分子操作すること（非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５）；（ｉｉｉ）アゴニスト抗ＣＴＬＡ−４抗体に対してＡＰＣ上で特異的抗原を認識する抗体を化学的に架橋すること（非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８）。

Ａｌｌａｎら、（２００８）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２２３：３９１−４２１ Ｊｉａｎｇら、（２００６）Ｅｘｐｅｒｔ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２：３８７−３９２ Ｒｉｌｅｙら、（２００９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３０：６５６−６６５ Ｔａｎｇら、（２０１２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ４：１１−２１ Ｋｏｅｎｅｎら、（２００８）Ｂｌｏｏｄ １１２：２３４０−２３５２ Ｚｈｏｕら、（２００９ｂ）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０：１０００−１００７ Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅら、（２００９）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：８１１−８１６ Ｚｈｏｕら、（２００９ａ）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２１：２８１−２８５ Ｊａｇｏら、（２００４）Ｃｌｉｎｉｃａｌ ＆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１３６：４６３−４７１ Ｂｌａｉｒら、（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１２−１５ ＫｒｕｍｍｅｌおよびＡｌｌｉｓｏｎ、（１９９６）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８３：２５３３−２５４０ Ｗａｌｕｎａｓら、（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２５４１−２５５０ Ｆｉｆｅら、（２００６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１６（８）：２２５２−６１ Ｇｒｉｆｆｉｎら、（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２４８（１−２）：７７−９０ Ｇｒｉｆｆｉｎら、（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（９）：４４３３−４２ Ｌｉら、（２００７）．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９（８）：５１９１−２０３ Ｒａｏら、（２００１）Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０１（２）：１３６−４５ Ｖａｓｕら、（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３（４）：２８６６−７６

Ｔｒｅｇ対エフェクターＴ細胞の平衡を元に戻すことは自己免疫疾患を治療する有望な手段である。しかしながら、Ｔｒｅｇの移入を含む細胞療法は特定の制限を有する。したがって、自己免疫疾患を治療するために抗原特異的様式でＴｒｅｇ（例えばＣＴＬＡ−４）の生成を誘導できる治療が緊急に必要とされている。

本発明は、Ｔ細胞活性化の初期段階の間、リガンドが会合した（ｌｉｇａｎｄ−ｅｎｇａｇｅｄ）細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）をＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に架橋し、それによりＴＣＲシグナル伝達を減衰し、Ｔ細胞阻害を導く、リガンドに関する。Ｔ細胞活性化を阻害できる薬剤を開発するために、ＣＴＬＡ−４に選択的に結合し、ＣＴＬＡ−４を活性化し、そのＣＴＬＡ−４をＴＣＲに共連結する（ｃｏ−ｌｉｇａｔｅ）部分を含む二重特異性融合タンパク質を生成した。従来技術のアプローチと対照的に、二
重特異性融合タンパク質を操作してＭＨＣをＣＴＬＡ−４に架橋し；その両方を次いでＴＣＲに引きつけ、免疫シナプス内にＣＴＬＡ−４／ＭＨＣＩＩ／ＴＣＲ三分子（ｔｒｉ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）複合体を生成した。

リガンドが会合した細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）を、同種異系ＭＬＲにおいて変異マウスＣＤ８０およびリンパ球活性化抗原−３を含む二重特異性融合タンパク質（ＢｓＢ）を用いてＴＣＲに架橋することにより、ＴＣＲシグナル伝達およびＦｏｘｐ３⁺制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する直接的なＴ細胞分化が減衰した。本明細書に
記載されるように、抗原特異的Ｔｒｅｇはまた、抗原特異的環境で誘導できる。ＢｓＢの短期間による非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスの治療は、血液中のＴｒｅｇを一過性に増加する自己免疫１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の発症を適度に遅延させた。しかしながら、ＢｓＢによるＮＯＤ動物の長期間の治療は、疾患の発症を顕著に遅延させ、また、糖尿病を呈している動物の指標を減少させた。非糖尿病のままであったＢｓＢで治療したマウスの膵臓の病理組織学的分析により、膵島周囲の他のＣＤ３⁺Ｔ細胞および非Ｔ細胞白血球と混合さ
れたＴｒｅｇの存在が現れた。この膵島周囲炎（ｐｅｒｉ−ｉｎｓｕｌｉｔｉｓ）は最小侵襲性膵島炎と関連し、インスリン産生β細胞の顕著な破壊はなかった。それ故、ＣＴＬＡ−４およびＭＨＣＩＩと会合でき、ＣＴＬＡ−４をＴＣＲに間接的に共連結できる二官能性タンパク質は、Ｔ１Ｄまたは他の自己免疫疾患からマウスを保護するためにインビボで抗原特異的Ｔｒｅｇを誘導できる。

特に、本発明はＣＴＬＡ−４をｐＭＨＣＩＩ複合体に架橋する二重特異性融合タンパク質を記載する。例えば、同時にＣＴＬＡ−４と会合し、そのＣＴＬＡ−４をｐＭＨＣＩＩを介してＴＣＲに架橋するように操作される変異マウスＣＤ８０（ＣＤ８０ｗ８８ａ）およびリンパ球活性化抗原−３（ＬＡＧ−３）を含む二重特異性融合タンパク質が記載される。したがって、第１の態様において、ＣＴＬＡ−４に特異的なリガンドおよびｐＭＨＣ複合体に特異的なリガンドを含む二重特異性バイオ医薬品（biologic）が提供される。

一態様において、本発明は、ＣＴＬＡ−４に特異的なリガンドおよびｐＭＨＣ複合体に特異的なリガンドを含む二重特異性バイオ医薬品を提供する。本発明に係る二重特異性バイオ医薬品は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のペプチドＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体を用いて、Ｔ細胞上に存在するＣＴＬＡ−４を架橋できる。ペプチドＭＨＣ複合体はＴ細胞上の同種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）により結合され、このことは、本発明に係る二重特異性バイオ医薬品が三者のＣＴＬＡ−４／ＭＨＣ／ＴＣＲ複合体を生じることを意味する。

本明細書に示した態様の種々の実施形態において、ＣＴＬＡ−４に特異的なリガンドは、ＣＴＬＡ−４に特異的な抗体、およびＣＤ８０（Ｂ７−１）またはＣＤ８６（Ｂ７−２）から選択される。特定の実施形態において、ＣＴＬＡ−４に特異的な抗体、およびＣＤ８０（Ｂ７−１）またはＣＤ８６（Ｂ７−２）はアゴニスト抗体である。ＣＴＬＡ−４に特異的な抗体は操作でき、ＣＤ８０およびＣＤ８６の両方はＣＴＬＡ−４に対する天然リガンドである。一態様において、ＣＤ８０はＣＤ２８よりＣＴＬＡ−４に優先的に結合し、それ故、活性化と反対にＴ細胞不活性化を促進するので、ＣＤ８０またはその変異体が使用される。

本明細書に示される態様の種々の実施形態において、ｐＭＨＣ複合体に特異的なリガンドは抗ＭＨＣ抗体およびＬＡＧ−３から選択され得る。ＬＡＧ−３ポリペプチドはＭＨＣＩＩタンパク質に対する天然リガンドである。一実施形態において、ＭＨＣはＭＨＣ−ＩＩ（ＣＤ４⁺Ｔ細胞と相互作用する）である。別の実施形態において、ＭＨＣは、ＣＤ８⁺Ｔ細胞と相互作用するＭＨＣ−Ｉである。

本発明に係る二重特異性バイオ医薬品において、ＣＴＬＡ−４に特異的なリガンドおよ
びｐＭＨＣ複合体に特異的なリガンドは好ましくはリンカーにより隔置される。リンカーは１つまたはそれ以上のポリアミノ酸配列および抗体Ｆｃドメインの形態を取ってもよい。適切なポリアミノ酸配列はＧ９（Ｇｌｙ−９）である。

本明細書に示される態様の種々の実施形態において、ＣＴＬＡ−４に特異的なリガンドはＣＤ８０、またはＣＤ２８よりＣＴＬＡ−４に対する特異性を増加させるように変異されるその変異体である。一実施形態において、変異したＣＤ８０は、マウスＣＤ８０前駆体における配列番号付けを使用して、Ｗ８８Ａ、Ｋ７５Ｇ、Ｋ７５Ｖ、Ｓ１１２Ｇ、Ｒ１２６Ｓ、Ｒ１２６Ｄ、Ｇ１２７Ｌ、Ｓ１９３Ａ、およびＳ２０４Ａ、またはそれらのヒトＣＤ８０対応物（Ｗ８４Ａ、Ｋ７１Ｇ、Ｋ７１Ｖ、Ｓ１０９Ｇ、Ｒ１２３Ｓ、Ｒ１２３Ｄ、Ｇ１２４Ｌ、Ｓ１９０Ａ、およびＳ２０１Ａ）およびさらにＲ６３Ａ、Ｍ８１Ａ、Ｎ９７Ａ、Ｅ１９６Ａから選択される１つまたはそれ以上の変異を含む。

一実施形態において、二重特異性バイオ医薬品は、変異Ｗ８４Ａ（ヒト）またはＷ８８Ａ（マウス）を含む、ＣＤ８０を含む。

特定の実施形態において、ＭＨＣＩＩ複合体に特異的なリガンドはＬＡＧ−３である。有利には、ＬＡＧ−３はｐＭＨＣＩＩに対する特異性を増加させるように変異される。例えば、ＬＡＧ−３は、Ｒ７３Ｅ、Ｒ７５Ａ、Ｒ７５ＥおよびＲ７６Ｅから選択される１つまたはそれ以上の変異を含む（Ｈｕａｒｄら、（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９４（１１）：５７４４−５７４９）。一実施形態において、ＬＡＧ−３は変異Ｒ７５Ｅを含む。

ＣＤ２８よりＣＴＬＡ−４への二重特異性融合タンパク質の選択的結合は、リガンドとして、アミノ酸８８（マウスＣＤ８０において番号付けした）においてトリプトファンの代わりにアラニンを含有する、変異体ＣＤ８０（ＣＤ８０ｗ８８ａ）を使用して達成された。ＣＤ８０ｗ８８ａはＣＴＬＡ−４に結合するが、ＣＤ２８に対して最小親和性を示す（Ｗｕら、（１９９７）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１３２７−１３３５）。

リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）、ＭＨＣＩＩの天然リガンドは二重特異性融合タンパク質の他の結合成分として選択された（Ｂａｉｘｅｒａｓら、（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：３２７−３３７；Ｔｒｉｅｂｅｌら、（１９９０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：１３９３−１４０５）。我々は、このような二官能性を有する融合タンパク質がＴ細胞活性化を効果的に阻害し、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０およびＴＧＦ−β産生を刺激することを示す。より重要なことに、この二重特異性融合タンパク質はまた、高い抑制性のＦｏｘｐ３⁺ＴｒｅｇへのＴ細胞分化を導いた。これは、十分に確立
された同時刺激阻害剤ＣＴＬＡ−４Ｉｇを代わりに使用した場合、起こらなかった（Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅら、（２００６）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２４：２３３−２３８；ＬｉｎｓｌｅｙおよびＮａｄｌｅｒ（２００９）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２２９：３０７−３２１）。したがって、Ｔ細胞活性化の間のＴＣＲに対するＣＴＬＡ−４の早期会合およびＣＴＬＡ−４の架橋はＴ細胞分化に能動的に影響を与えることができる。それ故、このような二重特異性融合タンパク質は、自己免疫疾患における過剰なＴ細胞応答を制御するために使用できるバイオ医薬品の新規クラスを表すことができる。

本発明の第２の態様において、Ｔ細胞を、ＭＨＣ分子と複合体化した抗原に由来するペプチドを提示する抗原提示細胞および二重特異性バイオ医薬品と接触させることによる前記Ｔ細胞の寛容化のための、本発明の第１の態様に係るＣＴＬＡ−４に特異的なリガンドおよびｐＭＨＣ複合体に特異的なリガンドを含む前記二重特異性バイオ医薬品の使用が提供される。

第３の態様において、自己免疫疾患および移植片拒絶反応から選択される疾患の治療における、本発明の第１の態様に係るＣＴＬＡ−４に特異的なリガンドおよびｐＭＨＣ複合体に特異的なリガンドを含む二重特異性バイオ医薬品の使用が提供される。

例えば、自己免疫疾患は、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（潰瘍性大腸炎（ＵＣ）およびクローン病（ＣＤ）を含む）、多発性硬化症（ＭＳ）、強皮症、ならびにＰＶ（尋常性天疱瘡）、乾癬、アトピー性皮膚炎、セリアック病、慢性閉塞性肺疾患、橋本甲状腺炎、グレーブス病（甲状腺）、シェーグレン症候群、ギラン・バレー症候群、グッドパスチャー症候群、アジソン病、ウェゲナー肉芽腫症、原発性胆汁性硬化症（ｐｒｉｍａｒｙ ｂｉｌｉａｒｙ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎、リウマチ性多発性筋痛、レイノー現象、側頭動脈炎、巨細胞性動脈炎、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、結節性多発動脈炎、ベーチェット病、原発性胆汁性肝硬変（ｐｒｉｍａｒｙ ｂｉｌａｒｙ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、ブドウ膜炎、心筋炎、リウマチ熱、強直性脊椎炎、糸球体腎炎（ｇｌｏｍｅｒｕｌｅｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、サルコイドーシス、皮膚筋炎、重症筋無力症、多発性筋炎、円形脱毛症、および白斑（ｖｉｔｉｌｇｏ）のような他の疾患および障害である。

第４の態様において、Ｔ細胞を、ＭＨＣ分子と複合体化した抗原に由来するペプチドを提示する抗原提示細胞および本発明の第１の態様に係る二重特異性バイオ医薬品と接触させる工程を含む、前記抗原に対して前記Ｔ細胞を寛容化する方法が提供される。

第５の態様において、本発明の第１の態様に係るＣＴＬＡ−４に特異的なリガンドおよびｐＭＨＣ複合体に特異的なリガンドを含む二重特異性バイオ医薬品を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、自己免疫疾患および移植片拒絶反応から選択される状態に罹患している対象を治療する方法が提供される。

例えば、自己免疫疾患は１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）である。

ＢｓＢおよびＢｓＢΔの設計を示す図である。（Ａ）ＢｓＢ（二重特異性バイオ医薬品）およびＢｓＢΔ融合タンパク質の概略図。（Ｂ）免疫シナプスにおけるｐＭＨＣＩＩ、ＴＣＲおよび同時刺激分子、ならびにＣＴＬＡ−４／ＭＨＣ ＩＩ／ＴＣＲ三分子複合体を介するＴＣＲへのＣＴＬＡ−４のＢｓＢ媒介性架橋について提案されるスキームの概略図。融合タンパク質はＣＴＬＡ−４と会合し、免疫シナプスにおけるＭＨＣＩＩへの結合を介してＴＣＲと間接的に連結する。三角形の２つの実線の辺はＭＨＣＩＩおよびＣＴＬＡ−４ならびにＭＨＣＩＩおよびＴＣＲの架橋を示し；破線の辺はＴＣＲへのＣＴＬＡ−４の連結を示す。点線はＢｓＢが会合したＣＴＬＡ−４によるＴＣＲシグナル伝達の阻害を示す。Ｃ．ＢｓＢΔの作用が、ＴＣＲに連結できないことを除いてＢｓＢの作用と同様であることを示す概略図。 混合リンパ球反応におけるＢｓＢによる同種異系Ｔ細胞活性化の阻害を示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の天然Ｔ細胞およびＬＰＳで処置し、放射線照射したＢＡＬＢ／ｃＡＰＣを２日間試験構築物と混合した。次いで培養培地を採取し、ＩＬ−２についてアッセイした。培地中の減少した量のＩＬ−２により示されるようにＢｓＢおよびＣＴＬＡ−４ＩｇのみがＴ細胞活性化を阻害した。この図は同様の研究であるが５回より多い独立した研究を代表するものである。 ＢｓＢによるＦｏｘｐ３⁺Ｔｒｅｇの誘導ならびにＩＬ−１０およびＴＧＦ−β産生を示す図である。（Ａ）同種異系混合リンパ球反応を、試験構築物の存在下でＦｏｘｐ３−ＥＧＦＰノックインマウスから単離した天然ＣＤ４⁺ＣＤ６２Ｌ^hiＣＤ２５^-ＧＦＰ’’細胞を使用して、図２の説明に記載したように設定した。活性化後５日に、ＣＤ４⁺Ｔ細胞をフローサイトメトリーによりＧＦＰ発現について分析した。ＧＦＰ⁺およびＣＤ２５⁺細胞としてＴｒｅｇにゲートをかけた。ＢｓＢ処置のみがＧＦＰ発現を導き、Ｆｏｘｐ３⁺Ｔｒｅｇの誘導を示す（真ん中の左パネル）。サイトカイン分析（右パネル）のために培養培地を収集し、これはＢｓＢの存在下で向上したＩＬ−１０およびＴＧＦ−βレベルを現した。このデータは同様の研究であるが複数の独立した研究を代表するものである。（Ｂ）Ｔｒｅｇ誘導についての自己分泌ＴＧＦ−βの要求が、ＴＧＦ−βに対する遮断抗体の存在下でＴｒｅｇ誘導の完全な遮断により示されるのに対して、対照ＡｂはＴｒｅｇ誘導に顕著な影響を与えなかった。 インビトロでの抗原特異的ＴｒｅｇのＢｓＢ媒介性誘導を示す図である。（Ａ）Ｏｖａ_233-339特異的Ｔｒｅｇのインビトロでの誘導。天然ＯＴ−ＩＩ Ｔ細胞を、０．５μｇ／ｍｌのＯｖａ_233-239ペプチドの存在下でＬＰＳにより活性化し、放射線照射した同系ＡＰＣと混合した。次いで対照ｍＩｇＧ２ａ、ＢｓＢ、およびＢｓＢプラス抗ＴＧＦ−β抗体（αＴＧＦ−β）を加え、示した（左パネル）ように試験した。細胞を５日間培養し、次いでフローサイトメトリーにより分析する前に抗ＣＤ２５および抗Ｆｏｘｐ３抗体で標識した。培養培地中のＩＬ−２、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βレベルをＥＬＩＳＡによりアッセイした（右パネル）。（Ｂ）誘導したＴｒｅｇ増殖のモニタリング。ＡＰＣと混合する前に天然ＯＴ−ＩＩ Ｔ細胞をＣＦＳＥで予め標識したことを除いてＡのように研究を実施した。Ｆｏｘｐ３およびＣＦＳＥ蛍光チャネル上で細胞にゲートをかけた。 ＢｓＢ誘導性Ｔｒｅｇの抑制機能を示す図である。（Ａ）ＢｓＢ誘導性またはＴＧＦ−β誘導性Ｔｒｅｇをフローサイトメトリーにより精製し、トランスウェル（黒塗りの柱）または通常の培養ウェル（ハッチング線の柱）中で示した割合にてＣ５７ＢＬ／６マウスから製造したＣＦＳＥ標識した天然応答Ｔ細胞と混合した。ＬＰＳで処置した同種異系ＢＡＬＢ／ｃ ＡＰＣを加えてＴ細胞活性化を刺激した。その結果（平均＋標準偏差）は、１００％に設定したＴｒｅｇを含まないＣＦＳＥ希釈（Ｔｒｅｓｐ＋ＡＰＣのみ）に基づいた増殖応答Ｔ細胞（Ｔｒｅｓｐ）の百分率を示す。（Ｂ）抗ＩＬ−１０および抗ＴＧＦ−β抗体を１：１のＴｒｅｓｐ：Ｔｒｅｇ比にて通常の培養ウェル中の細胞に加えて、Ｔ細胞増殖に対するサイトカインの寄与を決定した。抗ＴＧＦ−β抗体は、ＴＧＦ−β誘導性Ｔｒｅｇの抑制機能を部分的に阻害した（左パネル）が、ＢｓＢ誘導性Ｔｒｅｇに影響を与えなかった（右パネル）。この図は同様の研究であるが３回より多い独立した研究を代表するものである。 ＢｓＢによるＡＫＴおよびｍＴＯＲリン酸化の下方制御を示す図である。天然Ｔ細胞を、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８およびＢｓＢ、マウスＩｇＧ（ｍＩｇＧ）またはマウスＰＤ−Ｌ１（ｍＰＤ−Ｌ１）で１８時間同時コーティングした丸底９６ウェルプレート中で培養した。活性化しなかったとみなした細胞をＩｇＧのみでコーティングしたウェル中で培養した。次いでＡＫＴおよびｍＴＯＲのリン酸化状態を、リン酸化ＡＫＴおよびｍＴＯＲに対する蛍光標識抗体で染色した後、フローサイトメトリーによりモニターした。ＭＦＩは平均蛍光強度を示す。この図は３回の独立した実験のうちの１回を表す。 ＢｓＢでの連続刺激に応答するＴｒｅｇにおける持続性Ｆｏｘｐ３発現を示す図である。丸底９６ウェルプレートを、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８およびＢｓＢまたはマウスＩｇＧで同時コーティングした。Ｆｏｘｐ３−ＥＧＦＰノックインマウス由来の天然Ｔ細胞を５日間培養してＴｒｅｇを誘導し（左パネル）、次いでそのＴｒｅｇをＢｓＢで処置した細胞から精製し（赤の四角）、ＧＦＰ⁺細胞についてのフローサイトメトリーによる分析の前に５日間、上記のように同時コーティングしたウェル中の培養の別のラウンドで再刺激した。５日間のマウスＩｇＧ対照との精製したＴｒｅｇの再培養の結果、約６０％の細胞においてＦｏｘｐ３⁺発現の損失が生じた（上側右パネルの上側右の四分円）のに対して、ＢｓＢと再培養したＴｒｅｇの７％未満がＦｏｘｐ３⁺発現を損失した（下側右パネルの上側右の四分円）。この図は３回の独立した実験のうちの１回を表す。 インビボにおけるＢｓＢの薬物動態および生化学分析を示す図である。（Ａ）マウスにおけるＢｓＢの薬物動態プロファイル。正常なＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）に２０ｍｇ／ｋｇのＢｓＢを腹腔内に投与した。血液サンプルを示した異なる時点で採取し、ＥＬＩＳＡを使用してＢｓＢレベルのレベルを決定した。（Ｂ）ＦｃＲｎへのＢｓＢおよびマウスＩｇＧ２ａの結合の比較。ＦｃＲｎをＢｉａｃｏｒｅチップに固定した。ＢｓＢまたは対照マウスＩｇＧ２ａを種々の濃度でチップ上に負荷し、次いでシグナルを記録した。 ＢｓＢにおけるアスパラギン連結グリコシル化の分析を示す図である。ＢｓＢのアミノ酸配列を、Ａｓｎ連結グリコシル化部位を予測するためにＮｅｔＮＧｌｙｃ１．０サーバーに供した。全部で１０個のＡｓｎ連結グリコシル化部位（Ｎで示した）を予測し；他のアミノ酸は点で示す。ＢｓＢの単糖組成もまた、グリカンフコース（Ｆｕｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）の組成を決定するために実施した。０．６８のシアル酸：ガラクトース比は、ガラクトース残基の約３分の１がアシアログリコプロテイン受容体への結合に利用可能であることを示す。 ＢｓＢによる非糖尿病（ＮＯＤ）マウスの処置は後期予防治療パラダイムにおいて１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の発症を遅延させたことを示す図である。（Ａ）ＢｓＢで処置したＮＯＤ（閉じた円、ｎ＝１５）および生理食塩水で処置した対照ＮＯＤマウス（閉じた三角形、ｎ＝１４）の血液中のＦｏｘｐ３⁺Ｔｒｅｇのレベル。対照動物において示したものよりもＢｓＢで処置した動物においてＴｒｅｇの数はわずかだが有意に増加した。（Ｂ）ＢｓＢ（黒塗りの円）または生理食塩水（黒塗りの三角形）で処置したＮＯＤ動物における顕性糖尿病の累積発現率。 ＢｓＢによるＮＯＤマウスの処置は早期予防治療パラダイムにおいてＴ１Ｄの発症を遅延させたことを示す図である。（Ａ）ＢｓＢ（閉じた円、ｎ＝１０）、生理食塩水（閉じた三角形、ｎ＝１０）、ＣＴＬＡ−４Ｉｇ（閉じた四角形、ｎ＝１０）およびマウスＩｇＧ２ａ（開いた四角形、ｎ＝１０）で処置したマウスの血液中のＦｏｘｐ３⁺Ｔｒｅｇのレベル。生理食塩水またはｍＩｇＧ２ａで処置した対照と比較してＢｓＢによる処置の２週間後にＦｏｘｐ３⁺Ｔｒｅｇの数の増加は検出されなかった。しかしながら、ＣＴＬＡ−４Ｉｇでの処置の結果、血液中のＦｏｘｐ３⁺Ｔｒｅｇの数の統計的に有意な減少が生じた。（Ｂ）ＢｓＢまたは対照で処置した動物における顕性糖尿病の累積発現率。ＢｓＢ処置の結果、２４週齢の前に生理食塩水またはマウスＩｇＧ２ａで処置した対照群と比較してＴ１Ｄの発症の有意な遅延が生じた（ｐ＝０．０４）。しかしながら、群間の有意な差は研究の終わりに示されなかった。データは、各群において合計２６匹のＮＯＤマウスを用いて、同様の結果を有する２回の別々の研究のうちの１回を表す。 ＢｓＢによるＮＯＤマウスの長期間の処置はＮＯＤマウスにおけるＴ１Ｄの発症を顕著に遅延させたことを示す図である。（Ａ）ＢｓＢで処置した（ｎ＝１６）および未処置のマウス（ｎ＝１６）における顕性糖尿病の累積発現率。ＢｓＢでの処置は生理食塩水で処置したものと比較してＴ１Ｄの発現率を顕著に減少させた（ｐ＜０．０１）。（Ｂ）生理食塩水またはＢｓＢで処置した動物由来の膵臓組織の病理組織学的分析。パネルａ〜ｃは、Ｈ＆Ｅ、インスリンに対する抗体、または抗ＣＤ３およびフォークヘッドボックスＰ３（Ｆｏｘｐ３）のそれぞれを有する、非糖尿病のままである生理食塩水で処置したマウス由来の切片を表す。同様の観察が無病のままであるＢｓＢで処置したＮＯＤマウスにおいて示された。切片のいずれにおいても浸潤または膵島炎の証拠は示されず；少数のＦｏｘｐ３⁺Ｔｒｅｇが存在し得る（パネルｃにおける矢印）。パネルｄ〜ｆは糖尿病ＮＯＤ動物由来の膵臓切片を表す。侵襲的膵島炎が明確に示され、インスリン産生β細胞は完全に破壊した（ｅ）。一部のＣＤ３⁺Ｔ細胞浸潤もまた、少数のＴｒｅｇおよび青色の核を有する多くの非Ｔ細胞白血球と共に検出した（ｆ）。パネルｇ〜ｉは、特徴的な膵島周囲炎を示した非糖尿病のままであるＢｓＢで処置した動物の膵島を示す。膵島の周辺に制限されているが、白血球浸潤が示された。さらに、それらはインスリン産生β細胞の顕著な破壊がなかった。周辺における白血球の大部分は非Ｔ細胞（青色の核）であった。拡大した膵島（パネルｊ、ｉにおいて赤色の四角を表す）は、Ｆｏｘｐ３⁺Ｔｒｅｇ（黄色の矢印のヘッド）が、膵島の周辺において他のＣＤ３⁺Ｔ細胞および非Ｔ細胞白血球（青色の核）と混合されていることを示した。画像は４０倍の対物レンズを用いて獲得し；膵島は６０倍の対物レンズを用いて獲得し、次いでそれをデジタルで３倍にさらに拡大した。

他に記載しない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または等価の機能を有する任意の方法および材料が本発明を実施または試験するのに使用されてもよい。このような使用に適切な方法、装置、および材料をここで記載する。本明細書に引用される全ての刊行物は、本発明に関連して使用され得るその刊行物に報告されている方法論、試薬、および機器を記載し、開示する目的のために、その全体の参照によって本明細書に組み入れる。

本出願の方法および技術は概して、当業者に周知であり、他に示されない限り、本明細書全体を通して引用され、説明されている様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載されている従来の方法に従って実施される。そのような技術は文献に完全に説明されている。例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．編（１９９０）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．；Ｈａｒｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．、Ｌｉｍｂｉｒｄ，Ｌ．Ｅ．、およびＧｉｌｍａｎ，Ａ．Ｇ．編（２００１）Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第１０版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｃｏ．；Ｃｏｌｏｗｉｃｋ，Ｓ．ら編、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．、およびＢｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｃ．Ｃ．編（１９８６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ−ＩＶ巻、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら、編（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｉ−ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、編（１９９９）Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；Ｒｅａｍら、編（１９９８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｎ Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｎｅｗｔｏｎ，Ｃ．Ｒ．、およびＧｒａｈａｍ，Ａ．、編（１９９７）ＰＣＲ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｓｅｒｉｅｓ）、第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇを参照のこと。

他に示されない限り、「抗体」という用語は、完全な抗体およびそのような抗体の抗原結合断片を指すために使用される。例えば、その用語は４本の鎖のＩｇＧ分子、および抗体断片を包含する。

本明細書に使用される場合、「抗体断片」という用語は、インタクトな抗体の抗原結合または可変領域のようなインタクトな完全長抗体の部分を指す。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、およびＦｖ断片；ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）
；線形抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；二重特異性、三重特異性、および多特異性抗体のような多特異的抗体断片（例えば、ダイアボディ、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ））；結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質；ラクダ化抗体；ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）；キレート組換え抗体；トリアボディまたはバイボディ（ｂｉｂｏｄｉｅｓ）；イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ）；ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ）；小モジュラー免疫薬剤（ｓｍａｌｌ ｍｏｄｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）（ＳＭＩＰ
）、Ｖ_HH含有抗体；および例えば、以下にさらに記載されている抗体断片から形成される任意の他のポリペプチドが含まれる。

抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭのような任意のクラス；およびＩｇＧ１またはＩｇＧ４のような任意のサブクラスであってもよい。免疫グロブリンの異なるクラスおよびサブクラスは、異なる用途において利点があり得る、異なる特性を有する。

特に、本発明の文脈において、特許請求に係る抗体は、ＣＴＬＡ−４またはｐＭＨＣ複合体のいずれかである、その定義される同種抗原に選択的に結合できることを必要とする。

天然に存在する免疫グロブリンは、２本の同一の軽鎖（約２４ｋＤ）および２本の同一の重鎖（約５５または７０ｋＤ）が四量体を形成する共通のコア構造を有する。各鎖のアミノ末端部分は可変（Ｖ）領域として知られており、各鎖の残りのより保存される定常（Ｃ）領域から識別され得る。軽鎖の可変領域（Ｖ_Lドメインとも呼ばれる）内にＪ領域と
して知られているＣ末端部分がある。重鎖の可変領域（Ｖ_Hドメインとも呼ばれる）内に
Ｊ領域に加えてＤ領域が存在する。免疫グロブリンにおけるアミノ酸配列変異のほとんどは、抗原結合に直接関与する超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られているＶ領域における３つの別個の位置に限定される。アミノ末端から開始して、これらの領域はそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と指定される。ＣＤＲはより保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）により所定の位置に保持される。アミノ末端から開始して、これらの領域はそれぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４と指定される。ＣＤＲおよびＦＲ領域の位置および番号付けシステムは、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｕ．Ｓ． Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉｃｅにより定義されており、その更新情報はオンラインで見つけることができる。

本明細書で参照される、ヒト化モノクローナル抗体はヒト抗体フレームワークからなる抗体であり、そのヒト抗体フレームワーク内に非ヒト抗体由来の移植されたＣＤＲが存在している。ヒト化抗体を設計し、産生するための手順は当技術分野において周知であり、例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許出願公開第０ １２５ ０２３号；Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号；Ｂｏｓｓら、欧州特許出願公開第０ １２０ ６９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、ＷＯ８６／０１５３３；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、欧州特許出願公開第０ １９４ ２７６（Ｂｌ）号；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号；Ｗｉｎｔｅｒ、欧州特許出願公開第０ ２３９ ４００号；Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．ら、欧州特許出願公開第０ ５１９ ５９６号に記載されている。抗体、ヒト化抗体、ヒト操作抗体、およびそれらの製造方法についての詳細は、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．およびＤｕｂｅｌ，Ｓ．編（２００１、２０１０）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、２００１に見出され得る。

定常領域は任意のヒト抗体定常領域に由来してもよい。典型的に、可変領域遺伝子は重および軽免疫グロブリン鎖を発現するために定常領域遺伝子を有するフレームにおいて発現ベクター内にクローニングされる。そのような発現ベクターは抗体合成のための抗体産生宿主細胞内にトランスフェクトされてもよい。

必要とされる抗体可変および定常領域は配列データベースに由来してもよい。例えば、
免疫グロブリン配列はＩＭＧＴ／ＬＩＧＭデータベース（Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉら、（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４：（ｓｕｐｐｌ．１）：Ｄ７８１−Ｄ７８４）またはＶＢａｓｅ（ｖｂａｓｅ．ｍｒｃｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ）において利用可能である。

本明細書に参照される「核酸」は典型的に本発明の抗体をコードするＤＮＡ分子を含む。宿主細胞中で抗体遺伝子を発現するのに適している発現ベクターが好ましい。抗体遺伝子発現のための発現ベクターおよび宿主細胞は当技術分野において公知である；例えば、Ｍｏｒｒｏｗ，Ｋ．Ｊ．（２００８）Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｎｅｗｓ．（２００８、６月１５日）２８（１２）、ならびにＢａｃｋｌｉｗａｌ，Ｇ．ら（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３６（１５）：ｅ９６−ｅ９６を参照のこと。

本明細書に使用される場合、「ＣＤ８０」とは、ＣＴＬＡ−４に対する増加した結合親和力または特異性を有する哺乳動物ＣＤ８０抗原およびその変異体を指す。参照によって本明細書に組み入れる、Ｌｉｎｓｌｅｙら、（１９９４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：７９３−８０１、およびＷｕら、（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５（７）：１３２７−１３３５を参照のこと。哺乳動物ＣＤ８０はマウスのような齧歯動物、またはヒトＣＤ８０から選択されてもよい。

本明細書に使用される場合、「ＣＤ８６」とは、ＣＴＬＡ−４に対する増加した結合親和性または特異性を有する哺乳動物ＣＤ８６抗原およびその変異体を指す。参照によって本明細書に組み入れる、Ｌｉｎｓｌｅｙら、（１９９４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：７９３−８０１を参照のこと。哺乳動物ＣＤ８６はマウスのような齧歯動物、またはヒトＣＤ８６から選択されてもよい。

本明細書に使用される場合、「ＣＴＬＡ−４」とは、哺乳動物細胞傷害性リンパ球関連抗原−４（ＣＴＬＡ−４）を指す。ヒトＣＴＬＡ−４の配列はＧｅｎＢａｎｋ、アクセッション番号ＡＡＨ７４８９３．１、ＧＩ：４９９０４７４１に見出され得る。哺乳動物ＣＴＬＡ−４はマウスのような齧歯動物、またはヒトＣＴＬＡ−４から選択されてもよい。

本明細書に使用される場合、「ＬＡＧ−３」とは、哺乳動物リンパ球活性化抗原３（ＬＡＧ−３）を指す。ヒトＬＡＧ−３についての配列は、参照によって本明細書に組み入れる、Ｈｕａｒｄら、（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ９４：５７４４−５７４９に見出され得る。哺乳動物ＬＡＧ−３はマウスのような齧歯動物、またはヒトＬＡＧ−３から選択されてもよい。

「ＭＨＣ」は、ＴＣＲにより認識される、抗原提示細胞による抗原由来ペプチドの提示に関連する複合体である。特定の態様において、ＭＨＣは、ＣＤ４⁺ヘルパーＴ細胞に対
する抗原を提示する、ＭＨＣＩＩである。例えば、Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｇら、ＣＳＨ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｂｉｏｌ．２（４）：ａ００５１４０、ｅｐｕｂ２０１０ ３月１７日を参照のこと。

二重特異性リガンドと称され得る、二重特異性バイオ医薬品は、２つの標的に同時に結合できるか、または結合され得るリガンドである。二重特異性抗体は当技術分野において公知であり、以下にさらに記載されている。本発明の文脈において、２つの標的はＴ細胞上のＣＴＬＡ−４分子およびＡＰＣ上のＭＨＣペプチド複合体である。本発明に係る二重特異性バイオ医薬品は２つの標的を架橋でき；免疫シナプスにおけるＴＣＲへのｐＭＨＣ結合によって、その二重特異性バイオ医薬品はＣＴＬＡ−４分子をＴＣＲに架橋する。「バイオ医薬品」は一般に生物学的治療剤または生物学的治療薬であり、とりわけ、治療、
診断および／または研究目的のために有用であり得る。

リンカーは、タンパク質内の２つのポリペプチドドメインを結合し、分離する任意のアミノ酸配列である。本発明の二重特異性リガンドの文脈において、リンカーはＣＴＬＡ−４リガンドをＭＨＣリガンドに結合する配列である。例示的なリンカーは、ポリグリシン、例えばＧｌｙ−９のようなアミノ酸の配列である。代替のリンカーは抗体Ｆｃ領域である。そのようなリンカーは２つのリガンドドメインに約１２０Å間隔をあける。

本発明に係るリガンドは任意の組合せで抗体および非抗体リガンドを含んでもよい。例えば、ＣＴＬＡ−４リガンドは抗ＣＴＬＡ−４抗体であってもよく、ＭＨＣリガンドはＬＡＧ−３であってもよい。代替として、ＣＤ８０は、ＬＡＧ−３または抗ＭＨＣ抗体と組み合わせてＣＴＬＡ−４リガンドとして使用されてもよい。両方のリガンドは抗体であってもよいか、または両方は天然リガンド、ＣＤ８０およびＬＡＧ−３であってもよい。

細胞傷害性リンパ球関連抗原−４（ＣＴＬＡ−４）
ＣＤ１５２としても知られている、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４（ＣＴＬＡ−４）は、Ｔ細胞恒常性の維持および自己寛容の誘導において重要な役割を果たす、Ｔ細胞応答の負の調節因子である（Ｋａｒａｎｄｉｋａｒら、（１９９６）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８４：７８３−７８８；ＫｒｕｍｍｅｌおよびＡｌｌｉｓｏｎ、（１９９５）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８２：４５９−４６５；ＬｉｎｓｌｅｙおよびＧｏｌｓｔｅｉｎ、（１９９６）Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ ６：３９８−４００；ＷａｌｕｎａｓおよびＢｌｕｅｓｔｏｎｅ、（１９９８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６０：３８５５−３８６０；Ｗａｌｕｎａｓら、（１９９４）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６０：３８５５−３８６０）。ＣＴＬＡ−４を欠損しているマウスは多臓器自己免疫疾患を発症し、典型的に４週齢までに病気で死ぬ（Ｔｉｖｏｌら、（１９９５）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３：５４１−５４７；Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：９８５−９８８）。ＣＴＬＡ−４がＴ細胞活性を調節する分子機構は多面的であり、本質的に従来のＴ細胞上でまたは外発的に制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を介してのいずれかで発生すると考えられる（Ｉｓｅら、（２０１０）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１：１２９−１３５；Ｊａｉｎら、（２０１０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０７：１５２４−１５２８；ＰａｔｅｒｓｏｎおよびＳｈａｒｐｅ、（２０１０）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１：１０９−１１１）。

これらの機構は、リガンド結合に関してＣＤ２８と競合すること（Ｌｉｎｓｌｅｙら、（１９９４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：７９３−８０１）、ＡＰＣ内で寛容原性酵素インドールアミン２，３ジオキシゲナーゼの産生を誘導すること（Ｇｒｏｈｍａｎｎら、（２００２）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３：１０９７−１１０１；Ｏｎｏｄｅｒａら、（２００９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８３：５６０８−５６１４）、および免疫シナプスからＣＤ２８を移動させること（Ｐｅｎｔｃｈｅｖａ−Ｈｏａｎｇら、（２００４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２１：４０１：４１３）を含む。ＣＴＬＡ−４は同時刺激分子ＣＤ２８と相同性があり、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面で発現される、同じリガンド、ＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＣＤ８６（Ｂ７．２）を共有する。しかしながら、エフェクターＴ細胞上のＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４へのＡＰＣ上のＣＤ８０／ＣＤ８６の異なる結合は、ＣＤ２８がＴ細胞活性を誘発し、ＣＴＬＡ−４がＴ細胞阻害を引き起こすという反対の結果を導く。ＡＰＣ上のそのリガンド（ＣＤ８０／８６）によるＣＴＬＡ−４の会合もまた、ホスファターゼＳＨＰ−１（ＧｕｎｔｅｒｍａｎｎおよびＡｌｅｘａｎｄｅｒ、（２００２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６８：４４２０−４４２９）および活性化を受けているＴ細胞のＴＣＲに近接するＰＰ２Ａ（Ｂａｒｏｊａら、（２００２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６８：５０７０−５０７８；Ｃｈｕａｎｇら、（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：３１３−３２２）の動員を刺激する。ＴＣＲに関連する重要なシグナル伝達分子の結果として起こる
脱リン酸化により、Ｔ細胞活性化の終了が起こる（Ｇｒｉｆｆｉｎら、（２０００）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：４４３３−４４４２）。さらに、そのリガンドとのＣＴＬＡ−４の早期会合およびＴＣＲへの架橋を促進する介入により、重要なシグナル伝達特徴の早すぎる減衰が生じ、その結果としてＴ細胞活性化の阻害が起こり、Ｔ細胞低応答性またはアネルギーを導く（Ｂｌａｉｒら、（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｌ １６０：１２−１５；Ｇｒｉｆｆｉｎら、（２０００）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：４４３３−４４４２；ＫｒｕｍｍｅｌおよびＡｌｌｉｓｏｎ、（１９９６）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８２：４５９−４６５；Ｗａｌｕｎａｓら、（１９９６）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８３：２５４１−２５５０）。

Ｔ細胞活性化の早期段階の間のＴＣＲへのＣＴＬＡ−４の架橋を促進するために、変異体ＣＤ８０（ＣＤ８０ｗ８８ａ）およびリンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）を含む二重特異性融合タンパク質（「ＢｓＢ」と指定した）を生成した。ＢｓＢは免疫シナプスにおいてＣＴＬＡ−４およびＭＨＣＩＩを同時に会合するように設計したので、ＴＣＲとのＭＨＣＩＩの同種対合を介してそのＢｓＢをＴＣＲへ間接的に架橋する（Ｋａｒｍａｎら、（２０１２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ｅｐｕｂ ２０１２ ２月１５日）。同種異系ＭＬＲにおいて、ＢｓＢはＴ細胞活性化を阻害するのに効果的であることが示された。驚くべきことに、ＢｓＢはまた、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βの産生を誘導し、Ｔｒｅｇに対する活性化を受けているＴ細胞の分化を促進した。ＩＬ−１０は、マクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）、ならびに自己制御Ｔｈ１細胞の活性化を制御するその能力により広範な免疫抑制特性を与えることができる（Ｏｈａｔａら、（２００７）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ５６：２９４７−２９５６）。ＴＧＦ−βは、Ｔ細胞分化（Ｋｅｈｒｌら、（１９８６）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６３：１０３７−１０５０）、マクロファージ活性化（Ｔｓｕｎａｗａｋｉら、（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：２６０−２６２；Ｗａｈｌら、（１９９０）Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ５９３：１８８−１９６）および樹状細胞成熟（Ｓｔｅｉｎｍａｎら、（２００３）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２１：６８５−７１１）の阻害剤として作用できる。それらの抗炎症機能に加えて、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βはまた、Ｔｒｅｇ機能に意図的に影響を与えることができる。例えば、ＩＬ−１０は、ＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞を誘導し（Ｒｏｎｃａｒｏｌｏら、（２００６）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２１２：２８−５０）、Ｆｏｘｐ３の発現を維持するためにＦｏｘｐ３⁺Ｔｒｅｇに作用するので、それらの抑制機能を伝播するこ
とが示されている（Ｍｕｒａｉら、（２００９）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０：１１７８−１１８４）。同様に、ＴＧＦ−βは、Ｔｒｅｇの誘導のために（Ｃｈｅｎら、（２００３）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９８：１８７５−１８８６；Ｚｈｅｎｇら、（２００２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９：４１８３−４１８９）、およびＦｏｘｐ３発現を促進することによってそれらの抑制機能を維持するのに（Ｍａｒｉｅら、（２００５）Ｊ Ｅｘｐ
Ｍｅｄ ２０１：１０６１−１０６７）必要であることが報告されている。

制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）
Ｔｒｅｇは自己および非自己抗原に対する免疫応答を制御できるＴ細胞の機能的に異なる亜集団である。Ｔｒｅｇの欠損は増大した免疫応答および自己免疫疾患の提示を生じる（Ｓａｋａｇｕｃｈｉら、（１９９５）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５５：１１５１−１１６４）。広範な研究により、免疫応答の全ての態様を制御する際、特に自己寛容を生じる際のこれらの特異的なＴ細胞の役割が確立されている。特定の理論に束縛されずに、これらの見解は、Ｔｒｅｇのその場の産生を上昇できる因子またはＴｒｅｇの養子免疫伝達が自己免疫疾患を治療するために配置され得ることを示している。実際に、新たに単離されたまたはエキソビボで増殖したＴｒｅｇを使用したＴｒｅｇ細胞ベースの治療は、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）（Ｔａｎｇら、（２００４）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９：１４５５−１４６５；Ｔａｒｂｅｌｌら、（２００７）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０４：１９１−２０１）および移植片対宿主拒絶反応（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、（２００４）；Ｔａｙｌｏｒら、（
２００２）Ｂｌｏｏｄ ９９：３４９３−３４９９；Ｚｈａｏら、（２００８）Ｂｌｏｏｄ １１２：２１２９−２１３８）の動物モデルを治療するのに効果的であることが示されている。末梢血またはリンパ節由来のＦｏｘｐ３⁺ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔｒｅｇ（多くの
場合、天然ＴｒｅｇまたはｎＴｒｅｇと指定されている）を単離し、増殖する代わりに、Ｔｒｅｇは、ＴＣＲ活性化に関して、およびＴＧＦ−βの同時存在下で未処置のＣＤ４⁺
ＣＤ２５^-Ｔ細胞から誘導されてもよい。

これらのＴｒｅｇは、多くの場合、適応Ｔｒｅｇ（ａＴｒｅｇ）または誘導Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）と称される。それらはまた、Ｆｏｘｐ３⁺であり、ｎＴｒｅｇと等しい有効
な抑制機能を意図的に示す（Ｃｈｅｎら、（２００３）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９８：１８７５−１８８６；Ｙａｍａｇｉｗａら、（２００１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６６：７２８２−７２８９；Ｚｈｅｎｇら、（２００２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９：４１８３−４１８９）。ａＴｒｅｇまたはｉＴｒｅｇの養子免疫伝達は、コラーゲン誘導性関節炎の動物モデルにおける自己免疫疾患に対する防御を与えるのに効果的であると示されている（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｒｅｙら、（２００６）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ５４：８６４−８７６）。しかしながら、抗原特異的Ｔｒｅｇが、汎ＴＣＲレパートリーを有し（Ｍａｓｔｅｌｌｅｒら、（２００５）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７５：３０５３−３０５９；Ｔａｎｇら、（２００４）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９：１４５５−１４６５；Ｔａｒｂｅｌｌら、（２００７）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０４：１９１−２０１）、汎免疫抑制に対する潜在的副作用をほとんど有さない、ポリクローナルＴｒｅｇより著しく高い治療指数を与えることが、より明確になっている。この理由のために、我々は、インビトロでの抗原特異的Ｔ細胞活性化環境において抗原特異的Ｔｒｅｇを産生する時のＢｓＢの相対的利点を評価することを目的とした。さらに、我々は、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスにおける自己免疫性糖尿病の治療におけるその可能性を試験した。

１型糖尿病
１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）は、高血糖の結果として発症する、インスリン産生膵臓β−細胞の組織特異的破壊により引き起こされる自己免疫疾患である。非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウス（特にメスのマウス）は、膵島特異的自己抗原（例えばインスリンおよびグルタミン酸脱炭酸酵素６５）に対して自己反応性Ｔ細胞を自然発生する。他のリンパ球と呼応して、これらの自己反応性Ｔ細胞は３〜４週齢の間に膵島周囲炎、その後、９週間で侵襲的膵島炎、および１２〜３５週間で自然発生の顕性糖尿病の発症を開始する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ、（２００５）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３：４４７−４８５）。ＮＯＤマウスは、膵臓特異的自己抗体の産生ならびに自己反応性ＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺Ｔ細胞の活性化のようなヒト対象における疾患と多くの類似性を共有する。ヒトにおけるような自己免疫に対するこれらのマウスの感受性は、主要な組織適合性複合体（ＭＨＣ）、ＣＴＬＡ−４、およびＬＡＧ−３についての遺伝子により影響を受ける。ＮＯＤマウスは特有の主要な組織適合性複合体（ＭＨＣ）ハプロタイプ（Ｈ−２^g7）を保有し、これは報告によれば疾患感受性についての最も高い危険性を与える（ＭｃＤｅｖｉｔｔら、（１９９６）Ｈｏｒｍｏｎｅ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８：２８７−２８８；Ｗｉｃｋｅｒら、（１９９５）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３：１７９−２００）。ＣＴＬＡ−４多型はまた、ＮＯＤマウス（Ｕｅｄａら、（２００３）Ｎａｔｕｒｅ ４２３：５０６−５１１）およびヒト（Ｑｕら、（２００９）Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ２７−３２）およびＬＡＧ−３の欠失において示されており、ＮＯＤバックグラウンド上のＬＡＧ−３の欠損は１００％浸透度を有してＴ１Ｄ発症を加速する（Ｂｅｔｔｉｎｉら、（２０１１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８７：３４９３−３４９８）。ＢｓＢは全てのこれらの標的と会合するので、ＢｓＢの治療メリットをＴ１Ｄのこのマウスモデルにおいて試験した。

抗体
本発明は特許請求の範囲に記載されている抗体の抗原結合断片を包含する。本明細書に使用される場合、「断片」という用語は、インタクトな抗体の抗原結合または可変領域のようなインタクトな完全長抗体の部分を指す。抗体断片の例は上記に記載している。

本明細書に使用される場合、「断片」という用語は、特定される標的、ＣＴＬＡ−４分子またはｐＭＨＣ複合体に結合できる断片を指す。これらの断片は、インタクトな抗体のＦｃ断片を欠き、循環からより迅速に除去でき、インタクトな抗体より非特異的組織結合を有することがほとんどできない。これらの断片は、例えば、（Ｆａｂ断片を産生するために）パパインもしくは（Ｆ（ａｂ）₂断片を産生するために）ペプシンのような酵素を
用いたタンパク質分解的切断、または組換え技術によるこのような断片の発現による周知の方法を使用してインタクトな抗体から産生され得る。

抗体および断片はまた、ＣＴＬＡ−４分子またはｐＭＨＣ複合体に結合する一本鎖抗体断片（ｓｃＦＶ）を包含する。ｓｃＦＶは抗体軽鎖可変領域（Ｖ_L）に作動可能に連結さ
れる抗体重鎖可変領域（Ｖ_H）を含み、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は一緒にまたは
個々に、ＣＴＬＡ−４分子またはｐＭＨＣ複合体に結合する結合部位を形成する。ｓｃＦＶはアミノ末端においてＶ_H領域およびカルボキシ末端においてＶ_L領域を含んでもよい。代替として、ｓｃＦＶはアミノ末端においてＶ_L領域およびカルボキシ末端においてＶ_H領域を含んでもよい。さらに、Ｆ_V断片の２つのドメイン、Ｖ_LおよびＶ_Hは別個の遺伝子に
よりコードされるが、一価分子（一本鎖ＦＶ（ｓｃＦＶ）として知られている）を形成するためにＶ_LおよびＶ_H領域が対になる単一タンパク質鎖としてそれらを作製できる合成リンカーによって組換え法を使用してそれらは結合されてもよい。ｓｃＦＶは、場合によりさらに、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間にポリペプチドリンカーを含んでもよい。

抗体および断片はまた、Ｖ_Hドメインからなる、Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ら（１９８９）Ｎ
ａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６に記載されているドメイン抗体（ｄＡｂ）断片を包含する。

抗体および断片はまた、重鎖抗体（ＨＣＡｂ）を包含する。これらの抗体は、それらの機能的抗体が重鎖のみの二量体（「重鎖抗体」または「ＨＣＡｂ」と称される）であるという点で、重鎖可変領域のみを使用して抗原結合領域を形成するようであり得る。したがって、抗体および断片はＣＴＬＡ−４またはｐＭＨＣ標的に特異的に結合する重鎖抗体（ＨＣＡｂ）であってもよい。

抗体および断片はまた、ＣＴＬＡ−４またはｐＭＨＣ標的に特異的なＳＭＩＰまたは結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である抗体を包含する。これらの構築物は、抗体エフェクター機能を実施するのに必要な免疫グロブリンドメインと融合される抗原結合ドメインを含む一本鎖ポリペプチドである（ＷＯ２００５／０１７１４８を参照のこと）。

抗体および断片はまた、ダイアボディを包含する。これらは、Ｖ_HおよびＶ_Lドメインが単一ポリペプチド鎖上で発現される二価抗体であるが、短すぎて同じ鎖上の２つのドメイン間を対合できないリンカーを使用する。これにより、ドメインは別の鎖の相補ドメインと強制して対合するので、２つの抗原結合部位を生成する（例えば、ＷＯ９３／１１１６１を参照のこと）。ダイアボディは二重特異性または単一特異性であってもよい。

本発明に係る抗体またはその抗体断片は、目的とするＣＴＬＡ−４またはｐＭＨＣ標的以外のいかなる標的とも交差反応しない。

抗体およびその断片はそれ自体、二重特異性であってもよい。例えば、二重特異性抗体は単一抗体（または抗体断片）と類似してもよいが、２つの異なる抗原結合部位（可変領域）を有する。二重特異性抗体は、化学技術である、「ポリドーマ（ｐｏｌｙｄｏｍａ）」技術または組換えＤＮＡ技術のような様々な方法により産生できる。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープ、例えばＣＴＬＡ−４およびｐＭＨＣ標的の各々における１つのエピトープに対する結合特異性を有してもよい。

Ｖ_HおよびＶ_L領域の相補対を含む二重特異性抗体は当技術分野において公知である。これらの二重特異性抗体はＶ_HおよびＶ_Lの２つの対を含み、各々のＶ_HＶ_L対は単一抗原またはエピトープに結合する。このような二重特異性抗体は、ハイブリッドハイブリドーマ（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．およびＣｕｅｌｌｏ，Ａ．Ｃ．、（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ ３０５（５９３４）：５３７−４０）、ミニボディ（Ｈｕら、（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３０５５−３０６１）、ダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８；ＷＯ９４／１３８０４）、キレート組換え抗体（ＣＲＡｂ）（Ｎｅｒｉら、（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４６、３６７−３７３）、ｂｉｓｃＦＶ（例えば、Ａｔｗｅｌｌら、（１９９６）Ｍｏｌ．ｌｍｍｕｎｏｌ．３３：１３０１−１３１２）、「ｋｎｏｂｓ ｉｎ ｈｏｌｅｓ」安定化抗体（Ｃａｒｔｅｒら、（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．６：７８１−７８８）を含む。各場合において、各々の抗体種は２つの抗原結合部位を含み、各々はＶ_HおよびＶ_Lドメインの相補対により形成される。これにより、各抗原またはエピトープへの結合はＶ_Hおよびその相補的Ｖ_Lドメインにより媒介されながら、各抗体は同時に２つの異なる抗原またはエピトープに結合できる。

構造的に関連しない少なくとも２つ（通常、それ以上）の異なる抗原またはエピトープと反応する、多反応性（ｐｏｌｙｒｅａｃｔｉｖｅ）である天然自己抗体が記載されている（ＣａｓａｌｉおよびＮｏｔｋｉｎｓ（１９８９）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：５１５−５３１）。また、モノクローナル抗体においてファージディスプレイ技術を使用するランダムペプチドレパートリーの選択は抗原結合部位に適合する様々なペプチド配列を識別することが示されている。配列の一部は高度に関連し、コンセンサス配列と適合するが、他のものは非常に異なり、ミモトープと呼ばれている（ＬａｎｅおよびＳｔｅｐｈｅｎ（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５：２６８−２７１）。したがって、関連し、相補的Ｖ_HおよびＶ_Lドメインを含む、抗体の結合部位は、既知の抗原の大きな集団から多くの異なる抗原に結合する可能性を有することが明らかである。

ＷＯ０３／００２６０９（Ｄｏｍａｎｔｉｓ）は、各Ｖ_HＶ_L対が二重特異性を有する、すなわち同じまたは異なる抗原上の２つのエピトープに結合できる、二重特異性抗体の産生を記載している。構造は開いていてもよく、または閉じていてもよく；開いた構造において、２つのエピトープは同時に結合できるが、閉じた構造において、第１のエピトープへの結合は第２への結合を防ぐかまたは妨げる。

複数の結合特異性を有する非免疫グロブリンタンパク質は天然に知られている；例えば、多数の転写因子はＤＮＡおよび他のタンパク質分子の両方に結合する。しかしながら、従来技術において結合ペプチドを選択する方法は二重または多重ではなく単一の特異性を有するペプチドを選択するのみである。

異なる研究チームが以前に、システイン残基を有するポリペプチドを合成分子構造に係留させた（Ｋｅｍｐ，Ｄ．Ｓ．およびＭｃＮａｍａｒａ，Ｐ．Ｅ．、（１９８５）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｐ．ら、（２００５）ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ．６（５）：８２１−４）。Ｍｅｌｏｅｎおよび共同研究者はトリス（ブロモメチル）ベン
ゼンおよびタンパク質表面の構造上の模倣用の合成足場上での複数のペプチドループの迅速かつ定量的な環化のための関連分子を使用した（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｐ．ら、（２００５）ｉｂｉｄ）。候補薬物化合物を生成するための方法であって、前記化合物が、ポリペプチドを含有するシステインを、例えばトリス（ブロモメチル）ベンゼンのように分子足場に連結することにより生成される、方法は、ＷＯ２００４／０７７０６２およびＷＯ２００６／０７８１６１に開示されている。ディスプレイ技術を使用したそのような分子の選択はＷＯ２００９／０９８４５０に記載されている。二重特異性の実施形態はさらにＷＯ２０１０／０８９１１７に記載されている。

抗体またはその断片のようなリガンドは、例えば、半減期を増加させるために多糖ポリマーを含む、ＰＥＧまたは他の水溶性ポリマーのような分子を付加することにより、その血中半減期を増加させるために修飾されてもよい。一実施形態において、抗体Ｆｃ領域は、循環半減期を増加させるために、本発明に係る二重特異性リンカーに付加されてもよい。

抗体産生
抗体産生は、ヤギ（Ｐｏｌｌｏｃｋら（１９９９）Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１４７−１５７を参照のこと）、ニワトリ（Ｍｏｒｒｏｗ，ＫＪＪ（２０００）Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ ２０：１−５５を参照のこと）、マウス（Ｐｏｌｌｏｃｋら、ｉｂｉｄを参照のこと）または植物（Ｄｏｒａｎ ＰＭ（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：１９９−２０４；Ｍａ，ＪＫ−Ｃ（１９９８）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：６０１−６０６；Ｂａｅｚ，Ｊ．ら（２０００）ＢｉｏＰｈａｒｍ．１３：５０−５４；Ｓｔｏｇｅｒ，Ｅ．ら（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２：５８３−５９０を参照のこと）のようなトランスジェニック生物を含む、当技術分野において公知の任意の技術により実施できる。抗体はまた、化学合成により産生できる；しかしながら、宿主細胞中で抗体をコードする遺伝子の発現が好ましい。

抗体をコードするポリヌクレオチドは、単離され、宿主細胞中でさらなる増殖または発現のためにプラスミドのような複製可能な構築物またはベクター内に挿入される。本発明に係るヒト化免疫グロブリンの発現に適した構築物またはベクター（例えば、発現ベクター）は当技術分野において利用可能である。宿主細胞中の単一コピーもしくは多コピー中に維持される、または宿主細胞の染色体（複数も含む）内に組み込まれるベクターを含む、様々なベクターが利用可能である。構築物またはベクターは適切な宿主細胞内に導入されてもよく、ヒト化免疫グロブリンを発現する細胞が産生され、培養で維持されてもよい。単一ベクターまたは複数ベクターがヒト化免疫グロブリンの発現のために使用されてもよい。

抗体をコードするポリヌクレオチドは容易に単離され、従来の手順（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ）を使用して配列決定される。使用され得るベクターには、プラスミド、ウイルス、ファージ、トランスポゾン、ミニ染色体が含まれ、その中でプラスミドが典型的な実施形態である。一般にこのようなベクターはさらに、単一配列、複製起点、１つまたはそれ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーターならびに発現を促進するように軽および／または重鎖ポリヌクレオチドに作動可能に連結される転写終結配列を含む。軽および重鎖をコードするポリヌクレオチドは別のベクター内に挿入されてもよく、同時もしくは連続して同じ宿主細胞内に（例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーションもしくは形質導入により）導入されてもよく、または所望の場合、重鎖および軽鎖の両方はこのような導入の前に同じベクター内に挿入されてもよい。

適切な宿主細胞内での発現のためにプロモーターが提供されてもよい。プロモーターは
構成的または誘導的であってもよい。例えば、プロモーターは、それがコードされたポリペプチドの発現を導くように、ヒト化免疫グロブリンまたは免疫グロブリン鎖をコードする核酸に作動可能に連結されてもよい。原核および真核宿主のための様々な適切なプロモーターが利用可能である。原核生物プロモーターには、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）についてｌａｃ、ｔａｃ、Ｔ３、Ｔ７プロモーター；３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース６リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼおよびグルコキナーゼが含まれる。真核生物プロモーターには、アルコール脱水素酵素２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、メタロチオネインおよび窒素代謝またはマルトース／ガラクトース利用に関与する酵素のような誘導性酵母プロモーター；ポリオーマ、鶏痘およびアデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（特に前初期遺伝子プロモーター）、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、アクチン、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターおよび初期または後期シミアンウイルス４０のようなウイルスプロモーター、ならびにＥＦ−１アルファのような非ウイルスプロモーターを含むＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターが含まれる（ＭｉｚｕｓｈｉｍａおよびＮａｇａｔａ（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８（１７）：５３２２）。当業者は本発明のヒト化抗体またはその部分を発現するための適切なプロモーターを選択できる。

適切な場合、例えば、高等真核生物の細胞内での発現のために、さらなるエンハンサー要素が上記のプロモーターに位置して見られるものの代わりにまたは同様に含まれてもよい。適切な哺乳動物エンハンサー配列は、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテイン、メタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）およびインスリン由来のエンハンサー要素を含む。代替として、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、バキュロウイルスエンハンサーまたはマウスＩｇＧ２ａ遺伝子座のような真核細胞ウイルス由来のエンハンサー要素を使用できる（ＷＯ０４／００９８２３を参照のこと）。このようなエンハンサーは典型的にプロモーターの上流の部位においてベクター上に位置するが、それらはまた、例えば、非翻訳領域内またはポリアデニル化シグナルの下流の他の場所に位置してもよい。エンハンサーの選択および配置は発現に使用される宿主細胞との適合性に基づいてもよい。

さらに、ベクター（例えば、発現ベクター）は典型的に、ベクター、および複製可能なベクターの場合、複製起点を保有する宿主細胞を選択するための選択可能なマーカーを含む。抗生物質または薬物耐性を与える生成物をコードする遺伝子が一般的な選択可能なマーカーであり、原核生物（例えば、β−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性）、Ｔｅｔ遺伝子（テトラサイクリン耐性）および真核細胞（例えば、ネオマイシン（Ｇ４１８またはジェネテシン）、ｇｐｔ（ミコフェノール酸）、アンピシリン、またはハイグロマイシン耐性遺伝子）において使用されてもよい。ジヒドロ葉酸還元酵素マーカー遺伝子は様々な宿主中でメトトレキサートを用いた選択を可能にする。宿主の栄養要求性遺伝子マーカーの遺伝子産物をコードする遺伝子（例えば、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３）が多くの場合、酵母における選択可能なマーカーとして使用される。ウイルス（例えば、バキュロウイルス）またはファージベクター、およびレトロウイルスベクターのような宿主細胞のゲノム内に組み込むことができるベクターの使用もまた、意図される。

真核細胞系において、ポリアデニル化および終結シグナルは本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結される。このようなシグナルは典型的にオープンリーディングフレームの３’に配置される。哺乳動物系において、ポリアデニル化／終結シグナルの非限定的な例には、成長ホルモン、伸長因子−１アルファおよびウイルス（例えば、ＳＶ４０）遺伝子またはレトロウイルスの長末端反復配列に由来するものが含まれる。
酵母系において、ポリアデニル化（ｐｏｌｙｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）／終結シグナルの非限定的な例には、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）およびアルコール脱水素酵素１（ＡＤＨ）遺伝子に由来するものが含まれる。原核細胞系において、ポリアデニル化シグナルは典型的に必要とされず、代わりに、より短く、十分に定義されたターミネーター配列を利用することが普通である。ポリアデニル化／終止配列の選択は発現のために使用される宿主細胞との適合性に基づいてもよい。上記に加えて、収率を高めるために利用され得る他の特徴には、クロマチン再構築要素、イントロンおよび宿主細胞特異的コドン修飾が含まれる。本発明のその抗体のコドン使用頻度は転写産物および／または生成物の収率を増加させるように宿主細胞のコドンバイアスを適合するように修飾されてもよい（Ｈｏｅｋｅｍａ，Ａ．ら（１９８７）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７（８）：２９１４−２４）。コドンの選択は発現に使用される宿主細胞との適合性に基づいてもよい。

それ故、本発明は、本発明のヒト化免疫グロブリン、またはその重鎖もしくは軽鎖をコードする単離された核酸分子に関する。本発明はまた、免疫グロブリンおよびそれらの鎖の抗原結合部分をコードする単離された核酸分子に関する。

本発明に係る抗体は、例えば、適切な宿主細胞内で抗体をコードする１つまたはそれ以上の組換え核酸の発現により産生できる。宿主細胞は任意の適切な方法を使用して産生できる。例えば、本明細書に記載される発現構築物（例えば、１つまたはそれ以上のベクター、例えば哺乳動物細胞発現ベクター）が適切な宿主細胞内に導入されてもよく、得られた細胞が、構築物（複数も含む）またはベクター（複数も含む）の発現に適した条件下で、（例えば、培養で、動物で、植物で）維持されてもよい。適切な宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（例えば、ＤＨ５ａ（商標）株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ）、ＰｅｒＣ６細胞（Ｃｒｕｃｅｌｌ、ライデン、ＮＬ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）および／または他の適切な細菌のような細菌細胞を含む原核細胞；真菌もしくは酵母細胞（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ））または他の下等真核細胞のような真核細胞、ならびに昆虫由来のもの（例えば、ショウジョウバエシュナイダー（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓｃｈｎｉｅｄｅｒ）Ｓ２細胞、Ｓｆ９昆虫細胞（ＷＯ９４／１２６０８７（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ）、ＴＮ５ＢＩ−４（ＨＩＧＨ ＦＩＶＥ（商標））昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、哺乳動物（例えば、ＣＯＳ−Ｉ（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１６５０）およびＣＯＳ−７（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１６５１）のようなＣＯＳ細胞、ＣＨＯ（例えば、ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−９０９６）、ＣＨＯＤＧ４４（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．およびＣｈａｓｉｎ，ＬＡ．、（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｃ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７（７）：４２１６−４２２０）、２９３（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１５７３）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＣＬ−２）、ＣＶＩ（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＣＬ−７０）、ＷＯＰ（Ｄａｉｌｅｙ，Ｌ．ら、（１９８５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、５４：７３９−７４９）、３Ｔ３、２９３Ｔ（Ｐｅａｒ，Ｗ．Ｓ．ら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９０：８３９２−８３９６）、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨｕＴ７８細胞など、または植物（例えば、タバコ、アオウキクサ（ウキクサ科）、および藻類）のような高等真核生物の細胞であってもよい。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、編 Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．（１９９３）を参照のこと。一部の実施形態において、宿主細胞は多細胞生物（例えば、植物または動物）の部分ではなく、例えば、それは単離された宿主細胞または細胞培養物の部分である。

宿主細胞は、スピナーフラスコ、振盪フラスコ、回転ボトル、ウェーブバイオリアクタ（例えば、ｗａｖｅｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ製のシステム１０００）または中空糸システムにおいて培養されてもよいが、大規模産生に関して、撹拌タンク型バイオリアクタまたはバッグ型バイオリアクタ（例えば、Ｗａｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、サマセット、ニュージャージー州ＵＳＡ）が懸濁培養のために特に使用されることが好ましい。典型的に撹拌タンク型バイオリアクタは、例えば、スパージャ、バッフルまたは低剪断インペラを使用してエアレーションのために適合される。気泡塔およびエアリフトバイオリアクタに関して、空気または酸素気泡との直接的なエアレーションが使用されてもよい。宿主細胞が無血清培養培地中で培養される場合、エアレーションプロセスの結果として細胞損傷を防ぐ役割のために、培地にプルロニックＦ−６８のような細胞保護剤が加えられてもよい。宿主細胞の特性に応じて、マイクロキャリアが足場依存性細胞株のための増殖基質として使用されてもよいか、または細胞は懸濁培養に適合されてもよい。宿主細胞、特に脊椎動物宿主細胞の培養は、バッチ、フェドバッチ、反復バッチ処理（Ｄｒａｐｅａｕら（１９９４）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：１０３−１０９を参照のこと）、伸長バッチ処理または灌流培養のような様々な作動様式を利用してもよい。組換え的に形質転換された哺乳動物宿主細胞がウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含む培地のような血清含有培地中で培養されてもよいが、そのような宿主細胞は、Ｋｅｅｎら（１９９５）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：１５３−１６３に開示されているような無血清培地、または必要に応じて、グルコースのようなエネルギー源および組換えインスリンのような合成増殖因子が補足されたＰｒｏＣＨＯ−ＣＤＭもしくはＵｌｔｒａＣＨＯ（商標）（Ｃａｍｂｒｅｘ ＮＪ、ＵＳＡ）のような市販の培地中で培養されることが好ましい。宿主細胞の無血清培養は、これらの細胞が無血清条件中での増殖に適合されることを必要とし得る。１つの適合アプローチは、血清含有培地中でこのような宿主細胞を培養し、宿主細胞が無血清条件に適合するように培養培地の８０％を無血清培地に繰り返して交換することである（例えば、Ｓｃｈａｒｆｅｎｂｅｒｇ Ｋら（１９９５）ｉｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ Ｔｏｗａｒｄｓ ｔｈｅ ２１ｓｔ Ｃｅｎｔｕｒｙ（Ｂｅｕｖｅｒｙ Ｅ．Ｃ．ら編）、ｐｐ６１９−６２３、Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ出版社を参照のこと）。

本発明に係る抗体は、培地内に分泌され、様々な技術を使用してその培地から回収され、精製されて、目的とする使用に適した精製の程度を得ることができる。例えば、ヒト患者を治療するための本発明の治療抗体の使用は典型的に、治療抗体を含む培養培地と比較して、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定して少なくとも９５％の純度、より典型的には９８％または９９％の純度を要する。第１の例において、培養培地由来の細胞残屑が典型的に遠心分離を使用して除去され、続いて例えば、精密濾過、限外濾過および／または深層濾過を使用して上清の浄化工程が行われる。代替として、抗体は、事前に遠心分離を行わずに精密濾過、限外濾過または深層濾過により採取されてもよい。透析およびゲル電気泳動のような様々な他の技術ならびにヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、親和性クロマトグラフィー（場合により、ポリヒスチジンのような親和性標識システムを含む）および／または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）（米国特許第５，４２９，７４６号を参照のこと）のようなクロマトグラフ技術が利用可能である。一実施形態において、様々な浄化工程の後、本発明の抗体は、プロテインＡまたはＧ親和性クロマトグラフィーを使用して捕捉され、続いてさらに、イオン交換および／またはＨＡクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換、サイズ排除クロマトグラフィーおよび硫安沈殿のようなクロマトグラフィー工程が行われる。典型的に、様々なウイルス除去工程（例えばＤＶ−２０フィルタを使用した例えばナノ濾過）もまた、利用されてもよい。これらの様々な工程の後、本発明の抗体の少なくとも１０ｍｇ／ｍｌまたはそれ以上、例えば１００ｍｇ／ｍｌまたはそれ以上を含む精製した製造物が提供され、それにより本発明の実施形態を形成する。１００ｍｇ／ｍｌまたはそれ以上まで濃縮物が超遠心分離により生成されてもよい。このような製造物は本発明の抗体の凝集形態を実質的に含まない。

細菌系が抗体断片の発現に特に適している。このような断片は細胞内またはペリプラズム内に局在化する。当業者に公知の方法に従って、不溶性ペリプラズムタンパク質が抽出され、リフォールディングされて、活性タンパク質を形成することができる。Ｓａｎｃｈｅｚら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７２：１３−２０；Ｃｕｐｉｔ，ＰＭら（１９９９）Ｌｅｔｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９：２７３−２７７を参照のこと。

本発明はまた、本発明の核酸、例えば、ベクター（例えば、発現ベクター）を含む細胞に関する。例えば、本発明に係るヒト化免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードする核酸（すなわち、１つまたはそれ以上の核酸）、またはそのような核酸（複数も含む）を含む構築物（すなわち、１つまたはそれ以上の構築物、例えば、１つまたはそれ以上のベクター）が、１つまたはそれ以上の発現制御要素（例えば、ベクター内、細胞内のプロセスにより生成される構築物内で宿主細胞ゲノム内に組み込まれる）に作動可能に連結されるか、または作動可能に連結されるようになる核酸（複数も含む）と共に、選択される宿主細胞に適した方法（例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、感染）により適切な宿主細胞内に導入されてもよい。宿主細胞は、発現に適した条件下（例えば、誘導因子、適切な塩を補足した適切な培地、増殖因子、抗生物質、栄養剤の存在下）に維持されてもよく、それによりコードされるポリペプチド（複数も含む）が産生される。所望の場合、コードされるヒト化抗体は、例えば、宿主細胞、培養培地、またはミルクから単離されてもよい。このプロセスは、トランスジェニック動物または植物（例えば、タバコ）の宿主細胞（例えば、乳腺細胞）内での発現を包含する（例えば、ＷＯ９２／０３９１８を参照のこと）。

ＣＤ８０リガンド
ＣＤ８０リガンドの設計および構築物はＣＤ２８よりＣＴＬＡ−４に対するリガンドの特異性を最大化することを目的とする。ＣＤ８０の配列は当技術分野において公知であり、Ｗｕら、１９９７に例が引用されている。ＣＤ８０は、細胞外Ｉｇ−Ｖ可変様ドメイン、および細胞内ＩｇＣ定常様ドメインを含む。好ましい実施形態において、ＣＤ８０の細胞外ドメインがリガンドとして使用される。例えば、配列番号１５、特に残基１〜２４１を参照のこと。

変異が、ＣＤ２８よりＣＴＬＡ４に対する結合親和性を向上させるため、および選択性を向上させるためにヒトＣＤ８０においてなされてもよい。例えば、Ｗｕら、１９９７を参照のこと。

Ｋ７１Ｇ、Ｋ７１Ｖ、Ｓ１０９Ｇ、Ｒ１２３Ｓ、Ｒ１２３Ｄ、Ｇ１２４Ｌ、Ｓ１９０Ａ、Ｓ２０１Ａ、Ｒ６３Ａ、Ｍ８１Ａ、Ｎ９７Ａ、Ｅ１９６Ａを含む、Ｗ８４Ａ以外の変異体が作製されてもよい。Ｐｅａｃｈら、ＪＢＣ１９９５．２７０（６）：２１１８１−２１１８７を参照のこと。ＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８の両方に対する変異体の結合親和性の評価は、部位特異的変異誘発法により行われてもよく、続いて変異ポリペプチドの発現、ならびにＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８ Ｂｉａｃｏｒｅチップを使用した表面プラズモン共鳴によるＫｄの測定が行われてもよい。例えば、Ｇｕｏら、（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：１３４５−５５を参照のこと。

有益な結合および選択性プロファイルを有する変異体が選択され、細胞ベースアッセイにおいてさらに評価されてもよい。例えば、フローサイトメトリーが、野生型または細胞内にトランスフェクトされた変異体ＣＤ８０の効果をアッセイするために使用されてもよい。

ＬＡＧ−３リガンド
ＬＡＧ−３は当技術分野において記載されており、ＭＨＣＩＩタンパク質への結合部位が特徴付けられている。Ｈｕａｒｄら、（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４（１１）：５７４４−９を参照のこと。ＬＡＧ−３は４つの細胞外Ｉｇ様ドメインを有し、ＭＨＣＩＩへの結合を最適化するために変異がこれらのドメインに導入されてもよい。

変異の有効性がＣＤ８０リガンドに関して上記のように分析されてもよい。

一態様において、ＬＡＧ−３の４つのＩｇ様ドメインのドメイン１および２（Ｄ１およびＤ２）のみが本発明に係るリガンドにおいて使用される。これらのドメインはＭＨＣＩＩタンパク質との相互作用に関与すると考えられる。

二重特異性リガンド構築物
二重特異性リガンドの構築は一般式「リガンド−リンカー−リガンド」に従う。二重特異性抗体は当技術分野において公知であり、上に記載されている。

二重特異性リガンドの構築は好ましくは所望のポリペプチドをコードする適切な遺伝子の構築および発現に関与した。構築する他の方法は、共有結合、イオン、または疎水結合を可能にする条件下で２つのポリペプチドを混合することによる。好ましい実施形態において、その方法はポリペプチドを共有結合することを含む。ＣＴＬＡ−４リガンド、リンカーおよびＭＨＣリガンドのような３つの成分を含む二重特異性分子が構築される場合、３つのうちの２つが混合、結合され、第３のポリペプチドがその後に融合産物に加えられ、結合されて３つ全てのポリペプチドを含む融合産物を生成できる。

本発明に係るポリペプチドは、化学合成、生物サンプルからの単離およびそのようなポリペプチドをコードする核酸の発現を含む、任意の所望の技術により産生されてもよい。それらと同様に、核酸が合成され、または生物源から単離され、所望の場合、部位特異的変異誘発法により修飾されてもよい。

したがって、本発明は、本発明に係る二重特異性リガンド、またはその断片をコードするベクターに関する。ベクターは、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスベクターであってもよい。

本発明に係る核酸は宿主内で増殖するための選択可能なマーカーを含有するベクターの部分であってもよい。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物のような沈殿物内、または荷電脂質との複合体内に導入される。

ベクターがウイルスである場合、それは、適切なパッケージング細胞株を使用してインビトロで（ｉｎ ｖｔｒｏ）パッケージ化され、次いで宿主細胞内に形質導入されてもよい。

核酸挿入物が、ファージラムダＰＬプロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０早期および後期プロモーターならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターのような適切なプロモーターに作動可能に連結される。他の適切なプロモーターが当業者に公知である。発現構築物はさらに、転写開始、終結のための部位、および転写領域において翻訳するためのリボソーム結合部位を含有する。構築物により発現される転写産物のコード部分は好ましくは、開始時に翻訳開始コドンおよびポリペプチドの翻訳の終了時に適切に配置される終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含む。

示したように、発現ベクターは好ましくは少なくとも１つの選択可能なマーカーを含む。そのようなマーカーには、真核細胞培養に関して、ジヒドロ葉酸還元酵素、Ｇ４１８またはネオマイシン耐性、ならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および他の細菌の培養に関して、テトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子が含まれる。適切な宿主の代表的な例には、限定されないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびサルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）細胞のような細菌細胞；酵母細胞（例えば、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のような真菌細胞；ショウジョウバエＳ２およびスポドプテラＳｆ９細胞のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、およびボーズ（Ｂｏｗｅｓ）黒色腫細胞のような動物細胞；ならびに植物細胞が含まれる。

上記の宿主細胞についての適切な培養培地および条件は当技術分野において公知であり、市販されている。

細菌における使用に好ましいベクターの中には、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．から入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；ならびにＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃから入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５が含まれる。好ましい真核生物ベクターの中には、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐ０Ｇ４４、ｐＸＴＩおよびｐＳＧ；ならびにＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬがある。哺乳動物細胞発現における使用に好ましいベクターの中には、ｐＳＧ５ベクター、ｐＣＭＶ・ＳＰＯＲＴ６、ｐｃＤＮＡ、ｐＣＥＰ４、ｐＲＥＰ４、ｐＣＩ、ｐＳＩおよびｐＢＩＣＥＰ−ＣＭＶが含まれる。酵母系に使用するための好ましい発現ベクターには、限定されないが、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤＩ、ｐＴＥＦＩ／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺａｌｐｈ、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬＤ２、ｐＨＩＬ−ＳＩ、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、およびＰＡ０８１５（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡから入手可能）が含まれる。

宿主細胞内への構築物の導入はリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、陽イオン性脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または他の方法により行われてもよい。このような方法は、上記で参照したＳａｍｂｒｏｏｋらのような多くの標準的な実験マニュアルに記載されている。本発明に係るポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオン交換またはカチオン交換クロトマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収され、精製されてもよい。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために利用される。

本発明に係るポリペプチドはまた、体液、組織および細胞、特に腫瘍組織に由来する細胞または対象由来の疑わしい腫瘍組織を含む、生物源から回収されてもよい。

さらに、本発明に係るポリペプチドは当技術分野において公知の技術を使用して化学合成されてもよい（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、１９８３、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅ
ｍａｎ ＆ Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．、およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら、（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ、３１０：１０５−１１１を参照のこと）。例えば、本発明に係る二重特異性リガンドの全てまたは一部を含むポリペプチドはペプチドシンセサイザの使用により合成されてもよい。

本発明に係る二重特異性リガンドは本明細書に添付した配列番号に詳細に記載されている。配列番号１および２はＣＴＬＡ−４リガンドＣＤ８０ｗ８８ａが、ＭＨＣリガンドＬＡＧ−３と対になり、ＩｇＧ２ａＦｃ領域およびＧｌｙ−９（Ｇ９）配列によって分離される二重特異性リガンドのマウス代理ＤＮＡおよびタンパク質配列を提供する。末端Ｈｉｓタグ（Ｈ６）配列はＣ末端に提供される。配列番号３および４は、ＩｇＧ２ａＦｃ領域がＬＡＧ−３ポリペプチドのＣ末端に配置され、その結果ＣＤ８０およびＬＡＧ３−ペプチドがＧ９のみによって分離されていることを除いて、配列番号１および２と同じ構築物についてのマウス代理ＤＮＡおよびタンパク質配列を提供する。リガンドまたはそれに対するＣ末端の間にＦｃ領域を有する２つの配列はそれぞれ遺伝子１および遺伝子２構築物と称する。

配列番号５および６は、ヒトＤＮＡおよび野生型配列が保存されているタンパク質配列を提供する。ＣＤ８０またはＬＡＧ−３のいずれに対しても変異は作製されていない。配列番号７および８において、Ｗ８４Ａ変異がヒトＣＤ８０（マウスにおけるＷ８８Ａの等価物）に対して作製され、Ｒ７５Ｅ変異がＬＡＧ−３において作製される。残りの配列番号（番号７〜１４）はＣＤ８０およびＬＡＧ−３配列における他の変異を記載している。

治療応用
Ｔ細胞活性の抑制は、免疫抑制が正当である、および／または自己免疫状態が発生する多くの状況において望まれる。したがって、ＣＴＬＡ４／ＭＨＣ相互作用の標的化が、炎症、自己免疫、およびそのような機構に関与する状態のような不適切または望ましくない免疫応答に関与する疾患の治療において示されている。一実施形態において、そのような疾患または障害は自己免疫および／または炎症性疾患である。そのような自己免疫および／または炎症性疾患の例は上記で述べている。

一実施形態において、そのような疾患または障害は１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）である。

別の実施形態において、本発明に係るリガンドは対象を免疫抑制することにより移植を補助するために使用される。そのような使用は移植片対宿主拒絶反応を軽減する。移植片対宿主拒絶反応についての既存の治療の詳細に関しては、Ｓｖｅｎｎｉｌｓｏｎ、（２００５）Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ３５：Ｓ６５−Ｓ６７およびその文献に引用されている参考文献を参照のこと。有利には、本発明の抗体は他の利用可能な治療と組み合わせて使用されてもよい。

自己免疫疾患の治療に関して、併用療法は医薬と共に本発明のリガンドの投与を含んでもよく、その医薬と共にリガンドはそのような自己免疫疾患を予防または治療するための有効量を含む。前記自己免疫疾患が１型糖尿病である場合、併用療法は、ベータ細胞増殖もしくは生存因子または免疫調節抗体のような、膵臓ベータ細胞の増殖を促進するか、またはベータ細胞移植を増強する作用因子の１つまたはそれ以上を含んでもよい。前記自己免疫疾患が関節リウマチである場合、前記併用療法は、メトトレキサート、抗ＴＮＦ−α抗体、ＴＮＦ−α受容体Ｉｇ融合タンパク質、抗ＩＬ−６、もしくは抗ＩＬ１７、もしくは抗ＩＬ−１５もしくは抗ＩＬ−２１抗体、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、または疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）のうちの１つまたはそれ以上を含んでもよい。例えば、さらなる作用因子は、抗ＴＮＦ剤（例えば、エンブレル（登録商標）、インフリキシマブ（レミケード（登録商標）およびアダリムマブ（ヒュミラ（登録商標））また
はリツキシマブ（リツキサン（登録商標））のような生物剤であってもよい。前記自己免疫疾患が造血移植拒絶反応である場合、造血成長因子（複数も含む）（例えば、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−１１、トロンボポエチンなど）または抗菌剤（複数も含む）（例えば、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌薬）が投与されてもよい。前記自己免疫疾患が乾癬である場合、さらなる作用因子は、タールおよびその誘導体、光線療法、コルチコステロイド、シクロスポリンＡ、ビタミンＤ類似体、メトトレキサート、ｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）阻害剤、ならびに抗ＴＮＦ−α剤およびリツキサン（登録商標）のような生物剤のうちの１つまたはそれ以上であってもよい。前記自己免疫疾患が、例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎のような炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である場合、さらなる作用因子は、アミノサリチル酸、コルチコステロイド、免疫調節剤、抗生物質、またはレミケード（登録商標）およびヒュミラ（登録商標）のような生物剤のうちの１つまたはそれ以上であってもよい。

併用治療は、当業者により必要または都合が良いとみなされる限り、および本明細書の目的のためにいかなる方法で実施されてもよく、組み合わせて使用される化合物の順序、量、反復または相対量に関する制限は意図されない。したがって、療法に使用するための本発明に係る抗体は医薬組成物に製剤化されてもよい。本発明はまた、本発明に係るペプチドを含む医薬組成物に関する。

医薬組成物
好ましい実施形態において、本発明に係る二重特異性リガンド、または本発明の以前の態様において定義されるアッセイ方法により識別可能な１つもしくはそれ以上のリガンドを含む医薬組成物が提供される。リガンドは、本明細書で説明されている、免疫グロブリン、ペプチド、核酸または小分子であってもよい。それらは、以下の説明において、「化合物」と称する。

本発明に係る医薬組成物は、有効成分としてＴ細胞活性を調節できる１つまたはそれ以上の化合物を含む内容物の組成物である。典型的に、化合物は任意の薬学的に許容可能な塩、または例えば、適切な場合、その類似体、遊離塩基形態、互変異性体、エナンチオマーラセミ体、もしくはそれらの組合せの形態である。本発明に係る有効成分を含む医薬組成物の有効成分は、特定の状況に応じた量で投与される場合、例えば、移植片対宿主拒絶反応の治療において優れた治療活性を示すことが意図される。

別の実施形態において、本発明の１つまたはそれ以上の化合物は、前述の状態のいずれかを治療する際の特定の兆候を治療するのに適切であることが知られている任意の当技術分野で認識されている化合物と組み合わせて使用されてもよい。したがって、本発明の１つまたはそれ以上の化合物は、都合の良い単一の組成物が対象に投与できるように、上述の兆候を治療するのに適切であることが知られている１つまたはそれ以上の当技術分野で認識されている化合物と組み合わせてもよい。投薬計画は最適な治療反応を提供するために調節されてもよい。

例えば、数回の分割用量が毎日投与されてもよく、または用量は治療状況の要求により示されるように比例的に減少されてもよい。

有効成分は、経口、静脈内（水溶性である場合）、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内もしくは坐剤経路または埋め込み（例えば、持続放出分子を使用する）によるなどの都合のよい様式で投与されてもよい。

投与経路に応じて、有効成分は、酵素、酸の作用および前記成分を不活性化し得る他の天然状態から前記成分を保護する物質でコーティングすることが必要とされてもよい。

非経口投与以外により有効成分を投与するために、その有効成分は、その不活性化を防ぐために物質によりコーティングされるか、または物質と共に投与される。例えば、有効成分は、酵素阻害剤と同時投与される補助剤中、またはリポソーム中で投与されてもよい。補助剤はその広範な意味で使用され、インターフェロンのような任意の免疫刺激化合物を含む。本明細書に意図される補助剤には、レゾルシノール、ポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテルのような非イオン界面活性剤が含まれる。酵素阻害剤には、膵臓トリプシンが含まれる。

リポソームには、水中油中水ＣＧＦエマルションおよび従来のリポソームが含まれる。

有効成分はまた、非経口または腹腔内に投与されてもよい。

分散剤もまた、グリセリン、脂質ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中ならびに油中で製造されてもよい。貯蔵および使用の通常の条件下で、それらの製造物は微生物の増殖を防ぐために防腐剤を含有する。

注射可能な使用に適した医薬品形態には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散剤および滅菌注射溶液もしくは分散剤の即時製造のための滅菌粉末が含まれる。全ての場合、その形態は滅菌されなければならず、容易に注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度まで流動されなければならない。その形態は製造および貯蔵の条件下で安定していなければならず、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒体であってもよい。適切な流動性が、例えば、レクチンのようなコーティングの使用により、分散の場合に必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用により維持されてもよい。

微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール（ｔｈｉｒｍｅｒｏｓａｌ）などによりもたらされてもよい。特定の場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好適であり得る。注射可能な組成物の長期の吸収は、吸収を遅延させる作用因子、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物中の使用によりもたらされてもよい。

滅菌注射可能溶液は、上記に列挙した様々な他の成分と共に適切な溶媒中に必要な量で有効成分を組み込み、必要な場合、その後、濾過滅菌することにより製造される。一般に、分散剤は、滅菌有効成分を、基礎分散媒体および、上記に列挙したものからの必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクル内に組み込むことにより製造される。滅菌注射可能溶液を製造するための滅菌粉末の場合、製造する好ましい方法は、有効成分およびその以前に濾過滅菌した溶液からの任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥技術である。

本明細書に使用される場合、「薬学的に許容可能な担体および／または希釈剤」は、任意および全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および作用因子の使用は当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または作用因子が有効成分と不適合性である場合を除いて、治療組成物中のそれらの使用が意図される。補助的有効成分もまた、組成物中に組み込まれてもよい。

投与の容易さおよび投与の均一性のために投薬単位形態で非経口組成物を製剤化することが特に有益である。本明細書に使用される場合、投薬単位形態とは、治療される哺乳動物対象についての単一の投薬として適した物理的に別個の単位を指し；各単位は、必要とされる薬学的担体と関連して所望の治療効果を生じるように算出される所定量の有効物質を含有する。本発明の新規投薬単位形態についての仕様は、（ａ）有効物質の独自の特徴および達成される特定の治療効果、ならびに（ｂ）身体の健康が損なわれている、疾患状態を有する、生きている対象における疾患を治療するための有効物質のような化合物の当技術分野に固有の制限により決定され、それらに直接依存する。

主要な有効成分は、投薬単位形態における適切な薬学的に許容可能な担体と一緒の有効量の簡便かつ効果的な投与のために調合される。補助的有効成分を含有する組成物の場合、投薬量は、前記成分の通常の用量および投与様式に対する参照により決定される。

抗体を含む、ペプチド化合物の細胞への送達を促進するために、ペプチドは、細胞膜と交差するそれらの能力を改良するために修飾されてもよい。例えば、米国特許第５，１４９，７８２号は、融合ペプチド、イオンチャネル形成ペプチド、膜ペプチド、長鎖脂肪酸および細胞膜を横切るタンパク質輸送を増加させる他の膜混合作用因子の使用を開示している。これらおよび他の方法はまた、参照によって本明細書に組み入れる、ＷＯ９７／３７０１６および米国特許第５，１０８，９２１号に記載されている。

さらなる態様において、単独または特定の兆候の治療に適切であることが知られている当技術分野で認識されている化合物との併用のいずれかで疾患の治療に使用するための本明細書上記で定義した本発明の有効成分が提供される。それ故、異常免疫応答に関連する疾患を治療するための医薬を製造するための本発明の有効成分の使用が提供される。

さらに、上記のアッセイ法を使用して識別可能である治療有効量のリガンドを対象に投与する工程を含む、異常免疫応答に関連する状態を治療する方法が提供される。

本発明はさらに、以下の実施例において例示目的のみのために記載している。

〔実施例１〕
ＣＴＬＡ−４と会合し、それをＭＨＣ１１を介してＴＣＲに架橋する二重特異性融合タンパク質の設計
選択的および作動薬的にＣＴＬＡ−４と会合し、同時にそれをＴＣＲに連結する二重特異性融合タンパク質を生成するために、ＣＴＬＡ−４に結合するが、ＣＤ２８に対する最小親和性を有する（Ｗｕら、１９９７）変異体ＣＤ８０（ＣＤ８０ｗ８８ａ、本明細書以下でＣＤ８０ｗａと称する）を、ＬＡＧ−３、ＭＨＣＩＩの天然リガンド（Ｂａｉｘｅｒａｓら、１９９２；Ｔｒｉｅｂｅｌら、１９９０）に融合した。９個のグリシンからなるリンカーを使用してＣＤ８０ｗａをＬＡＧ−３に結合し、次いでそのＣＤ８０ｗａをマウスＩｇＧ２ａのＦｃ部分に付着させて、その循環半減期を意図的に増加させた（図１Ａ）。この構成のリガンドに応答して、ＣＴＬＡ−４会合およびＴＣＲへの連結は、早期Ｔ細胞活性化の間の免疫シナプスにおける三分子複合体（ＣＴＬＡ−４／ＭＨＣＩＩ／ＴＴＣＲ）の形成を介して間接的に発生することが予想された（図１Ｂ）。概念的に、免疫シナプスの関連以外に、ＣＴＬＡ−４またはＭＨＣＩＩのいずれかの単独またはＣＴＬＡ−４およびＭＨＣＩＩの両方への二重特異性融合タンパク質の結合はＴ細胞活性の阻害を導くはずがない。ＣＤ８０ｗａによるＣＴＬＡ−４の会合は、ＣＴＬＡ−４の細胞質尾部に対するホスファターゼの動員によるＣＴＬＡ−４シグナル伝達を誘発するように設計した。その一方で、ＭＨＣＩＩへのＬＡＧ−３の結合は、免疫シナプスにおいてｐＭＨＣＩＩ複合体に結合する、同種ＴＣＲにＣＴＬＡ−４を近接させることを意図した（図１Ｂ）。これらの２つの結合事象の組合せはＴＣＲに阻害シグナルを送達すると予想された。ＣＤ８
０ｗａおよびＩｇＧ２ａ Ｆｃを含む対照融合タンパク質もまた、構築し（図１Ａ）、その対照融合タンパク質は、ＬＡＧ−３を欠いているので、ＣＴＬＡ−４をＴＣＲに架橋できるはずがない（図１Ｃ）。

試験および対照融合タンパク質をチャイニーズハムスター卵巣細胞内で発現させ、プロテインＧカラム上の親和性クロマトグラフィーで精製した。サイズ排除クロマトグラフィーを使用して凝集体を除去した。試験二重特異性融合タンパク質（ＣＤ８０ｗａ−ＬＡＧ−３−Ｆｃ）はＢｓＢ（ヌクレオチド配列：配列番号３；アミノ酸配列：配列番号４）と称し、対照構築物（ＣＤ８０ｗａ−Ｆｃ）はＢｓＢΔ（ヌクレオチド配列：配列番号１６；アミノ酸配列：配列番号１７）として知られている。予想されるように、両方の融合タンパク質は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で二量体のようであり（ＢｓＢ、２００ｋＤａ；ＢｓＢΔ１４０ｋＤａ）、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で単量体（ＢｓＢ、１００ｋＤａ；ＢｓＢΔ７０ｋＤａ）のようであった。それらの識別はさらに、ＬＡＧ−３およびＣＤ８０に対する抗体を使用して、ウェスタンブロッティングにより確認した。

〔実施例２〕
ＢｓＢは同種異系混合リンパ球反応においてＴ細胞活性化を阻害する。
Ｔ細胞活性化を阻害するＢｓＢおよびＢｓＢΔの相対能力を、ＩＬ−２の産生を測定することにより同種異系混合リンパ球反応において評価した。ＢＡＬＢ／ｃマウスから精製した未処置のＣＤ４⁺ＣＤ２５^-ＣＤ６２Ｌ^highＣＤ４４^lowＴ細胞を、ＢｓＢまたはＢｓ
ＢΔの存在または非存在下でＣ５７ＢＬ／６マウスから単離したＡＰＣと混合した。ＣＤ８０／８６に結合し、ＣＤ２８に対するそれらの結合を遮断する同時刺激阻害剤である、マウスＩｇＧ２ａおよびＣＴＬＡ−４Ｉｇをそれぞれ陰性および陽性対照として含めた。混合リンパ球反応におけるＢｓＢΔではなくＢｓＢの包含はＩＬ−２産生を阻害したが、ＣＴＬＡ−４Ｉｇにより達成されたものと同じ程度ではなかった（図２）。この相違は恐らく、ＣＴＬＡ−４Ｉｇ媒介性阻害より後に発生するＢｓＢ媒介性Ｔ細胞阻害の結果であった。より具体的には、ＢｓＢに関して、ＣＴＬＡ−４の後に発生した阻害のみがＴ細胞活性化後に上方制御した。ＴＣＲへの同時架橋が必要とされるため、ＣＴＬＡ−４単独の会合がＴ細胞活性化を防ぐのに不十分であることが、ＩＬ−２産生を減少させることができないＢｓＢΔの能力により強く示唆される。ＢｓＢのＬＡＧ−３部分がＴ細胞阻害の役割を果たしている可能性を排除するために、ＬＡＧ−３Ｉｇをこのアッセイにおいて試験し、Ｔ細胞活性化を阻害しないことを検証した。

〔実施例３〕
ＢｓＢはＴｒｅｇへのＴ細胞分化を導く。
抗原刺激の離脱、ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害、低い親和性の抗原に起因する準最適なＴＣＲ刺激、またはＴ細胞活性化の間の弱い同時刺激によるＴＣＲシグナル伝達の早期終結は、Ｆｏｘｐ３⁺発現を誘導し、Ｔｒｅｇ表現型に対するＴ細胞分化を歪めることを示
している（Ｄｅｌｇｏｆｆｅら、（２００９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３０：８３２−８４４；Ｈａｘｈｉｎａｓｔｏら、（２００８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０５：５６５−５７４；Ｓａｕｅｒら、（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０５：７７９７−７８０２）。ＢｓＢは、結果として起こるＴＣＲシグナル伝達の減衰と共に、活性化により誘導されるＣＴＬＡ−４によるＴＣＲの早期会合を強制するので、Ｆｏｘｐ３⁺Ｔｒｅｇを生成するその能力も評価した。Ｆｏｘｐ３−ＥＧＦＰノックインマウス
から製造した未処置のＣＤ４⁺ＣＤ６２Ｌ^highＧＦＰ’’Ｔ細胞（Ｈａｒｉｂｈａｉら、
（２００７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １７８：２９６１−２９７２）を、ＢｓＢまたはＢｓＢΔの存在下で、ＬＰＳで処置した同種異系ＡＰＣと混合した。培養の５日後、細胞のフローサイトメトリー分析により、ＢｓＢで処置した細胞（図３Ａ、真ん中の左パネル）の中で多数のＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺ＧＦＰ⁺Ｔ細胞が現れたが、マウスＩｇＧ２ａ（図３Ａ、上
側の左パネル）またはＢｓＢΔ対照（図３Ａ、下側の左パネル）で処置した細胞の中では
現れず、これらのＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺ＧＦＰ⁺Ｔ細胞はＦｏｘｐ３⁺Ｔｒｅｇであったことが示唆される。この結果を確認するために、細胞培養培地を収集し、特徴的なＴｒｅｇサイトカイン、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βについてアッセイした（Ｃｏｏｌｓら、（２００８）Ｊ．ＣｅｌｌＭｏ／．Ｍｅｄ．１２：６９０−７００）。ＢｓＢで処置した細胞（図３Ａ、左のパネル）の培地中で多数のＩＬ−１０およびＴＦＧ−βを検出したが、ＢｓＢΔまたはｍＩｇＧ２ａで処置した細胞の培地中では検出しなかった。驚くべきことに、ＣＴＬＡ−４Ｉｇは、ＧＦＰ⁺ＴｒｅｇまたはＩＬ−１０の生成およびＴＧＦ−β産生を誘
導しなかった。特定の理論に束縛されずに、ＣＴＬＡ−４ｌｇがＴ細胞応答を抑制する機構はＢｓＢのものと異なる。ＬＡＧ−３Ｉｇ単独またはＢｓＢΔとの組合せもまた、ＧＦＰ⁺Ｔｒｅｇの生成を誘導できず、ＴＣＲによるＣＴＬＡ−４のＢｓＢ媒介性架橋がＴｒ
ｅｇ誘導に必要とされることが示唆される。

〔実施例４〕
ＢｓＢによるＴｒｅｇの誘導は自己刺激性ＴＧＦ−βを必要とする
ＢｓＢでの処置後のＩＬ−１０およびＴＧＦ−βの増加したレベルの同時検出は、サイトカイン、ＴＧＦ−βが特にＴｒｅｇの生成を促進する役割を果たす可能性を高めた（図３Ａ）。このことを扱うために、５日間にわたって培養培地を収集し、サイトカインおよびＦｏｘｐ３⁺Ｔｒｅｇ含有量について分析した。処置後２日の早さで増加したＩＬ−１
０およびＴＧＦ−βレベルを検出し、Ｆｏｘｐ３⁺Ｔｒｅｇは３日後に検出した。特定の
理論に束縛されずに、恐らくＢｓＢによる刺激されるＴＧＦ−βの内因性産生はＴｒｅｇ分化に関与する。Ｔｒｅｇ誘導アッセイに対する、アイソタイプ対照ＩｇＧ（クローン１３Ｃ４）ではなく、抗ＴＧＦ−β抗体（クローン１Ｄ１１）の添加はＦｏｘｐ３⁺Ｔｒｅ
ｇの出現を完全に遮断した（図３Ｂ）。特定の理論に束縛されずに、ＣＴＬＡ−４の早期会合およびその後のＢｓＢによるＴＣＲへの架橋は、内因性ＴＧＦ−β産生を刺激し、次いでＴｒｅｇ分化を促した。ＣＴＬＡ−４およびＴＣＲの架橋は、ＴＧＦ−β産生を誘導することが以前に報告されている（Ｃｈｅｎら、（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：１８４９−１８５７）が、Ｔｒｅｇ分化はこの研究で評価されていなかった。

Ｔｒｅｇは自己免疫疾患のいくつかの動物モデルにおいて疾患の兆候を調節する際のかなりの治療可能性が示されている。しかしながら、関連抗原に対して誘導されるＴｒｅｇの特異性の重要性が強調されている。自己抗原特異的反応性Ｔ細胞に関して特定の自己抗原に対して活性化しない非抗原特異的Ｔｒｅｇは恐らく機能的に免疫抑制しない。それ故、多数の抗原特異的Ｔｒｅｇの生成を促進するアプローチがこれらの病気を治療するのにかなり望まれる。さらに、その場（例えば、Ｔ１Ｄについての膵島内または潰瘍性大腸炎もしくはクローン病についての固有層内）での抗原特異的Ｔｒｅｇのデノボ誘導を促進する戦略は、インビトロで分化または増殖されるＴｒｅｇの養子免疫伝達の使用より好ましい。

〔実施例５〕
ＢｓＢ誘導性Ｔｒｅｇは細胞間接触依存的に機能的に抑制する。
ＢｓＢ誘導性Ｔｒｅｇが機能的に抑制するかどうかを評価するために、ＢｓＢ誘導性Ｔｒｅｇおよび対照としての役割をするＴＧＦ−β誘導性Ｔｒｅｇを、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を使用して精製し、異なる割合でＣＦＳＥ標識した同系応答Ｔ細胞および同種異系ＡＰＣと混合した。トランスウェルまたは通常の培養ウェルのいずれかで細胞を３日間同時培養し、その後、フローサイトメトリーを使用して応答Ｔ細胞の増殖を分析した。図５Ａにまとめるように、通常の培養ウェル中で培養したＢｓＢ誘導性およびＴＧＦ−β誘導性Ｔｒｅｇの両方は応答Ｔ細胞の増殖をほぼ完全に阻害した。ＢｓＢ誘導性Ｔｒｅｇの抑制活性の効力はＴＧＦ−β誘導性Ｔｒｅｇのものと匹敵した。対照的に、ＢｓＢまたはＴＧＦ−βのいずれかにより生成したＴｒｅｇは、Ｔ細胞をトランスウェル中のＴｒｅｇから分離した場合、応答Ｔ細胞の増殖を有意に阻害しなかった。特定の理論に束縛さ
れずに、Ｔｒｅｇ抑制活性は細胞間接触に依存し、分泌されたサイトカインまたは他の要因により媒介されなかった。この考えを支持して、通常の培養ウェル中でのＩＬ−１０（クローンＪＥＳ５−２Ａ５）への抗体の封入は、ＢｓＢ誘導性またはＴＧＦ−β誘導性Ｔｒｅｇのいずれの抑制活性にも影響を与えなかった（図５Ｂ）。ＴＧＦ−β１Ｄ１１への抗体の添加もまた、ＢｓＢ誘導性Ｔｒｅｇの抑制活性に影響を与えなかったが、ＴＧＦ−β誘導性Ｔｒｅｇにより抑制を部分的に減少させた（図５Ｂ）。

〔実施例６〕
ＢｓＢは抗原特異的ＴｒｅｇへのＯＴ−ＩＩＴ細胞の分化を導く。
（ＭＨＣＩＩを介して）ＴＣＲへＣＴＬＡ−４を架橋するＣＤ８０ｗａおよびＬＡＧ３（ＢｓＢ）を含む二官能性融合タンパク質は、同種異系ＭＬＲにおいてＦｏｘｐ３⁺Ｔｒ
ｅｇの産生を誘導できることを見出したので、抗原特異的Ｔｒｅｇの産生を導き出すＢｓＢの潜在能力を試験した。この可能性を調査するために、未処置のＯＴ−ＩＩＴ細胞を、ニワトリオボアルブミンペプチド（３２３〜３３９）（Ｂａｒｎｄｅｎら、１９９８）に特異的なＴＣＲ（α−およびβ−サブユニット）をコードする導入遺伝子を保有するトランスジェニックマウスから精製し、Ｏｖａ３２３〜３３９の存在下で同系ＡＰＣと混合した。培養の５日後、Ｆｏｘｐ３⁺Ｔｒｅｇの有意に増加した量を、ｍＩｇＧ対照（図４Ａ
、上側の左パネル）またはＣＴＬＡ−４Ｉｇ（データは示さず）によるよりも、ＢｓＢ（図４Ａ、真ん中の左パネル）で処置したＯＴ−ＩＩＴ細胞内で検出した。このＴｒｅｇの誘導は培養物中に抗ＴＧＦ−β抗体を包含することにより阻害された（図４Ａ、下側の左パネル）。特定の理論に束縛されずに、分化は、自己分泌またはパラクリン様式で内因的に産生されたＴＧＦ−βにより媒介された。ＩＬ−２のレベルは減少したのに対して、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βのレベルはＢｓＢで処置した細胞の培地中で増加した（図４Ａ、右のパネル）。

誘導されたＴｒｅｇの増殖活性をモニターするために、ＯＴ−ＩＩ細胞に蛍光トレーサー、ＣＦＳＥを前負荷した。図４Ｂに示すように、ＢｓＢ誘導性Ｆｏｘｐ３⁺Ｔｒｅｇは
ＣＦＳＥシグナルの希釈により示すように増殖性であると決定した。予想されるように、ＣＴＬＡ−４Ｉｇ、同時刺激遮断剤の添加により、Ｔ細胞増殖が減少した。それ故、ＢｓＢはＴ細胞活性化を阻害でき、同種異系ＭＬＲおよび抗原特異的環境の両方においてＴｒｅｇの産生を誘導できた。

〔実施例７〕
ＢｓＢによるＴｒｅｇの誘導はＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路の減衰に関与し得る。
最近の報告により、ＡＫＴおよびｍＴＯＲシグナル伝達経路がＴ細胞の運命を決定するのに重要な役割を果たすことが示されている。Ｔ細胞における構成的活性ＡＫＴの存在は、ラパマイシン感受性的にＴｒｅｇ分化を減少させ（Ｈａｘｈｉｎａｓｔｏら、２００８）、ＡＫＴおよびｍＴＯＲシグナル伝達経路がＴｒｅｇの運命に影響を与えるように交差することが示唆されている。さらに、ｍＴＯＲを欠くＴ細胞は、正常な対照Ｔ細胞より容易にＴｒｅｇに分化する（Ｄｅｌｇｏｆｆｅら、（２００９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３０：８３２−８４４）。ＡＫＴ／ｍＴＯＲに拮抗することによる適応Ｔｒｅｇ発生の制御における同時阻害分子ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１についての必須の役割もまた、報告されている（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏら、（２００９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０６：３０１５−３０２９）。これらの経路がまた、ＴｒｅｇのＢｓＢ媒介性誘導にも関与しているかどうかを決定するために、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を、９６ウェルプレート上でＢｓＢ、ｍＩｇＧ、またはＰＤ−Ｌ１と同時固定化し、その上に未処置のＴ細胞を播種した。活性化の１８時間後、リン酸化ＡＫＴおよびｍＴＯＲに対する蛍光標識した抗体で細胞を染色し、フローサイトメトリーにより分析した。ＡＫＴおよびｍＴＯＲの両方のリン酸化は、ＢｓＢおよびＰＤ−Ｌ１同時固定化により減衰した（図６）。特定の理論に束縛されずに、ＣＴ
ＬＡ−４およびＰＤ−Ｌ１阻害分子により媒介されるシグナル伝達事象は、Ｔｒｅｇ分化を調節するためのＴ細胞活性化の間、ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路に沿ってある時点に集中し得る。

〔実施例８〕
ＢｓＢへの曝露は誘導性Ｔｒｅｇ内でＦｏｘｐ３⁺発現を維持する。
完全に遂行する天然Ｔｒｅｇと異なる、インビトロ誘導性Ｔｒｅｇは、報告によればほとんど安定ではなく、開始誘導因子（例えば、ＴＧＦ−βまたはレチノイン酸）の非存在下で長期の培養時にＦｏｘｐ３⁺発現を損失し得る（ＳｅｌｖａｒａｊおよびＧｅｉｇｅ
ｒ、（２００７）Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．１７８：７６６７−７６７７）。現在の研究において、ＢｓＢ誘導性Ｔｒｅｇは、培養を繰り返した後、一部の細胞がＦｏｘｐ３発現を損失する、同様の不安定性を示した（図７）。ＢｓＢによる再刺激がＦｏｘｐ３発現を長引かせることができるかどうかを試験するために、Ｔｒｅｇをまず、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体およびＢｓＢの両方で９６ウェルプレートをコーティングすることにより誘導した。次いで精製したＴｒｅｇをＢｓＢの存在または非存在下で培養のさらなるラウンドに供した。ＢｓＢによる精製したＴｒｅｇの再刺激により、ＩｇＧ対照に応答する約４０％のＦｏｘｐ３発現（図７、上側の右パネル）と比較して、Ｆｏｘｐ３⁺Ｔｒｅｇの多くの集団
（全てのＴｒｅｇの約９３％）（図７、下側の右パネル）の維持が可能となった。

〔実施例９〕
マウスにおけるＢｓＢの薬物動態
自己免疫疾患の動物モデルにおけるＢｓＢの治療有用性を試験する前に、インビボでの投薬計画の設計に役立つようにその薬物動態プロファイルを決定した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスへのＢｓＢの腹腔内注射の結果、循環レベルの測定可能な増加が生じ、その後、約１２時間の推定血漿半減期（ｔ_1/2）で迅速なクリアランスが生じた（図８Ａ）。Ｆｃを含
有する融合タンパク質または抗体の薬物動態は典型的に、より長引いたので、このプロファイルは予想されなかった。新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への抗体の結合はそれらの長引いた半減期に主に関与するので（ＲｏｏｐｅｎｉａｎおよびＡｋｉｌｅｓｈ、２００７）、ＦｃＲｎに結合するＢｓＢおよび対照マウスＩｇＧ２ａの相対能力を比較した。図８Ｂは、ＦｃＲｎへの両方のタンパク質の結合特徴が非常に類似していることを示し、これは、ＦｃＲｎへのＢｓＢの結合の欠陥が、循環からのその迅速なクリアランスの原因ではないようであることを示している。

ＢｓＢの迅速なクリアランスについての別の可能性のある説明は、非標的細胞上の炭水化物受容体によるその摂取に起因し得る。このような受容体の例には、肝細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）（Ｗｅｉｇｅｌ、１９９４）およびマクロファージ上のマンノース受容体および細網内皮系の内皮細胞（Ｐｏｎｔｏｗら、１９９２）が含まれる。ＮｅｔＮＧｌｙｃサーバーを使用したＢｓＢの分析により、その受容体は単量体当たり最大１０個のアスパラギン連結オリゴ糖側鎖を保有する可能性が示唆された（図９）。単糖組成分析により、ＢｓＢが約３７のマンノース残基を含有することが示され、これらのアスパラギン連結オリゴ糖グリカンはそれぞれ３つのマンノース残基（全部で３０個のマンノース残基）を有するコアマンノース構造を含有するので、全ての予測されるアスパラギン連結グリコシル化部位が使用されてもよい。さらに、小量の高マンノース型オリゴ糖もまた、余分なマンノース残基を構成するために存在できる。実際に、有意な量のシアル化トリ−およびテトラ−アンテナリー（ａｎｔｅｎｎａｒｙ）アスパラギン連結、ならびにいくつかの高マンノース型オリゴ糖を、タンパク質から放出される過メチル化グリカンの質量分析により識別した。

この予測はまた、８０ｋＤａのＢｓＢの算出した重量と対照的に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により示したように１００ｋＤａのＢｓＢの分子量と一致する。加えられたオリゴ糖の
存在は分子量の相違（２０ｋＤａ）の原因であった。さらに、ＢｓＢは０．６８のシアル酸対ガラクトースの比を示し（図９）、これは、グリカンが不完全にシアル化されたことを示している。特定の理論に束縛されずに、ＡＳＧＰＲによるＢｓＢの炭水化物媒介性クリアランスは循環からのその迅速なクリアランスに寄与した。

〔実施例１０〕
ＢｓＢによる短期間の処置はＮＯＤマウスにおける自己免疫性糖尿病の発症を遅延させた。
インビトロでＴｒｅｇを誘導するＢｓＢのＥＣ₅₀は約１００ｎＭであると推定し、その循環半減期は短かった（約１２時間でｔ_1/2）ので、ＢｓＢを後期予防パラダイムのＮＯ
Ｄマウスにおいて試験した。ＮＯＤマウスが９から１２週齢の間にある場合に、短い間隔にわたって（４週間の間１日おきに）ＮＯＤマウスにＢｓＢを投与した。この齢数で、自己反応性Ｔ細胞および膵島炎は既に明らかであるが、マウスはまだ顕性糖尿病を発症していなかった。図１０Ａに示すように、ＢｓＢで２週間処置したＮＯＤマウスは、生理食塩水で処置した対照と比較して、血液中のＦｏｘｐ３⁺Ｔｒｅｇの数の適度だが統計的に有
意な増加（２５％）を示した。しかしながら、４週間の処置後または後の時点におけるＴｒｅｇの数の相違は検出できなかったので、このＴｒｅｇの増加は一時的であった。リンパ器官におけるＴｒｅｇの同様の一時的な増加は、抗ＣＤ３抗体によるＮＯＤマウスの処置後、以前に示されていた（Ｎｉｓｈｉｏら、２０１０）。特定の理論に束縛されずに、ＢｓＢ誘導性Ｔｒｅｇは、処置の停止後、Ｆｏｘｐ３^-Ｔ細胞に戻り得る。それらはまた
、それらの機能を実行するために特異的標的組織（例えば膵臓）により動員され得る。それにも関らず、後期予防治療パラダイムのＢｓＢによるこの短期間の処置は疾患の発症を適度に遅延させ、顕性Ｔ１Ｄを示すマウスの数を減少させるように見える（図１０Ｂ）。

示した適度の応答は療法の開始前の９週齢のＮＯＤマウスにおける活動中の膵島炎の存在に起因し得る。炎症マウスは、Ｔｈ１７細胞への活性化Ｔ細胞の変換を支持し、Ｔｒｅｇへのそれらの変換を抑制することが示された。ＩＬ−６またはＩＬ−４のような炎症性サイトカインはまた、Ｔｒｅｇ変換を阻害し、Ｔｒｅｇ内のＦｏｘｐ３⁺発現の損失を促
進することが示されている（Ｃａｒｅｔｔｏら、２０１０；Ｋａｓｔｎｅｒら、２０１０；Ｋｏｅｎｅｎら、２００８）。これらの課題を回避するために、ＮＯＤマウスを自己反応性Ｔ細胞および膵島炎の明らかな誘導の前に早い齢数（４週齢）で開始して処置した。ＣＴＬＡ−４Ｉｇもまた、このモデルにおいてこの作用因子を使用した有益性を実証しているＢｌｕｅｓｔｏｎｅおよび共同研究者（Ｌｅｎｓｃｈｏｗら、１９９５）のようにこの研究において陽性対照として含め；ｍＩｇＧ２ａを生理食塩水に対するさらなる陰性対照として使用した。高齢のマウス（図１０Ａ）における結果と対照的に、ＢｓＢで２週間処置したより若いＮＯＤマウスの末梢血中のＦｏｘｐ３⁺Ｔｒｅｇの数は、生理食塩水ま
たはｍＩｇＧを投与したものより増加しなかった（図１１Ａ）。特定の理論に束縛されずに、このことは、４週齢のＮＯＤマウス（以前の研究において使用した９〜１２週齢のマウスと対照的に）における自己反応性Ｔ細胞の数が非常に低いためであり得る。誘導した抗原特異的Ｔｒｅｇの数は、動物に存在する基礎レベルを超えて検知するには非常に少ないようであった。Ｔ１Ｄの顕著に低い発生率が、２４週齢の前に生理食塩水で処置した対照と比較して、ＢｓＢを投与したＮＯＤマウスにおいて示された（図１１Ｂ）。しかしながら、この有益性は後の時点で減少した。

ＣＴＬＡ−４Ｉｇを投与したＮＯＤマウスの報告（Ｓａｌｏｍｏｎら、２０００）と一致して、ＣＤ２８／Ｂ７シグナル伝達に対するＣＴＬＡ−４Ｉｇの効果（Ｔａｎｇら、２００３）のために、血液中のＴｒｅｇのレベル（図１１Ａ）は恐らく著しく低下した。ＣＴＬＡ−４Ｉｇによる処置はまた、生理食塩水およびｍＩｇＧで処置した対照（図１１Ｂ）と比較して、マウスが疾患の早期発症（図１１Ｂ）および疾患の高い浸透率を示しており、疾患を悪化させた。これらの結果と、Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅおよび共同研究者（Ｌｅｎ
ｓｃｈｏｗら、１９９５）により報告されている結果との相違に関する理由は不明確であるが、使用されるＣＴＬＡ−４Ｉｇまたは利用される投薬計画の相違に起因している可能性がある。この研究において、１０ｍｇ／ｋｇ用量のヒトＣＴＬＡ−４Ｉｇ（オレンシア）を、Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅおよび共同研究者による２．５ｍｇ／ｋｇのマウスＣＴＬＡ−４Ｉｇの代わりに使用した。さらに、ＢｓＢ処置は７週間を超えなかった。特定の理論に束縛されずに、高用量のＣＴＬＡ−４Ｉｇの使用はＴｒｅｇ恒常性に必要とされる同時刺激シグナルのより完全な遮断を与えた。

〔実施例１１〕
ＢｓＢによる長期間の処置は発症を顕著に遅延させ、ＮＯＤマウスにおける自己免疫性糖尿病の発生率を減少させた。
以前の研究におけるＮＯＤマウスにおける疾患の対処時にＢｓＢの観察された適度な有益性についての潜在的理由は、比較的短期間の処置の展開、Ｔｒｅｇの産生の誘導時のＢｓＢの中程度の有効性（＞１００ｎＭにおけるＥＣ₅₀）、および制限されたその曝露を有し得るＢｓＢの短い循環半減期を含む。ＢｓＢの有効性および循環半減期は分子に固有であるので、変化を容易に受け入れられず、長期間の処置を試験した。この目的を達成するために、ＮＯＤマウスを、そのマウスが４週齢の時に開始して、４週間の代わりに１０週間ＢｓＢで処置した。図１２Ａに示すように、ＢｓＢで１０週間処置したＮＯＤマウスはＴ１Ｄの発症において顕著な遅延を示した。重要なことに、３５週齢までに、生理食塩水で処置した対照における７０％以上と比較して、約１３％のみのＢｓＢで処置したＮＯＤマウスがＴ１Ｄを発生した。それ故、ＢｓＢによるＮＯＤマウスの長期の処置は、自己免疫性糖尿病の発生から動物を保護するように見えた。

研究の終わり（マウスが３５週齢であるとき）に、動物を屠殺し、それらの膵臓を病理組織分析のために採取した。隣接する連続した切片を、膵島の一般的な評価のためにＨ＆Ｅで染色し、β細胞内のインスリンの存在を検出するために抗インスリン抗体でプローブし、Ｔ細胞およびＴｒｅｇを見つけるために抗ＣＤ３および抗Ｆｏｘｐ３抗体で二重染色した。

ＮＯＤマウスの遺伝的異質性に起因して、少数の未処置の動物は３５週齢で疾患を発生しなかった。これらの非糖尿病動物（生理食塩水で処置したコホート由来）の膵島の分析により、リンパ球浸潤または膵島炎の明らかな証拠を有さず、β細胞がインタクトであることが示された（図１２Ｂ、パネルａ〜ｃ）。少数のＦｏｘｐ３⁺Ｔｒｅｇ細胞はこれら
のマウスの膵島内に存在した（パネルｃにおける矢印）。対照的に、糖尿病ＮＯＤマウス由来（生理食塩水で処置したコホート由来）の膵島は、侵襲性膵島炎の存在（図１２Ｂ、パネルｄ）およびβ細胞の完全な破壊を表した（パネルｅ）。ＣＤ３⁺Ｔ細胞およびＦｏ
ｘｐ３⁺Ｔｒｅｇに加えて、多数の非Ｔ細胞リンパ球もまた、明白であった（図１２Ｂ、
パネルｆ）。研究の終わりに無病のままであったまたは研究の間にＴ１Ｄを発生した対応するＢｓＢで処置したマウスにおいて同様の病理組織結果が示された。興味深いことに、非糖尿病のままであったＢｓＢで処置したＮＯＤマウスの約５０％の膵島において、膵島周囲炎の証拠が示された（図１２Ｂ、パネルｇ）；しかしながら、β細胞は十分に保存された（図１２Ｂ、パネルｈ）。抗体での染色により、膵島の周辺における細胞が主にＣＤ３⁺Ｔ細胞およびＴｒｅｇを含むことが示された（図１２Ｂ、パネルｉ）。画像の部分の
拡大（図１２Ｂにおける赤色の四角、パネルｉ）により、ＣＤ３⁺Ｔ細胞ではなく非Ｆｏ
ｘｐ３⁺（図１２Ｂにおける黒色の矢印ヘッド、パネルｊ）および非Ｔ細胞単核球（ｍｏ
ｎｏｎｕｃｌｅｏｃｙｔｅ）（青色の核）が散在した多数のＦｏｘｐ３⁺Ｔｒｅｇの存在
（図１２Ｂにおける黄色の矢印、パネルｊ）が明確に現れた。膵島周囲炎の発生は若い（４〜１０週齢）ＮＯＤマウスにおいて（ＡｎｄｅｒｓｏｎおよびＢｌｕｅｓｔｏｎｅ、２００５）、およびＮＯＤマウスにおいて新たに発症するＴ１Ｄを遅延または反転させる他の効果的な治療剤で処置した高齢のマウスにおいて（Ｃｈａｔｅｎｏｕｄら、１９９４；
Ｄａｎｉｅｌら、２０１１；Ｓｉｍｏｎら、２００８；Ｖｅｒｇａｎｉら、２０１０）示された。それ故、ＢｓＢによるＮＯＤマウスの長期間の処置は、侵襲性膵島炎および顕性ＴＩＤの発生から動物を保護した。特定の理論に束縛されずに、これは、少なくとも部分的に、膵島抗原特異的Ｔｒｅｇのデノボおよび場合によりその場の誘導により媒介された。

新規二重特異性融合タンパク質（ＢｓＢ）を使用してＭＨＣＩＩを介してＣＴＬＡ−４およびＴＣＲを架橋することは、抗原特異的Ｔｒｅｇならびに抗炎症性サイトカイン、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βの産生を効果的に誘導した。以前の研究により、Ｔｒｅｇが免疫寛容を与えるのに重要であり、抗原特異的Ｔｒｅｇが自己免疫疾患の動物モデルにおいて、より効果的であることが示された。Ｔ１Ｄのような自己免疫疾患の動物モデルにおいてＢｓＢをさらに評価した。特定の理論に束縛されずに、ＢｓＢが、ＮＯＤマウスにおける自己反応性Ｔ細胞の活性化の早期段階の間に抗原特異的Ｔｒｅｇの誘導を促進する場合、ＢｓＢは、Ｔｒｅｇに対する活性化を受けている自己反応性Ｔ細胞を変換することにより発症を遅延できるか、または疾患の進行停止できると仮定された。

ＢｓＢが適度な有効性（ＭＨＣ−ＩＩおよびＴＣＲに対するその中程度の親和性に起因する）および短い循環半減期（その曝露を制限した）を示すにも関わらず、短期間の処置は、再現性よく、若齢（４〜６週齢の間）で、およびそれらが高齢（９〜１２週齢の間）である場合に処置したＮＯＤマウスにおけるＴ１Ｄの発症を遅延させた。しかしながら、観察された有益性は適度であり、維持されなかった。ＢｓＢによるＮＯＤマウス（４から１３週齢の間）の長期間の処置（１０週）は疾患の発症およびＴ１Ｄを発生する動物の発生率を顕著に減少させた。特定の理論に束縛されずに、この有益性は、局所的（例えば、膵臓または膵臓の流入領域リンパ節において）または遠位のいずれかで産生され、次いで自己反応性Ｔ細胞および他の非Ｔ細胞白血球による破壊から膵島を保護するために膵臓に動員された誘導されたＴｒｅｇのデノボ生成により与えられた。非糖尿病のままであった３５週齢のＢｓＢで処置したマウスの膵臓組織の切片の免疫組織化学的染色により、膵島の周辺におけるＦｏｘｐ３⁺Ｔｒｅｇの数の増加が明確に示された。視覚的に、それらは
、ＣＤ３⁺Ｔ細胞および非Ｔ細胞リンパ球が膵島に進入することを防ぐように見えた。こ
の現象は、研究の終わりに非糖尿病のままであったＢｓＢで処置したＮＯＤマウスの約５０％の膵島で観察されたが、対照群における糖尿病動物の膵島のどれも観察されなかった。対照群における少数の非糖尿病マウスの膵島はリンパ球浸潤を欠いたままであり、膵島炎が存在しなかった。ＮＯＤマウスの遺伝的異質性のために、このサイズのコホートにおける少数の動物はこの時間枠内で糖尿病を決して発生しないことが知られている。ＢｓＢで処置した群における非糖尿病動物の残りの約５０％において、膵島はまた、リンパ球浸潤を欠き、膵島炎が存在しなかった。これらのマウスの無病の状態についての可能性はＢｓＢ処置および遺伝的背景を含む。

組織病理学的結果と一致して、Ｆｏｘｐ３⁺Ｔｒｅｇの数の小さいが統計的に有意な増
加が、未処置の対照と比較して、ＢｓＢで処置した（９〜１２週齢で処置した）動物の血液中で検出された。この増加は若齢（４週齢）で処置を開始したマウスでは明らかでなかった。特定の理論に束縛されずに、このことは、多くの自己反応性Ｔ細胞が４週齢のマウスにおいてより９週齢において活性化を受けているためであり得る。４週齢のマウスにおける低レベルの自己反応性Ｔ細胞は、Ｔｒｅｇの既存の環境におけるものを超えて誘導されるＴｒｅｇの検出を不可能にした。Ｔｒｅｇの増加はまた、天然において一時的であった。同様の観察が抗ＣＤ３療法を受けた動物において示されたので（Ｎｉｓｈｉｏら、２０１０）、誘導されたＴｒｅｇが不安定であり、Ｆｏｘｐ３の発現を損失することが起こり得る。Ｔｒｅｇが循環から影響を受けた標的組織まで動員されることは十分に考えられる。対照的に、ＣＴＬＡ−４Ｉｇで処置したＮＯＤマウスは循環Ｔｒｅｇの数の顕著な減少を示した。処置はまた、疾患の早まった発症および顕性疾患を示す動物の高い発生率に
より証明されるように疾患を悪化させた。このことは、同時刺激経路が、Ｔｒｅｇ恒常性に関与すること、および同時刺激の欠如がＴｒｅｇの産生を減少させることを示している以前の報告と一致する。ＮＯＤマウスにおける遮断またはノックアウトＣＤ８０またはＣＤ８６もまた、Ｔ１Ｄの早期発症を生じる（Ｓａｌｏｍｏｎら、２０００；Ｔａｎｇら、２００３）。

膵島周囲炎の出現は典型的に４から９週齢の間のＮＯＤマウスの膵臓において観察される。制御されていない場合、侵襲性膵島炎は１２から３５週齢の間のβ細胞の完全な破壊および顕性糖尿病の発生を導いた結果として起こる。ＢｓＢで１０週間処置し、３５週齢で分析した非糖尿病ＮＯＤマウスの膵臓は、それらの進行を停止させるように見える膵島周囲炎の証拠を示した。侵襲性膵島炎またはインスリン産生β細胞の過剰な破壊は示されなかった。ＮＯＤマウスにおける疾患を同様に遅延または予防する異なる治療介入の他の報告が存在する（Ｓｈｏｄａら、２００５）。ここでその結果は、ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔｒｅｇを含有する全てのＣＤ４⁺Ｔ細胞を投与したマウスと比較して、侵襲性膵島炎の発生
を早めたメスのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス内でＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔｒｅｇを枯渇した糖尿病誘発性ＣＤ４⁺ＣＤ２５^-ＢＤＣ２．５Ｔ細胞の移入を示した、Ｌｅｅら（２０１０）により報告されているものとほとんど同種である。侵襲性膵島炎は、大部分、ＢＤＣ２．５Ｔ細胞自体よりむしろ、樹状細胞（ＤＣ）の浸潤により占められている。著者は、Ｔｒｅｇが、少なくとも部分的に、膵島により分泌されるケモカインＣＣＬ１９およびＣＣＬ２１に応答して、ＤＣの走化性を調節することにより膵島内へのＤＣの侵襲性を調節したことをこれらの研究から推測した。ＢｓＢで処置した、非糖尿病ＮＯＤマウスの膵臓切片において示されたＦｏｘｐ３⁺Ｔｒｅｇ、ＣＤ３⁺Ｔ細胞および非Ｔ細胞白血球についての免疫組織化学的染色パターンは、これらの結果と一致する（図１２Ｂ）。特定の理論に束縛されずに、ＢｓＢに応答してＮＯＤマウスにおいて産生されるＴｒｅｇは、膵島内への自己反応性Ｔ細胞および非Ｔ細胞リンパ球の移動を停止するように作用するようである。ＢｓＢによる長期間の処置は、このことがＴｒｅｇのより強力で維持される誘導を生じるため、より効果的である。Ｔｒｅｇ内のＦｏｘｐ３⁺の発現を延ばした細胞培養物中でのＢｓ
Ｂによる誘導されるＴｒｅｇのその持続的刺激はこの考えを支持する（Ｋａｒｍａｎら、２０１２）。

自己免疫疾患または臓器移植の動物モデルにおいて新たに単離された、エキソビボで増殖したまたはインビトロで誘導したＴｒｅｇを使用した細胞療法により、Ｔｒｅｇの養子免疫伝達が、Ｔｒｅｇ対エフェクターＴ細胞の平衡を元に戻すことができ、それによりこれらの疾患に関連する過剰増殖自己免疫を制御することが実証されている（Ａｌｌａｎら、２００８；Ｊｉａｎｇら、２００６；Ｒｉｌｅｙら、２００９；Ｔａｎｇら、２０１２）。しかしながら、治療戦略としての養子免疫伝達の使用は臨床に移行するためのいくつかの課題を提示している。第１に、ヒト対象の末梢血から単離され得る自己Ｔｒｅｇの数は限られている。それ故、Ｔｒｅｇの広範囲のエキソビボでの増殖が多くの場合、必要であり、これはそれらの機能性および純度を変化させる場合がある。第２に、単離されるＴｒｅｇはポリクローナルであるので、それらは非標的エフェクターＴ細胞に対して汎免疫抑制機能を与える場合がある。第３に、および最も重要なことに、Ｔｒｅｇの柔軟性が重大な課題を引き起こす（Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅら、２００９；Ｚｈｏｕら、２００９ａ）。養子導入されたＴｒｅｇは、Ｆｏｘｐ３発現およびＴｈ１７細胞への再分化（Ｋｏｅｎｅｎら、２００８）または病原性記憶Ｔ細胞（Ｚｈｏｕら、２００９ｂ）を損失する場合があり、これにより自己免疫または炎症を悪化する危険性を増加させることが示されている。その結果として、その場で抗原特異的にＴｒｅｇの生成を誘導する治療は養子Ｔｒｅｇ細胞療法より有益である。本明細書に示した結果により、Ｔ１Ｄのマウスモデルに関連してＣＴＬＡ−４をＭＨＣＩＩに架橋するこのような作用因子（ＢｓＢ）の有用性および効果が実証される。ＢｓＢによる処置に応答するＩＬ−１０、ＴＧＦ−βおよびＴｒｅｇの産生の組み合わされた実証ならびにＴ１ＤのＮＯＤマウスモデルの効能は新規治療概念を
提供する可能性を有する。ＢｓＢはまた、それが休止しているＴ細胞または他のリンパ球に影響を与えないという点で他の免疫調節因子よりさらなる利点を与える。周辺におけるＣＤ４⁺Ｔ細胞およびＣＤ１９⁺Ｂ細胞の数および百分率は全ての我々のＮＯＤ研究において同じままであった。特定の理論に束縛されずに、このアプローチは疾患進行を遅延または停止するのに効果的である。より有効で、より好ましい薬物動態プロファイルを保有するＢｓＢバリアントの開発により、これらの研究が確認されるはずである。それ故、この概念はまた、他の免疫媒介性疾患の管理に対して適用されてもよい。

本明細書に報告される結果は、他に示されない限り、以下の方法および物質を使用して得た。

動物。Ｃ５７ＢＬ／６遺伝的背景においてニワトリオボアルブミン３２３〜３３９（Ｏｖａ_323-339）に特異的なマウスα鎖およびβ鎖Ｔ細胞受容体を発現するメスの野生型Ｃ
５７ＢＬ／６（Ｈ−２^b）、ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２^d）、トランスジェニックＯＴ−ＩＩマウス、ならびにメスの非肥満糖尿病（ＮＯＤ／ＬｔＪ）マウスは、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。動物は病原体を含まない施設に維持し、米国保険福祉省（ＮＩＨ公開番号８６〜２３）により、およびジェンザイム施設動物実験委員会（Ｇｅｎｚｙｍｅ’ｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ
Ｕｓｅ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により発行されているガイドラインに従って研究を行った。

抗体および試薬。機能的グレードまたは蛍光標識抗マウスＣＤ３（クローン１４５−２Ｃ１１）、ＣＤ２５、インスリンおよびＦｏｘｐ３⁺抗体は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅま
たはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。マウスＣＴＬＡ−４−ＦｃおよびヒトＣＴＬＡ−４Ｉｇ（オレンシア）は、それぞれ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．およびＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂから購入した。マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照は、ＢｉｏＸＣｅｌｌ Ｉｎｃから得た。ＣＦＳＥ、超低Ｉｇウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、および他の細胞培養培地はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製であった。ニワトリＯｖａ₃₂₃〜₃₃₉ペプチドはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅから得た。

二重特異性融合タンパク質ＢｓＢの構築および産生。ＣＤ８０ｗ８８ａおよびＬＡＧ−３の細胞外ドメインならびにマウスＩｇＧ２ａのＦｃ（ＣＤ８０ｗａ−ＬＡＧ−３−Ｆｃ、ＢｓＢ）を含む二重特異性融合タンパク質（ＢｓＢ）の構築および発現は以前に記載されていた（Ｋａｒｍａｎら、２０１２）。

Ｂｉａｃｏｒｅアッセイおよび単糖組成分析。マウス新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）へのＢｓＢおよびｍＩｇＧ２ａの結合を比較するためにＢｉａｃｏｒｅを使用した。簡潔に述べると、ＣＭ５チップを、アミン化学を使用して約１４３０ＲＵのマウスＦｃＲｎ−ＨＰＣ４と共に固定化した。各サンプルを、ＰＢＳＰ（０．００５％界面活性剤Ｐ−２０を含むＰＢＳ）、ｐＨ６．０中の２００から６．２５ｎＭの間の最終濃度まで１：２に連続希釈し、２連で３分間注入し、続いて３分間、解離緩衝液で洗浄した。１０ｍＭのホウ酸ナトリウムおよび１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５を用いて表面を再生した。ＢｓＢの炭水化物単糖組成をＺｈｏｕら（Ｚｈｏｕら、２０１１）に記載されているプロトコルに従って分析した。

未処置のＴ細胞の単離。８〜１２週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃまたはＯＴ−ＩＩマウスの脾臓およびリンパ節由来の未処置のＴ細胞を磁気分離により精製し、続いて蛍光活性化細胞分類を行った。細胞を最初に磁気細胞分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により負で選択し、次いで９８％超の純度までＣＤ４⁺ＣＤ２５^-ＣＤ６２Ｌ^hiＣＤ４４^low細
胞として分類した。

抗原特異的Ｔｒｅｇ誘導アッセイ。同種異系ＭＬＲ設定におけるアッセイを以前に報告されている（Ｋａｒｍａｎら、２０１２）ように実施した。抗原特異的Ｔ細胞活性化に関して、１０⁵個の未処置のＯＴ−ＩＩＴ細胞を、０．５μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌの
可溶性抗ＣＤ２８（クローン３７．５１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）にてＯｖａ_323-329
の存在下で、１０⁵個の放射線照射した同系ＡＰＣを有する丸底９６ウェルプレート中で
混合した。試験構築物、マウスＩｇＧ２ａ、またはマウスＣＴＬＡ−４Ｉｇを、１００μｇ／ｍｌの飽和濃度にて培養した細胞に加えた。Ｔｒｅｇの産生を誘導するために細胞を５日間培養し、フローサイトメトリーにより分析した。製造業者の指示書に従ってＥＬＩＳＡキットを使用してＩＬ−２、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βの分析のために培地を採取した。Ｔ細胞増殖を評価するために、精製した未処置のＯＴ−ＩＩＴ細胞を、３７℃にて５分間、５μＭのＣＦＳＥで標識した。次いでそれらを洗浄して未結合のＣＦＳＥを除去し、上記のようにＴｒｅｇ誘導アッセイに使用した。細胞を５日間培養し、フローサイトメトリーによる分析の前にそれらを分けた。Ｔ細胞中のＦｏｘｐ３⁺を検出するために、
上記の表面マーカーについて細胞を染色し、続いてＦｉｘ／Ｐｅｒｍ緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で透過処理し、ＰＥ−Ｃｙ７がコンジュゲートした抗Ｆｏｘｐ３抗体（クローンＦＪＫ−１６ｓ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。

マウスにおけるＢｓＢの薬物動態測定。ＢｓＢの薬物動態は８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて決定した。２０ｍｇ／ｋｇのＢｓＢを腹腔内注射によりマウスに投与した。投与後１時間、５時間、２４時間、４８時間、および７２時間にて伏在静脈出血により血液を採取した。ＥＬＩＳＡアッセイを使用して各時点にてＢｓＢのレベルを測定した。簡潔に述べると、ＰＢＳ中の１００μｌ（１μｇ／ｍｌ）の抗マウスＣＤ８０抗体を９６ウェルプレート上でコーティングし、４℃にて一晩インキュベートした。プレートを５％のウシ胎仔血清で１時間遮断し、その後、それらをＰＢＳで４回洗浄した。次いで種々の希釈にて１００μｌの血液サンプルをウェル中に加えた。プレートを室温で穏やかに振盪しながら２時間インキュベートし、ＰＢＳで４回洗浄した。ビオチン化抗マウスＬＡＧ−３抗体（１μｇ／ｍｌ）を加え、２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで４回洗浄し、その後、ストレプトアビジン−ＨＲＰを加えた。３０分後、プレートをＰＢＳで６回洗浄し、比色分析測定のために発達させた。種々の濃度にてアッセイ希釈物中で希釈した精製したＢｓＢを基準物として使用した。

ＢｓＢによるＮＯＤマウスの処置。短期間の処置において、４週齢のメスのＮＯＤマウスを、２．５週の期間にわたって１週間に３回、腹腔内注射により、生理食塩水、２０ｍｇ／ｋｇのＢｓＢ、２０ｍｇ／ｋｇのマウスＩｇＧ２ａ、または１０ｍｇ／ｋｇのヒトＣＴＬＡ−４Ｉｇ（オレンシア）で処置した。後期予防モデルに関して、９〜１２週齢のＮＯＤマウスを４週間上記のように生理食塩水または２０ｍｇ／ｋｇのＢｓＢで処置した。長い処置期間に関して、４週〜１３週齢のＮＯＤマウスを１０週間上記のようにＢｓＢまたは生理食塩水で処置した。非空腹時血糖レベルを８週齢で開始して毎週モニターした。マウスのグルコース読み取り値が３つの連続した読み取り値について３００ｍｇ／ｄＬ超である場合、マウスを糖尿病とみなした。末梢血中のＦｏｘｐ３⁺Ｔｒｅｇを、フローサ
イトメトリーにより処置の２週間後に試験した。

簡潔に述べると、５０μｌの全血を未標識の抗ＦｃγＲＩＩｂおよびＦｃｇＲＩＩＩ（クローン９３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で２０分間遮断した。その後、細胞を蛍光標識した抗ＣＤ４抗体で３０分間染色し、次いで洗浄した。ＦＡＣＳ溶解液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して５分間、赤血球を溶解した。洗浄後、細胞を固定し、透過処理し、上記のように３０分間、ＦＩＴＣ標識した抗Ｆｏｘｐ３抗体で染色した。膵臓を半分に切断して中性緩衝ホルマリン中に半分のうちの一方を固定し、他方をＯＣＴ化合物内に入れ、次いでドライアイス上で凍結させた。

統計的分析。Ｐｒｉｓｍ５（Ｇｒａｐｈｐａｄ、ｃｉｔｙ ａｎｄ ｓｔａｔｅ）において対数順位（Ｃｏｘ−Ｍａｎｔｅｌ）検定を使用してＢｓＢまたは対照による処置後にＴ１Ｄおよび高血糖を提示しているＮＯＤマウスの累積発現率を比較した。ｐ＜０．０５の値は統計的に有意とみなした。

病理組織学的分析。中性緩衝ホルマリンで固定した膵臓を、自動処理装置を使用してＣＤ３、Ｆｏｘｐ３⁺細胞について染色した。キシレン−エタノールを使用して組織切片を
脱ろうして、クエン酸塩緩衝液中で２５分間インキュベートすることによって抗原を取り出し、次いで血清で遮断した。スライドを４５分間、抗ＣＤ３抗体とインキュベートし、続いて２０分間、ヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼポリマーとインキュベートした。２〜４分間、３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリドとインキュベートすることによりＣＤ３の色原体視覚化を得た。Ｆｏｘｐ３⁺を検出するために、切片を血
清で再遮断し、続いて４５分間、抗Ｆｏｘｐ３抗体に曝露した。次いでスライドを３０分間、ウサギ抗ラットＩｇＧ抗体とインキュベートし、続いてヤギ抗ウサギアルカリホスファターゼポリマーとインキュベートした。１０分間、Ｆａｓｔ Ｒｅｄを使用して色原体視覚化を達成した。２分間、ヘマトキシリンを使用してこれらの組織切片を対比染色し、工程の間に０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水を用いて３回洗浄した。上記の抗インスリン抗体を使用して隣接した連続切片を染色した。Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｃ．製の付属のデジタルカメラを備えたＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ８００蛍光顕微鏡を使用して写真を撮り、Ｓｐｏｔ Ａｄｖａｎｃｅｄソフトウェアを使用して画像を獲得した。

配列
凡例
ＣＤ８０ｗ８８ａ＝ＣＴＬＡ−４リガンド
ＩｇＧ２ａ＝ＩｇＧ２ Ｆｃ領域
Ｇ９＝Ｇｌｙ９
Ｌａｇ−３＝ＭＨＣリガンド
Ｈ６＝Ｈｉｓ６
配列番号１：
ＣＴＬＡ−４ ＢｓＢ（遺伝子１）＝マウスＣＤ８０ｗ８８ａ（ａａ１〜２３５）−ＩｇＧ２ａ（ａａ２４１〜４７４）−Ｇ９−Ｌａｇ−３（ａａ２５−２６０）−Ｈ６
マウス代理構築物のヌクレオチド配列（遺伝子１）：
ATGGCTTGCAATTGTCAGTTGATGCAGGATACACCACTCCTCAAGTTTCCATGTCCAAGGCTCATTCTTCTCTTTGTGCTGCTGATTCGTCTTTCACAAGTGTCTTCAGATGTTGATGAACAACTGTCCAAGTCAGTGAAAGATAAGGTATTGCTGCCTTGCCGTTACAACTCTCCTCATGAAGATGAGTCTGAAGACCGAATCTACTGGCAAAAACATGACAAAGTGGTGCTGTCTGTCATTGCTGGGAAACTAAAAGTGGCGCCCGAGTATAAGAACCGGACTTTATATGACAACACTACCTACTCTCTTATCATCCTGGGCCTGGTCCTTTCAGACCGGGGCACATACAGCTGTGTCGTFCAAAAGAAGGAAAGAGGAACGTATGAAGTTAAACACTTGGCTTTAGTAAAGTTGTCCATCAAAGCTGACTTCTCTACCCCCAACATAACTGAGTCTGGAAACCCATCTGCAGACACTAAAAGGATTACCTGCTTTGCTFCCGGGGGITTCCCAAAGCCTCGCTTCTCTTGGTTGGAAAATGGAAGAGAATTACCTGGCATCAATACGACAATTTCCCAGGATCCTGAATCTGAATTGTACACCATTAGTAGCCAACTAGATTTCAATACGACTCGCAACCACACCATTAAGTGTCTCATFAAATATGGAGATGCTCACGTGTCAGAGGACTTCACCTGGGAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATGGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTCGTGAACAACGTGGAAGTACTCACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGCCCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTA
CAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGCTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAAGGCGGTGGCGGCGGAGGCGGTGGCGGTGGGCCTGGGAAAGAGCTCCCCGTGGTGTGGGCCCAGGAGGGAGCTCCCGTCCATCTTCCCTGCAGCCTCAAATCCCCCAACCTGGATCCTAACTTTCTACGAAGAGGAGGGGTTATCTGGCAACATCAACCAGACAGTGGCCAACCCACTCCCATCCCGGCCCTTGACCTTCACCAGGGGATGCCCTCGCCTAGACAACCCGCACCCGGTCGCTACACGGTGCTGAGCGTGGCTCCAGGAGGCCTGCGCAGCGGGAGGCAGCCCCTGCATCCCCACGTGCAGCTGGAGGAGCGCGGCCTCCAGCGCGGGGACTTCTCTCTGTGGTTGCGCCCAGCTCTGCGCACCGATGCGGGCGAGTACCACGCCACCGTGCGCCTCCCGAACCGCGCCCTCTCCTGCAGTCTCCGCCTGCGCGTCGGCCAGGCCTCGATGATTGCTAGTCCCTCAGGAGTCCTCAAGCTGTCTGATTGGGTCCTTTTGAACTGCTCCTTCAGCCGTCCTGACCGCCCAGTCTCTGTGCACTGGTTCCAGGGCCAGAACCGAGTGCCTGTCTACAACTCACCGCGTCATTTTTTAGCTGAAACTTTCCTGTTACTGCCCCAAGTCAGCCCCCTGGACTCTGGGACCTGGGGCTGTGTCCTCACCTACAGAGATGGCTTCAATGTCTCCATCACGTACAACCTCAAGGTTCTGGGTCTGGAGCCCGTAGCCCACCATCACCATCATCACTGA

配列番号２：
ＣＴＬＡ−４ ＢｓＢ（遺伝子１）＝マウスＣＤ８０ｗ８８ａ（ａａ１〜２３５）−ＩｇＧ２ａ（ａａ２４１〜４７４）−Ｇ９−Ｌａｇ−３（ａａ２５〜２６０）−Ｈ６
マウス代理構築物の翻訳されたタンパク質配列（遺伝子１）：
MACNCQLMQDTPLLKFPCPRLILLFVLLIRLSQVSSDVDEQLSKSVKDKVLLPCRYNSPHEDESEDRIYWQKHDKVVLSVIAGKLKVAPEYKNRTLYDNTTYSLIILGLVLSDRGTYSCVVQKKERGTYEVKHLALVKLSIKADFSTPNITESGNPSADTKRITCFASGGFPKPRFSWLENGRELPGINTTISQDPESELYTISSQLDFNTTRNHTIKCLIKYGDAHVSEDFTWEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPMVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVLTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKALPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGKGGGGGGGGGGPGKELPVVWAQEGAPVHLPCSLKSPNLDPNFLRRGGVIWQHQPDSGQPTPIPALDLHQGMPSPRQPAPGRYTVLSVAPGGLRSGRQPLHPHVQLEERGLQRGDFSLWLRPALRTDAGEYHATVRLPNRALSCSLRLRVGQASMIASPSGVLKLSDWVLLNCSFSRPDRPVSVHWFQGQNRVPVYNSPRHFLAETFLLLPQVSPLDSGTWGCVLTYRDGFNVSITYNLKVLGLEPVAHHHHHH

配列番号３：
ＣＴＬＡ−４ ＢｓＢ（遺伝子２）＝マウスＣＤ８０ｗ８８ａ（ａａ１〜２３５）−Ｇ９−Ｌａｇ−３（ａａ２５〜２６０）−ＩｇＧ２ａ（ａａ２４１〜４７４）
マウス代理構築物のヌクレオチド配列（遺伝子２）：
ATGGCTTGCAATTGTCAGTTGATGCAGGATACACCACTCCTCAAGTTTCCATGTCCAAGGCTCATTCTTCTCTTTGTGCTGCTGATTCGTCTTTCACAAGTGTCTTCAGATGTTGATGAACAACTGTCCAAGTCAGTGAAAGATAAGGTATTGCTGCCTTGCCGTTACAACTCTCCTCATGAAGATGAGTCTGAAGACCGAATCTACTGGCAAAAACATGACAAAGTGGTGCTGTCTGTCATTGCTGGGAAACTAAAAGTGGCGCCCGAGTATAAGAACCGGACTTTATATGACAACACTACCTACTCTCTTATCATCCTGGGCCTGGTCCTTTCAGACCGGGGCACATACAGCTGTGTCGTTCAAAAGAAGGAAAGAGGAACGTATGAAGTTAAACACTTGGCTTTAGTAAAGTTGTCCATCAAAGCTGACTTCTCTACCCCCAACATAACTGAGTCTGGAAACCCATCTGCAGACACTAAAAGGATTACCTGCTTTGCTTCCGGGGGTTTCCCAAAGCCTCGCTTCTCTTGGTTGGAAAATGGAAGAGAATTACCTGGCATCAATACGACAATTTCCCAGGATCCTGAATCTGAATTGTACACCATTAGTAGCCAACTAGATTTCAATACGACTCGCAACCACACCATTAAGTGTCTCATTAAATATGGAGATGCTCACGTGTCAGAGGACTTCACCTGGGGCGGTGGCGGCGGAGGCGGTGGCGGTGGGCCTGGGAAAGAGCTCCCCGTGGTGTGGGCCCAGGAGGGAGCTCCCGTCCATCTTCCCTGCAGCCTCAAATCCCCCAACCTGGATCCTAACTTTCTACGAAGAGGAGGGGTTATCTGGCAACATCAACCAGACAGTGGCCAACCCACTCCCATCCCGGCCCTTGACCTTCACCAGGGGATGCCCTCGCCTAGACAACCCGCACCCGGTCGCTACACGGTGCTGAGCGTGGCTCCAGGAGGCCTGCGCAGCGGGAGGCAGCCCCTGCATCCCCACGTGCAGCTGGAGGAGCGCGGCCTCCAGCGCGGGGACTTCTCTCTGTGGTTGCGCCCAGCTCTGCGCACCGATGCGGGCGAGTACCACGCCACCGTGCGCCTCCCGAACCGCGCCCTCTCCTGCAGTCTCCGCCTGCGCGTCGGCCAGGCCTCGATGATTGCTAGTCCCTCAGGAGTCCTCAAGCTGTCTGATTGGGTCCTTTTGAACTGCTCCTTCAGCCGTCCTGACCGCCCAGTCTCTGTGCACTGGTTCCAGGGCCAGAACCGAGTGCCTGTCTACAACTCACCGCGTCATTTTTTAGCTGAAACTTTCCTGTTACTGCCCCAAGTCAGCCCCCTGGACTCTGGGACCTGGGGCTGTGTCCTCACCTACAGAGATGGCTTCAATGTCTCCATCACGTACAACCTCAAGGTTCTGGGTCTGGAGCCCGTAGCCCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATGGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGG
ATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTCGTGAACAACGTGGAAGTACTCACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGCCCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGCTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAATGA

配列番号４：
ＣＴＬＡ−４ ＢｓＢ（遺伝子２）＝マウスＣＤ８０ｗ８８ａ（ａａ１〜２３５）−Ｇ９−Ｌａｇ−３（ａａ２５〜２６０）−ＩｇＧ２ａ（ａａ２４１〜４７４）
マウス代理構築物の翻訳されたタンパク質配列（遺伝子２）：
MACNCQLMQDTPLLKFPCPRLILLFVLLIRLSQVSSDVDEQLSKSVKDKVLLPCRYNSPHEDESEDRIYWQKHDKVVLSVIAGKLKVAPEYKNRTLYDNTTYSLIILGLVLSDRGTYSCVVQKKERGTYEVKHLALVKLSIKADFSTPNITESGNPSADTKRITCFASGGFPKPRFSWLENGRELPGINTTISQDPESELYTISSQLDFNTTRNHTIKCLIKYGDAHVSEDFTWGGGGGGGGGGPGKELPVVWAQEGAPVHLPCSLKSPNLDPNFLRRGGVIWQHQPDSGQPTPIPALDLHQGMPSPRQPAPGRYTVLSVAPGGLRSGRQPLHPHVQLEERGLQRGDFSLWLRPALRTDAGEYHATVRLPNRALSCSLRLRVGQASMIASPSGVLKLSDWVLLNCSFSRPDRPVSVHWFQGQNRVPVYNSPRHFLAETFLLLPQVSPLDSGTWGCVLTYRDGFNVSITYNLKVLGLEPVAPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPMVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVLTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKALPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK

配列番号５：
ＣＴＬＡ−４ ＢｓＢヒト構築物野生型ヌクレオチド配列＝（ヒトＣＤ８０（ａａ１〜２３４）−Ｇ９−Ｌａｇ−３（ａａ２７〜２６２−ＩｇＧｌａ（ａａ２４０〜４７１）
ATGGGCCACACACGGAGGCAGGGAACATCACCATCCAAGTGTCCATACCTCAATTTCTTTCAGCTCTTGGTGCTGGCTGGTCTTTCTCACTTCTGTTCAGGTGTTATCCACGTGACCAAGGAAGTGAAAGAAGTGGCAACGCTGTCCTGTGGTCACAATGTTTCTGTTGAAGAGCTGGCACAAACTCGCATCTACTGGCAAAAGGAGAAGAAAATGGTGCTGACTATGATGTCTGGGGACATGAATATATGGCCCGAGTACAAGAACCGGACCATCTTTGATATCACTAATAACCTCTCCATTGTGATCCTGGCTCTGCGCCCATCTGACGAGGGCACATACGAGTGTGTTGTTCTGAAGTATGAAAAAGACGCTTTCAAGCGGGAACACCTGGCTGAAGTGACGTTATCAGTCAAAGCTGACTTCCCTACACCTAGTATATCTGACTTTGAAATTCCAACTTCTAATATTAGAAGGATAATTTGCTCAACCTCTGGAGGTTTTCCAGAGCCTCACCTCTCCTGGTTGGAAAATGGAGAAGAATTAAATGCCATCAACACAACAGTTTCCCAAGATCCTGAAACTGAGCTCTATGCTGTTAGCAGCAAACTGGATTTCAATATGACAACCAACCACAGCTTCATGTGTCTCATCAAGTATGGACATTTAAGAGTGAATCAGACCTTCAACTGGAATACAACCGGCGGTGGCGGCGGAGGCGGTGGCGGTTCCGGAGCTGAGGTCCCGGTGGTGTGGGCCCAGGAGGGGGCTCCTGCCCAGCTCCCCTGCAGCCCCACAATCCCCCTCCAGGATCTCAGCCTTCTGCGAAGAGCAGGGGTCACTTGGCAGCATCAGCCAGACAGTGGCCCGCCCGCTGCCGCCCCCGGCCATCCCCTGGCCCCCGGCCCTCACCCGGCGGCGCCCTCCTCCTGGGGGCCCAGGCCCCGCCGCTACACGGTGCTGAGCGTGGGTCCCGGAGGCCTGCGCAGCGGGAGGCTGCCCCTGCAGCCCCGCGTCCAGCTGGATGAGCGCGGCCGGCAGCGCGGGGACTTCTCGCTATGGCTGCGCCCAGCCCGGCGCGCGGACGCCGGCGAGTACCGCGCCGCGGTGCACCTCAGGGACCGCGCCCTCTCCTGCCGCCTCCGTCTGCGCCTGGGCCAGGCCTCGATGACTGCCAGCCCCCCAGGATCTCTCAGAGCCTCCGACTGGGTCATTTTGAACTGCTCCTTCAGCCGCCCTGACCGCCCAGCCTCTGTGCATTGGTTTCGGAACCGGGGCCAGGGCCGAGTCCCTGTCCGGGAGTCCCCCCATCACCACTTAGCGGAAAGCTTCCTCTTCCTGCCCCAAGTCAGCCCCATGGACTCTGGGCCCTGGGGCTGCATCCTCACCTACAGAGATGGCTTCAACGTCTCCATCATGTATAACCTCACTGTTCTGGGTCTGCTGGTGCCCCGGGGCTCCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCTCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCC
TCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTATACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

配列番号６：
ＣＴＬＡ−４ ＢｓＢヒト構築物野生型の翻訳されたタンパク質配列＝（ヒトＣＤ８０（ａａ１〜２３４）−Ｇ９−Ｌａｇ−３（ａａ２７〜２６２−ＩｇＧｌａ（ａａ２４０〜４７１）
MGHTRRQGTSPSKCPYLNFFQLLVLAGLSHFCSGVIHVTKEVKEVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSVKADFPTPSISDFEIPTSNIRRIICSTSGGFPEPHLSWLENGEELNAINTTVSQDPETELYAVSSKLDFNMTTNHSFMCLIKYGHLRVNQTFNWNTTGGGGGGGGGSGAEVPWWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDVVVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLLVPRGSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号７：
ＣＴＬＡ−４ ＢｓＢヒト構築物バリアントヌクレオチド配列１＝（ヒトＣＤ８０Ｗ８４Ａ／Ｓ１９０Ａ（ａａ１〜２３４）−Ｇ９−Ｌａｇ−３Ｒ３１６／７５Ｅ（ａａ２７〜２６２−ＩｇＧｌａＮ５９６／２９７Ｑ（ａａ２４０〜４７１）
ATGGGCCACACACGGAGGCAGGGAACATCACCATCCAAGTGTCCATACCTCAATTTCTTTCAGCTCTTGGTGCTGGCTGGTCTTTCTCACTTCTGTTCAGGTGTTATCCACGTGACCAAGGAAGTGAAAGAAGTGGCAACGCTGTCCTGTGGTCACAATGTTTCTGTTGAAGAGCTGGCACAAACTCGCATCTACTGGCAAAAGGAGAAGAAAATGGTGCTGACTATGATGTCTGGGGACATGAATATAGCCCCCGAGTACAAGAACCGGACCATCTTTGATATCACTAATAACCTCTCCATTGTGATCCTGGCTCTGCGCCCATCTGACGAGGGCACATACGAGTGTGTTGTTCTGAAGTATGAAAAAGACGCTTTCAAGCGGGAACACCTGGCTGAAGTGACGTTATCAGTCAAAGCTGACTTCCCTACACCTAGTATATCTGACTTTGAAATTCCAACTTCTAATATTAGAAGGATAATTTGCTCAACCTCTGGAGGTTTTCCAGAGCCTCACCTCTCCTGGTTGGAAAATGGAGAAGAATTAAATGCCATCAACACAACAGTTGCCCAAGATCCTGAAACTGAGCTCTATGCTGTTAGCAGCAAACTGGATTTCAATATGACAACCAACCACAGCTTCATGTGTCTCATCAAGTATGGACATTTAAGAGTGAATCAGACCTTCAACTGGAATACAACCGGCGGTGGCGGCGGAGGCGGTGGCGGTTCCGGAGCTGAGGTCCCGGTGGTGTGGGCCCAGGAGGGGGCTCCTGCCCAGCTCCCCTGCAGCCCCACAATCCCCCTCCAGGATCTCAGCCTTCTGCGAAGAGCAGGGGTCACTTGGCAGCATCAGCCAGACAGTGGCCCGCCCGCTGCCGCCCCCGGCCATCCCCTGGCCCCCGGCCCTCACCCGGCGGCGCCCTCCTCCTGGGGGCCCAGGCCCGAGCGCTACACGGTGCTGAGCGTGGGTCCCGGAGGCCTGCGCAGCGGGAGGCTGCCCCTGCAGCCCCGCGTCCAGCTGGATGAGCGCGGCCGGCAGCGCGGGGACTTCTCGCTATGGCTGCGCCCAGCCCGGCGCGCGGACGCCGGCGAGTACCGCGCCGCGGTGCACCTCAGGGACCGCGCCCTCTCCTGCCGCCTCCGTCTGCGCCTGGGCCAGGCCTCGATGACTGCCAGCCCCCCAGGATCTCTCAGAGCCTCCGACTGGGTCATTTTGAACTGCTCCTTCAGCCGCCCTGACCGCCCAGCCTCTGTGCATTGGTTTCGGAACCGGGGCCAGGGCCGAGTCCCTGTCCGGGAGTCCCCCCATCACCACTTAGCGGAAAGCTTCCTCTTCCTGCCCCAAGTCAGCCCCATGGACTCTGGGCCCTGGGGCTGCATCCTCACCTACAGAGATGGCTTCAACGTCTCCATCATGTATAACCTCACTGTTCTGGGTCTGCTGGTGCCCCGGGGCTCCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACAAGCCCACCGAGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGATCCTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACCAGAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCTCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTATACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

配列番号８：
ＣＴＬＡ−４ ＢｓＢヒト構築物バリアントの翻訳されたタンパク質配列１＝（ヒトＣＤ８０Ｗ８４Ａ／Ｓ１９０Ａ（ａａ１〜２３４）−Ｇ９−Ｌａｇ−３Ｒ３１６／７５Ｅ（ａａ２７〜２６２−ＩｇＧｌａＮ５９６／２９７Ｑ（ａａ２４０〜４７１）
MGHTRRQGTSPSKCPYLNFFQLLVLAGLSHFCSGVIHVTKEVKEVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIAPEYKNRTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSVKADFPTPSISDFEIPTSNIRRIICSTSGGFPEPHLSWLENGEELNAINTTVAQDPETELYAVSSKLDFNMTTNHSFMCLIKYGHLRVNQTFNWNTTGGGGGGGGGSGAEVPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPERYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLLVPRGSEPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号９：
ＣＴＬＡ−４ ＢｓＢヒト構築物バリアントヌクレオチド配列２＝（ヒトＣＤ８０Ｗ８４Ａ／Ｓ１９０ＡＳ２０１Ａ（ａａ１〜２３４）−Ｇ９−Ｌａｇ−３Ｒ３１６／７５Ｅ（ａａ２７〜２６２−ＩｇＧｌａＮ５９６／２９７Ｑ（ａａ２４０〜４７１）
ATGGGCCACACACGGAGGCAGGGAACATCACCATCCAAGTGTCCATACCTCAATTTCTTTCAGCTCTTGGTGCTGGCTGGTCTTTCTCACTTCTGTTCAGGTGTTATCCACGTGACCAAGGAAGTGAAAGAAGTGGCAACGCTGTCCTGTGGTCACAATGTTTCTGTTGAAGAGCTGGCACAAACTCGCATCTACTGGCAAAAGGAGAAGAAAATGGTGCTGACTATGATGTCTGGGGACATGAATATAGCCCCCGAGTACAAGAACCGGACCATCTTTGATATCACTAATAACCTCTCCATTGTGATCCTGGCTCTGCGCCCATCTGACGAGGGCACATACGAGTGTGTTGTICTGAAGTATGAAAAAGACGCTTTCAAGCGGGAACACCTGGCTGAAGTGACGTTATCAGTCAAAGCTGACTTCCCTACACCTAGTATATCTGACTTTGAAATTCCAACTTCTAATATTAGAAGGATAATTTGCTCAACCTCTGGAGGTTTTCCAGAGCCTCACCTCTCCTGGTTGGAAAATGGAGAAGAATTAAATGCCATCAACACAACAGTTGCCCAAGATCCTGAAACTGAGCTCTATGCTGTTGCCAGCAAACTGGATTTCAATATGACAACCAACCACAGCTTCATGTGTCTCATCAAGTATGGACATTTAAGAGTGAATCAGACCTTCAACTGGAATACAACCGGCGGTGGCGGCGGAGGCGGTGGCGGTTCCGGAGCTGAGGTCCCGGTGGTGTGGGCCCAGGAGGGGGCTCCTGCCCAGCTCCCCTGCAGCCCCACAATCCCCCTCCAGGATCTCAGCCTTCTGCGAAGAGCAGGGGTCACTTGGCAGCATCAGCCAGACAGTGGCCCGCCCGCTGCCGCCCCCGGCCATCCCCTGGCCCCCGGCCCTCACCCGGCGGCGCCCTCCTCCTGGGGGCCCAGGCCCGAGCGCTACACGGTGCTGAGCGTGGGTCCCGGAGGCCTGCGCAGCGGGAGGCTGCCCCTGCAGCCCCGCGTCCAGCTGGATGAGCGCGGCCGGCAGCGCGGGGACTTCTCGCTATGGCTGCGCCCAGCCCGGCGCGCGGACGCCGGCGAGTACCGCGCCGCGGTGCACCTCAGGGACCGCGCCCTCTCCTGCCGCCTCCGTCTGCGCCTGGGCCAGGCCTCGATGACTGCCAGCCCCCCAGGATCTCTCAGAGCCTCCGACTGGGTCATTTTGAACTGCTCCTTCAGCCGCCCTGACCGCCCAGCCTCTGTGCATTGGTTTCGGAACCGGGGCCAGGGCCGAGTCCCTGTCCGGGAGTCCCCCCATCACCACTTAGCGGAAAGCTTCCTCTTCCTGCCCCAAGTCAGCCCCATGGACTCTGGGCCCTGGGGCTGCATCCTCACCTACAGAGATGGCTTCAACGTCTCCATCATGTATAACCTCACTGTTCTGGGTCTGCTGGTGCCCCGGGGCTCCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACAAGCCCACCGAGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGATCCTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACCAGAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCTCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTATACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

配列番号１０：
ＣＴＬＡ−４ ＢｓＢヒト構築物バリアントの翻訳されたタンパク質配列２＝（ヒトＣＤ８０Ｗ８４Ａ／Ｓ１９０ＡＳ２０１Ａ（ａａ１〜２３４）−Ｇ９−Ｌａｇ−３Ｒ３１６／７５Ｅ（ａａ２７〜２６２−ＩｇＧ１ａＮ５９６／２９７Ｑ（ａａ２４０〜４７１）
MGHTRRQGTSPSKCPYLNFFQLLVLAGLSHFCSGVIHVTKEVKEVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGD
MNIAPEYKNRTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSVKADFPTPSISDFEIPTSNIRRIICSTSGGFPEPHLSWLENGEELNAINTTVAQDPETELYAVASKLDFNMTTNHSFMCLIKYGHLRVNQTFNWNTTGGGGGGGGGSGAEVPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPERYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLLVPRGSEPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号１１：
ＣＴＬＡ−４ ＢｓＢヒト構築物バリアントヌクレオチド配列３＝（ヒトＣＤ８０Ｅ１９６Ａ／５１９０Ａ（ａａ１〜２３４）−Ｇ９−Ｌａｇ−３Ｒ３１６／７５Ｅ（ａａ２７〜２６２−ＩｇＧ１ａＮ５９６／２９７Ｑ（ａａ２４０〜４７１）
ATGGGCCACACACGGAGGCAGGGAACATCACCATCCAAGTGTCCATACCTCAATTTCTTTCAGCTCTTGGTGCTGGCTGGTCTTTCTCACTTCTGTTCAGGTGTTATCCACGTGACCAAGGAAGTGAAAGAAGTGGCAACGCTGTCCTGTGGTCACAATGTTTCTGTTGAAGAGCTGGCACAAACTCGCATCTACTGGCAAAAGGAGAAGAAAATGGTGCTGACTATGATGTCTGGGGACATGAATATATGGCCCGAGTACAAGAACCGGACCATCTTTGATATCACTAATAACCTCTCCATTGTGATCCTGGCTCTGCGCCCATCTGACGAGGGCACATACGAGTGTGTTGTTCTGAAGTATGAAAAAGACGCTTTCAAGCGGGAACACCTGGCTGAAGTGACGTTATCAGTCAAAGCTGACTTCCCTACACCTAGTATATCTGACTTTGAAATTCCAACTTCTAATATTAGAAGGATAATTTGCTCAACCTCTGGAGGTTTTCCAGAGCCTCACCTCTCCTGGTTGGAAAATGGAGAAGAATTAAATGCCATCAACACAACAGTTGCCCAAGATCCTGAAACTGCCCTCTATGCTGTTAGCAGCAAACTGGATTTCAATATGACAACCAACCACAGCTTCATGTGTCTCATCAAGTATGGACATTTAAGAGTGAATCAGACCTTCAACTGGAATACAACCGGCGGTGGCGGCGGAGGCGGTGGCGGTTCCGGAGCTGAGGTCCCGGTGGTGTGGGCCCAGGAGGGGGCTCCTGCCCAGCTCCCCTGCAGCCCCACAATCCCCCTCCAGGATCTCAGCCTTCTGCGAAGAGCAGGGGTCACTTGGCAGCATCAGCCAGACAGTGGCCCGCCCGCTGCCGCCCCCGGCCATCCCCTGGCCCCCGGCCCTCACCCGGCGGCGCCCTCCTCCTGGGGGCCCAGGCCCGAGCGCTACACGGTGCTGAGCGTGGGTCCCGGAGGCCTGCGCAGCGGGAGGCTGCCCCTGCAGCCCCGCGTCCAGCTGGATGAGCGCGGCCGGCAGCGCGGGGACTTCTCGCTATGGCTGCGCCCAGCCCGGCGCGCGGACGCCGGCGAGTACCGCGCCGCGGTGCACCTCAGGGACCGCGCCCTCTCCTGCCGCCTCCGTCTGCGCCTGGGCCAGGCCTCGATGACTGCCAGCCCCCCAGGATCTCTCAGAGCCTCCGACTGGGTCATTTTGAACTGCTCCTTCAGCCGCCCTGACCGCCCAGCCTCTGTGCATTGGTTTCGGAACCGGGGCCAGGGCCGAGTCCCTGTCCGGGAGTCCCCCCATCACCACTTAGCGGAAAGCTTCCTCTTCCTGCCCCAAGTCAGCCCCATGGACTCTGGGCCCTGGGGCTGCATCCTCACCTACAGAGATGGCTTCAACGTCTCCATCATGTATAACCTCACTGTTCTGGGTCTGCTGGTGCCCCGGGGCTCCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACAAGCCCACCGAGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGATCCTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACCAGAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCTCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTATACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

配列番号１２：
ＣＴＬＡ−４ ＢｓＢヒト構築物バリアントの翻訳されたタンパク質配列３＝（ヒトＣＤ８０Ｅ１９６Ａ／Ｓ１９０Ａ（ａａ１〜２３４）−Ｇ９−Ｌａｇ−３Ｒ３１６／７５Ｅ（ａａ２７〜２６２−ＩｇＧ１ａＮ５９６／２９７Ｑ（ａａ２４０〜４７１）
MGHTRRQGTSPSKCPYLNFFQLLVLAGLSHFCSGVIHVTKEVKEVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSVKADFPTPSISDFEIPTSNIRRIICSTSGGFPEPHLSWLENGEELNAINTTVAQDPETALYAVSSKLDFNMTTNHSFMCLIKYGHLRVNQTFNWNTTGGGGGGGGGSGAEVPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPERYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRA
SDVVVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLLVPRGSEPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号１３：
ＣＴＬＡ−４ ＢｓＢヒト構築物バリアントヌクレオチド配列４＝（ヒトＣＤ８０Ｅ１９６Ａ／Ｓ１９０ＡＳ２０１Ａ（ａａ１〜２３４）−Ｇ９−Ｌａｇ−３Ｒ３１６／７５Ｅ（ａａ２７〜２６２−ＩｇＧ１ａＮ５９６／２９７Ｑ（ａａ２４０〜４７１）
ATGGGCCACACACGGAGGCAGGGAACATCACCATCCAAGTGTCCATACCTCAATTTCTTTCAGCTCTTGGTGCTGGCTGGTCTTTCTCACTTCTGTTCAGGTGTTATCCACGTGACCAAGGAAGTGAAAGAAGTGGCAACGCTGTCCTGTGGTCACAATGTTTCTGYFGAAGAGCTGGCACAAACTCGCATCTACTGGCAAAAGGAGAAGAAAATGGTGCTGACTATGATGTCTGGGGACATGAATATATGGCCCGAGTACAAGAACCGGACCATCTTTGATATCACTAATAACCTCTCCATTGTGATCCTGGCTCTGCGCCCATCTGACGAGGGCACATACGAGTGTGTTGTTCTGAAGTATGAAAAAGACGCTTTCAAGCGGGAACACCTGGCTGAAGTGACGTTATCAGTCAAAGCTGACTTCCCTACACCTAGTATATCTGACTTTGAAATTCCAACTTCTAATATTAGAAGGATAATTTGCTCAACCTCTGGAGGTTTTCCAGAGCCTCACCTCTCCTGGTTGGAAAATGGAGAAGAATTAAATGCCATCAACACAACAGTTGCCCAAGATCCTGAAACTGCCCTCTATGCTGTTGCCAGCAAACTGGATTTCAATATGACAACCAACCACAGCTTCATGTGTCTCATCAAGTATGGACATTTAAGAGTGAATCAGACCTTCAACTGGAATACAACCGGCGGTGGCGGCGGAGGCGGTGGCGGTTCCGGAGCTGAGGTCCCGGTGGTGTGGGCCCAGGAGGGGGCTCCTGCCCAGCTCCCCTGCAGCCCCACAATCCCCCTCCAGGATCTCAGCCTTCTGCGAAGAGCAGGGGTCACTTGGCAGCATCAGCCAGACAGTGGCCCGCCCGCTGCCGCCCCCGGCCATCCCCTGGCCCCCGGCCCTCACCCGGCGGCGCCCTCCTCCTGGGGGCCCAGGCCCGAGCGCTACACGGTGCTGAGCGTGGGTCCCGGAGGCCTGCGCAGCGGGAGGCTGCCCCTGCAGCCCCGCGTCCAGCTGGATGAGCGCGGCCGGCAGCGCGGGGACTTCTCGCTATGGCTGCGCCCAGCCCGGCGCGCGGACGCCGGCGAGTACCGCGCCGCGGTGCACCTCAGGGACCGCGCCCTCTCCTGCCGCCTCCGTCTGCGCCTGGGCCAGGCCTCGATGACTGCCAGCCCCCCAGGATCTCTCAGAGCCTCCGACTGGGTCATTTTGAACTGCTCCTTCAGCCGCCCTGACCGCCCAGCCTCTGTGCATTGGTTTCGGAACCGGGGCCAGGGCCGAGTCCCTGTCCGGGAGTCCCCCCATCACCACTTAGCGGAAAGCTTCCTCTTCCTGCCCCAAGTCAGCCCCATGGACTCTGGGCCCTGGGGCTGCATCCTCACCTACAGAGATGGCTTCAACGTCTCCATCATGTATAACCTCACTGTTCTGGGTCTGCTGGTGCCCCGGGGCTCCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACAAGCCCACCGAGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGATCCTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACCAGAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCTCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTATACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

配列番号１４：
ＣＴＬＡ−４ ＢｓＢヒト構築物バリアントの翻訳されたタンパク質配列４＝（ヒトＣＤ８０Ｅ１９６Ａ／Ｓ１９０ＡＳ２０１Ａ（ａａ１〜２３４）−Ｇ９−Ｌａｇ−３Ｒ３１６／７５Ｅ（ａａ２７〜２６２−ＩｇＧ１ａＮ５９６／２９７Ｑ（ａａ２４０〜４７１）
MGHTRRQGTSPSKCPYLNFFQLLVLAGLSHFCSGVIHVTKEVKEVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSVKADFPTPSISDFEIPTSNIRRIICSTSGGFPEPHLSWLENGEELNAINTTVAQDPETALYAVASKLDFNMTTNHSFMCLIKYGHLRVNQTFNWNTTGGGGGGGGGSGAEVPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTINQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPERYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLLVPRGSEPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
K

配列番号１５
ヒトＣＤ８０
MGHTRRQGTS PSKCPYLNFF QLLVLAGLSH FCSGVIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DNLLPSWAIT LISVNGIFVI CCLTYCFAPR CRERRRNERL RRESVRPV

配列番号１６
ＢｓＢΔ（ＣＤ８０ｗａ−Ｆｃ）ＤＮＡ＝マウスＣＤ８０ｗ８８ａ（ａａ１〜２３５）−ＩｇＧ２ａ（ａａ２４１〜４７４）マウス代理構築物のヌクレオチド配列（ＢｓＢΔ；ＣＤ８０ｗａ−Ｆｃ）：
ATGGCTTGCAATTGTCAGTTGATGCAGGATACACCACTCCTCAAGTTTCCATGTCCAAGGCTCATTCTTCTCTTTGTGCTGCTGATTCGTCTTTCACAAGTGTCTTCAGATGTTGATGAACAACTGTCCAAGTCAGTGAAAGATAAGGTATTGCTGCCTTGCCGTTACAACTCTCCTCATGAAGATGAGTCTGAAGACCGAATCTACTGGCAAAAACATGACAAAGTGGTGCTGTCTGTCATTGCTGGGAAACTAAAAGTGGCGCCCGAGTATAAGAACCGGACTTTATATGACAACACTACCTACTCTCTTATCATCCTGGGCCTGGTCCTTTCAGACCGGGGCACATACAGCTGTGTCGTTCAAAAGAAGGAAAGAGGAACGTATGAAGTTAAACACTTGGCTTTAGTAAAGTTGTCCATCAAAGCTGACTTCTCTACCCCCAACATAACTGAGTCTGGAAACCCATCTGCAGACACTAAAAGGATTACCTGCTTTGCTTCCGGGGGTTTCCCAAAGCCTCGCTTCTCTTGGTTGGAAAATGGAAGAGAATTACCTGGCATCAATACGACAATTTCCCAGGATCCTGAATCTGAATTGTACACCATTAGTAGCCAACTAGATTTCAATACGACTCGCAACCACACCATTAAGTGTCTCATTAAATATGGAGATGCTCACGTGTCAGAGGACTTCACCTGGGAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATGGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTCGTGAACAACGTGGAAGTACTCACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGCCCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGCTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAAGGCGGTGGCGGCGGAGGCGGTGGCGGTGGGCCTGGGAAAGAGCTGGGTCTGGAGCCCGTAGCCCACCATCACCATCATCACTGA

配列番号１７
ＢｓＢΔ（ＣＤ８０ｗａ−Ｆｃ）タンパク質＝マウスＣＤ８０ｗ８８ａ（ａａ１〜２３５）−ＩｇＧ２ａ（ａａ２４１〜４７４）マウス代理構築物の翻訳されたタンパク質配列（ＢｓＢΔ；ＣＤ８０ｗａ−Ｆｃ）：
MACNCQLMQDTPLLKFPCPRLILLFVLLIRLSQVSSDVDEQLSKSVKDKVLLPCRYNSPHEDESEDRIYWQKHDKVVLSVIAGKLKVAPEYKNRTLYDNTTYSLIILGLVLSDRGTYSCVVQKKERGTYEVKHLALVKLSIKADFSTPNITESGNPSADTKRITCFASGGFPKPRFSWLENGRELPGINTTISQDPESELYTISSQLDFNTTRNHTIKCLIKYGDAHVSEDFTWEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPMVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVLTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKALPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGKGGGGGGGGGGPGKELGLEPVAHHHHHH

他の実施形態
上述の説明から、種々の用途および条件に本発明を採用するために変形および修飾が本明細書に記載される本発明に対してなされてもよいことは明らかになるであろう。そのような実施形態もまた、以下の特許請求の範囲内である。

本明細書における変量のいずれかの定義における要素の記載の列挙は、記載された要素のいずれかの単一の要素または組合せ（またはサブコンビネーション）としてのその変量の定義を含む。本明細書の実施形態の列挙は、いずれかの単一の実施形態またはいずれかの他の実施形態もしくはその部分との組合せとしてその実施形態を含む。

本明細書に述べた全ての特許および刊行物は、各々の独立した特許および刊行物が参照によって組み入れるかのように具体的かつ個々に示される限り、参照によって本明細書に組み入れる。

参考文献
以下の文書が本明細書に引用される。
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Claims (11)

1. ＣＴＬＡ−４に特異的なリガンドおよびｐＭＨＣ複合体に特異的なリガンドを含む二重特異性バイオ医薬品であって、ＣＴＬＡ−４に特異的なリガンドとｐＭＨＣ複合体に特異的なリガンドは、リンカーにより隔置され、ここで、
   ＣＴＬＡ−４に特異的なリガンドは、ＣＤ８０（Ｂ７−１）、ＣＤ８６（Ｂ７−２）およびＣＴＬＡ−４に特異的なアゴニスト抗体からなる群より選択され、そして
   ｐＭＨＣ複合体に特異的なリガンドは、抗ＭＨＣ抗体およびＬＡＧ−３から選択される、前記医薬品。
2. リンカーはポリアミノ酸配列および抗体Ｆｃドメインのうちの１つまたはそれ以上である、請求項１に記載の二重特異性バイオ医薬品。
3. ポリアミノ酸配列はＧ９（Ｇｌｙ−９）である、請求項２に記載の二重特異性バイオ医薬品。
4. ＣＴＬＡ−４に特異的なリガンドはＣＤ８０である、請求項１に記載の二重特異性バイオ医薬品。
5. ＣＤ８０はＣＴＬＡ−４に対する特異性を増加させるように変異される、請求項４に記載の二重特異性バイオ医薬品。
6. ＣＤ８０は変異Ｗ８４Ａ、Ｋ７１Ｇ、Ｋ７１Ｖ、Ｓ１０９Ｇ、Ｒ１２３Ｓ、Ｒ１２３Ｄ、Ｇ１２４Ｌ、Ｓ１９０Ａ、Ｓ２０１Ａ、Ｒ６３Ａ、Ｍ８１Ａ、Ｎ９７ＡおよびＥ１９６Ａのうちの少なくとも１つを含むヒトＣＤ８０である、請求項５に記載の二重特異性バイオ医薬品。
7. ＣＤ８０はヒトＣＤ８０の変異Ｗ８４ＡまたはＥ１９６Ａを含む、請求項６に記載の二重特異性バイオ医薬品。
8. ｐＭＨＣ複合体に特異的なリガンドはＬＡＧ−３である、請求項１に記載の二重特異性
   バイオ医薬品。
9. ＬＡＧ−３はｐＭＨＣＩＩに対する特異性を増加させるように変異される、請求項８に記載の二重特異性バイオ医薬品。
10. ＬＡＧ−３は変異Ｒ７３Ｅ、Ｒ７５Ａ、Ｒ７５ＥおよびＲ７６Ｅのうちの少なくとも１つを含むヒトＬＡＧ−３である、請求項９に記載の二重特異性バイオ医薬品。
11. ＬＡＧ−３は変異Ｒ７５ＡまたはＲ７５Ｅを含む、請求項１０に記載の二重特異性バイオ医薬品。

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