MX2013015384A - Inhibidores de la activacion de las celulas t. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un producto biológico biespecífico que comprende un ligando específico para CTLA-4 y un ligando específico para un complejo de pMHC.

Description

INHIBIDORES DE LA ACTIVACIÓN DE LAS CÉLULAS T Referencia cruzada con Solicitud Relacionada Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional U.S. siguiente No: 61/503.282, presentada el 30 de junio, 2011, el contenido completo de los cuales se incorporan en el presente documento por referencia.

Antecedentes de la Invención La terapia celular que usa Tregs recién aislados, expandidos ex vivo o inducidos in vitro en modelos de enfermedades autoinmunes o trasplantes de órganos ha demostrado que la transferencia adoptiva de Tregs puede restaurar el equilibrio de Tregs frente a células T efectoras, controlando de esta manera la autoinmunidad asociada con estas enfermedades (Alian et al., (2008) Immunol. Rev. 223:391-421; Jiang et al., (2006) Expert review of clinical immunology 2:387-392; Riley et al., (2009) Immunity 30:656-665; Tang et al., (2012) Journal of molecular cell biology 4:11-21). Sin embargo, el uso de transferencia adoptiva como una estrategia terapéutica presenta varios retos para su traslado a la clínica. El número de Tregs autólogo que puede aislarse de la sangre periférica de un sujeto humano es limitado y una expansión extensa ex vivo de los Tregs puede alterar su funcionalidad y/o pureza. Como los Tregs aislados son policlonales, pueden ejercer una función inmunosupresora generalizada en células T efectoras no objetivos. De forma importante, la plasticidad de los Tregs plantea un reto significativo (Bluestone eí al., (2009) Nat Rev Immunol 9:811-816; Zhou eí al., (2009a) Curr Opin Immunol 21:281-285), ya que los Tregs transferidos de manera adoptiva pueden perder la expresión de Foxp3 y rediferenciarse en células Th17 (Koenen eí al., (2008) Blood 12:2340-2352.) o células T de memoria patogénicas (Zhou eí al., (2009b) Nat Immunol 10: 000-1007) lo que eleva el riesgo de agravar la autoinmunidad o inflamación.

Un agente terapéutico que induce la generación de Tregs de una manera específica de antígeno \n situ tendría ventajas sobre la terapia de células Treg adoptiva. El antígeno 4 asociado con linfocitos T citotóxicos (CTLA-4; CD 152) es un regulador negativo bien establecido de la respuesta de células T, es importante para el mantenimiento de la homeostasis de las células T y la auto-tolerancia. CTLA-4 es homólogo a la molécula co-estimuladora CD28 y comparte los mismos ligandos, CD80 (B7.1) y CD86 (B7.2), que se expresan en la superficie de las células presentadoras de antígeno (APC por sus siglas en inglés). Sin embargo, la unión diferencial de CD80/CD86 en APC respecto a CD28 y CTLA-4 en células T efectoras da lugar a resultados opuestos, con CD28 desencadenando la activación de las células T y CTLA-4 causando la inhibición de las células T.

Como CD28 se expresa constitutivamente en las células T y la expresión de CTLA-4 sólo se induce después de la activación de las células T, con un pico 2-3 días después (Jago eí al., (2004) Clinical & Experimental Immunology, 136: 463-471), la activación extensa de las células T habría ocurrido antes de la activación de CTLA-4. Por lo tanto, el papel principal de CTLA-4 es actuar como una defensa frente a una respuesta excesiva de células T en lugar de inhibir la activación de las células T. Sin embargo, la activación temprana de CTLA-4 por su ligando y su entrecruzamiento posterior al receptor de la célula T (TCR por sus siglas en inglés) puede disminuir prematuramente la señalización del TCR, causando la inhibición de las células T y una menor capacidad de respuesta o anergia. Este concepto se ha validado experimentalmente usando una variedad de métodos, incluyendo lo siguiente: (i) entrecruzar anticuerpos activadores de células T (anti-CD3/anti-CD28) usando un anticuerpo agonista anti-CTLA-4 por co-inmovilización en un lecho o mediante un anticuerpo secundario (Blair et al., (1998) J. Immunol. 160: 12-15; Krummel y Allison, (1996) J Exp Med 183:2533-2540; Walunas et al., (1996) J. Exp. Med. 183:2541-2550); (ii) preparar por ingeniería molecular un scFv agonista unido a superficie frente a CTLA-4 en una APC (Fife et al., (2006) J. Clin. Invest. 116(8):2252- 61; Griffin et al., (2001) J. Immunol. Methods. 248(1-2):77-90; Griffin et al., (2000) J. Immunol. 164(9):4433-42); y (iii) entrecruzar químicamente anticuerpos que reconocen antígenos específicos en una APC con un anticuerpo agonista anti-CTLA-4 (Li et al., (2007). J. Immunol. 179(8):5191-203; Rao et al., (2001) Clin. Immunol. 101 (2): 136-45; Vasu et al., (2004) J.

Immunol. 173(4):2866- 76).

La restauración del equilibrio de Tregs frente a células T efectoras es un medio prometedor para tratar enfermedades autoinmunes. Sin embargo, la terapia celular que implica la transferencia de Tregs tiene determinadas limitaciones. De acuerdo con esto, se requieren urgentemente agentes terapéuticos que puedan inducir la generación de Tregs (por ejemplo, CTLA-4) de una manera específica de antígeno para el tratamiento de enfermedades autoinmunes.

Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere a ligandos que entrecruzan el antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA-4) activado por ligando con el receptor de células T (TCR) durante la fase temprana de la activación de las células T y de esta manera atenúan la señalización del TCR, dando lugar a la inhibición de las células T. Para desarrollar un agente que pueda inhibir la activación de las células T, se generó una proteína de fusión biespecífica que comprende restos que se unen selectivamente y activan CTLA-4 y lo co-l¡gan al TCR. A diferencia de las estrategias de la técnica anterior, la proteína de fusión biespecífica se preparó por ingeniería para entrecruzar MHC con CTLA-4; ambos se unen al TCR, generando el complejo trimolecular CTLA-4/MHCII/TCR en las sinapsis inmunes.

El entrecruzamiento del antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA-4) activado por ligando con el TCR con una proteína de fusión biespecífica (BsB) que comprende un CD80 de ratón mutante y el antígeno 3 de activación de linfocitos en un MLR alogénico atenuó la señalización de TCR y dirigió la diferenciación de las células T hacia células T reguladoras Foxp3+ (Tregs). Como se describe en el presente documento, los Tregs específicos de antígeno también pueden inducirse en un entorno específico de antígeno. El tratamiento de ratones diabéticos no obesos (NOD por sus siglas en inglés) con un curso corto de BsB retrasó moderadamente el inicio de la diabetes autoinmune de tipo 1 (T1D por sus siglas en inglés) con un incremento transitorio de Tregs en la sangre. Sin embargo, un curso más largo de tratamiento de animales NOD con BsB retrasó significativamente el inicio de enfermedad así como redujo la incidencia de animales que presentaban diabetes. El análisis histopatológico de los páncreas de ratones tratados con BsB que permanecieron no diabéticos reveló la presencia de Tregs que se entremezclaron con otras células T CD3+ y leucocitos distintos de células T alrededor de los islotes. Esta peri-insulitis estaba asociada con una insulitis invasiva mínima y sin destrucción notable de las células ß productoras de insulina. Así, las proteínas bifuncionales capaces de unir CTLA-4 y MHCII y co-ligarlo indirectamente con el TCR pueden inducir Tregs específicos de antígeno in vivo para proteger a los ratones de T1D u otras enfermedades autoinmunes.

En particular, la invención describe proteínas de fusión biespecíficas que entrecruzan CTLA-4 con el complejo pMHCII.

Por ejemplo, se describe una proteína de fusión biespecífica que comprende un CD80 de ratón mutante (CD80w88a) y antígeno 3 de activación de linfocitos (LAG-3) que se prepara por ingeniería para, simultáneamente, activar CTLA-4 y entrecruzarlo con el TCR a través de pMHCII. En un primer aspecto, por lo tanto, se proporciona un agente biológico biespecífico que comprende un ligando específico para CTLA-4 y un ligando específico para un complejo pMHC.

En un aspecto, la invención proporciona un agente biológico biespecífico que comprende un ligando específico para CTLA-4 y un ligando específico para un complejo pMHC. El agente biológico biespecífico de acuerdo con la invención es capaz de entrecruzar CTLA-4, presente en las células T, con el complejo de péptido MHC (pMHC) en células presentadoras de antígeno (APC). El complejo del péptido MHC se une por el receptor de células T cognado (TCR) en células T, lo que significa que el agente biológico de acuerdo con la invención da lugar a un complejo tripartito CTLA-4/MHC/TCR.

En varias modalidades de los aspectos descritos en el presente documento, el ligando específico para CTLA-4 se selecciona de un anticuerpo específico para CTLA-4, y CD80 (B7-1) o CD86 (B7-2). En una modalidad particular, el anticuerpo específico para CTLA-4, y CD80 (B7-1) o CD86 (B7-2) es un anticuerpo agonista. Los anticuerpos específicos para CTLA-4 pueden prepararse por ingeniería y tanto CD80 como CD86 son ligandos naturales para CTLA-4. En un aspecto, se usa CD80 o un mutante de éste, ya que CD80 se une preferentemente a CTLA-4 por encima de CD28, y estimula así la inactivación de las células T a diferencia de la activación.

En varias modalidades de los aspectos descritos en el presente documento, el ligando específico para el complejo pMHC puede seleccionarse de un anticuerpo anti-MHC y LAG-3. El polipéptido LAG-3 es un ligando natural para la proteína MHCII. En una modalidad, el MHC es MHC-II (que interacciona con células T CD4+). En otra modalidad, el MHC es MHC-I, que interacciona con células T CD8+.

En el agente biológico biespecífico de acuerdo con la invención, el ligando específico para CTLA-4 y el ligando específico para el complejo pMHC están espaciados preferiblemente por un conector. El conector puede tener la forma de una o más de una secuencia de poliaminoácido y un dominio Fe de anticuerpo. Una secuencia adecuada de poliaminoácido es G9 (Gly-9).

En varias modalidades de los aspectos descritos en el presente documento, el ligando específico para CTLA-4 es CD80, o un mutante de éste que está mutado para incrementar la especificidad para CTLA-4 sobre CD28. En una modalidad, el CD80 mutado comprende una o más mutaciones seleccionadas de W88A, K75G. K75V, S112G, R126S, R126D, G127L, S193A, y S204A, usando numeración de secuencia en el precursor de CD80 de ratón, o sus equivalentes CD80 humanos (W84A, K71G, K71V, S109G, R123S, R123D, G124L, S190A, y S201A) y además R63A, M81A, N97A, E196A.

En una modalidad, el agente biológico biespecífico comprende CD80, que comprende la mutación W84A (humano) o W88A (de ratón).

En una modalidad particular, el ligando específico para el complejo MHCII es LAG-3. Ventajosamente, LAG-3 está mutado para incrementar la especificidad para pMHCII. Por ejemplo, LAG-3 comprende una o más mutaciones seleccionadas de R73E, R75A, R75E y R76E (Huard et al., (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 94(11): 5744-5749. En una modalidad, LAG-3 comprende la mutación R75E.

La unión preferente de la proteína de fusión biespecífica a CTLA-4 sobre CD28 se alcanzó usando CD80 muíante (CD80w88a), que contiene alanina en lugar de triptófano en el aminoácido 88 (numerado en CD80 de ratón), como el ligando. CD80w88a se une a CTLA-4 pero presenta una afinidad mínima para CD28 (Wu et al., (1997), J. Exp. Med. 185:1327-1335).

El gen 3 de activación de linfocitos (LAG-3), un ligando natural de MHCII, se seleccionó como el otro componente de unión de la proteína de fusión biespecífica (Baixeras et al., (1992) J. Exp. Med. 176:327- 337; Triebel er al., (1990) J. Exp. Med. 171:1393-1405). Mostramos que una proteína de fusión con tal bi-funcionalidad inhibe eficazmente la activación de las células T y estimula la producción de las citoquinas anti-inflamatorias IL-10 y TGF-ß. De forma más importante, esta proteína de fusión biespecífica también dirigía la diferenciación de las células T en Tregs Foxp3+ altamente supresores. Esto no ocurría cuando se usó el inhibidor co-estimulador CTLA-4lg bien establecido en su lugar (Bluestone ef al., (2006) Immunity 24:233-238; Linsley y Nadler (2009) Immunol. Rev. 229:307-321). Por lo tanto, la activación temprana de CTLA-4 y el entrecruzamiento de CTLA-4 con el TCR durante la activación de las células T podrían influir activamente en la diferenciación de las células T. Tales proteínas de fusión biespecíficas podrían representar así una nueva clase de agentes biológicos que podrían usarse para controlar las respuestas excesivas de las células T en las enfermedades autoinmunes.

En un segundo aspecto de la invención, se proporciona el uso de un agente biológico biespecífico que comprende un ligando específico para CTLA-4 y un ligando específico para un complejo pMHC de acuerdo con el primer aspecto de la invención, para la inducción de tolerancia de una célula T poniendo en contacto dicha célula T con una célula presentadora de antígeno que está presentando un péptido derivado de dicho antígeno formando un complejo con una molécula MHC y dicho agente biológico biespecífico.

En un tercer aspecto, se proporciona el uso de un agente biológico biespecífico que comprende un ligando específico para CTLA-4 y un ligando específico para un complejo pMHC de acuerdo con el primer aspecto de la invención, en el tratamiento de una enfermedad seleccionada de una enfermedad autoinmune y rechazo de trasplante.

Por ejemplo, la enfermedad autoinmune es diabetes tipo 1 (T1D, Lupus Eritematoso Sistémico (SLE por sus siglas en inglés), Artritis Reumatoide (RA por sus siglas en inglés) y enfermedad inflamatoria del intestino (IBD por sus siglas en inglés) (incluyendo colitis ulcerosa (UC por sus siglas en inglés) y enfermedad de Crohn (CD por sus siglas en inglés)), esclerosis múltiple (MS por sus siglas en inglés), escieroderma, y otras enfermedades y trastornos, como PV (pénfigo vulgar por sus siglas en inglés), psoriasis, dermatitis atópica, enfermedad celiaca, enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Graves (tiroides), síndrome de Sjogren, síndrome de Guillain-Barre, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Addison, granulomatosis de Wegener, esclerosis biliar primaria, colangitis esclerosante, hepatitis autoinmune, polimialgia reumática, fenómeno de Raynaud, arteritis temporal, arteritis de células gigantes, anemia hemolítica autoinmune, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa. enfermedad de Behcet, cirrosis biliar primaria, uveitis, miocarditis, fiebre reumática, espondilitis anquilosante, glomerulonefritis, sarcoidosis, dermatomiositis, miastenia grave, polimiositis, alopecia areata, y vitíligo.

En un cuarto aspecto, se proporciona un método para inducir tolerancia de una célula T a un antígeno, que comprende poner en contacto dicha célula T con una célula presentadora de antígeno que está presentando un péptido derivado de dicho antígeno formando un complejo con una molécula MHC y un agente biológico biespecífico de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

En un quinto aspecto, se proporciona un método para tratar a un sujeto que padece una afección seleccionada de una enfermedad autoinmune y rechazo de trasplante, que comprende las etapas de administrar a un sujeto que lo necesita un agente biológico biespecífico que comprende un ligando específico para CTLA-4 y un ligando específico para un complejo pMHC de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

Por ejemplo, la enfermedad autoinmune es diabetes Tipo 1 (T1D).

Descripción de las Figuras Figura 1. Diseños de BsB y BsBA. (A) Dibujos esquemáticos del BsB (agente biológico biespecífico) y proteínas de fusión BsBA. (B) Dibujo esquemático de pMHCII, el TCR y moléculas co-estimuladoras en la sinapsis inmune, así como el esquema propuesto para el entrecruzamiento mediado por BsB de CTLA-4 con el TCR a través del complejo trimolecular CTLA-4/MHC 11/TCR. La proteína de fusión une CTLA-4 y liga indirectamente el TCR a través de la unión a MHCII en la sinapsis inmune. Los dos lados continuos del triángulo indican el entrecruzamiento de MHCI I y CTLA-4 así como MHCI I y TCR; el lado discontinuo representa la ligación de CTLA-4 a TCR. La línea punteada indica la inhibición de la señalización de TCR por CTLA-4 unido por BsB. C. Dibujo esquemático que muestra que la acción de BsBA es similar a la de BsB excepto en que es incapaz de ligar el TCR.

Figura 2. Inhibición de la activación alogénica de células T por BsB en una reacción de linfocitos mixtos. Las células T sin activar de ratones C57BL/6 y APC de BALB/c tratadas con LPS e irradiadas se mezclaron con las construcciones de ensayo durante 2 días. Los medios de cultivo se recogieron y ensayaron para IL-2. Sólo los BsB y CTLA-4lg inhibieron la activación de las células T, como se indica por una cantidad disminuida de IL-2 en los medios. La figura es representativa de más de cinco estudios independientes pero similares.

Figura 3. Inducción de Tregs Foxp3+ y producción de IL-10 y TGF-ß por BsB. (A) Se pusieron a punto reacciones de linfocitos mixtos alogénicos como se describe en la leyenda de la Figura 2, usando células sin activar CD4+CD62LhiCD25"GFP" que se habían aislado de ratones con inserciones génicas Foxp3-EGFP en presencia de las construcciones de ensayo. Cinco días después de la activación, las células T CD4+ se analizaron para expresión de GFP por citometría de flujo. Los Tregs se seleccionaron como células GFP+ y CD25+. Sólo el tratamiento con BsB dio lugar a la expresión de GFP, lo que indica la inducción de Tregs Foxp3+ (panel medio de la izquierda). Los medios de cultivo se recogieron para análisis de citoquinas (paneles de la derecha), que reveló niveles elevados de IL-10 y TGF-ß en presencia de BsB. Los datos son representativos de numerosos estudios independientes pero similares. (B) El requerimiento de TGF-ß autocrino para la inducción de Treg se indica por el bloqueo completo de la inducción de Treg en presencia de un anticuerpo bloqueante para TGF-ß, mientras que un Ab control no influyó de manera detectable en la inducción de Treg.

Figura 4. Inducción mediada por BsB de Tregs específicos de antígeno in vitro. (A) Inducción in vitro de Tregs específicos de Ova233-339- Se mezclaron células T OT-II sin activar con APC singénicas activadas por LPS e irradiadas en presencia de 0.5 pg/ml de péptido Ova233-239- Se añadieron mlgG2a control, BsB, y BsB más un anticuerpo anti-TGF-ß (aTGF-ß) y se ensayó como se indica (paneles de la izquierda). Las células se cultivaron durante 5 días y se marcaron con anticuerpos anti-CD25 y anti-Foxp3 antes de analizarlas por citometría de flujo. Se ensayaron los niveles de IL-2, IL-10 y TGF-ß en el medio de cultivo por ELISA (paneles de la derecha). (B) Monitorización de proliferación de Tregs inducidos. Se realizaron estudios como en A excepto que las células T OT-II sin activar se pre-marcaron con CFSE antes de ser mezcladas con las APC. Las células se separaron en canales fluorescentes Foxp3 y CFSE.

Figura 5. Función supresora de Tregs inducidos por BsB. (A) Se purificaron Tregs inducidos por BsB o TGF-ß por citometría de flujo y se mezclaron con células T respondedoras sin activar marcadas con CFSE preparadas a partir de ratones C57BL/6 en las proporciones indicadas en transwells (columnas llenas) o pocilios de cultivo normales (columnas con entramado). Se añadieron APC de BALB/c alogénicas tratadas con LPS para estimular la activación de las células T. Los resultados (media + desviación estándar) indican el porcentaje de células T respondedoras que proliferan (Tresp), tomando como base una dilución CFSE sin Tregs (Tresp + APC sólo) ajustada a 100%. (B) Se añadieron anticuerpos anti-IL-10 y anti-TGF-ß a las células en pocilios de cultivo normales a una proporción Tresp:Treg de 1:1 para determinar la contribución de las citoquinas a la proliferación de las células T. El anticuerpo anti-TGF-ß inhibió parcialmente la función supresora de Tregs inducidos por TGF-ß (panel de la izquierda) pero no afectó los Tregs inducidos por BsB (panel de la derecha). La figura es representativa de más de tres estudios independientes pero similares.

Figura 6. Regulación a la baja de la fosforilación de AKT y mTOR por BsB. Se cultivaron células T sin activar en placas de 96 pocilios de fondo redondo co-recubiertas con anti-CD3, anti-CD28 y BsB, IgG de ratón (mlgG) o PD-L1 de ratón (mPD-L1) durante 18 horas. Las células que se consideraron no activadas se cultivaron en pocilios recubiertos sólo con IgG. El estado de fosforilación de AKT y mTOR se monitorizó por citometría de flujo después de tinción con anticuerpos marcados fluorescentemente para AKT y mTOR fosforilados. MFI indica intensidad media de fluorescencia. Esta figura representa uno de tres experimentos independientes.

Figura 7. Expresión sostenida de Foxp3 en Tregs en respuesta a la estimulación continúa con BsB. Se co-recubrieron placas de 96 pocilios de fondo redondo con anti-CD3, anti-CD28 y BsB o IgG de ratón. Se cultivaron células T sin activar, de ratones con inserción génica de Foxp3-EGFP durante 5 días para inducir Tregs (paneles de la izquierda), que se purificaron a partir de células tratadas con BsB (cuadrado rojo) y se re-estimularon en otra ronda de cultivo en pocilios co-recubiertos, como anteriormente, durante 5 días, antes del análisis por citometría de flujo para células GFP+. El re-cultivo de Tregs purificados con la IgG de ratón control durante 5 días resultó en una pérdida de la expresión de Foxp3+ en -60% de las células (cuadrante superior derecho del panel superior de la derecha), mientras que menos del 7% de los Tregs re-cultivados con BsB había perdido la expresión de Foxp3+ (cuadrante superior derecho del panel inferior de la derecha). Esta figura representa uno de tres experimentos independientes.

Figura 8. Farmacocinética de BsB in vivo y análisis bioquímico. (A) Perfil farmacocinético de BsB en ratones. Se dosificaron ratones C57BL/6 normales (n = 5) intraperitonealmente con 20 mg/kg de BsB. Se recogieron muestras de sangre a los diferentes puntos de tiempo indicados y los niveles de niveles de BsB se determinaron usando un ELISA. (B) Comparación de la unión de BsB e lgG2a de ratón a FcRn. Se inmovilizaron FcRn en un chip Biacore. Se cargaron BsB o lgG2a control de ratón en el chip a varias concentraciones y las señales se registraron.

Figura 9. Análisis de glicosilación ligada a asparagina en BsB. La secuencia de aminoácidos de BsB se sometió al Servidor NetNGIyc 1.0 para predicción de sitios de glicosilación ligados a Asn. Se predijo un total de 10 sitios de glicosilación ligados a Asn (indicados N), otros aminoácidos se presentan como puntos. También se realizó la composición monosacarídica de BsB para determinar la composición de los glicanos fucosa (Fue), N-acetilglucosamina (GIcNAc), galactosa (Gal), mañosa (Man), ácido siálico (ácido N-acetilneurámico). Una proporción ácido síalico:galactosa de 0.68 indica que aproximadamente un tercio de los residuos de galactosa están disponibles para unión al receptor asialoglicoproteína.

Figura 10. El tratamiento de ratones no diabéticos (NOD) con BsB retrasó el inicio de la diabetes tipo 1 (T1D) en un paradigma de tratamiento de prevención tardío. (A) Niveles de Tregs Foxp3+ en la sangre de ratones NOD tratados con BsB (círculos cerrados, n = 15) y ratones NOD control tratados con solución salina (triángulos cerrados, n = 14). Hubo un incremento moderado pero significativo en el número de Tregs en los animales tratados con BsB sobre el observado en los animales control. (B) Incidencias acumulativas de diabetes manifiesta en animales NOD tratados con BsB (círculos llenos) o solución salina (triángulos llenos).

Figura 11. El tratamiento de ratones NOD con BsB retrasó el inicio de T1D en un paradigma de tratamiento de prevención temprano. (A) Niveles de Tregs Foxp3+ en la sangre de ratones tratados con BsB (círculos cerrados, n = 10), solución salina (triángulos cerrados, n = 10), CTLA-4lg (cuadrados cerrados, n = 10) e lgG2a de ratón (cuadrados abiertos, n = 10). No se detectó ningún incremento en el número de Tregs Foxp3+ después de dos semanas de tratamiento con BsB cuando se comparó con controles tratados con solución salina o mlgG2a. Sin embargo, el tratamiento con CTLA-4lg resultó en una disminución estadísticamente significativa en el número de Tregs Foxp3+ en la sangre. (B) Incidencias acumulativas de diabetes manifiesta en animales tratados con BsB o controles. El tratamiento con BsB resultó en un retraso significativo en el inicio de T1D cuando se comparó con los grupos control tratados con solución salina o lgG2a de ratón antes de 24 semanas de edad (p = 0.04). Sin embargo, no se observó ninguna diferencia significativa entre los grupos al final del estudio. Los datos representan uno de dos estudios separados con resultados similares, con un total de 26 ratones NOD en cada grupo.

Figura 12. El tratamiento a largo plazo de ratones NOD con BsB retrasó significativamente el inicio de T1D en ratones NOD. (A) Incidencias acumulativas de diabetes manifiesta en ratones tratados con BsB (n = 16) y no tratados (n = 16). El tratamiento con BsB redujo significativamente la incidencia de T1D cuando se comparó con los tratados con solución salina (p<0.01). (B) Análisis histopatológico de tejidos pancreáticos de animales tratados con solución salina o BsB. Los paneles a-c representan secciones de ratones tratados con solución salina que permanecieron no diabéticos con H&E, un anticuerpo frente a la insulina, o anti-CD3 y forkhead caja P3 (Foxp3), respectivamente. Se notaron observaciones similares en ratones NOD tratados con BsB que permanecieron sin enfermedad. No se observó ninguna evidencia de infiltración o insulitis en ninguna de las secciones; unos pocos Tregs Foxp3+ pueden estar presentes (flechas en el panel c). Los paneles d-f representan secciones pancreáticas de animales NOD diabéticos. Fue claramente evidente una insulitis invasiva y las células ß productoras de insulina fueron destruidas completamente (e). También se detectaron algunas infiltraciones de células T CD3+, junto con unos pocos Tregs y muchos leucocitos distintos de células T con núcleos azules (f). Los paneles g-i muestran islotes de animales tratados con BsB que permanecieron no diabéticos presentando peri-insulitis característica. Se observaron infiltraciones de leucocitos pero estaban restringidas a la periferia de los islotes. Además, no hubo una destrucción importante de las células ß productoras de insulina. La mayor parte de los leucocitos en la periferia no eran células T (núcleos azules). Un inserto aumentado (panel j, representa cuadrado rojo en i) indicó que los Tregs Foxp3+ (cabeza de flecha amarilla) estaban entremezclados con otras células T CD3+ y leucocitos distintos de células T (núcleos azules) en la periferia de los islotes. Las imágenes se adquirieron con un objetivo 40x; el inserto se adquirió con un objetivo 60x, que se aumentó adicionalmente 3x digitalmente.

Descripción Detallada de la Invención A no ser que se afirme otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen los mismos significados que los entendidos comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. En la práctica o ensayo de la presente invención pueden usarse cualquiera de los métodos y materiales con función similar o equivalente a los descritos en el presente documento. Ahora se describen los métodos, dispositivos y materiales adecuados para tales usos. Todas las publicaciones citadas en el presente documento se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad para el propósito de describir y revelar las metodologías, reactivos y herramientas indicadas en las publicaciones que podrían usarse en conexión con la invención.

Los métodos y técnicas de la presente solicitud se realizan generalmente de acuerdo con los métodos convencionales muy conocidos por los expertos en la técnica y como se describe en las diferentes referencias generales y más específicas que se citan y discuten a lo largo de la presente especificación a no ser que se indique otra cosa. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Ver, por ejemplo, Gennaro, A. R., ed. (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed., Mack Publishing Co.; Hardman, J. G., Limbird, L. E., y Gilman, A. G., eds. (2001) The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10a ed., McGraw-Hill Co.; Colowick, S. et al., eds., Methods In Enzymology, Academic Press, Inc.; Weir, D. M. , y Blackwell, C. C, eds. (1986) Handbook of Experimental Immunology, Vols. I - 1 V , Blackwell Scientific Publications; Maniatis, T. et al., eds. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Vols. I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al., eds. (1999) Short Protocols in Molecular Biology, 4a edición, John Wiley & Sons; Ream et al., eds. (1998) Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, Academic Press; Newton, C. R., y Graham, A., eds. (1997) PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2a ed., Springer-Verlag.

El término "anticuerpo", a no ser que se indique otra cosa, se usa para referirse a anticuerpos completos así como a fragmentos de unión a antígeno de tales anticuerpos. Por ejemplo, el término engloba moléculas de IgG de cuatro cadenas, así como fragmentos de anticuerpo.

Como se usa en el presente documento, el término "fragmentos de anticuerpo" se refiere a partes de un anticuerpo intacto de longitud completa - como una región de unión a antígeno o variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab )2, y Fv; fragmentos divalentes; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena única (por ejemplo, scFv); fragmentos de anticuerpo multiespecíficos como anticuerpos biespecíficos, triespecíficos y multiespecíficos (por ejemplo, fragmentos divalentes, fragmentos trivalentes, fragmentos tetravalentes); proteínas de fusión con dominio de unión de inmunoglobulina; anticuerpos camelizados; minicuerpos; anticuerpos recombinantes quelantes; tricuerpos o bicuerpos; intracuerpos; nanocuerpos; inmunofarmacéuticos pequeños modulares (SMIP por sus siglas en inglés), anticuerpos que contienen VHH; y cualquier otros polipéptidos formados a partir de fragmentos de anticuerpo, por ejemplo como se describe adicionalmente más adelante.

Los anticuerpos pueden ser de cualquier clase, como IgG, IgA, o IgM; y de cualquier subclase, como lgG1 o lgG4. Las diferentes clases y subclases de inmunoglobulinas tienen diferentes propiedades, que pueden ser ventajosas en diferentes aplicaciones.

La especificidad, en el contexto de la presente invención, requiere que el anticuerpo reivindicado sea capaz de unirse selectivamente a su antígeno cognado definido, que es bien CTLA-4 o el complejo pMHC.

Las ¡nmunoglobulinas naturales tienen una estructura central común en la que dos cadenas ligeras idénticas (aproximadamente 24 kD) y dos cadenas pesadas idénticas (aproximadamente 55 o 70 kD) forman un tetrámero. La parte amino terminal de cada cadena se conoce como la región variable (V) y puede distinguirse de las regiones constantes (C) más conservadas del resto de cada cadena. En la región variable de la cadena ligera (también denominado el dominio VL) está una parte C terminal conocida como la región J. En la región variable de la cadena pesada (también denominado el dominio VH), está una región D además de la región J. La mayor parte de la variación en la secuencia de aminoácidos en las ¡nmunoglobulinas está confinada en tres localizaciones separadas en las regiones V conocidas como regiones hipervariables o regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que están directamente implicadas en la unión al antígeno. Desde el extremo amino, estas regiones se designan CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente. Las CDR se mantienen en su sitio por regiones marco (FR) más conservadas. Desde el extremo amino, estas regiones se designan FR1, FR2, FR3 y FR4, respectivamente. Se ha definido las localizaciones de las regiones CDR y FR y un sistema de numeración por Kabat et al. (Kabat, E.A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, U.S.

Government Printing Office, y las actualizaciones de ésta que pueden encontrarse en línea.

Un anticuerpo monoclonal humanizado, como se refiere en el presente documento, es un anticuerpo que está compuesto por un marco de anticuerpo humano, en el que se han injertado CDR de un anticuerpo no humano. Los procedimientos para el diseño y producción de anticuerpos humanizados son muy conocidos en la técnica, y se han descrito, por ejemplo, en Cabilly et al., Patente Estadounidense No.4,816,567; Cabilly et al., Solicitud de Patente Europea 0 125 023; Boss er al., Patente Estadounidense No. 4,816,397; Boss er al., Solicitud de Patente Europea 0 120 694; Neuberger, M.S. et al., WO 86/01533; Neuberger, M.S. et al., Solicitud de Patente Europea 0 194 276 Bl; Winter, Patente Estadounidense No. 5,225,539; Winter, Solicitud de Patente Europea 0 239 400; Padlan, E.A. et al., Solicitud de Patente Europea 0 519 596. Los detalles adicionales sobre anticuerpos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos preparados por ingeniería, y métodos para su preparación pueden encontrarse en Kontermann, R. y Dübel, S. eds. (2001, 2010) Anticuerpo Engineering, 2a ed., Springer-Verlag, Nueva York, NY, 2001.

Las regiones constantes pueden derivar de las regiones constantes de cualquier anticuerpo humano. Típicamente, los genes de la región variable se clonan en vectores de expresión en marco con genes de región constante para expresar cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina. Tales vectores de expresión pueden transfectar en células huésped productoras de anticuerpo para la síntesis del anticuerpo.

Las regiones variables y constantes de anticuerpo requeridas pueden derivar de bases de datos de secuencia. Por ejemplo, las secuencias de inmunoglobulina están disponibles en la base de datos IMGT/LIGM (Giudicelli et al., (2006) Nucleic Acids Res. 34:(supl. 1 ):D781 -D784) o VBase (vbase.mrccpe.cam.ac.uk). "Ácido nucleicos" como se refiere en el presente documento incluyen típicamente moléculas de ADN que codifican los anticuerpos de la invención. Se prefieren vectores de expresión, que son adecuados para expresar los genes de anticuerpo en una célula huésped. Los vectores de expresión y células huésped para la expresión de genes de anticuerpo son conocidos en la técnica; ver, por ejemplo, Morrow, K.J. (2008) Genetic Engineering & Biotechnology News. (Junio 15, 2008) 28(12), y Backliwal, G., et al. (2008) Nucleic Acids Res. 36(15): e96-e96.

"CD80", como se usa en el presente documento, se refiere al antígeno CD80 de mamífero así como a mutantes de éste que tienen una avidez o especificidad de unión incrementada para CTLA-4. Ver Linsley et al., (1994) Immunity 1:793-801, y Wu et al., (1997) J. Exp. Med. 185(7):1327-1335, incorporadas en el presente documento por referencia. CD80 de mamífero puede seleccionarse de CD80 de roedor, como ratón, o de humano.

"CD86", como se usa en el presente documento, se refiere al antígeno CD86 de mamífero así como a mutantes de éste que tienen una avidez o especificidad de unión incrementada para CTLA-4. Ver Linsley et al., (1994) Immunity 1:793-801, incorporado en el presente documento por referencia. CD86 de mamífero puede seleccionarse de CD86 de roedor, como ratón, o de humano.

"CTLA-4", como se usa en el presente documento, se refiere al antígeno 4 asociado con linfocitos citotóxicos (CTLA-4) de mamíferos. La secuencia de CTLA-4 humano puede encontrarse en GenBank, Número de registro AAH74893.1, Gl:49904741. CTLA-4 de mamífero puede seleccionarse de CTLA-4 de roedor, como ratón, o de humano.

"LAG-3", como se usa en el presente documento, se refiere al antígeno 3 de activación de linfocitos (LAG-3) de mamífero. La secuencia para LAG-3 humano puede encontrarse en Huard ef al., (1997) Proc. Nati. Acad. Sci, USA 94:5744-5749, incorporado en el presente documento por referencia. LAG-3 de mamífero puede seleccionarse de LAG-3 de roedor, como ratón, o de humano.

El "MHC" es el complejo implicado en la presentación de péptidos derivados de antígeno por las células presentadoras de antígeno, que es reconocido por el TCR. En un aspecto determinado, el MHC es MHCII, que presenta el antígeno a células T auxiliares CD4 + . Ver, por ejemplo, Wucherpfennig et al., CSH Perspect. Biol. 2(4): a005140, epub 2010 Mar 17.

Un agente biológico biespecífico, que puede referirse como un ligando biespecífico, es un ligando que es capaz de unirse, o ser unido por, dos objetivos simultáneamente. Los anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica y se describen adicionalmente más adelante. En el contexto de la presente invención, los dos objetivos son la molécula CTLA-4 en una célula T y el complejo péptido MHC en una APC. El agente biológico biespecífico de acuerdo con la invención puede entrecruzar los dos objetivos; mediante la unión de pMHC al TCR en la sinapsis inmune, entrecruzada por lo tanto la molécula CTLA-4 con el TCR. Un "agente biológico", en general, es un agente o terapéutico biológico, que puede ser útil, Inter alia, para propósitos terapéuticos, de diagnóstico y/o de investigación.

Un conector es cualquier secuencia de aminoácidos que une y separa dos dominios polipeptídicos en una proteína. En el contexto del ligando biespecífico de la invención, el conector es la secuencia que une el ligando CTLA-4 al ligando MHC. Los conectores ejemplares son secuencias de aminoácidos, como poliglicina, por ejemplo Gly-9. Un conector alternativo es una región Fe de un anticuerpo. Tales espaciosa de un conector de los dos dominios de ligando aproximadamente 120A.

Un ligando de acuerdo con la invención puede comprender ligandos de anticuerpo y no anticuerpo en cualquier combinación. Por ejemplo, el ligando CTLA-4 puede ser un anticuerpo anti-CTLA-4 y el ligando MHC puede ser LAG-3. Alternativamente, puede usarse CD80 como el ligando CTLA-4, en combinación con LAG-3 o un anticuerpo anti-MHC. Ambos ligandos pueden ser anticuerpos, o ambos pueden ser lo ligandos naturales, CD80 y LAG-3.

Antígeno 4 asociado a Linfocitos Citotóxicos (CTLA-4) El antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), también conocido como CD152, es un regulador negativo de la respuesta de las células T, que juega un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis de las células T y en la inducción de la auto-tolerancia (Karandikar et al., (1996) J Exp Med 184:783-788; Krummel y Allison, (1995) J Exp Med 182:459-465; Linsley y Golstein, (1996) Curr Biol 6:398-400; Walunas y Bluestone, (1998) J Immunol 160:3855-3860; Walunas et al., (1994) J Immunol 160:3855-3860) Los ratones deficientes en CTLA-4 desarrollan enfermedad autoinmune multiorgánica y sucumben típicamente a la dolencia en las 4 semanas de edad(Tivol et al., (1995) Immunity 3:541-547; Waterhouse et al., (1995) Science 270:985-988). Los mecanismos moleculares a través de los cuales CTLA-4 modula la actividad de las células T son multifacéticos y se piensa que ocurren bien intrínsecamente en células T convencionales o extrínsecamente a través de células T reguladoras (Tregs) (Ise et al., (2010) Nat Immunol 11:129-135; Jain et al., (2010) Proc Nati Acad Sci U S A 107:1524-1528; Paterson y Sharpe, (2010) Nat Immunol 11:109-111).

Estos mecanismos incluyen competición con CD28 para la unión al ligando (Linsley et al., (1994) Immunity 1:793-801), inducción de la producción de la enzima tolerogénica indolamina 2,3 dioxigenasa en APC (Grohmann et al., (2002) Nat Immunol 3:1097-1101; Onodera et al., (2009) J Immunol 183:5608-5614), y desplazamiento de CD28 de la sinapsis inmunológica (Pentcheva-Hoang et al., (2004) Immunity 21:401-413). CTLA-4 es homólogo a la molécula co-estimuladora CD28 y comparte los mismos ligandos, CD80 (B7.1) y CD86 (B7.2), que se expresan en la superficie de las células presentadoras de antígeno (APC). Sin embargo, la unión diferencial de CD80/CD86 en APC respecto a CD28 y CTLA-4 en células T efectoras da lugar a resultados opuestos, con CD28 desencadenando la activación de las células T y CTLA-4 causando la inhibición de las células T. La activación de CTLA-4 por sus ligandos (CD80/86) en APC también estimula el reclutamiento de las fosfatases SHP-1 (Guntermann y Alexander, (2002) J Immunol 168:4420-4429) y PP2A (Baroja et al., (2002) J Immunol 168:5070-5078; Chuang et al., (2000) Immunity 13:313-322) en la proximidad del TCR de las células T que experimentan activación. La desfosforilación posterior de moléculas clave de señalización asociadas con el TCR resulta en la terminación de la activación de las células T (Griffin et al., (2000) J Immunol 164:4433-4442). Además, las intervenciones que estimulan la unión temprana de CTLA-4 con sus ligandos y el entrecruzamiento con el TCR resultan en la disminución prematura de firmas claves de señalización e inhibición consecuente de la activación de las células T, dando lugar a una capacidad de respuesta disminuida o anergia de células T (Blair et al., (1998) ¡mmunol 160:12-15; Griffin et al., (2000) J Immunol 164:4433-4442; Krummel y Allison, (1996) J Exp Med 182:459-465; Walunas et al., (1996) J Exp Med 183:2541-2550).

Para estimular el entrecruzamiento de CTLA-4 con el TCR durante la fase temprana de la activación de las células T, se generó una proteína de fusión biespecífica (designada "BsB") que comprende un CD80 mutante (CD80w88a) y el gen 3 de activación de linfocitos (LAG-3). Se diseñaron BsB para unir simultáneamente CTLA-4 y MHCII en la sinapsis inmune y de esta manera entrecruzarlo indirectamente con el TCR a través del emparejamiento cognado de MHCII con el TCR (Karman et al., (2012) J Biol Chem epub 2012 Feb 15). En un MLR alogénico, se mostró que BsB era eficaz inhibiendo la activación de las células T. Sorprendentemente, BsB también indujo la producción de IL-10 y TGF-ß y estimuló la diferenciación de las células T que experimentan activación a Tregs. IL-10 puede ejercer amplias propiedades inmunosupresoras mediante su capacidad de controlar la activación de macrófagos y células dendríticas (DC por sus siglas en inglés), así como auto-regular las células Th1 (Ohata et al., (2007) Arthritis Rheum 56:2947-2956). TGF-ß puede actuar como un inhibidor de la diferenciación de las células T (Kehrl et al., (1986) J Exp Meó 163:1037-1050), activación de macrófagos (Tsunawaki eí al., (1988) Nature 334:260-262; Wahl et al., (1990) Ann N Y Acad Sel 593:188-196) y maduración de células dendríticas (Steinman et al., (2003) Annu Rev Immunol 21:685-711). Además de sus funciones anti-inflamatorias, IL-10 y TGF-ß también pueden influir supuestamente en la función de Treg. Por ejemplo, se ha mostrado que IL-10 induce células Tr1 productoras de IL-10 (Roncarolo et al., (2006) Immunol Rev 212:28-50) y actúa en Tregs Foxp3+ para mantener la expresión de Foxp3 y de esta manera propagar su función supresora (Murai et al., (2009) Nat lmmuno\ 10:1178-1184). De manera similar, se ha indicado que TGF-ß es necesario para la inducción de Tregs (Chen et al., (2003) J Exp Med 198:1875-1886; Zheng et al., (2002) J Immunol 169:4183-4189) y para mantener su función supresora mediante la estimulación de la expresión de Foxp3 (Marie er al., (2005) J Exp Med 201:1061-1067).

Células T Reguladoras (Tregs) Los Tregs son una subpoblación funcionalmente distinta de células T capaz de controlar las respuestas inmunes a antígenos propios y no propios. Una deficiencia en Tregs resulta en una respuesta inmune intensificada y la presentación de enfermedades autoinmunes (Sakaguchi et al., (1995) J Immunol 155: 151-1164). Una investigación extensa ha establecido un papel de estas células T especializadas en el control de todos los aspectos de las respuestas inmunes, en particular en ocasionar auto-tolerancia. Sin estar ligado a una teoría particular, estos descubrimientos indican que los agentes capaces de reforzar la producción in situ de Tregs o la transferencia adoptiva de Tregs pueden usarse para tratar enfermedad autoinmunes. De hecho, se ha mostrado que las terapias basadas en células Treg usando Tregs recién aislados o expandidos ex vivo son eficaces para tratar modelos animales de diabetes tipo 1 (T1D) (Tang et al., (2004) J Exp Med 199:1455-1465; Tarbell et al., (2007) J Exp Med 204:191-201) y enfermedad de injerto frente a huésped (Anderson et al., (2004); Taylor et al., (2002) 8/oocí 99:3493-3499; Zhao et al., (2008) Blood 112:2129-2138). En lugar de aislar y expandir Tregs Foxp3 + CD4+CD25+ (designados habitualmente como Tregs naturales o nTregs) de sangre periférica o ganglios linfáticos, los Tregs pueden inducirse a partir de células T CD4+CD25" sin activar en el contexto de la activación de TCR y en la presencia simultánea de TGF-ß. Estos Tregs se refieren frecuentemente como Tregs adaptativos (aTregs) o Tregs inducidos (iTregs). También son Foxp3+ y presentan supuestamente funciones supresoras igualmente potentes a las de nTregs (Chen et al., (2003) J Exp Med 198:1875-1886; Yamagiwa et al., (2001) J Immunol 166:7282-7289; Zheng et al., (2002) J Immunol 169:4183-4189). Se ha mostrado que las transferencias adoptivas de aTregs o iTregs son eficaces para conferir protección frente a enfermedad autoinmune en un modelo animal de artritis inducida por colágeno (Gonzalez-Rey et al., (2006) Arthritis Rheum 54:864-876). Sin embargo, cada vez es más evidente que los Tregs específicos de antígeno ofrecen un coeficiente terapéutico significativamente mayor que los Tregs policlonales con un repertorio de TCR generalizado (Masteller et al., (2005) J Immunol 175:3053-3059; Tang et al., (2004) J Exp Med 199:1455-1465; Tarbell et al., (2007) J Exp Med 204:191-201), con menos efectos secundarios potenciales en la supresión inmune generalizada. Por esta razón, consideramos evaluar los méritos relativos de BsB en la producción de Tregs específicos de antígeno en un entorno de activación de células T específicas de antígeno in vitro. Además, ensayamos su potencial en el tratamiento de la diabetes autoinmune en el ratón diabético no obeso (NOD).

Diabetes Tipo 1 La diabetes tipo 1 (T1 D) es una enfermedad autoinmune causada por la destrucción específica de tejido de las células ß pancreáticas productoras de insulina con el consecuente desarrollo de hiperglucemia. Los ratones diabéticos no obesos (NOD) (ratones hembra en particular) desarrollan espontáneamente células T autorreactivas frente a auto-antígenos específicos de los islotes (por ejemplo, insulina y ácido glutámico descarboxilasa 65). Conjuntamente con otros linfocitos, estas células T autorreactivas inician el desarrollo de peri-insulitis entre las 3 y 4 semanas de edad seguido de insulitis invasiva a las 9 semanas y diabetes manifiesta espontánea entre las 12 y 35 semanas (Anderson y Bluestone, (2005) Annu Rev Immunol 23:447-485). Los ratones NOD comparten muchas similitudes con la enfermedad en sujetos humanos como la producción de autoanticuerpos específicos del páncreas y la activación de células T CD4+ y CD8+ autorreactivas. La susceptibilidad de estos ratones a autoinmunidad, como en los humanos, está influenciada por genes para el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), CTLA-4, y LAG-3. Los ratones NOD portan un único haplotipo (H-297) del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), que confiere según se ha constatado el mayor riesgo para la susceptibilidad a la enfermedad (McDevitt et al., (1996) Hormone and metabolic research 28:287-288; Wicker et al., (1995) Annu Rev Immunol 13:179-200). También se ha indicado polimorfismo de CTLA-4 en ratones NOD (Ueda et al., (2003) Nature 423:506-511) y en los humanos (Qu et al., (2009) Genes and immunity 10 SupI 1:S27-32) y una deficiencia de LAG-3 en el fondo NOD acelera el inicio de T1D con 100% de penetrancia (Bettini et al., (2011) J Immunol 187:3493-3498). Como BsB une todos estos objetivos, se ensayaron los méritos terapéuticos de BsB en este modelo murino de T1D.

Anticuerpos La invención engloba fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos mostrados en las reivindicaciones. Como se usa en el presente documento, el término "fragmentos" se refiere a partes de anticuerpo intacto de longitud completa - como una región de unión a antígeno o variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo se han mostrado anteriormente.

El término "fragmentos" como se usa en el presente documento se refiere a fragmentos capaces de unirse a los objetivos especificados, la molécula CTLA-4 o el complejo pMHC. Estos fragmentos pueden carecer del fragmento Fe de un anticuerpo intacto, aclararse más rápidamente de la circulación y pueden tener menos unión no específica a tejido que un anticuerpo intacto. Estos fragmentos pueden producirse a partir de anticuerpos intactos usando métodos muy conocidos, por ejemplo por escisión proteolítica con enzimas como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab )2), o expresión de tales fragmentos por tecnología recombinante.

Los anticuerpos y fragmentos también engloban fragmentos de anticuerpo de cadena única (scFv) que se unen a la molécula CTLA-4 o el complejo pMHC. Un scFv comprende una región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo unida de manera operativa a una región variable de cadena ligera (VL) de un anticuerpo en el que la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera, conjuntamente o individualmente, forman un sitio de unión que se une a la molécula CTLA-4 o el complejo pMHC. Un scFv puede comprender una región VH en el extremo amino terminal y una región VL en el extremo carboxi terminal. Alternativamente, scFv puede comprender una región VL en el extremo amino terminal y una región VH en el extremo carboxi terminal. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, pueden unirse, usando métodos recombinantes, por un conector sintético que les permite hacer una única cadena proteica en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena única (scFv)). Un scFv puede comprender además opcionalmente un conector polipeptídico entre la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera.

Los anticuerpos y fragmentos también engloban fragmentos de dominio de anticuerpo (dAb) como se describe en Ward, E.S. et al. (1989) Nature 341:544-546 que consisten en un dominio VH.

Los anticuerpos y fragmentos también engloban anticuerpos de cadena pesada (HCAb). Estos anticuerpos pueden formar aparentemente regiones de unión a antígeno usando sólo la región variable de cadena pesada, ya que estos anticuerpos funcionales son dímeros sólo de cadenas pesadas (referidos como "anticuerpos de cadena pesada" o "HCAb"). De acuerdo con esto, los anticuerpos y fragmentos pueden ser anticuerpos de cadena pesada (HCAb) que se unen específicamente a los objetivos CTLA-4 o pMHC.

Los anticuerpos y fragmentos también engloban anticuerpos que son SMIP o proteínas de fusión de dominio de unión de inmunoglobulinas específicos para los objetivos CTLA-4 o pMHC. Estas construcciones son polipéptidos de cadena única que comprenden dominios de unión a antígeno fusionados con dominios de inmunoglobulina necesarios para llevar a cabo las funciones efectoras del anticuerpo (ver WO 2005/017148).

Los anticuerpos y fragmentos también engloban fragmentos divalentes. Éstos son anticuerpos divalentes en los que los dominios VH y VL se expresan en una única cadena polipeptídica, pero usando un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Esto fuerza a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y de esta manera crea dos sitios de unión a antígeno (ver, por ejemplo, WO 93/11161). Los fragmentos divalentes pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de éste, de acuerdo con la invención no reacciona de manera cruzada con ningún objetivo distinto de los objetivos pretendidos CTLA-4 o pMHC.

Los anticuerpos y fragmentos de éstos pueden en sí mismos ser biespecíficos. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden parecerse a anticuerpos únicos (o fragmentos de anticuerpo) pero tienen dos sitios de unión a antígeno diferentes (regiones variables). Los anticuerpos biespecíficos pueden producirse por varios métodos - como técnicas químicas, técnicas de "polidoma" o técnicas de ADN recombinantes. Los anticuerpos biespecíficos pueden tener especificidades de unión para al menos dos epítopos diferentes, por ejemplo un epítopo en cada uno de los objetivos CTLA-4 y pMHC.

Los anticuerpos biespecíficos que comprenden parejas complementarias de regiones VH y VL se conocen en la técnica. Estos anticuerpos biespecíficos comprenden dos parejas de VH y VL, uniéndose cada pareja VHVL a un único antígeno o epítopo. Tales anticuerpos biespecíficos incluyen hibridomas híbridos (Milstein, C. y Cuello, A.C., (1983) Nature 305 (5934): 537-40), minicuerpos (Hu et al., (1996) Cáncer Res. 56:.3055-3061 ), fragmentos divalentes (Holliger er al., (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; WO 94/13804), anticuerpos recombinantes quelantes (CRAb) (Neri et al., (1995) J. Mol. Biol. 246,367- 373), biscFv (por ejemplo, Atwell et al., (1996) Mol. Immunol. 33:1301-1312), anticuerpos estabilizados "botón en ojal" (Cárter et al., (1997) Protein Sci. 6:781-788). En cada caso, cada especie de anticuerpo comprende dos sitios de unión a antígeno, cada uno compuesto por una pareja complementaria de dominios VH y VL. Cada anticuerpo es de esta manera capaz de unirse a dos antígenos o epítopos diferentes al mismo tiempo, con la unión a cada antígeno o epítopo mediada por un VH y su dominio VL complementario.

Se ha descrito que los autoanticuerpos naturales son polirreactivos (Casali y Notkins (1989) Ann. Rev. Immunol. 7: 515-531), reaccionando con al menos dos (habitualmente más) antígenos o epítopos diferentes que no están estructuralmente relacionados. También se ha mostrado que las selecciones de repertorios de péptidos al azar usando tecnología de exposición en fago en un anticuerpo monoclonal identificarán un rango de secuencias peptídicas que se ajusta al sitio de unión a antígeno. Algunas de las secuencias están altamente relacionadas, ajustándose a una secuencia consenso, mientras que otras son muy diferentes y se han denominado mimotopos (Lañe y Stephen (1993) Current Opinión in Immunology 5:268-271). Por lo tanto, está claro que el sitio de unión de un anticuerpo, que comprende dominio VH y VL asociados y complementarios, tiene el potencial de unirse a muchos antígenos diferentes de un gran universo de antígenos conocidos.

WO 03/002609 (Domantis) describe la producción de anticuerpos específicos duales en los que cada pareja VHVL posee una especificidad dual, es decir, es capaz de unirse a dos epítopos en el mismo o en diferentes antígenos. La conformación puede ser abierta o cerrada, en una conformación abierta, los dos epítopos pueden estar unidos simultáneamente, pero en la conformación cerrada la unión al primer epítopo evita o disuade la unión al segundo.

Las proteínas distintas de inmunoglobulina con múltiples especificidades de unión se conocen en la naturaleza; por ejemplo, un número de factores de transcripción se unen tanto el ADN como a otras moléculas de proteína. Sin embargo, los métodos para seleccionar péptidos de unión en la técnica anterior sólo seleccionan péptidos con especificidad única, no dual o múltiple.

Los diferentes equipos investigadores han ligado previamente polipéptidos con residuos de cisteína a una estructura molecular sintética (Kemp, D. S. y McNamara, P. E., (1985) J. Org. Chem. Timmerman, P. et al., (2005) ChemBioChem. 6(5):821-4). Meloen y colaboradores han usado tris(bromometil)benceno y moléculas relacionadas para la ciclación rápida y cuantitativa de múltiples bucles peptídicos en andamios sintéticos para mimetizar estructuralmente las superficies proteicas (Timmerman, P. et al., (2005) ibid). Los métodos para la generación de compuestos farmacéuticos candidatos en los que dichos compuestos se generan uniendo polipéptidos que contienen cisteína a un andamio molecular como por ejemplo tris(bromometil)benceno se describen en WO 2004/077062 y WO 2006/078161. La selección de tales moléculas usando tecnología de exposición se describe en WO 2009/098450. Las modalidades específicas duales se describen adicionalmente en WO 2010/089117.

El ligando, como un anticuerpo o fragmento de éste, puede modificarse con el fin de incrementar su vida media en suero, por ejemplo, añadiendo moléculas - como PEG u otros polímeros solubles en agua, incluyendo polímeros de polisacárido para incrementar la vida media. En una modalidad, una región Fe de anticuerpo puede añadirse al conector biespecífico de acuerdo con la invención, para incrementar la vida media circulante.

Producción de anticuerpos La producción de anticuerpos puede realizarse por cualquier técnica conocida en la técnica, incluyendo en organismos transgénicos como cabras (ver Pollock er al. (1999) J. Immunol. Methods 231:147- 157), pollos (ver Morrow, KJJ (2000) Genet. Eng. News 20:1 -55), ratones (ver Pollock er al. ibid) o plantas (ver Doran P (2000) Curr. Opinión Biotechnol. 11:199-204; Ma, JK-C (1998) Nat.Med. 4:601-606; Baez, J. et al. (2000) BioPharm.13:50-54; Stoger, E. et al. (2000) Plant Mol. Biol. 42:583-590). Los anticuerpos también pueden producirse por síntesis química; sin embargo, se prefiere la expresión de genes que codifican los anticuerpos en células huésped.

Un polinucleótido que codifica el anticuerpo se aisla y se inserta en una construcción o vector replicable como un plásmido para la propagación adicional o expresión en una célula huésped. Las construcciones o vectores (por ejemplo, vectores de expresión) adecuados para la expresión de una inmunoglobulina humanizada de acuerdo con la invención están disponibles en la técnica. Está disponible una variedad de vectores, incluyendo vectores que se mantienen en una única copia o múltiples copias en una célula huésped, o que se integran en el o los cromosomas de la célula huésped. Las construcciones o vectores pueden introducirse en una célula huésped adecuado, y las células que expresan una inmunoglobulina humanizada pueden producirse y mantenerse en cultivo. Puede usarse un único vector o múltiples vectores para la expresión de una inmunoglobulina humanizada.

Los polinucleótidos que codifican el anticuerpo se aislan y secuencian fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, sondas oligonucleotídicas). Los vectores que pueden usarse incluyen plásmidos, virus, fagos, transposones, minicromosomas de los que los plásmidos son una modalidad típica. Generalmente, tales vectores incluyen además una secuencia señal, origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y secuencias de terminación de las transcripciones unidas de manera operativa al polinucleótido de cadena ligera y/o pesada de manera que se facilita la expresión. Los polinucleótidos que codifican las cadenas ligera y pesada pueden insertarse en vectores separados e introducirse (por ejemplo, por transformación, transfección, electroporación o transducción) en la misma célula huésped simultáneamente o secuencialmente o, si se desea, tanto la cadena pesada como la cadena ligera pueden insertarse en el mismo vector antes de tal introducción.

Puede proporcionarse un promotor para la expresión en una célula huésped adecuada. Los promotores pueden ser constitutivos o inducibles. Por ejemplo, un promotor puede unirse de manera operativa a un ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina humanizada o cadena de inmunoglobulina, de manera que dirige la expresión del polipéptido codificado. Está disponible una variedad de promotores adecuados para huéspedes procariotas y eucariotas. Los promotores procariotas incluyen promotores lac, tac, T3. T7 para E. coli; 3- fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glicolíticas, por ejemplo, enolasa, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa 6 fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa y glucoquinasa. Los promotores eucariotas incluyen promotores de levaduras inducibles como alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, metalotioneína y enzimas responsables del metabolismo del nitrógeno o uso de maltosa/galactosa; promotores de ARN polimerasa II incluyendo promotores virales como promotor de polioma, viruela aviar y adenovirus (por ejemplo, adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus (en particular el promotor del gen inmediato temprano), retrovirus, virus de la hepatitis B, actina, virus del sarcoma de rous (RSV por sus siglas en inglés) y el temprano o tardío del virus de simio 40 y promotores no virales como EF-1 alfa (Mizushima y Nagata (1990) Nucleic Acids Res. 18(17):5322). Los expertos en la técnica serán capaces de seleccionar el promotor apropiado para expresar un anticuerpo humanizado o una parte de éste de la invención.

Cuando sea apropiado, por ejemplo, para la expresión en células de eucariotas superiores, pueden incluirse elementos potenciadores adicionales en lugar de o así como los encontrados localizados en los promotores descritos anteriormente. Las secuencias potenciadoras de mamíferos adecuadas incluyen elementos potenciadores de globina, elastasa, albúmina, fetoproteína, metalotionina e insulina. Alternativamente, se puede usar un elemento potenciador de un virus de célula eucariota como potenciador de SV40, potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, potenciador de polioma, potenciador baculoviral o locus lgG2a murino (ver WO 04/009823). Aunque tales potenciadores están localizados típicamente en el vector en un sitio en 5' del promotor, también pueden estar localizados en otro lugar, por ejemplo, en la región no traducida o en 3' de la señal de poliadenilación. La elección y posicionamiento del potenciador puede estar basado en la compatibilidad con la célula huésped usada para la expresión.

Además, los vectores (por ejemplo, vectores de expresión) comprenden típicamente un marcador seleccionable para la selección de células huésped que portan el vector y, en el caso de un vector replicable, un origen de replicación. Los genes que codifican productos que confieren resistencia a antibióticos o fármaco son marcadores seleccionables comunes y pueden usarse en células procariotas (por ejemplo, gen de ß-lactamasa (resistencia a ampicilina), gen Tet (resistencia a tetraciclina) y eucariotas (por ejemplo, genes de resistencia a neomicina (G418 o geneticina), gpt (ácido micofenólico), ampicilina o higromicina). Los genes marcadores de dihidrofolato reductasa permiten la selección con metotrexato en una variedad de huéspedes. Los genes que codifican el producto génico de marcadores auxotróficos del huésped (por ejemplo, LEU2, URA3, HIS3) se usan frecuentemente como marcadores seleccionares en levaduras. También se contempla el uso de vectores virales (por ejemplo, baculovirus) o de fago, y vectores que son capaces de integrarse en el genoma de la célula huésped, como vectores retrovirales.

En sistemas eucariotas, las señales de poliadenilación y terminación están unidas de manera operativa a un polinucleótido que codifica el anticuerpo de esta invención. Tales señales están situadas típicamente en 3' del marco de lectura abierto. En los sistemas de mamíferos, los ejemplos no limitativos de señales de poliadenilación/terminación incluyen aquellas derivadas de hormonas de crecimiento, factor de elongación 1 alfa y genes virales (por ejemplo, SV40) o repeticiones retrovirales terminales largas. En sistemas de levaduras, los ejemplos no limitativos de señales de poliadenilación/terminación incluyen aquellas derivadas de los genes de fosfoglicerato quinasa (PGK) y alcohol deshidrogenasa 1 (ADH). En sistemas procariotas, las señales de poliadenilación no se requieren típicamente y en su lugar se usan habitualmente secuencias terminadoras más cortas y definidas. La elección de las secuencias de poliadenilación/terminación puede estar basada en la compatibilidad con la célula huésped usada para la expresión. Además de lo anterior, otras características que pueden usarse para potenciar los rendimientos incluyen elementos remodeladores de cromatina, intrones y modificación de codones específica de la célula huésped. El uso de codones del anticuerpo de esta invención puede modificarse para acomodar el sesgo de codones de la célula huésped de manera que se aumente el rendimiento del transcrito y/o producto (por ejemplo, Hoekema, A. et al. (1987) Mol Cell Biol. 7(8):2914-24). La elección de codones puede estar basada en la compatibilidad con la célula huésped usada para la expresión.

La invención se refiere así a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican las inmunoglobulinas humanizadas, o cadenas pesadas o ligeras de éstas, de esta invención. La invención también se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican una parte de unión a antígeno de las inmunoglobulinas y sus cadenas.

Los anticuerpos de acuerdo con esta invención pueden producirse, por ejemplo, por la expresión de uno o más ácidos nucleicos recombinantes que codifican el anticuerpo en una célula huésped adecuada. La célula huésped puede producirse usando cualquier método adecuado. Por ejemplo, las construcciones de expresión (por ejemplo, uno o más vectores, por ejemplo, un vector de expresión de células de mamífero) descritas en el presente documento pueden introducirse en una célula huésped adecuada, y la célula resultante puede mantenerse (por ejemplo, en cultivo, en un animal, en una planta) en condiciones adecuadas para la expresión de la o las construcciones o vectores. Las células huésped adecuadas pueden ser procariotas, incluyendo células de bacterianas como E. coli (por ejemplo, cepa DH5a™ (Invitrogen, Carlsbad, CA), células PerC6 (Crucell, Leiden, NL), B. subtilis y/u otras bacterias adecuadas; células eucariotas, como células fúngicas o de levadura (por ejemplo, Pichia pastoris, Aspergillus sp., Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Neurospora crassa), u otras células de eucariotas inferiores y células de eucariotas superiores como las de insectos (por ejemplo, células de Drosophila Schnieder S2, células de insecto Sf9 (WO 94/126087 (O'Connor), células de insecto TN5BI-4 (HIGH FIVE™) (Invitrogen), de mamíferos (por ejemplo, células COS, como COS-I (ATCC No. de Registro CRL-1650) y COS-7 (ATCC No. de Registro CRL-1651), CHO (por ejemplo, ATCC No. de Registro CRL-9096), CHO DG44 (Urlaub, G. y Chasin, LA., (1980) Proc. Nati. Acac. Sci. USA, 77(7):4216-4220), 293 (ATCC No. de Registro CRL- 1573), HeLa (ATCC No. de Registro CCL-2), CVI (ATCC No. de Registro CCL-70), WOP (Dailey, L., et al., (1985) J. Virol., 54:739-749), 3T3, 293T (Pear, W. S., er al., (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 90:8392-8396), células NSO, células SP2/0, células HuT 78 y semejantes, o de plantas (por ejemplo, tabaco, lemna (lenteja de agua), y algas). Ver, por ejemplo, Ausubel, F.M. et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y John Wiley & Sons Inc. (1993). En algunas modalidades, la célula huésped no es parte de un organismo multicelular (por ejemplo, planta o animal), por ejemplo, es una célula huésped aislada o es parte de un cultivo celular.

Las células huésped pueden cultivarse en matraces de centrifugación, matraces agitados, botellas giratorias, biorreactores wave (por ejemplo Sistema 1000 de wavebiotech.com) o sistemas de fibra hueca pero para la producción a gran escala se prefiere usar biorreactores agitados o biorreactores de bolsa (por ejemplo, Wave Biotech, Somerset, New Jersey USA) particularmente para los cultivos en suspensión. Típicamente, los biorreactores con tanque agitado se adaptan para aireación usando, por ejemplo, burbujeadores, deflectores o propulsores de baja cizalla. Para biorreactores de columnas con burbujas y aireadas, puede usarse la aireación directa con burbujas de aire o de oxígeno. Cuando las células huésped se cultivan en un medio de cultivo sin suero, el medio puede suplementarse con un agente protector de las células como plurónico F-68 para ayudar a prevenir el daño celular como resultado del proceso de aireación. Dependiendo de las características de la célula huésped, pueden usarse microvehículos como sustratos de crecimiento para líneas celulares dependientes de anclaje, o las células pueden adaptarse a cultivo en suspensión. El cultivo de las células huésped, particularmente células huésped de vertebrados, puede usar una variedad de modos de operación como procesamiento discontinuo, de alimentación discontinua, discontinuo repetido (ver Drapeau et al (1994) Cytotechnology 15: 103-109), proceso discontinuo ampliado o cultivo en perfusión. Aunque las células huésped de mamífero transformadas recombinantemente pueden cultivarse en medios que contienen suero como medios que comprenden suero de ternera fetal (FCS), se prefiere que tales células huésped se cultiven en medios sin suero como se describe en Keen et al (1995) Cytotechnology 17:153-163, o medios disponibles comercialmente como ProCHO-CD o UltraCHO™ (Cambrex NJ, USA), suplementados cuando sea necesario con una fuente de energía como glucosa y factores de crecimiento sintéticos como insulina recombinante. El cultivo sin suero de células huésped puede requerir que las células se adapten a crecer en condiciones sin suero. Una estrategia de adaptación es cultivar tales células huésped en medios que contienen suero y cambiar repetidamente el 80% del medio de cultivo por el medio sin suero de manera que las células huésped aprendan a adaptarse a condiciones sin suero (ver por ejemplo, Scharfenberg K .et al (1995) en Animal Cell Technology Developments Towards the 21st Century (Beuvery E.C. ef al eds), p619-623, Kluwer Academic editores).

Los anticuerpos de acuerdo con la invención pueden secretarse en el medio y recuperarse y purificarse de éste usando una variedad de técnicas para proporcionar un grado de purificación adecuado para el uso pretendido. Por ejemplo, el uso de anticuerpos terapéuticos de la invención para el tratamiento de pacientes humanos obliga típicamente al menos al 95% de pureza según se determina por SDS-PAGE reductora, más típicamente 98% o 99% de pureza, cuando se compara con el medio de cultivo que comprende los anticuerpos terapéuticos. En el primer caso, los restos celulares del medio de cultivo se eliminan típicamente usando centrifugación seguida de una etapa de aclaramiento del sobrenadante usando, por ejemplo, microfiltración, ultrafiltración y/o filtración en profundidad. Alternativamente, el anticuerpo puede recogerse por microfiltración, ultrafiltración o filtración en profundidad sin centrifugación anterior. Está disponible una variedad de otras técnicas como diálisis y electroforesis en gel y técnicas cromatográficas como hidroxiapatito (HA), cromatografía de afinidad (que implica opcionalmente un sistema de etiquetado de afinidad como polihistidina) y/o cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) (Ver US 5,429,746). En una modalidad, los anticuerpos de la invención, después de varias etapas de aclaramiento, se capturan usando cromatografía de afinidad en Proteína A o G seguido de etapas adicionales de cromatografía como intercambio iónico y/o cromatografía HA, intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de exclusión por tamaño y precipitación con sulfato de amonio. Típicamente, también se usan varias etapas de eliminación de virus (por ejemplo, nanofiltración usando, por ejemplo, un filtro DV-20). Después de estas distintas etapas, se proporciona una preparación purificada que comprende al menos 10 mg/ml o más, por ejemplo, 100 mg/ml o más del anticuerpo de la invención y por lo tanto forma una modalidad de la invención. La concentración hasta 100 mg/ml o más puede generarse por ultracentrifugación. Tales preparaciones carecen sustancialmente de formas agregadas de los anticuerpos de la invención.

Los sistemas bacterianos son particularmente adecuados para la expresión de fragmentos de anticuerpo. Tales fragmentos están localizados intracelularmente o en el periplasma. Las proteínas periplasmáticas insolubles pueden extraerse y replegarse para formar proteínas activas según métodos conocidos para los expertos en la técnica, ver Sánchez et al. (1999) J. Biotechnol. 72:13-20; Cupit, PM ef al. (1999) Lefr. Appl. Microbiol. 29:273-277.

La presente invención también se refiere a células que comprenden un ácido nucleico, por ejemplo, un vector, de la invención (por ejemplo, un vector de expresión). Por ejemplo, un ácido nucleico (es decir, uno o más ácidos nucleicos) que codifica las cadenas pesada y ligera de una inmunoglobulina humanizada de acuerdo con la invención, o una construcción (es decir, una o más construcciones, por ejemplo, uno o más vectores) que comprende tales ácidos nucleicos, puede introducirse en una célula huésped adecuada por un método apropiado para la célula huésped seleccionada (por ejemplo, transformación, transfección, electroporación infección), estando, o convirtiéndose, el o los ácidos nucleicos unidos de manera operativa a uno o más elementos de control de la expresión (por ejemplo, en un vector, en una construcción creada por procesos en la célula, integrada en el genoma de la célula huésped). Las células huésped pueden mantenerse en condiciones adecuadas para la expresión (por ejemplo, en presencia de inductor, medio adecuado suplementado con sales, factores de crecimiento, antibióticos, suplementos nutricionales adecuados, etcétera), mediante lo cual se producen el o los polipéptidos codificados. Si se desea, el anticuerpo humanizado codificado puede aislarse, por ejemplo, de las células huésped, medio de cultivo o leche. Este proceso engloba la expresión en una célula huésped (por ejemplo, una célula de glándula de mamífero) de un animal o planta transgénico (por ejemplo, tabaco) (ver por ejemplo, WO 92/03918).

Liqandos CD80 El diseño y construcción de ligandos CD80 se pretende para maximizar la especificidad del ligando para CTLA-4 sobre CD28. La secuencia de CD80 es conocida en la técnica, citada por ejemplo en Wu et al., 1997. CD80 comprende un dominio semejante a Ig-V variable extracelular y un dominio semejante a Ig-C constante intracelular. En una modalidad preferida, el dominio extracelular de CD80 se usa como un ligando. Por ejemplo, ver SEC ID No.: 15, especialmente los residuos 1-241.

Pueden hacerse mutaciones en CD80 humano para mejorar la afinidad de unión y para mejorar la selectividad para CTLA4 sobre CD28. Ver, por ejemplo, Wu et al., 1997.

Pueden hacerse mutantes distintos de W84A, incluyendo K71G, K71V, S109G, R123S, R123D, G124L, S190A, S201A, R63A, M81A, N97A, E196A. Ver Peach et al., JBC 1995. 270(6): 21181-21187. La evaluación de la afinidad de unión de los mutantes tanto para CTLA-4 como para CD28 puede efectuarse por mutagénesis dirigida a sitio seguido de la expresión de los polipéptidos mutantes y determinación de Kd por resonancia de plasmón superficial usando chips Biacore de CTLA-4 y CD28. Ver, por ejemplo. Guo eí a/., (1995) J. Exp. Med. 181:1345-55.

Pueden seleccionarse los mutantes que tienen perfiles de unión y selectividad ventajosos y evaluarse adicionalmente en ensayos basados en células. Por ejemplo, puede usarse citometría de flujo para ensayar el efecto de CD80 de tipo salvaje o mutante transfectado en las células.

Ligandos LAG-3 LAG-3 se ha descrito en la técnica y se ha caracterizado el sitio de unión a la proteína MHCII. Ver Huard et al., (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94(11 ):5744-9. LAG-3 tiene cuatro dominios semejantes a Ig extracelulares y pueden introducirse mutaciones en estos dominios para optimizar la unión a MHCII.

La eficacia de las mutaciones puede analizarse como se ha descrito anteriormente respecto a los ligandos CD80.

En un aspecto, sólo se usan los dominios 1 y 2 (D1 y D2) de los cuatro dominios semejantes a Ig de LAG-3 en un ligando de acuerdo con la invención. Se cree que estos dominios son los responsables para la interacción con la proteína MHCII.

Construcciones de Ligando Biespecífico La construcción de un ligando biespecífico sigue la fórmula general "ligando-conector-ligando". Los anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica y se han descrito anteriormente.

La construcción de ligandos biespecíficos implica preferiblemente la construcción y expresión de un gen apropiado que codifica el polipéptido deseado. Otros métodos para la construcción es mezclar los dos polipéptidos en condiciones que permitan la unión covalente, iónica o hidrofóbica. En modalidades preferidas, comprende la unión covalente de los polipéptidos. Cuando se construye una molécula biespecífica que comprende tres componentes, como un ligando CTLA-4, un conector y un ligando MHC, dos de los tres pueden combinarse, unirse entre sí y el tercer polipéptido añadirse posteriormente al producto de fusión y unirse para crear un producto de fusión que comprende los tres polipéptidos.

Los polipéptidos de acuerdo con la presente invención pueden producirse por cualquier técnica deseada, incluyendo síntesis química, aislamiento de muestras biológicas y expresión de un ácido nucleico que codifica tal polipéptido. Los ácido nucleicos, a su vez, pueden sintetizarse o aislarse de fuentes biológicas y modificarse por mutagénesis dirigida a sitio si se desea.

La invención se refiere así a vectores que codifican un ligando biespecífico de acuerdo con la invención, o un fragmento de éste. El vector puede ser, por ejemplo, un vector de fago, plásmido, viral, o retroviral.

Los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención pueden ser parte de un vector que contiene un marcador seleccionable para la propagación en un huésped. Generalmente, un vector plasmídico se introduce en un precipitado, como un precipitado de fosfato de calcio, o en un complejo con un lípido cargado.

Si el vector es un virus, puede empaquetarse in vitro usando una línea celular de empaquetamiento apropiada y transducirse después en células huésped.

El inserto de ácido nucleico se une de manera operativa a un promotor apropiado, como el promotor del fago lambda PL, los promotores de E. coli lac, trp, phoA y tac, los promotores temprano y tardío de SV40 y promotores de LTR retrovirales. Otros promotores adecuados son conocidos para los expertos en la técnica. Las construcciones de expresión contienen además sitios para el inicio, terminación de la transcripción y, en la región transcrita, un sitio de unión a ribosoma para la traducción. La parte codificadora de los transcritos expresados por las construcciones incluye preferiblemente un codón de inicio de la traducción al comienzo y un codón de terminación (UAA, UGA o UAG) situado apropiadamente al final del polipéptido que se va a traducir.

Como se indica, los vectores de expresión incluyen preferiblemente al menos un marcador seleccionable. Tal marcador incluye resistencia a dihidrofolato reductasa, G418 o neomicina para cultivo de célula eucariota y genes de resistencia a tetraciclina, kanamicina o ampicilina para el cultivo en E. coli y otras bacterias. Los ejemplos representativos de huésped apropiados incluyen, pero no están limitados a, células bacterianas, como células de E. coli, Streptomyces y Salmonella typhimurium; células fúngicas, como células de levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris); células de insecto como células de Drosophila S2 y de Spodoptera Sf9; células animales como células CHO. COS, HEK293, y células de melanoma de Bowes; y células de planta.

Los medios y condiciones apropiados de cultivo para las células huésped descritas anteriormente son conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente.

Entre los vectores preferidos para uso en bacterias se incluyen pQE70, pQE60 y pQE-9, disponibles en QIAGEN, Inc.; vectores pBluescript, vectores Phagescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, disponibles en Stratagene Cloning Systems, Inc.; y ptrc99a, pKK2233, pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponibles en Pharmacia Biotech, Inc. Entre los vectores eucariotas preferidos están pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI y pSG disponibles en Stratagene; y pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL disponibles en Pharmacia. Entre los vectores preferidos para uso en la expresión en células de mamífero se incluyen Vector pSG5, PCMVSP0RT6, pcDNA, pCEP4, pREP4, pCI, pSI y pBICEP-CMV. Los vectores de expresión preferidos para uso en sistemas de levaduras incluyen, pero no están limitados a pYES2, pYDI, pTEFI/Zeo, pYES2/GS, pPICZ, pGAPZ, pGAPZalph, pPIC9, pPIC3.5, pHILD2, pHIL-SI, pPIC3.5K, pPIC9K, y PA0815 (todos disponibles en Invitrogen, Carlsbad, CA).

La introducción de la construcción en la célula huésped puede efectuarse por transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, infección, u otros métodos. Tales métodos se describen en muchos manuales estándar de laboratorio, como Sambrook et al., referido anteriormente. Un polipéptido de acuerdo con la invención puede recuperarse y purificarse de cultivos de células recombinantes por métodos muy conocidos incluyendo precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía en hidroxiapatito y cromatografía en lectina. Los más preferiblemente, se usan cromatografía líquida de alta resolución ("HPLC") para la purificación.

Los polipéptidos de acuerdo con la presente invención también pueden recuperarse de fuentes biológicas, incluyendo fluidos corporales, tejidos y células, especialmente células derivadas de tejido tumoral o tejidos que se sospecha que son tumorales de un sujeto.

Además, los polipéptidos de acuerdo con la invención pueden sintetizarse químicamente usando técnicas conocidas en la técnica (por ejemplo, ver Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principies, W. H. Freeman & Co., N. Y., y Hunkapiller et al., (1984) Nature, 310:105-111). Por ejemplo, puede sintetizarse un polipéptido que comprende todo o parte de un ligando biespecífico de acuerdo con la invención por el uso de un sintetizador de péptidos.

Los ligandos biespecíficos de acuerdo con la invención se describen con detalle en las SEC IDs adjuntas a la presente. Las SEC ID Nos.: 1 y 2 proporcionan las secuencias sucedáneas de ADN y proteína de ratón de ligandos biespecíficos en los que el ligando CTLA-4 CD80w88a está emparejado con el ligando MHC LAG-3, separados por la región Fe de IGg2a y una secuencia Gly-9 (G9). Se proporciona una etiqueta His terminal (H6) en el extremo C. Las SEC ID Nos.: 3 y 4 proporcionan las secuencias sucedáneas de ADN y proteína de ratón para las mismas construcciones que las SEC ID Nos.: 1 y 2, excepto en que la región Fe de lgG2a está situada C terminal respecto al polipéptido LAG-3, de manera que los péptidos CD80 y LAG-3 están separados sólo por G9. Las dos disposiciones, con la región Fe entre los ligandos o C terminal a éstos, se refieren como construcciones de gen 1 y gen 2, respectivamente.

Las SEC ID Nos.: 5 y 6 proporcionan las secuencias de ADN y proteína humanas en las que se ha mantenido la secuencia de tipo salvaje. No se han hecho mutaciones, ni en CD80 o LAG-3.

En las SEC ID Nos.: 7 y 8, se ha hecho una mutación W84A en CD80 humano (el equivalente de W88A en ratón) y se ha hecho una mutación R75E en LAG-3. Las SEC IDs (Nos.: 7- 14) restantes describen otras mutaciones en las secuencias de CD80 y LAG-3.

Aplicaciones Terapéuticas La supresión de la actividad de las células T es deseable en varias situaciones en las que se garantiza la inmunosupresión y/o se produce una afección autoinmune. De acuerdo con esto, tomar como objetivo la interacción CTLA-4/MHC está indicado en el tratamiento de enfermedades que implican una respuesta inmune inapropiada y/o no deseada, como inflamación, autoinmunidad y afecciones que implican tales mecanismos. En una modalidad, tal enfermedad o trastorno es una enfermedad autoinmune y/o inflamatoria. Los ejemplos de tales enfermedades autoinmunes y/o inflamatorias se han mostrado anteriormente.

En una modalidad, tal enfermedad o trastorno es Diabetes Tipo 1 (T1D).

En otra modalidad, los ligandos de acuerdo con la invención se usan para ayudar en el trasplante mediante la inmunosupresión del sujeto. Tal uso alivia la enfermedad de injerto frente a huésped. Para una descripción de los tratamientos existentes para la enfermedad de injerto frente a huésped, ver Svennilson, (2005) Bone Marrow Transplantation 35:S65-S67, y las referencias citadas en ella. Ventajosamente, los anticuerpos de la invención pueden usarse en combinación con otras terapias disponibles.

Respecto al tratamiento de enfermedades autoinmunes, la terapia de combinación puede incluir la administración de un ligando de la presente invención junto con un medicamento, que conjuntamente con el ligando comprende una cantidad eficaz para prevenir o tratar tales enfermedades autoinmunes. Cuando dicha enfermedad autoinmune es Diabetes Tipo 1, la terapia de combinación puede englobar uno o más de un agente que estimula el crecimiento de células beta pancreática o potencia el trasplante de células beta, como el crecimiento de células beta o factores de supervivencia o anticuerpos inmunomoduladores. Cuando dicha enfermedad autoinmune es artritis reumatoide, dicha terapia de combinación puede englobar uno o más de metotrexato, un anticuerpo anti-TNF-a, una proteína de fusión receptor de TNF-a-lg, un anticuerpo anti-IL-6, o anti-l L17, o anti-IL-15 o anti-l L-21 , un fármaco anti-inflamatorio no esteroideo (NSAID), o un fármaco anti-reumático modificador de la enfermedad (DMARD). Por ejemplo, el agente adicional puede ser un agente biológico como un agente anti-TNF (por ejemplo, Enbrel®, infliximab (Remicade® y adalimumab (Humira®) o rituximab (Rituxan®). Cuando dicha enfermedad autoinmune es rechazo de trasplante hematopoyético, pueden administrarse factores de crecimiento hematopoyético (como eritropoyetina, G-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-11, trombopoyetina, etcétera) o antimicrobianos (como fármacos antibióticos, antivirales, antifúngicos). Cuando dicha enfermedad autoinmune es psoriasis, el agente adicional puede ser uno o más de alquitrán y derivados de éste, fototerapia, corticosteroides, Ciclosporina A, análogos de la vitamina D, metotrexato, inhibidores de la proteína quinasa activada por el mitógeno p38 (MAPK), así como agentes biológicos como agentes anti-TNF-a y Rituxan®. Cuando dicha enfermedad autoinmune es una enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) como, por ejemplo, la Enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa, el agente adicional puede ser uno o más de aminosalicilatos, corticosteroides, inmunomoduladores, antibióticos o agentes biológicos como Remicade® y Humira®.

El tratamiento de combinación puede llevarse a cabo de cualquier forma que el experto en la técnica considere necesaria o conveniente y para el propósito de esta especificación, no se contemplan limitaciones respecto al orden, cantidad, repetición o cantidad relativa de los compuestos que se van a usar en combinación. De acuerdo con esto, los anticuerpos de acuerdo con la presente invención para uso en terapia pueden formularse en composiciones farmacéuticas. La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden péptidos de acuerdo con la presente invención.

Composiciones Farmacéuticas En una modalidad preferida, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un ligando biespecífico de acuerdo con la invención, o un ligando o ligandos identificables por un método de ensayo como se ha definido en el aspecto previo de la invención. Los ligandos pueden ser inmunoglobulinas, péptidos, ácidos nucleicos o moléculas pequeñas, como se discute en el presente documento. Se refieren, en la siguiente discusión, como "compuestos".

Una composición farmacéutica de acuerdo con la invención es una composición de materia que comprende un compuesto o compuestos capaces de modular la actividad de las células T como un ingrediente activo. Típicamente, el compuesto está en la forma de cualquier sal farmacéuticamente aceptable o, por ejemplo, cuando sea apropiado, un análogo, forma de base libre, tautómero, enantiómero, racemato, o combinación de éstos. Se contempla que los ingredientes activos de una composición farmacéutica que comprende el ingrediente activo de acuerdo con la invención presenten una actividad terapéutica excelente, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedad de injerto frente a huésped, cuando se administra en una cantidad que depende del caso particular.

En otra modalidad, pueden usarse uno o más compuestos de la invención en combinación con cualquier compuesto reconocido en la técnica que se conoce que es adecuado para tratar la indicación particular en el tratamiento de cualquiera de las afecciones mencionadas anteriormente. De acuerdo con esto, uno o más compuestos de la invención pueden combinarse con uno o más compuestos reconocidos en la técnica que se conoce que son adecuados para tratar las indicaciones anteriores de manera que puede administrarse una composición única conveniente al sujeto. El régimen de dosificación puede ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica óptima.

Por ejemplo, pueden administrarse varias dosis divididas diariamente o la dosis puede reducirse proporcionalmente según indiquen las exigencias de la situación terapéutica.

El ingrediente activo puede administrarse de una manera conveniente como por vía oral, intravenosa (cuando sea soluble en agua), intramuscular, subcutánea, intranasal, intradérmica o por supositorio o implante (por ejemplo, usando moléculas de liberación lenta).

Dependiendo de la vía de administración, el ingrediente activo puede requerir un recubrimiento en un material para proteger dichos ingredientes de la acción de enzimas, ácido y otras condiciones naturales que pueden inactivar dicho ingrediente.

Con el fin de administrar el ingrediente activo por administración diferente de la parenteral, se recubrirá con, o se administrará con, un material para evitar su inactivación. Por ejemplo, el ingrediente activo puede administrarse en un adyuvante, co administrarse con inhibidores enzimáticos o en liposomas. Adyuvante se usa en su sentido más amplio e incluye cualquier compuesto inmunoestimulador como interferón. Los adyuvantes contemplados en el presente documento incluyen resorcinoles, tensioactivos no iónicos como polioxietiien oleil éter y n-hexadecil polietilen éter. Los inhibidores enzimáticos incluyen tripsina pancreática.

Los liposomas incluyen emulsiones CGF agua en aceite en agua así como liposomas convencionales.

El ingrediente activo también puede administrarse parenteral o intraperitonealmente.

También pueden prepararse dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de éstos y en aceites. En las condiciones habituales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles o dispersión. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta el punto de que exista una jeringabilidad fácil. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe preservarse frente a la acción contaminante de microorganismos como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y semejantes), mezclas adecuadas de éstos y aceites vegetales. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de tensioactivos.

La prevención de la acción de microorganismos puede conseguirse por varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y semejantes. En determinados casos, puede ser preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede conseguirse por el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando el ingrediente activo en la cantidad requerida en el solvente apropiado con varios de los demás ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el ingrediente activo esterilizado en un vehículo estéril que contiene el medio básico de dispersión y los demás ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado en vacío y la técnica de liofilización que rinde un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de la solución de éste previamente esterilizada por filtración.

Como se usa en el presente documento "vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable" incluye cualquier y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y que retrasan la absorción y semejantes. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es muy conocido en la técnica. Excepto desde el momento en el que cualquier medio convencional o agente sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla el uso de éstos en las composiciones terapéuticas. También pueden incorporarse en las composiciones ingredientes activos suplementarios.

Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma unitaria de dosificación para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma unitaria de dosificación como se usa en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos que se van a tratar, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las nuevas formas unitarias de dosificación de la invención está dictada por y depende directamente de (a) las características únicas del material activo y el efecto terapéutico particular que se quiere conseguir, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de formación de compuestos como material activo para el tratamiento de enfermedad en sujetos vivos que tienen una afección patológica en la que la salud corporal está alterada.

Los ingredientes activos principales se usan para preparar compuestos para administración conveniente y eficaz en cantidades eficaces con un vehículo adecuado farmacéuticamente aceptable en forma unitaria de dosificación. En el caso de composiciones que contienen ingredientes activos suplementarios, las dosificaciones se determinan por referencia a la dosis y manera de administración habituales de dichos ingredientes.

Con el fin de facilitar la administración de los compuestos peptídicos, incluyendo anticuerpos, a células, los péptidos pueden modificarse con el fin de mejorar su capacidad de cruzar una membrana celular. Por ejemplo, US 5,149,782 describe el uso de péptidos fusogénicos, péptidos formadores de canales iónicos, péptidos de membrana, ácidos grasos de cadena larga y otros agentes de mezclado de membrana para incrementar el transporte de proteínas a través de la membrana celular. Éstos y otros métodos también se describen en WO 97/37016 y US 5,108,921, incorporados en el presente documento por referencia.

En un aspecto adicional se proporciona el ingrediente activo de la invención como se ha definido anteriormente en el presente documento para uso en el tratamiento de enfermedad bien solo o en combinación con compuestos reconocidos en la técnica que se conoce que son adecuados para tratar la indicación particular. Consecuentemente, se proporciona el uso de un ingrediente activo de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedad asociada con una respuesta inmune aberrante.

Además, se proporciona un método para tratar una afección asociada con una respuesta inmune aberrante, que comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un ligando identificable usando un método de ensayo como se ha descrito anteriormente.

La invención se describe adicionalmente, sólo para propósitos de ilustración, en los ejemplos siguientes.

Ejemplos Ejemplo 1 Diseño de una proteína de fusión biespecífica que une CTLA-4 y lo entrecruza con el TCR a través de MHC 11.

Para generar una proteína de fusión biespecífica que una selectiva y agonísticamente CTLA-4 y lo ligue simultáneamente al TCR, se fusionó CD80 mutante (CD80w88a, referido de aquí en adelante como CD80wa) que se une a CTLA-4 pero tiene una afinidad mínima para CD28 (Wu ef al., 1997) con LAG-3, un ligando natural de MHCII (Baixeras et al., 1992; Triebel et al., 1990). CD80wa se unió a LAG-3 usando un conector compuesto por nueve glicinas, que a su vez estaba unido a la parte Fe de lgG2a de ratón para incrementar supuestamente su vida media circulante (Figura 1A). En respuesta a un ligando de esta configuración, se espera que se produjera la unión de CTLA-4 y la ligación al TCR indirectamente, mediante la formación del complejo tri-molecular (CTLA-4/MHCII/TTCR) en las sinapsis inmunes durante la activación temprana de las células T (Figura 1B). Conceptualmente, fuera del contexto de la sinapsis inmune, la unión de la proteína de fusión biespecífica a CTLA-4 o MHCII solos o a ambos CTLA-4 y MHCII no debería dar lugar a la inhibición de la actividad de las células T. La unión de CTLA-4 por CD80wa se diseñó para desencadenar la señalización de CTLA-4 a través del reclutamiento de fosfatasas en la cola citoplásmica de CTLA-4. Mientras tanto, se pretendió que la unión de LAG-3 a MHCII pusiera a CTLA-4 en la proximidad del TCR cognado, que se une al complejo pMHCII en la sinapsis inmune (Figura 1B). Se esperaba que la combinación de estos dos eventos de unión proporcionara una señal inhibidora al TCR. También se construyó una proteína de fusión control que comprende CD80wa y Fe de lgG2a (Figura 1A), que no debería ser capaz de entrecruzar CTLA-4 con el TCR (Figura 1C) ya que carece de LAG-3.

Las proteínas de fusión de ensayo y control se expresaron en células de ovario de hámster chino y se purificaron con cromatografía de afinidad en una columna de proteína G. Los agregados se eliminaron usando cromatografía de exclusión por tamaño. La proteína de fusión biespecífica de ensayo (CD80wa-LAG-3-Fc) se refiere como BsB (secuencia de nucleótidos: SEC ID No.: 3; secuencia de aminoácidos: SEC ID No.: 4), y la construcción control (CD80wa-Fc) se conoce como BsBA (secuencia de nucleótidos: SEC ID No.: 16; secuencia de aminoácidos: SEC ID No.: 17). Como se esperaba, ambas proteínas de fusión aparecieron como dímeros en geles de SDS-PAGE no reductora (BsB, 200 kDa; BsBA 140 kDa) y como monómeros (BsB, 100 kDa; BsBA 70 kDa) en geles de SDS-PAGE reductora. Sus identidades se confirmaron además por transferencia Western, usando anticuerpos frente a LAG-3 y CD80.

Ejemplo 2 BsB inhibe la activación de células T en una reacción alogénica de linfocitos mixtos.

La capacidad relativa de BsB y BsBA para inhibir la activación de las células T se evaluó en una reacción alogénica de linfocitos mixtos midiendo la producción de IL-2. Células T CD4 + CD25 CD62LhighCD44 °w sin activar que se habían purificado de ratones BALB/c se mezclaron con APC aisladas de ratones C57BL/6 en presencia o ausencia del BsB o BsBA. Se incluyeron lgG2a murina y CTLA-4lg, un inhibidor de la co-estimulación que se une a CD80/86 y bloquea su unión a CD28, como controles negativo y positivo, respectivamente. La inclusión de BsB pero no de BsBA en la reacción de linfocitos mixtos inhibió la producción de IL-2 pero no en el mismo grado al conseguido por CTLA-4lg (Figura 2). Esta diferencia fue probablemente el resultado de que la inhibición de las células T mediada por BsB ocurría después que la inhibición mediada por CTLA-4lg. Más específicamente, para BsB, la inhibición sólo ocurrió después de que CTLA-4 se regulara al alza después de la activación de las células T. La incapacidad de BsBA de reducir la producción de IL-2 sugiere fuertemente que sólo la activación de CTLA-4 es insuficiente para evitar la activación de las células T porque se requiere el entrecruzamiento simultáneo al TCR. Para excluir la posibilidad de que la parte LAG-3 de BsB juegue un papel en la inhibición de las células T, LAG-3lg se ensayó en este ensayo y se verificó que no inhibía la activación de las células T.

Ejemplo 3 BsB dirige la diferenciación de las células T a Tregs.

Se ha mostrado que la terminación temprana de la señalización de TCR por la eliminación de la estimulación con antígeno, inhibición de la señalización de mTOR, estimulación subóptima de TCR debida a un antígeno de baja afinidad, o coestimulación débil durante la activación de las células T induce la expresión de Foxp3+ e inclina la diferenciación de las células T hacia un fenotipo Treg (Delgoffe et al., (2009) Immunity 30:832- 844; Haxhinasto et al., (2008) J. Exp. Med. 205:565-574; Sauer et al., (2008) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 105:7797-7802). Como BsB fuerza la activación temprana del TCR por CTLA-4 inducido por activación con la atenuación consecuente de la señalización de TCR, también se evaluó su capacidad para generar Tregs Foxp3+. Se mezclaron células T CD4+CD62LhighGFP" sin activar preparadas a partir de ratones con inserción génica de Foxp3-EGFP (Haribhai et al., (2007) J. Immunol 178:2961-2972) con APC alogénicas tratadas con LPS en presencia de BsB o BsBA. El análisis por citometría de flujo de las células después de cinco días de cultivo reveló un gran número de células T CD4+CD25+GFP+ entre las células tratadas con BsB (Figura 3A, panel medio de la izquierda) pero no entre las células tratadas con lgG2a de ratón (Figura 3A, panel superior de la izquierda) o el BsBA control (Figura 3A, panel inferior de la izquierda), lo que sugiere que estas células T CD4+CD25+GFP+ eran Tregs Foxp3+. Para confirmar este descubrimiento, se recogieron los medios de cultivo y se ensayaron para la firma de citoquinas Treg, IL-10 y TGF-ß (Cools et al., (2008) J. Cell Mo/. Med. 12:690-700). Se detectaron grandes cantidades de IL-10 y TFG-ß en los medios de células tratadas con BsB (Figura 3A, paneles de la izquierda) pero no en los medios de células tratadas con BsBA o mlgG2a. Sorprendentemente, CTLA-4lg no indujo la generación de Tregs GFP+ o la producción de IL-10 y TGF-ß. Sin estar vinculado a una teoría particular, el mecanismo por el que CTLA-4lg restringe la respuesta de las células T es diferente del de BsB. LAG-3lg solo o en combinación con BsBA también fracasó en inducir la generación de Tregs GFP+, lo que sugiere que se requería el entrecruzamiento mediado por BsB de CTLA-4 con el TCR para la inducción de Treg.

Ejemplo 4 La Inducción de Tregs por BsB requiere TGF-ß auto-estimulado La detección simultánea de niveles elevados de IL-10 y TGF-ß después del tratamiento con BsB planteó la posibilidad de que las citoquinas, TGF-ß en particular, jugaban un papel en facilitar la generación de Tregs (Figura3A). Para solucionar esto, se recogieron medios de cultivo durante un periodo de cinco días y se analizaron para contenido de citoquina y Treg Foxp3 + . Se detectaron niveles elevados de IL-10 y TGF-ß tan pronto como en el día 2 después del tratamiento y se detectaron Tregs Foxp3 + después del día 3. Sin estar vinculado a una teoría particular, la producción endógena de TGF-ß estimulada presumiblemente por BsB, está implicada en la diferenciación de Treg. La adición de un anticuerpo anti-TGF-ß (clon 1D11), pero no de una IgG de isotipo control (clon 13C4), al ensayo de inducción de Treg bloqueó completamente la aparición de Tregs Foxp3+ (Figura 3B). Sin estar vinculado a una teoría particular, la activación temprana de CTLA-4 y su entrecruzamiento posterior con el TCR por BsB estimuló la producción endógena de TGF-ß, que a su vez estimula la diferenciación de Treg. Se ha indicado previamente que el entrecruzamiento de CTLA-4 y el TCR induce la producción de TGF-ß (Chen et al., (1998) J. Exp. Med. 188:1849-1857), aunque la diferenciación de Treg no se evaluó en este estudio.

Se ha mostrado que los Tregs tienen un potencial terapéutico considerable en la modulación de las manifestaciones de enfermedad en varios modelos animales de enfermedades autoinmunes. Sin embargo, se ha subrayado la importancia de la especificidad de los Tregs inducidos frente a los antígenos relevantes. Los Tregs no específicos de antígeno que no se activarán frente a autoantígenos particulares en el contexto de células T reactivas específicas de autoantígenos son presumiblemente inmunosupresores no funcionales. Por lo tanto, las estrategias que facilitan la generación de grandes números de Tregs específicos de antígeno son altamente deseables para tratar estas dolencias. Además, se prefieren las estrategias que facilitan la inducción de novo de Tregs específicos de antígeno in situ (por ejemplo, en islotes de páncreas para T1D o en lámina propia para colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn) sobre el uso de transferencia adoptiva de Tregs diferenciados o expandidos in vitro.

Ejemplo 5 Los Tregs inducidos por BsB son funcionalmente supresores de una manera dependiente del contacto célula-célula.

Para evaluar si los Tregs inducidos por BsB eran funcionalmente supresores, se purificaron Tregs inducidos por BsB y Tregs inducidos por TGF-ß, que sirvieron como un control, usando separación celular activada por fluorescencia (FACS por sus siglas en inglés) y se mezclaron con células T respondedoras singénicas marcadas con CFSE a proporciones diferentes y APC alogénicas. Las células se co-cultivaron durante tres días en transwells o pocilios de cultivo normales, después de lo cual se analizó la proliferación de células T respondedoras usando citometría de flujo. Como se resume en la Figura 5A, los Tregs inducidos tanto por BsB como por TGF-ß cultivados en pocilios de cultivo normales inhibieron casi completamente la proliferación de células T respondedoras. La potencia de la actividad supresora de los Tregs inducidos por BsB fue comparable a la de los Tregs inducidos por TGF-ß. Por el contrario, los Tregs generados por BsB o TGF-ß no inhibieron significativamente la proliferación de células T respondedoras cuando las células T se separaron de los Tregs en un transwells. Sin estar vinculado a una teoría particular, la actividad supresora de Treg dependía del contacto célula-célula y no estaba mediada por citoquinas secretadas u otros factores. Apoyando este concepto, la inclusión de un anticuerpo frente a IL-10 (clon JES5-2A5) en el pocilio de cultivo normal no afectó la actividad supresora de los Tregs inducidos por BsB o TGF-ß (Figura 5B). La adición de un anticuerpo frente a TGF^1D11 tampoco afectó la actividad supresora de los Tregs inducidos por BsB, aunque redujo parcialmente la supresión por Tregs inducidos por TGF-ß (Figura 5B).

Ejemplo 6 BsB dirige la diferenciación de células T OT-II en Tregs específicos de antígeno.

Como se encontró que una proteína de fusión bifuncional que comprende CD80wa y LAG3 (BsB) que entrecruza CTLA-4 con el TCR (a través de MHCII) puede inducir la producción de Tregs Foxp3+ en un MLR alogénico, se examinó el potencial de BsB en la incitación de la producción de Tregs específicos de antígeno. Para investigar esta posibilidad, se purificaron células T OT-II sin activar a partir de ratones transgénicos que portan transgénes que codifican el TCR (subunidades a y ß) específico para un péptido de ovoalbúmina de pollo (323-339) (Barnden et al., 1998) y se mezclaron con APC singénicas en presencia de Ova323-339. Después de 5 días de cultivo, se detectaron cantidades significativamente mayores de Tregs Foxp3+ en las células T OT-II que habían sido tratadas con BsB (Figura 4A, panel medio de la izquierda) que por el mlgG control (Figura 4A, panel superior de la izquierda) o por CTLA-4lg (datos no mostrados). Esta inducción de Tregs se inhibió por la inclusión de un anticuerpo anti-TGF-ß en los cultivos (Figura 4A, panel inferior de la izquierda). Sin estar vinculado a una teoría particular, la diferenciación estaba mediada por TGF-ß producido endógenamente de una manera autocrina o paracrina. Los niveles de IL-2 estaban disminuidos mientras que los de IL-10 y TGF-ß estaban incrementados en los medios de las células tratadas con BsB (Figura 4A, paneles de la derecha).

Para monitorizar la actividad proliferativa de los Tregs inducidos, las células OT-II se precargaron con el trazador fluorescente, CFSE. Como se muestra en la Figura 4B, se determinó que los Tregs Foxp3+ inducidos por BsB eran proliferativos como se indica por una dilución de la señal CFSE. Como se esperaba, la adición de CTLA-4lg, un bloqueante co-estimulador, redujo la proliferación de las células T. Por lo tanto, BsB fue capaz de inhibir la activación de las células T e inducir la producción de Tregs tanto en un entorno de MLR alogénico como específico de antígeno.

Ejemplo 7 La inducción de Tregs por BsB puede implicar la atenuación de la ruta de señalización AKT/mTOR.

Publicaciones recientes han indicado que las rutas de señalización AKT y mTOR juegan un papel importante en la determinación del destino de las células T. La presencia de AKT constitutivamente activo en células T disminuye la diferenciación de Treg de una manera sensible a rapamicina (Haxhinasto et al., 2008), lo que sugiere que las rutas de señalización AKT y mTOR se cruzan para influir en el destino de Treg. Además, las células T deficientes en mTOR se diferencian en Tregs más fácilmente que las células T normales control (Delgoffe et al., (2009) Immunity 30:832-844). También se ha indicado un papel obligatorio para las moléculas co-inhibidoras PD-1/PD-L1 en el control del desarrollo de Treg adaptativos mediante el antagonismo de AKT/mTOR (Francisco et al., (2009) J. Exp. Med. 206:3015-3029). Para determinar si estas rutas también están implicadas en la inducción de Tregs mediada por BsB, se coinmovilizaron anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 con BsB, mlgG, o PD-L1 en placas de 96 pocilios, en las que se sembraron células T sin activar. Dieciocho horas después de la activación, las células se tiñeron con anticuerpos marcados fluorescentemente frente a AKT y mTOR fosforilados y se analizaron por citometría de flujo. La fosforilación tanto de AKT como de mTOR se atenuó por BsB y la co-inmovilización de PD-L1 (Figura 6). Sin estar vinculado a una teoría particular, los eventos de señalización mediados por las moléculas inhibidoras CTLA-4 y PD-L1 pueden converger en algún punto a lo largo de la ruta de señalización de AKT/mTOR durante la activación de las células T para regular la diferenciación de Treg.

Ejemplo 8 La exposición a BsB mantiene la expresión de Foxp3+ en Tregs inducidos.

Se ha indicado que los Tregs inducidos in vitro, a diferencia de los Tregs naturales plenamente comprometidos, son menos estables y pueden perder la expresión de Foxp3+ después de un cultivo extenso en ausencia del inductor inicial (por ejemplo, TGF-ß o ácido retinoico) (Selvaraj y Geiger, (2007) J. Immunol. 178:7667-7677). En el presente estudio, los Tregs inducidos por BsB mostraron una inestabilidad similar, con algunas células perdiendo la expresión de Foxp3 después de cultivos repetidos (Figura 7). Para ensayar si la re-estimulación por BsB podía prolongar la expresión de Foxp3, los Tregs se indujeron en primer lugar recubriendo placas de 96 pocilios tanto con los anticuerpos anti-CD3/anti-CD28 como con BsB. Los Tregs purificados se sometieron a una ronda adicional de cultivo en presencia o ausencia de BsB. La re-estimulación de los Tregs purificados con BsB permitió el mantenimiento de una gran población (~93% de los Tregs totales) de Tregs Foxp3+ (Figura 7, panel inferior de la derecha), comparado con ~40% de expresión de Foxp3 en respuesta a la IgG control (Figura 7, panel superior de la derecha).

Ejemplo 9 Farmacocinética de BsB en ratones.

Antes de ensayar la utilidad terapéutica de BsB en modelos animales de enfermedades autoinmunes, se determinó su perfil farmacocinético para ayudar a diseñar un régimen de dosificación in vivo. La inyección intraperitoneal de BsB en ratones C57BL/6 resultó en una elevación mensurable de los niveles circulantes seguido de un aclaramiento rápido con una vida media plasmática estimada (t 2) de -12 horas (Figura 8A). Este perfil fue inesperado ya que la farmacocinética de las proteínas de fusión que contienen Fe o anticuerpos es típicamente más prolongada.

Como la unión de anticuerpos al receptor Fe neonatal (FcRn) es principalmente responsable de sus vidas medias prolongadas (Roopenian y Akilesh, 2007), se compararon las capacidades relativas de BsB y una lgG2a control de ratón para unirse a FcRn. La Figura 8B muestra que las características de unión de ambas proteínas al FcRn eran muy similares lo que indica que era improbable que un defecto en la unión de BsB a FcRn fuera la causa de su aclaramiento rápido de la circulación.

Otra explicación potencial para el aclaramiento rápido de BsB podría deberse a su captación por receptores de carbohidrato en células no objetivo. Los ejemplos de tales receptores incluyen el receptor asialoglicoproteína (ASGPR por sus siglas en inglés) en hepatocitos (Weigel, 1994) y el receptor de mañosa en macrófagos y células endoteliales del sistema reticuloendotelial (Pontow et al., 1992). El análisis de BsB usando el servidor NetNGIyc sugirió que tiene el potencial de portar hasta 10 cadenas laterales oligosacarídicas ligadas a asparagina por monómero (Figura 9). Un análisis de la composición de monosacáridos indicó que BsB contenía aproximadamente 37 residuos de mañosa y pueden haberse usado todos los sitios de glicosilación ligados a asparagina previstos porque cada uno de estos glicanos oligosacarídicos ligados a asparagina contiene la estructura central de mañosa con tres residuos de mañosa (un total de 30 residuos de mañosa). Además, también puede existir una pequeña cantidad de oligosacáridos de tipo con alta mañosa para explicar los residuos de mañosa extra. De hecho, se identificaron cantidades significativas de oligosacáridos sub-sialilados con tri- y tetra-antena ligados a asparagina, así como de tipo con alta mañosa por espectrometría de masas de glicanos permetilados liberados de la proteína. Esta proyección también es consistente con el peso molecular de BsB de 100 kDa como se indica por un análisis de SDS-PAGE, a diferencia del peso calculado de BsB de 80 kDa. La presencia añadida de oligosacáridos contribuyó a la diferencia (20 kDa) en el peso molecular. Además, el BsB presentó una proporción de ácidos siálicos a galactosa de 0.68 (Figura 9), lo que indica que los glicanos estaban incompletamente sialilados. Sin estar vinculado a una teoría particular, el aclaramiento mediado por carbohidratos de BsB por el ASGPR contribuía a su aclaramiento rápido de la circulación.

Ejemplo 10 Un curso corto de tratamiento con BsB retrasó el inicio de diabetes autoinmune en ratones NOD.

Como la CE50 de BsB para inducir Tregs in vitro se estimó que era aproximadamente 100 nM y su vida media circulante era corta (ti 2 a ~12 horas), BsB se ensayó en ratones NOD en un paradigma de prevención tardía. Se administró a los ratones NOD BsB durante un intervalo corto (cada dos días durante 4 semanas) cuando tenían entre 9 y 12 semanas de edad. A esta edad, las células T autorreactivas y la insulitis son ya evidentes pero los ratones todavía tienen que desarrollar diabetes manifiesta. Como se muestra en la Figura 10A, los ratones NOD tratados durante 2 semanas con BsB mostraron un incremento modesto pero estadísticamente significativo (25%) en el número de Tregs Foxp3+ en la sangre cuando se comparan con los controles tratados con solución salina. Sin embargo, este incremento en Tregs fue transitorio ya que no se pudo detectar una diferencia en el número de Tregs después de 4 semanas de tratamiento o en puntos de tiempo posteriores. Un incremento transitorio similar en Tregs en órganos linfoides se observó previamente después de tratamiento de ratones NOD con un anticuerpo anti-CD3 (Nishio et al., 2010). Sin estar vinculado a una teoría particular, los Tregs inducidos por BsB pueden haber revertido a células T Foxp3" después del cese del tratamiento. También pueden haber sido reclutados por tejidos objetivo específicos (por ejemplo, páncreas) para ejercer su función. Independientemente, este curso corto de tratamiento con BsB en un paradigma de tratamiento de prevención tardía parece retrasar modestamente el inicio de la enfermedad y disminuir el número de ratones que presentan T1D manifiesta (Figura 10B).

La respuesta modesta observada puede haberse debido a la presencia de insulitis activa en los ratones NOD de 9 semanas de edad antes del comienzo de la terapia. Se ha mostrado que un entorno inflamatorio favorece la conversión de células T activadoras en células Th17 y suprime su conversión a Tregs.

También se ha mostrado que las citoquinas inflamatorias como IL-6 o IL-4 inhiben la conversión de Treg y estimulan la pérdida de la expresión de Foxp3+ en Tregs (Caretto et al., 2010; Kastner et al., 2010; Koenen et al., 2008). Para eludir estos retos, los ratones NOD se trataron empezando en una edad más temprana (4 semanas de edad) antes de la inducción manifiesta de células T auto-reactivas e insulitis. También se incluyó CTLA-4lg como un control positivo en este estudio ya que Bluestone y colegas (Lenschow et al., 1995) han demostrado un beneficio en el uso de este agente en este modelo; se usó mlgG2a como un control negativo adicional a la solución salina. A diferencia de los resultados en ratones más mayores (Figura 10A), el número de Tregs Foxp3+ en la sangre periférica de ratones NOD más jóvenes tratados durante 2 semanas con BsB no se incrementó por encima de a los que se había administrado solución salina o mlgG (Figura 11A). Sin estar vinculado a una teoría particular, esto podría ser porque el número de células T auto-reactivas en los ratones NOD de 4 semanas de edad (a diferencia de los ratones de 9-12 semanas de edad usados en el estudio anterior) era muy bajo. El número de Tregs específicos de antígeno inducidos probablemente era demasiado bajo para registro más allá de los niveles básales presentes en los animales. Se observó una incidencia significativamente más baja de T1D en los ratones NOD a los que se administró BsB cuando se compara con los controles tratados con solución salina antes de las 24 semanas de edad (Figura 11 B) . Sin embargo, este beneficio se redujo en los puntos de tiempo posteriores.

Consistente con la publicación de ratones NOD a los que se administró CTLA-4lg (Salomón et al., 2000), los niveles de Tregs en la sangre (Figura 11 A) estaban significativamente deprimidos presumiblemente por los efectos de CTLA-4lg en la señalización de CD28/B7 (Tang et al., 2003). El tratamiento con CTLA-4lg también agravó la enfermedad presentando los ratones un inicio más temprano de la enfermedad (Figura 11B) y una mayor penetración de la enfermedad cuando se compara con los controles tratados con solución salina y mlgG (Figura 11 B) . La razón para la discrepancia entre estos descubrimientos y los publicados por Bluestone y colegas (Lenschow et al., 1995) no está clara pero puede deberse a las diferencias en el CTLA-4lg usado o el régimen de dosificación usado. En los presentes estudios, se usó una dosis de 10 mg/kg de CTLA-4lg humano (Orencia) en lugar de 2.5 mg/kg de CTLA-4lg de ratón por Bluestone y colegas. Además, el tratamiento con BsB no se extendió más allá de 7 semanas. Sin estar vinculado a una teoría particular, el uso de una dosis mayor de CTLA-4lg rindió un bloqueo más completo de la señal co-estimuladora requerida para la homeostasis de Treg.

Ejemplo 11 Un curso más largo de tratamiento con BsB retrasó significativamente el inicio y redujo la incidencia de diabetes autoinmune en ratones NOD.

Las razones potenciales para los beneficios modestos observados de BsB en la dirección de la enfermedad en ratones NOD en los estudios anteriores incluyen el uso de un curso relativamente corto de tratamiento, la potencia moderada de BsB en la inducción de la producción de Tregs (CE50 a > 100 nM), y la vida media circulante corta de BsB que puede haber limitado su exposición. Como la potencia y vida media circulante de BsB son intrínsecas a la molécula y por lo tanto no son factibles de cambiar fácilmente, se ensayó un curso más largo de tratamiento. Para este fin, los ratones NOD se trataron con BsB durante 10 semanas en lugar de 4 semanas empezando cuando los ratones tenían 4 semanas de edad. Como se muestra en la Figura 12A, los ratones NOD tratados durante 10 semanas con BsB presentaron un retraso significativo en el inicio de T1D. De forma importante, a las 35 semanas de edad, sólo el -13% de los ratones NOD tratados con BsB desarrolló T1D comparado con más del 70% en los controles tratados con solución salina. Así, el tratamiento extendido de los ratones NOD con BsB parecía haber protegido a los animales frente al desarrollo de diabetes autoinmune.

Al final del estudio (cuando los ratones tenían 35 semanas de edad), los animales se sacrificaron y se recogieron sus páncreas para análisis histopatológico. Se tiñeron secciones seriadas adyacentes con H&E para una evaluación general de los islotes, se ensayó con un anticuerpo anti-insulina para detectar la presencia de insulina en las células ß y se tiñeron doblemente con anticuerpos anti-CD3 y anti-Foxp3 para localizar las células T y los Tregs.

Debido a la heterogeneidad genética de los ratones NOD, un pequeño número de animales no tratados no desarrolló la enfermedad a las 35 semanas de edad. El análisis de los islotes de estos animales no diabéticos (de la cohorte tratada con solución salina) mostró que las células ß estaban intactas sin evidencia obvia de infiltración linfocítica o insulitis, (Figura 12B, paneles a-c). Estaban presentes unas pocas células Treg Foxp3+ en los islotes de estos ratones (flechas en el panel c). Al contrario, los islotes de ratones NOD diabéticos (de la cohorte tratada con solución salina) reveló la presencia de insulitis invasiva (Figura 12B, panel d) y la destrucción completa de las células ß (panel e). Además de las células T CD3+ y Tregs Foxp3+, también fueron evidentes grandes números de linfocitos distintos de células T (Figura 12B, panel f). Se observaron descubrimientos histopatológicos similares en los ratones correspondientes tratados con BsB que permanecieron sin enfermedad al final del estudio o que desarrollaron T1D durante el estudio. De forma interesante, en el ~50% de los islotes de los ratones NOD tratados con BsB que permanecieron no diabéticos, se observó evidencia de peri-insulitis (Figura 12B, panel g); sin embargo, las células ß se conservaron bien (Figura 12B, panel h).

La tinción con anticuerpos indicó que las células en la periferia de los islotes comprenden principalmente células T CD3+ y Tregs. (Figura 12B, panel i). Un aumento de una sección de la imagen (cuadrado rojo en la Figura 12B, panel i) reveló claramente la presencia de numerosos Tregs Foxp3+ (flechas amarillas en la Figura 12B, panel j) que estaban intercalados con células T no Foxp3+ pero CD3+ (cabezas de flecha negra en la Figura 12B, panel j) así como mononucleocitos distintos de células T (núcleos azules). El desarrollo de peri-insulitis se ha observado en ratones NOD jóvenes (4-10 semanas de edad) (Anderson y Bluestone, 2005) y en ratones más mayores tratados con otros agentes terapéuticos eficaces que retrasan o revierten T1D de inicio nuevo en ratones NOD (Chatenoud et al., 1994; Daniel et al., 2011; Simón et al., 2008; Vergani et al., 2010). Por lo tanto, un curso más largo de tratamiento de ratones NOD con BsB protegió a los animales frente al desarrollo de insulitis invasiva y T1D manifiesta. Sin estar vinculado a una teoría particular, esto estaba mediado, al menos en parte, por la inducción de novo y posiblemente ¡n situ de Tregs específicos de antígeno de islotes.

El entrecruzamiento de CTLA-4 y TCR a través de MHCII usando una nueva proteína de fusión biespecífica (BsB) indujo eficazmente la producción de Tregs específicos de antígeno así como las citoquinas anti-inflamatorias, IL-10 y TGF-ß. Los estudios previos mostraron que los Tregs son críticos para conferir tolerancia inmune y que los Tregs específicos de antígeno son más eficaces en modelos animales de enfermedades autoinmunes. BsB se evaluó adicionalmente en modelos animales de enfermedades autoinmunes, como T1D. Sin estar vinculado a una teoría particular, se propuso la hipótesis de que si BsB estimulaba la inducción de Tregs específicos de antígeno durante la fase temprana de activación de las células T autorreactivas en ratones NOD puede retrasar el inicio o parar la progresión de la enfermedad convirtiendo las células T autorreactivas que están experimentando activación en Tregs.

A pesar de que BsB presenta un potencia modesta (debido a su moderada afinidad por el HC-II y TCR) y una vida media circulante corta (que limita su exposición), un curso corto de tratamiento retrasó de manera reproducible el inicio de T1D en ratones NOD tratados en una edad temprana (entre 4-6 semanas de edad) y cuando eran más mayores (entre 9-12 semanas de edad). Sin embargo, los beneficios observados fueron modestos y no sostenidos. Un curso más largo de tratamiento (10 semanas) de ratones NOD (entre 4 y 13 semanas de edad) con BsB retrasó significativamente el inicio de la enfermedad y la incidencia de animales que desarrollan T1D. Sin estar vinculado a una teoría particular, este beneficio se impartió por la generación de novo de Tregs inducidos que fueron producidos localmente (por ejemplo, en el páncreas o ganglios linfáticos de drenaje pancreáticos) o distalmente que fueron entonces reclutados al páncreas para proteger los islotes de destrucción por células T autorreactivas y otros leucocitos distintos de células T. La tinción inmunohistoquímica de secciones de tejidos pancreáticos de ratones de 35 semanas de edad tratados con BsB que permanecieron no diabéticos indicó claramente un incremento en el número de Tregs Foxp3+ en la periferia de los islotes. Visualmente, pareció que previnieron la entrada en los islotes de las células T CD3+ y los linfocitos distintos de células T. Este fenómeno se observó en el ~50% de los islotes de ratones NOD tratados con BsB que permanecieron no diabéticos al final del estudio pero en ninguno de los islotes de los animales diabéticos en el grupo control. Los islotes de unos pocos ratones no diabéticos en el grupo control permanecieron sin infiltraciones linfocíticas y no tenían insulitis. Se conoce que debido a la heterogeneidad genética de los ratones NOD, unos pocos animales en una cohorte de este tamaño jamás desarrollan diabetes en este marco de tiempo. En el -50% restante de animales no diabéticos en el grupo tratado con BsB, los islotes también carecían de infiltraciones linfocíticas y no tenían insulitis. Las posibilidades para este estado sin enfermedad de estos ratones incluyen el tratamiento con BsB y la base genética.

Consistente con los descubrimientos histopatológicos, se detectó un incremento pequeño pero estadísticamente significativo en el número de Tregs Foxp3+ en la sangre de animales tratados con BsB (tratados de 9-12 semanas de edad) cuando se compara con los controles no tratados. Este incremento no fue evidente en los ratones que empezaron el tratamiento a una edad más joven (4 semanas de edad). Sin estar vinculado a una teoría particular, esto puede ser porque más células T autorreactivas están experimentando activación en los ratones de 9 semanas de edad que en los de 4 semanas de edad. Los bajos niveles de células T autorreactivas en los ratones de 4 semanas de edad podrían haber impedido la detección de Tregs inducidos más allá del entorno existente de Tregs. El incremento en Tregs también fue de naturaleza transitoria. Como una observación similar se observó en los animales sometidos a terapia anti-CD3 (Nishio et al., 2010), es posible que los Tregs inducidos fueran inestables y perdieran la expresión de Foxp3. Es más concebible que los Tregs fueran reclutados de la circulación a tejidos objetivos afectados. Al contrario, los ratones NOD tratados con CTLA-4lg presentaron una disminución significativa en el número de Tregs circulantes. El tratamiento también agravó la enfermedad como se evidencia por un inicio acelerado de la enfermedad y una mayor incidencia de animales que presentan enfermedad manifiesta. Esto es consistente con publicaciones previas que muestran que la ruta co-estimuladora está implicada en la homeostasis de Treg y que una ausencia de co-estimulación reduce la producción de Tregs. El bloqueo o inactivación de CD80 o CD86 en ratones NOD también resulta en un inicio temprano de T1D (Salomón et al., 2000; Tang et al., 2003).

La aparición de peri-insulitis se observa típicamente en el páncreas de ratones NOD entre las 4 y 9 semanas de edad. Si no se controla, resulta la insulitis invasiva que da lugar a la destrucción completa de las células ß y al desarrollo de diabetes manifiesta entre fas 12 y 35 semanas de edad. Los páncreas de los ratones NOD no diabéticos que habían sido tratados durante 10 semanas con BsB y analizados a las 35 semanas de edad presentaron evidencia de peri-insulitis que pareció ser parada en su progresión. No se observó indicación de insulitis invasiva o destrucción excesiva de células ß productoras de insulina. Existen otras publicaciones de diferentes intervenciones terapéuticas que retrasan o previenen la enfermedad de manera similar en ratones NOD (Shoda et al., 2005). Los resultados aquí son más parecidos a los publicados por Lee et al. (2010), que mostraron que la transferencia de células T CD4+CD25" BDC2.5 diabetogénicas agotada de Tregs CD4+CD25+ en ratones hembra NOD/SCID aceleró el desarrollo de insulitis invasiva cuando se compara con ratones a los que se administró células T CD4+ totales que contienen Tregs CD4+CD25+. La insulitis invasiva estaba dominada en gran medida por la infiltración de células dendríticas (DC) en lugar de células T BDC2.5 per se. Los autores conjeturaron a partir de su estudio que los Tregs regulaban la invasividad de DC en los islotes modulando, al menos en parte, la quimiotaxis de las DC en respuesta a las quimioquinas CCL19 y CCL21 secretadas por los islotes. Los patrones de tinción inmunohistoquímica para Tregs Foxp3+, células T CD3+ y leucocitos distintos de células T observados en las secciones pancreáticas de ratones NOD no diabéticos tratados con BsB son consistentes con sus descubrimientos (Figura 12B). Sin estar vinculado a una teoría particular, los Tregs producidos en los ratones NOD en respuesta a BsB actuaban probablemente para parar la migración de las células T autorreactivas y linfocitos distintos de células T a los islotes. Un curso más largo de tratamiento con BsB fue más eficaz porque esto generó una inducción más robusta y sostenida de Tregs. Que la estimulación continua de los Tregs inducidos con BsB en cultivos celulares extendiera la expresión de Foxp3+ en Tregs apoya este concepto (Karman et al., 2012).

La terapia celular usando Tregs recién aislados, expandidos ex vivo o inducidos in vitro en modelos animales de enfermedades autoinmunes o trasplantes de órganos ha demostrado que la transferencia adoptiva de Tregs puede restaurar el equilibrio de Tregs frente a células T efectoras, controlando de esta manera la autoinmunidad exuberante asociada con estas enfermedades (Alian et al., 2008; Jiang et al., 2006; Riley et al., 2009; Tang et al., 2012). Sin embargo, el uso de transferencia adoptiva como una estrategia terapéutica presenta varios retos para su traslación a ia clínica. En primer lugar, el número de Tregs autólogos que puede aislarse de la sangre periférica de un sujeto humano es limitante. Por lo tanto, frecuentemente es necesaria la expansión ex vivo de los Tregs, lo que puede alterar su funcionalidad y pureza. En segundo lugar, como los Tregs aislados son policlonales, pueden ejercer una función inmunosupresora generalizada en células T efectoras no objetivo. En tercer lugar, y lo más importante, la plasticidad de Tregs presenta un reto significativo (Bluestone ef al., 2009; Zhou et al., 2009a). Se ha mostrado que los Tregs transferidos de manera adoptiva pueden perder la expresión de Foxp3 y rediferenciarse en células Th17 (Koenen ef al., 2008) o células T de memoria patogénicas (Zhou ef al., 2009b) lo que eleva el riesgo de agravar la autoinmunidad o inflamación. Consecuentemente, un terapéutico que induce la generación de Tregs de una manera específica de antígeno in situ es más ventajoso que la terapia con células Treg adoptiva. Los resultados presentados en el presente documento demuestran la utilidad y eficacia de tal agente (BsB) que entrecruza CTLA-4 con MHCII en el contexto de un modelo de ratón de T1D. La demostración combinada de producción de IL-10, TGF-ß y Tregs en respuesta a tratamiento con BsB así como la eficacia en el modelo de ratón NOD de T1D tiene el potencial de proporcionar un nuevo concepto terapéutico. BsB también ofrece ventajas adicionales sobre otros moduladores inmunes ya que no afecta a las células T en reposo ni a otros linfocitos. Los números y porcentajes de células T CD4+ y células B CD19* en la periferia permanecieron igual en todos nuestros estudios NOD. Sin estar vinculado a una teoría particular, esta estrategia es eficaz para retrasar o parar la progresión de la enfermedad. El desarrollo de variantes de BsB que son más potentes y que portan un perfil farmacocinético más favorable debería confirmar estos estudios. Así, este concepto también puede aplicarse hacia la gestión de otras enfermedades mediadas por inmunidad.

Los resultados indicados en el presente documento se obtuvieron usando los métodos y materiales siguientes a no ser que se indique otra cosa.

Animales. Los ratones hembra de tipo salvaje C57BL/6 (H-2 ), BALB/c(H-2d), ratones transgénicos OT-II que expresan la cadena a y cadena ß del receptor de células T de ratón específico para ovoalbúmina de pollo 323-339(Ova323-339) en una base genética C57BL/6, y los ratones hembra diabéticos no obesos (NOD/Lt ) se obtuvieron de The Jackson Laboratory. Los animales se mantuvieron en una instalación sin patógenos y los estudios se realizaron según las directrices expedidas por el U.S. Department of Health and Human Services (NIH Publication No 86-23) y por el comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Genzyme.

Anticuerpos y reactivos. Los anticuerpos de grado funcional o marcados fluorescentemente anti- CD3 de ratón (clon 145-2C11), CD25, insulina y Foxp3+ se obtuvieron de eBioscience o BD Biosciences. CTLA-4-Fc murino y CTLA-4lg humana (Orencia) se obtuvieron de R&D Systems, Inc. y Bristol-Myers Squibb, respectivamente. La lgG2a de isotipo control de ratón se obtuvo de BioXCell Inc. CFSE, suero bovino fetal (FBS) con Ig ultrabaja, y otros medios de cultivo celular fueron de Invitrogen. El péptido Ova323-339 de pollo se obtuvo de New England Peptide.

Construcción y producción de la proteína de fusión biespecífica BsB. La construcción y la expresión de la proteína de fusión biespecífica (BsB) que comprende los dominios extracelulares de CD80w88a y LAG-3 así como el Fe de lgG2a de ratón (CD80wa-LAG-3-Fc, BsB) se han descrito previamente (Karman et al., 2012).

Ensayos Biacore y análisis de la composición de monosacáridos. Se usó Biacore para comparar la unión de BsB y mlgG2a al receptor de Fe neonatal de ratón (FcRn). Brevemente, se inmovilizó un chip CM5 con ~1.430 RU de FcRn-HPC4 de ratón usando química de amina. Cada muestra se diluyó de manera seriada 1:2 hasta concentraciones finales de entre 200 y 6.25 nM en PBSP (PBS con 0.005% Tensioactivo P-20), pH 6.0 y se inyectó durante 3 minutos en duplicado, seguido de 3 minutos de lavado con amortiguador de disociación. La superficie se regeneró con 10 mM de borato de sodio y 1M NaCI, pH 8.5. La composición de carbohidrato de los monosacáridos de BsB se analizó según el protocolo descrito por Zhou et al. (Zhou et al., 2011).

Aislamiento de células T sin activar. Se purificaron células T sin activar de los bazos y ganglios linfáticos de ratones hembra de 8-12 semanas de edad BALB/c o OT-II por separación magnética seguido de separación celular activada por fluorescencia. Las células se seleccionaron en primer lugar negativamente por separación celular magnética (Miltenyi Biotech) y después se separaron como células CD4+CD25" CD62LhiCD44low hasta una pureza mayor de 98%.

Ensayo de inducción de Treg específicos de antigeno. Los ensayos en un entorno MLR alogénico se realizaron como se ha publicado previamente (Karman et al., 2012). Para la activación de células T específicas de antígeno, se mezclaron 105 células T OT-II sin activar en placas de 96 pocilios de fondo redondo con 105 APC singénicas irradiadas en presencia de Ova323-329 a 0.5 Mg/ml y 1 pg/ml de anti-CD28 soluble (clon 37.51, eBioscience). Las construcciones de ensayo, lgG2a de ratón o CTLA-4lg de ratón se añadieron a las células cultivadas a una concentración saturante de 100 pg/ml. Las células se cultivaron durante 5 días para inducir la producción de Tregs y se analizaron por citometría de flujo. Se recogieron los medios para análisis de IL-2, IL-10 y TGF-ß usando kits de ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para evaluar la proliferación de las células T, se marcaron células T OT-II sin activar purificadas con 5 µ? CFSE durante 5 minutos a 37°C. Entonces se lavaron para eliminar CFSE no unido y se usaron en los ensayos de inducción de Treg como se ha descrito anteriormente. Las células se cultivaron durante 5 días para permitir que se dividan antes de analizarlas por citometría de flujo. Para detectar Foxp3+ en las células T, las células se tiñeron para marcadores de superficie como se ha descrito anteriormente seguido de permeabilización con amortiguador Fix/Perm (eBioscience) y tinción con PE-Cy7 conjugado con anticuerpo anti-Foxp3 (clon FJK-16s, eBioscience).

Mediciones farmacocinéticas de BsB en ratones. La farmacocinética de BsB se determinó en ratones C57BL/6 de 8 semanas de edad. Se administraron 20 mg/kg de BsB a los ratones por inyección intraperitoneal. Se recogió sangre por sangrado de la vena safena a 1 hora, 5 horas, 24 horas, 48 horas, y 72 horas después de la administración. Se midieron los niveles de BsB a cada punto de tiempo usando un ensayo ELISA. Brevemente, 100 µ? (1 pg/ml) de un anticuerpo anti-CD80 de ratón en PBS se usaron para recubrir placas de 96 pocilios y se incubó toda la noche a 4°C. Las placas se bloquearon con 5% suero fetal bovino durante 1 hora, después de lo cual se lavaron 4 veces con PBS. Se añadieron 100 µ? de las muestras de sangre a varias diluciones a los pocilios. Las placas se incubaron durante 2 horas con agitación suave a temperatura ambiente y se lavaron 4 veces con PBS. Se añadió anticuerpo anti-LAG-3 de ratón biotinilado (1 pg/ml) y se incubó durante 2 horas. Las placas se lavaron 4 veces con PBS después de lo cual se añadió estreptavidina-HRP. Después de 30 minutos, las placas se lavaron 6 veces con PBS y se desarrollaron para medición colorimétrica. Como estándares se usaron BsB purificado diluido en diluyente de ensayo a varias concentraciones.

Tratamiento de ratones NOD con BsB. En el tratamiento de curso corto, se trataron ratones hembra NOD de 4 semanas de edad con solución salina, 20 mg/kg BsB, 20 mg/kg lgG2a de ratón, o 10 mg/kg CTLA-4lg humano (Orencia) tres veces a la semana por inyección intraperitoneal durante un periodo de 2.5 semanas. Para el modelo de prevención tardía, se trataron ratones NOD de 9-12 semanas de edad con solución salina o 20 mg/kg BsB como anteriormente durante 4 semanas. Para el tratamiento de curso más largo, se trataron ratones NOD con BsB o solución salina como anteriormente durante 10 semanas desde la edad de 4 semanas hasta 13 semanas. Se monitorizaron los niveles de glucosa sin ayunar semanalmente empezando a las 8 semanas de edad. Se consideró que los ratones eran diabéticos cuando sus lecturas de glucosa eran mayores de 300 mg/dL durante tres lecturas consecutivas. Se examinaron los Tregs Foxp3+ en sangre periférica después de dos semanas de tratamiento por citometría de flujo. Brevemente, se bloquearon 50 µ? de sangre completa con anti-FcyRIIb y FcgRIII no marcados (clon 93, eBioscience) durante 20 minutos. Las células se tiñeron posteriormente con anticuerpo anti-CD4 marcado fluorescentemente durante 30 minutos y se lavaron. Las células sanguíneas rojas se lisaron usando solución Lisante FACS (BD Biosciences) durante 5 minutos. Después de lavar, las células se fijaron, se permeabilizaron y se tiñeron con un anticuerpo anti-Foxp3 marcado con FITC durante 30 minutos como se ha descrito anteriormente. Los páncreas se diseccionaron a la mitad con una mitad fijada en formalina amortiguada neutra y la otra se puso en compuesto OCT y se congeló en nieve carbónica.

Análisis estadístico. Las incidencias acumulativas de ratones NOD que presentan T1D e hiperglucemia después del tratamiento con BsB o controles se compararon usando el ensayo de rango logarítmico (Cox-Mantel) en Prism 5 (Graphpad, city and state). Un valor de p<0.05 se consideró estadísticamente significativo.

Análisis histopatológico. Los páncreas fijados en formalina amortiguada neutra se tiñeron para células CD3, Foxp3+ usando un procesador automático. Las secciones de tejido se desparafinaron usando xileno-etanol, los antígenos se recuperaron incubando durante 25 minutos en amortiguador citrato y se bloquearon con suero. Los portaobjetos se incubaron con un anticuerpo anti-CD3 durante 45 minutos, seguido de un polímero con peroxidasa de rábano de cabra anti-conejo durante 20 minutos. La visualización del cromógeno de CD3 se obtuvo incubando con tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobenzidina durante 2-4 minutos. Para detectar Foxp3 + , se re-bloquearon las secciones con suero, seguido de exposición a un anticuerpo anti-Foxp3 durante 45 minutos. Los portaobjetos se incubaron con un anticuerpo de conejo anti-lgG de rata durante 30 minutos, seguido de polímero con fosfatasa alcalina de cabra anti-conejo. La visualización del cromógeno se consiguió usando Fast Red durante 10 minutos. Las secciones de tejido se contratiñeron usando hematoxilina durante 2 minutos y se lavaron 3 veces con 0.05% Tween-20/solución salina amortiguada con Tris entre las etapas. Las secciones seriadas adyacentes se tiñeron usando un anticuerpo anti-insulina como se ha descrito anteriormente. Se hicieron fotografías usando un microscopio fluorescente Nikon Eclipse E800 con una cámara digital unida de Diagnostic Inc. y las imágenes se adquirieron usando el software Spot Advanced. Secuencias Leyenda CD80w88a = ligando CTLA-4 lgG2a = región Fe de lgG2 G9 = Gly 9 Lag-3 = ligando HC H6 = His 6 SEC ID No.: 1: CTLA-4 BsB (Geni) = CD80w88a(aa1 -235)-lgG2a(aa241 -474)-G9-Lag-3(aa25-260)- H6 de ratón Secuencia de nucleótidos de la construcción sucedánea de ratón (Geni): ATGGCTTGCAATTGTCAGTTGATGCAGGATACACCACTCCTC AAGTTTCCATGTCCAAGGCTCATTCTTCTCTTTGTGCTGCTGATTC GTCTTTCACAAGTGTCTTCAGATGTTGATGAACAACTGTCCAAGTC AGTGAAAGATAAGGTATTGCTGCCTTGCCGTTACAACTCTCCTCAT GAAGATGAGTCTGAAGACCGAATCTACTGGCAAAAACATGACAAA GTGGTGCTGTCTGTCATTGCTGGGAAACTAAAAGTGGCGCCCGAG TATAAGAACCGGACTTTATATGACAACACTACCTACTCTCTTATCA TCCTGGGCCTGGTCCTTTCAGACCGGGGCACATACAGCTGTGTC GTFCAAAAGAAGGAAAGAGGAACGTATGAAGTTAAACACTTGGCT TTAGTAAAGTTGTCCATCAAAGCTGACTTCTCTACCCCCAACATAA CTGAGTCTGGAAACCCATCTGCAGACACTAAAAGGATTACCTGCT TTGCTFCCGGGGGITTCCCAAAGCCTCGCTTCTCTTGGTTGGAAAA TGGAAGAGAATTACCTGGCATCAATACGACAATTTCCCAGGATCC TGAATCTGAATTGTACACCATTAGTAGCCAACTAGATTTCAATACG ACTCGCAACCACACCATTAAGTGTCTCATFAAATATGGAGATGCTC ACGTGTCAGAGGACTTCACCTGGGAGCCCAGAGGGCCCACAATC AAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGT GGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTC ATGATCTCCCTGAGCCCCATGGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTG AGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTCGTGAACAAC GTGGAAGTACTCACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTAC AACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAG GACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAA GCCCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGG GTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGA AGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGA CTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAA AACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGA TGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAA CTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGCTCAGTGGTCCACGAGG GTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGG GTAAAGGCGGTGGCGGCGGAGGCGGTGGCGGTGGGCCTGGGAA AGAGCTCCCCGTGGTGTGGGCCCAGGAGGGAGCTCCCGTCCATC TTCCCTGCAGCCTCAAATCCCCCAACCTGGATCCTAACTTTCTAC GAAGAGGAGGGGTTATCTGGCAACATCAACCAGACAGTGGCCAA CCCACTCCCATCCCGGCCCTTGACCTTCACCAGGGGATGCCCTC GCCTAGACAACCCGCACCCGGTCGCTACACGGTGCTGAGCGTGG CTCCAGGAGGCCTGCGCAGCGGGAGGCAGCCCCTGCATCCCCAC GTGCAGCTGGAGGAGCGCGGCCTCCAGCGCGGGGACTTCTCTCT GTGGTTGCGCCCAGCTCTGCGCACCGATGCGGGCGAGTACCACG CCACCGTGCGCCTCCCGAACCGCGCCCTCTCCTGCAGTCTCCGC CTGCGCGTCGGCCAGGCCTCGATGATTGCTAGTCCCTCAGGAGT CCTCAAGCTGTCTGATTGGGTCCTTTTGAACTGCTCCTTCAGCCG TCCTGACCGCCCAGTCTCTGTGCACTGGTTCCAGGGCCAGAACC GAGTGCCTGTCTACAACTCACCGCGTCATTTTTTAGCTGAAACTTT CCTGTTACTGCCCCAAGTCAGCCCCCTGGACTCTGGGACCTGGG GCTGTGTCCTCACCTACAGAGATGGCTTCAATGTCTCCATCACGT ACAACCTCAAGGTTCTGGGTCTGGAGCCCGTAGCCCACCATCACC ATCATCACTGA SEC ID No.: 2: CTLA-4 BsB (Gen1) - CD80w88a(aa1 -235)-lgG2a(aa241 -474)-G9-Lag-3(aa25-260)- H6 de ratón Secuencia de proteína traducida de la construcción sucedánea de ratón (Geni ): MACNCQLMQDTPLLKFPCPRLILLFVLLIRLSQVSSDVDEQLSK SVKDKVLLPCRYNSPHEDESEDRIYWQKHDKVVLSVIAGKLKVAPEY KNRTLYDNTTYSLIILGLVLSDRGTYSCVVQKKERGTYEVKHLALVKL SIKADFSTPNITESGNPSADTKRITCFASGGFPKPRFSWLENGRELP GINTTISQDPESELYTISSQLDFNTTRNHTIKCLIKYGDAHVSEDFTWE PRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPMVTCVV VDVSEDDPDVQISWFVN NVEVLTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQH QDWMSGKEFKCKVNN KALPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEE EMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDG SYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGKG GGGGGGGGGPGKELPVVWAQEGAPVHLPCSLKSPNLDPNFLRRGG VIWQHQPDSGQPTPIPALDLHQGMPSPRQPAPGRYTVLSVAPGGLR SGRQPLHPHVQLEERGLQRGDFSLWLRPALRTDAGEYHATVRLPNR ALSCSLRLRVGQASMIASPSGVLKLSDWVLLNCSFSRPDRPVSVHW FQGQ RVPVYNSPRH FLAETFLLLPQVSPLDSGTWGCVLTYRDGFN VSITYNLKVLGLEPVAHHHHHH SEC ID No.: 3: CTLA-4 BsB (Gen2) = CD80w88a(aa1 -235)-G9-Lag-3(aa25-260)-lgG2a(aa241 -474) de ratón Secuencia de nucleótidos de la construcción sucedánea de ratón (Gen 2): ATGGCTTGCAATTGTCAGTTGATGCAGGATACACCACTCCTC AAGTTTCCATGTCCAAGGCTCATTCTTCTCTTTGTGCTGCTGATTC GTCTTTCACAAGTGTCTTCAGATGTTGATGAACAACTGTCCAAGTC AGTGAAAGATAAGGTATTGCTGCCTTGCCGTTACAACTCTCCTCAT GAAGATGAGTCTGAAGACCGAATCTACTGGCAAAAACATGACAAA GTGGTGCTGTCTGTCATTGCTGGGAAACTAAAAGTGGCGCCCGAG TATAAGAACCGGACTTTATATGACAACACTACCTACTCTCTTATCA TCCTGGGCCTGGTCCTTTCAGACCGGGGCACATACAGCTGTGTC GTTCAAAAGAAGGAAAGAGGAACGTATGAAGTTAAACACTTGGCT TTAGTAAAGTTGTCCATCAAAGCTGACTTCTCTACCCCCAACATAA CTGAGTCTGGAAACCCATCTGCAGACACTAAAAGGATTACCTGCT TTGCTTCCGGGGGTTTCCCAAAGCCTCGCTTCTCTTGGTTGGAAA ATGGAAGAGAATTACCTGGCATCAATACGACAATTTCCCAGGATC CTGAATCTGAATTGTACACCATTAGTAGCCAACTAGATTTCAATAC GACTCGCAACCACACCATTAAGTGTCTCATTAAATATGGAGATGCT CACGTGTCAGAGGACTTCACCTGGGGCGGTGGCGGCGGAGGCG GTGGCGGTGGGCCTGGGAAAGAGCTCCCCGTGGTGTGGGCCCA GGAGGGAGCTCCCGTCCATCTTCCCTGCAGCCTCAAATCCCCCAA CCTGGATCCTAACTTTCTACGAAGAGGAGGGGTTATCTGGCAACA TCAACCAGACAGTGGCCAACCCACTCCCATCCCGGCCCTTGACCT TCACCAGGGGATGCCCTCGCCTAGACAACCCGCACCCGGTCGCT ACACGGTGCTGAGCGTGGCTCCAGGAGGCCTGCGCAGCGGGAG GCAGCCCCTGCATCCCCACGTGCAGCTGGAGGAGCGCGGCCTCC AGCGCGGGGACTTCTCTCTGTGGTTGCGCCCAGCTCTGCGCACC GATGCGGGCGAGTACCACGCCACCGTGCGCCTCCCGAACCGCGC CCTCTCCTGCAGTCTCCGCCTGCGCGTCGGCCAGGCCTCGATGA TTGCTAGTCCCTCAGGAGTCCTCAAGCTGTCTGATTGGGTCCTTT TGAACTGCTCCTTCAGCCGTCCTGACCGCCCAGTCTCTGTGCACT GGTTCCAGGGCCAGAACCGAGTGCCTGTCTACAACTCACCGCGT CATTTTTTAGCTGAAACTTTCCTGTTACTGCCCCAAGTCAGCCCCC TGGACTCTGGGACCTGGGGCTGTGTCCTCACCTACAGAGATGGC TTCAATGTCTCCATCACGTACAACCTCAAGGTTCTGGGTCTGGAG CCCGTAGCCCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATG CAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTTCAT CTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCC CATGGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAG ATGTCCAGATCAGCTGGTTCGTGAACAACGTGGAAGTACTCACAG CTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTCCGGG TGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGC AAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGCCCTCCCAGCGCCC ATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCA CAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAA CAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGAC ATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTAC AAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGT ACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATA GCTACTCCTGCTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACA CGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAATGA SEC ID No.: 4: CTLA-4 BsB (Gen2) = CD80w88a(aa 1 -235)-G9-Lag-3(aa25-260)-lgG2a(aa241-474) de ratón Secuencia de proteína traducida de la construcción sucedánea de ratón (Gen 2): MACNCQLMQDTPLLKFPCPRLILLFVLLIRLSQVSSDVDEQLSK SVKDKVLLPCRYNSPHEDESEDRIYWQKHDKVVLSVIAGKLKVAPEY KNRTLYDNTTYSLIILGLVLSDRGTYSCVVQKKERGTYEVKHLALVKL SI KADFSTPN ITESG PSADTKRITCFASGGFPKPRFSWLENGRELP GINTTISQDPESELYTISSQLDFNTTRNHTIKCLI KYGDAHVSEDFTW GGGGGGGGGGPGKELPVVWAQEGAPVHLPCSLKSPNLDPNFLRRG GVIWQHQPDSGQPTPIPALDLHQGMPSPRQPAPGRYTVLSVAPGGL RSGRQPLHPHVQLEERGLQRGDFSLWLRPALRTDAGEYHATVRLPN RALSCSLRLRVGQASMIASPSGVLKLSDWVLLNCSFSRPDRPVSVH WFQGQNRVPVYNSPRHFLAETFLLLPQVSPLDSGTWGCVLTYRDGF NVSITYNLKVLGLEPVAPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKI KDVLMISLSP VTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVLTAQTQTHRE DYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKALPAPIERTISKPKG SVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFM PEDIYVEWTN NGKT ELNYKNTEPVLDSDGSYF YSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLH NHHTTKSFSRTPGK SEC ID No.: 5: CTLA-4 BsB secuencia de nucleótidos de la construcción humana de tipo salvaje = (CD80(aa1 -234)- G9-Lag-3(aa27-262-lgGla(aa240-471 ) humano ATGGGCCACACACGGAGGCAGGGAACATCACCATCCAAGT GTCCATACCTCAATTTCTTTCAGCTCTTGGTGCTGGCTGGTCTTTC TCACTTCTGTTCAGGTGTTATCCACGTGACCAAGGAAGTGAAAGA AGTGGCAACGCTGTCCTGTGGTCACAATGTTTCTGTTGAAGAGCT GGCACAAACTCGCATCTACTGGCAAAAGGAGAAGAAAATGGTGCT GACTATGATGTCTGGGGACATGAATATATGGCCCGAGTACAAGAA CCGGACCATCTTTGATATCACTAATAACCTCTCCATTGTGATCCTG GCTCTGCGCCCATCTGACGAGGGCACATACGAGTGTGTTGTTCTG AAGTATGAAAAAGACGCTTTCAAGCGGGAACACCTGGCTGAAGTG ACGTTATCAGTCAAAGCTGACTTCCCTACACCTAGTATATCTGACT TTGAAATTCCAACTTCTAATATTAGAAGGATAATTTGCTCAACCTCT GGAGGTTTTCCAGAGCCTCACCTCTCCTGGTTGGAAAATGGAGAA GAATTAAATGCCATCAACACAACAGTTTCCCAAGATCCTGAAACTG AGCTCTATGCTGTTAGCAGCAAACTGGATTTCAATATGACAACCAA CCACAGCTTCATGTGTCTCATCAAGTATGGACATTTAAGAGTGAAT CAGACCTTCAACTGGAATACAACCGGCGGTGGCGGCGGAGGCGG TGGCGGTTCCGGAGCTGAGGTCCCGGTGGTGTGGGCCCAGGAG GGGGCTCCTGCCCAGCTCCCCTGCAGCCCCACAATCCCCCTCCA GGATCTCAGCCTTCTGCGAAGAGCAGGGGTCACTTGGCAGCATC AGCCAGACAGTGGCCCGCCCGCTGCCGCCCCCGGCCATCCCCTG GCCCCCGGCCCTCACCCGGCGGCGCCCTCCTCCTGGGGGCCCA GGCCCCGCCGCTACACGGTGCTGAGCGTGGGTCCCGGAGGCCT GCGCAGCGGGAGGCTGCCCCTGCAGCCCCGCGTCCAGCTGGAT GAGCGCGGCCGGCAGCGCGGGGACTTCTCGCTATGGCTGCGCC CAGCCCGGCGCGCGGACGCCGGCGAGTACCGCGCCGCGGTGCA CCTCAGGGACCGCGCCCTCTCCTGCCGCCTCCGTCTGCGCCTGG GCCAGGCCTCGATGACTGCCAGCCCCCCAGGATCTCTCAGAGCC TCCGACTGGGTCATTTTGAACTGCTCCTTCAGCCGCCCTGACCGC CCAGCCTCTGTGCATTGGTTTCGGAACCGGGGCCAGGGCCGAGT CCCTGTCCGGGAGTCCCCCCATCACCACTTAGCGGAAAGCTTCCT CTTCCTGCCCCAAGTCAGCCCCATGGACTCTGGGCCCTGGGGCT GCATCCTCACCTACAGAGATGGCTTCAACGTCTCCATCATGTATAA CCTCACTGTTCTGGGTCTGCTGGTGCCCCGGGGCTCCGAGCCCA AATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTG AACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCA AGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTG GTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTG GTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGC GGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTC ACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTG CAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCAT CTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCC TGCCCCCATCTCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTG ACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAG TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCC TCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTATACAGCAAGCT CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCAT GCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGA GCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA SEC ID No.: 6: CTLA-4 BsB secuencia de proteína traducida de la construcción humana de tipo salvaje = (CD80(aa1 -234)-G9-Lag -3 (aa27-262-lgGla(aa 240-471 ) humano MGHTRRQGTSPSKCPYLNFFQLLVLAGLSHFCSGVI HVTKEVK EVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIWPEYKN RTIFDIT NLSIVI LALRPSDEGTYEC VVLKYEKDAFKREHLAEVTLSV KADFPTPSISDFEIPTSNIRRIICSTSGGFPEPHLSWLENGEELNAINT TVSQDPETELYAVSSKLDFNMTTNHSFMCLIKYGHLRVNQTFNWNT TGGGGGGGGGSGAEVPWWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAG VTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRYTVLSVG PGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAA VHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDVVVILNCSFSRPDR PASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGC ILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLLVPRGSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEC ID No.: 7: CTLA-4 BsB construcción humana secuencia de nucleótidos variante 1 = (C D80W84A/S190 A(aa1 -234)-G9-Lag- 3R316/75E(aa27-262-lgGlaN596/297Q(aa240-471 humano) ATGGGCCACACACGGAGGCAGGGAACATCACCATCCAAGT GTCCATACCTCAATTTCTTTCAGCTCTTGGTGCTGGCTGGTCTTTC TCACTTCTGTTCAGGTGTTATCCACGTGACCAAGGAAGTGAAAGA AGTGGCAACGCTGTCCTGTGGTCACAATGTTTCTGTTGAAGAGCT GGCACAAACTCGCATCTACTGGCAAAAGGAGAAGAAAATGGTGCT GACTATGATGTCTGGGGACATGAATATAGCCCCCGAGTACAAGAA CCGGACCATCTTTGATATCACTAATAACCTCTCCATTGTGATCCTG GCTCTGCGCCCATCTGACGAGGGCACATACGAGTGTGTTGTTCTG AAGTATGAAAAAGACGCTTTCAAGCGGGAACACCTGGCTGAAGTG ACGTTATCAGTCAAAGCTGACTTCCCTACACCTAGTATATCTGACT TTGAAATTCCAACTTCTAATATTAGAAGGATAATTTGCTCAACCTCT GGAGGTTTTCCAGAGCCTCACCTCTCCTGGTTGGAAAATGGAGAA GAATTAAATGCCATCAACACAACAGTTGCCCAAGATCCTGAAACT GAGCTCTATGCTGTTAGCAGCAAACTGGATTTCAATATGACAACCA ACCACAGCTTCATGTGTCTCATCAAGTATGGACATTTAAGAGTGAA TCAGACCTTCAACTGGAATACAACCGGCGGTGGCGGCGGAGGCG GTGGCGGTTCCGGAGCTGAGGTCCCGGTGGTGTGGGCCCAGGA GGGGGCTCCTGCCCAGCTCCCCTGCAGCCCCACAATCCCCCTCC AGGATCTCAGCCTTCTGCGAAGAGCAGGGGTCACTTGGCAGCAT CAGCCAGACAGTGGCCCGCCCGCTGCCGCCCCCGGCCATCCCCT GGCCCCCGGCCCTCACCCGGCGGCGCCCTCCTCCTGGGGGCCC AGGCCCGAGCGCTACACGGTGCTGAGCGTGGGTCCCGGAGGCCT GCGCAGCGGGAGGCTGCCCCTGCAGCCCCGCGTCCAGCTGGAT GAGCGCGGCCGGCAGCGCGGGGACTTCTCGCTATGGCTGCGCC CAGCCCGGCGCGCGGACGCCGGCGAGTACCGCGCCGCGGTGCA CCTCAGGGACCGCGCCCTCTCCTGCCGCCTCCGTCTGCGCCTGG GCCAGGCCTCGATGACTGCCAGCCCCCCAGGATCTCTCAGAGCC TCCGACTGGGTCATTTTGAACTGCTCCTTCAGCCGCCCTGACCGC CCAGCCTCTGTGCATTGGTTTCGGAACCGGGGCCAGGGCCGAGT CCCTGTCCGGGAGTCCCCCCATCACCACTTAGCGGAAAGCTTCCT CTTCCTGCCCCAAGTCAGCCCCATGGACTCTGGGCCCTGGGGCT GCATCCTCACCTACAGAGATGGCTTCAACGTCTCCATCATGTATAA CCTCACTGTTCTGGGTCTGCTGGTGCCCCGGGGCTCCGAGCCCA AATCTTGTGACAAAACTCACACAAGCCCACCGAGCCCAGCACCTG AACTCCTGGGGGGATCCTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCA AGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAQGTCACATGCGTG GTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTG GTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGC GGGAGGAGCAGTACCAGAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTC ACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTG CAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCAT CTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCC TGCCCCCATCTCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTG ACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAG TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCC TCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTATACAGCAAGCT CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCAT GCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGA GCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA SEC ID No.: 8: CTLA-4 BsB construcción humana secuencia de proteína traducida variante 1 = (CD80W84A/S190A(aa1 -234)-G9-Lag-3R316/75E(aa27-262-lgGlaN596/297Q(aa240-471 humano) MGHTRRQGTSPSKCPYLNFFQLLVLAGLSHFCSGVI HVTKEVK EVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIAPEYKN RTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSV KADFPTPSISDFEIPTSNIRRIICSTSGGFPEPHLSWLENGEELNAI T TVAQDPETELYAVSSKLDFNMTTNHSFMCLIKYGHLRVNQTFNWNT TGGGGGGGGGSGAEVPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRA GVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPERYTVLSV GPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRA AVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPD RPASVHWFRN RGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWG CILTYRDGFNVSI MYN LTVLGLLVPRGSEPKSCDKTHTSPPSPAPELL GGSSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEC ID No.: 9: CTLA-4 BsB construcción humana secuencia de nucleótidos variante 2 = (C D80W84A/S 190 AS201 A(aa I -234)-G9-Lag-3R316/75E(aa27-262-lgGlaN596/297Q(aa240-471 ) humano ATGGGCCACACACGGAGGCAGGGAACATCACCATCCAAGT GTCCATACCTCAATTTCTTTCAGCTCTTGGTGCTGGCTGGTCTTTC TCACTTCTGTTCAGGTGTTATCCACGTGACCAAGGAAGTGAAAGA AGTGGCAACGCTGTCCTGTGGTCACAATGTTTCTGTTGAAGAGCT GGCACAAACTCGCATCTACTGGCAAAAGGAGAAGAAAATGGTGCT GACTATGATGTCTGGGGACATGAATATAGCCCCCGAGTACAAGAA CCGGACCATCTTTGATATCACTAATAACCTCTCCATTGTGATCCTG GCTCTGCGCCCATCTGACGAGGGCACATACGAGTGTGTTGTICTG AAGTATGAAAAAGACGCTTTCAAGCGGGAACACCTGGCTGAAGTG ACGTTATCAGTCAAAGCTGACTTCCCTACACCTAGTATATCTGACT TTGAAATTCCAACTTCTAATATTAGAAGGATAATTTGCTCAACCTCT GGAGGTTTTCCAGAGCCTCACCTCTCCTGGTTGGAAAATGGAGAA GAATTAAATGCCATCAACACAACAGTTGCCCAAGATCCTGAAACT GAGCTCTATGCTGTTGCCAGCAAACTGGATTTCAATATGACAACC AACCACAGCTTCATGTGTCTCATCAAGTATGGACATTTAAGAGTGA ATCAGACCTTCAACTGGAATACAACCGGCGGTGGCGGCGGAGGC GGTGGCGGTTCCGGAGCTGAGGTCCCGGTGGTGTGGGCCCAGG AGGGGGCTCCTGCCCAGCTCCCCTGCAGCCCCACAATCCCCCTC CAGGATCTCAGCCTTCTGCGAAGAGCAGGGGTCACTTGGCAGCA TCAGCCAGACAGTGGCCCGCCCGCTGCCGCCCCCGGCCATCCCC TGGCCCCCGGCCCTCACCCGGCGGCGCCCTCCTCCTGGGGGCC CAGGCCCGAGCGCTACACGGTGCTGAGCGTGGGTCCCGGAGGC CTGCGCAGCGGGAGGCTGCCCCTGCAGCCCCGCGTCCAGCTGG ATGAGCGCGGCCGGCAGCGCGGGGACTTCTCGCTATGGCTGCGC CCAGCCCGGCGCGCGGACGCCGGCGAGTACCGCGCCGCGGTGC ACCTCAGGGACCGCGCCCTCTCCTGCCGCCTCCGTCTGCGCCTG GGCCAGGCCTCGATGACTGCCAGCCCCCCAGGATCTCTCAGAGC CTCCGACTGGGTCATTTTGAACTGCTCCTTCAGCCGCCCTGACCG CCCAGCCTCTGTGCATTGGTTTCGGAACCGGGGCCAGGGCCGAG TCCCTGTCCGGGAGTCCCCCCATCACCACTTAGCGGAAAGCTTCC TCTTCCTGCCCCAAGTCAGCCCCATGGACTCTGGGCCCTGGGGC TGCATCCTCACCTACAGAGATGGCTTCAACGTCTCCATCATGTATA ACCTCACTGTTCTGGGTCTGCTGGTGCCCCGGGGCTCCGAGCCC AAATCTTGTGACAAAACTCACACAAGCCCACCGAGCCCAGCACCT GAACTCCTGGGGGGATCCTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCC AAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTG GTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTG GTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGC GGGAGGAGCAGTACCAGAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTC ACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTG CAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCAT CTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCC TGCCCCCATCTCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTG ACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAG TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCC TCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTATACAGCAAGCT CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCAT GCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGA GCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA SEC ID No.: 10: CTLA-4 BsB construcción humana secuencia de proteína traducida variante 2 = (CD80W84A/S190AS201 A(aa1 -234)-G9-Lag-3R316/75E(aa27-262-lgG1aN596/297Q(aa240-471) humano MGHTRRQGTSPSKCPYLNFFQLLVLAGLSHFCSGVIHVTKEVK EVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIAPEYKN RTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSV KADFPTPSISDFEIPTS IRRIICSTSGGFPEPHLSWLENGEELNAINT TVAQDPETELYAVASKLDFNMTTN HSFMCLI KYGH LRVNQTFN WNT TGGGGGGGGGSGAEVPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRA GVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPERYTVLSV GPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRA AVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPD RPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWG C ILTYRDGFNVS IMYNLTVLGLL VPRG SEP KSCDKTHTSP PS PAPE LL GGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNA TKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEC ID No.: 11: CTLA-4 BsB construcción humana secuencia de nucleótidos variante 3 = (CD80E196A/5190A(aa1 -234)-G9-Lag-3R316/75E(aa27-262-lgG1aN596/297Q(aa240-471) humano ATGGGCCACACACGGAGGCAGGGAACATCACCATCCAAGT GTCCATACCTCAATTTCTTTCAGCTCTTGGTGCTGGCTGGTCTTTC TCACTTCTGTTCAGGTGTTATCCACGTGACCAAGGAAGTGAAAGA AGTGGCAACGCTGTCCTGTGGTCACAATGTTTCTGTTGAAGAGCT GGCACAAACTCGCATCTACTGGCAAAAGGAGAAGAAAATGGTGCT GACTATGATGTCTGGGGACATGAATATATGGCCCGAGTACAAGAA CCGGACCATCTTTGATATCACTAATAACCTCTCCATTGTGATCCTG GCTCTGCGCCCATCTGACGAGGGCACATACGAGTGTGTTGTTCTG AAGTATGAAAAAGACGCTTTCAAGCGGGAACACCTGGCTGAAGTG ACGTTATCAGTCAAAGCTGACTTCCCTACACCTAGTATATCTGACT TTGAAATTCCAACTTCTAATATTAGAAGGATAATTTGCTCAACCTCT GGAGGTTTTCCAGAGCCTCACCTCTCCTGGTTGGAAAATGGAGAA GAATTAAATGCCATCAACACAACAGTTGCCCAAGATCCTGAAACT GCCCTCTATGCTGTTAGCAGCAAACTGGATTTCAATATGACAACCA ACCACAGCTTCATGTGTCTCATCAAGTATGGACATTTAAGAGTGAA TCAGACCTTCAACTGGAATACAACCGGCGGTGGCGGCGGAGGCG GTGGCGGTTCCGGAGCTGAGGTCCCGGTGGTGTGGGCCCAGGA GGGGGCTCCTGCCCAGCTCCCCTGCAGCCCCACAATCCCCCTCC AGGATCTCAGCCTTCTGCGAAGAGCAGGGGTCACTTGGCAGCAT CAGCCAGACAGTGGCCCGCCCGCTGCCGCCCCCGGCCATCCCCT GGCCCCCGGCCCTCACCCGGCGGCGCCCTCCTCCTGGGGGCCC AGGCCCGAGCGCTACACGGTGCTGAGCGTGGGTCCCGGAGGCCT GCGCAGCGGGAGGCTGCCCCTGCAGCCCCGCGTCCAGCTGGAT GAGCGCGGCCGGCAGCGCGGGGACTTCTCGCTATGGCTGCGCC CAGCCCGGCGCGCGGACGCCGGCGAGTACCGCGCCGCGGTGCA CCTCAGGGACCGCGCCCTCTCCTGCCGCCTCCGTCTGCGCCTGG GCCAGGCCTCGATGACTGCCAGCCCCCCAGGATCTCTCAGAGCC TCCGACTGGGTCATTTTGAACTGCTCCTTCAGCCGCCCTGACCGC CCAGCCTCTGTGCATTGGTTTCGGAACCGGGGCCAGGGCCGAGT CCCTGTCCGGGAGTCCCCCCATCACCACTTAGCGGAAAGCTTCCT CTTCCTGCCCCAAGTCAGCCCCATGGACTCTGGGCCCTGGGGCT GCATCCTCACCTACAGAGATGGCTTCAACGTCTCCATCATGTATAA CCTCACTGTTCTGGGTCTGCTGGTGCCCCGGGGCTCCGAGCCCA AATCTTGTGACAAAACTCACACAAGCCCACCGAGCCCAGCACCTG AACTCCTGGGGGGATCCTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCA AGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTG GTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTG GTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGC GGGAGGAGCAGTACCAGAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTC ACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTG CAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCAT CTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCC TGCCCCCATCTCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTG ACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAG TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCC TCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTATACAGCAAGCT CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCAT GCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGA GCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA SEC ID No.: 12: CTLA-4 BsB construcción humana secuencia de proteína traducida variante 3 = (C D80E196A/S190A(aa1 -234)-G9-Lag-3R316/75E(aa27-262-lgG1 aN596/297Q(aa240-471 ) humano MGHTRRQGTSPSKCPYLN FFQLLVLAGLSHFCSGVI HVTKEVK EVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNI WPEYKN RTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSV KADFPTPSISDFEIPTSNIRRIICSTSGGFPEPHLSWLENGEELNAINT TVAQDPETALYAVSSKLDFNMTTNHSFMCLIKYGHLRVNQTFNWNT TGGGGGGGGGSGAEVPVVWAQEGAPAQ LPCSPTI PLQDLSLLRRA GVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPERYTVLSV GPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRA AVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDVVVI LNCSFSRPD RPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWG CILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLLVPRGSEPKSCDKTHTSPPSPAPELL GQSSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEC ID No.: 13: CTLA-4 BsB construcción humana secuencia de nucleótidos variante 4 = (CD80E196A/S190AS201 A(aa1 -234)-G9-Lag-3R316/75E(aa27-262-lgG1a N596/297Q(aa240-471 ) humano ATGGGCCACACACGGAGGCAGGGAACATCACCATCCAAGT GTCCATACCTCAATTTCTTTCAGCTCTTGGTGCTGGCTGGTCTTTC TCACTTCTGTTCAGGTGTTATCCACGTGACCAAGGAAGTGAAAGA AGTGGCAACGCTGTCCTGTGGTCACAATGTTTCTGYFGAAGAGCT GGCACAAACTCGCATCTACTGGCAAAAGGAGAAGAAAATGGTGCT GACTATGATGTCTGGGGACATGAATATATGGCCCGAGTACAAGAA CCGGACCATCTTTGATATCACTAATAACCTCTCCATTGTGATCCTG GCTCTGCGCCCATCTGACGAGGGCACATACGAGTGTGTTGTTCTG AAGTATGAAAAAGACGCTTTCAAGCGGGAACACCTGGCTGAAGTG ACGTTATCAGTCAAAGCTGACTTCCCTACACCTAGTATATCTGACT TTGAAATTCCAACTTCTAATATTAGAAGGATAATTTGCTCAACCTCT GGAGGTTTTCCAGAGCCTCACCTCTCCTGGTTGGAAAATGGAGAA 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-235)-lgG2a(aa241 -474) de ratón Secuencia de nucleótidos de la construcción sucedánea de ratón (BsBA; CD80wa-Fc): ATGGCTTGCAATTGTCAGTTGATGCAGGATACACCACTCCTC AAGTTTCCATGTCCAAGGCTCATTCTTCTCTTTGTGCTGCTGATTC GTCTTTCACAAGTGTCTTCAGATGTTGATGAACAACTGTCCAAGTC AGTGAAAGATAAGGTATTGCTGCCTTGCCGTTACAACTCTCCTCAT GAAGATGAGTCTGAAGACCGAATCTACTGGCAAAAACATGACAAA GTGGTGCTGTCTGTCATTGCTGGGAAACTAAAAGTGGCGCCCGAG TATAAGAACCGGACTTTATATGACAACACTACCTACTCTCTTATCA TCCTG GGCCTGGTCCTTTCAGACCGG GG CACATACAGCTGTGTC GTTCAAAAGAAGGAAAGAGGAACGTATGAAGTTAAACACTTG GCT TTAGTAAAGTTGTCCATCAAAGCTGACTTCTCTAC CCCCAACATAA CTGAGTCTGGAAACCCATCTG CAGACACTAAAAGGATTACCTGCT TTG CTTCC GGGGGTTTCC CAAAGCCTCG CTTCTCTTG GTTGGAAA ATGGAAGAGAATTACCTGGCATCAATACGACAATTTCCCAGGATC CTGAATCTGAATTGTACACCATTAGTAGCCAACTAGATTTCAATAC GACTCGCAACCACACCATTAAGTGTCTCATTAAATATGGAGATG CT CACGTGTCAGAGGACTTCACCTGGGAGCCCAGAGGGCCCACAAT CAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGG G TG GACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTC ATGATCTCCCTGAGCCCCATGGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTG AGCGAG GATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTCGTGAACAAC GTGGAAGTACTCACAGCTCAGACACAAAC CCATAGAGAGGATTAC AACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAG GACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAA G CCCTCCCAG CGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGG GTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGA AGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGA CTTCATG CCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAA AACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGA TGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAG CTGAGAGTGGAAAAGAAGAA CTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGCTCAGTGGTCCACGAGG GTCTG CACAATCACCACACGACTAAGAG CTTCTCCCGGACTCCGG GTAAAGGCGGTGGCGGCGGAGGCGGTGGCGGTGGGCCTGGGAA AGAGCTGGGTCTGGAGCCCGTAGCCCACCATCACCATCATCACTG A SEC ID No.: 17 BsBA (CD80wa-Fc) Proteína = C D80w88a(aa1 -235)-lgG2a(aa241 -474) de ratón Secuencia de proteína traducida de la construcción sucedánea de ratón (BsBA; CD80wa-Fc): M ACNCQLMQ DTPLLKFPCPRLILLFVLLI RLSQVSSDVDEQLSK SVKDKVLLPCRYNSPHEDESEDRIYWQKHDKVVLSVIAGKLKVAPEY KNRTLYDNTTYSLI I LGLVLSDRGTYSC VVQ KERGTYEVKHLALVKL SI KADFSTPNITESGNPSADT RITCFASGGFPKPRFSWLENGRELP GINTTISQDPESELYTISSQLDFNTTRNHTIKCLIKYGDAHVSEDFTWE PRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPMVTCVV VDVSEDDPDVQ ISWFVN NVEVLTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQH QDWMSGKEFKCKVNN KALPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEE EMTK QVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTN NGKTELNYKNTEPVLDSDG SYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGKG GGGGGGGGGPGKELGLEPVAHHHHHH Otras Modalidades A partir de la descripción anterior, será evidente que pueden hacerse a la invención descrita en el presente documento variaciones y modificaciones para adaptarla a varios usos y condiciones. Tales modalidades también están en el alcance de las siguientes reivindicaciones.

El recitado de un listado de elementos en cualquier definición de una variable en el presente documento incluye las definiciones de esa variable como cualquier elemento único o combinación (o subcombinación) de los elementos listados. El recitado de una modalidad en el presente documento incluye esa modalidad como cualquier modalidad única o en combinación con cualquier otra modalidad o partes de éstas.

Todas las patentes y publicaciones mencionadas en esta especificación se incorporan en el presente documento por referencia en el mismo grado que si cada patente y publicación independiente se indicara que se incorpora específicamente e individualmente por referencia.

Referencias Los documentos siguientes se citan en el presente documento.

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Claims (34)

REIVINDICACIONES

1. Uso de un agente biológico biespecífico que comprende un ligando específico para CTLA-4 y un ligando específico para un complejo pMHC de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para la inducción de tolerancia de una célula T por la puesta en contacto de dicha célula T con una célula presentadora de antígeno que está presentando un péptido derivado de dicho antígeno formando un complejo con una molécula MHC y dicho agente biológico biespecífico.

2. Uso de un agente biológico biespecífico que comprende un ligando específico para CTLA-4 y un ligando específico para un complejo pMHC de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el tratamiento de una enfermedad seleccionada de una enfermedad autoinmune y rechazo de trasplante.

3. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la enfermedad autoinmune es diabetes tipo 1 (T1D).

4. Uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el ligando específico para CTLA-4 se selecciona de un anticuerpo específico para CTLA-4, y CD80 (B7-1) o CD86 (B7-2).

5. Uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el ligando específico para el complejo pMHC se selecciona de un anticuerpo anti-MHC y LAG-3.

6. Uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el ligando específico para CTLA-4 y el ligando específico para el complejo pMHC están espaciados entre sí por un conector.

7. Uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el conector es uno o más de una secuencia de poliaminoácido y un dominio Fe de anticuerpo.

8. Uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la secuencia de poliaminoácido es G9 (Gly-9).

9. Uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el ligando específico para CTLA-4 es CD80.

10. Uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde CD80 está mutado para incrementar la especificidad para CTLA-4.

11. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde CD80 es CD80 humano que comprende al menos una de las mutaciones W84A, K71G, K71V, S109G, R123S, R123D, G124L, S190A, S201A, R63A, M81A, N97A y E196A.

12. Uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde CD80 comprende la mutación W84A o E196A de CD80 humano.

13. Uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el ligando específico para el complejo MHC es LAG-3.

14. Uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde LAG-3 está mutado para incrementar la especificidad para pMHCII.

15. Uso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde LAG-3 es LAG-3 humano que comprende al menos una de las mutaciones R73E, R75A, R75E y R76E .

16. Uso de acuerdo con la reivindicación 15, en donde LAG-3 comprende la mutación R75A o R75E.

17. Un agente biológico biespecífico que comprende un ligando específico para CTLA-4 y un ligando específico para un complejo pMHC.

18. Un agente biológico biespecífico de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el ligando específico para CTLA-4 se selecciona de un anticuerpo específico para CTLA-4, y CD80 (B7-1) o CD86 (B7-2).

19. Un agente biológico biespecífico de acuerdo con la reivindicación 17 o reivindicación 18, en donde el ligando específico para el complejo pMHC se selecciona de un anticuerpo antí-MHC y LAG-3.

20. Un agente biológico biespecífico de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el ligando específico para CTLA-4 y el ligando específico para el complejo pMHC están espaciados entre sí por un conector.

21. Un agente biológico biespecífico de acuerdo con la reivindicación 20, en donde el conector es uno o más de una secuencia de poliaminoácido y un dominio Fe de anticuerpo.

22. Un agente biológico biespecífico de acuerdo con la reivindicación 21, en donde la secuencia de poliaminoácido es G9 (Gly-9).

23. Un agente biológico biespecífico de acuerdo con la reivindicación 18, en donde el ligando específico para CTLA-4 es CD80.

24. Un agente biológico biespecífico de acuerdo con la reivindicación 23, en donde CD80 está mutado para incrementar la especificidad para CTLA-4.

25. Un agente biológico biespecífico de acuerdo con la reivindicación 24, en donde CD80 es CD80 humano que comprende al menos una de las mutaciones W84A, K71G, K71V, S109G, R123S, R123D, G124L, S190A, S201A, R63A, M81A, N97A y E196A .

26. Un agente biológico biespecífico de acuerdo con la reivindicación 25, en donde CD80 comprende la mutación W84A o E196A de CD80 humano.

27. Un agente biológico biespecífico de acuerdo con la reivindicación 19, en donde el ligando específico para el complejo MHC es LAG-3.

28. Un agente biológico biespecífico de acuerdo con la reivindicación 27, en donde LAG-3 está mutado para incrementar la especificidad para pMHCII.

29. Un agente biológico biespecífico de acuerdo con la reivindicación 28, en donde LAG-3 es LAG-3 humano que comprende al menos una de las mutaciones R73E, R75A, R75E y R76E .

30. Un agente biológico biespecífico de acuerdo con la reivindicación 29, en donde LAG-3 comprende la mutación R75A o R75E.

31. Un método para inducir tolerancia de una célula T a un antígeno, que comprende poner en contacto dicha célula T con una célula presentadora de antígeno que está presentando un péptido derivado de dicho antígeno formando un complejo con una molécula MHC y un agente biológico biespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 30.

32. Un método para tratar a un sujeto que padece una afección seleccionada de una enfermedad autoinmune o rechazo de trasplante, que comprende las etapas de administrar a un sujeto que lo necesita un agente biológico biespecífico que comprende un ligando específico para CTLA-4 y un ligando específico para un complejo pMHC de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 30.

33. Un método de acuerdo con la reivindicación 32, en donde el agente biológico biespecífico se administra en combinación con un inmunosupresor o modulador adicional.

34. Un método de acuerdo con la reivindicación 32 o reivindicación 33, en donde la enfermedad autoinmune se selecciona de diabetes tipo 1 (T1D), Lupus Eritematoso Sistémico (SLE), Artritis Reumatoide (RA) , enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), colitis ulcerosa (UC), enfermedad de Crohn (CD), esclerosis múltiple (MS), escleroderma, pénfigo vulgar (PV ), psoriasis, dermatitis atópica, enfermedad celiaca, enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Graves (tiroides), síndrome de Sjogren, síndrome de Guillain-Barre, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Addison, granulomatosis de Wegener, esclerosis biliar primaria, colangitis esclerosante, hepatitis autoinmune, polimialgia reumática, fenómeno de Raynaud, arteritis temporal, arteritis de células gigantes, anemia hemolítica autoinmune, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa. enfermedad de Behcet, cirrosis biliar primaria, uveitis, miocarditis, fiebre reumática, espondilitis anquilosante, glomerulenefritis, sarcoidosis, dermatomiositis, miastenia grave, polimiositis, alopecia areata, y vitíligo.