KR20230100729A - 면역반응 조절 또는 항종양 약물 제조에 있어 itpripl1 조절제의 용도 - Google Patents

면역반응 조절 또는 항종양 약물 제조에 있어 itpripl1 조절제의 용도 Download PDF

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Abstract

면역반응을 조절하거나 종양에 저항하는 약물의 제조에서 ITPRIPL1 조절제의 용도가 제공되며, 상기 조절제는 유기체에서 ITPRIPL1 유전자 또는 단백질의 발현 또는 기능을 증가 또는 감소시키는 데 사용된다. 또한 상기 용도에 사용되는 조절제를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 또한 단리된 ITPRIPL1 재조합 단백질 및 ITPRIPL1을 인식하고 결합하는 항체가 제공된다.

Description

면역반응 조절 또는 항종양 약물 제조에 있어 ITPRIPL1 조절제의 용도
본 출원은 2020년 10월 30일 중국특허청에 출원한, 출원번호 202011191447.3, 출원명칭 "면역반응 조절 또는 항종양 약물 제조에 있어 ITPRIPL1 조절제의 용도" 및 2021년 5월 24일 중국특허청에 출원한, 출원번호 202110566040.2, 출원명칭 "단리된 ITPRIPL1 항원-결합 단백질 및 이의 용도"의 두 건의 중국특허출원에 대한 우선권을 주장하며, 전체 내용은 참조를 통해 본 출원에 포함된다.
본 출원은 생물 의약 분야에 관한 것이며, 구체적으로 면역반응 조절 또는 항종양 약물 제조에 있어 ITPRIPL1 조절제의 용도에 관한 것이다.
ITPRIPL1 코딩 단백질은 Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor-interacting protein-like 1 (이노시톨 1,4,5-삼인산 수용체 상호작용 단백질-유사체 1)이며, 이전까지 ITPRIPL1의 기능에 대한 보고는 없었다. UniProtKB 데이터베이스의 주석에 따르면, 인간의 ITPRIPL1은 555개의 아미노산을 포함하고, 세포외 도메인(1-103번째 아미노산), 막횡단 도메인(104-124번째 아미노산) 및 세포내 도메인 (125-555번째 아미노산)으로 구분된다.
T세포는 적응성 면역반응의 주요 효과기 세포로, 병원체 제거와 자가면역질환에서 많은 중요한 역할을 한다. T세포에는 여러 하위 집단이 있으며, 각 하위 집단은 각각 다른 기능을 가진다. T세포 표면에서 발견되는 TCR(T cell receptor, T세포 수용체)은 TCR 집단의 약 95%를 구성하는 α 및 β 폴리펩티드 사슬 또는 γ 및 δ 폴리펩티드 사슬로 구성된 이종이량체이다[Pitcher and van Oers,(2003)]. 각각의 폴리펩티드는 불변(C) 및 가변(V) 영역을 포함한다. 불변영역은 세포막에 고정되어 있는 반면, 가변영역은 세포 외부로 확장하여 항원과 결합하는 역할을 한다. TCR의 세포질 내 짧은 꼬리는 신호를 전달하는 능력이 결여되어 있다. 세포내 신호전달은 세포내 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)를 포함하는 CD3 단백질 복합체에 의해 시작된다.
CD3(Cluster of Differentiation 3, 분화 클러스터 3) T세포 공동 수용체는 4개의 서로 다른 사슬로 구성된 단백질 복합체이다. 포유류에서 복합체는 1개의 CD3γ(γ) 사슬, 1개의 CD3δ(δ) 사슬 및 2개의 CD3ε(ε) 사슬을 포함한다. 이러한 사슬은 TCR 및 ζ 사슬(zeta 사슬)과 관련되어 T림프구에서 활성신호를 생성한다. TCR, ζ 사슬 및 CD3 분자가 함께 TCR 복합체를 형성한다. CD3γ, CD3δ 및 CD3ε 사슬은 단일한 세포외 면역글로불린 도메인을 포함하는 면역글로불린 슈퍼패밀리와 높은 관련도가 있는 세포 표면 단백질이다. TCR은 자유 에피토프/항원에 결합할 수 없는 반면, 인간의 인간백혈구항원(human leukocyte antigen, HLA) 시스템과 동의어인 주요조직적합성복합체(major histocompatibility complex, MHC)와 관련된 더 큰 폴리펩티드 단편에 결합한다. 이러한 상호작용은 면역시냅스라고 불리는 공간에서 발생한다. MHC 클래스 I 분자는 인체의 모든 유핵 세포에서 발현되고, MHC/TCR 상호작용을 안정화하는 CD8을 가진 세포독성 T세포에 항원을 제시한다. 세포독성 T세포의 활성화는 이후 표적 세포의 파괴로 이어진다. MHC 클래스 II는 대식세포, B세포 및 수지상세포에서 발견된다. 이들 면역세포는, MHC/TCR 상호작용을 안정화하는 CD4를 가진 보조 T세포에 항원을 제시한다. MHC 클래스 II와 TCR 사이의 상호작용은 궁극적으로 항체 매개 면역반응을 유도한다. 기타 공동자극 분자, 예를 들어, CD45, CD28 및 CD2는 면역시냅스에서 T세포 활성화에 기여하고, 세포내 신호전달을 담당하는 거대분자 단백질 복합체인 TCR 신호전달체의 형성을 시작한다.
인간 CD3ε에 결합하는 여러 항체, 예를 들어, 항체 OKT3(예를 들어, 문헌 [Kung, P. et al., (1979) Science 206:347-349; Salmeron, A. et al., (1991) J Immunol 147:3047-3052] 참조), 항체 UCHT1(예를 들어, 문헌[Callard, RE. et al., Clin Exp Immunol 43 (1981) 497-505] 참조) 또는 항체 SP34(예를 들어, 문헌[Pessano, S. et al., EMBO J 4 (1985) 337-344] 참조)가 보고되었다. 현재 알려진 항체 중, SP34는 인간 및 사이노몰구스 원숭이에서 교차 반응성인 항체이다 (Conrad M.L. et al., Cytometry A 71 (2007) 925-933). CD3ε 세포외 도메인에 직접 결합하는 단백질은 항체 분자로 알려져 있으며, 자연 비항체 단백질(예를 들어, 막횡단 단백질, 분비 단백질 및 기타 전형적인 리간드)이 CD3ε 세포외 도메인에 결합한다는 보고는 없다.
NRP-2(neuropilin-2)는 면역세포의 기능을 조절하는 수용체(Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2018)로, 항원제시세포의 기능을 조절하고 종양의 면역회피를 촉진하는 것으로 보고되었으며(Sohini Roy et al., Cancer Res. 2018), NRP2는 면역세포의 이동 및 식세포 기능 뿐만 아니라 면역세포 간 접촉에도 영향을 줄 수 있다 (S Schellenburg et al., Mol Immunol. 2017). NRP2와 Plexin으로 형성된 공동-수용체는 림프관 내피 세포의 이동에 대해 음성 화학주성 효과(negative chemotactic effect)를 가진다(Liu X et al., Cell Rep. 2016). NRP2는 또한 세포의 NFKB 신호전달을 조절할 수 있으며, 이는 보고된 바 있다([Rizzolio, S. et al., Cancer Research. 2017]). 이전에 발견된 NRP2 리간드에는 세마포린(Semaphorin) 계열의 구성원이 포함되지만, 다른 유형의 리간드는 보고되지 않았다.
본 명세서의 목적은 면역반응을 조절하고 종양을 억제하는 방법, 및 면역반응 조절 또는 항종양 약물의 제조에 있어서 ITPRIPL1 조절제의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 명세서는 면역반응 조절 또는 항종양 약물의 제조에 있어서 ITPRIPL1 조절제의 용도를 제공하고, 상기 조절제는 유기체에서 ITPRIPL1 유전자 또는 단백질의 발현 또는 기능을 증가 또는 감소시킨다.
바람직하게는, 상기 조절제는 다음 중 하나를 포함한다.
(1) 세포 내 ITPRIPL1 유전자의 녹아웃(knockout) 또는 돌연변이를 유발시키는 유전자 편집 시스템;
(2) ITPRIPL1 유전자의 발현 수준을 감소시키는 RNA 분자;
(3) 세포 내 도입을 위한 핵산 분자로, 상기 핵산 분자는 ITPRIPL1을 코딩하고 ITPRIPL1의 발현 수준을 증가시키는 핵산 분자;
(4) 단리된 ITPRIPL1 재조합 단백질;
(5) ITPRIPL1을 인식하고 결합하는 항체.
바람직하게는, 상기 유전자 편집 시스템은 CRISPR/Cas9 유전자 편집 시스템이고, 상기 CRISPR/Cas9 유전자 편집 시스템에 사용되는 표적 서열은 서열번호 11-13으로 표시되는 서열에서 선택되며, sgRNA 코딩에 사용되는 올리고머 DNA 서열은 서열번호 14-19에서 선택된다.
상기 핵산 분자는 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10으로 표시되는 서열을 포함한다.
상기 ITPRIPL1 재조합 단백질은 ITPRIPL1 단백질의 세포외 도메인에서 CD3ε 또는 NRP2 단백질과 결합할 수 있는 기능적 단편을 포함한다.
상기 ITPRIPL1을 인식하고 결합하는 항체는 다클론항체, 단클론항체, 단일사슬항체, 항원 결합 도메인, 이중특이항체, 다중특이항체, 또는 키메라 항원 수용체의 항원 결합 부분이다.
바람직하게는, 상기 기능적 단편의 서열은 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 선택되는 어느 하나, 또는 이의 유도체 서열이다. 상기 유도체 서열은 DRMDLDTLARSRQLEKRMSEEMRxLEMEFEERxxxAExxQKxENxWxGxTSxDQ("x"는 임의의 아미노산)를 포함한다. 유도 방법은 아미노산 1개 이상의 치환, 결실 또는 삽입을 포함하되 서열의 기능을 변경하지 않는다.
바람직하게는, 상기 ITPRIPL1 재조합 단백질은 항체 불변영역과 융합 단백질 (서열번호 5-7로 표시됨)을 형성하거나, 응고 인자와 융합 단백질을 형성하며; 대안적으로, 상기 ITPRIPL1 재조합 단백질은 폴리에틸렌 글리콜 변형, 글리코실화 변형, 폴리시알산 변형, 지방산 변형, KLH 변형 및 비오틴 변형의 방법으로 변형된다.
바람직하게는, 상기 핵산 분자는, 재조합 발현 벡터, 바이러스, 리포솜 또는 나노물질을 포함하는, 약물 전달 시스템을 통해 세포 내로 도입된다.
바람직하게는, 상기 면역반응 조절은 자가면역반응, 이식거부 면역반응 억제, 알레르기 반응, 항감염 면역반응, 항종양 면역반응의 과정 동안 항원제시세포 및 T림프구의 기능 조절을 포함한다.
바람직하게는, 상기 면역반응은 제1형 당뇨병, 면역성 불임, 장기 이식 후 거부 반응, 알레르기 반응, 전신 염증 또는 사이토카인 폭풍, 및 감염을 포함한다.
바람직하게는, 상기 종양은 고형 종양 또는 혈액학적 종양이고; 상기 고형 종양은 신경교종, 폐암, 두경부암, 위암, 결장직장암, 갑상선암, 식도암, 요로상피암, 고환암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 흑색종, 췌장암 또는 간암을 포함하며; 상기 혈액학적 종양은 백혈병 또는 림프종을 포함한다.
본 명세서는 상기 용도에 사용되는 조절제, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물을 추가적으로 제공한다.
본 명세서는 단리된 ITPRIPL1 재조합 단백질을 추가적으로 제공하고, 상기 재조합 단백질은 ITPRIPL1 단백질의 세포외 도메인에서 CD3ε 또는 NRP2 단백질과 결합할 수 있는 기능적 단편이다.
본 명세서는 ITPRIPL1을 인식하고 결합하는 항체를 추가적으로 제공하며, 상기 항체는 ITPRIPL1 단백질의 세포외 도메인을 인식하고 결합한다.
본 명세서는 자체 항-ITPRIPL1 항체의 존재를 검출하기 위해 사용되는 단리된 ITPRIPL1 재조합 단백질의 적용을 추가적으로 제공하고, 상기 검출의 주요 단계는 상기 ITPRIPL1 재조합 단백질을 대상체의 혈액 시료에 직접 접촉, 및 세척하여 비특이적 결합을 제거하는 것을 포함한다.
본 명세서는 시료에서 ITPRIPL1의 함량을 검출, 및 ITPRIPL1을 인식하고 결합하는 항체를 사용하여 세포, 조직, 기관 또는 개체 내 ITPRIPL1의 발현을 판단, 또는 ITPRIPL1을 표적으로 하여 면역반응을 조절하고 종양을 억제하는 본 명세서의 방법이 적용에 적합한지 여부를 판단하기 위한 상기 항체의 적용을 추가적으로 제공한다. 본 발명의 일부 실시예에서, ITPRIPL1을 특이적으로 인식하는 항체는 원발성 병변 내 암 조직과 암 인접 조직 사이의 경계, 림프절로 전이된 암세포와 정상 림프조직 사이의 경계, 멀리 전이된 암세포와 전이된 장기의 정상 조직 사이의 경계, 및 기타 생체시료 내 살아있는 암 조직 세포를 표지하기 위해 적용된다.
본 명세서는 면역반응 조절 또는 항종양 약물 제조 및 개체 내 lTPRIPL1의 발현을 검출하기 위한 단리된 ITPRIPL1 항원-결합 단백질의 용도를 제공하며, 상기 단리된 ITPRIPL1 항원-결합 단백질은 ITPRIPL1 항원 내에서 서열번호 49 또는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 결합할 수 있다.
본 발명의 일부 실시예에서, 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 포함하고, 여기에서 중쇄가변영역은 아미노산 서열 서열번호 24 또는 서열번호 34 중 어느 하나로 표시되는 중쇄가변영역 VH의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하며; 경쇄가변영역은 아미노산 서열 서열번호 25 또는 서열번호 35 중 어느 하나로 표시되는 경쇄가변영역 VL의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다.
본 발명의 일부 실시예에서, 아미노산 서열 서열번호 24의 중쇄가변영역 VH에서, 상기 HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 26으로 표시되고, 상기 HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 27로 표시되며, 상기 HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 28로 표시된다.
본 발명의 일부 실시예에서, 아미노산 서열 서열번호 34에서, 상기 HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 36으로 표시되고, 상기 HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 37로 표시되며, 상기 HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 38로 표시된다.
본 발명의 일부 실시예에서, 아미노산 서열 서열번호 25에서, 상기 LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 29로 표시되고, 상기 LCDR2의 아미노산 서열은 KV이며, 상기 LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 31로 표시되거나, 또는 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상 유사하다.
본 발명의 일부 실시예에서, 아미노산 서열 서열번호 35에서, 상기 LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 39로 표시되고, 상기 LCDR2의 아미노산 서열은 KV이며, 상기 LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 41로 표시된다.
본 발명의 일부 실시예에서, 상기 중쇄가변영역은 아미노산 서열 서열번호 24로 표시되는 중쇄가변영역 VH의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 경쇄가변영역은 아미노산 서열 서열번호 25로 표시되는 경쇄가변영역 VL의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다.
본 발명의 일부 실시예에서, 상기 중쇄가변영역은 아미노산 서열 서열번호 34로 표시되는 중쇄가변영역 VH의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 경쇄가변영역은 아미노산 서열 서열번호 35로 표시되는 경쇄가변영역 VL의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다.
본 발명의 일부 실시예에서, 항체 중쇄불변영역을 포함하고, 상기 항체 중쇄불변영역은 인간 IgG 중쇄불변영역으로부터 유래된다.
본 발명의 일부 실시예에서, 항체 경쇄불변영역을 포함하고, 상기 항체 경쇄불변영역은 인간 Igκ 불변영역을 포함한다.
본 발명의 일부 실시예에서, 항체 중쇄 HC를 포함하고, 상기 HC는 서열번호 22 또는 32 중 어느 하나로 표시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일부 실시예에서, 항체 경쇄 LC를 포함하고, 상기 LC는 서열번호 23 또는 33 중 어느 하나로 표시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일부 실시예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 상기 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab)2, Fv 단편, F(ab')2, scFv 및/또는 di-scFv를 포함한다.
본 발명의 일부 실시예에서, 상기 ITPRIPL1 단백질은 인간 ITPRIPL1 또는 사이노몰구스 원숭이, 랫, 마우스, 고릴라, 사바나 원숭이, 황금 들창코 원숭이, 검은 들창코 원숭이, 아마존 다람쥐 원숭이의 ITPRIPL1 단백질을 포함한다.
본 발명의 일부 실시예에서, 상기 인간 ITPRIPL1 단백질은 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 또다른 측면에서, 본 명세서는 본 명세서의 단리된 ITPRIPL1 항원-결합 단백질을 포함하는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 추가적으로 제공한다.
본 발명의 또다른 측면에서, 본 명세서는 본 명세서의 단리된 ITPRIPL1 항원-결합 단백질을 포함하는 면역접합체(immunoconjugate)를 추가적으로 제공한다.
본 발명의 또다른 측면에서, 본 명세서는 본 명세서의 단리된 ITPRIPL1 항원-결합 단백질 또는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 하나 이상의 단리된 핵산 분자를 추가적으로 제공한다.
본 발명의 또다른 측면에서, 본 명세서는 본 명세서의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 추가적으로 제공한다.
본 발명의 또다른 측면에서, 본 명세서는 본 명세서의 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 세포를 추가적으로 제공한다.
본 발명의 또다른 측면에서, 본 명세서는 본 명세서의 단리된 ITPRIPL1 항원-결합 단백질, 키메라 항원 수용체, 면역접합체, 및 임의의 약학적으로 허용되는 보조제를 포함하는, 약제학적 조성물을 추가적으로 제공한다.
본 발명의 또다른 측면에서, 본 명세서는 본 명세서의 단리된 ITPRIPL1 항원-결합 단백질이 발현되는 조건 하에서 본 명세서의 세포를 배양하는 것을 포함하는, 본 명세서의 단리된 ITPRIPL1 항원-결합 단백질을 제조하는 방법을 추가적으로 제공한다.
본 발명의 또다른 측면에서, 본 명세서는 종양의 예방, 완화 및/또는 치료에 사용되는 약물의 제조에 있어서, 본 명세서의 단리된 ITPRIPL1 항원-결합 단백질, 키메라 항원 수용체, 면역접합체, 및/또는 약제학적 조성물의 용도를 추가적으로 제공한다. 본 발명의 일부 실시예에서, 상기 종양은 고형 종양 및 림프종을 포함한다.
본 발명의 또다른 측면에서, 본 명세서는 ITPRIPL1 기능 조절 항체를 효율적으로 선별하고 제조하기 위해 사용될 수 있는 선형(linear) 에피토프 폴리펩티드를 추가적으로 제공하고, 상기 펩티드는 (i) 서열번호 49의 아미노산 서열, 즉 RLLEMEFEERKRAAE; 또는 (ii) 양 말단의 1-3개 아미노산이 결실될 수 있는 xxLxxxFxxRxxx(x는 임의의 아미노산)의 아미노산 서열; 또는 (iii) 서열번호 49의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 수득된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 선형 에피토프 폴리펩티드는 여러 측면에서 뚜렷한 이점을 가지고 있는데, 비교적 저렴한 비용으로 합성 제조할 수 있고, 에피토프 펩티드의 결합 능력 분석을 통해 ITPRIPL1 특이적 항체의 기능을 판단할 수 있으며, 조작이 간단하고 검출 결과가 안정적이고 신뢰할 수 있다는 이점이 있을 뿐만 아니라, 선형 에피토프 펩티드를 직접 면역원으로 사용하여 동물에게 주사하거나 스크리닝할 수 있어서, 전장 단백질을 사용하는 것보다 더 유효한 기능적 항체를 수득할 수 있으므로, 관련 약물의 발현 효율을 개선할 수 있다.
본 발명은 ITPRIPL1 기능 조절제를 발견 및 평가하는 방법을 추가적으로 제공하고, 상기 방법은 테스트 분자에 대해 세포 표면에 발현된 ITPRIPL1에 특이적으로 결합하는 능력; ITPRIPL1과 CD3ε의 결합에 대한 영향; ITPRIPL1과 NRP2의 결합에 대한 영향; ITPRIPL1과 SEMA3G의 결합에 대한 영향; ITPRIPL1과 EBI2의 결합에 대한 영향; 및 면역세포 또는 종양세포의 기능에 대한 영향 중 하나 이상의 성질을 검출하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 ITPRIPL1에 결합할 수 있는 표적 항체를 창의적으로 개발하였고, 상기 항체는 상기 표적 단백질에 높은 친화성으로 결합하여 그 기능을 중화시킬 수 있으며, 하나 이상의 리간드와의 결합을 억제함으로써 종양세포의 면역회피 기능을 완화시키는 작용을 달성하여, 면역세포가 시험관 내 및 생체 내에서 종양세포의 사멸을 촉진한다. 본 발명에서 제공하는 항체는 종양 치료 약물 제조에 유효 성분으로 사용될 수 있고, 종양 치료를 위한 새로운 효과적인 방안을 제공한다. 동시에, 본 발명은 중화 기능이 우수한 항체에 해당하는 선형 에피토프 및 상기 항체를 적용하기 위한 바이오마커도 제공한다.
이하, 본 발명의 목적, 특징 및 효과를 충분히 이해할 수 있도록 하기 첨부된 도면과 함께 그 개념, 구체적인 구성 및 이에 따른 기술적 효과에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 선행 기술 대비 다음과 같은 유익한 효과가 있다.
본 발명은 ITPRIPL1 유전자의 발현 또는 기능 조절을 통해 상기 목적을 실현하는, 면역반응 조절 및 종양 억제 방법을 개시한다. 본 발명은 ITPRIPL1이 CD3ε과 같은 단백질과 결합하여, 다양한 면역세포의 기능을 조절하고, 더 나아가 면역반응의 조절 및 종양의 면역회피 과정에 참여한다는 새로운 과학적 발견을 기반으로 한다. 본 발명은 ITPRIPL1의 조절제가 종양, 자가면역질환, 이식거부반응, 알레르기 및 감염과 같은 질환의 억제에 적용 가능성을 갖는 약물 또는 약제학적 조성물의 제조에 사용될 수 있음을 확인하였다.
도 1은 실시예 1의 플라스미드 구축 결과를 보여준다.
도 2는 실시예 1의 공동-면역침강(co-immunoprecipitation) 실험 결과를 보여준다.
도 3은 실시예 1에 따른 외인성 발현 ITPRIPL1 및 CD3E의 세포 내 공동 국소화(colocalization) 결과도이다.
도 4는 실시예 2에 따른 ITPRIPL1 세포외 도메인의 수용체 결합 도메인을 발현하는 발현 벡터의 구축 결과를 보여준다.
도 5는 실시예 2의 공동-면역침강 실험 결과를 보여준다.
도 6은 ITPRIPL1 세포외 도메인과 CD3 세포외 도메인이 트랜스-결합하는 실시예 2의 면역형광 및 공동 국소화 분석 실험 결과를 보여준다.
도 7은 실시예 3의 ITPRIPL1-RBD 재조합 단백질(IT1-RBD 단백질)의 겔 전기영동 후 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) 염색 결과를 보여준다 (주: ITPRIPL1=IT1, 이하 동일).
도 8은 실시예 4의 ELISA 실험 결과를 보여준다.
도 9 및 도 10은 ITPRIPL1의 세포외 도메인으로부터 정제된 단백질 단편이 높은 CD3 발현을 갖는 Jurkat 세포에 결합한다는 것을 증명하는 실시예 5의 유세포 분석 결과도이고, 여기에서 도 9(a)는 사멸된 세포를 제외한 임계값 설정을 보여주며, 도 9(b)는 Jurkat 세포와 다양한 농도의 ITPRIPL1 세포외 도메인 정제 단백질 단편의 결합을 보여준다. 도 10은 도 9(b)의 각 조건에서의 구체적인 염색 및 단백질 결합 프로파일을 보여준다.
도 11 및 도 12는 ITPRIPL1 단백질이 CD3 과발현 세포에 더 높은 효율로 결합한다는 것을 증명하는 실시예 5의 유세포 분석 결과도이고, 여기에서 도 11(a)는 사멸된 세포를 제외한 임계값 설정을 보여주고, 도 11(b)는 CD3ε의 발현 정도가 다른 세포와 다양한 농도의 ITPRIPL1 재조합 단백질의 결합을 보여준다. 도 12는 도 11(b)의 각 조건에서의 구체적인 염색 및 단백질 결합을 보여준다.
도 13 및 도 14는 CD3이 ITPRIPL1 과발현 세포에 더 높은 효율로 결합한다는 것을 증명하는 실시예 5의 유세포 분석 결과도이며, 여기에서 도 13(a)는 사멸된 세포를 제외한 임계값 설정을 보여주고, 도 13(b)는 ITPRIPL1의 발현 정도가 다른 세포와 CD3ε 단백질의 결합을 보여준다. 도 14는 도 13(b)의 각 조건에서의 구체적인 염색 및 단백질 결합을 보여준다.
도 15는 실시예 5에서 50 μg/mL ConA 활성화 조건에서 ITPRIPL1 단백질 농도에 따른 NFKB 신호전달 변화의 결과도이다.
도 16은 실시예 5에서 50 μg/mL ConA 활성화 조건에서 미소구체-코팅된 ITPRIPL1 단백질 농도에 따른 NFKB 신호전달 변화의 결과도이다.
도 17은 웨스턴 블롯에서 GAPDH를 내부참조로 사용하여 다양한 유형의 종양세포에서 ITPRIPL1의 발현 정도를 보여준다.
도 18은 정상 조직과 종양 조직에서 ITPRIPL1의 mRNA 발현 정도를 보여준다.
도 19는 실시예 6의 효소결합면역흡착분석(enzyme-linked immunosorbent assay)에서 다클론항체가 ITPRIPL1 발현 세포에 결합할 수 있음을 증명하는 결과도이다.
도 20은 실시예 6의 효소결합면역흡착분석에서 다클론항체가 ITPRIPL1과 CD3E의 결합을 차단할 수 있음을 증명하는 결과도이다.
도 21 및 도 22는 실시예 6의 유세포 분석에서 다클론항체가 ITPRIPL1과 CD3ε 과발현 세포의 결합을 차단할 수 있음을 증명하는 결과도이며, 여기에서 도 21(a)는 사멸된 세포를 제외한 임계값 설정을 보여주고, 도 21(b)는 다클론항체의 농도 변화에 따른 ITPRIPL1과 CD3ε의 결합 변화를 보여준다. 도 22는 도 21(b)의 각 조건에서의 구체적인 염색 및 단백질 결합을 보여준다.
도 23은 실시예 7의 루시페린 리포터 분석에서 ITPRIPL1 과발현 HCT116 세포가 Jurkat-dual 세포의 NFKB 증식 신호전달을 더욱 감소시킬 수 있음을 증명하는 결과도이다.
도 24는 실시예 7의 루시페린 리포터 분석에서 CD3E 단백질이 ITPRIPL1 단백질을 통해 Jurkat-dual 세포의 NFKB 증식 신호전달의 억제를 차단할 수 있음을 증명하는 결과도이다.
도 25 및 도 26은 실시예 8의 유세포 분석에서 ITPRIPL1-RBD 재조합 단백질이 인간 말초 혈액 단핵구(PBMC)를 통해 신장 유래 H3K293 세포의 사멸을 감소시킬 수 있음을 증명하는 결과도이고, 여기에서 도 25(a) 및 (b)는 CD45에 따른 293E 세포의 분류를 보여준다. 도 25(c)는 다양한 ITPRIPL1 단백질 농도 조건에서 각 그룹의 세포사멸 데이터를 기반으로 계산된 PBMC의 상대적 사멸 활성을 보여준다. 도 26은 도 25(c)의 각 조건에서의 구체적인 세포사멸 염색을 보여준다.
도 27 및 도 28은 실시예 9의 유세포 분석에서 ITPRIPL1 과발현이 PBMC에 의한 종양세포 사멸을 감소시킬 수 있는 반면, ITPRIPL1 녹아웃(knockout)이 PBMC에 의한 종양세포 사멸을 촉진시킬 수 있음을 증명하는 결과도이며, 여기에서 도 27(a) 및 (b)는 CD45에 기반하여 구분된 HCT116 세포를 나타낸다. 도 27(c)는 다양한 다클론항체 농도 조건에서 각 그룹의 세포사멸 데이터를 기반으로 계산된 PBMC의 상대적 사멸 활성을 보여준다. 도 28은 도 27(c)의 각 조건에서의 구체적인 세포사멸 염색을 보여준다.
도 29 및 도 30은 실시예 10의 유세포 분석에서 ITPRIPL1 다클론항체가 PBMC에 의한 종양세포 사멸을 촉진시킬 수 있음을 증명하는 결과도이다. 도 29(a) 및 (b)는 CD45에 기반하여 구분된 HCT116 세포를 나타낸다. 도 29(c)는 다양한 다클론항체 농도 조건에서 각 그룹의 세포사멸 데이터를 기반으로 계산된 PBMC의 상대적 사멸 활성을 보여준다. 도 30은 도 29(c)의 각 조건에서의 구체적인 세포사멸 염색을 보여준다.
도 31은 실시예 11의 공동-면역침강 실험 결과를 보여준다.
도 32는 실시예 12의 효소결합면역흡착분석(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)의 결과도이다.
도 33 및 도 34는 실시예 12의 유세포 분석에서 NRP2가 ITPRIPL1 과발현 세포에 더 높은 효율로 결합한다는 것을 증명하는 실험 결과를 보여준다. 여기에서, 도 33(a)는 사멸된 세포를 제외한 임계값 설정을 보여준다. 도 33(b)는 ITPRIPL1 발현 정도가 다른 세포와 NRP2 단백질의 결합을 보여주고, 도 34는 도 33(b)의 각 조건에서의 구체적인 염색 및 단백질 결합을 보여준다.
도 35는 실시예 13의 루시페린 리포터 분석 결과를 보여준다.
도 36은 실시예 14의 루시페린 리포터 분석 결과를 보여준다.
도 37 및 도 38은 실시예 14의 유세포 분석에서 정제된 IT1-RBD1-Fc 재조합 단백질이 인간 말초 혈액 단핵구(PBMC)를 통해 신장 유래 H3K293 세포의 사멸을 감소시킬 수 있음을 증명하는 결과도이고, 여기에서 도 37(a)는 CD45에 기반하여 구분된 293E 세포를 보여준다. 도 37(b)는 다양한 ITPRIPL1 발현 및 다양한 단백질 조건에서 각 그룹의 세포사멸 데이터를 기반으로 계산된 PBMC의 상대적 사멸 활성을 보여주고, 도 38은 도 37(b)의 각 조건에서의 구체적인 세포사멸 염색을 보여준다.
도 39는 실시예 14의 웨스턴 블롯 실험 결과를 보여준다.
도 40은 실시예 5의 OCTET 분자 상호작용 실험에서 ITPRIPL1 단백질이 CD3E 단백질과 직접 결합할 수 있음을 증명하는 결과를 보여준다.
도 41은 실시예 14의 웨스턴 블롯에서 CD3ε 단백질이 ITPRIPL1-RBD-Fc 재조합 단백질의 인산화 경로에 대한 영향을 차단하는 실험 결과를 보여준다.
도 42는 실시예 15의 웨스턴 블롯에서 Jurkat의 CD3 돌연변이가 인산화 경로에 미치는 영향을 나타낸 실험 결과를 보여준다.
도 43은 실시예 15에서 Jurkat 세포내 칼슘 이온 흐름에 대한 ITPRIPL1-RBD-Fc 재조합 단백질의 면역형광 실험 결과이다.
도 44는 실시예 15에서 ITPRIPL1-RBD-Fc 재조합 단백질의 세포내 칼슘 이온에 영향을 미치는 Jurkat의 CD3 돌연변이체의 다양한 반응을 보여주는 면역형광 실험 결과이다.
도 45는 실시예 16의 웨스턴 블롯에서 ITPRIPL1-RBD-Fc 재조합 단백질이 CD3과 Nck의 결합을 증가시키는 실험 결과를 보여준다.
도 46은 실시예 16의 근접결찰분석(proximity ligation assay)에서 ITPRIPL1-RBD-Fc 재조합 단백질이 CD3과 Nck의 결합을 증가시키는 실험 결과를 보여준다.
도 47은 실시예 17에서 인간화 CD3ε 마우스 MC38 피하 이종이식 종양모델의 종양 부피를 모니터링하고 종양 무게를 측정한 실험 결과이다.
도 48은 실시예 17에서 T세포-관련 면역 조절 포인트의 분석을 위해 인간화 CD3ε 마우스 MC38 피하 이종이식 종양모델을 희생시켜 수득한 PBMC에 대한 유세포 분석 실험 결과를 보여준다.
도 49는 실시예 17에서 인간화 CD3ε 마우스 MC38 피하 이종이식 종양모델로부터의 수득한 종양 조직의 면역조직화학염색 결과를 보여준다.
도 50은 실시예 17에서 T세포-관련 면역 조절 포인트의 분석을 위해 ITPRIPL1-녹아웃 및 야생형 마우스의 PBMC에 대한 유세포 분석 실험 결과를 보여준다.
도 51은 실시예 17에서 ITPRIPL1-녹아웃 및 야생형 마우스의 PBMC 분비형 사이토카인에 대한 ELISA 분석의 실험 결과를 보여준다.
도 52는 실시예 17에서 ITPRIPL1-녹아웃 및 야생형 마우스 고환 조직 T세포의 정자 형태 및 활력 분석 결과 뿐만 아니라, 면역조직화학염색 결과도 보여준다.
도 53은 실시예 18에서 종양 및 정상 조직에 발현된 ITPRIPL1의 분석 결과를 보여준다.
도 54는 실시예 14에서 기술한 ITPRIPL1 서열 및 기능 설명을 보여주고, 막대 그래프는 다양한 종(species)의 결합을 보여준다.
도 55는 종양 조직 및 정상 조직에 대한 ITPRIPL1 항체의 표지 및 구분 작용을 보여준다.
도 56은 멀리 전이된 종양세포에 대한 ITPRIPL1 항체의 특이적 표지 및 구분 작용을 보여준다.
도 57은 본 명세서의 마우스 하이브리도마 항체가 ITPRIPL1에 결합한 결과도를 보여주고, 도 57A는 1 μg/mL의 하이브리도마 항체 100개가 1 μg/mL의 ITPRIPL1과 반응한 ELISA 결과도이며, 도 57B는 1 μg/mL의 선별된 하이브리도마 항체 9개가 1 μg/mL의 ITPRIPL1과 반응한 ELISA 결과도이다. 도 57C는 13B7 항체와 ITPRIPL1의 결합 곡선도를 보여준다.
도 58은 각 마우스 하이브리도마 항체와 내인성 ITPRIPL1 고발현 Jurkat 세포의 결합을 검출한 본 명세서의 유세포 분석 결과도를 보여주고, 도 58A는 Jurkat 세포 게이팅 설정을 보여주며, 도 58B는 각 하이브리도마 항체 결합률 통계 결과를 보여주고, 도 58C-58L은 2E7, 5E5, 13B7, 13F7, 15C9, 16E1, 18B12, 18G5, 19B11 및 20E3을 포함하는 여러 하이브리도마 항체와 Jurkat 세포의 결합에 대한 유세포 분석 결과를 보여준다.
도 59는 마우스 하이브리도마 13B7 항체와 ITPRIPL1을 발현하는 다양한 종양세포의 결합을 검출한 본 명세서의 유세포 분석 결과도를 보여주고, 도 59A는 항체가 없는 HCT116 대조군, 도 59B는 항체가 있는 HCT116군, 도 59C는 항체가 없는 A549 대조군, 도 59D는 항체가 있는 A549군, 도 59E는 항체가 없는 MC38 대조군, 도 59F는 항체가 있는 MC38군, 도 59G는 항체가 없는 안정적으로 형질감염된 MC38-ITPRIPL1 세포주 대조군, 도 59H는 항체가 있는 안정적으로 형질감염된 MC38-ITPRIPL1 세포주 군, 도 59I는 항체가 없는 Jurkat 대조군, 도 59J는 항체가 있는 Jurkat군, 도 59K는 항체가 없는 Raji 대조군, 도 59L은 항체가 있는 Raji군을 보여주며, 도 59M은 ITPRIPL1을 발현하는 서로 다른 종양세포에 대한 13B7 항체의 결합률의 통계적 결과를 보여준다.
도 60은 다양한 농도의 마우스 하이브리도마 13B7 항체와 내인성 ITPRIPL1 고발현 Jurkat 세포의 결합을 검출한 본 명세서의 유세포 분석 결과도를 보여주고, 도 60A는 게이팅 설정을 보여주며, 도 60B는 음성 대조군을 보여주고, 도 60C-도 60H는 각각 0.0625/0.125/0.25/0.5/1/2 μg/ml의 13B7 항체가 결합하는 동안의 결합률을 보여주며, 도 60I는 각 그룹의 결합률에 대한 데이터 통계 결과를 보여준다.
도 61은 ITPRIPL1에 대한 13B7 항체의 결합을 분석한 본 명세서의 웨스턴 블롯 결과도를 보여주고, 상기 웨스턴 블롯 실험은 내인성 ITPRIPL1 고발현 Jurkat 세포, 내인성 ITPRIPL1 발현 HCT116 세포 및 ITPRIPL1을 발현하지 않는 MC38 세포로 수행되었으며, 13B7 항체는 인큐베이션에 사용되었다.
도 62는 본 명세서에서 다양한 마우스 하이브리도마 항체가 다양한 단백질에 대한 ITPRIPL1의 결합을 차단하는 결과를 보여주고, 도 62A는 다양한 마우스 하이브리도마 항체가 CD3E에 대한 ITPRIPL1의 결합을 차단하는 결과를 보여주며, 도 62B는 다양한 마우스 하이브리도마 항체가 SEMA3G에 대한 ITPRIPL1의 결합을 차단하는 결과를 보여준다.
도 63은 본 명세서에서 마우스 하이브리도마 단클론항체가 ITPRIPL1에 결합하는 ELISA 결과를 보여준다.
도 64는 내인성 ITPRIPL1 고발현 Jurkat 세포에 대한 다양한 마우스 하이브리도마 단클론 항체의 결합을 검출한 본 명세서의 유세포 분석 결과도를 보여준다.
도 65는 본 명세서에서 두 항체간 서열 비교 뿐만 아니라, 다양한 마우스 하이브리도마 단클론항체가 ITPRIPL1와 다양한 단백질의 결합을 차단하는 통계 결과도를 보여주고, 도 65A는 다양한 마우스 하이브리도마 단클론 항체가 ITPRIPL1과 CD3E의 결합을 차단하는 결과도를 보여주며, 도 65B는 다양한 마우스 하이브리도마 항체가 ITPRIPL1과 SEMA3G의 결합을 차단하는 통계도를 보여주고, 도 65C는 두 항체의 서열 간 비교 및 분석을 보여준다.
도 66은 본 명세서에서 ITPRIPL1 항원 결합 영역의 식별 결과도를 보여준다. 도 66A-66M은 순서대로, 18B12, 18B12D1A6, 13B7, 13B7A6H3, 16E1, 18G5, 20E3, 16E1D8H1, 5E5, 2E7, 19B7, 13F7, 18G5F3F4 항체가 ITPRIPL1 단백질 유래의 다양한 펩티드 부분에 결합하는 통계 결과도를 보여준다.
도 67은 본 명세서에서 다양한 마우스 하이브리도마 단클론항체가 PBMC에 의해 내인성 ITPRIPL1 고발현 Raji 세포의 사멸을 촉진시키는 것을 보여주는 유세포 분석 검출 결과도이고, 도 67A-B는 게이팅 설정을 보여주며, 도 67C는 Raji 세포의 자가사멸 대조군을 보여주고, 도 67D는 PBMC 첨가 및 음성 혈청의 사멸, 도 67E-도 67N은 PBMC 첨가 시 각각 0.5 μg/ml의 13B7A6H3 단클론항체, 2 μg/ml의 13B7A6H3 단클론항체, 0.5 μg/ml의 16E1D8C4 단클론항체, 2 μg/ml의 16E1D8C4 단클론항체, 0.5 μg/ml의 18G5F3E5 단클론항체, 2 μg/ml의 18G5F3E5 단클론항체, 0.5 μg/ml의 18B12D1 단클론항체, 2 μg/ml의 18B12D1 단클론항체, 0.5 μg/ml의 18B12D1A6 단클론항체, 2 μg/ml의 18B12D1A6 단클론항체를 첨가한 검출 결과를 보여준다.
도 68은 본 명세서에서 다양한 마우스 하이브리도마 단클론항체가 PBMC에 의해 내인성 ITPRIPL1 고발현 Raji 세포의 사멸을 촉진시키는 것을 보여주는 유세포 분석 검출 결과 통계도이다.
도 69는 P8 폴리펩티드 단편을 본 명세서에 따라 다양한 점 돌연변이를 유발시킨 후 13B7A6H3 단클론항체와 결합시킨 ELISA 실험 결과를 보여준다.
도 70은 본 명세서의 에피토프 매핑을 이용한 실험 결과 및 상응하는 항체 그룹 분석을 보여준다.
도 71은 ITPRIPL1-RBD에 결합된 단클론항체를 사용하여 치료한 마우스 MC38-ITPRIPL1-과발현 피하 이종이식 종양모델의 종양 부피 및 질량 변화에 대한 실험 결과를 보여준다.
도 72는 ITPRIPL1-RBD에 결합된 단클론항체를 사용하여 치료한 마우스 MC38-ITPRIPL1-과발현 피하 이종이식 종양모델의 말초 혈액 PBMC에 대한 유세포 분석 실험 결과를 보여준다.
도 73은 ITPRIPL1-RBD에 결합된 단클론항체를 사용하여 치료한 마우스 MC38-ITPRIPL1-과발현 피하 이종이식 종양모델로부터 수득한 종양 조직의 면역조직화학염색 결과를 보여준다.
도 74는 P8 폴리펩티드에 결합된 인간화 항체의 ELISA 실험 결과를 보여준다.
도 75는 13B7A6H3 단클론항체에 결합된 사이노몰구스 원숭이 ITPRIPL1-P8 대응 폴리펩티드의 ELISA 실험 결과를 보여준다.
본 발명은 매우 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 본 명세서에는 본 발명의 원리를 검증하기 위한 구체적인 예시적 실시양태를 개시한다. 본 발명은 본 명세서에 개시되는 구체적인 예시적 실시양태에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 또한, 본 명세서에 사용된 모든 장과 절의 제목은 구성 목적으로만 사용되며 기술된 주제에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 하기 실시예에서 구체적인 조건을 명시하지 않은 실험 방법은 일반 조건(예를 들어, 문헌 [Sambrook & Russell et al., (2001) Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 3rd edition, CSHL Press]에 기재된 조건)에 따르거나, 제조업체에서 권장하는 조건에 따른다. 달리 명시되지 않는 한 백분율과 분율은 중량에 따라 계산한다. 달리 명시되지 않는 한 본 발명의 실시예에 사용된 재료 및 시약은 모두 시판되는 제품이다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명의 구체적인 실시양태에서 사용된 과학 기술 용어는 당해 분야의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가진다. 하기 용어는 당해 분야의 기술자에 의해 매우 잘 이해되는 것으로 믿어지지만, 본 발명을 더 잘 설명하기 위해 다음과 같이 정의한다.
용어 "포괄한다", "포함한다", "가진다", "함유한다" 또는 "관련되다" 는 포괄적(inclusive) 또는 개방형이며, 기타 열거되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 용어 "…로 이루어진"은 용어 "포함한다"의 바람직한 실시양태로 간주된다. 이하, 어떤 군(group)이 적어도 일정한 수의 실시양태를 포함하는 것으로 정의되는 경우, 이 또한 바람직한 실시양태만으로 이루어진 군을 나타내는 것으로 이해되어야 한다.
단수 명사를 사용할 때 사용되는 부정 관사 또는 정관사, 예를 들어 "하나" 또는 "일종", "상기" 등은 해당 명사의 복수 형식을 포함한다.
또한, 명세서 및 청구 범위에 사용된 제1, 제2, 제3, (a), (b), (c) 등과 같은 용어는 순서나 시간적 순서를 설명하기 위한 필요에서가 아닌, 유사한 요소를 구별하기 위해 사용된다. 이와 같이 응용되는 용어는 적절한 문맥에서 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 본 발명에 설명된 실시양태는 본 발명에 설명되거나 예시된 것과 다른 순서로 구현될 수 있다는 것을 이해해야 한다.
용어 "및/또는"은 다른 두 개의 지정된 특징 또는 구성 요소 중 각 특징 또는 구성 요소를 포함하거나 포함하지 않는 것으로 간주된다. 예를 들어, "A 및/또는 B"라는 표현은 A 및 B; A 또는 B; A(단독); 및 B(단독)를 포함하는 것을 의미한다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"라는 표현은 A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독)를 포함하는 것을 의미한다:
용어 "예를 들어" 및 "즉"은 예시로만 사용되고 한정하는 의미가 없으며, 명세서에 명시적으로 나열된 항목만 포함하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
용어 "이상", "적어도", "초과" 등 용어, 예를 들어 "적어도 하나"는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,　20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000을 포함하지만, 이로 제한되지 않으며, 또는 언급한 값을 초과하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 그 사이의 더 큰 숫자 또는 분수도 포함한다.
반대로, 용어 "초과하지 않는다"는 언급한 값보다 작은 값을 포함한다. 예를 들어, "100개의 뉴클레오티드를 초과하지 않는다"라는 표현은 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 및 0개의 뉴클레오티드를 포함한다. 또한, 그 사이의 더 작은 숫자 또는 분수도 포함한다.
용어 "여러 개", "적어도 2개", "2개 이상", "적어도 두 번째" 등은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,　20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000을 포함하지만, 이로 제한되지 않으며, 또는 더 많은 것으로 이해되어야 한다. 또한, 그 사이의 더 큰 숫자 또는 분수도 포함한다.
용어 "약"또는 "실질적으로"은 언급한 특징의 기술적 효과를 보증할 수 있고 당해 분야의 기술자가 이해할 수 있는 정확도 범위를 의미한다. 이 용어는 통상적으로 지시된 값의 ±10% 범위 내, 바람직하게는 ±5% 범위 내에 있는 값을 나타낸다.
용어 "유도체" 또는 "돌연변이"는 핵산 또는 아미노산 서열을 치환, 삭제, 삽입 등의 변화를 거쳐 새로운 서열을 형성하는 것을 의미하며, 새로운 서열로 이루어진 군의 아미노산 서열 또는 군 내 서열은 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다.
본 명세서에서 달리 명시되지 않는 한 모든 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위 또는 정수 범위는 서술된 범위 내의 정수 값을 포함하고, 적절한 경우 그 분수(예를 들어, 정수의 10분의 1 및 100분의 1 등)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서의 목적, 기술적 방안 및 장점을 보다 용이하게 이해할 수 있도록 본 발명과 관련된 용어의 일부를 아래에서 정의한다.
용어 "면역반응"은 이종 성분 또는 변이된 자가 성분에 대한 신체의 방어 반응을 지칭한다.
용어 "종양"은 비정상적인 세포가 성장하여 형성된 신생물 또는 고체 병변을 지칭한다.
용어 "유전자 편집 시스템"은 특정 DNA 단편을 제거하거나, 삽입하거나, 돌연변이시키는 등의 방법 통해 표적 유전자를 편집하여 유전자 서열을 얻는 것을 지칭한다.
용어 "sgRNA"는 작은 가이드 RNA(small guide RNA)로, RNA 편집 과정에서 우리딘 잔기의 키네토플라스티드 내 삽입 또는 결실을 유도하는 소형의 비코딩 RNA에 속한다.
용어 "항체불변영역"은 항체 분자의 C-말단 아미노산이 상대적으로 안정적인 영역을 지칭하며, 많은 중요한 생물학적 기능을 가진다.
용어 "응고 인자"는 혈액 응고 과정에 참여하는 각종 단백질 성분을 지칭한다.
용어 "항원제시세포"는 체내에서 항원 정보를 흡수, 처리 및 전달하여 T세포와 B세포의 면역반응을 유발하는 세포로, 주로 대식세포, 수지상세포 및 B세포를 포함한다.
용어 "자가면역질환"은 신체가 자기 항원에 면역반응을 일으켜 자기 조직을 손상시키는 질환을 지칭한다.
용어 "이식거부 반응"은 동종의 조직이나 장기 이식 후 이식 수령인의 면역계가 외부 조직이나 장기 등의 이식물을 "이종 성분"으로 인식하여 이식물을 공격, 파괴 및 제거하는 면역학적 반응을 일으키는 것을 지칭한다.
용어 "알레르기"는 면역이 생긴 신체가 동일한 항원의 자극을 다시 받았을 때 발생하는 조직 손상 또는 기능 장애 반응을 지칭한다.
용어 "감염"은 세균, 바이러스, 진균, 기생충 등 병원체가 인체에 침입하여 발생하는 국소성 및 전신성 염증 반응을 지칭한다.
용어 "중화 항체"는 체내에 침입한 병원 미생물에 대응하여 형성되는 항체를 지칭한다. 병원 미생물은 세포에 침투할 때 병원체를 발현하는 특정 분자에 의존하여 세포의 수용체에 결합해야 세포를 감염시키고 증식할 수 있다. 중화 항체는 B림프구에서 생성되는 항체로, 병원 미생물 표면의 항원에 결합하여 병원 미생물이 표적 세포 수용체에 부착하는 것을 방지함으로써 세포에 침입하는 것을 방지한다.
용어 "차단 항체"는 세포 표면의 분자 작용 부위에 결합하여 수용체와 리간드의 결합을 차단하는 역할을 하는 항체를 지칭한다.
용어 "효소결합면역흡착분석"은 항원과 항체간의 특이적 결합 특성을 이용하여 검체를 검출하는 것으로, 고체 담체에 결합하는 항원 또는 항체는 면역 활성을 유지하기 때문에 그 결합 기전을 설계한 후 효소 발색 반응을 통해 특정 항원 또는 항체의 존재 여부를 나타낼 수 있으며, 발색 농도를 이용하여 정량 분석을 할 수 있다.
용어 "유세포 분석"은 유체 속에 부유하는 미립자를 계수하고 분류하는 데 사용된다. 이런 기술은 광학 또는 전자 검측기를 통과한 각 세포의 다양한 매개변수를 동시에 분석하는 데 사용될 수 있다.
용어 "신호전달경로"는 세포에서 어떤 반응이 일어나려고 할 때 신호가 세포 외부에서 세포 내부로 정보를 전달하며 세포는 이러한 정보를 근거로 반응하는 현상을 지칭한다.
용어 "면역회피"는 면역억제 병원체가 구조적 및 비구조적 산물을 통해 신체의 면역반응을 길항, 차단 및 억제하는 것을 지칭한다.
용어 "변형"은 화학적 연결 방법을 통해 폴리펩티드 또는 단백질을 다른 화합물 또는 기능기와 연결하는 것을 지칭하며, 그 예로 항체불변영역(Fc), 폴리에틸렌 글리콜 변형, 글리코실화 변형, 폴리시알산 변형, 지방산 변형, KLH 변형, 비오틴 변형 등이 있다.
본 명세서에서 용어 "단리된"은 일반적으로 자연 상태에서 인공적으로 수득하거나 인공적으로 합성된 것을 지칭한다. 자연계에 "단리된" 물질이나 성분이 존재한다면 그것은 해당 물질이 처한 자연 환경이 바뀌었거나, 자연 환경에서 해당 물질이 단리되었거나, 또는 이 두 가지 상황이 모두 발생할 수 있다. 예를 들어, 살아있는 동물의 체내에는 분리되지 않은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 자연적으로 존재하며, 이러한 자연 상태에서 단리한 높은 순도의 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 단리된 것이라고 한다. 용어 "단리된"은 인공 또는 합성 물질의 혼재를 배제하지 않으며, 물질의 활성에 영향을 미치지 않는 기타 불순 물질의 존재도 배제하지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"(antibody, Ab)는 항원에 특이적으로 결합하는 당단백질 면역글로불린을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일반적으로, 항체는 이황화 결합을 통해 서로 연결된, 적어도 2개의 중쇄(heavy, H)와 2개의 경쇄(light, L), 또는 그 항원 결합 분자를 포함할 수 있다. 각 중쇄는 중쇄가변영역(본 명세서에서 VH로 약칭됨)과 중쇄불변영역을 포함한다. 중쇄불변영역은 3개의 불변 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각 경쇄는 경쇄가변영역(본 명세서에서 VL로 약칭됨)과 경쇄불변영역을 포함한다. 경쇄가변영역은 1개의 불변 도메인 CL을 포함한다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역(complementarity determining regions, CDR)이라고 하는 초가변성 영역으로 더 세분화될 수 있으며 프레임 영역(framework regions, FR)이라고 하는 더욱 보존된 영역에 산재해 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카르복시 말단까지 다음 순서로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변영역은 면역글로불린이 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 효과기 세포) 및 전통적인 보체 시스템의 제1 성분(C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 결합하는 것을 매개할 수 있다.
경쇄가변영역 및 중쇄가변영역은 각각 3개의 초가변 영역("상보성 결정 영역" 또는 "CDR"이라고도 함)이 삽입된 "프레임" 영역을 포함한다. "상보성 결정 영역" 또는 "CDR 영역" 또는 "CDR" 또는 "초가변 영역"(본 명세서에서 초가변 영역(hypervariable region)　"HVR"과 상호 교환적으로 사용됨)은 항체 가변 도메인에서 서열 변화가 크고 구조적으로 확정된 고리("초가변 고리")를 형성하고/하거나 항원 접촉 잔기("항원 접촉점")를 함유하는 영역이다. CDR은 주로 항원의 에피토프에 대한 결합을 담당한다. 중쇄 및 경쇄의 CDR은 일반적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 불리며 N-말단부터 순서대로 번호가 매겨진다.　항체 중쇄 가변 도메인 내에 위치하는 CDR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3이라고 하고, 항체 경쇄 가변 도메인 내에 위치하는 CDR은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3이라고 한다. 주어진 경쇄가변영역 또는 중쇄가변영역의 아미노산 서열에서 각 CDR의 정확한 아미노산 서열 경계는 알려진 많은 항체 CDR 할당 시스템 중 하나 또는 그 조합을 사용하여 결정할 수 있으며, 상기 할당 시스템에 대한 정의는 예를 들어, 항체의 3차원 구조와 CDR 고리의 위상기하학에 기반한 Chothia 정의(Chothia et al., (1989) Nature　342:877-883, Al-Lazikani et al., (1997) "Standard conformations　for　the　canonical　structures　of　immunoglobulins", Journal　of　Molecular　Biology, 273, 927-948), 항체 서열 가변성에 기반한 Kabat 정의(Kabat et al., (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th edition, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health), AbM(University of Bath), Contact 정의(University College London), International ImMunoGeneTics database(IMGT), 및 대량의 결정체 구조를 이용한 유사도 전파 군집화(affinity propagation clustering)에 기반한 North CDR 정의를 포함한다.
그러나, 다른 할당 시스템을 기반으로 수득한 동일 항체의 가변영역에서 CDR의 경계는 다를 수 있다는 점에 유의해야 한다. 즉, 할당 시스템에 대한 정의에 따라 동일 항체가변영역의 CDR 서열이 다르다. 예를 들어, Kabat 및 Chothia 번호를 사용하는 CDR 영역의 경우, 다른 할당 시스템 정의에서의 잔기 범위는 하기 표 1과 같다.
할당 시스템 정의에 따른 CDR 잔기 범위
고리 Kabat CDR AbM Chothia Contact IMGT
L1 L24-L34 L24-L34 L24-L34 L30-L36 L27-L32
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L56 L46-L55 L50-L52
L3 L89-L97 L89-L97 L89-L97 L89-L96 L89-L96
H1 H31-H35b
Kabat 번호		 H26-H35b H26-H32...34 H30-H35b H26-H35b
H1 H31-H35
Chothia 번호		 H26-H35 H26-H32 H30-H35 H26-H35
H2 H50-H65 H50-H58 H50-H56 H47-H58 H51-H57
H3 H95-H102 H95-H102 H95-H102 H93-H101 H93-H102
따라서, 본 발명에서 정의하는 특정 CDR 서열로 항체를 한정하는 경우, 항체 범위는 이러한 항체를 포함하고 그 가변 영역 서열은 상기 특정 CDR 서열을 포함하지만, 다른 방식(예를 들어, 다른 할당 시스템 규칙 또는 조합)의 적용으로 인해 주장한 CDR 경계가 본 발명에서 정의한 특정 CDR 경계와 달라질 수 있다.
본 발명의 항체의 CDR은 당해 분야의 임의의 방식 또는 이들의 조합에 따라 인위적인 평가를 통해 경계를 결정할 수 있다. 본 명세서에서 달리 명시되지 않는 한 본 발명에서 사용되는 용어 "CDR" 또는 "CDR 서열"은 상기 임의의 방식으로 결정된 CDR 서열을 포함한다.
항체는, 예를 들어, 단클론항체, 재조합 항체, 단일특이항체, 다중특이항체(이중특이항체 포함), 인간 항체, 조작된 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 면역글로불린, 합성 항체, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄 분자를 포함하는 사량체 항체, 항체 경쇄 단량체, 항체 중쇄 단량체, 항체 경쇄 이량체, 항체 중쇄 이량체, 항체 경쇄-항체 중쇄 쌍, 세포내 항체, 항체 융합체(본 명세서에서 "항체 접합체"라고도 칭함), 이형접합 항체, 단일 도메인 항체, 1가 항체, 단일 가닥 항체 또는 단일 가닥 Fv(scFv), 낙타 유래 항체, 친화체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 이황화 결합으로 연결된 Fv(sdFv), 항유전자형(항-Id) 항체(예: 항-항-Id 항체 포함), 미니 항체, 도메인 항체, 합성 항체(본 명세서에서 "항체 모사체"라고도 칭함) 및 상기 항원 결합 단편을 포함한다.
용어 "인간화 항체"는 마우스종과 같은 다른 포유동물 종의 생식 계열로부터 유래된 CDR 서열을 인간 프레임 서열 상에 접목하여 수득한 항체를 지칭한다. 인간 프레임 서열에서 다른 프레임 영역을 변형시킬 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "항원 결합 분자", "항원 결합 단편" 또는 "항체 단편"은 해당 분자로부터 유래된 항체의 항원 결합 단편(예를 들어, CDR)을 포함하는 모든 분자를 지칭한다. 항원 결합 분자는 항원 상보성 결정 영역(CDR)을 포함할 수 있다. 항체 단편의 예는 항원 결합 분자로부터 형성된 Fab, Fab', F(ab')2 및 항원 결합 분자로부터 형성된 Fv 단편, dAb, 선형 항체, scFv 항체 및 다중특이항체를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 일부 실시예에서, 항원 결합 분자는 ITPRIPL1 단백질에 결합한다. 본 발명의 일부 실시예에서, 항원 결합 분자는 중화 활성을 가져 ITPRIPL1이 수용체 CD3E 또는 EBI2에 결합하는 것을 억제할 수 있다.
용어 "키메라 항원 수용체" 즉, Chimeric Antigen Receptor(CAR)는 특정 항원을 인식하고 결합하는 단백질 도메인으로 구성된 세포외 도메인, 막횡단 도메인 및 가능한 세포내 도메인을 포함한다. 키메라 항원 수용체는 면역세포에서 발현되고 표적 세포와 상호작용하는 능력을 조절할 수 있다.
용어 "면역접합체"는 생물학적 활성을 갖는 저분자 약물을 화학적 연결을 통해 항체에 연결하는 항체 면역접합체(즉, 항체 약물 접합체, antibody-drug conjugate, ADC)를 포함할 수 있다. 유사하게, 면역접합체는 단백질 약물 접합체, 핵산 약물 접합체도 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항원"은 면역반응을 일으키거나 항체 또는 항원에 의해 결합될 수 있는 모든 분자를 지칭한다. 면역반응은 항체 생성 또는 특이적 면역 활성 세포의 활성화 또는 이 두 가지에 영향을 미칠 수 있다. 당해 분야의 기술자는 모든 고분자(거의 모든 단백질 또는 펩티드 포함)가 항원으로 작용할 수 있다는 것을 용이하게 이해할 수 있다. 항원은 내인성 발현, 즉 게놈 DNA에 의해, 또는 재조합에 의해 발현될 수 있다. 항원은 암세포와 같은 특정 조직에 대해 특이성을 가지거나, 또는 광범위하게 발현될 수 있다. 또한, 고분자의 단편은 항원으로 작용할 수 있다. 본 발명의 일부 실시예에서, 항원은 ITPRIPL1 단백질 항원이다.
본 명세서에서 사용되는, 일부 실시예에서, 항원 결합 분자, scFv, 항체 또는 그 단편은 리간드 상의 결합 부위를 직접적으로 차단하거나, 리간드의 결합 능력을 간접적으로 변화(예를 들어, 리간드의 구조 또는 에너지 변화)시킬 수 있다. 본 발명의 일부 실시예에서, 항원 결합 분자, scFv, 항원 또는 그 단편은 결합된 단백질의 생물학적 기능 수행을 방지한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "펩티드", "폴리펩티드", 및 "단백질"은 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 펩티드 결합으로 공유 결합된 아미노산 잔기를 포함하는 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유하며, 단백질 또는 펩티드 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 수량은 제한이 없다. 폴리펩티드는 펩티드 결합으로 서로 연결된 아미노산을 2개 이상 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 이 용어는 짧은 사슬(당해 분야에서 일반적으로 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머라고도 칭함)과 더 긴 사슬(당해 분야에서 일반적으로 많은 유형의 단백질이라고 칭함)을 지칭한다. "폴리펩티드"는, 예를 들어, 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동성을 갖는 폴리펩티드, 올리고펩티드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질 등을 포함한다. 폴리펩티드는 자연 펩티드, 재조합 펩티드, 합성 펩티드 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"은 두 분자 사이, 예를 들어, 항체와 항원 사이의 비무작위적 결합 반응을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "결합 억제", "결합 차단" 또는 "동일 에피토프 경쟁" 능력은 두 분자의 결합을 검출 가능한 수준으로 억제하는 항체의 능력을 지칭한다. 본 발명의 일부 실시예에서, 두 분자의 결합을 차단하는 항체는 두 분자 간 결합 상호작용을 적어도 50％ 억제한다. 본 발명의 일부 실시예에서, 이러한 억제는 20％, 30％, 40%, 50％, 60％, 70％, 80％ 또는 90％ 이상일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "Ka"는 특정 항체-항원 상호작용의 결합률을 나타내는 반면, 용어 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리율을 나타낸다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "KD" 또는 "KD 값"은 Kd와 Ka의 비율(즉, Kd/Ka)에서 얻어지고 몰 농도(M)로 표시되는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 나타낸다. 항체의 KD 값은 당해 분야에서 확립된 방법을 사용하여 결정할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "고친화성" 항체는 표적 항원에 1×10-7 M 이하, 더 바람직하게는 5×10-8 M 이하, 더욱 바람직하게는 1×10-8 M 이하, 더욱더 바람직하게는 5×10-9 M 이하, 및 더욱더 바람직하게는 1×10-9 M 이하의 KD 값을 갖는 항체를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 항체에 특이적으로 결합하는 항원 부분을 지칭한다. "에피토프"는 "항원결정기"라고도 칭한다. 에피토프 또는 항원결정기는 일반적으로 아미노산, 탄수화물 또는 당과 같은 분자의 측쇄의 화학적 활성 표면기로 구성되며, 일반적으로 특정 3차원 구조와 특정 전하 특성을 가진다. 예를 들어, 에피토프는 일반적으로 고유한 입체 구조에 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 연속 또는 불연속 아미노산을 포함하며, "선형 에피토프" 또는 "입체 구조 에피토프"일 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol.66, G.E.Morris, Ed. (1996)]을 참조한다. 선형 에피토프에서 단백질과 상호작용 분자(예를 들어, 항체) 간의 모든 상호작용 부위는 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라 선형으로 배열된다. 입체 구조 에피토프에서 상호작용 부위는 서로 분리된 단백질의 아미노산 잔기에 걸쳐 있다. 당해 분야 기술자가 이미 알고 있는 통상적인 기술을 통해 검출한, 동일한 에피토프에 결합하는 경쟁성에 따라 항체를 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 경쟁 또는 교차 경쟁 연구를 수행하여 CLDN18.2와 같은 항원에 서로간의 경쟁 또는 교차 경쟁적으로 결합하는 항체를 얻을 수 있다. 교차 경쟁을 기반으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 얻기 위해 사용되는 고처리량 방법은 국제 특허 출원 WO 03/048731에 설명되어 있다.
본 발명에 사용되는 용어 "핵산" 또는 "핵산 서열"은 리보핵산, 데옥시리보핵산 또는 그 유사체의 단위를 포함하는 모든 분자, 바람직하게는 중합 분자를 지칭한다. 상기 핵산은 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있다. 단일 가닥 핵산은 변성된 이중 가닥 DNA의 단일 가닥 핵산일 수 있다. 또는 단일 가닥 핵산은 이중 가닥 DNA로부터 유래되지 않은 단일 가닥 핵산일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "상보성"은 주어진 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 서로 어닐링될 때, DNA에서 A와 T, G와 C, RNA에서 G와 C, A와 U가 짝을 이루게 하는 뉴클레오티드 염기 G, A, T, C 및 U 사이의 수소 결합 염기쌍과 관련이 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "암"은 체내의 비정상적인 세포가 무제한으로 성장하는 특징을 가진 질병군을 지칭한다. 통제되지 않은 세포 분열과 성장으로 인접한 조직을 침범하고, 림프계나 혈류를 통해 신체의 다른 부분으로 전이될 수 있는 악성 종양을 형성한다. "암" 또는 "암 조직"은 종양, 예를 들어, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 악성 흑생종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문암, 위장암, 고환암, 나팔관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 외음부암, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 연조직육종, 요도암, 음경암, 만성 또는 급성 백혈병(급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 포함), 소아기 고형종, 림프구성 림프종, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신우암, 중추신경계(central nervous system, CNS) 신생물/종양, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관 신생성, 척추(spinal axis) 종양, 뇌간교종, 뇌하수체 선종, 카포시(Kaposi) 육종, 표피암, 편평세포암, T세포 림프종, 환경유발암(석면에 의해 유발되는 암 포함), 및 상기 암의 조합을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "ITPRIPL1-관련 암"은 ITPRIPL1의 발현 또는 활성의 증가 또는 감소로 인해 발생하거나 악화되거나 또는 기타 방식으로 관련된 암을 지칭한다. 본 발명의 일부 실시예에서, 본 명세서에 개시된 방법은 결장직장암, 폐암, 유방암, 흑색종, 림프종, 간암, 두경부암, 위암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁내막암, 유방암, 난소암에서 선택되는 암의 치료에 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "유효 사용량", "유효량" 또는 "치료 유효량"은 단독으로 사용하거나 다른 치료제와 함께 사용할 때 대상체를 질병의 발병으로부터 보호하거나 질병의 감퇴를 촉진하는 양이다. 상기 질병 감퇴의 증거는 질병 증상의 중증도 감소, 질병 무증상기의 빈도 및 지속 기간 증가, 또는 질병의 고통으로 인한 손상 또는 장애의 예방을 기준으로 한다. 치료제의 질병 감퇴 촉진 효능은, 예를 들어, 임상 시험 중 인간 대상체에서의 평가, 인체에서의 효능을 예측하는 데 사용되는 동물 모델 시스템에서의 평가, 또는 시험관내 측정에서 시약의 활성 평가와 같은, 당해 분야의 숙련된 당업자에게 공지된 다양한 방법을 이용하여 평가할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "개체" 또는 "대상체"는 포유 동물이다. 포유 동물은 영장류(예컨대, 인간 및, 원숭이와 같은 비인간 영장류)와 설치류(예를 들어, 마우스, 랫)을 포함한다. 본 발명의 일부 실시예에서, 개체 또는 대상체는 인간이다. "대상체"는 "환자"일 수 있으며, 환자는 치료가 필요한 인간 대상체로, 유방암과 같은 ITPRIPL1-관련 암을 앓고 있는 개체, 또는 유방암과 같은 ITPRIPL1-관련 암이 발병할 위험이 있는 대상체일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "체외 세포"는 체외에서 배양된 모든 세포를 지칭한다. 특히, 체외 세포에 T세포를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는"은 벡터, 희석제, 부형제 및/또는 그의 염이 제제의 다른 성분과 화학적 및/또는 물리적으로 양립하고, 수용자와 생리학적으로 양립한다는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제"는 약리학적 및/또는 생리학적으로 대상체 및 활성제와 양립하는 담체 및/또는 부형제를 지칭하고, 당해 분야에 공지되어 있으며(예를 들어, 문헌 [Remington’s Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, (1995)] 참조), pH 조절제, 계면활성제, 면역보강제 및 이온 강도 증강제를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, pH 조절제는 인산염 완충액을 포함하지만 이로 제한되지 않고, 계면활성제는 양이온성, 음이온성 또는 비이온성 계면활성제(예컨대, Tween-80)를 포함하지만 이로 제한되지 않으며, 이온 강도 증강제는 염화나트륨을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "조정", "조절"은 전반적으로 상향 조정 또는 하향 조정의 두 가지 방향의 의미를 지니며, 경우에 따라 억제 또는 촉진, 저하 또는 향상, 감소 또는 증가 등으로 이해될 수 있으며, 구체적인 해석은 제한되지 않고 실제 적용 문맥에 따라 이해되고 해석된다. 예시적으로, 본 발명의 일부 실시예에서, 종양 세포 성장을 "조절"한다는 것은 종양 세포의 성장을 억제하거나 촉진시키는 것으로 이해될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "감소" 및 "저하"는 상호 교환적으로 사용될 수 있으며 원래보다 작거나 적은 변화를 나타낸다. "감소" 및 "저하"는 상대적인 용어로, 측정 전과 측정 후를 비교해야 한다. "감소" 및 "저하"는 완전 소모를 포함하며, 같은 이치로, 용어 "증가" 및 "향상"은 그 반대로 해석한다.
대상체의 "치료" 또는 "처리"는 증상, 합병증, 또는 상태, 또는 질병과 관련된 생화학적 지표의 발생, 진행, 발전, 심화 또는 재발을 역전, 완화, 개선, 억제, 둔화 및 예방하는 목적을 달성하기 위해 대상체에 행하는 모든 유형의 개입 또는 과정, 또는 활성제 투여를 의미한다. 본 발명의 일부 실시예에서, "치료" 또는 "처리"는 부분적 완화를 포함한다. 본 발명의 또다른 실시예에서, "치료" 또는 "처리"는 완전한 완화를 포함한다.
용어 "개체 내 ITPRIPL1의 발현"은 종양 조직 또는 자가면역질환 조직과 같은 병든 조직, 혈액 시료, 소변, 분변 및 기타 생물학적 시료의 함량을 포함하여 정상인과 환자 체내에서 ITPRIPL1의 단백질 또는 mRNA가 발현된 수준을 지칭한다. 이러한 발현량은 질병의 진단 바이오마커, 또는 관련 약물의 동반 진단 마커로 사용될 수 있다.
이하 도면과 실시예를 첨부하여 본 명세서의 기술 방안을 상세히 설명한다.
본 명세서는 ITPRIPL1의 세포외 도메인이 CD3ε 세포외 도메인 및 NRP2 세포외 도메인에 결합한다는 것을 처음으로 밝히고, ITPRIPL1이 CD3ε 및 NRP2에 결합한 후 각각 T세포와 항원제시세포에 미치는 조절 작용을 개시한다. 새로운 과학적 발견을 기반으로, 본 명세서는 ITPRIPL1을 표적으로 하여 면역반응을 조절하고 종양을 억제하는 방법을 개시하고, 면역반응 조절 또는 항종양 약물을 제조하는 데 있어 ITPRIPL1 조절제의 용도를 명시한다. 구체적으로, 본 명세서는 ITPRIPL1에 대한 유전자 편집 방법과, 유전 물질을 세포로 유입시켜 ITPRIPL1 발현을 조절하는 방법을 제공한다. 본 명세서는 ITPRIPL1의 수용체 결합 도메인(receptor-binding domain, RBD)을 추가로 개시하고, ITPRIPL1-RBD 분리 단백질 제조 프로토콜을 제공하며, ITPRIPL1-RBD가 CD3ε 및 NRP2에 결합하여 면역세포 기능을 조절하는 방법을 시연한다. 또한, 본 명세서는 ITPRIPL1 항체 제조 방법을 예시하고 상기 항체가 면역세포의 항종양 효과를 향상시킬 수 있다는 것을 입증한다. 본 명세서가 개시한 ITPRIPL1을 표적으로 하여 면역반응을 조절하고 종양을 억제하는 방법은 ITPRIPL1이 종양, 자가면역질환, 이식거부 반응, 알레르기, 감염 및 기타 질환의 치료에 표적 가치가 있음을 나타낸다.
이전까지 ITPRIPL1 유전자 기능에 대한 보고가 없었으며, 본 명세서는 ITPRIPL1을 CD3ε에서 새로 확인된 리간드로 개시하고(실시예 1), ITPRIPL1 세포외 도메인 수용체 결합 도메인(RBD)이 25-103번째 아미노산임을 밝히며(실시예 2), 이를 근거로 CD3ε 및 T세포를 조절하는 기능을 가진 단리된 재조합 단백질을 제조하였다(실시예 3). 본 명세서는 또한 상기 단리된 단백질의 제조, 용도 및 적용 방법을 개시한다.
본 명세서는 단리된 ITPRIPL1-RBD 단백질이 CD3ε에 결합하는 능력을 추가로 개시하고(실시예 4), 각각 효소결합면역흡착분석(ELISA), 유세포 분석 또는 기타 다른 실험 방법을 이용하여 단리된 ITPRIPL1-RBD 단백질이 CD3ε 세포외 도메인에 결합할 수 있음을 입증한다.
ITPRIPL1-RBD(서열번호 1에 기재된 서열)은 CD3ε에 결합하는 핵심 영역이기 때문에, 재조합 발현을 통해 단리된 ITPRIPL1-RBD 단백질을 제조하여 세포 표면의 CD3ε 단백질에 결합시키면 T세포 내부로 억제 신호를 전달할 수 있어(실시예 5), 단리된 ITPRIPL1-RBD 단백질을 T세포의 기능을 조절하는 데 사용할 수 있다. 본 명세서는 CD3ε 결합, T세포 조절 및 중화 항체 제조에 대한 단리된 단백질(서열번호 1의 서열)의 역할을 제공하지만, 당해 분야의 기술자가 쉽게 구현할 수 있는 비창조적인 파생 방법(예컨대, 절단, 삽입, 돌연변이 또는 융합 등)으로 얻은 유사한 기능을 가진 기타 단백질 서열도 본 명세서에서 주장하는 권리 범위 내에 있다.
본 명세서는 단리된 ITPRIPL1-RBD를 면역원으로 중화 항체를 제조하는 응용을 개시한다(실시예 6). ITPRIPL1을 CD3ε의 리간드로 개시하지 않은 상황에서 당해 분야의 기술자는 의도적으로 ITPRIPL1과 CD3의 결합을 차단하는 항체를 제조할 수 없다. 본 명세서는 수용체 리간드인 CD3ε 및 ITPRIPL1 쌍의 존재를 개시하고, ITPRIPL1이 CD3에 결합하는 핵심 구조를 정의하며, 단리된 ITPRIPL1-RBD 단백질의 제조 방법을 제공하여, ITPRIPL1과 CD3의 결합을 차단하는 데 사용되는 항체의 제조를 당업자가 통상적인 기술(예컨대, 하이브리도마, 파지 디스플레이 등)을 통해 용이하게 구현할 수 있게 하는 것이 목표이다. 따라서, ITPRIPL1 세포외 도메인 단편을 면역원으로 제조해 수득한 차단 항체도 본 명세서의 특허 청구 범위 내에 있다.
본 명세서는 또한 ITPRIPL1-RBD와 CD3 세포외 도메인의 결합을 조절하여 T세포 유래 세포주의 증식 신호전달경로 활성화를 조절할 수 있음을 개시한다(실시예 7).
본 명세서는 ITPRIPL1-RBD 재조합 단백질이 인간 말초 혈액 단핵구(PBMC)의 신장 유래 H3K293 세포 사멸력을 감소시킬 수 있음을 개시하고(실시예 8), 이에 따라 표적 ITPRIPL1의 자가면역 억제에 대한 적용 및 자가면역, 이식거부 반응, 알레르기, 감염 및 기타 질환을 치료하는 약학적 조성물 제조에 대한 적용 가치를 제시한다.
본 명세서는 종양 세포의 발현을 감소시키는 ITPRIPL1이 인간 말초 혈액 단핵구의 종양세포 사멸력을 유의하게 증가시킬 수 있음을 개시하고(실시예 9), 이에 따라 종양 면역회피에 대한 ITPRIPL1의 역할을 뒷받침하면서, 종양 면역치료의 표적으로서 ITPRIPL1의 중요한 가치를 제시한다.
본 명세서는 또한 ITPRIPL1-RBD 단백질을 면역원으로 하여 제조한 항체가 면역세포의 종양세포 사멸력을 효과적으로 촉진시킨다는 것을 개시한다(실시예 10). 이는 ITPRIPL1이 종양 면역치료의 표적으로서 중요한 가치가 있음 입증하며, ITPRIPL1과 CD3의 결합을 항체를 이용하여 차단하는 방법도 제시한다. 상기 항체는 ITPRIPL1을 인식하고 CD3ε와의 결합을 차단하여 T세포의 기능을 조절하는 새로운 기능을 가진 항체의 부류를 나타낸다.
추가로, 본 명세서는 다양한 길이의 ITPRIPL1 세포외 도메인 단편을 비교하여, ITPRIPL1-RBD2 서열이 CD3ε에 결합하는 능력은 다소 감소시키는 반면, ITPRIPL1-RBD3이 CD3에 결합하는 능력은 현저하게 감소시킨다는 것을 입증함으로써, ITPRIPL1 세포외 도메인의 길이와 CD3ε에 결합하는 능력 간의 양의 상관관계(positive correlation)를 개시하고 기능을 갖춘 ITPRIPL1 세포외 도메인 서열의 필수적인 특성을 특징지었다(실시예 11). 본 명세서는 ITPRIPL1-RBD 단백질이 NRP2에 결합하는 능력이 있음을 개시한다(실시예 12). 그리고, 단리된 ITPRIPL1-RBD 단백질은 NRP2 단백질을 발현하는 분화된 THP1 대식세포에 억제 신호를 전달하는 능력이 있다(실시예 13).
약물의 연구 개발 과정에서 약동학 등 속성을 개선하기 위해 일반적으로 사용되는 변형 방법으로 폴리펩티드 또는 단백질을 다른 화합물 또는 기능기와 연결할 수 있으며, 그 예로 항체 불변 영역(Fc), 폴리에틸렌 글리콜 변형, 글리코실화 변형, 폴리시알산 변형, 지방산 변형, KLH 변형, 비오틴 변형 등이 있다. 본 명세서는 Fc 변형을 통해 변형이 ITPRIPL1 재조합 단백질 기능에 미치는 영향을 예시한다. 정제하여 수득한 ITPRIPL1-RBD-Fc 변형 단백질은 T세포의 신호전달 및 사멸을 억제하는 기능이 있다(실시예 14). 추가로, 상기 ITPRIPL1-RBD-Fc 단백질은 T세포의 인산화 경로를 억제할 수 있으며, CD3ε에 의해 차단될 수 있다(실시예 14).
본 명세서는 Jurkat CD3 돌연변이체를 제조하고 인산화 경로에 대한 영향의 관련 기전을 추가로 개시한다(실시예 15). 동시에, 세포내 칼슘 이온 흐름을 검출하여 CD3의 발현 정도가 다른 Jurkat 세포에 대한 ITPRIPL1-Fc의 영향을 탐구하고(실시예 15), ITPRIPL1-Fc가 CD3와 Nck의 결합을 증가시켜 경로를 조절한다는 것을 발견하였다(실시예 16).
추가로, 본 명세서는 생체내 동물 모델을 이용하여 인간화 CD3ε 마우스 체내에 MC38 피하 이종이식 종양모델을 구축하여, 종양 성장, PBMC에서 T세포의 기능, 및 종양세포에서 T세포의 침윤을 측정하였다(실시예 17). 동시에, ITPRIPL1 녹아웃 마우스 모델을 구축하여, PBMC에서 T세포의 기능, 사이토카인 변화, 및 고환 T세포의 침윤을 측정함으로써, 본 명세서의 체내 적용 가능성을 검증하였다(실시예 17).
본 명세서는 흔히 볼 수 있는 다기관암의 ITPRIPL1 발현 정도를 개시하고, 해당 암의 주변 조직과 비교하여, 암으로 변화할 때 ITPRIPL1이 증가하는 것을 입증하였다(실시예 18).
실시예 1: ITPRIPL1을 CD3ε의 새로운 리간드로 확인
1. 발현 플라스미드 구축
개시된 서열(NCBI 참조 서열 NM_001008949.3)을 기반으로 전장 인간 ITPRIPL1의 cDNA를 합성하고 C-말단이 Flag 태그에 융합된 pcDNA 3.1을 벡터로 사용하여 Flag 태그를 포함하는 ITPRIPL1 플라스미드를 생성하였다. 플라스미드 구축 결과는 도 1에 제시하였다. 도 1(a)는 벡터 클로닝 구조의 개략도이고, 도 1(b)는 유전자 발현 벡터 플라스미드를 EcoRI/XhoI 효소로 절단한 후 DNA 겔 전기 영동한 결과로, 수득한 단편의 크기는 예상한 바와 같았으며, 도 1(c)는 벡터 서열 검증 결과의 일부를 캡처한 것이다.
2. 공동-면역침강 및 웨스턴 블롯 분석 결과는 ITPRIPL1이 CD3에 결합함을 입증한다.
Flag 태그가 포함된 ITPRIPL1(또는 비어있음(empty)) 및 HA 태그가 포함된 CD3ε의 pcDNA3.1 플라스미드로 HCT116 세포(ATCC, VA, USA)를 공동 형질감염시키고, 6웰 플레이트(Corning, NY, USA)에서 단백질이 충분히 발현될 때까지 48-72시간 동안 배양한 후, 1:100 비율의 면역침강 용해액(Thermo Fisher, MA, USA)과 프로테아제, 포스파타제, PMSF(Consun, Shanghai, China) 혼합 용해액으로 세포를 분리하여 긁어낸다. 일부 세포 시료를 원심분리하고, 로딩 완충액(Beyotime, Shanghai, China)을 혼합하여 100°C의 메탈 배스(metal bath)에서 변성시킨 후 Input 단백질 시료를 수득하였다. 나머지 세포 시료는 Flag 태그 특이적 마우스 항체(CST, MA, USA)로 면역침강시키고 PBS로 세척한 후, 로딩 완충액(Beyotime, Shanghai, China)을 혼합하여 100°C의 메탈 배스에서 변성시킨 후 면역침강된 단백질 시료를 수득하였다. 그런 다음, 설명서에 따라 겔 플레이트(Bio-Rad, CA, USA)에 12.5%의 PAGE 겔(EpiZyme, Shanghai, China)을 배치하였다. 준비된 겔을 전기영동조(Bio-Rad, CA, USA)에 넣은 후 전원(Bio-Rad, CA, USA)을 연결하고, 축적 겔(stacking gel)까지는 80V로 진행하고, 분해 겔(separating gel)부터는 120V의 전압으로 진행하였다. 밴드가 분해 겔 바닥에 도달하면 멤브레인에 대한 습식 전송을 이용하여 전송조(Bio-Rad, CA, USA)에서 350 mA로 90분간 멤브레인으로 전송하였다. 전송이 완료된 후 ITPRIPL1-Flag와 CD3ε-HA 단백질의 질량 크기에 따라 멤브레인을 절단 처리하였다. 신속 차단 완충액(EpiZyme, Shanghai, China)으로 10분간 차단한 후, Flag 태그 특이적 토끼 항체(Abcam, MA, USA) 및 HA 태그 특이적 토끼 항체(CST, MA, USA)로 각각 ITPRIPL1-Flag 및 CD3ε-HA에 해당하는 밴드를 4°C에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날 TBST로 세척한 후, 5% 탈지유(Sangon, Shanghai, China)를 함유한 TBS로 희석한 특이적 항토끼 2차 항체(Consun, Shanghai, China)를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, TBST로 세척한 후, 혼합 발광액(Share-Bio, Shanghai, China)에 1분간 넣어 겔 이미저(Bio-Rad, CA, USA)에 노출시켰다.
도 2는 공동-면역침강 실험 결과를 보여준다. 도 2(a)와 (b)는 각각 공동-면역침강 실험에 사용된 단백질 중 ITPRIPL1및 CD3ε의 함량, 즉, Input을 나타내고, 도 2(c)는 직접 침강된 ITPRIPL1를 나타내며, 도 2(d)는 간접적으로 침강된, ITPRIPL1과 결합한 CD3ε를 나타낸다. 공동-면역침강 실험 결과 ITPRIPL1과 CD3이 결합하는 것으로 나타났다.
3. 면역형광 및 공동 국소화 분석은 ITPRIPL1이 CD3과 유의한 공동 국소화를 갖는 것으로 나타났다.
Flag 태그가 포함된 ITPRIPL1(또는 비어있음) 및 HA 태그가 포함된 CD3ε의 pcDNA3.1 플라스미드로 HCT116 세포(ATCC, VA, USA)를 공동 형질감염시키고, 8웰 유리 슬라이드(Thermo Fisher, MA, USA)에서 단백질이 충분히 발현될 때까지 30시간 배양한 후, 배양액을 버린다. PBS로 세척한 후, 4% 파라포름알데히드로 20분 동안 고정하고, PBS로 다시 세척한 후 멤브레인-투과 차단 완충액으로 1시간 동안 차단한 다음, 멤브레인-투과 차단 완충액으로 희석한 Flag 태그 특이적 마우스 항체(CST, MA, USA) 및 HA 태그 특이적 토끼 항체(CST, MA, USA)를 첨가하여 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 밤새 인큐베이션한 8웰 유리 슬라이드를 PBS로 세척하고, PBS로 희석한 Alexa Fluor 488 형광 특이적 항마우스 항체(Invitrogen, CA, USA) 및 Alexa Fluor 594 형광 특이적 항토끼 항체(Invitrogen, CA, USA)를 첨가하여 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. PBS로 세척한 후, 슬라이드는 DAPI로 마운팅하고, 마운팅제가 건조된 후 형광현미경으로 관찰하였다.
도 3은 외인성으로 발현된 ITPRIPL1및 CD3ε의 세포 내 유의한 공동 국소화를 보여준다. 도 3(a)는 ITPRIPL1의 국소화 양상이고, (B)는 CD3ε 단백질의 국소화 양상이며, (c)는 단백질 국소화 패턴의 두 가지 색을 중첩한 것으로, 여기에서 흰색의 직선 상에 있는 ITPRIPL1 및 CD3ε의 형광 강도는 도 3(d)에 나타나 있다. 상기 실험 결과를 통해 이 두 가지 단백질의 국소화는 유의한 상관관계가 있음을 관찰할 수 있었으며, 이는 두 단백질의 상호 결합을 뒷받침한다.
실시예 2: ITPRIPL1 세포외 도메인 수용체 결합 도메인(RBD) 및 그의 유도체 서열의 기능
1. 발현 플라스미드 구축
개시된 서열(NCBI 참조 서열 NM_001008949.3)을 기반으로 세포외 도메인(25-103번째 아미노산), 세포외 도메인 및 막횡단 도메인 (25-124번째 아미노산), 막횡단 도메인 및 세포내 도메인(104-555번째 아미노산)을 각각 3개의 다른 표적 서열로 선택하여 전장 인간 ITPRIPL1을 합성하고, 세포외 도메인, 세포외 도메인 및 막횡단 도메인의 C-말단이 Flag 태그 및 녹색 형광 단백질(GFP)에 융합되고, 막횡단 도메인 및 세포내 도메인 N-말단이 Flag 태그 및 녹색 형광 단백질(GFP)에 융합된, pcDNA3.1을 벡터로 사용하여, Flag 태그 및 녹색 형광 단백질(GFP)이 포함된 ITPRIPL1 세포외 도메인, 세포외 도메인 및 막횡단 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 도메인 플라스미드를 생성하였다. 그중 CD3 결합 도메인의 발현 벡터인 ITPRIPL1(25-103)의 구축 결과는 도 4에서 보여준다. 도 4(a)는 벡터 플라스미드 구축도로, ITPRIPL1(25-103) 아미노산 단편을 코딩하는 cDNA의 말단에서 Flag 태그를 코딩하는 cDNA를 연결하고, pEGFP-C1(Shanghai Generay Biotech Co., Ltd)을 삽입하였다. 이 벡터의 발현 산물은 GFP 형광 표지를 가지고 있으며, 주요 기능 산물은 ITPRIPL1(25-103) 즉, CD3 결합 단편이다. 도 4(b)는 유전자 발현 벡터 플라스미드를 EcoRI/XhoI 효소로 절단한 후 DNA 겔 전기영동한 결과로, 수득한 단편의 크기는 예상한 바와 같았다. 도 4(c)는 서열 결과의 피크 그래프를 캡처한 것이다.
2. 공동-면역침강 실험 결과 ITPRIPL1의 세포외 도메인이(세포내 도메인 또는 막횡단 도메인이 아닌) CD3에 결합하는 것으로 나타났다.
Flag 태그가 포함된 ITPRIPL1 세포외 도메인, 세포외 도메인 및 막횡단 도메인, 세포내 도메인 및 막횡단 도메인과 HA 태그가 포함된 CD3ε의 pcDNA3.1 플라스미드로 각각 HCT116 세포(ATCC, VA, USA)를 공동 형질감염시키고, 6웰 플레이트(Corning, NY, USA)에서 단백질이 충분히 발현될 때까지 48-72시간 동안 배양한 후, 1:100 비율의 면역침강 용해액(Thermo Fisher, MA, USA)과 프로테아제, 포스파타제, PMSF(Consun, Shanghai, China) 혼합 용해액으로 세포를 분리하여 긁어낸다. 일부 세포 시료를 원심분리하고, 로딩 완충액(Beyotime, Shanghai, China)을 혼합하여 100°C의 메탈 배스(metal bath)에서 변성시킨 후 Input 단백질 시료를 수득하였다. 나머지 세포 시료는 Flag 태그 특이적 마우스 항체(CST, MA, USA)로 면역침강시키고 PBS로 세척한 후, 로딩 완충액(Beyotime, Shanghai, China)을 혼합하여 100°C의 메탈 배스에서 변성시킨 후 면역침강된 단백질 시료를 수득하였다. 그런 다음, 설명서에 따라 겔 플레이트(Bio-Rad, CA, USA)에 12.5%의 PAGE 겔(EpiZyme, Shanghai, China)을 배치하고 준비된 겔을 전기영동조(Bio-Rad, CA, USA)에 넣은 후 전원(Bio-Rad, CA, USA)을 연결하고, 축적 겔(stacking gel)까지는 80V로 진행하고, 분해 겔(separating gel)부터는 120V의 전압으로 진행하였다. 밴드가 분해 겔 바닥에 도달하면 멤브레인에 대한 습식 전송을 이용하여 전송조(Bio-Rad, CA, USA)에서 350 mA로 90분간 멤브레인으로 전송하였다. 전송이 완료된 후 ITPRIPL1 세포외 도메인, 세포외 도메인 및 막횡단 도메인, 세포내 도메인 및 막횡단 도메인-Flag와 CD3ε-HA 단백질의 질량 크기에 따라 멤브레인을 절단 처리하였다. 신속 차단 완충액(EpiZyme, Shanghai, China)으로 10분간 차단하고, Flag 태그 특이적 토끼 항체(Abcam, MA, USA) 및 HA 태그 특이적 토끼 항체(CST, MA, USA)로 각각 ITPRIPL1-Flag 및 CD3ε-HA 해당 밴드를 4°C에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날 TBST로 세척한 후 5% 탈지분유(Sangon, Shanghai, China)를 함유한 TBS로 희석한 특이적 항토끼 2차 항체(Consun, Shanghai, China)를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고 TBST로 세척한 후, 혼합 발광액(Share-Bio, Shanghai, China)에 1분간 넣어 겔 이미저(Bio-Rad, CA, USA)에 노출시켰다.
도 5는 공동-면역침강 실험 결과를 보여준다. 도 5(a)는 Flag 항체가 검출한 Input 단백질 중 ITPRIPL1의 함량을 보여주고, 도 5(b)는 Input 단백질 중 CD3ε의 함량을 보여준다. 도 5(c)는 직접 침강된 ITPRIPL1의 상이한 돌연변이체를 보여주고, 도 5(d)는 상응하는 간접 침강된(ITPRIPL1 돌연변이체와의 결합으로 인해) CD3ε을 보여준다. 상기 결과는 ITPRIPL1의 세포외 도메인이(세포내 도메인 또는 막횡단 도메인이 아닌) 존재하는 상태에서 CD3ε와 ITPRIPL1이 결합된 상태를 유지한다는 것을 시사한다. 따라서 ITPRIPL1의 세포외 도메인이 CD3ε에 결합하는 것은, CD3ε의 리간드인 ITPRIPL1의 세포외 도메인 수용체 결합 도메인(RBD)이 25-103번째 아미노산이라는 결론에 부합한다.
3. 면역형광 및 공동 국소화 분석은 ITPRIPL1 세포외 도메인과 CD3 세포외 도메인이 트랜스 결합하는 것으로 나타났다.
HA 태그의 CD3ε로 HCT116 세포를 형질감염시키고, Flag 태그의 ITPRIPL1(각각 인간, 마우스, 고릴라, 사바나 원숭이, 황금 들창코 원숭이, 아마존 다람쥐 원숭이의 ITPRIPL1 세포외 도메인과 인간 ITPRIPL1 막횡단 도메인)-녹색 형광 단백질의 pcDNA3.1 플라스미드로 또다른 배치의 HCT116을 형질감염시키고, 마지막으로 두 번에 걸쳐 각각 형질감염시킨 세포를 공동 배양하여 면역형광 이중 염색법으로 두 단백질의 국소화 모델을 결정하였다. 그중 랫, 마우스, 고릴라, 사바나 원숭이, 황금 들창코 원숭이, 검은 들창코 원숭이, 아마존 다람쥐 원숭이의 ITPRIPL1 세포외 도메인 서열은 도 54를 참조한다.
구체적인 절차는 다음과 같다: HA 태그가 포함된 CD3ε의 pcDNA3.1 플라스미드로 HCT116 세포(ATCC, VA, USA)를 형질감염시키고, Flag 태그를 포함한 ITPRIPL1(세포외 도메인 및 막횡단 도메인)-녹색 형광 단백질의 pcDNA3.1 플라스미드로 또다른 배치의 HCT116 세포(ATCC, VA, USA)를 형질감염시킨다. 20시간 동안 형질감염시킨 후, 트립신으로 세포를 각각 소화시키고, 혼합하여 재현탁시킨 후, 8웰 슬라이드(Thermo Fisher, MA, USA)에 플레이팅하여 10시간 배양하였다. 배양액을 버리고 PBS 세척 후 4% 파라포름알데히드로 20분 동안 고정하였다. PBS로 다시 세척한 후 멤브레인 차단 완충액으로 1시간 동안 차단한 후, 멤브레인-투과 차단 완충액으로 희석한 HA 태그 특이적 토끼 항체(CST, MA, USA)를 첨가하여 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 밤새 인큐베이션한 8웰 슬라이드를 PBS로 세척하고, PBS로 희석한 Alexa Fluor 594 형광 특이적 항토끼 항체(Invitrogen, CA, USA)를 첨가하여 실온에서 20분 동안 인큐베이션하고 PBS로 세척한 후 DAPI로 마운팅하고, 마운팅제 건조 후 형광현미경으로 관찰하였다. 면역형광 이중 염색법으로 두 단백질의 국소화 모델을 결정하였다.
도 6에 나타난 것과 같이, 도 6(a)는 ITPRIPL1과 CD3ε의 염색 중첩 이미지를 보여주고, 도 6(b) 및 (c)는 각각 ITPRIPL1 수용체 결합 도메인(ITPRIPL1-RBD) 및 CD3ε의 염색 결과를 보여준다. 도 6(d)는 ImageJ 소프트웨어의 공동 국소화 분석 모듈로 분석하여 얻은 두 단백질의 공동 국소화 영역이다. 여기서 흰색의 직선 상에 있는 ITPRIPL1과 CD3ε의 형광 강도는 도 6(e)에 나타나 있다. 두 세포가 접하는 부분에 ITP-RBD(녹색 형광) 및 CD3ε(적색 형광)의 신호가 유의하게 집중되고 강화되어 있는 것을 볼 수 있으며, 이는 두 단백질의 세포외 도메인이 세포 표면에서 트랜스 결합한다는 사실을 뒷받침한다. 실험 결과는 또한, 마우스, 고릴라, 사바나 원숭이, 황금 들창코 원숭이, 아마존 다람쥐 원숭이의 ITPRIPL1 세포외 도메인 서열이 인간 CD3E 세포외 도메인에 결합하는 것으로 나타났다.
실시예 3: CD3ε 및 T세포 조절 기능을 가진 단리된 ITPRIPL1-RBD 재조합 단백질의 제조
개시된 서열(NCBI 참조 서열 NP_001008949.1)을 기반으로 Cusabio(Wuhan, China)를 통해 인간 ITPRIPL1 세포외 도메인(25-103번째 아미노산) 재조합 단백질을 합성하고, 효모로 단백질을 발현 및 정제한 후, C-말단에 6x-His 및 Myc 태그를 융합시켜 6x-His 및 Myc 태그가 포함된 ITPRIPL1-RBD 재조합 단백질을 생성하였다.
도 7은 ITPRIPL1-RBD 재조합 단백질을 겔 전기영동한 후 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색한 결과이며, 분자량과 순도가 예상과 일치함을 나타낸다.
실시예 4: 콘카나발린A(ConA) 및 단리된 ITPRIPL1-RBD 단백질 각각의 CD3ε에 대한 결합 능력 확인
효소결합면역흡착분석(ELISA)을 통해 콘카나발린A(ConA)와 단리된 ITPRIPL1 세포외 도메인 단편은 각각 CD3ε 세포외 도메인에 농도 의존적으로 직접 결합한다는 것이 확인되었다. ELISA 전용 플레이트(costar, ME, USA)를 사용하였다. 먼저 0.5/1/2/4 μg/mL의 ConA 또는 0.03125/0.0625/0.125/0.25/0.5/1/2 μg/mL의 ITPRIPL1-RBD 재조합 단백질을 각각 100 μl의 ELISA 코팅액(Solarbio, Beijing, China)에 녹여 분주하고, 음성 대조군으로 단백질을 포함하지 않은 코팅액 100 μl를 분주하였다. 플레이트는 4℃에서 밤새 코팅하였다. PBST로 세척 후, 5% BSA를 함유한 PBS(VWR, PA, USA) 100 μl로 37°C의 인큐베이터에서 90분 동안 차단시켰다. PBST로 세척 후, hFc 태그가 있는 CD3ε(Met1-Asp126) 단백질의 세포외 도메인 단백질 단편(Sino Biological Inc., Beijing, China) 1 μg/ml을 37°C인큐베이터에서 60분 동안 결합시켰다. PBST로 세척 후, PBS로 희석한 특이적 항-인간 Fc 세그먼트 항체(Abcam, MA, USA)를 37°C의 인큐베이터에서 30분 동안 결합시켰다. PBST로 세척 후, 발색액(Sangon, Shanghai, China)을 웰당 100 μl씩 분주하고 인큐베이터에서 5~30분 동안 반응시킨 후, 정지액(Sangon, Shanghai, China) 50 μl를 첨가하고 마이크로플레이트 판독기(Thermo Fisher, MA, USA)로 450nm에서 발색을 판독하였다.
도 8은 ELISA 실험 결과를 보여준다. 실험 결과, 콘카나발린A(ConA)와 단리된 ITPRIPL1 세포외 도메인 정제 단백질(IT1-RBD)은 각각 CD3ε 세포외 도메인 정제 단백질에 농도 의존적으로 직접 결합하고, IT1-RBD의 결합 강도가 ConA보다 큰 것으로 나타났다. 상기 결과는, 콘카나발린A(ConA)와 단리된 ITPRIPL1 세포외 도메인 정제 단백질(IT1-RBD)은 각각 CD3ε 세포외 도메인 정제 단백질에 직접 결합하며, IT1-RBD의 결합 강도가 ConA보다 크다는 것을 증명한다.
실시예 5: 세포 표면의 CD3ε 단백질에 결합하고 T세포에 억제 신호를 전달하는 단리된 ITPRIPL1-RBD 단백질
1. 안정적으로 형질감염된 HCT116-ITPRIPL1 및 HCT116-CD3ε 세포주 구축
구축된 전장 ITPRIPL1-Flag 플라스미드, CD3ε-HA 플라스미드 및 빈(空) pcDNA3.1 플라스미드로 각각 HCT116 세포(ATCC, VA, USA)를 형질감염시켜 인큐베이터에 24-48시간 동안 배양한 후, 1000 μg/mL의 게네티신(Geneticin, G418)(Gibco, CA, USA)을 첨가하여 스크리닝하고, 10-14일 후, 빈 pcDNA3.1 플라스미드 형질감염군의 세포가 모두 사멸된 후 안정적으로 형질감염된 HCT116-ITPRIPL1 및 HCT116-CD3ε 세포주를 수득하였다.
2. 유세포 분석은 ITPRIPL1 세포외 도메인 정제 단백질 단편이 CD3 발현이 높은 Jurkat 세포에 결합함을 입증한다.
배양된 Jurkat 세포(ATCC, VA, USA)를 계수하고 세포 수를 2x105/mL로 조정한 후, 1.5 ml EP 튜브(Axygen, CA, USA) 6개에 각각 200 μl씩 분주하였다. EP 튜브 4개에는 각각 0.1 μg, 0.2 μg, 0.4 μg, 0.8 μg의 ITPRIPL1-RBD-6x-His 재조합 단백질(IT1-6x-His 단백질)을 첨가하여 각각0.5 μg/mL, 1 μg/mL, 2 μg/mL, 4 μg/mL의 농도를 만들었다. 모든 EP 튜브를 세포 인큐베이터에 넣고 30분 동안 방치한 후 EP 튜브를 꺼내 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하였다. 500 μl의 세포 염색 완충액(Invitrogen, CA, USA)으로 세포를 재현탁하고 세척한 후, 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하고 세척을 반복하였다. 세포 염색 완충액으로 6x-His-FITC 항체(Abcam, MA, USA)를 1:500 비율로 희석하고, 음성 대조군을 제외한 각 EP 튜브에 항체 희석액을 200 μl씩 첨가한 후, 실온에서 40 rpm으로 진탕기에서 30분 동안 배양하였다. EP 튜브를 꺼내 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하였다. 1000 μl의 세포 염색 완충액으로 세포를 재현탁하고 세척한 후, 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하고 세척을 반복하였다. 세척 완료 후 각 EP 튜브에 300 μl의 세포 염색 완충액을 첨가하여 재현탁하고, 테스트 튜브(Falcon, NY, USA)로 옮긴 후 유세포 분석기(Miltenyi Biotec, Cologne, Germany)로 분석하였다.
도 9(a)는 사멸된 세포를 제외한 임계값 설정을 보여준다. 도 9(b)는 Jurkat 세포와 다양한 농도의 ITPRIPL1 세포외 도메인 정제 단백질 단편의 결합을 보여준다. 도 10은 도 9(b)의 각 조건에서의 구체적인 염색 및 단백질 결합을 보여준다. 상기 결과는 ITPRIPL1 세포외 도메인 정제 단백질 단편이 CD3 발현이 높은 Jurkat 세포에 결합할 수 있다는 것을 시사한다.
3. 유세포 분석은 ITPRIPL1 단백질이 CD3 과발현 세포와 더 높은 효율로 결합함을 입증한다.
배양된 HCT116 야생형 세포(ATCC, VA, USA)와 안정적으로 형질감염된 HCT116-CD3ε 세포주를 소화시킨 후 계수하고, 세포 수를 2x105/mL로 각각 조정한 후, 각각 1.5 ml EP 튜브(Axygen, CA, USA) 5개와 3개에 200 μl씩 분주하였다. HCT116 야생형 세포의 EP 튜브 3개와 안정적으로 형질감염된 HCT116-CD3ε 세포주의 EP 튜브 3개에 각각 0.2 μg, 0.4 μg, 0.8 μg의 ITPRIPL1-RBD-6x-His 재조합 단백질을 첨가하여 각각 1 μg/mL, 2 μg/mL, 4 μg/mL의 농도를 만들었다. 모든 EP 튜브를 세포 인큐베이터에 넣고 30분 동안 방치한 후 EP 튜브를 꺼내 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하였다. 500 μl의 세포 염색 완충액(Invitrogen, CA, USA)으로 세포를 재현탁하고 세척한 후, 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하고 세척을 반복하였다. 세포 염색 완충액으로 6x-His-FITC 항체(Abcam, MA, USA)를 1:500 비율로 희석하고, 음성 대조군을 제외한 각 EP 튜브에 항체 희석액을 200 μl씩 첨가한 후, 실온에서 40 rpm으로 진탕기에서 30분 동안 배양하였다. EP 튜브를 꺼내 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하였다. 1000 μl의 세포 염색 완충액으로 세포를 재현탁하고 세척한 후, 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하고 세척을 반복하였다. 세척 완료 후 각 EP 튜브에 300 μl의 세포 염색 완충액을 첨가하여 재현탁하고, 테스트 튜브(Falcon, NY, USA)로 옮긴 후 유세포 분석기(Miltenyi Biotec, Cologne, Germany)로 분석하였다.
도 11(a)는 사멸된 세포를 제외한 임계값 설정을 보여준다. 도 11(b)는 CD3ε의 발현 정도가 다른 세포와 다양한 농도의 ITPRIPL1 재조합 단백질의 결합을 보여준다. 도 12은 도 11(b)의 각 조건에서의 구체적인 염색 및 단백질 결합을 보여준다. 상기 결과는 ITPRIPL1 세포외 도메인 정제 단백질 단편이 CD3이 과발현된 HCT116 세포에는 결합하지만, CD3이 발현되지 않은 HCT116 세포에는 결합하지 않는다는 것을 시사한다.
4. 유세포 분석은 CD3이 ITPRIPL1 과발현 세포와 더 높은 효율로 결합하는 것을 입증한다.
배양된 HCT116 야생형 세포(ATCC, VA, USA)와 안정적으로 형질감염된 HCT116-ITPRIPL1 세포주를 소화시킨 후 계수하고, 세포 수를 2x105/mL로 조정한 후, 각각 1.5 ml EP 튜브(Axygen, CA, USA) 3개와 1개에 200 μl씩 분주하였다. HCT116 야생형 세포의 EP 튜브 1개와 안정적으로 형질감염된 HCT116-ITPRIPL1 세포주의 EP 튜브에 CD3E-인간 Fc 단백질(Sino Biological Inc., Beijing, China) 0.4 μg을 각각 첨가하여 2 μg/mL의 농도를 만들었다. 모든 EP 튜브를 세포 인큐베이터에 넣고 30분 동안 방치한 후 EP 튜브를 꺼내 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하였다. 500 μl의 세포 염색 완충액(Invitrogen, CA, USA)으로 세포를 재현탁하고 세척한 후, 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하고 세척을 반복하였다. 세포 염색 완충액으로 항인간 IgG Alexa Fluor 647 항체(Invitrogen, CA, USA)를 1:1000 비율로 희석하고, 음성 대조군을 제외한 각 EP 튜브에 항체 희석액을 200 μl씩 첨가한 후, 실온에서 40 rpm으로 진탕기에서 30분 동안 배양하였다. EP 튜브를 꺼내 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하였다. 1000 μl의 세포 염색 완충액으로 세포를 재현탁하고 세척한 후, 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하고 세척을 반복하였다. 세척 완료 후 각 EP 튜브에 300 μl의 세포 염색 완충액을 첨가하여 재현탁하고, 테스트 튜브(Falcon, NY, USA)로 옮긴 후 유세포 분석기(Miltenyi Biotec, Cologne, Germany)로 분석하였다.
도 13(a)는 사멸된 세포를 제외한 임계값 설정을 보여준다. 도 13(b)는 ITPRIPL1의 발현 정도가 다른 세포와 CD3ε 단백질의 결합을 보여준다. 도 14는 도 13(b)의 각 조건에서의 구체적인 염색 및 단백질 결합을 각각 보여준다. 상기 결과는 CD3ε이 ITPRIPL1이 발현된 HCT116에 결합하고, ITPRIPL1이 과발현된 HCT116 세포에 더 강하게 결합한다는 것을 시사한다.
5. 루시페린 리포터 분석은 ITPRIPL1 세포외 도메인 정제 단백질 단편이 ConA로 활성화된 Jurkat-dual 세포의 NFKB 증식 신호를 억제한다는 것을 입증한다.
배양된 Jurkat-dual 세포(Invivogen, CA, USA)를 계수하고 1000 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후, 항생물질을 함유하지 않은 IMDM 배지(Gibco, CA, USA)로 재현탁하여 세포 수를 2 x 106/mL로 조정하고 투명한 96웰 플레이트(Thermo Fisher, MA, USA)에 웰당 200 μl의 세포를 분주하였다. 각 웰에 각각 0.2 μg, 0.4 μg, 0.8 μg의 ITPRIPL1-6x-His 재조합 단백질을 첨가하여 각각 1 μg/mL, 2 μg/mL, 4 μg/mL 농도를 만들었다. 세포 인큐베이터에서 2시간 동안 반응시킨 후, 각 웰에 콘카나발린A(ConA)(Aladdin, Shanghai, China) 10 μg/mL을 첨가하고 세포 인큐베이터에서 18-24시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후 불투명 96웰 플레이트(costar, ME, USA)의 각 웰에 Quanti-luc 시약(Invivogen, CA, USA) 50 μl와 반응 혼합액 20 μl를 넣고 잘 섞은 후 다기능 마이크로플레이트 판독기(Thermo Fisher, MA, USA)로 즉시 신호를 검출하였다.
도 15는 10 μg/mL ConA 활성화 조건에서 ITPRIPL1 단백질 농도에 따른 NFKB 신호 변화를 보여준다. 상기 결과는 ITPRIPL1-RBD 정제 단백질이 ConA로 활성화된 Jurkat-dual 세포의 NFKB 증식 신호를 농도 의존적인 방법으로 억제할 수 있음을 시사한다.
6. 루시페린 리포터 분석은 미소구체 표면에 고정된 ITPRIPL1 세포외 도메인 정제 단백질 단편이 ConA로 활성화된 Jurkat-dual 세포의 NFKB 증식 신호를 억제함을 입증한다.
G 단백질 자성 미소구체(Thermo Fisher, MA, USA)와 His 항체(Abcam, MA, USA)를 4개의 EP 튜브(Axygen, CA, USA)에 넣고 DNA 혼합기(Scientz, Ningbo, China)에 넣어 실온에서 최저속으로 1시간 동안 회전시켰다. 그중 3개의 EP 튜브에 각각 0.2 μg, 0.4 μg, 0.8 μg의 ITPRIPL1-6x-His 재조합 단백질을 첨가한 후 다시 실온에서 최저속으로 1시간 회전시켰다. 배양된 Jurkat-dual 세포(Invivogen, CA, USA)를 계수하고 1000 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후, 항생물질을 함유하지 않은 IMDM 배지(Gibco, CA, USA)로 재현탁하여 세포 수를 2 x 106/mL로 조정하고, 투명한 96웰 플레이트(Thermo Fisher, MA, USA)에 웰당 200 μl의 세포를 분주하였다. 각 웰에 각 EP 튜브의 내용물을 첨가하여 코팅 단백질 농도를 각각 1 μg/mL, 2 μg/mL, 4 μg/mL로 만들었다. 세포 인큐베이터에서 2시간 동안 반응시킨 후, 각 웰에 콘카나발린A(ConA)(Aladdin, Shanghai, China) 50 μg/mL을 첨가하고 세포 인큐베이터에서 18-24시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후, 불투명 96웰 플레이트(costar, ME, USA)의 각 웰에 Quanti-luc 시약(Invivogen, CA, USA) 50 μl와 반응 혼합액 20 μl를 넣고 잘 섞은 다음, 다기능 마이크로플레이트 판독기(Thermo Fisher, MA, USA)로 즉시 신호를 검출하였다.
도 16은 50 μg/mL ConA 활성화 조건에서 미소구체로 코팅된 ITPRIPL1 단백질 농도에 따른 NFKB 신호 변화를 보여준다. 상기 결과는 미소구체 표면에 고정된 ITPRIPL1-RBD 재조합 정제 단백질이 ConA로 활성화된 Jurkat-dual 세포의 NFKB 증식 신호를 농도 의존적인 방법으로 억제할 수 있음을 시사한다.
7. 다양한 유형의 종양 세포에서 ITPRIPL1의 발현 수준 측정
ITPRIPL1 세포외 도메인은 T세포와 같은 면역세포를 억제하는 기능을 가지고 있기 때문에 종양세포는 면역 시스템의 감시와 사멸을 피하기 위해 ITPRIPL1을 발현할 수 있다. 다양한 종양세포에서 ITPRIPL1이 비정상적으로 발현된 경우, ITPRIPL1이 종양의 발생 및 발전(면역회피 포함)을 촉진시킬 수 있음을 시사한다. 본 발명은 다양한 유형의 종양에서 유래한 세포주에서 ITPRIPL1이 비정상적으로 발현함을 개시한다. 구체적인 실험 절차는 다음과 같다: 배양된 각 세포주를 계수한 후, 2x106개의 세포를 15 ml 원심분리 튜브에 넣고 800 rpm으로 4분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거한다. PBS로 재현탁시킨 후 세척하여 800 rpm으로 4분 동안 원심분리한 후, PBS로 재현탁과 세척을 반복하였다. 원심분리 후 상청액을 제거하고 RIPA 세포 용해액 및 프로테아제, 포스파타제, PMSF의 트리플(triple)을 1:100의 비율로 제조하고, 각 튜브에 혼합 용해액 120 μl를 첨가하여 EP 튜브로 옮겼다. 각 EP 튜브는 액체질소-얼음 위에서 동결 및 해동을 3회 진행하였으며, 마지막 해동 후, 4℃에서 12000 rpm으로 15분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후 상청액을 취하여, 상청액 대 5x 로딩 완충액을 4:1의 비율로 다양한 세포 시료를 제조하고, 100℃의 메탈 배스에서 10분 동안 변성시켰다. 변성 완료 후, 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯 분석을 통해 GAPDH를 내부 참조로 사용하여 각 종양 세포주에서 ITPRIPL1의 내인성 발현을 확인하였다.
도 17은 웨스턴 블롯에서 GAPDH를 내부 참조로 조정한 후의 ITPRIPL1 발현 정도를 보여준다. 도 17에서 보는 바와 같이, 웨스턴 블롯 실험은 다양한 종양 세포주에서 ITPRIPL1 단백질의 발현 수준을 검출하였으며, LoVo 결장직장암, Raji 림프종, RL 림프종, MDA-MB-231 유방암, HCT116 결장직장암, A549 폐암, HL60, Jurkat 림프종, H1299 폐암, 및 A375 흑색종 세포에서 높은 수준으로 발현되었다. 발명자는 모든 유형의 종양세포에서 ITPRIPL1의 발현을 검출하지는 않았지만, 이미 검출한 종양세포에서 ITPRIPL1이 발현된 비율(10/11, 90% 이상)로 볼 때, ITPRIPL1은 악성 종양에서 다양한 유형으로 상당히 광범위하게 발현될 수 있다.
이에 따라 Protein Atlas 데이터베이스의 고처리량 mRNA 발현 프로파일 분석을 기반으로 추출한 결과에서, ITPRIPL1은 다양한 종양에서 발현이 크게 증가한 사례가 있을 수 있음을 시사하였다. 과거에는 ITPRIPL1의 기능에 대한 어떠한 보고도 없었다. 따라서 본 발명의 내용을 개시하기 전 당해 분야의 기술자는 종양의 발생, 발전 및 면역회피에서 ITPRIPL1이 수행하는 기능을 예견할 수 없었다. 본 발명은 ITPRIPL1 종양세포 단백질의 비정상적인 발현 수준 증가, ITPRIPL1 세포외 도메인의 CD3ε 결합, T세포 억제 등의 실험 데이터를 개시하여 종양 면역치료 표적으로서 ITPRIPL1의 중요한 가치를 처음으로 밝혀내었다.
도 18에서 보는 바와 같이, Protein Atlas 사이트에서 수집한 mRNA 발현 프로파일 데이터에 따르면, ITPRIPL1은 고환, 및 정상 조직이나 세포 중 T세포에서 주로 발현된다. mRNA의 발현은 단백질 발현수준을 직접적으로 대표할 수 없으며, 일반적으로 발현 프로파일 데이터의 재분석은 신뢰할 수 있는 결론을 도출하기 이전에 저처리량 생물학적 실험(예컨대, 단백질 겔 전기영동, 웨스턴 블롯 분석)에 의한 검증도 필요로 한다.
8. OCTET 분자 상호작용 실험은 ITPRIPL1 세포외 도메인 정제 단백질 단편이 CD3ε 단백질에 직접 결합할 수 있음을 입증한다.
OCTET 분석기를 작동시켰다. 100 μg의 CD3E-Fc 단백질(Sino Biological Inc., Beijing, China)을 Fc 프로브에 포화상태까지 흡착한 다음, ITPRIPL1 세포외 도메인 재조합 단백질 50 μg을 800 nM/1600 nM/3200 nM의 농도로 상응하게 결합시켜 결합 곡선을 작성하고 해리 상수를 계산하였다.
도 40은 전체 흡착-해리 과정과 계산된 관련 상수를 보여준다. 상기 결과는 ITPRIPL1의 세포외 도메인 정제 단백질 단편이 CD3E 단백질에 직접 결합할 수 있음을 증명한다.
실시예 6: 단리된 ITPRIPL1-RBD를 면역원으로 하여 체내에서 종양의 성장을 억제하는 항체 제조
1. 마우스 다클론항체 및 다클론항체 제조에 면역원으로 사용되는 ITPRIPL1-RBD Evacuation
인간 ITPRIPL1-RBD 재조합 단백질을 면역원으로 사용하여, 상기 실시예에서 시료의 순도와 생물학적 활성을 확인한 후, C57BL/6 마우스를 면역화시켰으며, 효과를 높이기 위해 다음과 같이 여러 번의 면역화를 진행하였다: (1) 1차 면역화, 항원 50 μg/개체, 완전 프로인트 애주번트 피하 다점 주사, 3주 간격; (2) 2차 면역화, 용량 및 투여 경로는 1차와 동일, 불완전 프로인트 애주번트, 3주 간격; (3) 3차 면역화, 용량은 1차와 동일, 애주번트 사용 안 함, 복강내 주사, 3주 간격; (4)부스터 면역화, 용량 50 μg, 복강내 주사. 마지막 주사 3일 후 혈액을 채취하여 역가를 측정하였다. 측정된 면역 효과가 요구 사항을 충족하면, 여러 번의 채혈, 다클론항체 분리, 다클론항체 정제 과정을 반복하였다. 구체적인 실험 절차는 다음과 같다: (1) G 단백질 세파로스(sepharose) CL-4B 친화성 컬럼 준비. 10 mL의 G 단백질 세파로스 CL-4B 충진제를 준비하고, 동일 부피의 충진제와 TBS 완충액을 진공 플라스크에 혼합하여 교반하였다. 충진제의 기포를 제거하기 위해 15분 동안 진공(evacuation)을 수행하였다. G 단백질 세파로스 CL-4B 충진제를 펌프를 이용해 충진 속도를 1 mL/분-2 mL/분으로 제어하면서 유리 컬럼에 천천히 첨가하였다. 컬럼이 건조되는 것을 방지하기 위하여, 컬럼은 미리 냉각한 TBS 완충액으로 충진 부피의 10배를 사용하여 평형화(equilibrate)하였다. (2) 다클론항체 제조. 단백질이 응집되지 않도록 다클론성 항체를 얼음물 또는 4°C의 냉장고에서 천천히 해동시켰다. 단백질의 해동 과정에서 나타나는 응집은 37°C로 예열하여 용해시킬 수 있다. 고체 아지드화나트륨을 0.05% 농도로 첨가하고, 4℃, 15,000×g으로 5분간 원심분리한 후, 침전된 다클론성 항체를 제거하고, 필터로 여과하여 과잉 지질을 제거하였다. (3) 친화성 크로마토그래피. 항체를 1:5 비율로 TBS 완충액에 희석한 후 필터로 여과시켰다. 분당 0.5mL의 속도로 다클론성 항체를 컬럼에 로딩시키고, 다클론성 항체와 충진제의 결합을 보장하기 위해 컬럼을 2회 연속 로딩하고 로딩 유출액을 유지하였다. 컬럼을 TBS 완충액으로 Aλ 280 nm<0.008이 될 때까지 세척한 후, Ph 2.7의 용리 완충액을 첨가하여 0.5 mL/min의 속도로 모든 단백질이 용출될 때까지 용리하였다. 100 μl의 중화 완충액을 첨가한 1.5 mL EP 튜브에 용리액을 수집하고 혼합한 후, pH 시험지로 용리액의 pH를 확인하고, pH가 7 미만인 경우 중화 완충액을 사용해 약 pH 7.4로 조정하여 항체의 변성을 방지하였다. 컬럼에10 mL, pH1.9의 용리 완충액을 첨가하고 상기 방법에 따라 Aλ 280 nm<0.008이 될 때까지 용리액을 수집하였다. 분광광도계를 사용하여 각 튜브의 단백질 함량을 측정하였다.
2. 효소결합면역흡착분석(ELISA)은 ITPRIPL1-RBD를 면역원으로 하는 다클론항체가 ITPRIPL1 발현 세포에 결합할 수 있음을 입증하였다.
ELISA 전용 플레이트(costar, ME, USA)를 사용하였다. 먼저 ITPRIPL1이 발현되지 않는 B16 세포(ATCC, VA, USA), ITPRIPL1이 중간 정도 발현된 LoVo 세포(ATCC, VA, USA) 및 안정적으로 형질감염된 HCT116-ITPRIPL1 세포주를 트립신으로 소화시켜 계수하고, 세포 수를 2x106/mL로 조정한 후, 웰당 100 μl의 세포를 플레이팅하여 4°C에서 밤새 코팅하였다. PBST로 세척 후, 5% 탈지분유를 함유한 PBS(Sangon, Shanghai, China) 100 μl로 37°C 인큐베이터에서 90분 동안 차단시켰다. PBST로 세척 후, 총 IgG 농도 10 mg/ml의 다클론성 항체를 1:1000/1:500/1:250/1:125로 구배 희석시키고, 플레이팅된 세포와 함께 37°C 인큐베이터에서 60분 동안 결합시켰다. PBST로 세척 후, PBS로 희석한 특이적 항-마우스 Fc 세그먼트 항체(Consun, Shanghai, China)를 37°C 인큐베이터에서 30분 동안 배양시켰다. PBST로 세척 후, 발색액(Sangon, Shanghai, China)을 웰당 100 μl씩 분주하고 인큐베이터에서 5~30분 동안 반응시킨 후, 정지액(Sangon, Shanghai, China) 50 μl를 추가로 첨가하여, 마이크로플레이트 판독기(Thermo Fisher, MA, USA)로 450nm에서 발색을 판독하였다.
도 19(a)는 B16 세포와 다양한 농도의 다클론성 항체의 결합률 변화를 보여준다. 도 19(b)는 LoVo 세포와 다양한 농도의 다클론성 항체의 결합률 변화를 보여준다. 도 19(c)는 안정적으로 형질감염된 HCT116-ITPRIPL1 세포주와 다양한 농도의 다클론성 항체의 결합률 변화를 보여준다. 이 실험은 다클론성 항체의 IgG 농도가 증가함에 따라 B16 세포와 다클론성 항체의 결합률은 뚜렷한 변화를 보이지 않았으며, LoVo 세포와 다클론성 항체의 결합률은 어느 정도 농도 의존적으로 증가했으며, 안정적으로 형질감염된 HCT116-ITPRIPL1 세포주와 다클론성 항체의 결합률은 뚜렷하게 농도 의존적으로 증가한 것으로 나타났다. 상기 결과는 다클론성 항체가 ITPRIPL1 발현 세포에 결합할 수 있다는 것을 증명한다.
3. 효소결합면역흡착분석(ELISA)은 다클론항체가 ITPRIPL1과 CD3ε의 결합을 차단할 수 있음을 입증한다.
ELISA 전용 플레이트(costar, ME, USA)를 사용하였다. 먼저, hFc 태그가 있는 CD3ε(Met 1-Asp117) 단백질 단편(Sino Biological Inc., Beijing, China) 0.1 μg을 100 μl의 ELISA 코팅액(Solarbio, Beijing, China)에 녹여 분주하고, 음성 대조군으로 단백질을 포함하지 않은 코팅액 100 μl를 분주하였다. 플레이트는 4℃에서 밤새 코팅하였다. PBST로 세척 후, 5% 탈지분유를 함유한 PBS(Sangon, Shanghai, China) 100 μl로 37°C 인큐베이터에서 90분 동안 차단시켰다. PBST로 세척 후, ITPRIPL1-RBD-6x-His 단백질 2 μg/ml을 각각 1:1000/1:500/1:250/1:125의 비율로 총 IgG 농도 10 mg/ml의 다클론성 항체와 혼합한 다음, 37°C의 인큐베이터에서 60분 동안 결합시키기 위해 공동배양시켰다. PBST로 세척 후, PBS로 희석한 특이적 항-6x-His 태그 서양고추냉이 퍼옥시다제 항체(Abcam, MA, USA)를 37°C 인큐베이터에서 30분 동안 결합시키기 위해 배양시켰다. PBST로 세척 후, 발색액(Sangon, Shanghai, China)을 웰당 100 μl씩 분주하고, 플레이트를 인큐베이터에서 5~30분 동안 반응시킨 후, 정지액(Sangon, Shanghai, China) 50 μl를 추가로 첨가하여, 마이크로플레이트 판독기(Thermo Fisher, MA, USA)로 450nm에서 발색을 판독하였다.
도 20에서 보는 바와 같이, 이 실험에서 다클론성 항체의 IgG 농도가 증가함에 따라 CD3ε와 ITPRIPL1-RBD 단백질의 결합률이 점차 감소하는 것으로 나타났다. 상기 결과는 다클론성 항체가 ITPRIPL1과 CD3ε의 결합을 차단할 수 있다는 것을 증명한다.
4. 유세포 분석은 다클론항체가 ITPRIPL1과 CD3ε 과발현 세포의 결합을 차단할 수 있다는 것을 입증한다.
안정적으로 형질감염된 HCT116-CD3ε 세포주를 소화시킨 후 계수하고, 세포 수를 2x105/mL로 조정한 후, 각각 1.5 ml EP 튜브(Axygen, CA, USA) 8개에 200 μl씩 분주하였다. EP 튜브에 IT1-RBD 단백질 0.8 μg을 첨가하여 각각 4 μg/mL의 농도를 만들었다. EP 튜브 5개에는 각각 1:1000/1:500/1:250/1:125/1:67.5로 희석된 총 IgG 농도 10 mg/ml의 다클론성 항체를 첨가한 후, 세포 인큐베이터에 30분 동안 방치하였다. EP 튜브를 꺼내 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하였다. 500 μl의 세포 염색 완충액(Invitrogen, CA, USA)으로 세포를 재현탁하고 세척한 후, 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 다음, 상청액을 제거하고 세척을 반복하였다. 세포 염색 완충액으로 6x-His-FITC 항체(Abcam, MA, USA)를 1:500 비율로 희석하고, 음성 대조군을 제외한 각 EP 튜브에 항체 희석액을 200 μl씩 첨가한 후, 실온에서 40 rpm으로 진탕기에서 30분 동안 배양하였다. EP 튜브를 꺼내 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하였다. 1000 μl의 세포 염색 완충액으로 세포를 재현탁하고 세척한 후, 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하고 세척을 반복하였다. 세척 완료 후 각 EP 튜브에 300 μl의 세포 염색 완충액을 첨가하여 재현탁하고, 테스트 튜브(Falcon, NY, USA)로 옮긴 후 유세포 분석기(Miltenyi Biotec, Cologne, Germany)로 분석하였다.
도 21(a)는 사멸된 세포를 제외한 임계값 설정을 보여준다. 도 21(b)는 다클론성 항체의 농도에 따른 ITPRIPL1과 CD3ε의 결합률 변화를 보여주는 것이다. 도 22는 도 21(b)의 각 조건에서의 구체적인 염색 및 단백질 결합을 보여준다. 상기 분석 결과 다클론성 항체가 ITPRIPL1과 CD3ε 과발현 세포의 결합을 차단할 수 있다는 것이 확인되었다.
5. 다클론항체를 기반으로 단클론항체를 제조하고, 종양 성장을 억제하는 항체의 효과를 추가로 입증한다.
ITRPRIPL1은 다양한 종양에서 발현이 상향 조절되므로, ITPRIPL1에 특이적으로 결합하는 항체는 체내의 종양세포를 식별할 수 있으며, 항체의 불변 영역 Fc 세그먼트를 통해 ADCC, ADCP 및 CDC 작용을 하여 종양세포를 사멸시킬 수 있다. ADCC, 즉, 항체 의존성 세포매개 세포독성 작용(Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity)은 항체의 Fab 부분이 바이러스에 감염된 세포 또는 종양세포의 항원 에피토프에 결합하고, 그의 Fc 부분이 킬러 세포(NK 세포, 대식세포, 호중구 등) 표면의 FcR과 결합하여 킬러 세포가 표적 세포를 직접 사멸시키는 것을 매개하는 것을 의미하며, 이는 항종양 치료용 항체 약물이 작용하는 중요한 기전이다. ADCP는 항체 의존성 세포성 식균 작용(Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis)으로, 종양세포에 대한 치료용 항체의 작용을 확인하고 매개하는 데 사용되는 중요한 기전이다. CDC는 보체 의존성 세포독성(Complement Dependent Cytotoxicity)으로, 보체가 관여하는 세포독성을 지칭하며, 특이적 항체가 세포막 표면의 해당 항원에 결합하여 복합체를 형성하고, 보체의 고전적 경로를 활성화하여 형성된 막공격 복합체를 통해 표적 세포를 용해시킨다. 이 실시예에서는 ITPRIPL1 세포외 도메인을 특이적으로 인식하는 항체에 의한 종양 성장 억제 효과를 확인할 것이다. 구체적인 실시 절차는 다음과 같다:
a) 융합을 통해 얻은 하이브리도마 세포를 희석하여 96웰 플레이트에 분주하고(추정 밀도는 웰당 약 0.5개 세포임) 클론이 형성될 때까지 추가로 인큐베이션하였다. 단클론 하이브리도마 배지의 상청액을 취하여 ELISA 실험을 진행하고, 분주된 ITPRIPL1(RBD1 단백질) 0.2 μg/mL과의 항원 결합 정도를 측정하였다. OD450 흡수값에 따라 순위를 매기고 가장 강하게 결합된 항체의 단클론 하이브리도마 세포를 취하여, 증식시켜 배양하고, 복수(ascites) 항체(이하 RBD1 결합 항체라 칭함)를 제조하여 동물 체내 기능 연구에 사용하였다.
b) 구축된 전장 ITPRIPL1-Flag 플라스미드와 빈 pcDNA3.1 플라스미드로 각각 MC38 세포(Kerafast, MA, USA)를 형질감염시키고, 인큐베이터에서 24-48시간 동안 배양한 후, 200 μg/mL의 게네티신(Geneticin, G418)(Gibco, CA, USA)을 첨가하여 스크리닝하였다. 10-14일이 지나고, 빈 pcDNA3.1 플라스미드-형질감염군의 세포가 모두 사멸된 후, 안정적으로 형질감염된 MC38-ITPRIPL1 세포주를 수득하였다. 6-8주령의 인간화 CD3ε 마우스(Model Organisms Center, Shanghai, China)를 선택하여 체중에 따라 무작위로 군(group)을 나눠, 각 군에 6마리씩 배정하였다. MC38 야생형 및 안정적으로 형질감염된 MC38-ITPRIPL1 세포주를 계수하고 PBS로 재현탁하여 1.5x107/mL의 세포 밀도를 만들었다. 제모한 마우스의 오른쪽 겨드랑이에 1.5 x106의 ITPRIPL1 과발현 MC38 세포를 피하 접종하여 인간화 CD3ε 마우스 MC38 ITPRIPL1 과발현 피하 종양이식 생체 내 모델을 구축하였다. 종양 접종 5일째부터 각 군의 MC38 ITPRIPL1 과발현 이식 종양-보유 마우스에 3일 간격으로 100 μg의 RBD1 결합 항체 또는 동일한 양의 PBS를 복강내 주사한 후, 3일 간격으로 총 4회 주사하였다. 종양의 크기는 버니어 캘리퍼스로 측정하였다. 종양의 장직경과 단직경을 각각 측정하고, 1/2*A*a*a의 공식을 사용하여 종양의 부피를 계산하였다. 3일마다 측정을 실시하고 종양의 부피를 기록하였다. 접종 후 23일째에, 모든 마우스를 희생시키고 종양을 적출하여 무게를 측정하고 통계적으로 분석하였다. 도 71에서 보는 바와 같이, 종양의 크기 및 종양의 무게는, RBD1 결합 항체로 치료 후 종양의 성장이 유의하게 억제되었음을 보여줌으로써, ITPRIPL1 단클론성 항체가 생체 내 기능을 가지고 있음을 증명하였다.
c) 유세포 분석은 ITPRIPL1 단클론성 항체가 ITPRIPL1 과발현 종양의 T세포 활성을 유의하게 증가시킬 수 있다는 것을 보여주었다. 심장 채혈 방식으로 마우스 체내에서 최소 1ml의 말초 혈액을 채취하였다. 마우스 말초 혈액 PBMC 분리 키트(Solarbio, Beijing, China)를 사용서에 따라 조작하여 마우스 PBMC 세포를 수득하였다. 마우스 PBMC를 EP 튜브(Axygen, CA, USA)에 넣고 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하였다. 500 μl의 세포 염색 완충액(Invitrogen, CA, USA)으로 세포를 재현탁하고 세척한 후, 원심분리와 세척을 반복하였다. 세포 염색 완충액에 마우스 CD8-APC 항체(Biolegend, CA, USA), 마우스 CD69-APC 항체(Biolegend, CA, USA), 마우스 CD137-APC 항체(Biolegend, CA, USA)를 1:20으로 희석하고, 각 EP 튜브에 혼합액 200 μl를 첨가하여 재현탁한 후 실온에서 천천히 흔들어 30분 동안 배양하였다. 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하고, 500 μl의 세포 염색 완충액으로 세포를 재현탁하고 세척한 후, 원심분리와 세척을 반복하였다. 각 EP 튜브에 200 μl의 세포 염색 완충액을 첨가하고, 테스트 튜브(Falcon, NY, USA)로 옮긴 후 유세포 분석기(Miltenyi Biotec, Cologne, Germany)로 분석하였다. 도 72에서 보는 바와 같이, 세포 형광 양성률에 따르면, RBD1 결합 항체는 CD8, CD25 및 CD139의 발현을 유의하게 증가시킬 수 있다. 이 실험 결과는 RBD1 결합 항체가 마우스 체내의 T세포 활성을 억제하는 ITPRIPL1의 기능을 완화할 수 있다는 것을 나타낸다.
d) 면역조직화학염색은 RBD1 결합 항체가 ITPRIPL1 과발현 종양의 면역세포 침윤을 유의하게 증가시킬 수 있음을 보여주었다. MC38-ITPRIPL1 과발현 종양 조직을 적출한 후 절편으로 자르고 파라핀 포매 처리(BIOSSCI, Wuhan, China)하였다 수득한 파라핀 절편에서 파라핀 제거, 수화, 항원 복구 등을 처리한 후, 마우스 CD8 항체(CST, MA, USA)를 습식 배양기에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날 재가온 후 시약 설명서에 따라 2차 항체를 인큐베이션하고, DAB 염색(Solarbio, Beijing, China) 및 헤마토실린 염색(Solarbio, Beijing, China) 후, 알코올 농도를 점진적으로 증가하여 공기 건조하고 밀봉하였다. 밀봉한 절편을 형광현미경에서 자연광으로 관찰하고 촬영하였다. 도 73에서 보는 바와 같이, RBD1 결합 항체 사용 후 종양 조직에서 CD8의 양성률을 유의하게 증가시킬 수 있었다. 이 실험 결과는 RBD1 결합 항체가 MC38 ITPRIPL1이 과발현된 종양 조직에서 면역세포의 침윤을 증가시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
상기 결과는 ITPRIPL1 세포외 도메인, 즉, RBD1을 특이적으로 식별하는 항체가 체내에서 종양세포의 성장을 유의하게 억제시킬 수 있다는 것을 시사한다. ITPRIPL1은 원발성암, 림프전이암, 원거리 전이암에서 동시에 발현되기 때문에 항체 약물이 다양한 부위 및 발전 단계의 종양에서 작용할 수 있으며, ADCC, ADCP, CDC 등의 작용을 통해 보다 지속적이고 광범위한 항종양 효과를 발휘하고, 종양 국소 면역 반응을 활성화할 수 있다. 또한, ITPRIPL1은 상기 종양의 대조군인 정상 조직에서 매우 낮게 발현되었기 때문에 ITPRIPL1에 대한 항체가 정상 조직 및 세포에 발생시킬 수 있는 독성 부작용은 매우 제한적이다. 상기 특성은 ITPRIPL1 특이적 항체가 새로운 항암 요법으로서 가지는 두드러진 장점과 응용 가능성을 뚜렷하게 보여준다.
실시예 7: ITPRIPL1-RBD와 CD3 세포외 도메인의 결합을 조절하여 T세포 유래 세포주의 증식 신호전달경로 활성화 조절
이전 연구에 따르면 CD3ε의 결합은 T세포의 증식과 기능의 변화를 일으킬 수 있으나, T세포는 1차 세포로 개입 및 검출에 적합하지 않기 때문에 이러한 연구에 가장 널리 사용되는 모델은 T세포 유래 세포주인 Jurkat 세포이며, NF-KB의 신호전달은 Jurkat 또는 T세포의 활성 정도를 나타내는 검출 지표로 광범위하게 사용된다. 따라서 우리는 Jurkat-NFKB 리포터 세포주를 구축하여(NF-KB 프로모터 하류에 반딧불이 루시페라제를 렌티바이러스를 통해 Jurkat 세포로 형질도입시키고, 검출 후 콘카나발린 A로 활성화 가능함) 종양세포에서 ITPRIPL1의 발현 정도가 공동 배양된 T세포의 기능에 미치는 영향을 조사하였다.
먼저, 도 23에서 보는 바와 같이, 루시페린 리포터 분석을 통해 ITPRIPL1을 과발현한 HCT116 세포가 Jurkat-dual 세포의 NFKB 증식 신호를 더 많이 감소시킨다는 것이 증명되었다. 배양된 Jurkat-dual 세포를 계수하고 1000 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후, 항생물질을 함유하지 않은 IMDM 배지로 재현탁하여 세포 수를 2x106/mL로 조정하고 투명한 96웰 플레이트에 웰당 200 μl의 세포를 분주하였다. HCT116 세포와 안정적으로 형질감염된 HCT116-ITPRIPL1 세포주를 트립신으로 소화시켜 계수하고, 세포 수를 2x106/mL로 조정한 후, 각각 20 μl를 첨가하여 해당 Jurkat-dual 세포와 혼합하였다. 세포 인큐베이터에 18-24시간 공동 배양하였다. 반응 완료 후 불투명 96웰 플레이트의 각 웰에 Quanti-luc 시약 50 μl와 반응 혼합액 20 μl를 넣고 잘 섞은 후 다기능 마이크로플레이트 판독기로 즉시 신호를 검출하였다. 상기 도는 ITPRIPL1 발현 HCT116 세포가 Jurkat-dual 세포의 NFKB 증식 신호를 억제할 수 있으며, ITPRIPL1 과발현 HCT116 세포는 NFKB 증식 신호를 더욱 유의하게 감소시킬 수 있다는 것을 보여준다. 상기 결과를 통해 ITPRIPL1을 과발현한 HCT116 세포가 Jurkat-dual 세포의 NFKB 증식 신호를 더 많이 감소시킬 수 있다는 것을 알 수 있다.
또한, 루시페린 리포터 분석 결과는 도 24에서 보는 바와 같이, CD3ε 단백질이 ITPRIPL1 단백질의 Jurkat-dual 세포에 대한 NFKB 증식 신호 억제를 차단할 수 있다는 것을 증명한다. 배양된 Jurkat-dual 세포를 계수하고 1000 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후, 항생물질을 함유하지 않은 IMDM 배지로 재현탁하여 세포 수를 2x106/mL로 조정하고 투명한 96웰 플레이트에 웰당 200 μl의 세포를 분주하였다. 각 웰에 각각 2 μg/mL의 ITPRIPL1 단백질과 0 μg/mL, 1 μg/mL, 2 μg/mL, 4 μg/mL의 CD3ε 단백질 혼합물을 분주하였다. 세포 인큐베이터에서 2시간 동안 반응시킨 후, 각 웰에 콘카나발린A 50 μg/mL을 첨가하고 세포 인큐베이터에서 18-24시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후 불투명 96웰 플레이트의 각 웰에 Quanti-luc 시약 50 μl와 반응 혼합액 20 μl를 넣고 잘 섞은 후 다기능 마이크로플레이트 판독기로 즉시 신호를 검출하였다. 상기 도는 50 μg/mL ConA 활성 조건에서 2 μg/mL ITPRIPL1 단백질과 다양한 농도의 CD3ε 단백질이 첨가된 조건에서의 Jurkat-dual 세포의 NFKB 신호 변화를 나타낸다. 상기 결과는 Jurkat-dual 세포에서 ITPRIPL1 단백질에 의해 ConA 활성화된 NFKB 증식 신호 억제는 CD3ε 단백질에 의해 농도 의존적으로 차단될 수 있고, 이는 ITPRIPL1의 억제 작용이 CD3ε를 통해 발생한다는 것을 시사한다.
실시예 8: 인간 말초 혈액 단핵구(PBMC)의 신장 유래 H3K293 세포 사멸력을 감소시키는 ITPRIPL1-RBD 재조합 단백질
유세포 분석 결과 ITPRIPL1-RBD 재조합 단백질이 인간 말초 혈액 단핵구(PBMC)의 신장 유래 H3K293 세포 사멸력을 감소시킬 수 있다는 것이 확인되었다. CD3을 CD28 항체(Invitrogen, CA, USA) 및 PBMC(ATCC, VA, USA)와 혼합 희석하여 최종 농도 1 μg/mL로 T세포를 활성화하고 밤새 배양하였다. 다음 날 PBMC와 293E(ATCC, VA, USA) 세포를 계수하고, 각각 세포 수를 1x106/mL로 조정하였다. 대조군에는 293E 세포 100 μl와 배양액 100 μl를 첨가하고, 실험군에는 두 세포를 각각 100 μl씩 96웰 플레이트(Thermo Fisher, MA, USA)에 첨가하고 4개의 실험군에는 각각 1, 2, 4, 8 μg/ml의 ITPRIPL1-RBD 재조합 단백질을 첨가하여 인큐베이터에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 96웰 플레이트를 꺼내 각 웰의 세포를 EP 튜브(Axygen, CA, USA)에 넣고 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하였다. 500 μl의 세포 염색 완충액(Invitrogen, CA, USA)으로 세포를 재현탁하고 세척한 후, 원심분리와 세척을 반복하였다. 세포 염색 완충액 1:20으로 CD45-APC 항체(Invitrogen, CA, USA)를 희석하고 각 EP 튜브에 혼합액 200 μl를 첨가하여 재현탁한 후 실온에서 천천히 흔들어 30분 동안 배양하였다. 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하고, 1 ml의 결합완충액(binding buffer; Meilun Biotech, Shanghai, China)으로 세포를 재현탁하고 세척한 후, 원심분리와 세척을 반복하였다. PBMC 불포함 무염색군, PBMC 불포함 이중염색군, PBMC 포함 무염색군, PBMC 포함 단일염색 Annexin V-FITC군, PBMC 포함 단일염색 PI군, PBMC 포함 이중염색군 및 각각 ITPRIPL1 단백질을 첨가한 이중염색군을 설정하고 조건에 따라 각각 결합완충액 100 μl, Annexin V-FITC(Meilun Biotech, Shanghai, China) 5 μl, PI(Meilun Biotech, Shanghai, China) 10 μl를 첨가하고 실온에서 천천히 흔들어 15분간 배양한 후, 각각 결합완충액 400 μl를 첨가하여 테스트 튜브(Falcon, NY, USA)에 옮긴 다음, 유세포 분석기(Miltenyi Biotec, Cologne, Germany)로 분석하였다.
도 25(a)와 (b)는 CD45로 구분된 293E 세포를 보여주는 것이다. 도 25(c)는 다양한 ITPRIPL1 단백질 농도 조건에서 각 군의 사멸 데이터를 기반으로 계산된 PBMC의 상대적 사멸 활성을 보여주는 것이다. 도 26은 도25(c)의 각 조건에서의 구체적인 세포사멸 염색 수준을 보여준다. 상기 결과를 통해 ITPRIPL1-RBD 재조합 단백질이 말초 혈액 단핵구(PBMC)의 신장 유래 H3K293 세포 사멸력을 감소시킬 수 있다는 것을 알 수 있다.
실시예 9: 유전자 편집으로 ITPRIPL1이 녹아웃된 종양세포에서 인간 말초 혈액 단핵구의 종양세포 사멸력 증가 확인
1. CRISPR/Cas9 유전자 편집 시스템, 즉, 퓨로마이신 내성을 지닌 ITPRIPL1를 특이적으로 절단하는 sgRNA의 렌티바이러스를 구축하였다.
실험의 전체적인 절차: 먼저 gRNA 서열의 단일 가닥 DNA 올리고를 합성하고 어닐링하여 이중 가닥 DNA 올리고를 생성한 다음, 그 양 끝에 포함된 제한효소 절단부위를 통해 절단된 CRISPR/Cas9 벡터에 직접 연결하고, 연결 생성물을 준비된 박테리아 컴피턴트 세포로 옮긴 후, 생성된 단클론 콜로니를 시퀀싱 회사에 보내 염기 서열을 분석한 후 대조하여 서열이 일치하는 클론이 성공적으로 구축된 CRISPR/Cas9 벡터가 되었다. 타겟 유전자의 표적 유전자 서열의 경우 공용 웹사이트에서 제공하는 gRNA 서열 설계 원칙을 이용하여 서열번호 11-13으로 표시되는, 여러 개의 표적 부위 서열을 설계하였다. 유전자 염기 서열에 따라 3쌍의 gRNA 올리고머 단일 가닥 DNA를 설계 및 합성하였으며, 올리고 염기서열은 서열번호 14-19으로 표시되고, 그중 서열번호 14, 15는 표적 염기 서열 서열번호 11에 해당하는 gRNA 올리고머 단일 가닥 DNA 염기 서열이며; 서열번호 16,17은 표적 염기 서열 서열번호 12에 해당하는 gRNA 올리고머 단일 가닥 DNA 염기 서열이고; 서열번호 18,19는 표적 염기 서열 서열번호 13에 해당하는 gRNA 올리고머 단일 가닥 DNA 염기 서열이다. 올리고머 단일 가닥 DNA를 이중 가닥으로 어닐링하고, 이중 가닥 gRNA 올리고를 각각 CRISPR/Cas9 벡터에 삽입하여 CRISPR/Cas9 재조합 플라스미드를 구축하고 컴피턴트 세포 Stbl3으로 형질전환시켰다. 벡터 구축의 구체적인 절차는 다음과 같다:
1) gRNA의 어닐링: 프라이머를 멸균된 TE 완충액으로 희석하여 최종 농도를 100 μMol로 만들었다. 상류 및 하류의 프라이머 10 μl를 취하여 혼합하고 피펫팅으로 고르게 섞어준 후 PCR 튜브에 넣고 어닐링한 다음, 얼음 위에 몇 분 동안 방치하여 직접 연결시키거나 -20°C에서 냉동 보관하였다.
2) CRISPR/Cas9 벡터의 효소 절단 및 회수: 효소 절단 시스템은 다음과 같다: CRISPR/Cas9 벡터 5 μg; 10* 완충액 5 μl; BsmBI 4 μl; ddH2O로 50 μl까지 보충함. 37°C에서 약 30분 동안 효소 절단하였다. 0.8% 아가로스 겔을 준비하여 효소 절단이 완료된 후 핵산 전기영동을 수행하였다. 전기영동이 끝난 후 타겟 단편이 포함된 겔 스트립을 잘라내었다. 저울로 총중량을 재고 빈 튜브의 무게를 빼서 겔의 무게를 계산하고, 100 mg을 약 100 μl로 겔의 부피를 계산한 후, 겔 부피의 3배에 해당하는 QG 완충액을 첨가하여 50℃ 수욕조에 넣어 겔을 완전히 녹이고, 그 동안 EP 튜브를 적절히 흔들어 겔의 용해를 가속화시켰다. 겔이 완전히 녹으면 겔과 같은 부피의 이소프로필 알코올을 넣고 잘 섞어주었다. 위의 액체를 전부 필터 컬럼으로 옮기고 13,000 rpm으로 30초 동안 원심분리하였다. 튜브 안의 액체를 버리고 컬럼에 750 μl의 PE 완충액을 추가하여 1분 동안 원심분리하였다. 튜브 안의 액체를 버리고 다시1분 동안 원심분리하였다. 새로운 1.5 ml EP 튜브로 교체하여 컬럼에 50 μl의 EB 완충액을 넣고 1분 동안 원심분리하여 벡터를 회수하였다.
3) CRISPR/Cas9 벡터와 프라이머의 연결. 연결 시스템은 다음과 같다: 회수 벡터 3 μl(50 ng); 올리고 프라이머 1 μl(0.5 μM); T4 DNA 리가제 완충액 1.5 μl; T4 DNA 리가제 1μl; ddH2O로 15 μl까지 보충함. 25℃의 수조에서 30분 동안 배양하였다.
4) 형질전환: 컴피턴트 세포를 얼음 위에서 자연 해동시킨 후, 연결 생성물을 모두 컴피턴트 세포에 첨가하고 얼음 위에 20분 동안 방치한 다음, 42°C의 수조에서 90초 동안 열충격을 주었다. 그런 다음 신속하게 얼음 위로 옮겨 2-3분 동안 방치하였다. 항생물질을 함유하지 않은 LB 배지 1000 μl를 첨가하여 37℃에서 150 rpm으로 45분 동안 진탕 배양하였다. 3000 rpm으로 2분 동안 원심분리하고 상청액 약 850 μl를 제거한 후 튜브 바닥에 있는 박테리아 용액을 피펫팅으로 분산시킨 후, 해당 내성이 있는 페트리 접시에 넣고 멸균 처리된 어플리케이터로 골고루 펴서 도말하여 37°C 항온 인큐베이터에 뒤집어서 밤새 배양하였다.
5) 재조합 플라스미드 제조: 몇 개의 단일 콜로니를 선택하여 소량의 진탕 배양을 진행하였다.
6) 양성 클론을 시퀀싱하고 대조하여 재조합 클론에 삽입한 단편의 서열과 설계한 올리고 서열이 완전히 일치하여 벡터를 성공적으로 구축하였다.
2. CRISPR/Cas9 유전자 편집 시스템으로 유전자를 편집하여 HCT116-ITPRIPL1 녹아웃 세포주를 구축하였다.
HCT116 세포(ATCC, VA, USA)를 적절한 밀도(2일차에 약 30-40% 밀도로 성장)로 24웰 플레이트(Corning, NY, USA)에 분주하고, 다음날 소화시켜 계수한 후, 먼저 GFP 대조 렌티바이러스(Genomeditech, Shanghai, China)의 양적 구배로 세포를 감염시켰다. 48시간 후에 용액을 교환하고 72시간 후에 GFP 형광을 관찰하여 최적의 바이러스 대 세포 감염 비율을 결정하여 MOI 값을 탐색하였다. MOI 값을 결정한 후 다시 분주하여 블라스티사이딘 내성을 지닌 Cas9 시스템 렌티바이러스(Genomeditech, Shanhai, China)를 MOI 값으로 HCT116 세포를 감염시키고, 48시간 후에 용액을 교환한 후, 72시간 후에 농도 구배로 블라스티사이딘(Invivogen, CA, USA)을 첨가하고 10-14일 동안 스크리닝하여 최종적으로 Cas9 시스템을 함유한 HCT116 세포를 수득하였다. 그런 다음, Cas9 시스템을 포함하는 HCT116 세포를 24웰 플레이트에 분주하고, MOI 값을 사용하여 ITPRIPL1을 특이적으로 절단하는, 퓨로마이신 내성을 지닌 sgRNA를 포함하는 렌티바이러스로 감염시키고, 48시간 후에 용액을 교환하였다. 72시간 후에 농도 구배로 퓨로마이신(Invivogen, CA, USA)을 첨가하고 10-14일 동안 스크리닝하여 HCT116-ITPRIPL1 녹아웃 세포주를 수득하였다.
3. 유세포 분석은 종양세포에 발현된 ITPRIPL1의 녹아웃이 인간 말초 혈액 단핵구의 종양세포 사멸력을 크게 증가시킬 수 있다는 것을 입증한다.
CD3을 CD28 항체(Invitrogen, CA, USA) 및 PBMC(ATCC, VA, USA)와 혼합 희석하여, 최종 농도 1 μg/mL로 T세포를 활성화하고 밤새 배양하였다. 다음 날 PBMC와 HCT116 야생형(ATCC, VA, USA)/ITPRIPL1 과발현/ITPRIPL1 녹아웃 세포를 계수하고, 각각 세포 수를 1x106/mL로 조정하였다. 대조군에는 종양세포 100 μl와 배양액 100 μl를 첨가하고, 실험군에는 종양세포와 PBMC를 각각 100 μl씩 96웰 플레이트(Thermo Fisher, MA, USA)에 첨가하여 인큐베이터에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 96웰 플레이트를 꺼내 PBS(Meilun Biotech, Dalian, China)로 세척하고, EDTA를 함유하지 않은 트립신(Beyotime, Shanghai, China)으로 세포를 소화시킨 후, EP 튜브(Axygen, CA, USA)에 넣고 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하였다. 500 μl의 세포 염색 완충액(Invitrogen, CA, USA)으로 세포를 재현탁하고 세척한 후, 원심분리와 세척을 반복하였다. 세포 염색 완충액에 CD45-APC 항체(Invitrogen, CA, USA)를 1:20으로 희석하고, 각 EP 튜브에 혼합액 200 μl를 첨가하여 재현탁한 후 실온에서 천천히 흔들어 30분 동안 배양하였다. 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하고, 1 ml의 결합완충액(Meilun Biotech, Dalian, China)으로 세포를 재현탁하고 세척한 후, 원심분리와 세척을 반복하였다. PBMC 불포함 무염색군, PBMC 불포함 이중염색군, PBMC 포함 무염색군, PBMC 포함 단일염색 Annexin V-FITC군, PBMC 포함 단일염색 PI군, PBMC 포함 이중염색군 및 각각 IT1 단백질을 첨가한 이중염색군을 설정하고 조건에 따라 각각 결합완충액 100 μl, Annexin V-FITC(Meilun Biotech, Dalian, China) 5 μl, PI(Meilun Biotech, Dalian, China) 10 μl를 첨가하고 실온에서 천천히 흔들어 15분간 배양하였다. 각각 결합완충액 400 μl를 첨가하여 테스트 튜브(Falcon, NY, USA)에 옮긴 다음, 유세포 분석기(Miltenyi Biotec, Cologne, Germany)로 분석하였다.
도 27(a)와 (b)는 CD45로 구분된 종양세포를 보여준다. 도 27(c)는 다양한 ITPRIPL1 발현 조건에서 각 군의 사멸 데이터를 기반으로 계산된 PBMC의 상대적 사멸 활성을 보여준다. 도 28은 도27(c)의 각 조건에서의 구체적인 세포사멸 염색 수준을 보여준다. 상기 결과는 ITPRIPL1의 과발현이 PBMC의 종양세포 사멸력을 감소시키는 반면, ITPRIPL1 녹아웃이 PBMC의 종양세포 사멸력을 촉진시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 10: 면역세포의 종양세포 사멸력을 유의하게 촉진시키는 ITPRIPL1-RBD 단백질을 면역원으로 제조된 항체
CD3을 CD28 항체(Invitrogen, CA, USA) 및 PBMC(ATCC, VA, USA)와 혼합 희석하여 최종 농도 1 μg/mL로 T세포를 활성화하고 밤새 배양하였다. 다음 날 PBMC와 HCT116 세포(ATCC, VA, USA)를 계수하고, 각각 세포 수를 1x106/mL로 조정하였다. 대조군에는 HCT116 세포 100 μl와 배양액 100 μl를 첨가하고, 실험군에는 두 세포를 각각 100 μl씩 96웰 플레이트(Thermo Fisher, MA, USA)에 첨가하고 4개의 실험군에는 각각 1:500/250/125/62.5의 ITPRIPL1 다클론성 항체를 첨가하여 인큐베이터에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 96웰 플레이트를 꺼내 PBS(Meilun Biotech, Dalian, China)로 세척하고, EDTA를 함유하지 않은 트립신(Beyotime, Shanghai, China)으로 세포를 소화시킨 후, EP 튜브(Axygen, CA, USA)에 넣고 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하였다. 500 μl의 세포 염색 완충액(Invitrogen, CA, USA)으로 세포를 재현탁하고 세척한 후, 원심분리와 세척을 반복하였다. 세포 염색 완충액에 CD45-APC 항체(Invitrogen, CA, USA)를 1:20으로 희석하고 각 EP 튜브에 혼합액 200 μl를 첨가하여 재현탁한 후 실온에서 천천히 흔들어 30분 동안 배양하였다. 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하고, 1 ml의 결합완충액(Meilun Biotech, Shanghai, China)로 세포를 재현탁하고 세척한 후, 원심분리와 세척을 반복하였다. PBMC 불포함 무염색군, PBMC 불포함 이중염색군, PBMC 포함 무염색군, PBMC 포함 단일염색 Annexin V-FITC군, PBMC 포함 단일염색 PI군, PBMC 포함 이중염색군 및 각각 ITPRIPL1 단백질을 첨가한 이중염색군을 설정하고 조건에 따라 각각 결합완충액 100 μl, Annexin V-FITC(Meilun Biotech, Shanghai, China) 5 μl, PI(Meilun Biotech, Shanghai, China) 10 μl를 첨가하고 실온에서 천천히 흔들어 15분간 배양한 후, 각각 결합완충액 400 μl를 첨가하여 테스트 튜브(Falcon, NY, USA)에 옮긴 다음, 유세포 분석기(Miltenyi Biotec, Cologne, Germany)로 분석하였다.
도 29(a)와 (b)는 CD45로 구분된 HCT116 세포를 보여주는 것이다. 도 29(c)는 다양한 다클론성 항체 농도 조건에서 각 군의 사멸 데이터를 기반으로 계산된 PBMC의 상대적 사멸 활성을 보여주는 것이다. 도 30은 도29(c)의 각 조건에서의 구체적인 세포사멸 염색 수준을 보여준다. 상기 결과는 ITPRIPL1 다클론성 항체가 PBMC의 종양세포 사멸력을 촉진시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 11: ITPRIPL1-RBD2 서열 돌연변이체와 CD3E의 결합 능력은 일정 수준 감소, 및 ITPRIPL1-RBD3과 CD3ε의 결합 능력은 유의하게 감소함
1. HCT116-RBD2 및 RBD3 서열 돌연변이체 구축
개시된 서열(NCBI 참조 서열 NM_001008949.3)을 기반으로 세포외 도메인(25-103번째 아미노산)의 DRMDLDTLARSRQLEKRMSEEMRLLEMEFEERKRAAEQRQKAENFWTGDTSSDQ(ITPRIPL1-RBD2, 즉 서열번호 2)와 MDLDTLARSRQLEKRMSEEMRLLEMEFEERKRAAEQRQKAEN(ITPRIPL1-RBD3, 즉 서열번호 3)을 각각 2개의 다른 표적 서열로 선택하여 특정 ITPRIPL1 서열 돌연변이체를 합성하고, pcDNA3.1을 벡터로 사용하여 세포외 도메인과 세포외 도메인 및 막횡단 도메인의 C-말단이 Flag 태그 및 녹색 형광 단백질(GFP)에 융합되어, Flag 태그 및 녹색 형광 단백질(GFP)이 포함된 ITPRIPL1 세포외 도메인, ITPRIPL1-RBD2, ITPRIPL1-RBD3 플라스미드를 생성하였다.
2. 공동면역침강 실험 결과 ITPRIPL1-RBD2는 CD3E에 결합하는 가장 짧은 서열로 분석되었다.
Flag 태그가 포함된 ITPRIPL1 세포외 도메인, ITPRIPL1-RBD2, ITPRIPL1-RBD3 및 HA 태그가 포함된 CD3E의 pcDNA3.1 플라스미드로 HCT116 세포(ATCC, VA, USA)를 공동 형질감염시키고, 6웰 플레이트(Corning, NY, USA)에서 단백질이 충분히 발현될 때까지 48-72시간 동안 배양한 후, 1:100 비율의 면역침강 용해액(Thermo Fisher, MA, USA)과 프로테아제, 포스파타제, PMSF(Consun, Shanghai, China) 트리플의 혼합 용해액으로 세포를 분리하여 긁어낸다. 일부 세포 시료를 원심분리하고, 로딩 완충액(Beyotime, Shanghai, China)을 혼합하여 100°C의 메탈 배스(metal bath)에서 변성시킨 후 Input 단백질 시료를 수득하였다. 나머지 세포 시료는 HA 태그 특이적 마우스 항체(Biolegend, CA, USA) 또는 Flag 태그 특이적 마우스 항체(CST, MA, USA)로 면역침강시키고 PBS로 세척한 후, 로딩 완충액(Beyotime, Shanghai, China)을 혼합하여 100°C의 메탈 배스에서 변성시킨 후 면역침강된 단백질 시료를 수득하였다. 그런 다음, 설명서에 따라 겔 플레이트(Bio-Rad, CA, USA)에 12.5%의 PAGE 겔(EpiZyme, Shanghai, China)을 배치하고 준비된 겔을 전기영동조(Bio-Rad, CA, USA)에 넣은 후 전원(Bio-Rad, CA, USA)을 연결하고, 축적 겔(stacking gel)까지는 80V로 진행하고, 분해 겔(separating gel)부터는 120V의 전압으로 진행하였다. 밴드가 분해 겔 바닥에 도달하면 멤브레인에 대한 습식 전송을 이용하여 전송조(Bio-Rad, CA, USA)에서 350 mA로 90분간 멤브레인으로 전송하였다. 전송이 완료된 후 ITPRIPL1 세포외 도메인, ITPRIPL1-RBD2, ITPRIPL1-RBD3 및 CD3E-HA 단백질의 질량 크기에 따라 멤브레인을 절단 처리하였다. 신속 차단 완충액(EpiZyme, Shanghai, China)으로 10분간 차단하고, Flag 태그 특이적 토끼 항체(Abcam, MA, USA) 및 HA 태그 특이적 토끼 항체(CST, MA, USA)로 각각 ITPRIPL1 세포외 도메인, ITPRIPL1-RBD2, ITPRIPL1-RBD3 및 CD3E-HA 해당 밴드를 4°C에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날 TBST로 세척한 후 5% 탈지분유(Sangon, Shanghai, China)를 함유한 TBS로 희석한 특이적 항토끼 2차 항체(Consun, Shanghai, China)를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고 TBST로 세척한 후, 혼합 발광액(Share-Bio, Shanghai, China)에 1분간 넣어 겔 이미저(Bio-Rad, CA, USA)에 노출시켰다.
도 31(a)는 Input 단백질 중 다양한 ITPRIPL1 서열 돌연변이체와 CD3ε의 함량을 보여주고, 도 31(b)는 간접 침강된(CD3ε와의 결합으로 인해) 다양한 ITPRIPL1 서열의 돌연변이체, 및 직접 침강된 CD3ε를 보여준다. 도 31(c)는 Input 단백질 중 다양한 ITPRIPL1 서열 돌연변이체와 CD3ε의 함량을 보여주고, 도 31(d)는 간접 침강된(다양한 ITPRIPL1 서열 돌연변이체와의 결합으로 인해) CD3E, 및 직접 침강된 다양한 ITPRIPL1 서열 돌연변이체를 보여준다. 상기 결과는 ITPRIPL1 세포외 도메인과 RBD2 서열 돌연변이체가 존재하는 상태에서 CD3E와 ITPRIPL1이 결합된 상태를 유지한다는 것을 시사하며, RBD3 서열은 뚜렷한 결합이 검출되지 않았다. 이에 따라 ITPRIPL1 세포외 도메인의 길이 또는 완전성이 CD3E에 결합하는 능력과 양의 상관관계가 있다는 것을 알 수 있다.
실시예 12: 단리된 ITPRIPL1-RBD 단백질의 NRP2에 대한 결합 능력 확인
1. 효소결합면역흡착분석(ELISA) 결과 단리된 ITPRIPL1(IT1) 세포외 도메인 단편과 NRP2 세포외 도메인은 농도 의존적으로 직접 결합한다는 것이 확인되었다.
ELISA 전용 플레이트(costar, ME, USA)를 사용하였다. 먼저 0.03125/0.0625/0.125/0.25/0.5/1/2 μg/mL의 ITPRIPL1-RBD 재조합 단백질을 각각 100 μl의 ELISA 코팅액(Solarbio, Beijing, China)에 녹여 분주하고, 음성 대조군으로 단백질을 포함하지 않은 코팅액 100 μl를 분주하였다. 4℃에서 밤새 코팅하였다. PBST로 세척 후, 5% BSA를 함유한 PBS(VWR, PA, USA) 100 μl로 37°C의 인큐베이터에서 90분 동안 차단시켰다. PBST로 세척 후, hFc 태그가 있는 NRP2 단백질(N2-Fc)의 세포외 도메인 단백질 단편(Sino Biological Inc., Beijing, China) 1 μg/ml 을 37°C의 인큐베이터에서 90분 동안 결합시켰다. PBST로 세척 후, PBS로 희석한 특이적 항-인간 Fc 세그먼트 항체(Abcam, MA, USA)를 37°C의 인큐베이터에서 30분 동안 결합시켰다. PBST로 세척 후, 발색액(Sangon, Shanghai, China)을 웰당 100 μl씩 분주하고 인큐베이터에서 5~30분 동안 반응시킨 후, 정지액(Sangon, Shanghai, China) 50 μl를 첨가하고 마이크로플레이트 판독기(Thermo Fisher, MA, USA)로 450nm에서 발색을 판독하였다.
도 32에서 보는 바와 같이, 이 실험을 통해 단리된, ITPRIPL1 세포외 도메인 단편과 NRP2 세포외 도메인 단편은 농도 의존적으로 직접 결합한다는 것이 확인되었다. 상기 결과는, 단리된 ITPRIPL1 세포외 도메인 정제 단백질(IT1-RBD)이 NRP2 세포외 도메인 정제 단백질에 직접 결합하며, 농도 의존성이 있다는 것을 증명한다.
2. 유세포 분석 결과 NRP2는 ITPRIPL1 과발현 세포와 더 높은 효율로 결합하는 것으로 확인되었다.
검출 결과, HEK293 세포는 내인적으로 일정 수준의 ITPRIPL1가 발현되었으며, 안정적 형질감염 후에는 발현 수준이 더욱 증가하였다. 배양된 293E 야생형 세포(ATCC, VA, USA)와 안정적으로 형질감염된 293E-ITPRIPL1 세포주를 소화시킨 후 계수하고, 세포 수를 2x106/mL로 조정한 후, 각각 96웰 플레이트(costar, ME, USA)의 각 웰에 200 μl씩 분주하였다. 각 실험군의 각 웰에 0/0.5/1/2/4 μg/mL의 NRP2 단백질((Sino Biological Inc., Beijing, China)을 첨가하였다. 96웰 플레이트를 세포 인큐베이터에 넣고 30분 동안 방치한 후 꺼내어 EP 튜브(Axygen, CA, USA) 옮겨 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하였다. 500 μl의 세포 염색 완충액(Invitrogen, CA, USA)으로 세포를 재현탁하고 세척한 후, 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하고 세척을 반복하였다. 세포 염색 완충액으로 항-인간 IgG Alexa Fluor 647 항체(Invitrogen, CA, USA)를 1:1000의 비율로 희석하고, 음성 대조군을 제외한 각 EP 튜브에 항체 희석액을 200 μl씩 첨가한 후, 실온에서 40 rpm으로 진탕기에서 30분 동안 배양하였다. EP 튜브를 꺼내 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하였다. 1000 μl의 세포 염색 완충액으로 세포를 재현탁하고 세척한 후, 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하고 세척을 반복하였다. 세척 완료 후 각 EP 튜브에 300 μl의 세포 염색 완충액을 첨가하여 재현탁하고, 테스트 튜브(Falcon, NY, USA)로 옮긴 후 유세포 분석기(Miltenyi Biotec, Cologne, Germany)로 분석하였다.
도 33(a)는 사멸된 세포를 제외한 임계값 설정을 보여준다. 도 33(b)는 ITPRIPL1의 발현 정도가 다른 세포와 NRP2 단백질의 결합을 보여준다. 도 34는 도 33(b)의 각 조건에서의 구체적인 염색 및 단백질 결합을 보여준다. 상기 결과는 NRP2가 ITPRIPL1이 일정 수준 발현된 293E에 결합하고, ITPRIPL1이 과발현된 293E 세포에 더 강하게 결합한다는 것을 시사한다.
실시예 13: 단리된 ITPRIPL1-RBD 단백질의 NRP2 단백질을 발현하는 분화된 THP1 대식 세포에 억제 신호를 전달하는 능력 확인
루시페린 리포터 분석 결과는 유리된 단리 ITPRIPL1 세포외 도메인 정제 단백질(IT1-RBD)이 비활성 조건에서 PMA 유도로 분화가 완료된 THP1-dual 세포의 IFN 증식 신호를 억제할 수 있다는 것을 증명한다.
배양된 THP1-dual 세포(Invivogen, CA, USA)를 계수하고 1000 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후, 항생물질을 함유하지 않은 RPMI-1640 배지(Gibco, CA, USA)로 재현탁하여 세포 수를 2 x 106/mL로 조정하고, 투명한 96웰 플레이트(Thermo Fisher, MA, USA)에 웰당 200 μl의 세포와 20 ng/mL의 PMA 시약(Invivogen, CA, USA)를 분주해 유도한 다음, 인큐베이터에서 3시간 동안 배양한 후 PBS로 세척하고 배지를 교체하였다. 72시간 후 배지를 다시 교체하고 각각 0/1/2/4/8 μg/mL의 유리된 단리 ITPRIPL1 세포외 도메인 정제 단백질을 첨가하고 세포 인큐베이터에서 18-24시간 배양하였다. 반응 완료 후 불투명 96웰 플레이트의 각 웰에 Quanti-luc 시약(Invivogen, CA, USA) 50 μl와 세포 혼합액 10 μl를 넣고 잘 섞은 후 다기능 마이크로플레이트 판독기로 즉시 신호를 검출하였다.
도 35에서 보는 바와 같이, 상기 결과는 유리된 단리 ITPRIPL1 세포외 도메인 정제 단백질(IT1-RBD)이 비활성 조건에서 PMA 유도로 분화가 완료된 THP1-dual 세포의 IFN 증식 신호를 억제할 수 있다는 것을 나타낸다. 이에 따라 단리된 ITPRIPL1-RBD 단백질은 NRP2 단백질을 발현하는 분화된 THP1 대식 세포에 억제 신호를 전달하는 능력이 있다는 것을 알 수 있다.
실시예 14: 정제된 IT1-RBD-Fc 단백질이 T세포의 신호전달 및 사멸력을 억제하는 기능 확인
1. IT1-RBD-Fc 단백질의 분리 및 정제.
개시된 서열(NCBI 참조 서열 NM_001008949.3)을 기반으로 세포외 도메인(HPLMVSDRMDLDTLARSRQLEKRMSEEMRLLEMEFEERKRAAEQRQKAENFWTGDTSSDQLVLGKKDMGWPFQADGQEG)을 IT1-RBD1로 선택하고(즉, 세포외 도메인에서 신호 펩티드의 모든 부분 제거); DRMDLDTLARSRQLEKRMSEEMRLLEMEFEERKRAAEQRQKAENFWTGDTSSDQ를 IT1-RBD2로 선택, 즉, RBD1을 기반으로 N-말단의 여러 보존 서열 아미노산과 C-말단의 여러 보존 및 비보존 서열 아미노산(포유동물의 보존 아미노산 부위의 기능에 대한 중요성을 검증하는 데 사용)을 제거하며; MDLDTLARSRQLEKRMSEEMRLLEMEFEERKRAAEQRQKAEN를 IT1-RBD3으로 선택(알파 나선 2차 구조로 예측된 서열만 남겨 해당 2차 구조가 기능에 필요한 최소 서열인지 검증)한 후, CH1 영역을 포함하지 않는 Fc 서열(PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK)을 차례로 연결하고, pcDNA3.1을 벡터로 사용하여 해당 플라스미드를 구축하였다. 상기 ITPRIPL1 세포외 도메인의 돌연변이 유도 서열은 도 54를 참조한다.
이 실시예를 통해 ITPRIPL1 세포외 도메인이 기능을 발휘하는 서열을 특징지었다. ITPRIPL1 세포외 도메인 기능 단편의 AlphaFold 예측 구조와 CD3E의 x선 회절 구조(1XIW.pdb)를 이용하여 단백질-단백질 도킹을 수행해 분석한 결과, 도 54에 표시된 인간, 마우스, 랫, 사바나 원숭이, 황금 들창코 원숭이, 검은 들창코 원숭이, 볼리비아 다람쥐 원숭이, 올빼미 원숭이, 침팬지 등 다양한 종의 ITPRIPL1이 모두 CD3E에 결합할 수 있다는 것을 보여주었으며, 이는 실시예 2의 면역형광 및 공동 국소화 분석 결과와 일치한다.
따라서, 종별 다른 부위를 기반으로 CD3E에 결합하는 기능이 있는 RBD1 유도체 서열을 수득하였다: DRMDLDTLARSRQLEKRMSEEMRxLEMEFEERxxxAExxQKxENxWxGxTSxDQ(여기서 x는 대체가능한 아미노산을 의미한다).
본 실시예는 RBD1, RBD2, RBD3의 기능적 검출 및 분석을 실시하였다.
플라스미드 수득 후 PEI 시약(Life iLab, Shanghai, China)으로 293E 세포(ATCC, VA, USA)를 형질감염시키고, 120시간 후 RIPA 용해액(Beyotime, Shanghai, China)과 프로테아제 억제제, 포스파타제 억제제, PMSF(Consun, Shanghai, China)의 트리플을 사용하여 얼음 위에서 10분 동안 세포를 용해시키고, 12000 rpm으로 15분 동안 원심분리한 후, 상청액을 취하여 1:100의 단백질A 마그네틱 비드(Smart-lifesciences, Changzhou, China)로 실온에서 130 rpm으로 2시간 동안 진탕시켰다. 혼합액을 미리 평형액(20mM 인산수소이나트륨, 0.15M 염화나트륨, pH 7.0)으로 평형화시킨 필터 컬럼(Millipore, MA, USA)에 주입하고 평형액으로 2회 세척한 후, 용리액(0.1M 글리신, pH 3.0):중화액(1M Tris-HCl, pH 8.5)=16:1로 용리하여 정제된 IT1-RBD-Fc 단백질을 수득하였다. Nanodrop 분광광도계로 단백질 농도를 측정하고 -20°C에 보관하였다.
2. 루시페린 리포터 분석 결과 IT1-RBD1-Fc 단백질은 ConA의 활성화 및 비활성화 조건 하에 Jurkat-dual 세포의 NFKB 증식 신호를 억제한다는 것이 확인되었다.
배양된 Jurkat-dual 세포(Invivogen, CA, USA)를 계수하고 1000 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후, 항생물질을 함유하지 않은 IMDM 배지(Gibco, CA, USA)로 재현탁하여 세포 수를 2 x 106/mL로 조정하고 투명한 96웰 플레이트에 웰당 200 μl의 세포를 분주하였다. 각 웰에 정제된 IT1-RBD1/RBD2/RBD3-Fc 단백질을 각각 0/4 μg/mL씩 첨가하였다. 세포 인큐베이터에서 2시간 동안 반응시킨 후, 각 웰에 콘카나발린A(ConA)(Aladdin, Shanghai, China) 50 μg/mL을 첨가하여 활성군을 만들고, 동량의 내독소 제거수를 첨가하여 비활성군을 만든 후, 세포 인큐베이터에서 18-24시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후 불투명 96웰 플레이트(costar, ME, USA)의 각 웰에 Quanti-luc 시약(Invivogen, CA, USA) 50 μl와 반응 혼합액 20 μl를 넣고 잘 섞은 다음, 다기능 마이크로플레이트 판독기로 즉시 신호를 검출하였다.
도 36은 50 μg/mL ConA 활성 및 비활성 조건에서 다양한 IT1-RBD의 Fc 단백질 4 μg/mL를 첨가한 조건에서의 Jurkat-dual 세포의 NFKB 신호 변화를 보여준다. 상기 결과는 IT1-RBD1-Fc 단백질이 ConA로 활성화 및 비활성화되지 않은 Jurkat-dual 세포의 NFKB 증식 신호를 억제할 수 있으며, 서열이 짧아질수록 억제 효과가 감소한다는 것을 시사한다.
3. 유세포 분석 결과 정제된 ITPRIPL1-RBD-Fc 재조합 단백질이 인간 말초 혈액 단핵구(PBMC)의 신장 유래 H3K293 세포 사멸력을 감소시킬 수 있다는 것이 확인되었다.
HEK293 세포는 신장 자가면역질환, 신경계 자가면역질환, 전신 홍반 루푸스(systemic lupus erythematosus, SLE) 등 질병의 진행 상황, 분자 세포 생물학적 기전 및 약리학 연구를 위한 자가면역질환 모델의 구축에 널리 사용된다(Stepanenko AA, Gene. 2015 Sep 15;569(2):182-90, Hira S. J Physiol Sci. 2019 Sep;69(5):723-732., Keskitalo S, Front Immunol. 2019 Dec 5;10:2770). 또한, HEK293 세포는 이식후거부반응 모델의 구축(Yi Gao. Int J Clin Exp Med. (2014); 7(11): 4572-4583, Lorber, Marc I, Transplantation: 1999 - 67(6) - p 897-903, Pabois A, Biochem Pharmacol. (2016) Mar 15;104:95-107), 항바이러스 감염 면역반응(Ismail Cem Yilmaz, Allergy. 2021 Sep 14. doi: 10.1111/all.15091, Elizabeth A Reap, Vaccine. 2007 Oct 16;25(42):7441-9), 및 종양 면역반응 (A A Stepanenko, Gene. 2015 Sep 15;569(2):182-90) 등에 사용된다.
그 밖에도 자가면역질환 또는 정상인의 말초 혈액 단핵구(PBMC)는 많은 연구에서 면역질환 모델의 구축(Yoshikawa N. Horm Metab Res. 1994 Sep;26(9):419-23), 이식후거부(Transplant Proc. 2016 Oct;48(8):2840-2844), 항감염 면역반응(Har-Noy M, J Transl Med. 2020 May 12;18(1):196, Nakamura-Hoshi M, Sci Rep. 2020 Jul 9;10(1):11394.), 항종양 면역반응(Zhuang X, Cancer Immunol Res. 2019 Jun;7(6):939-951) 등에 사용되고 있으며, 이와 관련된 표적 세포에 HEK293 세포도 포함된다. 실제로 PBMC를 기반으로 한 인간화 NSG 마우스 모델은 그 작용 효과가 시험관 내 표적 세포에 대한 PBMC의 작용과 높은 상관관계가 있다. 따라서 PBMC 및 표적 세포를 기반으로 한 시험관 내 모델은 질병 진행 과정 및 약효의 구현에 중요한 역할을 한다.
본 실시예는, HEK293 세포를 자가면역, 이식거부, 알레르기, 항종양 반응의 표적 세포로 사용하고, 인간 말초 혈액 단핵구(PBMC)를 효과기 세포로 사용함으로써, 대표적인 질병 모델을 통해 ITPRIPL1 기반 조절제가 항원제시세포와 T세포의 상호작용에 미치는 영향과 상기 전술한 다른 질환에 대한 개입 작용을 시연한다.
구체적인 실시 절차는 다음과 같다: CD3을 CD28 항체(Invitrogen, CA, USA) 및 PBMC(ATCC, VA, USA)와 혼합 희석하여, 최종 농도 1 μg/mL로 T세포를 활성화한 다음, 밤새 배양하였다. 다음 날 PBMC와 293E 야생형 세포(ATCC, VA, USA)/ITPRIPL1 과발현 세포를 계수하고, 각각 세포 수를 1x106/mL로 조정하였다. 대조군에는 293E 야생형 세포/ITPRIPL1 과발현 세포 100 μl와 배양액 100 μl를 첨가하고, 실험군에는 PBMC와 각기 다른 세포를 각각 100 μl씩 96웰 플레이트(costar, ME, USA)에 첨가하였다. 실험군 중, 야생형 293E 세포의 3개군에는 각각 2 μg/mL의 IT1-RBD1/RBD2/RBD3-Fc 단백질을 추가로 첨가하여 인큐베이터에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 96웰 플레이트를 꺼내 세포를 흡인한 후 EP 튜브(Axygen, CA, USA)로 옮기고, 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 다음 상청액을 제거하였다. 500 μl의 세포 염색 완충액(Invitrogen, CA, USA)으로 세포를 재현탁하고 세척한 후, 원심분리와 세척을 반복하였다. 세포 염색 완충액에 CD45-APC 항체(Invitrogen, CA, USA)를 1:20으로 희석하고, 각 EP 튜브에 혼합액 200 μl를 첨가하여 재현탁한 후 실온에서 천천히 흔들어 30분 동안 배양하였다. 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하고, 1 ml의 결합완충액(Beyotime, Shanghai, China)으로 세포를 재현탁하고 세척한 다음, 원심분리와 세척을 반복하였다. PBMC 불포함 무염색군, PBMC 불포함 이중염색군, PBMC 포함 무염색군, PBMC 포함 단일염색 Annexin V-FITC군, PBMC 포함 단일염색 PI군, PBMC 포함 이중염색군 및 각각 IT1 단백질을 첨가한 이중염색군을 설정하고 조건에 따라 각각 결합완충액 100 μl, Annexin V-FITC(Beyotime, Shanghai, China) 5 μl, PI(Beyotime, Shanghai, China) 10 μl를 첨가하고 실온에서 천천히 흔들어 15분간 배양한 후, 각각 결합완충액 400 μl를 첨가하여 테스트 튜브(Falcon, NY, USA)에 옮긴 다음, 유세포 분석기(Miltenyi Biotec, Cologne, Germany)로 분석하였다.
도 37(a)는 CD45로 구분된 293E 세포를 보여준다. 도 37(b)는 다양한 ITPRIPL1 발현 및 다양한 단백질 조건에서 각 군의 사멸 데이터를 기반으로 계산된 PBMC의 상대적 사멸 활성을 보여준다. 도 38은 도37(b)의 각 조건에서의 구체적인 세포사멸 염색 수준을 보여준다. 상기 결과는 정제된 IT1-RBD1-Fc 재조합 단백질이 인간 말초 혈액 단핵구(PBMC)의 신장 유래 H3K293 세포 사멸력을 감소시킬 수 있으며, 서열이 짧아질수록 효과가 감소한다는 것을 시사한다.
4. 웨스턴 블롯 실험 결과 ITPRIPL1-RBD 재조합 단백질 및 정제된 IT1-RBD1-Fc 재조합 단백질이 CD3E의 다운스트림인 ZAP70 및 Akt 경로를 억제하는 기능이 있다는 것이 확인되었다.
배양된 Jurkat 세포(ATCC, VA, USA)를 계수하고 4x106개의 세포를 15 ml 원심분리 튜브(Corning, NY, USA)에 넣고 800 rpm으로 4분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하였다. 혈청을 함유하지 않은 RPMI 1640 배지(Meilun Biotech, Dalian, China)로 재현탁하고 인큐베이터에서 3시간 동안 기아(starvation) 배양한 후, 800 rpm으로 4분 동안 원심분리하였다. 4 ml의 완전 배지(Meilun Biotech, Dalian, China)로 재현탁한 후, 12웰 플레이트(Corning, NY, USA)의 각 웰에 1 ml씩 분주하고, 무처리(no treatment), 4 μg/mL IT1-RBD 단백질, 4 μg/mL RBD1-Fc 단백질, 4 μg/mL RBD2-Fc 단백질을 첨가하였다. 이를 잘 혼합하고 인큐베이터에서 10분 동안 배양한 후 꺼내어, 세포를 1.5 ml EP 튜브(Axygen, CA, USA)로 옮기고, 800 rpm으로 4분 동안 원심분리한 후, PBS로 재현탁하고 세척한 후, 원심분리하고 세척을 반복하였다. 원심분리 후 상청액을 제거하고 RIPA 세포 용해액(Beyotime, Shanghai, China)을 프로테아제 억제제, 포스파타제 억제제, PMSF(Consun, Shanghai, China)의 트리플(triple)과 1:100의 비율로 제조하고, 각 튜브의 세포에 혼합 용해액 80 μl를 첨가하였다. 각 EP 튜브는 액체질소-얼음 위에서 동결 및 해동을 3회 진행하고, 마지막 해동 후 4℃에서 12000 rpm으로 15분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후 상청액을 취하여 상청액 대 5x 로딩 완충액(Beyotime, Shanghai, China)을 4:1의 비율로 각 세포 시료를 제조하고, 100℃의 메탈 배스에서 10분 동안 변성시켜 단백질 시료를 수득하였다. 그런 다음, 설명서에 따라 겔 플레이트(Bio-Rad, CA, USA)에 10%의 PAGE 겔(EpiZyme, Shanghai, China)을 배치하고 준비된 겔을 전기영동조(Bio-Rad, CA, USA)에 넣은 후 전원(Bio-Rad, CA, USA)을 연결하고, 축적 겔(stacking gel)까지는 80V로 진행하고, 분해 겔(separating gel)부터는 120V의 전압으로 진행하였다. 밴드가 분해 겔 바닥에 도달하면 멤브레인에 대한 습식 전송을 이용하여 전송조(Bio-Rad, CA, USA)에서 350 mA로 90분간 멤브레인으로 전송하였다. 전송이 완료된 후 Akt, ZAP70 및 GAPDH 단백질의 질량 크기에 따라 멤브레인을 절단 처리하였다. 신속 차단 완충액(EpiZyme, Shanghai, China)으로 10분간 차단하고, pAkt 특이적 토끼 항체(CST, MA, USA), Akt 특이적 토끼 항체(CST, MA, USA), pZAP70 특이적 토끼 항체(CST, MA, USA), GAPDH 항체(Consun, Shanghai, China)를 사용하여 각기 해당 밴드를 4°C에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날 TBST로 세척한 후 5% 탈지분유(Sangon, Shanghai, China)를 함유한 TBS로 희석한 특이적 항토끼 2차 항체(Consun, Shanghai, China)를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고 TBST로 세척한 후, 혼합 발광액(Share-Bio, Shanghai, China)에 1분간 넣어 겔 이미저(Bio-Rad, CA, USA)에 노출시켰다.
도 39(a)와 (b)는 웨스턴 블롯에서 GAPDH를 내부 참조로 조정한 후의 인산화된 Akt 및 인산화된 ZAP70의 발현 정도를 보여주고, Akt 인산화 및 ZAP70 인산화 모두 ITPRIPL1-RBD 재조합 단백질 및 정제된 IT1-RBD-Fc 단백질 처리 후 일정 수준 감소하였으며, IT1-RBD1-Fc 재조합 단백질의 인산화 감소가 IT1-RBD2-Fc 단백질보다 뚜렷하게 나타났다. 이 실험 결과는 ITPRIPL1-RBD 재조합 단백질 및 정제된 IT1-RBD1-Fc 단백질이 CD3E의 다운스트림인 Akt와 ZAP70의 인산화를 감소시키는 작용을 한다는 것을 보여주며, 이는 해당 T세포 경로를 억제하는 기능이 있다는 것을 나타낸다.
5. 웨스턴 블롯 실험으로 CD3E 단백질이 ZAP70 및 Akt 경로의 인산화에 대한 ITPRIPL1-RBD1-Fc 재조합 단백질의 영향을 차단하는 기능이 있다는 것이 확인되었다.
배양된 Jurkat 세포(ATCC, VA, USA)를 계수하고 4x106개의 세포를 15 ml 원심분리 튜브(Corning, NY, USA)에 넣고 800 rpm으로 4분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하였다. 혈청을 함유하지 않은 RPMI 1640 배지(Meilun Biotech, Dalian, China)로 재현탁하고 인큐베이터에서 3시간 동안 기아 배양한 후, 800 rpm으로 4분 동안 원심분리하였다. 4 ml의 완전 배지(Meilun Biotech, Dalian, China)로 재현탁한 후, 12웰 플레이트(Corning, NY, USA)의 각 웰에 1 ml씩 분주하고, 무처리, 4 μg/mL RBD1-Fc 단백질, 4 μg/mL RBD1-Fc 단백질 + 4 μg/mL CD3E 단백질을 첨가하였다. 이를 잘 혼합한 다음, 인큐베이터에서 10분 동안 배양한 후 꺼내어 세포를 1.5 ml EP 튜브(Axygen, CA, USA)로 옮기고, 800 rpm으로 4분 동안 원심분리한 후, PBS로 재현탁하고 세척한 후, 원심분리하고 세척을 반복하였다. 원심분리 후 상청액을 제거하고 RIPA 세포 용해액(Beyotime, Shanghai, China)을 프로테아제 억제제, 포스파타제 억제제, PMSF(Consun, Shanghai, China)의 트리플과 1:100의 비율로 제조하고, 각 튜브의 세포에 혼합 용해액 80 μl를 첨가하였다. 각 EP 튜브는 액체질소-얼음 위에서 동결 및 해동을 3회 진행하고 마지막 해동 후, 4℃에서 12000 rpm으로 15분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후 상청액을 취하여 상청액 대 5x 로딩 완충액(Beyotime, Shanghai, China)을 4:1의 비율로 각 세포 시료를 제조하고, 100℃의 메탈 배스에서 10분 동안 변성시켜 단백질 시료를 수득하였다. 그런 다음, 설명서에 따라 겔 플레이트(Bio-Rad, CA, USA)에 10%의 PAGE 겔(EpiZyme, Shanghai, China)을 배치하고 준비된 겔을 전기영동조(Bio-Rad, CA, USA)에 넣은 후 전원(Bio-Rad, CA, USA)을 연결하고, 축적 겔(stacking gel)까지는 80V로 진행하고, 분해 겔(separating gel)부터는 120V의 전압으로 진행하였다. 밴드가 분해 겔 바닥에 도달하면 멤브레인에 대한 습식 전송을 이용하여 전송조(Bio-Rad, CA, USA)에서 350 mA로 90분간 멤브레인으로 전송하였다. 전송이 완료된 후 Akt, ZAP70, ERK 및 GAPDH 단백질의 질량 크기에 따라 멤브레인을 절단 처리하였다. 신속 차단 완충액(EpiZyme, Shanghai, China)으로 10분간 차단하고, pAkt 특이적 토끼 항체(CST, MA, USA), Akt 특이적 토끼 항체(CST, MA, USA), pZAP70 특이적 토끼 항체CST, MA, USA), ZAP70 특이적 토끼 항체CST, MA, USA), pERK 특이적 토끼 항체(CST, MA, USA), ERK 특이적 토끼 항체(CST, MA, USA), GAPDH 항체(Consun, Shanghai, China)를 사용하여 각기 해당 밴드를 4°C에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날 TBST로 세척한 후 5% 탈지분유(Sangon, Shanghai, China)를 함유한 TBS로 희석한 특이적 항토끼 2차 항체(Consun, Shanghai, China)를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고 TBST로 세척한 후, 혼합 발광액(Share-Bio, Shanghai, China)에 1분간 넣어 겔 이미저(Bio-Rad, CA, USA)에 노출시켰다.
도 41는 해당 인산화 경로 변화 후의 웨스턴 블롯 실험 결과이다. 도에서 볼 수 있듯이, Akt, ZAP70, ERK의 인산화는 모두 ITPRIPL1-RBD1-Fc 첨가 후 뚜렷하게 감소되었고, ZAP70에서 가장 두드러졌으며, CD3E 단백질 첨가 후에는 인산화 감소 추세가 상쇄되었다. 이 실험 결과는 CD3E가 ITPRIPL1-RBD1-Fc 단백질의 인산화 경로 조절 작용을 차단할 수 있으며, ITPRIPL1-RBD-Fc는 CD3을 통해 T세포의 인산화 경로를 조절한다는 것을 시사한다.
실시예15: ITPRIPL1의 T세포 조절 기능은 CD3 및 PRS 세그먼트의 정확한 형태 변화를 요구함
1. CD3 돌연변이체 Jurkat 세포 구축
배양된 Jurkat 세포(ATCC, VA, USA)를 계수하고 2x105개의 세포를 24웰 플레이트(Corning, NY, USA)의 각 웰에 분주하여 밤새 배양하였다. 500 μl의 완전 배지(Meilun Biotech, Dalian, China)는 바이러스 감염을 위한 MOI 값 100에서 CD3에 대한 녹아웃 렌티바이러스(GenePharma, Shanghai, China)와 혼합하였다. 48시간 후 배지를 교체하였다. 24시간 동안 배양한 후, 1 μg/mL 퓨로마이신을 첨가하여 1주일 동안 스크리닝하였다. 스크리닝 종료 시에 CD3이 녹아웃된 Jurkat 세포주를 수득하였다.
CD3이 녹아웃된 Jurkat 세포를 계수하고, 2x105개의 세포를 24웰 플레이트의 각 웰에 분주하여 밤새 배양하였다. 바이러스 감염을 위해 500 μl의 완전 배지를 CD3-K76T(정확한 형태 변화 불가) 및 CD3-ΔPRS(PRS 세그먼트 변화 있음）과발현 바이러스와 MOI 값 100에서 혼합하였다. 48시간 후 배지를 교체하였다. 24시간 동안 배양한 후, 600 μg/mL의 게네티신(Geneticin, G418)(Gibco, CA, USA)을 첨가하여 1주일 동안 스크리닝하였다. 스크리닝 종료 시에 CD3이 녹아웃된 Jurkat 세포주를 수득하였다.
2. 웨스턴 블롯 실험 결과 ITPRIPL1이 T세포의 인산화 경로를 조절하려면 CD3 및 PRS 세그먼트의 형태 변화 가 필요하다는 것이 확인되었다.
야생형 Jurkat 세포, CD3 녹아웃 Jurkat 세포, CD3-K76T Jurkat 세포, 및 CD3-ΔPRS 세포를 계수하여, 1x106개의 세포를 12웰 플레이트(Corning, NY, USA)의 각 웰에 분주하고 10 μg/mL의 OKT3를 첨가하여 활성시킨 후, 각각 처리하지 않거나 4 μg/mL의 ITPRIPL1-RBD1-Fc를 첨가하여 처리하고, 10분 동안 배양한 후 세포를 수득하였다. 세포를 1.5 ml EP 튜브(Axygen, CA, USA)로 옮기고, 800 rpm으로 4분 동안 원심분리한 후, PBS로 재현탁하고 세척한 후, 원심분리하고 세척을 반복하였다. 원심분리 후 상청액을 제거하고 RIPA 세포 용해액(Beyotime, Shanghai, China)을 프로테아제 억제제, 포스파타제 억제제, PMSF(Consun, Shanghai, China)의 트리플과 1:100의 비율로 제조하여, 각 튜브의 세포에 혼합 용해액 80 μl를 첨가하였다. 각 EP 튜브는 액체질소-얼음 위에서 동결 및 해동을 3회 진행하고 마지막 해동 후, 4℃에서 12000 rpm으로 15분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후 상청액을 취하여 상청액 대 5x 로딩 완충액(Beyotime, Shanghai, China)을 4:1의 비율로 각 세포 시료를 제조하고, 100℃의 메탈 배스에서 10분 동안 변성시켜 단백질 시료를 수득하였다. 그런 다음, 설명서에 따라 겔 플레이트(Bio-Rad, CA, USA)에 10%의 PAGE 겔(EpiZyme, Shanghai, China)을 배치하고 준비된 겔을 전기영동조(Bio-Rad, CA, USA)에 넣은 후 전원(Bio-Rad, CA, USA)을 연결하고, 축적 겔(stacking gel)까지는 80V로 진행하고, 분해 겔(separating gel)부터는 120V의 전압으로 진행하였다. 밴드가 분해 겔 바닥에 도달하면 멤브레인에 대한 습식 전송을 이용하여 전송조(Bio-Rad, CA, USA)에서 350 mA로 90분간 멤브레인으로 전송하였다. 전송이 완료된 후 Akt, ZAP70, ERK 및 GAPDH 단백질의 질량 크기에 따라 멤브레인을 절단 처리하였다. 신속 차단 완충액(EpiZyme, Shanghai, China)으로 10분간 차단하고, pAkt 특이적 토끼 항체(CST, MA, USA), Akt 특이적 토끼 항체(CST, MA, USA), pZAP70 특이적 토끼 항체CST, MA, USA), ZAP70 특이적 토끼 항체CST, MA, USA), pERK 특이적 토끼 항체(CST, MA, USA), ERK 특이적 토끼 항체(CST, MA, USA), GAPDH 항체(Consun, Shanghai, China)를 사용하여 각기 해당 밴드를 4°C에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날 TBST로 세척한 후 5% 탈지분유(Sangon, Shanghai, China)를 함유한 TBS로 희석한 특이적 항토끼 2차 항체(Consun, Shanghai, China)를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고 TBST로 세척한 다음, 혼합 발광액(Share-Bio, Shanghai, China)에 1분간 넣어 겔 이미저(Bio-Rad, CA, USA)에 노출시켰다.
도 42는 ITPRIPL1-RBD1-Fc 단백질의 작용 하에 CD3 돌연변이체 Jurkat 세포의 인산화 경로 변화를 웨스턴 블롯으로 보여준다. 실험 결과, 야생형 Jurkat 세포에서 관찰된 ITPRIPL1에 의한 인산화 감소는 CD3 녹아웃/K76T 돌연변이/ΔPRS 돌연변이 Jurkat 세포에서 관찰되지 않았으며, 이는 ITPRIPL1이 T세포의 인산화 경로를 조절하려면 CD3 및 PRS 세그먼트의 형태 변화가 필요하다는 것을 시사한다.
3. 세포내 칼슘 이온 흐름에 대한 형광 염색 실험 결과 ITPRIPL1이 T세포의 활성을 감소시킨다는 것이 확인되었다.
배양된 Jurkat 세포(ATCC, VA, USA)를 계수한 후, 5x105개의 세포를 12웰 플레이트(Corning, NY, USA)의 각 웰에 분주하고, PBS 또는 2 μg/ml의 ITPRIPL1-RBD 단백질을 첨가하여 24시간 처리하였다. 처리 후, 4 μmol의 Fluo-8 AM(Abcam, MA, USA) 세포내 칼슘 이온 지시약으로 염색하고, 암실의 인큐베이터에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. HHBS 완충액(Solarbio, Beijing, China)으로 2회 세척한 후 형광현미경으로 관찰하였다.
도 43은 형광현미경에서 관찰된 세포내 칼슘 이온 흐름의 신호 강도이다. 이 실험 결과는 ITPRIPL1이 Jurkat 세포의 칼슘 이온 흐름을 유의하게 감소시키는 기능이 있다는 것을 보여주며, 이는 ITPRIPL1이 T세포의 활성을 감소시킨다는 것을 시사한다.
4. 세포내 칼슘 이온 흐름에 대한 형광 염색 실험 결과 ITPRIPL1이 T세포의 활성을 감소시키는 작용은 CD3 및 PRS세그먼트의 형태 변화에 의존한다는 것이 확인되었다.
야생형 Jurkat 세포, CD3 녹아웃 Jurkat 세포, CD3-K76T Jurkat 세포, CD3-ΔPRS 세포를 계수한 후, 5 x105개의 세포를 12웰 플레이트(Corning, NY, USA)의 각 웰에 분주하고, 각각 PBS 또는 4 μg/mL의 ITPRIPL1-RBD1-Fc 단백질을 첨가하여 24시간 동안 처리하였다. 처리 후, 4 μmol의 Fluo-8 AM(Abcam, MA, USA) 세포내 칼슘 이온 지시약으로 염색하고, 암실의 인큐베이터에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. HHBS 완충액(Solarbio, Beijing, China)으로 2회 세척한 후 형광현미경으로 관찰하였다.
도 44는 형광현미경에서 관찰된 각 세포내 칼슘 이온 흐름의 신호 강도이다. 실험 결과, 야생형 Jurkat 세포 내 칼슘 이온 흐름에 대한 ITPRIPL1의 유의한 영향이 CD3 녹아웃/K76T 돌연변이/ΔPRS 돌연변이 Jurkat 세포에서는 관찰되지 않았으며, 이는 ITPRIPL1이 T세포의 신호전달을 조절하려면 CD3 및 PRS 세그먼트의 형태 변화가 필요하다는 것을 시사한다.
실시예 16: CD3-Nck 결합을 조절하여 T세포의 신호전달 및 기능을 조절하는 ITPRIPL1
1. 웨스턴 블롯 실험 결과 ITPRIPL1-RBD1-Fc 단백질이 CD3과 Nck의 결합 신호를 농도 의존적으로 증가시킬 수 있다는 것이 확인되었다.
배양된 Jurkat 세포(ATCC, VA, USA)를 계수하고 5x106개의 세포를 15 ml 원심분리 튜브(Corning, NY, USA)에 넣고 800 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하였다. 혈청을 함유하지 않은 RPMI 1640 배지(Meilun Biotech, Dalian, China)로 재현탁하고, 인큐베이터에서 3시간 동안 기아 배양한 후, 800 rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 5 ml의 완전 배지(Meilun Biotech, Dalian, China)로 재현탁한 후, 12웰 플레이트(Corning, NY, USA)의 각 웰에 1 ml씩 분주하고, 먼저 10 μg/mL의 OKT3를 첨가하여 활성 처리하고, 동시에, 각 웰에 각각 무처리, 0.5/1/2/4 μg/mL RBD1-Fc 단백질을 첨가하였다. 이를 잘 혼합한 다음, 인큐베이터에서 5분 동안 배양한 후 꺼내어, 세포를 1.5 ml EP 튜브(Axygen, CA, USA)로 옮기고, 800 rpm으로 4분 동안 원심분리한 후, PBS로 재현탁하고 세척한 후, 원심분리하고 세척을 반복하였다. 원심분리 후 상청액을 제거하고, 면역침강 세포 용해액(Thermo Fisher, MA, USA)을 프로테아제 억제제, 포스파타제 억제제, PMSF(Consun, Shanghai, China)와 1:100의 비율로 제조한 다음, 각 튜브의 세포에 혼합 용해액 200 μl를 첨가하였다. 일부 세포 시료를 원심분리하고, 로딩 완충액(Beyotime, Shanghai, China)을 혼합하여 100°C의 메탈 배스(metal bath)에서 변성시킨 후 Input 단백질 시료를 수득하였다. 나머지 세포 시료는 CD3E 특이적 마우스 항체(Santa cruz biotechnology, CA, USA)로 면역침강시키고 PBS로 세척한 후, 로딩 완충액(Beyotime, Shanghai, China)을 혼합하여 100°C의 메탈 배스에서 변성시킨 후, 면역침강된 단백질 시료를 수득하였다. 원심분리 후 상청액 대 5x 로딩 완충액(Beyotime, Shanghai, China)을 4:1의 비율로 각 세포 시료를 제조하고, 100℃의 메탈 배스에서 10분 동안 변성시켜 단백질 시료를 수득하였다. 그런 다음, 설명서에 따라 겔 플레이트(Bio-Rad, CA, USA)에 10%의 PAGE 겔(EpiZyme, Shanghai, China)을 배치하고 준비된 겔을 전기영동조(Bio-Rad, CA, USA)에 넣은 후 전원(Bio-Rad, CA, USA)을 연결하고, 축적 겔(stacking gel)까지는 80V로 진행하고, 분해 겔(separating gel)부터는 120V의 전압으로 진행하였다. 밴드가 분해 겔 바닥에 도달하면 멤브레인에 대한 습식 전송을 이용하여 전송조(Bio-Rad, CA, USA)에서 350 mA로 90분간 멤브레인으로 전송하였다. 전송이 완료된 후 CD3E 및 Nck 단백질의 질량 크기에 따라 멤브레인을 절단 처리하였다. 신속 차단 완충액(EpiZyme, Shanghai, China)으로 10분간 차단하고, CD3E 특이적 토끼 항체(CST, MA, USA) 및 Nck 특이적 토끼 항체(CST, MA, USA)로 각각 해당 밴드를 4°C에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날 TBST로 세척한 후 5% 탈지분유(Sangon, Shanghai, China)를 함유한 TBS로 희석한 특이적 항토끼 2차 항체(Consun, Shanghai, China)를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고 TBST로 세척한 후, 혼합 발광액(Share-Bio, Shanghai, China)에 1분간 넣어 겔 이미저(Bio-Rad, CA, USA)에 노출시켰다.
도 45에서 보는 바와 같이, 상기 실험 결과는 ITPRIPL1-RBD1-Fc 단백질이 CD3와 Nck의 결합을 상향 조정하며, 농도 의존성이 있음을 보여준다. 이로써 ITPRIPL1이 CD3과 Nck의 결합 신호를 농도 의존적으로 증가시킬 수 있다는 것이 확인되었다.
2. 근접결찰분석(PLA) 결과 ITPRIPL1-RBD1-Fc 단백질이 CD3과 Nck의 결합 신호를 증가시킬 수 있다는 것이 확인되었다.
배양된 Jurkat 세포(ATCC, VA, USA)를 계수하고 2x106개의 세포를 15 ml 원심분리 튜브(Corning, NY, USA)에 넣고 800 rpm으로 4분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하였다. 혈청을 함유하지 않은 RPMI 1640 배지(Meilun Biotech, Dalian, China)로 재현탁하고 인큐베이터에서 3시간 동안 기아 배양한 후, 800 rpm으로 4분 동안 원심분리하였다. 2 ml의 완전 배지(Meilun Biotech, Dalian, China)로 재현탁한 후, 12웰 플레이트(Corning, NY, USA)의 각 웰에 1 ml씩 분주하고, 먼저 10 μg/mL의 OKT3를 첨가하여 활성 처리하였다. 동시에, 각각 무처리, 4 μg/mL RBD1-Fc 단백질을 첨가하였다. Jurkat 세포를 인큐베이터에 5분 동안 방치한 후 꺼내어, 근접결찰분석 실험 키트(Merck, NJ, USA)에 첨부된 설명서에 따라, CD3E 특이적 마우스 항체(Santacruz biotechnology, CA, USA) 및 Nck 특이적 토끼 항체(CST, MA, USA) 뿐만 아니라 키트 내 시약을 사용하여 관련 작업을 수행하였다. 마운팅한 후, 슬라이드를 형광현미경으로 관찰하였다.
도 46에서 보는 바와 같이, 근접결찰분석(PLA) 결과 ITPRIPL1-RBD1-Fc 단백질이 CD3과 Nck의 결합 신호를 증가시킬 수 있으며, 이를 통해 T세포의 신호전달과 기능을 조절할 수 있다는 것이 확인되었다.
실시예 17: 생체 내에서 면역 및 T세포의 기능을 조절하여 종양의 면역회피를 촉진시키는 ITPRIPL1
1. 인간화 CD3ε 마우스 MC38 피하 이종이식 종양 생체 내 모델 구축
구축된 전장 ITPRIPL1-Flag 플라스미드와 빈 pcDNA3.1 플라스미드로 각각 MC38 세포(Kerafast, MA, USA)를 형질감염시켜 인큐베이터에서 24-48시간 동안 배양한 후, 200 μg/mL의 게네티신(Geneticin, G418)(Gibco, CA, USA)을 첨가하여 스크리닝하였다. 10-14일 후, 빈 pcDNA3.1 플라스미드 형질감염군의 세포가 모두 사멸된 다음, 안정적으로 형질감염된 MC38-ITPRIPL1 세포주를 수득하였다.
6-8주령의 인간화 CD3ε 마우스(Model Organisms Center, Shanghai, China)를 선택하여 체중에 따라 무작위로 군을 나눠 각 군당 6마리씩 배정하였다. MC38 야생형 세포와 안정적으로 형질 감염된 MC38-ITPRIPL1 세포주를 계수하고 PBS로 재현탁하여 1.5x107/mL의 세포 밀도를 만들었다. 제모한 마우스의 오른쪽 겨드랑이에 1.5 x106 의 야생형 또는 ITPRIPL1 과발현 MC38 세포를 피하 접종하여 인간화 CD3ε 마우스 MC38 피하 이종이식 종양의 생체 내 모델을 구축하였다.
2. ITPRIPL1 과발현은 마우스 체내의 종양 성장을 유의하게 증가시켰다.
인간화 CD3ε 마우스 MC38 피하 이종이식 종양 생체 내 모델 구축 후, 접종 5일째부터 3일 간격으로 종양의 크기를 측정하기 위해 버니어 캘리퍼스로 종양의 장직경과 단직경을 측정하고, 종양의 부피를 측정하기 위해 1/2*A*a*a의 공식을 사용하여 종양의 부피를 계산하여 기록하였다. 접종 후 23일째에 모든 마우스를 희생시키고 종양을 적출하여 무게를 측정하고 통계적으로 분석하였다.
도 47에서 보는 바와 같이, 종양의 부피와 종양의 무게는 ITPRIPL1 과발현이 종양의 성장을 유의하게 증가시키는 생체 내 기능을 가지고 있음을 보여준다. ITPRIPL1은 인간 종양에서 보편적으로 발현이 상향 조절되기 때문에(본 명세서의 다른 실시예 참조), 이 실시예의 결과는 ITPRIPL1이 인간 종양에서 면역회피를 촉진시키는 역할을 한다는 것을 시사한다. 따라서, ITPRIPL1에 대한 억제제는 종양 성장을 억제하는 효과가 있으며, ITPRIPL1 조절제는 종양 치료용 약물의 제조에 적용 가치가 있다.
3. 유세포 분석에서 ITPRIPL1 과발현이 마우스 체내 T 세포의 활성을 억제하는 것으로 확인되었다.
심장 채혈 방식으로 마우스 체내에서 최소 1ml의 말초 혈액을 채취하였다. 마우스 말초 혈액 PBMC 분리 키트(Solarbio, Beijing, China)를 사용서에 따라 조작하여 마우스 PBMC 세포를 수득하였다.
마우스 PBMC를 EP 튜브(Axygen, CA, USA)에 넣고 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하였다. 500 μl의 세포 염색 완충액(Invitrogen, CA, USA)으로 세포를 재현탁하고 세척한 후, 원심분리와 세척을 반복하였다. 세포 염색 완충액에 마우스 CD8-APC 항체(Biolegend, CA, USA), 마우스 CD69-APC 항체(Biolegend, CA, USA), 및 마우스 CD137-APC 항체(Biolegend, CA, USA)를 1:20으로 희석하고 각 EP 튜브에 혼합액 200 μl를 첨가하여 재현탁한 후 실온에서 천천히 흔들어 30분 동안 배양하였다. 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하고, 500 μl의 세포 염색 완충액으로 세포를 재현탁하고 세척한 다음, 원심분리와 세척을 반복하였다. 각 EP 튜브에 200 μl의 세포 염색 완충액을 첨가하고, 테스트 튜브(Falcon, NY, USA)로 옮긴 후 유세포 분석기(Miltenyi Biotec, Cologne, Germany)로 분석하였다.
도 48에서 보는 바와 같이, 평균 형광 강도에 따르면 ITPRIPL1 과발현은 CD8, CD25, CD139의 발현을 유의하게 감소시킬 수 있다. 이 실험 결과는 ITPRIPL1 과발현이 마우스 체내 T세포의 활성을 억제할 수 있다는 것을 시사한다.
4. 면역조직화학염색에서 ITPRIPL1의 과발현이 종양 내 T세포의 침윤을 유의하게 감소시킨다는 것이 확인되었다.
MC38 종양 조직을 적출한 후 절편으로 자르고 파라핀 포매 처리(BIOSSCI, Wuhan, China)하였다. 수득한 파라핀 절편에서 파라핀 제거, 수화, 항원 복구 등을 처리한 후, 마우스 CD8 항체(CST, MA, USA)를 습식 배양기에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날 재가온 후 시약 설명서에 따라 2차 항체를 인큐베이션하고, DAB 염색(Solarbio, Beijing, China) 및 헤마토실린 염색(Solarbio, Beijing, China)한 다음, 역방향의 알코올 농도 구배로 공기 건조하고 마운팅하였다. 마운팅한 슬라이드를 형광현미경에서 자연광으로 관찰하고 촬영하였다.
도 49에서 보는 바와 같이, ITPRIPL1 과발현은 종양 조직에서 CD8의 양성률을 유의하게 감소시킬 수 있다. 이 실험 결과는 ITPRIPL1 과발현이 MC38 종양 조직에서 T세포의 침윤을 감소시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
5. ITPRIPL1 이형접합/동형접합 녹아웃 마우스 생체 내 모델 구축
CRISPR/Cas9 기술과 비상동 재조합 복구 돌연변이 도입 방식을 이용하여 Itpripl1 유전자 단백질의 판독 프레임을 이동시켜 기능을 결실시켰다. 간략한 절차는 다음과 같다: 시험관 내 전사 방식으로 Cas9 mRNA 및 gRNA를 수득하였으며, Cas9 mRNA 및 gRNA를 C57BL/6J 마우스의 수정란에 미세 주사하여 F0 세대 마우스를 수득하였다. PCR 증폭 및 시퀀싱 확인을 통해 양성으로 확인된 F0 세대 마우스와 C57BL/6J 마우스를 교배하여 6마리의 양성 F1 세대 마우스, 즉, ITPRIPL1 녹아웃 이종접합 및 동형접합 마우스를 수득하였다.
6. 유세포 분석에서 ITPRIPL1의 녹아웃이 T세포의 활성을 강화시키는 것으로 확인되었다.
마우스 모델에서 혈액을 채취해 PBMC를 분리하였다. 세포 현탁액에서 세포를 계수하였다. 세포 계수 후, PBS 용액으로 희석하여 검출할 세포의 농도를 106개/mL로 조절하였다. 200 ul의 세포 현택액을 취하여 4℃에서 1000 rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 세포를 100 ul PBS에 재현탁하고 검출 튜브를 다음과 같이 설정하였다:
음성 대조군: 100 ul 세포 현탁액.
CD39 검출 튜브: 100 ul 세포 현택액에 PD1 항체 2 ul 추가하여 가볍게 섞는다.
CD73 검출 튜브: 100 ul 세포 현택액에 PD-L1 항체 2 ul 추가하여 가볍게 섞는다.
항체는 모두 (Thermo Fisher, MA, USA) 제품이다.
암실의 4℃ 인큐베이터에 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 완료 후 유세포 분석기로 검출하였다.
도 50에서 보는 바와 같이, ITPRIPL1 녹아웃 후 억제성 표면 분자 CD39, CD73이 모두 유의하게 감소되었으며, 이는 ITPRIPL1 녹아웃을 통해 체내 T세포의 활성을 증가시킬 수 있다는 것을 시사하며, ITPRIPL1의 T세포에 대한 부정적인 조절 작용을 입증한다.
7. ELISA 분석 결과 ITPRIPL1 녹아웃은 면역활성 사이토카인의 분비를 증가시키는 것으로 확인되었다.
마우스 PBMC를 그랜자임 A, 그랜자임 B, IL-2, TNF-alpha, IL-21 과 같은 사이토카인에 대한 ELISA 키트(Abnova, CA, USA) 설명서에 따라 조작 및 처리하여 해당 실험 결과를 수득하였다.
도 51에서 보는 바와 같이, ITPRIPL1 녹아웃은 그랜자임A, 그랜자임 B, IL-2, TNF-alpha, IL-21과 같은 사이토카인의 분비량을 증가시켰으며, 이는 ITPRIPL1 녹아웃 후 체내 면역활성 인자의 분비량 증가를 설명하고, ITPRIPL1 자체의 면역억제 작용을 시사한다.
8. 면역조직화학염색에서 ITPRIPL1 녹아웃은 고환 조직 내 T세포 침윤을 증가시킨다는 것이 확인되었다.
마우스의 고환 조직을 적출해 염색하고 절편(Jrdun, Shanghai, China)을 만들어 형광현미경으로 그 결과를 관찰하였다.
도 52에서 보는 바와 같이, 면역조직화학염색에서 ITPRIPL1 녹아웃 후 고환 내 CD3, CD4, CD8의 양성률이 증가하였으며, 이는 T세포 침윤이 증가한 것을 나타낸다. 이에 따라 이형접합 및 동형접합 녹아웃 마우스의 정자 형태 이상, 운동 방식 이상, 및 활력 급감은, 고환에서 발생한 염증의 현저한 침윤과 일치하며, 이는 고환 조직 자가면역 장애를 뒷받침하는 유력한 증거이다. 상기 결과는 ITPRIPL1이 고환의 생리학적 조건에서 T세포의 활성을 부정적으로 조절하고, ITPRIPL1이 고환의 면역특권 상태를 유지하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 설명한다. 따라서, ITPRIPL1의 발현은 고환 자가면역질환 및 자가면역성 불임의 발생을 예측하고, ITPRIPL1의 활성을 조절하여 자가면역성 불임에 대한 개입 및 치료에 사용할 수 있다.
실시예 18: ITPRIPL1을 생체 내 종양세포의 존재를 표지하고, 종양의 진행 정도 및 단계를 예측하며, 종양과 정상 조직의 경계를 구분하는 생체 표지자로 사용
본 명세서는 ITPRIPL1이 종양의 면역회피에 중요한 역할을 하며, ITPRIPL1의 발현이 높은 종양은 ITPRIPL1 억제제를 사용하여 종양의 성장을 억제할 수 있다는 것을 창조적으로 개시한다. 따라서, ITPRIPL1의 발현을 검출하는 것이 매우 중요하다. 본 명세서는 ITPRIPL1 특이적 항체를 사용하여 그 발현을 검출하는 방법을 시연하고, ITPRIPL1의 고발현을 통해 체내 종양세포의 존재를 표지하고, 종양 조직과 정상 조직의 경계를 정확하게 표지할 수 있음을 개시한다. 또한, ITPRIPL1은 종양의 진행 정도 및 단계와도 유의한 상관관계가 있다. 구체적인 절차는 다음과 같다:
ITPRIPL1 다클론항체를 생성하는 과정은 전술한 바와 같다. 추가로 하이브리도마 스크리닝 및 분리 배양을 통해 ITPRIPL1의 단클론항체를 제조하였다. ITPRIPL1 항체를 통해 다양한 종양 조직의 마이크로어레이에 면역조직화학염색을 수행하고(Shanghai Outdo Biotech), 이미지를 스캔하여 ITPRIPL1의 발현 수준 및 분포를 통계적으로 분석하였다. 도 53에서 보는 바와 같이, ITPRIPL1의 발현은 여러 종류의 일반적인 암종 단백질 수준에서 유의하게 증가하였으며, 암 주변 조직과 뚜렷한 차이를 보였다. 또한, ITPRIPL1은 종양의 진행 정도 및 단계와도 유의한 상관관계가 있다. 예를 들어, 유방암의 진행기(3C, 4기)에서 그 발현량이 초기(1기)보다 유의하게 높았고, 폐암의 진행기(4기)에서 그 발현량이 초기(1A기)보다 유의하게 높았으며, 결장직장암과 갑상선암에서도 ITPRIPL1의 발현량이 초기 단계보다 진행기 단계에서 더 높은 특징을 보였다. 이 결과는 ITPRIPL1을 생체 내 종양세포의 존재를 표지하고 종양의 진행 정도 및 단계를 예측할 수 있는 생체 표지자로 사용할 수 있음을 시사한다.
종양 조직에서 ITPRIPL1의 염색은 매우 뚜렷한 일치성을 보여주었다. 첫째, 전술한 다양한 종양에서 ITPRIPL1의 존재는 보편적으로 유의하게 상향 조절되었으며 소수의 종양에서만 예외가 있었다. 둘째, 종양 조직에서 ITPRIPL1의 발현은 강한 균일성, 즉, 원발 병소의 다양한 부위와 전이 병소의 다양한 세포에서 발현이 비교적 일치하였다. 이러한 특징은 도 56에서 관찰할 수 있다. ITPRIPL1은 림프절로 전이된 종양세포에서 유의하게 발현되기 때문에 암세포 조직과 정상 림프절 조직을 구별하는 데 사용할 수 있으며, ITPRIPL1은 또한 멀리 전이된 종양세포에서도 유의하게 발현되기 때문에 전이 병소와 정상 조직의 구별에도 사용할 수 있다. ITPRIPL1의 상기 특징은 종양 및 정상의 세포 및 조직을 구별하고, 종양 및 정상의 세포 및 조직 사이의 경계를 정확하게 표지하는 데 적합하다. 이러한 표지자는 치료 전후 종양의 크기 및 침윤 정도를 분석하는 데 적합하다. 따라서, ITPRIPL1의 발현은 ITPRIPL1 조절제 약물의 중요한 동반 진단 표지자이다. 동시에, ITPRIPL1은 이질성이 낮아 종양 진단 생체 표지자로서 뛰어난 잠재력을 지닌다.
실시예 19: ITPRIPL1에 특이적으로 결합하는 마우스 하이브리도마 항체
1. ITPRIPL1 마우스 하이브리도마 항체 제조
(1) 인간 ITPRIPL1-Fc 재조합 단백질(서열번호 21로 표시됨)을 면역원으로 사용하여 C57BL/6 마우스를 면역화하고 효과를 높이기 위해 여러 번 면역화를 진행하였다:
1) 1차 면역화: 항원 50 μg/개체, 완전 프로인트 애주번트 피하 주사, 3주 간격
2) 2차 면역화: 용량 및 투여 경로는 1차와 동일함, 불완전 프로인트 애주번트, 3주 간격
3) 3차 면역화: 용량은 1차와 동일함, 애주번트 사용 안 함, 복강내 주사, 3주 간격
4) 부스터 면역화: 용량 50 μg, 복강내 주사, 마지막 주사 3일 후 혈액을 채취하여 역가를 측정함.
(2) 측정된 면역 효과가 요구 사항을 충족하면, 여러 번의 채혈, 다클론항체 분리, 다클론항체 정제 과정을 반복하였다. 구체적인 실험 절차는 다음과 같다:
1) G 단백질 세파로스 CL-4B 친화성 컬럼 준비. 10 mL의 G 단백질 세파로스 CL-4B 충진제를 준비하고, 동일 부피의 충진제와 TBS 완충액을 진공 플라스크에 혼합하여 교반하였다. 충진제의 기포를 제거하기 위해 15분 동안 진공을 수행하였다. G 단백질 세파로스 CL-4B 충진제를 펌프를 이용해 충진 속도를 1 mL/분-2 mL/분으로 제어하면서 유리 컬럼에 천천히 첨가하였다. 컬럼이 건조되는 것을 방지하기 위하여, 컬럼은 미리 냉각한 TBS 완충액으로 충진 부피의 10배를 사용하여 평형화하였다.
2) 다클론항체 제조. 단백질이 응집되지 않도록 다클론항체를 얼음물 또는 4°C의 냉장고에서 천천히 해동시켰다. 고체 아지드화나트륨을 0.05% 농도로 첨가하고, 4℃, 15,000×g으로 5분간 원심분리한 후, 침전된 다클론성 항체를 제거하고, 필터로 여과하여 과잉 지질을 제거하였다.
3) 친화성 크로마토그래피. 항체를 1:5 비율로 TBS 완충액에 희석한 후 필터로 여과시켰다. 분당 0.5mL의 속도로 다클론성 항체를 컬럼에 로딩시키고, 다클론성 항체와 충진제의 결합을 보장하기 위해 컬럼을 2회 연속 로딩하고 로딩 유출액을 유지하였다. 컬럼을 TBS 완충액으로 Aλ 280 nm<0.008이 될 때까지 세척한 후, Ph 2.7 용리 완충액을 첨가하여 0.5 mL/min의 속도로 모든 단백질이 용출될 때까지 용리하였다. 100 μl의 중화 완충액을 첨가한 1.5 mL EP 튜브에 용리액을 수집하고 혼합한 후, pH 시험지로 용리액의 pH를 확인하고, pH가 7 미만인 경우 중화 완충액을 사용해 약 pH 7.4로 조정하여 항체의 변성을 방지하였다. 컬럼에10 mL, pH1.9의 용리 완충액을 첨가하고 상기 방법에 따라 Aλ 280 nm<0.008이 될 때까지 용리액을 수집하였다. 분광광도계를 사용하여 각 튜브의 단백질 함량을 측정하였다.
2. 효소결합면역흡착분석(ELISA)으로 각 하이브리도마 항체와 ITPRIPL1의 결합 검증
각 하이브리도마 항체의 ITPRIPL1에 대한 결합력을 검증하기 위해 효소결합 면역흡착분석(ELISA)으로 각 항체와 ITPRIPL1 단백질의 직접 결합을 확인하였다. ELISA 전용 플레이트(costar, ME, USA)를 사용하였다. 먼저ELISA 코팅액(Solarbio, Beijing, China)에 희석된 ITPRIPL1 재조합 단백질(cusabio, Wuhan, China) 100 μl(1 μg/mL)를 분주하고, 음성 대조군으로 ITPRIPL1 재조합 단백질을 포함하지 않은 코팅액 100 μl를 분주하였다. 플레이트는 4℃에서 밤새 코팅하였다. PBST로 세척 후, 5% BSA를 함유한 PBS(VWR, PA, USA) 100 μl로 37°C의 인큐베이터에서 90분 동안 차단시켰다. PBST로 세척후, 37℃의 인큐베이터에서 60분 동안 결합시켰다. PBST로 세척 후, PBS로 희석한 특이적 항-마우스 Fc 세그먼트 항체(Consun, Shanghai, China)를 37°C의 인큐베이터에서 30분 동안 결합시켰다. PBST로 세척 후, 발색액(Invitrogen, CA, USA)을 웰당 100 μl씩 분주하고 인큐베이터에서 5~30분 동안 반응시킨 후, 정지액(Sangon, Shanghai, China) 50 μl를 첨가하고 마이크로플레이트 판독기(Thermo Fisher, MA, USA)로 450nm에서 발색을 판독하였다.
도 57은 상기 ELISA 실험 결과를 보여준다. 왼쪽 상단 도는 ITPRIPL1 단백질에 결합한 항체 100개 전체에 대한 ELISA 결과이고, 오른쪽 상단 도는 왼쪽 상단 도의 결과에서 결합력이 양호한 항체 9개를 선별하여 단독으로 반복 실험한 결과이다. 하단 도는 13B7 항체의 농도 의존적인 결합 곡선이다. 이 실험은 각 항체의 ITPRIPL1에 대한 결합력이 각기 다르고, 항체간 이질성이 있으며, 13B7 항체의 결합력이 가장 뛰어난 것으로 나타났다. 상기 결과는 각 하이브리도마 항체가 각기 다른 결합력으로 ITPRIPL1에 결합한다는 것을 증명한다.
3. 유세포 분석(FACS)으로 각 하이브리도마 항체와 ITPRIPL1의 결합 검증
각 하이브리도마 항체의 ITPRIPL1에 대한 결합력을 추가로 검증하기 위해 유세포 분석법(FACS)으로 각 항체와 ITPRIPL1 단백질의 직접 결합을 확인하였다. 내인성 고발현 ITPRIPL1의 Jurkat 세포(ATCC, VA, USA)를 계수하고, 세포 수를 1x106/mL로 조정한 후, 각각 100 μl씩 96웰 플레이트(Thermo Fisher, MA, USA)에 분주하고, 각 웰에 최종 농도 1 μg/mL의 하이브리도마 항체 또는 대조 혈청을 첨가한 다음 인큐베이터에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 96웰 플레이트를 꺼내 각 웰의 세포를 EP 튜브(Axygen, CA, USA)에 넣고 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하였다. 500 μl의 세포 염색 완충액(Invitrogen, CA, USA)으로 세포를 재현탁하고 세척한 후, 원심분리와 세척을 반복하였다. 세포 염색 완충액에 항마우스 Fc 세그먼트-Alexa Fluor 488 항체(Invitrogen, CA, USA)를 1:500으로 희석하고 각 EP 튜브에 혼합액 200 μl를 첨가하여 재현탁한 후 실온에서 30분 동안 배양하였다. 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하고, 1 ml의 세포 염색 완충액으로 세포를 재현탁하고 세척한 다음, 원심분리와 세척을 반복하였다. 각 EP 튜브에 300 μl의 세포 염색 완충액을 첨가하고, 테스트 튜브(Falcon, NY, USA)로 옮긴 후 유세포 분석기(Miltenyi Biotec, Cologne, Germany)로 분석하였다.
도 58은 상기 FACS 실험 결과이며, 이 실험은, 각 항체가 ITPRIPL1에 대한 결합력이 각기 다르고, 항체간 이질성이 있으며, 13B7이 결합력이 가장 항체라는 것을 보여준다.
실시예 20: 고친화성으로 ITPRIPL1에 특이적으로 결합하는 13B7 항체
1. 유세포 분석(FACS)으로 13B7 항체와 ITPRIPL1 발현량이 다른 세포의 결합 검증
13B7 항체의 ITPRIPL1에 대한 결합력을 추가로 검증하기 위해, 유세포 분석법(FACS)으로 13B7 항체와 ITPRIPL1 발현량이 다른 다양한 세포의 직접 결합을 확인하였다. 내인성 ITPRIPL1 발현량이 다른 세포, 즉, HCT116(ATCC, VA, USA), A549(ATCC, VA, USA), MC38(Kerafast, MA, USA), Jurkat(ATCC, VA, USA), Raji 세포(ATCC, VA, USA) 및 안정적으로 형질감염된 MC38-ITPRIPL1 세포주를 계수하고, 세포 수를 1x106/mL로 조정하였다. 각각 100 μl씩 96웰 플레이트(Thermo Fisher, MA, USA)에 분주하고, 각 웰에 최종 농도 1 μg/mL의 13B7 항체를 첨가한 후 인큐베이터에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 96웰 플레이트를 꺼내 각 웰의 세포를 EP 튜브(Axygen, CA, USA)에 넣고 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하였다. 500 μl의 세포 염색 완충액(Invitrogen, CA, USA)으로 세포를 재현탁하고 세척한 후, 원심분리와 세척을 반복하였다. 세포 염색 완충액에 항마우스 Fc 세그먼트-Alexa Fluor 488 항체(Invitrogen, CA, USA)를 1:500으로 희석하고, 각 EP 튜브에 혼합액 200 μl를 첨가하여 재현탁한 후 실온에서 30분 동안 배양하였다. 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하고, 1 ml의 세포 염색 완충액으로 세포를 재현탁하고 세척한 후, 원심분리와 세척을 반복하였다. 각 EP 튜브에 300 μl의 세포 염색 완충액을 첨가하고, 테스트 튜브(Falcon, NY, USA)로 옮긴 후 유세포 분석기(Miltenyi Biotec, Cologne, Germany)로 분석하였다.
도 59는 상기 FACS 실험 결과이며, 이 실험은, 각 세포주와 13B7 항체의 결합력이 기본적으로 각 세포주의 ITPRIPL1 단백질 발현 정도와 일치함을 보여주며, 이는 13B7 항체가 ITPRIPL1을 발현하는 세포주의 ITPRIPL1에 특이적으로 결합할 수 있음을 시사한다.
2. 유세포 분석(FACS)으로 13B7 항체의 Jurkat 세포에 대한 농도 의존적 결합 검증
13B7 항체의 ITPRIPL1에 대한 결합력을 검증하기 위해 유세포 분석법(FACS)으로 13B7 항체가 Jurkat 세포에 농도 의존적으로 결합하는지 확인하였다. 내인성 고발현 ITPRIPL1의 Jurkat 세포를 계수하고, 세포 수를 1x106/mL로 조정한 후, 각각 100 μl씩 96웰 플레이트(Thermo Fisher, MA, USA)에 분주하고, 각 웰에 최종 농도 0.0625/0.125/0.25/0.5/1/2 μg/mL의 13B7 항체를 첨가한 후 인큐베이터에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 96웰 플레이트를 꺼내 각 웰의 세포를 EP 튜브(Axygen, CA, USA)에 넣고 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하였다. 500 μl의 세포 염색 완충액(Invitrogen, CA, USA)으로 세포를 재현탁하고 세척한 후, 원심분리와 세척을 반복하였다. 세포 염색 완충액에 항마우스 Fc 세그먼트-Alexa Fluor 488 항체(Invitrogen, CA, USA)를 1:500으로 희석하고, 각 EP 튜브에 혼합액 200 μl를 첨가하여 재현탁한 후 실온에서 30분 동안 배양하였다. 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하고, 1 ml의 세포 염색 완충액으로 세포를 재현탁하고 세척한 다음, 원심분리와 세척을 반복하였다. 각 EP 튜브에 300 μl의 세포 염색 완충액을 첨가하고, 테스트 튜브(Falcon, NY, USA)로 옮긴 후 유세포 분석기(Miltenyi Biotec, Cologne, Germany)로 분석하였다.
도 60은 상기 FACS 실험 결과이며, 이 결과는 Jurkat 세포가 13B7 항체와 농도 의존적인 고친화성으로 결합할 수 있음을 보여준다.
3. 단백질 웨스턴 블롯으로 ITPRIPL1 발현량이 다른 세포의 ITPRIPL1 단백질에 대한 13B7 항체의 특이적 결합 검증
내인성 ITPRIPL1 발현량이 다른 Jurkat, HCT116, MC38 세포를 계수한다. 1x106개의 세포를 취하여 PBS로 세척하고 원심분리한 다음, 60 μl RIPA 용해액(Beyotime, Shanghai, China)과 프로테아제 억제제, 포스파타제 억제제, PMSF(Consun, Shanghai, China)의 트리플을 1：100의 비율로 제조하여, 얼음 위에서 15분 동안 세포를 용해시키고, 액체질소로 동결 및 해동을 3회 진행하였다. 원심분리 후, 로딩 완충액(Beyotime, Shanghai, China)을 혼합하여, 100℃의 메탈 배스(metal bath)에서 변성시켜 Input 단백질 시료를 수득하였다. 그런 다음, 설명서에 따라 겔 플레이트(Bio-Rad, CA, USA)에 12.5%의 PAGE 겔(EpiZyme, Shanghai, China)을 배치하고 준비된 겔을 전기영동조(Bio-Rad, CA, USA)에 넣은 후 전원(Bio-Rad, CA, USA)을 연결하고, 축적 겔(stacking gel)까지는 80V로 진행하고, 분해 겔(separating gel)부터는 120V의 전압으로 진행하였다. 밴드가 분해 겔 바닥에 도달하면 멤브레인에 대한 습식 전송을 이용하여 전송조(Bio-Rad, CA, USA)에서 350 mA로 90분간 멤브레인으로 전송하였다. 전송이 완료된 후 ITPRIPL1 단백질과 내부 참조용 GAPDH 단백질의 질량 크기에 따라 멤브레인을 절단 처리하였다. 신속 차단 완충액(EpiZyme, Shanghai, China)으로 10분간 차단하고, 최종 농도 1 μg/mL로 희석한 13B7 항체와 GAPDH-HRP 항체(Consun, Shanghai, China)를 사용하여 각각 ITPRIPL1 및 GAPDH 해당 밴드를 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날 TBST로 세척한 후 5% 탈지분유(Sangon, Shanghai, China)를 함유한 TBS로 희석한 특이적 항마우스 2차 항체(Consun, Shanghai, China)를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고 TBST로 세척한 다음, 혼합 발광액(Share-Bio, Shanghai, China)에 1분간 넣어 겔 이미저(Bio-Rad, CA, USA)에 노출시켰다.
도 61은 상기 웨스턴 블롯 실험 결과이다. 이 도에서 볼 수 있듯이, 내부 참조로 사용된 GAPDH를 기준으로 13B7 항체는 ITPRIPL1 단백질 분자량 위치에 특이적으로 밴드를 나타내고, 이는 각 세포의 내인성 ITPRIPL1 발현 정도에 부합하여 13B7 항체가 ITPRIPL1 단백질에 특이적으로 결합할 수 있음을 나타낸다.
실시예 21: ITPRIPL1과 CD3E/SEMA3G의 결합에 대한 각 하이브리도마 항체의 차단 효과 측정
CD3E 또는 SEMA3G에 대한 ITPRIPL1의 결합을 각 하이브리도마 항체가 차단하는 효과가 있는지 확인하기 위해, 효소결합면역흡착분석(ELISA)으로 각 항체에 대한 차단 효과를 검증하였다. ELISA 전용 플레이트(costar, ME, USA)를 사용하였다. 먼저1 μg/mL의 ITPRIPL1-Fc 태그 재조합 단백질(Abclonal, Wuhan, China) 또는 1 μg/mL의 CD3E-Fc 태그 단백질(Acro, Beijing, China)을 100 μl의 ELISA 코팅액(Solarbio, Beijing, China)에 녹여 분주하고, 음성 대조군으로 단백질을 포함하지 않은 코팅액 100 μl를 분주하였다. 플레이트는 4℃에서 밤새 코팅하였다. PBST로 세척 후, 5% BSA를 함유한 PBS(VWR, PA, USA) 100 μl로 37°C의 인큐베이터에서 90분 동안 차단시켰다. PBST 세척 후, ITPRIPL1-Fc 단백질을 코팅한 웰에 최종 농도 1 μg/mL의 SEMA3G-His 태그 단백질(cusabio, Wuhan, China)과 최종 농도 1/2 μg/mL의 하이브리도마 항체를 첨가하고, 동시에, CD3E-Fc 단백질을 코팅한 웰에 최종 농도 1 μg/mL의 ITPRIPL1-His 태그 단백질(cusabio, Wuhan, China)과 최종 농도 1/2 μg/mL의 하이브리도마 항체를 첨가한 다음, 37°C의 인큐베이터에서 60분 동안 결합시켰다. PBST로 세척 후, PBS로 희석한 특이적 항-His 세그먼트 항체(Abcam, MA, USA)를 37°C 인큐베이터에서 30분 동안 결합시켰다. PBST로 세척 후, 발색액(Invitrogen, CA, USA)을 웰당 100 μl씩 분주하고 인큐베이터에서 5~30분 동안 반응시킨 후, 정지액(Sangon, Shanghai, China) 50 μl를 첨가하고 마이크로플레이트 판독기(Thermo Fisher, MA, USA)로 450nm에서 발색을 판독하였다.
도 62은 상기 ELISA 실험 결과를 보여준다. 상단 도는 ITPRIPL1-CD3E 결합 시 각 하이브리도마 항체의 차단 수준을 보여주고, 하단 도는 ITPRIPL1-SEMA3G 결합 시 각 하이브리도마 항체의 차단 수준을 보여준다. 이 실험 결과는 각 하이브리도마 항체가 CD3E 또는 SEMA3G에 대한 ITPRIPL1의 결합을 다양한 수준으로 차단할 수 있고, 각 항체 간 이질성이 있으며, 그중 18B12 항체와 13B7 항체가 가장 뛰어난 결합 효과를 가지는 것으로 나타났다.
실시예 22: 더 높은 친화력으로 ITPRIPL1에 결합하는 단클론항체
1. 효소결합면역흡착분석(ELISA)으로 ITPRIPL1에 대한 각 단클론항체의 결합력 검증
각 하이브리도마 항체에서 단클론을 정제한 후, 성장 상태가 양호한 단클론항체 16개를 수득하였다. ITPRIPL1에 대한 각 단클론항체의 결합력을 검증하기 위해 효소결합면역흡착분석(ELISA)으로 각 항체와 ITPRIPL1 단백질의 직접 결합을 확인하였다. ELISA 전용 플레이트(costar, ME, USA)를 사용하였다. 먼저 ELISA 코팅액(Solarbio, Beijing, China)에 희석된 ITPRIPL1 재조합 단백질(cusabio, Wuhan, China) 100 μl(1 μg/mL)를 분주하고, 음성 대조군으로 단백질을 포함하지 않은 코팅액 100 μl를 분주하였다. 플레이트는 4℃에서 밤새 코팅하였다. PBST로 세척 후, 5% BSA를 함유한 PBS(VWR, PA, USA) 100 μl로 37°C 인큐베이터에서 90분 동안 차단시켰다. PBST로 세척 후, 최종 농도 1 μg/mL의 다양한 단클론항체를 첨가하여 37°C 인큐베이터에서 60분 동안 결합시켰다. PBST로 세척 후, PBS로 희석한 특이적 항-마우스 Fc 세그먼트 항체(Consun, Shanghai, China)를 37°C 인큐베이터에서 30분 동안 결합시켰다. PBST로 세척 후, 발색액(Invitrogen, CA, USA)을 웰당 100 μl씩 분주하고 인큐베이터에서 5~30분 동안 반응시킨 후, 정지액(Sangon, Shanghai, China) 50 μl를 첨가하고 마이크로플레이트 판독기(Thermo Fisher, MA, USA)로 450nm에서 발색을 판독하였다.
도 63은 상기 ELISA 실험 결과를 보여준다. 실험 결과, ITPRIPL1에 대한 각 단클론항체의 결합력에는 차이가 있지만, ITPRIPL1에 대한 전반적인 결합력은 단클론 정제 전의 결합력보다 훨씬 강한 것으로 나타났다. 이는 단클론항체가 더 높은 친화성으로 ITPRIPL1에 결합할 수 있다는 것을 나타낸다.
2. 유세포 분석(FACS)으로 각 단클론항체와 ITPRIPL1의 결합 검증
ITPRIPL1에 대한 각 단클론항체의 결합력을 추가로 검증하기 위해 유세포 분석법(FACS)으로 각 항체와 ITPRIPL1 단백질의 직접 결합을 확인하였다. 내인성 고발현 ITPRIPL1의 Jurkat 세포를 계수하고, 세포 수를 1x106/mL로 조정한 후, 각각 100 μl씩 96웰 플레이트(Thermo Fisher, MA, USA)에 분주하였다. 각 웰에 최종 농도 1 μg/mL의 단클론항체 또는 대조 혈청을 첨가한 후 인큐베이터에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 96웰 플레이트를 꺼내 각 웰의 세포를 EP 튜브(Axygen, CA, USA)에 넣고 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하였다. 500 μl의 세포 염색 완충액(Invitrogen, CA, USA)으로 세포를 재현탁하고 세척한 후, 원심분리와 세척을 반복하였다. 세포 염색 완충액에 항마우스 Fc 세그먼트-Alexa Fluor 488 항체(Invitrogen, CA, USA)를 1:500으로 희석하고, 각 EP 튜브에 혼합액 200 μl를 첨가하여 재현탁한 후 실온에서 30분 동안 배양하였다. 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하고, 1 ml의 세포 염색 완충액으로 세포를 재현탁하고 세척한 다음, 원심분리와 세척을 반복하였다. 각 EP 튜브에 300 μl의 세포 염색 완충액을 첨가하고, 테스트 튜브(Falcon, NY, USA)로 옮긴 후 유세포 분석기(Miltenyi Biotec, Cologne, Germany)로 분석하였다.
실험 결과는 도 64와 같다. 각 단클론항체는 ITPRIPL1에 대한 결합력이 각기 다르고, 항체간 이질성이 있으며, 전반적인 결합력은 단클론 정제 전보다 뛰어난 것으로 나타났다. 상기 결과는 각 하이브리도마 항체는 ITPRIPL1 단백질에 대한 결합력이 각기 다르고, 단클론 정제 후 ITPRIPL1에 대한 결합력이 훨씬 강하다는 것을 증명한다.
실시예 23: ITPRIPL1과 CD3E/SEMA3G의 결합에 대한 각 하이브리도마 항체의 차단 효과 측정
수득한 단클론항체가 CD3E 또는 SEMA3G에 대한 ITPRIPL1의 결합을 차단하는 효과가 있는지 확인하기 위해 효소결합면역흡착분석(ELISA)으로 각 항체에 대한 차단 효과를 검증하였다. ELISA 전용 플레이트(costar, ME, USA)를 사용하였다. 먼저 최종 농도 1 μg/mL의 ITPRIPL1-Fc 태그 재조합 단백질(Abclonal, Wuhan, China) 또는 최종 농도 1 μg/mL의 CD3E-Fc 태그 단백질(Acro, Beijing, China)을 100 μl의 ELISA 코팅액(Solarbio, Beijing, China)에 녹여 분주하고, 음성 대조군으로 단백질을 포함하지 않은 코팅액 100 μl를 분주하였다. 플레이트는 4℃에서 밤새 코팅하였다. PBST로 세척 후, 5% BSA를 함유한 PBS(VWR, PA, USA) 100 μl로 37°C 인큐베이터에서 90분 동안 차단시켰다. PBST 세척 후, ITPRIPL1-Fc 단백질을 코팅한 웰에 최종 농도 1 μg/mL의 SEMA3G-His 태그 단백질(cusabio, Wuhan, China)과 최종 농도 1 μg/mL의 단클론항체를 첨가하고, CD3E-Fc 단백질을 코팅한 웰에 최종 농도 1 μg/mL의 ITPRIPL1-His 태그 단백질(cusabio, Wuhan, China)과 최종 농도 1/2 μg/mL의 단클론항체를 첨가한 후, 37°C 인큐베이터에서 60분 동안 결합시켰다. PBST로 세척 후, PBS로 희석한 특이적 항-His 세그먼트 항체(Abcam, MA, USA)를 37°C 인큐베이터에서 30분 동안 결합시켰다. PBST로 세척 후, 발색액(Invitrogen, CA, USA)을 웰당 100 μl씩 분주하고 인큐베이터에서 5~30분 동안 반응시킨 다음, 정지액(Sangon, Shanghai, China) 50 μl를 첨가하고, 마이크로플레이트 판독기(Thermo Fisher, MA, USA)로 450nm에서 발색을 분석하였다.
도 65는 상기 ELISA 실험 결과를 보여준다. 실험 결과, 각 단클론항체는 ITPRIPL1과 CD3E/SEMA3G의 결합을 차단하는 효과에 각기 차이가 있으며, 그중 13B7A6H3/18B12D1A6/18B12D1F7의 차단 효과가 양호하고, 단클론 정제 이전의 결론과 일치하는 것으로 나타났다.
실시예 24: 단클론항체 및 폴리펩티드 단편에 대한 하이브리도마 항체의 결합 측정
ITPRIPL1 세포외 단편의 단백질 서열을 기반으로, 1/3 중첩 서열을 가진 폴리펩티드 단편을 총 17개 설계하였다(GenScript, Nanjing, China). 상기 서열은 서열번호 42-58에 제시되었다. 수득한 폴리펩티드를 400 μg/mL의 최종 농도로 DMSO에 녹이고, 효소결합면역흡착분석(ELISA)으로 각 하이브리도마 항체를 확인하고, 단클론항체 4개를 선택하여 폴리펩티드 단편의 결합을 검증하였다. ELISA 전용 플레이트(costar, ME, USA)를 사용하였다. 먼저 100 μl의 ELISA 코팅액(Solarbio, Beijing, China)에 녹인 최종 농도 1 μg/mL의 폴리펩티드 단편을 분주하고, 음성 대조군으로 단백질을 포함하지 않은 코팅액 100 μl를 분주하였다. 플레이트는 4℃에서 밤새 코팅하였다. PBST로 세척 후, 5% BSA를 함유한 PBS(VWR, PA, USA) 100 μl로 37°C 인큐베이터에서 90분 동안 차단시켰다. PBST로 세척 후, 최종 농도 1 μg/mL의 다양한 하이브리도마 항체 또는 단클론항체를 첨가하여 37°C 인큐베이터에서 60분 동안 결합시켰다. PBST로 세척 후, PBS로 희석한 특이적 항-마우스 Fc 세그먼트 항체(Consun, Shanghai, China)를 37°C 인큐베이터에서 30분 동안 결합시켰다. PBST로 세척 후, 발색액(Invitrogen, CA, USA)을 웰당 100 μl씩 분주하고 인큐베이터에서 5~30분 동안 반응시킨 다음, 정지액(Sangon, Shanghai, China) 50 μl를 첨가하고 마이크로플레이트 판독기(Thermo Fisher, MA, USA)로 450nm에서 발색을 판독하였다.
도 66은 상기 ELISA 실험 결과를 보여준다. 특정 폴리펩티드 단편에 대한 결합 판독값이 배경값 및 기타 폴리펩티드 단편의 판독값보다 3배 이상 높으면, 특정 펩티드 단편에 결합하는 것으로 간주된다. 실험 결과, 차단 효과가 양호한 13B7/18B12에서 생성된 단클론항체는 모두 P8에 결합한 반면, 차단 효과가 없거나 낮은 하이브리도마 항체 및 단클론항체는 특이적으로 결합하는 펩티드 단편이 없었으며, 이는 P8이 우세한 결합 부위라는 것을 설명한다.
실시예 25: PBMC 세포에 의한 종양세포 사멸력을 촉진시키는 ITPRIPL1 단클론항체의 효과 측정
유세포 분석을 통해, ITPRIPL1과 CD3E/SEMA3G의 결합을 차단하는 단클론항체는 PBMC에 의한 종양세포 사멸력을 촉진시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
소생시킨 PBMC 세포를 24시간 전에 1 ug/mL의 항-CD3/CD28(Invitrogen, CA, USA)로 활성시켰다. PBMC 세포와 Raji 세포를 계수하고 세포 수를 각각 4x106/ml 또는 1x106/ml로 조정하여, 각각 100 μl씩 96웰 플레이트(Thermo Fisher, MA, USA)에 분주하였다. 동시에, 농도가 다른 2개의 단클론항체 또는 대조군 혈청을 첨가하고 혼합한 후, 인큐베이터에서 6시간 동안 공동 배양하였다. 96웰 플레이트를 꺼내 각 웰의 세포를 EP 튜브(Axygen, CA, USA)에 옮기고, 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하였다. 500 μl의 세포 염색 완충액(Invitrogen, CA, USA)으로 세포를 재현탁하고 세척한 후, 원심분리와 세척을 반복하였다. 400 rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하고, 1 ml의 결합완충액(Beyotime, Shanghai, China)으로 세포를 재현탁하고 세척한 후, 원심분리와 세척을 반복하였다. 실험군과 대조군을 설정하고, 조건에 따라 각각 100 μl의 결합완충액, 5 μl의 Annexin V-FITC(Beyotime, Shanghai, China) 및 10 μl의 PI(Beyotime, Shanghai, China)를 첨가하여 실온에서 15분 동안 배양한 다음, 각각 400 μl의 결합완충액을 첨가하고 테스트 튜브(Falcon, NY, USA)로 옮긴 후, 유세포 분석기(Miltenyi Biotec, Cologne, Germany)로 분석하였다. 이 실험 결과는 도 67과 68에 제시하였다. 대조군과 비교하여, ITPRIPL1과 CD3E/SEMA3G의 결합을 차단하는 효과가 있고 P8(서열번호 49)에 결합할 수 있는, 단클론항체 13B7A6H3/18B12D1A6은 Raji 세포에 대한 PBMC의 사멸력을 유의하게 증가시킨 것으로 나타났다.
시퀀싱을 통해 확인된 단클론항체 13B7A6H3의 중쇄 서열은 서열번호 22, 경쇄 서열은 서열번호 23, 중쇄가변영역 VH 서열은 서열번호 24, 경쇄가변영역 VL은 서열번호 25, 중쇄 상보성 결정 영역HCDR1의 서열은 서열번호 26, 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR2의 서열은 서열번호 27, 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR3의 서열은 서열번호 28, 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1의 서열은 서열번호 29, 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR2의 서열은KV, 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR3의 서열은 서열번호 31; 단클론 항체 18B12D1A6의 중쇄 서열은 서열번호 32, 경쇄 서열은 서열번호 33, 중쇄가변영역 VH 서열은 서열번호 34. 경쇄가변영역 VL은 서열번호 35, 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1의 서열은 서열번호 36, 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR2의 서열은 서열번호 37, 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR3의 서열은 서열번호 38, 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1의 서열은 서열번호 39, 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR2의 서열은 KV, 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR3의 서열은 서열번호 41로 표시된다.
상기 항체 서열의 유사성을 분석한 결과(도 65C), 경쇄 CDR1의 서열은 xSLxNSKGNTH(x는 임의의 아미노산)이고, 13B7A6H3 경쇄 CDR1과의 유사성은 81.8%이며, 경쇄 CDR3의 서열은 SQSTHxPYT이고, 13B7A6H3 경쇄 CDR1과의 유사성은 87.5%이다. 다른 CDR 서열도 동일하다. 따라서, 경쇄 CDR1과 CDR3은 13B7A6H3과 유사성이 80% 이상이고, 다른 CDR 서열이 13B7A6H3과 동일한 경우, 항체는 여전히 ITPRIPL1에 결합하는 활성을 가질 수 있다고 예측할 수 있다. 모든 CDR 서열의 전체 유사성을 비교하면, 13B7A6H3의 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3과 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3의 전체적인 유사성이 94%에 달하는 서열은 ITPRIPL1에 결합하는 활성을 가질 수 있음을 알 수 있다.
실시예 26: 폴리펩티드 단편의 점 돌연변이가 단클론항체의 결합에 미치는 영향 측정
효소결합면역흡착분석(ELISA)으로 각 폴리펩티드 단편 점 돌연변이의 단클론항체에 대한 영향 검증
이전에 수득한 폴리펩티드 단편 P8의 구체적인 아미노산 서열을 하나씩 차례로 알라닌(A) 돌연변이시키고, 원래 알라닌이었던 부위는 돌연변이시키지 않았으며, 이것으로 수득한 서열은 서열번호 59-71로 표시된다. 수득한 폴리펩티드 단편과 돌연변이가 없는 폴리펩티드 단편을 400 μg/mL의 최종 농도로 DMSO에 녹이고, 효소결합면역흡착분석(ELISA)으로 13B7A6H3 단클론항체의 결합을 검증하였다. ELISA 전용 플레이트(costar, ME, USA)를 사용하였다. 먼저 최종 농도 1 μg/mL의 폴리펩티드 단편을 100 μl의 ELISA 코팅액(Solarbio, Beijing, China)으로 희석하여 분주하고, 음성 대조군으로 단백질을 포함하지 않은 코팅액 100 μl를 분주하였다. 플레이트는 4℃에서 밤새 코팅하였다. PBST로 세척 후, 5% BSA를 함유한 PBS(VWR, PA, USA) 100 μl로 37°C 인큐베이터에서 90분 동안 차단시켰다. PBST로 세척 후, 최종 농도 1 μg/mL의 13B7A6H3 단클론항체를 첨가하여 37°C 인큐베이터에서 60분 동안 결합시켰다. PBST로 세척 후, PBS로 희석한 특이적 항-마우스 Fc 세그먼트 항체(Consun, Shanghai, China)를 37°C 인큐베이터에서 30분 동안 결합시켰다. PBST로 세척 후, 발색액(Invitrogen, CA, USA)을 웰당 100 μl씩 분주하고 인큐베이터에서 5~30분 동안 반응시킨 다음, 정지액(Sangon, Shanghai, China) 50 μl를 첨가하여, 마이크로플레이트 판독기(Thermo Fisher, MA, USA)로 450nm에서 발색을 판독하였다.
도 69은 상기 ELISA 실험 결과를 보여준다. 실험 결과, P8의 3(L), 7(F), 10(R) 위치를 돌연변이시킨 후, 13B7A6H3 항체는 더 이상 폴리펩티드 단편에 결합하지 않았으며, 다른 위치의 돌연변이는 결합에 영향을 미치지 않았다. 이는 3(L), 7(F), 10(R)이 13B7A6H3 단클론항체와 ITPRIPL1 단백질 결합의 핵심 부위임을 알 수 있다.
실시예 27: 에피토프 매핑에 의한 ITPRIPL1 단클론항체 클러스터의 경쟁성 분석
에피토프 매핑(Epitope mapping)에 의한 ITPRIPL1 단클론항체 클러스터 분석을 수행하였다.
수득한 ITPRIPL1 단클론항체를 현재 수득한 ITPRIPL1 단클론항체 간의 경쟁을 위해 에피토프 매핑으로 분석하고 그룹화하였다. ELISA 전용 플레이트(costar, ME, USA)를 사용하였다. 먼저 최종 농도 0.5 μg/mL의 ITPRIPL1 단백질을 100 μl의 ELISA 코팅액(Solarbio, Beijing, China)으로 희석하여 분주하고, 음성 대조군으로 단백질을 포함하지 않은 코팅액 100 μl를 분주하였다. 플레이트는 4℃에서 밤새 코팅하였다. PBST로 세척 후, 5% BSA를 함유한 PBS(VWR, PA, USA) 100 μl로 37°C 인큐베이터에서 90분 동안 차단시켰다. PBST로 세척 후, 0.5 μg/mL의 각 ITPRIPL1 단클론항체를 첨가하고, 동시에 최종 농도 0.5 μg/mL의 각 ITPRIPL1 단클론항체를 교차 첨가하여, 37°C 인큐베이터에서 60분 동안 결합시켰다. PBST로 세척 후, PBS로 희석한 특이적 항-마우스 Fc 세그먼트 항체(Consun, Shanghai, China)를 37°C 인큐베이터에서 30분 동안 결합시켰다. PBST로 세척 후, 발색액(Invitrogen, CA, USA)을 웰당 100 μl씩 분주하고 인큐베이터에서 5~30분 동안 반응시킨 후, 정지액(Sangon, Shanghai, China) 50 μl를 첨가하고 마이크로플레이트 판독기(Thermo Fisher, MA, USA)로 450nm에서 발색을 판독하였다.
도 70은 에피토프 매핑 ELISA 실험 결과를 보여준다. 실험 결과, 13B7과 18B12 사이에 경쟁 관계가 있고, 13H10과 15C9 및 16E1 사이에 경쟁 관계가 있으며, 다른 항체 사이에는 경쟁 관계가 없는 것으로 나타났다. 이는 현재 ITPRIPL1 단클론항체를 (1) 13B7, 18B12; (2)13H10, 15C9, 16E1; (3) 13E8; (4) 18G5의 4 클러스터로 나눌 수 있음을 시사한다.
실시예 28: 인간화 ITPRIPL1 항체 구축 및 결합 부위 측정
1. 인간화 ITPRIPL1 항체의 구축
이전의 항체 시퀀싱 결과에 따르면, 13B7A6H3 단클론항체에 해당하는 쌍(paired)서열서열번호 73-82는 상응하는 인간화 서열을 얻기 위해 인간화 유전자 발현을 사용함으로써 최적화하고 재코딩하였다. 수득한 서열을 인간 Fc 단편에 상응하는 서열 벡터에 삽입하여 인간화 ITPRIPL1 항체 서열 플라스미드를 수득하였다. 인간화 ITPRIPL1 항체 서열 플라스미드로 HEK293 세포를 형질감염시켜 배양하였다. 72시간 후 상청액을 취하여, 평형화시킨 단백질 A 마그네틱 비드와 함께 실온에서 2시간 동안 진탕시키고, 크로마토그래피 컬럼에서 관류, 평형화/불순물 세척 및 용출을 수행한 다음, 중화하여 인간화 ITPRIPL1 항체를 수득하였다.
2. 인간화 ITPRIPL1 항체의 결합 활성 및 부위 측정
ELISA 전용 플레이트(costar, ME, USA)를 사용하였다. 먼저 최종 농도 1 μg/mL의 ITPRIPL1 P8 폴리펩티드를 100 μl의 ELISA 코팅액(Solarbio, Beijing, China)으로 희석하여 분주하고, 음성 대조군으로 단백질을 포함하지 않은 코팅액 100 μl를 분주하였으며, 양성 대조군으로 인간 ITPRIPL1 P8 폴리펩티드를 분주하였다. 플레이트는 4℃에서 밤새 코팅하였다. PBST로 세척 후, 5% BSA를 함유한 PBS(VWR, PA, USA) 100 μl로 37°C 인큐베이터에서 90분 동안 차단시켰다. PBST로 세척 후, 최종 농도 0.5 μg/mL의 키메라 및 인간화 13B7A6H3 단클론항체를 첨가하여 37°C 인큐베이터에서 60분 동안 결합시켰다. PBST로 세척 후, PBS로 희석한 특이적 항-인간 Fc 세그먼트 항체(Abcam, MA, USA)를 37°C 인큐베이터에서 30분 동안 결합시켰다. PBST로 세척 후, 발색액(Invitrogen, CA, USA)을 웰당 100 μl씩 분주하고 인큐베이터에서 5~30분 동안 반응시킨 다음, 정지액(Sangon, Shanghai, China) 50 μl를 첨가하여, 마이크로플레이트 판독기(Thermo Fisher, MA, USA)로 450nm에서 발색을 판독하였다.
도 74는 인간화 항체와 ITPRIPL1 P8 폴리펩티드 단편 결합의 ELISA 실험 결과를 보여준다. 실험 결과는 수득한 인간화 항체가 모두 활성을 가지며 13B7A6H3에 결합된 ITPRIPL1 폴리펩티드 단편 부위에 특이적으로 결합할 수 있다는 것을 보여주는 것으로, 이는 성공적인 항체 구축을 나타낸다.
실시예 29: 단클론성 ITPRIPL1 항체와 사이노몰구스 원숭이 ITPRIPL1 단백질의 결합 측정
효소결합면역흡착분석(ELISA)으로 13B7A6H3 단클론항체와 사이노몰구스 원숭이 ITPRIPL1 폴리펩티드 단편의 결합 검증
NCBI 단백질 데이터베이스에 따르면, 사이노몰구스 원숭이 ITPRIPL1 단백질 서열은 서열번호 72이고, 인간 ITPRIPL1 P8에 해당하는 사이노몰구스 원숭이 폴리펩티드 단편 서열은 서열번호이다. 사이노몰구스 원숭이에 상응하는 폴리펩티드 단편을 기반으로, 상응하는 폴리펩티드를 구축하였다. ELISA 전용 플레이트(costar, ME, USA)를 사용하였다. 먼저 최종 농도 1 μg/mL의 사이노몰구스 원숭이 ITPRIPL1 폴리펩티드를 100 μl의 ELISA 코팅액(Solarbio, Beijing, China)으로 희석하여 분주하고, 음성 대조군으로 단백질을 포함하지 않은 코팅액 100 μl를 분주하였으며, 양성 대조군으로 인간 ITPRIPL1 P8 폴리펩티드를 분주하였다. 플레이트는 4℃에서 밤새 코팅하였다. PBST로 세척 후, 5% BSA를 함유한 PBS(VWR, PA, USA) 100 μl로 37°C 인큐베이터에서 90분 동안 차단시켰다. PBST로 세척 후, 최종 농도 0.5 μg/mL의 13B7A6H3 단클론항체를 첨가하여 37°C 인큐베이터에서 60분 동안 결합시켰다. PBST로 세척 후, PBS로 희석한 특이적 항-마우스 Fc 세그먼트 항체(Consun, Shanghai, China)를 37°C 인큐베이터에서 30분 동안 결합시켰다. PBST로 세척 후, 발색액(Invitrogen, CA, USA)을 웰당 100 μl씩 분주하고 인큐베이터에서 5~30분 동안 반응시킨 다음, 정지액(Sangon, Shanghai, China) 50 μl를 첨가하여, 마이크로플레이트 판독기(Thermo Fisher, MA, USA)로 450nm에서 발색을 판독하였다.
도 75는 사이노몰구스 원숭이 ITPRIPL1 폴리펩티드와 ITPRIPL1 단클론항체 결합의 ELISA 실험 결과를 보여준다. 실험 결과, 사이노몰구스 원숭이 ITPRIPL1 폴리펩티드와 인간 ITPRIPL1 P8 폴리펩티드의 13B7A6H3 단클론항체에 대한 결합은 큰 차이가 없는 것으로 나타났으며, 이는 13B7A6H3 단클론항체가 사이노몰구스 원숭이 ITPRIPL1 단백질에 결합할 수 있음을 시사한다.
요약하면, 본 명세서는 CD3ε 세포외 도메인에 결합하는 새롭게 확인된 천연 막 단백질인 ITPRIPL1을 개시하고, ITPRIPL1이 CD3ε에 결합한 후 T세포 활성화를 제어하는 신호전달을 변화시킨다는 것을 밝혀냈다. 이는 과거에 발견된 CD3ε 결합 항체가 ITPRIPL1의 천연 리간드 기능을 어느 정도 모방하거나 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 한 쌍의 면역 체크포인트 수용체 리간드인 CD3ε 및 ITPRIPL1의 발견은, 신체의 면역 항상성 유지 및 종양세포의 면역회피 기전에 대한 심층적인 이해를 위해 새로운 관점을 제공한다.
본 명세서의 내용은 상기 기술한 바람직한 실시예를 통해 자세히 설명되었지만, 본 명세서의 내용이 이러한 실시예로 제한되는 것으로 이해해서는 안 된다. 당해 분야의 기술자는 상술한 내용을 읽은 후, 본 명세서에 대한 다양한 수정 및 대안을 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 따라서 본 명세서의 보호 범위는 첨부된 청구 범위로 정의되어야 한다.

Claims (47)

  1. 면역반응 조절 또는 항종양 약물 제조에서 ITPRIPL1 조절제의 용도로, 상기 조절제는 유기체 내 ITPRIPL1 유전자 또는 단백질의 발현 또는 기능을 증가 또는 감소시키는 데 사용되는 것을 특징으로 하는, 용도.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조절제는 다음 중 어느 하나를 포함하는, 면역반응 조절 또는 항종양 약물 제조에서 ITPRIPL1 조절제의 용도:
    (1) 세포 내 ITPRIPL1 유전자의 녹아웃(knockout) 또는 돌연변이를 유발시키는 유전자 편집 시스템;
    (2) ITPRIPL1 유전자의 발현 수준을 감소시키는 RNA 분자;
    (3) 세포 내 도입을 위한 핵산 분자로, 상기 핵산 분자는 ITPRIPL1을 코딩하고 ITPRIPL1의 발현 수준을 증가시키는 핵산 분자;
    (4) 단리된 ITPRIPL1 재조합 단백질;
    (5) ITPRIPL1을 인식하고 결합하는 항체.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 유전자 편집 시스템은 CRISPR/Cas9 유전자 편집 시스템이고; 상기 CRISPR/Cas9 유전자 편집 시스템에 사용되는 표적 서열은 서열번호 11-13으로 표시되는 서열에서 선택되는 서열이며, sgRNA 코딩에 사용되는 올리고머 DNA 서열은 서열번호 14-19에서 선택되는 서열이고;
    상기 핵산 분자는 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10으로 표시되는 서열을 포함하며;
    상기 ITPRIPL1 재조합 단백질은 ITPRIPL1 단백질의 세포외 도메인에서 CD3ε 또는 NRP2 단백질과 결합할 수 있는 기능적 단편이고;
    상기 항체는 ITPRIPL1을 인식하고 결합하는, 다클론항체, 단클론항체, 단일사슬항체, 항원 결합 도메인, 이중특이항체, 다중특이항체, 또는 키메라 항원 수용체의 항원 결합 부분인; 면역반응 조절 또는 항종양 약물 제조에서 ITPRIPL1 조절제의 용도.
  4. 제3항에 있어서, 상기 기능적 단편의 서열은 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 선택되는 어느 하나, 또는 이의 유도체 서열이고, 상기 유도체 서열은 DRMDLDTLARSRQLEKRMSEEMRxLEMEFEERxxxAExxQKxENxWxGxTSxDQ("x"는 임의의 아미노산)를 포함하며, 상기 유도체 서열은 서열의 기능을 변경하지 않고 1-10개의 아미노산을 치환, 결실 또는 삽입을 포함하고; 상기 유도체 서열은 바람직하게 DRMDLDTLARSRQLEKRMSEEMRxLEMEFEERxxxAExxQKxENxWxGxTSxDQ("x"는 임의의 아미노산)인, 면역반응 조절 또는 항종양 약물 제조에서 ITPRIPL1 조절제의 용도.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 ITPRIPL1 재조합 단백질은 항체 불변영역과 융합 단백질을 형성하거나, 응고 인자와 융합 단백질을 형성하는 재조합 단백질이고; 대안적으로, 상기 ITPRIPL1 재조합 단백질은 변형되고, 상기 변형은 폴리에틸렌 글리콜 변형, 글리코실화 변형, 폴리시알산 변형, 지방산 변형, KLH 변형 및 비오틴 변형을 포함하는, 면역반응 조절 또는 항종양 약물 제조에서 ITPRIPL1 조절제의 용도.
  6. 제3항에 있어서, 상기 핵산 분자는 약물 전달 시스템을 통해 세포 내로 도입되고, 상기 약물 전달 시스템은 재조합 발현벡터, 바이러스, 리포솜 또는 나노물질을 포함하는, 면역반응 조절 또는 항종양 약물 제조에서 ITPRIPL1 조절제의 용도.
  7. 제1항에 있어서, 상기 면역반응 조절은 자가면역반응, 이식거부 면역반응 억제, 알레르기 반응, 항감염 면역반응, 항종양 면역반응의 과정 동안 항원제시세포 및 T림프구의 기능 조절을 포함하는, 면역반응 조절 또는 항종양 약물 제조에서 ITPRIPL1 조절제의 용도.
  8. 제7항에 있어서, 상기 면역반응은 제1형 당뇨병, 면역성 불임, 장기 이식 후 거부 반응, 알레르기 반응, 전신 염증 또는 사이토카인 폭풍, 감염을 포함하는, 면역반응 조절 또는 항종양 약물 제조에서 ITPRIPL1 조절제의 용도.
  9. 제1항에 있어서, 상기 종양은 ITPRIPL1-관련 고형 종양 또는 혈액학적 종양이고; 상기 고형 종양은 신경교종, 폐암, 두경부암, 위암, 결장직장암, 갑상선암, 식도암, 요로상피암, 고환암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 흑색종, 췌장암 또는 간암을 포함하며; 상기 혈액학적 종양은 백혈병 또는 림프종을 포함하는, 면역반응 조절 또는 항종양 약물 제조에서 ITPRIPL1 조절제의 용도.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 용도로 사용되는 조절제, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  11. 단리된 ITPRIPL1 재조합 단백질로, 상기 재조합 단백질은 ITPRIPL1 단백질의 세포외 도메인에서 CD3ε 또는 NRP2 단백질과 결합할 수 있는 기능적 단편인 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
  12. 면역반응 조절 또는 항종양 약물 제조에서 ITPRIPL1을 인식하고 결합하는 항체의 용도로, 상기 항체는 ITPRIPL1 단백질의 세포외 도메인을 인식하고 결합하는 것을 특징으로 하는, 용도.
  13. ITPRIPL1을 특이적으로 인식하는, 원발성 병변 내 암 조직과 암 인접 조직 사이의 경계, 림프절로 전이된 암세포와 정상 림프조직 사이의 경계, 멀리 전이된 암세포와 전이된 장기의 정상 조직 사이의 경계, 및 기타 생체시료 내 살아있는 암 조직 세포를 표지하기 위한 항체의 적용.
  14. 제13항에 있어서, 상기 암은 갑상선암, 유방암, 결장직장암, 폐암, 식도암, 신장암 및 기타 ITPRIPL1-관련 종양을 포함하는, 적용.
  15. ITPRIPL1 항원에서 서열번호 49 또는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 결합할 수 있는, 단리된 ITPRIPL1 항원-결합 단백질.
  16. 제15항에 있어서, 중쇄가변영역과 경쇄가변영역을 포함하고, 상기 중쇄가변영역은 아미노산 서열 서열번호 24 또는 서열번호 34 중 어느 하나로 표시되는 중쇄가변영역 VH에서 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3를 포함하며; 상기 경쇄가변영역은 아미노산 서열 서열번호 25 또는 서열번호 35 중 어느 하나로 표시되는 경쇄가변영역 VL에서 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는, 단리된 ITPRIPL1 항원-결합 단백질.
  17. 제16항에 있어서, 상기 HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 26으로 표시되고, 상기 HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 27로 표시되며, 상기 HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 28로 표시되는, 단리된 ITPRIPL1 항원-결합 단백질.
  18. 제16항에 있어서, 상기 HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 36으로 표시되고, 상기 HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 37로 표시되며, 상기 HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 38로 표시되는, 단리된 ITPRIPL1 항원-결합 단백질.
  19. 제16항에 있어서, 상기 LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상 유사하고, 상기 LCDR2의 아미노산 서열은 KV이며, 상기 LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상 유사한, 단리된 ITPRIPL1 항원-결합 단백질.
  20. 제16항에 있어서, 상기 LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 29 또는 서열번호 39 중 어느 하나로 표시되고, 상기 LCDR2의 아미노산 서열은 KV이며, 상기 LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 31 또는 서열번호 41 중 어느 하나로 표시되는, 단리된 ITPRIPL1 항원-결합 단백질.
  21. 제16항에 있어서, 상기 LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 29로 표시되고, 상기 LCDR2의 아미노산 서열은 KV이며, 상기 LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 31로 표시되고; 대안적으로, 상기 LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 39로 표시되고, 상기 LCDR2의 아미노산 서열은 KV이며, 상기 LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 41로 표시되는, 단리된 ITPRIPL1 항원-결합 단백질.
  22. 제16항에 있어서, 상기 중쇄가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 24로 표시되고; 상기 경쇄가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 25 또는 서열번호 35 중 어느 하나로 표시되는, 단리된 ITPRIPL1 항원-결합 단백질.
  23. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 중쇄불변영역을 포함하고, 상기 항체 중쇄불변영역은 인간 IgG 중쇄불변영역으로부터 유래된, 단리된 ITPRIPL1 항원-결합 단백질.
  24. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 경쇄불변영역을 포함하고, 상기 항체 경쇄불변영역은 인간 Igκ 경쇄불변영역을 포함하는, 단리된 ITPRIPL1 항원-결합 단백질.
  25. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 중쇄 HC를 포함하고, 상기 HC는 서열번호 22 또는 32 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 ITPRIPL1 항원-결합 단백질.
  26. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 경쇄 LC를 포함하고, 상기 LC는 서열번호 23 또는 33 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 ITPRIPL1 항원-결합 단백질.
  27. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 상기 항원 결합 단편이 Fab, Fab', F(ab)2, Fv 단편, F(ab')2, scFv 및/또는 di-scFv를 포함하는, 단리된 ITPRIPL1 항원-결합 단백질.
  28. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITPRIPL1 단백질은 인간 및 사이노몰구스 원숭이 ITPRIPL1 단백질을 포함하는, 단리된 ITPRIPL1 항원-결합 단백질.
  29. 제15항 내지 제28항 중 어느 한 항의 단리된 ITPRIPL1 항원-결합 단백질을 포함하는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR).
  30. 제15항 내지 제28항 중 어느 한 항의 단리된 ITPRIPL1 항원-결합 단백질을 포함하는 면역접합체(immunoconjugate).
  31. 제15항 내지 제28항 중 어느 한 항의 단리된 ITPRIPL1 항원-결합 단백질 또는 제29항의 키메라 항원 수용체를 코딩하거나, 또는 제4항 및 제11항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 단백질 단편을 코딩하는, 하나 또는 그 이상의 단리된 핵산 분자.
  32. 제31항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  33. 제31항의 핵산 분자 또는 제32항의 벡터를 포함하는 세포.
  34. 제15항 내지 제28항 중 어느 한 항의 단리된 ITPRIPL1 항원-결합 단백질, 제29항의 키메라 항원 수용체, 제30항의 면역접합체, 및 약학적으로 허용되는 보조제를 선택적으로 포함하는, 약제학적 조성물.
  35. 제15항 내지 제28항 중 어느 한 항의 단리된 ITPRIPL1 항원-결합 단백질이 발현가능한 조건 하에서 배양되는, 제33항의 세포.
  36. 제15항 내지 제28항 중 어느 한 항의 단리된 ITPRIPL1 항원-결합 단백질, 제29항의 키메라 항원 수용체, 제30항의 면역접합체, 및/또는 제34항의 약제학적 조성물의 약물 제조 용도로, 상기 약물은 종양의 예방, 완화 및/또는 치료에 사용되는, 용도.
  37. 제36항에 있어서, 상기 종양은 ITPRIPL1-관련 종양을 포함하는, 용도.
  38. ITPRIPL1-관련 종양을 선별하고 감별하는 방법으로, 피험자로부터의 생체시료에서 ITPRIPL1의 발현을 검출하여 미리 설정된 값과 비교하는 방식으로 판정하고, 상기 검출은 항체, 핵산 프로브 또는 특정 프라이머를 포함하는 PCR 반응을 이용한 검출을 포함하며, 상기 생체시료는 조직, 혈액, 소변, 뇌척수액, 복수, 흉수, 조직삼출액, 대변 및 기타 시료를 포함하는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 방법은 종양 선별 또는 진단을 위한 키트 제조에 적용, 및 ITPRIPL1 조절제에 적합한 환자 선별을 위한 동반진단키트 제조에 적용하는, 방법.
  40. 다음의 서열을 포함하는, ITPRIPL1의 선형(linear) 에피토프 폴리펩티드:
    (i) 서열번호 49의 아미노산 서열, 즉 RLLEMEFEERKRAAE; 또는
    (ii) xxLxxxFxxRxxx(x는 임의의 아미노산)로 표시되는 아미노산 서열, 양 말단에서 1-3개의 아미노산이 결실될 수 있음; 또는
    (iii) 서열번호 49에서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 수득된 아미노산 서열.
  41. 제40항의 펩티드를 코딩하는 핵산 서열 또는 이의 상보적 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자.
  42. 제41항의 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 벡터.
  43. 제42항의 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는, 숙주 세포.
  44. 약학적으로 허용되는 담체 및 제40항의 펩티드, 제42항의 벡터 또는 제43항의 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  45. 제40항 내지 제44항의 에피토프 펩티드 및 상응하는 코딩된 핵산, 벡터, 숙주 세포, 및 약제학적 조성물, 및 그에 따른 ITPRIPL1 조절제의 선별 및 제조에서의 용도.
  46. 제1항 내지 제36항에 따른 ITPRIPL1 기능 조절제의 발견 및 평가를 위한 방법으로, 테스트 분자의 다음 특성 중 하나 이상이 검출되는 것을 특징으로 하는 방법: 세포 표면에 발현된 ITPRIPL1에 특이적으로 결합하는 능력; ITPRIPL1과 CD3ε의 결합에 대한 영향; ITPRIPL1과 NRP2의 결합에 대한 영향; ITPRIPL1과 SEMA3G의 결합에 대한 영향; ITPRIPL1과 EBI2의 결합에 대한 영향; 및 면역세포 또는 종양세포의 기능에 직접 또는 간접적인 효과, 상기 효과는 시험관 내 또는 생체 내에서 검출할 수 있는, 방법.
  47. 면역반응 조절 또는 항종양 약물 제조 및 개체 내 ITPRIPL1 발현의 검출에 있어서 단리된 ITPRIPL1 항원-결합 단백질의 용도로, 상기 단리된 ITPRIPL1 항원-결합 단백질은 ITPRIPL1 항원 내 서열번호 49 또는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 결합할 수 있는, 용도.
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